(57)【要約】  本発明はＤＮＡ中のメチルシトシンを、迅速、簡便に、高感度で検出する方法を提供する。  本発明は塩基部分として式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を有する核酸類からなるメチルシトシン光連結剤（光応答性プローブ）を用いたメチルシトシンの検出方法に関する。
2009113303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶ：
【化２１】
2009113303.tif 000024
（ただし、式Ｉ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R2は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２２】
2009113303.tif 000025
（ただし、式ＩＩ中、R４及びR６は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R５は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２３】
2009113303.tif 000026
（ただし、式ＩＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R７及びR９は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R８は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２４】
2009113303.tif 000027
（ただし、式ＩＶ中、R10及びR12は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R11は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）。
【請求項２】
Ｒ２，Ｒ５，Ｒ８及びＲ１１が、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する炭化水素基である、請求項１に記載の核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）。
【請求項３】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類からなる、メチルシトシン光連結剤。
【請求項４】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類からなる、光応答性メチルシトシン検出剤。
【請求項５】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを光連結する方法。
【請求項６】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを検出する方法。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法。
【請求項８】
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基とが、隣接して配置される配列である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標識部位が、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識によって標識されている、請求項７〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１又は請求項２に記載の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光応答性プローブ（メチルシトシン光連結剤）を用いたメチルシトシンの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのメチル化は、ＤＮＡを構成する塩基のひとつ「シトシン」に対して生じる反応で、いつ・どの遺伝子からタンパク質を作るのかを制御し、タンパク質合成に必要なＲＮＡへの転写ステップを正しく調節している。このシトシンのメチル化（５−メチルシトシンの生成）は、遺伝子の塩基配列によらずに、例えば遺伝子の働きを不活性化する役割を果たすが、異常を起こすと発がんへ至ることも知られている。塩基配列ではなく後天的な作用によって形質発現の調節機構に影響を与えるという観点、すなわち、エピジェネティクスの観点から、シトシンのメチル化はおいて極めて重要な現象である。【０００３】
そのために、メチル化が発生するＤＮＡの位置や、その量は正常なのかを即時に計測することが必要である。特に、例えば、医療の現場においてＤＮＡメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められる。【０００４】
従来のメチルシトシン（５−メチルシトシン）の検出の方法としては、亜硫酸水素塩処埋による方法が知られている。この亜硫酸水素塩処埋による方法では、被験試料であるＤＮＡに対して亜硫酸水素塩処埋の後に、ＰＣＲ、シーケンシング操作を行い、これによってメチル化されたシトシンはシトシンとして検出され、メチル化されていないシトシンは、チミンとして検出される。このような亜硫酸水素塩処埋による検出は、例えば特許文献１（特表２００４−５１１２３５号公報）に開示されている。しかし、このような亜硫酸水素塩処理は、長時間の加熱反応が必要で、大半のゲノムサンプルで非特異的損傷が生じ、これによるエラー（誤検出）も発生するという欠点があった。【０００５】
従来のメチルシトシンの検出の方法としては、亜硫酸水素塩処埋による方法の他に、メチルシトシン感受性の制限酵素と非感受性の制限酵素を使用する方法（ＭＩＡＭＩ法）が知られている。この方法では、メチルシトシン感受性の制限酵素と非感受性の制限酵素を使い分け、さらにＰＣＲ等を用いて検出を行う。しかし、酵素反応を使用するために、検出操作は煩雑であり、検出までに数日の時間を要するという欠点があった。
【特許文献１】特表２００４−５１１２３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、ＤＮＡ中のメチル化されたシトシン（メチルシトシン）を、メチル化されていないシトシンから区別して、検出する方法として知られる従来の方法は、迅速、簡便、高感度の点で十分ではなく、ＤＮＡ中のメチルシトシンを、迅速、簡便に、高感度で検出する方法が求められていた。【０００７】
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ中のメチルシトシンを、迅速、簡便に、高感度で検出する方法を提供することにある。【０００８】
さらに、本発明の目的は、迅速、簡便、高感度なメチルシトシン検出法に使用可能な化合物（検出用プローブ、検出剤）を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ＤＮＡ中のメチル化されたシトシン（メチルシトシン）を、メチル化されていないシトシンから区別して検出する方法を、鋭意研究してきたところ、塩基部分として後述する式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を有する核酸類が、疎水性基に結合したビニル基によって、ＤＮＡ中のメチル化されたシトシン（メチルシトシン）に対して、高い選択性をもって光連結すること、この性質を利用することによって、メチル化されたシトシン（メチルシトシン）を、メチル化されていないシトシンから区別して検出することができることを見出して、本発明に到達した。【００１０】
従って、本発明は、次の［１］〜［１０］にある。
［１］
塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶ：
【化１】
2009113303.tif 000003
（ただし、式Ｉ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R2は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２】
2009113303.tif 000004
（ただし、式ＩＩ中、R４及びR６は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R５は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化３】
2009113303.tif 000005
（ただし、式ＩＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R７及びR９は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R８は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化４】
2009113303.tif 000006
（ただし、式ＩＶ中、R10及びR12は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R11は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）。
［２］
Ｒ２，Ｒ５，Ｒ８及びＲ１１が、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する炭化水素基である、［１］に記載の核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）。
［３］
［１］〜［２］の何れかに記載の核酸類からなる、メチルシトシン光連結剤。
［４］
［１］〜［２］の何れかに記載の核酸類からなる、光応答性メチルシトシン検出剤。
［５］
［１］〜［２］の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを光連結する方法。
［６］
［１］〜［２］の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを検出する方法。
［７］
［１］又は［２］に記載の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法。
［８］
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基とが、隣接して配置される配列である、［７］に記載の方法。
［９］
標識部位が、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識によって標識されている、［７］〜［８］の何れかに記載の方法。
［１０］
［１］又は［２］に記載の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＤＮＡ中のメチル化されたシトシン（メチルシトシン）を、メチル化されていないシトシンから区別して、迅速、簡便に、高感度で検出することができる。本発明においては、メチルシトシンの検出は、選択的な光連結によって行われるために、連結に必要な操作は光の照射という簡便な操作で行うことができ、従来の亜硫酸水素塩処理や制限酵素処理のような複雑な操作は必要ない。また、本発明においては、メチルシトシンの検出は、選択的な光連結によって行われるために、連結は極めて迅速な光化学反応によって行われ、従来の亜硫酸水素塩処理や制限酵素処理による方法よりも、極めて短時間で検出を行うことができる。本発明によれば、ゲノムサンプルには非特異的損傷が生じることはなく、これによるエラー（誤検出）も発生することがない。【００１２】
本発明による光連結は、可逆的な光連結である。本発明による光連結によって生じた共有結合は、光連結に使用した波長とは異なる波長の光照射を行うことによって、光開裂をすることができる。このために、メチルシトシンの検出のために光連結されたＤＮＡは、所定の部位のシトシンについて、メチル化の有無の検出を行った後に、光開裂をさせることによって、再び遊離させることができる。すなわち、本発明によれば、検出の前後で、被験試料のＤＮＡに全く損傷を与えることなく、メチルシトシンの検出を行うことが可能である。本発明は、このような非破壊的なメチルシトシン検出を初めて可能にするものである。【００１３】
本発明によれば、被験試料のＤＮＡに全く損傷を与えることなく、所定の部位のシトシンについて、メチル化の有無を検出することができるために、同じ分子を反復して使用して、さらに別な部位のシトシンについても、メチル化の有無を検出することが可能である。すなわち、本発明によれば、わずか１分子のＤＮＡがあれば、それを破壊することなく反復して使用して、分子全体にわたってシトシンのメチル化の有無を検出することが可能であるために、極めて高感度の検出が可能である。また、従来のメチルシトシン検出法では、複数の部位のシトシンについてのメチル化の有無の情報を、同種のＤＮＡ分子の集合体についての情報として得ることができるだけである。しかし、本発明によれば、複数の部位のシトシンについてのメチル化の有無の情報を、ある１分子のＤＮＡについての情報として得ることができる。すなわち、本発明は、ある１分子のＤＮＡにおいて、複数の部位のシトシンについてのメチル化の有無の情報を得ることを、初めて可能にするものである。【００１４】
本発明によるメチルシトシンの検出は、迅速、簡便、高感度なものであるために、医療の現場において使用される場合も、その利用の価値は極めて高い。本発明によるメチルシトシンの検出は、迅速な点から日帰りの検診にも適し、簡便な点は広範な医療施設での実施を可能とし、高感度な点は被験試料を提供する患者の身体的な負担を極めて低減する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は本発明に係る光連結性核酸類のシトシン（Ｃ）及びメチルシトシン（ｍＣ）との光連結の選択性を蛍光強度の測定によって示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示される実施の形態に限定されるものではない。【００１７】
本発明によれば、
塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶ：
【化５】
2009113303.tif 000007
（ただし、式Ｉ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R2は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化６】
2009113303.tif 000008
（ただし、式ＩＩ中、R４及びR６は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R５は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化７】
2009113303.tif 000009
（ただし、式ＩＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R７及びR９は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R８は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化８】
2009113303.tif 000010
（ただし、式ＩＶ中、R10及びR12は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
R11は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）を、メチルシトシン光連結剤として使用して、メチルシトシンを光連結することにより、メチルシトシンを検出することができる。すなわち、上記塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）を、光応答性メチルシトシン検出剤として使用することができる。【００１８】
Ｒ２，Ｒ５，Ｒ８及びＲ１１は、水素原子、又はＣ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基である。このように、疎水性基をビニル基に結合することによって、シトシンがメチル化された場合に、高い選択性をもって光連結することを可能にしたものである。従って、疎水性基は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基であればよく、疎水性基は炭化水素基に限られず、例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子を含む基であってもよく、環構造を形成していてもよく、飽和又は不飽和の基とすることができる。【００１９】
本発明の好適な実施の態様において、Ｒ２，Ｒ５，Ｒ８及びＲ１１は、Ｃ１〜Ｃ１２、好ましくはＣ１〜Ｃ１０、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ８、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ３〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ４〜Ｃ６の炭素数を有する炭化水素基とすることができる。炭化水素基は、直鎖であってもよく、分岐を有していてもよく、環構造を形成していてもよい。炭化水素基は、飽和又は不飽和の炭化水素基とすることができる。好適に使用可能な不飽和の炭化水素基としては、例えば、メチル基（メタン−１−イル）、エチル基（エタン−１−イル）、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、ペンタン−１−イル、ペンタン−２−イル、ペンタン−３−イル、メチルプロパン−１−イル、メチルプロパン−２−イル、２−メチルブタン−１−イル、２−メチルブタン−２−イル、２−メチルブタン−３−イル、２−メチルブタン−４−イル、ヘキサン−１−イル、ヘキサン−２−イル、ヘキサン−３−イル、２−メチルペンタン−１−イル、２−メチルペンタン−２−イル、２−メチルペンタン−３−イル、２−メチルペンタン−４−イル、２−メチルペンタン−５−イル、３−メチルペンタン−１−イル、３−メチルペンタン−２−イル、３−メチルペンタン−３−イル、２，２−ジメチルブタン−１−イル、２，２−ジメチルブタン−３−イル、２，２−ジメチルブタン−４−イル、２，３−ジメチルブタン−１−イル、２，３−ジメチルブタン−２−イル等を挙げることができる。好適に使用可能な環状の飽和又は不飽和の炭化水素基としては、例えば、シクロヘキサン−１−イル、シクロヘキセン−１−イル、シクロヘキセン−３−イル、シクロヘキセン−４−イル、フェニル等を挙げることができる。【００２０】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基である。好適なアルキル基としては、一般にＣ１〜Ｃ８、好ましくはＣ１〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ３、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ２、さらに好ましくはＣ１の炭素数を有するアルキル基を挙げることができる。好適なアルコキシ基としては、一般にＣ１〜Ｃ８、好ましくはＣ１〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ３、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ２、さらに好ましくはＣ１の炭素数を有するアルコキシ基を挙げることができる。好適なアシル基としては、一般にＣ１〜Ｃ８、好ましくはＣ１〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ３、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ２、さらに好ましくはＣ１の炭素数を有するアシル基を挙げることができる。【００２１】
特に好適な実施の態様において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、シアノ基、アセチル基であり、好ましくは、水素、メチル基、メトキシ基、又はシアノ基である。【００２２】
本発明における核酸類とは、核酸及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み、さらにモノヌクレオチドを含む。モノヌクレオチドには、リボヌクレオチドのモノヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのモノヌクレオチドが含まれる。核酸としては、天然の核酸であるＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、さらに、非天然（人工）の核酸であるＬＮＡ（ＢＮＡ）等の修飾核酸が含まれる。【００２３】
本発明によるメチルシトシンの検出は、次の工程：
の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法によって、行うことができる。【００２４】
このような方法を行うことによって、ＤＮＡ中のメチル化されたシトシン（メチルシトシン）を、メチル化されていないシトシンから区別して、迅速、簡便に、高感度で検出することができる。【００２５】
本発明の好適な実施の態様において、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基とが、隣接して配置される配列であることが好ましい。【００２６】
このような好適な実施の１態様が、後述する式（２）の流れに図示されている。式（２）の左図では、
式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸、が用意されて、これらがハイブリッド形成（ハイブリダイズ）可能な条件下におかれることによって、ハイブリッド形成（ハイブリダイズ）している。【００２７】
式（２）の左図において、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を有する塩基は、Ｘと図示されている。Ｘを５’末端に有する核酸は、そのもう一方の末端を、担体に固定されている。固定は、必ずしも図示された末端で行う必要はなく、配列の途中を介して、行うこともできる。担体との結合は、ハイブリダイズの効率の向上のために、適切な長さのリンカーを介して行ってもよい。リンカーは、核酸類であってもよいが、その他の高分子であってもよい。リンカーと担体との結合には、公知の手段を使用することができる。担体は、好ましくはガラス基板やプラスチック基板である。蛍光測定装置での測定に適した光透過性のプレートに適切な間隔で多数の核酸をスポットして固定して使用することができ、あるいは蛍光測定装置での測定に適した光透過性の多数のウェルを備えたプレートを使用することもできる。【００２８】
式（２）の左図において、メチル化の有無を検出したい標的（ｔａｒｇｅｔ）となる部位のシトシンは、メチルシトシン（ｍＣ）又はシトシン（Ｃ）の何れかであり、Ｙと図示されている。本発明によってメチルシトシンが検出される場合には、Ｙがメチルシトシンである。Ｙをその配列の中に有している核酸が、被験核酸である。【００２９】
式（２）の左図において、鋳型核酸（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は、Ｘを末端に有する核酸の一部と、Ｙを配列中に有する被験核酸の一部と、ハイブリッド形成（ハイブリダイズ）可能な相補的な配列を有している。この配列の詳細は、表１に示されている。式（２）においては、鋳型核酸とハイブリッド形成することによって、Ｘを末端に有する核酸のＸと、被験核酸のＹとは、隣接して配置されている。鋳型核酸の役割は、このようにＸとＹとを隣接して配置することにあるので、鋳型核酸の配列は、そのような配置を可能とする配列であればどのようなものであってもよい。そのような隣接配置を可能とする限りにおいて、鋳型核酸の配列は、Ｘを末端に有する核酸の一部と相補的であってもよく、全部と相補的であってもよい。また、そのような隣接配置を可能とする限りにおいて、鋳型核酸の配列は、被験核酸のどの一部と相補的であってもよく、全部と相補的であってもよい。【００３０】
式（２）の左図にあるように、ＸとＹと隣接して配置された後に、光照射を行って、被験核酸のＹを、固定化された核酸又はペプチド核酸のＸと、光連結する。この光連結は、光反応によって行われるために、迅速であると同時に、意図しない副反応や非特異的な反応の心配もなく、クリーンであり、さらに、酵素反応を行う場合のような反応条件の精妙な維持は必要ない。【００３１】
光連結のために照射される光は、一般に３３０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３５０〜３８０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３５０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光である。【００３２】
式（２）の左図から中央図への流れにおいて、３６６ｎｍでの光照射に続けて、ハイブリダイズしていた鋳型核酸を、洗浄によって解離して除去する工程が示されている。解離と除去のための洗浄の条件は、このようなハイブリッド解離に通常使用可能な条件で行うことができる。ただし、被験核酸は、ＸとＹとの光連結によって、Ｘを末端に有する核酸を介して担体に共有結合的に固定されているので、鋳型核酸の解離と除去のための洗浄の条件は、通常使用される条件よりも、極めて強い条件で行うことができる。このような条件として、例えば、７０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜１００℃、さらに好ましくは８５℃〜１００℃以上、さらに好ましくは９０℃〜１００℃、さらに好ましくは９５℃〜１００℃、さらに好ましくは９８℃〜１００℃の範囲の温度の水又は水溶液での洗浄を挙げることができ、あるいは例えば大気圧での煮沸による洗浄を挙げることができ、このような温度の水又は水溶液で、例えば、１０秒〜１５分、好ましくは３０秒〜１０分の時間の洗浄を挙げることができる。このように強い条件の洗浄によって、鋳型核酸の解離と除去を行うことにより、検出のノイズを極めて低減することができる。【００３３】
ＸとＹとの光連結によって、被験核酸は、Ｘを末端に有する核酸を介して担体に共有結合的に固定されている。そのため、ハイブリッド形成が解かれて、鋳型核酸が解離して除去された後も、被験核酸は、担体に固定されたままとなっている。この様子が、式（２）の中央図に示されている。【００３４】
式（２）の中央図から右図への流れにおいて、固定化された核酸に連結した被験核酸と、被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸であって標識部位を有する標識核酸（ＯＤＮ（Ｃｙ３））とを、ハイブリダイズする工程が、示されている。ハイブリッド形成（ハイブリダイズ）は、通常使用される条件を使用することができる。ＯＤＮ（Ｃｙ３）は、被験核酸にハイブリダイズ可能な配列を有しており、その配列の一例が表１に示されている。【００３５】
式（２）の右図は、被験核酸が、ＸとＹとの光連結によってＸを末端に有する核酸を介して担体に共有結合的に固定され、さらに標識核酸（ＯＤＮ（Ｃｙ３））とハイブリッド形成している様子を示している。【００３６】
式（２）の右図に示されているＯＤＮ（Ｃｙ３）は、その標識部位として蛍光標識であるＣｙ３を有している。標識核酸の標識部位に使用可能な標識は、公知の標識を使用することができ、例えば、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識を使用することができ、これらの標識の検出は、それぞれ公知の手段によって行うことができる。【００３７】
式（２）の右図において、最終的に標識核酸の標識が検出されることによって、式（２）の左図において隣接して配置されていたＹとＸとが、光連結していたことが検出される。このようなＸとの光連結は、Ｙがメチルシトシン（ｍＣ）である場合に、高い選択性をもって生じるために、標識核酸の標識の検出される強度によって、被験核酸の中のＹがメチル化されたシトシンであることを、検出することができる。【００３８】
式（２）の右図のような状態で、Ｙのメチルシトシンが検出された被験核酸は、ＹがＸと光連結している他は、式（２）の左図の状態と比べて、特段の化学修飾等を受けてはいない。そして、本発明における光連結は、光照射によって光連結した後に、光連結時とは異なる波長の光を照射することによって、光開裂をすることができる。【００３９】
光開裂のために照射される光は、一般に３００〜３２０ｎｍの範囲、好ましくは３０５〜３１５の範囲、さらに好ましくは３１２ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３１２ｎｍの単波長のレーザー光である。【００４０】
光連結及び光開裂は、光反応を利用しているために、ｐＨ、温度、塩濃度などに特段の制約がなく、核酸類等の生体高分子が安定に存在可能なｐＨ、温度、塩濃度とした溶液中で、光照射によって行うことができる。【００４１】
メチルシトシンの検出に使用された被験核酸は、光連結した部分を光開裂することによって、何ら修飾や損傷を受けることなく回収することができる。これによって回収された被験核酸は、別な部位のメチルシトシンの検出のために、本発明に係る検出方法の被験試料として再び使用することができ、あるいはメチル化部位が特定された核酸として、別な用途の出発材料として使用することもできる。【００４２】
光連結した部分を光開裂することによって被験核酸を回収した場合には、固定化された核酸（Ｘを５’末端に有する核酸）もまた、何ら修飾や損傷を受けることなく、担体に固定された状態で回収することができ、このように回収した、固定化された核酸は、本発明に係る検出方法のために、再び使用することができる。【００４３】
このように、本発明に係る核酸類は、可逆的な光連結を可能とし、可逆的な光連結剤、可逆的な光応答性メチルシトシン検出剤として使用することができるものであるので、本発明に係る検出方法は、検出のための試薬や被験試料を、その原理において、いずれも再利用して使用できるという極めて有利な特徴を持っている。このために、本発明は、環境負荷が少なく、省資源、省エネルギーであり、また、被験試料を再利用できることから、極めて高感度の方法となっている。【００４４】
また、本発明は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キットにもある。【００４５】
本発明に係るキットは、本発明に係る検出方法の実施に好適に使用できるものである。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示される実施例に限定されるものではない。【００４７】
［メチルシトシン検出の為の光応答性核酸合成］
次の式（１）の流れに従いメチルシトシン検出に用いる光応答性核酸の合成を行った。【００４８】
式（１）
【化９】
2009113303.tif 000011
【００４９】
化合物２ａ
【化１０】
2009113303.tif 000012
【００５０】
［５−ヘプテン−２’−デオキシウリジン（ＨＵ）（２ａ）合成］
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１）（500 mg、1.41 mmol）をＤＭＦ（2.5 ml）とジオキサン（2.5 ml）に溶かし込み、そこヘパラジウムアセテート（31 mg、 0.14 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（340μl、1.41 mmol）、１−ヘプテン（5 ml、3.53 mmol)を加えマイクロウェーブによる加熱で１００℃、２０分間の反応を行った。反応後のサンプルはＴＬＣ(ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１)で原料が９割以上減少を確認し、シリカゲルカラムを用いて、展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１にして精製した。ＨＵは445 mg、 1.36 mmolで収率は９７％であった。1H NMRにて目的化合物を測定し同定した。またMALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した。(calcd. for C16H25N2O5 [M+H]+ 325.179, found 325.801)
1H NMR (CDCl3): 7.59 (s, 1H, H-C(6)); 6.29-6.13 (m, 2H, vinylic H, H-C(1')); 6.00 (d，1H, J=16.5 vinylic H); 4.58 (m, 1H, H-C(3')); 4.03 (m, 1H, H-C(4')); 3.90-3.80 (m, 2H, H-C(5')); 2.38 (m, 2H, H-C(2')); 1.95-0.84 (m, 11H, CH3(CH2)2).
【００５１】
化合物３ａ
【化１１】
2009113303.tif 000013
【００５２】
［５−ヘプテン−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（３ａ）合成］
化合物（２ａ）(340 mg、1.05 mmol)を脱水ピリジンで３回共沸した。そこへ脱水ピリジン（2.0 ml）を加え１時間脱気した４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（427 mg、1.26 mmol）を加え、続けてＤＭＡＰ（38 mg、0.31 mmol）を添加した。最後に、トリエチルアミン（170μl、1.26 mmol）を加えて室温で１３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９５：５）で生成物を確認した後シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９８：２から９５：５に変化させて精製し薄黄色い固体の目的化合物（３ａ）（304 mg、0.49 mmol、収率４６％）を得た。1H NMRにて目的化合物を測定し固定した。また、 MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した。(calcd. for C37H43N2O7 [M+H]+ 627.306, found 627.455)
1H NMR (CDCl3): 8.46 (br.s, 1H, NH); 7.63 (s, 1H, H-C(6)); 7.49-7.23 (m, 8H,
arom. H); 6.87-6.82 (m, 5H, arom. H); 6.45-6.16 (m, 3H, H-C(l'), vinylic H); 4.56 (m，1H, H-C(3')); 4.09-4.04 (m, 1H, H-C(4')); 3.76 (s, 6H, OMe); 3.53-3.33 (m, 2H, H-C(5')); 2.44-2.20 (m, 2H, H-C(2')); 1.79-1.63 (m, 11H, CH3(CH2)2).
【００５３】
化合物４ａ
【化１２】
2009113303.tif 000014
【００５４】
［５−ヘプテン−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジンホスホアミダイト（４ａ）合成］
アセトニトリル（0.5 mL）で共沸した化合物（３ａ）（233 mg、0.37 mmol）にアセトニトリル（1.5 ml）を加えた。反応溶液に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト（120μL、0.38 mmol）と０．４５Ｍ テトラゾールのアセトニトリル溶液（910μL、0.41 mmol）を加えて、反応溶液を室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで３回抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳ０４で乾燥し、溶媒を除去した。ゴムシールドボトルにアセトニトリルで移し３回共沸し、目的化合物（４ａ）（収量320 mg、0.39 mmol, quant)を得た。 MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C46H60N4O8P [M+H]+ 827.414, found 827.731)。
【００５５】
化合物２ｂ
【化１３】
2009113303.tif 000015
【００５６】
［５−シクロヘキシルビニル−２’−デオキシウリジン（ＨＶＵ）（２ｂ）合成］
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１）（505 mg、1.42 mmol）をＤＭＦ（2.5 mL）とジオキサン（2.5 mL）に溶かし込み、そこヘパラジウムアセテート（33 mg、0.14 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（340μl、1.41 mmol）、ビニルシクロヘキサン（2.0 mL、14.1 mmol）を加えマイクロウェーブによる加熱で１００℃、２０分間の反応を行った。原料の消失をＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１）にて確認した。その後、シリカゲルカラムを用いて、展開溶媒をＣＨＣｌ３:ＭｅＯＨ＝９：１にして精製した。（２ｂ）は400 mg、1.19 mmolで収率は８４％であった。1H NMRにて目的化合物を測定し同定した。またMALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C17H25N2O5 [M+H]+ 337.176, found 337.156)。
1H NMR (CDCl3): 7.62 (s, 1H, H-C(6)); 6.36-6.28 (m, 1H, vinylic H); 6.21-6.13 (m, 2H, vinylic H, H-C(1')); 6.03 (d, 1H, J=16.2, vinylic H); 4.61 (m, 1H, H-C(3')); 4.04 (m, 1H, H-C(4')); 3.97-3.81 (m, 2H, H-C(5')); 2.51-2.33 (m, 2H, H-C(2')); 2.14-1.06 (m，11H, C6H11).
【００５７】
化合物３ｂ
【化１４】
2009113303.tif 000016
【００５８】
［５−シクロヘキシルビニル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（３ｂ）合成］
化合物（２ｂ）（320 mg、0.95 mmol）を脱水ピリジンで３回共沸した。そこへ脱水ピリジン（1.5 mL）を加え、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（380 mg、1.12 mmol）を加え、続けてＤＭＡＰ（41 mg、0.34 mmol）を添加した。最後に、トリエチルアミン（160μl、1.14 mmol）を加えて室温で２１時間撹拌した。ＴＬＣ(ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１)で生成物を確認した後、シリカゲルカラムにて、展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９８：２から９５：５に変化させて精製し薄黄色い固体の目的化合物（３ｂ）（329 mg、0.52 mmol、収率５４％）を得た。1H NMRにて目的化合物を測定し同定した。また、MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C38H43N2O7 [M+H]+ 639.306, found 639.496)。
1H NMR (CDCl3): 8.17 (br. s, 1h, NH); 7.68 (s, 1H, H-C(6)); 7.44-7.22 (m, 8H, arom. H); 6.82 (m, 6H, arom. H, vinylic H); 6.42-6.19 (m, 2H, vinylic H, H-C(1')); 4.54(m, 1H, H-C(3')); 4.04(m, 1H, H-C(4')); 3.79 (s, 6H, OMe) 3.50 (dd, 1H, J=10.5, 3.0, H-C(5')); 2.99 (dd, 1H, J=10.5, 3.0, H-C(5'); 2.42-2.26 (m, 2H, H-C(2')); 1.99-1.22 (m, 11H, C6H11).
【００５９】
化合物４ｂ
【化１５】
2009113303.tif 000017
【００６０】
［５−シクロヘキシルビニル−２’−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジンホスホアミダイト（４ｂ）合成］
アセトニトリル（0.5 mL）で共沸した化合物（３ｂ）（320 mg、0.50 mmol）にアセトニトリル（2.5 ml）を加えた。反応溶液に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト（160μL、0.50 mmol）と０．４５Ｍ テトラゾールのアセトニトリル溶液（1.2 mL、0.55 mmol）を加えて、反応溶液を室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで３回抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳ０４で乾燥し、溶媒を除去した。ゴムシールドボトルにアセトニトリルで移し３回共沸し、目的化合物（４ｂ）（収量432 mg、0.51 mmol、quant.)を得た。MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した（calcd. for C47H60N4O8P [M+H]+ 839.414, found 839.330)。
【００６１】
化合物２ｃ
【化１６】
2009113303.tif 000018
【００６２】
［５−ｔｅｒｔ−ブチルビニル−２’−デオキシウリジン（ＢｕＶＵ)（２Ｃ）合成）
５−ヨードデオキシウリジン（１）（0.5 g、1.41 mmol）をＤＭＦ（2.5 mL）とジオキサン（2.5 mL）に溶かし込み、そこヘパラジウムアセテート（32.0 mg、 0.14 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（340μl、1.41 mmol）、３，３−ジメチル−１−ブテン（5.5 mL、42.3 mmol）を加えマイクロウェーブによる加熱で１００℃で１５分間、反応を行った。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１）にて原料６割以上の消失を確認し、反応を終了した。その後、さらに、この操作をもう一度行い、合成した後に、シリカゲルカラムを用いて、展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１にして精製した。目的化合物（２ｃ）（271 mg、0.87 mmol、 収率３１％）を得た。1H NMRにて目的化合物を固定した。また、MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した（calcd. for C15H23N2O5 [M+H]+ 311.160, found 311.355）。
1H NMR (DMSO): 8.03 (s, 1H, H-C(6)); 6.44 (d, 1H, J=16.5, vinylic H); 6.17 (t, 1H, J=6.6, H-C(1')); 5.96(d, 1H, J=16.5, vinylic H); 5.24 (m, 1H, 3'-0H); 5.13 (t, 1H, J=5.0, 5'-0H); 4.25 (m, 1H, H-C(3')); 3.78 (m, 1H, H-C(4')); 3.65-3.54 (m, 2H, H-C(5')); 2.12 (m, 2H, H-C(2')); 1.59-1.49 (m, 2H, (CH3)3C); 1.40-1.24(m, 2H, (CH3)3C); 1.04(m, 5H, (CH3)3C).
【００６３】
化合物３ｃ
【化１７】
2009113303.tif 000019
【００６４】
［５−ｔｅｒｔ−ブチルビニル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（３ｃ）合成］
化合物（２ｃ）（497 mg、1.60 mmol）を脱水ピリジンで３回共沸した。そこへ脱水ピリジン（2.0 ml）を加え４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（666 mg、 1.97 mmol）を加え、続けてＤＭＡＰ（67 mg、0.55 mmol）を添加した。最後に、トリエチルアミン（270μl、1.92 mmol）を加えて室温で１９時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９：１）で生成物を確認した後シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９７：３から９５：５に変化させて精製し薄黄色い固体の目的化合物（３ｃ）（601 mg、0.98 mmol、収率６１％）を得た。1H NMRにて目的化合物を同定した。MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C36H41N2O7 [M+H]+ 613.291, found 613.699)。
1H NMR (DMSO): 11.5(br. s, 1H, NH); 8.32 (s, 1H, H-C(6)); 7.43-7.22 (m, 8H, arom. H)； 6.89-6.85 (m, 5H, arom. H); 6.41 (d, 1H, J=16.2, vinylic H); 6.23 (t, 1H, J=6.3, H-C(1')); 5.72 (d, 1H, J=16.2, vinylic H); 5.32 (t, 1H, J=4.5, 3'-0H); 4.26 (m, 1H, H-C(3')); 3.91(m, 1H, H-C(4')); 3.73 (s, 6H, OMe); 3.27-3.11 (m, 2H, H-C(5')); 2.35-2.25 (m, 1H, H-C(2')); 2.21-2.13 (m, 1H, H-C(2')); 0.90-0.76 (m, 9H, (CH3)3C).【００６５】
化合物４ｃ
【化１８】
2009113303.tif 000020
【００６６】
［５−ｔｅｒｔ−ブチルビニル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル)ウリジンホスホアミダイト（４ｃ）合成］
アセトニトリル（0.5 mL）で共沸した化合物（３ｂ）（186 mg、0.25 mmol）にアセトニトリル（1.5 ml）を加えた。反応溶液に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト（80μL、0.25 mmol）と０．４５Ｍテトラゾールのアセトニトリル溶液（600μL、0.27 mmol）を加えて、反応溶液を室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで３回抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳ０４で乾燥し、溶媒を除去した。ゴムシールドボトルにアセトニトリルで移し３回共沸し、目的化合物（４ｂ）（収量197 mg、0.24 mmol、収率９９％）を得た。MALDI-TOF MSにて質量分析を行い目的化合物である事を同定した(calcd. for C45H58N4O8P [M+H]+ 813.399, found 814.770)。
【００６７】
［ＤＮＡ合成］
式（１）の流れによる合成で得られた光応答性核酸をABI 3400 DNA 合成機を用いて1μmolスケールで合成した。２８％アンモニア水溶液によるＣＰＧの切り出し後、５５℃で８時間インキュベートして脱保護を行い、speed vacにてアンモニアを除去した。凍結乾燥後、ＨＰＬＣにより精製を行いＯＤＮ（ＨＵ）、ＯＤＮ（ＨＶＵ）、ＯＤＮ（ＢｕＶＵ)を得た。その後、質量分析をMALDI-TOF-MSにて行った。【００６８】
ODN(HU):5'-HUGACGTGTATCGCATTGGSSSS-NH2-3'
ODN(HVU):5'-HVUGACGTGTATCGCATTGGSSSS-NH2-3'
ODN(BuVU):5'-BuVUGACGTGTATCGCATTGGSSSS-NH2-3'【００６９】
ただし、上記配列中のＳＳＳＳは、次の構造の単量体Ｓがリン酸基側を５’末端側に向けてリン酸エステル結合してなる鎖状構造（リンカー）を示す。【００７０】
【化１９】
2009113303.tif 000021
【００７１】
calcd. for ODN(HU):[(M+H)+] 7185.08, found 7184.36.
calcd. for ODN(HVU):[(M+H)+] 7197.09, found 7197.59.
calcd. for ODN(BuVU):[(M+H)+] 7171.05, found 7171.20.
【００７２】
［メチルシトシン検出］
次の表１に示した配列を用いて、ガラス基板上でのメチルシトシン検出を、以下の式（２）の流れに従って行った。【００７３】
【表１】
2009113303.tif 000022
【００７４】
式（２）
【化２０】
2009113303.tif 000023
【００７５】
（１）光応答性プローブの固定化
２μＭ ＯＤＮ（ＨＵ）、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌになる水溶液を調整した。ＯＤＮ（ＨＶＵ）、ＯＤＮ（ＢｕＶＵ)に関しても、それぞれ同様の水溶液を調整した。これらをガラス基板上に２．０μＬずつスポットし、基板上に固定化する為に１６時開静置した。固定終了後に、室温で、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液で２回洗浄し、その後さらに超純水で２回洗浄した。室温で乾燥させたガラス基板上にＮａＢＨ４（3.75 mg）をＰＢＳ（リン酸緩衝サリン溶液：ｐＨ７．２）（1.5 mL）、エタノール（375μＬ）に溶かした溶液を全面に滴下して５分開静置した。その後に超純水で洗浄し、９８℃の熱水で３分間煮沸し、煮沸後、室温で乾燥させた。【００７６】
（２）ガラス基板上での光連結反応
１０μＭ target(C)、10μＭ template、５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌになる水溶液を調整し、（１）で作製したガラス基板上の光応答性プローブを固定化した位置に４．０μＬずつスポットした。target(mC)に関しても同様の水溶液を調整して４．０μＬずつスポットした。このガラス基板を０℃の条件下でトランスイルミネーターを用いて３６６ｎｍの光照射を１時間行った。光照射後に９８℃の熱水で５分間煮沸して、未反応のtarget(C)、target(mC)とtemplateを洗い流した。【００７７】
（３）ＯＤＮ（Ｃｙ３）による蛍光検出
５μＭ ＯＤＮ（Ｃｙ３）、１０μＭ template、５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌになる水溶液を調整した。この水溶液を（２）のガラス基板上に５０μＬ滴下して、カバーガラスを上から載せて全面に広げ、４℃で２４時開静置してハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスをつけたまま、洗浄液１（１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）を満たした容器に入れてカバーガラスが外れるまで軽く震盪した。別の容器に洗浄液１を満たしてカバーガラスの外れたプレートを入れて室温で適度に震盪しながら５分開静置した。さらに別の容器に洗浄液２（０．１ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）を満たしてプレートを入れて、室温で適度に震盪しながら５分開静置し、更に同じ操作を別の容器でもう一度繰り返した。別の容器に洗浄液３（０．１ＸＳＳＣ）を満たしてプレートを入れて、室温で適度に震盪しながら１分開静置し、更に同じ操作を別の容器でもう一度繰り返した。最後にMilli Qを満たしたビーカにプレートを軽く浸して洗浄した。プレート用のスピナーで水分を取り除いた後にプレートリーダーにて蛍光の検出を行った。【００７８】
［結果］
プレートリーダーで蛍光強度を読み取った結果を図１（ａ）に示す。その強度を
target(C)とtarget(mC)とで比較したグラフが図１（ｂ）に示す。ＯＤＮ（ＨＵ）、ＯＤＮ（ＨＶＵ）、ＯＤＮ（ＢｕＶＵ)のいずれの構造も、メチルシトシンとの連結効率が検出可能な程度に高いものであった。 target(C)とtarget(mC)の蛍光強度の比をとると、ＯＤＮ（ＨＵ）を用いた場合に、メチルシトシン（ｍＣ）の蛍光強度はシトシン（Ｃ）の蛍光強度と比較して４．２倍という高い値であった。ＯＤＮ（ＨＶＵ）では、メチルシトシン（ｍＣ）の蛍光強度はシトシン（Ｃ）の蛍光強度と比較して４．１倍、ＯＤＮ（ＢｕＶＵ)ではメチルシトシン（ｍＣ）の蛍光強度はシトシン（Ｃ）の蛍光強度と比較して２．６倍という高い値であった。【００７９】
以上のように、ＯＤＮ（ＨＵ）、ＯＤＮ（ＨＶＵ）、ＯＤＮ（ＢｕＶＵ)のいずれの構造でも、メチルシトシン（ｍＣ）の蛍光強度は、シトシン（Ｃ）の蛍光強度と比較して極めて大きいことがわかった。このことから、本発明に係る光連結性核酸類を使用した場合に、メチルシトシン（ｍＣ）に対する光連結は、シトシン（Ｃ）に対する光連結と比較して、非常に高い効率で起こること、すなわち、メチル化されたシトシンに対して選択的に光連結が生じることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、ＤＮＡ中のメチル化されたシトシン（メチルシトシン）を、メチル化されていないシトシンから区別して、迅速、簡便に、高感度で検出することができるために、産業において非常に有用である。本発明は、非破壊的なメチルシトシン検出を初めて可能にするものであり、ある１分子のＤＮＡにおいて複数の部位のシトシンについてのメチル化の有無の情報を得ることを初めて可能にするものである。本発明によるメチルシトシンの検出は、医療の現場において使用される場合も、その利用の価値は極めて高く、迅速な点から日帰りの検診にも適し、簡便な点から広範な医療施設での実施を可能とし、高感度な点から被験試料を提供する患者の身体的な負担を極めて低減するものである。
【図１】
2009113303.tif 000028
【配列表】
2009113303000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月8日(2010.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶ：
【化２１】
2009113303.tif 000029
（ただし、式Ｉ中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨを示し、
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２２】
2009113303.tif 000030
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ４及びＲ６は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２３】
2009113303.tif 000031
（ただし、式ＩＩＩ中、Ｙは、Ｏ、ＳまたはＮＨを示し、
Ｚは、ＹがＯまたはＳであるときＮＨ２を示し、ＹがＮＨであるときは水素原子を示し、
Ｒ７及びＲ９は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
【化２４】
2009113303.tif 000032
（ただし、式ＩＶ中、Ｒ１０及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ１１は、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する疎水性基を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）からなる、メチルシトシン光連結剤。
【請求項２】
Ｒ２，Ｒ５，Ｒ８及びＲ１１が、Ｃ１〜Ｃ１２の炭素数を有する炭化水素基である、請求項１に記載の核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）からなる、メチルシトシン光連結剤。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類からなる、光応答性メチルシトシン検出剤。
【請求項５】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを光連結する方法。
【請求項６】
請求項１〜２の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを検出する方法。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法。
【請求項８】
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基とが、隣接して配置される配列である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標識部位が、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識によって標識されている、請求項７〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１又は請求項２に記載の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キット。
【国際調査報告】
2009113303.tif 000033
2009113303.tif 000034
2009113303.tif 000035
2009113303.tif 000036
2009113303.tif 000037
2009113303.tif 000038
2009113303.tif 000039
2009113303.tif 000040
2009113303.tif 000041
2009113303.tif 000042
2009113303.tif 000043
2009113303.tif 000044
2009113303.tif 000045
2009113303.tif 000046
2009113303.tif 000047
2009113303.tif 000048
2009113303.tif 000049
2009113303.tif 000050
2009113303.tif 000051
2009113303.tif 000052
2009113303.tif 000053
2009113303.tif 000054