(57)【要約】  キシロース代謝能を有する酵母おけるキシロース資化及びエタノール発酵に際して培地中の酢酸を代謝して酢酸濃度を低減する。  キシロース代謝能を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母を、セルロース、セルラーゼ及びキシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う。
2013061941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロース代謝能を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母を、セルロース、セルラーゼ及びキシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
【請求項２】
上記酵母は、キシロース代謝関連遺伝子が導入された組換え酵母であることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
上記アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素であるmhpFをコードすることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
上記大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素であるmhpFは、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする請求項３記載のエタノールの製造方法。
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質
【請求項５】
上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項２記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現することを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
上記組換え酵母は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものであることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロース代謝能を有する組換え酵母を用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、エタノール生産量を向上させるため、基質として５単糖のキシロースを利用できる酵母が開発されている。例えば、特許文献１は、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子とS. cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を染色体に組み込んだ酵母を開示している。【０００３】
また、酢酸は、セルロース系バイオマスの加水分解物に多く含まれ、酵母のエタノール発酵を阻害することが知られている。特に、キシロースの資化遺伝子を導入した酵母においては、キシロースを糖源としたエタノール発酵を著しく阻害することが知られている（非特許文献１及び２）
一方、セルロース系バイオマスをセルラーゼで糖化したものを発酵したもろみには、主として、未発酵残査、難発酵残渣、酵素及び発酵用微生物が含まれている。もろみを含む反応液を次に行う発酵に利用することで発酵用微生物の再利用ができ、発酵用微生物の新規投入量を削減でき、低コスト化を図ることができる。しかし、この場合、もろみに含まれる酢酸も同時に持ち込まれることになり、その結果、発酵培地に含まれる酢酸の濃度が上昇し、エタノール発酵を阻害する虞がある。また、発酵槽内のもろみを、減圧に保持したフラッシュタンクに送り、フラッシュタンク内でエタノールを除去した後、もろみを発酵槽に返送するような連続発酵法においても、酢酸をもろみから取り除くことは難しいため、酢酸による発酵阻害が重要な問題となる。【０００４】
酢酸による発酵阻害を回避するため、エタノール発酵で一般的に用いられる菌株であるサッカロマイセス・セレビジエのLPP1遺伝子やENA1遺伝子の過剰発現（非特許文献３）、FPS1遺伝子の破壊（非特許文献４）により、酢酸存在下でエタノールの発酵能力が改善されている報告がある。しかしながら、これらの報告は、グルコースを基質とした場合のエタノール発酵の結果であり、酢酸により発酵が著しく阻害されるキシロースを基質とした場合のエタノール発酵に対する効果は不明である。また、これらに報告された変異酵母を用いたとしても、上述したような発酵菌体再利用や連続発酵の際に問題になる酢酸の持ち込み量を減らすことには繋がらない。【０００５】
酢酸による発酵阻害を回避する別の方法としては、培地中の酢酸をエタノール発酵と同時に代謝させることが考えられる。しかし、酢酸の代謝は好気的な反応であり、エタノールの代謝経路と重複する。そのため、好気的な条件で発酵を行うと酢酸を代謝させることができる可能性はあるものの、同時に目的物質であるエタノールも代謝される。【０００６】
エタノールが代謝されない嫌気的な条件で酢酸を代謝させるために、サッカロマイセス・セレビジエのグルセリン生産経路のGPD1・GPD2遺伝子を破壊した株に、アセトアルデヒド脱水素酵素(EC 1.2.1.10)をコードするmhpF遺伝子を導入することで、酢酸を資化させた報告がある（非特許文献５、特許文献２）。なお、アセトアルデヒド脱水素酵素は以下の可逆反応を触媒する。【０００７】
アセトアルデヒド＋NAD＋＋コエンザイムA⇔アセチルコエンザイムA＋NADH＋H+
なお、GPD1・GPD2遺伝子によるグルセリン生産経路は、下記式に示すように、代謝で発生する余剰の補酵素NADHをNAD＋に酸化する経路である。【０００８】
0.5グルコース＋NADH＋H+＋ATP→グリセリン＋NAD＋＋ADP＋Pi
よってGPD1・GPD2遺伝子を破壊することでこの反応経路を破壊し、mhpFを導入することで余剰の補酵素NADHを供給し、下記の反応が進む。【０００９】
アセチルコエンザイムA＋NADH＋H+→アセトアルデヒド＋NAD＋＋コエンザイムA
また、アセチルコエンザイムAは酢酸からアセチル-CoA合成酵素により合成され、アセトアルデヒドはエタノールに変換されることから、最終的には下記反応式になり、余剰の補酵素NADHが酸化されると同時に、酢酸も代謝される。【００１０】
酢酸＋2NADH＋2H+＋ATP→エタノール＋NAD＋＋AMP＋Pi
上述したように、酵母に対する酢酸代謝能の付与メカニズムは、グリセリン経路を破壊する必要がある。しかしながら、GPD1遺伝子及びGPD2遺伝子の重複破壊株は、発酵能力が大幅に低下することが知られており、産業レベルでの実用性は低い。また、非特許文献５及び特許文献２は、キシロース資化酵母に関する報告ではなく、キシロース資化時に効果があるか不明である。【００１１】
なお、GPD1遺伝子及びGPD2遺伝子の非破壊株にmhpF遺伝子を導入した報告もある（非特許文献６）。しかしながら、非特許文献６には、mhpF遺伝子の導入により酢酸の生産量が減少するものの、培地中の酢酸が減少するといった報告はない。さらに、この非特許文献６もまたキシロース資化酵母に関する報告ではない。【００１２】
ところで、キシロース還元酵素（XYL1）遺伝子、キシリトール脱水素酵素（XYL2）遺伝子（ともにピキア・スチピチスPichia stipitis由来）及びキシルロキナーゼ（XKS1）遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエ由来）を導入したキシロース資化酵母に対して、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（Entamoeba histolytica由来）を導入した報告がある（非特許文献７及び特許文献３）。しかしながら、これら文献には、キシロース資化時に酢酸資化は起こらず、アセトアルデヒド脱水素酵素非導入株と比較して培地中の酢酸濃度に差がなかった。【００１３】
以上のように、従来技術ではキシロースを資化しながら、エタノール発酵する条件で、酢酸を効率よく代謝・分解させる技術は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開2009-195220号公報
【特許文献２】WO 2011/010923
【特許文献３】WO 2003/078643
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】FEMS Yeast Research, vol. 9, 2009, 358-364
【非特許文献２】Enzyme and Microbial Technology 33, 2003, 786-792
【非特許文献３】Biotechnol. Bioeng. 2009 103(3):500-512
【非特許文献４】Biotechnol. Lett. 2011 33: 277-284
【非特許文献５】Appl. Environ. Microbiol. 2010 76:190-195
【非特許文献６】Biotechnol. Lett. 2011 33:1375-1380
【非特許文献７】Appl. Environ. Microbiol. 2004 70:2892-2897
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、キシロース代謝能を有する酵母おけるキシロース資化及びエタノール発酵に際して培地中の酢酸を代謝して酢酸濃度を低減できる組換え酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、キシロース代謝能を有する酵母に対して特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入する組換え酵母が、セルロースとキシロースを含む培地においてセルロースを糖化しながらエタノール発酵する際に、培地中の酢酸を代謝できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１８】
本発明は以下を包含する。【００１９】
（１）キシロース代謝能を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母を、セルロース、セルラーゼ及びキシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。【００２０】
（２）上記酵母は、キシロース代謝関連遺伝子が導入された組換え酵母であることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。【００２１】
（３）上記アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素であるmhpFをコードすることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。【００２２】
（４）上記大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素であるmhpFは、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする（３）記載のエタノールの製造方法。【００２３】
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質
（５）上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする（２）記載のエタノールの製造方法。【００２４】
（６）上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。【００２５】
（７）上記組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現することを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。【００２６】
（８）上記組換え酵母は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものであることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。【００２７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-233300号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係るエタノールの製造方法では、培地中の酢酸濃度を低減することができ、酢酸に起因する発酵阻害を効果的に回避することができる。その結果、本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースを糖源としたエタノール発酵の効率を高く維持することができ、優れたエタノール収率を達成することができる。したがって、本発明に係るエタノールの製造方法は、例えば、組換え酵母を再利用する場合や連続培養に使用する場合において酢酸の持ち込み量を低減することができ、優れたエタノール収率を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】mhpF遺伝子過剰発現株の作製手順を説明するための模式図である。
【図２】培地中の酢酸濃度の推移を示す特性図である。
【図３】培地中のエタノール濃度の推移を示す特性図である。
【図４】培地中のキシロース濃度の推移を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
【００３１】
本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロース代謝能を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母を使用し、培地に含まれる糖源からエタノールを合成する方法である。本発明に係るエタノールの製造方法では、上記組換え酵母により培地に含まれる酢酸を代謝することができ、エタノール発酵に伴って培地中の酢酸濃度が低減するといった特徴がある。
【００３２】
＜組換え酵母＞
本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、キシロース代謝能を有し、少なくともアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した酵母である。ここで、キシロース代謝能を有するとは、キシロース代謝関連遺伝子を導入することでキシロース代謝能が付与された場合、本来的にキシロース代謝関連遺伝子を有しておりキシロース代謝能を本来的に有している場合のいずれも含む意味である。すなわち、キシロース代謝能を有する酵母といった場合、キシロース代謝関連遺伝子を導入した組換え酵母とキシロース代謝関連遺伝子を本来的に有する酵母のいずれも含む意味である。
【００３３】
キシロース代謝能を有する酵母は、培地中に含まれるキシロースを資化してエタノールを生産することができる。なお、培地中に含まれるキシロースとは、キシロースを構成糖とするキシランやヘミセルロース等を糖化するプロセスによって得られたものでも良いし、培地に含まれるキシランやヘミセルロース等が糖化酵素により糖化されることで培地に供給されるものであってもよい。後者の場合は、所謂、同時糖化発酵の系を意味する。
【００３４】
キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００３５】
キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、嫌気性のカビであるピロマイセス（Piromyces）sp. E2種由来（特表2005-514951号公報）、嫌気性のカビであるシラマイセス・アベレンシス（Cyllamyces aberensi）由来、バクテリアであるバクテロイデス・セタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）由来、バクテリアであるクロストリディウム・ファイトファーメンタス由来、ストレプトマイセス・ムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子（XI遺伝子）等を利用することもできる。
【００３６】
また、キシロース代謝能を本来的に有する酵母としては、特に限定されないが、Pichia stipitis、Candida tropicalis及びCandida prapsilosis等を挙げることができる。
【００３７】
一方、キシロース代謝能を有する酵母に導入するアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物由来の遺伝子を使用しても良い。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、酵母等の真菌以外の生物、例えば、細菌や動物、植物、昆虫、藻類由来の遺伝子を使用する場合、導入する酵母におけるコドン使用頻度に併せて塩基配列を改変した遺伝子を使用することが好ましい。
【００３８】
より具体的に、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、大腸菌におけるmhpF遺伝子や、Applied and Environmental Microbiology, May 2004, p. 2892-2897, Vol. 70, No. 5に開示されるようにEntamoeba histolyticaにおけるALDH1遺伝子を使用することができる。ここで、大腸菌におけるmhpF遺伝子の塩基配列及びmhpF遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
【００３９】
ただし、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００４０】
また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００４１】
さらに、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００４２】
さらにまた、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００４３】
上述したように、配列番号１と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアセトアルデヒド脱水素酵素活性を測定すればよい。アセトアルデヒド脱水素酵素活性は、基質としてアセトアルデヒド、CoA及びNAD+を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成したアセチルリン酸をリン酸アセチル転移酵素の作用によりアセチルリン酸に変換して測定でき、或いは生成するNADHを分光学的に計測して測定することができる。
【００４４】
ところで、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、キシロース代謝能を有し、少なくともアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した酵母であって、更に他の遺伝子が導入された酵母であってもよい。他の遺伝子としては特に限定されないが、例えば、グルコース等の糖代謝に関与する遺伝子を導入した物であっても良い。一例として組換え酵母は、β−グルコシダーゼ遺伝子を導入することでβ−グルコシダーゼ活性を有する酵母とすることができる。
【００４５】
ここでβ−グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β−グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入することもできる。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開２００６−１７４７６７号公報参照）。
【００４６】
βグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
【００４７】
また、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、βグルコシダーゼ遺伝子に加えて、或いはβグルコシダーゼ遺伝子以外に、セルラーゼを構成する他の酵素をコードする遺伝子を導入したものでもよい。βグルコシダーゼ以外にセルラーゼを構成する酵素としては、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ（CBH1及びCBH2）、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ（EG）を挙げることができる。
【００４８】
また、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）、酢酸をアセチル-CoAに変換する活性を有するアセチル-CoA合成酵素遺伝子（ACS1遺伝子）、アセトアルデヒドを酢酸に変換する活性を有する遺伝子（ALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子）を挙げることができる。なお、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）を破壊しても良い。
【００４９】
さらに、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）を高発現する特徴を有するものが好ましい。当該遺伝子を高発現させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを高発現用プロモーターに置換する、当該遺伝子を発現可能に有する発現ベクターを酵母に導入するといった方法が挙げられる。
【００５０】
Saccharomyces cerevisiaeのADH1遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７０及び７１に示す。ただし、高発現対象のアルコール脱水素酵素遺伝子としては、配列番号７０及び７１にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００５１】
また、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７０及び７１にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７１のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００５２】
さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７０及び７１にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７１のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アセトアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００５３】
さらにまた、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７０及び７１にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７０の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００５４】
上述したように、配列番号７０と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号７１とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アルコール脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば酵母等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアルコール脱水素酵素活性を測定すればよい。アルコール脱水素酵素活性は、基質としてアルコールとNAD+又はNADP+を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成するアルデヒドを計測するか、NADH又はNADPHを分光学的に計測して測定することができる。
【００５５】
さらに、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）の発現量が低下した特徴を有するものが好ましい。当該遺伝子の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを改変する、当該遺伝子を欠損させるといった方法が挙げられる。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。
【００５６】
Saccharomyces cerevisiaeのADH2遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７２及び７３に示す。ただし、対象のアルコール脱水素酵素遺伝子としては、配列番号７２及び７３にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００５７】
また、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７２及び７３にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７３のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００５８】
さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７２及び７３にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７３のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アセトアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００５９】
さらにまた、アルコール脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号７２及び７３にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７２の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００６０】
上述したように、配列番号７２と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号７３とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アルコール脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば酵母等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアルコール脱水素酵素活性を測定すればよい。アルコール脱水素酵素活性は、基質としてアルデヒド及びNADH又はNADPHを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成するアルコールを計測するか、又はNADP+を分光学的に計測して測定することができる。
【００６１】
さらに、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、バイオマスを構成するヘミセルロースに含まれる5炭糖であるL-アラビノースの代謝経路に関与する遺伝子を挙げることができる。このような遺伝子としては、例えば、原核生物由来のL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子、L-リブロース-5-ホスフェート4-エピメラーゼ遺伝子や、真核生物由来のL-アラビトール-4-デヒドロゲナーゼ遺伝子、L-キシロースレダクターゼ遺伝子を挙げることができる。
【００６２】
＜組換え酵母の作製＞
上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を宿主となる酵母ゲノムに導入することにより、本発明に使用できる組換え酵母を作製することができる。ここで、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、キシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロース代謝関連遺伝子を導入した組換え酵母に導入しても良いし、キシロース代謝能を本来的に有する酵母に導入しても良いし、キシロース代謝能を有しない酵母にキシロース代謝関連遺伝子とともに導入されても良い。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子をキシロース代謝能を有しない酵母に導入して組換え酵母を作製し、その後、キシロース代謝関連遺伝子を当該組換え酵母に導入することでキシロース代謝能を付与しても良い。
【００６３】
宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
【００６４】
また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開２００９−３４０３６号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００６５】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００６６】
また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００６７】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
【００６８】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００６９】
＜エタノール製造＞
以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、セルロース、セルラーゼ及びキシロースを含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくともキシロース及びセルラーゼがセルロースに作用することで生成するグルコースを含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース等の他の炭素源が含まれていても良い。
【００７０】
また、エタノール発酵に利用する培地に含まれるセルロース及びキシロースの一方又は両方は、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスと、セルロース系バイオマスに含まれるセルラーゼを糖化できるセルラーゼと、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースを糖化してキシロースを生成するヘミセルラーゼとを含む組成であってもよい。ここで、セルロース系バイオマスとしては、従来公知の前処理を施したものであっても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
【００７１】
また、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の糖化液を添加してもよい。この場合、糖化液には、残存するセルロースやセルラーゼとセルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースに由来するキシロースとが含まれる。
【００７２】
以上のように、本発明に係るエタノールの製造方法は、培地に含まれるセルロースをセルラーゼにより糖化する工程と、キシロースと糖化により生成されたグルコースとを糖源とするエタノール発酵の工程とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵処理となる。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。
【００７３】
いずれの培地を使用する場合でも、当該組換え酵母は、培地に含まれるキシロースを資化してエタノールを生成することができる。なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
【００７４】
同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25〜45℃とすることができ、30〜40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。さらに、先に酵素の至適温度（40〜70℃）で糖化を行い、その後、温度を所定の温度（30〜40℃）に下げて酵母を添加するといった変則的な同時糖化発酵でもよい。
【００７５】
本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００７６】
一般に、バイオマスに由来する糖を利用してエタノールを製造する場合、上述した前処理や糖化処理において酢酸やフルフラールといった発酵阻害物質が生産される場合がある。特に酢酸については、酵母の生育・増殖を阻害し、キシロースを糖源とするエタノール発酵の効率を低下させることが知られている。
【００７７】
しかしながら、本発明においては、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母を使用しているため、培地に含まれる酢酸を代謝することができ、培地に含まれる酢酸濃度を低く抑えることができる。よって、本発明に係るエタノールの製造方法は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入していない酵母を使用した場合と比較して優れたエタノール収率を達成できる。
【００７８】
また、本発明に係るエタノールの製造方法によれば、組換え酵母を所定期間培養した後においても培地中の酢酸濃度が低いため、所定期間培養後の培地の一部を利用して新たに培養を開始する連続培養系に使用しても、酢酸の持ち込み量を低減できる。また、本発明に係るエタノールの製造方法によれば、エタノール発酵工程の終了後、菌体を回収して再利用する場合でも同様な理由から酢酸の持ち込み量を低減できる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００８０】
〔実施例１〕
本実施例では、キシロース資化酵母に大腸菌のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（mhpF遺伝子）を導入した組換え酵母を作製し、この組換え酵母の酢酸代謝能を評価した。【００８１】
＜mhpF遺伝子過剰発現用DNA断片の構築＞
詳細を後述する参考例１にて作製したプラスミドpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1partを鋳型として、TDH2遺伝子のプロモーター領域とIDP2遺伝子を除くDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとして、TB2158（5'-ACCCGTGGCTGCGAGCGACCAGCTAACTTGGTCGAC-3'：配列番号３）とTB2797（5'-CCTCATTGCTGGATAGAGCCTCATCG-3'：配列番号４）を使用した。【００８２】
一方、酵母OC2株（NBRC2260）のゲノムを鋳型として、ERO1遺伝子ターミネーター領域を含むDNA断片とHOR7遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片を増幅した。これらPCRに使用するプライマーはSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）のDNA配列データを参考にし、増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計した。ERO1遺伝子ターミネーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRにはプライマーとしてTB2796（5'-TCTATCCAGCAATGAGGAGTGATTTTACAC-3'：配列番号５）とTB2462（5'-GAGCAACACAGTTTATCTTATATGTATTCAATG-3'：配列番号６）を使用した。また、HOR7遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRにはプライマーとしてTB2168（5'-TTTTATTATTAGTCTTTTTTTTTTTTGACAATATCTG-3'：配列番号７）とTB2654（5'-TCGCTCGCAGCCACGGGT-3'：配列番号８）を使用した。【００８３】
mhpF遺伝子は、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの（GenScript社から購入）を鋳型にPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB2463（5'-TAAACTGTGTTGCTCTTATGCGGCCTCTCCTGC-3'：配列番号９）とTB2464（5'-AGACTAATAATAAAAATGTCAAAGAGAAAAGTTGCTATTATCG-3'：配列番号１０）を使用した。それぞれのDNA断片を、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit （Clontech）を用いて、プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドをpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-PDC1partと命名した。【００８４】
＜XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子ホモ破壊株の作製＞
ホモタリックな2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103頁)にXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子をヘテロに導入した株（後述する参考例２参照）を、胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGRE3遺伝子座領域の両方にXYL1、XYL2、XKS1遺伝子が組み込まれGRE3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz326株とした。【００８５】
＜mhpF遺伝子過剰発現株の作製（図１）＞
mhpF過剰発現用DNA断片をUz326株のゲノムに導入するためには、相同組換え領域であるDNA断片の5'・3'両末端の配列がそれぞれの染色体上の近傍な位置にある必要がある。そこで、mhpF過剰発現用DNA断片の5'末端部分のHIS3遺伝子のターミネーター領域とTDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片と、3'末端部分のPDC1遺伝子の一部を含むDNA断片を含む配列を、PDC6遺伝子上流に導入するためのDNA断片（過剰発現土台用DNA断片）を含むプラスミドpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6（後述する参考例１参照）を鋳型として、ベクター部分のｐCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB0948（5'-GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3'：配列番号１１）とTB0735（5'-CGGTGATCCCCTTGAAAAAG-3'：配列番号１２）を使用した。Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH）を用いて、Uz326株に、キット添付のプロトコールに従い、増幅したDNA断片を形質転換した。形質転換後、ゼオシン（300μg/ml）を含むYPDとしたプレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得、Uz327株と命名した。【００８６】
次に、上記で得られたpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-PDC1partを鋳型として、ベクター部分のｐCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB1932（5'-TCCCTCCACCAAAGGTGTTC-3'：配列番号１３）とTB0115（5'-TTGCAAAGAACCGTCACCAATG-3'：配列番号１４）を使用した。増幅したDNA断片をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、Uz327株に形質転換し、形質転換体を得、Uz370株と命名した。【００８７】
＜発酵試験＞
上述のように得られたUz370株とUz327株をYPD培地（イーストエキストラクト 10ｇ/L、ペプトン 20g/L、グルコース 20g/L）に植菌し、150rpm/分（震とう幅35mm）で30℃、24時間培養を行った。培養した菌は、CX培地（セルロース100g/L、キシロース70g/L、イーストエキストラクト10g/L、酢酸2.75g/L、Cellic CTec2[ノボザイム社製のセルラーゼ] 40FPU/gセルロース；ｐH6.0に調整）、DX培地（グルコース100g/L、キシロース70g/L、イーストエキストラクト10g/L、酢酸2.75g/L；ｐH6.0に調整）、X培地（キシロース70g/L、イーストエキストラクト10g/L、酢酸2.75g/L；ｐH6.0に調整）を各28mlと直径10mmのナイロン被膜鉄球を30ml容のフラスコに入れ、上記菌体をOD＝7.3になるように接種し、80rpm/分（震とう幅35mm）・32℃で発酵を行い、エタノールの生産量と酢酸の消費量を検討した。なお、それぞれの濃度はHPLC(LC-10A;島津製作所、カラム：Aminex HPX-87H(Bio-Rad製)、移動相：0.01N H2SO4、流量：0.6ml/min、温度：30℃、検出器：示唆屈折率検出器RID-10A)で測定した。【００８８】
発酵試験の結果として、培地中の酢酸濃度の推移を図２に示し、培地中のエタノール濃度の推移を図３に示し、培地中のキシロース濃度の推移を図４に示す。図２に示すように、mhpF遺伝子を過剰発現したUz370株は、同時糖化発酵用の培地であるCX培地を使用した場合のみ培地中の酢酸を代謝することができた。一方、Uz370株は、糖源としてグルコースとキシロースを含む培地やキシロースのみを含む培地では酢酸を代謝することはなかった。なお、図２に示すように、グルコースとキシロースを含む培地（DX培地）を使用した場合、mhpF遺伝子を過剰発現したUz370株は、Uz327株と比較して酢酸生産量が低減していると評価できるが、発酵時間の経過に伴う酢酸生産はUz327株とほぼ同等と評価される。また、mhpF遺伝子を過剰発現したUz370株は、図３及び４に示すように、エタノール収率やキシロース代謝能に関してUz327株と比較して同等と評価できる。【００８９】
〔参考例１〕
本参考例では、実施例で使用したpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6の作製手順について説明する。先ず、酵母OC2株のゲノムを鋳型として、PDC6遺伝子5'上流非翻訳領域と一部PDC6遺伝子領域含むDNA断片を増幅し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使用してクローニングし、pCR-5U_PDC6と命名した。PCRにはプライマーとしてTB0948（5'-GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3’：配列番号１５）とTB0735（5'-CGGTGATCCCCTTGAAAAAG-3’：配列番号１６）を使用した。【００９０】
また、酵母OC2株のゲノムを鋳型として、HIS3遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片、TDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片、URA3遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片、PDC1遺伝子の一部を含むDNA断片をPCRで増幅した。【００９１】
HIS3遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRには、プライマーとしてTB1401（5'-TGCGGCCGGCCGCAGC-3’：配列番号１７）とTB1433（5'-CGCTAACATTCAACGCTAAGAGCGCGCCTCGTTC-3’：配列番号１８）を使用した。TDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRには、プライマーとしてTB2717（5'-TAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAAC-3’：配列番号１９）とTB1928（5'-TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC-3’：配列番号２０）を使用した。URA3遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRには、プライマーとしてTB2121（5'-TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTTCAATT-3’：配列番号２１）とTB1672（5'-GTCGACCAAGTTAGCTGGGGGTAATAACTGATATAATTAAA-3’：配列番号２２）を使用した。PDC1遺伝子の一部を含むDNA断片を増幅するPCRには、プライマーとしてTB2814（5'-CCAGCTAACTTGGTCGACTTG-3'：配列番号２３）とTB0115（5'-TTGCAAAGAACCGTCACCAATG-3'：配列番号２４）を使用した。【００９２】
さらに、pBBLE-LDHKCB（Applied and Environmental Microbiology, 71, 2789-2792）を鋳型として、フレオマイシン耐性遺伝子をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB2100（5'-ACATAAACAAACAAAATGACCGACCAAGCGACG-3’：配列番号２５）とTB0897（5'-AGTTTAGTAGACATGCATCATGAGATGCCTGCAAG-3’：配列番号２６）を使用した。【００９３】
さらにまた、pCR-5U_PDC6を鋳型として、PDC6遺伝子5'上流約700bpの部分で切断され直鎖上になるDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB2105（5'-CTGCGGCCGGCCGCACTTCCAAGCATCTCATAAACC-3’：配列番号２７）とTB4031（5'-ACATAAACAAACAAAGATGTACGATCGCCTGCAC-3’：配列番号２８）を使用した。このPCRにより得られたDNA断片と、上述したHIS3遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片と、上述したTDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片とを、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、得られたプラスミドをpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-3U_PDC6と命名した。【００９４】
次に、得られたpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-5U_PDC6を鋳型として、TDH3遺伝子のプロモーター領域とPDC6遺伝子5'上流非翻訳領域の配列の間で切断され直鎖上になるDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB1928（5'-TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC-3'：配列番号２９）とTB2118（5'-GACGGTTCTTTGCAAGATGTACGATCGCCTGCAC-3’：配列番号３０）を使用した。このPCRにより得られた本DNA断片と、上述したURA3遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片と、上述したフレオマイシン耐性遺伝子と、上述したPDC1遺伝子の一部を含むDNA断片とを、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、得られたプラスミドをpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6と命名した。【００９５】
また、本参考例では、上記のように作製したpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6を用いて、実施例で使用したpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1partを作製した。先ず、pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6を鋳型として、HIS3遺伝子のターミネーター領域とTDH3遺伝子のプロモーター領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとして、TB3345（5'-TGCGGCCGGCCGCAGCTTTGCAGAG-3'：配列番号３１）とTB1928を使用した。【００９６】
一方、酵母OC2株（NBRC2260）のゲノムを鋳型として、TDH2遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片、COX4遺伝子のミトコンドリア移行シグナルを含むDNA断片、IDP2遺伝子のORF及びターミネーター領域を含むDNA断片、並びにPDC1遺伝子の一部を含むDNA断片をPCRで増幅した。これらPCRに使用するプライマーはSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）のDNA配列データを参考にし、増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計した。TDH2遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRにはプライマーとしてTB2704（5'-CTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3'：配列番号３２）とTB2595（5'-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3'：配列番号３３）を使用した。COX4遺伝子のミトコンドリア移行シグナルを含むDNA断片を増幅するPCRにはプライマーとしてTB2448（5'-AACAAACAAAACAAAATGCTTTCACTACGTCAATC-3'：配列番号３４）とTB2449（5'-CTTAATCTTTGTCATAAGAGCATATCTAGAGCTACACAAAG-3'：配列番号３５）を使用した。IDP2遺伝子のORF及びターミネーター領域を含むDNA断片を増幅するPCRにはプライマーとしてTB2452（5'-ATGACAAAGATTAAGGTAGCTAACCCC-3'：配列番号３６）とTB2092（5'-GACCAAGTTAGCTGGTATATCGGTCCTCTGTGTAG-3'：配列番号３７）を使用した。PDC1遺伝子の一部を含むDNA断片を増幅するPCRにはプライマーとしてTB2814とTB0115を使用した。【００９７】
なお、COX4遺伝子のミトコンドリア移行シグナル配列は、O. Emanuelsson ら(J. Mol. Biol. 300,1005-1016のアルゴリズムを基にした予測プログラム「TargetP」(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)を用いて、ORF5'末端の25アミノ酸と推定した。【００９８】
また、pAUR101（タカラバイオ）を鋳型としてAUR1-C（オーレオバシジン耐性）遺伝子ORF及びターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとしてTB1972（5'-ACATAAACAAACAAAATGGCAAACCCTTTTTCGAGATG-3'：配列番号３８）とTB1973（5'-AGAATACCCGTCAAGCTGGATAGAGCCTCATCGTTAC-3'：配列番号３９）を使用した。【００９９】
次に、PCRで増幅したAUR1-C遺伝子を含むDNA断片とTDH2遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片とを、In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit （Clontech社製）を用いて結合し、プライマーTB1972及びTB2595を使用してPCRで増幅した。COX4遺伝子のミトコンドリア移行シグナルを含むDNA断片とIDP2遺伝子ORF及びターミネーター領域を含むDNA断片とPDC1遺伝子の一部を含むDNA断片とをプライマーTB2448及びTB0115を使用して結合し、PCRで増幅した。2つの結合DNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン社製）を使用して、プラスミドにクローニングした。クローニングした各プラスミドを鋳型としてPCRで増幅した2つのDNA断片と、HIS3遺伝子のターミネーター領域及びTDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片とをIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いて結合し、結合DNA断片をプライマーTB1932及びTB0115を使用してPCRで増幅した。PCRで増幅された結合DNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使用して、プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドをpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1partと命名した。【０１００】
〔参考例２〕
本参考例では、ホモタリックな2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103頁)にXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子をヘテロに導入した株の作製手順について説明する。【０１０１】
＜XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片の作製＞
酵母BY4742株（Open Biosystems）のゲノムDNAを鋳型として、GRE3遺伝子とその5’上流・3’下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2358（5'-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3'：配列番号４０）とTB2359（5'-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3'：配列番号４１）を使用した。なお、酵母BY4742株のDNA配列増幅ためのPCRプライマー設計は、Saccharomyces Genome DatabaseのDNA配列データを参考にした。プラスミドpUC19を鋳型として、pUC19のマルチクローニングサイトで切断されるようなpUC19全長を含む直鎖状DNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2373（5'-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3'：配列番号４２）とTB2374（5'-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3'：配列番号４３）を使用した。上記二つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(タカラバイオ)を用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3と命名した。【０１０２】
pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3を鋳型として、GRE3遺伝子の5’上流・3’下流非翻訳領域とpUC19を含む領域のDNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TEF1プロモーター領域を含むDNA断片、XKS1遺伝子、HIS3ターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB3018（5'-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3'：配列番号４４）とTB3017（5'-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3'：配列番号４５）、TB2210（5'-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3'：配列番号４６）とTB2269（5'-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3'：配列番号４７）、TB2345（5'-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3'：配列番号４８）とTB2346（5'-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3'：配列番号４９）、TB1401（5'-TGCGGCCGGCCGCAGC-3'：配列番号５０）とTB2683（5'-GCGCCTCGTTCAGAATGA-3'：配列番号５１）を使用した。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3と命名した。【０１０３】
pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3を鋳型として、HIS3ターミネーター領域と、GRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域の間で切断したようなプラスミド全長を含む直鎖状DNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TDH2プロモーター領域を含むDNA断片と、ILV3ターミネーター領域を含むDNA断片、ピキア・スチピチスのゲノムDNAを鋳型としてXYL1遺伝子をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB9020（5'-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3'：配列番号５２）とTB2457（5'-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3'：配列番号５３）、TB2844（5'-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3'：配列番号５４）とTB2595（5'-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3'：配列番号５５）、TB2314（5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3'：配列番号５６）とTB2455（5'-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3'：配列番号５７）、TB2456（5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3'：配列番号５８）とTB3019（5'-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3'：配列番号５９）を使用した。なお、XYL1遺伝子配列増幅のためのPCRプライマー設計は、GeneBankに登録されているピキア・スチピチスXYL1遺伝子（登録番号XM_001385144）を参考にした。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3と命名した。【０１０４】
pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3を鋳型として、ILV3ターミネーター領域と、GRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域の間で切断したようなプラスミド全長を含む直鎖状DNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、PDC1プロモーター領域を含むDNA断片とILV6ターミネーター領域を含むDNA断片、ピキア・スチピチスのゲノムDNAを鋳型として、XYL2遺伝子をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2375（5'-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3'：配列番号６０）とTB3021（5'-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3'：配列番号６１）、TB2010（5'-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3'：配列番号６２）とTB2261（5'-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3'：配列番号６３）、TB3022（5'-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3'：配列番号６４）とTB2347（5'-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3'：配列番号６５）、TB2351（5'-GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3'：配列番号６６）とTB2352（5'-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3'：配列番号６７）を使用した。なお、XYL2遺伝子配列増幅のためのPCRプライマー設計は、GeneBankに登録されているピキア・スチピチスXYL2遺伝子（登録番号AF127801もしくはX55392）を参考にした。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3と命名した。【０１０５】
pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3を鋳型とし、GRE3遺伝子の5’上流非翻訳領域からGRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域までのDNA断片をPCRで増幅し、本断片をXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊株作成に用いた。【０１０６】
＜XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子へテロ破壊株作製＞
XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片を用いて、OC2-T株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH）を用いて、キット添付のプロトコールに従い、形質転換した。形質転換後、キシロースを単独炭素源としたプレートにまいて、30℃で7日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法により挿入DNA断片の外側とベクター内側のプライマーであるTB2356（5'-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3'：配列番号６８）とTB592（5'-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3'：配列番号６９）を用いて、染色体に正常に1コピー組込まれていることを確認した。【０１０７】
〔実施例２〕
本実施例では、キシロース資化酵母に大腸菌のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（mhpF遺伝子）及びアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）を導入するとともに、アルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）を破壊した組換え酵母を作製し、この組換え酵母の酢酸代謝能を評価した。なお、導入するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するタンパク質をコードしている。また、破壊するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するタンパク質をコードしている。【０１０８】
＜供試株＞
本実施例では、実施例１で作製したUz326株、Uz326株にヒスチジン要求性を付与したUz644株、Uz644株を5-フルオロオロチン酸添加培地で生育した株を選抜して（Boeke, J.D., et al. 1987 Methods Enzymol.;154:164-75.）ウラシル要求性となったUz659株、Uz659株にmhpF遺伝子を導入したUz670株、Uz659株にmhpF遺伝子とADH1遺伝子とを導入したUz672株、Uz659株にADH1遺伝子を導入したUz822株、Uz659株のADH2遺伝子を破壊したUz674株、Uz659株のADH2遺伝子を破壊するとともにmhpF遺伝子を導入したUz669株、Uz659株のADH2遺伝子を破壊するとともにmhpF遺伝子とADH1遺伝子とを導入したUz737株を構築した（表1）。
【表１】
2013061941.tif 000003
【０１０９】
＜HIS3遺伝子破壊用DNA断片の作製＞
酵母OC2株のゲノムDNAを鋳型として、HIS3遺伝子とその5’上流・3’下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。使用したPCR用プライマーはそれぞれTB3164とTB3165を使用した（以下、本実施例で使用したプライマーを表２に纏めて示す）。増幅したDNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（ライフテクノロジーズ社製）を使用して、プラスミドにクローニングし、pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3と命名した。【０１１０】
pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3を鋳型として、HIS3遺伝子の5’上流・3’下流非翻訳領域及びpCR-BluntII-TOPOを含む領域のDNA断片と、pAUR101（タカラバイオ社製）を鋳型として、AUR1-C遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域を含むDNA断片とをそれぞれPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計したTB3458及びTB3459のペア、TB2885及びTB2859のペアを使用した。上記DNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いてクローニングし、pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3と命名した。【０１１１】
＜HIS3遺伝子破壊株の作製＞
pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅し、HIS3遺伝子破壊用DNA断片を作製した。PCR用プライマーはそれぞれTB3164とTB3165を使用した。本DNA断片を用いて、2倍体のホモタリックな酵母Saccharomyces cerevisiaeOC2株にキシロース資化遺伝子（XYL1、XYL2、XKS1）を過剰発現させたUz326株（実施例１）をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社製）を用いて、キット添付のプロトコールに従い、形質転換した。形質転換後、オーレオバシジンを含むYPDプレートにまいて、30℃で7日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のHIS3遺伝子座領域の両方にAUR1-C遺伝子が組み込まれHIS3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz644株とした。【０１１２】
＜ADH2遺伝子破壊用DNA断片（HIS3マーカー）の作製＞
酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、ADH2遺伝子とその5‘上流及び3’下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしては、TB2939とTB2940を使用した。増幅したDNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使用して、プラスミドにクローニングし、pCR-5U_ADH2-ADH2-3U_ADH2と命名した。【０１１３】
上記pCR-5U_ADH2-ADH2-3U_ADH2を鋳型として、ADH2遺伝子の5’上流・3’下流非翻訳領域及びpCR-BluntII-TOPOを含む領域のDNA断片と、上記pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3を鋳型として、HIS3遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域とを含むDNA断片をそれぞれPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計したTB3100及びTB3102のペア、TB3101及びTB3089のペアを使用した。上記DNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いてクローニングし、pCR-5U_ADH2-HIS3-3U_ADH2と命名した。【０１１４】
＜ADH2遺伝子破壊株の作製＞
pCR-5U_ADH2-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅し、ADH2遺伝子破壊用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB2939とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、Uz644株を形質転換した。形質転換後、ヒスチジンを含まないSC培地（Mthods in Yeast Genetics ,Cold Spring Harbor Laboratory Press）プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座領域の両方にHIS3遺伝子が組み込まれADH2遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz674株とした。【０１１５】
＜mhpF遺伝子過剰発現用DNA断片の作製＞
pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-PDC1part（実施例１参照）を鋳型として、ERO1遺伝子のターミネーター領域、mhpF遺伝子とHOR7遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB3598とTB2654を使用した。BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、CYC1遺伝子のターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB2236とTB3597を使用した。pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3を鋳型として、HIS3遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB3099とTB3089を使用した。pCR-5U_ADH2-ADH2-3U_ADH2を鋳型として、ADH2遺伝子と3’下流非翻訳領域の間で切断されて直鎖状になるようなDNA断片をPCRで増幅した。使用したPCR用プライマーとしてはTB3172とTB3100を使用した。なお、PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計した。上記4種のDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてクローニングしpCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2と命名した。【０１１６】
＜mhpF遺伝子過剰発現株の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅し、mhpF遺伝子過剰発現用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB3326とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、Uz644株を形質転換した。形質転換後、ヒスチジンを含まないSC培地プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座近傍領域の両方にmhpF遺伝子が組み込まれている株を取得した。これをUz670株とした。【０１１７】
＜mhpF・ADH1遺伝子過剰発現用DNA断片の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、CYC1遺伝子ターミネーター領域とERO1遺伝子ターミネーター領域の間で切断されて直鎖状になるようなDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB3173とTB2429を使用した。BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片とADH1遺伝子とADH1遺伝子のターミネーター領域の部分を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2717とTB1938のペア、TB2997とTB2998のペアを使用した。なお、PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計した。上記3種のDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてクローニングし、pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2と命名した。【０１１８】
＜mhpF・ADH1遺伝子過剰発現株の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のｐCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅し、mhpF・ADH1遺伝子過剰発現用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB3326とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、Uz644株を形質転換した。形質転換後、ヒスチジンを含まないSC培地プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座近傍領域の両方にmhpFとADH1遺伝子が組み込まれている株を取得した。これをUz672株とした。【０１１９】
＜mhpF・ADH1遺伝子過剰発現・ADH2破壊用DNA断片の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH2-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ADH2遺伝子以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB2717とTB2943を使用した。なお、PCR用プライマーは、増幅して得られたDNA断片が両末端において約15bp重複するように設計した。本断片を大腸菌に形質転換し、DNA断片が環状化したプラスミドを得、pCR-5U_ADH2- T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2と命名した。【０１２０】
＜mhpF・ADH1遺伝子過剰発現・ADH2破壊株の作製＞
上記pCR-5U_ADH2- T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のｐCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅しmhpF・ADH1遺伝子過剰発現・ADH2破壊用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB2939とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、Uz644株を形質転換した。形質転換後、ヒスチジンを含まないSC培地プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座の両方にmhpFとADH1遺伝子が組み込まれ、ADH2が破壊されている株を取得した。これをUz737株とした。【０１２１】
＜mhpF遺伝子過剰発現・ADH2破壊用DNA断片の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ADH1遺伝子以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB3217とTB1928を使用した。なお、PCR用プライマーは、増幅して得られたDNA断片が両末端において約15bp重複するように設計した。本断片を大腸菌に形質転換し、DNA断片が環状化したプラスミドを得、pCR-5U_ADH2- T_CYC1-P_TDH3-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2と命名した。【０１２２】
＜mhpF遺伝子過剰発現・ADH2破壊株の作製＞
上記pCR-5U_ADH2- T_CYC1-P_TDH3-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅しmhpF遺伝子過剰発現・ADH2破壊用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB2939とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、Uz644株を形質転換した。形質転換後、ヒスチジンを含まないSC培地プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座の両方にmhpF遺伝子が組み込まれ、ADH2が破壊されている株を取得した。これをUz669株とした。【０１２３】
＜ADH1遺伝子過剰発現用DNA断片の作製＞
pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、mhpF遺伝子発現カセット以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB3090とTB3086を使用した。なお、PCR用プライマーは、増幅して得られたDNA断片が両末端において約15bp重複するように設計した。本断片を大腸菌に形質転換し、DNA断片が環状化したプラスミドを得、pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-HIS3-3U_ADH2と命名した。【０１２４】
＜ADH1遺伝子過剰発現株の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅し、ADH1遺伝子過剰発現用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB3326とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、Uz644株を形質転換した。形質転換後、ヒスチジンを含まないSC培地プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座近傍領域の両方にADH1遺伝子が組み込まれている株を取得した。これをUz822株とした。【０１２５】
＜ADH2破壊用DNA断片（TRP1マーカー）の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-HIS3-3U_ADH2を鋳型として、HIS3遺伝子以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB4481とTB3435を使用した。酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TRP1遺伝子とその5‘上流及び3’下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーとしてはTB2799とTB2800を使用した。なお、PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計した。上記2種のDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてクローニングし、pCR-5U_ADH2-TRP1-3U_ADH2と命名した。【０１２６】
＜ADH2遺伝子株の作製＞
上記pCR-5U_ADH2-TRP1-3U_ADH2を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅し、ADH2破壊用DNA断片を作製した。PCR用プライマーとしてはTB2939とTB2940を使用した。本DNA断片を用いて、TPP1が破壊された酵母OC2株であるOC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996、81、98-103)を形質転換した。形質転換後、トリプトファンを含まないSC培地プレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成させ、2倍化を行った。2倍体である染色体のADH2遺伝子座領域の両方にTRP1遺伝子が組み込まれADH2遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz996株とした。
【表２】
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【０１２７】
＜フラスコ発酵試験＞
以上のように作製した菌株を用いてフラスコ発酵試験を以下のように実施した。まず、グルコース濃度20g/LのYPD液体培地を20ml分注した100ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃ 120rpmで24時間培養を行った。集菌後、下記発酵培地を10ml分注した20ml容フラスコに植菌し、振盪培養（80rpm、振幅35mm、30℃、n=１）にて発酵試験を行った。なお、フラスコにつける栓は、内径1.5mmニードルを通したゴム製で、ニードルの先に逆止弁を取り付けることでフラスコが嫌気的に保たれるようにした。
【表３】
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【０１２８】
発酵液中のグルコース、キシロース、セロビオース、酢酸、グリセリン、キシリトール、エタノールはHPLC（LC-10A；島津製作所）を使用して下記条件にて測定した。【０１２９】
カラム：AminexHPX-87H
移動相：0.01N  H2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
検出器：示差屈折率検出器  RID-10A 
＜発酵試験結果＞
ADH2破壊株Uz966（キシロース資化遺伝子非導入株）とOC2株をCm200Y10Ac15 15FPUの培地条件で発酵試験を行い、エタノールが最高濃度時のグルコースと酢酸の濃度を表４に示した。
【表４】
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【０１３０】
発酵時間:89時間    植菌量：PCV0.12%
表４から判るように、ADH2遺伝子を破壊した株では、発酵基質がグルコースのみ場合は特に非破壊株と発酵能力に差が無かった。【０１３１】
次に、キシロース資化遺伝子が導入された酵母において、キシロースを含む培地（表３のCm150X60Y10Ac5 25FPU）にて発酵試験を実施した。なお、植菌量はPCV:0.12％とし、発酵時間を113時間とした。結果を表５に示す。
【表５】
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【０１３２】
表５から判るように、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子mhpF過剰発現株と比較して、mhpF遺伝子及びADH1遺伝子を過剰発現するとともにADH2遺伝子を破壊したUz737株で、エタノール変換・グルコース代謝の効率改善効果が相乗的に発揮された。また、Uz737株では培地中の酢酸の濃度が有意に減少しており、酢酸資化能力も向上していることが明らかとなった。また、キシロースを含む培地条件で、キシロース資化遺伝子が導入された酵母のADH2破壊株（Uz674株）は発酵が著しく阻害されることが判った。しかしながら、mhpF遺伝子を過剰発現することで、ADH2遺伝子の破壊による発酵阻害を回復できることが判った。【０１３３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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