(57)【要約】  （ａ）小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、濾過工程（ａ）が、（ｑ）小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程を含み、低圧濾過工程（ｑ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０（式１）及び３．５≦Ｘ≦８．０（式５）又は、以下の式４及び式５：Ｙ＝０（式４）及び３．５≦Ｘ≦８．０（式５）を満たす方法を提供する。
2012176876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）：
（ａ）小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程；
を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、
濾過工程（ａ）が、以下の工程（ｑ）：
（ｑ）前記小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過して前記ウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程；
を含み、
低圧濾過工程（ｑ）における前記濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす方法。
【請求項２】
前記工程（ｑ）における前記濾過前溶液が、前記ウイルス含有タンパク質溶液であって、
濾過工程（ａ）で濾過される全ウイルス含有タンパク質溶液の５０％以上が低圧濾過工程（ｑ）で濾過される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
濾過工程（ａ）が、前記小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で前記ウイルス含有タンパク質溶液を濾過して前記ウイルス除去タンパク質溶液を得る工程であり、濾過工程（ａ）における前記濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５:
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
濾過工程（ａ）が、低圧濾過工程（ｑ）に先立って行われる以下の工程（ｐ）：
（ｐ）前記小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2超で前記ウイルス含有タンパク質溶液を濾過して前記ウイルス除去タンパク質溶液を得る高圧濾過工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
低圧濾過工程（ｑ）における前記濾過前溶液が洗浄用緩衝液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低圧濾過工程（ｑ）が、ポストウォッシュ工程あるいはストップアンドスタート工程である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
低圧濾過工程（ｑ）における前記濾過溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式２及び式５：
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２００    （式２）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
低圧濾過工程（ｑ）における前記濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式３及び式５：
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２５０    （式３）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
低圧濾過工程（ｑ）が、前記小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．２０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で前記溶液を濾過して前記ウイルス除去タンパク質溶液を得る工程である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
濾過工程（ａ）前の前記ウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と濾過後の前記ウイルス除去タンパク質溶液中のウイルス濃度（ＣF）から以下の式６：
ＬＲＶ＝ｌｏｇ10（Ｃ0／ＣF）    （式６）
を用いて算出されるＬＲＶ（Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ）が４以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
濾過工程（ａ）前の前記ウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と濾過後の前記ウイルス除去タンパク質溶液中のウイルス濃度（ＣF）から以下の式６：
ＬＲＶ＝ｌｏｇ10（Ｃ0／ＣF）    （式６）
を用いて算出されるＬＲＶ（Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ）が４以上であり、
濾過工程（ａ）前の前記ウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と、濾過工程（ａ）後の前記洗浄用緩衝液濾液中のウイルス濃度（Ｃw）から以下の式７：
ＬＲＶ’＝ｌｏｇ10（Ｃ0／Ｃw）    （式７）
を用いて算出されるＬＲＶ’が４以上である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１２】
前記小孔ウイルス除去膜の材質が、セルロース又は親水化された合成高分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記小孔ウイルス除去膜の材質が、親水化された合成高分子であり、前記合成高分子が、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン及びポリエチレンからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記小孔ウイルス除去膜の形状が、平膜又は中空糸膜である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス含有タンパク質溶液中のタンパク質濃度が、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス含有タンパク質溶液が、モノクローナル抗体、遺伝子組み換え血液凝固因子、インターフェロン、ホルモン、酵素、免疫グロブリン、アルブミン、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、フィブリノーゲン及びアンチトロンビンIIIからなる群から選択される１種以上のタンパク質含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス含有タンパク質溶液が、タンパク質として抗体を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルス含有タンパク質溶液が、タンパク質として血液凝固第VIII因子又はフィブリノーゲンを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルス含有タンパク質溶液が、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏ）、サーコウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）からなる群から選択される１種以上のウイルスを含有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルス含有タンパク質溶液が、エンベロープを持たない直径３２ｎｍ以下のウイルスを含有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルス含有タンパク質溶液が、無機塩、緩衝液成分、界面活性剤及び糖類からなる群から選択される１種以上の成分を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
以下の工程（ａ）：
（ａ）小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程；
を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、
濾過工程（ａ）が、以下の工程（ｑ）：
（ｑ）前記小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過して前記ウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程；
を含み、低圧濾過工程（ｑ）に先立って、工程（ｑ）における前記濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たすよう、前記濾過前溶液を調整する工程を含む方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法で得られる、ウイルス除去タンパク質製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス除去タンパク質製剤の製造方法及び該製造方法により製造されるウイルス除去タンパク質製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品や血漿分画製剤等に代表されるタンパク質製剤は、原料由来又は工程由来のウイルスの混入が懸念される。従って、このようなタンパク質製剤を製造する際には、製剤中のウイルスの不活化や除去が、製剤の安全性及び安定性の観点から非常に重要である。ウイルスの不活化方法としては、加熱処理や化学薬品による処理等が行われているが、それら単独の処理ではウイルスの不活化は充分でなく、またこれらの方法では製剤中のタンパク質そのものも変性するおそれがある。このような背景から、化学的な変性を伴わない物理的なウイルス除去手段として、ウイルス除去膜を用いた濾過によるウイルスの分離除去が実施されている（例えば、特許文献１〜３等）。【０００３】
ウイルス除去膜としては、セルロースのような天然素材よりなる膜、あるいはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のような合成高分子素材よりなる膜が知られている(非特許文献１〜４)。特に、タンパク質溶液中のタンパク質の分子が小さい場合、ウイルスは透過できないが、タンパク質分子は透過できるようなサイズの孔径を有する濾過膜である小孔ウイルス除去膜が用いられる。【０００４】
ウイルス除去膜を装填したウイルス除去装置によるウイルス含有溶液の濾過は、短時間でより多くの量のタンパク質溶液を濾過でき、かつ充分に高いウイルス除去性能を発揮できることが理想である。短時間でより多くの量のタンパク質溶液を処理するために、一般にウイルス含有溶液の濾過はできるかぎり高圧で行う。しかしながら、このような高圧での濾過を続けると、膜の内部に、濾液に含まれるべきタンパク質が残存する場合がある。また、近年ではタンパク質の製剤濃度が高くなる傾向にあり、それに伴いウイルスを除去するための濾過工程においてもタンパク質濃度を高くしたいという要求が高まりつつある。高濃度のタンパク質溶液を小孔ウイルス除去膜で濾過する場合、特に膜の内部へのタンパク質残存による目詰まりの発生が顕著である。【０００５】
小孔ウイルス除去膜の内部に残存したタンパク質の回収には、タンパク質の含まれていない緩衝液（通常は、タンパク質を溶解している緩衝液と同じもの）を洗浄液として濾過することが行われる。この工程は、タンパク質濾過の後で追加的に行われる濾過であるため、ポストウォッシュ（Ｐｏｓｔ−ｗａｓｈ、後洗浄）、後濾過（Ｐｏｓｔ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）と呼ばれている。ポストウォッシュの際、通常は、濾過液の入り口をタンパク質溶液のラインから洗浄液のラインに切り替えるために、濾過圧力を一旦開放する。濾過圧力を下げないと、洗浄液側に液が逆流してしまう。【０００６】
ポストウォッシュ工程と同様、ウイルス除去膜で濾過する際の濾過圧力が下がる場合としては、停電等の事情で、濾過中に加圧が一旦中断するケースも挙げられる（ストップ・アンド・スタート（Ｓｔｏｐ＆Ｓｔａｒｔ）と呼ばれる）。【０００７】
また、タンパク質製剤の種類によっては、製剤の製造において、ウイルス除去膜で濾過する際の濾過圧力が低いことが望ましい場合もある。低い濾過圧力での濾過は、目詰まりしやすい溶液の最終処理量を増加しようとする場合や、形状が細長い高分子タンパク質溶液の透過率や回収率を増加しようとする場合に実施されることが多い。低い濾過圧力を採用する際の具体的な濾過圧力は、透過性と生産性との兼ね合いで決定されることが多く、得ようとするタンパク質製剤の濃度等にも左右される。例えば特許文献４は、０．１５ｋｇｆ／ｃｍ2程度の濾過圧力を採用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−３３５５０９号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４９４１号公報
【特許文献３】国際公開２０１０／１０９９２０号公報
【特許文献４】米国特許７９３２３５５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Manabe S, Dev. Biol. Stand., (1996)88:81-90
【非特許文献２】Brandwein Hら、Dev Biol (Basel)., (2000)102:157-63
【非特許文献３】Aranha-Creadoら、Biologicals., (1998)Jun;26(2):167-72
【非特許文献４】L. Moce-Llivinaら、Journal of Virological Methods, (2003)April, Vol.109, Issue 1, Pages 99-101
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまで、ウイルス除去膜を用いたタンパク質溶液の濾過は、処理量を増やし、効率を上げるために、できるかぎり高圧で行う方法に注目が集まり、低い濾過圧力下での濾過については、十分な知見が得られていなかった。【００１１】
このような背景のもと、本発明者らは、低い濾過圧力下での、小孔ウイルス除去膜を用いたタンパク質溶液の濾過について、独自に研究を進めたところ、驚くべきことに、低い濾過圧力下での濾過を、高い濾過圧力下と同様の溶液条件で実施すると、溶液条件によっては、ウイルスが濾液側に漏れ、ウイルス除去率の低いタンパク質製剤が得られる場合があるという知見を得た。上述のポストウォッシュ工程や、ストップ・アンド・スタート工程においても、低い濾過圧力下で濾過が行われるため、溶液条件によっては、ウイルス除去率の低下が起こる場合があることも見出した。【００１２】
上記の新たな知見に基づき、本発明は、低い濾過圧力下で、小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過する工程を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、ウイルス除去率が高いタンパク質製剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた結果、濾過に供する溶液中のｐＨ及び塩のイオン強度の条件を特定の値にすることで、低い濾過圧力下であってもウイルス除去率の高いタンパク質製剤が得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は以下に関する。
〔１〕
以下の工程（ａ）：
（ａ）小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程；
を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、
濾過工程（ａ）が、以下の工程（ｑ）：
（ｑ）小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程；
を含み、
低圧濾過工程（ｑ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす方法。
〔２〕
前記工程（ｑ）における濾過前溶液が、ウイルス含有タンパク質溶液であって、
濾過工程（ａ）で濾過される全ウイルス含有タンパク質溶液の５０％以上が低圧濾過工程（ｑ）で濾過される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
濾過工程（ａ）が、小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下でウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る工程であり、濾過工程（ａ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５:
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
濾過工程（ａ）が、低圧濾過工程（ｑ）に先立って行われる以下の工程（ｐ）：
（ｐ）小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2超でウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る高圧濾過工程；
を含む、〔１〕に記載の方法。
〔５〕
低圧濾過工程（ｑ）における濾過前溶液が洗浄用緩衝液である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕
低圧濾過工程（ｑ）が、ポストウォッシュ工程あるいはストップアンドスタート工程である、〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔７〕
低圧濾過工程（ｑ）における濾過溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式２及び式５：
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２００    （式２）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
低圧濾過工程（ｑ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式３及び式５：
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２５０    （式３）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
低圧濾過工程（ｑ）が、小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．２０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る工程である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
濾過工程（ａ）前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と濾過後のウイルス除去タンパク質溶液中のウイルス濃度（ＣF）から以下の式６：
ＬＲＶ＝ｌｏｇ10（Ｃ0／ＣF）    （式６）
を用いて算出されるＬＲＶ（Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ）が４以上である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
濾過工程（ａ）前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と濾過後のウイルス除去タンパク質溶液中のウイルス濃度（ＣF）から以下の式６：
ＬＲＶ＝ｌｏｇ10（Ｃ0／ＣF）    （式６）
を用いて算出されるＬＲＶ（Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ）が４以上であり、
濾過工程（ａ）前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と、濾過工程（ａ）後の洗浄用緩衝液濾液中のウイルス濃度（Ｃw）から以下の式７：
ＬＲＶ’＝ｌｏｇ10（Ｃ0／Ｃw）    （式７）
を用いて算出されるＬＲＶ’が４以上である、〔５〕又は〔６〕に記載の方法。
〔１２〕
小孔ウイルス除去膜の材質が、セルロース又は親水化された合成高分子である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕
小孔ウイルス除去膜の材質が、親水化された合成高分子であり、前記合成高分子が、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン及びポリエチレンからなる群から選択される、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕
小孔ウイルス除去膜の形状が、平膜又は中空糸膜である〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕
ウイルス含有タンパク質溶液中のタンパク質濃度が、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕
ウイルス含有タンパク質溶液が、各種モノクローナル抗体、遺伝子組み換え血液凝固因子、インターフェロン、各種ホルモン、各種酵素、免疫グロブリン、アルブミン、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、フィブリノーゲン及びアンチトロンビンIIIからなる群から選択される１種以上のタンパク質含む、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕
ウイルス含有タンパク質溶液が、タンパク質として抗体を含む、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕
ウイルス含有タンパク質溶液が、タンパク質として血液凝固第VIII因子又はフィブリノーゲンを含む、請求項〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕
ウイルス含有タンパク質溶液が、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏ）、サーコウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）からなる群から選択される１種以上のウイルスを含有する、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕
ウイルス含有タンパク質溶液が、エンベロープを持たない直径３２ｎｍ以下のウイルスを含有する、〔１〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕
ウイルス含有タンパク質溶液が、無機塩、緩衝液成分、界面活性剤及び糖類からなる群から選択される１種以上の成分を含有する、〔１〕〜〔２０〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕
以下の工程（ａ）：
（ａ）小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程；
を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、
濾過工程（ａ）が、以下の工程（ｑ）：
（ｑ）小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程；
を含み、低圧濾過工程（ｑ）に先立って、工程（ｑ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たすよう、濾過前溶液を調整する工程を含む方法。
〔２３〕
〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載の方法で得られる、ウイルス除去タンパク質製剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、低い濾過圧力下で、小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過する工程を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法において、ウイルス除去率の高いタンパク質製剤を提供することができる。従って、例えば、低い濾過圧力で継続してウイルス含有タンパク質溶液を濾過する場合、ポストウォッシュ工程を含む場合、あるいはストップ・アンド・スタート工程を含む場合においても、ウイルス除去率の高いタンパク質製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例２において、ウイルスの漏れを生じない場合の濾過前溶液中のｐＨ（Ｘ）と塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））との関係を示すグラフである。左側から、実施例２で決定した、式１、式２及び式３に対応する線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１８】
本実施の形態におけるウイルス除去タンパク質製剤の製造方法は、小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程（ａ）を含む。
【００１９】
工程（ａ）で濾過される「ウイルス含有タンパク質溶液」は、後述の小孔ウイルス濾過膜で濾過した場合に濾過膜を通過するタンパク質を含み、ウイルスを含有する可能性のある溶液であれば特に制限されない。特に、ヒトを含む動物由来成分や遺伝子等を原料とする溶液は、ウイルスを含有する可能性が高いため、本実施の形態の製造方法におけるウイルス含有タンパク質溶液として用いることで、ウイルス除去タンパク質製剤を効率よく提供することができる。
【００２０】
ウイルス含有タンパク質溶液としては、例えば、バイオ医薬品の原料である、遺伝子工学、細胞培養等のバイオテクノロジーを利用して生産される、ペプチドやタンパク質を有効成分として含む溶液が挙げられる。具体的には、各種モノクローナル抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ等）、遺伝子組み換え血液凝固因子、インターフェロン、各種ホルモン（成長ホルモン、エリスロポエチン等）、各種酵素、糖改変タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質に代表される改変タンパク質、人工タンパク質等を含む溶液等が例示されるが、これに制限されるものではない。
【００２１】
また、ウイルス含有タンパク質溶液としては、例えば、血漿から精製して得られる血漿分画製剤の原料も挙げられる。血漿分画製剤としては、免疫グロブリン製剤、アルブミン製剤、血液凝固因子製剤等が例示され、特に血液凝固因子製剤としては、血液凝固第VIII因子製剤、血液凝固第IX因子製剤、フィブリノーゲン製剤、アンチトロンビンIII製剤等が例示される。従って、ウイルス含有タンパク質溶液としては、具体的には、免疫グロブリン、アルブミン、血液凝固因子（血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、フィブリノーゲン、アンチトロンビンIII等）等を含む溶液が例示されるが、これに制限されるものではない。一態様において、本実施の形態におけるウイルス含有タンパク質溶液は、タンパク質として抗体を含むことが好ましい場合がある。一態様において、本実施の形態におけるウイルス含有タンパク質溶液は、タンパク質として血液凝固第VIII因子又はフィブリノーゲンを含むことが好ましい場合がある。
【００２２】
ウイルス含有タンパク質溶液中のタンパク質の濃度は、小孔ウイルス除去膜により濾過可能な限り特に限定されないが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬである。タンパク質の濃度が高くなるとウイルス除去膜による濾過速度が低下する傾向にある。
【００２３】
ウイルス含有タンパク質溶液に含まれるウイルスは、特に限定されないが、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏ）、サーコウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）等が挙げられ、好ましくは、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏ）及びＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）からなる群から選択される。
【００２４】
上記のウイルスのうち、特にパルボウイルスは、血漿分画製剤分野において、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）による感染の事例が報告されており、血漿由来製剤のウイルス安全性に関するレポートがＥＭＥＡ（欧州医薬品審査庁）から出されている。さらに、バイオ医薬品分野においても、マウスパルボウイルスのＣＨＯ細胞（マウス由来）への混入による、製造プロセスにおけるモノクローナル抗体への汚染の実例があり、動物細胞を用いて作られたバイオ医薬品のウイルス安全性評価に関するガイドライン（ＩＣＨ  Ｑ５Ａ）がＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）から出されている。
【００２５】
パルボウイルスはパルボウイルス科に属し、現在公知の最小ウイルス（直径１８〜２４ｎｍ）である。ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、犬パルボウイルス（ＣＰＶ）ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）等が挙げられる。
【００２６】
パルボウイルスは、エンベロープを持たないことから、物理化学的に安定で、生物学的製剤の製造プロセス中の不活化工程で一般的に行なわれる加熱、低ｐＨ、化学薬品処理に対して耐性があり、不活化法とは異なる作用機序のウイルス除去方法として、ウイルス除去膜によるパルボウイルス除去のニーズが高まっている。一態様において、本実施の形態は、パルボウイルス除去タンパク質製剤の製造方法を提供する。
【００２７】
また、パルボウイルス以外のエンベロープを持たない小ウイルスとして、サーコウイルス（１７〜２２ｎｍ）、ピコルナウイルス科のＡ型肝炎ウイルス（２７〜３０ｎｍ）、ポリオウイルス（３０ｎｍ）、Ｅ型肝炎ウイルス（３２ｎｍ）等が挙げられ、一態様において、本実施の形態は、エンベロープを持たないウイルス（好ましくは直径３２ｎｍ以下、より好ましくは直径３０ｎｍ以下、さらに好ましくは直径２４ｎｍ以下のウイルス）を対象としたウイルス除去タンパク質製剤の製造方法を提供する。
【００２８】
ウイルス含有タンパク質溶液は、上記のタンパク質及びウイルスのほか、塩基性アミノ酸、無機塩、緩衝液成分、界面活性剤及び糖類からなる群から選ばれる一種以上の成分を含むことができる。
【００２９】
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、グアニジン、リジン又はそれらの誘導体、あるいはそれらの塩が挙げられ、好ましくは、アルギニン、ヒスチジン、リジン又はそれらの誘導体、あるいはそれらの塩であり、より好ましくはアルギニン又はその誘導体、あるいはそれらの塩である。
【００３０】
無機塩としては、ＮａＣｌ、緩衝塩を含むことができる。緩衝液成分としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等を用いることができる。無機塩及び緩衝液成分の濃度は、以下に詳述する塩のイオン強度を参照して決定することができる。
【００３１】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等が例示され、０．０１〜０．０５ｗｔ％の濃度で含むことができる。
【００３２】
糖類としては、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、糖アルコール等、特に限定されず、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、マルトース、スクロース(ショ糖)、ソルビトール、マンニトール、デキストラン等を１種又は複数種組み合わせて１〜１０ｗｔ％、好ましくは１〜５ｗｔ％含むことができる。
【００３３】
濾過前のウイルス含有タンパク質溶液の温度は、得られるタンパク質製剤の状態に影響しない温度範囲であればよいが、タンパク質の変性を防ぐという観点から、好ましくは４℃〜４０℃、より好ましくは４℃〜３５℃の範囲である。温度はタンパク質溶液の粘度に影響し、ウイルス除去膜濾過の際のＦｌｕｘに影響するので、タンパク質自体の温度に対する安定性にもよるが、さらに好ましくは２０℃〜３５℃の範囲である。
【００３４】
本実施の形態においてウイルス除去に用いる「小孔ウイルス除去膜」は、ＰＤＡ（Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により定義されており、３０〜３３ｎｍの粒子径を有するバクテリオファージＰＰ７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｇｅ  ７）の除去率が、ＰＤＡのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ４１（２００８年改訂、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １）に記載の手法に基づいて測定した場合に、４ｌｏｇ10より大きな膜を意味する。
【００３５】
ＰＤＡによる小孔ウイスル除去膜の別の定義としては、静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）水溶液又はＩＶＩＧ含有緩衝液を用いて、上記のバクテリオファージＰＰ７と同様の手法を用いて試験した場合に、タンパク質の透過率又は回収率が、９０％より大きな膜が挙げられる。タンパク質の透過率は、濾過前溶液のタンパク質濃度に対する、膜濾過後の溶液のタンパク質濃度の割合で表され、膜濾過後の溶液のタンパク質濃度が安定するまで十分な容量の溶液を膜濾過した後に測定される。タンパク質濃度の測定には、ＵＶ分光測定（Ａ280）を用いることができる。
【００３６】
小孔ウイルス除去膜は、各ウイルス除去膜の推奨圧力において、パルボウイルスの除去性能について後述の式６を用いて算出したＬＲＶが４以上であることが望ましい。
【００３７】
小孔ウイルス除去膜の材質は、セルロース又は親水化された合成高分子が好ましい。セルロースとしては、再生セルロース、天然セルロース、酢酸セルロース等を用いることができる。親水化された合成高分子としては、親水化ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、親水化ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、親水化ポリエチレン（ＰＥ）、親水化ポリスルホン（ＰＳ）等を用いることができる。親水化方法としては、コーティング、グラフト反応、架橋反応等の方法により、膜表面に親水性の官能基を導入する方法や、親水性ポリマーを固定する方法等があげられる。
【００３８】
膜の形状は平膜及び中空糸膜いずれでもよいが、膜面積が大きくても膜を容器に装填して作成したフィルターを小型にできるため、好ましくは中空糸膜である。被濾過液入り口側の一次側空間と濾過液出側の２次側空間が膜によって仕切られたフィルターを作成することができる。ウイルス除去膜を濾過に用いる際には、フィルターの形態として使用することができる。
【００３９】
パルボウイルス等の小ウイルス除去を対象とした市販の小孔ウイルス除去膜としては、セルロース製のＰｌａｎｏｖａ（登録商標）１５Ｎ（旭化成メディカル社製）及びＰｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ（旭化成メディカル社製）、親水化ＰＶＤＦ製のＰｌａｎｏｖａ（登録商標）ＢｉｏＥＸ（旭化成メディカル社製）、Ｕｌｔｉｐｏｒｅ（登録商標）ＶＦ  ＤＶ２０（Ｐａｌｌ社製）及びＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、親水化ＰＥＳ製のＶｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）等が挙げられる。除去しようとするウイルスや、製造しようとするタンパク質製剤の種類に応じて、ウイルス除去膜を適宜選択することができる。
【００４０】
小孔ウイルス除去膜を用いたウイルス含有タンパク質溶液の濾過は、各小孔ウイルス除去膜の通常の使用方法を用いて行うことができる。濾過は、回収率が高いという観点から、デッドエンドフィルトレーションが好ましい。濾過圧力を一定にする定圧濾過、濾過圧力を変動させる濾過、濾過速度を一定にする定速濾過等、いずれの濾過方法を用いてもよい。濾過前溶液の組成に応じて、好ましい濾過方法を採用する。
【００４１】
工程（ａ）における濾過圧力は、小孔ウイルス除去膜の材質によるが、膜の耐圧力以下の範囲で行なう。例えば、セルロースからなる小孔ウイルス除去膜の場合は、０．００ｋｇｆ／ｃｍ2（０．０ｋＰａ）〜１．００ｋｇｆ／ｃｍ2（９．８×１０ｋＰａ）の範囲が最適である。親水化ＰＶＤＦ、親水化ＰＥＳ又は親水化ＰＳからなる小孔ウイルス除去膜の場合、０．００ｋｇｆ／ｃｍ2（０．０ｋＰａ）〜５．００ｋｇｆ／ｃｍ2（４.９×１０２ｋＰａ）の範囲が最適である。
【００４２】
本実施の形態の製造方法において、工程（ｑ）は、上述の小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程であり、上記の工程（ａ）に含まれる工程である。すなわち、工程（ｑ）は、上記の工程（ａ）のうち、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で濾過を行う工程を指す。
【００４３】
通常、ウイルス除去膜を用いたウイルス含有溶液の濾過は、短時間でより多くの量のタンパク質溶液を処理できるよう、できるだけ高い濾過圧力で行う。しかしながら、上述の小孔ウイルス除去膜を用いて、低い濾過圧力でウイルス含有溶液を濾過する低圧濾過工程において、ウイルスが濾液中に漏れ出し、除去されない場合があることを本発明者らは見出した。そして、このような低圧濾過工程において、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５、又は式４及び式５を満たすよう調整することにより、ウイルスが濾液中に漏れ出すことがなく、ウイルス除去された濾液が得られることを本発明者らは見出した。
【００４４】
本実施の形態において、濾過圧力は、簡便には、上記の小孔ウイルス除去膜を装填したウイルス除去装置に備えられた圧力計を用いて測定することができる。供給液容器側に圧力計を設置し、測定することもできる。濾過圧力が０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下（例えば後述の実施例に示すように、０．２０ｋｇｆ／ｃｍ2付近）において、濾過前溶液の組成によってはウイルスが濾液中に漏れ出す。理論に束縛されるものではないが、この理由としては、濾過圧力が低くなるにつれ、小孔ウイルス除去膜へのウイルスの拘束力が弱まり、ウイルスの自由度が高まって濾液側に漏れ出し、特に濾過圧力が０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で、この現象が顕在化すると考えられる。
【００４５】
しかし、低圧濾過工程において、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす場合、ウイルス除去された濾液を得ることができる。
【００４６】
得ようとするタンパク質製剤におけるウイルス除去率に応じて、低圧濾過工程における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））は、さらに以下の式２及び式５：
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２００    （式２）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たすことがより好ましい場合があり、さらに以下の式３及び式５：
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２５０    （式３）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たすことが特に好ましい場合がある。
【００４７】
後述の実施例に示す通り、本発明者らは、濾過圧力が０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下、例えば０．２０ｋｇｆ／ｃｍ2付近（例えば０．１０ｋｇｆ／ｃｍ2〜０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2、さらに例示すれば０．１５ｋｇｆ／ｃｍ2〜０．２５ｋｇｆ／ｃｍ2）では、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が上記の式１を満たす場合、濾過後のウイルスの除去率が高いことを確認している。
【００４８】
濾過後のウイルスの除去率は、Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ（ＬＲＶ）を用いて示すことができる。ＬＲＶは、濾過前溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と、濾過後溶液中のウイルス濃度（ＣF）から、以下の式６を用いて算出され、ＬＲＶの値が小さいほどウイルス除去率が低い。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ10（Ｃ0／ＣF）    （式６）
【００４９】
ＬＲＶを算出する際のウイルス濃度は、感染価、ウイルス核酸のコピー数等で表現することができる。感染価の測定法としては、ＴＣＩＤ５０法、プラーク法等が挙げられる。ウイルスの核酸のコピー数はＰＣＲ法等を用いて測定することができる。
【００５０】
一般に、ウイルス除去膜の性能評価において、ＬＲＶが４以上であれば、膜濾過によりウイルスが十分に除去されており、ＬＲＶ５以上であれば、１０の５乗分の１以下までウイルスが除去されており、ＬＲＶ６以上であれば、１０の６乗分の１以下までウイルスが除去され、ほとんどウイルスの漏れがないとされている。
【００５１】
本実施の形態において、濾過工程（ａ）前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と濾過後のウイルス除去タンパク質溶液中のウイルス濃度（ＣF）から上記の式６を用いて算出されるＬＲＶは、好ましくは４以上であり、より好ましくは５以上であり、さらに好ましくは６以上である。ウイルス濃度（ＣF）が検出限界以下となることも好ましい。
【００５２】
後述の実施例の結果から明らかな通り、低圧濾過工程において、濾過前溶液のｐＨの低下に伴って、ウイルスの濾液中への漏れが増加し、ＬＲＶが低下する。この現象は、濾過前溶液の塩のイオン強度が高い場合、より顕著になり、濾過前溶液のｐＨが低く、塩のイオン強度が高い場合に、ウイルスの濾液中への漏れが最も多い。
【００５３】
後述の実施例に示すとおり、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、上記式１及び式５、又は式４及び式５のいずれかの組み合わせを満たす場合、ＬＲＶ４以上のウイルス除去率で低圧濾過工程を行うことができるが、一方、上記式１及び式５、又は式４及び式５の組み合わせをいずれも満たさない場合には、ウイルス除去率が低くなり、ウイルスが濾液中に漏れ出てしまう。さらに、Ｘ及びＹが、上記式２及び式５、又は式４及び式５のいずれかの組み合わせを満たす場合、ＬＲＶ５以上のウイルス除去率で低圧濾過工程を行うことができ、Ｘ及びＹが、上記式３及び式５、又は式４及び式５のいずれかの組み合わせを満たす場合、濾液中のウイルス濃度が検出限界以下となるような、さらに高いウイルス除去率で低圧濾過工程を行うことができる。従って、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、上記の式の組み合わせを満たすよう調整することにより、低い濾過圧力であっても、ウイルスが濾液側に漏れ出ることがなく、ウイルス除去された溶液を得ることができる。
【００５４】
低圧濾過工程において、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）は、３．５以上８．０以下であることが望ましく、４．０以上８．０以下であることがより好ましい。ｐＨが３．５未満及び８．０を超える場合、タンパク質の変性や分解が起こることがある。
【００５５】
濾過前溶液の塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））は、溶液中で解離した塩由来のイオン種全てについて、それぞれのイオンのモル濃度（Ｃｉ）とイオンの電荷数（Ｚｉ）の２乗の積を加え合わせ、さらにそれを１／２にしたものとして下記の式８で表される。
Ｙ＝１／２Σ（Ｃｉ×Ｚｉ2）    （式８）
【００５６】
塩由来のイオン種の例としては、無機塩由来のイオン、緩衝液成分を構成する塩由来のイオンが挙げられる。溶液が緩衝液成分を含まず、無機塩のみを含む場合、塩のイオン強度は、無機塩のイオン強度のみで算出できる。また、無機塩がＮａＣｌの場合、塩のイオン強度は、ＮａＣｌの塩濃度と同一となる。
【００５７】
通常、緩衝液成分を含む溶液では、緩衝液成分はｐＨ調整の役割を有し、塩のイオン強度の調整は、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）を加えることで行うことが多い。
【００５８】
低圧濾過工程において、濾過前溶液の塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））は、タンパク質の変性や凝集体形成に影響を及ぼさない範囲として、５００ｍM以下であることが望ましい。好ましくは３００ｍM以下、より好ましくは１５０ｍM以下である。
【００５９】
本実施の形態の一態様において、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が以下の範囲である場合にも、高いウイルス除去率で低圧濾過工程を行うことができる。
３．５≦Ｘ＜４であり、Ｙ＝０である場合；
４≦Ｘ＜４．６であり、０≦Ｙ≦５０、好ましくは０≦Ｙ≦１０、より好ましくはＹ＝０である場合；
４．６≦Ｘ＜５であり、０≦Ｙ≦１００、好ましくは０≦Ｙ≦５０、より好ましくは０≦Ｙ≦１０、さらに好ましくはＹ＝０である場合；
５≦Ｘ＜６であり、０≦Ｙ≦１５０、好ましくは０≦Ｙ≦１００、より好ましくは０≦Ｙ≦５０、さらに好ましくはＹ＝０である場合；及び
６≦Ｘ≦８であり、０≦Ｙ≦３００，好ましくは、０≦Ｙ≦１５０、より好ましくは、０≦Ｙ≦１００である場合。
【００６０】
濾過前溶液のｐＨの調整は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等の緩衝液成分の選択及び増減、ＮａＯＨ等のアルカリの添加、ＨＣｌ等の酸の添加により行うことができる。濾過前溶液の塩のイオン強度の調整は、ＮａＣｌ、緩衝塩等の塩の増減により行うことができる。また、濾過前溶液のｐＨ及び塩のイオン強度の測定も、当業者に公知の手法で行うことができる。
【００６１】
工程（ｑ）において濾過される濾過前溶液としては、濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、上記式１及び式５、又は式４及び式５を満たす限り特に限定されないが、上述のウイルス含有タンパク質溶液のほか、緩衝液（例えば後述する洗浄用緩衝液）、水等が挙げられる。緩衝液の組成も特に限定されず、上述の緩衝液成分のほか、上述の塩基性アミノ酸、無機塩、界面活性剤、糖類等を含んでいてもよい。工程（ａ）におけるウイルス含有タンパク質溶液と重複する成分を含むことが好ましい。
【００６２】
本実施の形態の一態様において、工程（ｑ）における濾過前溶液は、ウイルス含有タンパク質溶液であり、濾過工程（ａ）で濾過される全ウイルス含有タンパク質溶液の５０％以上が低圧濾過工程（ｑ）で濾過される。
【００６３】
一般に、小孔ウイルス濾過膜を用いたウイルス含有タンパク質溶液の濾過は、処理効率を高めるよう、できるだけ高い濾過圧力で行うが、低い濾過圧力での濾過が好ましいタンパク質もある。このようなタンパク質の一例としては、抗体が挙げられる。抗体としては、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体が挙げられる。このようなタンパク質を含む場合、濾過工程（ａ）で濾過される全ウイルス含有タンパク質溶液の５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が低圧濾過工程（ｑ）で濾過されることが望ましい。
【００６４】
本実施の形態の一態様において、濾過工程（ａ）で濾過される全ウイルス含有タンパク質溶液の全てが低圧濾過工程（ｑ）で濾過される場合、濾過工程（ａ）は、小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下でウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る工程であり、濾過工程（ａ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たす。
この場合の濾過圧力、式１、式４及び式５に関しては、工程（ｑ）について記載したとおりである。また、このような濾過に適したウイルス含有タンパク質溶液は、モノクローナル抗体溶液である。
【００６５】
本実施の形態の一態様において、濾過工程（ａ）は、上記の低圧濾過工程（ｑ）に先立って行われる以下の工程（ｐ）：
（ｐ）小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2超でウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る高圧濾過工程；
を含む。工程（ｐ）は、工程（ｑ）と同様、上記の工程（ａ）に含まれる工程であり、工程（ａ）のうち、０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下より高い濾過圧力で濾過を行う工程を指す。
工程（ｐ）における、小孔ウイルス除去膜、ウイルス含有タンパク質溶液及び濾過方法は、上記工程（ａ）について説明したとおりである。
【００６６】
工程（ｐ）における濾過圧力は、小孔ウイルス除去膜の材質にもよるが、０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2より高く、膜の耐圧力以下の範囲であれば特に限定されない。例えば、セルロースからなる小孔ウイルス除去膜の場合は、０．５０ｋｇｆ／ｃｍ2（４．９×１０ｋＰａ）〜１．００ｋｇｆ／ｃｍ2（９．８×１０ｋＰａ）の範囲が最適である。親水化ＰＶＤＦ、親水化ＰＥＳ又は親水化ＰＳからなる小孔ウイルス除去膜の場合、１．００ｋｇｆ／ｃｍ2（９．８×１０ｋＰａ）〜５．００ｋｇｆ／ｃｍ2（４.９×１０２ｋＰａ）の範囲が最適である。
【００６７】
小孔ウイルス濾過膜を用いたウイルス含有タンパク質溶液の継続濾過（処理効率を高めるよう、できるだけ高い濾過圧力で行われる）を行うと、濾過量に伴って膜の内部（濾液と反対側）にタンパク質粒子が残存し、目詰まりが生じる場合がある。そこで、タンパク質を含まない溶液（洗浄液）を濾過することにより、膜内部のタンパク質を濾液側に洗い出す、ポストウォッシュ工程と呼ばれる作業が行われることがある。本実施形態において、ポストウォッシュ工程とは、小孔ウイルス除去膜の内部に残存したタンパク質の回収のため、タンパク質濾過の後で追加的に行われる濾過のことである。ポストウォッシュ工程を行う場合、タンパク質含有溶液の代わりに洗浄液を濾過するために、濾過前溶液を導入するラインを切り替える。この切り替えの際、濾過圧力が高いままであると、洗浄液側に溶液が逆流するため、一度濾過圧力を開放し、０．０ｋＰａにする。ライン切り替え後、再度濾過圧力をかけて洗浄液を濾過する。圧力をゼロにしてから、再度濾過圧力をかけて洗浄液の濾過を開始するまでの時間は特に限定されない。圧力降下が充分に起こるのは、例えば、５秒以上であり、１分以上、５分以上、３０分以上の時に、より充分に圧力降下が起きる。また、作業性の観点から、例えば、７日以内、５日以内、３日以内、または２４時間以内に開始される場合が多い。ライン切り替えの際、濾過圧力が一時的に下がるため、濾過前溶液の組成によってはウイルスが濾液側に漏れ出す。このウイルスの漏れは、上述したように工程（ｑ）により防ぐことができる。
【００６８】
すなわち、本実施の形態の一態様において、上記の工程（ｐ）を行う過程で膜の内部に残存したタンパク質粒子を、低圧濾過工程（ｑ）を含むポストウォッシュ工程により洗浄する。低圧濾過工程（ｑ）がポストウォッシュ工程（の一部）である場合、工程（ｑ）における濾過前溶液は、タンパク質を含まない洗浄液であることが好ましい。洗浄液の組成は特に限定されないが、工程（ａ）又は（ｐ）におけるウイルス含有タンパク質溶液と重複する成分を含むことが好ましく、洗浄用緩衝液であることがより好ましい。洗浄用緩衝液とは、工程（ａ）におけるウイルス含有タンパク質溶液を製造する際にタンパク質を溶解する緩衝液である。ポストウォッシュ工程は、必要に応じて複数回行うことができる。
【００６９】
なお、工程（ａ）がポストウォッシュ工程を含む場合、濾過工程（ａ）前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と濾過後のウイルス除去タンパク質溶液中のウイルス濃度（ＣF）から上記の式６を用いて算出されるＬＲＶが４以上（好ましくは５以上）であり、濾過工程（ａ）前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と、濾過工程（ａ）後の洗浄用緩衝液濾液中のウイルス濃度（Ｃw）から以下の式７：
ＬＲＶ’＝ｌｏｇ10（Ｃ0／Ｃw）    （式７）
を用いて算出されるＬＲＶ’が４以上（好ましくは５以上）であることが好ましい。ウイルス濃度は、式６について上述した手法を用いて測定することができる。
【００７０】
なお、上記式７において、濾過工程（ａ）後の洗浄用緩衝液濾液中のウイルス濃度（Ｃw）とは、ポストウォッシュ工程で濾過する洗浄用緩衝液の濾液のみのウイルス濃度を指す。小孔ウイルス濾過膜内部には、ポストウォッシュ工程前に濾過したウイルス含有タンパク質溶液由来のウイルスが残存しており、低い濾過圧力での濾過を含むポストウォッシュ工程において、濾過前溶液のｐＨ及び塩のイオン強度によっては洗浄用緩衝液濾液中にウイルスが漏れ出すことがある。濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が上記式１及び式５、又は式４及び式５を満たすよう調整することにより、ポストウォッシュ工程においてもウイルスの漏れを防ぐことができる。
【００７１】
また、ポストウォッシュ工程と同様、ウイルス除去膜で濾過する際の濾過圧力が下がる場合として、濾過中に加圧が一旦中断し、その後、加圧が再開するケースを含む工程（ストップ・アンド・スタート工程）が挙げられる。例として、小孔ウイルス濾過膜を用いたウイルス含有タンパク質溶液の濾過の際、電源が落ちる等の事情により濾過圧力がかからなくなり、その後再度電源を入れることで濾過圧力がかかるようになる事態が考え得る。圧力がゼロになってから、再度濾過圧力をかけて洗浄液の濾過を開始するまでの時間は特に限定されない。圧力降下が充分に起こるのは、例えば、５秒以上であり、１分以上、５分以上、３０分以上の時に、より充分に圧力降下が起きる。また、作業性の観点から、例えば、７日以内、５日以内、３日以内、または２４時間以内に開始される場合が多い。このような場合にも、一旦濾過圧力が下がるため、濾過前溶液の組成によってはウイルスが濾液側に漏れ出す場合がある。このウイルスの漏れは、上述したように工程（ｑ）により防ぐことができる。
【００７２】
すなわち、本実施の形態の一態様において、上記の工程（ｐ）を行っていて濾過圧力が下がった場合、濾過前溶液中のｐＨ（Ｘ）と塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が所定の範囲にある低圧濾過工程（ｑ）を行うことにより、ウイルス除去タンパク質溶液を確実に得ることができる。
【００７３】
本実施の形態の一態様において、濾過工程（ａ）が上記の低圧濾過工程（ｑ）に先立って行われる工程（ｐ）を含む場合、工程（ｑ）における濾過圧力がほぼ０．０ｋＰａになる場合が含まれていてもよい。例えば、上述のポストウォッシュ工程において、濾過前溶液を導入するラインを切り替える場合や、ストップ・アンド・スタート工程で電源が落ちた場合に、濾過圧力がほぼ０．０ｋＰａになり得る。この場合、再加圧の仕方は、小孔ウイルス除去膜と濾過前溶液供給容器間を閉止後、供給容器側の圧力を、工程（ａ）について記載した最適な濾過圧力に設定後、小孔ウイルス除去膜と濾過前溶液供給容器間を開放し、一定圧で濾過することもできるし、小孔ウイルス除去膜と濾過前溶液供給容器間を開放し、徐々に所定圧力まで上げながら濾過することもできる。例えば濾過圧力が０．０ｋＰａになる放置時間（低い濾過圧力での濾過が行われる時間）を３時間として、その後再加圧して濾過をおこなった際のウイルス除去率を目安にすると、３時間より短い放置時間におけるウイルス除去率は、３時間の場合より高いと予想される。
【００７４】
本実施の形態のウイルス除去タンパク質製剤の製造方法において、工程（ａ）に先立って、小孔ウイルス除去膜の孔径サイズよりも大きい孔径の膜からなるフィルターで予備濾過をすることもできる。ここで大きい孔径のフィルターとしては、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）３５Ｎ，Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）７５Ｎ（以上旭化成メディカル社製）、０．１μｍフィルター、０．２μｍフィルター等を用いることができる。予備濾過なしに、直接、小孔ウイルス除去膜を用いて工程（ａ）を行うこともできる。
【００７５】
工程（ａ）に先立って、クロマトグラフィー処理、Ｓ／Ｄ処理、濃縮処理及び濃縮／バッファー交換処理のいずれか１以上を行ってもよい。
【００７６】
クロマトグラフィー処理としては、イオン交換樹脂、ゲル濾過樹脂をカラムに詰めたカラムクロマトグラフィー、多孔膜の表面にイオン交換基を付与したメンブレンクロマトグラフィーが例示できる。クロマトグラフィーの分離モードとしては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換：ＣＥＸ、陰イオン交換：ＡＥＸ）、疎水クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティクロマトグラフィー、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。クロマトグラフィーのリガンドとしてイオン交換と疎水相互作用を複合させたクロマトグラフィーを用いてもよい。
【００７７】
Ｓ／Ｄ処理は、公知の方法に従って、有機溶媒としてＴＮＢＰ（ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０等を用いて、ウイルスを不活化することにより行うことができる。
【００７８】
濃縮処理は、公知の方法に従って、限外濾過（ＵＦ）膜を用いた方法で行なうことができる。遠心濃縮により行なうことができる。
【００７９】
バッファー交換処理は、公知の方法に従って、限外濾過膜を用いて濃縮と同時に行なうこともできる。ゲル濾過法により行なうこともできる。透析膜を用いた透析法によっても行なうことができる。
【００８０】
工程（ａ）に引き続き、得られたウイルス除去タンパク質溶液について、クロマトグラフィー処理による精製処理をすることができる。また、ＵＦ処理によりさらに高濃度化することもできる。工程（ａ）で得られたウイルス除去タンパク質溶液、その精製物又は濃縮物について、そのままの液組成で最終製剤化することもできる。また、糖類や界面活性剤等を添加し、最終製剤化することもできる。他の組成の溶媒と、バッファー交換することもできる。また、さらに凍結乾燥処理することもできる。
【００８１】
本実施の形態は、一態様において、以下の工程（ａ）：
（ａ）小孔ウイルス除去膜を用いてウイルス含有タンパク質溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る濾過工程；
を含むウイルス除去タンパク質製剤の製造方法であって、濾過工程（ａ）が、以下の工程
（ｑ）：
（ｑ）小孔ウイルス除去膜を用いて、濾過圧力０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下で溶液を濾過してウイルス除去タンパク質溶液を得る低圧濾過工程；
を含み、低圧濾過工程（ｑ）に先立って、工程（ｑ）における濾過前溶液のｐＨ（Ｘ）及び塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））が、以下の式１及び式５：
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０    （式１）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
又は、以下の式４及び式５：
Ｙ＝０    （式４）
３．５≦Ｘ≦８．０    （式５）
を満たすよう調整する工程を含む方法にも関する。
【００８２】
本実施の形態は、上記の製造方法で得られるウイルス除去タンパク質製剤にも関する。本実施の形態はまた、上記の工程（ａ）（工程（ｑ）を含む）を行うことを特徴とする、ウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス除去方法にも関する。
【実施例】
【００８３】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。【００８４】
以下に示す実施例では、小孔ウイルス除去膜として、セルロース中空糸膜からなるＰｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ（旭化成メディカル株式会社製）を用いた。ｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定した。塩のイオン強度は各溶液調整の際に用いた塩の量（塩濃度）から算出した。【００８５】
（ｉ）タンパク質溶液の調製
ポリクローナル抗体(ヒトＩｇＧ)(ヴェノグロブリン−ＩＨ、ベネシス社製)を用いて、抗体濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように注射用水（大塚製薬）で希釈した。また、以下の各実施例に示した塩のイオン強度になるように１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を用いて調製した。さらに、ｐＨは０．１Ｍ  ＨＣｌ又は０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、以下の各実施例に示したｐＨになるように調整した。【００８６】
（ｉｉ）ウイルス除去率（ＬＲＶ）の測定
培養したＰＫ-１３細胞（ＡＴＣＣより入手、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−６４８９）を、牛血清（Ｕｐｓｔａｔｅ社製、５６℃の水浴で３０分間加熱し、非働化させた後に使用）３体積％及びペニシリン／ストレプトマイシン（＋１００００  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、＋１００００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、インビトロジェン製）１体積％含有Ｄ−ＭＥＭ（インビトロジェン製、ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）（この混合液は以後「３％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭ」と記載）で希釈し、細胞濃度２．０×１０5（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の希釈懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、９６ｗｅｌｌ丸底細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）を１０枚準備し、全てのｗｅｌｌに１００（μＬ）ずつ分注した。【００８７】
次いで、下記各実施例で濾過を行った濾液について、それらの３％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭによる１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍及び１０5倍希釈液を調製した。さらに、濾過直前に採取した各元液（ウイルス含有タンパク質溶液）について、それらの３％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭによる１０2倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍及び１０7倍希釈液を調製した。上記細胞懸濁液を分注した９６ｗｅｌｌ細胞培養プレートに、各濾液及び濾液の１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍及び１０5倍希釈液と、元液の１０2倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍及び１０7倍希釈液を、それぞれ８ｗｅｌｌに１００（μＬ）ずつ分注し、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下、インキュベーター中で、１０日間培養した。【００８８】
次いで、１０日間培養した上記の細胞培養プレートに対し、赤血球吸着法（ウイルス実験学  総論  国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．１７３参照）によるＴＣＩＤ５０（５０％感染価）の測定を行った。ニワトリ保存血（日本バイオテスト製）をＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社製、製品に添付の説明書に記載の方法で調製）で５倍に希釈後、２５００（ｒｐｍ）、４℃で５分間遠心分離し赤血球を沈殿させた後、上清を吸引除去して、得られた赤血球を含む沈殿物を再度上記ＰＢＳ（−）で２００倍に希釈した。【００８９】
次いで、調製した赤血球沈殿物のＰＢＳ（−）希釈液を、上記細胞培養プレートの全ｗｅｌｌに１００（μＬ）ずつ分注し、２時間静置した後、培養した細胞組織の表面に対する赤血球の吸着の有無を目視で確認し、吸着が確認されたものをウイルス感染が起きたｗｅｌｌ、吸着が確認されなかったものを感染なしのｗｅｌｌとして数えた。得られた培養液ごとのウイルス感染の有無について、濾液又はその各希釈液、あるいは元液の各希釈液ごとに割合を確認し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（ウイルス実験学  総論  国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．４７９−４８０参照）により、感染価としてｌｏｇ（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）を算出し、以下の式を用いてウイルス除去率ＬＲＶを算出した。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ10（Ｃ0／ＣF）
ここで、
Ｃ0＝小孔ウイルス除去膜で濾過する前の元液（ウイルス含有タンパク質溶液）中の感染価；
ＣF＝小孔ウイルス除去膜で濾過した後の溶液中の感染価；
である。【００９０】
（実施例１：異なる濾過圧力でのウイルス除去膜を用いた濾過）
上記の（ｉ）に記載の方法で、ｐＨ４、４．６、５、６、７又は８、塩のイオン強度は全て１００ｍＭの各タンパク質溶液（ポリクローナル抗体溶液）を調製した（実験例１〜１６）。その後、それぞれにＰＰＶ（ブタパルボウイルス、社団法人  動物用生物学的製剤協会、以下実施例２〜４についても同様）を０．５ｖｏｌ％添加し、よく攪拌してウイルス含有タンパク質溶液を得た。
得られた各溶液について、膜面積０．００１ｍ2の小孔ウイルス除去膜（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を用いて、０．１０、０．２０、０．５０又は０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2の濾過圧力でデッドエンドフィルトレーションを、濾過量が５０Ｌ／ｍ2に到達するまで行った。濾過圧力は供給液容器側に圧力計を設置して測定した。５０Ｌ／ｍ2  ｐｏｏｌでのＰＰＶの除去率を上記（ｉｉ）に記載の方法で測定した。【００９１】
各濾過圧力及びｐＨと、ウイルス除去率（ＬＲＶ）との関係を、以下の表１に示す。表１に示す通り、濾過圧力が高い場合にはｐＨが変化してもウイルス除去率は高く維持されていたが、濾過圧力が低い場合、濾過前のウイルス含有タンパク質溶液のｐＨ低下に伴って、ウイルス除去率が低下し、ウイルスが漏れ出すことが明らかになった。
【表１】
2012176876.tif 000003
【００９２】
（実施例２：ｐＨ及び塩のイオン強度の異なるウイルス含有タンパク質溶液の低圧継続濾過）
上記（ｉ）の方法で、表１に実験例１７〜３１として示すｐＨ及び塩のイオン強度の各タンパク質溶液（ポリクローナル抗体溶液）を調製した。その後、それぞれにＰＰＶ（ブタパルボウイルス）を０．５ｖｏｌ％添加し、よく攪拌してウイルス含有タンパク質溶液を得た。
得られた各溶液について、膜面積０．００１ｍ2の小孔ウイルス除去膜（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を用いて０．２０ｋｇｆ／ｃｍ2（２．０×１０ｋＰａ）の濾過圧力でデッドエンドフィルトレーションを、濾過量が５０Ｌ／ｍ2に到達するまで行った。濾過圧力は供給液容器側に圧力計を設置して測定した。５０Ｌ／ｍ2  ｐｏｏｌでのＰＰＶの除去率（ＬＲＶ）を上記（ｉｉ）に記載の方法で測定し、結果を表２に示した。【００９３】
表２に示す通り、濾過圧力が低く、濾過前のウイルス含有タンパク質溶液のｐＨが低い場合でも、塩のイオン強度によってはウイルスの濾液側への漏れがなく、ウイルス除去率が高いことが明らかになった。【００９４】
【表２】
2012176876.tif 000004
【００９５】
また、表２に示した結果から、低い濾過圧力での小孔ウイルス除去膜を用いたウイルス含有タンパク質溶液の濾過において、ウイルスの漏れを生じない場合の溶液中のｐＨ（Ｘ）と塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））との間には、相関があることが明らかになった。濾過前溶液中のｐＨ（Ｘ）と塩のイオン強度（Ｙ（ｍＭ））について、下記の関係式が成り立つ。なお、下記式１〜３で示されるＸとＹの関係を、図１に図示した。【００９６】
ＬＲＶ４以上となるＸ及びＹの範囲は、以下の式１又は式４を満たす（実験例１８（ｐＨ４、塩のイオン強度１０ｍＭ）と実験例２１（ｐＨ４．６、塩のイオン強度１００ｍＭ）の結果に基づく）。
０≦Ｙ≦１５０Ｘ−５９０      （式１）
Ｙ＝０    （式４）【００９７】
ＬＲＶ５以上となるＸ及びＹの範囲は、以下の式２又は式４を満たす（実験例２４（ｐＨ５、塩のイオン強度５０ｍＭ）と実験例２７（ｐＨ６、塩のイオン強度１００ｍＭ）の結果に基づく）。
０≦Ｙ≦５０Ｘ−２００      （式２）
Ｙ＝０    （式４）【００９８】
ＬＲＶに≧がつく場合（上記ＬＲＶの算出式において、ＣF（＝小孔ウイルス除去膜で濾過した後の溶液中の感染価）が検出限界以下である場合）のＸ及びＹの範囲は、以下の式３又は式４を満たす（実験例２２（ｐＨ５、塩のイオン強度０ｍＭ）と実験例２９（ｐＨ７、塩のイオン強度１００ｍＭ）の結果に基づく）。
Ｙ≦５０Ｘ−２５０    （式３）
Ｙ＝０    （式４）【００９９】
なお、一般に、小孔ウイルス濾過膜のウイルス除去率は、濾過前のタンパク質の種類に影響を受けにくいため、ポリクローナル抗体溶液以外のタンパク質溶液を用いた場合でも、同様の結果が得られると考えられた。また、濾過圧力が０．２０ｋｇｆ／ｃｍ2付近、例えば０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2以下、より特定すれば０．１０ｋｇｆ／ｃｍ2〜０．３０ｋｇｆ／ｃｍ2、さらに特定すれば０．１５ｋｇｆ／ｃｍ2〜０．２５ｋｇｆ／ｃｍ2の場合には、同様の結果が得られると考えられた。【０１００】
（実施例３：ポストウォッシュ工程を含む、小孔ウイルス除去膜による濾過）
上記（ｉ）の方法で、表３に実験例３２〜３４として示すｐＨ及び塩のイオン強度の各タンパク質溶液（ポリクローナル抗体溶液）を調製した。その後、それぞれにＰＰＶ（ブタパルボウイルス）を０．５ｖｏｌ％添加し、よく攪拌してウイルス含有タンパク質溶液を得た。
得られた各溶液について、膜面積０．００１ｍ2の小孔ウイルス除去膜（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を用いて０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2（７．８×１０ｋＰａ）の濾過圧力で、デッドエンドフィルトレーションを、濾過量が１００Ｌ／ｍ2に到達するまで行った（Virus  Filtration画分と呼ぶ）。濾過圧力は供給液容器側に圧力計を設置して測定した。
所定濾過量まで到達後、供給液容器出口ラインを閉止し、その後、まず、供給液側（外部）の圧力を０．０ｋＰａになるまで開放した。さらに、濾過膜の一次側（膜を介して供給液側）の出口側ラインを開放し、濾過膜内の圧力も０．０ｋＰａに開放後、３時間放置した。
次に、ポリクロナール抗体を用いない以外は上記（ｉ）と同様の方法で、表３に実験例３２〜３４として示すｐＨ及び塩のイオン強度の洗浄液（ウイルス非含有）を調整した。さらに、上記の洗浄液が入った供給液容器に切り替え、供給液容器出口ラインを閉止したまま、０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2まで加圧したのち、供給液容器出口ラインを開き、洗浄液を、放置後の小孔ウイルス除去膜を用いて０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2（７．８×１０ｋＰａ）の圧力で５Ｌ／ｍ2濾過した（Post-wash画分と呼ぶ）。
Virus  Filtration画分のＬＲＶを上記（ｉｉ）に記載の方法で算出し、結果を表３に示した。また、Post-wash画分のみのＬＲＶ’を、濾過前のウイルス含有タンパク質溶液中のウイルス濃度（Ｃ0）と、洗浄液のみ濾過後の洗浄液濾液中のウイルス濃度（Ｃw）から、以下の式７：
ＬＲＶ’＝ｌｏｇ10（Ｃ0／Ｃw）    （式７）
を用いて算出し、結果を同様に表３に示した。
実験例３４では、Virus Filtration画分のＬＲＶは高いにもかかわらず、Post-wash画分のＬＲＶ’が低くなっていることから、低い濾過圧力（濾過圧力０．０ｋＰａ）での濾過を含むPost-wash画分にウイルスが漏れ出ていることが明らかになった。一方、実験例３２及び３３では、このような低い濾過圧力での濾過を含む場合でもウイルス除去率が高かった。【０１０１】
【表３】
2012176876.tif 000005
【０１０２】
（実施例４：ストップ・アンド・スタート工程を含む、小孔ウイルス除去膜による濾過）
上記（ｉ）の方法で、表３に実験例３５〜３７として示すｐＨ及び塩のイオン強度の各タンパク質溶液（ポリクローナル抗体溶液）を調製した。その後、それぞれにＰＰＶ（ブタパルボウイルス）を０．５ｖｏｌ％添加し、よく攪拌してウイルス含有タンパク質溶液を得た。
得られた各溶液について膜面積０．００１ｍ2の小孔ウイルス除去膜（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を用いて０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2（７．８×１０ｋＰａ）の圧力で、デッドエンドフィルトレーションを、濾過量が１００Ｌ／ｍ2に到達するまで行った（Virus  Filtration画分と呼ぶ）。濾過圧力は供給液容器側に圧力計を設置して測定した。
所定濾過量まで到達後、供給液容器出口ラインを閉止し、その後、まず、供給液側（外部）の圧力を０．０ｋＰａになるまで開放した。さらに、濾過膜の一次側（膜を介して供給液側）の出口側ラインを開放し、濾過膜内の圧力も０．０ｋＰａに開放後、３時間放置した。
次に、供給液容器出口ラインを閉止し、０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2まで加圧したのち、供給液容器出口ラインを開き、ウイルス含有タンパク質溶液を、再度、放置後の小孔ウイルス除去膜を用いて０．８０ｋｇｆ／ｃｍ2（７．８×１０ｋＰａ）の圧力で１０Ｌ／ｍ2濾過した（Stop&Start画分と呼ぶ）。
Virus  Filtration画分のＬＲＶ及びStop&Start画分のＬＲＶを上記（ｉｉ）に記載の方法で算出し、結果を表４に示した。実験例３７では、Virus Filtration画分のＬＲＶは高いにもかかわらず、Stop&Start画分のＬＲＶが低くなっていることから、低い濾過圧力（濾過圧力０．０ｋＰａ）での濾過を含むStop&Start画分にウイルスが漏れ出ていることが明らかになった。一方、実験例３５及び３６では、このような低い濾過圧力での濾過を含む場合でもウイルス除去率が高かった。【０１０３】
【表４】
2012176876.tif 000006
【０１０４】
以上の実施例１〜４の結果、低い濾過圧力での濾過を含む場合であっても、ウイルス含有タンパク質溶液の小孔ウイルス除去膜を用いた濾過において、高いウイルス除去率（ＰＰＶのＬＲＶ  ４以上）を満たすことができる、濾過前溶液のｐＨ及び塩のイオン強度の範囲を見出した。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明によれば、低い濾過圧力下での濾過工程を含む、小孔ウイルス除去膜を用いたウイルス除去タンパク質製剤の製造において、ウイルス除去率の高いタンパク質製剤を提供することができる。従って、例えば、濾過圧力を低圧に固定してのタンパク質溶液の濾過、ポストウォッシュ工程を含む濾過、ストップ・アンド・スタート工程を含む濾過においても、ウイルス除去率の高いタンパク質製剤を提供することができるという産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2012176876.tif 000007
【国際調査報告】
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2012176876.tif 000009
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