(57)【要約】  病原性細菌の病原性をその細菌の遺伝子型の特徴を検出することによって、迅速確実に評価できる評価方法とその評価用キットを提供することを課題とし、病原性細菌の病原性を評価する方法であって、病原性細菌の滑走能を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中に先のタンパク質の機能に影響を与える変異が少なくともひとつあるか否か、を確認することを特徴とする病原性の評価方法、上記の病原性の評価方法を使用する病原性細菌の病原性の評価用キット、及び、（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子によって上記課題を解決した。（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有しその菌の病原性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ；（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌の病原性を評価する方法であって、病原性細菌の滑走能を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中に先のタンパク質の機能に影響を与える変異が少なくともひとつあるか否か、を確認することを特徴とする病原性の評価方法。
【請求項２】
病原性細菌の病原性を評価する方法であって、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中に先のタンパク質の機能を抑圧する変異が少なくともひとつあるか否か、を確認する請求項１に記載の病原性の評価方法。
【請求項３】
病原性細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である請求項１に記載の病原性の評価方法。
【請求項４】
病原性細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である請求項２に記載の病原性の評価方法。
【請求項５】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の病原性を評価する方法であって、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中の配列番号２に記載のアミノ酸番号２９に相当する塩基配列に変異があるか否か、を確認する請求項４に記載の病原性の評価方法。
【請求項６】
病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡからなるものである請求項２、請求項４又は請求項５のいずれかの請求項に記載の病原性の評価方法。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載の病原性の評価方法を使用するための評価用キットであって、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプライマー、又は、その遺伝子中の先のタンパク質の機能を抑圧する変異を検出するためのプライマーを少なくともひとつ有することを特徴とする病原性細菌の病原性の評価用キット。
【請求項８】
請求項４又は請求項５に記載の病原性の評価方法を使用するための評価用キットであって、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプライマー、又は、その遺伝子中の先のタンパク質の機能を抑圧する変異を検出するためのプライマーを少なくともひとつ有することを特徴とする病原性細菌の病原性の評価用キット。
【請求項９】
請求項６に記載の病原性の評価方法を使用するための評価用キットであって、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプライマー、又は、その遺伝子中の先のタンパク質の機能を抑圧する変異を検出するためのプライマーを少なくともひとつ有することを特徴とする病原性細菌の病原性の評価用キット。
【請求項１０】
下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有しその菌の病原性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
【請求項１１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有しその菌の病原性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）は、院内感染の主要菌として特に注意が必要とされている菌である。このＭＲＳＡは、病院から家庭等の市中に運ばれた場合、薬剤耐性以外の病原性は特に強くなく、また、駆逐され易いものと考えられてきた。しかしながら、近年、外来患者からもＭＲＳＡが検出され、市中感染型の病原性の高いＭＲＳＡの存在が報告されるようになり、病原性の高いＭＲＳＡへの新たな対応が求められるようになってきた。【０００２】
このような病原性の高いＭＲＳＡに対して適切に対応するためには、通常のＭＲＳＡと病原性の高いＭＲＳＡを明確に識別した上でそれぞれを評価し、その評価結果に応じて適切な薬剤を選択し、その使用方法を決定することが重要と考えられる。個々の患者から分離されたＭＲＳＡの病原性の高さを考慮することなく、バンコマイシン等の抗生物質を乱用することは、これらに対する耐性菌の出現を助長することとなるため厳に避けねばならない。また、新たな治療薬や治療法の開発の場面でも、ＭＲＳＡの病原性の高さを識別した上で開発を進めることが重要と考えられる。【０００３】
通常、ある菌を識別する方法は、その菌の外面的な特徴を分析する方法、その菌の生物活性を分析する方法、遺伝子型の特徴を分析する方法に大きく分けられる。これまで、病原性に関しては、その菌の産生する毒素に由来する溶血活性、嘔吐活性、致死性の強さ等により識別され評価されてきた。また、病原性に関する遺伝子型の特徴も、その毒素に係わる遺伝子の有無により識別されてきた（例えば、非特許文献１〜３）。【０００４】
しかしながら、多くの臨床的に高い病原性を示すＭＲＳＡの遺伝子型の特徴は明らかとなっておらず、ＭＲＳＡの遺伝子型による識別は、充分にはできていないという現状があった。すなわち、上記した従来の検討によって見出された遺伝子型の特徴によっては、病原性の高さを明確に評価できる状態には至っていなかった。【０００５】
最近、本発明者の研究により、従来、固体表面上での移動能力を持たないと考えられていた黄色ブドウ球菌が軟寒天培地上を滑走する能力を持つことが分かった（非特許文献４）。更に、本発明者がこの黄色ブドウ球菌の滑走能と黄色ブドウ球菌の病原性との相関を調べたところ、滑走能の低い黄色ブドウ球菌は、高いものに比べて明確に病原性が低いことを見出した。そしてその知見から、滑走能の大小の測定は、黄色ブドウ球菌の病原性を評価する為のこれまでにない評価方法として用いることができることを見出し、既に特許出願を行った（特願２００６−３４２７１３）。【０００６】
なお、本願は優先権主張がなされているが、その基礎出願（特願２００８−１５８１７６）の出願時は、上記特許出願（特願２００６−３４２７１３）は公開されていない。その後、優先権主張を伴った本願出願時には、上記特許出願（特願２００６−３４２７１３）は公開されている（特許文献１）。【０００７】
しかしながら、黄色ブドウ球菌等の滑走能を制御する因子をコードする遺伝子は明らかではなかった。
【特許文献１】特開２００８−１４８６６９号公報
【非特許文献１】山本達夫ら、日本化学療法学会雑誌、52(11),  635-652（2004）
【非特許文献２】伊藤輝代ら、感染症学雑誌、78(6),  459-469（2004）
【非特許文献３】重茂克彦、食品衛生、51(4),  81-90（2005）
【非特許文献４】C.Kaito  and  K.Sekimizu  J.Bacteriol.,189(6),  2553-2557(2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記した「菌の外面的な特徴や生物活性により菌を識別する方法」は、検体からの菌の分離工程、菌の培養工程等を行った後に識別工程を行う必要があるため、迅速に結果を得て治療方針を決定する必要のある臨床現場では、患者への対応や二次感染を防ぐという点で遅きに失する場合も多い。そこで、このような生物活性等を発現するに至った原因の遺伝子型の違いを明らかにし、それを直接分析することができれば、より確定的で迅速な識別方法と評価方法になり得るものと考えられる。【０００９】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、その課題は、病原性を示すがその遺伝子について未だ明らかとなっていない病原性細菌の遺伝子についての特徴を見出し、その特徴をターゲットとする、病原性細菌の病原性の評価方法、病原性評価用プライマー、そのプライマーを含む病原性の評価用キット等を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は先の課題を解決するために、まず臨床分離したメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＳＳＡ」と略記する）１０株とＭＲＳＡ４０株の滑走能力の比較を行った。その結果、ＭＳＳＡ１０株は、すべての株が滑走するのに対し、ＭＲＳＡは、４０株中２９株において滑走能力が低下しており、残りの１１株については滑走能力が高いことを確認した。【００１１】
メチシリン耐性に関係する遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子の存在するＳＣＣｍｅｃ領域に注目して鋭意検討を行ったところ、ｍｅｃＡ遺伝子、ｍｅｃＲ１、ｍｅｃＩ遺伝子等の既知の遺伝子は、滑走能力を強く抑圧する遺伝子ではないことが分かった。そこで、この領域上のオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」と略記する）を詳細に検討したところ、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５のゲノムデータベースではＯＲＦとして登録されていない、７０アミノ酸をコードする遺伝子（これを、「ｆｕｄｏｈ」と命名した。以下、「ｆｕｄｏｈ」と略記する）を見出した。そして、ｆｕｄｏｈ遺伝子を持つプラスミドは滑走能力を抑圧することを確認した。【００１２】
すなわち、ＭＲＳＡ株の中で滑走能力の高いＭＲＳＡ１１株のうち、１０株にはｆｕｄｏｈ遺伝子産物のアミノ酸置換を伴う一塩基変異が生じていること、残りの１株にはｆｕｄｏｈ遺伝子が存在しなかったこと、それらの株よりも滑走能力の低い２９株にはｆｕｄｏｈ遺伝子に変異がないことを確認した。【００１３】
更に、ＳＣＣｍｅｃ脱落株及びｆｕｄｏｈ遺伝子導入株の滑走能力の検討や、それらの株のカイコやマウスに対する病原性の検討等により、ｆｕｄｏｈ遺伝子が滑走能力を抑圧し、また病原性もそれに伴って低下していること等を確認し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち本発明は、
（１）病原性細菌の病原性を評価する方法であって、病原性細菌の滑走能を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中に先のタンパク質の機能に影響を与える変異が少なくともひとつあるか否か、を確認することを特徴とする病原性の評価方法。
（２）病原性細菌の病原性を評価する方法であって、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中に先のタンパク質の機能を抑圧する変異が少なくともひとつあるか否か、を確認する（１）記載の病原性の評価方法。
（３）病原性細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である（１）又は（２）記載の病原性の評価方法。
（４）メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の病原性を評価する方法であって、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の有無、又は、その遺伝子中の配列番号１に記載のアミノ酸番号２９に相当する塩基配列に変異があるか否か、を確認する（３）に記載の病原性の評価方法。
（５）病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡからなるものである（１）ないし（４）のいずれかに記載の病原性の評価方法。
（６）（１）ないし（５）の何れかひとつに記載の病原性の評価方法を使用することを特徴とする病原性細菌の病原性の評価用キット。
（７）病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプライマー、又は、その遺伝子中の先のタンパク質の機能を抑圧する変異を検出するためのプライマーを少なくともひとつ有する（６）記載の病原性細菌の病原性の評価用キット。
（８）下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有しその菌の病原性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（９）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有しその菌の病原性に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
等に関するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、薬剤耐性菌の遺伝子型による病原性の評価方法を提供することができる。すなわち、病原性細菌の病原性の高さを、その病原性細菌の滑走能を制御する新規遺伝子の有無、又は、その新規遺伝子中に存在する少なくともひとつの「その遺伝子の機能に影響を与える変異」の有無を確認することによって、確実で迅速に評価することができる。その結果、患者に対する適切な薬剤の選択等の治療方針の決定ができ、感染の広がりを防ぐことが可能になる。また、これまで識別が難しかったＭＲＳＡ等の薬剤耐性菌の病原性の高さを正確に評価できるようになることにより、バンコマイシン等のＭＲＳＡに感受性を有する薬剤の適切な使用をもたらすことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】黄色ブドウ球菌の臨床分離株であるＭＳＳＡ株１０株とＭＲＳＡ株４０株の軟寒天培地上における滑走能の測定結果を比較した図である。
【図２】ＭＲＳＡ臨床分離株３株とそのＳＣＣｍｅｃ領域脱落株中のｍｅｃＡ遺伝子の有無を確認した図である。
【図３】ＭＲＳＡ臨床分離株３株とそのＳＣＣｍｅｃ領域脱落株の滑走能を示す図である。    （Ａ）滑走能を測定した際のコロニーの状態を示す図である。  （Ｂ）滑走能を比較した結果をまとめたグラフを示す図である。
【図４】滑走能を制御する遺伝子の領域を検討する図である。    （Ａ）ＳＣＣｍｅｃ領域中のどの領域に滑走能を抑制する遺伝子が存在するかを検討するために調製した、それらの領域を導入したプラスミドを示す図である。  （Ｂ）図４（Ａ）の各プラスミドを導入した株の滑走能を測定した際の、コロニーの状態を示した図である。  （Ｃ）各プラスミドを導入した株の滑走能を比較した結果をまとめたグラフを示す図である。
【図５】臨床分離ＭＲＳＡ株４０株中のｆｕｄｏｈ遺伝子の塩基配列と各株の示す滑走能を比較した図である。
【図６】ｆｕｄｏｈ遺伝子とその変異遺伝子を導入したＭＳＳＡ株の示す滑走能を示す図である。    （Ａ）滑走能を測定した際の、コロニーの状態を示した図である。  （Ｂ）滑走能を比較した結果をまとめたグラフを示す図である。
【図７】カイコに対する病原性を示す図である。    （Ａ）ＳＣＣｍｅｃ脱落ＭＲＳＡ株の病原性をその親株と比較した図である。  （Ｂ）ｆｕｄｏｈ導入ＭＳＳＡ株の病原性をその親株と比較した図である。
【図８】マウスに対するｆｕｄｏｈ導入ＭＳＳＡ株の病原性をその親株と比較した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の具体的形態に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲内で任意に変形することができる。【００１８】
本発明は病原性細菌の滑走能の制御に係わる新たに見出した遺伝子の有無、又は、その遺伝子中に先の因子に影響を与える変異があるか否か、を確認することにより、病原性細菌の病原性の高さを評価する方法であり、通常の遺伝子の検出手段、その変異部分を検出する手段を実行することにより行うことができる。【００１９】
従って、今回見出された遺伝子等を増幅できるプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法等の遺伝子増幅法を実行して、先の遺伝子や遺伝子中の変異の有無の確認を行うことにより本発明を実施することができる。【００２０】
ここで、これまで細菌の病原性の遺伝子型による評価は、主にその細菌の有する「毒素」に係る遺伝子を評価することにより行われており（非特許文献１ないし３参照）、本発明の「滑走能」に係る遺伝子によって病原性を評価することは従来行われていない。そこで、まず本発明の根幹である「滑走能」に関係する遺伝子によって病原性細菌の病原性の評価を行うことができることについて、その根拠となった検討内容につき説明する。【００２１】
本発明における「滑走能」とは、細菌類が軟寒天培地上を動く能力のことであり、「その大きさ」とは一定条件下における軟寒天培地上のコロニーの広がりの大きさをいう。また「病原性の高さ」とは、病原体が宿主に感染している条件下でその宿主を傷害する力の強さをいい、「薬剤耐性の有無」とは切り離して評価するものである。【００２２】
細菌の滑走能に関しては鞭毛等の明確な運動用器官によって動くもの以外にその移動メカニズムが明確でないものも報告されている。黄色ブドウ球菌も鞭毛を持たないグラム陽性細菌であり、近年まで滑走能は有しないと考えられていた。本発明者らはこの黄色ブドウ球菌が軟寒天培地上を滑走する能力を持つことを見出した（非特許文献４）。鞭毛等の明確な運動用器官を持つ細菌のもつ滑走能は、その細菌の病原性に重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら、本発明者により見出された黄色ブドウ球菌の軟寒天培地における滑走能とその菌の病原性の高さとの関係は不明であった。【００２３】
そこで、本発明者は、黄色ブドウ球菌の滑走能もその病原性に何らかの役割を担っていると考え、菌株の軟寒天培地における滑走能の大きさとその菌株の宿主に対する病原性の高さとの関係の有無について、カイコを宿主として用いて確認することで滑走能の大きさがその病原性の高低とよく相関していることを見出し、既に特許出願を行っている（特願２００６−３４２７１３）。その既にした出願に係る発明は、種々の病原性の評価方法の内、外面に現れる特徴を評価するものであるが、それに対し、本発明は病原性細菌の滑走能に係わる遺伝子を明らかにし、その遺伝子型の特徴によって病原性を評価することを特徴としている。【００２４】
まず、臨床分離株のＭＳＳＡ株１０株とＭＲＳＡ株４０株の滑走能の比較を行った。（試験例１参照）その結果、ＭＳＳＡ株の滑走距離の平均値が６７．７ｍｍであるのに対し、ＭＲＳＡ株の滑走距離の平均値は３１．７ｍｍであった。またＭＲＳＡ株４０株中２９株は滑走距離が３５ｍｍ以下であり、大部分のＭＲＳＡ株が滑走能を低下させていることが見出された（図１）。【００２５】
次に、ＭＲＳＡを遺伝子型でＭＳＳＡと識別するための特徴である、メチシリン耐性能力を付与する遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子が存在するＳＣＣｍｅｃ領域の滑走能に与える影響について検討するために、滑走能の低いＭＲＳＡ株からＳＣＣｍｅｃ領域を脱落させ、その滑走能の確認を行った（試験例２参照）。ＰＣＲ法によりこれらの株ではｍｅｃＡ遺伝子が存在せず（図２）、メチシリンに対する耐性度が低下していることが確認された。またこれらの株は全て滑走能の増大が認められた（図３（Ａ）、図３（Ｂ））。【００２６】
先のＳＣＣｍｅｃ領域中のどの遺伝子が黄色ブドウ球菌の滑走能を抑制するかを検討するために、ＳＣＣｍｅｃ領域に存在するｍｅｃＡ遺伝子、ｍｅｃＲ１遺伝子、ｍｅｃＩ遺伝子の近傍を含む領域を持つプラスミドをメチシリン感受性黄色ブドウ球菌であるＮｅｗｍａｎ株の染色体に挿入し、その軟寒天培地における滑走能を検討した（試験例３参照）。その結果、先の３遺伝子とその近傍を含む領域を持つプラスミドを導入した株は、空ベクターを導入した株に比べて滑走能を低下させていた（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））。【００２７】
次に、先の３遺伝子のどれかが滑走能の低下に寄与しているものと予想し、どの遺伝子が滑走能の低下に寄与しているかについてそれぞれの遺伝子を持つプラスミドを作出し、先と同様に検討した（図４（Ａ））。その結果、以前に過剰発現系を用いた検討では滑走能を抑制する結果を与えたｍｅｃＡ遺伝子を含む領域は、通常発現系を用いた検討では滑走能を抑制しなかった（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））。一方、ｍｅｃＲ１、ｍｅｃＩ両遺伝子を含む領域は滑走能を抑制した（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））。【００２８】
そのため、ｍｅｃＲ１、ｍｅｃＩ両遺伝子を含む領域から各々の遺伝子とその両遺伝子を除いた３種類のプラスミドを作出して検討したところ、予想に反しどのプラスミドも滑走能を抑制した（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））。従って滑走能を抑制する遺伝子は先の３遺伝子のいずれでもないことが確認された。そこでこの領域上のＯＲＦを詳細に検討したところ、ＭＲＳＡのＮ３１５株のゲノムデータベースではＯＲＦとして登録されていない７０アミノ酸をコードするＯＲＦを見出した（図４（Ａ）右端の領域）。そしてこの遺伝子を持つプラスミドは滑走能を抑制した（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））。そこで本発明者はこの新規遺伝子を「ｆｕｄｏｈ」と命名した（配列表配列番号１）。【００２９】
先に述べたＭＲＳＡ株１１株の滑走能の高さがｆｕｄｏｈ遺伝子の有無や変異等によって説明ができるかどうかを知るために、ＭＲＳＡ株全４０株の持つｆｕｄｏｈ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、滑走能の高い１１株中１０株には、ｆｕｄｏｈ遺伝子産物のアミノ酸置換を伴う一塩基変異（Ｋ２９Ｒ）が生じていることが明らかとなった。また、残る１株にはｆｕｄｏｈ遺伝子が存在しなかった。更に、それらの株よりも滑走能の低い２９株にはｆｕｄｏｈ遺伝子に変異は見出されなかった（図５）。【００３０】
変異のあるｆｕｄｏｈ遺伝子が滑走能の抑制活性を失っているかについて検討するために、先の変異ｆｕｄｏｈ遺伝子をＭＳＳＡ株であるＮｅｗｍａｎ株に導入し滑走能を検討した（試験例４）。その結果、先の変異ｆｕｄｏｈ遺伝子はＮｅｗｍａｎ株の滑走能を全く阻害しなかった（図６（Ａ）、図６（Ｂ））。従って、先の変異ｆｕｄｏｈ遺伝子は滑走能の抑制活性を失っており、１１株中１０株のＭＲＳＡ株の滑走能の高さは、ｆｕｄｏｈ遺伝子の変異によってその機能を失っていると考えることで説明できることが明らかとなった。【００３１】
従って、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有しその菌の病原性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
かかるＤＮＡからなる遺伝子「ｆｕｄｏｈ」は、本発明で新たに見出された機能を有する遺伝子である。【００３２】
次に、黄色ブドウ球菌の滑走能と病原性との関係を検討する目的で、ＳＣＣｍｅｃ領域の脱落により滑走能が増大した、親株がＭＲＳＡ株であるＮＩ−５株と、その逆にｆｕｄｏｈ遺伝子の導入によって滑走能が抑制された、親株がＭＳＳＡ株であるＮｅｗｍａｎ株の、カイコガの幼虫（以下、「カイコ」と略記する）と、マウスに対する病原性を検討した（試験例５参照）。【００３３】
ＳＣＣｍｅｃ脱落ＮＩ−５株を注射したカイコが菌の投与から死に至るまでの時間は、親株を注射したカイコに比べて明確に早くなった（図７（Ａ））。一方、ｆｕｄｏｈ導入Ｎｅｗｍａｎ株を注射したカイコの死は親株を注射したカイコに比べて明確に遅延した（図７（Ｂ））。更に、マウス敗血症モデルにおいてｆｕｄｏｈ導入Ｎｅｗｍａｎ株を注射したマウスの死も、親株を注射したマウスに比べて明確に遅延した（図８）。以上の結果は、本発明者が見出したｆｕｄｏｈ遺伝子が黄色ブドウ球菌の滑走能を抑制すると同時に、カイコに対してもマウスに対しても、その病原性を低下させていることを示唆している。【００３４】
本発明の特徴的な点は、ｆｕｄｏｈ遺伝子を見出したという点だけではなく、ｆｕｄｏｈ遺伝子に変異が生じて滑走能を抑制するという機能が失われた場合、滑走能が高まると共にそれが病原性の増大をもたらし、その逆にｆｕｄｏｈ遺伝子の存在によって滑走能が抑制され、それによって病原性の低下がもたらされるという点である。【００３５】
従って、本発明によって具体的に見出されたアミノ酸置換を伴う一塩基変異以外の点変異、欠失、重複、逆位、挿入、転座等の何らかの新たな変異により、ｆｕｄｏｈ遺伝子が失活した場合、その場合でも滑走能を抑制する機能が失われ、それによって病原性が高まることを容易に予測することができる。すなわち、表現型である滑走能を指標としてその新たな変異を見出し、その新たな変異を検出するためのプライマーを設計し、病原性評価のためのターゲット変異を追加することは、本発明を基にすれば技術常識でできることであり、従って、具体的に述べた上記一塩基変異に限定されず、それらも本発明の範囲内に含まれるものである。【００３６】
以上に示した検討によって完成した本発明の適用可能な病原性細菌は、滑走能を有する細菌であって、かつ滑走能を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する病原性細菌であれば何れでもよい。本発明はたまたまＭＲＳＡを用いてなされたが、滑走能と病原性との関係から、病原性細菌はＭＲＳＡに限定されないことは原理的に明らかである。況や、本発明の適用可能な病原性細菌は、滑走能を有する細菌であって、かつｆｕｄｏｈ遺伝子を有し、ｆｕｄｏｈ遺伝子によって滑走能が抑制されている病原性細菌であれば、当然にＭＲＳＡと同様にその病原性の評価を行うことが可能である。そのような細菌の候補としては、ｆｕｄｏｈ遺伝子の存在がゲノム情報の開示により明らかになっている菌として、黄色ブドウ球菌以外には表皮ブドウ球菌が挙げられるが、本発明はそれらに限定されるものではない。【００３７】
本発明では、例えばＭＲＳＡの病原性を評価する場合において、臨床検体中の菌が黄色ブドウ球菌であることの確認とメチシリン耐性の有無の確認、更に今回見出されたｆｕｄｏｈ遺伝子の有無とその遺伝子中に変異があるかどうかの確認を行う。黄色ブドウ球菌であることの確認のためには、例えばプロテインＡの遺伝子であるｓｐａを増幅するフォワードプライマーとリバースプライマーの一組のプライマーを用いることができ、メチシリン耐性の有無を確認するためには、例えば表２中に示すｍｅｃＡ遺伝子を増幅するフォワードプライマーとしてのｍｅｃＡ−ＦとリバースプライマーであるｍｅｃＡ−Ｒの一組のプライマーを用いることができる。また、以上の目的のために報告されている他のプライマーやプライマーセットを用いることも可能である。【００３８】
すなわち、本発明は、上記の病原性の評価方法を使用するための評価用キットであって、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプライマー、又は、その遺伝子中の先のタンパク質の機能を抑圧する変異を検出するためのプライマーを少なくともひとつ有することを特徴とする「病原性細菌の病原性の評価用キット」でもある。【００３９】
ｆｕｄｏｈ遺伝子の有無を確認するためには、例えば、表２中に示すｆｕｄｏｈ−Ｆとｆｕｄｏｈ−Ｒのプライマーの組を用いることができる。ｆｕｄｏｈ遺伝子中のアミノ酸番号２９番の置換に係わる変異の有無を確認するためには、表２中に示すＳ２とＳ３のプライマーの組を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、そのＰＣＲ産物の塩基配列をＳ２とＳ３のプライマーを用いて決定する。ｆｕｄｏｈ遺伝子の変異は、このプライマーでは直接検出はできないので、このプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物の塩基配列を同じプライマーを用いて決定する。その結果、変異が存在するかどうかが分かる。また、後述するＡＲＭＳ（Amplification  Refractory  Mutation  System）に適合したプライマーを設計すれば、本発明者が見出した図５に示す部位での１塩基変異（Ｋ２９Ｒ）を簡便に検出するためのプライマーとして用いることができる。【００４０】
本発明において用いられるｆｕｄｏｈ遺伝子の有無とその変異を確認するために用いられるプライマーは、上記プライマーに限定されるものではなく、上記プライマーと同様にｆｕｄｏｈ遺伝子の検出とその遺伝子中の遺伝子機能の失活をもたらす変異を検出するという目的に用いることができるものであればよい。そのようなプライマーには同様の機能を発揮する限りにおいて、欠失、置換、挿入、付加等により先のプライマーの一部が改変されたＤＮＡを含むものである。また今後、遺伝子機能の失活をもたらす新たな変異が見出された場合は、その変異の検出のために新たに設計されたプライマーを使用する発明も、本発明の範囲内である。【００４１】
上記した臨床検体中の菌種の同定、薬剤耐性の有無の確認、ｆｕｄｏｈ遺伝子の有無及びその遺伝子中に変異があるか否かの確認は、各々を別々に検出する手段で行ってもよいし、全てを同時に検出する手段で行ってもよい。【００４２】
各遺伝子を別々に検出する手段としては、先のそれぞれの確認を独立した系でそれぞれに用いられるプライマーの組で通常のＰＣＲによって行なえばよい。また臨床検体から常法により抽出したＤＮＡサンプルと共にリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物の生成蛍光シグナルをリアルタイムに検出する方法を用いることもできる。また、全てを同時に検出する手段としては、黄色ブドウ球菌であることの確認と薬剤耐性の有無の確認、更に今回見出されたｆｕｄｏｈ遺伝子の有無とその遺伝子中の変異を検出するために用いられるプライマーの組を全て混合し、同一の反応系においてＰＣＲ反応を行うマルチプレックスＰＣＲが実施可能である。この場合は、各遺伝子に対応するＰＣＲ増幅産物の有無の確認はアガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動等で泳動して得られたバンドの有無を確認することで行うことができる。【００４３】
以下、本発明の手順につき説明する。
＜核酸の抽出＞
血液、痰、膿、咽頭ぬぐい液等の患者由来の検体あるいは患者に使用したガーゼ等の材料、若しくはそれらから培養して得られた菌液等から核酸を抽出する。抽出は熱処理、酵素処理、市販のＤＮＡ抽出キットを用いる等で行うことができる。ブドウ球菌の場合はリゾスタフィンやアクロモペプチダーゼ等のブドウ球菌膜の分解に適した酵素を使用することでＤＮＡの抽出効率を上げることができる。また得られた抽出液をフェノール処理等の核酸精製法で処理し更に濃縮操作を加えることで検査の感度を上げることができる。【００４４】
＜ＰＣＲ法＞
ＰＣＲは通常用いられる条件で行えばよく、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い、９２℃で１５秒の熱変性工程、６０℃〜６５℃で１５秒のアニーリング工程、７２℃で５秒〜１５秒の伸長工程の繰り返しを行う条件で行うことができる。【００４５】
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の判定は生成した増幅ＤＮＡのサイズを電気泳動で確認する方法や、ニトロセルロース膜等に反応物を固定し、目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ標識プローブとハイブリダイゼーションを行わせる方法等が可能である。より簡便にＤＮＡ増幅の判定を行いたい場合には、識別可能な標識を施したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ジゴキシゲニン等で標識された増幅ＤＮＡを固相に捕獲して識別する方法を行えばよい。【００４６】
その他増幅ＤＮＡを捕獲して識別する方法としては、プライマーの標識物に特異的に結合する物質をあらかじめ固定した固相を用いる方法、目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ捕獲プローブをあらかじめ固相に固定しておき、ハイブリダイゼーションによって特異的な結合を行わせる方法等があり、そのための固相としては、マイクロタイタープレート、あるいはビーズや磁性粒子等を用いることができる。一度に多検体を処理する場合にはマイクロタイタープレートの使用が好ましい。【００４７】
臨床検体を直接の試料として検査を行う場合、増幅したＤＮＡの捕獲にマイクロタイタープレート等に固定化した捕獲プローブとのハイブリダイゼーションを利用することによって反応の特異性と迅速性を高めることができる。従って、ｆｕｄｏｈ遺伝子にハイブリダイズする相補ＤＮＡやＤＮＡ断片は捕獲プローブ等の材料として用いることができるため、反応の特異性や迅速性を向上できる。【００４８】
以上に示した本発明に用いるｆｕｄｏｈ遺伝子検出用プライマー、その変異部位検出用プライマーの組み合わせは、病原性細菌の病原性を評価するためのプライマーセットとして提供される他、ＤＮＡ増幅用酵素や反応用緩衝液等のＤＮＡ合成用試薬、標識した捕獲プローブ、あるいは捕獲プローブを固定化したマイクロウエルプレート等とセットされて病原性を評価するために最適化された病原性評価用キットとして提供することができる。また、ＬＡＭＰ法等に適合するプライマーを別途設計し、組み合わせることで通常のＰＣＲ以外の増幅方法を行う為のプライマーセットやキットとして提供することも可能である。【００４９】
先に述べたように、本発明は、従来ない観点から病原性細菌の病原性を評価することができる点で有用である。特に本邦におけるいわゆる市中感染型の病原性の高いＭＲＳＡは、遺伝子型として病原性の高いＭＲＳＡの病原性を評価できる方法は見出されていない。このような現状において、本発明者により見出された病原性細菌の滑走能を抑制する機能を持つタンパク質をコードしていると考えられるｆｕｄｏｈ遺伝子とその遺伝子が変異により機能を失った結果、ＭＲＳＡに滑走能の増大と共に病原性の増大をもたらすという知見は、ｆｕｄｏｈ遺伝子とその変異をターゲットとして病原性の高いＭＲＳＡを通常のＭＲＳＡから明確に見分けることを可能とするものである。【００５０】
また、急速に技術革新が進んでいる遺伝子増幅法による簡便・迅速な検出手段を用いることができるので、薬剤開発等の研究用ツールとして有用であるだけでなく、臨床現場においても迅速で的確な治療方針の決定等を可能とする有用な病原性細菌の病原性の評価法を提供するものである。【００５１】
本発明の「病原性細菌の病原性の評価用キット」は、本発明者が新たな観点から見出した、病原性細菌の病原性を評価できるマーカー遺伝子の有無を確認すること、又はそのマーカー遺伝子の変異の有無を確認できるように組み上げられている。すなわち、評価対象の病原性細菌中に、病原性細菌の滑走能を制御する、又は抑制するタンパク質をコードする遺伝子が存在するか否か、その遺伝子が存在する場合に、その遺伝子中に先のタンパク質の機能に影響を与える、又はその機能を抑圧する変異が少なくともひとつあるか否か、を確認できる「病原性細菌の病原性の評価用キット」となっていることを特徴とするものである。【００５２】
従って、本発明の「病原性細菌の病原性の評価用キット」には、少なくとも、先のマーカー遺伝子の有無を確認するために設計されたプライマーセットが含まれていればよい。そのプライマーセットによって増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を、同じプライマーを用いて決定することで、マーカー遺伝子の存在と共にマーカー遺伝子中の変異の有無を確認することもできるからである。更に、検出したい変異が明らかとなっている場合には、マーカー遺伝子中に、その変異があることを確認するために用意されたプライマーのセットがキット構成中にあることが好ましい。より簡便に変異の有無を確認することができるからである。【００５３】
上記「その変異があることを確認するために用意されたプライマーのセット」とは、例えば、ＡＲＭＳ（Amplification  Refractory  Mutation  System）に適合したプライマーのセットを挙げることができる。ＡＲＭＳは、ＰＣＲのプライマーとしての働きが、プライマーの３’末端と鋳型ＤＮＡとのマッチングに強く依存していることを利用した方法である。従って、３’末端に目的の変異部位がくるようにプライマーを設計することがＡＲＭＳの特徴である。また、変異によるミスマッチが１つの場合には、アニーリングが可能なことが多く、増幅反応が進行してしまうことが多いため、この際にプライマーの３’末端の１塩基上流に、更に少なくとも１つのミスマッチを人為的に導入するようにプライマーを設計することが好ましい。それによってアニーリングがうまくできなくなって増幅反応が不可能となり、変異検出の特異性が向上するからである（Kwok  S.  et  al.，Nucleic  Acids  Res  18,  999‐1005(1990)）。【００５４】
この現象を利用して、人為的に導入されたミスマッチのみを有し、アニーリングが可能なプライマーを正常用プライマーとして作成し、変異によるミスマッチに加えて先の人為的なミスマッチを導入したプライマーを変異用プライマーとして作成してＰＣＲ反応を行うと、増幅反応が起きたか否かによって変異の有無を確認することができる。【００５５】
具体的には例えば、以下の操作によるが、本発明は以下の具体的操作には限定されない。すなわち、検査試料を半量ずつに分け、一方には正常用プライマーとそのカウンタープライマーを加えてＰＣＲを行い、他方には変異用プライマーとそのカウンタープライマーを加えてＰＣＲを行う。正常用プライマーは、正常型の遺伝子とはハイブリダイズしてＰＣＲが進行するが、変異型遺伝子とはハイブリダイズしないので変異型遺伝子は増幅されない。逆に、変異用プライマーは、変異型遺伝子とはハイブリダイズしてＰＣＲが進行するが、正常型遺伝子とはハイブリダイズしないので正常型遺伝子は増幅されない。従って、ＰＣＲ後、アガロース電気泳動にかけてそれぞれの増幅ＤＮＡのバンドを調べることで、評価対象である病原性細菌のＤＮＡ上に目的の変異があるか否かを判定することができる。【００５６】
病原性細菌が黄色ブドウ球菌の場合には、病原性細菌の滑走能を制御する、又は抑制するタンパク質をコードするマーカー遺伝子は本発明者らが見出した「ｆｕｄｏｈ」であり、その存在を確認する為のプライマーとして、例えば表２中に示すｆｕｄｏｈ−Ｆとｆｕｄｏｈ−Ｒのプライマーのセットを用いることができる。また、ｆｕｄｏｈ遺伝子の滑走能を抑制するという機能が失われる変異として、図５に示す部位での１塩基変異（Ｋ２９Ｒ）を見出しているので、先のＡＲＭＳに適合したプライマーセットを別途設計してキットに組み込めば、より簡便に変異を検出することができる。【００５７】
その他、本発明のキットには、病原性細菌を識別するためのプライマーセットや、ＰＣＲが正常に行われたことを確認するための内部コントロール用ＤＮＡやそのＤＮＡ検出用プライマーセットを含んでいることが好ましい。例えば、病原性細菌が黄色ブドウ球菌の場合には、黄色ブドウ球菌を他のブドウ球菌と識別するためのｓｐａ遺伝子等をターゲットとした増幅用プライマーセットや、黄色ブドウ球菌がメシチリン耐性であるか否かを判定するためのｍｅｃＡ遺伝子を増幅するためのプライマーセット等を含んでいることが好ましい。これらのプライマーセットを同時に用いるマルチプレックスＰＣＲの実施も可能なキット構成とすることで、検査全体の操作手順を大幅に簡略化することができるからである。【００５８】
また、核酸抽出用や反応用の各種緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等、用いられる遺伝子増幅方法に通常用いられる試薬類を方法に応じて組み込むことは、本発明の「病原性細菌の病原性の評価用キット」を組み上げる上で当然のことである。更に、増幅ＤＮＡの捕獲用プローブを固定化したマイクロタイタープレート等の各種固相を、本発明の「病原性細菌の病原性の評価用キット」に組み込むことは、検査の簡便性、特異性等を向上させることができるのでより好ましい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例・試験例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例等に限定されるものではない。【００６０】
＜試験材料の調製等＞
プラスミド：
大腸菌ＪＭ１０９株をｐＮＤ５０、ｐＣＫ２０プラスミドとそれらの派生物の調製に用いた。先のプラスミドで形質転換した大腸菌を２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培地中３７℃で培養した。【００６１】
黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡ：
黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡの抽出はＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。【００６２】
黄色ブドウ球菌株へのプラスミドの導入：
エレクトロポレーション法により行った。【００６３】
ＳＣＣｍｅｃ領域脱落株の調製：
ＳＣＣｍｅｃ領域の切り出し酵素をコードするｃｃｒＡＢ遺伝子をｐＮＤ５０プラスミドに挿入してｐｃｃｒＡＢプラスミド得た。滑走能の低いＭＲＳＡ株であるＮＩ−３、ＮＩ−４、ＮＩ−５株に、このプラスミドを導入してクロラムフェニコール抵抗性株を得、その内の５μＬを５ｍＬのクロラムフェニコール添加ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）液体培地で一晩培養した。同様の操作を繰り返した後、ＴＳ（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ）寒天培地上でシングルコロニーを得た。この株をＳＣＣｍｅｃ領域脱落株として以降の検討に用いた。【００６４】
Ｎｅｗｍａｎ株へのＳＣＣｍｅｃ領域の挿入：
Ｎｅｗｍａｎ株は東京大学大学院微生物薬品化学教室の実験室保有株でＭＳＳＡ株であり高い滑走能を持つ株である。このＮｅｗｍａｎ株の染色体にＳＣＣｍｅｃ領域のｍｅｃＡ遺伝子、ｍｅｃＲ１遺伝子、ｍｅｃＩ遺伝子の近傍を含む領域を持つプラスミドを挿入し、以降の検討に用いた。【００６５】
カイコ：
実験室で受精卵から孵化させ、人工飼料シルクメイト（片倉工業製）で５齢幼虫まで育てたものを遺伝子改変菌株の病原性評価に使用した。【００６６】
マウス：
８週齢のＣＤ−１マウスの雌（チャールズリバーラボラトリー社）をカイコ同様に菌株の病原性評価に使用した。【００６７】
菌株、プラスミド、プライマー：
実施例と試験例に用いた菌株とプラスミドのリストを表１に、プライマーのリストを表２に示す。【００６８】
【表１】
2009154016.tif 000002
【００６９】
【表２】
2009154016.tif 000003
【００７０】
＜試験例１＞  臨床分離された黄色ブドウ球菌株の滑走能の検討
臨床検体から分離されたメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株１０株と日本医科大学病院において臨床検体から分離され提供されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株４０株を以後の検討に用いた。【００７１】
[滑走能の測定]
それぞれの菌株をＴＳＢ液体培地中３７℃にて一晩培養した後１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した。予め直径１５ｃｍのプラスチック製滅菌シャーレに注入して固め、菌体接種の２０分前に乾燥処理しておいた０．２４％の寒天を含むＴＳＢ培地５０ｍＬ上に、先の菌液２μＬをスポットし、１５分間乾燥処理してから３７℃にて１０時間培養した。同様の試験を２回行い、各試験で形成されたコロニーの直径を測定してその平均値を滑走能とした。得られた結果を図１に示す。【００７２】
その結果、ＭＳＳＡ株１０株は全て軟寒天培地上を明確に滑走しており、その滑走距離（滑走能）の平均値は６７．７ｍｍであった。一方、ＭＲＳＡ株４０株の滑走能の平均値は３１．７ｍｍであった。またＭＲＳＡ株４０株中２９株は、滑走能が３５ｍｍ以下であり、大部分のＭＲＳＡ株が滑走能を低下させていることが見出された。この結果から、ＭＳＳＡ株に比べて多くのＭＲＳＡ株で滑走能が低下していることが分かった。【００７３】
＜試験例２＞  ＳＣＣｍｅｃ領域を脱落したＭＲＳＡの滑走能検討
ＳＣＣｍｅｃ領域はメチシリン耐性能力を付与する遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子が存在する領域である。ＭＲＳＡ株が滑走能を低下させている原因がＳＣＣｍｅｃ領域中にあるか否かを検討するために、ＭＲＳＡ株からＳＣＣｍｅｃ領域を脱落させ、その滑走能の検討を行った。検討には滑走能の低いＮＩ−３、ＮＩ−４、ＮＩ−５株にＳＣＣｍｅｃ領域の切り出し酵素をコードするｃｃｒＡＢ遺伝子を発現させ、ＳＣＣｍｅｃ領域を脱落させた。ＰＣＲ法により、これらの株ではｍｅｃＡ遺伝子が存在せず（図２）、またメチシリンに対する耐性度が４μｇ／ｍＬ以上から２μｇ／ｍＬに低下していることが確認された。更にこれらの株は元の株に比べて滑走能を増大させていた（図３（Ａ）、図３（Ｂ））。この結果から、ＭＲＳＡの滑走能はＳＣＣｍｅｃ領域によって抑制されているものと考えられた。【００７４】
＜試験例３＞  ＳＣＣｍｅｃ領域中の滑走能抑制に係わる遺伝子の検討
ＳＣＣｍｅｃ領域を持たないＭＳＳＡ株であるＮｅｗｍａｎ株の染色体に表１中に示すｐＩｎｔプラスミド以降のＳＣＣｍｅｃ領域のｍｅｃＡ遺伝子、ｍｅｃＲ１遺伝子、ｍｅｃＩ遺伝子の近傍を含む領域を持つ各プラスミド（図４（Ａ））を挿入し、その軟寒天培地における滑走能を検討した。滑走能の検討は試験例１と同様に行った。その結果、３つの遺伝子とその近傍を含む領域（ｐＩｎｔｍｅｃＡＲ１Ｉ−ｆｕｄｏｈ）を導入した株は、空ベクターｐＩｎｔを導入した株に比べて滑走能を低下させた（図４（Ｂ）、（Ｃ））。【００７５】
次に、先の３つの遺伝子のうち、いずれかが滑走能に寄与しているものと考え、それぞれの遺伝子を持つプラスミドを作出し、Ｎｅｗｍａｎ株に導入してその滑走能を検討した。高発現系を用いた検討では滑走能を抑制したｍｅｃＡ遺伝子を含む領域（ｐＩｎｔ  ｍｅｃＡ）は、本実施例における通常発現系では滑走能を抑制しなかった。一方、ｍｅｃＲ１、ｍｅｃＩ両遺伝子とその近傍を含む領域からｍｅｃＲ１、ｍｅｃＩのいずれかを除いたプラスミド、その両方を除いたプラスミドは、予想に反しどれも滑走能を抑制した（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））。この結果から、ＳＣＣｍｅｃ領域中の滑走能を抑制する遺伝子は、上記３遺伝子のいずれでもないことが判明した。【００７６】
＜実施例１＞  ｆｕｄｏｈ遺伝子の導入による滑走能の抑制
試験例３の結果からこれまでに知られていない遺伝子の存在が考えられるため、ＳＣＣｍｅｃ領域上のＯＲＦを詳細に検討した。そして、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株のゲノムデータベースではＯＲＦとして登録されていない７０アミノ酸をコードするＯＲＦを見出した（図４（Ａ）の上段右ｆｕｄｏｈ部分）。そこでこの遺伝子を持つプラスミド（ｐＩｎｔ  ｆｕｄｏｈ）をＮｅｗｍａｎ株に導入し、その滑走能を検討した。その結果、ｐＩｎｔ  ｆｕｄｏｈを導入したＮｅｗｍａｎ株は滑走能が抑制された（図４（Ｂ）、図４（Ｃ）ｆｕｄｏｈ導入株）。本発明者は、この滑走能を抑制する機能を有する新規遺伝子を、「ｆｕｄｏｈ」と命名した。【００７７】
＜実施例２＞  ＭＲＳＡ臨床分離株の持つｆｕｄｏｈ遺伝子の塩基配列
臨床分離したＭＲＳＡ株４０株中１１株は高い滑走能を示す。そこで、それらの滑走能の高さがｆｕｄｏｈ遺伝子の変異によって説明ができるかどうかを知るために、ＭＲＳＡ株全４０株のｆｕｄｏｈ遺伝子の塩基配列の決定を行った。その結果と各株の示す滑走能を図５に示す。【００７８】
［プライマーの合成と標識］
ｆｕｄｏｈ遺伝子に含まれている特異的な塩基配列とアニーリングできるように、プライマーセット（表２、ｆｕｄｏｈ−Ｆ、ｆｕｄｏｈ−Ｒ）を常法により設計し、ＤＮＡ合成機で合成した。
このプライマーの５’末端の塩基に、アミノリンクII（商標：アプライドバイオシステムズジャパン社）等を用いてアミノ基を導入することで、ビオチン標識、ジニトロフェニル標識等の各種標識化プライマーを作製することができる。【００７９】
［ＰＣＲ］
以下の反応液組成で行った。
１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，５μＬ
２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，５μＬ
ｆｕｄｏｈ−Ｆプライマー  １０μＭストック，０．７５μＬ
ｆｕｄｏｈ−Ｒプライマー  １０μＭストック，０．７５μＬ
５Ｕ／μＬ  ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μＬ
鋳型ＤＮＡ，  ５０ｎｇを、１μＬ
水  ３４．５μＬ      計５０μＬ【００８０】
［ＰＣＲ実施］
以下の反応条件で、アステック（ＡＳＴＥＣ）社製、ＰＣ−３５０遺伝子増幅装置を用いて行った。
ＤＮＡ変性：１回目  ９４℃、１２０ｓｅｃ
２回目以降  ９４℃、１５ｓｅｃ
アニーリング：５２℃、３０ｓｅｃ
伸長反応  ７２℃、６０ｓｅｃ
上記反応を２５サイクル行った。
得られたＰＣＲ生成物の確認はアガロースゲル電気泳動により行った。【００８１】
［変異の有無の確認］
ｆｕｄｏｈ遺伝子の塩基配列の決定と変異の有無の確認は、表２中のＳ２とＳ３のプライマーをシークエンシング用プライマーとして用いて行った。【００８２】
滑走能の高い１１株中１０株には、ｆｕｄｏｈ遺伝子のアミノ酸番号２９に相当する部分にアミノ酸置換を伴う一塩基変異（配列番号２のアミノ酸番号２９に相当するアミノ酸が、リシンＫからアルギニンＲに置換する変異）を生じていることが明らかとなった。また、１株にはｆｕｄｏｈ遺伝子が存在しなかった（図５  ＮＩ−１５株）。更に、これら１１株（図５  ＮＩ−２６株からＮＩ−３６株まで）より、滑走能の低い残り２９株にはｆｕｄｏｈ遺伝子に変異は見出されなかった。【００８３】
また、以上より、病原性細菌の病原性の評価方法を使用するための評価用キットであり、病原性細菌の滑走能を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプライマー、又は、その遺伝子中の先のタンパク質の機能を抑圧する変異を検出するためのプライマーを少なくともひとつ有する病原性細菌の病原性の評価用キットが実際にできることが分かった。【００８４】
＜実施例３＞  変異ｆｕｄｏｈ遺伝子導入Ｎｅｗｍａｎ株の滑走能
先の変異ｆｕｄｏｈ遺伝子（Ｋ２９Ｒｆｕｄｏｈ）が、滑走能の抑制能力を失っているかどうかを検討するために、Ｋ２９Ｒｆｕｄｏｈを滑走能の高いＮｅｗｍａｎ株に導入し、実施例１と同様に滑走能の抑制能力を確認した。その結果、Ｋ２９ＲｆｕｄｏｈはＮｅｗｍａｎ株の滑走能を全く阻害しなかった（図６（Ａ）、図６（Ｂ））【００８５】
この結果と実施例１の結果から、１１株の滑走能の高さは、１０株がｆｕｄｏｈ遺伝子の変異により説明でき、１株はｆｕｄｏｈ遺伝子が存在しないことにより説明できることが明らかとなった。【００８６】
＜実施例４＞  ＳＣＣｍｅｃ領域を脱落しｆｕｄｏｈ遺伝子を失ったＭＲＳＡ臨床分離株、及びｆｕｄｏｈ遺伝子を導入したＭＳＳＡ株のカイコに対する病原性
次に、黄色ブドウ球菌の滑走能と宿主に対する病原性との関係を検討する目的で、ＳＣＣｍｅｃ領域の脱落により滑走能が増大したＮＩ−５株（親株ＭＲＳＡ株）とその逆にｆｕｄｏｈ遺伝子の導入によって滑走能が抑制されたＮｅｗｍａｎ株（親株ＭＳＳＡ株）のカイコに対する病原性を検討した。【００８７】
＜実施例４−１＞  カイコに対するＳＣＣｍｅｃ脱落ＭＲＳＡ株の病原性
１群１０頭の５齢カイコにコントロールベクターｐＮＤ５０を導入したＮＩ−５株又はＳＣＣｍｅｃ脱落ＮＩ−５株（各１．９×１０４ｃｆｕ／一晩培養液を生理食塩水で希釈して調整）５０μＬを血液内注射した。また生理食塩水注射群を無菌コントロールとした。それぞれのカイコは絶食状態で、３７℃で飼育し、注射後の時間当たりの生存率をモニターした。結果を図７Ａに示す。【００８８】
ＳＣＣｍｅｃ脱落ＮＩ−５株を注射したカイコが菌の投与から死に至るまでの時間は親株を注射したカイコに比べて明確に短く、ＳＣＣｍｅｃ脱落ＮＩ−５株はカイコに対する病原性が高くなっていた。ＳＣＣｍｅｃ脱落ＮＩ−５株は試験例２において滑走能が増大することを確認しており(図３（Ａ）、図３（Ｂ)）、ＳＣＣｍｅｃ脱落による滑走能の増大がカイコに対する病原性を高める結果を与えている可能性が示唆された。【００８９】
＜実施例４−２＞  カイコに対するｆｕｄｏｈ導入ＭＳＳＡ株の病原性
１群１０頭の５齢カイコに空ベクターｐＩｎｔを導入したＮｅｗｍａｎ株又はｆｕｄｏｈ遺伝子を導入したＮｅｗｍａｎ株（各１．５×１０４ｃｆｕ／一晩培養液を生理食塩水で希釈）５０μＬを血液内注射した。また、生理食塩水注射群を無菌コントロールとした。カイコは絶食状態で、４０℃で飼育し、注射後の時間当たりの生存率をモニターした。結果を図７Ｂに示す。【００９０】
ｆｕｄｏｈ導入Ｎｅｗｍａｎ株を注射したカイコの死は、親株を注射したカイコに比べて明確に遅延し、カイコに対する病原性が低下していることが確認された。試験例３において、Ｎｅｗｍａｎ株にｆｕｄｏｈを導入すると滑走能が抑制されることが確認されており（図４（Ｂ）、図４（Ｃ））、ｆｕｄｏｈ導入による滑走能の低下がカイコに対する病原性の低下をもたらしている可能性が示唆された。この結果から、実施例４−１の結果はＳＣＣｍｅｃ領域中のｆｕｄｏｈの脱落によって病原性が高まったものと考えられる。【００９１】
＜実施例５＞  マウス（敗血症モデル）に対するｆｕｄｏｈ導入ＭＳＳＡ株の病原性
１群５匹８週齢のＣＤ−１マウスに空ベクターｐＩｎｔを導入したＮｅｗｍａｎ株又はｆｕｄｏｈを導入したＮｅｗｍａｎ株（各２．９×１０７ｃｆｕ／一晩培養液をＰＢＳで希釈）１００μＬを尾静脈注射した。またＰＢＳ注射群を無菌コントロールとした。通常のマウス飼育プロトコルによりマウスを飼育し、その注射後の時間当たりの生存率をモニターした。その結果、ｆｕｄｏｈ導入Ｎｅｗｍａｎ株を注射したマウスの死は、親株を注射したマウスに比べて明確に遅延した（図８）。この結果はｆｕｄｏｈがマウスに対する黄色ブドウ球菌の病原性に対してもカイコ同様に抑制的に働くことを示している。【００９２】
以上の結果から、今回新たに見出されたｆｕｄｏｈ遺伝子は黄色ブドウ球菌の滑走能を抑制する機能を有しており、また黄色ブドウ球菌の病原性の高さにも関与していて、カイコに対してもマウスに対しても、その病原性を低下させる結果をもたらしていることが確認された。このことは病原性細菌ゲノム中のｆｕｄｏｈの有無を検出する手段を行うことによって病原性細菌の宿主に対する病原性の高さを評価できることを示している。【００９３】
また、実施例３に示したように、変異ｆｕｄｏｈ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌は滑走能が増大していることから、変異ｆｕｄｏｈ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌は宿主に対する病原性を高めているものと考えられる。本発明で見出されたｆｕｄｏｈの２９番アミノ酸部分のアミノ酸の置換をもたらす一塩基変異の有無を検出する手段を行うことは、先のｆｕｄｏｈ自体の有無を検出する手段を行うことと同様に、病原性細菌の宿主に対する病原性の高さを評価する方法となることは明らかである。また同様に、表現型である「滑走能」を手がかりとして、ｆｕｄｏｈ中に新たな変異が見出された場合でも、その変異を検出する手段を行うことは容易であり、その変異の検出によっても病原性細菌の病原性の高さを評価することができる。【００９４】
更に、本発明は、具体的な「ｆｕｄｏｈ遺伝子」に係る発明に限定されず、「病原性細菌の滑走能を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子」に係る発明にも及ぶことは、本発明の基本発明的な性質からも明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の病原性細菌の病原性評価方法は、従来の毒素や薬剤耐性に係わる遺伝子型によってはその病原性の高さを評価することができなかった病原性細菌の病原性の高さを評価する新たな方法を提供するものであり、病原性細菌に対する新たな薬剤や治療方法の開発等を行っている分野に広く利用されるものである。また、病原性の評価に用いられる遺伝子とその遺伝子中の変異を明らかにしたことにより、それらをターゲットとしたあらゆる遺伝子増幅法を利用することができるため、迅速で正確な結果判定を求められる臨床現場に、有用な病原性細菌の評価方法や遺伝子増幅法を原理とする評価用キットを提供することができるので、臨床分野に広く利用されるものである。【００９６】
本願は、２００８年６月１７日に出願した日本の特許出願である特願２００８−１５８１７６に基づくものであり、その出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【図１】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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