(57)【要約】  本発明は、ナイルブルー硫酸水素塩、又はナイルブルーと酸とを含む血小板測定用試薬、該血小板測定用試薬を含む試薬キット、並びにこれらを用いる血小板測定方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を染色するための色素として下記一般式（III）：
【化１】
2009104598.tif 000019
で示される化合物を含む血小板測定用試薬。
【請求項２】
血小板を染色するための色素として下記一般式（III）：
【化２】
2009104598.tif 000020
で示される化合物を含む第１の試薬と、
緩衝剤を含有する第２の試薬と
を含む血小板測定用試薬キット。
【請求項３】
前記第２の試薬が、ｐＨ６．０〜１１．０の緩衝液である請求項２に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項４】
前記第２の試薬が、１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する請求項２に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項５】
前記第２の試薬が、前記色素による血小板の染色を促進するための染色促進剤をさらに含む請求項２に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項６】
前記染色促進剤が、カチオン界面活性剤である請求項５に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項７】
血小板を染色するための色素として下記一般式（III）：
【化３】
2009104598.tif 000021
で示される化合物を含む第１の試薬と、検体とを、緩衝剤を含有する第２の試薬を加えるか又は加えずに混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む血小板測定方法。
【請求項８】
検出された血小板を計数するステップをさらに含む請求項７に記載の血小板測定方法。
【請求項９】
血小板を染色するための色素として下記一般式（II）：
【化４】
2009104598.tif 000022
（式中、Ｘ-は、ＨＳＯ4-、１／２ＳＯ42-、Ｃｌ-、及びＣｌＯ4-からなる群より選択されるアニオンである）
で示される化合物と、酸とを含有する血小板測定用試薬。
【請求項１０】
前記酸が、無機酸である請求項９に記載の血小板測定用試薬。
【請求項１１】
前記色素と前記酸とのモル濃度比が、１０：１〜１：１である請求項９に記載の血小板測定用試薬。
【請求項１２】
血小板を染色するための色素として下記一般式（II）：
【化５】
2009104598.tif 000023
（式中、Ｘ-は、ＨＳＯ4-、１／２ＳＯ42-、Ｃｌ-、及びＣｌＯ4-からなる群より選択されるアニオンである）
で示される化合物と、酸とを含有する第１の試薬と、
緩衝剤を含有する第２の試薬と
を含む血小板測定用試薬キット。
【請求項１３】
前記第１の試薬における前記色素と前記酸とのモル濃度比が、１０：１〜１：１である請求項１２に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項１４】
下記一般式（II）：
【化６】
2009104598.tif 000024
（式中、Ｘ-は、ＨＳＯ4-、１／２ＳＯ42-、Ｃｌ-、及びＣｌＯ4-からなる群より選択されるアニオンである）
で示される化合物と、酸とを含有する第１の試薬と、検体とを、緩衝剤を含有する第２の試薬を加えるか又は加えずに混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む血小板測定方法。
【請求項１５】
検出された血小板を計数するステップをさらに含む請求項１４に記載の血小板測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット及びそれらを用いる血小板測定方法に関する。より具体的には、本発明は、血小板を測定するための色素としてナイルブルー、特にナイルブルー硫酸水素塩を含む血小板測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中の細胞、すなわち白血球、網状赤血球、赤血球などの血球を、フローサイトメトリ原理を用いて迅速に測定する方法が、従来知られている。
このような測定方法として、例えば、米国特許第６１１４１７３号公報（特許文献１）には、全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血小板の計数及び同定の方法、並びにその方法に用いる試薬組成物が開示されている。具体的には、カチオン性色素、特にオキサジン７５０を含む試薬混合物で網状赤血球を染色し、フローサイトメトリを用いて散乱光信号及び光吸収信号を測定する。そして、血液試料中の赤血球と網状赤血球とを吸収信号の違いによって、赤血球及び網状赤血球からなる群と血小板とを散乱光信号の違いによって分類し、それぞれの総数を決定するというものである。
【特許文献１】米国特許第６１１４１７３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
血小板を測定するに際しては、血液中に出現する破砕赤血球や脂質などが、そのサイズが血小板と類似しているために、測定上の夾雑物として影響を与えることが知られている。特に、輸血の必要性があるような血小板の少ない検体を測定する際には、これらの夾雑物の影響がより大きくなる。このような問題は、米国特許第６１１４１７３号公報に記載の方法によっても生じる問題であるが、夾雑物の影響を抑えて血小板を測定することについて、米国特許第６１１４１７３号には何ら記載されていない。【０００４】
また、血小板を染色できる色素は、溶液中で時間の経過と共に分解されることがある。フローサイトメトリによる血小板の測定は、試料中の色素により染色された細胞に光を照射して得られる散乱光及び蛍光を検出することにより行われる。しかし、含有される血小板染色用色素の量が低下した色素溶液を用いたのでは、正確に散乱光及び蛍光を得ることができず、よって、正確な測定結果を得ることができない。【０００５】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、血小板の検出を妨げ得る夾雑物を含む検体であっても、このような夾雑物の影響を抑えて血小板をより高い精度で測定することを可能にし、かつ保存安定性が高い血小板測定用試薬及び血小板測定用試薬キットを提供することを目的とし、さらに、血小板をより高い精度で測定することを可能にする血小板測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
よって、本発明は、血小板を染色するための色素としてカウンターイオンが硫酸水素イオンであるナイルブルーを含む血小板測定用試薬を提供する。
また、本発明は、血小板を染色するための色素としてカウンターイオンが硫酸水素イオンであるナイルブルーを含む第１の試薬と、緩衝剤を含有する第２の試薬と、を含む血小板測定用試薬キットを提供する。
さらに、本発明は、血小板を染色するための色素としてカウンターイオンが硫酸水素イオンであるナイルブルーを含む第１の試薬と、検体とを、緩衝剤を含有する第２の試薬を加えるか又は加えずに混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む血小板測定方法を提供する。【０００７】
また、別の態様において、本発明は、血小板を染色するための色素としてカウンターイオンが無機酸イオンであるナイルブルーと、酸とを含有する血小板測定用試薬を提供する。
本発明は、さらに、血小板を染色するための色素としてのナイルブルーと、酸とを含有する第１の試薬と、緩衝剤を含有する第２の試薬とを含む血小板測定用試薬キットを提供する。
さらに、本発明は、ナイルブルーと、酸とを含有する血小板測定用試薬と、検体とを、緩衝剤を含有する第２の試薬を加えるか又は加えずに混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む血小板測定方法も提供する。【０００８】
本明細書において、「ナイルブルー」とは、例えば以下の式（ＩＩ）：
【化１】
2009104598.tif 000002
（式中、Ｘ-はアニオンである）
で表され、Ｘ-で表されるカウンターイオンとの塩を形成した状態の化合物からなる色素のことをいう。本明細書では、Ｘ-で表されるカウンターイオンを特に限定しない場合には、式（II）で示される色素を単に「ナイルブルー」と呼称し、カウンターイオンが特定のイオンを示す場合には、式（II）で示される色素を「ナイルブルー（特定のイオン名）塩」と呼称する。例えば、カウンターイオンが硫酸イオン（１／２ＳＯ42-）であるナイルブルーを「ナイルブルー硫酸塩」と呼称し、カウンターイオンが硫酸水素イオン（ＨＳＯ42-）であるナイルブルーを「ナイルブルー硫酸水素塩」と呼称する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の血小板測定用試薬キットを収容し得る容器の外観を表す図である。
【図２】試料分析装置の概略構成を示す正面図である。
【図３】試料分析装置の概略構成を示すブロック図である。
【図４】検出部の構成を示す概略平面図である。
【図５】実験例９の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図６】実験例１０の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図７】実験例１１の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図８】実験例１２の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図９】実験例１３の色素試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１０】実験例９の血小板測定用試薬を用いた破砕赤血球含有血液の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１１】実験例９の血小板測定用試薬を用いた脂質粒子含有血液の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１２】実験例１０の血小板測定用試薬を用いた破砕赤血球含有血液の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１３】実験例１０の血小板測定用試薬を用いた脂質粒子含有血液の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１４】実験例１４〜２４の血小板測定用試薬を用いた検体の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１５】実験例２５の血小板測定用試薬を用いた検体の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１６】実験例４５の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１７】実験例４６の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１８】実験例４７の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図１９】実験例４８の血小板測定用試薬を用いた血小板測定により得られたスキャッタグラムである。
【図２０】実験例４５の血小板測定用試薬を用いた破砕赤血球含有血液の測定により得られたスキャッタグラムである。
【図２１】実験例４５の血小板測定用試薬を用いた脂質粒子含有血液の測定により得られたスキャッタグラムである。
【符号の説明】
【００１０】
Ａ      第１の容器
Ｂ      第２の容器
１      試料分析装置
２      測定ユニット
３      データ処理ユニット
４      制御部
５      検出部
６      試料調製部
７      インターフェース
８      制御部
９      データ分析部
１０    表示部
１１    操作部
１２    インターフェース
５１    フローセル
５２    レーザ光源
５３    照射レンズ系
５４、５７  フォトダイオード
５４ａ  ビームストッパ
５４ｂ  アンプ
５５    側方集光レンズ
５６    ダイクロイックミラー
５７    フォトダイオード
５７ａ、５８ｂ  アンプ
５８    フォトマルチプライヤ
５８ａ  光学フィルタ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜血小板測定用試薬＞
本発明者らは、フローサイトメトリを用いる血小板測定方法において、ナイルブルーを血小板染色用色素として用いることにより、血小板を他の血球成分や脂質粒子などの血液中の夾雑物から明確に区別できることを見出した。
さらに、本発明者らは、ナイルブルーを用いる血小板の測定条件について鋭意研究を重ねた結果、血小板測定用試薬が、（１）ナイルブルー硫酸水素塩を含有するか、又は（２）ナイルブルーと酸とを含有する場合に、保存安定性に優れることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。【００１２】
上記の式（II）中、Ｘ-のアニオン（カウンターイオン）としては、硫酸イオン（１／２ＳＯ42-）、塩素イオン（Ｃｌ-）、硫酸水素イオン（ＨＳＯ42-）、過塩素酸イオン（ＣｌＯ4-）などの無機酸イオンが挙げられる。
このようなナイルブルーは、市場で入手可能であり、例えば、シグマアルドリッチ社、東京化成、ナカライテスク社、和光純薬工業、キシダ化学社などから入手できる。
特に、ナイルブルー硫酸水素塩は、和光純薬工業、キシダ化学社などから入手できる。【００１３】
本発明の血小板測定用試薬中に含まれるナイルブルー（例えばナイルブルー硫酸水素塩）は、血小板測定用試薬を検体と混合したときに０．０５〜５．０ｐｐｍ、好ましくは０．１〜０．６ｐｐｍ、さらに好ましくは０．２〜０．５ｐｐｍの濃度となる濃度範囲で色素試薬中に含まれることが好ましい。例えば、検体と混合するときに血小板測定用試薬が５０倍に希釈される場合であれば、血小板測定用試薬中のナイルブルーの濃度は、２．５〜２５０ｐｐｍが好ましい。
このような濃度範囲であれば、血小板と、他の血球成分及び夾雑物との区別がより良好になる。【００１４】
本発明の血小板測定用試薬のナイルブルーと酸とを含む態様において、酸としては、有機酸及び無機酸のいずれであってもよいが、無機酸が好ましい。無機酸としては、硫酸、リン酸、過塩素酸などのオキソ酸、及び塩酸、フッ化水素酸、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、シアン化水素酸、イソシアン化水素酸、硫化水素、アジ化水素などの水素酸が挙げられる。【００１５】
本発明の血小板測定用試薬のこの態様において、酸は、そのモル濃度が、血小板測定用試薬に含まれるナイルブルーのモル濃度以下となるように血小板測定用試薬に含まれることが好ましい。具体的には、血小板測定用試薬におけるナイルブルーと酸とのモル濃度比が１０：１〜１：１であることが好ましい。特に酸として塩酸を用いる場合には、ナイルブルーと塩酸とのモル濃度比が３：１〜１：１であることが好ましく、酸として硫酸を用いる場合には、ナイルブルーと硫酸とのモル濃度比が４：１〜１：１であることが好ましい。このような濃度で酸を含有させることにより、時間経過に伴う血小板測定用試薬中のナイルブルーの有効色素成分濃度の低下をより効果的に抑制でき、血小板測定用試薬の保存安定性を向上させることができる。【００１６】
本発明の血小板測定用試薬のこの態様において、ナイルブルーと酸との組み合わせは、いずれのナイルブルー及び酸でも組み合わせることができる。しかし、
（Ａ）ナイルブルー硫酸塩とオキソ酸又は水素酸；
（Ｂ）ナイルブルークロリドと硫酸；及び
（Ｃ）ナイルブルー硫酸水素塩とオキソ酸又は水素酸
の組み合わせがより好ましい。【００１７】
本発明の血小板測定用試薬の別の態様において、ナイルブルーがナイルブルー硫酸水素塩である場合、上記の血小板測定用試薬は酸を含まないことも可能である。ナイルブルーとしてナイルブルー硫酸水素塩を用いる場合、酸を加えなくても、時間経過に伴う血小板測定用試薬中のナイルブルーの有効色素成分濃度の低下をより効果的に抑制でき、血小板測定用試薬の保存安定性を向上させることができる。【００１８】
上記の２つの態様の本発明の血小板測定用試薬において、保存安定性を向上できる要因としては、次のような２つの仮説が考えられる。
（１）ナイルブルーは、硫酸水素塩の形の場合に安定性が高いと考えられる。
ナイルブルー硫酸塩の場合は、酸を添加することにより、酸が解離して生じるプロトン（Ｈ+）がナイルブルー硫酸塩のＳＯ42-とＨＳＯ4-を形成し、ＨＳＯ4-とナイルブルーとのバランスが１：１になって安定化できる。
ナイルブルーが上記以外の塩である場合は、硫酸を添加することにより、硫酸から生じるＨＳＯ4-がナイルブルーを安定化できると考えられる。
よって、本発明の血小板測定用試薬は、硫酸水素イオンが存在することとなるように、ナイルブルーと必要に応じて酸とを含む血小板測定用試薬でもあり得る。【００１９】
（２）ナイルブルーの構造は、ジエチルアミノ基、アミノ基及びフェノキサジン構造中の窒素の３箇所に窒素原子を有する。これらの窒素原子のうち、上記のＸ-で表されるカウンターアニオンと塩を形成する窒素原子以外の窒素原子が酸付加塩を形成することにより、窒素原子の安定性が向上し、色素の溶解性がより向上して、血小板測定用試薬の安定性が向上すると考えられる。
すなわち、ナイルブルー硫酸水素塩の場合は、カウンターアニオンである硫酸水素イオン（ＨＳＯ4-）が解離してプロトン（Ｈ+）と硫酸イオン（ＳＯ42-）を生じ得る。このプロトンが、ナイルブルーのいずれかの窒素原子と結合してプロトン性窒素原子を生じ得る。このプロトン性窒素原子が、硫酸イオンを介して分子間塩を形成することにより、色素の溶解性が向上して、安定性が向上し得ると考えられる。
また、硫酸水素塩以外のナイルブルーに酸を添加すると、酸が解離して生じるプロトン及びアニオンが、ナイルブルーの分子間塩の形成に寄与でき、色素の溶解性及び安定性を向上できると考えられる。
よって、本発明の血小板測定用試薬は、ナイルブルーが分子間塩を形成できるようにナイルブルーと必要に応じて酸とを含む血小板測定用試薬でもあり得る。【００２０】
本発明の血小板測定用試薬は、水溶性有機溶媒をさらに含むことが好ましい。水溶性有機溶媒としては、上記のナイルブルーを溶解できるものであれば特に限定されず、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのプロトン性溶媒が挙げられる。【００２１】
本発明の血小板測定用試薬は、上記のナイルブルー及び場合により酸を、上記の所望の濃度になるように上記の水溶性有機溶媒に溶解することにより製造できる。【００２２】
＜血小板測定用試薬キット＞
上記の血小板測定用試薬は、色素を含む血小板測定用試薬を希釈するための緩衝剤を含有する試薬と組み合わせて、試薬キットとすることができる。
すなわち、ナイルブルー硫酸水素塩、又はナイルブルー及び酸を含む第１の試薬（以下、「色素試薬」ということがある）と、緩衝剤を含む第２の試薬（以下、「希釈試薬」ということがある）とを含む血小板測定用試薬キットも、本発明の一つである。【００２３】
上記の第１の試薬については、上記の血小板測定用試薬について述べたことと同じである。【００２４】
第２の試薬に含まれる緩衝剤は、第２の試薬のｐＨを所望の範囲に保つことができるものであれば特に限定されないが、カルボン酸塩類、リン酸塩、グッドバッファー、タウリン、トリエタノールアミンなどを所望のｐＨに応じて用いることができる。緩衝剤は、希釈試薬のｐＨが６．０〜１１．０の範囲となるように希釈試薬中に含まれていることが好ましく、より好ましくは７．０〜１０．０、さらに好ましくは８．０〜９．５である。希釈試薬のｐＨを６．０以上とすることにより、希釈試薬と検体とが混合された際に赤血球が溶血しにくくなり、夾雑物である破砕赤血球を低減させることが可能となり、また、ｐＨを１１．０以下とすることにより、破砕赤血球の非特異的染色を低減させることが可能となる。
上記の第２の試薬は、よって、ｐＨ６．０〜１１．０の緩衝液であることが好ましい。【００２５】
上記の希釈試薬は、上記の緩衝剤の他に、浸透圧補償剤、ナイルブルーによる血小板の染色を促進するための染色促進剤などの成分をさらに含み得る。【００２６】
浸透圧補償剤は、希釈試薬の浸透圧を適切な範囲に保つための化合物であればよく、例えばプロピオン酸などの有機酸のアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの糖類を挙げることができる。また、ＮａＣｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物やアルカリ土類金属ハロゲン化物も用いることができる。上記の浸透圧補償剤は、１種又は２種以上を用いることができる。
浸透圧補償剤は、希釈試薬の浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整するように希釈試薬に含まれていることが好ましく、より好ましくは２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。このような範囲の浸透圧とすることにより、試薬キットの各試薬と検体とが混合されたときの浸透圧を生理的浸透圧に近づけることができ、赤血球の低張溶血などを防ぐことができるため、破砕赤血球の増加が抑制され、より精度よく血小板を測定することができる。なお、上記の緩衝剤を用いて希釈試薬の浸透圧を上記の範囲に調整できる場合には、浸透圧補償剤は用いなくてもよい。【００２７】
上記の染色促進剤は、ナイルブルーの血小板への透過性を促進することができる化合物であればよく、界面活性剤、特にカチオン界面活性剤が好ましい。
好ましいカチオン界面活性剤は、以下の式（Ｉ）：
【化２】
2009104598.tif 000003
（式中、Ｒ11は炭素数８〜１２のアルキル基であり；Ｒ12、Ｒ13及びＲ14は同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基であり；Ｙ-はアニオンである）
で表されるものである。【００２８】
上記の式（Ｉ）において、Ｒ11としての炭素数８〜１２のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばオクチル基、デシル基、ラウリル基、セチル基、ミリスチル基などが挙げられる。
Ｒ12、Ｒ13又はＲ14としての炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル及びヘキシル基が挙げられる。なかでも、メチル又はエチル基が好ましい。
Ｙ-のアニオンとしては、臭素イオン又は塩素イオンが好ましい。【００２９】
上記の式（Ｉ）の好ましいカチオン界面活性剤は、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＭＴＡＢ）などが挙げられる。これらのカチオン界面活性剤は、１種又は２種以上を用いてもよい。【００３０】
上記のカチオン界面活性剤は、５０〜２００００ｐｐｍの濃度で希釈試薬に含まれていることが好ましく、特に好ましい濃度は、カチオン界面活性剤の種類により異なるが、例えば、ＤＴＡＢを用いる場合の濃度は、５００〜３０００ｐｐｍ程度、ＬＴＡＣを用いる場合の濃度は１００〜５００ｐｐｍ程度が好ましい。カチオン界面活性剤がこのような濃度で希釈試薬に含まれていることにより、血小板測定用試薬キットの各試薬と検体とを混合したときに、赤血球の溶血を引き起こすことなく、好適に血小板の染色を促進することができる。【００３１】
さらに、上記の希釈試薬は、上記の成分以外に、例えば、２−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウム、β−フェネチルアルコールなどの防腐剤を含んでいてもよい。【００３２】
上記の希釈試薬に含まれる緩衝剤及び該希釈試薬に含まれ得る任意の成分は、色素試薬に予め混合することもできるが、色素試薬に含まれるナイルブルーは、水やアルカリ成分によって劣化することがあるため、色素試薬と希釈試薬とを別々の試薬として含む上記の試薬キットが、保存安定性上好ましい。【００３３】
本実施形態による血小板測定用試薬キットは、図１に示すように、色素試薬を収容するための第１の容器Ａと、希釈試薬を収容するための第２の容器Ｂとに収容され得る。このように、色素試薬と希釈試薬とが別々の容器に収容されることにより、色素試薬に含まれるナイルブルーが、希釈試薬に含まれる水やアルカリ成分によって劣化することがなく、保存安定性に優れた血小板測定用試薬キットを提供することができる。【００３４】
＜血小板測定方法＞
上記の血小板測定用試薬又は血小板測定用試薬キットは、血小板を含み得る検体と混合することにより、該血小板を染色できる。
よって、本発明は、上記の血小板測定用試薬又は血小板測定用試薬キットを用いる血小板測定方法をさらに提供する。【００３５】
本発明の測定方法は、
ナイルブルー硫酸水素塩、又はナイルブルー及び酸を含有する第１の試薬と、検体とを混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む。【００３６】
上記の測定方法において、第１の試薬と検体とを混合するステップにおいて、緩衝剤を含む第２の試薬をさらに混合するか又はしなくてよいが、好ましくは、該第２の試薬がさらに混合される。
上記の第１の試薬及び第２の試薬については、上記の血小板測定用試薬キットについて述べたことと同じである。【００３７】
上記の検体は、生体、特にヒトを含む哺乳動物から採取した血液（全血、多血小板血漿（ＰＲＰ）など）、及び骨髄液を含む。検体は、これらの血液又は骨髄液を緩衝液などの適当な溶液で希釈したものであってもよい。【００３８】
上記の第１の試薬と検体とは、混合したときに、測定用試料中のナイルブルーの濃度が０．０５〜５．０ｐｐｍ、好ましくは０．１〜０．６ｐｐｍ、さらに好ましくは０．２〜０．５ｐｐｍとなるように混合することが好ましい。【００３９】
上記の第１の試薬は、検体と混合して得られる測定用試料中のナイルブルーの濃度を上記のものとするために、第２の試薬で希釈されていてもよい。
よって、第２の試薬を用いる場合、上記の第１の試薬及び第２の試薬と、検体とは、第１の試薬＋第２の試薬：検体＝１００：１〜１０００：１の容量比で混合することが好ましい。
また、第２の試薬を用いる場合、第１の試薬と第２の試薬との容量比は、１：１０〜１：１００が好ましく、より好ましくは１：２０〜１：７５である。
上記の混合するステップにおいて、第２の試薬を加える場合、第１の試薬、第２の試薬及び検体の混合順序は、特に限定されない。【００４０】
上記の混合するステップは、２５〜５０℃程度、より好ましくは３５〜４５℃程度の温度で行うことが好ましい。また、混合は、１０秒〜５分程度、より好ましくは１０秒〜２分程度、さらに好ましくは１０秒〜６０秒程度の時間行うことが好ましい。【００４１】
本発明の測定方法においては、次いで、上記のようにして得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出する。
光を照射するための装置としては、フローサイトメータが好ましい。フローサイトメータを用いる場合、該測定用試料は、フローサイトメータのフローセルに導入され、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に光が照射されることとなる。
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、ナイルブルーの励起に好適な波長（例えば６００〜６８０ｎｍ付近）の光源を用いることができる。光源としては、例えば、赤半導体レーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが挙げられる。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。【００４２】
上記のようなフローサイトメータにおいて光を照射することにより細胞から発せられる散乱光は、前方散乱光（受光角度０〜２０°付近）又は側方散乱光（受光角度９０°付近）のいずれでもよい。また、前方散乱光としては、前方低角散乱光（受光角度１〜５°付近）又は前方高角散乱光（受光角度６〜２０°付近）のいずれでもよい。【００４３】
上記のようなフローサイトメータにおいて光を照射することにより細胞から発せられる蛍光については、ナイルブルーに適当な受光波長（６３０〜６８０ｎｍ程度）を選択することができる。【００４４】
上記のようにして得られた散乱光及び蛍光に基づいて、スキャッタグラムを作成することにより、血小板と、その他の血球成分及び脂肪粒子などの夾雑物とを区別して、血小板を検出することができる。このようにして検出された血小板を計数することもできる。血小板の検出及び／又は計数には、適切な解析用ソフトウェアを用いることが好ましい。【００４５】
以下に、図面を参照して、フローサイトメータを備えた試料分析装置を用いる血小板の測定について説明する。
図２は、試料分析装置の概略構成を示す正面図である。この試料分析装置１は、例えば血液検査に使用される装置であり、図２に示すように、測定ユニット２と、データ処理ユニット３とによって主として構成されていて、測定ユニット２によって血液検体中に含まれる成分について所定の測定を行い、この測定データをデータ処理ユニット３で受信して分析処理を行うようになっている。【００４６】
図３は、試料分析装置１の概略構成を示すブロック図である。図３に示すように、測定ユニット２は、各部の動作を制御するための制御部４と、試料中の被検粒子を検出するためのフローサイトメータを備えた検出部５と、測定用試料を調製し、調製された測定用試料を検出部５に供給するための試料調製部６と、データ処理ユニット３とデータの送受信を行うためのインターフェース７とを備えている。データ処理ユニット３は、各部の動作を制御するための制御部８と、測定ユニット２から受信した検出データを分析するためのデータ分析部９と、データ分析部９による分析結果をスキャッタグラムとして表示する表示部１０と、オペレータからの操作を受け付ける操作部１１と、測定ユニット２とデータの送受信を行うためのインターフェース１２とを備えている。【００４７】
次に、フローサイトメータを備えた検出部５の構成について、図４を参照して説明する。図４は、検出部の構成を示す概略平面図である。検出部５には、半導体レーザ光源５２が、フローセル５１へ向けてレーザ光を出射するように配置されている。半導体レーザ光源５２とフローセル５１との間には、複数のレンズからなる照射レンズ系５３が配されている。半導体レーザ光源５２から直線的に延びた光軸上には、フローセル５１を挟んで照射レンズ系５３に対向するように、ビームストッパ５４ａが設けられており、半導体レーザ光源５２からの直接光はビームストッパ５４ａによって遮光される。また、ビームストッパ５４ａの更に光軸下流側には、フォトダイオード５４が配されている。【００４８】
フローセル５１に測定用試料が流れると、レーザ光により散乱光及び蛍光の光信号が発生する。このうち前方の信号光が前記フォトダイオード５４へ向けて照射される。半導体レーザ光源５２から直線的に延びた光軸に沿って進行する光のうち、半導体レーザ光源５２の直接光はビームストッパ５４ａによって遮断され、フォトダイオード５４には概ね前記光軸方向に沿って進行する散乱光（以下、前方散乱光という）のみが入射する。フローセル５１から発せられた前方散乱光は、フォトダイオード５４で光電変換され、これによって生じた電気信号（以下、前方散乱光信号という）がアンプ５４ｂによって増幅される。そして、前方散乱光信号は、制御部４に出力されたのち、インターフェース７を介してデータ処理ユニット３に出力されて、データ処理ユニット３のデータ分析部９において信号処理される。
かかる前方散乱光信号は、被検粒子の大きさを反映しており、データ分析部９がこの前方散乱光信号を信号処理することによって、被検粒子の大きさ等を得るようになっている。【００４９】
また、半導体レーザ光源５２からフォトダイオード５４へ直線的に延びる光軸に対して直交する方向には、側方集光レンズ５５が配されており、フローセル５１内を通過する被検粒子に半導体レーザを照射したときに発生する側方光（前記光軸に対して交差する方向へ出射される光）がこの側方集光レンズ５５で集められるようになっている。側方集光レンズ５５の側方光の進行方向について下流側にはダイクロイックミラー５６が設けられており、側方集光レンズ５５から送られた信号光は、ダイクロイックミラー５６で散乱光成分と蛍光成分とに分けられる。ダイクロイックミラー５６の側方（側方集光レンズ５５とダイクロイックミラー５６とを結ぶ光軸方向に交差する方向）には、側方散乱光受光用のフォトダイオード５７が設けられており、ダイクロイックミラー５６の前記光軸下流側には、光学フィルタ５８ａ及びフォトマルチプライヤ５８が設けられている。そして、ダイクロイックミラー５６で分けられた側方散乱光成分は、フォトダイオード５７で光電変換され、これによって生じた電気信号（以下、側方散乱光信号という）がアンプ５７ａによって増幅される。側方散乱光信号は、制御部４に出力されたのち、インターフェース７を介してデータ処理ユニット３に出力され、データ処理ユニット３のデータ分析部９において信号処理される。
この側方散乱光信号は、被検粒子の内部情報（例えば白血球の核の大きさ等）を反映しており、データ分析部９がこの側方散乱光信号を信号処理することによって、白血球の核の大きさ等を得るようになっている。【００５０】
また、ダイクロイックミラー５６から発せられた側方蛍光成分は光学フィルタ５８ａによって波長選択された後、フォトマルチプライヤ５８で光電変換され、これによって生じた電気信号（側方蛍光信号）がアンプ５８ｂによって増幅される。側方蛍光信号は、制御部４に出力されたのち、インターフェースを介してデータ処理ユニット３に出力され、データ処理ユニット３のデータ分析部９において信号処理される。
この側方蛍光信号は、被検粒子の染色度合いに関する情報を反映しており、データ分析部９がこの側方蛍光信号を信号処理することによって、被検粒子の染色性等を得るようになっている。【００５１】
データ処理ユニット３のデータ分析部９は、上記のようにして得られた前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号を分析して被検粒子を検出し、さらに検出された被検粒子の計数を行うことができる。さらにデータ分析部９は、前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号の分析結果に基づいてスキャッタグラムを作成する。作成されたスキャッタグラムは表示部１０に表示される。【００５２】
このような試料分析装置を用いて、血小板を測定することができる。
まず、試料調製部６において、検体と血小板測定用試薬、あるいは検体と血小板測定用試薬キットに含まれる各試薬とが混合されて、測定用試料が調製される。ここで使用される血小板測定用試薬又は血小板測定用試薬キットとして上記の血小板測定用試薬、又は血小板測定用試薬キットを使用することができる。上記の血小板測定用試薬又は血小板測定用試薬キットの色素試薬には、ナイルブルーが含まれており、このナイルブルーが、検体に含まれる血小板を染色する。
試料調製部６は、測定用試料中のナイルブルーの濃度が０．０５〜５．０ｐｐｍ（０．０００１４〜０．０１４ｍｍｏｌ／Ｌ）、好ましくは０．１〜０．６ｐｐｍ、さらに好ましくは０．２〜０．５ｐｐｍとなるように、検体と上記血小板測定用試薬又は上記血小板測定用試薬キットに含まれる各試薬とを混合して、測定用試料を調製することが好ましい。測定用試料を調製する際の反応温度及び反応時間は、血小板測定用試薬の説明において記載した反応温度及び反応時間が好ましい。【００５３】
次に、試料調製部６において調製された測定用試料は、試料調製部６から検出部５に供給される。検出部５において、測定用試料はフローサイトメータのフローセル５１に導入され、半導体レーザ光源５２によって測定用試料中の被検粒子にレーザ光が照射される。レーザ光を照射して得られた被検粒子の前方散乱光信号、側方散乱光信号及び蛍光信号は、データ処理ユニット３のデータ分析部９において信号処理される。【００５４】
データ分析部９は、測定用試料中の血小板を、検体に含まれる破砕赤血球や脂肪粒子のような他の成分から、前方散乱光信号及び蛍光信号に基づいて明確に区別して検出することができる。データ分析部９は、このようにして検出された血小板を計数することもできる。このように前方散乱光信号及び蛍光信号に基づいて血小板を検出及び計数するために、データ分析部９の信号処理に適切な解析用ソフトウェアを使用することが好ましい。
なお、ここでは前方散乱光信号と蛍光信号とに基づいて血小板を検出する構成を示したが、このような構成に限らず、例えば側方散乱光信号と蛍光信号とに基づいて血小板を検出する構成であってもよい。
【実施例】
【００５５】
本発明を、以下の実施例に従ってより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実験例１〜８  ナイルブルー硫酸水素塩を含む血小板測定用試薬の保存安定性
ここでは、色素試薬の保存安定性を検証するため、表１に記載のナイルブルーを、表１に記載の濃度になるよう含有させた血小板測定用試薬（色素試薬）を調製し、色素試薬中のナイルブルーの有効色素成分濃度を反映するパラメータである吸光度を測定して、色素試薬中のナイルブルーの保存安定性を評価した。
血小板測定用試薬
色素                                                      以下に記載の濃度
エチレングリコール                                        ５ｍＬ【００５６】
【表１】
2009104598.tif 000004
【００５７】
得られた色素試薬をエタノールで１０倍に希釈し、分光光度計を用いて色素の吸光スペクトルが最大となる６３０ｎｍにおける各色素試薬の吸光度を測定した。なお、吸光度の測定はエタノールを対照として行った。さらに、この希釈した試薬を４５℃で保存し、希釈後２ヶ月目、４ヶ月目及び７ヶ月目における吸光度を測定し、その変化率を求めた。吸光度測定の結果を表２−１に、吸光度変化率を表２−２に示す。
なお、「吸光度変化率」とは、当該実験例から得られた複数の吸光度の測定値のうち、最も測定値の高いものを基準値として、吸光度の変化の割合をパーセンテージで表したものである。【００５８】
【表２−１】
2009104598.tif 000005
【００５９】
【表２−２】
2009104598.tif 000006
【００６０】
表２−２に示されるとおり、色素としてナイルブルー硫酸水素塩を用いた実験例１の色素試薬の吸光度低下は、２ヶ月目において２．５％、４ヶ月目において５．０％、７ヶ月目において６．９％であった。同じく色素としてナイルブルー硫酸水素塩を用いた実験例２の色素試薬の吸光度低下は、２ヶ月目において３．５％、４ヶ月目において６．９％、７ヶ月目において１６．９％であった。
一方、カウンターイオンが硫酸水素イオンでないナイルブルーを用いた実験例３〜８の色素試薬は、２ヶ月目において１０％以上、４ヶ月目において２０％以上、７ヶ月目において３０％以上も吸光度が低下していた。
これら実験例３〜８との対比によっても明らかなように、カウンターイオンが硫酸水素イオンであるナイルブルーを用いた実験例１及び２の色素試薬は、カウンターイオンが硫酸水素イオンでないナイルブルーを用いた色素試薬に比べ、時間経過に伴う吸光度の低下が小さく、保存安定性に優れていることがわかる。【００６１】
実験例９〜１３  ナイルブルー硫酸水素塩を含有する血小板測定用試薬の血小板染色性
ここでは、ナイルブルー硫酸水素塩を含有する血小板測定用試薬による血小板の染色性を検証するために、以下の実験を行った。
まず、次の組成からなる色素試薬と、希釈試薬とからなる試薬キットを製造した。
（１）色素試薬
血小板を染色するための色素                              以下に記載の濃度
エチレングリコール                                      １Ｌ
（２）希釈試薬
トリシン（緩衝剤）                                          １．８ｇ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）          ０．１５ｇ
精製水                                                      １Ｌ
（ｐＨ９．０、浸透圧２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏに調整）【００６２】
上記血小板を測定するための色素として、表３に示した色素を、それぞれ表３に示した濃度で用いた。なお、括弧内には、試薬と検体とが混合されたときの最終の濃度を示した。
これらの色素の化学式は、表３に示すとおりである。
上記の希釈試薬１ｍＬをチューブに分注して４０℃の水槽で加温し、さらにこの希釈試薬に、得られた色素試薬２０μＬ及び検体として健康なヒトの全血５μＬを添加し、４０℃で２５秒間反応させて測定用試料を調製した。この測定用試料を、６３３ｎｍ波長の光を発する光源を有するフローサイトメータの検出部に導入し、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、該細胞から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出して、得られた信号を解析して測定用試料中の血小板を測定した。これら測定用試料の調製、並びにフローサイトメータによる血小板測定には、血液分析装置ＸＥ−２１００（シスメックス社製）を用いた。なお、上記血液分析装置は、光源の出力を通常の３Ｗから９Ｗに変更した改造機を用いた。【００６３】
【表３】
2009104598.tif 000007
【００６４】
実験例９〜１３により得られたスキャッタグラムを、それぞれ図５〜図９に示す。なお、各図（ａ）は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったスキャッタグラムであり、各図（ｂ）は、各図（ａ）に示されるスキャッタグラムの縦軸をlogに変換したものである。各図（ｂ）において、血小板が出現する領域を実線で示した。各実験例の測定結果は表３に示したとおりである。【００６５】
図５〜図９からも明らかなように、血小板を染色するための色素としてナイルブルー硫酸水素塩を用いた実験例９及び１０は、ナイルブルーでない他の色素を用いた実験例１１〜１３に比べ、血小板がよく染色されるので、蛍光強度が強い範囲で血小板が検出できることがわかる。
よって、血小板を染色するための色素としてナイルブルー硫酸水素塩を用いることにより、他の血球成分とより良好に区別して血小板を測定できる。【００６６】
次に、血液中に脂質粒子などの夾雑物が存在する場合であっても、ナイルブルー硫酸水素塩を用いた実験例９及び１０の色素試薬を用いることにより、血小板を特異的に染色できるか否かを検証した。
実験例９及び１０の色素試薬を使用して、破砕赤血球含有血液及び脂質粒子含有血液の血小板測定を行った。なお、実験方法は、健康なヒトの全血に代えて、破砕赤血球含有血液及び脂質粒子含有血液を使用した点を除いては上記と同様であるため、詳細な説明は省略する。【００６７】
実験例９の色素を用いて破砕赤血球含有血液、脂質粒子含有血液を測定して得られたスキャッタグラムをそれぞれ図１０、図１１に示す。実験例１０の色素を用いて破砕赤血球含有血液、脂質粒子含有血液を測定して得られたスキャッタグラムをそれぞれ図１２、図１３に示す。なお、各図（ａ）は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったスキャッタグラムであり、各図（ｂ）は、各図（ａ）に示されるスキャッタグラムの縦軸をlogに変換したものであり、各図（ｃ）は、各図（ｂ）の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。各図（ｃ）において、血小板が出現する領域を実線で示した。【００６８】
図１０〜１３の結果から、実験例９及び１０の色素試薬は、血液中の破砕赤血球や脂質粒子などの夾雑物と明確に区別して、血小板を特異的に染色できていることがわかる。よって、血小板を染色するための色素としてナイルブルー硫酸水素塩血小板を用いることにより、血液中に破砕赤血球や脂質粒子などの夾雑物が存在する場合であっても、他の血球成分とより良好に区別して血小板を測定できる。【００６９】
実験例１及び２より、ナイルブルー硫酸水素塩を用いた色素試薬は、時間の経過に伴う吸光度の低下が小さく、保存安定性に優れていることがいえる。また、実験例９及び１０より、血小板を染色するための色素としてのナイルブルー硫酸水素塩は、血液中の血小板を特異的に染色することができ、破砕赤血球や脂質粒子などの夾雑物が存在する血液であっても、正確な血小板測定を可能とする色素であることがいえる。【００７０】
実験例１４〜２４  種々の濃度のナイルブルー硫酸水素塩を含む血小板測定用試薬の血小板染色性
ナイルブルー硫酸水素塩（メルク社製）の色素試薬を、以下の表４に記載する濃度でエチレングリコール中に調製した。
得られた色素試薬を、実験例９〜１３に記載したような希釈試薬と組み合わせて用いて、健常なヒトの全血、破砕赤血球含有血液及び脂質粒子含有血液を検体として用いて、実験例９〜１３と同様にして血小板を測定した。【００７１】
【表４】
2009104598.tif 000008
【００７２】
得られたスキャッタグラムを、図１４に示す。
図１４の結果から、試験した全ての濃度範囲において、ナイルブルー硫酸水素塩を用いて良好に血小板の測定を行うことができたことがわかる。
なかでも、破砕赤血球含有血液を検体として用いた場合に、実験例１７〜２２の血小板測定用試薬（ナイルブルー硫酸水素塩の最終濃度：0.24〜0.44mg/L）を用いて測定すると、血小板と他の血球成分及び夾雑物との分離がより明確であることがわかる。【００７３】
実験例２５  ナイルブルー硫酸水素塩を含む血小板測定用試薬の保存安定性
ナイルブルー硫酸水素塩（メルク社製）の色素試薬を、１４．４ｐｐｍ濃度となるようにエチレングリコール中に調製した。この色素試薬を４５℃の温度条件下で１６週間保存し、保存後の色素試薬を使用して検体を測定した。【００７４】
検体は、健常人から採取された血液、低値血小板血液、人工脂質含有血液、及び破砕赤血球含有血液を用い、実験例９〜１３に記載したようにして血小板を測定した。【００７５】
得られたスキャッタグラムを、図１５に示す。
図１５のスキャッタグラムから明らかなように、いずれの検体においても、夾雑物と明確に区別して血小板を染色できていることがわかる。
この結果から、血小板を染色するための色素としてナイルブルー硫酸水素塩を用いることにより、色素にとって不利な条件下で長期間保存した場合であっても、夾雑物の影響を抑えて血小板を精度よく測定できることが示された。【００７６】
上記の条件下における保存による色素濃度の変化を検討するため、次の実験を行った。
色素試薬の調製直後、及び保存後１６週目における色素試薬をエタノールで１０倍に希釈し、６２８ｎｍにおける吸光度を測定した以外は、実験例１〜８と同様にして吸光度を測定した。さらに、測定された吸光度の低下率に基づいて、保存後１６週目における色素試薬中の色素の濃度を求めた。これらの結果を以下の表５に示す。【００７７】
【表５】
2009104598.tif 000009
【００７８】
表５に示したとおり、保存後１６週目における色素原液の色素濃度は１３．１ｐｐｍと換算された。よって、上記の条件下で保存した後であっても、血小板を測定するための好ましい色素濃度を維持できることがわかる。【００７９】
実験例２６〜２９  ナイルブルーと酸とを含有する血小板測定用試薬の保存安定性
ここでは、ナイルブルーを溶解した溶液（ナイルブルー溶液）に塩酸、又は水酸化ナトリウムを含有させた場合のナイルブルー溶液の保存安定性を調べる実験を行った。ナイルブルー溶液の保存安定性は、溶液中のナイルブルーの有効色素成分濃度を反映するパラメータである吸光度を測定することによって評価した。
なお、以下の説明において「吸光度変化率」とは、当該実験例から得られた複数の吸光度の測定値のうち、最も測定値の高いものを基準値として、吸光度の変化の割合をパーセンテージで示したものである。「初期吸光度」とは、当該実験例に係る色素試薬の調製直後の吸光度の測定値である。【００８０】
本実験例においては、カウンターイオンが硫酸イオンであるナイルブルー（ナイルブルーＡ、シグマ社製）を使用した。このナイルブルーを、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるようエチレングリコールに溶解させ、ナイルブルー溶液を調製した（比較例１）。
さらに、このナイルブルー溶液５ｍＬに、以下に記載の物質を、以下に記載の濃度となるよう含有させ、実験例２６〜２９とした。
実験例
２６    塩酸                ２ｍｍｏｌ／Ｌ
２７    塩酸                ０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ
２８    水酸化ナトリウム    ２ｍｍｏｌ／Ｌ
２９    水酸化ナトリウム    ０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ【００８１】
各溶液をエタノールで５倍に希釈し、分光光度計を用いて色素の吸光スペクトルが最大となる６３０ｎｍにおける各溶液の吸光度を測定した。さらに、この希釈溶液を６０℃の温度負荷の条件下で保存し、希釈後２週目及び４週目における吸光度を測定し、その吸光度変化率を求めた。なお、吸光度の測定はエタノールを対照とした。吸光度測定の結果を表６−１に、吸光度変化率を表６−２に示す。【００８２】
【表６−１】
2009104598.tif 000010
【００８３】
【表６−２】
2009104598.tif 000011
【００８４】
表６−１に示されるとおり、塩酸又は水酸化ナトリウムを添加していない比較例１の初期吸光度は０．５１５８であった。また、比較例１の吸光度変化率は、表６−２に示されるとおり調製後２週間で−２．４％、調製後４週間で−１６．５％であった。【００８５】
塩酸を含有している実験例２６及び２７の初期吸光度についてみると、表６−１にも示されているように、実験例２６の初期吸光度は０．５３８８、実験例２７の初期吸光度は０．５３１９であり、比較例１の初期吸光度との間に大きな差は認められなかった。
吸光度変化率についてみると、表６−２に示されるとおり、２ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の塩酸を含有している実験例２６の吸光度変化率は、２週目において−８５．２％、４週目において−９９．０％であり、比較例１に比べて、時間の経過に伴う吸光度の低下が顕著になっている。つまり、ナイルブルー溶液の保存安定性が低下していることがわかる。
一方、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の塩酸を含有している実験例２７の吸光度変化率は、２週目において−０．６％、４週目において−１０．９％であり、比較例１に比べて、時間の経過に伴う吸光度の低下が緩やかになっていることがわかる。つまり、ナイルブルー溶液の保存安定性が向上していることがわかる。【００８６】
水酸化ナトリウムを添加した実験例２８及び２９の初期吸光度についてみると、表６−１に示されるように、実験例２８の初期吸光度は０．００６５、実験例２９の初期吸光度は０．４９４８であり、いずれも比較例１に比べて初期吸光度が低下している。
さらに吸光度変化率についてみると、表６−２に示されるように、実験例２８及び２９の吸光度変化率は、いずれも調製後４週目において−２０％以下であり、比較例１に比べて、時間の経過に伴う吸光度の低下が顕著になっていることがわかる。つまりナイルブルー溶液の保存安定性が低下していることがわかる。【００８７】
これらの実験結果から、ナイルブルー溶液に塩酸を所定の濃度で添加することにより、ナイルブルー溶液の保存安定性が向上することが示唆された。【００８８】
実験例３０〜３６  血小板測定用試薬の保存安定性に対するナイルブルーと塩酸のモル濃度比の影響
上記実験例２６〜２９から、塩酸を所定の濃度で添加することにより、ナイルブルー溶液の保存安定性が向上することがわかった。
ここで、ナイルブルー溶液の保存安定性、すなわちナイルブルーの有効色素成分濃度の低下は、溶液中のナイルブルーの有効色素成分の分解によるものと考えられるため、溶液に添加される塩酸の濃度は、ナイルブルーの分子数との関係で検討されるべきである。
そこで、本実験例においては、ナイルブルー溶液中の塩酸とナイルブルーとの比（モル濃度比）を種々変更し、ナイルブルーと塩酸との比（モル濃度比）とナイルブルー溶液の保存安定性との関係を調べた。
なお、ナイルブルー溶液の保存安定性は、実験例２６〜２９と同様に、ナイルブルー溶液の吸光度を評価することにより行った。【００８９】
上記実験例２６〜２９と同様に、ナイルブルーＡ（シグマ社製）を、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるようエチレングリコールに溶解させ、ナイルブルー溶液を調製した（比較例２）。
さらに、このナイルブルー溶液５ｍＬに、塩酸を以下に記載の濃度となるよう含有させ、実験例３０〜３６とした。なお、カッコ内は溶液中のナイルブルーと塩酸のモル濃度比を示している。
実験例
３０    塩酸    ０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ  （１０：１）
３１    塩酸    ０．００６ｍｍｏｌ／Ｌ  （３：１）
３２    塩酸    ０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：１）
３３    塩酸    ０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：３）
３４    塩酸    ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：１０）
３５    塩酸    ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：３０）
３６    塩酸    ２ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：１００）
得られた色素溶液をエタノールで２０倍に希釈し、分光光度計を用いて色素の吸光スペクトルが最大となる６３０ｎｍにおける各色素溶液の吸光度を測定した。さらに、この色素溶液を４５℃の温度負荷の条件下で保存し、調製後４週目、９週目及び１８週目における吸光度を測定し、その吸光度変化率を求めた。なお、吸光度の測定はエタノールを対照とした。
吸光度測定の結果を表７−１に、吸光度変化率を表７−２に示す。【００９０】
【表７−１】
2009104598.tif 000012
【００９１】
【表７−２】
2009104598.tif 000013
【００９２】
表７−１に示されるように、塩酸を加えていない比較例２の初期吸光度は０．１３４２であった。また比較例２の吸光度変化率は、表７−２に示されるように、調製後４週目において−１０．０％、調製後９週目において−１２．５％、調製後１８週目において−２６．５％であった。【００９３】
実験例３０〜３６の初期吸光度についてみると、表７−１に示されるように、実験例３０〜３６のいずれも比較例２との間に大きな差は認められなかった。
次に、吸光度変化率についてみると、ナイルブルーと塩酸とのモル濃度比が１０：１である実験例３０の吸光度変化率は、調製後４週目において−９．０％、調製後９週目において−１０．５％、調製後１８週目において−２３．２％であった。
ナイルブルーと塩酸とのモル濃度比が３：１である実験例３１の吸光度変化率は、調製後４週目において−６．９％、調製後９週目において−９．３％、調製後１８週目において−２０．９％であった。
ナイルブルーと塩酸とのモル濃度比が１：１である実験例３２の吸光度変化率は、調製後４週目において−５．６％、調製後９週目において−５．２％、調製後１８週目において−１６．８％であった。【００９４】
比較例２との対比によっても明らかなように、塩酸のモル濃度がナイルブルーのモル濃度以下である実験例３０〜３２の吸光度の低下は、調製後４週目、９週目、１８週目のいずれの時点においても、塩酸を含有していない比較例２に比べて緩やかになっている。つまりナイルブルー溶液の保存安定性が向上している。
特に、ナイルブルーと塩酸とのモル濃度比が１：１である実験例３２は、他の実験例に比べて、良好な保存安定性が得られた。【００９５】
実験例３７〜４４  ナイルブルーと硫酸とを含有する血小板測定用試薬の保存安定性
次に、塩酸に代えてナイルブルー溶液に硫酸を含有させ、ナイルブルー溶液の保存安定性を検討した。【００９６】
上記実験例２６〜３６と同様に、ナイルブルーＡ（シグマ社製）を、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるようエチレングリコールに溶解させ、ナイルブルー溶液を調製した（比較例３）。
このナイルブルー溶液５ｍＬに、硫酸を以下に記載の濃度で含有させ、実験例３７〜４０とした。なお、カッコ内は溶液中のナイルブルーと硫酸のモル濃度比を示している。
実験例
３７  硫酸    ０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ  （４：１）
３８  硫酸    ０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ  （２：１）
３９  硫酸    ０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：１）
４０  硫酸    ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：２．５）【００９７】
実験例３７〜４０において使用したナイルブルーＡ（シグマ社製）に代えて、カウンターイオンが硫酸イオンであるナイルブルーＡ（ナカライテスク社製）を用いてナイルブルー溶液を調製した（比較例４）。
このナイルブルー溶液５ｍＬに、硫酸を以下に記載の濃度で含有させ、実験例４１〜４４とした。なお、カッコ内は溶液中のナイルブルーと硫酸のモル濃度比を示している。
実験例
４１  硫酸    ０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ  （４：１）
４２  硫酸    ０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ  （２：１）
４３  硫酸    ０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：１）
４４  硫酸    ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ  （１：２．５）【００９８】
実験例３７〜４４の溶液の調製直後の吸光度を測定した。さらに、各溶液を４５℃の温度負荷の条件下で保存し、調製後１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、４ヶ月目における吸光度を測定し、その吸光度変化率を求めた。
実験例３７〜４０によって得られた吸光度測定の結果を表８−１に、吸光度変化率を表８−２に示す。
実験例４１〜４４によって得られた吸光度測定の結果を表９−１に、吸光度変化率を表９−２に示す。【００９９】
【表８−１】
2009104598.tif 000014
【０１００】
【表８−２】
2009104598.tif 000015
【０１０１】
【表９−１】
2009104598.tif 000016
【０１０２】
【表９−２】
2009104598.tif 000017
【０１０３】
表８−２からも明らかなように、ナイルブルーのモル濃度以下の濃度で硫酸を含有する実験例３７〜３９は、硫酸を含有しない比較例３に比べて、いずれの時点においても吸光度の低下が緩やかになっている。すなわち、ナイルブルー溶液の保存安定性が向上している。
また、表９−２からも明らかなように、ナイルブルーのモル濃度以下の濃度で硫酸を含有する実験例４１〜４３は、硫酸を含有しない比較例４に比べて、いずれの時点においても吸光度の低下が緩やかになっている。すなわち、ナイルブルー溶液の保存安定性が向上している。
特に、ナイルブルーと硫酸とのモル濃度比が２：１〜１：１である実験例３９及び実験例４２においては、４ヶ月を経過した時点における吸光度変化率は、それぞれ０．０％と−４．２％であり、極めて良好な保存安定性が得られた。【０１０４】
以上のことから、ナイルブルー溶液中に、ナイルブルーのモル濃度以下の濃度で酸を含有させることにより、ナイルブルー溶液の保存安定性が向上することが実証された。
なお、実験例３７〜４０と実験例４１〜４４とでは、ナイルブルー溶液に含まれる硫酸の至適濃度に差異が見られたが、これは市販のナイルブルー試薬に含まれるナイルブルーの純度の違いによるものと考えられ、誤差の範囲内のものと考えられる。【０１０５】
実験例４５〜４８  ナイルブルーと酸とを含有する血小板測定用試薬の血小板染色性
ここでは、ナイルブルーを含有する血小板測定用試薬による血小板の染色性を検証するために、以下の実験を行った。
まず、次の組成からなる血小板測定用試薬と、希釈溶液とを製造した。
（１）血小板測定用試薬
血小板を染色するための色素                                以下に記載の濃度
エチレングリコール                                        １Ｌ
（２）希釈溶液
トリシン（緩衝剤）                                          １．８ｇ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）          ０．１５ｇ
精製水                                                      １Ｌ
（ｐＨ９．０、浸透圧２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏに調整）【０１０６】
上記血小板を測定するための色素として、表１０に示した色素を、それぞれ表に示した濃度で用いた。なお、括弧内には、血小板測定用試薬と希釈溶液と検体とが混合されたときの最終の濃度を示した。これらの色素の化学式は、表１０に示すとおりである。
血小板の測定は、実験例９〜１３について記載したようにして行った。【０１０７】
【表１０】
2009104598.tif 000018
【０１０８】
実験例４５により得られたスキャッタグラムを図１６に、実験例４６により得られたスキャッタグラムを図１７に、実験例４７により得られたスキャッタグラムを図１８に、実験例４８により得られたスキャッタグラムを図１９に示す。なお、各図において、図（ａ）は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったスキャッタグラムであり、図（ｂ）は、図（ａ）に示されるスキャッタグラムの縦軸をlogに変換したものである。各図において、図（ｂ）の血小板が出現する領域を実線で示した。
各実験例の測定結果は表１０に示したとおりである。【０１０９】
図１６に示すように、色素としてナイルブルーを用いた実験例４５においては、血小板の集団がスキャッタグラム上の蛍光強度の高い位置に出現しており、ナイルブルーによって血小板が良好に染色されていることがわかる。一方、ナイルブルー以外の他の色素を用いた実験例４６〜４８は、血小板の集団がスキャッタグラム上の蛍光強度の低い位置に集中しており、血小板の染色性が十分でないことがわかる。
このことから、血小板を測定するための色素としてナイルブルーを用いることにより、他の色素を用いた場合に比べて、血小板を良好に染色できることが示唆された。そして、ナイルブルーを用いて血小板を染色することにより、前方散乱光強度と蛍光強度とによって血小板を正確に検出できることが示唆された。【０１１０】
次に、血液中に脂質粒子などの夾雑物が存在する場合であっても、ナイルブルー及び酸を含有する実験例４５の血小板測定用試薬を用いることにより、血小板を夾雑物と区別して検出できるか否かを、実施例９〜１３に記載したものと同様の実験により検証した。【０１１１】
実験例４５の血小板測定用試薬を用いて破砕赤血球含有血液、脂質粒子含有血液を測定して得られたスキャッタグラムをそれぞれ図２０、図２１に示す。なお、各図において、図（ａ）は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったスキャッタグラムであり、図（ｂ）は、図（ａ）に示されるスキャッタグラムの縦軸をlogに変換したものであり、図（ｃ）は、図（ｂ）の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。図（ｃ）において、血小板が出現する領域を実線で示した。【０１１２】
図２０及び図２１に示すように、検体に含まれる血小板の集団は、破砕赤血球や脂質粒子などの検体中の他の成分と明確に区別されてスキャッタグラム上に出現していることがわかる。この結果から、本発明による血小板測定用試薬を用いることにより、血液中に破砕赤血球や脂質粒子などの夾雑物が存在しても血小板を明確に区別して検出でき、正確に血小板を測定できることが実証された。【０１１３】
本出願は、２００８年２月１８日、３月２６日及び９月２６日にそれぞれ出願された日本国特許出願特願２００８−３６０１３、２００８−７９７８５及び２００８−２４７４８４号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
2009104598.tif 000025
【図２】
2009104598.tif 000026
【図３】
2009104598.tif 000027
【図４】
2009104598.tif 000028
【図５】
2009104598.tif 000029
【図６】
2009104598.tif 000030
【図７】
2009104598.tif 000031
【図８】
2009104598.tif 000032
【図９】
2009104598.tif 000033
【図１０】
2009104598.tif 000034
【図１１】
2009104598.tif 000035
【図１２】
2009104598.tif 000036
【図１３】
2009104598.tif 000037
【図１４−１】
2009104598.tif 000038
【図１４−２】
2009104598.tif 000039
【図１４−３】
2009104598.tif 000040
【図１４−４】
2009104598.tif 000041
【図１５】
2009104598.tif 000042
【図１６】
2009104598.tif 000043
【図１７】
2009104598.tif 000044
【図１８】
2009104598.tif 000045
【図１９】
2009104598.tif 000046
【図２０】
2009104598.tif 000047
【図２１】
2009104598.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月21日(2010.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を染色するための色素として下記式（III）：
【化１】
2009104598.tif 000049
で示される化合物を含む血小板測定用試薬。
【請求項２】
血小板を染色するための色素として下記式（III）：
【化２】
2009104598.tif 000050
で示される化合物を含む第１の試薬と、
緩衝剤を含有する第２の試薬と
を含む血小板測定用試薬キット。
【請求項３】
前記第２の試薬が、ｐＨ６．０〜１１．０の緩衝液である請求項２に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項４】
前記第２の試薬が、１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する請求項２又は３に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項５】
前記第２の試薬が、前記色素による血小板の染色を促進するための染色促進剤をさらに含む請求項２〜４のいずれか１項に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項６】
前記染色促進剤が、カチオン界面活性剤である請求項５に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項７】
血小板を染色するための色素として下記式（III）：
【化３】
2009104598.tif 000051
で示される化合物を含む第１の試薬と、検体とを、緩衝剤を含有する第２の試薬を加えるか又は加えずに混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む血小板測定方法。
【請求項８】
検出された血小板を計数するステップをさらに含む請求項７に記載の血小板測定方法。
【請求項９】
血小板を染色するための色素として下記式（II）：
【化４】
2009104598.tif 000052
（式中、Ｘ-は、ＨＳＯ4-、１／２ＳＯ42-、Ｃｌ-、及びＣｌＯ4-からなる群より選択されるアニオンである）
で示される化合物と、酸とを含有する血小板測定用試薬。
【請求項１０】
前記酸が、無機酸である請求項９に記載の血小板測定用試薬。
【請求項１１】
前記色素と前記酸とのモル濃度比が、１０：１〜１：１である請求項９又は１０に記載の血小板測定用試薬。
【請求項１２】
血小板を染色するための色素として下記式（II）：
【化５】
2009104598.tif 000053
（式中、Ｘ-は、ＨＳＯ4-、１／２ＳＯ42-、Ｃｌ-、及びＣｌＯ4-からなる群より選択されるアニオンである）
で示される化合物と、酸とを含有する第１の試薬と、
緩衝剤を含有する第２の試薬と
を含む血小板測定用試薬キット。
【請求項１３】
前記第１の試薬における前記色素と前記酸とのモル濃度比が、１０：１〜１：１である請求項１２に記載の血小板測定用試薬キット。
【請求項１４】
下記式（II）：
【化６】
2009104598.tif 000054
（式中、Ｘ-は、ＨＳＯ4-、１／２ＳＯ42-、Ｃｌ-、及びＣｌＯ4-からなる群より選択されるアニオンである）
で示される化合物と、酸とを含有する第１の試薬と、検体とを、緩衝剤を含有する第２の試薬を加えるか又は加えずに混合して測定用試料を調製するステップと、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を検出するステップと、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて測定用試料に含まれる血小板を検出するステップと、
を含む血小板測定方法。
【請求項１５】
検出された血小板を計数するステップをさらに含む請求項１４に記載の血小板測定方法。
【国際調査報告】
2009104598.tif 000055
2009104598.tif 000056
2009104598.tif 000057
2009104598.tif 000058