(57)【要約】  本発明は、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、新規の骨形成促進剤を提供する。本発明はまた、そのような骨形成促進剤を含有する医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする骨形成促進剤。
【請求項２】
フムロン、コフムロン及びアドフムロンのうちの少なくとも１種のアルファ酸を有効成分とする、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項３】
イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロンのうちの少なくとも１種のイソアルファ酸を有効成分とする、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンのうちの少なくとも１種のテトラヒドロイソアルファ酸を有効成分とする、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項５】
ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロンのうちの少なくとも１種のローイソアルファ酸を有効成分とする、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項６】
ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロンのうちの少なくとも１種のヘキサヒドロイソアルファ酸を有効成分とする、請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨形成促進剤を含有する医薬。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨形成促進剤を含有する飲食品添加物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨形成促進剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代謝においては、破骨細胞が骨吸収を担い、骨芽細胞が骨形成を担っている。正常な骨組織では、骨吸収と骨形成とが絶えずバランスよく繰り返されることで、骨代謝が進み、骨密度が一定に維持されている。このバランスが破綻して骨吸収が骨形成を上回ると、骨密度が低下し、やがて骨粗鬆症が発症する。骨吸収及び骨形成のバランスを是正して、骨粗鬆症を治療又は予防するには、骨吸収を抑制するか、骨形成を促進することが有効である。【０００３】
骨吸収抑制作用を有する化合物としては、例えば、ホップの苦味成分であるアルファ酸及びイソアルファ酸が知られている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平７−３３０５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、骨吸収及び骨形成のバランスの破綻が主として骨形成の低下に起因する場合には、骨形成を促進することが特に有効と考えられる。【０００５】
そこで、本発明は、新規の骨形成促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする骨形成促進剤を提供する。【０００７】
アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、それぞれ、下記一般式（１）〜（５）で表される化合物である。なお、一般式（１）〜（５）中、Ｒは、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３等から選択される基を表す。【０００８】
【化１】
2009072576.tif 000002
【０００９】
【化２】
2009072576.tif 000003
【００１０】
【化３】
2009072576.tif 000004
【００１１】
【化４】
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【００１２】
【化５】
2009072576.tif 000006
【００１３】
アルファ酸としては、例えば、フムロン、コフムロン及びアドフムロンが挙げられ、アルファ酸を含有する骨形成促進剤としては、例えば、フムロン、コフムロン及びアドフムロンのうちの少なくとも１種を含有する骨形成促進剤が挙げられる。フムロン、コフムロン及びアドフムロンは、それぞれ、一般式（１）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である化合物である。【００１４】
イソアルファ酸としては、例えば、イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロンが挙げられ、イソアルファ酸を含有する骨形成促進剤としては、例えば、イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロンのうちの少なくとも１種を含有する骨形成促進剤が挙げられる。イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロンは、それぞれ、一般式（２）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である化合物である。【００１５】
テトラヒドロイソアルファ酸としては、例えば、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンが挙げられ、テトラヒドロイソアルファ酸を含有する骨形成促進剤としては、例えば、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンのうちの少なくとも１種を含有する骨形成促進剤が挙げられる。テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンは、それぞれ、一般式（３）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である化合物である。【００１６】
ローイソアルファ酸としては、例えば、ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロンが挙げられ、ローイソアルファ酸を含有する骨形成促進剤としては、例えば、ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロンのうちの少なくとも１種を含有する骨形成促進剤が挙げられる。ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロンは、それぞれ、一般式（４）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である化合物である。【００１７】
ヘキサヒドロイソアルファ酸としては、例えば、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロンが挙げられ、ヘキサヒドロイソアルファ酸を含有する骨形成促進剤としては、例えば、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロンのうちの少なくとも１種を含有する骨形成促進剤が挙げられる。ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロンは、それぞれ、一般式（５）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である化合物である。【００１８】
テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、光に対して安定であるので、光分解による効果の低減・喪失が起こりにくい。このため、本発明の骨形成促進剤は、取扱い（保管、運搬等）が容易である。【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、少なくとも、骨形成を担う骨芽細胞の前駆細胞を増殖させることができ、そのような作用を介して骨形成を促進することができる。従って、特に、骨形成の低下に起因する骨密度の低下を改善又は予防するのに有用である。また、成長期ないし若年期は最大骨密度及び最大骨量を増大させるべき時期であるが、本発明の骨形成促進剤は、成長期ないし若年期における最大骨密度及び最大骨量の増大を促進するためにも使用することができる。【００２０】
また、ホップの苦味成分であるアルファ酸及びイソアルファ酸はもとより、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸も、既にビール系飲料において苦味成分として利用され、生体に対する安全性は高いと考えられる。従って、本発明の骨形成促進剤は、生体に対する安全性に優れていると考えられる。【００２１】
なお、本発明の骨形成促進剤は、医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等の成分として使用することができる。すなわち、本発明はまた、本発明の骨形成促進剤を含有する医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、新規の骨形成促進剤が提供される。また、そのような骨形成促進剤を含有する医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】各種濃度のアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図２】各種濃度のイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図３】各種濃度のテトラヒドロイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図４】各種濃度のローイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図５】各種濃度のヘキサヒドロイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。
【図６】テトラヒドロイソアルファ酸を投与されたＳＡＭＰ６マウスの大腿骨近位部の骨密度を示すグラフである。
【図７】テトラヒドロイソアルファ酸を投与されたＳＡＭＰ６マウスの大腿骨遠位部の骨密度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。【００２５】
本発明の骨形成促進剤は、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。【００２６】
ホップの苦味成分であるアルファ酸は、天然のホップを抽出し、抽出物を分画・精製することにより得ることができる。例えば、特開平７−３３０５９４号公報に記載の方法により得ることができる。【００２７】
また、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、例えば、下記反応式で表される方法に従って得ることができる。なお、下記反応式において、一般式（１）〜（５）は、それぞれ、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸を表す。また、一般式（１）〜（５）中、Ｒは、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３等から選択される基を表す。【００２８】
【化６】
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【００２９】
このように、イソアルファ酸は、アルファ酸をアルカリ条件下で加熱することにより得ることができる。また、テトラヒドロイソアルファ酸は、イソアルファ酸をパラジウム付活性炭の存在下、水素ガスで接触還元させることにより得ることができる。また、ローイソアルファ酸は、イソアルファ酸を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることにより得ることができる。また、ヘキサヒドロイソアルファ酸は、テトラヒドロイソアルファ酸を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることにより得ることができる。【００３０】
なお、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、所望の成分を含有する市販のホップエキスから、ＨＰＬＣ等を用いて分取することによって得ることもできる。【００３１】
本発明の骨形成促進剤は、固体、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形をとってもよい。また、放出制御製剤の形態をとることもできる。また、本発明の骨形成促進剤は、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸のうちの少なくとも１種からなるもの、或いは、本質的に、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸のうちの少なくとも１種からなるものであってもよい。【００３２】
上述の各種製剤は、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸のうちの少なくとも１種と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）と、を混和することによって調製することができる。【００３３】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、上述の界面活性剤の他、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。【００３４】
本発明の骨形成促進剤は、医薬、飲食品添加物、飲食品、飼料添加物、飼料等の成分として使用することができる。【００３５】
例えば、本発明の骨形成促進剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有していてもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース等の単糖類；スクロース、フルクトース、マンニトール等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本発明の骨形成促進剤はまた、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。【００３６】
本発明の骨形成促進剤は、ヒトに投与されても、非ヒト哺乳動物に投与されてもよい。投与方法は、経口投与、直腸投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、槽内投与、膣内投与、腹腔内投与、膀胱内投与、吸入投与等の全身投与、及び軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤等による局所投与のいずれでもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。【００３８】
〔実施例１：アルファ酸による骨芽細胞前駆細胞の増殖〕
（試験サンプルの調製）
アルファ酸（フムロン、コフムロン及びアドフムロン）及びベータ酸の混合物（ＨＰＬＣ用標準品、ＩＣＥ−２、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ）を８５％ＭｅＯＨ／４．５％ＣＨ３ＣＯＯＨで５ｍｇ/ｍＬの濃度に調整し、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけた後、ＨＰＬＣによりベータ酸を除去し、得られたアルファ酸画分を２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、試験サンプルを得た。なお、アルファ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
カラム：Ｃ１８カラム（資生堂  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８；１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動層：８５％ＭｅＯＨ／４．５％ＣＨ３ＣＯＯＨ
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ【００３９】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
ヒト由来骨芽細胞前駆細胞ＭＧ−６３（ＲＣＢ１８９０、理研セルバンク）２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬをＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１０％ＦＢＳ添加）に懸濁し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ播種した後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。【００４０】
次いで、培地交換し、培地に試験サンプル１％（ｖ／ｖ培地）を添加し、４８時間後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同人化学）で測定した。ここで、吸光度から細胞数への変換は、同様の方法で別途作成していた検量線を用いて行った。【００４１】
結果を図１に示す。図１は、各種濃度のアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。図１において、（ａ）は、１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで表される細胞数を示し、（ｂ）は、コントロール（２０％ＤＭＳＯ溶液のみ）を１００％とする相対細胞数を示している。横軸の濃度は、培地中のアルファ酸の濃度である。【００４２】
〔実施例２：イソアルファ酸による骨芽細胞前駆細胞の増殖〕
（試験サンプルの調製）
イソアルファ酸（イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロン）を含有するイソ化ホップエキス（ＩＳＯＨＯＰ、Ｂａｒｔｈ）を２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、試験サンプルを得た。なお、イソアルファ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。【００４３】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にして骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定を行った。【００４４】
結果を図２に示す。図２は、各種濃度のイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。図２において、（ａ）は、１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで表される細胞数を示すグラフであり、（ｂ）は、コントロール（２０％ＤＭＳＯ溶液のみ）を１００％とする相対細胞数を示すグラフである。横軸の濃度は、培地中のイソアルファ酸の濃度である。【００４５】
〔実施例３：テトラヒドロイソアルファ酸による骨芽細胞前駆細胞の増殖〕
（試験サンプルの調製）
テトラヒドロイソアルファ酸（テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロン）を含有する試薬（Ｔｅｔｒａ（ＩＣＳ−Ｔ２）、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ、純度：９９．４％）を２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、試験サンプルを得た。なお、テトラヒドロイソアルファ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。【００４６】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にして骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定を行った。【００４７】
結果を図３に示す。図３は、各種濃度のテトラヒドロイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。図３において、（ａ）は、１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで表される細胞数を示すグラフであり、（ｂ）は、コントロール（２０％ＤＭＳＯ溶液のみ）を１００％とする相対細胞数を示すグラフである。横軸の濃度は、培地中のテトラヒドロイソアルファ酸の濃度である。【００４８】
〔実施例４：ローイソアルファ酸による骨芽細胞前駆細胞の増殖〕
（試験サンプルの調製）
ローイソアルファ酸（ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロン）を含有する試薬（ＤＣＨＡ−Ｒｈｏ（ＩＣＳ−Ｒ２）、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ、純度：６５．３％）から、ＨＰＬＣによりジシクロヘキシルアミンを除去し、得られたローイソアルファ酸画分を２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、試験サンプルを得た。なお、ローイソアルファ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
カラム：Ｃ１８カラム（資生堂  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８；１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動層：８０％ＭｅＯＨ／４％ＣＨ３ＣＯＯＨ
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ【００４９】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にして骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定を行った。【００５０】
結果を図４に示す。図４は、各種濃度のローイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。図４において、（ａ）は、１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで表される細胞数を示すグラフであり、（ｂ）は、コントロール（２０％ＤＭＳＯ溶液のみ）を１００％とする相対細胞数を示すグラフである。横軸の濃度は、培地中のローイソアルファ酸の濃度である。【００５１】
〔実施例５：ヘキサヒドロイソアルファ酸による骨芽細胞前駆細胞の増殖〕
（試験サンプルの調製）
ヘキサヒドロイソアルファ酸（ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロン）を含有する試薬（ＤＣＨＡ−Ｈｅｘａ（ＩＣＳ−Ｈ１）、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ、純度：６５．７％）から、ＨＰＬＣによりジシクロヘキシルアミンを除去し、得られたヘキサヒドロイソアルファ酸画分を２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、試験サンプルを得た。なお、ヘキサヒドロイソアルファ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
カラム：Ｃ１８カラム（資生堂  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８；１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動層：８０％ＭｅＯＨ／４％ＣＨ３ＣＯＯＨ
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ【００５２】
（骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定）
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にして骨芽細胞前駆細胞増殖活性の測定を行った。【００５３】
結果を図５に示す。図５は、各種濃度のヘキサヒドロイソアルファ酸の存在下で骨芽細胞前駆細胞を４８時間培養した後の細胞数を示すグラフである。図５において、（ａ）は、１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで表される細胞数を示すグラフであり、（ｂ）は、コントロール（２０％ＤＭＳＯ溶液のみ）を１００％とする相対細胞数を示すグラフである。横軸の濃度は、培地中のヘキサヒドロイソアルファ酸の濃度である。【００５４】
図１〜５より明らかなように、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、いずれも顕著な骨芽細胞前駆細胞増殖活性を示した。【００５５】
〔実施例６：テトラヒドロイソアルファ酸による骨密度低下の抑制〕
ＳＡＭＲ１マウス及びＳＡＭＰ６マウス（７週齢、雄性。日本エスエルシー社より入手。）を用いて、以下のようにして、テトラヒドロイソアルファ酸（以下、場合により「ＴＨＩＡＡ」という。）の骨密度低下抑制作用を確認した。なお、ＳＡＭＲ１マウスは、老化促進に抵抗性を示すマウスであり、ＳＡＭＰ６マウスは、老化が促進される傾向のある老年性骨量減少モデルマウスである。【００５６】
１週間の馴化飼育後、一般状態が良好であったマウス［ＳＡＭＲ１マウス８匹（ＳＡＭＲ１群）、ＳＡＭＰ６マウス２４匹（ＳＡＭＰ６群）］を選抜し、ＳＡＭＰ６群のマウスを、無作為に、コントロール群、ＴＨＩＡＡ０．２％群及びＴＨＩＡＡ０．５％群の３群（各群８匹）に分けた。馴化飼育期間及び試験期間を通じて、マウスは、温度２３±１℃、湿度６０±５％、明暗サイクル１２時間（明期：８時〜２０時；暗期：２０時〜８時）の条件で飼育した。【００５７】
（飼料の調製）
各群のマウスに投与する飼料は、粉末飼料ＡＩＮ９３Ｍをベースにして、表１の組成が得られるように調製した（ＳＡＭＲ１群及びコントロール群のマウスに投与する飼料は、粉末飼料ＡＩＮ９３Ｍをそのまま使用した）。表中、各成分量の単位はｇ／ｋｇ飼料である。また、「テトラヒドロイソアルファ酸試薬」は、テトラヒドロイソアルファ酸（テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロン）を含有する市販の試薬（Ｔｅｔｒａ（ＩＣＳ−Ｔ２）、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ、純度：９９．４％）を表す。【００５８】
【表１】
2009072576.tif 000008
【００５９】
（飼料の投与）
上述の馴化飼育後、８週間、各群のマウスに所定の飼料及び水を自由摂取させた。【００６０】
（骨密度の測定）
８週間の飼料投与後、各群のマウスを解剖し、ＤＣＳ６００ＥＸ−ＩＩＩＲ（アロカ社）を用いて、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ法）により大腿骨近位部及び大腿骨遠位部の骨密度を測定した。【００６１】
結果（平均±標準誤差）を図６及び７に示す。図６は、各群のマウスの大腿骨近位部の骨密度を示すグラフである。図７は、各群のマウスの大腿骨遠位部の骨密度を示すグラフである。【００６２】
図６及び７から明らかなように、ＴＨＩＡＡ０．２％群及びＴＨＩＡＡ０．５％群では、コントロール群と比較して、大腿骨近位部及び大腿骨遠位部の骨密度低下が顕著に抑制された。【００６３】
実施例６により、テトラヒドロイソアルファ酸は、骨密度低下を顕著に抑制することが可能であることが示された。【００６４】
以上の実施例により、本発明の骨形成促進剤によれば、骨形成の顕著な促進が可能となることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の骨形成促進剤は、骨粗鬆症の治療及び予防に利用可能である。
【図１】
2009072576.tif 000009
【図２】
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【図３】
2009072576.tif 000011
【図４】
2009072576.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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