(57)【要約】効率が向上した合成アミロスフェロイドの製造方法の提供。可塑剤の存在下でアミロイドβペプチドを含む液体を撹拌することを含む、合成アミロスフェロイドの製造方法。アミロスフェロイドとは、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発できるアミロイドβペプチドの集合体をいう。アミロスフェロイドはアルツハイマー病やレビー小体型認知症の発症において重要な役割を果たすと考えられる。
2013094614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可塑剤の存在下でアミロイドβペプチドを含む液体を撹拌することを含む、合成アミロスフェロイドの製造方法。
【請求項２】
アミロイドβペプチドを、前記可塑剤を含む有機溶媒に溶解すること、
前記アミロイドβペプチドの溶液を水性溶液で希釈すること、及び、
前記希釈後の溶液を撹拌することを含む、請求項１記載の合成アミロスフェロイドの製造方法。
【請求項３】
前記有機溶媒が、水混和性溶媒である、請求項２記載の合成アミロスフェロイドの製造方法。
【請求項４】
前記可塑剤が、フタル酸エステルである、請求項１から３のいずれかに記載の合成アミロスフェロイドの製造方法。
【請求項５】
請求項２から４のいずれかに記載の製造方法に使用する試薬キットであって、
凍結乾燥したアミロイドβペプチドと、前記有機溶媒と、前記可塑剤とを含む、試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、合成アミロスフェロイドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、シナプス変性を経て成熟神経細胞が死に至る病である。最近の研究により、アルツハイマー病の発症は段階的であることがわかってきた。最初の段階として、シナプス変性が主に起こる段階がある。この段階は可逆的な段階である。前記可逆的段階の次の段階として、神経細胞死が起こる段階がある。この段階は不可逆的な段階であり、この不可逆的段階に至ることにより、アルツハイマー病が発症すると考えられている（非特許文献１）。【０００３】
シナプス変性は、主に、蓄積したβアミロイド（Ａβ）２量体及び１２量体がグルタミン酸受容体等に作用して起こるとされている。しかし、Ａβ２量体及び１２量体のいずれも、in vitro及びin vivoで神経細胞死を引き起こさない（非特許文献２）。よって、ヒトのアルツハイマー病の病態解析のために、可逆的なシナプス変性段階の後の不可逆的段階で起こる神経細胞死の原因と分子機構の解明が必要とされている。【０００４】
アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）は、非神経細胞及び幼若神経細胞には毒性を示さず、機能的に成熟した神経細胞を選択的に死にいたらしめるユニークなＡβ集合体である（非特許文献１）。アミロスフェロイドは、in vitroで神経細胞死を起こす直径約１０ｎｍの球状Ａβ集合体として最初に単離された（非特許文献３）。その後、この合成アミロスフェロイドに対する特異的な抗体が作製され（特許文献１及び２）、この抗体を用いてアルツハイマー病のヒト患者の脳から生体内で形成された（すなわち、ネイティブな）アミロスフェロイドが単離された（非特許文献３）。このネイティブアミロスフェロイドを用いた研究から、ｉ）ネイティブアミロスフェロイドは、合成アミロスフェロイドと同様に、成熟神経細胞に対して選択的に細胞死を誘発し、また、ｉｉ）神経細胞脱落が認められるアルツハイマー病患者の大脳皮質におけるネイティブアミロスフェロイド量は、アルツハイマー病の重症度に相関して増加していること、そして、ｉｉｉ）神経細胞脱落があまり認められないアルツハイマー病患者の小脳におけるネイティブアミロスフェロイド量は微量しか存在しないことが明らかとなった（非特許文献３）。したがってアミロスフェロイドは、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ネイティブアミロスフェロイドは、レビー小体型認知症患者の脳からも検出されており（非特許文献１）、レビー小体型認知症においてもアミロスフェロイドはその発症において重要な役割を果たすと考えられる。【０００５】
なお、アミロスフェロイドと、シナプス変性を引き起こす主な原因であるとされるＡβ２量体及び１２量体とは、ともにＡβ集合体ながら、異なる経路でＡβモノマーから形成されることが示されている。すなわち、Ａβ２量体及び１２量体はＡβ２量体を経由するのに対し、アミロスフェロイドはＡβ３量体から形成される（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１６６４４
【特許文献２】ＷＯ２００９／０５７６６４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Noguchi et al. J.Biol.Chem. vol.284 no. 47, 32895-32905 (2009)
【非特許文献２】Shankar et al. Nature Medicine 14, 837-842 (2008)
【非特許文献３】Hoshi et al. Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol.100, no.11, 6370-6375 (2003)
【非特許文献４】Matsumura et al. J.Biol.Chem. vol.286 no. 13, 11555-11562 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、アミロスフェロイドはアルツハイマー病やレビー小体型認知症において重要な役割を果たす。しかしながら、ネイティブアミロスフェロイドを患者脳から精製して治療薬などの開発に使うことは非常に困難である。よって、患者脳に存在するネイティブアミロスフェロイドと等価である合成アミロスフェロイドが、in vitroでより製造され易くなれば、アルツハイマー病やレビー小体型認知症の研究、並びに、これらの疾病に対する予防方法及び予防薬、及び、治療方法及び予防・治療薬の開発に大きく寄与するものと考えられる。例えば、合成アミロスフェロイドそのものを抗原とした能動ワクチン療法の開発や、神経細胞死の分子機構に迫り、神経細胞死阻止薬の開発が容易になる。また、現在、ヒト脳において凝集体が形成される機序がわからないため、合成アミロスフェロイドの形成をモデル系に用いて、アミロスフェロイドの形成を阻止する予防薬の開発を行うことが可能になる。【０００９】
そこで、本開示は、効率が向上した合成アミロスフェロイドの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、一態様において、可塑剤の存在下でアミロイドβペプチドを含む液体を撹拌することを含む合成アミロスフェロイドの製造方法（以下、「本開示の製造方法」ともいう）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本開示の製造方法によれば、合成アミロスフェロイドの製造効率を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１（ＤＥＨＰ＋）及び比較例１（ＤＥＨＰ−）におけるＡＳＰＤ形成効率の測定結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１（ＤＥＨＰ＋）及び比較例１（ＤＥＨＰ−）における細胞毒性試験の結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１（ＤＥＨＰ存在下）及び比較例１（ＤＥＨＰ非存在下）における電子顕微鏡観察写真の一例である。
【図４】図４は、実施例３〜６及び比較例１におけるＡＳＰＤ形成効率測定及び細胞毒性試験の結果の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、アミロイドβペプチドを含む液体を撹拌することにより合成アミロスフェロイドを形成させる場合に、前記溶液に可塑剤を存在させると形成効率が著しく向上するという知見に基づく。言い換えれば、本開示は、非特許文献１及び３に記載される従来の合成ＡＳＰＤの製造方法における撹拌を可塑剤の存在下で行うことにより、合成アミロスフェロイドの形成効率が著しく向上するという知見に基づく。
【００１４】
前記可塑剤が存在することで合成アミロスフェロイドの形成効率が向上するメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推定される。アミロイドβは通常ではモノマーとして安定している（Grant MA et al. PNAS 104,16522-16527, 2007）。そして、アミロイドβが線維形成をする場合にはまずアミロイドβの２量体が形成されること、また、アミロイドβがアミロスフェロイド形成をする場合にはまずアミロイドβの３量体が形成されることがわかっている（Matsumura et al JBC2011、非特許文献４）。さらに、線維形成とは異なり、アミロスフェロイド形成は、生理的溶媒環境においてリン酸などの特定の部分構造を持つ溶質存在下で、その形成が促進されることがわかっている（星ら学会発表データ）。従って、可塑剤はアミロイドβモノマーと相互作用することで３量体形成を促進する効果を発揮し、特にアミロスフェロイド形成を促進していると考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。なお、本明細書において「合成アミロスフェロイドの形成効率」は、例えば、使用したアミロイドβペプチド量に対する製造された合成アミロスフェロイドに含まれるアミロイドβペプチド量の割合（合成ＡＳＰＤを形成するＡβ量／原料のＡβ量）とすることができる。前記割合は重量比でもよく、モル比であってもよい。
【００１５】
［アミロスフェロイド］
本明細書において、アミロスフェロイド（以下、「ＡＳＰＤ」ともいう。）とは、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発できるＡβ集合体をいう。ＡＳＰＤは、「合成ＡＳＰＤ」及び「ネイティブＡＳＰＤ」を含む。合成ＡＳＰＤ（合成アミロスフェロイド）とは、合成Ａβを用いてin vitroで調製及び単離されうる、電子顕微鏡観察上で直径約１０〜１５ｎｍの球状体であるＡＳＰＤをいう（非特許文献３）。また、ネイティブＡＳＰＤとは、ヒト生体内（とりわけ、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の患者の脳）から、単離されうるＡＳＰＤをいう（非特許文献１）。合成ＡＳＰＤ及びネイティブＡＳＰＤは、ともに、成熟ヒト神経細胞に細胞死を誘発する。ＡＳＰＤに特異的な立体構造を認識できる抗ＡＳＰＤ抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）も作製されている（例えば、特許文献１及び２に開示されるｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｍＡＳＤ３など）。抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体の特性解析やＡＳＰＤのＮＭＲ解析の結果から、ＡＳＰＤは、これまで報告された他のＡβ集合体とは異なるユニークな立体構造をもつことがわかっている（例えば、非特許文献１のSupplemental Table S1）。したがって、本明細書においてＡＳＰＤは、特許文献１及び２に開示されるＡＳＰＤに特異的な抗ＡＳＰＤ抗体に反応し、かつ、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発できるＡβ集合体ともいうことができる。
【００１６】
［アミロイドβペプチド］
本明細書において「アミロイドβペプチド」とは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がα−、β−、γ−セレクターゼに切断されることよって切り出されるペプチドをいい、「βアミロイド」、「Ａβ」又は「Ａβペプチド」とも表記される。また、本明細書において、Ａβはそのアミノ酸配列の長さからＡβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、及びＡβ１−４３と呼ばれるものを含みうる。本明細書において、Ａβは、ヒト型（ヒトに存在する配列）であってもよく、非ヒト型（ヒト以外の動物に存在する配列）であってもよい。また、本明細書において、Ａβは、生体内の（ネイティブな）Ａβ、及び、合成されたＡβを含みうる。合成Ａβは、特に限定されないが、公知のペプチド合成法（例えば、Ｆｍｏｃ法やＢｏｃ法）で合成でき、例えば、公知のペプチド合成機を利用して製造できる。ヒト型のＡβ１−４２（「Ａβ４２」ともいう。）は、アミノ酸配列（Ｎ末端から）：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドである。また、ヒト型のＡβ１−４１（Ａβ４１）、Ａβ１−４０（Ａβ４０）、及びＡβ１−３９（Ａβ３９）は、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端からそれぞれＡ、ＩＡ、及びＶＩＡを欠いたアミノ酸配列からなるペプチドである。さらに、ヒト型のＡβ１−４３（Ａβ４３）は、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端にトレオニン残基（Ｔ／Ｔｈｒ）が１つ付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１７】
［可塑剤］
本明細書において「可塑剤」は、特に限定はなく公知のものが挙げられる。本開示の製造方法に使用する可塑剤としては、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、例えば、ジ−ｎ−オクチルフタレート、ジ−２−エチルヘキシルフタレート（ＤＥＨＰ）、ジベンジルフタレート、ジイソデシルフタレート等のフタル酸エステル、ジオクチルイソフタレート等のイソフタル酸エステル、ジ−ｎ−ブチルアジペート、ジオクチルアジペート等のアジピン酸エステル、ジ−ｎ−ブチルマレート等のマレイン酸エステル、アセチルトリ−ｎ−ブチルシトレート等のクエン酸エステル、モノブチルイタコネート等のイタコン酸エステル、ブチルオレート等のオレイン酸エステル、ジアセチルカプリル酸モノグリセライド、ジアセチルラウリン酸モノグリセライド、リシノール酸モノグリセライド、デカグリセリンモノエレート等の多価アルコールエステル、トリクレジルホスフェート等のリン酸エステル、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）、ＰＥＧジアセテート、ポリプロピレングリコール（以下ＰＰＧ）、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックポリマー、ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＰＧブロックポリマー等のポリアルキレングリコール類、トリエチレングリコールモノメチルエーテル乳酸オリゴマーエステル等の乳酸オリゴマーエステル類、ジエチレングリコールロジンエステルアセテート等のロジン酸エステル類が好ましい。これらの中でも、同様の観点から、ジ−ｎ−オクチルフタレート、ジ−２−エチルヘキシルフタレート、ジベンジルフタレート、ジイソデシルフタレート等のフタル酸エステルがより好ましく、ジ−２−エチルヘキシルフタレートがさらに好ましい。
【００１８】
［撹拌］
本明細書において「撹拌」とは、流体に動きを加えることをいう。本開示において「撹拌」は、Ａβの集合及び／又はＡＳＰＤの形成を妨げないように、低速及び／又はおだやかな撹拌であることが好ましい。本開示における撹拌は、Ａβを含む液体を保持する容器を動かすこと、例えば、前記容器に、回転、振とう、揺動、及びこれらの組み合わせの動きを加えることで行ってもよく、或いは、Ａβを含む液体中に撹拌子を配置し、前記撹拌子を回転させることにより行ってもよい。撹拌の強さは、上述のとおり、低速及び／又はおだやかであることが好ましく、非特許文献１及び３に記載される従来の合成ＡＳＰＤの製造方法における撹拌と同程度であってよい。また、本開示の製造方法における撹拌は、所定の時間内に連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよい。
【００１９】
［合成ＡＳＰＤの形成］
本開示の製造方法は、可塑剤の存在下でＡβを含む液体を撹拌することを含む。合成ＡＳＰＤは、前記撹拌中に前記Ａβが集合又は会合をすることで形成されると考えられる。したがって、本開示の製造方法は、一実施形態において、合成ＡＳＰＤ形成工程を含み、前記工程は、Ａβ及び可塑剤を含む液体を撹拌することを含む。
【００２０】
合成ＡＳＰＤ形成工程に供する、Ａβ及び可塑剤を含む液体におけるＡβの含有量は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、０．１〜５００μＭが好ましく、より好ましくは１〜３５０μＭ、さらに好ましくは１０〜２００μＭ、さらにより好ましくは２０〜１００μＭ、さらにより好ましくは３０〜７５μＭ、さらにより好ましくは４０〜６０μＭである。前記液体に含まれるＡβは、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、モノマーであること、すなわち、合成ＡＳＰＤ形成工程の前に既にＡβ集合体を形成していないことが好ましい。また、前記液体に含まれるＡβは、１種類であってもよく、複数種類の混合物であってもよい。例えば、Ａβ４２又はＡβ４０の１種類であってもよく、Ａβ４２とＡβ４０との混合物であってもよい。
【００２１】
合成ＡＳＰＤ形成工程に供する、Ａβ及び可塑剤を含む液体における可塑剤の含有量は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、１０μＭ〜１０ｍＭが好ましく、より好ましくは１００〜１０００μＭ、さらに好ましくは２００〜９００μＭ、さらにより好ましくは４００〜８００μＭ，さらにより好ましくは５００〜７５０μＭ、さらにより好ましくは６００〜７００μＭである。前記液体に含まれる可塑剤は、１種類であってもよく、複数種類の混合物であってもよい。
【００２２】
合成ＡＳＰＤ形成工程における撹拌の温度は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、０℃を超え４０℃以下が好ましく、より好ましくは３７℃以下、さらに好ましくは３２℃以下、さらにより好ましくは１２℃以下、さらにより好ましくは５℃以下である。なお、本明細書において、「撹拌の温度」とは、撹拌を行う環境温度又は周囲温度をいう。
【００２３】
合成ＡＳＰＤ形成工程における撹拌の時間は、例えば、１０時間〜８日である。前記工程に供する前記液体中のＡβがＡβ４２である場合、撹拌時間は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、１０〜２０時間が好ましく、より好ましくは１１〜１８時間、さらに好ましくは１２〜１６時間、さらにより好ましくは１３〜１５時間である。前記ＡβがＡβ４０である場合、撹拌時間は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、４〜８日が好ましく、より好ましくは５〜７日である。前記Ａβがこれら以外又は混合物である場合は、上記範囲内で適宜調節できる。
【００２４】
［合成ＡＳＰＤの形成確認］
本開示の製造方法、又は、前記合成ＡＳＰＤ形成工程で形成された合成ＡＳＰＤは、細胞毒性及び／又は抗体反応性で確認することができる。例えば、成熟した神経細胞に添加した場合に細胞死（アポトーシス）を誘導できれば、ＡＳＰＤの存在が確認できる（非特許文献１及び３）。あるいは、ＡＳＰＤの存在は、ＡＳＰＤに特異的な抗体を用いて確認できる。前記抗体としては、特許文献１及び２に開示されるｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｍＡＳＤ３等のＡＳＰＤに特異的なモノクローナル抗体やｒｐＡＳＤ１等のＡＳＰＤに特異的なポリクローナル抗体を使用できる。これら抗体を用いれば、従来公知の方法にしたがって、合成ＡＳＰＤを定量することもできる。
【００２５】
［合成ＡＳＰＤの精製］
本開示の製造方法、又は、前記合成ＡＳＰＤ形成工程で形成された合成ＡＳＰＤは、撹拌後の液体を孔径０．２２μｍのフィルタを用いてろ過し、そのろ液を５０ｋＤａ又は１００ｋＤａカットオフの限外ろ過器でろ過し、滞留物を回収することによって精製できる。或いは、前記合成ＡＳＰＤは、ＡＳＰＤに特異的な抗体、例えば、前記特許文献１又は２に開示される抗体を用いた免疫沈降法によっても精製できる。本開示の製造方法は、形成された合成ＡＳＰＤを精製する工程を含んでもよい。但し、合成ＡＳＰＤの精製方法は、この方法に限定されない。
【００２６】
［Ａβ及び可塑剤を含む液体の調製］
本開示の製造方法において、撹拌に供する、Ａβ及び可塑剤を含む液体は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、可塑剤を含む有機溶媒にＡβを溶解すること、及び、得られたＡβ溶液を水性溶液で希釈することを含む方法で調製されることが好ましい。したがって、本開示の製造方法は、その他の実施形態において、１）Ａβ及び可塑剤を含む液体の調製工程、及び２）合成ＡＳＰＤ形成工程を含み、前記工程１）は、可塑剤を含む有機溶媒にＡβを溶解すること、及び、得られたＡβ溶液を水性溶液で希釈することを含み、前記工程２）は、前記工程１）で得られたＡβ及び可塑剤を含む液体を撹拌することを含む、合成ＡＳＰＤの製造方法に関する。
【００２７】
可塑剤を含む有機溶媒に溶解させるＡβは、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、凍結乾燥であることが好ましい。前記有機溶媒は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、Ａβ及び可塑剤を溶解可能であり、かつ、水混和性である有機溶媒が好ましく、より好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、及びこれらの混合物から選択される有機溶媒、さらに好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、さらにより好ましくは無水ＤＭＳＯである。
【００２８】
前記可塑剤を含む有機溶媒における可塑剤の濃度は、後述する水性溶液による希釈倍率と前述したＡβ及び可塑剤を含む液体における可塑剤濃度とから適宜決定できる。
【００２９】
希釈に用いる水性溶液は、従来公知のバッファー溶液や細胞培養培地が使用できる。前記水性溶液としては、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、生理的イオン強度とｐＨを有する水性溶液が好ましい。
【００３０】
前記水性溶液として用いるバッファー溶液としては、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、tris(hydroxymethyl)methyl骨格（(HOCH2)3C-骨格）を持つバッファーの溶液、2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol（ＨＭＰＤ）溶液、及び、1,3-propanediol溶液が好ましい。なお、前記tris(hydroxymethyl)methyl骨格を持つバッファーとしては、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid（ＴＥＳ）、tris(hydroxymethyl)aminomethane（Ｔｒｉｓ）、N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＴＡＰＳ）及び1,1,1-tris(hydroxymethyl)ethane（ＴＨＭＥ）が挙げられる。前記水性溶液としては、同様の観点から、ＰＢＳがより好ましく、カルシウム及びマグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））がさらに好ましい。
【００３１】
前記水性溶液として用いる細胞培養培地としては、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が好ましく、これらの培地においてｐＨ指示薬を除いたものがより好ましい。前記水性溶液としては、同様の観点から、ハムＦ１２培地がより好ましく、Ｌグルタミン及びフェノールレッド不含ハムＦ１２培地がさらに好ましい。
【００３２】
前記Ａβ溶液を前記水性溶液で希釈する希釈倍率は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、５〜５０００倍が好ましく、より好ましくは１０〜１０００倍、さらに好ましくは５０〜５００倍、さらにより好ましくは７５〜２００倍、さらにより好ましくは９０〜１２０倍である。
【００３３】
［前処理］
前記「Ａβ及び可塑剤を含む液体の調製」に供するＡβは、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点及びＡβにαへリックスを誘導する観点から、揮発性溶媒に溶解し凍結乾燥することを含む前処理を施すことが好ましい。また、前記前処理は、同様の観点から、粉末状又は凍結乾燥のＡβを揮発性溶媒に溶解し凍結乾燥することを１サイクルとし、２〜３サイクル行うことが好ましい。前記１サイクル目においては、Ａβを完全に溶解するために、揮発性溶媒で溶解したのちインキュベーションすることが好ましい。前記インキュベーションは、例えば、２〜８℃（好ましくは約４℃）で、オーバーナイト（例えば、６〜１２時間）行った後に、２５〜４０℃（好ましくは約３７℃）で、３０分〜４時間（好ましくは約２時間）行うことが好ましいが、この条件に限定されない。また、前記インキュベーションは、一又は複数の実施形態において、２〜８℃で行う第１のインキュベーションと、２５〜４０℃で行う第２のインキュベーションとの２段階のインキュベーションを行うことが好ましい。第１のインキュベーションの温度は、２〜８℃であり、好ましくは約４℃であり、時間は、例えば、オーバーナイト、好ましくは６〜１２時間である。第２のインキュベーションの温度は、２５〜４０℃であり、好ましくは約３７℃であり、時間は、例えば、３０分〜４時間、好ましくは約２時間である。
【００３４】
前記前処理で使用する揮発性溶媒は、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点及びＡβにαへリックスを誘導する観点から、塩化メチレン、アセトン、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（ＨＦＩＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、及びこれらの組み合わせなどが好ましく、ＨＦＩＰがより好ましい。
【００３５】
［試薬キット］
本開示は、その他の態様において、凍結乾燥したＡβと、前記有機溶媒と、前記可塑剤とを含む、本開示の製造方法によって合成ＡＳＰＤを製造するための試薬キットに関する。前記凍結乾燥したＡβは、前記前処理が行われたものであることが好ましい。本開示の試薬キットによれば、容易に前記「Ａβ及び可塑剤を含む液体の調製」を行うことができ、一層簡便に本開示の製造方法を行うことができる。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］
下記の条件で調製された凍結乾燥状態のＡβ４２原料（Ｃａ．５０ｎｍｏｌ／チューブ）に、下記のように調製した６５ｍＭフタル酸ビス（２−エチルヘキシル)（ＤＥＨＰ）含有ＤＭＳＯ溶液を１０μＬ添加して溶解させ、５ｍＭ  Ａβ溶液を得た。この５ｍＭ  Ａβ溶液に、Ｌ−グルタミン及びフェノールレッドを含まないＦ１２バッファー（コージンバイオ社製）９９０μＬ添加し、５０μＭ  Ａβ溶液を得た。この５０μＭ  Ａβ溶液を、ローテータを用い、４℃、１４時間、回転撹拌することにより、合成ＡＳＰＤを形成させた。形成された合成ＡＳＰＤを含む前記溶液から、下記の条件で合成ＡＳＰＤを精製した。精製した合成ＡＳＰＤは、下記条件で算出される合成ＡＳＰＤ形成効率は５７％（モノマー換算）であった。なお、合成ＡＳＰＤが形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察、及び抗ＡＳＰＤ抗体を用いたドットブロット、アミノ酸分析を用いて行い、最終的に神経毒性は下記条件の細胞毒性試験にて行った。【００３７】
〔Ａβ４２原料の調製方法〕
配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβ４２ペプチドを、ペプチド合成機（Applied Biosystems社製、model 433A）を用いＦｍｏｃ法により合成し、精製した。凍結乾燥後の約５０ｍｇのＡβ４２ペプチドに、１００ｍＬのＨＦＩＰ（1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol、ＨＰＬＣ用、関東化学社製）を添加して溶解し、４℃、オーバーナイトでインキュベーションし、３７℃、３時間インキュベーションし、その後、チューブに５００μＬずつ分注して−８０℃でストックした。ストックしたＡβ４２溶液を凍結乾燥後、再度ＨＦＩＰを５００μＬ添加しＡβ４２を溶解した（Ａβ濃度Ｃａ．１００μＭ）。この溶液を再び凍結乾燥し、−２０℃でストックし、Ａβ４２原料とした。【００３８】
〔６５ｍＭ  ＤＥＨＰ／ＤＭＳＯ溶液の調製〕
７５．７μＬの無水ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide anhydrous  SIGMA社製）に２μＬのＤＥＨＰ（bis(2-ethylhexyl)phthalate  東京化成工業社製）を添加し、６５ｍＭ  ＤＥＨＰ／ＤＭＳＯ溶液とした。【００３９】
〔合成ＡＳＰＤの精製条件〕
回転撹拌後の５００μＬの合成ＡＳＰＤ溶液を孔径０．２２μｍのフィルタでろ過し、ろ液を１００ｋＤａ又は５０ｋＤａカットオフの限外ろ過器でろ過し、滞留物を回収し、「１５８−６６９ｋＤａ  合成ＡＳＰＤフラクション」とした。【００４０】
〔ＡＳＰＤ形成効率の測定条件（算出方法）〕
ＡＳＰＤ形成効率を調べるため、上記のとおり精製したＡＳＰＤ量を、ウサギポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｒｐＡＳＤ１を用いたドットブロット法により、濃度既知の標準ＡＳＰＤをもとに算定した。これをさらに確認するため、アミノ酸分析によりアミロイドβ含有量を求めた。【００４１】
〔細胞毒性試験〕
ＡＳＰＤの形成は、以下の細胞毒性試験により確認した。成熟したラット海馬由来初代培養神経細胞（培養１９日以降）を用いて、一定量のＡＳＰＤを一晩投与し、神経毒性をロシュ社製のCell Death Detection ELISAを用いてプロトコルに従って測定した。これは、アポトーシスにより生じる、細胞内のヒストン結合ＤＮＡ段片化を定量的に検出するELISAキットである。【００４２】
［比較例１］
６５ｍＭ  ＤＥＨＰ含有ＤＭＳＯ溶液に換えて無水ＤＭＳＯを用いた他は実施例１と同様にして、Ａβ４２ペプチドから合成ＡＳＰＤを製造した。その結果、合成ＡＳＰＤ形成効率は１．２％（モノマー換算）であった。【００４３】
実施例１及び比較例１のドットブロット及びアミノ酸分析の結果の一例を図１に示す。図１に示すとおり、実施例１（ＤＥＨＰ＋）は、比較例１（ＤＥＨＰ−）に比べて著しくＡＳＰＤ形成効率が向上したことが示された。【００４４】
また、実施例１及び比較例１により製造された合成ＡＳＰＤを用いた細胞毒性試験の結果の一例を図２に示す。図２は、精製前の合成ＡＳＰＤを含む実施例１（ＤＥＨＰ＋）の溶液及び比較例１（ＤＥＨＰ−）の溶液を、同図に示すＡβ４２換算濃度（１，２，４μＭ）で使用して細胞毒性試験を行った結果である。図２に示すとおり、実施例１の溶液は、濃度依存的に、比較例１の溶液に比べて著しい細胞毒性を示した。なお、合成ＡＳＰＤを含まない同濃度のＤＥＨＰを含む溶液では細胞毒性は認められなかった（データ示さず）。【００４５】
図３は、精製前の合成ＡＳＰＤを含む実施例１（ＤＥＨＰ存在下）の溶液及び比較例１（ＤＥＨＰ非存在下）の溶液を電子顕微鏡観察した写真の一例である。図３に示す通り、比較例１に比べて実施例１において、直径約１０〜１５ｎｍの球状体の合成ＡＳＰＤが大量に確認された。【００４６】
［実施例３〜６］
６５ｍＭ  ＤＥＨＰ／ＤＭＳＯ溶液のＤＥＨＰの濃度を１３、２６、５１、及び１０２ｍＭとした他は実施例１と同様にしてＡβ４２ペプチドから合成ＡＳＰＤを製造し（実施例３〜６）、実施例１と同様にＡＳＰＤ形成効率の測定及び細胞毒性試験を行った。その結果、合成ＡＳＰＤ形成効率は、それぞれ、６７％、６１％、３８％、及び２８％（モノマー換算）であった。比較例１及び実施例３〜６（ＤＥＨＰ濃度がそれぞれ、０、１３、２６、５１、及び１０２ｍＭ）のＡＳＰＤ形成効率の測定結果及び細胞毒性試験の結果の一例を図４に示す。図４に示す通り、ＡＳＰＤ形成に使用したＤＥＨＰの濃度に依存してＡＳＰＤ形成効率及び細胞毒性が増加した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本開示は、例えば、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に関する医療及び医薬、研究の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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