(57)【要約】  プライマー設計が容易であり、かつ、増幅距離を短くすることが可能なプライマーセットを提供する。  標的核酸配列４の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、前記プライマーセットが、第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒを含み、前記第一プライマー１Ｆが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、前記第二プライマー１Ｒが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列４の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、さらに、前記第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とする。
2013035875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、
前記プライマーセットが、第一プライマー及び第二プライマーを含み、
前記第一プライマーが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、
前記第二プライマーが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、
さらに、前記第一プライマー及び第二プライマーが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むことを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含み、
前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含み、
前記配列（Ｄ−Ｄ´）及び前記配列（Ｅ−Ｅ´）が、互いに異なる配列であることを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
【請求項４】
さらに、第三プライマーを含み、前記第三プライマーは、前記標的核酸配列、前記標的核酸配列の相補配列、又は、前記第一プライマーの伸長鎖若しくは前記第二プライマーの伸長鎖にハイブリダイズし、かつ、前記第三プライマーのハイブリダイゼーションが、前記第一プライマー及び第二プライマーと競合しないことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
プライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記プライマーセットとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする方法。
【請求項６】
プライマーセットを用いた等温増幅方法により核酸試料中の核酸配列における変異を検出する方法であって、
前記プライマーセットとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用い、
前記プライマーセットが、前記変異を有する核酸配列又は前記変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、前記変異に係るヌクレオチド残基が、第一プライマーの相補配列（Ａ）又は第二プライマーの相補配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットであり、
前記核酸試料の存在下、前記プライマーセットによる等温増幅反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項７】
少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、
下記の（Ａ１）〜（Ａ６）の各工程を含むことを特徴とする核酸の合成方法。
（Ａ１）  ３´末端を含む３´側ステム配列と、５´末端を含む５´側ステム配列とが、ループ配列を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸であって、前記３´側ステムの３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ａ２）  前記一本鎖鋳型核酸の前記ループにプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを前記５´側ステム配列の５´末端に向かって伸長させる工程。
（Ａ３）  前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
（Ａ４）  前記（Ａ３）の前記折り返し配列の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、前記（Ａ２）で形成された一本鎖鋳型核酸にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする工程。
（Ａ５）  前記（Ａ４）のプライマー伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端で停止する工程。
（Ａ６）  前記（Ａ４）で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸の前記折り返し配列の３´末端を伸長させる工程。
【請求項８】
（Ａ３）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする請求項７記載の核酸の合成方法。
【請求項９】
前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、請求項２記載のプライマーセットであって、第一プライマーにのみ前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された一本鎖鋳型核酸であり、
前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む第一プライマーである
ことを特徴とする請求項７または８に記載の核酸の合成方法。
【請求項１０】
前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、さらに、前記５´側ステムループ配列の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸であり、
前記（Ａ３）工程に代えて、下記（Ａ３−２）工程を含むことを特徴とする請求項７記載の核酸の合成方法。
（Ａ３−２）  前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端に連結した前記折り返し配列を介することなく、直接、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
【請求項１１】
（Ａ３−２）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする請求項１０記載の核酸の合成方法。
【請求項１２】
前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、請求項３のプライマーセットを用いた等温増幅法で形成された一本鎖鋳型核酸であり、
前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、請求項３のプライマーセットの第一プライマー又は第二プライマーである
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の核酸の合成方法。
【請求項１３】
核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、請求項７から１２のいずれか一項に記載の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項１４】
少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、下記の（Ｂ１）〜（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び下記の（Ｃ１）〜（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含むことを特徴とする核酸の合成方法。
（Ｂ１）  ３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する工程。
（Ｂ２）  前記（Ｂ１）の二つの二重鎖の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
（Ｂ３）  前記工程（Ｂ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
（Ｃ１）  ３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を一つ提供する工程。
（Ｃ２）  前記（Ｃ１）の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
（Ｃ３）  前記工程（Ｃ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
【請求項１５】
前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖が、請求項２または３に記載のプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であることを特徴とする請求項１４記載の核酸の合成方法。
【請求項１６】
核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、請求項１４または１５に記載の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする核酸の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。【０００３】
目的遺伝子の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われる。このような酵素的方法の主要なものとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法；米国特許第４６８３１９５号明細書（特許文献１）、米国特許第４６８３２０２号明細書（特許文献２）および米国特許第４８００１５９号明細書（特許文献３））、さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法；Trends  in  Biotechnology  10,  pp146-152,  1992（非特許文献１））がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。【０００４】
さらに、欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書（特許文献４）には、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が開示されており、前記方法では、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて２工程の温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより既知の遺伝子配列が増幅される。しかし、以上に記載した方法においては、広い温度範囲で、かつ、厳密な温度制御を経時的に行うことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、これらの反応は、２種類〜３種類の温度条件で行うために、各反応温度に調整するための時間が必要であり、サイクル数が増えれば増えるほど、それに要する時間は増大する。【０００５】
前記の問題点を解決すべく、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平７−１１４７１８号公報（特許文献５）に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；strand  displacement  amplification）法、自立複製（３ＳＲ；self-sustained  sequence  replication）法、日本国特許第２６５０１５９号公報（特許文献６）に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；nucleic  acid  sequence  based  amplification）法、ＴＭＡ(transcription-mediated  amplification)法、日本国特許第２７１０１５９号公報（特許文献７）に記載のＱベータレプリカーゼ法、米国特許第５８２４５１７号明細書（特許文献８）、国際公開第９９／０９２１１号パンフレット（特許文献９）または国際公開第９５／２５１８０号パンフレット（特許文献１０）に記載の種々の改良ＳＤＡ法、国際公開第００／２８０８２号パンフレット（特許文献１１）に記載のＬＡＭＰ法（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレット（特許文献１２）に記載のＩＣＡＮ法（Isothermal  and  Chimeric  primer-initiated  Amplification  of  Nucleic  acids）、日本国特許第３８９７８０５号公報（特許文献１３）に記載のSmartAmp2法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。【０００６】
前記の等温増幅方法の中で、ＬＡＭＰ法及びSmartAmp2法は、実用性が高い方法である。まず、ＬＡＭＰ法は、二つのターンバックプライマー（ＴＰ）と二つのアウタープライマー（ＯＰ）を必須とする等温増幅方法である。このため、４種類のプライマーを必要とし、ゲノムの認識サイトも合計で６個となる。図１１に、ＬＡＭＰ法の例を示す。同図では、二つのＯＰを省略し、二つのＴＰのみを示している。同図に示すように、ＴＰは、標的核酸配列にハイブリダイズする配列を３´側に持ち、かつ、５´側に、プライマー伸長鎖に相補的な配列を持つ。例えば、同図において、一方のＴＰ（同図において左側）は、３´側に、標的核酸配列の配列（Ａ）と相補的な配列（Ａ´）を有し、５´側に、プライマー伸長鎖の配列（Ｍ´）に相補的な配列（Ｍ）を持つ。他方のＴＰ（同図において右側）も同様である。このような構成になっているため、ＴＰが、鋳型配列にハイブリダイズして伸長鎖が生成すると、前記ＴＰの５´側がターンバックして前記伸長鎖とハイブリダイズし、その結果、プライマー伸長鎖の５´側にステムループ構造が形成される。ＬＡＭＰ法では、二つのＴＰを使用するため、標的核酸配列の増幅領域配列を短くすることが困難であるという問題がある。また、前述のように、ＬＡＭＰ法では、４種類のプライマーを必要とし、かつ、ゲノム認識サイトが合計で６個もあるため、プライマー設計が難しいという問題もある。一方、SmartAmp2法は、ＴＰとフォールディングプライマー（ＦＰ）を使用する方法であるため、ＬＡＭＰ法のような前述の問題がない。図１２に、SmartAmp2法の例を示す。同図に示すように、SmartAmp2法では、一方のプライマーとしてＴＰを使用し、他方のプライマーとしてＦＰを使用する。同図に示すように、ＦＰは、標的核酸配列の配列（Ｂ）に相補的な配列（Ｂ´）を３´側に有し、５´側には、相互に相補的な配列Ｆ−Ｆ´を一本鎖上に含む折返し配列を有する。SmartAmp2法では、ＴＰとＦＰを使用するため、ゲノム認識サイトが三か所であり、かつ、ＦＰは、ターンバックしない。このため、増幅速度が速く、特異性が高いという利点に加え、さらに、プライマー設計が容易で、増幅領域を短くすることができるという利点も持つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書
【特許文献５】特公平７−１１４７１８号公報
【特許文献６】日本国特許第２６５０１５９号公報
【特許文献７】日本国特許第２７１０１５９号公報
【特許文献８】米国特許第５８２４５１７号明細書
【特許文献９】国際公開第９９／０９２１１号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９５／２５１８０号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０２／１６６３９号パンフレット
【特許文献１３】日本国特許第３８９７８０５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Trends  in  Biotechnology  10,  pp146-152,  1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のように、SmartAmp2法は、種々の利点があり、実用性に優れた方法である。しかし、SmartAmp2法は、ＴＰを使用するため、ゲノム認識サイトのさらなる少数化、及び、増幅距離の短縮化においては、限界がある。【００１０】
そこで、本発明は、ゲノム認識サイトが少なく、かつ、増幅距離を短くすることが可能な等温増幅方法に使用するプライマーセット及びそれを用いた等温増幅方法並びに核酸配列の変異の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、標的核酸配列の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、前記プライマーセットが、第一プライマー及び第二プライマーを含み、前記第一プライマーが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、前記第二プライマーが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、さらに、前記第一プライマー及び第二プライマーが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とする。【００１２】
本発明の等温増幅方法は、プライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記プライマーセットとして、前記本発明のプライマーセットを用いることを特徴とする。【００１３】
本発明の核酸配列の変異の検出方法は、プライマーセットを用いた等温増幅方法により核酸試料中の核酸配列における変異を検出する方法であって、前記プライマーセットとして、前記本発明のプライマーセットを用い、前記プライマーセットが、前記変異を有する核酸配列又は前記変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、前記変異に係るヌクレオチド残基が、第一プライマーの相補配列（Ａ）又は第二プライマーの相補配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットであり、前記核酸試料の存在下、前記プライマーセットによる等温増幅反応を行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプライマーセットでは、ゲノムの認識サイトは二つであり、しかも、ＴＰを用いないため、プライマー設計が容易であり、かつ、増幅領域配列を短くすることができる。このため、本発明のプライマーセットを用いれば、従来の方法では増幅できなかったマイクロＲＮＡ等のような短い配列であっても増幅可能となる。このように、本発明は、本発明者等が開発したSmartAmp2とは全く異なるプライマーセットおよび等温増幅方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のプライマーセットの一例を示す図である。
【図２】図２は、本発明のプライマーセットのその他の例を示す図である。
【図３】図３は、本発明のプライマーセットのさらにその他の例を示す図である。
【図４】図４は、本発明のプライマーセットの増幅反応の一例を示す模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構の一例を示す模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。
【図６】図６は、ニック乗り越え型伸長に基づく伸長鎖交換反応の反応機構の一例を示す模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構のその他の例を示す模式図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構のさらにその他の例を示す模式図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構のさらにその他の例を示す模式図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａに続く反応工程における反応機構のその他の例を示す模式図である。
【図１０】図１０は、本発明のプライマーセットにおける、第一プライマーの一例を示す図である。
【図１１】図１１は、ＬＡＭＰ法の例を示す図である。
【図１２】図１２は、SmartAmp2法の例を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例１のプライマーセット（Forwardプライマー１およびReverseプライマー１）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図１４】図１４は、図１３で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図１５】図１５は、実施例１のプライマーセット（Forwardプライマー２およびReverseプライマー２）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図１６】図１６は、図１５で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図１７】図１７は、実施例２のプライマーセット（Forwardプライマー３およびReverseプライマー３）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図１８】図１８は、図１７で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図１９】図１９は、実施例３のプライマーセット（Forwardプライマー４およびReverseプライマー４）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図２０】図２０は、実施例３のBoostプライマー1のみを用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図２１】図２１は、実施例３のBoostプライマー２のみを用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図２２】図２２は、実施例３のBoostプライマー１および２を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図２３】図２３は、図１９〜２２で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図２４】図２４は、実施例４のプライマーセット（Forwardプライマー５およびReverseプライマー５）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図２５】図２５は、図２４で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図２６】図２６は、実施例４のプライマーセットの増幅反応を示す模式図である。
【図２７】図２７は、実施例５のプライマーセット（Forwardプライマー６およびReverseプライマー６）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図２８】図２８は、図２７で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図２９】図２９は、実施例５のプライマーセットの増幅反応を示す模式図である。
【図３０】図３０は、実施例６のプライマーセット（Forwardプライマー７およびReverseプライマー７）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図３１】図３１は、図３０で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図３２】図３２は、実施例７のプライマーセット（Forwardプライマー８およびReverseプライマー６）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図３３】図３３は、図３２で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図３４】図３４は、実施例８のプライマーセット（Forwardプライマー５およびReverseプライマー８）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。
【図３５】図３５は、図３４で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。
【図３６】図３６は、実施例８のプライマーセットの増幅反応を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
前記第一プライマー及び第二プライマーは、前述のとおり、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含む。前記２つの配列（Ｃ）が「実質的に同一」とは、前記２つの配列（Ｃ）が、それぞれ、他方のプライマーの相補的配列にハイブリダイズすることが可能であることをいう。具体的には、例えば、前記２つの配列（Ｃ）は、互いに完全に同一の配列（フルマッチ）でも良いし、一部の塩基が異なっている配列（ミスマッチ）であっても良い。前記ミスマッチにおいては、例えば、２つの配列（Ｃ）のうち一方が、他方の配列（Ｃ）に対する塩基の置換、挿入及び欠失の少なくとも一つにより生じる配列であっても良い。前記２つの配列（Ｃ）において、置換、挿入又は欠失が生じている塩基の数は、前記２つの配列（Ｃ）の塩基数の合計に対し、１０分の２以下であることが好ましく、１０分の１以下であることがより好ましい。また、前記２つの配列（Ｃ）が、完全に同一である（すなわち、置換、挿入又は欠失が生じている塩基の数がゼロである）ことが特に好ましい。
【００１７】
本発明のプライマーセットは、前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むという態様であってもよい。
【００１８】
本発明のプライマーセットは、前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含み、前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含み、前記配列（Ｄ−Ｄ´）及び前記配列（Ｅ−Ｅ´）が、互いに異なる配列であるという態様であってもよい。
【００１９】
本発明のプライマーセットにおいて、さらに、第三プライマーを含み、前記第三プライマーは、前記標的核酸配列、前記標的核酸配列の相補配列、又は、前記第一プライマーの伸長鎖若しくは前記第二プライマーの伸長鎖にハイブリダイズし、かつ、前記第三プライマーのハイブリダイゼーションが、前記第一プライマー及び第二プライマーと競合しないという態様であってもよい。
【００２０】
本発明の別の側面は、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する第一の核酸の合成方法であって、下記の（Ａ１）〜（Ａ６）の各工程を含むことを特徴とする第一の核酸の合成方法であってもよい。
（Ａ１）  ３´末端を含む３´側ステム配列と、５´末端を含む５´側ステム配列とが、ループ配列を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸であって、前記３´側ステムの３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ａ２）  前記一本鎖鋳型核酸の前記ループにプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを前記５´側ステム配列の５´末端に向かって伸長させる工程。
（Ａ３）  前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
（Ａ４）  前記（Ａ３）の前記折り返し配列の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、前記（Ａ２）で形成された一本鎖鋳型核酸にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする工程。
（Ａ５）  前記（Ａ４）のプライマー伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端で停止する工程。
（Ａ６）  前記（Ａ４）で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸の前記折り返し配列の３´末端を伸長させる工程。
【００２１】
本発明の第一の核酸の合成方法において、（Ａ３）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返してもよい。
【００２２】
本発明の第一の核酸の合成方法において、前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、本発明のプライマーセットであって、前記第一プライマーにのみ、前記配列（Ｃ）の５´側に前記折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された一本鎖鋳型核酸であり、前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む前記第一プライマーであってもよい。
【００２３】
本発明の第一の核酸の合成方法は、前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、さらに、前記５´側ステムループ配列の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸であり、前記（Ａ３）工程に代えて、下記（Ａ３−２）工程を含んでいてもよい。
（Ａ３−２）  前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端に連結した前記折り返し配列を介することなく、直接、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
【００２４】
本発明の第一の核酸の合成方法において、（Ａ３−２）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返してもよい。
【００２５】
本発明の第一の核酸の合成方法が、前記（Ａ３）工程に代えて、前記（Ａ３−２）工程を含む場合、前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む前記第一プライマーと、前記折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含む前記第二プライマーとを含む本発明のプライマーセットを用いた等温増幅法で形成された一本鎖鋳型核酸であり、前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記本発明のプライマーセットの第一プライマー又は第二プライマーであってもよい。
【００２６】
また、本発明のさらに別の側面は、核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、本発明の第一の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする第一の核酸の増幅方法であってもよい。
【００２７】
また、本発明のさらに別の側面は、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する第二の核酸の合成方法であって、下記の（Ｂ１）〜（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び下記の（Ｃ１）〜（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含むことを特徴とする第二の核酸の合成方法であってもよい。
（Ｂ１）  ３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する工程。
（Ｂ２）  前記（Ｂ１）の二つの二重鎖の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
（Ｂ３）  前記工程（Ｂ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
（Ｃ１）  ３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を一つ提供する工程。
（Ｃ２）  前記（Ｃ１）の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
（Ｃ３）  前記工程（Ｃ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
【００２８】
前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖は、本発明のプライマーセットの前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であってもよい。または、前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖は、本発明のプライマーセットの前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含み、前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含み、前記配列（Ｄ−Ｄ´）及び前記配列（Ｅ−Ｅ´）が、互いに異なる配列であるプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であってもよい。
【００２９】
また、本発明のさらに別の側面は、核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、本発明の第二の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする第二の核酸の増幅方法であってもよい。
【００３０】
次に、本発明について、例を挙げて詳細に説明する。
【００３１】
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または前記配列を有する核酸をも意味する。
【００３２】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、例えば、本発明によるプライマーとその相補鎖との二本鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J.  Sambrook,  E.  F.  Frisch,  T.  Maniatis;  Molecular  Cloning  2nd  edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行うと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead  Institute  for  Biomedical  Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００３３】
図１に、本発明のプライマーセットの一例を示す。同図に示すように、本例のプライマーセットは、標的核酸配列４の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、前記プライマーセットが、第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒを含み、前記第一プライマー１Ｆが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、前記第二プライマー１Ｒが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列４の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、さらに、前記第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒが、それぞれの５´側に、互いに同一の配列（Ｃ）を含む。
【００３４】
本例のプライマーセットの増幅反応の一例の模式図を図４に示す。同図において、図１と同一部分には同一符号を付している。
【００３５】
図４（ａ）に示すように、第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒは、標的核酸配列４にハイブリダイズして伸長反応が生じる。すると、同図（ｂ）に示すように、第一プライマーの伸長鎖に、第二プライマーがハイブリダイズして伸長することにより、又は、第二プライマーの伸長鎖に、第一プライマーがハイブリダイズして伸長することにより、二本鎖の中間体が形成される。同図（ｃ）及び（ｃ´）に示すように、二本鎖の中間体は、動的平衡反応により一本鎖になった際に、分子内のハイブリダイズにより、ステムループ構造をとる。そして、ステムループ構造の一本鎖の中間体のループに、第一プライマー又は第二プライマーがハイブリダイズして伸長鎖を形成することにより、同図（ｄ）及び（ｄ´）で示す二本鎖の中間体が形成される。同図（ｄ）及び（ｄ´）の二本鎖中間体は、同図（ｂ）の二本鎖の中間体と同じものであるため、再度、動的平衡反応により、ステムループ構造の一本鎖の中間体となる。これらの一連のサイクルにより、標的核酸配列が増幅される。
【００３６】
本発明のプライマーセットの第一プライマー及び第二プライマーにおいて、標的核酸配列とハイブリダイズする配列（Ａ´）及び（Ｂ´）の塩基数は、特に制限されず、例えば、３〜１００塩基、好ましくは、１０〜６０塩基、より好ましくは、１５〜５０塩基である。また、本発明のプライマーセットの第一プライマー及び第二プライマーの同一配列（Ｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、３〜１００塩基、好ましくは、１０〜６０塩基、より好ましくは、１５〜５０塩基である。
【００３７】
図２に、本発明のプライマーセットにおける前記第一プライマー２Ｆにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む例を示す。
【００３８】
本発明において、折返し配列（Ｄ−Ｄ´）の全長は特に制限されず、例えば、３〜１００塩基であり、好ましくは、４〜６０塩基であり、より好ましくは５〜５０塩基である。折返し配列（Ｄ−Ｄ´）の互いに相補的な配列のいずれか一つの塩基数は、特に制限されず、例えば、１〜５０塩基であり、好ましくは１〜３０塩基であり、より好ましくは、１〜２０塩基である。折返し配列（Ｄ−Ｄ´）の互いに相補的な配列の間には、介在配列が存在してもよい。前記介在配列の塩基数は、例えば、１〜５０塩基であり、好ましくは、１〜２０であり、より好ましくは１〜１０である。また、本発明において、折返し配列の一部は、第一プライマー及び第二プライマーの同一配列（Ｃ）の一部を形成していてもよい。これらの折返し配列（Ｄ−Ｄ´）の条件は、折返し配列（Ｄ−Ｄ´）と異なる折返し配列（Ｅ−Ｅ´）にも適用できる。
【００３９】
図３に、前記第一プライマー３Ｆにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含み、前記第二プライマー３Ｒにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含み、記配列（Ｄ−Ｄ´）及び前記配列（Ｅ−Ｅ´）が、互いに異なる配列であるという態様を示す。
【００４０】
次に、本発明の核酸の合成方法について、例を挙げて詳細に説明する。
【００４１】
後述の実施例で示すように、本発明の核酸の合成方法では、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する。この、本発明の核酸の合成方法の反応機構としては、例えば、後述の図５Ａ〜図７Ｂで示す第一の合成反応と、後述の図８Ａ〜図９Ｃで示す第二の合成反応とがある。前記第一の合成反応は、前記工程（Ａ１）〜（Ａ６）を含み、又は、前述のとおり、前記（Ａ３）工程に代えて、前記（Ａ３−２）工程を含んでいてもよい。前記第二の合成反応は、前記（Ｂ１）〜（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び前記（Ｃ１）〜（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含む。ただし、本発明のプライマーセットを用いた増幅反応は、これら第一の合成反応及び第二の合成反応以外の合成反応を含んでいても良い。また、本発明のプライマーセットを用いた増幅反応は、前記第一の合成反応及び第二の合成反応の少なくとも一方を含むことが好ましいが、前記第一の合成反応及び第二の合成反応を含んでいなくても良い。
【００４２】
まず、前記第一の合成反応は、ニック乗り越え型伸長に基づく伸長鎖交換反応である。以下、図５Ａ〜図７Ｂを用いて、前記第一の合成反応の例について説明する。
【００４３】
図５Ａ及び５Ｂに、前記第一の合成反応の一例を示す。この反応は、片方のプライマーのみが折り返し配列を含む、図２と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む第一プライマー２Ｆと、折り返し配列を含まない第二プライマー２Ｒとを含む。なお、図５Ａ及び５Ｂにおいて、図２と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
【００４４】
まず、図５Ａ（ａ）〜（ｇ）に示すように、Ω中間体を提供する（（Ａ１）工程）。このΩ中間体は、図５Ａ（ｇ）に示すように、３´末端を含む３´側ステム配列（Ｃ´）と、５´末端を含む５´側ステム配列（Ｃ）とが、ループ配列（Ａ−Ｂ´）を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸の前記３´側ステム（Ｃ´）の３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ´）及び（Ｄ）を同一鎖状に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）が連結した一本鎖鋳型核酸である。
【００４５】
前記（Ａ１）工程（図５Ａ（ａ）〜（ｇ））について、具体的に説明する。すなわち、まず、図５Ａ（ａ）に示すように、第一プライマー２Ｆが標的核酸配列の配列（Ａ）にハイブリダイズする。さらに、同図（ｂ）に示すように、第一プライマー２Ｆが伸長することにより、第１鎖の伸長が起こる。次に、同図（ｃ）に示すように、第一プライマー２Ｆの伸長鎖は、その配列（Ａ´）が、ゆらぎによって標的核酸配列の配列（Ａ）から遊離し、第一プライマー２Ｆと同一配列を有するプライマーが、前記標的核酸配列の配列（Ａ）に鎖置換ハイブリダイゼーション（SDH）し、さらに伸長反応することで、前記第一プライマー２Ｆの伸長鎖（第１鎖）が遊離する。
【００４６】
次に、同図（ｄ）及び（ｅ）に示すように、遊離した前記第１鎖への、第二プライマー２Ｒのハイブリダイズ及び伸長反応が起こることにより、第二プライマー２Ｒの伸長鎖（第２鎖）が形成される。前記第２鎖は、同図（ｅ）に示すように、第一プライマーの配列（Ａ´−Ｃ−Ｄ−Ｄ´）に相補的な配列（Ｄ−Ｄ´−Ｃ´−Ａ）を含む。さらに、同図（ｆ）に示すように、第二プライマー２Ｒの伸長鎖は、その配列（Ｂ´）が、ゆらぎによって標的核酸配列の配列（Ｂ）から遊離し、第二プライマー２Ｒと同一の配列を有するプライマーが、前記第１鎖の配列（Ｂ）に鎖置換ハイブリダイゼーション（SDH）し、さらに伸長反応することで、前記第２鎖が遊離する。そして、同図（ｇ）に示すように、遊離した前記第２鎖の配列（Ｃ）及び（Ｃ´）が自己ハイブリダイズし、Ω状構造の一本鎖鋳型核酸が形成される。これが、前述のΩ中間体である。なお、図５Ａ（ｃ）及び（ｆ）のプライマー伸長鎖の遊離は、アウタープライマー（ＯＰ）を用いて実施してもよい。
【００４７】
次に、図５Ａ（ｈ）〜図５Ｂ（ｉ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー２Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる（（Ａ２）工程）。この伸長反応が、前記５´側ステム配列（Ｃ）まで達すると、図５Ｂ（ｉ）に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）を鋳型とした伸長反応が、鎖置換反応を伴って起こる。なお、ここで、前記５´側ステム配列（Ｃ）（Tail配列）の５´末端部分と、前記折り返し（hook）配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端とから形成されるニックで伸長が停止する場合は、１倍体のアンプリコン（前記一本鎖鋳型核酸）が形成される。以下、前記ニックで伸長が停止せずに、ニック乗り越え型伸長に基づく伸長鎖交換反応が起こる場合について説明する。
【００４８】
すなわち、まず、図５Ｂ（ｉ）の点線矢印に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端から前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端にかけて連続して続行する（（Ａ３）工程）。そして、同図（ｊ）〜（ｌ）に示すように、同図（ｉ）（前記（Ａ３）工程）の前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、図５Ａ（ｈ）〜図５Ｂ（ｉ）（前記（Ａ２）工程）で形成された一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする（（Ａ４）工程）。そして、前記（Ａ４）工程のプライマー伸長反応を、図５Ｂ（ｌ）に示す前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止する（（Ａ５）工程）。これにより、前記プライマー伸長鎖は、アンプリコン配列（前記一本鎖鋳型核酸配列）が二つ順方向に連結された（タンデムな）２倍体ｌａとなる。さらに、図５Ｂ（ｍ）に示すように、前記（Ａ４）工程で一本鎖になったプライマー伸長鎖（タンデムな２倍体ｌａ）を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）の前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端を伸長させる（（Ａ６）工程）。この伸長反応により、前記プライマー伸長鎖（タンデムな２倍体ｌａ）に相補的な鎖が形成され、前記プライマー伸長鎖及びそれに相補的な鎖からなる完全な二本鎖ｍａが形成される。
【００４９】
なお、図５Ａ及び５Ｂでは、前記（Ａ３）工程及び前記（Ａ４）工程を１回のみ行うことで、タンデムな２倍体を形成する例を示した。これに対し、前記（Ａ３）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返す以外は同様にすることで、３倍体以上のタンデムな鎖を形成することもできる。すなわち、前記（Ａ４）工程後、前記（Ａ３）工程に戻り、前記（Ａ３）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返したところで前記（Ａ５）工程及び前記（Ａ６）工程に進み、３倍体以上のタンデムな鎖を形成しても良い。
【００５０】
図６に、ニック乗り換え反応が起こる場合と起こらない場合を示す。まず、同図（ａ）に示すように、Ω中間体において、５´側ステムの５´末端と、折り返し配列の３´末端が接近してニックを形成している場合は、ニックを乗り越えてプライマー伸長反応がおこる。これに対し、同図（ｂ）に示すように、Ω中間体において、５´側ステムの５´末端と、折り返し配列の３´末端が離れてニックを形成していない場合は、プライマーの伸長反応は、５´側ステムの５´末端で停止する。
【００５１】
次に、図７Ａ及び７Ｂに、前記第一の合成反応の別の例を示す。この反応は、両方のプライマーが折り返し配列を含む、図３と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む第一プライマー３Ｆと、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含む第二プライマー３Ｒとを含む。なお、図７Ａ及び７Ｂにおいて、図３と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
【００５２】
まず、図７Ａ（ａ）〜（ｇ）に示すように、Ω中間体を提供する（（Ａ１）工程）。このΩ中間体は、図７Ａ（ｇ）に示すように、３´末端を含む３´側ステム配列（Ｃ´）と、５´末端を含む５´側ステム配列（Ｃ）とが、ループ配列（Ａ−Ｂ´）を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸の前記３´側ステム（Ｃ´）の３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ）及び（Ｄ´）を同一鎖状に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）が連結した一本鎖鋳型核酸である。ただし、図７Ａ（ｇ）に示すΩ中間体は、さらに、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｅ）及び（Ｅ´）を同一鎖状に含む折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）が連結している点が、図５Ａ（ｇ）のΩ中間体と異なる。前記折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含むこと以外は、図５Ａ（ｇ）のΩ中間体と同様である。
【００５３】
前記（Ａ１）工程（図７Ａ（ａ）〜（ｇ））において、図７Ａ（ａ）〜（ｃ）（第一プライマーの鋳型核酸へのハイブリダイズ、伸長反応、及び、前記第一プライマーの伸長鎖（第１鎖）の遊離）は、図５Ａ（ａ）〜（ｃ）と同じである。図７Ａの第一プライマー３Ｆの配列は、図５Ａの第一プライマー２Ｆと同一である。
【００５４】
次に、図７Ａ（ｄ）〜（ｇ）に示すように、折り返し配列を含まない第二プライマー２Ｒに代えて折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含む第二プライマー３Ｒを用いること以外は、図５Ａ（ｄ）〜（ｇ）と同様にして、図７Ａ（ｇ）に示す一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）を形成する。
【００５５】
次に、図７Ａ（ｈ）〜図７Ｂ（ｉ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー３Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる（（Ａ２）工程）。この伸長反応が、前記５´側ステム配列（Ｃ）まで達すると、図７Ｂ（ｉ）に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）を鋳型とした伸長反応が、鎖置換反応を伴って起こる。この後、同図（ｊ´）に示すように、前記Ω中間体の折り返し配列（Ｅ´−Ｅ）の５´末端までそのまま伸長反応が進む場合は、完全相補なアンプリコン２本鎖DNAが生成される（同図（ｋ´））。
【００５６】
一方、タンデムなアンプリコン配列を形成する場合は、図７Ｂ（ｉ）の点線矢印に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に連結した前記折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）を介することなく、直接、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端から前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端にかけて連続して続行する（（Ａ３−２）工程、Ｎｉｃｋ乗り換え工程）。なお、前記Ｎｉｃｋ乗り換え工程においては、例えば、前記５´側ステム配列の途中から折り返し配列の３´末端にかけてプライマー伸長反応が進んでもよいし、その他、５´側ステムの５´末端に連結している折り返し配列の途中又は前記折り返し配列の５´末端から前記３´側ステム配列に連結している折り返し配列の３´末端にかけてプライマー伸長反応が進んでもよい。そして、同図（ｊ）〜（ｌ）に示すように、同図（ｉ）（前記（Ａ３−２）工程）の前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、図７Ａ（ｈ）〜図７Ｂ（ｉ）（前記（Ａ２）工程）で形成された一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする（（Ａ４）工程）。そして、前記（Ａ４）工程のプライマー伸長反応を、図７Ｂ（ｌ）に示す前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止する（（Ａ５）工程）。ただし、前記プライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする反応は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止するが、伸長反応自体は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端を超えて前記Ω中間体の折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）の５´末端まで進むことになる。これにより、前記プライマー伸長鎖は、アンプリコン配列が二つ順方向に連結された（タンデムな）２倍体となる（図７Ｂ（ｍ）又は（ｎ）の上側の鎖）。さらに、図７Ｂ（ｍ）及び（ｎ）に示すように、前記（Ａ４）工程で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）の前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端を伸長させる（（Ａ６）工程）。この伸長反応により、図７Ｂ（ｎ）に示すように、前記プライマー伸長鎖に相補的な鎖（同図の下側の鎖）が形成され、前記プライマー伸長鎖及びそれに相補的な鎖からなる完全な二本鎖が形成される。なお、５´側ステムの５´末端から折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端への連続したプライマー伸長反応は、前述のニック乗り換え反応と同様のメカニズムで起きる。
【００５７】
なお、図７Ａ及び７Ｂでは、前記（Ａ３−２）工程及び前記（Ａ４）工程を１回のみ行うことで、タンデムな２倍体を形成する例を示した。これに対し、前記（Ａ３−２）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返す以外は同様にすることで、３倍体以上のタンデムな鎖を形成することもできる。すなわち、前記（Ａ４）工程後、前記（Ａ３−２）工程に戻り、前記（Ａ３−２）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返したところで前記（Ａ５）工程及び前記（Ａ６）工程に進み、３倍体以上のタンデムな鎖を形成しても良い。
【００５８】
次に、図８Ａ〜９Ｃを用いて、前記第二の合成反応について説明する。
【００５９】
図８Ａ及び８Ｂに、前記第二の合成反応の一例を示す。この反応は、片方のプライマーのみが折り返し配列を含む、図２と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む第一プライマー２Ｆと、折り返し配列を含まない第二プライマー２Ｒとを含む。なお、図８Ａ及び８Ｂにおいて、図２と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
【００６０】
まず、図８Ａ（ａ）〜（ｉ）により形成した相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）を、図８Ｂ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図８Ｂ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。図８Ａ（ａ）〜（ｇ）（Ω中間体の形成）までは、図５Ａ（ａ）〜（ｇ）（前記第一の合成反応）と全く同じである。次に、図８Ａ（ｈ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー２Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる。この伸長反応は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止し、同図（ｉ）に示すように、前記Ω中間体と前記プライマーの伸長鎖とからなる相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）が形成される。このアンプリコンは、図示のとおり、３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ）及び（Ｄ´）を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む一本鎖核酸（図８Ａ（ｉ）の下側の鎖）と、前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸（同図の上側の鎖）とからなる二重鎖である。なお、第二のプライマー２Ｒが反応起点となった場合にも、同様の反応過程でアンプリコンが形成される。
【００６１】
図８Ａ（ｉ）のアンプリコン（図８Ｂ（ｉ）と同一）からは、図８Ｂに示すように、二通りの反応経路で、前記Ω中間体又はその相補鎖が順方向に連結された（タンデムな）増幅産物が形成される。一方の反応経路は、図８Ｂ（ｊ）〜（ｌ）に示したように、前記二本鎖アンプリコン（図８Ｂ（ｉ））の分子内で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。もう一方の反応経路は、図８Ｂ（ｊ´）〜（ｌ´）に示したように、二分子の前記二本鎖アンプリコン間で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。すなわち、まず、前記アンプリコンを、図８Ｂ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図８Ｂ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。つぎに、前記二本鎖アンプリコンが、同図（ｊ）〜（ｋ）に示すように、前記アンプリコンの分子内で、又は、同図（ｊ´）〜（ｋ´）に示すように、２分子間の前記アンプリコンの間で、５´末端配列（Ｃ）が他の鎖の配列（Ｃ´）にハイブリダイズする（Tail置換）。このTail置換が起きた際、同図（ｌ）および（ｌ´）に示すように、それぞれの末端の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の折りたたみが起きる。これにより、３´末端の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）における配列Ｄの３´末端から、逆側の鎖を鋳型とする組み換え型伸長が起きる。この伸長反応により、新しく合成された伸長鎖が生成する（同図（ｍ））。図８Ｂ（ｌ）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｃ１）の二重鎖（図８Ｂ（ｊ））の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｃ２）工程）に該当する。図８Ｂ（ｌ´）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｂ１）の二つの二重鎖（図８Ｂ（ｊ´））の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｂ２）工程）に該当する。なお、これらの伸長反応は、前記３´末端の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）から自身の配列を鋳型にするスイッチバック伸長ではない。
【００６２】
さらに、同図（ｎ）に示すように、新しく合成された伸長鎖の相補鎖の３´末端部位から、逆側の鎖を鋳型とする伸長反応が起きる。その結果、前記アンプリコンが順方向に連結した（タンデムな）二本鎖が形成される（同図（ｏ））。この図８Ｂ（ｎ）から（ｏ）にかけての反応は、前記工程（Ｂ２）又は（Ｃ２）の部分的二重鎖（同図（ｍ））において、前記相補的な一本鎖核酸（同図（ｍ）の上側の鎖）の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応（同図（ｎ））により、完全二重鎖（同図（ｏ））を形成する工程（（Ｂ３）工程又は（Ｃ３）工程）に該当する。
【００６３】
次に、図９Ａ〜９Ｃに、前記第二の合成反応の別の例を示す。この反応は、両方のプライマーが折り返し配列を含む、図３と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む第一プライマー３Ｆと、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含む。なお、図９Ａ〜９Ｃにおいて、図３と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
【００６４】
まず、図９Ａ（ａ）〜（ｉ）により形成した相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）を、図９Ｃ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図９Ｃ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。図９Ａ（ａ）〜（ｇ）（Ω中間体の形成）までは、図７Ａ（ａ）〜（ｇ）（前記第一の合成反応）と全く同じである。次に、同図（ｈ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー３Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる。この伸長反応は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に連結された折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）の５´末端で停止し、図９Ａ（ｉ）に示すように、前記Ω中間体と前記プライマーの伸長鎖とからなる相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）が形成される。このアンプリコンは、図示のとおり、３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ）及び（Ｄ´）を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む一本鎖核酸（図９Ａ（ｉ）の下側の鎖）と、前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸（同図の上側の鎖）とからなる二重鎖である。なお、第二のプライマー３Ｒが反応起点となった場合にも、同様の反応過程でアンプリコンが形成される。
【００６５】
図９Ａ（ｉ）以降は、図９Ｂ又は９Ｃのいずれかで示される二通りの反応経路が考えられる。一方の反応経路は、図９Ｂに示すように、類似したパリンドローム配列を有する折り返しを用いた経路である。具体的には、図９Ａ（ｉ）の二本鎖アンプリコンの折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）及び（Ｅ−Ｅ´）が、類似したパリンドローム配列である場合の経路である。まず、追加図９Ｂ（ｐ）に示すように、二分子の前記二本鎖アンプリコン間で、前記類似したパリンドローム配列を有するヘテロな折り返し（Ｄ−Ｄ´）及び（Ｅ−Ｅ´）が、互いにハイブリダイズする。このようにして３´末端を有する折り返し同士が互いにハイブリダイズした場合のみ、次の段階（同図（ｑ））に進む。次に、同図（ｑ）〜（ｒ）に示すように、互いにハイブリダイズした折り返し配列の３´末端を起点に鎖置換伸長反応が起きる。これにより、同図（ｒ）に示すように、鎖置換伸長反応により順方向に前記アンプリコンが連結された（タンデムな）二本鎖核酸が生じる。このときに、前記鎖置換伸長反応により遊離した一本鎖ＤＮＡはΩ中間体となる。
【００６６】
他方の反応経路は、図９Ｃに示すように、前記二本鎖アンプリコンの配列（Ｃ）及びそれに相補的な配列（Ｃ´）（Tail配列）間で組み換えハイブリダイゼーションが生じる経路である。この反応経路は、同図に示すように、さらに二通りの反応経路に分かれる。すなわち、一方の反応経路は、図９Ｃ（ｊ）〜（ｌ）に示したように、図９Ｃ（ｉ）で表される前記二本鎖アンプリコン（図９Ａ（ｉ）と同一）の分子内で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。もう一方の反応経路は、図９Ｃ（ｊ´）〜（ｌ´）に示したように、二分子の前記二本鎖アンプリコン間で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。すなわち、まず、前記アンプリコンを、図９Ｃ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図９Ｃ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。つぎに、前記二本鎖アンプリコンが、同図（ｊ）〜（ｋ）に示すように、前記アンプリコンの分子内で、又は、同図（ｊ´）〜（ｋ´）に示すように、２分子間の前記アンプリコンの間で、配列（Ｃ）が他の鎖の配列（Ｃ´）にハイブリダイズする（Tail置換）。このTail置換が起きた際、同図（ｌ）および（ｌ´）に示すように、それぞれの末端の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）又は（Ｅ−Ｅ´）の折りたたみが起きる。これにより、３´末端の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）における配列Ｄ又は（Ｅ−Ｅ´）における配列Ｅの３´末端から、逆側の鎖を鋳型とする組み換え型伸長が起きる。この伸長反応により、新しく合成された伸長鎖が生成する（同図（ｍ））。図９Ｃ（ｌ）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｃ１）の二重鎖（図９Ｃ（ｊ））の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｃ２）工程）に該当する。図９Ｃ（ｌ´）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｂ１）の二つの二重鎖（図９Ｃ（ｊ´））の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｂ２）工程）に該当する。なお、これらの伸長反応は、前記３´末端の折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）又は（Ｅ−Ｅ´）から自身の配列を鋳型にするスイッチバック伸長ではない。
【００６７】
さらに、同図（ｎ）に示すように、遊離した折り返し配列（Ｅ−Ｅ´）の３´折り返し部位から、逆側の鎖を鋳型とする組換え型伸長反応が起きる。その結果、前記アンプリコンの連結部分でヘテロな折り返し同士がハンマーヘッド構造を成した増幅産物が形成される（同図（ｏ））。この図９Ｂ（ｎ）から（ｏ）にかけての反応は、前記工程（Ｂ２）又は（Ｃ２）の部分的二重鎖（同図（ｍ））において、前記相補的な一本鎖核酸（同図（ｍ）の上側の鎖）の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応（同図（ｎ））により、完全二重鎖（同図（ｏ））を形成する工程（（Ｂ３）工程又は（Ｃ３）工程）に該当する。
【００６８】
以上、本発明の核酸の合成方法における第一及び第二の合成反応について説明した。ただし、本発明のプライマーセットを用いた等温増幅方法は、これらの本発明の合成反応を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００６９】
本発明のプライマーセットにおいて、図１０に示すように、第一プライマーは、配列（Ａ´）と配列（Ｃ）との間に介在配列（Ｇ）を持っていてもよい。介在配列（Ｇ）の長さは、例えば、１〜３０塩基、好ましくは、１〜２０塩基、より好ましくは、１〜１０塩基である。また、本発明のプライマーセットにおいて、図１０に示すように、第一プライマーは、配列（Ｃ）と折返し配列（Ｄ−Ｄ´）との間に介在配列（Ｈ）を持っていてもよい。介在配列（Ｈ）の長さは、例えば、１〜３０塩基、好ましくは、１〜２０塩基、より好ましくは、１〜１０塩基である。
【００７０】
本発明によるプライマーセットは、第一プライマーおよび第二プライマー以外に、第三プライマーを含むものとすることができる。第三プライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
【００７１】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００７２】
第一プライマーおよび第二プライマーにより標的核酸が増幅された場合には、例えば、第三プライマーは、前記標的核酸の増幅による増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００７３】
第三プライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三プライマーを同時に用いてもよい。これら第三プライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三プライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００塩基、より好ましくは５〜５０塩基、さらに好ましくは７〜３０塩基である。
【００７４】
第三プライマーは、第一プライマーおよび第二プライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三プライマーは、第一プライマーおよび第二プライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三プライマーの増幅反応液への添加量は、第一プライマーおよび第二プライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００７５】
第三プライマーとしては、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
【００７６】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
【００７７】
また、前記プライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
【００７８】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Applied  Biosystem  Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００７９】
核酸増幅反応において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸、または核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよく、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料もしくはウイルス由来試料から調製することができる。
【００８０】
鋳型核酸または核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
【００８１】
より具体的には、前記鋳型核酸または前記核酸試料としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（denaturing）を行って一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００８２】
前記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
【００８３】
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行うこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００８４】
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand  displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus  stearothermophilus、本明細書において「Ｂ.ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus  caldotenax、本明細書において「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent  DNAポリメラーゼ、Vent  (Exo-)  DNAポリメラーゼ、DeepVent  DNAポリメラーゼ、DeepVent  (Exo-)  DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq  DNAポリメラーゼ、Pfu  DNAポリメラーゼ、Pfu  turbo  DNAポリメラーゼ、KOD  DNAポリメラーゼ、9°Nm  DNAポリメラーゼ、Therminater  DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００８５】
さらに、前記核酸増幅反応においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行うことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの上述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
【００８６】
核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl  sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００８７】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、二本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００８８】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００８９】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００９０】
本発明によるプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
【００９１】
一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００９２】
前記の核酸増幅反応においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。
【００９３】
前記の核酸増幅反応においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸（標的核酸配列）とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、isoG，isoC（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92,  6329-6333,  1995）等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、前記核酸増幅反応は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）が失活する可能性が低い。従って、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Y188L/E478Q変異型ＨＩＶ  Ｉ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°N  DNAポリメラーゼ、HotTub  DNAポリメラーゼ等が好適である（Michael  Sismour  1  et  al.,  Biochemistry  42,  No.28,  8598,  2003／米国特許第６６１７１０６号明細書、Michael  J.  Lutz  et  al.,  Bioorganic  &  Medical  Chemistry  letters  8,  1149-1152,  1998等）。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロースなど、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。
【００９４】
本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明による核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome  Black  T、Hydroxy  Naphthol  Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
【００９５】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、増幅産物の生成に起因する固相担体の凝集を観察することによって検出することもできる。このような検出を行う場合には、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、固相担体または固相担体と結合可能な部位を含んでなるものとされる。固相担体または固相担体と結合可能な部位は、プライマーの３’末端部、５’末端部、中央領域など、いかなる部分に導入されたものであってもよいが、好ましくは５’末端部に導入されたものとされる。あるいは、核酸増幅反応において用いられる基質を、固相担体または固相担体と結合可能な部位を含んでなるものとしてもよい。
【００９６】
本発明に用いられる固相担体としては、核酸増幅反応に用いられる反応溶液に不溶性の担体、または増幅の前後において液相から固相（ゲル相）もしくは固相（ゲル相）から液相に性状が変化する相転移性担体であれば、いずれも使用することが可能である。好ましい固相担体としては、水不溶性有機高分子担体、水不溶性無機高分子担体、合成高分子担体、相転移性担体、金属コロイド、磁性粒子等が挙げられ、さらには、溶媒不溶性有機高分子担体、溶媒不溶性無機高分子担体、溶媒可溶性高分子担体、ゲル高分子担体等が挙げられる。さらに、水不溶性有機高分子としては、例えば、多孔質シリカ、多孔質ガラス、珪藻土、セライトなどの珪素含有物質、ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト、アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体、メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体、ゲル状粒子、染料ゾル等が挙げられる。水不溶性無機高分子としては、例えば、酸化アルミニウム、酸化チタン、セラミック粒子等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。金属コロイドとしては、金コロイド等が挙げられる。磁性粒子としては、磁性酸化鉄のビーズ、磁性酸化鉄の微粉砕粒子を表面に有する単分散、超常磁性粒子（特表平４−５０１９５９号公報）、重合性シラン被膜によって覆われた超常磁性酸化鉄を有する磁気応答粒子（特公平７−６９８６号公報）、有機ポリマー中に封入された微粉末状の磁化可能な粒子等が挙げられる。磁性化された固相担体は、固体と液体との分離を磁力を利用して簡単に行うことができる。固相担体の形状としては、粒子、膜、繊維状、フィルター等が挙げられる。固相担体の形状としては粒子が特に好ましく、その表面は多孔質または非多孔質のいずれであってもよい。特に好ましい固相担体としては、合成高分子担体が水などに均一に分散されたラテックス、金コロイドなどの金属コロイド粒子、マグネットビーズなどの磁性粒子等が挙げられる。
【００９７】
プライマーまたは基質の固相担体への固定化は当業者に公知の方法によって行うことができ、物理的な結合または化学的な結合のいずれによる方法であってもよい。プライマーまたは基質の固相担体への固定化は、例えば、一般的にプライマーやプローブなどのオリゴヌクレオチドを標識化しうる物質と、これに結合可能な物質を結合させた固相担体とを組み合わせて行うことができる。このような目的で用いられる物質の組み合わせは、当技術分野において周知のものを用いることができ、例えば、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの組み合わせ、抗原とこれに結合しうる抗体との組み合わせ、リガンドとこれに結合しうるレセプターとの組み合わせ、相互にハイブリダイズする２つの核酸の組み合わせ等が挙げられる。具体的には、例えば、ビオチンで標識したプライマーまたは基質を、アビジンもしくはストレプトアビジンで表面をコートした固相担体に結合させることにより、プライマーまたは基質を固相担体に固定化することができる。前記抗原としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＤＮＰ等のハプテンが挙げられ、これらと結合しうる抗体としては、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ＤＩＧ抗体、抗ＤＮＰ抗体等の抗体が挙げられる。また、これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。特に、ビオチンとストレプトアビジンとの結合は特異性が高く、結合効率も良好であるため、これらの組み合わせは特に好ましい。ビオチン、ハプテン、リガンド等の標識物質は、いずれも単独で、あるいは必要であれば複数の組み合わせで、公知の手段（特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−１４８７９８号公報、および特開昭５９−２０４２００号公報を参照のこと）により、プライマーの５’末端部に導入することができる。
【００９８】
本発明に用いられる固相担体と結合可能な部位（または基）は、プライマーまたは基質の固相担体への固定化のために用いられる上述の方法に従って選択することができ、従って、固相担体との物理的な結合を可能とするものまたは化学的な結合を可能とするもののいずれであってもよいが、好ましくは特異的結合を可能とするものとされる。このような固相担体と結合可能な部位としては、上述のような、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、リガンド、レセプター、核酸、タンパク質などが挙げられ、好ましくはビオチンまたはストレプトアビジンとされ、より好ましくはビオチンとされる。このような部位を含むプライマーまたは基質を用いることにより、核酸増幅反応を行った後に、増幅産物に上記固相担体を結合させることが可能となる。この場合において用いられる固相担体は、必要に応じて、プライマーまたは基質に含まれる前記部位の結合相手を含むものとすることができる。このような結合相手は、プライマーまたは基質に含まれる前記部位との結合が可能な形で存在するものであり、好ましくは固相担体の表面上に存在するものとされ、より好ましくは固相担体の表面上に塗布されたものとされる。
【００９９】
本発明の一つの実施態様によれば、複数の標的核酸のそれぞれについて本発明によるプライマーセットを用意し、これら複数のプライマーセットを相互に識別可能な形で固相担体に固定化し、これらの固定化プライマーセットを用いて核酸増幅反応が行われる。これにより、複数の標的核酸を同時に増幅し、それぞれについての増幅産物を識別可能な形で検出することが可能となる。増幅産物の検出は、インターカレーターなどを用いて行うことができる。例えば、平面状の固相担体上において、複数のプライマーをそれぞれ特定の位置に固定化しておくことにより、核酸増幅反応および増幅産物の検出の後に、増幅産物が検出された位置によって、増幅された標的核酸を特定することができる。また、このような目的に使用可能な固相担体は、上記の平面状の固相担体のみならず、相互に識別可能なビーズ表面（米国特許第６０４６８０７号明細書および米国特許第６０５７１０７号明細書）、繊維状の担体にそれぞれのプライマーセットを固相化したものを束ねた後に薄片に切断して作製される準平板担体（特開２０００−２４５４６０号公報）等の、当技術分野において公知のものを使用することができる。
【０１００】
本発明による核酸増幅法によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅後、増幅断片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブクローニングすることも可能である。さらに、前記増幅断片は、ＲＦＬＰのように、制限酵素処理することも可能であり、遺伝子検査の分野においても広く利用することができる。また、前記増幅断片は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むものとして生成させることができ、これにより、増幅断片から直接ＲＮＡを合成することが可能となる。このようにして合成されたＲＮＡは、ＲＮＡプローブ、ｓｉＲＮＡ等として使用することもできる。
【０１０１】
さらに、本発明による核酸増幅法においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を基質として使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。さらには、それらビオチンや標識物質などの何らかの構造を介して増幅産物の有無を確認することも可能である。
【０１０２】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、制限酵素認識部位を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。すなわち、プライマー内の制限酵素認識部位に対応する制限酵素により増幅産物中にニックが生じるため、このニックを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成反応を生じさせることが可能になる。この方法は、基本的には先行技術として記載したＳＤＡ法の原理に基づく。
【０１０３】
また、本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。この方法は、基本的には先行技術として記載したＮＡＳＢＡ法の原理に基づく。
【０１０４】
さらに、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法またはＳＤＡ法において利用される「アウタープライマー」を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。アウタープライマーとしては、鋳型核酸上において標的核酸配列の外側に位置する部分に相補鎖合成起点を提供しうるプライマーを用いることができる。
【０１０５】
本発明による核酸増幅法により、ＤＮＡチップに固定するための一本鎖核酸、塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡプローブ、長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマー等を簡便かつ迅速に作製することができる。また、本発明による核酸増幅法により、目的に応じて、標的核酸のセンス配列のみまたはアンチセンス配列のみを選択的に増幅することも可能である。
【０１０６】
本発明による核酸増幅法により調製された一本鎖核酸は、ＤＮＡチップ上に固定するためのＤＮＡ断片として使用することができる。すなわち、本発明による核酸増幅法は、ＤＮＡチップ作製において固定化するためのＤＮＡ鎖を調製する方法にも応用が可能である。また、プライマーの５’末端をあらかじめＤＮＡチップ上に固定しておき、そのチップ上で核酸増幅を行い、ＤＮＡチップを作製することも可能である。また、その核酸増幅を行う前に、あらかじめ増幅産物にハイブリダイズする蛍光標識プローブを反応液に添加しておくことにより、ＤＮＡチップ上で核酸増幅を行いながら、リアルタイムに増幅産物を検出することが可能となる。
【０１０７】
本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を利用して、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を検出（判定）することが可能である。この目的のためには、変異部位が、前記配列（Ａ）または前記配列（Ｂ）に含まれるようにプライマーセットを設計することができ、これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を検出（判定）することが可能となる。
【０１０８】
本発明による変異検出法では、目的とする変異を有する核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が変異の存在を示し、増幅産物の不在または減少が変異の不在を示す。一方で、目的とする変異を有さない核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が変異の不在を示し、増幅産物の不在または減少が変異の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを意味する。
【０１０９】
本発明において「変異」とは、核酸配列中に対照核酸配列とは異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対）が存在することを意味する。本発明において、「変異」は、塩基の欠失、挿入、付加、置換を含む。また、本発明において「対照核酸」とは、ある特定の塩基配列に関して、標準的な塩基配列、例えば標準的な遺伝子型、であるとされる野生型（wild  type、正常型(normal  type)とも称される。）の配列を有する核酸をいう。これに対し、「被検核酸」とは、本発明による変異検出法において、対照核酸と異なる塩基（変異）を有するか否かを調べる対象となる核酸を意味し、換言すれば、核酸試料中に存在する核酸であって、変異に係る塩基を除いて対照核酸と同一の配列を有するものを意味する。さらに、本発明において「変異に係る塩基」または「変異に係るヌクレオチド残基」とは、核酸中における変異の部位に存在する塩基またはヌクレオチド残基を意味し、従って、対照核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基および変異型の核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基のどちらをも意味する。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出する場合において、変異を有することが疑われる患者の遺伝子は被検核酸であり、この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。
【０１１０】
上記の被検核酸および対照核酸は、天然物由来の核酸であっても、人工的に合成された核酸であってもよい。本発明において用いられる「核酸」という用語は、任意の未修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。被検核酸および対照核酸は、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどのＤＮＡ、またはｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、合成ＲＮＡなどのＲＮＡである。また、本発明において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、便宜的に、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ-オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。被検核酸および対照核酸は、試験実施者が自由に選択することができる。さらに、検出を行う際には、これらの核酸が混在していてもよい。
【０１１１】
被検核酸を含む核酸試料は、被検体、例えばヒトまたは非ヒト動物から取得することができる。その場合には、該被検体からの所望の組織、臓器および細胞などのサンプルから当技術分野において公知の方法により核酸を抽出することができ、必要に応じて、抽出の後に核酸断片の大きさおよび精製純度などの条件を適度な状態に調整することもできる。その後、さらに、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅反応を行うことにより、核酸試料中の被検核酸を増幅してもよい。
【０１１２】
被検核酸および対照核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明において用いられる「二本鎖核酸」という用語は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡのいずれをも意味する。二本鎖核酸は、そのまま核酸試料として用いてもよいし、ファージまたはプラスミドなどのベクターで増幅されたものを用いてもよい。
【実施例】
【０１１３】
次に、本発明の実施例について説明する。但し、本発明は、下記の実施例により制限及び限定されない。【０１１４】
（実施例１）
本実施例では、第一プライマー及び第二プライマーのいずれか一方に折返し配列（Ｄ−Ｄ´）が付加されている場合、及び、第一プライマーに折返し配列（Ｄ−Ｄ´）が付加され、第二プライマーに折返し配列（Ｅ−Ｅ´）が付加されている場合の、二種類のプライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅した。【０１１５】
容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および１２ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液に、以下に示す配列のForwardプライマー（Forwardプライマー１：配列番号1、又はForwardプライマー２：配列番号２）、およびReverseプライマー（Reverseプライマー１：配列番号３、又はReverseプライマー２：配列番号４）を各2μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。なお、下記各プライマーにおいて、下線部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示した。【０１１６】
2013035875.tif 000003
【０１１７】
鋳型DNAとして、インフルエンザA(H3N2)のRNAゲノムN2分節のcDNAの部分配列（配列番号５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に２×１０４コピー加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００p（アジレント製）にて６０℃、60分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを3%(w/v)  NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。【０１１８】
Influenza  A(H3N2)  N2  segment,  partial  cDNA（配列番号５）
401  bp
5’-CCAGGAGTCAGAATGCGTTTGTATCAATGGAACTTGTACAGTAGTAATGACTGATGGGAGTGCTTCAGGAAAAGCTGATACTAAAATACTATTCATTGAGGAGGGGAAAATCGTTCATACTAGCACATTGTCAGGAAGTGCTCAGCATGTCGAGGAGTGCTCCTGCTATCCTCGATATCCTGGTGTCAGATGTGTCTGCAGAGACAACTGGAAAGGCTCCAATAGGCCCATCGTAGATATAAACATAAAGGATCATAGCATTGTTTCCAGTTATGTGTGTTCAGGACTTGTTGGAGACACACCCAGAAAAAACGACAGCTCCAGCAGTAGCCATTGTTTGGATCCTAACAATGAAGAAGGTGGTCATGGAGTGAAAGGCTGGGCCTTTGATGATGGAAATG-3’【０１１９】
（結果１：Forwardプライマーのみに折り返し配列を有するプライマーを用いた場合の等温反応結果）
図１３は、Forwardプライマー１（配列番号１）およびReverseプライマー１（配列番号３）を用いた場合の、鋳型DNAを加えたもの（○）と加えないもの（●）それぞれの蛍光増幅曲線（○と●の意味は以下の実施例において同じ）を示す。図示のように、鋳型DNAを加えたものにおいて、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、図１４は、図１３で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。図１４に示すように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが観察され、等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。【０１２０】
（結果２：Forwardプライマー及びReverseプライマーの両方に異なる折り返し配列を有するプライマーを用いた場合の等温反応結果）
図１５は、Forwardプライマー２（配列番号２）およびReverseプライマー２（配列番号４）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示す。図１５に示すように、前記結果１と同様に、鋳型DNAを加えたものにおいて、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、図１６は、図１５で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。図１６に示すように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが観察された。ただし、図１４におけるバンドパターンと比較すると、バンド周期のパターンが異なっており、前記結果１の場合と異なる増幅パターンを有する等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。【０１２１】
（実施例２）
本実施例では、第一プライマー及び第二プライマーの双方において、折返し配列（Ｄ−Ｄ´）又は（Ｅ−Ｅ´）と共通配列（Ｃ）との間に、介在配列（Ｈ）を挿入した場合で、標的核酸配列を等温で増幅反応した。また、第一プライマー及び第二プライマーにおいて、介在配列（Ｈ）は異なるようにした。【０１２２】
プライマー以外の反応組成液は、前述の実施例１と同様にした。すなわち、容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および１２ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液とし、プライマーは、以下に示す配列のForwardプライマー（Forwardプライマー３：配列番号６）、およびReverseプライマー（Reverseプライマー３：配列番号７）を各2μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。なお、下記各プライマーにおいて、下線（一重下線）部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列、更に二重下線部は介在配列を示した。【０１２３】
2013035875.tif 000004
【０１２４】
また、前述の実施例１と同様に、鋳型DNAとしてインフルエンザA(H3N2)のRNAゲノムN2分節のcDNAの部分配列（配列番号５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に２×１０４コピー加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００p（アジレント製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを3%(w/v)  NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。【０１２５】
（結果３：介在配列（Ｈ）を持つプライマーを用いた場合の等温反応結果）
図１７は、Forwardプライマー３（配列番号６）、およびReverseプライマー３（配列番号７）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示す。図１７に示すように、鋳型DNAを加えたものにおいて、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図１８は、図１７で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。図１８に示すように、短鎖から長鎖に渡る周期的な２本ずつのバンドパターンが観察され、等温核酸増幅が反応溶液中で起きていることが明らかとなった。【０１２６】
（実施例３：第三プライマーの効果）
本実施例では、標的核酸において第一プライマー及び第二プライマーのアニーリング領域間に相補的に設計した第三プライマーが、本発明における等温増幅反応を向上させる効果について示す。【０１２７】
まず、本実施例で用いた第一プライマー及び第二プライマーの双方は、折返し配列（Ｄ−Ｄ´）又は（Ｅ−Ｅ´）と共通配列（Ｃ）との間に、介在配列（Ｈ）を挿入したものを使用した。プライマー以外の反応組成液は、前述の実施例１と同様にした。すなわち、容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および１２ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液とした。プライマーは、以下に示す配列のForwardプライマー（Forwardプライマー４：配列番号８）を第一プライマー、およびReverseプライマー（Reverseプライマー４：配列番号９）を第二プライマーとして各2μMの濃度で加え、更に第三プライマーとして下記Boostプライマー（Boostプライマー１又は２：配列番号１０又は１１）を０．６６μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。なお、下記各プライマー配列において、下線（一重下線）部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列、更に二重下線部は介在配列を示した。【０１２８】
2013035875.tif 000005
【０１２９】
本実施例では、k-ras遺伝子を含む部分配列（配列番号１２）を標的配列とするため、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA(Promega社製  Human  Genomic  DNA,  Male;  Cat  #  G1471)を用いた。反応溶液中に前記ヒトゲノムDNAを10ng加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００p（アジレント製）にて６０℃、１００分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを3%(w/v)  NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。【０１３０】
Human  genome,  partial  DNA（配列番号１２）
401  bp
5’-TTTCATGATTGAATTTTGTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAAA-3’【０１３１】
（結果４：第三プライマーを用いた場合の等温反応結果）
図１９は、第一および第二プライマーとしてForwardプライマー４（配列番号８）およびReverseプライマー４（配列番号９）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示した。図２０〜２２は、第一および第二プライマーに更に第三プライマーを加えた場合の蛍光増幅曲線の結果であり、図２０の反応ではBoostプライマー1のみを、図２１の反応ではBoostプライマー２のみを、図２２の反応では、Boostプライマー1および２の両方を添加した結果である。【０１３２】
まず図１９の結果では、鋳型DNAを加えた場合、蛍光シグナルの増加が８０分以降に認められた。次にBoostプライマー１を加えた図２０の結果では、図１９の蛍光増幅曲線との違いが認められなかったものの、Boostプライマー２を加えた図２１の結果においては、鋳型DNAを加えた場合の蛍光シグナルの増加が50分以降に認められた。更に、Boostプライマー１および２を両方加えた図２２では、図２１の結果と同様の時間でシグナルが上昇する蛍光増幅曲線が認められた。なお、図２３は、図１９〜２２において蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果である。この結果より、蛍光シグナルが認められた鋳型DNAを加えた場合の反応溶液においては、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが増幅産物として観察され、等温核酸増幅が反応溶液中で起きていることが明らかとなった。また、Boostプライマー２、又はBoostプライマー１および２を両方加えた場合は、より長鎖の核酸増幅産物が増大している事が明らかとなった。この電気泳動結果と図１９〜２２の結果より、本実施例においては、第一および第二プライマーによって生じる等温核酸増幅は、Boostプライマー２が第三プライマーとして作用する事によって、その核酸増幅効率が著しく上昇する事が明らかとなった。【０１３３】
（実施例４）
本実施例における等温核酸増幅法は、２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、以下に示す配列のForwardプライマー５（配列番号１３）、およびReverseプライマー５（配列番号１４）を各２．５μＭの濃度で加えたものを反応溶液とした。尚、下記各プライマーにおいて、下線部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示した。【０１３４】
2013035875.tif 000006
【０１３５】
さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。また、短鎖鋳型DNAからの増幅には、Forwardプライマー５とReverseプライマー５のアニーリング配列とそれらに挟まれたB型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５、下線部）に相当する52-merのオリゴDNAを鋳型DNAとし、反応液中に前記鋳型DNAを６×１０３コピーとなる様に加えた。【０１３６】
Influenza  B  MP  segment,  partial  cDNA（配列番号１５）
740  bp
5’-AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTTGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCTTATCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAAAAGAAAGGCCTGATTCTGGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGCTACTATACTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTATGCGAGAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTCCAAAAGCTGGCAGAAGAGCTGCAAAGCAACATTGGAGTGCTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGGATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCCATGGG-3’【０１３７】
等温核酸増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度でのインキュベーションによって実施し、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅の有無を調べた。【０１３８】
増幅反応終了後、核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを4.5％(W/V)  NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。また、FluB cDNAプラスミドを鋳型とした増幅産物に関し、アガロース電気泳動で認められたDNAバンドを切り出し、Wizard  SV  Gel  and  PCR  Clean-Up  System（プロメガ社製）を用いてDNAを抽出した。その精製DNA断片の3’末端に、TAKARA  ExTaq  DNA  ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた60℃、10分間のインキュベーションによってA付加を行い、その３’A付加DNA断片をTOPO  TA  Cloning  Kit（ライフテクノロジーズ社製）を用いてTAクローニングした。得られたクローニング産物のインサート配列をBigDye  Terminator  Cycle  sequencing  kit  ver.1.1  およびABI3100-Avant(ライフテクノロジーズ社製)によって決定し、配列情報から増幅産物の一次構造を解析した。【０１３９】
（結果：Forwardプライマー及びReverseプライマーの両方に異なる折り返し配列を有するプライマーを用いた場合の等温増幅反応結果）
図２４では、Forwardプライマー５（配列番号１３）およびReverseプライマー５（配列番号１４）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAとしてFluB  cDNAを含むプラスミドを用いた場合（白丸）、および両プライマーのアニーリング配列とそれらに挟まれたFluBのターゲット領域のみで構成される52-merの一本鎖オリゴDNAを用いた場合(灰色四角)のどちらにおいても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（黒三角）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図２５は、図２４での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。同図からわかるように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが鋳型DNAを含む反応標品で観察され、等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。また、鋳型DNAが長鎖二本鎖となるプラスミドを供した場合と短鎖一本鎖オリゴDNAを供した場合ではバンドパターンの違いは認められず、同一の増幅反応が起きている事が明らかとなった。【０１４０】
図２５Ａにおいて矢印１および２で示したバンドに関し、各DNAの塩基配列を決定した結果を図２６に示した。図２５Ａにおいて矢印1に相当するDNAからは105  bpの塩基配列、矢印2に相当するDNAからは202  bpの塩基配列が得られ、アガロース電気泳動で認められたDNA断片長とほぼ一致した。各DNA断片の一次構造を解析した結果、図２５Ａにおいて矢印1に相当するDNAは、鋳型DNAからForwardおよびReverseプライマーに挟まれたアンプリコン配列が得られていることが判明した(図２６Ａ)。さらに、図２５Ａにおいて矢印2に相当するDNAは、アンプリコン配列が2つ順方向(タンデム)に連結された配列が認められ、そのアンプリコンの連結部位では片方のプライマー折り返し配列のみが含まれる形状を成すことが判明した(図２６Ｂ)。【０１４１】
（実施例５）
本実施例では、本発明の等温核酸増幅法におけるプライマーの標的配列への特異性について検討した。２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０  ｍＭ硫酸アンモニウム、８  ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、以下に示すForwardプライマー６（配列番号１６）、およびReverseプライマー６（配列番号１７）を各2.5μMの濃度で加えた。尚、下記各プライマーにおいて、下線部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示した。【０１４２】
2013035875.tif 000007
【０１４３】
さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。また、上記鋳型DNAと共に、１反応液あたり20ngのヒトゲノムDNA（Human  Genomic  DNA,  Male、プロメガ社製、１０３コピー相当）を添加した反応溶液を調製した。【０１４４】
上記反応用液を用いた等温核酸増幅反応、増幅反応産物の確認は、実施例４と同様の方法によって実施した。【０１４５】
（結果：Forwardプライマー及びReverseプライマーの両方に異なる折り返し配列を有するプライマーを用いた等温核酸増幅における鋳型DNA上の標的部位への特異性）
図２７は、Forwardプライマー６（配列番号１６）およびReverseプライマー６（配列番号１７）をプライマーとして用い、その標的配列を含むFluB  cDNAプラスミドを鋳型DNAとして加えると共に、ヒトゲノムDNAを添加した場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAを加えたもの（白丸）、およびヒトゲノムDNAを更に添加した場合(灰色四角)のどちらにおいても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（灰色菱形）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、ヒトゲノムDNAのみを鋳型として加えた場合(黒三角)では蛍光シグナルの増加は認められなかった。また図２８Ａは、図２７での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。同図からわかるように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが、FluB  cDNAプラスミドの鋳型DNAを含む反応標品で観察され、鋳型DNAを含まないもしくはヒトゲノムDNAのみを含んだ反応溶液では、顕著な増幅パターンは認められなかった。よって、本実施例において使用したプライマーは等温核酸増幅を果たし、FluB  cDNAプラスミドを鋳型DNAとして特異的に認識していることが明らかとなった。【０１４６】
また、図２８Ｂにおいて矢印で示したバンドに関し、各DNAの塩基配列を決定した結果を図２９に示した。図２８Ｂにおいて矢印に相当するDNAからは105  bpの塩基配列が得られ、アガロース電気泳動で認められたDNA断片長とほぼ一致した。その一次配列構造を解析した結果、図２８Ｂにおいて矢印で示したDNAは、鋳型DNAからForwardおよびReverseプライマーに挟まれたアンプリコン配列を有しており、両プライマーの3’末端に相当する配列に挟まれた区間では、アニーリング領域から連続したFluBに特異的な配列が含まれている事が認められた。よって増幅産物の一次配列構造解析からも、本実施例で用いたプライマーの標的配列認識の特異性が証明された。【０１４７】
（実施例６）
本実施例では、本発明における等温核酸増幅法により、RNAを鋳型とした逆転写反応溶液からの直接的な等温核酸増幅が実施可能かについて検討した。実施例４で使用したFluB cDNAの部分配列を含むプラスミドDNAから、以下に示すFluB  cDNA増幅用プライマー（配列番号１８および１９）を用い、T7プロモータ配列を付加したFluB  cDNAの直鎖状二本鎖DNAをPCR法により作成した。このPCR産物とCUGA  T7  RNAポリメラーゼ（ニッポンジーンテク社製）を用いてin  vitro転写反応を行ない、反応溶液から酸性フェノール抽出法によって得られたRNAを本実施例における逆転写反応の鋳型RNAとした。【０１４８】
T7／FluB  cDNA増幅用Forwardプライマー７（配列番号１８）
39-mer
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGAAGCACGCACTTTC-3’
T7／FluB  cDNA増幅用Reverseプライマー７（配列番号１９）
20-mer
5’-CCCATGGAGCTCTGCTTTAG-3’【０１４９】
上記で調製したRNA  200  ngを逆転写反応液25μL（50  mM  Tris-HCl  [pH  8.3]、75  mM塩化カリウム、3  mM塩化マグネシウム、10  mM  DTT、200  unit  M-MLV  Reverse  transcriptase  [deletion  mutant,  RNaseH(-)、プロメガ社製]、逆転写用プライマー[配列番号２０]）中で４２℃、１時間反応させた。その後、M-MLV  Reverse  transcriptaseを失活させるため、９５℃で５分間保持した。【０１５０】
逆転写用プライマー（配列番号２０）
18-mer
5’-TGGACGTCTTCTCCTTTT-3’【０１５１】
上記逆転写反応液を1/4000希釈した溶液を、等温増幅反応溶液(試薬組成およびプライマーは実施例1に記載と同様)に1μL加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅の有無を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを4.5%  (W/V)  NuSieve  GTGアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。【０１５２】
（結果：RNAを鋳型とした逆転写反応溶液からの直接的な等温核酸増幅）
図３０は、Forwardプライマー５（配列番号１３）およびReverseプライマー６（配列番号１４）を用いた等温増幅反応において、本実施例にて作成した逆転写反応液の1/4000希釈液を添加した反応標品（白丸）、および実施例４と同様、FluB  cDNAプラスミドを鋳型DNAとして添加した場合（灰色四角）とを比較した結果である。結果、プラスミドを鋳型としたものに比べ、蛍光シグナルの立ち上がり時間に遅延はあるものの、逆転写反応液を添加した反応標品においても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（黒三角）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図３１は、図３０での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。結果、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが逆転写反応液を添加した反応標品においても、鋳型DNAを用いた場合と同様のパターンが観察され、同一の等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。【０１５３】
（実施例７）
本実施例では、本発明における等温核酸増幅法に供するプライマーの構造において、5’末端に位置する折り返し配列を、片方のプライマーのみ除去した場合の挙動について検討した。容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、以下に示すForwardプライマー８（配列番号２１）、および実施例５で使用したReverseプライマー６（配列番号１７）を各2.5μMの濃度で加えた。尚、下記プライマーにおいて、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示しており、Forwardプライマー８は、Forwardプライマー６（配列番号１６）の5’末端の折り返し配列（16  base）を除去した配列と同様の配列である。【０１５４】
2013035875.tif 000008
【０１５５】
さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。また、上記鋳型DNAと共に、１反応液あたり20ngのヒトゲノムDNA（Human  Genomic  DNA,  Male、プロメガ社製、１０３コピー相当）を添加した反応溶液を調製した。【０１５６】
上記反応用液を用いた等温核酸増幅反応、増幅反応産物の確認は、実施例４と同様の方法によって実施した。【０１５７】
（結果：片方のプライマーにおける5’末端折り返し配列を除去した場合の等温核酸増幅反応）
図３２は、5’末端に折り返し配列を含まないForwardプライマー８（配列番号２１）および5’末端に折り返し配列を含むReverseプライマー６（配列番号１７）をプライマーとして用い、その標的配列を含むFluB  cDNAプラスミドを鋳型DNAとして加えると共に、ヒトゲノムDNAを添加した場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAを加えたもの（白丸）、およびヒトゲノムDNAを更に添加した場合(灰色四角)のどちらにおいても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（灰色菱形）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、ヒトゲノムDNAのみを鋳型DNAのみに加えた場合(黒三角)では蛍光シグナルの増加は認められなかった。また図３３は、図３２での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。結果、短鎖から長鎖に渡るバンドパターンが、FluB  cDNAプラスミドの鋳型DNA含む反応標品で観察され、鋳型DNAを含まないもしくはヒトゲノムDNAのみを含んだ反応溶液では、顕著な増幅パターンは認められなかった。よって、プライマーの片方が5’末端を含まない場合においても、標的の鋳型DNAに対する等温核酸増幅を果たしていることが明らかとなった。但し、増幅産物として得られたバンドパターンを実施例５の結果（図２８）と比較すると、異なるバンドパターンが得られており、片側のプライマー5’末端折り返し配列を除去する事により、異なる増幅産物が得られる事が明らかとなった。【０１５８】
（実施例８）
本実施例における等温核酸増幅法は、２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR  Green  I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、実施例４で使用したForwardプライマー５（配列番号１３）、およびReverseプライマー８（配列番号２２）を各2.5μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。尚、下記プライマーにおいて、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示しており、Reverseプライマー８は、Reverseプライマー５（配列番号１４）の5’末端の折り返し配列（13base）を除去した配列と同様の配列である。【０１５９】
2013035875.tif 000009
【０１６０】
さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。【０１６１】
上記反応溶液を用いた等温核酸増幅反応、増幅反応産物の電気泳動、および増幅産物のシーケンス解析は、実施例４と同様の方法によって実施した。【０１６２】
（結果：片方のプライマーにおける5’末端折り返し配列を除去した場合の等温核酸増幅反応と増幅産物のシーケンス解析）
図３４は、5’末端に折り返し配列を含むForwardプライマー５（配列番号１３）および5’末端に折り返し配列を含まないReverseプライマー８（配列番号２２）をプライマーとして用い、その標的配列を含むFluB  cDNAプラスミドを鋳型DNAとして加えた場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAとしてFluB  cDNAを含むプラスミドを用いた場合（白丸）において、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（黒三角）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図３５は、図３４での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。結果、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが鋳型DNA含む反応標品で観察され、等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。【０１６３】
図３５において矢印１および２で示したバンドに関し、各DNAの塩基配列を決定した結果を図３６に示した。図３５において矢印1に相当するDNAからは92bpの塩基配列、矢印２に相当するDNAからは186bpの塩基配列が得られ、アガロース電気泳動で認められたDNA断片長とほぼ一致した。各DNA断片の一次構造を解析した結果、図３５において矢印1に相当するDNAは、鋳型DNAからForwardおよびReverseプライマーに挟まれたアンプリコン配列がコピーされた配列を有していることが判明した(図３６Ａ)。さらに、図３５において矢印２に相当するDNAは、アンプリコン配列が2つ順方向(タンデム)に、GT（グアニン、チミン）の2塩基を介して連結された配列が認められた（図３６Ｂ）。【０１６４】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。また、本願明細書中で文献名を示している全ての文献の記載内容は、それらの文献を参照することにより、本願明細書に組み込まれる。
【図１】
2013035875.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３６】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２８】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月26日(2013.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、
前記プライマーセットが、第一プライマー及び第二プライマーを含み、
前記第一プライマーが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、
前記第二プライマーが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、
さらに、前記第一プライマー及び第二プライマーが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むことを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含み、
前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ−Ｅ´）を含み、
前記配列（Ｄ−Ｄ´）及び前記配列（Ｅ−Ｅ´）が、互いに異なる配列であることを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
【請求項４】
さらに、第三プライマーを含み、前記第三プライマーは、前記標的核酸配列、前記標的核酸配列の相補配列、又は、前記第一プライマーの伸長鎖若しくは前記第二プライマーの伸長鎖にハイブリダイズし、かつ、前記第三プライマーのハイブリダイゼーションが、前記第一プライマー及び第二プライマーと競合しないことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
プライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記プライマーセットとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする方法。
【請求項６】
プライマーセットを用いた等温増幅方法により核酸試料中の核酸配列における変異を検出する方法であって、
前記プライマーセットとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用い、
前記プライマーセットが、前記変異を有する核酸配列又は前記変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、前記変異に係るヌクレオチド残基が、第一プライマーの相補配列（Ａ）又は第二プライマーの相補配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットであり、
前記核酸試料の存在下、前記プライマーセットによる等温増幅反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項７】
少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、
下記の（Ａ１）〜（Ａ６）の各工程を含み、
（Ａ１）  ３´末端を含む３´側ステム配列と、５´末端を含む５´側ステム配列とが、ループ配列を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸であって、前記３´側ステムの３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ａ２）  前記一本鎖鋳型核酸の前記ループにプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを前記５´側ステム配列の５´末端に向かって伸長させる工程。
（Ａ３）  前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
（Ａ４）  前記（Ａ３）の前記折り返し配列の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、前記（Ａ２）で形成された一本鎖鋳型核酸にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする工程。
（Ａ５）  前記（Ａ４）のプライマー伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端で停止する工程。
（Ａ６）  前記（Ａ４）で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸の前記折り返し配列の３´末端を伸長させる工程。
前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、請求項２記載のプライマーセットであって、第一プライマーにのみ前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された一本鎖鋳型核酸であり、
前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記折り返し配列（Ｄ−Ｄ´）を含む第一プライマーである
ことを特徴とする核酸の合成方法。
【請求項８】
（Ａ３）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする請求項７記載の核酸の合成方法。
【請求項９】
少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、
下記の（Ａ１）〜（Ａ２）、（Ａ３−２）、および（Ａ４）〜（Ａ６）の各工程を含み、
（Ａ１） ３´末端を含む３´側ステム配列と、５´末端を含む５´側ステム配列とが、ループ配列を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸であって、前記３´側ステムの３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ａ２） 前記一本鎖鋳型核酸の前記ループにプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを前記５´側ステム配列の５´末端に向かって伸長させる工程。
（Ａ３−２） 前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端に連結した前記折り返し配列を介することなく、直接、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
（Ａ４） 前記（Ａ３−２）の前記折り返し配列の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、前記（Ａ２）で形成された一本鎖鋳型核酸にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする工程。
（Ａ５） 前記（Ａ４）のプライマー伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端で停止する工程。
（Ａ６） 前記（Ａ４）で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸の前記折り返し配列の３´末端を伸長させる工程。
前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、さらに、前記５´側ステムループ配列の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸であり、かつ、請求項３記載のプライマーセットを用いた等温増幅法で形成された一本鎖鋳型核酸であり、
前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、請求項３記載のプライマーセットの第一プライマー又は第二プライマーである
ことを特徴とする核酸の合成方法。
【請求項１０】
（Ａ３−２）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする請求項９記載の核酸の合成方法。
【請求項１１】
少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、下記の（Ｂ１）〜（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び下記の（Ｃ１）〜（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含み、
（Ｂ１） ３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する工程。
（Ｂ２） 前記（Ｂ１）の二つの二重鎖の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
（Ｂ３） 前記工程（Ｂ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
（Ｃ１） ３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を一つ提供する工程。
（Ｃ２） 前記（Ｃ１）の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
（Ｃ３） 前記工程（Ｃ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖が、請求項２または３に記載のプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であることを特徴とする核酸の合成方法。
【国際調査報告】
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