(57)【要約】  血清等の生体試料から、何ら煩雑な分離操作をすることなく、簡便かつ正確に免疫学的手段により、生体試料の可溶性ＬＲ１１を定量する方法を提供。  哺乳動物由来試料中の可溶性ＬＲ１１の免疫学的定量方法であって、試料をポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミド、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤の１種以上で処理することを特徴とする可溶性ＬＲ１１の免疫学的測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来試料中の可溶性ＬＲ１１の免疫学的定量方法であって、試料をポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤の１種以上で処理することを特徴とする可溶性ＬＲ１１の免疫学的測定方法。
【請求項２】
試料が、血液、血漿、血清、髄液又は尿である請求項１記載の免疫学的定量方法。
【請求項３】
免疫学的定量方法が、少なくとも２種の異なる抗原認識部位を有する抗体を用いて免疫複合体を形成する工程を含むものである請求項１又は２記載の免疫学的定量方法。
【請求項４】
界面活性剤がアシル−Ｎ−メチルグルカミンである請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫学的定量方法。
【請求項５】
抗可溶性ＬＲ１１抗体と、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる１種以上の界面活性剤とを含むことを特徴とする可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キット。
【請求項６】
抗可溶性ＬＲ１１抗体と、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる１種以上の界面活性剤との組み合わせの、可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キットの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類動物由来試料中の可溶性ＬＲ１１の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＤＬ receptor relative with 11 ligand-binding repeats（ＬＲ１１）は、ＬＤＬ受容体ファミリーの特徴的な構造を有するＬＤＬ受容体類似タンパク（特許文献１、非特許文献１）であり、正常血管壁細胞ではほとんど発現されていないが、肥厚内膜平滑筋細胞において特異的に発現が認められていることが知られている（非特許文献２）。また、培養平滑筋細胞を用いた検討では、平滑筋細胞の増殖に伴いＬＲ１１の発現量が亢進し、培養液中にＬＲ１１の分泌が認められることや、カフ障害マウスモデルにおいて、ＬＲ１１遺伝子を発生工学的に機能欠損させると、平滑筋細胞の遊走及び増殖によって引き起こされる血管内膜の肥厚が阻害されることが知られている（非特許文献３）。更に、近年、ＬＲ１１は、膜結合型とともにプロテアーゼによって切断された可溶性ＬＲ１１が存在することが示されている（非特許文献４）。また、ヒト血液中に、可溶性ＬＲ１１が存在することが報告された（非特許文献５）。【０００３】
可溶性ＬＲ１１の測定方法としては、ＬＲ１１と親和性を有するシャペロン分子ＲＡＰ  （receptor associated protein）を結合させた不溶性担体を用いて、試料中の可溶性ＬＲ１１を分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットを行い、抗ＬＲ１１抗体による免疫染色で検出する方法（非特許文献５、６）等が知られているが、試料中の可溶性ＬＲ１１を分離する操作が必要であり、操作が煩雑である。
【先行技術文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−１６３９８８号公報
【非特許文献１】J.Biol.Chem.1996;271, p24761-24768
【非特許文献２】Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.1999;19, p2687-2695
【非特許文献３】Circ.Res.2004;94; p752-758
【非特許文献４】医学のあゆみ、Vol.221, No.13, p1200-1203
【非特許文献５】J Clin Invest. 2008 ;118, p2733-2746
【非特許文献６】第39回  日本動脈硬化学会総会・学術集会 プログラム・抄録集、一般演題（ポスター）189, p264
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
また、本発明者らは、動脈硬化性疾患患者の血中の可溶性ＬＲ１１の濃度が、健常者に比べて有意に高値となることを見出し、血中に存在する可溶性ＬＲ１１濃度の測定は、新たな動脈硬化性疾患のマーカーになることを報告した（非特許文献５、特願２００７−１６０２２５）が、そのような診断のためにも、簡便な操作で可溶性ＬＲ１１を定量する方法の開発が望まれている。
しかしながら、体液、たとえば血清成分が存在する系、すなわち血清や血漿を対象として、可溶性ＬＲ１１と反応する抗体を用いて免疫学的測定を行った場合、何らかの妨害物質の影響により、可溶性ＬＲ１１が正確に定量できないことが判明した。
従って、本発明の目的は、血清等の生体試料から、何ら煩雑な分離操作をすることなく、簡便かつ正確に免疫学的手段により、生体試料の可溶性ＬＲ１１を定量する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、体液、たとえば血清や血漿を直接測定試料とした場合でも可溶性ＬＲ１１を正確に定量すべく、妨害物質の影響防止手段について種々検討した結果、試料をある特定の界面活性剤で処理した後、免疫学的測定法で測定を行えば、試料中の可溶性ＬＲ１１を簡便かつ正確に定量できることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、哺乳動物由来試料中の可溶性ＬＲ１１の免疫学的測定方法であって、試料をポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミド、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤の１種以上で処理することを特徴とする可溶性ＬＲ１１の免疫学的定量方法を提供するものである。【０００８】
また、本発明は、抗可溶性ＬＲ１１抗体と、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる１種以上の界面活性剤とを含むことを特徴とする可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キットを提供するものである。【０００９】
また、本発明は、抗可溶性ＬＲ１１抗体と、上記特定の界面活性剤との組み合わせの、可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キットを製造するための使用を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の定量法及び免疫学的測定用キットにより、体液、たとえば血液等の試料中に存在する可溶性ＬＲ１１の濃度を簡便に高感度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】固相化可溶性ＬＲ１１に対する各モノクローナル抗体の反応を示す。
【図２】サンドイッチＥＬＩＳＡによる精製ヒト可溶性ＬＲ１１の測定を示す。
【図３】サンドイッチＥＬＩＳＡによる精製ウサギ可溶性ＬＲ１１の測定を示す。
【図４】ＥＬＩＳＡ系での血清の影響を示す。
【図５】界面活性剤処理による血清成分の影響回避を示す。
【図６】血清成分の影響除去に有効な界面活性剤（ＭＥＧＡ−９）濃度を示す。
【図７】固相化モノクローナル抗体Ａ２−２−３とのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。
【図８】固相化モノクローナル抗体Ｍ３とのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。
【図９】固相化モノクローナル抗体Ｍ５とのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。
【図１０】固相化モノクローナル抗体Ｒ１４とのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。
【図１１】固相化モノクローナル抗体Ｒ２３とのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。
【図１２】ヒト血清中可溶性ＬＲ１１の測定を示す。
【図１３】各種哺乳動物の血清中可溶性ＬＲ１１の測定を示す（Ａ: ＭＥＧＡ-９処理、Ｂ：未処理）。
【図１４】ヒト脳髄液中ＬＲ１１の測定を示す（Ａ: ＭＥＧＡ-９処理、Ｂ：未処理）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の定量方法は、哺乳動物由来試料中の可溶性ＬＲ１１の免疫学的定量方法である。哺乳動物としては、ヒトを含む哺乳動物、例えばヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、モルモット、マウス等が挙げられる。試料としては、血清成分と同様の妨害物質を含む生体試料、例えば血液、血漿、血清等のほか、髄液や尿が挙げられる。
【００１３】
本発明における免疫学的定量方法は、抗原抗体反応を利用した可溶性ＬＲ１１の定量方法であれば特に制限されないが、体液、たとえば血清成分による妨害物質の影響回避という点から、少なくとも２種の抗体を用いる定量方法が好ましい。特に、少なくとも２種の異なる抗原認識部位を有する抗体を用いて免疫複合体を形成する工程を含む定量方法が好ましい。本発明において、少なくとも２種の異なる抗原認識部位を有する抗体を用いて免疫複合体を形成する工程を含む定量方法とは、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡやラテックス比濁イムノアッセイ（ＬＴＩＡ）等が挙げられる。
【００１４】
抗可溶性ＬＲ１１抗体としては、血清から精製した可溶性ＬＲ１１と反応する抗体であれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。当該抗体の作製は周知の方法にて作製することができる。
【００１５】
ポリクローナル抗体の作製には、例えば、免疫する動物としてマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等が用いられる。抗血清は、抗原を動物の皮下、皮内、または腹腔等に、一回又は複数回投与した後、血清から得ることができる。タンパク質、ペプチドを抗原として用いる時は、免疫賦活効果を有する補液との混合物の免疫がより好ましい。
【００１６】
また、モノクローナル抗体の作製には、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「単クローン抗体」廣川書店（１９９０年）や、Jame W.Golding,“Monoclonal Antibody”,3rd edition,Academic Press,1996年に従い作製することができる。また、ＤＮＡ免疫法によりモノクローナル抗体を作製することもでき、Nature 1992 Mar12;356, p152-154やJ.Immunol Methods Mar 1;249, p147-154を参考に作製することができる。
【００１７】
抗体の作製に用いられる抗原としては、ＬＲ１１タンパク質若しくはその一部断片（ペプチド）、又はＬＲ１１タンパク質若しくはその一部断片をコードするｃＤＮＡを組み込んだベクターを用いることができる。当該一部断片としては、例えば、後記する配列番号１や配列番号２で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。当該アミノ酸配列は、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。
ＬＲ１１の高次構造を認識するモノクローナル抗体を得るために、ヒトＬＲ１１全長遺伝子が入った構築物である全長ＬＲ１１ベクターが最適な免疫用抗原遺伝子となるが、そのほか、前記ＬＲ１１タンパク質の一部断片（ペプチド）をコードする遺伝子が挿入された構築物も免疫用抗原遺伝子として使用できる。ＤＮＡ免疫法は、上記遺伝子構築物を単独または混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法（例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、又は遺伝子銃等）のいずれかを用いて、動物（マウス、又はラット等）の皮下に注入し、細胞内に取り込ませることにより実施できる。
【００１８】
ペプチド抗原を用いたモノクローナル抗体の作製例を参考として次に示す。
（１）ハイブリドーマの調製
ＬＲ１１の一部アミノ酸配列［４３２−４４７］の合成ペプチド（ＳＭＮＥＥＮＭＲＳＶＩＴＦＤＫＧ）（配列番号１）のＣ末端にシステイン残基を導入し、架橋剤のＮＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて、ＫＬＨ（Keyhole lympet hemocyanin）のリジン残基を介して両者を結合させ免疫原とした。この免疫原を完全フロイントアジュバンド（ＧＩＢＣＯ社製）と１対１で混和乳化し、０．１ｍｇ／０．１ｍＬ（エマルジョン）で６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に１週間間隔で１０回投与後、最終免疫の３日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４とを６対１の割合で混合し、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ  Solution（ＳＩＧＭＡ社製）等の細胞凝集体存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２．５×１０6／ｍＬになるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマの生育してきた培養上清について、次に示すＥＬＩＳＡ法にしたがって、前記の合成ペプチド（配列番号１）に対する抗体の有無を確認し、抗体産生が有望なハイブリドーマ株を選択した。
【００１９】
具体的には、まず、マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に前記の合成ペプチド（配列番号１）を固相化した。これに、各培養上清中のＩｇＧを反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体を反応させ、次いでオルトフェニレンジアミン（東京化成社製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させ、１．５Ｎ硫酸を加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定した。こうして、前記の合成ペプチドに反応性を示したハイブリドーマ株を選択し、限界希釈法によるクローン化を行った。ＬＲ１１に対する最終的な反応性は、後述する血清から精製した可溶性ＬＲ１１との反応性により確認した。こうして、抗ヒト可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（Ａ２−２−３）を樹立した。
【００２０】
（２）モノクローナル抗体の調製
２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、上記で得られたハイブリドーマを細胞数０．５×１０6個の量で腹腔内に投与した。約１４日後に腹水を採取し、遠心分離して上清を得た。該上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ  NaCl−１．５ｍｏｌ／Ｌ  Glycine-NaOH、ｐＨ８．５）と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に通して抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でカラムより溶出させ、抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３抗体）を精製した。
【００２１】
また、ＤＮＡ免疫法によるモノクローナル抗体の作製例を参考として次に示す。
（１）発現ベクターの構築
ＬＲ１１の全長遺伝子（Ｑ９２６７３）を構成する一部分の遺伝子断片（ＬＲ１１のアミノ配列〔１０００−１５５０〕（配列番号２）からなるペプチドをコードする遺伝子）を、ＦＬＡＧタグ付の哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込んだ。発現ベクターはヒトアルカリフォスファターゼ由来ＧＰＩアンカー配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを含む。これをＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターとした。
【００２２】
（２）ＣＨＯ発現物の確認
構築したＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターにより、目的とする遺伝子産物が、設計通りに細胞膜表面に発現するかどうかについて、免疫前にＣＨＯ細胞(チャイニーズハムスター卵巣由来)を用いた一過性導入発現実験により確認した。すなわち、前日に6-well plateのｗｅｌｌあたり１×１０6個の細胞をplatingした。５％ＣＯ2、３７℃の条件下で一晩培養した。Transfection当日、ポリスチレンラウンドチューブ内でプラスミド希釈液（３μｇ  plasmid DNA＋５００μＬ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ））とlipofectamine2000希釈液（９μＬのLipofectamine2000＋５００μＬのＤ−ＭＥＭ）を良く混ぜ、室温で２０分間インキュベート後、前日にplatingしてあった培養上清を捨て、細胞を剥がさないように静かに細胞に添加した。５％ＣＯ2，３７℃で５時間インキュベート後、上清を取り除き、５％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を添加後２４時間５％ＣＯ2，３７℃で培養した。
翌日、細胞はDissociation buffer（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でplateから剥がし、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析に使用された。ＦＣＭ解析は以下のように実施した。すなわち、１次抗体反応は、細胞に３％ＦＣＳ入りＰＢＳ中でＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ）を４℃、３０分間反応させた。２次抗体は、細胞を３％ＦＣＳ入りＰＢＳで洗浄後、３％ＦＣＳ入りＰＢＳ中でＰＥ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ）を４℃、３０分間反応させた。細胞を３％ＦＣＳ入りＰＢＳで洗浄後、適量の３％ＦＣＳ入りＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターに供した。
この結果、構築したＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターにより目的の遺伝子産物が細胞表面に発現していることが確認された。
【００２３】
（３）ＤＮＡ免疫法による抗体の作製
ＤＮＡ免疫法は、前記（１）のＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターを単独または混合して金粒子に感作したものを、遺伝子銃で免疫動物（マウス又はラット）の皮下に打ち込み、細胞内に取り込ませた。具体的には、Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Gene Gun Optimization Kit（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、該キットの使用説明書に従って、２５ｍｇの金粒子あたり２００μｇの前記ＬＲ１１［１０００−１５５０］ベクターを感作したものを投与した。免疫は２週間おきに４回実施した。４回目の免疫時に、少量の抗血清をサンプリングし、３％ＦＣＳ入りＰＢＳで１，０００倍希釈した抗血清を１次抗体としてＦＣＭ解析を行った。この際、前記（２）の目的とする遺伝子産物を一過性発現させたＣＨＯ細胞（以下、強制発現細胞ともいう）を用いてＦＣＭ解析を行い、抗体価が上昇していることを確認した。また、モノクローナル抗体の作製は一般的な細胞融合法を用いて実施した。すなわち、最終ブースト（final boost）を２回行った後、免疫した動物を解剖し、定法に従い抗体産生細胞を単離してマウス骨髄腫細胞と細胞融合させて抗体産生ハイブリドーマ株を調製した。これらハイブリドーマ株を培養後、その培養上清の一部をとり、強制発現細胞を用いた酵素免疫測定法およびＦＣＭを行った場合、抗原蛋白質に反応するが、非抗原蛋白質には反応しないハイブリドーマ株を選択した。
尚、強制発現細胞を用いた酵素免疫測定法は、次のようにして行った。強制発現細胞を９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清を第一抗体として反応させ、第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加した。ここで、第二抗体とは、第一抗体のマウスイムノグロブリンまたはラットイムノグロブリンを認識できる抗体であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗体である。反応後、第二抗体を標識した酵素に応じた蛍光基質を添加し、蛍光測定プレートリーダーで解析した。
【００２４】
次いで、選択したハイブリドーマ株について限界希釈法によりクローニングを行い、安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。
次に、腹水からのモノクローナル抗体の大量調製を次のようにして実施した。プリスタン０．５ｍＬで前処理したヌードマウスに、１×１０6〜３×１０6クローン化ハイブリドーマ細胞を含む０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を腹腔内注射した。およそ２週間後に、腹水を集め、モノクローナル抗体をプロテインＡで親和精製した。
こうしてＤＮＡ免疫法により抗可溶性ＬＲ１１マウスモノクローナル抗体（Ｍ３）及び（Ｍ５）、抗ＬＲ１１ラットモノクローナル抗体（Ｒ１４）及び（Ｒ２３）を精製した。ＬＲ１１に対する最終的な反応性は、後述する血清から精製した可溶性ＬＲ１１との反応性により確認した。以上が、ＤＮＡ免疫法によるモノクローナル抗体の作製例である。
【００２５】
本発明方法においては、試料を特定の界面活性剤で処理した後に免疫学的定量を行う。当該処理により、試料中の可溶性ＬＲ１１定量を妨害する物質の影響を防止することができる。
該界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる１種以上である。
このうち、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド及びアシル−Ｎ−メチルグルカミンがより好ましく、アシル−Ｎ−メチルグルカミンが特に好ましい。
【００２６】
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル及びポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンＣ8−Ｃ24アルキルエーテル、ポリオキシエチレンＣ8−Ｃ24アルキルフェニルエーテルが好ましく、具体例としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテル、ポリオキシエチレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンデシルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルフェニルエーテル等が挙げられる。ここで、ポリオキシエチレン数は４〜４０が好ましい。ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルの市販品としてはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）等が挙げられる。
【００２７】
アルキルグリコシド及びアルキルチオグリコシドとしては、Ｃ8−Ｃ24アルキルグルコシド、Ｃ8−Ｃ24アルキルマルトシド、Ｃ8−Ｃ24アルキルチオグルコシド、Ｃ8−Ｃ24アルキルチオマルトシドが好ましく、具体例としては、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド等が挙げられ、中でもｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドが好ましい。この市販品としてはｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（同仁化学研究所製）等が挙げられる。コール酸塩としては、コール酸ナトリウム、コール酸カリウム等が挙げられる。
【００２８】
アシル−Ｎ−メチルグルカミンとしては、Ｃ8−Ｃ24アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミンが好ましく、具体例としては、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン等が挙げられ、中でもオクタノイル−Ｎ−メチルグルカミンやノナノイル−Ｎ−メチルグルカミンが好ましい。オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミンの市販品としてはＭＥＧＡ−８（同仁化学研究所製）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミンの市販品としてはＭＥＧＡ−９（同仁化学研究所製）等が挙げられる。
【００２９】
試料を界面活性剤で処理する手段としては、免疫測定前又は測定時の試料中に、上記特定の界面活性剤を添加すればよく、免疫測定前に添加することが好ましい。
界面活性剤の使用濃度は、用いる種類により適宜決定すれば良いが、例えば試料中０．１〜１５質量％、さらに２〜１０質量％が好ましい。処理温度は、５〜４０℃、特に１０〜３０℃が好ましく、このときの反応時間は、界面活性剤処理並びに処理検体と抗体の結合を含めて、１〜２４時間、更に６〜２０時間が好ましい。
また、試料を、１（原液）〜５０倍、特に４〜３０倍に希釈することが好ましい。このとき、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液等のｐＨ７〜１０の中性〜アルカリ性の緩衝液で希釈するのが好ましい。
【００３０】
上記特定の界面活性剤が添加されている試料を用いて通常の手段により抗可溶性ＬＲ１１抗体を用いた免疫学的定量を行えばよい。
免疫学的定量方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンプロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等が挙げられる。
このとき、抗可溶性ＬＲ１１抗体と反応する可溶性ＬＲ１１を、定量又は半定量的に評価する場合、基準となるＬＲ１１と比較することが好ましい。基準となるＬＲ１１としては、例えば、既知濃度の血清可溶性ＬＲ１１、平滑筋細胞や神経芽細胞株の培養細胞若しくは培養上清より回収したＬＲ１１、リコンビナントＬＲ１１、又は抗体作製において免疫原として使用した合成ペプチド等を使用することが好ましい。
【００３１】
上記免疫学的測定において、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による定量を例にして説明すれば、例えば抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体の１種を適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して固相化抗体とし、第二の抗体として認識部位の異なる抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体を酵素で標識し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に結合させた酵素の活性を測ることにより、試料中の可溶性ＬＲ１１を測定することができる。また、第二の抗体として、ビオチン標識した抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体を用い、被検体との反応後に酵素標識したアビジンを反応させ、該標識酵素の活性を測ることにより、試料中のＬＲ１１を測定することもできる。
【００３２】
上記で使用する不溶性担体としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の各種合成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架橋デキストラン、ポリサッカライド）等が好ましく、これらの担体は球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは試験管、マイクロプレート等の形態で用いることができる。固相化抗体の作成の条件としては、球状、棒状、試験管、マイクロプレートの形態の担体を用いる場合の抗体濃度は各々１〜１０μｇ／ｍＬであり、微粒子の形態の担体を用いる場合の抗体濃度は１〜１０ｍｇ／ｍＬである。また、緩衝液は、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液等のｐＨ７〜１０の中性〜アルカリ性の緩衝液を用い、４℃〜２５℃で１時間〜７２時間感作して調製することが好ましい。
【００３３】
使用する酵素標識抗体は、公知の方法によって作製することができる。例えば、中根らの方法（Nakane P.K et al,J.Histochem Cytochem,22, p1084-1089, 1974）あるいは石川らの方法（マレイミド法：「酵素免疫測定法  第３版」医学書院）等に従い、断片化していない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ（ａｂ’）2、又はＦａｂ’とした後、酵素で標識することにより酵素標識抗体を作製できる。標識に使用する酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。
ビオチン標識抗体も公知の方法によって作製できるが、市販のビオチン化試薬（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製、Sulfo-NHS-Biotinylation Kit）を用いることで更に容易に作製することができる。
酵素標識アビジンも公知の方法によって作製できるが、市販品（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製、StreptAvidin, Horseradish Peroxidase Conjugated）を使用することもできる。
【００３４】
また、標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、及び必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノジ−〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アンモニウム塩等；酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基質として、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−〔３．３．１．１3,7〕デカン｝−４−イル）フェニルフォスフェート：ＡＭＰＰＤ等；酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、基質として、β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等；酵素としてグルコースオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼの共存下で基質として、β−Ｄ−グルコース、発色剤としてペルオキシダーゼの発色剤を用いることができる。
【００３５】
後記実施例に示すように、血清成分と同様の妨害物質を含む生体試料を上記特定の界面活性剤で処理した後、可溶性ＬＲ１１と反応する抗体にて免疫学的測定を行なえば、前記試料中の可溶性ＬＲ１１を簡便且つ正確に定量することができる。よって、本発明は、前記免疫学的測定を実施するにあたって、抗可溶性ＬＲ１１抗体と、上記特定の界面活性剤を予め組み合わせたキット、すなわちこれらを含む可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キットを提供することもできる。また、抗可溶性ＬＲ１１抗体及び上記特定の界面活性剤を、可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キットを製造するために使用することができる。
当該免疫学的測定用キットは、抗可溶性ＬＲ１１抗体と、上記特定の界面活性剤とを含むが、これら成分が第一試薬と第二試薬として別々の状態、又は混合された状態であってもよい。また、当該キットには、可溶性ＬＲ１１の検出に用いる任意の構成要素、例えば緩衝液、安定化剤や反応容器等を含んでいてもよい。
【００３６】
そして、前述のとおり、血中に存在する可溶性ＬＲ１１の濃度の測定は、動脈硬化性疾患マーカーとなるので、前記キットは動脈硬化性疾患の存在・程度の評価に用いることができる。
ここで、「動脈硬化性疾患」とは、動脈硬化病変の進展に付随して引き起こされる疾患を含む概念である。当該疾患としては、例えば、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後の再狭窄、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、「存在・程度の評価」とは、既に動脈硬化性疾患に罹患している場合に限らず、将来的に罹患する可能性があるか否かを判定する場合も包含する概念である。
【００３７】
前記動脈硬化性疾患の存在・程度の評価の方法としては、例えば、動脈硬化性疾患が疑われる哺乳動物から生体試料を採取し、上述の如く可溶性ＬＲ１１濃度を測定し、別に予め動脈性疾患の疑いのない健常哺乳動物集団から同様に採取した生体試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を算出しておき、両者の濃度レベルを比較することによって、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価を行なうことができる。
【００３８】
ここで、「健常」とは、動脈硬化性疾患を有さない個体を云う。動脈硬化性疾患の有無の客観的な指標としては、ヒトにおいては、冠動脈の閉塞等の動脈硬化性疾患の既往歴がなく、例えば、日本高血圧学会の「高血圧治療ガイドライン２００４」による正常血圧（収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ未満、拡張期血圧８５ｍｍＨｇ未満）；日本糖尿病学会の「糖尿病の分類と診断基準に関する委員会報告（１９９９）」に基づく正常型（空腹時血糖が１１０ｍｇ／ｄｌ未満）；及び日本動脈硬化学会の「高脂血症の診断基準（２００２年）」に該当しないこと（即ち空腹時採血の血清脂質値が総コレステロール２２０ｍｇ／ｄｌ未満、ＬＤＬコレステロール１４０ｍｇ／ｍｌ未満、ＨＤＬコレステロール４０ｍｇ／ｄｌ以上、及びトリグリセリド１５０ｍｇ／ｄｌ未満）、を云う。
【００３９】
さらに、本発明のキットを用いて可溶性ＬＲ１１濃度の経時的変化をモニターすることによって、薬剤等による治療の効果判定を行なうこともできる。
このときの判定は、可溶性ＬＲ１１の濃度変化によってすることができ、例えば、増加傾向を示す場合は疾患（例えば動脈硬化性疾患）の進展、減少又は横ばい傾向を示す場合には疾患の進展が抑制されていると判定される。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４１】
（参考例１）
ウサギ血清或いはヒト血清中の可溶性ＬＲ１１の精製は次のようにして実施した。
（可溶性ＬＲ１１の精製）
ヒトＲＡＰ遺伝子を組み込んだｐＧＥＸ２Ｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）ベクターにより形質転換した大腸菌ＤＨ５αを培養して、遠心分離により菌体を回収した。３Ｌの培養液から回収した菌体を、リゾチーム及び界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液の遠心上清中のＲＡＰ／ＧＳＴ融合タンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）１０ｍＬに通し吸着させた後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で洗浄しＲＡＰ−セファロース樹脂を調製した。
このＲＡＰ−セファロース樹脂１０ｍＬとウサギ血清またはヒト血清１Ｌをそれぞれ混和し、４℃で穏やかに撹拌しながら一晩反応させた後、ＲＡＰ−セファロース樹脂をそれぞれ回収してリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。次にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にてウサギ可溶性ＬＲ１１またはヒト可溶性ＬＲ１１をそれぞれ溶出して濃縮後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析して、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１または精製ヒト可溶性ＬＲ１１とした。【００４２】
（実施例１）
１）血清から精製した可溶性ＬＲ１１とモノクローナル抗体との反応性
固相化可溶性ＬＲ１１に対する各モノクローナル抗体の反応性は、次のようにして確認した。まず、マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０６１２０８）を２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で１００倍希釈した液、または精製ヒト可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０６１２０８）をＰＢＳで２０倍希釈した液を５０μＬ／ウェル用いてそれぞれの可溶性ＬＲ１１を一晩固相化した。これを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）で洗浄後、１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）を１ウェル当たり１００μＬ添加し室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、これに、ビオチン化試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）にてビオチン標識した各モノクローナル抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、及びＲ１４をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して１０μｇ／ｍＬとした抗体液５０μＬを添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとした液５０μＬを添加し、室温で２時間反応させ、ＰＢＳＴで洗浄後、次いでＯＰＤ基質溶液（２０ｍＭオルトフェニレンジアミン、１２ｍＭ過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間反応させ、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定した。尚、抗体の反応性の陰性コントロールとしてマウスＩｇＧを用いた。
その結果（図１）、モノクローナル抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、Ｍ５、Ｒ１４、及びＲ２３は、陰性コントロールであるマウスＩｇＧでは、反応が殆ど認められなかったのに対し、固相化ウサギ可溶性ＬＲ１１及び固相化ヒト可溶性ＬＲ１１にそれぞれ反応が認められた。【００４３】
２）ＥＬＩＳＡ測定系
モノクローナル抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、Ｍ５、Ｒ１４、またはＲ２３をＰＢＳでそれぞれ５μｇ／ｍＬに希釈した後、マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウェル当たり５０μＬを添加し、一晩固相化した。尚、陰性コントロールとしてマウスＩｇＧも固相化した。これをＰＢＳＴにて洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、これに、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０６１２０８）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで２５倍希釈した液、または精製ヒト可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０６１２０８）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで２５倍希釈した液を５０μＬ添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ビオチン標識したモノクローナル抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、Ｍ５、Ｒ１４、またはＲ２３をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して１０μｇ／ｍＬとした抗体液５０μＬ添加し、室温で２時間反応させた（陰性コントロールにはビオチン標識したマウスＩｇＧを用いた）。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとして５０μＬ添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、次いでＯＰＤ基質液を５０μＬ添加し、室温で１０分間反応させ、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定した。【００４４】
その結果、表１及び表２に示すように、次のモノクローナル抗体の組み合わせのサンドイッチＥＬＩＳＡ系にて、液相の精製ウサギ可溶性ＬＲ１１及びヒト可溶性ＬＲ１１を検出することが確認された。【００４５】
【表１】
2009116268.tif 000002
【００４６】
【表２】
2009116268.tif 000003
【００４７】
固相側抗体Ａ２−２−３−液相側抗体Ｍ３、Ｍ５、Ｒ１４、Ｒ２３
固相側抗体Ｍ３    −液相側抗体Ａ２−２−３、Ｍ５、Ｒ１４、Ｒ２３
固相側抗体Ｍ５    −液相側抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、Ｒ１４、Ｒ２３
固相側抗体Ｒ１４  −液相側抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、Ｍ５、Ｒ２３
固相側抗体Ｒ２３  −液相側抗体Ａ２−２−３、Ｍ３、Ｍ５【００４８】
３）サンドイッチＥＬＩＳＡによる精製ＬＲ１１の測定
マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）にＰＢＳで希釈して５μｇ／ｍＬとしたモノクローナル抗体Ｍ３を１ウエルあたり５０μＬ添加して室温で２時間固相化した。ＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１ウエルあたり１００μｇ／ｍＬ添加し室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、これに、参考例１で示した方法で精製したウサギ可溶性ＬＲ１１またはヒト可溶性ＬＲ１１をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ビオチン標識したモノクローナル抗体Ｒ１４をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈し５μｇ／ｍＬとして反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとして反応させ、ＰＢＳＴで洗浄後、次いでＴＭＢ基質液（０．３ｍｇ／ｍＬ  ３，３’−５，５’−Tetramethyl-benzidine dihydrochloride（ＳＩＧＭＡ社製）、１２ｍＭ過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．７）５０μＬを加え室温で３０分間発色させた。その後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）で測定した。
その結果、図２及び図３に示すように、精製可溶性ＬＲ１１を用いれば、抗原濃度すなわちウサギ可溶性ＬＲ１１またはヒト可溶性ＬＲ１１濃度を変動させた場合、抗原濃度依存的な反応を得られることが確認された。【００４９】
４）ＥＬＩＳＡ系に与える血清の影響
まず、マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）にモノクローナル抗体Ｍ３をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈して１ウエルあたり５０μＬ添加して室温で２時間固相化した。ＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１ウエルあたり１００μＬ添加して室温で１時間ブロッキングした。
ＰＢＳＴで洗浄後、これに、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７０６０１）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで１００倍、２００倍、又は４００倍希釈したもの、或いは、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７０６０１）をヒト血清で１００倍、２００倍、又は４００倍希釈したもの５０μＬをそれぞれ加え、室温で２時間反応させた。
ＰＢＳＴで洗浄後、ビオチン標識したモノクローナル抗体Ｒ１４をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して５μｇ／ｍＬとしたもの５０μＬを加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとしたもの５０μＬを添加し、室温で２時間反応させ、次いでＴＭＢ基質液５０μＬを加え、室温で３０分間発色させた。
その後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）で測定した。
その結果、図４に示すように、緩衝液ベースではウサギ可溶性ＬＲ１１の濃度依存的反応が認められたのに対し、ヒト血清ベースでは血清成分の影響により反応阻害を受け検出できなかった。
また、２）で液相の精製ウサギ可溶性ＬＲ１１及びヒト可溶性ＬＲ１１を検出することが確認できた抗体のいずれの組み合わせにおいても、同様に血清成分の影響により検出できなかったことから、特定の抗体の組み合わせの場合に限らず、血清成分の影響が認められた。【００５０】
５）界面活性剤処理による血清成分の影響回避
マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、モノクローナル抗体Ｍ３をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈して１ウエルあたり５０μＬ添加し、室温で２時間固相化した。
ＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、これに、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７０６０１）が反応時５０倍、１００倍、２００倍希釈になるよう添加（ＢｌａｎｋはＰＢＳ）したヒト血清（ヒト血清濃度は反応時１０倍希釈）を、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−９）、コール酸Ｎａ、及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの各界面活性剤３．６％存在下で、１ウエルあたり５０μＬで室温（１５℃〜２５℃）で２時間反応させた。
ＰＢＳＴで洗浄後、ビオチン標識した抗ヒト可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体Ｒ１４をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して５μｇ／ｍＬとした標準抗体液を、１ウエルあたり５０μＬ添加して室温で４時間反応させた。これらをＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとしたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を、１ウエルあたり５０μＬ添加して室温で２時間反応させた。
次いで、ＰＢＳＴで洗浄後、ＴＭＢ基質液を１ウエルあたり５０μＬ加え室温で３０分間発色させた後、１．５Ｎ硫酸を１ウエルあたり５０μＬ加えて発色を停止させた。これを、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）で測定した。
その結果、図５の如く、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）では血清成分の影響を回避できなかったが、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、コール酸Ｎａ、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドでは、血清成分の共存下においても、添加したウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７０６０１）の濃度依存的な反応が得られ、その効果は、特にＭＥＧＡ−８及びＭＥＧＡ−９で顕著であることが判る。尚、図５は試薬Ｂｌａｎｋ値を差し引いたものである。【００５１】
（実施例２）
（ＭＥＧＡ−９濃度変動）
実施例１の５）と同様にして、精製ウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７０６０１）をＰＢＳにて５０倍、１００倍に希釈したものをそれぞれ添加（ＢｌａｎｋはＰＢＳ）したヒト血清（反応時８倍希釈）を、界面活性剤ＭＥＧＡ−９（０％、２．５％、５％、１０％）存在下で反応させた。その結果（図６）、ＭＥＧＡ−９が２．５％〜１０％ではほぼ同等の反応が得られ、血清成分の影響を回避して可溶性ＬＲ１１の測定が可能であることが判る。【００５２】
（実施例３）
実施例２の固相側モノクローナル抗体Ｍ３と液相側モノクローナル抗体Ｒ１４の組み合わせ以外のモノクローナル抗体の組み合わせについて、ＭＥＧＡ−９（０％、２％、４％、５％、７．５％）の効果を確認した。尚、試料はヒト血清（終濃度８倍希釈したもの）である。その結果（図７〜図１１）、検討した何れの組み合わせにおいても、ＭＥＧＡ−９の添加により測定値の上昇が認められ、２％〜７．５％でほぼ一定の値が得られたことから、特定の抗体の組合わせに限らず、界面活性剤の添加により血清成分の影響を受けることなく、可溶性ＬＲ１１の測定が可能であることが判る。【００５３】
（実施例４）
（ヒト血清中可溶性ＬＲ１１の測定）
精製したウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７１１２０）及び蛋白濃度既知の高純度ウシ血清アルブミンを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動して銀染色しこの染色像をデンシトメトリーで解析して、精製したウサギ可溶性ＬＲ１１（Ｌｏｔ．０７１１２０）のＬＲ１１濃度を算出したところ、３．０μｇ／ｍＬであった。この値付けした精製ウサギ可溶性ＬＲ１１を標準物質として、下記の方法により測定したヒト血清中の濃度を算出した。
マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、モノクローナル抗体Ｍ３をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈して１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で２時間固相化した。ＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１ウエルあたり２００μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。
ＰＢＳＴで洗浄後、これに、３例のヒト血清をＰＢＳで３２倍、１６倍、８倍、又は４倍にそれぞれ希釈したものを、５％ＭＥＧＡ−９存在下で、１ウエルあたり１００μＬ添加して、室温（１５℃〜２５℃）で一晩反応させた。
その後、ビオチン標識したモノクローナル抗体Ｒ１４をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．４μｇ／ｍＬとした標準抗体液を、１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で４時間反応させた。これらをＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとしたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を、１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。
次いで、ＰＢＳＴで洗浄後、次いでＴＭＢ基質液を１ウエルあたり１００μＬ加え室温で３０分間発色させた後、１．５Ｎ硫酸を１ウエルあたり１００μＬ加えて発色を停止させた。これを、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）で測定した。
その結果（図１２）、ＭＥＧＡ−９で処理した場合は、３例の血清全てにおいて血清希釈濃度、すなわち血清中ＬＲ１１濃度依存的な反応を示し、得られたＬＲ１１濃度換算値について、血清希釈３２倍から８倍の範囲で良好な希釈直線性が認められた。【００５４】
（実施例５）
（ヒト以外の哺乳動物血清中可溶性ＬＲ１１の測定）
実施例４の測定方法に準じて、ウサギ、サル、ヤギ、ブタの各血清をＭＥＧＡ-９で処理した後、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。
その結果、いずれの場合もヒト血清と同様に良好な希釈直線性が認められた（図１３Ａ）。これに対し、ＭＥＧＡ-９で処理しなかった場合、サル、ヤギ、ブタの血清では殆ど吸光度増加が認められず、ウサギ血清では吸光度増加が認められるものの、ＭＥＧＡ−９で処理した場合に比べ著しく吸光度の増加割合が小さかった（図１３Ｂ）。【００５５】
（実施例６）
（ヒト脳髄液中可溶性ＬＲ１１の測定）
実施例４で使用した値付けした精製ウサギ可溶性ＬＲ１１を標準物質として、下記の方法により、希釈したヒト脳髄液中の可溶性ＬＲ１１濃度を算出した。
マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）にモノクローナル抗体Ｍ３をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈して、１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で２時間固相化した。ＰＢＳＴで洗浄後、１０％シュークロースを含むＢＳＡ−ＰＢＳＴを、１ウエルあたり２００μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。このブロッキング液を吸引除去後、プレートを乾燥させた。
これに、３例のヒト脳髄液をＰＢＳで３２倍、１６倍、８倍、４倍、および２倍にそれぞれ希釈したものを、５％ＭＥＧＡ−９存在下で、１ウエルあたり１００μＬ添加して、室温（１５℃〜２５℃）で一晩反応させた。
その後、ビオチン標識したモノクローナル抗体Ｒ１４をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．４μｇ／ｍＬとした標識抗体液を、１ウエルあたり１００μＬ添加して室温で４時間反応させた。これらをＰＢＳＴで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとしたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を、１ウエルあたり１００μＬ添加して室温で１時間反応させた。
次いで、ＰＢＳＴで洗浄後、ＴＭＢ基質液を１ウエルあたり１００μＬ加えて室温で３０分間発色させた後、１．５Ｎ硫酸を１ウエルあたり１００μＬ加えて発色を停止させた。これを、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）で測定した。
その結果、ＭＥＧＡ-９で処理した場合は、３例の脳髄液全てにおいて、脳髄液希釈濃度すなわち脳髄液中ＬＲ１１濃度依存的な反応を示し、得られたＬＲ１１濃度換算値について、脳髄液希釈３２倍から２倍の範囲で良好な希釈直線性が認められた（図１４Ａ）。
これに対し、ＭＥＧＡ-９で処理しなかった場合は、何れの脳髄液でも十分な吸光度増加は見られなかったため、ＬＲ１１濃度換算値が著しく小さい値となり（図１４Ｂ）、正確な測定ができていないと考えられた。
【図１】
2009116268.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2009116268000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月24日(2009.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来試料中の可溶性ＬＲ１１の免疫学的定量方法であって、試料をポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤の１種以上で処理することを特徴とする可溶性ＬＲ１１の免疫学的測定方法。
【請求項２】
試料が、血液、血漿、血清、髄液又は尿である請求項１記載の免疫学的定量方法。
【請求項３】
免疫学的定量方法が、少なくとも２種の異なる抗原認識部位を有する抗体を用いて免疫複合体を形成する工程を含むものである請求項１又は２記載の免疫学的定量方法。
【請求項４】
界面活性剤がアシル−Ｎ−メチルグルカミンである請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫学的定量方法。
【請求項５】
抗可溶性ＬＲ１１抗体と、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる１種以上の界面活性剤とを含むことを特徴とする可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キット。
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月26日(2009.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の血液、血漿、血清又は髄液の試料中の可溶性ＬＲ１１の免疫学的定量方法であって、試料をポリオキシエチレンＣ8−Ｃ24アルキルフェニルエーテル、Ｃ8−Ｃ24アルキルグリコシド、Ｃ8−Ｃ24アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤で処理することを特徴とする可溶性ＬＲ１１の免疫学的測定方法。
【請求項２】
免疫学的定量方法が、少なくとも２種の異なる抗原認識部位を有する抗体を用いて免疫複合体を形成する工程を含むものである請求項１記載の免疫学的定量方法。
【請求項３】
界面活性剤が、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸ナトリウムから選ばれるものである請求項１又は２項記載の免疫学的定量方法。
【請求項４】
抗可溶性ＬＲ１１抗体と、ポリオキシエチレンＣ8−Ｃ24アルキルフェニルエーテル、Ｃ8−Ｃ24アルキルグリコシド、Ｃ8−Ｃ24アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤とを含むことを特徴とする哺乳動物由来の血液、血漿、血清又は髄液を試料とする可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キット。
【請求項５】
界面活性剤が、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、及びコール酸ナトリウムから選ばれるものである請求項４項記載の可溶性ＬＲ１１免疫学的測定用キット。
【国際調査報告】
2009116268.tif 000018
2009116268.tif 000019
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