(57)【要約】  血液中の赤血球等の細胞膜を破壊しやすく、血液汚れの洗浄効果に優れたリゾリン脂質含有洗浄剤を提供する。  リン脂質に酵素としてホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢの少なくともいずれかを作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有する。
2013145289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質に酵素としてホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢの少なくともいずれかを作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするリゾリン脂質含有洗浄剤。
【請求項２】
リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするリゾリン脂質含有洗浄剤。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ１−１）、（ａ１−２）又は（ａ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）又は（ｂ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
【請求項３】
リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするリゾリン脂質含有洗浄剤。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ２−１）、（ａ２−２）又は（ａ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ２−１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ２−１）、（ｂ２−２）又は（ｂ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ２−１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【請求項４】
前記酵素がストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物に由来するものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリゾリン脂質含有洗浄剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質をホスホリパーゼ（リン脂質分解酵素）で分解して得られたリゾリン脂質を含有するリゾリン脂質含有洗浄剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、内視鏡等の医療機器の洗浄剤として、非イオン界面活性剤、プロテアーゼ、金属イオン封鎖剤及びベンゾトリアゾール等からなる洗浄剤組成物が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、プロテアーゼ、ノニオン界面活性剤、酵素安定剤を含有する洗浄剤組成物も知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平５−２７９７００号公報
【特許文献２】特開２００１−３１９９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の洗浄剤では、例えば内視鏡を洗浄するにあたって、特にレンズ等がある先端部及び鉗子口内に付着した血液及びその他の細胞等の汚れを十分に洗い落とすことが困難である。特に鉗子口内等の狭窄した箇所には、浸漬により洗浄しても血液汚れが残留しやすく、ブラッシングによる洗浄が必須となっている。また、冬季など低温になると従来の洗浄剤は洗浄効率が低下するので、血液汚れがさらに残留しやすくなる。この他にも再利用する医療器具及び機器の洗浄においても同様の洗浄の問題がある。また、腹腔鏡手術時に体内で生じる凝固した血液（血塊）をできるだけ速やかに除去する技術が求められているが、現在このような技術の開発は行われていない。【０００５】
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、血液中の赤血球等の細胞膜を破壊しやすく、血液汚れの洗浄効果に優れたリゾリン脂質含有洗浄剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素としてホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢの少なくともいずれかを作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするものである。【０００７】
本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするものである。【０００８】
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ１−１）、（ａ１−２）又は（ａ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。【０００９】
（ａ１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。【００１０】
（ａ１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。【００１１】
（ａ１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。【００１２】
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）又は（ｂ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。【００１３】
（ｂ１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。【００１４】
（ｂ１−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。【００１５】
（ｂ１−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。【００１６】
本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするものである。【００１７】
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ２−１）、（ａ２−２）又は（ａ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。【００１８】
（ａ２−１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。【００１９】
（ａ２−２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。【００２０】
（ａ２−３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。【００２１】
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ２−１）、（ｂ２−２）又は（ｂ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。【００２２】
（ｂ２−１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。【００２３】
（ｂ２−２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。【００２４】
（ｂ２−３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。【００２５】
前記リゾリン脂質含有洗浄剤において、前記酵素がストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物に由来するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤は、特に血液を構成する赤血球や白血球等の細胞膜を破壊しやすいものであり、例えば、内視鏡等の医療機器に付着した血液及びその他の細胞等の汚れを低温でも短時間で十分に洗い落とすことができ、血液汚れの洗浄効果に優れているものである。しかも本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤はヒトに対する毒性が非常に低いので、このようなリゾリン脂質含有洗浄剤を用いて洗浄した後の医療機器等はさらに特別な処理を行わなくても再使用することができるものである。例えば、内視鏡及び腹腔鏡手術において、これらの機器の先端部のレンズ等に付着した赤血球や白血球等の細胞をリゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したり、体内で生じた凝固した血液（血塊）をリゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したりすることができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）濃度と溶血率との関係を示すグラフである。
【図２】１００℃での加熱処理時間と、加熱前に対する加熱後の溶血率の割合との関係を示すグラフである。
【図３】酵素（ＰＬＡ１）及び基質（ＰＣ）の反応時間と、分解生成物のリゾリン脂質であるＬＰＣ生成濃度との関係を示すグラフである。
【図４】ｐＨ９．０、５０℃、５分間の条件におけるＰＳの酵素活性を基準（１００％）、ｐＨ５．６、５０℃、５分間の条件におけるＰＩの酵素活性を基準（１００％）として、その他の基質の相対活性を示すグラフである。
【図５】ｐＨ７．２、５０℃、５分間の条件におけるＰＯＰＡの酵素活性を基準（１００％）として、その他の基質の相対活性を示すグラフである。
【図６Ａ】ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）由来のホスホリパーゼＡ１の立体構造を示すリボンモデルである。
【図６Ｂ】図６Ａの破線で囲まれた箇所（活性中心）の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［リゾリン脂質含有洗浄剤の原料］
本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質（特に１，２−ジアシルグリセロリン脂質）に酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）の少なくともいずれかを作用させて、リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有するものである。このリゾリン脂質には、リン脂質の分解生成物の全部又は一部が含まれる。
【００２９】
［酵素］
酵素は、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の方法を用いて行うことができる。これにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られる。
【００３０】
微生物は、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、あるいは、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているような技術を用いて容易に作成される。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液及び遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
【００３１】
酵素としては、リン脂質に対して加水分解活性を示す酵素を用いる。いわゆるホスホリパーゼ（ＰＬ）と称せられる酵素である。ホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）などを用いることができる。このような酵素としては、例えば、シグマアルドリッチから市販されているブタ膵臓由来、ムフェジコブラ由来、放線菌Streptomyces violaceoruber由来などのＰＬＡ２や、Thermomyces lanuginosus由来ＰＬＡ１、Lecitase Ultra由来ＰＬＡ１などの市販されている酵素などが挙げられる。あるいは、酵素として、三菱化学フーズ株式会社製ＰＬＡ１、ノボザイムズ社製レシターゼ、ジェネンコア協和株式会社製ＰＬＡ２リポモッド６９９Ｌ、ナガセケムテックス株式会社製ＰＬＡ２ナガセ、ディー・エス・エムジャパン株式会社製ＰＬＡ２マキサパールＡ２、旭化成ファーマ株式会社製ＰＬＡ２、旭化成ファーマ株式会社製ＰＬＢなどの産業用酵素を用いてもよい。
【００３２】
リゾリン脂質含有洗浄剤を製造するにあたっては、特に以下に説明するホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を酵素として用いることが好ましい。これらの酵素は、カルシウム塩などの無機塩の添加を不要にすることができ、低温〜高温（２０〜７０℃）で反応させることができ、酵素処理の効率を向上させることができる。また、ｐＨ３〜１１で反応させることができるため、反応制御しやすい。また、酵素の力価が極めて高いため、反応効率が格段に高い。さらに、多くの種類のリン脂質に作用するため、反応収率が高い。
【００３３】
［ホスホリパーゼＡ１］
ホスホリパーゼＡ１は、下記の（ａ１−１）、（ａ１−２）又は（ａ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する酵素である。
【００３４】
（ａ１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００３５】
（ａ１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００３６】
（ａ１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
【００３７】
またホスホリパーゼＡ１は、下記の（ａ２−１）、（ａ２−２）又は（ａ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する酵素でもよい。
【００３８】
（ａ２−１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００３９】
（ａ２−２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００４０】
（ａ２−３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００４１】
配列番号３に記載の塩基配列のポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のポリペプチド（アミノ酸配列）をコードし得る。
【００４２】
ホスホリパーゼＡ１は、リン脂質中のグリセロール基のα位（ｓｎ−１位）の脂肪酸エステル結合を優先的に（ｓｎ−２位よりも優位に）加水分解する酵素である。したがって、ホスホリパーゼＡ１は、リン脂質から、２−アシルグリセロール−３−ホスホジエステル化合物、グリセロール−３−リン酸、グリセロール−３−ホスホコリンなどのグリセロール−３−ホスホジエステル化合物の少なくとも１種以上、好ましくは３種全てを生成する酵素である。
【００４３】
ＰＬＡ１活性は、以下の方法で確認することができるが、確認方法はこれに限定されるものではない。例えば、酵素反応の結果、生成する遊離脂肪酸量を測定することにより、ＰＬＡ１活性を確認することができる。
【００４４】
具体的な方法としては、まず、０．０２％（ｗ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク株式会社製）１０ｍＬに卵黄ホスファチジルコリン１ｇ（ナカライテスク株式会社製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリンを調製する。この１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリン０．０２５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０６０ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）０．００５ｍＬとを加える。そして、３７℃で５分間予備加温した後、酵素活性を確認する試料０．０１０ｍＬを添加し、３７℃で５分間反応させる。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、反応を停止させる。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業株式会社製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位（１Ｕ）とする。
【００４５】
ホスホリパーゼＡ１は、例えば、緩衝液として、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１〜５．６）、ビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．６〜７．２）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２〜８．８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８〜１０．５）を用いて、上記の卵黄ホスファチジルコリンと反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ４．１〜１０．５）でＰＬＡ１活性を示し得る。至適ｐＨはｐＨ５．６付近であるが、ｐＨ５〜８で実質的に１００％の活性を示す。
【００４６】
ホスホリパーゼＡ１は、例えば、上記のように卵黄ホスファチジルコリンと３７℃にて５分間反応させた条件下でｐＨ５．６における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ４．１からｐＨ１０の範囲内で５０％以上の活性を示すことが好ましい。
【００４７】
ホスホリパーゼＡ１は、例えば、上記の卵黄ホスファチジルコリンに対しては、約２０〜６５℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３０〜５５℃の範囲内にあり、より好ましくは４０〜５５℃の範囲内にあり、さらにより好ましくは約５０℃である。
【００４８】
ホスホリパーゼＡ１は、例えば、１２０ｍＭ  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で３０分間処理した場合、４℃から４０℃までは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり、そして４５℃でも８０％程度（例えば７５％）以上の活性が残存している。
【００４９】
ホスホリパーゼＡ１は、例えば、緩衝液として酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）を用いて、上記のリン脂質と反応条件下におくと、１００ｍＭのＥＤＴＡが存在しても阻害を受けず、ＥＤＴＡを添加しない場合とほぼ同一の活性を示すことが好ましい。また、１０ｍＭ  Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋の存在下では、約８０％の活性（例えば８０〜９５％程度の活性）を示すことが好ましい。一方、１０ｍＭのＦｅ３＋、Ｆｅ２＋では活性が阻害され得るものである。
【００５０】
ホスホリパーゼＡ１は、ｐＨ７．２の条件下で上記のように基質と５０℃にて５分間反応させた場合、卵黄レシチン（Ｌ）が基質であるときの加水分解活性を１００％とすると、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）に対して５０％以上、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）に対して５００％以上、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）に対して１５０％以上、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対して３００％以上、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）に対して３００％以上、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＰＯＰＧ）に対して１００％以上、大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリン（ＳＢ−ＰＣ）に対して１００％以上、大豆レシチン（ＳＢＬ）に対して３０％以上、Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して２５０％以上、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰｌｓＰＥ（Ｃ１８，２０：４））に対して５０％以上、１−ヘキサデシル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰｌｓＰＥ（Ｃ１６，１８：１））に対して２００％以上、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰｌｓＰＣ（Ｃ１８，２０：４））に対して０％、大豆油及びオリーブ油に対して１０％以下、４−ニトロフェニルブチレート（ｐＮＰＢ）、４−ニトロフェニルオクタノエート（ｐＮＰＯ）、４−ニトロフェニルデカノエート（ｐＮＰＤ）、４−ニトロフェニルラウレート（ｐＮＰＬ）、４−ニトロフェニルミリステート（ｐＮＰＭ）、４−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）及び４−ニトロフェニルステアレート（ｐＮＰＳ）に対して１５％以下の相対活性を有する（図５参照。ただし、図５ではＰＯＰＡの酵素活性を１００％として他の酵素の相対活性を示している。）。
【００５１】
またホスホリパーゼＡ１は、ｐＨ９．０の条件下で上記のように基質と５０℃にて５分間反応させた場合、卵黄レシチン（Ｌ）が基質であるときの加水分解活性を１００％とすると、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：ＤＰＰＣ）に対して５０％以下（下限は３０％）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate：ＤＭＰＡ）に対して３５０％以上（上限は４００％）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１−ｒａｃ−グリセロール）（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)：ＰＧ）に対して４００％以上（上限は４５０％）、Ｌ−α−ホスファチジルセリン（L-α-Phosphatidylserine：ＰＳ）に対して４５０％以上（上限は４８０％）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine：ＤＯＰＥ）に対して１００％以上（上限は１４０％）、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（L-α-Phosphatidylinositol：ＰＩ）に対して３５０％以上（上限は３８０％）、大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリン（L-α-Phosphatidylcholine：ＳＢ−ＰＣ）に対して３００％以上（上限は３６０％）、大豆レシチン（ＳＢＬ）に対して７５．０％以上（上限は９０％）である（図４参照。ただし、図４ではｐＨ９．０の場合、ＰＳの酵素活性を１００％として他の酵素の相対活性を示している。）。
【００５２】
またホスホリパーゼＡ１は、ｐＨ５．６の条件下で上記のように基質と５０℃にて５分間反応させた場合、卵黄レシチン（Ｌ）が基質であるときの加水分解活性を１００％とすると、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：ＤＰＰＣ）に対して１００％以上（上限は１４０％）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）に対して１００％以下（下限は６０％）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１−ｒａｃ−グリセロール）（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)：ＰＧ）に対して１５０％以上（上限は１９０％）、Ｌ−α−ホスファチジルセリン（L-α-Phosphatidyl-L-serine：ＰＳ）に対して１５０％以上（上限は１９０％）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine：ＤＯＰＥ）に対して１００％以上（上限は１２０％）、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（L-α-Phosphatidylinositol：ＰＩ）に対して２５０％以上（上限は２９０％）、大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリン（L-α-Phosphatidylcholine：ＳＢ−ＰＣ）に対して２５０％以上（上限は２９０％）、大豆レシチン（ＳＢＬ）に対して２５０％以上（上限は２８０％）の活性を有し、トリグリセリド（オリーブ油）に対する活性がほぼ０％（例えば５％以下、３％以下、又は１％以下、あるいは検出限界以下）である（図４参照。ただし、図４ではｐＨ５．６の場合、ＰＩの酵素活性を１００％として他の酵素の相対活性を示している。）。
【００５３】
なお、例えば、ストレプトマイセス・アルブス（Streptomycesalbus J1074）株由来の分泌性ヒドロラーゼには、上記のホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を示すものがある。しかし、上記の分泌性ヒドラーゼは、単にリパーゼと推定されているだけであって、上記のホスホリパーゼＡ１が有する理化学的性質は明らかにされておらず、なおかつ当業者であっても上記のホスホリパーゼＡ１を推定することは不可能である。このことは、上記のホスホリパーゼＡ１がリパーゼ活性を示さず、エステラーゼ活性もほとんど示さないことからも明らかである。このように相同性が高くても、酵素の理化学的性質には、立体構造などその他の要因も大きな影響を及ぼすので、上記のホスホリパーゼＡ１のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を示す酵素であっても、上記のホスホリパーゼＡ１のような基質特異性は有しないものと考えられる。上記のホスホリパーゼＡ１の立体構造については実施例として後述する。
【００５４】
ホスホリパーゼＡ１は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が２５，０００〜３０，０００の範囲内（例えば、約２８，０００又は約２７，０００）を示すことが好ましい。またホスホリパーゼＡ１は、アミノ酸組成から計算した分子量が２５，０００〜３０，０００の範囲内であることが好ましい。例えば、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約２８，０００、具体的には２８，０００を示す。このストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株由来の天然の酵素では、そのアミノ酸組成から計算した分子量は２７，１９９である。
【００５５】
ホスホリパーゼＡ１は、６．０〜６．１の範囲内（例えば６．０６）の等電点を示すことが好ましい。酵素の等電点は、そのアミノ酸配列からＧＥＮＥＴＹＸにより算出することができる。
【００５６】
ホスホリパーゼＡ１の一態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるものである。ホスホリパーゼＡ１は、好ましくは配列番号１の３４位から２６９位までのアミノ酸配列（以下「配列番号１に記載内のアミノ酸配列」ともいう）を有する。
【００５７】
ホスホリパーゼＡ１は、ＰＬＡ１活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１に記載内のアミノ酸配列に対して、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を有する酵素でもよい。例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入及び／又は付加変異を導入することにより、酵素（タンパク質）の構造を改変することができる。置換、欠失、挿入及び／又は付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、ＰＬＡ１活性を有する限り、ホスホリパーゼＡ１に含まれる。
【００５８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１に記載内のアミノ酸配列に対して、相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＰＬＡ１活性を有する限り、ホスホリパーゼＡ１に含まれる。ホスホリパーゼＡ１は、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列番号１に記載内のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００５９】
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行うことができる。
【００６０】
ホスホリパーゼＡ１の供給源は特に限定されるものではないが、ホスホリパーゼＡ１は、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくはストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）及びストレプトマイセス・アルブス（Streptomyces albus）であり、最も好ましくはストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４菌株、以下「ＮＡ２９７株」という）である。このストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株は、配列番号３の塩基配列で示されるポリヌクレオチドをＤＮＡ中に有している。
【００６１】
例えば、上記のストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）ＮＡ２９７株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４）は、適当な栄養培地で液体培養することにより、ホスホリパーゼＡ１を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものを酵素製剤として製造することができる。
【００６２】
酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ホスホリパーゼＡ１を生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然又は人為的変異株や、ＰＬＡ１活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもホスホリパーゼＡ１の製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のホスホリパーゼＡ１を生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。
【００６３】
ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）ＮＡ２９７株を用いた酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
【００６４】
この菌は栄養培地で液体培養することによりホスホリパーゼＡ１を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、ホスホリパーゼＡ１を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉及び澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類及び有機酸（例えば、酢酸及びクエン酸）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第一鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、ホスホリパーゼＡ１が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜３７℃であることが好ましい。培養時間は、ホスホリパーゼＡ１が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは好気的な条件下で、例えば、通気攪拌又は振とうしながら行うことができる。
【００６５】
ホスホリパーゼＡ１に含まれるポリペプチドは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記の微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、ホスホリパーゼＡ１を構成するポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定することができる。
【００６６】
［ホスホリパーゼＢ］
ホスホリパーゼＢは、下記の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）又は（ｂ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する酵素である。
【００６７】
（ｂ１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００６８】
（ｂ１−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００６９】
（ｂ１−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
【００７０】
またホスホリパーゼＢは、下記の（ｂ２−１）、（ｂ２−２）又は（ｂ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する酵素でもよい。
【００７１】
（ｂ２−１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００７２】
（ｂ２−２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００７３】
（ｂ２−３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【００７４】
配列番号４に記載の塩基配列のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のポリペプチド（アミノ酸配列）をコードし得る。
【００７５】
ホスホリパーゼＢは、リン脂質中のグリセロール基のα位（ｓｎ−１位）の脂肪酸エステル結合と、グリセロール基のβ位（ｓｎ−２位）の脂肪酸エステル基との両方の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素活性を有する。すなわち、ホスホリパーゼＢは、ＰＬＡ１活性及びＰＬＡ２活性を併有する酵素である。したがって、ホスホリパーゼＢは、リン脂質から、１−アシルグリセロール−３−ホスホジエステル化合物、２−アシルグリセロール−３−ホスホジエステル化合物、グリセロール−３−リン酸、グリセロール−３−ホスホコリンなどのグリセロール−３−ホスホジエステル化合物の少なくとも１種以上、好ましくは３種全てを生成する酵素である。
【００７６】
ＰＬＢ活性は、以下の方法で確認することができるが、確認方法はこれに限定されるものではない。例えば、酵素反応の結果、生成する遊離脂肪酸量を測定することにより、ＰＬＢ活性を確認することができる。
【００７７】
具体的な方法としては、まず、１０％（ｗ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク株式会社製）１０ｍＬにジミリストイルホスファチジン酸１ｇ（フナコシ株式会社製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸を調製する。この１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸０．００５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）０．０２５ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）０．００２ｍＬと、蒸留水０．０６３ｍＬとを加える。そして、３７℃で５分間予備加温した後、酵素活性を確認する試料０．００５ｍＬを添加し、３７℃で５分間反応させる。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、反応を停止させる。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、例えば遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業株式会社製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定する。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位（１Ｕ）とする。
【００７８】
ホスホリパーゼＢは、例えば、緩衝液として、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１〜５．６）、ビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．６〜７．２）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２〜８．８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８〜１０．５）、を用いて、上記のホスファチジン酸と反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ４．１〜１０．５）でＰＬＢ活性を示し得る。至適ｐＨは、ｐＨ８〜８．８付近とすることができる。
【００７９】
ホスホリパーゼＢは、例えば、上記のようにジミリストイルホスファチジン酸と３７℃にて５分間反応させた条件下でｐＨ８．４における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ７．２からｐＨ１０．０の範囲内で５０％以上の活性を示すことが好ましい。
【００８０】
ホスホリパーゼＢは、例えば、上記のようにジミリストイルホスファチジン酸に対しては、約２０〜６５℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３７〜６０℃の範囲内であり、より好ましくは４５〜５５℃の範囲内であり、さらにより好ましくは約５０℃である。
【００８１】
ホスホリパーゼＢは、例えば、１６０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で３０分間処理した場合、４℃から４５℃までは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり、そして好ましくは、５０℃でも８０％程度（例えば７５％）以上の活性が残存している。
【００８２】
ホスホリパーゼＢは、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いて、上記のリン脂質と反応条件下におくと、１０ｍＭのＥＤＴＡによって阻害を受けず、ＥＤＴＡを添加しない場合とほぼ同一の活性を示すことが好ましい。また、１０ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下では、約９０％の活性（例えば８５〜９５％程度の活性）を示すことが好ましい。一方、１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋では活性が阻害され得るものである。
【００８３】
ホスホリパーゼＢは、ｐＨ８．４の条件下で上記のように基質と５０℃にて５分間反応させた場合、ジミリストイルホスファチジン酸（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate）が基質であるときの加水分解活性を１００％とすると、大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリン（L-α-Phosphatidylcholine：ＳＢ−ＰＣ）に対して９５％以上、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（L-α-Phosphatidylinositol：ＰＩ）及び１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１−ｒａｃ−グリセロール）（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)：ＰＧ）に対して２０％以上、Ｌ−α−ホスファチジルセリン（L-α-Phosphatidyl-L-serine：ＰＳ）に対して２５％以上の活性を有することが好ましい。また、同じ条件において、スフィンゴミエリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine：ＤＯＰＥ）、トリステアリン及びジパルミトイルグリセリドに対する活性がほぼ０％（例えば５％以下、３％以下、又は１％以下、あるいは検出限界以下）であることが好ましい。このような基質特異性を有することが好ましいものである。
【００８４】
ホスホリパーゼＢは、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が３８，０００〜４０，０００の範囲内（例えば、約３９，０００又は３８，９００）を示すことが好ましい。またホスホリパーゼＢは、アミノ酸組成から計算した分子量が４１，０００〜４３，０００の範囲内であることが好ましい。例えば、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約３９，０００、具体的には３８，９００を示す。このストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株由来の天然の酵素では、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約４２，０００である。
【００８５】
ホスホリパーゼＢは、６．２〜６．６の範囲内（例えば６．４）の等電点を示すことが好ましい。酵素の等電点は、そのアミノ酸配列からＧＥＮＥＴＹＸにより算出することができる。
【００８６】
ホスホリパーゼＢの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。ホスホリパーゼＢは、好ましくは配列番号２の３１位から４１２位までのアミノ酸配列（以下「配列番号２に記載内のアミノ酸配列」ともいう）を有する。
【００８７】
ホスホリパーゼＢは、ＰＬＢ活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を有する酵素でもよい。例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入及び／又は付加変異を導入することにより、酵素（タンパク質）の構造を改変することができる。置換、欠失、挿入及び／又は付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、ＰＬＢ活性を有する限り、ホスホリパーゼＢに含まれる。
【００８８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＰＬＢ活性を有する限り、ホスホリパーゼＢに含まれる。ホスホリパーゼＢは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列番号２に記載内のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００８９】
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行うことができる。
【００９０】
ホスホリパーゼＢの供給源は特に限定されるものではないが、ホスホリパーゼＢは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）及びストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）が挙げられる。これらの菌株は近縁であることから同種の活性のホスホリパーゼＢが得られると考えられる。
【００９１】
例えば、上記のストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）は、適当な栄養培地で液体培養することにより、ホスホリパーゼＢを菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものを酵素製剤として製造することができる。ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株は、配列番号４の塩基配列で示されるポリヌクレオチドをＤＮＡ中に有している。
【００９２】
また、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyceschattanoogensis）ＮＢＲＣ１２７５４でもＮＡ６８４株と同様の活性が得られることを実験で確認している。したがって、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４株とストレプトマイセス・チャッタノゲンシスとは同様の活性を示すものである。
【００９３】
酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４株に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ホスホリパーゼＢを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然又は人為的変異株や、ＰＬＢ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもホスホリパーゼＢの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のホスホリパーゼＢを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。
【００９４】
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４株を用いた酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
【００９５】
この菌は栄養培地で液体培養することによりホスホリパーゼＢを菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、ホスホリパーゼＢを分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉及び澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類及び有機酸（例えば、酢酸及びクエン酸）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第一鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、ホスホリパーゼＢが安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜３７℃であることが好ましい。培養時間は、ホスホリパーゼＢが十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは好気的な条件下で、例えば、通気攪拌又は振とうしながら行うことができる。
【００９６】
ホスホリパーゼＢに含まれるポリペプチドは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記の微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、ホスホリパーゼＢを構成するポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定することができる。
【００９７】
［微生物］
ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢは、微生物によって産生し得るものである。特にホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢについては、配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列情報や、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列情報から、人工的にポリペプチドを生成することができ、リゾリン脂質含有洗浄剤の製造に人工合成によって得た酵素（ポリペプチド）を用いてもよい。しかしながら、微生物により酵素を産生する場合、容易に上記の酵素を得ることができる。
【００９８】
微生物としては、上述したストレプトマイセス属の菌を利用することができるが、上記のポリヌクレオチドが導入された微生物を用いてもよい。すなわち、その微生物とは、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドの中から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドが導入された微生物である。上記のポリヌクレオチドが導入された微生物は、ベクターや形質転換体によって得ることができる。つまり、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することにより、ホスホリパーゼＡ１やホスホリパーゼＢを産生する能力を保有する形質転換体を作製することができる。
【００９９】
形質転換体の作製のための手順及び宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。
【０１００】
微生物中で、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。この時使用するシグナル配列はホスホリパーゼでもその他のものでもよい。
【０１０１】
形質転換の対象となる宿主は、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
【０１０２】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
【０１０３】
得られた形質転換体は、上記のように酵素の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したポリペプチドを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理して酵素を製造することができる。
【０１０４】
宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、通常の条件下で行うことができる。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いることができる。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製することができる。
【０１０５】
［リゾリン脂質含有洗浄剤］
本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）の少なくともいずれかを作用させて、リン脂質をリゾリン脂質に加水分解することによって得ることができる。
【０１０６】
リン脂質としては、特に限定されるものではないが、例えば、卵黄レシチン（Ｌ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１−ｒａｃ−グリセロール）（ＰＧ）、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリン（ＳＢ−ＰＣ）、大豆レシチン（ＳＢＬ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ＰＯＰＧ）、１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰｌｓＰＥ（Ｃ１８，２０：４））、１−ヘキサデシル−２−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰｌｓＰＥ（Ｃ１６，１８：１））等を用いることができる。
【０１０７】
リン脂質分解酵素であるホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）としては、市販のものを用いることができるが、特にホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）については既述のもの（配列番号１〜４参照）を用いることが好ましい。
【０１０８】
リゾリン脂質含有洗浄剤においてリゾリン脂質の濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、０．３ｍｇ／ｍＬ以上であることがさらにより好ましい。
【０１０９】
そして、リゾリン脂質含有洗浄剤は、次のようにして製造することができる。まずリン脂質と、リン脂質分解酵素（ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢの少なくともいずれか）とを含有する水溶液（酵素反応液）を調製する。次にこの酵素反応液をリン脂質分解酵素の至適温度（例えば３７℃）に調整し、例えば３０〜１２０分間かけて酵素反応を行う。その後、必要があればその目的に応じて酵素反応液を濾紙やフィルターにより濾過して濾液としてリゾリン脂質含有洗浄剤を得たり、遠心分離にかけて上澄み液としてリゾリン脂質含有洗浄剤を得たりすることもできる。濾過は、濁りの原因となる未反応の基質や不純物を除去するために行うが、特に大豆レシチン（ＳＢＬ）のように不純物の多い基質を用いる場合に有効である。濁りが気にならない程度であれば濾過は不要であり、特に基質が卵黄レシチン（Ｌ）の場合、未反応の基質があれば濾過又は遠心分離により十分に透明度のあるリゾリン脂質含有洗浄剤を得ることができる（表７参照）。
【０１１０】
上記のようにして得られたリゾリン脂質含有洗浄剤は、特に血液を構成する赤血球や白血球等の細胞膜を破壊しやすいものであり、例えば、内視鏡等の医療機器に付着した血液及びその他の細胞等の汚れを低温でも短時間で十分に洗い落とすことができ、血液汚れの洗浄効果に優れているものである。しかも本発明に係るリゾリン脂質含有洗浄剤はヒトに対する毒性が非常に低いので、このようなリゾリン脂質含有洗浄剤を用いて洗浄した後の医療機器等はさらに特別な処理を行わなくても再使用することができるものである。例えば、内視鏡及び腹腔鏡手術において、これらの機器の先端部のレンズ等に付着した赤血球や白血球等の細胞をリゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したり、体内で生じた凝固した血液（血塊）をリゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したりすることができるものである。
【実施例】
【０１１１】
［ホスホリパーゼＡ１の精製］
（ａ）微生物の培養
菌体として、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomycesalbidoflavus）ＮＡ２９７株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４）を使用した。【０１１２】
まず、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに５０ｍｌずつ分注して、さらに１％大豆レシチン（ＳＢＬ）と０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。【０１１３】
そして、あらかじめ平板培地に生育した上記菌体のコロニーを適当量とり、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地５０ｍＬに０．５ｍｌずつ接種し、２８℃で５５時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。【０１１４】
（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）３０ｍｌで可溶化し、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。【０１１５】
（ｃ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液に終濃度で１．５Ｍの硫酸アンモニウムを添加し、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ３８ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１．５Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１１６】
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ（ザルトリウス株式会社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ  ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。これを、２０ｍＭ  ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１１７】
（ｅ）ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１１８】
（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析したところ、溶出画分において、分子量約２８，０００Ｄａで、単一のバンドが観察された。これにより、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）ＮＡ２９７株より、電気泳動的に単一に精製されたポリペプチドを得た。このポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定された。【０１１９】
（ｇ）アミノ酸配列の解析
上記のポリペプチドを用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。また、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより内部アミノ酸配列の解析を行った。解析により、ストレプトマイセス・アルビドフラブスＮＡ２９７株から得られた精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１に示すものであることが確認された。よって、上記のポリペプチドはホスホリパーゼＡ１であることが確認された。【０１２０】
なお、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて酵素のアミノ酸配列に基づいて等電点を予測した結果、上記のポリペプチドの等電点は６．０６であった。【０１２１】
［ホスホリパーゼＢの精製］
（ａ）微生物の培養
菌体として、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）を使用した。【０１２２】
まず、ＮＢ培地「１％ペプトン（べクトン・ディンキンソン社製）、１％肉エキス（極東製薬工業株式会社製）、０．５％塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）、ｐＨ７．２」３００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、さらに１％大豆レシチン（ＳＢＬ）と０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。【０１２３】
そして、あらかじめ平板培地に生育した上記菌体のコロニーを適当量とり、トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で１０８時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。【０１２４】
（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を可溶化し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。【０１２５】
（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であらかじめ平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍカラム」（内径２６ｍｍ、高さ５５ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１２６】
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ（ザルトリウス株式会社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であらかじめ平衡化した「ＨｉＴｒａｐ  Ｑ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１２７】
（ｅ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化した「ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１２８】
（ｆ）Ｍｏｎｏ  Ｓカラムクロマトグラフィー
上記（ｅ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに２０ｍＭ  メス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた。２０ｍＭ  メス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡化した「Ｍｏｎｏ  Ｓ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。【０１２９】
（ｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析したところ、溶出画分において、分子量約３９，０００Ｄａで、単一のバンドが観察された。これにより、電気泳動的に単一に精製されたポリペプチドを得た。このポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定された。【０１３０】
（ｈ）アミノ酸配列の解析
上記のポリペプチドを用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。また、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより内部アミノ酸配列の解析を行った。解析により、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４株から得られた精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号２に示すものであることが確認された。よって、上記のポリペプチドＢはホスホリパーゼＢであることが確認された。【０１３１】
なお、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて酵素のアミノ酸配列に基づいて等電点を予測した結果、上記のポリペプチドの等電点は６．４であった。【０１３２】
［微生物のＤＮＡ］
配列番号１のポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号３の塩基配列であり、そのため、ストレプトマイセス・アルビドフラブスＮＡ２９７株は、配列番号３のポリヌクレチドをＤＮＡとして有していることが推定される。そして、このストレプトマイセス・アルビドフラブスにおけるコア領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて解析したところ、配列番号３のポリヌクレオチドが確認された。よって、ストレプトマイセス・アルビドフラブスＮＡ２９７株は配列番号３のポリヌクレチドをＤＮＡの一部として有していることが確認された。【０１３３】
配列番号２のポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号４の塩基配列であり、そのため、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４株は配列番号４のポリヌクレチドをＤＮＡとして有していることが推定される。そして、このストレプトマイセス・エスピーにおけるコア領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて解析したところ、配列番号４のポリヌクレオチドが確認された。よって、ストレプトマイセス・エスピーＮＡ６８４株は配列番号４のポリヌクレチドをＤＮＡの一部として有していることが確認された。【０１３４】
［ホスホリパーゼ活性］
上記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢについて、次の方法によりホスホリパーゼ活性及び活性の条件を確認した。【０１３５】
（ａ）ホスホリパーゼＡ１
０．０２％（ｗ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク株式会社製）１０ｍＬに卵黄ホスファチジルコリン１ｇ（ナカライテスク株式会社製、L-α-phosphatidylcholine（egg yolk））を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリンを調製した。この１０％（ｗ／ｖ）卵黄ホスファチジルコリン０．０２５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０６０ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）０．００５ｍＬとを加えた。そして、３７℃で５分間予備加温した後、ホスホリパーゼＡ１を含む試料０．０１０ｍＬを添加し、３７℃で５分反応させた。ここで、リン脂質１００質量部に対するホスホリパーゼＡ１の質量は、０．０１ｍｌがすべて酵素で比重１とすれば４質量部となるが、使用するサンプル中のホスホリパーゼＡ１の純度によってホスホリパーゼＡ１の質量が変わるのでホスホリパーゼＡ１含有試料の添加量の調整に留意した。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、酵素反応を停止させた。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業株式会社製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とした。【０１３６】
この酵素試験により、ホスホリパーゼＡ１はＰＬＡ１活性を示すことが確認された。【０１３７】
ｐＨの条件としては、ホスホリパーゼＡ１は、少なくともｐＨ４．０〜１０．５の範囲で強いＰＬＡ１活性を示すことが確認された。【０１３８】
温度の条件としては、ホスホリパーゼＡ１は、少なくとも２０〜６０℃の範囲で強いＰＬＡ１活性を示すことが確認された。【０１３９】
上記のようにして得られた精製酵素について、Ｘ線結晶構造解析を行ったところ、ストレプトマイセス・アルビドフラブス（Streptomyces albidoflavus）由来のホスホリパーゼＡ１の立体構造（リボンモデル）が図６Ａに示すようなものであることが判明した。なお、Ｘ線結晶構造解析の分解能は２．２Åであった。この立体構造から、上記のホスホリパーゼＡ１が、７つのα−ヘリックス、６つのβ−シート、３つのＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を有することが分かった。そして、上記のホスホリパーゼＡ１については、図６Ｂに示すように、主としてＳｅｒ１１、Ｓｅｒ２１６、Ｈｉｓ２１８が活性中心に位置してリン脂質の加水分解反応を触媒しているものと考えられる。このことは、Ｓｅｒ１１、Ｓｅｒ２１６、Ｈｉｓ２１８を各アラニンに置換した変異酵素が酵素として生産されたものの活性を失ったという結果からも裏付けられた。【０１４０】
（ｂ）ホスホリパーゼＢ
１０％（ｗ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ナカライテスク株式会社製）１０ｍＬにジミリストイルホスファチジン酸１ｇ（フナコシ株式会社製）を溶解し、１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸を調製した。この１０％（ｗ／ｖ）ジミリストイルホスファチジン酸０．００５ｍＬに、０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）０．０２５ｍＬと、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）０．００２ｍＬと、蒸留水０．０６３ｍＬとを加えた。そして、３７℃で５分間予備加温した後、ホスホリパーゼＢを含む試料０．００５ｍＬを添加し、３７℃で５分反応させた。ここで、リン脂質１００質量部に対するホスホリパーゼＢの質量は、０．００５ｍｌがすべて酵素で比重１とすれば２質量部となるが、使用するサンプル中のホスホリパーゼＢの純度によってホスホリパーゼＢの質量が変わるのでホスホリパーゼＢ含有試料の添加量の調整に留意した。酵素反応後、１００℃で５分間加熱し、酵素反応を停止させた。反応停止後、反応液５μＬ中に含まれる遊離脂肪酸量を、遊離脂肪酸測定キットである「ＮＥＦＡ  Ｃテストワコー」（和光純薬工業株式会社製）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測定した。１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素量を、１単位とした。【０１４１】
この酵素試験により、ホスホリパーゼＢはＰＬＢ活性を示すことが確認された。【０１４２】
ｐＨの条件としては、ホスホリパーゼＢは、少なくともｐＨ６．０〜１０．５の範囲で強いＰＬＢ活性を示すことが確認された。【０１４３】
温度の条件としては、ホスホリパーゼＢは、少なくとも２０〜６５℃の範囲で強いＰＬＢ活性を示すことが確認された。【０１４４】
［ＬＰＣの有効濃度］
リゾリン脂質含有洗浄剤を製造するにあたって、市販のリゾリン脂質を用いて、高い洗浄効果を得るために有効なリゾリン脂質の濃度をあらかじめ次のように調べた。【０１４５】
ヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤入り）を生理食塩水で約１００〜１２０倍に希釈した試料に対して、複数の濃度の市販ＬＰＣ（Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（L-α-Lysophosphatidylcholine）、表１２参照）水溶液６μＬを加え、直ちに混合後、室温（約２０℃）下で５分間静置した。その後、遠心分離を行い、その上澄み液を取り、波長５７６ｎｍの吸光度（Ａ５７６）を測定することにより、溶血率を調べた。溶血率は次式より算出した。これにより、ＬＰＣの有効濃度を調べた。なお、溶血は通常、赤血球が破壊される現象を意味するが、本明細書では、血液中の赤血球以外の細胞も破壊される現象を意味する。【０１４６】
溶血率＝Ａ／Ｂ
Ａ＝（試料液を入れた血液のＡ５７６）−（生理食塩水を入れた血液のＡ５７６）
Ｂ＝（蒸留水を入れた血液のＡ５７６）−（生理食塩水を入れた血液のＡ５７６）
図１にＬＰＣ濃度と溶血率との関係を示すグラフを示す。このグラフからＬＰＣの有効濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ以上であることが分かった。【０１４７】
［ＬＰＣの耐熱性試験］
ＬＰＣ水溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を１００℃で時間を変えて加熱処理した後、上記と同様に溶血率を算出し、ＬＰＣの耐熱性について調べた。その結果、図２に示すようにＬＰＣ水溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を１００℃、６時間加熱処理しても溶血能力に変化が無く、極めて耐熱性に優れていることが確認された。【０１４８】
［リゾリン脂質の種類による違い］
陶器（白磁）製プレートにヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤入り）を入れ、約７０〜８０℃で約１５分間加温することで血液を凝固させた。そこに、市販リゾリン脂質水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）（表１２参照）を４０μＬ滴下して１０分間静置した後に蒸留水４００μＬで洗浄し、血液汚れが落ちるか目視により確認し、洗浄力を判定した。その結果、表１に示すように、ＬＰＧ、ＬＰＣ、ＬＰＡはほぼ同程度の洗浄力を示した。強いて言えば、ＬＰＧ＞ＬＰＣ＞ＬＰＡ＞ＬＰＩ＝ＬＰＳ＞ＬＰＥの順に洗浄力が強かった。【０１４９】
【表１】
2013145289.tif 000003
【０１５０】
［リゾリン脂質生成の経時変化］
基質としてホスファチジルコリン（ＰＣ）（表１２参照）を用い、酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）を用いて、表２に示す反応液組成にて３７℃で３０分間酵素反応を行い、ＬＰＣ（１−アシル及び２−アシルリゾホスファチジルコリンの合計）生成の経時変化を調べた。その結果は、図３に示すように２０分間程度の酵素反応が好ましいことを示唆するものであった。これにより、リゾリン脂質含有洗浄剤を製造するにあたっては、酵素反応を追跡し、リゾリン脂質の収量が最大となる反応時間で停止させる必要があることが分かった。【０１５１】
【表２】
2013145289.tif 000004
【０１５２】
［リゾリン脂質含有洗浄剤］
（試料１）
試料１は、次のようにして調製した。基質として大豆レシチン（ＳＢＬ）を用い、酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）又はホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）を用いて、表３に示す反応液組成にて３７℃で６０〜１２０分間酵素反応を行った後、酵素反応液を各種フィルター膜（後述の表４参照）で濾過して濾液を得た。この濾液を試料１とした。【０１５３】
（試料２）
試料２は、次のようにして調製した。基質として大豆レシチン（ＳＢＬ）を用い、酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）又はホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）を用いて、表３に示す反応液組成にて３７℃で６０〜１２０分間酵素反応を行った。この酵素反応液をクロロホルム／メタノール（体積比２／１）で抽出した後、リゾリン脂質を含むクロロホルム層を回収し、溶媒を減圧除去後、得られたリゾリン脂質約１０〜１８ｍｇに蒸留水を加えて０．３ｇ／ｍＬとして試料２を得た。【０１５４】
（試料３）
試料３は、次のようにして調製した。基質として卵黄レシチン（Ｌ）を用い、酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）又はホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）を用いて、表３に示す反応液組成にて３７℃で６０分間酵素反応を行った後、上記と同様にクロロホルム／メタノールで抽出して得られた抽出物０．６６３ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製した。抽出物の２０倍質量のシリカゲル（和光純薬工業株式会社製、Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００  型番２３７−０００７５）１３．３gをカラム（内径φ２３mm）に詰め（ゲル高８５mm）、溶出液（クロロホルム／メタノール／水、体積比７０／２５／３）で溶出させ、８ｍＬずつ回収した。このうち、リゾリン脂質を含むフラクションを回収し、溶媒を減圧除去した。その結果、１．０５ｇの基質から１８ｍｇのリゾリン脂質を得ることができた。このリゾリン脂質に蒸留水を加えて２０〜１００ｍｇ／ｍＬとした試料３を得た。【０１５５】
【表３】
2013145289.tif 000005
【０１５６】
試料１について濾過に最適なフィルター膜の材質を調べ、濾過して得られた濾液（リゾリン脂質含有洗浄剤）について血液汚れの洗浄力（溶血力）を上記と同様に調べた。表４に示すように、孔径０．４５μｍのＰＥＳ（Polyethersulphone：ポリエーテルサルフォン）膜及びＰＶＤＦ（PolyVinylidene DiFluoride：ポリフッ化ビニリデン）膜を用いて濾過した濾液には濁りが少なく、しかも洗浄力も強いことから、酵素反応液の濾過にはこの２種類の膜を用いることが好ましいことが分かった。濾過に用いるフィルター膜の孔径には他にも０．２μｍや０．８μｍなどがあるが、目的に応じて適宜選択すればよい。また、表３に示す反応液に含まれるトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を添加しないで製造したリゾリン脂質含有洗浄剤についてもほぼ同様の洗浄力が得られた。【０１５７】
【表４】
2013145289.tif 000006
【０１５８】
リゾリン脂質含有洗浄剤の製造に用いる酵素は、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、若しくはホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）、又はこれらが混合しているものでもよい。例えば、基質として大豆レシチン（ＳＢＬ）又は卵黄レシチン（Ｌ）を用い、市販のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を用いて、表５に示す反応液組成にて３７℃で６０分間酵素反応を行い、この酵素反応液をＰＶＤＦ膜を用いて濾過して得られた濾液の洗浄力は、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）を用いて同様に得られた濾液の洗浄力とほぼ同様であった。【０１５９】
【表５】
2013145289.tif 000007
【０１６０】
［試料１〜３の洗浄力］
表６に示すように、酵素反応時間が６０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られた試料１−１、酵素反応時間が９０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られた試料１−２、酵素反応時間が１２０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られた試料１−３はいずれも、市販ＬＰＣ（０．１ｍｇ／ｍＬ）（表１２参照）よりも強い洗浄力を示した。【０１６１】
また、試料１、試料２、試料３では洗浄力はほぼ同等であった。【０１６２】
また、試料２を蒸留水で適宜希釈し、血液汚れ等を洗浄する場合のリゾリン脂質の有効濃度について調べた。その結果、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度が必要であることが分かった。【０１６３】
また、試料３を蒸留水で適宜希釈し、血液汚れ等を洗浄する場合のリゾリン脂質の有効濃度について調べた。その結果、試料３−１〜試料３−５のいずれについても洗浄力は試料１、２と同等であることが分かった。【０１６４】
以上より、リゾリン脂質含有洗浄剤を低コストで製造する方法としては、試料１の製造方法が優れていることが確認された。【０１６５】
【表６】
2013145289.tif 000008
【０１６６】
また、表７に示すように、原料（基質）として大豆レシチン（ＳＢＬ）を用いてリゾリン脂質含有洗浄剤を製造する場合には、ＰＶＤＦ膜によるフィルター濾過が必要である。これに対して、原料（基質）として卵黄レシチン（Ｌ）を用いてリゾリン脂質含有洗浄剤を製造する場合には、遠心分離後の上澄み液をそのまま利用することができ、特にフィルター濾過を行わなくてもよい。また、大豆レシチン（ＳＢＬ）から得られたリゾリン脂質含有洗浄剤は黄色でやや濁りがあるが、卵黄レシチン（Ｌ）から得られたリゾリン脂質含有洗浄剤はわずかに白濁しているだけで濁りが少ないという特徴がある。また、いずれのリゾリン脂質含有洗浄剤も洗浄力は同じであった。【０１６７】
【表７】
2013145289.tif 000009
【０１６８】
［洗浄効果確認試験その１］
試料１−１（酵素反応時間が６０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）及び市販の内視鏡・手術器具用洗浄剤（乾商事株式会社、メディポールＥＸ−１）を用いて血液汚染試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄インジケーターＴＯＳＩ）の洗浄効果を確認する試験を行った。具体的には、上記の血液汚染試験片上の血液汚染部位に上記の試料１−１及び市販の洗浄剤をそれぞれ滴下し、室温（約２０℃）下で１０分間放置した。その後、水洗した結果、市販の洗浄剤では血液汚れの残存が確認されたのに対して、試料１−１では血液汚れ及びフィブリンの残存は全く観察されなかった。また、表８に示すように、試料１−２（酵素反応時間が９０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）、試料１−３（酵素反応時間が１２０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）試料１−４（酵素反応時間が３０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）、試料１−５（酵素反応時間が４０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）を用いて上記と同様の試験を行った結果、いずれも洗浄力はほぼ同一であった。このことから、酵素反応時間は３０分間で十分であることが分かった。【０１６９】
【表８】
2013145289.tif 000010
【０１７０】
［洗浄効果確認試験その２］
血液汚染試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄インジケーターＴＯＳＩ）を２本のサンプル瓶に入れ、一方のサンプル瓶に試料１−１（酵素反応時間が６０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）を入れ、他方のサンプル瓶に市販の内視鏡・手術器具用洗浄剤（乾商事株式会社、メディポールＥＸ−１）を入れて、両方のサンプル瓶内を室温（２４℃）及び４０℃でスターラーにより攪拌（約５００ｒｐｍ）することによって、洗浄効果を確認する試験を行った。その結果、表９及び表１０に示すように、４０℃では試料１−１も市販の洗浄剤も１０分で血液汚染の基底面にあるフィブリンまで完全に除去することができた。一方、室温（２４℃）では試料１−１は約１３分間、市販の洗浄剤は約１５分間の洗浄時間により完全に血液汚れを洗浄することができた。【０１７１】
以上より、４０℃では試料１−１と市販の洗浄剤の洗浄力は同等であるが、より低温となる室温（２４℃）では両者の洗浄力に差が見られ、市販の洗浄剤に比べて試料１−１の方が洗浄力が高いことが明らかとなった。これにより、リゾリン脂質含有洗浄剤は温度の影響を受けにくく、広い温度範囲で十分な洗浄効果を発揮することが分かった。【０１７２】
【表９】
2013145289.tif 000011
【０１７３】
【表１０】
2013145289.tif 000012
【０１７４】
［洗浄効果確認試験その３］
内視鏡（オリンパス株式会社製）及びピンセットに付着した血液汚れの洗浄効果を確認する試験を行った。具体的には、内視鏡先端部（カメラ、鉗子口がある部分）及びステンレス製ピンセットをヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤無し）に浸し、血液を内視鏡先端部及びステンレス製ピンセット先端部に付着させた。その後、室温で３時間静置して血液を固化させ、手術時の血液汚れを再現した。次にサンプル瓶に試料１−１（酵素反応時間が６０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）を約３０ｍＬ入れ、さらに上記の血液汚染された内視鏡先端部及びステンレス製ピンセット先端部を浸し、室温（２４℃）でサンプル瓶内を軽くかき回した。その結果、数秒間で内視鏡先端部及びステンレス製ピンセット先端部の血液汚れを完全に除去することができた。【０１７５】
［洗浄効果確認試験その４］
内視鏡鉗子が挿入される管（約２mm）内に残留する血液汚れの洗浄効果を確認する試験を行った。具体的には、内視鏡鉗子挿入管の代わりに透明プラスチック製チューブ（ＴＹＧＯＮ  Ｒ−３６０３、ＩＤ，３／３２”、ＯＤ，５／３２”、Ｗａｌｌ，１／３２”、内径２．３ｍｍ）を用いて、次のようにして洗浄効果確認試験を行った。まず２本の透明プラスチック製チューブ内をヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤無し）で満たし、１０分間室温（２４℃）で放置した後、４０℃で２時間加温して血液を固化させた。次に、試料１−１（酵素反応時間が６０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）をシリンジで吸い上げるようにして一方のチューブ内を満たし、２分間室温（２４℃）で静置した。同様に市販の内視鏡・手術器具用洗浄剤（乾商事株式会社、メディポールＥＸ−１）をシリンジで吸い上げるようにして他方のチューブ内を満たし、２分間室温静置した。その後、両方のチューブ内の液体を除き、水洗した。その結果、表１１に示すように、試料１−１は室温（２４℃）でも４０℃でも完全に血液汚れを除去することができたのに対して、市販の洗浄剤は血液汚れの残留が顕著で完全に血液汚れを除去することができなかった。これにより、リゾリン脂質含有洗浄剤の洗浄能力が極めて優れていることが分かった。【０１７６】
【表１１】
2013145289.tif 000013
【０１７７】
［血塊分解試験］
陶器（白磁）製プレートにヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤入り）の凝固血塊を取り、ここに表６に記載の試料１−１を適当量加えて室温にて静置した後に、血塊の崩壊（分解）の程度を目視により確認することによって、試料１−１の洗浄力を判定した。ここで血塊の崩壊（分解）とは、血塊の堅さが低下すると共に血塊がほぐれて小さくなること（細分化されること）を意味する。その結果、約１０分間で血塊の堅さが低下し、血塊がほぐれて細分化した。さらに短時間で血塊を分解させるために超音波発振子（超音波振動子）（株式会社トミー精工、Handy Sonic  ＵＲ−２１Ｐ、２８ｋＨｚ・１０Ｗ）による物理的処理を併用した。その結果、瞬時に血塊を分解することができ、さらにはシリンジ（例えば、テルモ株式会社、ＮＮ−２１３８Ｒ、２１Ｇ×１  １／２”，０．８０×３８ｍｍ）で容易に吸引除去することができるまでの状態となった。以上より、例えば内視鏡や腹腔鏡の鉗子からリゾリン脂質含有洗浄剤を注入すると同時に、超音波発振子（超音波振動子）による物理的処理を併用することによって、血塊を一層速やかに分解除去することができるものと考えられる。【０１７８】
なお、本明細書に記載の基質及び酵素のメーカー・品番等を表１２に示す。【０１７９】
【表１２】
2013145289.tif 000014
【受託番号】
【０１８０】
［Streptomyces albidoflavus ＮＡ２９７（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４）］
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日。
［Streptomyces sp. ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）］
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１１年１月２６日。
【配列表フリーテキスト】
【０１８１】
配列番号１：ＰＬＡ１（ポリペプチド）の全長
配列番号２：ＰＬＡ１遺伝子
配列番号３：ＰＬＢ（ポリペプチド）の全長
配列番号４：ＰＬＢ遺伝子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2013145289.tif 000019
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月26日(2014.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とする血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ１−１）、（ａ１−２）又は（ａ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）又は（ｂ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
【請求項２】
リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とする血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ２−１）、（ａ２−２）又は（ａ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ２−１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ２−１）、（ｂ２−２）又は（ｂ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ２−１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【請求項３】
前記酵素がストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物に由来するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤。
【請求項４】
リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質をリゾリン脂質に加水分解することを特徴とする血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の製造方法。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ１−１）、（ａ１−２）又は（ａ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）又は（ｂ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
【請求項５】
リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質をリゾリン脂質に加水分解することを特徴とする血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の製造方法。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ２−１）、（ａ２−２）又は（ａ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ２−１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ２−１）、（ｂ２−２）又は（ｂ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ２−１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、リン脂質をホスホリパーゼ（リン脂質分解酵素）で分解して得られたリゾリン脂質を含有する血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤及びその製造方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、血液中の赤血球等の細胞膜を破壊しやすく、血液汚れの洗浄効果に優れた血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有することを特徴とするものである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
前記血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤において、前記酵素がストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物に由来するものであることが好ましい。
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の製造方法は、リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質をリゾリン脂質に加水分解することを特徴とするものである。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ１−１）、（ａ１−２）又は（ａ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ａ１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）又は（ｂ１−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ１−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｂ１−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の製造方法は、リン脂質に酵素として下記のホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を作用させて前記リン脂質をリゾリン脂質に加水分解することを特徴とするものである。
ホスホリパーゼＡ１：下記の（ａ２−１）、（ａ２−２）又は（ａ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基をｓｎ−２位アシル基に対して優先的に切断する。
（ａ２−１）配列番号３に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−２）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ａ２−３）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
ホスホリパーゼＢ：下記の（ｂ２−１）、（ｂ２−２）又は（ｂ２−３）のポリペプチドを含み、リン脂質のｓｎ−１位アシル基とｓｎ−２位アシル基を共に切断する。
（ｂ２−１）配列番号４に記載の塩基配列をポリヌクレオチドとして有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−２）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
（ｂ２−３）配列番号４に記載の塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを有する微生物から産生されるポリペプチド。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、特に血液を構成する赤血球や白血球等の細胞膜を破壊しやすいものであり、例えば、内視鏡等の医療機器に付着した血液及びその他の細胞等の汚れを低温でも短時間で十分に洗い落とすことができ、血液汚れの洗浄効果に優れているものである。しかも本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤はヒトに対する毒性が非常に低いので、このような血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を用いて洗浄した後の医療機器等はさらに特別な処理を行わなくても再使用することができるものである。例えば、内視鏡及び腹腔鏡手術において、これらの機器の先端部のレンズ等に付着した赤血球や白血球等の細胞を血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したり、体内で生じた凝固した血液（血塊）を血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したりすることができるものである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
［血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の原料］
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質（特に１，２−ジアシルグリセロリン脂質）に酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）の少なくともいずれかを作用させて、リン脂質を加水分解することによって得られたリゾリン脂質を含有するものである。このリゾリン脂質には、リン脂質の分解生成物の全部又は一部が含まれる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を製造するにあたっては、特に以下に説明するホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢの少なくとも一方を酵素として用いることが好ましい。これらの酵素は、カルシウム塩などの無機塩の添加を不要にすることができ、低温〜高温（２０〜７０℃）で反応させることができ、酵素処理の効率を向上させることができる。また、ｐＨ３〜１１で反応させることができるため、反応制御しやすい。また、酵素の力価が極めて高いため、反応効率が格段に高い。さらに、多くの種類のリン脂質に作用するため、反応収率が高い。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
［微生物］
ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢは、微生物によって産生し得るものである。特にホスホリパーゼＡ１及びホスホリパーゼＢについては、配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列情報や、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列情報から、人工的にポリペプチドを生成することができ、血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の製造に人工合成によって得た酵素（ポリペプチド）を用いてもよい。しかしながら、微生物により酵素を産生する場合、容易に上記の酵素を得ることができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
［血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤］
本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、リン脂質に酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）の少なくともいずれかを作用させて、リン脂質をリゾリン脂質に加水分解することによって得ることができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤においてリゾリン脂質の濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、０．３ｍｇ／ｍＬ以上であることがさらにより好ましい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
そして、血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、次のようにして製造することができる。まずリン脂質と、リン脂質分解酵素（ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２及びホスホリパーゼＢの少なくともいずれか）とを含有する水溶液（酵素反応液）を調製する。次にこの酵素反応液をリン脂質分解酵素の至適温度（例えば３７℃）に調整し、例えば３０〜１２０分間かけて酵素反応を行う。その後、必要があればその目的に応じて酵素反応液を濾紙やフィルターにより濾過して濾液として血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を得たり、遠心分離にかけて上澄み液として血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を得たりすることもできる。濾過は、濁りの原因となる未反応の基質や不純物を除去するために行うが、特に大豆レシチン（ＳＢＬ）のように不純物の多い基質を用いる場合に有効である。濁りが気にならない程度であれば濾過は不要であり、特に基質が卵黄レシチン（Ｌ）の場合、未反応の基質があれば濾過又は遠心分離により十分に透明度のある血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を得ることができる（表７参照）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
上記のようにして得られた血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は、特に血液を構成する赤血球や白血球等の細胞膜を破壊しやすいものであり、例えば、内視鏡等の医療機器に付着した血液及びその他の細胞等の汚れを低温でも短時間で十分に洗い落とすことができ、血液汚れの洗浄効果に優れているものである。しかも本発明に係る血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤はヒトに対する毒性が非常に低いので、このような血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を用いて洗浄した後の医療機器等はさらに特別な処理を行わなくても再使用することができるものである。例えば、内視鏡及び腹腔鏡手術において、これらの機器の先端部のレンズ等に付着した赤血球や白血球等の細胞を血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したり、体内で生じた凝固した血液（血塊）を血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を用いて速やかに溶解除去したりすることができるものである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
［ＬＰＣの有効濃度］
血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を製造するにあたって、市販のリゾリン脂質を用いて、高い洗浄効果を得るために有効なリゾリン脂質の濃度をあらかじめ次のように調べた。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
［リゾリン脂質生成の経時変化］
基質としてホスファチジルコリン（ＰＣ）（表１２参照）を用い、酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）を用いて、表２に示す反応液組成にて３７℃で３０分間酵素反応を行い、ＬＰＣ（１−アシル及び２−アシルリゾホスファチジルコリンの合計）生成の経時変化を調べた。その結果は、図３に示すように２０分間程度の酵素反応が好ましいことを示唆するものであった。これにより、血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を製造するにあたっては、酵素反応を追跡し、リゾリン脂質の収量が最大となる反応時間で停止させる必要があることが分かった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
［血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤］
（試料１）
試料１は、次のようにして調製した。基質として大豆レシチン（ＳＢＬ）を用い、酵素としてホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）又はホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）を用いて、表３に示す反応液組成にて３７℃で６０〜１２０分間酵素反応を行った後、酵素反応液を各種フィルター膜（後述の表４参照）で濾過して濾液を得た。この濾液を試料１とした。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
試料１について濾過に最適なフィルター膜の材質を調べ、濾過して得られた濾液（血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤）について血液汚れの洗浄力（溶血力）を上記と同様に調べた。表４に示すように、孔径０．４５μｍのＰＥＳ（Polyethersulphone：ポリエーテルサルフォン）膜及びＰＶＤＦ（PolyVinylidene DiFluoride：ポリフッ化ビニリデン）膜を用いて濾過した濾液には濁りが少なく、しかも洗浄力も強いことから、酵素反応液の濾過にはこの２種類の膜を用いることが好ましいことが分かった。濾過に用いるフィルター膜の孔径には他にも０．２μｍや０．８μｍなどがあるが、目的に応じて適宜選択すればよい。また、表３に示す反応液に含まれるトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を添加しないで製造した血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤についてもほぼ同様の洗浄力が得られた。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の製造に用いる酵素は、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、若しくはホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）、又はこれらが混合しているものでもよい。例えば、基質として大豆レシチン（ＳＢＬ）又は卵黄レシチン（Ｌ）を用い、市販のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を用いて、表５に示す反応液組成にて３７℃で６０分間酵素反応を行い、この酵素反応液をＰＶＤＦ膜を用いて濾過して得られた濾液の洗浄力は、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）を用いて同様に得られた濾液の洗浄力とほぼ同様であった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
以上より、血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を低コストで製造する方法としては、試料１の製造方法が優れていることが確認された。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
また、表７に示すように、原料（基質）として大豆レシチン（ＳＢＬ）を用いて血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を製造する場合には、ＰＶＤＦ膜によるフィルター濾過が必要である。これに対して、原料（基質）として卵黄レシチン（Ｌ）を用いて血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を製造する場合には、遠心分離後の上澄み液をそのまま利用することができ、特にフィルター濾過を行わなくてもよい。また、大豆レシチン（ＳＢＬ）から得られた血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は黄色でやや濁りがあるが、卵黄レシチン（Ｌ）から得られた血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤はわずかに白濁しているだけで濁りが少ないという特徴がある。また、いずれの血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤も洗浄力は同じであった。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
以上より、４０℃では試料１−１と市販の洗浄剤の洗浄力は同等であるが、より低温となる室温（２４℃）では両者の洗浄力に差が見られ、市販の洗浄剤に比べて試料１−１の方が洗浄力が高いことが明らかとなった。これにより、血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤は温度の影響を受けにくく、広い温度範囲で十分な洗浄効果を発揮することが分かった。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
［洗浄効果確認試験その４］
内視鏡鉗子が挿入される管（約２mm）内に残留する血液汚れの洗浄効果を確認する試験を行った。具体的には、内視鏡鉗子挿入管の代わりに透明プラスチック製チューブ（ＴＹＧＯＮ  Ｒ−３６０３、ＩＤ，３／３２”、ＯＤ，５／３２”、Ｗａｌｌ，１／３２”、内径２．３ｍｍ）を用いて、次のようにして洗浄効果確認試験を行った。まず２本の透明プラスチック製チューブ内をヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤無し）で満たし、１０分間室温（２４℃）で放置した後、４０℃で２時間加温して血液を固化させた。次に、試料１−１（酵素反応時間が６０分間でＰＶＤＦ膜で濾過して得られたもの）をシリンジで吸い上げるようにして一方のチューブ内を満たし、２分間室温（２４℃）で静置した。同様に市販の内視鏡・手術器具用洗浄剤（乾商事株式会社、メディポールＥＸ−１）をシリンジで吸い上げるようにして他方のチューブ内を満たし、２分間室温静置した。その後、両方のチューブ内の液体を除き、水洗した。その結果、表１１に示すように、試料１−１は室温（２４℃）でも４０℃でも完全に血液汚れを除去することができたのに対して、市販の洗浄剤は血液汚れの残留が顕著で完全に血液汚れを除去することができなかった。これにより、血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤の洗浄能力が極めて優れていることが分かった。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
［血塊分解試験］
陶器（白磁）製プレートにヒト全血（コージンバイオ、抗凝固剤入り）の凝固血塊を取り、ここに表６に記載の試料１−１を適当量加えて室温にて静置した後に、血塊の崩壊（分解）の程度を目視により確認することによって、試料１−１の洗浄力を判定した。ここで血塊の崩壊（分解）とは、血塊の堅さが低下すると共に血塊がほぐれて小さくなること（細分化されること）を意味する。その結果、約１０分間で血塊の堅さが低下し、血塊がほぐれて細分化した。さらに短時間で血塊を分解させるために超音波発振子（超音波振動子）（株式会社トミー精工、Handy Sonic  ＵＲ−２１Ｐ、２８ｋＨｚ・１０Ｗ）による物理的処理を併用した。その結果、瞬時に血塊を分解することができ、さらにはシリンジ（例えば、テルモ株式会社、ＮＮ−２１３８Ｒ、２１Ｇ×１  １／２”，０．８０×３８ｍｍ）で容易に吸引除去することができるまでの状態となった。以上より、例えば内視鏡や腹腔鏡の鉗子から血液汚れ洗浄用リゾリン脂質含有洗浄剤を注入すると同時に、超音波発振子（超音波振動子）による物理的処理を併用することによって、血塊を一層速やかに分解除去することができるものと考えられる。
【国際調査報告】
2013145289.tif 000022
2013145289.tif 000023
2013145289.tif 000024
2013145289.tif 000025