(57)【要約】  優れたＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制作用を有し且つ安全性の改善された新規な薬剤を提供する。  ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とするＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とするＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項２】
ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制する物質がｓｉＲＮＡである請求項１記載のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の物質を有効成分とするＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じた癌細胞の抗癌剤耐性克服剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の物質と、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤とを組み合せてなる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１又は２記載の物質の、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現抑制剤、又はＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じた癌細胞の抗癌剤耐性克服剤製造のための使用。
【請求項６】
請求項１又は２記載の物質と、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤との組み合せの、医薬組成物製造のための使用。
【請求項７】
請求項１又は２記載の物質の有効量を投与することを特徴とする、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現抑制方法、又はＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じた癌細胞の抗癌剤耐性克服方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載の物質と、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤とを投与することを特徴とするがん治療方法。
【請求項９】
ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制する物質を探索することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤に対する感受性判定方法。
【請求項１１】
ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤投与時の副作用発現程度の判定方法。
【請求項１２】
ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質による抗癌剤耐性の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩酸イリノテカン等のカンプトテシン類、ミトキサントロン等の抗癌剤は、抗悪性腫瘍効果が極めて高いことから広く用いられているが、長期連用により抗癌効果が低下する場合のあることが指摘されている。癌細胞による、これらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては最近研究されており、ＡＢＣトランスポーターの一つであるＢＣＲＰが、これらの抗癌剤耐性獲得に関与していることが知られている（非特許文献１）。すなわち、抗癌剤が長期連用されると癌細胞内にＢＣＲＰが発現し、当該ＢＣＲＰは抗癌剤を細胞外へ排出することにより抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を有することが判明した。なお、ＭＤＲ１遺伝子にコードされるＰ−糖蛋白質も抗癌剤耐性獲得に関与するＡＢＣトランスポーターとして知られている（非特許文献２）。Ｐ−糖蛋白質は二つのＡＴＰ結合カセットを有し、ＢＣＲＰとは基質特異性が異なる。【０００３】
現在知られているＡＢＣトランスポーター阻害剤としては、ジフェニルアセチルピペラジン誘導体を有効成分とする耐性克服剤（特許文献１）、エニアチン類を有効成分として含有するＡＢＣトランスポーター阻害剤（特許文献２）及びアントラニル酸誘導体を有効成分として含有するＰ−糖蛋白阻害剤（特許文献３）等が報告されているが、いずれも阻害剤としての十分な効果が得られておらず、さらには、阻害の対象となる蛋白質に対する特異性が低いことにより望ましくない副作用が誘導されるという問題があった。
【先行技術文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３３９０７３号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７７１６号公報
【特許文献３】特表２００１−５０２６８３号公報
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５（２６），  １５６６５−１５６７０（１９９８）．
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２９２：２４８−５９４（１９９８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、優れたＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制作用を有し且つ安全性の改善された新規な薬剤を提供することである。
また、本発明の課題は、ＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤のスクリーニング方法を提供することである。
また、本発明の更なる課題は、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤に対する感受性判定方法、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤投与時の副作用発現程度の判定方法及びＡＢＣトランスポーター蛋白質による抗癌剤耐性の判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく、外因性Ｐ−糖蛋白質を発現させたヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７／ＭＤＲ）及び外因性ＢＣＲＰを発現させたヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７／ＢＣＲＰ）を用いて、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現を抑制する化合物を見出す目的で種々の物質についてスクリーニングしたところ、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ又はＺＮＦ２５９を標的遺伝子とするｓｉＲＮＡが、ＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞のＰ−糖蛋白質の発現及びＭＣＦ−７／ＢＣＲＰ細胞のＢＣＲＰの発現を抑制することを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とするＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現抑制剤を提供するものである。【０００９】
また、本発明は、上記物質を有効成分とするＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じた癌細胞の抗癌剤耐性克服剤を提供するものである。【００１０】
また、本発明は、上記物質と、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤とを組み合せてなる医薬組成物を提供するものである。【００１１】
また、本発明は、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現を抑制する物質を探索することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。【００１２】
また、本発明は、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤に対する感受性判定方法を提供するものである。【００１３】
また、本発明は、上記した遺伝子の発現量を測定することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤投与時の副作用発現程度の判定方法を提供するものである。【００１４】
また、本発明は、上記した遺伝子の発現量を測定することを特徴とするＡＢＣトランスポーター蛋白質による抗癌剤耐性の判定方法を提供するものである。【００１５】
また、本発明は、上記物質の、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現抑制剤、又はＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じた癌細胞の抗癌剤耐性克服剤製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、上記物質とＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤との組み合せの、医薬組成物製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、上記物質の有効量を投与することを特徴とする、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現抑制方法、又はＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じた癌細胞の抗癌剤耐性克服方法を提供するものである。
また、本発明は、上記物質と、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の基質となり得る抗癌剤とを投与することを特徴とするがん治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＡＢＣトランスポーター蛋白質、特にＢＣＲＰ又はＰ−糖蛋白質の発現により十分に薬効の発現できなくなった抗癌剤の効果を回復できることから、抗癌剤の投薬量の管理が容易となり、その結果、副作用を抑制した癌化学療法が可能となる。
また、ＡＢＣトランスポーター蛋白質、特にＢＣＲＰ又はＰ−糖蛋白質の発現を抑制する物質の探索及びその作用機構を解明するための有用な薬剤開発系を提供することができる。
さらに、本発明の対象となる遺伝子の発現量を測定することにより、抗癌剤を投与した場合の副作用の発現程度や抗癌剤耐性の程度も予測することが可能であり、より安全な抗癌剤治療指針の策定に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤の対象となる遺伝子はＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である。
ここで、「ＡＲＨＧＡＰ１７」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８０５４に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＣＴＤＳＰ２」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５７３０に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＤＵＳＰ１」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４１７に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＩＭＰＡ２」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４２１４に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＲＨＯＢＴＢ３」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４８９９に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＳＧＫ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５６２７に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＵＢＥ２Ｈ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３４４に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＩＮＰＰ５Ｆ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４９３７に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＭＡＰ２Ｋ６」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２７５８に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＰＰＭ１Ｅ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４９０６に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＰＲＫＡＧ２」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６２０３に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＰＲＫＣＤ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６２５４に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＰＴＰＮ２１」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７０３９に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＵＢＥ２Ｂ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３３７に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＵＢＴＦ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４２３３に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいい、
「ＺＮＦ２５９」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３９０４に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいう。【００１８】
本発明において、その発現が抑制されるＡＢＣトランスポーターの種類は特に限定されるものではないが、例えば、薬剤耐性に関与することが報告されているＡＢＣトランスポーターとして、Ｐ−糖蛋白質、ＢＣＲＰ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５、ＭＲＰ７、ＡＢＣＡ／ＡＢＣ２、ＡＢＣＢ５等を挙げることができる。これらのうち、Ｐ−糖蛋白質、ＢＣＲＰは広範な抗癌剤耐性と関係しており、本発明抑制剤の対象として特に重要である。【００１９】
本発明の対象となる遺伝子であるＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ及びＺＮＦ２５９は、当該遺伝子の発現を抑制することでＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現が抑制される。【００２０】
本発明において、「遺伝子の発現を抑制する物質」は特に限定されるものではなく、例えばｓｉＲＮＡ、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｍｉＲＮＡ等を好適に用いることができる。これらのうち、標的遺伝子に対する特異性が高く、望ましくない副作用が誘導されない点で、特にｓｉＲＮＡを好適に用いることができる。
また、本発明の対象遺伝子の発現を抑制する方法として、上記した物質を用いる他、内在性遺伝子の置き換え（ノックアウト）等の手法を用いてもよい。さらには、対象遺伝子がコードする蛋白質に対する公知の阻害剤等を用いることでも、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現を抑制することができる。【００２１】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、発現抑制の対象となる遺伝子のセンス鎖又はその一部の塩基配列に対応するＲＮＡと、そのＲＮＡに相補的なＲＮＡとを、ＲＮＡ合成機を用いて人工的に合成することができる。
その他、発現抑制の対象となる遺伝子又はその一部を正と負の両方向にクローニングしたウイスルベクター又はプラスミドなどの発現ベクターをそれぞれ細胞内に導入し、ＤＮＡの両鎖を細胞内で発現させることによって、細胞内でｓｉＲＮＡができるようにし、標的のｍＲＮＡを分解させるようにしてもよい。
また、発現抑制の対象となる遺伝子又はその一部に対応する二重鎖の各鎖のＤＮＡ配列を融合した配列を持つＤＮＡ、すなわち、センス鎖のＤＮＡの３’末端とアンチセンス鎖のＤＮＡの５’末端を融合させた配列を持つＤＮＡ、又は相補的なＤＮＡの３’末端とセンス鎖のＤＮＡの５’末端を融合させた配列を持つＤＮＡを発現ベクターに組み込んだものを用いてもよい。上記ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどであってもよい。なお、これらのｓｉＲＮＡは３０塩基以内のものが好ましく、さらに２１〜２３塩基、特に２１塩基が好ましい。【００２２】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、発現抑制の対象となる遺伝子のセンス鎖又はその一部の塩基配列に対応するＲＮＡと、そのＲＮＡに相補的なＲＮＡからなるものであれば特に限定されないが、例えば、表１〜１６に示すｓｉＲＮＡを好適に用いることができる。当該ｓｉＲＮＡのターゲット配列を配列番号１〜１６に示す。これらのｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社で市販されている。【００２３】
【表１】
2009122639.tif 000002
【００２４】
【表２】
2009122639.tif 000003
【００２５】
【表３】
2009122639.tif 000004
【００２６】
【表４】
2009122639.tif 000005
【００２７】
【表５】
2009122639.tif 000006
【００２８】
【表６】
2009122639.tif 000007
【００２９】
【表７】
2009122639.tif 000008
【００３０】
【表８】
2009122639.tif 000009
【００３１】
【表９】
2009122639.tif 000010
【００３２】
【表１０】
2009122639.tif 000011
【００３３】
【表１１】
2009122639.tif 000012
【００３４】
【表１２】
2009122639.tif 000013
【００３５】
【表１３】
2009122639.tif 000014
【００３６】
【表１４】
2009122639.tif 000015
【００３７】
【表１５】
2009122639.tif 000016
【００３８】
【表１６】
2009122639.tif 000017
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養系において発現抑制物質を細胞内へ導入する際、調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどの発現抑制物質を、対象の癌細胞に対し、エレクトロポーション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等を用いて導入することができる。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う発現抑制剤の個体への導入方法としては、前記調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどの発現抑制物質を有効成分とする発現抑制剤を、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、導入対象の癌細胞の近傍に直接投与するか、発現抑制剤によっては、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内に投与する方法であってもよい。また、全身投与のための手段として、胆汁酸塩又はフクジン酸又は他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜又は経皮投与も可能である。これらの医薬組成物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
個体に投与する発現抑制剤としては、発現抑制剤が細胞内に取り込まれやすいように調製されているものが好ましい。例えば、前記アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡをウイルスベクターに組み込んだ発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで適当な細胞株に感染させ、ウイルスを産生し、そのウイルスを注射（ｉｎｊｅｃｔ）して感染させる方法であってもよい。ウイルスベクターとしては、細胞内で発現するアデノウイルスベクターや、レトロウイルスベクターを用いてもよい。
また、前記発現ベクターをリポソームの中に入れて癌細胞と融合させることによって、プラスミドを細胞内に導入させてもよい。
また、前記調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法により細胞内に導入されやすいＨＩＶのＴＡＴなどのペプチドと結合させたＲＮＡアプタマーを発現抑制剤として注射してもよい。【００４０】
本発明において、ＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤とは、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現を抑制する作用を奏するものであれば特に限定されるものではないが、後述の方法（実施例１）により求められる相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）を指標とするＰ−糖蛋白質の発現の変化率が２２〜８３％のものが好ましく、２２〜５０％のものがさらに好ましく、２２〜４０％のものが特に好ましく、２２〜３０％のものが最も好ましい。
また、後述の方法（実施例２）により求められる相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）を指標とするＢＣＲＰの発現の変化率が３７〜８７％のものが好ましく、３７〜６０％のものがさらに好ましく、３７〜５０％のものが特に好ましく、３７〜４０％のものが最も好ましい。【００４１】
前記の方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された特定の癌細胞に発現抑制物質を導入したものと、導入していないものについて、発現抑制の対象となる遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を比較評価することにより、発現抑制物質による発現抑制の評価を行うことができる。ｍＲＮＡの量は、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザン・ブロッティング法などにより測定することができる。この結果を用いて、発現抑制の対象となる遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳をより有効に抑制することができる物質を探索することで、ＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤をスクリーニングすることができる。より具体的には、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７に被験物質を処理した後、回収した細胞からｍＲＮＡを精製し、ＡｆｆｉｍｅｔｒｙｘのＤＮＡマイクロアレイに供し、遺伝子発現変動を検索する方法が好適に用いられる。なお、前記スクリーニング方法において用いられる細胞は特に限定されるものではなく、本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤の対象遺伝子を１種以上発現している細胞であれば何れも好適に用いることができる。【００４２】
上記はｉｎ  ｖｉｔｒｏによる実験であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験においても評価することが可能である。すなわち、担癌非ヒト動物に発現抑制剤を投与し、その癌の大きさや生存率を、発現抑制剤を投与していない動物と対比することにより評価できる。具体的には、正常マウスに前記特定の癌細胞を投与し、一定期間をおいて腫瘍を拡大させ、その後、前記導入方法により前記調製した発現抑制剤を１〜数回投与する。投与後、発現抑制剤を導入したマウスと、導入していないマウスとの癌の大きさや生存率を比較評価することにより、発現抑制物質による発現抑制の評価を行うことができる。【００４３】
本発明においては、被験細胞として、癌細胞、例えば患者より切除した癌細胞（組織）、あるいはバイオプシー検体を用い、本発明の遺伝子の発現量を測定し、所定の標準値（例えば、抗癌剤耐性を有してない通常の癌細胞における当該遺伝子の発現量）と比較してその感受性を判定すれば、結果的に癌細胞の抗癌剤耐性を判定できる。ここで、被験者の癌細胞における本発明の遺伝子発現量が所定の標準値と比較して低い場合には、その癌細胞は当該抗癌剤に対して感受性である（抗癌剤耐性が弱い）と判定される。一方、その逆の場合には、当該抗癌剤に対して感受性ではない（抗癌剤耐性が強い）と判定される。抗癌剤に対して感受性を有しない場合は、その薬効を期待することができず、抗癌剤による副作用のみが発現すると考えられるため、本発明の判定方法によれば、不必要な副作用の発現もしくは無効な治療継続に伴う癌の進行や副作用の増大を回避することができる。
また、以下の方法によれば、抗癌剤投与時の副作用発現程度をより正確に判定することができる。すなわち、被験細胞として被験者の正常細胞を用い、当該被験細胞における本発明の遺伝子の発現量を測定し、所定の標準値（例えば、健常者の正常細胞における当該遺伝子の発現量）と比較してその感受性を把握することにより、抗癌剤投与時の副作用発現程度を判定（予測）することが可能となり、結果的に安全な薬剤投与が達成できる。ここで、被験者の正常細胞における本発明の遺伝子発現量が所定の標準値と比較して低い場合には、その被験者は当該抗癌剤に対して感受性である（抗癌剤投与時の副作用発現程度が高い）と判定される。一方、その逆の場合には、当該抗癌剤に対して感受性ではない（抗癌剤投与時の副作用発現程度が低い）と判定される。【００４４】
本発明において、発現抑制剤の対象となる抗癌剤としては、ＢＣＲＰ又はＰ−糖蛋白質等のＡＢＣトランスポーター蛋白質により耐性を生じる抗癌剤であれば特に限定されず、例えば、塩酸イリノテカン、トポテカン、トポテシン等のカンプトテシン類；ミトキサントロン等のアンスラキノン類；７−ヒドロキシスタウロスポリン等のスタウロスポリン類；塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸エピルビシン、アドリアマイシン等のアンスラサイクリン類；ビンクリスチン等のビンカアルカロイド類；パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン類；エトポシド、マイトマイシン、ゲフィチニブ、イマチニブ、エルロチニブ等が挙げられる。【００４５】
また、本発明の抗癌剤に対する感受性判定方法、抗癌剤投与時の副作用発現程度の判定方法、抗癌剤耐性の判定方法及び抗癌剤耐性克服剤の対象癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に限定されない。【００４６】
本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤は、ＡＢＣトランスポーター蛋白質の発現を強力に阻害するので、抗癌剤耐性克服剤又は抗癌剤効果増強剤として使用することが出来る。抗癌剤の投与によってＡＢＣトランスポーター関与の耐性を獲得した癌に対し、抗癌剤耐性克服剤として使用することができ、また、もとからＡＢＣトランスポーター蛋白質を発現し、抗癌剤に対して低感受性の癌に対しては抗癌剤効果増強剤として使用することができる。【００４７】
本発明の（Ａ）抗癌剤耐性克服剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治療効果が回復するので、これら成分（Ａ）及び（Ｂ）の組み合せは新たな抗癌用医薬組成物として有用である。【００４８】
本発明の発現抑制剤又は新たな抗癌剤は、従来からこれらの成分が用いられている製剤をそのまま併用することにより投与してもよいが、これらの成分を含む新たな製剤としてもよい。これらの製剤の形態としては、経口剤、注射剤（筋肉、皮下、静脈を含む）、坐剤、外用剤（パッチ剤、塗布剤）等が挙げられる。【００４９】
本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜薬物動態などの試験後に投与量を設定することが望ましいが、例えば、ＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤としてｓｉＲＮＡを使用する場合、通常成人１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。また、（Ｂ）癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤の投与量は、通常の薬効量でよく、例えば、通常成人１日当たり１ｍｇ〜１ｇ、特に２ｍｇ〜３００ｍｇが好ましい。【００５０】
本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤は、そのうち１種を単独で使用しても、あるいは複数を組み合わせて使用してもよい。さらには、治療上有利となる他の化合物と併用してもよく、当該他の化合物の作用機作は本発明の化合物と同一であっても、また異なっていてもよい。【００５１】
本発明の医薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は、薬学的に許容される担体を用いて製剤上の常套手段により調製することができる。上記の薬学的に許容される担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。【００５２】
また、本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤は、上記のような医薬品として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明ＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。具体的に本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。【００５３】
さらに飲食品としては、本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤を含有する発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵乳製品が好適に用いられる。これら発酵乳飲食品の製造は定法に従って製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地に乳酸菌やビフィズス菌を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで別途調製したシロップ溶液及び本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、さらにフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。【００５４】
また、本発明のＡＢＣトランスポーター蛋白質発現抑制剤は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物に適用できる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。【００５６】
実施例１  ｓｉＲＮＡ導入によるＰ−糖蛋白質の発現変化
（１）試験方法
ｓｉＲＮＡ導入によるＰ−糖蛋白質の発現変化測定法を以下に示す。
外因性Ｐ−糖タンパク質を発現させたヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７／ＭＤＲ（特開２００６−６９９１０に記載されているＭＣＦ−７／ＭＤＲ１と同一の細胞）を６０ｍｍ−ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ社）に４×１０５個でまき、１６時間培養した。この細胞に目的遺伝子を標的とした、発現抑制実証済みの市販のｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）（表１〜表１６）を遺伝子導入した。具体的には、２０μｍｏｌ／Ｌに調製したｓｉＲＮＡ  ４μＬ（８０ｐｍｏｌ）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）１９６μＬをマイクロチューブに加えた。マイクロピペッターで５回ピペッティングして混和し、室温で５分間静置した。別のマイクロチューブにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）６μＬとＯＰＴＩ−ＭＥＭ  １９４μＬを加えて、マイクロピペッターで５回ピペッティングして混和した。５分間静置したｓｉＲＮＡ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を全量加えて４００μＬとした後、マイクロピペッターで５回ピペッティングして混和した。このｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を室温で２０分間静置した。この間にＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞を４ｍＬのＰＢＳ（−）（ニッスイ社）で洗い、最終濃度５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ｓｉｇｍａ社）入りＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）を１．６ｍＬ加えた。ｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を室温で２０分間静置後、全量４００μＬをＭＣＦ−７／ＭＤＲ細胞に加えて軽く揺すった。溶液が均一になったことを確認したら、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７２時間培養した。【００５７】
細胞表面に発現しているＰ−糖タンパク質の発現量は、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）により測定した。ＦＡＣＳでの測定は、標識抗体を用いて細胞表面に発現しているであろうＰ−糖タンパク質を染色し、染色処理後の細胞を液流にのせ、標識量（Ｐ−糖タンパク質）を測定することによって行った。具体的には、５×１０５個の細胞を１０％ガンマガード／Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ニッスイ社）２００μＬに懸濁して１５分間氷上で精置することにより、細胞表面のタンパク質をブロッキングした。さらに、最終濃度１００μｇ／ｍＬのビオチン化Ｐ−糖タンパク質抗体（ＭＲＫ１６）／１０％ガンマガード／Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬを細胞表面に発現しているＰ−糖タンパク質と反応させた後、４０％  ＰＥ標識ストレプトアビジン（ベクトン・ディッキンソン社）／１０％ガンマガード／Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬと反応させ、ＦＡＣＳではＰＥの輝度（相対蛍光強度：ｃｈａｎｎｅｌ）を測定することにより、細胞表面上に発現しているＰ−糖タンパク質量を測定した。【００５８】
（２）結果
表１〜１６に示すｓｉＲＮＡを用いた場合のＰ−糖蛋白質の発現量の変化を表１７に示した。結果は、「ａ：ｓｉＲＮＡを遺伝子導入していない未処理の細胞の相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）」と「ｂ：ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した後の細胞の相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）」のＭｅｄｉａｎ（中央値）を測定し、これらの値の変化率（ｂ／ａ×１００（％））を算出して、Ｐ−糖蛋白質の発現量の変化の指標とした。【００５９】
表１７に示したように、表１〜１６で示されるｓｉＲＮＡを用いた場合、Ｐ−糖蛋白質の発現量（相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）の変化率）は未処理細胞と比較して、２２〜８３％に抑制された。
すなわち、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ、ＺＮＦ２５９の遺伝子の発現を抑制することで、Ｐ−糖蛋白質の発現量が強力に抑制されることから、これらの遺伝子の発現を抑制する物質（例えば、表１〜１６で示されるｓｉＲＮＡ）はＰ−糖蛋白質の発現抑制剤として好適に用いることができる。【００６０】
【表１７】
2009122639.tif 000018
【００６１】
実施例２  ｓｉＲＮＡ導入によるＢＣＲＰの発現変化
（１）試験方法
ｓｉＲＮＡ導入によるＢＣＲＰの発現変化測定法を以下に示す。
外因性ＢＣＲＰを発現させたヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７／ＢＣＲＰ（特開２００３−６３９８９）を６０ｍｍ−ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ社）に４×１０５個でまき、１６時間培養した。この細胞に目的遺伝子を標的とした、発現抑制実証済みの市販のｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）（表１〜表１６）を遺伝子導入した。具体的には、２０μｍｏｌ／Ｌに調製したｓｉＲＮＡ  ４μＬ（８０ｐｍｏｌ）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）１９６μＬをマイクロチューブに加えた。マイクロピペッターで５回ピペッティングして混和し、室温で５分間静置した。別のマイクロチューブにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）６μＬとＯＰＴＩ−ＭＥＭ  １９４μＬを加えて、マイクロピペッターで５回ピペッティングして混和した。５分間静置したｓｉＲＮＡ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を全量加えて４００μＬとした後、マイクロピペッターで５回ピペッティングして混和した。このｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を室温で２０分間静置した。この間にＭＣＦ−７／ＢＣＲＰ細胞を４ｍＬのＰＢＳ（−）（ニッスイ社）で洗い、最終濃度５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ｓｉｇｍａ社）入りＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）を１．６ｍＬ加えた。ｓｉＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ混合液を室温で２０分間静置後、全量４００μＬをＭＣＦ−７／ＢＣＲＰ細胞に加えて軽く揺すった。溶液が均一になったことを確認したら、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７２時間培養した。【００６２】
細胞表面に発現しているＢＣＲＰの発現量は、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）により測定した。ＦＡＣＳでの測定は、標識抗体を用いて細胞表面に発現しているであろうＢＣＲＰを染色し、染色処理後の細胞を液流にのせ、標識量（ＢＣＲＰ）を測定することによって行った。具体的には、５×１０５個の細胞を１０％ガンマガード／Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ニッスイ社）２００μＬに懸濁して１５分間氷上で精置することにより、細胞表面のタンパク質をブロッキングした。さらに、最終濃度１００μｇ／ｍＬのビオチン化ＢＣＲＰ抗体（ａｎｔｉ  ＢＣＲＰ−Ｂｉｏｔｉｎ）／１０％ガンマガード／Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬを細胞表面に発現しているＢＣＲＰと反応させた後、４０％  ＰＥ標識ストレプトアビジン（ベクトン・ディッキンソン社）／１０％ガンマガード／Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬと反応させ、ＦＡＣＳではＰＥの輝度（相対蛍光強度：ｃｈａｎｎｅｌ）を測定することにより、細胞表面上に発現しているＢＣＲＰ量を測定した。【００６３】
（２）結果
表１〜１６に示すｓｉＲＮＡを用いた場合のＢＣＲＰの発現量の変化を表１８に示した。結果は、「ａ：ｓｉＲＮＡを遺伝子導入していない未処理の細胞の相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）」と「ｂ：ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した後の細胞の相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）」のＭｅｄｉａｎ（中央値）を測定し、これらの値の変化率（ｂ／ａ×１００（％））を算出して、ＢＣＲＰの発現量の変化の指標とした。【００６４】
表１８に示したように、表１〜１６で示されるｓｉＲＮＡを用いた場合、ＢＣＲＰの発現量（相対蛍光強度（ｃｈａｎｎｅｌ）の変化率）は未処理細胞と比較して、約３７〜８７％に抑制された。
すなわち、ＡＲＨＧＡＰ１７、ＣＴＤＳＰ２、ＤＵＳＰ１、ＩＭＰＡ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＳＧＫ、ＵＢＥ２Ｈ、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＰＰＭ１Ｅ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＰＮ２１、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＴＦ、ＺＮＦ２５９の遺伝子の発現を抑制することで、ＢＣＲＰの発現量が強力に抑制されることから、これらの遺伝子の発現を抑制する物質（例えば、表１〜１６で示されるｓｉＲＮＡ）はＢＣＲＰの発現抑制剤として好適に用いることができる。【００６５】
【表１８】
2009122639.tif 000019
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009122639.tif 000021
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