(57)【要約】Ｚ−３−［２，４−（ジメチルピロール−５−イル）メチルイデニル］−２−インドリノンを含有する脂質分散体製剤により、非経口投与時に安全性、利便性、効果に優れた抗悪性腫瘍剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｚ−３−［２，４−（ジメチルピロール−５−イル）メチルイデニル］−２−インドリノンを含有する非経口投与用の脂質分散体製剤。
【請求項２】
脂質膜を構成する脂質成分の少なくとも１種がリン脂質である請求項１に記載の脂質分散体製剤。
【請求項３】
リン脂質が、精製卵黄ホスファチジルコリン、精製大豆ホスファチジルコリン、水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項２に記載の脂質分散体製剤。
【請求項４】
脂質分散粒子の平均粒子径が１μｍ以下である請求項１〜３に記載の脂質分散体製剤。
【請求項５】
製剤中のリン脂質濃度が１〜１００ｍＭである請求項１〜４に記載の脂質分散体製剤。
【請求項６】
製剤中のＺ−３−［２，４−（ジメチルピロール−５−イル）メチルイデニル］−２−インドリノンの濃度が０．２〜２０ｍＭである請求項１〜５に記載の脂質分散体製剤。
【請求項７】
脂質膜の表面がポリエチレングリコール誘導体又はＰＲＰ配列を含むペプチドで修飾されている請求項１〜６に記載の脂質分散体製剤。
【請求項８】
脂質膜の表面がＰＲＰ配列を含むペプチドで修飾されている請求項７に記載の脂質分散体製剤。
【請求項９】
ＰＲＰ配列を含むペプチドがＡＰＲＰＧである請求項８に記載の脂質分散体製剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の脂質分散体製剤を含有する非経口投与用抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−インドリノン誘導体を含有する脂質分散体製剤及び当該脂質分散体製剤を含有する抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在までにがん治療のために多くの薬物が開発され、医療に用いられている。しかし、現在に至るまで腫瘍組織に対してのみ選択的に殺細胞効果を示す抗がん剤は開発されていない。抗がん剤をそのまま血管内に投与した場合、血中から速く消失する、標的以外の臓器にも分布することがあり、必ずしも効果的にがん組織に集積するとは限らない。このため抗がん剤の多くは、がん組織に対する抗腫瘍作用（主作用）を十分に発揮できず、またしばしば望ましくない正常組織への作用（副作用）を伴い、重篤な毒性を引き起こしている。抗がん剤の主作用の増強、副作用の軽減は、現在のがん化学療法の重要な課題であり、薬物をがん組織、がん細胞に効率的に集積する薬物送達システム（ＤＤＳ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の開発が強く求められている。
リポソームやＯ／Ｗエマルションに代表される脂質分散体は生体成分由来のリン脂質を膜脂質とする閉鎖小胞であり、生体に投与したときの毒性、抗原性が低い特徴を持つ。また脂質分散体内に薬物を封入することにより、その薬物の血中安定性及び生体内分布を変化させて標的組織への到達性を改善できることが示されている（非特許文献１、特許文献１）。またがん組織に多く存在する新生血管の血管壁は既存の血管のそれと比較して透過性が高く、平均粒子径５０〜２００ｎｍ程度の脂質分散体の小胞はがん組織に集積しやすいことが知られている（非特許文献２）。従って抗腫瘍活性薬物を脂質分散体内に封入した製剤は主作用を増強し、副作用を軽減することが大いに期待されるＤＤＳのひとつである。
本発明で使用するＺ−３−［２，４−（ジメチルピロール−５−イル）メチルイデニル］−２−インドリノン（ファイザー社，大鵬薬品工業株式会社  開発コード：ＳＵ５４１６）は血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のリン酸化を阻害することにより腫瘍組織における血管新生阻害作用を示し、幅広いスペクトルのヒト腫瘍に対して強い増殖抑制効果を示すことが知られており、下記一般式（１）で表される化合物である（特許文献２、非特許文献３）。
【化１】
2009125858.tif 000002
ＳＵ５４１６は経口投与した場合は十分な有効性を発揮しないことから、静脈内投与を代表とした非経口投与で治療に用いられている。しかしながら、ＳＵ５４１６は水に極めて難溶であるため、水を溶媒として用いて注射剤とすることは困難である。このため従来は、ＳＵ５４１６を、溶解度を高めるためのエタノール、ポリエチレングリコールなどの有機溶媒と水とを混合したときに析出する結晶を抑制するためにクレモホールやソルトールなどの非イオン性界面活性剤からなる混合溶媒に溶解して製剤とし、投与直前に生理食塩水で希釈して投与液とし、静脈内点滴投与が行われてきた。しかしクレモホールなどの静脈内投与は過敏症の副作用を頻繁に引き起こすため、現状では、抗ヒスタミン剤やステロイド剤の事前投与が必須となっており、患者及び医療従事者の大きな時間的、経済的、精神的負担となっている。また、生理食塩水で希釈された後の投与液は長時間経過すると結晶が析出するおそれがあり、希釈後は数時間以内に投与を開始する必要があり、医療施設での負担がより大きくなっていた。このため、クレモホールや有機溶媒を含有しない、静脈内投与に適した投与液の開発が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ９５／２４２０１
【特許文献２】ＷＯ９５／３２１８７
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．４、６６７、１９９４
【非特許文献２】Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｏｌ．１４、４３３、１９９９
【非特許文献３】Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．９０、５７８、１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は抗悪性腫瘍作用を示すＳＵ５４１６の非経口投与時に適した安全性、利便性に優れた脂質分散体製剤を提供することにある。
また本発明の課題はＳＵ５４１６を含有する抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＳＵ５４１６が脂溶性であり、脂質膜に親和性が高いことを着想し、ＳＵ５４１６をリポソーム又はＯ／Ｗエマルションといった脂質分散体に封入した結果、クレモホールや有機溶媒を含有しない投与形態を確立し、本発明を完成するに至った。さらに、脂質分散体のサイズなどを適切に調節することによって、ＳＵ５４１６をマウスの血管内に投与したときの抗腫瘍活性が有意に増大し、かつ毒性の増加は認められないことを見出した。
即ち、以下の発明に係るものである。
１．Ｚ−３−［２，４−（ジメチルピロール−５−イル）メチルイデニル］−２−インドリノンを含有する非経口投与用の脂質分散体製剤。
２．上記脂質膜を構成する脂質成分の少なくとも１種がリン脂質である脂質分散体製剤。
３．リン脂質が、精製卵黄ホスファチジルコリン、精製大豆ホスファチジルコリン、水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンからなる群より選択される少なくとも１種である上記脂質分散体製剤。
４．脂質分散粒子の平均粒子径が１μｍ以下である上記脂質分散体製剤。
５．製剤中のリン脂質濃度が１〜１００ｍＭである上記脂質分散体製剤。
６．製剤中のＺ−３−［２，４−（ジメチルピロール−５−イル）メチルイデニル］−２−インドリノンの濃度が０．２〜２０ｍＭである上記脂質分散体製剤。
７．脂質膜の表面がポリエチレングリコール誘導体又はＰＲＰ配列を含むペプチドで修飾されている上記脂質分散体製剤。
８．脂質膜の表面がＰＲＰ配列を含むペプチドで修飾されている上記脂質分散体製剤。
９．ＰＲＰ配列を含むペプチドがＡＰＲＰＧである上記脂質分散体製剤。
１０．上記のいずれかに記載の脂質分散体製剤を含有する非経口投与用の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、脂質分散体製剤は利便性を高めるとともに、毒性を上昇させることなく、抗腫瘍効果を高めることができる。従って、本発明の脂質分散体製剤は抗腫瘍剤として格別顕著な効果を示し、癌患者の生存期間をより延長させる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は実施例１のＰＥＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６のリポソーム画分への分布を示すグラフである。
【図２】図２は実施例２のＡＰＲＰＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６のリポソーム画分への分布を示すグラフである。
【図３】図３は試験例１によるリポソーム製剤の粒子径の経時的変化を示すグラフである。
【図４】図４は試験例１によるＯ／Ｗエマルション製剤の粒子径の経時的変化を示すグラフである。
【図５】図５は試験例１によるリポソーム製剤のＳＵ５４１６封入率の経時的変化を示すグラフである。（初期値を１００％とする）
【図６】図６は試験例１によるＯ／Ｗエマルション製剤のＳＵ５４１６封入率の経時的変化を示すグラフである。（初期値を１００％とする）
【図７】図７は試験例２の溶血試験結果を示すグラフである。
【図８】図８は試験例３のマウスでの腫瘍容積変化を示すグラフである。
【図９】図９は試験例３のマウスの体重変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の脂質分散体の具体的形態として、リポソーム及びＯ／Ｗエマルションが挙げられる。
本発明に用いられるリポソームとは、前記したように細胞膜を構成しているリン脂質を水中に分散させて形成される脂質二分子膜により囲まれた内水相部分を有する閉鎖小胞であり、そのサイズや脂質二分子の数によって多重相リポソーム（Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）、大きな一枚膜リポソーム（Ｌａｒｇｅ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶ）及び小さな一枚膜リポソーム（Ｓｍａｌｌ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ）の３種類に分類される。本発明ではいずれの種類のリポソームも使用可能である。本発明のリポソームは生体内投与前に安定なリポソーム構造を形成しなければならない。
リポソームを構成するリン脂質としては、例えば精製卵黄フォスファチジルコリン（以下ＥＰＣとする）、精製大豆フォスファチジルコリン（以下ＳＰＣとする）、水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン（相転移温度５０〜６０℃、以下ＨＥＰＣ）、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン（相転移温度約５５℃、以下ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（相転移温度約４１℃、以下ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（相転移温度約５８℃、以下ＤＳＰＣ）及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（相転移温度−３℃、以下ＰＯＰＣ）から選ばれ、より好ましくはＤＰＰＣ及びＤＳＰＣがあげられる。これらは１種又は２種以上混合して用いることができ、相転移温度の低いリン脂質、例えばＰＯＰＣを用いる場合は２種以上混合して調製する。
本発明に用いられるリポソームは、これらリン脂質に加えて、好ましくはリポソームの安定性を改善することが報告されているコレステロール誘導体などの安定化剤と混合して使用される。コレステロール誘導体とリン脂質のモル比は、１：１〜１０が好ましく、１：２．５〜５がさらに好ましい。
また、等張化剤として、例えば、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウムなどの添加も可能である。さらに、パラベン類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールなどの防腐剤を加えてもよい。
本発明で用いられるリン脂質とＳＵ５４１６とのモル比は、１：０．０１〜０．１が好ましく、１：０．０２５〜０．０７５がさらに好ましく、１：０．０４〜０．０６が特に好ましい。
本発明のリポソーム製剤は公知の方法により調製される。公知のリポソーム製剤の調製方法としては、例えば、逆相蒸発法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，４１９４（１９７８），ＷＯ９７／４８３９８］、凍結融解法［Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，２１２，１８６（１９８１）］、ｐＨ勾配法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８１６，２９４（１９８５）、特開平７−１６５５６０］などがあげられる。
これらの中で、逆相蒸発法は、水に難溶な薬物をリポソーム内に高い包含率で封入する際に有用であり、ＳＵ５４１６においても最適な方法のひとつである。逆相蒸発法による本発明のリポソーム製剤の調製方法としては、例えば、ＳＵ５４１６と脂質成分をクロロホルム、エーテル、エタノールなどの溶媒に溶解後、ナス型フラスコに入れ、減圧下溶媒留去し脂質薄膜を形成する。次いで、緩衝液を薄膜に加え、凍結融解を行い、内水相が緩衝液である大きな多重相リポソーム（ＭＬＶ）を調製する。さらに、エクストルージョン法などにより、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）とする。以上の操作により、薬物をリポソームの脂質膜に高率かつ定量的に封入することができる。
本発明に用いられるＯ／Ｗエマルションとは、膜相脂質であるリン脂質が、内相脂質を取り巻いた脂質粒子を含有するものであり、内相脂質中及び膜相脂質中に薬物が溶解した状態で存在する。
Ｏ／Ｗエマルションを構成する膜相脂質としては、界面活性を有する必要があり、種々のリン脂質を使用することができる。例えばＥＰＣ、ＳＰＣ、ＨＥＰＣ、ＨＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ及びＰＯＰＣから選ばれる。これらは１種又は２種以上混合して用いることができる。
一方、Ｏ／Ｗエマルションを構成する内相脂質としては薬物を溶解できる脂質が望ましく、精製ダイズ油、コレステロール、コレステロールエステル、トリオレイン、トリカプリリン、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、オレイン酸、オレイン酸エチル、トコフェロールなどを挙げることができる。
Ｏ／Ｗエマルションは粒子間で凝集しやすい性質があるため、ポリビニルピロリドン、血清アルブミンなどの高分子を外水相に溶解して、凝集を抑制する方法をとることができる。また、等張化剤として、例えば、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウムなどの添加も可能である。さらに、パラベン類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールなどの防腐剤を加えてもよい。
本発明のＯ／Ｗエマルションで用いられる脂質とＳＵ５４１６とのモル比は、１：０．０１〜０．５が好ましく、１：０．０２〜０．２がさらに好ましく、１：０．０４〜０．１が特に好ましい。
リポソーム及びＯ／Ｗエマルションの粒子サイズは内包されている薬物の生体内分布、腫瘍組織への送達性に大きな影響を与えることが報告されている［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１７，９３５（１９９４）］。従って、本発明においては、薬物を内包した脂質分散体の粒子径を適切かつ均一にするために、サイジング処理を行うのが好ましく、例えば、エクストルーダー（リペックスバイオメンブラン社製など）を使用し、適切た孔径のメンブランフィルターに数回通過させることにより、或いは超音波ホモジナイザーを使用することにより調製する。
リポソームの平均粒子径は、好ましくは１μｍ（１０００ｎｍ）以下、より好ましくは５０〜５００ｎｍ、更に好ましくは１００〜３００ｎｍ、特に好ましくは７５〜１５０ｎｍ、最も好ましくは７５〜１２５ｎｍである。Ｏ／Ｗエマルションの平均粒子径は、好ましくは１μｍ（１０００ｎｍ）以下、より好ましくは５０〜５００ｎｍ、更に好ましくは１００〜３００ｎｍ、特に好ましくは１５０〜３００ｎｍである。
製剤中のリン脂質およびＳＵ５４１６の濃度は、ＳＵ５４１６の脂質分散体への封入率を高め、ＳＵ５４１６の析出を防止し、溶液の粘度を非経口投与に適した範囲とするために調整する必要があり、リン脂質濃度は１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭとし、ＳＵ５４１６濃度は０．２〜２０ｍＭ、好ましくは０．５〜１０ｍＭとすることが望ましい。
またリポソーム及びＯ／Ｗエマルションの膜表面を、必要に応じ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体で修飾することによって、リポソームの血中での安定性を改善することができる。多くの場合、ＰＥＧ誘導体としては、分子量５００〜２００００のＰＥＧとリン脂質の共有結合体を用い、分子量２０００〜５０００のＰＥＧとジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（以下ＤＳＰＥ）の結合体（以下ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）が最も広汎に使われている。
また、ペプチド、レクチン、抗体、糖質、糖タンパク、糖脂質などのリガンドで修飾することによって、リポソーム及びＯ／Ｗエマルションの血中での安定性、組織分布、腫瘍組織への移行性等をさらに向上させることができる。特に、ＰＲＰ配列を含むペプチドはがん組織に多く存在する新生血管に特異的に集積することが確認されており、ＶＥＧＦ受容体の一つであるｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−１（ｆｌｔ−１）へ親和性を持つことが示唆されている［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，２６６２（２００２）、ＷＯ００／２３４７６］。ポリエチレングリコール誘導体及びＰＲＰ配列を含むペプチドで膜表面を修飾することにより、血中で安定であり、かつ腫瘍組織への移行性が高いリポソーム及びＯ／Ｗエマルションを得ることができる。
ここで、用いられるＰＲＰ配列を含むペプチドは、プロリン−アルギニン−プロリンのアミノ酸配列を含むペプチドであればよく、ペプチド合成分野において公知の方法により作成することができる。例えばＡＰＲＰＧ（アラニン−プロリン−アルギニン−プロリン−グリシン）、ＧＰＲＰＬ（グリシン−プロリン−アルギニン−プロリン−ロイシン）、ＧＰＲＰＲ（グリシン−プロリン−アルギニン−プロリン−アルギニン）を例示することができる。
以上の操作によって、本発明の脂質分散体製剤が調製され、必要に応じ、超遠心処理、ゲル濾過処理、限外濾過処理及び透析処理を単独又は適宜組み合わせて行うことによって、リポソーム及びＯ／Ｗエマルションに内包されなかった薬物を除去することができる。
上記の方法により得られる本発明の脂質分散体製剤はそのままでも使用できるが、保存期間、保存条件などを考慮して、マンニトール、トレハロース、ラクトース、グリシンなどの賦形剤を加えて凍結乾燥することもできる。またグリセリンなどの凍結保存剤を加え、凍結保存してもよい。
本発明の脂質分散体製剤は、一般的には、使用時に生理的に許容される水溶液で懸濁又は希釈して注射剤（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内投与製剤）として用いられるが、点鼻剤、吸入剤、点眼剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などとして使用することもできる。最終製剤は、悪性腫瘍〔ヒトなどの哺乳動物の肺がん、消化器がん（食道がん、胃がん、直腸がん、結腸がん）、乳がん、頭頸部がん、肝臓がん、胆嚢がん、膵臓がん、婦人科がん（子宮がん、子宮頸がん、卵巣がんなど）、泌尿器がん（腎がん、膀胱がん、前立腺がん）、脳腫瘍、白血病、メラノーマ、悪性リンパ腫など〕の治療、緩解のための有効量が投与されるように設計されていればよい。例えば、静脈内投与リポソーム製剤としてＳＵ５４１６が０．０１〜１００００ｍｇ含有されていればよい。本発明のリポソーム製剤に含まれるＳＵ５４１６の投与量は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｄａｙとするのが好ましい。
【実施例】
【００１０】
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
（ポリエチレングリコール誘導体で修飾したＳＵ５４１６リポソーム製剤、以下ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６とする）
ＤＰＰＣ３０μｍｏｌ、ＰＯＰＣ３０μｍｏｌ、コレステロール１５μｍｏｌ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ６μｍｏｌ、ＳＵ５４１６（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ溶液）３μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：  ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ＳＵ５４１６＝１０／１０／５／２／１）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。エバポレーターで減圧下、クロロホルムを留去し、ナス型フラスコの内壁面に脂質薄膜を形成させた。さらにデシケーター内で１時間真空乾燥した。次に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ〔４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ〕緩衝液（ｐＨ７．４）１．５ｍＬで水和後、凍結融解を３回行った。バス型ソニケーターを用いて１０分間超音波処理した後、エクストルーダー（リペックスバイオメンブラン社製）を用い、孔径１００ｎｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ヌクレポア）に５回通過させてリポソーム製剤を調製した。リポソームの平均粒子径は約１２０ｎｍであった。
［実施例２］
（ポリエチレングリコール誘導体及びＡＰＲＰＧペプチドで修飾したＳＵ５４１６リポソーム製剤、以下ＡＰＲＰＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６とする）
ＤＰＰＣ３０μｍｏｌ、ＰＯＰＣ３０μｍｏｌ、コレステロール１５μｍｏｌ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ化したＡＰＲＰＧ配列を含むペプチド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧ）６μｍｏｌ、ＳＵ５４１６（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ溶液）３μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧ／ＳＵ５４１６＝１０／１０／５／２／１）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例１の方法に従い、リポソーム製剤を調製した。リポソームの平均粒子径は約１３０ｎｍであった。
［実施例３］
（ＥＰＣとトリオレインから成るＳＵ５４１６エマルション製剤、以下Ｏ／Ｗ−ＥＰＣ−ＳＵ５４１６とする）
ＥＰＣのクロロホルム溶液（１００ｍＭ）とトリオレイン（油状）を、ＥＰＣ：トリオレインのモル比が２：８となるようにマイクロシリンジを用いて５０ｍＬナス型フラスコに分取した。次に、ＳＵ５４１６のクロロホルム溶液（５０ｍＭ）を、ＥＰＣ：トリオレイン：ＳＵ５４１６のモル比が２：８：１になるように必要量をナス型フラスコに添加した。さらに少量のクロロホルムを加え、脂質溶液が均一になるように軽く混和した。ロータリーエバポレーターで減圧下、クロロホルムを留去し、ナス型フラスコの底に脂質の薄膜を形成した。８０℃に保ちながら、０．３Ｍグルコース／１％  ポリビニルピロリドン溶液を加え、ボルテックスミキサーで激しく攪拌することにより水和させた。粒子径を均質にするために、超音波ホモジナイザー（ＳＯＮＩＦＥＲ  Ｍｏｄｅｌ２５０，ＢＲＡＮＳＯＮ）で超音波処理を９０分間行った。最終的な脂質濃度は、ＥＰＣとして２０ｍＭである。エマルションの平均粒子径は約２４０ｎｍであった。
［実施例４］
（ＰＥＧ誘導体で修飾した、ＤＰＰＣ、コレステロール、コレステロールオレエートから成るＳＵ５４１６Ｏ／Ｗエマルション製剤、以下Ｏ／Ｗ−ＤＰＰＣ−ＰＥＧ−ＳＵ５４１６とする）
ＤＰＰＣ、コレステロール、コレステロールオレエートのクロロホルム溶液（いずれも１００ｍＭ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧのクロロホルム／メタノール（１／３）溶液（１００ｍＭ）を、ＤＰＰＣ：コレステロール：コレステロールオレエート：ＤＳＰＥ−ＰＥＧのモル比が１０：１０：２０：２となるようにマイクロシリンジを用いて５０ｍＬナス型フラスコに分取した。次に、ＳＵ５４１６のクロロホルム溶液（５０ｍＭを、ＤＰＰＣ：コレステロール：コレステロールオレエート：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ：ＳＵ５４１６のモル比が１０：１０：２０：２：１となるように必要量をナス型フラスコに添加した。さらに少量のクロロホルムを加え、脂質溶液が均一になるように軽く混和した。ロータリーエバポレーターで減圧下、クロロホルムを留去し、ナス型フラスコの底に脂質の薄膜を形成した。８０℃に保ちながら、０．３Ｍ  ＨＥＰＥＳ／１％  ポリビニルピロリドン溶液を加え、ボルテックスミキサーで激しく攪拌することにより水和させた。粒子径を均質にするために、超音波ホモジナイザー（ＳＯＮＩＦＥＲ  Ｍｏｄｅｌ２５０，ＢＲＡＮＳＯＮ）で超音波処理を９０分間行った。最終的な脂質濃度は、ＤＰＰＣとして１０ｍＭである。エマルションの平均粒子径は約１６０ｎｍであった。
［比較例１］
（脂質分散体としていないＳＵ５４１６溶液、以下Ｆｒｅｅ  ＳＵ５４１６製剤とする）
ポリエチレングリコール４００、クレモホールＥＬ（Ｐｏｌｙｏｘｙｌ  ３５ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）、ベンジルアルコール、無水エタノールを重量比４５：３１．５：２：２１．５で混合して、Ｆｒｅｅ  ＳＵ５４１６用の溶媒とした。これにＳＵ５４１６を１．２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。動物に投与する直前に０．４５％塩化ナトリウム溶液で４倍希釈した。
［試験例１］
（ＳＵ５４１６の脂質分散体封入率と経時安定性）
実施例１及び実施例２で調製したリポソーム溶液を、それぞれセファデックスＧ−２５を充てんしたＰＤ−１０カラムを用いたゲル濾過法により、６画分に分画した。各画分に１０％  ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液５０μＬ及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え混合し、さらに超音波処理を行うことによりリポソーム膜を可溶化した。ＨＰＬＣを用いて吸収波長４４０ｎｍの条件下における溶液の吸光度を測定し、検量線から各画分のＳＵ５４１６濃度を求めた。一方、各画分について濁度（吸収波長７５０ｎｍ）を測定し、リポソーム濃度を決定した（図１及び図２、ｆｒａｃｔｉｏｎ１−３）。
実施例３で調製したＯ／Ｗエマルション溶液を、上記と同様の方法でＳＵ５４１６濃度、Ｏ／Ｗエマルション濃度を求めた。
実施例１、実施例２及び実施例３の各画分のＳＵ５４１６濃度及び脂質分散体濃度から脂質分散体へのＳＵ５４１６封入率を求めた結果、脂質分散体へのＳＵ５４１６の封入率は、実施例１で得たＰＥＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６は８６．０％、実施例２で得たＡＰＲＰＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６は８５．８％、実施例３で得たＯ／Ｗ−ＥＰＣ−ＳＵ５４１６は８６．９％であり、高い効率で封入されていることが確認された。また、いずれの脂質分散体製剤についても、平均粒子径は調製後１４日間変化しなかった（図３及び図４）。また、いずれの脂質分散体製剤についても、ＳＵ５４１６封入率が調製直後から１４日間変化せず製剤として安定であることが明らかとなった（図５及び図６）。
ＨＰＬＣ条件
検出器：紫外可視吸光光度計（測定波長：４４０ｎｍ）
カラム：ＴＳＫＧＥＬ  ＯＤＳ−８０ＴＳ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ  （ＴＯＳＯＨ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ｍｅｔｈａｎｏｌ／３５ｍＭＫＨ２ＰＯ４  （ｐＨ３．０）  混液（７５：２５）
流速  ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ  （Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  約１６ｋｇｆ／ｃｍ２）
注入量：１０又は２０μＬ
測定時間  ：２５ｍｉｎ（ピークは約１５分のところで検出）
［試験例２］
（脂質分散体ＳＵ５４１６製剤とＦｒｅｅ  ＳＵ５４１６製剤の溶血性）
マウスから採取した血液を遠心分離（２０００×ｇ，５ｍｉｎ）して上清を採取した。残渣にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を加え混合した後、遠心分離（２０００×ｇ，５ｍｉｎ）して上清を採取し、この操作を５回繰り返した。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で５％（ｖ／ｖ）に希釈し、赤血球溶液とした。赤血球溶液１８０μＬに実施例１及び実施例２で調製した脂質分散体ＳＵ５４１６リポソーム溶液、比較例１で調製したＦｒｅｅ  ＳＵ５４１６溶液ならびにＦｒｅｅ  ＳＵ５４１６溶解用の溶媒のそれぞれ２０μＬを加え、ボルテックスミキサーで混合した。その後３７℃で１０，３０，６０ｍｉｎインキュベートし、遠心分離（１０，０００×ｇ，５ｍｉｎ）を行った。上清１００μＬを取り、マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍの波長を測定し、溶血率を算出した。
その結果、図７に示すように、Ｆｒｅｅ  ＳＵ５４１６溶液及びＦｒｅｅ  ＳＵ５４１６の溶媒では顕著な溶血が見られた一方、ＰＥＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６及びＡＰＲＰＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６溶液ではほとんど溶血は認められなかった。この理由として、リポソーム製剤中にクレモホールＥＬ及び有機溶媒が含まれていないため、赤血球膜を破壊する作用がないことが考えられた。
［試験例３］
（脂質分散体ＳＵ５４１６製剤とＦｒｅｅ  ＳＵ５４１６製剤の抗腫瘍効果と毒性評価）
抗腫瘍効果の評価に用いるマウス大腸がん細胞株Ｃｏｌｏｎ２６ＮＬ１７を５％ＣＯ２存在下、３７℃１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｈａｍ  Ｆ１２＝１／１で培養し、継代した。５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＣｏｌｏｎ２６ＮＬ１７を４週齢雄性Ｂａｌｂ／Ｃマウスの左腹側部に０．２ｍＬ皮下投与（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）して固形がん担がんマウスを作成した。Ｃｏｌｏｎ２６ＮＬ１７移植後５，７，９，１１及び１３日目の計５回、コントロールとしてＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ及び実施例２で調製されたＡＰＲＰＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６溶液或いは比較例１で調製されたＦｒｅｅ  ＳＵ５４１６溶液の０．２ｍＬ／ｂｏｄｙ／ｄａｙをマウスの尾静脈内に投与した（投与量はいずれもＳＵ５４１６として３ｍｇ／ｋｇ）。がん移植４日後から腫瘍容積を測定することにより、ＳＵ５４１６封入リポソーム溶液の抗腫瘍効果を調べた。腫瘍容積は以下の式を用いて算出した。
腫瘍容積（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）＝０．４×ａ×ｂ２
（ａ：腫瘍部位の長径、ｂ：腫瘍部位の短径）
その結果、図８に示すように、ＡＰＲＰＧ−Ｌｉｐ−ＳＵ５４１６処置群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ処置群、リポソーム化していないＳＵ５４１６処置群（Ｆｒｅｅ  ＳＵ５４１６）に比べ有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。
また副作用の指標として体重変化を調べた結果、図９に示すように、すべての処置群において顕著な体重減少はみられなかった。
これらの結果より、ＳＵ５４１６のリポソーム製剤はリポソーム化していない溶液と比較して有意に抗腫瘍活性を増強することが示された。抗がん活性の増強の原因は、ＳＵ５４１６をリポソーム製剤とすることでＳＵ５４１６の体内動態を改善し、問題点であった血中半減期の延長、さらに標的化による新生血管への集積性の向上などが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の脂質分散体製剤は利便性を高めるとともに、毒性を上昇させることなく、抗腫瘍効果を高めることができる。従って、本発明の脂質分散体製剤は抗腫瘍剤として格別顕著な効果を示すことが期待され、癌患者の生存期間をより延長させるような治療効果の高い治療法への応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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