(57)【要約】  本発明は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する方法等を提供するものである。  本発明のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法は、（ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、（ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、を含むことを特徴とする。
2009144914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖構造か二本鎖構造かＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｄ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンであるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
【請求項４】
試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べることにより、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下に置く工程と、
（ｂ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｃ）前記（ａ）工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｅ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
【請求項６】
請求項４に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）テロメラーゼの基質となるＤＮＡを含む基質溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
（ｄ）前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるＤＮＡ付加反応が行われる条件下に置く工程と、
（ｅ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｆ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記（ｄ）の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｈ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項９】
請求項７に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているテロメラーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡの高次構造の検出方法およびそれを利用した診断方法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは真核生物の染色体の両末端部分に位置するＤＮＡとさまざまなタンパク質からなる構造である。これまでの研究より、このテロメア構造がある種のＤＮＡ分解酵素や不適切なＤＮＡ修復などから染色体を保護していることが明らかになっている。またこのテロメア部分は細胞分裂のたびに短くなることから細胞の老化や不死化と呼ばれる現象において重要な役割を担っていると考えられている。【０００３】
一方、テロメアを構造的な側面から見るといくつかの特徴を有していることが分かる。すなわち、染色体ＤＮＡ中のほとんどの部分では、互いに相補的な二本のＤＮＡ鎖間において、アデニン（以下、Ａと呼ぶ）塩基とチミン（以下、Ｔと呼ぶ）塩基、グアニン（以下、Ｇと呼ぶ）塩基とシトシン（以下、Ｃと呼ぶ）塩基がそれぞれ特異的に水素結合してワトソン−クリック型塩基対を形成し、さらにその塩基対間においてπ−πスタッキング相互作用が生じることで二重らせん構造が構築されている（図１）。【０００４】
しかし、テロメアＤＮＡにおいては、やはりその大部分は互いに相補的な二本鎖ＤＮＡからなるものの、その最末端部分はＤＮＡの３’末端が突出（オーバーハング）して一本鎖状態になっている。このオーバーハングした部分の長さや、テロメアの全長は種によって異なるが、ヒトの場合はオーバーハングした部分は５０−１００塩基程度、全長は初期の段階で約１００００塩基対程度である。そしてテロメア配列のもう一つの構造的特徴としては、オーバーハングしている側の鎖はＧを多く含む繰り返し配列からなり、したがってその相補鎖となるもう一方の鎖はＣを多く含む繰り返し配列であるという点である。【０００５】
具体的には、ヒトの場合はオーバーハングしている側の鎖が５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’ （配列番号：１）の繰り返し（Ｇリッチな配列）であり、もう一方は５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’ （配列番号：１のアンチセンス鎖）の繰り返し（Ｃリッチな配列）となる。【０００６】
近年、テロメア部位中のＧリッチな配列が特に精力的に研究されている。その理由は、この配列がＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる四重鎖ＤＮＡ構造を形成できるということが明らかになってきたためである。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）には、四本のＤＮＡ鎖全ての５’から３’への方向が同じ方向を向いているパラレル型と呼ばれるものや、あるいは二本は同じ方向を向いているが残りの二本は反対方向を向いているアンチパラレル型と呼ばれるものなど複数のパターンが知られているが、いずれも図２に示すような特徴を有している。すなわち、４つのＧ塩基がフーグスティーン型の水素結合を介してＧカルテットと呼ばれる構造を形成し、さらにこのＧカルテット面どうしがπ−πスタッキング相互作用することによって構造を保持している。【０００７】
また、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造形成にはＧ−カルテット面とＧ−カルテット面の間において金属イオンの配位が必要であり、ＫイオンやＮａイオンなどが配位することが知られている。このようなＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘがテロメア内においてどのような条件下で形成され、またそれがどのような機能を果たしているのかについての詳細は現時点では不明である。しかしながら上述の染色体保護や細胞の老化などと関連する重要な構造ではないかと考えられている。【０００８】
またさらに、上記のようなＧリッチな配列はテロメアだけに存在するわけではないことも明らかになってきている。例えば、ガン原遺伝子であるｃ−ｍｙｃ中においてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列が存在する。また、これ以外にもｃ−ｋｉｔ、ｂｃｌ−２、ＶＥＧＦ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域においてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列が発見されている。これらはいずれも細胞のガン化などに関連する遺伝子であり、このことは、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが人体に対して重要な役割を果たしていることを示唆している。そして現在のところ、さらに、３０万を超えるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成可能なＧリッチ配列が存在すると予想されており（以下、このような配列をＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列と呼ぶ）、これらが実際にＧｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するのか、そして形成するのであればその構造がどのような機能を果たしているのかが注目されている。【０００９】
このような技術背景において最も必要とされる技術の一つが、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する方法である。すなわち試料中のＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを含んでいるか否か、あるいは試料中のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列からなるＤＮＡが実際にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる技術が必要とされる。例えば、前者について従来技術を用いて調べるとすると、次のように示すようになる。すなわち、目的のＤＮＡを含む試料溶液を用意し、この溶液のＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：円二色性）スペクトルを測定する。そして、得られたＣＤスペクトルがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特有のものであるか否かについて解析すればよい。しかし、ＣＤスペクトルを測定する装置は非常に高価かつ大型である。また解析時間も３０分程度と長時間を要する上に、一度に解析できる試料数も通常一種類であるため、ハイスループット性の面で著しく劣る。さらに四重鎖の形によっては、ＣＤを用いることでＤＮＡの他の形からと識別することができないという問題もある。【００１０】
この課題に対する解決手段としては、図３に示すように、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの有無に依存して、安価な装置で解析可能なシグナル（吸光度や蛍光強度など）を発するプローブ材料を上記溶液中に混合しておき、この溶液中のシグナルを検出する方法が挙げられる。このとき重要なのは、このプローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性である。すなわちゲノムＤＮＡ中には、その大部分を占める二本鎖ＤＮＡ構造と、上述のテロメア部位のオーバーハング部分に代表される一本鎖ＤＮＡ構造が存在するため、これらと比較した場合のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が重要となる。したがって、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのみの有無を調べたいにも関わらず、プローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が低く、その結果、一本鎖や二本鎖ＤＮＡとも相互作用してシグナルを発してしまえば、溶液中のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを正確に検出するのは困難となるためである。【００１１】
また、試料中のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡが実際にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて従来技術を用いて調べる場合は、図４に示すようになる。すなわち、まずＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列を有するＤＮＡを溶液中に用意する。その後、この溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下におき、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせる。そして、反応後の溶液中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが存在しているか否かについてＣＤスペクトル測定を行うことで解析すればよい。ただし、この場合においても、上述したとおり装置が高価、大型であるという課題、およびハイスループット面での課題が生じる。したがって、やはりこの場合においても、図３で示したＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出用プローブがあれば非常に有用である。【００１２】
具体的には、図５に示すように、このプローブを、上記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の溶液に混合し、その結果発せられるシグナルを測定すればよい。このとき、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応前のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡは、上述のとおり、一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡの何れの可能性もあり得るため、プローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性は極めて重要である。つまり、上記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後において、Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを全く形成しなかった場合や、あるいは一部しか形成しなかった場合に、上記プローブがＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡのもとの構造（一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡ）に対しても相互作用しシグナルを発してしまえば、形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを正確に検出するのは困難となるためである。逆にプローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性が極めて高い場合、図５に示す方法において、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応前から溶液中にプローブを混合しておくことも可能となり、操作の煩雑性も防ぐことができる。【００１３】
上記のとおり、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列は、染色体中のガンや老化などに関わる部位において発見されており、それゆえ将来的には患者の染色体中のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを調べることで疾病診断を行うことが予想される。したがって、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できる方法の開発は非常に重要な課題と言える。また上記プローブの特性として、単にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘやＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡを特異的に検出できるだけではなく、それらの存在量に依存してシグナルの増大あるいは減少といった変化があれば、単なる検出のみならず定量的な解析も可能となるためより有用となることは言うまでもない。【００１４】
また、テロメラーゼと呼ばれる酵素が知られている。この酵素はＲＮＡと逆転写酵素などからなる複合体であり、細胞分裂によって短くなるテロメア部位のＧリッチな側の繰り返し配列を複製し、伸ばしていくことができる（すなわちヒトの場合、テロメラーゼは５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列（配列番号：１）を付加していく。以下、この付加反応をテロメラーゼ反応と呼ぶ）。この酵素はヒトの通常の体細胞には見られないが、生殖細胞やほとんどのガン細胞において大量に発現していることが知られており、そのためテロメラーゼ活性を指標として被験者の細胞がガン化しているか否かについて調べることができる。【００１５】
この従来方法として、ＴＲＡＰアッセイと呼ばれるものが知られている。ＴＲＡＰアッセイについて図６を用いて説明する。ＴＲＡＰアッセイでは、まずテロメラーゼの鋳型となる合成一本鎖ＤＮＡを含む溶液を調製する。この一本鎖ＤＮＡは通常５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：２）という配列からなるもので、ＴＳプライマーと呼ばれる（したがって、テロメラーゼはこのＴＳプライマーの３’末端に５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列（配列番号：１）を付加していく。非特許文献３を参照）。ただし、ＴＳプライマーはこの配列に限られる必要はなく、テロメラーゼの鋳型となる一本鎖ＤＮＡであればよい。【００１６】
次に、この溶液中にガン化していると疑われる細胞試料や組織試料からの抽出物を添加、混合し、テロメラーゼ反応が行われる条件下に置く。ここで、もしこれら試料がガン化しているのであればテロメラーゼ活性があるため、ＴＳプライマーを起点としたテロメラーゼ反応が起こる。一方、ガン化していなければテロメラーゼ反応は起こらない。そして最後にテロメラーゼ反応により伸長されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法により検出する。【００１７】
テロメラーゼ反応より得られるＤＮＡの長さはさまざまであるため、得られる電気泳動像は図７のようになる。すなわち、用いた試料のテロメラーゼ活性が強い場合、得られるＤＮＡ断片の長さは短いものから長いものまで広範囲にわたるラダー（はしご）状のバンドとして現われ、またそのバンドの濃さは濃い傾向にある。一方、活性の弱いテロメラーゼからは長いＤＮＡ断片は得られないため、短い範囲でのラダー状のバンドが現れ、またバンドの濃さは薄い傾向にある。したがって試料のガン化を判断するためには、ＴＲＡＰアッセイの結果より得られる電気泳動像のＤＮＡ断片の長さの範囲とバンドの濃さを解析すればよいのだが、これを定量的に解析することは困難であるため、あくまで定性的な判断となってしまう。【００１８】
このような点に関して、図３および図５で説明したＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出用プローブが、単にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的なだけではなく、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの存在量に依存してそのシグナル量を変える場合、テロメラーゼの活性を指標にしたガン診断においても有用である。その流れ図を図８に示す。【００１９】
この方法においても、まずＴＳプライマーを含む溶液を調製する、次にこの溶液中へ細胞試料や組織試料からの抽出物を添加、混合する、そして、この溶液についてテロメラーゼ反応を行わせた後、ＰＣＲ法によってテロメラーゼ反応により伸長されたＤＮＡを増幅させる、という操作までは図６と同じである。しかし、図８に示す方法では、このＰＣＲ後の溶液について電気泳動するのではなく、図５の場合と同様にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせる。その結果、形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｌｅｘをＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出用プローブを用いて検出する。ここで、形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量はテロメラーゼ活性の強さを反映しているため、上記プローブがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に応じてそのシグナル量を変えるのであれば、この方法により定量的なテロメラーゼ活性の解析およびガン化の判断を行うことが可能となる。【００２０】
言うまでもなくここでもプローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が極めて重要となる。つまり、細胞試料がガン化していない場合、テロメラーゼ反応は進行しないことになるが、その結果、一本鎖ＤＮＡであるＴＳプライマーがそのまま反応液中に残る。また、さらにその後のＰＣＲ反応も進行しないため、ＰＣＲ反応用のプライマーも一本鎖ＤＮＡの状態で残る。したがって、細胞試料がガン化していない場合は、最終的に反応溶液中に大量の一本鎖ＤＮＡが存在していることになり、上記プローブがこれら一本鎖ＤＮＡと反応しシグナルを出してしまえば、定量的なテロメラーゼ活性解析およびガン診断が困難となるためである。【００２１】
以上、説明してきたように一本鎖、二本鎖ＤＮＡのいずれかが溶液中に存在しえる状況において、特異的にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出可能な方法は非常に有用である。またさらに定量性も備えていれば定量的なＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出が可能となるだけでなく、従来のＴＲＡＰアッセイの課題を解決できる。そのため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと特異的に相互作用し、かつ、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に依存してシグナルを変化させるプローブを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法の開発が精力的になされている。【００２２】
例えば、特許文献１ではＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的な新規化合物を提案している。しかし、このプローブは確かに一本鎖、二本鎖ＤＮＡに比べＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの結合選択性は高いものの、一本鎖、二本鎖ＤＮＡに対しても結合が確認できる。【００２３】
また、非特許文献１では下記（化１）の構造からなるカチオン性ポルフィリンのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性について報告がなされている。この文献ではＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：表面プラスモン共鳴）現象を利用して、金基板上での上記ポルフィリンと二本鎖構造ＤＮＡあるいはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとの結合を解析しており、その結果、確かに二本鎖ＤＮＡの場合に比べＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合の方がシグナルの変化は大きいものの、二本鎖ＤＮＡの場合においてもシグナルの変化は観察され、十分な特異性は確認されない。【００２４】
【化１】
2009144914.tif 000003
【００２５】
また、非特許文献２では下記（化２）および（化３）の構造からなるカチオン性ポルフィリンなどのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性について報告がなされている。この文献でも、やはりＳＰＲ現象や紫外可視吸光スペクトルを解析することで、これらポルフィリンのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異的結合が調べられているが、ＤＮＡ濃度が５μＭ以上の条件下において二本鎖ＤＮＡとこれらポルフィリンが非特異的に結合してしまうことが記されている。【００２６】
【化２】
2009144914.tif 000004
【００２７】
【化３】
2009144914.tif 000005
【００２８】
以上のように、これまでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を目的として開発されてきたプローブはいずれもカチオン性のものである。これはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘがアニオン性であり、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへ結合させるという観点から考えた場合、カチオン性であることが非常に有利であると考えられるためである（すなわちアニオン性にすると静電的な反発が起こり、結合反応において不利と考えられる）。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに限らず全てのＤＮＡ鎖はアニオン性であるため、これらをターゲットとしたプローブを開発する場合はカチオン性にすることが最も重要な設計指針であり、アニオン性にするという考え方はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７２０２７号パンフレット
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，１５０２−１５０３
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６８５−４６８７
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，２５９５−２５９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
以上のように、一本鎖、二本鎖ＤＮＡのいずれかが溶液中に存在しえる状況において、特異的にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出可能な方法は非常に有用である。またさらに定量性も備えていれば定量的なＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出が可能となるだけでなく、従来のＴＲＡＰアッセイの課題を解決できる。そのため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと特異的に相互作用し、かつＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に依存してシグナルを変化させるプローブを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法の開発が精力的になされているものの、これまで提案されてきた方法ではいずれの場合もＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できない。そこで本発明者は鋭意検討した結果、アニオン性の平面型フタロシアニンがアニオン性であるにも関わらず、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと極めて高い特異性をもって相互作用し、なおかつＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの濃度に依存して吸光度が変化することを見出し、本発明を達成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
上記課題を解決する本発明は、一本鎖構造か二本鎖構造かＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中の、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｄ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法である。【００３３】
また、本発明は、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べることにより、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下に置く工程と、
（ｂ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｃ）前記（ａ）工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｅ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法である。【００３４】
また、本発明は、試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）テロメラーゼの基質となるＤＮＡを含む基質溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
（ｄ）前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるＤＮＡ付加反応が行われる条件下に置く工程と、
（ｅ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｆ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記（ｄ）の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｈ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法である。【００３５】
本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンが、配位金属として銅、と錯形成しているもの、亜鉛、と錯形成しているもの、コバルト若しくはと錯形成しているもの、ニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンと錯形成しているもの、錯形成していないもの、からなる群より選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。【００３６】
また本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有していることが好ましい。【００３７】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明により、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的かつ定量的に検出する方法、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるＤＮＡを特異的かつ定量的に検出する方法、およびテロメラーゼ活性測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、二本鎖ＤＮＡの構造を説明するための図である。
【図２】図２は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を説明するための図である。
【図３】図３は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法を説明するための図である。
【図４】図４は、ＣＤ解析装置を用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。
【図５】図５は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。
【図６】図６は、従来のテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。
【図７】図７は、従来のテロメラーゼ活性測定方法より得られる電気泳動像の一例を示す図である。
【図８】図８は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。
【図９】図９は、アニオン性フタロシアニンを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法を説明するための図である。
【図１０】図１０は、アニオン性フタロシアニンを用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。
【図１１】図１１は、アニオン性フタロシアニンを用いたテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。
【図１２】図１２は、実施例２における、ＣＤ測定結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例２における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例２における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例２における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、実施例２における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例１における、ＣＤ測定結果を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例１における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、実施例１における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、実施例１における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例１における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２２】図２２は、実施例３における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２３】図２３は、実施例３における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２４】図２４は、実施例３における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２５】図２５は、実施例４における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２６】図２６は、実施例４における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２７】図２７は、実施例４における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２８】図２８は、実施例４における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２９】図２９は、本実施例１〜４の結果をまとめた図である。
【図３０】図３０は、フタロシアニンが会合した状態の場合と、分散した場合の典型的な吸光度スペクトルを表す図である。
【図３１】図３１は、本発明のメカニズムを表す図である。
【図３２】図３２は、平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンを表す図である。
【図３３】図３３は、実施例１における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図３４】図３４は、実施例２における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図３５】図３５は、実施例３における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図３６】図３６は、実施例４における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下本発明の実施の形態について、図９〜１１を用いて説明する。
【００４１】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、一本鎖構造か二本鎖構造かＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中の、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法について図９を用いて説明する。
【００４２】
本実施の形態１では、まず試料溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合する。そして次にこの混合した溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内の特定の波長における吸光度を測定する。このとき、上記試料溶液中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０〜７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れるが、その一方で、一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしても上記波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの有無を解析することで、上記試料溶液中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在していたか否かを知ることができる。
【００４３】
ピークの有無を解析するには、例えば、少なくともＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが含まれていないことが分かっている参照溶液を調製し、これについても上記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と混合した際の上記特定の波長における吸光度を測定し、これと試料溶液を用いた際に得られた吸光度値との差を求めればよい。
【００４４】
さらに、この上記吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。したがって、吸光度を解析することによりＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度を解析することができる。
【００４５】
実施の形態１で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
【００４６】
また、実施の形態１で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
【００４７】
また、上記特定の波長は６４０〜７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
【００４８】
（実施の形態２）
本実施の形態２では、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法について図１０を用いて説明する。
【００４９】
本実施の形態２では、まず上記試料溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合し、これをＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置いてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせた後、この混合溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内における特定の波長の吸光度を測定するか（図１０（Ａ））、あるいは上記試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置いてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせた後、アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と混合し、この混合溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内
における特定の波長の吸光度を測定する（図１０（Ｂ））。このとき、上記実施の形態１と同様に、この混合溶液中においてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０〜７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。
【００５０】
しかし、その一方でこの混合溶液中に一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしてもこの波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの有無を解析することで、上記試料溶液中のＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成したか否かを知ることができる。ピークの有無を解析する手段としては、例えば、ＤＮＡが含まれていないか、あるいは含まれていたとしてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しないＤＮＡしか含まれていない参照溶液を調製し、この参照液について、上記試料溶液の場合と全く同じ工程を経て吸光度値を測定し、上記試料溶液の場合の吸光度値との差を解析すればよい。
【００５１】
また、上記吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。したがって、吸光度を解析することにより上記試料中のどれだけの濃度のＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成したかについて定量的に解析することができる。
【００５２】
本実施の形態２で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１と同じく、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
【００５３】
また、本実施の形態２で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１と同じく、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
【００５４】
また、上記特定の波長は６４０〜７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
【００５５】
（実施の形態３）
本実施の形態３では、試料中に含まれるテロメラーゼ活性を定量的に解析する方法について図１１を用いて説明する。
【００５６】
本実施の形態３では、まず上記試料とテロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを含む溶液を混合し、この混合溶液についてテロメラーゼ反応が行われる条件下に置く。このとき、上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれていれば、この条件下に置いてテロメラーゼ反応が行われ、その結果、上記基質一本鎖ＤＮＡから５‘−ＴＴＡＧＧＧ−３’からなるＤＮＡが付加されていくが、その一方で、上記試料中において活性を持つテロメラーゼが存在しなければそのようなＤＮＡ付加は行われない。
【００５７】
そして次に、上記テロメラーゼ反応後の混合溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置く。ここで、仮に上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれ、これによりテロメラーゼ反応が進んでいれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成され、その量は上記試料中のテロメラーゼ活性に依存する（活性が大きければ形成されるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ量も多くなる）。逆に例えば、上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれておらず、その結果、上記テロメラーゼ反応が行われていなければ、ここでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは形成されない。
【００５８】
そして最後に、このＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の混合溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合し、この溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内における特定の波長の吸光度を測定すればよい。このとき、上記実施の形態１や２と同様に、この混合溶液中においてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０〜７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。しかし、その一方でこの混合溶液中に一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしてもこの波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの吸光度値を測定することで上記試料中のテロメラーゼ活性を定量的に解析することができる。
【００５９】
ここで、図１１において上記アニオン性平面型フタロシアニン溶液はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の混合溶液に対して加えられたが、上記アニオン性平面型フタロシアニン溶液を加えるタイミングはこれに限られない。すなわち、テロメラーゼ反応後であり、かつ、吸光度測定前までであれば、どのタイミングで上記試料溶液を含む混合溶液に加えてもよい。
【００６０】
本実施の形態３で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１および実施の形態２と同じく、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
【００６１】
また、本実施の形態３で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１および実施の形態２と同じく、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
【００６２】
また、上記特定の波長は６４０〜７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
【００６３】
［実施例］
以下に記載する実施例で用いられるＤＮＡは、全て北海道システム・サイエンス株式会社の合成品である。また本実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅはシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄおよびＺｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄは（株）フナコシより購入した。Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄは合成した。合成方法は下記のとおりである。
【００６４】
トリメリット酸６．４ｇ、尿素２０ｇ、塩化コバルト六水和物４．７５ｇおよびモリブデン酸アンモニウム四水和物０．８２ｇを１００ｍｌのニトロベンゼン中１７０〜１８０℃の油浴中で４．５時間加熱し、放冷後、デカンテーションでニトロベンゼン層を除いた。残留物をメタノールおよび水で洗浄後、真空乾燥して８．６６ｇの固形物を得た。この固形物１．０ｇを５０％水酸化カリウム水溶液３０ｇ中、７０〜７５℃で２時間攪拌後、９０ｍｌの水を添加、攪拌し、これをろ過した。ここで得られたろ液を３５〜３７％塩酸で強酸性にすることで沈殿物を析出させ、これをろ取した。この沈殿物を１００ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かして再度ろ過した。ここで得られたろ液を再び塩酸によって強酸性にし、析出した沈殿物をろ取した。これを大量の水で洗浄した後、真空乾燥することでＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを０．１ｇの粉末として得た。以下の実施例で用いられるＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄは全てこの合成により得られたものである。
【００６５】
（実施例１）
本実施例では、アニオン性平面型フタロシアニンを用いて、溶液中に存在するアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを含む溶液を調製した。
【００６６】
＜アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを含む溶液の調製＞
まず５’−ｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ−３’の配列（配列番号：３）からなる一本鎖ＤＮＡを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このＤＮＡをヒトテロメアＤＮＡと呼ぶ。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡ濃度は０．５、２、５、１０、２５、５０、１００μＭのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡを含まない５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液も調製した。
【００６７】
次に、これらの溶液を９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした（以降、特に断りなく「アニーリング」あるいは「アニーリング処理」という表現が出てきた場合は、この一連の温度制御のことを言う）。
【００６８】
次に、以上の結果得られた各溶液中のヒトテロメアＤＮＡがアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかを確認するため、各溶液についてＣＤ解析を行った。その結果、図１７に示すように、ネガティブコントロールの溶液を除き、いずれの場合も２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークが認められた。これはアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成されていることを示すものである。
【００６９】
また、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００μＭであった溶液における上記正および負のピークの絶対値は最も大きく、その他については５０、２５、１０、５、２、０．５μＭの順で小さくなっている。このことは最初に含まれていたヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きければ、得られるアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度も大きいということを示している。
【００７０】
以降、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、５、２、０．５μＭであった溶液について上記一連のアニーリング処理を行った結果得られた溶液をそれぞれＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ぶ。一方、ネガティブコントロールとして調製したＤＮＡが含まれていなかった溶液について上記一連のアニーリング処理を行った結果得られた溶液はＮＣ溶液と呼ぶ。
【００７１】
次に、以上の工程より得られたＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによるアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
【００７２】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（配位金属として銅を有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００７３】
測定結果を図１８（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れた。また、このピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できることが分かる。
【００７４】
さらに、図１８（Ａ）で得られた各グラフの６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１８（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【００７５】
また、図１８（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図１８（Ｂ）の場合と同様に、得られた６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【００７６】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（配位金属としてニッケルを有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００７７】
測定結果を図１９（Ａ）に示す。これより、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【００７８】
さらに、図１９（Ａ）で得られた各グラフの６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１９（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【００７９】
また、図１９（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図１９（Ｂ）の場合と同様に、得られた６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【００８０】
＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（配位金属を持たず、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。
【００８１】
次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図２０（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【００８２】
さらに、図２０（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図２０（Ｂ）に示し、７１０．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図２０（Ｃ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【００８３】
また、図２０（Ｂ）および図２０（Ｃ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図２０（Ｂ）および図２０(Ｃ)の場合と同様に、得られた６７７．５ｎｍおよび７１０．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
【００８４】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（配位金属としてコバルトを有し、官能基としてカルボキシル基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００８５】
測定結果を図３３（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【００８６】
さらに、図３３（Ａ）で得られた各グラフの６８４．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図３３（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。また、図３３（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図３３（Ｂ）の場合と同様に、得られた６８４．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
【００８７】
ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合の結果より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【００８８】
＜アニオン性鉄フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅ（配位金属として鉄を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性フタロシアニン）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００８９】
測定結果を図２１に示す。これよりＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂの場合もＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果であった。以上の結果より、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを用いても溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができないことが分かる。
【００９０】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝配位金属として亜鉛を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）についても同様の実験を行った結果、Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液と混合した場合のみ６４０〜７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。
【００９１】
したがって、実施例１の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性平面型フタロシアニンを用いてもアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とサンプル中のヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が認められた。
【００９２】
したがって、以上実施例１の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いても試料溶液中に存在するアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
【００９３】
（実施例２）
本実施例では、アニオン性フタロシアニンを用いて、溶液中に混在するアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡとパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが混在している溶液を調製した。
【００９４】
＜アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡとパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡが混在している溶液の調製＞
まず、ヒトテロメアＤＮＡを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡ濃度は１、２、１０、２５、５０、１００μＭのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡを含まない５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液も調製した。次にこれらの溶液をアニーリング処理した。
【００９５】
次に、以上の結果得られた各溶液中のヒトテロメアＤＮＡがパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかを確認するため、各溶液についてＣＤ解析を行った。その結果を、図１２に示す。
【００９６】
ここで、実施例１でも説明したとおり、アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合は、そのＣＤ測定結果において２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークを示すことが知られている。一方、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合は、２６０ｎｍ付近に正のピーク、２４０ｎｍ付近に負のピークを示すことが知られている。これらの知見を踏まえると、図１２に示されたＣＤ結果では、ネガティブコントロールの溶液以外においては、２４０ｎｍ付近に負のピーク、２９５ｎｍ付近に正のピークが存在することから、これらはパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが混在していると考えられる。
【００９７】
また、２９５ｎｍ付近の正のピーク、２４０ｎｍ付近の負のピークのいずれについても、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きくなるにつれ、その絶対値が大きくなっている。このことは、最初に含まれていたヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きければ、上記アニーリング処理後に得られる溶液中のパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡとアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度の何れもが大きくなるということを示している。
【００９８】
以降、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、２、１μＭであった溶液について上記アニーリング処理を行った結果得られた溶液をそれぞれＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆと呼ぶ。一方、ネガティブコントロールとして調製したＤＮＡが含まれていなかった溶液について上記アニーリング処理を行った結果得られた溶液はＮＣ−２溶液と呼ぶ。
【００９９】
次に、以上の工程より得られたＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ−２溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
【０１００】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＦおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０１】
測定結果を図１３（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。
【０１０２】
以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１０３】
さらに、図１３（Ａ）で得られた各グラフの６８９．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１３（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１０４】
また、図１３（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合においても、図１３（Ｂ）の場合と同様に、得られた６８９．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【０１０５】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０６】
測定結果を図１４（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｅの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１０７】
さらに、図１４（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１４（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１０８】
また、図１４（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合においても、図１４（Ｂ）の場合と同様に、得られた６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
【０１０９】
＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＦおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１０】
測定結果を図１５（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１１１】
さらに、図１５（Ａ）で得られた各グラフの７０８．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図１５（Ｂ）に示し、６７５．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図１５（Ｃ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１１２】
また、図１５（Ｂ）および図１５(Ｃ)は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合においても図１５（Ｂ）および図１５(Ｃ)の場合と同様に、得られた７０８．０ｎｍおよび６７５．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【０１１３】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１４】
測定結果を図３４（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｅの順番で大きいことが分かる。
【０１１５】
以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１１６】
さらに、図３４（Ａ）で得られた各グラフの６７９．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図３４（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１１７】
また、図３４（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合においても、図３４（Ｂ）の場合と同様に、得られた６７９．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【０１１８】
ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【０１１９】
＜アニオン性鉄フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２０】
測定結果を図１６に示す。これよりＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ−２溶液の場合の両方より得られる結果はほぼ同じであることが分かる。したがって以上の結果より、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを用いて溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することはできないことが分かる。
【０１２１】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性平面型フタロシアニンを用いて、同様の実験を行った結果、Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液と混合した場合のみ６４０〜７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。したがって以上の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いても溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。
【０１２２】
また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とサンプル中のヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が認められた。したがって、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いても試料溶液中に存在するアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
【０１２３】
（実施例３）
上記実施例１および実施例２の結果より、アニオン性鉄フタロシアニン以外のいずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもパラレル型、アンチパラレル型に関わらずＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。本実施例３では、これらアニオン性フタロシアニンによるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性について確かめるため、アニオン性フタロシアニンを用いた一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡＤＮＡの検出実験を行った。そのためにまず以下の手順で一本鎖ＤＮＡを含む溶液、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を調製した。
【０１２４】
＜一本鎖ＤＮＡを含む溶液の調製＞
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’の配列（配列番号：４）からなる一本鎖ＤＮＡが５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のＤＮＡは、インキュベート後も一本鎖ＤＮＡである（以降、この溶液を一本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
【０１２５】
＜二本鎖ＤＮＡを含む溶液の調製＞
５’−ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ−３’の配列（配列番号：５）からなる一本鎖ＤＮＡと５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’の配列（配列番号：５のアンチセンス鎖）からなる一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。上記二種類のＤＮＡは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成している（以降、この溶液を二本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
【０１２６】
以上の工程で得られた一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによる一本鎖および二本鎖ＤＮＡ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
【０１２７】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２２（Ａ）および図２２（Ｂ）に示す。
【０１２８】
それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
【０１２９】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２３（Ａ）および図２３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。
【０１３０】
これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は、極めて特異性が高いことが分かる。
【０１３１】
＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２４（Ａ）および図２４（Ｂ）に示す。
【０１３２】
それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。これより、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって、以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
【０１３３】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を、図３５（Ａ）および図３５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。
【０１３４】
これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって、以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
【０１３５】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性フタロシアニン）を用いて、同様の実験を行った結果、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となった。
【０１３６】
（実施例４）
上記実施例１および実施例２では、ヒトのテロメア部分の配列と同じ配列からなる一本鎖ＤＮＡを用い、パラレル型、アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのＤＮＡを調製し、配位金属が鉄以外のアニオン性フタロシアニンによってこれらの検出が可能であることや、あるいはこの検出結果を基にして、上記一本鎖ＤＮＡを定量的に検出できることを示した。本実施例４では、上記実施例１および実施例２の結果が、ヒトテロメア部分の配列からなるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに限られたものであるのか、それともヒトテロメア部分の配列以外からなるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘでも同様の結果が得られるのかについて検討した。
【０１３７】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
まず５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’の配列（配列番号：６）からなる一本鎖ＤＮＡ（以下、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡと呼ぶ）と、２．５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔと５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ配列はヒトテロメア部分の配列とは異なるが、Ｋ＋存在下においてアニーリング処理することでパラレル型のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。上記溶液は、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度が０、１、２、３、４、５、１０μＭのものをそれぞれ用意した。
【０１３８】
次に、これらの溶液をアニーリング処理し、これらについて４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図２５（Ａ）に示す。これより、上記Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
【０１３９】
以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４０】
さらに図２５（Ａ）で得られた各グラフの６８７ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図２５（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１４１】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いて実験を行った。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、３、４、５、１０、２５μＭとした。結果を図２６（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
【０１４２】
以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４３】
さらに図２６（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図２６（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１４４】
＜配位金属をもたないアニオン性フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いて実験を行った。またＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、１０、２５μＭとした。結果を図２７（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れることが分かる。
【０１４５】
以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４６】
さらに、図２７（Ａ）で得られた各グラフの７０５．０ｎｍにおける吸光度値とそのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｂ）に示し、６７４０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｃ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１４７】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’
（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いて実験を行った。ただし、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄの濃度は３０μＭとした。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、５、１０、２５、５０μＭとした。結果を図３６（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
【０１４８】
以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４９】
さらに、図３６（Ａ）で得られた各グラフの６８０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図３６（Ｂ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１５０】
ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【０１５１】
＜アニオン性鉄フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを用いて実験を行った。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、３、４、５、１０、２５μＭとした。
【０１５２】
結果を図２８に示す。これよりいずれの濃度の場合も０μＭの場合と同じ結果であったことが分かる。したがって、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅによってＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できないことが分かる。
【０１５３】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性フタロシアニン）を用いて同様の実験を行った結果、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度が０μＭの場合を除き、いずれの場合も６４０〜７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。したがって以上の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できることが分かった。
【０１５４】
また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が認められた。したがって、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いてもＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
【０１５５】
実施例１〜実施例４までの結果を、各フタロシアニンの構造を示す図とともに図２９にまとめた。図２９中の○は、各実施例のＤＮＡ検出実験において、目的のＤＮＡの存在に依存して６４０〜７４０ｎｍの波長範囲内で吸光度ピークが得られたことを示している。一方×はそのようなピークが得られなかったことを示している。また「−」は実験を行っていないことを示している。これより、アニオン性鉄フタロシアニンの場合を除き、アニオン性官能基の種類（スルホ基かカルボキシル基）に関わらず、また配位金属の種類に関わらず、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できることが分かる。またＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの種類に関してもパラレル型やアンチパラレル型に依存せず、さらに配列についてもヒトテロメアＤＮＡ配列に限られず、図２を用いて説明したＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘであれば検出できることが分かる。
【０１５６】
ところで、フタロシアニンおよびＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘについては下記の二つの重要な事柄が知られている。まず一つ目はフタロシアニンが示す吸光度についてである。フタロシアニン類は通常溶液中に溶かされている場合、その広いπ平面のために互いにスタッキング相互作用を起こし分子間会合している。このときの典型的なＵＶ吸収スペクトルが図３０（Ａ）に示すものである。一方、この状態のフタロシアニンの溶液に界面活性剤を加えると６４０〜７４０ｎｍ付近にピークが現れてくる（図３０（Ｂ））。これは界面活性剤の添加によりフタロシアニンの会合が解けた状態（言い換えれば単量体の状態）として存在していることを示しているピークであることが知られている。すなわち、本実施例１〜４の結果においては、アニオン性鉄フタロシアニンを除く他のアニオン性フタロシアニンはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと混合された状態であるときに、その少なくとも一部が単量体として存在しており、それが６４０〜７３０ｎｍのピークとなって現れているのである。
【０１５７】
二つ目の重要な知見は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと他の有機分子との相互作用についてである。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは図２で説明したとおり、Ｇ−ｑａｒｔｅｔ面と呼ばれる広いπ平面がスタッキングした構造をとっている。このような構造は、他のπ平面を有する分子がこのＧ−ｑａｒｔｅｔ面とＧ−ｑａｒｔｅｔ面との間にインターカレートし易い構造となっている。したがって、例えばこれまでカチオン性のアントラキノン類やカチオン性のポルフィリンなどの分子が、その静電的相互作用とスタッキング相互作用の効果によってＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートすることが示されている。
【０１５８】
したがって、これらの知見を考慮に入れると、本実施例１〜実施例４の結果は、図３１に示すメカニズムで、アニオン性鉄フタロシアニンを除く他のアニオン性フタロシアニンがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出していることを示している。すなわち、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが存在してない場合は、これらアニオン性フタロシアニンは会合しており、そのＵＶ吸収スペクトルは図３０（Ａ）に示すものである。しかし、これにＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが混合されるとこれらアニオン性フタロシアニンはその少なくとも一部がＧｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートする。インターカレートしたアニオン性フタロシアニンは単量体の状態と同じであるため６４０〜７３０ｎｍの吸光度ピークを示す。
【０１５９】
ここで予想外であった点は、用いられているフタロシアニンが、上述のカチオン性アントラキノン類やカチオン性ポルフィリン類とは異なり、アニオン性であったにも関わらずこのような効果が得られた点である。一方で、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡにはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのような広いπ平面は存在せず、またアニオン性同士の静電的反発も働き、その結果、混合しても何も起こらない。したがって本発明者は、本来ＤＮＡ検出のプローブとしてはカチオン性が有利であると考えられていた常識に反し、アニオン性のフタロシアニンを用いることでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する高い特異性が得られることを見出し、本発明を達成するにいたったと言える。
【０１６０】
また、図２９に示すフタロシアニンの配位金属に着目すると、鉄の場合のみ、ヒトテロメアＤＮＡ、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡに関わらずＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できないことが分かる。これは以下の理由による。すなわちフタロシアニンの代表的な構造として平面型と呼ばれるものとシャトルコック型と呼ばれるものがある。平面型はその名のとおり分子全体が平面となっている（図３２（Ａ））のに対し、シャトルコック型は金属やその配位子がフタロシアニン平面から一方向のみ突き出した構造（図３２（Ｂ））となっている。
【０１６１】
本実施例において用いたアニオン性鉄フタロシアニンであるＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅは配位金属の鉄に酸素が付いたものであり、これはシャトルコック型のフタロシアニンである。一方、本実施例において用いられた他のフタロシアニンは全て平面型である。上述のとおりシャトルコック型フタロシアニンは中央部分より突出した構造をとっており平面性に乏しい。したがって、平面型フタロシアニンが図３１に示すメカニズムのように、Ｇｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートできるのに対して、本実施例において用いたアニオン性鉄フタロシアニンに代表されるシャトルコック型フタロシアニンは平面型でないために、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘにインターカレートできず、結果として他のアニオン性フタロシアニン類の場合には認められた６４０〜７３０ｎｍの吸光度ピークが認められないのである。このようなＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンの相互作用についての知見は、本発明者が世界で初めて見出したものである。
【０１６２】
以上まとめると、本発明者は、従来の常識に反してあえてアニオン性のフタロシアニンを用い、かつ世界で初めてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンの相互作用の違いを見出すことで、本発明のアニオン性平面型フタロシアニンを用いた極めて特異性の高いＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出方法を完成するに至った。
【０１６３】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明により、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法は、バイオテクノロジー分野における分析方法として有用である。
【符号の説明】
【０１６５】
１  相補的な関係にある二本のＤＮＡ鎖
２  Ｔ−Ａ塩基対
３  Ｃ−Ｇ塩基対
４  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ
５  Ｇカルテット面
６  金属イオン
７  Ｇカルテット面の化学構造
８  容器
９  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ以外のＤＮＡ鎖
１０  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと結合したプローブ
１１  遊離のプローブ
１２  Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列
１３  ＴＳプライマー
１４  伸長されたＴＳプライマー
１５  ＰＣＲ用プライマー
１６  試料溶液
１７  アニオン性フタロシアニンを含む溶液
１８  テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを含む溶液整理番号:2040300046 特願2008-137574   (Proof) 提出日:平成20年 5月27日 27/E
１９  会合したアニオン性フタロシアニン
２０  単量体状態のフタロシアニン
２１  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘにインターカレートしたアニオン性フタロシアニン
２２  平面型フタロシアニン
２３  シャトルコック型フタロシアニン
【図１】
2009144914.tif 000006
【図２】
2009144914.tif 000007
【図３】
2009144914.tif 000008
【図４】
2009144914.tif 000009
【図５】
2009144914.tif 000010
【図６】
2009144914.tif 000011
【図８】
2009144914.tif 000012
【図９】
2009144914.tif 000013
【図１０】
2009144914.tif 000014
【図１１】
2009144914.tif 000015
【図１２】
2009144914.tif 000016
【図１３】
2009144914.tif 000017
【図１４】
2009144914.tif 000018
【図１５】
2009144914.tif 000019
【図１６】
2009144914.tif 000020
【図１７】
2009144914.tif 000021
【図１８】
2009144914.tif 000022
【図１９】
2009144914.tif 000023
【図２０】
2009144914.tif 000024
【図２１】
2009144914.tif 000025
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2009144914.tif 000028
【図２５】
2009144914.tif 000029
【図２６】
2009144914.tif 000030
【図２７】
2009144914.tif 000031
【図２８】
2009144914.tif 000032
【図２９】
2009144914.tif 000033
【図３０】
2009144914.tif 000034
【図３１】
2009144914.tif 000035
【図３２】
2009144914.tif 000036
【図３３】
2009144914.tif 000037
【図３４】
2009144914.tif 000038
【図３５】
2009144914.tif 000039
【図３６】
2009144914.tif 000040
【図７】
2009144914.tif 000041
【配列表】
2009144914000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月21日(2009.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡの高次構造の検出方法およびそれを利用した診断方法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは真核生物の染色体の両末端部分に位置するＤＮＡとさまざまなタンパク質からなる構造である。これまでの研究より、このテロメア構造がある種のＤＮＡ分解酵素や不適切なＤＮＡ修復などから染色体を保護していることが明らかになっている。またこのテロメア部分は細胞分裂のたびに短くなることから細胞の老化や不死化と呼ばれる現象において重要な役割を担っていると考えられている。
【０００３】
一方、テロメアを構造的な側面から見るといくつかの特徴を有していることが分かる。すなわち、染色体ＤＮＡ中のほとんどの部分では、互いに相補的な二本のＤＮＡ鎖間において、アデニン（以下、Ａと呼ぶ）塩基とチミン（以下、Ｔと呼ぶ）塩基、グアニン（以下、Ｇと呼ぶ）塩基とシトシン（以下、Ｃと呼ぶ）塩基がそれぞれ特異的に水素結合してワトソン−クリック型塩基対を形成し、さらにその塩基対間においてπ−πスタッキング相互作用が生じることで二重らせん構造が構築されている（図１）。
【０００４】
しかし、テロメアＤＮＡにおいては、やはりその大部分は互いに相補的な二本鎖ＤＮＡからなるものの、その最末端部分はＤＮＡの３’末端が突出（オーバーハング）して一本鎖状態になっている。このオーバーハングした部分の長さや、テロメアの全長は種によって異なるが、ヒトの場合はオーバーハングした部分は５０−１００塩基程度、全長は初期の段階で約１００００塩基対程度である。そしてテロメア配列のもう一つの構造的特徴としては、オーバーハングしている側の鎖はＧを多く含む繰り返し配列からなり、したがってその相補鎖となるもう一方の鎖はＣを多く含む繰り返し配列であるという点である。
【０００５】
具体的には、ヒトの場合はオーバーハングしている側の鎖が５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’ （配列番号：１）の繰り返し（Ｇリッチな配列）であり、もう一方は５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’ （配列番号：１のアンチセンス鎖）の繰り返し（Ｃリッチな配列）となる。
【０００６】
近年、テロメア部位中のＧリッチな配列が特に精力的に研究されている。その理由は、この配列がＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる四重鎖ＤＮＡ構造を形成できるということが明らかになってきたためである。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）には、四本のＤＮＡ鎖全ての５’から３’への方向が同じ方向を向いているパラレル型と呼ばれるものや、あるいは二本は同じ方向を向いているが残りの二本は反対方向を向いているアンチパラレル型と呼ばれるものなど複数のパターンが知られているが、いずれも図２に示すような特徴を有している。すなわち、４つのＧ塩基がフーグスティーン型の水素結合を介してＧカルテットと呼ばれる構造を形成し、さらにこのＧカルテット面どうしがπ−πスタッキング相互作用することによって構造を保持している。
【０００７】
また、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造形成にはＧ−カルテット面とＧ−カルテット面の間において金属イオンの配位が必要であり、ＫイオンやＮａイオンなどが配位することが知られている。このようなＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘがテロメア内においてどのような条件下で形成され、またそれがどのような機能を果たしているのかについての詳細は現時点では不明である。しかしながら上述の染色体保護や細胞の老化などと関連する重要な構造ではないかと考えられている。
【０００８】
またさらに、上記のようなＧリッチな配列はテロメアだけに存在するわけではないことも明らかになってきている。例えば、ガン原遺伝子であるｃ−ｍｙｃ中においてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列が存在する。また、これ以外にもｃ−ｋｉｔ、ｂｃｌ−２、ＶＥＧＦ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域においてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列が発見されている。これらはいずれも細胞のガン化などに関連する遺伝子であり、このことは、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが人体に対して重要な役割を果たしていることを示唆している。そして現在のところ、さらに、３０万を超えるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成可能なＧリッチ配列が存在すると予想されており（以下、このような配列をＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列と呼ぶ）、これらが実際にＧｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するのか、そして形成するのであればその構造がどのような機能を果たしているのかが注目されている。
【０００９】
このような技術背景において最も必要とされる技術の一つが、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する方法である。すなわち試料中のＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを含んでいるか否か、あるいは試料中のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列からなるＤＮＡが実際にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる技術が必要とされる。例えば、前者について従来技術を用いて調べるとすると、次のように示すようになる。すなわち、目的のＤＮＡを含む試料溶液を用意し、この溶液のＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：円二色性）スペクトルを測定する。そして、得られたＣＤスペクトルがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特有のものであるか否かについて解析すればよい。しかし、ＣＤスペクトルを測定する装置は非常に高価かつ大型である。また解析時間も３０分程度と長時間を要する上に、一度に解析できる試料数も通常一種類であるため、ハイスループット性の面で著しく劣る。さらに四重鎖の形によっては、ＣＤを用いることでＤＮＡの他の形からと識別することができないという問題もある。
【００１０】
この課題に対する解決手段としては、図３に示すように、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの有無に依存して、安価な装置で解析可能なシグナル（吸光度や蛍光強度など）を発するプローブ材料を上記溶液中に混合しておき、この溶液中のシグナルを検出する方法が挙げられる。このとき重要なのは、このプローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性である。すなわちゲノムＤＮＡ中には、その大部分を占める二本鎖ＤＮＡ構造と、上述のテロメア部位のオーバーハング部分に代表される一本鎖ＤＮＡ構造が存在するため、これらと比較した場合のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が重要となる。したがって、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのみの有無を調べたいにも関わらず、プローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が低く、その結果、一本鎖や二本鎖ＤＮＡとも相互作用してシグナルを発してしまえば、溶液中のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを正確に検出するのは困難となるためである。
【００１１】
また、試料中のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡが実際にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて従来技術を用いて調べる場合は、図４に示すようになる。すなわち、まずＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列を有するＤＮＡを溶液中に用意する。その後、この溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下におき、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせる。そして、反応後の溶液中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが存在しているか否かについてＣＤスペクトル測定を行うことで解析すればよい。ただし、この場合においても、上述したとおり装置が高価、大型であるという課題、およびハイスループット面での課題が生じる。したがって、やはりこの場合においても、図３で示したＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出用プローブがあれば非常に有用である。
【００１２】
具体的には、図５に示すように、このプローブを、上記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の溶液に混合し、その結果発せられるシグナルを測定すればよい。このとき、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応前のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡは、上述のとおり、一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡの何れの可能性もあり得るため、プローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性は極めて重要である。つまり、上記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後において、Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを全く形成しなかった場合や、あるいは一部しか形成しなかった場合に、上記プローブがＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡのもとの構造（一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡ）に対しても相互作用しシグナルを発してしまえば、形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを正確に検出するのは困難となるためである。逆にプローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性が極めて高い場合、図５に示す方法において、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応前から溶液中にプローブを混合しておくことも可能となり、操作の煩雑性も防ぐことができる。
【００１３】
上記のとおり、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列は、染色体中のガンや老化などに関わる部位において発見されており、それゆえ将来的には患者の染色体中のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを調べることで疾病診断を行うことが予想される。したがって、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できる方法の開発は非常に重要な課題と言える。また上記プローブの特性として、単にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘやＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡを特異的に検出できるだけではなく、それらの存在量に依存してシグナルの増大あるいは減少といった変化があれば、単なる検出のみならず定量的な解析も可能となるためより有用となることは言うまでもない。
【００１４】
また、テロメラーゼと呼ばれる酵素が知られている。この酵素はＲＮＡと逆転写酵素などからなる複合体であり、細胞分裂によって短くなるテロメア部位のＧリッチな側の繰り返し配列を複製し、伸ばしていくことができる（すなわちヒトの場合、テロメラーゼは５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列（配列番号：１）を付加していく。以下、この付加反応をテロメラーゼ反応と呼ぶ）。この酵素はヒトの通常の体細胞には見られないが、生殖細胞やほとんどのガン細胞において大量に発現していることが知られており、そのためテロメラーゼ活性を指標として被験者の細胞がガン化しているか否かについて調べることができる。
【００１５】
この従来方法として、ＴＲＡＰアッセイと呼ばれるものが知られている。ＴＲＡＰアッセイについて図６を用いて説明する。ＴＲＡＰアッセイでは、まずテロメラーゼの鋳型となる合成一本鎖ＤＮＡを含む溶液を調製する。この一本鎖ＤＮＡは通常５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：２）という配列からなるもので、ＴＳプライマーと呼ばれる（したがって、テロメラーゼはこのＴＳプライマーの３’末端に５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列（配列番号：１）を付加していく。非特許文献３を参照）。ただし、ＴＳプライマーはこの配列に限られる必要はなく、テロメラーゼの鋳型となる一本鎖ＤＮＡであればよい。
【００１６】
次に、この溶液中にガン化していると疑われる細胞試料や組織試料からの抽出物を添加、混合し、テロメラーゼ反応が行われる条件下に置く。ここで、もしこれら試料がガン化しているのであればテロメラーゼ活性があるため、ＴＳプライマーを起点としたテロメラーゼ反応が起こる。一方、ガン化していなければテロメラーゼ反応は起こらない。そして最後にテロメラーゼ反応により伸長されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法により検出する。
【００１７】
テロメラーゼ反応より得られるＤＮＡの長さはさまざまであるため、得られる電気泳動像は図７のようになる。すなわち、用いた試料のテロメラーゼ活性が強い場合、得られるＤＮＡ断片の長さは短いものから長いものまで広範囲にわたるラダー（はしご）状のバンドとして現われ、またそのバンドの濃さは濃い傾向にある。一方、活性の弱いテロメラーゼからは長いＤＮＡ断片は得られないため、短い範囲でのラダー状のバンドが現れ、またバンドの濃さは薄い傾向にある。したがって試料のガン化を判断するためには、ＴＲＡＰアッセイの結果より得られる電気泳動像のＤＮＡ断片の長さの範囲とバンドの濃さを解析すればよいのだが、これを定量的に解析することは困難であるため、あくまで定性的な判断となってしまう。
【００１８】
このような点に関して、図３および図５で説明したＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出用プローブが、単にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的なだけではなく、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの存在量に依存してそのシグナル量を変える場合、テロメラーゼの活性を指標にしたガン診断においても有用である。その流れ図を図８に示す。
【００１９】
この方法においても、まずＴＳプライマーを含む溶液を調製する、次にこの溶液中へ細胞試料や組織試料からの抽出物を添加、混合する、そして、この溶液についてテロメラーゼ反応を行わせた後、ＰＣＲ法によってテロメラーゼ反応により伸長されたＤＮＡを増幅させる、という操作までは図６と同じである。しかし、図８に示す方法では、このＰＣＲ後の溶液について電気泳動するのではなく、図５の場合と同様にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせる。その結果、形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｌｅｘをＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出用プローブを用いて検出する。ここで、形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量はテロメラーゼ活性の強さを反映しているため、上記プローブがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に応じてそのシグナル量を変えるのであれば、この方法により定量的なテロメラーゼ活性の解析およびガン化の判断を行うことが可能となる。
【００２０】
言うまでもなくここでもプローブのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が極めて重要となる。つまり、細胞試料がガン化していない場合、テロメラーゼ反応は進行しないことになるが、その結果、一本鎖ＤＮＡであるＴＳプライマーがそのまま反応液中に残る。また、さらにその後のＰＣＲ反応も進行しないため、ＰＣＲ反応用のプライマーも一本鎖ＤＮＡの状態で残る。したがって、細胞試料がガン化していない場合は、最終的に反応溶液中に大量の一本鎖ＤＮＡが存在していることになり、上記プローブがこれら一本鎖ＤＮＡと反応しシグナルを出してしまえば、定量的なテロメラーゼ活性解析およびガン診断が困難となるためである。
【００２１】
以上、説明してきたように一本鎖、二本鎖ＤＮＡのいずれかが溶液中に存在しえる状況において、特異的にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出可能な方法は非常に有用である。またさらに定量性も備えていれば定量的なＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出が可能となるだけでなく、従来のＴＲＡＰアッセイの課題を解決できる。そのため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと特異的に相互作用し、かつ、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に依存してシグナルを変化させるプローブを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法の開発が精力的になされている。
【００２２】
例えば、特許文献１ではＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的な新規化合物を提案している。しかし、このプローブは確かに一本鎖、二本鎖ＤＮＡに比べＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの結合選択性は高いものの、一本鎖、二本鎖ＤＮＡに対しても結合が確認できる。
【００２３】
また、非特許文献１では下記（化１）の構造からなるカチオン性ポルフィリンのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性について報告がなされている。この文献ではＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：表面プラスモン共鳴）現象を利用して、金基板上での上記ポルフィリンと二本鎖構造ＤＮＡあるいはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとの結合を解析しており、その結果、確かに二本鎖ＤＮＡの場合に比べＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合の方がシグナルの変化は大きいものの、二本鎖ＤＮＡの場合においてもシグナルの変化は観察され、十分な特異性は確認されない。
【００２４】
【化１】
2009144914.tif 000042
また、非特許文献２では下記（化２）および（化３）の構造からなるカチオン性ポルフィリンなどのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性について報告がなされている。この文献でも、やはりＳＰＲ現象や紫外可視吸光スペクトルを解析することで、これらポルフィリンのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異的結合が調べられているが、ＤＮＡ濃度が５μＭ以上の条件下において二本鎖ＤＮＡとこれらポルフィリンが非特異的に結合してしまうことが記されている。
【００２５】
【化２】
2009144914.tif 000043
【００２６】
【化３】
2009144914.tif 000044
以上のように、これまでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を目的として開発されてきたプローブはいずれもカチオン性のものである。これはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘがアニオン性であり、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへ結合させるという観点から考えた場合、カチオン性であることが非常に有利であると考えられるためである（すなわちアニオン性にすると静電的な反発が起こり、結合反応において不利と考えられる）。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに限らず全てのＤＮＡ鎖はアニオン性であるため、これらをターゲットとしたプローブを開発する場合はカチオン性にすることが最も重要な設計指針であり、アニオン性にするという考え方はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７２０２７号パンフレット
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，１５０２−１５０３
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６８５−４６８７
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，２５９５−２５９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
以上のように、一本鎖、二本鎖ＤＮＡのいずれかが溶液中に存在しえる状況において、特異的にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出可能な方法は非常に有用である。またさらに定量性も備えていれば定量的なＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出が可能となるだけでなく、従来のＴＲＡＰアッセイの課題を解決できる。そのため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと特異的に相互作用し、かつＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に依存してシグナルを変化させるプローブを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法の開発が精力的になされているものの、これまで提案されてきた方法ではいずれの場合もＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できない。そこで本発明者は鋭意検討した結果、アニオン性の平面型フタロシアニンがアニオン性であるにも関わらず、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと極めて高い特異性をもって相互作用し、なおかつＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの濃度に依存して吸光度が変化することを見出し、本発明を達成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
上記課題を解決する本発明は、一本鎖構造か二本鎖構造かＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中の、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｄ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法である。
【００３１】
また、本発明は、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べることにより、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下に置く工程と、
（ｂ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｃ）前記（ａ）工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｅ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法である。
【００３２】
また、本発明は、試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）テロメラーゼの基質となるＤＮＡを含む基質溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
（ｄ）前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるＤＮＡ付加反応が行われる条件下に置く工程と、
（ｅ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｆ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記（ｄ）の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｈ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法である。
【００３３】
本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンが、配位金属として銅、と錯形成しているもの、亜鉛、と錯形成しているもの、コバルト若しくはと錯形成しているもの、ニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンと錯形成しているもの、錯形成していないもの、からなる群より選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【００３４】
また本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有していることが好ましい。
【００３５】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的かつ定量的に検出する方法、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるＤＮＡを特異的かつ定量的に検出する方法、およびテロメラーゼ活性測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】二本鎖ＤＮＡの構造を説明するための図である。
【図２】Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を説明するための図である。
【図３】Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法を説明するための図である。
【図４】ＣＤ解析装置を用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。
【図５】Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。
【図６】従来のテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。
【図７】従来のテロメラーゼ活性測定方法より得られる電気泳動像の一例を示す図である。
【図８】Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。
【図９】アニオン性フタロシアニンを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法を説明するための図である。
【図１０】アニオン性フタロシアニンを用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。
【図１１】アニオン性フタロシアニンを用いたテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。
【図１２】実施例２における、ＣＤ測定結果を示す図である。
【図１３】実施例２における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１４】実施例２における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１５】実施例２における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１６】実施例２における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１７】実施例１における、ＣＤ測定結果を示す図である。
【図１８】実施例１における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図１９】実施例１における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２０】実施例１における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２１】実施例１における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２２】実施例３における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２３】実施例３における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２４】実施例３における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２５】実施例４における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２６】実施例４における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２７】実施例４における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２８】実施例４における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図２９】本実施例１〜４の結果をまとめた図である。
【図３０】フタロシアニンが会合した状態の場合と、分散した場合の典型的な吸光度スペクトルを表す図である。
【図３１】本発明のメカニズムを表す図である。
【図３２】平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンを表す図である。
【図３３】実施例１における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図３４】実施例２における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図３５】実施例３における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【図３６】実施例４における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下本発明の実施の形態について、図９〜１１を用いて説明する。
【００３９】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、一本鎖構造か二本鎖構造かＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中の、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法について図９を用いて説明する。
【００４０】
本実施の形態１では、まず試料溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合する。そして次にこの混合した溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内の特定の波長における吸光度を測定する。このとき、上記試料溶液中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０〜７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れるが、その一方で、一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしても上記波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの有無を解析することで、上記試料溶液中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在していたか否かを知ることができる。
【００４１】
ピークの有無を解析するには、例えば、少なくともＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが含まれていないことが分かっている参照溶液を調製し、これについても上記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と混合した際の上記特定の波長における吸光度を測定し、これと試料溶液を用いた際に得られた吸光度値との差を求めればよい。
【００４２】
さらに、この上記吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。したがって、吸光度を解析することによりＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度を解析することができる。
【００４３】
実施の形態１で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
【００４４】
また、実施の形態１で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
【００４５】
また、上記特定の波長は６４０〜７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
【００４６】
（実施の形態２）
本実施の形態２では、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法について図１０を用いて説明する。
【００４７】
本実施の形態２では、まず上記試料溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合し、これをＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置いてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせた後、この混合溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内における特定の波長の吸光度を測定するか（図１０（Ａ））、あるいは上記試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置いてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせた後、アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と混合し、この混合溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内
における特定の波長の吸光度を測定する（図１０（Ｂ））。このとき、上記実施の形態１と同様に、この混合溶液中においてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０〜７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。
【００４８】
しかし、その一方でこの混合溶液中に一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしてもこの波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの有無を解析することで、上記試料溶液中のＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成したか否かを知ることができる。ピークの有無を解析する手段としては、例えば、ＤＮＡが含まれていないか、あるいは含まれていたとしてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しないＤＮＡしか含まれていない参照溶液を調製し、この参照液について、上記試料溶液の場合と全く同じ工程を経て吸光度値を測定し、上記試料溶液の場合の吸光度値との差を解析すればよい。
【００４９】
また、上記吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。したがって、吸光度を解析することにより上記試料中のどれだけの濃度のＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成したかについて定量的に解析することができる。
【００５０】
本実施の形態２で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１と同じく、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
【００５１】
また、本実施の形態２で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１と同じく、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
【００５２】
また、上記特定の波長は６４０〜７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
【００５３】
（実施の形態３）
本実施の形態３では、試料中に含まれるテロメラーゼ活性を定量的に解析する方法について図１１を用いて説明する。
【００５４】
本実施の形態３では、まず上記試料とテロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを含む溶液を混合し、この混合溶液についてテロメラーゼ反応が行われる条件下に置く。このとき、上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれていれば、この条件下に置いてテロメラーゼ反応が行われ、その結果、上記基質一本鎖ＤＮＡから５‘−ＴＴＡＧＧＧ−３’からなるＤＮＡが付加されていくが、その一方で、上記試料中において活性を持つテロメラーゼが存在しなければそのようなＤＮＡ付加は行われない。
【００５５】
そして次に、上記テロメラーゼ反応後の混合溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置く。ここで、仮に上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれ、これによりテロメラーゼ反応が進んでいれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成され、その量は上記試料中のテロメラーゼ活性に依存する（活性が大きければ形成されるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ量も多くなる）。逆に例えば、上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれておらず、その結果、上記テロメラーゼ反応が行われていなければ、ここでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは形成されない。
【００５６】
そして最後に、このＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の混合溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合し、この溶液の６４０〜７４０ｎｍの範囲内における特定の波長の吸光度を測定すればよい。このとき、上記実施の形態１や２と同様に、この混合溶液中においてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０〜７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。しかし、その一方でこの混合溶液中に一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしてもこの波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの吸光度値を測定することで上記試料中のテロメラーゼ活性を定量的に解析することができる。
【００５７】
ここで、図１１において上記アニオン性平面型フタロシアニン溶液はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の混合溶液に対して加えられたが、上記アニオン性平面型フタロシアニン溶液を加えるタイミングはこれに限られない。すなわち、テロメラーゼ反応後であり、かつ、吸光度測定前までであれば、どのタイミングで上記試料溶液を含む混合溶液に加えてもよい。
【００５８】
本実施の形態３で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１および実施の形態２と同じく、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
【００５９】
また、本実施の形態３で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１および実施の形態２と同じく、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
【００６０】
また、上記特定の波長は６４０〜７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
【００６１】
［実施例］
以下に記載する実施例で用いられるＤＮＡは、全て北海道システム・サイエンス株式会社の合成品である。また本実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔおよびＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅはシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄおよびＺｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄは（株）フナコシより購入した。Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄは合成した。合成方法は下記のとおりである。
【００６２】
トリメリット酸６．４ｇ、尿素２０ｇ、塩化コバルト六水和物４．７５ｇおよびモリブデン酸アンモニウム四水和物０．８２ｇを１００ｍｌのニトロベンゼン中１７０〜１８０℃の油浴中で４．５時間加熱し、放冷後、デカンテーションでニトロベンゼン層を除いた。残留物をメタノールおよび水で洗浄後、真空乾燥して８．６６ｇの固形物を得た。この固形物１．０ｇを５０％水酸化カリウム水溶液３０ｇ中、７０〜７５℃で２時間攪拌後、９０ｍｌの水を添加、攪拌し、これをろ過した。ここで得られたろ液を３５〜３７％塩酸で強酸性にすることで沈殿物を析出させ、これをろ取した。この沈殿物を１００ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かして再度ろ過した。ここで得られたろ液を再び塩酸によって強酸性にし、析出した沈殿物をろ取した。これを大量の水で洗浄した後、真空乾燥することでＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを０．１ｇの粉末として得た。以下の実施例で用いられるＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄは全てこの合成により得られたものである。
【００６３】
（実施例１）
本実施例では、アニオン性平面型フタロシアニンを用いて、溶液中に存在するアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを含む溶液を調製した。
【００６４】
＜アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを含む溶液の調製＞
まず５’−ｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ−３’の配列（配列番号：３）からなる一本鎖ＤＮＡを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このＤＮＡをヒトテロメアＤＮＡと呼ぶ。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡ濃度は０．５、２、５、１０、２５、５０、１００μＭのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡを含まない５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液も調製した。
【００６５】
次に、これらの溶液を９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした（以降、特に断りなく「アニーリング」あるいは「アニーリング処理」という表現が出てきた場合は、この一連の温度制御のことを言う）。
【００６６】
次に、以上の結果得られた各溶液中のヒトテロメアＤＮＡがアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかを確認するため、各溶液についてＣＤ解析を行った。その結果、図１７に示すように、ネガティブコントロールの溶液を除き、いずれの場合も２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークが認められた。これはアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成されていることを示すものである。
【００６７】
また、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００μＭであった溶液における上記正および負のピークの絶対値は最も大きく、その他については５０、２５、１０、５、２、０．５μＭの順で小さくなっている。このことは最初に含まれていたヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きければ、得られるアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度も大きいということを示している。
【００６８】
以降、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、５、２、０．５μＭであった溶液について上記一連のアニーリング処理を行った結果得られた溶液をそれぞれＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ぶ。一方、ネガティブコントロールとして調製したＤＮＡが含まれていなかった溶液について上記一連のアニーリング処理を行った結果得られた溶液はＮＣ溶液と呼ぶ。
【００６９】
次に、以上の工程より得られたＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによるアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
【００７０】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（配位金属として銅を有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００７１】
測定結果を図１８（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れた。また、このピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できることが分かる。
【００７２】
さらに、図１８（Ａ）で得られた各グラフの６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１８（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【００７３】
また、図１８（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図１８（Ｂ）の場合と同様に、得られた６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【００７４】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（配位金属としてニッケルを有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００７５】
測定結果を図１９（Ａ）に示す。これより、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【００７６】
さらに、図１９（Ａ）で得られた各グラフの６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１９（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【００７７】
また、図１９（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図１９（Ｂ）の場合と同様に、得られた６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【００７８】
＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（配位金属を持たず、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。
【００７９】
次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図２０（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【００８０】
さらに、図２０（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図２０（Ｂ）に示し、７１０．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図２０（Ｃ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【００８１】
また、図２０（Ｂ）および図２０（Ｃ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図２０（Ｂ）および図２０(Ｃ)の場合と同様に、得られた６７７．５ｎｍおよび７１０．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
【００８２】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（配位金属としてコバルトを有し、官能基としてカルボキシル基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００８３】
測定結果を図３３（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【００８４】
さらに、図３３（Ａ）で得られた各グラフの６８４．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図３３（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。また、図３３（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図３３（Ｂ）の場合と同様に、得られた６８４．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
【００８５】
ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合の結果より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【００８６】
＜アニオン性鉄フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅ（配位金属として鉄を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性フタロシアニン）を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００８７】
測定結果を図２１に示す。これよりＡｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂの場合もＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果であった。以上の結果より、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを用いても溶液中のアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができないことが分かる。
【００８８】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝配位金属として亜鉛を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）についても同様の実験を行った結果、Ａｎｔｉ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液と混合した場合のみ６４０〜７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。
【００８９】
したがって、実施例１の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性平面型フタロシアニンを用いてもアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とサンプル中のヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が認められた。
【００９０】
したがって、以上実施例１の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いても試料溶液中に存在するアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
【００９１】
（実施例２）
本実施例では、アニオン性フタロシアニンを用いて、溶液中に混在するアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡとパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが混在している溶液を調製した。
【００９２】
＜アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡとパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡが混在している溶液の調製＞
まず、ヒトテロメアＤＮＡを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡ濃度は１、２、１０、２５、５０、１００μＭのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡを含まない５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液も調製した。次にこれらの溶液をアニーリング処理した。
【００９３】
次に、以上の結果得られた各溶液中のヒトテロメアＤＮＡがパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかを確認するため、各溶液についてＣＤ解析を行った。その結果を、図１２に示す。
【００９４】
ここで、実施例１でも説明したとおり、アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合は、そのＣＤ測定結果において２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークを示すことが知られている。一方、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合は、２６０ｎｍ付近に正のピーク、２４０ｎｍ付近に負のピークを示すことが知られている。これらの知見を踏まえると、図１２に示されたＣＤ結果では、ネガティブコントロールの溶液以外においては、２４０ｎｍ付近に負のピーク、２９５ｎｍ付近に正のピークが存在することから、これらはパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが混在していると考えられる。
【００９５】
また、２９５ｎｍ付近の正のピーク、２４０ｎｍ付近の負のピークのいずれについても、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きくなるにつれ、その絶対値が大きくなっている。このことは、最初に含まれていたヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きければ、上記アニーリング処理後に得られる溶液中のパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡとアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度の何れもが大きくなるということを示している。
【００９６】
以降、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、２、１μＭであった溶液について上記アニーリング処理を行った結果得られた溶液をそれぞれＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆと呼ぶ。一方、ネガティブコントロールとして調製したＤＮＡが含まれていなかった溶液について上記アニーリング処理を行った結果得られた溶液はＮＣ−２溶液と呼ぶ。
【００９７】
次に、以上の工程より得られたＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ−２溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
【００９８】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＦおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００９９】
測定結果を図１３（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。
【０１００】
以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１０１】
さらに、図１３（Ａ）で得られた各グラフの６８９．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１３（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１０２】
また、図１３（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合においても、図１３（Ｂ）の場合と同様に、得られた６８９．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【０１０３】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０４】
測定結果を図１４（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｅの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１０５】
さらに、図１４（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１４（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１０６】
また、図１４（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した場合においても、図１４（Ｂ）の場合と同様に、得られた６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
【０１０７】
＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＦおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０８】
測定結果を図１５（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１０９】
さらに、図１５（Ａ）で得られた各グラフの７０８．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図１５（Ｂ）に示し、６７５．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図１５（Ｃ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１１０】
また、図１５（Ｂ）および図１５(Ｃ)は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合においても図１５（Ｂ）および図１５(Ｃ)の場合と同様に、得られた７０８．０ｎｍおよび６７５．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【０１１１】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１２】
測定結果を図３４（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ−２溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｅの順番で大きいことが分かる。
【０１１３】
以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１１４】
さらに、図３４（Ａ）で得られた各グラフの６７９．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図３４（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１１５】
また、図３４（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを添加した場合においても、図３４（Ｂ）の場合と同様に、得られた６７９．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
【０１１６】
ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【０１１７】
＜アニオン性鉄フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ−２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１８】
測定結果を図１６に示す。これよりＡｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ−２溶液の場合の両方より得られる結果はほぼ同じであることが分かる。したがって以上の結果より、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを用いて溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することはできないことが分かる。
【０１１９】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性平面型フタロシアニンを用いて、同様の実験を行った結果、Ａｎｔｉ−Ｐａｒａ−Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液と混合した場合のみ６４０〜７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。したがって以上の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いても溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。
【０１２０】
また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とサンプル中のヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が認められた。したがって、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いても試料溶液中に存在するアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
【０１２１】
（実施例３）
上記実施例１および実施例２の結果より、アニオン性鉄フタロシアニン以外のいずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもパラレル型、アンチパラレル型に関わらずＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。本実施例３では、これらアニオン性フタロシアニンによるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性について確かめるため、アニオン性フタロシアニンを用いた一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡＤＮＡの検出実験を行った。そのためにまず以下の手順で一本鎖ＤＮＡを含む溶液、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を調製した。
【０１２２】
＜一本鎖ＤＮＡを含む溶液の調製＞
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’の配列（配列番号：４）からなる一本鎖ＤＮＡが５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のＤＮＡは、インキュベート後も一本鎖ＤＮＡである（以降、この溶液を一本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
【０１２３】
＜二本鎖ＤＮＡを含む溶液の調製＞
５’−ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ−３’の配列（配列番号：５）からなる一本鎖ＤＮＡと５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’の配列（配列番号：５のアンチセンス鎖）からなる一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。上記二種類のＤＮＡは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成している（以降、この溶液を二本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
【０１２４】
以上の工程で得られた一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによる一本鎖および二本鎖ＤＮＡ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
【０１２５】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２２（Ａ）および図２２（Ｂ）に示す。
【０１２６】
それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
【０１２７】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２３（Ａ）および図２３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。
【０１２８】
これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は、極めて特異性が高いことが分かる。
【０１２９】
＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２４（Ａ）および図２４（Ｂ）に示す。
【０１３０】
それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。これより、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって、以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
【０１３１】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を、図３５（Ａ）および図３５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。
【０１３２】
これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって、以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
【０１３３】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性フタロシアニン）を用いて、同様の実験を行った結果、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となった。
【０１３４】
（実施例４）
上記実施例１および実施例２では、ヒトのテロメア部分の配列と同じ配列からなる一本鎖ＤＮＡを用い、パラレル型、アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのＤＮＡを調製し、配位金属が鉄以外のアニオン性フタロシアニンによってこれらの検出が可能であることや、あるいはこの検出結果を基にして、上記一本鎖ＤＮＡを定量的に検出できることを示した。本実施例４では、上記実施例１および実施例２の結果が、ヒトテロメア部分の配列からなるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに限られたものであるのか、それともヒトテロメア部分の配列以外からなるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘでも同様の結果が得られるのかについて検討した。
【０１３５】
＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
まず５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’の配列（配列番号：６）からなる一本鎖ＤＮＡ（以下、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡと呼ぶ）と、２．５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔと５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ配列はヒトテロメア部分の配列とは異なるが、Ｋ＋存在下においてアニーリング処理することでパラレル型のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。上記溶液は、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度が０、１、２、３、４、５、１０μＭのものをそれぞれ用意した。
【０１３６】
次に、これらの溶液をアニーリング処理し、これらについて４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図２５（Ａ）に示す。これより、上記Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
【０１３７】
以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１３８】
さらに図２５（Ａ）で得られた各グラフの６８７ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図２５（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１３９】
＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いて実験を行った。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、３、４、５、１０、２５μＭとした。結果を図２６（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
【０１４０】
以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４１】
さらに図２６（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図２６（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１４２】
＜配位金属をもたないアニオン性フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いて実験を行った。またＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、１０、２５μＭとした。結果を図２７（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れることが分かる。
【０１４３】
以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４４】
さらに、図２７（Ａ）で得られた各グラフの７０５．０ｎｍにおける吸光度値とそのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｂ）に示し、６７４０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｃ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１４５】
＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’
（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いて実験を行った。ただし、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄの濃度は３０μＭとした。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、５、１０、２５、５０μＭとした。結果を図３６（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
【０１４６】
以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
【０１４７】
さらに、図３６（Ａ）で得られた各グラフの６８０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図３６（Ｂ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【０１４８】
ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いた場合より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【０１４９】
＜アニオン性鉄フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’−ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ−３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔの代わりに、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅを用いて実験を行った。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、３、４、５、１０、２５μＭとした。
【０１５０】
結果を図２８に示す。これよりいずれの濃度の場合も０μＭの場合と同じ結果であったことが分かる。したがって、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅによってＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できないことが分かる。
【０１５１】
以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性フタロシアニン）を用いて同様の実験を行った結果、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度が０μＭの場合を除き、いずれの場合も６４０〜７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。したがって以上の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できることが分かった。
【０１５２】
また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が認められた。したがって、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いてもＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
【０１５３】
実施例１〜実施例４までの結果を、各フタロシアニンの構造を示す図とともに図２９にまとめた。図２９中の○は、各実施例のＤＮＡ検出実験において、目的のＤＮＡの存在に依存して６４０〜７４０ｎｍの波長範囲内で吸光度ピークが得られたことを示している。一方×はそのようなピークが得られなかったことを示している。また「−」は実験を行っていないことを示している。これより、アニオン性鉄フタロシアニンの場合を除き、アニオン性官能基の種類（スルホ基かカルボキシル基）に関わらず、また配位金属の種類に関わらず、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できることが分かる。またＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの種類に関してもパラレル型やアンチパラレル型に依存せず、さらに配列についてもヒトテロメアＤＮＡ配列に限られず、図２を用いて説明したＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘであれば検出できることが分かる。
【０１５４】
ところで、フタロシアニンおよびＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘについては下記の二つの重要な事柄が知られている。まず一つ目はフタロシアニンが示す吸光度についてである。フタロシアニン類は通常溶液中に溶かされている場合、その広いπ平面のために互いにスタッキング相互作用を起こし分子間会合している。このときの典型的なＵＶ吸収スペクトルが図３０（Ａ）に示すものである。一方、この状態のフタロシアニンの溶液に界面活性剤を加えると６４０〜７４０ｎｍ付近にピークが現れてくる（図３０（Ｂ））。これは界面活性剤の添加によりフタロシアニンの会合が解けた状態（言い換えれば単量体の状態）として存在していることを示しているピークであることが知られている。すなわち、本実施例１〜４の結果においては、アニオン性鉄フタロシアニンを除く他のアニオン性フタロシアニンはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと混合された状態であるときに、その少なくとも一部が単量体として存在しており、それが６４０〜７３０ｎｍのピークとなって現れているのである。
【０１５５】
二つ目の重要な知見は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと他の有機分子との相互作用についてである。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは図２で説明したとおり、Ｇ−ｑａｒｔｅｔ面と呼ばれる広いπ平面がスタッキングした構造をとっている。このような構造は、他のπ平面を有する分子がこのＧ−ｑａｒｔｅｔ面とＧ−ｑａｒｔｅｔ面との間にインターカレートし易い構造となっている。したがって、例えばこれまでカチオン性のアントラキノン類やカチオン性のポルフィリンなどの分子が、その静電的相互作用とスタッキング相互作用の効果によってＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートすることが示されている。
【０１５６】
したがって、これらの知見を考慮に入れると、本実施例１〜実施例４の結果は、図３１に示すメカニズムで、アニオン性鉄フタロシアニンを除く他のアニオン性フタロシアニンがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出していることを示している。すなわち、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが存在してない場合は、これらアニオン性フタロシアニンは会合しており、そのＵＶ吸収スペクトルは図３０（Ａ）に示すものである。しかし、これにＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが混合されるとこれらアニオン性フタロシアニンはその少なくとも一部がＧｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートする。インターカレートしたアニオン性フタロシアニンは単量体の状態と同じであるため６４０〜７３０ｎｍの吸光度ピークを示す。
【０１５７】
ここで予想外であった点は、用いられているフタロシアニンが、上述のカチオン性アントラキノン類やカチオン性ポルフィリン類とは異なり、アニオン性であったにも関わらずこのような効果が得られた点である。一方で、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡにはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのような広いπ平面は存在せず、またアニオン性同士の静電的反発も働き、その結果、混合しても何も起こらない。したがって本発明者は、本来ＤＮＡ検出のプローブとしてはカチオン性が有利であると考えられていた常識に反し、アニオン性のフタロシアニンを用いることでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する高い特異性が得られることを見出し、本発明を達成するにいたったと言える。
【０１５８】
また、図２９に示すフタロシアニンの配位金属に着目すると、鉄の場合のみ、ヒトテロメアＤＮＡ、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡに関わらずＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できないことが分かる。これは以下の理由による。すなわちフタロシアニンの代表的な構造として平面型と呼ばれるものとシャトルコック型と呼ばれるものがある。平面型はその名のとおり分子全体が平面となっている（図３２（Ａ））のに対し、シャトルコック型は金属やその配位子がフタロシアニン平面から一方向のみ突き出した構造（図３２（Ｂ））となっている。
【０１５９】
本実施例において用いたアニオン性鉄フタロシアニンであるＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−４，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅは配位金属の鉄に酸素が付いたものであり、これはシャトルコック型のフタロシアニンである。一方、本実施例において用いられた他のフタロシアニンは全て平面型である。上述のとおりシャトルコック型フタロシアニンは中央部分より突出した構造をとっており平面性に乏しい。したがって、平面型フタロシアニンが図３１に示すメカニズムのように、Ｇｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートできるのに対して、本実施例において用いたアニオン性鉄フタロシアニンに代表されるシャトルコック型フタロシアニンは平面型でないために、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘにインターカレートできず、結果として他のアニオン性フタロシアニン類の場合には認められた６４０〜７３０ｎｍの吸光度ピークが認められないのである。このようなＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンの相互作用についての知見は、本発明者が世界で初めて見出したものである。
【０１６０】
以上まとめると、本発明者は、従来の常識に反してあえてアニオン性のフタロシアニンを用い、かつ世界で初めてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンの相互作用の違いを見出すことで、本発明のアニオン性平面型フタロシアニンを用いた極めて特異性の高いＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出方法を完成するに至った。
【０１６１】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明により、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法は、バイオテクノロジー分野における分析方法として有用である。
【符号の説明】
【０１６３】
１  相補的な関係にある二本のＤＮＡ鎖
２  Ｔ−Ａ塩基対
３  Ｃ−Ｇ塩基対
４  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ
５  Ｇカルテット面
６  金属イオン
７  Ｇカルテット面の化学構造
８  容器
９  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ以外のＤＮＡ鎖
１０  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと結合したプローブ
１１  遊離のプローブ
１２  Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列
１３  ＴＳプライマー
１４  伸長されたＴＳプライマー
１５  ＰＣＲ用プライマー
１６  試料溶液
１７  アニオン性フタロシアニンを含む溶液
１８  テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを含む溶液
１９  会合したアニオン性フタロシアニン
２０  単量体状態のフタロシアニン
２１  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘにインターカレートしたアニオン性フタロシアニン
２２  平面型フタロシアニン
２３  シャトルコック型フタロシアニン
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖構造か二本鎖構造かＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｄ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンであるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
【請求項４】
試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べることにより、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下に置く工程と、
（ｂ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｃ）前記（ａ）工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｅ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
【請求項６】
請求項４に記載のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）テロメラーゼの基質となるＤＮＡを含む基質溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
（ｄ）前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるＤＮＡ付加反応が行われる条件下に置く工程と、
（ｅ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｆ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記（ｄ）の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）の一連の工程後の混合液の６４０〜７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｈ）前記６４０〜７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項９】
請求項７に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているテロメラーゼ活性測定方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
2009144914.tif 000046
【図３】
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【図４】
2009144914.tif 000048
【図５】
2009144914.tif 000049
【図６】
2009144914.tif 000050
【図８】
2009144914.tif 000051
【図９】
2009144914.tif 000052
【図１０】
2009144914.tif 000053
【図１１】
2009144914.tif 000054
【図１２】
2009144914.tif 000055
【図１３】
2009144914.tif 000056
【図１４】
2009144914.tif 000057
【図１５】
2009144914.tif 000058
【図１６】
2009144914.tif 000059
【図１７】
2009144914.tif 000060
【図１８】
2009144914.tif 000061
【図１９】
2009144914.tif 000062
【図２０】
2009144914.tif 000063
【図２１】
2009144914.tif 000064
【図２２】
2009144914.tif 000065
【図２３】
2009144914.tif 000066
【図２４】
2009144914.tif 000067
【図２５】
2009144914.tif 000068
【図２６】
2009144914.tif 000069
【図２７】
2009144914.tif 000070
【図２８】
2009144914.tif 000071
【図２９】
2009144914.tif 000072
【図３０】
2009144914.tif 000073
【図３１】
2009144914.tif 000074
【図３２】
2009144914.tif 000075
【図３３】
2009144914.tif 000076
【図３４】
2009144914.tif 000077
【図３５】
2009144914.tif 000078
【図３６】
2009144914.tif 000079
【図７】
2009144914.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月16日(2009.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンが、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンからなる群より選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
さらに、図２７（Ａ）で得られた各グラフの７０５．０ｎｍにおける吸光度値とそのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｂ）に示し、６７３．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｃ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
【国際調査報告】
2009144914.tif 000081
2009144914.tif 000082