(57)【要約】【課題】老人斑等のプラーク周辺に沈着したＡβ1-42に対する親和性が強いTAPIR抗体を提供すること。【解決手段】重鎖及び軽鎖の可変領域が、下記の超可変領域を有することを特徴とする、モノクローナル抗体である。重鎖超可変領域１：配列番号１重鎖超可変領域２：配列番号２重鎖超可変領域３：配列番号３軽鎖超可変領域１：配列番号４軽鎖超可変領域２：配列番号５軽鎖超可変領域３：配列番号６【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖及び軽鎖の可変領域が、下記の超可変領域を有することを特徴とする、モノクローナル抗体。
重鎖超可変領域１：配列番号１
重鎖超可変領域２：配列番号２
重鎖超可変領域３：配列番号３
軽鎖超可変領域１：配列番号４
軽鎖超可変領域２：配列番号５
軽鎖超可変領域３：配列番号６
【請求項２】
重鎖可変領域が配列番号１３，軽鎖可変領域が配列番号１４で表されるものであることを特徴とする、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体のアミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸配列が、欠失，置換，付加，及び／又は挿入されており、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）の少なくともいずれかに対する親和性を有していることを特徴とする、モノクローナル抗体。
（Ａ）アミロイドβ1-42蛋白質の多量体
（Ｂ）アミロイドβ1-42蛋白質凝集体
【請求項４】
（Ｂ）アミロイドβ1-42蛋白質凝集体が、脳組織アミロイドプラークに沈着しているものであることを特徴とする、請求項３記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
定常領域が、ヒトモノクローナル抗体又はマウスモノクローナル抗体由来のものであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載の、モノクローナル抗体。
【請求項６】
アミロイドβ1-42蛋白質に対する親和性が、解離定数0.01×10-11〜9×10-11であることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の、モノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１乃至６記載のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１乃至６記載のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含むことを特徴とする、アミロイド蛋白質の沈着に起因する疾病の予防又は治療剤。
【請求項９】
アミロイド蛋白質の沈着に起因する疾病が、アルツハイマー病であることを特徴とする、請求項７記載の、疾病の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー等の原因として知られている、アミロイドβ1-42蛋白質に対する抗体であって、更に詳しくは、老人斑等のプラークに結合したアミロイドペプチド（凝集体）等に対する親和性の高い、モノクローナル抗体，及びそれを利用した医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマーは、６０歳以上の人に見られる、記憶障害の一種である。【０００３】
このアルツハイマーについての研究の結果、アミロイドβ（以下、Ａβと記載する。）蛋白質が、沈着防止酵素の機能低下に伴って、脳組織へ沈着する事が、この疾病の主な原因であることが、明らかとなって来た。【０００４】
そこで、Ａβ蛋白質に関連する免疫療法が、種々、研究・開発されている。【０００５】
免疫療法には、抗原を外から人体に免疫し、免疫対象自身に抗体を作らせる、いわゆる能動免疫と、予め用意した抗体を人体に投与する、受動免疫がある。【０００６】
アルツハイマーの治療に関しては、最初に、Ａβ蛋白（Ａβ1-42）を、免疫増感剤（アジュバント）とともに患者に免疫する能動免疫が試みられたが、髄膜脳炎という副作用が出現してしまったため、臨床試験が中止されたという経緯がある。【０００７】
しかしながら、この臨床試験において、人体で実際に記憶障害の改善効果が見られる事も同時に判明し、副作用さえなければ、免疫療法は、アルツハイマー等の有用な治療方法であるということが確認された。【０００８】
その後の調査で、この髄膜脳炎は、Ａβ蛋白質に対する抗体が直接の原因という訳では無く、抗原投与によって引き起こされた、Ｔ細胞やキラー細胞が関与するいわゆる細胞性免疫による、自己免疫疾患であることが分かってきた（非特許文献１）。【０００９】
そこで、細胞性免疫の活性化を伴わない、受動免疫に注目が集まり、アルツハイマー治療用の抗体が、各種、研究・開発されるようになってきている。【００１０】
ところで、能動免疫に関する臨床試験の追跡調査の過程で、免疫療法を受けた患者の血清における、Ａβ蛋白質に対する抗体価（抗Ａβ抗体価）が、必ずしも、記憶障害の改善効果に相関しておらず、むしろ、組織アミロイドプラーク免疫反応性（TAPIR）と言う新たな指標が、この改善効果との相関が高いことが明らかとなってきた（非特許文献２）。【００１１】
このTAPIRとは、「脳組織に沈着してプラークを形成しているＡβ蛋白質」に対する、抗体の親和性の強さの指標である。【００１２】
つまり、単に、Ａβ蛋白質やその分解生成物であるＡβペプチド等に対する親和性がある抗体があれば良いというものでは無く、「脳組織に出来たプラーク（老人斑）を形成するＡβ蛋白質」に対する結合力が強い抗体が多く産生している場合ほど、認知機能の改善効果が高かったのである。【００１３】
しかし、その後の、各種のＡβ抗体開発においても、TAPIRの高いいわゆるTAPIR抗体は、得られていないのが現状であった。【００１４】
ところで、Ａβ蛋白質とは、Ａβ蛋白質前駆体（ＡβＰＰ）から、βセクレターゼとγセクレターゼによって膜結合部位が切り出されて出来る、４０〜４２アミノ酸からなるペプチドであり、主にＡβの第１位から４０位までのアミノ酸からなるＡβ1-40と、第１位から４２位までのアミノ酸からなるＡβ1-42の二種が知られている。【００１５】
そして、アルツハイマー等における老人斑等のプラークの中心には、Ａβ1-40が多く、プラークの周辺部位には、Ａβ1-42が多い事も分かってきた。【００１６】
一方、血管の周りに沈着するＡβ（血管アミロイド）は、Ａβ1-40が多いことが分かって来ている。【００１７】
この事は、近年報告された、“AβPPトランスジェニックマウスに対する受動免疫（抗体投与）の副作用である、微小出血(Science, 298, 2002, 1379，J. Neurosci., 25, 2005, 629-636)”の原因が、Ａβ1-40への抗体の結合によるものであった事を示唆している。【００１８】
従って、Ａβ1-42に対する親和性は高いが、Ａβ1-40に対する親和性は低い抗体であれば、TAPIR抗体として機能し得る一方で、脳出血等の副作用も起こさないことになり、アルツハイマー等のアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の、有効な予防又は治療剤になることが期待される。【００１９】
【非特許文献１】Nat Med；9，448，2003
【非特許文献２】Neuron；38，547，2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明者等は、上述の問題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、偶然にも、Ａβ1-42ペプチドを免疫した動物由来脾臓細胞を用いたハイブリドーマの中から、Ａβ1-40に比べてＡβ1-42に強い親和性を有するものを得ることに成功し、しかも驚くべきことに、このモノクローナル抗体が、Ａβ1-42単体よりも、多量体や凝集体に対し、より強い親和性を有するという、理想的なモノクローナル抗体（TAPIR抗体）を産生するハイブリドーマ株であることを見出し、本発明を完成するに至ったものであり、その目的とするところは、脳組織に沈着し老人斑（プラーク）を形成したＡβ1-42に対して、より強い親和性を有するTAPIR抗体，及びそれを用いた医薬組成物を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上述の目的は、下記第一の発明から第九の発明によって、達成される。【００２２】
＜第一の発明＞
重鎖及び軽鎖の可変領域が、下記の超可変領域を有することを特徴とする、モノクローナル抗体。
重鎖超可変領域１：配列番号１
重鎖超可変領域２：配列番号２
重鎖超可変領域３：配列番号３
軽鎖超可変領域１：配列番号４
軽鎖超可変領域２：配列番号５
軽鎖超可変領域３：配列番号６【００２３】
＜第二の発明＞
重鎖可変領域が配列番号１３，軽鎖可変領域が配列番号１４で表されるものであることを特徴とする、第一の発明記載のモノクローナル抗体。【００２４】
＜第三の発明＞
第一の発明又は第二の発明記載のモノクローナル抗体のアミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸配列が、欠失，置換，付加，及び／又は挿入されており、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）の少なくともいずれかに対する親和性を有していることを特徴とする、モノクローナル抗体。
（Ａ）アミロイドβ1-42蛋白質の多量体
（Ｂ）アミロイドβ1-42蛋白質凝集体【００２５】
＜第四の発明＞
（Ｂ）アミロイドβ1-42蛋白質凝集体が、脳組織アミロイドプラークに沈着しているものであることを特徴とする、第三の発明に記載のモノクローナル抗体。【００２６】
＜第五の発明＞
定常領域が、ヒトモノクローナル抗体又はマウスモノクローナル抗体由来のものであることを特徴とする、第一の発明乃至第四の発明のいずれかに記載の、モノクローナル抗体。【００２７】
＜第六の発明＞
アミロイドβ1-42蛋白質に対する親和性が、解離定数0.01×10-11〜9×10-11であることを特徴とする、第一の発明乃至第五の発明のいずれかに記載の、モノクローナル抗体。【００２８】
＜第七の発明＞
第一の発明乃至第六の発明のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物。【００２９】
＜第八の発明＞
第一の発明乃至第六の発明のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含むことを特徴とする、アミロイド蛋白質の沈着に起因する疾病の予防又は治療剤。【００３０】
＜第九の発明＞
アミロイド蛋白質の沈着に起因する疾病が、アルツハイマー病であることを特徴とする、請求項八記載の、疾病の予防又は治療剤
【発明の効果】
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体は、アルツハイマー等の原因として知られているＡβ，特に、脳組織に沈着し老人斑（プラーク）を形成しているＡβ1-42に対する親和性が強く、血管アミロイドには、あまり結合しないという特性を有している。そのため、脳出血や脳脊髄炎等の副作用無しで、アルツハイマー等の、アミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の、予防又は治療剤としての使用が可能である。
また、本発明のモノクローナル抗体は、Ａβ1-42の凝集性が高まっている場合ほど、良く認識・溶解し、或いはその凝集の生成を防ぐ一方、沈着前に遊離しているＡβ1-42単体や、Ａβ1-42の前駆体であるＡβPPに対する親和性は弱いため、生体にとって本来ある種の役割を有しているであろうＡβやAβPPの機能を、完全に抑制するのでは無く、疾患に直接繋がる凝集段階で、選択的に抑制することができると言う利点を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−Ａ】実施例１及び比較例２の抗体に起因する、老人斑の染色の様子を示す図である。
【図１−Ｂ】実施例１及び比較例２の抗体に起因する、芯を有する老人斑の染色割合を示す図である。
【図２−Ａ】ドットブロット及びウェスタンブロットによる、実施例１及び比較例２の抗体の、各種Ａβペプチドに対する親和性試験の結果を示す図である。
【図２−Ｂ】ウェスタンブロットによる、実施例１及び比較例４の抗体の、各種のＡβ前駆体との親和性試験の結果を示す図である。
【図２−Ｃ】実施例１，比較例１，及び対照例１の抗体による、AβPP遺伝子導入SH-SY5Y生細胞の染色結果を示す図である。
【図３−Ａ】実施例１の抗体及びコントロール（PBS）による、Aβ1-42の凝集阻害（予防）試験の結果（蛍光写真）を示す図である。
【図３−Ｂ】実施例１の抗体及びコントロール（PBS）による、凝集したAβ1-42の凝集融解（治療）試験の結果（蛍光強度）を示す図である。
【図４−Ａ】実施例１の抗体と、対照（PBS）の、大脳皮質及び海馬のアミロイド蓄積の程度を、アビジン・ビオジンHRP/DAB法によって視覚化した結果を示す図である。
【図４−Ｂ】図4-Aのアミロイド沈着の占める面積比を、海馬と大脳皮質ごとに、定量的解析した結果を示す図である。
【図４−Ｃ】脳のTBS画分のAβオリゴマーのウェスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図５−Ａ】実施例１の抗体・3.4A10が脳に入ったかどうかを調べるために行った、実施例１の抗体で治療したマウス（上段）又は対照マウス（下段）の、脳切片の免疫蛍光染色の結果を示す図である。
【図５−Ｂ】治療群（3.4A10陽性老人斑）と非治療群（3.4A10陰性老人斑）のそれぞれの、老人斑を取り囲んでいるミクログリアの数を調べるために行った、脳切片の免疫蛍光染色の結果を示す図である。
【図５−Ｃ】図１のミクログリア数を計測した結果を示す図である。
【図６】図６中のＡは、実施例１の抗体で治療したマウスの脳を、ヘマトキシリン・エオジン染色して、脳のリンパ球浸潤を調べた結果を示す図である。図６中のＢは、非治療マウスの脳を、ヘマトキシリン・エオジン染色して、脳のリンパ球浸潤を調べた結果を示す図である。図６中のＣは、実施例１の抗体で治療したマウスの脳を、T細胞のマーカーである参考例１のCD3e抗体で免疫染色して、脳のリンパ球浸潤を調べた結果を示す図である。図６中のＤは、非治療マウスの脳を、T細胞のマーカーである参考例１のCD3e抗体で免疫染色して、脳のリンパ球浸潤を調べた結果を示す図である。図６中のＥは、実施例１の抗体で治療したマウスの脳を、B細胞のマーカーである参考例２のCD19抗体で免疫染色して、脳のリンパ球浸潤を調べた結果を示す図である。図６中のＦは、非治療マウスの脳を、B細胞のマーカーである参考例２のCD19抗体で免疫染色して、脳のリンパ球浸潤を調べた結果を示す図である。図６中のＧは、実施例１の抗体で治療したマウスの脳を、ベルリン・ブルー染色した結果を示す図である。図６中のＨは、非治療マウスの脳を、ベルリン・ブルー染色した結果を示す図である。
【図７】配列番号１〜６のCDRのアミノ酸配列及び、配列番号７〜１２のCDRをコードする遺伝子の一例の配列を表す図である。
【図８】配列番号１３のVH鎖及び配列番号１４のVL鎖の、アミノ酸配列を表す図である。
【図９】配列番号１５の、VH鎖をコードするポリヌクレオチド，及び配列番号１６の、VL鎖をコードするポリヌクレオチドの配列を表す図である。
【図１０】配列番号１７のマウスモノクローナル抗体由来CH鎖及び配列番号１８のマウスモノクローナル抗体由来CL鎖のアミノ酸配列を表す図である。
【図１１】配列番号１９の実施例１の抗体（3.4A10）H鎖のアミノ酸配列，及び配列番号２０の実施例１の抗体（3.4A10）H鎖のポリヌクレオチド配列を表す図である。
【図１２】列番号２１の実施例１の抗体（3.4A10）L鎖のアミノ酸配列，及び配列番号２２の実施例１の抗体（3.4A10）L鎖のポリヌクレオチド配列を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
［本発明のモノクローナル抗体］
（本発明のモノクローナル抗体の超可変領域）
本発明のモノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域（以下「VH（領域又は鎖）や「VL（領域又は鎖）」と記載する。）が、下記の超可変領域（以下、「CDR」と記載する。）を有することを特徴とするものである。【００３４】
重鎖超可変領域１（VH  CDR1）：配列番号１
重鎖超可変領域２（VH  CDR2）：配列番号２
重鎖超可変領域３（VH  CDR3）：配列番号３
軽鎖超可変領域１（VL  CDR1）：配列番号４
軽鎖超可変領域２（VL  CDR2）：配列番号５
軽鎖超可変領域３（VL  CDR3）：配列番号６【００３５】
上記のCDRをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７〜１２のようなものが挙げられるが、当然、これらに限られるものでは無い。【００３６】
「VH  CDR1」に対応する遺伝子：配列番号７
「VH  CDR2」に対応する遺伝子：配列番号８
「VH  CDR3」に対応する遺伝子：配列番号９
「VL  CDR1」に対応する遺伝子：配列番号１０
「VL  CDR2」に対応する遺伝子：配列番号１１
「VL  CDR3」に対応する遺伝子：配列番号１２【００３７】
上記のCDRを有する可変領域として、例えば、VHが配列番号１３，VLが配列番号１４で表されるものが、好ましいものとして挙げられる。【００３８】
このようなVH鎖及びVL鎖をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１５，１６等が挙げられる。【００３９】
本発明において、ポリヌクレオチドとは、アデニン（A），グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T），ウラシル（U），シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA，一本鎖又は二本鎖のRNA，一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体，RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。
また、DNAには、cDNAも含まれる。【００４０】
これらのCDR，VH鎖，及びVL鎖等をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子工学による常法に基づき人工的にあるいは天然由来の遺伝子をもとに半人工的に合成することもできるが、マウス等の動物にヒトＡβ1-42を免疫して得られた抗体産生細胞あるいはそれを用いたハイブリドーマから、cDNA等として取得することもできる。【００４１】
尚、本発明で言う、モノクローナル抗体には、VH鎖及びVL鎖のみを含む、いわゆるファージ抗体も含まれる。【００４２】
（本発明のモノクローナル抗体のCDR以外の配列）
本発明のモノクローナル抗体の、Ａβ1-42蛋白質の多量体及び／又は凝集体との親和性に関しては、モノクローナル抗体中のCDRのアミノ酸配列が重要であり、CDR以外の配列は、特に限定されるものでは無い。【００４３】
CDR以外の配列とは、重鎖及び軽鎖それぞれおける、可変領域中のCDR以外のフレームワーク領域（以下、FRと記載する。）及び、重鎖及び軽鎖それぞれの定常領域（以下、CH領域やCL領域等と記載する。）を意味する。【００４４】
但し、これらのCDR以外のアミノ酸配列は、人体に投与した際に、抗体反応を引き起こさないようなものが好ましく、例えば、ヒトモノクローナル抗体由来のものや、マウスモノクローナル抗体由来のもの、そのキメラ型のもの等が挙げられ、中でも少なくとも一部がヒトモノクローナル抗体由来のものが好ましく、このようなものを使用して作られた場合、ヒト化モノクローナル抗体等と呼ばれる。【００４５】
そして、このヒト化モノクローナル抗体の中でも、特に、CDR以外の全ての配列が、ヒトモノクローナル抗体由来のものを使用した、いわゆる完全ヒト化モノクローナル抗体が、人体に対する副作用が、より少ないと考えられるため、最も好ましい。【００４６】
これらの、CDR以外の領域をコードする遺伝子としては、各種の具体的な配列やその改良方法等が文献に記載されており、また、実際の遺伝子が遺伝子バンク等にも預けられている。
また、公知の、CDR以外の領域を含む完全ヒト化プラスミドベクター等を用いることもできる。【００４７】
マウスモノクローナル抗体由来の定常領域としては、例えば、配列番号１７（CH鎖），配列番号１８（CL鎖）で表されるようなもの等が挙げられる。【００４８】
この定常領域は、公知のIgG2bマウス定常領域配列(GenBank accession number: J00461)を元に、公知の文献等に基づき、ヒンジ領域配列を改変したものである。【００４９】
具体的には、（L鎖全長のN末端から）869〜1033位の塩基は、下記の文献を参考に、改良した。
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (9), 4240-4244 (1979)【００５０】
173〜464，781〜846，954〜1283，1396〜1822位の塩基は、下記の文献を参考に、改良した。【００５１】
Science 206 (4424), 1299-1303 (1979)【００５２】
113〜1931位の塩基は、下記の文献を参考に、改良した。【００５３】
Science 206 (4424), 1303-1306 (1979)【００５４】
41〜1874位の塩基は、下記の文献を参考に、改良した。【００５５】
Nature 283 (5749), 786-789 (1980)【００５６】
275〜322，1097〜1283，1396〜1436，1608〜1822位の塩基は、下記の文献を参考に、改良した。【００５７】
Nucleic Acids Res. 8 (3), 453-466 (1980)【００５８】
1〜1921位の塩基は、下記の文献を参考に、改良した。【００５９】
Nature 296 (5859), 761-763 (1982)【００６０】
また、ヒトモノクローナル抗体由来の定常領域としては、公知のヒトモノクローナル抗体の定常領域であれば良く、例えばハーセプチン（登録商標，中外製薬，東京，日本）その他の、既に市販されている、ヒト化抗体と同じ定常領域を用いることができる。
また、pMH-gpt（九州大学生体防御研究所  渡邉武教授所有）等のように、予めヒトモノクローナル抗体の定常領域が組み込まれたプラスミドベクターを用いれば、本発明で用いる、新規なVH鎖及びVL鎖に、ヒトモノクローナル抗体の定常領域を結合させて、ヒト化モノクローナル抗体を得ることができる。【００６１】
（本発明のモノクローナル抗体の製造方法）
本発明のモノクローナル抗体は、遺伝子工学を用いた合成手法の常法に準じて、人工的に、あるいは天然界から抽出した配列も利用して、半人工的に合成するのが効率的ではあるが、後述するように、マウス等の動物に、ヒトＡβ1-42を免疫した抗体から、スクリーニングすることも可能である。
以下、これらの方法について、更に詳細に説明する。【００６２】
（Ｉ）人工的又は半人工的な、本発明のモノクローナル抗体の作製方法
本発明のモノクローナル抗体を人工的又は半人工的に製造するには、次のような方法が挙げられる。【００６３】
（１）本発明のモノクローナル抗体の配列を組み込んだベクターの製造【００６４】
（１）−ａ：CDRをコードするポリヌクレオチドを基本材料として製造する場合
例えば、配列番号７〜１２のような、本発明で必要な配列番号１〜６のCDRをコードするポリヌクレオチドを用いる場合には、まず、CDR以外の、「FR」と「C領域」をコードするポリヌクレオチドを、予め適当な動物細胞用発現ベクターに組み込む。
このようなベクターは、複数市販されているので、それを用いても良い。【００６５】
次に、CDRをコードするポリヌクレオチドを、それぞれが、ベクターが発現した際に、VH鎖CDR1,2,3及びVL鎖CDR1,2,3のあるべき位置に該当するように、ベクター上の適当な位置に、通常の遺伝子工学の手法を用いて組み込む。【００６６】
尚、H鎖及びL鎖をコードする遺伝子は、同じベクター中に組み込んで発現させても良いし、別々のベクターに組み込んで発現させても良い。【００６７】
（１）−ｂ：VH鎖及びVL鎖をコードするポリヌクレオチドを基本材料として製造する場合
例えば、配列番号１５，１６のような、本発明で必要な配列番号１３のVH鎖及び配列番号１４のVL鎖をコードするポリヌクレオチドを用いる場合には、まず、「C領域」（CH鎖及びCL鎖）をコードするポリヌクレオチドを、予め適当な動物細胞用発現ベクターに組み込む。【００６８】
次に、VH鎖及びVL鎖をコードするポリヌクレオチドを、それぞれが、ベクターが発現した際に、VH鎖及びVL鎖のあるべき位置に該当するように、ベクター上の適当な位置に、通常の遺伝子工学の手法を用いて組み込む。【００６９】
上記で、先にベクターに組み込んでおく遺伝子は、CH鎖及びCL鎖では無く、VH鎖及びVL鎖であっても良いが、一般には、CH鎖及びCL鎖よりも、VH鎖及びVL鎖を変化させる要望が高いため、予めCH鎖やCL鎖を組み込んだベクターが数多く市販等されており、このようなベクターを利用するのが簡便である。【００７０】
この場合も、H鎖及びL鎖をコードする遺伝子は、同じベクター中で発現させても良いし、別々に２つのベクターによって発現させても良い。【００７１】
尚、上記（１）−a，（１）−ｂいずれの場合でも、モノクローナル抗体がファージ抗体の場合には、C領域は不要なので、VH領域とVL領域のみを含むベクターを準備すれば良い。【００７２】
（２）ベクターの発現による、ヒト化モノクローナル抗体の産生
そして、当該１又は２つのベクターを、適当な発現用の動物細胞へ導入することによって、ヒト化モノクローナル抗体を発現させることができる。【００７３】
尚、（１）で用いられる動物細胞用発現ベクターとしては、公知のものを利用することができ、例えば、以下のようなものが挙げられ、これらに限定されるものでは無い。【００７４】
pAGE107［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］
pAGE103［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］
pHSG274［Gene, 27, 223 (1984)］
pKCR［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)］
pSG1βd2-4［Cytotechnology, 4, 173 (1990)］【００７５】
（II）免疫による、本発明のモノクローナル抗体の製造方法
本発明のモノクローナル抗体は、上述のように、遺伝子工学による常法によって、効率的に製造することもできるが、もちろん、Ａβ1-42を用い、通常の免疫手法とスクリーニングとの組み合わせによって、製造することも可能である。【００７６】
（１）適当な動物に免疫する。
（２）得られた免疫動物の、例えば脾臓細胞等から、Ａβ1-42蛋白質の多量体又は凝集体に対する親和性が高い抗体を産生する細胞株を選択する。
（３）選択した細胞株を、骨髄細胞等と細胞融合してハイブリドーマを作る。
（４）当該ハイブリドーマを、限界希釈及びELISA分析等によって、単クローン化する。【００７７】
尚、単クローン化する際の、親和性の指標（被験抗体の結合対象）としては、Ａβ1-42蛋白質の多量体やＡβ1-42蛋白質凝集体を用いるのが直接的かつ確実であるが、多数の抗体の中から、効率良くクローニングするための方法としては、一旦、Ａβ1-42（単量体）への親和性によって選択（第一段階スクリーニング）した後に、Ａβ1-42蛋白質の多量体又はＡβ1-42蛋白質凝集体に対する親和性を確認（第二段階スクリーニング）する方法もある。【００７８】
［本発明のモノクローナル抗体（改変体）］
本発明のモノクローナル抗体の、他の例は、上述したモノクローナル抗体のアミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸配列が、欠失，置換，付加，及び／又は挿入されており、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）の少なくともいずれかに対する親和性を有しているモノクローナル抗体である。【００７９】
（Ａ）Ａβ1-42蛋白質の多量体
（Ｂ）Ａβ1-42蛋白質凝集体【００８０】
このモノクローナル抗体は、Ａβ1-42蛋白質の多量体又は凝集体の、少なくともいずれかに対する親和性を保持している限り、上記のモノクローナル抗体のアミノ酸配列のうち、いずれの箇所において、１又は数個のアミノ酸が、欠失，置換，付加，及び／又は挿入されていても良い。【００８１】
Ａβ1-42蛋白質の多量体又は凝集体に対する親和性を変更しない可能性が高い置換としては、１又は数個のアミノ酸残基の、当該アミノ酸と化学的性状または構造的に類似のアミノ酸への置換等が挙げられる。【００８２】
このような、化学的性状または構造的に類似したアミノ酸の置換の例としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。【００８３】
グリシン（Gly）→プロリン（Pro），アラニン（Ala），又はバリン（Val）
ロイシン（Leu）→イソロイシン（Ile）
グルタミン酸（Glu）→グルタミン（Gln）
アスパラギン酸（Asp）→アスパラギン（Asn）
システイン（Cys）→スレオニン（Thr）
スレオニン（Thr）→セリン（Ser）又はアラニン（Ala）
リジン（Lys）→アルギニン（Arg）【００８４】
ここで、Ａβ1-42蛋白質の多量体とは、２つ以上のＡβ1-42蛋白質からなる、水に可溶のオリゴマーを言い、特に、アルツハイマー病の脳組織において多く存在しているとされる１０〜１２量体が好ましいものとして例示される。【００８５】
凝集体とは、２つ以上のＡβ1-42蛋白質が寄り集まってできた、水不溶性の複合体であり、組織に沈着する前の、遊離凝集体も含む、本発明のモノクローナル抗体は、凝集体の中でも、脳組織に沈着している凝集体に対する親和性（TAPIR）を有しているものであることが好ましい。【００８６】
但し、「Ａβ1-42蛋白質の多量体又は凝集体の、少なくともいずれかに対する親和性を保持している」とは、他のアミロイド蛋白質，そのフラグメント，それらの多量体や凝集体，或いは、Ａβ1-42の単量体に対する親和性を問うものでは無く、これらに対して親和性を有していても勿論構わない。【００８７】
但し、本発明のモノクローナル抗体（改変体で無い、第一の発明）の様に、親和性の強さに下記のような差があることが好ましい。【００８８】
ＡβＰＰ（殆ど結合せず）＜Ａβ1-40＜＜Ａβ1-42＜＜Ａβ1-4０凝集体＜＜＜Ａβ1-42凝集体【００８９】
この親和性の差を利用することによって、選択的な治療や、脳出血等の副作用の無い治療が可能となるからである。【００９０】
尚、上記改変体における、アミノ酸の欠失，置換，付加，及び／又は挿入等の導入位置は、具体的には、配列番号１〜６（CDR），配列番号１３（VH鎖），あるいは配列番号１４（VL鎖）の配列中に行われるものである。
なぜなら、それ以外の位置の場合、変異させたものも、全て、第一の発明や第二の発明のモノクローナル抗体に該当するからである。【００９１】
そして、これらの改変体の中では、配列番号１３や１４の、FRへの変異の導入が、Ａβ1-42蛋白質の多量体又は凝集体への親和性を変更しない可能性が極めて高く、上記の第一の発明や第二の発明のモノクローナル抗体同様に、アルツハイマー等の治療への使用が、十分可能と考えられるため好ましい。【００９２】
これらの変異体は、遺伝子工学による常法によって、製造することができる。【００９３】
［本発明のモノクローナル抗体の親和性（解離定数）］
本発明のモノクローナル抗体は、Ａβ1-42蛋白質の多量体又はＡβ1-42蛋白質凝集体に対する親和性を有しているだけでなく、Ａβ1-42蛋白質（単量体）に対する親和性が、Ａβ1-40蛋白質（単量体）に対する親和性よりも、高いという特性を有している。【００９４】
具体的に、その親和性の差を、解離定数で表すと、Ａβ1-42蛋白質に対する親和性（解離定数）は、0.01×10-11〜9×10-11が好ましく、Ａβ1-40蛋白質に対する親和性（解離定数）は、0.01×10-8〜9×10-8であることが好ましい。【００９５】
従って、本発明のモノクローナル抗体（改変体）も、このように、Ａβ1-42蛋白質に対する解離定数は、およそ0.01×10-11〜9×10-11の範囲であることが好ましく、更に好ましくは、Ａβ1-40蛋白質に対する解離定数が、それより大きい（つまり親和性が低い）ことが好ましく、例えば、解離定数が、0.01×10-8〜9×10-8と同等かそれ以上に大きいことが好ましい。【００９６】
尚、組織アミロイドプラークの外側は、主にＡβ1-42であるため、上記の組織アミロイドプラークに対する親和性（TAPIR）とは、Aβ1-42に対する解離定数で評価することができる。【００９７】
また、血管アミロイドが、主にＡβ1-40であることから、脳出血等の副作用を防ぐ意味でも、本発明のモノクローナル抗体の、Ａβ1-40に対する親和性は、Ａβ1-42に対する親和性より低いことが好ましく、上記の通り、解離定数が、0.01×10-8〜9×10-8であることが好ましい。【００９８】
［本発明の予防又は治療剤］【００９９】
（含有量）
本発明の、医薬組成物やアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤中の、有効成分であるモノクローナル抗体の含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良いが、例えば液剤の場合、好ましくは０．０００１〜１０（ｗ／ｖ％），より好ましくは０．００１〜５（ｗ／ｖ％），特に注射剤の場合、好ましくは０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％），より好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％），固形剤の場合、好ましくは０．０１〜５０（ｗ／ｗ％），より好ましくは０．０２〜２０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。【０１００】
（投与量）
本発明の医薬組成物やアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤の投与量は、投与経路，症状，年齢，体重，予防又は治療剤の形態等によって異なり、一概には言えないが、有効成分であるモノクローナル抗体の量として、処置を必要としている対象体重１ｋｇ当たり、好ましくは０．００５〜５００ｍｇ，より好ましくは、０．１〜１００ｍｇ，但し、成人に対して１日あたり、下限として好ましくは０．０１ｍｇ（より好ましくは０．１ｍｇ），上限として、好ましくは２０ｇ（より好ましくは２０００ｍｇ，更に好ましくは１０００ｍｇ，特に好ましくは７００ｍｇ）となるように、１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。【０１０１】
（第三成分）
また、本発明の医薬組成物やアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤には、その予防又は治療効果を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば、免疫増感剤（完全又は不完全アジュバント等）の他、薬学的に許容される担体として、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等等の賦形剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，ヒトアルブミン等の安定（化）剤，矯味矯臭剤，希釈剤，界面活性剤，乳化剤，可溶化剤，吸収促進剤，保湿剤，吸着剤，充填剤，増量剤，付湿剤，防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。【０１０２】
（投与経路）
本発明の医薬組成物やアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤の投与経路としては、経口投与，静注等の静脈投与，筋肉内投与,  経皮投与，経鼻投与，皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与、吸入等が挙げられるが、静注等の静脈投与が安全かつ血中濃度を一定に保つという点で好ましい。【０１０３】
（投与形態（剤形））
本発明の医薬組成物やアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤の剤形は、例えば錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，丸剤，トローチ，もしくはシロップ剤，注射剤等の形態が挙げられる。【０１０４】
（合剤）
本発明の医薬組成物やアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤は、従来知られているアミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤の有効成分との合剤としても良い。その有効成分としては、以下のもの等が例示される。【０１０５】
１．アセチルコリン分解酵素阻害薬：
塩酸ドネペジル（化学名：１−ベンジル−４−（５、６−ジメトキシインダノン−２−イル)メチルピペリジン，商品名「アリセプト」（登録商標），エーザイ（株），日本）【０１０６】
２．コリンエステラーゼ阻害薬：
リバスチグミン（アセチルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼの双方を阻害，エクセロン（登録商標），ノバルティス，日本）【０１０７】
３．神経栄養因子（ニューロトロフィン）：
NGF（Nerve Growth Factor），BDNF（Brain-derived neurotrophic factor），NT-3（Neurotrophin-3），NT-4（Neurotrophin-4），CNTF（ciliary neurotrophic factor），GDNF（glial cell line-derived neurotrophic factor）【０１０８】
［対象疾患］
本発明の医薬組成物，特に、アミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の予防又は治療剤の、予防又は治療対象となる疾患としては、アルツハイマーの他、アミロイドーシスや、パーキンソン病，レビー小体病，網膜変性症等が挙げられる。【０１０９】
以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限られるものでは無い。
【実施例１】
【０１１０】
下記の方法によって、本発明のモノクローナル抗体を製造した。【０１１１】
［免疫対象動物］
雌Balb/cマウスは中部科学資材（株）(名古屋，日本)から、アミロイド前駆体蛋白(AβPP)トランスジェニックマウスTg2576マウスはTaconic Farm (Germantown, New York)から購入した。マウスはプラスチックケージ内で飼育し、餌はCE2(日本クレア)を与え、水は自由に飲み、12時間サイクルの明暗光調節を行った。すべての動物実験は国立長寿医療センターの動物実験倫理委員会の承認を得て、実験動物ガイドラインに沿って行われた。【０１１２】
［免疫とハイブリドーマの樹立］
6-8週齢の雌Balb/cマウスを100μlの完全フロインドアジュバント(1mg/mlの結核死菌H37Ra(Difco, Detroit, USA)を含む)と100μlのリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)に溶かした100μgのAβ1-42(商品コード「4349-v」，ペプチド研究所，大阪，日本)で、公知の方法(Nature 400 (1999), 173-177等)に従って免疫し、2週間後100μlの不完全フロインドアジュバントと100μlのPBSに溶かした100μgのAβ1-42で追加免疫した。【０１１３】
細胞融合をする1日前に、100μlのPBSに溶かした100μgのAβ1-42を腹腔内に注射し、３度目の免疫を行った。【０１１４】
最初の免疫から4週間後、無菌的に脾臓を取り出し、脾細胞と骨髄腫細胞株P3-Ｘ63-Ag8.653（理研バイオソースセンター  CELL  BANK，細胞番号RCB0146，理化学研究所，日本）を5:1の比で50%(w/v)ポリエチレングリコール(Hybri-Max（登録商標）, 分子量1450, Sigma・Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)の存在下に融合させ、96穴プレート(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jew Jersey)に100μl/ウェルずつ入れ、2×HAT(Hybri-Max（登録商標）) を含む培地100μlを2日後に加え選択した。【０１１５】
［ハイブリドーマの第一段階スクリーニングと抗体のアイソタイピング］
まず、組織に沈着していない遊離Ａβ1-42との親和性を指標として、ハイブリドーマの、第一段階のスクリーニングを行った。
５匹のマウス由来の脾臓を用いた、５系統の細胞融合操作の後、最も増殖の良いウェルが10-25%の密度になった時、その培養上澄100μlをとって、ELISA法により陽性クローンのスクリーニングを行った。【０１１６】
96穴ELISAプレートを、4μg/mlのAβ1-42を溶かした55mMNaHCO3 (pH9.0)100μlで、4℃で一晩コーティングを行った。150mM NaCl, 0.05%Tween20を含む20mM Tris-塩酸pH7.4で2回洗浄後、1%ウシ血清アルブミンと2%正常ヤギ血清を加えたTBS-T溶滅(ブロッキングバッファー)で、1時間室温でブロッキングを行った。【０１１７】
プレートをTBS-T（Tween 20 添加トリス緩衝液：pH7.4）で2回洗浄し、100μlのハイブリドーマ培養上澄と2時間室温で作用させた。
TBS-T（pH7.4）で4回洗浄後、100μlの2,000倍希釈ブロッキングバッファーにヤギ抗マウスIgG + IgM (H&L)(American Qualex, Sam Clemente, California)を加えたもので室温2時間インキュベートした。【０１１８】
その後、TBS-T（pH7.4）プレートを4回洗浄し、100μlのSureBlue Reserve （登録商標）TBM Microwell Peroxidase (KPL, Baltimore, Maryland)を加え、室温で30分間、暗状態で発色させた。【０１１９】
100μlのTMBストップ溶液(KPL)を加え、プレートを450nmの波長でマイクロプレートリーダー(Bio-Rad, Hercules, California)にかけた。【０１２０】
その結果、8つの陽性ハイブリドーマが得られた。【０１２１】
これを、5細胞/mlの限界希釈を2回以上行い単クローンとした。【０１２２】
細胞が少数でも増殖するように10%の牛胎児血清(ICN Biomedicals, Aurora, Ohio, USA)と10%のハイブリドーマクローニングファクター(Bio Veris, Gaithersburg, Maryland, USA)を培養液RPMI 1640(Gibco（登録商標）, Invitrogen, Grand Island, New York, USA)に加えた。細胞は5%CO2インキュベーターで、37℃で培養した。【０１２３】
尚、抗体のアイソタイプを、マウスIgG アイソタイピングELISA キット(BD Bioscience, Pharmingen)を用いて調べたところ、８つの陽性ハイブリドーマから得られた抗体のうち、IgG2b型の抗体を分泌する一つの細胞株が得られた。尚、他はIgM であった。【０１２４】
この、IgG2b型の抗体を分泌する細胞株から得られた抗体を、以下、3.4A10と記載する。【０１２５】
［腹水産生と抗体精製］
3.4A10は、下記の様に、マウスの腹水中に産生させ、精製することによって得られた。【０１２６】
0.5mlのプリスタン(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)を6-8週齢のBalb/cマウス腹腔に注射し、1週後ハイブリドーマを注射した。
ハイブリドーマ細胞はウシ胎児血清を除く為にPBSで2回洗浄後5×106細胞/ml PBSに調整した。その2mlをマウス腹腔に注射し、腹水がたまるのを2週間待った。
腹水がたまらない場合、もう一度ハイブリドーマ細胞を注射した。
腹水は16ゲージ注射針を用いて腹水が出なくなるかマウスが死亡するまで3日毎に採取した。腹水は1500×gで10分間、室温で遠沈した。上澄をとり、4℃に保存した。【０１２７】
モノクローナル抗体はAKTA FPLCシステム(Amercham Bioscience, Uppsala)を用いてAffi-Gel Protein AMAPS（登録商標）IIキット(Bio-Rad)を用いて精製した。【０１２８】
精製したモノクローナル抗体はPBSに対して透析を行った。4回の透析後0.22μmのフィルター(MILLEX（登録商標）-GV PVDF Syringe driven filter unit, Millipore, Cork)に通した。蛋白濃度はBCA（登録商標）protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)を用い、ウシガンマグロブリン(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)を標準として測定した。生体投与する為にはエンドトキシンをProteoSpin（登録商標）endotoxin removal kit(Norgen Biotek, Ontario, Canada)で除去した。【０１２９】
［第二段階スクリーニング］
次に、第二段階として、脳組織中のプラークに沈着したＡβへの親和性のあるものをスクリーニングした。【０１３０】
（老人斑の染色）
御家族よりAD研究に使用することが許可されたAD患者の剖検脳の連続凍結切片を作製し、100μmおきに3対の切片を用意し、この６つの切片を、各々70%ギ酸で室温20分間固定した。TBS-Tで洗浄後、0.3%H2O2のメタノール液で30分間インキュベートし、内因性のペルオキシダーゼを消去した。【０１３１】
TBS-Tで洗浄後、ブロッキングバッファー（5%スキムミルク，TBS液，0.4% TritonX-100及び10%正常ウマ血清含有）で1μg/mlの濃度に調整した、実施例１の抗体（3.4A10）又は比較例２の抗体（4G8）と、室温で1時間インキュベートした。【０１３２】
TBS-Tで洗浄後、ブロッキングバッファーで1:500希釈したビオチン化ウマ抗マウスIgG (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)と室温で1時間インキュベートした。洗浄後、HRP化アビジン/ジアミノベンジディンキット(Vector Lab)で発色させた様子を観察した。芯を有する老人斑と芯を有しない老人斑の数を数え、3.4A10と後述する比較例２の抗体（4G8）を比較した。
観察と計測の結果を、それぞれ図1-A及び図1-Bに示す。【０１３３】
図1-Aから分かる通り、第一段階でスクリーニングした抗体（3.4A10）は、比較例２の抗体（4G8）と同様、古典的老人斑とびまん性老人斑を似たように染色したが、図1-Bからは、3.4A10が芯のある老人斑を染色する頻度は、全老人斑の7.5±1.57%であり、比較例２（4G8）の14.93%±2.7%に比べて、有意に少ないことが分かった(p＜0.05)。【０１３４】
この結果を確かめる為に、更に別の3対の切片を染色したが、結果は同じであった(データは示されていない) 。【０１３５】
つまり、第一段階のスクリーニングで得られた3.4A10は、TAPIR抗体であったことが確認できた。【０１３６】
上記で得られた実施例１のTAPIR抗体（3.4A10）のアミノ酸配列及び遺伝子配列を、配列番号１９〜２２に示す。【０１３７】
配列番号１９：3.4A10のV鎖アミノ酸配列【０１３８】
配列番号２０：3.4A10のV鎖遺伝子配列【０１３９】
配列番号２１：3.4A10のL鎖アミノ酸配列【０１４０】
配列番号２２：3.4A10のL鎖遺伝子配列【０１４１】
［比較例］
尚、実施例との比較のために、下記の、公知のＡβ蛋白質抗体を用いた。
また、各種の試験を実施するに際し、以下の参考例の抗体も利用した。【０１４２】
《比較例１》
マウス抗ヒトAβモノクローナル抗体6E10(AβのN末1-17位アミノ酸を認識するモノクローナル抗体。Chemicon International, Temecula, California)【０１４３】
《比較例２》
マウス抗ヒトAβモノクローナル抗体4G8(Aβの17-24位アミノ酸を認識するモノクローナル抗体。Signet, Dedham, Massachusetts)【０１４４】
《比較例３》
マウス抗ヒトAβモノクローナル抗体12F4(Aβ1-42のC末を認識するモノクローナル抗体。Signet)【０１４５】
《比較例４》
マウス抗AβPP A4モノクローナル抗体22C11(Ａβ前駆体ＡβＰＰを認識するモノクローナル抗体。Chemicon Internat)
尚、AβPP A4とは、Ａβ蛋白質前駆体ＡβＰＰの一部である。【０１４６】
《参考例１》
ハムスター抗マウスCD3eモノクローナル抗体（マウスT細胞抗原の一種CD3eを認識するモノクローナル抗体。BD Bioscience Pharmingen, Samdose, California）【０１４７】
《参考例２》
ラット抗マウスCD19モノクローナル抗体(マウスB細胞抗原の一種CD19を認識するモノクローナル抗体。BD Bioscience Pharmingen, Samdose, California)【０１４８】
《参考例３》
ウサギ抗全Aβポリクローナル抗体(全長Ａβ（Ａβ1-42）を認識するポリクローナル抗体。Biosource, Camarillo, California)【０１４９】
《対照例１》
正常マウスIgG【０１５０】
以下、実施例及び比較例，対照例のモノクローナル抗体等について、各種の確認試験を行った。【０１５１】
［モノクローナル抗体の試験管内分析］
ドットブロット及びウェスタンブロットによるAβペプチドとアミロイド前駆体蛋白（AβPP）の検出：
実施例１の抗体（3.4A10）の認識エピトープを調べる為に、先ず色々なAβペプチドフラグメントとの親和性を調べ（ドットブロット及びウェスタンブロット−１）、その後、Ａβ前駆体との親和性についても調べた（ウェスタンブロット−２及びAβPP遺伝子導入SH-SY5Y生細胞の染色試験）。【０１５２】
（ドットブロット）
Aβ1-28とAβ34-42はSigma-Aldrich(Missouri, USA)から、Aβ25-35，Aβ1-40とAβ1-42はペプチド研究所（大阪，日本）から購入した(商品コード「4309-v」，「4307-v」，及び「4349-v」，ペプチド研究所，大阪，日本)で。【０１５３】
AβペプチドはDMSOに1mMの濃度で溶解し、4μg/mlの濃度にPBSで希釈した。
各ペプチドの100μlの溶液を、ドットブロット装置(Bio-Rad)を用いて0.2μmのニトロセルロース転写膜(Whatman GmbH, Dassel, Germany)に転写し、TBSに溶解した5%スキムミルクで、室温下30分作用させた。軽く純水で洗浄後、StartingBlocking（登録商標）T20ブロッキングバッファー（Tween 20 含有TBS，Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA）で1μg/mlの濃度に調整した3.4A10(本発明のモノクローナル抗体)あるいは4G8（比較例２の公知の抗体）をかけ、室温1時間インキュベートした。その後TBS-Tで3回洗浄し、ブロッキングバッファーで1:2000に希釈したヤギ抗マウスIgG (H&L)-HRPO(American Qualex)を室温下1時間作用させた。洗浄後、化学発光試験薬(PerkinElmer, Boston)で発色した。
尚、HRPOとは、西洋ワサビペルオキシダーゼである。【０１５４】
その結果、実施例１の3.4A10は、Aβ1-42，Aβ1-40，Aβ1-28の順に濃く検出されたが(図2-Aの(1))、Aβ25-35，Aβ34-42は検出されなかった(データは示されていない)。
一方、陽性コントロールとして用いた4G8では、Aβ1-28，Aβ1-40，Aβ1-42が、同等の濃さで検出された(図2- Aの(2))。【０１５５】
（ウェスタンブロット−１）
次に、ウェスタンブロットにより、各種のＡβペプチドと3.4A10との親和性を測定した。
ウェスタンブロットには100ngのAβ1-28，Aβ1-40，Aβ1-42を16.5%ペプチドSDS-PAGEゲル(Bio-Rad)に載せ、0.2μmのニトロセルロース膜に200mAで1時間転写した。その後の操作はドットブロットと同じである。【０１５６】
ウェスタンブロットの結果、3.4A10は、Aβ1-40のモノマーよりはるかに強くAβ1-42に結合し、Aβ1-28モノマーには反応しなかった(図2- Aの(3))。【０１５７】
（ウェスタンブロット−２）
次に、各種のＡβ前駆体との親和性を調べた。【０１５８】
αセクレターゼで切断されてできた分泌型AβPPα、未成熟AβPP、及び成熟AβPPは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に、ヒト野生型AβPP遺伝子を導入した細胞(国立長寿医療センター研究所の武田和也先生提供)より調整した。【０１５９】
10μlの細胞溶解液を、7.5%SDS-PAGEゲル(Daiichi Pure Chemicals, Tokyo)に載せ、StartingBlocking（登録商標）T20ブロッキングバッファーで1μg/mlに希釈した3.4A10あるいは22C11で検出し、上記の様に視覚化した。【０１６０】
ウェスタンブロットの結果、3.4A10はヒト野生型AβPP遺伝子をヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yに遺伝子導入し、その溶出液をSDS-PAGEで展開した時の、変性させた分泌型AβPPα(sAβPPα)，未成熟AβPP，及び成熟AβPPとは反応しなかった。【０１６１】
これに対し、陽性コントロールとして用いた比較例４の22C11（マウス抗AβPP A4モノクローナル抗体）は、これらと反応した(図2-B)。【０１６２】
尚、3.4A10が自然のままのAβPPとも結合しないことを示す為に、以下の通り、生細胞の染色を行った。【０１６３】
（AβPP遺伝子導入SH-SY5Y生細胞の染色）
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に、野生型ヒトAβPPを発現プラスミドに入れて導入した。【０１６４】
AβPPの細胞外ドメインに対する染色は、以前に報告された方法(Nat.Med.8(2002),1270-1275参照)に従った。
つまり、細胞を、PBS溶液（1% BSA, 10% 正常ロバ血清含有）で5μg/mlに希釈した3.4A10（実施例１），6E10（比較例１），あるいは正常マウスIgG（対照例１）と、4℃で30分間インキュベートし、PBSで軽く洗浄後、細胞を4%パラフォルムアルデヒドで15分固定し、ブロッキングを施し、PBS溶液（1% BSA, 10% 正常ロバ血清含有）で1:500希釈したAlexa-595標識ロバ抗マウスIgG (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)を作用させ、核をPBS溶液で1万倍希釈したHoechest33342(Molecular Probes)で染色した。【０１６５】
その結果、3.4A10と陰性コントロールとして用いた正常マウスIgGは共に、細胞を染色しないことから、細胞表面に表出したAβPPを認識しないことが判明した（図2-Cの(1)：3.4A10／図2-Cの(3)：正常マウスIgG）。
一方、陽性コントロールとして用いた比較例１の6E10は、細胞を染色した(図2-Cの(2))。【０１６６】
自然のままのAβPPや変性させたAβPPと反応しないことは、上述のTAPIR抗体の1つの特徴である。
従って、上述の結果からも、実施例１の本発明のモノクローナル抗体3.4A10が、TAPIR抗体の一種であることが裏付けられた。【０１６７】
尚、ウェスタンブロットの結果からは、抗原認識部位は決定できなかったので、さらにビアコアを用いて詳しい解析を行った。【０１６８】
（ビアコアによるエピトープの検討）
ビアコアを用いて実施例１の抗体（3.4A10）の、Aβ1-40とAβ1-42に対する親和性を調べた。
尚、比較のため、比較例の抗体についても調べた。
10mM酢酸ナトリウム、pH4.0で新しく調整した50μg/ml濃度のAβ1-40とAβ1-42をCM5センサーチップ(Biacore AB, Uppsala)に固定し、Biacore Jシステムで解析した。エピトープの競合解析では、Aβ1-42を固定したCM5チップを、PBSで200μg/mlに希釈した3.4A10を、30μl/minの流速で5分間作用させ、次いで3.4A10（実施例１）と6E10（比較例１），3.4A10（実施例１）と4G8（比較例２），あるいは3.4A10（実施例１）と12F4（比較例３）を、各々20:1の比で混合した液を、同じ流速で3分間作用させ、反応レベルを記録した。【０１６９】
その結果、Aβ1-42を結合させたCM5チップを3.4A10で飽和させた後、他の抗体を流すと6E10のみ反応の増強は見られず、4G8、12F4では2000IU以上の反応増強が見られた(表1)。
このデータは3.4A10の抗原認識部位が6E10と競合することを示している。6E10がAβのN末部分を認識することが分かっていることから、3.4A10の認識部位も、N末部分にあると考えられた。【０１７０】
【表１】
2009104736.tif 000002
【０１７１】
（ビアコアによる親和性の検討）
親和性の検討のため、PBSで100nM〜500nM に希釈した3.4A10を、Aβ1-40又はAβ1-42を固定したCM5チップに、30μl/minの流速で5分間作用させた。その後PBSを流し、抗体の解離を3分間追跡し、BIA evaluationソフトウェア(Biacore AB)を用いて解析した。検査後50mMNaOHを30μl/mlの速度で2分間流し、チップを再生させた。【０１７２】
100nM から500nM の3.4A10を用いて、ビアコア結合カーブを1:1対応とみなし、BIA evaluationソフトウェアを用いて解析した。【０１７３】
3.4A10のAβ1-40とAβ1-42に対する解離定数はそれぞれ3.77×10-8、5.64×10-11であった(カイ2乗検定はそれぞれ10.4と11.7)(表2)。
つまり、3.4A10は、Aβ1-40よりAβ1-42に高親和性を示すことが判明した。【０１７４】
【表２】
2009104736.tif 000003
【０１７５】
これらのデータはドットブロット，ウェスタンブロット，更に上述の老人斑の染色結果とも矛盾しなかった。【０１７６】
（チオフラビンT蛍光スペクトル計測）
3.4A10がAβ1-42の凝集を阻害するか否か、或いは、すでに凝集したAβ1-42を融解するか否かを調べる為に、既報（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93(1996),452-455 / Proc.Natl. Acad. Sci.USA, 94(1997), 4109-4112）の方法に従って、実験を行った。【０１７７】
（１）Aβ1-42の凝集阻害（予防）試験
阻害実験では、新しく調整した25mM Aβ1-42のPBS溶液と3.4A10(最終容量25μl，最終濃度2.5mM)を、10:1のモル比で混合し、37℃で1週間インキュベートし、1mlの5mM チオフラビンT(Sigma Aldrich)のPBS溶液を加え、蛍光強度を、445nmの励起波長，490nmの検出波長で、蛍光分光光度計 (モデルF-2500、日立) を使用して測定した。【０１７８】
尚、抗体を含まないPBSを加えたものをコントロールとした。【０１７９】
その結果、3.4A10は、コントロール（PBS）の凝集量の、36.7±0.67%（低下後の量）までに、Aβ1-42の凝集を抑制していることが分かった(図3-A)。【０１８０】
（２）Aβ1-42の凝集融解（治療）試験
凝集体の融解試験では、10μlの62.5mM Aβ1-42のPBS溶液を37℃で1週間インキュベートすることによって凝集させたものと、その後3.4A10を最終濃度が2.5mM／最終容量25μlとなるように調整し、Aβ1-42：3.4A10＝10:1の比で混和した。これを1mlの5mMチオフラビンT と37℃で48時間インキュベートし、上記の方法で蛍光強度を計測した。【０１８１】
尚、抗体を含まないPBSを加えたものをコントロールとした。【０１８２】
これらの実験は、２つのチューブを用いた実験を3回繰り返し、結果は3回（６チューブ）の平均値を出し、コントロールに対する%で表した。【０１８３】
その結果、3.4A10は、コントロール（PBS）の凝集量を、22.3±3.48%程（低下した量）、低下させた(図3-B)。【０１８４】
［本発明のモノクローナル抗体による治療効果の確認］【０１８５】
本発明のモノクローナル抗体による治療効果を確認するため、下記の試験を行った。【０１８６】
（3.4A10による受動免疫）
PBS溶液に溶解させた3.4A10を、10mg/kg体重の割合で、18カ月齢の雌Tg2576マウス(n=4)の腹腔に毎週1回8週間投与した。対照(n=4)はPBSを注射した。【０１８７】
治療群マウスのうち1匹は、4回の注射後、原因不明で死亡したので、治療群は3匹、対照群は4匹のマウスについて検討した。【０１８８】
（免疫組織化学）
8週間の治療後、マウスをジエチルエーテルで麻酔し、心臓より血液を採取した後、頚椎脱臼により安楽殺を行った。一側大脳半球を、4%パラフォルムアルデヒドを用いて4℃で一晩固定し、PBSで洗浄後、徐々に濃度を上げた庶糖液に浸し、脱水した後、O.C.T (Sakura Finetechnical, Tokyo)に包埋した。9μmの厚さの凍結切片をLeicaクリオスタットCM1850で作製し、PBSで洗浄後、5%スキムミルク・0.4%TritonX・100，10%の二次抗体と同じ動物種由来の正常動物血清を含むブロッキングTBSバッファーで、室温下30分間インキュベートし、ブロッキングを行った。そして、下記一次抗体で室温2時間インキュベート後、TBS-Tで洗浄し、ビオチンが結合した二次抗体で、2時間室温でインキュベートし、TBS-Tで再び洗浄し、アビジン・ビオジンHRP/DAB法によって染色した。【０１８９】
アミロイド蓄積の定量的解析はWinroofのソフトウェア(バージョン5.7, 三谷商事（株），福井，日本)を用いて行い、全大脳皮質と海馬について行い、Aβ蓄積面積の全脳面積に対する比で表した。1匹のマウス当たり3つの切片を数え、その平均値からグループの平均値を算出した。【０１９０】
その結果、実施例１の抗体（3.4A10）を投与したマウスでは、対照（PBS）に比べて、大脳皮質及び海馬のアミロイド蓄積の程度が顕著に減少していることが判明した(図4-A)。【０１９１】
アミロイド沈着の占める面積比は、治療群の大脳皮質が0.31±0.09%、海馬が0.59%±0.08%であり、対照のそれぞれ0.72±0.23%、0.99±0.25%に比べて、有意に少なかった(p＜0.05)(図4-B)。【０１９２】
尚、アミロイドの減少を確かめる為に、更に脳組織液中のAβ1-42とAβ1-40のELISAによる定量を行った。【０１９３】
（脳組織抽出液中Aβ濃度のELISA測定）
既報(J. Alzheimer’s Dis.6(2004), 483-488 / FASEB J.21(2007), 2135-48. 参照)の方法に従い、脳の可溶画分と不溶画分を調整した。【０１９４】
即ち、治療群と対照群のマウス大脳半球に、完全蛋白分解酵素阻害剤と20μg/mlのペプスタチンＡ(Roche)を含む1mlTBSを加え、ホモジナイズした後、オプティマTLX超遠心機(Beckman-Coulter, Fullerton, CA,USA)により4℃で1時間，100,000gで遠心し、上澄をTBS可溶画分とした。【０１９５】
沈澱物に1mlの2%SDS/TBSと、完全蛋白分解酵素阻害剤（Roche）を１錠／10ml加え、ホモナイズし、37℃で15分インキュベート後、25℃1時間にて100,000gで遠心し、その上澄を、SDS可溶画分とした。
その沈澱物(Aβの不溶画分に相当)に70%ギ酸を加えてホモジナイズし、100,000gで1時間遠心した。その上澄を1MTris・HCl pH8.0と1:20の容量比で中和し、その上澄を、不溶画分（ギ酸可溶画分）とした。
各々の画分は-80℃で保存した。【０１９６】
SDS可溶画分及びギ酸可溶画分について、β-amyloid ELISAキット(Wako)を用いてAβ量を測定した。上澄は、ELISA kitに付属のスタンダード希釈液で、Aβ1-40の場合は1:2000，Aβ1-42の場合は1:400希釈を行った。得られた値は脳の湿重量で補正し、nmol/g脳で表した。【０１９７】
3.4A10による治療を受けた群と対照群の、SDS可溶画分，及びギ酸可溶画分のAβX-42の量を測定し、下記の表３に示した。
尚、AβX-42とは、少なくともＡβ1-42の末端（42番目）アミノ酸を含む、Ａβ由来フラグメントの集合を表す。【０１９８】
【表３】
2009104736.tif 000004
【０１９９】
表３から分かる通り、対照群と比較した際の、本発明のモノクローナル抗体による治療群のＡβX-42の減少量には、有意差があった。【０２００】
次に、同様にして、3.4A10治療群と対照群の、SDS可溶画分，及びギ酸可溶画分のAβX-40の量を測定し、下記の表４に示した。
尚、AβX-40とは、少なくともＡβ1-40の末端（40番目）アミノ酸を含む、Ａβ由来フラグメントの集合を表す。【０２０１】
【表４】
2009104736.tif 000005
【０２０２】
表４から分かる通り、ＡβX-40の量については、対照群と本発明のモノクローナル抗体による治療群とで、有意差は無かった。【０２０３】
つまり、本発明のモノクローナル抗体は、Ａβ1-40よりも、Ａβ1-42に対して、より治療効果を発揮することが分かった。
このことは、本発明のモノクローナル抗体による治療は、抗体の血管アミロイド（Ａβ1-40）への結合に起因する、脳出血という副作用を起こす可能性が低いことを示唆している。【０２０４】
尚、Aβオリゴマーを、下記の様にして、TBS可溶画分のウェスタンブロットで検出した。【０２０５】
（脳のTBS画分のAβオリゴマーのウェスタンブロット解析）
マウス脳のTBS可溶画分におけるAβオリゴマーを解析するにあたって、10μlのTBS画分を15/25のSDS/PAGEゲル(第一化学薬品（株）)で電気泳動後、0.2μmニトロセルロース膜に転写した。
1:2000希釈の6E10と1:5000希釈HRP標識ヤギ抗マウスIgG (H＆Ｌ)で上述の様に視覚化し、ＡＰＰαと、Aβオリゴマー（１２量体）を検出した。
分子量の標準マーカーとAlpha Ease FCソフトウェア(Alpha Innotech)を用いて、検出された各バンドの分子量を決定し、結果を図4-Cに示した。
各レーンが、各被験マウスの結果である。【０２０６】
図4-Cから分かる通り、3.4A10治療により、Aβ1-42の12量体（分子量56kD）は、対照群に比べて減少した(図4-C)。【０２０７】
（免疫蛍光染色）
末梢に投与した実施例１の3.4A10が脳に入ったかどうかを調べる為に、脳の切片を、ブロッキングバッファー(10%正常ロバ血清と2%ウシ血清アルブミンを含むPBS)で1μｇ/mlの濃度に調整した参考例３の、ウサギ抗全Aβポリクローナル抗体と室温で1時間インキュベートした後、ブロッキングバッファーで30分間インキュベートした。【０２０８】
TBS-Tで3回洗浄後、PBS溶液（1% BSA, 10% 正常ロバ血清含有）で1:500に希釈したAlexa594（赤色）標識ロバ抗マウスIgG抗体（3.4A10の検出用抗体）または1:500希釈Alexa488（緑色）標識ロバ抗ウサギIgG抗体(Molecular Probes)（ウサギ抗全Aβ抗体の検出用抗体）で室温1時間インキュベートし、PBSTで2回、PBSで1回洗浄後オリンパスＩＸ70（オリンパス，東京，日本）顕微鏡で観察、ニコンデジタルカメラDXM1200F（ニコン，東京，日本）で記録した。【０２０９】
免疫蛍光染色の結果、赤色に光る実施例１の3.4A10が、ウサギ全Ａβ抗体が検知する、緑色に光る老人斑の一部と、一致して見られるところから、3.4A10が脳内に入っていることが分かった(図5-A上段)。【０２１０】
これに対して、Alexa594で標識したロバ抗マウスIgGは、実施例１の3.4A10で治療を行わなかった対照マウスの老人斑を染色することはなかった(図5-A下段)。【０２１１】
尚、ミクログリアの活性化を見る為には、脳の切片を、Iba-1（緑色）抗ミクログリアポリクローナルウサギ抗体（国立・精神神経センター神経研究所，今井先生提供）1μg/mlで染色し、上記のようにそれぞれPBS溶液（1% BSA, 10% 正常ロバ血清含有）で1:500に希釈した、Alexa488標識ロバ抗ウサギIgG抗体とAlexa594標識ロバ抗マウスIgG抗体で検出した。
3.4A10陽性老人斑，及び3.4A10陰性老人斑と関連する、ミクログリアの数をそれぞれ数え、平均値を比較した。【０２１２】
3.4A10が付着した老人斑（3.4A10陽性老人斑）と、付着していない老人斑（3.4A10陰性老人斑）で、ミクログリアの数を比較したところ、3.4A10が付着した老人斑では、より多くのIbal陽性ミクログリアに取り囲まれていた(9.28±1.80対5.43±1.51、p＜0.001)(図5-B、5-C)。【０２１３】
（細胞性免疫確認試験及び脳出血確認試験）
本発明のモノクローナル抗体を用いた治療が、能動免疫の副作用である、細胞性免疫や、Ａβ1-40に対する抗体等が引き起こす脳出血等を伴わないことを確認するため、下記の（１），（２）の試験を行った。【０２１４】
（１）細胞性免疫確認試験
実施例１の抗体での治療によって、細胞性免疫が起こっているか否かを調べるため、3.4A10で治療したマウスの脳を、ヘマトキシリン・エオジン染色と、T細胞のマーカーである参考例１のCD3e抗体及びB細胞のマーカーである参考例２のCD19抗体で免疫染色して、脳のリンパ球浸潤を調べたが、対照との間に組織学的及び免疫組織化学的違いは見られなかった(図６中のA〜F)。
つまり、能動免疫における副作用のようなリンパ球の脳への浸潤が起こっていないことが分かった。【０２１５】
尚、CD3e、CD19に対する抗体は、1μg/mlの濃度で用いた。
組織はヘマトキシリンにより対比染色を行った。【０２１６】
（２）ベルリンブルー染色
マウス脳の出血病変を検出する為に、ベルリンブルー染色を用いた。
脳切片を2%フェロシアン化カリウム：2%塩酸＝1vol:1vol溶液に、室温下30分浸漬し、純水で洗浄後、ケルネヒトローロ（Kernechtrot）染色液(Muto Pure Chemicals)と2分間インキュベートした。
各マウスよりとった脳の3切片における染色陽性の血管を数え、個々の平均からグループの平均を計算した。【０２１７】
その結果、実施例１の抗体（3.4A10）治療マウスの脳には、ベルリン・ブルー染色陽性の血管は治療群で少し増加していたが、統計学的には有意では無く(1.67±1.17対0.42±0.21，p=0.27)、従来の受動免疫における副作用である、リンパ球の浸潤や、微小出血の明らかな増加は見られなかった。
尚、両群のベルリン・ブルー染色陽性の血管は図６中のG，Hに示してある。【０２１８】
尚、上記の試験例において、すべての結果は特別記載がない場合は平均±標準誤差で表し、2群間の有意差比較はStudent tテストで解析した。
【実施例２】
【０２１９】
［本発明の抗体を含む注射剤用製剤（粉末）］
下記のような組成で、本発明の抗体を含む、注射用粉末剤を作製する。
実施例１の抗体    150mg
トレハロース      130mg
L-ヒスチジン      3mg
【実施例３】
【０２２０】
［本発明の抗体を含む注射剤］
アンプルに入れた実施例２の粉末剤を、日局注射用水7.2ml及び希釈剤である日局生理食塩水250mlを添加して溶解させ、注射剤を作製する。
【産業上の利用可能性】
【０２２１】
本発明のモノクローナル抗体は、脳出血や脳脊髄炎等の副作用無しで、アルツハイマー等の、アミロイド蛋白質の脳組織その他への沈着に起因する疾病の、予防又は治療剤としての使用が可能である。
【図１−Ｂ】
2009104736.tif 000006
【図３−Ａ】
2009104736.tif 000007
【図３−Ｂ】
2009104736.tif 000008
【図４−Ｂ】
2009104736.tif 000009
【図５−Ｃ】
2009104736.tif 000010
【図７】
2009104736.tif 000011
【図８】
2009104736.tif 000012
【図９】
2009104736.tif 000013
【図１０】
2009104736.tif 000014
【図１１】
2009104736.tif 000015
【図１２】
2009104736.tif 000016
【図１−Ａ】
2009104736.tif 000017
【図２−Ａ】
2009104736.tif 000018
【図２−Ｂ】
2009104736.tif 000019
【図２−Ｃ】
2009104736.tif 000020
【図４−Ａ】
2009104736.tif 000021
【図４−Ｃ】
2009104736.tif 000022
【図５−Ａ】
2009104736.tif 000023
【図５−Ｂ】
2009104736.tif 000024
【図６】
2009104736.tif 000025
【配列表】
2009104736000001.app
【国際調査報告】
2009104736.tif 000026
2009104736.tif 000027
2009104736.tif 000028
2009104736.tif 000029