(57)【要約】【課題】  尿細管上皮細胞前駆細胞及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、を含んだ方法を行なうことにより、尿細管上皮細胞前駆細胞を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、
前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、
を含む、尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞がアクチビン含有培地で培養され、生じた胚様体が接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、
胚様体を形成させないでＫＳＰカドヘリン発現細胞が製造される、製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞が胚様体を形成しない条件で接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、製造方法。
【請求項６】
請求項１の方法に従って、尿細管上皮細胞前駆細胞を製造する工程と、
前記尿細管上皮細胞前駆細胞を尿細管上皮細胞に分化誘導する工程と、
を含む、尿細管上皮細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の尿細管上皮細胞の製造方法であって、
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法であって、
ＫＳＰカドヘリン発現細胞が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１７３（受領機関：産業総合研究所；受領日：２０１１年９月１４日）として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗ＫＳＰカドヘリン抗体を用いて、単離される、製造方法。
【請求項９】
尿細管上皮細胞への分化能を有する尿細管上皮細胞前駆細胞であって、
ＫＳＰカドヘリン陽性で、Ｏｓｒ１陽性である、前駆細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞であって、
胚性幹細胞由来または人工多能性幹細胞由来である、前駆細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞を含有する医薬組成物の製造方法であって、
多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、
前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞がアクチビン含有培地で培養され、生じた胚様体が接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、
胚様体を形成させないでＫＳＰカドヘリン発現細胞が製造される、製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞が胚様体を形成しない条件で接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記培養する工程に胚様体の形成工程を含む、製造方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の製造方法であって、
ＫＳＰカドヘリン発現細胞が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１７３（受領機関：産業総合研究所；受領日：２０１１年９月１４日）として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗ＫＳＰカドヘリン抗体を用いて、単離される、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿細管上皮細胞前駆細胞、その製造方法、及びその前駆細胞を用いた尿細管上皮細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療において、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞などの多能性を有する幹細胞は、末期腎不全患者に対する腎臓再生のための有用な資源になり得ると考えられている。現在、多能性幹細胞を、神経、心臓、皮膚、血液などの組織や臓器へ誘導分化させるための研究は進んでいるが、多能性幹細胞を腎臓再生に用いるための研究は著しく遅れている。【０００３】
例えば、アクチビンで中胚葉へ分化誘導したマウスＥＳ細胞から、中胚葉のマーカー遺伝子であるBrachyuryを発現する細胞を選別し、胎仔の後腎に注射することによって、尿細管の分化誘導に成功しているが、糸球体への分化は認められなかった（Vigneau et al., J.Am.Soc.Nephrol vol.18 p.1709-1720, 2007）。また、アクチビン、レチノイン酸、ＢＭＰ７の組み合わせが後腎間葉細胞への分化誘導を促進するが、尿細管や足細胞などの成熟した腎構成細胞への分化は認められなかった（Kim D. et al., J.Am.Soc.Nephrol. vol.16 p.3527-3534, 2005）。一方、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いてアクチビン含有培地で胚様体を作製し、ディッシュ上で分化させたところ、尿細管上皮細胞が分化誘導された（Morizane, R et al, Biochem.Biophys.Res.Commun. vol.390）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞を再生医療に応用するには、最終分化した尿細管上皮細胞ではなく、その前駆細胞を得ることが好ましい。それにもかかわらず、これまで、尿細管上皮細胞に分化し得る尿細管上皮細胞前駆細胞が単離された報告が無い。【０００５】
そこで、本発明は、尿細管上皮細胞前駆細胞及びその製造方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＥＳ細胞を分化させ、尿細管上皮細胞に分化できる尿細管上皮細胞前駆細胞を単離する方法の開発を試みていたところ、分化した尿細管上皮細胞のマーカーであるＫＳＰカドヘリンの抗体を用いて、尿細管上皮細胞前駆細胞を単離できることを見出し、本発明の完成に至った。【０００７】
本発明の一実施態様は、尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、を含む。前記培養工程において、前記多能性幹細胞がアクチビン含有培地で培養され、生じた胚様体が接着培養され、前記単離工程において、当該接着培養された胚様体からＫＳＰカドヘリン発現細胞が単離されてもよい。また、前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞の場合、胚様体を形成させないでＫＳＰカドヘリン発現細胞が製造されてもよい。この場合、前記培養工程において、前記多能性幹細胞が胚様体を形成しない条件で接着培養され、前記単離工程において、前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞が単離されてもよい。【０００８】
本発明の他の実施態様は、尿細管上皮細胞の製造方法であって、前記尿細管上皮細胞前駆細胞を尿細管上皮細胞に分化誘導する工程と、を含む。その際、前記尿細管上皮細胞前駆細胞は、in vitroで分化条件に置かれても、in vivoでヒトまたはヒト以外の哺乳類体内に移植されてもよい。【０００９】
本発明のさらなる実施態様は、尿細管上皮細胞への分化能を有する尿細管上皮細胞前駆細胞であって、ＫＳＰカドヘリン陽性で、Ｏｓｒ１陽性である、前駆細胞である。【００１０】
本発明のさらなる実施態様は、上記尿細管上皮細胞前駆細胞を含有する医薬組成物である。【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、上記尿細管上皮細胞前駆細胞を含有する医薬組成物の製造方法であって、多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、を含む。前記培養工程において、前記多能性幹細胞がアクチビン含有培地で培養され、生じた胚様体が接着培養され、前記単離工程において、当該接着培養された胚様体からＫＳＰカドヘリン発現細胞が単離されてもよい。また、前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞の場合、胚様体を形成させないでＫＳＰカドヘリン発現細胞が製造されてもよい。この場合、前記培養工程において、前記多能性幹細胞が胚様体を形成しない条件で接着培養され、前記単離工程において、前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞が単離されてもよい。【００１２】
なお、前記多能性幹細胞は、いずれも、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であってもよい。【００１３】
また、ＫＳＰカドヘリン発現細胞は、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１７３（受領機関：産業総合研究所；受領日：２０１１年９月１４日）として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗ＫＳＰカドヘリン抗体を用いて、単離されてもよい。【００１４】
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１１年９月２６日付で出願した日本国特許出願２０１１-２０９７９２に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例において、Flow cytometryを用いて、抗ＫＳＰカドヘリン抗体でＫＳＰカドヘリン陽性細胞と陰性細胞を選別したときの、Flow cytometryの結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ＫＳＰカドヘリン陽性細胞（右２レーン：KSP-posi-0422.CHP、KSP(+)-3.CHP）と陰性細胞（左２レーン：KSP-nega-0422.CHP、KSP(-)-3.CHP）とを比較して、陽性細胞で発現が２倍以上である遺伝子のヒートマップを示す図である。なお、陽性細胞は、カラーレンジがすべて正側（すなわち、全て高発現であることを示す）であって、陰性細胞は、カラーレンジがすべて負側（すなわち、全て低発現であることを示す）である。
【図３】本発明の一実施例において、ＫＳＰカドヘリン陽性細胞（Ａ右、Ｂ、Ｃ右）及び胎仔腎臓（Ａ左、Ｃ左）の３次元培養による尿細管の環状構造の形成を示した写真である（Ａ：位相差顕微鏡、Ｂ：蛍光顕微鏡、倍率は１００倍、Ｃ：電子顕微鏡）。
【図４】本発明の一実施例において、図３とは異なる条件下における、ＫＳＰカドヘリン陽性細胞の３次元培養による尿細管の環状構造の形成を示した写真である（Ａ：位相差顕微鏡、Ｂ：蛍光顕微鏡、倍率は１００倍）。
【図５】本発明の一実施例において、細胞培養中に胚様体形成を経由する場合（ＥＢ（＋））またはしない場合（ＥＢ（−））および、ＢＩＯで刺激した場合（ＢＩＯ（＋））またはしない場合（ＢＩＯ（−））の細胞のＫＳＰカドヘリン発現量を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、アクチビン単独、またはアクチビンと共にＨＧＦまたはＩＧＦ−１を培地に含有させた場合のＫＳＰカドヘリンの発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; Juan S. Bonifacino (Bethesda, Maryland); Mary Dasso (Bethesda, Maryland); J. B. Harford, J. L-Schwartz, K. M. Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
（１）尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法
本発明の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法は、多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、この部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、を含む。以下に具体的に説明する。
【００２０】
（１−１）多能性幹細胞の培養工程
本発明の尿細管上皮細胞前駆細胞を製造するため、まず、多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
多能性幹細胞の培養では、胚様体を形成させることが好ましい。胚様体を形成するための培養は、浮遊状態で行なう（浮遊培養）。胚様体が形成された後であれば、いつでも胚様体を回収してもよいが、胚様体は培養開始から約１〜７日後に回収することが好ましく、約２〜５日後に回収することがより好ましく、約２〜３日後に回収することがもっとも好ましい。胚様体を回収後、必要であれば、培地交換などのために、接着状態でしばらく培養してもよい（接着培養）。この接着培養は、約４日〜２５日間行なえばよいが、約６日〜２０日間行なうのが好ましく、約８日〜１６日間行なうのがもっとも好ましい。
【００２２】
なお、多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である場合、一切の工程において、胚様体を形成させる必要はなく、培養工程および単離工程においても、細胞は胚様体を形成させずに接着培養してもよい。この場合は、胚様体の形成を経由する場合と比べて、各ＫＳＰカドヘリン発現細胞のＫＳＰカドヘリン発現レベルは低くなるが、ヒト胚性幹細胞から得られるＫＳＰカドヘリン発現細胞の数は多くなる。
【００２３】
なお、本明細書において、部分分化細胞とは、多能性幹細胞または胚様体を接着培養して生じる、部分的に、あるいは全面的に分化している細胞をいうが、接着培養させた細胞中にＫＳＰカドヘリン発現細胞が生じている限り、その分化程度や分化方向は特に限定されない。
【００２４】
浮遊培養及び接着培養のための培地は、当業者に周知の培地であれば特に限定されず、ＦＢＳなどの血清を含んでいても含んでいなくても良く、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＥＧＭ、市販の無血清培地などが挙げられる。培地には、アクチビンを含有させることが好ましく、その濃度は、２〜１００ｎｇ／ｍＬであれば良いが、５〜１５ｎｇ／ｍＬが好ましく、約１０ｎｇ／ｍＬが最も好ましい。ここで、アクチビンが由来する動物種は特に限定されず、例えば、マウスやヒト由来であっても構わない。また、培地にアクチビンと共にＨＧＦ（hepatocyte growth factor）またはＩＧＦ−１(insulin-like growth factor)を加えることが好ましい。それによって、ＫＳＰ発現量が増大するからである。ＨＧＦの含有濃度は、１〜１００ｎｇ／ｍＬであれば良いが、３０〜７０ｎｇ／ｍＬが好ましく、４０〜６０ｎｇ／ｍＬが最も好ましい。ＩＧＦ−１の含有濃度は、１〜２００ｎｇ／ｍＬであれば良いが、２〜１０ｎｇ／ｍＬが好ましく、４〜６ｎｇ／ｍＬが最も好ましい。
【００２５】
浮遊培養には、非接着状態で培養できる浮遊培養用のディッシュ（培養皿）を用いる。例えば、細菌培養用プラスティックディッシュなどの、非接着培養用ディッシュを用いればよい。接着培養には、接着状態で培養できる細胞接着培養用のディッシュを用いる。例えば、市販の多くの真核細胞培養用ディッシュを用いることができる。ここで、浮遊培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、接着培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させて培養することを意味する。培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着するとは、細胞や細胞塊が、ＥＣＭ（extracellular matrix、即ち細胞外マトリックス）などに含まれる細胞−基質接着分子を通じて、培養器底面と接着している状態を意味し、培養液を軽く揺らしても細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでこない状態を言う。一方、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着しないとは、細胞や細胞塊が、ＥＣＭなどに含まれる細胞−基質接着分子を通じて培養器底面と接着していない状態を意味し、たとえ底面に触れていても培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態を言う。接着培養の際は、細胞の基質への接着を促進するために、プラスティックディッシュの底表面を化学処理したり、接着を促進する接着用コーティング剤（ゼラチン、ポリリジン、寒天など）でコートしたりすることが好ましい。浮遊培養の際は、プラスティックディッシュの底表面を処理しなかったり、あるいは、細胞の基質への接着を阻止するための接着阻止用コーティング剤（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）など）でコートしたりすることが好ましい。なお、接着培養であっても、目的の細胞が接着するまでに時間がかかり、ある程度の時間、浮遊状態にある場合があるが、時間がかかってもその細胞が最終的に培養器底面に接着する場合は、接着培養に含めることとする。
【００２６】
（１−２）ＫＳＰカドヘリン発現細胞の単離工程
次に、培養工程で得られた部分分化細胞から、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する。
【００２７】
ＫＳＰカドヘリン発現細胞の単離の際、培養工程において細胞を接着培養させて得られた部分分化細胞の細胞塊を解離することが好ましい。解離方法は特に限定されず、ピペッティングなどによる物理的方法であっても、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼなどのプロテアーゼを用いた化学的方法であってもよい。
【００２８】
解離した細胞から、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する方法は、特に限定されない。例えば、細胞が、ＫＳＰカドヘリン遺伝子のプロモーターで発現制御されているＧＦＰ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼなどのマーカーを有する場合、それらのマーカー発現を指標に細胞を単離してもよい。あるいは、ＫＳＰカドヘリンを特異的に認識する抗体を用いてもよい。その場合、直接蛍光標識した抗体や、蛍光標識した二次抗体を結合させた抗体を、解離した細胞に添加して、ＫＳＰカドヘリン発現細胞に結合させ、ＦＡＣＳで結合した細胞を単離する方法や、微小磁石を用いる方法などがあるが、ＫＳＰカドヘリン発現細胞が単離できればよく、これらの方法に限定されない。
【００２９】
なお、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離した後、Osr1など、別のマーカーを用いて、より均一な細胞群を単離してもよい。
【００３０】
（２）尿細管上皮細胞前駆細胞
尿細管上皮細胞前駆細胞とは、分化段階が尿細管上皮細胞の前段階（より未分化な状態）にあり、尿細管上皮細胞に分化誘導しうる細胞をいう。
【００３１】
本発明のＫＳＰカドヘリン発現細胞は、中腎及び後腎の間充織前駆体の最も早い段階から発現し、尿細管上皮細胞に分化が進行すると発現が消失するOsr1（Odd-skipped related 1）遺伝子を発現している。Osr1を腎臓の前駆細胞で強制発現すると、腎臓の尿細管の分化が抑制される（Richard GJ et al., development vol.133 p.2995-3004, 2006）ことから、このＫＳＰカドヘリン発現細胞は、ＫＳＰカドヘリンを発現しているにもかかわらず、分化段階は、尿細管上皮細胞以前のステージにあると考えられる。
【００３２】
さらに、ＫＳＰカドヘリン発現細胞は、以下に示すように、３次元培養を行なうことによって、in vitroで尿細管の管腔構造を形成することが可能である。マウス腎臓から尿細管上皮細胞を抽出しても、in vitroで尿細管の管腔構造を再現できないので、やはり、このＫＳＰカドヘリン発現細胞の分化段階は、尿細管上皮細胞以前のステージにあると考えられる。そして、このＫＳＰカドヘリン発現細胞から形成された管腔構造は、マウス胎児腎臓を用いて形成されるものと非常に類似した形態を有するため、本発明のＫＳＰカドヘリン発現細胞は、尿細管上皮細胞前駆細胞であると結論される。
【００３３】
なお、ＫＳＰカドヘリンは尿細管上皮細胞特異的マーカーであって（Whyte, DA, et al., Am.J.Physiol. vol.277 p.F587-F598, 1999；Shao, X. et al., J.Am.Soc.Nephrol. vol.13 p.1824-1836, 2001）、尿細管上皮細胞の分化を阻害する、間充織前駆体のマーカーであるOsr1とは、発現が両立しないと考えられてきたにもかかわらず、本発明のＫＳＰカドヘリン発現細胞は両方の遺伝子が発現しているので、新規尿細管上皮細胞前駆細胞であると考えられる。
【００３４】
（３）尿細管上皮細胞への分化誘導
こうして得られたＫＳＰカドヘリン発現細胞を培養することによって、尿細管上皮細胞に分化させることができる。例えば、in vitroでは、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を浮遊培養し、細胞塊を形成させた後、マトリゲルで３次元培養することによって、尿細管上皮細胞からなる管腔構造を形成することができる。in vivoでは、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物に移植することにより、尿細管上皮細胞に分化させることができる。直接的な移植部位は、腹膜（例えば大網など）、胎仔後腎、腎臓などが考えられるが、静脈注射によって目的の組織（例えば腎臓など）に移植してもよい。
【００３５】
（４）医薬組成物
本発明のＫＳＰカドヘリン発現細胞は、尿細管上皮細胞前駆細胞であって、尿細管上皮細胞に分化し得る。従って、本発明のＫＳＰカドヘリン発現細胞は、医薬組成物として有用であって、腎疾患に対する医薬剤として有効である。腎疾患としては、薬剤性、または脱水などによる急性腎不全や、糖尿病性腎症や原発性糸球体腎炎などによる慢性腎不全などが例示できる。  
この医薬組成物は、多能性幹細胞をアクチビン含有培地で培養し、胚様体を形成させ、その胚様体の細胞から、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離することによって、作製することができる。  
剤形は特に限定されないが、注射剤や液剤が好ましく、緩衝液や保存剤などの添加物を含有してもよい。  
投与方法も特に限定されないが、例えば、腎疾患に罹患した患者に対し、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を、経静脈を通じて細胞移植することにより、あるいは腎実質へ直接的に細胞移植することにより、腎機能の改善や腎不全の進行抑制が期待できる。
【００３６】
（５）薬のスクリーニング方法
既述のように単離した尿細管上皮細胞前駆細胞またはこの尿細管上皮細胞前駆細胞からin vitroで作製した尿細管上皮細胞に、試験物質を接触させて、この試験物質の各細胞に対する薬効や毒性などの生理作用を評価し、目的の薬効や毒性を有する試験物質を同定することにより、目的の作用を有する薬をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００３７】
[実施例１]  マウスＥＳ細胞株を用いたＫＳＰカドヘリン陽性細胞の作製
（１）ＥＳ細胞の分化誘導
本実施例では、恒常的にＧＦＰを発現するマウスＥＳ細胞株、CAG-GFP EB3 (Yoshizaki et al., Neurosci Lett., vol.363 p.33-37, 2004）を用いて、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を作成した。  
まず、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビン含有）を用いて約10,000個／ｍＬの細胞を非接着ディッシュ（超低接着表面ディッシュ、コーニング社）に播種し、浮遊培養して胚様体を形成させた。３日間培養後、接着ディッシュ（微生物用ペトリディッシュ、BD Falcon社）に移し、ディッシュ以外は浮遊培養と同じ条件で１８日間培養し、部分分化細胞を得た。その間、２日に一度、培地交換を行なった。【００３８】
（２）抗ＫＳＰカドヘリン抗体による細胞選別
接着培養１８日後に、部分分化細胞をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで７分間処理した後、ピペッティングで細胞を解離させた。遠心後０．２％コラゲナーゼに置換し３７度で１５分間処理して、細胞をさらに解離した。１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール含有）を用いて、得られた細胞を約2,000,000個／ｍＬの濃度で非接着ディッシュに播種し、４５分間インキュベートして、ＫＳＰカドヘリンを膜上に再生させた後、１ｘ１０７個／ｍＬの濃度で細胞を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに希釈し、４℃で１５分間、ブロッキングを行った。細胞をＰＢＳで洗浄後、ビオチン結合抗ＫＳＰカドヘリン抗体（作製方法は後述）（０．０８ｍｇ／ｍＬ、溶媒は０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を４℃で３０分間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン結合ＡＰＣ（Allophycocyanin）（２μｇ／ｍＬ）（０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を４℃で２０分反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、セル・ソーターＭｏＦｌｏＴＭＸＤＰ（Beckman coulter社）を用いてFlow cytometryを行い、陽性細胞と陰性細胞を選別した（図１）。陽性細胞率は１．３６％であった。【００３９】
<抗ＫＳＰカドヘリン抗体の作製>
以下の３種類のペプチドを化学合成し、Ｎ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した。  
[1] PEPEEGAENKAFELDPTC  （配列番号１）
[2] QPAESLHTEVPENYGGNC  （配列番号２）
[3] NVEGQCMRKVGRMKGMPTKLS  （配列番号３）
この３種類のペプチドを混合して用いて、定法に従って、以下のようにマウスへの免疫を行なった。まず、合成ペプチド３種類を混ぜ、マウス４匹に免疫を行った。免疫したマウスから、肥大したリンパ節を取り出し、細胞を回収した。回収したリンパ節由来細胞とミエローマ細胞を混合し、細胞融合を行った。細胞を９６穴プレートに播種し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された段階で、培養上清をサンプリングし、１次スクリーニングを行った。１次スクリーニングはELISA、Western blot、Flow cytometryで行い、特異性の高いサンプルを５つ選別した。選別した５つのサンプルについてクローン化の作業を行った。その結果、５サンプルについて複数のクローンを確立し、合わせて１５クローンを取得した。これらの培養上清で、１次スクリーニングと同様の方法で２次スクリーニングを行い、最も特異性の高いクローンを１つ選別した。このクローンのハイブリドーマ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１７３（受領機関：産業総合研究所；受領日：２０１１年９月１４日）として寄託された）をヌードマウスの腹腔に注射し、腹水が増えたのち回収した。回収した腹水から、Protein AカラムによるIgG精製を行った。  
なお、精製した抗体は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Thermo scientific)を用いて、ビオチン化を行った。【００４０】
（３）ＫＳＰカドヘリン陽性細胞における遺伝子発現
選別されたＫＳＰカドヘリン陽性細胞及び陰性細胞の各２サンプルから、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、分光光度分析で濃度、純度及び分解度を確認した。Two-Cycle cDNA Synthesis Kit(Affymetrix)、MEGAscript T7 Kit (Ambion)、IVT cRNA Cleanup Kit（Affymetrix）、GeneChip IVT Labeling Kit（Affymetrix）を用いて２回増幅法によるラベル化ｃＲＮＡの合成を行った。ｃＲＮＡを断片化後、GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit(Affymetrix)を用いて、AffymetrixのGeneChip、Mouse Genome 430 2.0 Arrayにハイブリダイゼーションを行い、マイクロアレイ解析を行った。データの解析には、Gene spring(Agilent)を使用した。【００４１】
ＫＳＰカドヘリン陽性細胞で陰性細胞と比較して発現が２倍以上である遺伝子を抽出すると、約２５００個の遺伝子が得られた。これら遺伝子の機能をGene springのGo analysisで解析すると、腎臓の発生過程に関連した遺伝子（例えば、BMP4、Slit2、Robo2などの、後腎間葉細胞で発現する遺伝子（Vainio, S and Lin, Y., Nature Reviews vol.3 p.533-543, 2002）など）、尿細管細胞で発現しているチャネルタンパク質をコードする遺伝子（例えば、AQP1、AQP2、AQP3など）などがＫＳＰカドヘリン陽性細胞で有意に高発現していた（図２には、腎臓の発生に関係した遺伝子についてのヒートマップを示す）。特に、腎臓の分化初期段階（間充織前駆体など）で発現し、分化後期段階（尿細管上皮細胞など）では発現が消失するOsr1遺伝子が、ＫＳＰカドヘリン陽性細胞で高発現していた。このように、遺伝子発現のパターン解析から、得られたＫＳＰカドヘリン陽性細胞には、腎臓の分化段階において、分化した尿細管上皮細胞より前の段階にある細胞が含まれていることがわかる。少なくとも、このようなＫＳＰカドヘリン陽性でOsr1陽性の細胞は、尿細管上皮細胞前駆細胞であると考えられる。【００４２】
一方、ＫＳＰカドヘリン陰性細胞で陽性細胞と比較して発現が２倍以上である遺伝子を抽出すると、神経系に関連した遺伝子（例えば、Nrcam遺伝子やDab1遺伝子）や幹細胞に関連した遺伝子（例えば、Sox2遺伝子やNanog遺伝子）が含まれていた。これらの発現は、他の細胞タイプに分化した細胞やオリジナルのＥＳ細胞に由来すると考えられる。【００４３】
（４）ＫＳＰカドヘリン陽性細胞による環状構造の形成
Flow cytometryでＫＳＰカドヘリン陽性細胞を選別した後、ヒト近位尿細管初代培養用の腎上皮細胞培地キット（REGMTM BulletKitTM）（０．５％ＦＢＳ添加）を用いて、約500,000個／ｍＬの細胞を非接着ディッシュに播種し、２４時間培養して細胞塊を形成させた。その後、９６ウエルのディッシュ及び同キット（１０％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビン）を用い、マトリゲル内に約100,000個／ウエルの細胞由来の細胞塊を包埋し、２〜３日培養を行った。位相差顕微鏡で観察した像を図３Ａ右に、細胞が有しているＧＦＰによる蛍光を蛍光顕微鏡で観察した像を図３Ｂに、電子顕微鏡で観察した像を図３Ｃ右に示す。対照として、図３Ａ左及び図３Ｃ左に、マウス胎仔腎臓細胞を尿細管上皮細胞に分化させ、得られた環状構造の写真（Taub M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. vol.87 p.4002-4006, 1990より）を示し、本実施例の結果と比較した。なお、この対象実験では、マウスC57/BL6Jの胎生１０から１４日の胎仔腎臓が摘出し、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３７℃、１５分インキュベートした後、重力で腎臓の残塊を除去することによって単離した細胞を、約10,000個／ｍＬでマトリゲル内に包埋し、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で６〜１３日培養することによって得られた環状構造が、位相差顕微鏡（図３Ａ）または電子顕微鏡（図３Ｃ）で観察された。【００４４】
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、位相差顕微鏡による観察では、両者とも、非常に類似した環状構造を有していた。また、図３Ｃに示すように、電子顕微鏡による観察では、両者とも、同様の接着複合体が細胞間に認められ、微絨毛の形成も認められる。【００４５】
次に、Flow cytometryで選別したＫＳＰカドヘリン陽性細胞を、９６ウエルのディッシュに約100,000個／ウエルで、細胞塊を形成させずに、そのままマトリゲル上に播種し、REBM（Activin10ng/ml及び10%FCSを含有）を培地として３日間培養した後、ビオチン化した抗ＫＳＰカドヘリン抗体（０．０８ｍｇ／ｍＬ、溶媒は０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）とAlexa594結合ストレプトアビジン（５μｇ／ｍＬ、Invitrogen社S-11227）で免疫染色した。位相差顕微鏡で観察した像を図４Ａに、抗体染色による蛍光を蛍光顕微鏡で観察した像を図４Ｂに示す。【００４６】
この実験でも、図４に示されるように、ＫＳＰカドヘリン陽性細胞は、尿細管と類似した管状構造を形成することができた。【００４７】
このように、ＫＳＰカドヘリン陽性細胞は、胎児腎臓と同様、形態上も尿細管上皮細胞に分化し、尿細管上皮細胞前駆細胞の性質を有していることがわかる。【００４８】
[実施例２]  ＫＳＰカドヘリン発現量の解析
ここでは、ヒトＥＳ細胞株の分化誘導中に、胚様体の形成を経由して作製する場合（ＥＢ（＋））のＫＳＰカドヘリン発現量は、胚様体の形成をせずに作製する場合（ＥＢ（−））よりもＫＳＰカドヘリン発現量が高いことを示す。また、分化誘導中、ＧＳＫ−３β阻害剤（ＢＩＯ（6-bromoindirubin-3’-oxime））で刺激するとＫＳＰカドヘリン発現量が増強する傾向があることを示す。【００４９】
（１）ＥＳ細胞の分化誘導
本実験例では、ヒトＥＳ細胞株（KhES-１）を用いて、以下のとおりＫＳＰカドヘリン発現細胞を作製した。【００５０】
（１−１）分化誘導中に胚様体形成を経由する場合
８０％コンフルエントの未分化ヒトＥＳ細胞を、コロニーのまま、おおよそディッシュ底面積辺りの細胞数が変化しないような濃度で、超低接着表面ディッシュ（コーニング社）に移し、ＲＧＥＭ（１０ｎｇ／ｍＬアクチビン含有）を用いて、４日間浮遊培養して胚様体を形成させた。ＢＩＯで刺激するものは、２日目から４日目まで培地にＢＩＯを５μＭ添加した。次に、形成した胚様体を接着ディッシュ（微生物用ペトリディッシュ、BD Falcon社）に移し、ＲＧＥＭを用いて５日間または８日間接着培養した。その間、２日に一度、培地交換を行なった。【００５１】
（１−２）分化誘導中に胚様体形成を経由しない場合
８０％コンフルエントの未分化ヒトＥＳ細胞を、コロニーのまま、おおよそディッシュ底面積辺りの細胞数が変化しないような濃度で、接着ディッシュ（微生物用ペトリディッシュ、BD Falcon社）に移し、ＲＧＥＭを用いて９日間または１２日間接着培養した。ＢＩＯで刺激するものは、２日目から４日目まで培地にＢＩＯを５μＭ添加した。その間、２日に一度、培地交換を行なった。【００５２】
（２）ＫＳＰカドヘリンの発現量
次に、ＫＳＰの発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた。結果はＧＡＰＤＨを対照として、図５に示す。【００５３】
いずれの細胞もＫＳＰカドヘリンを発現していた。そのうち、胚様体を経由して形成した場合はＫＳＰカドヘリンの発現量が高かった。また、ＢＩＯで刺激するとＫＳＰカドヘリンの発現量が高くなる傾向があった。【００５４】
[実施例３]  ＨＧＦまたはＩＧＦ−１含有培地による分化誘導
ここでは、分化誘導中の培地にＨＧＦまたはＩＧＦ−１をアクチビンと共に含有させることによりＫＳＰ発現量が増強することを示す。【００５５】
（１）ＥＳ細胞の分化誘導
本実施例では、マウスＥＳ細胞株（EB3）を用いて、ＫＳＰカドヘリン発現細胞を作成した。  
まず、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビン含有）を用いて約10,000個／ｍＬの細胞を非接着ディッシュ（超低接着表面ディッシュ、コーニング社）に播種し、浮遊培養して胚様体を形成させた。３日間培養後、接着ディッシュ（微生物用ペトリディッシュ、BD Falcon社）に移し１５日間培養した。この培養には、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビン含有）に、１，１０，５０ｎｇ／ｍＬのマウスＨＧＦまたは５，１０，１００ｎｇ／ｍＬのマウスＩＧＦ−１を含有させたものを用いた。その間、２日に一度、培地交換を行なった。【００５６】
（２）ＫＳＰカドヘリンの発現量
次に、ＫＳＰの発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた。結果はＧＡＰＤＨを対照として図６に示す。アスタリスクは、アクチビン１０ｎｇ／ｍｌのみの結果に対して有意に差があること（ｐ＜０．０５）を示す。【００５７】
アクチビンと共にＨＧＦまたはＩＧＦ−１を含有する培地で分化誘導させた場合は、ＨＧＦまたはＩＧＦ−１を含有しない培地よりもＫＳＰ発現量がさらに増強した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によって、尿細管上皮細胞前駆細胞及びその製造方法を提供することが可能になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月26日(2013.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、
前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、
を含む、尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞がアクチビン含有培地で培養され、生じた胚様体が接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、
胚様体を形成させないでＫＳＰカドヘリン発現細胞が製造される、製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞が胚様体を形成しない条件で接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞の製造方法であって、
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、製造方法。
【請求項６】
請求項１の方法に従って、尿細管上皮細胞前駆細胞を製造する工程と、
前記尿細管上皮細胞前駆細胞を尿細管上皮細胞に分化誘導する工程と、
を含む、尿細管上皮細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の尿細管上皮細胞の製造方法であって、
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法であって、
ＫＳＰカドヘリン発現細胞が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１７３（受領機関：産業総合研究所；受領日：２０１１年９月１４日）として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗ＫＳＰカドヘリン抗体を用いて、単離される、製造方法。
【請求項９】
尿細管上皮細胞への分化能を有する尿細管上皮細胞前駆細胞であって、
請求項１〜６および８のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された、前駆細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞であって、
胚性幹細胞由来または人工多能性幹細胞由来である、前駆細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の尿細管上皮細胞前駆細胞を含有する医薬組成物の製造方法であって、
多能性幹細胞を培養して生じる部分分化細胞を得る培養工程と、
前記部分分化細胞からＫＳＰカドヘリン発現細胞を単離する単離工程と、
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞がアクチビン含有培地で培養され、生じた胚様体が接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、
胚様体を形成させないでＫＳＰカドヘリン発現細胞が製造される、製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記培養工程において、前記多能性幹細胞が胚様体を形成しない条件で接着培養されて部分分化細胞を生じる、製造方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
前記培養する工程に胚様体の形成工程を含む、製造方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の製造方法であって、
ＫＳＰカドヘリン発現細胞が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１７３（受領機関：産業総合研究所；受領日：２０１１年９月１４日）として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗ＫＳＰカドヘリン抗体を用いて、単離される、製造方法。
【国際調査報告】
2013047529.tif 000008
2013047529.tif 000009
2013047529.tif 000010
2013047529.tif 000011
2013047529.tif 000012