(57)【要約】  効率よく高感度且つ簡便に標的物質を検出することができる標的物質の検出方法、該方法に用いられる標的物質検出用ポリマー、及び該ポリマーの形成方法を提供する。標的物質の検出方法において、（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する工程；（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる工程；及び（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する工程を含むようにした。
2009057702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程；
（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び
（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含み、
前記複数種の核酸プローブは、
５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、
５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、
からなることを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する工程；
（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる工程；及び
（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する工程を含み、
前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする標的物質の検出方法。
【化１】
2009057702.tif 000013
（前記式（Ｉ）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す）
【請求項３】
（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程；
（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び
（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含み、
前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする標的物質の検出方法。
【化２】
2009057702.tif 000014
（前記式（II）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す）
【請求項４】
前記形成工程が、前記複数種の核酸プローブをハイブリダイズさせ、第一のポリマーを形成する第１のハイブリダイズ工程、及び
該第一のポリマーと前記結合用プローブをハイブリダイズさせ、前記標的物質検出用ポリマーを形成する第２のハイブリダイズ工程、を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項５】
前記形成工程が、前記複数種の核酸プローブ及び前記結合用プローブを同時にハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項６】
前記形成工程後に、前記標的物質検出用ポリマーを含む溶液を希釈し、検出用溶液を調製する工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項７】
前記複数種の核酸プローブの少なくとも１種の核酸プローブが、標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項８】
前記結合用プローブのターゲット領域が、前記標的物質と特異的に結合可能な部分を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項９】
前記標的物質が核酸であり、前記結合用プローブのターゲット領域が前記標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸からなることを特徴とする請求項８記載の標的物質の検出方法。
【請求項１０】
前記標的物質検出用ポリマーと前記標的物質の結合が、前記標的物質に結合可能な部位と前記結合用プローブのターゲット領域に結合可能な部位とを有するスペーサー物質を介してなされることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項１１】
前記標的物質検出用ポリマーは、前記結合用プローブを介してアビジン又はビオチンが結合されてなることを特徴とする請求項１〜８及び１０のいずれか１項記載の標的物質の検出方法。
【請求項１２】
前記結合工程が、前記標的物質検出用ポリマー及び前記標的物質を、ビオチンとアビジンの結合を介して結合させる工程であることを特徴とする請求項１１記載の標的物質の検出方法。
【請求項１３】
ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程を含む標的物質検出用ポリマーの形成方法であって、
前記結合用プローブは標的物質と結合しておらず、
前記複数種の核酸プローブは、
５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、
５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、
からなることを特徴とする標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項１４】
ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程を含む標的物質検出用ポリマーの形成方法であって、
前記結合用プローブは標的物質と結合しておらず、
前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【化３】
2009057702.tif 000015
（前記式（Ｉ）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す）
【請求項１５】
ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程を含む標的物質検出用ポリマーの形成方法であって、
前記結合用プローブは標的物質と結合しておらず、
前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【化４】
2009057702.tif 000016
（前記式（II）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す）
【請求項１６】
前記形成工程が、
前記複数種の核酸プローブをハイブリダイズさせ、第一のポリマーを形成する第１のハイブリダイズ工程と、
該第一のポリマーと前記結合用プローブをハイブリダイズさせ、前記標的物質検出用ポリマーを形成する第２のハイブリダイズ工程と、
を含むことを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項１７】
前記形成工程が、前記複数種の核酸プローブ及び前記結合用プローブを同時にハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項１８】
前記複数種の核酸プローブの少なくとも１種の核酸プローブが、標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項１９】
前記結合用プローブのターゲット領域が、前記標的物質と特異的に結合可能な部分を有することを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項２０】
前記標的物質が核酸であり、前記結合用プローブのターゲット領域が前記標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸からなることを特徴とする請求項１９記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項２１】
前記標的物質検出用ポリマーは、前記結合用プローブを介してアビジン又はビオチンが結合されてなることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項２２】
前記結合用プローブのターゲット領域がアビジン又はビオチンを結合してなることを特徴とする請求項２１記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項２３】
前記結合用プローブのターゲット領域が、アビジン又はビオチンを直接又は間接的に結合可能な領域であり、
前記形成工程が、
前記ポリマーを形成する複数種の核酸プローブと、前記結合用プローブとをハイブリダイズさせ、第二のポリマーを形成する工程と、
前記第二のポリマーの結合用プローブにアビジン又はビオチンを結合させる工程と、
を含むことを特徴とする請求項２１記載の標的物質検出用ポリマーの形成方法。
【請求項２４】
ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより形成され、前記結合用プローブが標的物質と結合していない標的物質検出用ポリマーであって、
前記複数種の核酸プローブは、
５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、
５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、からなることを特徴とする標的物質検出用ポリマー。
【請求項２５】
ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより形成され、前記結合用プローブが標的物質と結合していない標的物質検出用ポリマーであって、
前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする標的物質検出用ポリマー。
【化５】
2009057702.tif 000017
（前記式（Ｉ）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す）
【請求項２６】
ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能なターゲット領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより形成され、前記結合用プローブが標的物質と結合していない標的物質検出用ポリマーであって、
前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする標的物質検出用ポリマー。
【化６】
2009057702.tif 000018
（前記式（II）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す）
【請求項２７】
前記結合用プローブのターゲット領域が、前記標的物質と特異的に結合可能な部分を有することを特徴とする請求項２４〜２６のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマー。
【請求項２８】
前記標的物質が核酸であり、前記結合用プローブのターゲット領域が前記標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸からなることを特徴とする請求項２７記載の標的物質検出用ポリマー。
【請求項２９】
前記標的物質検出用ポリマーは、前記結合用プローブを介してアビジン又はビオチンが結合されてなることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマー。
【請求項３０】
請求項１３〜２３のいずれか１項記載の方法により形成されることを特徴とする標的物質検出用ポリマー。
【請求項３１】
請求項２４〜３０のいずれか１項記載の標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び
前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含むことを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項３２】
前記標的物質検出用ポリマーと前記標的物質の結合が、前記標的物質に結合可能な部位と前記結合用プローブのターゲット領域に結合可能な部位とを有するスペーサー物質を介してなされることを特徴とする請求項３１記載の標的物質の検出方法。
【請求項３３】
前記結合工程が、請求項２９記載の標的物質検出用ポリマー及び標的物質を、ビオチンとアビジンの結合を介して結合させる工程であることを特徴とする請求項３１記載の標的物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質検出用ポリマー、該ポリマーの形成方法及び該ポリマーを用いた標的物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１〜４は、互いに相補的な塩基配列を有する複数種の核酸プローブを用いて、自己集合反応（Probe alternation link self-assembly reaction）により核酸プローブの集合体（ポリマー）を形成する方法（以下、プローブの自己集合反応によるポリマーの形成法を、パルサー法（PALSAR法）と称する。）を開示している。【０００３】
特許文献１は、前記パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出方法として、ポリマー形成に用いられる核酸プローブに相補的な領域と標的核酸に相補的な領域とを持つプローブとターゲット遺伝子を反応させた後、ポリマー形成用の複数の核酸プローブを添加し、自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させ、ターゲット遺伝子を検出する方法を開示している。
また、特許文献１は、前記パルサー法を利用した抗原・抗体の検出方法として、抗原に抗体を結合させた後、ポリマー形成に用いられる核酸プローブに相補的な領域を有しビオチン化した遺伝子、プロテインＡ及びストレプトアビジンを用いて、抗原、抗体、プロテインＡ、ストレプトアビジン及びビオチン化した遺伝子の複合体を形成し、その後、ポリマー形成用の複数の核酸プローブを添加し、自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させ、抗原・抗体を検出する方法を開示している。【０００４】
また、特許文献５は、前記パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出方法として、マイクロプレート等の反応機材に標的核酸を捕捉可能なキャプチャープローブ（捕捉用プローブ）を結合させ、標的核酸を捕捉した後、ポリマー形成に用いられる核酸プローブに相補的な領域と標的核酸に相補的な領域とを持つ結合用プローブを加え、キャプチャープローブ、標的核酸及び結合用プローブの複合体を形成した後、ポリマー形成用の複数の核酸プローブを添加し、自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させ、標的核酸を検出する方法を開示している。【０００５】
上記方法により、ターゲット遺伝子や抗原・抗体等の標的物質の検出感度を著しく向上させることが可能であるが、標的物質を結合させた固相表面上で核酸プローブの自己集合反応を行なう為、反応時の緩衝液の条件や温度条件が制約されるといった問題があった。特に、大きなポリマーを形成させるためにはポリマー形成に用いる核酸プローブの濃度を上げる必要があるが、固相上で短時間で大きなポリマーを形成させるためには反応条件に制限があり、効率よく自己集合反応させることは容易ではなかった。さらに、核酸プローブの濃度を上げることにより、反応に寄与しない核酸プローブが増加し、それに伴って固相への物理吸着や非特異反応が増すといった問題も生じる為、核酸プローブの濃度が最小限で最大の効果を発揮させることが望まれる。【０００６】
また、抗原抗体反応により蛋白質や低分子を測定する際、抗体や蛋白は熱の安定性が良くないから反応温度は２５〜３７℃で行われるのが通常であるが、パルサー法による自己集合反応は抗体や蛋白を変性させる温度領域である４５℃〜６５℃で行われる為、パルサー法を利用した抗原抗体反応を効率よく行うことが困難であった。
【特許文献１】特許第３２６７５７６号公報
【特許文献２】特許第３３１０６６２号公報
【特許文献３】国際公開第０２／３１１９２号公報
【特許文献４】特開２００２−３５５０８１号公報
【特許文献５】国際公開第０３／０２９４４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率よく高感度且つ簡便に標的物質を検出することができる標的物質の検出方法、該方法に用いられる標的物質検出用ポリマー、及び該ポリマーの形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を行なった結果、予めポリマー形成用の核酸プローブ及び結合用プローブを反応させ、標的物質と結合可能なポリマーを形成させた後、該ポリマーを標的物質と反応させることにより、反応溶液等の条件の制約を軽減させることができ、さらに検出感度を著しく向上させることができることを見出した。
なお、本願明細書において、結合用プローブとは、検出する標的物質と直接又は間接的に結合可能な部分を有し、且つポリマー形成に用いられる複数の核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域を有するプローブを意味する。【０００９】
本発明の標的物質の検出方法の第一の態様は、（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程；（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含み、前記複数種の核酸プローブは、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、からなることを特徴とする。【００１０】
本発明の標的物質の検出方法の第二の態様は、（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程；（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含み、前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする。【００１１】
【化１】
2009057702.tif 000003
【００１２】
なお、前記式（I）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表し、矢印方向は５’末端から３’末端方向を示す。また、本発明において、他の核酸プローブとハイブリダイズしている領域を相補的領域と称するが、核酸プローブ中の相補的領域の間にはギャップを含んでいてもよいが、ギャップはない方が好ましい。【００１３】
本発明の標的物質の検出方法の第三の態様は、（Ａ）ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程；（Ｂ）前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び（Ｃ）前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含み、前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする。【００１４】
【化２】
2009057702.tif 000004
【００１５】
なお、前記式（II）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表し、矢印方向は５’末端から３’末端方向を示す。また、本発明において、他の核酸プローブとハイブリダイズしている領域を相補的領域と称するが、核酸プローブ中の相補的領域の間にはギャップを含んでいてもよいが、ギャップはない方が好ましい。【００１６】
本発明の標的物質の検出方法の第一〜第三の態様において、前記形成工程が、前記複数種の核酸プローブをハイブリダイズさせ、第一のポリマーを形成する第１のハイブリダイズ工程、及び該第一のポリマーと前記結合用プローブをハイブリダイズさせ、前記標的物質検出用ポリマーを形成する第２のハイブリダイズ工程、を含むことが好ましい。
また、本発明の標的物質の検出方法の第一〜第三の態様において、前記形成工程が、前記複数種の核酸プローブ及び前記結合用プローブを同時にハイブリダイズさせる工程を含んでいてもよい。【００１７】
本発明の標的物質の検出方法の第一〜第三の態様において、前記形成工程後に、前記標的物質検出用ポリマーを含む溶液を希釈し、検出用溶液を調製する工程を含むことが好適である。【００１８】
本発明の標的物質検出用ポリマーの形成方法の第一の態様は、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程を含む標的物質検出用ポリマーの形成方法であって、前記結合用プローブは標的物質と結合しておらず、前記複数種の核酸プローブは、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、からなることを特徴とする。【００１９】
本発明の標的物質検出用ポリマーの形成方法の第二の態様は、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程を含む標的物質検出用ポリマーの形成方法であって、前記結合用プローブは標的物質と結合しておらず、前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする。【００２０】
【化３】
2009057702.tif 000005
【００２１】
（なお、前記式（I）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す。）【００２２】
本発明の標的物質検出用ポリマーの形成方法の第三の態様は、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより標的物質検出用ポリマーを形成する形成工程を含む標的物質検出用ポリマーの形成方法であって、前記結合用プローブは標的物質と結合しておらず、前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする。【００２３】
【化４】
2009057702.tif 000006
【００２４】
（なお、前記式（II）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す。）【００２５】
本発明の標的物質検出用ポリマーの形成方法の第一〜第三の態様において、前記標的物質検出用ポリマーを形成する工程が、前記複数種の核酸プローブをハイブリダイズさせ、第一のポリマーを形成する第１のハイブリダイズ工程と、該第一のポリマーと前記結合用プローブをハイブリダイズさせ、前記標的物質検出用ポリマーを形成する第２のハイブリダイズ工程と、を含むことが好ましい。
また、本発明の標的物質検出用ポリマーの形成方法の第一〜第三の態様において、前記標的物質検出用ポリマーを形成する工程が、前記複数種の核酸プローブ及び前記結合用プローブを同時にハイブリダイズさせる工程を含んでいてもよい。【００２６】
本発明の形成方法において、前記複数種の核酸プローブの少なくとも１種の核酸プローブが、標識物質で標識されてなることが好ましい。【００２７】
本発明の形成方法において、前記結合用プローブのターゲット領域が、前記標的物質と特異的に結合可能な部分を有することが好ましい。前記標的物質が核酸の場合は、前記結合用プローブの標的物質に結合可能な領域が前記標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸領域であることが好ましい。【００２８】
また、本発明の形成方法において、前記標的物質検出用ポリマーが、前記結合用プローブを介してアビジン又はビオチンが結合されてなることが好適である。
前記標的物質検出用ポリマーにアビジン又はビオチンを結合する工程順は特に制限はない。例えば、予めアビジン又はビオチンを結合してなる結合用プローブを用いて、結合用プローブと、前記ポリマーを形成する複数種の核酸プローブとを反応させて、アビジン又はビオチンが結合した標的物質検出用ポリマーを形成することが好ましい。
また、ターゲット領域が、アビジン又はビオチンを直接又は間接的に結合可能な領域である結合用プローブを用いて、ポリマー形成中又はポリマー形成後にアビジン又はビオチンを結合させることもできる。アビジン及びビオチンが結合していない結合用プローブを用いる場合、前記標的物質検出用ポリマーを形成する工程が、前記ポリマーを形成する複数種の核酸プローブと、前記結合用プローブとをハイブリダイズさせ、第二のポリマーを形成する工程と、前記第二のポリマーの結合用プローブにアビジン又はビオチンを結合させる工程と、を含むことが好ましい。【００２９】
本発明の標的物質検出用ポリマーの第一の態様は、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより形成され、前記結合用プローブが標的物質と結合していない標的物質検出用ポリマーであって、前記複数種の核酸プローブは、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する核酸プローブと、からなることを特徴とする。【００３０】
本発明の標的物質検出用ポリマーの第二の態様は、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより形成され、前記結合用プローブが標的物質と結合していない標的物質検出用ポリマーであって、前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする。【００３１】
【化５】
2009057702.tif 000007
【００３２】
（なお、前記式（I）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す。）【００３３】
本発明の標的物質検出用ポリマーの第三の態様は、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブ、をハイブリダイズさせることにより形成され、前記結合用プローブが標的物質と結合していない標的物質検出用ポリマーであって、前記複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと下記式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有する複数種の核酸プローブからなることを特徴とする。【００３４】
【化６】
2009057702.tif 000008
【００３５】
（なお、前記式（II）において、梯子状に示した２本の直線は互いにハイブリダイズしている核酸を表す。）【００３６】
本発明の標的物質検出用ポリマーにおいて、前記結合用プローブのターゲット領域が、前記標的物質と特異的に結合可能な部分を有することが好ましい。前記標的物質が核酸の場合は、前記結合用プローブの標的物質に結合可能な領域が前記標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸領域であることが好ましい。
また、本発明の標的物質検出用ポリマーが、前記結合用プローブを介してアビジン又はビオチンが結合されてなることが好適である。【００３７】
本発明の標的物質検出用ポリマーの第四の態様は、前記本発明の標的物質検出用ポリマーの形成方法により形成されることを特徴とする。【００３８】
本発明の標的物質の検出方法の第四の態様は、前述した本発明の標的物質検出用ポリマー及び標的物質を結合させる結合工程；及び前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する検出工程を含むことを特徴とする。【００３９】
本発明の検出方法において、前記複数種の核酸プローブの少なくとも１種の核酸プローブが、標識物質で標識されてなることが好ましい。【００４０】
本発明の検出方法において、前記結合用プローブのターゲット領域が、前記標的物質と特異的に結合可能な部分を有することが好ましい。前記標的物質が核酸の場合は、前記結合用プローブのターゲット領域が前記標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸からなることが好適である。
また、本発明の検出方法において、前記標的物質検出用ポリマーと前記標的物質の結合が、前記標的物質に結合可能な部位と前記結合用プローブのターゲット領域に結合可能な部位とを有するスペーサー物質を介してなされてもよい。【００４１】
本発明の検出方法において、前記標的物質検出用ポリマーは、前記結合用プローブを介してアビジン又はビオチンが結合されてなることが好ましい。該アビジン又はビオチンが結合されてなる標的物質検出用ポリマーを用い、前記標的物質検出用ポリマー及び前記標的物質を、ビオチンとアビジンの結合を介して結合させることが好適である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、反応溶液や反応温度等の種々の反応条件の制約を軽減させることができ、標的物質を効率よく高感度且つ簡便に検出することができる。また、本発明によれば、標的物質検出用ポリマーの大きさを制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第１の例を示す概略説明図である。
【図２】図１記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
【図３】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第２の例を示す概略説明図である。
【図４】図３記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
【図５】図３記載の複数の核酸プローブにおける第２ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
【図６】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第３の例を示す概略説明図である。
【図７】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第４の例を示す概略説明図である。
【図８】図７記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
【図９】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第５の例における２組のダイマープローブを示す概略説明図である。
【図１０】図７記載の複数の核酸プローブにおける架橋プローブの他の例を示す概略説明図である。
【図１１】図７記載のダイマープローブ及び図１０記載の架橋プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
【図１２】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第５の例における２組の架橋プローブを示す概略説明図である。
【図１３】ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第６の例を示す概略説明図である。
【図１４】図１３記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
【図１５】本発明の標的物質検出用ポリマーの一例を示す概略説明図である。
【図１６】本発明の標的物質検出用ポリマーの他の例を示す概略説明図である。
【図１７】実施例６の結果を示すグラフである。
【図１８】実施例８の結果を示すグラフである。
【図１９】実施例９の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４４】
１０：第１の核酸プローブ、１２：第２の核酸プローブ、１３：水素結合、１４、２２、３４：ポリマー、２０ａ：第１ダイマープローブ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ：第２ダイマープローブ、２０ｅ：第３ダイマープローブ、２１ａ〜２１ｈ、２１ｊ、２１ｋ：ダイマー形成用プローブ、３０ａ，３０ｂ：ダイマープローブ、３１ａ〜３１ｄ：ダイマー形成用プローブ、３２ａ〜３２ｄ：架橋プローブ、４０ａ，４０ｂ：ダイマープローブ、４１ａ〜４１ｄ：ダイマー形成用プローブ、４２ａ〜４２ｄ：架橋プローブ、５０ａ，５０ｂ：結合用プローブ、５２ａ，５２ｂ：標的物質検出用ポリマー、Ｓ：ストレプトアビジン。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。【００４６】
本発明は、パルサー法により予め作製したポリマーを利用し、且つ結合用プローブを結合させたポリマー（本発明において、標的物質と結合していない結合用プローブを結合させたポリマーを標的物質検出用ポリマーと称する）を用いて標的物質を検出するものである。
即ち、本発明の標的物質の検出方法は、標的物質検出用ポリマーを準備する工程と、前記標的物質検出用ポリマーと標的物質を反応させ、前記標的物質検出用ポリマーと前記標的物質を直接又は間接的に結合させる工程と、前記標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出する工程とを含むことを特徴とする。【００４７】
本発明の標的物質検出用ポリマーは、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブ、及び標的物質に直接又は間接的に結合可能な領域と前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有する結合用プローブを溶液中で反応させることにより形成することができる。
前記複数種の核酸プローブとしては、互いに相補的な塩基配列を有し、自己集合反応により核酸プローブのポリマーを形成可能なものであれば特に限定されないが、具体的には、後述する３つの態様（パルサーI、パルサーII及びパルサーIII）が挙げられる。本発明において、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブは、アビジン及びビオチンのいずれも結合していない核酸プローブが用いられる。【００４８】
（パルサーI）
図１は、ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第１の例を示す概略説明図である。図２は、図１記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブとしては、図１に示した如く、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する第１の核酸プローブ１０、及び５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する第２の核酸プローブ１２の２種の核酸プローブが挙げられる。なお、図１では、ｎが３の場合の例を示した。ｎの数は３以上であれば特に限定されないが、３以上５以下が好ましく、３がより好ましい。【００４９】
該２種の核酸プローブ１０及び１２をハイブリダイズさせることにより、図２に示した如く、２種の核酸プローブ１０及び１２が自己集合し、核酸プローブのポリマー１４が形成される。なお、パルサーIにおいて、相補的な核酸領域数ｎが３である複数種の核酸プローブを用いる場合、該複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと前述した式（I）で示されるようにハイブリダイズするものである（図２及び式（I）参照）。【００５０】
（パルサーII）
図３は、ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第２の例を示す概略説明図である。図４は、図３記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブとしては、図３に示した如く、ポリマーを形成する複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブが挙げられる。前記複数のダイマープローブは、複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ前記複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献３記載の核酸プローブが用いられる。パルサーIIの複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと前述した式（I）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有するものである（図４及び式（I）参照）。【００５１】
図３は２組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ２０ａ，第２ダイマープローブ２０ｂ）を用いた場合の一例を示した。
図３（ａ）に示した如く、第１ダイマープローブ２０ａは２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ２１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ２１ｂ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第１ダイマー形成用プローブ２１ａは、５’側領域（領域Ａ）、中央領域（領域Ｂ）及び３’側領域（領域Ｃ）の３領域を含み、第２ダイマー形成用プローブ２１ｂは、５’側領域（領域Ｄ）、中央領域（領域Ｂ’）及び３’側領域（領域Ｆ）の３領域を含み、第１ダイマー形成用プローブ２１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ２１ｂは、中央領域（領域Ｂ及びＢ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ及びＦ）及び該５’側領域（領域Ａ及びＦ）が互いに非相補的である。【００５２】
図３（ｂ）に示した如く、第２ダイマープローブ２０ｂは、２種の一本鎖核酸プローブ（第３ダイマー形成用プローブ２１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ２１ｄ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第３ダイマー形成用プローブ２１ｃは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、第４ダイマー形成用プローブ２１ｄは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、第３ダイマー形成用プローブ２１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ２１ｄは、中央領域（領域Ｅ及びＥ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）及び該５’側領域（領域Ａ’及びＦ’）が互いに非相補的である。
なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。【００５３】
第１ダイマープローブ２０ａの５’側領域（領域Ａ及びＤ）は第２ダイマープローブ２０ｂの５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）と相補的であり、第１ダイマープローブ２０ａの３’側領域（領域Ｃ及びＦ）は第２ダイマープローブ２０ｂの３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）と相補的であり、前記第１及び第２ダイマープローブ２０ａ及び２０ｂをハイブリダイズさせることにより、核酸プローブのポリマー２２を形成することができる（図４）。
本発明において、ダイマープローブの代わりに、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブを用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。【００５４】
図３では、第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第３ダイマー形成用プローブ２１ｃの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第４ダイマー形成用プローブ２１ｄの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、ダイマープローブは、１つのダイマープローブの５’側領域が他のダイマープローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマープローブの３’側領域が他のダイマープローブの３’側領域と相補的であればよいものである。【００５５】
図５は、図３記載の第１ダイマープローブ２０ａと共に用いられる第２ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
図５に示した如く、５’側領域が第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域に相補的な領域（領域Ａ’）であり且つ３’側領域が第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの３’側領域に相補的な領域（領域Ｆ’）であるダイマー形成用プローブ２１ｅと、５’側領域が第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域に相補的な領域（領域Ｄ’）であり且つ３’側領域が第１ダイマー形成用プローブ２１ａの３’側領域に相補的な領域（領域Ｃ’）であるダイマー形成用プローブ１１ｆと、をハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブ２０ｃを、第２ダイマープローブとして用いることもできる。【００５６】
また、図１では、２種類のダイマープローブを使用した例を示したが、相補的な領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（特許文献３）。
図６は、ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第３の例を示す概略説明図であり、３組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ２０ａ，第２ダイマープローブ２０ｄ，第３ダイマープローブ２０ｅ）を用いた場合の一例を示す概略説明図である。
図６（ａ）において、第１ダイマープローブ２０ａは図３（ａ）と同様に構成されている。
図６（ｂ）において、第２ダイマープローブ２０ｄは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ２１ｇ，２１ｈ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ２１ｇは、５’側領域（領域Ｇ）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、３’側領域（領域Ｃ’）が第１ダイマープローブ２０ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ２１ｈは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｈ）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｄ’）が第１ダイマープローブ２０ａの５’側領域（領域Ｄ）と相補的である。【００５７】
図６（ｃ）において、第３ダイマープローブ２０ｅは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ２１ｊ，２１ｋ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ１１ｊは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｊ）及び３’側領域（領域Ｈ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ａ’）が第１ダイマープローブ２０ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｈ’）が第２ダイマープローブ２０ｄの３’側領域（領域Ｈ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ２１ｋは、５’側領域（領域Ｇ’）、中央領域（領域Ｊ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｇ’）が第２ダイマープローブ２０ｄの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｆ’）が第１ダイマープローブ２０ａの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である。なお、図中、領域Ｊ’は領域Ｊに相補的な領域である。【００５８】
即ち、図６において、第１ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域は、第２ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第１ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第２ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域と相補的であるように構成されている。【００５９】
図６に示した如く、各ダイマープローブの各３’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的とし、且つ各ダイマープローブの各５’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的となるように構成した複数種のダイマープローブを用いて、これら複数種のダイマープローブをハイブリダイズさせることにより、ダイマープローブの集合体であるポリマーが形成される。
なお、本発明において、相補的な関係を有するダイマープローブの組み合わせに特に制限はないが、図６に示した如く、各ダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域が、他の１つのダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域とそれぞれ相補的となるように構成することが好ましい。【００６０】
（パルサーIII）
図７は、ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第４の例を示す概略説明図である。図８は、図７記載の複数の核酸プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブとしては、図７に示した如く、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブとが挙げられる。パルサーIIIの複数種の核酸プローブは、他種の核酸プローブと前述した式（II）で示されるようにハイブリダイズする塩基配列を有するものである（図８及び式（II）参照）。【００６１】
図７は、１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１組の一対の架橋プローブを用いた場合の第１の例を示した。
図７において、（ａ）は１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ３１ａ，第２ダイマー形成用プローブ３１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ３１ａ，３１ｂから形成されるダイマープローブ３０ａである。
図７（ａ）に示した如く、一対のダイマー形成用プローブは、２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ３１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ３１ｂ）からなり、各ダイマー形成用プローブ３１ａ，３１ｂは、中央領域、該中央領域より５’側に位置する５’側領域、及び該中央領域より３’側に位置する３’側領域の少なくとも３領域を含む。図７中、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示した。第１ダイマー形成用プローブ３１ａと第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの中央領域（領域Ｂ及びＢ’）は互いに相補的であり、第１ダイマー形成用プローブ３１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ３１ｂのそれぞれの５’側領域（領域Ａ及びＤ）及び３’側領域（領域Ｃ及びＦ）の４領域は全て互いに非相補的であり、両者をハイブリダイズさせることにより、１組のダイマープローブ３０ａが形成される。図中、符号１３は水素結合である。【００６２】
本発明において、予め一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブを用いてもよく、ダイマー形成用プローブをそのまま用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。【００６３】
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、前述した１組の場合と同様に各組の一対のダイマー形成用プローブを構成する。複数組の一対のダイマー形成用プローブにより同数組のダイマープローブが形成される。【００６４】
図９は、ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第５の例における２組の一対のダイマー形成用プローブの一例及び該一対のダイマー形成用プローブから形成される２組のダイマープローブを示す概略説明図である。図９において、（ａ）は１組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ４１ａ，第２ダイマー形成用プローブ４１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ４１ａ，４１ｂから形成されるダイマープローブ４０ａであり、（ｂ）は２組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ４１ｃ，第２ダイマー形成用プローブ４１ｄ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ４１ｃ，４１ｄから形成されるダイマープローブ４０ｂである。
図９中、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示し、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの５’側領域を領域Ｇ、中央領域を領域Ｅ、３’側領域を領域Ｈで示し、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｄの５’側領域を領域Ｉ、中央領域を領域Ｅ’、３’側領域を領域Ｊで示した。各組の第１及び第２ダイマー形成用プローブの中央領域（領域Ｂ及びＢ’、領域Ｅ及びＥ’）はそれぞれ互いに相補的であり、各一対の第１及び第２ダイマー形成用プローブの５’側領域及び３’側領域の４領域（領域Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ、領域Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）は全て互いに非相補的であり、各組の一対のダイマー形成用プローブ４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄをハイブリダイズさせることにより、２組のダイマープローブ４０ａ，４０ｂが形成される。本発明において、パルサーIIIで用いるダイマー形成用プローブの３’側領域及び５’側領域が全て互いに非相補的であることが好ましい。【００６５】
本発明において、架橋プローブはダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを架橋することができる１種以上の一本鎖核酸プローブであり、少なくとも２領域を含む。該２領域の内、５’側に位置する領域を５’側領域と称し、３’側に位置する領域を３’側領域と称する。本発明において、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的である。該構成とすることにより、架橋プローブは、ダイマー形成用プローブから形成される１種以上の複数のダイマープローブを架橋するように、ダイマー形成用プローブに結合し、プローブの集合体（プローブポリマー）を形成することができる。【００６６】
１組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、１組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ及び第２ダイマー形成用プローブ）及び１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ及び第２架橋プローブ）は、一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各５’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各３’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成される。【００６７】
図７（ｂ）は、図７（ａ）記載の一対のダイマー形成用プローブ３１ａ，３１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ３２ａ及び第２架橋プローブ３２ｂ）の一例を示す概略説明図である。
図７（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ３１ａ，３１ｂと共に用いられる架橋プローブとしては、例えば、図７（ｂ）に示した如く、第１架橋プローブ３２ａの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ３２ａの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的であり、第２架橋プローブ３２ｂの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ３２ｂの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である、一対の架橋プローブが好適である。図７（ａ）記載のダイマー形成用プローブ１３ａ−３１ｄ及び図７（ｂ）記載の架橋プローブ３２ａ、３２ｂをハイブリダイズさせることにより、ポリマー３４を形成することができる（図８）。【００６８】
図７では、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第１架橋プローブ３２ａの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第２架橋プローブ３２ｂの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、１つのダイマー形成用プローブの５’側領域が１つの架橋プローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマー形成用プローブの３’側領域が１つの架橋プローブの３’側領域と相補的であればよいものである。【００６９】
図１０は、図７記載の一対のダイマー形成用プローブ３１ａ，３１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ３２ｃ及び第２架橋プローブ３２ｄ）の他の例を示す概略説明図である。
図１０に示した如く、一対の架橋プローブの他の例として、第１架橋プローブ３２ｃの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ３２ｃの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的であり、第２架橋プローブ３２ｄの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ３２ｄの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ｂの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である、一対の架橋プローブが挙げられる。図７（ａ）記載のダイマー形成用プローブ３１ａ−３１ｄ及び図１０記載の架橋プローブ３２ｃ、３２ｄをハイブリダイズさせることにより、ポリマー３４を形成することができる（図１１）。【００７０】
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、同数組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。具体的には、ｎ組（ｎは２以上の整数）の一対のダイマー形成用プローブ（即ち、２ｎ個のダイマー形成用プローブ）及びｎ組の一対の架橋プローブ（即ち、２ｎ個の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの５’側領域は、ダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの３’側領域は、前記ダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるでるように構成することが好適である。【００７１】
図１２は、図９記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄと共に用いられる２組の一対の架橋プローブ４２ａ−４２ｄの一例を示す概略説明図である。図１２において、（ａ）は１組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ４２ａ，第２架橋プローブ４２ｂ）であり、（ｂ）は２組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ４２ｃ，第２架橋プローブ４２ｄ）である。
図１２に示した如く、図９記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄと共に用いられる架橋プローブとしては、２組の一対の架橋プローブ（即ち、４種の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域が架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各架橋プローブの５’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域が架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、各架橋プローブの３’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。【００７２】
具体的には、図１２に示した如く、１組目の第１架橋プローブ４２ａの５’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ４２ｂの５’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ４２ｃの５’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ４２ｄの５’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｄの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、１組目の第１架橋プローブ４２ａの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄのいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１２では、領域Ｈと相補的である場合を示した）、１組目の第２架橋プローブ４２ｂの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ中、１組目の第１架橋プローブ４２ａで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１２では、領域Ｊと相補的である場合を示した）、２組目の第１架橋プローブ２２ｃの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ４２ａ−４２ｂで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１２では、領域Ｃと相補的である場合を示した）、２組目の第２架橋プローブ４２ｄの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ４２ａ−４２ｂ及び２組目の第１架橋プローブ４２ｃで選択したものを除く１つの３’側領域と相補的である（図１２では、領域Ｆと相補的である場合を示した）、２組の一対の架橋プローブが好適である。図９記載のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ及び図１２記載の架橋プローブ４２ａ−４２ｄをハイブリダイズさせることにより、ポリマー３４を形成することができる。【００７３】
なお、図１２では、１組目の第１架橋プローブ４２ａの３’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの３’側領域と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ４２ｂの３’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ４２ｃの３’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの３’側領域と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ４２ｄの３’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域と相補的である場合を示したが、各架橋プローブの３’側領域と相補的となるダイマー形成用プローブの３側領域の組み合わせに制限はないものである。【００７４】
本発明において、非相補的な塩基配列とは、互いにハイブリダイズしない塩基配列であればいかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。
図１３は、ポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの第６の例を示す概略説明図であり、１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１種の一対の架橋プローブの第２の例を示す概略説明図である。図１３（ａ）において、符号３０ｂはダイマープローブであり、３’側領域並びに５’側領域をそれぞれ同一の塩基配列とした２種のダイマー形成用プローブ３１ｃ，３１ｄを用いてダイマーを形成した例を示した。即ち、図７のダイマープローブ３０ａにおいて、領域Ａと領域Ｄを同一の塩基配列とし、領域Ｃと領域Ｆを同一の塩基配列としたものである。該構成とすることにより、図１３（ｂ）に示した如く、ダイマープローブ３０ｂと共に用いられる一対の架橋プローブは同一となり、１種の架橋プローブ３２ｃが用いられる。図１３記載のダイマー形成用プローブ３１ｃ−３１ｄ及び架橋プローブ３２ｃをハイブリダイズさせることにより、ポリマー３４を形成することができる（図１４）。【００７５】
本発明のポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブにおいて、各プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。【００７６】
本発明のポリマー形成に用いられる複数種の核酸プローブの各領域の塩基配列は、ポリマーが形成されるように所定の領域が相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。【００７７】
上記核酸プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54, 3607-3630.、Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253.、Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、複数の核酸プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。【００７８】
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。【００７９】
本発明で用いられる結合用プローブは、標的物質と直接又は間接的に結合可能なターゲット領域Ｔと前記核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域とを有するものであり、該結合用プローブが、ターゲット領域Ｔを有し、且つポリマー形成に用いられる複数の核酸プローブの１つの核酸プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することが好適である。前記ターゲット領域は、結合用プローブの端部に位置することが好ましい。【００８０】
本発明において、結合用プローブと標的物質の結合は、両者を直接結合させてもよいが、他の物質を介して間接的に結合させてもよいものであり、前記ターゲット領域Ｔは、標的物質に直接結合可能な領域のみならず、他の物質を介して標的物質と間接的に結合可能な領域も含むものである。
前記ターゲット領域Ｔは標的物質に応じて適宜選択可能である。前記ターゲット領域Ｔを、標的物質と特異的に結合可能な部分を有するか、もしくは標的物質と特異的に結合可能な物質と直接又は間接的に結合可能な部位を有するように構成することにより、標的物質検出用ポリマーと標的物質を特異的に結合させることができる。具体的には、標的物質が核酸の場合は、ターゲット領域Ｔを標的核酸に相補的な塩基配列を有するように構成することが好ましい。標的物質が抗原等のタンパク質の場合は、抗体等の標的物質と特異的に結合する物質を直接又は間接的に結合させることが好ましい。【００８１】
また、標的物質に結合可能な部位と前記ターゲット領域Ｔに結合可能な部位を有するスペーサー物質を用い、標的物質と結合用プローブをスペーサー物質を介して間接的に結合させることが好適である。スペーサー物質と結合用プローブの結合手段に制限はないが、例えば、一方をポリＴ配列（もしくはポリＧ配列）を有する領域とし、他方をポリＡ配列（もしくはポリＣ配列）を有する領域とする等の核酸の相補的結合を利用する方法や、ビオチンとアビジンの結合を利用する方法、抗原と抗体の結合を利用する方法、リガンドとリセプターの結合を利用する方法が好適である。【００８２】
本発明において、前記ターゲット領域Ｔを、アビジン又はビオチンが結合した領域もしくはアビジン又はビオチンが直接又は間接的に結合可能な領域Ｓとし、アビジンを結合させた標的物質検出用ポリマー、又はビオチンを結合させた標的物質検出用ポリマーを形成し、ビオチンとアビジンの結合を介して標的物質検出用ポリマーと標的物質を検出することが好適である。該標的物質検出用ポリマーとしては、アビジンを結合させた標的物質検出用ポリマーがより好適である。アビジンを結合させた標的物質検出用ポリマーを用いる場合はビオチンを介して標的物質検出用ポリマーと標的物質を結合させ、ビオチンを結合させた標的物質検出用ポリマーを用いる場合はアビジンを介して標的物質検出用ポリマーと標的物質を結合させる。【００８３】
標的物質検出用ポリマーとして、アビジンが結合された標的物質検出用ポリマーを用いる場合、結合用プローブにアビジンを結合させる方法は特に制限はないが、例えば、ポリマーを形成する核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域を有するプローブをビオチン標識し、ビオチンを介してアビジンを結合させることが好ましい。また、核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域を有するプローブをＮＨ２、ＣＯＯＨ又はＳＨ等で修飾し、アビジンを化学的に結合させてもよい。【００８４】
本発明に用いられるアビジンは、ビオチンを結合する活性を有する蛋白質であり、ストレプトアビジン及びアビジン（卵白由来）が挙げられ、ストレプトアビジンがより好ましい。【００８５】
結合用プローブにアビジンを結合する時期に制限はないが、予めアビジンを結合してなる結合用プローブを用いて、該結合用プローブと、核酸プローブとを反応させて、アビジンが結合した標的物質検出用ポリマーを形成する方法や、アビジンが結合していない結合用プローブ（例えば、前述したビオチンが結合したプローブ）を用いて、核酸プローブと結合用プローブからなるポリマー（例えば、ビオチンが結合したポリマー）を形成した後、アビジンを反応させ、該ポリマーにアビジンを結合する方法が好適である。
予めアビジンを結合させた結合用プローブを用いる場合、標的物質検出用ポリマーを形成するためのハイブリダイゼーション工程の前に結合用プローブを精製することが好ましい。【００８６】
標的物質検出用ポリマーとして、ビオチンが結合された標的物質検出用ポリマーを用いる場合、結合用プローブにビオチンを結合させる方法は特に制限はないが、例えば、ポリマーを形成する核酸プローブの少なくとも１つと結合可能な領域を有するプローブをビオチン標識することが好ましい。
結合用プローブにビオチンを結合する時期に制限はないが、予めビオチン標識した結合用プローブを用いて、該結合用プローブと、核酸プローブとを反応させて、ビオチンが結合した標的物質検出用ポリマーを形成することが好適である。【００８７】
図１５は、本発明の標的物質検出用ポリマーの一例を示す概略説明図であり、図１記載の複数種の核酸プローブを用いた例を示した。図１５に示した如く、前記複数種の核酸プローブ１０，１２及び結合用プローブ５０ａを溶液中で反応させることにより、標的物質と結合可能なターゲット領域Ｔを有する標的物質検出用ポリマー５２ａを形成することができる。【００８８】
該標的物質検出用ポリマーの形成は、複数種の核酸プローブ及び結合用プローブを同時にハイブリダイズさせてもよく、又は複数種の核酸プローブをハイブリダイズさせ、第一のポリマーを形成した後、該第一のポリマーと結合用プローブをハイブリダイズさせ、前記標的物質検出用ポリマーを形成してもよい。
該標的物質検出用ポリマーにおける核酸プローブと結合用プローブの組成比は、各核酸プローブ１００モル部に対して結合用プローブを０．１〜２０モル部の範囲とすることが好ましく、１〜１０モル部の範囲とすることがより好ましい。【００８９】
本発明は、ポリマー形成反応の際の核酸プローブの濃度に応じて標的物質検出用ポリマーの大きさを制御することができるものである。核酸プローブを高濃度とすることにより、大きな標的物質検出用ポリマーを得ることができる。
本発明において、核酸プローブの濃度条件は必要とする標的物質検出用ポリマーの大きさにより適宜選択すればよいが、各核酸プローブの濃度を５０〜１０００ｐｍｏｌ／ｍＬとすることが好ましく、１００〜５００ｐｍｏｌ／ｍＬとすることがより好ましい。
結合用プローブの濃度は、核酸プローブの濃度に応じて適宜選択すればよいが、各核酸プローブ１００モル部に対して０．１〜２０モル部の範囲とすることが好ましく、１〜１０モル部の範囲とすることがより好ましい。【００９０】
反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。但し、アクリジニウムエステル標識の核酸プローブを用いる場合、ｐＨは５．０〜６．０の範囲が好ましい。ハイブリダイゼーション反応の温度条件も特に限定されず、通常の温度条件でよいが、４０〜８０℃が好ましく、５５℃〜６５℃がより好ましい。また、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成させ、当該反応温度領域において自己集合反応を行わせるようにすることが好ましい（国際公開第２００５／１０６０３１号公報）。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は４０〜８０℃が好ましく、より好ましくは５５〜６５℃である。【００９１】
標的物質検出用ポリマーを含む溶液は、作製後そのまま使用してもよいが、必要に応じて、適当な濃度に希釈（例えば、５〜８０倍希釈）することが好ましい。本発明においては、標的物質検出用ポリマーを予め作製させる為、標的物質検出の際に標的物質検出用ポリマーの濃度に依存せず、所定の大きさの標的物質検出用ポリマーを用いることができる。標的物質検出用ポリマーを低濃度とすることにより、非特異的反応を抑制することができる。【００９２】
得られた標的物質検出用ポリマーは、未反応の核酸プローブをゲルろ過、限外ろ過、透析等で除去することが好ましい。また、一定の大きさに分画し、集めたものを用いることが好適である。【００９３】
本発明の標的物質検出用ポリマーは、標識物質で標識されていることが好ましい。標識方法は特に制限されないが、予め標識物質で標識した核酸プローブを用いることが好ましい。前記標識物質としては、アクリジニウムエステル、ユーロピウム、ルテニウム、テレビウム、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適に用いられ、操作性、定量性及び感度の点からアクリジニウムエステルが特に好ましい。
また、形成されたポリマーに対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイド、Oligreen、SYBR Green I等のインターカレーター）を加えて、標的物質検出用ポリマーを標識してもよい。【００９４】
前記標的物質検出用ポリマー及び標的物質を反応させ、前記標的物質検出用ポリマーと前記標的物質を結合させた後、該標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出することにより、標的物質が検出される。【００９５】
本発明における標的物質測定用試料は、該標的物質を含む可能性のあるあらゆる試料が適用でき、例えば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、喀痰、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。
前記標的物質としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー、糖質及びそれらの組み合わせからなるものが挙げられる。該標的物質は試料より適宜調製または単離したものでもよい。また、試料中の標的核酸を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。前記標的核酸（ターゲット遺伝子）として、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。また、前記標的核酸にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることができる。【００９６】
本発明の標的物質の検出方法は、標的物質を捕捉可能な物質を固定化させた担体を用いることが好ましい。例えば、標的物質が核酸の場合は、結合用プローブとの結合部位とは異なる部位に相補的な配列を有する核酸プローブを捕捉用プローブ（キャプチャープローブ）として用い、該捕捉用プローブを表面に固定化させた担体を用いることが好ましい。結合用プローブと捕捉用プローブが隣接する状態で標的核酸に結合するように構成することが好適である。
前記担体としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。【００９７】
図１６は、本発明の標的物質検出用ポリマーの他の例を示す概略説明図であり、図１記載の複数種の核酸プローブを用い、且つ予めアビジンとしてストレプトアビジンを結合させた結合用プローブを用いた例を示した。なお、図１６ではアビジンを結合させた結合用プローブの例を示したが、アビジンの代わりにビオチンを結合させた結合用プローブも同様に用いることができる。
図１６に示した如く、前記複数種の核酸プローブ１０，１２及び結合用プローブ５０ｂを溶液中で反応させることにより、ストレプトアビジンＳが結合された標的物質検出用ポリマー５２ｂを形成することができる。【００９８】
図１６では、予めアビジン又はビオチンを結合してなる結合用プローブ（即ち、ターゲット領域がアビジン又はビオチンである結合用プローブ）を用いた例を示したが、アビジン又はビオチンが結合可能な領域を有する結合用プローブを用い、ポリマーを形成する複数種の核酸プローブと、該結合用プローブとをハイブリダイズさせ、ポリマーを形成した後、該ポリマーの結合用プローブにアビジン又はビオチンを結合させ、標的物質検出用ポリマーを形成してもよい。【００９９】
前記標的物質検出用ポリマーと標的物質とをビオチンとアビジンの結合を介して結合させた後、該標的物質が結合した標的物質検出用ポリマーを検出することにより、標的物質が検出される。
標的物質検出用ポリマーとして、アビジンを結合させた標的物質検出用ポリマーを用いる場合、標的物質検出用ポリマーと標的物質はビオチンを介して結合する。
標的物質とビオチンの結合方法は特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、標的物質が核酸の場合、該標的核酸と相補的な領域を有するビオチン標識プローブを用いることが好ましい。標的物質が抗原の場合、該抗原と特異的に結合する、ビオチン標識した抗体を用いることが好ましい。【０１００】
標的物質検出用ポリマーとして、ビオチンを結合させた標的物質検出用ポリマーを用いる場合、標的物質検出用ポリマーと標的物質はアビジンを介して結合する。
標的物質とアビジンの結合方法は特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、標的物質が核酸の場合、該標的核酸と相補的な領域を有するビオチン標識プローブを用いて標的核酸とビオチンを結合させた後、アビジンを反応させ、標的核酸とアビジンを結合させることが好ましい。また、標的物質が抗原の場合、該抗原と特異的に結合する、ビオチン標識した抗体を用い、抗原とビオチンを結合させた後、アビジンを反応させ、抗原とアビジンを結合させることが好ましい。また、標的物質と結合可能な領域を有するプローブをＮＨ２、ＣＯＯＨ又はＳＨ等で修飾し、アビジンを化学的に結合させてもよい。
【実施例】
【０１０１】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【０１０２】
（実施例１）
ポリマー形成用の複数の核酸プローブとして、下記塩基配列（配列番号１）を有する核酸プローブ（以下、ＨＣＰ−１と称する）、及び下記塩基配列（配列番号２）を有する核酸プローブ（以下、ＨＣＰ−２と称する）を用いた。該ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２の５’末端をアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識した。
ＨＣＰ−１の塩基配列（5'-X1-X2-X3-3'）
5'-GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG CTGGCGGTATCAAC-3'（配列番号１）
ＨＣＰ−２の塩基配列（5'-X1'-X2'-X3'-3'）
5'-CATCCCGAGACATC CGTAACTCCGAAGC GTTGATACCGCCAG-3'（配列番号２）【０１０３】
標的物質として、下記塩基配列（配列番号３）を有するS.Aureus Oligo（以下、ターゲットオリゴと称する）を用いた。
ターゲットオリゴの塩基配列
5'-TTCGGGAAACCGGAGCTAATA CCGGATAATATTTTGAACCGC ATGGTTCAAAAGTGAAAGACG GTCTTGCTGTCACTTATAGAT GGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3'（配列番号３）【０１０４】
キャプチャープローブとして、ターゲットオリゴと相補的な配列を有する核酸プローブ（配列番号４）を用いた。
キャプチャープローブの塩基配列
5'-CGTCTTTCACTTTTGAACCAT GCGGTTCAAAATATTATCCGG-3'（配列番号４）【０１０５】
結合用プローブとして、ターゲットオリゴＤＮＡと相補的な塩基配列及びＨＣＰ−１の一部と同じ塩基配列を有する核酸プローブ（配列番号５）を用いた。
結合用プローブの塩基配列（5'-X1-X2-X1-T-3'）
5'-GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG GATGTCTCGGGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号５）【０１０６】
反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＬＤＳ、添加剤、ｐＨ５．０］に前記ＡＥ標識されたＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ添加した後、結合用プローブを６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ添加した。得られた反応液を５５℃で１０分間攪拌しながら反応させ、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した。
前記得られたポリマー含有溶液を反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＬＤＳ、添加剤、ｐＨ５．０］で１０倍に希釈し、検出用溶液を調製した。【０１０７】
前記キャプチャープローブを固相化したマイクロプレート（白色）のウェルに、１０ｆｍｏｌ／ｍＬのターゲットオリゴを５０μＬ、反応液［ＳＳＣ  １０Ｘ、Ｔｒｉｓ  ６２．５ｍＭ、ｐＨ８．０］を１２．５μＬ添加した。ろ紙を貼り付けたアルミシートをプレートの上面に貼り付けた後、該プレートを上部１０℃と下部６５℃に設定したインキュベータにセットし、３０分間反応させた。【０１０８】
反応後、アルミシートを剥がして、Washer（Bio-Rad社Model 1575）を用いて洗浄液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Triton X-100、ｐＨ７．０］で５回マイクロプレートのウェルを洗浄した。洗浄液を完全にデカントした後、ウェルに前記調製した検出用溶液を１００μＬ添加した。ろ紙を貼り付けたアルミシートをプレートの上面に貼り付けた後、上部１０℃と下部６５℃設定したインキュベータにセットし、１０分間反応させた。【０１０９】
反応後、アルミシートを剥がして、Washer（Bio-Rad社製Model 1575）を用いて前記洗浄液で５回マイクロプレートのウェルを洗浄した。洗浄液を完全にデカントしたあと、Berthold社ルミノメータのCentro LB960を用いてGen Probe社製の発光試薬Iと発光試薬IIを各５０μＬ添加すると同時に発光強度を測定した。結果を表１に示した。【０１１０】
（実施例２）
検出用溶液の調製方法を下記の通り変更した以外は実施例１と同様の方法でオリゴＤＮＡを検出した。結果を表１に示した。
反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＬＤＳ、添加剤、ｐＨ５．０］に前記ＡＥ標識されたＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ添加し、５５℃で１０分間攪拌しながら反応させた後、結合用プローブを６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ添加し、５５℃で１０分間攪拌しながら反応させ、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した以外は、実施例１と同様にして検出用溶液を調製した。【０１１１】
（比較例１）
検出用溶液の代わりに、実施例１で用いたＡＥ標識されたＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２を各２５ｐｍｏｌ／ｍｌ、結合用プローブを０．６２５ｐｍｏｌ／ｍｌ含む反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＬＤＳ、添加剤、ｐＨ５．０］を用いた以外は実施例１と同様の方法でオリゴＤＮＡを検出した。結果を表１に示した。【０１１２】
【表１】
2009057702.tif 000009
【０１１３】
表１に示した如く、実施例１及び２は、比較例１に比べて２倍〜３倍に高い発光強度を示した。【０１１４】
（実施例３）
反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、０．２％Triton X-100、添加剤、ｐＨ７．５］に、未標識のＨＣＰ−１（塩基配列：配列番号１）を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬ、未標識のＨＣＰ−２（塩基配列：配列番号２）を２７５ｐｍｏｌ／ｍＬ添加した後、結合用プローブ（塩基配列：配列番号５）を６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ添加した。得られた反応液を５５℃で１０分間攪拌しながら反応させ、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した。
前記得られたポリマー含有溶液を室温に戻し、サイバグリーンI（CAMBREX Bio Science Rockland, Inc.製、商品名SYBR Green I Nucleic Acid）を最終希釈が４０００倍になるよう加え、室温で１５分間染色した。その後、反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、０．２％Triton X-100、添加剤、ｐＨ７．５］で５倍に希釈し、検出用溶液を調製した。【０１１５】
標的物質捕捉用プローブとして、下記塩基配列（配列番号６）を有する核酸プローブ（以下、ヘルパープローブと称する）を用いた。
ヘルパープローブの塩基配列
5'-CGTCTTTCACTTTTGAACCAT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'（配列番号６）【０１１６】
ポリスチレン試験管に前記調製した検出用溶液を２００μＬ添加した後、ヘルパープローブを２０ｐｍｏｌ／ｍＬ、ターゲットオリゴ（配列番号３）を２５μＬ（２０００ａｍｏｌ）添加し、５５℃で３０分間攪拌させながらWater Bath中で反応させた。室温に戻してからｄＴ１４を固相化したマグネチックビーズを２．５μＬ加え、室温１５分間反応させた。【０１１７】
ポリスチレン試験官をWater Bathから取り出し磁石にあて、洗浄液［ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＬｉＣｌ  ６００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  １ｍＭ、０．０５％Triton X-100、ｐＨ７．８］を加えて洗浄液の吸引・吐出を繰り返して３回マグネチックビーズを洗浄した。ポリスチレン試験官のマグネチックビーズの沈殿物にＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ７．８）を１００μＬ加えマグネチックビーズを再浮遊させた。再浮遊したマグネチックビーズの全量をすべて黒のマイクロプレートのウェルに移しかえ、蛍光リーダBerthold LB970で励起波長４８５ｎｍと蛍光波長５２０ｎｍでマグネチックビーズ上に固定化されたＳＹＢＲの蛍光強度を測定した。結果を表２に示した。【０１１８】
（実施例４）
検出用溶液の調製方法を下記の通り変更した以外は実施例３と同様の方法でオリゴＤＮＡを検出した。結果を表２に示した。
反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、０．２％Triton X-100、添加剤、ｐＨ７．５］に前記未標識のＨＣＰ−１を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬ、前記未標識のＨＣＰ−２を２７５ｐｍｏｌ／ｍＬ添加し、５５℃で１０分間攪拌しながら反応させた後、結合用プローブを６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ添加し、５５℃で１０分間攪拌しながら反応させ、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した以外は、実施例３と同様にして検出用溶液を調製した。【０１１９】
（比較例２）
検出用溶液の代わりに、実施例３で用いた未標識のＨＣＰ−１を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬ、未標識のＨＣＰ−２を２７５ｐｍｏｌ／ｍＬ、結合用プローブを１．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ含む反応液［１００ｍＭコハク酸リチウム、６００ｍＭ塩化リチウム、０．２％Triton X-100、添加剤、ｐＨ７．５］を用いた以外は実施例３と同様の方法でオリゴＤＮＡを検出した。結果を表２に示した。【０１２０】
【表２】
2009057702.tif 000010
【０１２１】
表２に示した如く、実施例３及び４は、比較例２に比べて１．５倍〜２倍程に高い蛍光強度を示した。【０１２２】
（実施例５）
ポリマー形成用の複数の核酸プローブとして、下記塩基配列（配列番号７）を有する核酸プローブ（以下、ダイマープローブ−１と称する）、下記塩基配列（配列番号８）を有する核酸プローブ（以下、ダイマープローブ−２と称する）、下記塩基配列（配列番号９）を有する核酸プローブ（以下、ダイマープローブ−３と称する）、下記塩基配列（配列番号１０）を有する核酸プローブ（以下、ダイマープローブ−４と称する）を用いた。該ダイマープローブ−１〜４の５’末端をアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識した。
ダイマープローブ−１の塩基配列
5'-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号７）
ダイマープローブ−２の塩基配列
5'-GCACATTCACACCG CGACGCAGCCGAGG CCTGACCTCTATGC-3'（配列番号８）
ダイマープローブ−３の塩基配列
5'-GACCAGCAGAGATG GCAGCGACGGCACC CGTCTATGGCGAAC-3'（配列番号９）
ダイマープローブ−４の塩基配列
5'-CGGTGTGAATGTGC GGTGCCGTCGCTGC GCATAGAGGTCAGG-3'（配列番号１０）【０１２３】
結合用プローブとして、ターゲットオリゴＤＮＡと相補的な塩基配列及びダイマープローブ−１の全てと同じ塩基配列を有する核酸プローブ（配列番号１１）を用いた。
結合用プローブの塩基配列
5'-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１１）【０１２４】
反応液［コハク酸リチウム１００ｍＭ、塩化リチウム０．３Ｍ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）５％、添加剤、ｐＨ５．０］に、前記ＡＥ標識されたダイマープローブ−１及びダイマープローブ−２を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ加え、混合し、第１ダイマープローブ溶液とした。また、反応液に前記ＡＥ標識されたダイマープローブ−３及びダイマープローブ−４を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ加え、混合し、第２ダイマープローブ溶液とした。
結合用プローブ（配列番号１１）の濃縮液をあらかじめ入れた試験官に第１ダイマープローブ溶液と第２ダイマープローブ溶液を等量ずつ加えた（なお、この時のダイマープローブ−１〜４の濃度は各１２５ｐｍｏｌ／ｍＬ、結合用プローブの濃度は６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬである。）後、６０℃で１０分間静置で反応させ、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した。
前記得られたポリマー含有溶液を、反応液［コハク酸リチウム１００ｍＭ、塩化リチウム６００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）５％、添加剤、ｐＨ５．０］で４０倍に希釈し、検出用溶液を調製した。【０１２５】
ポリスチレン試験管に前記調製した検出用溶液を２００μＬ添加した後、ヘルパープローブ（配列番号６）を２０ｐｍｏｌ／ｍＬ、ターゲットオリゴ（配列番号３）を２５μＬ（１００ａｍｏｌ／Ｔｕｂｅ）添加し、５５℃で３０分間攪拌させながらWater Bath中で反応させた。室温に戻してからｄＴ１４を固相化したマグネチックビーズを２．５μＬ加え、室温１５分間反応させた。【０１２６】
ポリスチレン試験官をWater Bathから取り出し磁石にあて、洗浄液［ＰＩＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＬｉＣｌ  １００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  １ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）０．０５％、ｐＨ６．０］を加えて洗浄液の吸引・吐出を繰り返して３回マグネチックビーズを洗浄した。ポリスチレン試験官のマグネチックビーズの沈殿物に洗浄液［ＰＩＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＬｉＣｌ  １００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  １ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）０．０５％、ｐＨ６．０］を１００μＬ加えマグネチックビーズを再浮遊させた。再浮遊したマグネチックビーズの全量を新しいポリスチレン試験官に移しかえ、ルミノメータ（Berthold Lumat LB9507）にセットし、Gen Probe社製の発光試薬Iと発光試薬IIを２００μＬずつ加え発光量を測定した。結果を表３に示した。【０１２７】
（比較例３）
前記ＡＥ標識されたダイマープローブ−１及び２（配列番号７及び８）を６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬずつ反応液［コハク酸リチウム１００ｍＭ、塩化リチウム６００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）５％、添加剤、ｐＨ５．０］に加え混合し、第３ダイマープローブ溶液とした。次に前記ＡＥ標識されたダイマープローブ−３及び４（配列番号９及び１０）を６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬずつ反応液に加え混合し、第４ダイマープローブ溶液とした。
第３ダイマープローブ溶液と第４ダイマープローブ溶液を等量ずつ混合し、結合用プローブ（配列番号１１）を０．１５６ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度になるよう加え、検出用溶液を調製した。【０１２８】
前記得られた検出用溶液を用いた以外は実施例５と同様の方法によりターゲットオリゴの検出を行なった。結果を表３に示した。【０１２９】
【表３】
2009057702.tif 000011
【０１３０】
表３に示した如く、比較例３と比べて実施例５は１６倍程高い発光強度を得た。【０１３１】
（実施例６）
添加するターゲットオリゴの濃度を０、０．５、１、２、５、１０及び５０ａｍｏｌ／ｔｕｂｅに変更した以外は実施例５と同様の方法でターゲットオリゴの検出を行なった。結果を図１５に示した。図１５に示した如く、原点を通る良好な直線性が得られた。【０１３２】
（実施例７）
ポリマー形成用の複数の核酸プローブとして、ダイマープローブ−１（配列番号７）、ダイマープローブ−２（配列番号８）、下記塩基配列（配列番号１２）を有する核酸プローブ（以下、架橋プローブ−１と称する）、下記塩基配列（配列番号１３）を有する核酸プローブ（以下、架橋プローブ−２と称する）を用いた。該ダイマープローブ−１及び２の５’末端をアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識した。
架橋プローブ−１の塩基配列
5'-GACCAGCAGAGATG CGTCTATGGCGAAC-3'（配列番号１２）
架橋プローブ−２の塩基配列
5'-CGGTGTGAATGTGC GCATAGAGGTCAGG-3'（配列番号１３）【０１３３】
前記ＡＥ標識されたダイマープローブ−１及び２を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ反応液［コハク酸リチウム１００ｍＭ、塩化リチウム０．３Ｍ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）５％、添加剤、ｐＨ５．０］に加え混合し、さらに前記架橋プローブ−１及び２を各２５０ｐｍｏｌ／ｍＬ加え、反応溶液とした。
結合用プローブ（配列番号１１）の濃縮液をあらかじめ入れた試験官に前記反応溶液を加えた（なお、この時のダイマープローブ−１及び２の濃度は各２５０ｐｍｏｌ／ｍＬ、架橋プローブ−１及び２の濃度は各２５０ｐｍｏｌ／ｍＬ、結合用プローブの濃度は１８．７５ｐｍｏｌ／ｍＬである。）後、６０℃で１０分間静置で反応させ、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した。
前記得られたポリマー含有溶液を、反応液［コハク酸リチウム１００ｍＭ、塩化リチウム６００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）５％、添加剤、ｐＨ５．０］で４０倍に希釈し、検出用溶液を調製した。【０１３４】
前記得られた検出用溶液を用いて、実施例５と同様の方法によりターゲットオリゴの検出を行なった。結果を表４に示した。【０１３５】
（比較例４）
前記ＡＥ標識されたダイマープローブ−１及び２を６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬずつ反応液［コハク酸リチウム１００ｍＭ、塩化リチウム６００ｍＭ、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）５％、添加剤、ｐＨ５．０］に加え混合し、さらに前記架橋プローブ−１及び２を各６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ、結合用プローブ（配列番号１１）を０．４８９ｐｍｏｌ／ｍＬ加え、検出用溶液を調製した。【０１３６】
前記得られた検出用溶液を用いた以外は、実施例７と同様の方法によりターゲットオリゴの検出を行なった。結果を表４に示した。【０１３７】
【表４】
2009057702.tif 000012
【０１３８】
表４に示した如く、比較例４と比べて実施例７は１２倍程高い発光強度を得た。【０１３９】
（実施例８）
ポリマー形成用の複数の核酸プローブとして、実施例１で用いたＡＥ標識されたＨＣＰ−１（配列番号１）及びＨＣＰ−２（配列番号２）を用いた。
結合用プローブとして、ＨＣＰ−１と同じ塩基配列を有し、ビオチンを結合させた核酸プローブ（配列番号１４）を用いた。
結合用プローブの塩基配列（5'-polyT-X1-X2-X3-3'）
5'-Biotin-TTTTTTTTTT GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG CTGGCGGTATCAAC-3'（配列番号１４）【０１４０】
０．５ｍｌの反応液［コハク酸リチウム  １００ｍＭ、塩化リチウム  ６００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、添加剤、ｐＨ  ５．０］にストレプトアビジン１０ｐｍｏｌ／ｍＬと前記結合用プローブ１０ｐｍｏｌ／ｍＬを加え、室温で３０分間攪拌しながら反応させ、ストレプトアビジンが結合した結合用プローブを含むプローブ溶液を調製した。【０１４１】
前記調製したプローブ溶液に、前記ＡＥ標識したＨＣＰ−１とＨＣＰ−２を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ加え、６０℃、３０分間加熱し、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した。
前記得られたポリマー含有溶液を反応液［コハク酸リチウム  １００ｍＭ、塩化リチウム  ６００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、添加剤、ｐＨ７．０］で１０倍に希釈し、検出用溶液を調製した。【０１４２】
シアル化糖鎖抗原ＫＬ−６測定用キット（三光純薬（株）製、商品名：エイテスト（エーザイ（株）の登録商標）ＫＬ−６）を用いて、キット添付の操作法に準じて下記測定を行った。
ＫＬ−６モノクローナル抗体５μｇ／ｍＬを加えた２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を白色マイクロプレートのウェルに１００μＬ加え、抗体をプレートの底面に固定化した。洗浄液（２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を３５０μＬ加え、４℃、３時間静置した後、内溶液を捨て、ＫＬ−６モノクローナル抗体固相プレートを作製した。【０１４３】
前記作製したＫＬ−６モノクローナル抗体固相プレートのウェルにキット添付の反応溶液１００μＬを分注し、標準抗原（０、１、２．５、５、１０、２０Ｕ／ｍＬ）を２０μＬ分注した後、室温で２時間反応させた。
反応後、キット添付の洗浄液Ｉで各ウェルを３回洗浄した後、ビオチン標識ＫＬ−６抗体１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３５６３、２％ウサギ血清添付）緩衝液を１００μＬ分注し、室温で１時間反応させた。【０１４４】
前記反応後、洗浄液Ｉで各ウェルを３回洗浄した後、前記調製した検出用溶液を１００μＬ分注し、室温でマイクロプレートを揺り動かしながら３０分反応させた。反応後、洗浄液ＩＩ［Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％、ＮａＮ３  ０．０１％、ｐＨ  ７．０］で各ウェルを３回洗浄した。
洗浄後、Ｇｅｎｐｒｏｂｅ社の発光試薬Ｉと発光試薬ＩＩを５０μＬずつ加え、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社ＬＢ−９６０を用いてＡＥの発光量を測定した。結果を図１８に示した。図１８に示した如く、本発明により抗原を高感度に定量的に測定することができた。【０１４５】
（実施例９）
ポリマー形成用の複数の核酸プローブとして、実施例１で用いたＡＥ標識されたＨＣＰ−１（配列番号１）及びＨＣＰ−２（配列番号２）を用いた。
結合用プローブとして、ＨＣＰ−１と同じ塩基配列を有し、ビオチンを結合させた核酸プローブ（配列番号１５）を用いた。
結合用プローブの塩基配列（5'-polyC-X1-X2-X3-3'）
5'-Biotin-CCCCCCCCCC GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG CTGGCGGTATCAA-3'（配列番号１５）【０１４６】
０．５ｍｌの反応液［コハク酸リチウム  １００ｍＭ、塩化リチウム  ６００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、添加剤、ｐＨ  ５．０］にストレプトアビジン１０ｐｍｏｌ／ｍＬと前記結合用プローブ１０ｐｍｏｌ／ｍＬを加え、室温で３０分間攪拌しながら反応させ、ストレプトアビジンが結合した結合用プローブを含むプローブ溶液を調製した。【０１４７】
前記調製したプローブ溶液に、前記ＡＥ標識したＨＣＰ−１とＨＣＰ−２を２５０ｐｍｏｌ／ｍＬずつ加え、６０℃、３０分間加熱し、ポリマーを形成させ、ポリマー含有溶液を調製した。
前記得られたポリマー含有溶液を反応液［コハク酸リチウム  １００ｍＭ、塩化リチウム  ６００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、添加剤、ｐＨ７．０］で２０倍に希釈し、検出用溶液を調製した。【０１４８】
標的物質として、実施例１で用いたターゲットオリゴ（配列番号３）を用いた。
標的物質捕捉用プローブとして、実施例３で用いたヘルパープローブ（配列番号６）を用いた。
標的物質検出用ポリマーと標的物質とを結合させるためのプローブとして、ターゲットオリゴと相補的な塩基配列を有し、ビオチン標識された核酸プローブ（配列番号１６、以下、ビオチン標識プローブと称する）を用いた。
ビオチン標識プローブの塩基配列
5'-Bitoin-CCCCCCCC CCATCTATAAGTGACAGCAAG-3'（配列番号１６）【０１４９】
白マイクロプレートのウェルに前記ヘルパープローブと相補的な配列を有する核酸プローブ（配列番号１７、以下、第２キャプチャープローブと称する）を固定化し、マイクロプレートを調製した。
第２キャプチャープローブの塩基配列
5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号１７）【０１５０】
試験官にヘルパープローブ５ｐｍｏｌ／ｍＬと前記ビオチン標識プローブ０．２５ｐｍｏｌ／ｍＬを含む反応液［コハク酸リチウム  １００ｍＭ、塩化リチウム  ６００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、添加剤、ｐＨ７．０］を９５μＬ、前記ターゲットオリゴを２５μＬ［ターゲットオリゴ濃度；０、１００、５００amol/well］加え、５５℃で３０分反応させた後、前記調製した検出用溶液を５μＬ加えて室温で３０分反応させた。【０１５１】
次に試験官の内溶液全量を前記調製したマイクロプレートのウェルに移し換え、室温で３０分間、マイクロプレートを揺り動かしながら反応させた。
洗浄液でマイクロプレートのウェルを５回洗浄した後、Ｇｅｎｐｒｏｂｅ社の発光試薬Ｉと発光試薬ＩＩを５０μＬずつ加え、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社ＬＢ−９６０を用いてＡＥの発光量を測定した。結果を図１９に示した。図１９に示した如く、原点を通る良好な直線性が得られ、本発明によりターゲットオリゴを高感度に定量的に測定することができた。
【図１】
2009057702.tif 000019
【図２】
2009057702.tif 000020
【図３】
2009057702.tif 000021
【図４】
2009057702.tif 000022
【図５】
2009057702.tif 000023
【図６】
2009057702.tif 000024
【図７】
2009057702.tif 000025
【図８】
2009057702.tif 000026
【図９】
2009057702.tif 000027
【図１０】
2009057702.tif 000028
【図１１】
2009057702.tif 000029
【図１２】
2009057702.tif 000030
【図１３】
2009057702.tif 000031
【図１４】
2009057702.tif 000032
【図１５】
2009057702.tif 000033
【図１６】
2009057702.tif 000034
【図１７】
2009057702.tif 000035
【図１８】
2009057702.tif 000036
【図１９】
2009057702.tif 000037
【配列表】
2009057702000001.app
【国際調査報告】
2009057702.tif 000038
2009057702.tif 000039
2009057702.tif 000040