(57)【要約】  ビフィズス菌の増殖性を改善させ得る乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、前記製造方法により製造された発酵乳の提供。細胞壁局在性タンパク質分解酵素 （ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ）を有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法、及び前記発酵乳の製造方法により製造された発酵乳。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁局在性タンパク質分解酵素（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ）を有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である請求項１記載の発酵乳の製造方法。
【請求項３】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株である請求項２又は３記載の発酵乳の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 （ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ）を有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを共発酵させることにより得られる発酵乳の製造方法に関する。
本願は、２００８年６月１１日に、日本に出願された特願２００８−１５２９４９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、すなわちビフィズス菌は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。
このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。【０００３】
ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有させるために、通常、酵母エキス等の様々な増殖促進物質を添加することが行われている。しかし、前記増殖促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。【０００４】
ビフィズス菌以外の乳酸菌と混合発酵をさせることにより、前記生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびビフィズス菌属を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。【０００５】
その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、（２）乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【特許文献１】特許第３３６４４９１号公報
【特許文献２】特許第３０６８４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）の方法では、必ずしも充分なビフィズス菌の生育促進及び発酵時間短縮の効果があるとは言えない。また、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの２種類の菌が存在する条件下でビフィズス菌の生育が促進されるとされているが、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスまたはラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスをそれぞれ単独で用いた場合の効果については、一切記載がない。【０００７】
一方、上記（２）の方法では、特定のビフィズス菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィズス菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガムについては、一切記載がない。【０００８】
本発明は、ビフィズス菌の増殖性を改善させ得る乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、前記製造方法により製造された発酵乳を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、細胞壁局在性タンパク質分解酵素ＰｒｔＰを有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を、ビフィズス菌と混合発酵させた場合に、ビフィズス菌の増殖が促進されることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 （ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ）を有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムが、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の発酵乳の製造方法により、従来に無くビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する発酵乳を、効率よく製造することができる。また、本発明の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳は、より整腸効果が高く、健康管理上も有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ラクトコッカス・ラクチスの各菌株由来のＤＮＡを鋳型として、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を検出するプライマーを用いてＰＣＲを行った結果得られたＰＣＲ産物を、電気泳動法により分離し、染色により検出したバンドパターンを示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において用いられる乳酸菌は、ＰｒｔＰ酵素を有しているラクトコッカス・ラクチスである。ＰｒｔＰ酵素は、細胞膜に存在し、細胞表面に活性部位が剥き出しになっている酵素である。ＰｒｔＰ酵素を有している乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）やラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属菌において、ＰｒｔＰを有する菌株が幾つか報告されている。【００１４】
これまでに、ラクトコッカス・ラクチス由来のＰｒｔＰ酵素には、ＰＩ型（α―カゼインを余り分解せず、β―カゼインをＣ末端の近辺からよく分解する）、ＰＩＩＩ型（α―カゼイン及びβ―カゼインをＣ末端及びＮ末端の両方からよく分解する）及びその中間型（ＰＩ／ＰＩＩＩ型）が知られている（例えば、Ｒｅｉｄ，ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、第６０巻第３号、第８０１〜８０６ページ参照。）。
具体的には、ラクトコッカス・ラクチス由来のＰｒｔＰ酵素として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にアクセッション番号ＡＹ５４２６９０、ＡＹ５４２６９１等として遺伝子配列が登録されているＰｒｔＰ酵素等が挙げられる。【００１５】
ある乳酸菌が、ＰｒｔＰ酵素を有する乳酸菌であるか否かは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の遺伝子解析技術を用いて、ＰｒｔＰ酵素をコードするＰｒｔＰ遺伝子を有しているか否かを調べることにより確認することができる。【００１６】
ＰｒｔＰ酵素は、細胞外に酵素活性部位を有するため、培地中のタンパク質を分解することができる。例えば、乳酸菌が乳性培地で増殖するときに、ＰｒｔＰ酵素が、乳性培地中の乳タンパク質を分解し、乳酸菌の生育に必要となるオリゴペプチドやアミノ酸が提供される。このため、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスは、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３０℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する、という特徴がある。このような増殖性や発酵性が高いという特徴を利用して、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスを検出することもできる。その他、ＰｒｔＰ酵素活性を検出することによっても、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスを検出することができる。【００１７】
本発明に用いられるラクトコッカス・ラクチスは、ＰｒｔＰ酵素を有するものであれば特に限定されるものではないが、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスやラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス等であることが好ましい。発酵乳等のビフィズス菌を原料とする乳製品において、従来から原料として使用されていることから、安全性が高いと考えられるためである。ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスとしては、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株や、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株等がある。【００１８】
以下、本発明に用いられるＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチス及びビフィズス菌増殖促進作用について、さらに詳細に説明する。
１．ラクトコッカス・ラクチスの菌株のＰｒｔＰ酵素保有性の検出
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ（ＡＴＣＣ１９２５７Ｔ）株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７（ＮＣＤＯ  ４９７）株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株、及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株が、ＰｒｔＰ酵素を保有しているか否かを確認した。
具体的には、ラクトース及びグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、各菌株を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により菌体を得、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりＰｒｔＰ遺伝子の保有性を確認した。ＰＣＲは参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｉｅｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年、第１００巻、第１３０７〜１３１７ページ。）に記載の手法に準じて行った。プライマーは、フォワードプライマーＧＢｆ（ＧＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡ）及びリバースプライマーＧＢ２ｒ（ＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣ）のプライマーセット、もしくはフォワードプライマーＧＨｆ（ＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡ）及びリバースプライマーＧＨ２ｒ（ＴＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣＡ）のプライマーセットを用いた。【００１９】
図１はＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、染色により検出したバンドパターンを示した図である。図１中、「１」は分子量マーカーを流したレーンであり、「２」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株のＰＣＲ産物、「３」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のＰＣＲ産物、「４」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株のＰＣＲ産物、「５」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のＰＣＲ産物、「６」はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株のＰＣＲ産物を、それぞれ流したレーンである。この結果、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株にはＰｒｔＰ遺伝子の保有が確認された。一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のそれぞれの菌株では保有していないことが判明した。【００２０】
２．乳性培地でのラクトコッカス・ラクチスの発酵性試験
まず、ラクトースおよびグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）  Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、各菌株を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の後述組成の乳性培地に懸濁し、シードカルチャーを得た。
次に、１％（Ｗ／Ｗ）グルコース、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、９５℃で３０分間殺菌し、前記各菌株のシードカルチャーを３％接種し、３０℃で１６時間培養した。得られた培養液を急冷し、凝固状況、ｐＨ、及び含有される乳酸菌数を測定した。乳酸菌数の測定は、市販されているＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研器材社製）平板で行った。【００２１】
測定結果を表１に示す。ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株ではｐＨが５．０以下まで低下して培地が凝固した。また、含有される乳酸菌数も３×１０8ＣＦＵ／ｇ以上であり、非常に増殖・発酵性の良いことが分かった。対して、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株、およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のそれぞれの菌株ではｐＨが５．５以上であり、培地は凝固せず、乳酸菌数が１×１０8ＣＦＵ／ｇ以下であった。【００２２】
【表１】
2009150897.tif 000002
【００２３】
３．ビフィズス菌との混合培養試験
まず、後記実施例１に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株を調製した。
また、ラクトースおよびグルコースを０．５％添加したＤｉｆｃｏ（登録商標）  Ｍ１７  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、ラクトコッカス・ラクチス各菌株を３％接種し、３０℃で１６時間培養した。遠心分離により集菌し、洗浄後、元の培養液と同量の後述組成の乳性培地に懸濁し、シードカルチャーを得た。
１％グルコース（Ｗ／Ｗ）、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳を含む乳性培地を、９０℃で１０分間殺菌し、前記のように調製したラクトコッカス・ラクチスの各菌株のシードカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。測定結果を表２に示す。なお、ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行った。【００２４】
測定結果を表２に示す。ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株と混合培養したものでは、ｐＨが５．０以下まで低下し、凝固した発酵乳が作られて、ビフィズス菌数が２×１０８ＣＦＵ／ｇ以上に達した。これに対して、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＡＴＣＣ−９６２５株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株、およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１２８株のそれぞれと混合培養したものでは、ｐＨが５．５以上であり、発酵用ベースが凝固せず、ビフィズス菌数が２×１０7ＣＦＵ／ｇ以下であった。
すなわち、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスは、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有さないものと比べて、ビフィズス菌に対する増殖促進性が優れていること、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスをビフィズス菌と混合培養することにより、ビフィズス菌の増殖促進効果が得られることが明らかである。【００２５】
【表２】
2009150897.tif 000003
【００２６】
４．特許文献１、２記載の乳酸菌と本発明のラクトコッカス・ラクチスとの比較
まず、上記３記載の方法で、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のシードカルチャーを調製した。
次に、後記実施例１に記載の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャーを調製した。
また、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、特許文献２記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーを３０ｍＬ接種し、３０℃で１６時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーを調製した。
これとは別に、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株または、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャー１％と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。
一方、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、上記のように調整したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャー１％と、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）２％を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。なお、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」は、特許文献１に記載の「ＥＺＡＬ ＭＲ０１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）に相当する混合物である。【００２７】
測定結果を表３に示す。ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株では、ビフィズス菌数が３×１０８ＣＦＵ／ｇ前後に達した。これに対し、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」を用いた発酵乳では、ｐＨが５．０以下に低下し、発酵用ベースが凝固したものの、発酵乳を１０６倍に希釈した希釈溶液からは、ビフィズス菌が全く検出されず、前記発酵乳に含有されるビフィズス菌数は１×１０６ＣＦＵ／ｇ以下であることが判明した。
すなわち、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、ビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を十分に得ることができないことが明らかである。
また、特許文献２記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた発酵乳では、１６時間発酵を行ってもｐＨが５．０以上で凝固せず、発酵乳にならなかった。発酵終了後のビフィズス菌数は１×１０８ＣＦＵ／ｇ以下であり、本発明のＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス菌株と比較して、ビフィズス菌の増殖促進作用は顕著に弱かった。
これらの結果から、ＰｒｔＰ酵素遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチスであるラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株は、ビフィドバクテリウム属菌に対して増殖促進作用に優れることが明らかになった。【００２８】
【表３】
2009150897.tif 000004
【００２９】
本発明において、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスとビフィズス菌を混合培養することによりビフィズス菌の増殖促進効果が得られる理由は明らかではないが、ラクトコッカス・ラクチスが有するＰｒｔＰにより、乳性培地中の乳タンパク質が加水分解されることにより、ビフィズス菌増殖促進作用を有するオリゴペプチドが得られるためではないかと推察される。【００３０】
本発明で用いられるビフィズス菌は、特に限定されるものではないが、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることが好ましい。ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスによる増殖促進効果が、より顕著に得られるためである。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株や、ビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株であることが好ましい。【００３１】
本発明において、ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスやビフィズス菌の前培養に用いられる培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。前記還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。前記殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。【００３２】
本発明において、ビフィズス菌とＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスを用いた発酵に用いられる発酵用ベースは、発酵乳の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではない。前記ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。【００３３】
ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチスのスターターの発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１が特に好ましい。また、発酵用ベースへ添加する量も、特に限定されるものではないが、ビフィズス菌とラクトコッカス属菌を合わせた添加量が、発酵用ベースに対して０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％が特に好ましい。【００３４】
本発明に用いる乳酸菌には、ラクトコッカス・ラクチスのビフィズス菌に対する生育促進効果及び保存生残性促進効果を阻害しない範囲において、ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチスの他に、他の乳酸菌を含有してもよい。前記他の乳酸菌は、通常発酵乳の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスが好ましい。ビフィズス菌とラクトコッカス・ラクチスを合わせた摂取量と、その他の乳酸菌を合わせた摂取量の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、ラクトコッカス・ラクチスのビフィズス菌に対する効果を阻害しない限り、特に限定されるものではないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。【００３５】
本発明の発酵乳の製造方法における、混合培養の温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。ビフィズス菌と本発明に用いるラクトコッカス・ラクチスの両方が充分に生育可能な温度範囲であるためである。また、培養時間は、製造する発酵乳の種類によって適宜決定されるが、５〜１８時間が好ましい。【００３６】
培養後得られた発酵乳は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状に加工してもよい。その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３８】
［実施例１］  
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔ株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で６時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖８．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６Ｔのカルチャー５０ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株のカルチャー株５００ｍＬを接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。前記発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６、５．０×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この前記ドリンクヨーグルトを１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は２．５×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は５０％であった。【００３９】
［実施例２］  
１％グルコース入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃で１６時間培養した。一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＡＴＣＣ１５７００株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃で１６時間培養した。また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃で５時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．０％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し、４０℃に冷却した。前記殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＪＣＭ２０１０１株のカルチャー５００ｍＬ、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＡＴＣＣ１５７００株のカルチャー５００ｍＬ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５ｍＬを接種し、５００ｍＬ容の樹脂容器に充填し、密封し、３７℃で６時間培養した後、直ちに冷却した。得られた発酵乳は乳酸酸度０．７％、ｐＨ４．６であり、４．８×１０８ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。この前記発酵乳を１０℃で１４日間保存した時のビフィズス菌数は１．８×１０８ＣＦＵ／ｇであり、生残率は３８％であった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の製造方法により、生きているビフィズス菌を従来に無く多く含有する発酵乳を製造することができるため、発酵乳等の製造分野で利用が可能である。
【図１】
2009150897.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月26日(2009.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である請求項１記載の発酵乳の製造方法。
【請求項３】
前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベ  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株である請求項１記載の発酵乳の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、細胞壁局在性タンパク質分解酵素 (ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＰｒｔＰ)を有するラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）と、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌とを用いて発酵用ベースを発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株及び／又はビフィドバクテリウム・ブレーベ  タイプストレインＡＴＣＣ１５７００株である前記記載の発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明で用いられるビフィズス菌は、特に限定されるものではないが、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることが好ましい。ＰｒｔＰ酵素を有するラクトコッカス・ラクチスによる増殖促進効果が、より顕著に得られるためである。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ-９９９株や、ビフィドバクテリウム・ロンガム  タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株であることが好ましい。
【国際調査報告】
2009150897.tif 000006
2009150897.tif 000007
2009150897.tif 000008
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