(57)【要約】  本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産する微生物であって、（１）ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されており、（２）ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が向上されており、及び（３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子及びクロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されている微生物に関する。当該微生物を培養することにより、柔軟性にすぐれ適応用途範囲が広いＰＨＡであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を、安価な炭素源を用いて効率よく製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）から（３）の要件を備えた微生物；
（１）ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されていること、
（２）ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が向上されていること、
（３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、および／または、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されていること。
【請求項２】
次の（１）から（６）の少なくとも一つにより、ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されている、請求項１記載の微生物；
（１）ｐｈｂＡ遺伝子の開始コドンと終止コドンの間に、新たな終止コドンが導入されている、
（２）ｐｈｂＡ遺伝子のリボソーム結合部位に、リボソーム結合活性が低下する変異を導入している、
（３）ｐｈｂＡ遺伝子内部に、ｐｈｂＡ遺伝子がコードする酵素の触媒活性が低下する変異を導入している、
（４）ＲＮＡ干渉を利用する、
（５）ｐｈｂＡ遺伝子内部に、トランスポゾンを挿入している、
（６）ｐｈｂＡ遺伝子の一部或いは全部を欠失している。
【請求項３】
ｂｋｔＢ遺伝子の上流に、新たにｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する活性を有するプロモーターが挿入されることにより、ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されたている、請求項１記載の微生物。
【請求項４】
新たに挿入されるプロモーターが、次の（１）または（２）のＤＮＡである、請求項３記載の微生物；
（１）ｂｋｔＢ遺伝子の上流に、配列番号１または２に示される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有し、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する活性を有するＤＮＡ、
（２）ｂｋｔＢ遺伝子の上流に、配列番号１または２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する活性を有するＤＮＡ。
【請求項５】
次の（１）から（４）の少なくとも一つの、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、および／または、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されている、請求項１記載の微生物；
（１）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有し、クロトニル−ＣｏＡを還元し、ブチリル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子、
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、クロトニル−ＣｏＡを還元し、ブチリル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子、
（３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有し、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする遺伝子、
（４）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする遺伝子。
【請求項６】
植物油脂を炭素源として乾燥菌体量１５０ｇ／Ｌ以上でポリマー含量７０％以上、且つ３−ヒドロキシヘキサン酸組成比１２ｍｏｌ％以上のポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な微生物。
【請求項７】
遺伝子組換えにより作製した請求項５記載の微生物。
【請求項８】
植物油脂を炭素源として乾燥菌体量１５０ｇ／Ｌ以上でポリマー含量７０％以上、且つ３−ヒドロキシヘキサン酸組成比１２ｍｏｌ％以上のポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な、請求項１〜５の何れかに記載の微生物。
【請求項９】
ポリヒドロキシアルカノエートが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を構成単位に含むポリエステルである請求項１〜８の何れかに記載の微生物。
【請求項１０】
微生物がCupriavidus necator由来である請求項１〜９の何れかに記載の微生物。
【請求項１１】
微生物がCupriavidus necator H16株由来である請求項１０記載の微生物。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載の微生物を、植物油脂を炭素源として培養することを特徴とする３−ヒドロキシヘキサン酸単位含有ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素数４以上の３−ヒロドキシアルカノエート単位を有するポリヒドロキシアルカノエート共重合体を生産する微生物および該微生物を用いて該共重合体を効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記す）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子である。また、ＰＨＡは再生可能資源から産生されうる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。【０００３】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は１９２５年にBacillusmegateriumで最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物学的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。【０００４】
そこで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記す）とからなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と記す）の製造方法が開示されている（特許文献１、特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰＨＡの一種である。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。【０００５】
Ｐ（３ＨＢ）の柔軟性を高めるために、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）からなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と記すこともある）及びその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）もＰＨＡの一種である。これら報告におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたAeromonascaviaeの野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産するものであった。３ＨＨ組成比はオレイン酸を炭素源としたとき１５ｍｏｌ％、パルミチン酸を炭素源としたとき５ｍｏｌ％であった。【０００６】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性に関する研究もなされている（非特許文献１）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてA. caviaeを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、低３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を用いたテレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、高３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を用いたフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、前記製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、菌体あたりのポリマー含量３０％とポリマー生産性は低いものであったため、実用化に向けて更に高い生産性、特にポリマー含量を向上させる方法が探索されてきた。【０００７】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みの例として、以下の技術が挙げられる。非特許文献２では、Aeromonas hydrophilaを用い、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養を行うことにより、菌体量９５．７ｇ／Ｌ、ポリマー含量４５．２％、３ＨＨ組成比１７ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された。また、A.hydrophilaを用いたグルコース及びラウリン酸を炭素源とした培養により、３ＨＨ組成比が１１ｍｏｌ％であり、菌体量５０ｇ／Ｌ、ポリマー含量５０％が達成された（非特許文献３）。しかしながら、A.hydrophilaはヒトに対して病原性を有する（非特許文献４）ことから、工業生産に適した微生物とはいえなかった。また、これらの培養生産で用いられている炭素源は高価であるため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用が求められていた。【０００８】
このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指して以下のような取組みが行なわれた。A. caviaeよりクローニングされたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子をCupriavidusnecator (旧分類：Ralstonia eutropha或いはAlcaligenes eutrophus)に導入した形質転換体を用い、オクタン酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、３ＨＨ組成比は２２ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３３重量％であった（特許文献５、非特許文献５）。更に前記形質転換体を、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、３ＨＨ組成比は４〜５ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献６）。後者の製造方法は安価な植物油脂を炭素源とし、ポリマー含量も高いものの、菌体量が低いため、ポリマー生産性が低く、且つ３ＨＨ組成比４〜５ｍｏｌ％ではフィルム等の用途に適用できるほど柔らかいものではなかった。【０００９】
大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株も構築された。Aeromonas属のＰＨＡ合成酵素遺伝子、C. necatorのＮＡＤＰ−アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として該大腸菌を４０．８時間培養した結果、菌体量７９ｇ／Ｌ、ポリマー含量２７．２％、３ＨＨ組成比１０．８ｍｏｌ％であった（非特許文献８）。A.caviaeのＰＨＡ合成酵素遺伝子、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌も構築された。ラウリン酸を含む培地で該大腸菌を培養すると、菌体生産性は１ｇ／Ｌ、ポリマー含量約１６％、３ＨＨ組成比約１６ｍｏｌ％であった（非特許文献９）。これらの大腸菌でもポリマー生産性は低く、工業的生産への適用は困難であった。【００１０】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた（非特許文献１０）。A. caviae由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示され、また、５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリマー含量が向上したことが報告されている。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており、更にポリマー含量は約１３％と低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。【００１１】
また、ｐＪＲＤ２１５（ATCC 37533）にポリエステル合成酵素遺伝子やＲ−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等（特許文献５、非特許文献５参照）のＰＨＡ合成酵素発現プラスミドにによってC.necatorを形質転換し、該形質転換体のＰＨＡ生産性が調べられている。該菌株の菌体量は４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善により菌体量４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量６２．５％、３ＨＨ組成比８．１ｍｏｌ％にまでポリマー生産性が向上した。このように、培養方法によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比やポリマー生産性を改善する試みがなされた（特許文献６）。【００１２】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性を制御する方法も開示されている（特許文献６）。少なくとも２種類の炭素数の異なる油脂および／または脂肪酸を炭素源として用いることによって、３ＨＨ組成比が１〜４０ｍｏｌ％のポリエステルを生産することが可能となり、種々の物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できるようになった。しかしながら、本製造方法では、３ＨＨ組成制御のために比較的高価なヘキサン酸、オクタン酸等を添加する必要があり、また高濃度のヘキサン酸は細胞毒性を示すことから菌体生産性が低下する結果となっている。また、多成分の炭素源を添加するため、生産設備が複雑・高価になる場合がある。【００１３】
C. necatorを宿主とし、果糖を炭素源とした培養で３ＨＨ組成を向上させる方法も開示されている。ポリエステル合成酵素遺伝子と放線菌Streptomycescinnamonensis由来のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（以下ｃｃｒと略記する）を導入すると３ＨＨ組成は０．９％であったものの、更にＲ−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入すると３ＨＨ組成は１．６％に向上した。しかし、その時の菌体量は約１．５ｇ／Ｌ、ポリマー含量は４０％前後と低く、高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業的生産には一層の改良が必要であった（非特許文献７）。【００１４】
フィルムやシート、軟質系包装容器等への応用には３ＨＨ組成比が１２ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が望まれている。しかし、従来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産において、３ＨＨ組成比を向上させようとすれば、ポリマー含量あるいは菌体量の低下を招いていた。工業生産において望ましいとされる７０％以上のポリマー含量且つ１５０ｇ／Ｌ以上の菌体量かつ３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上を実現する方法はなく、一層の改良が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献６】特開２００１−３４００７８号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe; Macromolecules, 28, 4822-4823 (1995)
【非特許文献２】Biotechnology and Bioengineering, vol.67, 240 (2000)
【非特許文献３】Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.57, 50 (2001)
【非特許文献４】国立感染症研究所、病原体等安全管理規定、別表１付表１（１９９９）
【非特許文献５】T. Fukui, Y. Doi; J. Bacteriol, 179, 15, 4821-4830 (1997)
【非特許文献６】T. Fukui等、Appl. Microbiol. Biotecnol., 49, 333 (1998)
【非特許文献７】T. Fukui等、Biomolecules, vol.3, 618 (2002)
【非特許文献８】S. Park等、Biomacromolecules, vol.2, 248 (2001)
【非特許文献９】X. Lu等、FEMS Microbiology Letters, vol.221, 97 (2003)
【非特許文献１０】T. Kichise等、Appl. Environ. Microbiol., 68, 2411-2419 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、柔軟性に優れ幅広い用途が期待される高３ＨＨ組成比のＰＨＡを、安価な炭素源である植物油を用いて、実用的な生産性で製造することを目的とする。特には、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を効率よく発酵生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物中のＰＨＡ合成酵素量を増加させるとともに、３ＨＢモノマー合成能を減少させ且つ新たな３ＨＨモノマー合成経路を創出し３ＨＨモノマー供給系を増強させることによって前記微生物中に、３ＨＨ組成比率の向上したＰＨＡが大量に生成・蓄積できる事を見出し、本発明を完成するに至った。【００１９】
即ち、本発明の第一は、ｐｈｂＡ遺伝子が不活性化され、ｐｈａＣ遺伝子及びｂｋｔＢ（β−ケトチオラーゼ）遺伝子発現が増強されると共に新たにｃｃｒ遺伝子導入でブチリル−ＣｏＡ合成経路が導入されることによって３ＨＨモノマー合成能が向上した３−ヒドロキシヘキサン酸単位含有ポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な微生物に関する。【００２０】
より詳細には、次の（１）から（３）の要件を備えた微生物に関する；
（１）ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されていること、
（２）ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が向上されていること、
（３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、および／または、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されていること。【００２１】
本発明の第二は、上記記載の微生物を用い、安価な炭素源を用いて菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上であることを特徴とする３ＨＨ単位含有ＰＨＡの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、安価で安全な炭素源を用いて、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上のＰＨＡを発酵生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明の３ＨＨ単位含有ＰＨＡとは、３ＨＨとともに、３ＨＢ、３ＨＶ、３−ヒドロキシオクタン酸、および、それらよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸からなる群より選らばれる1以上の３−ヒドロキシアルカン酸が共重合したポリエステルである。
【００２４】
本発明のｐｈｂＡ遺伝子とは、β−ケトチオラーゼ活性を有する酵素のうち、２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合する反応を触媒するが、β−ケトバレリル−ＣｏＡのチオリシスを殆ど触媒しない酵素をコードする遺伝子で、例えば配列番号５に示される塩基配列からなるｐｈｂＡ遺伝子が例示される。配列番号５に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合する反応を触媒するが、β−ケトバレリル−ＣｏＡのチオリシスを殆ど触媒しない酵素をコードする遺伝子は本発明に好適に用いることができる。配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。
【００２５】
本発明のｂｋｔＢ遺伝子とは、β−ケトチオラーゼ活性を有する酵素のうち、２分子のアセチル−ＣｏＡの縮合およびアセチル−ＣｏＡとそれよりも鎖長の長い、例えばプロピオニル−ＣｏＡの縮合の両方をよく触媒し、且つ３−ケトバレリル−ＣｏＡのチオリシスを触媒する酵素をコードする遺伝子で、例えば配列番号２９に示される塩基配列からなる遺伝子が例示される（SLATER等、J.Bacteriol., vol.180, 1979-1987, 1998）。配列番号２９に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、２分子のアセチル−ＣｏＡの縮合およびアセチル−ＣｏＡとそれよりも鎖長の長い、例えばプロピオニル−ＣｏＡの縮合の両方をよく触媒し、且つ３−ケトバレリル−ＣｏＡのチオリシスを触媒する酵素をコードする遺伝子は本発明に好適に用いることができる。配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。
【００２６】
また、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能なポリメラーゼをコードする遺伝子としては、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子或いは、配列番号４に示される塩基配列からなるｐｈａＣ変異遺伝子などが例示でき、宿主が結果として該ＰＨＡを産生可能であればよい。ｐｈａＣ遺伝子が有する塩基配列あるいは配列番号４に示される塩基配列と、８５％以上の配列同一性を有する遺伝子で、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能なポリメラーゼをコードする遺伝子は本発明に好適に用いることができる。配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。
【００２７】
本発明において、ｂｋｔＢ構造遺伝子の内在のプロモーターとは、ｂｋｔＢ構造遺伝子の転写を誘発するＤＮＡのことであり、宿主として用いるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物中に内在する。
【００２８】
本発明におけるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物とは、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を有する野生株、或いは該野生株に遺伝子操作した微生物であれば特に制限はなく、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能な菌株であれば、それらを宿主として使用することができる。具体的にはラルストニア（Ralstonia）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ワウテルシア（Wautersia）属、アエロモナス(Aeromonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomonas)属等の細菌類を使用することが好ましい。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、特に好ましくはCupriavidusnecatorである。C. necatorとしては、例えば、C. necator H16（ATCC17699）等が挙げられる。当該株はAmerican Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。勿論、前記微生物を人工的に突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された類縁菌株であっても、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能な菌株であれば本発明に使用できる。
【００２９】
そして、３ＨＨ組成比を高めるためには、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子が不活性化されていることが好ましい。ｐｈｂＡ遺伝子がコードする酵素は、前記のようにアセチル−ＣｏＡ２分子の縮合によって、ＰＨＡモノマーの一つである３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの前駆体であるアセトアセチル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する。一方、ｐｈｂＡ遺伝子がコードする酵素はアセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡを縮合する反応を触媒しない。従って、ｐｈｂＡ遺伝子の不活性化はポリマー中の３ＨＢ比率を低くするため、結果として３ＨＨ比率が向上すると考えられる。
【００３０】
ｐｈｂＡ遺伝子を不活性化する方法は、結果としてｐｈｂＡが不活性化されていればよく、例えば、１）phbA遺伝子の開始コドンと終止コドンの間に新たな終止コドンを導入する、２）リボソーム結合部位にリボソーム結合活性が低下する変異を導入する、３）ｐｈｂＡ構造遺伝子内部に酵素の触媒活性を低下させる変異を導入する、４）ＲＮＡ干渉を利用する、５）トランスポゾンを挿入する、６）ｐｈｂＡ構造遺伝子の一部或いは全部を欠失させる等の方法が挙げられる。これらの方法は当業者に周知である。
【００３１】
また、ＰＨＡの生産性を高めつつ３ＨＨ組成比を高めるためには、ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素を増強することが好ましい。ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素は、アセチル−ＣｏＡ２分子の縮合だけではなく、アセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡを縮合する反応も触媒する。アセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡが縮合すると、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの前駆体である３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡが生じる。ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素の活性は、アセチル−ＣｏＡ２分子の縮合反応に対してよりもアセチル−ＣｏＡとブタノイル−ＣｏＡの縮合反応に対しての方が高い。
【００３２】
ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素を増強する方法は特に限定しないが、発現ベクターによる高発現化や発現調節領域の改変による高発現化が可能である。好ましくはｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の染色体上にある該遺伝子のプロモーターを改変して転写活性を上げること、例えば、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物に内在しているｂｋｔＢ遺伝子の上流に、さらにｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発するプロモーターが組み込まれていると、転写活性が上がることによって高発現化が可能である。
【００３３】
ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発するプロモーターは、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流に挿入されることが好ましい。プロモーターは、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限りはどのようなプロモーターでも本発明に用いうる。該プロモーターはｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物内在のプロモーター及び異種微生物のプロモーターの少なくとも何れかであることが好ましい。例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるC.necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターや、配列番号２に示される塩基配列からなるA. caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターは、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物としてC.necatorを用いる場合に好適である。
【００３４】
ここで、プロモーターとして用いるＤＮＡは、配列番号１および２に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、より好ましくは８５％以上であり、更に好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限りは本発明に用いることができる。
【００３５】
さらに、プロモーターとして用いるＤＮＡとして、配列番号１および２に示した塩基配列と相補的な塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を行った時に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを用いることができる。ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限りは本発明に用いることができる。
【００３６】
前記ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition（ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００３７】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１、或いは２に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限り、上記プロモーターに包含される。
【００３９】
更に３ＨＨ組成を高める方法として、ｃｃｒ遺伝子導入で３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ合成経路を導入することが有効である。ｃｃｒ遺伝子がコードするクロトニル−ＣｏＡ還元酵素は脂肪酸のβ酸化経路の中間体であるクロトニル−ＣｏＡを還元し、ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素の基質であるブチリル−ＣｏＡを生成する酵素である。この遺伝子を導入することにより、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡはβ酸化経路からの直接的な供給のみでなく、β酸化経路から派生するアセチル−ＣｏＡからも供給される。
【００４０】
本発明に用いるｃｃｒ遺伝子は、クロトニル−ＣｏＡを還元し３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする限り本発明に用いることができるが、配列番号３に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であることが好ましく、より好ましくは８５％以上であり、更に好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。
【００４１】
さらに、配列番号３に示した塩基配列と相補的な塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を行った時に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも、クロトニル−ＣｏＡを還元しブチリル−ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする限り、本発明に用いることができる。
【００４２】
本発明に用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする限り、本発明に用いることができるが、配列番号４に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であることが好ましく、より好ましくは８５％以上であり、更に好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。
【００４３】
さらに、配列番号４に示した塩基配列と相補的な塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を行った時に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする限り、本発明に用いることができる。
【００４４】
本発明において、３ＨＨ含有ＰＨＡの生産に用い得る炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース等の糖類や、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール類、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸などの脂肪酸類、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体、乳酸等の有機酸類、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えば植物油脂、中でも、ヤシ油、パーム油、パーム核油、パーム核油オレイン（以下、ＰＫＯＯとも記載する）、パームダブルオレイン（以下、ＰＯＯとも記載する）等が挙げられる。培養する際の炭素源の添加量としては、菌株が増殖し、ポリエステルを合成できる範囲であれば良い。
【００４５】
本発明において、宿主に用いるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の野生株が、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを殆どＰＨＡへと変換させる事ができない場合、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素をコードする遺伝子を染色体上へ挿入するか、或いはプラスミドベクターなどを用いて導入する事で、細胞内にて合成された３３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する効率を向上させる必要がある。例えば、宿主としてC.necatorを使用する場合、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素をコードする遺伝子として、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子或いは配列番号４に示したその変異体遺伝子を導入することが好ましい。
【００４６】
本発明の３ＨＨ含有ＰＨＡを生産可能な微生物の作製方法は、特に限定するわけではないが、C. necatorを宿主として以下に例示する。A.caviae由来で３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素をコードするポリエステル合成酵素変異体遺伝子を染色体上に相同組換え法などで元のポリエステル合成酵素遺伝子と置換する。そして遺伝子破壊法を用いて、染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子を不活性化するが、その態様はｐｈｂＡ遺伝子産物であるタンパク質の活性が低下或いは消失すればどのような方法でも良い。例えば、ｐｈｂＡ遺伝子の内部に終止コドンを導入しても良いし、遺伝子上流のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を改変しても良い。更にｂｋｔＢ遺伝子の発現を増強するが、その態様はｂｋｔＢ遺伝子産物の活性が上がればどのような方法でも良い。例えば、より比活性の向上したｂｋｔＢ変異体遺伝子を用いてもよく、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流に異種又は同種のプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡを挿入してもよいし、ｂｋｔＢ遺伝子の本来のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を異種又は同種のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡに置換する方法でもよい。本来のプロモーターは染色体上からすべて失われていてもよいし、一部が欠失していてもよい。
【００４７】
前記染色体の改変において、染色体上に任意の遺伝子を部位特異的に挿入／置換する方法は当業者に周知であり、代表的な方法としては特に限定するわけではないが以下の方法が挙げられる。トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman等、J.Bacteriol., vol.162, p1068 (1985)）や相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti等、MethodsEnzymol., vol.154, p197 (1987)）などがあり、また、Bacillus subtilis由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Schweizer;Mol. Microbiol., vol.6, p1195 (1992)、Lenz等; J. Bacteriol., vol.176, p4385(1994)）も利用することができるが、染色体上に任意遺伝子を挿入／置換出来ればその方法は特に制限されない。
【００４８】
例えばC. necatorのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前に、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子のプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを挿入する場合の方法を、より具体的に例示する。まず、置換フラグメントを作製する。置換フラグメントはｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの直前にA.caviaeのｐｈａＣ遺伝子（以下、ｐｈａＣとも記す）のプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡがつながり、その後にｂｋｔＢ遺伝子がつながった形とする。すなわち、該遺伝子の開始コドンの直前にｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたＤＮＡ断片である。ｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを挟んで存在する上流と下流は染色体上のＤＮＡと相同組換えを起こすために必要な相同配列であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ起こればよく、その長さは任意に設定できる。
【００４９】
置換断片には、遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することができる。選択マーカーとなる遺伝子は、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。C.necatorを宿主とする場合にはカナマイシンの耐性遺伝子が好適である。さらにそれらに加えて、第二段階の相同組換えによって選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのような遺伝子としてはBacillussubtilis由来のｓａｃＢ遺伝子が例示できる。この遺伝子が発現している微生物株はシュークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シュークロースを含む培地での生育によりこの遺伝子を脱落によって失った株を選択することが容易となる。
【００５０】
これらで構成された置換フラグメントは、宿主微生物株中で複製しないベクターに接続することによって遺伝子置換用のプラスミドとして作製される。ラルストニア属やシュードモナス属等で利用できるこのようなベクタープラスミドには、例えばｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、或いはそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙げられる。さらには、接合伝達を可能にするｍｏｂ、ｏｒｉＴなどのＤＮＡ配列を共存させることも可能である。
【００５１】
このような構成で作製された遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーション法や接合伝達法など公知の方法によりC. necatorに導入することができ、相同組換えを行うことができる。
【００５２】
次に相同組換えによって染色体上に遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡが挿入された株の選択を行う。株の選択は、遺伝子置換用プラスミドＤＮＡに共存させた選択用の遺伝子に基づいた方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、カナマイシンを含む培地で生育してきた株から選ぶことができる。
【００５３】
次の段階で、第二の相同組換えによって染色体上から選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えばカナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよいが、ｓａｃＢ遺伝子を遺伝子置換用プラスミドに共存させている場合は、シュークロースを含む培地で生育してくる株から容易に選択できる。このようにして得られた株が、所望するように遺伝子が置換された株かどうか確認するには、ＰＣＲ法やサザン・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。
【００５４】
以上のようにして、C. necatorの染色体上にあるｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流にA. caviaeのｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株を取得することができる。
【００５５】
次に発現ベクターについて説明する。C. necatorで通常用いられる発現ベクターにはｐＪＲＤ２１５由来の発現ベクター（例えば特許文献５）やｐＢＢＲ１２２由来の発現ベクター（非特許文献７）がある。発現ベクターはその宿主細胞内において、非選択圧条件下でも安定に複製・維持されることが望ましい。従って国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２等がより好適である。ｐＣＵＰ２にはC.necatorと近縁であるカプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８由来のプラスミドの複製や安定維持に必要な領域が含まれている。
【００５６】
このｐＣＵＰ２にA. caviae由来のｐｈａＣ遺伝子発現ユニットとS. cinnamonensis由来のｃｃｒ遺伝子発現ユニットを挿入したプラスミドがｐＣＵＰ２−６３１ベクターである。ｐＣＵＰ２−６３１に更にA.caviae由来のフェイシンをコードするｐｈａＰ遺伝子及び同由来のＲ−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子を挿入しても良い。また、ｐＣＵＰ２−６３１に更にC.necator由来のフェイシンをコードするｐｈｂＰ遺伝子及びA. caviae由来のＲ−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子を挿入しても良い。
【００５７】
前述した染色体上のｐｈｂＡ遺伝子を破壊し、且つｂｋｔＢ遺伝子発現を増強した株に、この発現ベクターを導入して得られる菌株としてＫＮＫ−６３１株等の菌株が例示できる。これらの株はいずれも安価で安全な炭素源を用いて、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上のＰＨＡを発酵生産することができる。
【００５８】
前述した方法で作製した微生物を用いて３ＨＨ含有ＰＨＡを製造する方法について説明する。その方法は特に限定するわけではないが、以下のようにして行う事ができる。本発明のＰＨＡの生産においては、炭素源、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。
【００５９】
炭素源としては、糖類、油脂類、脂肪酸類などが好ましく、より好ましくは植物油脂類であり、更に好ましくはパーム油及びパーム核油である。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００６０】
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
【００６１】
本発明において、菌体からの３ＨＨ含有ＰＨＡの回収は、特に限定はないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いて３ＨＨ含有ＰＨＡを抽出する。この３ＨＨ含有ＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えて３ＨＨ含有ＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて３ＨＨ含有ＰＨＡを回収する。
【００６２】
得られた３ＨＨ含有ＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ組成(ｍｏｌ％)の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。
【００６３】
本発明で得られる柔軟性の高いＰＨＡは、フィルムやシート、軟質系包装容器などに好適に用いられる。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお一般的な遺伝子操作は、MolecularCloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従い使用することができる。なお、酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００６５】
（実施例１）
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。A.caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号６および配列番号７で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏとした。【００６６】
次に、特開2008-029218号公報[0038]に記載のＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。【００６７】
特開2008-029218号公報[0036]に記載のＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号８および配列番号９で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。【００６８】
ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号８および配列番号７で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。【００６９】
次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１０および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。【００７０】
ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号８および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。【００７１】
続いて、特開2008-029218号公報[0037]に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。【００７２】
＜遺伝子挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ−００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。【００７３】
この遺伝子挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。【００７４】
（実施例２）  Ｐｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてC. necatorのｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡ（以下Ｐｒｅとする）を次のように作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１２および配列番号１３で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、５４℃で３０秒、６８℃で２５秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化した。このＤＮＡ断片をＰｒｅ−５Ｐとした。【００７５】
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定した。【００７６】
ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡとして実施例１で作製したＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａを用いた。【００７７】
Ｐｒｅ−５ＰおよびＯＲＦ−５Ｐ−Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１２および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、５４℃で３０秒、６８℃で５０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＲＯ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。【００７８】
次に、該遺伝子の開始コドンより上流側の配列を作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号８および配列番号１４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、５８℃で３０秒、６８℃で２０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。【００７９】
ＰｂｋｔＢ−５Ｐ＋ＢａｍとＰＲＯ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号９および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）を同制限酵素で消化した部位に、サブクローニングした。得られたベクターをｂＲＯ／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。【００８０】
続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＲＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＲＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。【００８１】
＜遺伝子挿入株Ｐｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
実施例１の遺伝子置換株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＲＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＰｒｅ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。【００８２】
（実施例３）  ＢＡＢ３／ＡＳ株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側９１塩基目と９２塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドン直後と設定した。【００８３】
挿入用ＤＮＡとして、A. caviaeのｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。【００８４】
A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１５および配列番号１６で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−Ｍｕｎ／３とした。【００８５】
また以下の手順で挿入部位より上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。【００８６】
ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の上流側ＯＲＦの塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３とした。【００８７】
ＰＡｃ−Ｍｕｎ／３およびｍｉａＢ−Ｍｕｎ／３をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号１６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＡＢ３−Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。【００８８】
このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＡＢ３／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列であることを確認した。【００８９】
続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＡＢ３／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ３／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。【００９０】
＜遺伝子挿入株ＢＡＢ３／ＡＳ株の作製＞
実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてＢＡＢ３／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ３／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側９１塩基目と９２塩基目の間にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。【００９１】
（実施例４）  ＢＡＢ４／ＡＳ株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側６５塩基目と６６塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドンから２６塩基下流と設定した。【００９２】
挿入用ＤＮＡとして、A. caviaeのｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。【００９３】
A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１５および配列番号１９で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−Ｍｕｎ／４とした。【００９４】
また以下の手順で挿入部位より上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。【００９５】
ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１７および配列番号２０で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の上流側ＯＲＦの塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ−Ｍｕｎ／４とした。【００９６】
ＰＡｃ−Ｍｕｎ／４およびｍｉａＢ−Ｍｕｎ／４をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＡＢ４−Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。【００９７】
このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＡＢ４／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列であることを確認した。【００９８】
続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＡＢ４／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ４／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。【００９９】
＜遺伝子挿入株ＢＡＢ４／ＡＳ株の作製＞
実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてＢＡＢ４／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ４／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側６５塩基目と６６塩基目の間にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。【０１００】
（実施例５）  ＢＡＢ５／ＡＳ株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドンから３３塩基下流と設定した。【０１０１】
挿入用ＤＮＡとして、A. caviaeのｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。【０１０２】
A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１５および配列番号２１で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−Ｍｕｎ／５とした。【０１０３】
また以下の手順で挿入部位より上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１７および配列番号２２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の上流側ＯＲＦの塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ−Ｍｕｎ／５とした。【０１０４】
ＰＡｃ−Ｍｕｎ／５およびｍｉａＢ−Ｍｕｎ／５をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号２１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＡＢ５−Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。【０１０５】
このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＡＢ５／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列からなるＤＮＡであることを確認した。【０１０６】
続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＡＢ５／ｐＢｌｕを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。【０１０７】
＜遺伝子挿入株ＢＡＢ５／ＡＳ株の作製＞
実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてＢＡＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ５／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。【０１０８】
（実施例６）  ＢＲＢ５／ＡＳ株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドンから３３塩基下流と設定した。【０１０９】
挿入用ＤＮＡとしてC. necatorのｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。【０１１０】
C. necatorのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号２３および配列番号２４で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をＰＲｅ−Ｍｕｎ／５とした。【０１１１】
ＰＲｅ−Ｍｕｎ／５および実施例５で調製したｍｉａＢ−Ｍｕｎ／５をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号２４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＲＢ５−Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。【０１１２】
このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＲＢ５／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列からなるＤＮＡであることを確認した。【０１１３】
続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＲＢ５／ｐＢｌｕを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＲＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。【０１１４】
＜遺伝子挿入株ＢＲＢ５／ＡＳ株の作製＞
実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてＢＲＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＲＢ５／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。【０１１５】
（実施例７）
＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
クロトニル−ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomycescinnamonensis）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ  １０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号２５及び配列番号２６記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（J.Bacteriol., 179, 4821 (1997)）を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。【０１１６】
（実施例８）
＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
配列番号４を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開2007-228894号公報[0031]に記載のＨＧ：：ＰＲｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。【０１１７】
（実施例９）
＜発現ベクターの構築＞
発現ベクターｐＣＵＰ２−６３１は以下のようにして構築した。
C. necatorにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず実施例７で構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次に実施例８で作製したｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２−６３１ベクターを構築した。【０１１８】
（実施例１０）形質転換細胞の作製
ｐＣＵＰ２−６３１ベクターの種々の細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体を取得した。【０１１９】
（実施例１１）
作製した種々の形質転換体の培養を行った。前培地の組成は１％(w/v)Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１％(w/v)Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２％(w/v)Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、および、０．１５％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４で、ｐＨ６．７に調整した。【０１２０】
ポリエステル生産培地の組成は１．１％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．６％(w/v)（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％(v/v)微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％(w/v)ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％(w/v)ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％(w/v)ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％(w/v)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％(w/v)ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１％(w/v)ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてＰＫＯＯ（パーム核油オレイン画分）を流加する流加培養にて行った。【０１２１】
それぞれの形質転換体のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、２．５Ｌのポリエステル生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ−５００型）に１０％(v/v)接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには１４％のアンモニア水を使用した。培養は６５時間まで行った。培養後遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、３ＨＨ組成比率を分析した。【０１２２】
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、化学式（１）に示すような共重合体ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。乾燥菌体重量、ポリマー含量、３ＨＨ比率を表１に示した。【０１２３】
【表１】
2009145164.tif 000002
【０１２４】
【化１】
2009145164.tif 000003
【０１２５】
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）
【配列表】
2009145164000001.app
【国際調査報告】
2009145164.tif 000004
2009145164.tif 000005
2009145164.tif 000006
2009145164.tif 000007