(57)【要約】【課題】ＴＬＲのシグナル伝達の調整剤を提供すること。【解決手段】（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［（１Ｓ）−１−イソブトキシメチル−３−メチルブチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸モノナトリウム）などのカテプシン阻害剤を有効成分として含有する製剤をＴＬＲのシグナル伝達の調整剤、ＴＬＲのシグナル伝達が関与する疾患の治療の治療剤、Ｔｈ１７細胞の誘導が関与する疾患の治療剤、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７又はＩＬ−２３の産生が関与する疾患の治療剤、並びに全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、クローン病、乾癬、又は急性散在性脳脊髄炎の治療剤として使用する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴｏｌｌ様受容体のシグナル伝達の調整剤。
【請求項２】
カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴｏｌｌ様受容体のシグナル伝達が関与する疾患の治療剤。
【請求項３】
Ｔｏｌｌ様受容体がＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９から選択される請求項１又は２記載の調整剤又は治療剤。
【請求項４】
Ｔｏｌｌ様受容体がＴＬＲ９である請求項１又は２記載の調整剤又は治療剤。
【請求項５】
カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴｈ１７細胞の誘導が関与する疾患の治療剤。
【請求項６】
カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＩＬ−１７又はＩＬ−２３の産生が関与する疾患の治療剤。
【請求項７】
疾患が免疫関連疾患、骨関連疾患及び癌疾患から選択される請求項２〜６の何れかの項に記載の治療剤。
【請求項８】
疾患が、自己免疫疾患である請求項２〜６の何れかの項に記載の治療剤。
【請求項９】
カテプシン阻害剤を有効成分として含有する全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、クローン病、乾癬、又は急性散在性脳脊髄炎の治療剤。
【請求項１０】
カテプシン阻害剤が、カテプシンＫ阻害剤、カテプシンＬ阻害剤、カテプシンＢ阻害剤、カテプシンＨ阻害剤又はカテプシンＳ阻害剤から選択される請求項１〜９の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１１】
カテプシン阻害剤が、カテプシンＫ阻害剤である請求項１〜９の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１２】
カテプシン阻害剤が、Ｎ−［１−［（シアノメチル）カルバモイル］シクロヘキシル］−４−（４−プロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド、Ｎ−［（１Ｓ）−３−メチル−１−［［（４Ｓ，７Ｒ）−７−メチル−３−オキソ−１−（ピリジン−２−イルスルホニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−４−イル］カルバモイル］ブチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、（２Ｒ）−Ｎ−シアノメチル−４−メチル−２−（４’−ピペラジン−１−イル−１，１’−ビフェニル−３−イル）ペンタンアミド、Ｎ−［３−［（２Ｚ）−２−（３−メチル−１，３−チアゾリジン−２−イリデン）ヒドラジノ］−２，３−ジオキソ−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルプロピル］シクロヘプタンカルボキサミド、Ｎ−シアノメチル−４−メチル−２−［２，２，２−トリフルオロ−１−（４’−メチルスルホニル−１，１’−ビフェニル−４−イル）エチルアミノ］ペンタンアミド、又は（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［（１Ｓ）−１−イソブトキシメチル−３−メチルブチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸モノナトリウムから選択される請求項１〜９の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１３】
カテプシン阻害剤が、次の一般式（１）で表わされるエポキシコハク酸アミド誘導体またはその生理学的に許容できる塩である請求項１〜９記載の調整剤又は治療剤。
【化１】
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［上記の式において、Ｒ１は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が２〜１０のアルケニル基、炭素原子数が２〜１０のアルキニル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり；Ｒ２は、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が２〜１０のアルケニル基、炭素原子数が２〜１０のアルキニル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり；Ｒ３は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が２〜１０のアルケニル基、炭素原子数が２〜１０のアルキニル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり；Ｘは、−Ｏ−または−ＮＲ４−（Ｒ４は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）であり；Ｙ１は、ＯＲ５（Ｒ５は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が２〜２０のアシル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）、ＳＲ６（Ｒ６は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が２〜２０のアシル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）、またはＮＲ７Ｒ８（Ｒ７は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が２〜２０のアシル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり、そしてＲ８は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）であり；そしてＹ２は、水素原子または炭素原子数が１〜１０のアルキル基である；あるいは、Ｙ１とＹ２とは一緒になって、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ９（Ｒ９は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）、あるいは＝Ｎ−ＯＲ１０（Ｒ１０は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）を表わしてもよい；なお、上記Ｒ５〜Ｒ１０のアルキル基はいずれも、ヒドロキシル基、アミノ基、炭素原子数が１〜６のアルキルアミノ基、合計炭素原子数が２〜１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素原子数が２〜７のアルコキシカルボニル基、カルバモイル基、炭素原子数が２〜７のアルキルアミノカルボニル基、合計炭素原子数が３〜１３のジアルキルアミノカルボニル基、およびグアニジノ基からなる群より選ばれる一もしくは二以上の置換基を有していてもよく、また上記Ｒ１〜Ｒ１０の各アリール基および各複素環基は、炭素原子数が１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、炭素原子数が１〜６のアルキルアミノ基、合計炭素原子数が２〜１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が１〜６のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素原子数が１〜６のハロアルキル基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、炭素原子数が２〜７のアルコキシカルボニル基、カルバモイル基、炭素原子数が２〜７のアルキルアミノカルボニル基、合計炭素原子数が３〜１３のジアルキルアミノカルボニル基、アミジノ基、およびグアニジノ基からなる群より選ばれる一もしくは二以上の置換基を有していてもよい］。
【請求項１４】
一般式（１）のＲ１が、水素原子または炭素原子数が１〜６のアルキル基である請求項１３記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１５】
一般式（１）のＲ２が、炭素原子数が１〜６のアルキル基、フェニル基又はベンジル基である請求項１３又は１４記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１６】
一般式（１）のＲ３が、水素原子または炭素原子数が６〜２０のアリール基である請求項１３〜１５の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１７】
一般式（１）のＸが、−Ｏ−である請求項１３〜１６の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１８】
一般式（１）のＹ１が、ヒドロキシル基、炭素原子数が１〜６のアルコキシ基、アセトキシ基、又は炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基からなるアラルキルオキシ基である請求項１３〜１７の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項１９】
一般式（１）のＲ２が、イソブチル基またはイソプロピル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｙ１がＯＲ５（Ｒ５は請求項１３と同じ）であり、そしてＹ２が水素原子である請求項１３、１４又は１７のうちの何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項２０】
一般式（１）のＲ２がイソブチル基またはイソプロピル基であり、Ｒ３が炭素原子数が６〜２０のアリール基であり、Ｙ１がＯＲ５（Ｒ５は請求項１３と同じ）であり、そしてＹ２が水素原子である請求項１３、１４又は１７の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項２１】
一般式（１）のＹ１とＹ２とが一緒になって、＝Ｏを形成する請求項１３〜１７の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項２２】
生理学的に許容できる塩がアルカリ金属塩である請求項１３〜２１の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【請求項２３】
カテプシン阻害剤が、（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［（１Ｓ）−１−イソブトキシメチル−３−メチルブチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸モノナトリウムである請求項１〜９の何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達の調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は動物の細胞表面にある受容体タンパク質で、病原微生物の特異的な構造（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ：ＰＡＭＰｓ）を認識して自然免疫を活性化するシグナル伝達に関与することが知られている。
ＴＬＲはヒトでは１０種類のサブタイプの存在が確認されており、そのうち微生物由来の糖タンパク質、脂質成分を認識するＴＬＲ１，２，４，６は、細胞膜表面に局在し、微生物由来の核酸成分を認識するＴＬＲ３，７，８，９は、細胞内エンドソームに局在している。
そして、ＴＬＲは異物を認識すると、炎症性サイトカインやインターフェロン（ＩＦＮ）を産生することから、ＴＬＲの機能を適切に制御することが、病気をコントロールする上で重要となる。たとえば、ＴＬＲ３，７，８，９のアンタゴニストである４−第一級アミノキノリンを自己免疫、炎症、アレルギー、喘息等の疾患へ応用することが提案されている。（特許文献１）【０００３】
従来、ＣＤ４＋ヘルパ−Ｔ細胞には細胞性免疫に関与する１型ヘルパ−Ｔ（Ｔｈ１）細胞と、液性免疫に関与するＴｈ２細胞があることが知られていた。
最近、Ｔｈ１７と呼ばれる新たなＴ細胞サブセットが存在し、これがアレルギー応答や自己免疫、細胞外増殖性の細菌感染防御などで中心的な役割を果たしていることが分かってきている。
そして、Ｔｈ１７は、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）により維持・誘導されることも判明している。
Ｔｈ１７は、ＩＬ−１７を産生することも知られている。
そこで、ＩＬ−２３のアゴニスト又はアンタゴニストを腫瘍の治療に使用することが提案されている。（特許文献２）
ＩＬ−１７活性を阻害する物質の多発性硬化症や慢性関節リウマチの治療への応用も提案されている。（特許文献３、４、５）
また、ＩＬ−１７の産生を阻害するために、ＩＬ−２３アンタゴニスト（抗ＩＬ−２３又は抗ＩＬ−２３レセプター抗体）で処理することで、炎症性疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症等）を治療することも提案されている。（特許文献６）【０００４】
ところで、カテプシンはパパイン様リソソームシステインタンパク質分解酵素ファミリーを構成し、その分解活性を発揮するのに低いｐＨ環境が必要とされる。カテプシンはかつて非特異的に細胞内タンパク質を除去する必須の酵素として認識されていたが、時空的発現様式と基質特異性に基づいた特定の細胞型特異的機能を持っている。
そして、ファミリーを構成するカテプシンＫは、その遺伝子発現において他の細胞と比べて、特に破骨細胞に多く発現しているタンパク質分解酵素である。さらに、破骨細胞におけるカテプシンＫの発現レベルは、他のシステインプロテアーゼに比べて約２０〜５００倍も高いことがわかり、カテプシンＫが破骨細胞特異的に多く発現している酵素であることが確認されている。またカテプシンＫは破骨細胞が分泌し、骨基質を消化するタンパク質分解酵素の中で、特に重要な酵素であることが理解されてきている。
従って、カテプシンＫ阻害作用を有する薬物である（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［（１Ｓ）−１−イソブトキシメチル−３−メチルブチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸モノナトリウムは、骨粗鬆症治療薬として期待されている。（特許文献７）
しかしながら、カテプシンＫ阻害剤が、上記のＴＬＲのシグナル伝達に関与することや、Ｔｈ１７の産生、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３の産生に関与する疾患に有効であることは知られていない。【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２４６１５号公報
【特許文献２】特表２００６−５２０７８１号公報
【特許文献３】特表２００７−５１１５９３号公報
【特許文献４】特開２０００−１８６０４６号公報
【特許文献５】特表２００４−５１７９１８号公報
【特許文献６】特表２００６−５１４００４号公報
【特許文献７】国際公開第９９／１１６４０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的はカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達の調整剤を提供すること、ＴＬＲのシグナル伝達が関与する疾患の治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達の調整剤に関する。
また、本発明はカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達が関与する疾患の治療剤に関する。
本発明はカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴｈ１７細胞の誘導が関与する疾患の治療剤にも関する。
本発明はカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７又はＩＬ−２３の産生が関与する疾患の治療剤にも関する。
本発明はカテプシン阻害剤を有効成分として含有する全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、クローン病、乾癬、又は急性散在性脳脊髄炎の治療剤にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
次に本発明を詳細に説明する。
本発明のカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達の調整剤及びカテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達が関与する疾患の治療剤において、ＴＬＲとしてはＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９から選択されるものが挙げられ、好ましくはＴＬＲ９である。
カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴＬＲのシグナル伝達が関与する疾患、カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＴｈ１７細胞の誘導が関与する疾患、カテプシン阻害剤を有効成分として含有するＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７又はＩＬ−２３の産生が関与する疾患としては、免疫関連疾患、骨関連疾患及び癌疾患から選択されるものが挙げられる。
免疫関連疾患としては、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、クローン病、乾癬、急性散在性脳脊髄炎、又は多発性硬化症等の自己免疫疾患、感染症、喘息が挙げられ、特に自己免疫疾患が好ましい疾患として挙げられる。【０００９】
また、本発明のカテプシン阻害剤としては、ＷＯ９６／３０３５４、ＷＯ９９／１１６４０、ＷＯ９７／２１６９４、ＷＯ９８／４７８８７、特開平１１−２６３７８３、ＷＯ０１／０５８８８６、ＷＯ０１／４９２８８、ＷＯ０１／７０２３２、ＷＯ０３／０５３３３１、ＷＯ０３／０７５８３６、ＷＯ０３／０９１２０２、ＷＯ２００４／１０８６６１、ＷＯ２００５／０００８００、ＷＯ２００５／０６６１８０、ＷＯ２００７／０２５７７４等の特許文献記載のものやＴ．Ｙａｓｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，４１，４３０１−４３０８；Ｎ．Ｋａｔｕｍｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，４５８，６−１０；Ｔ．Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，１９９９，５２，５３６−５４１；Ｒ．Ｗ．Ｍａｒｑｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，４４，１３８０−１３９５；Ｊ．Ｒｏｂｉｃｈａｕｄ  ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ。２００３，４６，３７０９−３７２７；Ｃ．Ｓ．Ｌｉ  ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００６，１６，１９８５−１９８９等に記載のカテプシンＢ阻害剤、カテプシンＨ阻害剤、カテプシンＫ阻害剤、カテプシンＬ阻害剤又はカテプシンＳ阻害剤が挙げられ、好ましくはカテプシンＢ阻害剤、カテプシンＨ阻害剤、カテプシンＫ阻害剤であり、さらに好ましくはカテプシンＫ阻害剤である。【００１０】
また、本発明において、カテプシン阻害剤としては、Ｎ−［１−［（シアノメチル）カルバモイル］シクロヘキシル］−４−（４−プロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド、Ｎ−［（１Ｓ）−３−メチル−１−［［（４Ｓ，７Ｒ）−７−メチル−３−オキソ−１−（ピリジン−２−イルスルホニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−４−イル］カルバモイル］ブチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、（２Ｒ）−Ｎ−シアノメチル−４−メチル−２−（４’−ピペラジン−１−イル−１，１’−ビフェニル−３−イル）ペンタンアミド、Ｎ−［３−［（２Ｚ）−２−（３−メチル−１，３−チアゾリジン−２−イリデン）ヒドラジノ］−２，３−ジオキソ−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルプロピル］シクロヘプタンカルボキサミド、Ｎ−シアノメチル−４−メチル−２−［２，２，２−トリフルオロ−１−（４’−メチルスルホニル−１，１’−ビフェニル−４−イル）エチルアミノ］ペンタンアミド、又は（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［（１Ｓ）−１−イソブトキシメチル−３−メチルブチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸モノナトリウムが好ましい。
また、本発明において、カテプシン阻害剤としては、Ｅ−６４ｄが好ましい。
さらに、本発明において、カテプシン阻害剤としては、次に挙げるエポキシコハク酸アミド誘導体も好ましい。
（１）次の一般式（１）で表わされるエポキシコハク酸アミド誘導体またはその生理学的に許容できる塩。【００１１】
【化１】
2009054454.tif 000003
【００１２】
［上記の式において、Ｒ１は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が２〜１０のアルケニル基、炭素原子数が２〜１０のアルキニル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり；Ｒ２は、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が２〜１０のアルケニル基、炭素原子数が２〜１０のアルキニル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり；Ｒ３は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が２〜１０のアルケニル基、炭素原子数が２〜１０のアルキニル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり；Ｘは、−Ｏ−または−ＮＲ４−（Ｒ４は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）であり；Ｙ１は、ＯＲ５（Ｒ５は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が２〜２０のアシル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）、ＳＲ６（Ｒ６は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が２〜２０のアシル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）、またはＮＲ７Ｒ８（Ｒ７は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が２〜２０のアシル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基であり、そしてＲ８は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）であり；そしてＹ２は、水素原子または炭素原子数が１〜１０のアルキル基である；あるいは、Ｙ１とＹ２とは一緒になって、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ９（Ｒ９は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）、あるいは＝Ｎ−ＯＲ１０（Ｒ１０は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基、炭素原子数が６〜２０のアリール基、炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなるアラルキル基、炭素原子数が３〜１２の複素環基、または炭素原子数が３〜１２の複素環基と炭素原子数が１〜６のアルキル基とからなる複素環アルキル基である）を表わしてもよい；なお、上記Ｒ５〜Ｒ１０のアルキル基はいずれも、ヒドロキシル基、アミノ基、炭素原子数が１〜６のアルキルアミノ基、合計炭素原子数が２〜１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素原子数が２〜７のアルコキシカルボニル基、カルバモイル基、炭素原子数が２〜７のアルキルアミノカルボニル基、合計炭素原子数が３〜１３のジアルキルアミノカルボニル基、およびグアニジノ基からなる群より選ばれる一もしくは二以上の置換基を有していてもよく、また上記Ｒ１〜Ｒ１０の各アリール基および各複素環基は、炭素原子数が１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、炭素原子数が１〜６のアルキルアミノ基、合計炭素原子数が２〜１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が１〜６のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素原子数が１〜６のハロアルキル基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、炭素原子数が２〜７のアルコキシカルボニル基、カルバモイル基、炭素原子数が２〜７のアルキルアミノカルボニル基、合計炭素原子数が３〜１３のジアルキルアミノカルボニル基、アミジノ基、およびグアニジノ基からなる群より選ばれる一もしくは二以上の置換基を有していてもよい］。【００１３】
（２）一般式（１）のＲ１が、水素原子または炭素原子数が１〜６のアルキル基である（１）記載の化合物。
（３）一般式（１）のＲ２が、炭素原子数が１〜６のアルキル基、フェニル基又はベンジル基である（１）又は（２）記載の化合物。
（４）一般式（１）のＲ３が、水素原子または炭素原子数が６〜２０のアリール基である（１）〜（３）の何れかに記載の化合物。
（５）一般式（１）のＸが、−Ｏ−である（１）〜（４）の何れかに記載の化合物。
（６）一般式（１）のＹ１が、ヒドロキシル基、炭素原子数が１〜６のアルコキシ基、アセトキシ基、又は炭素原子数が６〜２０のアリール基と炭素原子数が１〜６のアルキル基からなるアラルキルオキシ基である（１）〜（５）の何れかに記載の化合物。
（７）一般式（１）のＲ２が、イソブチル基またはイソプロピル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｙ１がＯＲ５（Ｒ５は（１）と同じ）であり、そしてＹ２が水素原子である（１）、（２）又は（５）のうちの何れかの項に記載の調整剤又は治療剤。
（８）一般式（１）のＲ２がイソブチル基またはイソプロピル基であり、Ｒ３が炭素原子数が６〜２０のアリール基であり、Ｙ１がＯＲ５（Ｒ５は（１）と同じ）であり、そしてＹ２が水素原子である（１）、（２）又は（５）の何れかに記載の化合物。
（９）一般式（１）のＹ１とＹ２とが一緒になって、＝Ｏを形成する（１）〜（５）の何れかに記載の化合物。
（１０）生理学的に許容できる塩がアルカリ金属塩である（１）〜（９）の何れかに記載の化合物。【００１４】
上記一般式（１）で表されるエポキシコハク酸アミド誘導体の具体例を、下記の第１表（第１−１表、第１−２表、第１−３表、そして第１−４表）に示す。
第１−１表、第１−２表、第１−３表、そして第１−４表におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ前記の一般式（１）に示した記号に相当する。また、下記の各表において、各記号はそれぞれ下記の基を表わす。
Ｈ：水素、Ｍｅ：メチル、Ｅｔ：エチル、Ｐｈ：フェニル、Ｂｎ：ベンジル、ｉＰｒ：イソプロピル、ｉＢｕ：イソブチル、ｓＢｕ：ｓｅｃ−ブチル、ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル、ｃＨｅｘ：シクロヘキシル、４−ＭｅＰｈ：４−メチルフェニル、４−ＣｌＰｈ：４−クロロフェニル、４−ｔＢｕＰｈ：４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、４’−ＨＯＢｎ：４’−ヒドロキシベンジル【００１５】
【表１】
2009054454.tif 000004
【００１６】
【表２】
2009054454.tif 000005
【００１７】
【表３】
2009054454.tif 000006
【００１８】
【表４】
2009054454.tif 000007
【００１９】
【表５】
2009054454.tif 000008
【００２０】
【表６】
2009054454.tif 000009
【００２１】
上記一般式（１）で表されるエポキシコハク酸アミド誘導体は、生理学的に許容可能な塩として用いてもよい。例えば、Ｒ１が水素原子で、Ｘが−Ｏ−の場合における、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム）との塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム）との塩、有機アミン（例、トリエチルアミン、ピリジン）との塩を挙げることができる。
次に上記一般式（１）で表されるエポキシコハク酸アミド誘導体の製造方法について説明する。上記一般式（１）で表されるエポキシコハク酸アミド誘導体は、公知の物質から、アミド結合の生成反応、エステル反応、あるいは加水分解反応を利用して製造することができる。下記に、それぞれの反応の反応式を示す。
１）アミド結合の生成（１）【００２２】
【化２】
2009054454.tif 000010
【００２３】
２）アミド結合の生成（２）【００２４】
【化３】
2009054454.tif 000011
【００２５】
３）エステル化反応【００２６】
【化４】
2009054454.tif 000012
【００２７】
４）エステル化反応【００２８】
【化５】
2009054454.tif 000013
【００２９】
５）加水分解反応【００３０】
【化６】
2009054454.tif 000014
【００３１】
さらにまた、本発明において、カテプシン阻害剤としては、（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［（１Ｓ）−１−イソブトキシメチル−３−メチルブチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸モノナトリウム（以下、ＮＣ−２３００と略す。図１）が好ましい。【００３２】
次に薬理実験について記載する。
ラットアジュバント関節炎モデルにＮＣ−２３００を経口投与して、破骨細胞性骨吸収の阻害剤として臨床で使用されているビスホスホネート製剤の１つであるアレンドロネートとの薬効比較実験を行った。アジュバントモデルでの骨量減少は主に２つのタイプがあり、炎症関節部位での骨侵食と関節周囲の骨粗鬆症である。軟Ｘ線解析の結果、ＮＣ−２３００が足蹠の骨浸食を顕著に抑制することが明らかになった。この作用はアレンドロネートではみられなかった（図２ＡとＢ）。しかしながら、骨密度（ＢＭＤ）の測定では両化合物がともに脛骨近位端関節周囲の骨粗鬆症を同程度抑制することを示した（図２ＣとＤ）。アレンドロネートは骨浸食を効果的に抑制しなかった理由として、１つは炎症性サイトカインによって刺激された破骨細胞がビスホスホネート耐性になっていることが考えられた。これらの結果はカテプシンＫが関節炎で関節周囲骨粗鬆症と同様に骨浸食をも防ぐための有望な標的であることを示している。【００３３】
次にＮＣ−２３００が関節炎の発症率には影響を与えず、関節炎の過程で足蹠浮腫を改善し（図３ＡとＢ）、運動機能も改善することを見出した（図３Ｃ）。ＮＣ−２３００は関節炎の発症開始後に投与しても炎症を改善した。これらの結果はカテプシンＫが破骨細胞以外の細胞で機能し、自己免疫性の炎症に重要な役割を担っていることを示している。【００３４】
アジュバント関節炎ではアジュバント局所注射が樹状細胞による抗原提示を刺激し、さらにＴ細胞の自己免疫、マクロファージによる炎症性サイトカイン及び破骨細胞を介した骨破壊に至る。そのアジュバント効果は主にＴＬＲシグナルの活性化を誘導する病原微生物の特異的な構造（ＰＡＭＰｓ）に依存している。それゆえに、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞におけるカテプシンＫの発現の有無を解析して、これらの細胞の活性化に対するカテプシンＫ阻害剤の効果を調べた。
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、カテプシンＫ  ｍＲＮＡは非接着性の骨髄細胞や脾臓由来Ｔ細胞ではほとんど検出されなかった（図４Ａ）。一貫して、ＮＣ−２３００は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＴ細胞の増殖やＩＬ−２産生に影響を与えなかった。マクロファージでカテプシンＫは発現しているという報告があるが、ＮＣ−２３００はＰＡＭＰｓによって刺激した骨髄由来マクロファージの活性化には有意な効果はなかった。骨髄由来樹状細胞ではカテプシンＫ  ｍＲＮＡが検出できるレベルまで発現していることを明らかにした（図４Ａ）。樹状細胞のカテプシンＫ  ｍＲＮＡ発現は破骨細胞と比べてはるかに低いが、樹状細胞でのカテプシンＫ活性はカテプシンＫ特異的な蛍光基質であるＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｚ：ベンジロキシカルボニル；ＭＣＡ：４メチルクマリル７アミド）を用いて確認することができた。そしてその活性はＮＣ−２３００によって濃度依存的に阻害された（図４Ｂ）。
なお、樹状細胞の抗原提示能におけるカテプシンＫの役割を調べたところ、樹状細胞による抗原取り込み、分解もしくは提示にはカテプシンＫ活性は必要ではないと考えられた。【００３５】
アジュバント関節炎を誘発するのに用いた完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は不完全フロイントアジュバントとマイコバクテリア死菌の混合物であり、この死菌はＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９のアゴニストを含む様々なＰＡＭＰｓが入っている。それゆえに、カテプシンＫ不活化の有無でこれらＰＡＭＰｓへの樹状細胞の反応を調査した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の解析により、樹状細胞によるサイトカイン産生はＴＬＲ２アゴニストであるペプチドグリカン（ＰＧＮ）やＴＬＲ４アゴニストであるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ではなくＴＬＲ９アゴニストである非メチル化ＣｐＧ鎖を含んだオリゴデオキシヌクレオチドによって刺激されたときに産生されるＩＬ−１２やＩＬ−２３がＮＣ−２３００よって有意に阻害されることを明らかにした（図５Ａ）。カテプシンＫの不活化はＴＬＲ９のｍＲＮＡ発現に大きな影響を示さなかった。骨髄由来樹状細胞においてＣｐＧによるＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３の発現はＮＣ−２３００によりｍＲＮＡレベルで抑制され（図５Ｂ）、Ｆｌｔ３リガンドで分化誘導した樹状細胞のＣｐＧによる１型ＩＦＮ産生はＮＣ−２３００によって抑制された。これらの結果はＴＬＲ９シグナルによって調節されている遺伝子誘導プログラムにおいてカテプシンＫが重要な役割を演じていることを示唆している。【００３６】
次にｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３リガンド）及びＲ８３７（ＴＬＲ７，８リガンド）で処理したマウス脾臓由来樹状細胞のサイトカインｍＲＮＡ発現に対するＮＣ−２３００の効果を測定した。
マウス脾臓由来樹状細胞は脾臓より調製した。総（Ｔｏｔａｌ）ＲＮＡは刺激３時間後に抽出した。
その結果、マウス脾臓由来樹状細胞においてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＲ８３７処理前による１型ＩＦＮの発現はＮＣ−２３００によりｍＲＮＡレベルで抑制された（図６）。
また、カテプシン阻害剤であるＥ６４ｄも同様にマウス脾臓由来樹状細胞において、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＲ８３７処理による１型ＩＦＮの発現をｍＲＮＡレベルで抑制した。【００３７】
ＣＦＡ中のマイコバクテリア成分をＤＮＡ分解酵素で処理すると、アジュバント関節炎の誘発に影響せずに重症度が著しく減弱することが報告されている。ＤＮＡ分解酵素処理したマイコバクテリア成分にＣｐＧ  ＤＮＡを加えることで、アジュバントは重度な関節炎を誘発するようになる。これらの結果は、ＴＬＲ９を介する免疫反応が自己免疫性炎症の重症度を決定することを示唆する。ＣＦＡ接種後の数週間に亘りマイコバクテリアＤＮＡが検出されることから、その間、ＣｐＧ  ＤＮＡが自己免疫性炎症を増悪しているのかもしれない。これらの結果はカテプシンＫがＴＬＲ９シグナルを介して炎症に関与しているという考えを支持するものである。
ＣｐＧ  ＤＮＡは細胞の中に取り込まれた後、エンドソームコンパートメントのＴＬＲ９に結合する。ＴＬＲ９とＣｐＧの結合はＭｙＤ８８を活性化し、さらにマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）そして核内因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）経路のような下流の伝達経路を活性化する。これらの経路の活性化は樹状細胞で炎症性サイトカインの産生とＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６のような細胞表面分子の発現を誘導する。ＮＣ−２３００はｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄由来の樹状細胞の分化には影響がなく、電子顕微鏡解析ではカテプシンＫ欠損マウスの骨髄由来樹状細胞は正常な細胞形態を示していた（図７Ａ）。次に樹状細胞でＣｐＧによって誘導されるシグナル系について調査をおこなった。ＬＰＳではなく、ＣｐＧによって引き起こされる樹状細胞内での細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化がカテプシンＫ不活化によって抑制されていた（図７Ｂ）。ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果、ＣｐＧによる樹状細胞でのＩＲＦとＮＦ−κＢの活性化がカテプシンＫの不活化によって抑制されていることが明らかになった（図７Ｃ）。加えて、ＮＣ−２３００の処理により、樹状細胞でＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現が減少した（図８Ａ）。したがって、カテプシンＫの不活化が樹状細胞のＴＬＲ９シグナルの下流経路を抑制したことから、カテプシンＫがＴＬＲ９の近位のシグナルに重要な役割を担っていることが示唆された。しかしながら、カテプシンＫ欠損マウスの樹状細胞ではＣｐＧのエンドサイトーシスには影響がみられなかった（図８Ｂ）。【００３８】
カテプシンＫ欠損マウスの樹状細胞でＣｐＧによるＩＬ−１２とＩＬ−６の産生が著しく減少していることを観察した。ところがＬＰＳによるこれらサイトカインの産生には影響が見られなかった（図８Ｃ）。エンドソームの酸性化を抑制するクロロキンはＴＬＲ９シグナルを阻害することが知られている。ＴＬＲ９はエンドソーム内ｐＨが酸性状態の時により強くＣｐＧと相互作用していることが報告されている。しかしながら、ＴＬＲ９シグナルにおけるエンドソーム酸性化の役割については未だその詳細は明らかになっていない。カテプシンＫ欠損によるＣｐＧ−ＴＬＲ９シグナルの選択的な阻害はクロロキンの作用と似ており、これはクロロキンとカテプシンＫの不活性化が同じシグナル系を標的としている可能性を示すものである。カテプシンＫ欠損マウスの樹状細胞におけるサイトカイン産生はクロロキン添加によってより一層抑制された（図８Ｃ）。このことは、わずかであるが他のｐＨ感受性酵素の関与もあることを示唆している。カテプシンはエンドソームに局在することが知られており、もっぱら酸性条件下で活性化される。従って、クロロキンの効果は、これら酵素の阻害、主にカテプシンＫの阻害を介しているものと考えている。カテプシンＫがエンドソーム内でＣｐＧ−ＴＬＲ９シグナルをどのように調節しているかは不明であるが、薬剤によってカテプシンＫを阻害したことによって得られた結果から、この酵素のタンパク質分解活性がＣｐＧ−ＴＬＲ９シグナルにおいて重要であることを明確に示唆している。カテプシンＫがＴＬＲ９シグナルの近位に影響を与える細胞内タンパク質を分解している可能性を無視することはできないが、カテプシンＫがＣｐＧ−ＴＬＲ９の間の相互作用を抑制しているタンパク質の分解に関与していたり、またはカテプシンＫを介したタンパク質分解がＴＬＲ９の構造的変化をもたらし、ＣｐＧとの相互作用を増強している可能性もあると考えている。【００３９】
カテプシン類が破骨細胞非依存的に自己免疫性炎症で重要な役割を担っていることを明らかにするために、カテプシンＫ欠損マウスを用いてＴＬＲ９シグナルが強く関与するとされる実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルの作製を試みた。野生型とカテプシンＫ欠損マウスの間にＥＡＥの発症頻度には違いは見られなかったが、カテプシンＫ欠損マウスでは麻痺の重症度がコントロールマウスよりより低くなっていた（図９Ａ）。また、脊髄の病理学的解析において、カテプシンＫ欠損マウスでは炎症（図９Ｂ上，ＨＥ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、Ｔ細胞の浸潤（図９Ｂ中、ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｓｔａｉｎｉｎｇ）および脱髄（図９Ｂ下、ＬＦＢ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）が劇的に減少していることが示された。【００４０】
Ｔｈ１７細胞がＥＡＥでの自己免疫性炎症には必須であることが示されていることから、樹状細胞のＴｈ１７細胞誘導能に対するカテプシンＫの不活化がもたらす影響を検討した。樹状細胞をＣｐＧ、ＬＰＳ、あるいはＰＧＮの存在下でＣＤ４陽性Ｔ細胞と共培養し、ＩＬ−１７の細胞内染色法によってＴｈ１７細胞の誘導に対するＮＣ−２３００の効果を評価した。興味深いことに樹状細胞をＣｐＧで刺激したときのみ、樹状細胞のＴｈ１７細胞誘導能がカテプシンＫの不活化によって顕著に阻害された（図１０）。
ＣｐＧ刺激でした時のみにみられる樹状細胞のサイトカイン発現に対するカテプシンＫの役割の結果と併せて考えると、カテプシンＫ不活化によるＴｈ１７細胞誘導の減少は、少なくとも部分的にはＩＬ−６やＩＬ−２３のようなＴｈ１７細胞の誘導、増殖に関与しているサイトカインの発現が樹状細胞で減少した結果と考えられる。【００４１】
以上、破骨細胞特異的な酵素として考えられていたカテプシンＫが免疫系で重要な役割を担っていることが判明した。カテプシンＫはＴＬＲ９によるＣｐＧの取り込みが行われるエンドソームの酸性条件下で機能し、ＴＬＲ９シグナルの近位で重要な役割を担っている。エンドソーム酸性化阻害剤であるクロロキンがＣｐＧを介したＴＬＲ９シグナルをどのように阻害しているかは明確ではないが、ＴＬＲ９シグナルに対するカテプシンＫの役割はこの結果とよく一致している。クロロキンは関節リウマチの治療で長く使用されてきている。クロロキンをカテプシン阻害剤ととらえる概念は抗リウマチ薬として臨床効果があるクロロキンの分子的、細胞的なメカニズムを説明してくれるものかもしれない。近年、別の抗リウマチ薬である金チオマレートがカテプシンＫの触媒ドメインに結合することが報告されていた。カテプシンの直接の基質が何であるか不明であるが、カテプシンの薬剤による阻害と遺伝子破壊による研究によって、カテプシンが樹状細胞特異的なＴＬＲ９シグナルでそれまで予想をもしえなかった免疫学的役割を担っていることが総合的に示唆された。
カテプシン阻害剤が関節炎モデルの自己免疫性炎症を抑制すること、および破骨細胞がその発症に関与していないことが明らかなＥＡＥモデルに対してカテプシンＫ欠損マウスが耐性を持つということから、免疫系調節にカテプシン類が重要であるということが強く示されることになった。詳細なメカニズムについては不明であるものの、Ｔｈ１７の調節がカテプシンによる自己免疫性炎症の制御機構の１つであることをここで明らかになった。したがって、骨粗鬆症治療においてはカテプシンＫ阻害剤の免疫系への副作用に対しては十分な配慮が払われるべきであるが、その一方でＴｈ１７細胞と破骨細胞の両方に依存した病態である自己免疫性関節炎の治療においては、カテプシン阻害剤が２重の恩恵をもたらすかもしれない。【００４２】
以上、本発明の有効成分であるカテプシン阻害剤は、ＴＬＲのシグナル伝達を調整し、Ｔｈ−１７細胞の誘導を抑制し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３の誘導を抑制することから、これらに関連する疾患の治療剤として有用で、特に全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、クローン病、乾癬、急性散在性脳脊髄炎あるいは多発性硬化症等の自己免疫疾患、感染症、喘息等の免疫疾患の治療剤、並びに骨関連疾患、癌疾患等の治療剤として期待される。
特にカテプシンＫ阻害剤は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、クローン病、乾癬、又は急性散在性脳脊髄炎等の自己免疫疾患の治療剤として有用である。
本発明の有効成分であるカテプシン阻害剤は、ヒトに対して一般的な経口投与又は非経口投与のような適当な投与方法によって投与することができる。【００４３】
製剤化するためには、製剤の技術分野における通常の方法で錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、注射剤、坐薬等の剤型に製造することができる。
これらの調製には、通常の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、色素、希釈剤などが用いられる。ここで、賦形剤としては、乳糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、ブドウ糖などが、崩壊剤としては、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム（ＣＭＣ−Ｃａ）などが、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどが、結合剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などが挙げられる。【００４４】
投与量は通常成人においては、注射剤で有効成分である本発明化合物を１日約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、経口投与で１日１ｍｇ〜２０００ｍｇであるが、年齢、症状等により増減することができる。【００４５】
次に、実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
本発明で使用した材料と方法は以下のとおりである。
＜材料と方法＞
１。動物
我々はＰ．Ｓａｆｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，１３４５３（１９９８）に記載されているカテプシンＫ欠損マウスともう１つのカテプシンＫ欠損マウスの２種類のカテプシンＫ欠損マウスを使用した。もう１つのカテプシンＫ欠損マウスはカテプシンＫ遺伝子座にＣｒｅがノックインしたマウス（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ＫＣｒｅ／＋ヘテロマウス）を交配させることによって繁殖させた。バックグラウンドがＢＡＬＢ／ｃマウスでＩ−Ａｄが卵白アルブミンの３２３−３３９番目のペプチドを認識するＤＯ１１．１０ＴＣＲをトランスジェニックしたマウスを含むすべての動物は特定病原体のない環境下で維持された。そしてすべての動物実験は東京医科歯科大学の施設委員会の許可のもとで行われた。【００４７】
２。骨髄細胞からの樹状細胞とマクロファージの発生
マウスからの未成熟樹状細胞はＫ．Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６９３（１９９２）に記載されているように発生させた。簡潔に書くと、骨髄細胞は１０ｎｇｍｌ−１のマウスＧＭ−ＣＳＦもしくはマウスＦｌｔ３Ｌを含む１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で６日間培養した。緩く張り付いている細胞は静かにピペッティングすることで回収して、骨髄由来樹状細胞として使用した。骨髄由来マクロファージを獲得するために骨髄細胞は１０ｎｇｍｌ−１のＭ−ＣＳＦを含む１０％ＦＢＳ入りα−ＭＥＭ培地で２日間培養した。そして張り付いた細胞を骨髄由来マクロファージとして使用した。病原微生物の特異的な構造（ＰＡＭＰｓ）を用いた刺激のために、細胞を２４穴プレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ  ｍＬ−１で播種して、１０ｎｇｍＬ−１リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、３０μｇｍＬ−１ペプチドグリカンタイプＩ（ＰＧＮ）もしくはエンドトキシンのないホスホロチオエイトで安定化したＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）とともに培養した。【００４８】
３。酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）
細胞はＮＣ−２３００の存在下もしくは非存在下でＰＡＭＰｓもしくは抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の有無で３時間から２４時間培養した。そして培養上清中のサイトカイン濃度はＥＬＩＳＡキットにより製造者の指示に従って測定した。【００４９】
４。細胞増殖試験
細胞増殖はＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の手順に従って評価した。【００５０】
５。フローサイトメトリー
染色前、細胞は非特異的染色を最小限にするためにマウスＢＤ  ＦＣ  Ｂｌｏｃｋで処理した。それから細胞は蛍光色素分子が結合したモノクローナル抗体で染色した。以下の蛍光色素分子が結合したモノクローナル抗体を使用した；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）が結合した抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５−２Ｃ１１）、フルオレセインイソチオシアネイト（ＦＩＴＣ）が結合した抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＨＬ３）、抗ＣＤ４０抗体（３／２３）、抗ＣＤ８０抗体（１６−１０Ａ１）、抗ＣＤ８６抗体（ＧＬ１）、抗Ｉ−Ａｄ抗体（ＡＭＳ−３２．１）、およびフィコエリトリン（ＰＥ）が結合した抗マウスＩＬ−１７抗体（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）。細胞内サイトカイン染色のために細胞を集め、推奨された濃度のＧｏｌｇｉＰｌｕｇの存在下で未刺激のまま、もしくはイオノマイシン（４μｇ  ｍｌ−１）とＰＭＡ（４０ｎｇ  ｍＬ−１）で５時間刺激した。標準的な細胞内サイトカイン染色は次のように行った。はじめに細胞をＡＰＣが結合した抗ＣＤ３抗体およびＦＩＴＣが結合した抗ＣＤ４抗体で細胞外染色を行い、それからＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液で固定と細胞膜透過処理を行った。そして最後に、ＰＥが結合した抗ＩＬ−１７抗体で細胞内染色を行った。フローサイトメトリーによる解析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔを用いたＦＡＣＳｃａｎもしくはＤｉｖａソフトを用いたＦＡＣＳＣａｎｔｏIIによって行った。【００５１】
６。Ｔｈ１７細胞分化
ＣＤ４陽性Ｔ細胞と脾臓の樹状細胞は抗ＣＤ４抗体マイクロビーズと磁気ソーターを使用して脾臓から分離した。これらの細胞は２ｎｇ  ｍｌ−１のヒトＴＧＦ−β、１０μｇ
ｍｌ−１の抗ＩＦＮ−γ抗体および抗ＩＬ−４抗体の存在下、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＬＰＳ、もしくはＰＧＮの有無で３日間、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体（それぞれ１μｇ  ｍｌ−１）が結合したプレートで刺激した。【００５２】
７。電子顕微鏡（ＥＭ）
樹状細胞は２．５％ＥＭグレードグルタルアルデヒド（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で希釈）で２時間固定して、それから１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２時間洗浄し、されに１％四酸化オスミウム（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で希釈）で２時間後固定したのち、ＥＭ標本として処理した。【００５３】
８。エンドサイトーシス試験
ＦＩＴＣが結合した卵白アルブミン（卵白アルブミンＦＩＴＣ）もしくはＦＩＴＣが結合したＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ−ＦＩＴＣ）をそれぞれ終濃度１００μｇ  ｍｌ−１もしくは１μＭで細胞培養液に加えた。それから細胞を５％ＣＯ２と湿気のある環境で４℃もしくは３７℃で３０分間処理した。細胞は１％ＦＣＳと０．０１％ＮａＮ３を含有する冷ＰＢＳで３回洗浄して、フローサイトメトリーで解析した。トリパンブルーは細胞外蛍光を消失するために使用した。【００５４】
９。ＲＴ−ＰＣＲ解析
ＲＴ−ＰＣＲ解析はＫ．Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，１４１０（２００６）に記載してあるように行った。次のＰＣＲプライマーを使用した。【００５５】
カテプシンＫ：
５’−ＡＴＡＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＡＴＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）；【００５６】
ベータアクチン：
５’−ＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＧ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）．【００５７】
１０。定量ＲＴ−ＰＣＲ
定量ＲＴ−ＰＣＲはＫ．Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，１４１０（２００６）に記載してあるように行った。次のプライマーを使用した。【００５８】
Ｉｌ２３ａ：
５’−ＡＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＡ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＡＣＧＧＧＧＣＡＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＣＴ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）；【００５９】
Ｉｌ１２ａ：
５’−ＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣＡＣ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＡＧＡＧＴＧＣＴＴＡＣＴ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）；【００６０】
Ｉｌ１２ｂ：
５’−ＧＡＣＡＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＴＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）；  【００６１】
Ｉｆｎｂ１：
５’−ＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＧＣＡＴＣＡＧ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＣＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＧ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）．【００６２】
ｍＲＮＡ発現レベルはベータアクチンの発現レベルで標準化した。【００６３】
１１。免疫ブロット法解析
樹状細胞はバックグラウンドを減らすために低濃度血清入り培地（０．１％ＦＢＳ）で４時間培養した。それからＮＣ−２３００非存在下もしくは存在下でＣｐＧ  ＯＤＮもしくはＬＰＳで刺激した。刺激した細胞はＫ．Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ１２，１４１０（２００６）に記載したように免疫ブロット法解析を抗ＥＲＫ１／２抗体、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ベータアクチン抗体を用いて行った。【００６４】
１２。ゲルシフト法（ＥＭＳＡ）
樹状細胞はバックグラウンドを減らすために低濃度血清入り培地（０．１％ＦＢＳ）で４時間培養した。それからＮＣ−２３００非存在下もしくは存在下でＣｐＧ  ＯＤＮもしくはＬＰＳで刺激した。ＥＭＳＡはＨ．Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８、７４０（２０００）に記載してあるように行った。ＥＭＳＡで使用したオリゴヌクレオチドプローブを次に示す。【００６５】
ＮＦ−κＢ：
５’−ＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）；【００６６】
ＩＳＲＥ：
５’−ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＣ−３’（ｓｅｎｓｅ）および
５’−ＧＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）．【００６７】
オリゴヌクレオチドプローブはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを末端にラベルした。【００６８】
１３。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
マウスＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）は東京大学医科学研究所で合成された。６〜１２週齢のマウスは２５０μｇ  ｍｌ−１Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡを含んだコンプリートフロイントアジュバントで乳化したＭＯＧペプチド（２５０μｇ／マウス）で免疫した。免疫後、そのマウスに百日せき毒素（２００ｎｇ／マウス）を０日目と２日目に腹腔内投与した。動物は次の基準を使用して３週間にわたってＥＡＥのクリニカルサインを記録した。０：クリニカルサインなし、１：尻尾の下垂、２：尻尾の不動および歩行異常、３：部分的な後肢麻痺、４：後肢麻痺、５：前肢麻痺および瀕死、６：死。組織学的解析は次のように行った。マウスはＰＢＳでかん流して、次に４％パラホルムアルデヒドでかん流した。脊髄はパラフィンで包埋して、炎症評価のためにヘマトキシリン―エオシン染色を、脱髄の程度の評価のためにルクソールファーストブルー染色を、そしてＴ細胞浸潤の評価のために抗ＣＤ３抗体を用いた免疫染色を行った。【００６９】
１４。統計分析
統計分析は適用する場合スチューデントｔ検定、フィッシャーの直接確率計算法およびチューキークレーマー検定もしくはダネット多重比較検定を伴う分散分析を行った。すべての統計分析データは平均値±標準誤差である。【００７０】
［実施例１］
ＮＣ−２３００とアレンドロネートのアジュバント関節炎の改善効果の比較
（１）足関節の軟Ｘ線評価
ラットアジュバント関節炎モデルにＮＣ−２３００を経口投与して、アレンドロネートとの薬効比較実験を行った。ラットは０日目に完全フロイントアジュバントを接種した。ＮＣ−２３００、アレンドロネート及び媒体を表記された投与量で０日目から始めて３５日までラットに投与した。
足関節の軟Ｘ線評価（３６日目）から重度な関節破壊（関節空の狭窄、浸潤、そして骨棘形成）が媒体もしくはアレンドロネート投与ラットで観察されたが、ＮＣ−２３００投与ラットでは観察されなかった。（図２ＡとＢ）。【００７１】
（２）関節周囲の骨粗鬆症に対するＮＣ−２３００及びアレンドロネートの効果
次に、関節周囲の骨粗鬆症に対するＮＣ−２３００及びアレンドロネートの効果を測定するため、脛骨近位端について３６日目に軟Ｘ線評価を行った。また脛骨近位端の骨中無機質密度はｐＱＣＴによって評価した。
骨密度（ＢＭＤ）の測定では両化合物がともに脛骨近位端関節周囲の骨粗鬆症を同程度抑制することを示した（図２ＣとＤ）。【００７２】
（３）足蹠浮腫におけるＮＣ−２３００およびアレンドロネートの効果、並びにＮＣ−２３００及び媒体を投与したアジュバント関節炎の後肢足蹠の評価
次に、足蹠浮腫におけるＮＣ−２３００およびアレンドロネートの効果を測定しその結果を図３Ａに示す。
また、ＮＣ−２３００および媒体を投与したアジュバント関節炎の後肢足蹠の評価を測定し、その結果を図３Ｂに示す。
ＮＣ−２３００は関節炎の発症率には影響を与えず、関節炎の過程で足蹠浮腫を改善した。（図３ＡとＢ）【００７３】
（４）ＮＣ−２３００による関節炎ラットの行動量の回復
次に、ＮＣ−２３００による関節炎ラットの行動量の回復（３５日目）を測定し、その結果を図３Ｃに示す。
ＮＣ−２３００高用量の投与群は関節炎により誘発される立ち上がり行動の不能を有意に改善して（左）、後肢跛行の重症度を減少した（右）。【００７４】
図２のＢ、Ｄ及び図３のＡ及びＣ：ｎ＝１０、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対媒体投与群）。Ｎ．Ｄ．検出できず。【００７５】
［実施例２］
カテプシンＫ阻害に基づく骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣｓ）のＴｏｌｌ様受容体９シグナルの選択的抑制
骨髄由来樹状細胞は表示がない限り顆粒球・単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によって誘導した。【００７６】
（１）骨髄由来樹状細胞におけるカテプシンＫ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析
Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞におけるカテプシンＫの発現の有無を解析して、これらの細胞の活性化に対するカテプシンＫ阻害剤の効果を調べた。
図４Ａに骨髄由来樹状細胞におけるカテプシンＫ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、カテプシンＫ  ｍＲＮＡは非接着性の骨髄細胞や脾臓由来Ｔ細胞ではほとんど検出されなかった（図４Ａ）。ＮＣ−２３００は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＴ細胞の増殖やＩＬ−２産生に影響を与えなかった。
ＮＣ−２３００はＰＡＭＰｓによって刺激した骨髄由来マクロファージの活性化には有意な効果はなかった。骨髄由来樹状細胞ではカテプシンＫ  ｍＲＮＡが検出できるレベルまで発現していることを明らかにした（図４Ａ）。【００７７】
（２）骨髄由来樹状細胞のカテプシンＫ活性の測定
次に、骨髄由来樹状細胞のカテプシンＫ活性を測定した。
骨髄由来樹状細胞をカテプシンＫ阻害剤であるＮＣ−２３００有無で２４時間前処理した。冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したのち、そして細胞粉砕後は酵素活性に供した。カテプシンＫ活性はカテプシンＫ特異的基質であるＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ＧＰＲ）を用いて測定した。
その結果、樹状細胞のカテプシンＫ  ｍＲＮＡ発現は破骨細胞と比べてはるかに低いが、樹状細胞でのカテプシンＫ活性はカテプシンＫ特異的な蛍光基質であるＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｚ：ベンジロキシカルボニル；ＭＣＡ：４メチルクマリル７アミド）を用いて確認することができた。そしてその活性はＮＣ−２３００によって濃度依存的に阻害された（図４Ｂ）。【００７８】
（３）ＴＬＲ刺激によるサイトカイン産生に対するカテプシン阻害の効果
次に、ＴＬＲ刺激によるサイトカイン産生に対するカテプシンＫ阻害の効果を測定した。骨髄由来樹状細胞をペプチドグリカン（ＰＧＮ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、そして非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）で２４時間刺激し、その培養上清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に用いた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対媒体投与群）。【００７９】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の解析により、樹状細胞によるサイトカイン産生はＴＬＲ２アゴニストであるペプチドグリカン（ＰＧＮ）やＴＬＲ４アゴニストであるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ではなくＴＬＲ９アゴニストである非メチル化ＣｐＧ鎖を含んだオリゴデオキシヌクレオチドによって刺激されたときに産生されるＩＬ−１２やＩＬ−２３がＮＣ−２３００よって有意に阻害されることを明らかにした（図５Ａ）。【００８０】
（４）ＣｐＧ処理した骨髄由来樹状細胞のサイトカインｍＲＮＡ発現に対するＮＣ−２３００の効果
次に、ＣｐＧ処理した骨髄由来樹状細胞のサイトカインｍＲＮＡ発現に対するＮＣ−２３００の効果を測定した。骨髄由来樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦもしくはＦｌｔ３リガンドによって分化させた。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＣｐＧ刺激６時間後に抽出した。【００８１】
その結果、骨髄由来樹状細胞においてＣｐＧによるＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３の発現はＮＣ−２３００によりｍＲＮＡレベルで抑制され（図５Ｂ）、Ｆｌｔ３リガンドで分化誘導した樹状細胞のＣｐＧによる１型ＩＦＮ産生はＮＣ−２３００によって抑制された。【００８２】
［実施例３］
ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３リガンド）及びＲ８３７（ＴＬＲ７，８リガンド）で処理したマウス脾臓由来樹状細胞のサイトカインｍＲＮＡ発現に対するＮＣ−２３００の効果
ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＲ８３７処理したマウス脾臓由来樹状細胞のサイトカインｍＲＮＡ発現に対するＮＣ−２３００の効果を測定した。
脾臓を８〜１０週齢の雌性マウスから摘出した。摘出した脾臓から樹状細胞（ＤＣ）を分離するためにｐａｎ  ＤＣマイクロビーズを製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の指示に従って使用した。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは刺激３時間後に抽出した。
その結果、マウス脾臓由来樹状細胞においてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＲ８３７処理による１型ＩＦＮの発現はＮＣ−２３００によりｍＲＮＡレベルで抑制された（図６）。
また、カテプシン阻害剤であるＥ６４ｄも同様にマウス脾臓由来樹状細胞において、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＲ８３７処理による１型ＩＦＮの発現をｍＲＮＡレベルで抑制した。【００８３】
［実施例４］
ＴＬＲ９を介した免疫反応と自己免疫性炎症のカテプシンによる調節
（１）野生型とカテプシンＫ遺伝子欠損マウスの骨髄由来樹状細胞の電子顕微鏡写真
次に、野生型とカテプシンＫ遺伝子欠損マウスの骨髄由来樹状細胞の電子顕微鏡写真
を図７Ａに示す。
ＮＣ−２３００はｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄由来の樹状細胞の分化には影響がなく、電子顕微鏡解析ではカテプシンＫ欠損マウスの骨髄由来樹状細胞は正常な細胞形態を示していた（図７Ａ）。【００８４】
（２）ＣｐＧ刺激した樹状細胞におけるＥＲＫリン酸化に対するＮＣ−２３００の抑制作用
次に樹状細胞でＣｐＧによって誘導されるシグナル系について調査をおこなった。ＬＰＳではなく、ＣｐＧによって引き起こされる樹状細胞内での細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化がカテプシンＫ不活化によって抑制されていた（図７Ｂ）。【００８５】
（３）ＣｐＧ誘導によるインターフェロン調節因子とＮＦ−κＢ転写因子活性化に対するカテプシンＫ阻害の効果（ＥＭＳＡ）
次に、ＣｐＧ誘導によるインターフェロン調節因子（図７Ｃの左）とＮＦ−κＢ（図７Ｃの右）転写因子活性化に対するカテプシンＫ阻害の効果（ＥＭＳＡ）を測定した。
ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果、ＣｐＧによる樹状細胞でのＩＲＦとＮＦ−κＢの活性化がカテプシンＫの不活化によって抑制されていることが明らかになった（図７Ｃ）。【００８６】
（４）ＮＣ−２３００処理した樹状細胞の細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６のＴＬＲを介した発現
次に、ＮＣ−２３００処理した樹状細胞の細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６のＴＬＲを介した発現の減弱を測定した。樹状細胞はＣｐＧもしくはＬＰＳで２４時間刺激し、フローサイトメトリーで解析した。
その結果ＮＣ−２３００の処理により、樹状細胞でＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現が減少した（図８Ａ）。したがって、カテプシン類の不活化が樹状細胞のＴＬＲ９シグナルの下流経路を抑制したことから、カテプシン類がＴＬＲ９の近位のシグナルに重要な役割を担っていることが示唆された。【００８７】
（５）カテプシンＫ遺伝子欠損マウス由来樹状細胞におけるＣｐＧの取り込み
カテプシンＫ遺伝子欠損マウス由来樹状細胞におけるＣｐＧの取り込みを測定した。樹状細胞はＣｐＧ−ＦＩＴＣ存在下で４℃もしくは３７℃で培養した。細胞内活性はフローサイトメトリーで解析した。
その結果、カテプシンＫ欠損マウスの樹状細胞ではＣｐＧのエンドサイトーシスには影響がみられなかった（図８Ｂ）。【００８８】
（６）ＬＰＳもしくはＣｐＧによる野生型もしくはカテプシンＫ遺伝子欠損マウス由来樹状細胞のサイトカイン産生
次に、ＬＰＳもしくはＣｐＧによる野生型もしくはカテプシンＫ遺伝子欠損マウス由来樹状細胞のサイトカイン産生を測定した。クロロキンはエンドソームの酸性化を抑制するために刺激１時間前に加えた。Ｎ．Ｄ．検出できず。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対野生型）。
その結果、カテプシンＫ欠損マウスの樹状細胞でＣｐＧによるＩＬ−１２とＩＬ−６の産生が著しく減少していることを観察した。ところがＬＰＳによるこれらサイトカインの産生には影響が見られなかった（図８Ｃ）。
カテプシンＫ欠損マウスの樹状細胞におけるサイトカイン産生はクロロキン添加によってより一層抑制された（図８Ｃ）。このことは、わずかであるが他のｐＨ感受性酵素の関与もあることを示唆している。従って、クロロキンの効果は、これら酵素の阻害、主にカテプシンＫの阻害を介しているものと考えている。
薬剤によってカテプシンＫを阻害したことによって得られた結果から、この酵素のタンパク質分解活性がＣｐＧ−ＴＬＲ９シグナルにおいて重要であることを明確に示唆している。【００８９】
（７）カテプシンＫ遺伝子欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重症度
カテプシンＫが破骨細胞非依存的に自己免疫性炎症で重要な役割を担っていることを明らかにするために、カテプシンＫ欠損マウスを用いてＴＬＲ９シグナルが強く関与するとされる実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルの作製を試みた。
図９Ａに対照群（野生型とカテプシン１つ欠損マウス）とカテプシンＫ遺伝子欠損マウスにおけるＥＡＥのクリニカルスコアを示す。
図９Ｂに、免疫後２１日目の対照マウスとカテプシンＫ遺伝子欠損マウスの脊髄切片の病理学的解析結果を示す。野生型とカテプシンＫ遺伝子欠損マウスからの腰髄切片は炎症を評価するためにヘマトキシリンとエオシンで染色して（ＨＥ染色）、ＣＤ３を免疫染色して（抗ＣＤ３染色）、そしてミエリン量を評価するためにルクソールファーストブルー（ＬＦＢ染色）で染色した。矢印は炎症細胞の浸潤（ＨＥ染色）と脱髄範囲（ＬＦＢ染色）を示している。【００９０】
その結果、野生型とカテプシンＫ欠損マウスの間にＥＡＥの発症頻度には違いは見られなかったが、カテプシンＫ欠損マウスでは麻痺の重症度がコントロールマウスよりより低くなっていた（図９Ａ）。また、脊髄の病理学的解析において、カテプシンＫ欠損マウスでは炎症（図９Ｂ上、ＨＥ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、Ｔ細胞の浸潤（図９Ｂ中、ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｓｔａｉｎｉｎｇ）および脱髄（図９Ｂ下、ＬＦＢ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）が劇的に減少していることが示された。【００９１】
（８）ＬＰＳもしくはＰＧＮではなくＣｐＧによるＴｈ１７分極のカテプシンＫ不活化の影響
ＬＰＳもしくはＰＧＮではなくＣｐＧによるＴｈ１７分極がカテプシンＫ不活化による影響を測定した。
ＣＤ４陽性Ｔ細胞と樹状細胞は脾臓から調製し、３日間ＣｐＧ、ＬＰＳもしくはＰＧＮの存在下で共培養した。培養後、ＣＤ３ｅ陽性ＣＤ４陽性ＩＬ−１７陽性細胞の存在率をフローサイトメトリーで解析した。
ＩＬ−１７の細胞内染色法によってＴｈ１７細胞の誘導に対するＮＣ−２３００の効果を評価した。その結果、樹状細胞をＣｐＧで刺激したときのみ、樹状細胞のＴｈ１７細胞誘導能がカテプシン類の不活化によって顕著に阻害された（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＮＣ−２３００の構造式を示す。
【図２】ＮＣ−２３００とアレンドロネートのアジュバント関節炎に関する実験結果を示す図である。
【図３】ＮＣ−２３００とアレンドロネートのアジュバント関節炎に関する実験結果を示す図である。
【図４】カテプシンＫ  ｍＲＮＡの発現及びカテプシンＫ活性を示す図である。
【図５】カテプシン阻害に基づく骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣｓ）のＴＬＲ９シグナルの選択的抑制を示す図である。
【図６】カテプシン阻害に基づくＴＬＲ３，７，８シグナルの選択的抑制を示す図である。
【図７】電子顕微鏡写真及びカテプシン阻害の効果を示す図である。
【図８】ＴＬＲ９を介した免疫反応と自己免疫性炎症とカテプシン類による調節を示す図である
【図９】野生型とカテプシンＫ欠損マウスでのＥＡＥの発症頻度を示す図である。
【図１０】Ｔｈ１７細胞の誘導に対するＮＣ−２３００の効果を示す図である。
【符号の説明】
【００９３】
図２のＡ  足関節の軟Ｘ線評価
図２のＢ  足関節の軟Ｘ線評価
図２のＣ  骨密度の測定
図２のＤ  骨中無機質密度の測定
図３のＡ  足蹠浮腫の効果
図３のＢ  後肢足蹠の評価
図３のＣ  行動量の回復
図４のＡ  ｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ解析
図４のＢ  カテプシンＫ活性の測定
図５のＡ  カテプシンＫ阻害の効果
図５のＢ  サイトカインｍＲＮＡの発現
図６のＡ  ＴＬＲ３シグナルの阻害
図６のＢ  ＴＬＲ７，８シグナルの阻害
図７のＡ  電子顕微鏡写真
図７のＢ  ＥＲＫ１／２のリン酸化
図７のＣ  カテプシンＫ阻害の効果
図８のＡ  フローサイトメトリー解析
図８のＢ  フローサイトメトリー解析
図８のＣ  サイトカインの産生
図９のＡ  ＥＡＥのクリニカルスコア
図９のＢ  脊髄切片の病理学的解析
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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