(57)【要約】  温度環境による活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いるグルコースの測定法を提供する。  下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す；（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す；
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％である。
【請求項２】
酵素のポリペプチド部分の分子量が６０〜７０ｋＤａである請求項１記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
至適温度が４０〜４５℃である請求項１又は２記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
下記の性質（６）及び（７）を有する請求項１〜３のいずれか１項記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（６）至適ｐＨ：６．０〜７．５；
（７）安定ｐＨ範囲：４．５〜７．０。
【請求項５】
４０℃、１５分間の熱処理後の残存活性が７０％以上である請求項１〜４のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
糸状菌由来である請求項１〜５のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
キンカクキン科に属する糸状菌由来である請求項１〜６のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号２若しくは１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、配列番号４、６、１２若しくは１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、又は配列番号８若しくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項９】
（ｄ）配列番号１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）〜（ｖ）の性質を有する精製されたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである：
（ｉ）グルコースの１位を酸化する、
（ｉｉ）実質的に酸素を電子受容体としない、
（ｉｉｉ）安定ｐＨ：４．５〜７．０、
（ｉｖ）糖タンパク質である、及び
（ｖ）酵素のポリペプチド部分の分子量が６０〜７０ｋＤａ。
【請求項１０】
糸状菌又は酵母に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項１１】
被検試料と請求項１〜９のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼを接触させる工程を含む該被検試料中のグルコースの測定方法。
【請求項１２】
測定時のｐＨが５．０〜９．０であって、溶存酸素の影響を受けない請求項１１に記載のグルコースの測定方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定試薬。
【請求項１４】
ｐＨが４．０〜７．５である請求項１４に記載のグルコース測定試薬。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定用バイオセンサ。
【請求項１６】
反応層のｐＨが４．０〜７．５であって、溶存酸素の影響を受けない請求項１６に記載のグルコース測定用バイオセンサ。
【請求項１７】
請求項８記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
（ｅ）（ｄ）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｆ）配列番号１若しくは９に示される塩基配列と少なくとも９０％、配列番号３、５、１１若しくは１３に示される塩基配列と少なくとも９５％、又は配列番号７若しくは１５に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号９、１１、１３又は１５に示される塩基配列と少なくとも６０％の同一性を有する塩基配列からなり、開始コドンのＡから５７番目までの塩基を削除した改変遺伝子で、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１】
請求項１８若しくは１９に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２０に記載のベクターを用いて作成された形質転換細胞。
【請求項２２】
糸状菌から調製された染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから、配列番号１７及び１８に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの一部を取得する工程を含む、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースの測定に有用なフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びこれを用いるグルコースの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコース濃度の迅速かつ正確な測定は、糖尿病を診断するうえで重要である。グルコースの測定法としては、化学法と酵素法があるが、酵素法が特異性、安全性の点で優れている。当該酵素法の中でも、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点から、電気化学的バイオセンサが有利である。【０００３】
そのようなバイオセンサに使用可能な酵素として、グルコースオキシダーゼが知られている。しかし、グルコースオキシダーゼは、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があるため、いくつかのグルコースデヒドロゲナーゼが開発されてきた。グルコースデヒドロゲナーゼのうち、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼは、補酵素の添加を必要としないこと及び溶存酸素の影響を受けないことから、グルコースバイオセンサ用の酵素として注目されている（特許文献１〜７）。これらのフラビン結合型デヒドロゲナーゼの中には、基質特異性に優れるもの（特許文献５）、５０℃における活性値を１００％とする場合に、１０℃における活性値が１５％以上、２０℃における活性値が３０％以上、６０℃における活性値が７０％以上であるもの（特許文献６）、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの組換え大腸菌の細胞破砕液で、３７℃における活性値を１００％とする場合に２５℃における相対的な活性値が改善された改変型酵素（特許文献７）等がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】国際公開２００７／１３９０１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００８／００１９０３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット
【特許文献５】国際公開２０１０／１４０４３１号パンフレット
【特許文献６】特開２０１０−０５７４２７号公報
【特許文献７】国際公開２０１１／０３４１０８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら従来のグルコースデヒドロゲナーゼの活性は、高温側で反応性が顕著に低下するものや高温側では反応性が強いが低温側で反応性が低下するものなど、温度帯によって活性の変動が大きく、広い温度帯でより活性の変動が小さい酵素が求められていた。
従って、本発明の課題は、１０〜５０℃の広い温度帯において活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いるグルコースの測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明は、種々の微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼを探索したところ、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼの中に、グルコースに対する基質特異性が高く、かつ３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値が２０〜１５０％と、活性を測定する際の温度環境による活性の変動が極めて小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが存在し、これを用いれば様々な温度環境下で正確かつ再現性良く、グルコース濃度が測定できることを見出した。また、これらのフラビン型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングにも成功し、当該酵素を効率的に生産できることも見出した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す；
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％である。
［２］酵素のポリペプチド部分の分子量が６０〜７０ｋＤａである［１］記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［３］至適温度が４０〜４５℃である［１］又は［２］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［４］下記の性質（６）及び（７）を有する［１］〜［３］のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（６）至適ｐＨ：６．０〜７．５；
（７）安定ｐＨ範囲：４．５〜７．０。
［５］４０℃、１５分間の熱処理後の残存活性が７０％以上である［１］〜［４］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［６］糸状菌由来である［１］〜［５］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［７］キンカクキン科に属する糸状菌由来である［１］〜［６］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［８］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号２若しくは１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、配列番号４、６、１２若しくは１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、又は配列番号８若しくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列。
［９］配列番号１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）〜（ｖ）の性質を有する精製されたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（ｉ）グルコースの１位を酸化する、
（ｉｉ）実質的に酸素を電子受容体としない、
（ｉｉｉ）安定ｐＨ：４．５〜７．０、
（ｉｖ）糖タンパク質である、及び
（ｖ）酵素のポリペプチド部分の分子量が６０〜７０ｋＤａである。
［１０］糸状菌又は酵母に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする［１］〜［９］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造法。
［１１］被検試料と［１］〜［９］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを接触させる工程を含む該被検試料中のグルコースの測定方法。
［１２］測定時のｐＨが５．０〜９．０であって、溶存酸素の影響を受けない［１１］に記載のグルコースの測定方法。
［１３］［１］〜［９］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定試薬。
［１４］ｐＨが４．０〜７．５である［１３］に記載のグルコース測定試薬。
［１５］［１］〜［９］のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定用バイオセンサ。
［１６］反応層のｐＨが４．０〜７．５であって、溶存酸素の影響を受けない［１５］に記載のグルコース測定用バイオセンサ。
［１７］［８］又は［９］記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
［１８］以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
（ｅ）（ｄ）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１若しくは９に示される塩基配列と少なくとも９０％、配列番号３、５、１１若しくは１３に示される塩基配列と少なくとも９５％、又は配列番号７若しくは１５に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
［１９］配列番号９、１１、１３又は１５に示される塩基配列と少なくとも６０％の同一性を有する塩基配列からなり、開始コドンのＡから５７番目までの塩基を削除した改変遺伝子で、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
［２０］［１８］又は［１９］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［２１］［１８］若しくは［１９］に記載のポリヌクレオチド又は［２０］に記載のベクターを用いて作成された形質転換細胞。
［２２］糸状菌から調製された染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから、配列番号１７及び１８に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの一部を取得する工程を含む、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いれば、測定環境が１０〜５０℃の間で変化しても、正確かつ再現性良く、血中グルコースを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｄ）の熱安定性を示す図である。
【図３】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）の安定なｐＨの範囲を示す図である。
【図４】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｄ）の至適温度の範囲を示す図である。
【図６】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｅ）の至適ｐＨの範囲を示す図である。
【図７】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）によるグルコース量測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、フラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼであり、補酵素としてのフラビンが結合した状態で活性を示す酵素である。例えば、ＥＣ１．１．９９．１０又はＥＣ１．１．９９．１３に分類される酵素であり、好ましくはＥＣ１．１．９９．１０に分類される酵素である。ここでフラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられる。
【００１１】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、下記の性質（１）〜（３）を有するものであり、特に下記（３）の性質を有する点に特徴がある。
【００１２】
（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値が２０〜１５０％。
【００１３】
まず、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（１）電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す。すなわち、電子受容体の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。ＦＡＤ結合型のグルコースデヒドロゲナーゼがグルコースに作用すると、補酵素ＦＡＤはＦＡＤＨ２となるが、電子受容体としてフェリシアン化物（例えば、「Ｆｅ（ＣＮ）６」３−）を存在させると、ＦＡＤＨ２はこれをフェロシアン化物（この場合、「Ｆｅ（ＣＮ）６」４−）へと変換し、自らはＦＡＤへと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質を電子受容体とすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
【００１４】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性は、Ｄ−グルコースに対する特異性が高いため、グルコースの測定に適している。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（２）Ｄ−グルコースに対する反応性に対してマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する反応性が低く、１０％以下である。より詳細には、Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値は１０％以下であり、好ましくは８％以下、より好ましくは５％以下である。更に好ましくはＤ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のＤ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値は１％以下であって、特に好ましくは０．５％以下である。
【００１５】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（３）３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％である。当該１０〜５０℃における活性値の下限は３０％であるのが好ましく、４０％であるのがより好ましく、５０％であるのが更に好ましい。更に、当該１０〜５０℃における活性値の上限値は１４０％であるのが好ましく、１３０％以上であるのがより好ましく、１２０％であるのが更に好ましく、１１０％であるのが特に好ましい。
また、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値は２０〜１５０％であるのが好ましく、当該１０〜４５℃における活性値の下限値は３０％であるのがより好ましく、４０％であるのが更に好ましく、５０％であるのが特に好ましい。更に、当該１０〜４５℃における活性値の上限値は１４０％であるのがより好ましく、１３０％であるのが更に好ましく、１２０％であるのが特に好ましく、１１０％であるのが最も好ましい。
また、４５℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値は２０〜１２０％であるのが好ましく、当該１０〜４５℃における活性値の下限値は３０％であるのがより好ましく、４０％であるのが更に好ましく、５０％であるのが特に好ましい。更に、当該１０〜４５℃における活性値の上限は１１５％であるのがより好ましく、１１０％であるのが更に好ましく、１０５％であるのが特に好ましく、１００％であるのが最も好ましい。
また、５０℃における活性値を１００％とした場合に、１０℃における活性値は２５％以上であるのが好ましく、３０％以上であるのがより好ましく、４０％以上であるのが更に好ましく、５０％以上であるのが特に好ましい。更に、２０℃における活性値は４０％以上であるのが好ましく、５０％以上であるのがより好ましく、６０％以上であるのが更に好ましく、７０％以上であるのが特に好ましい。
【００１６】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（４）酵素のポリペプチド部分の分子量が６０〜７０ｋＤａであるのが好ましく、更に６０〜６５ｋＤａであるのがより好ましい。酵素のポリペプチド部分の分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により変動し易く、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。
【００１７】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（５）至適温度は、４０〜４５℃であるのが好ましい。より詳細には、該酵素を、各種温度で、後述の酵素活性測定法により測定し、該酵素が最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、４０〜４５℃で相対活性値が８０％以上であるのが好ましい。
【００１８】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（６）至適ｐＨは、６．０〜７．５であるのが好ましい。より詳細には、該酵素を、各種ｐＨの緩衝液を用いて、２５℃で後述の酵素活性測定法により測定し、該酵素が最大活性を示す緩衝液のｐＨにおける活性値を１００％とした場合に、ｐＨ６．０〜７．５で相対活性値が８０％以上、又はｐＨ５．０〜９．０で相対活性値が４０％以上であるのが好ましい。
【００１９】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（７）安定ｐＨ範囲は、４．５〜７．０であるのが好ましい。より詳細には、該酵素を１００ｍＭ各種ｐＨの緩衝液で２５℃、１６時間処理した後に、後述の酵素活性測定法により測定し、最も安定だったｐＨの緩衝液で処理した酵素の活性を１００％とした場合に、７０％以上の活性が残存する緩衝液のｐＨが４．５〜７．０、又は４０％以上の活性が残存する緩衝液のｐＨが４．０〜７．５であるのが好ましい。
【００２０】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（８）４０℃、１５分間熱処理した後の残存活性が７０％以上であるのが好ましい。より詳細には、該酵素を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で、４℃、１５分間処理した後に、後述の酵素活性測定法により測定した活性を１００％とした場合に、各温度で１５分間処理した後に、後述の酵素活性測定法により測定した残存活性が、４０℃で７０％以上、又は３５℃で９０％以上であるのが好ましい。
【００２１】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの具体例としては、後記実施例に示すように（Ａ）〜（Ｄ）の４種挙げられる。以下、各グルコースデヒドロゲナーゼについて説明する。
【００２２】
グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）は、下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであり、下記の性質（４）〜（８）のいずれかを有するものが特に好ましい。
（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％であって、好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１４０％、より好ましくは４０〜１３０％、更に好ましくは５０〜１２０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１４０％、より好ましくは４０〜１３０％、更に好ましくは５０〜１２０％である。
４５℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値の好適範囲は２０〜１２０％であって、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１２０％、より好ましくは４０〜１２０％、更に好ましくは５０〜１２０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１２０％、より好ましくは３０〜１１０％、更に好ましくは４０〜１１０％である。
５０℃における活性値を１００％とした場合の好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、より好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは８０％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは４５％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは５５％以上、特に好ましくは６０％以上である。
（４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである。
（５）至適温度が３０〜４５℃である。
下記の性質（６）及び（７）：
（６）至適ｐＨが６．０〜８．０である。
（７）安定ｐＨ範囲が４．５〜７．０である。
（８）４０℃、１５分間の熱処理後の残存活性が７０％以上である。
【００２３】
当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）のＤ−グルコースに対するＫｍ値は、約１００〜２００ｍＭである。また、当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）はＤｕｍｏｎｔｉｎｉａ属由来であるのが好ましく、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ由来であるのが特に好ましい。
【００２４】
グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｂ）は、下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであり、下記の性質（４）〜（８）のいずれかを有するものが特に好ましい。
（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％であって、好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１４０％、より好ましくは４０〜１３０％、更に好ましくは４０〜１２０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは２０〜１４０％、より好ましくは３０〜１４０％、更に好ましくは３０〜１３０％である。
４５℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値の好適範囲は２０〜１２０％であって、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１２０％、より好ましくは３０〜１１０％、更に好ましくは４０〜１１０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは２５〜１２０％、より好ましくは２５〜１１０％、更に好ましくは３０〜１１０％である。
５０℃における活性値を１００％とした場合の好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、より好ましくは３５％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは４５％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは６５％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上、更に好ましくは５０％以上である。
（４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである。
（５）至適温度が３５〜５０℃である。
下記の性質（６）及び（７）：
（６）至適ｐＨが６．０〜７．５である。
（７）安定ｐＨ範囲が４．５〜７．０である。
（８）４０℃、１５分間の熱処理後の残存活性が７０％以上である。
【００２５】
当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｂ）のＤ−グルコースに対するＫｍ値は、約１０〜４０ｍＭである。また、当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｂ）は、Ｏｖｕｌｉｎｉａ属由来であるのが好ましく、Ｏｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ由来であるのが更に好ましい。
【００２６】
グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃ）は、下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであり、下記の性質（４）〜（８）のいずれかを有するものが特に好ましい。
（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％であって、好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは２０〜１４０％、より好ましくは３０〜１４０％、更に好ましくは３０〜１３０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは２５〜１５０％、より好ましくは３０〜１５０％、更に好ましくは３５〜１５０％；１０〜４５℃における活性値の好適範囲は、基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは３５〜１４５％である。
４５℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値の好適範囲は２０〜１２０％であって、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは２５〜１２０％、より好ましくは２５〜１１０％、更に好ましくは３０〜１１０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは２０〜１１５％、より好ましくは２０〜１１０％、更に好ましくは２５〜１１０％である。
５０℃における活性値を１００％とした場合の好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上、更に好ましくは５０％以上、特に好ましくは５５％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上である。
（４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである。
（５）至適温度が４０〜５０℃である。
下記の性質（６）及び（７）：
（６）至適ｐＨが５．５〜７．５である。
（７）安定ｐＨ範囲が５．０〜８．０である。
（８）４０℃、１５分間の熱処理後の残存活性が７０％以上である。
【００２７】
当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃ）のＤ−グルコースに対するＫｍ値は、約１０〜３０ｍＭである。また、当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃ）は、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属由来であるのが好ましく、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ由来であるのが更に好ましい。
【００２８】
グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｄ）は、下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであり、下記の性質（４）〜（８）のいずれかを有するものが特に好ましい。
（１）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％であって、好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは２０〜１４０％、より好ましくは３０〜１３０％、更に好ましくは３０〜１２０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは２０〜１４０％、より好ましくは３０〜１３０％、更に好ましくは４０〜１２０％；１０〜４５℃における活性値の好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは４０〜１２０％である。
４５℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値の好適範囲は２０〜１２０％であって、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１２０％、より好ましくは４０〜１２０％、更に好ましくは４５〜１２０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１２０％、より好ましくは３５〜１２０％、更に好ましくは４０〜１２０％である。
５０℃における活性値を１００％とした場合の好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、１０℃における活性値が好ましくは２５％以上、２０℃における活性値が好ましくは４０％以上である。
（４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである。
（５）至適温度が３０〜４５℃である。
下記の性質（６）及び（７）：
（６）至適ｐＨが５．５〜７．５である。
（７）安定ｐＨ範囲が４．５〜７．０である。
（８）４０℃、１５分間の熱処理後の残存活性が７０％以上である。
【００２９】
当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｄ）のＤ−グルコースに対するＫｍ値は、約２０〜５０ｍＭである。また当該グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｄ）は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属由来であるのが好ましく、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｆａｂａｅ由来であるのが更に好ましい。
【００３０】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの由来は特に制限されないが、糸状菌であるのが好ましく、より好ましくはビョウタケ目（Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ）に属する糸状菌であり、更に好ましくはキンカクキン科（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ）に属する糸状菌であり、特に好ましくはデュモンティニア属（Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ）、オブリニア属（Ｏｖｕｌｉｎｉａ）、スクレロティニア属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、ボトリティス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）又はシボリニア属（Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ）に属する糸状菌であり、最も好ましくはデュモンティニア・テュベロセ（Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ）、オブリニア・アザレア（Ｏｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ）、スクレロティニア・スクレロティオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ボトリティス・ファバエ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｆａｂａｅ）、ボトリティス・テュリパエ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ）又はシボリニア・カメリア（Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ）である。
【００３１】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、例えば、糸状菌又は酵母に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物から採取することにより製造することができる。
【００３２】
本発明で使用される微生物の培養には、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
【００３３】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌などの方法による好気的条件下で行うのがよく、２０℃から５０℃、かつｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましい。培養期間は２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中、特に培養液中にグルコースデヒドロゲナーゼを生成蓄積することができる。又は該培養方法により、培養微生物内にもグルコースデヒドロゲナーゼを生成蓄積することができる。ついで、培養物中からグルコースデヒドロゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。この方法は、例えば、微生物を培養後、遠心分離などにより微生物を除き培養上清を得る方法、又は微生物を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離などによって上清液を得る方法である。これらの上清液中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００３４】
更に、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを得るための培養は、固体培地も使用できる。培養方法には特に制限はなく、静置培養によってもよく、培養物を常時混合するような回転培養や流動層培養などによっても行うことができるが、設備投資の少ない培養装置としては静置培養が好ましい。ついで、培養物中からグルコースデヒドロゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。すなわち、培養物に水などの抽出剤を加えて攪拌したのち、ふすまなどの培地固形分を遠心分離、ろ過などの分離法により除去して抽出液を得ることにより行うことができる。一方、菌体内に蓄積されたグルコースデヒドロゲナーゼの回収は、上記の抽出液を得た培養物残渣を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離されたグルコースデヒドロゲナーゼを抽出する方法などで行うことができる。又は、全グルコースデヒドロゲナーゼを得るには、培養物全体を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離されたグルコースデヒドロゲナーゼと培地中に分泌されたグルコースデヒドロゲナーゼの両方を一挙に抽出する方法などで行うことができる。これらの上清液中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００３５】
本発明者は、更に前記グルコースデヒドロゲナーゼのうち、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ属（ｉ）、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属（ｉｉ）、Ｏｖｕｌｉｎｉａ属（ｉｉｉ）及びＣｉｂｏｒｉｎｉａ属（ｉｖ）に属する糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングに成功した。より詳細には、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ、Ｏｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ及びＣｉｂｏｒｉｎｉａ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ由来のグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子のクローニングに成功した。
Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号１であり、その遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号２である。また、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ由来のグルコースデヒドロゲナーゼのシグナル配列を除いたアミノ酸配列は配列番号１０であり、それに対応する塩基配列は配列番号９である。
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号３であり、その遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号４である。また、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼのシグナル配列を除いたアミノ酸配列は配列番号１２であり、それに対応する塩基配列は配列番号１１である。
Ｏｖｕｌｉｎｉａ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号５であり、その遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号６である。また、Ｏｖｕｌｉｎｉａ由来のグルコースデヒドロゲナーゼのシグナル配列を除いたアミノ酸配列は配列番号１４であり、それに対応する塩基配列は配列番号１３である。
Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号７であり、その遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号８である。また、Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ由来のグルコースデヒドロゲナーゼのシグナル配列を除いたアミノ酸配列は配列番号１６であり、それに対応する塩基配列は配列番号１５である。
【００３６】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであり、好ましくは糖タンパク質から成るフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号２若しくは１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、配列番号４、６、１２若しくは１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、又は配列番号８若しくは１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
数個とは、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下、更に好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下である。
【００３７】
更に本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、配列番号１０、１２、１４又は１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）〜（ｖ）の性質を有する精製されたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである：
（ｉ）グルコースの１位を酸化する、
（ｉｉ）実質的に酸素を電子受容体としない、
（ｉｉｉ）安定ｐＨ：４．５〜７．０、
（ｉｖ）糖タンパク質である、及び
（ｖ）酵素のポリペプチド部分の分子量が６０〜７０ｋＤａ。
実質的に酸素を電子受容体としないとは、後述のグルコース酸化酵素活性測定方法により活性がみられない程度であり、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールを電子受容体とした場合の反応性を１００％とした場合に、酸素を電子受容体とした場合の反応性が好ましくは１％以下、より好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．１％以下、特に好ましくは０．０５％以下である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドであり、イントロンを含む塩基配列から成るポリヌクレオチドでも良く、宿主に応じたコドンユーセージに変更した塩基配列から成るポリヌクレオチドでもよい。更に、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドである。
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド。
（ｅ）（ｄ）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号１若しくは９に示される塩基配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、配列番号３、５、１１若しくは１３に示される塩基配列と少なくとも９５％、又は配列番号７若しくは１５に示される塩基配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の同一性を有する塩基配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【００３９】
更に本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９、１１、１３又は１５に示される塩基配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列からなり、開始コドンのＡから５７番目までの塩基を削除した改変遺伝子で、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドである。該改変遺伝子を使用することで大腸菌などグラム陰性菌での組換製造が可能になる他、分泌効率の良いシグナル配列を付加することも可能である。
【００４０】
アミノ酸配列及び塩基配列の同一性パーセンテージは、基準配列（本発明では配列番号１〜１６）を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、ＧｅｎｅＤｏｃ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）のＭａｘｉｍｕｍ  Ｍａｔｃｈｉｎｇなどを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
【００４１】
本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、０．１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。
【００４２】
染色体ＤＮＡであるポリヌクレオチドやＲＮＡは、例えば、糸状菌、好ましくはビョウタケ目に属する菌、より好ましくはキンカクキン科に属する菌から常法により調製することができる。プローブやプライマーは、ＷＯ２００６／１０１２３９に記載のアスペルギルス・テレウス由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の遺伝子配列、特許文献３に記載のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の遺伝子配列の他、公知のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の遺伝子配列に基づいて作成することができる。又は、これらのプローブやプライマーは、例えば本発明のポリヌクレオチドであるｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断して作成することもできる。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、作成した複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いて当業者に公知のハイブリダイゼーションなどの方法によって上記染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。プローブの標識は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法又は非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ  ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって得ることができる。更に、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５に代表されるｃＤＮＡであるポリヌクレオチドは、例えば、前記の菌から調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によって得ることができる。又は、イントロンを含む該酵素のコード領域についてＧＥＮＥＴＹＸなどの解析ソフトを用いてｃＤＮＡを決定し、ＰＣＲ法によりイントロンを削除したポリヌクレオチドを得ることができる。尚、プライマーを設計する場合には、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ  ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができる。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドの取得方法は特に限定されないが、例えば次の方法で取得できる。配列番号１７及び１８のプライマー対を用いて、前記のＲＮＡや染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲを行い、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の内部配列を解明する。該ＰＣＲにより得られた産物は、好ましくは１，１００〜１，３００ｂｐであり、より好ましくはイントロンを含まない場合は１，１５０〜１，２００ｂｐであり、イントロンを含む場合は１，２００〜１，２５０ｂｐである。次に該内部配列から設計したプライマーを用いて、５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法を行い、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺を解明する。続いて本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする開始コドンから終止コドンまでの全長遺伝子を増幅できるプライマーを設計し、本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。又は、配列番号１、３、５又は７の全長遺伝子を増幅させたプライマーを用いて解明したい全長遺伝子を増幅できることもある。更に、シグナル部分をコードする塩基配列を除いたポリヌクレオチドが増幅できるように設計したプライマーを用いて、本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。又は配列番号１７及び１８を用いて得たＰＣＲ産物を前記スクリーニング用のプローブとして用いることもできる。最終的にＰＣＲで大量に増幅することにより本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、公知のミューテーション導入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作成することができる。更に、染色体ＤＮＡやそのｃＤＮＡライブラリーから、ヌクレオチド配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーションに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、上記ポリヌクレオチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定され、例えば、米国特許Ｎｏ．６，１００，０３７号明細書等に開示されているような、当業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
【００４７】
文献（例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
【００４８】
本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡ又はそのＯＲＦ領域をインサートとしてフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを生産する場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。
【００４９】
本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターと、このベクターによる形質転換大腸菌、形質転換酵母及び形質転換糸状菌が挙げられる。
【００５０】
本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを微生物で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ断片を得ることもできる。又は、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによっても目的とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを取得することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
【００５１】
或いは、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを真核細胞で発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを真核細胞で生産することができる。該酵素は糖タンパク質であることが好ましく、該酵素を発現させる形質転換細胞は真核細胞が好ましい。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰＣ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質としてフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、糸状菌、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００５２】
フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
【００５３】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、合成によるグルコースデヒドロゲナーゼや遺伝子工学によって得られた組換え型のグルコースデヒドロゲナーゼであってもよい。当業者は本発明の開示に基づいて容易にグルコースデヒドロゲナーゼを得ることができる。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼについては、糸状菌を含む微生物や動植物などの天然物から抽出するほか、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列をもとに合成法によって得ることができる。一方、組換製造法としては、本発明のポリヌクレオチドを市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドを使用して大腸菌や糸状菌などの宿主を形質転換し、形質転換体を培養して培養物から目的のグルコースデヒドロゲナーゼを得ることによって、工業的に製造することも可能である。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼとしては、前記のように糖タンパク質であるのが好ましいので、糸状菌又は酵母（組み換え）などの真核細胞を培養し、培養物から採取するのが好ましい。更に、野生型の分泌シグナル配列遺伝子、ベクター内の分泌シグナル配列遺伝子又は宿主と同属の分泌シグナル配列遺伝子、好ましくは分泌効率の高い分泌シグナル配列遺伝子を利用して菌体外（培養液中）に分泌生産させるのが好ましく、菌体内に生産させるより大量に酵素を製造することができる。
【００５４】
本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５−０．６ｕｎｉｔ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。なお、該酵素の酵素活性単位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）の酵素活性は、次の方法で測定できる。
【００５５】
（酵素活性測定法）
以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定し、ＧＬＤ活性を調べた。
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、超純水０．６１ｍＬ、３ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト（以下１−ｍ−ＰＭＳという）０．２０ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から式１に従いＧＬＤ活性を算出した。この際、ＧＬＤ活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
【００５６】
【数１】
2013031664.tif 000002
【００５７】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍率を表す。
【００５８】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、特に限定されないが、例えばグルコース測定、測定試薬、バイオセンサ又はバイオ電池に用いることができる。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼのうち、糖タンパク質であるグルコースデヒドロゲナーゼを各用途に用いるのが好ましい。具体的には、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、前述のようにグルコースに対する特異性が高く、かつ室温でも高い活性を維持しており、更に測定時に溶存酸素の影響を受けないため、グルコース濃度、特に血中グルコース濃度の測定用として有用である。グルコースを含む被検試料、例えば血液と本発明のグルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程により、被検試料中のグルコースが測定できる。好ましくは測定時のｐＨが５．０〜９．０であるグルコース測定方法であれば、酵素の反応性が良い。
【００５９】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース測定試薬に用いることができる。該測定試薬は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等から成る群より選ばれる熱安定化剤、又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。好ましくは測定試薬のｐＨが４．０〜７．５であれば、保存安定性が良い。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませることができる。尚、該測定試薬の製造方法は特に限定されないが、好ましくはｐＨ４．０〜７．５の範囲で製造することができる。
【００６０】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、バイオセンサに用いることができる。本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを反応層に使用したセンサであればよい。好ましくは反応層のｐＨが４．０〜７．５であれば、安定してセンサを保存することができる。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着などの方法を利用して電極系を形成し、更に酸化還元酵素と電子受容体とを含む測定試薬を備えることによって作製される。このバイオセンサの測定試薬に基質を含む試料液を接触させると、測定試薬が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。この他に、発色強度又はｐＨ変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。例えば、酵素に本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを選択すると、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサを作製することができる。
【００６１】
バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた物質を用いることができる。電子の授受能に優れた物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質やタンパク質性の電子メディエータであり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表２００２−５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。
【００６２】
更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース酸化還元酵素又は上記の融合体を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
【００６３】
尚、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，１９９５などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法又はそれらと実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。更に、この発明における用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。又、本明細書中に引用される文献に記載された内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するものである。以下の実施例におけるグルコースデヒドロゲナーゼ活性の定量は前記の方法に従って行った。【００６５】
［実施例１］
（本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの取得）
自然界から分離した菌株及び微生物保存機関（独立行政法人  製品評価技術基盤機構）から購入した、計約３，８００株からＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ  ＮＢＲＣ３０２５４、Ｏｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ  ＮＢＲＣ６６１０、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ９３９５、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ１０３６５２、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｆａｂａｅ  ＮＢＲＣ５８９５、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｆａｂａｅ  ＮＢＲＣ７１７１、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ  ＮＢＲＣ５８９６、Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ  ＮＢＲＣ１０３６６３の培養ろ液にＧＬＤ活性が確認できた。【００６６】
（Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤの精製：グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ））
前培養培地（Ｄ−グルコース１．０％、大豆粉２．０％、コーンスティープリカー０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ｐＨ７．０）０．０５Ｌを０．２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ処理し、これに予めプレート上で培養したＤｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ  ＮＢＲＣ３０２５４を約０．５ｃｍ２分接種し、２５℃、１００ｒｐｍで３日間回転振盪培養をした。これを種培養として、５Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブ処理した上記培地３．５Ｌに０．０５Ｌずつ接種し（ジャーファーメンター５基）、２５℃、３００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで７日間培養した。培養終了後、培養液１７．５Ｌをろ布でろ過し、ろ液を回収した。次いで、得られたろ液を遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収し、メンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）で吸引ろ過し、培養上清とした。【００６７】
上記の培養上清を、分画分子量８，０００の限外ろ過濃縮膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを５０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。該酵素液を、一晩、４℃で放置後、遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収した。【００６８】
この上清を緩衝液Ａ１（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、５０％飽和硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ３．００ｃｍ×２０．０ｃｍ）に通液し、緩衝液Ａ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ａ１から緩衝液Ｂ１（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）のリニアグラジエントによってタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ１（１ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で透析し、予め緩衝液Ｃ１で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ２．１０ｃｍ×２２．０ｃｍ）に通液した。緩衝液Ｃ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｃ１から緩衝液Ｄ１（２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）のリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ１で透析し、予め緩衝液Ｃ１で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ１．００ｃｍ×１２．７ｃｍ）に通液した。緩衝液Ｃ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｅ１（４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）、緩衝液Ｆ１（７０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）、緩衝液Ｇ（８０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）のステップワイズでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｈ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．２Ｎ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）で透析し、予め緩衝液Ｈで平衡化したＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）カラム（φ２．１５ｃｍ×６０．０ｃｍ）に通液した。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮・脱塩し、水置換したＤｕｍｏｎｔｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素を得た。以降、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素をＤｕＧＬＤと表記する。【００６９】
［実施例２］
（Ｏｖｕｌｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤの精製：グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｂ））
前培養培地（Ｄ−グルコース１．０％、大豆粉２．０％、コーンスティープリカー０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ｐＨ７．０）０．０５Ｌを０．２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ処理し、これに予めプレート上で培養したＯｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ  ＮＢＲＣ６６１０を約０．５ｃｍ２分接種し、２５℃、１００ｒｐｍで３日間回転振盪培養をした。これを種培養として、５Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブ処理した上記培地３．５Ｌに０．０５Ｌずつ接種し（ジャーファーメンター５基）、２５℃、３００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで４日間培養した。培養終了後、培養液１７．５Ｌをろ布でろ過し、ろ液を回収した。次いで、得られたろ液を遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収し、メンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）で吸引ろ過し、培養上清とした。【００７０】
上記の培養上清を、分画分子量８，０００の限外ろ過濃縮膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。該酵素液を、一晩、４℃で放置後、遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収した。【００７１】
この上清を緩衝液Ａ２（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、６０％飽和硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ２．２０ｃｍ×２１．３ｃｍ）に通液し、緩衝液Ａ２で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ａ２から緩衝液Ｂ１（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）のリニアグラジエントによってタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ１（１ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で透析し、予め緩衝液Ｃ１で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ２．２０ｃｍ×１０．８ｃｍ）に通液した。緩衝液Ｃ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｃ１から緩衝液Ｄ２（１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）のリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｈ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．２Ｎ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）で透析し、予め緩衝液Ｈで平衡化したＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）カラム（φ２．１５ｃｍ×６０．０ｃｍ）に通液した。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮・脱塩し、水置換したＯｖｕｌｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素を得た。以降、Ｏｖｕｌｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素をＯｖＧＬＤと表記する。【００７２】
［実施例３］
（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤの精製：グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃ））
前培養培地（Ｄ−グルコース１．０％、大豆粉２．０％、コーンスティープリカー０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ｐＨ７．０）０．０５Ｌを０．２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ処理し、これに予めプレート上で培養したＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ１０３６５２を約０．５ｃｍ２分接種し、２５℃、１００ｒｐｍで３日間回転振盪培養をした。これを種培養として、５Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブ処理した上記培地３Ｌに０．０５Ｌずつ接種（ジャーファーメンター５基）し、２５℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで６日間培養した。培養終了後、培養液１５Ｌをろ布でろ過し、ろ液を回収した。次いで、得られたろ液を遠心分離（５，０００×ｇ、１５分）により上清を回収し、メンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）で吸引ろ過し、培養上清とした。【００７３】
上記の培養上清を、分画分子量８，０００の限外ろ過濃縮膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。該酵素液を、一晩、４℃で放置後、遠心分離（５，０００×ｇ、１５分）により上清を回収した。【００７４】
この上清を緩衝液Ａ３（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、４０％飽和硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ６．００ｃｍ×５．７０ｃｍ）に通液し、緩衝液Ａ３で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ａ３から緩衝液Ｂ２（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）のリニアグラジエントによってタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ２（１ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で透析し、予め緩衝液Ｃ２で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ２．００ｃｍ×１０．２ｃｍ）に通液した。緩衝液Ｃ２で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｃ２から緩衝液Ｄ３（５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）のリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｅ２（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で透析し、予め緩衝液Ｅ２で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ１．００ｃｍ×１２．７ｃｍ）に通液した。緩衝液Ｅ２で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｅ２から緩衝液Ｆ２（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）のリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮・脱塩し、水置換したＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素を得た。以降、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素をＳｃＧＬＤと表記する。【００７５】
［実施例４］
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属微生物由来ＧＬＤの精製：グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｄ））
前培養培地（Ｄ−グルコース１．０％、大豆粉２．０％、コーンスティープリカー０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ｐＨ７．０）０．０５Ｌを０．２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ処理し、これに予めプレート上で培養したＢｏｔｒｙｔｉｓ  ｆａｂａｅ  ＮＢＲＣ７１７１を約０．５ｃｍ２分接種し、２５℃、１３０ｒｐｍで４日間回転振盪培養をした。これを種培養として、５Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブ処理した上記培地３Ｌに０．０５Ｌずつ接種し（ジャーファーメンター５基）、２５℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで４日間培養した。培養終了後、培養液１５Ｌをろ布でろ過し、ろ液を回収した。次いで、得られたろ液を遠心分離（５，０００×ｇ、１５分）により上清を回収し、メンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）で吸引ろ過し、培養上清とした。【００７６】
上記の培養上清を、分画分子量８，０００の限外ろ過濃縮膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを５０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。該酵素液を、一晩、４℃で放置後、遠心分離（５，０００×ｇ、１５分）により上清を回収した。【００７７】
この上清を緩衝液Ａ４（２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、５０％飽和硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ６．０ｃｍ×１１．３ｃｍ）に通液し、緩衝液Ａ４で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ａ４から緩衝液Ｂ３（２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）のリニアグラジエントによってタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ３（１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）で透析し、予め緩衝液Ｃ３で平衡化したＳＰトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（φ４．６ｃｍ×１１．４ｃｍ）に通液し、緩衝液Ｄ４（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）でタンパクを溶出させた。透過した活性画分と吸着後溶出された活性画分とを合わせて濃縮し、緩衝液Ｃ３で透析した後、予め緩衝液Ｃ３で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ４．６ｃｍ×１２．０ｃｍ）に通液した。緩衝液Ｃ３で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｃ３から緩衝液Ｅ３（２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）のリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮・脱塩し、水置換したＢｏｔｒｙｔｉｓ属由来ＧＬＤの精製酵素を得た。以降、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属由来ＧＬＤの精製酵素をＢｏＧＬＤと表記する。【００７８】
［実施例５］
（Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤ遺伝子のクローニング１）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ  ＮＢＲＣ３０２５４株を接種し、１５℃で９０時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。【００７９】
（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。【００８０】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。【００８１】
（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマーは、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ配列から共通配列を解析し、その共通配列を基に相同性の低いＧＬＤ配列でも増幅するように、縮重塩基を用いて設計した。最終的に下記の配列番号１７、１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行ったところ、１，２００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認された。このＤＮＡ断片を精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。
得られたプラスミドを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−Ｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミドに含まれる前記増幅ＤＮＡの遺伝子配列を決定した（１，１７１ｂｐ）。更に、得られた内部配列を基に設計した下記の配列番号１９のプライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの上流を、配列番号２０のプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの下流部分をＰＣＲ増幅し、前記の方法に従って得られたＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号１に示す全鎖長１，７７０ｂｐのＤｕｍｏｎｔｉｎｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓｅ  ＮＢＲＣ３０２５４株由来ＧＬＤ全長遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列がコードする全長アミノ酸配列を配列番号２に示す。
配列番号１７：5’−GGAACCAGTGGTCTAGTCATCGCAAAYCGKYTATCYGA−3’
配列番号１８：5’−TGGATACTTCCTCTTGCAAATGGTARYARRGCCCAATA−3’
配列番号１９：5’−GATCGCCGCAGGGGTGCCTGGTATCG−3’
配列番号２０：5’−GGTGCCGATGTCCCTACTGCAAATGGAG−3’
（プライマー配列中のＹはＣ又はＴ、ＫはＧ又はＴ、ＲはＡ又はＧ）【００８２】
（５）プラスミドｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤの構築
（４）で明らかになった全長アミノ酸配列から予想シグナル配列を除いた１７番目以降のアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅できるようにプライマー（配列番号２１、２２）を設計し、（３）で調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、改変遺伝子を得た。このとき、配列番号２１のプライマーは予めリン酸化しておいた。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩで処理した後に、予めＮａｅＩ、ＳａｌＩで処理し、ＮａｅＩの切断部位は脱リン酸化しておいた分泌型プラスミドｐＡＦＦ２（独立行政法人産業技術総合研究所より分譲）に対して導入し、プラスミドｐＡＦＦ３／ＤｕＧＬＤを取得した。続いて、ｐＡＦＦ３／ＤｕＧＬＤを鋳型とし、配列番号２１、２３のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩで処理し、予めＢｇｌＩＩとＳｐｈＩで処理しておいたプラスミドｐＡＦＦ３／ＤｕＧＬＤに対し導入し、プラスミドｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤを取得し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体のうち５クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで処理したところ、全てのクローンで目的のサイズの断片が確認できた。そのうち４クローンについてプラスミドを調製してそのインサートの配列決定を行ったところ、全てのプラスミドにおいて目的の遺伝子が確認された（ｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤ）。以下の実験にはｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤを用いた。
配列番号２１：5’−GGCAGATCTAGTCCTGACCTTAGTCTAACTTATGACTAT−3’
配列番号２２：5’−CTGCAGGTCGACGCATGCTTAAATATCCTCCTTGATCAAATCTGCCGC−3’
配列番号２３：5’−ACATGCATGCTCTAGATTAAATATCCTCCTTGATCAAATCTGCCGC−3’【００８３】
（６）酵母の形質転換とＧＬＤ活性の確認
調製した組換えベクター（ｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤ）を宿主酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１に導入した。導入にはＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いた。得られた形質転換体をイーストエクストラクト（ＢＤ社製）１．０％、トリプトン（ＢＤ社製）２．０％、グルコース（和光純薬製）２．０％からなるＹＰＤ培地１００ｍＬを加えた５００ｍＬ容の坂口フラスコに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養後、遠心して上清を回収した。前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いてＧＬＤ活性を測定した。ＧＬＤ遺伝子を挿入していないプラスミド（ｐＡＦＦ４）で形質転換したコントロール株を用いて得られた上清中のＧＬＤ活性は０．１Ｕ／ｍＬ以下であったのに対し、ｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤを形質転換した株を用いて得られた上清中のＧＬＤ活性は１．６Ｕ／ｍＬであり、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。この培養上清を分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（ザルトリウス社製）を用いて濃縮し、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ属由来ＧＬＤの粗酵素を得た。【００８４】
［実施例６］
（Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤ遺伝子のクローニング２）
（１）プラスミドｐＳＥＮＳ／ＤｕＧＬＤ及びＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇの構築
実施例５（３）で調製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に記載の配列から設計した下記の配列番号３４、３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、全長ＤｕＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。更に、ＤｕＧＬＤの予想シグナル配列をアスペルギルス・テレウス由来ＧＬＤのシグナル配列に置換する蛋白をコードするＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を取得するためのＰＣＲを、三段階で行った。リバースプライマーは何れも配列番号３５に記載のプライマーを使用した。一段階目のＰＣＲは、前記ＰＣＲ産物を鋳型として、ＤｕＧＬＤの予想シグナル配列を除いた１７番目以降のアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅できるように設計したプライマー（配列番号３６）をフォワードプライマーとして行った。二段階目のＰＣＲは一段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３７に記載のプライマーをフォワードプライマーとして行い、三段階目のＰＣＲは二段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３８に記載のプライマーをフォワードプライマーとして行い、ＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
配列番号３４： 5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGAATCATTTACTTCCTGCTTTTGC-3’
配列番号３５：5’-((CGCTTCTAGA))GCATGCTTAAATATCCTCCTTGATCAAATCTGCC-3’
配列番号３６：5’-CCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTGAGTCCTGACCTTAGTCTAACTTATG-3’
配列番号３７：5’-ATGTTGGGAAAGCTCTCCTTCCTCAGTGCCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTG-3’
配列番号３８：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGAAAGCTCTCCTTCCTCA-3’
（括弧内：転写増強因子、二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、配列番号３６、３７、３８の下線部：シグナル配列）
次に、上記全長ＤｕＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物及びＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を含むＰＣＲ産物を各々鋳型とし、何れも配列番号３９、３５に記載のプライマー対を用いて各々ＰＣＲを行い、Ｎ末端側に制限酵素認識部位及びベクター配列を付加した。
配列番号３９：5’-((CCGTCCTCCAAGTTA))GTCGAC(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)-3’
（括弧内：転写増強因子、二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳａｌＩ））
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用し、その下流に上記で得られた二つのＰＣＲ産物を各々結合させることで、遺伝子が発現可能な二つのプラスミドベクターを各々調製した。これらの発現用プラスミドベクターを各々大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた各形質転換体を培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｐｒｅｐ  ＭＩＮＩ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて各プラスミドを抽出した。各プラスミド中のインサートの配列解析を行ったところ、ＤｕＧＬＤ遺伝子（配列番号１）又はＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子（配列番号４８）が確認できた。【００８５】
（２）形質転換体の取得
（１）で抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＤｕＧＬＤ遺伝子又はＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を挿入した組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を各々作製し、得られた各組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で各々純化した。宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。【００８６】
（３）組換えカビ由来ＧＬＤの活性確認
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１５ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（２）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に従い各々ＧＬＤ活性（Ｕ／ｍＬ）を測定したところ、何れもＧＬＤ活性を確認でき、ＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子で形質転換した組換えカビは、培養液１ｍＬ当たり５００Ｕ／ｍＬの生産性を確認できた。【００８７】
［実施例７］
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属微生物由来ＧＬＤ遺伝子のクローニング１）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ  ＮＢＲＣ５８９６株を接種し、１５℃で９０時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。【００８８】
（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。【００８９】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。【００９０】
（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、実施例５の（４）に記載の配列番号１７、１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行ったところ、１，２００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認された。このＤＮＡ断片を精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。
得られたプラスミドを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−Ｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミドに含まれる前記増幅ＤＮＡの遺伝子配列を決定した（１，１７４ｂｐ）。
更に、得られた内部配列、及び本発明者らによって既に解明されていたＧＬＤ配列を基に設計した、下記の配列番号２４のプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの下流部分を、配列番号２５、２６のプライマー対でＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅し、前記の方法に従って得られたＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号３に示す全鎖長１，７７３ｂｐのＧＬＤ全長遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列がコードする全長アミノ酸配列を配列番号４に示す。
配列番号２４：5’−CGTTCGTCATGACGCTGGACGAGC−3’
配列番号２５：5’−GAAGATCTATGTATCGTTTACTCTCTACATTTGC−3’
配列番号２６：5’−GCTCTAGACTAAATGTCCTCCTTGATCAAATCTG−3’【００９１】
（５）酵母の形質転換とＧＬＤ活性の確認
（４）で明らかになった全長アミノ酸配列から予想シグナル配列を除いた１７番目以降のアミノ酸配列をコードする改変遺伝子を増幅できるようにプライマー（配列番号２７、２８）を設計し、（３）で調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、改変遺伝子を得た。ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供したところ、約１．８ｋｂ付近にバンドが確認されたため、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてゲル精製後、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで切断した。また、実施例５の（５）で作製したｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤも同制限酵素で処理し、制限酵素処理後のＰＣＲ産物をベクターにライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体のうち５クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで処理したところ、全てのクローンで目的のサイズの断片が確認できた。これら５クローンについてプラスミドを調製してそのインサートの配列決定を行ったところ、全てのプラスミドにおいて目的の遺伝子が確認された（ｐＡＦＦ４／ＢｏｔＧＬＤ）。
配列番号２７：5’−GAAGATCTAGCACCGACTCTACTTTAACTTATG−3’
配列番号２８：5’−GCTCTAGACTACATGTCTTCCTTGATCAAATCTGC−3’
調製した組換えベクター（ｐＡＦＦ４／ＢｏｔＧＬＤ）を宿主酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１に導入した。導入にはＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いた。得られた形質転換体をイーストエクストラクト（ＢＤ社製）１．０％、トリプトン（ＢＤ社製）２．０％、グルコース（和光純薬製）２．０％からなるＹＰＤ培地１００ｍＬを加えた５００ｍＬ容の坂口フラスコに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養後、遠心して上清を回収した。前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてＧＬＤ活性を測定した。コントロール株を用いて得られた上清中のＧＬＤ活性は０．１Ｕ／ｍＬ以下であったのに対し、ｐＡＦＦ４／ＢｏｔＧＬＤを形質転換した株を用いて得られた上清中のＧＬＤ活性は２．６Ｕ／ｍＬであり、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。【００９２】
［実施例８］
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属微生物由来ＧＬＤ遺伝子のクローニング２）
（１）プラスミドｐＳＥＮＳ／ＢｏｔＧＬＤ及びＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇの構築
実施例７（３）で調製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３に記載の配列から設計した下記の配列番号４０、４１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、全長ＢｏｔＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。更に、ＢｏｔＧＬＤの予想シグナル配列をアスペルギルス・テレウス由来ＧＬＤのシグナル配列に置換する蛋白をコードするＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を取得するためのＰＣＲを、三段階で行った。リバースプライマーは何れも配列番号４１に記載のプライマーを使用した。一段階目のＰＣＲは、前記ＰＣＲ産物を鋳型として、ＢｏｔＧＬＤの予想シグナル配列を除いた１７番目以降のアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅できるように設計したプライマー（配列番号４２）をフォワードプライマーとして行った。二段階目のＰＣＲは一段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３７に記載のプライマーをフォワードプライマーとして行い、三段階目のＰＣＲは二段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３８に記載のプライマーをフォワードプライマーとして行い、ＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
配列番号４０：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTATCGTTTACTCTCTACATTTGC-3’
配列番号４１：5’-((CGCTTCTAGA))GCATGCCTAAATGTCCTCCTTGATCAAATCTGC-3’
配列番号４２：5’-CCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTGAGCACCGACTCTACTTTAACTTATG-3’
（括弧内：転写増強因子、二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、配列番号４２の下線部：Ａｔシグナル配列）
次に、上記全長ＢｏｔＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物及びＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を含むＰＣＲ産物を各々鋳型とし、何れも配列番号３９、４１に記載のプライマー対を用いて各々ＰＣＲを行い、Ｎ末端側に制限酵素認識部位及びベクター配列を付加した。
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用し、その下流に上記で得られた二つのＰＣＲ産物を各々結合させることで、遺伝子が発現可能な二つのプラスミドベクターを各々調製した。これらの発現用プラスミドベクターを各々大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた各形質転換体を培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｐｒｅｐ  ＭＩＮＩ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて各プラスミドを抽出した。各プラスミド中のインサートの配列解析を行ったところ、ＢｏｔＧＬＤ遺伝子（配列番号３）又はＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子（配列番号５０）が確認できた。【００９３】
（２）形質転換体の取得
（１）で抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＢｏｔＧＬＤ遺伝子又はＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を挿入した組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を各々作製し、得られた各組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で各々純化した。宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。【００９４】
（３）組換えカビ由来ＧＬＤの活性確認
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１５ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（２）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に従い各々ＧＬＤ活性（Ｕ／ｍＬ）を測定したところ、何れもＧＬＤ活性を確認でき、ＢｏｔＧＬＤ遺伝子で形質転換した組換えカビは、培養液１ｍＬ当たり１３Ｕ／ｍＬ、ＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子で形質転換した組換えカビは、培養液１ｍＬ当たり３６Ｕ／ｍＬの生産性を確認できた。【００９５】
［実施例９］
（Ｏｖｕｌｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤ遺伝子のクローニング）
（インサートＤＮＡを含むベクターの調製）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ｏｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ  ＮＢＲＣ６６１０株を接種し、１５℃で９０時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。【００９６】
（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。【００９７】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。【００９８】
（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、実施例５の（４）に記載の配列番号１７、１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行ったところ、１，２００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認された。このＤＮＡ断片を精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。
得られたプラスミドを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−Ｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミドに含まれる前記増幅ＤＮＡの遺伝子配列を決定した（１，１７４ｂｐ）。
更に、得られた内部配列、及び本発明者らによって既に解明されていたＧＬＤ配列を基に設計した下記の配列番号２９のプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの下流部分を、配列番号３０、３１のプライマー対でＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅し、前記の方法に従って得られたＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号５に示す全鎖長１，７７３ｂｐのＧＬＤ全長遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列がコードする全長アミノ酸配列を配列番号６に示す。
配列番号２９：5’−CACATGGACATCCGACGCTAATACCCC−3’
配列番号３０：5’−ATGTATCGTTTACTCTCTACATTTGC−3’
配列番号３１：5’−CTACATGTCTTCCTTGATCAAATCTG−3’【００９９】
（５）酵母の形質転換とＧＬＤ活性の確認
（４）で明らかになった全長アミノ酸配列から予想シグナル配列を除いた１７番目以降のアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅できるようにプライマー（配列番号３２、３３）を設計し、（３）で調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、改変遺伝子を得た。ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供したところ、約１．８ｋｂ付近にバンドが確認されたため、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてゲル精製後、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで切断した。また、実施例５の（５）で作製したｐＡＦＦ４／ＤｕＧＬＤも同制限酵素で処理し、制限酵素処理後のＰＣＲ産物をベクターにライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体のうち５クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで処理したところ、全てのクローンで目的のサイズの断片が確認できた。これら５クローンについてプラスミドを調製してそのインサートの配列決定を行ったところ、全てのプラスミドにおいて目的の遺伝子が確認された（ｐＡＦＦ４／ＯｖＧＬＤ）。
配列番号３２：5’−GAAGATCTAGCACCGACTCTACTTTAACTTATG−3’
配列番号３３：5’−GCTCTAGACTACATGTCTTCCTTGATCAAATCTG−3’
調製した組換えベクター（ｐＡＦＦ４／ＯｖＧＬＤ）を宿主酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１に導入した。導入にはＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いた。得られた形質転換体をイーストエクストラクト（ＢＤ社製）１．０％、トリプトン（ＢＤ社製）２．０％、グルコース（和光純薬製）２．０％からなるＹＰＤ培地１００ｍＬを加えた５００ｍＬ容の坂口フラスコに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養後、遠心して上清を回収した。前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてＧＬＤ活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。【０１００】
［実施例１０］
（Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤ遺伝子のクローニング）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ  ＮＢＲＣ１０３６６３株を接種し、１５℃で９０時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。【０１０１】
（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。【０１０２】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。【０１０３】
（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、実施例５の（４）に記載の配列番号１７、１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行ったところ、１，２００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認された。このＤＮＡ断片を精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。
得られたプラスミドを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−Ｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミドに含まれる前記増幅ＤＮＡの遺伝子配列を決定した。更に、得られた内部配列を基に設計した下記の配列番号４３のプライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの上流を、配列番号４４のプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの下流部分をＰＣＲ増幅し、前記の方法に従って得られたＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号７に示す全鎖長１，７７６ｂｐのＣｉｂｏｒｉｎｉａ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ  ＮＢＲＣ１０３６６３株由来ＧＬＤ全長遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列がコードする全長アミノ酸配列を配列番号８に示す。
配列番号４３：5’−ACGGAAATGTTGTACTTCTCAAGGATAGCA−3’
配列番号４４：5’−CGTCGTTGATCTCCCAACCGTCGGAGAGAA−3’【０１０４】
（５）プラスミドｐＳＥＮＳ／ＣｉＧＬＤ及びＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇの構築
（３）で調製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号７に記載の配列から設計した下記の配列番号４５、４６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、全長ＣｉＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。更に、ＣｉＧＬＤの予想シグナル配列をアスペルギルス・テレウス由来ＧＬＤのシグナル配列に置換する蛋白をコードするＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を取得するためのＰＣＲを、三段階で行った。リバースプライマーは何れも配列番号４６に記載のプライマーを使用した。一段階目のＰＣＲは、前記ＰＣＲ産物を鋳型として、ＣｉＧＬＤの予想シグナル配列を除いた２０番目以降のアミノ酸配列をコードする遺伝子を増幅できるように設計したプライマー（配列番号４７）をフォワードプライマーとして行った。二段階目のＰＣＲは一段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３７に記載のプライマーをフォワードプライマーとして行い、三段階目のＰＣＲは二段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３８に記載のプライマーをフォワードプライマーとして行い、ＤｕＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
配列番号４５：5’-（CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCATCGCTTCCTTCCTGCC-3’
配列番号４６：5’-（GTTACGCTTCTAGA）GCATGCGTTCATTTACATATCTTCCTTGATC-3’
配列番号４７：5’-GTGGCGGCACCTTTGGTTGCCTTAACCTACGATTAT-3’
（括弧内：転写増強因子、二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、配列番号４７の下線部：シグナル配列）
次に、上記全長ＣｉＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物及びＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を含むＰＣＲ産物を各々鋳型とし、何れも配列番号３９、４６に記載のプライマー対を用いて各々ＰＣＲを行い、Ｎ末端側に制限酵素認識部位及びベクター配列を付加した。
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用し、その下流に上記で得られた二つのＰＣＲ産物を各々結合させることで、遺伝子が発現可能な二つのプラスミドベクターを各々調製した。これらの発現用プラスミドベクターを各々大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた各形質転換体を培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｐｒｅｐ  ＭＩＮＩ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて各プラスミドを抽出した。各プラスミド中のインサートの配列解析を行ったところ、ＣｉＧＬＤ遺伝子（配列番号７）又はＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子（配列番号５２）が確認できた。【０１０５】
（６）形質転換体の取得
（５）で抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＣｉＧＬＤ遺伝子又はＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を挿入した組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を各々作製し、得られた各組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で各々純化した。宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。【０１０６】
（７）組換えカビ由来ＣｉＧＬＤ、及びＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇの確認
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１５ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に従い各々ＧＬＤ活性（Ｕ／ｍＬ）を測定したところ、何れもＧＬＤ活性を確認でき、ＣｉＧＬＤ遺伝子で形質転換した組換えカビは、培養液１ｍＬ当たり９０Ｕ／ｍＬ、ＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子で形質転換した組換えカビは、培養液１ｍＬ当たり２５０Ｕ／ｍＬの生産性を確認できた。【０１０７】
［実施例１１］
（Ｎ末端解析）
実施例１で得られた精製ＤｕＧＬＤのＮ末端を解析したところ、ＬＳＬＴＹＤであることが明らかになった。つまり、ＭＮＨＬＬＰＡＦＡＬＡＳＬＡＶＡＳＰＤの１９アミノ酸がシグナル配列であり、該酵素は、翻訳後にシグナルペプチダーゼによる修飾で、該１９アミノ酸が削除されており、配列番号８からなるグルコースデヒドロゲナーゼとして存在していることが分かった。更に、配列相同性や特許文献１記載のアスペルギルス・テレウスＧＬＤ配列との比較からＯｖＧＬＤ、ＢｏｔＧＬＤ及びＣｉＧＬＤも同様に１９アミノ酸がシグナル配列と考えられた。
【０１０８】
［実施例１２］
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ属微生物由来ＧＬＤの精製：グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅ））
前培養培地（Ｄ−グルコース１．０％、大豆粉２．０％、コーンスティープリカー０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ｐＨ７．０）０．０５Ｌを０．２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ処理し、これに予めプレート上で培養したＢｏｔＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を導入したＡ．ｏｒｙｚａｅＮＳ４株を約０．５ｃｍ２接種し、２５℃、１００ｒｐｍで３日間回転振盪培養をした。これを種培養として、５Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブ処理した上記培地３．５Ｌに０．０５Ｌ接種し、２５℃、３００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで７日間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、ろ液を回収した。次いで、得られたろ液を遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収し、メンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）で吸引ろ過し、培養上清２Ｌを回収した。【０１０９】
上記の培養上清を、分画分子量８，０００の限外ろ過濃縮膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを５０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。該酵素液を、一晩、４℃で放置後、遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収した。【０１１０】
この上清を緩衝液Ａ１（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、５０％飽和硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ２．０ｃｍ×１４．０ｃｍ）に通液し、緩衝液Ａ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ａ１から緩衝液Ｂ１（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）へのリニアグラジエントによってタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ１（１ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で透析し、予め緩衝液Ｃ１で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液した。緩衝液Ｃ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｃ１から緩衝液Ｄ１（２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）へのリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮・脱塩し、水置換したＢｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ由来ＧＬＤの精製酵素を得た。以降、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ由来ＧＬＤの精製酵素をＢｏｔＧＬＤと表記する。【０１１１】
［実施例１３］
（Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ属微生物由来ＧＬＤの精製：グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｆ））
前培養培地（Ｄ−グルコース１．０％、大豆粉２．０％、コーンスティープリカー０．５％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ｐＨ７．０）０．０５Ｌを０．２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ処理し、これに予めプレート上で培養したＣｉＧＬＤ−Ａｔｓｉｇ改変遺伝子を導入したＡ．ｏｒｙｚａｅＮＳ４株を約０．５ｃｍ２接種し、２５℃、１００ｒｐｍで３日間回転振盪培養をした。これを種培養として、５Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブ処理した上記培地３．５Ｌに０．０５Ｌ接種し、２５℃、３００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで７日間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、ろ液を回収した。次いで、得られたろ液を遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収し、メンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）で吸引ろ過し、培養上清２Ｌを回収した。【０１１２】
上記の培養上清を、分画分子量８，０００の限外ろ過濃縮膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを５０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。該酵素液を、一晩、４℃で放置後、遠心分離（７，０００×ｇ、３０分）により上清を回収した。【０１１３】
この上清を緩衝液Ａ１（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、５０％飽和硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ２．０ｃｍ×１４．０ｃｍ）に通液し、緩衝液Ａ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ａ１から緩衝液Ｂ１（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）へのリニアグラジエントによってタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮後、緩衝液Ｃ１（１ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で透析し、予め緩衝液Ｃ１で平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液した。緩衝液Ｃ１で該カラムを洗浄した後、緩衝液Ｃ１から緩衝液Ｄ１（２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）へのリニアグラジエントでタンパクを溶出させた。溶出されたタンパクの内、活性画分を濃縮・脱塩し、水置換したＣｉｂｏｒｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素を得た。以降、Ｃｉｂｏｒｉｎｉａ属由来ＧＬＤの精製酵素をＣｉＧＬＤと表記する。  【０１１４】
［実施例１４］
（本発明のＧＬＤの性質試験）
実施例  で得られた各精製ＧＬＤの諸性質を調べた。（Ａ）はＤｕＧＬＤ、（Ｂ）はＯｖＧＬＤ、（Ｃ）はＳｃＧＬＤ、（Ｄ）はＢｏＧＬＤ、（Ｅ）はＢｏｔＧＬＤ、（Ｆ）はＣｉＧＬＤの酵素である。
（ａ）補酵素
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤの３００−６００ｎｍにおける吸収スペクトルを、プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＰＬＵＳ  ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定し、測定結果を図１に示した。各精製ＧＬＤで、３６０−３８０ｎｍ付近及び４５０−４６０ｎｍ付近に吸収極大が認められた。これらの吸収極大はフラビンに特有であるため、本発明のＧＬＤは、何れも補酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドであることが明らかになった。【０１１５】
（ｂ）Ｄ−グルコースに対するＫｍ値
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤについて、前記活性測定法において、基質であるＤ−グルコース濃度を変化させて活性測定を行った。Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから各ＧＬＤのミカエリス定数（Ｋｍ）を求め、表１にまとめた。尚、Ｋｍ値は、測定方法や算出するプロットによって値が変動し易いため、ＤｕＧＬＤのＫｍは約１００〜２００ｍＭ、ＯｖＧＬＤのＫｍは約１０〜４０ｍＭ、ＳｃＧＬＤのＫｍは約１０〜３０ｍＭ、ＢｏＧＬＤのＫｍは約２０〜５０ｍＭ、ＢｏｔＧＬＤのＫｍは約２０〜５０ｍＭ、ＣｉＧＬＤのＫｍは約１．０〜２０ｍＭと考えられる。【０１１６】
【表１】
2013031664.tif 000003
【０１１７】
（ｃ）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤのＧＯＤ活性を調べた結果、何れのＧＬＤについてもＧＯＤ活性は見られなかった。よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として実質的に利用しないため、血糖測定用バイオセンサに本発明のＧＬＤを用いると溶存酸素の影響を受けにくいバイオセンサを作成できることが明らかになった。【０１１８】
ＧＯＤ活性は、以下の方法で測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、２５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン０．１０ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．１０ｍＬ、ペルオキシダーゼ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）０．１０ｍＬ、超純水０．６５ｍＬ、Ｄ−グルコース１．００ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５００）を測定し、式２に従いＧＯＤ活性を算出した。この際ＧＯＤ活性は、３７℃、ｐＨ７．０で、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．６６は本測定条件におけるモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）、０．５は１モルの過酸化水素の生成量に対するキノン型色素の生成量、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ５００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍率を表す。【０１１９】
【数２】
2013031664.tif 000004
【０１２０】
（ｄ）熱安定性
（Ａ）〜（Ｄ）の各精製ＧＬＤを６Ｕ／ｍＬに調製し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で、４〜６０℃の各温度で１５分間処理した後、前記酵素活性測定方法で酵素活性を測定した。酵素活性の残存率を算出し、熱安定性として図２に示した。各精製ＧＬＤを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で、４℃、１５分間処理した後に、前記酵素活性測定法により測定した活性を１００％とした場合に、各温度で１５分間処理した後に、前記酵素活性測定法により測定した残存活性が、ＤｕＧＬＤは３５℃で９０％以上、４０℃で７０％以上、４５℃で３０％以上、ＯｖＧＬＤは３５℃で９０％以上、４０℃で８０％以上、４５℃で３０％以上、ＳｃＧＬＤは４０℃で９０％以上、４５℃で７０％以上、ＢｏＧＬＤは３５℃で９０％以上、４０℃で８０％以上、４５℃で１５％以上の残存活性だった。以上から、本発明のＧＬＤは、４０℃、１５分間の熱処理後に７０％以上、３５℃、１５分処理後に９０％以上の残存活性を有していることがわかった。【０１２１】
（ｅ）安定ｐＨ
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤを６Ｕ／ｍＬに調製し、終濃度が１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５−５．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０−６．０、図中四角印でプロット）、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０−６．０図中黒丸印でプロット）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−７．５図中三角印でプロット）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−９．０図中白丸印でプロット）、１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０−１１．０図中×でプロット）になるように緩衝液を添加し、２５℃で１６時間処理した後、前記酵素活性測定方法で酵素活性を測定した。酵素活性の残存率を算出し、安定ｐＨとして図３に示した。その結果、各精製ＧＬＤを１００ｍＭ各種ｐＨの緩衝液で２５℃、１６時間処理した後に最も安定だったｐＨの緩衝液で処理した酵素の活性を１００％とした場合に、ＤｕＧＬＤはｐＨ４．４〜７．２で８０％以上、ｐＨ４．４〜７．３で７０％以上、ｐＨ４．１〜８．１で４０％以上、ＯｖＧＬＤはｐＨ４．５〜７．０で８０％以上、ｐＨ３．９〜７．８で７０％以上、ｐＨ３．５〜７．８で４０％以上、ＳｃＧＬＤはｐＨ５．０〜７．９で８０％以上、ｐＨ４．５〜８．４で７０％以上、ｐＨ４．０〜９．１で４０％以上、ＢｏＧＬＤはｐＨ４．５〜７．３で８０％以上、ｐＨ４．１〜７．３で７０％以上、ｐＨ３．６〜７．８で４０％以上、ＢｏｔＧＬＤはｐＨ５．０〜７．５で８０％以上、ｐＨ３．９〜７．７で７０％以上、ｐＨ３．３〜７．８で４０％以上、ＣｉＧＬＤはｐＨ５．１〜７．４で８０％以上、ｐＨ３．９〜７．９で７０％以上、ｐＨ３．５〜７．９で４０％以上の残存活性だった。以上から、本発明のＧＬＤの安定ｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜７．０で８０％以上、ｐＨ４．５〜７．０で７０％以上、ｐＨ４．０〜７．５で４０％以上であることがわかった。尚、同じｐＨであっても緩衝液の種類によって残存活性は異なることがある。【０１２２】
（ｆ）分子量
ＤｕＧＬＤ及びＯｖＧＬＤを、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、移動相に同緩衝液を使用してＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３０００ＳＷ（φ２．１５ｃｍ×６０．０ｃｍ、東ソー社製）にて分析した。ゲルろ過法による分析で測定した結果、分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）を指標にして、ＤｕＧＬＤの分子量は１５０〜２３０ｋＤａ、ＯｖＧＬＤの分子量は２６０〜４４０ｋＤａだった。【０１２３】
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤの糖鎖切断前後の分子量を以下の方法で求めた。各酵素溶液（各１．０ｍｇ／ｍＬに調製）５μＬと１％ＳＤＳ及び２％β―メルカプトエタノールを含む０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５μＬを混合し、１００℃で３分間熱処理を行った。糖鎖切断処理として、熱処理後のサンプルにエンドグリコシダーゼＨ（ロシュ製）を１０μＬ（５０ｍＵ）添加し、３７℃で１８時間反応させた。糖鎖切断処理前後のサンプルをｅ−パジェル７．５％（アトー社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢで）染色した。結果を図４に示した。各ＧＬＤと分子量マーカーの移動度を比較して分子量を求めた。泳動サンプルは以下の通りである。
図４（Ａ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製  ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＤｕＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＤｕＧＬＤ糖鎖切断後
図４（Ｂ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製  ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＯｖＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＯｖＧＬＤ糖鎖切断後
図４（Ｃ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製  ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＳｃＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＳｃＧＬＤ糖鎖切断後
図４（Ｄ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製  ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＢｏＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＢｏＧＬＤ糖鎖切断後
図４（Ｅ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製  ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＢｏｔＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＢｏｔＧＬＤ糖鎖切断後
図５（Ｆ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製  ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＣｉＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＣｉＧＬＤ糖鎖切断後【０１２４】
図４より、ＤｕＧＬＤの分子量は９０〜１３０ｋＤａ、ＯｖＧＬＤの分子量は１３０〜２００ｋＤａ、ＳｃＧＬＤの分子量は７０〜９０ｋＤａ、ＢｏＧＬＤの分子量は９０〜１００ｋＤａ、ＢｏｔＧＬＤの分子量は１００〜１２０ｋＤａ、ＣｉＧＬＤの分子量は９００〜１００ｋＤａ、糖鎖切断後の分子量は、何れも６０〜７０ｋＤａだった。【０１２５】
（ｇ）基質特異性
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤについて、前記酵素活性測定法におけるＤ−グルコースを他の基質に置き換え、各基質に対する酵素活性を測定した。各基質としては、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース、スクロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース及びトレハロースを用いた。Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合の各基質に対する相対活性を求め、基質特異性として表２にまとめた。【０１２６】
【表２】
2013031664.tif 000005
【０１２７】
本発明のＧＬＤは、基質濃度３３３ｍＭでの測定時に、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する反応性が２０％以下で、更にＤ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性は１％以下だった。【０１２８】
（ｈ）至適温度
（Ａ）〜（Ｄ）の各精製ＧＬＤについて、前記酵素活性測定法における温度を５〜６０℃の各温度に設定し、更に基質の終濃度を１０ｍＭ及び５０ｍＭとして酵素活性を測定した。基質の終濃度が１０ｍＭの場合、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液０．０３ｍＬ、超純水１．５８ｍＬ、３ｍＭ  ＤＣＩＰ０．１４ｍＬ及び３ｍＭ  １−ｍ−ＰＭＳ０．２０ｍＬを混合し、基質の終濃度が５０ｍＭの場合、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液０．１５ｍＬ、超純水１．４６ｍＬ、３ｍＭ  ＤＣＩＰ０．１４ｍＬ及び３ｍＭ  １−ｍ−ＰＭＳ０．２０ｍＬを混合し、何れの基質の終濃度の場合も３７℃で保温する代わりに各温度で１０分間保温し、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を測定し、直線部分から前記式１に従いＧＬＤ活性を算出した。各精製ＧＬＤが最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合の各温度における相対活性を求め、至適温度として図５に示した。その結果、各精製ＧＬＤが最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、基質濃度１０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは３０〜４５℃で８０％以上、ＯｖＧＬＤは３０〜５０℃で８０％以上、ＳｃＧＬＤは３０〜５０℃で８０％以上、ＢｏＧＬＤは３０〜４５℃で８０％以上の相対活性で、基質濃度５０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは３０〜５０℃で８０％以上、ＯｖＧＬＤは３５〜５５℃で８０％以上、ＳｃＧＬＤは４０〜５５℃で８０％以上、ＢｏＧＬＤは３０〜４５℃で８０％以上の相対活性で、何れの基質濃度においても、ＤｕＧＬＤは３０〜４５℃で８０％以上、ＯｖＧＬＤは３５〜５０℃で８０％以上、ＳｃＧＬＤは４０〜５０℃で８０％以上、ＢｏＧＬＤは３０〜４５℃で８０％以上の相対活性であった。以上から、本発明のＧＬＤは、最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、基質濃度１０ｍＭでは３０〜４５℃、基質濃度５０ｍＭでは４０〜４５℃で相対活性値が８０％以上であり、何れの基質の終濃度においても４０〜４５℃で相対活性値が８０％以上だった。【０１２９】
（ｉ）至適ｐＨ
（Ａ）〜（Ｅ）の各精製ＧＬＤについて、前記酵素活性測定法におけるリン酸カリウム緩衝液を各基質に置き換え、各ｐＨにおける酵素活性を測定した。各緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５、図中四角印でプロット）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０、図中斜め四角印でプロット）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５、図中三角印でプロット）、トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０、図中白丸印でプロット）及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜１０．０、図中黒丸印でプロット）を用いた。各精製ＧＬＤが最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合の各ｐＨにおける相対活性を求め、至適ｐＨとして図６に示した。その結果、各精製ＧＬＤが最大活性を示す緩衝液のｐＨにおける活性値を１００％とした場合に、ＤｕＧＬＤはｐＨ６．０〜８．０で８０％以上、ｐＨ５．０〜９．０で４０％以上、ＯｖＧＬＤはｐＨ６．０〜７．５で８０％以上、ｐＨ５．０〜９．０で４０％以上、ＳｃＧＬＤはｐＨ５．５〜７．５で８０％以上、ｐＨ５．０〜９．５で４０％以上、ＢｏＧＬＤはｐＨ５．５〜７．５で８０％以上、ｐＨ５．０〜９．０で４０％以上、ＢｏｔＧＬＤはｐＨ５．５〜７．５で８０％以上、ｐＨ５．０〜９．０で４０％以上だった。以上から、本発明のＧＬＤは、最大活性を示す緩衝液のｐＨにおける活性値を１００％とした場合に、ｐＨ６．０〜７．５で相対活性値が８０％以上、ｐＨ５．０〜９．０で４０％以上だった。【０１３０】
（ｊ）温度特性
（Ａ）〜（Ｄ）の各精製ＧＬＤについて、前記酵素活性測定法における温度を１０〜５０℃の各温度に設定し、更に基質の終濃度を１０ｍＭ及び５０ｍＭとして酵素活性を測定した。３０、４５℃における活性値を１００％とした場合の各温度の相対活性を求め、表３にまとめた。尚、同条件で１サンプルにつき２回ずつ測定し、平均した値について表にまとめた。その結果、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲は、基質濃度１０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは６０．６〜１０８％、ＯｖＧＬＤは５４．４〜１０７％、ＳｃＧＬＤは４３．２〜１１９％、ＢｏＧＬＤは５５．０〜１０６％で、基質濃度５０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは５６．０〜１１１％、ＯｖＧＬＤは４３．７〜１２３％、ＳｃＧＬＤは４１．６〜１４１％、ＢｏＧＬＤは４９．５〜１１２％だった。３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値の範囲は、基質濃度１０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは６０．６〜１０８％、ＯｖＧＬＤは５４．４〜１０７％、ＳｃＧＬＤは４３．２〜１１９％、ＢｏＧＬＤは５５．０〜１０６％で、基質濃度５０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは５６．０〜１１１％、ＯｖＧＬＤは４３．７〜１２３％、ＳｃＧＬＤは４１．６〜１３７％、ＢｏＧＬＤは４９．５〜１１２％だった。４５℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４５℃における活性値の範囲は、基質濃度１０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは６０．１〜１０７％、ＯｖＧＬＤは５１．９〜１０２％、ＳｃＧＬＤは３６．４〜１００％、ＢｏＧＬＤは５８．８〜１１３％で、基質濃度５０ｍＭでは、ＤｕＧＬＤは５０．５〜１００％、ＯｖＧＬＤは３５．４〜１００％、ＳｃＧＬＤは３０．５〜１００％、ＢｏＧＬＤは４８．６〜１１０％だった。以上から、本発明のＧＬＤは、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜５０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％であることがわかった。よって、広い温度範囲で活性の変動が少ない。【０１３１】
【表３】
2013031664.tif 000006
【０１３２】
（ｋ）１，１０−フェナントロリンによる阻害効果
（Ａ）〜（Ｆ）の各精製ＧＬＤについて、前記酵素活性測定法において、終濃度が２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭになるようにメタノールに溶解した１，１０−フェナントロリンをそれぞれ加えた場合の酵素活性を測定した。メタノールのみ添加の阻害効果を０％として、各濃度の１，１０−フェナントロリンの阻害効果を求め、１，１０−フェナントロリンの阻害効果として表４にまとめた。【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
本発明のＧＬＤに対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果は、２ｍＭでは、ＤｕＧＬＤ、ＯｖＧＬＤ及びＢｏｔＧＬＤは２０〜３４％、ＳｃＧＬＤ、ＢｏＧＬＤ及びＣｉＧＬＤでは５〜１０％程度だった。【０１３５】
［実施例１５］
（本発明のＧＬＤによるグルコースの定量）
（Ａ）〜（Ｆ）の本発明のＧＬＤを用いて、前記活性測定法におけるＤ−グルコースの濃度を０．３ｍＭ（５．５ｍｇ／ｄＬ）〜５０ｍＭ（９００ｍｇ／ｄＬ）の範囲に変化させて、吸光度変化を測定した。結果を図７に示した。本発明のＧＬＤを用いてＤ−グルコースの定量が可能であることが示された。【０１３６】
［実施例１６］
本発明の各ＧＬＤのアミノ酸配列同士又は塩基配列同士をＧｅｎｅＤｏｃ（２．７．０．０）により比較して、各ｉｄｅｎｔｉｔｙ％の数値を表５にまとめた。【０１３７】
【表５】
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【０１３８】
表５の結果より、本発明では、同一性が少なくとも６０％のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び同一性が少なくとも６０％の塩基配列であり、かつグルコースデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月21日(2012.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】追加
【補正の内容】
【０１３９】
［配列表］
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【国際調査報告】
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