(57)【要約】  所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させた組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させて、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を生産する方法、および所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換され、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化させた組換え動物細胞を提供する。  本発明は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させて組換え動物細胞をタンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化させ、この馴化した動物細胞をタンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させることで、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させた組換え動物細胞であって、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖可能な組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で馴化する工程と、
前記タンパク性の増殖因子を添加していない培地で馴化した細胞を、前記タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させる工程と、
前記培地の培養上清から所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程と
を含む、生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項２】
動物細胞を、生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させて組換え動物細胞を作る工程と、
前記組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化させる工程と、
前記馴化した組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させる工程と、
前記培地の培養上清から前記生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程と
を含む、生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項３】
前記タンパク性の増殖因子を添加していない培地は、ポリリン酸を含む、請求項１または２に記載の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項４】
前記ポリリン酸の濃度は、１０ｎＭ〜１０ｍＭである、請求項３に記載の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項５】
前記生理活性ペプチドまたはタンパク質が、ネコエリスロポエチンである、請求項１から４のいずれかに記載の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項６】
前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞である、請求項１に記載の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項７】
前記生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程は、前記培養上清を銅キレート担体に通過させる工程を含む、請求項１に記載の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項８】
前記生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程は、前記培養上清を銅キレート担体に通過させる工程と、前記培養上清に含まれる生理活性ペプチドまたはタンパク質を陰イオン交換担体に吸着させる工程とを含む、請求項１に記載の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法。
【請求項９】
生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換され、
タンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化されている、組換え動物細胞。
【請求項１０】
前記所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に記載のネコエリスロポエチン遺伝子である、請求項８に記載の組換え動物細胞。
【請求項１１】
前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞である、請求項９または１０に記載の組換え動物細胞。
【請求項１２】
ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０１７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０１８として寄託されている、請求項９に記載の組換え動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造する生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法、および組換え動物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物細胞、とりわけ、遺伝子組換え動物を大量培養し、生理活性ペプタイドやタンパク質を製造することが行われている。これらの生理活性ペプタイドやタンパク質を製造するために、ほ乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザルの腎線維芽細胞のＳＶ４０形質転換体）、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）、ＢＨＫ細胞（ハムスター腎臓細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルの腎臓上皮由来動物培養細胞）などの接着性細胞が用いられている。【０００３】
これらの接着性細胞に対しては、通常ローラーボトル培養やマイクロキャリアー培養など固定化床に細胞を付着させて培養する固定化培養法が行われている。例えば、特許文献１には、ヒトエリスロポエチン（以下、ヒト「ＥＰＯ」という）製剤を、遺伝子組換えＣＨＯ細胞を用いて製造する技術が開示されている。この文献に記載の方法では、使用する遺伝子組換えＣＨＯ細胞株は、その増殖にウシ胎児血清を必要とする。このため、ウシ胎児血清に由来するウイルスやプリオンなどの病原性因子の危険性がある。【０００４】
また、この文献に記載の方法では、遺伝子組換えＣＨＯ細胞をローラーボトルの壁面に接着させて培養する。接触細胞が十分に増殖した後、ローラーボトル内を無血清培地で洗浄する。その後、再度無血清培地をローラーボトル内に充填し、数日間培養する。培養後、培養上清中に分泌生産されたヒトＥＰＯを回収することで、ヒトＥＰＯを生産する。【０００５】
無血清培地を用いて動物細胞などを培養する場合に、血清をできるだけ使わず、安定して細胞を増殖させる必要がある。インスリンなどの成長促進因子やホルモンを添加する方法では、成長促進因子やホルモンが高価であるために、培養細胞の維持にコストがかさむ。このため、培養細胞自体が分泌し、その細胞自身の増殖を促進させる細胞培養因子を安定化させることが試みられている（例えば、特許文献２参照）。この方法では、接着細胞を、直鎖ポリリン酸を含有する培地で、培養する。直鎖ポリリン酸が、細胞培養因子を安定化させている。【０００６】
一方、固定化培養法では、工業的に有用物質を大量生産するには、操作面やスケールアップの点から問題がある。このため、操作やスケールアップが容易な浮遊細胞を用いて浮遊培養する浮遊培養法が望まれる。浮遊培養法では、浮遊細胞を攪拌培養するので、大量生産に適する。このため、接着性細胞を浮遊化することが試みられている。【０００７】
遺伝子組換え動物培養細胞においても、浮遊培養法が検討されている。また、浮遊培養法においても、無血清培地で培養する方法が開発されている（例えば、特許文献３参照）。特許文献３に記載の方法では、浮遊細胞を無機または有機鉄化合物、シクロデキストリンおよび非イオン性界面活性剤を無血清培地に含有させた培地で培養する。【０００８】
しかし、この文献に記載の方法を用いても、インスリンやインスリン用増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）などのタンパク性の増殖因子を含む培地のほうが、タンパク性の増殖因子を添加していない培地より、生理活性ペプチドやタンパク質の生産量が多い。
【特許文献１】特公平５−３５１５９号公報
【特許文献２】特開２００７−５４０８０号公報
【特許文献３】特開平８−７０８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させた組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させて、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を生産する方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換され、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化させた組換え動物細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させて組換え動物細胞をタンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化させ、この馴化した動物細胞をタンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させることで、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。【００１１】
本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させた組換え動物細胞であって、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖可能な組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で馴化する工程と、前記タンパク性の増殖因子を添加していない培地で馴化した細胞を、前記タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させる工程と、前記培地の培養上清から所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程とを含む。【００１２】
本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法は、動物細胞を、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させて組換え動物細胞を作る工程と、前記組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化させる工程と、前記馴化した組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖させる工程と、前記培地の培養上清から所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程とを含む。【００１３】
前記所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質は、ネコエリスロポエチンであると好ましい。また、前記動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞であると好ましい。【００１４】
前記タンパク性の増殖因子を添加していない培地は、ポリリン酸を含む。前記ポリリン酸の濃度は、１０ｎＭ〜１０ｍＭであると好ましい。【００１５】
前記生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程は、前記培養上清を銅キレート担体に通過させる工程を含むものであるとよい。また、前記生理活性ペプチドまたはタンパク質を回収する工程は、前記培養上清を銅キレート担体に通過させる工程と、前記培養上清に含まれる生理活性ペプチドまたはタンパク質を陰イオン交換担体に吸着させる工程とを含むものであってもよい。【００１６】
本発明は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換され、タンパク性の増殖因子を添加していない培地により浮遊状態で増殖可能になるように馴化されている、組換え動物細胞である。前記所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に記載のネコネコエリスロポエチン遺伝子であるとよい。前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞であるとよい。この組換えチャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０１７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０１８として寄託されている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法では、血清を含まない培地で培養する。この結果、未知ウイルスやプリオンなどの混入のおそれがない安全な生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法を提供することができる。【００１８】
また、本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法で生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造する培地は、通常の基本培地にポリリン酸を添加する。したがって、成分組成が明らかであり、ロット間で差のない均一な培養条件を提供できる。【００１９】
さらに、組換え動物細胞を、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖することができきる。このため、タンパク性の増殖因子を除去する必要がない。この結果、安価に所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造できる。また、組換え動物細胞を浮遊化して用いる。この結果、浮遊培養法により、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を大量に製造できる。【００２０】
さらにまた、製造した所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質は、銅キレート担体または銅キレート担体と陰イオン交換担体とを用いて精製することにより、純度の高い所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を容易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の無タンパク培地馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン１）を培地Ｎｏ１、２で培養した場合の細胞濃度の変化を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の無タンパク培地馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン２）を培地Ｎｏ１、２で培養した場合の細胞濃度の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、血清要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１）を血清培地で培養し、インスリン要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’）をＤＭＥＭおよびインスリン添加ＤＭＥＭ培地で培養した場合の細胞濃度の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、無タンパク馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン１）をＤＭＥＭおよびインスリン添加ＤＭＥＭ培地で培養した場合の細胞濃度の変化を示すグラフである。
【図５】図５は、無タンパク馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン２）をＤＭＥＭおよびインスリン添加ＤＭＥＭ培地で培養した場合の細胞濃度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明を詳細に説明する。【００２３】
［組換え動物細胞の作成］
本発明の組換え動物細胞は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換され、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で浮遊状態で増殖可能になるように馴化されている。具体的には、（１）動物細胞を所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換し、組換え動物細胞株を樹立し、（２）この組換え動物細胞株を、液体培地で浮遊化し、（３）タンパク性の増殖因子を添加していない培地で増殖可能にすることによって、得られる。【００２４】
（１）組換え動物細胞株の樹立
本発明で用いる組換え動物細胞は、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換されているものであれば、公知の組換え動物細胞を用いてもよい。また、以下の方法により、動物細胞に所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子により形質変換させたものであってもよい。【００２５】
（所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質）
本発明で、「所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質」としては、ホルモン，鎮痛物質，リンホカイン，血球作用性因子，酵素，神経伝達因子，成長因子などおよびこれらの活性型誘導体またはムテインが挙げられる。その具体例として例えばホルモンとしては、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ），甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、インスリン，ソマトスタチン，成長ホルモン，プロラクチン，副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ），メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），バソプレシン，バソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑誌，第５４巻第５号第６７６〜６９１頁（１９７８）〕など｝，オキシトシン，カルシトニン，副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ），グルカゴン，ガストリン，セクレチン，パンクレオザイミン，コレシストキニン，アンジオテンシン，ヒト胎盤ラクトーゲン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ），セルレイン，モチリンなどが挙げられる。鎮痛物質としては、エンケファリン，エンケファリン誘導体〔米国特許第４２７７３９４号，ヨーロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕，エンドルフィン，ディノルフィン，キョウトルフィンなどが挙げられる。リンホカインとしては、インターフェロン（α型，β型，γ型），インターロイキン類（ＩＬ−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７，−８，−９，−１０，−１１など）などが挙げられる。血球作用因子としては、顆粒球コロニー刺激因子，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子，マクロファージコロニー刺激因子，エリスロポエチン，サイモポエチン，サイモシンなどが挙げられる。酵素としては、ウロキナーゼ，ティシュープラスミノーゲンアクチベータ，カリクレインなどが挙げられる。神経伝達物質としては、ボムベシン，ニュウロテンシン，ブラジキニン，サブスタンスＰなどが挙げられる。成長因子としては、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー（ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＮＧＦ−２，ＮＴ−４，ＮＴ−５など），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー（ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＩＮＴ−２，ＨＳＴ−１，ＦＧＦ−５，ＦＧＦ−６など）などが挙げられる。【００２６】
なかでも、本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、特にネコＥＰＯの製造に好ましく用いられる。ＥＰＯは、赤血球産生を促進するホルモンで、主に腎臓において生産される。ヒトＥＰＯは１９２残基のアミノ酸で構成されており、その内２７残基がシグナルペプチド、１６５残基が成熟タンパク質のアミノ酸配列からなり、Ｎ型結合糖鎖およびＯ型結合糖鎖修飾を受けた分子量約３４，０００Ｄａの糖タンパク質である。ＥＰＯは、組織が低酸素ストレスを受けた際に骨髄中の原始前駆細胞が前赤芽球に変換されるのを促進し、もって赤血球の産生を増大させる作用を有する。ＥＰＯ  ｃＤＮＡクローニングは、ヒト以外にも、マウス、ラット、イヌ、ネコなどで行われている（ヴェンら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、１９９３年、第８２巻、ｐｐ１５０７−）。【００２７】
ヒトで報告のある慢性腎不全、化学療法剤又は外科手術によって引き起こされる貧血は、コンパニオンアニマルであるイヌおよびネコにおいても見られ、これらの動物の死亡および能力障害の主な原因となっている。現在、イヌやネコの輸血などに際して、さらにほとんどのネコの慢性腎疾患および感染症(ＦｅＬＶ感染)による貧血症状に対して、利用可能な唯一の方法は、組換えヒトエリスロポエチンの投与である。この動物種が異なるヒトＥＰＯの投薬は、イヌ、ネコの生活の質を改善するものの、２つの欠点を有するとされている。まず、第一の欠点は、ネコに対するヒトＥＰＯの活性は、ネコＥＰＯに比べて低下することが予想され、目的の治療効果を得るためには大量の投与を余儀なくされることである。第二の欠点は、ヒト由来ＥＰＯを投与されたイヌ、ネコは、その投与によって中和抗体が発現し、この抗体により投与したＥＰＯの有効性が減弱し、またイヌ、ネコ本来のＥＰＯと交叉反応して貧血を悪化させる（ヴェンら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、８２，１５０７（１９９３））。イヌ、ネコのＥＰＯ製剤が得られれば、これらの免疫学的な問題は克服され、ヒトＥＰＯ製剤投与による諸問題は解決される。【００２８】
（遺伝子の取得）
プラスミドの作成のために、まず、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を有する細胞から、（１）ポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、（２）ｃＤＮＡを合成し、（３）所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と略す）を行い、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を得る。【００２９】
（ＲＮＡの抽出）
ネコＥＰＯのポリ（Ａ）ＲＮＡは、虚血状態のネコの腎臓を処理して得られる細胞から、ポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出する。【００３０】
動物の細胞から、ＲＮＡを抽出する方法としては、（１）グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（チルインら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８、５２９４（１９７９））、（２）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、（３）グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、（４）グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、（５）グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、（６）グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの公知の方法から適当な方法を選んで行えばよい。【００３１】
（ｃＤＮＡの合成）
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、例えばトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いる方法のほか、一部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてもよい。市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。【００３２】
上記ＲＮＡ抽出方法のうち、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（ガブラーら：ジーン（Ｇｅｎｅ）．２５，２３６−２６９（１９８３））、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（オカヤマら：モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ），２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，（１９８３））などによりｃＤＮＡを合成することができる。【００３３】
（プライマーの設計）
以上のようにして得られたｃＤＮＡを鋳型として、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を基にし、かつベクターに組込みが可能なように適切な制限酵素サイトを付加したプライマーを設計する。【００３４】
このプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を得る。【００３５】
上記のようにして得られた所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに導入し、動物細胞に組み込む。本発明で用いることのできる発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクターなどを用いることができる。発現ベクターは、複製起点、マーカー遺伝子、プロモーター、ターミネーターなどを備えていればよい。【００３６】
プロモーターは、宿主である動物細胞により、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ｈＣＭＶ（ヒトサイトロメガウイルス）など、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質が生産できるものであれば、公知のプロモーターを使用できる。【００３７】
マーカー遺伝子は、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などが公知のマーカー遺伝子が用いられる。選択用添加物質として、Ｇ‐４１８、メトトレキセートが例示される。【００３８】
動物細胞としてＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を用いる場合には、マーカー遺伝子として、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を増幅させるために、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（ｍｄｈｆｒ）をコードする遺伝子を用いると、特に好ましい。所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質遺伝子とマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素遺伝子の両遺伝子が導入された動物細胞の培養液中にメトトレキセート（ＭＴＸ）を段階的に添加していくことで、動物細胞内のｍｄｈｆｒの発現量が向上する。また、同時に、目的の所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質遺伝子が増幅され、結果的に所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質発現量が向上する。【００３９】
ｍｄｈｆｒのｃＤＮＡは、例えば、マウスキラーＴ（ＴＫ）細胞などのマウス細胞から、上記所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質遺伝子の取得方法と同様の方法を用いて、得られる。ｍｄｈｆｒのｃＤＮＡは、上記所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が導入された発現ベクターに導入するか、別個の発現ベクターに導入する。【００４０】
上記発現ベクターを動物細胞に導入し、動物細胞を形質転換する。動物細胞への形質転換は、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法などの沈殿法、プロトプラストポリエチレン法、エレクトロポレーション法などが利用できる。【００４１】
形質転換に用いることができる動物細胞としては、ほ乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞などが挙げられる。これらのうち、ＣＨＯ細胞が好ましく用いられる。ＣＨＯ細胞としては、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞やＣＨＯ  Ｋ−Ｉ細胞を好適に使用することができる。具体的には、ネコＥＰＯのタンパク質の発現はチャイニーズハムスター卵巣細胞のＤＨＦＲ−（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ‐）株を用いることができる。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞は、構造遺伝子の突然変異によりジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（ＤＨＦＲ）を欠如しており、このため培地中にグリシン、ヒポキサンチン、チミジンの存在を要求する（ウルラシブら：プロシーディング・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サインス．７７，４４６１−４４６９（１９８０））。【００４２】
上記発現ベクターが導入された動物細胞は、（１）血清培地中で、培養し、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を産生する細胞を選択分離し、（２）無血清培地への馴化と浮遊細胞化、（３）無タンパク培地への馴化、（４）無タンパク培地への馴化した細胞からの単クローンのスクリーニングを行う。【００４３】
接着性の血清要求性のある動物細胞培養に用いる培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ））を加えたＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ−α培地、およびこれらの混合培地を用いる。無血清培地とは、血清非存在下各種タンパク性の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ（上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ））など）を加えたＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ−α培地、およびこれらの混合培地を用いる。【００４４】
（所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を産生する細胞の選択分離）
上記発現ベクターを導入した動物細胞から、発現ベクターが発現した動物細胞をスクリーニングする。例えば、上記発現ベクターを導入した動物細胞を、培地中にヒポキサンチン、チミジンを含み、グリシンを含まない、血清培地中で培養する。この培地中では、発現ベクター中のｄｈｆｒ遺伝子が発現した動物細胞のみが生存することができる。この結果、生存した細胞を選択することで、発現ベクターが発現した動物細胞が得られる。【００４５】
次に、選択した動物細胞を、血清培地で増殖させた培養液中にメトトレキセート（ＭＴＸ）を段階的に添加する。これにより、動物細胞内のｍｄｈｆｒの発現量が向上する。これにより、ｍｄｈｆｒの発現量が増加した動物細胞を選択することができる。【００４６】
ｍｄｈｆｒの発現量が増加した動物細胞を培養した培養液を分析し、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質が産生されていることを確認する。これにより、高濃度で所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を産生できる動物細胞を選択することができる。【００４７】
所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質が産生されていることは、公知の方法を用いて確認すればよい。例えば、ネコＥＰＯ産生は以下のようにして確認する。【００４８】
分子量は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて測定する。後述の実施例で得られた細胞形質転換動物細胞により生産されたネコＥＰＯは還元条件下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、分子量が約３０〜３５ｋＤである。【００４９】
ネコＥＰＯは、iｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＴＦ細胞による細胞増殖活性や赤血球前駆細胞の細胞増殖活性により生理活性が主に特性化される。したがって、ヒトＴＦ細胞による細胞増殖活性や赤血球前駆細胞の細胞増殖活性を測定することにより、ネコＥＰＯの比活性を評価する。【００５０】
本発明によるネコＥＰＯの比活性とは、ネコＥＰＯタンパク質１ｍｇあたりの生理活性の強さを意味する。比活性はタンパク質の精製が進むに従って増大するために純度の指標ともなりうる。ネコＥＰＯの比活性は、以下のように算出することができる。すなわち、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）に添付の方法に従い、キット中のヒトＥＰＯ国際標準品をスタンダードとして用いて、溶液中のネコＥＰＯの活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。次に、ネコＥＰＯ溶液のタンパク定量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、タンパク濃度（ｍｇ／Ｌ）の算出を行う。得られた活性値（Ｕ／ｍＬ）をタンパク濃度（ｍｇ／Ｌ）で除した数値の商を比活性値とした。すなわち、比活性値は、溶液あたりのネコＥＰＯ活性値（Ｕ／ｍＬ）／溶液あたりのネコＥＰＯタンパク濃度（ｍｇ／Ｌ）で表される。【００５１】
（無血清培地への馴化と浮遊細胞化）
形質転換された動物細胞の無血清培地への馴化方法としては、公知の方法、例えば血清を含有する培地で継代した細胞を、市販の無血清培地等へ直接馴化させる方法や連続馴化させる方法（セルアンドティシューカルチャーラボラトリープロセジャー  ジョン  ウイリーアンド  ソンズ）などが挙げられる。【００５２】
好ましくは、上記形質変換された組換え動物細胞を無血清培地へ馴化させる。血清培地と、インスリン等のタンパク性の増殖因子と抗生物質とを含む培地とを作成する。形質変換された組換え動物細胞を、（１）血清培地、（２）血清培地とタンパク性の増殖因子と抗生物質とを含む培地との混合培地、（３）タンパク性の増殖因子と抗生物質とを含む培地の順で培養する。この培養により、生育してきた細胞を取得する。この培養により、形質変換された組換え動物細胞は、無血清培地へ馴化する。【００５３】
上記無血清培地へ馴化する際に、攪拌手段を備えた小型の培養器を用いて培養をする。攪拌手段を備えた小型の培養器とは、例えば各種容量のスピナーフラスコ、テクネ・スピナーフラスコ、エルレンマイヤーフラスコおよびジャーファーメンターなどが用いられる。このように攪拌しながら培養することで、接着性の形質変換された組換え動物細胞を浮遊化することができる。【００５４】
タンパク性の増殖因子としては、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）などが挙げられる。培地に、これらの増殖因子を添加する場合の増殖因子の濃度は、インスリン０．２〜２０μｇ／ｍＬ、トランスフェリン０．２〜２０μｇ／ｍＬ、ＩＧＦ  ０．１〜１０μｇ／ｍＬ、ＮＧＦ  ０．１〜１０μｇ／ｍＬ、ＥＧＦ  ０．１〜１０μｇ／ｍＬである。但し、増殖因子の種類や濃度は、これらに限定されない。また、これらの増殖因子は細胞の増殖性に寄与するタンパク質である。これらの増殖因子の定量は、公知の方法によればよい。また、各増殖因子のＥＬＩＳＡキットが市販されており、キットを使用して、濃度を定量してもよい。各増殖因子のＥＬＩＳＡキットおよび検出限界の一例を以下に列記する。すなわち、インスリン：〜１０ｎｇ／ｍＬ（森永株式会社製）、トランスフェリン：〜３．９ｎｇ／ｍＬ（コスモバイオ社製）、ＥＧＦ：〜１００ｎｇ／ｍＬ（フナコシ株式会社製）、ＩＧＦ：〜０．０９ｎｇ／ｍＬ（コスモバイオ社製）。【００５５】
浮遊攪拌および無血清培地に細胞を馴化するための培養方法自体は、公知の方法に従えばよい。通常、約３０〜４０℃、攪拌回転数２０〜１００ｒｐｍで約３日〜７日毎に継代を繰り返して行い、必要に応じてｐＨ調節や通気を行う。具体的には、通常種細胞濃度５×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養を開始し、細胞濃度が、１×１０６〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達すると、境内を行う。これらの馴化に要する全期間は約１ヵ月〜５ヵ月である。上記のようにして得られた馴化細胞株より高産生クローンを選択して用いる。高産生クローン選択のためのクローニングの方法は公知であり、例えばコロニー分離法、限界希釈法、マイクロウェル法（日本生化学会編・新生化学実験講座１８、細胞培養技術第１２〜１３頁（１９９０）、東京化学同人）などが挙げられる。また、例えば限界希釈法などを用いる高産生クローンの選択を繰り返す、培地中の選択薬剤(ＭＴＸなど)の濃度を徐々に上げながら継代し、選択薬剤耐性にすることにより、生理活性ペプチドの構造遺伝子を増幅させる、あるいはこれらを組み合わせることにより、株レベルでの生産性を向上させるとよい。【００５６】
（無タンパク培地への馴化）
次に、無血清培地への馴化した動物細胞を、無タンパク培地へ馴化させる。具体的には、タンパク性の増殖因子と抗生物質とを含む培地と、抗生物質とポリリン酸とを含む無タンパク培地（以下に記載する「タンパク性の増殖因子を添加していない培地」のことをいう。以下に、「無タンパク培地」または「ポリリン酸を含む培地」ということもある。）とを作成する。無血清培地への馴化した形質変換された組換え動物細胞を、（１）タンパク性の増殖因子と抗生物質とを含む培地、（２）タンパク性の増殖因子と抗生物質とを含む培地と抗生物質とポリリン酸とを含む培地との混合培地、（３）抗生物質とポリリン酸とを含む培地の順で培養する。この培養により、形質変換された組換え動物細胞は、無タンパク培地へ馴化する。【００５７】
タンパク性の増殖因子を添加していない培地とは、血清およびインスリンなどのタンパク性の増殖因子を添加していない培地である。基本培地に、ポリリン酸を含有させた培地である。本発明の動物細胞用培地は血清を含まないので、未知ウイルスやプリオンなどの混入のおそれがない。また、本発明の動物細胞用培地はタンパク性の増殖因子を添加していないので、培養物からの生理活性ペプチドまたはタンパク質の分離精製が極めて容易になる。【００５８】
基本培地としては、一般的に用いられる基礎培地が挙げられる。一般的に用いられる基礎培地とは、通常動物細胞が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源および無機塩などを含有させたものをいう。また、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質などの微量有効物質を配合してもよい。このような基礎培地としては、細胞培養のための全ての公知培地を使用することができる。具体的には、ＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）−１６４０培地、ＭＥＭ−α培地、ＣＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ）−ＣＨＯ培地などのケミカリー・ディファインド培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、グルタミン０．５〜５ｍＭ、抗生物質（ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（０．３ｍｇ／ｍＬ））などを添加してもよい。【００５９】
基本培地に添加するポリリン酸としては、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が挙げられる。特に、一般式ＰｎＯ（３ｎ＋１）Ｈ（ｎ＋２）で、２個以上のＰＯ４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状になった直鎖縮合ポリリン酸が好ましい。ｎは、通常１５〜２０００である。また、ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造を持つポリリン酸塩であってもよい。金属としてはナトリウム、カリウムが挙げられる。【００６０】
なお、この無タンパク培地への馴化の方法を、無血清培地で増殖可能な公知の組換え動物細胞に適用して、無タンパク培地への馴化させることとしてもよい。【００６１】
（無タンパク培地馴化細胞のスクリーニング）
上記操作により、無タンパク培地への馴化した組換え動物細胞を、ポリリン酸を含む培地中で継代培養する。この操作により、増殖性のある細胞を選択することで、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で好適に増殖できるクローンを得ることができる。クローンの取得方法は、上記と同様である。【００６２】
さらに、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で好適に増殖できるクローンから、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を効率よく生産できるクローンを選択することにより、より効率的に生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造することができる。形質変換された組換え動物細胞を浮遊化することができる。【００６３】
動物細胞の培養には、種々の培養ビン、ディッシュ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ジャーファーメンターなどを用いることができる。通常種細胞濃度５×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、培養温度３０〜４０℃で、２〜１０日間培養を行うと、各細胞濃度に応じ、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質が主に細胞外に分泌される。【００６４】
上記のようにして得られた所望の生理活性生理活性ペプチドまたはタンパク質の高産生株を用いて、目的の生理活性ペプチドを大量に生産するべく無血清培地で大量培養を実施する。この時の培養装置としては、通気手段、攪拌手段、温度調節手段、ｐＨ制御ならびに溶存酸素（ＤＯ）制御手段など培養に必要な部材が必要に応じて具備された公知の浮遊攪拌培養槽（日本生化学会編・新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩ合成および発現２８２頁、２８６頁（１９９２）、東京化学同人；日本生化学会編・新生化学実験講座１８、細胞培養技術第３１３〜３２３頁（１９９０）、東京化学同人）が用いられる。またエアーリフト式培養槽（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｒｃｈら，トレンズ  イン  バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）第３巻，１６２頁（１９８５）も用いられる。培養法としては、バッチ培養，フィード培養（フェッド・バッチ培養），灌流培養などが挙げられる。これらのうち、フィード培養は、新鮮な培地を間欠的に供給し、細胞の増殖および組換えタンパクの生産を向上させることができる点で好ましい。フィード培養の場合の新鮮培地の供給は、通常、対数増殖期から静止期までの期間において、培養開始後約２〜１０日目、好ましくは約３〜７日目から行われることが好ましい。また、灌流培養は、新鮮な培地を連続的にまたは間欠的に供給し、同量の培養上清液を連続的にまたは間欠的に排出することにより、細胞を生存状態で高密度に保ちつつ長期間維持することが可能である点で好ましい。また、フィード培養は、コンタミネーションの危険が低いことから、特にＧＭＰ管理下の製造設備が求められる医薬品製造において有用である。【００６５】
本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質製造方法では、タンパク性の増殖因子を添加していない培地で所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を製造する。このため、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質の分離・精製が容易である。具体的には、公知の分離、精製法を適切に組み合わせて実施すればよい。これらの公知の分離、精製法としては、塩析、硫安沈殿および溶媒沈殿法などの溶解度の差を利用する法、透析法、限外ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、例えば抗体カラムおよびＣｕ２＋カラムなどのメタルキレートカラム、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。【００６６】
本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質の製造方法において、上記のようにして動物細胞を培養して培養上清中に得られた生理活性ペプチドまたはタンパク質は、銅キレート担体を用いて好ましく精製される。【００６７】
銅キレート担体は、銅キレートを形成するのに適当なリガンドが結合されているセファロースなどの担体に銅イオンを接触させて調製された、銅イオンをキレート結合させた担体である。タンパク質を構成するアミノ酸は、キレート形成している銅イオンと複合体を形成するため、銅キレート担体にタンパク質を接触させることにより担体に吸着する。しかし、この担体への吸着はｐＨに依存する。またキレート形成するアミノ酸（主にヒスチジン、システイン）が糖鎖などでマスクされると銅キレート担体に結合しない場合もある。この性質を利用し、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む動物細胞の培養液や精製された溶液中の不純物すべてを銅キレートに吸着させる。これにより、特別な塩溶液を通液することなく、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質の高純度化が可能になる。逆に、予め所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質のみを銅キレートに吸着させ、塩の使用により、イオン強度を上げることで、溶出させ高純度化することも可能である。【００６８】
本発明において生理活性ペプチドまたはタンパク質の精製に使用される銅キレート担体としては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、銅キレートを形成するリガンド、例えばイミノジ酢酸などを親水性のスペーサーを介して、導入したものが挙げられる。好ましくは、イミノジ酢酸を導入したハイトラップキレーティング（ＧＥ社製）やキレーティングセファロースファーストフロー（ＧＥ社製）などが用いられる。【００６９】
銅キレート担体は、例えば次のようにして作製することができる。まず、上述した担体を精製水で予め平衡化しておき、０．１Ｍ硫酸銅水溶液を通液させる。その後に再度精製水を通液して余分な銅を除去し、精製に使用する平衡化緩衝液を通液する。以上のようにして作製した銅キレート担体を、本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質の精製に用いることができる。【００７０】
本発明の製造方法では、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む溶液（培養上清）を銅キレート担体に接触させ、生理活性ペプチドまたはタンパク質はフロースルー画分で回収する方法が好ましく採用される。【００７１】
銅キレート担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、生理活性ペプチドまたはタンパク質各成分の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。好ましくは、次の条件を適用することができる。すなわち、２０〜１００ｍＬの銅キレート担体を用い、これを１００〜５００ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液で平衡化する。次に、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む溶液を通液した後、再度４０〜１２５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を通液することで、生理活性ペプチドまたはタンパク質を精製することができる。【００７２】
本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質の製造方法においては、銅キレート担体を用いる精製工程に加えて、陰イオン交換担体（アニオン交換担体）を用いる精製工程を組み合わせることで、目的の生理活性タンパク質またはペプチドをさらに高純度化することが可能になる。【００７３】
陰イオン交換担体としては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、親水性のスペーサーを介して、化学的に安定なエーテル結合によってジエチルアミノエチル基やクオータナリーアンモニウム基を導入したものが挙げられる。好ましくは、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン（アニオン）交換担体、例えばＤＥＡＥセファロース（登録商標）（ＧＥ社製）などが用いられる。本発明の方法では、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む溶液を陰イオン交換担体であるＤＥＡＥセファロースに接触させ、担体への吸着物を溶出剤で溶出させる方法が好ましく採用される。【００７４】
陰イオン交換担体としてＤＥＡＥセファロースを用いた精製は、例えば次のように行う。まずｐＨを下げて生理活性ペプチドまたはタンパク質の等電点に近づけることで不純物を効果的に除去する。次にイオン強度を上げること、すなわち塩などの溶出剤による溶出を行うことで、純度の高いネコエリスロポエチンなどの所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む画分を溶出させる。溶出剤としては、例えば塩化ナトリウムや塩化カルシウムなどが挙げられる。目的の生理活性ペプチドまたはタンパク質の溶出は、溶出剤の濃度に依存し、溶出剤の濃度を変化させることにより、ＤＥＡＥセファロースに吸着したタンパク質を個々に分離・分画することができる。【００７５】
陰イオン交換担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、生理活性ペプチドまたはタンパク質の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。好ましくは、次の条件を適用することができる。すなわち、５ｍＬ〜２０ｍＬのＤＥＡＥセファロースを用い、これを５０ｍＬ〜２００ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液で平衡化する。次に、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む溶液を通液し、再度５０ｍＬ〜２００ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液で平衡化する。次に、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を溶出剤として、塩濃度を段階的に上げて担体に吸着した生理活性ペプチドまたはタンパク質を溶出させる。溶出剤は、Ｔｒｉｓ緩衝液２０ｍＬ〜１００ｍＬを通液する【００７６】
また、陰イオン交換担体による精製は、銅キレート担体による精製工程の後に実施しても、前に実施してもよいが、銅キレート担体による精製工程の後に実施することが好ましい。【００７７】
上記の銅キレート担体を用いて精製する工程、陰イオン交換担体を用いて精製する工程を含め、本発明の生理活性ペプチドまたはタンパク質を精製する工程においては、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む溶液（培養上清）やカラムクロマトで使用する溶出液に、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤としては、ラウロイルザルコシン酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤又はＨＣＯ６０、Ｔｗｅｅｎ８０等の非イオン系界面活性剤が挙げられる。これらの中でもＴｗｅｅｎ８０等の非イオン系界面活性剤が好ましい。また、界面活性剤の添加量としては、生理活性ペプチドまたはタンパク質上清液中又は溶出液中に０．００５重量％〜１重量％の範囲とすることが可能である。具体的には、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を用い、添加量０．０１重量％の濃度とすることが好ましい。【００７８】
本発明の生理活性ペプチド又はタンパク質の製造方法においては、さらにタンデンシャルウルトラフィルトレーションの工程を加えてもよい。これにより目的の生理活性ペプチドまたはタンパク質のさらなる高純度化が可能になる。タンデンシャルウルトラフィルトレーションは、主に限外ろか膜（ＵＦ膜）を用いたタンパク質の濃縮やバッファー交換を行う工程を意味する。この工程において、膜表面に対し溶液を平行に流すことによってファルリング（膜の目詰まり）を抑制し、安定で短時間での濾過工程を可能にする。ＵＦ膜としては、材質がポリエーテルスルホンや再生セルロースなどの膜を用いることができる。また、ＵＦ膜の分子量サイズは、目的となるタンパク質の分子量サイズに合わせて選択することができ、本発明によって好ましく製造されるネコエリスロポエチンの場合は１０００−１０００００が好ましい。ＵＦ膜としては、具体的にはＹＭ−１０（ミリポア社製）などが好ましいものとして挙げられる。【００７９】
本発明において、精製された生理活性ペプチドまたはタンパク質の純度の確認は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行うことができる。例えば、精製により得られたネコＥＰＯを含む溶液１０〜１００μｇをＨＰＬＣに導入したとき、得られた検量線から全てのピークの面積値における生理活性ペプチドまたはタンパク質以外の不純物のピーク面積値の割合を算出し、純度１００％から不純物の割合を差し引いた値を生理活性ペプチドまたはタンパク質の純度とすることができる。
【実施例】
【００８０】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、後述の実施例で得られた動物細胞は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  に、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０１７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０１８として寄託されている（寄託日：平成２０年（２００８年）９月１６日）。【００８１】
（実施例１）  組換えネコEPO生産ＣＨＯ細胞株の取得
（１）ＣＨＯ細胞へのネコＥＰＯ遺伝子およびマウスｄｈｆｒ遺伝子のトランスフェクション
ネコＥＰＯ遺伝子（配列番号１）およびマウスｄｈｆｒ遺伝子（配列番号２）をそれぞれ含む発現用遺伝子ベクターＤＮＡをそれぞれ１００μｇ，１０μｇを調製し、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞１×１０７ｃｅｌｌｓ／７５０μＬ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製したものと混合した。室温で３０分静置し、エレクトロポレーション装置（バイオラッド社製）に設置し、３３０μＦ，４００Ｖで通電した。５分間静置後、氷上でさらに１０分静置し、１０％ＦＢＳ、ヒポキサンチン、チミジンを含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１０ｃｍシャーレに撒いた。３７℃、５％ＣＯ２条件下２日間培養し、細胞を遠心操作により回収し、１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬＧ−４１８を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｃｃに懸濁し、１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で９６穴プレートに処理した。３日毎に１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬ  Ｇ−４１８を含むＩＭＤＭ培地で交換し、１５日間培養を行った。１５日後、顕微鏡観察を行い、生存している細胞を選択し、コロニー単離を行った。
配列番号１：
atggggtcgt  gcgaatgtcc  tgccctgctg  cttctgctat  ctttgctgct  gcttcccctg
ggcctcccag  tcctgggcgc  cccccctcgc  ctcatctgtg  acagccgagt  cctggagagg
tacattctgg  gggccaggga  ggccgaaaat  gtcacgatgg  gctgtgctga  aggctgcagc
ttcagtgaga  atatcactgt  cccagacacc  aaggtcaact  tctatacctg  gaagaggatg
gacgtcgggc  agcaggctgt  ggaagtctgg  cagggcctcg  ccctgctctc  agaagccatc
ctgcggggcc  aggccctgct  ggccaactcc  tcccagccat  ctgagaccct  gcagctgcag
tggataaagc  cgtcagcagc  ctgcgcagcc  tcacctccct  gcttcgggca  ctgggagccc
agaaggaagc  cacctccctt  ccagaggcaa  cctctgctgc  tccactccga  acattcactg
tcgatacttt  gtgcaaactt  ttccgaatct  actccaactt  cctgcgggga  aagctgacgc
tgtacacagg  ggaggcctgc  cgaagaggag  acaggtga
配列番号２：
atgaagctga  ccgccctgca  gctgctgctg  tggcacagcg  cactctggat  ggtgcaagaa
gccgcccccc  tgggccctac  cggccccctg  ccccagagct  tcctgctcaa  gtgcctagag
caaatgagga  aggtccaggc  tgatggcacg  gcgctgcagg  agacgctgtg  tgccacccac
cagctgtgcc  atcctgagga  gttggtgctg  ctcgggcacg  ctctgggcat  cccccagcct
cccctgagca  gctgctccag  ccaggccctg  cagctgatgg  gctgcctgcg  tcaactccac
agcggcctct  tcctctacca  gggcctcctg  caggccctgg  cagggatatc  ccccgagtta
gcgcccacct  tggacacact  gcagctggac  accaccgact  ttgccatcaa  catctggcag
cagatggaag  atctaggaat  ggcccccgcc  gtgccaccta  cccagggcac  catgccagcc
ttcacctcgg  ccttccagcg  ccgggcagga  ggtgtcctgg  tggcctccaa  cctgcagagc
【００８２】
（２）メトトレキセートによる遺伝子増幅
上記（１）で得られたクローンを１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍＬＧ−４１８を含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｃｃ／１０ｃｍシャーレを準備し、最終濃度５ｎＭ  メトトレキセート（ＭＴＸ）を添加した。３日毎に５ｎＭ  ＭＴＸを含む上記培地と交換し、１０−１５日間培養を継続し、細胞が生存していてコロニーを形成しているものについて、細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｃｃ／１０ｃｍシャーレを準備し、最終濃度５０ｎＭ  メトトレキセート（ＭＴＸ）を添加した。同様の方法で、５００ｎＭ  ＭＴＸまで処理を行い、細胞の生存が確認できる２クローンを選別した。【００８３】
ここで作製したネコＥＰＯをコードするＤＮＡ及びマウスｄｈｆｒをコードするＤＮＡを含む組換えＣＨＯ細胞を、それぞれ「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１」および「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２」とした。【００８４】
これらの細胞は、１０％ＦＢＳ存在下生育可能な血清要求性の細胞であり、接着性を有する細胞である。【００８５】
（３）ネコＥＰＯの活性測定
上記（２）の培養上清中に生産されたネコＥＰＯの活性測定は、ヒトＥＰＯの活性測定法を適応し、ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いて以下のようにして行った。【００８６】
ＴＦ−１細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。さらに標準品として、ヒトＥＰＯの１０Ｕ、５Ｕ、１Ｕ、０．５Ｕ、０．１Ｕ、０Ｕをそれぞれ１０μＬ、上記（２）で得られた培養液の原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液、１０００倍希釈液それぞれを１０μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃条件下、２４時間培養し、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、ｋｉｔのＷＳＴ−８を各穴１０μＬずつ添加し、１時間培養後、ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ(アマシャム社製)により吸光度Ａ４５０を測定した。【００８７】
標準品として用いたヒトＥＰＯの各添加量（１０Ｕ、５Ｕ、１Ｕ、０．５Ｕ、０．１Ｕ、０Ｕ）における吸光度Ａ４５０をプロットしたグラフを検量用に用いて、上記（２）で得られた培養液の×１０００、×１００希釈液の吸光度から、ネコＥＰＯ含有量を定量した。その結果、上記（２）で得られた培養液中のネコＥＰＯの含有量は、いずれも１５００〜２０００Ｕ／ｍＬであった。また、濃度依存的なＴＦ−１細胞の増殖が確認できた。すなわち、ネコＥＰＯの活性が確認できた。【００８８】
（４）ネコＥＰＯの検出
上記（２）で得られた培養上清中のネコＥＰＯをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させた。その後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１およびｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２ともに約３０〜３５ｋＤのバンドを検出した。ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、培養液中のネコＥＰＯの定量を行った。その結果、ネコＥＰＯの生産速度は８００〜１２００Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／４８ｈであった。ネコＥＰＯの推定分子量がおよそ３０〜３５ｋＤａであり、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定の結果、ＥＰＯの定量が可能であったことから、上記（２）の培養上清中にネコＥＰＯが発現したものと考えられた。【００８９】
（実施例２）無血清培地への馴化
上記実施例１の（２）で得られた動物細胞形質転換体（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２）を用いて、無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、２０ｕｇ／ｍＬインスリンおよび抗生物質としてペニシリン(１００Ｕ／ｍＬ)、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）を準備した。上記（２）の１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（血清培地とする）で継代した細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地Ａ），５０：５０(培地Ｂ)，１００：０(培地Ｃ)の混合液をそれぞれ用意し、細胞接種時に細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、２５０ｍＬ三角フラスコによる浮遊撹拌培養を行った。まず培地Ａで３７℃、５％ＣＯ２存在下、１００ｒｐｍでの撹拌条件で細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｂで３７℃、５％ＣＯ２存在下、１００ｒｐｍでの撹拌条件で細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｃで３７℃、５％ＣＯ２存在下、１００ｒｐｍでの撹拌条件で細胞培養を行い、継代を４−６回実施した。得られた各細胞をそれぞれ「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’」および「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’」とした。これらの細胞は、２０ｕｇ／ｍＬインスリン存在下生育可能なインスリン要求性の細胞であり、浮遊性細胞である。【００９０】
（実施例３）  無タンパク培地への馴化
実施例２で得られた無血清培地馴化動物細胞形質転換体（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’、ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’）を用いて、無タンパク培地への馴化を行った。無タンパク培地として、抗生物質としてペニシリン（１０Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）を準備した。実施例２の２０ｕｇ／ｍＬインスリン、抗生物質としてペニシリン(１００Ｕ／ｍＬ)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍＬ)を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）（無血清培地）で馴化した細胞を用いて以下の方法で馴化した。無タンパク培地：無血清培地＝０：１００（培地Ａ），５０：５０（培地Ｂ），１００：０（培地Ｃ）の混合液をそれぞれ用意し、細胞接種時に細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、２５０ｍＬ三角フラスコによる浮遊撹拌培養を行った。まず培地Ａで３７℃、５％ＣＯ２存在下、１００ｒｐｍでの撹拌条件で細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｂで３７℃、５％ＣＯ２存在下、１００ｒｐｍでの撹拌条件で細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Ｃで３７℃、５％ＣＯ２存在下、１００ｒｐｍでの撹拌条件で細胞培養を行い、継代を４−６回実施した。得られた各細胞をそれぞれ「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’’」および「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ２’’」とした。【００９１】
（実施例４）  無タンパク培地馴化細胞のスクリーニング
実施例３で得られた無タンパク培地馴化動物細胞形質転換体（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’’）を用いて、スクリーニングによる単クローンの取得を行った。すなわち無タンパク培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）に０．１ｍＭポリリン酸の培地を調製し、９６穴プレートを用いて１ウエル当たり１ｃｅｌｌｓ入るように細胞培養液を調製した。１ウエル辺り細胞培養液が１００μＬ入るように９６穴プレートに処理した。２週間３７℃、５％ＣＯ２存在下培養し、死滅せず、増殖性のある細胞を選択した結果、２つのクローンを得た（２クローンをそれぞれＥ１Ｃ２クローン１，Ｅ１Ｃ２クローン２とする)。【００９２】
（実施例５）  無タンパク馴化細胞を用いたポリリン酸の効果
無タンパク馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン１，Ｅ１Ｃ２クローン２）を用いて、培地中にポリリン酸を添加した場合の各クローンの細胞増殖性およびネコＥＰＯ生産性を検討した。培地条件は表１に示す通りである。
【表１】
2009090787.tif 000002
【００９３】
無タンパク培地馴化細胞を培地Ｎｏ１、２でそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１２穴プレート１ウエルあたり培地が、１ｍＬになるように処置し、３７℃、５％ＣＯ２存在下培養した。培養を６日間継続し、各ウエルの細胞数の計測および培養６日目の培養上清を回収しネコＥＰＯ生産性を比較した。ネコＥＰＯ生産性については実施例１（３）に従って行った。細胞増殖の結果を図１、２に示す。図１、２は、本発明の無タンパク培地馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン１、Ｅ１Ｃ２クローン１）を培地Ｎｏ１、２で培養した場合の細胞濃度を示すグラフである。図１、２において、横軸は培養日数（日）を、縦軸は培地中の細胞濃度（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示す。【００９４】
図１、２から、細胞増殖性はポリリン酸を添加しても問題がないことがわかる。また、ネコＥＰＯ生産性は、培養６日目においてコントロールである培地Ｎｏ．１で約１．０μｇ／１０５ｃｅｌｌｓであり、ポリリン酸を添加した場合（培地Ｎｏ．２）の生産量は約１．５／１０５ｃｅｌｌｓと、培地Ｎｏ．２のほうが、培地Ｎｏ．１に比較してと約１．５倍高かった。【００９５】
（実施例６）  ミニジャーファーメンターによる組換えネコＥＰＯ生産無タンパク馴化細胞の培養
７５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製）を用いて、細胞接種濃度２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう培地（培地Ｎｏ．２：２０ｍＬ）で調製し、３日間３７℃５％ＣＯ２存在下細胞培養を行った。次に、２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）を用いて、細胞接種濃度２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう培地（培地Ｎｏ．２：５０〜１００ｍＬ）で調製し、３日間１００ｒｐｍ，３７℃、５％ＣＯ２、存在下細胞培養を行った。次に、前培養液を遠心操作（２０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により細胞ペレットにし、最終濃度が４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地（培地Ｎｏ．２）で懸濁し、ミニジャーファーメンターへ植え継ぎ、３７℃、１２５ｒｐｍ、４０％ＤＯ、ｐＨ７．５の条件で培養を開始した（ＡＢＬＥ社製２５０ｍＬスケール動物細胞培養用ミニジャーファーメンター）。培養７日目に、培養上清を回収した。【００９６】
（実施例７）  ＣＨＯ細胞生産ネコＥＰＯの精製
１．限外濾過法による濃縮・バッファー交換
実施例６で得られたネコＥＰＯを含む細胞培養上清を、限外ろ過装置（ミリポア社製）により、分子量１００００以下の物質の除去およびＴｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）にバッファー置換を行い、３０倍濃縮を行った。限外ろかに使用した膜は、ＹＭ１０（ミリポア社製、分子量１００００カット）を使用した。【００９７】
２．銅キレートカラムクロマトグラフィー
次に、銅イオンをキレート結合させた銅キレーティングセファロースファーストフロー（ＧＥ社製）を予めＴｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５）で平衡化させた後、通液した。さらにＴｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ５）でカラムに通液したところ、ネコＥＰＯ以外の高分子量不純物が除去され、これらのフロースルーを回収した。【００９８】
３．陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
次に、上記２のフロースルーを、Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イオン（アニオン）交換担体であるＤＥＡＥセファロース（ＧＥ社製）を用意し、濃縮したネコＥＰＯを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（酢酸）緩衝液（ｐＨ６）、Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ緩衝液(ｐＨ５)を通液し、カラム内のｐＨを低下させて不純物を除去した。次に、通過液のｐＨが５に達したところで、５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５）／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０で段階的に溶出させ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ５）／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０の画分を次のゲル濾過に供した。【００９９】
４．ゲル濾過
最後に、上記３の精製フラクションを、セファクリルＳ−２００（ＧＥ社製）のカラムに導入し脱塩操作を行った。このカラムは、ｐＨ６．８〜７．０の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム／１５０ｍＭ  塩化ナトリウム／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０で展開した。【０１００】
５．得られたネコＥＰＯの純度、精製収率および比活性
上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、図１のレーン５に示すように銀染色によるゲル染色において、ネコＥＰＯの単一化を確認した。また、イメージアナライザー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９０％の純度を確認することができた。さらに、得られたネコＥＰＯサンプルをＣ４樹脂カラム（ＶＹＤＡＣ社製）に供した。測定条件は、流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液し、０〜８０体積％エタノール／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）のグラジエント溶出を行い、２３０ｎｍのＵＶ吸光度測定を行った。その結果、リテンションタイム５０−６０ｍｉｎ、約６６−８０体積％エタノールの画分に溶出が見られ、得られたネコＥＰＯの純度は約９０％であった。【０１０１】
さらに、上記１〜４の操作の結果得られたネコＥＰＯの最終的な精製収率をヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによる測定した結果、３５−５０％であった。また、ゲル濾過精製溶液のタンパク定量をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて定量した結果、比活性は約１０００００Ｕ／ｍｇであった。また、エンドトキシン含量は０．９ｎｇ／ｍｇ蛋白量であった。【０１０２】
（実施例８）  ネコＥＰＯの活性測定
実施例７で製造されたネコＥＰＯの活性測定は、ヒトＥＰＯの活性測定法を適応し、ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いて以下のようにして行った。【０１０３】
ＴＦ−１細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６穴ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに１００μＬ添加した。さらに標準品として、ヒトＥＰＯの１０Ｕ、５Ｕ、１Ｕ、０．５Ｕ、０．１Ｕ、０Ｕをそれぞれ１０μＬ、実施例７で得られたネコＥＰＯ精製サンプルの原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液、１０００倍希釈液それぞれを１０μＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃条件下、２４時間培養し、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、ｋｉｔのＷＳＴ−８を各穴１０μＬずつ添加し、１時間培養後、ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（アマシャム社製）により吸光度Ａ４５０を測定した。【０１０４】
標準品として用いたヒトＥＰＯの各添加量（１０Ｕ、５Ｕ、１Ｕ、０．５Ｕ、０．１Ｕ、０Ｕ）における吸光度Ａ４５０をプロットしたグラフを検量用に用いて、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製液×１０００、×１００希釈液の吸光度から、各ネコＥＰＯ精製液中のネコＥＰＯ含有量を定量した。その結果、実施例７で得られたネコＥＰＯ精製液中のネコＥＰＯの含有量は、いずれも２０００〜３０００Ｕ／ｍＬであった。また、濃度依存的なＴＦ−１細胞の増殖が確認できた。すなわち、ネコＥＰＯの活性が確認できた。【０１０５】
（比較例１）  血清要求性細胞「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１」およびインスリン要求性細胞「ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’」の細胞増殖性およびネコＥＰＯ生産性
実施例１で得られた血清要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１）および実施例２で得られたインスリン要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’）を用いて、各クローンの細胞増殖性およびネコEPO生産性を検討した。培地条件は表２に示す通りである。
【表２】
2009090787.tif 000003
【０１０６】
各細胞を各培地条件でそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１２穴プレート１ウエルあたり培地が１ｍＬになるように処置し、３７℃、５％ＣＯ２存在下培養した。培養を６日間継続し、各ウエルの細胞数の計測および培養６日目の培養上清を回収しネコＥＰＯ生産性を比較した。ネコＥＰＯ生産性については実施例１（３）に従って行った。細胞増殖の結果を図３に示す。図３において、横軸は培養日数（日）を、縦軸は培地中の細胞濃度（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示す。【０１０７】
図３から、血清培地中の血清要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１）およびインスリン添加培地中のインスリン要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’）は、上記実施例５の本発明の無タンパク培地馴化細胞と同等以上に、細胞増殖性が認められることがわかる。【０１０８】
一方、ネコＥＰＯ生産性は、血清要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１）を血清培地で培養した場合およびインスリン要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’）をインスリン存在下で培養した場合は約１μｇ／１０５ｃｅｌｌｓであった。インスリン要求性細胞（ｒＦｅＥＰＯ／ＣＨＯ１’）をインスリン非存在下で培養した場合は約０．７μｇ／１０５ｃｅｌｌｓであった。【０１０９】
このことから、本発明の無タンパク培地馴化細胞を、ポリリン酸を添加した培地で培養した場合は、ネコＥＰＯ生産性が高いことがわかる。【０１１０】
（比較例２）  無タンパク培地馴化細胞を用いたインスリンの効果
無タンパク馴化細胞（Ｅ１Ｃ２クローン１，Ｅ１Ｃ２クローン２）を用いて、ＤＭＥＭ培地中にインスリンを添加した場合の各クローンの細胞増殖性およびネコＥＰＯ生産性を検討した。培地条件は表３に示す通りである。
【表３】
2009090787.tif 000004
【０１１１】
無タンパク培地馴化細胞を培地Ｎｏ１、３でそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１２穴プレート１ウエルあたり１ｍＬになるように処置し、３７℃、５％ＣＯ２存在下培養した。培養を６日間継続し、各ウエルの細胞数の計測および培養６日目の培養上清を回収しネコＥＰＯ生産性を比較した。ネコＥＰＯ生産性については実施例１（３）に従って行った。細胞増殖の結果を図４、５に示す。図４、５において、横軸は培養日数（日）を、縦軸は培地中の細胞濃度（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示す。【０１１２】
図４、５から、無タンパク培地馴化細胞においては、ＤＭＥＭにインスリンを加えても、細胞増殖性に大きな影響を与えないことがわかる。一方、ネコＥＰＯ生産性は培養６日目においてコントロールである培地Ｎｏ１で約１．０μｇ／１０５ｃｅｌｌｓであり、インスリンを添加した場合（培地Ｎｏ３）の生産量は培地Ｎｏ１と同等であった。すなわち、本発明の無タンパク培地馴化細胞では、タンパク製の増殖因子であるインスリンを添加しても、ネコＥＰＯ生産性は影響を与えないことがわかった。【０１１３】
以上から、本発明の遺伝子組換え動物細胞は、無タンパク培地における細胞増殖性は、タンパク製の増殖因子を必要とする遺伝子組換え動物細胞にくらべ、やや劣るが、生理活性ペプチドまたはタンパク質の生産性には、優れることがわかった。本発明の遺伝子組換え動物細胞を用いれば、所望の生理活性ペプチドまたはタンパク質を、安全に、効率よく生産できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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