(57)【要約】  有効成分として核酸を含有するラクトフェリン熱安定化剤を、ラクトフェリンに添加することによって、ラクトフェリンに熱安定性を付与する。熱安定化されたラクトフェリンは、中性近傍領域のｐＨにおいても活性を維持したまま加熱殺菌が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として核酸を含有する、ラクトフェリン熱安定化剤。
【請求項２】
ｐＨ６〜９の範囲のｐＨ用である、請求項１に記載のラクトフェリン熱安定化剤。
【請求項３】
核酸が、白子から抽出された核酸である、請求項１〜２の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
【請求項４】
核酸に加えて、さらに金属を含有する、請求項１〜３の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
【請求項５】
金属が、鉄、亜鉛及び銅からなる群から選択された１種以上である、請求項４に記載のラクトフェリン熱安定化剤。
【請求項６】
ラクトフェリン殺菌補助剤である、請求項１〜５の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤と、ラクトフェリンとを含有する、熱安定化されたラクトフェリン組成物。
【請求項８】
核酸とラクトフェリンとを、核酸（質量）／ラクトフェリン（質量）の質量比の値が０．０９〜６．３の範囲で含有する、請求項７に記載のラクトフェリン組成物。
【請求項９】
請求項１〜６の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤をラクトフェリンに添加して、ラクトフェリンを熱安定化する方法。
【請求項１０】
ラクトフェリンを加熱殺菌する方法であって、
請求項１〜６の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤を、ラクトフェリンに添加して、ラクトフェリンを熱安定化する工程、
熱安定化されたラクトフェリンを加熱殺菌する工程、
を含む、方法。
【請求項１１】
ラクトフェリンに核酸を添加することによって、ラクトフェリンを熱安定化する方法。
【請求項１２】
核酸に加えて、さらに金属を添加する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ラクトフェリンを熱安定化するための、核酸の使用。
【請求項１４】
ラクトフェリンを加熱殺菌するための、核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤、及び核酸とラクトフェリンとを含有し、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３である、核酸とラクトフェリンとを含有する組成物に関する。【０００２】
また、本発明は、核酸及び金属を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤、及び核酸、金属及びラクトフェリンを含有する組成物であって、金属／ラクトフェリンのモル比が０．０４〜３．０であり、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３である組成物にもある。さらには、ラクトフェリンを加熱殺菌する方法であって、核酸及び金属を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤を添加する工程を含むことを特徴とする方法にもある。
【背景技術】
【０００３】
核酸は、生物の細胞核中に存在し、塩基と糖、リン酸からなるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子である。核酸には、糖の違いによって２−デオキシリボースを持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と、リボースを持つリボ核酸（ＲＮＡ）とに大別される。これらは生体の細胞内における遺伝情報の保存や、情報の伝達に深く関わっている。
また、ＤＮＡ、ＲＮＡは共に４種の塩基を構成要素とし、二重らせん構造を有する二本のヌクレオチド鎖からなることが知られている。【０００４】
近年、核酸の摂取が、細胞代謝、免疫機能、脳機能、脂質代謝等に影響を及ぼすこと、美白効果を奏すること等が知られている。また、これらの効果を利用して、核酸を配合した飲食品、健康食品、医薬品原料等が製造、販売されている。【０００５】
例えば、生物活性プロスタグランジンと、ＲＮＡまたはＤＮＡとを混合してなるプロスタグランジン熱安定化組成物が知られている［例えば、特許文献１］。この組成物の製造方法は、プロスタグランジンの１に対し、重量比で通常１０〜１０００、好ましくは５０〜４００になるようなＲＮＡまたはＤＮＡを含むｐＨ７〜８の水溶液にプロスタグランジンを結晶、粉末、あるいは溶液の形で加えるものである。【０００６】
また、ＤＮＡゲル中に安定化された温泉水のリポソームを含有することを特徴とする、温泉水を主剤とする組成物が知られている［例えば、特許文献２］。
しかし、核酸が蛋白質に対して耐熱性を付与することは知られていなかった。【０００７】
ラクトフェリン（ＬＦ）は、生体内では、涙、唾液、末梢血、乳等に含まれている鉄結合性蛋白質であり、有害細菌に対する抗菌作用、腸管からの鉄の吸収促進作用、免疫賦活作用、細胞増殖作用、抗炎症作用、ビフィズス菌増殖効果等、種々の生理活性を有していることが報告されている。【０００８】
ラクトフェリンは、上述の優れた生理活性を有すると同時に、ほ乳類の母乳等に含まれるタンパク質であり、極めて安全性が高く、安心して摂取することができるものである。そこで、ラクトフェリンは種々の飲食品、加工食品、医薬品等に配合され、ラクトフェリン入り乳幼児用調製粉乳も発売される等、様々な製品に利用されている。【０００９】
しかし、ラクトフェリンは熱に不安定であり、特に中性のｐＨ領域では、６２．５℃で３０分間の加熱によりほぼ失活し、７０℃で１５分間の加熱により完全に失活することが知られており［例えば、非特許文献１］、加熱による変性によって鉄結合能が減少すること等が報告されている［例えば、非特許文献２］。【００１０】
一方、ラクトフェリン溶液のｐＨを１．０〜６．５の範囲、特にｐＨ２．０〜６．０の範囲で加熱に対して安定であることが開示されている［例えば、特許文献３］。【００１１】
従来、ラクトフェリンの熱安定性を強化したものとして、大豆多糖類やキサンタンガム等を安定剤として含有したラクトフェリン組成物が報告されている［例えば、特許文献４］。
【特許文献１】特許昭６０−１９７４２号公報
【特許文献２】特許第３２３０２３９号公報
【特許文献３】特許第２６８８０９８号公報
【特許文献４】特開２００４−３５２６６９公報
【特許文献５】特許３２２３９５８号
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ペディアトリックス(Journal・of・Pediatrics)、第９０巻、第２９ページ、１９７７年
【非特許文献２】アドバンシス・イン・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー（Advances in Experimental Medicine and Biology）、第３５７巻、第２１９ページ、１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のように、ラクトフェリンは、その優れた生理活性と安全性から、種々の飲食品、加工食品、医薬品等に配合されるようになってきた。これらの製品の製造においては、加熱殺菌が簡便且つ確実な殺菌方法として広く使用されている。しかし、上述のように、ラクトフェリンは熱に対して不安定であり、熱変性して失活したラクトフェリンは有効な生理作用を期待できない。このことが、製品の製造において大きな制約となっていた。そこで、従来から、ラクトフェリンの熱安定性向上を目的として、種々の方法が開発されてきた。【００１３】
上述した特許文献３の知見に従えば、ラクトフェリンのｐＨを１．０〜６．５の範囲に調製して加熱殺菌することによって、熱変性によるラクトフェリン活性の損失を減らす方法がある。しかし、中性のｐＨ領域である製品を、いったん酸性のｐＨ領域とすることは製造工程を複雑にするという欠点がある。さらに、酸性条件下の加熱は、製品中の他の活性成分に対する影響が懸念される。【００１４】
上述した特許文献４では、ラクトフェリン類に対し、安定剤として大豆多糖類やキサンタンガム等を、重量比で０．５〜１００倍を使用することを好ましい態様として開示している。しかし、安定剤を多量に配合することは、ラクトフェリンを添加する食品を製造する上で大きな制約となる。すなわち、大豆多糖類やキサンタンガム等のガム類を配合すると、粘度が増加して製品の物性に影響を与える為、このように大量に添加することは困難である。さらに、特許文献４の試験例で示されたラクトフェリン類の濃度は８ｍｇ％〜２０ｍｇ％の範囲という比較的低濃度に限定されており、ラクトフェリンを高濃度とした場合における効果は示されていない。【００１５】
上述した特許文献５では、安定化のために、モル比でラクトフェリン１Ｍに対し、複数種の金属イオンを３〜５００Ｍ添加することを開示している。しかし、金属イオンは油脂の酸化促進効果を有することから、油脂等を含有する飲食品等の酸化抑制の観点から、金属イオンの添加量は少ないことが好ましい。また、金属特有の臭気を低減させる観点からも、金属イオンの添加量は少ないことが好ましい。【００１６】
このように、加熱した場合にもラクトフェリンを熱変性させない方法、すなわち、ラクトフェリンの熱安定性を向上させる方法については、原料の使用量や外観、風味、粘度、ｐＨ、色調などによって配合割合が制限され、蛋白質の添加量が制限されることが問題となっていた。特にラクトフェリンについては、熱安定性の低い中性域のｐＨでの熱安定性保持が問題となっていた。さらに、ラクトフェリンの熱安定性を向上する方法については、ラクトフェリン以外の原料が少量であっても、熱安定性向上効果を発揮し、製品設計等を制限することのない簡便な方法が望まれていた。【００１７】
従って、本発明の目的は、ラクトフェリンの熱安定性を向上する方法、すなわち、ラクトフェリンを熱安定化する方法を提供することにあり、特に中性領域のｐＨにおいてラクトフェリンを熱安定化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明者らは鋭意研究により、核酸をラクトフェリンに混合すると、ラクトフェリンの耐熱性が顕著に向上することを見出した。この耐熱性の向上、すなわち熱安定化は、ラクトフェリンが中性近傍領域のｐＨにある場合にも、有効に発揮されるものであった。すなわち、核酸を熱安定化剤（耐熱化剤）としてラクトフェリンに添加して使用することによって、上記目的が達成されることを見出して、本発明に到達した。
また、核酸及び少量の金属をラクトフェリンに混合すると、核酸のみをラクトフェリンに混合した場合と比較して、ラクトフェリンの耐熱性がさらに向上することを見出した。【００１９】
前記課題を解決する本願第一の発明は、核酸を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤、である。
また、本願第一の発明は、核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンであること、核酸が白子由来であること、及び、ｐＨが６〜９の範囲において耐熱性を付与すること、をそれぞれ好ましい態様としている。【００２０】
本願第二の発明は、核酸及び金属を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤、である。
また、本願第二の発明は、核酸がラクトフェリン１に対して質量比で０．０９〜６．３の割合で使用され、金属がラクトフェリン１に対してモル比で０．０４〜３．０使用されることを好ましい態様としている。また、核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンであること、核酸が白子由来であること、金属が鉄、亜鉛、銅から選ばれるいずれか１種以上の金属であることを好ましい態様としている。金属は銅であることをさらに好ましい態様としている。【００２１】
本願第三の発明は、核酸とラクトフェリンとを含有し、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３である、核酸とラクトフェリンを含有する組成物、である。また、本願第三の発明は、ラクトフェリンに耐熱性が付与されていること、核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンであること、を好ましい態様としている。【００２２】
本願第四の発明は、核酸、金属及びラクトフェリンを含有する組成物であって、核酸／ラクトフェリンの重量比が０．０９〜６．３であり、金属／ラクトフェリンのモル比が０．０４〜３．０である組成物である。
本願第四の発明は、ラクトフェリンに耐熱性が付与されていること、核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンであること、金属が鉄、亜鉛、銅から選ばれるいずれか１種以上の金属であることを好ましい態様としている。金属は銅であることをさらに好ましい態様としている。【００２３】
本願第五の発明は、本願第三の発明又は本願第四の発明の組成物を配合した医薬品である。
本願第六の発明は、本願第三の発明又は本願第四の発明の組成物を配合した飲食品である。
本願第七の発明は、本願第三の発明又は本願第四の発明の組成物を配合した飼料である。【００２４】
本願第八の発明は、ラクトフェリンを加熱殺菌する方法であって、核酸を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤を添加する工程を含むことを特徴とする方法、である。
本願第八の発明は、核酸が、ラクトフェリン１に対して質量比で０．０９〜６．３の割合で使用されるものであること、核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンであること、核酸が白子由来であること、を好ましい態様としている。【００２５】
本願第九の発明は、ラクトフェリンを加熱殺菌する方法であって、核酸及び金属を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤を添加する工程を含むことを特徴とする方法、である。
本願第九の発明は、核酸がラクトフェリン１に対して質量比で０．０９〜６．３の割合で使用され、金属がラクトフェリン１に対してモル比で０．０４〜３．０の割合で使用されるものであること、核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンであること、核酸が白子由来であること、金属が鉄、亜鉛、銅から選ばれるいずれか１種以上の金属であることを好ましい態様としている。金属は銅であることをさらに好ましい態様としている。【００２６】
すなわち、本発明は、ラクトフェリンの熱安定性を増強する薬剤を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、熱安定性の付与されたラクトフェリン組成物を提供することにもある。
本発明は、熱安定性の増強されたラクトフェリン組成物を含有する医薬品、飲食品、飼料にもある。
さらには、本発明は、ラクトフェリンの熱安定性を増強する薬剤を用いた、ラクトフェリンを加熱殺菌する方法にもある。【００２７】
本発明により、ラクトフェリンを、変性、凝集、沈殿等を生じさせることなく、高温殺菌することが可能となる。また、ラクトフェリンの熱安定性の低い中性域のｐＨにおいても、その機能を損なうことなく高温殺菌することができる。【００２８】
従って、本発明は、次の［１］〜［９］にある。
［１］
核酸を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤。
［２］
核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンである［１］の薬剤。
［３］
核酸が白子由来である［１］又は［２］に記載の薬剤。
［４］
ｐＨが６〜９の範囲において、耐熱性を付与する［１］〜［３］のいずれか一項に記載の薬剤。
［５］
核酸とラクトフェリンとを含有し、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３である、核酸とラクトフェリンとを含有する組成物。
［６］
ラクトフェリンに耐熱性が付与されている［５］に記載の組成物。
［７］
［５］又は［６］に記載された組成物を配合した医薬品。
［８］
［５］又は［６］に記載された組成物を配合した飲食品。
［９］
［５］又は［６］に記載された組成物を配合した飼料。【００２９】
さらに、本発明は、次の［１１］〜［２８］にもある。
［１１］
核酸及び金属を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤。
［１２］
ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤であって、核酸がラクトフェリン１に対して質量比で０．０９〜６．３の割合で使用され、金属がラクトフェリン１に対してモル比で０．０４〜３．０の割合で使用されることを特徴とする、［１１］に記載の薬剤。
［１３］
核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンである［１１］又は［１２］に記載の薬剤。
［１４］
核酸が白子由来である［１１］〜［１３］のいずれか一項に記載の薬剤。
［１５］
金属が銅である［１１］〜［１４］のいずれか一項に記載の薬剤。
［１６］
核酸、金属及びラクトフェリンを含有する組成物であって、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３であり、金属／ラクトフェリンのモル比が０．０４〜３．０である組成物。
［１７］
ラクトフェリンに耐熱性が付与されている［１６］に記載の組成物。
［１８］
核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンである［１６］又は［１７］に記載の組成物。
［１９］
核酸が白子由来である［１６］〜［１８］のいずれか一項に記載の組成物。
［２０］
金属が銅である［１６］〜［１９］のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］
［６］〜［２０］のいずれか一項に記載の組成物を配合した医薬品。
［２２］
［６］〜［２０］のいずれか一項に記載の組成物を配合した飲食品。
［２３］
［６］〜［２０］のいずれか一項に記載の組成物を配合した飼料。
［２４］
ラクトフェリンを加熱殺菌する方法であって、核酸及び金属を有効成分とする、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤を添加する工程を含むことを特徴とする方法。
［２５］
核酸がラクトフェリン１に対して質量比で０．０９〜６．３の割合で使用され、金属がラクトフェリン１に対してモル比で０．０４〜３．０使用されるものである、［２４］に記載の方法。
［２６］
核酸の分子量が６０〜１２００キロダルトンである、［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２７］
核酸が白子由来である［２４］〜［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
金属が銅である［２４］〜［２７］のいずれか一項に記載の方法。【００３０】
さらに、本発明は、次の［３１］〜［３２］にもある。
［３１］
有効成分として核酸を含有する、ラクトフェリン熱安定化剤。
［３２］
核酸からなる、ラクトフェリン熱安定化剤。【００３１】
本発明によれば、ラクトフェリンに対して、熱安定性（耐熱性）を付与することができるので、本発明は、ラクトフェリン用熱安定化剤、ラクトフェリン用熱安定性付与剤、ラクトフェリン用耐熱化剤、及びラクトフェリン用耐熱性付与剤にもあり、ラクトフェリン熱安定化剤、ラクトフェリン熱安定性付与剤、ラクトフェリン耐熱化剤、ラクトフェリン耐熱性付与剤、ラクトフェリン殺菌補助剤、及びラクトフェリン加熱殺菌補助剤にもある。【００３２】
さらに、本発明は、次の［３３］〜［３６］にもある。
［３３］
ｐＨ６〜９の範囲のｐＨ用である、［３１］〜［３２］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
［３４］
ｐＨ６〜９の範囲で熱安定化するための、［３１］〜［３２］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
［３５］
核酸が、６０〜１２００キロダルトンの分子量を有する、［３１］〜［３４］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
［３６］
核酸が、白子から抽出された核酸である、［３１］〜［３５］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。【００３３】
本発明によるラクトフェリンの熱安定化は、あらゆるｐＨ領域において有効であり、従来は熱安定化が困難であった中性近傍領域のｐＨにおいても有効である。好適に実施可能な中性近傍領域のｐＨとしては、例えば、ｐＨ６〜９の範囲、ｐＨ６〜８の範囲、ｐＨ６．５〜９の範囲、ｐＨ６．５〜８の範囲、ｐＨ６．５〜７．５の範囲、ｐＨ７〜９の範囲、ｐＨ７〜８の範囲を挙げることができる。従って、本発明は、ｐＨ６〜９用、ｐＨ６〜８の範囲、ｐＨ６．５〜９用、ｐＨ６．５〜８用、ｐＨ６．５〜７．５用、ｐＨ７〜９用、ｐＨ７〜８用の、ラクトフェリン熱安定化剤にもある。また、このような好ましいｐＨの範囲にあることを確実とするために、本発明の熱安定化剤は、核酸に加えて、ｐＨ調節成分を含有させることもできる。すなわち、本発明は、上記好ましいｐＨの範囲とするためのｐＨ調節成分と、核酸とを有効成分として含有するラクトフェリン熱安定化剤にもある。【００３４】
本発明の核酸としては、核酸の粗抽出物あるいは粗精製物を使用することができ、特定の配列の核酸である必要はなく、広範な分子量の範囲の核酸を使用することができる。核酸としては、核酸及び／又はその塩を使用することができる。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を例示することができる。【００３５】
さらに、本発明は、次の［３７］〜［４０］にもある。
［３７］
核酸に加えて、さらに金属を含有する、［３１］〜［３６］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。
［３８］
金属が、鉄、亜鉛及び銅からなる群から選択された１種以上である、［３７］に記載のラクトフェリン熱安定化剤。
［３９］
金属が、銅である、［３７］に記載のラクトフェリン熱安定化剤。
［４０］
ラクトフェリン殺菌補助剤である、［３１］〜［３９］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤。【００３６】
本発明のラクトフェリン熱安定化剤は、核酸に加えて、さらに金属を含有させることができる。これによって、さらにラクトフェリンの熱安定性を向上させることができる。この場合に添加する金属は少量でよいために、製品の風味を金属臭で損ねる心配はない。金属としては、金属及び／又はその塩を使用することができる。塩としては、例えば、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、グルコン酸塩等を例示することができる。好適な実施の一態様において、金属として銅を使用した場合に、銅と核酸との質量比は、銅を単体に換算して、銅（質量）／核酸（質量）の質量比の値を、例えば、０〜１×１０−２、０〜１×１０−３、０〜１×１０−４の範囲で使用することができ、また、例えば、１×１０−６〜１×１０−２、１×１０−６〜１×１０−３、１×１０−６〜１×１０−４の範囲で使用することができる。【００３７】
さらに、本発明は、次の［４１］〜［４５］にもある。
［４１］
核酸とラクトフェリンとを含有する、ラクトフェリン組成物。
［４２］
核酸とラクトフェリンとを含有する、ラクトフェリンが熱安定化されたラクトフェリン組成物。
［４３］
核酸とラクトフェリンとを含有し、さらに金属を含有する、［４１］〜［４２］の何れかに記載のラクトフェリン組成物。
［４４］
［３１］〜［４０］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤と、ラクトフェリンとを含有する、熱安定化されたラクトフェリン組成物。
［４５］
核酸とラクトフェリンとを、核酸（質量）／ラクトフェリン（質量）の質量比の値が０．０９〜６．３の範囲で含有する、［４１］〜［４４］の何れかに記載のラクトフェリン組成物。【００３８】
本発明のラクトフェリン組成物は、含有されるラクトフェリンが熱安定化されており、熱変性によってラクトフェリンが失活することなく、加熱殺菌等を目的とした加熱処理を、好適に行うことができる。従って、本発明のラクトフェリン組成物は、加熱殺菌等が常用される医薬品、飲食品等の原材料として、好適に使用することができる。【００３９】
さらに、本発明は、次の［４６］〜［５４］にもある。
［４６］
ラクトフェリンを熱安定化するための、核酸の使用。
［４７］
ラクトフェリンを加熱殺菌するための、核酸の使用。
［４８］
ラクトフェリンに核酸を添加することによって、ラクトフェリンを熱安定化する方法。
［４９］
ラクトフェリンに核酸を添加する工程、
を含んでなる、ラクトフェリンを熱安定化する方法。
［５０］
ラクトフェリンを熱安定化するための、核酸及び金属の使用。
［５１］
核酸に加えて、さらに金属を添加する、［４８］に記載の方法。
［５２］
ラクトフェリンに核酸を添加する工程の前又は後に、
ラクトフェリンに金属を添加する工程、
を含むか、あるいは、
ラクトフェリンに核酸を添加する工程として、
ラクトフェリンに核酸と金属とを添加する工程、
を含む、［４９］に記載の方法。
［５３］
［３１］〜［４０］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤をラクトフェリンに添加して、ラクトフェリンを熱安定化する方法。
［５４］
［３１］〜［４０］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤をラクトフェリンに添加する工程、
を含む、ラクトフェリンを熱安定化する方法。【００４０】
本発明によるラクトフェリンの熱安定化方法は、好ましい実施の態様において、ラクトフェリン又はラクトフェリンを含有する組成物を、加熱殺菌等を目的とする加熱処理を行う前の、前処理として好適に実施することができる。【００４１】
従って、本発明は、次の［５５］にもある。
［５５］
ラクトフェリンを加熱殺菌する方法であって、
［３１］〜［４０］の何れかに記載のラクトフェリン熱安定化剤を、ラクトフェリンに添加して、ラクトフェリンを熱安定化する工程、
熱安定化されたラクトフェリンを加熱殺菌する工程、
を含む、方法。【００４２】
ラクトフェリン熱安定化剤によるラクトフェリンの熱安定化は、単離されたラクトフェリンに対しても発揮され、他の成分と混合されてなるラクトフェリン含有組成物の中のラクトフェリンに対しても発揮される。従って、上述した熱安定化方法、及び加熱殺菌方法は、それぞれ、ラクトフェリン含有組成物の熱安定化方法、及びラクトフェリン含有組成物の加熱殺菌方法を含むものである。
【発明の効果】
【００４３】
本願第一の発明及び第二の発明の薬剤によれば、弱酸性から弱アルカリ性のｐＨ範囲、具体的にはｐＨ６〜９において、ラクトフェリンに対して耐熱性を付与することができる。このため、該ｐＨ範囲であれば、蛋白質を含む多くの飲食品、飼料、医薬品等の殺菌処理を、ラクトフェリンの物性、機能を損なうことなく実施することができる。
例えば、飲食品としては、ゼリー、プリン、アイスクリーム、ヨーグルト、ジュース、乳飲料、スポーツドリンク、スープ、焼成食品、粉乳、育児用調製粉乳、及び流動食等の食品群等、加熱工程を含む飲食品に好適に使用することができる。【００４４】
また、本願第三の発明及び第四の発明である組成物によれば、核酸又は核酸及び金属の使用量がラクトフェリンに対して極めて少量でも効果を発揮するため、製品の組成や物性に影響を与えずに、飲食品や飼料、医薬品等に、本発明における核酸とラクトフェリンとを含有する組成物、又は核酸、金属及びラクトフェリンを含有する組成物を配合することができる。【００４５】
本願第五の発明の医薬品、本願第六の発明の飲食品、本願第七の発明の飼料によれば、変性させることなく、ラクトフェリンを効果的に摂取することができる。
本願第八の発明及び第九の発明のラクトフェリンを加熱殺菌する方法によれば、熱変性させることなく、ラクトフェリンを加熱殺菌することができる。【００４６】
また、本願発明は、金属を使用する態様が含まれる。金属を使用する場合においても、ごく少量の使用で効果を発揮するため、金属臭が発生する心配もなく、金属の添加が好ましくない場合にも問題なく使用することができる。【００４７】
さらには、本発明で使用した白子由来の核酸の利用は、これまで大部分が廃棄されていた白子の有効な利用方法として提起することもできる。【００４８】
このように、本発明によれば、ラクトフェリンを熱安定化することができる。熱安定化されたラクトフェリンは、加熱殺菌処理をした場合にも、熱変性による失活が最小限となっている。そのために、本発明によれば、ラクトフェリンの加熱殺菌のために、ｐＨをいったん酸性とした後に加熱殺菌処理を行って再びｐＨを中性とする等の複雑な工程は必要なく、物性に影響を与えるほどの大量の安定剤を添加する必要もない。【００４９】
また、本発明によれば、その製品製造工程上、加熱が必須であるために、ラクトフェリンの添加が困難であったプリンやゼリー等の製品に対しても、ラクトフェリンを添加して、その活性を十分に発揮させることができる。プリンやゼリー等の製品は、嚥下容易という長所から、嚥下困難な幼児や高齢者にも適している。また、ラクトフェリンは、その種々の活性から、身体の弱い幼児や高齢者に、特に適した成分である。従って、ラクトフェリンが添加されたプリンやゼリー等の製品は、育児や介護の現場でも待ち望まれるものであったが、従来は製造が困難なものであった。本発明によれば、このように、従来は困難であったラクトフェリン添加製品を、好適に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の実施可能な範囲内で自由に変更することができる。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り、質量（ｍｇ）／容積（ｍｌ）による表示である。また、試料の溶媒として使用する精製水の比重は１に近いので、百分率は重量パーセント濃度［質量（ｍｇ）／質量（ｍｇ）］と表示することもできる。【００５１】
［耐熱性（熱安定性）］
本発明における「耐熱性」が付与されたラクトフェリンとは、加熱後のラクトフェリンが、加熱前と同様にラクトフェリン特有の立体構造を保持し、若しくは様々な生理活性が失われないことを示す。尚、「耐熱性」は「熱安定性」と換言することもできる。
具体的には、ラクトフェリンによる不飽和鉄結合能を測定することによって、本発明における「耐熱性」を有するラクトフェリンを評価することが可能である。
また、構造の保持という観点で、耐熱性の指標として、ＳＤＳ電気泳動によるラクトフェリン分子量測定や、目視によるラクトフェリンの凝集・沈殿を確認することも「耐熱性」を有するラクトフェリンとして評価することが可能である。【００５２】
さらには、本発明における「耐熱性」は、抗原抗体反応に基づくラテックス凝集法にて加熱前後のラクトフェリン含有量を測定し、該測定値に基づいたラクトフェリンの残存率で評価することができる。本発明におけるラクトフェリン残存率は、
「ラクトフェリン残存率（％）＝（加熱後のラクトフェリン含有量／加熱前のラクトフェリン含有量）×１００」
と定義される。【００５３】
ラクトフェリン残存率は２０％以上あれば、ラクトフェリンを含有する飲食品等において、ラクトフェリンの活性を十分に発揮できる。ラクトフェリン残存率は、２０％以上が好ましく、２５％以上がより好ましく、３０％以上がより好ましく、３５％以上がさらに好ましい。【００５４】
［核酸］
本発明において、ラクトフェリンに耐熱性を付与する核酸とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）やこれらの混合物を指す。ＤＮＡやＲＮＡは、二本鎖または一本鎖の状態であってもよい。好適な実施の一態様において、核酸の分子量は、５キロダルトン〜１２，０００キロダルトン、好ましくは６０キロダルトン〜１２００キロダルトンとすることができる。
本発明において使用する核酸は、常法により化学合成された核酸であっても良いし、ヒト、ウシ、マウス、魚類などの動物や植物、細菌等の天然物から抽出した核酸を用いてもよい。天然物由来の核酸として用いられるものとしては、サケ、ニシン、マス、タラ等の魚類の白子（精巣）等から抽出された核酸が特に好ましい。核酸としては、核酸及び／又はその塩を使用することができる。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を例示することができる。【００５５】
本発明における核酸として、種々の核酸試薬を使用することができ、核酸試薬は、核酸及び／又はその塩を含んでもよく、試薬中に６０〜１００％の核酸が含まれていることが好ましく、８０〜１００％の核酸が含まれていることがより好ましく、９０〜１００％の核酸が含まれていることが特に好ましい。
ここで、核酸試薬中のＤＮＡの純度は、ＤＮＡを含む試薬１００ｍｇを精製水１００ｍｌに溶解し、分光光度計（ナノドロップ社製、商品名：NanoDrop ND-1000）で波長を２６０ｎｍに設定して測定することが可能である。【００５６】
尚、核酸試薬には、核酸及び／又はその塩に加えて無機塩類を混合しても良く、混合される塩類としては、通常用いられる塩類であればいずれの塩類であっても良く、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、ピリジニウム塩等を例示することができる。【００５７】
［ラクトフェリン］
本発明で熱安定化されるラクトフェリンは、市販品の他、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳、ホエイ等からイオン交換クロマトグラフィー等の常法により分離したラクトフェリン、ラクトフェリンから常法により鉄を除去したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンに鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属を一部又は完全にキレートさせた金属不飽和ラクトフェリン、または金属飽和ラクトフェリンのいずれであっても使用することができる。
また、組換えＤＮＡ技術により得られる組換え真菌、組換え乳牛（トランスジェニック・カウ）等により生産されるヒト・ラクトフェリン等も、同様に本発明に使用することができる。【００５８】
本発明で熱安定化されるラクトフェリンとして、種々のラクトフェリン試薬を使用することができ、ラクトフェリン試薬は、その純度として、試薬中に３０〜１００％のラクトフェリンが含まれていることが好ましく、７０〜１００％のラクトフェリンが含まれていることがより好ましく、８５〜１００％のラクトフェリンが含まれていることが特に好ましい。
また、ラクトフェリンの純度は、例えば以下の式によって算出することができる。
ラクトフェリン純度（％）＝蛋白質の組成比率 × 蛋白質中のラクトフェリン比率【００５９】
［金属］
本発明で使用可能な金属としては、種々の金属及びこれらの塩を挙げることができ、具体的には、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ニッケル、アルミニウムやこれらの塩類を挙げることができる。好適な実施の一態様において例示すれば、金属として、具体的には、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸ニッケル、硫酸アルミニウム等を使用することができ、これらの金属の塩化物や燐酸塩、グルコン酸塩等を使用することができる。
金属の中では、鉄、銅、亜鉛が好ましく、銅が最も好ましい。【００６０】
尚、本発明における金属として、種々の金属試薬を使用することができ、金属試薬は、金属及び／又はその塩を含んでもよく、例えば、金属塩を例示することができる。【００６１】
［薬剤（熱安定化剤）］
本願第一の発明および第二の発明である薬剤は、ラクトフェリンに耐熱性を付与し、ラクトフェリンの加熱殺菌時の変性を抑制することができるので、ラクトフェリンに好適に使用することができる。また、ラクトフェリンを配合した医薬品、飲食品、飼料等に配合することにより、加熱殺菌時にラクトフェリンに耐熱性が付与され、加熱後でもラクトフェリンの構造や活性を保持することができるので、好適に使用することができる。本発明の熱安定化剤は、このように使用することができる。このように、本発明の薬剤（熱安定化剤）は殺菌補助剤及び加熱殺菌補助剤として使用することもできる。【００６２】
［ｐＨ］
ラクトフェリンの熱安定性が高まる、すなわち、核酸、又は核酸と金属によりラクトフェリンに耐熱性が付与されるｐＨ環境として、好適な実施の態様において、ラクトフェリンが熱に不安定な弱酸性域からアルカリ性のｐＨ範囲において熱安定性を高めることが可能であり、好適に実施可能であるｐＨ範囲として、ｐＨが６〜１０の範囲、さらにｐＨ６〜９の範囲、特にｐＨ６〜８の範囲を挙げることができる。
本発明において、核酸を有効成分とする薬剤（熱安定化剤）、又は核酸と金属を有効成分とする薬剤（熱安定化剤）は前記ｐＨ６〜１０の範囲においてラクトフェリンに耐熱性を付与することができるので、従来のようにラクトフェリンを加熱殺菌する際に、予めｐＨを中性以下の酸性域に調整する必要はない。また、ラクトフェリンに核酸又は核酸と金属を添加することによって、中性域からアルカリ性域であっても、簡便にラクトフェリンの殺菌を行うことが可能であるという効果も兼ね備えている。すなわち、本発明によれば従来は不可能であったような加熱処理が可能になるために、ｐＨ６〜９の範囲において、ラクトフェリンに対する殺菌効果、及び殺菌の補助効果を高めることが可能である。【００６３】
このように、本発明の核酸を有効成分とする耐熱性を付与する薬剤（熱安定化剤）は、ラクトフェリンが、従来、熱に対して不安定な環境であったアルカリ性域で耐熱性を付与できる効果を有するのであって、ラクトフェリンに対する新たな加熱殺菌方法を提供するとともに、ラクトフェリンを含む中性からアルカリ性域が好まれる医薬品、食品、飼料に添加することによって、ｐＨ調整を必要とせずに加熱殺菌を行うことができる。【００６４】
また、上述したような好ましいｐＨの範囲にあることを確実とするために、本発明の熱安定化剤に、ｐＨ調節成分を添加することもできる。このようなｐＨ調節成分としては、ラクトフェリンを加熱処理する際のｐＨを上記好ましい範囲に安定させるための緩衝能があればどのようなものであってもよく、例えば有機酸及び／又は有機酸の塩類を使用することができ、例えば、市販食品添加物のクエン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、グルタミン酸、アルギニン酸等からなる群より選択される少なくとも１種以上の酸、及びクエン酸塩（例えば、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム等）、乳酸塩（例えば、乳酸ナトリウム等）、リンゴ酸塩（例えば、リンゴ酸ナトリウム等）、コハク酸塩（例えば、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウム等）、酒石酸塩（例えば、酒石酸ナトリウム、酒石酸水素カリウム等）、グルタミン酸塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム等）、アルギニン酸塩（例えば、アルギニン塩酸塩等）等からなる群より選択される少なくとも１種以上の塩類の組み合わせを使用することが可能である。これらの塩類はいずれも食品添加物や医薬成分として広く利用されており、また市販されており容易に入手可能である。【００６５】
［有効量］
本発明において、ラクトフェリンに耐熱性を付与する（熱安定化する）ために必要な核酸の有効量は、ラクトフェリン１に対し、質量比で０．０９〜６．３の範囲で添加されることが好ましく、０．１〜６．０の範囲で添加されることが好ましく、０．１０〜５．７の範囲でラクトフェリンに添加されることが好ましく、０．０９〜４．２の範囲で添加されることが好ましく、０．０９〜２．１の範囲で添加されることが好ましく、０．０９〜１．０であることが好ましく、１．０であることがさらに好ましい。
好適な実施の一態様において、核酸の添加量は、ラクトフェリン１に対して、質量比で、０．１９〜６．３の範囲、好ましくは０．２〜６．０の範囲、好ましくは０．２１〜５．７の範囲とすることができ、あるいは０．２８〜６．３の範囲、好ましくは０．３〜６．０の範囲、好ましくは０．３１〜５．７の範囲とすることができ、あるいは０．３８〜６．３の範囲、好ましくは０．４〜６．０の範囲、好ましくは０．４２〜５．７の範囲とすることができ、あるいは０．４７〜６．３の範囲、好ましくは０．５〜６．０の範囲、好ましくは０．５２〜５．７の範囲とすることができ、あるいは０．９〜６．３の範囲、好ましくは１〜６．０の範囲、好ましくは１〜５．７の範囲とすることができ、あるいは１．９〜６．３の範囲、好ましくは２．０〜６．０の範囲、好ましくは２．１〜５．７の範囲とすることができ、あるいは３．８〜６．３の範囲、好ましくは４．０〜６．０の範囲、好ましくは４．２〜５．７の範囲とすることができる。
特に、ｐＨが６〜９の範囲にあっては、核酸は、ラクトフェリンに対して質量比が０．１９〜４．２の範囲で添加されることが好ましく、０．２１〜３．８の範囲で添加される
ことがさらに好ましい。【００６６】
また、ラクトフェリンに耐熱性を付与するために必要な金属の有効量は、ラクトフェリン１に対してモル比で０．０４〜３であることが好ましく、０．０４〜２であることがより好ましく、０．０４〜１であることがより好ましく、０．０４〜０．５であることがより好ましく、０．０４〜０．４であることがより好ましく、０．０４〜０．３であることがより好ましく、０．０４〜０．２であることがより好ましく、０．０４〜０．１であることがより好ましく、０．０４〜０．０９であることが最も好ましい。【００６７】
従って、ラクトフェリンを含む組成物、具体的にはラクトフェリンを含む医薬品、食品、飼料を製造する際には、加熱殺菌工程によるラクトフェリンの熱変性を防止する目的で核酸を使用する場合、質量比で０．０９〜６．３の範囲で添加することが好ましい。
また、ラクトフェリンを含む組成物、具体的には医薬品、食品、飼料を製造する際には、加熱殺菌工程によるラクトフェリンの熱変性を防止する目的で核酸及び金属を使用する場合、ラクトフェリンに対して核酸を質量比で０．０９〜６．３の範囲で添加し、金属を質量比で０．０４〜３を使用することが好ましい。
これらにより、耐熱性を有する核酸とラクトフェリンとを含有する組成物、または耐熱性を有する核酸、金属及びラクトフェリンを含有する組成物を配合した医薬品、食品、飼料を製造することが可能である。【００６８】
［組成物］
本発明の第三の発明である組成物は、核酸とラクトフェリンとを含有し、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３である、核酸とラクトフェリンとを含有する組成物である。
本発明において核酸として使用される核酸試薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡやこれらの混合物、あるいはこれらと塩類との混合物であっても良い。
また、本発明においてラクトフェリンとして使用されるラクトフェリン試薬は、ヒト由来、ウシ由来等、塩類との混合物であっても良い。【００６９】
本発明の第四の発明である組成物は、核酸、金属及びラクトフェリンを含有する組成物であって、核酸／ラクトフェリンの質量比が０．０９〜６．３であり、金属／ラクトフェリンのモル比が０．０４〜３．０である組成物である。
第四の発明である組成物に使用される核酸は、本発明の薬剤に使用できる核酸試薬であれば、いかなるものも使用することができる。ラクトフェリンに耐熱性を付与するために必要な核酸の有効量は、上述した通りであり、例えば、ラクトフェリン１に対して質量比で０．０９〜６．３であることが好ましく、０．０９〜４．２であることがより好ましく、０．０９〜２．１であることがより好ましく、０．０９〜１．０であることがより好ましく、１．０であることが好ましい。
また、第四の発明である組成物に使用される金属としては、本発明の薬剤に使用できる金属試薬であれば、いかなるものでも使用することができる。ラクトフェリンに耐熱性を付与するために必要な金属の有効量は、ラクトフェリン１に対してモル比で０．０４〜３であることが好ましく、０．０４〜２であることがより好ましく、０．０４〜１であることがより好ましく、０．０４〜０．５であることがさらに好ましく、０．０４〜０．０９であることが好ましい。
また、本発明の組成物として使用されるラクトフェリンは、本発明の薬剤に使用できるラクトフェリン試薬であれば、如何なるものも使用することができるが、加熱や殺菌による変性が既に生じていないものが好ましい。ラクトフェリンを、核酸及び金属との組成物として加熱することによって、本発明の効果が発揮されるからである。【００７０】
［医薬品］
本発明の第五の発明は、本発明の組成物を配合した医薬品である。医薬品の形態としては、公知の方法により種々の態様に製剤化して投与することができ、好適な実施の態様において経口投与することができる。製剤化する際には、核酸とラクトフェリンを混合するか、核酸、金属及びラクトフェリンを混合した状態で使用される。【００７１】
例えば、核酸とラクトフェリン、又は核酸、金属及びラクトフェリンを薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造できる。製剤化する場合、製剤中のラクトフェリンの含有量は特に限定されるものではない。基本的に核酸及びラクトフェリンによる副作用はほとんどないと考えられるが、核酸の含有量としては、通常０．０１〜６０質量％、好ましくは１〜３０質量％、ラクトフェリンの含有量としては、通常０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。金属の含有量としては、通常０〜１×１０−１質量％、好ましくは０〜１×１０−２質量％、あるいは通常１×１０−８〜１×１０−１質量％、好ましくは１×１０−８〜１×１０−２質量％である。【００７２】
製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。具体的な製剤として、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む。）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コーティングしたものを含む。）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。【００７３】
これらの製剤に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末など、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を例示することができる。【００７４】
また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を、それぞれ例示することができる。
更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を、それぞれ例示することができる。【００７５】
錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
また、併用する医薬組成物は、本発明の薬剤中に有効成分として含有させてもよいし、本発明の薬剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。【００７６】
［飲食品］
本発明の組成物を添加した飲食品の形態としては、例えば、ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等を本発明の核酸とともに配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；経腸栄養食；調製粉乳、液状調製乳；機能性食品等が挙げられ、さらに、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、餃子の皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、パン等を挙げることができる。【００７７】
このような飲食品は、例えば、ラクトフェリン（ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等の形態を含む）に、核酸、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、アルギニン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより、製造することができる。
また、飲食品の好適な形状としては、液状、タブレット状のサプリメント等を例示することができる。【００７８】
［飼料］
本発明に係る組成物を添加した飼料は、核酸とラクトフェリン、又は核酸、金属及びラクトフェリンを含有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ラクトフェリンに、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トラル酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。【００７９】
本発明の試験例で実施した試験方法は次の通りである。
すなわち本発明のラクトフェリンの耐熱性を判定する指標としては、ラクトフェリンによる不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）、ＳＤＳ電気泳動、ラテックス凝集法、目視による凝集・沈殿反応の確認の各々によって行った。【００８０】
［不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）］
ラクトフェリン分子が鉄分子をキレート結合する機能、いわゆる鉄結合能は、ラクトフェリンの生理機能の一つとしてよく知られ、ラクトフェリンが変性せずに存在していることの指標とされてきた［例えば、特許第2835902号］。
試験方法は、検体に既知過剰量の鉄を加え、遊離ラクトフェリンを飽和させる。これに還元・呈色試薬にて残余鉄量を測定し、既知過剰鉄量から差し引いて不飽和鉄結合能を求めるものである。不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）の測定は、市販の測定キット等を使用することができ、例えば、不飽和結合能キット（日東紡績社製、商品名：Ｎ−テストＵＩＢＣ）を用いることができる。【００８１】
測定方法は、試験管に鉄試液として硫酸第二鉄アンモニウムを１ｍｌ投入し、試料０．２ｍｌを投入した。よく混和して室温で５分放置した後に、還元・呈色試薬として2-ニトロソ-5-(N-プロピル-N-スルフォプロピルアミノ)-フェノール（Nitroso-PSAP）１ｍｌを投入した。これをよく混和し、精製水を対照として波長７６０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度は以下の式によって求めた。【００８２】
ＵＩＢＣ値（μｇ/ｄＬ）＝（ＡＲｂ−ＡＳ）／ＡＲｂ×５００
ＡＲｂ：試薬ブランクの吸光度
ＡＳ  ：検体の吸光度【００８３】
尚、本発明においては、加熱前のラクトフェリンのＵＩＢＣ値を１００％とした時、加熱後のラクトフェリンのＵＩＢＣ値は１０〜１００％であることが好ましく、３０〜１００％であることが特に好ましい。そして、ＵＩＢＣ値がこのような好ましい範囲であるとき、「耐熱性」が良好であると判断した。【００８４】
［ＳＤＳ電気泳動］
加熱処理したラクトフェリンについて、ＳＤＳ電気泳動を実施した。電気泳動の結果から、ラクトフェリンのバンドパターンを解析後、ラクトフェリンに相当するバンドの有無を確認し、ラクトフェリンの耐熱性の有無を判断した。評価方法は下記の通りである。このうち、「○」と「△」の評価であったものを「耐熱性良好」であると判断した。
○：ラクトフェリンのバンドが確認される。
△：ラクトフェリンのバンドが僅かに確認される。
×：ラクトフェリンのバンドが確認できない。【００８５】
［ラテックス凝集法］
本発明の試験例においては、ラクトフェリンの耐熱性を判定する指標として、ラテックス凝集法によるラクトフェリン含有量の測定を行った。
本発明のラテックス凝集法は、抗ラクトフェリン抗体（ウサギ）感作ラテックスを用いたラテックス凝集比濁法である。ラテックス法では、ラテックス粒子に抗ラクトフェリン抗体を結合したものを使用する。試料中のラクトフェリンは、ラテックス粒子に結合した抗ラクトフェリン抗体と抗原抗体反応を示し、凝集を生じる。この凝集を一定波長にて吸光度変化を測定し、これを換算してラクトフェリンの含有量とした。ラクトフェリンの含有量は試料の加熱前後に測定した。【００８６】
ラテックス凝集法によるラクトフェリンの測定方法としては、市販のキット（フジテックス株式会社製、ウシラクトフェリンラテックステスト）を用いて測定する方法が好適な例として挙げられる。【００８７】
［目視による凝集・沈殿反応の確認］
加熱後のラクトフェリンの凝集、沈殿について目視により確認し、以下の評価方法に従って評価した。
−：凝集・沈殿は確認されず、透明である。
±：凝集・沈殿は確認されないが、白濁している。
＋：凝集・沈殿が確認される。
【実施例】
【００８８】
次に実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８９】
［試験例１］
この試験は、核酸による、ラクトフェリンに耐熱性を付与する効果について、弱酸性からアルカリ性の範囲のｐＨと温度との関係を検討することを目的とした。【００９０】
（１）試料の調製
精製水１００ｍｌに核酸として核酸試薬（日生バイオ社製、商品名：ＤＮＡナトリウム）１００ｍｇとラクトフェリンとしてラクトフェリン試薬（ミライ社製、商品名：ＭＬＦ−１）１００ｍｇを溶解した試料を試験試料とした。また、精製水１００ｍｌにラクトフェリン試薬（ミライ社製、商品名：ＭＬＦ−１）１００ｍｇを溶解した溶液を対照試料とした。
ここで、核酸試薬として使用したＤＮＡナトリウム（日生バイオ社製）は、サケの白子を原料とした高分子ＤＮＡ濃縮粉末であり、ＤＮＡ含有量は９０％以上のものを使用した。当該ＤＮＡナトリウムは、電気泳動法によって分子量を測定したところ、１００〜２０００ｂｐ（base pair：塩基対数）であり、分子量換算すると、６０〜１２００キロダルトンの範囲に含まれるものであった。【００９１】
また、ラクトフェリン試薬におけるラクトフェリン純度は、蛋白質濃度をケルダール法によって測定し、蛋白質中のラクトフェリン含量を高速液体クロマトグラフィー法によって測定した結果、前記の方法で算出したところ、９５．３％（蛋白質の組成比率：９７．８％、蛋白質中のラクトフェリン比率：９７．４％）であった。以下、断りのない限り、ラクトフェリン試薬のラクトフェリン純度は９５．３％である。
各試料は、それぞれ０．１Ｎ塩酸溶液、又は０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨが６、７、８、９、１０、１１、及び１２となるように試験試料及び対照試料についてそれぞれ作成した。【００９２】
（２）試験方法
各試料をガラス管に４ｍｌずつ分注し、それぞれ８０〜１２０℃の範囲で５分間加熱処理した。尚、８０℃、９０℃の加熱はウォーターバス（ＨＡＡＫＥ社製）を使用し、１００℃、１１０℃、１２０℃の加熱についてはオートクレーブ（ＴＯＭＹ社製）を使用した。加熱後のラクトフェリンの凝集、沈殿について目視により確認し、以下の評価方法に従って評価した。
−：凝集・沈殿は確認されず、透明である。
±：凝集・沈殿は確認されないが、白濁している。
＋：凝集・沈殿が確認される。【００９３】
また、他のラクトフェリンの耐熱性を検討する指標としては、ラボチップ型全自動電気泳動システムExperionTM（バイオラッド社製）によりＳＤＳ電気泳動を行って、泳動後のラクトフェリンのバンドパターンを評価方法に従って解析した。
加熱処理後のラクトフェリン試薬について、ＳＤＳ電気泳動を実施した。電気泳動の結果から、ラクトフェリンのバンドパターンを解析後、ラクトフェリンに相当するバンドの有無を確認し、ラクトフェリンの耐熱性の有無を判断した。評価方法は下記の通りである。
○：ラクトフェリンのバンドが確認される。
△：ラクトフェリンのバンドが僅かに確認される。
×：ラクトフェリンのバンドが確認できない。【００９４】
（３）試験結果
本試験の結果は表１及び表２に示すとおりである。表１は、ラクトフェリン・核酸混合溶液（試験試料）におけるラクトフェリンの耐熱性を検討した結果である。表２は、ラクトフェリン単独溶液（対照試料）による耐熱性を検討した結果である。
その結果、表２から明らかなように、ラクトフェリン単独（対照試料）溶液では、加熱温度が９０℃以上であると、ＳＤＳ電気泳動でラクトフェリンのバンドが確認できなくなってしまうｐＨ領域が一部確認された。また、ラクトフェリンの凝集、沈殿は、８０℃の加熱であっても、ｐＨ７〜９の範囲で白濁または凝集・沈殿が確認され、耐熱性が低下していることが確認された。
これに対して、表１から明らかなように、ラクトフェリン・核酸混合溶液（試験試料）では、加熱温度が８０〜１２０℃のいずれの条件であっても、ｐＨが６〜１０の範囲でＳＤＳ電気泳動においてラクトフェリンのバンドが確認された。
また、ラクトフェリンの凝集、沈殿反応については、加熱温度が８０〜１２０℃、ｐＨが６〜１２のいずれの条件であっても、溶液に凝集・沈殿は確認されず、透明な状態であった。
その結果、ｐＨ６〜１２の領域において、核酸によりラクトフェリンの耐熱性が維持されていることが明らかとなった。【００９５】
【表１】
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【００９６】
【表２】
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【００９７】
［試験例２］
この試験は、核酸によるラクトフェリンに耐熱性を付与する効果について、核酸とラクトフェリンとの混合比の関係を検討することを目的とした。【００９８】
（１）試料の調製
精製水に対し、核酸試薬／ラクトフェリン試薬の質量比が、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、４、６となるようにそれぞれ核酸とラクトフェリン試薬を添加した試料を調製した。尚、核酸試薬及びラクトフェリン試薬は前記試験例１と同様のものを使用した。
また、各試料は、０．１Ｎ塩酸溶液、又は０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨが６、７、８、９となるようにそれぞれ調整して、試験試料とした。【００９９】
（２）試験方法
各試験試料は、ウォーターバス（ＨＡＡＫＥ社製）内で、８０℃で５分間保温して加熱処理を行った。
加熱処理後の試料は、以下の方法により、ラクトフェリンによる不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）を測定した。【０１００】
不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）の測定は、不飽和結合能キット（日東紡績社製、商品名：Ｎ−テストＵＩＢＣ）を用いた。
まず、試験管に鉄試液として硫酸第二鉄アンモニウムを１ｍｌ投入し、試料０．２ｍｌを投入した。よく混和して室温で５分放置した後に、還元・呈色試薬として2-ニトロソ-5-(N-プロピル-N-スルフォプロピルアミノ)-フェノール（Nitroso-PSAP）１ｍｌを投入した。これをよく混和し、精製水を対照として波長７６０ｎｍで吸光度を測定し、不飽和鉄結合能を算出した。【０１０１】
（３）試験結果
本試験の結果は表３〜表６に示すとおりである。表３はｐＨ６における核酸試薬／ラクトフェリン試薬の各質量比でのラクトフェリンの耐熱性を検討した結果である。同様に表４はｐＨ７における耐熱性、表５はｐＨ８における耐熱性、表６はｐＨ９における耐熱性をそれぞれ示している。尚、表３〜表６中の核酸／ラクトフェリンは本試験で使用した試薬に基づく混合比率である。【０１０２】
その結果、ｐＨ６〜９のいずれの条件においても、ラクトフェリンと核酸が共存する条件（核酸試薬／ラクトフェリン試薬の質量比＝０．１〜６）において、ラクトフェリンの不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）がラクトフェリン単独に比して上昇し、耐熱性が高められていることが明らかとなった。【０１０３】
中でも、核酸試薬／ラクトフェリン試薬の質量比が０．２〜２においてラクトフェリンの不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）は５０％以上を示すことが明らかとなった。【０１０４】
よって、核酸によるラクトフェリンに耐熱性を付与する効果は、核酸試薬とラクトフェリン試薬の質量比が０．１〜６において有効であることが明らかとなった。
ここで、試験例において使用した核酸試薬の純度は９０〜１００％であり、ラクトフェリン試薬の純度は測定結果より９５．３％であったことから、核酸試薬の純度が１００％のとき、核酸／ラクトフェリンの質量比の最小値０．１は０．１０、最大値６は６．３であり、核酸試薬の純度が９０％のとき、核酸／ラクトフェリンの質量比の最小値０．１は０．０９となり、最大値６は５．７である。【０１０５】
従って、本発明における核酸によるラクトフェリンに耐熱性を付与する効果は、核酸／ラクトフェリンの質量比が、少なくとも０．０９〜６．３の範囲で好適に発揮されることが明らかとなった。【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
［試験例３］
この試験は、本発明の薬剤による耐熱性付与効果が従来技術と比較して顕著なことを明らかにすることを目的とした。本発明の薬剤の対照薬剤としては、特許文献５（特開２００４−３５２６６９）を参照し、ラクトフェリンの安定化に使用されていた大豆多糖類（三栄源エフ・エフ・アイ社製。商品名：SM-MN-3300）を用いた。また、核酸試薬とラクトフェリン試薬は前記試験例１と同様のものを使用した。【０１１１】
（１）試料の調製
精製水に対し、核酸試薬／ラクトフェリン試薬の質量比が０．５となるように核酸試薬とラクトフェリン試薬を添加した試料を調製した。また、精製水に対し、大豆多糖類／ラクトフェリン試薬の質量比が０．５となるように大豆多糖類とラクトフェリン試薬を添加した試料を調製した。
各試料は、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨが９になるように調整し、試験試料とした。【０１１２】
（２）試験方法
各試験試料は、ウォーターバス（ＨＡＡＫＥ社製）内で、８０℃で５分間保温して加熱処理を行った。
加熱処理後の試料は、前記試験例２に記載されたラクトフェリンの不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）を測定することにより、ラクトフェリンの耐熱性について検討した。【０１１３】
（３）試験結果
本試験の結果は表７に示す通りである。ラクトフェリン・核酸試薬混合溶液では加熱後のラクトフェリンにおける不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ値）は８２．９％であった。一方、ラクトフェリン・大豆多糖類混合溶液では、同じ条件で１２．７％であった。よって、ラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤の有効成分としては、大豆多糖類に比して、核酸の方が耐熱性付与効果が高いことが確認された。【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
［試験例４］
この試験は本発明の一態様である核酸及び金属を有する薬剤が顕著な効果を有することを示すことを目的とした。【０１１６】
（１）試料の調製
精製水１００ｍｌに核酸試薬（日生バイオ社製、商品名：ＤＮＡナトリウム、分子量１３０〜１５０キロダルトン）１０ｍｇとラクトフェリン試薬（ミライ社製、商品名：ＭＬＦ−１）１００ｍｇを溶解した。さらに、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨを７．４に調製し、これを試験試料とした。一方、ラクトフェリン試薬のみを溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨを７．４に調製したものを対照試料とした。
尚、使用した拡散試薬の純度は９０〜１００％であり、ラクトフェリン試薬の純度は９４．７％（蛋白質構成比率９７．５％、蛋白質中のＬＦ比率９７．１％）であった。【０１１７】
（２）試験方法
上記試料を複数調製し、グルコン酸銅（富田製薬社製）を銅として０μＭ、０．５５μＭ、１．１０μＭとなるように計量し、各試料に添加した。【０１１８】
次に、グルコン酸銅を添加した各試料を、ラテックス凝集法により、ラクトフェリン（ＬＦ）含有量を測定した。続いてウォーターバス（ＴＡＩＴＥＣ社製）内で、８０℃、１０分間の加熱処理を行った。加熱処理後の試料は、直ちに氷水中で冷却した。冷却後、ラテックス凝集法によりラクトフェリンの含有量を測定した。ラクトフェリンの残存率は、『ラクトフェリン残存率＝（加熱後のラクトフェリン含有量／加熱前のラクトフェリン含有量）×１００％』
として計算した。
尚、本試験のｐＨや殺菌温度の条件は、実際に飲食品として用いるときの指標となるような数値に設定した。【０１１９】
（３）試験結果
本試験の結果を表８に示した。表８ではラクトフェリンをＬＦと表記した。
核酸及び銅を添加しない試料では、ラクトフェリン残存率はわずかに４．５％であった。一方、核酸を、核酸／ラクトフェリンの重量比にて０．１となるように添加した場合、ラクトフェリン残存率は２１．６％となった。【０１２０】
さらに、核酸の添加に加え、銅を、銅／ラクトフェリンのモル比として０．０４添加した試料では、ラクトフェリンの残存率は２６．５％となり、核酸のみを添加した場合の残存率と比較すると、１２３％であった。さらに、銅を、銅／ラクトフェリンのモル比として０．０９添加した試料では、ラクトフェリンの残存率は３５．７％となり、核酸のみを添加した場合の残存率と比較すると、１６５％であった。【０１２１】
このことから、ラクトフェリンと少量の核酸の存在下、さらに銅を添加することにより、ラクトフェリンの残存率が顕著に向上することが明らかとなった。
なお、銅の代わりに、鉄（鉄として、硫酸第一鉄）、亜鉛（亜鉛として、グルコン酸亜鉛）を用いて試験を行った結果、同様にラクトフェリンの残存率の向上が確認された。【０１２２】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のラクトフェリンに耐熱性を付与する薬剤（ラクトフェリン熱安定化剤）によれば、ｐＨの弱酸性域からアルカリ性域において、ラクトフェリンの耐熱性を増強させ、熱変性や失活をさせることなく加熱殺菌することができる。また、殺菌工程が必要な飲食品、飼料、医薬品等の製品にラクトフェリンを添加する際にラクトフェリンを加えることによって、製造工程の最終段階で直接加熱殺菌が可能であり、簡便な製造方法を提供できる。
【国際調査報告】
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