(57)【要約】  より簡便に硫酸化糖鎖を検出する方法として一般的に有効とされる競合的検出法による定量には適さないという従来技術が持つ問題点を解決する糖鎖の検出方法を提供する。  糖鎖に特異的に結合できる分子プローブを用いて糖鎖を検出する方法であって、糖鎖に結合できる光架橋剤で分子プローブを標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む前記方法。下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖を検出するためのキット。(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ  糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニング法及びそのキット、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査法及びそのキットも提供される。
2013035727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖に特異的に結合できる分子プローブを用いて糖鎖を検出する方法であって、糖鎖に結合できる光架橋剤で分子プローブを標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む前記方法。
【請求項２】
さらに、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を可視化することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出の対象となる糖鎖が固定されている固相の上で、光を照射する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
競合法で糖鎖が定量的に検出される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
染色により糖鎖が可視化される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
糖鎖に結合できる光架橋剤で標識した被験物質を糖鎖と接触させ、その後、光を照射して、前記被験物質に特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニング法。
【請求項７】
糖鎖に特異的に結合することができる分子プローブを糖鎖に結合できる光架橋剤で標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査法。
【請求項８】
下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖を検出するためのキット。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
【請求項９】
さらに、検出の対象となる糖鎖が固定された固相を含む請求項８記載のキット。
【請求項１０】
さらに、分子プローブに特異的に結合した糖鎖を可視化するための試薬を含む請求項８又は９記載のキット。
【請求項１１】
下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニングキット。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
【請求項１２】
下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査キット。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖の検出方法に関し、より詳細には、光架橋剤と分子プローブを用いた糖鎖の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカン糖鎖（硫酸化糖鎖）は、高等動物細胞表面に普遍的に発現しているヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸などの総称であり、ムコ多糖症などの血中、尿中で使用できる診断マーカーの指標分子である。【０００３】
指標の認識機構は、タンパク質の構造で識別する抗体反応が広く用いられている。しかし、硫酸化糖鎖は、酸性糖や硫酸基から構成される負電荷を有する生体内高分子である。そのため、抗体を利用した検出方法では、非特異的に負電荷分子と相互作用することが起こり、微量なサンプルを検出するのが困難である。【０００４】
上記の硫酸化糖鎖の高感度認識に有用な分子プローブは、本発明者自身が特許出願している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０４８９２２パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＷＯ２０１１／０４８９２２の発明は、硫酸化糖鎖の定性的検出の点では優れている一方、使用している分子プローブと糖鎖間の相互作用が非常に速く、結合と解離を繰り返す（回転速度が速い＝“弱い結合”）ために、より簡便に硫酸化糖鎖を検出する方法として一般に有効とされる競合的検出法（抗原―抗体結合において、標識された抗原を混入させることで、未知の試料中の抗原が抗体と結合する量が逆転して測定される方法）による定量には適さないことが問題点であった。【０００７】
本発明は、かかる問題点を解決する糖鎖の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明では、“弱い結合”を“強固”にする改良に着眼した。具体的には、化学的修飾法を利用して光反応性架橋剤で分子プローブを標識し、プローブとグリコサミノグリカン糖鎖との相互作用の回転速度の速さを、光架橋により永続的に固定してしまうことで通常方法では困難な糖鎖の検出を可能とした。本発明で利用する光反応架橋剤は、本来タンパク質分子間相互作用分析の目的で利用されている（Stauffer, D.A., and Karlin, A. (1994) Biochemistry 33, 6840-6849.Holmgren, M., et al. (1996) Neuropharmacology 35, 797-804.Liu, Y., et al. (1996) Neuron 16, 859-867.）。しかしながら、糖鎖の定量法に利用された事例はない。【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）糖鎖に特異的に結合できる分子プローブを用いて糖鎖を検出する方法であって、糖鎖に結合できる光架橋剤で分子プローブを標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、前記方法。
（２）さらに、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を可視化することを含む（１）記載の方法。
（３）検出の対象となる糖鎖が固定されている固相の上で、光を照射する（１）又は（２）記載の方法。
（４）競合法で糖鎖が定量的に検出される（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）染色により糖鎖が可視化される（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）糖鎖に結合できる光架橋剤で標識した被験物質を糖鎖と接触させ、その後、光を照射して、前記被験物質に特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニング法。
（７）糖鎖に特異的に結合することができる分子プローブを糖鎖に結合できる光架橋剤で標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査法。
（８）下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖を検出するためのキット。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
（９）さらに、検出の対象となる糖鎖が固定された固相を含む（８）記載のキット。
（１０）さらに、分子プローブに特異的に結合した糖鎖を可視化するための試薬を含む（８）又は（９）記載のキット。
（１１）下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニングキット。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
（１２）下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査キット。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
【発明の効果】
【００１０】
本発明の検出方法では、１．硫酸化糖鎖に非特異的に検出試薬（分子プローブ）が結合することによる検出誤差を生じる点、２．標的分子とプローブの結合力が微小な場合の両者複合体の検出が困難な点、３．光架橋の標的が限定される点、４．従来の検出法はキット化が容易な競合法が利用できない点、といった課題を解決することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2011‐195558の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】光架橋剤で標識した分子プローブを糖鎖と結合させた（“弱い結合”）後、光を照射して、糖鎖を架橋することにより、“強固な結合”とすることができることを模式的に示した図である。
【図２】本発明の検出方法を競合法で用いる態様を模式的に示した図である。
【図３】光架橋剤により標識したHappY-Cysペプチドとヘパリン表示量を混合した後、UV照射により固定化ヘパリンを光架橋し、検出された結合HappY-Cysペプチド量（競合法、FITCにより検出）を示すグラフである。コンドロイチン硫酸とは競合しなかった。GAG: グリコサミノグリカン、HP:ヘパリン、CS-A:コンドロイチン硫酸Ａ、CS-C:コンドロイチン硫酸Ｃ。
【図４】パラフィン包埋組織切片（組織：小腸）を用いて、光反応性架橋試薬（Mts-Atf-LC-Biotin）を標識した分子プローブ（HappY-Cys）によって、ヘパラン硫酸・ヘパリン糖鎖の局在部位を染色によって検出した結果を示す。酵素処理によりヘパリン／ヘパラン硫酸を除去したもの、10E4（抗ヘパラン硫酸抗体）を用いて組織染色したもの、ヘマトキリシン／エオジン染色したものも示す。
【図５】パラフィン包埋組織切片（組織：腎臓）を用いて、光反応性架橋試薬（Mts-Atf-LC-Biotin）を標識した分子プローブ（HappY-Cys）によって、ヘパラン硫酸・ヘパリン糖鎖の局在部位を染色によって検出した結果を示す。10E4（抗ヘパラン硫酸抗体）を用いて組織染色したもの、ヘマトキリシン／エオジン染色したものも示す。
【図６】上：HappYプローブによる皮膚組織切片（ネコ由来）の染色像を示す。中央：HappYプローブによる皮膚組織切片（ネコ由来）の染色像（糖鎖分解酵素処理済）を示す。下：市販抗体（10E4）による皮膚組織切片（ネコ由来）の染色像を示す。
【図７】上：トルイジンブルーによる肥満細胞腫（ネコ由来）皮膚組織切片の染色像を示す。中央：HappYプローブによる肥満細胞腫（ネコ由来）皮膚組織切片の染色像を示す。下：市販抗体（10E4）による肥満細胞腫（ネコ由来）皮膚組織切片の染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、糖鎖に特異的に結合できる分子プローブを用いて糖鎖を検出する方法であって、糖鎖に結合できる光架橋剤で分子プローブを標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、前記方法を提供する。本発明において、検出には定量も含まれる。
【００１４】
本発明の検出方法において、検出の対象となる糖鎖は、いかなる糖鎖であってもよいが、特異的に結合できる分子プローブが存在するものであるとよく、グリコサミノグリカンを例示することができる。
【００１５】
グリコサミノグリカンは、硫酸基が付加したものを含むアミノ糖とウロン酸またはガラクトースの二糖の繰り返し構造を有する糖鎖であり、線虫以上の高等動物のほぼすべての細胞表面および細胞外マトリクスに遊離状態あるいはタンパク質に結合した状態で存在する。グリコサミノグリカンは、アミノ糖（ガラクトサミン、グルコサミンなど）とウロン酸（グルクロン酸、イズロン酸など）又はガラクトースからなる二糖の繰り返し長鎖構造を持ち、アセチル化や硫酸化されている場合もある。硫酸化部位は構成糖の特定の水酸基（O-硫酸化）またはアミノ基（N-硫酸化）に硫酸基が転移されたものである。
【００１６】
グリコサミノグリカンは、硫酸基やウロン酸のカルボキシル基により負に荷電している。グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチンなどが知られている。
【００１７】
コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリンなどは、プロテオグリカンのコアタンパクに共有結合した形で、細胞表面や細胞外マトリックスに存在する。ヘパリンは、ヘパラン硫酸の一種であり、D-グルクロン酸又はL-イズロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンの二糖単位の繰り返し構造をとり、二糖あたり平均２〜３個の硫酸基を持つ高分子であるが、ヘパラン硫酸より硫酸化の度合いが高い。生体内において、ヘパリンは、抗凝固作用に関与する凝固系のタンパク質と相互作用する。ヘパリンは、抗凝固薬の一つとして利用されており、血栓塞栓症、播種性血管内凝固症候群の治療、人工透析、体外循環での凝固防止などに用いられている。ヘパリンは、アンチトロンビンIIIと結合することによって、アンチトロンビンIIIの抗凝血作用を賦活化し、凝固系を抑制する。アンチトロンビンIIIは、トロンビンと複合体を形成することによって、トロンビンの血液凝固活性を阻害する糖タンパク質である。
【００１８】
ヒアルロン酸は、他のグリコサミノグリカンと異なり、コアタンパクに結合しておらず、また硫酸基も持たない。ヒアルロン酸は、関節、硝子体、皮膚、脳などの生体内の細胞外マトリックスに存在する。
【００１９】
本発明において、検出の対象とする糖鎖（例えば、グリコサミノグリカン）は、遊離の状態で存在しているものであってもよいし、コアタンパクなどの他の物質と結合している状態のものであってもよい。
【００２０】
本発明の検出方法に用いる分子プローブは、糖鎖に特異的に結合することができ、かつ糖鎖に結合できる光架橋剤で標識可能なものであればよい。例えば、糖鎖に結合できる光架橋剤が2-{N2-[N6-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl-6-aminocaproyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinylamido]}ethyl methanethiosulfonate  (Mts-Atf-LC-Biotin)(Pierce Bioctechnology)である場合、Mts-Atf-LC-Biotin のメタンチオスルフォネート基と結合できるチオール基(SH)を持つものであるとよく、このような分子プローブは、糖鎖を特異的に認識する物質に、必要により、遊離のチオール基を導入することにより得られる。
【００２１】
糖鎖がグリコサミノグリカンである場合、グリコサミノグリカンを特異的に認識する物質としては、以下のものを挙げることができる。
・ヘパリンやヘパラン硫酸に特異的に結合するHappY（Heparin-associated peptide Y, 2008年8月19日第28回日本糖質学会年会（つくば）口頭発表及び要旨集p.79）（アミノ酸配列：RTRGSTREFRTG）（配列番号３）
・HappYにCysを付加したもの(HappY-Cys)（アミノ酸配列：RTRGSTREFRTGC）（配列番号１）
・グリコサミノグリカンを特異的に認識する抗体として，CS-56（抗-コンドロイチン硫酸抗体；Avnur Z. and Geiger, B.，Exp. Cell Res. 158，321-332，1985），MO-224（抗-コンドロイチン硫酸抗体；Yamagata, M. et al.，J. Biol. Chem. 262，4146-4152，1987），HepSS-1（抗-ヘパラン硫酸抗体；Kure, S. and Yoshie, O.，J. Immunol. 137，3900-3908，1986）などがある。
・ヘパリンを特異的に認識するアンチトロンビンIII（Bjork, I. and Lindahl, U.，Mol. Cell. Biochem. 48，161-182，1982）
グリコサミノグリカンを特異的に認識する物質は、2008年8月19日第28回日本糖質学会年会（つくば）口頭発表及び要旨集p.79に報告されているファージディスプレイ法、Kuppeveltらの方法（Van Kuppevelt, T. H. et al.，J. Biol. Chem. 273，12960-12966，1998）などに報告されているスクリーニング法などにより、探索することができる。
【００２２】
グリコサミノグリカン以外の糖については，レクチンに代表されるような糖特異的認識蛋白質が広く多数知られており、それらを利用することができる。
【００２３】
糖鎖を特異的に認識する物質に遊離のチオール基を導入する場合には、糖鎖を特異的に認識する物質の構造特異的な結合力を妨げることがないよう、結合に干渉しない部位（例えば、糖鎖を特異的に認識する物質がペプチド又はタンパク質である場合には、ペプチド又はタンパク質のC末端など）に導入するとよい。遊離のチオール基の導入は、例えば、ペプチド合成時のシステイン残基の付加、チオール基導入試薬を用いてアミノ酸側鎖を修飾するなどにより行なうことができる。システイン残基の付加は、9-フルオレニルメトキシ基（Fmoc基）で保護したシステインを用いたペプチド固相合成法により、行なうことができる。
【００２４】
分子プローブが遊離のチオール基を有していれば、Mts-Atf-LC-Biotinなどのメタンチオスルフォネート基を有する光架橋剤で標識することができるので、光架橋剤で標識した分子プローブを糖鎖と結合させた（“弱い結合”）後、光を照射して、糖鎖を架橋することにより、“強固な結合”とすることができる（図１参照）。また、分子プローブがタンパク質やペプチドであり、すでに遊離のチオール基を含有している場合は、このチオール基を利用して、Mts-Atf-LC-Biotinなどのメタンチオスルフォネート基を有する光架橋剤で標識できるため、あらかじめ分子プローブにチオール基を導入する必要はない。
【００２５】
本発明の検出方法は、分子プローブが認識する糖鎖を光架橋剤により架橋することにより、十分な洗浄後でも信頼性の高い検出を可能にする。
【００２６】
光架橋剤は、光照射により糖鎖を架橋でき、かつ分子プローブに結合できるものであれば、いかなるものであってもよい。
【００２７】
本発明で利用する光架橋剤の一例として、以下の3つの機能を分子内に有するものを挙げることができる。
１．メタンチオスルフォネート基（分子プローブのチオール基とジスルフィド結合する）
２．フェニルアジド基（紫外線照射により糖鎖のC-H又はC-NH2と化学的に結合可能する）
３．ビオチン（色素、酵素標識ストレプトアビジンなどによる定量時の可視化に利用できる）
光架橋剤の具体例として、2-{N2-[N6-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl-6-aminocaproyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinylamido]}ethyl methanethiosulfonate (Mts-Atf-LC-Biotin)(Pierce Bioctechnology)、2-[N2-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]ethyl methanethiosulfonate (Mts-Atf-Biotin)(Pierce Bioctechnology)などを挙げることができる。Mts:スルフヒドリル反応性メタンチオスルフォネート基、Atf:テトラフルオロフェニルアジド基。
Mts-Atf-LC-Biotin
2-{N2-[N6-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl-6-aminocaproyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinylamido]}ethyl methanethiosulfonate 
分子量：953.11
Biotin -Mtsスペーサーアーム：29.3Å
Biotin -Atfスペーサーア−ム：35.2Å
Mts-Atfスペーサーア−ム：21.8Å
【００２８】
【化１】
2013035727.tif 000003
【００２９】
Mts-Atf-Biotin
2-[N2-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]ethyl methanethiosulfonate
分子量：839.95
Biotin -Mtsスペーサーアーム：29.3Å
Biotin -Atfスペーサーア−ム：30.7Å
Mts-Atfスペーサーア−ム：11.1Å
【００３０】
【化２】
2013035727.tif 000004
【００３１】
分子プローブは、試料と接触させる前に、光架橋剤と反応させておくとよい（標識）。
【００３２】
光架橋剤は十分飽和量を加えるとよく、光架橋剤と分子プローブの比が、１：１〜10：１、好ましくは１：１〜５：１、より好ましくは１：１〜２：１の質量比となるように添加するとよい。
【００３３】
光架橋剤は、DMSO、DMFなどの溶媒に溶解して、添加するとよい。光架橋剤は、溶液100μLに対して、１〜200 mM、好ましくは10〜100 mM、より好ましくは25〜50 mMの量で溶解して、使用するとよい。
【００３４】
光架橋剤と分子プローブとの反応は、適切な条件下で行うとよい。例えば、Mts-Atf-LC-Biotin（光架橋剤）とHappY-Cys（HappYにシステインが付加したもの）との反応は、暗所，室温で１〜２時間または４℃で４〜８時間の条件下で反応させるとよい。
【００３５】
分子プローブを光架橋剤と反応させ、過剰な光架橋剤を透析やイオン交換カラムにより取り除いた後，分子プローブを試料と接触させるとよい。
【００３６】
分子プローブと接触させる試料としては、血清、血漿、胸水、腹水、尿、関節液、培養液、脳脊髄液，組織のホモジネートなどの種々の生体試料を例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
検出の対象となる試料中の糖鎖と分子プローブは、1：0.1〜1：100、好ましくは1：1〜1：50、より好ましくは1：5〜1：20の質量比となるように接触させるとよい。
【００３８】
分子プローブと試料を接触させるためには、分子プローブを溶解した溶液を試料に添加するとよく、分子プローブは、溶液100μLに対して、0.01〜100 nmol、好ましくは0.05〜50 nmol、より好ましくは1〜10 nmolの量で溶解して、使用するとよい。試料は、その物性や糖鎖の含有量・種類などに応じて、必要により、リン酸緩衝生理食塩水などの適当な溶液で適当な濃度に希釈して用いることにより、使用量を適宜調整するとよい。分子プローブを溶解する溶液は、ウシ血清アルブミンを含むとよく、ウシ血清アルブミンの濃度は、2〜10％（重量％）が適当である。ウシ血清アルブミンは一般的にブロッキング剤として使用されており、本発明の検出法でもその役割で使用することができる。すなわち、反応の場となる固相（例えば、プラスチックウェル）には、非特異的に分子プローブが少なからず結合してしまうが、少量の分子プローブを使用したときにはそれが検出量に対して大きな影響を与えてしまうので、ウシ血清アルブミンを相対的に多量に存在させ、固相（例えば、プラスチックウェル）に結合してしまう分子プローブの割合を下げる（原理的にはほとんど結合しない状態である）効果があると考えられる。大前提として検出対象の糖鎖にはウシ血清アルブミンが結合しないことが条件となるが、ヘパリン糖鎖については、すでにそれは確認している。
【００３９】
光架橋剤で標識した分子プローブと試料を接触させ、4〜37℃、好ましくは、4〜25℃、より好ましくは、15〜25℃で、0.5〜24時間、好ましくは、0.5〜16時間、より好ましくは、0.5〜3時間、試料中の糖鎖と分子プローブとの結合反応を行わせるとよい。
【００４０】
分子プローブと試料を接触させ、検出の対象となる試料中の糖鎖と分子プローブを結合させた後、光照射により架橋する。
【００４１】
照射する光とその照射時間は、検出の対象となる糖鎖と光架橋剤の間に結合が生じる波長と時間であればよく、例えば、光架橋剤がMts-Atf-LC-Biotinであり、糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖である場合、氷上で、300nm〜370nmの紫外線を１〜１５分間照射すれば、グリコサミノグリカン糖鎖を架橋することができる。
【００４２】
本発明の検出方法では、さらに、分子プローブに特異的に結合した糖鎖を可視化するとよい。
【００４３】
分子プローブに特異的に結合した糖鎖の可視化は、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、光架橋剤が分子内にビオチン部分を有する場合、色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate; FITC）、Texas red，Cy3，Cy5，Cy7など）、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（AP）など）などで標識したストレプトアビジンにより可視的な検出をすることができる。例えば、FITCで標識したストレプトアビジンにより検出する場合は、485 nmの光で励起し、520 nmの蛍光を検出する。また、HRPで標識したストレプトアビジンにより検出する場合は、DAB呈色反応により検出する。
【００４４】
本発明の検出法は、競合法又は非競合法のいずれの方法でも用いることができる。競合法又は非競合法のいずれの場合であっても、検出の対象となる糖鎖が固定されている固相の上で、光を照射して、分子プローブと結合した糖鎖を架橋するとよい。
【００４５】
競合法で用いる場合には、検出の対象となる糖鎖と同じ糖鎖を固定した固相を準備しておき、分子プローブ（光架橋剤で標識されている）と試料を接触させ、検出の対象となる糖鎖と分子プローブを結合させた後、糖鎖を固定した固相に分子プローブと試料の混合物を添加し、次いで、光照射により、糖鎖を架橋させた後、蛍光により、糖鎖を検出することができる（図２）。固相に固定する糖鎖は、既知量でなくとも、一定量固定されていれば十分である。競合法の場合、固相に固定された糖鎖と試料中の糖鎖との競合により、分子プローブを奪い合うことになる。試料と分子プローブを固定化糖鎖に作用させた後、遊離の分子プローブと、試料中の糖鎖と結合した分子プローブを洗浄により除去する。分子プローブで検量線を作成し、競合した分の蛍光の減少量から試料中の糖鎖量を求めることができる（すなわち、定量的な検出が可能である。）
非競合法で用いる場合には、試料中の糖鎖を固相に固定した後、分子プローブと接触させ、検出の対象となる糖鎖と分子プローブを結合させた後、光照射により、糖鎖を架橋し、次いで、蛍光により、糖鎖を検出することができる。この場合、試料中の糖鎖を直接検出することができる。すなわち、分子プローブで検量線を作成し、蛍光量から試料中の糖鎖量を求めることができる。
【００４６】
固相としては、マイクロプレートのウェル、プラスチックチューブ、ビーズなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。固相表面をストレプトアビジンでコーティングしておけば、ビオチン標識した糖鎖を固定できる。糖鎖のビオチン標識化は、市販のビオチン化試薬を用いて行なうことができる。
【００４７】
また、分子プローブに特異的に結合し、かつ光架橋剤で架橋した糖鎖を染色により、可視化することもできる。
【００４８】
例えば、後述の実施例では、HappYにCysを付加したもの（分子プローブ）をMts-Atf-LC-Biotin（光架橋剤）で標識したものとパラフィン包埋組織（小腸又は腎臓）切片を室温で30分間インキュベーションし、その後、氷上で紫外線を15分間照射して架橋反応を行った後、洗浄して未架橋のHappYを除去した後、ストレプトアビジン-HRPにて標識し、DAB呈色反応により染色した。
【００４９】
本発明の糖鎖検出法は、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニング、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査などに応用することができる。
【００５０】
従って、本発明は、糖鎖に結合できる光架橋剤で標識した被験物質を糖鎖と接触させ、その後、光を照射して、前記被験物質に特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニング法を提供する。
【００５１】
被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。被験物質に光架橋剤と結合できる官能基がない場合には、予めそのような官能基を導入しておくとよい。
【００５２】
また、本発明は、糖鎖に特異的に結合することができる分子プローブを糖鎖に結合できる光架橋剤で標識したものを試料と接触させ、その後、光を照射して、前記分子プローブに特異的に結合した糖鎖を架橋することを含む、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査法を提供する。
【００５３】
ヒアルロン酸は、肝疾患、慢性関節リウマチ、変形性膝関節症、癌などの疾患の診断マーカーとして、コンドロイチン硫酸は、甲状腺疾患、膠原病、糖尿病、外傷性膝関節症などの疾患の診断マーカーとして、ヘパラン硫酸は、糖尿病性腎症などの疾患の診断マーカーとして、ケラタン硫酸は、外傷性膝関節症などの疾患の診断マーカーとして有効であることが知られているので、本発明により、これらの疾患の検査が可能となる。被験者からの試料（例えば、被験者から採取した血清、血漿、胸水、腹水、尿、関節液など）中の糖鎖の量を健常者と比較することにより、罹患の有無を判定することができる。
【００５４】
本発明は、下記の(a)又は(b) を含む、糖鎖を検出するためのキットも提供する。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
糖鎖に結合できる光架橋剤、分子プローブ及び糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブについては、上述した。
【００５５】
本発明のキットは、さらに、糖鎖の標準品を含んでもよい。その他、固相（マイクロプレート、プラスチックチューブ、ビーズなど）、分子プローブに特異的に結合した糖鎖を可視化するための試薬（ストレプトアビジン、ビオチン化試薬など）、緩衝液、洗浄液、フレーム、シール、取扱い説明書、ブロッキング剤などを含んでもよい。固相には、糖鎖の標準品が固定されていてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、検量線なども記載しておくとよい。
【００５６】
本発明は、下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖に特異的に結合する物質のスクリーニングキットも提供する。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
糖鎖に結合できる光架橋剤、分子プローブ及び糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブについては、上述した。
【００５７】
本発明のスクリーニングキットは、さらに、糖鎖の標準品を含んでもよい。その他、固相（マイクロプレート、プラスチックチューブ、ビーズなど）、ストレプトアビジン、ビオチン化試薬、緩衝液、洗浄液、フレーム、シール、取扱い説明書、ブロッキング剤などを含んでもよい。固相には、糖鎖の標準品が固定されていてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、スクリーニングの判定基準なども記載しておくとよい。
【００５８】
本発明は、下記の(a)又は(b)を含む、糖鎖が診断マーカーとなる疾患の検査キットも提供する。
(a)糖鎖に結合できる光架橋剤及び分子プローブ
(b)糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブ
糖鎖に結合できる光架橋剤、分子プローブ及び糖鎖に結合できる光架橋剤で標識された分子プローブについては、上述した。
【００５９】
本発明の検査キットは、さらに、糖鎖の標準品を含んでもよい。その他、固相（マイクロプレート、プラスチックチューブ、ビーズなど）、ストレプトアビジン、ビオチン化試薬、緩衝液、洗浄液、フレーム、シール、取扱い説明書、ブロッキング剤などを含んでもよい。固相には、糖鎖の標準品が固定されていてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、疾患の評価及び／又は鑑別基準なども記載しておくとよい。
【００６０】
本発明の利点を以下に列挙する。
１．標的糖鎖を特異的に認識する分子プローブが、糖鎖と結合した状態で不可逆的に架橋されるため、反応後の十分な洗浄が可能となり、より信頼できる特異的な検出が可能となる。（糖鎖と結合する分子プローブは結合力が弱いうえ、硫酸化糖鎖はその負電荷によってさらに反応性を制限するため、硫酸化糖鎖の検出は非常に難しい。）
２．本検出法で使用する光架橋剤は、システインなどのチオール基を含むプローブであれば簡便に標識することができる。従って、検出したい糖鎖をあらかじめ固相化した定量化キットによる操作が可能である。
３．光架橋剤の種類によって生体内負電荷分子に対しても応用が可能である。光架橋剤は、CH基やNH基を認識し架橋反応する。よって、硫酸化糖鎖に限らず、広範な架橋効果が期待できる。
４．操作として簡便な競合法を利用して定量キットなどの普及タイプの開発が容易である。蛍光色素による蛍光強度の測定は非常に高感度であるばかりでなく定量性にも優れているため、構造特異的な分子プローブの開発により、特定の構造を有する糖鎖（例えば、硫酸化糖鎖）のみを定量的に測定することができるようになる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実験材料）
光架橋剤：Thermo，ヘパリン：ナカライテスク，CS-A：生化学工業，CS-C：生化学工業，パラフィン切片：ジェノスタッフ，抗ヘパラン硫酸抗体(10E4)：生化学工業，小腸組織切片：ジェノスタッフ，腎臓組織切片：ジェノスタッフ，ネコ皮膚組織切片：岐阜大学・酒井洋樹准教授提供，肥満細胞腫（ネコ由来）の皮膚組織切片；岐阜大学・酒井洋樹准教授提供
（プローブの作製方法）
HappY（Heparin-associated peptide Y）と命名された分子プローブ（WO/2011/048922）のC末端にCysを付加した状態のペプチド(HappY-Cys)をFmoc法により合成した。HappYのアミノ酸配列を配列番号３に、それをコードするDNAの塩基配列を配列番号２に示す。
（光反応性架橋試薬によるHappY-Cysの標識）
Mts-Atf-LC-biotin 1 mgに対し，DMSO 25 μLを加え溶かした。20.9 mg/mlのHappY-Cys 50μL(=685 nmol)にPBS 267.5 μLを加えたものに，HappY-Cysに対し2倍モル量の光架橋剤（=1.37 μmol，32.5 μL）を加え，暗所，室温で１時間インキュベートして反応させた。未反応の試薬はVivapureカラム（vivascience）で除去した。【００６２】
〔実施例１〕
光架橋剤で標識した分子プローブ（HappY-Cys）によりヘパリン糖鎖を検出した（競合法、FITCにより検出）。
ビオチンを還元末端に導入したヘパリンを含むPBS-tween(0.025%)溶液をストレプトアビジンをコートした96穴プレートに分注して，室温で１時間または4℃で一晩反応させた。PBS-tweenで洗浄して未結合のヘパリンを除去した後，ストレプトアビジンを含む5％BSA/PBS-tweenで余剰なビオチンをブロッキングした。次いで，ビオチンを含む5％BSA/PBS-tweenで余剰なストレプトアビジンのブロッキングを行った。暗所にてマイクロチューブに既知濃度のヘパリン，コンドロイチン硫酸を分注しておき，これに5％BSA/PBS-tweenで希釈した標識化HappY-Cysを加え，混ぜた後，ヘパリンをコートした96穴プレートに分注した。遮光して室温で15分間インキュベートした後，氷上にプレートを置いて，2.5 cmの距離からUV 365 nmを15分間照射した。2M NaClで6回洗浄後，PBS-tweenで3回洗浄した。PBS-tweenにて希釈したフルオレセイン-ストレプトアビジンを分注し，遮光して室温で30分間インキュベートした。2M NaClで6回洗浄後，PBS-tweenで2回洗浄した。PBS-tweenを200 μL/wellずつ分注し，蛍光プレートリーダー（TECAN）にてEx/Em=485/520 nmにおける蛍光強度を測定した。結果を図３に示す。【００６３】
各サンプルの相対蛍光強度は，それぞれ測定値から標識化HappY-Cysを含まない反応液のみのwell（ブランク）の蛍光強度を差し引いた値（ΔFI）として示した。その結果，HappY-Cysのみを含み，グリコサミノグリカン（GAG）を含まない溶液を加えたwellでは，9020.8±1221.1が検出された（コントロール）のに対し，ヘパリンとHappY-Cysとを混合した溶液を加えたwellでは，ヘパリンの濃度依存的に相対蛍光強度が低下し，溶液中のヘパリン量を測定することが出来た。一方，HappY-Cysが特異的に結合することの出来ないコンドロイチン硫酸（CS-AおよびCS-C）は，ヘパリンでは有意に定量可能な1000 ngを含む溶液でもコントロールと比較して，相対蛍光強度の有意な低下がないことから，HappY-Cysはヘパリンのみを特異的に定量していることが示された。【００６４】
〔実施例２〕
細胞内の核を染色するヘマトキシリンと細胞質を染色するエオジンでパラフィン包埋組織切片（組織：小腸）を染色した。図４に示されているように，小腸組織の絨毛を形づくる上皮細胞が検出された。【００６５】
この組織切片に対してヘパラン硫酸を検出することが知られている抗ヘパラン硫酸抗体（10E4）を用いて、通常の免疫組織化学染色法に従い、組織染色を行ったところ、従来報告されているように，絨毛の内側（上皮細胞の底部）に存在する基底膜中のヘパラン硫酸が染色された（図４）。【００６６】
一方，同じ組織切片に対して，光反応性架橋試薬を標識したHappY-Cysを用いて，組織切片とHappY-Cysを室温で30分間インキュベーションし，その後氷上で2.5cmの距離から365nmの紫外線ランプを15分間照射して光架橋反応を行った。PBSで洗浄して未架橋のHappY-Cysプローブを除去した後，ストレプトアビジン-HRPにて標識し，DAB呈色反応により検出した。【００６７】
その結果，10E4とは異なる箇所の染色像，すなわち，上皮細胞の基底膜側はほとんど染色されず，むしろ粘膜側がよく染色されている像が得られた（図４）。【００６８】
HappY-Cysがヘパラン硫酸・ヘパリン糖鎖を特異的に認識せず，非特異的に組織に結合しているかどうかを確認するため，組織切片に対してヘパリン・ヘパラン硫酸特異的分解酵素（ヘパリナーゼ，ヘパリチナーゼI，ヘパリチナーゼII）を用いて処理し，糖鎖を除去した後，同様にHappY-Cysを用いて染色を行った。その結果，糖鎖を除去するとHappY-Cysによる染色像は全く得られず，HappY-Cysはヘパラン硫酸・ヘパリン糖鎖を特異的に検出していることが明らかとなった（図４）。【００６９】
以上より，光反応性架橋試薬を標識した分子プローブを利用して，パラフィン包埋組織切片のグリコサミノグリカン糖鎖を検出することができた。また，HappY-Cysを用いた場合，検出された糖鎖は，従来の抗体で検出される糖鎖とは異なる構造を有する糖鎖が特異的に検出されることが明らかとなった。【００７０】
〔実施例３〕
細胞内の核を染色するヘマトキシリンと細胞質を染色するエオジンでパラフィン包埋組織切片（組織：腎臓）を染色した。図５に示されているように，腎臓組織の腎小体が検出された。【００７１】
この組織切片に対してヘパラン硫酸を検出することが知られている抗ヘパラン硫酸抗体（10E4）を用いて、通常の免疫組織化学染色法に従い、組織染色を行ったところ、従来報告されているように，基底膜中のヘパラン硫酸が染色された（図５）。【００７２】
一方，同じ組織切片に対して，光反応性架橋試薬を標識したHappY-Cysを用いて，組織切片とHappY-Cysを室温で30分間インキュベーションし，その後氷上で2.5cmの距離から365nmの紫外線ランプを15分間照射して光架橋反応を行った。PBSで洗浄して未架橋のHappY-Cysプローブを除去した後，ストレプトアビジン-HRPにて標識し，DAB呈色反応により検出した。【００７３】
その結果，10E4とは異なる箇所の染色像，すなわち，ボーマン嚢の内腔表面のみが染色された像が得られた（図５）。【００７４】
〔実施例４〕
皮膚組織切片（ネコ由来）と光反応性架橋試薬を標識したHappYを室温で30分間インキュベーションし，その後氷上で2.5cmの距離から365nmの紫外線ランプ（40ワット）を15分間照射して光架橋反応を行った。1 M NaClとPBSで洗浄して未架橋のHappYプローブを除去した後，ストレプトアビジン-HRPにて標識し，DAB呈色反応により糖鎖を検出した。【００７５】
その結果，皮膚表皮層（ケラチノサイトと呼ばれる角化細胞よりなる層）がよく染色された像が得られた（図６上）。また，肥満細胞の一部も染色された。【００７６】
HappYがヘパラン硫酸・ヘパリン糖鎖を特異的に認識しているかどうかを確認するため，組織切片をヘパリン・ヘパラン硫酸特異的分解酵素（ヘパリナーゼ，ヘパリチナーゼI，ヘパリチナーゼII）を用いて処理し，糖鎖除去した後，同様にHappYプローブを用いて染色を行った。その結果，糖鎖除去によりHappYによる鮮明な染色性が失われ，HappYはヘパラン硫酸・ヘパリン糖鎖を特異的に検出していることが明らかとなった（図６中央）。【００７７】
上述と同じ組織切片に対して，ヘパラン硫酸を検出することが知られ，広く使用されている抗ヘパラン硫酸抗体（10E4）を用いて組織染色を行うと，従来報告されているように，組織内の肥満細胞のヘパリンが染色された（図６下）。HappYプローブよりも多くの肥満細胞が染色されるのが特徴的であった。【００７８】
以上より，光反応性架橋試薬で標識した分子プローブを利用して，皮膚におけるグリコサミノグリカン糖鎖（ヘパラン硫酸）を検出することができた。また，HappYを用いた場合，検出された糖鎖は，従来の抗体で検出される糖鎖とは異なる構造を有する糖鎖が特異的に検出されることが明らかとなった。【００７９】
〔実施例５〕
肥満細胞より構成される肥満細胞腫（ネコ由来）の皮膚組織切片を用いて，まず，肥満細胞の分布を調べるために，常法としてもちいられるトルイジンブルー染色を行った。肥満細胞腫は，老齢のイヌやネコにおいて皮膚の悪性腫瘍として一般的である。トルイジンブルー染色の結果，肥満細胞が観察組織中で一面に存在していることを確認した（図７上）。【００８０】
皮膚組織切片（ネコ肥満細胞腫由来）と光反応性架橋試薬を標識したHappYを室温で30分間インキュベーションし，その後氷上で2.5cmの距離から365nmの紫外線ランプ（40ワット）を15分間照射して光架橋反応を行った。1 M NaClとPBSで洗浄して未架橋のHappYプローブを除去した後，ストレプトアビジン-HRPにて標識し，DAB呈色反応により糖鎖を検出した。【００８１】
その結果，ネコ肥満細胞腫に存在する肥満細胞は，HappYプローブによって，まったく認識されることなく，染色像が見られないことが確認された（図７中央）。肥満細胞は本来HappYが認識するヘパリンを多く含む細胞であり，この結果は，肥満細胞腫における肥満細胞中のヘパリンが特殊な構造を有していることを示唆している。【００８２】
上述と同じ組織切片に対して，ヘパラン硫酸を検出することが知られ，広く使用されている抗ヘパラン硫酸抗体（10E4）を用いて組織染色を行うと，正常皮膚組織と同様に，組織内の肥満細胞のヘパリンが染色された（図７下）。トルイジンブルー染色とほぼ同じ染色像が見られる。【００８３】
以上より，肥満細胞腫における肥満細胞が生合成するヘパリンは，HappYによって認識されない特殊な構造をもつヘパリンであることが推察され，これを利用して，皮膚における肥満細胞腫の診断に応用することができると考える。例えば、HappYプローブによる染色をトルイジンブルー染色と組み合わせることで，通常の肥満細胞か，腫瘍化した肥満細胞かを見分けられる可能性がある。【００８４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
特定の病気に関係する糖鎖に対するプローブと本発明の検出（定量も含む）方法の併用により、そのプローブを診断マーカーとして病気の診断に利用する際の簡便な糖鎖の検出（定量も含む）が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
＜配列番号１＞
配列番号１は、HappYにCysを付加したペプチドのアミノ酸配列(RTRGSTREFRTGC)を示す。このペプチドは、グリコサミノグリカン(ヘパリン、ヘパラン硫酸)に特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する。
＜配列番号２＞
配列番号２は、グリコサミノグリカン（ヘパリン、ヘパラン硫酸）を特異的に認識するペプチド、HappY（Heparin-associated peptide Y）をコードするDNAの塩基配列(CGGACGCGTGGGTCGACCCGGGAATTCCGGACCGGT)を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、グリコサミノグリカン（ヘパリン、ヘパラン硫酸）を特異的に認識するペプチド、HappY（Heparin-associated peptide Y）のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTG)を示す。
【図１】
2013035727.tif 000005
【図２】
2013035727.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2013035727.tif 000009
【図６】
2013035727.tif 000010
【図７】
2013035727.tif 000011
【配列表】
2013035727000001.app
【国際調査報告】
2013035727.tif 000012
2013035727.tif 000013
2013035727.tif 000014