(57)【要約】  微生物を含有する検体、特に粉乳等の粉製品に含まれる微生物の生菌数測定において、従来よりも正確な測定値が得られる懸濁用希釈液および生菌数測定方法を提供する。検体中に含まれる微生物の生菌数測定を行う際に、当該検体を懸濁液とするために用いられる懸濁用希釈液であって、０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有することを特徴とする懸濁用希釈液。検体中に含まれる微生物の生菌数測定方法であって、前記検体を、０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有する懸濁用希釈液を用いて懸濁液とする工程と、前記懸濁液中に含まれる微生物の生菌数を測定する工程とを有することを特徴とする生菌数測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる微生物の生菌数測定を行う際に、当該検体を懸濁液とするために用いられる懸濁用希釈液であって、０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有することを特徴とする懸濁用希釈液。
【請求項２】
前記ポリソルベート類の濃度が０．５％〜３０％である請求項１に記載の懸濁用希釈液。
【請求項３】
前記ポリソルベート類が、ツイーン４０、ツイーン６０およびツイーン８０からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載の懸濁用希釈液。
【請求項４】
前記微生物がビフィズス菌である請求項１〜３のいずれか一項に記載の懸濁用希釈液。
【請求項５】
検体中に含まれる微生物の生菌数測定方法であって、前記検体を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の懸濁用希釈液を用いて懸濁液とする工程と、前記懸濁液中に含まれる微生物の生菌数を測定する工程とを有することを特徴とする生菌数測定方法。
【請求項６】
前記微生物がビフィズス菌である請求項５に記載の生菌数測定方法。
【請求項７】
前記検体が粉末状である請求項５または６に記載の生菌数測定方法。
【請求項８】
前記検体が育児用粉乳である請求項７に記載の生菌数測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる微生物の生菌数を測定する際に、当該検体を懸濁液とするために用いられる懸濁用希釈液および前記懸濁用希釈液を用いた生菌数測定方法に関するものである。
本願は、２００８年６月２４日に、日本に出願された特願２００８−１６４２２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィズス菌は有用な腸内細菌の一つとして広く知られており、その生理学的意義については多数の報告があり、腸内において乳酸、酢酸等の有機酸を生産し、かつ有害菌の増殖を抑制する作用、ビタミンの産生、免疫力の賦活化等が明らかにされている（非特許文献１）。そのため、ビフィズス菌を摂取することにより健康を維持することを目的として、ヨーグルト、菓子類、飲料類、健康食品類等のビフィズス菌を含有する種々の食品が開発されている（非特許文献２）。また、乳幼児期において、母乳を接種する乳幼児はビフィズス菌が優勢になることから、日本外ではビフィズス菌を含んだ育児用粉乳なども開発されている。【０００３】
このようにビフィズス菌を含有する種々の食品については、当該食品にどれだけの菌数が含まれているかを示すために生菌数測定が行われる。
微生物の生菌数の測定に従来用いられている方法としては、検体を含む懸濁液を調製した後、前記懸濁液を、希釈液（生理食塩水等）を用いて段階的に希釈し、それらを混釈法、平板塗沫法等の培養法により培養し、培地に形成されたコロニー数をカウントする方法が一般的である。検体が粉末状（たとえば微生物の菌末や、粉乳等の粉製品）の場合、懸濁液は、当該検体に希釈液を添加、撹拌することにより調製されている。
かかる従来法は、ビフィズス菌末について直接生菌数測定を行う場合は問題にはならないが、食品中に配合されたビフィズス菌の生菌数を測定する場合、得られる測定値にばらつきが大きく、また、前記測定値が、実際に含まれている生菌数（実菌数）よりも低い値になる問題がある。かかる問題は、粉製品、特に粉乳中に配合されたビフィズス菌の生菌数を測定する場合に顕著である。たとえば粉乳中に含まれるビフィズス菌の生菌数を従来法により測定した場合、得られる測定値は、実際に含まれている生菌数（実菌数）よりも大幅に低い値（たとえば実菌数の６０〜７０％程度）となってしまう。
このように各種食品中に配合されたビフィズス菌については、生菌数を正確に測定できないため、分析機関等において、生菌数の正確な測定値が得られる測定方法の開発が期待されていた。【０００４】
上記のような状況から、各種食品中のビフィズス菌の生菌数測定についての公定法は存在しないが、非特許文献３には、はっ酵乳・乳酸菌飲料中のビフィズス菌の生菌数測定方法として、社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会が推奨する方法が記載されている。前記方法では、希釈液について、食品衛生検査指針に記載された嫌気性検体希釈液（以下、希釈液（Ａ）という。）が推奨されている。また、前記非特許文献３には、希釈液（Ａ）の代わりに生理食塩水を利用できることも記載されている。
希釈液（Ａ）は、ＫＨ２ＰＯ４：４．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４：６．０ｇ、Ｌ−システインＨＣＬ・Ｈ２Ｏ：０．５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：０．５ｇ、寒天：１．０ｇ、精製水：１，０００ｍＬからなる液体で、腸内フローラ中に存在する嫌気性菌検出の際に、広く使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】光岡知足編著、「ビフィズス菌の研究」、第１章、第９〜１４頁、財団法人日本ビフィズス菌センター（１９９４年）
【非特許文献２】光岡知足編著、「ビフィズス菌の研究」、第７章、第２６７頁および第２８２頁、財団法人日本ビフィズス菌センター（１９９４年）
【非特許文献３】「はっ酵乳・乳酸菌飲料中のビフィズス菌の菌数測定法」、第６頁、社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会  ビフィズス菌検査法検討委員会（２０００年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、粉製品の場合、希釈液として上記のような希釈液（Ａ）や生理食塩水を用いても、粉乳等の粉製品中に配合されたビフィズス菌の生菌数の測定値は、上記と同様、実菌数よりも大幅に低い値となってしまう。
生菌数が低く検出されてしまうことは、たとえば育児粉乳等の粉製品にビフィズス菌を配合する場合、当該粉製品中に規格値の倍以上のビフィズス菌を入れる必要がある等、経済的な面からも問題となる。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、微生物を含有する検体、特に粉乳等の粉製品に含まれる微生物の生菌数測定において、従来よりも正確な測定値が得られる懸濁用希釈液および生菌数測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討を行った結果、微生物を含有する検体を懸濁液とする際に用いる希釈液（懸濁用希釈液）に所定量以上のポリソルベート類を含有させることにより上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。
上記課題を解決する本発明は以下の態様を有する。
［１］検体中に含まれる微生物の生菌数測定を行う際に、当該検体を懸濁液とするために用いられる懸濁用希釈液であって、０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有することを特徴とする懸濁用希釈液。
［２］前記ポリソルベート類の濃度が０．５％〜３０％である［１］に記載の懸濁用希釈液。
［３］前記ポリソルベート類が、ツイーン４０、ツイーン６０およびツイーン８０からなる群から選択される少なくとも１種である［１］または［２］に記載の懸濁用希釈液。
［４］前記微生物がビフィズス菌である［１］〜［３］のいずれか一項に記載の懸濁用希釈液。
［５］検体中に含まれる微生物の生菌数測定方法であって、前記検体を、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の懸濁用希釈液を用いて懸濁液とする工程と、前記懸濁液中に含まれる微生物の生菌数を測定する工程とを有することを特徴とする生菌数測定方法。
［６］前記微生物がビフィズス菌である［５］に記載の生菌数測定方法。
［７］前記検体が粉末状である［５］または［６］に記載の生菌数測定方法。
［８］前記検体が育児用粉乳である［７］に記載の生菌数測定方法。【０００８】
本明細書および請求の範囲において、濃度（％）は、ｗ／ｖ（質量／体積）による値である。
ビフィズス菌を粉末化したものを「ビフィズス菌末」、ビフィズス菌以外の乳酸菌類を「乳酸菌」、乳酸菌を粉末化したものを「乳酸菌末」という。また、微生物の細胞又は菌体をまとめて「菌体」と記載することがある。
ここで、「ビフィズス菌」はビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）に属する微生物を示す。「乳酸菌類」は、発酵によって乳酸を産生する嫌気性の細菌を示す。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、微生物を含有する検体、特に粉乳等の粉製品に含まれる微生物の生菌数測定において、従来よりも正確な測定値が得られる懸濁用希釈液および生菌数測定方法を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜懸濁用希釈液＞
本発明の懸濁用希釈液は、０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有する。
ポリソルベート類は、ソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドが縮合したもの（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）である。ソルビタン脂肪酸エステルに縮合するエチレンオキシドの数は、通常、約２０分子である。
ソルビタン脂肪酸エステルは、ソルビトールと脂肪酸とを反応させることにより得られ、脂肪酸としては、Ｒ−ＣＯＯＨにおけるＲが炭素数１１〜１７の飽和または不飽和の炭化水素基であるものが一般的である。脂肪酸の具体例としては、ラウリン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸等が挙げられる。
【００１１】
ポリソルベート類として、具体的には、ツイーン（以下、「Ｔｗｅｅｎ」と記載する。）２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。
Ｔｗｅｅｎ２０は、ポリソルベート２０、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate）とも称される。
Ｔｗｅｅｎ４０は、ポリソルベート４０、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate）とも称される。
Ｔｗｅｅｎ６０は、ポリソルベート６０、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate）とも称される。
Ｔｗｅｅｎ６５は、ポリソルベート６５、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Polyoxyethylene Sorbitan Tristearate）とも称される。
Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリソルベート８０、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate）とも称される。
これらのポリソルベート類はいずれも市販のものを利用できる。
本発明に用いられるポリソルベート類は、本発明の効果に優れることから、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０およびＴｗｅｅｎ８０からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００１２】
懸濁用希釈液中、ポリソルベート類の濃度は、０．５％以上であり、１％以上が好ましい。ポリソルベート類の濃度が０．５％未満であると、本発明の効果が得られない。
また、ポリソルベート類の濃度が３０％を超えると溶解性が低下することから、懸濁用希釈液中のポリソルベート類の濃度は、０．５〜３０％が好ましい。経済性を考慮すると、前記濃度は、２％以下がより好ましい。
【００１３】
本発明の懸濁用希釈液は、任意に、本発明の効果を損なわない範囲で、ポリソルベート類以外の他の成分を含有してもよい。
前記他の成分としては、特に限定されず、一般的に希釈液に添加されている成分を添加できる。かかる成分として、具体的には、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、寒天、大豆ペプチド、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、ペプトン、酵母エキス、リンガー溶液等が挙げられる。
【００１４】
本発明の懸濁用希釈液は、ポリソルベート類および任意の成分を水と混合することにより調製できる。
【００１５】
上記本発明の懸濁用希釈液は、検体中に含まれる微生物の生菌数測定を行う際に、当該検体を懸濁液とするために用いられる。検体および生菌数の測定方法については、詳しくは、以下の本発明の生菌数測定方法にて説明する。
【００１６】
＜生菌数測定方法＞
本発明の生菌数測定方法は、微生物を含有する検体を、上述した本発明の懸濁用希釈液を用いて懸濁液とする工程と、前記懸濁液中に含まれる微生物の生菌数を測定する工程とを有する。
微生物としては、たとえば、ビフィズス菌、乳酸菌等が挙げられる。これらの中でも、ビフィズス菌が好ましい。
ビフィズス菌としては、特に限定されないが、たとえばビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum subsp. longum）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）等が挙げられる。これらはいずれも市販されているか又は寄託機関から容易に入手することができる菌株である。また、粉製品、健康食品においても容易に購入することのできる製品である。
乳酸菌としては、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）等が挙げられる。
【００１７】
本発明により生菌数を測定する検体としては、微生物を含むものであれば特に限定されないが、懸濁液の調製のしやすさ等を考慮すると、粉末状であることが好ましい。
粉末状の検体として、具体的には、粉製品にビフィズス菌、乳酸菌等の微生物の菌体が配合されたものが挙げられる。粉製品としては、たとえば、育児用粉乳、妊婦用粉乳等の粉乳が挙げられる。また、微生物の菌体が配合された固形の検体に対して粉砕処理を行い、粉末状としたものであってもよい。
本発明において、検体としては、育児用粉乳、特にビフィズス菌を含む育児用粉乳が好ましい。
【００１８】
前記検体の懸濁液は、懸濁のために本発明の懸濁用希釈液を用いる以外は、従来、懸濁液を調製するために用いられている公知の方法により調製でき、たとえば検体が粉末状の場合、前記検体と本発明の懸濁用希釈液とを混合、撹拌することにより調製できる。
【００１９】
懸濁液中に含まれる微生物の生菌数の測定は、寒天培地にて培養を行う培養法（固体培養法）を用いた方法により実施できる。
前記方法は、具体的には、懸濁液を段階的に希釈し、各希釈物を寒天培地にて培養し、形成されたコロニー数をカウントすることにより実施できる。このとき形成されたコロニー数が、当該寒天培地で培養した希釈物中に含まれる微生物の生菌数に該当する。そのため、コロニー数の値と希釈倍率とから、懸濁液中に含まれる微生物の生菌数が求められる。このようにして求められた懸濁液中の生菌数と、当該懸濁液中に含まれる検体の量から、当該検体中に含まれる微生物の生菌数（／ｇ）が求められる。
上記の方法においては、懸濁液を段階的に希釈する際に希釈液（二次希釈液）が用いられる。本発明においては、懸濁液とする際に用いる希釈液として本発明の懸濁用希釈液を用いればよく、二次希釈液の種類については特に限定されない。二次希釈液としては、生理食塩水、上述した希釈液（Ａ）（食品衛生検査指針に記載された嫌気性検体希釈液）等の公知の希釈液が利用できる。
培養法として、具体的には、混釈法、平板塗沫法等が挙げられる。混釈法は、適宜希釈した懸濁液を、加温溶解した寒天培地と混和し、冷却固形化して培養する方法である。平板塗沫法は、適宜希釈した懸濁液を、寒天培地上に塗抹して培養する方法である。
培養に用いる寒天培地の種類、培養条件（培養温度、培養時間等）については、測定対象の微生物に応じて公知の培養条件を利用でき、たとえば寒天培地としては、測定対象の微生物が生育可能なものであればよい。たとえばビフィズス菌が生育可能な培地としては、強化クロストリジア寒天培地、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地等が挙げられる。また、ビフィズス菌の場合、コロニー数のカウントは、主に、３７℃で７２時間嫌気培養した後に行われる。
【実施例】
【００２０】
次に、試験例および実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜試験例１＞
この試験は、ビフィズス菌末を粉ミルクに倍散した後に生菌数を測定し、倍散剤による菌数低下を観察するために実施した。
１）試験試料の調製：
ビフィズス菌末（原末）として、ＢＢ５３６菌末（森永乳業社製、生菌：８．１×１０１０／ｇ含有品）を用意した。
前記原末に、森永フォローアップミルク  チルミル（森永乳業社製）を１：１０００（ｗ／ｗ）の割合で混合したもの（１０００倍散）を調製し、倍散試料とした。
以下、原末の生菌数（実菌数）を１０００で割った値を、倍散試料の実菌数として用いた。【００２１】
【表１】
2009157316.tif 000002
【００２２】
２）懸濁用希釈液の調製：
懸濁用希釈液として、以下の表２に示す各成分に、それぞれ、全量が１０００ｍｌとなるように純水を添加し、混合することにより、生理食塩水、希釈液（Ａ）および１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を調製した。尚、各懸濁用希釈液は、オートクレーブにて１２１℃１５分の滅菌を行った。【００２３】
【表２】
2009157316.tif 000003
【００２４】
３）培養法（混釈法）による生菌数測定：
所定量の試験試料（倍散試料５ｇまたは原末１ｇ）を秤量し、そこに懸濁用希釈液（生理食塩水、希釈液（Ａ）または１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液）を、全量が１００ｇとなるように（倍散試料５ｇに対して９５ｇ（２０倍希釈）、または原末１ｇに対して９９ｇ（１００倍希釈））添加して激しく攪拌し、懸濁液（試料１−１〜１−４）を調製した。
次に、生理食塩水を二次希釈液として用いて各懸濁液を希釈（１００倍希釈を１回と１０倍希釈を１回の合計１０００倍希釈）し、希釈物を、予め溶解した強化クロストリジア寒天培地（Reinforced clostridial medium Agar）（ＯＸＯＩＤ社製）とともに混釈法によりプレートに撒き、寒天が固まった後、３７℃３日間の嫌気培養を行った。培養後、培地に生育したコロニー数をカウントして解析を行い、各試験試料中の生菌数の測定値を求めた。その結果を表３に示す。【００２５】
【表３】
2009157316.tif 000004
【００２６】
上記結果に示すように、ＢＢ５３６菌末の原末について生菌数を測定した試料１−１、１−２の生菌数の測定値は実菌数の９５〜１０２％であり、懸濁用希釈液として希釈液（Ａ）、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液のいずれを用いた場合でも、実菌数に近い正確な値が得られた。
一方、ＢＢ５３６菌末をチルミルにて１０００倍散した倍散試料について、生理食塩水を用いて懸濁した試料１−３では、生菌数の測定値が５．６×１０７／ｇであり、実菌数の６９％しか菌を検出できなかった。また、希釈液（Ａ）を用いて懸濁した試料１−４も、生菌数の測定値が５．９×１０７／ｇであり、実菌数の７３％しか検出できなかった。
これに対し、倍散試料について、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いて懸濁した試料１−５では、生菌数の測定値が８．４×１０７／ｇであり、倍散試料の実菌数に近い正確な値が得られた。
以上のように、粉乳中に含まれる菌末の生菌数を測定する場合、懸濁用希釈液として生理食塩水や希釈液（Ａ）を用いると、生菌数が実菌数の６９〜７３％と大きく低下して検出され、生菌数を正確に測定できない。これに対し、懸濁用希釈液として１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いると、粉乳中に含まれる菌末の生菌数を測定する場合であっても、原末の生菌数を直接測定する場合と同様、生菌数を正確に測定できる。【００２７】
＜試験例２＞
この試験は、試験例１で観察された菌数低下の現象に、懸濁用希釈液の配合組成が関与するのかを調べるために実施した。
１）懸濁用希釈液の調製：
リン酸二水素カリウム４．５ｇと、リン酸水素二ナトリウム６．０ｇと、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物０．５ｇと、表４に示す成分−１〜成分−４のいずれかと、純水とを混合して懸濁用希釈液１〜４を調製した。純水は、各懸濁用希釈液の全量が１０００ｍｌとなるように添加した。尚、各懸濁用希釈液は、オートクレーブにて１２１℃１５分の滅菌を行った。
表４中、「ＲＣＭ培地」は強化クロストリジア培地（Reinforced clostridial medium）（ＯＸＯＩＤ社製）を示す。大豆ペプチド（Soy Peptide）としてはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ社製のものを使用した。【００２８】
【表４】
2009157316.tif 000005
【００２９】
２）試験方法：
試験試料として、試験例１で調製した倍散試料（ＢＢ５３６菌末を１０００倍で倍散したもの）を使用し、懸濁用希釈液として、希釈液（Ａ）および懸濁用希釈液１〜４のいずれかを使用した以外は試験例１と同様に、培養法（混釈法）による生菌数測定を行った。
その結果を表５に示す。【００３０】
【表５】
2009157316.tif 000006
【００３１】
表５に示すように、懸濁用希釈液として、Ｔｗｅｅｎ８０を０．０５％含む希釈液（Ａ）を用いた試料２−１の生菌数の測定値は５．９×１０７／ｇ（実菌数の７３％）であった。
これに対し、Ｔｗｅｅｎ８０を１％含有する懸濁用希釈液１を用いた試料２−２の生菌数の測定値は８．４×１０７／ｇ（実菌数の１０４％）であり、試料２−１よりも実菌数に近い正確な値が得られた。
Ｔｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％とし、ＲＣＭ培地、大豆ペプチドまたはＬ−アスコルビン酸ナトリウムをそれぞれ添加した懸濁用希釈液２〜４を用いた試料２−３〜２−５は、生菌数の測定値が実菌数の７０〜７８％であり、試料２−１よりは若干実菌数に近い値であったが、試料２−２ほど正確な結果は得られなかった。
以上の結果より、菌末を粉乳で倍散した試料に対し、Ｔｗｅｅｎ８０を１％含有する懸濁用希釈液を用いることで、生菌数をより正確に測定できることが示された。【００３２】
＜試験例３＞
この試験は、懸濁用希釈液におけるＴｗｅｅｎ８０の適切な濃度の範囲、およびＴｗｅｅｎ８０以外のポリソルベート類を添加した場合の菌数を調べるために実施した。
１）懸濁用希釈液の調製：
リン酸二水素カリウム４．５ｇと、リン酸水素二ナトリウム６．０ｇと、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物０．５ｇと、表６に示す成分−５〜成分−１９のいずれかと、純水とを混合して懸濁用希釈液５〜１９を調製した。純水は、各懸濁用希釈液の全量が１０００ｍｌとなるように添加した。尚、各懸濁用希釈液は、オートクレーブにて１２１℃１５分の滅菌を行った。
懸濁用希釈液５〜１５はそれぞれＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．２％から３０％まで段階的に変化させたもので、懸濁用希釈液１６〜１９はそれぞれＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ６５をそれぞれ１．０％含有させたものである。【００３３】
【表６】
2009157316.tif 000007
【００３４】
２）試験方法：
試験試料として、試験例１で調製した倍散試料（ＢＢ５３６菌末を１０００倍で倍散したもの）を使用し、懸濁用希釈液として、希釈液（Ａ）および懸濁用希釈液５〜１９のいずれかを使用した以外は試験例１と同様に、培養法（混釈法）による生菌数測定を行った。その結果を表７に示す。【００３５】
【表７】
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【００３６】
表７に示すように、懸濁液用希釈液として、Ｔｗｅｅｎ８０を０．０５％含む希釈液（Ａ）を用いた試料３−１の生菌数の測定値は５．９×１０７／ｇ（実菌数の７３％）であった。また、０．２％のＴｗｅｅｎ８０を含む懸濁液用希釈液５を用いた試料３−２の生菌数の測定値は５．５×１０７／ｇ（実菌数の６８％）であった。
これに対し、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が０．５〜３０％の懸濁液用希釈液６〜１５を用いた試料３−３〜３−１２の生菌数の測定値は実菌数の８６〜１０７％であり、実菌数に近似した正確な値が得られた。特に、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が１．０〜３０％のＴｗｅｅｎ８０を含む懸濁用希釈液７〜１５を用いた試料３−４〜３−１２は、実菌数との誤差が９％以内の測定値（９１％〜１０７％）が得られた。
また、Ｔｗｅｅｎ８０以外のポリソルベート類であるＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ６５をそれぞれ１．０％含む懸濁液用希釈液１６〜１９を用いた試料３−１３〜３−１６の生菌数の測定値はそれぞれ実菌数の８８％、９８％、１０１％、８５％であり、試料３−１〜３−２よりも実菌数に近い正確な値が得られた。なかでも、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０をそれぞれ用いた試料３−１４、３−１５において特に正確な測定値が得られた。
以上の結果より、菌末を粉ミルクで倍散した試料の生菌数の測定の際、Ｔｗｅｅｎ８０を０．５〜３０％の範囲で含有することにより、実菌数に近い正確な測定値が得られること、同様の効果は他のポリソルベート類（特にＴｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０）の場合にも得られることが明らかとなった。【００３７】
＜実施例１＞
育児用粉乳もしくは妊婦用粉乳を含むビフィズス菌含有食品を１９種類用意した。表８にこれらの製品名、会社名、記載のあるものについてはそのビフィズス菌種を示す。尚、これらはいずれも市販品であり、容易に手に入るものである。
表８中の会社名のうち、「Dairyland」はPT Dairyland Indonesiaであり、「Morinagaa」はMorinaga milk industry Co., Ltd.であり、「Morinagab」はPT Kalbe Morinaga Indonesiaであり、「Morinagac」はPT SANGHIANG PERKASAである。また、「ABBOTT」はP.T.ABBOTT INDONESIAであり、「YILI」はInner Mongolia Yili Industrial Group Co., Ltd. である。
表８中、B. lactisはビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium animalissubsp. lactis）を示し、B. longumはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum subsp. longum）を示す。
また、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により各製品に含まれるビフィズス菌種を確認した。その結果を表８に併記する。【００３８】
懸濁液用希釈液として、試験例１で用いたのと同じ生理食塩水、希釈液（Ａ）、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液の３種類を用い、上記各製品に含まれるビフィズス菌の生菌数測定を以下の手順で行った。
各製品を、懸濁液用希釈液を用いて懸濁した。得られた懸濁液を生理食塩水で適宜希釈（菌数に応じて１〜１０６倍に希釈）した後、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（栄研化学社）を用いて、混釈培養により３７℃３日間の嫌気培養を行い、培養後、コロニー数をカウントした。
同様の操作を合計３回（１回あたり３枚のシャーレを使用。）実施し、それらの結果から、１９製品それぞれについて、生理食塩水、希釈液（Ａ）、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いた場合の生菌数（／ｇ）を求めた。その結果を表８に併記する。尚、コロニーをカウントする前には、代表的なコロニーの菌を顕微鏡観察してビフィズス菌であることを確認した。
また、カウントされたコロニー数（コロニーカウント数）の統計解析を行った。統計解析は、ＪＭＰ（バージョン５．１．１、ＳＡＳインスティチュート社製）のソフトを用い、使用した懸濁用希釈液および製品を因子とした２元配置の分散分析によるＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定を用いて検定した。その結果を表９にまとめた。【００３９】
【表８】
2009157316.tif 000009
【００４０】
【表９】
2009157316.tif 000010
【００４１】
表９に示すとおり、１９種類の市販製品中、コロニーカウントの最小二乗平均値は、生理食塩水を用いた場合を１００％とすると、希釈液（Ａ）では１１５％、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液では１３９％であり、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いることにより、統計的に有意に高い生菌数の測定値が得られることが示された。また、用いた製品のうち、Morinaga Chil-kid及びMorinaga Chil-schoolに関しては、得られた生菌数の測定値が、実際に配合している実菌数値とほぼ同等であることが分かっている。これらの結果から、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いることによって、生理食塩水や希釈液（Ａ）を用いる場合に比べて、より正確に生菌数を測定できることが示された。
また、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いた場合、１９製品中１３製品で、最も高い生菌数の測定値が得られた。この結果から、１％Ｔｗｅｅｎ８０含有液を用いることで、製品中のビフィズス菌数を安定的に測定することが可能であることが示された。【００４２】
以上詳記したとおり、本発明においては、育児用粉乳で倍散したビフィズス菌末の生菌数を培養法にて測定する際に、懸濁用希釈液として０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有するものを用いることで、当該育児用粉乳中に含まれるビフィズス菌の生菌数を正確に測定できる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、微生物を含有する検体、特に粉乳等の粉製品に含まれる微生物の生菌数測定において、従来よりも正確な測定値が得られる懸濁用希釈液および生菌数測定方法を提供できるため、食品の製造分野等で利用可能性がある。
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月20日(2009.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる微生物の生菌数測定を行う際に、当該検体を懸濁液とするために用いられる懸濁用希釈液であって、０．５％以上の濃度でポリソルベート類を含有し、前記微生物がビフィズス菌であることを特徴とする懸濁用希釈液。
【請求項２】
前記ポリソルベート類の濃度が０．５％〜３０％である請求項１に記載の懸濁用希釈液。
【請求項３】
前記ポリソルベート類が、ツイーン４０、ツイーン６０およびツイーン８０からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載の懸濁用希釈液。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
検体中に含まれる微生物の生菌数測定方法であって、前記検体を、請求項１〜３のいずれか一項に記載の懸濁用希釈液を用いて懸濁液とする工程と、前記懸濁液中に含まれる微生物の生菌数を測定する工程とを有し、前記微生物がビフィズス菌であることを特徴とする生菌数測定方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
前記検体が粉末状である請求項５に記載の生菌数測定方法。
【請求項８】
前記検体が育児用粉乳である請求項７に記載の生菌数測定方法。
【国際調査報告】
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