(57)【要約】【課題】機能性と品質に優れ、しかも、低コストでの量産が可能なナノ機能性シリカ粒子を提供する。【解決手段】メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＰＳ）およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）からなる群より選択される１種または数種のシリカ化合物を含む被覆層と、前記被覆層内部に機能性粒子を含む、イメージングやアッセイ、診断、治療等、医療やバイオ研究等に利用される、ナノ機能性シリカ粒子が本発明によって提供される。
2009072657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＰＳ）、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上の有機シリカ化合物から得られるシリカを主成分とするシェルと、該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の１種または複数種を含む直径２〜２００ｎｍのコアとを有する、ナノ機能性シリカ粒子。
【請求項２】
メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＰＳ）、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上の有機シリカ化合物と、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）とから得られるシリカを主成分とするシェルと、該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の１種または複数種を含む直径２〜２００ｎｍのコアとを有する、ナノ機能性シリカ粒子。
【請求項３】
前記シェルの表面および／または前記シェルの内部および／または前記コアの内部に機能性化合物を保有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項４】
前記シェルと前記機能性化合物自体との表面電位差が３ｍＶ以上である、請求項３に記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項５】
前記シェルの表面および／または前記シェルの内部および／または前記コアの内部に保有される機能性化合物が官能基、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖、生理活性物質、造影剤、薬剤およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３または４に記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項６】
粒径が３〜５００ｎｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項７】
前記蛍光性物質が、ローダミンレッド、フルオロセイン、ヘキサン酸−６−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）、ヘキサン酸５−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＤＹ
６３５、ＤＹ ４８５、ＤＹ４９５、ＤＹ
５０５およびトリスジクロロツテニウム（ＩＩ）ヘキサハイドレートからなる群より選択され、かつ、該蛍光性物質が単独、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、イソチオシアネート（ＩＴＣ）およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有される、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項８】
前記シェルの表面に保有される機能性化合物が官能基、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖、生理活性物質、造影剤、薬剤およびそれらの組合せからなる群より選択されるが、単独による結合状態、単独とカップリング試薬の添加による結合状態、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、イソチオシアネート（ＩＴＣ）およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有される、請求項１〜７のいずれかに記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項９】
前記シェルの表面および／または前記シェルの内部および／または前記コアの内部に細胞障害活性機能を有する物質を保有する、請求項１〜８のいずれかに記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項１０】
前記物質は、光照射されることにより細胞障害活性機能を発揮する、請求項９に記載のナノ機能性シリカ粒子。
【請求項１１】
ナノ機能性シリカ粒子の作製方法であって、
（ａ）有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；および
（ｂ）所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程；
を包含し、
ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプト−３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴｃＰＳ）およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上であり、
前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される１種または複数種であり、
そして、工程（ａ）および（ｂ）における、アンモニア水溶液および温度条件が、
（ｉ）高温（８０〜１００℃での温度範囲）；及び
（ｉｉ）高アンモニア濃度（最終濃度２５％以上）
の条件を満たすように調整される方法。
【請求項１２】
ナノ機能性シリカ粒子の作製方法であって、
（ａ）有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；および
（ｂ）所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程；
を包含し、
ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴｃＰＳ）およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上と、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）とであり、
前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される１種または複数種であり、
そして、工程（ａ）および（ｂ）における、アンモニア水溶液および温度条件が、
（ｉ）高温（８０〜１００℃での温度範囲）；及び
（ｉｉ）高アンモニア濃度（最終濃度２５％以上）
の条件を満たすように調整される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、表層を占める外層ないしは殻［シェル（ｓｈｅｌｌ）］の領域と、その下層を占める内層ないしは核［コア（ｃｏｒｅ）］の領域に概別される二重構造を有するナノシリカ粒子であって、特に、多機能性を発揮する新規なナノシリカ粒子の製造方法と用途に関するものである。更に詳しくは、従来のシリカ粒子に比べ、著しく優れた特長を有し、その表面および／またはシェル領域および／またはコア領域に機能性物質を含み、該機能性物質の性質も併せ持つナノ機能性シリカ粒子に関するものである。また、かかるナノ機能性シリカ粒子の作製につき開示するものである。
【背景技術】
【０００２】
シリカ粒子ないしはシリカ球の製造方法と用途に関する技術は、世界各地で多種多様に研究開発されており、これ等の一部はバイオアッセイ等において既に実用化されている。その合成には、出発材料としてＴＥＯＳ（テトラエチルオルソシラン；ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｏｒｔｈｓｉｌａｎｅ；以下「ＴＥＯＳ」と略記する）が常用された。しかし、かかるＴＥＯＳを用いた粒子の表層は化学反応性、即ち、外来のタンパク質や核酸への結合能）が低いため、上記ＴＥＯＳとは別のシリカ化合物によるアクセプター基の導入による活性化が試みられていた（特許文献１）。例えば、ＭＰＳ（メルカプトプロピルエトキシシラン；３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；以下「ＭＰＳ」と略記する）によるＳＨ基の導入、その他（導入基）、テトラエトキシシラン（ＯＨ基）、アミノプロピルエトキシシラン（ＮＨ２基）等が知られている。しかし、これら活性シリカ粒子は、ＴＥＯＳからなる内殻とアクセプター基からなる外殻あるいは表層の二重構造になっており、その製造に要する時間や労力等のコストは高価であった。また、TEOSでは4本存在する、シリカネットワークを形成するための結合サイト（Ｓｉ−Ｏ）が3本以下であるシリカ化合物（MPS等）を選択して粒子を作成することは容易ではない。実際、ＭＰＳを塩酸単独（又は塩酸と塩化セチルメチルアンモニウムとの混合液）で前処理（室温で２〜５日間）の後、これにアンモニア水溶液を添加混合し、更に、室温で２日間、反応させ、ＭＰＳ粒子を得る技術（特許文献２）が知られているが、この技術は、製造コストが高く、製造工程が煩雑な上、その粒子の製造にかなりの日数を要する。また、作製された粒子のサイズ（粒径）の調整が困難であった。【０００３】
また、特許文献２の方法で得られるＭＰＳ粒子は、空洞形成性が高く、形成された空洞による表面積の拡大という点では利点がある。しかし、機能性物質を取り込むことを目的とする場合、また、ＤＮＡおよびタンパク質等に対する定量的な実験への利用を目的とする場合、有利とは言えない。なぜならば、内部機能化にとっては、空洞形成性が低い方が、内部に機能性物質を配置できるサイトが増加するようになり、有利な結果となる（一粒子当りの蛍光強度は高い）からである。また、定量性にとっては、特許文献２の様な多くのポアを有する粒子ではＤＮＡや蛋白が付着する有効付着面積は粒子の直径に基づく表面積のみに依存せず、ポアのサイズや数、位置により変化するため付着面積のパラメーターが多様化し、問題が生じると考えられるからである。よって、無孔性シリカ粒子の作成の必要性があった。【０００４】
これに対して本発明者らは、特許文献３において、ＴＥＯＳ粒子を含めた上述した従来型のシリカ粒子の欠陥、即ち、高い製造コスト、低い化学反応性（外来のタンパク質や核酸への結合能）等の問題を克服した、機能性と品質に優れ、しかも、低コストでの量産が可能なシリカ粒子とその製法を提案している。この製法により、シリカ粒子の表層又は内部に機能性物質を配置し又は含み、かつ安定化させることができ、これにより、シリカ粒子に表層機能化能又は内部機能化能を持たせることができる。ここに用いられる機能性物質としては、薬剤、蛍光性物質、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ、糖鎖などが挙げられるがこれらに限定されない。しかしながら、本発明者による当該シリカ粒子において金コロイドや磁性体等の機能性物質の含有は行われておらず、用途の拡大を目的とするより多機能性を有したシリカ粒子が望まれていた。【０００５】
さらに、近年、バイオテクノロジーやナノテクノロジーの発展によりナノ医療、イメージングなど医療技術に変革を与えつつある。従来、イメージングにおいては一つのプローブは一つの評価法において活用されるのみであった。例として磁性体はMRIで造影剤として用いられるが詳細な顕微鏡観察には通常、用いられない。しかし、近年の技術開発によりin vivo とin vitroまたミクロとマクロ、さらにCTやPET,
MRIなど多種の装置において共通に用いることができる、多モードの（Multimodal）機能を持つ多機能性プローブの開発が所望され進められている（非特許文献１及び２）。また、多モードのイメージングプローブに治療効果を付加し、診断から治療まで一貫して活用できる多機能粒子の開発が所望されている。こうした多機能性粒子は医療に革新をもたらし、患者の負担が軽減し、高い治療効果を得ることができると考えられる。
しかしながら、現存の造影剤はマクロ観察が可能であっても顕微鏡を用いたミクロ観察は行うことができない。また、顕微鏡観察に用いる蛍光標識した抗体をCTやMRIにて観察することができない。多モードのイメージング効果を持ち、さらに治療効果を合わせ持つ粒子も世界各地で開発競争が進められているが、技術的に難点があり完成には至っていない。【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７０５８２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３／００２６３３号パンフレット
【特許文献３】特願２００６−１６０１０７号
【非特許文献１】Journal of American Chemical Society, 2007, 129, 8962-8963
【非特許文献２】Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46, 3680-3682
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したような従来技術のおける課題を解決することが本願発明の目的である。即ち、ＴＥＯＳ粒子を含めた従来のシリカ粒子に比べ、機能性と品質に優れ、しかも、低コストでの量産が可能なシリカ粒子に、既存の機能性物質を含有させ、より高機能化すると共に粒子の問題点を克服し新たな価値を生み出す、機能融合型ナノ機能性シリカ粒子を作成することを目的とする。
さらに、近年開発された有機シリカ粒子の優れた表面ならびに内部機能化能と他の機能性物質との機能的融合の実現により、in vivo とin vitroまたミクロとマクロ、さらにCTやPET、MRIなど多種の装置において共通に用いることができる多モードの機能を持つ多機能性プローブ並びに治療用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明によって以下が提供される：
本発明のナノ機能性シリカ粒子は、
（Ａ１）メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＰＳ）、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上の有機シリカ化合物から得られるシリカを主成分とするシェルと、
（Ａ２）該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の１種または複数種を含む直径２〜２００ｎｍのコアと、
を有している。【０００９】
また、本発明のナノ機能性シリカ粒子は、
（Ａ１）メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＰＳ）、アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上の有機シリカ化合物と、
（Ａ２）アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）と、
から得られるシリカを主成分とするシェルと、
（Ａ３）該シェル内部に磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液の１種または複数種を含む直径２〜２００ｎｍのコアと、
を有しても良い。【００１０】
また、上記ナノ機能性シリカ粒子のシェルの表面および／またはシェルの内部および／またはコアの内部には、機能性化合物を保有することができる。また、前記シェルと前記機能性化合物自体との表面電位差は、３ｍＶ以上であることが好ましい。この前記シェルの表面および／または前記シェルの内部および／または前記コアの内部に保有される機能性化合物は、官能基、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖、生理活性物質、造影剤、薬剤およびそれらの組合せからなる群より選択されることが好ましい。上記ナノ機能性シリカ粒子の粒径は、３〜５００ｎｍであることが好ましい。【００１１】
また、前記蛍光性物質は、ローダミンレッド、フルオロセイン、ヘキサン酸−６−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）、ヘキサン酸５−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＤＹ
６３５、ＤＹ ４８５、ＤＹ４９５、ＤＹ
５０５およびトリスジクロロツテニウム（ＩＩ）ヘキサハイドレートからなる群より選択され、かつ、該蛍光性物質が単独、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、イソチオシアネート（ＩＴＣ）およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有することが好ましい。【００１２】
また、シェルの表面に保有される機能性化合物が官能基、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖、生理活性物質、造影剤、薬剤およびそれらの組合せからなる群より選択されるが、単独による結合状態、単独とカップリング試薬の添加による結合状態、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、イソチオシアネート（ＩＴＣ）およびマレイミドから選択される化合物との結合状態で保有されることが好ましい。【００１３】
さらに、シェルの表面および／または前記シェルの内部および／または前記コアの内部に細胞障害活性機能を有する物質、詳細には、物質は、光照射されることにより細胞障害活性機能を発揮することが好ましい。【００１４】
次に、本発明は上記ナノ機能性シリカ粒子の作製方法も提供する。具体的には、
（Ａ１）（ａ）有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；および
（ｂ）所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程；
を包含し、
（Ａ２）ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプト−３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴｃＰＳ）およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上であり、
（Ａ３）前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される１種または複数種であり、
（Ａ４）そして、工程（ａ）および（ｂ）における、アンモニア水溶液および温度条件が、
（ｉ）高温（８０〜１００℃での温度範囲）；及び
（ｉｉ）高アンモニア濃度（最終濃度２５％以上）
の条件を満たすように調整される。【００１５】
また、上記ナノ機能性シリカ粒子の作製方法としては、
（Ａ１）（ａ）有機シリカ化合物、機能性物質、およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；または有機シリカ化合物、機能性物質、機能性化合物およびアンモニア水溶液の混合液を調製する工程；および
（ｂ）所定の温度条件下で該有機シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程；
を包含し、
（Ａ２）ここで、前記有機シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７−オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプトー３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴｃＰＳ）およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡＣＰＳ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）からなる群より選択される１種以上と、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）とであり、
（Ａ３）前記機能性物質が、磁性体、金コロイド、量子ドット、ガドリニウム含有粒子、イメージング機能性物質含有液からなる群より選択される１種または複数種であり、
（Ａ４）そして、工程（ａ）および（ｂ）における、アンモニア水溶液および温度条件が、
（ｉ）高温（８０〜１００℃での温度範囲）；及び
（ｉｉ）高アンモニア濃度（最終濃度２５％以上）
の条件を満たすように調整されることもできる。【００１６】
（本発明のナノ機能性シリカ粒子）
更に、本発明に係るナノ機能性シリカ粒子と製造方法には、効果に関し、従来にない次の特長ないしは特徴を有する。
（ａ）ナノ機能性シリカ粒子の特長は次の通りである：
（１）機能性物質がナノ機能性シリカ粒子の内部あるいは内層ないしはコア領域に局在し、有機シリカ化合物の上層あるいは外層ないしはシェル領域と形態学的に区別しうる。換言すれば、該シリカ粒子の構造は、シェル領域とコア領域の２つに概別できる；
（２）ナノ機能性シリカ粒子が、含有する機能性物質の有する機能を保持している：
（３）ナノ機能性シリカ粒子の表面および／またはシェル内および／またはコア内に蛍光色素、薬剤等の機能性化合物を保有することができる。
（４）有機シリカ化合物の表層あるいは表面のアクセプター基により、タンパク質や核酸等の吸着能が高い；
（５）抗原、抗体、酵素等の変性（活性や機能の失活）を生じることなく、これ等の機能を保持した状態で効率良く、これ等を表面に結合させることができる；
（６）表層上で抗原抗体反応が可能である；
（７）粒子の表面上で高感度に物質を検出することができる；
（８）共役試薬によるタンパク質、核酸、色素等の化学物質の表層への結合が可能である；
（９）粒子の作製や表層修飾に起因する凝集が少ない；及び
（１０）粒径とその形態は、シリカ層の調節により、機能性物質を核（コア）として、ナノサイズからミクロンサイズまでの調整・調節が可能である。
（１１）シリカ層に化学共役物質を結合させるとタンパク質等の吸着効率が飛躍的に向上する。
（１２）本粒子に励起光を照射することを条件に周囲の細胞の増殖活性が低下する。従って、本粒子は、イメージング機能を有していることのみならず、励起光照射を条件に細胞障害機能をも有している。【００１７】
（ｂ）また、製造方法の特長は次の通りである：
（１）製造に要する日数が、極めて短時間（１〜１２時間）である；及び
（２）製造に要する試薬の種類が少なく（サーファクタントや塩酸等を使用しない）、製造プロセスが１段階ないしは１工程の反応で量産可能である；製造に要する容器、チューブ、フラスコ、タンク等は、生産規模に応じ１個である。
【発明の効果】
【００１８】
従来のシリカ粒子の機能の向上、用途の多様化と拡大等により、シリカ粒子の付加価値を高める。イメージングやアッセイ、診断、治療等に用いられ、医療やバイオ研究に革新的な技術発展を与えるナノ機能性シリカ粒子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（用語の定義）【００２０】
「ナノ粒子」とは、直径が数ナノメートルオーダーの粒子であり、これの粒子は、原子・分子が集合・反応・成長して、安定化・配列した結果、クラスターとなり、そのクラスターがさらに成長した結果得られる。本明細書において、「シリカ粒子」、「シリカ球」、「ナノシリカ粒子」または「ＮＰ」との用語は、交換可能に使用され、「シリカ化合物」から生成される粒子状物質をいう。【００２１】
本明細書で使用される場合に、「シリカ化合物」は、ケイ素Ｓｉを原子その中心とする化合物を指し、ナノ粒子を生成するに当たり、ケイ素をその粒子に提供する供給源としての役割を果たすものを意図するものであり、例えば、ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、任意の有機基）などの形態で提供される化合物であり、より好ましくは、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＥＳ）、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）、トリメトキシ［２−（７一オキサビシクロ［４．１．０］−ヘプト−３−イル）エチル］シラン（ＥｐｏＰＳ）、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＴＣＰＳ）アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＡｃＰＳ）、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）およびアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）などならびにこれらの物理的・化学的特性と等価な特性を有する化合物をいう。これは、特許文献３からも明らかである。【００２２】
ナノスケール物質の創製方法は、一般に、ボトムアップ法およびトップダウン法に分類される。この前者、すなわち、ボトムアップ法は、原子または分子を物理的または化学的な方法で相互作用させ反応させながらそのスケールを大きくする方法である。原子・分子オーダーでの制御が可能である。このボトムアップ法としては、例えば、レーザー照射法（薄膜成長法）、自己組織化法、化学気相蒸着法、ブルブル法、凝集沈殿法、コンビナトリアルケミストリー法など挙げられる。トップダウン法は、バルクの物質を破壊すること、または加工することにより微細化していく方法であり、そのリソグラフィー法、エッチング法などが挙げられる。ナノ粒子合成では、ブルブル法、気相法、噴霧法などが行われている。このうち、ブルブル法は、ゾル状の液体を乾燥させてケル化して固体を合成する方法である（Ｓｔｏｂｅｒ，Ｗ．；Ｆｉｎｋ，Ａ．；Ｂｏｈｎ，Ｅ．Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄｌｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１９６８，２６，６２〜69）。本発明のナノ粒子を合成するために、ゾルケル法（ストーバー法；Ｓｔｏｂｅｒ法）を利用する。このブルブル法においては、その粒子製造過程においては、従来技術においては、室温にて製造される。本発明のナノ機能性シリカ粒子の生成方法における、「高温条件」とは、７０〜１００℃での温度範囲の反応条件をいい、好ましくは、８０〜１００℃で、さらに好ましくは、９０〜１００℃である。【００２３】
本発明のナノ機能性シリカ粒子生成方法における、「高アンモニア条件」とは、調製したアンモニア水溶液の濃度が、最終濃度にして最終濃度２０％以上をいい、好ましくは、２０％〜３０％、２５％〜３０％、２６％〜２８％、また、より好ましい濃度条件としては、２７％である。また、上記方法において、中アンモニア濃度とは、調製したアンモニア水溶液の濃度が、最終濃度１０％以上２０％未満をいう。低アンモニア濃度とは、調製したアンモニア水溶液の濃度が、最終濃度２％以上５％未満をいう「高アンモニア条件」については、ゾルゲル法においてアンモニアが使用される場合、従来の方法は、数パーセントのアンモニア濃度が利用されており、上述のような本発明において使用される「高アンモニア条件」は利用されない。これは、ナノ粒子を生成するのにこれまで使用されてきたＴＥＯＳが、粒子形成においてＴＥＯＳは高アンモニアを嫌う傾向があることが１つの原因であると理解される。実際、発明者らの自身の検証結果からも、粒子形成においてＴＥＯＳは高アンモニアを嫌う傾向があるものと判断され、粒子が完全に形成しない、もしくは凝集が起こる、などの不良な結果を得ている（未発表）。したがって、本発明のナノ機能性シリカ粒子の製造方法において、これらの条件を使用して、これまでにない優れた特性のナノ粒子を迅速に合成し得たことは、技術常識からは驚くべき結果である。【００２４】
本明細書において使用される場合、本発明のナノ粒子における「格子」および「シリカネットワーク」は、交換可能に使用され、その粒子の格子は一次粒子としての内部構造を示すものであり、Ｓｉ−Ｏ−、Ｓｉ−Ｃ−等に代表される化学結合を介した網目状の立体的な構造を意図するものである。【００２５】
本明細書中で使用される場合、「粒径」は、測定対象としている粒子の大きさを示す指標であって、その粒子の直径により表現され得る。この「粒径」は、種々の技術により測定・決定され得る。例えば、透過型電子顕微鏡を使用することによっても粒径は決定され得る。【００２６】
本明細書において、「アクセプター基」とは、シリカ粒子またはシリカ球上に導入される官能基をいう。シリカ粒子を形成するために使用されるシリカ化合物と、導入されるアクセプター基との関係は、例えば、以下の表に記載される対応関係がある。【００２７】
【表１】
2009072657.tif 000003
【００２８】
本明細書で使用される場合に、「蛍光性物質」は、電磁波（例えば、紫外線、Ｘ線、電子線など）等の外部刺激によって励起したときに、蛍光を発する物質をいう。この「蛍光性物質」としては、例えば、ローダミンレッド、フルオロセイン、ヘキサン酸−６−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）、ヘキサン酸−５−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＤＹ  ６３５、ＤＹ  ４８５、ＤＹ  ４９５、ＤＹ  ５０５、トリスジクロロツテニウム（ＩＩ）ヘキサハイドレート（Ｔｒｉｓ  ｄｉｃｈｌｏｒｏｒｕｔｈｅｎｉｕｍ  （ＩＩ）ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。この蛍光性物質は、例えば、以下（１）〜（４）のような態様でシリカ粒子中に存在するが、これらの態様に限定されない。すなわち、（１）単独で内部に含まれる；（２）蛍光性物質とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、イソチオシアネート（ＩＴＣ）から選択される化合物と結合したものと３−（アミノプロピル）トリエトキシシラン［３−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ１）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ］との反応産物がシリカネットワークに結合する形態で内部に含まれるかまたは表層に存在する；（３）またはマレイミドと結合したものとＭＰＳとの反応産物がシリカネットワークに結合する形態で内部に含まれるかまたは表層に存在する；（４）または蛍光性物質とマレイミドと結合したものがチオールを持つシリカ化合物を含むシリカ粒子との反応により表層に存在する。これらは、特許文献３からも明らかである。【００２９】
本明細書で使用される場合、「表層機能化」とは、本発明のシリカ粒子の表層に機能性物質を配置しかつ安定化させることをいう。また、この表層機能化を行うことができる対象粒子の性質を、表層機能化能と表現する。本明細書において、「安定化」させるとは、例えば、シリカ粒子中において、その機能性物質がその使用環境下で所望する機能を再現性をもって実現するのに必要な物理的・化学的な安定化状態を提供することである。【００３０】
本明細書で使用される場合に、「内部機能化」とは、本発明のシリカ粒子の内部に機能性物質を含みかつ安定化させることをいう。また、この内部機能化を行うことができる対象粒子の性質を、内部機能化能と表現する。【００３１】
本明細書において「機能性物質」とは、それ自体一個で機能し得る物質をいい、例えば、磁性体や金コロイド、量子ドット、コアシリカ粒子、細胞、細胞構造物、生物活性物質、触媒、触媒ナノ粒子および機能性化合物含有液が含まれるが、これらに限定されない。【００３２】
本明細書において「磁性体」とは、平易には磁性を帯びることが可能な物質をいう。望ましくは強磁性体をいい、ここで強磁性体とは、強く磁化しヒステリシスを示す物質をいう。代表的な磁性体に酸化鉄、酸化クロム、コバルト、フェライトなどがあるが、これらに限定されない。【００３３】
本明細書において「金コロイド」とは、金原子凝集体が液層などに分散したものをいう。金コロイドは走査型または透過型電子顕微鏡で直接観察できる。また、金コロイドは抗体などの蛋白質に非共有結合的に標識でき、電子顕微鏡でその局在を観察できる。また、プラズモン共鳴やプラズモン共鳴による発熱現象を持つサイズのものも含まれる。【００３４】
本明細書において「量子ドット」とは、励起子に三次元的な量子閉じ込めを与えるほど微細なポテンシャルの箱を形成したものをいい、蛍光を発する量子ドットも含まれる。【００３５】
本明細書において「コアシリカ粒子」とは、有機シリカのシェルで被覆されたコアとしてのシリカ粒子を意味する。  用いる有機シリカの種類により、形成されるシリカ粒子のサイズやその分布、また、コアとなる粒子に対する被覆の可否が異なる。  所望の官能基を有する有機シリカにてコア粒子を直接的に被覆できない場合には、他の無機または有機シリカにて該コア粒子を予め被覆することにより、上述「コアとしてのシリカ粒子」を作製した後、該コアシリカ粒子を所望の有機シリカで被覆することができる。その具体例は、後述の実施例２６を参照。【００３６】
本明細書で用いる「細胞」とは、動物細胞、植物細胞、カビ、酵母、大腸菌、枯草菌などが含まれるが、これらに限定されない。【００３７】
本明細書において「細胞構造物」とは、細胞内に存在する構造物であり、具体的には、細胞核、ミトコンドリア、葉緑体、ゴルジ体、リボソーム、細胞膜などが含まれるが、これらに限定されない。【００３８】
本明細書において「生物活性物質」としては、具体的には、ウイルス、プリオン、抗原、抗体、毒素、トキソイドなどが含まれるが、これらに限定されない。【００３９】
本明細書で使用される場合に、「機能性化合物」とは、物理的、化学的、または生物学的な作用を担う物質をいい、作用する対象と相互作用する部位を有する物質であればその形態は任意である。機能性化合物としては、蛍光性物質、蛋白質、ペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ、糖類、生理活性物質、色素、塗料、造影剤、薬剤（例えば、光感受性薬）などが挙げられるがこれらに限定されない。これらは、特許文献３からも明らかである。【００４０】
本明細書において「機能性化合物含有液」とは、上述したような「機能性化合物」を含有する液状のものをいい、「含有液」として、具体的には溶液、コロイド溶液、懸濁液、エマルジョンなどの液状のものが含まれる。【００４１】
本明細書において使用される用語「蛋白質」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーおよびその改変体をいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得るものを包含する。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の組織物において使用される場合は、「タンパク質」は、その組織物が使用されるべき宿主において適合比のあるタンパク質であることが好ましいが、遺伝子工学的改変や化学修飾などによりその宿主において適合するように処置され得る限り、どのようなタンパク質を用いてもよい。あるタンパク質が宿主に適合性があるかどうか、または宿主において適合するように処置され得るかどうかは、そのタンパク質をその宿主に投与して、必要に応じて免疫拒絶反応などの副反応を抑制することによりその宿主に定着するかどうかを観察することによって、判定することができる。代表的には、上述の適合比があるようなタンパク質としては、その宿主に由来するタンパク質を挙げることができるがそれに限定されない。【００４２】
本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで、ヌクレオシドは、塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物をいう。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。【００４３】
本明細書において「生理活性物質」としては、具体的には、ホルモンやビタミン、酵素などが含まれるが、これに限定されない。【００４４】
本明細書において「バイオ材料」とは、生体材料一般をいい、例えば、大腸菌、酵母が含まれるが、これに限定されない。【００４５】
本明細書において「化学共役物質」とは、蛋白質のアミノ基と有機シリカ化合物のチオール基に結合し、蛋白質を粒子表面に結合させることができる物質をいう。また、「マレイミド」、「マレイミド化合物」は、例えば3-Maleimidopropionic Acid,
N-(4-Aminophenyl)maleimide,1,2-Bis(maleimido)ethane,
N,N'-1,4-Phenylenedimaleimide, N-(4-Nitrophenyl)maleimide,
N-Bromomethyl-2,3-dichloromaleimide, N-[4-(2-Benzimidazolyl)phenyl]maleimide,
N-Succinimidyl 4-Maleimidobutyrate, N-Cyclohexylmaleimide, 4-Maleimidobutyric
acid sulfo-N-succinimidyl ester, 1,2-Bis(maleimido)ethane, TFA/N+Maleimide  が含まれ、これを用いると粒子表面の官能基との結合が可能となる。【００４６】
また、本明細書で「官能基」とは、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、-SO3Na、-SO3H、エチル基、メチル基、4-(2-Benzimidazolyl)phenyl]、Phenyl基、4-ニトロフェニル基、クロール基、クロロフェニル基、ブロム基  (Br)、シクロヘキサン、サクシミドエステル、マレイミド
などまたはそれらを含むものなどである。【００４７】
この発明の実施の形態に関し、以下、詳述する。先ず、ＭＰＳを用いたナノ機能性シリカ粒子の生成あるいは作製につき説明する。【００４８】
（多機能性ＭＰＳ粒子）
（ａ）ＭＰＳとアンモニアとを用いる多機能性ＭＰＳ粒子の作製：
機能性物質に、ＭＰＳと２８重量％アンモニア水溶液とを混合した後、温度８０〜１００℃で、好ましくは９５±５℃にて、１〜１２時間、好ましくは７±５時間、攪拌・保温し、反応させ、多機能性ＭＰＳ粒子を生成させる。生成した多機能性ＭＰＳ粒子は、高速遠心によるペレットのかたちで採取し、これを７０％エタノール水溶液と蒸留水とで交互に計４〜８回、遠心により洗浄する。採取したペレット（多機能性ＭＰＳ粒子）は高速ホモジナイザーや超音波処理等により分散させた後、使用に供する。多機能性ＭＰＳ粒子の粒径はナノサイズからミクロンサイズまで、生成に用いるＭＰＳ濃度の変量により、調整・調節できる。例えば、２８重量％アンモニア水溶液（一定量）に対するＭＰＳの添加量を、所望の粒径が得られるよう調節し、適宜、変量できる。【００４９】
（ｂ）標識分子を含有の、ＭＰＳ層状被覆金コロイドの生成：
チオール基と反応する物質、例えば、マレイミド化合物と、標識分子、例えば、ローダミンとの結合物と、ＭＰＳのチオール基とを反応させることによりＭＰＳ一標識分子共役体を事前に調製する。次いで、該共役体、金コロイド、ＭＰＳ及びアンモニア水溶液を混合の後、又は該共役体、ＭＰＳ、アンモニア水溶液を混合の後、上記（ａ）と同様にして、攪拌・保温することにより、標識分子含有MPS層状被覆金コロイドを生成させる。尚、標識分子は一種以上を含有させることができる。また、ＭＰＳに限らず、他種のシリカ化合物を用い、他種のシリカ化合物一標識分子共役体を調製することも可能である。粒径は上述の通りＭＰＳ濃度により調節できる。生成したMPS層状被覆金コロイドは、採取、洗浄、及び分散の後、使用に保する。具体例は後述する実施例４に記載されている。【００５０】
（ｃ）標識分子を含有の、MPS層状被覆磁性体又は量子ドットの生成：
磁性体又は量子ドットに、ＭＰＳと２８重量％アンモニア水溶液、標識分子、例えば、ローダミンとの結合物とを混合した後、上記（ａ）と同様にして、攪拌・保温することにより、標識分子を含有させた、磁性体又は量子ドット含有多機能性ＭＰＳ粒子を生成させる。具体例は後述する実施例１３及び実施例１９に記載されている。【００５１】
次いで、本発明のナノ機能性シリカ粒子の用途につき説明する。本発明のナノ機能性シリカ粒子は、イメージングやアッセイ、診断、治療等、医療やバイオ研究に利用される。以下、機能性物質を磁性体、金コロイド、量子ドットとした場合の用途につき説明する。
（１）MPS層状被覆磁性体
（ａ）イメージング技術の向上
MRIによるマクロ評価と組織学的評価が可能なボーダーレスプローブとしての用途が期待される。蛍光MRIプローブの最大のメリットとして、マクロミクロ観察が1つのプローブで行えることが挙げられ、様々な波及効果をもたらすと考えられる。
（b）分子標的薬の開発
新規抗体をプローブ表面に標識し生体に投与しMRIで観察することにより、標的臓器へのターゲッティングの確認のみならず予期せぬ臓器や組織へのターゲッティングを検出し、副作用の予測や回避を行うことが可能となる。また、細胞レベルでターゲッティングを確認できることから、標的組織へのターゲッティングをより正確に評価可能となる。また様々なリガンド等を結合させた粒子を投与し、ハイスループットなターゲッティングのスクリーニングが可能となり、分子標的薬の開発をより加速するものと考えられる。
（c）ドラッグデリバリーの担体
例えば、ナノ機能性シリカ粒子による悪性腫瘍に対する治療のメリットとしては、１）100ｎｍ前後の粒子サイズが腫瘍部位に集積しやすいとする腫瘍組織選択効果（Effect of permeability and retention）、2）ナノ粒子表面の抗体などの腫瘍特異的結合する分子による機能化による腫瘍細胞選択効果、3）磁気、蛍光などのシグナル機能によるターゲット評価効果、4）粒子内部もしくは表面に薬剤を含有させ、光線や磁場誘導温熱による薬剤の活性化や放出による物理力学的選択効果、が考えられ、これら4つの効果により、革新的な医療が開発できると考える。
（２）MPS層状被覆金コロイド
局所プラズモン共鳴プローブとしての用途が期待される。本発明により金コロイド表面の表層修飾能は飛躍的に向上し、局所プラズモン共鳴を用いた新たなアッセイデザインが構築されるものと期待される。
（３）MPS層状被覆量子ドット
高速動画撮影用量子ドット、低毒素・無毒素量子ドット、サイズ制御量子ドット、二蛍光量子ドット等の開発が期待される。有機シリカ被覆層内に蛍光色素を含有させることにより、近年、汎用されつつある量子ドットの蛍光点滅を改良した粒子として生物現象のより詳細な観察となる。また毒性低下によりユーザーへの安心をもたらすと共に生体内への投与を可能とし、蛍光イメージング技術に大きく寄与すると考えられる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げ、この発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の実施例にのみに制限されるわけではない。【００５３】
実施例１
（20
nm以下のMPS層状被覆100 nm金コロイド）
100 nm金コロイド(田中貴金属製) 90μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液810μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以下のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約１５％であった。【００５４】
実施例２
（10
nm以下のMPS層状被覆100 nm金コロイド）
100 nm金コロイド(田中貴金属製) 85μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ50μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液865μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、10 nm以下のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約３０％であった。【００５５】
実施例３
（30
nm以下のMPS層状被覆250 nm金コロイド）
250 nm金コロイド(BBinternational製) 500μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液450μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、30 nm以下のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約１６であった。【００５６】
実施例４
（20
nm以下かつ蛍光色素(ローダミン)を含有するMPS層状被覆40 nm金コロイド）
マレイミド化合物として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ  Ｃ２  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（約５ｍｇ）を73.5μｌのＤＭＳＯ溶液に溶解した後、チオール基を有する（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎ）を、上記Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ  Ｃ２  ｍａｌｅｉｍｉｄｅと等モルになるように添加混合し、２時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、ローダミン（標識分子）含有シリカ化合物を調製した。
100 nm金コロイド(田中貴金属製) 400μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液500μｌ, 100 mM MPS-Rhodamineをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以下のMPS層状被覆が確認された。また蛍光顕微鏡にてローダミンの蛍光が確認できた。なお、シェルの厚みの制御率は約１７であった。【００５７】
実施例５
（蛍光色素(ローダミン)含有MPS層状被覆金コロイドよる細胞標識）
実施例４にて調製した粒子をマウス腹腔内投与し、翌日、腹腔内の細胞を回収し、5%バラフォルムアルデヒトで固定後蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察(図５右)にて粒子に標識されローダミンの蛍光を持つ細胞が確認できた。図５左は明視野の観察、中央はマージした所見である。【００５８】
実施例６
（MPS層状被覆金コロイドの局所プラズモン共鳴による蛋白の検出）
実施例２と同様の方法にて作製した10 nm以下のMPS層状被覆100 nm金コロイドを用いて局所プラズモン共鳴による蛋白の検出を検討した。MPS層状被覆100 nm金コロイド溶液900μl(A1)に100μg/ml 抗グルタチオン-S-トランスフェラーゼ抗体溶液を9μl(A2)加え、さらに9μl(A3)を加えた後、溶液の吸収を評価した(図６左)。また抗体溶液の添加による希釈の影響を考慮し400nmで補正を行った(図６左)。局所プラズモン共鳴による吸収の変化が確認できた。【００５９】
実施例７
（20
nm以上のMPS層状被覆40 nm金コロイド）
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μｌに、100倍に希釈したＭＰＳ50μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液250μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以上のMPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約１２であった。【００６０】
実施例８
（20
nm以上のTcPS層状被覆40 nm金コロイド）
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μｌに、77倍に希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 50μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液250μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以上のTcPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約２０％であった。【００６１】
実施例９
（20
nm以下のTcPS層状被覆40 nm金コロイド）
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μｌに、385倍に希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 25μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液275μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、20 nm以上のTcPS層状被覆が確認された。なお、シェルの厚みの制御率は約６％であった。【００６２】
実施例１０
（5
nm以下のTcPS層状被覆40 nm金コロイド）
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μｌに、385倍に希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 5μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液295μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、5 nm以上のTcPS層状被覆が確認された。【００６３】
実施例１１
（5
nm以下のEpoPS層状被覆40 nm金コロイド）
40 nm金コロイド(田中貴金属製) 200μｌに、80倍に希釈した 2-(3,4-Epoxycyclohexyl)-ethyltrimethoxysilane (EpoPS) 25μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液275μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、5 nm以上のEpoPS層状被覆が確認された。【００６４】
実施例１２
（MPS層状被覆量子ドット）
Qdot 605 crystal (4μM, Quantum dot 社製) 3μｌに、100倍に希釈したＭＰＳ50μｌ(a)または100μｌ(b)及び２８重量％アンモニア水溶液947μｌ(a)または897μｌ(b)をそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆量子ドットが確認された(図１２左は(a),図１２右は(b))。なお、粒子のサイズ制御率は約３６％であった。【００６５】
実施例１３
（ローダミン含有MPS層状被覆量子ドット）Qdot 605 crystal (4μM, Quantum dot 社製) 3μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液896μｌ, 100 mM MPS-Rhodamine 1μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆量子ドットが確認された (図13上)。さらに、この粒子一つの蛍光強度の変化を蛍光顕微鏡で評価した。図13下グラフ、赤線はローダミン含有MPS層状被覆量子ドット、黒破線は無処理の量子ドットの蛍光強度を示している。ローダミン含有MPS層状被覆量子ドットは高強度並びに安定し、点滅のない蛍光を持続したのに対して、無処理の量子ドットは蛍光強度の変動が激しく蛍光が低下した時には観察できなかった(photo blinking現象)。なお、粒子のサイズ制御率は約２１％であった。【００６６】
実施例１４
（蛍光色素で表層修飾を行ったMPS層状被覆量子ドット）
実施例12の方法で作成したMPS層状被覆量子ドットの含む溶液20μｌに蒸留水 75μｌ、10 mM fluorescein-5-maleimide (A)または10 mM DY-635 maleimide (B)  20μｌをそれぞれ添加混合し、室温で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし蛍光顕微鏡で観察した。図14下a-d
はfluorescein
(A)、e-hはDY-635(B)で表層修飾したものの所見である。いずれもQdot
605 の蛍光が確認できたと共に(A)ではfluorescein、(B)ではDY-635の蛍光がそれぞれ観察できた。dはaとb、hはeとgをマージさせた所見である。
これらから、マレイミドとフルオレセイン、ローダミンなどの蛍光色素との結合体や、ストレプトアビジン、HRP（Horseradish roots peroxidase：西洋わさびペルオキシターゼ)など蛋白質との結合体、その他、ビオチンやポリエチレングリコールなどの機能性物質との結合体を直接粒子表面に結合させることも可能であることがわかる。【００６７】
実施例１５
（MPS層状被覆量子ドットの蛋白による表層修飾）
実施例12の方法で作成したMPS層状被覆量子ドットの含む溶液10μｌに10μg/ml
green fluorecent protein (GFP)溶液  10μｌを混合し、数分反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットを生理的食塩水で３回、洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし蛍光顕微鏡で観察した。粒子はQdotの蛍光(a)に加え、GFPの蛍光(b)も観察できた。図15cはaとbのマージ像。【００６８】
実施例１６
（MPS層状被覆量子ドットによる細胞標識）
実施例１３にて調製した粒子をマウス腹腔内投与し、翌日、腹腔内の細胞を回収し、5%バラフォルムアルデヒトで固定後蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察(図１６右)にて粒子に標識されローダミンの蛍光を持つ細胞が確認できた。図１６左は明視野の観察、中央はマージした所見である【００６９】
実施例１７
（TcPS層状被覆量子ドット）
Qdot 605 crystal (4μM, Quantum dot 社製) 3μｌに、385倍に希釈したTcPS 100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液897μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆量子ドットが確認された。なお、粒子のサイズ制御率は約２５％であった。【００７０】
実施例１８
（MPS層状被覆磁性体）
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの2μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液690μｌ, 2-propanol 200μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆が確認された(図１８上)。また２８重量％アンモニア水溶液, 2-propanol の容量を498μｌ、400μｌ(図１８下左)、398μｌ、500μｌ(図１８下右)ではMPS層状被覆層の厚みに変化が認められた。なお、粒子のサイズ制御率は約１３％であった。【００７１】
実施例１９
（蛍光色素含有MPS層状被覆磁性体）
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの50μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液650μｌ, 2-propanol 200μｌ、 100 mM MPS-Rhodamine 1μｌ をそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、5分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆が確認された(図１９右)。また蛍光顕微鏡にて粒子(層)にローダミンの蛍光が確認できた(図１９左)。【００７２】
実施例２０
（蛍光色素含有MPS層状被覆磁性体による細胞標識）
実施例１９にて調製した粒子をマウス腹腔内投与し、翌日、腹腔内の細胞を回収し、5%バラフォルムアルデヒトで固定後蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察(図２０右)にて粒子に標識されローダミンの蛍光を持つ細胞が確認できた。図２０左は明視野の観察、中央はマージした所見である。【００７３】
実施例２１
（TcPS層状被覆磁性体）
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの10μｌに、364倍に希釈したTcPＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液890μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆が確認された。なお、粒子のサイズ制御率は約１３％であった。【００７４】
実施例２２
（MPS層状被覆大腸菌）
一晩培養しした大腸菌JM109を25% グルタールアルデヒト溶液にて固定を行い洗浄をした後、その固定した大腸菌液100μｌに、50倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液800μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。左図は被覆化処理を行っていないもの、右図は処理を行ったものである。処理を行ったものでは大腸菌のサイズ表面構造に変化が確認でき、MPS層状被覆が確認された。【００７５】
実施例２３
（MPS層状被覆大腸菌の蛋白による表層修飾）
一晩培養した大腸菌JM109を4% パラフォルムアルデヒト溶液にて固定を行い洗浄をした後、その固定した大腸菌液100μｌに、50倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液800μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌した。大腸菌溶液5μｌに250μg/ml Green fluorescein protein (GFP) 溶液を混合し蛍光顕微鏡にて観察を行った。上図は被覆化処理を行っていないもの、下図２３は処理を行ったものである。被覆化処理を行った大腸菌はGFPの付着による蛍光が確認できた。【００７６】
実施例２４
(Liquid core organosilica shellの作製)
32倍希釈したＭＰＳ19μｌ、32倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 27.7μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液453.3μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、約50〜100
nmのMPSとTcPSからなるシリカシェルに液体が被覆された直径約300~600
nm Liquid core organosilica shellが確認された。なお、粒子のサイズ制御率は約２５％であった。【００７７】
実施例２５
(蛍光色素含有Liquid core organosilica shellの作製)
32倍希釈したＭＰＳ19μｌ、32倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)
triethoxysilane (TcPS) 27.7μｌ、100 mM Fluorescein 50μｌ水溶液、及び２８重量％アンモニア水溶液403.3μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で4時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、約60~100 nmのMPSとTcPSからなるシリカシェルに液体が被覆されたLiquid core organosilica shellが確認された。さらに蛍光顕微鏡で観察を行ったところMPS、TcPSで単独で同じ方法で作製した粒子と比較して優位に強い蛍光が観察された。【００７８】
実施例２６
tetraethoxyorthosilicate 15μｌ、エタノール500μｌ、蒸留水125μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液50μｌをそれぞれ添加混合し、室温で2日間反応させ、無機シリカTEOS粒子を作製した。
無機シリカTEOS粒子5μｌに500倍希釈したＭＰＳ  10μｌ、10 mM MPS-rhodamine 1μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液84μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし蛍光顕微鏡で観察した。その結果、粒子より蛍光が観察でき、シリカ表面の蛍光色素を含む有機シリカ被覆が行えたことを確認した。【００７９】
実施例２７
（量子ドットの有機シリカ被覆）
T2-MP EviTags (evident社製; Non-functionalized) 10μｌに、100倍希釈したＭＰＳ19μｌ、100倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)
triethoxysilane (TcPS) 27.7μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液443.3μｌ、100℃で1.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（20,000×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、二種の有機シリカによる層状被覆が確認された。【００８０】
実施例２８
（磁性体の有機シリカ被覆-1)
4倍希釈したＭＰＳ4.7μｌ、4倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)
triethoxysilane (TcPS) 6.9μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液388.4μｌに100 mg/ml に調整したblack iron oxide
particles (Polyscience 社製、直径約200nm)を100μｌそれぞれ添加混合し、100℃で2時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（１０，０００×ｇ、５分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPSとTcPSからなるシリカシェル層に被覆された磁性体が確認できた。また下図上段は被覆した粒子が0.1 mg/ml GFP溶液との混合においてGFPと良好に結合し蛍光を確認できるが、下段の非被覆の粒子は蛍光は確認できなかった。【００８１】
実施例２９
（磁性体の有機シリカ被覆-2）
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) 2μｌに、100倍希釈したＭＰＳ19μｌ、100倍希釈した(3-Thiocyanatopropyl)triethoxysilane (TcPS) 27.7μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液451.3μｌ、100℃で1.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（20,000×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、シリカ層状被覆が確認された。【００８２】
実施例３０
（有機シリカ被覆磁性体のMRI評価）
実施例18にて作製したMPS層状被覆磁性体(A)並びに上記、<磁性体の有機シリカ被覆-2>にて作製したMPSとTcPSで層状被覆した磁性体(B)を小動物用コンパクトMRI(DSファーマバイオメディカル(株)社製)にて評価を行った。コントロールとして実施例-00の方法にて作製した磁性体を含まないMPSとTcPSからなるLiquid core
organosilica shell(C)を用いた。
磁性体はT2強調条件にて陰性造影剤として水のシグナルを減弱する。下図は核粒子を遠心チューブに入った状態でT2強調条件で撮影したものである。(C)においては白い陽性シグナルが観察されるのに対して(A), (B)共に陽性シグナルが検出出来ず、シグナルが陰性化していた。有機シリカ被覆磁性体がMRIのT2強調条件にて陰性シグナルを示すことが確認できた。【００８３】
実施例３１
（二種の機能性物質の有機シリカ被覆１：量子ドットと磁性体を含有するMPSシリカ粒子)
Qdot 605 crystal (320 nM, Quantum dot 社製) 50μｌと100倍希釈した10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を10μｌに、500倍に希釈したＭＰＳ100μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液840μｌを添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、15分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆された量子ドットと磁性体のハイブリッド粒子が確認された。【００８４】
実施例３２
(二種の機能性物質の有機シリカ被覆２：量子ドットと磁性体を含有する有機シリカ粒子) 
20倍希釈した10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を2μｌに、10μM T2-MP EviTags (evident社製; Non-functionalized) を5 μｌ、100倍に希釈したＭＰＳ19μｌ、100倍に希釈したTcPＳ27.7μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液438.3μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で1.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。さらに、次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、有機シリカ層状被覆が確認された。【００８５】
実施例３３
（二種の有機シリカによる被覆：APS/MPS被覆）
10 nm磁性粒子(FerroTec社製) を100倍希釈したもの10μｌに、40倍に希釈したＭＰＳとAPSをそれぞれ19μｌ、22.6μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液448.4μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で16時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機（2０，０００×ｇ、30分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、APS/MPS層状被覆された磁性体が確認された。なお、磁性粒子を含まないAPS/MPSからなる粒子も観察されている。【００８６】
実施例３４
（非水溶性磁性体を用いたMPS層状被覆磁性体の作製）
32 mg 乾燥磁性粒子(EMG1500, FerroTec社製) に、ＭＰＳ10μｌ及び２８重量％アンモニア水溶液940μｌ, 10 mM Rhodamine B 50μｌをそれぞれ添加混合し、100℃で3時間反応させた。次いで、反応終了液上清を高速遠心機（2０，０００×ｇ、10分間）にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、７０容量％エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に３回、合計６回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレットを超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、MPS層状被覆磁性体粒子が確認された(図３４)。また蛍光顕微鏡において粒子より蛍光が観察できた(図３５)。被覆された粒子は水中において分散していた。【００８７】
・磁性体で疎水性のタイプの粒子に対して、シリカ被覆反応を行なうことにより粒子を親水化することができた。被覆された粒子は(図３６)に示すように分散性の高い粒子となった。被覆前の粒子(図左)は凝集し、沈殿もしくは水表面に浮上するのに対して被覆粒子(図右)は分散している。
・シリカ化合物と蛍光色素の結合体(MPS-Rhodamineなど)を用いずに、Rhodamine B（ローダミンＢ）のみで一段階の反応で、色素が粒子の有機シリカ被覆層に含有されている。【００８８】
実施例３５
（金コロイドのＭＰＳ被覆粒子と従来の金コロイド粒子との表面修飾能比較）
種々の濃度（0〜20μg/ml：具体的には0μg/mｌ,10μg/mｌ,20μg/mｌ）のGreen fluorescent
protein(GFP)溶液を作製した。このGFP溶液５μｌと、以下のＡ〜Ｅの粒子溶液５μｌとをフローサイトメーター用試験管に加え、よく混和した後、（特に反応のための時間を加えず）４９０μｌの蒸留水で希釈しフローサイトメトリーで測定(FCM-48-3820)を行った。【００８９】
A: 100 nm金コロイド
B: 100 nm金コロイドをSiO2にて被覆
C: 100 nm金コロイドをSiO2にて被覆したものをMPSにて処理
D: 100 nm金コロイドをSiO2にて被覆したものをAPSにて処理 
E: 100 nm金コロイドをMPSにて被覆
このうち粒子Ａ〜Ｄは、従来の被覆粒子と、更にその表面にＡＰＳ、ＭＰＳをカップリング剤として処理したものであり、粒子Ｅが本発明の一例であるＭＰＳの被覆粒子Ｅであることがわかる。【００９０】
上記フローサイトメトリーでの測定の結果が以下の表２と表３とに示されており、これをグラフ化したものが図３７に示されている。表２はそれぞれの粒子Ａ〜Ｅについての測定結果であり、表３は表１における濃度が０μg/mｌの場合をバックグラウンドデータとして差し引いた結果である。また、図３７は表２のデータをグラフ化したものである。被覆粒子(E)はGFP濃度20 micro-g/mlにおいて他の粒子の約3倍から30倍、高い表面修飾能を示した。このことから金コロイドに直接MPS被覆した粒子は、他の被覆処理した粒子よりタンパク質との結合効率が高いことがわかる。【００９１】
【表２】
2009072657.tif 000004
【００９２】
【表３】
2009072657.tif 000005
【００９３】
実施例３６
（有機シリカ被覆粒子の化学共役物質を用いた表面の機能化）
有機シリカにて被覆を行なった粒子表面に蛋白質をより高効率に結合させるため化学共役物質、具体的にはカップリング剤としてマレイミド化合物の１つである4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl esterを使用し、有効な結果を得た。具体的には種々の濃度（0〜50μg/ml：具体的には0μg/mｌ,12.5μg/mｌ,25μg/mｌ,50μg/mｌ）のGreen fluorescent
protein(GFP)溶液を作製した。このGFP溶液2５μｌと、以下のＡ〜Ｃの粒子溶液５μｌとをフローサイトメーター用試験管に加え、よく混和し30分反応させた後、47０μｌの蒸留水で希釈しフローサイトメトリー（実施例３５と同様）で測定を行った。【００９４】
A: 250 nm金コロイド
B: 250 nm金コロイドをMPSにて被覆
C:  250 nm金コロイドをMPSにて被覆した粒子250μｌに対して終濃度 1 mM となるように4-maleimidobutyric
acid N-succinimidyl esterを加えて1時間反応させた粒子
ここで、4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl esterは蛋白質のアミノ基とMPS被覆粒子のチオール基に結合し、蛋白質を粒子表面に結合させることができる化学共役物質の１つであり、本粒子ではサクシミドエステルを表面保有させた粒子作製がなされている。【００９５】
上記フローサイトメトリーでの測定の結果が以下の表４に示されており、これをグラフ化したものが図３８に示されている。表４はそれぞれの粒子Ａ〜Ｃについての測定結果であり、濃度が０μg/mｌの場合をバックグラウンドデータとして差し引いたものである。また、図３８は表４のデータをグラフ化したものである。このことから化学共役物質としての4-maleimidobutyric acid N-succinimidyl esterをMPSに結合させると、他の粒子に比してタンパク質の結合効率が高いことがわかる。【００９６】
【表４】
2009072657.tif 000006
【００９７】
これらの結果（実施例３５および３６）は有機シリカ被覆層さらにカップリング剤の応用によりこれまでに得られなかった優れた、粒子自体の表面機能化能、粒子表面機能化の方法、そして高度に表面機能化された粒子であることを示している。また、N-Succinimidyl 4-MaleimidobutyrateとMPS層状被覆金コロイドを反応させた粒子表面はサクシミドエステルの存在によりアミノ基を持った蛋白質、アミノ基標識DNAなど、アミノ基を持つ任意の物質との共役結合を可能としている。またMPS層状被覆粒子に1,2-Bis(maleimido)ethane を反応させることにより粒子表面にマレイミド基を持つ粒子となり、チオール基を持つ蛋白質やその他の機能性物質との結合が可能となる。この反応は一段階のみならず多段階化する、多種のカップリング剤の多段階反応により多様な粒子表面の機能化が可能となる。【００９８】
実施例３７
（有機シリカで被覆した粒子のゼータ電位）
コアとなる種々の機能性粒子について表面修飾（被覆）しない場合とシリカ化合物で被覆した場合と表面修飾しない場合とのゼータ電位差（Ｚ電位の差）について測定した。表５は左から順にそれぞれの粒子のゼータ電位と、コア粒子とのゼータ電位の差と、コア粒子とのゼータ電位の差の絶対値と、コア粒子とこれに被覆した粒子の説明と、を示している。【００９９】
【表５】
2009072657.tif 000007
【０１００】
実施例３８
（励起光の照射により細胞障害機能の検証：（ＥＭＧ１５００）ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ／ＭＰＳ）粒子）
本実施例では、マウス腹腔よりマクロファージを２ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩにて採取し９６ウェルのマイクロウェートに培養した。その後、以下のＡ〜Ｃの条件の溶液に細胞増殖試薬（Cell Proliferation Reagent WST-1：Roche社）  10μl添加し、30分または90分培養後、溶液の吸収波長 (440 nm 参照波長  750 nm)を測定した。【０１０１】
A: 腹腔マクロファージ  100  μl
B: 腹腔マクロファージ  100  μl + ((EMG1500)RhodamineB/MPS) 粒子  10μl
添加
C: 腹腔マクロファージ  100  μl + ((EMG1500)RhodamineB/MPS) 粒子  10μl
添加した後、蛍光顕微鏡下にて励起光(528-553 nm)を照射
ここで、((EMG1500)RhodamineB/MPS) 粒子とは、乾燥磁性ナノ粒子EMG1500（フェローテック社）に蛍光色素（Rhodamine B）を含有させMPS被覆した粒子である。【０１０２】
下記の表６は、上段がマイクロウェートで30分培養した場合、下段が90分培養した場合を示しており、それぞれ吸収波長440nm,750nmを測定し、それぞれの吸光度を示している。また、表７は、吸収波長750nmの吸光度の測定値をバックグラウンドデータとして吸収波長440nmの吸光度の測定値差し引いた結果である。また、図３９は表７の結果から30分培養した場合と90分培養した場合との吸光度をグラフ化したものであり、左側は30分の場合、右側が90分の場合を示している。ここで吸光度は、その値と細胞の増殖活性が比例する、および細胞が障害を受けた程度が反比例する、すなわち図３９の棒グラフの高さとマクロファージの増殖活性が比例し、棒グラフの相対的低下はマクロファージが細胞障害を受け、増殖が低下している。【０１０３】
これらから理解されるように条件Ｂにおいて増殖したマクロファージが励起光を照射した条件Ｃでは減少している。すなわち励起光照射により細胞の増殖活性の低下が認められる。これは粒子が発生する活性酸素の影響により細胞が障害をうけた結果と考えられる。従って、本粒子はイメージング機能を有していることのみならず、励起光照射を条件に細胞障害機能を有すると言える。
なお、図４０では蛍光顕微鏡下にて励起光(528-553 nm)を照射した細胞（マクロファージ）の形態変化を示している（上記条件Ｃ）。照射開始時 (0sec)において細胞内の粒子からの蛍光が観察できるが、100 sec 後において蛍光は消失し、その後、細胞の形態変化・破壊所見が観察される。【０１０４】
本実施例３８の粒子は、近年注目されている治療法である磁性流体ハイパーサーミアへの活用が期待される。この治療法は、体内の腫瘍部位に磁性粒子を集積させた後、磁場をかけ、磁性体に熱を発生させることにより熱に感受性の高い腫瘍細胞を殺傷するものである。この治療法において本粒子を活用すれば、従来の熱による腫瘍細胞の殺傷よりも殺傷効果を向上させることができる。この粒子が光照射により細胞障害機能を有するからである。【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
【表７】
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【０１０７】
上記シリカ被覆以外にその他カルボキシ基を含有するシリカ化合物である2-(CARBOMETHOXY)ETHYLTRIMETHOXYSILANEなど様々な有機シリカの単独もしく2種以上のシリカ化合物の混合したシリカ被覆が可能と考えられる。また、コア粒子としてガドリニウム含有粒子も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】１００ｎｍ金コロイドを内部に含有した２０ｎｍ以下の多機能性MPS粒子である（実施例１）。
【図２】１００ｎｍ金コロイドを内部に含有した１０ｎｍ以下の多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例２）。
【図３】２５０ｎｍ金コロイドを内部に含有した３０ｎｍ以下の多機能性MPS層状粒子電子顕微鏡像である（実施例３）。
【図４】４０ｎｍ金コロイドを内部に含有しかつ蛍光色素（ローダミン）を有する20nm以下の多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例４）。
【図５】実施例４にて作成した粒子をマウス腹腔内投与し、回収した腹腔内の細胞の蛍光顕微鏡写真である（図右）（実施例５）。図左は明視野の観察、中央はマージした所見である。
【図６】実施例２にて作成した粒子を用いて、局所プラズモン共鳴による蛋白の検出結果を示すグラフである（実施例６）。図左は、MPS層状被覆100 nm金コロイド溶液900μl(A1)に100μg/ml 抗グルタチオン-S-トランスフェラーゼ抗体溶液を9μl(A2)加え、さらに9μl(A3)を加えた後、溶液の吸収を評価したグラフである。また図左は、抗体溶液の添加による希釈の影響を考慮し400nmで補正を行ったグラフである。
【図７】４０ｎｍ金コロイドを内部に含有した２０ｎｍ以上の多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例７）。
【図８】４０ｎｍ金コロイドを内部に含有した２０ｎｍ以上の多機能性TcPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例８）。
【図９】４０ｎｍ金コロイドを内部に含有した２０ｎｍ以下の多機能性TcPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例９）。
【図１０】４０ｎｍ金コロイドを内部に含有した５ｎｍ以下の多機能性TcPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例１０）。
【図１１】４０ｎｍ金コロイドを内部に含有した５ｎｍ以下の多機能性ＥｐｏPＳ層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例１１）。
【図１２】粒子ドットを内部に含有した多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例１２）。左図は１００倍に希釈したMPS５０μｌを用いて作成した粒子、右図は同様のMPSを１００μｌ用いて作成した粒子である。
【図１３】上図は、粒子ドットを内部に含有しかつ蛍光色素（ローダミン）を有する多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例１３）。下図は、この粒子一つの蛍光強度の変化を蛍光顕微鏡で評価したものであり、下図グラフ、赤線はローダミン含有MPS層状被覆量子ドット、黒破線は無処理の量子ドットの蛍光強度を示している。
【図１４】図１２にて作成した粒子に蛍光色素で表層修飾を行った、粒子ドットを内部に含有した多機能性MPS層状粒子の蛍光顕微鏡像である（実施例１４）。下図a-d はfluorescein (A)、e-hはDY-635(B)で表層修飾したものの所見である。ｄはaとb、hはeとgをマージさせた所見である。
【図１５】実施例12にて作成した粒子にgreen fluorescent protein（GFP）で表層修飾を行った、粒子ドットを内部に含有した多機能性MPS層状粒子の蛍光顕微鏡像である（実施例１５）。図aはQdotの蛍光、図ｂはGFPの蛍光、図ｃはaとｂのマージ像である。
【図１６】実施例１３にて作成した粒子をマウス腹腔内投与し、回収した腹腔内の細胞の蛍光顕微鏡写真である（図右）（実施例１６）。図左は明視野の観察、中央はマージした所見である。
【図１７】量子ドットを内部に含有した多機能性TcPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例１７）。
【図１８】磁気粒子を内部に含有した多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例１８）。上図、下図左、下図右はそれぞれ２８重量％アンモニア水溶液, 2-propanol の容量を690μｌ、200μｌ（上図）、498μｌ、400μｌ(下図左)、398μｌ、500μｌ(下図右)としたときの電子顕微鏡像である。
【図１９】右図は、磁性粒子を内部に含有しかつ蛍光色素（ローダミン）を有する多機能性MPS層状粒子の電子顕微鏡像である。左図は、蛍光顕微鏡にて粒子（層）にローダミンの蛍光が確認された図である（実施例１９）。
【図２０】実施例１９にて作成した粒子をマウス腹腔内投与し、回収した腹腔内の細胞の蛍光顕微鏡写真である（図右）（実施例２０）。図左は明視野の観察、中央はマージした所見である。
【図２１】磁気粒子を内部に含有した多機能性TcPS層状粒子の電子顕微鏡像である（実施例２１）。
【図２２】MPS層状被覆を行った大腸菌JM１０９の電子顕微鏡像である。左図は被覆化処理を行っていないもの、右図は処理を行ったものである（実施例２２）。
【図２３】MPS層状被覆を行った大腸菌JM１０９のMPS表層に、GFPを修飾させた際の、当該大腸菌JM１０９の蛍光顕微鏡像である。上図は被覆化処理を行っていないもの、下図は処理を行ったものである（実施例２３）。
【図２４】MPSとTcPSからなるシリカシェルに液体が被覆されたLiquid core organosilica shellの電子顕微鏡像である（実施例２４）。
【図２５】上図はMPSとTcPSからなるシリカシェルに液体が被覆されたLiquid core organosilica shellの電子顕微鏡像であり、下図はぞれぞれ左からMPS単独、MPSとTcPS、 TcPS単独からなる蛍光色素を含む粒子の蛍光顕微鏡像である（実施例２５）。（実施例２５）
【図２６】シリカ表面の蛍光色素を含む有機シリカ被覆の蛍光顕微鏡像である（実施例２６）
【図２７】量子ドットの有機シリカ被覆の蛍光顕微鏡像である（実施例２７）。
【図２８】上図は、MPSとTcPSからなるシリカシェル層に被覆された磁性体の電子顕微鏡像で、下図上段は被覆した粒子がGFPと良好に結合し、下図下段は非被覆の粒子の蛍光顕微鏡像である（実施例２８）。
【図２９】MPSとTcPSからなるシリカシェル層に被覆された他の磁性体の電子顕微鏡像である（実施例２９）。
【図３０】上図は、実施例18のMPS層状被覆磁性体(A)、並びに実施例29のMPSとTcPSで層状被覆した磁性体(B)、コントロールとしての実施例24の磁性体を含まないMPSとTcPSからなるLiquid coreorganosilica shell(C)を小動物用コンパクトMRI評価を示しており、下図はそれぞれ核粒子を遠心チューブに入った状態でT2強調条件で撮影したものである（実施例３０）。
【図３１】MPS層状被覆された量子ドットと磁性体のハイブリッド粒子の電子顕微鏡像である（実施例３１）。
【図３２】量子ドットと磁性体を含有する有機シリカ粒子の電子顕微鏡像である（実施例３２）。
【図３３】APS/MPS層状被覆された磁性体の電子顕微鏡像である（実施例３３）。
【図３４】MPS層状被覆された磁性体の電子顕微鏡像である（実施例３４）。
【図３５】MPS層状被覆された磁性体の蛍光顕微鏡像である（実施例３４）。
【図３６】MPS層状被覆された磁性体の被覆前後の凝集・分散状態を示した図である（実施例３４）
【図３７】種々の濃度（0〜40μg/ml）のGFP溶液５μｌと粒子溶液５μｌを混和した後、４９０μｌの蒸留水で希釈しフローサイトメトリーで測定した測定結果である（実施例３５）。
【図３８】種々の濃度（0〜50μg/ml）のGFP５μｌと粒子溶液５μｌを混和し30分反応させた後、47０μｌの蒸留水で希釈しフローサイトメトリーで測定した測定結果である（実施例３６）。
【図３９】実施例３８における表７をそれぞれ左から30分培養した場合と、90分培養した場合とでグラフ化したものである。
【図４０】蛍光顕微鏡下にて励起光(528-553 nm)を照射した細胞の形態変化を時系列に配した蛍光顕微鏡像である（実施例３８）。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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