(57)【要約】  本発明の目的は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することである。本発明によれば、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項２】
BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項３】
以下の何れかの多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
（ｉ）配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（NCBI SNP Databaseにおける登録番号３７８２８８６）；
（ｉｉ）配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ１１０６６００１）；又は
（ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載した多型と連鎖不平衡の指標ｒ squareが０．８以上の連鎖不平衡状態にある多型；
【請求項４】
炎症性疾患が心筋梗塞である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基、又は配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基、又は配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
プライマーがフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５から７のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、炎症性疾患診断用キット。
【請求項９】
炎症性疾患が心筋梗塞である請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、又は配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を検出することを含む、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現状態の分析方法。
【請求項１１】
候補物質の存在下で細胞内のBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現量またはBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の機能を分析し、当該発現量を抑制させる物質あるいは当該機能を阻害又は修飾する物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含むＢＲＡＰ遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ＢＲＡＰの転写活性の測定方法。
【請求項１３】
配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含むＢＲＡＰ遺伝子断片を細胞に導入し、ＢＲＡＰの転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ＢＲＡＰの転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含むＢＲＡＰ遺伝子断片とＢＲＡＰの転写制御因子の存在が予想される試料とを接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、ＢＲＡＰの転写制御因子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する遺伝子多型を検出することを含む炎症性疾患の診断方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフスタイルの変化及び新しい薬理学的アプローチにも関わらず、心筋梗塞を含む冠状動脈疾患は多くの国々において主要な死亡原因となっている。従って、それらの発症における遺伝的及び環境的因子を同定することが強く望まれている。【０００３】
共通の遺伝的変異は、糖尿病や高血圧症などの生活習慣病に罹患する危険性と顕著に関連していることが知られている。多遺伝子性疾患の感受性遺伝子を同定するには、「連鎖」を利用する方法と、「関連」を利用する方法がある。連鎖解析では、疾患感受性遺伝子の座位と遺伝マーカーー(主としてマイクロサテライト)の座位が連鎖しているかを検出する、すなわち遺伝子座位間の関係を調べるのに対して、関連解析では特定の遺伝マーカー（主として一塩基多型：ＳＮＰ）のどの型（アレル：対立遺伝子）が疾患と関連しているかを検出する、つまり対立遺伝子間の関係を調べる。従って、共通の変異をマーカーとして用いる関連解析は疾患関連遺伝子の局在に対する連鎖解析のよりもずっと強力といえる。一塩基多型（ＳＮＰｓ）は、疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーとなる。ＳＮＰｓは、遺伝子産物の質や量に直接影響を与えたり、ある疾患や薬剤による重篤な副作用に対する危険性を増やすことがある。よって、多くのＳＮＰｓを探索することにより、疾患関連遺伝子の同定や薬剤による副作用を避ける診断方法の確立に寄与できることを期待される。【０００４】
遺伝子変異と心筋梗塞との関係については、リンホトキシン-α（ＬＴ-α）遺伝子、Ｉ Kappa Ｂ−like（ＩＫＢＬ）遺伝子、又はＢＡＴ１遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（ＷＯ２００４／０１５１００号公報）、ガレクチン−２の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（国際公開ＷＯ２００５／０１７２００号公報）などがある。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子内のＳＮＰと心筋梗塞との関連についても報告されている（S.Takagi他、Hypertens Res. Vol.25, No.5 (2002), pages 677-681）。しかしながら、この報告では、サンプル数、Ｐ値とも十分ではなく、データの信頼性としては低いものであった。即ち、この文献では、少ないサンプル数でALDH2のSNPしか解析していないため、ジェノタイピングエラーも考えられることより、結果の信頼性が低く、その有意性も低いものである。上記の通り、心筋梗塞と関連のある遺伝子変異の解明は未だ十分なものではない。【０００５】
【非特許文献１】S.Takagi他、Hypertens Res. Vol.25, No.5 (2002), pages 677-681
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０１５１００号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０１７２００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、同定したＳＮＰを利用して、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）が心筋梗塞の発症進展に関連していることを同定することにより本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
（２）  BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。【０００９】
（３）  以下の何れかの多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
（ｉ）配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ３７８２８８６）；
（ｉｉ）配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ１１０６６００１）；又は
（ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載した多型と連鎖不平衡の指標ｒ squareが０．８以上（好ましくは、０．９以上）の連鎖不平衡状態にある多型；【００１０】
（４）  炎症性疾患が心筋梗塞である、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）  配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基、又は配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、（１）から（４）の何れかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。【００１１】
（６）  配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基、又は配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、（１）から（４）の何れかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
（７）  プライマーがフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである（６）に記載のオリゴヌクレオチド。
（８）  （５）から（７）のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、炎症性疾患診断用キット。
（９）  炎症性疾患が心筋梗塞である（８）に記載のキット。【００１２】
（１０）  配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型、又は配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を検出することを含む、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現状態の分析方法。【００１３】
（１１）  候補物質の存在下で細胞内のBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現量またはBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の機能を分析し、当該発現量を抑制させる物質あるいは当該機能を阻害又は修飾する物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１２）  配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含むＢＲＡＰ遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ＢＲＡＰの転写活性の測定方法。【００１４】
（１３）  配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含むＢＲＡＰ遺伝子断片を細胞に導入し、ＢＲＡＰの転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ＢＲＡＰの転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法。
（１４）  配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型を含むＢＲＡＰ遺伝子断片とＢＲＡＰの転写制御因子の存在が予想される試料とを接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、ＢＲＡＰの転写制御因子のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する一塩基多型（ＳＮＰ）が新たに同定された。本発明で同定されたＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明では、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子産物が、心筋梗塞等の炎症性疾患感受性遺伝子産物として知られているガレクチン−２遺伝子産物と結合することを同定した。本発明により同定されたBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の新たな診断、予防法、治療薬の開発が可能になる。以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。【００１７】
［１］  炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することによって、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する方法である。【００１８】
本発明において「BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型（一塩基多型など）を検出する」とは、（ｉ）当該遺伝子多型（遺伝子側多型と称する）を直接検出すること、及び（ｉｉ）前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型（相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものとする。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。【００１９】
BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）2遺伝子に存在する遺伝子多型の好ましい具体例としては、
（ｉ）配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ３７８２８８６）；
（ｉｉ）配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ１１０６６００１）；又は
（ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載した多型と連鎖不平衡の指標ｒ squareが０．８以上（好ましくは、０．９以上）の連鎖不平衡状態にある多型；
を挙げることができる。【００２０】
なお、配列番号１における９０番目の塩基であるｒは、Ａ又はＧのいずれかを示す。また、配列番号２における２７０番目の塩基であるｒは、Ａ又はＧのいずれかを示す。【００２１】
上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載した多型と連鎖不平衡の指標ｒ squareが０．８以上（好ましくは、０．９以上）の連鎖不平衡状態にある多型としては、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子内における当該多型、並びにＦＬＪ３００９２遺伝子内における当該多型でもよいし、上記２種類の遺伝子以外の遺伝子内における当該多型でもよい。なお、ＦＬＪ３００９２遺伝子は、ＡＦ−１特異的プロテインホスファターゼ遺伝子である。【００２２】
上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載した多型と連鎖不平衡の指標ｒ squareが０．８以上（好ましくは、０．９以上）の連鎖不平衡状態にある多型の具体例としては、ＦＬＪ３００９２遺伝子内のＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ２０７４３５６）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２ファミリー（ＡＬＤＨ２）遺伝子内の２つのＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ６７１、及びｒｓ４６４６７７６）などを挙げることができる。【００２３】
例えば、後記表４に示すように、配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基がＡである場合は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。【００２４】
これに対し、配列番号１に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のエキソン５の塩基配列において９０番目の塩基がＧである場合は、炎症性疾患が発症しているか、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。【００２５】
本発明では、上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載した多型と連鎖不平衡の指標Δ2が０．８以上（好ましくは、０．９以上）の連鎖不平衡状態にある多型を用いることもできる。【００２６】
連鎖する二つの座位があるとする。どちらも対立遺伝子が二つ存在する(SNPの様な二対立遺伝子座位: biallelic loci)とし、第一の座位の対立遺伝子を1, 2、第二の座位の対立遺伝子を1,2とする(言うまでもなく、第一遺伝子座と第二遺伝子座の対立遺伝子1は別のもの)。もし、第一座位と第二座位に連鎖不平衡がなければ、染色体が第一遺伝子座の1, 2のどちらを持っているかと、第二遺伝子座の1,2のどちらを持っているかで4つのハプロタイプがあることになる。それぞれのハプロタイプの頻度を次のようにする。【００２７】
【表１】
2009057640.tif 000002
【００２８】
この場合、それぞれの遺伝子座における対立遺伝子1,2の頻度は次のようになる。【００２９】
【表２】
2009057640.tif 000003
【００３０】
・は積の記号ではなく、ドットである。p1・ は一つの変数。
もし、連鎖不平衡が無ければ1-1のハプロタイプの頻度は第一遺伝子座、第二遺伝子座の対立遺伝子1の頻度の関である。 即ち、連鎖不平衡が無ければ、
p11=p1・ p・1。
しかし、連鎖不平衡があるとそうはならない。そのずれの程度を下式のようにDで表すと、 D = p11-p1・ p・1 
そうすると、4つのハプロタイプの頻度は対立遺伝子の頻度とDを用いて次のように表すことができる。【００３１】
【表３】
2009057640.tif 000004
【００３２】
Dを連鎖不平衡係数という。Dは次のようにも表すことができる。
D = p11 p22 - p12 p21 
連鎖不平衡が無いとき、D = 0であり、D > 0のとき、正の連鎖不平衡という。
rを組み換え割合とすると、Dは世代あたりrの割合で減少する。即ち、ある世代の連鎖不平衡係数をDとすると、n 世代後の連鎖不平衡係数Dnは、
Dn = (1-r)n D
実は、すべてのハプロタイプ頻度と対立遺伝子頻度が0と1の間の値を取るという要請から、Dの範囲は以下のように限られている。
即ち、D>0 or D=0の場合は、Dの取り得る最大値は、
Dmax = min (p1・ p・2, p2・ p・1)
D<0の場合は Dの取り得る最小値は
Dmin = max (-p1・ p・1, -p2・ p・2)
従って、以下のように連鎖不平衡係数を標準化した次の値で表すこともある。
D' = D/Dmax (Dが正の場合) 
D' = D/Dmin (Dが負の場合) [ただし、D<0の場合、D'=-D/Dminとしている論文もある。] 
上のように定義した場合、D'は必ず正または0となる。[しかし、[]内のようにすればD<0となる。] 
DやD'以外にも、次のρが用いられることもある。ρ2はχ2/nに等しく、しばしばΔ2と表される。【００３３】
Δ2=ρ2 = D2/(p1・ p2・ p・1 p・2)
これらを含め、しばしば用いられる連鎖不平衡の指標を示す。【００３４】
【化１】
2009057640.tif 000005
【００３５】
上記したΔ2（又はρ2）は、連鎖不平衡の指標ｒ squareと同義である。【００３６】
上記多型のうち、一方のアレル頻度が任意の非罹患者集団におけるよりも任意の患者集団において有意に高いものが、本発明の診断方法に利用することができる。【００３７】
患者集団および非罹患者集団は、それぞれ統計学上信頼し得る結果を与えるに十分な数からなる集団であれば、その大きさ（サンプル数）、各サンプルの背景（例えば、出身地、年齢、性別、疾患等）などに特に制限はない。【００３８】
本明細書において、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の多型分析（ＶＮＴＲやＲＦＬＰ）及び／又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。【００３９】
また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。【００４０】
（検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位及びその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合）ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。【００４１】
（増幅）
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。【００４２】
プライマーの選択は、例えば、配列番号１又は配列番号２に示される配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅するように行う。
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。【００４３】
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。【００４４】
（遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、被検試料とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号１又は配列番号２に示す配列における前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プローブには、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になることによって上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。【００４５】
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。【００４６】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。【００４７】
遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する。【００４８】
遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによって行ってもよい（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等の公知の方法により行うことができる。【００４９】
遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：denaturing gradient gel electrophoresis）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ：single strand conformation polymorphism）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（allele- specific PCR）、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：chemical cleavage of mismatches）、ＨＥＴ（heteroduplex method）法、ＰＥＸ（primer extension）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等を用いることができる。【００５０】
［２］  炎症性疾患診断用キット
前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。【００５１】
［３］  BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現状態の分析方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を検出することによって、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現状態を分析することができる。
例えば、配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基がＧである場合（ＢＲＡＰ  イントロン３  ２７０Ｇ）は、ＢＲＡＰの発現量が高いと判断できる。これに対し、配列番号２に示すBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子のイントロン３の塩基配列において２７０番目の塩基がＡである場合（ＢＲＡＰ  イントロン３  ２７０Ａ）は、ＢＲＡＰの発現量が低いと判断できる。【００５２】
［４］  炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明によれば、候補物質の存在下で細胞内のBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子の発現量を分析し、その発現量を抑制させる物質を選択することによって、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、候補物質の存在下で細胞内のBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子の発現量を分析し、その発現量を減少させる物質を選択することができる。【００５３】
上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を変化させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。【００５４】
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。【００５５】
［５］  BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写活性の測定方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を含むBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写活性を測定することができる。
本発明の好ましい態様によれば、前記BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポーター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。【００５６】
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。【００５７】
［６］  BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記した一塩基多型を含むBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子断片を細胞に導入し、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）転写活性を阻害又は促進する物質をスクリーニングすることできる。
本発明の好ましい態様によれば、前記BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば、ＢＲＡＰ  イントロン３  ２７０Ｇ）を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質はBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）転写活性阻害物質として選択することができる。【００５８】
ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。【００５９】
上記のスクリーニング法により得られるBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写活性を阻害又は促進する物質もまた本発明の範囲内である。このようなBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写活性を阻害する物質は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有用である。【００６０】
［７］ BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写制御因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、前記した一塩基多型を含む遺伝子断片とBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写制御因子をスクリーニングすることもできる。前記の一塩基多型を含む遺伝子断片とBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析：electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、DNase I フットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動におけるＤＮＡの移動度が低下するので、32Ｐで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィーでＤＮＡの位置を見ると、因子の結合したＤＮＡはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。【００６１】
［８］BRCA1 関連タンパク質の阻害・修飾剤のスクリーニング方法
本発明においては、候補物質の存在下でBRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の機能を分析し、その機能を阻害又は修飾する物質を選択することによって、BRCA1 関連タンパク質の阻害・修飾剤をスクリーニングすることができる。ＢＲＡＰの機能としては、ガレクチン−２に結合する機能、又はＮＦｋＢの活性を維持又は向上させる機能などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。従って、例えば、候補物質の存在下または非存在下において、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）とガレクチン−２との結合状態を分析し、上記結合を阻害する物質をBRCA1 関連タンパク質の阻害剤として選択することができる。あるいは、候補物質の存在下または非存在下において、BRCA1 関連タンパク質（ＢＲＡＰ）を発現する細胞、組織、器官又は個体におけるＮＦｋＢの活性を測定し、ＮＦｋＢの活性を低下させる物質を、BRCA1 関連タンパク質の阻害剤として選択することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
［実施例１］ガレクチン−２に結合するタンパク質である、ＢＲＣＡ１関連タンパク質（ＢＲＡＰ）の同定
ＨｅＬａ細胞から抽出したタンパク質を用いて、タンデム・アフィニティー精製により心筋梗塞感受性遺伝子産物ガレクチン−２に結合する新規タンパク質をスクリーニングした。
具体的には、タンデム・アフィニティー精製操作は、リガウト（Ｒｉｇａｕｔ）らにより記載された方法（Ｒｉｇａｕｔ，Ｇ．ｅｔａｌ．  Ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７，  １０３０−１０３２（１９９９））を基本として、該方法にいくつかの修正を加えて実施した。【００６３】
ｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクター（シグマ）において、ＴＡＰタグ配列として、ＴＥＶ切断部位、ＳタグおよびＨｉｓタグをコードする融合発現カセットを構築した。構築したＴＡＰベクターは、サイトメガロウイルス・プロモーターの制御の下、哺乳動物細胞内でＣ末端ＴＡＰタグとともにＮ末端Ｍｙｃタグ化標的タンパク質を発現する。１５０ｍｍディッシュ内でＦｕｇｅｎｅ（ロシュ）を使って、ガレクチン−２ＴＡＰベクター又はネガティブコントロールであるＴＡＰベクターをＨｅＬａ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク；ＪＣＲＢ９００４から入手）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、２０ｍｌあたり１つのコンプリート・プロテアーゼ・インヒビター・タブレット（ロシュ）および５μｇ ｍｌ-1  ＭＧ−１３２（カルビオケム）を含むタンパク質抽出試薬（クロンテク）を使って氷上で溶解し、およびＳ−プロテイン結合／洗浄緩衝液（ノバジェン）を使って１０倍に希釈した。抽出物を４℃で１２〜１８時間Ｓ−タンパク質・アガロース（ノバジェン）でインキュベートした。アガロースをＳ−タンパク質結合／洗浄緩衝液で３回洗浄し、およびＴＥＶプロテアーゼ分解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ノニデントＰ−４０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０）で一度洗浄し、および１００ユニットのＴＥＶプロテアーゼ（インビトロジェン）を用いて１７℃で２時間インキュベートすることで結合したＴＡＰ−タグ化タンパク質を溶出した。溶出したタンパク質を、リン酸緩衝塩溶液で透析し、およびさらにタロン（ＴＡＬＯＮ）・アフィニティー精製システム（クロンテク）で精製した。これらのタンパク質複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびシンプリー・ブルー（インビトロジェン）で溶出し、濃縮し、および分析した。タンパク質結合物を、アプロ・ライフサイエンス・インスティトゥートにてＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分光計で分析した。【００６４】
分析した結果、ガレクチン−２に結合するタンパク質としてＢＲＣＡ１関連タンパク質（ＢＲＡＰ）を同定した（図１ａを参照）。【００６５】
［実施例２］ＢＲＡＰ遺伝子内一塩基多型と心筋梗塞との相関
ガレクチン−２がＢＲＡＰと結合することが明らかとなり、ＢＲＡＰの遺伝子産物の機能変化が心筋梗塞の感受性に関連している可能性が示唆されることから、ＢＲＡＰ遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を用いて、患者（３３６２名）、コントロール（３８２３名）についてcase-control association studyを、国際公開ＷＯ２００４／０１５１００号公報に記載の方法に準じて行った。即ち、ＳＮＰのタイピングは、インベーダーアッセイにより行い、カイ二乗検定により解析を行った。その結果、ＢＲＡＰ遺伝子内エキソン５  ９０番目Ａ＞ＧのＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ３７８２８８６）のminor homozygote (ＧＧ allele)が心筋梗塞患者で有意に多いことを見出した（表４）。このことから、ＢＲＡＰ遺伝子内エキソン５  ９０番目Ａ＞ＧのＳＮＰが、心筋梗塞に関連している可能性が示唆された。また、このＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ３７８２８８６）は、同遺伝子イントロン３  ２７０Ａ／Ｇ  ＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ１１０６６００１）、および染色体上近接した遺伝子であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ２ファミリー（ＡＬＤＨ２）遺伝子内の２つのＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ６７１、及びｒｓ４６４６７７６）、ＦＬＪ３００９２遺伝子内の一つのＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ２０７４３５６）と強い連鎖不平衡の関係にあることがＨａｐＭａｐデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ／）で確認できた。また、ＡＬＤＨ２遺伝子内のＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ６７１）及びＦＬＪ３００９２遺伝子内のＳＮＰ（NCBI SNP Databaseにおける登録番号ｒｓ２０７４３５６）もまた、心筋梗塞と強い関連が見られた。【００６６】
【表４】
2009057640.tif 000006
【００６７】
［実施例３］ガレクチン−２とＢＲＡＰのＣＯＳ７共強制発現系での結合確認
動物細胞内でＭｙｃタグ化ガレクチン−２およびＳ−タグ化ＢＲＡＰを発現するベクターを構築し、ＣＯＳ７細胞（サル腎臓細胞株）に共強制発現して、各発現タンパク質に特異的な抗体で免疫沈降することにより結合の有無を確認した。【００６８】
哺乳動物細胞における共免疫沈降のために、Ｆｕｇｅｎｅを使ってＣＯＳ７細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク；ＪＣＲＢ９１２７から入手）にＭｙｃタグ化ガレクチン−２およびＳ−タグ化ＢＲＡＰの発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした。４０ｍｌあたり１つのコンプリート・プロテアーゼ・インヒビター・タブレットＥＤＴＡ（ロシュ）および５μｇ ｍｌ-1  ＭＧ−１３２（カルビオケム）を含む溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％  ノニデントＰ−４０を含む２０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．５）内で免疫沈降を実施した。トランスフェクションした２４時間後、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞をＳ−タンパク質（ノバジェン）またはＭｙｃアガロース（サンタ・クルズ）を使って、４℃で２時間処理した。免疫沈降物を溶解緩衝液で３回洗浄した。Ｓ−タンパク質（ノバジェン）又は抗Ｍｙｃペロキシダーゼ・コンジュゲート（サンタ・クルズ）で複合化させたホースラディッシュ・ペロキシダーゼを使って免疫混合物を視覚化した。【００６９】
ＢＲＡＰのＳタグに特異的に結合するＳ−タンパク質またはＭｙｃ−ガレクチン−２に特異的に結合する抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降したとき、ガレクチン−２またはＢＲＡＰがそれぞれ同時に沈降した（図１ｂを参照）。これは、ガレクチン−２とＢＲＡＰが直接かつ特異的に結合する可能性のあることを示す。【００７０】
［実施例４］ＢＲＡＰとガレクチン−２の血管平滑筋細胞における共局在
ガレクチン−２に特異的な抗体をフルオレセイン、およびＢＲＡＰに特異的な抗体をローダミンで標識し、冠動脈血管平滑筋細胞を免疫染色して、共焦点レーザー顕微鏡でガレクチン−２およびＢＲＡＰの発現を観察した。【００７１】
ポリクローナル抗ヒトガレクチン−２およびＢＲＡＰ免疫血清を、大腸菌で合成した組換えタンパク質を使ってウサギで作製した。ポリクローナル抗ガレクチン−２免疫血清およびＢＲＡＰを、ＥＺラベルTMタンパク質標識キット（ピアース）を使って、それぞれフルオレセインおよびローダミンで標識した。ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ；カンブレックス）を培養し、および固定した。その後、３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝塩溶液内で標識した抗体とともに該ＨＣＡＳＭＣを培養した。検体をオリンパス・フルオビィウ（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＦＬＵＯＶＩＥＷ）共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス）で観察した。【００７２】
その結果、ガレクチン−２およびＢＲＡＰは細胞質および核に共局在していることが観察できた（図１ｃを参照）。【００７３】
［実施例５］冠動脈血管平滑筋細胞におけるＢＲＡＰイントロン３ＳＮＰのルシフェラーゼ・アッセイ
ｐＧＬ３基本ベクター（ルシフェラーゼ）にＢＲＡＰプロモーター領域（ＢＲＡＰプロモーター−ルシフェラーゼ）を挿入したベクターを構築した。さらに該ベクターにＳＮＰのＡアレルまたはＧアレルを１回または３回含むオリゴヌクレオチドをそれぞれ挿入したものを構築し、該構築物を血管平滑筋細胞にトランスフェクションして、ルシフェラーゼ活性を測定した。【００７４】
ＢＲＡＰプロモーター−ｐＧＬ３基本ベクター（ＢＲＡＰプロモーター−ルシフェラーゼ）の構築のために、５’側非コード領域の２１番目の塩基からプロモーター領域の−９９１番目に対応するＤＮＡ断片を、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲで増幅した。増幅したＰＣＲ産物をｐＧＬ３−基本ベクター（プロメガ）のＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限酵素部位に５’−３’方向でクローン化した。ＢＲＡＰプロモーター−ＳＮＰ−ルシフェラーゼを含むベクターを構築するために、ＢＲＡＰルシフェラーゼのベクター構築物のＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位に、１又は３の繰り返しの二本鎖オリゴヌクレオチド（イントロン３の２６４〜２７８位）をクローン化したベクターを構築した。ＨＣＡＳＭＣ生育培地（ペプチド研）でＨＣＡＳＭＣを培養した。その後、ヌクレオフェクター・システム（アマクサ）を用いて、１μｇのベクター構築物および０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫベクター（トランスフェクション効率の内部コントロール）を細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収し、およびデュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プロメガ）を使ってルシフェラーゼ活性を測定した。【００７５】
その結果、ＧアレルではＡアレルに比較して強いルシフェラーゼ活性が観察され、これはＧアレルを持つ個体においてＢＲＡＰの発現がＡアレルよりも高いことを示す（図２ａを参照）。【００７６】
［実施例６］冠動脈血管平滑筋細胞核抽出液を用いたＢＲＡＰイントロン３ＳＮＰ領域配列オリゴによるゲルシフトアッセイ
既報の方法で、ＨＣＡＳＭＣから調製した核酸抽出物を、１％のウシ血清アルブミンの存在下、およびＤＩＧゲル−シフトキット（ロシュ）を使ったジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄｄＵＴＰで標識した１６のオリゴヌクレオチド（ＢＲＡＰのイントロン３の２６４〜２７６）の６タンデムコピーとともにインキュベートした。室温でポリ［Ｉ（ｄｃ）］試薬を用いずに反応した。比較実験として、非標識化オリゴヌクレオチド（１２５倍過剰）をＤＩＧ標識化オリゴヌクレオチドの添加前に核酸抽出物でプリインキュベートした。タンパク質／ＤＮＡ複合体を、０．５倍トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液内で非変性６％ポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン）を用いて分離し、およびニトロセルロース膜に移した。製造者の指示に従って、化学蛍光検出システム（ロシュ）でシグナルを検出した。【００７７】
その結果、Ａアレルに強く結合する未知の因子が存在することが確認できた（図２ｂを参照）。【００７８】
［実施例７］冠動脈血管内皮細胞でＢＲＡＰおよびＡＬＤＨ２のｍＲＮＡをノックダウンしたときのＮＦｋＢ活性の変化
ＢＲＡＰおよびＡＬＤＨ２に対する各２種類のｓｉＲＮＡを用いてＢＲＡＰおよびＡＬＤＨ２をノックダウンし、ＮＦｋＢ特異的なＥ−セレクション・プロモーター配列にルシフェラーゼを結合したベクター（ＮＦｋＢが活性を間接的にルシフェラーゼで測定できる）をトランスフェクトしてルシフェラーゼ活性を測定した。【００７９】
ＢＲＡＰおよびＡＬＤＨ２のｍＲＮＡをノックダウンするために、合成ステルス（ＳｔｅａｌｔｈTM）ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド二本鎖（ＢＲＡＰに対してＢＲＡＰ−ＨＳＳ１１２１３８およびＢＲＡＰ−１１２１３９、ＡＬＤＨ２に対してＡＬＤＨ２−ＨＳＳ１００３６９およびＡＬＤＨ２−ＨＳＳ１００３７０）を使った。ステルス（ＳｔｅａｌｔｈTM）ＲＮＡｉネガティブコントロール高ＧＣ含二本鎖（インビトロジェン）を陰性コントロールとして使った。ＨＣＡＥＣ生育培地でＨＣＡＥＣを培養した。細胞に各ステルスＲＮＡｉをトランスフェクトした。２４時間後、各ステルスＲＮＡｉ、ｐＮｉＦｔｙプラスミドベクターおよびヌクレオフェクター・システム（アマクサ）によりＮＦｋＢ特異的Ｅ−セレクション・プロモーター（インビボジェン）を結合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を細胞に共トランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収し、およびルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システムを用いて測定した。ＳＹＢＲグリーンおよびＡＢＩ７７００配列検出機を使ってｍＲＮＡを定量した。【００８０】
ＢＲＡＰをノックダウンすることによりＮＦｋＢの活性が低下し、およびＡＬＤＨ２をノックダウンすると逆にＮＦｋＢの活性が上昇した（図２ｃを参照）。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明で同定されたＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、ＴＡＰ法によるＢＲＡＰの同定（ａ）、ＣＯＳ７強制発現系によるＢＲＡＰとガレクチン−２の結合確認（ｂ）、及び血管平滑筋細胞におけるガレクチン−２とＢＲＡＰの共局在（ｃ）を示す。
【図２】図２は、冠動脈血管平滑筋細胞におけるＢＲＡＰイントロン３Ａ／Ｇ  ＳＮＰのルシフェラーゼアッセイ（ａ）、冠動脈血管平滑筋細胞抽出液によるＢＲＡＰイントロン３Ａ／Ｇ  ＳＮＰ領域のゲルシフトアッセイ（ｂ）、冠動脈血管内皮細胞でのＢＲＡＰ、ＡＬＤＨ２ノックダウンによるＮＦκＢ活性の変化を示す。
【図１】
2009057640.tif 000007
【図２】
2009057640.tif 000008
【配列表】
2009057640000001.app
【国際調査報告】
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