(57)【要約】環状ニトロキシドラジカル化合物を特定の親−疎水性ブロック共重合体の疎水性ブロックに共有結合せしめる方法、及びそのように共有結合した高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物、並びにこのような化合物の例えば、医療分野での使用について提供される。該化合物は還元性環境下の生体内において、長期安定性を示す。
2009133647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法であって、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基と該共重合体の反応性基を介して共有結合せしめる工程を含んでなり、該官能基がアミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基であり、そして前記ブロック共重合体は該環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合した形態において水性溶媒中で高分子ミセルを形成できる、上記方法。
【請求項２】
ブロック共重合体が一般式（Ｉ）
2009133647.tif 000030
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−（ＣＨ２）ｃＮＨ−、−（ＣＨ２）ｃＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−及び−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれる連結基を表し、ここで、各ｃは独立して、１〜５の整数であり、
（ｈ−ｐｈｏｂｉｃ）は、下記式：
2009133647.tif 000031
ここで、ｐは１または２を表し、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリアミノ酸エステル鎖セグメント；
2009133647.tif 000032
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはＣ１−５アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（（メタ）アクリル酸エステル）鎖セグメント；
2009133647.tif 000033
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のスチレン−無水マレイン酸共重合体鎖セグメント；
2009133647.tif 000034
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリリンゴ酸エステル鎖セグメント；
2009133647.tif 000035
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリアミック酸鎖セグメント；
2009133647.tif 000036
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリマレイミド鎖セグメント；
2009133647.tif 000037
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメント；
2009133647.tif 000038
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（塩化ビニル）鎖セグメント；
2009133647.tif 000039
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（クロロプレン）鎖セグメント；
2009133647.tif 000040
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（グリシジル  メタクリレート）鎖セグメント；
2009133647.tif 000041
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（２−ヒドロキシエチル  メタクリレート）鎖セグメント；
2009133647.tif 000042
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリエピクロロヒドリン鎖セグメント；
2009133647.tif 000043
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ−３，３−ビスクロロメチルオキセタン鎖セグメント；
2009133647.tif 000044
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリ（オキサゾリン）鎖セグメント；
2009133647.tif 000045
ここで、ａ及びｂは独立して３〜５００の整数を表す、
のポリシロキサン鎖セグメント；
2009133647.tif 000046
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（ビニルフェニルボロン酸）鎖セグメント；
2009133647.tif 000047
ここで、ｎはそれぞれ３〜１，０００の整数を表す、
の１−ナイロン鎖セグメント；及び
2009133647.tif 000048
ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す、
のポリ（ビニルベンズアルデヒド）鎖セグメント
からなる群より選ばれる反応性基を担持する疎水性鎖セグメントであり、そして
Ｚは水素原子、ヒドロキシル基、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシ基または非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニル基を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロック共重合体の反応性基を担持する疎水性鎖セグメントが、式
2009133647.tif 000049
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
環状ニトロキシドラジカル化合物が、４−置換２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−置換２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、３−置換２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル、２−置換２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル、２−置換２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル及び２−置換−２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシルからなる群より選ばれ、４−置換、３−置換または２−置換の置換基が、アミノ基、アミノメチル基及びヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基及びカルボキシメチル基からなる群より選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
安定化が還元性条件下での還元に対する抵抗性の付与に向けられる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかの一に記載の方法により得られる高分子化ニトロキシドラジカル化合物。
【請求項７】
エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、ことを特徴とする高分子化ニトロキシドラジカル化合物。
【請求項８】
一般式（ＩＩ）
2009133647.tif 000050
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
一般式（ＩＩ）における、Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
2009133647.tif 000051
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
有効成分としての請求項６記載の化合物と食品または製薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含んでなる抗酸化剤。
【請求項１１】
一般式（ＩＩＩ）
2009133647.tif 000052
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｃＳ−からなる群より選ばれる連結基を表し、ｃは１ないし５の整数であり、
Ｘは、塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表されるブロック共重合体。
【請求項１２】
一般式（ＩＩ）
2009133647.tif 000053
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物および製薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含んでなる、生体内で活性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状の予防または治療用の製薬学的組成物。
【請求項１３】
該化合物は、一般式（ＩＩ）における、Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
2009133647.tif 000054
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、請求項１２に記載の製薬学的組成物。
【請求項１４】
一般式（ＩＩ）
2009133647.tif 000055
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物および製薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含んでなる生体内における活性酸素またはフリーラジカルの存在の検出用試薬。
【請求項１５】
検出手段が電子スピン共鳴法である、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
活性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状が脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷よりなる群から選ばれる請求項１２に記載の製薬学的組成物。
【請求項１７】
活性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状が脳梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、脳血管攣縮、ウィルス輪動脈閉塞症、脳主幹動脈閉塞症・狭窄症および腸間膜血管閉塞症よりなる群から選ばれる請求項１２に記載の製薬学的組成物。
【請求項１８】
活性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状を有する患者に、該疾患または症状を予防または治療するのに有効量の、一般式（ＩＩ）
2009133647.tif 000056
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物を投与することを含んでなる生体内で活性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状の予防または治療方法。
【請求項１９】
該化合物が、一般式（ＩＩ）における、Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
2009133647.tif 000057
式中、Ｒ’はメチル基である，
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性酸素またはフリーラジカルが関与する疾患または症状が脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷よりなる群から選ばれる請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明は、環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法、ならびに高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素やラジカル種による生体内の反応をトレースするための電子スピン共鳴（ＥＳＲ）イメージングや該活性酸素の関与する疾患または症状の予防または治療等への安定ラジカルの使用が注目されている。
ＥＳＲ法はシグナル解析やスピントラッピング法を利用して、ＬバンドＥＳＲイメージングや活性酸素の生成、消滅など生体内外の環境下において広範に利用されてきている。ＥＳＲ活性な電子スピンは極めて不安定な活性種として知られているものの、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）等の安定な環状ニトロキシドラジカル類はラジカルが安定化されることによってさらに様々な用途が開発され、また、検討されている（例えば、下記の非特許文献１参照）。しかしながらこのような安定な環状ニトロキシドラジカル類はラジカルまたは安定電子スピンでさえ、生体中にあるアスコルビン酸のような還元種の存在下では短時間で還元されるため、取り扱いが難しいのが現状である。
なお、上記利用の一つである、所謂、スピン標識法は、安定なニトロキシドラジカル類をラベル剤として用いタンパク質や脂肪酸やステロイドに結合させる方法であるが、これは安定なニトロキシドラジカル類を外部環境下でさらに安定化することを意図するものではないし、また、向上した安定化が期待できるものでもない。さらに、複数の安定なニトロキシドラジカル類を１つまたは複数の金属イオン・キレートとともにポリマーまたはオリゴマーに共有結合し、ＭＲＩ造影剤に新たな機能を付加しようとすることも提案されている（下記、特許文献１参照）。
他方、活性酸素や反応性ラジカル種が生体内で重要な役割を担うことも知られている。例えば、脳の損傷に関与する原因の一つとしてヒドロキシラジカルなどのフリーラジカルが挙げられている。典型的なものとしては、脳虚血時や再還流後に薬物治療領域とされるペナンブラ（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｅｎｕｍｂｒａ）領域においてフリーラジカルが発生する傾向があることが知られている。そのため一定のフリーラジカルスカベンジャーが脳血管や神経細胞の損傷の原因であるラジカルを消去無害化する脳保護剤として着目されており、このようなスカベンジャーの一つであるエダラボン（３−メチル‐１−フェニル‐２−ピラゾリン‐５−オン）は商品名ラジカットとして販売されている（下記、非特許文献２参照）。しかし、エダラボンの使用には、急性腎不全（合併症として腎機能障害、肝機能障害、心疾患）の副作用のリスクを伴うことも明らかとなっている。さらに、エダラボンは動物実験で著しい効果がみられる投与量よりもヒトでは安全性の面から少量を複数回に分けて投与しており、効果の面、安全性の面からも改善の余地があると考えられている。
また、上記の安定な環状ニトロキシドラジカル類に分類される、ユニークな抗酸化剤特性を有する４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（テンポオール（Ｔｅｍｐｏｌ））を初めとする環状ニトロキシド化合物は、スーパーオキシドや過酸化物の分解能を有し、それによりラジカルスカベンジャーとして機能し、酸化ストレスを改変し、組織の酸化還元状態を改変することにより、多くの代謝過程と相互作用しそして改変することが見出されている（下記、非特許文献３参照）。そして、非特許文献３には、これらの相互作用が電離放射線に対する保護、機能性磁気共鳴イメージングのプローブ、癌の予防もしくは治療、高血圧及び体重の制御、虚血及び再還流からもたらされる損傷の防御を包含する治療及び研究用途で利用できることも示唆されている。しかし、環状ニトロキシド化合物は生体内に入ると内在性のアスコルビン酸などの還元剤により還元されるとラジカルスカベンジャーとして機能しなくなる。
ところで、本発明者等は、従来から、親−疎水型のブロック共重合体の水中での自己組織化によるナノ粒子（または高分子ミセル）が薬物キャリアーやナノ診断を可能にする新規材料として機能することを明らかにし、様々な材料設計を進めてきた。特に、親−疎水性ブロック共重合体の水溶性高分子末端に官能基を導入することによって、表層にリガンド導入部位を有する数十ナノメートルサイズのコアーシェル型ナノ粒子はアクティブターゲッティングを可能にする新しい薬物キャリアーとして期待されている（例えば、下記、特許文献２、特許文献３参照）。
【特許文献１】特表２００１−５２３２１５（またはＷＯ９６／３２９６７）
【特許文献２】ＷＯ９６／３３２３３（またはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．５，９２５，７２０）
【特許文献３】ＷＯ９７／０６２０２（またはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．５，９２９，１７７）
【非特許文献１】Ｂ．Ｐ．Ｓｏｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４２（２００７）１６３２−１６５０
【非特許文献２】Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８１：９２１−９２７，１９９７
【非特許文献３】Ｊａｍｅｓ  Ｂ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４２（２００７）１６３２−６５０
【発明の開示】
【０００３】
上記のように、Ｔｅｍｐｏｌなどの安定な環状ニトロキシラジカルは、「安定な」と称されているが、ラジカルスカベンジャーとして機能するが、生体還元環境下では還元されてラジカルスカベンジャーとして機能しなくなる。具体的には、当該環状ニトロキシラジカルは生体内では、例えば、アスコルビン酸のような還元種の存在下で、短時間または容易に還元されるため、それ自体造影剤や治療剤として医療用に使用することは困難であった。したがって、生体内に長時間安定にラジカル種を導入し、保持できる手段の提供が可能であれば、有意義であろう。
本発明者らは、今回、特定のブロック共重合体の疎水性セグメントに安定なニトロキシドラジカル（ＴＥＭＰＯ等）を導入し、主としてコア領域に安定なニトロキシドラジカルを有する新しいナノ粒子（ＲＮＰ）の調製を行い、それらの体内動態を検討したところ、安定なニトロキシドラジカルに対し有意に高い血中安定性を付与し得ることを確認した。（Ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２００７年１２月７日  発行者：第１８回  日本ＭＲＳ学術シンポジウム実行委員会、発行所日本ＭＲＳ事務局）。
さらに、このような高分子ミセル化環状ニトロキシドラジカル化合物が、虚血部等で産生されるフリーラジカルに起因すると推測される脳細胞の傷害を予防または治療できることを見出した。このことは、該高分子ミセル化環状ニトロキシドラジカル化合物は、血液脳関門による脳内移行の制限を受けることなく脳内移行でき、しかも脳内では本来のラジカルスカベンジャーとしての作用を発揮したものと推測される。また、該化合物は脳細胞傷害を予防または治療できる用量で動脈または静脈に投与したときに、被験動物に対して顕著な毒性または重篤な副作用を示さないことも確認できた。上記の脳傷害の予防または治療が該高分子ミセル化環状ニトロキシラジカル化合物のフリーラジカルスカベンジャー作用によると推測されることを考慮すると、脳内での活性酸素やフリーラジカル（もしくはヒドロキシラジカル）の産生機構のどのような様式によるかを問わず、該化合物は同様に活性酸素やフリーラジカルの生じた生体内における活性酸素やフリーラジカルの関与する広範な疾患または症状を予防または治療できるものと考えられる。
したがって、本願により以下の態様の発明が開示される。
第一の態様：
環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法であって、環状ニトロキシドラジカル化合物をポリ（エチレングリコール）鎖セグメントと反応性基を担持する疎水性鎖セグメントを含むブロック共重合体に、該化合物のラジカル以外の官能基と該共重合体の反応性基を介して共有結合せしめる工程を含んでなり、該官能基がアミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基であり、該反応性基がハロゲン原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基であり、そして前記ブロック共重合体は該環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合された形態において水性溶媒中で高分子ミセルを形成できる、上記方法。
第二の態様：
このような安定化方法により得ることのできる高分子化ニトロキシドラジカル化合物。
好ましい態様としての、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が共有結合しており、存在するばあいには、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、上記高分子化ニトロキシドラジカル化合物。
第三の態様：
一般式（ＩＩＩ）
2009133647.tif 000003
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−及び−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｘは、塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表されるブロック共重合体。
第四の態様：
上記高分子化ニトロキシドラジカル化合物、好ましくは、一般式（ＩＩ）
2009133647.tif 000004
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基または式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、メチルエステル及びメチルエステルメチルからなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表される、
化合物および製薬学的に許容されるキャリアーを含んでなる活性酸素またはヒドロキシラジカルが関与する疾患または症状、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷よりなる群かの予防または治療用の製薬学的組成物。
第五の態様：
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物および製薬学的に許容されるキャリアーを含んでなる生体内における活性酸素またはフリーラジカル（もしくはヒドロキシラジカル）の存在の検出用試薬。
第六の態様：
活性酸素またはフリーラジカル（もしくはヒドロキシラジカル）が関与する疾患または症状を有する患者に、該疾患または症状を予防または治療するのに有効量の、一般式（ＩＩ）で表される化合物を投与することを含んでなる活性酸素またはフリーラジカル（もしくはヒドロキシラジカル）が関与する疾患または症状、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管傷害および神経細胞傷害の予防または治療方法。
上記のような高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、理論により拘束されるものではないが、水性媒体中で自己組織化することによってコア領域にニトロキシドラジカル部分が担持され、シェル領域にポリ（エチレングリコール）鎖が存在するとみなせる数十ナノ粒子径を有する高分子ミセルを形成する（高分子ミセルの概念図については、図２０の高ｐＨ下の構造を参照のこと）。このような環状ニトロキシドラジカルを内包する高分子ミセルは、上述したような、グルタチオンまたはアスコルビン酸のような還元種の存在下でも安定に長時間維持される。さらに、本発明に従い環状ニトロキシドラジカル化合物を、イミノ基を介して高分子化すると、酸性ｐＨ条件下で環状ニトロキシドラジカルを内包する高分子ミセルの崩壊が促進され、ラジカルが周囲環境下に放出されるので環状ニトロキシドラジカル本来の作用（上記非特許文献１参照）を奏するようになる。そのため、通常、酸性状態にあることが知られている炎症部位等で、選択的に環状ニトロキシドラジカルの作用を発揮せしめ得ることが予期できる。したがって、本発明の高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、疾病部位における活性酸素や反応性ラジカル種を有効に消失させるため、抗炎症剤や血圧降下剤や高脂血漿治療薬、減量薬などに期待できるだけでなく、放射線治療における正常細胞へのネクローシス抑制など全く新しい薬物にもなりうる新規材料である。こうして、本発明は、新たなタイプ造影剤としてのみならず、酸化還元反応を制御しうる医療用酸化剤、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷の治療剤、さらには血圧降下剤、抗炎症剤、加えて食品等の抗酸化剤やサプリメントとしても期待される化合物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、製造例１で得られた生成物アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのサイズ排除クロマトクラフィーの結果を示すグラフ（ａ）及び１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムである。
図２は、製造例２で得られた生成物アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯの１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムである。
図３は、ＥＳＲシグナル測定により追跡した製造例２の反応生成物の精製による未反応低分子ＴＥＭＰＯの除去される挙動を示すグラフ表示である。
図４は、製造例３で得られたアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯによるナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）の動的光散乱（ＤＬＳ）測定結果を示す図である。
図５は、製造例３で得られたＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰによるナノ粒子のＥＳＲスペクトラム（ａ）と低分子ＴＥＭＰＯの希薄溶液中でのＥＳＲスペクトラム（ｂ）である。
図６は、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰとＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのミセル水溶液のｐＨの変化に伴うＥＳＲスペクトラムの変動を示す。
図７は、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのＴＥＭＰＯＬと低分子ＴＥＭＰＯのグルタチオンよる還元耐性試験の結果を示すグラフ表示である。
図８は、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのＴＥＭＰＯＬと低分子ＴＥＭＰＯＬのアスコルビン酸による還元耐性試験の結果を示すグラフ表示である。
図９は、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのＴＥＭＰＯＬと低分子ＴＥＭＰＯの体内動態の結果を示す血中濃度変化を示すグラフ表示である。
図１０は、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの体内動態の結果を示す血中濃度変化を示すグラフ表示である。
図１１は、試験５における大脳切片のＴＴＣ染色写真である。それぞれ、上段は無投与オ対照群、中段は、Ｔｅｍｐｏｌ投与群であり、下段はＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰミセル投与群であり、中段及び後段の左側の写真は、静脈投与群であり、右側の写真は動脈投与群である。
図１２は、試験５における、ＴＴＣ染色の結果において梗塞部分面積（ｉｎｆｒａｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）を数値化した結果のグラフ表示である。Ｔｅｍｐｏ  ｍｉｃｅｌｌｅ（Ｃ）ｉｖ及びｉａは、ナノ粒子の溶液をそれぞれ静脈内及び動脈内投与した群でありＴｅｍｐｏ  ｉｖ及びｉａはＴｅｍｐｏｌの溶液をそれぞれ静脈内投与した群及び例である。
図１３は、試験５における、脳梗塞の症状を数値化した神経症状スコア（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｓｃｏｒｅ）のグラフ表示である。
図１４は、試験５（２）における、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）、Ｂｌａｎｋ−ＮＰ、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの薬剤投与時の平均血圧の変動の結果をグラフ表示である。
図１５は、試験５（２）における、ＴＴＣ染色の結果において梗塞部分面積（ｉｎｆｒａｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）を数値化した結果の表示である。
図１６は、試験５（２）における、脳梗塞の症状を数値化した神経症状スコア（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｓｃｏｒｅ）のグラフ表示である。
図１７は、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰとヒドラジン還元にされたＲＮＰ（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈ）のＥＳＲスペクトルである。
図１８は、ヒドラジン還元されたＲＮＰ（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈ）のｐＨ５．６およびｐＨ７．４の酸化環境で観測されたＥＳＲシグナル強度の経時変化のグラフ表示である。
図１９は、本発明のアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯによるナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）のｐＨ応答性のついての説明する概略図である。
発明の詳細な記述
第一の態様の本発明である環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法では、ブロック共重合体の疎水性セグメントに共有結合可能な環状ニトロキシドラジカル化合物は、例えば、スピン標識法で有利に使用されるような、所謂、安定なニトロキシドラジカル化合物に限定されることなく、広範な化合物を安定化できる。
このような安定化方法に用いることのできるブロック共重合体は、上記に規定するように、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメント（Ａ）と反応性基を担持する疎水性鎖セグメント（Ｂ）を含んでなり、好ましくは、ＡＢ型のジブロック共重合体であるが、ＡＢＡ型のトリブロック共重合体、ＡＢＢＡ型のテトラブロック共重合体であってもよい。しかしかような共重合体のうち、好ましいものとしては、一般式（Ｉ）
2009133647.tif 000005
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、−（ＣＨ２）ｃＮＨ−、−（ＣＨ２）ｃＣＯ−（ここで、各ｃは１〜５、好ましくは１または２の整数である。）、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−及び−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれる連結基を表し、
（ｈ−ｐｈｏｂｉｃ）は、それ自体当該技術分野で生体適合性または医療用ポリマーとして公知のポリマー由来のものから選ぶことができる。限定されるものでないが、下記式で表わされるものを具体例として挙げることができる：
2009133647.tif 000006
ここで、ｐは１または２を表し、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリアミノ酸エステル鎖セグメント；
2009133647.tif 000007
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはＣ１−５アルキル基、好ましくはメチル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（（メタ）アクリル酸エステル）鎖セグメント；
2009133647.tif 000008
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のスチレン−無水マレイン酸共重合体鎖セグメント；
2009133647.tif 000009
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリリンゴ酸エステル鎖セグメント；
2009133647.tif 000010
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリアミック酸鎖セグメント；
2009133647.tif 000011
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリマレイミド鎖セグメント；
2009133647.tif 000012
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、の
ポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメント；
2009133647.tif 000013
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（塩化ビニル）鎖セグメント；
2009133647.tif 000014
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（クロロプレン）鎖セグメント；
2009133647.tif 000015
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、のポリ（グリシジル  メタクリレート）鎖セグメント；
2009133647.tif 000016
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（２−ヒドロキシエチル  メタクリレート）鎖セグメント；
2009133647.tif 000017
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリエピクロロヒドリン鎖セグメント；
2009133647.tif 000018
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ−３，３−ビスクロロメチルオキセタン鎖セグメント；
2009133647.tif 000019
ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（オキサゾリン）鎖セグメント；
2009133647.tif 000020
ここで、ａ及びｂは独立して３〜５００の整数を表す、
のポリシロキサン鎖セグメント；
2009133647.tif 000021
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ビニルフェニルボロン酸）鎖セグメント；
2009133647.tif 000022
ここで、ｎはそれぞれ３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
の１−ナイロン鎖セグメント；及び
2009133647.tif 000023
ここで、ｎは３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜３００の整数を表す、
のポリ（ビニルベンズアルデヒド）鎖セグメント。
さらに、上記式（Ｉ）において、
Ｚは水素原子、ヒドロキシ、非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルコキシまたは非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルカルボニルを表す、ジブロック共重合体を挙がることができる。
しかし、特に、ブロック共重合体の反応性基を担持する疎水性鎖セグメントが、式
2009133647.tif 000024
ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す、のポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメントである、ブロック共重合体を好ましく使用できる。
このようなブロック共重合体の一部は公知であり、例えば、疎水性セグメントがポリアミノ酸エステル鎖セグメントを表すものは特許第２６９０２７６号公報（または米国特許第５，４４９，５１３号明細書）等により、また、ポリ（（メタ）アクリル酸エステル鎖セグメントを表すものは特許文献３により公知である。その他のブロック共重合体は上記ブロック共重合体の製造方法または本明細書に後述する製造例１を参照すれば当業者にとって容易に取得できる。なお、本発明で使用するブロック共重合体を規定する一般式中の連結基または反復単位を式で表す場合には、記載されている方向性でそれが一般式中組込まれることが意図されている。
環状ニトロキシドラジカルは、本発明の方法により安定化できるものであれば、限定されることなく使用できるが、しかし、本発明で安定化することを強く企図している環状ニトロキシドラジカル化合物は、４−置換２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−置換２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、３−置換２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル、２−置換２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル、２−置換２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル及び２−置換−２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシルからなる群より選ばれ、４−置換、３−置換または２−置換の置換基が、アミノ基、アミノメチル基及びヒドロキシル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基及びカルボキシメチル基からなる群より選ばれる。
該環状ニトロキシドラジカル化合物のラジカル以外の官能基（例えば、アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはカルボメチル基）と該ブロック共重合体の反応性基（ハロゲン原子、特に、塩素、臭素もしくはヨウ素原子、カルボキシル基、イソシアナート残基、イソチオシアナート残基、エステル残基、酸無水物残基、ボロン酸残基、マレイミド残基またはエポキシ基）を介して共有結合を形成する方法は、それ自体公知の縮合反応、付加反応または、例えばエステル残基にあっては環状ニトロキシドラジカル化合物の官能基（アミノ基）を介するアミノリシス等により実施できる。このような反応は、必要により、水性溶媒（水及び水に混和しうる有機溶媒、例えば、低級アルコール、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、シメチルスルホキシド、等を含んでいてもよい）中、有機塩基（トリメチルアミン、トリエタノールアミン等）または無機塩基（炭酸カリウム、炭酸ナトリウウム、水酸化ナトリウム等）、その他の当該技術分野で公知の縮合剤の存在下で実施してもよい。前記ブロック共重合体はそれ自体としても水性溶媒中で自己組織化により高分子ミセルを形成できるものが都合よく使用できるが、該環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合された形態において水性溶媒中で高分子ミセルを形成し得るものであれば、本発明で使用できる。
本発明の別の態様では、上記のようなブロック共重合体を使用する環状ニトロキシドラジカル化合物の安定化方法により製造される環状ニトロキシドラジカル化合物の高分子化化合物が提供される。限定されるものでないが、好ましい態様としては、エチレングリコールの反復単位が１５〜１０，０００のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとスチレンの反復単位が３〜３，０００のポリ（スチレン）鎖セグメントを含んでなり、かつ、該ポリ（スチレン）鎖セグメントにおけるスチレンの反復単位の少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは８０％、特に好ましくは１００％がフェニル基の４位において−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＯ−及び−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−からなる群より選ばれる連結基を介して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基が共有結合しており、該４位の残りがハロゲン原子、水素原子またはヒドロキシル基であり、そして該環状ニトロキシドラジカル化合物が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる、ことを特徴とする高分子化ニトロキシドラジカル化合物が提供される。さらに具体的であり、かつ、より好ましいものとしては、一般式（ＩＩ）
2009133647.tif 000025
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｌ２は、メチルイミノ（−ＣＨ２ＮＨ−）、メチルイミノメチル（−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−）、メチルオキシ（−ＣＨ２Ｏ−）、メチルオキシメチル（−ＣＨ２ＯＣＨ２−）、メチルエステル（−ＣＨ２ＯＣＯ−）及びメチルエステルメチル（−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−）からなる群より選ばれる連結基を表し、
Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシル基であり、
ｍは、２０〜５，０００，好ましくは３０〜３，０００、より好ましくは、４０〜１，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００、好ましくは５〜５００、より好ましくは１０〜５００の整数を表す、
の高分子化ニトロキシドラジカル化合物が提供される。さらに、一般式（ＩＩ）において、Ｌ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
2009133647.tif 000026
式中、Ｒ’はメチル基である、
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、これらの化合物から形成できる高分子ミセルの安定化にｐＨ応答性を付与する点でも特に好ましいものとして提供される。
上記の各基または部分の定義において、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシのアルキル部分は、直鎖または分岐のアルキルであることができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ドデカニル等を挙がることができる。また、Ａが、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−で置換されたアルコキシ基を表し、かつ、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す場合には、このような置換基は酸性条件下で容易に開裂してホルミル基に転化できるので、タンパク質（例えば、抗体その他のリガンド）等をそのアミノ基を介して容易に共有結合できる。かような置換基は、存在する場合には、アルコキシ基の未結合末端に存在するのが好ましい。これらの置換基は、例えば、上記特許文献２及び３に記載のポリ（エチレングリコール）鎖セグメントの生成方法を参照して導入できる。
また、上記ブロック共重合体における、連結基Ｌ１は、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントとポリ（スチレン）をどのように結合させるかにより代わり得るので限定されるものでない。例えば、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントをアニオンリビング重合で生成し、次いで、ハロメチルスチレンのリビング重合を継続する場合には、Ｌ１は原子価結合となる。ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントのω−末端に硫黄原子を持つポリ（エチレングリコール）誘導体を用意した場合は、該誘導体の存在下にハロメチルスチレンのラジカル重合を行うことで連結基が、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−または−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−となり得る。
Ｌ２は、典型的には、メチルイミノ、メチルイミノメチル、メチルオキシ、メチルオキシメチル、からなる群より選ばれる連結基を挙げることができる。このような連結基は、都合よくは、ブロック共重合体、例えば  一般式（ＩＩＩ）
2009133647.tif 000027
式中、Ａは、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ１は、原子化結合、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、からなる群より選ばれる連結基を表し、ここでｃは１ないし５、好ましくは２の整数であり、
Ｘは、塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、
ｍは、２０〜５，０００の整数を表し、そして
ｎは、３〜１，０００の整数を表す、
で表されるブロック共重合体のハロゲン原子と環状ニトロキシドラジカル化合物のラジカル以外の官能基の種類により、変動しうるものであるが、通常、ハロゲン化水素の脱離を伴う共有結合形成反応により形成できる。
なお、一般式（ＩＩＩ）で表される共重合体は、本発明者等の知る限りでは、文献未記載であり、本発明の別の一態様として提供される。
一般式（ＩＩ）における、Ｒは、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは１００％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，４，４−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，４，４−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシル基を表す。Ｒの総数ｎにおける環状ニトロキシドラジカル化合物の残基の占める割合は、例えば、上記一般式（ＩＩＩ）の共重合体と環状ニトロキシドラジカル化合物の反応を制御、例えば、反応時間を制御することにより、変動せしめることができる。
ｍは、上述したが、また、２０〜５，０００、好ましくは３５〜３，０００、より好ましくは６０〜５００の整数であることができ、そしてｎは、３〜５０００、好ましくは１０〜３００、より好ましくは１５〜１００の整数であることもできる。
本発明の高分子化ニトロキシドラジカル化合物は、具体的には、後述する試験例で示されるとおり、還元性条件下でも、環状ニトロキシドラジカル化合物本来の作用（例えば、非特許文献１も参照）を示すので、生体の内外で抗酸化剤として使用できる。
本明細書では、上記の方法により安定化された化合物、より具体的に記載された化合物のさらなる具体的な使用例として、生体内で活性酸素またはフリーラジカル（もしくヒドロキシラジカル）が関与する疾患または症状の予防または治療に使用できる。
本発明にいう、生体内とは、ヒトをはじめとする動物一般、哺乳類、魚類等の生体内を意味し、器官、臓器、体液を挙げることができる。
活性酸素またはヒドロキシラジカルが関与する疾患または症状は、限定されるものでないが、脳梗塞、心筋梗塞、脳浮腫、神経脱落症状、炎症、高血圧、高脂血症、肥満、脳血管損傷および神経細胞損傷、より具体的には脳梗塞、脳浮腫、および神経脱落症状、脳梗塞（特に、アテローム血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞、脳塞栓症）、脳血管攣縮（特に、くも膜下出血後に起こる一過性の脳動脈の狭窄）、もやもや病（特に、ウィルス輪動脈閉塞症）、脳主幹動脈閉塞症・狭窄症、腸間膜血管閉塞症を挙げることができる。
かような疾患または症状に効能を発揮する化合物であれば、上記の化合物のいずれを有効成分とすることもできるが、好ましいものとしては、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物を、そしてより好ましいものとしては該一般式（ＩＩ）で表わされる化合物であって、式中のＬ１が原子化結合または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルであり、そして
Ｒの全てが、次式
2009133647.tif 000028
式中、Ｒ’はメチル基である、
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基である、高分子化ニトロキシドラジカル化合物挙げることができる。Ｌ２がメチルイミノまたはメチルイミノメチルである場合には、酸性ｐＨ条件下で環状ニトロキシドラジカルを内包する高分子ミセルの崩壊が促進され、ラジカルが周囲環境下に放出されるので環状ニトロキシドラジカル本来の作用（上記非特許文献１参照）を発揮するようになる。そのため、通常、酸性状態にあることが知られている炎症部位等で、選択的に環状ニトロキシドラジカルの作用を発揮せしめ得ることが期待できる。
製薬学的組成物に含めることができる製薬学的に許容できる希釈剤または賦形剤としては、当該技術分野の注射剤（静脈内、動脈内注入剤）、局所投与剤（脳内埋包剤を含む）などの調製に常用されている添加剤であって、高分子化環状ニトロラジカルの特性または機能に悪影響を及ぼさない化合物または物質であればいかなるものも挙げることができる。限定されるものでないが、注射剤にあっては、希釈剤としては、典型的には純水、脱イオン水、または生理食塩水が挙げられ、これらの液には、緩衝剤を含めることもできる。また、これらの液には、一般式（Ｉ）で表される化合物が形成する高分子ミセルの安定性に悪影響を及ぼさない限り、エタノール、ジメチルスルホキシドなどの水混和性の有機溶媒を含めてもよい。賦形剤としては、医薬製剤に使用できる各種分子量のポリエチレングリコール（マクロゴール）、グルコース、ラクトース、マンニトール、等の糖または糖アルコールを挙げることができる。脳内埋包剤としては、例えば、脳内に設置するステントの被覆マトリックス層中に該化合物を含めた形態のものを挙げることができる。本明細書にいう、食品に許容できる希釈剤または賦形剤（またはキャリアー）は、上記製薬学的に許容できるものに準ずることができる。
静脈内投与剤を例にすると、最適な用量は、患者の年齢、症状、年齢、性別等により変動するので限定されないが、本発明に従う組成物の用量は、環状ニトロキシドラジカル化合物基準で、通常、成人に対して、１日当たり０．１〜９００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜２５０ｍｇ／ｋｇであり、一度ないし３度に分けて投与できる。
以下、具体例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明をこれらの態様に限定することを意図するものではない。
製造例１：α―末端にアセタール基を有するポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）の合成
アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
2009133647.tif 000029
α―末端にアセタール基、ω―末端にチオール基を有しているヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（アセタール−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：４，６００；０．０２ｍｍｏｌ，９２ｍｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１ｍＬのアゾビスイソブチロニトリル／ベンゼン（０．０１ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液とクロロメチルスチレン（１ｍｍｏｌ，０．１３８ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をヘキサン中に流し込んだところ、白い沈殿が生じた。ポリクロロメチルスチレンホモポリマーを除去するために、得られた沈殿物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、１３４ｍｇであり、収率は５５．１％であった。得られたアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定の結果から、二峰性の分布が確認された（図１ａ）。生成物の情報を得るために、ＳＥＣを用いてこの２つの分布を分別し、それぞれのフラクションの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを測定した。
その結果、二つのフラクションのＰＥＧとＰＣＭＳの成分比率がほぼ同じであることが明らかとなった。また、得られたブロック共重合体中のＰＣＭＳセグメントの分子量を算出するために、ＳＥＣより決定したアセタール−ＰＥＧ−ＳＨの分子量に基づき１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを解析ところ、ＰＣＭＳセグメントの分子量は、それぞれ３，３００、６，６００であることが明らかとなった（図１ｂ）。これらの結果により、二峰性の分布は、一方がジブロック共重合体の生成物であり、他方がトリブロック共重合体の生成物であることが明らかとなった。これは、テロメリゼーション中のジブロック共重合体同士の再結合により、トリブロック共重合体が生成したということが示唆される。また、ピークフィッティングにより、ジブロック共重合体とトリブロック共重合体の成分比は、２３％と７７％であることが確認された。
製造例２：イミノ結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；４０ｍｇ，５．２μｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（８８ｍｇ，５２０ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、７６．３％であった。
１Ｈ  ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた（図２）。またサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分取し、各フラクションにおけるＥＳＲシグナルを測定した。その結果、再沈殿の回数が増すごとに２０分〜２７分に見られる未反応アミノ−ＴＥＭＰＯのＥＳＲシグナルが消失したことから、未反応のアミノ−ＴＥＭＰＯが精製によって完全除去されていることが確認された（図３）。
製造例３：エーテル結合を介して結合したＴＥＭＰＯを有するブロックポリマー（メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯ）の合成
反応容器に、メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：７，９００；２００ｍｇ，３０．６μｍｏｌ）を加え、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬに溶解した。次に、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（２６０ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）とＮａＨ（７０．３ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＦに溶解し、反応容器に加え、室温で５時間攪拌を行った。反応終了後、−１５℃に冷却した２−プロパノール中に反応混合物を注ぎ、次に２−プロパノールを用いて３回、再沈殿を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、目的のメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯを得た。収率は、７０．０％であった。
製造例４：アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯによるナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）の調製
２０ｍｇのアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯを２ｍＬのＤＭＦに溶解し、ポリマー溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｓｉｚｅ  ３，５００  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）中に加え、２Ｌの蒸留水に対して透析を行った。蒸留水は、２、４、８時間後に３回交換した。透析後、得られたＲＮＰの平均粒子径をＤＬＳ測定により行ったところ、平均粒径４０ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された（図４）。次に、得られたＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのＥＳＲスペクトルの測定を行った。通常、低分子ＴＥＭＰＯは希薄溶液中において、窒素核と不対電子の相互作用により３本線のスペクトルを示すものの（図５ｂ）、アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯを用いて調製したＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰはブロードな１本線のスペクトルを示すことが明らかとなった（図５ａ）。これは、疎水性のＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯセグメントが粒子コアとして凝集した固体相を形成することでＴＥＭＰＯの運動性が低下し、さらにＴＥＭＰＯ間が隣接したことによりスペクトルの線幅が増大した結果、スペクトルが３本線から１本線に変化したものと考えられる。
製造例５：メトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯによるナノ粒子（Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）の調製
製造例４における、アセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯをメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｏ−ＴＥＭＰＯに代えたこと以外、反応体、溶媒、等の量は同様な割合で使用して、製造例４の処理手順を繰り返した。こうして得られたＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの平均粒子径を確認するためにＤＬＳ測定を行ったところ、製造例４のＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰと同様に平均粒子径４０ｎｍの単峰性であることが確認された。次に、得られたＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのＥＳＲスペクトルの測定を行った。通常、低分子ＴＥＭＰＯは希薄溶液中において、窒素核と不対電子の相互作用により３本線のスペクトルを示すものの（上記図５ｂ参照）、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰは図５ａに示されるＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰと同様にブロードな１本線のスペクトルを示すことが確認された。この原因は、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰについて記述したのと同様であると考えられる。
試験１：Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰとＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのｐＨ応答性
製造例４で得られたＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのｐＨ変化に対する平均粒径とＥＳＲスペクトルを動的光散乱（ＤＬＳ）とＥＳＲにより測定した。中性ｐＨから塩基性ｐＨ領域においては、平均粒径４０ｎｍの単峰性の粒子であり散乱強度に変化がなかったものの、酸性領域においては、散乱強度が減少し、粒子径が増大することが明らかとなった。またＥＳＲ測定により、中性ｐＨと塩基性ｐＨにおけるＲＮＰのＥＳＲスペクトルは、ブロードな１本線であったものの、酸性条件下においては、スペクトルの形状が１本線から３本線に変化することが明らかとなった（図６の上段）。この原因は、ブロックポリマーの疎水セグメント側鎖に存在するアミノ基のプロトン化によって粒子が崩壊し、さらに側鎖間での静電反発が生じることにより、ＴＥＭＰＯの運動性が増加し、またＴＥＭＰＯ間距離が増大したものと考えられる。
これに対し、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰはどのｐＨ領域においても同様のＥＳＲシグナルを示している（図６の下段）。
試験２：グルタチオンに対するＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰラジカルの還元耐性
通常、細胞内は還元環境であり、高濃度（０．５ｍＭ〜１０ｍＭ）のグルタチオンが存在しているものの、血中では細胞中の１００〜１０００分の１程度しか存在しないことが知られている。よって、安定ラジカルを有している低分子ＴＥＭＰＯは、細胞内に入ると容易に還元され、急速にＥＳＲシグナル強度を消失する。そこで、高分子化環状ニトロキシドラジカルのグルタチオン還元耐性を評価するために、９００ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝溶液を用いて６４μＭのアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯから成るミセル（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）の溶液を調製し（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのグルタチオン存在下でのＥＳＲスペクトルの変化を観測した。ＧＳＨ共存下１時間後、低分子ＴＥＭＰＯのＥＳＲシグナル（灰色バー）強度は、５０％の減少が認められたのに対し、調製したＲＮＰのＥＳＲシグナル強度の変化は認められなかった（図７）。この結果から、ナノ粒子のコア内に存在するＴＥＭＰＯは、外部に存在するＧＳＨに対して安定であるため、強いＥＳＲシグナル強度を保持することができたと考えられる。
試験３：アスコルビン酸（ＡｓＡ）に対するＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰラジカルの還元耐性
ビタミンＣとも称されるＡｓＡは、通常、血中で高濃度に存在する。安定ラジカルを有している低分子ＴＥＭＰＯは生体内投与後血液中で容易に還元され、急速にＥＳＲシグナル強度を低下することが知られている。そこで、ＡｓＡに対するＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの還元耐性を評価するために、３．６ｍＭ  ＡｓＡの存在下、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）において、９０μＭのアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯ調製されたＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰのＥＳＲスペクトルの変化を観察した。その結果を図８に示す。図より、低分子ＴＥＭＰＯの半減期は２０秒以内であるのに対し、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの半減期は約１５分であることが明らかである（半減期が約４５倍に増加している）。
試験４：Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰとＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの血中滞留性
上記のように調製したＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰおよびＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰをそれぞれ独立して、別々のマウスの静脈に注射し、一定時間後、開腹手術を行い、心臓より採血を行った。採血後、６，２００ｒｐｍ（２０００×ｇ）で１０分間遠心分離し、血漿を得た。得られた血漿のＥＳＲスペクトルを測定したところ、血中からそれぞれのＲＮＰのＥＳＲシグナルが観測された。また、その体内動態を検討したところ、半減期は前者が約２０分であり（図９）、後者が約１時間であった（図１０）。ｐＨ応答性を示すＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰはコントロールとして用いた低分子ＴＥＭＰＯＬの血中半減期（＜１分）よりもきわめて高い血中安定性を有するが、ｐＨ応答姓を示さないＯ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰはさらに血中安定性が高まることが明らかとなった。
試験５：脳虚血モデルラットの処置
（１）製造例２のアセタール‐ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳの製造において使用したアセタール‐ＰＥＧ−ＳＨに代え、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＨを用いて同様製造したメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを原料に、製造例３及び４に従って処理することにより得られたメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯのジメチルホルムアミドのポリマー溶液を透析後、得られたＲＮＰ（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）の平均粒子径をＤＬＳ測定により行ったところ、平均粒径６０ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された。こうして得られたＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ水溶液に生理食塩水を添加して１００％生理食塩水の濃度となるように遠心エバポレーターにより濃縮して２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
脳虚血モデルラットは次のように作成した：
ＳＤ系の雄のラット（３週齢）を１週間馴化飼育後、イソフルランによる吸入麻酔を行なった。総頚動脈を塞栓糸により閉塞し、２時間後に再還流した。再還流後、直ちにＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ（２０ｍｇ／ｍＬ）を１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＬ／ｍｉｎの速度で大腿静脈（もしくは総頚動脈）から注射した。２４時間後、ネンブタール注射麻酔により屠殺した。大脳を摘出し、液体酸素もしくはドライアイスで表面を固めた後、厚さ２ｍｍにスライスし、２，３，５−トリフェニルテトラゾリュームクロライド（ＴＴＣ）溶液で両面を３７度で３０分間ずつ染色した。コントロールとして再還流後に何も投与しない群と高分子化ＴＥＭＰＯミセル（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰともいう）中のＴＥＭＰＯと同モル濃度のＴｅｍｐｏｌを投与した群の試験も平行して行なった。それぞれ試行数Ｎ＝３であった。
図１１にＴＴＣ染色した脳写真の例を示した。赤く染色された部分（図では、黒色の濃淡として表せれている）が生細胞、白い部分が死細胞である。投与しない群と比べてＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの静脈投与群では明らかに赤い部分が増え、有意に細胞死が防がれており、特に脳虚血の際の薬物治療領域といわれるペナンブラ領域にその傾向が顕著であることがわかった。またＴｅｍｐｏｌでは静脈投与群においてＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰよりも効果が見られなかった。これは静脈投与をすることによりＴｅｍｐｏｌが血中の還元成分により還元されたためであると考えられる。ＴＥＭＰＯは高分子化し、ミセル形成を可能にしたことにより、生体の外的環境から一定の保護がなされたものと推測される。
一方、動脈投与ではＴｅｍｐｏｌにおいても静脈内投与より一定以上の細胞死防護効果が得られた。動脈投与ではＴｅｍｐｏｌが血液還流成分により還元される前に疾患部分に到達するためと考えられる。また、静脈投与の場合、血流に乗って体中に分散され、総頚動脈からの投与よりも患部に到達する量が少なくなるためと考えられる。
また、ＴＴＣ染色の結果において梗塞部分面積（ｉｎｆｒａｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）を数値化して図１２（Ｎ＝３）に示す。図から、静脈投与Ｔｅｍｐｏｌ群に対して静脈Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰでは梗塞面積が減少する傾向があることがわかった。また、脳梗塞の症状を数値化した神経症状スコア（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｍｐｔｏｍｓｃｏｒｅ：０：両前肢が伸びている、欠陥なし。１：左前肢が胸に置かれており、右前肢が伸びている。２：スコア１に加え側方の押しへの抵抗が低下する。３：スコア２に加え身体の上半身をよじる。これらの値が大きいほど症状が重くなる。図１３）でも同様の傾向が得られ、脳梗塞面積が多いほど症状が重いという相関がみられた。
（２）上記のような脳虚血モデルラットに対し、試行数およびコントロールまたは比較例を追加した試験を行った。
試験を行った薬剤またはコントロールは次のとおりである。上記Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ、コントロールとして再還流後に何も投与しない群、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ中のＴＥＭＰＯと同じモル濃度のＴｅｍｐｏｌを投与した群、１００％生理食塩水を投与した群、ＴＥＭＰＯを付加していないメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのミセル（以下、Ｂｌａｎｋ−ＮＰともいう。製造例４に従って作製）の群も平行して行った。それぞれの試験数Ｎは、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ、ＴｅｍｐｏｌでＮ＝２０、生理食塩水、Ｂｌａｎｋ−ＮＰはＮ＝８であった。術中のラットの体温、血圧、血中ガス分析を行った。また。モデル作成前と屠殺前での体重変化も調べた。
試験前後での各群の体重変化に大きな違いは見られなかった。また、体重、血中ガス分析の結果にも違いは見られず、各郡でのモデル作成が一定の条件で行われたことが確認された。薬剤投与時の平均血圧はＴｅｍｐｏｌで有意に下がった（図１４参照）。Ｔｅｍｐｏｌが血圧降下作用を有することは知られており、脳虚血時には一般に血圧が下がることは治療上逆効果である。しかし、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰでは血圧降下が有意に抑制された（ｐ＜０．０１）。これはＴｅｍｐｏｌ中のニトロキシドラジカルは投与時に血管拡張に働くために血圧が下がるが、高分子ミセル化することにより投与時にはニトロキシドラジカルが保護されているものと考えられる。その分、ニトロキシドラジカルが効果的に脳内フリーラジカルの消去に使用されうると考えられる。
脳梗塞面積（ｉｎｆｒａｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）については、生理食塩水、Ｂｌａｎｋ−ＮＰ、Ｔｅｍｐｏｌと比較してＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰは有意に脳梗塞面積を減少させた（図１５，それぞれ、ｐ＜０．０１，０．０５，０．０５）。Ｔｅｍｐｏｌに比べてＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの高い脳保護効果は、高分子ミセル化により安定ラジカルが患部まで保持移行されるためと考えられる。
神経症状スコア（０：尾を持ち、持ち上げた時、両前肢が伸びている。欠陥なし。１：尾を持ち、持ち上げた時、左前肢が胸に置かれており、右前肢が伸びている。２：スコア１に加え側方の押しへの対抗が低下する。３：スコア２に加え身体の上半身をよじる。これらの値が大きいほど症状が重くなる。）でも、Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰはＴｅｍｐｏｌよりも有意に神経症状を減少させた（図１６参照）。また、生理食塩水、Ｂｌａｎｋ−ＮＰ、Ｔｅｍｐｏｌの間では有意差はなかった。
試験６：癌・炎症組織において活性酸素（ＲＯＳ）の可視化を目指したＥＳＲプローブの創製
活性酸素（ＲＯＳ）によって誘発される酸化ストレスは、さまざまな障害や疾患の病因として関与していることが明らかになってきている。例えば、癌組織や炎症組織においては、ＲＯＳが産出していることが知られている。生体内でのＲＯＳの可視化はＲＯＳと疾患の関連を明らかにするためにも非常に重要である。ＥＳＲイメージングは、生体内の酸化還元反応を可視化するツールとして近年注目を集めている。さまざまなＥＳＲイメージング用プローブがこれまでに開発されているが、低分子のＥＳＲプローブは血中半減期が短く、また目的部位に特異的に集積させる機能を有していないため特定の組織での観察は困難である。また、酸化ストレスが関与していると考えられる炎症部位や癌組織においては、ｐＨが低下していることが知られている。そこで、酸性条件下においてＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰが崩壊することを利用して、ＲＯＳの可視化できる新規ＥＳＲプローブの開発の可能性を検討した。
（１）ＲＯＳの可視化できるＥＳＲプローブ（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈ）の開発
５ｍｇ／ｍＬのメトキシ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯのＤＭＦ溶液に１５００倍量の無水ヒドラジンを添加し、ポリマー溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｓｉｚｅ  ３，５００  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）中に加え、２Ｌの蒸留水に対して透析を行った。蒸留水は、２、４、８時間後に３回交換した。透析後、得られたＲＮＰの平均粒子径をＤＬＳ測定したところ、平均粒子径約４０ｎｍの単峰性であることが確認された（製造例４のアセタール−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯによるナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）の調製と同様）。次いで、こうして得られたＲＮＰのＥＳＲスペクトルの測定を行った。無水ヒドラジンを添加していない場合、ＲＮＰはブロードな１本線のスペクトルを示すものの（図１７ａ）、ヒドラジンを添加した場合では非常に小さな強度のスペクトルに変化することが明らかになった（図１７ｂ）。これは、ヒドラジンによってＴＥＭＰＯラジカルが還元されたため、ＥＳＲシグナル強度が減少したものと考えられる。
（２）生体内酸化反応の可視化のモデル実験
Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈ（４６ｍＭ，６０μＬ）に、Ｈ２Ｏ２水溶液（５００ｍＭ，６０μＬ）と西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ））／１００ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（３７５  Ｕ／ｍＬ，４８０μＬ）を添加し、酸性ｐＨ（ｐＨ５．６）と中性ｐＨ（ｐＨ７．４）においてＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈの酸化反応を行いＥＳＲスペクトルの変化を観測した。通常、低分子ＴＥＭＰＯＬはｐＨが酸性になるに従い酸化反応速度が低下することが知られているものの、高分子化ミセル化Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈを用いた場合は、ｐＨ５．６のみの条件において、著しくＥＳＲシグナル強度が増大することが明らかとなった。この結果より、癌や炎症組織周辺での酸性条件下においてＲＯＳを可視化することができるプローブとしてＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ−Ｈを用いることが可能であると推測される（図１８）。
【産業上の利用可能性】
【０００５】
以上のとおり、本発明により提供される環状状ニトロキシドラジカルの安定化方法、および該方法により提供される高分子化化合物は、特に、安定ラジカルの生体内での安定化が達成されるので、医療、診断の分野で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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