(57)【要約】  量産性に優れており、かつ、ビフィズス菌の主要な培養原料である乳由来原料以外のタンパク質源を要することなく、ビフィズス菌の増殖を促進し得る乳タンパク質分解物、該乳タンパク質分解物の製造方法、及び該乳タンパク質分解物を有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤の提供。細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分からなる群より選択される１以上を用いて、乳タンパク質を加水分解することにより得られることを特徴とする乳タンパク質分解物、該乳タンパク質分解物の製造方法、及び該乳タンパク質分解物を有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分からなる群より選択される１以上を用いて、乳タンパク質を加水分解することにより得られることを特徴とする乳タンパク質分解物。
【請求項２】
前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）である、請求項１記載の乳タンパク質分解物。
【請求項３】
前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、請求項２記載の乳タンパク質分解物。
【請求項４】
前記乳タンパク質が、カゼイン又はトータルミルクプロテインであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳タンパク質分解物。
【請求項５】
前記加水分解が、ｐＨ６．０〜８．０に調整された乳タンパク質を基質として、２０〜３７℃、乳タンパク質濃度が０．５重量％以上の条件で行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の乳タンパク質分解物。
【請求項６】
細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分からなる群より選択される１以上を用いて、乳タンパク質を加水分解することを特徴とする、乳タンパク質分解物の製造方法。
【請求項７】
前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）である、請求項６記載の乳タンパク質分解物の製造方法。
【請求項８】
前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、請求項７記載の乳タンパク質分解物の製造方法。
【請求項９】
前記乳タンパク質が、カゼイン又はトータルミルクプロテインであることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の乳タンパク質分解物の製造方法。
【請求項１０】
前記加水分解が、ｐＨ６．０〜８．０に調整された乳タンパク質を基質として、２０〜３７℃、乳タンパク質濃度が０．５重量％以上の条件で行われることを特徴とする請求項６〜９のいずれか一項に記載の乳タンパク質分解物の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳タンパク質分解物を有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤。
【請求項１２】
前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である請求項１１記載のビフィズス菌増殖促進剤。
【請求項１３】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株である請求項１２記載のビフィズス菌増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の破砕菌体、及び前記乳酸菌から分画された酵素画分等を用いて得られるタンパク質分解物、該タンパク質分解物の製造方法、及び、該タンパク質分解物を有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤に関する。
本願は、２００８年６月１１日に、日本に出願された特願２００８−１５２９５１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、すなわちビフィズス菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。
このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。【０００３】
ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有させるために、通常、酵母エキス等の様々な増殖促進物質を添加することが行われている。しかし、該増殖促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。このため、より安価であり、かつ風味に対する影響が小さいビフィズス菌の増殖促進剤の開発が求められている。【０００４】
例えば、（１）ヒト乳をペプシン処理して得られたペプチドに、ビフィズス菌増殖促進作用があること、特に、ヒトタンパク質ラクトフェリンのペプシン分解物に、ビフィズス菌増殖促進作用があることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、（２）アクトミオシン又はアクトミオシンを含む食肉タンパク質懸濁液をプロテアーゼで処理することにより得られるペプチド含有画分を有効成分とすることを特徴とするビフィズス菌増殖促進剤に係る発明が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【非特許文献１】リープケ（Ｌｉｅｐｋｅ,Ｃ.）、他５名、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年、第２６９巻、第７１２〜７１８ページ。
【特許文献１】特開２００７−１８９９１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記（１）のペプチドは、原料がヒト乳やヒト乳に含有されているタンパク質であるため、原料の確保が困難であり、飲食品に添加する等の産業利用にはあまり適さない。一方、上記（２）のビフィズス菌増殖促進剤は、原料が食肉タンパク質であるため、原料の確保には特に問題はないが、ペプチドはアレルゲンとなり得ることから、ビフィズス菌発酵乳等の元々食肉由来タンパク質を原料としていない飲食品にこのビフィズス菌増殖促進剤を添加することは、食品アレルギーに対する配慮の点から好ましくない。【０００６】
本発明は、量産性に優れており、かつ、ビフィズス菌の主要な培養原料である乳由来原料以外のタンパク質源を要することなく、ビフィズス菌の増殖を促進し得る乳タンパク質分解物、該乳タンパク質分解物の製造方法、及び該乳タンパク質分解物を有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に代表される細胞壁局在性タンパク質分解酵素ＰｒｔＰを有する乳酸菌の生菌体や前記乳酸菌の菌体破砕物、前記乳酸菌から分画された細胞壁局在性タンパク質分解酵素ＰｒｔＰ画分による乳タンパク質分解物が、ビフィズス菌増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素(ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分からなる群より選択される１以上を用いて、乳タンパク質を加水分解することにより得られることを特徴とする乳タンパク質分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）である前記記載の乳タンパク質分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする前記記載の乳タンパク質分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記乳タンパク質が、カゼイン又はトータルミルクプロテインであることを特徴とする、前記いずれか記載の乳タンパク質分解物を提供するものである。
また、本発明は、前記加水分解が、ｐＨ６．０〜８．０に調整された乳タンパク質を基質として、２０〜３７℃、乳タンパク質濃度が０．５重量％以上の条件で行われることを特徴とする、前記いずれか記載の乳タンパク質分解物を提供するものである。
また、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分からなる群より選択される１以上を用いて、乳タンパク質を加水分解することを特徴とする、乳タンパク質分解物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）である前記記載の乳タンパク質分解物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクチスが、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする前記記載の乳タンパク質分解物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳タンパク質が、カゼイン又はトータルミルクプロテインであることを特徴とする、前記いずれか記載の乳タンパク質分解物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記加水分解が、ｐＨ６．０〜８．０に調整された乳タンパク質を基質として、２０〜３７℃、乳タンパク質濃度が０．５重量％以上の条件で行われることを特徴とする、前記いずれか記載の乳タンパク質分解物の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の乳タンパク質分解物を有効成分とするビフィズス菌増殖促進剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である前記記載のビフィズス菌増殖促進剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株である前記記載のビフィズス菌増殖促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の乳タンパク質分解物は、乳酸菌由来の細胞壁局在性タンパク質分解酵素ＰｒｔＰにより乳タンパク質を加水分解することにより得られるものであるため、量産性に優れており、比較的安価に製造することも可能である。
また、本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、従来に無くビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを増殖させることができる。また、有効成分である乳タンパク質分解物は乳由来物質であるため、本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、発酵乳等の乳由来原料でビフィズス菌を培養して製造される飲食品にも、乳タンパク質以外のタンパク質アレルギーに配慮する必要がなく使用することも可能であり、発酵乳等の乳製品の設計上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ラクトコッカス・ラクチスの各菌株由来のＤＮＡを鋳型として、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を検出するプライマーを用いてＰＣＲを行った結果得られたＰＣＲ産物を、電気泳動法により分離し、染色により検出したバンドパターンを示した図である。
【００１１】
本発明の乳タンパク質分解物は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素ＰｒｔＰ（以下、単に「ＰｒｔＰ酵素」と記載することがある。）を有する乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画された前記酵素画分からなる群より選択される１以上を用いて、乳タンパク質を加水分解することにより得られることを特徴とする。本発明の乳タンパク質分解物は、ビフィズス菌増殖促進活性を有しているため、本発明の乳タンパク質分解物を有効成分とすることにより、ビフィズス菌増殖促進効果の高い優れたビフィズス菌増殖促進剤を得ることができる。本発明の乳タンパク質分解物がビフィズス菌増殖促効果を奏する理由は明らかではないが、乳タンパク質を、ＰｒｔＰを用いて加水分解することにより、ビフィズス菌増殖促進作用を有するオリゴペプチドが得られるためではないかと推察される。【００１２】
本発明において用いられる乳酸菌は、ＰｒｔＰ酵素を有している。ＰｒｔＰ酵素は、細胞膜に存在し、細胞表面に活性部位が剥き出しになっている酵素である。ＰｒｔＰ酵素を有している乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）やラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属菌において、ＰｒｔＰを有する菌株が幾つか報告されている。【００１３】
これまでに、ラクトコッカス・ラクチス由来のＰｒｔＰ酵素には、ＰＩ型（α―カゼインを余り分解せず、β―カゼインをＣ末端の近辺からよく分解する）、ＰＩＩＩ型（α―カゼイン及びβ―カゼインをＣ末端及びＮ末端の両方からよく分解する）及びその中間型（ＰＩ／ＰＩＩＩ型）が知られている（例えば、Ｒｅｉｄ，ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、第６０巻第３号、第８０１〜８０６ページ参照。）。
具体的には、ラクトコッカス・ラクチス由来のＰｒｔＰ酵素として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にアクセッション番号ＡＹ５４２６９０、ＡＹ５４２６９１等として遺伝子配列が登録されているＰｒｔＰ酵素等が挙げられる。【００１４】
ある乳酸菌が、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌（ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌）であるか否かは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の遺伝子解析技術を用いて、ＰｒｔＰ酵素をコードするＰｒｔＰ遺伝子を有しているか否かを調べることにより確認することができる。【００１５】
ＰｒｔＰ酵素は、細胞外に酵素活性部位を有するため、培地中のタンパク質を分解することができる。例えば、乳酸菌が乳性培地で増殖するときに、ＰｒｔＰ酵素が、乳性培地中の乳タンパク質を分解し、乳酸菌の生育に必要となるオリゴペプチドやアミノ酸が提供される。このため、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスは、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する、という特徴がある。このような増殖性や発酵性が高いという特徴を利用して、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌を検出することもできる。その他、ＰｒｔＰ酵素活性を検出することによっても、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌を検出することができる。【００１６】
本発明に用いられる乳酸菌は、ＰｒｔＰ酵素を有するものであれば特に限定されるものではないが、ラクトコッカス属菌であることが好ましく、ラクトコッカス・ラクチスであることがより好ましく、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスやラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス等であることがさらに好ましい。
発酵乳等のビフィズス菌を原料とする乳製品において、従来から原料として使用されていることから、安全性が高いと考えられるためである。ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスとしては、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株や、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株等がある。【００１７】
本発明において、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の前培養に用いられる培地は、ラクトコッカス・ラクチスの培養に通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）  Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）等の市販の半合成培地や、還元脱脂粉乳培地等の乳性培地であることが好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、グルコースや酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。【００１８】
本発明において、乳タンパク質の加水分解に用いられるものとしては、ＰｒｔＰ酵素の酵素活性を維持しているものであれば、特に限定されるものではないが、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分であることが好ましい。【００１９】
本発明において用いられるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体は、常法により培養した乳酸菌をそのまま用いてもよく、凍結乾燥等の常法により調整した乾燥菌末であってもよい。培養した乳酸菌としては、培養に用いた培地ごと用いてもよく、遠心分離処理等により培地から菌体のみを回収した後、適当なバッファー等に懸濁させたものであってもよい。
余分な培地等を除去し得ること、また濃縮や希釈により濃度を調整することも可能であることから、培地から回収した菌体をバッファーに懸濁させたものを用いることが好ましい。【００２０】
培地から回収した菌体を懸濁させるバッファー等としては、乳酸菌を生菌の状態で懸濁させることができる溶媒であれば、特に限定されるものではなく、乳酸菌等の懸濁に通常用いられるバッファー等を用いることができるが、カルシウムイオンを含むバッファー等であることが好ましい。懸濁に用いられるバッファーのｐＨとしては、４．５〜８．０であることが好ましい。該バッファーとして、例えば、ＭＥＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー等が挙げられる。その他、生理食塩水であってもよい。【００２１】
本発明において用いられるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の菌体破砕物は、該乳酸菌をＰｒｔＰ酵素の酵素活性を損なうことなく破砕することにより得られたものであれば、特に限定されるものではない。このような破砕方法として、例えば、超音波を利用した破砕処理、ガラスビーズ破砕処理、浸透圧ショックを利用した破砕処理等が挙げられる。なお、これらの破砕処理は、５０℃以下、好ましくは室温以下、より好ましくは１０℃以下の低温下において行うことが好ましい。加熱により、ＰｒｔＰ酵素が失活してしまうためである。【００２２】
本発明において用いられるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分は、該乳酸菌から、ＰｒｔＰ酵素の酵素活性を損なうことなく、ＰｒｔＰ酵素を分画することにより得られたものであれば、特に限定されるものではない。例えば、培養後に培地から回収された乳酸菌を、バッファー中に懸濁して保持した後、遠心分離処理等によって菌体を除去することにより、乳酸菌の細胞表面から遊離したＰｒｔＰ酵素を含む上清を、ＰｒｔＰ酵素画分として得ることができる。該バッファーに、ＥＤＴＡ等のキレート剤を添加することにより、乳酸菌の細胞表面からＰｒｔＰ酵素が遊離されやすくなるため、ＥＤＴＡ等のキレート剤を添加したバッファーを用いることが好ましい。このような上清を得るためのバッファーとしては、例えば、上記生菌体の懸濁に用いることができるバッファーとして挙げられたものに、ＥＤＴＡ等のキレート剤を添加したものを用いることができる。また、バッファー中に乳酸菌を保持する温度は、５０℃未満であれば特に限定されるものではないが、４〜３７℃程度であることが好ましく、３０℃程度であることがより好ましい。また、保持時間は、保持温度やバッファーの種類等を考慮して適宜決定することができるが、１時間以内であることが好ましく、５〜３０分間であることがより好ましく、５〜１５分間であることがさらに好ましい。【００２３】
なお、このようにして得られた上清を、透析処理することにより、ＰｒｔＰ酵素画分からキレート剤を除去することができる。さらに、分画されたＰｒｔＰ酵素画分は、凍結濃縮等の公知の手法により、ＰｒｔＰ酵素活性を損なうことなく濃縮することもできる。その他、乳酸菌の菌体破砕物を、硫酸アンモニウム沈殿法やクロマトグラフィー法等の公知の分画手段を用いて分画することにより得られたＰｒｔＰ酵素画分であってもよい。【００２４】
本発明において用いられる乳タンパク質は、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の動物（但しヒトを除く）から採取された乳由来のタンパク質であれば、特に限定されるものではなく、食用に通常用いられる乳由来のタンパク質を適宜選択して用いることができる。本発明においては、産業上の利用価値の高い牛乳に含まれている乳タンパク質であることが好ましい。
また、牛乳タンパク質としては、カゼインであってもよく、ホエータンパク質（ホエー中に含まれるタンパク質）であってもよく、トータルミルクプロテインであってもよい。
本発明において用いられる乳タンパク質としては、牛乳由来のカゼイン又はトータルミルクプロテインであることが好ましく、牛乳由来のカゼインであることがより好ましい。よりビフィズス菌増殖促進効果が高い乳タンパク質分解物を得ることができるためである。
なお、カゼイン、トータルミルクプロテイン、ホエータンパク質等の乳タンパク質は、常法により調製したものを用いることができる。また、市販されているものを用いてもよい。【００２５】
本発明の乳タンパク質分解物は、乳タンパク質に、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体、前記乳酸菌の菌体破砕物、及び前記乳酸菌から分画されたＰｒｔＰ酵素画分からなる群より選択される１以上を添加して加水分解することにより得られる。添加されるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体、菌体破砕物、及びＰｒｔＰ酵素画分は、上記のように調整したものを、適宜に凍結濃縮または凍結乾燥したものとして添加することが好ましい。また、この加水分解の反応条件は、ＰｒｔＰ酵素により酵素反応が可能な条件であれば特に限定されるものではなく、ＰｒｔＰ酵素の種類、乳タンパク質の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、由来する乳酸菌が生育（増殖）し得る環境と実質的に同等の条件であれば、ＰｒｔＰ酵素が酵素活性を有することが期待できる。【００２６】
本発明においては、加水分解における反応温度は、５０℃未満であることが好ましく、１０〜４２℃であることがより好ましく、２０〜３７℃であることがさらに好ましく、３０℃前後であることが特に好ましい。
また、加水分解に供される乳タンパク質は、ｐＨ６．０〜８．０に調整されたものであることが好ましく、６．０〜７．５に調整されたものであることがより好ましく、６．５前後に調整されたものであることがさらに好ましい。基質である乳タンパク質のｐＨが６．０以上である場合には、得られた乳タンパク質分解物を加熱殺菌する場合に、タンパク質凝集が生じ難い。一方、乳タンパク質のｐＨが８．０以下である場合には、得られた乳タンパク質分解物を加熱殺菌する場合に、タンパク質の変性が生じ難い。【００２７】
本発明においては、加水分解における反応系中の乳タンパク質濃度は、所望の乳タンパク質分解物の濃度や、添加するＰｒｔＰ酵素の量、反応時間等を考慮して適宜決定することができる。本発明においては、加水分解における乳タンパク質濃度は、０．５重量％以上であることが好ましく、１重量％以上であることがより好ましい。よりビフィズス菌増殖促進能に優れた乳タンパク質分解物を得ることができるためである。【００２８】
また、本発明においては、加水分解における反応系中に添加されるＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体、菌体破砕物、及びＰｒｔＰ酵素画分の量は、添加する乳タンパク質量等を考慮して適宜決定することができるが、後述するＰｒｔＰ酵素活性の単位として、１Ｕｎｉｔ／ｍｌ以上となるように添加することが好ましい。加水分解の反応時間は、反応温度、乳タンパク質濃度、添加するＰｒｔＰ酵素の量等を考慮して適宜決定することができるが、例えば、ＰｒｔＰ酵素含有乳酸菌の生菌体等の添加量が後述するＰｒｔＰ酵素活性の単位として３．５Ｕｎｉｔ／ｍｌであり、反応温度が３０℃である場合には、５時間以上であることが好ましい。【００２９】
なお、本発明においては、加水分解により得られた乳タンパク質分解物は、反応後の反応液をそのまま用いてもよいが、反応後に加熱処理等により反応液中のＰｒｔＰ酵素を失活させておくことが好ましい。【００３０】
本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、上記のように製造された乳タンパク質分解物を有効成分とする。このように、乳由来成分を有効成分とするため、発酵乳等の乳由来原料でビフィズス菌を培養して製造される飲食品に対して、乳タンパク質以外のタンパク質アレルギーに配慮することなく用いることができる。【００３１】
本発明のビフィズス菌増殖促進剤中に含まれる本発明の乳タンパク質分解物量は、ビフィズス菌増殖促進効果が得られる量であれば特に限定されるものではないが、１０重量％以上であることが好ましく、１５重量％以上であることがより好ましく、２０重量％以上であることがさらに好ましく、４０重量％以上であることが特に好ましい。【００３２】
本発明のビフィズス菌増殖促進剤の剤型は特に限定されるものではなく、凍結乾燥品等の粉末剤であってもよく、錠剤であってもよく、液剤であってもよく、ペースト状であってもよい。また、本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、本発明の乳タンパク質分解物によるビフィズス菌増殖促進効果を阻害しない限り、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分として、例えば、澱粉や乳糖等の、一般的に添加される剤型補助剤や安定化剤等が挙げられる。その他、本発明の乳タンパク質分解物の他に、ビフィズス菌増殖促進作用を有する公知物質を添加してもよい。【００３３】
本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、具体的には、ビフィズス菌の培養培地に添加することにより、ビフィズス菌増殖促進効果を発揮することができる。培養培地に添加する量は、ビフィズス菌増殖促進効果が得られる量であれば特に限定されるものではなく、ビフィズス菌増殖促進剤中の乳タンパク質分解物量、ビフィズス菌の培養培地の組成、スターターであるビフィズス菌の接種量、ビフィズス菌の種類等を考慮して、適宜決定することができる。本発明のビフィズス菌増殖促進剤としては、例えば、ビフィズス菌の培養培地に対して、０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％となるように添加することが好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％となるように添加することが特に好ましい。【００３４】
本発明のビフィズス菌増殖促進剤が添加されるビフィズス菌の培養培地としては、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではなく、所望のビフィズス菌含有製品の種類等を考慮して適宜選択することができる。例えば、ビフィズス菌発酵乳を製造するために用いられる発酵用ベースとしては、発酵乳の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではない。該ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。【００３５】
なお、本発明のビフィズス菌増殖促進剤が添加されるビフィズス菌は、常法により前培養したものを用いることができる。ビフィズスの前培養に用いられる培養培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。【００３６】
本発明のビフィズス菌増殖促進剤の増殖対象菌は、ビフィズス菌であれば特に限定されるものではないが、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることが好ましい。本発明の乳タンパク質分解物による増殖促進効果が、より顕著に得られるためである。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株や、ビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株であることが好ましい。【００３７】
また、本発明のビフィズス菌増殖促進剤は、従来に無くビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを増殖させることができるため、本発明のビフィズス菌増殖促進剤を用いることにより、より整腸効果が高く、健康管理上も有用な、ビフィズス菌発酵乳等のビフィズス菌含有飲食品を製造することができる。【００３８】
以下、本発明の乳タンパク質分解物の製造方法及びビフィズス菌増殖促進作用について、さらに詳細に説明する。
１．ラクトコッカス・ラクチスの菌株のＰｒｔＰ酵素保有性の検出
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ（ＡＴＣＣ１９２５７Ｔ）株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７（ＮＣＤＯ  ４９７）株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株、及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株が、ＰｒｔＰ酵素を保有しているか否かを確認した。
具体的には、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）  Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、各菌株を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により菌体を得、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりＰｒｔＰ遺伝子の保有性を確認した。ＰＣＲは参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｉｅｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年、第１００巻、第１３０７〜１３１７ページ。）に記載の手法に準じて行った。プライマーは、フォワードプライマーＧＢｆ（ＧＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡ）及びリバースプライマーＧＢ２ｒ（ＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣ）のプライマーセット、もしくはフォワードプライマーＧＨｆ（ＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡ）及びリバースプライマーＧＨ２ｒ（ＴＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡ）のプライマーセットを用いた。【００３９】
図１はＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、染色により検出したバンドパターンを示した図である。図１中、「１」は分子量マーカーを流したレーンであり、「２」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株のＰＣＲ産物、「３」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のＰＣＲ産物、「４」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株のＰＣＲ産物、「５」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のＰＣＲ産物、「６」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株のＰＣＲ産物を、それぞれ流したレーンである。この結果、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株にはＰｒｔＰ遺伝子の保有が確認された。一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株では、のそれぞれの菌株には保有していないことが判明した。【００４０】
２．ＰｒｔＰ酵素活性の単位定義
まず、０．０２％のＦＴＣ−カゼインを含む３０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  バッファー（ｐＨ６．５）０．４ｍｌに、０．１ｍｌの市販タンパク分解酵素トリプシン溶液（Ｓｉｇｍａ社製、酵素活性１１，１００Ｕｎｉｔ／ｍｇ）を添加し、３０℃で１時間反応させた。５％のトリクロロ酢酸１．２ｍｌを添加し、ボルテックスで混合後、室温にて１５分静置した。１５０００×ｇ、５分の遠心分離した上清液０．３ｍｌを５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２ｍｌに混合し、蛍光強度を測定した。測定はＭＴＰ−８００ＡＦＣ／Ｌａｂマイクロプレートリーダ（コロナ電気株式会社製）を用い、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍの条件で行った。
一方、前記トリプシン溶液の代わりに、後述の方法で調製したＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスの生菌体、菌体破砕物又はＰｒｔＰ酵素画分を添加し、同様に分解反応を行った。その結果、上記１ユニットのトリプシンの分解により得られた蛍光強度の値を、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスの生菌体、菌体破砕物又はＰｒｔＰ酵素画分で分解した場合のＰｒｔＰ酵素活性の１酵素単位と定義した。【００４１】
３．乳タンパク質分解物の調製
まず、７０ｍＭのβ―グリセロリン酸２ナトリウムを含む１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、９５℃で３０分間殺菌し、前記各菌株のシードカルチャーを３％接種し、３０℃で１６時間培養した。この際、菌株の必要に応じて、培地中に０．５％のグルコース及び０．０５％の酵母エキスを添加した。その後、１％のクエン酸３ナトリウムと水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８に調整した後、遠心分離により菌体を得た。次に、菌体を１０ｍＭ塩化カルシウム含有３０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  バッファー（ｐＨ６．５）で２回洗浄後、同ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、１０倍濃縮した洗浄菌体（生菌体）を得た。また、菌体の一部に対して、９０℃で１０分の加熱処理を行った。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液に生菌体又は加熱処理菌体を１％添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の過熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した溶液は、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により５０分の１容量まで濃縮した。【００４２】
４．ビフィズス菌増殖促進活性の測定４−１  ビフィズス菌数の測定
トータルミルクプロテイン５％（Ｗ／Ｗ）、乳糖５％（Ｗ／Ｗ）を含む培地を９０℃で１０分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株の菌体によるカゼイン分解物を一定量添加し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャー０．１％を接種し、３７℃で１６時間培養した。培養後に、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）を用いて、段階希釈法によりビフィズス菌数を測定した。【００４３】
４−２  ｐＨ変動の測定
上記４−１の培養試験にて、ビフィズス菌の増殖に伴い、乳酸や酢酸を生成し、培地のｐＨを低下させることが知られている。このため、培地のｐＨの低下程度から、ビフィズス菌の増殖程度を判定することが出来る。ｐＨの測定はｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ社製）を用いて行った。なお、本発明の乳タンパク分解物によるビフィズス菌増殖促進活性は無添加の対照と比較して、ｐＨ低下の違いが０．３以上を基準に判断した。【００４４】
５．乳タンパク質分解物によるビフィズス菌への増殖促進作用
まず、後記実施例１記載の通り、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャーを調製した。
次に、トータルミルクプロテイン５％（Ｗ／Ｗ）、乳糖５％（Ｗ／Ｗ）を含む培地を９０℃で１０分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株の菌体によるカゼイン分解物を１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャー０．１％を接種し、３７℃で１６時間培養した。該培養液を急冷し、ビフィズス菌数及びｐＨを測定した。測定結果を表１に示す。【００４５】
【表１】
2009150888.tif 000002
【００４６】
無添加対照と比べて、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の生菌体によるカゼイン分解物添加では、ｐＨが５．０以下まで低下し、ビフィズス菌数が３×１０８ＣＦＵ／ｇ前後に達した。対して、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株、及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のそれぞれの生菌体によるカゼイン分解物添加では、ｐＨが５．５以上であり、ビフィズス菌数が５×１０7ＣＦＵ／ｇ以下で、菌体無処理の対照と大きく違わなかった。一方、加熱処理菌体によるカゼイン分解物ではビフィズス菌増殖促進活性が見られなかった。
すなわち、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスの生菌株による乳タンパク質分解物は、ビフィズス菌に対する増殖促進性を有していることが明らかである。
なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のカゼイン分解物に、より強いビフィズス菌増殖促進活性が見られたことから、以下、ＪＣＭ２０１０１株を用いて分解条件の検討を行った。【００４７】
６．他の市販酵素との比較
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体（ＰｒｔＰ酵素含有生菌体）を得た。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液にＰｒｔＰ酵素含有生菌体を、ＰｒｔＰ酵素単位として３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
一方、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液に上記生菌体の変わりに、市販タンパク分解酵素トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）を３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、同様に分解を行った。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。結果を表２に示す。市販タンパク分解酵素トリプシンと比較して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の生菌体によるカゼイン分解物は、強いビフィズス菌増殖促進活性を示した。【００４８】
【表２】
2009150888.tif 000003
【００４９】
７．乳タンパク質の分解時間の影響
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体（ＰｒｔＰ酵素含有生菌体）を得た。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液にＰｒｔＰ酵素含有生菌体を、ＰｒｔＰ酵素単位として３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で５〜２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。結果を表３に示す。分解５時間〜２４時間の範囲では、分解時間が長いほうがより強いビフィズス菌増殖促進活性が見られた。すなわち、本発明のＰｒｔＰ酵素活性３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌの場合には、分解５時間以上であれば強いビフィズス菌増殖促進作用が見られた。なお、ＰｒｔＰ酵素活性を強くした場合には、より短い分解時間でも充分なビフィズス菌増殖促進作用を有する分解物を得ることが出来た。【００５０】
【表３】
2009150888.tif 000004
【００５１】
８．乳タンパク質の分解温度の影響
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体（ＰｒｔＰ酵素含有生菌体）を得た。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液にＰｒｔＰ酵素含有生菌体を、ＰｒｔＰ酵素単位として３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら１０〜５０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。結果を表４に示す。分解温度５０℃未満において、ビフィズス菌増殖促進活性が観察された。１０℃〜４２℃ではビフィズス菌増殖促進活性が弱かったが、２０〜３７℃では強い活性が見られ、特に３０℃前後ではより強い活性が見られた。【００５２】
【表４】
2009150888.tif 000005
【００５３】
９．ＰｒｔＰ酵素活性依存性
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体（ＰｒｔＰ酵素含有生菌体）を得た。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液にＰｒｔＰ酵素含有生菌体を、ＰｒｔＰ酵素単位として０．０１〜１０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。
回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。結果を表５に示す。それぞれの分解物によるビフィズス菌増殖促進作用は、ＰｒｔＰ酵素活性に依存して強くなり、１Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ以上の酵素活性でより強いビフィズス菌増殖促進活性が見られた。【００５４】
【表５】
2009150888.tif 000006
【００５５】
１０．乳タンパク質分解時の基質濃度の影響
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体（ＰｒｔＰ酵素含有生菌体）を得た。
次に、１〜１０％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液にＰｒｔＰ酵素含有生菌体を、ＰｒｔＰ酵素単位として３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。結果を表６に示す。それぞれの分解物によるビフィズス菌増殖促進作用は、カゼインタンパク濃度０．５％以上でビフィズス菌増殖促進活性が見られ、特に１％以上の濃度でより強い活性が見られた。【００５６】
【表６】
2009150888.tif 000007
【００５７】
１１．乳タンパク質分解時のｐＨの影響
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体（ＰｒｔＰ酵素含有生菌体）を得た。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．０〜８．０）溶液にＰｒｔＰ酵素含有生菌体を、ＰｒｔＰ酵素単位として３．５Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。
回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により２０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。結果を表７に示す。ｐＨ６．０〜８．０の範囲ではビフィズス菌増殖促進活性が見られ、特にｐＨ６．５前後ではより強い活性が見られた。【００５８】
【表７】
2009150888.tif 000008
【００５９】
１２．ＰｒｔＰ酵素含有菌体破砕物による分解活性
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体を得た。続いて、この洗浄菌体を、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＦＩＥＲ  ４５０）を用いて１０分間以上の超音波破砕処理を行い、菌体を破砕した後、遠心分離（５０００×ｇ、１０分）により未破砕菌体を除き、菌体破砕物を得た。なお、菌体破砕物に生きている細胞が存在しないことは、顕微鏡観察及びコロニー培養で確認した。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液に菌体破砕物をＰｒｔＰ酵素単位として１Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で１６時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により５０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後の、培養後のビフィズス菌数及びｐＨを測定した。無添加の対照ではビフィズス菌が１．５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、ｐＨが６．１８であったのに対して、上記菌体破砕物によるカゼイン分解物添加では、ビフィズス菌が２．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ｐＨが５．３１まで低下した。これらの結果から、本発明の菌体破砕物が、ビフィズス菌に対する増殖促進性を有していることが明らかである。【００６０】
１３．ＰｒｔＰ酵素画分による分解活性
上記３記載の通りに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の洗浄菌体を得た。続いて、この洗浄菌体を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む３０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、３０℃で１０分間保持した。その後急冷し、４℃の遠心分離（８５００×ｇ、１０分）により遊離したＰｒｔＰ酵素を含む上清液を得た。このＰｒｔＰ酵素画分を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  バッファー（ｐＨ６．５）で一晩透析した後、凍結濃縮により５０分の１容量まで濃縮し、これをＰｒｔＰ酵素画分とした。
次に、１％カゼインを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．５）溶液に、このＰｒｔＰ酵素画分をＰｒｔＰ酵素単位として１Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で１６時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱処理を行い、塩酸でｐＨ４．６に調整し、遠心分離により上清液を回収した。回収した上清液は水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、凍結濃縮により５０分の１容量まで濃縮した。
得られたそれぞれのカゼイン分解物を、上記５記載の方法でビフィズス菌増殖促進テストを行い、培養後のｐＨを測定した。無添加の対照ではビフィズス菌が１．７５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、ｐＨが６．１７であったのに対して、上記ＰｒｔＰ酵素画分によるカゼイン分解物添加では、ビフィズス菌が３．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ｐＨが５．３４まで低下した。これらの結果から、本発明のＰｒｔＰ酵素画分が、ビフィズス菌に対する増殖促進性を有していることが明らかである。【００６１】
以上のように、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株の生菌体、菌体破砕物、及びＰｒｔＰ酵素画分による乳タンパク質分解物には、ビフィズス菌に対する増殖促進活性を有していることが明らかになった。また、その活性は、一般的な市販タンパク分解酵素による分解物より強いことが判明した。【００６２】
また、これらのＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスは、ダイアセチル及びアセトインを生成しないため、これらの乳酸菌を用いることにより、風味の良い発酵物を製造し得ることも期待できる。
さらに、高いビフィズス菌数を確保するために、ビフィズス菌スターターを、これらのＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスの生菌体、菌体破砕物、又はＰｒｔＰ酵素画分による乳タンパク質分解物を添加して発酵してもよい。
【実施例】
【００６３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６４】
［実施例１］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるカゼイン分解物の調製１
まず、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１００Ｌを、１２１℃で１５分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーを３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。続いて、遠心分離（８５００×ｇ、１０分間、４℃）によりＰｒｔＰ酵素含有生菌体を得た。
次に、１００Ｌの１０％カゼイン（フォンテラ社製）溶液に得られたＰｒｔＰ酵素含有生菌体を添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、凍結乾燥により１０．５ｋｇのカゼイン分解物を得た。【００６５】
［実施例２］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるカゼイン分解物の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーに代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のシードカルチャーを用いた以外は、実施例１と同様にしてカゼイン分解物１１ｋｇを得た。【００６６】
［実施例３］  ＰｒｔＰ酵素含有菌体破砕物によるカゼイン分解物の調製１
まず、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１００Ｌを、１２１℃で１５分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーを３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。続いて、遠心分離（８５００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を得た。次に、この菌体を３０分間の超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＦＩＥＲ  ４５０、１０分間破砕処理）により菌体を破砕した後、遠心分離（８５００×ｇ、１０分、４℃）により未破砕菌体を除き、凍結濃縮し、ＰｒｔＰ酵素含有菌体破砕物を得た。
次に、１００Ｌの１０％カゼイン（フォンテラ社製）溶液に得られたＰｒｔＰ酵素含有菌体破砕物を添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、凍結乾燥により１０ｋｇのカゼイン分解物を得た。【００６７】
［実施例４］  ＰｒｔＰ酵素含有菌体破砕物によるカゼイン分解物の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーに代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のシードカルチャーを用いた以外は、実施例３と同様にしてカゼイン分解物１０．１ｋｇを得た。【００６８】
［実施例５］  ＰｒｔＰ酵素画分によるカゼイン分解物の調製１
まず、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１００Ｌを、１２１℃で１５分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーを３Ｌ接種し、３０℃で１６時間培養した。続いて、遠心分離（８５００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を得た。
次に、この菌体を、５Ｌの１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む３０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、３０℃で１０分間保持した。その後急冷し、遠心分離（８５００×ｇ、１０分間、４℃）により遊離したＰｒｔＰ酵素を含む上清液を得た。この上清液を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含む３０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）で一晩透析し、凍結濃縮により２Ｌ容量まで濃縮し、ＰｒｔＰ酵素画分を得た。
次に、１００Ｌの１０％カゼイン（フォンテラ社製）溶液に得られたＰｒｔＰ酵素画分を添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間殺菌の過熱処理を行い、凍結乾燥により１０．１ｋｇのカゼイン分解物を得た。【００６９】
［実施例６］  ＰｒｔＰ酵素画分によるカゼイン分解物の調製２
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーに代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のシードカルチャーを用いた以外は、実施例５と同様にしてカゼイン分解物１０．１ｋｇを得た。【００７０】
［実施例７］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるカゼイン分解物によるビフィズス菌スターターの調製
まず、上記実施例１記載の方法に調製したカゼイン分解物を０．１％（Ｗ／Ｗ）となるように添加した１０％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳を含む培地１０００ｍＬを、９０℃で３０分間殺菌した。この殺菌済みの培地に、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で５時間培養し、カルチャーを得た。得られたカルチャーのｐＨは４．７で、ビフィズス菌数は１．２×１０９ＣＦＵ／ｇであった。【００７１】
［実施例８］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるカゼイン分解物による整腸剤の調製
乾燥殺菌した澱粉５９ｋｇ、砂糖４０ｋｇに、上記実施例２記載の方法に調製したカゼイン分解物１ｋｇを加えて、均一に混合し、整腸剤約１００ｋｇを得た。【００７２】
［実施例９］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるカゼイン分解物による飲料の調製
りんごジュース１００ｋｇに、上記実施例１記載の方法に調製したカゼイン分解物１ｋｇを加えて、１４０℃で２秒間殺菌し、ペットボトルに充填し、本発明の乳タンパク質分解物含有飲料を得た。この飲料は、ビフィズス菌増殖作用が期待できる飲料である。【００７３】
［実施例１０］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるカゼイン分解物による飼料の調製
脱脂粉乳１００ｋｇに、上記実施例２記載の方法に調製したカゼイン分解物１ｋｇを加えて、均一に混合し、本発明の乳タンパク質分解物含有飼料として約１００ｋｇを得た。【００７４】
［実施例１１］  ＰｒｔＰ酵素含有生菌体によるトータルミルクプロテイン分解物の調製
実施例１と同様にして、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６株のシードカルチャーに代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のシードカルチャーを用いて、ＰｒｔＰ酵素含有生菌体を得た。
次に、１００Ｌの１０％トータルミルクプロテイン（ミライ社製）溶液に、得られたＰｒｔＰ酵素含有生菌体を添加し、緩やかに撹拌しながら３０℃で２４時間保持した。反応後、９０℃で１０分間の加熱殺菌処理を行い、凍結乾燥により１０．２ｋｇのトータルミルクプロテイン分解物を得た。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の乳タンパク質分解物は、ビフィズス菌増殖促進活性を有するため、ビフィズス菌含有発酵乳等のビフィズス菌含有飲食品等の製造分野で利用が可能である。また、本発明の乳タンパク質分解物は、牛乳等の乳タンパク質を原料とするため、本発明の乳タンパク質分解物を用いることにより、乳製品のみでビフィズス菌含有製品の設計が可能となり有用であるため、特に乳製品の分野で利用が可能である。
【図１】
2009150888.tif 000009
【国際調査報告】
2009150888.tif 000010
2009150888.tif 000011
2009150888.tif 000012
2009150888.tif 000013
2009150888.tif 000014