(57)【要約】  核酸プローブのポリマーを簡便且つ効率的に形成することができるプローブポリマーの形成方法、該方法で形成されるプローブポリマー、該方法で用いられる新規の核酸プローブ、及び高感度且つ簡便に標的分析物を検出することができる標的分析物の検出方法を提供する。３以上の核酸領域を含む核酸プローブであって、該核酸プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むようにした。該核酸プローブを反応させることにより、該核酸プローブのポリマーが形成される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３以上の核酸領域を含む核酸プローブであって、該核酸プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする核酸プローブ。
【請求項２】
請求項１記載の核酸プローブを反応させて、該核酸プローブのポリマーを形成することを特徴とするプローブポリマーの形成方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法により形成されることを特徴とするプローブポリマー。
【請求項４】
請求項２記載の方法によりプローブポリマーを形成させ、該プローブポリマーを検出することにより標的分析物を検出することを特徴とする標的分析物の検出方法。
【請求項５】
前記標的分析物と特異的に結合可能であり且つ前記核酸プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するアシストプローブを用い、前記標的分析物と前記アシストプローブと前記プローブポリマーとを含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出することを特徴とする請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
前記標的分析物が核酸であり、前記核酸プローブが、前記標的核酸の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項４記載の検出方法。
【請求項７】
前記標的分析物が、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー及び糖質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項４又は５記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸プローブ、該核酸プローブの自己集合体（ポリマー）を形成させ、標的分析物の検出の感度を向上させることができるプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されるプローブポリマー、及び該方法を利用した標的分析物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法として、他の核酸プローブと相補的な塩基配列を有する複数種の核酸プローブを用いて、プローブの自己集合反応（Probe alternation link self-assembly reaction）により核酸プローブの集合体（ポリマー）を形成する方法（以下、プローブの自己集合反応によるポリマーの形成法を、パルサー法（PALSAR法）と称する。）を提案した（特許文献１〜４）。また、本発明者らはパルサー法を利用し、ターゲット遺伝子の検出感度を向上させる方法を提案している（特許文献５）。【０００３】
上記方法により、ターゲット遺伝子を高感度に検出することが可能であるが、シグナルプローブポリマーの形成に複数種の核酸プローブを用いる必要があった。
【特許文献１】特許第３２６７５７６号公報
【特許文献２】特許第３３１０６６２号公報
【特許文献３】国際公開第０２／３１１９２号公報
【特許文献４】特開２００２−３５５０８１号公報
【特許文献５】国際公開第０３／０２９４４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、核酸プローブのポリマーを簡便且つ効率的に形成することができるプローブポリマーの形成方法、該方法で形成されるプローブポリマー、該方法で用いられる新規の核酸プローブ、及び高感度且つ簡便に標的分析物を検出することができる標的分析物の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、核酸プローブの１つの領域において、その領域の中心となる位置を境にして、対称的に相対する塩基が相補的となるような鏡像関係（対称）にある塩基配列となるように構成することにより、１種の核酸プローブのみによって該核酸プローブのポリマーを形成することができることを見出した。【０００６】
即ち、本発明の核酸プローブは、３以上の核酸領域を含む核酸プローブであって、該核酸プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。【０００７】
本発明のプローブポリマーの形成方法は、本発明の核酸プローブを反応させて、該核酸プローブのポリマーを形成することを特徴とする。【０００８】
本発明のプローブポリマーは、前記本発明のプローブポリマーの形成方法により形成されることを特徴とする。【０００９】
本発明の標的分析物の検出方法は、前記本発明のプローブポリマーの形成方法によりプローブポリマーを形成させ、該プローブポリマーを検出することにより標的分析物を検出することを特徴とする。【００１０】
本発明の標的分析物の検出方法において、前記標的分析物と特異的に結合可能であり且つ前記核酸プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するアシストプローブを用い、前記標的分析物と前記アシストプローブと前記プローブポリマーとを含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出することが好ましい。なお、本願明細書において、アシストプローブとは、検出する標的分析物と特異的に結合可能な部分を有し、且つポリマー形成に用いられる前記核酸プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するプローブを意味し、標的分析物とプローブポリマーをつなぐ働きをする。【００１１】
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー及び糖質からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。【００１２】
前記標的分析物が核酸の場合、前記核酸プローブが、前記標的核酸（ターゲット遺伝子）の一部に相補的な配列を有するように構成することにより、標的核酸とプローブポリマーを結合させることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、１種の核酸プローブのみによって該核酸プローブのポリマーを形成することができる。また、本発明によれば、簡便に標的分析物を検出することができ、標的分析物の検出感度を著しく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の核酸プローブの一例を示す概略説明図である。
【図２】図１記載の核酸プローブの結合様式を示す概略説明図である。
【図３】図１記載の核酸プローブにより形成されたプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図４】実施例１の結果を示す写真である。
【図５】実施例２の結果を示す写真である。
【図６】実施例３の結果を示す写真である。
【符号の説明】
【００１５】
１０：本発明の核酸プローブ、１０ａ，１０ｂ，１０ｃ：核酸領域、２０：水素結合、３０：プローブポリマー。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。【００１７】
図１は、本発明の核酸プローブの一例を示す概略説明図である。図２は、図１の核酸プローブの結合態様を示す概略説明図である。図３は、図１の核酸プローブにより形成された自己集合体（プローブポリマー）を示す概略説明図である。【００１８】
本発明の核酸プローブは、３以上の核酸領域を含む核酸プローブであって、該核酸プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含み、該核酸プローブを反応させることにより該核酸プローブのポリマーを形成し得ることを特徴とする。本願明細書において、核酸プローブの核酸領域とは、前記第１領域及び第２領域からなる領域を意味する。また、各核酸領域中の第１領域及び第２領域をそれぞれ相補領域と称する。本発明の核酸プローブに含まれる核酸領域の数は３以上であり、３以上１０以下が好ましく、３以上５以下がより好ましい。【００１９】
図１は、本発明の核酸プローブの一例を示す概略説明図であり、３箇所の核酸領域を含む例を示した。図１に示した如く、本発明の核酸プローブ１０は、５’端部から順に核酸領域１０ａ，核酸領域１０ｂ及び核酸領域１０ｃを有し、各核酸領域１０ａ，１０ｂ及び１０ｃは互いに相補的な２領域を隣接して含む。即ち、前記核酸領域１０ａは相補領域Ｘ及び該相補領域Ｘに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｘ’を隣接して含み、前記核酸領域１０ｂは相補領域Ｙ及び該相補領域Ｙに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｙ’を隣接して含み、前記核酸領域１０ｃは相補領域Ｚ及び該相補領域Ｚに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｚ’を隣接して含むものである。【００２０】
本発明の核酸プローブ１０において、相補領域Ｘと相補領域Ｘ’、相補領域Ｙと相補領域Ｙ’、相補領域Ｚと相補領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、図２に示した如く、相補領域Ｘと相補領域Ｘ’が結合し［図２（ａ）］、相補領域Ｙと相補領域Ｙ’が結合し［図２（ｂ）］、相補領域Ｚと相補領域Ｚ’が結合する［図２（ｃ）］。図２において、符号２０は水素結合を示す。なお、図１では、好適な例として、３個の核酸領域（１０ａ，１０ｂ及び１０ｃ）を有する核酸プローブを示したが、核酸領域の数は３個以上であれば特に限定されないものである。【００２１】
本発明の核酸プローブ１０をハイブリダイゼーション反応させることにより、図３に示した如く、核酸プローブ１０が自己集合し、核酸プローブ１０の自己集合体であるプローブポリマー３０を形成させることができる。【００２２】
本発明の核酸プローブにおいて、各相補領域の長さは、塩基数にして２塩基以上が好ましく、３塩基〜５０塩基がより好ましく、さらに好ましくは４〜１５塩基である。また、核酸プローブ中の各相補領域の長さは同じであることが望ましい。【００２３】
本発明の核酸プローブの塩基配列は、各核酸領域中の第１領域及び第２領域が互いに相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各相補領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各相補領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。【００２４】
本発明の核酸プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc.1998.120,13252-13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、核酸プローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。【００２５】
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかな
る方法で合成されたものであってもよい。【００２６】
本発明のプローブポリマーの形成方法は、前述した本発明の核酸プローブを反応させてプローブポリマーを形成させるものである。図３に示した如く、複数の本発明の核酸プローブ１０をハイブリダイゼーション反応させることにより、プローブの濃度に応じて効率的に核酸プローブ１０の自己集合体であるプローブポリマー３０を形成させることができる。【００２７】
使用する核酸プローブの本数は特に限定されないが、１０２〜１０１５本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。ハイブリダイゼーション反応の温度条件も特に限定されず、通常の温度条件でよいが、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成させ、当該反応温度領域において自己集合反応を行わせるようにすることが好ましい（国際公開第２００５／１０６０３１号公報）。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は４０〜８０℃が好ましく、より好ましくは５５〜６５℃である。【００２８】
本発明のプローブポリマーの形成方法を利用して標的分析物を検出することにより、標的分析物を簡便且つ高感度に検出することができる。標的分析物の検出方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。【００２９】
本発明の標的分析物の検出方法は、前記本発明のプローブポリマーの形成方法を利用してポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより試料中の標的分析物の存在を検出するものである。前記標的分析物の検出方法としては、具体的には、標的分析物とプローブポリマーの複合体を形成させ、プローブポリマーの検出により標的分析物を検出する方法、及び標的分析物が存在する場合にのみポリマーが形成される方法を用いてポリマーを形成させ、ポリマーの検出により標的分析物を検出する方法（例えば、切断された核酸プローブを用い、標的分析物が存在する場合のみライゲーション反応により核酸プローブが連結され、ポリマーが形成される方法）が挙げられる。【００３０】
本発明における標的分析物測定用試料は、該標的分析物を含む可能性のあるあらゆる試料が適用でき、例えば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、喀痰、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、ペプチド、ポリマー、糖質及びそれらの組み合わせからなるものが挙げられる。該標的分析物は試料より適宜調製または単離したものでもよい。また、試料中の標的核酸を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。前記標的核酸（ターゲット遺伝子）として、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。また、前記標的核酸にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることができる。【００３１】
本発明の検出方法において、本発明の核酸プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有する領域（プローブ結合領域と称する）を１又は複数有し、且つ標的分析物に特異的に結合可能な部分（ターゲット領域Ｔと称する）を有するアシストプローブを用いることが好ましい。前記アシストプローブを用いて、標的分析物とアシストプローブとポリマーとを含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出することにより、より簡便に標的分析物を検出することができる。ターゲット領域は、アシストプローブの端部に位置することが好ましい。【００３２】
前記ターゲット領域は標的物分析物に応じて適宜選択可能である。例えば、標的分析物が核酸の場合、ターゲット領域が標的核酸に相補的な塩基配列を有するように構成し、標的核酸の１領域に相補的な配列を有するアシストプローブを用い、ハイブリダイゼーションにより結合させることが好ましい。
標的分析物が抗原等のタンパク質の場合は、抗体等の標的分析物と特異的に結合する物質を直接又は間接的に結合させることが好ましい。なお、アシストプローブと標的分析物の結合は、両者を直接結合させてもよいが、他の物質を介して間接的に結合させてもよい。具体的には、化学的結合により抗体を結合させたアシストプローブ、例えば、予め抗体にアミノ基とカルボキシル基等の結合によりコンジュゲートさせたものを用いることが好ましい。また、ビオチン化した抗体を、ストレプトアビジンを用いて結合させたアシストプローブを用いてもよい。【００３３】
前記アシストプローブのプローブ結合領域は、本発明の核酸プローブの相補領域と同一の塩基配列を有する領域を１以上含むように構成することが好ましく、本発明の核酸プローブと同一の相補領域を２種以上含み、アシストプローブと本発明の核酸プローブが２相補領域以上連続して結合するように構成することがより好ましい。また、同一のプローブ結合領域を複数個含むアシストプローブを用い、１つのアシストプローブを２以上の核酸プローブと結合せしめてもよい。【００３４】
また、標的分析物が核酸の場合、本発明の核酸プローブを前記標的核酸の一部に相補的な配列を有するように構成し、該核酸プローブを用いて標的核酸とプローブポリマーの複合体を形成させ、プローブポリマーの検出により、標的核酸を検出することができる。【００３５】
また、本発明の検出方法において、標的分析物検出用の反応機材で標的分析物を捕捉する工程を含むことが好ましい。本発明は、標的分析物検出の為の種々の反応機材に適用可能であるが、特に、ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips:an array of possibilities.Nat Biotechnol.16,27-31,1998.等参照）、マイクロプレート、及び磁性体粒子等に好適に用いられる。【００３６】
標的分析物を反応機材で捕捉する方法は特に限定されないが、標的分析物に特異的に結合可能な捕捉用物質を結合させた反応機材を用い、該捕捉用物質と標的分析物の結合により反応機材と標的分析物を結合させることが好ましい。
該捕捉用物質は標的分析物に応じて適宜選択すればよく特に限定されない。標的分析物が核酸の場合、捕捉用物質として、該標的核酸の１領域（アシストプローブに相補的な領域を除く）に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（キャプチャープローブ）を用いることが好ましい。標的分析物が抗原又は抗体の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合する抗体又は抗原を用いることが好ましい。また、標的分析物が糖質の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合するレクチンを用いることが好ましい。【００３７】
本発明において、プローブポリマーの検出方法としては、特に限定はないが、前記核酸プローブを予め標識物質で標識し、該標識物質を利用して検出することが好ましい。前記標識物質が、アクリジニウムエステル、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましく、操作性、定量性及び感度の点からアクリジニウムエステルが特に好ましい。具体的には、あらかじめ本発明の核酸プローブを蛍光物質で標識し、プローブポリマーの存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。また、あらかじめ本発明の核酸プローブを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、プローブポリマーの存在を光化学的な変化により検出することが可能である。さらにまた、あらかじめ本発明の核酸プローブをラジオアイソトープで標識し、プローブポリマーの存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。【００３８】
また、前記形成されたプローブポリマーに対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせてプローブポリマーの存在を検出することが可能である。標識プローブとしては、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。また、前記形成されたプローブポリマーに対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記プローブポリマーの存在を検出することが可能である。蛍光物質としては、２本鎖の塩基対の中に挿入する性質を持った蛍光物質が好ましい。【００３９】
また、本発明のプローブポリマーは、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果の発現が極めて大きい為、波長２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定することにより、ポリマーの状態を確認することが可能である。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【００４１】
（実施例１）
本発明の核酸プローブによるプローブポリマーの形成の有無を、電気泳動により確認した。【００４２】
下記塩基配列を有する核酸プローブ−１（配列番号１）を2000pmol/mLになるように反応溶液［4XSSC］に溶解し、プローブ溶液を調製した。
核酸プローブ−１の塩基配列（5'-X1(塩基数7)X1'(塩基数7)-Y1(塩基数7)Y1'(塩基数7)-Z1（塩基数７）Z1'（塩基数７）-3'）
5’-CCTGTCT AGACAGG CTTCGGA TCCGAAG GGTAGCA TGCTACC-3’（配列番号１）【００４３】
前記調製したプローブ溶液を、９４℃で１分加熱後、直ちに氷上で冷却した。次に、予め各反応温度[35,38,40,43,46,48,50,53,55,57,59,61,64,66,68又は70℃］に到達した状態でチューブをセットし、１時間反応させた。反応後のサンプルを0.25%アガローズゲルにより電気泳動を行った。結果を図４に示した。図４〜図６において、Ｍは分子サイズマーカーであり、各数字は反応温度条件を示す。
図４に示した如く、５５℃〜６１℃の反応温度において、プローブポリマーの形成が確認された。【００４４】
（実施例２）
核酸プローブ−１の代わりに下記塩基配列を有する核酸プローブ−２（配列番号２）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を図５に示した。
核酸プローブ−２の塩基配列（5'-X2(塩基数６)X2'(塩基数６)-Y2(塩基数６)Y2'(塩基数６)-Z2（塩基数６）Z2'（塩基数６）-3'）
5’-CCTGTC GACAGG CTCGGA TCCGAG GGAGCA TGCTCC-3’（配列番号２）
図５に示した如く、５３℃〜６１℃の反応温度において、プローブポリマーの形成が確認された。【００４５】
（実施例３）
核酸プローブ−１の代わりに下記塩基配列を有する核酸プローブ−３（配列番号３）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を図６に示した。
核酸プローブ−３の塩基配列（5'-X3(塩基数５)X3'(塩基数５)-Y3(塩基数５)Y3'(塩基数５)-Z3（塩基数５）Z3'（塩基数５）-3'）
5’-CCTGC GCAGG CTCGG CCGAG GGACG CGTCC-3’（配列番号３）
図６に示した如く、５０℃〜５９℃の反応温度において、プローブポリマーの形成が確認された。【００４６】
（実施例４）
本発明の核酸プローブによるプローブポリマーの形成を利用したターゲット遺伝子の検出を行った。【００４７】
標的分析物として、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のｒＲＮＡと同じ塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ターゲットオリゴＤＮＡ）（配列番号４）を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡの塩基配列
5’-TTCGGGAAACCGGAGCTAATA CCGGATAATATTTTGAACCGC ATGGTTCAAAAGTGAAAGACG GTCTTGCTGTCACTTATAGAT GGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3’（配列番号４）【００４８】
キャプチャープローブとして、前記ターゲットオリゴＤＮＡ（配列番号４）に相補的な配列を有する核酸プローブ（配列番号５）を用いた。
キャプチャープローブの塩基配列
5’-CGTCTTTCACTTTTGAACCAT GCGGTTCAAAATATTATCCGG-3’-Amino link（配列番号５）
前記キャプチャープローブを各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実験に用いた。【００４９】
プローブポリマーの形成に用いられる核酸プローブとして、実施例１で用いた核酸プローブ−１（配列番号１）の５’末端がアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識された核酸プローブを用いた。該ＡＥ標識された核酸プローブ−１を50pmol/mLになるように溶液［100mM-コハク酸リチウム、600mM-塩化リチウム、2mM-EDTA、5%-LDS、安定化剤］に溶解し、第２ハイブリダイゼーション溶液を調製した。【００５０】
アシストプローブとして、前記核酸プローブ−１の一部と同じ塩基配列及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−１）（配列番号６）を用いた。
アシストプローブ−１の塩基配列（5'-Y1'-X1-polyT-Y1'-X1-T'-3'）
5’-TCCGAAG CCTGTCT TTTTT TCCGAAG CCTGTCT ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3’（配列番号６）
前記アシストプローブを25pmol/mLになるように溶液［100mM-コハク酸リチウム、600mM-塩化ナトリウム、2mM-EDTA、1%-LDS］に溶解し、第１ハイブリダイゼーション溶液を調製した。【００５１】
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに0又は10fmol/mLのターゲットオリゴＤＮＡ（配列番号４）を50μL、第１ハイブリダイゼーション溶液を50μLずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、マイクロプレートの上部20℃、下部55℃に設定した条件下で45分間反応させた。反応後、洗浄液［50mM-Tris、0.3M-NaCl、0.01％-TritonX-100、pH 7.0］で洗浄した。【００５２】
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション溶液を100μLずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で30分間反応させた後、洗浄液で洗浄した。【００５３】
マイクロプレートウェルを洗浄後、発光試薬−I，II（Gen Probe社製）測定液-1を50μLずつ添加し、ルミノメーター（Centro LB960、Berthold製）で発光強度（RLU）を測定した。発光強度（RLU）の測定結果を表１に示した。【００５４】
（実施例５）
条件を下記の如く変更した以外は実施例４と同様に実験を行った。結果を表１に示した。
プローブポリマーの形成に用いられる核酸プローブとして、実施例３で用いた核酸プローブ−３（配列番号３）の５’末端がアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識された核酸プローブを用いた。
アシストプローブとして、前記核酸プローブ−３の一部と同じ塩基配列及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−２）（配列番号７）を用いた。
アシストプローブ−２の塩基配列（5'-Y3'-X3-X3'-Y3'-X3-X3'-T'-3'）
5’-CCGAG CCTGC GCAGG CCGAG CCTGC GCAGG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3’（配列番号７）【００５５】
（比較例１）
２種の核酸プローブを用いたプローブポリマーの形成方法を利用したターゲット遺伝子の検出を行った。
条件を下記の如く変更した以外は実施例４と同様に実験を行った。結果を表１に示した。
プローブポリマーの形成に用いられる核酸プローブとして、５’末端がアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識された下記２種の核酸プローブ（第１及び第２プローブ；配列番号８及び９）を用いた。該ＡＥ標識された２種の核酸プローブを各々25pmol/mLになるように溶液［100mM-コハク酸リチウム、600mM-塩化リチウム、2mM-EDTA、5%-LDS、安定化剤］に溶解し、第２ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
第１プローブの塩基配列（5'-X4-Y4-Z4-3')
5’-GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG CTGGCGGTATCAAC-3’（配列番号８）
第２プローブの塩基配列（5'-X4'-Y4'-Z4'-3')
5’-CATCCCGAGACATC CGTAACTCCGAAGC GTTGATACCGCCAG-3’（配列番号９）【００５６】
アシストプローブとして、前記第１プローブの一部と同じ塩基配列及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−３）（配列番号１０）を用いた。
アシストプローブ−３の塩基配列（5'-X4-Y4-X4-T'-3'）
5’-GATGTCTCGGGATG GCTTCGGAGTTACG GATGTCTCGGGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3’（配列番号１０）【００５７】
【表１】
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【００５８】
表１に示したように、１種の核酸プローブを用いた場合においても、２種の核酸プローブを用いた場合と同様に、ターゲットを検出することが可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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