(57)【要約】マーモセット等の非ヒト霊長類動物を用いたヒト疾患モデル霊長類動物の作出のための胚への遺伝子導入方法の提供を目的とし、非ヒト霊長類初期胚を０．２〜０．３Ｍスクロース溶液に入れ囲卵腔の容積を増加させ、初期胚の囲卵腔にプロモータに作動可能に連結したヒト外来遺伝子を含むウイルスベクターを注入することを含む、非ヒト霊長類動物初期胚に外来遺伝子を導入する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト霊長類動物初期胚を０．２〜０．３Ｍスクロース溶液に入れスクロース処理し囲卵腔の容積を増加させ、初期胚の囲卵腔にプロモータに作動可能に連結したヒト外来遺伝子を含むウイルスベクターを注入することを含む、非ヒト霊長類動物初期胚に外来遺伝子を導入する方法。
【請求項２】
スクロース処理により、初期胚の囲卵腔の容積をスクロース処理する前の初期胚の囲卵腔の容積の１．２〜８倍に増大させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
スクロース処理していない初期胚に注入可能な外来遺伝子の量の１．２〜８倍の量の外来遺伝子を初期胚に注入する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
霊長類動物がマーモセットである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
初期胚が自然交配により得られた着床前の前核期から桑実胚期の胚である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
初期胚が人工受精により得られた前核期から桑実胚期の胚である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスベクターを胚当たり１．３×１０３〜１．３×１０５ＣＦＵの力価で注入する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で初期胚に外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子を導入した初期胚を仮母に移植し発生させることを含む、導入外来遺伝子が生殖系列へ伝播し得るトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１１】
外来遺伝子がヒトの疾患に関与する遺伝子である、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１２】
ヒトの疾患に関与する遺伝子が、ヒトパーキンソン病の原因遺伝子である変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ又はヒトハンチントン病の原因遺伝子である変異型ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子であり、ヒト疾患モデル霊長類動物がヒトパーキンソン病モデル霊長類動物又はヒトハンチントン病モデル霊長類動物である、請求項１１記載のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１３】
外来遺伝子が非ヒト霊長類動物に内在性のヒトの疾患に関与する遺伝子のオルソログ遺伝子をノックアウトするためのものであり、トランスジェニック非ヒト霊長類動物がヒト疾患モデルノックアウト霊長類動物である、請求項１１記載のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法で作出された、導入外来遺伝子が生殖系列伝播能を有するトランスジェニック霊長類動物。
【請求項１５】
ヒトパーキンソン病の原因遺伝子であるヒト変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子又はヒトハンチントン病の原因遺伝子であるヒト変異型ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子が導入され、該遺伝子が生殖系列へ伝播する、トランスジェニック霊長類動物。
【請求項１６】
ヒトパーキンソン病モデル霊長類動物又はヒトハンチントン病モデル霊長類動物である、請求項１５記載のトランスジェニック霊長類動物。
【請求項１７】
霊長類動物がマーモセットである、請求項１５又は１６に記載のトランスジェニック霊長類動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト疾患モデル動物として利用できるトランスジェニック非ヒト霊長類動物の作出に関し、霊長類動物の初期胚に遺伝子を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスやラットを用いてヒト疾患モデル動物が種々作出されている。ヒトの疾患に関与する遺伝子を非ヒト動物に導入し、又はヒトの疾患に関与する遺伝子の相同遺伝子をノックアウトする等の遺伝子操作によりトランスジェニック非ヒト動物を作出し、該トランスジェニック非ヒト動物をヒト疾患モデル動物として利用することができる。しかしながら、マウスやラットとヒトの解剖学的、生理学的及び遺伝的違いから、これらの動物を用いて得られた結果から、ヒトへの臨床的応用の適否を推定することは困難である。このため進化学的にヒトに類縁な霊長類を用いたトランスジェニック動物の利用が望まれていた。
トランスジェニック非ヒト動物を作出する場合、非ヒト動物の初期胚にヒトの疾患に関与する遺伝子等の外来遺伝子を導入する必要がある。従来より、ＤＮＡマイクロインジェクション法や、レンチウイルス等のウイルスをベクターとして用いる方法があった。しかしながら、マイクロインジェクション法では、胚の損傷が大きく遺伝子導入効率が低くなるという問題があった（非特許文献１を参照）。この非効率性を補うためには、多数の卵母細胞を用いる必要があった。しかしながら、霊長類や家畜等においては倫理的及び経済的理由から多数の卵母細胞を準備することは困難であった。このため、家畜類においてレトロウイルスベクターを用いる方法が行われた（非特許文献２〜４を参照）。レトロウイルスベクターを用いる方法においては、導入したトランスジーンが動物個体において抑制されてしまうという問題があった（非特許文献５を参照）。この遺伝子抑制の問題を改善するために、ウシ及びブタにおいてレンチウイルスベクターが用いられた（非特許文献３及び４を参照）。
霊長類については、トランスジェニックアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の作出がレトロウイルス及びレンチウイルスを用いて試みられた（非特許文献５及び６を参照）。しかしながら、レンチウイルスを用いた場合であっても、導入遺伝子の発現は、胎盤で認められたものの、新生仔では認められなかった（非特許文献６を参照）。さらに、ヒトハンチントン遺伝子を導入したアカゲザルについても報告されていたが（非特許文献７を参照）、該アカゲザルについても、生存している新生仔では導入遺伝子の発現は認められず、導入したトランスジーンの生殖系列伝播は認められていない。アカゲザルやカニクイザルは（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｃｕｌａｒｉｓ）、従来より実験用非ヒト霊長類として用いられていた。しかしながら、これらの霊長類の繁殖率の低さからモデル動物作出のための出発動物を得ることが困難であり、次世代動物を得るまでに３年程度かかり、さらに次世代動物として、１０個体程度しか得られないという問題があった。
上記のように、霊長類等の一部の哺乳動物では、胚への高い遺伝子導入効率を得ることができていない。
マウス等の一部動物においては、ＥＳ細胞を用いてトランスジェニック動物を作出することができる。しかしながら、ＥＳ細胞を用いて導入外来遺伝子の生殖系列への伝播が生じるトランスジェニック霊長類動物は作出できていない。例えば、本願発明者はマーモセットのＥＳ細胞の作出に成功しているが（特許文献１を参照）、ＥＳ細胞を用いた技術では生殖系列伝播が生じるトランスジェニック霊長類の作出には成功していない。
一方、人工受精の技術として囲卵腔精子注入法という技術があった（特許文献２を参照）。該技術においては、例えば卵母細胞の透明帯と卵細胞の隙間である囲卵腔に精子を注入することにより受精を促進する。この際、卵母細胞をあらかじめスクロース溶液で処理し、囲卵腔を拡げることもあった。該技術は例えば透明帯を通過する能力が低下した精子を人工的に卵内に侵入させる技術である。人工受精を目的とするため、１個の卵母細胞に単一の精子を入れることを目的とし、１つの細胞に多量のＤＮＡを入れることは目的としていない。該方法では必ずしも高い受精率が達成できず、その後細胞質に直接精子を注入する細胞質内注入法にとって代わられた。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／０２９０９３号パンフレット
【特許文献２】特開平１０−１８５９１９号公報
【非特許文献１】Ｈａｍｍｅｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，６８０−３（１９８５）
【非特許文献２】Ｃｈａｎ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５，１４０２８−３３（１９９８）
【非特許文献３】Ｈｏｆｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ４，１０５４−６０（２００３）
【非特許文献４】Ｈｏｆｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ７１，４０５−９（２００４）
【非特許文献５】Ｃｈａｎ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，３０９−１２（２００１）
【非特許文献６】Ｗｏｌｆｇａｎｇ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，１０７２８−３２（２００１）
【非特許文献７】Ｓ．Ｈ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４５３，Ｎｏ．７１９７，９２１−（２００８）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、マーモセット等の非ヒト霊長類動物を用いたヒト疾患モデル動物の作出のための初期胚への遺伝子導入方法の提供を目的とする。
新世界サルの一種であるコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）は、ヒトに近縁な真猿類に属する超小型サルであり、大型サルに比べて繁殖効率が良くしかも小型で取り扱いが容易であるという利点を有する。本発明者らは、パーキンソン病、ハンチントン病などのヒト疾患モデルマーモセットを外来遺伝子導入又は標的遺伝子を破壊することにより作出することが可能になれば、神経やその他の臓器の再生医療の開発へ大きく貢献することが期待できると考えた。本発明者らは先にコモンマーモセットのＥＳ細胞の作出に成功し（ＷＯ２００６／０２９０９３）、ＥＳ細胞を用いてトランスジェニックコモンマーモセットの作出を試みたが、成功しなかった。そこで本発明者らは、他の技術でトランスジェニックコモンマーモセットの作出を試みることとし、トランスジェニックコモンマーモセット作出において必須となる発生工学的、分子生物学的技術の基礎的研究を行い、トランスジェニックコモンマーモセットを効率的に作成するための細胞の調製法等について鋭意検討を行った。
具体的には、トランスジェニックコモンマーモセットを作出するために必須の技術であるコモンマーモセットの初期胚への遺伝子導入法を確立した。特に、従来から霊長類では初期胚への外来遺伝子の導入効率を上げることが困難であり、ヒト遺伝子を導入したトランスジェニック霊長類の作成に成功したという報告はほとんどなかった。本発明者らは、初期胚へウイルスベクターを介して外来遺伝子を導入する際に、スクロースを含む溶液を用いることにより、効率よく外来遺伝子を初期胚に導入できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］  非ヒト霊長類動物初期胚を０．２〜０．３Ｍスクロース溶液に入れスクロース処理し囲卵腔の容積を増加させ、初期胚の囲卵腔にプロモータに作動可能に連結したヒト外来遺伝子を含むウイルスベクターを注入することを含む、非ヒト霊長類動物初期胚に外来遺伝子を導入する方法。
［２］  スクロース処理により、初期胚の囲卵腔の容積をスクロース処理する前の初期胚の囲卵腔の容積の１．２〜８倍に増大させる、［１］の方法。
［３］  スクロース処理していない初期胚に注入可能な外来遺伝子の量の１．２〜８倍の量の外来遺伝子を初期胚に注入する、［１］の方法。
［４］  霊長類動物がマーモセットである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］  ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、［５］の方法。
［７］  初期胚が自然交配により得られた着床前の前核期から桑実胚期の胚である、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］  初期胚が人工受精により得られた前核期から桑実胚期の胚である、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［９］  ウイルスベクターを胚当たり１．３×１０３〜１．３×１０５ＣＦＵの力価で注入する、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］  ［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で初期胚に外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子を導入した初期胚を仮母に移植し発生させることを含む、導入外来遺伝子が生殖系列へ伝播し得るトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
［１１］  外来遺伝子がヒトの疾患に関与する遺伝子である、［１０］のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
［１２］  ヒトの疾患に関与する遺伝子が、ヒトパーキンソン病の原因遺伝子である変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ又はヒトハンチントン病の原因遺伝子である変異型ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子であり、ヒト疾患モデル霊長類動物がヒトパーキンソン病モデル霊長類動物又はヒトハンチントン病モデル霊長類動物である、［１１］のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
［１３］  外来遺伝子が非ヒト霊長類動物に内在性のヒトの疾患に関与する遺伝子のオルソログ遺伝子をノックアウトするためのものであり、トランスジェニック非ヒト霊長類動物がヒト疾患モデルノックアウト霊長類動物である、［１１］のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
［１４］  ［１１］〜［１３］のいずれかの方法で作出された、導入外来遺伝子が生殖系列伝播能を有するトランスジェニック霊長類動物。
［１５］  ヒトパーキンソン病の原因遺伝子であるヒト変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子又はヒトハンチントン病の原因遺伝子であるヒト変異型ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子が導入され、該遺伝子が生殖系列へ伝播する、トランスジェニック霊長類動物。
［１６］  ヒトパーキンソン病モデル霊長類動物又はヒトハンチントン病モデル霊長類動物である、［１５］のトランスジェニック霊長類動物。
［１７］  霊長類動物がマーモセットである、［１５］又は［１６］のトランスジェニック霊長類動物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−０１７９５５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ウイルスベクターの囲卵腔への注入方法の概要を示す図である。
図２は、０．２５Ｍスクロース溶液中又はＭ２培地中でウイルスベクター液を注入した直後の胚を示す写真である。
図３は、０．２５Ｍスクロース溶液中又はＭ２培地中でウイルスベクター液を注入し、２．５日、３．５日、８．５日経過した胚を示す写真である。
図４は、トランスジェニックコモンマーモセットの線維芽細胞、血液及び胎盤から抽出したサンプルのサザンブロット分析の結果を示す写真である。
図５は、産まれたトランスジェニックコモンマーモセットの写真である。
図６は、トランスジェニックコモンマーモセットの毛根、血液及び胎盤におけるＥＧＦＰの転写を示す写真である。
図７は、トランスジェニックコモンマーモセットの胎盤におけるＥＧＦＰの発現を示す写真である。
図８は、トランスジェニックコモンマーモセットの耳におけるＥＧＦＰの発現を示す写真である。
図９は、トランスジェニックコモンマーモセットの毛根におけるＥＧＦＰの発現を示す写真である。
図１０は、トランスジェニックコモンマーモセットの末梢血のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
図１１は、＃６６６からの泳ぐ精子及びＩＶＦ胚、並びに＃５８４及び野生型動物からの天然の胚のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す写真である。
図１２は、ＩＶＦ胚の落射蛍光顕微鏡法分析による明視野と暗視野を示す写真である。
図１３は、変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子を含むレンチウイルスベクターの構造を示す図である。
図１４は、体外受精（Ａ）及び発生した桑実胚（Ｂ及びＣ）の写真である。
図１５は、マイクロサテライトマーカーによる親子鑑定の結果を示す図である。
図１６は、得られた産仔の毛根サンプルのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。
図１７は、得られたヒトパーキンソン病モデルコモンマーモセットの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
新世界サルの一種であるコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）等のマーモセットは、ヒトに近縁な真猿類に属する超小型サルであり、大型サルに比べて繁殖効率が良くしかも小型で取り扱いが容易である。マーモセットの妊娠期間は約１４４日と短い。また１２〜１８ヶ月で性的に成熟する。さらに、一度に２〜３頭の仔を産み、１頭のメスが生涯４０〜８０頭の仔を産む。
マーモセット等の霊長類動物のヒト疾患モデル動物は、霊長類動物において、ヒトの疾患に関与するヒト遺伝子に相当する霊長類動物のオルソログ遺伝子もしくはヒトの疾患に関与するヒト遺伝子を導入することによりこれらの原因遺伝子タンパク質を高発現させるか、霊長類動物のオルソログ遺伝子をノックアウトするか、あるいはヒトの疾患に関与するヒト遺伝子をノックインすることにより得ることができる。
ヒト疾患としては、パーキンソン病、ハンチントン病が挙げられる。パーキンソン病の疾患モデル動物は、霊長類動物に変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子を導入すればよい。ヒト野生型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。ヒトパーキンソン病の原因遺伝子となる変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子は、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質の３０番目のアラニンがプロリンに変異するように、３０番目のアラニンに対応する配列番号１６の１０１〜１０３番目の塩基配列（ｇｃａ）がｃｃｃ、ｃｃｔ、ｃｃａ又はｃｃｇに変異している。また、変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子は、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質の５３番目のアラニンがトレオニンに変異するように、５３番目のアラニンに対応する配列番号１６の１７０〜１７２番目の塩基配列（ｇｃａ）がａｃｕ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇに変異している。本発明においては、ヒトの野生型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子をベースに、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質の３０番目のアラニンがプロリンに置換し、さらに５３番目のアラニンがトレオニンに置換するような塩基の変異を有する変異遺伝子をパーキンソン病の原因となるヒトの変異型のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子という。例えば、配列番号１６に示す塩基配列において、１０１番目のｇがｃに、１７０番目のｇがａに変異している。また、変異型α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質は、配列番号１７に示すアミノ酸配列において、３０番目のアラニンがプロリンへ、５３番目のアラニンがトレオニンへ変異している（配列番号１８）。霊長類動物がマーモセットの場合、マーモセットの野生型のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子は、配列番号１６に塩基配列を示すヒトの野生型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子の１７０〜１７２番目の塩基配列がｇｃａであるのに対してａｃａであり、マーモセットの野生型のα−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質は、ヒトの野生型α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質の５３番目のアミノ酸がアラニンであるのに対してトレオニンである。従って、変異型ヒトα−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質は野生型のマーモセットα−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質の３０番目のアラニンがプロリンに変異したタンパク質と同一である。配列番号１９にヒトパーキンソン病モデルマーモセットに導入し得る変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子配列の一例を示す。配列番号１９の塩基配列においては、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質の３０番目のアラニンに対応する塩基配列（ｇｃａをｃｃｃに変異）のみならず、３１番目のグリシンに対応する塩基配列も野生型遺伝子に対して変異させている（ｇｇａをｇｇｇに変異）。但し、３１番目のグリシンに対応する塩基配列の変異はアミノ酸の置換をもたらさない。この変異は、変異型遺伝子の選抜の際の便宜を図ったためである。即ち、３０〜３１番目のアミノ酸に対応する塩基配列がｃｃｃｇｇｇとなることで、新たに制限酵素ＳｍａＩの認識配列（野生型には存在しない配列）が生じ、変異体選抜の際、ＳｍａＩによって消化されるクローンを選抜することで、目的の変異導入体の選抜が容易となる。
例えば、配列番号１９に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号１９に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡであって、霊長類動物に導入した場合に、ヒトのパーキンソン病の症状を呈するヒトパーキンソン病モデル霊長類動物を得ることできる。ここで、１又は数個とは、１〜５個、好ましくは１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１若しくは２個、特に好ましくは１個をいう。さらに、配列番号１９に示す塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有しており、かつ霊長類動物に導入した場合に、ヒトのパーキンソン病の症状を呈させることができるＤＮＡを導入することもできる。さらに、配列番号１９に示す塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ霊長類動物に導入した場合に、ヒトのパーキンソン病の症状を呈させることができるＤＮＡを導入することもできる。ここでストリンジェントな条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載された条件である。Ｓａｍｂｒｏｏｋらによれば、５×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩のハイブリダイゼーション条件が挙げられる。また、より高温のハイブリダイゼーションと洗浄も含まれる。その際、プローブの長さ等の各種要因に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節され得る。例えば、５×ＳＳＣ以下で２０℃以上の範囲の条件を採用することができる。
ヒトの変異型のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子を霊長類動物に導入した場合、得られたトランスジェニック霊長類動物において、その霊長類動物が元来有するα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子とヒトの変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子が共存する。ヒトの変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子の発現産物がヒトのパーキンソン病の症状を呈する原因となる。なお、この際、相同組換え等により霊長類動物が元来有するα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子をヒトの変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子に置き換えることもできる。
又はンチントン病の疾患モデル霊長類動物は、ヒトｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子（ＨＴＴ遺伝子）の第１エクソンに３７〜８７６のＣＡＧ配列の繰り返し配列が存在する変異型を霊長類動物に導入することにより作出することができる。
これらのヒト疾患の原因遺伝子を霊長類動物に導入することにより、トランスジェニック霊長類動物はヒトの前記疾患の病態を呈するようになる。例えば、パーキンソン病モデル霊長類動物の場合、生後１〜数年で、振戦、無動、筋強剛、姿勢反射障害、神経細胞のドーパミンの減少等の症状を呈するようになる。又はンチントン病の場合、大脳基底核や前頭葉の萎縮、痴呆症状、てんかん等の症状を呈するようになる。疾患によっては、その症状を呈するようになるまでに時間がかかる場合があり、本発明においては、症状を呈する前の、原因遺伝子を導入したトランスジェニック霊長類動物も疾患モデル動物という。
本発明のトランスジェニック霊長類動物においては、導入した外来遺伝子であるトランスジーンが生殖系列へ伝播し、生殖系列を介して子孫に伝播される。すなわち、本発明のトランスジェニック霊長類動物は生殖系列伝播能を有し、子孫においても、トランスジーンの発現が認められ、ヒト疾患モデル霊長類動物の子孫もヒト疾患モデル霊長類動物として利用することができる。生殖系列伝播は、例えば、初代のトランスジェニック霊長類動物より生殖細胞（卵又は精子）を採取し、それを正常霊長類動物から採取した生殖細胞と受精させ、受精卵を発生させ、トランスジーンの存在を検出することにより確認することができる。
トランスジェニック霊長類動物の作出は、以下の工程を経て作出する。従って、以下の工程のそれぞれを最適化し、それを組み合わせて初めて効率的にトランスジェニック霊長類動物を作出することが可能になる。
（ａ）霊長類動物の受精卵を採取し回収する工程、又は未受精卵を採取し卵を体外受精させる工程；
（ｂ）初期胚に外来遺伝子を導入して遺伝子操作をする工程；
（ｃ）受精卵又は初期胚を保存する工程；
（ｄ）初期胚を雌霊長類動物仮母に移植し、発生させる工程。
上記の工程の順序は複雑であり、必ずしも（ａ）から（ｄ）の順番で行われるのではない。
以下、それぞれの工程について詳細に説明する。以下の説明においては、主に霊長類に属するマーモセットを例にしているが、本発明の方法は他の霊長類やウシ等初期胚の囲卵腔の容積が小さい哺乳類に適用することができる。
（１）マーモセットの未受精卵を採取する工程
未受精卵は、マーモセットの卵巣を刺激することにより採取することができる。卵巣を刺激する方法として、例えば性成熟に達した雌のマーモセットに卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を投与し、さらに絨毛性性腺刺激（ＣＧ）ホルモンを投与する方法が挙げられる。ＦＳＨ及びＣＧは、マーモセットのものを用いることもできるし、ヒトを含む他の霊長類に属する種のものを用いることもできる。また、天然のホルモンを用いてもよいし、組換えホルモンを用いてもよい。入手の容易性の観点からヒトの組換えＦＳＨ（ｈＦＳＨ）又はＣＧ（ｈＣＧ）を好適に用いることができる。投与するＦＳＨの濃度は、１００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１００〜７５０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは１００〜５００であり、投与する量は１０〜１００ＩＵ／頭である。投与は６〜１５日間、好ましくは７〜１５日間、さらに好ましくは８〜１５日間、さらに好ましくは９〜１５日間、さらに好ましくは１０〜１５日間、特に好ましくは１０又は１１日間連続で投与する。投与方法は、筋肉内投与が好ましい。
ＦＳＨを上記期間毎日投与した後、ＣＧを投与する。投与するＣＧの濃度は、１００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１００〜７５０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは１００〜５００ＩＵ／ｍｌであり、投与する量は１０〜１００ＩＵ／頭である。投与はＦＳＨの投与後、７〜２１日、好ましくは１０〜１５日、さらに好ましくは１２日で行う。投与方法は、筋肉内投与が好ましい。
ＣＧの投与から１５〜３０、好ましくは２０〜２５、さらに好ましくは２１又は２２時間後に卵胞卵子を採取する。卵胞卵子の採取は、例えば外科的手術法を用いた吸引採取により行うことができる。
（２）採取した未受精卵の体外成熟
採取した卵子を、霊長類の卵子成熟に適した培地中で数時間から数日、好ましくは一晩培養することにより、体外成熟（ＩＶＭ）させる。体外成熟に用いる培地としては、Ｗａｙｍｏｕｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩＶＭ培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ社）等を用いることができるが、ＩＶＭ培地が体外受精後の胚の発生率の高さの観点から望ましい。成熟させた卵子を精子を用いて体外受精により受精させる。受精させた後に、ＩＳＭ１培地やＩＳＭ２培地で培養することにより、初期胚まで発生させる。ここで、初期胚とは前核期から胚盤胞期の胚をいう。外来遺伝子を導入し、トランスジェニックマーモセットを作出するためには、前核期（ＰＮ期から２ＰＮ期）から桑実胚期の胚が好ましい。
（３）マーモセットの初期胚の保存
得られたマーモセットの初期胚は必要に応じて凍結保存する。
この際、多価アルコールとして、１０〜１５％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコールのみを含むリン酸緩衝液をベースとする哺乳動物初期胚又は哺乳動物ＥＳ細胞用ガラス化保存液（特開２００７−１０５０１３号公報）を用いるのが好ましい。該ガラス化保存液は、リン酸緩衝液をベースとする保存液であり、修正リン酸緩衝液（ＰＢ１）にプロピレングリコールを添加したＰＢ１０、並びにＰＢ１にプロピレングリコール、エチレングリコール、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）及びスクロースを添加したＰＥＰｅＳがある。Ｐ１０は、ＰＢ１に５〜１５％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０〜１５％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１０％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコールを添加したものである。また、ＰＥＰｅＳは、ＰＢ１に５〜１５％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０〜１５％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１０％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコール、２５〜３５％（ｖ／ｖ）、好ましくは３０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコール、１５〜２５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、及び０．２Ｍ〜０．５Ｍ、好ましくは０．３Ｍのスクロースを添加したものである。マーモセットの初期胚をガラス化保存液Ｐ１０に１〜２０分間、好ましくは３〜１５分間、さらに好ましくは５〜１０分間浸漬する。浸漬は室温（２２〜２５℃）で行えばよい。次いで浸漬により前処理した胚をガラス化保存液Ｐ１０と共に凍結保存チューブに入れ、数十秒から数分間、好ましくは３０秒〜２分間、さらに好ましくは１分間、０℃〜５℃、好ましくは０℃で冷却する。その後、Ｐ１０に入れたまま、ガラス化保存液ＰＥＰｅＳに入れて−１９６℃以下の低温で凍結すればよい。凍結保存した初期胚は、例えば凍結胚を含む凍結チューブを液体窒素から取り出し、１０秒から６０秒、好ましくは約３０秒室温に置き、その後５〜１０倍量の室温に保持した融解用溶液を注入し、融解させ、その後、融解用溶液で胚を洗浄すればよい。融解用溶液は限定されないが、例えば、上記のＢＰ１に０．２〜０．５Ｍ、好ましくは０．３Ｍのスクロースを添加した溶液を用いることができる。
（４）マーモセット初期胚の遺伝子操作による形質転換
遺伝子操作は、マーモセットの初期胚において、ヒトの疾患に関与する遺伝子を導入するか、又はヒトの疾患に関与するマーモセットにおけるヒト遺伝子のオルソログ遺伝子をノックアウトすることにより行う。本発明において、ヒトの遺伝子を導入したマーモセット及び遺伝子をノックアウトしたマーモセットをトランスジェニックマーモセットと呼ぶ。導入する遺伝子又はノックアウトする遺伝子は、疾患の種類による。ヒトの疾患に関与する遺伝子を導入する場合、該遺伝子を相同組換え等により、マーモセットのその遺伝子のオルソログ遺伝子と置き換えてもよい。
遺伝子の導入及びノックアウトは、公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
マーモセットに導入するＤＮＡは、マーモセット細胞中で発現可能なプロモータと連結する。発現可能なプロモータとして、例えば、ＣＡＧ（ニワトリβアクチン）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモータ、ＥＦ１α（エロンゲーションファクター１α）プロモータなどの哺乳動物細胞由来のプロモータや、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータ、レトロウイルスプロモータ、ポリオーマウイルスプロモータ、アデノウイルスプロモータなどのウイルスプロモータが挙げられる。これらのプロモータのうち、ＣＡＧプロモータ及びＣＭＶプロモータが好ましい。また、遺伝子の発現を増強するエンハンサーを組込んでもよい。導入しようとする遺伝子をプロモータと作動可能に連結し、ベクターに導入する。ベクターとしては、導入遺伝子を動物の生体内で発現誘導させることができるものであればよく、あらかじめプロモータが組込まれたベクターを用いてもよい。ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターが好ましい。ベクターの中でも、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター、が好ましい。レンチウイルスとしては、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられる。例えばＳＩＮベクター（ＳＩＮ第３世代ＶＳＶ−Ｇシュードタイプヒト免疫不全ウイルスベクター（第３世代レンチウイルスベクター）（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，８１５０−７（１９９８））を好適に用いることができる。
ウイルスベクターは、初期胚の囲卵腔又は胚盤胞の胚盤腔へ注入（インジェクション）すればよい。初期胚は、人工受精により得られた胚でもよいし、自然交配により受精した着床前の胚を用いてもよい。注入するウイルスベクターの力価は高いほうがよく、例えば胚１個当たり１．３×１０３〜１．３×１０５ＣＦＵの力価で注入することが望ましい。初期胚としては、前核期（ＰＮ期から２ＰＮ期）から桑実胚期の胚が好ましい。この際、細胞質を一時的に縮小させるために、初期胚を０．２Ｍ〜０．３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍのスクロースに入れて行う。この操作により囲卵腔の容積が大きくなりウイルス液がより大量に注入される。この結果、初期胚に多くの外来遺伝子が導入され、形質転換が起こりやすくなる。霊長類動物の初期胚を用いた場合、囲卵腔の容積は約１．２倍〜１０倍、好ましくは約１．２倍〜８倍、さらに好ましくは約１．３倍〜８倍、さらに好ましくは約１．５倍〜８倍、あるいは約１．２〜６．５倍、好ましくは１．３〜６．５倍に増加する。一例では、マーモセットの前核期の胚の囲卵腔の容積は約３１．５ｐｌであるが、スクロース処理することにより約２３１ｐｌと約７．３倍に増加する。すなわち、本発明の方法においては、スクロース処理により、霊長類動物の初期胚の囲卵腔の容積を、スクロース処理していない囲卵腔の容積に対して、約１．２倍〜１０倍、好ましくは約１．３倍〜８倍、さらに好ましくは約１．５倍〜８倍、さらに好ましくは約２倍〜８倍に増大させる。増大後の囲卵腔の容積は、１００〜５００ｐｌ、好ましくは１５０〜４００ｐｌさらに好ましくは２００〜３００μｌである。この結果、同時に調製した外来遺伝子を含むベクターを用いる場合、スクロース処理した初期胚においては、スクロース処理しない初期胚に対して、約１．２倍〜１０倍、好ましくは約１．３倍〜８倍、さらに好ましくは約１．５倍〜８倍、さらに好ましくは約２倍〜８倍の量の遺伝子を初期胚に導入することができる。この際スクロース濃度が高すぎると胚に対して毒性を示すので、スクロースは０．３Ｍ以下の濃度で用いることが望ましい。
本発明の初期胚に遺伝子導入を行なう際に、初期胚をスクロース処理する方法は、囲卵腔が小さく十分な量のウイルスベクター液を注入することができない哺乳動物に適用することができる。このような胚の囲卵腔が小さい哺乳動物として、霊長類に属する哺乳類、ウシ等が挙げられる。
ノックアウトマーモセットは相同組換え等の公知の方法で作製することができる。相同組換えとは、細胞内で２つのＤＮＡ分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象である。相同組換えにおいては、標的とする遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、プロモータと外来遺伝子を連結したトランスファーベクターを構築し、これを、初期胚に導入すると、細胞の遺伝子とトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたプロモータと外来遺伝子が細胞のゲノム中に組み込まれ、標的遺伝子が分断されて機能を失い該遺伝子がノックアウトされる。トランスファーベクターは、標的遺伝子の塩基配列情報を基に設計・作製することができ、該トランスファーベクターを用いて破壊しようとする遺伝子を相同組換えすればよい。トランスファーベクターは、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ他編、加藤郁之進  監訳ＤＮＡクローニング４−哺乳類のシステム−（第２版）ＴａＫａＲａ等に記載の方法に従って作製することができる。ベクターとしては、上記の種々のウイルスベクターを用いることができるが、レンチウイルスベクターが好ましい。また、リコンビナーゼと該リコンビナーゼの認識部位を利用した方法によっても相同組換えにより標的遺伝子をノックアウトすることができる。該方法においては、マーモセットにノックアウトしようとする標的遺伝子を前記リコンビナーゼの認識部位のヌクレオチド配列で挟んだＤＮＡ及び前記リコンビナーゼの上流にプロモータを連結したＤＮＡを導入する。前記リコンビナーゼが発現されると、リコンビナーゼ認識部位で挟まれた標的遺伝子が切り出されて機能を失う。このような方法としてＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用した方法が挙げられる。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５１６６−５１７０，１９８８；Ｇｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７３，１１５５−１１６４，１９９３等に記載されており、これらの記載に従いＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いて標的遺伝子をノックアウトしたマーモセット初期胚を作出することができる。
（５）遺伝子操作を行ったマーモセット初期胚のマーモセット仮母への移植
仮母への移植は、公知の方法で仮母の子宮に移植すればよい。
この際、仮母となるレシピエントマーモセットと胚のドナーとなるドナーマーモセットは、性周期（排卵周期）の同期化を施しておく。性周期同期化は、プロスタグランジン等の性ホルモンを投与することにより行うことができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ホルモン剤を用いた卵巣刺激法の検討
マーモセットを用いた発生工学の基礎研究として、コモンマーモセットの卵巣刺激法の検討を行った。
性成熟に達したメス個体に、５０ＩＵ／頭のヒト組換え卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）を５日間、１０日間、及び１１日間継続して筋肉内投与し、ｈＦＳＨ投与開始から１２日後に７５ＩＵ／頭のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を筋肉内投与し、ｈＣＧ投与から２１時間〜３７時間後に外科的手法を用いて卵胞卵子を吸引採取した。その後５％ＣＯ２下でＷａｙｍｏｕｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて一晩培養し、卵子の体外成熟（ＩＶＭ）培養を行い、体外受精（ＩＶＦ）を行うことにより、卵巣刺激法を検討した。
その結果、ＦＳＨ投与期間５日間、１０日間及び１１日間において、平均採取卵子数はそれぞれ９．０±５．７個、１２．８±６．７個、１４．７±８．１個であり、統計的に有意な差は認められなかったが、ｈＦＳＨ投与期間が長くなるのに比例して得られる卵子数が多くなる傾向が認められた。またＩＶＭ率はそれぞれ３０．２％、８４．５％及び６７．４％であり、ｈＦＳＨ投与日数が１０日、１１日のグループは５日間のグループより有意（ｐ＜０．０１）に高いＩＶＭ率が認められた。またＩＶＦ率（０％，３５％及び４０％）においても同様に有意（ｐ＜０．０１）な差がみられた。
次いで卵子の成熟開始を促すヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の暴露時間を検討した。ｈＣＧ投与後２１〜２２時間、２３〜２５時間及び３１〜３７時間に採卵を行い、採卵個数、ＩＶＭ率及び体外受精率について検討を行った。その結果、平均採卵個数はそれぞれ２０．４±１２．８個、１０．６７±４．０個及び３．６７±１．５個であり、ｈＣＧ投与後２１〜２２時間に採卵すると有意（Ｐ＜０．０１）に採卵個数が多かった。ＩＶＭ率はそれぞれ７２％、５４．３％及び１００％であり、ｈＣＧ投与後３１〜３７時間に採卵すると有意（Ｐ＜０．０５）にＩＶＭ率が高いことが示された。また、体外受精率はそれぞれ３６．３％、２２．８％及び７６．７％であった。
以上の結果から、採卵個数、卵子成熟率及び体外成熟率とのバランスを考えるとｈＦＳＨの投与は、１０又は１１日間が適当であり、ｈＣＧの暴露時間は２１〜２２時間が適当であることがわかった。
【実施例２】
【０００７】
体外受精法の検討
体外受精を行うためには、卵胞卵子採取、卵子の体外成熟、体外受精というステップが必要である。そこで、体外受精法の検討の第一段階として、体外成熟培地の検討を行った。これまでにサル類の卵子成熟に適していると報告があったＷａｙｍｏｕｔｈ培地とヒトの不妊治療で用いられているＩＶＭ培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ社）とを比較をした。その結果、ＩＶＭ培地の卵子成熟率（３９．７％）はＷａｙｍｏｕｔｈ培地での成熟率（６１．５％）に比べて有意に低いが、ＩＶＭ培地中で成熟した卵子の体外受精後の胚盤胞までの発生率（２２．２％）はＷａｙｍｏｕｔｈ培地のそれ（４．３％）と比較すると有意に高かった。
以上より、体外受精する胚はＩＶＭ培地で成熟させ、子宮へ移植することがよいことがわかった。
【実施例３】
【０００８】
コモンマーモセット初期胚の仮腹への移植方法の条件検討
体外受精により得られた受精卵２５７個及び自然交配により受精した受精卵４９個を子宮及び卵管に移植し、これらの受精卵の発生能及び移植法について検討した。体外受精により得られた受精卵を移植した結果、３匹の産仔が得られ、出生率は１．２％であった。一方、自然交配による受精卵を移植した場合、９匹の産仔が得られ、出生率は１８．４％であり、自然交配卵の出生率は有意（Ｐ＜０．０１）に高かった。更に、受精卵の移植部位について卵管（ｎ＝１４０）及び子宮（ｎ＝１６６）で出生率を比較した。その結果、卵管に移植した場合の出生率は２．１％、子宮に移植した場合の出生率は５．４％であり、移植部位による出生率の有意な差は認められなかった。
【実施例４】
【０００９】
コモンマーモセット配偶子及び初期胚の凍結保存方法の検討
コモンマーモセットの初期胚の保存は未だ十分な検討がなされていない。そこで、桑実歴〜胚盤胞の保存方法について検討した。これらのコモンマーモセット胚（ｎ＝６）を本発明者等が開発したガラス化保存液（特開２００７−１０５０１３号公報）を用いて保存を行った。この胚を１２〜２０日間液体窒素中で保存したのち、加温液によって加温を行った。その結果、全ての胚が拡張胚盤胞への発生が認められた。このことから、この方法はコモンマーモセット初期胚にも応用可能であることが判明した。
【実施例５】
【００１０】
レンチウイルスベクター液の注入法の検討
ＰＮ（一前核）胚を０．２５Ｍスクロース又はスクロースを含まないＭ２培地中に入れ、その後ＥＧＦＰを導入したレンチウイルスベクターを囲卵腔（卵黄周囲腔）に注入した。胚盤胞期の胚の場合、ウイルスを胞胚腔に注入した。胚への注入はＤＮＡ注入針を用いて行った。プロモータは、ＣＡＧプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＰＧＫプロモータ又はＥＦ１αプロモータを使用した。
図１にレンチウイルスベクターの囲卵腔への導入の方法の概要を示す。
図２にレンチウイルスベクター液を注入した直後のＰＮ胚の写真を示す。図２Ａが０．２５Ｍスクロース溶液を用いたもの、図２ＢがＭ２培地を用いたものである。図２に示すようにスクロース液中でレンチウイルスベクター液を注入したＰＮ胚ではウイルス液が囲卵腔の全体に認められるのに対し、Ｍ２培地中でレンチウイルスベクターを注入したＰＮ胚では注入部周辺のみにレンチウイルスベクターが認められた。
図３にレンチウイルス液注入２．５日から８．５日のＰＮ胚の写真を示す。図３Ａが０．２５Ｍスクロース溶液を用いたもの、図３ＢがＭ２培地を用いたものである。
表１にスクロースを用いた場合と用いない場合の遺伝子の発現率を示す。表１に示すように、スクロースを用いた場合に、ＧＦＰの発現効率が顕著に高かった。
【表１】
2009096101.tif 000002
ただし、スクロースの濃度が高すぎる場合は、胚に対して毒性が認められる。
【実施例６】
【００１１】
コモンマーモセット初期胚への遺伝子導入
Ａ．方法
（１）  ホルモン剤を用いた卵巣刺激による未受精卵採取
マーモセットは２歳を越えた年齢のものを用いた。
性成熟に達したメス個体に、５０ＩＵ／頭のヒト組換え卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）を１１日間継続して筋肉内投与し、ｈＦＳＨ投与開始から１２日後に７５ＩＵ／頭のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を筋肉内投与し、ｈＣＧ投与から２１時間〜３７時間後に２．３ｍｌのシリンジ及び２３ゲージの注射針を用いて外科的手術により卵胞卵子を吸引採取した。卵胞卵子の吸引は１０％ＦＢＳを含むＷａｙｍｏｕｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ中で行った。培地中から卵母細胞を採取し、２回洗浄し、５％ＣＯ２、３８℃の条件下でＷａｙｍｏｕｔｈ  ｍｅｄｉｕｍを用いて２４時間培養した。培養後成熟卵母細胞（中期ＩＩ）のみを集め体外受精（ＩＶ）に用いた。
（２）精液の採取及び精子の調製
Ｆｅｒｔｉ  Ｃａｒｅ  ｐｅｒｓｏｎｅｌ  ｖｉｂｒａｔｏｒ（Ｋｕｅｄｅｒｌｉｎｇ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ  ５２，１４９−５４（２０００））を用いてマーモセットの精液を採取した。精液をＴＹＨ培地に集め３ｍｌのＴＹＨ培地で２回洗浄した。３００μｌのＴＹＨ培地を添加し、ＣＯ２インキュベータ中に３０℃、１０分間置き精子を泳がせた。
（３）体外受精（ＩＶＦ）
ヒアルロニダーゼ処理した卵母細胞をＴＹＨ培地で洗浄し、７０μｌを液滴として分注した。７０μｌ中には最大で１０個の卵母細胞が含まれていた。この液滴に上記の方法で調製した精子１０μｌを添加した。この際の最終精子濃度は、５×１０９精子／ｍｌであった。精子添加の２６〜３０時間後に、卵母細胞を採取し、ＩＳＭ１培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ）で洗浄した。受精卵をＩＳＭ１培地で４８時間培養し、マウス胎児フィーダー細胞を含むＩＩＳＭ２培地に写し、培養した。
（４）胚の採取及び胚移植
ドナー及びレシピエントコモンマーモセットにプロスタグランジンＦ２αアナログであるクロプロステノール（Ｃｌｏｐｒｏｓｔｅｎｏｌ）（Ｅｓｔｒｕｍａｔｅ，Ｔａｋｅｄａ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｋ．Ｋ．）０．７５ｍｇ／頭を黄体期の１０日後に投与することにより排卵周期を同期化させた（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  ７３，１３３−８（１９８５））。血漿サンプル０．１ｍｌをクロプロステノール投与２、９、１１及び１３日後に大腿静脈より採取し、排卵日をＲＩＡを用いた血漿プロゲステロンレベルの測定により決定した。血漿プロゲステロンレベルが１０ｎｇ／ｍｌに達する日を排卵日（０日目）とした。排卵日の７〜１０日後にドナーマーモセットに麻酔をかけ、卵をコモンマーモセットより採取した。子宮頸部と両方の卵管を正中線開腹により体外に出し、クランプで挟み、子宮ルーメンを近接端部から子宮頸部まで１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含む２．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄａｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で洗い流した。洗い流しに用いた培地を子宮ルーメンに置いた２３ゲージ注射針を用いて子宮底部から回収した。胚採取の４日後にクロプロステノールをさらに投与した。血漿プロゲストステロン濃度をＤＰＣプロゲステロンキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて決定した。
ドナーとの排卵周期を同期化させたレシピエントコモンマーモセットに麻酔をかけ、子宮及び卵巣を正中線開腹により体外に出した。子宮頸部から子宮の近接端部に子宮ルーメンを通して、２３ゲージの注射針を突き通した。１から３個の胚をグラスキャピラリーピペットを用いて子宮ルーメンに移植した。胚移植後、レシピエントは腹部を通した子宮の触診により妊娠をモニタできるようになるまで、１週間に１度血漿プロゲステロンを測定することにより妊娠成立の有無を調べた。
（５）レンチウイルスベクターの調製及び導入
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞を１０％加熱不活化ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２５０ｎｇ／ｍｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂを添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。ＣＭＥＳ中に外来ＤＮＡを導入するために、ＳＩＮベクターシステムを用いた。４つの異なるプロモータＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ−１α及びＰＧＫプロモータを有するＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する３種類のベクターを構築し、それぞれＣＡＧ−ＥＧＦＰ、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ＥＦ１α−ＥＧＦＰ及びＰＧＫ−ＥＧＦＰと名付けた。
レンチウイルスベクターは、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて２９３Ｔ細胞にベクターとパッケージング構築物をＶＳＶ−Ｇ及びＲｅｖ発現構築物と共に同時トランスフェクトすることにより作製した。トランスフェクションの４日後に、培地に含まれるウイルス粒子を回収し、０．２２μｍフィルターに通し、４℃、２５，０００ｒｐｍ、４時間遠心分離を行った。ウイルスの沈殿物をＩＳＭ２培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ）に、１／１０００容積のオリジナルのレンチウイルスベクター上清とともに懸濁した。
レンチウイルス導入は、コモンマーモセットの胚にウイルス溶液を注入することにより行った。２ＰＮ（２前核）胚から桑実胚まで、胚を０．２５Ｍスクロース中に入れ、その後ウイルスを囲卵腔（卵黄周囲腔）に注入した。胚盤胞期の胚の場合、ウイルスを胞胚腔に注入した。
すべての胚の注入はマイクロインジェクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｆｅｍｔｏｊｅｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ）及びマイクロマニュピレータ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）を用いて行った。
（６）ＲＴ−ＰＣＲ
Ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡを毛根、皮膚小片及び赤血球からＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ精製キット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ）を用いて単離した。ＲＮＡサンプルはＩｍｐｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて逆転写した。それぞれのＰｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡの半量は第１鎖ｃＤＮＡ合成のために逆転写酵素と反応させ、残りの半量は陰性対照として、逆転写酵素なしで反応させた。胎盤については、ＲＮＡ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて総ＲＮＡを単離した。１００ｎｇから１μｇの総ＲＮＡについて逆転写を行った。
ＰＣＲは１／４０〜３／２０のｃＤＮＡ合成反応混液を鋳型として用いて行った。１０μｌのＰＣＲミクスチャーは、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＫＣｌ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μＭのプライマー及び１．０ＵのＴａｑポリメラーゼを含んでいた。ＥＧＦＰ遺伝子発現を検出するために、９４℃３０秒間の変性、６２℃３０秒間のアニーリング、７２℃３０秒間の伸長からなる３５サイクルのＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列は以下のとおりであった。
2009096101.tif 000003
βアクチン発現を検出するために、９４℃３０秒間の変性、５８℃３０秒間のアニーリング、７２℃３０秒間の伸長からなる３０サイクルのＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列は以下のとおりであった。
2009096101.tif 000004
（７）免疫組織化学分析
組織をＯＣＴコンパウンドに包埋、液体窒素中で凍結し、分析するまで−８０℃に保存した。塊を５μｍの切片とし、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間固定した。内因性のペルオキシダーゼ活性を０．０３％過酸化水素水を用いて室温で３０分間処理することにより抑え、５分間水で洗浄し、次いでＰＢＳで２分間洗浄した。スライドを１０％ヤギ血清（ニチレイ）を用いて１０分間室温でブロッキング処理し、ウサギ抗Ｐ．ｖ抗体と４℃でオーバーナイトで反応させた。ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、スライドをビオチン化２次抗体、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＭＡＸ  ＰＯ（ニチレイ）と室温で３０分間反応させＰＢＳを用いて３回洗浄した。結合したモノクローナル抗体の局在はＤＡＢ（３，３，−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体により検出した。その後、サンプルをＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ及びｅｏｓｉｎ）で染色し、包埋した。
（８）ＦＡＣＳ分析
末梢血サンプルを２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、全血細胞を採取し１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。全血細胞を０．１３ＭのＮＨ４Ｃｌに懸濁し２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳで再度洗浄した。沈殿をマウスＩｇＧ１抗マーモセットＣＤ４５，６Ｃ９抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。サンプルをＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体と混合し氷上で３０分間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーションの後、サンプルをＰＢＳで洗浄し、２００μｌのＰＩ溶液に懸濁し、ＦＡＣＳ分析を行った。
（９）サザンブロット分析
ゲノムＤＮＡを皮膚、全血細胞及び胎盤の線維芽細胞からＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ＣＡＧ−ＥＧＦＰを注入した動物のゲノムＤＮＡはＢａｍ  ＨＩにより消化し、ＣＭＶ−ＥＧＦＰを注入した動物のゲノムＤＮＡはＥｃｏ  ＲＩを用いて消化した。サザンブロット分析はＤＩＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｒｏｃｈｅ）により行った。すなわち、５μｇのゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で２５ボルトでオーバーナイトで泳動させ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンに転写した。ＣＭＶ−ＥＧＦＰはＥｃｏ  ＲＩで消化し、その後ＰＣＲ  ＤＩＧ  ｐｒｏｂｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔによりＤＩＧで標識した。メンブレンをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｇｒａｎｕｌｅｓ（Ｒｏｃｈｅ）中でＤＩＧ標識プローブとハイブリダイズした。メンブレンを洗浄後、ハイブリダイズしたプローブを３０分間ブロッキング溶液に浸し、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼコンジュゲートと反応させた。メンブレンを洗浄後、ハイブリダイズしたプローブＣＳＰＤを用いて検出しＸ線フィルムに暴露した。
（１０）胎盤及び仔における導入遺伝子の定量
胎盤の小片及び成体動物の耳の皮膚サンプルを採取し、プロテイナーゼＫ処理を行った。ゲノムＤＮＡをＭａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＦＸ−９６００  Ｍａｇｎｉａ  Ｒ  Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いて抽出した。さらに、成体動物の全血サンプル及び新生仔の毛根から、それぞれＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。
ＥＧＦＰ導入遺伝子の検出は以下のＰＣＲプライマーセットを用いて行った。
2009096101.tif 000005
内在性のコントロール遺伝子であるβアクチン遺伝子の検出は以下のＰＣＲプライマーセットを用いて行った。
2009096101.tif 000006
ＥＧＦＰとβアクチンの遺伝子導入効率はほぼ同じであったので、ＥＧＦＰ導入遺伝子の相対的定量はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びｔｈｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｏｆ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ）を用いた比較ＣＴ法により行った。
（１１）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
導入遺伝子を検出するために、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。末梢血サンプルをフィトヘマグルチニン、コンカナバリン  Ａ、リポポリサッカライド及び２メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で数日間培養した。最終濃度３０μｇ／ｍｌのＢｒｄＵと共に数時間培養した後に、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌのコルセミドを培地に添加しさらに数時間培養した。リンパ球を回収し、低張溶液処理し、赤血球を除去し、沈殿をメタノール／酢酸（３：１  ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて固定した。固定をした後、細胞をスライドに拡げオーバーナイトで風乾させた、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて染色し、紫外線処理した。
ＣＡＧ−ＥＧＦＰをジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを用いて標識しプローブとして、３７℃オーバーナイトでハイブリダイズした。ストリンジェント条件でスライドを洗浄した後、抗Ｄｉｇ−Ｃｙ３を用いて結合した標識を検出した。染色体分析は、Ｌｅｉｃａ  ＣＷ４０００  ＦＩＳＨ及びＬｅｉｃａ  ＣＷ４０００  ｋａｒｙｏを用いた。
Ｂ．結果
（１）レンチウイルスベクターを用いたトランスジェニックコモンマーモセットの作出
遺伝子導入胚として、体外受精（ＩＶＦ）胚と自然交配により得られた着床前胚の両方を用いた。ＥＧＦＰ遺伝子の導入は３種類のプロモータ、ＣＡＧ、ＣＭＶ及びＥＦ１−αプロモータを含む３種類のＳＩＮベクターを用いて行った。それぞれのベクターは、ＣＡＧ−ＥＧＦＰ、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ及びＥＦ１α−ＥＧＦＰと名付けた。作製したＳＩＮベクターを胚の囲卵腔に注入した。コモンマーモセットの初期胚は囲卵腔が小さく、充分な量のウイルス液を注入できないため、ウイルスを注入しても導入遺伝子の発現率は４６％と低い。そこで、初期胚を０．２５Ｍスクロース液に入れ、細胞質を一時的に縮小させることによりウイルス液の注入量を増加させる方法を試みた。胚は、前核期から桑実胚期の胚を用いた。胞胚期の胚については、ＳＩＮベクターを胞胚腔に注入した。
総計２７の体外受精（ＩＶＦ）胚及び６４の自然交配により得られた着床前胚を高力価（５．６×１０９〜５．６×１０１１ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））のＳＩＮベクターを用いて注入した。表２に結果を示す。２７のＩＶＦ胚のうち１６胚、６４の着床前胚のうち４７胚について０．２５Ｍスクロースを用いてレンチウイルスベクターを注入した（表３）。０．２５Ｍスクロース処理により囲卵腔の容積は１．２倍〜６．５倍に増大した。ＩＶＦ胚のうち１１の胚について及び着床前胚のうち１５の胚については、胞胚期の胚を用い０．２５Ｍスクロースを用いずに胞胚腔にＳＩＮベクターを注入した。ＳＩＮベクターの注入後４８時間より後にＥＧＦＰ発現が起こるため、ＩＶＦ胚のうち４胚、着床前胚のうち１２胚は注入後すぐにレシピエント動物に移植した。そのため、胚の段階でのＥＧＦＰ発現は測定しなかった。レンチウイルスベクターを注入後４８時間でのＥＧＦＰ発現率はスクロース処理した着床前胚で８９．７％であり、処理しない胞胚期の胚で９２．９％であった。４８の着床前胚及び１７のＩＶＦ胚について、蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰの発現が認められた。６１の着床前胚及び１９のＩＶＦ胚を排卵周期をドナーと同期化させたレシピエント動物に移植した。それぞれのレシピエント動物には、周期当たり１〜３個の胚を移植した。代理母の総数は５１頭であった。ＩＶＦ胚又は着床前胚を移植したレシピエントのうち７頭が妊娠した。そのうち３頭は、それぞれ４３、６２及び８２日後に流産した。１４４〜１４７日目に、残った４頭から計５頭の健康な仔が産まれた。３頭は１頭ずつ産み、１頭は双子を産んだ。産まれた５頭の仔のうち、４頭がメスで、１頭がオスであった。産まれた５頭のうち、３頭はＣＡＧ−ＥＧＦＰを注入した胚由来であり、２頭はＣＭＶ−ＥＧＦＰを注入した胚由来であった（表４）。従って、プロモータとしては、ＣＡＧ又はＣＭＶが好ましい。また、表３に示すように、スクロース処理しない着床前（ＩＶＦ）胚を用いた場合、ＥＧＦＰの発現率は４０．８％であり、スクロース処理した着床前（ＩＶＦ）胚を用いた場合には、９７．７％であった。このＥＧＦＰの発現率はスクロース処理をすると有為に高かった（Ｐ＜０．０１）。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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（２）導入遺伝子の組込み
産仔における導入遺伝子の組込み、転写及び発現は、胎盤、体毛、皮膚及び血液を用いて検出した。通常マーモセットは分娩後に胎盤を食べてしまうので、個体番号Ｎｏ．５８４、５８８及び５９４／６６６の３つの胎盤のみ回収できた。コモンマーモセットの双子は胎盤が共通であるので、Ｎｏ．５９４と６６６の胎盤は共通である。
導入遺伝子の組込みは最初に出生直後に胎盤、毛根について、次いで生後１〜２ヶ月に皮膚及び血液から抽出したゲノムＤＮＡを用いたリアルタイムＰＣＲにより測定した。表５にリアルタイムＰＣＲの結果を非トランスジェニックコモンマーモセットの血液に対する相対的なＥＧＦＰ導入遺伝子量で示す。個体番号Ｎｏ．５８４及び５８８については、導入遺伝子の組込みが認められたが、Ｎｏ．５９４／６６６は極めて低い量の組込みしか認められなかった。体毛、耳の断片及び血液における導入遺伝子の組込みは個体番号Ｎｏ．５８４、５８７、５９４及び６６６で認められた。
サザンブロット分析は個体番号Ｎｏ．５８４、５８７、５９４及び６６６の皮膚片の培養線維芽細胞、５頭総ての仔の血液、個体番号Ｎｏ．５８４、５８８及び５９４／６６６の胎盤からの抽出ＤＮＡを用いて行った。Ｎｏ．５８８の線維芽細胞は培養しても増殖しなかったので、得られなかった。サザンブロット分析により少なくとも４コピーの導入遺伝子がＮｏ．５８４に組込まれ、２コピーの導入遺伝子がＮｏ．５８７に組込まれていることがわかった（図４）。さらに、Ｎｏ．５９４及び６６６の線維芽細胞及び末梢血細胞、並びにＮｏ．５８８の胎盤において、ゲノムへの複数の組込みが認められた。個体番号Ｎｏ．５８８においては、胎盤のみに導入遺伝子の組込みが認められ、Ｎｏ．５９４／６６６においては、胎盤への組込みは認められなかった（図４）。
導入遺伝子の染色体上の組込み部位を特定するために、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。サザンブロットと同様に、ＦＩＳＨにおいても末梢血リンパ球の染色体の複数の部位への組込みが認められた。さらに、総ての仔において、導入遺伝子の組込みパターンが異なる数種の細胞が認められた（表６）。個体番号Ｎｏ．５８４においては、４個の導入遺伝子の組込み部位が２、７、１１及び１３番染色体に認められ、Ｎｏ．５８７においては、末梢血リンパ球の第３及び１２番染色体において異なるシグナルが認められた。導入遺伝子の複数の組込みパターンを有するＮｏ．５８８、５９４及び６６６の末梢血リンパ球サンプルでは、ハイブリダイゼーションシグナルは認められなかった。個体番号Ｎｏ．５９４は少なくとも３つの異なるタイプの導入遺伝子の組込みが認められ、６以上のパターンの存在が示唆された。個体番号Ｎｏ．６６６は最も多くの組込みパターン、最大１３のパターンを有していた。さらに、１３の調べた核型の中で、個体番号Ｎｏ．５９４は造血系のキメラ双子であったため、８つのサンプルはメスの核型であった。
図５に生まれたトランスジェニックコモンマーモセットの写真を示す。
【表５】
2009096101.tif 000011
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【表６】
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（３）導入遺伝子の転写及び発現
ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＥＧＦＰ遺伝子ｍＲＮＡの転写がＮｏ．５８８を除く総ての仔の毛根において、そしてＮｏ．５８４及び５８７の全血で認められた。胎盤サンプルにおいては、ＥＧＦＰ遺伝子の転写はＮｏ．５８４、５８８及び５９４／６６６の総てのサンプルで認められた（図６）。
毛根、皮膚片及び胎盤サンプルを用いて蛍光顕微鏡によりＥＧＦＰの蛍光を直接検出した。切片サンプルを作製するため、耳皮膚の小片及び胎盤サンプルをＯＣＴコンパウンド（ｓａｋｕｒａ−ｆｉｎｅｔｅｋ）に包埋し、液体窒素で凍結させ、分析まで−８０℃に保存した。組織中でのＥＧＦＰの発現を確かめるため、免疫組織化学分析を耳皮膚の小片及び胎盤組織サンプルについて行った。免疫組織化学分析の結果、ＥＧＦＰが耳の皮膚及び胎盤の間質細胞で強く発現していることがわかった。Ｎｏ．５８８を除く総ての個体で毛根と皮膚でのＥＧＦＰの発現が認められた。Ｎｏ．５８４及びＮｏ．５８８の胎盤サンプルでは、ＥＧＦＰの高レベルの発現が認められたが、Ｎｏ．５９４／６６６の発現は検出できなかった（図７、８及び９）。
末梢血サンプルについては、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を行った。ＦＡＣＳにより、Ｎｏ．５８４及び５８７において、末梢血細胞でのＥＧＦＰの発現が認められた。それぞれの発現レベルは、それぞれ２２．８％及び２１．３％であった（図１０）。これらの血液細胞では、顆粒球、リンパ球及びマクロファージにおけるＥＧＦＰ発現レベルはＮｏ．５８４ではそれぞれ４３．４％、１５．９％、３６．５％であり、Ｎｏ．５８７ではそれぞれ４７．７％、９．２５％及び３２．０％であった。ＦＡＣＳの結果は、ＲＴ−ＰＣＲの結果に対応していた。
上記のように、本実施例において、４頭のトランスジェニックコモンマーモセットにおいて、体細胞に導入遺伝子が組込まれるだけでなく、導入遺伝子が発現していることが示された。本実施例の結果は、用いたＳＩＮベクターがトランスジェニックコモンマーモセット作出のための遺伝子導入に効果的であることを示している。さらに、本実施例においては、レンチウイルスの注入をできるだけ初期胚の段階で行ったことも成功に貢献している。
従来の方法と本実施例の方法との技術的な相違点は、本実施例の方法においては、自然交配した着床前胚を用いたこと、高力価のＳＩＮベクターを用いたこと、及び０．２５Ｍスクロースを用いたことである。
【実施例７】
【００１２】
トランスジェニックコモンマーモセットの生殖系列伝播
実施例６で得られた性的に成熟しているトランスジェニックコモンマーモセット（＃６６６及び＃５８４）を用いてトランスジーンの生殖系列伝播の有無を確認した。
精液サンプルを＃６６６個体から集め、生きている精子をＴＹＨ培地上でのｓｗｉｍ−ｕｐ法で集め、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。次いで、＃６６６から集めた精液を用いて以下の方法で体外受精（ＩＶＦ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を行い、トランスジーンを有している生殖細胞の受精能を分析した。
ヒアルロニダーゼ処理した卵母細胞をＴＹＨ培地を用いて洗浄し、７０μｌの液滴中に入れた。各ＴＹＨ液滴は、最大１０個の卵母細胞を含んでいた。精液１０μＬを卵母細胞インキュベーション液滴に添加した。精子の最終濃度は５×１０６精子／ｍＬであった。２６〜３０時間の受精の後、卵母細胞を受精液滴から除き、ＩＳＭ１培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ；Ｎｏｓａｎ社）で洗浄した。受精胚を４８時間ＩＳＭ１培地中で培養し、その後マウス胎児フィーダー細胞を含むＩＳＭ２（Ｎｏｓａｎ）培地に移した。
ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法で行った。
Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡは、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて組織サンプルから単離した。ＲＮＡサンプルを、Ｉｍｐｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＫＫ）を用いて逆転写した。各々のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルの半分を逆転写酵素と反応させて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、もう半分は逆転写酵素と反応させず陰性コントロールとして用いた。生殖系列トランスミッション分析のために、２〜８個の胚をＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＰＣＲは、１／１０の第１鎖ｃＤＮＡ及びＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＰＣＲ酵素（タカラ）を用いて行った。ＰＣＲ反応はメーカーのプロトコルに従って行った。ＥＧＦＰ遺伝子発現を検出するために、９８℃１０秒間の変性、６０℃１０秒間のアニーリング、７２℃３０秒間の伸長からなる３５サイクルのＰＣＲを行った。用いたプライマーは、ＥＧＦＰ５−４（５’−ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ−３’）（配列番号９）及びＥＧＦＰ３−３ｅｓ（５’−ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ−３’）（配列番号１０）であった。次いで、ＰＣＲ産物の１／１２．５をプライマー、ＥＧＦＰ５−６（５’−ＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣ−３’）（配列番号１１）及びＥＧＦＰ３−１（５’−ＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴ−３’）（配列番号１２）を用いて再増幅した。この際、９８℃１０秒間の変性、６０℃１０秒間のアニーリング、７２℃３０秒間の伸長からなる３５サイクルのＰＣＲを行った。βアクチン発現を検出するために、９４℃１０秒間の変性、６０℃１０秒間のアニーリング、７２℃３０秒間の伸長からなる３５サイクルのＰＣＲを行った。プライマーは、βアクチン００３（５’−ＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴ−３’）（配列番号１３）、βアクチン００６Ｒ（５’−ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列番号１４）及び００５Ｒ（５’−ＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号１５）を用いた。
その結果、＃６６６の生殖細胞中でトランスジーンの伝達と発現が認められた。図１１に、＃６６６からの泳ぐ精子及びＩＶＦ胚、並びに＃５８４及び野生型動物からの天然の胚のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。上の中央はＥＧＦＰを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示し、下はコントロールとして発現したβアクチン遺伝子を示す。
次いで、＃６６６から集めた精液を用いて体外受精（ＩＶＦ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を行い、トランスジーンを有している生殖細胞の受精能を分析した。蛍光顕微鏡により、２０〜２５％のＩＶＦによる胚がＥＧＦＰを強く発現していることが明らかになった。図１２に、ＩＶＦ胚の落射蛍光顕微鏡法分析による明視野（Ａ）と暗視野（Ｂ）を示す。＃６６６の精子とＩＶＦ胚は白い矢印によって示さている。残った胚は野生型である。＃６６６のＩＶＦ胚のみがＥＧＦＰを発現していた。図１２は、ＩＶＦ胚のＥＧＦＰの高い発現を示す。一方、３つの未着床の生きた天然の胚を＃５８４から採取したところ、これらの胚の１つはＥＧＦＰを強く発現していた。＃６６６からのＩＶＦ胚及び＃５８４からの２つの天然の胚盤胞について、ＲＴ−ＰＣＲによりＥＧＦＰトランスジーンを発現していることが確認された。
【実施例８】
【００１３】
変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（ＳＮＣＡ）過剰発現によるパーキンソン病モデルコモンマーモセットの作出
ヒトの家族性パーキンソン病（ＰＡＲＫ１）ではα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子が変異しており、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質はアミノ酸配列の３０番目のアラニン（Ａ）がプロリン（Ｐ）へ５３番目のアラニン（Ａ）がトレオニン（Ｔ）へ変異している。コモンマーモセットα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングし、ヒトの家族性パーキンソン病変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子に対応する変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子を作製し、ＥＦ１αプロモータの下流にマーモセット変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子と赤色蛍光タンパク質ｍＲＦＰ遺伝子とを２Ａペプチド配列で挟み両遺伝子の融合タンパク質を発現するレンチウイルスベクターを作製した。この際、プロモーターはＥＦ１αを用いた。図１３にレンチウイルスベクターの構造を示す。
実施例１及び２に記載の方法で、卵巣刺激、採卵を行い、体外成熟させた成熟卵子に０．２〜０．３Ｍスクロース溶液中でコモンマーモセット変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子と赤色蛍光タンパク質ｍＲＦＰ遺伝子とを２Ａペプチド配列で挟み両遺伝子の融合タンパク質を発現するウイルスベクターをＭＩＩ期の卵子へ注入し、その後人工受精（ＩＶＦ）した。変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子と赤色蛍光タンパク質ｍＲＦＰ遺伝子は２Ａペプチドにより発現後分離するため、両タンパク質は１：１の分子量で発現する。ＭＩＩ期卵子へ遺伝子を導入することにより、モザイク率の低いトランスジェニック動物の作出が可能となる。蛍光顕微鏡下で赤い蛍光タンパク質を発現している桑実胚受精卵のみを借り腹コモンマーモセットの子宮内へ移植を行った。図１４に体外受精（Ａ）及び発生した桑実胚（Ｂ及びＣ）の写真を示す。
その結果、２匹の産仔が得られた。コモンマーモセットマイクロサテライトマーカーを用いた親子鑑定の結果、卵子、精子提供動物由来の個体であることが明らかとなった。毛根のサンプルを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果、得られた産仔２匹のいずれもが、ｍＲＦＰ、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子を毛根で発現していることが示された。α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子は、非遺伝子導入個体も保有しているが、毛根では発現していないので、差異が認められる。図１５にマイクロライトマーカーによる親子鑑定の結果を示す。図中、下の２つのサンプル（Ｉ２３４３仔１及びＩ２３４３仔２）は産まれた仔を示す。図に示すように、１ＣＪ００３−ＮＥＤマーカー及びＣＪ０９１−ＦＡＭマーカーのジェノタイプがサンプルＩＨ５５５のものと一致し、ＣＪ０８１−ＶＩＣマーカーがＩ２９９１のジェノタプと一致していた。この結果は、生まれてきた仔がドナー（Ｉ２９９１及びＩＨ５５５）由来の仔であることを示す。図１６に得られた産仔の毛根サンプルのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図１６の左及び中央のレーンは産仔の毛根サンプルであり、右は野生型コモンマーモセットのサンプルである。図１７に得られたヒトパーキンソン病モデルコモンマーモセットの写真を示す。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明によりヒト疾患モデル動物として用い得るトランスジェニックマーモセット等のトランスジェニック霊長類動物の作出のための発生工学的技術が提供される。本発明の技術を利用することにより、霊長類動物の初期胚への効率的な外来遺伝子の導入が可能になり、トランスジェニック霊長類動物を効率的に作出することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月26日(2009.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト霊長類動物初期胚を０．２〜０．３Ｍスクロース溶液に入れスクロース処理し囲卵腔の容積を増加させ、初期胚の囲卵腔にプロモータに作動可能に連結したヒト外来遺伝子を含むウイルスベクターを注入することを含む、非ヒト霊長類動物初期胚に外来遺伝子を導入する方法であって、スクロース処理により、初期胚の囲卵腔の容積をスクロース処理する前の初期胚の囲卵腔の容積の１．２〜８倍に増大させスクロース処理していない初期胚に注入可能な外来遺伝子の量の１．２〜８倍の量の外来遺伝子を初期胚に注入する、非ヒト霊長類動物初期胚に外来遺伝子を導入する方法
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
霊長類動物がマーモセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１又は４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
初期胚が自然交配により得られた着床前の前核期から桑実胚期の胚である、請求項１又は４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
初期胚が人工受精により得られた前核期から桑実胚期の胚である、請求項１又は４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスベクターを胚当たり１．３×１０３〜１．３×１０５ＣＦＵの力価で注入する、請求項１又は４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１又は４〜９のいずれか１項に記載の方法で初期胚に外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子を導入した初期胚を仮母に移植し発生させることを含む、導入外来遺伝子が生殖系列へ伝播し得るトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１１】
外来遺伝子がヒトの疾患に関与する遺伝子である、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１２】
ヒトの疾患に関与する遺伝子が、ヒトパーキンソン病の原因遺伝子である変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ又はヒトハンチントン病の原因遺伝子である変異型ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子であり、ヒト疾患モデル霊長類動物がヒトパーキンソン病モデル霊長類動物又はヒトハンチントン病モデル霊長類動物である、請求項１１記載のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１３】
外来遺伝子が非ヒト霊長類動物に内在性のヒトの疾患に関与する遺伝子のオルソログ遺伝子をノックアウトするためのものであり、トランスジェニック非ヒト霊長類動物がヒト疾患モデルノックアウト霊長類動物である、請求項１１記載のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を作出する方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法で作出された、導入外来遺伝子が生殖系列伝播能を有するトランスジェニック霊長類動物。
【請求項１５】
ヒトパーキンソン病の原因遺伝子であるヒト変異型α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子又はヒトハンチントン病の原因遺伝子であるヒト変異型ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子が導入され、該遺伝子が生殖系列へ伝播する、トランスジェニック霊長類動物。
【請求項１６】
ヒトパーキンソン病モデル霊長類動物又はヒトハンチントン病モデル霊長類動物である、請求項１５記載のトランスジェニック霊長類動物。
【請求項１７】
霊長類動物がマーモセットである、請求項１５又は１６に記載のトランスジェニック霊長類動物。
【国際調査報告】
2009096101.tif 000041
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2009096101.tif 000043
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