(57)【要約】  確度が高く臨床上有用な冠動脈攣縮のリスク検査法、それに使用する試薬及びキットを提供することを課題とする。被験者から採取された核酸検体において、Rho GTPase活性化タンパク質9（Rho GTPase activating protein 9）遺伝子のG3034T多型を検出し、冠動脈攣縮のリスクを判定・評価する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された核酸検体において、Rho GTPase活性化タンパク質9（Rho GTPase activating protein 9）遺伝子のG3034T多型を検出するステップを含む、冠動脈攣縮のリスク検査法。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、請求項１に記載のリスク検査法：
(a)前記多型について、塩基がTのアレルが検出されるとリスクが高い；
(b)前記多型について、遺伝子型がG/G型、G/T型、T/T型の順にリスクが高くなる。
【請求項３】
以下の核酸を含む、冠動脈攣縮のリスク検査用の試薬、
Rho GTPase活性化タンパク質9遺伝子のG3034T多型を検出するための核酸であって、前記多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の試薬を含む、冠動脈攣縮のリスク検査用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は冠動脈攣縮のリスク検査法、該リスク検査法に利用される試薬及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
冠動脈攣縮は、冠攣縮性狭心症（CSA）及び急性冠動脈症候群（ACS）の病態に重要な役割を果たしている（Oliva, P.B., Potts, D.E. & Pluss, R.G. N Engl J Med 288, 745-51 (1973); Maseri, A. et al. N Engl J Med 299, 1271-7 (1978).）。高血圧症、脂質代謝異常、糖尿病や喫煙といった冠動脈疾患の危険因子のうち、喫煙がCSAの主要な危険因子であることが報告された（Sugiishi M. & Takatsu, F. Circulation 1993;87:76-9）。CSAの生理学的、薬理学的、遺伝学的危険因子についての報告があるものの（Kawano H. & Ogawa, H. Intern Med 44, 91-9 (2005)）、CSAのメカニズムの詳細は明らかになっていない。いくつかの報告において、動脈硬化性変性の存在に冠動脈攣縮が関係していることが示された（Bertrand, M.E. et al. Circulation 65, 1299-306 (1982).; Miyao, Y. et al. J Am Coll Cardiol 36, 432-7 (2000).）。血漿Pセレクチン、高感度CRP、Eセレクチン、ICAM-1濃度がCSA患者において上昇しており（Kaikita, K. et al. Circulation 92, 1726-30 (1995).; Miwa, K., Igawa, A. & Inoue, H. Cardiovasc Res 36, 37-44 (1997).; Hung, M.J., Cherng, W.J., Yang, N.I., Cheng, C.W. & Li, L.F. Am J Cardiol 96, 1484-90 (2005).）、これが冠動脈攣縮における炎症の関わりを示している。【０００３】
これまで、アセチルコリンやエルゴノビンなどによる薬剤誘発テストがCSAの診断に用いられてきた。これらの薬剤は、健常人においては血管拡張を誘発するが、冠動脈疾患患者においては冠動脈攣縮の原因となる（Ludmer, P.L. et al. N Engl J Med 315, 1046-51 (1986).; Yasue, H. et al. Circulation 74, 955-63 (1986).; Waters, D.D. et al. Circulation 67, 310-5 (1983).）。これらの所見はまた、冠動脈攣縮は血管内皮機能異常と関連していることを示している。【０００４】
冠動脈攣縮は白人よりも日本人において発症頻度が高い（Beltrame, J.F., Sasayama, S. & Maseri, A. J Am Coll Cardiol 33, 1442-52 (1999).; Pristipino, C. et al. Circulation 101, 1102-8 (2000).）。逆に、閉塞性冠動脈疾患については、白人よりも日本人の方が罹患率が低い（Baba, S. et al. Circulation 89, 109-15 (1994).）。この人種差は、冠動脈攣縮の病態生理学に遺伝的因子が関連していることを示している。尚、内皮性NO合成、NADH/NADPH酸化酵素、ACE、AGT2R1とパラオキソナーゼ（paraoxonase）がCSAの危険度を増すことが報告された。【０００５】
ここ十数年の間に、Rho、Rac、Cdc42を含むRhoファミリーGTPaseの異常な活性が高血圧、動脈硬化、CSAや肺高血圧などの心血管系疾患において認められることが報告された。また、RhoキナーゼがRhoAの重要なエフェクターの一つであり、ミオシン軽鎖とミオシン脱リン酸酵素のミオシン結合性サブユニットをリン酸化することが示された（Amano, M., Fukata, Y. & Kaibuchi, K. Exp Cell Res 261, 44-51 (2000); Kimura, K. et al. Science 273, 245-8 (1996); Amano, M. et al. J Biol Chem 271, 20246-9 (1996)）。このRhoA/Rhoキナーゼ経路は、CSAや高血圧症のような病態において、カルシウムイオンに対する血管平滑筋の感受性を増強させる（Somlyo, A.P. & Somlyo, A.V. Physiol Rev 83, 1325-58 (2003).; Loirand, G., Guerin, P. & Pacaud, P. Circ Res 98, 322-34 (2006).）。尚、Rhoキナーゼ阻害剤の有用性が報告された（Shimokawa, H. & Rashid, M. Trends Pharmacol Sci 28, 296-302 (2007).; Liao, J.K., Seto, M. & Noma, K. J Cardiovasc Pharmacol 50, 17-24 (2007).）。【０００６】
Racは心血管系の様々なタイプの細胞において細胞や生理的プロセスを制御する（Gregg, D., Rauscher, F.M. & Goldschmidt-Clermont, P.J. Am J Physiol Cell Physiol 285, C723-34 (2003).）。Rac媒介NADP酸化酵素の活性化は活性酸素種の産生に重要な役割を果たしている（Hordijk, P.L. Circ Res 98, 453-62 (2006).）。RacとCdc42は、一般的に、細胞遊走の間、細胞伸展縁（leading edge）においてアクチン重合やmembrane protrusionを制御している。一方、Rhoは後端（rear）において収縮を制御している（Raftopoulou, M. & Hall, A. Dev Biol 265, 23-32 (2004).）。Rac、Cdc42、Rhoの共同作業は、動脈硬化巣において、白血球、単球や血管平滑筋細胞などの様々な細胞の遊走を仲介している。【０００７】
RhoファミリーGTPaseは活性型（GTP結合型）と不活性型（GDP結合型）の間を相互交換している。RhoファミリーGTPaseの主な制御因子は３つのクラス、即ちグアニンヌクレオチド交換因子（guanine nucleotide exchange factors: GEF）、GTPase活性化タンパク質（GTPase activating protein: GAP）及びGDP解離抑制タンパク質（GDP dissociation inhibitor: GDI）に分類される（Kaibuchi, K., Kuroda, S. & Amano, M. Annu Rev Biochem 68, 459-86 (1999).; Jaffe, A.B. & Hall, A. Annu Rev Cell Dev Biol 21, 247-69 (2005).)。GEFはGTPからGDPへの変換を促進し、RhoファミリーGTPaseを活性化する（Rossman, K.L., Der, C.J. & Sondek, J. Nat Rev Mol Cell Biol 6, 167-80 (2005).）。GAPは内因性GTPase活性を刺激し、RhoファミリーGTPaseをブロックする（Moon, S.Y. & Zheng, Y. Trends Cell Biol 13, 13-22 (2003).）。GDIは、プレニル化された不活性型RhoファミリーGTPaseと相互作用し、RhoファミリーGTPaseのサイクルをコントロールする（DerMardirossian, C. & Bokoch, G.M. Trends Cell Biol 15, 356-63 (2005).）。【０００８】
冠動脈攣縮の遺伝的リスクに関し、NADH/NADPHオキシダーゼp22フォックス遺伝子の多型（SNP）、ストロメライシン-1遺伝子の多型（SNP）、インターロイキン-6遺伝子の多型（SNP）と冠動脈攣縮との関連性が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。その他、内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子(eNOS）の特定の多型が冠動脈攣縮に関連すること（非特許文献２〜６）、アンジオテンシン変換酵素遺伝子（ACE）の特定の多型が冠動脈攣縮に関連すること（非特許文献７）、アンジオテンシンIIの１型受容体遺伝子の特定の多型が冠動脈攣縮に関連すること（非特許文献８）、パラオキソナーゼ１（PON1）の特定の多型が冠動脈攣縮に関連すること（非特許文献９）、SNP rs10498345が冠動脈攣縮に関連すること（非特許文献１０）も報告された。冠動脈攣縮の病態、診断法、発症機構、治療法などについては非特許文献１１を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１１３０９３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Murase Y, et al. European Heart Journal (2004) 25, 970-977
【非特許文献２】Nakayama M, Yasue H, Yoshimura M et al. Circulation 1999;99:2864-70.
【非特許文献３】Yoshimura M. et al. J Investig Med. 2000 Sep;48(5):367-74
【非特許文献４】Ogimoto A. et al. J Mol Med (2005) 83: 619-625
【非特許文献５】Nakayama M. et al. Pharmacogenetics and Genomics 2006, Vol 16 No 5, 339-345
【非特許文献６】Nishijima T. et al. Pharmacogenetics and Genomics 2007, Vol 17 No 8
【非特許文献７】Oike Y, Hata A, Ogata Y et al. J Clin Invest 1995;96:2975-9.
【非特許文献８】Amant C, Hamon M, Bauters C et al. J Am Coll Cardiol 1997;29:486-90.
【非特許文献９】Ito T. et al. Hum Genet. 2002 Jan;110(1):89-94
【非特許文献１０】Suzuki S. et al. Pharmacogenetics and Genomics 2007, Vol 17 No 11, 919-930
【非特許文献１１】Yasue H. et al. Journal of Cardiology (2008) 51, 2-17
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、確度が高く臨床上有用な冠動脈攣縮のリスク検査法、それに使用する試薬及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記のように、RhoファミリーGTPaseが冠攣縮性狭心症（CSA）に関連することが示唆されているものの、その詳細は未だ充分明らかにされていない。特に、RhoファミリーGTPaseがCSA発症原因に関わるか否かについては不明な点が多い。このような背景の下、本発明者らは、RhoファミリーGTPaseの活性化を担うグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）及び不活性化を担うGTPase活性化タンパク質（GAP）に注目した。そして、100類以上存在するGEF遺伝子／GAP遺伝子に関して、アミノ酸置換を伴い、活性に影響を与える可能性の高い遺伝子多型（SNP）を抽出し、その冠攣縮との関連性について、冠動脈造影にて冠攣縮が確認された103症例と、冠動脈造影の際、薬物（アセチルコリン及び／又はエルゴノビン）による負荷によっても冠攣縮が誘発されなかった102症例（対照）を用いて解析した。その結果、GAPの一つであるRho GTPase活性化タンパク質9（Rho GTPase activating protein 9）のG3034T多型が薬剤誘発性冠攣縮に有意且つ強く関連していることが明らかとなった。
本発明は、主として以上の知見に基づき完成されたものであり、以下の通りである。
[１]  被験者から採取された核酸検体において、Rho GTPase活性化タンパク質9（Rho GTPase activating protein 9）遺伝子のG3034T多型を検出するステップを含む、冠動脈攣縮のリスク検査法。
[２]  以下の(a)又は(b)の基準に従いリスクを判定することを特徴とする、[１]に記載のリスク検査法：
(a)前記多型について、塩基がTのアレルが検出されるとリスクが高い；
(b)前記多型について、遺伝子型がG/G型、G/T型、T/T型の順にリスクが高くなる。
[３]  以下の核酸を含む、冠動脈攣縮のリスク検査用の試薬、
Rho GTPase活性化タンパク質9遺伝子のG3034T多型を検出するための核酸であって、前記多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
[４]  [３]に記載の試薬を含む、冠動脈攣縮のリスク検査用のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】対象（患者及び健常者）の背景。*は有意差(P<0.05)があることを表す。冠攣縮患者（spasm）、対照間の有意差は以下の検定方法で確認した。年齢及びBMI：スチューデントのｔ検定（Student's t-test）。性別、喫煙、高血圧、２型糖尿病、高脂血症及び高尿酸血症：χ2検定（chi-square test）
【図２】解析対象の遺伝子多型。
【図３】図２の続き。
【図４】図３の続き。
【図５】多重ロジスティック回帰分析の結果。年齢、BMI及び喫煙歴、並びに高血圧、２型糖尿病、高脂血症、高尿酸血症の有無により補正した。rs11544238とrs2277315は強い連鎖不平衡にあった。
【図６】ARHGAP9及びGAPDH特異的mRNAの検出。（ａ）トータルRNAをHUVEC、HCAEC、HAoSMC、リンパ球、T細胞（CD3陽性リンパ球）及び単球（CD14陽性細胞）から抽出した。遺伝子発現レベルの評価にはRT-PCRを用いた。（ｂ）遺伝子型がARHGAP9 370Alaの対象、遺伝子型がARHGAP9 370Serの対象からそれぞれリンパ球（血液）を調製し、ARHGAP9特異的mRNA及びGAPDH特異的mRNAをRT-PCRで検出した。GAPDH特異的mRNAに対するARHGAP9特異的mRNAの比を示した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。
【図７】ARHGAP9のドメイン構造。上段は全体の構造。中段及び下段は、一部が欠失した構造。
【図８】細胞接着及び細胞遊走に対する、ARHGAP9 370Ala及びARHGAP9 370Serの効果。（ａ）細胞遊走に対する、ARHGAP9 370Ala及びARHGAP9 370Serの効果をボイデン・チャンバー・アッセイで調べた。データを±標準偏差で示した。（ｂ）（ｃ）伸展するHeLa細胞及びRAW264マウス単球細胞に対する、ARHGAP9 370Ala及びARHGAP9 370Serの効果。スケールバーは10μm。（ｄ）Jurkat細胞の細胞接着に対する、ARHGAP9 370Ala及びARHGAP9 370Serの効果。星印は有意差があることを示す（*p＜0.01）。
【図９】ARHGAP9の遺伝子多型に起因する冠動脈攣縮の発症メカニズム（仮説）。
【図１０】解析対象の遺伝子多型と使用したプライマー。
【図１１】図１０の続き。
【図１２】図１１の続き。
【図１３】図１２の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（冠動脈攣縮のリスク検査法）
本発明の第１の局面は冠動脈攣縮（慣例に従い、「冠動脈攣縮」のことを「冠攣縮」又は「SPASM」とも呼ぶ）のリスク検査法に関する。本発明において「冠動脈攣縮のリスク」とは、冠動脈攣縮を生ずるおそれの程度（生じ易さ）をいう。冠動脈攣縮のリスクを把握することにより、冠動脈攣縮が原因で発症する疾患の易罹患性（疾患への罹りやすさ）を判定・評価することが可能となる。ここでの「原因」は直接的な原因に限られない。「冠動脈攣縮が原因で発症する疾患」の例は、冠攣縮性狭心症（異型狭心症を含む）、労作性狭心症、安静時狭心症、心筋梗塞である。好ましい「冠動脈攣縮が原因で発症する疾患」は、冠動脈攣縮が直接的な原因となり発症する冠攣縮性狭心症である。即ち、好ましい一態様では、冠攣縮性狭心症のリスクの判定／評価に本発明が利用される。
【００１５】
本発明のリスク検査法では、被験者から採取された核酸検体において、Rho GTPase活性化タンパク質9のG3034T多型を検出する。このように特定の多型を検出し、検出結果に基づきリスクを判定・評価する。
【００１６】
まず、被験者から採取された核酸検体を用意する。本発明では、冠動脈攣縮のリスク判定を必要とする者（被験者）に由来する核酸検体を使用する。核酸検体は、被験者の血液、唾液、リンパ液、尿、汗、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。多型検出対象であるRho GTPase活性化タンパク質9遺伝子を含むものであれば任意の長さのゲノムDNAを核酸検体として用いることができる。尚、核酸検体において解析対象の遺伝子が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくてもよい。即ち、検出対象となる多型部位が少なくとも存在している限りにおいて断片的、部分的な状態であってもよい。
【００１７】
被験者は特に限定されない。即ち、冠動脈攣縮のリスク判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。例えば、冠動脈疾患の患者、冠動脈疾患に罹患していることが疑われる者、又は健常者が被検者となる。前二者についての判定結果はより適切な治療方針の決定に役立ち、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促す。一方、健常者についての判定結果は冠動脈攣縮又は冠動脈攣縮が原因となる疾患の予防や早期診断に役立つ。即ち、リスクが高いとの情報に基づいて予防的措置や生活習慣の改善等を図れば、冠動脈攣縮の発生可能性や冠動脈攣縮が原因となる疾患への罹患可能性を低下させることができる。また、リスクが高いとの情報は冠動脈疾患の検診を受診させる契機となり、これによって冠動脈疾患の早期診断（早期発見）が可能となる。尚、ここでの「健常者」とは、本発明のリスク検査法を適用する時点において、冠動脈疾患に罹患しているとの判断が行われていない者のことをいう。
【００１８】
一般に、多型を扱う際には人種差を考慮する必要がある。多型によっては、集団（日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。その一方で、遺伝的に近い集団（例えば日本人集団に対して中国人集団や韓国人集団は近い）では多型の種類・頻度が同様の傾向を示すことが多い。この事実を考慮すれば、日本人を対象とした大規模解析によって得られた知見に基づくものであるものの、本発明の適用範囲は日本人に限られないといえる。但し、好ましくは日本人、中国人、韓国人等のアジア人を被験者とし、最も好ましくは日本人を被験者とする。
【００１９】
本発明ではRho GTPase活性化タンパク質9のG3034T多型を検出する。本発明において用語「多型を検出する」は、用語「多型を解析する」又は用語「アレルを検出する」と置換可能である。多型の検出によって多型位置の状態（即ち、塩基の種類）が明らかとなる。
【００２０】
Rho GTPase活性化タンパク質9はARHGAP9とも呼ばれ、RhoファミリーGTPaseの不活性化を担うGAPの一つであり、GTP結合型Cdc42及びRacの加水分解を促進する（Furukawa, T. et al.: Isolation of a novel human gene, ARHGAP9, encoding a rho-GTPase activating protein. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Jun 15;284(3):643-9.）。説明の便宜上、以下では「Rho GTPase活性化タンパク質9」のことを「ARHGAP9」と呼ぶことにする。
【００２１】
本明細書に記載する遺伝子及び遺伝子多型に関する配列や多型位置は、NCBI（The National Center for Biotechnology Information）のデータベースに登録された情報に基づき規定される。ARHGAP9遺伝子の配列（配列番号１）は、NCBIのデータベースにAccession No.NC_000012（DEFINITION  Homo sapiens chromosome 12, reference assembly, complete sequence. REGION: complement(56152305..56159900)）で登録されている。また、G3034T多型はNCBIのデータベース（Entrez SNP）にID番号（refSNP ID）rs11544238で登録されている。G3034T多型は、ARHGAP9遺伝子の開始コドンの第１塩基を起点（0番目）として3034番目に位置する塩基GがTに変異する一塩基多型（SNP）である。G3034T多型は370番アミノ酸のアラニンからセリンへの置換を伴う多型であることから、本明細書では「G3034T多型」を「Ala370Ser多型」と呼ぶことがある。また、「G3034T多型」のことを省略して「G3034T」と呼ぶことがある。「Ala370Ser多型」についても同様に略称することがある。尚、ARHGAP9遺伝子の遺伝子座は染色体12q14に存在し、開始コドンの第１塩基の染色体上の位置は56159456であり、G3034T多型の染色体上の位置は56156422である。配列番号１の配列においては、445番塩基（a）が開始コドンの第１塩基であり、3479番塩基（t）がG3034T多型の位置に相当する。
【００２２】
上記のようにして多型の検出を行うと、多型位置の塩基がTのアレル又は多型位置の塩基がGのアレル（ヘテロ接合型の遺伝子である場合、二つのアレル）が検出される。本発明では多型の検出結果、即ち検出されたアレルの種類を基にリスクを判定する。ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
【００２３】
実施例の欄に示すように、優性（Dominant）モデルを採用した多重ロジスティック分析の結果、Tアレルがリスクアレルであることが明らかとなった（Tアレルがリスクアレルであることは付加（Additive）モデルを採用した多重ロジスティック分析の結果によっても裏付けられる）。そこで、本発明の一態様では、好ましくは以下の基準(a)に従ってリスクを判定・評価する。
(a)G3034T多型について、塩基がTのアレルが検出されるとリスクが高い。
【００２４】
一方、付加（Additive）モデルを採用した多重ロジスティック分析の結果により、TアレルとGアレルのヘテロ接合型よりもTアレル同士のホモ接合型の方が高リスクであることが示された。そこで本発明の好ましい態様では、多型の検出結果より遺伝子型（アレルの組合せ）を決定し、遺伝子型に基づきリスクを判定・評価する。具体的には、G/G型（多型位置の塩基がGのアレルのホモ接合型）、G/T型（多型位置の塩基がGのアレルと多型位置の塩基がTのアレルのヘテロ接合型）及びT/T型（多型位置の塩基がTのアレルのホモ接合型）のいずれであるかを決定した後、以下の基準(b)に従ってリスクを判定・評価する。このように遺伝子型を用いれば、より確度の高い判定・評価が可能になる。
(b)G3034T多型について、遺伝子型がG/G型、G/T型、T/T型の順にリスクが高くなる。
【００２５】
多型の検出法（解析法）は特に限定されるものではなく例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって検出する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号パンフレット、特開2004-121232号公報など）、ASP-PCR（Allele Specific Primer-PCR)法（国際公開第01/042498号公報など）、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の多型部位を直接シークエンスすることにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型を検出してもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの検出方法を適用することもできる。
【００２６】
多数の核酸検体を検出する場合にはアレル特異的PCR法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、FRETを利用した方法、ASP-PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で検出可能な検出法を用いることが特に好ましい。
【００２７】
以上の方法では、各方法に応じたプローブやプライマー等の核酸（本発明において「多型検出用核酸」ともいう）が使用される。プローブとして利用される多型検出用核酸の例としては、検出対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）に特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。具体的には例えば、G3034T多型部位の塩基がGであるARHGAP9遺伝子の当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）領域に相補的な配列を有する核酸や、G3034T多型部位の塩基がTであるARHGAP9遺伝子の当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する核酸が当該プローブに該当する。ここでの「部分DNA領域」の長さは、例えば16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。また、当該核酸は好ましくは部分DNA領域に相補的な配列を有するが、特異的なハイブリダイゼーションに支障のない限り、多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは1〜3個である。ここでの「特異的なハイブリダイゼーション」とは、核酸プローブによる検出の際に通常採用されるハイブリダイゼーション条件（好ましくはストリンジェントな条件）の下、標的の核酸（部分DNA領域）に対してハイブリダイズする一方で、他の核酸との間にクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。尚、当業者であれば例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参考にしてハイブリダイゼーション条件を容易に設定可能である。
【００２８】
プライマーとして利用される多型検出用核酸の例としては、検出対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸を挙げることができる。プライマーとして利用される多型検出用核酸の他の例として、検出対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ当該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には検出対象の多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。具体的には、ARHGAP9遺伝子のG3034T多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、G3034T多型部位の塩基がGであるARHGAP9遺伝子のアンチセンス鎖において当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セット、又はG3034T多型部位の塩基がTであるARHGAP9遺伝子のアンチセンス鎖において当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットが該当する。ここで、増幅される部分DNA領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、更に好ましくは30〜200塩基長である。
尚、プローブの場合と同様、プライマーとして利用される多型核酸用核酸についても、増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り、鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。
【００２９】
多型検出用核酸（プローブ、プライマー）には、検出法に応じて適宜DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA:Peptide nucleic acid：)等が用いられる。多型検出用核酸の塩基長はその機能が発揮される長さであればよく、プローブとして用いられる場合の塩基長の例としては16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。他方、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50塩基長、好ましくは15〜40塩基長、更に好ましくは15〜30塩基長である。
【００３０】
多型検出用核酸（プローブ、プライマー）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型検出用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkやCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））を参考にすることができる。
【００３１】
本発明における多型検出用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として多型を検出することができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アレル特異的センスプライマー）をフルオレセインイソチオシアネートとテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分DNA領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００３２】
多型検出用核酸の標識に用いられる標識物質としては7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin（APC）、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド（Texas Red（登録商標））、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC-CyTM7、オレゴングリーン（Oregon Green）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００３３】
以上の多型検出用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の検出をより簡便に行うことができる。
【００３４】
本発明の検出対象であるG3034T多型は、アミノ酸の変化を伴う。従って、遺伝子の発現産物であるペプチドないしタンパク質を用いて多型の検出をすることにしてもよい。この場合、多型部位に対応するアミノ酸を含んでいる限り、発現産物の大きさ（長さ）は特に限定されない。遺伝子の発現産物を用いた検出方法としては、多型部位のアミノ酸を直接検出する方法、又は立体構造の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては、例えば、周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有する抗体を用いた、ELISA法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等などを用いることができる。
【００３５】
標的（多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物）に対する抗体は免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。標的に対する抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。標的（又はその一部）を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。標的（又はその一部）としては、生体材料から調製したもの（天然抗原）又は組換え抗原を用いることができる。免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタールアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、CD46（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
【００３６】
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
【００３７】
以上の方法で得られたポリクローナル又はモノクローナル抗体は必要に応じて標識化される。標識物質としては7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin（APC）、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド（Texas Red（登録商標））、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC-CyTM7、オレゴングリーン（Oregon Green）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示できる。
【００３８】
（冠動脈攣縮のリスク検査用試薬及びキット）
本発明の他の局面は、冠動脈攣縮のリスク検査に用いられる試薬及びキットを提供する。本発明の試薬は、G3034T多型検出用核酸からなる。これら各核酸の詳細については上記の通りである。
【００３９】
G3034T多型検出用核酸は、それが適用される検出法（上述したアレル特異的核酸等を用いたPCR法を利用する方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP、TaqMan（登録商標）-PCR法、Invader（登録商標）法等）において、検出対象である多型部分を含む連続した領域（DNA領域）を特異的に検出できるもの（プローブ）又は特異的に増幅できるもの（プライマー）として設計される。多型検出用核酸の詳細については既述の通りであるが、キットの成分として特に有効であるG3034T多型検出用核酸（又はG3034T多型検出用核酸のセット）の具体例を以下に示す。
【００４０】
(1)G3034T多型部位の塩基がGであるARHGAP9遺伝子の当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(2)G3034T多型部位の塩基がTであるARHGAP9遺伝子の当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する非標識又は標識核酸
(3)(1)の核酸と(2)の核酸との組合せ
(4)核酸検体中のARHGAP9遺伝子におけるG3034T多型部位の塩基がGである場合にのみ、該ARHGAP9遺伝子の該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(5)核酸検体中のARHGAP9遺伝子のG3034T多型部位の塩基がTである場合にのみ、該ARHGAP9遺伝子の該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅するように設計された核酸セット
(6)(4)の核酸セットと(5)の核酸セットとの組合せ
(7)ARHGAP9遺伝子のG3034T多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、G3034T多型部位の塩基がGであるARHGAP9遺伝子の当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー、及び／又はG3034T多型部位の塩基がTであるARHGAP9遺伝子において当該塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、ARHGAP9遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット
(8)G3034T多型部位の塩基がGであるARHGAP9遺伝子のアンチセンス鎖において当該塩基に対応する塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、G3034T多型部位の塩基がTであるARHGAP9遺伝子のアンチセンス鎖において当該塩基に対応する塩基を含む連続した領域（部分DNA領域）、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びARHGAP9遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてARHGAP9遺伝子の当該多型部位を含む連続した領域（部分DNA領域）を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット
【００４１】
本発明のキットには、G3034T多型検出用核酸が含まれる。G3034T多型検出用核酸を使用する際（即ち多型検出の際）に必要な試薬（DNAポリメラーゼ、制限酵素、緩衝液、発色試薬など）や容器、器具等を本発明のキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００４２】
＜遺伝子多型と冠動脈攣縮との関連＞
Rho/Racファミリータンパク質、Rho/Racファミリーの活性化を担うGEF、Rho/Racファミリーを不活化するGAPの遺伝子変異によってタンパク質の発現や機能の変化、或いは活性の変化が生じ、細胞遊走、細胞接着、サイトカイン分泌、平滑筋収縮などが影響を受け、その結果として冠動脈攣縮が引き起こされるというメカニズムの存在を想定した上で、これらの分子における遺伝子多型が薬剤誘発性冠攣縮に関与するか否かを調査することにした。【００４３】
１．方法
（１）対象
名古屋大学医学部付属病院および関連病院において、冠動脈造影にて冠攣縮が確認された103症例（冠攣縮患者群）と、冠動脈造影の際、薬物（アセチルコリン及び／又はエルゴノビン)による負荷によっても冠攣縮が誘発されなかった102症例（対照群）を用いて解析した。対象の背景を図１に示す。【００４４】
（２）評価項目
BMI（body mass index)、血圧、空腹時血糖値、IRI(空腹時インスリン濃度)、血清脂質値（総コレステロール、トリグリセライド、HDLコレステロール)、尿酸値などを測定した。【００４５】
（３）DNA抽出
EDTA 50mmolを含む採血管を用い、約10mlの静脈血を採取し、Qiagen FlexiGene DNA Kitを用いDNAの抽出を行なった。【００４６】
（４）遺伝子多型解析
100類以上存在するGEF遺伝子／GAP遺伝子に関して、アミノ酸置換を伴い、且つ活性に影響を与える可能性の高い（活性に影響を与えるドメイン内にSNPを認める、３次元構造解析で活性に影響を与える、及び／又は細胞生物学的に影響を与えているもの）遺伝子多型（SNP）を抽出し（図２〜４）、解析を行った。
一塩基多型(SNP)の解析には、ASP-PCR(Allele Specific Primer-PCR)法(株式会社  東洋紡ジーンアナリシス)及びIFP（Intercalater mediated FRET Probe）法を利用した。ASP-PCRでは、5’末端にテキサスレッド又はビオチンをラベルしたアレル特異的プライマー（センス及びアンチセンス)を用い（図１０〜１３）、PCRにより増幅を行い、増幅産物の標識を測定することでアレルを決定した。IFP法とは、２本鎖のDNAが温度上昇に伴って分離(融解)する現象を、蛍光インターカレーターと蛍光標識プローブとの蛍光共鳴エネルギー転移(FRET）を利用して検出する方法である。【００４７】
（５）統計解析
アリル頻度はgene-counting methodにより求めた。Hardy-Weinberg平衡からの逸脱はχ2検定により確認した。疾患と遺伝子多型との関連解析は、χ2検定およびFisherの直接確率法を用いた。判別分析、多重ロジスティック回帰分析を用い、他の背景因子・基礎疾患の補正を行った。【００４８】
２．結果
多重ロジスティック回帰分析の結果を図５に示す。年齢、BMI及び喫煙歴、並びに高血圧、糖尿病、脂質代謝異常及び高尿酸血症の有無により補正した。図５に示した通り、多重ロジスティック回帰分析により、ARHGAP9遺伝子のrs11544238(Ala370Ser多型)、rs2277315(Ala449Thr多型)及びARHGEF10L遺伝子のrs2270976(Val1219Ile多型)と薬剤誘発性冠攣縮との間に有意な関連が認められた。特にrs11544238(Ala370Ser多型)は優性（dominant）モデルでオッズ比2.67（Tアレルを有する場合のリスクがTアレルを有しない場合のリスクの2.67倍）、P値0.004を示し、有意かつ強く疾患と関連していることが明らかとなった。また、G/G型、G/T型、T/T型を比較する付加（additive）モデルにおいても高いオッズ比1.77（G/T型のリスクはG/G型のリスクの1.77倍、T/T型のリスクはG/G型のリスクの1.77×1.77=3.13倍）を示した。このようにrs11544238(Ala370Ser多型)についてTアレルをもつと冠攣縮のリスクが高くなること、及びリスクの高さがG/G型＜G/T型＜T/T型であることが示された。
以上の結果より、rs11544238(Ala370Ser多型)を検出し、アレル又は遺伝子型の判定を行えば冠動脈攣縮のリスク（発生可能性）を把握できることが明らかとなった。【００４９】
＜冠動脈攣縮を引き起こすメカニズムの検討＞
冠動脈攣縮との間に関連が認められたrs11544238(Ala370Ser多型)に関して各種実験を行い、当該多型が冠動脈攣縮の発症に関与することの妥当性を評価した。【００５０】
１．方法
（１）材料及び試薬
ヒトARHGP9をコードするcDNAはATCC（No.MGC-12959）より入手した。抗GFPモノクローナル抗体はRoche Diagnostics（Mannheim, Germany）、抗CD3抗体はBD Bioscience（San Jose, CA USA）、抗CD14抗体はCaltag Laboratories（CA USA）からそれぞれ購入した。抗HAモノクローナル抗体（12CA5）はマウスハイブリドーマから調製した。その他の材料及び試薬は市販品を用いた。
ARHGAP9断片をPCRで増幅し、pGEX（GE Healthcare）及びpEGFP（タカラバイオ株式会社）にそれぞれサブクローンした。370位がAla（アラニン）に置換されたARHGAP9 370Alaは部位特異的突然変異によって調製した。【００５１】
（２）RT-PCR
既報（Inoue, N. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27, 99-105 (2007)）の方法に従い、RNeasy Protect kit (QIAGEN)及びSuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いたRT-PCRによって遺伝子発現レベルを評価した。
使用したプライマーは次の通りである。
ヒトARHGAP9用フォワードプライマー
5’-TCCGATGGGAGGTATGTGTT-3’（配列番号２）
ヒトARHGAP9用リバースプライマー
5’-ATCTGAGTGTGCTATCACCCTG-3’（配列番号３）
ヒトGAPDH（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）用フォワードプライマー
5’-CTTCACCACCATGGAGAAGG-3’（配列番号４）
ヒトGAPDH用リバースプライマー
5’-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3’（配列番号５）【００５２】
RT-PCR産物のサイズは、ヒトARHGAP9が300bp、ヒトGAPDHが557bpであった。ヒトリンパ球は、Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）を用いて健常ボランティアの全血から単離した。CD3陽性細胞（T細胞）及びCD14陽性細胞（単球）は、FACS Aria Ver2.0 Diva4.1 (BD Bioscience)を用いて、単離したリンパ球から調製した。【００５３】
（３）三次元細胞遊走アッセイ
既報（Nakayama, M. et al. Genes Cells 10, 107-17 (2005)）の方法に従い、Transwell（Coaster, Cambridge, MA, USA）を用いて三次元細胞遊走アッセイ（ボイデン・チャンバー・アッセイ）を行った。LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)を用い、GFP-GST、GFP-ARHGAP9-FL 370Ala又はGFP-ARHGAP9-FL 370SerをVero細胞にトランスフェクトした。Transwellのアッパーチャンバー膜（φ8μmの孔を有する）を10μg/mLのフィブロネクチン(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA)で2時間コートした。トランスフェクションから18時間後に、0.1% BSA含有の無血清培地500μLに懸濁したVero細胞1×104個をTranwellのアッパーチャンバーに播種した。３時間インキュベートした後、アッパーチャンバー内の細胞を綿棒で除去した。アッパーチャンバー膜の下面側に移動した細胞を3.0%ホルムアルデヒド含有PBSで10分間固定した後、0.2% Triton X-100及び2 mg/mL BSA含有PBSで10分間処理した。固定した細胞を100μg/mLのHoechst 33342 (Sigma-Aldrich Co)で染色した。PBSで３回洗浄した後、Zeiss axiophoto microscope(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)で観察した。各Transwellについて、無作為に抽出した２０視野におけるHoechst 33342及びGFP陽性細胞を数えた。独立した三回の実験を行い、代表的な結果で評価した（倍率は200倍、各実験についてn数＞20）。【００５４】
（４）細胞伸展アッセイ
LipofectAMINE (Invitrogen)を用いてHeLa細胞にGFP-ARHGAP9断片をトランスフェクトした。0.1% BSA含有の無血清培地で処理後の細胞を培養した。一方、Nucleofector kit (Amaxa biosystems)を用いてRAW264細胞にGFP-ARHGAP9断片をトランスフェクトした。トランスフェクションから18時間後に、10μg/mLのフィブロネクチンをコートしたカバースリット上に細胞を播種した。１時間のインキュベーション後、PBSで２回洗浄し、上記と同様の方法で細胞を固定した。固定後の細胞をテトラメチルローダミンＢ  イソチオシアネート−ファロイドジンで染色し、ソフトウエアLSM 510 (Carl Ziess, Oberkochene, Germany）を用いて伸展した細胞の面積を測定した。Hela細胞（≧400μm2）とRAW264細胞（≧40μm2）を「伸展した細胞」とした。独立した三回の実験を行い、代表的な結果で評価した（各実験についてn数＞20）。【００５５】
（５）細胞接着アッセイ
既報（Furukawa, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 284, 643-9 (2001)）の方法に従い、細胞接着アッセイを行った。Nucleofector kit (Amaxa biosystems)を用いてJurkat細胞にGFP-ARHGAP9断片をトランスフェクトした。0.1% BSA含有の無血清培地で処理後の細胞を24時間培養した。GFP陽性細胞を数えた。10μg/mLのフィブロネクチンをコートした各カバースリット上に5,000個のGFP陽性細胞を播種した。30分のインキュベーション後、上記と同様の方法で細胞を固定し、GFP陽性細胞を数えた。独立した三回の実験を行い、代表的な結果で評価した。【００５６】
２．結果
（１）ARHGAP9の発現
冠動脈攣縮に関わる細胞におけるARHGAP9の発現状態を調べるため、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、正常ヒト冠状動脈内皮細胞（HCAEC）、正常ヒト大動脈平滑筋細胞（HAoSMC）、正常ヒトリンパ球、正常ヒトCD3陽性リンパ球（T細胞）及び正常ヒトCD14陽性細胞（単球）における、ARHGAP9のmRNA発現レベルをRT-PCRで評価した（図６（ａ））。ARHGAP9特異的なPCR産物の量は、リンパ球、T細胞及び単球で多く、HAoSMCで少ない。HUVEC及びHCAECでは、ARHGAP9特異的なPCR産物をほとんど認めない。【００５７】
次に、ARHGAP9のAla370Ser多型がmRNAの発現に影響を与えるか否か検討した（図６（ｂ））。具体的には、対象（ARHGAP9 370Alaの遺伝子型を有する者、及びARHGAP9 370Serの遺伝子型を有する者）の白血球からmRNAを抽出し、ARHGAP9のmRNA発現レベルを評価した。その結果、Ala370Ser多型とARHGAP9のmRNA発現レベルとの間に有意な相関は認められなかった。【００５８】
（２）ARHGAP9の機能
ARHGAP9のタンパクドメインを図７に示す。Ala370Ser多型はPH（Pleckstrin homology）ドメインに位置する。PHドメインはホスホイノシチドへの結合を通して細胞内シグナル伝達に関与する。ホスホイノシチドとの結合解析の結果、Ala370Ser多型による結合性の変化は認められなかった（データを示さず）。【００５９】
細胞と細胞外マトリックス（特にフィブロネクチン）との接着においてARHGAP9が重要な役割を果たすとの報告がある（Furukawa, Y. et al. Isolation of a novel human gene, ARHGAP9, encoding a rho-GTPase activating protein. Biochem Biophys Res Commun 284, 643-9 (2001)）。Ala370Ser多型が、フィブロネクチンの存在下での細胞遊走に影響を与えるか否かを調べるため、GFP-ARHGAP9-FL 370Ala又はGFP-ARHGAP9-FL 370Serを発現するVero細胞を用いてボイデン・チャンバー・アッセイを行った（図８（ａ））。フィルター下面上のGFP陽性細胞を数えた。GFP-ARHGAP9-FL 370Ala及びGFP-ARHGAP9-FL 370Serの発現はともにVero細胞の遊走を抑制した。GFP-ARHGAP9-FL 370Serの方が抑制効果が低い。この結果より、細胞遊走を抑制するという、ARHGAP9の機能にAla370Ser多型が影響すると考えられる。【００６０】
Ala370Ser多型が細胞伸展に影響するか否かを調べるため、GFP-GST、GFP-ARHGAP9-FL 370Ala又はGFP-ARHGAP9-FL 370Serを発現する、HeLa細胞及びRAW264細胞の面積を測定した（図８（ｂ）（ｃ））。GFP-ARHGAP9-FL 370Alaを発現する細胞と、GFP-ARHGAP9-FL 370Serを発現する細胞はいずれも、GFP-GSTを発現する細胞よりも低い伸展を示した。GFP-ARHGAP9-FL 370Serの方が抑制効果が低い。この結果より、細胞伸展に関する、ARHGAP9の機能にAla370Ser多型が影響すると考えられる。【００６１】
Ala370Ser多型が細胞の接着に影響するか否かを調べるため、GFP-GST、GFP-ARHGAP9-FL 370Ala又はGFP-ARHGAP9-FL 370Serを発現するJurkat細胞を用いて細胞接着アッセイを行った（図８（ｄ））。GFP-ARHGAP9-FL 370Alaの発現と、GFP-ARHGAP9-FL 370Serの発現はいずれも、フィブロネクチンへ結合する細胞の数を減少させた。細胞の結合に対する抑制効果は、細胞遊走及び細胞伸展の場合と同様、GFP-ARHGAP9-FL 370Serの方が低かった。【００６２】
ここで、（ａ）Ala370Ser多型は、ARHGAP9のPHドメインに存在すること、（ｂ）PHドメインは細胞膜への結合に働くこと、（ｃ）ARHGAP9はRacのGAPであること、（ｄ）ARHGAP9の発現は白血球、脾、胸腺に多いことを総合的に考慮すると、ARHGAP9の遺伝子多型に起因して活性型Racが増加することにより、スーパーオキサイド（Superoxide）の増加、白血球浸潤による粥状硬化の進展などが生じ、これによって血管内皮からの一酸化窒素(NO)の産生が低下し、その結果、冠攣縮が起こり易い状態が形成される、というメカニズム（図９）の存在が想定される。三次元細胞遊走アッセイと細胞伸展アッセイの結果はこの仮説を支持するものであった（図８）。
以上の結果より、Ser型（リスクアレル）では細胞の遊走・浸潤能、伸展性が増加し、この変化によって白血球による血管内皮障害が起こりやすくなり、その結果、冠動脈攣縮が引き起こされると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のリスク検査法は、冠動脈攣縮に関して確度が高く臨床上有用なリスク情報（発生可能性に関する情報）を与える。リスク情報は、冠動脈攣縮の発生可能性の低下、冠動脈攣縮が原因となる疾患（例えば冠攣縮性狭心症）の予防や早期診断、より適切な治療方針の決定、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life：生活の質）の向上などに役立つ。また、無駄な医療行為を未然に防止することによる医療経済への貢献も期待される。【００６４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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