(57)【要約】  医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンを製造することができるＬ−アミノアシラーゼを提供する。  下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質：（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
2009136500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、およびＮ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸がＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱菌由来の新規なＬ−サクシニルアミノアシラーゼに関し、特に、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用できる新規なＬ−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこの酵素を用いたＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品、農薬および食品などの多くの産業分野でＬ−アミノ酸は有用である。例えば産業上有用なＬ−アミノ酸としては、動物飼料用の添加物、健康食品の成分およびアミノ酸輸液等として使用されるＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−プロリン、肝機能促進薬、アミノ酸輸液および総合アミノ酸製剤等の成分として使用されるＬ−アルギニンおよびＬ−オルニチン、肝機能促進薬およびヒスタミンの前駆体として使用されるＬ−ヒスチジン、甘味料の前駆体として使用されるＬ−フェニルアラニン、様々な医薬品の中間体として使用されるＬ−ターシャリーロイシンが知られている。従って、これらの有用なＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸から分離された状態で効率的に得ることが求められている。【０００３】
Ｌ−アミノ酸の製造方法としては、Ｎ−アシルアミノ酸のラセミ体を合成し、Ｌ−アミノアシラーゼという酵素を用いてラセミ体中のＬ体のみを加水分解し、Ｌ−アミノ酸のみを特異的に生成させる方法が従来から使用されている。この方法で使用するＬ−アミノアシラーゼとしては、例えば、ペニシリウム・フニコロサム由来のＬ−アミノアシラーゼ（特許文献１）やストレプトミセス・モバラエンシス由来のＬ−アミノアシラーゼ（特許文献２）が知られている。【０００４】
しかし、これらのＬ−アミノアシラーゼは、加水分解能に優れるものの、基質特異性は未だ満足のゆくものではなく、Ｎ−アシル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として認識できなかった。従って、従来のＬ−アミノアシラーゼを用いた方法では、Ｎ−アシル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを光学分割することができず、医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンを製造することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−３２８９７２号公報
【特許文献２】特開２００６−６７８７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンを製造することができる新規なＬ−アミノアシラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するために、様々な生物由来のＬ−アミノアシラーゼの基質特異性について鋭意検討した結果、好熱菌の一種であるゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＡ１５０３株から採取されたＬ−サクシニルアミノアシラーゼがＮ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用できることを見出し、その塩基配列を決定し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。【０００９】
また、本発明によれば、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。【００１０】
さらに、本発明によれば、上記遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記タンパク質の製造方法が提供される。【００１１】
さらに、本発明によれば、上記タンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、従来公知のＬ−アミノアシラーゼとは異なり、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用できるので、医薬品の中間体として有用なＬ−ターシャリーロイシンを効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例２において、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼによるＬ−ターシャリーロイシンの生成をＴＬＣにより確認した結果を示す。
【図２】図２は、比較例において、市販のＬ−アミノアシラーゼによるＬ−ターシャリーロイシンの生成をＴＬＣにより確認した結果を示す。
【図３】図３は、実施例３において、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより生成したＬ−アミノ酸のＴＬＣによる検出結果を示す。
【図４】図４は、実施例３において、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより生成したＬ−アミノ酸のＴＬＣによる検出結果を示す。
【図５】図５は、実施例４において、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより生成したＬ−ターシャリーロイシンの収率のＨＰＬＣによる測定結果を示す。反応開始からの経過時間（ｈｒ）を横軸に、Ｌ−ターシャリーロイシンへの変換率（％）を縦軸に示す。
【図６】図６は、実施例６において、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより生成したＬ−ターシャリーロイシンの収率のＨＰＬＣによる測定結果を示す。反応開始からの経過時間（ｈｒ）を横軸に、Ｌ−ターシャリーロイシンへの変換率（％）を縦軸に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号１は、好熱菌の一種であるゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＡ１５０３株のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの塩基配列であり、配列番号２は、そのアミノ酸配列である。
【００１５】
上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＤ体とＬ体のうちＬ体であるＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸のみを特異的に加水分解してＬ−アミノ酸を特異的に生成させることができるという特徴を有する。生体内に、Ｎ−アセチルアミノ酸とＮ−サクシニルアミノ酸は一般的に存在すると考えられるが、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−アセチルアミノ酸よりもＮ−サクシニルアミノ酸に対して１００倍以上高い活性を有する。これらのことから、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解してＬ−アミノ酸とコハク酸を生成する反応を触媒する酵素、つまりＬ−サクシニルアミノアシラーゼであると言える。
【００１６】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの最大の特徴は、基質のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸としてＮ−サクシニル−Ｌ−非天然アミノ酸の一種であるＮ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを利用することができることにある。従来公知のＬ−アミノアシラーゼは、Ｎ−アシル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用することができなかったため、Ｌ−ターシャリーロイシンを製造することができなかった。本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼはこのような欠点を有さず、医薬品の中間体として需用の高いＬ−ターシャリーロイシンを高収率で製造することができる。なお、本明細書において、「収率」の語は、「変換率」の語と同様の意味で使用する場合がある。
【００１７】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの理化学的性質は、以下の（ｉ）〜（ｖ）に示す通りである。
（ｉ）分子量：４３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
（ｉｉ）基質特異性：Ｎ−サクシニルターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニルシクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−４−ブロモフェニルアラニンに作用する；
（ｉｉｉ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では安定であり７５℃以上では失活する；
（ｉｖ）至適温度：ｐＨ７〜８で反応させる場合、温度５５〜６０℃において作用が至適である；および
（ｖ）至適ｐＨ：６０℃で３０分間反応させる場合、ｐＨ７において作用が至適である。
【００１８】
また、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、２価または１価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を有する。ここで使用する２価または１価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｎｉ２＋，Ｋ＋などが挙げられ、なかでもＣｏ２＋が特に好ましい。Ｃｏ２＋を使用すると、Ｚｎ２＋を使用したときより活性が２倍以上増加することが判明している。
【００１９】
本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質に対応する遺伝子である。
【００２０】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、上記（ａ）および（ｂ）のものに限定されず、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質も含む。また、本発明の遺伝子は、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含む。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。
【００２１】
上記（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。
【００２２】
ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行なった後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行なう。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２％×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えばプローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子がＬ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この酵素タンパク質を精製してＮ−サクシニル−ＤＬアミノ酸に添加してＬ−アミノ酸の生成をクロマトグラフィーなどで測定することによって確認することができる。
【００２３】
また、上記（ｄ）のタンパク質の遺伝子である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えばＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡製）などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号１に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子がＬ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子の場合と同様の方法で確認することができる。
【００２４】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
【００２５】
ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
【００２６】
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。
【００２７】
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
【００２８】
形質転換体中に蓄積した本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
次に、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いてＬ−アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によるＬ−アミノ酸は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸（Ｌ体）を特異的に加水分解する工程によって製造される。
【００３０】
この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと原料のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件で反応させることによって行うことができる。
【００３１】
使用する溶液は、蒸留水で十分であるが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は２０〜２００ｍＭであることが好ましく、ｐＨは６．５〜８であることが好ましい。
【００３２】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、反応液中５〜５００ｍｇ／Ｌ（１００〜１００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。また、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、上述の通り、２価または１価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つため、反応液中に２価または１価の金属イオンを添加することが必要である。添加する２価または１価の金属イオンの例としては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｎｉ２＋およびＫ＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。
【００３３】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼと反応させるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えばＳａｋａｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２に記載の方法によって合成することができる。原料のＤＬ−アミノ酸の種類は、製造したいＬ−アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する２０種のアミノ酸およびその誘導体、並びにターシャリーロイシン、シクロヘキシルグリシン、４−ブロモフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。
反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％〜３０重量％である。
【００３４】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法では、反応液を反応させる温度は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２０〜７０℃が好ましく、３０〜６０℃がより好ましく、５５〜６０℃がさらに好ましい。また、反応時のｐＨは、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に１日〜７日程度である。反応時間は、製造したいＬ−アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応ｐＨなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。
【００３５】
好ましくは、本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＬ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸のみを特異的に加水分解するため、このままではラセミ体の残り半分のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸は無駄になってしまう。そこで、Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させてやれば、残ったＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸も結果的にすべてＬ−アミノ酸に変換することができる。
【００３６】
Ｎ−サクシニルラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しく（ラセミ化）する酵素である。本発明の製造方法で使用するＮ−サクシニルラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開２００７−８２５３４号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼや特開２００８−６１６４２号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。
【００３７】
Ｎ−サクシニルラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−サクシニルラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するＮ−サクシニルラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５〜７０℃が好ましく、３７〜７０℃がより好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ−サクシニルラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６．５〜８がより好ましい。Ｎ−サクシニルラセマーゼは、反応液中５〜５００ｍｇ／Ｌ（５００〜５００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。Ｎ−サクシニルラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つ。添加する２価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｆｅ２＋およびＮｉ２＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。Ｃｏ２＋は終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。Ｎ−サクシニルラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。
【００３８】
前述のＮ−サクシニルラセマーゼによるラセミ化反応とＬ−サクシニルアミノアシラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸のうちＬ体のみが本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより脱アシル化（加水分解）され、目的のＬ−アミノ酸が生成する。基質のＬ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ−サクシニルラセマーゼはＤ体をＬ体に変換する反応をより促進する。Ｎ−サクシニルラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより順次Ｌ−アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、Ｎ−サクシニルラセマーゼおよび本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度０．０１ｍＭ〜５００ｍＭ、ｐＨ６〜８、温度３０〜６０℃で行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、所望する量のＬ−アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に１日〜７日程度である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されない。【００４０】
Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸の合成
（１）Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンの合成
Ｌ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）１０ｇを水５０ｍＬと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇに溶解し、無水コハク酸８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。濃縮物にヘキサンを加えて結晶化し、乾燥して、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンの白色粉末を１４ｇ得た。
（２）Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリンの合成
Ｌ−バリン（ナカライテスク製）１０ｇを水５０ｍＬと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇに溶解し、無水コハク酸（ナカライテスク製）８．８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸（ナカライテスク製）で中和後、酢酸エチル（ナカライテスク製）で抽出し、濃縮した。濃縮物にヘキサンを加えて結晶化し、乾燥して、Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリンの白色粉末を１５ｇ得た。
（３）Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−セリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンの合成
これらのＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、（２）のＮ−サクシニル−Ｌ−バリンの合成方法に準じた方法で合成した。【００４１】
Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を含む反応試薬の調製
（１）Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを含む反応試薬の調製
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９
１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液
１５０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン
上記１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（２．０ｍＬ）、１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液（０．１ｍＬ）、１５０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン（１．０ｍＬ）および水（６．４ｍＬ）を混合して反応試薬とした。
（２）Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−セリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、またはＮ−サクシニル−Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンを含む反応試薬の調製
これらのＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を含む反応試薬は、（１）のＮ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを含む反応試薬の調製と同様の方法で調製した。【００４２】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの合成
Ｄ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）とＬ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍＬと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇに溶解し、無水コハク酸８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇを加え、２０℃〜４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。濃縮物にヘキサンを加えて結晶化し、乾燥して、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンの白色粉末を１４ｇ得た。【００４３】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンを含む反応試薬の調製
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９
１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液
１５０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン
上記１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（２．０ｍＬ）、１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液（０．１ｍＬ）、１５０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン（１．０ｍＬ）および水（６．４ｍＬ）を混合して反応試薬とした。【００４４】
Ｎ−サクシニルラセマーゼの調製
（１）特開２００８−６１６４２号公報に記載のＮ−サクシニルラセマーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍＬ仕込み／３０ｍＬ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。得られた培養物１ｍＬを採取して、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。上記の操作により、得られた培養物１ｍＬより得られた菌体から、約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＮ−サクシニルラセマーゼ遺伝子（配列番号３）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号４に示される５’プライマーおよび配列番号５に示される３’プライマーを用いた。これらのＰＣＲプライマーおよびＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキットＴａｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＢＳＮＡＲ１を取得した。このｐＢＳＮＡＲ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍＬ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍＬと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）の培養液を５ｍＬ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。【００４５】
実施例１  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍＬ仕込み／３０ｍＬ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。得られた培養物１ｍＬを採取して、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。上記の操作により、得られた培養物１ｍＬより得られた菌体から、約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＬ−サクシニルアミノアシラーゼ遺伝子（配列番号１）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号６に示される５’プライマーおよび配列番号７に示される３’プライマーを用いた。これらのＰＣＲプライマー、およびＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキット（Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ（登録商標）−Ｐｌｕｓ−、東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られたベクターをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＬＳＡ１を取得した。このｐＬＳＡ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ１）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍＬ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍＬと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ１）の培養液を５ｍＬ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。さらにＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単一であることが確認された。【００４６】
実施例２  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼのＬ−ターシャリーロイシン合成能の確認
上述のＮ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを含む反応試薬（９．５ｍＬ）に、実施例１で調製したＬ−サクシニルアミノアシラーゼ（２．３ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ）を添加し、緩やかに混和後、５７℃で６時間反応を行なった。盲検はＬ−サクシニルアミノアシラーゼ溶液の代わりに５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液  ｐＨ７．５を試薬混合液に加えて同様に反応させた。酵素反応後、溶液のサンプルをＴＬＣ上に、スポットし、展開溶媒（ブタノール：酢酸：水＝３：１：１）で展開し、ＴＬＣで、ニンヒドリン反応により、生成物であるアミノ酸を呈色させ、生成物を検出することによりＬ−アミノ酸を直接定量した。【００４７】
結果を図１に示す。図中、１のレーンは、実施例１で調製したＬ−サクシニルアミノアシラーゼを使用した時の生成物を、２のレーンはＬ−ターシャリーロイシンの標品（東京化成工業製）を示す。図１より明らかなように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、標品と同じＬ−ターシャリーロイシンを生成することができた。【００４８】
比較例  市販のＬ−アミノアシラーゼのＬ−ターシャリーロイシン合成能の確認
（１）Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸の合成
Ｌ−ターシャリーロイシン（東京化成工業製）４．７ｇを氷酢酸（ナカライテスク製、４０ｍＬ）に懸濁させ、これに３倍モルの無水酢酸（ナカライテスク製）を添加しながら４０〜５０℃に熱し、反応させた。減圧下で氷酢酸を留去後、粗結晶を得た。次に、粗結晶を２０％イソプロピルアルコールで再結晶化した。沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、Ｎ―アセチル−Ｌ−ターシャリーロイシンの粉末を得た。詳細は（Ｊ．Ｐ．Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，１９６１，３）に記載されている。【００４９】
（２）Ｌ−アミノアシラーゼ溶液の調製
Ａｃｙｌａｓｅ  ＡＭＡＮＯ（シグマ社、コードＮｏ．０１８１８−５Ｇ）及びｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ＡｃｙｌａｓｅＩ（シグマ社、コードＮｏ．Ａ３０１０−１００ＭＧ）をそれぞれ２６００Ｕ／ｍＬとなるように５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液  ｐＨ７．５で溶解してＬ−アミノアシラーゼ溶液とした。【００５０】
（３）Ｎ−アセチル−Ｌ−ターシャリーロイシンを含む反応試薬の調製
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９
１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液
１５０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−ターシャリーロイシン
上記１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（２．０ｍＬ）、１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２溶液（０．１ｍＬ）、１５０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−ターシャリーロイシン（１．０ｍＬ）および水（６．４ｍＬ）を混合して反応試薬とした。【００５１】
（４）測定
上述のＮ−アセチル−Ｌ−ターシャリーロイシンを含む反応試薬（９．５ｍＬ）に、上述の市販のＬ−アミノアシラーゼ溶液（比較例２）（０．５ｍＬ）を添加し、緩やかに混和後、２５℃で１２時間反応を行なった。盲検はＬ−アミノアシラーゼ溶液の代わりに５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液  ｐＨ７．５を試薬混合液に加えて同様に反応させた。酵素反応後、実施例２と同様にしてＴＬＣおよびニンヒドリン反応によりＬ−アミノ酸を直接定量した。【００５２】
ＴＬＣの結果は図２に示す通りである。図中、１のレーンは、Ａｃｙｌａｓｅ  ＡＭＡＮＯ（市販品）を使用した時の結果を、２のレーンはｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ＡｃｙｌａｓｅＩ（市販品）を使用した時の結果を示す。３のレーンはＬ−ターシャリーロイシンの標品（東京化成工業製）を示す。図２より明らかなように、従来の市販のＬ−アミノアシラーゼは、Ｌ−ターシャリーロイシンを合成できない。【００５３】
図１および図２から、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、従来のＬ−アミノアシラーゼではまったく合成できないＬ−非天然アミノ酸であるＬ−ターシャリーロイシンを合成することができることが明らかである。【００５４】
実施例３  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ−サクシニル−Ｌ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−セリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンからの対応する各Ｌ−アミノ酸の合成
Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸として、Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−セリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、またはＮ−サクシニル−Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンを用い、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンに準じた方法で反応試薬を調製した。この反応試薬を用い、実施例２と同様の条件で実施例１のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを反応させ、Ｌ−アミノ酸を生成させ、実施例２と同様にしてＬ−アミノ酸を直接定量した。【００５５】
結果を、図３および図４に示す。図３中、１のレーンは、生成したＬ−バリンの検出結果を、２のレーンは生成したＬ−フェニルアラニンの検出結果を、３のレーンは生成したＬ−トリプトファンの検出結果を、４のレーンは生成したＬ−アスパラギンの検出結果を、５のレーンは生成したＬ−アスパラギン酸の検出結果を、６のレーンは生成したＬ−セリンの検出結果を、７のレーンは生成したＬ−グルタミン酸の検出結果を示す。また、図４中、１のレーンは、生成したＬ−４−ブロモフェニルアラニンの検出結果を、２のレーンは、生成したＬ−シクロヘキシルグリシンの検出結果を示す。【００５６】
図３および図４から、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼはＮ−サクシニル−Ｌ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−セリン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンのいずれをも基質として、これらから対応するＬ−アミノ酸を合成できることが明らかである。【００５７】
実施例４  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成
１重量％  Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）１０ｍＬ（１ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む）に、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ溶液１ｍＬ（２．３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、撹拌しながら５７℃で９０時間反応を行なうことにより、Ｌ−ターシャリーロイシンを得た。反応開始の１６時間後、４２時間後、６５時間後、および９０時間後にサンプルを採取して以下の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（粒径５μｍ、内４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）ＧＬサイエンス（株）製
溶離液：ｐＨ２．３リン酸水溶液／ＨＰＬＣ用アセトニトリル＝８０：２０
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ  カラム温度：４０℃  検出器：２１０ｍｎ【００５８】
ＨＰＬＣ測定の結果を図５に示す。図５からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンのほぼすべて（収率約９０％以上）をＬ−ターシャリーロイシンに変換できた。【００５９】
実施例５  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成
１重量％  Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）１０ｍＬ（１ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む）に、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ溶液１ｍＬ（２．３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、撹拌しながら５７℃で９０時間反応を行なうことにより、Ｌ−ターシャリーロイシンを得た。反応終了後、サンプルを採取し、実施例４と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。その結果、収率は４５％以上であり、理論上の最高収率である５０％に近い値が得られた。【００６０】
実施例６  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼおよびＮ−サクシニルラセマーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成
１重量％  Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）１０ｍＬ（１ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む）に、実施例１で調製したＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液１ｍＬ（２．３ｍｇ／ｍＬ）と、上述のＮ−サクシニルラセマーゼ０．１ｍＬ（１０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、撹拌しながら５７℃で９０時間反応を行なうことにより、Ｌ−ターシャリーロイシンを合成した。反応開始の２４時間後および９０時間後にサンプルを採取し、実施例４と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。【００６１】
ＨＰＬＣ測定の結果を図６に示す。図６からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼとＮ−サクシニルラセマーゼを併用することにより、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンのほぼすべて（収率約８５％）をＬ−ターシャリーロイシンに変換できた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｌ−ターシャリーロイシンをはじめとする種々の非天然アミノ酸および天然アミノ酸を効率良く製造できるので、医薬品、農薬、食品などの中間体や原料として有用なＬ−アミノ酸を製造するために広く利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号４，５，６，７は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【図５】
2009136500.tif 000003
【図６】
2009136500.tif 000004
【図１】
2009136500.tif 000005
【図２】
2009136500.tif 000006
【図３】
2009136500.tif 000007
【図４】
2009136500.tif 000008
【配列表】
2009136500000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月17日(2010.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、およびＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸がＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
好ましくは、本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＬ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸のみを特異的に加水分解するため、このままではラセミ体の残り半分のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸は無駄になってしまう。そこで、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を生成させてやれば、残ったＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸も結果的にすべてＬ−アミノ酸に変換することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しく（ラセミ化）する酵素である。本発明の製造方法で使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開２００７−８２５３４号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼや特開２００８−６１６４２号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５〜７０℃が好ましく、３７〜７０℃がより好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６．５〜８がより好ましい。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、反応液中５〜５００ｍｇ／Ｌ（５００〜５００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つ。添加する２価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｆｅ２＋およびＮｉ２＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。Ｃｏ２＋は終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。
完全な除去を表し、５は像受容層からの中間層及び乳剤層の除去がないことを表す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
前述のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼによるラセミ化反応とＬ−サクシニルアミノアシラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸のうちＬ体のみが本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより脱アシル化（加水分解）され、目的のＬ−アミノ酸が生成する。基質のＬ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼはＤ体をＬ体に変換する反応をより促進する。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼにより順次Ｌ−アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度０．０１ｍＭ〜５００ｍＭ、ｐＨ６〜８、温度３０〜６０℃で行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、所望する量のＬ−アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に１日〜７日程度である。
白い点の全く存在しないことを表し、５は印刷領域で非常に多い数の白い点を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの調製
（１）特開２００８−６１６４２号公報に記載のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍＬ仕込み／３０ｍＬ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。得られた培養物１ｍＬを採取して、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。上記の操作により、得られた培養物１ｍＬより得られた菌体から、約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（配列番号３）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号４に示される５’プライマーおよび配列番号５に示される３’プライマーを用いた。これらのＰＣＲプライマーおよびＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
次に、クローニングキットＴａｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＢＳＮＡＲ１を取得した。このｐＢＳＮＡＲ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）と命名した。
ＴＢ培地（５００ｍＬ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍＬと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）の培養液を５ｍＬ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例６  本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼおよびＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成
１重量％  Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７〜８）１０ｍＬ（１ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む）に、実施例１で調製したＬ−サクシニルアミノアシラーゼの溶液１ｍＬ（２．３ｍｇ／ｍＬ）と、上述のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ０．１ｍＬ（１０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、撹拌しながら５７℃で９０時間反応を行なうことにより、Ｌ−ターシャリーロイシンを合成した。反応開始の２４時間後および９０時間後にサンプルを採取し、実施例４と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンからのＬ−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
ＨＰＬＣ測定の結果を図６に示す。図６からわかるように、本発明のＬ−サクシニルアミノアシラーゼとＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを併用することにより、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ターシャリーロイシンのほぼすべて（収率約８５％）をＬ−ターシャリーロイシンに変換できた。
【国際調査報告】
2009136500.tif 000009
2009136500.tif 000010
2009136500.tif 000011
2009136500.tif 000012