(57)【要約】ワスレグサ属植物の抽出物を有効成分として含む抗うつ様作用又は睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物の提供。  ワスレグサ属植物の熱水抽出物を有効成分として含む抗うつ様作用又は睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
2009145363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワスレグサ属植物の熱水抽出物を有効成分として含む抗うつ様作用を有する組成物。
【請求項２】
ワスレグサ属植物がアキノワスレグサである請求項１記載の抗うつ様作用を有する組成物。
【請求項３】
熱水抽出物がワスレグサ属植物の葉の熱水抽出物である請求項１又は２に記載の抗うつ様作用を有する組成物。
【請求項４】
飲食品である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗うつ様作用を有する組成物。
【請求項５】
うつ症状を軽減するために用いられるものである旨の表示を付した請求項４記載の抗うつ様作用を有する組成物。
【請求項６】
ワスレグサ属植物の熱水抽出物を有効成分として含む睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
【請求項７】
ワスレグサ属植物がアキノワスレグサである請求項６記載の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
【請求項８】
熱水抽出物がワスレグサ属植物の葉の熱水抽出物である請求項６又は７に記載の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
【請求項９】
飲食品である請求項６〜８のいずれか１項に記載の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
【請求項１０】
疲労を回復するために用いられるものである旨の表示を付した請求項９記載の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
【請求項１１】
ワスレグサ属植物より、抗うつ様作用及び睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物を製造する方法であって、
乾燥させたワスレグサ属植物を６０〜１００℃の水で３０〜９０分間熱し、得られた抽出物をろ過し、次いで乾燥させたワスレグサ属植物１ｇ当たり０．５〜２ｍｌに濃縮することを含む、方法。
【請求項１２】
さらに、ろ過した抽出物１容に対して、水溶性の有機溶剤１〜３容を、添加したときの有機溶剤濃度が５５〜９０％になるように添加し、ろ過し、次いで乾燥させたワスレグサ属植物１ｇ当たり０．５〜２ｍｌに濃縮することを含む、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワスレグサ属植物の抽出物を有効成分として含む抗うつ様作用又は睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アキノワスレグサは亜熱帯地域に、日本国では沖縄県等に自生するユリ科ユリ目ワスレグサ属に属する植物であり、沖縄県ではクワンソウとも呼ばれる。アキノワスレグサは伝承的に不眠症、興奮、いらいら、黄疽、乳瘍、腫痛等に効果があり、補血剤、強壮薬としての効果があると言われていた。例えば、アキノワスレグサの全草の発酵処理物が睡眠時間を延長させる効果があることが報告され（特許文献１を参照）、またアキノワスレグサの花、葉の白い部分（茎）、根の乾燥粉末や抽出物に深夜の覚醒の回数を減少させ中途覚醒に効果があることが報告されていたが、睡眠の質を改善したと証明できる十分な実験データはなかった（特許文献２を参照）。
また、アキノワスレグサの抽出物が肝臓障害抑制剤として用い得ることが報告されていた（特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−６２９９８号公報
【特許文献２】特開２００７−６８０４号公報
【特許文献３】特開２００１−１０９６８号公報
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、ワスレグサ属植物の抽出物を有効成分として含む抗うつ様作用又は睡眠改善後の疲労回復作用を有する組成物の提供を目的とする。
アキノワスレグサが不眠症等に効果があることが伝承的に言われていたが、その効果は実証されていなかった。また、アキノワスレグサの葉は硬く食用に向かないこと、葉の白い部分（茎）にえぐみがあること、葉の白い部分（茎）を食べると人によりお腹がゆるくなること、根は睡眠効果と相反する強壮作用も示すこと、アキノワスレグサの花、葉、葉の白味の部分（茎）、根の有効成分含有量が季節や日照時間、栽培環境に変動することが知られていた。
本発明者等は、アキノワスレグサのどの部分に存在するいかなる有効成分がどのような効果を有するか、アキノワスレグサの上記の好ましくない作用を持つ成分や不純物を除き、季節性や栽培地域性に関係なく有効成分を一定に高度に品質管理することを可能にし、食品や食品素材として加工し易い形状にする方法について包括的に鋭意検討を行った。
その結果、地上部、主に葉と葉の白味部分から熱水抽出により得られる抽出物中の成分、すなわち熱に安定な水溶性で有機溶剤により変性しない成分が有効成分であること、濃縮抽出により、弱酸性の芳香性抽出液を得れ、その中にアキノワスレグサの葉を主体とする熱水抽出物が抗うつ様効果を有すること、睡眠の質を高めることによる疲労回復効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  ワスレグサ属植物の熱水抽出物を有効成分として含む抗うつ様作用を有する組成物。
［２］  ワスレグサ属植物がアキノワスレグサである［１］の抗うつ様作用を有する組成物。
［３］  熱水抽出物がワスレグサ属植物の葉の熱水抽出物である［１］又は［２］の抗うつ様作用を有する組成物。
［４］  飲食品である［１］〜［３］のいずれかの抗うつ様作用を有する組成物。
［５］  うつ症状を軽減するために用いられるものである旨の表示を付した［４］の抗うつ様作用を有する組成物。
［６］  ワスレグサ属植物の熱水抽出物を有効成分として含む睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
［７］  ワスレグサ属植物がアキノワスレグサである［６］の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
［８］  熱水抽出物がワスレグサ属植物の葉の熱水抽出物である［６］又は［７］の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
［９］  飲食品である［６］〜［８］のいずれかの睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
［１０］  疲労を回復するために用いられるものである旨の表示を付した［９］の睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物。
［１１］  ワスレグサ属植物より、抗うつ様作用及び睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物を製造する方法であって、
乾燥させたワスレグサ属植物を６０〜１００℃の水で３０〜９０分間熱し、得られた抽出物をろ過し、次いで乾燥させたワスレグサ属植物１ｇ当たり０．５〜２ｍｌに濃縮することを含む、方法。
［１２］  さらに、ろ過した抽出物１容に対して、水溶性の有機溶剤１〜３容を、添加したときの有機溶剤濃度が５５〜９０％になるように添加し、ろ過し、次いで乾燥させたワスレグサ属植物１ｇ当たり０．５〜２ｍｌに濃縮することを含む、［１１］の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−１４３４７１号および２００９−０３５７４６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、アキノワスレグサの熱水抽出物の官能試験の結果を示す図である。
図２は、アキノワスレグサの熱水抽出物の鎮静効果を示す図である。
図３は、アキノワスレグサの熱水抽出物の他のサプリメントとの鎮静効果の比較を示す図である。
図４は、アキノワスレグサの熱水抽出物の鎮静効果と安全性を示す図である。
図５は、アキノワスレグサの熱水抽出物の抗うつ様作用を示す図である。
図６は、アキノワスレグサの熱水抽出物の睡眠改善作用（睡眠量）を示す図である。
図７は、アキノワスレグサの熱水抽出物の睡眠改善作用（脳波の出現頻度）を示す図である。
図８は、アキノワスレグサの熱水抽出物の末梢効果を示す図である。
図９は、アキノワスレグサの熱水抽出物の睡眠改善による疲労回復作用を示す図である。
図１０は、アキノワスレグサ熱水抽出物含有ゼリー摂食者のピッツバーグ睡眠質問票への回答結果を示す図である。
図１１は、ピッツバーグ睡眠質問票の中で回答された過去１ヶ月間における１日あたりの平均的な睡眠時間を示す図である。
図１２は、眠気に関する質問の回答結果を示す図である。
図１３は、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物の脳波への影響（被験体１）を示す図である。
図１４は、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物の脳波への影響（被験体２）を示す図である。
図１５は、抗うつ様効果の判定方法を示す図である。
図１６は、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物及び他の試験物質の抗うつ様効果を示す図である。
図１７は、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物及び他の試験物質の抗うつ様効果を示す図である。
図１８は、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物及び他の試験物質の深部体温への影響を示す図である。
図１９は、アキノワスレグサ熱水抽出物と他の睡眠改善・抗不安・抗鬱関連物質の特徴を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
ユリ目ユリ科ワスレグサ属（キスゲ属）に属する植物の熱水抽出物を用いる。前記植物としては、アキノワスレグサ（Ｈｏｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．ｖａｒ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ  Ｍ．Ｈｏｔｔａ又はＨｏｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ  Ａｒａｋｉ）、ホンカンゾウ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．ｖａｒ．ｆｕｌｖａ）、ノカンゾウ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｔｕｂａ  Ｍａｘｉｍ又はＨｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｌｏｎｇｉｔｕｂａ  Ｍｉｑ．）、ヤブカンゾウ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．ｖａｒ．ｋｗａｎｓｏ  Ｒｅｇａｌ）等が挙げられ、この中でも日本国沖縄県に自生するアキノワスレグサ（クワンソウ）が好ましい。熱水抽出物は、全草からの抽出物でもよく、葉、茎、根等の植物の部分の抽出物でもよい。この中でも葉が好ましい。また、葉には葉の白い部位も含まれる。
本発明の熱水抽出物は、以下の方法で得ることができる。
（１）  植物を乾燥させる。乾燥は天日干しでもよいし、乾燥機で４０〜１２０℃で乾燥させてもよい。
（２）  乾燥させた植物を用いて熱水を用いて抽出を行う。抽出は６０〜１００℃で、抽出時間は２０〜９０分間である。この際、植物の乾燥物の重量当り１〜５％になるように水を用いる。抽出に用いる水はミネラル成分を調整した軟水や脱イオン水等を用いることが好ましい。熱水抽出により濃い茶緑色を呈し濁りのある中性の抽出物が得られる。濁りのある熱水抽出物を粒子の大きさの違いや重力の差を利用して１００メッシュ以上または数十マイクロメータ以上の大きさの固形物を除く。遠心分離は百〜数千ｘｇで数分〜数十分行えばよい。これを中性熱水抽出粗精製物という。
（３）  次いで、（２）で得られた中性熱水抽出粗精製物を水溶性の有機溶剤で処理する。水溶性の有機溶剤としてエタノール、アセトン、メタノール等を用いることができるが、エタノールが好ましい。用いる水溶性の有機溶剤の濃度は、（２）で得られた中性熱水抽出粗精製物に対して３０〜９０％（ｖ／ｖ）である。水溶性の有機溶剤処理の際、中性熱水抽出粗生成物に水溶性有機溶剤を一度に添加し、５〜６０分攪拌することが好ましい。攪拌後６〜２４時間低温〜室温で静置する。水溶性有機溶剤処理と温度処理により、中性熱水抽出物粗生成物中の高分子が凝固沈殿する。次いで、水溶性の有機溶剤処理物中の凝固沈殿物をろ過又は遠心分離により除去する。ろ過は、例えば布や専用カートリッジを用いてろ過する。遠心分離は数百〜数万ｘｇで数分〜数十分行えばよい。ろ過又は遠心分離操作により透明度の高い芳香性のある弱酸性の紅茶色〜濃いオレンジ系茶色の液体が得られる。これを上清という。
（４）  次いで、凝固物を除いた上清中の水溶性有機溶剤を除去し、抽出物を濃縮する。この際、減圧エバポレーター等を用いて行えばよい。濃縮後、メンブレンフィルターを用いてろ過滅菌を行い、最終弱酸性熱水抽出物を得ることができる。
熱水抽出により、有効成分を抽出することができ、植物の高分子構造化合物やクロロフィル等の植物色素が除去することができ、抽出物のえぐみや苦味を除去することができる。
（５）  （２）で得られた中性熱水抽出粗精製物を、２次遠心分離と２次ろ過により透明度の高い芳香性のある弱酸性の紅茶色〜濃いオレンジ系茶色の液体を得ることもできる。ろ過は、例えば専用カートリッジや数〜数十ミクロンサイズの専用ろ紙を用いてろ過する。遠心分離は数百〜数千ｘｇで数分〜数十分行えばよい。次いで、この水溶液を加熱濃縮する。この際、温度は６０〜９０℃で、数時間行う。加熱濃縮操作により透明度のある芳香性のある弱酸性のオレンジ系茶色〜紅茶色の濃い液体である最終弱酸性熱水抽出物が得られる。
本発明のアキノワスレグサの葉や葉の根元の白味の部分の弱酸性熱水抽出物等のワスレグサ属植物の弱酸性熱水抽出物には、熱に安定な水溶性の有機溶剤で変性しない有効成分が含まれている。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、抗うつ様作用を有し、うつ様症状やうつ的症状の予防又は治療に有用である。本発明にいう「抗うつ様作用を有する」とは、うつ様症状を軽減、改善又は予防することをいい、組成物が「抗うつ様作用を有する」効果を示すかどうかは、自覚症状と医師の診断等により判断できる。また、マウスを用いた水迷路試験により確認することができる。抗うつ様効果を有し、一般大衆薬としての抗うつ剤、あるいはストレス緩和、抗うつ様効果を有する食品、飲料等として用いることができる。
うつ病については種々の分類方法が提案されているが、本発明においては、うつ病は、例えば、世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）が発表している「国際疾病分類・第１０版」（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｎｊｕｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅａｔｈ．１０ｔｈ  ｖｅｒｓｉｏｎ；ＩＣＤ−１０）において「うつ病」関連障害と分類されている疾患、又は米国精神医学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＡＰＡ）の「精神障害の診断と統計分類のための手引き」（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ＤＳＭ）のＤＳＭ−ＩＶによる多軸診断によって評価される「うつ病」をいう。
また、本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、睡眠改善効果を有し、睡眠改善剤、睡眠改善効果を有する食品、飲料等として用いることができる。
睡眠改善とは、不眠あるいは不眠症の改善をいう。不眠症は睡眠障害の１つであり、なかなか寝付けないことを特徴とする入眠障害、夜中に何度も目が覚めることを特徴とする中途覚醒、早く目覚めてその後眠れなくなることを特徴とする早期覚醒、充分な睡眠時間の確保にかかわらず熟睡感を得られないことを特徴とする熟睡感不足の４症状がある。睡眠障害には一般的にニトラゼパム等のベンゾジアゼピン系の睡眠薬が用いられる。ベンゾジアゼピン系睡眠薬を服用時は入眠を促進させるが、睡眠中の脳波周波数の出現頻度を調べると、０．７５〜４Ｈｚのデルタ帯域を示す深いノンレム睡眠の減少、６〜９Ｈｚのシータ帯域を示すレム睡眠の減少、さらに、１５Ｈｚ〜２０Ｈｚにピークを持つ覚醒状態に似た異常な速波が出現するという特徴を有し（菅野道、渡辺洋文、渕野和子他、帝京医学雑誌、ｖｏｌ．６，ｐｐ３１１−３２０，１９８３；川崎博己、高橋浩一朗：日薬理誌（Ｆｏｌｉａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊａｐｏｎ．）Ｖｏｌ．９８，ｐｐ２５９−２７２，１９９１）。これは睡眠の質の低下を意味する。
本発明のワスレグサ属植物の弱酸性熱水抽出物が脳の疲労回復効果を有するかどうかは、例えば、前記弱酸性熱水抽出物を動物に投与した後、睡眠時の出現脳波の帯域と出現頻度（量）を解析することにより確認することができる。脳神経の疲労回復に熟睡睡眠の確保が有効である。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、睡眠前に摂取すると鎮静効果と末梢血管拡張作用による深部体温低下を起こして入眠を促進し、脳では入眠時のノンレム睡眠のデルタ帯域に見られる脳波を増加させ、熟睡時間帯に見られる１１〜１４Ｈｚのシグマ帯域を示す浅いノンレム睡眠を減少させ、深い睡眠を持続させる効果を有する。また、その後ノンレム睡眠だけでなくレム睡眠をともに増加させ中途覚醒を抑制する。また、睡眠時間が延長される。さらに、起床時の疲労感を低下させ、さらに起床後の日中の眠気が緩和される。
アキノワスレグサ植物の熱水抽出物の睡眠に関する上記効果を睡眠改善効果という。
さらに、本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、睡眠改善による疲労回復効果を有し、疲労回復剤、疲労回復効果を有する食品、飲料等として用いることができる。ここで、疲労とは、激しい運動等によって誘発される生理的変化であって、通常の行動が維持されない状態、あるいは栄養状態の改善や安静・睡眠によって回復する状態をいう。本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、これらの疲労の回復に効果がある。また、疲労には、中枢性疲労と末梢性疲労がある。中枢性疲労は、脳神経系の精神的な疲労で、主にストレスなどによって生じる。一方、末梢性疲労は、筋運動を行うことによって生じる疲労で、エネルギーの枯渇、疲労物質の蓄積、内部環境の失調が主原因と考えられている。
本発明において「疲労」とは、「激しい運動等によって誘発される生理的変化であって、通常の行動が維持されない状態」あるいは「栄養状態の改善や安静・睡眠によって回復する状態」をいう。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物が睡眠改善による疲労回復効果を有するかどうかは、本願発明者が新たに開発した実施例４に記載の評価方法により確認することができる。
本発明の「疲労回復作用（効果）」は、強制水泳処置（Ｐｏｒｓｏｌｔ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２６６，７３０−７３２，１９７７）により誘発される身体的疲労に対する効果として示される。強制水泳処置は、うつ的な状態の誘発手段として認知されており、そのうつ的な状態は、強制水泳場面での不動反応の持続時間延長によって定義される。抗うつ様作用（効果）は、不動反応の持続時間の短縮によって判定される。しかしながら、強制水泳処置は、うつ的な反応、即ち、精神的な疲労に類する反応以外にも、身体的な疲労、即ち、激しい運動（水泳）によるエネルギー消費を伴った生理的変化をも誘発すると考えられる。この身体的な疲労は、暗期（マウスの活動期）における自発活動性の低下として表出する。この自発活動性の低下は、抗うつ処置によって改善されないため、うつ的な反応とは区別される。一方、睡眠を誘発するジアゼパムによって緩和され、逆に、覚醒を誘発するカフェインによって影響を受けないことから、睡眠によって改善され、覚醒によって影響を受けない状態、即ち、疲労が誘発されていると考えられる。本発明のアキノワスレグサの熱水抽出物は、ジアゼパムと同様、強制水泳処置誘発性の自発活動性低下を緩和する。但し、ジアゼパムは抗うつ様作用（効果）を持たないため、両者の効果は同一ではない。アキノワスレグサの熱水抽出物は、強制水泳処置によって誘発されるうつ的な状態をも緩和する。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物が睡眠改善による疲労回復効果を有するかどうかは、例えば、前記熱水抽出物を動物に投与した後、睡眠時の脳波を解析することにより確認することができる。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物を含む、抗うつ様作用を有する組成物、睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物又は睡眠改善作用を有する組成物は、ヒトを含む哺乳動物を対象とする。ヒト以外の哺乳動物としては、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ等が挙げられる。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物を含む、抗うつ様作用を有する組成物、睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物又は睡眠改善作用を有する組成物は、抗うつ剤、睡眠改善による疲労回復剤、睡眠改善剤である医薬組成物として用いることができる。該組成物は、経口で投与してもよく、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。該抗うつ様作用を有する組成物、睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物又は睡眠改善作用を有する組成物は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤等を含んでいても良い。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などがそれぞれあげられる。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などがそれぞれあげられる。また、上記注射剤は、必要により緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定化剤などを添加して製造することができる。経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口剤としては、直腸投与剤、油脂性座剤、水性座剤、経皮クリーム剤、経皮軟膏剤などがあげられる。本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、その剤型に応じて異なるが、通常全組成物中ワスレグサ属植物の熱水抽出物が０．１〜５０重量％、好ましくはワスレグサ属植物の熱水抽出物中の有効成分が０．１〜２０重量％程度である。投与量は患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定され、１日１回又は数回に分けて投与する。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、食品又は飲料品に混合し飲食品組成物として使用することができる。この際、食品又は飲料品の１回の摂取分量に対して本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物の含有量が乾燥葉１〜４ｇ重量相当の量となるように配合すればよい。本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、粉末、顆粒状、液状、ペースト状などの食品用又は飲料品用組成物として用いることもできる。食品及び飲料品としては、清涼飲料、乳酸飲料、嗜好飲料、コーヒー、緑茶、紅茶、ウーロン茶などの飲料品；キャンディー、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類などの菓子類；果実飲料、野菜飲料、ジャム類、ペースト類などの野菜・果実加工品；日本酒、焼酎、ワイン、中国酒、ウイスキー、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム、酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなどのアルコ−ル飲料；ヨーグルト、アイスクリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳のなどの乳製品；ドレッシング、マヨネーズ、てんぷら油、サラダ油などの油脂加工品；しょうゆ、ソース、酢、みりん、ドレッシングタイプ調味料などの調味料；粉末ジュース、粉末スープ、インスタントコーヒー、即席麺類、即席カレー、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなどの乾燥飲食品、小麦粉加工品、でんぷん類加工品などの穀物加工品等が挙げられる。また、健康食品として熱水抽出物それ自体、又は他の有用成分と混合した錠剤や顆粒として利用することもできる。さらに、本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物を食品や飲料品の原料として用いることもできる。
食品又は飲料品は、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。これらの食品又は飲料品には、例えば、ストレスを緩和するために用いられるものである旨の表示、イライラを緩和するために用いられるものである旨の表示、うつ症状を軽減するために用いられるものである旨の表示、沈んでいる気分を改善するために用いられるものである旨の表示、疲労を回復するために用いられるものである旨の表示、睡眠を改善させるために用いられるものである旨の表示、寝不足を解消するために用いられるものである旨の表示、睡眠のリズムを整えるためのものである旨の表示、朝の目覚めをすっきりとさせるためのものである旨の表示、睡眠時間を延長させるためのものである旨の表示、起床時の疲労感を低下させるものである旨の表示、日中の眠気を緩和させるものである旨の表示、毎日の生活リズムを整えるためのものである旨の表示などの表示が付されていてもよい。
さらに、本発明は被験物質の疲労回復効果を評価する方法を包含する。ここで、疲労回復効果は、睡眠改善による疲労回復を含む。
従来より、種々の薬の効果の評価に実験動物が用いられていた。例えば、抗うつ薬のスクリーニングに、強制水泳試験が用いられており、例えばＰｏｒｓｏｌｔ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２６６，７３０−７３２，１９７７に記載の方法が知られている。しかしながら、従来は薬の疲労回復効果を評価する方法は知られていなかった。本発明者は新たに睡眠改善による疲労回復効果を評価する方法を確立した。
該方法に用いる動物は、マウス、ラット等のげっ歯類の実験動物が好ましく、特にマウスが好ましい。該方法においては、最初に動物を１２−１２時間の明−暗サイクル条件下に馴化させる。次いで、該動物を明期に１５分以上、好ましくは１５分〜１時間、さらに好ましくは１５分〜３０分強制水泳させる。この際、強制水泳は暗期開始６〜８時間前から開始するのが好ましい。その後、被験物質を投与し、その後の暗期における自発活動量を測定する。
強制水泳の際の水温は、２０〜３０℃、好ましくは２２〜２７℃、さらに好ましくは２４℃±１℃である。この際、水泳を行わせる水槽は遮光及び防音が可能な実験チャンバーに入れ、事件は遮光及び防音条件で行うのが好ましい。強制水泳とは、水槽内で動物が逃避不可能な条件下で強制的に水泳を行わせることをいう。この際、コントロールとしては水の入っていない水槽に、強制水泳と同じ時間、動物を放置すればよい。
強制水泳後の疲労回復効果を評価しようとする被験物質の投与は、経口投与又は静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射等の非経口投与により行なえばよい。投与量は、被験物質により適宜決定すればよい。この際、コントロールとして水、生理食塩水等を投与すればよい。
自発活動量とは、動物の自発的な運動の量をいい、例えば立ち上がりや位置移動が含まれる。自発運動量の測定は、例えば動物の立ち上がり回数や位置移動回数により測定することができる。自発活動量は、赤外線を利用した自動測定システム等を用いて測定することができる。このようなシステムとして例えばスーパーメックス（室町機械株式会社）等がある。自発活動量は暗期の間に測定し、例えば１２時間の暗期の間連続して測定すればよい。
自発活動量は、例えば１時間ごとの平均を計測し、解析することができる。
自発活動量がコントロールに比較して有意に多い場合、被験物質は疲労回復効果があると判断することができる。
すなわち、本発明は、被験物質の疲労回復効果を評価する方法であり、１２−１２時間の明−暗サイクル条件下に馴化させた動物を明期に１５分以上の強制水泳させた後に、被験物質を投与し、その後の暗期における自発活動量を測定することを含む方法である。
また、本発明は暗期開始６〜８時間前に強制水泳をさせる上記方法である。
また、本発明は、疲労回復効果が睡眠改善による疲労回復効果である上記方法である。
また、本発明は、自発活動量が運動量である上記方法である。
さらに、本発明は動物がマウスである上記方法である。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
アキノワスレグサ熱水抽出物の作製及び評価
１．有機溶剤を用いての抽出
（１）熱水抽出
アキノワスレグサの乾燥葉１２０ｇをステンレス鍋に入れ、イオン交換水１６００ｍｌを加え、９２℃で加熱した。この際の溶質率（乾燥葉／イオン還元水体積×１００）は７．５％であり、乾燥葉とイオン交換水の重量比は、３：４０であった。
液量が半減したところで、１２メッシュのステンレス製のザルで１次ろ過した、次いで５０メッシュの木綿布１枚を用いて２次ろ過した。２回のろ過後の液量は３００ｍｌであり、ろ過液の色は濃い茶緑色であった。ろ過液を粗精製水溶液とした。
（２）有機溶媒抽出
（１）で得られた粗精製水溶液３００ｍｌに６０％エタノール４５０ｍｌを添加し、５分間攪拌した。攪拌は、容器としてコニカルチューブを用いた場合、チューブの上下反転を繰り返すことにより行い、ビーカーを用いた場合ガラス攪拌棒でゆっくりとかき混ぜた。攪拌後、室温で６時間静置した。次いで、溶液を５０メッシュの木綿布２枚を用い、ろ過し、凝固物を除去した。ろ過液は透明度のある濃いオレンジ色を呈していた。
ろ過上清を減圧エバポレーターで体積が３００ｍｌになるまで濃縮し、エタノールを除去した。脱イオン水を３０〜１００ｍｌ添加し、さらに減圧エバポレーターでの濃縮を２回繰り返し、エタノールを除去した。
ろ紙（ｗｈａｔｍａｎろ紙Ｇｒａｄｅ３）でろ過し、上清をフィルターＢＴＦ０．２２μｍを用いて滅菌ろ過した。
得られたろ過物をアキノワスレグサ熱水抽出物とした。
２．  有機溶剤を用いない大量抽出
アキノワスレグサの乾燥葉７ｋｇを容器に入れ、イオン交換水を２５０ｋｇ加え、８０〜９０℃で６０分間加熱した。抽出液をステンレスろ過器でろ過し、さらに５０メッシュの布でろ過し、ろ液を７２００ｒｐｍで５〜２０分遠心分離を行い、１０μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過した。さらに、２μｍの６層ろ過機（内外醸機工業株式会社）でろ過後、再び加熱濃縮し、最終的に１４ｋｇの熱水抽出物が得られた。
３．官能試験
得られた抽出物（粗精製水溶液、有機溶媒を用いた抽出した熱水抽出物及び有機溶媒を用いず（非有機溶媒）抽出した熱水抽出物）について、官能試験を行なった。
試験項目は、色、匂い、透明度、味、甘味、旨み、酸味、えぐみであった。また、同じ効果を得るための摂取量を算出し、ｐＨ測定した。
結果を図１に示す。
【実施例２】
【０００８】
アキノワスレグサ熱水抽出物の鎮静効果
自発活動量測定システムを用いて、Ａｋｉｎｏ（アキノワスレグサより抽出した水溶性成分）がマウスの自発活動量の日内変動に及ぼす効果について検討した。実験経験のない雄性ｄｄＹマウス２４匹を、１２−１２時間の明−暗サイクルが設定された恒温・恒湿状態の動物飼育室内で飼育し、飼育環境へ十分に馴致させた後に被験体とした。実験開始時、マウスは１０−１６週齢で、平均体重は４４．０ｇ（ＳＤ＝３．９２）であった。被験体を、体重と週齢の平均値がほぼ等しい１２匹ずつ２群に分け、一方をＡｋｉｎｏ群、他方をＶｅｈｉｃｌｅ群とした。暗期開始７時間前に、Ａｋｉｎｏ群にはＡｋｉｎｏを、Ｖｅｈｉｃｌｅ群には蒸留水を、胃ゾンデを用いて、体重１ｋｇあたり溶液１０ｍｌの割合で経口投与した。その後、被験体をアクリル製飼育ケージ（縦２０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ１２ｃｍ）へ入れて約１時間放置した後、暗期開始６時間前より自発活動量を４８時間連続で測定した。飼育ケージは予め滅菌処理し、床敷き、エサ、給水ボトル等は全て新しく準備したものを用いた。自発活動量の測定は、スーパーメックスセンサを利用した室町機械株式会社製の実験動物運動量測定システムおよび専用ソフトウェア（ＣｏｍｐＡＣＴ  ＡＭＳ  ｖｅｒ．３）を用いて行った。飼育ケージを格納するチャンバー内は、動物飼育室内の明−暗サイクルと同期するように設定されていた。飼育ケージには、給水管が取り付けられており、Ａｋｉｎｏ群の被験体はＡｋｉｎｏを、Ｖｅｈｉｃｌｅ群の被験体は蒸留水を、それぞれ自由に摂取することが可能であった。
自発活動量性の推移を図２に示す。図は、各群における１時間あたりの自発活動量の平均値（±標準誤差）の推移を６時間毎に示したものである。Ａｋｉｎｏ群の自発活動量は、暗期より明期へ移行した直後の６時間、即ち、暗期の前半において、Ｖｅｈｉｃｌｅ群よりも有意に少なかった。その他の測定区画では、有意な群間差は認められなかった。従って、アキノワスレグサより抽出した水溶性成分は、マウスの自発活動量が比較的少ない明期においてのみ、自発活動量を減少させる効果、即ち、鎮静効果を有することが示された。
さらに、アキノワスレグサ熱水抽出物（θ）と他の試験物質（Ｇｌｙ：グリシン、ＧＡＢＡ：γ−アミノ酪酸、Ｔｈｅ：テアニン）の鎮静効果の比較試験を行なった。結果を図３に示す。同じ投与量で比較した場合（例えば、０．８ｇ／ｋｇ，ｐ．ｏ．）、アキノワスレグサ熱水抽出物（θ）はグリシン（Ｇｌｙ）、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）およびテアニン（Ｔｈｅ）と同様の鎮静効果を示した。
【実施例３】
【０００９】
アキノワスレグサ乾燥葉の鎮静効果と安全性
実験経験のない雄性１０−１２週齢のｄｄＹマウスを、１２−１２時間の明−暗サイクルが設定された恒温・恒湿状態の動物飼育室内で飼育し、飼育環境へ十分に馴致させた後に被験体とした。滅菌処理したアクリル製飼育ケージ（縦２０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ１２ｃｍ）に床敷き、エサを入れ、給水ボトルを取り付けた。エサは、アキノワスレグサ乾燥葉粉末を混同した混合エサ（Ａｋｉｎｏ群）とコントロールとして非混合エサ（Ｃｎｔ群）を１週間に１回以上調製し、被験体に与えた。アキノワスレグサ乾燥葉粉末混合エサ中には、マウスの１日の摂食量５ｇ当り有効濃度のアキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物が含まれている。
自発活動量の測定は、スーパーメックスセンサを利用した室町機械株式会社製の実験動物運動量測定システムおよび専用ソフトウェア（ＣｏｍｐＡＣＴ  ＡＭＳ  ｖｅｒ．３）を用いて、６ヶ月間にわたり行った。
一ヶ月後の自発活動量測定の結果を図４に示す。図は２日間の結果で、左から明期の後半（１４−２０時）、暗期の前半（２０−０２時）と後半（０２−０８時）、明期の前半（０８−１４時）ごとの６時間平均積算値（±標準誤差）を示す。
マウスにとって暗期の前半は活動が最も活発な時間帯であり、Ａｋｉｎｏ群とＣｎｔ群ともに自発活動量が多くなっている。Ａｋｉｎｏ群の自発活動量は、Ｃｎｔ群に比べていずれの時間帯も減少していたが、明期の後半（１４−２０時）、暗期の前半（２０−０２時）と後半（０２−０８時）では統計学的に有意な差は認められなかった。このような現象は６ヶ月間投与中にも再現された（図省略）。従って、アキノワスレグサ乾燥葉中に耐性と蓄積性を示す成分組成が含有されていないと考えられる。
一方、明期の前半（０８−１４時）のＡｋｉｎｏ群の自発活動量は、Ｃｎｔ群に比べて統計学的に有意に減少し、マウスが鎮静状態になったことを示した。この有意な減少は次の日にも認められ、さらに６ヶ月間投与中にも再現された。従って、マウスが休息時間帯（明期前半）に入る前に鎮静状態になり、入眠しやすくなっていると考えられる。
これらの結果より、アキノワスレグサ乾燥葉の長期摂取でも、薬剤様耐性と蓄積性が認められず、安全性が高いことが明らかになった。
【実施例４】
【００１０】
アキノワスレグサ熱水抽出物の抗うつ様効果
水迷路学習場面を応用した抗うつ様作用（効果）判定実験を行なった。実験経験のない雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス５０匹を、１２〜１２時間の明−暗サイクルが設定された恒温・恒湿状態の動物飼育室内で飼育し、飼育環境へ十分に馴致させた後に被験体とした。実験開始時、マウスは１０〜１４週齢で、平均体重は２３．７ｇ（ＳＤ＝３．２１）であった。被験体を、体重と週齢の平均値が等しくなるよう、１２又は１３匹の４群に分け、それぞれＯＳ−Ａｋｉｎｏ群、ＯＳ−ＳＳＲＩ群、ＯＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群、およびｎｏＯＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群と命名した。実験装置は、直径１１０ｃｍ、高さ４０ｃｍの白色に塗装された円型プールで、これに深さ２２ｃｍまで水を満たした。水は酸化チタンを添加して白濁させ、水温を２４±１℃に維持した。
実験は、２つのＰｈａｓｅより構成されていた。Ｐｈａｓｅ１では、ＯＳ条件の３群の被験体に対し、オープンスペース水泳処置（ＯＳ）を５日間連続で与えた。即ち、被験体を、１日１回プールの壁際から投入し、５分間水泳させた。Ｐｈａｓｅ２では、プール内に直径１１．５ｃｍの円盤型の逃避台を水面下５ｍｍに設置し、水迷路学習訓練を行った。即ち、１日５回、マウスをプール内へ放ち、逃避台へ到達するまでの時間（逃避潜時）を計測した。マウスが６０秒以内に逃避台へ到達しなかった場合は、これを回収し、逃避潜時は６０秒とした。このような水迷路学習訓練を１０日間連続で行った。Ｐｈａｓｅ２では、毎日、水迷路学習訓練の開始３０分前に、各群の群名の後半に掲げた成分、即ち、Ａｋｉｎｏ（アキノワスレグサより抽出した水溶性成分）、ＳＳＲＩ（マレイン酸フルボキサミン，２５ｍｇ／ｋｇ）、又はＶｅｈｉｃｌｅ（蒸留水）を与えた。Ａｋｉｎｏおよび蒸留水は胃ゾンデを用いて経口投与し、ＳＳＲＩは腹腔内に注射した。投与量は、いずれも体重１ｋｇあたり溶液１０ｍｌの割合とした。
本実施例は、Ｓｕｎ，Ｍ．Ｋ．，＆  Ａｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．（２００３），Ｏｐｅｎ  ｓｐａｃｅ  ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｔｏ  ｉｎｄｅｘ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２６，３５−４０．を参考に行った。
Ｐｈａｓｅ２の結果を図５に示す。図中の値は、各群の各訓練日における平均逃避潜時（±標準誤差）である。ｎｏＯＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、逃避潜時は訓練日の関数として速やかに短縮し、適応的な逃避行動が獲得された。一方、ＯＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、逃避潜時が殆ど短縮せず、明らかな水迷路学習の獲得障害が観察された。これは、Ｐｈａｓｅ１のオープンスペース水泳処置により被験体にうつ的な状態が誘発されたことを示唆しており、動機づけが低下した状態であると解釈される。この解釈は、ＯＳ−ＳＳＲＩ群において良好な学習が生起したことからも支持される。ＯＳ−Ａｋｉｎｏ群の逃避潜時は、Ｐｈａｓｅ２の前半においては、ＯＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群とほぼ同じ程度であったが、中盤以降、徐々に短縮する傾向が現れ、Ｐｈａｓｅ２最終日には、ｎｏＯＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群やＯＳ−ＳＳＲＩ群と遜色ない水準に達した。即ち、アキノワスレグサより抽出した水溶性成分には、ＳＳＲＩに類する抗うつ様作用（効果）があることが証明された。
【実施例５】
【００１１】
アキノワスレグサ熱水抽出物の睡眠改善作用（効果）
あらかじめ雄性成獣Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの首の筋肉に筋電位電極を挿入し、大脳皮質の表面に脳波電極を取り付けたマウスを、１２−１２時間の明−暗サイクル（８：００点灯、２０：００消灯）に設定された恒温・恒湿状態（２５℃、５５％）の防音実験室／箱に入れた。これらの２種類の電極にマウスの行動を制限しない有線ケーブルをつなぎ、数日間馴致させたところで、専用睡眠解析ソフトを用いてマウスの脳波と筋肉の活動記録をリアルタイムで自動収録した。
朝８：００から自動記録を開始し（１日目、基礎睡眠覚醒量の日内変動）、次の日の１０：００に無麻酔下マウスに滅菌水を滅菌したゾンデを介して１回経口投与した（２日目、コントロール実験）。投与量は１匹体重１ｋｇあたり１０ｍＬとした。例えば、マウスの体重が３０ｇの場合、溶媒０．３ｍＬを１回投与分とした。投与後もとのケージに戻し、脳波・筋電位の活動シグナルを記録した。次の日の１０：００に、アキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物（図中、θで示す）を同量経口投与し、脳波・筋電位の活動シグナルを記録し（３日目、サンプル実験）、４８時間後に停止した（４日目、リカバリー実験）。
収録した脳波・筋電位の活動電位はデジタル処理し、４秒間隔でマウスの睡眠ステージの判定を行った。睡眠ステージ判定は、脳波の周波数（Ｈｚ）と振幅幅および筋電位の緊張度の組み合わせで、深いノンレム睡眠（０．７５〜４．０Ｈｚのデルタ帯域）、浅いノンレム睡眠（１１〜１４Ｈｚのシグマ帯域）、レム睡眠（６〜９Ｈｚのシータ帯域）、覚醒（１５〜２５Ｈｚ）の４ステージに分類する。各ステージに相当する脳波の出現頻度（回数）の２時間の積算値を算出し、折れ線グラフに図式化した。
マウスの休息時間帯（８：００〜２０：００）に投与したアキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物（ｎ＝５）は、溶媒投与（ｎ＝５）と比べて、ノンレム睡眠量を増加させ、約３時間持続させた。その後、ノンレム睡眠とレム睡眠の両方の睡眠量を約５時間増加させた（図６）。さらに、アキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物は、投与６〜９時間後のノンレム睡眠深度を維持させた（図７）。
このような増加現象は、マウスの活動時間帯（２０：００〜８：００）に投与しても認められなかった。
次に、アキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物の末梢効果を調べるために、休息時間帯開始２時間後の朝１０時に、アキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物を経口投与（矢印）し、１時間ごとに専用センサーでマウスの直腸温度を測定した。マウスの深部体温に対する直腸温度値はコントロールとの温度差を示す（Ｘ＋ＳＥ，ｎ＝１３；図８）。その結果、アキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物は投与後３０分後から四肢の末梢血管が拡張して赤みを帯び、それに伴い深部体温の下降が認められた。投与１時間後を最低温度のピークに到達し、その後徐々にもとの基礎温度に回復した。
以上の結果より、アキノワスレグサ弱酸性熱水抽出物は、投与後末梢血管拡張作用に伴う体温低下により入眠を促進する作用があり、その後中枢でノンレム睡眠やレム睡眠の睡眠量の増加を持続させる効果をもつと考えられる。
【実施例６】
【００１２】
アキノワスレグサ熱水抽出物の疲労回復効果
マウスの強制水泳試験と自発活動量測定システムを利用した疲労改善作用（効果）判定実験を行なった。実験経験のない雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス６８匹を、１２−１２時間の明−暗サイクルが設定された恒温・恒湿状態の動物飼育室内で飼育し、飼育環境へ十分に馴致させた後に被験体とした。実験開始時、マウスは１０〜１２週齢で、平均体重は２２．８ｇ（ＳＤ＝１．２８）であった。被験体を、体重と週齢の平均値がほぼ等しい７群に分け、それぞれＦＳ−Ａｋｉｎｏ群（ｎ＝１１）、ＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群（ｎ＝１０）、ｎｏＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群（ｎ＝９）、ＦＳ−Ｄｉａ群（ｎ＝９）、ＦＳ−Ｃａｆ群（ｎ＝９）、ＦＳ−Ｉｍｉ群（ｎ＝１１）及びＦＳ−ＳＳＲＩ群（ｎ＝９）と命名した。
暗期開始７時間前、ＦＳ条件の被験体に対し、遮光・防音が可能な実験チャンバー内へ格納した円筒型水槽（底面の直径１８ｃｍ、高さ２９ｃｍ）に２４±１℃の水を深さ１５ｃｍまで満たし、ここで３０分間の強制水泳処置を与えた。即ち、逃避不可能な条件下で強制的に水泳させた。統制群であるｎｏＦＳ−Ｃｎｔ群の被験体は、空の同型の水槽内に３０分間放置した。
強制水泳処置の３０分後、各被験体に、群名の後半に掲げた成分、即ち、Ａｋｉｎｏ（アキノワスレグサより抽出した水溶性成分）、ジアゼパム（Ｄｉａ，２．５ｍｇ／ｋｇ）、カフェイン（Ｃａｆ，１５ｍｇ／ｋｇ）、イミプラミン（Ｉｍｉ，３０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＳＲＩ（マレイン酸フルボキサミン，２５ｍｇ／ｋｇ）又はＶｅｈｉｃｌｅ（蒸留水）を与えた。Ａｋｉｎｏおよび蒸留水は胃ゾンデを用いて経口投与し、ジアゼパム、カフェイン、イミプラミン、およびＳＳＲＩは、腹腔内に注射した。投与量は、いずれも体重１ｋｇあたり溶液１０ｍｌの割合とした。
薬物投与後、被験体をアクリル製飼育ケージ（縦２０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ１２ｃｍ）へ入れ、その６時間後から始まる暗期中の自発活動量を１２時間にわたり測定した。飼育ケージは予め滅菌処理し、床敷き、エサ、給水ボトル等は全て新しく準備したものを用いた。自発活動量の測定は、スーパーメックスセンサを利用した室町機械株式会社製の実験動物運動量測定システムおよび専用ソフトウェア（ＣｏｍｐＡＣＴ  ＡＭＳ  ｖｅｒ．３）を用いて行った。
自発活動量測定の結果を図９に示す。図の左半分は暗期の前半（２０−０２時）、同右半分は暗期の後半（０２−０８時）における各群の１時間あたりの自発活動量の平均値（±標準誤差）である。マウスにとって、暗期は活動が活発な時間帯であり、その前半において特に自発活動量が多くなることが知られている。ＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群とｎｏＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群の比較から明らかなように、強制水泳処置によって自発活動性は顕著に抑制された。ＦＳ−Ｃａｆ群、ＦＳ−Ｉｍｉ群、およびＦＳ−ＳＳＲＩ群でも、自発活動量はＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群と同程度であり、ｎｏＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群より有意に少なかった。一方、ＦＳ−Ｄｉａ群では、前後半いずれの時間帯においても、自発活動量がＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群より多く、ｎｏＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群に近い水準であった。ジアゼパムは睡眠薬として用いられるが、強制水泳処置後に睡眠を誘発することで、低下していた自発活動性が回復したと解釈される。強制水泳処置によって誘発される自発活動性の低下は、睡眠によって改善されることから、疲労の指標であると考えられる。
ＦＳ−Ａｋｉｎｏ群では、ＦＳ−Ｄｉａ群と同様、自発活動量が、ＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群より多く、ｎｏＦＳ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群と同水準であった。従って、アキノワスレグサより抽出した水溶性成分は、睡眠改善効果を媒介し、疲労を緩和する効果を持つと考えられる。
【実施例７】
【００１３】
アキノワスレグサ熱水抽出物のヒトの睡眠改善作用（効果）
アキノワスレグサ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ  Ｌ．ｖａｒ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ  Ｍ．Ｈｏｔｔａ）の乾燥葉から抽出したエキスが、夜間の睡眠や翌日の体調、および日中の眠気に及ぼす影響について、健常な成人を対象に二重盲検比較法（ダブルブラインド・クロスオーバー試験）で検討した。
材料および方法
被験者  ソムノクエスト株式会社が企画した「睡眠改善サプリメントのモニタ試験」への応募者３５名の内、睡眠障害を含む何らかの疾患で通院治療中の者と何らかの薬やサプリメントを日常的に服用している者以外を被験者とした。また、後述する質問項目への回答漏れが多かった（全項目の１２％以上が無回答）者のデータは分析対象から除外した。最終的に分析対象となった被験者は２５名（男性１０名、女性１５名）で、平均年齢は４２．４歳であった（範囲：２２−６８）。被験者の平均睡眠時間は、６．０時間（過去１ヶ月自己申告）であった。
評価対象物
実施例１に記載の方法でアキノワスレグサの乾燥葉から抽出した熱水抽出物を用いてゼリーを作製し、評価対象のサプリメント（以下、エキス・ゼリーと記述）として用いた。エキス・ゼリーは、半透明のＰＰ製小型ポーションへ充填され、透明のＥＰ／ＤＬ／ＮＹフィルムで密封されたていた。ゼリー１個あたりの重量は約１７ｇで、アキノワスレグサの乾燥葉から抽出した熱水抽出物が２ｇ含まれていた。比較対照のために、同型のポーションに充填・密封された熱水抽出物を添加しないプラセボ・ゼリーも作製した。２種類のゼリーに添加された香料は同一であったが、エキス・ゼリーは果糖ブドウ糖液糖で、プラセボ・ゼリーは黒糖で味が調整されていた。両者は、色および味によって弁別が困難であった。
実験手法
被験者の自宅に、エキス・ゼリーとプラセボ・ゼリーを３個ずつ、実験（被験者には「睡眠改善サプリメントのモニタ試験」と表記）の実施手順の説明書と後述する質問紙一式を添付して郵送し、各被験者の任意の日に、ゼリーの摂取・評定を行うよう依頼した。
本実施例は、被験者内計画法で実施した。即ち、被験者全員に、エキス・ゼリーとプラセボ・ゼリーの両方を経験させ、各ゼリーに対する評定結果を比較した。約半数の被験者に対してはエキス・ゼリーを「サプリメントＡ」、プラセボ・ゼリーを「サプリメントＢ」とラベルし、残りの被験者に対してはこの組み合わせを逆転した。全ての被験者へ、最初にサプリメントＡを、その後２日以上の間隔をあけてサプリメントＢを摂取・評定するよう教示し、２種類のゼリーの経験順序を被験者間でカウンターバランスした。被験者には、２種類のゼリーの両方が睡眠改善を目的に開発されたサプリメントであると教示した。２回のゼリーの摂取・評定の手続きは同一であった。被験者には、どちらのゼリーを試す際も、就寝予定時間の約２時間前に指定されたゼリーを３個摂取し、その翌日、起床３０分後に「朝の質問」へ、更に、その夜の就寝１時間前に「夜の質問」へ、それぞれ回答させた。どの質問紙も、回答後は速やかに封筒へ入れて保管し、後に加筆修正することのないよう指示した。
調査項目および質問票
（１）ピッツバーグ睡眠質問票  被験者の睡眠状況を調査するために、日本語版のピッツバーグ睡眠質問票（土井由利子・箕輪眞澄・内山  真・大川匡子（１９９８）ピッツバーグ睡眠質問票日本語版の作成，精神科治療学，１３（６），７６１−７６３．）を用いた。本質問票への回答は、２回のゼリー試食機会いずれかの前に行うものとした。
（２）朝の質問
ゼリーを摂取した夜の睡眠時間、睡眠の質、起床時の気分・感情状態、および睡眠の状況について回答させた。睡眠時間は、分の単位まで質問紙の所定欄に記入させた。睡眠の質については、ＶＡＳ（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ）を用いて回答させた。即ち、紙面に描かれた１００ｍｍの線分の左端を「非常に良い」睡眠、右端を「非常に悪い」睡眠と仮定し、昨晩の被験者自身の主観的な睡眠の質を線分上の任意の箇所に切れ目を入れることで表現させた。質問紙回収後、線分の左端から切れ目までの長さをｍｍ単位で測定して得点とした。気分・感情状態の測定には、ＰＯＭＳ（Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  Ｍｏｏｄ  Ｓｔａｔｅｓ）の日本語版（ＭｃＮａｉｒｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｏｒｒ，Ｍ．，＆  Ｄｒｏｐｐｌｅｍａｎ，Ｌ．Ｆ．１９９２  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  Ｍｏｏｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅ．；横山和仁・荒記俊一（１９９７）日本版ＰＯＭＳ手引き，金子書房．）のＶ（活力）尺度８項目とＦ（疲労）尺度７項目を用い、各項目に「よく当てはまる」（４点）から「まったく当てはまらない」（０点）までの５件法で回答させた。また、睡眠状況については、「床に入ってからすぐに寝付けた」、「起床時に爽快感があった」といった睡眠の質や状況を尋ねる１０項目を提示し、それぞれ「よく当てはまる」（４点）から「まったく当てはまらない」（０点）までの５件法で回答させた。
（３）夜の質問
ＶＡＳを用いて、ゼリーを摂取して睡眠をとった翌日の体調について回答させた。１００ｍｍの線分の左端を「非常に良い」、右端を「非常に悪い」と仮定し、睡眠の質と同様の方法で被験者自身の主観的な体調を得点化した。また、昼間の眠気について、「本や雑誌、漫画、書類などを読んでいるとき」、「昼食後に、一休みしているとき」といった８つの場面を挙げ、それぞれの場面で実際に眠気を感じたかどうか、あるいは、もしもそのような場面を経験したと仮定すれば眠気を感じたと思うかどうかを、「決して眠らなかった（だろう）」（０点）、「眠らないが眠かった（だろう）」（１点）、「うとうとしてしまった（だろう）」（２点）、あるいは「熟睡してしまった（だろう）」（３点）の４件法で回答させた。
結果
本実施例の被験者は、「寝つきが良くない」、「夜中あるいは朝早くに目が覚めてしまう」、あるいは「眠りが浅く翌日に疲れが残ってしまう」といった睡眠不調または睡眠障害の軽い症状が自覚されている者、あるいは、睡眠改善サプリメントに興味を持つ者を条件に募集された。実施時には、喫煙、睡眠薬服用、アルコール飲用、カフェインを含む飲食物の摂食制限規則に従ってもらった。
睡眠時間、睡眠の質、および翌日の体調
表１、図１０および図１１には、睡眠時間、ＰＯＭＳの得点、ＶＡＳによって測定した睡眠の質および体調の得点を条件別に示した。参考のため、ピッツバーグ睡眠質問票の中で回答された過去１ヶ月間における１日あたりの平均的な睡眠時間も併せて示した。プラセボ・ゼリー摂取条件の平均睡眠時間が５．６時間（標準偏差＝１．７５）であったのに対し、エキス・ゼリー摂取条件の平均睡眠時間は６．７時間（標準偏差＝１．４９）と長く、対応のあるｔ検定を行ったところ、条件間で有意な差が認められた（ｔ（２４）＝２．７３，ｐ＜．０５）。また、エキス・ゼリー摂取条件の睡眠時間と過去１ヶ月の平均的な睡眠時間との差についても同様の検定で比較したところ、有意な差が認められた（ｔ（２４）＝２．２３，ｐ＜．０５）。一方、プラセボ・ゼリー摂取条件の睡眠時間と過去１ヶ月の平均的な睡眠時間の間には、統計的に有意な差は検出されなかった（ｔ（２４）＝１．１６，ｎ．ｓ．）。以上より、アキノワスレグサ由来の熱水抽出物の摂取により、睡眠時間が延長された。
一方、睡眠の質（ｔ＜１）および体調（ｔ（２４）＝１．２６，ｎ．ｓ．）の得点は、エキス・ゼリー摂取条件の値がプラセボ条件の値を若干上回っていたものの、有意な差が検出されるには至らなかった。また、ＰＯＭＳのＶ尺度得点（ｔ（２４）＝１．１７，ｎ．ｓ．）には条件間の差は見られなかった。しかしながら、Ｆ尺度得点（ｔ（２４）＝１．７７，ｐ＜．１）には、条件間の差が有意傾向にあり、熱水抽出物の摂取後の睡眠により、起床時の疲労威が低下した。
【表１】
2009145363.tif 000003
2009145363.tif 000004
睡眠状況および起床時の気分・感情状態
表２には、「朝の質問」として回答させた睡眠の状況と起床時の気分・感情状態に関する１０項目の結果を条件別にまとめた。全ての項目について、条件間で対応のあるｔ検定を行ったところ、有意な差が検出された項目はなかった。
【表２】
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翌日の昼間の眠気
表３、図１２Ａおよび１２Ｂには、「夜の質問」として回答させた日中の眠気に関する８項目の結果を条件別にまとめた。８つの場面の内、「公共の場面で、じっとしているとき」（ｔ（２４）＝２．２８，ｐ＜．０５）と「昼食後に、一休みしているとき」（ｔ（２４）＝２．７９，ｐ＜．０５）の２つの場面において、エキス・ゼリー摂取条件の値がプラセボ条件の値を有意に下回っており、熱水抽出物の摂取後の睡眠により、翌日の日中の眠気が緩和された。
【表３】
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【実施例８】
【００１４】
アキノワスレグサの葉の熱水抽出物の脳波への影響
実施例７に記載の方法でアキノワスレグサの乾燥葉から抽出した熱水抽出物を含むゼリーをヒト被験体（被験体１：４９歳女性及び被験体２：４４歳男性）に摂食させた。その後、就寝中に脳波を測定し、睡眠ステージの経時的変化を調べた。
比較対照のために、同型のポーションに充填・密封された熱水抽出物を添加しないプラセボ・ゼリーも摂食させ、脳波を測定した。
図１３に被験体１の結果を示す。図１３Ａはエキス無しゼリーサンプル（プラセボ）を摂食した場合の脳波を示し、図１３Ｂはエキス入りゼリーサンプルを摂食した場合の脳波を示す。図１３の脳波測定の結果により、（ｉ）就寝１時間後までに深い熟睡（ＮＲＥＭ−Ｓ４）の回数が増加したこと、及び（ｉｉ）就寝時間全体的にデルタ波（熟睡を示す脳波の周波数）の出現頻度が増えていたことがわかった。このことは、エキス摂食により、寝入りばなの熟睡が増加し、さらに、就寝中の熟睡頻度が増えたことを示す。
図１４に被験体２の結果を示す。図１４Ａはエキス無しゼリーサンプル（プラセボ）を摂食した場合の脳波を示し、図１４Ｂはエキス入りゼリーサンプルを摂食した場合の脳波を示す。図１４の脳波測定の結果により、（ｉ）就寝１時間後までに深い熟睡（ＮＲＥＭ−Ｓ４）の回数が増え、持続時間も延長したこと、及び（ｉｉ）明け方４〜５時の覚醒状態（中途覚醒）が、エキス摂食により明らかに無くなったことがわかった。このことは、エキス摂食により、寝入りばなの熟睡が増加し、さらに、さらに夜中の中途覚醒が減少したことを示す。
【実施例９】
【００１５】
アキノワスレグサ熱水抽出物と他の物質との抗うつ様効果及び深部体温変化に対する効果の比較
１．抗うつ様効果
実施例４で用いた抗うつ様効果を判定する実験装置（強制水泳装置）を用いた。実験経験のない雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス及び雄性ｄｄＹマウス、１２〜１２時間の明−暗サイクルが設定された恒温・恒湿状態の動物飼育室内で飼育し、飼育環境へ十分に馴致させた後に被験体とした。
１日目に１５分間の強制水泳処置を行い、処置３０分後にアキノワスレグサの乾燥葉から抽出した熱水抽出物又はその他の物質を投与した。次いで２日目に５分間の強制水泳処置を行った。この際、処置３０分前にアキノワスレグサの乾燥葉から抽出した熱水抽出物又はその他の物質を投与した。
両日の５分間中の不動反応時間をスーパーメックスセンサ（室町機械）を用いて測定した。
実験の方法を図１５に示す。
用いた物質は以下のとおりであった。
（ａ）  θ−ｈｉｇｈ（アキノワスレグサの葉の熱水抽出物）
（ｂ）  θ−ｌｏｗ（アキノワスレグサの葉の熱水抽出物）
（ｃ）  ＦＸ−ｈｉｇｈ（アキノワスレグサの花の熱水抽出物）
（ｄ）  ＦＸ−ｌｏｗ（アキノワスレグサの花の熱水抽出物）
（ｅ）  ＳＪＷ（セントジョーンズ・ワート（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ）
（ｆ）  Ｖａｌｌｅｒｉ（バレリアン）
図１６に、上記被験物質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を投与した場合の結果を示す。結果は、それぞれの不動時間により示してある。
図１６に示すように、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物を用いた場合に、不動時間の延長が抑制され、アキノワスレグサの花の抽出物を用いた場合には不動時間が延長された。この結果は、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物の抗うつ様効果がアキノワスレグサの花の抽出物よりも優れていることを示す。
図１７に、上記被験物質（ａ）、（ｅ）及び（ｆ）を投与した場合の結果を示す。結果は、それぞれの不動時間により示してある。
図１７に示すように、アキノワスレグサの葉の抽出物は、セントジョーンズ・ワートと同等の抗うつ様効果を示した。一方、バレリアンは抗うつ様効果を示さなかった。
２．深部体温に対する効果
図１８にアキノワスレグサの葉の熱水抽出物と他の試験物質の深部体温測定の結果を示す。アキノワスレグサの葉の熱水抽出物（θ）を投与したマウスでは、速やかに四肢の皮膚毛細血管の拡張を認め、それに伴い直腸温度（深部体温）も低下した。同濃度の他の試験物質（Ｇｌｙ：グリシン、ＧＡＢＡ：γ−アミノ酪酸、テアニン）では、深部体温を低下させたものの、その低下速度はアキノワスレグサの葉の熱水抽出物より遅かった。
この結果は、試験した物質の中で、アキノワスレグサの葉の熱水抽出物の睡眠促進効果が最も大きいことを示す。
図１９は、アキノワスレグサ熱水抽出物と他の睡眠改善・抗不安・抗鬱関連物質の特徴を示す。他の睡眠改善・抗不安・抗鬱関連物質の特徴は、独立行政法人国立健康・栄養研究所の健康食品の素材データベース上の特徴である。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
実施例に示すように、ワスレグサ属植物の熱水抽出物は抗うつ様効果及び睡眠の質を高めることによる疲労回復効果が認められた。従来ワスレグサ属植物の熱水で抽出した抽出物、特に葉の抽出物に抗うつ様効果や睡眠改善による疲労回復効果があることは見出されておらず、本発明によりワスレグサ属植物の熱水抽出物の抗うつ様効果及び睡眠改善による疲労回復効果が初めて示された。
本発明のワスレグサ属植物の熱水抽出物は、抗うつ様作用及び睡眠改善による疲労回復作用を有する組成物として、飲食品や医薬の分野で利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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