(57)【要約】  外因性オピオイドペプチドを効率的に分解する手段を提供することを課題とする。ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物からなる群より選択される一以上の成分を含み、小麦グルテン由来のオピオイドペプチド及びカゼイン由来のオピオイドペプチドに対する分解活性を示す、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物からなる群より選択される一以上の成分を含み、小麦グルテン由来のオピオイドペプチド及びカゼイン由来のオピオイドペプチドに対する分解活性を示す、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
【請求項２】
前記３種の酵素調製物を含む、請求項１に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
【請求項３】
小麦グルテン由来のオピオイドペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むグリアドルフィンであり、カゼイン由来のオピオイドペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含むカゾモルフィンである、請求項１又は２に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
【請求項４】
アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物がセミアルカリプロテアーゼを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の外因性オピナイドペプチド分解酵素剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を含む、外因性オピオイドペプチド関連疾患治療用の医薬又は食品組成物。
【請求項６】
外因性オピオイドペプチド関連疾患が自閉症である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
外因性オピオイドペプチド関連疾患の患者に対して、請求項６に記載の医薬組成物を治療上有効量投与するステップを含む、外因性オピオイドペプチド関連疾患の治療法。
【請求項８】
外因性オピオイドペプチド関連疾患が自閉症である、請求項７に記載の治療法。
【請求項９】
外因性オピオイドペプチド関連疾患治療用の医薬又は食品組成物を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤の使用。
【請求項１０】
外因性オピオイドペプチド関連疾患が自閉症である、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素剤及びその用途に関する。詳しくは外因性オピオイドペプチドに対する分解活性を示す酵素剤及びそれを用いた医薬組成物などに関する。本出願は、２０１１年９月２９日に出願された日本国特許出願第２０１１−２１５５２５号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
食品由来のオピオイドペプチドが自閉症などの精神疾患や脳機能障害の発症・進展に関与することが報告されている（Sun Z and Cade R. Peptides. 24(2), 321-3 (2003).; Shattock P & Whiteley, P, Expert Opin. Ther. Targets 6 (2),175-183 (2002).; Cade R et al. Nutritional Neurosci 3, 57-72 (2000).; Knivsberg AM et al., Nutritional Neurosci 3, 251-61 (2002).; Muruganandam A et al., FASEB-J 16(2), 240-2 (2002).; Reichelt KL et al., Dev Brain Dysfunction  7, 71-85 (1994).; Shattock P et al., Brain Dysfunction 3, 328-45 (1990).; Sun Z et al., Autism 3(1), 67-83 (1999).; Christison GW and Ivany K, J Dev Behav Pediatr 27(2 Suppl), S162-71 (2006)）。特に、カゾモルフィン（乳由来）及びグリアドルフィン（小麦由来）は自閉症の増悪因子として注目されている。また、小児自閉症においてはこれらのペプチドを体内で消化（分解）できないことが示唆されており、小児自閉症患者に対してグルテンフリー、カゼインフリーの食事制限が行われることがある。尚、カゾモルフィン／グルテオモルフィン阻害剤を含む酵素剤によって自閉症の症状を軽減する試みがある（特許文献１〜６）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第6,899,876号公報
【特許文献２】米国特許第6,821,514号公報
【特許文献３】米国特許第6,808,708号公報
【特許文献４】米国特許第6,447,772号公報
【特許文献５】米国特許第6,251,391号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第2007/0092501号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、外因性オピオイドペプチドを効率的に分解する手段を提供することにより、外因性オピオイドペプチドが関与する疾患ないし病態に対する治療法の確立等に資することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み本発明者らは、様々な酵素調製物についてグリアドルフィン及びカゾモルフィンに対する分解活性を検討した。鋭意検討の結果、強い分解活性を示し、グリアドルフィン及びカゾモルフィンの効率的な分解を促す酵素調製物を見出した。また、複数の酵素調製物を併用した場合、或いは更にタンパク分解酵素などを併用した場合には相乗効果を発揮し、極めて効率的にグリアドルフィン及びカゾモルフィンを分解可能であることも明らかとなった。このように、本発明者らの検討によって、自閉症等の治療に有効であると期待される酵素調製物が見出されるとともに、より効果的な適用方法（即ち特定の併用態様）が明らかとなった。以下の本発明は当該成果に基づく。
［１］ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物からなる群より選択される一以上の成分を含み、小麦グルテン由来のオピオイドペプチド及びカゼイン由来のオピオイドペプチドに対する分解活性を示す、外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
［２］前記３種の酵素調製物を含む、［１］に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
［３］小麦グルテン由来のオピオイドペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むグリアドルフィンであり、カゼイン由来のオピオイドペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含むカゾモルフィンである、［１］又は［２］に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤。
［４］アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物がセミアルカリプロテアーゼを含む、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の外因性オピナイドペプチド分解酵素剤。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の外因性オピオイドペプチド分解酵素剤を含む、外因性オピオイドペプチド関連疾患治療用の医薬又は食品組成物。
［６］外因性オピオイドペプチド関連疾患が自閉症である、［５］に記載の組成物。
［７］外因性オピオイドペプチド関連疾患の患者に対して、［６］に記載の医薬組成物を治療上有効量投与するステップを含む、外因性オピオイドペプチド関連疾患の治療法。
［８］外因性オピオイドペプチド関連疾患が自閉症である、［７］に記載の治療法。
［９］外因性オピオイドペプチド関連疾患治療用の医薬又は食品組成物を製造するための、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の酵素剤の使用。
［１０］外因性オピオイドペプチド関連疾患が自閉症である、［９］に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】グリアドルフィンペプチドに対する各酵素調製物及び４種混合酵素剤の分解活性を示すグラフ。グリアドルフィン定量キットを利用して評価した。縦軸はグリアドルフィンの残存率である。
【図２】カゾモルフィンペプチドに対する各酵素調製物及び４種混合酵素剤の分解活性を示すグラフ。カゾモルフィン定量キットを利用して評価した。縦軸はカゾモルフィンの残存率である。
【図３】グリアドルフィン分解産物の解析結果。４種混合酵素剤、又はそれを構成する４種の酵素／酵素調製物を単独でグリアドルフィンに作用させた。得られた各分解産物をLC-MSに供した。
【図４】カゾモルフィン分解産物の解析結果。４種混合酵素剤、又はそれを構成する４種の酵素／酵素調製物を単独でカゾモルフィンに作用させた。得られた各分解産物をLC-MSに供した。
【図５】FRETS基質を用いたカゾモルフィン分解性及びグリアドルフィン分解性評価。カゾモルフィンのアミノ酸配列を配したFRETS基質に対して４種混合酵素剤を構成する４種の酵素／酵素調製物を単独で作用させ、分解活性を調べた。グリアドルフィンのアミノ酸配列を配したFRETS基質を用いて同様の評価を行った。左：カゾモルフィンFRETS基質の分解活性、右：グリアドルフィンFRETS基質の分解活性
【図６】ペニシリウム・シトリヌム８株の培養上清中のカゾモルフィン及びグリアドルフィン分解活性。公的保存機関に保存されているペニシリウム・シトリヌム８株の培養上清をカゾモルフィンFRETS基質及びグリアドルフィンFRETS基質に作用させ、分解活性を評価した。
【図７】小麦由来33merペプチド分解産物（10倍濃度サンプルを使用）の蛍光検出結果。
【図８】グリアドルフィン分解産物（10倍濃度サンプルを使用）の蛍光検出結果。
【図９】カゾモルフィン分解産物の蛍光検出結果。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．酵素剤
本発明の第１の局面は新規酵素剤に関する。本発明の酵素剤は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）からの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物からなる群より選択される一以上の成分を含む。本発明の酵素剤は、当該成分の作用により、外因性オピオイドペプチドである、小麦グルテン由来のオピオイドペプチド及びカゼイン由来のオピオイドペプチドに対して分解活性を示す。本明細書において用語「酵素調製物」とは、目的の酵素を含む材料（例えば微生物の培養液）を加工して得られる組成物であり、一又は二以上の酵素を含む。ここでの「加工」は通常、精製を意味するが、精製方法は特に問わない。一方、用語「オピオイドペプチド」とは、オピオイド受容体に特異的作用を示すペプチド又はその類縁ペプチドであり、内因性と外因性がある。内因性オピオイドペプチドは、作用する受容体の種類によりエンドルフィン類、エンケファリン類、ダイノルフィン類に大別される。外因性オピオイドペプチドは「エキソルフィン」とも呼ばれる。外因性オピオイドペプチドの代表的なものは食品由来オピオイドペプチドである。食品由来オピオイドペプチドとして、カゼイン由来のβ−カゾモルフィンやα−カゼイン・エキソルフィンなど、及び小麦グルテン由来のグリアドルフィン（グルテオモルフィン）などが知られている（Henschen A. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.,360,1217 (1979).; Lottspeich,F. et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 361, 1835-1839 (1980).; Loukas S. et al., Biochemistry. 13, 22(19):4567-73 (1983).; Zioudrou C et al., J Biol Chem. 10, 254(7):2446-9 (1979).; Fukudome S. et al., FEBS Lett., 296, 107 (1992); Fukudome S. et al., FEBS Lett., 316, 17 (1993).）。グリアドルフィンはライ麦、大麦、オーツ麦などにも含まれている。
【０００８】
本発明の酵素剤は小麦グルテン由来のオピオイドペプチド及びカゼイン由来のオピオイドペプチドを効率的に分解し得る。一態様では、本発明の酵素剤は小麦グルテン由来のオピオイドペプチド及びカゼイン由来のオピオイドペプチドを一箇所以上切断することができる。一方、後述の実施例に示す通り、本発明の酵素剤はグリアドルフィン７の特徴的なアミノ酸配列YPQPQPF（Tyr-Pro-Gln-Pro-Gly-Pro-Phe）（配列番号２）及びβ−カゾモルフィン７の特徴的なアミノ酸配列YPFPGPI（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile）（配列番号３）に対して強い分解活性を示した。従って、本発明の酵素剤を、アミノ酸配列YPQPQPF（配列番号２）に対する分解活性を示すこと、及び／又はアミノ酸配列YPFPGPI（配列番号３）に対して強い分解活性を示すこと、によって更に特徴付けることができる。尚、上掲の特許文献１〜７は、グリアドルフィン（グルテオモルフィン）阻害剤の利用に言及するが、そこでのグリアドルフィンの配列はGYYPT（Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr）（配列番号４）、GFFP（Gly-Phe-Phe-Pro）（配列番号５）、FGGYL（Phe-Gly-Gly-Tyr-Leu）（配列番号６）又はFGGY（Phe-Gly-Gly-Tyr）（配列番号７）であり、本発明におけるグリアドルフィンの配列（配列番号２）と完全に異なる。少なくともこの点において、本発明は特許文献１〜７に開示される技術と峻別されるものである。
【０００９】
後述の実施例に示すように、特にペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物およびアスペルギルス・メレウスからの酵素調製物はそれぞれ単独でもグリアドルフィン及びカゾモルフィンに対して強い分解活性を示した。なかでもペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物は最も強い分解活性を示した。この事実を考慮し、単独成分又は併用成分として、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物を使用することが好ましい。そこで本発明の一態様は、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物を必須成分とする。また、他の態様は、第１成分としてペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物を含み、且つ第２成分としてアスペルギルス・オリゼからの酵素調製物を含む。更に他の態様では、第３成分としてアスペルギルス・メレウスからの酵素調製物も含む。ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物と、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物とを併用すれば、実施例に示したように相加的ないし相乗的な効果が期待できる。
【００１０】
グリアドルフィン、カゾモルフィンはともに「Tyr-Pro-X-Pro-X-Pro-X（配列番号８）」という相同のアミノ酸配列モチーフを持っており、プロリンリッチの難分解性ペプチドである。ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物は、実施例に示したようにグリアドルフィンおよびカゾモルフィンに対して良好な分解活性を示す。換言すれば、この両者のペプチド配列を配したFRETS基質による、後述の実施例に示したFRETS法（FRETS基質による分解性評価）で検出し得る分解活性を示す。尚、37℃の条件下で反応させたときに1分あたり1μMのNmaを遊離する酵素活性を１ユニット（u）とする。
【００１１】
実際、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）からの酵素調製物の分解活性を上記評価法で評価した結果、グリアドルフィン（配列番号２）（約6,300u/g）、カゾモルフィン（配列番号３）（約5,900u/g）に対して優れた分解活性を示した。
【００１２】
アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物もグリアドルフィン（配列番号２）（約6,000u/g）及びカゾモルフィン（配列番号３）（約2,200u/g）に対して良好な分解活性を示した。また、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物についてもグリアドルフィン（配列番号２）（約14,000u/g）に対する強い分解活性が確認された。
【００１３】
ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物は常法で調製することができる。例えば、ペニシリウム・シトリヌムの培養液をろ過した後、ろ液を限外ろ過等を利用して濃縮する。必要に応じて硫安沈澱、透析、脱塩、各種クロマトグラフィーによる精製等を行う。また、例えばスプレードライ法又はエタノール沈澱法によって最終的な形態に調製することができる。ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物は所定の濃度で使用することができ、使用前に希釈又は濃縮してもよい。
【００１４】
ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物と同等の分解活性を示すのであれば、当該酵素調製物に代えて、植物由来の酵素調製物、動物由来の酵素調製物、又は微生物由来の酵素調製物を用いることにしてもよい。他の菌類（例えばアスペルギルス・ニガー）や細菌（例えばストレプトマイセス・アウレウスなどのアクチノマイセス属細菌）からの酵素調製物を用いることにしてもよい。
【００１５】
アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物は常法で調製することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼの培養液をろ過した後、ろ液を限外ろ過等を利用して濃縮する。必要に応じて硫安沈澱、透析、脱塩、各種クロマトグラフィーによる精製等を行う。また、例えばスプレードライ法又はエタノール沈澱法によって最終的な形態に調製することができる。アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物は所定の濃度で使用することができ、使用前に希釈又は濃縮してもよい。
【００１６】
アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物は常法で調製することができる。例えば、アスペルギルス・メレウスの培養液をろ過した後、ろ液を限外ろ過等を利用して濃縮する。必要に応じて硫安沈澱、透析、脱塩、各種クロマトグラフィーによる精製等を行う。また、例えばスプレードライ法又はエタノール沈澱法によって最終的な形態に調製することができる。アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物は所定の濃度で使用することができ、使用前に希釈又は濃縮してもよい。
【００１７】
一態様では、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物は、少なくともオライジン（Oryzin）、中性プロテアーゼI（NPI）及び中性プロテアーゼII（NPII）を含む。
【００１８】
一態様では、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物は、セミアルカリプロテアーゼを含む。ここで「セミアルカリプロテアーゼ」とは、タンパク質及びその分解産物（ポリペプチド、ペプチド）を加水分解する酵素であり、pH6.0〜11の範囲で活性を示すものをいう。
【００１９】
本発明の酵素剤の有効成分として、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物が含有する特定のプロテアーゼ成分を用いることにしてもよい。例えば、アオルシン（Aorsin）は酸性pH域においてトリプシン様特異性をもつセリンプロテナーゼであり、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物から精製され得る。アオルシンA及びアオルシンBの詳細は特許第4401555号及び特開2009-232835号公報に記載される。これらの特許文献の全内容は引用により援用される。アオルシンは酸性pH域において効率的にグルテン由来ペプチドを加水分解する。アオルシンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はLeeらの文献（Biockem. J. 371(PT 2), 541-548(2003)）に開示されている。アオルシンAのヌクレオチド配列はアクセッション番号AB084899.1でGenBankに登録されている。また、対応するアミノ酸配列はアクセッション番号BAB97387でGenBankに登録されている。同様にアオルシンBについては、ヌクレオチド配列がアクセッション番号XM001820783.1で、アミノ酸配列がアクセッション番号XP_001820835.1でそれぞれGenBankに登録されている。
【００２０】
アオルシンのアミノ酸配列を含む酵素或いはアオルシンのアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を用いることにしてもよい。当該同一性は好ましくは少なくとも80%、更に好ましくは少なくとも90%、一層好ましくは少なくとも99%である。
【００２１】
アオルシンのアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有する酵素を用いることにしてもよい。少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも99%の同一性が認められ、且つ機能も同等であれば、二つのアミノ酸配列が等価であるといえる。等価な配列は、例えばGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、或いはBLASTなどやFASTA等の配列比較アルゴリズムを用いて同定することができる。
【００２２】
本発明の一態様では、追加の成分（任意成分）として、その他のタンパク分解酵素およびペプチド分解酵素、例えばセミアルカリプロテアーゼ、タンパク分解酵素（例えばパパイン、キモパパイン、トリプシン、キモトリプシン）、カルボキシペプチダーゼなども用いられる。当該態様の酵素剤によれば相加的ないし相乗的効果が奏され、外因性オピオイドペプチドのより効率的な分解が可能となる。実際、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物及びパパインを併用して作用させた結果、グリアドルフィン7merペプチドに対する極めて強い分解活性を認めた（後述の実施例を参照）。これらの成分は例えばタンパク分解酵素（ペプシン、トリプシン、セミアルカリプロテアーゼなど）やペプチド分解酵素（カルボキシペプチダーゼなど）などと併用しても良い。
【００２３】
タンパク分解酵素については市販品（例えばパパインW-40）を利用することができる。市販品はそのままの濃度で或いは希釈又は濃縮した後に使用される。市販品ではなく、新たに精製したタンパク分解酵素を使用してもよい。精製方法としては例えば塩析、ろ過、限外ろ過、遠心分離、各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）を採用できる。
【００２４】
活性化させたタンパク分解酵素（例えば活性化パパイン）を用いることにしてもよい。例えば、パパインであれば還元剤によって活性化することができる。このような活性化に使用される還元剤としては例えばグルタチオン、ジチオトレイトール（DTT）、L-システイン、N-アセチルL-システインを挙げることができる。
【００２５】
エキソモルフィンペプチドの分解活性を単独では持たないようなタンパク分解酵素剤やペプチド分解酵素剤を用いることにしてもよい。実施例に示したように、パパインにはエキソモルフィンペプチドに対する直接的な分解性は確認されないが、グリアドルフィン含有ペプチド分解の際には、結果として分解性の向上に寄与している。
【００２６】
分解にはエンド型のペプチダーゼのみならず、エキソ型のペプチダーゼを用いることができる。エキソ型ペプチダーゼの例として、例えばカルボキシペプチダーゼY（CPY）を用いることができる。CPYはプロテアーゼC或いはyscYとも呼ばれる。）CPYは特異性の広いエキソペプチダーゼであり、タンパク質やペプチドのカルボキシ末端からアミノ酸を遊離させる。CPYはセリンカルボキシペプチダーゼファミリーに属し、その保存性は高い。CPYの活性化部位の周囲には活性化に必須のセリン及びヒスチジン残基が存在する。例えば酵母又は菌類（例えばサッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、アスペルギルス、カンジダ、ピキア）由来のCPYを用いることができる。より具体的には、例えば、サッカロマイセス・セレビシエのCPY、アスペルギルス・ニガーのCPY、シゾサッカロマイセス・ポンベのCPY、又はアスペルギルス・フミガタスのCPYと少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、更に好ましくは少なくとも90％、一層好ましくは100%のアミノ酸配列同一性を示すCPYを用いることができる。
【００２７】
本発明の酵素剤の各成分（酵素調製物、酵素）は、それを産生する天然の微生物から調製することができる。一方、遺伝子組換えを施した微生物（いわゆる変異株）から調製することにしてもよい。
【００２８】
本発明の酵素剤の各成分（酵素調製物、酵素）は、当該分解活性を持つ酵素としてそれを産生する天然の植物からも調製することができる。一方、遺伝子組換えを施した植物（いわゆる変異株）から調製することにしてもよい。
【００２９】
ここで、本発明の酵素剤が含有する成分の種類、組合せなどに関して、いくつかの具体例（酵素剤の例１〜６）を以下に示す。
酵素剤の例１・・必須成分として、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物を含む
酵素剤の例２・・必須成分として、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物を含む
酵素剤の例３・・必須成分として、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物を含む
酵素剤の例４・・必須成分として、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物と、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物を含む
酵素剤の例５・・必須成分として、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物と、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物と、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物を含む
酵素剤の例６・・必須成分として、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物と、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物と、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物と、パパインを含む
酵素剤の例７・・必須成分として、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物と、ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物と、パパインを含む
【００３０】
本発明の酵素剤は、有効成分の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００３１】
２．医薬組成物、食品組成物
本発明の酵素剤は外因性オピオイドペプチドに対する分解作用を示すものであり、外因性オピオイドペプチドが関与する疾患ないし病態に適用され得る。そこで本発明は他の局面として、本発明の酵素剤を含む、外因性オピオイドペプチドが関与する疾患ないし病態に対する医薬又は食品組成物を提供する。
【００３２】
本明細書では「外因性オピオイドペプチドが関与する疾患ないし病態」のことを便宜上、「外因性オピオイドペプチド関連疾患」と呼ぶ。ここで、「外因性オピオイドペプチドが関与する」とは、外因性オピオイドペプチドが疾病ないし病態の発現（即ち発症、罹患）又は進展の少なくとも一因になっていることをいう。
【００３３】
ここで、治療的効果には、外因性オピオイドペプチド関連疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、外因性オピオイドペプチド関連疾患に特徴的な症状の発現（発症）を阻止ないし遅延することである。外因性オピオイドペプチド関連疾患に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、外因性オピオイドペプチド関連疾患に対する治療薬に該当する。
【００３４】
外因性オピオイドペプチドであるカゾモルフィンやグリアドルフィンは、広汎性発達障害の代表である自閉症、統合失調症、うつ病（特に産後うつ病）などの精神障害（精神病）に関与していることが示唆されている（Sun Z and Cade R. Peptides. 24(2), 321-3 (2003).; Shattock P & Whiteley, P, Expert Opin. Ther. Targets 6 (2),175-183 (2002) ;Cade R et al. Nutritional Neurosci 3, 57-72 (2000). ;Knivsberg AM et al., Nutritional Neurosci 3, 251-61 (2002). ;Muruganandam A et al., FASEB-J 16(2), 240-2 (2002). ;Reichelt KL et al., Dev Brain Dysfunction  7, 71-85 (1994). ;Shattock P et al., Brain Dysfunction 3, 328-45 (1990). ;Sun Z et al., Autism 3(1), 67-83 (1999).; Christison GW and Ivany K, J Dev Behav Pediatr 27(2 Suppl), S162-71 (2006)）。この事実に基づき、本発明の組成物が適用され得る「外因性オピオイドペプチド関連疾患」は例えば広汎性発達障害、統合失調症又はうつ病である。ここでの広汎性発達障害には、自閉症の他、アスペルガー症候群、レット障害、小児期崩壊性障害、特定不能の広汎性発達障害等が含まれる。好ましくは、自閉症、統合失調症又はうつ病（産後うつ病）の治療用又は予防用として本発明の組成物が提供される。更に好ましくは自閉症の治療用又は予防用として本発明の組成物が提供される。
【００３５】
本発明の医薬組成物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００３６】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤及び注射剤などとして本発明の医薬を提供できる。
【００３７】
本発明の医薬組成物には、期待される治療効果（予防効果も含む）、即ち、外因性オピオイドペプチド関連疾患に対する治療効果に有効な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の医薬組成物中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量%〜約95重量%の範囲内で設定する。
【００３８】
本発明の医薬組成物はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（によって患者（又は潜在的患者）に適用される。本明細書で用いる「非経口」による投与は特に限定はしないが、例えば、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、及び胸骨内注射並びに注入を挙げることができる。
【００３９】
本発明の医薬組成物の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約10mg〜約2000mg、好ましくは約50mg〜約1000mg、更に好ましくは約100mg〜700mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００４０】
上記の通り本発明の一態様は、本発明の酵素剤を含む食品組成物である。本発明での「食品組成物」の例として一般食品（穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子類、牛乳、清涼飲料水、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント、栄養ドリンク等）、食品添加物を挙げることができる。栄養補助食品又は食品添加物の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。本発明の酵素剤を食品組成物の形態で提供することによって、本発明の酵素剤を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。
【００４１】
本発明の食品組成物には、治療的又は予防的効果が期待できる量の有効成分が含有されることが好ましい。添加量は、それが使用される対象となる者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
【実施例】
【００４２】
１．グリアドルフィン定量キットによる分解産物中のグリアドルフィン定量
グリアドルフィンを含む難分解性ペプチドである33merペプチド（LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF：配列番号１）は、グルテンを構成するα２グリアジンの56-88番目のアミノ酸配列である。この33merペプチドを基質として、各種酵素（ペプシン、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物（AOEP）、パパイン（アサヒフードアンドヘルスケア社製）、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物（AMEP）及びペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物（PCEP））及び４種混合酵素剤（AOEP、パパイン、AMEP及びPCEPを含む）によって分解を試みた。反応液組成・反応条件は以下の通りである。
(1)以下の各溶液を混合する。尚、コントロールとして、酵素の代わりにmiliQ（登録商標）水を加えたもの（ブランク）と予め10分間ボイルして熱失活させた酵素溶液を加えたもの（サンプルブランク）もそれぞれ調製した。
33merペプチド溶液(1mg/ml miliQ（登録商標）)  10μl
酵素溶液（0.2mg/ml 20mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）。酵素を0.15mg含む。４種混合酵素剤の場合はACEPを0.015mg、パパインを0.015mg、AMEPを0.015mg、PCEPを0.015mg含む）  10μl
150mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)  10μl
(2)37℃で1時間反応させる。
(3)90℃で5分間処理し、反応を停止させる。
(4)反応液を常温まで冷やし、適時希釈した後、BACHEM社製「Gliadorphin-7, EIA Kit, High Sensitivity Cat.No. S-1399」を用いて、全ての反応サンプルのグリアドルフィンを定量する。【００４３】
定量結果を図１に示す。図１のグラフの縦軸はグリアドルフィンの残存率である。４種混合酵素剤によってグリアドルフィンがほぼ完全に分解されていることがわかる。また、AOEP、AMEP及びPCEPはそれぞれ単独でも高い分解活性を示した。【００４４】
２．カゾモルフィン定量キットによる分解産物中のカゾモルフィン定量
１．と同様の方法で各酵素及び４種混合酵素剤のカゾモルフィン分解性を調べた。基質にはカゾモルフィン（YPFPGPI：配列番号３）を含む難分解性ペプチドを使用した。また、カゾモルフィンの定量にはBACHEM社製「Beta Casomorphin, EIA Kit Cat.No. S-1334」を用いた。【００４５】
定量結果を図２に示す。図２のグラフの縦軸はカゾモルフィンの残存率である。４種混合酵素剤によってカゾモルフィンがほぼ完全に分解されていることがわかる。また、AOEP、AMEP及びPCEPはそれぞれ単独でも分解活性を示した。特にPCEPの分解活性は高い。【００４６】
３．グリアドルフィン分解産物のLC-MSによる解析
グリアドルフィンのペプチド配列（YPQPQPF：配列番号２）を完全合成し、基質として用いた。上記４種混合酵素剤及びそれを構成する4種の酵素／酵素調製物それぞれ単独でグリアドルフィンに作用させ、分解産物をLC-MSによって解析した。酵素無添加で反応させたものをコントロールとした。また、比較のため、ペプシンを反応させた場合の分解産物も解析した。結果、図３の分解断片パターンを示した。PCEP、AOEP及びAMEPは単独でもグリアドルフィンを分解していることが分かる。但し、単独ではAOEP、パパインに未分解7merが検出され、また、AMEPとPCEPでは最大断片がそれぞれ6merとなっている。一方、４種混合酵素剤では未分解7merは検出されず（同位置のピークは詳細に解析しても3merのみが確認された）、さらに最大断片も4merとなっている。このように４種混合酵素剤には相乗効果が認められた。【００４７】
４．カゾモルフィン分解産物のLC-MSによる解析
カゾモルフィンのペプチド配列（YPFPGPI：配列番号３）を完全合成し、基質として用いた。上記４種混合酵素剤及びそれを構成する4種の酵素／酵素調製物それぞれ単独でカゾモルフィンに作用させ、分解産物をLC-MSによって解析した。酵素無添加で反応させたものをコントロールとした。また、比較のため、ペプシンを反応させた場合の分解産物も解析した。結果、図４の分解断片パターンを示した。PCEP、AOEP及びAMEPは単独でもグリアドルフィンを分解していることが分かる。但し、単独ではいずれについても未分解7merの残留が見られるが、４種混合酵素剤では未分解7merは検出されない。このように４種混合酵素剤には相乗効果が認められた。【００４８】
５．FRETS基質によるカゾモルフィン及びグリアドルフィンの分解性評価
FRETS（Fluorescence Resonance Energy Transfer Substrate）は蛍光基と消光基を利用したプロテアーゼ基質であり、特定のペプチド配列を切断可能なペプチダーゼを発見するために利用される。FRETSを用い、各酵素／酵素調製物のカゾモルフィン分解活性を評価した。以下に評価方法を示す。
(1)カゾモルフィンのアミノ酸配列（YPFPGPI：配列番号３）を配したFRETS基質を10μM濃度で20mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)に溶解し、基質溶液とする。
(2)各酵素／酵素調製物をそれぞれ0.01%(w/v)の濃度で20mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)に溶解し、酵素溶液とする。
(3)基質溶液100μlに対して、酵素溶液10μlを添加し、直ちに攪拌の上、20分間のカイネティック測定を行う。励起光波長及び蛍光波長はλex（励起光波長）＝340nm、λem（蛍光波長）＝440nmとした。尚、ブランクでは酵素溶液の代わりに20mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)を用いた。
(4)得られた蛍光強度と検量線の値から酵素活性を算出する。37℃下で1分間に1μmolのNmaを遊離する酵素量を1ユニット（u)と定義した。【００４９】
評価結果を図５に示す。尚、グリアドルフィンのアミノ酸配列（YPQPQPF：配列番号２）を配したFRETS基質を用い、同様に評価した結果も併せて示した。AOEP及びPCEPが強いカゾモルフィン分解活性を示した。PCEPの分解活性は特に強い。グリアドルフィンに対しては、AOEP、AMEP及びPCEPに強い分解活性を認めた。AMEPの分解活性は極めて強い。【００５０】
６．ペニシリウム・シトリヌム保存株（タイプカルチャー）の培養物によるグリアドルフィン及びカゾモルフィンの分解
ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物（PCEP）のグリアドルフィン分解活性及びカゾモルフィン分解活性を以下の方法で調べた。【００５１】
公的保存機関に保存されているペニシリウム・シトリヌム８株（NBRC 6026、JCM 22500、JCM 5591（NBRC 6026)、IFO 6225、JCM 22508、JCM 22511、JCM 22517、JCM 22519）をMalt extract Agarスラント培地にアンプルから植菌した。25℃恒温槽で3〜5日培養した。コロニーを白金耳にて無菌的に5mm画切り取り、Malt extract培地50ml/300ml三角フラスコに植菌した。ロータリー（200rpm、25℃）にて12日間培養し、培養上清中の各FRETS基質（グリアドルフィンのアミノ酸配列を配したFRETS基質又はカゾモルフィンのアミノ酸配列を廃したFRETS基質）分解活性を測定した。測定方法は５．の方法に準じた。【００５２】
＜培地組成及び調製法＞
（１）Malt extract Agarスラント培地
Malt extract（Difco)    2%(w/v)
D-グルコース    2%(w/v)
Bacto Peptone(Difco）    1%(w/v)
寒天（Agar）    1.5%(w/v)
pH6.0に調整しメスアップした後、寒天が溶けるまで加温溶解し、7mlずつ18mm径試験管に分注した。121℃で20分間殺菌後、傾けて1晩静置し、固化させスラント培地とした。
（２）Malt extract培地
Malt extract（Difco)    2%(w/v)
D-グルコース    2%(w/v)
Bacto Peptone(Difco）    1%(w/v)
pH6.0に調整しメスアップした後、300ml三角フラスコに50mlずつ分注した。121℃で20分間殺菌後、室温冷却し、培養に用いた。【００５３】
測定結果を図６に示す。いずれの菌株についても、その培養上清は良好にグリアドルフィン及びカゾモルフィンを分解した。この結果は、ペニシリウム・シトリヌムの培養上清から調製される酵素剤（酵素調製物）がグリアドルフィン及びカゾモルフィンの分解に有効であることを示す。【００５４】
６．オピオイドペプチド分解産物のオピオイド受容体に対する結合能の評価
（１）方法
グリアドルフィン分解産物及びカゾモルフィン分解産物の生理的活性をMu opioid receptor ligand binding assay kit（Cisbio社製）で評価した。本キットでは、ヒト型のMuオピオイド受容体を発現した細胞を利用することにより、時間分解蛍光（TR-FRET）法によってサンプル中のオピオイド受容体結合分子を定量できる。バッファーは終濃度50mM 酢酸ナトリウム(pH4.5)を用いた。オピオイドペプチドとしてグリアドルフィン、カゾモルフィンの2種、及びオピオイドペプチド配列をC末端側に含む小麦由来33merペプチドを、終濃度0.33mg/mlになるよう、反応系に添加した。ペニシリウム・シトリヌムからの酵素調製物（PCEP）、アスペルギルス・オリゼからの酵素調製物（AOEP）、アスペルギルス・メレウスからの酵素調製物（AMEP）およびパパインを、それぞれ終濃度50mg/Lになるように添加した。キットでの検出限界を考慮し、上述のペプチド、酵素をそれぞれ10倍濃度で調製したもの（10倍濃度サンプル）を使用した試験区も設けた。120分間、37℃で反応後、15分間煮沸によって酵素を失活させ、更に15,000rpm 10分間の遠心分離によって、固形分を除いた上清をサンプルとし、キットでの評価に用いた。【００５５】
（２）結果
キットのプロトコールに従い、TR665nm/TR620nmの値を取得・算出した。各サンプルの結果を図７〜９に示した。本キットは、テルビウム標識されたオピオイド受容体結合リガンドとサンプル中のオピオイド受容体結合分子を競合的に受容体へ結合させてその蛍光を測定する方法であるため、TR665nm/TR620nmの値が大きいほどサンプル中にオピオイド受容体結合分子が少ないことを示し、逆に値が小さいほどサンプル中にオピオイド受容体結合分子が多いことを示す。いずれのペプチドについても、酵素添加なし（図中「−」と表記）のものに比べて、酵素添加あり（図中「＋」と表記）のもののほうが、TR665nm/TR620nm値が高い結果を得た。即ち、酵素添加によってオピオイド受容体結合分子が低減していることを示している。【００５６】
以上の通り、オピオイド分解酵素によって、２種のオピオイドペプチドと、オピオイドペプチド配列をC末端側に含む小麦由来33merペプチドの合計3種類のペプチドを分解し、その分解産物をMu opioid receptor ligand binding assay kit（Cisbio社製）を用いて評価した結果、分解産物では受容体結合能が低減していることが確認された。本結果と、LC-MS、カゾモルフィン・グリアドルフィン定量キットでの結果を考え合わせると、酵素剤によってオピオイドペプチドが分解され、その結果、受容体への結合能という生理活性をも低減できていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の酵素剤は外因性オピオイドペプチドに対する分解活性を示すものであり、自閉症をはじめとする外因性オピオイドペプチド関連疾患の治療への適用が想定される。【００５８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013047082.tif 000008
【図８】
2013047082.tif 000009
【図９】
2013047082.tif 000010
【配列表】
2013047082000001.app
【国際調査報告】
2013047082.tif 000011
2013047082.tif 000012
2013047082.tif 000013
2013047082.tif 000014
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