(57)【要約】  微生物に酸素耐性能を付与するために有用な遺伝子及びその利用法の提供。  以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする酸素耐性付与遺伝子；（ａ）配列番号２又は６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする酸素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２又は６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる酸素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１又は５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と75％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする微生物の酸素耐性能の付与又は増強方法。
【請求項４】
遺伝子の改変が、請求項１又は２記載の遺伝子の発現増強である請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
【請求項６】
微生物がグラム陽性細菌である請求項５記載の微生物。
【請求項７】
グラム陽性細菌がラクトバチルス属細菌である請求項６記載の微生物。
【請求項８】
ラクトバチルス属細菌がラクトバチルス・カゼイ又はラクトバチルス・ラムノーサスである請求項７記載の微生物。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項記載の微生物を含有する飲食品。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項記載の微生物を含有する医薬品。
【請求項１１】
請求項１又は２記載の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする酸素耐性能を有する微生物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項２記載のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換えベクターを含む宿主微生物。
【請求項１４】
請求項２記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
【請求項１５】
請求項２記載のポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に酸素耐性能を付与する遺伝子及びその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの好気性微生物は酸素代謝を司る呼吸鎖を有し、酸素存在下でエネルギーを獲得し、良好な生育が可能である。また、酸素の一部はその代謝の過程で、スーパーオキシドアニオンや過酸化水素を発生するが、それらを消去するスーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等によって、それらを無毒化しその毒性を回避する機構を有している。【０００３】
嫌気性微生物の中でも有用菌として知られている乳酸菌は通性嫌気性菌に属し、呼吸鎖やカタラーゼを持たないとされているが、多くの乳酸菌は酸素存在下でも生育が可能で、酸素耐性を有している。以前より、乳酸菌の酸素耐性機構についていくつかの研究がなされており、その中で、酸素を代謝する酵素として、NADHオキシダーゼやピルビン酸オキシダーゼ等が知られている。NADHオキシダーゼは、水生成型と過酸化水素生成型の２つの型が報告されており、水生成型は酸素を4電子還元し水へと無毒化する。一方、過酸化水素生成型は2電子還元で過酸化水素を発生するが、ストレプトコッカス・ミュータンス等の乳酸菌ではこの過酸化水素をAlkylhydroperoxide reductaseによって水へと変換し、2成分性のペルオキシダーゼとして機能していることが報告されている。
また、酸素から発生するスーパーオキシドアニオンや過酸化水素を消去する、スーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、NADHペルオキシダーゼ等を持つものも報告されている。【０００４】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムWCFS1においては、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の発現を強めることによって、過酸化水素等の酸化ストレスに対してより抵抗になることから、チオレドキシンレダクターゼが酸化ストレス抵抗性に重要な働きをすることが提案されている（非特許文献１）。
また、嫌気性グラム陰性細菌バクテロイデス・フラジリスにおいては、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系がチオール／ダイサルファイドの酸化還元反応を司る唯一のシステムであると考えられており、チオレドキシンレダクターゼの欠損により、菌は嫌気的環境下にあってもシステインやジチオスレイトールなどの還元剤の添加なくしては生育できないことが報告されている（非特許文献２）。
また、大腸菌においては、細胞内を還元状態へ保つために必須なグルタチオン−グルタチオンレダクターゼ系や、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系が存在しており、それらに関わる遺伝子破壊株は過酸化水素等の酸化ストレスに感受性になることが報告されている。【０００５】
一方、乳酸菌ラクトコッカス・ラクチスにおいてはチオレドキシンレダクターゼを破壊することで、好気条件下では生育が阻害されることが報告されているが（非特許文献３）、好気条件下での生育阻害は、ジチオスレイトールの添加で回復すること、また24時間培養すると野生株と同程度の菌体量になることから、酸素耐性との関係は不明である。【０００６】
また、ストレプトコッカス・ミュータンスではNADHオキシダーゼ、Alkylhydroperoxidereductase(ahpC)をダブルノックアウトした変異株が酸素耐性を有することから、さらに別の鉄結合性を有するタンパク質である遺伝子が酸素耐性に関わる遺伝子であると報告されている（特許文献１）。しかし、これらの遺伝子はすべての微生物が有する遺伝子ではなく、未だ酸素耐性機構は不明な点が多い。またここに挙げた様に、酸素耐性に関わる遺伝子は複数あり、１つの遺伝子のみで酸素耐性能を発揮するものではないことから、簡便に実用に供することは困難であった。【０００７】
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029（FERM BP-1366）及びラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103は好気条件下で良好な生育が可能であり、ヒトに対して種々の生理効果を発揮する乳酸菌であることが知られているが、酸素耐性に関与する遺伝子は同定されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−３２７９２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】L. Mariela Serrano et al. Microbial Cell Factories 6:29(2007)
【非特許文献２】Edson R. Rocha et al. J. Bacteriol. 189:8015-8023(2007)
【非特許文献３】Karin Vido et al. J. Bacteriol. 187:601-610(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、微生物に酸素耐性能を付与する遺伝子及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029及びラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103のゲノム情報を検討し、遺伝子破壊株を作製した結果、酸素耐性の発揮に必須な遺伝子があり、該遺伝子を利用することにより、微生物における酸素耐性能を付与または増強できることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする酸素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２又は６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質
２）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる酸素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１又は５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と75％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
３）上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする微生物の酸素耐性能の付与又は増強方法。
４）上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
５）上記微生物を含有する飲食品。
６）上記微生物を含有する医薬品。
７）上記遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする酸素耐性能を有する微生物のスクリーニング方法。
８）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
９）上記組換えベクターを含む宿主微生物。
１０）上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
１１）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の遺伝子又はポリヌクレオチドを利用することにより、微生物における酸素耐性能を付与又は増強させたり、酸素耐性能を有する微生物をスクリーニングすることができる。
また、本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、所望の酸素耐性能を有する飲食品、医薬品の製造が可能となる。また、酸素存在下で生菌数を高く維持することが可能になることから、製品製造時の嫌気装置、製品の嫌気保存容器が不要となり、コストを抑えた製造が可能となる。また、一般に生菌数が高くなるほど、微生物の生理効果は増大することから、微生物が有する生理効果を効果的に発揮させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】pYSSE3の図である。
【図２】fnr遺伝子破壊株、既知酸素耐性遺伝子破壊株の嫌気培養条件下での生育を示す図である。
【図３】fnr遺伝子破壊株、既知酸素耐性遺伝子破壊株の好気静置培養条件下での生育を示す図である。
【図４】fnr遺伝子破壊株、既知酸素耐性遺伝子破壊株の好気振とう培養条件下での生育を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の同一性（相同性）は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス社製）を用いたLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson, W. R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science227:1435-1441)によるホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いることが出来る。具体的には、例えばラクトバチルス・カゼイ YIT 9029及びラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103の遺伝子を既知の遺伝子と相同性比較して解析することにより算出したものであり、パラメーターとしては、Unit Size to compare=2, Pick up Location=5とし、結果を％表示させて行う。
【００１６】
また、遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、ポリヌクレオチドとしては、RNA、DNAを例示でき、DNAは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAを包含する。
【００１７】
本発明の酸素耐性付与遺伝子は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029及びラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103から見出され、fnrと命名された遺伝子（ラクトバチルス・カゼイfnr、ラクトバチルス・ラムノーサスfnr（fnr-rとも称する））、並びに当該遺伝子から演繹される遺伝子であり、酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするものである。
【００１８】
本発明の酸素耐性付与遺伝子は、具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２又は６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質
【００１９】
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトバチルス・カゼイ YIT 9029由来のタンパク質であり、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103由来のタンパク質である。
配列番号２又は６に示すアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２０】
アミノ酸の欠失、置換、付加は、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が1塩基置換等の天然に生じる変異や、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等により生じ得るものが包含される。斯かるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることができる。
【００２１】
また、（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２又は６に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該アミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
尚、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質とのアミノ酸配列の同一性は89.0％である。
【００２２】
「酸素耐性付与」とは、微生物に酸素耐性を付与すること、すなわち、微生物が酸素存在下でも生育可能ならしめること、及び／又は生育した微生物を酸素存在下においても死滅しないことを意味し、酸素の消去能を有すること、酸素から発生する活性酸素の消去能を有すること、酸化状態となった細胞内を還元状態へと変換すること、酸素や活性酸素により酸化されたDNA、タンパク質、脂質等を還元することができることも包含される。
具体的には、大気中において寒天平板培地上で培養した時にコロニー形成を可能ならしめること、液体培地では振とうして溶存酸素を飽和に保った状態や、大気中の酸素が自然に溶け込んだ状態で生育可能ならしめることを言う。
【００２３】
配列番号２又は６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と既知のタンパク質との相同性（同一性）を以下に示す。尚、同一性検索は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYXを使用し、該塩基配列によって規定されるタンパク質のアミノ酸配列と、公開されている主に乳酸菌のゲノムやDNA断片の塩基配列により規定されるタンパク質のアミノ酸配列との比較を行なうことにより、同一性を有する遺伝子を検索した。同一性の指標としては、該アミノ酸配列全体あるいは一部でもより長い領域での同一性が50％以上を目安に行なった。
【００２４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（FNR）は、そのアミノ酸配列において、ラクトバチルス・カゼイ ATCC 334株由来のチオレドキシンレダクターゼとアノテーションされているtrxBにコードされるタンパク質と99.4%の同一性を有し、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（FNR-R）は、同タンパク質と89.3%の同一性を有する。
【００２５】
本発明の酸素耐性付与遺伝子は、好適には、以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号１又は５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と75％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ酸素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２６】
ここで、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドはラクトバチルス・カゼイ YIT 9029由来のDNA（ラクトバチルス・カゼイ fnr遺伝子）であり、配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドはラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103由来のDNA（ラクトバチルス・ラムノーサス fnr遺伝子（fnr-r遺伝子））であり、共に当該微生物に酸素耐性を付与し、酸素存在下での生育を可能とする。
【００２７】
本発明において、「ストリンジエントな条件下」とは、例えばMolecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、6XSSC（1XSSCの組成：0.15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、5Xデンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液に当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２８】
また、（ｄ）の塩基配列と75％以上の同一性を有する塩基配列としては、配列番号１又は５に示す塩基配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該塩基配列と75％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列を意味する。
尚、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとの塩基配列の同一性は75.3％である。
【００２９】
本発明の遺伝子は、配列番号１又は５の塩基配列を参考にプライマーを作製し、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029又はラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103のDNAをテンプレートとする常法のPCR法で容易に得ることができる。
すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドAとBを１セットにし、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号１又は５に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基等が挙げられる。
また、PCRの条件は、例えば2000塩基対の長さのDNA断片を得る場合には、94℃2分、（95℃10秒、52℃10秒、72℃2分）x30サイクル、72℃7分が挙げられる。
【００３０】
また、その当該塩基配列に従い、DNA合成機により人工的に合成して得ることもできる。
【００３１】
本発明の遺伝子は、酸素耐性付与に関与する遺伝子であることから、これを微生物に導入する、或いは微生物が有する当該遺伝子を改変することにより、当該微生物において、酸素耐性能を付与又は増強することができる。
本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、元来有しない微生物に導入することにより行うことができる。遺伝子を導入する方法としてはDNAの取り込み能を利用したコンピテンス法、プロトプラストを利用したプロトプラストPEG法及び高電圧パルスを利用したエレクトロポレーション法等を利用すればよく、特にエレクトロポレーション法が好ましい。また、遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、相同組換えを利用した方法、部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
【００３２】
本発明の遺伝子の改変には、発現増強が挙げられる。
遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微生物に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって微生物内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、制御遺伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。具体的には、１個の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作成し、微生物細胞内にエレクトロポレーション法などによって導入することによって、微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
【００３３】
また、当該遺伝子を元来有する微生物に対しては、当該遺伝子を発現阻害若しくは発現抑制することにより、当該微生物の酸素耐性能を低下させることも可能である。
遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法を用いればよく、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によって標的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
【００３４】
遺伝子の発現を抑制するには、本発明の遺伝子のmRNAの5’末端領域と相補的な短いRNAを合成することによる、いわゆるRNA干渉による方法や、該遺伝子の発現を制御する領域又は制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変する方法を用いることができ、特に該遺伝子の発現を制御する領域の改変が好ましい。具体的には、遺伝子の転写を制御するプロモーターの配列を改変することによって、該遺伝子のmRNAへの転写量を多くしたり、少なくしたりすることができる。
【００３５】
ここで、遺伝子導入又は改変の対象となる微生物は、特に限定されるものではなく、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母等を用いることができるが、グラム陽性細菌を好適に利用することができ、特に生体への安全性が確認されているラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌等の利用が好ましい。ラクトバチルス属細菌の中でも、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌の利用が好ましく、特にラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーサスを好適に利用することができる。また、酸素耐性付与遺伝子を元来有する微生物としては、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9018（FERM BP-665）やラクトバチルス・カゼイ YIT 9029や、ラクトバチルス・カゼイ ATCC 334、ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103が挙げられる。
【００３６】
ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気性菌であり、酸素や低ｐＨ、高酸度に弱く、製造時の増殖や保存時の生残性等、取扱いに困難な点が多い。ビフィドバクテリウム属細菌はヒトにとって有用な生理効果を示すことから、育種改良により酸素耐性を有する変異株を取得したり、酸素不透過性容器を使用する等の工夫をして、飲食品や医薬品への応用が進んでいるが、培養が困難であったり、保存中に生菌数が低下するといった様々な問題がある。ビフィドバクテリウム属細菌は、本願発明の酸素耐性付与遺伝子を有さないことが明らかになっているので、本願発明の遺伝子導入又は改変の対象となる微生物として好適に利用することができる。
【００３７】
斯くして得られる遺伝子導入又は改変された微生物は、酸素耐性能が付与又は増強されているため、当該微生物が元来有する種々の生理効果を効果的に発揮する飲食品や医薬品として利用することができる。
【００３８】
遺伝子導入又は改変された本発明の微生物を飲食品や医薬品とする場合、菌体は、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、又凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら微生物を含む培養物、菌体処理物として利用することもできるが、生菌の状態で利用することが好ましい。
【００３９】
医薬品として使用する場合は、本発明の微生物を固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００４０】
また、遺伝子導入又は改変された本発明の微生物は、上記のような製剤とするだけでなく、飲食品に配合して使用することもできる。飲食品に配合する場合は、そのまま、または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。この飲食品は、微生物の酸素耐性能が付与又は増強されているため、当該微生物が元来有する種々の生理作用を効果的に発揮する保健用食品又は食品素材として利用できる。具体的に本発明の方法により得られた微生物を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。
【００４１】
さらに飲食品としては、本発明の微生物を利用した発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵飲食品の例が挙げられる。これら発酵飲食品の製造は常法に従えばよい。例えば発酵乳を製造する場合は、まず、殺菌した乳培地に本発明の微生物を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる発酵乳は、シロップ（甘味料）を含有しないプレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００４２】
本発明の方法により得られた微生物は、高い酸素耐性能を有することから、飲食品中での菌の生残性が高いため、保存中の生菌数の低下や死滅速度の増加が抑制され、製品規格の維持が容易となり、ラクトバチルス属細菌等の微生物が有する整腸作用等の一般的な生理効果を効果的に発揮させることができる。また、抗がん作用、ヘリコバクター・ピロリの除菌作用等の特異的な生理効果を元来有するラクトバチルス属細菌やビフィドバクテリウム属細菌に対して、本発明の方法により酸素耐性能を付与又は増強することで、該菌株を様々な飲食品に利用することが可能になると共に、該菌株の生残性が改善することで該菌株が有する生理効果を増強させることが可能となる。
【００４３】
また、ビフィドバクテリウム属細菌を利用した飲食品において、保存時の生残性を高める目的で、ガラスやアルミコーティング紙等の酸素不透過性の包剤で構成された容器が主に用いられてきたが、本発明の方法により得られた酸素耐性能を有するビフィドバクテリウム属細菌は、高い生残性を有し、厳密な嫌気状態を必要としないため、酸素透過性の高い樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等）も容器素材として使用できる。これらの樹脂を用いた容器は、酸素不透過性の包剤で構成された容器と比較して、コストが低く、成型の自由度が高いというメリットを有する。
【００４４】
本発明の遺伝子は、酸素耐性能を有する微生物のスクリーニングのために使用することもできる。
すなわち、本発明の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することにより、酸素耐性能を有する微生物をスクリーニングすることができる。
ここで、遺伝子の有無及び／又はその発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法により行うことができる。そして、標的遺伝子やその発現の有無により、目的の微生物を選択すればよい。
【００４５】
（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明の組換えベクターは、大腸菌及び対象とする微生物において該ベクターの導入を選択できるような遺伝子マーカーを有している任意のベクター（例えば、pHY400、pSA1、pYSSE3等）を用いてインビトロライゲーション法等の公知の方法により得ることができる。
【００４６】
また、上記の組換えベクターを含む宿主微生物は、公知の方法、すなわち、当該組換えベクターを宿主微生物に導入する場合はエレクトロポレーション法等の方法により、微生物染色体に組み込む場合は該微生物と相同なDNA領域を持つ組換えベクターをエレクトロポレーション法等により導入した後に相同組換えにより染色体に組み込まれたものをPCR法等によって確認する等の方法を用いることにより得ることができる。
【００４７】
また、（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明のDNAアレイ又はDNAチップは、フォトリソグラフィー法等の公知の方法により作製することができる。このDNAアレイ又はDNAチップを用いることにより、本発明の遺伝子を発現する微生物をスクリーニングすることができる。
【００４８】
尚、上述した微生物の遺伝子導入又は改変や微生物のスクリーニングを効率よく行うためには、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター、本発明のポリヌクレオチドの一部断片からなるPCR及びRT-PCR用プライマー、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を増幅することができるPCR及びRT-PCR用プライマー、本発明のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその一部からなるハイブリダイゼーション用の核酸断片を用いることが好ましい。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号１又は５に示す塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４９】
実施例１  ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029の遺伝子解析（遺伝子の抽出）：
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のチオレドキシンレダクターゼとホモロジーの高い遺伝子を、既知の微生物由来チオレドキシンレダクターゼ遺伝子との相同性等をもとに染色体上から検索した。すなわち、ゼネティックス社製  遺伝情報処理ソフトウェアGENETYXを用いたLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson, W. R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 227:1435-1441)により、個々の上記遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を相手として、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノム配列から予想されるタンパク質をコードすると思われるオープンリーディングフレーム（ORF）の全てに対してホモロジー解析した。その結果、ゲノム上にチオレドキシンレダクターゼとホモロジーの高い２つのORFを抽出した。これらのうちの一つが配列番号１記載の遺伝子であり、配列番号１記載の遺伝子は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のもうひとつのチオレドキシンレダクターゼと相同性のある遺伝子（遺伝子A）と29.0％の相同性を示した。しかし、配列番号１記載の遺伝子は、チオレドキシンレダクターゼの活性中心であるCXXCモチーフを持たないことから、チオレドキシンレダクターゼ活性を有さず、その機能はこれまでに報告されていない未知の遺伝子であることが分かった。一方、遺伝子AはCXXCモチーフを有することから、チオレドキシンレダクターゼと推定された。【００５０】
実施例２  ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029の遺伝子破壊株の分離
配列番号１記載の遺伝子（fnr）を欠損する変異株の作成は次のように行った。
配列番号１内部の配列から選択した配列の５’末端側に制限酵素BamHI切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド5'-cgggatccagatggctttttcacatt-3'（配列番号３）、及び配列番号１と相補的な配列から選択した配列の５’末端側に制限酵素PstI切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド5'-aaactgcagccaccagtataccattacg-3'（配列番号４）をプライマーとし、KOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製、製品番号KOD-201）を用いて本酵素に添付の方法に従って、ラクトバチラス・カゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。こうして増幅されるDNA断片はfnr遺伝子のアミノ末端とカルボキシル末端の両側を欠いた部分配列である。生成物を等量のトリス−イーディーティーエー（10mM Tris(pH8.0)−1mM EDTA, TEと呼ぶ）飽和フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（25：24：1）と混合し、よく攪拌した後、15,000 x g 5分の遠心を行って、2層に分離した。上層の水層を回収し、その10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。【００５１】
この沈殿物を100μlのKバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、前述のTE飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール処理（溶媒混合から水層回収まで）を2回繰り返し、回収した水層に10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。【００５２】
プラスミドベクターとして、プラスミドpUC19に由来する大腸菌用複製領域と、大腸菌とラクトバチルスの両方で機能するプラスミドpAMβ1に由来するエリスロマイシン耐性遺伝子を持つpYSSE3（図１）を用いた。pYSSE3 DNAを100μlのKバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、10倍濃度のCIPバッファー（TOYOBO社製）20μlと水を加えて容量を200μlとし、カーフインテスティンフォスファターゼ（TOYOBO社製）3μlを加えて37℃で2時間インキュベートした。その後、前述のTE飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール処理とエタノール沈澱処理を行い、沈殿物を真空乾燥した。【００５３】
上記fnr内部配列からなるDNA断片と制限酵素切断したプラスミドベクターをそれぞれおよそ0.01〜0.1μgずつ混合し、これに等容量のDNAライゲーションキットVer.2.1（タカラバイオ社製）I液を加えて16℃で30分間インキュベートした後、氷中に置いた。【００５４】
次に、溶解後氷中に置いたJM109コンピテントセル（TOYOBO社製）100μlに上記反応液5μlを加え、軽く混合して氷中で30分間インキュベートした後、42℃に30秒間さらしヒートショックを与え、再び氷中に戻した。この菌液にSOC培地（TOYOBO社製）を1mL加え37℃で1時間培養した後にエリスロマイシン（注射用エリスロマイシン、ダイナボット社製）を500μg／mLの濃度で加えたLB寒天培地（1L中に10g バクトトリプトン、5g バクトイーストエキストラクト、5g 塩化ナトリウム、15g 寒天を含む）に塗布して、37℃でインキュベートした。【００５５】
生成したエリスロマイシン耐性のコロニーを500μg／mLのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地で生育し、ウィザードプラスSVミニプレップDNAピューリフィケーションシステム（プロメガ社製）を用いて組換えプラスミドDNAを抽出した。【００５６】
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で1時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気状態にし、37℃で2日又は3日間インキュベートした。【００５７】
生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、50μlのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029染色体のfnr遺伝子下流の配列から選ばれたプライマーと、プラスミドベクターにあって、クローニングしたfnr遺伝子内部断片の近傍にある配列から選ばれたプライマーを用いて、PCR解析を行うことにより、導入したプラスミドがラクトバチルス・カゼイ YIT 9029染色体のfnr遺伝子内部の組換えプラスミド上のfnr遺伝子断片と相同な領域に組み込まれて、fnr遺伝子が分断（破壊）されていることを確認した。こうして得たクローンをΔfnrとした。【００５８】
実施例３  ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103の遺伝子解析（遺伝子の抽出）
ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103について、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のチオレドキシンレダクターゼ遺伝子（遺伝子A）とホモロジーを有する遺伝子を実施例１と同様に検索したところ、これと99.5％相同なチオレドキシンレダクターゼと推定される遺伝子と、これと29.3％相同な遺伝子を見出した。後者の遺伝子は上記fnrと塩基配列で75.3％、アミノ酸配列で89.0％の相同性を有する遺伝子であった。この遺伝子はラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のfnr遺伝子オルソログであり、fnrと同様にチオレドキシンレダクターゼに特有のCXXCモチーフを持たず、該活性を持たないと考えられる機能未知の遺伝子であった。【００５９】
実施例４  ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103の遺伝子破壊株の分離
実施例３で得られた機能未知の遺伝子である配列番号5記載の遺伝子（fnr-r；ラクトバチルス・ラムノーサス由来のfnr遺伝子）を欠損する変異株の作成は、プライマーとして、配列番号５内部の配列から選択した配列の５’末端側に制限酵素BamHI切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド5'-TATGGATCCACACTAAAACGGTCAT-3'（配列番号７）、及び配列番号５と相補的な配列から選択した配列の５’末端側に制限酵素PstI切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-ATTCTGCAGTCGGTGCCTCACC-3'（配列番号８）を用いた以外は実施例２と同様にして行った。導入したプラスミドがラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103染色体のfnr-r遺伝子内部の組換えプラスミド上のfnr-r遺伝子断片と相同な領域に組み込まれて、fnr-r遺伝子が分断（破壊）されていることを確認した。こうして得たクローンをΔfnr-rとした。【００６０】
実施例５  ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029遺伝子破壊株の好気条件、嫌気条件における生育
fnr遺伝子の機能を調べるために、実施例２で取得したfnr遺伝子破壊株と、酸素耐性に関与すると予想される遺伝子（NADHオキシダーゼ（nox2）、NADHペルオキシダーゼ(npr)、チオレドキシン（trxA1）、Alkylhydroperoxide reductase(ahpC)）の破壊株（Δnox2、Δnpr、ΔtrxA1、ΔahpC）について、嫌気（溶存酸素濃度小）、好気静置（溶存酸素濃度中）、好気振とう（溶存酸素濃度大）でMRS培地で培養した時の増殖を測定し、野生株のラクトバチルス・カゼイ YIT 9029の増殖能と比較した。酸素耐性に関与すると予想される遺伝子の破壊株は実施例２に示した方法と同様の方法により、取得した。
fnr遺伝子破壊株は嫌気MRS培地で、それ以外の菌株は好気MRS培地で一晩前培養を行った。野性株以外の遺伝子破壊株の培養液にはエリスロマイシンを20μg/mlの濃度になるよう添加した。前培養液を本培養のMRS培地にそれぞれ1％接種した。嫌気培養は、窒素循環した培地を試験管に注入し、気相を窒素ガスで置換して、ブチル栓で蓋をし、37℃で静置培養した。好気静置培養は、培地を試験管に注入し、シリコ栓で蓋をし、37℃で静置培養した。好気振とう培養は、培地を試験管に注入し、シリコ栓で蓋をし、試験管を斜めにして160rpmで振とうしながら37℃で培養した。それぞれクレット計（KLETT MFG製）を用いて2時間置きに濁度を測定した。
その結果、嫌気条件下では、fnr遺伝子破壊株を含めすべての変異株で野生株と同程度に良好な生育を示した。好気静置培養では、野生株とΔnox2、Δnpr、ΔtrxA1、ΔahpCは良好な生育を示したが、Δfnrは著しい生育阻害が見られた。好気振とう培養では野生株とΔnox2、ΔahpCは良好な生育を示したが、Δnpr、ΔtrxA1は僅かな生育阻害が見られ、Δfnrは著しい生育阻害が見られた。fnr遺伝子破壊株は中程度に酸素が存在する場合においても、著しい生育阻害が見られたことから、fnr遺伝子は酸素耐性付与遺伝子であることが明らかになり、従来より酸素耐性に関与することが公知である遺伝子と比較しても酸素耐性への寄与度が非常に大きく、fnr遺伝子がなければ好気条件下での生育ができないことが分かった。
なお、前培養液を取得する際、fnr遺伝子破壊株を嫌気MRS培地で培養した理由は、好気MRS培地ではfnr遺伝子破壊株が生育しなかったためであり、この事実も、fnr遺伝子は酸素存在下での生育に必須の遺伝子であることを示している。【００６１】
実施例６  ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103のfnr-r遺伝子破壊株の好気条件、嫌気条件における生育
実施例４で作成したfnr-r遺伝子破壊株（Δfnr-r）を、エリスロマイシンを20μg/mlの濃度になるように添加したMRS寒天平板培地に、白金耳で画線し、好気条件はそのまま静置で、嫌気条件はアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気状態にし、37℃で3日間インキュベートした。その結果、嫌気条件下ではMRS寒天平板培地上で生育したが、好気条件下ではまったく生育が観察されなかった。以上から、ラクトバチルス・ラムノーサス ATCC 53103においてもラクトバチルス・カゼイfnr遺伝子のオルソログfnr-r遺伝子は好気条件下での生育に必須であり、酸素耐性遺伝子であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009150856.tif 000007
2009150856.tif 000008
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