(57)【要約】【課題】糖尿病性動脈硬化を非糖尿病性動脈硬化と区別して判定することができる手段を提供する。【解決手段】本発明の一形態によれば、動脈硬化の検査方法が提供される。そして、当該検査方法は、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定する工程と、測定された値を指標として、前記被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を検査する工程とを含む点に特徴を有する。【選択図】図２
2013151053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定する工程と、
その測定値を指標として、前記被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を検査する工程と、
を含む、動脈硬化の検査方法。
【請求項２】
前記代謝物質が、下記の表１に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上を含む、請求項１に記載の検査方法。
【表１】
2013151053.tif 000017
【請求項３】
前記代謝物質が、下記の表２に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上を含む、請求項１または２に記載の検査方法。
【表２】
2013151053.tif 000018
【請求項４】
前記代謝物質が、下記の表３に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検査方法。
【表３】
2013151053.tif 000019
【請求項５】
糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の検査が、前記被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の有無もしくは罹患の危険性の判断、前記被検体に存在する糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化のステージの決定、前記被検体に存在する糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の治療効果の評価、または前記被検体に存在する糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の予後の予測もしくは再罹患の危険性の評価である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項６】
前記被検試料中の前記代謝物質の量を、対照検体から採取した対照試料中の前記代謝物質の量と対比する工程をさらに含み、
対比の結果に基づいて、前記被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を検査する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項７】
前記対照試料が健常被検体から採取した健常試料を含む、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記被検試料中の上記表２および上記表３に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が前記健常被検体から採取した前記対照試料中の量よりも多く、
前記被検試料中の上記表１に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が糖尿病性動脈硬化の患者から採取した前記対照試料中の量よりも少ないときに、前記被検体は非糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断する、請求項７に記載の検査方法。
【請求項９】
さらに、前記被検試料中の上記表２に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が糖尿病性動脈硬化の患者から採取した前記対照試料中の量よりも多いときに、前記被検体は非糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断する、請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
さらに、前記被検試料中の上記表３に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が糖尿病性動脈硬化の患者から採取した前記対照試料中の量よりも少ないときに、前記被検体は非糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断する、請求項８または９に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記被検試料中の上記表１および上記表３に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が前記健常被検体から採取した前記対照試料中の量よりも多く、
前記被検試料中の上記表２に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した前記対照試料中の量よりも少ないときに、前記被検体は糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断する、請求項７に記載の検査方法。
【請求項１２】
さらに、前記被検試料中の上記表３に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した前記対照試料中の量よりも多いときに、前記被検体は糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断する、請求項１１に記載の検査方法。
【請求項１３】
さらに、前記被検試料中の上記表３に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した前記対照試料中の量よりも多いときに、前記被検体は糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断する、請求項１１または１２に記載の検査方法。
【請求項１４】
前記代謝物質の量の測定を、質量分析法を用いて行う、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１５】
前記代謝物質の量の測定を、陽電子放射断層撮影法、単一光子放射断層撮影法、コンピュータ断層撮影法、核磁気共鳴画像法および核磁気共鳴分光法からなる群から選択される１または２以上を用いて行う、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１６】
動脈硬化治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
動脈硬化に罹患した非ヒト被検体に被検物質を与える工程と、
請求項１〜７、１４および１５のいずれか１項に記載の検査方法により、前記被検体の動脈硬化が治癒または改善したか否かを判定する工程と、
前記被検体の動脈硬化が治癒または改善したことを指標として、前記被検物質が動脈硬化治療薬の候補物質であると判定する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病罹患率の爆発的上昇は、社会的、経済的および医療上の問題であり、日本のみならず世界的に解決が望まれている喫緊の課題である。糖尿病患者の生命予後規定因子は心血管病であり、そのなかでも動脈硬化の進展は生命予後に直結する。これまで、糖尿病性動脈硬化の進展予防に対して、血糖値を指標とした薬剤介入が行われてきたが、十分な効果が得られていない。【０００３】
この背景には、糖尿病性動脈硬化の病変特異的な指標がこれまで知られていないことがある。すなわち、糖尿病自体が動脈硬化症に与える影響や、抗糖尿病薬の糖尿病性動脈硬化に対する影響が評価できず、糖尿病性動脈硬化の進展予防や治療に関して有効な手段はいまだに得られていないのである。【０００４】
ところで、従来、α２インテグリン遺伝子の第７エクソンの所定の遺伝子多型を指標として、２型糖尿病患者における動脈硬化への易罹患性を判定する方法が提案されている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１４１１１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の技術は遺伝子の発現を指標としているため、その変動が表現型にまで現れない場合も多く、臨床上の判定に用いるのは困難であり、また現実的ではない。このように、糖尿病性動脈硬化、非糖尿病性動脈硬化、健常状態を相互に区別して確実に判定する方法はいまだ知られていないのが現状である。【０００７】
そこで本発明は、糖尿病性動脈硬化、非糖尿病性動脈硬化、正常状態を相互に区別して判定することができる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った。その結果、驚くべきことに、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定し、測定された値を指標とすることで、糖尿病性動脈硬化、非糖尿病性動脈硬化、正常状態を相互に区別して判定することができることを見出した。そしてこの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明の一形態によれば、動脈硬化の検査方法が提供される。そして、当該検査方法は、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定する工程と、測定された値を指標として、前記被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を検査する工程とを含む点に特徴を有する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、糖尿病性動脈硬化、非糖尿病性動脈硬化、正常状態を相互に区別して判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例において、糖尿病誘起日本白色家兎および非糖尿病日本白色家兎に動脈硬化病変を作製したプロトコールを説明するための説明図である。
【図２】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードにより代謝物質の測定を行った結果を統計解析し、主成分分析（ＰＣＡ；Principle Component Analysis）を行った結果を示すグラフである。なお、図中の１〜１５の番号は、分析に供した試料の番号を表す。
【図３】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードにより代謝物質の測定を行った結果を統計解析し、各種代謝産物をサンプル毎にヒートマップ表示した結果を示す表である。
【図４】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したすべての代謝経路を一覧で記載した経路図である。
【図５】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画した解糖系/糖新生、ペントースリン酸経路、およびクエン酸回路の経路図である。
【図６】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画した尿素回路、およびアミノ酸代謝（Glu、Gln、His、Pro）の経路図である。
【図７】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したアミノ酸代謝（Gly、Ser、Cys）の経路図である。
【図８】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したアミノ酸代謝（Asp、Ala、Lys）の経路図である。
【図９】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したアミノ酸代謝（分枝鎖アミノ酸）の経路図である。
【図１０】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したアミノ酸代謝（芳香族アミノ酸）の経路図である。
【図１１】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したプリン代謝、およびピリミジン代謝の経路図である。
【図１２】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したその他の糖代謝の経路図である。
【図１３】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物を描画したニコチン酸およびニコチンアミド代謝の経路図である。
【図１４】実施例において、大腿動脈血管サンプルを用いてキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードによる代謝物質の測定で検出された化合物のうち、代謝経路図に描画されなかった代謝物質の検出量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。
【００１３】
本発明の一形態は、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定する工程と、その測定値を指標として、前記被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を検査する工程とを含む、動脈硬化の検査方法である。
【００１４】
≪被検体≫
本発明において、「被検体」とは、糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化に罹患しうる動物であればよく、特に限定されないが、ヒトが特に好ましい。ヒト以外の被検体としては、例えば、サル、チンパンジー等の非ヒト霊長類や、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモット等の他の哺乳類が挙げられる。ヒト以外の動物（非ヒト動物）を被検体とした場合に得られる情報（判定結果）は、当該非ヒト動物の糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の検査自体にも利用されうる。さらに、その判定結果をヒトにおける糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化に関連した疾患を診断・検査するための方法の確立に向けた研究開発に利用できる点での有用性も大きい。本発明において検査の指標とする代謝物質については、種を越えてゲノム情報や分析法を共有できることから、非ヒト動物での実験結果はヒトに対しても外挿可能であるといえる。
【００１５】
本発明の検査方法は、以下に詳述するように、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定する点に特徴を有する。
【００１６】
≪試料≫
本発明の検査方法では、被検体から採取した被検試料を用いる。本発明において、「被検試料」とは、組織、細胞、粘膜、血液成分（血清、血漿、血球細胞）、唾液、尿、糞便、汗、体毛、乳汁等の生体に由来するサンプルであってもよく、または培養組織もしくは細胞、培養細胞の抽出物、培養上清等の培養組織もしくは細胞に由来するサンプルであってもよい。被検試料は、好ましくは血管組織または血液成分に由来するサンプルであり、より好ましくはヒトの血管組織または血液成分に由来するサンプルである。
【００１７】
また、本発明の検査方法では、検査の態様に応じて、被検試料以外の試料を対照試料とともに用いてもよい。このような対照試料としては、たとえば、健常被検体から採取した健常試料が挙げられる。また、非糖尿病性動脈硬化または糖尿病性動脈硬化に罹患している（または、特定のステージである）との確定診断がなされている被検体（患者）から採取した試料を対照試料（患者試料）として用いてもよい。さらに、治療効果を判定することを目的として、治療前の被検体から採取した試料（治療前試料）を対照試料として用いてもよい。
【００１８】
≪代謝物質≫
本明細書において、「代謝物質」とは、生体内における生体による化学反応（同化および異化）により生成する中間体および最終生成物を意味する。代謝物質は表現型に近く、表現型での変化を観察しやすいため、臨床上の検査に用いることに利点がある。本発明において、代謝物質は１種のみであってもよいが、通常は複数（すなわち、好ましくは、少なくとも２、３、４、５、１０、５０、１００種）である。代謝物質の種類としては、生物などの生体に含まれるものをはじめとして、すべてのクラスの有機または無機の化合物を包含しうる。好ましくは、本発明に係る代謝物質は、低分子化合物である。より好ましくは、複数の代謝物質が想定される場合、この複数の代謝物質とは、メタボローム（すなわち、特定の時間に特定の条件下で生物、器官、組織、または細胞に含まれる一群の代謝物質）を意味する。
【００１９】
代謝物質は、より詳細には、代謝経路の酵素に対する基質、そのような経路の中間体、または代謝経路を経て生成する最終生成物などの低分子化合物である。代謝経路は、本技術分野において周知である。好ましくは、代謝経路は、少なくとも、クエン酸回路、呼吸鎖、光合成、光呼吸、解糖、糖新生、ヘキソース一リン酸経路、酸化的ペントースリン酸経路、脂肪酸の産生およびβ酸化、尿素回路、アミノ酸生合成経路、タンパク質分解経路たとえばプロテアソームによる分解、アミノ酸分解経路、次の物質の生合成または分解を包含する：脂質類、ポリケチド類（たとえば、フラボノイド類およびイソフラボノイド類を包含する）、イソプレノイド類（たとえば、テルペン類、ステロール類、ステロイド類、カロテノイド類、キサントフィル類を包含する）、炭水化物類、フェニルプロパノイド類およびその誘導体、アルカロイド類、ベンゼノイド類、インドール類、インドール硫黄化合物類、ポルフィリン類、アントシアン類、ホルモン類、ビタミン類、補因子たとえば補欠分子族または電子伝達体、リグニン、グルコシノレート類、プリン類、ピリミジン類、ヌクレオシド類、ヌクレオチド類、および関連分子、たとえば、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはｍＲＮＡ。したがって、低分子化合物である代謝物質は、好ましくは、次のクラスの化合物を包含する：アルコール類、アルカン類、アルケン類、アルキン類、芳香族化合物類、ケトン類、アルデヒド類、カルボン酸、エステル類、アミン類、イミン類、アミド類、シアニド類、アミノ酸類、ペプチド類、チオール類、チオエステル類、ホスフェートエステル類、スルフェートエステル類、チオエーテル類、スルホキシド類、エーテル類、または上述の化合物類の組合せもしくは誘導体。代謝物質のうちの低分子は、正常な細胞機能、器官機能、または動物の成長、発育、もしくは健康に必要とされる一次代謝物質でありうる。さらに、低分子代謝物質は、不可欠な生態学的機能を有する二次代謝物質、たとえば、生物をその環境に適応できるようにする代謝物質をも包含する。また、代謝物質は、前記一次代謝物質および前記二次代謝物質に限定されるものではなく、人工の低分子化合物であってもよい。かような人工の低分子化合物は、上述したような一次代謝物質や二次代謝物質以外の化合物であって、投与されるかまたは生物により取り込まれる化合物である。たとえば、人工の低分子化合物は、動物の代謝経路により薬剤から得られる代謝産物でありうる。さらに、代謝物質は、ペプチド類、オリゴペプチド類、ポリペプチド類、オリゴヌクレオチド類、およびポリヌクレオチド類、たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡをも包含する。より好ましくは、代謝物質は、５０Ｄａ（ダルトン）〜３０，０００Ｄａ、さらに好ましくは、３０，０００Ｄａ未満、２０，０００Ｄａ未満、１５，０００Ｄａ未満、１０，０００Ｄａ未満、８，０００Ｄａ未満、７，０００Ｄａ未満、６，０００Ｄａ未満、５，０００Ｄａ未満、４，０００Ｄａ未満、３，０００Ｄａ未満、２，０００Ｄａ未満、１，０００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、３００Ｄａ未満、２００Ｄａ未満、１００Ｄａ未満の分子量を有する。しかしながら、好ましくは、代謝物質は、少なくと���５０Ｄａの分子量を有する。最も好ましくは、本発明に係る代謝物質は、５０Ｄａ〜１，５００Ｄａの分子量を有する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、被検試料中の量を測定する対象である代謝物質は、下記の表１に記載の化合物（後述する図３に示すクラスター２に属する化合物）からなる群から選択される１または２以上である。後述する実施例から明らかなように、下記の表１に記載の化合物は、健常サンプルおよび非糖尿病性動脈硬化サンプルと比較して、糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多い化合物に相当する。
【００２１】
【表１】
2013151053.tif 000003
【００２２】
また、本発明の他の好ましい実施形態において、被検試料中の量を測定する対象である代謝物質は、下記の表２に記載の化合物（後述する図３に示すクラスター１に属する化合物）からなる群から選択される１または２以上である。後述する実施例から明らかなように、下記の表２に記載の化合物は、健常サンプルおよび糖尿病性動脈硬化サンプルと比較して、非糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多い化合物に相当する。
【００２３】
【表２】
2013151053.tif 000004
【００２４】
さらに、本発明の他の好ましい実施形態において、被検試料中の量を測定する対象である代謝物質は、下記の表３に記載の化合物（後述する図３に示すクラスター３に属する化合物）からなる群から選択される１または２以上である。後述する実施例から明らかなように、下記の表３に記載の化合物は、健常サンプルと比較して非糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多く、かつ、非糖尿病性動脈硬化サンプルと比較して、糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多い化合物に相当する。
【００２５】
【表３】
2013151053.tif 000005
【００２６】
≪代謝物質の量の測定≫
試料（被検試料、対照試料）中の代謝物質の測定を行うための具体的な手法について特に制限はなく、被検試料の種類や量、被検代謝物質の特性等に応じて、従来公知の種々の技術が適宜用いられうる。代謝物質を測定する手法としては、例えば、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法、ＨＰＬＣ−タンデム四重極質量分析法などの質量分析（ＭＳ）法；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法；免疫学的測定法；生化学的測定法が挙げられる。なかでも、好ましくは質量分析（ＭＳ）法が用いられ、特に好ましくはキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法が用いられる。また、代謝物質を測定する手法として、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）法、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）法、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）法、核磁気共鳴分光（ＭＲＳ）法などの断層撮影法が用いられてもよい。また、超音波検査法、近赤外線イメージング（ＮＩＲＳ）法も用いることができる。
【００２７】
≪代謝物質の量の測定値を指標とした「検査」≫
本発明の検査方法は、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定する工程を含むが、対照試料についても同様の測定を行う場合には、測定の対象となる各種の代謝物質の被検試料における絶対的な量を測定する必要は必ずしもなく、対照試料中の対応する代謝物質の量との相対的な関係を明らかにできれば評価としては十分である。
【００２８】
本発明では、上述したような手法によって被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量を測定し、その測定値を指標として、被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を「検査」する工程を含む。ここで、「検査」の具体的な態様としては、例えば、被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の有無または罹患の危険性の判断が挙げられる。また、被検体に糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化が存在することが既知である場合に、そのステージの決定を本発明に係る「検査」としてもよい。さらに、被検体に糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化が存在することが既知であって、それに対して何らかの治療が施されている場合に、当該治療による治療効果の評価を本発明に係る「検査」としてもよい。また、被検体に糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化が存在することが既知である場合に、その予後の予測または再罹患の危険性の評価を本発明に係る「検査」としてもよい。すなわち、本発明に係る検査方法は、被検試料中の代謝物質の量を、対照検体から採取した対照試料中の当該代謝物質の量と対比する工程をさらに含み、対比の結果に基づいて、被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化を検査するものであることが好ましい。なお、本発明に係る検査方法において測定対象とされる各種の代謝物質は、糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の早期の段階においても顕著に変動が確認されることから、本発明の検査方法は、糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の早期の診断・検査に有用であるといえる。
【００２９】
被検体における糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化の有無の判断を「検査」とする場合には、健常検体から採取した健常試料中の代謝物質の量を基準とすることができる。また、治療効果を判定する際には、治療前の被検体から採取した試料中の代謝物質の量を基準とすることができる。以下、本発明の好ましいいくつかの実施形態における検査方法について説明する。
【００３０】
上述したように、表１に記載の化合物は、図３のクラスター２に属する化合物であり、健常サンプルおよび非糖尿病性動脈硬化サンプルと比較して、糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多い化合物に相当する。また、表２に記載の化合物は、図３のクラスター１に属する化合物であり、健常サンプルおよび糖尿病性動脈硬化サンプルと比較して、非糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多い化合物に相当する。そして、表３に記載の化合物は、図３に示すクラスター３に属する化合物であり、健常サンプルと比較して非糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多く、かつ、非糖尿病性動脈硬化サンプルと比較して、糖尿病性動脈硬化サンプルにおける量が多い化合物に相当する（つまり、その量が健常サンプル＜非糖尿病性動脈硬化サンプル＜糖尿病性動脈硬化サンプルの順に増加するものである）。
【００３１】
このことから、例えば、非糖尿病性動脈硬化の有無または罹患の危険性の判断の例として：
（１−１）被検試料中の表２（クラスター１）および表３（クラスター３）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が健常被検体から採取した対照試料（健常試料）中の量よりも多く；かつ、
（１−２）被検試料中の表１（クラスター２）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも少ない、
という条件を満たすときに、被検体は非糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断することができる。
【００３２】
また、このような検査（非糖尿病性動脈硬化の有無または罹患の危険性の判断）の精度を上げることを目的として、さらに：
（１−３）被検試料中の表２（クラスター１）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも多い、
という条件を満たすときに、被検体は非糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断することとしてもよい。
【００３３】
（１−３）と併せて、またはこれに替えて：
（１−４）被検試料中の表３（クラスター３）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも少ない、
という条件を満たすときに、被検体は非糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断することとしてもよい。
【００３４】
同様に、例えば、糖尿病性動脈硬化の有無または罹患の危険性の判断の例として：
（２−１）被検試料中の表１（クラスター２）および表３（クラスター３）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が健常被検体から採取した対照試料（健常試料）中の量よりも多く；かつ、
（２−２）被検試料中の表２（クラスター１）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも少ない、
という条件を満たすときに、被検体は糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断することができる。また、このような検査（糖尿病性動脈硬化の有無または罹患の危険性の判断）の精度を上げることを目的として、さらに：
（２−３）被検試料中の表１（クラスター２）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも多いときに、被検体は糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断することとしてもよい。
【００３５】
（２−３）と併せて、またはこれに替えて：
（２−４）被検試料中の表３（クラスター３）に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも多いときに、被検体は糖尿病性動脈硬化に罹患しているか、それに罹患する危険性が高いと判断することとしてもよい。
【００３６】
以上の方法では、複数の代謝物質の量の測定値を指標として用いるため、極めて高精度に検査を実施することができる。かような観点から、本発明の好ましい実施形態では、各クラスターに属する代謝物質の２以上、より好ましくは５以上、さらに好ましくは７以上が上記の規定を満たすときに、所定の判断を下すこととすることができる。
【００３７】
一方、高精度の検査を、少数の代謝物質の量の測定値を指標として用い簡便に実施することも可能である。すなわち、糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化で特異的な測定値を示す化合物を指標とするものである。
【００３８】
具体的には、糖尿病性動脈硬化の検査に用いる化合物として、好適であるのは、下記の表４に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上である。表４に記載の化合物は、被検試料中の化合物の量が健常被検体から採取した対照試料中の量よりも顕著に多く、かつ、被検試料中の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料中の量よりも顕著に多い。かつ、健常被検体から採取した対照試料中の量と非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料中の量に統計上の差がない。このため、糖尿病性動脈硬化の検査には十分な精度を達成することができる。なお、表４に記載の化合物は全て、上述した表１および後述する図３に示すクラスター２に属する。
【００３９】
同様に、非糖尿病性動脈硬化の検査に用いる化合物として好適であるのは、下記の表５に記載の化合物からなる群から選択される１または２以上である。表５に記載の化合物は、被検試料中の化合物の量が健常被検体から採取した対照試料中の量よりも顕著に多く、かつ、被検試料中の化合物の量が非糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料（患者試料）中の量よりも顕著に多い。かつ、健常被検体から採取した対照試料中の量と糖尿病性動脈硬化の患者から採取した対照試料中の量に統計上の差がない。このため、非糖尿病性動脈硬化の検査には十分な精度を達成することができる。なお、表５に記載の化合物は全て、上述した表２および後述する図３に示すクラスター１に属する。
【００４０】
被検試料が動脈硬化を呈していることが既知であり、その要因が糖尿病であるか否かを判断する場合には、表１および表２に記載の化合物の１または２以上を用いることができる。すなわち、被検試料中における表１に記載の化合物の１または２以上の測定量が、健常被検体もしくは非糖尿病性動脈硬化患者から採取した対照試料中の量と比較して多い場合には、糖尿病性動脈硬化と判断することができる。同様に、被検試料中における表２に記載の化合物の１または２以上の測定量が、健常被検体もしくは糖尿病性動脈硬化患者から採取した対照試料中の量と比較して多い場合には、非糖尿病性動脈硬化と判断することができる。
【００４１】
【表４】
2013151053.tif 000006
【００４２】
【表５】
2013151053.tif 000007
【００４３】
なお、対照検体（健常検体、患者検体、治療前検体など）から採取した対照試料（健常試料、患者試料、治療前試料）中の代謝物質の量の測定は、被検体から採取した被検試料中の代謝物質の量の測定と同様の手順で行うことができる。また、対照検体から採取した対照試料中の代謝物質の量は、被検体から被検試料を採取するたびに測定してもよいし、事前に測定しておいてもよい。
【００４４】
≪動脈硬化治療薬の候補物質のスクリーニング方法≫
本発明の他の形態によれば、動脈硬化治療薬の候補物質のスクリーニング方法もまた、提供される。具体的には、本発明に係るスクリーニング方法は、動脈硬化治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって：
（ａ）動脈硬化に罹患した非ヒト被検体に被検物質を与える工程；
（ｂ）上述した本発明の一形態に係る検査方法により、被検体の動脈硬化が治癒または改善したか否かを判定する工程；
（ｃ）被検体の動脈硬化が治癒または改善したことを指標として、被検物質が動脈硬化治療薬の候補物質であると判定する工程、
を含むものである。
【００４５】
ここで、工程（ａ）では、「動脈硬化に罹患した非ヒト被検体」に被検物質を与えるが、「非ヒト被検体」はヒト以外の動物であればよく、例えば、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなどが挙げられる。また、被検物質は任意の物質であり、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【００４６】
工程（ｂ）における判定は、上述した検査方法によって行われるが、これは、上述した検査方法において、被検体に糖尿病性動脈硬化または非糖尿病性動脈硬化が存在することが既知であって、それに対して何らかの治療が施されている場合に、当該治療による治療効果の評価を当該検査方法に係る「検査」とする場合と本質的には同等である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。本実施例においては日本白色家兎をモデルに実験を行っているが、代謝物量の測定は被検体をヒトの血管組織、血液成分に由来するサンプルを用いる場合でも測定に最適な条件を適宜設定することにより、同様の手法で測定をすることができることは言うまでもない。【００４８】
≪被検体≫
糖尿病誘起日本白色家兎（ｎ＝５）および非糖尿病日本白色家兎（ｎ＝５）において、図１に記載のプロトコールに従って動脈硬化病変を作製し、大腿動脈の血管組織を外科的に採取した。なお、通常食日本白色家兎（ｎ＝５）を対照群として、同様に大腿動脈の血管組織を採取した。採取したこれらの血管サンプルを、以下の実験に供した。ここで、各サンプルの質量を下記の表６に示す。なお、本モデルの動脈硬化病変は、ヒトの動脈硬化病変と形態学的特徴等に類似性があり、実験モデルとして広く用いられている。【００４９】
【表６】
2013151053.tif 000008
【００５０】
≪代謝物質の量の測定≫
上記で準備した３つの群の大腿動脈血管サンプルを用い、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモードおよびアニオンモードにより、代謝物質の測定を行った。【００５１】
＜サンプルの前処理＞
各試料に５００μＬのメタノール溶液（５０μＭ内部標準物質）を加え、冷却下にてビーズ式細胞破砕装置（トミー精工、ＭＳ−１００Ｒ）を用いて破砕（４０００ｒｐｍ、６０秒×１２回）した。その後、５００μＬのクロロホルムおよび２００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて撹拌し、遠心分離（２３００×ｇ、４℃、５分）を行った。遠心分離後、水層を限外ろ過チューブ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ウルトラフリーＭＣＰＬＨＣＣ ＨＭＴ 遠心式フィルターユニット ５ｋＤａ）に４００μＬ×１本移し取った。これを遠心（９１００×ｇ、４℃、１２０分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して測定に供した。【００５２】
＜測定＞
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った（参考文献；T. Soga, D. N. Heiger: Amino acid analysis by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal.Chem. 72: 1236-1241, 2000.;T. Soga, Y. Ueno, H. Naraoka, Y. Ohashi, M. Tomita et al.: Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal.Chem. 74: 2233-2239, 2002.；T. Soga, Y. Ohashi, Y. Ueno, H. Naraoka, M. Tomita et al.: Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2: 488-494, 2003.）。得られたピーク強度、形状から判断して、アニオンモードでの測定には２倍に希釈した試料を用いた。
・陽イオン性代謝物質（カチオンモード）
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）１号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
測定条件
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
・陰イオン性代謝物質（アニオンモード）
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）５号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1021)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1022)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
＜データ処理および解析＞
（データ処理）
ＣＥ−ＴＯＦＭＳで検出されたピークを、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.9.0.9（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比（m/z）、泳動時間（Migration time: MT）およびピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は下記数式１を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ＋やＫ＋などのアダクトイオンおよび、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。ただし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、m/zの値およびMTの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。【００５３】
【数１】
2013151053.tif 000009
【００５４】
（候補代謝物質検索）
検出されたピークに対してm/zおよびMTの値をもとにＨＭＴ代謝物質データベース（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社）に登録された全物質との照合、検索を行った。検索のための許容誤差はMTで±0.5min、m/zでは質量誤差を±10ppmとした（下記数式２）。【００５５】
【数２】
2013151053.tif 000010
【００５６】
その結果、ＨＭＴ代謝物質データベースに登録された物質のm/zおよびMTの値から２１１（カチオン１２２、アニオン８９）のピークに候補化合物が付与された。そして、候補化合物が絞り込まれた２１１ピークについて、各群間の相対面積値比の算出およびWelchのt-検定を実施した。【００５７】
候補化合物が付与された２１１個のピークに対応する化合物を、各群間の相対面積値比の算出およびWelchのt-検定の結果と併せて下記の表７に示す。なお、表７において、IDは測定モードの頭文字および通し番号からなり、Ｃはカチオンモード、Ａはアニオンモードを示す。また、「N.D.」は、解析対象であるが、検出限界以下であったことを示す。さらに、「N.A.」は、計算対象であるが、計算不可であったことを示す。「HMT DB」は検出ピークのm/zおよびMTからHMTデータベースに照合し得られた候補化合物であり、「¶」は後者を分母として算出している。また、「||」はWelchのt-検定のp値を示し、*<0.05、**<0.01、***<0.001である。【００５８】
【表７−１】
2013151053.tif 000011
【００５９】
【表７−２】
2013151053.tif 000012
【００６０】
【表７−３】
2013151053.tif 000013
【００６１】
【表７−４】
2013151053.tif 000014
【００６２】
（統計解析：ＰＣＡ、ＨＣＡ）
主成分分析（ＰＣＡ；Principle Component Analysis）はSampleStat ver.3.14（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社開発）を用いて行った。また、階層的クラスタリング解析（ＨＣＡ；Hierarchical Clustering Analysis）およびヒートマップ表記はPeakStat ver.3.18（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社開発）を用いて行った。なお、両解析とも、データの前処理としてN.D.にはeps（≒０）を代用し、ピーク単位での標準化（μ＝０、σ＝１）を行った。【００６３】
これらの統計解析の結果について、まず、主成分分析（ＰＣＡ）の結果を図２に示す。ここで、図２に示すグラフにおいて、横軸ＰＣ１および縦軸ＰＣ２はそれぞれ第１主成分得点、第２主成分得点を示し、括弧内の数字は各主成分の寄与率を示す。また、各プロットのラベルはサンプル名を示す。【００６４】
図２に示す結果から明らかなように、各代謝産物の組み合わせによって、非糖尿病（通常食のみ）正常血管群（試料１〜５）、非糖尿病性動脈硬化群（試料６〜１０）、および糖尿病性動脈硬化群（試料１１〜１５）のそれぞれを、互いに明確に判別することができることがわかる。【００６５】
続いて、各種代謝産物をサンプル毎にヒートマップ表示したものを図３に示す。ここで、図３に示すヒートマップ表示において、横軸はサンプル名を示し、縦軸はピークを示す。ピークに対してＨＣＡを実施しており、ピーク間の距離は図３中の樹形図で表している。緑が濃いほど対応する代謝物質の量が平均（１５サンプル間での相加平均）よりも小さいことを示し、赤が濃いほど平均（１５サンプル間での相加平均）よりも大きいことを示す。ここで、図３に示すクラスター２に属する化合物群は上記表１に列挙されており、クラスター１に属する化合物群は上記表２に列挙されており、クラスター３に属する化合物群は上記表３に列挙されている。【００６６】
図３に示す結果の一部について、説明する。まず、クラスター１に属する代謝物質（例えば、 Glucose 6-phosphate、Fructose 6-phosphate、2-Deoxyglucose 6-phosphateなど）の量は、非糖尿病正常血管群（試料１〜５）では少なく、非糖尿病性動脈硬化群（試料６〜１０）では多い。その一方で、糖尿病性動脈硬化群（試料１１〜１５）においては非糖尿病正常血管群（試料１〜５）と同程度のレベルにまで低下している。【００６７】
また、クラスター２に属する代謝物質（例えば、 3-Methylhistidine、ADP-ribose、Glucosamine、UDP-N-acetylglucosamineなど）の量は、糖尿病性動脈硬化群（試料１１〜１５）において特異的に上昇している。さらに、クラスター３に属する代謝物質（例えば、Valine、leucine、Histidineなど）の量は、非糖尿病正常血管群＜非糖尿病性動脈硬化群＜糖尿病性動脈硬化群の順に段階的な上昇が認められた。したがって、各クラスターに属する代謝物質の少なくとも１つの存在量のプロファイルを指標とすることで、糖尿病性動脈硬化を非糖尿病性動脈硬化と区別して判別することが可能であると考えられる。【００６８】
（代謝経路の描画）
上述の結果に基づいて、代謝物質定量データの代謝経路マップへの描画を行った。代謝経路の描画には、VANTED（Visualization and Analysis of Networks containing Experimental Data）（参考URL；http://vanted.ipk-gatersleben.de/）を用いた。また、描画に用いた代謝物質の名称には、一部HMT化合物データベースとは異なる略称を用いている。なお、代謝経路はヒトで確認された酵素をもとに作成した。【００６９】
具体的には、図４〜図１４に示すように、上記で検出された２１１（カチオン１２２、アニオン８９）の化合物を、解糖系/糖新生、ペントースリン酸経路、クエン酸回路、尿素回路、プリン代謝経路、ピリミジン代謝経路、ニコチン酸・ニコチンアミド代謝経路および各種アミノ酸代謝経路に描画した。なお、図４〜図１４に示すグラフは、左から順に、非糖尿病正常血管群（青色）、非糖尿病性動脈硬化群（赤色）、および糖尿病性動脈硬化群（緑色）における各化合物の検出量（相対面積値）を表す。ここで、図４は、本実験で検出された代謝物質を描画したすべての代謝経路を一覧で記載した経路図である。図５は、解糖系/糖新生、ペントースリン酸経路、およびクエン酸回路の経路図である。図６は、尿素回路、およびアミノ酸代謝（Glu、Gln、His、Pro）の経路図である。図７は、アミノ酸代謝（Gly、Ser、Cys）の経路図である。図８は、アミノ酸代謝（Asp、Ala、Lys）の経路図である。図９は、アミノ酸代謝（分枝鎖アミノ酸）の経路図である。図１０は、アミノ酸代謝（芳香族アミノ酸）の経路図である。図１１は、プリン代謝、およびピリミジン代謝の経路図である。図１２は、その他の糖代謝の経路図である。図１３は、ニコチン酸およびニコチンアミド代謝の経路図である。そして、代謝経路図に描画されなかった代謝物質の検出量（相対面積値）を図１４に示す。【００７０】
（主要代謝物質の定量）
ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社において通常、主要な代謝物質として選択し、定量を行っているアミノ酸、有機酸、糖リン酸および核酸を含む１１０個の物質（カチオン５４個、アニオン５６個）について解析を行った。検量線は内部標準物質により補正したピーク面積を用い、各物質について100μＭの一点検量（内部標準物質200μＭ）として濃度を算出した。その結果、９０個の物質（カチオン５０個、アニオン４０個）のピークが検出され、その定量値を算出した。結果を下記の表８に示す。なお、表８において、IDは測定モードの頭文字および通し番号からなり、Ｃはカチオンモード、Ａはアニオンモードを示す。また、「N.D.」は、解析対象であるが、検出限界以下であったことを示す。【００７１】
【表８−１】
2013151053.tif 000015
【００７２】
【表８−２】
2013151053.tif 000016
【００７３】
≪まとめ≫
以上のように、糖尿病性動脈硬化血管における特異的代謝物質および代謝経路を同定した本発明者らの知見は、糖尿病性動脈硬化に対する新規な治療手段の標的候補を提供するだけでなく、本発明に係る代謝産物および代謝経路を指標とした診断、治療効果判定（マーカーおよび画像）の分野への発展の開発基盤となる。
【図１】
2013151053.tif 000020
【図２】
2013151053.tif 000021
【図３】
2013151053.tif 000022
【図４】
2013151053.tif 000023
【図５】
2013151053.tif 000024
【図６】
2013151053.tif 000025
【図７】
2013151053.tif 000026
【図８】
2013151053.tif 000027
【図９】
2013151053.tif 000028
【図１０】
2013151053.tif 000029
【図１１】
2013151053.tif 000030
【図１２】
2013151053.tif 000031
【図１３】
2013151053.tif 000032
【図１４】
2013151053.tif 000033
【国際調査報告】
2013151053.tif 000034
2013151053.tif 000035
2013151053.tif 000036
2013151053.tif 000037
2013151053.tif 000038
2013151053.tif 000039
2013151053.tif 000040
2013151053.tif 000041