(57)【要約】  血管新生を伴わず、側副血行路の発達促進を介して四肢循環障害部位の血流を改善する化合物を提供すること、及び四肢循環障害部位の血流を改善する化合物を有効成分とする冷え性又は冷感の治療剤を提供すること。  （−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする側副血行路発達促進剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする側副血行路発達促進剤。
【請求項２】
側副血行路の発達促進が、血管新生に基づかない請求項１に記載の側副血行路発達促進剤。
【請求項３】
側副血行路発達促進剤が、四肢循環障害部位の血流を改善するための側副血行路発達促進剤である、請求項１又は２に記載の側副血行路発達促進剤。
【請求項４】
（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする冷え性の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする四肢骨格筋血流改善剤、より詳細には四肢骨格筋の側副血行路発達促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の欧米化による生活習慣病の増加に伴い、末梢動脈疾患（Peripheral Arterial Disease：ＰＡＤ）の罹患率が増加している。ＰＡＤの主な疾患として、動脈硬化を原因とした閉塞性動脈硬化症（Arteriosclerosis Obliterans：ＡＳＯ）と、血管炎を原因とした閉塞性血栓血管炎（Thromboangiitis Obliterans：ＴＡＯ、別名バージャー病）がある。慢性動脈閉塞症のほとんどを占めるＡＳＯは、動脈硬化により四肢末梢動脈が慢性的に狭窄・閉塞したために循環障害を来した病態であり、虚血性の臨床症状（冷感、間歇性跛行、しびれ感、安静時疼痛）を示す。その発症・進展の中心には血管内皮細胞の障害があり、種々の生理活性物質のバランスの異常が深く関わっている。さらに、ＰＡＤは重篤化により重症下肢虚血（Critical Limb Ischemia：ＣＬＩ）へ至り、血行再建術を施行せずに経過すると栄養障害性潰瘍や壊疽に進展し、いずれは下肢切断に至る。下肢の切断はQuality of Life（ＱＯＬ）を著しく低下させ、予後も悪化させる。【０００３】
ＡＳＯの臨床症状としては間歇性跛行が最も多く、ＡＳＯ患者の約１／３には典型的な跛行がある。間歇性跛行患者においては、安静時における血流は正常であるが、運動時には筋血流増加が制限されるため、跛行症状と関連のある酸素供給と筋代謝の不均衡が生じて歩行障害の一因となる。運動（歩行）機能と、下肢血流には密接な関係があると言われており、臨床では、トレッドミル運動の前後における足関節上腕血圧比（ＡＢＩ：ankle-brachial index）、下肢血流、筋肉内酸素飽和度等を測定することによって、病態の診断や治療効果の確認に用いられている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。【０００４】
薬物によるＡＳＯの治療目標は、虚血性の臨床症状を緩和し、その進行を抑制すると共に、全身的には他臓器における動脈硬化やそのリスクファクターを改善し、心血管イベントを抑制することにある。特に、患者数の最も多い間歇性跛行については、歩行能力の低下により日常生活の活動性やＱＯＬが著しく損なわれることから、運動能力及びＱＯＬの改善は極めて重要である。そこでＰＡＤの治療には、禁煙、及び糖尿病、脂質異常症、高血圧、高ホモシステイン血症等の危険因子をコントロールするほか、運動療法、薬物療法、血管閉塞部位における血管再建を目的とした外科的な手術等が行われている。また跛行の適切な治療には、下肢血行動態の改善と続発する致死的あるいは非致死的心血管イベントのリスクを減少させることが理想的とされている（非特許文献１参照）。【０００５】
血小板の活性化がプラーク崩壊によるアテローム性動脈硬化症や塞栓形成の進展に関与しているとする報告が多数存在する（非特許文献４、非特許文献５参照）。しかしながら、アスピリンやＰ２Ｙ１２阻害剤のような抗血小板剤が間歇性跛行の治療に有益な効果があることを報告した論文はない。非特許文献１によると、ホスホジエステラーゼ３（Phosphodiesterase 3：ＰＤＥ３）阻害剤シロスタゾール及び５−ＨＴ２拮抗薬ナフチドロフリルが間歇性跛行の選択薬として推奨されているが、ナフチドロフリルは既に製造販売が中止されていることから、シロスタゾールが唯一の選択薬と言える。【０００６】
重症虚血肢に対する外科的治療は著しく進歩しているが、外科的治療が困難な症例や適応にならない症例では下肢切断に至る可能性が高く、このような重症例に対する新しい治療法として、血管新生療法（therapeutic angiogenesis）が注目を集めている。血管新生療法は、血管増殖因子やその遺伝子、あるいは骨髄や末梢血細胞などを用いて、血管新生を誘導することにより側副血行路の発達を促進させ、虚血状態を改善する治療法である。血管増殖因子であるＶＥＧＦ、ＨＧＦ及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などは強力な血管内皮細胞増殖作用を有しており、虚血などの刺激により誘導され、新しい毛細血管網の形成を促進する。ＶＥＧＦなどによる血管新生には、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを介したｅＮＯＳの活性化によるＮＯ産生の増加及びＥＰＣの末梢血中への動員が関与していると考えられている。また、ｅＮＯＳの活性化はｃＡＭＰ／ＰＫＡの活性化やｍＲＮＡの安定化によっても誘導される。脂質低下薬のスタチンはｅＮＯＳの活性化が提唱されており、ウサギの下肢虚血モデルではスタチンによる血管新生を介した虚血改善効果も報告されている。また、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ：human aortic endothelial cells)を用いたin vitroの実験において、シロスタゾールがｃＡＭＰ／ＰＫＡ及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを介してｅＮＯＳをリン酸化し、ＮＯ産生を増加させることにより内皮細胞の管腔形成を促進することが示されており、それらの効果が血管新生の促進に関与している可能性が示唆されている（非特許文献６参照）。また、下肢虚血マウスにおいて、シロスタゾールの長期投与により、下肢筋肉における血管密度の上昇が見られることが報告されていることから（非特許文献７参照）、シロスタゾールは、血管新生作用、あるいは、虚血による血管密度減少に対する抑制作用を有することが可能性として考えられる。【０００７】
一方、末梢の循環系においては、普段は血流がない血管が存在し、末梢での動脈から静脈への血流が詰まった場合、これらの血管がやがては第３の血管ともいうべき側副血行路へ発達するということが知られている（非特許文献８）。このように血管新生とは異なる側副血行路の発達促進による血流改善もＰＡＤの有効な治療方法になると考えられる。しかしながら、シロスタゾールには、血管新生作用を有する可能性が指摘されているが、血管新生作用に基づかない側副血行路の発達促進といった作用は知られていない。【０００８】
冷え性及び冷感は、言い換えると「血行不良」とも言え、動脈硬化などにより毛細血管まで血液が回らない、あるいは気温により毛細血管が縮んでしまい、元に戻らず血行が悪くなり、血液が行き届きにくく、特に手足が冷えているように感じる状態である。自律神経の機能低下、低血圧、貧血なども血流を悪くし、冷え性の原因となる。いずれにしても血流が悪くなるため毛細血管までエネルギーが行き渡らなくなり、「冷える状態」となる。血行不良による頭痛、肩こり、肌荒れ、下痢や腹痛、自律神経の不調による胃もたれ、生理不順といった症状も現れる。【０００９】
一方、次式（１）：【００１０】
【化１】
2013103148.tif 000002
【００１１】
で示される、（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン（以下、「化合物１」と表記することがある。）は、抗血小板作用、抗血栓作用やＰＤＥ３阻害作用を有し、適用対象としては、脳粥状硬化、脳梗塞、一過性脳虚血発作、回復型虚血性神経脱落症等の脳疾患、心筋梗塞、狭心症等の心疾患、バージャー病、閉塞性動脈硬化症、間歇性跛行等の慢性動脈閉塞症、糖尿病性神経症、糖尿病性皮膚潰瘍、糖尿病性腎症等の糖尿病合併症、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、方向性冠動脈粥腫切除術（ＤＣＡ）やステントのインターベンション処置後の再狭窄防止、人工血管等の人工臓器や腎等の移植処置後の再閉塞の防止、また手術後、人工腎透析等の体外循環時の血栓、塞栓の発生防止等の虚血性疾患等が知られている（非特許文献９、特許文献１）。しかしながら、四肢の側副血行路発達促進作用や冷え性、冷感に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ９７／０１２８６９号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】下肢閉塞性動脈硬化症の診断・治療指針II (TASC II) 2007, 日本脈管学会編
【非特許文献２】J. Jpn. Coll. Angiol. 45, 312-316 (2005)
【非特許文献３】日本血栓止血学会誌, 19(1), 45-47 (2008)
【非特許文献４】Atherosclerosis., 187, 221-237 (2006)
【非特許文献５】J Intern Med., 263, 517-527 (2008)
【非特許文献６】Atherosclerosis., 189, 350-357 (2006)
【非特許文献７】Eur J Vasc Endovasc Surg. 2011 Aug 16. [Epub ahead of print]
【非特許文献８】Annals of the Royal College of Surgeons of England, 161-176 (1953)
【非特許文献９】Biochem. Biophys. Research. Commun., 353(4), 1111-1114 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、血管新生を伴わず、側副血行路の発達促進を介して四肢循環障害部位の血流を改善する化合物を提供することにある。また、本発明は、四肢循環障害部位の血流を改善する化合物を有効成分とする冷え性又は冷感の治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、前記式（１）で示される化合物が、血管新生を伴わず、側副血行路の発達促進を介して四肢循環障害部位の血流を改善することを見出し、本発明を完成した。【００１６】
すなわち、本発明は、（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン（化合物１）若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする四肢の血流改善剤を提供するものである。より好ましくは、化合物１若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする側副血行路発達促進剤、好ましくは四肢循環障害部位の血流を改善するための側副血行路発達促進剤、より好ましくは下肢循環障害部位の血流を改善するための側副血行路発達促進剤を提供するものである。さらに好ましくは、化合物１若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする血管新生に基づかない側副血行路発達促進剤を提供するものである。【００１７】
また、本発明は、（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする冷え性の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の（−）−６−［３−［３−シクロプロピル−３−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］プロポキシ］−２（１Ｈ）−キノリノン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物は、後記実施例に示すとおり、後肢骨格筋血流改善作用、特に血管新生を介さない後肢骨格筋側副血行路発達促進作用を示し、末梢動脈疾患に伴う症状、例えば、冷え性や冷感の予防又は治療に有用である。
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の治療法として歩行訓練などの運動療法があげられているが（非特許文献３参照）、歩行訓練により側副血行路が発達し、これにより血流の改善がなされるとされている。本発明の化合物１は、薬物の投与による側副血行路の発達を促進するものであり、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の新たな治療方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の増殖能に対する化合物１の作用の検討結果を示す図である。値は平均値±標準誤差（ｎ＝３）で示した。
【図２】図２は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管腔形成に対する化合物１の作用の検討結果を示す写真である。
【図３】図３は、ＨＵＶＥＣの管腔形成に対する化合物１の作用の検討結果を示す図である。値は平均値（ｎ＝２）で示した。
【図４】図４は、作成したラット大腿動脈閉塞モデルの腓腹筋血流量に対する効果を示す図である。図４の腓腹筋血流量は術後２８日目に評価され、擬似手術コントロール群に対するラット大腿動脈閉塞モデルにおける運動負荷前（図４の左側）及び運動負荷後（図４の右側）の腓腹筋の血流量欠損を示している。値は平均値±標準誤差（ｎ＝７）で示した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図５】図５は、作成したラット大腿動脈閉塞モデルの前脛骨筋血流量に対する効果を示す図である。図５の前脛骨筋血流量は術後２８日目に評価され、擬似手術コントロール群に対するラット大腿動脈閉塞モデルにおける運動負荷前（図５の左側）及び運動負荷後（図５の右側）の前脛骨筋の血流量欠損を示している。値は平均値±標準誤差（ｎ＝７）で示した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図６】図６は、作成したラット大腿動脈閉塞モデルを用いて、化合物１を１日２回２７日間の経口連続投与を行ったときの運動負荷前（図６の左側）及び運動負荷後（図６の右側）の腓腹筋(Gastrocnemius muscle)の血流量の増加を示す図である。値は平均値±標準誤差（ｎ＝２０）で示した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図７】図７は、作成したラット大腿動脈閉塞モデルを用いて、化合物１を１日２回２７日間の経口連続投与を行ったときの運動負荷前（図７の左側）及び運動負荷後（図７の右側）の前脛骨筋(Anterior tibialis muscle)の血流量の増加を示す図である。値は平均値±標準誤差（ｎ＝２０）で示した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図８】図８は、ラット大腿動脈閉塞モデルの筋肉内動脈に対する化合物１の効果を示す図である。作成したラット大腿動脈閉塞モデルを用いて、化合物１を１日２回２７日間の経口連続投与し、腓腹筋の筋肉内動脈の内腔面積(Luminal area)を測定した。値は平均値±標準誤差（ｎ＝１６）で示した。＊は、Ｐ＜０．０５で有意差があったことを示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図９】図９は、化合物１によるラット大腿動脈の血管拡張を示す図である。値は平均値±標準誤差（ｎ＝３）で示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明における化合物１は公知であり、ＷＯ９７／０１２８６９号パンフレットに記載の方法、又はそれに準じた方法によって製造することができる。
また、本発明では化合物１の塩若しくは溶媒和物を用いることもできる。化合物１の塩及び溶媒和物は、常法により製造することができる。
【００２１】
本発明の化合物１の塩としては塩基との付加塩が挙げられ、薬学的に許容できるものであれば特に制限はない。このような塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属類、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属類との塩基付加塩が挙げられる。
【００２２】
本発明の化合物１の溶媒和物としては、水和物、アルコール和物（例えば、エタノール和物）等が挙げられる。
【００２３】
本明細書において、下肢循環障害動物モデルとは、下肢血管の結紮、切除、血管内への血小板凝集惹起剤若しくは薬品注入による末梢血管の閉塞、血管への電気刺激による末梢血管の閉塞、血管へのレーザー光照射による末梢血管の閉塞によるもの、及びカフなどにより血管を狭窄することによって下肢循環障害を惹起した動物を意味する。具体的には、例えば、ラウリン酸誘発末梢循環障害モデル、下肢動脈結紮末梢循環障害モデル、エルゴタミン誘発末梢循環障害モデル、エルゴタミン＋エピネフリン誘発末梢循環障害モデル等が挙げられる。より好ましいモデルとしては、ラウリン酸誘発末梢循環障害モデル、下肢動脈結紮末梢循環障害モデルが挙げられる。
【００２４】
本明細書において、運動負荷としては、動物用トレッドミル、ロータロッドでの運動、麻酔下での神経刺激等が挙げられるが、動物用トレッドミル、ロータロッドでの運動がより好ましく、動物用トレッドミルでの運動が特に好ましい。動物用トレッドミルは、傾斜角度のついた駆動式ベルト上で動物を走行させ、連続的な運動負荷を与えるものである。本発明の方法におけるトレッドミルでの運動負荷は、ベルト駆動速度が５〜４０ｍ／ｍｉｎ、好ましくは１５〜２５ｍ／ｍｉｎであり、ベルト傾斜角が５〜４０度、好ましくは１０〜２０度であり、運動負荷時間が３０秒〜３０分、好ましくは１〜１０分である。
【００２５】
本明細書において後肢血流量を測定に利用するカラードマイクロスフィアとは、９８％のポリスチレンと２％のジビニルベンゼンから構成される平均直径１５．５μｍの微小球体であり、特定の波長の光に吸収ピークをもつ特殊な染料でラベルされており、その染色溶液の吸光度を分光光度計で測定することによりマイクロスフェアの数を換算できる。マイクロスフェアを動物の頚動脈を介して左心室内に投与した場合、マイクロスフェアは各組織の血流量に比例して組織内に分布するため、組織に蓄積したマイクロスフェアを抽出することにより、組織血流量を算出することができる。
【００２６】
本発明の側副血行路発達促進剤は、循環障害部位における側副血行路の発達を促進するものであるが、好ましくは四肢循環障害部位の血流を改善するためのものであり、より好ましくは下肢四肢循環障害部位の血流を改善するためのものである。
また、本発明の側副血行路発達促進剤は、新たな血管新生によるものではなく、動脈や静脈の血行路に閉塞が生じた場合に、組織への血流や心臓への還流が維持されるために用意されている迂回路を活性化させ、当該迂回路の発達を促進させるものである。
本発明の側副血行路発達促進剤は、特に四肢循環障害部位の血流を改善させ、閉塞性動脈硬化症（ＡＳＯ）や閉塞性血栓血管炎（ＴＡＯ）などの末梢動脈疾患（ＰＡＤ）における症状の改善、治療、及び／又は予防に有用である。
【００２７】
本発明の医薬は、単独又は他の薬学的に許容される溶解剤、賦形剤、結合剤、希釈剤等の担体を用いて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、ローション剤、軟膏剤、注射剤、座剤等の剤型とすることができる。これらの製剤は、公知の方法で製造することができる。例えば、経口投与用製剤とする場合には、トラガントガム、アラビアガム、ショ糖エステル、レシチン、オリーブ油、大豆油、ＰＥＧ４００等の溶解剤；澱粉、マンニトール、乳糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤；トウモロコシデンプン等の希釈剤等を適宜組み合わせて処方することにより製造することができる。
【００２８】
本発明の医薬は、経口投与又は非経口投与により投与される。本発明の医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって異なるが、通常成人の場合、化合物１として一日０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは２５〜１００ｍｇを１〜３回に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。【００３０】
実施例１  化合物１の血管内皮細胞に対する作用の検討
（１）使用薬物と使用細胞
化合物１は、ＷＯ９７／０１２８６９号パンフレットに記載の方法に従って製造し、ジメチルスルホキシド（溶媒）に溶解した。使用細胞として、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ（Lonza Group Ltd.））と、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：Human Umbilical Vein Endothelial Cells；American Type Culture Collection）を用いた。【００３１】
（２）ＨＡＥＣの増殖能に対する作用の検討
ＨＡＥＣは１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する内皮細胞成長培地（EGM-2 bullet kit; Lonza）を用いて培養した。ＨＡＥＣの細胞増殖能は細胞計測キット（Cell Counting Kit（Dojindo Laboratries））を用いたＷＳＴ−８アッセイにより評価した。ＨＡＥＣを９６ウェルプレートに、１ウェルあたり５０００個の細胞数の濃度で播種し、２４時間インキュベートした。次に、各濃度に調製した化合物１又は溶媒のみを含む１００μＬの新しい培地に交換し、さらに４８時間インキュベートした後、各ウェルに、１０μＬのＷＳＴ−８試薬を添加した。添加後、プレートを４時間インキュベートした後、４５０ｎｍにおける吸光度を、吸光プレートリーダーを用いて測定した。【００３２】
（３）ＨＵＶＥＣの管腔形成に対する作用の検討
ＨＵＶＥＣは１０％のＦＢＳを含有する内皮細胞成長培地（Endothelial Cell Growth Medium：Cell Applications）を用いて培養した。ＨＵＶＥＣをマトリゲルマトリックスでコーティングされた９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１．５×１０４個の細胞数の濃度で播種し、各濃度に調製した化合物１又は溶媒のみを含む２００μＬの培地中にて１８時間インキュベートした後、光学顕微鏡検査によるイメージ分析（E-400；Nikon Corp.）にて視野中の管腔の長さの合計（Total tube length）を算出した。【００３３】
（４）統計分析
値は、平均値±標準誤差、又は、平均値で表した。全ての統計分析はSAS9.1.3 (SAS Institute Japan Ltd.)を用いて実行した。全ての分析において、Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を示す。【００３４】
（５）結果
１．化合物１によるＨＡＥＣの増殖能に対する作用の検討
化合物１によるＨＡＥＣの増殖能に対する結果を図１にグラフで示す。図１の縦軸は４５０ｎｍにおける単位中の細胞数（Arbitrary number/OD450）を示し、横軸は左から溶媒のみの対照、化合物１の１μＭ、化合物１の３μＭの場合を示す。この結果、有意差は認められず、化合物１によるＨＡＥＣの増殖能に対する影響は認められなかった。
２．化合物１によるＨＵＶＥＣの管腔形成に対する作用の検討
化合物１によるＨＵＶＥＣの管腔形成に対する結果を図２の写真及び図３の管腔の長さの合計のグラフで示す。図２の写真は、溶媒のみの対照、化合物１の０．０１μＭ、化合物１の０．１μＭ、化合物１の１μＭ、化合物１の１０μＭ、及び化合物１の１００μＭの場合をそれぞれ示す。これらの写真からは血管新生を確認することはできなかった。また、血管が新生される際には、内皮細胞の増殖、及び、内皮細胞同士の融合による管腔の形成などによる初期段階の血管系構築が重要である。管腔の形成を調べた結果を図３のグラフに示す。図３の縦軸は対照に対する管腔の長さの合計の割合（％）を示し、横軸は化合物１の各濃度（μＭ）を示す。この結果、対照に対する有意差は認められず、化合物１によるＨＵＶＥＣの管腔形成に対する影響は認められなかった。
３．化合物１による血管新生の作用
これらの結果から、化合物１が内皮細胞への直接的な作用を介した血管新生作用を有していないことが示された。【００３５】
実施例２  化合物１のラット大腿動脈結紮モデルにおける下肢腓腹筋血流量に対する効果
（１）使用薬物と使用動物
化合物１は、ＷＯ９７／０１２８６９号パンフレットに記載の方法に従って製造し、ジメチルスルホキシドに溶解又は１％（Ｗ／Ｗ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース水溶液に懸濁して使用した。使用動物は、７〜９週齢のSprague-Dawley（Ｓｌｃ：ＳＤ）系雄性ラットを使用した。外科手術に用いる麻酔は、ペントバルビタール・ナトリウム５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。【００３６】
（２）大腿動脈結紮によるラット後肢虚血モデル
双方の大腿動脈を露出し、麻酔下に縫合糸を用いて結紮した。組織学的分析のために、化合物１又は基剤のみを、外科手術の日から２７日間、１日２回経口投与した。２８日目に、左腓腹筋を摘出し、Tissue-Tek O.C.T. compound（Sakura Finetech Japan Co., Ltd.）で冷凍した。凍結組織標本から凍結ミクロトームを用いて１０μｍの厚さで組織切片を作成し、空気乾燥し、アセトンで固定した。固定した組織切片は、５％ヤギ血清を用いて非特異的な抗体結合を阻害した後、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）に対するウサギ抗体で一次反応を、ビオチンで標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ(Vector Laboratories Inc.)で二次反応を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたストレプトアビジン（KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.）で三次反応を行うことにより、免疫複合体を形成させた。この免疫複合体はジアミノベンジジンを基質としたＨＲＰの酵素反応により可視化された。α−ＳＭＡ陽性部分は、光学顕微鏡検査により決定され、筋肉内動脈の内腔面積は、イメージ分析(Win ROOF; Mitani Co., Ltd.)により定量化された。このモデルの２８日目における後肢筋血流量は、運動前と運動後の２時点で、Dye-Trak VII+ マイクロスフェア (Triton Technology, Inc.)を用いて決定した。【００３７】
詳細には、まず、ラットにペントバルビタール・ナトリウム溶液を５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し麻酔した。次に、ラットを体温維持用保温マット上に伏臥位にし、保温器（BWT-100、バイオリサーチセンター（株））で体温を３７℃に維持した。次いで、臀部を切開し、左坐骨神経を剥離・露出させ、後の結紮用に絹製縫合糸を２本掛けておいた。ラットを仰臥位にし、適量のヘパリンを含む生理食塩液を満たしたカテーテルを、左上腕動脈より挿入・留置し、血圧トランスデューサに接続した。次いで、右総頚動脈に、適量のヘパリンを含む生理食塩液を満たしたカテーテルを挿入して、先端を左心室内に留置し、血圧トランスデューサ（DX-360、（株）光電エンジニアリング）に接続して心内圧の測定を行った。カテーテルが左心室へ到達したことは左心室に特徴的な血圧波形により確認した。瞬時血圧脈波及び平均血圧は血圧トランスデューサを介して血圧計を用いて測定した。心拍数の測定は血圧パルスにて瞬時心拍用タコメーターを駆動して行った。また、これらのデータは、感熱紙に記録した。ラットの血圧及び心拍数が安定したことを確認した後、上腕動脈留置カテーテル末梢側を、適量のヘパリンを含む１ｍＬディスポーザブルシリンジに接続し、シリンジを拡散ポンプに装着した。次いで、左心室留置カテーテル内に、黄色マイクロスフェア溶液（０．２ｍＬ、６０万個）を満たし、カテーテル末梢側を、生理食塩水で満たした５ｍＬディスポーザブルシリンジに接続し、シリンジを薬物注入ポンプに装着した。左心室留置カテーテルより、０．３ｍＬ／ｍｉｎの速度で、黄色マイクロスフェア溶液、及びそれに引き続く０．５ｍＬの生理食塩水を、計１４０秒間かけて注入した。運動負荷終了１分後に、前述と同じ方法で、基準血液サンプルの回収と、カキ色（Persimmon）マイクロスフェア溶液の注入（０．２ｍＬ、６０万個）を行った。【００３８】
次に、ラットをペントバルビタール・ナトリウム溶液の過剰投与により安楽死させた後、左腓腹筋を回収し、直ちに湿重量を測定し、１５ｍＬポリプロピレンチューブに移した。回収した基準血液サンプルと腓腹筋は、マイクロスフェアの回収の実験日まで４℃で保存した。基準血液サンプルの入った１５ｍＬチューブに２％ツウィーン８０を含む生理食塩水を加え、９ｍＬまでメスアップし、３ｍＬの１６ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨを加えた。腓腹筋が入った１５ｍＬチューブには、１２ｍＬの４ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨを加えた。次に、血液及び腓腹筋の両サンプルチューブに、マイクロスフェアの抽出効率の測定用に９９９０個の青色マイクロスフェアを添加した。両サンプルチューブを６０℃で３時間以上インキュベーションし、アルカリ溶解させた。分解された組織溶液を、濾過器と吸引ポンプを用いて減圧濾過し、ポリテトラフルオロエチレンフィルター（孔径１０μｍ、直径２５ｍｍ）上にマイクロスフェアを回収した。次に、フィルターを６０℃に温めておいた１０ｍＬの精製水で３回洗浄し、さらに１０ｍＬのエタノールで１回洗浄し、乾燥後、１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移した。このチューブに、３１０μＬの酸性酢酸セルソルブを添加し、マイクロスフェアから染料を抽出した。次いで、この１．５ｍＬチューブを、２２℃、２０００Ｇの条件で５分間遠心し、上清２００μＬを、９６ウェルマイクロプレートに移し、４４０ｎｍ(黄色マイクロスフェアの最大吸収波長)、５４５ｎｍ(カキ色マイクロスフェアの最大吸収波長)、６７２ｎｍ(青色マイクロスフェアの最大吸収波長)の吸光度を吸光プレートリーダーを用いて測定した。血流量解析用のエクセルマクロ（A Dye-Trak matrix inversion macro for Microsoft Excel、Triton Technology, Inc.）に、吸光度値を入力し、各血液及び腓腹筋サンプルに含まれているマイクロスフェアの個数を算出した。
腓腹筋の血流量値Ｑｇ（ｍＬ／ｍｉｎ／ｇ）は、
Ｑｇ＝（Ｎｇ×Ｑｒ）／（Ｎｒ×Ｗｇ）
の計算式により算出した。ここで、Ｎｇは腓腹筋サンプルに含まれているマイクロスフェアの個数、Ｑｒは基準血液サンプルの回収率（ｍＬ／ｍｉｎ）、Ｎｒは基準血液サンプルに含まれているマイクロスフェアの個数、Ｗｇは腓腹筋の湿重量値（ｇ）を意味する。【００３９】
（３）大腿動脈の血管拡張の検討
アビルらの方法（Abiru T,et.al., Eur J Pharmacol. 1995;281:9-15.）を参考に、ラットから摘出された大腿動脈血管（３ｍｍ幅）を、３７℃のKrebs-Henseleit溶液で満たされたマグヌス管に装着し、９５％Ｏ２と５％ＣＯ２の混合ガスを継続的に注入した。血管の等尺性張力は、張力トランスデューサーで測定し、感熱記録計を用いて記録した。血管は０．７５ｇの静止張力に調節した。６０ｍｍｏｌ／Ｌ(rats)の塩化カリウムによって収縮させた後、化合物１又は基剤がマグヌス管に継続的に注入された。それぞれの実験の終わりに、１００ｍｍｏｌ／Ｌのパパベリンが最大弛緩を決定するために加えられた。【００４０】
（４）ラットにおける化合物１の薬物動態的な検討
下大静脈より取得した血清の濃度−時間プロフィールを決定するため、化合物１を非絶食下条件のラット（ｎ＝３）に単回経口投与した。血清中の化合物１の濃度は、蛍光検出器を装着した高速液体クロマトグラフィーシステムを用いて検出した。最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）と最大血漿中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）が、血清中薬物の値、消失半減期（Ｔ１／２）、ＡＵＣの測定から決定された。時間曲線は最小二乗法と台形法によりそれぞれ計算した。
（５）統計分析
値は平均値±標準誤差で表した。全ての統計分析はSAS9.1.3 (SAS Institute Japan Ltd.)を用いて実行した。全ての分析において、Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を示す。【００４１】
（６）結果１．化合物１による後肢筋血流量の増加
腓腹筋（後肢筋）の血流の変化の結果を図４にグラフで示す。図４の縦軸は血流量（ｍＬ／分／ｇ）を示し、横軸の左側は運動負荷前であり、右側は運動負荷後であり、それぞれのシャムは擬似手術処置群であり、結紮は結紮群である。この結果、大腿動脈結紮によるラット後肢虚血モデルは、２８日の運動負荷後の擬似手術処置群と比べて腓腹筋（後肢筋）の血流を有意に減少させた（結紮群が０．５１５±０．０６７ｍＬ／分／ｇであるのに対して、シャム群は１．４９２±０．１４５ｍＬ／分／ｇであり、Ｐ＜０．００１で有意差が認められた。ｎ＝７）。
また、前脛骨筋（後肢筋）の血流の変化の結果を図５にグラフで示す。図５の縦軸は血流量（ｍＬ／分／ｇ）を示し、横軸の左側は運動負荷前であり、右側は運動負荷後であり、それぞれのシャムは擬似手術処置群であり、結紮は結紮群である。この結果、大腿動脈結紮によるラット後肢虚血モデルは、２８日の運動負荷後の擬似手術処置群と比べて前脛骨筋（後肢筋）の血流も有意に減少させた（結紮群が０．５１６±０．０９８ｍＬ／分／ｇであるのに対して、シャム群は１．６８７±０．１６３ｍＬ／分／ｇであり、Ｐ＜０．００１で有意差が認められた。ｎ＝７）。
運動負荷後の結果とは対照的に、運動負荷前（休息時）の血流量は両群の間で差がなかった（図４及び図５参照）。これは、Brevetti LS, et. al, J Surg Res. 2001;98:21-61で既に報告されている結果と一致している。すなわち、後肢虚血モデルにおいて、運動負荷後の血流増加は、骨格筋血流では欠損しており、この動物モデルはヒトの間歇性跛行の病態を反映していることを示している。【００４２】
次に、このモデルを用いて化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）の１日２回２７日間反復経口投与による効果を評価したところ、化合物１はコントロールと比較して、２８日目の運動負荷後の腓腹筋及び前脛骨筋の血流量を増加することが示された。
腓腹筋（後肢筋）の血流の変化の結果を図６にグラフで示す。図６の縦軸は血流量（ｍＬ／分／ｇ）を示し、横軸の左側は運動負荷前であり、右側は運動負荷後であり、それぞれの左側は溶剤のみを投与した対照群であり、右側は化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群である。この結果、腓腹筋の血流量は、対照群では０．５６１±０．０３４ｍＬ／分／ｇであったのに対して、化合物１投与群では０．８１８±０．０５８ｍＬ／分／ｇであり、Ｐ＜０．００１で有意差が認められた（ｎ＝２０）。
また、前脛骨筋の血流量の変化の結果を図７にグラフで示す。図７の縦軸は血流量（ｍＬ／分／ｇ）を示し、横軸の左側は運動負荷前であり、右側は運動負荷後であり、それぞれの左側は溶剤のみを投与した対照群であり、右側は化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群である。この結果、前脛骨筋の血流量は、対照群では０．６９７±０．０３９ｍＬ／分／ｇであったのに対して、化合物１投与群では０．９９２±０．０６０ｍＬ／分／ｇであり、Ｐ＜０．００１で有意差が認められた（ｎ＝２０）。
しかし、いずれの場合においても運動負荷前の後肢血流量には変化がなかった（図６及び図７参照）。
２．化合物１による後肢筋肉内血管の拡張
同じラット後肢虚血モデルにおいて、腓腹筋の筋肉内幹動脈の内腔面積を計測した結果を図８にグラフで示す。図８の縦軸は腓腹筋の筋肉内幹動脈の内腔面積（μｍ２）を示し、横軸は、左側から擬似手術コントロール群、結紮した溶剤のみの対照群、化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群をそれぞれ示す。この結果、結紮した対照群は３３１５±４１６μｍ２となり、擬似手術コントロール群の１４６４２±１０６２μｍ２，と比較して有意に減少していた（Ｐ＜０．００１，ｎ＝１６）。この筋肉内動脈の狭窄は、化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）の１日２回２７日間の経口反復投与により有意に抑制された（７１００±８２４μｍ２，Ｐ＜０．０５，ｎ＝１６）。【００４３】
３．化合物１による大腿動脈の血管弛緩
化合物１による大腿動脈の血管弛緩の結果を、図９にグラフで示す。図９の縦軸は血管弛緩の割合（％）を示し、横軸は薬物濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。図９の白三角印は溶剤のみを投与した対照群を示し、黒丸印は化合物１投与群を示す。この結果、化合物１（０．１μｍｏｌ／Ｌ〜３０μｍｏｌ／Ｌ）はin vitroにてマグヌス管内でＫＣｌによって収縮させたラット摘出大腿動脈のリング標本に対して濃度依存的な弛緩作用を示すことがわかった。【００４４】
４．ラットにおける化合物１の薬物動態的な検討
ラットにおける化合物１の薬物動態的な検討を行った。この結果を次の表１に示す。この結果、化合物１の３０ｍｇ／ｋｇの用量におけるラットへの単回経口投与により、図９で観察された十分な血管弛緩作用を発揮する濃度に匹敵する血中濃度が得られた（Ｃｍａｘ＝４．７３±０．２８μｍｏｌ／Ｌ）（表１参照）。
これらの結果から、図６、図７、及び図８で観察された化合物１による下肢循環障害に対する改善作用は、化合物１による血管弛緩作用による血流量上昇が関与している可能性が示された。【００４５】
【表１】
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【００４６】
以上により、化合物１はラット末梢血管疾患モデルにおける後肢骨格筋の血流を改善することが示された。この効果は、シロスタゾールで報告されている血管新生促進作用とは異なるメカニズムにより発現すると考えられる。また、アスピリンやＰ２Ｙ１２阻害剤といったその他の抗血小板剤には間歇性跛行の治療に有益な効果は示されていない。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の化合物１は、側副血行路の形成促進を介して四肢循環障害部位の血流を改善する作用を有し、末梢動脈疾患等に起因する間歇性跛行を含む諸症状、例えば、冷え性又は冷感などの予防及び治療に有効であり、産業上の利用可能性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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