(57)【要約】  本発明の目的は、生体分子分析方法において、生体分子数の計数による広いダイナミックレンジと、迅速な分析を実現する生体分子分析方法及び手段を提供すること。  本発明は、分析対象の生体分子101を磁気微粒子108表面に固定する工程と、標識したプローブ分子104を分析対象の生体分子101と反応させる工程と、前記微粒子108を支持基体110上に収集及び固定する工程と、前記支持基体110上の標識を測定する工程を含むことを特徴とする生体分子分析方法に関する。本発明は、一分子付き磁気微粒子を用いることで、生体分子数の計数を実現するとともに、生体分子を固定した微粒子を分散した状態でハイブリダイゼーションや抗原抗体間の反応を行うことで、迅速な反応を実現する。さらに、一分子レベルで目的生体分子の種類の判別と存在量を定量し、特に絶対濃度を評価することができる。
2013051651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程と、
標識したプローブ分子を、分析対象の生体分子と反応させる工程と、
前記微粒子を支持基体上に収集及び固定する工程と、
前記支持基体上の標識を測定する工程
を含むことを特徴とする、生体分子分析方法。
【請求項２】
前記磁気微粒子表面には予め捕捉用分子を固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉用分子を介して前記磁気微粒子表面に固定することを特徴とする、請求項1に記載の生体分子分析方法。
【請求項３】
前記磁気微粒子に予め捕捉用分子を一分子固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉用分子を介して前記磁気微粒子表面に固定することを特徴とする、請求項1又は2に記載の生体分子分析方法。
【請求項４】
前記磁気微粒子1個につき前記分析対象の生体分子が一分子固定されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項５】
磁力を用いることで、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項６】
分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程を行った後、標識したプローブ分子を前記分析対象の生体分子と反応させる工程を行うことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項７】
標識したプローブ分子を分析対象の生体分子と反応させる工程を行った後、前記分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程を行うことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項８】
前記標識が蛍光標識であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光標識が、測定しようとする生体分子の種類ごとに配合割合が異なる複数種類の蛍光体で、前記プローブ分子を標識することを特徴とする、請求項8に記載の生体分子分
析方法。
【請求項１０】
前記蛍光標識が、測定しようとする生体分子の種類ごとに異なる色の蛍光を発する蛍光体で、前記プローブ分子を標識することを特徴とする、請求項8に記載の生体分子分析方法。
【請求項１１】
標識を測定する工程が、蛍光測定を含むことを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項１２】
分析対象の生体分子に共通の標識を付加する工程をさらに含み、前記共通の標識とは異なる標識で標識したプローブ分子と前記分析対象の生体分子とを反応させ、前記共通の標識と前記異なる標識との比を算出することにより、前記分析対象の生体分子の全体量に対する反応した生体分子量を評価することを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体分子が核酸であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項１４】
前記プローブ分子が、測定しようとする生体分子とハイブリダイズすることができる核酸であることを特徴とする、請求項13に記載の生体分子分析方法。
【請求項１５】
前記生体分子がタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
【請求項１６】
前記プローブ分子が、測定しようとする生体分子に対する抗体であることを特徴とする、請求項15に記載の生体分子分析方法。
【請求項１７】
分析対象の生体分子を磁気微粒子上に固定する手段と、
標識したプローブ分子と分析対象の生体分子とを反応させる手段と、
前記反応工程後に、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定する手段と、
標識を測定する手段と
を具備することを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項１８】
標識を測定する手段が、光照射手段及び発光検出手段を含むことを特徴とする、請求項17に記載の生体分子分析装置。
【請求項１９】
分析対象の生体分子を用意し、標識されたプローブ分子を前記生体分子と反応させ、前記生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出することにより、目的生体分子の絶対濃度を評価することを特徴とする、生体分子の分析方法。
【請求項２０】
分析対象の生体分子を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
分析対象の生体分子を、濃度調整する工程と、撹拌する工程と、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
分析対象の生体分子が、支持基板上に、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定されることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
生体分子が核酸分子であり、プローブ分子が目的生体分子に相補的な配列を有する核酸分子である、請求項１９〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
生体分子が核酸分子であり、分析対象の核酸分子を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ標識されたプローブ核酸分子を、前記分析対象の核酸分子とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記標識を検出することにより、目的核酸分子の絶対濃度を評価することを特徴とする、核酸分子の分析方法。
【請求項２５】
分析対象の核酸分子を、濃度調整する工程と、撹拌する工程と、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分析対象の核酸分子が、支持基板上に、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
分析対象の生体分子を、微粒子上に、微粒子1つあたり前記生体分子を一分子ずつ固定する工程を含むことを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
標識が蛍光標識である、請求項１９〜２７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識が、目的生体分子の種類ごとに、配合割合が異なる複数種類の蛍光体を含む微粒子であることを特徴とする、請求項１９〜２８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
目的生体分子以外の生体分子に対するプローブ分子に同一の標識を用い、前記目的生体分子ごとに標識数を計数した上で、総標識数に対する目的生体分子ごとの標識数の比を算出することにより、前記目的生体分子ごとの絶対濃度を評価することを特徴とする、請求項１９〜２９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
分析対象の生体分子に対して共通の標識を付加する工程をさらに含み、前記共通の標識とは異なる標識で標識されたプローブ分子と前記分析対象の生体分子とを反応させ、前記共通の標識の数と前記異なる標識の数との比を算出することにより、前記目的生体分子の種類ごとの絶対濃度を評価することを特徴とする、請求項１９〜３０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
分析対象の生体分子を一分子ずつ固定した微粒子が磁気微粒子であり、前記標識が、目的生体分子の種類ごとに、配合割合が異なる複数種類の蛍光体を含む微粒子であり、前記分析対象の生体分子と前記プローブ分子との反応後に、未結合のプローブ分子と前記磁気微粒子を分離した後、前記磁気微粒子上の生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出することを特徴とする、請求項２７〜３１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
分析対象の生体分子を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する手段と、
標識されたプローブ分子を前記生体分子と反応させる手段と、
前記生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出する手段と
を備え、検出された標識の数から目的生体分子の絶対濃度を評価することを特徴とする生体分子の分析装置。
【請求項３４】
前記固定手段が、
分析対象の生体分子を濃度調整する手段と、
分析対象の生体分子を撹拌する手段と
を具備することを特徴とする、請求項３３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子分析方法及び生体分子分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の分析方法として、試料中に含まれる生体分子の種類と量を簡便に解析する方法が開発されている。例えば、DNAマイクロアレイでは、既知の遺伝子の配列を識別し得る配列を有する合成DNAを多種類、支持基体上の所定の箇所に固定しておき、蛍光体標識を施した核酸試料又は核酸試料の逆転写物や増幅産物を前記支持基体上にハイブリダイゼーションさせた後、蛍光スキャナーにより蛍光画像を取得し、どの遺伝子が、どれだけの量発現しているかを蛍光強度から解析することができる（非特許文献１）。また、検出対象の生体分子と特異的に結合する抗体を支持基体上に固定しておき、これに分析対象の試料を流して所定の特異的な結合反応を行い、さらに蛍光標識を施した抗体を流して蛍光検出を行う、所謂、サンドイッチアッセイで、特定の生体分子を検出する方法（酵素結合免疫吸着法：ELISA）が実用化されている。【０００３】
いずれの場合にも、検出対象の生体分子を特異的に捕捉するプローブ分子を支持基体上に予め固定しておき、これに分析対象の試料を流して所定の特異的な結合反応を行い、蛍光測定等により定量化されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Science Vol.270, pp.467-470, 1995年
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.103, pp.3687-3692, 2006年
【非特許文献３】Nature Biotechnology Vol.28, pp.595-599, 2010年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
DNAマイクロアレイやELISA（酵素結合免疫吸着法）に代表される従来の解析方法では、数千から数万分子のプローブ分子を固定した反応サイトに、蛍光標識（又は酵素標識）した生体分子による特異的結合反応を行った後、蛍光強度の測定からその反応サイトに結合した生体分子数を相対的に比較するというものであり、ダイナミックレンジが2〜3桁と、報告（非特許文献２）されている実際の生体分子の存在量のダイナミックレンジ（〜4桁）に比べて低かった。【０００６】
また、単一分子ELISA法が報告されており、該方法では、複数の抗体を微粒子に固定して、希釈したサンプル中の抗原を微粒子当たり1分子のみ該抗体に結合させ、微粒子を支持体上に収集・固定した後、支持体上で標識を測定することによって、生体分子（抗原）を分析している（非特許文献３）。しかしながら、微粒子上に複数の抗体が固定されていることから、2分子以上の抗原が結合してしまう可能性があり、もし結合してしまった場合でも、検出工程でそれを判別することは困難であること、支持体上の穴に微粒子が入らない箇所があっても、検出工程でそれを判別できないことが知られていた。【０００７】
さらに、前記特異的な結合反応においては、特異的に結合するプローブ分子は支持基体上に固定されているため移動できず、反応時間が非常に長くかかっていた。例えば、前記のDNAマイクロアレイの場合には、ハイブリダイゼーションに10時間以上を要し、迅速な解析が求められる、例えば臨床検査などに適用することが困難であるという課題が残されていた。【０００８】
さらに、上記のような手法は、試料間の発現比較解析は行えるが、基本的に抽出された生体分子の絶対数を測定することを目的としていない。そのため、微量の発現でも細胞全体に大きな影響を与える生体分子は発現量が多い他の生体分子の存在のために見逃されてしまうという問題が残されていた。【０００９】
本発明の目的は、生体分子分析方法において、生体分子数の計数による広いダイナミックレンジと、迅速な分析を実現する生体分子分析方法及び手段を提供することにある。【００１０】
さらに、本発明の目的は、生体分子、特に核酸分子の分析方法において、検体から抽出した生体分子を捕捉し、かつPCR等の増幅反応を用いずに、一度に解析できる生体分子の種類が千種類以上という網羅性と、ダイナミックレンジが4桁以上で一分子レベルでの生体分子の種類の判別と定量が可能で、簡便な生体分子の絶対数の直接的分析方法を提供することにある。特に、分析対象の生体分子として、1万種以下である非翻訳RNAやマイクロRNAの解析に極めて有効な分析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生体分子を含む試料における生体分子の種類と存在量を分析する方法に関する。具体的には、本発明者は、分析対象の生体分子を磁気微粒子上に固定し、磁気微粒子が溶液中で分散した状態で、生体分子に特異的に結合するプローブ分子との反応を行い、反応後に前記微粒子を支持基体上に磁力を用いて収集・固定した後、蛍光測定などによる検出・評価を行うことによって、生体分子数の計数及び迅速な反応を実現することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下を包含する。【００１３】
［1］分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程と、
標識したプローブ分子を、分析対象の生体分子と反応させる工程と、
前記微粒子を支持基体上に収集及び固定する工程と、
前記支持基体上の標識を測定する工程
を含むことを特徴とする、生体分子分析方法。【００１４】
［2］前記磁気微粒子表面には予め捕捉用分子を固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉用分子を介して前記磁気微粒子表面に固定することを特徴とする、［1］に記載の生体分子分析方法。【００１５】
［3］前記磁気微粒子に予め捕捉用分子を一分子固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉用分子を介して前記磁気微粒子表面に固定することを特徴とする、［1］又は［2］に記載の生体分子分析方法。【００１６】
［4］前記磁気微粒子1個につき前記分析対象の生体分子が一分子固定されることを特徴とする、［1］〜［3］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００１７】
［5］磁力を用いることで、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定することを特徴とする、［1］〜［4］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００１８】
［6］分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程を行った後、標識したプローブ分子を前記分析対象の生体分子と反応させる工程を行うことを特徴とする、［1］〜［5］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００１９】
［7］標識したプローブ分子を分析対象の生体分子と反応させる工程を行った後、前記分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程を行うことを特徴とする、［1］〜［5］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００２０】
［8］前記標識が蛍光標識であることを特徴とする、［1］〜［7］のいずれかに記載の方法。【００２１】
［9］前記蛍光標識が、測定しようとする生体分子の種類ごとに配合割合が異なる複数種類の蛍光体で、前記プローブ分子を標識することを特徴とする、［8］に記載の生体分子分析方法。【００２２】
［10］前記蛍光標識が、測定しようとする生体分子の種類ごとに異なる色の蛍光を発する蛍光体で、前記プローブ分子を標識することを特徴とする、［8］に記載の生体分子分析方法。【００２３】
［11］標識を測定する工程が、蛍光測定を含むことを特徴とする、［8］〜［10］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００２４】
［12］分析対象の生体分子に共通の標識を付加する工程をさらに含み、前記共通の標識とは異なる標識で標識したプローブ分子と前記分析対象の生体分子とを反応させ、前記共通の標識と前記異なる標識との比を算出することにより、前記分析対象の生体分子の全体量に対する反応した生体分子量を評価することを特徴とする、［1］〜［11］のいずれかに記載の方法。【００２５】
［13］前記生体分子が核酸であることを特徴とする、［1］〜［12］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００２６】
［14］前記プローブ分子が、測定しようとする生体分子とハイブリダイズすることができる核酸であることを特徴とする、［13］に記載の生体分子分析方法。【００２７】
［15］前記生体分子がタンパク質であることを特徴とする、［1］〜［12］のいずれかに記載の生体分子分析方法。【００２８】
［16］前記プローブ分子が、測定しようとする生体分子に対する抗体であることを特徴とする、［15］に記載の生体分子分析方法。【００２９】
［17］分析対象の生体分子を磁気微粒子上に固定する手段と、
標識したプローブ分子と分析対象の生体分子とを反応させる手段と、
前記反応工程後に、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定する手段と、
標識を測定する手段と
を具備することを特徴とする生体分子分析装置。【００３０】
［18］標識を測定する手段が、光照射手段及び発光検出手段を含むことを特徴とする、［17］に記載の生体分子分析装置。【００３１】
［19］分析対象の生体分子を用意し、標識されたプローブ分子を前記生体分子と反応させ、前記生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出することにより、目的生体分子の絶対濃度を評価することを特徴とする、生体分子の分析方法。【００３２】
［20］分析対象の生体分子を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程をさらに含むことを特徴とする、［19］に記載の方法。【００３３】
［21］分析対象の生体分子を、濃度調整する工程と、撹拌する工程と、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程をさらに含むことを特徴とする、［19］又は［20］に記載の方法。【００３４】
［22］分析対象の生体分子が、支持基板上に、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定される、［19］〜［21］のいずれかに記載の方法。【００３５】
［22-2］分析対象の生体分子が、実質的に全て、好ましくは全て固定されることを特徴とする、［19］〜［21］のいずれかに記載の方法。【００３６】
［23］生体分子が核酸分子であり、プローブ分子が目的生体分子に相補的な配列を有する核酸分子である、［19］〜［22］のいずれかに記載の方法。【００３７】
［23-2］生体分子がタンパク質であり、プローブ分子が目的生体分子に対する抗体である、［19］〜［22］のいずれかに記載の方法。【００３８】
［24］生体分子が核酸分子であり、分析対象の核酸分子を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ標識されたプローブ核酸分子を、前記分析対象の核酸分子とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記標識を検出することにより、目的核酸分子の絶対濃度を評価することを特徴とする、核酸分子の分析方法。【００３９】
［25］分析対象の核酸分子を、濃度調整する工程と、撹拌する工程と、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程をさらに含むことを特徴とする、［24］に記載の方法。【００４０】
［26］分析対象の核酸分子が、支持基板上に、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定される、［24］又は［25］に記載の方法。【００４１】
［27］分析対象の生体分子を、微粒子上に、微粒子1つあたり前記生体分子を一分子ずつ固定する工程を含むことを特徴とする、［19］〜［26］のいずれかに記載の方法。【００４２】
［27-2］前記微粒子に予め捕捉分子を一分子固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉分子を介して前記微粒子に固定することを特徴とする、［27]に記載の方法。【００４３】
［28］標識が蛍光標識である、［19］〜［27］のいずれかに記載の方法。【００４４】
［29］前記標識が、目的生体分子の種類ごとに、配合割合が異なる複数種類の蛍光体を含む微粒子であることを特徴とする、［19］〜［28］のいずれかに記載の方法。【００４５】
［29-2］前記標識が、目的生体分子の種類ごとに異なる色の蛍光を発する蛍光体であることを特徴とする、［19］〜［28］のいずれかに記載の方法。【００４６】
［29-3］標識の検出が蛍光の検出であることを特徴とする、［28］又は［29］に記載の方法。【００４７】
［30］目的生体分子以外の生体分子に対するプローブ分子に同一の標識を用い、前記目的生体分子ごとに標識数を計数した上で、総標識数に対する目的生体分子ごとの標識数の比を算出することにより、前記目的生体分子ごとの絶対濃度を評価することを特徴とする、［19］〜［29］のいずれかに記載の方法。【００４８】
［31］分析対象の生体分子に対して共通の標識を付加する工程をさらに含み、前記共通の標識とは異なる標識で標識されたプローブ分子と前記分析対象の生体分子とを反応させ、前記共通の標識の数と前記異なる標識の数との比を算出することにより、前記目的生体分子の種類ごとの絶対濃度を評価することを特徴とする、［19］〜［30］のいずれかに記載の方法。【００４９】
［32］分析対象の生体分子を一分子ずつ固定した微粒子が磁気微粒子であり、前記標識が、目的生体分子の種類ごとに、配合割合が異なる複数種類の蛍光体を含む微粒子であり、前記分析対象の生体分子と前記プローブ分子との反応後に、未結合のプローブ分子と前記磁気微粒子を分離した後、前記磁気微粒子上の生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出することを特徴とする、［27］〜［31］のいずれかに記載の方法。【００５０】
［33］分析対象の生体分子を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する手段と、
標識されたプローブ分子を前記生体分子と反応させる手段と、
前記生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出する手段と
を備え、検出された標識の数から目的生体分子の絶対濃度を評価することを特徴とする生体分子の分析装置。【００５１】
［34］前記固定手段が、
分析対象の生体分子を濃度調整する手段と、
分析対象の生体分子を撹拌する手段と
を具備することを特徴とする、［33］に記載の装置。【００５２】
［34-2］標識を検出する手段が、光照射手段及び発光検出手段を含むことを特徴とする、［33］又は［34］に記載の装置。
【発明の効果】
【００５３】
本発明により、生体分子の存在量を一分子の分解能で分子数を計数することが可能となるため、非常に大きなダイナミックレンジが得られる。さらに、生体分子を固定した微粒子を分散した状態でプローブ分子と液中で反応させるため、プローブ分子と生体分子の結合反応を迅速に行うことができる。従って、本発明に係る分析方法及び分析装置により、生体分子分析を高いダイナミックレンジで迅速に行うことができる。【００５４】
さらに、本発明により、試料濃度調整と、撹拌等の工程により、抽出した試料を取りこぼすことなく、非常に高い確率で空間的に分離された位置に一分子ずつ生体分子を配置することができ、一分子の感度及び分解能で、高い網羅性と定量性を有し、かつ簡便、迅速に生体分子の分析を行うことができる。さらに従来の手法と比較して、非常に高感度、かつ増幅バイアスがかからないため、細胞内にある分析対象の生体分子の存在数を実際と非常に近い状態で評価することができる。【００５５】
また、複数の生体分子種から構成される生体分子試料に対しては、分析対象の生体分子を支持基体上の規則性を有する位置に、各固定箇所一箇所に前記生体分子を一分子ずつ固定し、目的生体分子と結合することが既知であるプローブ分子を前記支持基体上に固定した生体分子と反応させ、前記プローブ分子を検出する。したがって、分析対象の生体分子の種類と存在量を、網羅性と定量性を兼ね備え、一分子の感度及び分解能で、簡便かつ迅速に分析することができる。【００５６】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本実施例の分析方法の一例を説明するための図である。
【図２】本実施例の分析方法の一例を説明するための図である。
【図３】本実施例の分析方法の一例を説明するための図である。
【図４】本実施例の分析方法に用いるデバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図５】本実施例の分析方法に用いるデバイスの製造方法の一例を説明するための図である。
【図６】本実施例の一分子固定微粒子の作製方法の一例を説明するための図である。
【図７】本実施例の分析方法の一例を説明するための図である。
【図８】捕捉分子を一分子固定した微粒子を作製する方法及びデバイスの一例を説明するための図である。
【図９】本実施例の分析方法の一例を説明するための図である。
【図１０】本実施例の生体分子分析装置の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、分析対象の生体分子と、測定しようとする生体分子に特異的に結合するプローブ分子とを反応させて生体分子を分析する方法に関し、分析対象の生体分子を磁気微粒子に固定することによって、磁気微粒子を簡便かつ迅速に支持基体上に収集及び固定して、上記反応を検出することを特徴としている。また分析対象の生体分子を微粒子1個当たり一分子で固定することで、生体分子の分析を高精度にかつ高いダイナミックレンジで行う。さらに、分析対象の生体分子を一分子ずつ空間的に分離された位置に固定することによって、目的生体分子の絶対濃度を、高い網羅性とダイナミックレンジで評価することを特徴としている。
【００５９】
分析対象の生体分子は、その種類、発現量又は存在量、存在の有無などについて分析しようとする生体由来の分子であれば特に限定されるものではない。例えば、核酸（メッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、マイクロRNA、DNA、アプタマーなど）及びその断片、タンパク質（ペプチド、ポリペプチド、抗体など）及びその断片、糖などが含まれる。なお、生体分子には、自然には存在しない配列や構成要素を含むポリマーが含まれ、例えばpoly(A)、poly(T)、poly(G)、poly(C)などの配列又は任意の配列を有する人為的に合成された生体分子も含まれる。また、生体分子には、当技術分野で公知の核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応）によって調製された核酸や、ベクターにクローニングされている核酸も含まれる。
【００６０】
また分析対象の生体分子の由来も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類など）、無脊椎動物（例えば昆虫、線虫、甲殻類など）、原生生物、植物、真菌、細菌、ウイルスなどの任意の生体の、細胞サンプル、組織サンプル、液体サンプルなどの任意のサンプルに由来するものとすることができる。具体的には、1細胞からなるサンプル、複数の細胞を含むサンプル、組織切片サンプルなどが挙げられる。あるいは、DNAライブラリ、抗体ライブラリ、ペプチドライブラリなどの人工的な供与源に由来する生体分子であってもよい。
【００６１】
サンプルから分析対象の生体分子を調製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Proteinase Kのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Tween及びSDSといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちDNA及びRNAを溶出することができる。分析対象の生体分子としてRNA（mRNAなど）を用いる場合には、上記の細胞溶解により溶出された核酸のうち、DNAをDNA分解酵素（DNase）により分解し、核酸としてRNAのみを含む試料が得られる。
【００６２】
分析対象の生体分子には共通の標識を付加してもよく、その場合、後述する標識測定工程において該共通の標識を測定することにより、分析対象の生体分子の数又は量を測定することができる。共通の標識は、後述するプローブ分子に付加する標識とは異なるものとし、標識測定工程において識別できるようにする。該共通の標識としては、当技術分野で公知の任意の標識を用いることができ、例えば蛍光標識（Cy3、Cy5、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）など）、発光性半導体標識（セレン化亜鉛（Zn-Se）など）、化学発光標識（ルシフェリンなど）、酵素標識（ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）、放射性標識（トリチウム、ヨウ素125など）が挙げられる。後述する標識測定工程における測定容易性を考慮して、標識は蛍光標識であることが好ましい。
【００６３】
分析対象の生体分子に標識を付加する方法も特に限定されるものではなく、当技術分野で公知の方法を採用することができる。例えば、直接的に標識を生体分子に結合させてもよいし、適当なリンカー（例えば実施例１における捕捉用タグ）を介して生体分子と標識とを結合させてもよいし、あるいは一次抗体を介して二次又は三次抗体として生体分子を標識に結合させてもよい。
【００６４】
プローブ分子は、分析対象の生体分子に特異的に結合することができるものであれば特に限定されるものではなく、分析対象の生体分子の種類及び測定しようとする生体分子に応じて異なる。分析対象の生体分子が核酸である場合には、プローブ分子として、測定しようとする生体分子とハイブリダイズする核酸、例えば生体分子の配列に対し相補的な配列を有する核酸を用いることができる。生体分子（核酸）とハイブリダイズするプローブ分子の設計及び調製方法は当技術分野で公知であり、10〜60塩基程度の長さで、融解温度（Tm）及びGC含量などを考慮して、適当な分子を設計することができる。また、そのような分子を設計するためのプログラムも知られている。
【００６５】
また分析対象の生体分子がタンパク質である場合には、プローブ分子として、測定しようとするタンパク質に対する抗体（全抗体、抗体フラグメント、ドメイン抗体などを含む）、アプタマー核酸などを用いることができる。分析対象の生体分子が抗体（例えば血清中抗体）である場合には、測定しようとする抗体が結合する抗原（ペプチド、糖など）、該抗体と結合する抗体などをプローブ分子として使用することができる。分析対象の生体分子が糖又は糖タンパク質である場合には、プローブ分子としてレクチンなどを用いることができる。いずれの場合にも、当業者であれば、測定しようとする生体分子に基づいて適当なプローブ分子を設計し調製することができる。
【００６６】
プローブ分子は、1種類でもよいし、複数種類であってもよい。測定しようとする生体分子の種類に応じてプローブ分子を準備する。
【００６７】
プローブ分子は、適当な標識により標識する。標識の種類及び標識付加方法は、上述と同様に適宜選択することができる。なお、複数種類の生体分子を測定するためにそれに対応した複数種類のプローブ分子を使用する場合には、異なる標識を用いて当該複数種類を識別可能に標識することが好ましい。例えば、生体分子の種類ごとに配合割合が異なる複数種類の蛍光体を用いて、あるいは生体分子の種類ごとに異なる色の蛍光を発する蛍光体を用いて、プローブ分子を識別可能に標識することができる。
【００６８】
分析対象の生体分子と標識したプローブ分子との反応は、それらの種類に応じて異なり、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば分析対象の生体分子が核酸である場合には、プローブ分子（核酸）とのハイブリダイゼーション反応を行うことができる。ハイブリダイゼーション反応は、磁気微粒子に固定された又は固定されていない分析対象の生体分子（核酸）と、プローブ分子（核酸）とを、固相系又は液相系において、ストリンジェントな条件下でインキュベーションすることにより実施する。ストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、当業者であれば適宜選択することができる。また、ハイブリダイゼーション反応後に、残留試薬や結合しなかった分子を洗浄・除去することが好ましい。
【００６９】
分析対象の生体分子がタンパク質又は抗体である場合には、該タンパク質又は抗体に特異的に結合する抗体又はタンパク質との抗原−抗体反応に基づく反応を行うことができる。このような反応は、当技術分野で公知であり、例えば、磁気微粒子に固定された又は固定されていない分析対象の生体分子と、プローブ分子とを、固相系又は液相系において接触させることにより反応させることができる。分析対象の生体分子がタンパク質であり、タンパク質に特異的に結合するアプタマー核酸をプローブ分子として用いる場合も同様に、両者を固相系又は液相系において接触させることにより両者を結合させることができる。反応後に、残留試薬や結合しなかった分子を洗浄・除去することが好ましい。
【００７０】
なお、分析対象の生体分子は、磁気微粒子の表面に固定する。微粒子への固定は、標識したプローブ分子を分析対象の生体分子と反応させる工程を行う前に行ってもよいし（例えば実施例２）、又は該工程の後に行ってもよい（例えば実施例１）。
【００７１】
さらに、分析対象の生体分子は、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定されることが好ましい。特に、分析対象の生体分子の実質的に全て、例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が、固定される。例えば、分析対象の生体分子を微粒子に固定することができる。微粒子への固定は、標識されたプローブ分子を分析対象の生体分子と反応させる工程を行う前に行ってもよいし（例えば実施例３）、又は該工程の後に行ってもよい（例えば実施例７及び９）。
【００７２】
磁気微粒子は、磁化された又は磁化可能な磁気微粒子であれば特に限定されるものではなく、当技術分野において使用可能な磁気微粒子は市販されている。磁気微粒子は、例えばマグネタイトなどの酸化鉄（超常磁性体）で作製された微粒子、超常磁性体層をコーティングして作製された微粒子であり、その直径は100ミクロン（μm）以下、好ましくは50ミクロン以下、より好ましくは10ミクロン以下、例えば1.0ミクロン〜10.0ミクロンである。磁気微粒子は、溶液中での分散性、分析対象の生体分子の種類、反応の種類などを勘案して、その材質及びサイズを決定することが好ましい。磁気微粒子を用いることによって、後述する支持基体への収集及び固定について、自動化、効率化又は迅速化することができる。
【００７３】
分析対象の生体分子の磁気微粒子への固定は、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができる。例えば磁気微粒子の表面に、共有結合、イオン結合、物理吸着、相補的結合、生物学的結合（例えば、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合など）を利用して生体分子を固定することができる。また、他の分子（例えば、実施例１及び３における捕捉用タグや捕捉用分子など）を介して生体分子を磁気微粒子に固定することも可能である。なお、本明細書中では、分析対象の生体分子及び磁気微粒子に結合させる他の分子をそれぞれ便宜的に「捕捉用タグ」及び「捕捉用分子」と称しているが、両者が存在してもよいし、一方のみが存在してもよいし、又は両方とも存在しなくてもよい。具体的には、例えば、磁気微粒子表面に予め捕捉用分子を固定しておき、分析対象の生体分子（又は捕捉用タグを結合した分析対象の生体分子）を該捕捉用分子を介して磁気微粒子表面に固定する。当該他の分子、すなわち捕捉用タグ又は捕捉用分子は、限定されるものではないが、例えば核酸分子（RNA分子など）、タンパク質分子（抗体など）とすることができ、当技術分野で公知の方法（リガーゼを用いたライゲーション反応、官能基を利用したカップリング反応、結合分子を介した結合、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの結合を使用した反応など）により分析対象の生体分子又は磁気微粒子とそれぞれ結合させることができる。
【００７４】
共有結合を介した生体分子の磁気微粒子への固定は、例えば、分析対象の生体分子又は捕捉用タグに官能基を導入しかつ該官能基と反応性の官能基を磁気微粒子表面又は捕捉用分子に導入して両者を反応させることにより実施できる。例えば、生体分子又は捕捉用タグにアミノ基を導入し、磁気微粒子又は捕捉用分子に活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基を導入することにより共有結合を形成できる。また、分析対象の生体分子又は捕捉用タグにメルカプト基を導入し、磁気微粒子又は捕捉用分子に活性エステル基、マレイミド基又はジスルフィド基を導入してもよい。官能基を磁気微粒子の表面に導入する方法の一つとしては、所望の官能基を有するシランカップリング剤（γ-アミノプロピルトリエトキシシランなど）によって磁気微粒子を処理する方法が挙げられる。結合部位となる官能基を磁気微粒子に導入する別の方法としては、プラズマ処理が挙げられる。また物理吸着によって生体分子又は捕捉用タグを磁気微粒子に固定する方法としては、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した磁気微粒子に、生体分子又は捕捉用タグの荷電を利用して静電結合させる方法などが挙げられる。
【００７５】
磁気微粒子には、微粒子1個につき分析対象の生体分子が一分子固定されることが好ましい。例えば、磁気微粒子に1分子の捕捉用分子を結合し、その捕捉用分子を介して、分析対象の生体分子を磁気微粒子に固定することによって、一分子の固定を行うことができる。なお、磁気微粒子には、他の物質（核酸やタンパク質など）が吸着しないように、表面コーティングを行うことが好ましい。
【００７６】
磁気微粒子は、適当な溶液中に分散させることが好ましい。すなわち、本発明の方法は、磁気微粒子を溶液中に分散させる工程を含んでいてもよい。使用することができる溶液は、磁気微粒子への生体分子の固定、生体分子とプローブ分子との反応などを阻害するものでなければ、任意の溶液を用いることができる。例えば、水、塩類バッファー（生理食塩水など）、Trisバッファー、アルコール（メタノール、エタノールなど）、ケトン（アセトンなど）、エーテル（ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなど）を用いることができ、必要であれば、分散剤を添加してもよい。
【００７７】
磁気微粒子を収集及び固定する支持基体は、当技術分野で担体又は支持体として一般的に使用されている材料で作製されたものであれば特に限定されるものではなく、例えばシート、メンブレン、ゲル薄膜、キャピラリープレート、フィルムなどである。後に行う標識測定工程を考慮して、支持基体は平面状であることが好ましい。その材料としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンが挙げられる。
【００７８】
支持基体への磁気微粒子の収集及び固定は、磁力を利用して、例えば磁石を用いて行うことができる。好ましくは、後述する標識測定工程のために、磁気微粒子が単層として支持基体上に収集・固定される。
【００７９】
支持基体への生体分子又は微粒子の固定は、上述したように生体分子の微粒子への固定と同様に行うことができる。また、微粒子は、接着パッドを介して支持基体に固定することも可能である。具体的には、支持基板上の微粒子の固定位置に接着パッドを形成し、該微粒子と該接着パッドとを結合させることにより、微粒子を支持基体へ固定する。
【００８０】
接着パッドは、支持基体と異なる材質のものであれば特に限定されるものではなく、例えば金、チタン、ニッケル、アルミなどの金属及び金属酸化物などの材質のものを使用することができる。接着パッドを支持基体上に配置する方法も特に限定されるものではなく、例えば半導体分野で利用されている薄膜プロセス、具体的には蒸着及びスパッタリングによる接着パッドの形成、又は蒸着及びスパッタリング後のドライ又はウェットエッチングによる接着パッドの形成を利用することができる。接着パッドへの生体分子又は微粒子の固定も、上述したように生体分子の微粒子への固定と同様に行うことができる。
【００８１】
分析対象の生体分子は、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定されることが好ましい。そのため、接着パッドは、支持基体上に規則性をもって形成されていることが好ましい。特に、微粒子（すなわち生体分子）が空間的に分離された位置に固定されるように、接着パッド間の距離、位置を決定する。接着パッド1つあたりに固定される微粒子（すなわち生体分子）の数は1個であることが好ましい。このような固定を行うため、分析対象の生体分子又は微粒子を濃度調整して、生体分子の分子数が、支持基体上の固定位置や接着パッドの数よりも少なくなるようにする。また、分析対象の生体分子又は微粒子を含む溶液を撹拌し、支持基体と接触させることにより、衝突頻度を高めて、固定率を高めることができる。
【００８２】
次いで、支持基体上で標識の測定を行うが、標識の測定は、標識の種類に応じて、当技術分野で公知の方法及び機器を使用して行うことができる。例えば蛍光標識、発光性半導体標識及び化学発光標識は、適当な光レーザを用いて励起し、放出される光をカウントする光学系、蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて測定することができる。また酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって標識を測定することができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。本発明の方法においては、蛍光を利用して、得られる輝点をカウントすることにより、生体分子を定量的に分析することが好ましい。例えば、分析対象の生体分子に付加された共通の標識と、プローブ分子に付加された異なる標識を測定し、両者の比を算出することによって、分析対象の生体分子の全体量に対する反応した生体分子量を評価することができる。
【００８３】
上述のようにして、分析対象の生体分子における目的の生体分子の存在の有無及び／又は量を分析することができる。分析終了後、分析対象の生体分子からプローブ分子を除去することにより、磁気微粒子上に固定された分析対象の生体分子を別のプローブ分子との反応に用いることもできるし、磁気微粒子上に固定された分析対象の生体分子を除去することにより、磁気微粒子を別の生体分子の分析反応に用いることもできる。このような分子の除去は、分子の固定及び結合に使用した反応及び手段に応じて異なるが、例えば熱変性（高温処理）により行うことができる。
【００８４】
また本発明は、上述した本発明に係る生体分子分析方法を実施するための装置にも関する。本発明に係る生体分子分析装置は、例えば以下の手段を含むものである：
分析対象の生体分子を磁気微粒子上に固定する手段と、
標識したプローブ分子と分析対象の生体分子とを反応させる手段と、
前記反応工程後に、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定する手段と、
標識を測定する手段。
【００８５】
磁気微粒子上に固定する手段には、例えば分析対象の生体分子を供給する手段、磁気微粒子を供給する手段、分析対象の生体分子と磁気微粒子とを混合する反応チャンバなどが含まれる。
【００８６】
分析対象の生体分子と反応させる手段には、例えば生体分子又は捕捉分子が固定された材料（「生体分子分析用デバイス」ともいう）、プローブ分子を供給する手段、分析対象の生体分子とプローブ分子とを混合する反応チャンバ、温度調節手段などが含まれる。
【００８７】
支持基体上に収集及び固定する手段には、例えば磁石ユニット、洗浄ユニットなどが含まれる。
【００８８】
標識測定手段には、例えば蛍光標識、発光性半導体標識又は化学発光標識を測定する場合には、光照射手段、発光検出手段などが含まれる。光照射手段及び発光検出手段は、使用する標識の種類と、励起・発光波長などに応じて、選択及び設計することができる。
【００８９】
さらに本発明に係る生体分子分析装置は、洗浄液を供給する手段、洗浄液を排液する手段、分析結果を記録する手段、分析結果をデータベースと比較する手段などを備えることも可能である。
【実施例】
【００９０】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。【００９１】
［実施例１］
本実施例の分析方法を、分析対象の生体分子が核酸である場合を例にとり、図１を用いて説明する。分析対象の核酸断片101に蛍光色素103が標識された捕捉用タグ102を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め分析対象の核酸断片101と捕捉用タグ102にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、分析対象の核酸断片101がマイクロRNAの場合には、捕捉用タグ102を10〜20塩基長程度のRNA分子とし、T4RNAリガーゼを用いて両者を結合する方法が有効である。分析対象の核酸断片101に蛍光色素103が標識された捕捉用タグ102を結合させた後、蛍光体105で標識された核酸分子（プローブ分子）104とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子104は個々の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識された核酸分子で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±3℃程度に抑えることが好ましい。また、標識された核酸分子同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、相同性を70％以下、より好ましくは60％以下に抑えることが好ましい。次に、実施例６に記載した方法を用いて、磁気微粒子108に捕捉用分子106を結合分子107を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、磁気微粒子108上に、分析対象の核酸断片101と蛍光体105で標識された核酸分子104のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体105には、Cy3やCy5などの通常の蛍光色素分子や、Zn-Seなどからなる半導体微粒子、さらに、Genisphere社から製品として市販されているデンドリマーに蛍光色素を数百分子付けたものを用いることができる。【００９２】
次に、このハイブリッドを形成した磁気微粒子108を支持基体110上に磁石109を用いて収集・固定する。【００９３】
最後に、蛍光色素103と蛍光体105の蛍光を検出器111で測定し、蛍光色素103と、各蛍光体105の種類ごとの輝点数を算出する。蛍光色素103の輝点数は、分析対象の核酸断片101の総数に対応し、各蛍光体105の種類ごとの輝点数は各種類の核酸断片数に相当する。したがって、両者の比を算出することで、分析対象の総核酸断片数に対する各核酸断片数の割合を算出することができる。この比を算出することは、試料間の核酸断片の発現比較解析をする場合に特に有用である。例えば、健常者と特定の疾患の患者間で発現量の異なるマーカー遺伝子を探索する場合、両試料間で発現量の等しい遺伝子を見つけ出して、その発現量で規格化することが必要になるが、両試料間で発現量の等しい遺伝子を見つけることは実際上非常に困難である。特に、定量PCRではその困難性が指摘されている（Nature Methods 2010, Vol. 7, pp 687-692）。これに対して、本実施例の方法では、試料全体に対する割合が個々の生体分子に対して簡便に算出されるため、健常者と患者の比較も直接、試料中の全生体分子数に対する割合で比較することができる。この点は、特に、臨床検体での核酸分子の比較解析には有用となる。【００９４】
識別すべき生体分子の種類数が多い場合には、標識の蛍光体105として、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。例えば、2種類の蛍光体の含有量を各々10種のレベルとし、2種類の蛍光体の含有量のレベルを変えて混合することで、100種類の蛍光ビーズを作製することができ、蛍光体の数を3種類とすれば、1000種類の識別が可能なビーズセットを容易に作ることができる。例えば、ルミネックス社から2波長のレーザ光で励起することで100種類の識別ができる蛍光ビーズセットが市販されている。これらの蛍光ビーズの表面を化学修飾し、核酸分子と結合させることで蛍光体標識付核酸分子104を作製することができる。ハイブリダイゼーション後、適切な非特異吸着物の洗浄を行い、続いて蛍光検出を行うことで、分析対象の核酸断片101の分析を行う。蛍光体標識としてCy3やCy5などの通常の蛍光色素分子を一分子だけ付けた蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）104の場合には、支持基体110上の分析対象の核酸断片101を固定した箇所から、一分子蛍光が観察されることになる。この場合、蛍光が微弱であるため、電子増倍CCD（EM-CCD）など高感度の蛍光検出機が必要となる。蛍光体として蛍光ビーズを用いた場合には、一分子蛍光よりも強い蛍光が発せられるため、通常のCCDでも十分検出できる。【００９５】
一分子固定磁気微粒子108（108個）と核酸分子104（1.7nM）を液ボリューム10ulで攪拌しながら反応させた場合、反応時間が約3時間程度で反応効率が飽和値に到達した。この時間は、A molecular Cloning Manual DNA Microarrays 2002, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 228-239に記載されているDNAマイクロアレイの一般的なハイブリダイゼーションに要する時間（14〜16時間）に比べて非常に短く、結合反応が迅速に進行していることが明らかとなった。このことから、本発明により、生体分子とプローブ分子としての核酸分子との結合反応を迅速に行うことができ、生体分子分析を迅速に行うことができると言える。【００９６】
上記実施例では、分析対象の生体分子試料を一分子ずつ微粒子上に固定した例を示したが、一分子ずつ固定したほうが、計数する上で容易ではあるが、一分子ずつ固定することは必須の条件ではなく、二個又は三個ずつ固定されても、計数ができさえすれば、分析対象の生体分子試料の種類と存在量を分析するという、本発明の目的が達成される。【００９７】
［実施例２］
本実施例の分析方法を、分析対象の生体分子がタンパク質である場合を例にとり、図２を用いて説明する。【００９８】
分析対象のタンパク質204に特異的に結合する抗体202を結合分子203を介して磁気微粒子201表面に固定する。磁気微粒子201に特別な制約はないが、溶液中でタンパク質試料と反応する必要があるため、分散性が高いことが好ましい。直径は100ミクロン以下、より好ましくは10ミクロン以下が好ましい。抗体付き微粒子をタンパク質試料と溶液中で反応させることで、分析対象のタンパク質204が磁気微粒子201上に捕捉される。次に、蛍光色素標識を施した抗体（プローブ分子）205を反応させることで、磁気微粒子201に捕捉された分析対象のタンパク質204を蛍光標識することができる。次に、磁気微粒子201を支持基体206表面に、磁石207を用いて、簡便に、収集・固定することができる。次に、支持基体206の表面に集まった分析対象のタンパク質204に光を照射することで、蛍光輝点を検出器208で検出する。蛍光輝点数は、分析対象のタンパク質204の濃度に相関することから、輝点数を求めることで、分析対象のタンパク質204の濃度に関する情報を得ることができる。特に、実施例６に記載した方法を用いて、磁気微粒子201に抗体202を一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを用いることで、分析対象のタンパク質204の絶対濃度を求めることができる。【００９９】
［実施例３］
本実施例のデバイス構成及び分析方法を、図３を用いて説明する。【０１００】
本実施例のデバイス構成は以下の通りである。支持基体301の上に接着パッド302が形成してある。支持基体301としては、石英等のガラス基板やシリコンウエハなどを用いることができる。接着パッド302としては、支持基体301と異なる材質であればよく、金属又は金属の酸化物を用いることができる。接着パッド302の作製方法は実施例５で詳細を述べる。接着パッド302は支持基体301上に規則性を持って形成されていることが好ましいが、詳細は実施例５で述べる。接着パッド302の上には微粒子303が固定されている。接着パッド1つ当たり固定される微粒子数は1個である。微粒子303には、捕捉分子304が結合分子305を介して一分子のみ固定されている。分析対象の核酸断片306の種類に依存して、捕捉用タグ分子307、捕捉分子304、結合分子305にはいろいろな組合せの分子群を用いることができる。例えば、分析対象の核酸断片306がRNAの逆転写物である場合には、捕捉用タグ分子307は逆転写反応時のプライマDNAを用いることができ、捕捉分子304として捕捉用タグ分子307の相補配列を有する核酸分子を用いることができる。あるいは、捕捉用タグ分子307として末端にビオチンを有する核酸分子とし、捕捉分子304として末端にアビジンを有する分子を用いることもできる。結合分子305には炭素数10程度以下のアルカン分子を用いることができ、化学結合を介して捕捉分子304に結合し、反対側の末端にはビオチンがついているものを用いることができる。その場合、微粒子303の表面にはアビジン、ストレプトアビジンなどが修飾されていることが望ましい。捕捉用タグ分子307と捕捉分子304の反応は、両者が相補配列を有する核酸分子の場合には、ハイブリダイゼーションが好ましい。また、ライゲーションにより両者を化学結合で結びつける方法を用いることも好ましい。結果として、支持基体301上には、規則的な配置で、分析対象の核酸断片306が一分子ずつ孤立した状態で固定されることになる。分析対象の核酸断片306の絶対数を求めるには、核酸断片306の数よりも接着パッド302及び微粒子303を多くすればよい。核酸断片306の総分子数は核酸断片306の総重量から推測できる。総重量は波長260nmの吸光度から求める。ここから算出された分子数が、接着パッド302の数よりも少なくなるように試料濃度を希釈する。分析対象の核酸断片306をより多く固定するには以下の方法で達成できる。例えば、接着パッド302表面に結合分子としてアルカン分子で覆い、ポリスチレンなどのポリマーで構成される微粒子303と分子間力により結合させることである。これにより、接着パッド302に対して微粒子303が接近することで速やかに結合が起こり一度接着すれば剥がれることはない。さらに微粒子303が接着パッド302に衝突する頻度を高めることで固定率が高まる。衝突頻度を高めるには、微粒子303を含む溶液を撹拌することが望ましい。具体的には、微粒子303を含む溶液を通す流路に溝又は突起物を配置し、流れを層流から乱流に変える方法である。このとき、接着パッド302を配置している支持基体301からの液厚は薄い方がよく、衝突頻度を上げることができる。この流路構造に関しては実施例９に詳細に記述する。すべての微粒子303が接着パッド302に結合したことを確認するためには、反応後の溶液を基板上に乾燥固定後、捕捉用タグ分子307をライゲーションにより結合させて検出されないことを確認すればよい。【０１０１】
次に、固定した分析対象の核酸断片306の種類の同定と存在数を求める。蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308を分析対象の核酸断片306を固定した支持基体301に反応させる。分析対象の核酸断片306と相補的な核酸配列を蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308は含むことになる。蛍光体標識には、Cy3やCy5などの通常の蛍光色素分子やZn-Seなどからなる半導体微粒子を用いることができる。識別すべき評価目的の核酸断片の数が多い場合には、蛍光体標識として、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。例えば、2種類の蛍光体の含有量を各々10種のレベルとし、2種類の蛍光体の含有量のレベルを変えて混合することで、100種類の蛍光ビーズを作製することができ、蛍光体の数を3種類とすれば、1000種類の識別が可能なビーズセットを容易に作ることができる。例えば、ルミネックス社から2波長のレーザ光で励起することで100種類の識別ができる蛍光ビーズセットが市販されている。これらの蛍光ビーズの表面を化学修飾し、核酸分子と結合させることで蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308を作製することができる。【０１０２】
ハイブリダイゼーション後、適切な非特異吸着物の洗浄後、蛍光検出を行うことで、分析対象の核酸断片306の分析を行う。蛍光体標識にCy3やCy5などの通常の蛍光色素分子を一分子だけ付けた蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308の場合には、支持基体301上の分析対象の核酸断片306を固定した箇所から、一分子蛍光が観察されることになる。この場合、蛍光が微弱であるため、EM-CCDなど高感度の蛍光検出機が必要となる。蛍光体として蛍光ビーズを用いた場合には、一分子蛍光よりも強い蛍光が発せられるため、通常のCCDでも十分検出できる。接着パッド302は支持基体301上に規則性高く、例えば格子状に形成されるため、蛍光画像においても、規則性を持った位置に蛍光の輝点が観測される。そのため、非特異的に蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308が支持基体301上に付着しても、蛍光画像の輝点位置から容易に識別・除去することができる。この点は、微量な試料の解析、微弱な蛍光観察において、実際上、非常に有用な特徴である。蛍光体又は蛍光ビーズの識別には、回折格子を用いて発光スペクトルを分光してCCDの感光面に照射し、波長方向に分けた各画素の強度を調べることで、蛍光体又は蛍光ビーズの種類を識別できる。あるいは、反射特性に大きな波長依存性を持たせたダイクロイックミラーを用いて、反射光と透過光の比率を用いて、蛍光体又は蛍光ビーズの種類を識別することもできる。個々の輝点の識別を行った後、それらを集計することで、分析対象の核酸断片306の種類と輝点数、すなわち、存在量（絶対濃度）の情報を最終的に得ることができる。例えば、接着パッド302を1μmピッチで作製した場合、1mm角の中に106個の接着パッドが存在するので、最大総分子数106の中で所定の種類の目的核酸断片が何分子存在するかを調べることができる。【０１０３】
以下、具体的な分析対象としてマイクロRNAを例に取り、詳細を説明する。【０１０４】
分析対象がマイクロRNAの場合には、既知のマイクロRNAの塩基配列データベース（例えばhttp://www.microrna.org/）から、個々のマイクロRNA分子の配列データを取得できる。これを基に、逆転写用のプライマを設計できる。プライマの塩基長は10〜15塩基程度が好ましく、5’端に捕捉用タグ分子307として10塩基のDNAを付加する。例えば、ヒトマイクロRNAを対象とし、1000種類のプライマを設計・合成する。合成した1000種類のプライマを等量ずつ混ぜたプライマのカクテルを作製し、トータルRNAを対象に、逆転写用プライマのカクテル、逆転写酵素を混合後、37〜40℃の環境下で逆転写反応を起こし、cDNAを合成することで分析対象の核酸断片306と捕捉用タグ分子307を結合させたものを得る。あるいは、分析対象の核酸断片306としてRNAを、捕捉用タグ分子307として10塩基程度のRNAを用い、両者をT4RNAリガーゼを用いて結合させることで分析対象の核酸断片306に捕捉用タグ分子307を結合させることもできる。微粒子303には、予め、捕捉用タグ分子307の10塩基の核酸に対する相補鎖DNAを捕捉分子304として一分子固定しておく。微粒子303に対する捕捉分子304の一分子固定に関しては、実施例８に詳細を記載した。cDNA（分析対象の核酸断片306と捕捉用タグ分子307を結合させたもの）を支持基体上で常套手段によりハイブリダイゼーションを行うことで、分析対象の核酸断片306を支持基体上に固定する。【０１０５】
前記と同様に、既知のマイクロRNAの塩基配列データベースから、個々のマイクロRNA分子の配列データを取得し、この配列と同じ塩基配列で、5’端にビオチンを修飾した合成オリゴを1000種類合成する。【０１０６】
蛍光ビーズに使う蛍光体として、例えば、Cy5、Cy5.5、Cy3を用いることができ、励起光には532nm、633nmの2種類で対応できる。各色素の濃度比が異なる溶液を作製し、スチレンモノマーからポリスチレンビーズを合成する段階で混合することで、所定の色素混合比のポリスチレンビーズを作製できる。ポリスチレン表面にアビジン等の修飾を施すには、アクリル酸/メタクリル酸とスチレンの共重合反応を用いることでビーズ表面にカルボキシル基を導入しておき、アビジンのアミノ基とカルボジイミドを架橋剤として反応させることで容易に修飾できる。【０１０７】
アビジン修飾した蛍光ビーズと5’端にビオチンを修飾した合成オリゴを反応させることで、蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308を合成することができる。【０１０８】
次に、分析対象の核酸断片306を固定した支持基体301に、蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308を通常の方法を用いてハイブリダイゼーションさせる。【０１０９】
ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄液で洗浄後、蛍光画像を取得し、各接着パッド302の蛍光輝点がどの種類の蛍光ビーズに相当するかを識別した上で輝点を計数することで、各種マイクロRNAの存在量を解析することができる。【０１１０】
検出できる核酸種の数は、識別し得る蛍光ビーズの数に依存する。マイクロRNAの種類として凡そ1000種類が存在すると仮定した場合、1000種類の蛍光ビーズを作製すればよく、前述のように、蛍光体の含有量を各々10種のレベルとし、3種類の蛍光体の含有量のレベルを変えて混合することで、1000種類の識別が可能なビーズセットを容易に作ることができ、全マイクロRNA種のすべてを一度に検出することができる。また、特定のマイクロRNAだけの発現量を調べたい場合には、特定のマイクロRNA種に対応した蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308を作製し、蛍光ビーズもその数だけ用意する。特定のマイクロRNA種以外のマイクロRNA種に対しては、それら以外で同一の蛍光ビーズを用いることで、蛍光ビーズの種類として1000種類を用意しなくとも、全マイクロRNAの存在量を輝点の計数値として知ることができ、また、特定のマイクロRNAの全マイクロRNAに対する存在比を求めることができる。【０１１１】
あるいは、捕捉用タグ分子307に、蛍光体標識付核酸分子308とは異なる発光波長又は発光強度を有する共通の蛍光色素標識を予め施しておき、捕捉用タグ分子307に標識した蛍光色素による蛍光輝点数を全核酸試料分子数に相当するもの、各種の蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）308に標識した蛍光体の蛍光輝点数を各種の核酸試料分子数に相当するものと判断し、両者の輝点数の比を各種の核酸試料分子の存在比率と判断することも、特定の核酸分子だけの発現量を調べたい時には、極めて、有効である。【０１１２】
さらに、本発明の方法は、核酸試料のみならず、タンパク質などの核酸試料以外の生体分子の解析にも、捕捉分子304を最適化することで、適用できる。複数の生体分子種から構成される生体分子試料に対しては、分析対象の生体分子306を支持基体301上の規則性を有する位置に、適切な抗体などを捕捉分子304に用いることで各固定箇所一箇所に前記生体分子306を一分子ずつ固定し、特定の生体分子に結合することが既知であるプローブ分子308を前記支持基体301上に固定した生体分子306と反応させ、前記プローブ分子308を検出することで、核酸試料の場合と同様に分析することができる。したがって、分析対象の生体分子の種類と絶対数を評価でき、一分子の感度及び分解能で、生体分子を簡便かつ迅速に分析することができる。【０１１３】
［実施例４］
本実施例のデバイスの構成を、図４を用いて説明する。支持基体401の上に接着パッド402が規則正しく、例えば図４に示すように格子状に形成されている。接着パッド402と微粒子403は、線状分子405を介して化学結合又は化学的相互作用により結ばれている。線状分子405の末端の官能基406と、接着パッド402とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基406は、支持基体401との相互作用が弱く、接着パッド402との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、支持基体401としては、石英ガラス、サファイア、シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド402には、金、チタン、ニッケル、アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基406は、支持基体401と接着パッド402との組合せを考えて選択する必要があるが、例えば、スルホヒドリル基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、アルデヒド基等を用いることができる。線状分子405は、微粒子403と接着パッド402を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして3から20程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子405の末端の官能基407は、微粒子403との接着性をもたらす。また、線状分子405として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基406を有する側鎖と官能基407を有する側鎖を併せ持つものを用いることができる。微粒子403としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径5nm〜100nmのものが市販されており、利用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が10nm〜20nm程度のCdSe等の化合物半導体が市販されており、利用することができる。官能基407として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基、アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基407としてビオチンを用いることができる。さらに、微粒子403として、ポリスチレンなどの高分子材料からなる微粒子を用いることもできる。高分子材料の場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十nmから数μmまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定する捕捉分子404の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、捕捉分子404を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。【０１１４】
捕捉分子404には、DNAやRNAの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基407と同様に予め修飾しておき、微粒子403と反応させておく。一つの微粒子403に固定する捕捉分子404は一分子であることが好ましく、接着パッド402の上には捕捉分子404が一分子だけ固定されることになる。【０１１５】
簡便な蛍光検出でプローブを識別する場合、回折限界を考慮するとプローブ間が1μm程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子403のサイズは1μm以下であることが適している。【０１１６】
接着パッド402を支持基体401上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライ又はウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると1μm以上が好ましい。【０１１７】
接着パッド402を支持基体401上に形成した後、微粒子403と接着パッド402を結ぶ線状分子405を供給し、接着パッド402上に線状分子405を固定する。この際、支持基体401上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子405を供給する前に、支持基体401との接着力の強い材料を支持基体401上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。次に、捕捉分子404を固定した微粒子403を支持基体401上に供給して、微粒子403を接着パッド402上に固定させることにより、生体分子分析用デバイスを完成する。【０１１８】
接着パッド402上に微粒子403を固定させる際、一つの接着パッド402に複数個の微粒子403が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の異なる生体分子の情報が重なり合ってしまい、正確な分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド402には、1個の微粒子403を固定する必要がある。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド402の直径dが微粒子403の直径Dに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド402に1個の微粒子403を固定できることを見出した（例えばWO 2010/087121号）。接着パッド402に比べて同等以上の大きさの微粒子403が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子403がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド402の直径dが微粒子403の直径Dに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が1個になることが判明した。したがって、微粒子403の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド402の直径dが微粒子403の直径Dに比べて小さいことが好ましく、微粒子403の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド402の直径dは必ずしも微粒子403の直径Dよりも小さくなくてもよいことが明らかとなった。【０１１９】
［実施例５］
本実施例の分析用デバイスの製造方法を、図５を用いて説明する。平滑な支持基体501上に電子線用ポジ型レジスト502をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体501としては、ガラス基板、サファイア基板、シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子506を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジスト502としては、例えば、ポリメチルメタクリレートやZEP-520A（日本ゼオン社製）を挙げることができる。支持基体501上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径15nmのスルーホールを形成する。並行処理で分析できる生体分子の分子数に依存するが、スルーホールは1μm程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ、歩留まりの高さ、及び並行処理で分析できる生体分子の分子数を勘案すると、適している。スルーホール形成領域も、並行処理で分析できる生体分子の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。例えば、1μmピッチで反応サイト（接着パッド）を構成した場合、スルーホール形成領域を1mm×1mmとすると、100万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着パッド503を構成する材料、例えば金、チタン、ニッケル、アルミをスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体501としてガラス基板、サファイア基板を用い、接着パッド503の材料として金、アルミ、ニッケルを用いる場合には、支持基体材料と接着パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着パッド503に線状分子504を反応させる。接着パッド503が金、チタン、アルミ、ニッケルの場合には、線状分子504末端の官能基505としては、各々、スルホヒドニル基、リン酸基、チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子504の反対側の官能基506には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子504を接着パッド503と反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着パッド503を形成した以外の支持基体501表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチド（プローブ分子）に対する吸着防止を実現するには、負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子507でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液（pH5〜pH6程度）で処理することにより、エポキシ基を開環させOH基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。【０１２０】
微粒子508表面には、予めアビジン509を修飾しておくことが好ましい。金又は白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製NHS-Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金又は白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド（Pierce社製NHS-Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子508として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が15〜20nmである製品名「Qdot(R)ストレプトアビジン標識」（インビトロジェン社製）を利用することができる。また、微粒子508として、ポリスチレンビーズを用いることもできる。例えば、直径が40nmである製品名「フルオスフィア ニュートラビジン修飾」（インビトロジェン社製）を利用することができる。捕捉分子510としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子508上に固定できる。捕捉分子510を固定した微粒子508を接着パッド503上に固定することにより、本実施例の分析用デバイスを製造することができる。【０１２１】
［実施例６］
本実施例では、捕捉用分子（分析対象の生体分子が核酸の場合には核酸、タンパク質の場合には抗体が好ましい）を一分子だけ固定した微粒子の製造方法の一例を、特に、微粒子一個につき一分子の捕捉用分子を固定する方法を図６を用いて説明する。微粒子601の表面に捕捉用分子604を固定するための結合サイト602を結合させておく。例えば、結合サイトとしてストレプトアビジンを用いることができ、市販のストレプトアビジンコート微粒子（インビトロジェン社製）を微粒子として用いることができる。捕捉用分子604には予め、結合サイト603を修飾しておく。結合サイト603には微粒子601表面の結合サイト602と容易に結合するものを選択する。例えば、結合サイト602として前記のストレプトアビジンを用いた場合には結合サイト603としてビオチンを用いる。次に、微粒子601と捕捉用分子604を反応させることで、捕捉用分子604を微粒子601に結合させる。微粒子601一個につき一分子の捕捉用分子604を固定するには、単位体積中の捕捉用分子604の分子数を微粒子601の個数よりも少なくすることが好ましい。微粒子601よりも捕捉用分子604が過剰にあると微粒子601一個当たりの捕捉用分子数が一分子よりも多くなる可能性が高いからである。発明者らが検討した結果では、微粒子601の数を捕捉用分子604の数よりも10倍多くして反応させると、凡そ90％の微粒子601には捕捉用分子604は固定されず、約9％の微粒子601には捕捉用分子604が一分子固定されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果と良く一致している。したがって、捕捉用分子604を捕捉した微粒子601のみを捕集すれば、捕集した微粒子601のうち90％以上は捕捉用分子604を一分子のみ固定した微粒子601となる。【０１２２】
捕捉用分子604が核酸の場合には、捕捉用分子604の末端配列と相補的な配列を持ち末端に結合サイト606が修飾されたオリゴヌクレオチド605を用意し、結合サイト606と結合する結合サイト608を予め、回収用微粒子607の表面にコートしておく。こうして作製した回収用微粒子607を用いることで捕捉用分子604を固定した微粒子601を回収用微粒子607に結合することができる。捕集方法としては、例えば、水溶液609中で、ポリプロピレン等の比重の軽いポリマーからなる回収用微粒子607に捕捉用分子604を結合させて、捕捉用分子604が固定された微粒子601のみが浮遊するようにし、捕捉用分子604が固定されていない微粒子601は、容器の下に沈むようにすることで、捕捉用分子604が固定された微粒子601のみを分離・収集することができる。回収用微粒子607から微粒子601を単離するには、例えば、捕捉用分子604とオリゴヌクレオチド605の二本鎖を分離するディネイチャー処理（高温処理）を用いることができる。分離後、磁石610を用いることで、捕捉用分子604が固定された微粒子601を単離することができる。【０１２３】
捕捉用分子604が抗体の場合には、捕捉用分子604と特異的に結合するアプタマー配列を有するオリゴヌクレオチド605を用意することで、上記の捕捉用分子604が核酸の場合と同様に、回収用微粒子607を用いて、捕捉用分子604を固定した微粒子601を90％以上と高い割合で分離、収集することができる。回収用微粒子607から微粒子601を単離するには、例えば、捕捉用分子604とアプタマーのオリゴヌクレオチド605を分離する加熱処理を用いることができる。【０１２４】
［実施例７］
本実施例のデバイスの構成及び分析方法を、図７を用いて説明する。分析対象の核酸断片701に蛍光色素703が標識された捕捉用タグ分子702を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め分析対象の核酸断片701と捕捉用タグ分子702にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、分析対象の核酸断片701がマイクロRNAの場合には、捕捉用タグ分子702を10〜20塩基長程度のRNA分子とし、T4RNAリガーゼを用いて両者を結合する方法が有効である。分析対象の核酸断片701に蛍光色素703が標識された捕捉用タグ分子702を結合させた後、蛍光体705で標識された核酸分子（プローブ分子）704とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子（プローブ分子）704は個々の評価目的の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識された核酸分子（プローブ分子）で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±3℃程度に抑えることが好ましい。また、標識された核酸分子（プローブ分子）同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、相同性を70％以下、より好ましくは60％以下に抑えることが好ましい。次に、実施例６に記載した方法を用いて、微粒子708に捕捉分子706を結合分子707を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、微粒子708上に、分析対象の核酸断片701と蛍光体705で標識された核酸分子（プローブ分子）704のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体705には、実施例３で述べたように、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。【０１２５】
次に、このハイブリッドを形成した微粒子708を支持基体710に形成しておいた接着パッド709上に固定する。固定反応条件は実施例３に記載した条件を適用することができる。【０１２６】
最後に、蛍光色素703と蛍光体705の蛍光を検出器711で検出し、蛍光色素703と、各蛍光体705の種類ごとの輝点数を算出する。蛍光色素703の輝点数は、分析対象の核酸断片701の総数に対応し、各蛍光体705の種類ごとの輝点数は各種類の核酸断片数に相当する。このようにすべての分析対象とする核酸断片について輝点数をカウントすることによって試料に含まれる生体分子の絶対分子数を求めることができる。また、両者の絶対数の比を算出することで、分析対象の総核酸断片数に対する各核酸断片数の割合を算出することができる。この比を算出することは、試料間の発現比較解析をする場合に特に有用である。例えば、健常者と特定の疾患の患者間で発現量の異なるマーカー遺伝子を探索する場合、両試料間で発現量の等しい遺伝子を見つけ出して、その発現量で規格化することが必要になるが、試料間で発現量の等しい遺伝子を見つけることは実際上非常に困難である。特に、定量PCR法ではその困難性が指摘されている（Nature Methods 2010, Vol. 7, pp 687-692）。これに対して、本実施例の方法では、試料全体に対する割合が個々の目的生体分子に対して簡便に算出されるため、健常者と患者の比較も直接、試料中の全生体分子数に対する割合で比較することができる。この点は、特に、臨床検体での核酸分子の比較解析には有用となる。【０１２７】
［実施例８］
実施例８では捕捉分子を一分子だけ固定した微粒子803の固定率を著しく向上させる方法とデバイスの構成を、図８を用いて説明する。その方法の一つは捕捉分子を一分子だけ固定した微粒子803を含む溶液を接着パッド802を配置した支持基体801上に滴下して、乾燥しないように蓋をしてしばらく放置して反応させる方法である。このとき微粒子803はブラウン運動により、確率的に接着パッド802に接近する。例えば、接着パッド802表面に結合分子としてアルカン分子で覆い、ポリスチレンなどのポリマーで構成される微粒子803と分子間力が働くようにすることで、接着パッド802に対して微粒子803が接近することで速やかに結合が起こり一度接着すれば剥がれることはない。さらに能動的な衝突を促進するために、溶液を撹拌子で撹拌する、熱又はマイクロ波を加えて溶液を対流させる、などによって微粒子803が接着パッド802に衝突する頻度を高めることができる。さらに微粒子803の衝突頻度を積極的に高める効果的な方法として微粒子803を含む溶液を流路で撹拌する方法がある。この方法に関して図８を用いて説明する。まず、図８のAに示したように、支持基体801上に流路を配置し、流路の蓋には図８のBで示すような溝を切った凹凸板804を使用する。流路形成部材としてはシランカップリング剤などで非特異的吸着防止処理をした石英やPDMS（Polydimethylsiloxane）などが好ましい。通常、微小な流路に溶液を一定方向に流すと、溶液は層流となって流路を通過する。そのため、支持基体801に近い層にある微粒子803のみが、接着パッド802に固定され、支持基体801から離れた層にある微粒子803は支持基体801に接近することができない。例えば、静置又は層流中で微粒子803を接着パッド802に分子間力で吸着させる場合、ポテンシャルエネルギーは距離の6乗に反比例するため、支持基体801の近傍、せいぜい数十マイクロメートル付近に存在する微粒子803のみが衝突の機会を得られる。微粒子803の接着パッドに対する衝突頻度は微粒子803の濃度に比例するため、支持基体801の表層の微粒子803は一定時間後にほとんどが接着パッド802に固定される。そのため、液層間の微粒子803の移動は拡散のみとなり、表層近傍とそれ以外の液層に濃度差が生じ、接着パッド802に対する実質的な微粒子803の濃度は著しく低下する。【０１２８】
そこで図８のBに示すような、凹凸板804を流体の進行方向に配置する。図８の例では、支持基体801に対面するように配置した構成を示している。一定方向に進行する流体がこの凹凸板804を通過する過程でX方向を軸とする渦、又は乱流が発生して、Z軸方向にも流体が移動する。流れ方は凹凸板804の形状に依存する。こうした現象の一例はScience 2002, Vol. 295, pp 647-650で説明されている。【０１２９】
以上の方法で上下方向の流れを発生させることによって、溶液内に含まれる微粒子803の接着パッド802に対する衝突頻度が著しく向上する。同時に、溶液を支持基体801上で静置して反応させる方法と比較して、時間を著しく短縮することができる。一般に、1マイクロメートルの微粒子の拡散速度は0.1〜1マイクロメートル毎秒であるのに対して、図８のBのような凹凸板804を配置し、流速200マイクロメートル毎秒で溶液を流した場合、Z軸方向に約10マイクロメートル毎秒の流れが発生する。したがって、静置に比べて理論上、約10〜100倍反応速度が向上する。また、反応チャンバをダイヤフラムポンプなどで流路の出入口をチューブで接続することによって、流体の進行方向は一方向だけでなく、一定の周期で方向を転換させることができ、微量な液量でも繰り返し撹拌をすることもできる。このとき、接着パッド802を配置している支持基体801からの液厚は薄い方がよく、より衝突頻度を上げることができる。105分子の生体分子（すなわち微粒子）を106の接着パッドに対して、長さ10ミリメートル、幅5ミリメートル、高さ1ミリメートルの反応チャンバ内で反応させる場合、流速200マイクロメートル毎秒で溶液を15回往復させると約50％の生体分子が接着パッドに固定される計算になる。さらに約95％の生体分子（すなわち微粒子）を固定するには、約100回の往復が必要になるが、要する時間は約80分間程度である。実際に同程度の流れを10回程度発生させた場合、反応効率は静置条件に比べて約30％程度増加した。撹拌は微粒子803の固定率を上げるだけでなく、分析対象の生体分子と捕捉分子のハイブリダイゼーションや、検出用の蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）と分析対象の生体分子のハイブリダイゼーションの効率を上げる目的にも同様に利用することができる。【０１３０】
［実施例９］
本実施例の分析方法を、図９を用いて説明する。分析対象の核酸断片901に蛍光色素903が標識された捕捉用タグ分子902を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め分析対象の核酸断片901と捕捉用タグ分子902にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、分析対象の核酸断片901がマイクロRNAの場合には、捕捉用タグ分子902を10〜20塩基長程度のRNA分子とし、T4RNAリガーゼを用いて両者を結合する方法が有効である。分析対象の核酸断片901に蛍光色素903が標識された捕捉用タグ分子902を結合させた後、蛍光体905で標識された核酸分子（プローブ分子）904とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子（プローブ分子）904は個々の評価目的の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識された核酸分子（プローブ分子）で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±3℃程度に抑えることが好ましい。また、標識された核酸分子（プローブ分子）同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、相同性を70％以下、より好ましくは60％以下に抑えることが好ましい。次に、実施例６に記載した方法を用いて、微粒子908に捕捉分子906を結合分子907を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、微粒子908上に、分析対象の核酸断片901と蛍光体905で標識された核酸分子904のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体905には、実施例１で述べたように、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。【０１３１】
次に、このハイブリッドを形成した微粒子908を流路909中に流し、励起光を照射することで、蛍光色素903の蛍光と蛍光体905の蛍光強度を検出器910で検出する。流路909の直径を、微粒子908の直径の2倍以下とすることで、同時に複数個の蛍光色素903の蛍光を測定することなく、一個一個の微粒子908を識別して蛍光を測定できるため好ましい。蛍光色素903の蛍光輝点数をカウントし、総核酸断片数に相当する値を得る。一方、蛍光色素903の蛍光と蛍光体905の蛍光が同時に測定された場合にのみ、特定の蛍光体の輝点をカウントし、各種類の核酸断片数に相当する値を得る。すべての蛍光体の輝点をカウントすることで核酸断片数の絶対数が得られる。両者の絶対数の比を算出することで、試料中の総核酸断片数に対する各核酸断片数の割合を算出することができる。本実施例の方法では、個々の遺伝子の発現量が全遺伝子の発現量に対する発現量の比で得られるため、異なる試料間、例えば健常者と患者試料の比較も直接、比較することができる。この点は、特に、臨床検体での核酸分子の比較解析には有用となる。【０１３２】
微粒子908として、ポリスチレンなどの高分子からなる微粒子を用いることも可能であるし、高分子中に磁性金属粉体を含有したような磁気微粒子を用いることも可能である。特に、磁気微粒子を用いた場合には、反応後の微粒子908を流路909に流す前に、反応液中に残っている微粒子908に固定されていない未反応の、蛍光色素903が標識された捕捉用タグ分子902や、蛍光体905で標識された核酸分子（プローブ分子）904を、容易に取り除くことができ、蛍光色素903の蛍光と蛍光体905の蛍光が同時に測定された場合にのみ、特定の蛍光体の輝点をカウントする際に、測定が容易になるという大きなメリットがあり、好ましい。【０１３３】
［実施例１０］
本実施例では、生体分子分析方法に用いる生体分子分析装置の好ましい構成の一例について、生体分子が核酸の場合を例にとり、図１０を参照しながら説明する。【０１３４】
本実施例の核酸分析装置は、核酸分析用デバイス基板に対して、核酸試料溶液、蛍光標識付分子溶液及び洗浄液を供給する手段と、反応チャンバにおいてハイブリダイゼーションを行うための温度調節手段と、核酸分析用デバイス基板に光を照射する手段と、蛍光標識付分子の蛍光体の蛍光を測定する発光検出手段、を備える。より具体的には、核酸分析用デバイス基板1001を温調プレート1003上に置き、流路1004を設けた流路部材1002をその上に貼り合せることで反応チャンバを形成する。流路部材1002には、例えばPDMS（Polydimethylsiloxane）を使用することができる。【０１３５】
注入口1014には送液ユニット1005が接続されており、送液ユニット1005中に保管されている、核酸試料溶液、蛍光標識付分子溶液及び洗浄液が順次、核酸分析用デバイス基板1001上の反応チャンバへ供給される。核酸試料溶液及び蛍光標識付分子溶液が反応チャンバへ供給された後、流路1004中で溶液は核酸分析用デバイス基板1001上の反応チャンバに保持され、温調プレート1003で30℃から80℃の温度範囲でハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーション後、磁石ユニット1016によって反応チャンバ内の磁気微粒子が核酸分析用デバイス基板1001上に収集・固定された後、送液ユニット1005から洗浄液が反応チャンバに供給され、未反応物が洗浄される。【０１３６】
洗浄後、蛍光検出が行われる。励起光源は、用いる蛍光体の種類によって適切なものを選択できる。例えば、蛍光ビーズに使う蛍光体として、Cy5、Cy5.5、Cy3を用いる場合には、励起光には532nm（YAGレーザ）、633nm（He-Neレーザ）の2種類で対応できる。YAGレーザ光源（波長532nm，出力20mW）1007及びHe-Neレーザ光源（波長633nm，出力20mW）1013から発振するレーザ光をダイクロイックミラー1015によって、前記2つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ1008を通過させ、ダイクロイックミラー1009によって対物レンズ1006に導き、核酸分析用デバイス基板1001上に照射される。蛍光標識付分子から発せられる蛍光は、励起光と同軸光路を逆に進み、対物レンズ1006で集められた後ダイクロイックミラー1009を通過し、結像レンズ1011により2次元CCDカメラ1012の感光面上に結像される。励起光の散乱光は光学フィルタ1010によって除去される。【０１３７】
上記のように、送液ユニット、温調プレート、励起光源及び蛍光検出ユニットで核酸分析装置を組上げることにより、自動でハイブルダイゼーションによる核酸分析を行うことが可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。【０１３８】
なお、生体分子がタンパク質の場合にも、同じ装置構成の分析装置で分析できる。
【符号の説明】
【０１３９】
101  分析対象の核酸断片
102  捕捉用タグ
103  蛍光色素
104  核酸分子（プローブ分子）
105  蛍光体
106  捕捉用分子
107  結合分子
108  磁気微粒子
109  磁石
110  支持基体
111  検出器
201  磁気微粒子
202  抗体
203  結合分子
204  分析対象のタンパク質
205  蛍光標識を施した抗体（プローブ分子）
206  支持基体
207  磁石
208  検出器
301  支持基体
302  接着パッド
303  微粒子
304  捕捉分子
305  結合分子
306  分析対象の核酸断片（生体分子）
307  捕捉用タグ分子
308  蛍光体標識付核酸分子（プローブ分子）
401  支持基体
402  接着パッド
403  微粒子
404  捕捉分子
405  線状分子
406  官能基
407  官能基
501  平滑な支持基体
502  電子線用ポジ型レジスト
503  接着パッド
504  線状分子
505, 506  線状分子末端の官能基
507  非特異吸着防止用分子
508  微粒子
509  アビジン
510  捕捉分子
601  微粒子
602  結合サイト
603  結合サイト
604  捕捉用分子
605  オリゴヌクレオチド
606  結合サイト
607  回収用微粒子
608  結合サイト
609  水溶液
610  磁石
701  分析対象の核酸断片
702  捕捉用タグ分子
703  蛍光色素
704  核酸分子（プローブ分子）
705  蛍光体
706  捕捉分子
707  結合分子
708  微粒子
709  接着パッド
710  支持基体
711  検出器
801  支持基体
802  接着パッド
803  微粒子
804  凹凸板
901  分析対象の核酸断片
902  捕捉用タグ分子
903  蛍光色素
904  核酸分子（プローブ分子）
905  蛍光体
906  捕捉分子
907  結合分子
908  微粒子
909  流路
910  検出器
1001  核酸分析用デバイス基板
1002  流路部材
1003  温調プレート
1004  流路
1005  送液ユニット
1006  対物レンズ
1007  YAGレーザ光源
1008  レンズ
1009  ダイクロイックミラー
1010  光学フィルタ
1011  結像レンズ
1012  2次元CCDカメラ
1013  He-Neレーザ光源
1014  注入口
1015  ダイクロイックミラー
1016  磁石ユニット
【図１】
2013051651.tif 000003
【図２】
2013051651.tif 000004
【図３】
2013051651.tif 000005
【図４】
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【図５】
2013051651.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
2013051651.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2013051651.tif 000012
【国際調査報告】
2013051651.tif 000013
2013051651.tif 000014
2013051651.tif 000015
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