(57)【要約】本発明は生体細胞における脂肪酸及びコレステロールの取り込みを阻害する組成物の提供を目的とする、一酸化炭素（ＣＯ）又はＣＯを生体内で放出し得る化合物を含む、生体細胞の脂肪酸又はコレステロール取り込み阻害剤である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素（ＣＯ）を含む、生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項２】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物を含む生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項３】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、メチレンジオキシフェニル（ＭＤＰ）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物又は金属カルボニル錯体である、請求項２記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項４】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、以下の式で表されるメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物である、請求項３記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤：
2012169654.tif 000010
［式中、Ｒ１はベンゼン環上の置換基を表し、ｎは置換基の数を表し、０、１、２、３又は４である］。
【請求項５】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、ミリスチシン、サフロール、イソサフロール、メチスチシン及びピペリンからなる群から選択される、請求項３記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項６】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る金属カルボニル錯体が、ルテニウムカルボニル錯体又は鉄カルボニル錯体である、請求項３記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項７】
ＣＯが、ＰＧＲＭＣ１を介して生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込みを阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項８】
ＣＯがＰＧＲＭＣ１のヘムに結合することによりＰＧＲＭＣ１の機能を抑制し、脂肪酸やコレステロールの細胞への取り込みが阻害される、請求項７記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態又は疾患の改善、治療又は予防剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、体脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１１】
一酸化炭素（ＣＯ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることを含む、細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込みを阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素（ＣＯ）を用いて生体細胞における脂肪酸及びコレステロールの取り込みを阻害することに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪は、重要な栄養素であり、特にエネルギー源として重要である。しかしながら、遊離脂肪酸を肝臓細胞等の細胞において過剰に取り込むと、肥満を助長し、メタボリックシンドロームなどの生活習慣病の問題を引き起こす。
一酸化炭素（ＣＯ）の生体に対する作用に関して、アテローム性（粥状）動脈硬化の進展中にＨＯ−１（ヘムオキシゲナーゼ−１）／ＣＯシステムによりＣＯの産生が上昇し、血管壁を弛緩させることが報告されている（非特許文献１）。また、同文献には、該システムがアテローム性動脈硬化におけるプラークの形成を阻害することが示唆されている。
また、ＣＯに暴露された動脈において内皮膜（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の透過性が増大し、コレステロールの血管壁を通しての取り込みが増大することが報告されている（非特許文献２）。同文献において、内皮膜の透過性については、ＣＯにより内皮細胞間のギャップが広がることが示唆されている。
さらに、ＣＯの血管に対する作用として、ＣＯが血管を拡張させることが報告されており、ＣＯを放出し得るカルボニル化合物を高血圧等の治療に用いることが報告されている（特許文献１）。
しかしながら、ＣＯと細胞における脂肪酸やコレステロール等の代謝との関係についての知見はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２１５３１１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＤＡ−ＮＡＮ  ＬＩＵ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＲＤＩＯＶＡＳＣＵＬＡＲ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＡＦＲＩＣＡ，Ｖｏｌ２１，Ｎｏ５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ／Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１０
【非特許文献２】Ｊ．Ｓ．Ｍ．ＳＡＲＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２２（１９７５）１９３−１９８
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、生体細胞における脂肪酸及びコレステロールの取り込みを阻害する組成物の提供を目的とする。
上記のように、ＣＯにより血管の細胞間のギャップが拡がり、血管壁が弛緩し、コレステロールの血管壁を通しての取り込みが増大することは報告されていた。しかしながら、ＣＯが細胞の物質の取り込み等に関与することについては何ら知見がなかった。
本発明者らは、ＣＯが生体細胞において、ステアリン酸、パルミチン酸等の脂肪酸及びコレステロールの取り込みを阻害することを見出した。この知見より、ＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物を生体細胞における脂肪酸やコレステロールの取り込み阻害に用い脂肪酸やコレステロールの細胞への蓄積が関与するメタボリックシンドローム等の状態を改善し、さらに該状態に関連する疾患を予防又は治療できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  一酸化炭素（ＣＯ）を含む、生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［２］  一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物を含む生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［３］  一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、メチレンジオキシフェニル（ＭＤＰ）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物又は金属カルボニル錯体である、［２］の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［４］  一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、以下の式で表されるメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物である、［３］の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤：
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［式中、Ｒ１はベンゼン環上の置換基を表し、ｎは置換基の数を表し、０、１、２、３又は４である］。
［５］  一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、ミリスチシン、サフロール、イソサフロール、メチスチシン及びピペリンからなる群から選択される、［３］の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［６］  一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る金属カルボニル錯体が、ルテニウムカルボニル錯体又は鉄カルボニル錯体である、［３］の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［７］  ＣＯが、ＰＧＲＭＣ１を介して生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込みを阻害する、［１］〜［６］のいずれかの脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［８］  ＣＯがＰＧＲＭＣ１のヘムに結合することによりＰＧＲＭＣ１の機能を抑制し、脂肪酸やコレステロールの細胞への取り込みが阻害される、［７］の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
［９］  ［１］〜［８］のいずれかの阻害剤を含む、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態又は疾患の改善、治療又は予防剤。
［１０］  ［１］〜［８］のいずれかの阻害剤を含む、体脂肪蓄積抑制剤。
［１１］  一酸化炭素（ＣＯ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることを含む、細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込みを阻害する方法。
実施例に示すように、ＣＯは細胞における脂肪酸やコレステロールの取り込みを阻害する。従って、ＣＯを生体に投与するか、あるいはＣＯを生体内で生成し放出し得る化合物、例えばメチレンジオキシフェニル（ＭＤＰ）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物を生体に投与することにより、生体内の細胞における脂肪酸やコレステロールの取り込みが阻害され、脂肪酸やコレステロールの細胞への蓄積が関与するメタボリックシンドローム等の疾患の治療や予防に役立てることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−１２７４０７号、２０１１−２６３０１５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ＣＯによる細胞におけるステアリン酸の取り込み阻害を示す図である。
図２は、ＣＯによる細胞におけるＬＤＬの取り込み阻害を示す図である。
図３は、ＰＧＲＭＣ１タンパク質の吸収スペクトルを示す図である。
図４は、ＰＧＲＭＣ１を標的とするｓｉＲＮＡによりＰＧＲＭＣ１遺伝子をノックダウンした細胞におけるステアリン酸及びパルミチン酸の取り込み阻害を示す図である。
図５は、ＰＧＭＲＣ１ノックダウン作出に用いたベクターのコンストラクトを示す図である。
図６は、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおけるＰＧＲＭＣ１遺伝子の発現の有無を示す図である。
図７は、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスに高脂肪食を与えた場合の体重増加を示す図である。
図８は、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスに高脂肪食を与えた場合の脂肪の蓄積を示す図である。
図９は、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスに高脂肪食を与えた場合の脂肪体積率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、一酸化炭素（ＣＯ）又は生体内でＣＯを生成し得る化合物を有効成分として含む、生体細胞における脂肪酸又はコレステロール取り込み阻害剤であり、ＣＯを生体細胞に作用させることにより、該細胞における脂肪酸及び／又はコレステロールの取り込みが阻害される。
本発明の脂肪酸又はコレステロール取り込み阻害剤により取り込みが阻害される脂肪酸は限定されないが、遊離脂肪酸であり、ステアリン酸、パルミチン酸等を含む。また、本発明においてコレステロールは、リポ蛋白質に含まれるコレステロール、例えば、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロールが含まれ、さらにコレステロールが酸化されてできる酸化コレステロールが含まれる。好ましくは、本発明において、細胞への取り込みが阻害されるコレステロールは、細胞に取り込まれることにより、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、アルコール性脂肪肝等の脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎等の原因となり得るコレステロールである。
さらに、生体内でＣＯを放出し得る化合物を生体に投与してもよい。このような化合物を生体内に投与した場合、生体内で酵素の作用により代謝されＣＯを放出し、放出されたＣＯの作用により、生体の細胞における脂肪酸又はコレステロールの取り込みが阻害される。また、脂肪酸とコレステロールの取り込みを同時に阻害することもできる。
生体内でＣＯを放出し得る化合物として、以下の式Ｉで表されるメチレンジオキシフェニル（ＭＤＰ）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物が挙げられる。
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メチレンジオキシベンゼン誘導体化合物として、例えば一般式ＩＩで表わされる化合物が挙げられる。
2012169654.tif 000005
［式中、Ｒ１はベンゼン環上の置換基を表し、ｎは置換基の数を表し、０、１、２、３又は４であり、好ましくは０又は１である。］
さらに、メチレンジオキシベンゼン誘導体化合物として、一般式ＩＩＩで表される化合物が挙げられる。
2012169654.tif 000006
これらの化合物の多くは植物油中に含まれ植物から抽出し、精製することができる。また、化学合成して得ることも可能である。
例えば、Ｒ２がＣＨ３Ｏ−であり、Ｒ３がＨ２Ｃ＝ＣＨ−ＣＨ２−である化合物（ナツメグ（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）由来のミリスチシン）、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＨ２Ｃ＝ＣＨ−ＣＨ２−である化合物（ササフラス（Ｓａｓｓａｆｒａｓ  ａｌｂｉｄｕｍ）由来のサフロール）、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＣＨ３−ＨＣ＝ＣＨ−である化合物（ササフラス由来のイソサフロール）等が挙げられ、さらに、下記式ＩＶで表されるカバ（Ｂｅｔｉｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）由来のメチスチシン、下記式Ｖで表されるコショウ（Ｐｉｐｅｒ  ｎｉｇｒｕｍ）由来のピペリン等が挙げられる。
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これらの化合物は、生体内の水酸化酵素であるチトクロームＰ４５０ファミリーに属する酵素により以下の式に示すように酸化され、ＣＯが生成する。シトクロームＰ４５０ファミリーに属する酵素は肝臓に多く存在し、ＣＯも主に肝臓で発生する。
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さらに、生体内でＣＯガスを放出する化合物として、金属カルボニル化合物も利用することができる。金属カルボニル化合物として金属と配位子としてカルボニルを含む金属カルボニル錯体が挙げられる。金属としては、ルテニウム（Ｒｕ）、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、ロジウム（Ｒｈ）等が挙げられるが、この中でもルテニウム、鉄が好ましい。
上記の金属カルボニル錯体としては、例えば、式［Ｍ（ＣＯ）ａＸｂ］ｄで表される化合物が挙げられる。式中、Ｍは上記の金属、Ｘは原子又はイオン結合、共有結合、若しくは配位結合によりＭに結合した基であり、ａ、ｂ、ｃは少なくとも１であり、ｂ＞１の時、各Ｘは同じであっても異なっていてもよい。Ｘとして、例えば、ハロゲン類、Ｍに配位結合するための孤立電子対を与えるＮ、Ｐ、Ｏ若しくはＳ原子を有する基、又は共役炭素基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｇｒｏｕｐｓ）が挙げられる。上記式で表される化合物として、例えば、［Ｒｕ（ＣＯ）３Ｃｌ２］２で表される化合物が挙げられる。
さらに、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）も生体内のチトクロームＰ４５０の作用により、ＣＯを放出する。
生体内に投与されたＣＯ又は生体内に投与した化合物から放出されたＣＯが生体内で細胞に接触すると、該細胞において脂肪酸又はコレステロールの取り込みが阻害されることを見出した。
さらに、ＣＯによる脂肪酸、あるいは、コレステロールの取り込み阻害に関与する分子のひとつとして、ＰＧＲＭＣ１（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  １）を同定した。ＰＧＲＭＣ１はヘム結合タンパク質であり、ＣＯがＰＧＲＭＣ１のヘムに結合したことで４１９ｎｍに吸収ピークが出現したものと考えられる（図３）。以上のことから、ＣＯがＰＧＲＭＣ１のヘムに結合することによりＰＧＲＭＣ１の機能を抑制し、脂肪酸やコレステロールの細胞への取り込みが阻害されることが示唆された。そこで、細胞においてＰＧＲＭＣ１遺伝子をノックダウンしたところ、脂肪酸の取り込みが抑制された（図４）。
また、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスに高脂肪食を与えた場合、対照群と比較して体重増加が顕著に抑制されること（図７）、および、体脂肪（皮下脂肪及び内蔵脂肪）の蓄積が抑制されること（図８、９）を見出した。
本発明のＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物を含む、生体の細胞における脂肪酸又はコレステロール取り込み阻害剤が対象とする生体は限定されず、哺乳類、鳥類、魚類等脂肪をエネルギーとして貯蔵し得るあらゆる動物の生体が対象となる。この中でも哺乳動物が好ましく、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等が挙げられ、その中でもヒトやイヌ、ネコ等の愛玩動物が好ましい。また、対象とする細胞も限定されず、生体のあらゆる細胞が対象となる。この中でも特に脂肪組織における脂肪細胞や肝臓細胞が好ましい。
脂肪酸が脂肪組織の細胞に取り込まれた場合、脂肪酸は、グリセロールに結合し、脂肪を形成する。脂肪の形成は、メタボリックシンドロームや肥満等の原因となり得る。
従って、ＣＯにより生体の細胞における脂肪酸、コレステロールの取り込みを阻害することにより、メタボリックシンドロームや肥満を予防し、あるいは治療を行うことができる。ここで、メタボリックシンドロームは、高脂血症や肥満等の生活習慣により惹起される状態をいい、日本においては、厚生労働省により、腹腔内臓脂肪蓄積を表す一定サイズ以上のウエストサイズを有する被験体が、さらに脂質代謝異常、高血圧、高血糖のうち２つ以上を有する場合と定義されている。
また、本発明の脂肪酸又はコレステロール取り込み抑制剤は、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、アルコール性脂肪肝等の脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態や代謝性疾患に対する改善、予防又は治療効果を発揮する。メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる疾患は、メタボリックシンドロームから生じる疾患または状態をいい、高血圧、糖尿病、高脂血症、肥満、糖尿病合併症（糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症など）等が挙げられる。
本発明は、ＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物を有効成分として含む脂肪酸又はコレステロールの取り込み阻害剤を含む、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、アルコール性脂肪肝等の脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態や代謝性疾患を改善、予防又は治療するための医薬組成物を包含する。また、本発明の脂肪酸又はコレステロールの取り込み阻害剤は、例えば体脂肪蓄積抑制剤等としても用いることができる。
本発明の医薬組成物は、有効成分がＣＯの場合、例えば、ＣＯガスを含んだ溶液である。この場合、例えば、ＣＯガスを溶存させた溶液を静脈注射、静脈への点滴等により投与すればよい。ＣＯガスを溶存させる溶液としては、点滴に用いる輸液を用いることができ、０．９％生理食塩水、５％ブドウ糖液、リンゲル液等を用いることができる。ＣＯガスを溶存させた溶液は、加圧下においてＣＯガスを水溶液に溶解させることにより製造することができる。２５℃でＣＯは水溶液１Ｌ当たり約２１．４ｍＬ溶存し得る。本発明の水溶液形態の脂肪酸又はコレステロール取り込み阻害剤は、水溶液１Ｌ当たり、５ｍＬ以上、好ましくは１０ｍＬ以上、さらに好ましくは１５ｍＬ以上、特に好ましくは２０ｍＬ以上のＣＯを含む。ＣＯガスを溶存させた溶液は静脈注射、静脈への点滴等により被験体に投与することができる。
有効成分が生体内でＣＯを放出し得る化合物である場合、その形態は制限されず、固体状（錠剤状、粉末状、顆粒状等）、液状（乳液状、溶液状、分散液状等）の形態とすることができる。具体的には、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤、エアゾル剤、腸溶剤、徐放製剤、埋め込み型製剤等として調製することができる。
該医薬組成物は、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与等の非経口、経肺、経鼻、経口、局部埋め込みを含めた種々の投与経路で投与することができる。
上記医薬組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含んでいてもよい。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖などが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
上記医薬組成物には、有効成分である生体内でＣＯを放出し得る化合物を、０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％、さらに好ましくは０．０５〜５重量％で含有させればよい。
本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。
ＣＯ又はＣＯを放出し得る化合物は、例えば、脂肪組織や肝臓に局所投与してもよい。
また、ＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることにより、該細胞の脂肪酸及び／又はコレステロールの取り込みを阻害することができる。本発明は、ＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることを含む、該細胞の脂肪酸及び／又はコレステロールの取り込みを阻害する方法を包含する。用いる細胞としては、生体から採取した脂肪組織における脂肪細胞や肝臓細胞が挙げられる。接触は、例えば、細胞を培養している培地中にＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物を添加すればよい。接触させるＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物の量は限定されないが、例えば、細胞を含む培地に、生体内でＣＯを放出し得る化合物を、０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％、さらに好ましくは０．０５〜５重量％添加すればよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の脂肪酸及び／又はコレステロールの取り込みを阻害する方法は、例えば、細胞における脂肪酸及び／又はコレステロールの取り込みのメカニズムの研究等に有用である。
また、ＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物は実験用試薬等の試薬としても用いることができ、本発明はＣＯ又は生体内でＣＯを放出し得る化合物を含む試薬を包含する。
さらに、生体内でＣＯを放出し得る化合物は、飲食品に混合し、飲食品組成物として利用することもできる。食品及び飲料は健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメント等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。これらの飲料品には、メタボリックシンドロームを改善するために用いられるものである旨の表示等が付されていてもよい。
食品及び飲料としては、限定はないが、例えば乳製品、菓子（ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリーム等）、スープ、ジュース、パン、食肉加工食品（ハム、ソーセージ等）。麺、水産加工食品、調味料（ドレッシング等）などが挙げられる。
飼料としては、任意の形態で使用することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
ＣＯによる細胞におけるステアリン酸の取り込み阻害
ヒトｈｅｐａｔｏｍａ細胞株ＨｕＨ７細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを用いて６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（イワキ）中にスライドガラス（１ｃｍ２；ｍａｔｓｕｎａｍｉ  ｇｌａｓｓ）を入れて一晩ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、メディウムを捨て、血清を含まないＤＭＥＭ中に、ステアリン酸（ｓｉｇｍａ）を終濃度４００μＭとなるように溶解した１％ＢＳＡ（和光純薬）を加えて、再度ＣＯ２インキュベーターで１２時間培養した。また、ＣＯの徐放剤としてＣＯ−Ｒｕ（ｓｉｇｍａ社のＣＯＲＭ２（［Ｒｕ（ＣＯ）３Ｃｌ２］２））を使用）を１μＭ、またはこのｃｏｎｔｒｏｌとしてＲｕｔｅｎｉｕｍ錯体１μＭを脂肪酸と同時に加えて培養を行った。この後、メディウムを捨てＰＢＳで３回洗浄し、スライドガラス上でＰＢＳ中に１００ｎｇ／ｍｌとなるように溶かしたＮｉｌｅ  Ｒｅｄ試薬（ｓｉｇｍａ）を加えて５分間反応を行って脂肪酸を染色した。さらに、ＰＢＳで３回洗浄しＤＡＰＩ試薬（２ｎｇ／ｍｌ；和光純薬）を加えて５分間反応させ、核を染色した。これを蛍光顕微鏡で観察を行い、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ由来のＧｒｅｅｎの蛍光を脂肪酸及び、ＤＡＰＩ由来のＢｌｕｅの蛍光を検出した。結果を図１に示す。図はステアリン酸のみを加えたものをＳＡ４００、Ｒｕｔｅｎｉｕｍ錯体を加えたものをＲｕ、ＣＯ−Ｒｕを加えたものをＣＯ−Ｒｕ  １μＭと表記している。図中、青色部分はＤＡＰＩ試薬で染色された核を表し、緑色部分は細胞中に取り込まれたステアリン酸の存在を示す。ステアリン酸のみを加えた細胞（ＳＡ４００）、及びＲｕｔｅｎｉｕｍｕ錯体を加えた細胞（Ｒｕ）においては、青色に染色された周囲が緑色に染色されており、この結果は細胞にステアリン酸が取り込まれたことを示す。一方、ＣＯ−Ｒｕを添加した細胞においては、青色に染色された部分の周囲は緑色に染色されていない。この結果は、ＣＯ−Ｒｕを添加した細胞においては、ステアリン酸の取り込みが抑制されたことを示す。
【実施例２】
【０００９】
ＣＯによる細胞におけるＬＤＬの取り込み阻害
上記と同様にＨｕＨ７細胞を、スライドガラスを入れたｄｉｓｈで培養後、メディウムを捨て血清を含まないＤＭＥＭ中に蛍光標識したＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を終濃度８ｍｇ／ｍｌとなるように加え２時間培養を行った（コントロール）。またこれと同時に、上記と同様にＣＯ−Ｒｕ  １μＭを加えて解析を行った。培養後、メディウムを捨てＰＢＳで三回洗浄し、ＤＡＰＩ試薬（２ｎｇ／ｍｌ；和光純薬）を加えて５分間反応させた。これを蛍光顕微鏡で観察を行い、ＦＩＴＣ−ＬＤＬ由来のＧｒｅｅｎの蛍光を脂肪酸および、ＤＡＰＩ由来のＢｌｕｅの蛍光を検出した。結果を図２に示す。上のパネルがコントロールを示し、下のパネルがＣｏ−Ｒｕを添加したものを示す。コントロールにおいては、青色に染色された周囲が緑色に染色されており、この結果は細胞にＬＤＬが取り込まれたことを示す。一方、ＣＯ−Ｒｕを添加した細胞においては、青色に染色された部分の周囲は緑色に染色されていない。この結果は、ＣＯ−Ｒｕを添加した細胞においては、ＬＤＬの取り込みが抑制されたことを示す。
【実施例３】
【００１０】
ＰＧＲＭＣ１を標的とするｓｉＲＮＡによりＰＧＲＭＣ１遺伝子をノックダウンした細胞におけるステアリン酸及びパルミチン酸の取り込み阻害
実施例１の実験において、ＰＧＲＭＣ１を標的とするｓｉＲＮＡ（配列：ＧＡＵＧＵＧＡＣＣＡＡＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＡＵＵＣＵ）（配列番号１）をｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）によりヒト肝癌由来細胞株ＨｕＨ７細胞に遺伝子導入し、ＰＧＭＲＭＣ１遺伝子をノックダウンした。実施例１と同様に、ＰＧＲＭＣ１遺伝子をノックダウンしたＨｕＨ７細胞に、ステアリン酸（ｓｉｇｍａ）又はパルミチン酸を終濃度４００μＭとなるように溶解した１％ＢＳＡ（和光純薬）を加えて、培養した。メディウムを捨てＰＢＳで３回洗浄し、スライドガラス上でＰＢＳ中に１００ｎｇ／ｍｌとなるように溶かしたＮｉｌｅ  Ｒｅｄ試薬（ｓｉｇｍａ）を加えて５分間反応を行って脂肪酸を染色した。さらに、ＰＢＳで３回洗浄しＤＡＰＩ試薬（２ｎｇ／ｍｌ；和光純薬）を加えて５分間反応させ、核を染色した。これを蛍光顕微鏡で観察を行い、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ由来のＧｒｅｅｎの蛍光を脂肪酸及び、ＤＡＰＩ由来のＢｌｕｅの蛍光を検出した。結果を図４に示す。図中、青色部分はＤＡＰＩ試薬で染色された核を表し、緑色部分は細胞中に取り込まれたステアリン酸またはパルミチン酸の存在を示す。ＰＧＲＭＣ１遺伝子がノックダウンされていない細胞にパルミチン酸（図４Ａ）またはステアリン酸（図４Ｂ）を加えた場合、青色に染色された周囲が緑色に染色されており、この結果は細胞にステアリン酸又はパルミチン酸が取り込まれたことを示す。一方、ＰＧＲＭＣ１遺伝子をノックダウンした細胞にパルミチン酸（図４Ｃ）またはステアリン酸（図４Ｄ）を加えた場合、青色に染色された部分の周囲は緑色に染色されていない。この結果は、ＰＧＲＭＣ１ノックダウン細胞においては、ステアリン酸およびパルミチン酸の取り込みが抑制されたことを示す。
【実施例４】
【００１１】
ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウス（ＰＧＲＭＣ１  ＫＤマウス）を用いた高脂肪食投与による脂肪蓄積における効果
（１）ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスの作出
ドキシサイクリン依存性にＰＧＲＭＣ１遺伝子がノックダウンされるマウスを作出した。用いたマウス系統はＣ５７／ＢＬ６であり、図５に示すコンストラクトをマウスに公知の方法で導入することにより作出した。該マウスにおいては、ｓｈＲＮＡ遺伝子の上流にｔｅｔＲ制御下にあるＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒが挿入してあり、ドキシサイクリン非投与下ではｓｈＲＮＡの発現は起こらないが、マウスにドキシサイクリンを投与することによりｓｈＲＮＡが発現し、マウスにおいてＰＧＲＭＣ１の発現が抑制される。このように、ドキシサイクリン誘導性にＰＧＲＭＣ１の発現が抑制されるマウスをＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスと呼ぶ。
（２）ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおけるＰＧＲＭＣ１の発現
野性型マウス及びＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウス（雄、８週齢）に、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を２ｇ／Ｌ含む水を飲水として与えた後、肝臓におけるＰＧＲＭＣ１の発現を抗ＰＧＲＭＣ１抗体を用いたウエスタンブロット法により検討した。図６に示すように、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにドキシサイクリンを与えた場合に、ＰＧＲＭＣ１の発現が抑制されることを確認した。
（３）ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスの体重増加
ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウス及び野性型マウスにドキシサイクリンを含むか又は含まない飲水を与えて、高脂肪食（Ｆａｔ：４０％，Ｓｕｃｒｏｓｅ：４０％，リサーチダイエット社Ｄ１２３２７）を与え、３．５ヶ月（１４週間）にわたって体重を測定した。
結果を図７に示す。図中Ｗｔ（−）及びＷｔ（＋）は、それぞれドキシサイクリンを与えなかった場合及び与えた場合の野性型マウスの体重変化を示す。また、ＰＧＲＭＣ１（−）及びＰＧＲＭＣ１（＋）は、それぞれドキシサイクリンを与えなかった場合及び与えた場合のＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスの体重変化を示す。図７に示すようにドキシサイクリンを与えたＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおいて、対照群と比較して体重の増加が顕著に抑制された。
（４）ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおける脂肪の蓄積
上記（３）で用いたＷｔ（＋）及びＰＧＲＭＣ１（＋）のマウスについて１４週目にＣＴスキャンにより内蔵脂肪及び皮下脂肪の蓄積を分析した。結果を図９に示す。図８Ａが野性型マウスのＣＴスキャン像を示し、図８ＢがＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスのＣＴスキャン像を示す。図８Ａ及び図８Ｂの左の図は断面の様子を示し、図８Ａ及び図８Ｂの中央の図はＣＴスキャンデータを処理して得られたマウスの横から見た場合の脂肪蓄積を示す図であり、図８Ａ及び図８Ｂの右の図はＣＴスキャンデータを処理して得られたマウスの上から見た場合の脂肪蓄積を示す図である。中央の図及び右の図のＺ−Ｚで示される断面の図が左の断面図である。ＣＴスキャン分析の結果は、内臓脂肪部分は黄色で表され、皮下脂肪部分はオレンジ色で表される。図においては、左の図においては、マウスの体の中央部分に認められる白い部分が内臓脂肪を表し。その周囲のグレーの部分が皮下脂肪を表す。中央及び右の図においては、Ｘ−ＸからＹ−Ｙの間の領域において、白い部分が内臓脂肪を表し、その周囲のグレーの部分が皮下脂肪を表す。図に示すように、ＰＧＲＭＣ１遺伝子の発現が抑制されたＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおいて、脂肪の蓄積が抑制されていた。さらに、図９に１４週目の野性型マウスとＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおける蓄積した脂肪体積率（体の体積に対する脂肪体積の割合）を示す。体脂肪は皮下脂肪と内蔵脂肪の合計である。図９に示すように、ＰＧＲＭＣ１ノックダウンマウスにおいて、脂肪体積率が野性型マウスに比べ低下していた。
以上の結果から、ＰＧＲＭＣ１が、生体において脂肪の代謝を制御している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００１２】
本発明のＣＯ又はＣＯを生体内で放出し得る化合物を含む細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤は医薬品や食品として利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素（ＣＯ）を含む、生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤（肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎の治療に用いる場合に限る）。
【請求項２】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物（ミリスチン及びピペリンを除く）を含む生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤（肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎の治療に用いる場合に限る）。
【請求項３】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、メチレンジオキシフェニル（ＭＤＰ）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物又はルテニウムカルボニル錯体若しくは鉄カルボニル錯体である、請求項２記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、サフロール、イソサフロール及びメチスチシンからなる群から選択される、請求項３記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態又は疾患の改善、治療又は予防剤。
【請求項１０】
請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、体脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１１】
一酸化炭素（ＣＯ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることを含む、細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込みを阻害する方法。
【請求項１２】
一酸化炭素（ＣＯ）を含む、生体細胞のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１３】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物（ミリスチン及びピペリンを除く）を含む生体細胞のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１４】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、メチレンジオキシフェニル（ＭＤＰ）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物又はルテニウムカルボニル錯体若しくは鉄カルボニル錯体である、請求項１３記載のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１５】
一酸化炭素（ＣＯ）を生体内で放出し得る化合物が、サフロール、イソサフロール及びメチスチシンからなる群から選択される、請求項１４記載のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態又は疾患の改善、治療又は予防剤。
【請求項１７】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、体脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１８】
一酸化炭素（ＣＯ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞と接触させることを含む、コレステロール取り込みを阻害する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月27日(2013.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素（CO）を含む、生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤（肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎の治療に用いる場合に限る）。
【請求項２】
一酸化炭素（CO）を生体内で放出し得る化合物（ミリスチン及びピペリンを除く）を含む生体細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤（肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎の治療に用いる場合に限る）。
【請求項３】
一酸化炭素（CO）を生体内で放出し得る化合物が、メチレンジオキシフェニル（MDP）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物又はルテニウムカルボニル錯体若しくは鉄カルボニル錯体である、請求項２記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項４】
一酸化炭素（CO）を生体内で放出し得る化合物が、サフロール、イソサフロール及びメチスチシンからなる群から選択される、請求項３記載の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態又は疾患の改善、治療又は予防剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、体脂肪蓄積抑制剤。
【請求項７】
一酸化炭素（CO）をin vitroで細胞と接触させることを含む、細胞の脂肪酸及び／又はコレステロール取り込みを阻害する方法。
【請求項８】
一酸化炭素（CO）を含む、生体細胞のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項９】
一酸化炭素（CO）を生体内で放出し得る化合物（ミリスチン及びピペリンを除く）を含む生体細胞のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１０】
一酸化炭素（CO）を生体内で放出し得る化合物が、メチレンジオキシフェニル（MDP）基を有するメチレンジオキシベンゼン誘導体化合物又はルテニウムカルボニル錯体若しくは鉄カルボニル錯体である、請求項９記載のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１１】
一酸化炭素（CO）を生体内で放出し得る化合物が、サフロール、イソサフロール及びメチスチシンからなる群から選択される、請求項１０記載のコレステロール取り込み阻害剤。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームに関連する疾患、メタボリックシンドロームによって発症リスクの上がる心疾患若しくは脳血管疾患、肥満、脂肪肝及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される状態又は疾患の改善、治療又は予防剤。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、体脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１４】
一酸化炭素（CO）をin vitroで細胞と接触させることを含む、コレステロール取り込みを阻害する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2012169654.tif 000020
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2012169654.tif 000021
【国際調査報告】
2012169654.tif 000022
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2012169654.tif 000024
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