(57)【要約】本発明は、自己免疫疾患の治療・予防のための医薬組成物および治療法を提供することを目的とする。  ＣＤ９８重鎖を発現抑制するｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物が、自己免疫疾患の予防・治療に有用であることを見出した。その結果、自己免疫疾患として１型糖尿病や関節リウマチなどの自己免疫疾患に上記ｓｉＲＮＡを使用する新たな治療方法を提供できるようになった。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分として含むことを特徴とする自己免疫疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２】
上記機能性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記自己免疫疾患が１型糖尿病又は関節リウマチである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
上記ｓｉＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡ部分が、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
哺乳類に、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
【請求項１０】
上記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項９記載の治療方法。
【請求項１１】
上記ｓｉＲＮＡが、請求項７または８の２本鎖ｓｉＲＮＡである、上記（１０）記載の治療方法。
【請求項１２】
上記自己免疫疾患が、１型糖尿病又は関節リウマチである、請求項９〜１１のいずれかに記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ９８に関する機能性核酸の新規用途に関する。より詳細には、本発明は、ＣＤ９８のｓｉＲＮＡを用いた自己免疫疾患治療用医薬組成物に関するものである。更に詳しくは、糖尿病治療剤（特に１型糖尿病）や関節リウマチ治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９８とは、細胞膜上に幅広く発現している約１２０ｋＤａのヘテロ２量体の糖タンパク質であり、アミノ酸輸送、増加した細胞膜発現とインテグリンが仲介する接着に付随する細胞融合に関連すると考えられている。ＣＤ９８の構造は、約８０ｋＤａＩＩ型膜貫通型タンパク質ＣＤ９８ｈｃ（重鎖：４Ｆ２ｈｃ、ＳＬＣ３Ａ２）と６種類ある約４０ｋＤａの軽鎖（ＬＡＴ１，ＬＡＴ２，ｙ＋ＬＡＴ１，ｙ＋ＬＡＴ２，ｘＣＴ，ａｓｃ）の１つとジスルフィド結合によるヘテロ２量体を構成し、アミノ酸トランスポーターとして機能している。ＣＤ９８の重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）は細胞膜に２量体を移動させる役割を持ち、軽鎖（ｌｃ）がトランスポーターの機能を持つと考えられている。
ＣＤ９８ｈｃは、最初、Ｔ細胞活性化抗原として発見されたものであり、様々な機能を持った糖タンパク質である。その機能としては、増殖中リンパ球、腫瘍細胞、その他の増殖能の高い細胞で高発現し、腫瘍形成を促進するインテグリン依存性シグナルに重要な役割を果たしている。
ＣＤ９８が関与するアミノ酸輸送システムは、基質となるアミノ酸分子の多様性を反映して６種類のトランスポーター（約４０ｋＤａの軽鎖）の一つから構成されており、その輸送基質選択性とＮａ＋依存性により種々の輸送系に分類されている。例えば、中性アミノ酸輸送系Ｌ、小型中性アミノ酸輸送系ａｓｃ、中性および塩基性アミノ酸輸送系ｙ＋Ｌ、シスチン、塩基性および中性アミノ酸輸送系ｘ−ｃに相当する特定のトランスポーター（ＬＡＴ１，ＬＡＴ２，ｙ＋ＬＡＴ１，ｙ＋ＬＡＴ２，ｘＣＴ，ａｓｃ）とジスルフィド結合している。そして、ＣＤ９８重鎖は、上皮細胞の血管側の細胞膜に存在し、上記のトランスポーターを上皮細胞の血管側の細胞膜へ移送する働きをしている。
また、ＣＤ９８は、多種の癌細胞で高発現していることが知られている。その理由として、癌細胞は細胞増殖を促進させるために、増殖に必要な必須アミノ酸を積極的に取り込む必要があり、そこで中性アミノ酸トランスポーターが過剰発現していると考えられる。例えば、癌細胞に特異的に高く発現しているアミノ酸トランスポーターとして、Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １（ＬＡＴ１）がクローニングされている（Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），２７３，２３６２９−２３６３２）。ＬＡＴ１は、ＣＤ９８重鎖と複合体を形成し、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジン等の大型の側鎖を持つ中性アミノ酸をナトリウムイオン非依存的に輸送する機能を有している。このＬＡＴ１は、脳、胎盤、骨髄、精巣を除く殆どの正常組織において、その発現が低いか、あるいは認められないものであるが、大腸癌、胃癌、乳癌、膵癌、腎癌、喉頭癌、食道癌、肺癌等のヒト悪性腫瘍組織では、ＣＤ９８と共に発現が亢進していることが知られている（非特許文献１）。
そこで、ＣＤ９８重鎖や軽鎖（ＬＡＴ１）の発現を低下させ、アミノ酸取り込みを抑制すると、腫瘍の増殖が抑えられることが考えられた。即ち、軽鎖（ＬＡＴ１）の発現を低下させると、腫瘍の増殖抑制が起きることが癌移植マウスモデルで報告されている（特許文献１）。そこで、ＬＡＴ１の活性を抑えることは癌の治療法に有望であると考えられた。
また、ＣＤ９８（重鎖と軽鎖の複合体）のアミノ酸輸送を抑制するため、抗ＣＤ９８抗体を用いた癌細胞の抑制効果が癌移植マウスモデルで報告されている（特許文献２、３）。このように、抗ＣＤ９８抗体を使用して、抗癌剤として使用する試みについては、色々取り組みが行われている。しかし、抗癌剤以外の用途に関する取り組みは、ほとんど行われていない状況である。
しかも、ｓｉＲＮＡを用いてＣＤ９８の発現を抑制し、上記抗癌剤等に関する治療効果を評価する試みについては、全く行なわれていない状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−１５７２８６号公報
【特許文献２】特開２００９−１８９３７６号公報
【特許文献３】ＷＯ２００７／１１４４９６号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｙａｎａｇｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（２００１），１５１４，２９１−３０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＣＤ９８の機能性核酸による自己免疫疾患の医薬組成物の提供を目的とする。特に、ＣＤ９８重鎖の発現抑制型のｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ＣＤ９８の重鎖を認識するモノクロナール抗体を特定し、このモノクロナール抗体がＴ細胞の活性化を抑制することを見出した。そして、この抗体は、アミノ酸輸送に影響を与えず、フィブロネクチンを介した細胞接着を抑制することを見出した。そして、この抗体を用いて糖尿病ＮＯＤマウスを治療したところ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制し、糖尿病の状態を通常のレベルに戻すことが出来た（ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０５７４３２）。
そこで、本発明者は、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いて、糖尿病ＮＯＤマウスの治療を行なったところ、ＣＤ９８の重鎖に対するｓｉＲＮＡが１型糖尿病の進行を抑制するだけでなく、治療できることを見出した。即ち、これまでインスリンの補充療法以外に適切な治療方法のなかった膵臓β細胞のアポトーシスに基づく１型糖尿病に対して、本抗体が非常に有効であることが示された。更に関節リウマチモデルマウスにＣＤ９８重鎖の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを投与したところ、関節炎の発症が抑制されることを確認した。このような知見は、ＣＤ９８のｓｉＲＮＡを有効成分として含む医薬組成物が、自己免疫疾患（１型糖尿病や関節リュウマチ等）の治療・予防に有効であることを示すものである。
これらの知見から、本発明のｓｉＲＮＡは、自己免疫疾患の治療薬として有用であることが示された。本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分として含むことを特徴とする自己免疫疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
（２）上記機能性核酸がｓｉＲＮＡである、上記（１）記載の医薬組成物。
（３）上記自己免疫疾患が１型糖尿病又は関節リウマチである、上記（１）又は（２）の医薬組成物。
（４）上記ｓｉＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、上記（２）記載の医薬組成物。
（５）上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、上記（４）記載の医薬組成物。
（６）上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、上記（４）記載の医薬組成物。
（７）配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
（８）二本鎖ＲＮＡ部分が、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
（９）哺乳類に、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
（１０）上記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである、上記（９）記載の治療方法。
（１１）上記ｓｉＲＮＡが、上記（７）または（８）の２本鎖ｓｉＲＮＡである、上記（１０）記載の治療方法。
（１２）上記自己免疫疾患が、１型糖尿病又は関節リウマチである上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の治療方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を投与することにより、高い治療効果を得ることができるため、本発明の医薬組成物および治療法は、自己免疫疾患の治療に極めて有用である。特に、これまで効果的な治療方法のなかった、１型糖尿病と関節リウマチに有効である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は１型糖尿病を発症したＮＯＤマウスのＴ細胞を重症複合型免疫不全症のＮＯＤモデルマウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス）に投与する。投与後のマウスに、ＣＤ９８重鎖に対するマウスｓｉＲＮＡ（４ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）、あるいはコントロールのｓｉＲＮＡを、２日目、５日目、８日目に投与する。なお、Ｔ細胞を投与した日を起算日とする。
図１は、３日後の末梢血単核球細胞のＣＤ９８重鎖の発現をフローサイトメトリーで評価した図である。灰色（ＧＲＡＹ）の部分は、ＣＤ９８抗体を投与した場合の測定結果である。点線部分は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果であり、実線部分は、ＣＤ９８重鎖に対するｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果を示している。
図２は１型糖尿病の治療効果を見るために、血糖値を測り、評価した図である。マウス５匹を一群として実験を行い、＊印は統計的な有意差を示す（ｐ＜０．０５）。点線部分は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した場合の結果であり、実線部分は、ＣＤ９８重鎖に対するｓｉＲＮＡを投与した場合の結果である。
図３はリウマチモデルマウス（コラーゲン誘導性関節炎モデル）を使用し、ｓｉＲＮＡを０日目、１日目、２日目、３日目、４日目に腹腔内投与した結果を表わした図である。マウスｓｉＲＮＡの投与により、リウマチの発症が大きく軽減された結果が示されている。
図４はヒトＴリンパ腫由来のＪｕｒｋａｔ細胞に対してヒトｓｉＲＮＡを投与し、細胞表面におけるＣＤ９８タンパクの発現の変化を、フローサイトメーターで測定、評価した図である。無処置群、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比較し、ヒトｓｉＲＮＡを投与することにより、ＣＤ９８タンパクの発現の抑制が大きく抑制されたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
−本発明の第一の態様−
本発明の一つの態様としては、「ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分として含むことを特徴とする自己免疫疾患を予防又は治療するための医薬組成物」および「ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法」が挙げられる。ここで「ＣＤ９８」は公知のタンパク質であり、ＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、特許文献２等に記載されている。本発明における「ＣＤ９８」は、これらの配列に限定されるものではなく、ＣＤ９８の機能が保持される限り、アミノ酸やＤＮＡの変異数や変異部位には制限はないものとする。
本発明において「機能性核酸」とは、タンパク質の発現を抑制できる機能を持ったｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、アンチセンス核酸のことを言う。好ましいものとしては、ｓｉＲＮＡを挙げることができる。即ち、本発明のｓｉＲＮＡとは、ＣＤ９８重鎖の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡをさす。具体的には、対照群（コントロールｓｉＲＮＡを使用した場合）と比較してＣＤ９８の遺伝子発現を５０％以上抑制できるｓｉＲＮＡを、好ましくは８０％以上抑制できるｓｉＲＮＡをいう。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現の抑制を誘導することが知られている。ｓｉＲＮＡは、一般的に二本鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング部分から構成される。ｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知の方法によって設計することができる。例えば、選択したＤＮＡ配列（１９〜２１塩基が望ましい）をそのままＲＮＡ配列に変換したもの（センス鎖）とそのアンチセンス鎖を二本鎖ＲＮＡ部分とし、オーバーハング部を付加する。オーバーハング部は、１又は２塩基の任意の核酸（リボ核酸またはデオキシ核酸）であるが、ウリジン（Ｕ）もしくはチミジン（ｄＴ）が好ましい。本発明のｓｉＲＮＡは、ＣＤ９８、好ましくはヒトのＣＤ９８重鎖のＤＮＡ配列に基づいて設計され、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制できるｓｉＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。発現の抑制は、ＣＤ９８重鎖に特異的であることが望ましい。特異的であるかどうかは、一般公開されているＢＬＡＳＴ検索を実施することにより確認できる。またオーバーハング部分は必須ではない。
また本発明のｓｉＲＮＡには、投与対象内で本発明のｓｉＲＮＡと同じ効果を有する任意の分子も含まれる。このような分子としては、例えば、ｓｈＲＮＡが挙げられる。ｓｈＲＮＡとはショートヘアピン構造型のＲＮＡであり、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。二本鎖ＲＮＡ部分が、本発明のｓｉＲＮＡと同一構造を有するｓｈＲＮＡも本発明のｓｉＲＮＡに含まれる。他には、投与対象に投与することによって本発明のｓｉＲＮＡを発現することができるようなＤＮＡも本発明のｓｉＲＮＡに含まれる。このようなＤＮＡは、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを発現ベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどのベクター）に組み込んで構築して使用される。
本発明において、機能性核酸を医薬組成物として使用する場合には、治療薬としての特性を改善するための修飾、あるいはリポソームなどの輸送担体に含包することが望ましい。ポリヌクレオチドの治療薬としての特性を改善するには、ヌクレオチドの修飾または類似体を導入することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性の向上および／または細胞透過性の向上などである。ヌクレアーゼ耐性は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはリボザイムの生理活性を妨げないような技術上周知の任意の方法によりもたらされる。ヌクレアーゼ耐性の向上を目的にオリゴヌクレオチドに加えることができる修飾の例としては、リン酸骨格中のヘテロ原子のリンまたは酸素の修飾である。例えば、メチルリン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびモルホリノオリゴマーなどである。また、技術上周知の他の修飾により、生理活性は維持したまま、ヌクレアーゼに対する安定性を大幅に高めるようにしてもよい。
更に、本発明において機能性核酸を医薬組成物や治療方法として使用する場合には、機能性核酸そのものを治療に用いる方法と、ベクターを用いて機能性核酸を発現させて治療に用いる方法が存在する。
機能性核酸そのものを治療に用いる場合には、アテロコラーゲン等の安定化剤、ｐＨ調節剤などを添加した水溶液を作製し、そのまま非経口で投与することが望ましい。
ベクターを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ発現を行なう場合には、特に本発明の治療を必要とする患者体内での発現に際しては、発現ベクター、特に哺乳動物発現ベクターを使用するのが望ましい。発現ベクターは技術上周知であり、好ましくはプラスミド、コスミド、ウイルス発現系を含む。好ましいウイルス発現系の例としてはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどである。また細胞や組織にベクターを導入する方法は技術上周知である。好ましい例としては、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組み換えウイルスベクターによる感染などである。
本発明の「哺乳動物」とは、例えばラット、マウス、モルモット等のげっ歯類、例えばイヌやネコ、更には例えばヒトやサルの霊長類を挙げることができる。
本発明の「自己免疫疾患」とは、免疫系が内因性抗原に対する自己抗体を起こすことで起こる疾患であり、例えば１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病等を挙げることができる。いずれの自己免疫疾患も、Ｔ細胞の異常な過剰活性化がその原因となっていることがこれまでの研究から明らかになっている。特に、ＣＤ４陽性あるいはＣＤ８陽性のＴリンパ球（Ｔ細胞）が過剰に活性化し、自己抗体の産生を促したり、組織破壊を引き起こしたりすることが病状の進展に大きな影響を与えることは広く知られている事実である。従って、本発明のｓｉＲＮＡが抗ＣＤ９８抗体と同様にＴリンパ球（Ｔ細胞）の活性化を抑制することから、本発明のｓｉＲＮＡを用いて、上記の自己免疫疾患の治療を行なうことができる。例えば、図２に示されるように、本発明のｓｉＲＮＡは、１型糖尿病の治療に有効であり、また、図３に示されるように、関節リウマチの治療に有効である。このように、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病等の自己免疫疾患の治療に使用することができる。以上のように、本発明のｓｉＲＮＡの好ましい用途としては、１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病であり、特に好ましい用途として、１型糖尿病あるいは関節リウマチを挙げることができる。
本発明の「関節リウマチ」とは、関節や骨、筋肉、じん帯、腱などが痛む自己免疫疾患のことを言い、きわめて慢性の経過をたどり治療に難渋することが多いもっとも頻度の高い自己免疫疾患である。関節リウマチは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が過剰に活性化し、様々なサイトカインを産生することに加えて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が関節組織を破壊することによって病状が進展することが知られている。そのため、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の活性化抑制作用を持つ、本発明のｓｉＲＮＡは、関節リウマチの治療に好適なものである。
本発明の「１型糖尿病」とは、主に自己免疫により膵β細胞が破壊され、インスリンの産生が枯渇して、インスリン不足に陥る疾患を言う。また、糖尿病が重症化し、インスリン抵抗性が亢進し、膵臓β細胞が疲弊し、アポトーシスが起こり始めると、２型糖尿病から結果として、１型糖尿病に推移して来ることになる。１型糖尿病の発症にはＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれもが寄与し、最終的にＣＤ８陽性Ｔ細胞が膵臓β細胞を破壊することによりインスリンの欠乏が惹起される。従って、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の活性化抑制作用を持つ、本発明のｓｉＲＮＡは、１型糖尿病の予防と治療に好適なものである。
本発明の医薬組成物により、自己免疫疾患を治療する際には、上記の機能性核酸と共に、通常の製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて医薬組成物を製造して投与することが好ましい。本発明の医薬組成物の投与方法は非経口投与が望ましく、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。
本発明の機能性核酸の投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば非経口投与する場合は、自己免疫疾患の患者（６０ｋｇ）に対して、例えば、一日約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射することができる。
【実施例】
【００１０】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。
（実施例１）ＣＤ９８重鎖の発現抑制用のｓｉＲＮＡによる１型糖尿病の進行抑制試験
１）実験材料：
ａ）動物：
１型糖尿病モデルマウス（ＮＯＤマウス）：ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、日本ＳＬＣ社（浜松、日本）から購入した。すべてのマウスは徳島大学の動物センター内で無菌条件下で飼育され、すべての実験は動物の管理と利用のガイドラインに則って実施された。
ＮＯＤマウスの糖尿病発症状況は、このマウスの尿中の糖濃度と空腹時の血糖値を一週間毎に測定してモニターした。２５０ｍｇ／ｄｌ以上の血中濃度を持つマウスが糖尿病であるとした。ＮＯＤの雌性マウスが２０〜２５週令になると８０％以上の割合で、１型糖尿病になる。
ｂ）フローサイトメトリー：
脾臓、膵臓リンパ節、膵臓から得られるリンパ球は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲＶα２とＴＣＲＶβ５に対する蛍光色素の結合抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＵＡＳ）で染色された。幾つかの実験では、細胞をメモンシンの存在下、２５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（シグマ社）と１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（シグマ社）で５時間刺激し、ＣＤ４又はＣＤ８用の表面染色をした。更に、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１７用の細胞内染色をした。７−アミノアクチノマイシンＤ（シグマ社）は、死細胞を除くために使用された。
実験操作は、マニュアルに則って実施した。データは、ＦＡＣＳのコントロール下で集計され、ＦｌｏｗＪｏソフト（スリースター、米国）を使用して行った。
ｃ）マウスｓｉＲＮＡ：
ＣＤ９８重鎖の発現抑制用の下記表１の３種のマウスｓｉＲＮＡの混合物、又は標的遺伝子を持たないコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社）を作製し、使用した。
【表１】
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２）方法：
上記ＣＤ９８重鎖の発現抑制用の３種のｓｉＲＮＡの混合物、又は標的遺伝子を持たないコントロールのｓｉＲＮＡとアテロコラーゲン（高研、日本）とを実験手順書に従い混合し、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。
糖尿病ＮＯＤマウスのＴ細胞が投与された重症複合型免疫不全症モデルマウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス）に、上記ｓｉＲＮＡ溶液を４ｎｍｏｌ／マウスになるように腹腔内投与した。ｓｉＲＮＡの投与スケジュールは、２日目、５日目と８日目である。なお、Ｔ細胞が投与された日を起算日とする。上記ｓｉＲＮＡ溶液の投与後３日目に、血液を採取し、白血球を単離して、抗マウスＣＤ９８抗体で染色して、フローサイトメトリーで評価した。
３）結果：
フローサイトメトリーでの評価結果を図１に示す。灰色（ＧＲＡＹ）の部分は、ＣＤ９８抗体を投与した場合の測定結果である。点線部分は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果であり、実線部分は、ＣＤ９８重鎖に対するｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果を示している。
統計解析として、すべての実験において群間の有意差は、マン−ホワイトニイ  Ｕテストを用いて計算された。差がｐ＜０．０５の場合に有意差があると考えられる。
また、上記の１型糖尿病モデルマウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス）にＣＤ９８重鎖のｓｉＲＮＡを投与した結果を図２に示す。図２に示されるように、このマウスの１型糖尿病の進行をｓｉＲＮＡの投与で抑制できることが分かった。この結果は、ＣＤ９８が１型糖尿病の進展に極めて重大な役割を果していることを示すと共に、ＣＤ９８重鎖をターゲットとするｓｉＲＮＡを用いた治療が、１型糖尿病や他のＴ細胞に起因する自己免疫疾患の予防と治療に非常に有効であることを示している。
（実施例２）ＣＤ９８重鎖の発現抑制用のｓｉＲＮＡによる関節リウマチの進行抑制試験
１）実験材料：
リウマチ・モデルマウス（コラーゲン誘導性関節炎モデルマウス）の作製：
ＤＢＡ／１Ｊマウス（７週齢の雌、１０匹）のそれぞれ２群に分け、牛コラーゲンＩＩと完全アジュバントを混合乳化させたエマルジョン投与を投与した。更に、２６日目に２回目の牛コラーゲンＩＩを投与し、関節炎の発症を観察評価した。
図３では、その臨床スコアの平均±標準偏差で表している。横軸は二回目のコラーゲン免疫後からの日数を表している。
２）方法：
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雌性）にＩＩ型コラーゲンを投与した日を起算日として、実施例１に記載の３種のｓｉＲＮＡ混合溶液を４ｎｍｏｌ／マウスになるように腹腔内投与した。ｓｉＲＮＡの投与スケジュールは、０日目、１日目、２日目、３日目と４日目である。
なお、ｓｉＲＮＡ混合溶液は、実施例１に記載のようにｓｉＲＮＡをアテロコラーゲンと用事調整で混合し、作製後直ちにマウスに投与した。
３）結果：
上記のリウマチモデルマウス（ＤＢＡ／１Ｊマウス）にＣＤ９８重鎖のｓｉＲＮＡを投与したところ、図３に示すように、リウマチの進行を抑制できることが分かった。このように、ＣＤ９８が１型糖尿病の進展に極めて重大な役割を果していることを示すと共に、ＣＤ９８重鎖をターゲットとするｓｉＲＮＡを用いた治療が、自己免疫疾患（リウマチ）の予防と治療に非常に有効であることを示している。
（実施例３）ＣＤ９８重鎖の発現抑制用のｓｉＲＮＡによるヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）のＣＤ９８発現進行抑制試験
１）実験材料：
・Ｊｕｒｋａｔ細胞：  ヒトＣＤ９８タンパクを高発現するＪｕｒｋａｔ細胞をＡＴＣＣから購入した。
・トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ８）：非リポソーム系トランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ８をロシュ・アプライド・サイエンス社から購入した。
・ヒトｓｉＲＮＡ：
ＣＤ９８重鎖の発現抑制用の下記表２の３種のヒトｓｉＲＮＡの混合物のｓｉＲＮＡを作製（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ社に依頼）し、使用した。
【表２】
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２）方法：
Ｊｕｒｋａｔ細胞にＣＤ９８に対して上記ヒトｓｉＲＮＡを使用し、Ｆｕｇｅｎｅ８をつかって遺伝子導入し、２日後に細胞表面上のＣＤ９８発現をＦＩＴＣ標識したヒトＣＤ９８抗体を用いて、フローサイトメーターで測定し、非処理を１００としたときの発現量を測定した。
３）結果：
Ｊｕｒｋａｔ細胞表面におけるＣＤ９８発現の比率をフローサイトメーターにより測定、評価し、その結果を図４に示す。図４に示されるように、コントロールｓｉＲＮＡ投与群では、ＣＤ９８のタンパク発現は非処理群と同じであった。しかし、ヒトｓｉＲＮＡの投与群では、ＣＤ９８のタンパク発現が約７５％抑制された。このことから、これらの３種のヒトｓｉＲＮＡを使用して、１型糖尿病や他のＴ細胞に起因する自己免疫疾患の予防と治療ができることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の自己免疫疾患の予防・治療用医薬組成物は、ｓｉＲＮＡによるＣＤ９８の発現抑制という新たな作用機序により、自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病や関節リウマチでなど）を予防・治療し得るものである。本発明の医薬組成物を用いることにより、これまで適切な治療方法がなかった、自己免疫疾患の治療方法に新たな道を開くものとなっている。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月6日(2013.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分として含むことを特徴とする自己免疫疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２】
上記機能性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記自己免疫疾患が１型糖尿病又は関節リウマチである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記ｓｉＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記自己免疫疾患が１型糖尿病であり、１型糖尿病の進行を３０日間抑制できる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記自己免疫疾患が関節リウマチであり、関節リウマチの進行を３０日間抑制できる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項９】
配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
哺乳類に、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
【請求項１２】
上記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項１１記載の治療方法。
【請求項１３】
上記ｓｉＲＮＡが、請求項９または１０の二本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１４】
上記自己免疫疾患が、１型糖尿病又は関節リウマチである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の治療方法。
【国際調査報告】
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