(57)【要約】本発明は、（蛍光基）−（リンカー）−（トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が認識可能なＧｌｎ残基を含む部分）−Ｒで表される、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）の基質を提供する。（式中：蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（ＴＲ）若しくはダンシル（Ｄｎｓ）又はそれから誘導される基であり、リンカーが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（ｎは１〜６の整数）で表される基であり、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＧ等から選択されるペプチドから誘導される基であり、かつＲが、水酸基、又はビオチン、核酸、アジド、アルキン、マレイミド若しくはシクロペンタジエン又はそれから誘導される基である。）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（蛍光基）−（リンカー）−（トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を含む部分）−Ｒ
で表される、ＴＧａｓｅの基質。
（式中：
蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（ＴＲ）若しくはダンシル（Ｄｎｓ）又はそれから誘導される基であり、
リンカーが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（ｎは１〜６の整数）で表される基であり、
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＸ（Ｘはリシン（Ｌｙｓ）以外のアミノ酸残基）であり、
かつ
Ｒが、水酸基、又はビオチン、核酸、ポリエチレングリコール、アジド、アルキン、マレイミド若しくはシクロペンタジエン又はそれから誘導される基である。）
【請求項２】
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＧであり、かつＲが、水酸基又はビオチン若しくはアルキンから誘導される基である、請求項１に記載のＴＧａｓｅの基質
【請求項３】
以下からなる群より選択される一つである、請求項２に記載のＴＧａｓｅの基質。
【化１】
2010002042.tif 000037
【化２】
2010002042.tif 000038
【化３】
2010002042.tif 000039
【化４】
2010002042.tif 000040
【化５】
2010002042.tif 000041
【化６】
2010002042.tif 000042
【化７】
2010002042.tif 000043
【請求項４】
ＴＧａｓｅにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を有するタンパク質と、請求項１〜３のいずれか１項に記載されたＴＧａｓｅの基質とを連結することにより得られる、蛍光標識化タンパク質。
【請求項５】
タンパク質が、ＩｇＧ抗体である、請求項４に記載の蛍光標識化タンパク質。
【請求項６】
蛍光標識化されたタンパク質の製造方法であって：
ＴＧａｓｅを用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基又を有するタンパク質と、請求項１〜３のいずれか１項に記載されたＴＧａｓｅの基質とを連結して蛍光標識化されたタンパク質を得る工程を含む、製造方法。
【請求項７】
タンパク質が、ＩｇＧ抗体である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
ＴＧａｓｅを用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を有する機能性タンパク質と、蛍光基にリンカーを介してＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分を結合させたものとを連結して、機能が維持されたままの、蛍光標識化機能性タンパク質を得る工程を含む、タンパク質の蛍光標識化方法。
【請求項９】
ＴＧａｓｅを用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基又を有するタンパク質と、
（蛍光基）−（リンカー）−（ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分）−（機能性有機分子）
で表されるＴＧａｓｅの基質とを連結する工程を含む、タンパク質の標識化方法。
（式中：
蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（ＴＲ）若しくはダンシル（Ｄｎｓ）又はそれから誘導される基であり、
リンカーが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（ｎは１〜６の整数）で表される基であり、
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＸ（Ｘは、Ｌｙｓ以外のアミノ酸残基）である。）
【請求項１０】
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＧであり、かつ機能性有機分子がビオチン又はアルキンから誘導される基である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧａｓｅの基質が、
【化８】
2010002042.tif 000044
【化９】
2010002042.tif 000045
【化１０】
2010002042.tif 000046
である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて、タンパク質へ機能性分子を連結する方法、特に、抗体へ蛍光物質を連結する方法に関する。本発明はまた、トランスグルタミナーゼの新規蛍光基質にも関する。本発明は、組換えタンパク質や抗体の蛍光ラベル化のために用いることができ、また部位特異的固定化を介した抗体アレイ作成に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプル中の特定物質（ホルモン、基質、タンパク質、ペプチドなど）を検出、定量化するバイオアッセイは近年、臨床をはじめ、組織学、分子生物学、免疫学などの分野で欠くことのできない分析法である。なかでも、目的の分子の認識に抗原抗体反応を利用したイムノアッセイは、高感度で特異性の高い方法として、バイオアッセイの中心的な位置を占めている。さらに医療分野においての抗体利用も盛んであり、バイオイメージングやドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）におけるターゲティング素子として、また、医薬品としての抗体利用（抗体医薬）も精力的に検討されている。
他の物質との相互作用（特異性）の点において、抗体は酵素にも優る特性を示し、抗原とのレパートリーは無限といえるほどに大きい。しかしながら、抗体はタンパク質であることから、制約を受けることになる。抗体へ機能性分子を導入しようとした際、活性中心（抗原認識部位）へ導入されると抗原認識能が失われてしまう恐れがあるといった問題点が挙げられる。
そこで必要となるのが、抗体の抗原認識能を失活させることなく、その特定部位へ選択的に標識を修飾する技術の開発である。現在、一般的に行われている抗体への修飾法は化学修飾法である。しかし、化学修飾法では、抗原認識能を失活してしまう恐れがある。また、導入数、導入部位の制御が困難などといった問題点がある。このような背景より、新規修飾法の開発が必要とされている。
一方、トランスグルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ；ＴＧａｓｅ）は、アシル転移反応を触媒するトランスフェラーゼの一種であり、特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、様々な１級アミンや、ペプチドやタンパク質中に存在する特定のＬｙｓ残基（Ｋ）と結合させる酵素である。また、１級アミンもＬｙｓ残基も存在しない場合には、水分子がアシル受容体として働き、Ｇｌｎ残基が加水分解により脱アミド化されＧｌｕ（Ｅ）となる。これらの反応は全てＮＨ３の脱離が生じるため平衡が大きく右に傾いた可逆反応となる（非特許文献１）。
ＴＧａｓｅは自然界に広く存在しており、特にモルモット肝臓由来のもの（ＧＴＧ）や真鯛由来のもの（ＦＴＧ）、ヒト血液凝固因子の一つであるＦａｃｔｏｒＸＩＩＩに関しては、詳しく研究がなされてきた。そして、１９８９年に微生物由来のＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）が発見された。哺乳類由来のＴＧａｓｅは大量生産することが困難であったため、コストの面で問題を抱えていたが、ＭＴＧは微生物由来であるため、大量培養による大量生産が可能であり、低コストで入手可能となった。またＭＴＧは分子量３８０００であり、哺乳類由来のもの（約８００００）と比較して小さい。さらに、哺乳類由来のものは活性発現にＣａ２＋を必要とするのに対し、ＭＴＧは活性発現にＣａ２＋を必要としない。また副反応であるＧｌｎの加水分解活性が哺乳類由来のものに比べて低い。このようにＭＴＧは、産業利用に当たって有利な特性を有しており、近年ＭＴＧに関する研究が活発に行われている。
ＭＴＧの活性中心はＣｙｓ６４であり、その周辺に存在するＡｓｐ２５５、Ｈｉｓ２７４の作用が加わり、触媒活性を発現すると考えられている。ＭＴＧの推定反応機構では、まずＣｙｓ６４のチオレートイオンが、アシル供与体であるＧｌｎ残基の側鎖を求核攻撃し、チオエステル活性中間体の形成とともにアンモニアが遊離される。続いて、Ｌｙｓ残基側鎖のようなアシル受容体が活性中心に近接し、活性中間体を求核攻撃することで生成物が遊離し、反応が終結する（非特許文献２）。
ＴＧａｓｅの基質認識に関する研究がいくつかされている。
Ｇｌｎ側の基質認識として、ＡｎｄｏらはＴＧａｓｅの良基質として知られているＺ−ＱＧのＧｌｎ周辺のアミノ酸を変化させて、反応性の評価を行っている。その結果、ＴＧａｓｅの反応において、Ｃ末端のエステル化、ＧｌｎのＣ末端及びＮ末端へのＧｌｙ、Ｇｌｎの導入において活性の低下が見られたこと、またＧｌｙの除去、ＧｌｎのＡｓｎへの変異、Ｚ基の除去においては、ＴＧａｓｅに認識されなかったことを報告している（非特許文献３）。
また、Ｏｔｓｕｋａらは、Ｇｌｎの周辺のアミノ酸配列を変化させた７残基からなるポリペプチドを合成し、ＴＧａｓｅのアシルアクセプター蛍光試薬であるモノダンシルカダベリンと反応させることで、Ｇｌｎ残基周辺の基質特異性について、検討を行っている。その結果、ＴＧａｓｅはＧｌｎ残基のＮ末端側は嵩高く、疎水性の強い環境を好み、Ｃ末端側は立体障害の小さなアミノ酸を好むことを示している（非特許文献４）。
他方で、ＩｇＧ抗体は、パパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼを用いて限定分解を行うと、ヒンジ部付近で切断されることが知られているが、Ｐｅｄｅｒｓｅｎらは、ＴＧａｓｅがＣｙｓプロテアーゼであるパパインと活性中心の似た構造を取っていて、プロテアーゼの加水分解の逆反応に類似の触媒機構を示すことを報告している（非特許文献５）。またＭａｋａｒｏｖａらは、真核性のＴＧａｓｅはプロテアーゼから進化したのではないかと推測している（非特許文献６）。ＴＧａｓｅがプロテアーゼと類似の基質認識をすることは、プロテアーゼによるタンパク質の限定分解部位とＴＧａｓｅ認識部位の類似性からも支持されている（非特許文献７）。
そして、現在まで、架橋化反応を触媒するＴＧａｓｅによるタンパク質への機能性分子の導入に関する研究がいくつか報告されている。
Ｔｏｍｉｎａｇａらは化学的手法によりＭＴＧの良基質として知られているＮ−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ  ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ  ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｚ−ＱＧ）のＣ末端へアミノ化ＤＮＡを導入したものと、遺伝子工学的手法により酵素へＬｙｓタグを導入したものとを、ＭＴＧによって架橋化させることによって、タンパク質−ＤＮＡのハイブリッドに成功しており（特許文献１）、ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＤＤＩ）へ応用している（非特許文献８）。
Ｓａｔｏらはタンパク質中のＧｌｎ残基とＰＥＧを結合したアミン誘導体をＭＴＧによって架橋させることに成功している（非特許文献９）。
Ｌｉｎらは遺伝子工学的手法によりＧｌｎタグを導入したタンパク質を細胞表面に発現させ、そこへ１級アミン蛍光プローブをＭＴＧによって導入することに成功しており、細胞中でのタンパク質の挙動解析やイメージングへ応用している（非特許文献１０）。
さらにＭｉｎｄｔらはＴＧａｓｅを用いて、グルタミン又はリシンを介してＩｇＧを修飾することを検討している（非特許文献１１）。
【特許文献１】特開２００８−５４６５８号公報
【非特許文献１】Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ｃａｓａｄｉｏ，Ｃ．Ｍ．Ｂｅｒｇａｍｉｎｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６８．３７７−３９６（２００２）
【非特許文献２】Ｔ．Ｋａｓｈｉｗａｇｉ，Ｋ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｋ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｏｎｏ，Ｄ．Ｅｊｉｍａ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｅ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，４４２５２−４４２６０（２００２）
【非特許文献３】Ｈ．Ａｎｄｏ，Ｍ．Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．Ｕｍｅｄａ，Ａ．Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｍ．Ｎｏｎａｋａ，Ｒ．Ｕｃｈｉｏ，Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｍｏｔｏｋｉ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２６１３−２６１７（１９８９）
【非特許文献４】Ｔ．Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｍ．Ｏｔａ，Ｎ．Ｎｉｏ，Ｍ．Ｍｏｔｏｋｉ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，２６０８−２６１３（２０００）
【非特許文献５】Ｌ．Ｃ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｖ．Ｃ．Ｙｅｅ，Ｐ．Ｄ．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｉ．Ｌｅ−Ｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｃ．Ｔｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｓｔｅｎｋａｍｐ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，３，１１３１−１１３５（１９９４）
【非特許文献６】Ｋ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｌ．Ａｒａｖｉｎｄ，Ｅ．Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，８，１７１４−１７１９（１９９９）
【非特許文献７】Ａ．Ｆｏｎｔａｎａ，Ｂ．Ｓｐｏｌａｏｒｅ，Ａ．Ｍｅｒｏ，Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，６０，１３−２８（２００８）
【非特許文献８】Ｊ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｙ．Ｋｅｍｏｒｉ，Ｙ．Ｔａｎａｋａ，Ｔ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｎ．Ｋａｍｉｙａ，Ｍ．Ｇｏｔｏ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４０１−４０３（２００７）
【非特許文献９】Ｈ．Ｓａｔｏ，Ｅ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．Ｙａｍａｄａ，Ｍ．Ｙａｔａｇａｉ，Ｙ．Ｔａｋａｈａｒａ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．，１２，７０１−７１０（２００１）
【非特許文献１０】Ｃ．Ｌｉｎ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８，４５４２−４５４３（２００６）
【非特許文献１１】Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍｉｎｄｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９，２７１−２７８（２００８）
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、ＭＴＧの抗体修飾への応用を試みた。標識体としては、安定性が高く、分解能が良い蛍光を選択し、ＭＴＧの蛍光基質は蛍光基にリンカーを挟み、Ｇｌｎ、Ｇｌｙを結合させたものを用いて検討した。その結果、タグ導入部位選択的な組換えタンパク質の蛍光標識化に加え、タグの導入などの遺伝子工学的な組み換えを必要とせず、抗体そのものへ直接ＭＴＧにより蛍光基質を導入できる汎用性の高い新規修飾法を開発し、本発明を成すに至った。
本発明は、以下を提供する：
１）（蛍光基）−（リンカー）−（トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が認識可能なＧｌｎ残基を含む部分）−Ｒ
で表される、ＴＧａｓｅの基質。
（式中：
蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（ＴＲ）若しくはダンシル（Ｄｎｓ）又はそれから誘導される基であり、
リンカーが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（ｎは１〜６の整数）で表される基であり、
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＸ（Ｘはリシン（Ｌｙｓ）以外のアミノ酸残基）であり、
かつ
Ｒが、水酸基、又はビオチン、核酸、ポリエチレングリコール、アジド、アルキン、マレイミド若しくはシクロペンタジエン又はそれから誘導される基である。）
２）ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＧであり、かつ水酸基又はビオチン若しくはアルキンから誘導される基である、１）に記載のＴＧａｓｅの基質
３）以下からなる群より選択される一つである、２）に記載のＴＧａｓｅの基質。
【化１】
2010002042.tif 000002
【化２】
2010002042.tif 000003
【化３】
2010002042.tif 000004
【化４】
2010002042.tif 000005
【化５】
2010002042.tif 000006
【化６】
2010002042.tif 000007
【化７】
2010002042.tif 000008
４）ＴＧａｓｅにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を有するタンパク質と、１）〜３）のいずれか１項に記載されたＴＧａｓｅの基質とを連結することにより得られる、蛍光標識化タンパク質。
５）タンパク質が、ＩｇＧ抗体である、４）に記載の蛍光標識化タンパク質。
６）蛍光標識化されたタンパク質の製造方法であって：
ＴＧａｓｅを用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基又を有するタンパク質と、１）〜３）のいずれか１に記載されたＴＧａｓｅの基質とを連結して蛍光標識化されたタンパク質を得る工程を含む、製造方法。
７）タンパク質が、ＩｇＧ抗体である、６）に記載の製造方法。
８）ＴＧａｓｅを用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を有する機能性タンパク質と、蛍光基にリンカーを介してＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分を結合させたものとを連結して、機能が維持されたままの、蛍光標識化機能性タンパク質を得る工程を含む、タンパク質の蛍光標識化方法。
９）ＴＧａｓｅを用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基又を有するタンパク質と、
（蛍光基）−（リンカー）−（ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分）−（機能性有機分子）
で表される、ＴＧａｓｅの基質とを連結する工程を含む、タンパク質の標識化方法。
（式中：
蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（ＴＲ）若しくはダンシル（Ｄｎｓ）又はそれから誘導される基であり、
リンカーが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（ｎは１〜６の整数）で表される基であり、
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＸ（ＸはＬｙｓ以外のアミノ酸残基）である。）
１０）ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分が、ＱＧであり、かつ機能性有機分子がビオチン又はアルキンから誘導される基である、９）に記載の方法。
１１）ＴＧａｓｅの基質が、
【化８】
2010002042.tif 000009
【化９】
2010002042.tif 000010
【化１０】
2010002042.tif 000011
である、１０）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図２】ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図３】Ｆｌｃ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図４】ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図５】Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図６】ＭＴＧによる修飾、未修飾のＮＫ６−ＡＰの相対性評価。
【図７】ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応の経時変化。
【図８】ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応の基質濃度変化。
【図９】ＴＧａｓｅによるβ−カゼインへの蛍光基質の導入。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図１０】ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図１１】ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図１２】ＭＴＧによる抗体へのＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図１３】ＭＴＧによる抗体へのＤｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図１４】ＥＬＩＳＡによる抗原認識能の確認。ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ（Ｉ）、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ（ＩＩ）。
【図１５】ＡＰによる蛍光強度の比較。
【図１６】蛍光イメージャーによるＥＬＩＳＡの観察結果（左）と蛍光強度（右）。
【図１７】Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＢｉｏｔｉｎのＨＰＬＣ精製後ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳの結果。
【図１８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認（左）、トランスイルミネーターによる確認（右）。
【図１９】ＭＴＧによるＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの導入前後におけるＮＫ６−ＡＰの活性。
【図２０】精製後ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質の吸光度測定結果。
【図２１】アビジンコートマイクロプレート固定化ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質のＤａｎｓｙｌ蛍光強度測定結果（左）、ＡＰ相対活性結果（右）。
【図２２】ＨＰＬＣ精製後ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳの結果。
【図２３】ｐＨ条件の最適化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（左）、蛍光強度解析結果（右）。
【図２４】ＭＴＧ濃度の最適化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（左）、蛍光強度解析結果（右）
【図２５】ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅに対するＭＴＧの反応性。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果。
【図２６】ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの導入前後におけるＮＫ６−ＡＰの相対活性。
【図２７】クリック反応によるタンパク質間の連結。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（左）と蛍光イメージャーによる観察結果（右）。
【図２８】ｐＨ条件の最適化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（抗体Ｈ鎖のバンド）（左）、蛍光強度解析結果（右）。
【図２９】ＭＴＧ濃度の最適化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（抗体Ｈ鎖のバンド）（左）、蛍光強度解析結果（右）。
【図３０】基質濃度の最適化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（抗体Ｈ鎖のバンド）（左）、蛍光強度解析結果（右）。
【図３１】反応温度の最適化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（Ａ）、蛍光強度基準での経時変化（Ｂ）。
【図３２】アビジン被覆樹脂へのマルチラベル化抗体の固定化。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（ＣＢＢ染色（上）、蛍光像（下））。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
Ｉ．ＴＧａｓｅの新規蛍光基質：
本発明により、下記の構造を有するＴＧａｓｅの新規蛍光基質が提供される。
（蛍光基）−（リンカー）−（ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を含む部分）−Ｒ
本発明で「蛍光基」というときは、特別な場合を除き、ある波長の電磁照射（光、Ｘ線等）を吸収し、吸収されたエネルギーをより長波長な放射線として再放射することができる基をいう。蛍光基には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（ＴＲ；スルホローダミン）、ダンシル（Ｄｎｓ；（５−ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニル）、カルボシアニン（Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシ−４，４−ジメチルオキサゾリジン）、ＰＲＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン）、ＴＥＭＰＯ（Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）、ウンベリフェロン、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、エリトロシン、ローダミン、テトラメチルローダミン、若しくは７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、又はそれから誘導される基が含まれる。
本発明により抗体を標識化する場合、好ましい蛍光基の例は、ＦＩＴＣ、ＴＲ、Ｄｎｓから誘導される基である。
本発明においては、蛍光基には、リンカーを介してＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するを含む部分が結合されている。
本発明において「リンカー」というときは、特別な場合を除き、蛍光基とＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分とを連結するために用いるものであり、熱化学的及び光化学的に不活性な連結形成のための基をいう。リンカーとしてどのようなものを用いるかは、当業者であれば、その長さ、分子柔軟性、連結のための反応の行いやすさ等の様々な要因を考慮して適宜選択しうる。
リンカーの例として、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（ｎは１〜６の整数）で表される基を挙げることができ、より具体的な例として、β−アラニン（β−Ａｌａ）又はε−アミノカプロン酸（ε−ａｍｉｎｏ  ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ，ε−Ａｃｐ）から誘導される基を挙げることができる。
本発明における「ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分」は、できる限り小さな基質ペプチドであること、またＬｙｓにすると自己架橋する可能性があることを考慮すると、ＱＸ（Ｘは、Ｌｙｓ以外のアミノ酸残基である。）であることが好ましい。Ｌｙｓ以外のアミノ酸残基の例は、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）又はアルギニン（Ａｒｇ）の残基である。複数のＴＧａｓｅによって認識されうるとの観点からは、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分は、Ｌ−グルタミルグリシル基（ＱＧ）として存在することが好ましい。
また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、若しくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、又はＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、若しくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、モルモット由来ＴＧａｓｅの良基質として、カルボベンゾイル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、カルボベンゾイル−Ｌ−グルタミルグルタミルグリシン（Ｚ−ＱＱＧ）又はＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、又はＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）若しくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチド又はペプチドから誘導される基として存在してもよい。
本発明でペプチドに関し、それから「誘導される基」というときは、当該ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端から、水素原子及び／又は水酸基を除くことにより生じる基を指す。
標識物質（例えば蛍光基）、リンカー、及びＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分の結合は、当業者であれば類似の目的で実施される種々の手法を用いて適切に行いうる。
例えば、ＡＢＩ４３３Ａ型全自動固相合成機を用い、ｗａｎｇ樹脂又はＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂を出発原料としてＦｍｏｃ法又はＢｏｃ法にて合成することができる。Ｆｍｏｃ−アミノ酸、Ｆｍｏｃ−ε−Ａｃｐ、Ｂｏｃ−アミノ酸及びＢｏｃ−β−Ａｌａは、市販のものを用いることができる。より詳細な条件は、本明細書の実施例を参照することができる。
Ｒは、水酸基又は機能性有機分子（特定の機能を有する有機分子）とすることができる。機能性高分子の例は、対象物質を標識化するための標識物質であり、又は担体に固定化するため、若しくは対象物質に反応サイトを提供するための基である。
本発明において「標識物質」というときは、それ自体により若しくは検出のためのシステムの一部として検出可能な官能基部分を有するものをいう。検出可能な官能基部分の例としては、蛍光基（これについては後述する）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル基、放射性同位体を含む基、ＭＲＩ造影剤、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ）、ビオチン、化学ルミネセンス基（化学反応中に光の放出により検出可能な標識）、抗体等が挙げられる。
本明細書で「アルキン」というときは、特に示した場合を除き、炭素数２〜６の低級アルキンを指し、好ましい例は末端アルキン（一方の端が水素原子と結合しているもの。）であり、より好ましい例は、Ｃ２アルキン（プロピン、メチルアセチレン）である。
標識化対象であるタンパク質の機能を維持しつつ標識化するためには、機能性有機分子は、比較的小分子であることが好ましい場合がある。また、水溶性が高い方が、タンパク質の立体構造に悪影響を与える有機溶媒の割合を減らす、あるいはなくすことができるので好ましい場合がある。また、分子量の小ささは、細胞への投与においても、有利である。
本発明においてＲの好ましい例は、ビオチン（より特定するとアミノ化ビオチン）、アルキン、マレイミド、核酸、アジド又はシクロペンタジエンから誘導される基である。
本発明において、ビオチン、核酸、ポリエチレングリコール、アジド、アルキン、マレイミド又はシクロペンタジエンから「誘導される基」というときは、それらの物質から誘導される基であって、必要に応じ追加されたスペーサー部分（ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ｎ（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ｎとも呼ばれる。）。ｎは１〜６の整数、例えば、２又は３を表す。）を含み、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有する部分のＣ末端に、連結可能である基（例えば、側鎖から水素原子、水酸基等を除いてできる基）を指す。
立体障害を減らすために、Ｒが機能性有機分子である場合、適切な長さのスペーサーを有する基であるとよい。なお、本明細書においては、適当な長さのスペーサーを有するアミノ化ビオチンのことを、単に「ビオチン」と表していることがあるが、これは前後の文脈などから、適切に解釈することができる。このことは適当な長さのスペーサーを有するアルキンについても当てはまる。
本発明の特に好ましい態様においては、Ｒとして、ビオチン（スペーサーを有するアミノ化ビオチン）を用いることができる。下記のアミノ化ビオチン（商品名ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ａｍｉｎｅ−ＰＥＯ２−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）として市販されている。）は、この好ましい例である。
【化１１】
2010002042.tif 000012
Ｒがビオチンである本発明の基質は、当業者であれば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法の手順に従って、合成することができる。より詳細な合成のための手順及び条件は、本発明の実施例を参照することができる。Ｒがビオチンである本発明の基質は、Ｔｇａｓｅを用いて、タンパク質へ連結された後、アビジンコートされた固相へ、固定化することができる。
本発明の特に好ましい態様においては、Ｒとして、クリックケミストリーの中で代表的な反応であるＨｕｉｓｇｅｎ付加環化反応の反応サイトであるアルキンを用いることができる。クリック反応は、実験操作が非常に簡便で、副生成物を生じずに、水中でも高効率で反応が進行することが可能である。なお、クリック反応に関しては、Ｐ．−Ｃ．Ｌｉｎ，Ｓ．−Ｈ．Ｕｅｎｇ，Ｍ．−Ｃ．Ｔｓｅｎｇ，Ｊ．−Ｌ．Ｋｏ，Ｋ．−Ｔ．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．−Ｃ．Ｙｕ，Ａ．Ｋ．Ａｄａｋ，Ｙ．−Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．−Ｃ．Ｌｉｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，４２８６−４２９０、Ｔ．Ｓ．Ｓｅｏ，Ｚ．Ｌｉ，Ｈ．Ｒｕｐａｒｅｌ，Ｊ．Ｊｕ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００３，６８，６０９−６１２及びＴ．Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ，Ｐ．Ｊｏｎｋｈｅｉｊｍ，Ｌ．Ｇｏｇｏｌｉｎ，Ｈ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｃ．Ｆ．Ｗ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，２００８，３７２３−３７２５等の文献を参照することができる。
本発明においては、Ｒを、クリック反応のための反応サイトとすることができる。クリック反応の中でもアジドとアルキンの、無触媒又は銅触媒によるＨｕｉｓｇｅｎ付加環化反応は、本発明に適用することのできるもっとも好ましい例の一つである。
Ｒがアルキンである本発明の基質は、当業者であれば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法の手順に従って、市販の樹脂（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ＰＥＧ  ＮｏｖａＴａｇＴＲＲｅｓｉｎ）を用いて、適宜合成することができる。より詳細な合成のための手順及び条件は、本発明の実施例を参照することができる。Ｒがアルキンである本発明の基質は、Ｔｇａｓｅを用いて、タンパク質へ連結された後、アジド化された他の蛋白質とクリック反応により、さらに連結することができる。
本発明により、トランスグルタミナーゼの新規蛍光基質が提供される。この蛍光基質は、
組換えタンパク質の蛍光ラベル化試薬、抗体の蛍光ラベル化試薬（キット）として、また部位特異的固定化を介したプロテインアレイや抗体アレイ作成、蛍光ラベル化抗体を利用する分子イメージングや薬物ターゲティングのために有用である。
ＩＩ．標識化の対象となるタンパク質
本発明の方法において用いられる、標識化の対象となるタンパク質は、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ基を有するか、又はＣ末端又はＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加したタンパク質である。
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ基を有するタンパク質の例として、ＩｇＧ抗体、カゼインを挙げることができる。
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドの例として、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号：２２）がある。
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加したタンパク質は、組換えタンパク質として調製可能であるとの観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。このような例として、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、抗体エピトープ配列を含むペプチドが挙げられる。
組換えタンパク質は、精製のためにそれぞれＮ末端又はＣ末端にさらに（Ｈｉｓ）６−ｔａｇを付加してもよい。ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するためには、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端にＨｉｓ−ｔａｇを入れるようにデザインするとよい。このようなタンパク質の調製は、当業者であれば類似の目的で実施される種々の手法を用いて適切に行いうるが、例えば、ＴＧａｓｅ活性なＬｙｓ残基を含むＭＫＨＫＧＳ配列をＮ末端に有するアルカリホスファターゼ（ＮＫ６−ＡＰ）は、次の手順を参考にして調製することができる。すなわち、ＡＰをコードするＤＮＡを含む増幅用ベクターを入手又は調製し、ＰＣＲによりＡＰをコードするＤＮＡを増幅するが、このときＮ末端側に適当な制限酵素に認識されるサイト（制限部位）とＭＫＨＫＧＳをコードするＤＮＡが、Ｃ末端側に適切な制限部位と必要に応じＨｉｓ−ｔａｇをコードするＤＮＡが導入されるようにプライマーを設計する。増幅後、生成したＤＮＡを制限酵素で処理し、同じく制限酵素で処理した発現用ベクターに挿入することにより、ＮＫ６−ＡＰ発現ベクターを調製する。得られた発現ベクターは、適切な宿主（例えば大腸菌）に導入し、形質転換宿主を得て、この形質転換体を、選抜培地等で培養する。培養物からの組換えＡＰを含む画分は、Ｈｉｓ−ｔａｇ及び／又はゲル濾過カラムを利用して精製を行い、組換えＡＰを調製する。組換えＡＰは必要に応じ、適切な手段で配列を確認し、また適切な手段で精製を確認してもよい。
ＩＩＩ．トランスグルタミナーゼによる反応：
本発明においては、トランスグルタミナーゼとして、種々のものを用いうる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（モルモット、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。当業者であれば、本発明に具体的に開示された例を基に、それぞれのＴＧａｓｅの基質特異性等を考慮して条件設定を行い、これらのＴＧａｓｅのいずれをも用いることができる。ＴＧａｓｅの好ましい例は、微生物由来のもの（ＭＴＧ）、モルモット肝臓由来のもの（ＧＴＧ）である。
本発明の方法において、トランスグルタミナーゼを用いる反応は、穏和な条件で、例えば、４℃で、数時間〜１日で、実施することができる。本発明者らが実施した条件では、ＮＫ６−ＡＰとＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧとのＭＴＧによる反応は、ほぼ３時間で終了した（実施例参照）。
また、本発明においては、標識物質を含む基質（例えば、蛍光基質）の濃度は、比較的低くても反応が進行し、検出に足る標識化を行うことができる。本発明者らが実施した条件においては、最終濃度では１μＭまで落としても標識化反応が進行した（実施例参照）。
ＩＶ．その他（本発明の効果、用途、有用性等）：
本発明により、新規蛍光基質であるＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧがＭＴＧの基質となることが確認された。これらの基質を用いることにより、タンパク質を部位特異的に標識化することができる。適切な部位を標識化されたタンパク質は、標識化しても機能を消失しない。
本発明により抗体を標識化することもでき、この場合、標識化はＨ鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）上へ行われる。抗体を標識化した場合にも、標識化に伴う抗原認識能は消失しない。
本発明のより得られる蛍光ラベル化抗体は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、免疫染色、及びフロー・サイトメトリーにおいて、有用である。
本発明に拠れば、蛍光基質と標識化したいタンパク質とが共存する溶液に、トランスグルタミナーゼを添加するだけで、容易に蛍光ラベル化することができる。
ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を含む部分として、ＴＧａｓｅの良基質であるペプチドを利用した本発明の蛍光基質は、ペプチドのフリーのＣ末端を利用して、さらなる機能性の付与が可能である。例えば、ビオチン、ＤＮＡ、磁性ナノ粒子など、あるいはアジド、アルキン、マレイミド、シクロペンタジエン誘導体などと結合させることにより、二重標識（ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）が可能となる
例えば、ＧｌｎのＮ末端側にリンカーと蛍光基、そしてＧｌｙのＣ末端にアミノ化ビオチンを導入したｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化基質は、検出感度が高い、広いダイナミックレンジで定量化ができ、またイメージングへの応用も可能にする。また、ビオチンはアビジンと極めて高い親和性を持つため、ビオチンとアビジンの相互作用を介して、タンパク質の機能を保持したままマイクロプレート上や量子ドット、蛍光ナノ粒子や磁性微粒子などに固定化することができる。固定化により、バックグラウンドの低減が可能となり検出感度が向上しうる。また、固定化量に対する活性を追うことができ、酵素の比活性を算出でき、プロテインアレイを開発する際の問題点となる定量的な議論の発展が期待される。
例えば、ＧｌｎのＮ末端側にリンカーと蛍光基、そしてＧｌｙのＣ末端にアルキンを導入した本発明の基質は、部位特異的な反応サイトと共有結合的な反応サイトとを有するペプチドであり、異種タンパク質の連結を可能とする。
【実施例】
【０００６】
［実施例１：蛍光基質の合成］
蛍光基としては、ＭＴＧの良基質として知られているＺ−ＱＧをモデルとし、嵩高く、疎水性であるＮ−ベンジルオキシカルボニル基に代わるものとして、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｄａｎｓｙｌの３種類を用いた。また、リンカーとしては、ε−Ａｃｐ（ａｍｉｎｏ  ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、β−Ａｌａ、なしを選択した。
１．ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの合成
【化１２】
2010002042.tif 000013
ペプチド樹脂はＡＢＩ４３３Ａ型全自動固相合成機を用い、ｗａｎｇ樹脂（渡辺化学工業製）を出発原料としてＦｍｏｃ法にて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）（ペプチド研究所製）、Ｆｍｏｃ−ε−Ａｃｐ（渡辺化学工業製）並びにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（同仁化学研究所製）を用いた。
得られたペプチド樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（９５：５：５）で室温下１．５時間処理し、樹脂から切り出して、粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、黄色のＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧを得た（純度９６．７％）。
アミノ酸分析（６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２ｈｒｓ）結果：Ｇｌｎ（１）１．０１，Ｇｌｙ（１）１．００，ＮＨ２（１）１．０３，ε−Ａｃｐ（１）１．００
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＨ＋＝７０６．３（Ｔｈｅｏｒ．７０６．２，ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）。
２．ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの合成
【化１３】
2010002042.tif 000014
ペプチド樹脂はＡＢＩ４３０Ａ型全自動固相合成機を用い、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂［ＢｅａｄＴｅｃｈ社製］を出発原料としてＢｏｃ法にて合成した。Ｂｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−β−Ａｌａ（ペプチド研究所製、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（同仁化学研究所製）を用いた。
得られたペプチド樹脂を、無水フッ化水素／ｐ−クレゾール（８：２）で−５〜−２℃下１時間処理し、樹脂から切り出して、粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、黄色のＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを得た（純度９８．８％）。
アミノ酸分析（６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２ｈｒｓ）結果：Ｇｌｎ（１）１．０１，Ｇｌｙ（１）１．００，ＮＨ２（１）１．０７，β−Ａｌａ（１）１．０６
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＨ＋＝６６４．２（Ｔｈｅｏｒ．６６４．２，ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）。
３．ＴＲ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの合成
【化１４】
2010002042.tif 000015
ε−Ａｃｐ−ＱＧペプチド樹脂はＡＢＩ４３３Ａ型全自動固相合成機を用い、ｗａｎｇ樹脂（渡辺化学工業製）を出発原料としてＦｍｏｃ法にて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）（ペプチド研究所製）並びにＦｍｏｃ−ε−Ａｃｐ（渡辺化学工業製）を用いた。
得られたペプチド樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（９５：５：５）で室温下１．５時間処理し、樹脂から切り出して、ε−Ａｃｐ−ＱＧ粗ペプチドを得た。これをＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１  ａｃｉｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学研究所製）と反応して、目的とするＴＲ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、赤紫色のＴＲ−ε−Ａｃｐ−ＱＧを得た（純度９８．１％）。
アミノ酸分析（６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２ｈｒｓ）結果：Ｇｌｎ（１）１．００，Ｇｌｙ（１）０．９９，ＮＨ２（１）１．０２，β−Ａｌａ（１）０．９９
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ−Ｈ）−８６１．３（理論値８６１．３，ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）。
４．Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの合成
【化１５】
2010002042.tif 000016
ペプチド樹脂はＡＢＩ４３３Ａ型全自動固相合成機を用い、ｗａｎｇ樹脂（渡辺化学工業製）を出発原料としてＦｍｏｃ法にて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）（ペプチド研究所製）、Ｆｍｏｃ−ε−Ａｃｐ（渡辺化学工業製）、並びにＤａｎｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（東京化成工業製）を用いた。
得られたペプチド樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（９５：５：５）で室温下１．５時間処理し、樹脂から切り出して、粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、淡黄色の目的のＤｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧを得た（純度９８．２％）。
アミノ酸分析（６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２ｈｒｓ）結果：Ｇｌｎ（１）１．０１，Ｇｌｙ（１）１．００，ＮＨ２（１）１．０９，ε−Ａｃｐ（１）０．１８（この条件では、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐはかなり切断されにくい。）
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝５４９．３（Ｔｈｅｏｒ．５４９．６）。
５．Ｆｌｃ−ＱＧの製造
【化１６】
2010002042.tif 000017
ペプチド樹脂はＡＢＩ４３３Ａ型全自動固相合成機を用い、ｗａｎｇ樹脂（渡辺化学工業製）を出発原料としてＦｍｏｃ法にて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）（ペプチド研究所製）並びに５−Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いた。
得られたペプチド樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（９５：５：５）で室温下１．５時間処理し、樹脂から切り出して、粗ペプチドを得た。
得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用い、０．１Ｍ  ＡｃＯＮＨ４を含むＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、橙色のＦｌｃ−ＱＧを得た（純度９９．２％）。
アミノ酸分析（６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２ｈｒｓ）結果：Ｇｌｎ（１）１．０２，Ｇｌｙ（１）１．００，ＮＨ２（１）１．６６
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝５６１．２（理論値５６１．２）。
［実施例２：ＭＴＧによるタンパク質への蛍光基質の反応性］
１．緒言
本実施例では、Ｇｌｎを含む蛍光基質と遺伝子工学的にＬｙｓタグを導入した酵素が部位特異的に修飾されるか検討することによって、蛍光基質が、ＭＴＧが認識する基質であることを確認し、導入に伴う酵素活性の影響を検討した。また蛍光基質を認識するＴＧａｓｅの由来による汎用性を示すために、モルモット肝臓由来のＴＧａｓｅであるＧＴＧに対する蛍光基質の反応性を検討した。
モデルタンパク質として、天然型ではＭＴＧの基質とならないことが知られているアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を選択した。
ＡＰは、Ｎ末端へ遺伝子工学的手法によりＬｙｓタグを導入することによってＭＴＧの良基質となることが知られており（下表）、本実施例ではＬｙｓ側の基質として、このＮＫ６−ＡＰを用いて、蛍光基質の反応性を検討した。
【表１】
2010002042.tif 000018
２．実験
２−１．試薬
ＭＴＧは味の素（株）より提供して頂いたものを用いた。ＮＫ６−ＡＰは既報に準じて調製した。ＮＫ６−ＡＰの製造方法は、本願明細書の記載のほか、前掲特許文献１を参照することができる。蛍光基質として、実施例１で合成したものを用いた。その他の試薬は市販のものを用いた。
２−２．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへの蛍光基質の導入
それぞれの蛍光基質が、ＭＴＧの基質となるかを確認するために、Ｇｌｎを含む蛍光基質と遺伝子工学的にＬｙｓタグを導入したＡＰ（ＮＫ６−ＡＰ）が部位特異的に修飾されるか検討を行った。
結合反応は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１Ｕ／ｍｌとなるように蛍光基質（ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｆｌｃ−ＱＧ、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ）、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加え、それらをよく攪拌し、４℃で一晩静置させることで行った。比較としてＭＴＧを加えないものを用意した。
反応後のサンプルに対して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色液で染める前に、蛍光イメージャーによって観察した。Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧに関してはトランスイルミネーターによって観察した。
２−３．修飾によるＮＫ６−ＡＰの酵素活性評価
導入に伴う酵素活性の影響を検討した。ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）を基質として用い、実験２−２で調製したサンプルの活性測定を行った。ＡＰはｐ−ＮＰＰの脱リン酸化反応を触媒し、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）を形成する。活性測定は、ＡＰ２８ｎＭ、ｐ−ＮＰＰ１ｍＭ、ｐＨ８．０の反応条件下、２７℃で行い、ｐ−ＮＰに由来する４１０ｎｍの吸収を追跡することによって活性測定を行った。
２−４．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへの蛍光基質の反応の経時変化
蛍光基質は、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを用いて検討を行った。ＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入の反応条件は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が０．１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加え、それらをよく攪拌し、４℃において０〜５時間で行った。結合追跡はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルを蛍光イメージャーによって解析することによって行った。
２−５．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへの蛍光基質の反応における基質濃度依存性
蛍光基質は、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを用いて検討を行った。ＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入の反応条件は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が１〜１０００μＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加え、それらをよく攪拌し、４℃において１５分間で行った。反応後のサンプルに対する追跡は実験２−４と同様の手順で行った。
２−６．蛍光基質に対するＧＴＧの反応性評価
ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを有するタンパク質としてβ−カゼインを用い、蛍光基質との架橋化反応を行い、ＧＴＧに対する蛍光基質の反応性を評価した。
結合反応は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に最終濃度が１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，０．２Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、β−カゼイン、ＧＴＧを加え、２７℃で一晩静置させることで反応を行った。比較として、ＧＴＧを加えないもの、ＭＴＧによって反応させたものを用意した。ＭＴＧによる結合反応は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中に、最終濃度が１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１Ｕ／ｍｌとなるように、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、β−カゼイン、ＭＴＧを加え、２７℃で一晩静置させることで反応を行った。反応後のサンプルに対する追跡は実験２−２と同様の手順で行った。
３．実験結果及び考察
３−１．蛍光基質に対するＭＴＧの反応性評価
Ｇｌｎを含む蛍光基質と遺伝子工学的にＬｙｓタグを導入することによってＭＴＧの良基質となることが知られているＮＫ６−ＡＰとを反応させ（下記）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られたゲルの蛍光を観察することによって追跡を行った。
【化１７】
2010002042.tif 000019
３−１−１．ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性
図１にＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧとＮＫ６−ＡＰの反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、約４５ｋＤａにＮＫ６−ＡＰ、約３５ｋＤａにＭＴＧのバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅの約４５ｋＤａにＦＩＴＣ由来の蛍光が観測され、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光が観測されなかった。よって、ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧがＭＴＧによって、ＮＫ６−ＡＰへ導入され、ＭＴＧの基質として認識されることが確認された。
３−１−２．ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性
図２にＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧとＮＫ６−ＡＰの反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、約４５ｋＤａにＮＫ６−ＡＰ、約３５ｋＤａにＭＴＧのバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅの約４５ｋＤａにＦＩＴＣ由来の蛍光が観測され、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光が観測されなかった。よって、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧがＭＴＧによって、ＮＫ６−ＡＰへ導入され、ＭＴＧの基質として認識されることが確認された。
３−１−３．Ｆｌｃ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性
図３にＦｌｃ−ＱＧとＮＫ６−ＡＰの反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、約４５ｋＤａにＮＫ６−ＡＰ、約３５ｋＤａにＭＴＧのバンドが見られた。この蛍光像の結果では、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎに由来する蛍光が観察されなかった。よって、Ｆｌｃ−ＱＧがＭＴＧに認識されないことが確認された。Ｆｌｃ−ＱＧが認識されない原因として、ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧとＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧが認識されることから、ＭＴＧのＧｌｎを認識する際の立体障害だと考えられる。よって、ＧｌｎのＮ末端へのリンカーの導入の有用性が確認された。
３−１−４．ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性
図４にＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧとＮＫ６−ＡＰの反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、約４５ｋＤａにＮＫ６−ＡＰ、約３５ｋＤａにＭＴＧのバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅの約４５ｋＤａにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ由来の蛍光が観測され、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光が観測されなかった。よって、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧがＭＴＧによって、ＮＫ６−ＡＰへ導入され、ＭＴＧの基質として認識されることが確認された。
３−１−５．Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧに対するＭＴＧの反応性
図５にＤｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧとＮＫ６−ＡＰの反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルをトランスイルミネーターによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、約４５ｋＤａにＮＫ６−ＡＰ、約３５ｋＤａにＭＴＧのバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅの約４５ｋＤａにＤａｎｓｙｌ由来の蛍光が観測され、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光が観測されなかった。よって、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧがＭＴＧによって、ＮＫ６−ＡＰへ導入され、ＭＴＧの基質として認識されることが確認された。
３−２．導入によるＮＫ６−ＡＰの相対活性評価
図６に導入によるＮＫ６−ＡＰの相対活性の結果を示した。結果より、ＭＴＧを加えたもの、加えなかったものに、ＡＰの活性にほとんど変化がなかった。よって、修飾による機能損失を伴わないＮＫ６−ＡＰへの蛍光基質の導入が可能なことが示唆された。
３−３．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへの蛍光基質の反応の経時変化
図７にＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応の経時変化を示す。結果より、この条件においては、ほぼ、３時間で反応が終了することが明らかとなった。
３−４．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへの蛍光基質の反応における基質濃度依存性
図８にＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応の基質濃度変化を示す。結果より、この条件において、最小濃度では１Ｍまで落としても反応が進行し、検出できることが確認された。また、最大濃度では、１ｍＭにおいて反応が進行した。これ以上の濃度における検討は、蛍光基質を溶かしているＤＭＳＯの水溶液中の割合が変わってくるため実験が行えなかった。
３−５．ＧＴＧに対する蛍光基質の反応性評価
蛍光基質に対するモルモット肝臓由来のＴＧａｓｅであるＧＴＧの反応性の検討を、ＴＧａｓｅの良基質として知られているβ−カゼインを用い、ＴＧａｓｅの架橋化反応において、蛍光基質が反応性を示すか評価することによって行った。
カゼインは、そのタンパク質を構成するアミノ酸のうち、Ｓｅｒ残基の多くにリン酸を結合したリンタンパク質の代表的な例である。この特徴のため、カゼインは分子全体としてマイナスの電荷を帯びており、カルシウムイオンやナトリウムイオンと結びつきやすい性質を持つ。またカゼインはその分子構造中に、α−ヘリックスやβ−シートのような二次構造を有しておらず、ＴＧａｓｅに認識されるＧｌｎやＬｙｓを複数有していることが知られている。そのため、β−カゼインはＴＧａｓｅによって自己架橋反応が起こる。そこで、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを持つ蛍光基質を加えることで、β−カゼインが自己架橋反応を起こしながら、蛍光基質を取り込み、下記のような結合反応が見られると考えられる。本実験においては、蛍光基質にＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを用いて、実験を行った。
【化１８】
2010002042.tif 000020
図９に反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、ＧＴＧ、ＭＴＧを加えたＬａｎｅともにβ−カゼインが消失しており、架橋化したことがわかる。この蛍光像の結果より、ＧＴＧ及びＭＴＧと、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを加えたＬａｎｅにおいて、ＦＩＴＣ由来の蛍光が観察された。よって、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧがＧＴＧにも認識されることが確認された。また、ＭＴＧによる処理を施したＬａｎｅの方が高い蛍光強度を示し、ＭＴＧの方が高い反応性を示すことが確認された。これはＭＴＧとＧＴＧの基質特異性の違いに起因するものと考えられる。
４．結言
本実施例では、新規蛍光基質であるＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｆｌｃ−ＱＧ、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧがＭＴＧの基質となるかを確認した。本実験では、ＭＴＧの良基質として知られているＮＫ６−ＡＰとこれらの蛍光基質がＭＴＧによって架橋化されるか検討した。結果より、Ｆｌｃ−ＱＧ以外の蛍光基質において反応が進行し、ＭＴＧの基質となることが確認された。修飾を行ったＮＫ６−Ａｐに対して活性測定を行ったところ、修飾に伴う酵素の失活も見られず、タグへの部位特異的な修飾が達成された。またＦｌｃ−ＱＧが基質として認識されないことより、ＧｌｎのＮ末端側におけるリンカーの有用性が示唆された。
また蛍光基質を認識するＴＧａｓｅの由来による汎用性を示すために、モルモット肝臓由来のＴＧａｓｅであるＧＴＧに対する蛍光基質の反応性の検討を行った。本実験では、ＴＧａｓｅの良基質として知られているβ−カゼインを用い、ＴＧａｓｅの架橋化反応において、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧが反応性を示すか評価することによって行った。ＧＴＧ及びＭＴＧともに、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを加えたＬａｎｅにおいて、ＦＩＴＣ由来の蛍光が観察され、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧがＧＴＧにも認識されることが確認されたが、ＱのＣ末端側のアミノ酸配列を変えることで、ＧＴＧに対する反応性を高めることが可能であると考えられる。
［実施例３：ＭＴＧによる抗体への蛍光基質の導入］
１．緒言
本実施例では、組み換えや断片化を行っていないそのままの抗体へ直接、蛍光基質をＭＴＧによって導入することを試みた。
【化１９】
2010002042.tif 000021
２．実験
２−１．試薬
各種抗体はコスモバイオから購入した。ＡＰの蛍光基質であるＥＣＦはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅより購入した。９６穴マイクロプレートはＮｕｎｃより購入した。１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅより購入した。ｅｔｈａｎｏｌ  ａｍｉｎｅはＷａｋｏより購入した。その他の試薬は市販のものを用いた。
２−２．ＭＴＧによる抗体への蛍光基質の導入
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中に、最終濃度が１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１Ｕ／ｍｌとなるように蛍光基質（ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ）、マウス由来抗Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ＩｇＧ２ａ抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、ＭＴＧを加えた。比較としてＭＴＧを加えないものを用意した。それらをよく攪拌し、４℃で一晩静置させることで反応を行った。
反応後のサンプルに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたゲルをＣＢＢ染色液で染める前に、蛍光イメージャーによって観察した。Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧに関してはトランスイルミネーターによって観察した。
２−３．ＥＬＩＳＡによる抗原認識能の評価
実験２−２と同条件でラビット由来抗ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）へ蛍光基質（ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを導入したサンプルに関して検討を行った。
ＥＬＩＳＡは以下の手順で実験を行った（Ｆｉｇ．３−５）。
１）Ｂｌａｃｋ  Ｐｌａｔｅに５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（抗原）を１５０ｌ／ｗｅｌｌずつ添加し３７℃で一晩静置した。
２）１）をＰＢＳＴで５回洗浄した。
３）修飾した抗ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体を６０ｌ／ｗｅｌｌずつ添加し室温で５時間静置した。
４）３）をＰＢＳＴで５回洗浄した。
５）蛍光イメージャーによって観測した。
６）１．３ｇ／ｍｌのＡＰ標識抗ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＩｇＧ抗体を１５０ｌ／ｗｅｌｌずつ添加し３７℃で３時間静置した。
７）６）をＴＢＳＴで５回洗浄した。
８）基質を添加し１０分後に酵素反応に由来する蛍光を蛍光イメージャーによって観測した。
２−４．サンプル精製
まず以下に示すバッファーを用意した。
カップリングバッファー（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）
バッファーＡ（０．５Ｍ  ｅｔｈａｎｏｌ  ａｍｉｎｅ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）
バッファーＢ（０．１Ｍ  ａｃｅｔａｔｅ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）
溶出バッファー（０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ３．０）
化学修飾法によりＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰへ抗ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＩｇＧ抗体の固定化及び精製の操作の手順を以下に示す。
１）ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰを冷１ｍＭ  ＨＣｌ  １ｍｌを６回洗浄した。
２）直ちにカップリングバッファー（１ｍｌ）に溶解した抗ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＩｇＧ抗体（１０ｍｇ）を加え、２５℃において２時間反応させた。
３）過剰な活性基を不活性にし、カップリングしなかった抗体を除去するために、バッファーＡ→バッファーＢ→バッファーＡの順に、１ｍｌを６回ずつ洗浄した。
４）２５度において２時間反応させた。
５）バッファーＢ→バッファーＡ→バッファーＢの順に、１ｍｌを６回ずつ洗浄した。
６）ＰＢＳを１０ｍｌ加え、カラムを平衡化させた。
７）ＭＴＧにより抗体へＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧを導入したサンプルをアプライした。
８）ＰＢＳを１０ｍｌ加え、カラムを洗浄した。
９）溶出バッファーを３ｍｌ加え、抗体を溶出させた。
１０）バッファーＡとバッファーＢを１ｍｌを交互に送液後、ＰＢＳを１０ｍｌ加え、再平衡化させた。
３．実験結果及び考察
３−１．ＭＴＧによる抗体への蛍光基質の反応性評価
ＭＴＧによってＧｌｎを含む蛍光基質と抗体中のＬｙｓを反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られたゲルの蛍光を観察することによって追跡を行った。
１−１．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの反応性
図１０にＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧと抗体の反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＩｇＧ抗体は４本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合によって結合している構造をとっており、分子量自体は約１５０ｋＤａである。今回は還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っており、ジスルフィド結合がメルカプトエタノールによって開裂している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、Ｌ鎖の約２５ｋＤａとＨ鎖の約５０ｋＤａ、そしてＭＴＧの約３８ｋＤａにバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅには約５０ｋＤａにＦＩＴＣに由来する蛍光が見られ、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光は見られなかった。よって、ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧがＭＴＧにより抗体Ｈ鎖へ修飾されていると考えられる。
３−１−２．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応性
図１１にＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧと抗体の反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、Ｌ鎖の約２５ｋＤａとＨ鎖の約５０ｋＤａ、そしてＭＴＧの約３８ｋＤａにバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅには約５０ｋＤａにＦＩＴＣに由来する蛍光が見られ、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光は見られなかった。よって、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧがＭＴＧにより抗体Ｈ鎖へ修飾されていると考えられる。
３−１−３．ＭＴＧによる抗体へのＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応性
図１２にＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧと抗体の反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルを蛍光イメージャーによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、Ｌ鎖の約２５ｋＤａとＨ鎖の約５０ｋＤａ、そしてＭＴＧの約３８ｋＤａにバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅには約５０ｋＤａにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄに由来する蛍光が見られ、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光は見られなかった。よって、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧがＭＴＧにより抗体Ｈ鎖へ修飾されていると考えられる。
３−１−４．ＭＴＧによる抗体へのＤｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧの反応性
図１３にＤｎｓ−ε−Ａｌａ−ＱＧと抗体の反応後のサンプルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルをトランスイルミネーターによって確認した結果を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、Ｌ鎖の約２５ｋＤａとＨ鎖の約５０ｋＤａ、そしてＭＴＧの約３８ｋＤａにバンドが見られた。この蛍光像の結果より、ＭＴＧを加えたＬａｎｅには約５０ｋＤａにＤｎｓｙｌに由来する蛍光が見られ、ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光は見られなかった。よって、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧがＭＴＧにより抗体Ｈ鎖へ修飾されていると考えられる。
３−２．ＥＬＩＳＡによる抗原認識能の確認
図１４に蛍光イメージャーによる一次抗体の蛍光の観察結果と蛍光強度の結果を示し、図１５に蛍光イメージャーによる二次抗体のＡＰに由来する蛍光強度の結果を示した。これらの結果より、導入を行った抗体が抗原認識能を維持しているかを評価した。図１４よりＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧともにＭＴＧを加えたｗｅｌｌにおいて蛍光が観察され、図１５よりＭＴＧを加えたｗｅｌｌにＭＴＧを加えていないｗｅｌｌと同程度の一次抗体量が検出され、抗原認識能が維持されていることを確認した。
４．結言
本章では、ＭＴＧによって抗体へ蛍光基質が導入されるか検討した。結果より、ＭＴＧによる抗体Ｈ鎖への蛍光基質（ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＴＲ−β−Ａｌａ−ＱＧ、Ｄｎｓ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ）の部位特異的修飾が確認された。ＥＬＩＳＡによって抗原認識能の確認を行ったところ、修飾に伴う抗原認識能の失活は見られなかった。
［実施例４：種々の動物種由来の抗体に対する反応性評価］
種々のＩｇＧ抗体（ｍｏｕｓｅ，ｓｈｅｅｐ，ｃｈｉｃｋｅｎ，ｒａｂｂｉｔ由来）に対する蛍光基の導入を試みた。
１  実験
１−１．試薬
各種抗体はコスモバイオから購入した。その他の試薬は市販のものを用いた。
１−２．ＭＴＧによる抗体への蛍光基質の導入
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中に、最終濃度が１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１Ｕ／ｍｌとなるように蛍光基質（ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ，ＦＩＴＣ−ε−Ａｃｐ−ＱＧ）、抗ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体（ｍｏｕｓｅ，ｓｈｅｅｐ，ｃｈｉｃｋｅｎ，ｒａｂｂｉｔ由来）、ＭＴＧを加えた。比較としてＭＴＧを加えないものを用意した。それらをよく攪拌し、４℃で一晩静置させることで反応を行った。
１−３．ＥＬＩＳＡによる抗原認識能の評価
ＥＬＩＳＡは以下の手順で実験を行った。
１）Ｂｌａｃｋ  Ｐｌａｔｅに５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（抗原）を１５０ｌ／ｗｅｌｌずつ添加し３７℃で一晩静置した。
２）１）をＰＢＳで５回洗浄した。
３）修飾した抗ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体を６０ｌ／ｗｅｌｌずつ添加し室温で３時間静置した。
４）３）をＰＢＳで５回洗浄した。
５）蛍光イメージャーによって観測した。
２．実験結果及び考察
２−１．ＭＴＧによる抗体への蛍光基質の反応性評価
図１６に蛍光イメージャーによるＥＬＩＳＡの観察結果と蛍光強度の結果を示す。この結果より、抗体への蛍光基質の導入、ならびに導入を行った抗体が抗原認識能を維持しているかを評価した。
結果より、ＭＴＧを加えたどのｗｅｌｌにおいて、ＭＴＧを加えていないｗｅｌｌより強い蛍光が観察された。よって、ＭＴＧによる抗体への蛍光基質の導入、及びラベル化抗体の抗原認識能の維持を確認した。
［実施例５：新規ＭＴＧ認識ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化基質の開発］
１．緒言
ＧｌｎのＮ末端側にリンカーと蛍光基、そしてＧｌｙのＣ末端にアミノ化ビオチンを導入したｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化基質の開発を目的とした。蛍光基は、検出感度が高い、広いダイナミックレンジで定量化が可能なこと、またイメージングへの応用も可能にする。また、ビオチンはアビジンと極めて高い親和性（Ｋａ＝１０１５Ｍ）を持つため、バックグラウンドの低減が可能となり検出感度が向上する。これらの標識を１つの基質に導入することで、固定化量に対する活性を追うことができ、酵素の比活性を算出でき、プロテインアレイを開発する際の問題点となる定量的な議論の発展が期待される。
今回の検討では、新規ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化基質であるＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの設計、合成を行った。導入を行ったモデルタンパク質として、Ｎ末端に遺伝子工学的にリジンタグを導入することによってＭＴＧの良基質となることが知られているアルカリフォスファターゼ（ＮＫ６−ＡＰ）を選択し、反応性の検討を行い、導入に伴うＡＰの活性を評価した。そして導入を試みたｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質をアビジンコートマイクロプレートへの固定化を試みた。本研究の概念図を以下に示す。
【化２０】
2010002042.tif 000022
２．実験
２．１．Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの合成
【化２１】
2010002042.tif 000023
Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧは、以下に示すＦｍｏｃ固相ペプチド合成法の手順に従って合成した。樹脂はアミノ酸Ｂａｒｌｏｓ  Ｒｅｓｉｎ樹脂を用いた。合成スケールは０．３ｍｍｏｌで行った。
ペプチド合成の手順
１）ＰＤ−１０カラムを組み立て、その中に０．３ｍｍｏｌ分のアミノ酸Ｂａｒｌｏｓ  Ｒｅｓｉｎを添加した。
２）ジクロロメタン（ＤＣＭ）５ｍｌで３回洗浄した。
３）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５ｍｌで３回洗浄した。
４）０．９ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−アミノ酸及び０．４５Ｍ  ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液２．１ｍｌ、０．９Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液２．１ｍｌを加え、Ｖｏｒｔｅｘを用いて、適当な時間で攪拌した。
５）ＤＭＦ５ｍｌで５回洗浄した。
この際、Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔによって未反応樹脂の確認を行った。陽性の場合、４）に戻りアミノ酸を再伸長させる。陰性の場合、先に進める。
６）ＤＣＭ５ｍｌで３回洗浄した。
７）ＤＭＦ５ｍｌで３回洗浄した。
８）２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＤＭＦ溶液５ｍｌを加え、１分間攪拌しＦｍｏｃの脱保護を行った。
９）２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＤＭＦ溶液５ｍｌを加え、１５分間攪拌しＦｍｏｃの脱保護を行った。
１０）ＤＭＦ５ｍｌで３回洗浄した。
１１）４）か１０）までを繰り返し、アミノ酸を伸長させた。
１２）伸長させた樹脂に、０．９ｍｍｏｌのＤａｎｓｙｌ−ＳＯ３Ｃｌ及び、０．４５Ｍ  ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液２．１ｍｌ、０．９Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液２．１ｍｌを加え、１ｈ反応させた。
１３）ＤＭＦ５ｍｌで７回、ＤＣＭ５ｍｌで５回、メタノール１ｍｌで５回洗浄した。
１４）洗浄後、一晩真空乾燥した。
１５）ＴＦＡ、ＴＩＳ、脱イオン水を９５：２．５：２．５で混合したカクテル１ｍｌを添加し、一時間攪拌し、樹脂からの切り出しを行った。
１６）切り出し溶液にジエチルエーテルを添加し析出させた後、遠心、デカントを４回繰り返し、一晩真空乾燥した。
１７）１０ｍＭ  Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ、１０ｍＭアミノ化ビオチン、１０ｍＭ  ＨＢＴＵ、１０ｍＭ  ＨＯＢｔ、２０ｍＭ  ＤＩＥＡをＤＭＦに溶かし込み反応させた。
１８）得られた粗ペプチドをＨＰＬＣで精製を行った。
１９）ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳによって生成物の確認を行った。
２−２．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの導入
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が１００μＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１Ｕ／ｍｌとなるようにＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加えた。比較としてＭＴＧを加えないものを用意した。それらをよく攪拌し、４℃で一晩静置させることで反応を行った。
２−３．Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎに対するＭＴＧの反応性の評価
反応後のサンプルに対して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色液で染める前に、トランスイルミネーターによって観察した。
２−４．修飾によるＮＫ６−ＡＰの酵素活性評価
ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）を基質として用い、実験１−２で調製したサンプルの活性測定を行った。ＡＰはｐ−ＮＰＰの脱リン酸化反応を触媒し、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）を形成する。活性測定は、ＡＰ２８ｎＭ、ｐ−ＮＰＰ  １ｍＭ、ｐＨ８．０の反応条件下、２７℃で行い、ｐ−ＮＰに由来する４１０ｎｍの吸収を追跡することによって活性測定を行った。
２−５．Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製によるｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質の精製及びラベル化率の算出
Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰のＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎからｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質を分離した。溶出に用いた過剰のイミダゾールは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を溶出バッファーとして用い、ＰＤ−１０カラムによるゲルろ過精製により除去した。
得られたｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質を吸引遠心エバポレーターにて濃縮し、ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質の２８０ｎｍと３３０ｎｍの吸光度測定することによって、ラベル化率の算出を試みた。
２−６．ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質のマイクロプレートへの固定化
１）Ｈｉｓ−ｔａｇ精製後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に溶解したｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質（１．５μＭ）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるようにアビジンコートマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）上に添加し、ビオチン−アビジン相互作用で固定化を行った（３７℃、１ｈ）。
２）Ｄａｎｓｙｌ基由来の蛍光を観察するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加し、蛍光イメージャーにより固定化の確認を行った。
３）ＡＰの蛍光基質であるＥＣＦ基質溶液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で１００倍に希釈したものをプレート上に１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加し、固定化されたＡＰと反応させた（２５℃、５ｍｉｎ）。
（２）、３）の操作の前に、マイクロプレートウォッシャーを用い、ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋５％  Ｔｗｅｅｎ２０）３００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄を行った。）
３．結果と考察
３−１．Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの合成
ＨＰＬＣを用いて精製した後のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを行った結果、８８６にするどいピークが観測された（図１７）。これは、Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎのナトリウム塩の分子量の計算値（Ｍｗ：８８６．３６）に一致する。
３−２．Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎに対するＭＴＧの反応性の評価
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる観察結果
図２０（左）にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。約４５ｋＤａにＮＫ６−ＡＰ、約３５ｋＤａにＭＴＧのバンドが見られた。（２）のＭＴＧを加えたＬａｎｅにおいては、若干高分子量側へシフトが見られ、ＮＫ６−ＡＰへのＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの導入が示唆された。
蛍光イメージャーによる観察結果
図１８にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルをトランスイルミネーターによって確認した結果を示した。（２）のＭＴＧを加えたＬａｎｅの約４５ｋＤａにＤａｎｓｙｌ基に由来する蛍光が見られ、（３）のＭＴＧを加えなかったＬａｎｅには蛍光は見られなかった。よって、Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＢｉｏｔｉｎがＮＫ６−ＡＰへ導入されたことを確認した。
３−３．ＭＴＧによるｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質の活性評価
ＭＴＧによるＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの導入によるタンパク質に与える影響について検討するために、導入前後におけるＮＫ６−ＡＰの活性評価を行った。結果を図１９に示した。結果より、ＭＴＧを加えたもの、加えなかったもののＡＰの活性にほとんど変化がなかった。よって、修飾による機能損失を伴わないＮＫ６−ＡＰへのＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの導入が可能なことが示唆された。
３−４．ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質のラベル化率の算出
Ｈｉｓ−ｔａｇ精製後、ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質を濃縮し、２８０ｎｍと３３０ｎｍの吸光度を測定することによって、ラベル化率を算出した。図２０にｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質の吸光度を測定した結果を示す。ＮＫ６−ＡＰの分子量を５００００Ｄａと仮定すると、本実験条件下でＮＫ６−ＡＰのモル吸光係数はε２８０＝２００００［Ｍ−１ｃｍ−１］、ε３３０＝５５０［Ｍ−１ｃｍ−１］。Ｄａｎｓｙｌ基のモル吸光係数はε２８０＝２４６０［Ｍ−１ｃｍ−１］、ε３３０＝４４５０［Ｍ−１ｃｍ−１］。これらの結果より、ラベル化率は１．１と計算され、Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＢｉｏｔｉｎはＮＫ６−ＡＰに定量的、高効率に導入された。
【数１】
2010002042.tif 000024
３−５．ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質のマイクロプレートへの固定化
Ｈｉｓ−ｔａｇ精製後のｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質をアビジンコートマイクロプレートへ固定化した。図２１（左）に、ラベルしたＤａｎｓｙｌ基由来の蛍光強度測定結果を示し、図２１（右）に、固定化したＮＫ６−ＡＰ由来の相対活性測定結果を示した。図２１（右）・（左）ともにＭＴＧを加えたｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質において有意な蛍光強度差が観察された。図２１（左）の蛍光強度差は、蛍光基部位を変えることで改善できる。また、図２１（右）から、酵素によるシグナル増幅により、大きくＳｉｇｎａｌ−ｔｏ−Ｎｏｉｓｅ（Ｓ／Ｎ）比を改善できることが分かる。このことから、ラベル化したＤａｎｓｙｌ基の蛍光が発光され、かつビオチンとアビジンの相互作用を介して、タンパク質の機能を保持したままマイクロプレート上に固定化されたといえる。
４．結言
Ｄｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの合成に成功した。また、ＭＴＧによるＤｎｓ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＢｉｏｔｉｎのＮＫ６−ＡＰへの導入が確認された。導入におけるＮＫ６−ＡＰの活性への影響は見られなかった。ｄｕａｌ  ｌａｂｅｌ化タンパク質のプレートの固定化に成功した。
［実施例６：ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの合成とその利用］
１．緒言
本実施例では、多機能性ペプチド“ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅ”の合成を行い、ＧｌｎのＮ末端側にリンカーと蛍光基としてＦＩＴＣ、そしてＧｌｙのＣ末端にＰＥＧを介し、アルキンを導入した異種分子の連結を目的とした多機能性ペプチド“ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅ”（下記）を合成した。
【化２３】
2010002042.tif 000025
本実施例では、ＭＴＧによるＫ−ｔａｇタンパク質へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入条件の最適化を行った後に、合成したＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＡｌｋｙｎｅがＭＴＧによって認識されるか評価した。また、モデルタンパク質として、ＮＫ６−ＡＰとＢＳＡを用いて、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅを導入したＮＫ６−ＡＰとアジドを誘導化したＢＳＡとをクリック反応による連結を試みた。本研究の概念図を下に示す。
【化２４】
2010002042.tif 000026
２．実験
２−１．ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの合成
ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅは、以下に示すＦｍｏｃ固相ペプチド合成法の手順に従って合成した。樹脂はＵｎｉｖｅｒｓａｌ−ＰＥＧ  ＮｏｖａＴａｇＴＲＲｅｓｉｎを用いた（下記）。合成スケールは０．０８３ｍｍｏｌで行った。
２５  ペプチド合成の手順
１）ＰＤ−１０カラムを組み立て、その中に０．０８３ｍｍｏｌ分のＵｎｉｖｅｒｓａｌ−ＰＥＧ  ＮｏｖａＴａｇＴＲＲｅｓｉｎを添加した。
２）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌで３０分間樹脂を膨潤させた。
３）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌで３回洗浄した。
４）１Ｍ  ＨＯＢｔ（ジクロロメタン（ＤＣＭ）／ＴＦＥ＝１：１）１時間攪拌し、Ｓ−Ｍｍｔ基の脱保護を行った。
５）ＤＣＭ３ｍｌで３回洗浄した。
６）ＤＭＦ３ｍｌで３回洗浄した。
７）０．３ｍｍｏｌ  ４−Ｐｅｎｔｙｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、０．３ｍｍｏｌ  ＨＢＴＵ、０．６ｍｍｏｌ  ＨＯＢｔを加え、１時間反応させた。
８）２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＤＭＦ溶液５ｍｌを加え、１分間攪拌しＦｍｏｃの脱保護を行った。
９）２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＰＰＤ）／ＤＭＦ溶液５ｍｌを加え、１５分間攪拌しＦｍｏｃの脱保護を行った。
１０）ＤＭＦ３ｍｌで５回洗浄した。
以降Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、β−Ａｌａ、ＦＩＴＣの順に伸長させ、切り出したのちに、ＨＰＬＣで精製した。生成物の評価はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳによって確認した。
２−２．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるｐＨ条件の最適化
５０ｍＭ緩衝液のｐＨを５〜９まで変化させ、最終濃度が０．１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。サンプルに対して、１５分、６時間反応させたものをサンプルバッファーに加えて、９５℃で１５分間熱を加えることによって、反応を停止させた。その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色、及び蛍光イメージャーによって観察した。
２−３．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるＭＴＧ濃度の最適化
５０ｍＭ  Ｔｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が０．１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，０．００１〜１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。実験２−２と同様の手順で反応を停止させ、評価した。
２−４．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの導入
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が０．１ｍＭ，０．５ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅ、ＮＫ６−ＡＰ、ＭＴＧを加えた。比較としてＭＴＧを加えないものを用意した。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。実験２−２と同様の手順で反応を停止させ、評価した。
２−５．修飾がＮＫ６−ＡＰの酵素活性に与える影響の評価
ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）を基質として用い、実験２−４で調製したサンプルの活性測定を行った。ＡＰはｐ−ＮＰＰの脱リン酸化反応を触媒し、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）を形成する（下記）。活性測定は、ＡＰ２８ｎＭ、ｐ−ＮＰＰ  １ｍＭ、ｐＨ８．０の反応条件下、２７℃で行い、ｐ−ＮＰに由来する４１０ｎｍの吸収を追跡することによって活性測定を行った。
【化２５】
2010002042.tif 000027
２−６．Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製によるアルキン化タンパク質の精製及びラベル化率の算出
Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰の未反応ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅからアルキン化ＡＰを分離した。溶出に用いた過剰のイミダゾールは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を溶出バッファーとして用い、ＰＤ−１０カラムによるゲルろ過精製により除去した。
得られたアルキン化ＡＰを限外ろ過にて濃縮し、ＮＫ６−ＡＰに由来する２８０ｎｍとＦＩＴＣに由来する５００ｎｍの吸光度測定することによって、ラベル化率の算出を行った。
２−７．化学修飾法によるＢＳＡへのＮＨＳ化アジドの導入
２００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ８．３）中に、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ，１ｍＭとなるようにＢＳＡ、ＮＨＳ化アジドを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で１２時間静置させることで反応を行った。
２−８．クリック反応によるタンパク質間の連結
実験２−６，２−７で調製したアルキン化ＡＰとアジド化ＢＳＡのクリック反応での連結を試みた。反応条件の組成を下表に示す。比較として、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅを導入していないＡＰとＣｕＳＯ４を加えないものを用意した。それらをよく攪拌し、４℃で１２時間、静置させることで反応を行った。
【表２】
2010002042.tif 000028
３．結果と考察
３−１．ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの合成
図２２にＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの構造、及びＨＰＬＣを用いて精製した後のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを行った結果を示す。結果より、［Ｍ＋Ｈ］：９４６．３２、［Ｍ＋Ｎａ］：９６９．３４にするどいピークが観測された。これは、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの分子量（Ｅｘａｃｔ  Ｍｓ：９４５．３６）に一致した。
３−２．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるｐＨ条件の最適化
図２３にｐＨ条件を最適化するために、反応時間１５分と６時間後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルの蛍光強度解析を行った結果を示す。１５分後のサンプルにおいては、ｐＨ６とｐＨ８が迅速に導入された。この原因として、ＭＴＧによってＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧがＮＫ６−ＡＰに導入されることに、二つの要因が含まれるためであると考えられる。一つ目の要因として、低ｐＨ側におけるＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧのフルオレセインのプロトン化（ＦＩＴＣ：ｐＫａ６．４）による、疎水性の増大が考えられる。ＭＴＧの基質特異性としてＧｌｎ残基のＮ末端側は嵩高く疎水的な環境が好まれることが知られており（前掲非特許文献４参照）、Ｋｍ値の低下が導入効率の向上につながったと考えられる。二つ目の要因として、ｐＨ８付近におけるＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧのフルオレセインの脱プロトン化による、アニオン性の増大が考えられる。ＭＴＧの基質特異性として、Ｌｙｓ残基（ｏｒ一級アミン）はＭＴＧの負電荷を帯びたクレフトへ入っていき、アシル中間体へ求核攻撃するため、基質は正電荷を帯びたアミノ酸残基の存在により、反応性が向上することが知られている（Ｓ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｋ．−Ｉ．Ｎｉｓｈｉｈａｍａ，Ｋ．Ｉｇｉ，Ｋ．Ｉｔｏ，Ｈ．Ｔａｉｒａ，Ｍ．Ｍｏｔｏｋｉ，Ｈ．Ｍｏｍｏｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，１２８，４１５−４２５）。この場合、フルオレセインの脱プロトン化によってアニオン性が増大し、Ｋ−ｔａｇの正電荷を帯びたアミノ酸と相互作用し、反応性が向上したことも示唆される。ｐＨ９では、Ｋ−ｔａｇのカチオン性が弱まったこと、またＭＴＧのｐＩは８．９であり（ＡＰのｐＩは４．５）、静電的な近接効果が弱まったためと考えられる。６時間後のサンプルにおいては、ｐＨ５〜８で同程度の蛍光強度が観測され、ほぼ反応が飽和していると考えられる。
３−３．ＭＴＧによるＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるＭＴＧ濃度の最適化
図２４にＭＴＧ濃度を最適化するために、反応時間１５分と６時間後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルの蛍光強度解析を行った結果を示す。ＭＴＧは水分子もアシルアクセプターとして働き、Ｇｌｎの加水分解により脱アミド化されＧｌｎとなる競合反応が起こる。そのため、ＭＴＧ濃度が高すぎると、副反応が起こりやすくなる恐れがあり、適切なＭＴＧ濃度を決定する必要がある。結果より、０．１Ｕで十分迅速に反応が進行することがわかった。１Ｕにおいて、導入率の低下は見られなかった。これは、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ及びＫ−ｔａｇの反応性が高いため、水分子より優先的に反応が進行したためだと考えられる。
３−４．ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅに対するＭＴＧの反応性の評価
図２５に、１５分、１時間、６時間後の反応後のサンプルに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果を示す。ＭＴＧを加えなかったＬａｎｅのＡＰのバンドにはＦＩＴＣに由来する蛍光は見られなかったのに対し、ＭＴＧを加えたＬａｎｅのＡＰのバンドには蛍光が見られた。よって、ＭＴＧによってＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＡｌｋｙｎｅがＮＫ６−ＡＰへ導入されたことを確認した。反応時間もＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧと変わらず、迅速に導入できることを確認した。
３−５．ＭＴＧによるアルキン化タンパク質の活性評価
ＭＴＧによるＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの導入によるタンパク質に与える影響について検討するために、導入前後におけるＮＫ６−ＡＰの活性評価を行った。図２６より、ＭＴＧ処理を加えたものでＡＰの活性にほとんど変化がなかったため、機能損失を伴わないＮＫ６−ＡＰへのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの導入が可能なことが示された。
３−６．クリック反応によるタンパク質間の連結
図２７にアルキン化ＡＰとアジド化ＢＳＡのクリック反応での連結を試みたサンプルに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果を示す。ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅを導入していないＡＰを用いたもの、ＣｕＳＯ４を加えていないものは、タンパク質の連結反応は見られなかったのに対し、ＭＴＧによってＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅを導入したＡＰを用い、ＣｕＳＯ４を加えたものにおいてのみ、タンパク質の連結による高分子量化が見られた。これは、ＭＴＧによって導入したアルキンとアジド化タンパク質とがクリック反応によって連結されたことが示された。
４．結言
ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅの合成に成功した。ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ＡｌｋｙｎｅがＡＰの活性にほとんど影響を与えることなく導入されたことを確認した。ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ａｌｋｙｎｅによりラベル化されたタンパク質は、アジド化されたタンパク質と、クリック反応により連結可能なことを確認した。
［実施例７：抗体ラベル化条件の最適化、抗体のビオチン標識によるアビジン被覆樹脂への固定化］
１．緒言
本実施例では、ＧｌｎのＮ末端側に蛍光物質であるＦＩＴＣ、そしてＧｌｙのＣ末端にビオチンを導入したマルチラベル化基質ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎ（下記）について、抗体への導入条件の最適化を行い、ラベル化率の向上を目指した。最後に、抗体アレイ化技術を目的とした、ビオチンによるアビジン被覆樹脂への固定化を行った。
【化２６】
2010002042.tif 000029
本研究の概念図を下記に示す。
【化２７】
2010002042.tif 000030
２．実験
２−１．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるｐＨ条件の最適化
５０ｍＭ緩衝液のｐＨを５〜９（ｐＨ５  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６〜７  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ８  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９  ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ）まで変化させ、最終濃度が１ｍＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ａｎｔｉ−ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ＩｇＧ抗体（ｍｏｕｓｅ由来、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。１時間、６時間反応させたものをサンプルバッファーに加えて、１５分間９５℃で加熱することによって、反応を停止させた。その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色、及び蛍光イメージャーによって解析した。
２−２．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるＭＴＧ濃度の最適化
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が１ｍＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．００１〜１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。実験２−１と同様の手順で反応を停止させ、評価した。
２−３．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入における基質濃度の最適化
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が０．００１〜１ｍＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。実験２−１と同様の手順で反応を停止させ、評価した。
２−３．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入における基質濃度の最適化
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に、最終濃度が０．００１〜１ｍＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で静置させることで反応を行った。実験２−１と同様の手順で反応を停止させ、評価した。
２−４．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入における反応温度の最適化
ＰＢＳ中に、最終濃度が１ｍＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ａｎｔｉ−ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体（ｍｏｕｓｅ由来、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃及び４０℃で静置させることで反応を行った。実験２−１と同様の手順で、３時間、６時間、１８時間反応させたものを停止させ、評価した。
２−５．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎの導入
ＰＢＳ中に、最終濃度が１ｍＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ａｎｔｉ−ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体（ｍｏｕｓｅ由来、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、ＭＴＧを加えた。それらをよく攪拌し、４℃で１８時間静置させることで反応を行った。比較としてＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎを加えないもの、ビオチンを導入していない蛍光基質（ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ）を反応させたものを用意した。反応後のサンプルを限外ろ過（ＭＩＬＬＩ  ＰＯＲＥ社製；１００ｋＤａ  ｃｕｔ）によって精製を行った。
２−６．アビジン被覆樹脂へのマルチラベル化ａｎｔｉ−ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体の固定化
以下に示す手順で、アビジン被覆樹脂へのマルチラベル化抗体の固定化を行った（Ｆｉｇｕｒｅ４）。
１）アビジン被覆樹脂（ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｌｕｓ；ＰＩＥＲＣＥ社製）（１００μｌ）をＰＢＳ（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｍｌ）で２回洗浄した。
２）各サンプル（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を樹脂へ１００μｌ添加し、３０分間攪拌させた。
３）上澄みを回収するために、遠心分離によって樹脂を沈降させ、回収した。
４）ＰＢＳ（１ｍｌ）によって２回洗浄した。
５）樹脂へ２×サンプルバッファー（２０μｌ）を添加し、９０度まで加熱することにより、樹脂からマルチラベル化抗体を溶出させた。
６）樹脂添加前のサンプル、３）で回収した上澄み、４）で溶出させたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【化２８】
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アビジン被覆樹脂へのマルチラベル化ａｎｔｉ−ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体の固定化操作
３．結果と考察
３−１．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるｐＨ条件の最適化（ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体）
図２８にｐＨ条件を最適化するために、反応時間１、６時間後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルの蛍光強度解析を行った結果を示す。これまでの検討で、抗体のＨ鎖特異的に反応が進行することがわかっており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、抗体Ｈ鎖のバンドを示している。結果より、ｐＨ７付近において高効率に導入されることを確認した。この抗体とＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの反応は、ハイドロキサーメート法により求めたＭＴＧの至適ｐＨ（Ｈ．Ａｎｄｏ，Ｍ．Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．Ｕｍｅｄａ，Ａ．Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｍ．Ｎｏｎａｋａ，Ｒ．Ｕｃｈｉｏ，Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｍｏｔｏｋｉ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３，２６１３−２６１７）と一致していた。
３−２．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入におけるＭＴＧ濃度の最適化（ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体）
図２９にＭＴＧ濃度を最適化するために、反応時間１、６時間後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルの蛍光強度解析を行った結果を示す。ＭＴＧは水分子もアシルアクセプターとして働き、Ｇｌｎの加水分解により脱アミド化されＧｌｎとなる競合反応が起こる。そのため、ＭＴＧ濃度が高すぎると、副反応が起こりやすくなる恐れがあり、適切なＭＴＧ濃度を決定する必要がある。結果より、１Ｕで高効率に反応が進行することがわかった。抗体中のＬｙｓの反応性が低いため、十分量のＭＴＧ濃度がないと、高効率にラベル化が進行しないと考えられる。
３−３．ＭＴＧによる抗体へのＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの導入における基質濃度の最適化（ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体）
図３０に基質濃度を最適化するために、反応時間１、６時間後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルの蛍光強度解析を行った結果を示す。この検討も、ＭＴＧ濃度の最適化同様、濃度増加に伴って、ラベル化が進行することがわかった。
３−４．新規蛍光基質による抗体ラベル化の比較（ａｎｔｉ−ＰＳＡ  ＩｇＧ抗体）
３−１〜３の検討で、系中の最適化を行った。最後に異なる基質間の反応性の比較検討を行った。図３１に、反応時間０，１，６，１２，２４時間後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルの蛍光強度解析を行った結果を示す。この結果から、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧへのビオチンの導入は、抗体ラベルへの反応性を損なうことはないことが明らかとなった（図３１（Ａ））。さらに、反応時間２４時間における蛍光強度基準での経時変化を追跡したところ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−ｂｉｏｔｉｎの方が、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧよりもより早く反応することが明らかとなった（図３１（Ｂ））。以上のことから、新規蛍光基質のＣ末端に新たな機能性を導入することは、ＭＴＧラベルの障害にはならないことが明らかとなった
３−５．アビジン被覆樹脂へのマルチラベル化抗体の固定化（ａｎｔｉ−ＢＳＡ  ＩｇＧ抗体）
前回までの検討では、マルチラベル化抗体のアビジンとの結合、すなわちマルチラベル化抗体へのビオチン基の導入は確認できていなかった。今回、ラベル化条件の最適化を行い、アビジン被覆樹脂へのマルチラベル化抗体の固定化を試みた。結果を図３２に示す。樹脂添加前の結果（Ｌａｎｅ１〜３）より、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ−Ｂｉｏｔｉｎともに抗体へ導入されていることが確認された。続いて、アビジン被覆樹脂を添加し、反応後、遠心で樹脂を沈降させ、その上澄みを解析した結果（Ｌａｎｅ４〜６）を示す。Ｌａｎｅ５の結果より、ＦＩＴＣ由来の蛍光が観察され、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧラベル化抗体は、アビジン被覆樹脂へ結合されず、上澄みとして回収され、Ｌａｎｅ６の結果より、蛍光は確認されず、マルチラベル化抗体は、アビジン被覆樹脂へ結合したことが示唆された。最後に、アビジン被覆樹脂をサンプルバッファーに分散させ、加熱することによって、アビジンからマルチラベル化抗体を遊離させたものを解析した結果を（Ｌａｎｅ７〜９）を示す。Ｌａｎｅ９において、強いＦＩＴＣ由来の蛍光が観察され、アビジン被覆樹脂からマルチラベル化抗体が遊離したためだと考えられる。よって、抗体へ蛍光物質であるＦＩＴＣ及びリガンドであるビオチン基が導入されていることを確認した。
４．結言
ＭＴＧによるＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧの抗体への導入条件の最適化を行った。マルチラベル化抗体のアビジン樹脂への固定化に成功した。
［配列表］
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【図７】
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【図８】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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