(57)【要約】  本発明は、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出する手段及び方法を提供する。ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーとして、５'末端側に第一配列、３'末端側に第二配列を含み、第一配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、第二配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１において第一領域よりも３'末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であるプライマーを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーであって、
５’末端側に第一配列、３’末端側に第二配列を含んでなり、
前記第一配列が、
（ａ１）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ１）  配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第二配列が、
（ｃ１）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ１）  配列番号１において第一領域よりも３’末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第二領域が、
（ｉ）  配列番号１の９０１及び９０２番目のヌクレオチド；又は
（ii）  配列番号１の１１１８及び１１１９番目のヌクレオチド；
を含む領域である、プライマー。
【請求項２】
（Ａ１）配列番号１４〜１９の何れかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
（Ｂ１）前記（Ａ１）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなる、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
配列番号１の８８６〜９０８番目の領域；
配列番号１の１１１０〜１１３３番目の領域；
配列番号１の１１１４〜１１３１番目の領域；及び
配列番号１の１１１４〜１１３３番目の領域
のいずれかにハイブリダイズする、請求項１記載のプライマー。
【請求項４】
前記第二配列が、３’末端に、前記第二領域の配列に完全に相補的な連続した３ヌクレオチドからなる配列を含んでいる、請求項１記載のプライマー。
【請求項５】
試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセットであって、
第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含み、
前記第一プライマーが、請求項１記載のプライマーであり、
前記第二プライマーが、５’末端側に第三配列、３’末端側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
（ａ２）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ２）  前記配列番号１の第一領域よりも５’末端側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第四配列が、
（ｃ２）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ２）  前記配列番号１の第三領域よりも５’末端側に位置する第四領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第三プライマーが、前記配列番号１の第四領域よりも５’末端側に位置する第五領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列からなるプライマーである、チロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセット。
【請求項６】
前記第二プライマーが、
（Ａ２）  配列番号７〜１３の何れかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
（Ｂ２）  前記（Ａ２）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなり、
前記第三プライマーが、
（Ａ３）  配列番号２〜６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
（Ｂ３）  前記（Ａ３）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなる、請求項５記載のプライマーセット。
【請求項７】
前記第二プライマーが、
配列番号１の７３１〜７５１番目の領域；
配列番号１の９６３〜９７７番目の領域；
配列番号１の９６４〜９８６番目の領域；
配列番号１の９７１〜９９２番目の領域；
配列番号１の９７２〜９９２番目の領域；及び
配列番号１の９８６〜１００８番目の領域；
のいずれかの領域の相補領域にハイブリダイズする請求項５記載のプライマーセット。
【請求項８】
前記第三プライマーが、
配列番号１の７０３〜７２２番目の領域；
配列番号１の９３１〜９５３番目の領域；
配列番号１の９４５〜９６２番目の領域；
配列番号１の９５０〜９６２番目の領域；及び
配列番号１の９６６〜９８５番目の領域；
のいずれかの領域の相補領域にハイブリダイズする請求項５記載のプライマーセット。
【請求項９】
前記配列番号１の第二領域よりも３’末端側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である第四プライマーをさらに含む、請求項５記載のプライマーセット。
【請求項１０】
前記第四プライマーが、
（Ａ４）  配列番号２０〜２５のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
（Ｂ４）  前記（Ａ４）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなる、請求項９記載のプライマーセット。
【請求項１１】
前記第四プライマーが、
配列番号１の９１７〜９３６番目の領域；
配列番号１の１１３５〜１１５３番目の領域；
配列番号１の１１３８〜１１５５番目の領域；
配列番号１の１１３８〜１１５６番目の領域；
配列番号１の１１４１〜１１６０番目の領域；及び
配列番号１の１１４２〜１１６１番目の領域；
のいずれかにハイブリダイズする、請求項９記載のプライマーセット。
【請求項１２】
前記配列番号１の前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマーをさらに含む請求項５記載のプライマーセット。
【請求項１３】
前記第五プライマーが、
（Ａ５）  配列番号２６〜５５のいずれかに記載のポリヌクレオチド；又は
（Ｂ５）  前記（Ａ５）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド。
からなる、請求項１２記載のプライマーセット。
【請求項１４】
前記第五プライマーが、
配列番号１の７５２〜７７６番目の領域；
配列番号１の９８１〜１００４番目の領域；
配列番号１の９８２〜１００４番目の領域；
配列番号１の９８２〜１００６番目の領域；
配列番号１の９８６〜１０１０番目の領域；
配列番号１の９８７〜１０１１番目の領域；
配列番号１の９８８〜１０１１番目の領域；
配列番号１の９８８〜１０１２番目の領域；
配列番号１の９８９〜１０１１番目の領域；
配列番号１の９８９〜１０１２番目の領域；
配列番号１の９８９〜１０１３番目の領域；
配列番号１の９９０〜１０１２番目の領域；
配列番号１の９９０〜１０１３番目の領域；
配列番号１の９９０〜１０１４番目の領域；
配列番号１の９９２〜１０１５番目の領域；
配列番号１の９９３〜１０１６番目の領域；
配列番号１の９９４〜１０１６番目の領域；
配列番号１の９９５〜１０１６番目の領域；
配列番号１の９９５〜１０１８番目の領域；
配列番号１の９９６〜１０１８番目の領域；
配列番号１の１０００〜１０１９番目の領域；
配列番号１の１００１〜１０２０番目の領域；
配列番号１の１００３〜１０２２番目の領域；
配列番号１の１００４〜１０２２番目の領域；
配列番号１の１００５〜１０２４番目の領域；
配列番号１の１００６〜１０２４番目の領域；
配列番号１の１００８〜１０２７番目の領域；
配列番号１の１００９〜１０２７番目の領域；
配列番号１の１００９〜１０２８番目の領域；及び
配列番号１の１０１０〜１０２９番目の領域
のいずれかにハイブリダイズする、請求項１２記載のプライマーセット。
【請求項１５】
前記配列番号１の前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマーをさらに含む、請求項５記載のプライマーセット。
【請求項１６】
前記第六プライマーが、
（Ａ６）配列番号５６〜７５のいずれかに記載のポリヌクレオチド；又は
（Ｂ６）前記（Ａ６）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなる、請求項１５記載のプライマーセット。
【請求項１７】
前記第六プライマーが、
配列番号１の８６０〜８８４番目の領域；
配列番号１の１０６３〜１０８７番目の領域；
配列番号１の１０６５〜１０８９番目の領域；
配列番号１の１０６６〜１０９０番目の領域；
配列番号１の１０６７〜１０８９番目の領域；
配列番号１の１０６７〜１０９０番目の領域；
配列番号１の１０６８〜１０９１番目の領域；
配列番号１の１０６８〜１０９２番目の領域；
配列番号１の１０６９〜１０９１番目の領域；
配列番号１の１０６９〜１０９２番目の領域；
配列番号１の１０６９〜１０９３番目の領域；
配列番号１の１０７０〜１０９３番目の領域；
配列番号１の１０７０〜１０９４番目の領域；
配列番号１の１０７３〜１０９７番目の領域；
配列番号１の１０７４〜１０９８番目の領域；
配列番号１の１０７５〜１０９９番目の領域；
配列番号１の１０８２〜１１０４番目の領域；
配列番号１の１０８３〜１１０５番目の領域；
配列番号１の１０８４〜１１０５番目の領域；及び
配列番号１の１０８５〜１１０７番目の領域
のいずれかの領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項１５記載のプライマーセット。
【請求項１８】
請求項５記載のプライマーセットと、
ｄＮＴＰｓと、
ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと
を含んでなるチロシナーゼｍＲＮＡ検出用試薬キット。
【請求項１９】
前記第二プライマーが、
（Ａ２）  配列番号７〜１３の何れかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
（Ｂ２）  前記（Ａ２）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなり、
前記第三プライマーが、
（Ａ３）配列番号２〜６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
（Ｂ３）前記（Ａ３）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
からなる、請求項１８記載のチロシナーゼｍＲＮＡ検出用試薬キット。
【請求項２０】
試料と、請求項５記載のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
前記プライマーセットと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、前記工程で合成されたｃＤＮＡとを反応させて、前記ｃＤＮＡを増幅する工程、及び
前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法。
【請求項２１】
試料と、請求項５記載のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するとともに、このｃＤＮＡを鋳型として当該ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する工程、及び
前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ（以下、「ＴＹＲ」という）のｍＲＮＡを検出するために用いられるプライマーに関する。さらに詳しくは、試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出に好適なプライマー、プライマーセット及びＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＹＲは、動物や植物の細胞で発現し、チロシンを酸化してメラニンを合成する反応を触媒する酵素の一種である。近年の研究により、ＴＹＲは、メラノーマのリンパ節転移を検出するための分子マーカーとして有用であることが分かってきた。例えば、非特許文献１には、生体から採取したリンパ節から測定試料を調製し、測定試料中のＴＹＲのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって検出することによって、メラノーマのリンパ節転移の有無を判定できることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】エブラハムセン(Abrahamsen)ら、「センチネル節におけるメラノーマｍＲＮＡマーカーの定量：シングルステップリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイの前臨床評価(Quantification of Melanoma mRNA Markers in Sentinel Nodes:Pre-Clinical Evaluation of a Single-Step Real-Time ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction Assay)」、２００４年８月、第６巻、第３号、ｐ．２５３-２５９
【発明の概要】
【０００４】
上述の通り、ＴＹＲのｍＲＮＡは、メラノーマ等のがんの検出のための分子マーカーとして有用である。しかしながら、非特許文献１に記載の技術は、検出の際に、高感度に標的核酸を検出することができるＲＴ−ＰＣＲが用いられているため、例えば、がん細胞のリンパ節への微小転移をも検出できるが、検出までに非常に時間（２〜４時間程度）がかかっていた。
【０００５】
本発明は、従来の技術よりも短時間でＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出することができる、ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマー、ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーセット、ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用試薬キット及びＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
すなわち、本発明は、
〔１〕  試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーであって、
５’末端側に第一配列、３’末端側に第二配列を含んでなり、
前記第一配列が、
（ａ１）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ１）  配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第二配列が、
（ｃ１）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ１）  配列番号１において第一領域よりも３’末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第二領域が、
（ｉ）  配列番号１の９０１及び９０２番目のヌクレオチド；又は
（ii）  配列番号１の１１１８及び１１１９番目のヌクレオチド；
を含む領域であるチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマー、
〔２〕  試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセットであって、
第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含み、
前記第一プライマーが、請求項１記載のプライマーであり、
前記第二プライマーが、５’末端側に第三配列、３’末端側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
（ａ２）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ２）  前記配列番号１の第一領域よりも５’末端側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第四配列が、
（ｃ２）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ２）  前記配列番号１の第三領域よりも５’末端側に位置する第四領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第三プライマーが、前記配列番号１の第四領域よりも５’末端側に位置する第五領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列からなるプライマーであるチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセット、
〔３〕  前記〔２〕記載のプライマーセットと、
ｄＮＴＰｓと、
ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素、またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと
を含むチロシナーゼｍＲＮＡ検出用試薬キット、
〔４〕  試料と、前記〔２〕記載のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
前記プライマーセットと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、前記工程で合成されたｃＤＮＡとを反応させて、前記ｃＤＮＡを増幅する工程、及び
前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法、並びに
〔５〕  試料と、前記〔２〕記載のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するとともに、このｃＤＮＡを鋳型として当該ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する工程、及び
前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法
に関する。
【０００７】
本発明のＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマー、ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーセット、ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用試薬キット及びＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出方法によれば、短時間でＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プライマーと、プライマーがハイブリダイズする領域とを示した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔プライマー及びプライマーセット〕
まず、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出するためのＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーを説明する。
【００１０】
なお、本明細書において、「検出する」とは、標的とする物質であるＴＹＲ  ｍＲＮＡが試料中に存在するか否かを判定することだけでなく、試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡを定量することをも含む。
【００１１】
本明細書において、「プライマー」とは、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（米国特許第６４１０２７８号公報及び米国特許第６９７４６７０号公報参照）等の核酸増幅技術において、増幅対象となる核酸の特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能（以下、「プライマー機能」という）を有するポリヌクレオチドをいう。検出対象となる核酸はｍＲＮＡであるため、逆転写反応を含む核酸増幅反応（例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法等）により検出することができる。
【００１２】
「ハイブリダイズ」とは、ストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドの塩基同士の相補性に基づいて、あるポリヌクレオチドの一部又は全部の配列が別のポリヌクレオチドの一部又は全部の配列に水素結合を介して結合することをいう。
【００１３】
「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行なう際に当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマーがＴＹＲ  ｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al., 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件等を用いることができる。より具体的には、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。
【００１４】
ＴＹＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列に対応する配列である。なお、ｍＲＮＡにはチミンは存在せず、代わりにウラシルが含まれるが、配列番号１では便宜上ウラシルをチミン（ｔ）として表記してある。この配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_000372として登録されている。
【００１５】
本発明の一実施形態（実施形態１）に係るプライマーは、試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーであって、
５’末端側に第一配列、３’末端側に第二配列を含み、
前記第一配列が、
（ａ１）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ１）  配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第二配列が、
（ｃ１）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ１）  配列番号１において第一領域よりも３’末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第二領域が、
（ｉ）  配列番号１の９０１及び９０２番目のヌクレオチド；又は
（ii）  配列番号１の１１１８及び１１１９番目のヌクレオチド；
を含む領域であることを特徴としている。
【００１６】
本実施形態１のプライマーは、特に、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いたＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出に好適に用いられるプライマーである。本実施形態１のプライマーによれば、５’末端側に前記第一配列、３’末端側に前記第二配列を含んでいるため、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを効率よく、かつ再現性よく検出することができる。
【００１７】
前記ＲＴ−ＬＡＭＰ法においては、まずは逆転写反応（ＲＴ反応）によってＴＹＲ  ｍＲＮＡからｃＤＮＡが合成され、続いて合成されたｃＤＮＡがＬＡＭＰ反応により増幅される。
かかるＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いたＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出では、本実施形態１のプライマーとして、例えば、図１に模式的に示されるように、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの一部の領域（図１中、「Ｒ１ｃ」）の相補領域（図１中、「Ｒ１」）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第一配列を５’末端側に有し、ＴＹＲ  ｍＲＮＡにおいて前記領域Ｒ１ｃよりも下流（３’末端側）に位置する領域（図１中、「Ｒ２ｃ」）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第二配列を３’末端側に有するポリヌクレオチドからなるプライマーを用いることができる。
【００１８】
前記第一配列及び第二配列は、本実施形態１のプライマーと当該プライマーがハイブリダイズする領域との間のハイブリダイゼーションの特異性の観点から、それぞれ独立して、好ましくは１０ヌクレオチド以上の長さであり、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出に際して、操作が容易なハイブリダーゼーション温度を確保する観点から、好ましくは３０ヌクレオチド以下の長さである。
【００１９】
本実施形態１のプライマーにおいては、第一配列と第二配列とは直接連結されていてもよく、介在配列を介して連結されていてもよい。介在配列としては、ＴＹＲ  ｍＲＮＡやＴＹＲ  ｃＤＮＡとは関連性の低い配列であることが好ましい。例えば、5'-tttt-3'等が挙げられる。介在配列の長さは、１〜５０ヌクレオチドであることが好ましく、１〜４０ヌクレオチドであることがより好ましい。
【００２０】
本実施形態１のプライマーは、前記ＲＴ−ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーのうち、リバースインナープライマー（以下、「ＲＩＰ」という）として機能することができる。
【００２１】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いてＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出するためには、前記実施形態１のプライマー（ＲＩＰ）と、フォワードインナープライマー（以下、「ＦＩＰ」という）と、Ｆ３プライマーとを用いることができる。本発明には、これらのプライマーを含むＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーセットも包含される。
【００２２】
本発明の一実施形態に係るＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーセットは、試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用プライマーセットであって、
第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含み、
前記第一プライマーが、前記実施形態１のプライマーであり、
前記第二プライマーが、５’末端側に第三配列、３’末端側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
（ａ２）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ２）  前記配列番号１の第一領域よりも５’末端側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第四配列が、
（ｃ２）  １０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ２）  前記配列番号１の第三領域よりも５’末端側に位置する第四領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
前記第三プライマーが、前記配列番号１の第四領域よりも５’末端側に位置する第五領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列からなるプライマーであることを特徴としている。
【００２３】
本実施形態のプライマーセットによれば、前記第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含むため、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを高い効率で、迅速に、かつ再現性よく検出することが可能になる。
【００２４】
本実施形態のプライマーセットは、前記配列番号１の第二領域よりも３’末端側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である第四プライマーをさらに含んでいてもよい。また、本実施形態のプライマーセットは、前記配列番号１の前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマーをさらに含んでいてもよい。さらに、本実施形態のプライマーセットは、前記配列番号１の前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマーをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
以下、図１に基づいて、前記プライマーおよびプライマーセットをさらに説明する。
図１は、プライマーと、プライマーがハイブリダイズする領域とを示した模式図である。なお、図１中、Ｆ１、Ｆ２、Ｌ、Ｆ１、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ及びＲ３ｃの各領域は、ＴＹＲ  ｍＲＮＡ上の領域であり、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｒ１、Ｍ、Ｒ２及びＲ３の各領域は、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの相補鎖であるＴＹＲ  ｃＤＮＡ上の領域である。また、Ｆ１とＦ１ｃ、Ｆ２とＦ２ｃ、Ｆ３とＦ３ｃ、Ｒ１とＲ１ｃ、Ｒ２とＲ２ｃ、及びＲ３とＲ３ｃは、それぞれ相補的である。これらの領域は、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出効率、再現性等を考慮して選択される。
【００２６】
図１において、ＲＩＰは前記第一プライマー、ＦＩＰは前記第二プライマー、Ｆ３プライマーは前記第三プライマー、Ｒ３プライマーは前記第四プライマー、ループプライマーＦは前記第五プライマー、ループプライマーＲは前記第六プライマーにそれぞれ対応している。
【００２７】
ＦＩＰ（第二プライマー）は、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの相補鎖であるＴＹＲ  ｃＤＮＡの領域Ｆ１（Ｆ１ｃの相補領域）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第三配列を５’末端側に有し、ＴＹＲ  ｃＤＮＡの領域Ｆ２ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第四配列を３’末端側に有するポリヌクレオチドである。第三配列と第四配列とは、直接連結されていてもよく、前記介在配列を介して連結されていてもよい。また、ＦＩＰにおいて、第三配列及び第四配列の長さは、前記第一配列及び第二配列の長さと同様である。
【００２８】
Ｆ３プライマー（第三プライマー）は、ＴＹＲ  ｃＤＮＡのＦ２ｃよりも下流（３’末端側）に位置する領域Ｆ３ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドからなる。
【００２９】
さらに、本発明のプライマーセットは、ＦＩＰ、ＲＩＰ及びＦ３プライマーに加えて、Ｒ３プライマーを含んでいてもよい。このＲ３プライマーは、ＴＹＲ  ｍＲＮＡのＲ２ｃよりも下流（３’末端側）に位置する領域Ｒ３ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドからなる。
【００３０】
さらに、本発明のプライマーセットは、ループプライマーを含んでいてもよい。ループプライマーとしては、ＴＹＲ  ｍＲＮＡにおいてＦ２とＦ１との間に位置する領域Ｌにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマーＦ、ＴＹＲ  ｃＤＮＡにおいてＲ１とＲ２との間に位置する領域Ｍにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマーＲ等が挙げられる。本発明のプライマーセットは、これらのループプライマーＦ及びＲの一方又は両方を含んでいてもよい。
本発明のプライマーセットがループプライマーＦ及びＲの片方又は両方を含むものである場合、かかるプライマーセットによれば、ＬＡＭＰ反応によるｃＤＮＡの増幅をより迅速に行なうことが可能となる。
【００３１】
Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー、ループプライマーＦ及びＲの鎖長は、プライマー機能を発現するに十分な長さであれば特に限定されない。核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は、５ヌクレオチド以上であることから、前記各プライマーの鎖長は、それぞれ、好ましくは５〜１００ヌクレオチドである。また、プライマーのヌクレオチド配列とプライマーがハイブリダイズする領域との間の特異性を考慮すると、前記各プライマーの鎖長は、好ましくは１０ヌクレオチド以上、プライマーのハイブリダイゼーション温度を考慮すると、好ましくは３０ヌクレオチド以下である。また、ＦＩＰ及びＲＩＰの鎖長は、２０〜２００ヌクレオチドが好ましく、２０〜６０ヌクレオチドがより好ましい。
【００３２】
本発明のプライマーセットでは、上述のプライマーのうち、少なくとも一つがＴＹＲ  ｍＲＮＡのエキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズすることが好ましい。ＴＹＲ遺伝子は、９個のエキソンからなり、エキソンとエキソンとの間にはイントロンが介在している。細胞内でＴＹＲ遺伝子からｍＲＮＡが合成される際はスプライシングによってイントロンが除去され、エキソン同士が直接連結される。このエキソンとエキソンとが連結されたつなぎ目の部分をエキソンジャンクションという。例えば、ゲノムではエキソン１とエキソン２とはイントロンによって隔離されているが、ｍＲＮＡ合成において前記イントロンは除去されるためｍＲＮＡではエキソン１の３’末端とエキソン２の５’末端とは隣接している。配列番号１は５個のエキソンからなるため、配列番号１には、以下の４個のエキソンジャンクション（エキソンジャンクション１〜４）がある。
エキソン１と２とのエキソンジャンクション１：配列番号１の９０１番目と９０２番目との結合部分
エキソン２と３とのエキソンジャンクション２：配列番号１の１１１８番目と１１１９番目との結合部分
エキソン３と４とのエキソンジャンクション３：配列番号１の１２６６番目と１２６７番目との結合部分
エキソン４と５とのエキソンジャンクション４：配列番号１の１４４８番目と１４４９番目との結合部分
【００３３】
エキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーは、ＴＹＲ遺伝子のｍＲＮＡにはハイブリダイズするが、ＴＹＲ遺伝子のゲノムＤＮＡにはハイブリダイズする可能性は極めて低い。このようなプライマーによれば、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によるｍＲＮＡ検出の際に非特異的に核酸を増幅してしまうことを防止することが可能となる。
【００３４】
また、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の反応機序（米国特許第６４１０２７８号公報及び米国特許第６９７４６７０号公報参照）によると、試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡに最初にハイブリダイズするのは、ＲＩＰの第二配列からなるポリヌクレオチド部分であると考えられる。したがって、本発明のプライマーセットでは、上述のプライマーのうち、ＲＩＰの第二配列からなるポリヌクレオチド部分がエキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズすることがより好ましい。すなわち、前記領域Ｒ２ｃがエキソンジャンクションを含むことがより好ましい。これにより、反応の初期の段階で非特異的に核酸を増幅してしまうことを避けることができる。
【００３５】
ＴＹＲ  ｍＲＮＡと、試料中の他の遺伝子に由来するｍＲＮＡとの間の相同性や、検出速度、検出の再現性等の観点から、本発明のプライマーセットは、好ましくは上記のエキソンジャンクションのうちエキソンジャンクション１又は２を含む領域にハイブリダイズするプライマー、より好ましくはエキソンジャンクション２を含む領域にハイブリダイズするプライマーを含む。
【００３６】
本実施形態のプライマーと、このプライマーがハイブリダイズするＴＹＲ  ｍＲＮＡの特定の領域とは、互いに完全に相補的である必要はなく、両者は、互いにハイブリダイズできる程度の相補性を有していればよい（このことは、米国特許第４８００１５９号公報にも記載されている）。すなわち、プライマー機能を有するポリヌクレオチドであれば、このプライマーは、上記特定の領域と完全な相補性を有する配列に置換、欠失、挿入、付加等のような変異を１又は複数個、すなわち、数個有するポリヌクレオチドであってもよい。この変異を有するポリヌクレオチドは、変異を有していないポリヌクレオチドに対して８０％以上の相同性を有していることが好ましく、９０％以上の相同性を有していることがより好ましく、９５％以上の相同性を有していることがさらに好ましい。
【００３７】
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応では、プライマーが目的の核酸であるＴＹＲ  ｍＲＮＡにハイブリダイズした後、ポリメラーゼの作用によってプライマーの３’末端を起点として核酸合成が行なわれる。このため、プライマーの３’末端部分とＴＹＲ  ｍＲＮＡとの間の相補性が高いほど、核酸合成反応が進行しやすくなることが考えられる。したがって、本発明のプライマーは、好ましくは３’末端の３ヌクレオチドが、当該プライマーのハイブリダイズする領域と完全に相補的なポリヌクレオチドであり、より好ましくは３’末端の５ヌクレオチドが完全に相補的なポリヌクレオチドである。
【００３８】
なかでも、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出に際して、特異性を向上させる観点から、前記第二配列が、３’末端に、前記第二領域の配列に完全に相補的な連続した３ヌクレオチドからなる配列を含んでいることが好ましく、前記第二領域の配列に完全に相補的な連続した５ヌクレオチドからなる配列を含んでいることがより好ましい。
【００３９】
Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、Ｌ及びＭの各領域は、配列番号１に示されるＴＹＲ  ｍＲＮＡの配列中に設定される。以下に、これらの領域の具体例を挙げる。
【００４０】
（Ｆ１）
７９５〜８１７番目の領域
１００５〜１０２４番目の領域
１０１５〜１０３６番目の領域
１０１６〜１０４０番目の領域
１０３１〜１０５４番目の領域
【００４１】
（Ｆ２）
７３１〜７５１番目の領域
９６３〜９７７番目の領域
９６４〜９８６番目の領域
９７１〜９９２番目の領域
９７２〜９９２番目の領域
９８６〜１００８番目の領域
【００４２】
（Ｆ３）
７０３〜７２２番目の領域
９３１〜９５３番目の領域
９４５〜９６２番目の領域
９５０〜９６２番目の領域
９６６〜９８５番目の領域
【００４３】
（Ｒ１ｃ）
８２５〜８４８番目の領域
１０２６〜１０４９番目の領域
１０４１〜１０６２番目の領域
１０４４〜１０６４番目の領域
１０４４〜１０６８番目の領域
１０５７〜１０８０番目の領域
【００４４】
（Ｒ２ｃ）
８８６〜９０８番目の領域
１１１０〜１１３３番目の領域
１１１４〜１１３１番目の領域
１１１４〜１１３３番目の領域
【００４５】
（Ｒ３ｃ）
９１７〜９３６番目の領域
１１３５〜１１５３番目の領域
１１３８〜１１５５番目の領域
１１３８〜１１５６番目の領域
１１４１〜１１６０番目の領域
１１４２〜１１６１番目の領域
【００４６】
（Ｌ）
７５２〜７７６番目の領域
９８１〜１００４番目の領域
９８２〜１００４番目の領域
９８２〜１００６番目の領域
９８６〜１０１０番目の領域
９８７〜１０１１番目の領域
９８８〜１０１１番目の領域
９８８〜１０１２番目の領域
９８９〜１０１１番目の領域
９８９〜１０１２番目の領域
９８９〜１０１３番目の領域
９９０〜１０１２番目の領域
９９０〜１０１３番目の領域
９９０〜１０１４番目の領域
９９２〜１０１５番目の領域
９９３〜１０１６番目の領域
９９４〜１０１６番目の領域
９９５〜１０１６番目の領域
９９５〜１０１８番目の領域
９９６〜１０１８番目の領域
１０００〜１０１９番目の領域
１００１〜１０２０番目の領域
１００３〜１０２２番目の領域
１００４〜１０２２番目の領域
１００５〜１０２４番目の領域
１００６〜１０２４番目の領域
１００８〜１０２７番目の領域
１００９〜１０２７番目の領域
１００９〜１０２８番目の領域
１０１０〜１０２９番目の領域
【００４７】
（Ｍ）
８６０〜８８４番目の領域
１０６３〜１０８７番目の領域
１０６５〜１０８９番目の領域
１０６６〜１０９０番目の領域
１０６７〜１０８９番目の領域
１０６７〜１０９０番目の領域
１０６８〜１０９１番目の領域
１０６８〜１０９２番目の領域
１０６９〜１０９１番目の領域
１０６９〜１０９２番目の領域
１０６９〜１０９３番目の領域
１０７０〜１０９３番目の領域
１０７０〜１０９４番目の領域
１０７３〜１０９７番目の領域
１０７４〜１０９８番目の領域
１０７５〜１０９９番目の領域
１０８２〜１１０４番目の領域
１０８３〜１１０５番目の領域
１０８４〜１１０５番目の領域
１０８５〜１１０７番目の領域
【００４８】
本発明においては、前記プライマーは、上記の各領域に基づき設計することができる。以下に、各プライマーの具体例を挙げる。なお、配列の後の括弧内の記載は、各プライマーがＴＹＲ  ｍＲＮＡの配列（配列番号１）のどの領域と同じ配列であるか、又は相補的であるかを示したものである。
【００４９】
（Ｆ３プライマー）
配列番号２：5'-AATGGAACGCCCGAGGGA-3'（950-967番目の領域と同じ配列）
配列番号３：5'-GACCTTTACGGCGTAATCCT-3'（966-985番目の領域と同じ配列）
配列番号４：5'-TATGCAATGGAACGCCCG-3'（945-962番目の領域と同じ配列）
配列番号５：5'-CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3'（931-953番目の領域と同じ配列）
配列番号６：5'-TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3'（703-722番目の領域と同じ配列）
【００５０】
（ＦＩＰ）
配列番号７：5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3'
（1031-1054番目の領域の相補配列と971-992番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号８：5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3'
（1031-1054番目の領域の相補配列と986-1008番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号９：5'-TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3'
（1015-1036番目の領域の相補配列と963-977番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１０：5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3'
（1031-1054番目の領域の相補配列と972-992番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１１：5'-AGAGGGGAGCCTTGGGGTTCAGGGACCTTTACGGC-3'
（1005-1024番目の領域の相補配列と963-977番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１２：5'-ATTCTACATCAGCTGAAGAGGGGAGGGGACCTTTACGGCGTAATCCTG-3'
（1016-1040番目の領域の相補配列と964-986番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
配列番号１３：5'-GTCACACTTTTCTGCATCCCGCCCGGTGGGAACAAGAAATCCAG-3'
（795-817番目の領域の相補配列と731-751番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
【００５１】
（ＲＩＰ）
配列番号１４：5'-CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
（1057-1080番目の領域と同じ配列と、1114-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１５：5'-TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
（1041-1062番目の領域と同じ配列と、1114-1131番目の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１６：5'-GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
（1044-1064番目の領域と同じ配列と、1114-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１７：5'-CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
（1026-1049番目の領域と同じ配列と、1114-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１８：5'-GCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCGTGGACTAGCAAATCCTTCCAGTG-3'
（1044-1068番目の領域と同じ配列と、1110-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
配列番号１９：5'-CAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCAGACAATCTGCCAAGAGGAGAAG-3'
（825-848番目の領域と同じ配列と、886-908番目の領域の相補配列とを連結した配列）
【００５２】
（Ｒ３プライマー）
配列番号２０：5'-GAGGCATCCGCTATCCCA-3'  （1138-1155番目の領域の相補配列）
配列番号２１：5'-TTTGAGAGGCATCCGCTATC-3'  （1141-1160番目の領域の相補配列）
配列番号２２：5'-GGCATCCGCTATCCCAGTA-3'  （1135-1153番目の領域の相補配列）
配列番号２３：5'-AGAGGCATCCGCTATCCCA-3'  （1138-1156番目の領域の相補配列）
配列番号２４：5'-CTTTGAGAGGCATCCGCTAT-3'  （1142-1161番目の領域の相補配列）
配列番号２５：5'-TGGCTGTTGTACTCCTCCAA-3'  （917-936番目の領域の相補配列）
【００５３】
（ループプライマーＦ）
配列番号２６：5'-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCA-3'（994-1016番目の領域の相補配列）
配列番号２７：5'-CTGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3'（1009-1028番目の領域の相補配列）
配列番号２８：5'-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCAT-3'（993-1016番目の領域の相補配列）
配列番号２９：5'-TGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3'（1009-1027番目の領域の相補配列）
配列番号３０：5'-GGAGCCTTGGGGTTCTGGAT-3'（1000-1019番目の領域の相補配列）
配列番号３１：5'-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3'（995-1016番目の領域の相補配列）
配列番号３２：5'-GGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTCC-3'（986-1010番目の領域の相補配列）
配列番号３３：5'-GGGAGCCTTGGGGTTCTGGA-3'（1001-1020番目の領域の相補配列）
配列番号３４：5'-GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGT-3'（996-1018番目の領域の相補配列）
配列番号３５：5'-GCTGAAGAGGGGAGCCTTGG-3'（1010-1029番目の領域の相補配列）
配列番号３６：5'-TCTGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3'（982-1006番目の領域の相補配列）
配列番号３７：5'-GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3'（995-1018番目の領域の相補配列）
配列番号３８：5'-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3'（989-1012番目の領域の相補配列）
配列番号３９：5'-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTC-3'（987-1011番目の領域の相補配列）
配列番号４０：5'-TGAAGAGGGGAGCCTTGGGG-3'（1008-1027番目の領域の相補配列）
配列番号４１：5'-CTTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3'（990-1014番目の領域の相補配列）
配列番号４２：5'-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3'（990-1012番目の領域の相補配列）
配列番号４３：5'-AGGGGAGCCTTGGGGTTCT-3'（1004-1022番目の領域の相補配列）
配列番号４４：5'-AGAGGGGAGCCTTGGGGTTC-3'（1005-1024番目の領域の相補配列）
配列番号４５：5'-TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3'（990-1013番目の領域の相補配列）
配列番号４６：5'-AGAGGGGAGCCTTGGGGTT-3'（1006-1024番目の領域の相補配列）
配列番号４７：5'-TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGAT-3'（981-1004番目の領域の相補配列）
配列番号４８：5'-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3'（988-1012番目の領域の相補配列）
配列番号４９：5'-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3'（989-1011番目の領域の相補配列）
配列番号５０：5'-CCTTGGGGTTCTGGATTTGTCATG-3'（992-1015番目の領域の相補配列）
配列番号５１：5'-TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3'（982-1004番目の領域の相補配列）
配列番号５２：5'-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3'（988-1011番目の領域の相補配列）
配列番号５３：5'-TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3'（989-1013番目の領域の相補配列）
配列番号５４：5'-AGGGGAGCCTTGGGGTTCTG-3'（1003-1022番目の領域の相補配列）
配列番号５５：5'-TGAAGTTTTCATCTCCTGTCAGCTT-3'（752-776番目の領域の相補配列）
【００５４】
（ループプライマーＲ）
配列番号５６：5'-AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3'（1082-1104番目の領域と同じ配列）
配列番号５７：5'-AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3'（1084-1105番目の領域と同じ配列）
配列番号５８：5'-GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3'（1085-1107番目の領域と同じ配列）
配列番号５９：5'-AAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3'（1083-1105番目の領域と同じ配列）
配列番号６０：5'-ATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3'（1066-1090番目の領域と同じ配列）
配列番号６１：5'-AATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3'（1065-1089番目の領域と同じ配列）
配列番号６２：5'-CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3'（1068-1092番目の領域と同じ配列）
配列番号６３：5'-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3'（1069-1092番目の領域と同じ配列）
配列番号６４：5'-GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3'（1070-1093番目の領域と同じ配列）
配列番号６５：5'-TCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCA-3'（1073-1097番目の領域と同じ配列）
配列番号６６：5'-CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3'（1068-1091番目の領域と同じ配列）
配列番号６７：5'-TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3'（1067-1090番目の領域と同じ配列）
配列番号６８：5'-TGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCT-3'（1063-1087番目の領域と同じ配列）
配列番号６９：5'-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3'（1069-1091番目の領域と同じ配列）
配列番号７０：5'-CATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGC-3'（1075-1099番目の領域と同じ配列）
配列番号７１：5'-GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATT-3'（1070-1094番目の領域と同じ配列）
配列番号７２：5'-CCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAG -3'（1074-1098番目の領域と同じ配列）
配列番号７３：5'-TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3'（1067-1089番目の領域と同じ配列）
配列番号７４：5'-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3'（1069-1093番目の領域と同じ配列）
配列番号７５：5'-CCTAACTTACTCAGCCCAGCATCAT-3'（860-884番目の領域と同じ配列）
【００５５】
上記のプライマーのうち、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーは、エキソンジャンクション１を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号１４〜１８のプライマーは、エキソンジャンクション２を含む領域にハイブリダイズ可能である。
【００５６】
上記のプライマーは、増幅領域に応じてＦ３プライマー、ＦＩＰ、ＲＩＰ及びＲ３プライマーを適宜組み合わせて４種類のプライマーを含むプライマーセットとして用いることができる。また、さらにループプライマーＦ及びＲを組み合わせて６種類のプライマーを含むプライマーセットとして用いることができる。このようなプライマーセットの具体例を下記表１に示す。
【００５７】
【表１】
2009145303.tif 000002
【００５８】
逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、公知のものを用いることができる。また、これら二種類の酵素（逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）の代わりに、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた一種類の酵素を用いてもよい。
【００５９】
さらに、酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤をも用いることが好ましい。
上述の物質はそれぞれ別々の容器に収容することができるが、逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。また、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、及び各種プライマーのうち少なくとも二種類の物質を同一の容器に収容してもよい。これらの試薬をユーザに提供する際は、上記の試薬の一部又は全部を含む試薬キットとして提供してもよい。
【００６０】
〔ＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出方法及びＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出用試薬キット〕
つぎに、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出方法を説明する。本発明のＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出方法は、
上述のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを用いること（下記「実施形態１の検出方法」）、または
上述のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを用いること（下記「実施形態２の検出方法」）
により実施することができる
【００６１】
前記実施形態１の検出方法は、
（Ｉ−１）  試料と、上述のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
（II−１）  前記プライマーセットと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、前記工程（Ｉ−１）で合成されたｃＤＮＡとを反応させてｃＤＮＡを増幅する工程、
（III−１）  前記工程（II−１）で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程、
を含む方法である。
【００６２】
また、前記実施形態２の検出方法は、
（Ｉ−２）  試料と、上述のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するとともに、このｃＤＮＡを鋳型として当該ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する工程、及び
（II−２）  前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む方法である。
【００６３】
実施形態１及び２の検出方法は、高い効率で、正確にかつ短時間でＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出する観点から、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いて行なうことが好ましい。
【００６４】
前記実施形態１の検出方法において、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合、上述のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「逆転写酵素」という）と、鎖置換活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ」という）と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを含む）と、試料とを混合して、反応させることにより試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出することができる。したがって、この場合、前記工程（Ｉ−１）及び（II−１）は、１ステップで行なわれる。
【００６５】
一方、前記実施形態２の検出方法において、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合、上述のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素と、ｄＮＴＰｓと、試料とを混合して、反応させることにより試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出することができる。
【００６６】
逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、公知のものを用いることができる。
【００６７】
さらに、実施形態１の検出方法の工程（Ｉ−１）及び（II−１）及び実施形態２の検出方法の工程（Ｉ−２）では、各工程における酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤をも用いることが好ましい。
【００６８】
ＴＹＲ  ｍＲＮＡ検出に供される試料としては、生体から採取した組織（リンパ節、リンパ液、血液等）や便等が例示される。
【００６９】
実施形態１の検出方法において、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの検出は、増幅工程〔前記工程（Ｉ−１）及び（II−１）〕及び検出工程〔前記工程（III−１）〕を経て行なわれる。
【００７０】
まず、生体から採取したＴＹＲ  ｍＲＮＡを含む試料と、上述のプライマーセット、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを混合する。そして、得られた混合物を一定の温度（例えば、６５℃）まで加温してＲＴ反応及びＬＡＭＰ反応を行ない、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを鋳型としてＴＹＲ  ｃＤＮＡを合成するとともに、このＴＹＲ  ｃＤＮＡを鋳型として当該ＴＹＲ  ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する〔前記工程（Ｉ−１）及び（II−１）〕。
【００７１】
ＲＴ反応及びＬＡＭＰ反応の機序は、以下の通りである。
まず、反応液中のＴＹＲ  ｍＲＮＡの領域Ｒ２ｃにＲＩＰの第二配列がハイブリダイズする。その後、逆転写酵素によってＲＩＰの３’末端からＴＹＲ  ｍＲＮＡを鋳型としてＴＹＲ  ｃＤＮＡが合成される。これにより、ＲＩＰから伸長したＴＹＲ  ｃＤＮＡ（ＲＩＰ伸長鎖）とＴＹＲ  ｍＲＮＡとからなる二本鎖核酸が合成される。
【００７２】
次に、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの領域Ｒ３ｃにＲ３プライマーがハイブリダイズする。その後、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを鋳型として、Ｒ３プライマーの３’末端から、既にＴＹＲ  ｍＲＮＡと結合しているＲＩＰ伸長鎖が剥がされながら（置換されながら）、ＴＹＲ  ｃＤＮＡが合成される。
【００７３】
前記ＲＩＰ伸長鎖は、一本鎖の状態になっており、ＴＹＲ  ｍＲＮＡと相補的な配列を有するため、ＲＩＰ伸長鎖にはＴＹＲ  ｍＲＮＡの領域Ｆ２に相補的な領域Ｆ２ｃが含まれている。このＲＩＰ伸長鎖の領域Ｆ２ｃにＦＩＰの第四配列がハイブリダイズする。
【００７４】
その後、ＦＩＰの３’末端から鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによってＲＩＰ伸長鎖を鋳型としてＤＮＡ合成が行なわれる。ここで合成されたＤＮＡは、５’末端に第三配列（領域Ｆ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列）を持っているため、第三配列からなるポリヌクレオチドは、このＤＮＡ上の領域Ｆ１にハイブリダイズしてステムループ構造を形成する。また、このＤＮＡは、３’末端に第一配列の相補配列（領域Ｒ１ｃにハイブリダイズする配列）を持っているため、第一配列の相補配列は、このＤＮＡ上の領域Ｒ１ｃにハイブリダイズしてステムループ構造を形成する。したがって、このＤＮＡは５’末端と３’末端の両方でステムループ構造を形成したダンベル構造となる。
【００７５】
前記ダンベル構造のＤＮＡ（ダンベルＤＮＡ）は、３’末端から当該ダンベルＤＮＡ中の他の部分を鋳型として５’末端側のステムループ構造が解かれながら鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、伸長鎖が得られる。この伸長鎖は、５’末端、３’末端及びこれらの中央にそれぞれ互いに相補的な配列を有するため、伸長鎖内では、３つのステムループ構造が形成される。さらに、前記伸長鎖は、３’末端から当該伸長鎖中の他の部分を鋳型としてステムループ構造を解きながら鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。この反応が実質的に等温下で繰り返されることにより、分子内に特定の配列を複数有する核酸が合成される（反応の詳細は米国特許第６４１０２７８号公報及び米国特許第６９７４６７０号公報参照）。
【００７６】
このようにして得られた増幅産物中の核酸の大部分は、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）であるため、検出工程〔前記工程（III−１）〕では、この増幅産物を蛍光インターカレーター、例えば、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）等で蛍光染色し、紫外線を照射することによって蛍光を生じさせることにより、当該増幅産物を検出することができる。
【００７７】
蛍光染色は、増幅反応後〔前記工程（II−１）後〕の反応液に蛍光色素を添加することによって行なってもよく、あらかじめ反応液に蛍光色素を添加し、蛍光色素の存在下で核酸増幅を実施することにより行なってもよい。検出工程〔前記工程（III−１）〕では、蛍光が検出されるか否かにより、試料中にＴＹＲ  ｍＲＮＡが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅反応後〔前記工程（II−１）後〕の反応液の蛍光強度を測定することによって増幅産物の定量を行なうことができ、この定量結果に基づいて試料に含まれるＴＹＲ  ｍＲＮＡを定量することも可能である。特に、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行なう場合は、反応液の蛍光強度の増大をリアルタイムに測定し、一定の蛍光強度に達するまでの時間を測定することによって、試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡの量に換算することもできる（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＬＡＭＰ法等）。
【００７８】
また、前記工程（II−１）におけるＬＡＭＰ反応では、副産物として水に不溶なピロリン酸マグネシウムが生成する。前記ピロリン酸マグネシウムは核酸増幅が進むにつれて増加し、この増加に伴って反応液が白濁する。そのため、ｉ）反応液の濁りを目視により確認すること、ii）反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定すること、又はiii）反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより、標的核酸を検出することができる（国際公開第０１／８３８１７号を参照）。反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定する場合、前記蛍光色素を用いた場合と同様に、濁度変化をリアルタイムでモニターすることによって閉鎖系でＤＮＡの増幅と濁度の増加が追跡可能である。したがって、検出工程〔前記工程（III−１）〕では、反応液が白濁するか否かで、試料中にＴＹＲ  ｍＲＮＡが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅産物の濁度を測定することによって増幅産物の定量を行なうことができ、定量結果に基づいて試料に含まれるＴＹＲ  ｍＲＮＡを定量することも可能である。濁度の増大をリアルタイムに測定する場合は、一定の濁度に達するまでの時間（以下、増幅立ち上がり時間とする）を測定し、この時間を試料中のＴＹＲ  ｍＲＮＡの量に換算することも可能である。
【００７９】
一方、実施形態２の検出方法においては、工程（Ｉ−２）は、前記実施形態１の検出方法における増幅工程〔前記工程（Ｉ−１）及び（II−１）〕に対応する増幅工程である。かかる工程（Ｉ−２）では、前記工程（Ｉ−１）及び（II−１）における二種類の酵素（逆転写酵素および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）の代わりに、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた一種類の酵素が用いられることを除き、前記工程（Ｉ−１）及び（II−１）と同様に行なうことができる。
【００８０】
また、実施形態２の検出方法では、工程（II−２）は、前記実施形態１の検出方法における検出工程〔前記工程（III−１）〕と同様に行なうことができる。
【００８１】
本発明においては、前記工程（Ｉ−１）、工程（II−１）及び工程（Ｉ−２）で用いられる試薬をｍＲＮＡ検出用試薬キットとして提供することができる。かかるｍＲＮＡ検出用試薬キットは、上述したプライマーセットと、ｄＮＴＰｓと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを含むものである。
【００８２】
上述の各試薬はそれぞれ別々の容器に収容されていてもよい。また、逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、同一の容器に収容されていてもよい。また、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、及び各種プライマーのうち少なくとも二種類の試薬が、同一の容器に収容されていてもよい。
【００８３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００８４】
（実施例１）
表１に示されるプライマーセット１〜４５を用いてＴＹＲ  ｍＲＮＡを検出できるか否かを以下の通り検証した。
【００８５】
（１）試料調製
５×１０１０コピー／μＬのＴＹＲ  ｍＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの超純水にて段階希釈し、２．５×１０３コピー／μＬのＴＹＲ  ｍＲＮＡ試料を調製した。
【００８６】
（２）反応液の調製
表１に示されるＦ３プライマー、ＦＩＰ、ＲＩＰ及びＲ３プライマーを、下記組成となるように、緩衝液〔１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕に添加し、プライマーミックスを調製した。
１６μＭ  ＦＩＰ
１６μＭ  ＲＩＰ
１μＭ  Ｆ３プライマー
１μＭ  Ｒ３プライマー
１２μＭ  ループプライマーＦ
１２μＭ  ループプライマーＲ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
【００８７】
また、下記組成となるように、各試薬を混合し、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応用緩衝液を調製した。
５３ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１．８×  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  ｂｕｆｆｅｒ
(New England Biolabs製)
１．４３ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Invitrogen製）
５．３６ｍＭ  ＭｇＳＯ４〔ナカライテスク（株）製〕
８．９３ｍＭ  ＤＴＴ  〔和光純薬（株）製〕
２体積％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Sigma製）
【００８８】
次に、下記組成となるように、各試薬を混合し、酵素液（３．０４μＬ）を調製した。
１０Ｕ／μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素（Promega製）       ０．１４μＬ
８Ｕ／μＬ  ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ
（New England Biolabs製）            ２．２７μＬ
４０Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（Promega製）                       ０．６３μＬ
【００８９】
下記組成となるように、各試薬を混合し、２５μＬの反応液を調製した。なお、反応液は、４５種類のプライマーセットそれぞれについて調製された。
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応用緩衝液            １４．０μＬ
酵素液                                  ３．０μＬ
プライマーミックス                      ５．０μＬ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）    １．０μＬ
ＲＮＡ試料                              ２．０μＬ
【００９０】
４５種類の反応液のそれぞれに対応するネガティブコントロール（ＮＣ）として２．０μＬのＲＮＡ試料の代わりに超純水２．０μＬを添加したＮＣ用反応液（４５種類）も調製した。
【００９１】
（３）検出及び検出結果
４５種類のプライマーセットのいずれかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ６５℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置〔テラメックス社製、商品名：ＬＡ−２００〕にセットした。その後、６５℃で前記チューブ内の反応液をインキュベーションし、ＬＡＭＰ反応を行なった。反応開始から反応液の濁度が０．１に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定は、１回行なった。また、ＲＮＡ試料を含む反応液の測定は、３回行なった（ｎ＝３）。ネガティブコントロールの場合の測定結果及びＲＮＡ試料を含む反応液の場合の測定結果の平均値を、表２に示す。表中、「ＮＣ」は、ネガティブコントロールの場合の測定結果を示す。また、表中、「−（ハイフン）」は６０分以内に濁度が０．１に達しなかったことを示す。
【００９２】
【表２】
2009145303.tif 000003
【００９３】
表２に示される結果から、ネガティブコントロールの場合、６０分以内に、非特異的な核酸増幅が起こらず、ＴＹＲ  ｍＲＮＡの存在を検出することができないことがわかる。しかしながら、ＲＮＡ試料を含む反応液の場合、６０分以内に反応液の濁度が０．１に達したため、本発明の一実施形態に係るプライマーセット１〜４５のいずれを用いた場合であっても、ＴＹＲ  ｍＲＮＡを迅速に検出できることがわかった。
【図１】
2009145303.tif 000004
【配列表】
2009145303000001.app
【国際調査報告】
2009145303.tif 000005
2009145303.tif 000006
2009145303.tif 000007
2009145303.tif 000008