(57)【要約】  生体内の特定機能細胞を動員する活性を持つ生体内因子を充填した生体低浸襲性容器を生体内に留置し、容器内に特定機能細胞を遊走させた後に、容器を生体外に取り出し、あるいは生体内に留置した容器から直接、容器内に動員した機能的細胞集団を回収する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下から体外に取り出された容器から細胞集団を回収する方法。
【請求項２】
皮下から体外に取り出された容器から細胞集団を回収する方法であって、該細胞集団が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物によって骨髄より該容器内に動員される、前記方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
【請求項３】
皮下に埋め込まれた容器から回収された細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法。
【請求項４】
皮下に埋め込まれた容器から回収された細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法であって、該細胞集団が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物によって骨髄より該容器内に動員される、前記方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
【請求項５】
細胞集団から骨髄細胞を単離する工程の前に、体外に取り出された該容器から細胞集団を回収する工程を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
細胞又は組織の抽出液が細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される、請求項２又は４記載の方法。
【請求項７】
細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分が以下の工程を含む方法で製造される、請求項２又は４記載の方法；
（ａ）細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
【請求項８】
請求項１、２、６、および７のいずれかに記載の方法によって回収される細胞集団。
【請求項９】
請求項３〜７のいずれかに記載の方法によって単離される骨髄細胞。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞集団を含有する、組織再生剤。
【請求項１１】
請求項９に記載の骨髄細胞を含有する、組織再生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内組織に極めて少数存在する幹細胞などの機能的細胞を、低浸襲かつ高効率に回収するための新規細胞採取法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体内から高機能細胞を採取する方法としては、例えば造血髄幹細胞であれば、長骨や骨盤骨の骨髄中に針を直接刺入して骨髄液を採取した後、ヒト投与の場合は遠心分離により幹細胞集団を濃縮し幹細胞表面マーカーを指標にして蛍光標識した細胞をセルソーターで採取・確認するなどの手法が、末梢血幹細胞であれば、G-CSFを投与して末梢血中に造血幹細胞を動員しその後に末梢血を採取して造血幹細胞を分離するなどの手法が、間葉系幹細胞であれば、直接骨髄液を培養し付着性増殖細胞を回収して間葉系幹細胞を得る、脂肪組織などの末梢組織を手術により採取しその中に存在する間葉系幹細胞を分離・培養するなどの手法がある。しかし、骨髄からの骨髄液採取は浸襲性が強く、痛みを伴い、骨髄内感染による骨髄炎の危険を伴うため、その施術には専門家による極めて厳密な医療管理が必要であり、頻回の施行は困難である。末梢組織の手術的採取も同様のリスクが伴う。G-CSFによる造血幹細胞動員は、経済的に負担が多く、やはり頻回の施行は困難である。
より効率よく安全に生体内機能性細胞を採取する方法が開発されれば、それら細胞を必要とする多くの難治性疾患に苦しむ患者にとって朗報であることは言うまでも無い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. J Cell Mol Med. 2005;9:37-50
【非特許文献２】Role of mesenchymal stem cells in regenerate medicine:application to bone and cartilage repair. Expert Opin Biol Ther. 2008;8:255-268
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、生体内組織に極めて少数存在する幹細胞などの機能的細胞を、低浸襲かつ高効率に回収するための新規技術の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、生体内に低浸襲性にチューブを挿入するだけで、高効率に生体内機能性細胞を採取する全く新しい技術を提供する。
具体的には、生体低刺激性シリコンで作成された円筒状チューブ（片面が解放面、その反対側面は閉鎖面からなり、長径は１０ミリメートル、断面積は約２平方ミリメートル）内に、HMGB1、ヒアルロン酸、リン酸緩衝液などをそれぞれ充填したのち、GFP骨髄移植マウス背部皮下に移植した。移植2週間後にチューブを回収し、チューブ内に動員され集積していた細胞を採取し、その一部は細胞培養、一部はFACSによる細胞表面マーカーの解析を進めた。その結果、リン酸緩衝液に比較して、その他の因子を充填したチューブからは優位に多くのPDGFRα陽性細胞が回収され、それら細胞集団の中に、骨分化能や軟骨分化能を持った間葉系幹細胞が含まれていることが確認された。
本願は、この知見に基づき、以下の発明を提供するものである。
〔１〕  皮下から体外に取り出された容器から細胞集団を回収する方法。
〔２〕  皮下から体外に取り出された容器から細胞集団を回収する方法であって、該細胞集団が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物によって骨髄より該容器内に動員される、前記方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔３〕  皮下に埋め込まれた容器から回収された細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法。
〔４〕  皮下に埋め込まれた容器から回収された細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法であって、該細胞集団が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物によって骨髄より該容器内に動員される、前記方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔５〕  細胞集団から骨髄細胞を単離する工程の前に、体外に取り出された該容器から細胞集団を回収する工程を含む、〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔６〕  細胞又は組織の抽出液が細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される、〔２〕又は〔４〕記載の方法。
〔７〕  細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分が以下の工程を含む方法で製造される、〔２〕又は〔４〕記載の方法；
（ａ）細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔８〕  〔１〕、〔２〕、〔６〕、および〔７〕のいずれかに記載の方法によって回収される細胞集団。
〔９〕  〔３〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法によって単離される骨髄細胞。
〔１０〕  〔８〕に記載の細胞集団を含有する、組織再生剤。
〔１１〕  〔９〕に記載の骨髄細胞を含有する、組織再生剤。
〔１２〕  以下の工程を含む、細胞集団を回収する方法；
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程、
（II）容器から細胞集団を回収する工程。
〔１３〕  工程（Ｉ）の後に、以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を血管または筋肉に投与する工程を含む、〔１２〕に記載の方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔１４〕  容器が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を含有する、〔１２〕に記載の方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔１５〕  以下の工程を含む、骨髄細胞を収集する方法；
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程、
（II）容器から細胞集団を回収する工程、
（III）回収した細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程。
〔１６〕  工程（Ｉ）の後に、以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を血管または筋肉に投与する工程を含む、〔１５〕に記載の方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔１７〕  容器が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を含有する、〔１５〕に記載の方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分。
〔１８〕  細胞又は組織の抽出液が細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される、〔１３〕、〔１４〕、〔１６〕、および〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕  細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分が以下の工程を含む方法で製造される、〔１３〕、〔１４〕、〔１６〕、および〔１７〕のいずれかに記載の方法；
（ａ）細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔２０〕  〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法によって回収される細胞集団。
〔２１〕  〔１５〕〜〔１７〕のいずれかに記載の方法によって単離される骨髄細胞。
〔２２〕  〔２０〕に記載の細胞集団を含有する、組織再生剤。
〔２３〕  〔２１〕に記載の骨髄細胞を含有する、組織再生剤。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】生体内機能的細胞の高効率回収法の概略図である。生体内機能性細胞の特異的動員因子を充填した低刺激性チューブ（シリコンチューブなど）を生体内に留置することにより、末梢循環中あるいは組織中に存在する機能的細胞が選択的にチューブ内に動員される。
【図２】チューブ内に集積した細胞（tube-entrapping cells; TECs）がGFP陽性であることを示す写真である。
【図３】TECsの培養開始２４時間後の写真である。左の写真は培養プラスチックシャーレに付着して増殖している線維芽細胞様細胞および上皮細胞様細胞の明視野像を、右の写真はその暗視野におけるGFP蛍光像を示す。
【図４】チューブ内から回収したTECsの骨芽細胞分化能を評価した写真である。チューブから回収した細胞を骨芽細胞分化誘導培地中で培養した結果、約２週間でアリザリンレッド染色陽性骨芽細胞への分化が確認された。
【図５】チューブ内から回収したTECsの脂肪細胞分化能を評価した写真である。チューブから回収した細胞を脂肪細胞分化誘導培地中で培養した結果、約２週間でオイルレッド染色陽性脂肪細胞への分化が確認された。
【図６】チューブ内から回収したTECsの表皮細胞分化能を評価した写真である。チューブから回収した細胞を表皮細胞分化誘導培地中で培養した結果、約２週間で表皮細胞特異的ケラチン５を発現する角化細胞への分化が確認された。
【図７】PDGFRαおよびCD44のTECsにおける発現を検討した図である。PDGFRα陽性およびCD44陽性細胞がチューブ内に回収されたことが確認された。
【図８】新生マウス皮膚抽出液中のHMGBファミリーをWestern blot 法を用いて検出した写真である。
【図９】HMGB1発現ベクターの図である。
【図１０】HEK293細胞に発現させた精製リコンビナントFlag tag-HMGBファミリー融合タンパク質のWestern blotの結果を示す写真である。
【図１１】ボイデン・チャンバーを用いたリコンビナントHMGB1・HMGB2・HMGB3の骨髄間葉系幹細胞遊走活性を示す図である。いずれのリコンビナントタンパク質もコントロール群に比べ遊走活性を示した。
【図１２】マウスの皮膚潰瘍治療モデルにおけるHMGB ファミリーによる治療結果を示す図である。HMGB1・HMGB2・HMGB3いずれもコントロール群に比べ有意に潰瘍面積の縮小効果を示した。
【図１３】ヒトHMGB1及びヒト皮膚抽出液がヒト骨髄由来間葉系幹細胞を遊走する活性をボイデン・チャンバーを用いて確認した写真である。
【図１４】マウス心臓、マウス脳及びマウス皮膚抽出液中の骨髄間葉系幹細胞誘導活性物質をヘパリンカラムで精製し、ボイデン・チャンバーを用いて、活性を確認した写真である。
【図１５】培養細胞株HEK293およびHeLa抽出液のヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性をボイデン・チャンバー法を用いて確認した写真である。いずれの培養細胞株もヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を示した。
【図１６】Aはマウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開しドリルを用いて穿頭を施した写真である。Bは脳にシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳組織を一部吸引した写真である。Cはフィブリン糊製剤（フィブリノゲン）に溶解した皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を5μl注入し、次にフィブリン糊製剤（トロンビン）を5μl注入した後の写真である。DおよびEは脳損傷モデル治療後２週間後の写真である。コントロールのDに比べ皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分による治療群のEでGFP陽性細胞の集積が認められた。FおよびGは脳損傷モデル治療後6週間後の写真である。コントロールのFに比べ皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分による治療群のGでGFP陽性細胞の集積が認められた。
【図１７】ボイデン・チャンバーを用いた皮膚抽出液の骨髄由来間葉系幹細胞遊走能活性測定結果を示す写真である。ボイデン・チャンバーの上槽内から8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレン膜の微細穴を通過して皮膚抽出液を含む下槽側に遊走し、膜下槽側に付着している骨髄間葉系幹細胞を、青色色素にて染色した像である。下層には2日齢マウスおよび6週齢マウスから採取した皮膚の抽出液を入れた。
【図１８】皮膚抽出液中のS100A8、S100A9のタンパク質の存在をWestern blot 法で確認した図である。
【図１９】皮膚抽出液中のHeparin 結合タンパク質をHeparin affinity column からNaCl濃度勾配によって溶出した結果を示す写真である。それぞれのフラクションのタンパク質をSDS-PAGEによって分画し銀染色にて検出した。
【図２０】ボイデン・チャンバーを用いた皮膚抽出液の骨髄由来間葉系幹細胞遊走能活性測定結果を示す写真である。ボイデン・チャンバーの上槽内から膜上の微細穴を通過して皮膚抽出液のヘパリン結合した各分画（下槽側）に遊走し、膜下槽側に付着している骨髄間葉系幹細胞を、青色色素にて染色した像である。
【図２１】皮膚抽出液のヘパリン結合した各分画中のS100A8、S100A9タンパク質の存在をWestern blot 法を用いて検出した結果を示す写真である。
【図２２】S100A8、S100A9発現ベクターの図である。
【図２３】ボイデン・チャンバーを用いた皮膚抽出液の骨髄由来間葉系幹細胞遊走能活性測定結果を示す写真である。ボイデン・チャンバーの上槽内から膜上の微細穴を通過してリコンビナントGST-S100A8、GST-S100A9、皮膚抽出液をそれぞれ含む下層側に遊走し、膜下槽側に付着している骨髄間葉系幹細胞を、青色色素にて染色した像である。
【図２４】Aはマウスの尾静脈からGST-S100A8、GST-S100A9を投与し、12時間後末梢血中のCD45陰性細胞の画分に対してCD44、PDGFRα、PDGFRβのFACSを行った図である。BはFACSの結果を基にして、GST-S100A8、GST-S100A9投与12時間後末梢血中のCD45陰性CD44陽性PDGFRα陽性細胞、あるいはCD45陰性CD44陽性PDGFRβ陽性細胞の出現を定量的にグラフ化した図である。
【図２５】正常マウスにおけるS100A8の皮膚潰瘍治療効果を示す図である。
【図２６】糖尿病マウスにおけるS100A8の皮膚潰瘍治療効果を示す図である。
【図２７】皮膚抽出液、末梢血抽出液によってデバイス内に動員した細胞による皮膚潰瘍の治療効果を示す図である。
【図２８】末梢血抽出液のヘパリンアフィニティーカラム結合成分によってデバイス内に動員した骨髄細胞を蛍光顕微鏡で検出した図である。
【図２９】末梢血抽出液のヘパリンアフィニティーカラム結合成分によってデバイス内に動員した骨髄細胞を蛍光顕微鏡で検出し、画像処理ソフトを用いて細胞数を定量化したグラフである。
【図３０】S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3それぞれを用いてデバイス内に動員した骨髄由来細胞（GFP陽性細胞）を蛍光顕微鏡で検出した図である（A:S100A81、B:HMGB1、C: HMGB2 D: HMGB3 E:陰性コントロール）。
【図３１】S100A8、HMGB1、HMGB2、それぞれを用いてデバイス内に動員した骨髄由来細胞によるBALB/cAJcl-nu/nu  に作製した皮膚潰瘍に対する治療効果を示す図である。
【図３２】HMGB1発現ベクターの図である。
【図３３】マウス尾静脈から、皮膚抽出液（SE）を投与し、末梢血を採取する図である。
【図３４】皮膚抽出液（SE）を投与後１２時間後のマウス末梢血単核球画分を抗マウスPDGFRα抗体、抗マウスCD44抗体で蛍光標識し、フローサイトメトリーで分画した図である。上段３つは陰性コントロールのPBS投与群（n=3）、下段３つは皮膚抽出液（SE）投与群(n=3)である。縦軸はCD44の発現量を横軸はPDGFRαの発現量を示している。青腺で囲んだ部分がCD44陽性かつPDGFRα陽性細胞群を示し、皮膚抽出液投与群(SE)でPBS群に比して増加している。
【図３５】マウス尾静脈から、HMGB1を投与し、末梢血を採取する図である。
【図３６】HMGB1を投与後１２時間のマウス末梢血単核球画分を抗マウスPDGFRα抗体、抗マウスCD44抗体で蛍光標識し、フローサイトメトリーで分画した図である。左は陰性コントロールのPBS投与マウス、右はHMGB1投与マウスの図である。縦軸はCD44の発現量を横軸はPDGFRαの発現量を示している。青線で囲んだ部分がCD44陽性かつPDGFRα陽性細胞群を示し、HMGB1投与マウスでPBS投与マウスに比して増加している。
【図３７】AはCD44およびPDGFRαをもつ細胞の存在頻度を表したフローサイトメトリーの結果を示す図である。末梢血中のPDGFRα陽性かつCD44陽性細胞およびPDGFRα陽性かつCD44陰性細胞いずれの細胞群もHMGB1投与によって増加している。BはPDGFRα陽性かつCD44陽性細胞、CはPDGFRα陽性かつCD44陰性細胞についてそれぞれPBS投与群とHMGB1投与群で末梢血中の出現頻度を比較した結果を示す図である。いずれの細胞群においても、HMGB1投与群において統計的有意に増加している。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、皮下から体外に取り出された容器から細胞集団を回収する方法を提供する。
また、本発明は、皮下に埋め込まれた容器から回収された細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法を提供する。前期方法は、細胞集団から骨髄細胞を単離する工程の前に、体外に取り出された該容器から細胞集団を回収する工程を含んでもよい。
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、細胞集団を回収する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
また、本発明は、以下の工程を含む、骨髄細胞を収集する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
（III）回収した細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程
また、上記方法は、工程（Ｉ）の後に、容器を皮下から取り出す工程を含んでもよい。
【０００９】
上記容器の素材としては、シリコン、ビニール、プラスチック、その他生体低刺激性素材が好ましいが、これに制限されない。また、容器の大きさとしては、本実施例では長径10mm ｘ 断面積2mm（容積20ml、マウス用）のものを用いたが、皮下に挿入可能なサイズであればこれに制限されない。容器の厚みとしては、本実施例では壁の厚さが約0.5mmの容器を用いたが、十分な強度維持に必要な厚みがあればこれに制限されない。容器の形状としては、本実施例では円筒形で片面のみ解放したものを用いたが、円筒、紡錘形、球形、卵形など生体組織に損傷を与えない形状であれば特に制限されない。本願で用いられる容器としては、シリコンチューブ、ビニールバック、注射用留置針など、生体内留置が可能な医療用器材、医療材料であれば特に制限されない。
【００１０】
本発明において容器から回収される細胞集団には、骨髄由来細胞が含まれる。
本発明の骨髄細胞は、造血系幹細胞及びこれに由来する白血球、赤血球、血小板以外の細胞であり、これまで骨髄間葉系幹細胞あるいは骨髄間質多能性幹細胞あるいは骨髄多能性幹細胞と呼ばれている細胞に代表される幹細胞もしくは骨髄中に存在する組織前駆細胞集団を含む。本発明の骨髄細胞としては、骨髄採取（骨髄細胞採取）、あるいは末梢血採血により単離することができる細胞である。造血系幹細胞は非付着細胞であり、本発明の骨髄細胞は、骨髄採取（骨髄細胞採取）、末梢血採血により得られた血液中の単核球分画細胞培養により付着細胞として得られる。また、本発明の骨髄細胞は間葉系幹細胞を含み、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めることで特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性などで特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性で特定可能）、さらには線維芽細胞、平滑筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞、などの間葉系細胞、さらには神経細胞、上皮細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリーを発現する）、血管内皮細胞への分化能力を有することが好ましいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではなく、肝臓、腎臓、膵臓などの実質臓器細胞への分化能も含む。
【００１１】
本発明において、骨髄由来間葉系幹細胞あるいは骨髄間質多能性細胞あるいは骨髄多能性幹細胞とは、骨髄内に存在する細胞であって、骨髄から直接あるいはその他の組織（血液や皮膚、脂肪、その他の組織）から間接的に採取され、（プラスチックあるいはガラス製）培養皿への付着細胞として培養・増殖可能であり、骨、軟骨、脂肪などの間葉系組織（間葉系幹細胞）、あるいは骨格筋、心筋、さらには神経組織、上皮組織（多能性幹細胞）への分化能を有するという特徴を持つ細胞であり、骨髄血採血、末梢血採血、さらには脂肪など間葉組織、皮膚などの上皮組織、脳などの神経組織からの採取によって取得することができる。また骨髄由来間葉系幹細胞あるいは骨髄由来多能性幹細胞あるいは骨髄多能性幹細胞は一度培養皿へ付着させた細胞を生体の損傷部に投与することにより、例えば皮膚を構成するケラチノサイトなどの上皮系組織、脳を構成する神経系の組織への分化能も有するという特徴も持つ。
【００１２】
本発明の骨髄間葉系幹細胞あるいは骨髄間質多能性幹細胞あるいは骨髄多能性幹細胞は、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めること等で特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性等で特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性等で特定可能）の他に、例えば線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞などの間葉系細胞、神経細胞、色素細胞、表皮細胞、毛包細胞(サイトケラチンファミリー、ヘアケラチンファミリー等を発現する)、上皮系細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリー等を発現する）、内皮細胞、さらに肝臓、腎臓、膵臓等の実質臓器細胞に分化する能力を有することが好ましいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではない。
【００１３】
組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ未分化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。
【００１４】
また、本発明の骨髄細胞としては、例えば、細胞表面マーカーCD44、PDGFRαおよびPDGFRβの少なくとも１つに対して陽性である骨髄細胞が挙げられるが、このような細胞に限定されない。
【００１５】
本発明において、容器を皮下に埋め込む工程は、全身（あるいは局所）麻酔を施行後、メスにより数ミリメートルの皮膚切開を施行、先端の丸い金属棒（モスキートペアンなど）を用いて皮下脂肪組織内に鈍的剥離により必要なスペースを作成し、そのスペース内にシリコンチューブなど、細胞回収用容器を埋め込み、最後に縫合あるいはホチキス固定することによって行われる。
皮下への容器留置のためのその他の方法としては、注射用針の外筒として内筒（注射針）ごと皮下に刺入し、そののちに内筒のみ取り出して外筒を留置する、ガイド針の挿入されたバルーンカテーテルとして皮下にカテーテルを挿入し、ガイド針を取り除いた後にバルーンを薬液により拡大させて留置する、などの方法が考えられる。
【００１６】
容器を埋め込む対象としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、好ましくはヒトである。
【００１７】
本発明において、容器から細胞集団を回収する工程としては、皮下に埋め込んだ状態の容器から細胞集団を回収する工程、または、皮下から容器を取り出し、取り出された容器から細胞集団を回収する工程のどちらであってもよい。例えば、本願実施例では、皮下に埋め込んだシリコンチューブを皮膚切開により回収し、チューブ内から細胞をピペットにより吸引・回収したが、その他の方法を用いてもよい。
皮下に埋め込んだ状態の容器から細胞集団を回収する方法としては、皮下に埋め込む容器の一方の端をチューブ状に延長させて体外に取り出した状態で固定し、細胞回収時にチューブに注射器を固定させて、陰圧により細胞を吸引・回収する。その後にHMGB1溶液など、細胞誘導液を生体内に留置したチューブ内に再注入することにより、くりかえし皮下に埋め込んだ容器内の細胞を回収できる。この方法を可能にする形状の容器を生体内に留置する。
【００１８】
本発明において、回収した細胞集団から骨髄細胞を単離する工程は、例えば、回収した細胞集団から培養皿に付着する付着性細胞を単離することによって行われる。
その他の方法としては、例えば、体外に取り出したチューブ内からピペット操作により回収した細胞を、細胞表面マーカーCD44、PDGFRα、PDGFRβの少なくとも一つと反応させ、異なる蛍光種で標識された抗体と反応させた後、セルソーターを用い、それぞれの蛍光の有無を指標に特定の細胞表面マーカーを持った細胞集団を分取することによって行われる。
また、その他の方法としては、例えば、蛍光の代わりに金属粒子を固定させた抗体を用いて同様にそれぞれの細胞表面マーカーと反応させ、この金属付着抗体と結合した細胞を磁力によりチューブ内で片方の壁に吸着・固定して、抗体と非反応性の細胞は十分に溶出させたのち、磁力を取り除くことによってチューブ内に吸着した目的細胞を回収する方法（MACS）もある。
【００１９】
本発明は、皮下から体外に取り出された容器から細胞集団を回収する方法であって、該細胞集団が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物によって骨髄より該容器内に動員される、前記方法を提供する。
また、本発明は、皮下に埋め込まれた容器から回収された細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法であって、該細胞集団が以下の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または以下の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物によって骨髄より該容器内に動員される、前記方法を提供する。前記方法は、細胞集団から骨髄細胞を単離する工程の前に、体外に取り出された該容器から細胞集団を回収する工程を含んでもよい。
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｊ）S100A8タンパク質
（ｋ）S100A8タンパク質を分泌する細胞
（ｌ）S100A8タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｍ）S100A9タンパク質
（ｎ）S100A9タンパク質を分泌する細胞
（ｏ）S100A9タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｐ）ヒアルロン酸
（q）細胞又は組織の抽出液
（ｒ）細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分
【００２０】
本発明は、以下の工程を含み、工程（Ｉ）の後に、上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を血管または筋肉に投与する工程を含む、細胞集団を回収する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
工程（II）については体内にある容器から細胞集団を回収してもよいし、体外に取り出した容器から細胞集団を回収してもよい。
また、本発明は、以下の工程を含み、工程（Ｉ）の後に、上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を血管または筋肉に投与する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
（III）回収した細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程
工程（II）については体内にある容器から細胞集団を回収してもよいし、体外に取り出した容器から細胞集団を回収してもよい。
【００２１】
本発明は、以下の工程を含む、容器が上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を含有する、細胞集団を回収する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
工程（II）については体内にある容器から細胞集団を回収してもよいし、体外に取り出した容器から細胞集団を回収してもよい。
また、本発明は、以下の工程を含む、容器が上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を含有する、骨髄細胞を収集する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
（III）回収した細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程
工程（II）については体内にある容器から細胞集団を回収してもよいし、体外に取り出した容器から細胞集団を回収してもよい。
【００２２】
さらに、本発明は、以下の工程を含み、容器が上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を含有し、かつ工程（Ｉ）の後に、上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を血管または筋肉に投与する工程を含む、細胞集団を回収する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
工程（II）については体内にある容器から細胞集団を回収してもよいし、体外に取り出した容器から細胞集団を回収してもよい。
また、本発明は、以下の工程を含み、容器が上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を含有し、かつ工程（Ｉ）の後に、上記の（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の物質、または上記の（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物を血管または筋肉に投与する工程を含む、骨髄細胞を収集する方法を提供する。
（Ｉ）容器を皮下に埋め込む工程
（II）容器から細胞集団を回収する工程
（III）回収した細胞集団から、骨髄細胞を単離する工程
工程（II）については体内にある容器から細胞集団を回収してもよいし、体外に取り出した容器から細胞集団を回収してもよい。
【００２３】
本発明におけるHMGB1タンパク質としては、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB1タンパク質には、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：２、４または６に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明におけるHMGB2タンパク質としては、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB2タンパク質には、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：８、１０または１２に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明におけるHMGB3タンパク質としては、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB3タンパク質には、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：１４または１６に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
【００２４】
本発明におけるS100A8タンパク質としては、配列番号：１７、１９または２１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のS100A8タンパク質には、配列番号：１７、１９または２１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：１７、１９または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１７、１９または２１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：１８、２０または２２に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：１８、２０または２２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明におけるS100A9タンパク質としては、配列番号：２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のS100A9タンパク質には、配列番号：２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：２４、２６または２８に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
【００２５】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のホモログあるいはパラログでありうる。配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者によって公知の方法（実験医学別冊・遺伝子工学ハンドブック, pp246-251、羊土社、1991年発行）で単離することができる。
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、骨髄由来細胞の誘導活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２６】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、天然に存在するタンパク質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、１または複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加される場合がある。このように自然に存在するタンパク質であって、かつ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、本発明のHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質に含まれる。
【００２７】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質である限り、人為的に作製された変異タンパク質も本発明に含まれる。与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法としては、たとえばDNAの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている（Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982）。この方法では、変異を導入したいセグメントを亜硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入することができる。あるいはまた、目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としてはgapped duplex法等がある（Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987）。変異を導入すべき遺伝子をクローニングした環状２本鎖のベクターを１本鎖とし、目的とする部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。制限酵素により切断して線状化させたベクター由来の相補１本鎖DNAを、前記環状１本鎖ベクターにアニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間のギャップをDNAポリメラーゼで充填し、更にライゲーションすることにより完全な２本鎖環状ベクターとする。
改変されるアミノ酸の数は、典型的には50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、1アミノ酸）であると考えられる。
【００２８】
アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸置換において保存的置換が加えられたタンパク質であって、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。保存的置換は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。
【００２９】
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む）させることも考えられる。
【００３０】
この他、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８に示すような本発明によるHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズすることができるDNAを単離する。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いDNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば70%以上、望ましくは90%以上の同一性を示すことができる。
【００３１】
なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえば配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質以外のHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質のホモログをコードするDNAの単離が可能である。
【００３２】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも30％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、および SSEARCH 等の相同性検索が利用できる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis）のページ ; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html］。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うことができる（例えばNCBIのホームページのウェブサイトのBLASTのページ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402）］。
【００３３】
例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、および Lambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（identity）の値（%）を得ることができる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7）。
【００３４】
本発明によるタンパク質、またはその機能的に同等なタンパク質は、糖鎖等の生理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質であることができる。ことに後に述べる遺伝子組換え体においては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性がある。しかしたとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、本明細書中に開示されたHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質と同様の性状を示すものであれば、いずれも本発明によるHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質、または機能的に同等なタンパク質である。
【００３５】
HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質は、生体材料のみならず、これをコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体（recombinant）として得ることもできる。HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を遺伝子工学的な手法によって得るためには、先に述べたHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAを適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。本発明に応用可能なホスト／ベクター系としては、例えば、発現ベクターpGEXと大腸菌を示すことができる。pGEXは外来遺伝子をグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることができる（Gene, 67:31-40, 1988）ので、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだpGEXをヒートショックでBL21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後に isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）を添加してGST融合HMGB1、GST融合HMGB2、GST融合HMGB3、GST融合S100A8またはGST融合S100A9タンパク質の発現を誘導する。本発明によるGSTはグルタチオンセファロース4Bに吸着するため、発現生成物はアフィニティークロマトグラフィーによって容易に分離・精製することが可能である。
【００３６】
HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の recombinant を得るためのホスト／ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合には、ヒスチジンタグ、HAタグ、FLAGタグ等を利用した融合タンパク質の発現用ベクターが市販されている。酵母では、Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988）。更に、哺乳動物の細胞を利用して、CMV、RSV、あるいはSV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらのホスト／ベクター系は、いずれもHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の発現系として利用することができる。また、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできる。
【００３７】
得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
【００３８】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００３９】
また、本発明のタンパク質は、実質的に精製されたタンパク質であることが好ましい。ここで「実質的に精製された」とは、本発明のタンパク質の精製度（タンパク質成分全体における本発明のタンパク質の割合）が、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％若しくは100％に近いことを意味する。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。
【００４０】
また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製されたものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明におけるHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を放出または分泌する細胞としては、基本的に生体内のすべての組織由来細胞が該当する。採取および培養が容易な細胞としては、線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）が例示できるが、これに限定されるものではない。また、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を分泌する細胞は、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNA、あるいは、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAに分泌シグナルをコードするDNA（ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；配列番号：２９）を結合させたDNAを、公知の発現ベクターや遺伝子治療用ベクターに挿入することで作製されたベクターを、線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）などの哺乳類細胞や昆虫細胞、その他の細胞に導入することによっても作製することができる。分泌シグナルをコードするDNAとしては上述の配列を有するDNAが例示されるが、これに限定されない。また、これら細胞が由来する動物種に特に制限はないが、ベクターが投与される対象動物種の細胞、対象自身の細胞、あるいはベクターが投与される対象の血縁にあたる者に由来する細胞を使用することが好ましい。
【００４２】
本発明におけるHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAは、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードする限り、cDNAであっても、ゲノムDNAであってもよく、また、天然のDNAであっても、人工的に合成されたDNAであってもよい。HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAは、通常、ベクターに挿入された状態で、投与される。
【００４３】
本発明におけるベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエートウイルスベクター、センダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター、などが例示できるが、これらに限定されるものではない。該ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターDNA配列や、遺伝子発現を制御する因子、DNAの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。
【００４４】
なお、本発明においては、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の部分ペプチドであって骨髄由来細胞の誘導活性を有するペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または、該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを利用することもできる。
【００４５】
ヒアルロン酸はNアセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖が結合・連結したグリコサミノグリカン（ムコ多糖）で、ヒアルノナンとも呼ばれる。化学名は[→3]-2acetamiod-2deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)β-D-glucopyranosyluronic acid-(1→]nで表記される。天然のヒアルロン酸の多くは分子量数十万以上の分子量を持つ高分子ヒアルロン酸であるが、一方人工的に２糖から１４糖までの低分子ヒアルロン酸を作製することが可能である。例えば医療の分野では関節腔内に注入する用途でヒアルロン酸ナトリウムとして使用されている。製造方法としては、乳酸菌の一種であるStreptococcus zooepidemicus に生産させたヒアルロン酸を抽出し精製する方法、鶏のとさかなどから抽出し精製する方法などがある。ヒアルロン酸はエステル化、過ヨウ素酸酸化、イソウレアカップリング、硫酸化など様々な修飾を行うことが可能である。また、エーテル架橋、エステル架橋を行うことも可能である。このような修飾を行うことにより、分解に対して安定化したり、不溶性したり、スポンジ状に整形したり、物質を徐放化する性質を付加することが可能である。また、CD44はヒアルロン酸のレセプターであり、CD44を細胞表面に持つ間葉系幹細胞に対してヒアルロン酸は遊走活性を持つ。
【００４６】
本発明の方法で利用される細胞又は組織の抽出液は、細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造することができる。
溶媒に浸される細胞又は組織としては、特に制限はないが、組織由来細胞、組織由来細胞から樹立された株化細胞（例えば、HeLa、HEK293が例示できるが、これらに制限されない）、単離された細胞、単離されていない細胞（例えば単離された組織中に存在する細胞）、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAが導入された細胞などが例示できる。上記組織としては、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術）組織（脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）が例示できるが、これらに制限されるものではない。
【００４７】
上記溶媒としては生理食塩水、PBS（Phosphate-buffered saline）、TBS（Tris-buffered saline）が例示できるが、これらに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸す時間としては、細胞壊死が誘導されるために必要・十分な時間、すなわち1時間から48時間（例えば6時間から48時間）、好ましくは12から24時間であるが、この時間に限定されるものではない。よって、「細胞を溶媒に浸す工程」は「壊死が誘導されるために必要・十分な時間、細胞を溶媒に浸す工程」や「細胞を壊死させる工程」と言い換えることができる。また、細胞や組織を溶媒に浸す温度として4℃から25℃（例えば4℃から8℃）、好ましくは4℃が例示できるが、これに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸すpHとしてはpH7から8、好ましくはpH7.5が例示できるが、これに制限されない。また、緩衝液の成分として、10 mM〜50 mM、好ましくは10〜20 mMの濃度のリン酸緩衝液が挙げられるが、これに制限されない。
【００４８】
また、本発明においては、細胞や組織を溶媒に浸した後に、細胞や組織を含む溶媒から該細胞や該組織を取り除くこともできる。溶媒から細胞や組織を取り除く方法は当業者に周知な方法であれば、特に制限されない。例えば、４℃〜２５℃（例えば４℃）、また重力加速度１０Ｇ〜１０００００Ｇ（例えば４４０Ｇ）で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞や組織を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。
【００４９】
本発明で用いられる細胞又は組織を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される細胞又は組織の抽出液としては、例えば、皮膚抽出液や末梢血単核球抽出液（末梢血抽出液）が挙げられるが、これらに制限されない。
末梢血抽出液の調整方法は、注射器などを用いて採血した後、冷凍庫や液体窒素、ドライアイスなどで細胞を凍結し、その後0℃以上の温度下で再融解する。さらに、細胞の不溶成分を取り除くために、例えば、４℃〜２５℃（例えば４℃）、また重力加速度１０Ｇ〜１０００００Ｇ（例えば４４０Ｇ）で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞の不溶成分を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。細胞の不溶成分を除去するためには、遠心操作の代わりに、0.45μmの微少の孔をもつニトロセルロースフィルターなどを通過させることで、不溶成分を取り除くことができる。また、採血した末梢血を３時間から48時間４℃の状態に置くことで、細胞の壊死を誘発し、末梢血中の細胞から細胞内成分を分泌させることができる。この後重力加速度１０Ｇ〜１０００００Ｇ（例えば４４０Ｇ）で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞の不溶成分を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。細胞の不溶成分を除去するためには、遠心操作の代わりに、0.45μmの微少の孔をもつニトロセルロースフィルターなどを通過させることで、不溶成分を取り除くことができる。
【００５０】
本発明の方法で利用される細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分は、以下の工程を含む方法で製造することができる。
（ａ）細胞又は組織を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分（ヘパリン精製画分、ヘパリンカラム精製画分とも表現しうる）を溶出する工程
固定化ヘパリンとは、ヘパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。上記不溶性担体としては、Sepharose beads(Sepharose 4B,Sepharose 6B等:GE Healthcare)が例示されるが、これに制限されるものではない。本発明においては、市販の固定化ヘパリン(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)を用いてもよい。
細胞や組織の抽出液と固定化ヘパリンの接触条件としては、pH7〜8程度（好ましくはpH7.5）、塩濃度は0〜200mM、好ましくは100〜200mM程度が例示されるが、これらに制限されない。抽出液と固定化ヘパリンとが接触している時間は特に限定されないが、ヘパリン結合画分を固定化ヘパリンに十分吸着させるという観点では5分以上保持されることが好ましい。また、温度としては、4〜8℃、好ましくは4℃が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、固定化ヘパリンに吸着したヘパリン結合画分の溶出条件としては、pH7〜8程度、塩濃度200〜1000mM（好ましくは1000mM程度）が例示されるが、これらに制限されるものではない。
【００５１】
また、本発明の方法で利用される、上記（ａ）から（ｒ）に記載の物質のいずれか2つ以上の物質の混合物としては、例えばヒアルロン酸とHMGB1タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB２タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB３タンパク質、ヒアルロン酸とS100A8タンパク質、ヒアルロン酸とS100A9タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB1タンパク質とHMGB２タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB２タンパク質とHMGB３タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB1タンパク質とHMGB3タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB1タンパク質とHMGB２タンパク質とHMGB３タンパク質、ヒアルロン酸とS100A8タンパク質とS100A9タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB1タンパク質とS100A8タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB２タンパク質とS100A8タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB３タンパク質とS100A8タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB1タンパク質とS100A9タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB２タンパク質とS100A9タンパク質、ヒアルロン酸とHMGB３タンパク質とS100A9タンパク質、細胞又は組織の抽出液とヒアルロン酸、細胞又は組織の抽出液のヘパリン結合画分とヒアルロン酸などの組み合わせが挙げられ、好ましくは、細胞や組織の抽出液とヒアルロン酸の混合液であるが、これに限定されない。混合の割合は、溶媒に溶解した状態で、体積比として最も少ない成分を1とした場合、その10000倍まで他の成分を混合することができるが、好ましくは、もっとも少ない成分を１とした場合他の成分は、１から１０倍量加えることができる。
【００５２】
本発明における抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の起源となる動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、上記抽出液等が投与される動物種と同じ動物種であることが好ましい。
【００５３】
本発明の抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を投与する場合、その投与方法は、血管内または筋肉への非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与が挙げられる。例えば、血管内注射（動脈内注射、静脈内注射等）、筋肉内注射、皮下注射などによって本発明の薬剤を血管、筋肉、または皮下（例えば皮下に埋め込んだ容器の中や、容器の近傍）に投与できる。また、経皮吸収可能な貼付剤や外用剤によって除放的に吸収させることも可能である。
【００５４】
また、投与対象の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重1 kgあたり0.0000001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、対象あたり0.00001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を分泌する細胞やHMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質をコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本発明の本発明における抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００５５】
投与に際しては、抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含んでもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００５６】
また、本発明の抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質を容器に含有する場合、抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質の容器への注入は次のように行われる。具体的には、生理食塩水にそれぞれの溶媒を溶解し、注射器やピペットを用いて用手的に注入する。あるいはチューブ製造時に機械的に注入する。
【００５７】
また、容器に含有される、本発明の抽出液、ヘパリン結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8またはS100A9タンパク質について、容器への注入量については、細胞回収用容器の容積に応じて適宜決定する。たとえば腹部皮下脂肪内に留置する際には10ml程度の注入が可能であり、その他の皮下に留置する際には〜数mlが予想される。
【００５８】
本発明は、上記細胞集団を回収する方法によって回収される細胞集団を提供する。
また、本発明は、上記骨髄細胞を収集する方法によって回収される骨髄細胞を提供する。
本発明の細胞集団または骨髄細胞は、遺伝性疾患、皮膚疾患（熱傷、皮膚潰瘍等）、脳神経疾患（脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷、脳損傷等）、循環器疾患（心筋梗塞、心筋症、動脈塞栓症等）、骨軟骨疾患（骨折、リウマチ等）、などの組織損傷を伴う疾患に対して投与することで治療することができる。採取後直接静脈内、動脈内などの循環血流内に投与すること、もしくは損傷組織部位に直接投与することにより組織を再生することができる。もしくは培養皿、培養フラスコを用いて培養操作を加えた後に、細胞を拡散した状態、シート状に整形した状態、細胞塊を形成した状態で投与することにより組織を再生することができる。投与量は、細胞1個から1014個投与することができるが、好ましくは102個から1010個を投与することができる。したがって、本発明はまた、上記細胞集団を回収する方法によって回収される細胞集団または上記骨髄細胞を収集する方法によって回収される骨髄細胞を含有する、組織再生剤を提供する。
【００５９】
再生される組織としては、特に制限はなく、損傷している組織である限り、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術）組織（脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）が例示できる。特に、本発明の薬剤は、体外から直接薬剤を投与することが困難な組織（脳、心臓など）を再生するために、有効に利用される。本発明において、損傷組織としては、虚血、疎血・低酸素状態をきたす種々の病態、外傷、熱傷、炎症、自己免疫、遺伝子異常などによって損傷した組織が挙げられるが、これら原因に限定されるものではない。また、損傷組織には、壊死組織も含まれる。
【００６０】
本発明における組織としては、骨髄由来細胞が分化可能な組織である限り、特に制限はないが、例えば皮膚組織、骨組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、消化管組織、肝・胆・膵組織、泌尿・生殖器など、生体内のすべての組織が例示できる。また、上記組織再生剤を用いることで、難治性皮膚潰瘍、皮膚創傷、水疱症、脱毛症などの皮膚疾患はもとより、脳梗塞、心筋梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎、などの組織損傷に対する治療が可能となる。上記組織再生剤が投与される動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の薬剤は、糖尿病患者に対して投与することができる。糖尿病における皮膚の合併症である難治性皮膚潰瘍は、正常人の皮膚潰瘍に比べて治癒が困難であることが知られているが、本発明の薬剤はこのような糖尿病患者にも有効に利用される。
【００６１】
本発明の組織再生剤は、採取後、生理的食塩水をもちいて細胞を拡散して静脈内、動脈内などの循環血流内に投与することにより組織を再生することができる。もしくは損傷組織部位の表面に塗る、貼るなどして投与することにより組織を再生することができる。さらに損傷部位の内部に注射器などを用いて、注入することにより組織を再生することもできる。また、培養皿、培養フラスコを用いて培養操作を加えた後に、細胞を拡散した状態、シート状に整形した状態、細胞塊を形成した状態で損傷部位に投与することにより組織を再生することができる。投与量は、細胞1個から1014個投与することができるが、好ましくは102個から1010個を投与することができる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕
目的：生体内組織に極めて少数存在する幹細胞などの機能的細胞を、低浸襲かつ高効率に回収するための新規技術開発
方法：上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
１）8週齢マウス（オス）に放射線（10Gy）照射した後、green fluorescent protein (GFP)トランスジェニックマウス由来骨髄細胞（5x106個/0.1ml生理的リン酸緩衝溶液pH7.4 ）を尾静脈から移植してGFP骨髄移植マウスを作成した。【００６３】
２）生体内低刺激性材料（シリコン）で作られたチューブにHMGB1、ヒアルロン酸、皮膚抽出液、生理的リン酸緩衝溶液（pH7.4）をそれぞれ充填し、これをGFP骨髄移植マウス背部皮下に移植した（図１）。【００６４】
３）2週間後に移植チューブを取り出し（図２）、チューブ内に集積した細胞（tube-entrapping cells; TECs）を回収した後、10%牛胎仔血清含有ダルベッコ培地（D-MEM）にて37℃、炭酸ガス濃度5%の条件下で培養した。【００６５】
４）TECsの培養密度が培養皿底面積の約80％となった段階で、培地を骨分化誘導培地、脂肪分化誘導培地、表皮分化誘導培地のそれぞれに交換し、さらに培養を継続した。それぞれの分化誘導培地で培養開始2週間後に、骨分化はアリザリンレッド染色、脂肪分化はオイルレッド染色、表皮分化はケラチン５に対する免疫染色により評価した。【００６６】
５）TECsにおけるplatelet-derived growth factorα(PDGFRα陽性、CD44陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーにより解析した。【００６７】
結果：HMGB1、ヒアルロン酸、皮膚抽出液を充填したシリコンチューブをGFP骨髄移植マウス皮下に移植した結果、いずれの溶液を充填した場合にも、１週間でGFP陽性の骨髄由来細胞（TECs）が多数チューブ内に集積した。図２にHMGB1充填シリコンチューブ内に集積したGFP陽性細胞像を示す。一方リン酸緩衝液を充填したシリコンチューブでは、回収された付着性TECsの数は有意に少なかった。HMGB1充填シリコンチューブから回収した細胞を培養した結果、培養開始後24時間で培養皿に付着して増殖する付着性TECsが観察された（図３）。これらHMGB1充填シリコンチューブ内に遊走した付着性TECsを骨分化、脂肪分化、および表皮分化誘導培地で培養した結果、それぞれアリザリンレッド陽性骨芽細胞、オイルレッド陽性脂肪細胞、ケラチン5陽性表皮細胞への分化能を示し、付着性TECsに間葉系および上皮系の分化能を持つ細胞集団が存在することが明らかとなった（図４〜６）。また、フローサイトメトリーにて、間葉系幹細胞表面で発現していることが知られているPDGFRαおよびCD44のTECsにおける発現を検討した結果、TECsの約60％がPDGFRαおよびCD44陽性であることが示された（図７）。【００６８】
また、ヒアルロン酸を100ng/ml (PBS)で充填したシリコンチューブをGFP骨髄移植マウス背部皮下に移植し、2週間後に取り出してチューブ内に動員された細胞の表面マーカーをFACSにて解析した結果、HMGB1チューブから得られたTECsと同様に、約60％がCD44陽性、PDGFRα陽性のP44細胞で、骨芽細胞や脂肪細胞などの間葉系細胞や上皮系細胞への分化能を示した。【００６９】
考察：今回本発明者らは、HMGB1、ヒアルロン酸、皮膚抽出液をそれぞれ充填したシリコンチューブを皮下に移植することにより、極めて効率よく骨分化能、脂肪分化能、表皮分化能を持つ骨髄由来TECsを回収できることを見出した。これら骨髄由来TECsの多くが間葉系幹細胞表面で発現することが知られているPDGFRαおよびCD44を発現していること、HMGB1、ヒアルロン酸、皮膚抽出液がいずれも間葉系幹細胞動員活性を持つことと併せ考えると、TECsに骨髄由来間葉系幹細胞が選択的に動員されていると思われる。シリコンチューブに充填する溶液を選択することにより、その溶液内に含まれる特定機能細胞動員活性物質に応じて選択的かつ高効率に、特定の生体内機能細胞を回収することが可能になる。この新しい発明技術を用いることにより、骨髄に針を刺入するなどの高浸襲性の方法を回避して、必要に応じた生体内機能細胞を回収し、目的に応じたオーダーメード再生医療をデザインすることが可能になると期待される。また、回収した細胞は、幹細胞研究をはじめとする多くの基礎研究の材料として提供可能であり、基礎的、臨床的研究の進展、創薬、医療技術の進歩に大きく寄与すると確信する。【００７０】
〔実施例２〕
目的：皮下デバイスに動員した骨髄由来細胞の皮膚潰瘍治療効果の評価
方法：
１）体内埋め込み型デバイスを作製した。【００７１】
２）骨髄多能性幹細胞動員因子を含有する皮膚組織抽出液を調製するために、C57/BL6新生マウス(2日齢)2匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）2ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。また、末梢血単核球抽出液を調製するために、4週齢C57/BL6 マウス２匹から末梢血全血を採取した後PBSを用いて全量を4mLに希釈した。遠心管にFicoll-Paque Plus(GE)液を3mL 挿入後、その上に希釈血液を重層した。100G （18℃）で10分間遠心し、単核球を含む中間層を新しい遠心管に回収した。回収した中間層からFicoll-Paque Plus 液をのぞくため、45 mL のPBSを加え440G(18℃)5分で遠心し上清を除去し、さらにもう一度45 mL のPBSを加え440G(18℃)5分で遠心し上清を除去した。沈殿した細胞に200μLのPBSを加え懸濁した。細胞懸濁液は-80℃の冷凍庫内において30分間凍結し、冷凍庫から氷上で融解した。この凍結融解の操作を3回繰り返した。さらに440G(4℃)15分で遠心して上清を回収した（末梢血抽出液）。【００７２】
３）C57/BL6雄マウス（6〜8週齢）に致死量放射線（10Gy）を照射し、その直後に尾静脈からGFP（green fluorescent protein）トランスジェニックマウス由来骨髄細胞（5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4）を移植した。移植後8週間後まで生存しているマウスのみ以後の実験に使用した。【００７３】
４）デバイスに、２）で作製した皮膚抽出液、末梢血抽出液、陰性コントロールのためのPBS40μLを挿入した。このデバイスを３）で作製したマウスの左右の背部皮下の筋膜側にデバイスの穴が接するように左右一個ずつ（計2個/匹）挿入した。２週間後、デバイスをマウスから取り出した。【００７４】
５）C.B-17/lcr-scid/scidJcl8週齢（日本チャールズリバー）の背部の毛を除去後、背部左右に直径6mmの円形の皮膚潰瘍を作製した。マウスの皮膚が収縮することを防ぐため、シリコン製の外径10mm内径6mm厚さ1mmの円盤を両面粘着テープおよび医療用接着剤アロンアルファA（三共）を用いて潰瘍部に接着した。３）で取り出した左右のデバイスの片側のデバイス内部から細胞を採取し、皮膚潰瘍に投与した。潰瘍部分の乾燥と細菌感染を防ぐため直径10mm厚さ1mmのシリコン製の円盤で潰瘍部を覆った。潰瘍部を保護するため、テガダーム（3M）で被覆した。7日後に潰瘍の面積を測定した。（図２７）【００７５】
その結果、陰性コントロールの潰瘍面が7日経過しても閉鎖しなかったのに対し、血液抽出液で採取した細胞を投与した潰瘍では5日目に潰瘍面積の減少が観察された。また、皮膚抽出液で採取した細胞を投与した潰瘍では7日目に潰瘍面積の閉鎖が観察された（図２７）。【００７６】
本実施例によって、組織抽出液を含む体内埋め込み型デバイス内に動員された、骨髄由来の細胞を皮膚潰瘍部分に投与することによる、潰瘍治療効果が確認された。骨髄細胞を骨髄から採取するのではなく、体内デバイスに動員しその細胞を利用して治療に応用する例はこれまでにない新規の治療法である。【００７７】
〔実施例３〕
１）上記実施例２に記載の方法で、皮膚抽出液および末梢血抽出液を作製した。
HiTrap Heparin HP 1mL カラム（GE）を10mM リン酸バッファーpH.7.5 10mLで平衡化した。皮膚抽出液、末梢血抽出液をそれぞれ10倍容の10mM リン酸バッファーpH 7.5で希釈し、平衡化したカラムに結合させた。10mM リン酸バッファーpH7.5を10mL用いてカラム内を洗浄し、非特異的吸着した成分を洗い流した。吸着した成分は1000mM NaCl 含有10mM リン酸バッファーpH7.5を用いて溶出し、120μLずつプラスチックチューブに分注した。Protein assay kit（Bio-Rad）を用いてタンパク量を定量し最も濃度の高い３フラクションを回収した（組織抽出液ヘパリン吸着）。【００７８】
２）0.1%ヒアルロン酸含有PBSを作製し、このヒアルロン酸溶液10μLと組織抽出液40μLを混合して実施例２のデバイス内に挿入した。陰性コントロールは1000mM NaCl 含有10mM リン酸バッファーpH7.5とヒアルロン酸との混合液を使用した。【００７９】
３）実施例２と同様にGFP骨髄移植マウスを作製し、同マウスの背部皮下に２）で作製したデバイスを挿入した。挿入10日後、皮下からデバイスを取り出し、細胞を回収した。回収した細胞は、10%Fetal bovine serum 含有IMDM(Invitrogen)中で培養皿を用いて、37℃、5％CO2環境下で培養した。培養開始1日後に培地を交換し非付着性細胞を除去した。その後は3日おきに培地を交換した。細胞回収1週間後に蛍光顕微鏡を用いて観察し、骨髄由来細胞（GFP陽性細胞）を検出した（図２８）。また。GFP陽性細胞数を画像処理ソフト（Image J）を用いて計測した（図２９）。【００８０】
ヒアルロン酸と組織抽出液のヘパリン結合画分混合液（血液抽出液（図２８C）、皮膚抽出液(図２８D)）では、ヒアルロン酸単独（図２８B）やPBS（図２８A）に比べ、デバイス内への骨髄由来付着系細胞に対して強い動員活性があることが観察された（図２８、２９）。【００８１】
本実施例により、組織抽出液の骨髄細胞動員因子がヘパリンカラムで精製できることが確認された。皮膚抽出液中には、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9が含有されており、これらの成分はヘパリンカラムに結合することから、骨髄細胞の動員はこれらの細胞が関与している可能性が示唆される。また、ヘパリンカラムには多くの成長因子などのサイトカインも結合するため、これらの複数の因子による総合的な効果によるものとも考えられる。【００８２】
〔実施例４〕
１）新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し、更にSuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen） を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてS100A8のcDNAをPCR （ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅し、精製のためにアミノ酸配列のN末端にFlag tagおよび6XHis tagの配列を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した。ヒト胎児腎細胞由来HEK293培養細胞株にポリエチレンイミン（PEI）を用いてpCAGGS-Flag-His-S100A8をトランスフェクションし、48時間後細胞及び培養上清を回収した。細胞及び培養上清は4℃で4400G・5分間遠心し上清と細胞を分離しそれぞれ回収した。回収した上清はさらに直径0．8μm孔をもつセルロースアセテートフィルター(Nalgene)を通過させた後、0.45μmの孔を持つニトロセルロースフィルター(Corning)を通過させ不溶画分を除去したサンプルを調製した。本サンプルを、50mMNaCl含50mM Tris HCl pH8.0 (50mL)で平衡化した5 mL HisTrap FF(GE)に挿入し、吸着成分をさらに、10mM イミダゾール含有50mMNaCl  50mM Tris HCl pH8.0で洗浄して非特異的吸着成分を除去した。特異的吸着成分をカラムから100mM イミダゾール含有50mM NaCl  50mM Tris HCl pH8.0溶出した。吸着画分はそれぞれ、500μLずつシリコンコートしたプラスチックチューブに分画し、タンパク質含有フラクションをまとめて抗Flag 抗体M2ビーズ（Sigma）と混合し、4℃、12時間緩やかに混合しながら反応させた。反応後、ビーズを440G 5分間遠心し、上清を除去後、PBSでビーズを懸濁し、さらに同様に遠心して上清を除去した。ビーズを容量3mL内径1cm のカラムに挿入し、100mM Glycine-pH3.5 でビーズから吸着タンパク質を溶出させ、10分の1量の500 mM Tris HCl pH 7.5 を用いて中和した。精製したタンパク質量はProtein assay kit (Bio-Rad)を用いて定量した。【００８３】
２）新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し更にSuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen） を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてHMGB1のcDNAをPCR （ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅し、精製のためにアミノ酸配列のN末端にFlag tagおよび6XHis tagの配列を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した。ヒト胎児腎細胞由来HEK293培養細胞株にポリエチレンイミン（PEI）を用いてpCAGGS-GST-His-HMGB1をトランスフェクションし、48時間後細胞及び培養上清を回収した。細胞及び培養上清は4℃で4400g・5分間遠心し上清と細胞を分離しそれぞれ回収した。回収した上清はさらに直径0．8μm孔をもつセルロースアセテートフィルターを通過させた後、0.45μmの孔を持つニトロセルロースフィルターを通過させ不溶画分を除去したサンプルを調整した。本サンプルを、50mM NaCl含50mM Tris HCl pH8.0 (50mL)で平衡化した5 mL HisTrap FF(GE)に挿入し、吸着成分をさらに、10mM イミダゾール含有50mM NaCl  50mM Tris HCl pH8.0で洗浄して非特異的吸着成分を除去した。特異的吸着成分をカラムから100mM イミダゾール含有50mMNaCl  50mM Tris HCl pH8.0溶出した。吸着画分はそれぞれ、500μLずつシリコンコートしたプラスチックチューブに分画し、タンパク質含有フラクションをまとめた後、脱塩カラムPD10（GE）を用いてイミダゾールを除去し、50mM Tris HCl pH. 7.5, 150mM NaCl を用いて溶出した。溶出したサンプルにHRV3C(Novagen)を添加し、4℃、3時間反応させた。切断後サンプルを50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClで平衡化したHiTrap Heparin 1 mL カラム(GE)に結合させ、50mM Tris HCl pH.7.5,150 mM NaClでカラム内部を洗浄後、50mM Tris HCl pH.7.5,1000 mM NaClで結合タンパク質を溶出した。溶出したサンプルはシリコンコートしたプラスチックチューブに500μLずつ分注した。【００８４】
３）S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3をそれぞれ40μgずつシリコン製デバイスに挿入し、GFP骨髄移植マウスの左右背部皮下に孔が筋膜と接するように挿入した。挿入10日後、皮下からデバイスを取り出しデバイス内に集積した細胞を回収した。細胞は、10%Fetal bovine serum 含有IMDM(Invitrogen)中で培養皿を用いて、37℃、5％CO2環境下で培養した。培養開始1日後に培地を交換し非付着性細胞を除去した。その後は3日おきに培地を交換した。細胞回収1週間後に蛍光顕微鏡を用いて観察し、骨髄由来細胞（GFP陽性細胞）を検出した（図３０）。【００８５】
４）BALB/cAJcl-nu/nu  8週齢（日本クレア）の背部左右に直径6mmの円形の皮膚潰瘍を作製した。マウスの皮膚が収縮することを防ぐため、シリコン製の外径10mm内径6mm厚さ1mmの円盤を両面粘着テープおよび医療用接着剤アロンアルファA（三共）を用いて潰瘍部に接着した。【００８６】
５）３）の細胞を0.5g/l-Trypsin/0.53mmol/l-EDTA 液（ナカライ）を用いて処理し、培養皿から遊離させ、10% FBS 含IMDMでトリプシンを不活化後、440G、4℃、5分間遠心し上清を除去後、４）で作製した潰瘍に投与した。局所の乾燥と細菌感染を防ぐため直径10mm厚さ1mmのシリコン製の円盤で潰瘍部を覆った。さらに潰瘍部を保護するため、テガダーム（3M）で被覆した。7日後に潰瘍の大きさを測定した（図３１）。【００８７】
陰性コントロール（E）に比較し、S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3のいずれにおいても骨髄細胞の動員活性が認められた（図３０-A;S100A8、B;HMGB1、C;HMGB2、D;HMGB3）。特に、HMGB1、HMGB2に強い動員活性が観察された。
また、HMGB1、HMGB2、S100A8によって動員された骨髄由来細胞を投与することで、皮膚潰瘍を治療した結果陰性コントロール（PBS投与）に比較し潰瘍の縮小効果が観察された（図３１）。【００８８】
本実施例においては、S100A8、HMGB1、HMGB2、HMGB3いずれにおいてもデバイス内への骨髄由来付着性細胞の動員活性が認められた。骨髄内の主な細胞は赤血球、血球などの血球系細胞であるが、これらの細胞のほとんどは非付着性の細胞である。付着性の細胞としては間葉系幹細胞などの間葉系細胞が知られており、また上皮系や神経系に分化可能な多能性の細胞が含まれていると考えられている。本実施例によってS100A8、HMGB1、HMGB2によってデバイス内に動員した細胞によって皮膚潰瘍の治療効果が認められたことから、デバイス内に動員された細胞は、組織損傷を治療誘導可能な骨髄由来細胞である。骨髄間葉系幹細胞を皮膚潰瘍部位に投与することで治療効果を示すという報告もあり（Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Wu Y, Chen L, Scott PG, Tredget EE.Stem Cells. 2007 Oct;25(10):2648-59. Epub 2007 Jul 5.）、本実施例における治療効果には骨髄間葉系幹細胞の関与が示唆される。また、骨髄間葉系幹細胞などの骨髄由来細胞は、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、上皮系細胞に分化することが知られている。本デバイスで採取した細胞によって、損傷組織においてこれらの細胞を供給し治療する新しい再生誘導医療に応用することが可能である。【００８９】
〔参考例１〕
目的：皮膚抽出液中HMGB1ファミリーの同定と骨髄間葉系幹細胞誘導活性の検討
方法：新生マウス皮膚抽出液中に含まれるHMGB蛋白ファミリーの有無をWestern blot 法を用いて確認した。サンプルとして、新生マウス400匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）400ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して得られた皮膚抽出液を10μl をSDS-PAGE法を用いて電気泳動し、ゲル中で分離した蛋白をブロッティング装置（ATTO）を用いPVDF膜にトランスファーした。3％スキムミルク0.1% Tween 20 含PBS（S-T-PBS）にて、室温で1時間インキュベートした後、S-T-PBSで1000倍に希釈したラビット抗マウスHMGB1 抗体、ラビット抗マウスHMGB2抗体、ラビット抗マウスHMGB3抗体をそれぞれ4℃で16時間反応させた。反応後、同PVDF膜をS-T-PBSにて5分間5回洗浄後、S-T-PBSで2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラビットIgG抗体（GE Healthcare）にて同PVDF膜を25℃で1時間インキュベートした。さらにS-T-PBSにて5分間5回洗浄後ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare)を同PVDF膜と反応させ、ECL film を感光させた後現像してHMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質の存在を検出した。【００９０】
新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し更にSuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen） を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてHMGB1、HMGB2、及びHMGB3 のcDNAをPCR （ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅し、アミノ酸配列のN末端にFlag tagの配列（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；配列番号：３０）を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した。これらのプラスミドベクターをHEK293 （ヒト胎児腎細胞由来培養細胞株）に遺伝子導入し48時間培養しタンパク質を発現させた。HMGB1、HMGB2、及びHMGB3タンパク質をそれぞれ発現させた細胞及び培養上清は4℃で16時間インキュベートした後、4400g・5分間遠心し上清を回収した。この上清50mL あたり100μLのAnti Flag 抗体Gel（Sigma） を混合し4℃で16時間インキュベートした。 遠心しGelを回収した後PBSを用いて、5回洗浄した。更に 3X Flag peptide （final 100μg/ml） を用いて溶出した。リコンビナントタンパク質の発現をS-T-PBS で1000倍希釈したマウス抗Flag 抗体、及びS-T-PBS で2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（GE Healthcare） を用いたWestern blot 法にて確認した。これらの精製リコンビナントタンパク質のマウス骨髄間葉系幹細胞の遊走活性をボイデン・チャンバーを用いて評価した。また、HMGBファミリーのin vivoでの薬効を観察するために、8週齢C57BL/6マウスの背部皮膚を直径8μmの円形に切除し皮膚潰瘍モデルを作製し、そこに精製したHMGB1・HMGB2・HMGB3それぞれ（100ng/μL）を、1g/100mL PBSの濃度のヒアルロン酸溶液と等量ずつ混合しそのうち100 μLを潰瘍面に投与した。潰瘍面は乾燥しないように、粘着性透明創傷被覆・保護材Tegaderm (スリーエムヘルスケア)で覆い、経時的に創傷面積を計測し治癒効果を測定した。【００９１】
さらにヒト骨髄間葉系幹細胞をヒト皮膚抽出液およびヒト精製HMGB1が遊走する活性があるかを調べるために、ボイデン・チャンバーを用いて評価した。面積１cm2のヒト皮膚を１mlのPBSに浸し、4℃の条件下で16時間インキュベーションした後、4℃の条件下で10分間44０Gで遠心した。上清のみを回収し、ヒト皮膚抽出液として使用した。また、ボイデン・チャンバーの上部に入れる細胞はヒト骨髄間葉系幹細胞（Cambrex社）を用いた。（本細胞はフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析の結果、CD105陽性、CD166陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD34陰性、CD45陰性とされている。さらに分化誘導試験によって脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞への分化が陽性である。）また、チャンバー下部には、ヒトHMGB1を100ng /well (R &D社)及びPBSにて10倍希釈したヒト皮膚抽出液を入れ、コントロールとしてPBSを用いた。【００９２】
結果：Western blotの結果、HMGB1のバンドの他にHMGB2やHMGB3のバンドが検出された。よって新生マウス皮膚抽出液の中には、HMGB1の他にファミリータンパク質であるHMGB2およびHMGB3が含有されていることが確認された（図８）。それぞれのタンパク質のＮ末端にFlag tagを付加したHMGB1・HMGB2・HMGB3の発現ベクターを作製した（図９）。HEK293細胞に発現ベクターを遺伝子導入し、発現したタンパク質をFlag tag を用いて精製した後、Western blot 法を用いてタンパク質を確認した（図１０）。これらの精製タンパク質を用いたマウス骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を測定したところ、いずれのタンパク質においても活性が確認された（図１１）。マウスの背部に作製した潰瘍面積を７日毎に計測したところ、非治療群に比べHMGB1,2および3による治療群の方が有意に潰瘍面積の縮小効果を確認できた（図１２）。マウスの場合と同様に、ヒトHMGB1及びヒト皮膚抽出液はヒト骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性があることが明らかとなった（図１３）。【００９３】
考察：HMGB1と相同性が高いタンパク質としてHMGB2及びHMGB3が知られている。これらのタンパク質もHMGB1と同様の性質を有することが期待される。そこで、遊離皮膚片抽出液からHMGB1のファミリーであるHMGB2およびHMGB3も産生されることを確認した。さらに HMGB１・HMGB2・HMGB3のリコンビナントタンパク質を作製し、in vitroでの骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認し、in vivoにおける皮膚潰瘍治療効果も確認した。新生マウス遊離皮膚片中のHMGBファミリー（HMGB1・HMGB2・HMGB3）およびリコンビナントHMGBファミリーには骨髄間葉系幹細胞誘導活性や骨髄由来の上皮系に分化可能な幹細胞を局所に誘導する活性があり、さらにこれらの誘導された骨髄由来の細胞群が損傷組織において表皮ケラチノサイトや毛包や線維芽細胞のようなさまざまな細胞に分化して損傷組織の治癒を促進する効果があることが明らかになった。また骨髄間葉系幹細胞は多能性幹細胞であるので、他の組織損傷状態、例えば、脳損傷、心筋梗塞、骨折などの組織損傷の治療にHMGBファミリーを全身投与もしくは局所投与することで同様に治療効果が期待できると確信する。【００９４】
また、ヒトとマウスのHMGB1はそれぞれを構成するアミノ酸配列で98%（213/215）の相同性があり、HMGB2はそれぞれを構成するアミノ酸配列で96%(202/210)の相同性があり、HMGB3はそれぞれを構成するアミノ酸配列で97%(195/200)の相同性があることがわかっている。そこで、ヒトのHMGBがマウスのHMGBと同様の活性を有することが考えられるが、本結果から、ヒトの皮膚抽出液やHMGB1がマウスの皮膚抽出液や、HMGB1と同様に骨髄間葉系幹細胞を誘導する活性があることが明らかになった。【００９５】
〔参考例２〕
目的：骨髄間葉系幹細胞誘導因子組織抽出液の作製方法の確立
方法：6週齢C57BL6一匹分の脳、心臓、腸、腎臓、肝臓及び新生マウス皮膚一匹分を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）1ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して組織抽出液とした。得られた抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。また、同じサンプル中に含まれるHMGB1の濃度をHMGB1 ELISA kit(シノテスト)を用いて計測した。更に脳、心臓および皮膚の組織抽出液をヘパリンアフィニティーカラムに結合させ、結合画分のタンパク質の骨髄間葉系幹細胞誘導活性をボイデン・チャンバーを用いて確認した。【００９６】
結果：マウス脳抽出液には新生マウス皮膚抽出液と同等のHMGB1が含有されていた。さらに、骨髄間葉系幹細胞の誘導活性はマウス脳でも皮膚と同様に認められた。マウス腸抽出液とマウス心臓抽出液中にHMGB1はほとんど含まれなかったが、骨髄間葉系幹細胞の誘導活性は認められた。また、マウス脳、マウス心臓のヘパリンカラム結合画分はマウス皮膚のヘパリンカラム結合画分と同様に骨髄間葉系幹細胞を誘導する活性があった（図１４）。表１は、マウス各組織抽出液のHMGB1濃度と骨髄間葉系幹細胞の誘導活性を測定した結果を示す。【００９７】
【表１】
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【００９８】
考察：皮膚のみならず脳でも臓器を生理的緩衝液に浸すだけという簡便な方法でHMGB1を簡便に抽出する方法を開発した。この方法は、他の臓器例えば、肝臓や腎臓でも同様である。また心臓や腸からの抽出液にはHMGB1をほとんど含有しないにもかかわらず骨髄間葉系幹細胞誘導活性を認めた。このことは抽出液中にHMGB1と異なる、他の骨髄間葉系幹細胞誘導物質が含まれていることが考えられる。これらの抽出液に含まれる物質は、もともとそれぞれの組織に存在するものであり、生理的には組織損傷時に骨髄間葉系幹細胞を損傷組織に誘導していると考えられる。本発明によってHMGB1を含む複数の骨髄間葉系幹細胞誘導物質を各種臓器から機能的にかつ簡便に抽出する新規の方法を開発できた。さらに、組織抽出液から骨髄間葉系幹細胞誘導物質を精製するためにヘパリンカラムに結合させる方法を開発した。また、これらの骨髄間葉系幹細胞誘導活性を有する成分は皮膚と同様の方法で脳や心臓からもヘパリンカラムを用いて精製することが可能である。【００９９】
〔参考例３〕
目的：培養細胞から間葉系幹細胞遊走活性物質を抽出する方法を確立する。
方法：ヒト胎児腎由来培養細胞株HEK293及びヒト子宮頸癌細胞株HeLaはそれぞれ1０％胎仔牛血清含D-MEM(nacalai 社製）で培養した。それぞれの細胞をPBSで洗浄後、細胞１０7個を４℃の5mlのPBS(nacalai社製)に16時間浸した。重力加速度４４０Ｇで４℃で５分間遠心し上清を回収した。ボイデン・チャンバーの上層にヒト骨髄間葉系幹細胞をいれ、下層にDMEMで5倍希釈した細胞抽出液をいれ、ヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認した。
結果：HEK293抽出液もHeLa抽出液も同様に骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性を示した（図１５）。
考察：培養細胞をPBSに浸すという簡便な方法で骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を抽出することに成功した。【０１００】
〔参考例４〕
目的：マウス脳欠損モデルを作成し、局所損傷部位に皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を徐放化して投与することで、自己の骨髄系に含まれる幹細胞を局所損傷部位に遊走させ、神経系細胞の再生を誘導できないか検討する。
方法：
(1) 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の作製
切除した新生マウス皮膚からPBS（一匹/ｍｌ）中に４℃で16時間インキュベーションし抽出した皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5（30ml）をHiTrap Hepalin HP column（カラム容量： 5ml、GE Healthcare）の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液をカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl（30ml）でカラムを洗浄した。吸着したタンパク質を溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、マウス骨髄由来細胞株の遊走活性をボイデン・チャンバー法を用いて評価し遊走能を有する画分を集めた。この活性を有する溶液を皮膚抽出液ヘパリン精製画分として以下の参考例に使用した。【０１０１】
（2）骨髄抑制マウスの作成
マウスに10GyのX線単回照射を行い、骨髄抑制マウスを作成した。【０１０２】
（3）骨髄抑制マウスへのGFPマウス骨髄移植
GFPマウスの両側大腿骨および下腿骨より骨髄細胞を採取した。これを照射後24時間経過した骨髄抑制マウスの尾静脈より投与した。なお、投与はイソフルランによる吸入麻酔下に施行した。【０１０３】
（4）マウス脳損傷（脳組織欠損）モデルの作成
GFPマウスの骨髄細胞を移植した骨髄抑制マウスにイソフルランにて吸入麻酔を行い、ペントバルビタール（45mg/kg）を腹腔内に注入した。マウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開を加えた。ブレグマから右外側2.5mm、前方1mmにドリルを用いて穿頭を施した(図１６Ａ)。この部位から深さ3mmの位置を先端にして、20Gサーフロー針の外筒を挿入して固定した。ここでシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳組織を一部吸引した（図１６Ｂ）。【０１０４】
（5）皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の脳組織欠損部への投与
前述の位置に、ハミルトンシリンジと26Gシリンジを用いて、フィブリン糊製剤（フィブリノゲン）（ボルヒール（化血研））に溶解した皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を5μl注入し、次にフィブリン糊製剤（トロンビン）（ボルヒール（化血研））を5μl注入した(図１６Ｃ)。この操作によって、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の徐放剤としての効果を狙った。【０１０５】
（6）脳組織欠損部における神経系細胞再生効果の評価
コントロール群と治療群のマウスとを用いて評価した。適切な経過設定を決め（経時的に）、マウスを4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、脳の切り出しを行った。さらに、4%パラホルムアルデヒドを外固定した。15%と30%の勾配をつけたショ糖にて脱水後、凍結切片を作成した。
DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)solusionにて核染色を行い、退光防止剤を用いて封入した。共焦点レーザー顕微鏡にて損傷部位（脳組織欠損部）でのGFP陽性細胞の集積を評価した。
結果：投与後、2週間および6週間後のGFP陽性細胞集積を定性的に示す。2週間後（コントロール；図１６D, 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分；図１６E）および6週間後（コントロール；図１６F 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分；図１６G）ともに、コントロール群に比して治療群の損傷部位にGFP陽性細胞の集積が高い傾向にあった。
考察：皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分投与により、骨髄由来細胞が脳組織欠損部位に集積し神経細胞の形態を示した。骨髄由来間葉系幹細胞は神経細胞にも分化することが知れており、本結果から、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分によって脳損傷部位における神経系細胞再生の誘導できることが明らかになった。また、これは、脳虚血性疾患や脳挫傷における脳組織障害部位での神経再生にも応用可能である。【０１０６】
〔参考例５〕
目的：皮膚組織抽出液内に存在する骨髄由来組織幹細胞誘導因子の同定
方法：疎血状態にある切除皮膚からの放出が予想される骨髄間葉系幹細胞動員因子の同定を目的として以下の方法のように研究を進めた。
１）マウス骨髄由来間葉系幹細胞を得るために、C57BL/6マウスの骨髄細胞を大腿骨もしくは下腿の骨から採取し、10％胎仔ウシ血清含D-MEM(Nacalai 社製)を細胞培養培地として細胞培養皿に撒き、37℃、炭酸ガス濃度5％の条件下で培養した。細胞が占める面積が培養皿底面積に対して70から100％に増殖した時点で、0.25％トリプシン1mMEDTA（Nacalai社製）を用いて細胞を培養皿からはがし、さらに同じ条件で継代培養した。継代作業は少なくとも5回以上繰り返した。さらにこれらの付着細胞を単離培養しフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析を行いLin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性であることを確認した。これらの細胞は骨細胞、脂肪細胞に分化可能で骨髄間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。
２）新生マウス(2日齢)5匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）5ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。また同様に、6週齢マウス1匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）5ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。
３）得られた皮膚抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、本発明者らが既に株化しているC57BL6マウス骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。具体的にはボイデン・チャンバーの下槽（容量25μl）に2日齢もしくは6週齢のマウス皮膚抽出液（5μl）とDMEM(20μl)の混合液を挿入し、8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン・チャンバー上槽（容量50μl）を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液（5x104個/50ml培養液：DMEM/10％ウシ胎仔血清）を入れ、CO2インキュベーター内で37℃、4〜24時間培養した。培養後、チャンバーの上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通過してチャンバー下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的に検討した(図１７)。【０１０７】
４）２日齢マウス、6週齢マウスそれぞれの皮膚を約2cm2採取し、速やかに液体窒素で凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。これらのサンプルからRNeasy (Qiagen)を用いてRNAを抽出精製した。精製したRNAを用いてマイクロアレイアッセイにより２日齢マウスでより多く発現しているmRNAをスクリーニングした。２日齢マウスの方が2倍以上のスコアが高い遺伝子は767あった。これらの遺伝子のうち、ヘパリンに親和性の高いタンパク質、分泌される可能性のあるタンパク質、２日齢マウスの方が６倍以上スコアが高い遺伝子を検討したところ上位57番目の遺伝子としてS100A9が存在した。そこで、S100A9とヘテロダイマーを形成することで知られているS100A8の2日齢皮膚抽出液中の存在をWestern blot 法で検出した。すなわち、２日齢皮膚抽出液5μl とSDS-PAGE sample buffer 5μl(Bio-Rad)を混合し、98℃、5分間ヒートブロックで熱した後、25℃にまで冷却した。このサンプルを12.5% アクリルアミドゲルのe-PAGEL(ATTO)にアプライし、電気泳動装置（ATTO）を用いて、40mA で75分間電気泳動した。電気泳動後ゲルを回収し、ブロッティング装置（ATTO）を用いて、あらかじめ100% メタノールにて処理した縦7cm 横9cmのPVDF膜（Millipore）にゲル中のタンパク質を転写した。転写は120mA 、75分間施行した。転写終了後、PVDF膜を回収し、4％スキムミルク含PBS(nacalai)中で30分間室温振盪した。その後、抗S100A8抗体（R&D）もしくは抗S100A9(R&D)5μlを10mLの4％スキムミルク含PBSに希釈した液中に回収したPVDF膜を浸し、60分間室温振盪した。抗体液を除去後、30 mL の0.1% Tween 20 含PBSで膜を５分間室温で振盪し洗浄した。洗浄は５回繰り返した。洗浄後、HRP標識抗goat IgG 抗体（GE healthcare）5μlを10mLの4％スキムミルク含PBSに希釈した液中に膜を入れ室温で45分間振盪した。抗体液を除去後、30 mL の0.1% Tween 20 含PBSで膜を５分間室温で振盪し洗浄した。洗浄は５回繰り返した。膜をECL検出キット（GE healthcare）にて発光させフィルムを感光させた。現像装置でフィルムを現像し、S100A8及びS100A9のタンパク質のシグナルを得た（図１８）。【０１０８】
５）皮膚抽出液内の骨髄由来間葉幹細胞動員活性をもつ因子を精製するために、ヘパリンアフィニティーカラム・クロマトグラフィーを施行した。以下の操作は、FPLC装置（GE healthcare）を用いて施行した。まず、2日齢マウス皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した（希釈液A）。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5（300ml）をHiPrep 16/10 Heparin FF（GE Healthcare）の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Aをカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, （300ml）でカラムを洗浄した。吸着したタンパク質を溶出するため、（A液）20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 10mM NaCl と（B液）20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 500mM NaClを作製した。はじめA液100%/B液0%で送液し、徐々にB液の割合を増加し最終的にA液0%/B液100%で送液した。総送液量は150mLとした。溶出液はシリコンコートしたチューブに3mLずつ分画した。分画したサンプルのそれぞれ5μl とSDS-PAGE sample buffer 5μl(Bio-Rad)を混合し、98℃、5分間ヒートブロックで熱した後、25℃にまで冷却した。このサンプルを（5-20% graduent） アクリルアミドゲルのe-PAGEL(ATTO)にアプライし、電気泳動装置（ATTO）を用いて、40mA で75分間電気泳動した。泳動後、Dodeca silver stain kit(Bio-Rad)を用いて泳動したタンパク質を検出した（図１９）。
分画したサンプルをそれぞれ、上記と同様にボイデン・チャンバーを利用した遊走活性を評価した（図２０）。
分画したサンプルをそれぞれ、上記と同様にWestern blot法を用いてS100A8とS100A9のタンパク質の存在を検出した（図２１）。【０１０９】
６）新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し更にSuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen） を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてS100A8及びS100A9のcDNAをPCR （ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅し、アミノ酸配列のN末端にGST tagの配列（配列番号：31（アミノ酸配列）、配列番号：32（DNA配列））を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した。（図２２）ヒト胎児腎細胞由来HEK293培養細胞株にリポフェクション試薬（Invitrogen）を用いてpCAGGS-GST-S100A8もしくはpCAGGS-GST-S100A9をトランスフェクションし、48時間後細胞及び培養上清を回収した。細胞及び培養上清は4℃で4400g・5分間遠心し上清（上清A）と細胞を分離しそれぞれ回収した。細胞は0.1%Tween20含PBSを加え氷冷下で30秒間超音波をあてることで細胞膜を破壊した。さらに、4℃で4400g・5分間遠心し上清を回収した（上清B）。上清Aおよび上清Bを混合し、あらかじめ30mLのPBSでバッファーを置換したHiTrap GST FF column (GE healthcare, 5mL)に添加した。添加後PBS100mLでカラムを洗浄し、還元型グルタチオン含20mM リン酸バッファー（pH.8）で吸着したタンパク質を溶出した。リコンビナントS100A8およびS100A9のボイデン・チャンバーを用いた、骨髄間葉系幹細胞遊走活性を検討した。ボイデン・チャンバーの下層には、精製したS100A8およびS100A9タンパク質を0.1ng/μLの濃度に調整しDMEMに溶かしたサンプルもしくは2日齢マウス皮膚抽出液は4倍容のDMEMで希釈したサンプルを挿入した。Negative controlはS100AおよびS100A9 cDNAを挿入していないコントロールベクターをトランスフェクションした細胞からタンパク質を抽出し、HiTrap GST FF columnから溶出した画分を同様に用いた。下層にサンプルを挿入後、8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン・チャンバー上槽（容量50μl）を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液（5x104個/50ml培養液：DMEM/10％ウシ胎仔血清）を入れ、CO2インキュベーター内で37℃、4〜24時間培養した。培養後、チャンバーの上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通過してチャンバー下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的に検討した（図２３）。【０１１０】
７）前述の精製したGST-S100A8およびS100A9リコンビナントタンパク質を８週齢雄マウスの尾静脈から250μL(1ng/μL)注入した。12時間後イソフルランに容吸入麻酔下に、マウスの心臓からヘパリンコートした1mLのシリンジを用いて、末梢血1mLを採血し、３mLのPBSと混合した後、３mLのFicol(GE healthcare)の上に静かに重層した。遠心機を用い、25℃で400g、40分間遠心した。中間層の白濁した層の細胞を単核球画分として回収した。回収した細胞に1mLの溶血剤であるHLB solution（免疫生物研究所）を加え室温で5分インキュベートした。この溶血操作を２回繰り返した。10mLのPBSを加え、25℃で440g、5分間遠心し上清を除去して細胞を回収した。この細胞1,000,000個に抗マウスPE標識PDGFRα抗体（e-Bioscience）、PE標識抗マウスPDGFRβ抗体(e-Bioscience)、FITC標識抗マウスCD45抗体(BD biosciences)、PerCy5標識抗マウスCD44抗体（BD biosciences）それぞれをPBSで100倍希釈し20分間室温でインキュベートした。その後この細胞を25℃、440g、５分間遠心し上清を除去した。1％パラホルムアルデヒド含PBSを400μL加え、フローサイトメトリー解析のサンプルとした。抗体は（I）PDGFRα/CD45/CD44（II）PDGFβ/CD45/CD44の組み合わせで使用した。解析結果はCD45弱陽性-陰性細胞に対してのPDGFRα（もしくはβ）及びCD44の発現細胞の割合を検討した。(図２４A,図２４B)【０１１１】
結果：切除した2日齢マウス皮膚及び６週齢マウス皮膚の骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を検討し、６週齢マウスに比べ２日齢マウスの皮膚抽出液に強い活性を見出した。DNAマイクロアレイの結果からS100A9が２日齢マウス皮膚で強い発現が認められた。皮膚抽出液をヘパリンカラムで粗精製したサンプルの間葉系幹細胞遊走活性とS100A9及びS100A8の含有に相関が認められた。これらのタンパク質の発現ベクターを作製し、HEK293を用いてリコンビナントタンパク質を生産精製した。これらのS100A8・S100A9精製品はボイデン・チャンバーを用いたアッセイにおいて骨髄間葉系幹細胞遊走活性を有していた。また、マウス静脈投与によってもPDGFRα、CD44陽性細胞群を末梢血中に動員する活性が認められた（図２４）。【０１１２】
考察：今回本発明者らは、世界で初めて、遊離皮膚片がS100A8およびS100A9を産生し、産生されたS100A8およびS100A9は骨髄由来間葉系幹細胞を遊走する強い活性を有することを見出した。また、骨髄間葉系幹細胞は骨組織、脂肪組織、軟骨組織、線維芽細胞等に分化する多能性幹細胞であることが知られているが、最近骨髄由来細胞の中には、心筋、神経細胞、表皮細胞等の組織にも分化する多能性幹細胞も存在することも指摘されている。今回植皮片の表皮細胞、毛包細胞、皮下組織の線維芽細胞などが骨髄由来の細胞で構成されていることから、S100A8やS100A9が骨髄由来組織幹細胞を植皮片に動員し、損傷組織の機能的修復を誘導していると考えられる。S100A8およびS100A9は静脈注射による投与で末梢血中に骨髄間葉系幹細胞を動員可能なため、局所投与が困難な深部組織（脳、心臓、脊髄など）にも末梢循環を介して投与可能である。本技術を医薬品をとして利用することで、損傷組織再生時に間葉系幹細胞を含む骨髄由来組織幹細胞を局所に動員することが可能になれば、皮膚組織の組織損傷治癒のみならず脳、筋肉、骨などの様々な組織損傷治癒過程において治癒期間の短縮、損傷組織の機能的再生などの効果が期待されると確信する。【０１１３】
〔参考例６〕
目的：正常マウスおよび糖尿病マウスにおけるS100A8の皮膚潰瘍治療効果の確認
方法：マウス皮膚潰瘍モデルにリコンビナントS100A8タンパク質を投与し、潰瘍治療効果を検討した。被験マウスはGFPを発現する骨髄細胞を移植したC57/Bl6 マウスもしくは糖尿病モデルマウスであるBKS.Cg-m+/+Leprdb/J（dbマウス）を使用した。マウス皮膚に直径6mmの皮膚潰瘍を作成した。マウスに作製した皮膚潰瘍は皮膚欠損部分の周囲の皮膚が速やかに収縮する。本実験では、欠損皮膚を収縮ではなく再生皮膚で覆うことにより治療するモデルを作製するために、皮膚欠損部に外径10mm 、内径6mm 、厚さ0.5mm のシリコンゴム製の円盤を皮膚手術用接着剤（アロンアルファA）およびナイロン糸で潰瘍周囲の皮膚を固定した。さらにリコンビナントS100A8タンパク質を1.5μg /日、7日間連日潰瘍面に直接投与した。また潰瘍面の乾燥を防ぐため表面をフィルムドレッシング剤  Tegaderm（3M）で保護した。治療効果を確認するため経時的に潰瘍面積を測定した。【０１１４】
結果と考察：正常マウスにおいては、治療開始7日目以降から優位にS100A8治療群においてコントロール群より潰瘍面積の縮小がみられた（図２５）。また、糖尿病マウスにおいても、治療開始7日目以降から優位にS100A8治療群においてコントロール群より潰瘍面積の縮小がみられた（図２６）。すなわち、正常マウス、糖尿病マウスいずれでも有意な皮膚潰瘍の縮小効果が確認された。今回の結果からS100A8は正常のマウスのみならず糖尿病マウスにおいても皮膚潰瘍の治療効果を有することが確認された。【０１１５】
〔参考例７〕
目的：皮膚組織抽出液内に存在する骨髄由来組織幹細胞誘導因子による骨髄組織幹細胞の末梢血への動員
方法：上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
１）骨髄由来組織幹細胞誘導剤の調製：新生マウス(2日齢)25匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH 7.4（PBS）25 mlに浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440 Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液（SE）を作製した。
また、C57/Bl6新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し更にSuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen） を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてHMGB1のcDNAをPCR （ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅し、アミノ酸配列のN末端にFlag tagの配列（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；配列番号：３０）を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した（図３２）。これらのプラスミドベクターをHEK293 （ヒト胎児腎細胞由来培養細胞株）に遺伝子導入し48時間培養しタンパク質を発現させた。HMGB1タンパク質をそれぞれ発現させた細胞及び培養上清は4℃で16時間インキュベートした後、4400 g・5分間遠心し上清を回収した。この上清50 mL あたり100μLのAnti Flag 抗体Gel（Sigma）を混合し4℃で16時間インキュベートした。遠心しGelを回収した後PBSを用いて、5回洗浄した。更に 3X Flag peptide（final 100μg/ml）を用いて溶出した。溶出したタンパク質はHMGB1 ELISA kit (シノテスト)を用いて濃度を確認し、凍結乾燥後PBSを用いて200μg/mLに調整した。【０１１６】
２）8週齢雄マウス（C57/Bl6）の尾静脈から前述の皮膚抽出液（SE）500μLもしくは陰性コントロール群としてPBS500μLを30G1/2の注射針を装着したシリンジを用い投与した（図３３）。投与6/12/24/48時間後、イソフルランによる吸入麻酔下、マウスの心臓からヘパリンコートした1 mLのシリンジを用いて末梢血1 mLを採血し、３ mLのPBSと混合した後、３ mLのFicol(GE healthcare)の上に静かに重層した。遠心機を用い、25℃で400 g、40分間遠心した。中間層の白濁した層の細胞を単核球画分として回収した。回収した細胞に1 mLの溶血剤であるHLB solution（免疫生物研究所）を加え室温で5分インキュベートした。この溶血操作を２回繰り返した。10 mLのPBSを加え、25℃で440 g、5分間遠心し上清を除去して細胞を回収した。この細胞1,000,000個に抗マウスPE標識PDGFRα抗体（e-Bioscience）、PE標識抗マウスPDGFRβ抗体(e-Bioscience)、PerCy5標識抗マウスCD44抗体（BD biosciences）それぞれをPBSで100倍希釈し20分間室温でインキュベートした。その後この細胞を25℃、440 g、５分間遠心し上清を除去した。1％パラホルムアルデヒド含PBSを400μL加え、フローサイトメトリー解析のサンプルとした。
8週齢雄マウス（C57/Bl6）の尾静脈からマウスHMGB1を250μL(1μg/μL)もしくは陰性コントロール群としてPBS250μLを30G1/2の注射針を装着したシリンジを用い投与した（図３５）。投与12時間後、イソフルランによる吸入麻酔下、マウスの心臓からヘパリンコートした1 mLのシリンジを用いて末梢血1 mLを採血し、３ mLのPBSと混合した後、３ mLのFicol(GE healthcare)の上に静かに重層した。遠心機を用い、25℃で400 g、40分間遠心した。中間層の白濁した層の細胞を単核球画分として回収した。回収した細胞に1 mLの溶血剤であるHLB solution（免疫生物研究所）を加え室温で5分インキュベートした。この溶血操作を２回繰り返した。10 mLのPBSを加え、25℃で440 g、5分間遠心し上清を除去して細胞を回収した。この細胞1,000,000個に抗マウスPE標識PDGFRα抗体（e-Bioscience）、PerCy5標識抗マウスCD44抗体（BD biosciences）それぞれをPBSで100倍希釈し20分間室温でインキュベートした。その後この細胞を25℃、440 g、５分間遠心し上清を除去した。1％パラホルムアルデヒド含PBSを400μL加え、フローサイトメトリー解析のサンプルとした。【０１１７】
結果：皮膚抽出液（SE）を注射12時間後の末梢血において、有意にPDGFRα陽性、CD44陽性細胞が動員されていることが確認された（図３４）。HMGB1を注射12時間後の末梢血において、有意にPDGFRα陽性、CD44陽性細胞が動員されていることが確認された（図３６）。【０１１８】
〔参考例８〕
目的：組み換えHMGB1蛋白の静脈内投与によって、間葉系幹細胞が末梢血中へ動員されるかを確認した。
方法：C57BL6マウス（8〜10週齢、オス）尾静脈より組み換えHMGB1蛋白/生理食塩水（100 μg/ml）を400μl (40μg HMGB1)あるいは生理食塩水400μl投与した。12時間後にマウス末梢血を採取してPBSを加え全量を4mLに希釈した。遠心管にFicoll-Paque Plus(GE)液を3mL 挿入後その上に希釈血液を重層した。100G （18℃）で10分間遠心し、単核球を含む中間層を新しい遠心管に回収し、45 mL のPBSを加え440G(18℃)5分で遠心し上清を除去した。さらにもう一度45 mL のPBSを加え440G(18℃)5分で遠心し上清を除去した。得られた単核球をPhycoerythrobilin(PE)標識抗マウスPDGFRα抗体およびAllophycocyanin（APC）標識抗マウスCD44抗体で反応させた後、フローサイトメトリー（Facscan ; Becton, Dickinson and Company)により単核球分画内のPDGFRα陽性/CD44陽性細胞の存在頻度を評価した。【０１１９】
結果：HMGB1投与12時間後に、末梢血単核球分画内のPDGFRα陽性かつCD44陽性細胞およびPDGFRα陽性かつCD44陰性細胞が有意に増加していることが明らかとなった（図３７）。即ち、HMGB1は骨髄内から末梢血中に、間葉系幹細胞のマーカーとして知られているPDGFRα陽性細胞を動員する活性があることが示された。【０１２０】
考察：PDGFRαおよびCD44は骨髄由来の多能性幹細胞を代表する骨髄間葉系幹細胞の表面マーカーとして知られている。骨髄間葉系幹細胞は骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化可能な多能性幹細胞であり、さらに神経細胞や上皮細胞などにも分化可能とされている。また、本実験で使用した皮膚片は、阻血状態であるため、徐々に組織が壊死状態となり、細胞の表面のタンパク質から核などの細胞内のタンパク質が周囲に放出される。また、HMGB1は皮膚抽出液に含有されるタンパク質である。植皮などではこれらのタンパク質が、シグナルとなって植皮片に骨髄由来の組織幹細胞を動員し、植皮片内で骨髄細胞由来表皮、皮下組織、毛包組織などを再構築し、機能的皮膚を再生していると考えられる。本実験は、このような皮膚抽出液もしくはHMGB1を静脈内に投与することで、末梢循環中に骨髄由来組織幹細胞を動員することに成功した初めての発見である。本発見によって、骨髄由来多能性幹細胞を末梢血中に動員し、脳梗塞や心筋梗塞、骨折、皮膚潰瘍、などの組織損傷を伴う難治性疾患に対する新規治療法が可能になる。また、末梢血中に動員した細胞は通常の採血と同様に採取が可能であり、これまで脳梗塞治療のために骨髄から採取してきた従来の方法にくらべ、簡便で安全な骨髄由来組織幹細胞の採取方法が可能になった。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、従来困難であった生体内機能的細胞の低浸襲性回収が可能にするものである。その結果、それら生体由来機能性細胞を用いた基礎研究の進展、回収細胞を利用した再生医療の進展が期待され、難治性疾患に苦しむ患者に新たな医療を提供するための革新技術となると期待される。また、生体内に挿入する容器は、新たな医療材料開発のためのシーズであり、この分野の産業の進展に寄与すると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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