(57)【要約】 本発明の目的は、ＮＫ４を特異的に認識することができる新規な抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、並びに該抗体を用いたＮＫ４の検出方法及び精製方法を提供することである。本発明によれば、ＮＫ４と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスターゼ消化によって得られるＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）のα鎖からなる、分子量が約55〜69 kDaであり、c-Met/ＨＧＦレセプターのアンタゴニスト活性を有するタンパク質（ＮＫ４）と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＨＧＦ又はＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質、又はその部分配列を有するペプチドを単独又はキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質又はその部分配列を有するペプチドにスぺーサーを結合させ、さらにキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
免疫動物がマウスである、請求項２又は３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
１ｎｇ／ｍＬのＮＫ４を検出できる、請求項１から４の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、ＮＫ４検出のための試薬。
【請求項１０】
請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体、及びＮＫ４を認識できる第二の抗体を少なくとも含む、ＮＫ４検出キット。
【請求項１１】
請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを反応させることを含む、ＮＫ４の検出方法。
【請求項１２】
請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体からなる、ＮＫ４精製カラム。
【請求項１３】
請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを接触させることを含む、ＮＫ４の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ４に対するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、並びに該抗体を用いたＮＫ４の検出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ４は、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）がプロテアーゼ（エラスターゼ）により切断され発生する産物であり、ＨＧＦに対するアンタゴニストである。ＨＧＦは肝細胞の増殖因子として発見されたが、その後、組織形成や発生など、様々な作用を有する物質であることが確認され、ヒトＨＧＦのcDNAもクローニングされている（BBRC Vol.172, No.1, 321-327, 1990）。また、ＨＧＦには血管新生作用を有することから、治療薬としての治験も進められている。ＨＧＦの血管新生作用は、癌においては癌細胞の浸潤や転移を促進するとの報告がある。ＮＫ４はＨＧＦの作用を阻害し、ＨＧＦが引き起こす癌細胞の浸潤や転移を阻害する治療薬としての開発が期待されている。例えば、特許第３８３２６７４号公報には、エラスターゼ消化によって得られるＨＧＦのα鎖からなる蛋白質を有効成分として含有する抗癌剤が記載されている。【０００３】
ＮＫ４を治療薬として開発するためには、治験などでその効果を確認する必要がある。ＨＧＦには反応せず、ＮＫ４に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いたＮＫ４測定系を確立することができれば、ＮＫ４治療薬のモニタリング、又は治療薬中に存在するＮＫ４の同定・確認などに利用することが可能になる。しかしながら、ＨＧＦには反応せず、ＮＫ４に特異的に反応するモノクローナル抗体に関する報告はない。【０００４】
【非特許文献１】BBRC Vol.172, No.1, 321-327, 1990
【特許文献１】特許第３８３２６７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＮＫ４を特異的に認識することができる新規な抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、並びに該抗体を用いたＮＫ４の検出方法及び精製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＨＧＦ又はＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質又はその部分配列を有するペプチドを単独で、又はキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより、ＮＫ４と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  エラスターゼ消化によって得られるＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）のα鎖からなる、分子量が約55〜69 kDaであり、c-Met/ＨＧＦレセプターのアンタゴニスト活性を有するタンパク質（ＮＫ４）と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体。
（２）  ＨＧＦ又はＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質、又はその部分配列を有するペプチドを単独又はキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（３）  ＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質又はその部分配列を有するペプチドにスぺーサーを結合させ、さらにキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（４）  免疫動物がマウスである、（２）又は（３）に記載のモノクローナル抗体。
（５）  １ｎｇ／ｍＬのＮＫ４を検出できる、（１）から（４）の何れかに記載のモノクローナル抗体。
（６）  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマにより産生される、（１）から（５）の何れかに記載のモノクローナル抗体。
（７）  （１）から（６）の何れかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（８）  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマ。
（９）  （１）から（６）の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、ＮＫ４検出のための試薬。
（１０）  （１）から（６）の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体、及びＮＫ４を認識できる第二の抗体を少なくとも含む、ＮＫ４検出キット。
（１１）  （１）から（６）の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを反応させることを含む、ＮＫ４の検出方法。
（１２）  （１）から（６）の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体からなる、ＮＫ４精製カラム。
（１３）  （１）から（６）の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを接触させることを含む、ＮＫ４の精製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＨＧＦとは反応せず、ＮＫ４を特異的に認識することができる新規な抗体が提供される。本発明の抗ＮＫ４モノクローナル抗体を使用することにより、ＮＫ４を特異的に精製するカラムを作製することが可能になる。また、本発明のＮＫ４ ＥＩＡキットを併用することにより、これまでできなかったヒト血液等の検体に含まれるＨＧＦとその一部の構造からなるＮＫ４それぞれの量を分けて測定することが可能になった。ＮＫ４の Ｃ末端部位の前後は、どの動物種にも共通のアミノ酸配列になっていることから、本発明の抗ＮＫ４モノクローナル抗体は、ヒトをはじめとして、ラット、マウスなどのほ乳類、その他の動物のＮＫ４も認識するものと思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のモノクローナル抗体は、ＮＫ４と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないことを特徴とする抗体であり、好ましくは、ＨＧＦ又はＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質、又はその部分配列を有するペプチドを単独又はキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる抗体、さらに好ましくは、ＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質又はその部分配列を有するペプチドにスぺーサーを結合させ、さらにキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる抗体である。本発明では、上記のタンパク質又はその部分配列を有するペプチドを抗原として用いることによって、ＮＫ４と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しない抗体を取得することができるが、これは、そのアミノ酸配列が、ＨＧＦの構造上では表に出ず、ＮＫ４ではＣ末端に位置して露出するためである。キャリアタンパク質の種類は特に限定されないが、例えば、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）などを用いることができる。本発明でも用いることができる抗原の具体例としては、Cys-[NH(CH2CH2O)2-CH2CO]2-Glu-Gly-Asp-Thr-Thr-Pro-Thr-Ile-Val及び／又はPro-Ile-Ser-Arg- Cys-Glu-Gly-Asp-Thr-Thr-Pro-Thr-Ile-Valで表されるペプチドをキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを挙げることができる。【００１０】
本発明においては、ＮＫ４で特異的に露出している目的抗原部位は１４個のアミノ酸しかなく、その前には、大きなクリングルと呼ばれるドメイン４個からなるα鎖が存在している。エラスターゼ切断により出現する１４個のアミノ酸はその４個のクリングル構造に対して非常に小さく、抗体が反応するものとして認識が難しく、通常の免疫からは特異性の高い抗体を得ることは非常に難しい。そこで、１４個或いはその一部を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドを抗原と宿主に認識してもらうために、合成ペプチド中にスペーサーを入れるよう設計し、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたとき、抗原アミノ酸の自由度が高まることを想定した免疫原を準備した。スペーサーの種類は特に限定されないが、例えば、（[NH(CH2CH2O)2-CH2CO]2）などを用いることができる。【００１１】
また、ＨＧＦの構造の中で、Cysはジスルフィド結合により、立体的形状に大きく関与している。上記１４個のアミノ酸配列で、アミノ酸Cysを介してキャリアタンパク質へコンジュゲートさせた時に、Cysを中心に実際に近い立体構造を作り出すことを想定し、１４個の全アミノ酸からなる合成ペプチドも準備した。【００１２】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１，１９８０）。【００１３】
抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。抗原を動物に免疫するには、例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞（例えば、脾臓細胞）を採取し、細胞融合を行うことができる。【００１４】
免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いることができる。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、 P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等を使用できる。免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、公知の方法（例えば、Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）に準じて行うことができる。細胞融合は、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を用いて実施できる。上記のようにして得られたハイブリドーマは、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）などの選択培地で培養することにより選択される。【００１５】
続いて、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、ＮＫ４を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することができる。本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングすることができる。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。【００１６】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることもできる。具体的には、抗ＮＫ４抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＮＫ４抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を確認する。目的とする抗ＮＫ４抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをそれぞれ得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。本発明の抗ＮＫ４抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することもできる。【００１７】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生される抗体、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生される抗体のいずれでもよい。本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体 、例えば、キメラ抗体 、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体 は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体 であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体 の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体 の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体 のＣＤＲとヒト抗体 のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体 定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる。【００１８】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体 を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体 遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体 を取得することができる。さらに、ヒト抗体 ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体 を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体 の可変領域を一本鎖抗体 （scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体 の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体 を取得することができる。これらの方法は既に周知である。【００１９】
また、本発明のモノクローナル抗体 は、ＮＫ４と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないという特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体 や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Diabodyなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。【００２０】
ＮＫ４の検出方法は、本発明の抗ＮＫ４抗体を用いた免疫学的方法により行うことができる。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法、イムノクロマトグラフィー法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのはELISA（enzyme-linked immunosorbent assay)（例えば、サンドイッチELISA）である。ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。一般的な検出方法としては、例えば、抗ＮＫ４抗体を担体に固定し、ここにＮＫ４を含む被検試料を加え、インキュベートを行い、抗ＮＫ４抗体とＮＫ４タンパク質を結合させた後、洗浄し、ＮＫ４を特異的に認識する抗体を介して担体に結合したＮＫ４タンパク質を検出することにより、被検試料中のＮＫ４タンパク質の検出を行うことができる。本発明で用いる担体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラス、フェライトなどの不溶性の支持体を挙げることができる。担体は、好ましくはプレート（９６穴マルチウェルプレート等）である。【００２１】
抗ＮＫ４抗体とＮＫ４タンパク質との結合は、緩衝液中で行うことができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜３７℃にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、例えば、Tween 20等の界面活性剤を含む緩衝液などを用いて行うことができる。【００２２】
本発明の抗ＮＫ４抗体を介して担体に結合したＮＫ４タンパク質を検出するためには、標識物質で標識されたＮＫ４を特異的に認識する抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、担体に固定された抗ＮＫ４抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＮＫ４タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出することができる。【００２３】
ＮＫ４を特異的に認識する抗体の標識は常法により行うことができる。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などを用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、ルテニウムなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、ペルオキシダーゼなどの酵素を結合させたストレプトアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質とＮＫ４を特異的に認識する抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。【００２４】
具体的には、抗ＮＫ４抗体を含む溶液をプレートなどの担体に加え、抗ＮＫ４抗体を担体に固定する。担体を洗浄後、被検試料を担体に加える。インキュベートの後、洗浄し、標識されたＮＫ４を特異的に認識する抗体を加える。適度なインキュベーションの後、担体を洗浄し、担体に残った標識されたＮＫ４を特異的に認識する抗体を検出する。検出は、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやRIA法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンチジン（TMB）などを挙げることができる。蛍光物質または化学発光物質の場合にはルミノメーターにより検出することができる。【００２５】
本発明によれば、被検試料中のＮＫ４タンパク質を検出するための診断薬またはキットも提供される。なお、本発明におけるＮＫ４の検出とは、ＮＫ４の存在の検出のみならず、ＮＫ４の測定又は定量を含む意味を有するものとする。診断薬またはキットは、少なくとも、本発明の抗ＮＫ４抗体を含む。診断薬またはキットがELISA法等のEIA法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。また、キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。【００２６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：原料の調製
（１）免疫原の調製
（１−１）  ＮＫ４で特異的に露出しているC末端部分のペプチドを合成し、抗原性を持たせるためにキャリアタンパクにコンジュゲートした。ペプチドは以下の２種類を作製し免疫原性を強めるために自由度を持たせるよう工夫して合成ペプチド1はスペーサーを付け、合成ペプチド2は実際の構造に近い形になるようにキャリア蛋白に結合させた。その方法は以下のとおりである。【００２８】
（１−２）  合成ペプチドの作製
合成ペプチド１；Cys-[NH(CH2CH2O)2-CH2CO]2-Glu-Gly-Asp-Thr-Thr-Pro-Thr-Ile-Val （[NH(CH2CH2O)2-CH2CO]2はスペーサー）（ＮＫ４ C末端アミノ酸10残基）
合成ペプチド２；Pro-Ile-Ser-Arg-Cys-Glu-Gly-Asp-Thr-Thr-Pro-Thr-Ile-Val（ＮＫ４ C末端アミノ酸14残基）【００２９】
（３）合成ペプチド-コンジュゲート免疫原の作製
MBS（m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）法にてキャリア蛋白（スカシガイヘモシアニン/Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)；CALBIOCHEM、374817）へ合成ペプチドをアミノ酸システイン（「C」）のチオール（-SH）基を利用して結合させる。【００３０】
【化１】
2009125831.tif 000002
【００３１】
実施例２：抗体作製
（１）リコンビナントＮＫ４を抗原としての抗体作製の試み（比較例）
リコンビナントＮＫ４(ｒＮＫ４；特許第３８３２６７４号に記載)と完全フロイントアジュバント（DIFCO、263810）のエマルジョン液を免疫原投与量100μg/匹で6週令のBALB/cマウスの腹腔内に接種した。追加で、3回の免疫を行った。得られた抗体はいずれもＮＫ４及びＨＧＦ両者に反応し、ＮＫ４のみに特異的に反応する抗体を得ることができなかった。【００３２】
（２）ヒトＨＧＦ寛容状態でのＮＫ４免疫による抗体作製の試み（比較例）
生後24時間以内にＨＧＦを皮下注射し、生後6週目にＮＫ４を免疫し、マウスのＨＧＦ免疫寛容状態としてＮＫ４のみに特異的に反応し、ＨＧＦに反応しない抗体を作製することを試みた。しかし、免疫寛容な状態を作ることができなかった。【００３３】
（３）合成ペプチド１（スペーサーなし）を抗原としての抗体作製の試み（比較例）
スペーサーを付けない合成ペプチド１をKLHにコンジュゲートさせたものと完全フロイントアジュバント（DIFCO、263810）のエマルジョン液を免疫原投与量100μg/匹で6週令のBALB/cマウスの腹腔内に接種した。追加で、3回の免疫を行った。ＮＫ４のみに反応してＨＧＦに反応しない抗体をセレクトしたが、反応が弱くELISAに使用できる抗体を得ることができなかった。【００３４】
（４）合成ペプチドを抗原としての抗体作製（比較例）
（４−１）マウスへの抗原免疫
初回免疫：等容量のKLHコンジュゲート合成ペプチド1もしくは2と完全フロイントアジュバント（DIFCO、263810）のエマルジョン液を免疫原投与量100μg/匹で6週令のBALB/cマウスの腹腔内に接種した。
2回目および3回目免疫：初回免疫から2週間隔で追加免疫を3回まで実施した。方法は等容量のKLHコンジュゲート-合成ペプチドと不完全フロイントアジュバント（DIFCO、263910）のエマルジョン液を免疫原投与量100μg/匹で腹腔内に接種することにより行った。
最終免疫：3回目免疫の2週間後に同じ合成ペプチドを50μg/匹で尻尾の静脈へ接種した。【００３５】
（４−２）細胞融合
最終免疫から3日後のマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞液を調製した。マウス骨髄腫細胞、NS-1（DSファーマバイオメディカル、85011427）と脾臓細胞をポリエチレングリコール1500（Roche Diagnostics GmbH、10783641001）を使用し、KoehlerとMilsteinらの方法（Koehler, G. et al. Nature vol.256, 495-497,1975）に準じて細胞融合を実施した。融合細胞を選択するために、仔ウシ血清を含むHAT（H.A.T.SUPPLEMENT(50X)；GIBCO invitrogen cell culture、21060）選択培地添加によりセレクションを行なった。【００３６】
（４−３）1stスクリーニング／ELISAによる反応性評価
融合細胞を播種した96穴プレートに対し、それぞれｒＮＫ４およびリコンビナント-ヒトＨＧＦ（ｒヒトＨＧＦ；特殊免疫研究所、6R71）を96穴アッセイプレート（Corning Incorporated、costar 2959）にウェルあたり50μLずつ分注し、4℃にて一晩置き、固相化した。細胞融合後のセレクトされた培養上清を40 vol％ブロックエース（大日本住友製薬、UK-B40）を含む10mMトリス緩衝液（pH 7.5）（40％BA-TBS）にて希釈して、培養上清サンプルとした。培養上清サンプルを50μLずつそれぞれの固相プレートに添加し、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG羊アフィニティー精製抗体（MP Biomedicals, cappel 55569）およびペルオキシダーゼ標識抗マウスIgM羊アフィニティー精製抗体（MP Biomedicals, cappel 55568）を10 vol％ブロックエース（大日本住友製薬、UK-B40）を含む10mMトリス緩衝液（pH 7.5）（10％BA-TBS）に混合希釈した液、さらに酵素基質液（TMB；ScyTek Laboratories、TM4999）を用いてELISAを実施し、450nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ｒＮＫ４固相プレートに反応し、ｒヒトＨＧＦ固相プレートには反応しないサンプルを陽性判定とし、反応性を評価したが、陽性と判定される抗体は得られなかった。【００３７】
（５）合成ペプチド及びリコンビナントＮＫ４を抗原としての抗体作製（参考例）
（５−１）マウスへの抗原免疫
初回免疫：等容量のKLHコンジュゲート合成ペプチドと完全フロイントアジュバント（DIFCO、263810）のエマルジョン液を免疫原投与量100μg/匹で6週令のBALB/cマウスの腹腔内に接種した。
2回目および3回目免疫：初回免疫から2週間隔で追加免疫を3回まで実施した。追加免疫は、実施例２の（４−１）の「２回目及び３回目免疫」に記載の方法により行った。
最終免疫：3回目免疫の2週間後にｒＮＫ４を50μg/匹で尻尾の静脈へ接種した。【００３８】
（５−２）細胞融合
実施例２の（４−２）の細胞融合方法と同じ方法によりセレクションを行なった。【００３９】
（５−３）1stスクリーニング
実施例２の（４−３）の1stスクリーニングと同じ方法により反応性を評価し、陽性判定とされた30サンプルについて、2ndスクリーニングを行った。【００４０】
（５−４）2ndスクリーニング
ｒＮＫ４およびｒヒトＨＧＦの固相プレートの他、合成ペプチド2種（濃度；5μg/mL-10mM リン酸緩衝液pH6.0）をそれぞれ固相化したプレート、および非特異的反応の確認として固相液を入れないプレートの計５種類のアッセイ用プレートを使用した。培養上清を40％BA-TBSにて希釈した培養上清サンプルについて、実施例２の（４−３）の1stスクリーニングと同じ方法でアッセイを行った。ｒＮＫ４固相プレートへ反応し、ｒヒトＨＧＦ固相プレートには反応しないサンプルを陽性判定とし、合成ペプチドへの反応も確認した。合成ペプチドへの反応が強く、かつrヒトＨＧＦへのシグナルに対するｒＮＫ４へのシグナルの比の良いものをセレクトし、合成ペプチド1からは6個、合成ペプチド2からは5個についてクローニング対象とした。【００４１】
（５−５）クローン化
限界希釈法によるクローニングにより、以下の方法で実施した。4〜6週令のマウスから胸腺を摘出し、1 x 107cells/mL濃度の胸腺細胞培養液を調製し、クローニング用培養液として使用する。96穴プレート1ウェルに対して、抗体産生細胞を0.1、0.3、1、3個の濃度に、それぞれ24ウェルずつ撒き込む。合成ペプチド2種をそれぞれに固相したプレートを用意し、実施例２の（４−３）の1stスクリーニングと同様のアッセイより、1コロニーからなるウェルにおいて抗体産生が確認されたウェルを選別する。合成ペプチド1では6サンプルのクローニングから2個を、合成ペプチド2では5サンプルから3個のクローンを樹立した。樹立した細胞をプリスタン処理（2，6，10，14-テトラメチルペンタデカン0.5 mL／匹を腹腔内投与し、1〜2週間飼育する。）したマウス2匹の腹腔内へ投与して腹水化し、得られた腹水を硫酸アンモニウムによる塩析法にて精製し、抗体の評価を行なった。得られた抗ｒＮＫ４-モノクローナル抗体をプレートに固相し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体とのサンドウィッチ系（特殊免疫研究所、1EH1：イムニスＨＧＦ EIAの構成試薬を使用）にてｒＮＫ４およびｒヒトＨＧＦの検出を比較したところ、ヒトＨＧＦは全く検出せずＮＫ４を特異的に検出できたものの、反応が弱くELISAに使用できる抗体を得ることができなかった。【００４２】
（６）合成ペプチドを抗原としての抗体作製
（６−１）マウスへの抗原免疫
初回免疫：等容量のKLHコンジュゲート合成ペプチド1あるいは2と完全フロイントアジュバント（DIFCO、263810）のエマルジョン液を免疫原投与量100μg/匹で6週令のBALB/cマウスの腹腔内に接種した。
2回目および3回目免疫：初回免疫から2週間隔で追加免疫を3回まで実施した。追加免疫は実施例２の（４−１）の「2回目および3回目免疫」に記載の方法により行った。
最終免疫：3回目免疫の2週間後に同じ合成ペプチドを50μg/匹で尻尾の静脈へ接種した。【００４３】
（６−２）1stスクリーニング
実施例２の（４−３）の1stスクリーニングと同じ方法により反応性を評価し、陽性判定とされたサンプルについて、2ndスクリーニングを行った。【００４４】
（６−３）2ndスクリーニング
中村らによりクローニングされたヒトＨＧＦ cDNA 2.3kb（BBRC Vol.172, No.1, 321-327, 1990）をデハイドロフォーレトレダクダーゼ(DHFR)およびネオマイシン（Nmr）を組み込んだベクター（pNOW）のサイトメガロウィルス(CMV)プロモーターの下流に挿入し、ヒト ＨＧＦ cDNA発現ベクターを構築した。そのヒト ＨＧＦ cDNA発現ベクターをリポフェクチンにてチャイニーズハムスター（CHO）細胞にトランスフェクションした。形質転換した細胞をG418耐性により選別し、続いてメトレキセート(MTX)により遺伝子増幅した。ヒトＨＧＦ高産生株について、CHO-S-SFM II培地（GIBCO社製、22052-039）中で、37℃、24時間培養し、発現されたヒトＨＧＦを含む培養上清を得た。【００４５】
ヒトＨＧＦを含む培養上清を東尾らの方法（Higashio et al. BBRC Vol. 170, 397-404, 1990）を若干改変した方法で、SP Sepharose Fast Flow（GE ヘルスケア社製、17-0729-01）、HiTrap Heparin カラム（GE ヘルスケア社製、17-407-01）による2段階のクロマト精製を行ない、SDS-PAGEで単一な精製ヒトＨＧＦを得た。【００４６】
上記ヒトＨＧＦ抗原を、ウサギ１羽に対して100μgを完全フロイントアジュバントとのエマルジョン液を作製し、背中の皮下約10カ所へ100μLずつ、2週間隔で4回繰り返し投与し、最終免疫から1週間後に抗血清を得た。
得られた抗血清からヒトＨＧＦに対するポリクローナル抗体をProteinG affinity カラム（GE ヘルスケア社製、17-0404-03）を用いて精製した。【００４７】
抗ヒトＨＧＦウサギポリクローナル抗体生理的食塩水溶液（20μg/mL）をアッセイプレートに50μLずつ分注し4℃にて一晩固相化し、40％BA-TBSにてブロッキング処理した。プレートを洗浄後、ｒＮＫ４あるいはｒヒトＨＧＦを1 ng/mLで含む40％BA-TBSを50μLずつウェルに分注し、室温で1時間反応させたものをｒＮＫ４あるいはｒヒトＨＧＦ固相プレートとした。また、合成ペプチド2種の固相プレートと固相なしのプレートも準備した。【００４８】
培養上清を40％BA-TBSにて希釈した培養上清サンプルについて、実施例２の（４−３）の1stスクリーニングと同じ方法でアッセイを行った。【００４９】
ｒＮＫ４固相プレートへ反応し、ｒヒトＨＧＦ固相プレートには反応しないサンプルを陽性判定とし、合成ペプチドへの反応も確認した。合成ペプチドへの反応が強く、かつｒヒトＨＧＦへのシグナルに対するｒＮＫ４へのシグナルの比の良いものをセレクトし、クローニング対象とした。【００５０】
（６−４）クローン化
限界希釈法によるクローニングを行った。実施例２の（５−５）に記載の方法により、合成ペプチド1由来ではHyb-N5221を含む7個を、合成ペプチド2由来ではHyb-N5304を含む5個のクローンを得た。【００５１】
（６−５）モノクローンの樹立
得られたモノクローンについて、順次培養スケールをアップして細胞凍結し、ならびにマウス2匹へ細胞を接種して腹水を作製した。先ず、樹立したクローンを、プリスタン 0.5mL/匹投与2週間後のマウスに、細胞を1x107個/匹以上で腹腔内へ接種した。得られた腹水について、50％飽和硫安塩析精製により精製抗体を調製した。上記で得られたハイブリドーマHyb-N5221及びHyb-N5304は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター 中央第6）に、２００７年１０月３１日にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４１７及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１４１８として寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４１７及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１４１８の寄託はそれぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２として２００９年３月２日に国際寄託に移管されている。【００５２】
実施例３：精製モノクローナル抗体を用いた特異性評価
得られたHyb-N5221及びHyb-N5304の塩析精製抗体を用いて、特異性および性能の評価を行った。ｒＮＫ４、ｒヒトＨＧＦ、ならびに合成ペプチド2種を固相したアッセイプレートに、各モノクローナル抗体の塩析精製抗体3μg/mLからの3倍希釈列サンプルを調製し反応させた。その結果、ヒトＨＧＦには反応を示さず、他3種の抗原物質固相プレートに反応を示したことから、ＮＫ４に特異的に反応することが確認された。（図１；Bindingデータ）【００５３】
実施例４：ＮＫ４に特異的な抗体を用いたＮＫ４検出サンドウィッチ系の作製及び検討
（１）精製抗ＮＫ４モノクローナル抗体生理的食塩水溶液（20μg/mL）をプレートに分注して固相化した。また、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を固相したイムニスＨＧＦ EIAのプレート及びＮＫ４にもＨＧＦにも関係しないモノクローナル抗体を固相したプレートの4種類のプレートを使用した。
（２）ｒＮＫ４およびｒヒトＨＧＦを40％BA-TBSにて30 ng/mLから3倍希釈列を作製し、一次反応に供した。
（３）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体とのサンドウィッチ系（特殊免疫研究所、1EH1：イムニスＨＧＦ ＥＩＡの構成試薬）を利用してアッセイを行った。【００５４】
（４）結果（図２）
Hyb-N5221、Hyb-N5304を固相化したアッセイ系のどちらもＮＫ４検出感度が良く、0濃度における非特異的発色は認められなかった。また、どちらの系もヒトＨＧＦを検出せず、ＮＫ４を特異的に検出できることを確認した。両抗体ではHyb-N5221の感度がより良好であった。一方、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体固相のイムニスＨＧＦ EIAの場合は、ヒトＨＧＦとＮＫ４を同様に検出し、両者を測り分けられない。なお、ＮＫ４にもＨＧＦにも関係しないモノクローナル抗体固相プレートでは、ヒトＨＧＦもＮＫ４も検出しなかった。
以上の様にHyb-N5221、Hyb-N5304の抗ＮＫ４モノクローナル抗体固相と標識抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を組み合わせて、ＮＫ４を検出するサンドウィッチ系が成り立つことが確認できた。【００５５】
実施例５：ＮＫ４ EIAキットの改良及び性能評価
（１）  抗ＮＫ４モノクローナル抗体固相−標識抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体のＮＫ４検出サンドウィッチ系について、ゲルろ過精製により固相用抗ＮＫ４モノクローナル抗体の純度を上げ、また各ステップのバッファーや発色液を変更することにより感度を上げ、より高感度の測定キット（ＮＫ４ ＥＩＡキット）に改良した。抗ＮＫ４モノクローナル抗体としてはHyb-N5221を使用し、固相プレートは凍結乾燥により製造した。ＮＫ４ ＥＩＡキットの組成及び操作方法を以下に示す。
＊ＮＫ４ ＥＩＡキットの組成；
(1) 検体希釈液  仔牛胎児血清, マウス血清を含むリン酸緩衝液
(2) 洗浄液  Tween 20を含む生理食塩水
(3) 標識抗体液  ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（マウス）
(4) 酵素基質（発色液）  TMB（BioFX社製）
(5) 反応停止液  発色停止液（BioFX社製）【００５６】
＊ＮＫ４ ＥＩＡキットの操作方法；
(1) 抗ＮＫ４モノクローナル抗体固相プレートへ検体希釈液を 50μLずつウェルに分注
(2) ＮＫ４標準液および検体を検体希釈液の入ったウェルへ 50μLずつウェルに分注
(3) 検体希釈液と検体を振盪器にて撹拌
(4) 37℃、2時間、静置反応（一次反応）
(5) 反応液を除き、プレートを洗浄液にて5回洗浄後、標識抗体液を 100μLずつウェルに分注
(6) 37℃、1時間、静置反応（二次反応）
(7) 反応液を除き、プレートを洗浄液にて5回洗浄後、酵素基質（発色液）を 100μLずつウェルに分注
(8) 25℃、30分、暗所にて静置反応
(9) 反応停止液を 100μLずつウェルに分注して反応を停止し、プレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定
(10) 標準液の吸光度をプロットして検量線を作成し、各種検体の吸光度を当てはめて ＮＫ４濃度を算出【００５７】
（２）  ＮＫ４ ＥＩＡキットについて、イムニスＨＧＦ ＥＩＡを対照としてヒトＨＧＦとＮＫ４の特異性比較（図３）
イムニスＨＧＦ EIAでは、ヒトＨＧＦならびにＮＫ４両方を測定しうるが、ＮＫ４ ＥＩＡキットではＮＫ４のみ検出し、ヒトＨＧＦは検出しないことを確認した。
ＮＫ４ ＥＩＡキットの検量線はイムニスＨＧＦ ＥＩＡと同等の発色を示すことを確認した。
ＮＫ４ ＥＩＡキットの標準液の検量線は、R2=0.9997と良好な直線性を示すことが確認され、また最小検出感度はイムニスＨＧＦ ＥＩＡと同等の1 ng/mLであることを確認した。【００５８】
（３）健常人血清検体の測定（図４）
健常人血清検体23例について、ＮＫ４およびＨＧＦを測定した。その結果、イムニス ＨＧＦ ＥＩＡにおける健常人血清中のＨＧＦ値が0.13〜0.55 ng/mLであったのに対し、ＮＫ４はほとんど血中では検出されないことを確認した。【００５９】
（４）添加回収試験（図５）
健常人血清検体 50μLに、ＮＫ４：0.3、2.5、4.0 ng/mLの3種類の濃度を各50μLずつ添加して一次反応を行い、検体希釈液に同様に3種類の濃度のＮＫ４調製液を添加して反応させた時の吸光度を比較した。
健常人血清検体は3種のＮＫ４添加率についていずれも90%以上の回収率が得られ、添加回収率が良好な測定系であることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、Binding titration assayによる抗ｒＮＫ４モノクローナル抗体の特異性評価結果を示す図である。固相抗原をそれぞれｒＮＫ４、ｒヒトＨＧＦ、合成ペプチド1、または合成ペプチド2とし、Hyb-N5221及びHyb-N5304を添加した。図１−１は、各固相抗原に対するHyb- N5221の反応性を示す。図１−２は、各固相抗原に対するHyb-N5304の反応性を示す。
【図２】図２は、抗ｒＮＫ４モノクローナル抗体を使用したサンドウィッチ系の特異性評価結果を示す図である。固相抗体をHyb- N5221、Hyb-N5304、抗ＨＧＦ抗体（anti-HGF）、ＮＫ４にもＨＧＦにも関係しないモノクローナル抗体の4種類にした場合について、ｒＮＫ４及びｒヒトＨＧＦを段階希釈して測定を行った。図２−１は、各抗体を固相化した場合のｒＮＫ４の反応性を示す。図２−２は、各抗体を固相化した場合のｒヒトＨＧＦの反応性を示す。
【図３】図３は、ＮＫ４ ＥＩＡキットとイムニスＨＧＦ ＥＩＡとの特異性を比較した図である。両キットはｒＮＫ４に対し同等に発色を示し、直線性も良好であった。ＮＫ４ ＥＩＡキットは、ｒＨＧＦと反応しなかった。図３−１は、イムニスＨＧＦ ＥＩＡの標準液検量線を示す。図３−２は、ＮＫ４ ＥＩＡキットの標準液検量線を示す。
【図４】図４は、健常人血清検体におけるＮＫ４ ＥＩＡキット及びイムニスＨＧＦ ＥＩＡによる測定値を示した図である。
【図５】図５は、各濃度のＮＫ４を添加した場合のＮＫ４ ＥＩＡキットの添加回収率を示した図である。
【図１】
2009125831.tif 000003
【図２】
2009125831.tif 000004
【図３】
2009125831.tif 000005
【図４】
2009125831.tif 000006
【図５】
2009125831.tif 000007
【配列表】
2009125831000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月25日(2010.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスターゼ消化によって得られるＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）のα鎖からなる、分子量が約５５〜６９ｋＤａであり、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのアンタゴニスト活性を有するタンパク質（ＮＫ４）と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないモノクローナル抗体であって、前記ＮＫ４で特異的に露出している部位を有する抗原で免疫することによって得られた抗体群を、抗ＨＧＦ抗体と前記ＮＫ４との反応物及び抗ＨＧＦ抗体とＨＧＦとの反応物との反応を指標としてスクリーニングすることにより得られることを特徴とする、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ＮＫ４で特異的に露出している部位の全体又は部分配列を有するペプチドを、当該ペプチドに含まれるＣｙｓを中心として、実際のＮＫ４に近い立体構造を作り出すように、キャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記ＮＫ４で特異的に露出している部位の全体又は部分配列を有するペプチドにスペーサーを結合させ、当該ペプチドに含まれるＣｙｓを中心として、実際のＮＫ４に近い立体構造を作り出すように、キャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＮＫ４で特異的に露出している部位を有する抗原が、Ｃｙｓ−［ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＯ］２−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ及び／又はＰｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌで表されるペプチドをキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートである、請求項１から３の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記抗体群を、抗ＨＧＦポリクローナル抗体と前記ＮＫ４との反応物及び抗ＨＧＦポリクローナル抗体とＨＧＦとの反応物との反応を指標としてスクリーニングすることにより得られることを特徴とする、請求項１から４の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
免疫動物がマウスである、請求項２から５の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
１ｎｇ／ｍＬのＮＫ４を検出できる、請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項１から８の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、ＮＫ４検出のための試薬。
【請求項１２】
請求項１から８の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体、及びＮＫ４を認識できる第二の抗体を少なくとも含む、ＮＫ４検出キット。
【請求項１３】
請求項１から８の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを反応させることを含む、ＮＫ４の検出方法。
【請求項１４】
請求項１から８の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体からなる、ＮＫ４精製カラム。
【請求項１５】
請求項１から８の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを接触させることを含む、ＮＫ４の精製方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月16日(2011.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスターゼ消化によって得られるＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）のα鎖からなる、分子量が約55〜69 kDaであり、c-Met/ＨＧＦレセプターのアンタゴニスト活性を有するタンパク質（ＮＫ４）と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないモノクローナル抗体であって、
抗ヒトＨＧＦ抗体をアッセイプレートに固相化し、
該固相化された抗ヒトＨＧＦ抗体に、ＮＫ４又はヒトＨＧＦを反応させることで、ＮＫ４固相プレート及びヒトＨＧＦ固相プレートを作成し、
ＨＧＦ又はＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質、又はその部分配列を有するペプチドを単独又はキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる抗体群の中から、前記ＮＫ４固相プレートに反応し、前記ヒトＨＧＦ固相プレートには反応しない抗体を選択するスクリーニングによって得られることを特徴とする、上記のモノクローナル抗体。
【請求項２】
抗ヒトＨＧＦ抗体が、抗ヒトＨＧＦポリクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質又はその部分配列を有するペプチドにスぺーサーを結合させ、さらにキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
抗原が、Cys-[NH(CH2CH2O)2-CH2CO]2-Glu-Gly-Asp-Thr-Thr-Pro-Thr-Ile-Val及び／又はPro-Ile-Ser-Arg- Cys-Glu-Gly-Asp-Thr-Thr-Pro-Thr-Ile-Valで表されるペプチドをキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートである、請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
免疫動物がマウスである、請求項１から４の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
１ｎｇ／ｍＬのＮＫ４を検出できる、請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１から６の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項９】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０１又は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０２を有するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、ＮＫ４検出のための試薬。 
【請求項１１】
請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体、及びＮＫ４を認識できる第二の抗体を少なくとも含む、ＮＫ４検出キット。 
【請求項１２】
請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを反応させることを含む、ＮＫ４の検出方法。
【請求項１３】
請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体を固定化した担体からなる、ＮＫ４精製カラム。
【請求項１４】
請求項１から７の何れかに記載のモノクローナル抗体と、ＮＫ４を含む試料とを接触させることを含む、ＮＫ４の精製方法。
【請求項１５】
エラスターゼ消化によって得られるＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）のα鎖からなる、分子量が約55〜69 kDaであり、c-Met/ＨＧＦレセプターのアンタゴニスト活性を有するタンパク質（ＮＫ４）と特異的に反応し、ＨＧＦとは反応しないモノクローナル抗体の製造方法であって、
抗ヒトＨＧＦ抗体をアッセイプレートに固相化し、
該固相化された抗ヒトＨＧＦ抗体に、ＮＫ４又はヒトＨＧＦを反応させることで、ＮＫ４固相プレート及びヒトＨＧＦ固相プレートを作成し、
ＨＧＦ又はＨＧＦをエラスターゼ消化して得られるＨＧＦのα鎖からなるタンパク質、又はその部分配列を有するペプチドを単独又はキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを抗原として免疫動物に免疫することにより得られる抗体群の中から、前記ＮＫ４固相プレートに反応し、前記ヒトＨＧＦ固相プレートには反応しない抗体を選択することを含む、
上記の製造方法。
【請求項１６】
抗ヒトＨＧＦ抗体が、抗ヒトＨＧＦポリクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
2009125831.tif 000008
2009125831.tif 000009
2009125831.tif 000010
2009125831.tif 000011