(57)【要約】  本発明は、容易且つ効率よく製造が可能であり、遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子の提供を目的とする。  標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、アミノ酸から誘導される原子団を含むことを特徴とする分子とする。この一本鎖核酸分子によれば、前記標的遺伝子の発現を抑制できる。
2013103146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、アミノ酸から誘導される原子団を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【化Ｉ】
2013103146.tif 000053
前記式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、前記アミノ酸であり、かつ、下記式（Ｉａ）は、ペプチド以外のアミノ酸である。
【化Ｉａ】
2013103146.tif 000054
【請求項３】
前記式（Ｉ）中、
Ａが、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含み、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項４】
前記アミノ酸が、天然アミノ酸または人工アミノ酸である請求項１から３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項５】
前記アミノ酸が、タンパク質を構成するアミノ酸である請求項１から３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項６】
前記アミノ酸が、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、またはアミノ安息香酸であり、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項１から３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項７】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）または式（５）の条件を満たす、請求項１から６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【請求項８】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、請求項７記載の一本鎖核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
【請求項９】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１９塩基〜３０塩基である、請求項１から８のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１０】
さらに、領域（Ｙ）および領域（Ｙｃ）を有し、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成している、請求項１から９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１１】
さらに、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間に、前記リンカー（Ｌｙ）が連結している、請求項１０記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１２】
前記リンカー領域（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、請求項１１記載の一本鎖核酸分子。
【化Ｉ】
2013103146.tif 000055
前記式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、ペプチドではないアミノ酸であり、
【化Ｉａ】
2013103146.tif 000056
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記式（Ｉ）で表される場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）中のＡ、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、同一でも異なっていても良い。
【請求項１３】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記式（Ｉ）の構造との結合、ならびに、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）の前記式（Ｉ）の構造との結合が、それぞれ、下記（１）〜（４）のいずれか一つの条件を満たす、請求項１２記載の一本鎖核酸分子。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【請求項１４】
前記式（Ｉ）において、Ｌ１は、前記ポリエーテル鎖であり、前記ポリエーテル鎖が、ポリエチレングリコールである、請求項２から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１５】
前記式（Ｉ）において、Ｌ１の原子個数（ｎ）とＬ２の原子個数（ｍ）との合計（ｍ＋ｎ）が、０〜３０の範囲である、請求項２から１４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１６】
前記式（Ｉ）の構造が、下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれか一つであり、下記式において、ｎは、０〜３０の整数、ｍは、０〜３０の整数である、請求項２から１５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【化Ｉ−１】
2013103146.tif 000057
【化Ｉ−２】
2013103146.tif 000058
【化Ｉ−３】
2013103146.tif 000059
【化Ｉ−４】
2013103146.tif 000060
【請求項１７】
前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２である、請求項１６記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１８】
前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項１６記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１９】
前記式（Ｉ−４）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項１６記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２０】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（２）の条件を満たす、請求項７から１９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項２１】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす、請求項７から２０のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【請求項２２】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差が、下記条件を満たす、請求項２１記載の一本鎖核酸分子。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【請求項２３】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜１１塩基である、請求項７から２２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２４】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜７塩基である、請求項２３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２５】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜３塩基である、請求項２３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２６】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜１１塩基である、請求項７から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２７】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜７塩基である、請求項２６記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２８】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜３塩基である、請求項２６記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２９】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３０】
標識物質を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３１】
安定同位体を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３２】
ＲＮＡ分子である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３３】
前記一本鎖核酸分子において、塩基数の合計が、５０塩基以上である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３４】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３５】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項３６】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項３７】
炎症治療用である、請求項３６記載の薬学組成物。
【請求項３８】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項３９】
前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項３８記載の発現抑制方法。
【請求項４０】
前記一本鎖核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与する、請求項３９記載の発現抑制方法。
【請求項４１】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項４２】
標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項４３】
標的遺伝子の発現抑制のための、請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項４４】
ＲＮＡ干渉の誘導のための、請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項４５】
疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする一本鎖核酸分子。
【請求項４６】
核酸分子合成用のモノマーであって、
下記式（ＩＩ）の構造を有することを特徴とするモノマー。
【化ＩＩ】
2013103146.tif 000061
前記式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、ペプチドでないアミノ酸である。
【化Ｉａ】
2013103146.tif 000062
【請求項４７】
前記式（ＩＩ）の構造が、下記式（ＩＩ−１）〜式（ＩＩ−４）のいずれか一つであり、下記式において、ｎは、０〜３０の整数、ｍは、０〜３０の整数である、請求項４６記載のモノマー。
【化ＩＩ−１】
2013103146.tif 000063
【化ＩＩ−２】
2013103146.tif 000064
【化ＩＩ−３】
2013103146.tif 000065
【化ＩＩ−４】
2013103146.tif 000066
前記式（ＩＩ−４）中、
Ｒ１０１は、Ｒ１１およびＲ２１と独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。
【請求項４８】
前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２である、請求項４７記載のモノマー。
【請求項４９】
前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項４７記載のモノマー。
【請求項５０】
前記式（ＩＩ−４）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項４７記載のモノマー。
【請求項５１】
前記式（ＩＩ）において、Ｌ１は、前記ポリエーテル鎖であり、前記ポリエーテル鎖が、ポリエチレングリコールである、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のモノマー。
【請求項５２】
前記式（ＩＩ）において、Ｌ１の原子個数（ｎ）とＬ２の原子個数（ｍ）との合計（ｍ＋ｎ）が、０〜３０の範囲である、請求項４６から５１のいずれか一項に記載のモノマー。
【請求項５３】
標識物質を含む、請求項４６から５２のいずれか一項に記載のモノマー。
【請求項５４】
安定同位体を含む、請求項４６から５３のいずれか一項に記載のモノマー。
【請求項５５】
自動核酸合成用である、請求項４６から５４のいずれか一項に記載のモノマー。
【請求項５６】
核酸分子の製造方法であって、
請求項４６から５５のいずれか一項に記載のモノマーを使用することを特徴とする製造方法。
【請求項５７】
前記核酸分子が、請求項１から３４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子である請求項５６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を抑制する一本鎖核酸分子に関し、より詳細には、アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子、それを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であって、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８  Ｆｅｂ  １９；３９１（６６６９）：８０６−１１
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国公開公報２００４−０５８８８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記各手法では、遺伝子の発現抑制を誘導するＲＮＡ分子は、以下のような問題がある。【０００６】
まず、前記ｓｉＲＮＡを製造する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖を別々に合成した上で、最後にこれらの鎖をハイブリダイズする工程が必要である。このため、製造効率が悪いという問題がある。また、前記ｓｉＲＮＡを細胞に投与する際、一本鎖ＲＮＡへの解離を抑制した状態で、細胞に投与する必要があるため、その取り扱い条件の設定にも労力を要する。つぎに、環状のＲＮＡ分子の場合、その合成が困難という問題がある。【０００７】
また、これらのＲＮＡ分子は、基本的にヌクレオチド残基から構成されている。そして、前記ＲＮＡ分子に、なんらかの機能や標識を付与する場合、例えば、ヌクレオチド残基の構成要素である、塩基、糖残基またはリン酸基に修飾を施すしかないのが現状である。このため、ＲＮＡ干渉を利用した医薬品等の開発において、遺伝子発現の抑制機能を維持した状態で、さらなる機能や標識を付与するための改変が、極めて困難である。【０００８】
そこで、本発明は、容易且つ効率よく製造が可能であり、遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の核酸分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、アミノ酸から誘導される原子団を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の第１の組成物は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明の第２の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。【００１２】
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする。【００１３】
本発明の発現誘導方法は、標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする。【００１４】
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の一本鎖核酸分子は、遺伝子の発現抑制が可能であり、かつ、環状ではないため、その合成が容易であり、また、一本鎖であるため、二本鎖のアニール工程が無く、効率良く製造可能である。また、前記リンカー領域が前記非ヌクレオチド残基を含むため、例えば、従来のようなヌクレオチド残基の改変に限られず、例えば、前記リンカー領域における修飾等の改変も可能となる。【００１６】
なお、本発明の一本鎖核酸分子の構造が、遺伝子の発現を抑制可能であることを見出したのは、本発明者が初めてである。本発明の一本鎖核酸分子の遺伝子の発現抑制効果は、ＲＮＡ干渉と同様の現象によるものと推測されるが、本発明における遺伝子発現抑制は、ＲＮＡ干渉に制限および限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図５】図５は、参考例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図６】図６は、参考例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、参考例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図８】図８は、参考例におけるＬＡＭＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図９】図９は、参考例におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図１０】図１０は、参考例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図１１】図１１は、参考例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１９】
１．ｓｓＰＮ分子
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、アミノ酸から誘導される原子団を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等があげられる。
【００２１】
本発明の一本鎖核酸分子は、以下、本発明の「ｓｓＰＮ分子」ともいう。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＰＮ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＮＰ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導用ｓｓＰＮ分子」または「ＲＮＡ干渉剤もしくはＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。また、本発明は、例えば、インターフェロン誘導等の副作用を抑制できる。
【００２２】
本発明のｓｓＰＮ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【００２３】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡ分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。
【００２４】
なお、本発明は、前記標的遺伝子に対する前記発現抑制配列の配列情報がポイントではなく、前記発現抑制配列による前記標的遺伝子の発現抑制活性を、例えば、細胞内で機能させるための核酸分子の構造に関する。したがって、本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２５】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００２６】
具体例として、標的遺伝子がＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号５に示す１９塩基長の配列が使用できる。標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号１５に示す２１塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＬＡＭＡ１遺伝子の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号１６に示す１９塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＬＭＮＡ遺伝子の場合、例えば、配列番号１７に示す１９塩基長の配列が使用できる。
５’−GUUGUCAUACUUCUCAUGG−３’  （配列番号５）
５’−AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU−３’  （配列番号１５）
５’−AUUGUAACGAGACAAACAC−３’  （配列番号１６）
５’−UUGCGCUUUUUGGUGACGC−３’  （配列番号１７）
【００２７】
本発明のｓｓＰＮ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２８】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、生体内におけるインターフェロン誘導等の副作用を抑制でき、ヌクレアーゼ耐性に優れる。
【００２９】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００３０】
前記リンカー領域において、前記「アミノ酸から誘導される原子団」は、特に限定されないが、例えば、下記式（ＩＡ）で表される原子団である。
【化ＩＡ】
2013103146.tif 000003
【００３１】
前記式（ＩＡ）中、例えば、
Ｘ１は、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、
原子団Ａは、任意であり、ただし、ペプチド結合を含まないものとする。
【００３２】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化Ｉ】
2013103146.tif 000004
【００３３】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、前記アミノ酸であり、かつ、下記式（Ｉａ）は、ペプチド以外のアミノ酸である。
【化Ｉａ】
2013103146.tif 000005
【００３４】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００３５】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００３６】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００３７】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００３８】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００３９】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、１または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
【００４０】
前記保護基（または、前記さらなる保護基）は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.  F.  W.  McOmie,  「Protecting  Groups  in  Organic  Chemistry」  Prenum  Press,  London  and  New  York,  1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、後述する化学式（Ｐ１）および（Ｐ２）のシリル含有基もあげられる。以下において同様である。
【００４１】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００４２】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｘｃ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００４３】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００４４】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記式（Ｉ）中の原子団Ａは、特に限定されず、任意であり、ただし、前述のとおり、下記式（Ｉａ）が、ペプチドでないアミノ酸である。
【化Ｉａ】
2013103146.tif 000006
【００４５】
前記式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。また、前記式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
【００４６】
本発明において、「アミノ酸」は、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。また、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
【００４７】
本発明の一本鎖核酸の前記リンカー領域において、前記アミノ酸は、例えば、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、またはアミノ安息香酸であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
【００４８】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および後述のリンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造およびピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を、いずれも含まない。前記ピロリジン骨格としては、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格も挙げられ、置換される炭素は、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子が挙げられる。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換される場合もある。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含む場合もある。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合する場合もあるし、前述のような置換基が結合する場合もある。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの原子を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合することも可能である。前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合する前記ピロリジン骨格の原子は、例えば、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、より具体的には、例えば、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格が挙げられ、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子である。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換される場合もある。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含む場合もある。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合する場合もあるし、後述するような置換基が結合する場合もある。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの原子を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合することも可能である。前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合する前記ピペリジン骨格の原子は、例えば、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、より具体的には、例えば、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【００４９】
前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造または前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造は、例えば、下記式（Ｉｂ）で表わされる構造が挙げられる。本発明のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および後述のリンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造およびピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を、いずれも含まない。
【化Ｉｂ】
2013103146.tif 000007
【００５０】
前記式（Ｉｂ）中、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１およびＲ２は、前記式（Ｉ）と同様である。
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。
ｌは、１または２であり；ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。
【００５１】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。
【化Ｉ−１】
2013103146.tif 000008
【化Ｉ−２】
2013103146.tif 000009
【化Ｉ−３】
2013103146.tif 000010
【化Ｉ−４】
2013103146.tif 000011
【００５２】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２があげられる。その構造を、下記式（Ｉ−１ａ）に示す。別の具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４があげられる。その構造を、下記式（Ｉ−１ｂ）に示す。さらに別の具体例として、前記式（Ｉ−４）において、ｎ＝５およびｍ＝４があげられる。その構造を、下記式（Ｉ−４ａ）に示す。
【化Ｉ−１ａ】
2013103146.tif 000012
【化Ｉ−１ｂ】
2013103146.tif 000013
【化Ｉ−４ａ】
2013103146.tif 000014
【００５３】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、本発明のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。本発明のｓｓＰＮ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【００５４】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）のみが折り返して前記領域（Ｘ）と二重鎖を形成してもよいし、さらに、他の領域において新たな二重鎖を形成してもよい。以下、前者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が１カ所である分子を「第１のｓｓＰＮ分子」といい、後者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が２カ所である分子を「第２のｓｓＰＮ分子」という。以下に、前記第１のｓｓＰＮ分子および前記第２のｓｓＰＮ分子について、例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００５５】
（１）第１のｓｓＰＮ分子
前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる分子である。
【００５６】
前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。
【００５７】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００５８】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００５９】
後者の場合、前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。前記第１のｓｓＰＮ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、前記第１のｓｓＰＮ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。
【００６０】
前記第１のｓｓＰＮ分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００６１】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００６２】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
【００６３】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００６４】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【００６５】
前記領域（Ｘ）および／または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００６６】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【００６７】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【００６８】
前記ｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド残基の他に、前記ヌクレオチド残基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。
【００６９】
前記第１のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００７０】
（２）第２のｓｓＰＮ分子
前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘｃ）の他に、さらに、領域（Ｙ）および前記領域（Ｙ）に相補的な領域（Ｙｃ）を有する分子である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成している。なお、特に示さない限り、前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記第１のｓｓＰＮ分子の記載を援用できる。
【００７１】
前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、５’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部５’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部３’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、３’側領域（Ｙｃ）ともいう。また、前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、３’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部３’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部５’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、５’側領域（Ｙｃ）ともいう。
【００７２】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記ｓｓＰＮ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００７３】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７４】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７５】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００７６】
前記第２のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。
【００７７】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結等があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態等があげられる。
【００７８】
前記第２のｓｓＰＮ分子が前記リンカー領域（Ｌｙ）を有する場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）で表わすことができ、前記リンカー領域（Ｌｘ）における前記式（Ｉ）の説明を全て援用できる。また、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、いずれも前記式（Ｉ）で表される場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）中のＡ、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、同一でも異なっていても良い。
【００７９】
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、前述のリンカー領域（Ｌｘ）と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
【００８０】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００８１】
前記第２のｓｓＰＮ分子について、前記リンカー領域（Ｌｙ）を有するｓｓＰＮ分子の一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図２は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
【００８２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００８３】
前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８４】
また、前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８５】
前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８６】
また、前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８７】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【００８８】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【００８９】
第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【００９０】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３
・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０      ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０      ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０      ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０      ・・・（１８）
【００９１】
前記（ａ）〜（ｄ）の第２のｓｓＰＮ分子について、それぞれの構造の一例を、図３の模式図に示す。図３は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＰＮ分子であり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子の例である。図３において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図３のｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図３は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
【００９２】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、および、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図３において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００９３】
他方、前記(ｄ)のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００９４】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００９５】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、例えば、この条件が好ましい。
【００９６】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００９７】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９８】
前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９９】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１塩基、２塩基、３塩基または４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１００】
前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【０１０１】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１０２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１０３】
前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
【０１０４】
前記第２のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１０５】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド構造を有していればよく、その他の構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１０６】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０７】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基と前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、下記（４）〜（７）の残基で構成される。
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０８】
前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前述のように、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０９】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＰＮ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＰＮ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１または２個である。
【０１１０】
本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、「ｓｓＲＮＡ分子」、または「Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１１１】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１１２】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓ等があげられる。
【０１１３】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように、例えば、前記非ヌクレオチド構造に前記標識物質を導入することが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記非ヌクレオチド残基に前記標識物質を導入することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基への標識物質の導入は、例えば、簡便かつ安価に行うことができる。
【０１１４】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現を抑制ができる。このため、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む前記ｓｓＰＮ分子であれば、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１１５】
本発明のｓｓＰＮ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＰＮ分子を投与すればよい。
【０１１６】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１１７】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定でき、前記遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【０１１８】
本発明のｓｓＰＮ分子の具体例を以下に示すが、本発明はこれには何ら制限されない。前記ｓｓＰＮ分子の塩基配列は、例えば、前記標的遺伝子がＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、配列番号４および１８の塩基配列が例示でき、前記塩基配列において、例えば、１もしくは数個の欠失、置換および／または付加された塩基配列でもよく、また、前記標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、例えば、配列番号１９〜２３の塩基配列が例示でき、前記塩基配列において、例えば、１もしくは数個の欠失、置換および／または付加された塩基配列でもよい。なお、下記配列番号４および１８の配列において、下線部GUUGUCAUACUUCUCAUGG（配列番号５）が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制に関する領域である。また、下記配列番号１９〜２３において、「＊」は、フリー塩基を表す。また、下記配列番号４および１８〜２３において、ＬｘおよびＬｙの構造は、特に限定されないが、例えば、後述の実施例に示す構造（Ｌｇ）でもよい。
【化ＳＥＱ４】
2013103146.tif 000015
（配列番号１８）
5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-Lx-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’
【化ＳＥＱ１９−２２】
2013103146.tif 000016
【化ＳＥＱ２３】
2013103146.tif 000017
【０１１９】
本発明のｓｓＰＮ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を援用できる。
【０１２０】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１２１】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【０１２２】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【０１２３】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
【０１２４】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【０１２５】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリ二ル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリ二ル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【０１２６】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【０１２７】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【０１２８】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【０１２９】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【０１３０】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【０１３１】
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１３２】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１３３】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１３４】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１３５】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
【０１３６】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
【０１３７】
２．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１３８】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１３９】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基の代替物の残基であってもよい。
【０１４０】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
【０１４１】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボース残基に置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１４２】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチド残基の代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１４３】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１４４】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１４５】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換されても良い。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１４６】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１４７】
本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１４８】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子の検出等に利用できる。
【０１４９】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１５０】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１５１】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１５２】
本発明のｓｓＰＮ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸化は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１５３】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１５４】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１５５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１５６】
３．本発明のｓｓＰＮ分子の合成方法
本発明のｓｓＰＮ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。これに限定されない。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子については、例えば、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
【０１５７】
４．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１５８】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１５９】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１６０】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１６１】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患等があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１６２】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＰＮ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１６３】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＰＮ分子を投与すればよい。
【０１６４】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１６５】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。前記投与がｉｎ  ｖｉｖｏの場合、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、注射、皮下投与、局所投与等があげられる。
【０１６６】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１６７】
本発明の組成物において、前記ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体により、例えば、前記ｓｓＰＮ分子を効率よくデリバリーできる。前記ｓｓＰＮ分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合等があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体等があげられる。
【０１６８】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１６９】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤等があげられる。
【０１７０】
前記担体は、例えば、高分子が好ましく、より好ましくは、生体高分子である。前記担体は、例えば、生分解性が好ましい。前記担体は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グロブリン等のタンパク質；例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸等の糖質；脂質等があげられる。前記担体は、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマーも使用できる。前記ポリアミノ酸は、例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ)等があげられる。
【０１７１】
前記結合物質は、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Ｎｅｐｒｏｘｉｎ)、ＲＧＤペプチド、ＲＤＧペプチド擬似体等があげられる。
【０１７２】
前記融合剤および縮合剤は、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミノ鎖等があげられる。ＰＥＩは、例えば、直鎖状および分岐状のいずれでもよく、また、合成物および天然物のいずれでもよい。前記ＰＥＩは、例えば、アルキル置換されてもよいし、脂質置換されてもよい。また、前記融合剤は、この他に、例えば、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、ポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール等）等が使用できる。前記融合剤は、例えば、αらせん構造を有してもよい。前記融合剤は、例えば、メリチン等の膜崩壊剤でもよい。
【０１７３】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体の形成等について、米国特許第６，５０９，３２３号、米国特許公報第２００３／０００８８１８号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号等を援用できる。
【０１７４】
前記添加剤は、この他に、例えば、両親媒性分子等があげられる。前記両親媒性分子は、例えば、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。前記分子は、例えば、ポリマーが好ましい。前記ポリマーは、例えば、二次構造を有するポリマーであり、反復性の二次構造を有するポリマーが好ましい。具体例としては、例えば、ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、αらせん状ポリペプチド等である。
【０１７５】
前記両親媒性ポリマーは、例えば、２つ以上の両親媒性サブユニットを有するポリマーでもよい。前記サブユニットは、例えば、少なくとも１つの親水性基および１つの疎水性基を有する環状構造を有するサブユニット等があげられる。前記サブユニットは、例えば、コール酸等のステロイド、芳香族構造等を有してもよい。前記ポリマーは、例えば、芳香族サブユニット等の環状構造サブユニットとアミノ酸の両方を有してもよい。
【０１７６】
５．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１７７】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉による発現抑制等があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１７８】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＰＮ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＰＮ分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１７９】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＰＮ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＰＮ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類の種類に応じて適宜選択できる。
【０１８０】
６．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＰＮ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＰＮ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＰＮ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法を援用できる。
【０１８１】
７．ｓｓＰＮ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＰＮ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＰＮ分子の使用である。
【０１８２】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＰＮ分子であり、前記ｓｓＰＮ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【０１８３】
８．モノマー
本発明のモノマーは、核酸合成用のモノマーであって、下記式（ＩＩ）の構造を有することを特徴とする。本発明のモノマーは、特に示さない限り、前記本発明のｓｓＰＮ分子の説明を援用できる。
【化ＩＩ】
2013103146.tif 000018
【０１８４】
本発明のモノマーを用いれば、例えば、前記本発明のｓｓＰＮ分子の合成において、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を容易に合成できる。本発明のモノマーは、例えば、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な核酸自動合成装置に適用可能である。前記合成方法は、例えば、ホスホロアミダイト法、および、Ｈ−ホスホネート法等があげられる。
【０１８５】
前記式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、ペプチドでないアミノ酸である。
【化Ｉａ】
2013103146.tif 000019
【０１８６】
前記式（ＩＩ）において、前記式（Ｉ）と同一箇所は、前記式（Ｉ）の説明を援用できる。具体的に、前記式（ＩＩ）において、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、ｍ、ｎおよび環Ａは、前記式（Ｉ）の説明を全て援用できる。
【０１８７】
前記式（ＩＩ）において、Ｒ１１およびＲ２１は、前述のように、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。
【０１８８】
前記保護基は、例えば、前記式（Ｉ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、群Ｉから選択できる。前記群Ｉは、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、および、下記式（Ｐ１）または（Ｐ２）に示すシリル含有基があげられ、中でも、ＤＭｔｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
【化Ｐ１−Ｐ２】
2013103146.tif 000020
【０１８９】
前記リン酸保護基は、例えば、下記式で表わすことができる。
−Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８）
前記式において、Ｒ６は、水素原子または任意の置換基である。置換基Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、および、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
【０１９０】
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ、水素原子または任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。置換基Ｒ７およびＲ８は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。前記炭化水素基は、例えば、前述した前記Ｒ６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、−ＮＲ７Ｒ８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等があげられる。または、置換基Ｒ７およびＲ８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、−ＮＲ７Ｒ８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。
【０１９１】
前記リン酸保護基の具体例としては、例えば、下記群ＩＩから選択できる。群ＩＩは、例えば、−P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、−P(OCH3)(N(i-Pr)2)等があげられる。前記式において、i-Prは、イソプロピルを示す。
【０１９２】
前記式（ＩＩ）において、例えば、Ｒ１およびＲ２は、いずれか一方が、Ｈまたは保護基であり、他方が、Ｈまたはリン酸保護基である。例えば、Ｒ１が、前記保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記リン酸保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１が、前記群Ｉから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記群ＩＩから選択されることが好ましい。また、例えば、Ｒ１が、前記リン酸保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１が、前記群ＩＩから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記群Ｉから選択されることが好ましい。
【０１９３】
前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、下記式（ＩＩ−１）〜式（ＩＩ−４）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（ＩＩ）と同じである。
【化ＩＩ−１】
2013103146.tif 000021
【化ＩＩ−２】
2013103146.tif 000022
【化ＩＩ−３】
2013103146.tif 000023
【化ＩＩ−４】
2013103146.tif 000024
前記式（ＩＩ−４）中、
Ｒ１０１は、Ｒ１１およびＲ２１と独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。Ｒ１０１における前記保護基および前記リン酸保護基は、特に限定されないが、例えば、Ｒ１１およびＲ２１と同様でもよく、または、Ｔｆａ（トリフルオロアセチル基）等のぺルフルオロアルカノイル基、もしくはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）等であってもよい。
【０１９４】
前記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２があげられる。その構造を、下記式（ＩＩ−１ａ）に示す。別の具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４があげられる。その構造を、下記式（ＩＩ−１ｂ）に示す。さらに別の具体例として、前記式（ＩＩ−４）において、ｎ＝５およびｍ＝４があげられる。その構造を、下記式（ＩＩ−４ａ）に示す。
【化ＩＩ−１ａ】
2013103146.tif 000025
【化ＩＩ−１ｂ】
2013103146.tif 000026
【化ＩＩ−４ａ】
2013103146.tif 000027
【０１９５】
本発明のモノマーの製造方法は特に限定されないが、例えば、下記スキーム１のように、前記アミノ酸（Ｉａ）のアミノ基が保護基Ｒ３１で保護された化合物（Ｉｂ）から、縮合反応により下記化合物（Ｉｃ）を製造し、さらに（Ｉｃ）から（ＩＩａ）を製造し、（ＩＩａ）を（ＩＩ）に変換しても良い。ただし、下記スキーム１は例示であって、本発明は、これに制限されない。なお、下記化学式（Ｉｂ）および（Ｉｃ）において、保護基Ｒ３１は、例えば、Ｆｍｏｃ（９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基）、Ｚ(ベンジルオキシカルボニル)またはＢＯＣ(t-ブトキシカルボニル)等が挙げられる。下記化学式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（ＩＩａ）において、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１１およびＲ２１は、前記式（ＩＩ）と同様である。なお、下記化合物（ＩＩａ）は、前記式（ＩＩ）において、Ｘ１がＯ、Ｘ２がＯの化合物である。下記式（ＩＩ）におけるカルボニル酸素は、適宜、前記式（ＩＩ）におけるＸ１およびＸ２に変換しても良いし、変換する必要がなければ、下記化合物（ＩＩａ）を、そのまま化合物（ＩＩ）として用いても良い。
【０１９６】
【化Ｓ１】
2013103146.tif 000028
【０１９７】
本発明のモノマーおよびその製造方法を、下記スキーム２にさらに具体的に例示する。ただし、下記スキーム２は例示であり、本発明は、これに限定されない。なお、下記スキーム２中、「Ｆｍｏｃ」は、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表し、「ｉＰｒ」は、イソプロピル基を表し、「Ｔｒ」は、トリチル基すなわちトリフェニルメチル基を表し、「ＯＤＭＴｒ」は、４，４’−ジメトキシトリチルオキシ基を表す。以下において同様である。
【０１９８】
【化Ｓ２】
2013103146.tif 000029
【０１９９】
本発明のモノマーは、例えば、前記標識物質を含むことが好ましく、中でも、前記安定同位体を含むことが好ましい。前記標識物質は、前述の通りである。
【０２００】
本発明のモノマーが、前記安定同位体等の同位体を含む場合、例えば、簡便に、前記本発明のｓｓＰＮ分子に前記同位体を導入できる。同位体を有する前記モノマーは、例えば、前記同位体を導入したアミノ酸（Ｉａ）の原料から、合成可能である。本発明において、同位体を導入したアミノ酸（Ｉａ）の入手方法は特に限定されず、例えば、適宜な方法で製造しても良いし、市販品を入手可能であればそれを用いても良い。
【０２０１】
安定同位体が導入されたアミノ酸として、例えば、重水素（Ｄ）が導入されたアミノ酸は、例えば、下記スキーム３に示すように、アミノ酸（Ｉａ）をＬｉＡｌＤ４で処理し、さらに、生じたOH基を酸化することで製造できる。
【化Ｓ３】
2013103146.tif 000030
【０２０２】
他の安定同位体が導入されたアミノ酸として、例えば、重酸素（１８Ｏ）が導入されたアミノ酸は、例えば、下記式に示すように、塩基性条件下で、アミノ酸（Ｉａ）のメチルエステルをＨ２１８Ｏと反応させることにより製造できる。
【化Ｓ４】
2013103146.tif 000031
【０２０３】
その他、重窒素（１５Ｎ）または重炭素（１３Ｃ）導入等が導入されたアミノ酸（Ｉａ）の製造方法も、特に限定されず、適宜な方法で製造することができる。
【０２０４】
このようにして、安定同位体が導入されたモノマーが合成可能であり、また、前記モノマーを合成用アミダイトとして使用することによって、安定同位体が前記リンカー領域に導入された核酸分子を合成可能である。
【０２０５】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０２０６】
（実施例Ａ１）
下記スキーム５に従い、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）を合成した。なお、化合物（６）は、前記本発明のモノマーの一例である。また、下記スキーム５中の「Ｇｌｙ」は、下記式で表される構造を表し、すなわち、グリシンから、アミノ基の水素１原子およびカルボキシ基のＯＨを除いた構造の原子団である。以下、「Ｇｌｙ」は、特に断らない限り、下記式の構造を表す。また、下記スキーム５において、ＧｌｙのＮＨ側は、Ｆｍｏｃまたはカルボニル炭素に結合し、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側は、ＯＨまたはＮ原子に結合している。
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−【０２０７】
【化Ｓ５】
2013103146.tif 000032
【０２０８】
（１）１２−トリフルオロアセトアミドドデカノール（化合物１）
１２−アミノドデカノール（４．８１ｇ，  ２３．９ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸エチル（６．７９ｇ，  ４７．８ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の１２−トリフルオロアセトアミドドデカノール（１）（６．９８ｇ，  ｑ．）を得た。【０２０９】
（２）１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（化合物２）
化合物１（３．００ｇ，  １０．０８ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．３２ｇ，  １２．１ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５０ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約３０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（２．０２ｇ，  ５０．４０ｍｍｏｌ）を加え室温で終夜撹拌した。その反応混合物を、減圧下に約３０ｍＬまで濃縮し、水（１００ｍＬ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、有機層を分取した。分取した有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）（５．１９ｇ，  ｑ．）を得た。以下に、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）の機器分析値を示す。【０２１０】
１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４５−７．４３（２Ｈ，ｍ），７．３４−７．２５（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．７９（４Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．７０−２．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６１−１．５４（６Ｈ，ｍ），１．３３−１．２４（１４Ｈ，ｍ）．【０２１１】
（３）Ｆｍｏｃ−グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物３）
Ｆｍｏｃ−グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、和光純薬工業株式会社から購入）（２．００ｇ，  ６．７３ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６６ｇ，  ８．０７ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．３１ｇ，  １６．１４ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物２（４．０７ｇ，  ８．０７ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に室温で加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ−グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルドデカンアミド（３）（５．８８ｇ，  ｑ．）を得た。【０２１２】
（４）グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物４）
化合物３（５．８８ｇ，  ６．７３ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）およびピペリジン（４．８ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）（３．４４ｇ，  ９１％）を得た。以下に、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）の機器分析値を示す。【０２１３】
グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４７−７．４４（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．３４（２Ｈ，ｓ），３．３０−３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．０６−３．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６４−１．５０（６Ｈ，ｍ），１．３８−１．２５（１４Ｈ，ｍ）．【０２１４】
（５）ヒドロキシドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物５）
化合物４（３．１５ｇ，  ５．６２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に１２−ヒドロキシドデカン酸（３．４１ｇ，  ６．７４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．２９ｇ，  ６．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．０６ｇ，  １３．４８ｍｍｏｌ）、および無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（２．０５ｇ，  ２０．２２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）（２．９７ｇ，  ７０％）を得た。以下に、ヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）の機器分析値を示す。【０２１５】
ヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４２−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２１（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８４（２Ｈ，ｓ），３．７９（６Ｈ，ｓ），３．６４−３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０８−３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２８−２．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６９−１．５２（１２Ｈ，ｍ），１．４４−１．３９（２６Ｈ，ｍ）．【０２１６】
（６）ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（化合物６）
化合物５（２．７８ｇ，  ３．７６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（７７２ｍｇ，  ４．５１ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（３ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３６ｇ，  ４．５１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン溶液（３ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）（２．７２ｇ，  ７７％，  ＨＰＬＣ９８．５％）を得た。以下に、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）の機器分析値を示す。【０２１７】
ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ＝７．４１−７．４９（ｍ，  ２Ｈ），  ７．２６−７．３０（ｍ，  ６Ｈ），  ７．１７−７．１９（ｍ，  １Ｈ），  ６．８０−６，８３（ｍ，  ４Ｈ），  ６．４６−６．６２（ｍ，  ２Ｈ），  ４．０７−４．２９（ｍ，  ２Ｈ），  ３．８９（ｄ，  Ｊ＝５．４Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７５−３．８７（ｍ，  ４Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．４７−３．７０（ｍ，  ４Ｈ），  ３．２０−３．２６（ｍ，  ２Ｈ），  ３．０２（ｔ，  Ｊ＝６．４Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ２．６３（ｔ，  ６．４Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＣＨ３），  １．５６−１．６３（ｍ，  ６Ｈ），  １．４７−１．５１（ｍ，  ２Ｈ），  １．２４−１．３３（ｍ，  ２６Ｈ），  １．１３−１．２０（ｍ，  １２Ｈ）：  
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ＝１４６．６２．【０２１８】
（実施例Ｂ１）ＲＮＡの固相合成
本発明のリンカーを有するＲＮＡ（本発明の一本鎖核酸分子）を合成した。ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）により、３’側から５’側に向かって合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）を用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従い、合成したＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製した。以下の実施例において、ＲＮＡの合成は、特に示さない限り、同様に行った。【０２１９】
具体的には、前記スキーム５の前記化合物（６）を本発明のモノマーとして用い、本実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）の構造が、それぞれ下記化学式Ｌｇで表される一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を合成した。
（Ｌｇ［ＬｘまたはＬｙの構造］）
−Ｏ（ＣＨ２）１１ＣＯ−Ｇｌｙ−ＮＨ（ＣＨ２）１２Ｏ−【０２２０】
まず、下記配列番号１に示す配列のＲＮＡを合成した。そして、前記ＲＮＡの５’末端に、前記化合物６を連結した。つぎに、前記配列番号１に示すＲＮＡの５’側に、前記化合物６を介して、下記配列番号２に示す配列のＲＮＡを連結した。さらに、前記配列番号２に示すＲＮＡの５’末端に、前記化合物６を連結した。さらに、前記配列番号２に示すＲＮＡの５’側に、前記化合物６を介して、下記配列番号３に示す配列のＲＮＡを連結し、実施例のｓｓＲＮＡを合成した。
5’-GAA-3’（配列番号１）
5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-3’（配列番号２）
5’-CAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’（配列番号３）【０２２１】
上記のようにして合成した実施例のｓｓＲＮＡを、以下、ＰＫ−００５４という。前記ＰＫ−００５４は、下記配列番号４に示すように、５’側から、前記配列番号３のＲＮＡ、前記配列番号２のＲＮＡ、および前記配列番号１のＲＮＡが前記順序で配列され、前記配列番号３のＲＮＡ（Ｘｃに該当する）と前記配列番号２のＲＮＡ（内部領域Ｚに該当する）とがリンカーＬｘ（前記構造Ｌｇ）を介して連結され、前記配列番号２のＲＮＡ（内部領域Ｚに該当する）と前記配列番号１のＲＮＡ（Ｙｃに該当する）とがリンカーＬｙ（前記構造Ｌｇ）を介して連結されている構造である。また、下記配列に示すように、前記配列番号２のＲＮＡ配列と、前記配列番号１および３のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＫ−００５４は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。なお、下記配列において、下線部GUUGUCAUACUUCUCAUGG（配列番号５）が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制に関与する領域である。
【化ＳＥＱ４】
2013103146.tif 000033
ＰＫ−００５４の発現抑制領域（配列番号５）
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’
【化ＰＫ−００５４】
2013103146.tif 000034
【０２２２】
一方、前記配列番号２のＲＮＡに代えて、下記配列番号６のＲＮＡを用い、前記配列番号３のＲＮＡに代えて、下記配列番号７のＲＮＡを用いること以外はＰＫ−００５４と同様にして、実施例の他のｓｓＲＮＡを合成した。これを、以下、ＰＫ−００５５という。
5’-GAA-3’（配列番号１）
5’-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-3’（配列番号６）
5’-CCAUCAACGAUAAGUGAAAGCC-3’（配列番号７）【０２２３】
前記ＰＫ−００５５は、下記配列番号８に示すように、５’側から、前記配列番号７のＲＮＡ、前記配列番号６のＲＮＡ、および前記配列番号１のＲＮＡが前記順序で配列され、前記配列番号７のＲＮＡ（Ｘｃに該当する）と前記配列番号６のＲＮＡ（内部領域Ｚに該当する）とがリンカーＬｘ（前記構造Ｌｇ）を介して連結され、前記配列番号６のＲＮＡ（内部領域Ｚに該当する）と前記配列番号１のＲＮＡ（Ｙｃに該当する）とがリンカーＬｙ（前記構造Ｌｇ）を介して連結されている構造である。また、下記配列に示すように、前記配列番号６のＲＮＡ配列と、前記配列番号１および７のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＫ−００５５は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。
【化ＳＥＱ８】
2013103146.tif 000035
【化ＰＫ−００５５】
2013103146.tif 000036
【０２２４】
（実施例Ａ２）
下記スキーム６に従い、ブタン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（１１）を合成した。なお、化合物（１１）は、前記本発明のモノマーの一例である。また、化合物（１１）は、化合物（６）（スキーム５、実施例Ａ１）において、  −ＣＯ−Ｇｌｙ−ＮＨ−  の両端に直接結合したメチレン鎖の炭素数を変えた化合物に相当する。【０２２５】
【化Ｓ６】
2013103146.tif 000037
【０２２６】
（１）Ｆｍｏｃ−グリシン−ブタンアミド（化合物７）
Ｆｍｏｃ−グリシン（４．００ｇ，  １３．４５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．３３ｇ，  １６．１５ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（４．９４ｇ，  ３２．２９ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００ｍＬ）に４−アミノブタノール（１．４４ｇ，  １６．１５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）に付し、Ｆｍｏｃ−グリシン−ブタンアミド（７）（４．３０ｇ，  ８７％）を得た。以下に、Ｆｍｏｃ−グリシン−ブタンアミド（７）の機器分析値を示す。【０２２７】
Ｆｍｏｃ−グリシン−ブタンアミド（７）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７８−７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６５−７．６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４２−７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３４−７．３０（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．１Ｈｚ），４．４２−４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．２５−４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．８３（２Ｈ，ｓ），３．６０−３．５５（２Ｈ，ｍ），３．３０−３．２５（２Ｈ，ｍ），１．６１−１．５５（４Ｈ，ｍ）．【０２２８】
（２）Ｆｍｏｃ−グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（化合物８）
化合物７（４．２０ｇ，  １１．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（５．８０ｇ，  １７．１０ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（８０ｍＬ）を加え、室温下で終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（２０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。未精製のＦｍｏｃ−グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（８）（１１．４０ｇ）を得た。【０２２９】
（３）グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（化合物９）
未精製の化合物８（１１．４０ｇ，  １６．９９ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）およびピペリジン（１１．７ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（９）（４．９０ｇ，  ９６％、  ２ｓｔｅｐｓ）を得た。以下に、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（９）の機器分析値を示す。【０２３０】
グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（９）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４４−７．４２（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．４９（２Ｈ，ｓ），３．３０−３．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．０９−３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），１．６１−１．５５（４Ｈ，ｍ）．【０２３１】
（４）ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（化合物１０）
化合物９（４．８０ｇ，  １０．７０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下で６−ヒドロキシヘキサン酸（１．７０ｇ，  １２．８４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．４６ｇ，  １２．８４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．９３ｇ，  ２５．６９ｍｍｏｌ）、および無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（３．９０ｇ，  ３８．５３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（１０）（４．８０ｇ，  ８０％）を得た。以下に、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（１０）の機器分析値を示す。【０２３２】
ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（１０）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４３−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８５（２Ｈ，ｓ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６３−３．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０７−３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２６−２．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６８−１．５２（８Ｈ，ｍ），１．４１−１．３６（２Ｈ，ｍ）．【０２３３】
（５）ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（化合物１１）
化合物１０（４．７０ｇ，  ８．３５ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．７２ｇ，  １０．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．０２ｇ，  １０．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン混合溶液（１：１）（４ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（３：２）＋０．１％トリエチルアミン）に残渣を付し、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（１１）（４．５０ｇ，  ７１％，  ＨＰＬＣ９８．２％）を得た。以下に、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（１１）の機器分析値を示す。【０２３４】
ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（１１）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４３−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８５−３．８１（４Ｈ，ｓ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６３−３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０５−２．９７（４Ｈ，ｍ），２．６４−２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．２５−２．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６８−１．５２（８Ｈ，ｍ），１．４０−１．３８（２Ｈ，ｍ），１．１３−１．２０（１２Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ＝１４６．５７．【０２３５】
（実施例Ａ３）
下記スキーム７に従い、リシン誘導体であるモノマー（１１）を合成した。なお、下記スキーム７中、「Ｔｆａ」は、トリフルオロアセチル基を表す。
【化Ｓ７】
2013103146.tif 000038
【０２３６】
（１）化合物（１３）の合成
６−ヒドロキシヘキサン酸（化合物１２）（６ｇ，  １５．１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１２４ｍＬ）に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２０ｇ，  １．３ｅｑ．）およびジメチルアミノピリジン（０．５ｇ，  ０．１ｅｑ．）を加え、室温にて２０時間撹拌した。反応終了後メタノール（１０ｍＬ）を加えて１０分間撹拌し、溶媒留去した。反応液を酢酸エチルで希釈し、ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ８−９）で３回洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。薄黄色油状物質である化合物（１３）３１ｇ（ピリジン含有）を得た。【０２３７】
（２）化合物（１５）の合成
化合物１４（２．７ｇ，  ７．９ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．９ｇ，  １．２ｅｑ．）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（２．６ｇ，  ２．４ｅｑ．）のアセトニトリル溶液（４５ｍＬ）に、４−アミノ−１−ブタノール（０．８６ｇ，  １．２ｅｑ．）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液（ｐＨ４）で３回、飽和重曹水で３回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）により精製し、白色固体である化合物（１５）２．８ｇ（収率８５％）を得た。以下に、化合物（１５）の機器分析値を示す。【０２３８】
化合物（１５）；
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）    δ：７．０７（ｂｒ，  １Ｈ），  ６．７２（ｔ，  Ｊ＝５．６Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０３（ｍ，  １Ｈ），  ３．６６（ｄ，  Ｊ＝４．９Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３７（ｄｄ，  Ｊ＝１２．９，  ６．３Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．２９（ｄｄ，  Ｊ＝１２．４，  ６．３Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．８３（ｓ，  ２Ｈ），  １．６６−１．６０（ｍ，  ６Ｈ），  １．４４（ｓ，  ９Ｈ），  １．４１−１．３７（ｍ，  ２Ｈ）【０２３９】
（３）化合物（１６）の合成
化合物１５（２．５ｇ，  ６．１ｍｍｏｌ）を塩酸／テトラヒドロフラン溶液（４Ｍ，  ４５ｍＬ）中で室温にて２時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をエタノールに溶かし、トルエンを加えて共沸した。溶媒留去後、白色固体である化合物（１６）１．９ｇを得た。以下に、化合物（１６）の機器分析値を示す。【０２４０】
化合物（１６）；
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）    δ：  ３．８５−３．８１（ｍ，  １Ｈ），  ３．５９−３．５６（ｍ，  ２Ｈ），  ３．３２−３．２０（ｍ，  ２Ｈ），  １．９４−１．８０（ｍ，  ２Ｈ），  １．６６−１．５８（ｍ，  ６Ｈ），  １．４６−１．４０（ｍ，  ２Ｈ）【０２４１】
（４）化合物（１７）の合成
化合物１３（ピリジン含有，  ２４ｇ，  ３５．５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（８．８ｇ，  １．２ｅｑ．）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（７．２ｇ，  １．５ｅｑ．）の溶液（１５０ｍＬ）にトリエチルアミン（４．５ｍＬ，  ０．９ｅｑ．）を加え、さらに化合物１６（１０ｇ，  ０．９ｅｑ．）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水で３回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝２０／１＋０．０５％ピリジン）により精製し、薄黄色固体の化合物（１７）１６ｇ（収率７０％）を得た。以下に、化合物（１７）の機器分析値を示す。【０２４２】
化合物（１７）；
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）    δ：  ７．４３−７．４０（ｍ，  ２Ｈ），  ７．３２−７．２６（ｍ，  ６Ｈ），  ７．２１−７．１７（ｍ，  １Ｈ），  ６．８１（ｄ，  Ｊ＝８．８Ｈｚ，  ４Ｈ），  ４．３９−４．３７（ｍ，  １Ｈ），  ３．７８（ｓ，  ６Ｈ），  ３．６４−３．６１（ｍ，  ２Ｈ），  ３．３３−３．２２（ｍ，  ４Ｈ），  ３．０３（ｔ，  Ｊ＝６．６Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１９（ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７９−１．５４（ｍ，  １２Ｈ），  １．４０−１．３４（ｍ，  ４Ｈ）【０２４３】
（５）化合物（１８）の合成
アセトニトリルにて共沸乾燥した化合物（１７）（１．２６ｇ，  １．７３ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（３．５ｍＬ）に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（３９４ｍｇ，  １．３ｅｑ．）、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７００ｍｇ，  １．３ｅｑ．）を加え、室温にて２．５時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（アミノシリカ、展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２／３）し、白色固体の化合物（１８）１．３ｇ（収率７８％）を得た。以下に、化合物（１８）の機器分析値を示す。【０２４４】
化合物（１８）； 
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）    δ：  ７．４３−７．４１（ｍ，  ２Ｈ），  ７．３２−７．１７（ｍ，  ７Ｈ），  ６．８１（ｄｔ，  Ｊ＝９．３，  ２．９Ｈｚ，  ４Ｈ），  ４．４２−４．３７（ｍ，  １Ｈ），  ３．７８（ｓ，  ６Ｈ），  ３．８８−３．５４（ｍ，  ６Ｈ），  ３．３２−３．２０（ｍ，  ４Ｈ），  ３．０３（ｔ，  Ｊ＝６．３Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１９（ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．８３−１．５３（ｍ，  １２Ｈ），  １．４２−１．３１（ｍ，  ４Ｈ），  １．２８−１．２４（ｍ，  ２Ｈ），  １．１８−１．１６（ｍ，  １２Ｈ）
３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  １４６．９【０２４５】
（実施例Ｂ３）ＲＮＡの固相合成
前記スキーム５の前記化合物（６）に代えて前記スキーム７の前記化合物（１８）を本発明のモノマーとして用いること、前記配列番号１のＲＮＡに代えてグアノシンを用いること、前記配列番号２のＲＮＡに代えて下記配列番号６３のＲＮＡを用いること、および、前記配列番号３のＲＮＡに代えて下記配列番号６４のＲＮＡを用いること以外は前記実施例Ｂ１と同様にして本実施例のＲＮＡの固相合成を行った。なお、このようにして合成した本実施例のＲＮＡは、リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）の構造が、それぞれ下記化学式Ｌｌで表される一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。なお、本実施例のＲＮＡにおけるリンカー領域（Ｌｘ）（下記化学式Ｌｌで表される）を、以下において、前記実施例Ｂ１におけるリンカー領域（Ｌｘ）（前記化学式Ｌｇで表される）と区別するために「Ｌｘ’」という。同様に、本実施例のＲＮＡにおけるリンカー領域（Ｌｙ）（下記化学式Ｌｌで表される）を、以下において、前記実施例Ｂ１におけるリンカー領域（Ｌｙ）（前記化学式Ｌｇで表される）と区別するために「Ｌｙ’」という。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’（配列番号６３）
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’（配列番号６４）
（Ｌｌ［Ｌｘ’またはＬｙ’の構造］）
−Ｏ（ＣＨ２）５ＣＯ−Ｌｙｓ−ＮＨ（ＣＨ２）４Ｏ−【０２４６】
なお、前記リンカーの構造Ｌ１中、「Ｌｙｓ」は、下記化学式で表される構造である。
【化Ｌｙｓ】
2013103146.tif 000039
よって、前記リンカーの構造Ｌ１は、下記化学式で表される。
【化Ｌｌ】
2013103146.tif 000040
【０２４７】
上記のようにして合成した実施例のｓｓＲＮＡを、以下、ＰＫ−０１００という。前記ＰＫ−０１００は、下記配列番号６５に示すように、５’側から、前記配列番号６４のＲＮＡ、前記配列番号６３のＲＮＡ、およびグアノシンが前記順序で配列され、前記配列番号６４のＲＮＡ（Ｘｃに該当する）と前記配列番号６３のＲＮＡ（内部領域Ｚに該当する）とがリンカーＬｘ’（前記構造Ｌｌ）を介して連結され、前記配列番号６３のＲＮＡ（内部領域Ｚに該当する）とグアノシン（Ｙｃに該当する）とがリンカーＬｙ’（前記構造Ｌｌ）を介して連結されている構造である。また、下記配列に示すように、前記配列番号６３のＲＮＡ配列と、グアノシンおよび前記配列番号６４のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＫ−０１００は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。
【化ＳＥＱ６５】
2013103146.tif 000041
【化ＰＫ−０１００】
2013103146.tif 000042
【０２４８】
（参考例Ａ１）
下記スキーム８に従い、プロリン骨格を含む一本鎖核酸の合成原料であるモノマーを製造した。【０２４９】
【化Ｓ８】
2013103146.tif 000043
【０２５０】
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１０４）
前記スキーム８の開始原料である化合物１０２（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）は、東京化成工業株式会社から購入した。この化合物１０２（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物１０４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物１０４の機器分析結果を示す。【０２５１】
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（１０４）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．【０２５２】
（２）Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１１８）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１０４）（２．００ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチル−ジメチルシリルクロリド（１．１１ｇ、３５ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１０．９０ｇ、７１ｍｍｏｌ）を混合した。前記混合物に対し、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（２０ｍＬ）を室温で加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、水で３回洗浄し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）に供し、無色シロップ状の化合物１１８（２．３５ｇ、収率９２％）を得た。以下に、前記化合物１１８の機器分析結果を示す。【０２５３】
Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（１１８）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．７８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３４（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．１０−４．４６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２），３．４７−３．５９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２）、３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ）、１．８５−１．９５（ｍ，２Ｈ）、１．４２−１．５５（ｍ，６Ｈ）、０．９６（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０２（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ５２３（Ｍ＋Ｈ＋）．【０２５４】
（３）ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１１９）
上記により得られた前記Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１１８）（１．１８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）に対し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）およびピペリジン（２．４ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合物にアセトニトリル（５０ｍＬ）を加え、不溶物をろ別した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）に供し、無色シロップ状の化合物１１９（０．６１ｇ、収率９０％）を得た。以下に、前記化合物１１９の機器分析結果を示す。【０２５５】
ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（１１９）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ３．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，５．２Ｈｚ，ＣＨ）、３．６１−３．６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．２２−３．２８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９８−３．０４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．８６−２．９１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８６−１．９３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．６６−１．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．５２−１．５７（ｍ，４Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０５（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ３０１（Ｍ＋Ｈ＋）．【０２５６】
（４）ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１２０）
上記により得られた前記ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１１９）（５５０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、６−ヒドロキシヘキサン酸（３００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４３４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６９５ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）を混合した。前記混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、トリエチルアミン（６８９ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、終夜撹拌した。前記混合液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、前記を硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）に供し、無色シロップ状の化合物１２０（６９６ｍｇ、収率９２％）を得た。以下に、前記化合物１２０の機器分析結果を示す。【０２５７】
ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（１２０）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．５４（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）、３．５８−３．６７（ｍ，５Ｈ）、３．５２−３．５６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．３２−３．３９（ｍ，１Ｈ），３．２０−３．２５（ｍ，２Ｈ）、２．４０−２．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２５（ｍ，２Ｈ）、１．９３−２．０３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５０−１．７３（ｍ，８Ｈ）、１．３７−１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、０．８７（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０４（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４１５（Ｍ＋＋１）．【０２５８】
（５）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物１２１）
上記により得られた前記ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１２０）（６４０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１ｍＬ）と混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（６５７ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した後、メタノール（１ｍＬ）を加え、３０分室温で撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣に、無水アセトニトリル（５ｍＬ）および１ｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液（１．４２ｍＬ、テトラブチルアンモニウムフルオリド１．４２ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物に酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、水で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１２１（６８０ｍｇ、収率７３％）を得た。以下に、前記化合物１２１の機器分析結果を示す。【０２５９】
ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（１２１）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４４（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２６−７．３３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２１（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｄ，６．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５２−１．６７（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０２６０】
（６）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイトタイプＢ（化合物１２２）
上記により得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物１２１）（６３７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０１ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３５０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝７：３）に供し、無色シロップ状の化合物１２２（６８０ｍｇ、純度９５％、収率７６％）を得た。以下に、前記化合物１２２の機器分析結果を示す。【０２６１】
ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（１２２）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．３２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，３Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４６−３．６８（ｍ，５Ｈ）、３．３４−３．４１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．１０−３．３１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３９−２．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．２９（ｔ，７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９０−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．４  Ｈｚ，６Ｈ，  ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ  （ＣＨ３ＣＮ）  δ１４６．９０；
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０３（Ｍ＋＋１）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０２６２】
（参考例Ｂ１）ＲＮＡの固相合成
前記スキーム５の前記化合物６（本発明のモノマー）に代えて前記化合物１２２を用い、リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）に相当する部分の構造を、前記Ｌｇに代えて下記Ｌｐとする以外は前記実施例Ｂ１のＰＫ―００５４と同様にして、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を合成した。
【化Ｌｐ】
2013103146.tif 000044
【０２６３】
上記のようにして合成したｓｓＲＮＡを、以下、ＰＫ−０００４という。前記ＰＫ−０００４は、下記配列番号９に示すように、５’側から、前記配列番号３のＲＮＡ、前記配列番号２のＲＮＡ、および前記配列番号１のＲＮＡが前記順序で配列され、各ＲＮＡが、前記構造Ｌｐを介して連結されている構造である。また、前記実施例Ｂ１でも説明したように、前記配列番号２のＲＮＡ配列と、前記配列番号１および３のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＫ−０００４は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。なお、前記ＰＫ−００５４と同じく、下線部GUUGUCAUACUUCUCAUGG（配列番号５）が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制に関与する領域である。
5’-GAA-3’（配列番号１）
5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-3’（配列番号２）
5’-CAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’（配列番号３）
Ｅｘ：ＰＫ−０００４（配列番号９）
5’-CAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-Lp-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-Lp-GAA-3’
ＰＫ−０００４の発現抑制領域（配列番号５）
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’
【化ＰＫ−０００４】
2013103146.tif 000045
【０２６４】
一方、前記配列番号２のＲＮＡに代えて、下記配列番号６のＲＮＡを用い、前記配列番号３のＲＮＡに代えて、下記配列番号７のＲＮＡを用いること以外はＰＫ−０００４と同様にして、参考例の他のｓｓＲＮＡを合成した。これを、以下、ＰＫ−０００３という。
5’-GAA-3’（配列番号１）
5’-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-3’（配列番号６）
5’-CCAUCAACGAUAAGUGAAAGCC-3’（配列番号７）【０２６５】
前記ＰＫ−０００３は、下記配列番号１０に示すように、５’側から、前記配列番号７のＲＮＡ、前記配列番号６のＲＮＡ、および前記配列番号１のＲＮＡが前記順序で配列され、各ＲＮＡが、前記構造Ｌｐを介して連結されている構造である。また、前記実施例Ｂ１のＰＫ−００５５と同様に、前記配列番号６のＲＮＡ配列と、前記配列番号１および７のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＫ−０００３は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。
ＰＫ−０００３（配列番号１０）
5’-CCAUCAACGAUAAGUGAAAGCC-Lp-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-Lp-GAA-3’
【化ＰＫ−０００３】
2013103146.tif 000046
【０２６６】
（参考例Ｂ２）
前記スキーム７の前記化合物１８（本発明のモノマー）に代えて前記化合物２２を用い、リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）に相当する部分の構造を、前記Ｌｌに代えて前記Ｌｐ（前記参考例Ｂ１）とする以外は前記実施例Ｂ３のＰＫ―０１００と同様にして、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を合成した。【０２６７】
上記のようにして合成したｓｓＲＮＡを、以下、ＰＫ−００７１という。前記ＰＫ−００６１は、下記配列番号６６に示すように、５’側から、前記配列番号６４のＲＮＡ、前記配列番号６３のＲＮＡ、およびグアノシンが前記順序で配列され、各ＲＮＡおよびグアノシンが、前記構造Ｌｐを介して連結されている構造である。また、前記実施例Ｂ３でも説明したように、前記配列番号６３のＲＮＡ配列と、グアノシンおよび前記配列番号６４のＲＮＡ配列は、相補的な配列を有している。このため、前記ＰＫ−００７１は、下記式に示すように、自己アニーリングしてステム構造をとっている。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’（配列番号６３）
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’（配列番号６４）
Ｅｘ：ＰＫ−００７１（配列番号６６）
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lｐ-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lｐ-G-3’
【化ＰＫ−００７１】
2013103146.tif 000047
【０２６８】
（実施例Ｃ１）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
本発明のＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２６９】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ１のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−００５４およびＰＫ−００５５）を使用した。また、参考例のＲＮＡとして、前記参考例Ｂ１のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４およびＰＫ−０００３）も使用した。前記各ＲＮＡを、所望の濃度（１０μｍｏｌ／Ｌ）となるように、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。【０２７０】
細胞は、ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用し、培地は、１０  ％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用し、培養条件は、３７℃、５％  ＣＯ２下とした。【０２７１】
まず、ＨＣＴ１１６細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、２×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ＲＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【表１】
2013103146.tif 000048
【０２７２】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。【０２７３】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＸ４００（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’（配列番号１１）
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’（配列番号１２）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’（配列番号１３）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’（配列番号１４）【０２７４】
なお、コントロール１として、前記（Ｂ）液１００μLのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。【０２７５】
補正後のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０２７６】
（２）結果
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。【０２７７】
図４に示すように、ＰＫ−０００４およびＰＫ−００５４は、ヒトＧＡＰＤＨを標的とした配列を組み込んでいるために、発現抑制効果を示した。これに対し、ＰＫ−０００３およびＰＫ−００５５は、配列が異なるために、ＰＫ−０００４およびＰＫ−００５４と比較して発現抑制効果が低かった。すなわち、これらのＲＮＡは、標的塩基配列に対する反応特異性に優れていた。【０２７８】
また、ＰＫ−００５４は、ｓｓＲＮＡ（一本鎖ＲＮＡ）であるために、ｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）と比較して、容易にかつ効率良く製造が可能であり、かつ、取り扱い易さにも優れていた。【０２７９】
さらに、実施例のｓｓＲＮＡであるＰＫ−００５４は、参考例のｓｓＲＮＡであるＰＫ−０００４とも同等の発現抑制効果を示した。また、合成の出発原料が、ＰＫ−０００４ではＬ−プロリンであるのに対し、ＰＫ−００５４ではグリシンであり、ＰＫ−００５４の方が原料がはるかに安価で入手しやすいため、製造の簡便さとコストにおいて圧倒的に有利である。【０２８０】
（実施例Ｃ２）ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果
本発明のＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２８１】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ３のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−１０００）を使用した。また、参考例のＲＮＡとして、前記参考例Ｂ２のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−００７１）も使用した。前記各ＲＮＡを、所望の濃度（１０μｍｏｌ／Ｌ）となるように、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。【０２８２】
細胞は、ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）を使用し、培地は、１０％  ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％  ＦＣＳを使用し、培養条件は、３７℃、５％  ＣＯ２下とした。【０２８３】
ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）の培養は、より具体的には、以下のようにして行った。
[1]  前記細胞を培地中で培養し、その培養液を９６穴プレートに５０μＬずつ１×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。
[2]  つぎに、ウェル中の前記細胞に対し、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従ってＲＮＡサンプルをトランスフェクションした。具体的には、ウェルあたり前記ＲＮＡサンプルと前記トランスフェクション試薬との複合体５０μＬを添加し、全量を１００μＬ、前記ＲＮＡサンプルの最終濃度を０．１、１、または１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。コントロール１として、前記ＲＮＡサンプルおよび前記トランスフェクション試薬を添加していない細胞（−）、コントロール２として、トランスフェクションにおいて前記ＲＮＡサンプルを未添加とし、前記トランスフェクション試薬のみを添加した細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
[3]  さらに、前記トランスフェクション後、２４時間培養した。【０２８４】
ルシフェラーゼ活性測定は、以下のようにして行った。このルシフェラーゼ活性測定は、すなわち、ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果の測定である。
[1]  まず、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（商品名）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、添付のプロトコールに従ってルシフェラーゼによる発光強度をマルチラベルリーダーＡＲＶＯ  Ｘ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。
[2]  前記[1]のルシフェラーゼ活性測定結果は、ＲＮＡサンプルおよびトランスフェクション試薬を添加していない細胞（−）（前記コントロール１、非添加細胞群）を１とした相対活性で表した。【０２８５】
（２）結果
これらの結果を、図１２に示す。図１２は、ルシフェラーゼ活性の相対値を示すグラフである。【０２８６】
図１２に示すように、実施例のｓｓＲＮＡであるＰＫ−０１００によれば、ルシフェラーゼの相対活性を約０．７〜約０．３まで低減させることができた。すなわち、ＰＫ−０１００は、ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子に対し、優れた発現抑制効果を示した。また、ＰＫ−０１００は、参考例のｓｓＲＮＡであるＰＫ−００７１に対しても同等以上の発現抑制効果を示した。【０２８７】
（参考例１）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２８８】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、図５に示すｓｓＲＮＡを使用した。図５において、右端の番号は、配列番号を示す。図５において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。前記Ｘｃと前記Ｚとの間が、リンカー領域（Ｌｘ）であり、前記Ｚと前記Ｙｃとの間が、リンカー領域（Ｌｙ）である。また、「Ｘｃ／Ｙｃ」は、前記領域（Ｘｃ）の塩基長（Ｘｃ）と、前記領域（Ｙｃ）の塩基長（Ｙｃ）との比を示す。図５において、「＊」は、フリー塩基を示す。【０２８９】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、内部領域（Ｚ）の塩基長を２６塩基、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基とした。また、ＮＫ−００３６およびＮＫ−００４０は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）との合計塩基数（Ｘｃ＋Ｙｃ）を２６塩基とし、それ以外は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）との合計塩基数（Ｘｃ＋Ｙｃ）を２５塩基とした。そして、この条件の下、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基長を変化させた。これによって、ＮＫ−００３６およびＮＫ−００４０は、フリー塩基を有さない分子とした。また、これら以外の各ｓｓＲＮＡは、前記内部領域（Ｚ）における、二重鎖を形成しないフリー塩基を全て１塩基とし、且つ、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の位置を３’側から５’側に変動させた。【０２９０】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｃ１と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０２９１】
（２）結果および考察
これらの結果を、図６に示す。図６は、終濃度１０ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図６に示すように、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。【０２９２】
特に、前記領域（Ｘｃ）の塩基長と前記領域（Ｙｃ）の塩基長の差が大きくなるに従って、相対的に遺伝子の発現量が低下し、発現抑制活性が増加したことが確認された。すなわち、前記内部領域（Ｚ）におけるフリー塩基の位置を、前記内部領域の中央よりも、５’側または３’側に配置するほど、前記発現抑制活性を向上できることがわかった。【０２９３】
（参考例２）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果を確認した。【０２９４】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、以下に示すｓｓＲＮＡを使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化ＳＥＱ４２−４５】
2013103146.tif 000049
【０２９５】
（１．２）遺伝子の発現抑制
凍結保存した前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。そして、前記ＲＮＡ溶液を使用した以外は、前記実施例Ｃ１と同様にして、Ｈｅｐａｌ−６細胞への前記ｓｓＲＮＡのトランスフェクション、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い。ＴＧＦ−β１遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０２９６】
（２）結果
これらの結果を、図７に示す。図７は、ＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図７に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、遺伝子発現抑制活性を示した。また、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目および３番目としたＮＫ−００５５およびＮＫ−００６２は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目および５番目としたＮＫ−００３３およびＮＫ−００６１よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果は、異なる遺伝子をターゲットとする前記参考例１と同様の挙動であった。【０２９７】
（参考例３）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現抑制を確認した。【０２９８】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、以下に示すｓｓＲＮＡを使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化ＳＥＱ４６−４７】
2013103146.tif 000050
【０２９９】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｃ１と同様にして、２９３細胞へのトランスフェクションを行い、前記細胞を４８時間培養した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、以下のＬＡＭＡ１遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ｃ１と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＬＡＭＡ１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＬＡＭＡ１遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＬＡＭＡ１遺伝子用プライマーセット
5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’（配列番号４８）
5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3’（配列番号４９）【０３００】
また、前記実施例Ｃ１と同様にして、コントロール１（−）およびコントロール２（ｍｏｃｋ）に関しても、発現量を測定した。そして、補正後のＬＡＭＡ１遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０３０１】
（２）結果
これらの結果を、図８に示す。図８は、２９３細胞におけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図８に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、遺伝子発現抑制活性を示した。また、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目としたＮＫ−００６４は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目としたＮＫ−００４３よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果は、異なる遺伝子をターゲットとする前記参考例１および参考例２と同様の挙動であった。【０３０２】
（参考例４）
フリー塩基の位置が異なるｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＭＮＡ遺伝子の発現抑制を確認した。【０３０３】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、以下に示すｓｓＲＮＡを使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化ＳＥＱ５０−５１】
2013103146.tif 000051
【０３０４】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ｃ１と同様にして、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションを行い、前記細胞を４８時間培養した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、３ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、以下のＬＭＮＡ遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ｃ１と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＬＭＮＡ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＬＭＮＡ遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＬＭＮＡ遺伝子用プライマーセット
5’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3’（配列番号５２）
5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3’（配列番号５３）【０３０５】
また、前記実施例Ｃ１と同様にして、コントロール１（−）およびコントロール２（ｍｏｃｋ）に関しても、発現量を測定した。そして、補正後のＬＭＮＡ遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０３０６】
（２）結果
これらの結果を、図９に示す。図９は、Ａ５４９細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図９に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、遺伝子発現抑制活性を示した。また、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から２番目としたＮＫ−００６６は、フリー塩基の位置を、前記内部領域（Ｚ）における３’末端から４番目としたＮＫ−００６３よりも、高い発現抑制活性を示した。この結果は、異なる遺伝子をターゲットとする前記参考例１〜参考例３と同様の挙動であった。【０３０７】
参考例１〜参考例４の結果から、例えば、フリー塩基の位置に関しては、標的遺伝子の種類ならびにそれに対する発現抑制配列にかかわらず、同様の挙動を示すことは明らかである。そして、前記実施例Ｃ１においては、これらの参考例と同様の挙動を示していることは、前述の通りである。【０３０８】
（参考例５）
前記内部５’側領域（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の各長さを変化させたｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０３０９】
（１）材料および方法
ＲＮＡとして、図１０に示すｓｓＲＮＡを使用した。図１０において、右端の番号は、配列番号を示す。図１０において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。また、「Ｘｃ＋Ｙｃ／Ｘ＋Ｙ」は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基長の合計と、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基長の合計との比を示す。図１０において、「＊」は、フリー塩基を示す。【０３１０】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基、前記領域（Ｙｃ）の塩基長を１塩基とし、前記内部領域（Ｚ）の３’側から２番目の塩基を、フリー塩基とした。そして、前記内部領域（Ｚ）の塩基長と前記領域（Ｘｃ）の塩基長を変動させた。【０３１１】
特に示さない限りは、前記実施例Ｃ１と同様にして、前記ＲＮＡについて、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した。前記トランスフェクションの条件は、前記ウェルあたりの組成を下記表２と同様とした。
【表２】
2013103146.tif 000052
【０３１２】
（２）結果および考察
これらの結果を、図１１に示す。図１１は、終濃度１ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１１に示すように、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。【０３１３】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０３１４】
本発明のｓｓＰＮ分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能であり、かつ、環状ではないため、その合成が容易であり、また、一本鎖であるため、二本鎖のアニール工程が無く、効率良く製造可能である。また、前記リンカー領域が前記非ヌクレオチド残基を含むため、例えば、従来のようなヌクレオチド残基の改変に限られず、例えば、前記リンカー領域における修飾等の改変も可能となる。このように、本発明のｓｓＰＮ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月5日(2014.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＰＮ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＰＮ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ｂ３のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０１００）を使用した。また、参考例のＲＮＡとして、前記参考例Ｂ２のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−００７１）も使用した。前記各ＲＮＡを、所望の濃度（１０μｍｏｌ／Ｌ）となるように、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
細胞は、ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）を使用し、培地は、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％  ＦＣＳを使用し、培養条件は、３７℃、５％  ＣＯ２下とした。
【国際調査報告】
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