(57)【要約】  迅速且つ的確なマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法を提供する。マクロライド系抗生物質耐性変異菌を、第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブにてリアルタイムPCRで検出する。第１の加水分解プローブは、配列の一部がLNAにより構成され、第２の加水分解プローブは、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されている。マクロライド系抗生物質感受性菌が検出される場合は第１、第２の双方の加水分解プローブ由来の蛍光が観察される。マクロライド系抗生物質耐性変異菌が検出される場合は、第２の加水分解プローブ由来の蛍光のみが観察される。
2013136818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の生物学的試料において、23S rRNAドメインVへの結合が阻害されることによりマクロライド系抗生物質に対する耐性化が生じたマクロライド系抗生物質耐性変異菌をリアルタイムPCRで検出する検出方法であって、
前記生物学的試料を、第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有し、
前記第１の加水分解プローブと前記第２の加水分解プローブとは同一の鋳型配列と結合するように設計されており、
前記第１の加水分解プローブは、架橋構造を核酸分子内にもつことで２つの環状構造を持つ核酸を有して構成されており、
前記第２の加水分解プローブは、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されており、
標準株の場合は、前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブ由来の蛍光が観察される一方、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の場合は、前記第２の加水分解プローブのみの蛍光が観察されることを特徴とするマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項２】
被検体の生物学的試料において、23S rRNAドメインVへの結合が阻害されることによりマクロライド系抗生物質に対する耐性化が生じたマクロライド系抗生物質耐性変異菌をリアルタイムPCRで検出する検出方法であって、
前記生物学的試料を、第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有し、
前記第１の加水分解プローブと前記第２の加水分解プローブとは同一の鋳型配列と結合するように設計されており、
前記第１の加水分解プローブ及び前記第２の加水分解プローブは、標準株の配列を対象とした場合と、変異を有する配列を対象にした場合とで、２つのprobeの熱安定性の変化の挙動が相異することにより、
標準株の場合は、前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブ由来の蛍光が観察される一方、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の場合は、前記第２の加水分解プローブのみの蛍光が観察されることを特徴とするマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項３】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、肺炎マイコプラズマ変異菌であることを特徴とする請求項１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項４】
前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブの配列は、5’-aacgggacggaaag-3’（配列番号１）であることを特徴とする請求項３に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項５】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、百日咳菌変異菌であることを特徴とする請求項１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項６】
前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブの配列は、5’-cggctagacggaaag-3’（配列番号５）であることを特徴とする請求項５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項７】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、ピロリ変異菌であることを特徴とする請求項１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項８】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、キャンピロバクター・ジェジュニ菌変異菌であることを特徴とする請求項１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項９】
前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブの配列は、5’-cggcaagacggaaag-3’（配列番号９）であることを特徴とする請求項７又は８に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項１０】
前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブの配列は、5’-ggcaagacggaaag-3’（配列番号１３）であることを特徴とする請求項７又は８に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項１１】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、クラミジア・トラコマチス菌変異菌であることを特徴とする請求項１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項１２】
前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブの配列は、5’-cgaaaggacgaaaag-3’（配列番号１７）であることを特徴とする請求項１１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項１３】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、MAC変異菌であることを特徴とする請求項１に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項１４】
前記第１の加水分解プローブの配列は、5’-cggcaggacgaaaag-3’（配列番号２１）であり、前記第２の加水分解プローブの配列は、5’-IIgcaggacgaaaag-3’（配列番号２３）であることを特徴とする請求項１３に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法。
【請求項１５】
23S rRNAドメインVへの結合が阻害されることによりマクロライド系抗生物質に対する耐性化が生じたマクロライド系抗生物質耐性変異菌をリアルタイムPCRにて検出する検出キットであって、
第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有し、
前記第１の加水分解プローブと第２の加水分解プローブとは同一の鋳型配列と結合するように設計されており、
前記第１の加水分解プローブは、配列の一部がLNA(Locked Nucleic Acid)により構成されており、
前記第２の加水分解プローブは、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGBで標識されており、
標準株の場合は、前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブ由来の蛍光が観察される一方、肺炎マイコプラズマ変異菌の場合は、前記第２の加水分解プローブのみの蛍光が観察されることを特徴とするマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【請求項１６】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、肺炎マイコプラズマ変異菌であることを特徴とする請求項１５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【請求項１７】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、百日咳菌変異菌であることを特徴とする請求項１５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【請求項１８】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、ピロリ変異菌であることを特徴とする請求項１５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【請求項１９】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、キャンピロバクター・ジェジュニ菌変異菌であることを特徴とする請求項１５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【請求項２０】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、クラミジア・トラコマチス菌変異菌であることを特徴とする請求項１５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【請求項２１】
前記マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、MAC変異菌であることを特徴とする請求項１５に記載のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、23S rRNAドメインVへの結合が阻害されることによりマクロライド系抗生物質に対する耐性化が生じたマクロライド系抗生物質耐性変異菌を迅速且つ的確に検出することができる検出方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロライド系抗生物質は、細菌の細胞内にあるリボゾームの50Sサブユニットに結合してタンパク質の合成を阻害する抗生物質であり、比較的副作用が少なく抗菌スペクトルも広いことで知られている。マクロライド系抗生物質は、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、ピロリ菌、キャンピロバクター属、クラミジア属、非定形抗酸菌等による感染症に対する治療において第一選択薬あるいは複数の薬剤を組み合わせる際の主要な薬剤として位置づけられている。【０００３】
一方、上に例示した諸病原体においては報告の頻度の多寡はあるもののマクロライド系抗生物質に対する耐性を獲得した菌の存在が知られており、適切な治療を行なうためにはマクロライド系抗生物質への耐性変異を迅速に判断する手段、あるいはそれを実施するための検査試薬キットが求められている。【０００４】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌の変異は、SNPのような定まった1塩基の変異ではなく、臨床的に問題になる耐性を付与するのは定まった隣接する2塩基の一方の変異である。それゆえに既存のSNP検出の方法論の延長では必ずしも明快に、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の変異を検出できるとは限らない。【０００５】
肺炎マイコプラズマは、ウイルスと細菌の中間に位置する病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)の感染でおこる肺炎であり、罹患対象は小児・若年成人が中心とされ、発熱や頭痛を伴った気分不快が数日間続くと共にしつこく乾いた咳が生じるのが特徴である。【０００６】
肺炎マイコプラズマは、直径125〜153nm程度のウイルス程度の小さな病原体であるが、ウイルスと異なり増殖に生きた細胞を必要とせず、一部の抗生物質が有効なことから細菌に分類される。その一方で、肺炎マイコプラズマは、細菌の特徴である細胞壁を有しておらず、そのため細菌感染症治療の第一選択として使われるβ−ラクタム系の抗生物質（ペニシリン系、セフェム系等）は細菌の細胞壁を障害して菌を殺す作用を有するところ、細胞壁を持たないマイコプラズマには効力をほとんど有せず、上述のように蛋白合成阻害剤のマクロライド系抗生物質等が有効とされる。【０００７】
しかしながら、近年、小児のマイコプラズマ肺炎例から全国規模でマクロライド系抗生物質耐性変異菌（非特許文献１）が検出されており、マクロライド系抗生物質の臨床効果がみられない遷延化例や、有熱期間が有意に延長する等の重症化例が増加している（非特許文献２、３）。特にマイコプラズマの流行年にマクロライド系抗生物質耐性変異菌の発生率が上昇し、この変異菌は、特にエリスロマイシン（EM）、クラリスロマイシン(CAM)、アジスロマイシン(AZM)等に高度耐性化している。【０００８】
マイコプラズマ肺炎に対する治療方針としては、第１選択はマクロライド系抗生物質が基本として用いられ、そして投与開始後４日を過ぎても解熱しない場合には、全身状態の良し悪しや胸部写真上の肺炎の重症度等に応じて、ミノサイクリン（MINO）等のマクロライド系抗生物質耐性変異菌にも抗菌作用を有する薬剤への変更が考慮される。【０００９】
もっともMINOは６歳未満では歯牙の色素沈着の問題があり、小児への投与は、整容上の不利益を上回る利益を見込む場合に限定して慎重投与されるべきである。そのため、MINOが投与される場合を考慮して、患者がマクロライド系抗生物質耐性変異菌に罹患しているとの病理学上の的確な証拠が取得できる判断手法が望まれる。更に、罹患している病原菌がマクロライド耐性菌によるものと早期に判明すれば、より適切な時期にMINO等を投与する是非の判断を判断することが可能となるので、罹患している病原菌がマクロライド系抗生物質耐性変異菌によるものか否かの迅速且つ的確な判断手法が求められる。【００１０】
肺炎マイコプラズマの判断手法としては、ペア血清による抗体価上昇の確認や、IgM抗体検査（キット）等があるが、検出感度と精度の点でリアルタイムPCR法が比較的よく用いられ（非特許文献４）、非特許文献５には、融点解析法(melting curve analysis)によるマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法が記載されている。融点解析法は、増幅反応を終えたリアルタイムPCR反応液の温度を徐々に上昇させながら、蛍光信号の強度の変化を計測し、蛍光強度が急激に変化する点を求め、配列の内容の相異を反映するものと判断する手法である。【００１１】
しかし、この融点解析法では、リアルタイムPCR反応を終えてから、徐々に加温する過程が必要であり、判断に所定の時間を要する。また、この融点解析法では、曲線を比較して判断する事が必要であるが、被検対象によっては形態が類似しており紛らわしい曲線が検出されることがあり、かかる場合は正確に検出することが難しい。【００１２】
次に、百日咳は、主にグラム陰性桿菌の百日咳菌(Bordetella pertussis)による呼吸器感染症の一種あり、発症機序は未解明で特有の痙攣性の咳発作を特徴とする急性気道感染症である。百日咳菌に対する治療としてEM、CAM等のマクロライド系抗生物質が用いられているものの、近年は米国・フランスにおいてマクロライド系抗生物質耐性変異菌の発生が報告されている。【００１３】
百日咳に罹患しているか否かの診断は困難な場合があり、特に生後６ヶ月未満の乳幼児では早期診断が困難となる場合がある。また生後６ヵ月未満の乳幼児が百日咳に罹患すると、肺炎、脳症、痙攣等を合併して、死亡することもある。このように特に乳幼児の場合は致死率が高いため、罹患している病原菌がマクロライド耐性菌によるものか否かにつき、迅速且つ的確な判断手法が求められる。【００１４】
百日咳の判断手法としては、培養検査方法が標準的に使用される。百日咳の培養検査方法では、検査材料としての例えば鼻咽頭分泌物を特殊培地にて４〜５日間培養しコロニーを形成させ、培養後７日目で百日咳菌様集落を認めない場合は培養陰性とする（非特許文献６）。しかしながら、このように培養に日数を要するうえ、百日咳様患者からの百日咳菌分離率は１０〜２０％程度と低いので、検査結果が陰性であったとしても本検査結果から直ちに百日咳への罹患を否定することはできない。更には薬剤耐性を判断することも困難である。【００１５】
次に、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)は、ヒト等の胃に生息するらせん型の細菌である。
ヘリコバクター・ピロリ菌に感染すると、胃粘膜に定着して毒素を出し、粘膜を損傷し、胃潰瘍・十二指腸潰瘍はもちろん、萎縮性胃炎を引きおこすことが知られている。また、ピロリ菌の感染者は非感染者にくらべ、約５倍ほど胃がんになりやすいことが判明している。ピロリ菌に対する治療として、CAM等のマクロライド系抗生物質を含んだ併用療法が行われているものの、近年はマクロライド系抗生物質耐性変異菌の発生率が上昇している。【００１６】
ピロリ菌の培養検査は本菌の感染を直接的に証明する唯一の方法であるが、特殊な培地を必要とする事に加え、高湿度、微好気条件で培養することが求められ、必ずしも全ての医療機関の細菌検査室で容易に実施可能ではない。また培養が可能であっても結果判定までには３〜７日を要する。【００１７】
胃生検試料を用いるピロリ菌の検査法に迅速ウレアーゼ試験があるが、検査結果を保存することも、薬剤耐性を判断することも不可能である（非特許文献７）。また便検体を用いてピロリ菌を検出し、その薬剤耐性も判定する手法が報告されている（非特許文献８）。【００１８】
次に、キャンピロバクター属に属する細菌でヒトに感染するものとして多く問題になるものはキャンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)菌である。Campylobacterjejuni菌(C.jejuni)は、胃腸炎症状を主たる臨床症状として惹起する細菌である。胃腸炎に占めるC.jejuniの割合は成人よりも小児において高く、また特に10歳以下の小児においては入院症例が多い。感染の治療において抗生物質の投与は必須ではなく、多くの場合は自然軽快する。【００１９】
しかしながら、時に重症化する場合もありそのような場合には抗生物質投与が必要とされ、第一選択薬はマクロライド系抗生物質である。C.jejuniは一般的には同菌の分離培養によって確認され、さらに微量液体希釈法によって感受性が測定される。しかしながら、C.jejuniの感受性の測定結果を得るまでには最低でも3〜5日の期間を要する。即ち、選択分離培地を用いて微好気条件で培養を行ない、発育が確認されるまでに1〜2日；その後、感受性検査に供するための純培養処理に1〜2日；感受性パネルに接種してさらに1〜2日の期間が必要である(非特許文献９)。このように、必ずしも治療介入に対して有益なタイミングで結果が得られない問題がある。【００２０】
研究的な手法としては、遺伝子配列をシークエンスによって解析してマクロライド耐性変異の有無を精査する手法(非特許文献１０)や、当該変異を含む遺伝子断片をPCRで増幅し、その断片の制限酵素切断パターンによって変異の有無を判定する手法(RFLP;Restriction Fragment Length Polymorphism(制限酵素断片長多型)法:非特許文献１１)や、PCRで増幅した産物を固相に固定したプローブと結合させた後に発色させて判定する方法(PCR-LiPA; PCR and Line Probe Assay法:非特許文献１２)等の報告があるものの、一般的な臨床検査手法ではない。また、これらの手法は培養に基づく手法よりも短時間で結果を得ることが可能であるが、PCR法によって増幅した産物を操作する必要があり、手技の煩雑さとともに増幅産物による実験環境の汚染の危険を孕んでいる。【００２１】
次に、クラミジア属に属する細菌でヒトに感染するものとして問題になるものにクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)菌がある。Chlamydiatrachomatis菌(C.trachomatis)は新生児においては結膜炎や肺炎を来たし、成人においては尿道炎、子宮頸管炎、骨盤炎等を来す病原体である。生物としては、真核細胞の中でのみ増殖する二相性の増殖環を有する偏性細胞内寄生性細菌である。本菌の感染の治療に用いられる抗生物質は小児の場合はマクロライド系抗生物質が第一選択薬である。【００２２】
偏性細胞内寄生性細菌であるC.trachomatisの分離培養には細胞培養が必須であるため、分離培養は日常的には行われておらず、耐性菌の存在が発見出来ない問題がある。一般的に同菌の検出には抗原検出法、核酸検出法、抗体検査法が用いられている。これらの手法によって菌を検出することは可能であるが、菌の増殖を捉える手法ではないため、宿主細胞内で増殖している菌に対する抗生物質の効果を判定することは出来ない。臨床的に抗生物質が奏功しない例や再発例が報告されており、抗生物質耐性の存在が示唆されており、それをより容易に検出する手法が待たれている。【００２３】
分離培養の上でマクロライド耐性が認められた菌において、他の細菌におけるマクロライド系抗生物質に対する薬剤耐性変異と相同する部位の変異が見出した報告がある(非特許文献1３)。本報告は、菌を分離培養した後に核酸を抽出し、PCR法によって増幅した遺伝子断片のシークエンスを解読する手法で行われている。従って、再現するためには、分離培養のための日常的な細胞を培養して維持できる施設が必要であり、さらに分離培養の手間、そしてPCR増幅産物の操作が必要とされる。またPCRの増幅産物を操作する必要は必然的に実験環境を汚染する危険も孕んでいる。【００２４】
次に、非定形抗酸菌に属する細菌でヒトに感染するものの一群としてトリ型結核菌群(Mycobacterium avium complex; MAC)が知られており、これらはヒトに日和見感染を起こす事が知られている環境常在菌であって土壌や水系に汎く存在している。本菌群には、Mycobacterium avium、Mycobacteriumintracellulareが知られている。また、本菌群は結核菌と同じMycobacterium属に属しているが総じて抗結核薬は効果が乏しく、本菌の感染の治療は単剤ではなく複数の抗生物質を組み合わせる併用療法行われる。この際のキードラッグがマクロライド系抗生物質であり、マクロライド系抗生物質に耐性を有する菌が感染している場合には治療が失敗となるおそれがある。ATS(米国胸部学会)/IDSA(米国感染症学会)ガイドラインにおいては、MACについてはマクロライド系抗生物質であるCAMに対する感受性を調べる事が推奨されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Lucier TS. et al., Transition Mutations in the 23S rRNA ofErythromycin-Resistant Isolates of Mycoplasma pneumoniae.Antimicrob.Agents Chemother. 39,. 2770-2773
【非特許文献２】Suzuki S.et al., Clinical Evaluation of Macrolide-ResistanTmycoplasmapneumoniae, Antimicrob Agents Chemother 50,p709-712
【非特許文献３】Matsubara K. et al., A comparative study of macrolide-sensitive andmacrolide-resistanTmycoplasma pneumoniaeinfectionsin pediatric patients, J Infect Chemother 15, p380-383
【非特許文献４】Morozumi M, Nakayama E, Iwata S, et al.: Simultaneous detection ofpathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumoniaby real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. J ClinMicrobiol 33:1440-1446, 2006
【非特許文献５】Peuchant O,  Menard A,  Renaudin H,  MorozumiM,  Ubukata K, Bebear CM,  Pereyre S.  Increased macrolideresistance of Mycoplasma pneumoniae in France directly detected in clinicalspecimens by real-time PCR and melting curve analysis.. J Antimicrob Chemother.2009 ;64:52-8.
【非特許文献６】石川隆、田中真理子  青年及び成人百日咳の診断は難しい  総合臨床,58(10):2081-2084,2009年
【非特許文献７】日本ヘリコバクター学会ガイドライン作成委員会編. H. pylori 感染の診断と治療のガイドライン2009改訂版. 日本ヘリコバクター学会誌Vol.10Supplement
【非特許文献８】Schabereiter-Gurtner C et al. Novel real-time PCR assay fordetection of Helicobacter pylori infection and simultaneous clarithromycinsusceptibility testing of stool and biopsy specimens. J Clin Microbiol. 2004Oct;42(10):4512-8.
【非特許文献９】丸山英行, Campylobacter jejuni の感受性検査, 検査と技術 2013;41(2), 114-5
【非特許文献１０】Gibreel A., et al.Macrolide resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli: molecularmechanism and stability of the resistance phenotype. Antimicrob. AgentsChemother 2005; 49(7):2753-2759.
【非特許文献１１】Vacher S., Menard A.,Bernard E., Megraud F. PCR-restriction fragment length polymorphism analysisfor detection of poinTmutations associated with macrolide resistance inCampylobacter spp. Antimicrob. Agents Chemother 2003 47(3):1125-1128.
【非特許文献１２】Niwa H, Chuma T,Okamoto K, Itoh K. Rapid detection of mutations associated with resistance toerythromycin in Campylobacter jejuni/coli by PCR and line probe assay. Int JAntimicrob Agents. 2001 Oct;18(4):359-64.
【非特許文献１３】Misyurina OY, Chipitsyna EV, Finashutina YP, Lazarev VN, Akopian TA,Savicheva AM, Govorun VM. Mutations in a 23S rRNA gene of Chlamydia trachomatisassociated with resistance to macrolides. Antimicrob Agents Chemother. 2004Apr;48(4):1347-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
既存の判定手法として報告されている手法はPCR反応産物を電気泳動した後にさらに染色して増幅産物の大きさを解析・確認する報告や、リアルタイムPCR法に融点解析法を組み合わせて用いる報告である。これらはいずれも、PCR反応に引き続いて追加の解析を実施する時間、更にその結果を判定する手間を要する問題が残っている。【００２７】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、既存のSNP検出手法に依拠することなく、迅速且つ的確なマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法及び検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明にかかるマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法は、被検体の生物学的試料において、23S rRNAドメインVへの結合が阻害されることによりマクロライド系抗生物質に対する耐性を獲得したマクロライド系抗生物質耐性変異菌をリアルタイムPCRで検出する検出方法であって、前記生物学的試料を、第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有し、前記第１の加水分解プローブと前記第２の加水分解プローブとは同一の鋳型配列と結合するように設計されており、標準株の場合は、前記第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブ由来の蛍光が観察される一方、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の場合は、前記第２の加水分解プローブのみの蛍光が観察されることを特徴とする。【００２９】
この特徴は、いずれも鎖長が短い第１の加水分解プローブと第２の加水分解プローブとに対して、熱安定性を向上させるための相違する修飾技術をそれぞれに用いることによって、この２種類のプローブを組合せて用いた際に、標準株を対象とした場合にはそれぞれのプローブはともに類似した熱安定性を示し、結果として安定して鋳型配列に結合することが可能である一方で、マクロライド系抗生物質耐性変異配列を対象とした場合にはそれぞれのプローブの熱安定性の変化の程度が相違する結果として熱安定性の変動の少ない第２のプローブのみが鋳型配列に安定して結合できることによって達成されるものである。【００３０】
第１の加水分解プローブは、配列の一部がLNA(Locked Nucleic Acid)により構成され、第２の加水分解プローブは、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGBで標識されているものを使用することが可能である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、マクロライド系抗生物質耐性変異菌を迅速且つ的確に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】肺炎マイコプラズマの場合における、第１の加水分解プローブを説明する図である。
【図２】肺炎マイコプラズマの場合における、鋳型配列を説明する図である。
【図３】肺炎マイコプラズマの場合における、第２の加水分解プローブを説明する図である。
【図４】百日咳菌の場合における、第１の加水分解プローブを説明する図である。
【図５】百日咳菌の場合における、鋳型配列を説明する図である。
【図６】百日咳菌の場合における、第２の加水分解プローブを説明する図である。
【図７】ピロリ菌又はキャンピロバクター・ジェジュニ菌の場合における、第１の加水分解プローブを説明する図である。
【図８】ピロリ菌の場合における、鋳型配列を説明する図である。
【図９】ピロリ菌又はキャンピロバクター・ジェジュニ菌の場合における、第２の加水分解プローブを説明する図である。
【図１０】キャンピロバクター・ジェジュニ菌又はピロリ菌の場合における、第１の加水分解プローブを説明する図である。
【図１１】キャンピロバクター・ジェジュニ菌の場合における、鋳型配列を説明する図である。
【図１２】キャンピロバクター・ジェジュニ菌又はピロリ菌の場合における、第２の加水分解プローブを説明する図である。
【図１３】クラミジア・トラコマチス菌の場合における、第１の加水分解プローブを説明する図である。
【図１４】クラミジア・トラコマチス菌の場合における、鋳型配列を説明する図である。
【図１５】クラミジア・トラコマチス菌の場合における、第２の加水分解プローブを説明する図である。
【図１６】トリ型結核菌群の場合における、第１の加水分解プローブを説明する図である。
【図１７】トリ型結核菌群の場合における、鋳型配列を説明する図である。
【図１８】トリ型結核菌群の場合における、第２の加水分解プローブを説明する図である。
【図１９】実施例１において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。
【図２０】肺炎マイコプラズマの場合における、シークエンス結果を示す図である。
【図２１】実施例１において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。
【図２２】実施例２において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。
【図２３】実施例２において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。
【図２４】百日咳菌の場合における、シークエンス結果を示す図である。
【図２５】実施例３において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）はB1228であり、（ｂ）はC0127であり、（ｃ）はC0131であり、（ｄ）はB0902であり、（ｅ）はD0104であり、（ｆ）はD0403であり、（ｇ）はD0423であり、（ｈ）はD0425である。
【図２６】実施例３において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）はB1228であり、（ｂ）はC0127であり、（ｃ）はC0131であり、（ｄ）はB0902であり、（ｅ）はD0104であり、（ｆ）はD0403であり、（ｇ）はD0423であり、（ｈ）はD0425である。
【図２７】実施例４において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tである。
【図２８】実施例４において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tである。
【図２９】ピロリ菌の場合における、シークエンス結果を示す図である。
【図３０】実施例５において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株JCM12093由来のゲノムDNAである。
【図３１】実施例５において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株JCM12093由来のゲノムDNAである。
【図３２】実施例５において、５’端の１塩基を削除したプローブを用いた場合における、感受性配列の増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株由来のゲノムDNAである。
【図３３】実施例５において、５’側の１塩基を削除したプローブを用いた場合における、感受性不問の増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株由来のゲノムDNAである。
【図３４】キャンピロバクター・ジェジュニ菌の場合における、シークエンス結果を示す図である。
【図３５】実施例６において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株JCM2013由来のゲノムDNAである。
【図３６】実施例６において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株JCM2013由来のゲノムDNAである。
【図３７】実施例６において、５’端を１塩基延長したプローブを用いた場合における、感受性配列の増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株由来のゲノムDNAである。
【図３８】実施例６において、５’端を１塩基延長したプローブを用いた場合における、感受性不問の増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性対象株由来のゲノムDNAである。
【図３９】クラミジア・トラコマチス菌の場合における、シークエンス結果を示す図である。
【図４０】実施例７において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は２の陽性検体由来核酸である。
【図４１】実施例７において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、（ｈ）は陽性検体由来核酸である。
【図４２】トリ型結核菌群の場合における、シークエンス結果を示す図である。
【図４３】実施例８において、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、(h)は陽性対象として用いた標準株JCM6384由来のゲノムDNAである。
【図４４】実施例８において、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図であり、そのうち（ａ）は変異無しであり、（ｂ）はA2058Gであり、（ｃ）はA2058Cであり、（ｄ）はA2058Tであり、（ｅ）はA2059Gであり、（ｆ）はA2059Cであり、（ｇ）はA2059Tであり、(h)は陽性対象として用いた標準株JCM6384由来のゲノムDNAである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
本実施形態にかかるマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法は、被検体の生物学的試料において、23S rRNAのドメインVへの結合が阻害されることによりマクロライド系抗生物質に対する耐性化が生じた耐性変異菌を検出する。
【００３５】
リボソームは50Sサブユニットと30Sサブユニットとが合体した形状であり、30Sサブユニットの中でメッセンジャーRNAが読み込まれ、50Sサブユニットの中でペプチジルトランスフェラーゼという酵素の機能でアミノ酸がつながれポリペプチドが合成されていくが、この際に重要な働きをするのが23S rRNAである。その機能部位の中心が６つのドメインのうち５番目のドメインであるドメインVであり、マクロライド系抗生物質はこのドメインVに結合することによりその機能を阻害し、蛋白の合成を抑制して抗生物質として働くところ、このマクロライド系抗生物質がドメインVに結合するうえで重要な部位が、塩基番号が大腸菌では2058番目と2059番目の隣接する２つのアデニンであり、これらの部位に塩基置換やメチル化の変異が生ずるとその立体構造に変化が生じ、マクロライド系抗生物質はドメインVに結合できなくなり、蛋白合成を阻害できず、その菌は臨床的に問題となる程度のマクロライド系抗生物質に対する耐性を獲得することになる。
【００３６】
この部位は肺炎マイコプラズマに限らず多くの細菌に共通であり、マクロライド系抗生物質への耐性化のホットスポットと考えられている。介在する塩基の数により塩基番号には若干の差があり、最も良く研究されているモデルである大腸菌においては2058番目と2059番目であるが、肺炎マイコプラズマ(標準株M129; NCBI Reference Sequence:NC_000912.1)では2063番目と2064番目が、百日咳菌(標準株 Tohama I; NCBI Reference Sequence:NC_002929.2)では2037番目と2038番目が、ピロリ菌(標準株 Helicobacter pylori 26695; NCBI Reference Sequence: NC_000915.1)では2146番目と2147番目(Accession番号U27270の配列を標準として2142番目と2143番目とする文献もある)が、Campylobacterjejuni (標準株Campylobacterjejuni subsp. jejuni; NCBI Reference Sequence:NC_002163.1)では2074番目と2075番目が、Chlamydia trachomatis (標準株Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX; NCBIReference Sequence: NC_000117.1)では2038番目と2039番目が、Mycobacterium avium (標準株Mycobacterium avium 104; NCBI Reference Sequence: NC_008595.1)では2279番目と2280番目が、Mycobacteriumintracellulare (標準株Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950; NCBI Reference Sequence:NC_016946.1)では2266番目と2267番目が、これらの部位に対応する。なお、上述したマクロライド系抗生物質への耐性化のホットスポットは、病原微生物の種類によって、あるいは株によって塩基番号が相違するので、大腸菌における番号で記載する。また、特に断らない限り、以降は上で標準株として例示したものをそれぞれ病原菌の標準株として記載する。
【００３７】
本実施形態において、マクロライド系抗生物質耐性変異菌は、肺炎マイコプラズマ変異菌、百日咳菌変異菌、ピロリ菌変異菌、Campylobacter jejuni変異菌、Chlamydiatrachomatis変異菌、MAC変異菌、であるが、これに限定されるものではなく、大腸菌や肺炎球菌等の耐性変異菌も含まれる。
【００３８】
マクロライド系抗生物質は、特に限定されるものではないが、例えば、14員環系であるならばEM、CAM、ロキシスロマイシン(RXM)であり、15員環系であるならばAZMであり、16員環であるならばジョサマイシン(JM)、ロキタマイシン(RKM)である。
【００３９】
以下、マクロライド系抗生物質耐性変異菌が肺炎マイコプラズマ変異菌の場合について記載する。
【００４０】
本実施形態では、リアルタイムPCRにて生物学的試料を第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有する。
【００４１】
第１の加水分解プローブは、5’-aacgggacggaaag-3’（配列番号１）なる配列を有し（図１）、Tmは６６℃である。ここでTmは融解温度であり、二本鎖DNAの５０％が一本鎖DNAに解離する温度（melting temperature）である。第１の加水分解プローブは、5’端がssH amino linkerを介してレポーター色素Alexa647で標識されており、3'端がクエンチャー非蛍光色素であるBlack Hole Quencher 3(BHQ3)で標識されている。
【００４２】
第１の加水分解プローブは、図１にて大文字でGAAAと示されているように、配列の一部がLNA(Locked NucleicAcid)により構成されている。配列にLNAが導入されることによって完全に相補的な二本鎖の熱安定性が上がる結果、Tm値が上昇し、プローブの長さを短くすることが可能となる。ここでLNAがgaaaである理由は、図２に示される鋳型配列ctcgg tgaaa tccaggtacg ggtga agaca cccgt taggc gcaac gggac ggaaa gaccc cgtga agctt tactg tagcttaata ttgat cagga catta tcatg tagag aatag gtagg agcaa tcgat gca（配列番号２）において、下線(B)で示される箇所における矢印が変異箇所である2058番目と2059番目(肺炎マイコプラズマ標準株においては2063番目と2064番目)のアデニンを示すところ、その両側の塩基を含む配列が好ましいからである。なお、図２において下線(A)で示される箇所は、後述するように、Forwardのprimer配列tccag gtacg ggtga agaca（配列番号３）であり、下線(C)で示される箇所はReverseのprimer配列atcat gtaga gaata ggtag gagc（配列番号４）である。この第１の加水分解プローブは、変異株の場合、二本鎖の熱安定性の変化の程度すなわちTmの下降の程度が比較的大きい。
【００４３】
第２の加水分解プローブは、図３に示されるように、第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、Tmは６７℃である。第２の加水分解プローブは、５’末端がレポーター蛍光色素VICで標識され、３’末端がクエンチャー非蛍光色素及びMinor Groove Binder(MGB)で標識されている。３’末端を標識しているMGBが、プローブとターゲット配列との二本鎖螺旋構造の副溝(Minor Groove)に結合することにより二本鎖の熱安定性が上がる結果、比較的短い配列でTm値が高いプローブが得られる。この第２の加水分解プローブでは、変異株の場合、二本鎖の熱安定性の変化の程度すなわちTmの下降の程度が第１の加水分解プローブよりも穏やかである。なお、図３では３’末端にクエンチャー非蛍光色素及びMGBがそれぞれ接合しているが、このような構造に限定されるものではなく、例えば３’末端にクエンチャー非蛍光色素が接合しており、そのクエンチャー非蛍光色素にMGBが接合している構造も可能である。この説明は、以下に記載される第２の加水分解プローブについても同様にあてはまる。
【００４４】
第１、第２いずれの加水分解プローブにおいても、プローブがDNAポリメラーゼにより加水分解されるまでは、５’末端のレポーター蛍光色素と３’末端のクエンチャー非蛍光色素の２つの物質が近接しているため、レポーター色素から発せられるの蛍光シグナルのエネルギーはクエンチャー色素に吸収される(クエンチング)結果として抑制されている。リアルタイムPCR反応の進行に伴って、DNAポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって鋳型配列に安定に結合しているプローブは加水分解され、レポーター蛍光色素とクエンチャー非蛍光色素が分離し、分離したレポーター色素由来の蛍光シグナルのエネルギーがクエンチングを受けなくなるため、励起されると蛍光シグナルが観察される。
【００４５】
MGBとしては、特に限定されるものではないが、例えばベレニル、ネトロプシン、ジスタマイシンＡ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール(DAPI)等を挙げることができる。レポーター蛍光色素としては、特に限定されるものではないが例えばFluoresceine系の蛍光色素であり、具体的にはVICやFAMである。クエンチャー非蛍光色素としては、特に限定されるものではないが例えばBHQ1である。
【００４６】
生物学的試料としては、特に限定されるものではないが、例えば被験者からの気道由来試料、血清、血漿、リンパ液、血液、唾液等であり、このうち特に好ましくは気道由来試料であり、具体的には喀痰、気道吸引物、気管支肺胞洗浄液等である。
【００４７】
リアルタイムPCR用プライマーは、マクロライド系抗生物質耐性変異菌の特異的な領域の塩基配列において、選択される１０〜４０個の連続した塩基配列と同一の塩基配列を、被検体DNAのForwardのプライマーとして設計し、また、Reverseのプライマーとしては、本発明のマクロライド系抗生物質耐性変異菌の特異的な領域の塩基配列において、選択される１０〜４０個の連続した塩基配列と相補的な塩基配列から設計することができる。例えば、Forwardのプライマーとして、tccag gtacg ggtga agaca（配列番号３）であり、Reverseのプライマーとしてatcat gtaga gaata ggtag gagc（配列番号４）である塩基配列を例としてあげることができる。これらのリアルタイムPCR用プライマーは、塩基配列に従って公知の方法により合成することができる。
【００４８】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌が肺炎マイコプラズマ変異菌の場合についてのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キットは、上述した第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有する。更に、リアルタイムPCR用のプライマー、リアルタイムPCR用ポリメラーゼを含む。また、他の構成要素として、各種バッファー、ヌクレアーゼ・フリーの水、固定化単体等を含めることもできる。
【００４９】
本実施形態にかかる発明では、上述したように、全く同じ標的鋳型配列と結合するように設計されている、Tm値がほぼ等しい(即ち、互いに競合的に結合する)プローブを用いている。これゆえに、標的配列が感受性配列(プローブ配列と標的が完全に一致)する際には、二つのプローブは同等に標的配列と反応液中でアニールし、同等に加水分解を受けるため、双方のプローブ由来の蛍光が観測される。一方で、二つのプローブは鎖長が短い(14塩基)にも関わらず、互いに異なる修飾技術(LNAあるいはMGB)によって、例えば66〜67℃のように比較的高いTmを保つことができている。このように、鎖長が短いプローブのTmを上昇させている修飾技術が相違するため、変異が入った配列が標的となった際のTmは２種類のプローブ間では乖離すると考えられる。即ち、変異を有する配列を標的とした際のTmの変化(下降)の程度が、第１の加水分解プローブ(LNAプローブ)の場合の方が、第２の加水分解プローブ(MGBプローブ)よりも大きい(MGBプローブの方が、Tm変化は穏やかである)と考えられる。
【００５０】
この結果、変異を有した配列が対象となった場合に、２種類のプローブのTmが乖離を来すこととなり、一方の第２の加水分解プローブ(MGBプローブ)のみが加水分解を受けると考えられ、第２のプローブ由来の蛍光のみが観測される。この結果、第２のプローブ由来の蛍光のみが観測されるマクロライド耐性変異株を双方のプローブ由来の蛍光が観測される通常株とを一目瞭然に区別して正確に判定することができる。なお、第２の加水分解プローブのみの蛍光が観察されるとは、第１の加水分解プローブの蛍光が第２の加水分解プローブの蛍光と比較して極めて弱く、ほとんど観察されない結果、第２の加水分解プローブの蛍光が極めて強く観察される場合を含む。また、従前の融点解析法(melting curve analysis)のように、増幅反応を終えたリアルタイムPCR反応液の温度を徐々に上昇させながら、蛍光信号の強度変化を計測する加温過程は不要であるため、マクロライド系抗生物質耐性変異菌を通常株と区別して迅速に判定することができる。
【００５１】
次に、マクロライド系抗生物質耐性変異菌が百日咳菌変異菌の場合について記載する。
【００５２】
前述と同様に、リアルタイムPCRにて生物学的試料を第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有する。
【００５３】
第１の加水分解プローブは、5’-cggctagacggaaag-3’（配列番号５）なる配列を有し（図４）、Tmは６７℃である。第１の加水分解プローブは、5’端がssH amino linkerを介してAlexa647で標識されており、3'端がBHQ3で標識されている。
【００５４】
第１の加水分解プローブは、図４にて大文字でGAAAと示されているように、配列の一部がLNA(Locked NucleicAcid)により構成されている。ここでLNAがgaaaである理由は、図５に示される鋳型配列ttccg acctg cacga atggc gtaac gatgg ccaca ctgtc tcctc ctgag actcagcgaa gttga agtgt ttgtg atgat gcaat ctacc cgcgg ctaga cggaa agacc ccatg aacct ttactgtagc tttgc attgg actgt gaacc ggcct gtgta ggata ggtgg gaggc gcaga actcg agtcgccaga ttcga gggag ccatc cttga aatac（配列番号６）において、下線(B)で示される箇所における矢印が変異箇所である2058番目と2059番目(百日咳菌標準株においては2037番目と2038番目)のアデニンを示すところ、その両側の塩基を含む配列が好ましいからである。なお、図５において下線(A)で示される箇所は、Forwardのprimer配列に対応し、下線(C)で示される箇所はReverseのprimer配列に対応する。この第１の加水分解プローブは、変異株の場合Tmの下降の程度が比較的大きい。
【００５５】
第２の加水分解プローブは、図６に示されるように、第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、Tmは６８℃である。第２の加水分解プローブは、更に、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されている。MGB、レポーター蛍光色素、及びクエンチャー非蛍光色素については前述と同様に特に限定されるものではない。生物学的試料としては、前述と同様に特に限定されるものではない。
【００５６】
リアルタイムPCR用プライマーは、前述と同様に適宜設計することが可能であり、例えば、Forwardのプライマーとしてgcacgaatggcgtaacgatg（配列番号７）であり、Reverseのプライマーとしてctccctcgaatctggcgactc（配列番号８）である塩基配列を例としてあげることができる。
【００５７】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌が百日咳菌変異菌の場合についてのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キットは、上述した第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有する。更に、リアルタイムPCR用のプライマー、リアルタイムPCR用ポリメラーゼを含む。また、他の構成要素として、各種バッファー、ヌクレアーゼ・フリーの水、固定化単体等を含めることもできる。
【００５８】
これにより、マクロライド系抗生物質耐性変異菌が百日咳菌変異菌の場合であっても前述と同様に、マクロライド耐性変異株を通常株と区別して一目瞭然に正確に判定することができる。
【００５９】
次に、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がピロリ菌変異菌の場合について記載する。
【００６０】
前述と同様に、リアルタイムPCRにて生物学的試料を第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有する。
【００６１】
第１の加水分解プローブは、5’-cggcaagacggaaag-3’（配列番号９）なる配列を有し（図７）、Tmは６８℃である。第１の加水分解プローブは、5’端がssH amino linkerを介してAlexa647で標識されており、3'端がBHQ3で標識されている。
【００６２】
第１の加水分解プローブは、図７にて大文字でGAAAと示されているように、配列の一部がLNA(Locked NucleicAcid)により構成されている。ここでLNAがgaaaである理由は、図８に示される鋳型配列ccgac ctgca tgaat ggcgt aacga gatgg gagct gtctc aacca gagat tcagtgaaat tgtag tggag gtgaa aattc ctcct acccg cggca agacg gaaag acccc gtgga ccttt actacaactt agcac tgcta atggg aatat catgc gcagg atagg tggga ggctt tgaag taagg gctttggctc ttatg gagcc atcct（配列番号１０）において、下線(B)で示される箇所における矢印が変異箇所である2058番目と2059番目(ピロリ菌標準株においては2146番目と2147番目)のアデニンを示すところ、その両側の塩基を含む配列が好ましいからである。なお、図８において下線(A)で示される箇所は、Forwardのprimer配列に対応し、下線(C)で示される箇所はReverseのprimer配列に対応する。この第１の加水分解プローブは、変異株の場合Tmの下降の程度が比較的大きい。
【００６３】
第２の加水分解プローブは、図９に示されるように、第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、Tmは７０℃である。第２の加水分解プローブは、更に、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されている。MGB、レポーター蛍光色素、及びクエンチャー非蛍光色素については前述と同様に特に限定されるものではない。生物学的試料としては、前述と同様に特に限定されるものではない。
【００６４】
リアルタイムPCR用プライマーは、前述と同様に適宜設計することが可能であり、例えば、Forwardのプライマーとしてgcgtaacgagatgggagctg（配列番号１１）であり、Reverseのプライマーとしてtggctccataagagccaaagc（配列番号１２）である塩基配列を例としてあげることができる。
【００６５】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌がピロリ菌変異菌の場合についてのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キットは、上述した第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有する。更に、リアルタイムPCR用のプライマー、リアルタイムPCR用ポリメラーゼを含む。また、他の構成要素として、各種バッファー、ヌクレアーゼ・フリーの水、固定化単体等を含めることもできる。
【００６６】
これにより、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がピロリ菌変異菌の場合であっても前述と同様に、マクロライド耐性変異株を通常株と区別して一目瞭然に正確に判定することができる。
【００６７】
なお、後述の実施例にて記載するように、図７に示す第1の加水分解プローブ及び図９に示す第２の加水分解プローブは、キャンピロバクター・ジェジュニ菌変異菌の検出にも利用できる。また、全ての実施形態において共通することであるが、実施形態に示したプローブの配列の一部の追加、削除又は変更した配列のプローブであっても、本発明の効果を奏する限り、用いることが可能である。
【００６８】
次に、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がキャンピロバクター・ジェジュニ菌変異菌の場合について記載する。
【００６９】
前述と同様に、リアルタイムPCRにて生物学的試料を第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有する。
【００７０】
第１の加水分解プローブは、5’- ggcaagacggaaag -3’（配列番号１３）なる配列を有し（図１０）、Tmは６７℃である。第１の加水分解プローブは、5’端がssH amino linkerを介してAlexa647で標識されており、3'端がBHQ3で標識されている。
【００７１】
第１の加水分解プローブは、図１０にて大文字でGAAAと示されているように、配列の一部がLNA(Locked NucleicAcid)により構成されている。ここでLNAがgaaaである理由は、図１１に示される鋳型配列ttaaa taccg acctg catga atggc gtaac gagat gggag ctgtc tcaaa gagggatcca gtgaa attgt agtgg aggtg aaaat tcctc ctacc cgcgg caaga cggaa agacc ccgtg gacctttact acagc ttgac actgc tactt ggata agaat gtgca ggata ggtgg gaggc tttga gtatatgacg ccagt tgtat atgag ccatt gttga gatac（配列番号１４）において、下線(B)で示される箇所における矢印が変異箇所である2058番目と2059番目(キャンピロバクター・ジェジュニ菌標準株においては2074番目と2075番目)のアデニンを示すところ、その両側の塩基を含む配列が好ましいからである。なお、図１１において下線(A)で示される箇所は、Forwardのprimer配列に対応し、下線(C)で示される箇所はReverseのprimer配列に対応する。この第１の加水分解プローブは、変異株の場合Tmの下降の程度が比較的大きい。
【００７２】
第２の加水分解プローブは、図１２に示されるように、第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、Tmは６７℃である。第２の加水分解プローブは、更に、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されている。MGB、レポーター蛍光色素、及びクエンチャー非蛍光色素については前述と同様に特に限定されるものではない。生物学的試料としては、前述と同様に特に限定されるものではない。
【００７３】
リアルタイムPCR用プライマーは、前述と同様に適宜設計することが可能であり、例えば、Forwardのプライマーとしてcgtaacgagatgggagctgt（配列番号１５）であり、Reverseのプライマーとしてctcccacctatcctgcacat（配列番号１６）である塩基配列を例としてあげることができる。
【００７４】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌がキャンピロバクター・ジェジュニ菌変異菌の場合についてのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キットは、上述した第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有する。更に、リアルタイムPCR用のプライマー、リアルタイムPCR用ポリメラーゼを含む。また、他の構成要素として、各種バッファー、ヌクレアーゼ・フリーの水、固定化単体等を含めることもできる。
【００７５】
これにより、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がキャンピロバクター・ジェジュニ菌変異菌の場合であっても前述と同様に、マクロライド耐性変異株を通常株と区別して一目瞭然に正確に判定することができる。
【００７６】
なお、後述の実施例にて記載するように、図１０に示す第1の加水分解プローブ及び図１２に示す第２の加水分解プローブは、ピロリ菌変異菌の検出にも利用できる。
【００７７】
次に、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がクラミジア・トラコマチス菌変異菌の場合について記載する。
【００７８】
前述と同様に、リアルタイムPCRにて生物学的試料を第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有する。
【００７９】
第１の加水分解プローブは、5’-cgaaaggacgaaaag-3’（配列番号１７）なる配列を有し（図１３）、Tmは６０℃である。第１の加水分解プローブは、5’端がssH amino linkerを介してAlexa647で標識されており、3'端がBHQ3で標識されている。
【００８０】
第１の加水分解プローブは、図１３にて大文字でAAAAと示されているように、配列の一部がLNA(Locked NucleicAcid)により構成されている。ここでLNAがaaaaである理由は、図１４に示される鋳型配列cctgc acgaa tggtg taacg atctg ggcac tgtct caacg aaaga ctcgg tgaaattgtagtagc agtga agatg ctgtt taccc gcgaa aggac gaaaa gaccc cgtga acctttactgtactt tggta ttgat ttttg gtttg ttatg tgtag gatag ccagg agact aagaacactcttctt cagga gagtg ggagt caacg ttgaa atact ggtct taaca agctg ggaat ctaac（配列番号１８）において、下線(B)で示される箇所における矢印が変異箇所である2058番目と2059番目(クラミジア・トラコマチス菌標準株においては2038番目と2039番目)のアデニンを示すところ、その両側の塩基を含む配列が好ましいからである。なお、図１４において下線(A)で示される箇所は、Forwardのprimer配列に対応し、下線(C)で示される箇所はReverseのprimer配列に対応する。この第１の加水分解プローブは、変異株の場合Tmの下降の程度が比較的大きい。
【００８１】
第２の加水分解プローブは、図１５に示されるように、第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、Tmは６６℃である。第２の加水分解プローブは、更に、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されている。MGB、レポーター蛍光色素、及びクエンチャー非蛍光色素については前述と同様に特に限定されるものではない。生物学的試料としては、前述と同様に特に限定されるものではない。
【００８２】
リアルタイムPCR用プライマーは、前述と同様に適宜設計することが可能であり、例えば、Forwardのプライマーとしてtgggcactgtctcaacgaaa（配列番号１９）であり、Reverseのプライマーとしてcaacgttgactcccactctc（配列番号２０）である塩基配列を例としてあげることができる。
【００８３】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌がクラミジア・トラコマチス菌変異菌の場合についてのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キットは、上述した第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有する。更に、リアルタイムPCR用のプライマー、リアルタイムPCR用ポリメラーゼを含む。また、他の構成要素として、各種バッファー、ヌクレアーゼ・フリーの水、固定化単体等を含めることもできる。
【００８４】
これにより、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がクラミジア・トラコマチス菌変異菌の場合であっても前述と同様に、マクロライド耐性変異株を通常株と区別して一目瞭然に正確に判定することができる。
【００８５】
次に、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がMAC変異菌の場合について記載する。
【００８６】
前述と同様に、リアルタイムPCRにて生物学的試料を第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブと接触させる工程を有する。
【００８７】
第１の加水分解プローブは、5’-cggcaggacgaaaag-3’（配列番号２１）なる配列を有し（図１６）、Tmは６７℃である。第１の加水分解プローブは、5’端がssH amino linkerを介してAlexa647で標識されており、3'端がBHQ3で標識されている。
【００８８】
第１の加水分解プローブは、図１６にて大文字でAAAAと示されているように、配列の一部がLNA(Locked NucleicAcid)により構成されている。ここでLNAがaaaaである理由は、図１７に示される鋳型配列gactt cccaa ctgtc tcaac catag actcg gcgaa attgc actac gagta aagatgctcg ttacg cgcgg cagga cgaaa agacc ccggg acctt cacta caact tggta ttggt gttcg gtacggtttg tgtag gatag gtggg agact ttgaa gcaca gacgc cagtt tgtgt ggagt cgttg ttgaaatacc actct gatcg tattg gacac ctaac gtcga accct tatcg ggttc acgga cagtg cctggcgggt agttt aactg gggcg gttgc ctcct aaaat gtaac ggagg（配列番号２２）において、下線(B)で示される箇所における矢印が変異箇所である2058番目と2059番目(M.avium 標準株においては2279番目と2280番目)のアデニンを示すところ、その両側の塩基を含む配列が好ましいからである。なお、図１７において下線(A)で示される箇所は、Forwardのprimer配列に対応し、下線(C)で示される箇所はReverseのprimer配列に対応する。この第１の加水分解プローブは、変異株の場合Tmの下降の程度が比較的大きい。
【００８９】
第２の加水分解プローブは、図１８に示されるように、第１の加水分解プローブの５’末端の2塩基をイノシン(I)に置換した5’-IIgcaggacgaaaag-3’（配列番号２３）なる配列を有しており、Tmは６６℃である。一般にイノシンを通常の塩基の代わりにオリゴヌクレオチド配列に挿入することによって、DNA二本鎖を構成する塩基相補的結合に影響を与えずにオリゴヌクレオチド配列中に1塩基分の位置を占めることが可能となり、この結果Tmに影響を与えずにオリゴヌクレオチドを伸ばすことができる。この特性を利用して第２の加水分解プローブは検出対象変異から最も離れた５’末端の２塩基をイノシンに置換することによってTm値を抑えながらも第１のプローブと同一の対象配列と競合して結合するように設計された。第２の加水分解プローブは、更に、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGB(Minor Groove Binder)で標識されている。MGB、レポーター蛍光色素、及びクエンチャー非蛍光色素については前述と同様に特に限定されるものではない。生物学的試料としては、前述と同様に特に限定されるものではない。
【００９０】
リアルタイムPCR用プライマーは、前述と同様に適宜設計することが可能であり、例えば、Forwardのプライマーとしてtcggcgaaattgcactacga（配列番号２４）であり、Reverseのプライマーとしてaacccgataagggttcgacg（配列番号２５）である塩基配列を例としてあげることができる。
【００９１】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌がMAC変異菌の場合についてのマクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出キットは、上述した第１の加水分解プローブと、第２の加水分解プローブと、を有する。更に、リアルタイムPCR用のプライマー、リアルタイムPCR用ポリメラーゼを含む。また、他の構成要素として、各種バッファー、ヌクレアーゼ・フリーの水、固定化単体等を含めることもできる。
【００９２】
これにより、マクロライド系抗生物質耐性変異菌がMAC変異菌の場合であっても前述と同様に、マクロライド耐性変異株を通常株と区別して一目瞭然に正確に判定することができる。
【実施例】
【００９３】
以下に示す本件発明における検討の全ての実施例おいて、次の５点は共通事項である。
(I)リアルタイムPCR反応システムにはBIO-RAD社製「CFX96 Real-Time PCR System」を使用した点
(II)リアルタイムPCR反応が次の組成の反応液で実施した点：BIO-RAD社製 iQ SuperMixが10μL、検討対象試料が4μL、PCRプライマーがForward,reverseそれぞれ500[nM]の濃度で、第１の加水分解プローブ及び第２の加水分解プローブがそれぞれ100[nM]の濃度含まれ、ヌクレアーゼ・フリーの水で最終容量20μLに調製されたもの
(III)第１の加水分解プローブは５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はダーククエンチャー色素BHQ3で標識されているものを使用し、レポーター蛍光色素はAlexa647であった点
(IV)第２の加水分解プローブは５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGBで標識されているものを使用し、レポーター蛍光色素はVICであった点
(V)蛍光の測定に関しては、第１の加水分解プローブ(LNA probe)のレポーター色素Alexa647由来の蛍光をCy5のチャネルで、第２の加水分解プローブ(MGB probe)のレポーター色素VIC由来の蛍光をVICのチャネルで測定した点（なお、Alexa647のEmission peakは665nmであり、Cy5のEmissionpeakである667nmとほぼ一致する）。【００９４】
（実施例１  肺炎マイコプラズマ変異菌の検出）
これまでに別のhousebredのPCR検出系を用いて肺炎マイコプラズマ陽性と判断された、１２の患者検体由来の核酸標品を使用した。核酸標品は、気道由来臨床検体をQIAGEN社のQIAamp（登録商標）DNAmini kitを用いて抽出し、元の検体の量に依らず一律に100μLの容量に溶出することによって調製した。陰性対照には核酸溶出に用いているのと同一のQIAGENBuffer AEを使用した。【００９５】
Forward/Reverseのprimer配列は文献(Wolff BJ, Thacker WL, Schwartz SB, et al., Detection of MacrolideResistance in Mycoplasma pneumoniae by Real-Time PCR and High-Resolution MeltAnalysis,Antimicrob. Agents Chemother.2008, 52(10):3542.DOI:10.1128/AAC.00582-08.)のTable.1中に報告されている Forward_2020とReverseを用いた。即ち、Forwardのprimer配列はtccaggtacg ggtga agaca（配列番号３）であり、Reverseのprimer配列はatcat gtaga gaata ggtag gagc（配列番号４）であった。【００９６】
第１の加水分解プローブは、図１に示されるように、5’-aacgggacggaaag-3’（配列番号１）なる配列を有し、図中にて大文字で示されている部分にLNAが導入されているものを使用した。また、第２の加水分解プローブは、図３に示されるように第１の加水分解プローブと同じ配列を有しているものを使用した。【００９７】
PCRプログラム(thermal profile)は次の通りであった。
95.0℃  3分00秒の初期加温(DNA合成酵素活性化)に引き続き、
95.0℃  0分05秒
60.0℃  0分20秒(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を50サイクル反復
リアルタイムPCRの測定にかかる所要時間は１時間程度であった。【００９８】
図１９は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図２０は、シークエンス結果を示す図である。図１９に示されるように、１２本(＋陰性対照)の増幅曲線中、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が２本示されている(C0826,C1012)。図２０には、リアルタイムPCRで検討した１２のマイコプラズマ陽性検体から、23S rRNA領域の2058,2059番の塩基（肺炎マイコプラズマ菌標準株における2063,2064番に相当）とその周囲の配列を別途シークエンシングで確認した結果が、標準株(M129)の当該部位の配列と並べて示して示されている。M129は標準株(M129)の配列であり、そのうち下線を付したAAの２文字が2058,2059番に相当する部位、即ち、耐性変異の入る部位である。M129の下に実際にシークエンスで求められた配列を並べてられており、M129標準株と塩基が一致している場合には「-」が記され、相違があった場合にはその塩基が記されている。図１９に示された２本の陽性反応を示した増幅曲線C0826とC1012に対応するシークエンス結果は、図２０によれば、標準株と完全に配列が一致していたことが示された。そして、図１９において検出されなかった株は、図２０に示されるように、2058番あるいは2059番に塩基変異が入っていたことが示された。一方、図２１は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図２１に示されるように、図２０で示された耐性変異菌につき、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、本発明によれば、形態が類似している曲線を比較して判断するのではなく、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異菌の有無が検出できた。【００９９】
（実施例２  肺炎マイコプラズマの耐性変異の検出）
上述の実施例１では、A2058Gが９例、A2059Cが１例であったが、本実施例では変異を有さない配列とともに、A2058G、A2059C、A2058C、A2058T、A2059Gの計５種類の既報のマクロライド系抗生物質耐性変異の陽性対照、及び報告はされていないが生じうる１塩基変異であるA2059T、さらには2058,2059の２塩基ともに変異を有する９通りの変異をも加えた、これらマクロライド系抗生物質への耐性化のホットスポットの２塩基に生じ得る全16通りの配列の検出結果を示す。サンプルは、1)臨床検体由来核酸から目的配列をサブクローニングし、2)シークエンスを確認し、3)部位特異的変異導入法（Site-DirectedMutagenesis）で一塩基変異を導入し、4)意図した変異が導入されたことをシークエンスでそれぞれ確認することにより、人為的に作出した。それ以外の実験手法は実施例１と同様に行った。図２２は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図２３は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。【０１００】
図２２及び図２３に示されるように、2058、2059の2塩基の少なくとも一方に変異を有する全ての変異型、即ち既報の５種類の耐性変異A2058G、A2058C、A2058T、A2059G、A2059C及び生じうる１塩基変異A2059T、さらには2058,2059の２塩基双方に変異の生じた９通りの変異のいずれにおいても一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できることが判明した。【０１０１】
（実施例３  百日咳菌変異菌の検出）
これまでに別のPCR検出系（KostersK, Riffelmann M, Wirsing von Konig CH.Evaluation of a real-time PCR assay fordetection of Bordetella pertussis and B. parapertussis in clinical samples.JMed Microbiol. 2001 May;50(5):436-40.）を用いて百日咳陽性と判断された、８の患者検体由来の核酸標品(B1228,C0127,C0131,B0929,D0104,D0403,D0423,D0425)を使用した。上述の実施例１と同様に、核酸標品は、気道由来臨床検体をQIAGEN社のQIAamp（登録商標）DNAmini kitを用いて抽出し、元の検体の量に依らず一律に100μLの容量に溶出することによって調製した。陰性対照には核酸溶出に用いているのと同一のQIAGENBuffer AEを使用した。【０１０２】
Forwardのprimer配列はgcacgaatggcgtaacgatg（配列番号７）であり、Reverseのprimer配列はctccctcgaatctggcgactc（配列番号８）であった。これらのprimerはPrimer BLASTソフトウエアにて設計した。【０１０３】
第１の加水分解プローブは、図４に示されるように、5’-cggctagacggaaag-3’（配列番号５）なる配列を有し、図中にて大文字で示されている部分にLNAが導入されているものを使用した。また、第２の加水分解プローブは、図６に示されるように第１の加水分解プローブと同じ配列を有しているものを使用した。【０１０４】
PCRプログラム(thermal profile)は上述の実施例１と同様であった。【０１０５】
リアルタイムPCRの測定にかかる所要時間は１時間程度であった。【０１０６】
図２４は、シークエンス結果を示す図である。図２４には、リアルタイムPCRで検討した８の百日咳菌陽性検体から、23S rRNA領域の2058,2059番の塩基（百日咳菌における2037,2038番に相当）とその周囲の配列を別途シークエンシングで確認した結果が、標準株(Tohama I)の当該部位の配列と並べて示して示されている。Tohama Iは標準株の配列であり、そのうち下線を付したAAの２文字が2058,2059番に相当する部位、即ち、耐性変異の入る部位である。Tohama Iの下に実際にシークエンスで求められた配列を並べてられており、TohamaI標準株と塩基が一致している場合には「・」が記され、相違があった場合にはその塩基が記されている。【０１０７】
図２５は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図２５に示されるように、８の増幅曲線中、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(B1228,C0127,C0131,B0929,D0104,D0403,D0423,D0425)。図２５に示された陽性反応を示した増幅曲線B1228,C0127,C0131,B0929,D0104,D0403,D0423,D0425に対応するシークエンス結果は、図２４によれば、標準株と完全に配列が一致していたことが示された。一方、図２６は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。【０１０８】
このように、上述の実施例と同様に、本発明によれば、形態が類似している曲線を比較して判断するのではなく、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。【０１０９】
（実施例４  百日咳菌の耐性変異の検出）
上述の実施例３で検討した８の患者検体由来の核酸標品はいずれも変異を有さないマクロライド系抗生物質に感受性の配列であった。対して、本実施例では、耐性変異を有さない陽性対象に加え、耐性変異を人為的に導入したA2058G陽性対照、A2058C陽性対照、A2058T陽性対照、A2059G陽性対照、A2059C陽性対照、A2059T陽性対照についての検出結果を示す。サンプルは、実施例２と同様に、1)臨床検体由来核酸から目的配列をサブクローニングし、2)シークエンスを確認し、3)部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis）で一塩基変異を導入し、4)意図した変異が導入されたことをシークエンスでそれぞれ確認することにより、人為的に作出した。それ以外の実験手法は実施例３と同様に行った。図２７は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図２８は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。【０１１０】
図２７及び図２８に示されるように、全ての変異型、即ち、A2058G陽性対照、A2058C陽性対照、A2058T陽性対照、A2059G陽性対照、A2059C陽性対照、A2059T陽性対照において一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できることが判明した。【０１１１】
（実施例５  ピロリ菌の耐性変異の検出）
理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けたJCM12093株由来の核酸標品を耐性変異を有さないサンプル(感受性配列のサンプル)として使用した。このサンプルは上述の実施例１と同様に抽出され、核酸標品は、200μLの容量に溶出することによって調製した。この標品の核酸濃度を吸光度により測定し、凡そ1×105ゲノム毎μLとなるようにさらに希釈した。変異を有する配列のサンプルは、1)互いに36塩基ずつoverlapする8本の130merのオリゴヌクレオチド(アクション番号NC_011333を参考配列として使用)をPCR反応液中で繋ぎ、この反応産物を鋳型としてPCRの反応で増幅を行ない、2)シークエンスを確認し、3)部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis）で一塩基変異を導入し、4)意図した変異が導入されたことをシークエンスでそれぞれ確認することにより作出されたものである。陰性対照には核酸溶出に用いているのと同一のQIAGEN Buffer AEを使用した。【０１１２】
Forwardのprimer配列はgcgtaacgagatgggagctg（配列番号１１）であり、Reverseのprimer配列はtggctccataagagccaaagc（配列番号１２）であった。【０１１３】
第１の加水分解プローブは、図７に示されるように、5’-cggcaagacggaaag-3’（配列番号９）なる配列を有し、図中にて大文字で示されている部分にLNAが導入されているものを使用した。また、第２の加水分解プローブは、図９に示されるように第１の加水分解プローブと同じ配列を有しているものを使用した。【０１１４】
PCRプログラム(thermal profile)は次の通りであった。
95.0℃  3分00秒の初期加温(DNA合成酵素活性化)に引き続き、
95.0℃  0分05秒
64.0℃  0分20秒(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を50サイクル反復
リアルタイムPCRの測定にかかる所要時間は１時間程度であった。【０１１５】
図２９は、シークエンス結果を示す図である。図２９には、リアルタイムPCRで検討した８の核酸標品（理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けたJCM12093株由来、及びJCM12093株由来ゲノムDNAからサブクローニングした配列、人為的に作出した６種類の変異を有する配列）から、23S rRNA領域の2058,2059番の塩基（ピロリ菌標準株における2146,2147番に相当(既報文献ではピロリ菌の2142，2143番とも言及される部位)）とその周囲の配列を別途シークエンシングで確認した結果が、標準株(Helicobacter pylori 26695 (NCBI Reference Sequence:NC_000915.1))の当該部位の配列と並べて示して示されている。Helicobacterpylori 26695は標準株の配列であり、そのうち下線を付したAAの２文字が2058,2059番に相当する部位、即ち、耐性変異の入る部位である。Helicobacter pylori 26695の下に実際にシークエンスで求められた配列が並べてられており、Helicobacter pylori 26695標準株と塩基が一致している場合には「・」が記され、相違があった場合にはその塩基が記されている。【０１１６】
図３０は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３０に示されるように、８の増幅曲線中、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(AA)。図３０に示された陽性反応を示した増幅曲線AAに対応するシークエンス結果は、図２９によれば、標準株と完全に配列が一致していたことが示された。そして、図３０において検出されなかった配列は、図２９に示されるように、2058番あるいは2059番に塩基変異が入っていたことが示された。一方、図３１は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３１に示されるように、図２９で示された耐性変異配列についても耐性変異を有さない配列ともども、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、上述の実施例と同様に、本発明によれば、形態が類似している曲線を比較して判断するのではなく、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。【０１１７】
次に、上述の実施例におけるプローブの配列を変えた場合において、ピロリ菌の耐性変異の検出を試みた。【０１１８】
第１の加水分解プローブは、後述する実施例６のもの、即ち図１０に示される5’-ggcaagacggaaag-3’（配列番号１３）なる配列を有するものを使用した。また、同様に、第２の加水分解プローブは、後述する実施例６のもの、即ち図１２に示される配列を有するものを使用した。これらのプローブの配列(配列番号１３)は先に用いたプローブの配列(配列番号９)の、５’末端のC(シトシン)を１塩基除いた配列であり、図８に示される鋳型配列と完全に一致する配列である。【０１１９】
PCRプログラム(thermalprofile)は次の通りであった。
95.0℃  3分00秒の初期加温(DNA合成酵素活性化)に引き続き、
95.0℃  0分05秒
60.0℃  0分20秒(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を60サイクル反復
図３２は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３２に示されるように、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(AA)。一方、図３３は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３３に示されるように、耐性変異配列についても耐性変異を有さない配列ともども、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、上述の実施例におけるプローブよりも１塩基短いプローブを用いた場合においても、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。【０１２０】
（実施例６  Campylobacter jejuni菌の耐性変異の検出）
理化学研究所バイオリソースセンターからCampylobacter jejuni subsp. jejuni菌JCM2013株由来の核酸標品を緩衝液に溶解したものの分譲を受け、これを耐性変異を有さないサンプル(感受性配列のサンプル)として使用した。この標品をさらに1000倍に希釈したものを実験に供した。変異を有する配列のサンプルは、1)上記JCM2013株由来の核酸表品から目的配列をサブクローニングし、2)シークエンスを確認し、3)部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis）で一塩基変異を導入し、4)意図した変異が導入されたことをシークエンスでそれぞれ確認することにより作出されたものである。陰性対照には核酸溶出に用いているのと同一のヌクレアーゼ・フリーの水を使用した。【０１２１】
Forwardのprimer配列はcgtaacgagatgggagctgt（配列番号１５）であり、Reverseのprimer配列はctcccacctatcctgcacat（配列番号１６）であった。【０１２２】
第１の加水分解プローブは、図１０に示されるように、5’-ggcaagacggaaag-3’（配列番号１３）なる配列を有し、図中にて大文字で示されている部分にLNAが導入されているものを使用した。また、第２の加水分解プローブは、図１２に示されるように第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGBで標識されているものを使用した。レポーター蛍光色素はVICであった。【０１２３】
PCRプログラム(thermal profile)は上述の実施例１と同様であった。【０１２４】
リアルタイムPCRの測定にかかる所要時間は１時間程度であった。【０１２５】
図３４は、シークエンス結果を示す図である。図３４には、リアルタイムPCRで検討した８の核酸標品（理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けたJCM2013株由来、及び変異を含まない配列ならびに人為的に作出した６種類の変異を有する配列）から、23S rRNA領域の2058,2059番の塩基（Campylobacter jejuni菌標準株における2074,2075番に相当）とその周囲の配列を別途シークエンシングで確認した結果が、標準株(Campylobacter jejuni subsp. jejuni (NCBI Reference Sequence:NC_002163.1))の当該部位の配列と並べて示して示されている。これは標準株の配列であり、そのうち下線を付したAAの２文字が2074,2075番に相当する部位、即ち、耐性変異の入る部位である。標準株Campylobacter jejuni subsp. jejuniの配列の下に実際にシークエンスで求められた配列が並べてられており、この標準株と塩基が一致している場合には「・」が記され、相違があった場合にはその塩基が記されている。【０１２６】
図３５は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３５に示されるように、増幅曲線中、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(AA)。図３５に示された陽性反応を示した増幅曲線AAに対応するシークエンス結果は、図３４によれば、標準株と完全に配列が一致していたことが示された。そして、図３５において検出されなかった配列は、図３４に示されるように、2058番あるいは2059番に塩基変異が入っていたことが示された。一方、図３６は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３６に示されるように、図３４で示された耐性変異配列についても耐性変異を有さない配列ともども、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、上述の実施例と同様に、本発明によれば、形態が類似している曲線を比較して判断するのではなく、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。【０１２７】
次に、上述の実施例におけるプローブの配列を変えた場合において、Campylobacter jejuni菌の耐性変異の検出を試みた。【０１２８】
第１の加水分解プローブは、前述した実施例５のもの、即ち図７に示される5’-cggcaagacggaaag-3’（配列番号９）なる配列を有するものを使用した。また、同様に、第２の加水分解プローブは、前述した実施例５のもの、即ち図９に示される配列を有するものを使用した。これらのプローブの配列(配列番号９)は先に用いたプローブの配列(配列番号１３)の、５’末端側にC(シトシン)を１塩基付加した配列であり、図１１に示される鋳型配列と完全に一致する配列である。【０１２９】
PCRプログラム(thermalprofile)は次の通りであった。
95.0℃  3分00秒の初期加温(DNA合成酵素活性化)に引き続き、
95.0℃  0分05秒
64.0℃  0分20秒(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を50サイクル反復
図３７は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３７に示されるように、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(AA)。一方、図３８は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図３８に示されるように、耐性変異配列についても耐性変異を有さない配列ともども、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、上述の実施例におけるプローブよりも１塩基長いプローブを用いた場合においても、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。【０１３０】
（実施例７  Chlamydia trachomatis菌の耐性変異の検出）
Amplicor（登録商標）法によってChlamydia trachomatis菌が陽性だと判定された臨床検体からフェノール・クロロホルム抽出された２件の核酸標品を使用した。これらの1)臨床検体由来核酸から目的配列をサブクローニングし、2)シークエンスを確認し、3)部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis）で一塩基変異を導入し、4)意図した変異が導入されたことをシークエンスでそれぞれ確認することにより、変異を有する配列のサンプルを人為的に作出した。陰性対照には核酸溶出に用いているのと同一のヌクレアーゼ・フリーの水を使用した。【０１３１】
Forwardのprimer配列はtgggcactgtctcaacgaaa（配列番号１９）であり、Reverseのprimer配列はcaacgttgactcccactctc（配列番号２０）であった。【０１３２】
第１の加水分解プローブは、図７に示されるように、5’-cgaaaggacgaaaag-3’（配列番号１７）なる配列を有し、図中にて大文字で示されている部分にLNAが導入されているものを使用した。また、第２の加水分解プローブは、図９に示されるように第１の加水分解プローブと同じ配列を有しており、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGBで標識されているものを使用した。レポーター蛍光色素はVICであった。【０１３３】
PCRプログラム(thermal profile)は上述の実施例１と同様であった。【０１３４】
リアルタイムPCRの測定にかかる所要時間は１時間程度であった。【０１３５】
図３９は、シークエンス結果を示す図である。図３９には、リアルタイムPCRで検討した９の核酸標品（Chlamydia trachomatis菌陽性臨床検体0630,0707由来、及び人為的に作出した変異を含まない配列ならびに６種類の変異を有する配列）から、23S rRNA領域の2058,2059番の塩基（Chlamydia trachomatis菌標準株における2038,2039番に相当）とその周囲の配列を別途シークエンシングで確認した結果が、標準株(Chlamydiatrachomatis D/UW-3/CX (NCBI Reference Sequence: NC_000117.1))の当該部位の配列と並べて示して示されている。NC_000117は標準株の配列であり、そのうち下線を付したAAの２文字が2038,2039番に相当する部位、即ち、耐性変異の入る部位である。NC_000117.1の配列の下に実際にシークエンスで求められた配列を並べてられており、この標準株と塩基が一致している場合には「・」が記され、相違があった場合にはその塩基が記されている。【０１３６】
図４０は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図４０に示されるように、増幅曲線中、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(AA,陽性検体)。図４０に示された陽性反応を示した増幅曲線AAおよび陽性検体に対応するシークエンス結果は、図３９によれば、標準株と完全に配列が一致していたことが示された。そして、図４０において検出されなかった株は、図３９に示されるように、2058番あるいは2059番に塩基変異が入っていたことが示された。一方、図４１は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図４１に示されるように、図３９で示された耐性変異配列についても耐性変異を有さない配列ともども、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、上述の実施例と同様に、本発明によれば、形態が類似している曲線を比較して判断するのではなく、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。【０１３７】
（実施例８  MACの耐性変異の検出）
理化学研究所バイオリソースセンターからMycobacterium intracellulare菌JCM6384標準株(ATCC13950と同一)由来の核酸標品を緩衝液に溶解したものの分譲を受け、これを耐性変異を有さないサンプル(感受性配列のサンプル)として使用した。この標品をさらに1000倍に希釈したものを実験に供した。陽性対照として用いる変異を有する配列ならびに有さない配列のサンプルは、1)互いに36塩基ずつoverlapする6本の160mer、ほぼ中央に目的の変異を含む82mer、Forwardプライマーとしての57mer、Reverseプライマーとしての50merのオリゴヌクレオチド(アクション番号NC008595.1を参考配列として採用)をPCR反応液中で繋ぎ、この反応産物を鋳型としてPCRの反応で増幅を行ない、2)シークエンスを確認し、3)意図した変異が導入されたことをシークエンスでそれぞれ確認することにより作出されたものである。陰性対照には核酸溶出に用いているのと同一のヌクレアーゼ・フリーの水を使用した。【０１３８】
Forwardのprimer配列はtcggcgaaattgcactacga（配列番号２４）であり、Reverseのprimer配列はaacccgataagggttcgacg（配列番号２５）であった。【０１３９】
第１の加水分解プローブは、図１６に示されるように、5’-cggcaggacgaaaag-3’（配列番号２１）なる配列を有し、図中にて大文字で示されている部分にLNAが導入されているものを使用した。また、第２の加水分解プローブは、図１８に示されるように第１の加水分解プローブと同じ長さだが、５’末端の2塩基がイノシン(I)に置き換えられた5’-IIgcaggacgaaaag-3’（配列番号２３）なる配列を有しており、５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端はクエンチャー非蛍光色素及びMGBで標識されているものを使用した。レポーター蛍光色素はVICであった。【０１４０】
PCRプログラム(thermal profile)は次の通りであった。
95.0℃  3分00秒の初期加温(DNA合成酵素活性化)に引き続き、
95.0℃  0分05秒
62.0℃  0分20秒(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を50サイクル反復
リアルタイムPCRの測定にかかる所要時間は１時間程度であった。【０１４１】
図４２は、シークエンス結果を示す図である。図４２には、リアルタイムPCRで検討した７の核酸標品（人為的に作出した標準株と同一の配列ならびに６種類の変異を有する配列）から、23S rRNA領域の2058,2059番の塩基（標準株Mycobacterium avium 104における2279,2280番に相当）とその周囲の配列を別途シークエンシングで確認した結果が、２種類のMAC標準株(Mycobacterium avium 104 (NCBIReference Sequence: NC_008595.1)、Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950 (NCBI Reference Sequence:NC_016946.1))の当該部位の配列と並べて示して示されている。Mycobacteriumavium 104はMACの標準株の配列であり、そのうち下線を付したAAの２文字が2058,2059番に相当する部位、即ち、耐性変異の入る部位である。Mycobacterium avium 104の下に実際にシークエンスで求められた配列を並べてられており、この標準株と塩基が一致している場合には「・」が記され、相違があった場合にはその塩基が記されている。図の最も下がM.intracellulare ATCC 13950標準株の配列である。【０１４２】
図４３は、感受性配列における増幅曲線の検出結果を示す図である。図４３に示されるように、増幅曲線中、感受性配列でのみ蛍光が観察されることが期待されるチャートにおいて、陽性反応を示した増幅曲線が示されている(AA、JCM6384(標準株))。図４３に示された陽性反応を示した増幅曲線AAに対応するシークエンス結果は、図４２によれば、標準株と完全に配列が一致していたことが示された。そして、図４３において検出されなかった配列は、図４２に示されるように、2279番あるいは2280番に塩基変異が入っていたことが示された。一方、図４４は、感受性不問の場合における増幅曲線の検出結果を示す図である。図４４に示されるように、図４２で示された耐性変異配列についても耐性変異を有さない配列ともども、陽性反応を示す増幅曲線が検出された。このように、上述の実施例と同様に、本発明によれば、形態が類似している曲線を比較して判断するのではなく、all or noneにて一目瞭然にしかも極めて短時間でマクロライド系抗生物質耐性変異の有無が検出できた。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
配列番号１，５，９，１３，１７，２１，２３：プローブ
配列番号２，６，１０，１４，１８，２２：鋳型配列
配列番号３，４，７，８，１１，１２，１５，１６，１９，２０，２４，２５：プライマー
【図１】
2013136818.tif 000003
【図２】
2013136818.tif 000004
【図３】
2013136818.tif 000005
【図４】
2013136818.tif 000006
【図５】
2013136818.tif 000007
【図６】
2013136818.tif 000008
【図７】
2013136818.tif 000009
【図８】
2013136818.tif 000010
【図９】
2013136818.tif 000011
【図１０】
2013136818.tif 000012
【図１１】
2013136818.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2013136818.tif 000015
【図１４】
2013136818.tif 000016
【図１５】
2013136818.tif 000017
【図１６】
2013136818.tif 000018
【図１７】
2013136818.tif 000019
【図１８】
2013136818.tif 000020
【図１９】
2013136818.tif 000021
【図２０】
2013136818.tif 000022
【図２１】
2013136818.tif 000023
【図２２】
2013136818.tif 000024
【図２３】
2013136818.tif 000025
【図２４】
2013136818.tif 000026
【図２９】
2013136818.tif 000027
【図３０】
2013136818.tif 000028
【図３１】
2013136818.tif 000029
【図３２】
2013136818.tif 000030
【図３３】
2013136818.tif 000031
【図３４】
2013136818.tif 000032
【図３５】
2013136818.tif 000033
【図３６】
2013136818.tif 000034
【図３７】
2013136818.tif 000035
【図３８】
2013136818.tif 000036
【図３９】
2013136818.tif 000037
【図４０】
2013136818.tif 000038
【図４１】
2013136818.tif 000039
【図４２】
2013136818.tif 000040
【図４３】
2013136818.tif 000041
【図４４】
2013136818.tif 000042
【図２５】
2013136818.tif 000043
【図２６】
2013136818.tif 000044
【図２７】
2013136818.tif 000045
【図２８】
2013136818.tif 000046
【国際調査報告】
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