(57)【要約】  がん幹細胞を特定する。ＳＬＤ５が高発現されているがん幹細胞。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＤ５が高発現されているがん幹細胞。
【請求項２】
ＳＬＤ５遺伝子の導入により形質転換された、請求項１に記載のがん幹細胞。
【請求項３】
ＳＬＤ５が高発現されているがん細胞を選別することを特徴とする、がん幹細胞の調製方法。
【請求項４】
薬物候補化合物の有無による細胞のＳＬＤ５の発現の増減を調べることを特徴とする、がん幹細胞に有効な抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記細胞が、ＳＬＤ５のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物もしくは発現ベクターを組み込むことにより形質転換された正常細胞またはがん細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＳＬＤ５遺伝子を正常細胞もしくはがん細胞に導入してＳＬＤ５を高発現させることを特徴とするがん幹細胞の調製方法。
【請求項７】
ＳＬＤ５遺伝子の発現抑制剤を有効成分とするがん幹細胞増殖阻害剤。
【請求項８】
ＳＬＤ５遺伝子の発現抑制剤が、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項７に記載のがん幹細胞増殖阻害剤。
【請求項９】
ＳＬＤ５のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物もしくは発現ベクターを組み込むことにより形質転換された細胞。
【請求項１０】
請求項９の細胞の、がん幹細胞抑制剤のスクリーニングにおける使用。
【請求項１１】
がん幹細胞を増殖することを特徴とするがん組織の構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞及びその単離方法、がん幹細胞を用いたがん組織の構築方法、正常細胞からがん幹細胞を作製する方法、がん幹細胞ないし抗がん剤のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のがん治療薬の開発においては、試験管内で維持されるがん細胞株を用いて、ある特定の物質がこれらの細胞に対して増殖抑制、あるいは細胞死の誘導ができるか否かで薬剤スクリーニングを行ってきた。また、がん細胞における正常細胞との遺伝子発現の相違から分子標的を探索する創薬研究においては、がん細胞は一様な細胞で構成されるという発想によりがん組織と正常組織との単純な比較により、遺伝子の相違が解析されてきた。【０００３】
しかし近年、がん組織の中に従来の抗癌剤や放射線療法に抵抗性を示し、少数の細胞でがん組織を再構築する、いわゆるがん幹細胞が存在し、このがん幹細胞の存在により、がんの再発／転移が引き起こされるとの概念が提唱されてきている。このような背景に立脚して、実際のがん組織の中から、通常のがん細胞とは異なる形質のがん幹細胞を単離し、これらの細胞をターゲットにしたがん治療薬／診断薬を開発する試みがなされてきている。【０００４】
しかし、がん組織のサンプルは細胞数に限界があり、また扱う研究者によっても解析法によっても結果が一定せず、がん幹細胞といわれる表現型をもつがん細胞が現在真のがん幹細胞か否かも定かではない。そこで、求められてきた技術は、いかに正常細胞をがん幹細胞化させるか、これらのがん幹細胞をどのように単離するか、多くのがん幹細胞を採取できるか、そして単離されたがん細胞が、がん幹細胞であることを立証する方法論である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＳＬＤ５はＰＳＦ１、ＰＳＦ２そしてＰＳＦ３とＧＩＮＳ複合体を形成し、この複合体は下等真核生物のＤＮＡ複製開始に必須である。すべての構成要素は哺乳類細胞において、良く保存されているにもかかわらず、その生物学的機能の大部分においてはまだ不明である。ここで、われわれはマウスにおいてＳＬＤ５への標的破壊が内細胞塊の細胞増殖不良を引き起こし、結果として着床周辺期の致死になることを示した。ＥＳ細胞奇形腫モデルを用いることで、ＳＬＤ５の転写活性が、ガン幹細胞/原始細胞を運命付ける。さらに、ＳＬＤ５の発現はほとんどのガン細胞株において豊富に観察され、ＳＬＤ５発現のサイレンシングはＰＳＦ１およびＰＳＦ３の不安定を引き起こし、結果としてガン細胞増殖が抑制される。近年、胚性幹（ＥＳ）細胞や人工多能性（iPS）細胞が再生医療への近付きを見せている。これらの細胞を用いることで、ガンの個体発生を理解できる。われわれはＳＬＤ５が、ＥＳ細胞やiPS細胞から生じたガンの潜在的に新規な標的であることを提唱する。【０００６】
本発明は、がん幹細胞を調製する技術を提供することを目的とする。【０００７】
がん幹細胞を抑制できれば、がんの増殖や転移を抑制することができるため、がん幹細胞を特定し、その特徴が明確になれば、より有効な抗がん剤のスクリーニング系が確立できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、正常細胞としてembryonic stem cell（ES細胞）を使用し、この細胞をマウスに移植することにより得られたがん組織から、がん幹細胞を特定の表現型により単離することに成功し、またこれらの細胞は試験管内で維持された。これら培養したがん幹細胞はマウスにおいて再度がんを構築し、これらがん組織は、移植したがん幹細胞とがん細胞からなり、がん幹細胞によるがん組織の構築に世界で初めて成功した。正常細胞からがん幹細胞を作成する方法、また、その単離方法も確立できたことから、これらがん幹細胞を用いて、がん新薬のスクリーニング、がん幹細胞診断薬の探索に応用でき、また個体を用いたがん幹細胞モデルにより、生体内でのがん幹細胞治療のモデルを提供する。このようながん幹細胞の作成の方法論は国内外で成功しておらず、がんの診断、治療において革新的な技術を提供すると考えられる。【０００９】
本発明は、以下のがん幹細胞及びその調製方法、がん幹細胞を阻害ないし抑制する薬剤のスクリーニング方法、該スクリーニングに使用できる細胞などを提供するものである。
項１．  ＳＬＤ５が高発現されているがん幹細胞。
項２．  ＳＬＤ５遺伝子の導入により形質転換された、項１に記載のがん幹細胞。
項３．  ＳＬＤ５が高発現されているがん細胞を選別することを特徴とする、がん幹細胞の調製方法。
項４．  薬物候補化合物の有無による細胞のＳＬＤ５の発現の増減を調べることを特徴とする、がん幹細胞に有効な抗がん剤のスクリーニング方法。
項５．  前記細胞が、ＳＬＤ５のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物もしくは発現ベクターを組み込むことにより形質転換された正常細胞またはがん細胞である、項４に記載の方法。
項６．  ＳＬＤ５遺伝子を正常細胞もしくはがん細胞に導入してＳＬＤ５を高発現させることを特徴とするがん幹細胞の調製方法。
項７．  ＳＬＤ５遺伝子の発現抑制剤を有効成分とするがん幹細胞増殖阻害剤。
項８．  ＳＬＤ５遺伝子の発現抑制剤が、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、項７に記載のがん幹細胞増殖阻害剤。
項９．  ＳＬＤ５のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物もしくは発現ベクターを組み込むことにより形質転換された細胞。
項１０．  項９の細胞の、がん幹細胞抑制剤のスクリーニングにおける使用。
項１１．  がん幹細胞を増殖することを特徴とするがん組織の構築方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者は、がん幹細胞を特定の表現型により単離することに成功し、がん幹細胞によるがん組織の構築に世界で初めて成功した。【００１１】
正常細胞からがん幹細胞を作成する方法、また、その単離方法も確立できたことから、これらがん幹細胞を用いて、がん新薬のスクリーニング、がん幹細胞診断薬の探索に応用でき、また個体を用いたがん幹細胞モデルにより、生体内でのがん幹細胞治療のモデルを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】がん細胞中のSLD5の発現トータルRNAを、様々なヒトガン、および正常組織細胞株における、SLD5の発現を定量RT-PCRによって解析した。数値は肝臓におけるmRNAの量で、標準化した。
【図２】マウスSLD5の標的破壊SLD5欠損マウスの作製。（A）エキソンは縦線によって表され、イントロンは横線で分断している。SLD5のエキソンは相同組み換えでベータ  ガラクトシターゼ遺伝子（LacZ）とMC1プロモーターによって作動する、ネオマイシン耐性遺伝子（Neo）に置換された。B、BamHI。この、標的遺伝子変異は、BamHI制限断片のサイズが3.8 kbpから3.4 kbpに減少する。（B）野生型（胎生１４日）と被標的化（＃４．５）ES細胞のサザンブロット解析は、SLD５の相同組み替えを立証した。（C）野生型（Wt１、Wt２、Wt３）、ヘテロSLD5変異体（Ht１、Ht２、Ht３）の精巣におけるSLD5mRNAの定量RT-PCR解析。数値は、Wt1の量でノーマライズ（標準化）した。
【図３】マウスの早期胚発生におけるSLD5の発現  SLD5の発現はX-gal染色によって可視化した。これは、SLD5の対立遺伝子座に標的化されたLacZの発現を検出したものである。（A）メスのSLD5+/-マウスから過排卵した卵母細胞。（B-G）オスのSLD5+/-マウスとメスの野生型マウスを掛け合わせて得た胚。（B）４細胞胚。（C）胚盤胞細胞。（D）胎生７．５日から得た胚。（E）胎生８．５日から得た胚。（F）胎生８．５日から得た胚。（G）胎生９．５日から得た胚。（D）野生型胎生９．５日から得た、陰性対象としての胚。
【図４】SLD5は胚発生に必須である  （A）野生型（+/+）およびSLD5-/-（-/-）胚の組織化学的解析。ヘマトキシリン・エオシン染色、胎生６．５日の胚の脱落膜の長軸切片像。Epcは栄養膜錐体（ectoplacental cone）、exeは胚外性外胚葉（embryonic endoderm）、eeは胚性内胚葉（embryonic endoderm）、バーは50 μmを表す。（B）ヘテロ接合体マウスの交雑によって得られた、胎生３．５日目の胚盤胞細胞は５日間培養し、PCRによってその遺伝子型を決定した。表示した図は、+/+および、-/-胚盤胞細胞の培養像である。ICMは矢印で示し、栄養芽細胞を矢頭で示した。スケールバーは100 μmを表す。（C）胚盤胞細胞の培養のBrdUとりこみ解析。抗BrdU抗体を用いた免疫化学染色を行った。上パネルの差込図は培養ディッシュの異なる視野である。ICMは矢印で示し、栄養芽細胞を矢頭で示した。SLD5欠損した胚盤胞培養細胞からはBrdUのとりこみは観察されなかったことが分かる。スケールバーは50 μmを表す。（D）胚盤胞細胞から得た、ICM培養細胞のアポトーシス。（TUNELアッセイ、緑はアポトーシスを引き起こした細胞）。核は、ヨウ化ピリジニウムで対称染色した。下パネルにて観察される巨大核は栄養芽細胞由来のものである。スケールバーは100 μmを表す。
【図５】SLD５はCSCに対するマーカーである。培地からLIFを除くことで分化を誘導した、（上）未分化SLD5+/-ES細胞のFACS解析、および（下）分化SLD5+/-ES細胞（＃４．５）のFACS解析。細胞は、抗E-カドヘリン、ベータガラクトシターゼ基質のFDGで染色した。（B）奇形腫アッセイの実験手順。Tx、移植。LT-Cult、長期培養。（C）SLD5+/-ES (#4.5)細胞のFACS解析。ES細胞はMEFｓなしで、２週間培養し、FDGで染色した。FDGhigh及び、FDGlow細胞集団を示したとおり、ソートした。（D）（C）で記載した、培養細胞からソートした。FDGhigh及び、FDGlow細胞のDNA含量。（E）奇形腫形成。（C）に記載した、104個のFDGhigh、及びFDGlow細胞、ソートされてない細胞をヌードマウスの皮下に注射した。奇形腫は、５週間後に摘出し、その重量を測定した。（F）細胞由来の奇形腫のFACS解析。すでに記載されたのと同様に、FDGhigh及び、FDGlow細胞集団をソートした。（G）（F）に記載した、ソートされた細胞の成長曲線（H）SLD5-/-の胚性ガン腫細胞のFACS解析。（F）に記載された奇形腫からソートされた細胞は、LIFなしで３０日間メンテナンスし、FDGで染色した。すでに記載されたのと同様に、FDGhigh及び、FDGlow細胞集団をソートした。（I）ソートされた細胞の細胞接着（Plating）効率。（H）に記載された１００個の細胞をΦ10 cmの培養ディッシュに播種し、１０日間培養した後、総コロニー数を数えた。１００個（播種した細胞数）中のコロニーの数の比は％で示した。（J）一細胞培養。（H）に記載した細胞からソートした１細胞を播種し、一細胞から得た細胞数を３日後に測定した。（K）２次奇形種形成。（H）に記載した細胞、104個をヌードマウスの皮下に注射した。奇形種は５週間後に摘出し、その重量を測定した。
【図６】奇形種組織の組織学的解析図５Cに記載し、得られた、細胞のFDGhigh（上段パネル）もしくはFDGlow（下段パネル）の初回移植で得られた奇形腫の低倍率像。(A) 1st Transplantation （B）図５Cに記載し、得られた、FDGhighSLD5+/- ES細胞の初回移植で得られた奇形腫を呈する様々な組織を示している（左上（muscle）、右上（epidermis）、左下（ephithelium）、右下（cartilage））。（C）図５H示したEC様細胞を連続的に移植した奇形腫の低倍率像。（D）（C）に示した二次移植ガン組織の様々な組織の奇形種に存在する様々な組織（左上（muscle）、右上（epidermis）、左下（ephithelium）、右下（cartilage））。
【図７】PSF1とPSF3の安定性の制御と、ガン細胞増殖にSLD5が不可欠である。（A、B）図５（G）に記載して得た、Hela細胞、HEK２９３T細胞（２９３T）およびEC細胞のRNAi処理を行った、96時間後の総細胞数。S5-6、S5-18の二つの異なるSLD5に対するRNAi。SCRは非特異的スクランブルshRNAで、陰性対象として用いた。（B）SLD５に対するshRNAで処理したHela細胞中にDNA量はフローサイトメトリーで決定した。スクランブルshRNAで処理した細胞をコントロールとして用いた。（C）（B）で示した、RNAiで処理した（SCRおよびSLD5）Hela細胞をPSF1-1、およびPSF3に対する抗体で染色した。PSF1およびPSF3の発現が、SLD5遺伝子のノックダウンによって弱められたことが分かる。（D）野生型（Wt）、およびSLD-/-（KO）の胚盤胞細胞は４日間培養し、その後ICM細胞から得た細胞を抗PSF1、および抗PSF3抗体で染色した。SLD5の欠失は、ICM由来細胞のPSF1およびPSF3の発現を弱めた。
【図８】奇形種組織のX-gal染色図５に示したように、FDGhigh細胞のヌードマウス（nu/nu）への連続注入によって、奇形種を得た。矢印は、X-galレベルの高い細胞を示している。矢頭はX-galレベルの低い細胞集団を示している。バーは20 μm。
【図９】プレーティング効率アッセイ図５Hに記載の、ソートされた１００個の細胞を１０cｍディッシュに播種し、コロニーをギムザ染色した。
【図１０】ＳＬＤ５の転写活性を可視化したマウスＥＳ細胞を樹立した本発明のスキームを概略的に示す。Ａは、Sld5の転写活性を可視化したＥＳ細胞樹立成功を示す。（ａ）は、LacZ弱陽性ＥＳ細胞を示し、（ｂ）は、LacZ強陽性ＥＳ細胞を示す。（ｃ）は、LacZ弱陽性がん細胞を示し、（ｄ）は、LacZ強陽性がん幹細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
抗がん剤の発展において、第一にガン細胞に対する選択的な毒性を生み出すことが重要である。この目的を達成するためには、最も可能性のあるターゲット遺伝子の候補が、基本的なガンの増殖（ガン細胞の増殖の増大、もしくはガン細胞の死の減少、もしくはその両方）に寄与する経路に関与することが必要である。ほとんどの体細胞ホスト細胞は定常状態で増殖できないにもかかわらず、ガン細胞は絶え間なく増殖できるので、ゆえに細胞分裂関連分子を標的とした、いくつかの抗ガン剤が開発されている。例えば、チミジル酸シンターゼ阻害薬として使われる、５-FU剤（chemotherapy agent 5-fluorouracil）化学療法である。この酵素はDNA複製に必須で、葉酸補因子によって供給されるメチル基を用いることで、チミジン核酸前駆体の合成を触媒する(Sampath et al., 2003)。加えて、ガンの増殖において決定的な遺伝子の抑制のために、RNAi技術を用いた遺伝子サイレンシングが発達してきており、インビボやインビトロにおいて、顕著な抗増殖効果や、アポトーシス促進効果を示している(Pai et al., 2006)。ゆえに、ガン細胞増殖の正確な分子解析が、抗ガン剤開発において重要である。
【００１５】
DNA複製の開始は、複製起点における、多数からなる複合体に関与するしっかりと秩序だった一連の段階を経て、コントロールされている(Blow and Dutta, 2005; Takahashi et al., 2005)。この段階は、６つのサブユニットからなる起点認識複合体（ORC）が複製起点に結合することで開始する。CDC6とCdt1は、Mcm2-7 (minichromosome maintenance)複合体に対するローディングファクターとして働くことで、ORCに結合し、その後、前複製複合体(pre-RC)が形成される。細胞周期におけるG1/S移行期において、前複製複合体は開始複合体(ICs)へと変化する。MCMヘリカーゼの活性化には、DDK(Cdc7-Dbf4)とCDK(cyclin-dependent)といった、二つのタンパク質リン酸化酵素だけでなく、Mcm10、Cdc45、Dpb11、Sld2（synthetic lethal with dpb11 mutant-2）、Sld3そしてGINSを含む、少なくとも８つの追加ファクターの関与が必要である(Labib and Gambus, 2007)。GINSは近年、新規へテロ４量体複合体形成タンパク質として、下等真核生物より同定された。この複合体はSLD5、PSF1、PSF2、PSF3の四つのサブユニットからなり、それぞれ大体２００アミノ酸残基で、真核生物内において高く保存されている。GINSは真核生物における、DNA複製の際の開始、進行共に重要である(Kanemaki et al., 2003; Kubota et al., 2003; Takayama et al., 2003)。
【００１６】
哺乳類の、ほとんどの成体における体細胞は細胞分裂が停止している。しかしながら、骨髄内の特に造血幹細胞（HSC）や、血管ニッチに存在する幹細胞集団では細胞周期が活発である（Morrison and Spradling, 2008)。成人体細胞の増大に関与する遺伝子を発見するために、ガン細胞の増殖を以下に解析した。HSC特異的なライブラリーを構築し、PSF-1 (partner of sld5-1)と、その結合相手のSLD5のオルソログクローンマウス作成した(Ueno et al., 2005; Kong et al. 2005)。GINSをコードしているすべての遺伝子は下等真核生物において、進化的に保存されており、細胞増殖に不可欠である(Kanemaki et al., 2003; Kubota et al., 2003; Takayama et al., 2003)。しかしながら、哺乳類細胞における、GINS複合体の機能はまだ理解されていない。近年、幹細胞系が正常器官/組織のみならず、ガンにおいても、共通に使われていることが提唱された。なぜなら、多数のガンのクローン的な起源があるにもかわらず、多くの研究では増殖や分化について、ガン細胞集団が異種のものであるということが示唆されており、また何名かの研究者たちは、ガン細胞における小規模な亜集団のみが、例えば、ガン原始細胞やガン幹細胞（CSC）のみが、白血病や固形ガンにおいてガン新生を形成する能力を持っていることを立証した。このCSC仮説は、新たな見込みのある実例であり、潜在的にガンの診断や取り扱いに影響を及ぼす可能性がある。ゆえに、遺伝子治療のための抗ガン剤の発展において、すべての増殖しているガン細胞だけでなく、休止状態、もしくは増殖しているCSC細胞に対しても殺傷する狙いを付けることが重要である(Blagosklonny, 2004; Massard et al., 2006)。ゆえに、固形ガンからのガン幹細胞の単離は、基礎、及び応用研究に対して重要な意味合いを持っている。にもかかわらず、現在はCSCの性質（nature）や、幹細胞性（Stemness）や自己再生脳の制御機構に関する情報は少ない。CSCの特異的マーカーやCSC増殖に関するシグナル伝達の同定が、新たなガン治療の標的の提供を解明するのに必要である。本研究においては、我々は、マウスのSLD5遺伝子の標的破壊によって内細胞塊（ICM）の細胞増殖におけるSLD５の重要な役割を立証した。さらに、SLD5の対立遺伝子にLacZ遺伝子をノックインすることで発現させたES細胞を用いた奇形種モデルで、SLD5遺伝子が転写的に活性化している細胞が、奇形種幹細胞が濃縮されることを、我々は立証し、またSLD5の発現のサイレンシングにより、ガン細胞の増殖が減少することも立証した。これらのデータは明らかにSLD５が哺乳類細胞の増殖に必須で、がん幹細胞にとっての有用なバイオマーカーであることを示している。
【００１７】
SLD5は、PSF1、PFS2、PFS3とともに染色体DNA複製に関与していることが示されており、その遺伝子配列、プロモーター配列は以下のとおりである。
ヒトSLD5遺伝子配列（アクセッション番号： AAH05995）
マウスSLD5遺伝子配列（アクセッション番号：AK076104）
ヒトSLD5プロモーター配列（アクセッション番号：NW_001839130, 652967-702969）
マウスSLD5プロモーター配列（アクセッション番号： NT_039457, 2309419- 2314418）
SLD5遺伝子の発現の評価は、ノーザンブロッティングによるmRNAの発現レベルの測定、ウエスタンブロッティングによる発現タンパク質の量の測定、SLD5プロモーターにレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物／発現ベクターで細胞（ＲＳ細胞やｉＰＳなどの万能細胞、がん細胞など）を形質転換することにより、レポーター遺伝子産物に基づくSLD5プロモーター活性の測定などにより行うことができる。SLD5プロモーターに発現可能に連結したレポーター遺伝子を含む遺伝子構築物／発現ベクターによる形質転換は、ランダムに染色体にこれら遺伝子構築物／発現ベクターを組み込んでも良く、相同組換えにより特定の位置(たとえばSLD5遺伝子)に組み込んでも良い。なお、相同組換えによりSLD5遺伝子の位置にレポーター遺伝子を組み込む場合には、レポーター遺伝子にプロモーターを必ずしも連結する必要はなく、細胞内に本来存在するSLD5プロモーターにレポーター遺伝子が発現可能なように組み込まれるように遺伝子構築物／発現ベクターを設計しても良い。
【００１８】
SLD5遺伝子またはプロモーターを含む遺伝子構築物／発現ベクターは、正常細胞ないしがん細胞に組み込まれる。SLD5はPSF1,PSF2,PSF3と複合体を形成し、SLD5と協調して機能するため、SLD5の代わりに、PSF1,PSF2,PSF3を用いてもかまわない。
【００１９】
正常細胞としては、がん細胞になり得る細胞であり、たとえばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、などのがん化可能な多能性幹細胞が挙げられ、がん細胞としては、Ｌ１２１０、Ａ５４９、ＳＫＯＶ−３、ＭＣＦ−７、ＳＫＭＥＬ−２、ＨＣＴ−１５、HeLa, LLC(マウス肺癌細胞), B16（マウスメラノーマ）, colon26 (マウス大腸癌細胞),  C6(ラットグリオーマ)などの株化細胞が挙げられる。
【００２０】
上記多能性幹細胞は、たとえばヌードマウスなどの動物に移植することにより、がん化した細胞に転換することができる。
【００２１】
SLD5遺伝子を高発現するがん細胞は、がん幹細胞であり、癌の増殖や転移に非常に重要である。本発明により得られたがん幹細胞は、これに対して薬物候補物質を作用させて、抗がん作用の強い物質を選別することにより、有効な抗がん剤を容易にスクリーニングすることができる。特に、SLD5が低発現である通常のがん細胞よりもがん幹細胞に強い作用を有する物質は、抗がん剤として特に有用であり、転移を有効に抑制することができる。
【００２２】
本発明によれば、ＳＬＤ５遺伝子を恒常性プロモーターなどの強力に発現するプロモーターに連結して細胞(特にがん細胞)に組み込むことで、がん幹細胞を作製することができる。得られたがん幹細胞は、抗がん剤のスクリーニングに好ましく使用できる。
【００２３】
本発明により、がん幹細胞は、ＳＬＤ５遺伝子の発現量が高いものであることが実証された。ここで、「ＳＬＤ５遺伝子の発現量が高い」とは、癌細胞株の標準的なＳＬＤ５発現量よりも有意に高い発現量を有することを意味する。たとえばがん細胞株では、がん幹細胞は通常５％以下、さらには3％以下、特に1％程度であると考えられる。したがって、ＳＬＤ５遺伝子の発現量が上位の５％程度以下、さらには3％程度以下、特に1％程度を選別することで、がん幹細胞に富む細胞が分離できる。あるいは、ＳＬＤ５遺伝子を強力なプロモータの制御下に組み込んだ遺伝子構築物/発現ベクターで細胞(たとえば多能性幹細胞)を形質転換することで、がん幹細胞を得ることができる。
【００２４】
がん幹細胞の分離は、タンパク質またはｍＲＮＡに基づきＳＬＤ５遺伝子の発現量を測定することにより行うこともできる。好適には、ＳＬＤ５プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を組み込むことで、容易にがん幹細胞を分離・精製できる。レポーター遺伝子としては、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子および蛍光タンパク質（ＧＦＰ．ＹＦＰ、ＲＦＰなど）遺伝子が挙げられる。
【００２５】
本発明により、ＳＬＤ５を抑制すれば、がん幹細胞の働きを抑制し、癌の増殖、転移を効果的に抑制できることが明らかになった。したがって、ＳＬＤ５の抑制剤は、癌の増殖・転移を抑制する抗がん剤として機能することができる。ＳＬＤ５の抑制剤としては、ＳＬＤ５の遺伝子発現を抑制する物質が該当し、ＳＬＤ５のアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが抗がん剤として機能し得る。
【００２６】
また、抗がん剤のスクリーニングは、ＳＬＤ５の発現抑制を指標に実施することができる。たとえばＳＬＤ５の発現量がレポーター遺伝子により可視化された細胞を用いる場合、薬物候補物質の存在下でＳＬＤ５の発現量が抑制されるか否かを観察することにより、がん幹細胞を抑制できる抗がん剤を製造することができる。ＳＬＤ５を選択的に抑制する物質は、副作用の低い抗がん剤であることが期待できる。
【００２７】
以下、マウスのＥＳ細胞からがん幹細胞を得る方法を例にとって、より詳細に説明する。
【００２８】
本発明で用いる、マウスのES細胞はあらかじめ、幹細胞系列の細胞に発現が観察されるDNA複製因子複合体(GINS複合体)を構成するPSF1, SLD5, PSF2, PSF3の中で、SLD5の遺伝子座にLacZ遺伝子が挿入されている。ES細胞を未分化な幹細胞状態で培養すると、SLD5遺伝子のプロモーター活性が維持され、LacZ染色により染色される。しかし、このES細胞を分化させる条件で培養すると、LacZの発現は消失する。よって、このLacZの発現により、幹細胞性を可視化できる。通常ES細胞をマウスの皮下や、腎臓皮膜下に移植すると、100％に近い確率で奇形腫が形成されるが、あらかじめ、我々が作成したES細胞を数日間ES細胞が分化する条件で培養し、ES細胞であり続けている細胞と、分化しかかったES細胞が混在した条件を作成し、この条件で培養された細胞の中からLacZの発現が高いES細胞を移植すると、LacZの発現が低いES細胞に比べ、腫瘍サイズのきわめて大きな腫瘍が形成される。一旦、生体内に移植されたES細胞は生体内ではES細胞としては存在せず、分化するか、あるいは奇形腫細胞として腫瘍形成細胞として存在することが知られている。そこで、再度、本発明で用いているES細胞により構築された腫瘍から、LacZの発現を指標に腫瘍細胞を分画して試験管内で培養すると、LacZの発現の低い腫瘍細胞は20日間ほど継代することが可能であったがその後死滅した。しかし、LacZの発現が高い腫瘍細胞は無期限的に細胞増殖が維持され、最低でも60日間の継代が可能である。LacZの低い細胞から由来する培養腫瘍細胞はすでに生体に移植しても、造腫瘍能は低下していたが、LacZの高い細胞に由来する培養腫瘍細胞は培養後さらにLacZの高い細胞群と、低い細胞群に分画され、このうちLacZの発現の高い培養腫瘍細胞を生体へ移植すると高い造腫瘍能を有している。さらにLacZの高い腫瘍細胞は、生体内でLacZの高い細胞と低い腫瘍細胞に分裂する、いわゆる分化能を有している。がん幹細胞の定義は、がん幹細胞はいわゆるがん細胞を産生するという分化能と、さらに、最初に移植したがん幹細胞により形成された腫瘍中に同じ表現型を示すがん幹細胞が存在し、これらを再度純化して移植すれば、がんが形成されるといういわゆる再移植能を獲得していることである。本発明で単離される、がん細胞はこの定義に完全にあてはまる。以上より、本発明では、正常細胞からスタートして、がん幹細胞を作成／単離／増殖することに成功し、さらに個体を用いたがん幹細胞モデルが構築されたといえる。
【００２９】
本発明で用いる、マウスのES細胞のSLD5の遺伝子座にLacZ遺伝子及びネオマイシン耐性酵素遺伝子が挿入された、本発明の組換えES細胞（識別のための表示：SLD5 KO 080505）は、受領番号FERM AP-21576として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東一丁目１番地１中央６）に２００８年９月３０日付で寄託されている。また、この菌株は現在国際寄託に移管されており、その受領番号はＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１１２９であり、寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２９となる。
【００３０】
本発明の各種応用例を、以下に示す。
・単離されたがん幹細胞に発現する分子標的の探索から、がん幹細胞診断薬、診断法の開発
・ がん幹細胞を殺傷する薬剤のスクリーニング
・ がん幹細胞腫瘍モデルを用いた個体におけるがん幹細胞の診断、治療法の開発
・ ES細胞に各臓器特有のがん原遺伝子を導入しておくことで、奇形腫だけでなく、大腸がん、肝臓がんなどのがん幹細胞の単離への応用
・ DNA複製因子複合体GINSの他の遺伝子のプロモーター活性を指標にしたがん幹細胞モデルの作成
・ES細胞あるいは近年話題となっている万能細胞iPS細胞を用いた再生医療が近い将来臨床現場で行われようとしているが、これら細胞を用いた際、がんの発生が危惧されている。本発明では、ES細胞からのがん幹細胞の作成に成功していることから、ES, iPS細胞の再生医療に付随するおそれのある、がんに対する治療薬の開発
【００３１】
ＳＬＤ５の転写活性を可視化したマウスＥＳ細胞を樹立した本発明のスキームを図１０に概略的に示し、具体的なプロトコルを、以下の(i)〜(vi)に示す。
(i) Sld5の遺伝子座にLacZを発現するES細胞をhomologous recombinationにより作成し、フローサイトメトリーを用いて、数日間分化条件で培養後にLacZ強陽性のES細胞と、弱陽性のES細胞に分画。
(ii) Sld5プロモーター活性をLacZの発現強度により分画してマウスに移植すると、LacZ強陽性のES細胞はきわめて大きな腫瘍を形成する。
(iii) このLacZ強陽性のES細胞に形成された腫瘍から細胞を回収し、フローサイトメトリーで解析すると、腫瘍中にはLacZ強陽性と弱陽性の腫瘍細胞により構築されていることが分かる。
(iv) そこで、LacZの発現強度により、腫瘍細胞を分画して試験管内で培養すると、LacZ強陽性の細胞は無尽蔵に増殖傾向を示すのに対して、LacZ弱陽性の細胞は、長期には維持されない。
(v) LacZ強陽性に由来する細胞を長期に培養した後に、再度LacZの発現強度を観察すると、これらの中にも再度LacZの陽性度の異なる細胞が存在する。
(vi) そこで、長期培養後の腫瘍からの細胞をLacZの発現強度により分画してマウスに移植すると、LacZ強陽性の細胞は、LacZ陰性の細胞に比べ、がんの形成効率がきわめて高く、また大きな癌の形成を誘導する。これら、LacZ陽性がん細胞は、LacZ陰性のがん細胞にも分化していることから、がん幹細胞の表現型と一致した。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。【００３３】
実施例１
実験手順
動物
BALB/c, KSN 、C57BL/6マウス、およびFischer ラットは日本SLCより購入した（静岡、日本）。すべての動物実験は大阪大学動物飼育・使用委員会に承認された。【００３４】
定量RT-PCR
定量リアルタイムRT-PCRのために、トータルRNAはRNAeasy kit (キアゲン, チャットワース, ファリフォルニア)を用いて得た。ヒト肝臓、および肺由来のトータルRNAはクロンテック (マウンテンビュー, カリフォルニア)より購入した。RNAはTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (ロシュダイアグノスティックス, インディアナポリス, インディアナ)とオリゴdTプライマーを用いて逆転写した。定量RT-PCRは、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (インビトロジェン, カールスバッド, カリフォルニア)を用いて、Mx3000 (ストラタジーン, ラ・ジョラ, カリフォルニア)装置にて行った特異的遺伝子に対する値は、ハウスキーピングコントロールにGAPDHを用いて標準化した。使用したプライマーセットは以下に示す。配列番号１：5’-GAT CCG CTA TGT CCT CAG CAG C-3’ and配列番号２：5’-GTG TGG TCC ATA TAC TCT TTG-3’ (マウスSLD5); 配列番号３：5’-GAA GGG CTC ATG ACC ACA GT-3’ and配列番号４：5’-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3’ (マウス GAPDH); 配列番号５：5’-TCC GCT ACG TCC TCA GCA GC-3’ and配列番号６：5’-GTG TTC GCC ATG AAC TCT CTG-3’ (ヒト SLD5); 配列番号７：5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’ and配列番号８：5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’ (ヒト GAPDH).【００３５】
SLD5への遺伝子標的化
プローブとして、マウスSLD5cDNAを使って、マウスSLD5遺伝子をコードするゲノムクローンを、129Sv/Jマウスライブラリー(ストラタジーン)より単離した。標的構築物において、開始ATGを持つエキソン２とエキソン５の間を、NLS-beta-galactosidase遺伝子と、pMC1-ネオマイシン耐性遺伝子で置換した。この構築物はXhoIで直鎖化し、129Sv/J E14.1 ES cellsにエレクトロポレーションで導入した。G418耐性クローンを選抜し、正しい組み換えが起こっているか判断するPCR法とサザンブロット解析によって、スクリーニングを行った。キメラマウスの作製は (Ueno et al. 2005)に記載された方法で作成した。オスのキメラマウスを、メスのC57BL/6J マウスと掛け合わせ、SLD5+/-の遺伝子型を得るために、子孫をPCR法とサザンブロット解析によって、スクリーニングした。胚は(Ueno et al. 2005)に記載された方法で回収し、培養を行った。組織学的観察とBrdU結合アッセイも(Ueno et al. 2005)に記載された方法で行った。【００３６】
Beta-Galアッセイ
X-Gal染色において、解剖した胚や組織は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の４％パラフォルムアルデヒド（PFA）１５分から６０分（ステージによる）、氷上で固定を行った。胚は、リン酸緩衝生理食塩水で二度洗浄した後、1 mg/ml X-Gal（和光純薬工業、大阪、日本）、2 mM MgCl2、0.02% NP-40、5 mM K4Fe(CN)6、および5 mM K3Fe(CN)6を含むリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.5）を用いて、３７℃、4-16時間、振盪させながらX-Gal染色を行った。胚は、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、4% PFAで、さらに一晩固定を行った。ソーティング解析では、生存に影響を及ぼさないベータガラクトシターゼ基質のフルオレセイン-ベータ-D-ガラクトロ-ピラノシド（fluorescein-di-beta-D-galacto-pyranoside（FDG;モレキュラ  プローブ、ユージーン、オレゴン)）を用い、製造元のプロトコルに従って、細胞に取り込ませた。細胞はJSAN（ベイ  バイオサイエンス、神戸、日本）によって同定し、ソートした。最も高い蛍光値１０％（FDGhigh）もしくは、より低い蛍光値（FDGlow）の細胞を回収した。【００３７】
細胞培養
NIH3T3、HEK293T、およびHeLa細胞はATCCより入手し、１０％仔牛由来血清（FCS）と、100 units/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシンを添加したDMEM中、5% CO2、37°Cでメンテナンスした。形質転換はリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）用いて行った。EC細胞には、プラスミドはヌクレオファクター（アマクサ  バイオシステムズ、コロゲン、ドイツ）を用いて形質転換した。細胞は、回収し、細胞接着を促進するため、播いて一晩培養を行った。RNAiの研究では、形質転換した細胞は形質転換後24時間に形質転換細胞の質を高めるために細胞を1 μg/ml のプロマイシン（シグマ、セントルイス、ミズーリ）で処理した。【００３８】
乳ガン細胞株（MCF７）、胃ガン細胞株（HGC27およびAZ521）、結腸ガン細胞株（HCT116、Colo320DM、およびSW837）、肺ガン細胞株（LLC）、前立腺ガン細胞株（PC3）はユツド博士（大阪大学、日本）より、厚意に贈呈された。【００３９】
奇形種アッセイでは、ES細胞は（(E14.1 SLD5+/LacZ）は、ゼラチンコートを施したディッシュにて、15 ％仔牛由来血清（FCS）と、100 units/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、0.1 mMのnone-essential amino asides、0.11 μg/mlのピルビンサンナトリウム、0.1mM β-メルカプトエタノール、及び 1,000 U/mlの白血病抑制因子（LIF）を添加したDMEMで、フィーダーフリー培養した。奇形腫から得たEC様細胞は、上記培地から、LIFを除いたものでメンテナンスした。【００４０】
FACS解析
DNA含有量と細胞表層抗原の解析には、（Takakura et al., 1998; Takakura et al. 2000; Nitta et a. 2004) に記載された手法で行った。E-カドヘリン染色では、抗E-カドヘリン抗体（DECMA-1; シグマ）を一次抗体として用いた。【００４１】
奇形腫アッセイ
皮下移植には、KSNヌードマウスに100 μlのマトリゲル（BD  バイオサイエンス）と共に104個の細胞を注入した。移植５週間後、ガンを取り出し、重量の測定を行った。組織化学解析は（Ueno et al., 2005）に記載した方法で行った。【００４２】
抗体
モノクローナル抗PSF-1、PSF-3抗体の作製のために、それぞれ、全長のアミノ酸残基をコードするcDNAをPCR法によって増幅させた。その後DNA断片はpGEX-2T（GE  ヘルスケア、バッキンガムシャー、イングランド）ベクターに組み込み、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質の調製を行い、精製GST融合タンパク質は、マウス、もしくはラットへ免疫付加する抗原として用いた。そして、ハイブリドーマ細胞を常法に従って樹立した。最終的に安定したハイブリドーマ細胞株が得られ、クローン化されたものは以下の通りである。Aho57.2（抗PSF1）、aps3.2およびaps3.14（asp3.2は抗PSF3として用いた）。すべての抗体の特異性は免疫ブロット法、及び免疫細胞化学法にて解析した。【００４３】
プラスミド構築
一過性にshRNAベクターで形質転換した細胞の質を高めるため、プロマイシン耐性遺伝子を、pSINsi-hU6（タカラ、大阪、日本）ベクターのXhoIサイトに組み込んだ。そしてその後、センス鎖、アンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを対合させ、pSINsi-hU6-PベクターのBamHI/ClaIサイトに組み込んだ。使用したオリゴヌクレオチドを下に示す（下線はRNA干渉の対象配列を表す）配列番号９：5’-GATCCGGCA GTT CCC AAA CCA GATCTT TCA AGA GAAGAT CTG GTT TGG GAACTG CCC TTT TTT AT-3’および配列番号１０：5’-CGA TAA AAA AGG GCA GTT CCC AAACCA GATCTT CTC TTG AAA GAT CTG GTT TGGGAACTG CCG-3’ (for SLD5; S5-6)、配列番号１１：5’-GAT CCG CCTTTG CCA GAG AGT TCA TGT TCA AGA GACATG AAC TCT CTG GCA AAGGCC TTT TTT AT-3’及び、配列番号１２：5’-CGA TAA AAA AGG CCTTTG CCA GAG AGTTCA TGT CTC TTG AACATG AAC TCT CTG GCAAAG GCG-3’ (SLD5; S5-18)、配列番号１３：5’-GAT CCG ATC GTTGGTGTG GTG GGT CGT TCA AGA GAA CTA CCATGCTCC CAT GAA CAT TTT TTA T-3’および、配列番号１４：5’-CGA TAA AAA ATG TTC ATGGGA GCA TGG TAG TTC TCT TGA ACG ACCCAC CAC ACC AAC GATCG-3’ (スクランブルヌクレオチド SCR).【００４４】
免疫細胞化学
PSF-1の染色において、細胞は室温で4 %のPFAで１５分固定した。PSF3の染色では冷メタノールを用いて固定した。その後、0.5 %のTriton X-100の入った、リン酸緩衝生理食塩水で、細胞透過化を行った。続いて三回洗浄した後、細胞を様々な抗体とインキュベートし、その後リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次にCy-3結合抗マウスIgG抗体（ジャクソン  イムノリサーチ、ウエストグローブ、ペンシルバニア）と、インキュベートした。核内のDNAをヨウ化プロピジウム（シグマ）で対比染色を行った。【００４５】
結果
SLD５はヒトガン細胞株において高く発現している。
本発明者は、高い増殖能を持つ細胞でもあるガン細胞のSLD５の発現を解析するために、様々な株化ガン細胞や正常組織におけるSLD５mRNAの発現量を定量RT-PCRによって解析した。株化ガン細胞は全体的に正常肺細胞と比較して３から１６倍のSLD５発現レベルであることが示された（図１）。さらに、SLD5と共にGINS複合体の構成要素であるPSF1の発現もSLD5の発現と同様に観測された（未発表データ）。これらのデータは、SLD５の発現が、様々なガンの進行や、様々な種類のガンの有用なマーカーに関与しているかもしれないことを示している。【００４６】
SLD５遺伝子座への無発現変異(null mutation)の作成
哺乳類細胞におけるSLD5の生理的機能を知るために我々はSLD5欠損マウスを作成した。戦略として、始めのATGを有するエキソン２とエキソン５の間を、一般的な遺伝子標的技術を用いて、NLS-beta-galactosidase遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子に置換することで変異導入した（図２）。２２個の独立したES細胞を検査したところ、我々は、一つの相同組換体を得ることに成功した（＃４．５）。正しくSLD5遺伝子座に標的されていることを、標的ベクターの外側の３‘プローブを用いたサザンブロットにて確認した（図２B）。【００４７】
得られたESクローン＃４．５（識別のための表示：SLD5 KO 080505）は、受領番号FERM AP-21576として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東一丁目１番地１中央６）に２００８年９月３０日付で寄託されている。また、この菌株は現在国際寄託に移管されており、その受領番号はＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１１２９であり、寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１２９となる。ES クローン＃４．５のために、C57BL/6の胚盤胞細胞と凝集させ、その後続いて生殖細胞系へ伝達を行うキメラ作成させた。遺伝子破壊変異マウスにおける、SLD5転写の喪失を確認するために、精巣における定量RT-PCRを行った。予想通り、野生型マウスと比較して、SLD５+/-マウスでは精巣でのSLD５mRNAの発現量が半分であった（図２C）。SLD５+/-マウスはメンデルの頻度で生まれ、SLD５＋/−ヘテロ接合体マウスは正常な表現型を呈し、概して健康であった。そして、６ヶ月齢で妊娠期に入った。【００４８】
胚発生時におけるSLD5の発現
胚におけるSLD５の発現の解析を行うため、我々はベータガラクトシターゼ遺伝子カセットの利点を用いた。これによって、結果として内在性のSLD５プロモーターの転写制御領域の下にLacZの発現が生じ、次にSLD５の発現を模倣するレポーターとしてX-Gal染色が可能となる。SLD５+/-のメスのマウスから得た未受精の卵母細胞はX-Gal発現に陽性であった（図３A）。このことは、SLD５転写物（及び可能性としては、母由来のSLD5タンパク質）が、成熟卵母細胞に存在していることを示唆している。野生型メスのマウスをSLD５+/-のオスのマウスと掛け合わせたら、SLD5の転写産物は4細胞期ぐらいで始まる（図３B）。胚盤胞細胞では、内細胞塊において高いX-Galシグナルが検出された（図３C）。我々はさらに、胎生７．５日から９．５日にかけての胚発生の際のSLD5の発現を検討した。X-Galのシグナルは胎生７．５日目に胚外部ではなく胚内部の性質（intra-embryonic property）として観察された（図３D）。８．５日目には特にヘッドフォールドや神経冠でシグナルが観察された（図３E）。さらに、胎生９．５日目にはユビキタスにX-Gal染色が確認され（図３G）、野生型ではX-Gal染色は確認できなかった（図３H）。しかしながら、成体では、PSF1の発現が確認され、精巣、卵巣、骨髄を除く部位でのLacZ陽性細胞は確認できなかった（未発表データ）(Ueno et al., 2005)。これらのことから、SLD5の発現プロファイルは、株化ガン細胞由来の細胞や胚由来の細胞、成体における骨髄や精巣、卵巣の幹細胞、前駆体細胞のように、急速な細胞分裂を行っている細胞で、SLD５が発現していることが示された。【００４９】
SLD5は初期胚発生に必須である。
インビボにおけるSLD5の機能を決定するために、SLD5-/-マウスの作製として、SLD5+/-マウスの交配を行った。しかしながら、SLD5-/-胎仔を得ることはできなかった（表１）。我々は次に、様々なステージの胚の遺伝子型を解析し、単離することで、胎生３．５日目の胚盤胞期胚を見つけた（表１）。正常胚の６．５日目には、円柱状の二層の構造が、組織化学的な研究によって観察された。しかしながら。SLD5-/-胚にはそのような構造は見られなかった（図４A）。これらの結果は、SLD5-/-胚が、胚盤胞細胞間で生存し、その後着床に進んだということを示している。しかしながら、変異体は脱落膜において出血を誘発し、続いて着床後すぐに死亡した。さらに、SLD5-/-表現型を調べるために、SLD5+/-を掛け合わせてできた胚盤胞細胞をインビトロで５日間まで培養することができた（図４B）。SLD5+/+およびSLD5-/-の胚盤胞細胞共に透明体より孵化し、二日間の培養ディッシュでの接着培養に成功した。巨大栄養芽細胞の発達が両遺伝子型について確認ができた。しかしながら、将来的に胚組織を形成するICM細胞はSLD5-/-胚盤胞では成長できなかった。BrdUとりこみアッセイで、初めの５日間はSLD5+/+ICM細胞と栄養芽細胞中で、DNA合成が確認された。しかしながら、SLD5-/-の胚の培養ではBrdUのとりこみは見られず（図４C）、その上SLD5-/-の胚盤胞の培養のICM細胞において、TUNELアポトーシス陽性細胞が培養４日目に表れた（図４D）。ゆえに、SLD5-/-ICM細胞では、増殖することができず、培養ではアポトーシスを受けることになる。これらのデータは、SLD5が初期胚発生における、ES細胞の起源として知られるICM由来の細胞の増殖に必須であることが明白になり示唆している。【００５０】
【表１】
2009142271.tif 000002
【００５１】
NDa, 測定せず。17 E5.5及び27 E6.5胎児embryos の遺伝子型は決定されなかった。NAb, 入手困難。この表は、研究対象のSLD5ヘテロ接合体の交配により得られた子孫の数を示す。【００５２】
SLD５はCSCに対する有用なマーカー
ES細胞はICM由来の多分化能を持った細胞で、その多分化性は白血病阻害因子（LIF）存在下の培養で維持される（Smith, 1992）。ES細胞は、染色体異常を持たないにもかかわらず、未成熟ES細胞は、インビボの移植によってガン（奇形腫、および奇形ガン）を形成する。ES細胞は特にRas様ガン遺伝子E-Rasを発現しているので、腫瘍原性を示す（Takahashi et al., 2003）。成長培地から、LIFを除くと、ES細胞は結果として分化し（Smith, 1992）、ES細胞はガン形成能を失う（Nishimoto et al., 2005）。【００５３】
ES細胞内におけるSLD5の発現レベルが未成熟状態に関与するかどうかを調べるために、蛍光ベータガラクトシターゼ基質（FDG）を用いたフローサイトメトリーにて、図２に記載したSLD5+/-ES細胞(#4.5)における、ベータガラクトシターゼ活性を測定した（図５A）。SLD5+/- ES細胞は、FDGと抗E-カドヘリン（E-cad）抗体とを用いて共染色を行った。E-cadはES細胞と上皮細胞に発現し、E-cadのES細胞における発現が、中胚葉系列細胞への分化の際にダウンレギュレーションされることが広く知られている（Nishikawa et al, 1998; Spencer et al. 2007）。培養培地からLIFを除くことによってES細胞の分化が引き起こされた後に、E-カドヘリンの一様な染色ピークが確認された（図５A）。LIFのない培養１３日目には、E-カドヘリン-の分化した細胞集団が確認され、FDG-（SLD5-）細胞集団（図５A、青枠内）及びFDGhigh細胞集団が、分化したES細胞（赤枠内）において減少した。これらのデータはSLD5の発現レベルが、ES細胞の未熟な状態と関連していることを示唆している。近年、ガンはガン幹細胞（CSC）と呼ばれる異なる生物学的特性を持った異種の細胞集団の階層に含まれ、ガン形成及びガンの成長を維持する能力は、ガン細胞内の小規模なガン幹細胞や、ガン原始細胞と呼ばれる細胞集団に排他的に備わっているという、ガン幹細胞仮説を支持する証拠が報告されてきている（Reya et al., 2001; Marx, 2003; Pardal et al., 2003）。これらの細胞は、分化済み細胞と共に幹細胞を有しており、奇形ガンは、連続的に移植を行うことで、二次的にガンを形成することができる（Kleinsmith and Pierce, 1964）。一方で、奇形腫は未分化な部分を欠いている（Chambers and Smith, 2004）。ES細胞におけるSLD5の発現と、腫瘍原性の関係を知るために、我々は、連続的に移植する実験を行った（図５B）。ES細胞そのものが、高い増殖能力に対するものと、同等の可能性を持つと解釈されるのでES細胞の通常培養法における、SLD5の発現と関連する細胞増殖能力を判断するのは難しい。親の胎生１４日目のES細胞は、未熟な状態を維持するのにフィーダー細胞に頼ることになる（Hooper et al., 1987）。ゆえに、フィーダー細胞なしでの培養条件では、ES細胞の２週間培養後には、図２Aで観察されたような、未熟なES細胞、及び不均一に分化した細胞を含む培養を得る必要がある。ES細胞は高い増殖能を持っており、そしてそれから、もしもES細胞が分化誘導後の培養中に留まっていれば、これらの細胞はSLD5の強い発現があり、SLDの弱い陽性細胞と比較して、効率的に奇形腫/奇形ガンを引き起こしたであろう。よって、SLD5の細胞内発現レベルが生存活性と関連するかどうか調べるためには、フィーダー細胞なしでSLD5+/-ES細胞を２週間培養し、この培養条件中にてFDGhigh及びFDGlowの細胞集団を観察した（図５C）。細胞周期解析では、FDGlow細胞集団と比較して、FDGhigh細胞集団がS期、およびG2期の細胞をたくさん含んでいることが明らかになり（図５D）、SLD5の高い発現は細胞増殖状態と関連性があることを示唆している。【００５４】
次に我々は、細胞内のSLD5の発現レベルが腫瘍原性と関連があるかどうか調べるために、ES細胞由来のソートされたFDGhigh及びFDGlowの細胞集団を図５Cで観察されたようにフィーダー細胞なしで培養を行い、免疫不全マウスに移植した。５週間後、FDGhigh細胞集団から得たガンは、FDGlowの細胞集団と比較して。有意に大きなガン形成が確認された（図５E）。FDGhigh細胞集団由来のガンは、筋細胞、表皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞などの様々な組織特異的細胞を含んでいたが、しかしながら、FDGlow細胞集団由来のガンにて含まれていた分化組織の種類はほとんどなかった（図６A、図６B）。これらのデータによって、FDGhigh細胞集団が未熟で進行性のあるガン細胞、例えばCSCのようなものを生じさせていることが示唆される。【００５５】
FDGhighES細胞集団による移植から５週間の後、Lac Zを発現している少数の細胞が、奇形腫組織中に観察された（図８）。よって、FDGhighES細胞由来のガンを、コラゲナーゼによって１細胞に浮遊状態に解離させ、FDGhigh及びFDGlowの細胞集団に再度ソートを行い（図５F）、LIFなしの条件で長期間培養を行った（図５BのイラストのLT-Cult参照）。FDGlow細胞集団は増殖能力に限界があることを示し、細胞集団がヘイフリック限界に達することを示唆している（Hayflick, 1985）。ほとんどの真核生物細胞は、インビボにおいて増殖能力に限りがあり、複製老化に導かれる（Hayflick, 1985）。さらにガンの進行にとって必要な、決定的な段階の１つとして、この分裂能の限界を取り払うことが提案された（Hanahan and Weinberg, 2000）。FDGhigh細胞集団はインビトロにおいて、老化を被ることなしに少なくとも二ヶ月間、指数関数的に増殖した（図５G、及びデータ未発表）。F9、又はP19のような、胚性癌腫（EC）細胞株の大部分は、LIF又はフィーダー層なしで、自己複製できることが知られている（Chambers and Smith, 2004）。これらのデータは、FDGhighES細胞由来のガンのFDGhigh細胞から樹立した細胞が、EC細胞に不死化されたものであると示唆される。次に、我々は、樹立したEC細胞を再度FDGで染色し、それからFDGhigh及びFDGlow細胞集団は独立にソートし、更なる解析の研究を行った（図５Hおよび図５Bの2ndTxのイラストを参照）。FDGhigh及びFDGlowEC細胞の間で、クローニング効率の比較を行った。100個のソートされた細胞を10 cmのディッシュに播種し、その後形成されたコロニーを１０日後に計算したところ（図５Iおよび図９）、FDGhighEC細胞では、FDGlowEC細胞や未分画の細胞と比較して、顕著にたくさんの数のコロニーの形成が見られた。さらに、１細胞培養ではFDGhighEC細胞がより急速にその他の細胞集団に分割することが明らかになった（図５J）。これらのデータから、SLD5を高発現している細胞は高いクローニング効率、及び増殖活性を有することが示された。【００５６】
最後に、二次移植解析で、図５Hで観察された長期培養後のFDGhigh細胞集団は、FDGlow細胞集団と比較して顕著に大きいガンが形成され（図５K）、FDGhighEC細胞からのガンもまた、組織特異的細胞の様々なタイプが含まれていた（図６C、及びD）。これらのデータは、SLD５の発現が、腫瘍原性と明らかに関連して、奇形腫ガンのCSCに対するバイオマーカーになりうることを示唆している。【００５７】
SLD５はガン治療の新たな標的である。
ほとんどのガン細胞に於いて、SLD5が強く発現している（図１）。これは、CSCを含むガン細胞における分化にSLD5が機能していると示唆される。次に、我々は、ヒトガン細胞にてSLD5の機能と解析するために、Hela細胞、Hek293細胞のインビトロにおいて、RNA干渉（RNAi）を介した内在性遺伝子のサイレンシングのために低ヘアピン型RNA（shRNA）発現プラスミドを用いた。リアルタイム逆転写PCRにて、スクランブルドshRNA（SCR）プラスミドを用いた形質転換と比較して、遺伝子特異的shRNA（S5-6、及びS5-18）によって、７２時間以内に７５％以上のSLD5の発現が減少していることを確認した（データ未発表）。形質転換後９６時間では、両方の細胞において、SLD５-shRNAで処理した細胞の総数は、コントロールのものと比較して、顕著に減少した（図７A）。これは、GINS構成体の減少が、結果として細胞の増殖を阻止していることが示唆される。この問題に言及して、SCRもしくはS5-6で形質転換した後のDNA量の解析を行った（図７B）。結果、SLD5の減少がサブG1期、及びS期の細胞集団の減少を導き、これは、SLD5が哺乳類細胞においてS期の進行に関与していることを示唆している。さらに、このRNAi法は図５に示したようなES細胞のモデル奇形ガン由来のFDGhighCSCの細胞増殖を弱めることも判明した。これらの結果は、ＳＬＤ５がCSCを含むガン細胞を標的にする分子となり得ることを示唆している。【００５８】
SLD5-/- 胚に見られる表現型は過去に報告したPSF1-/-胚（Ueno et al. 2005）と似ている。その上、PSF1はSLD５、及びPSF3の安定性を調節する（M.U. and N.T.  未発表データ）。よって、SLD5とPSF1は共に、相互依存的な方法で制御していることが示唆された。GINS構成体の１つであるSLD5のサイレンシングが他のGINS構成体の細胞内局在、及び又は、その安定性に影響を与えるかどうか解決するために、S5-6shRNAで形質転換した細胞の免疫染色を行った（図７C）。結果、SLD5の減少により、PSF1およびPSF3の発現が抑制された。PSF1及びPSF3の内在性の発現もまたSLD5-/-胚において減少していた（図７C）。これらのデータは、GINS構成体のそれぞれの安定性が共に、相互依存的な方法で制御されており、SLD5は恒久的な増殖能を必要とするガン細胞やES細胞の細胞周期の進行に不可欠であることを示唆している。【００５９】
考察
SLD5はマウスにおいて胚発生に必須である。
本研究において、インビボにおける遺伝子標的化技術を用いたSLD5の機能について検討を行った。われわれの結果は、SLD5-/-胚の栄養芽細胞、及びICM細胞において増殖が弱まることが明らかになった。GINS複合体と、CDC45はDNA複製の開始に協調的に関与することが報告されていた。（Kubota et al., 2003; Takayama et al., 2003; Gambus et al., 2006; Moyer et al., 2006; Pacek et al., 2006; Yabuuchi et al., 2006, Bauerschmidt, et al., 2007）。マウスにおいて、CDC45欠損胚の子宮着床後の表現形は、SLD5もしくはPSF1欠損胚ときわめて同様であった。その上、CDC45の欠損胚では、本研究において観察されたSLD5欠損胚盤胞細胞のように、胚盤胞細胞の培養において、増殖が欠失した。ゆえに、DNA複製に関して、SLD5、及びCDC45、分子機能は哺乳類細胞においては保存されているのかもしれない。酵母における細胞増殖に、SLD5が不可欠であるにもかかわらず（Takayama et al., 2003）、着床前のSLD5-/-胚に、はっきりとした形態学上の異常は見られなかった（データ未発表）。われわれのX-gal染色の実験では（図３）母系由来のSLD転写産物が未受精卵に残っていることが示唆された。母系由来のPSF1転写産物も未受精な卵母細胞に観察された（Ueno et al., 2005）。これら、母系SLD5転写物の蓄えが、初期発生段階を通してSLD5-/-胚の成長に重要であるかもしれない。我々は、SLD5-/-の死亡性の時期は着床時期周辺における、母系由来のSLD５転写産物の欠失及び又は希釈によるものと結論付ける。【００６０】
SLD５はガン幹細胞の治療に対する新規標的能を持っている。
この報告では、SLD5の様々なヒトガン細胞及び、マウスモデル奇形ガンES細胞中のCSC細胞で、SLD５が強く発現していることを報告した。メラノーマ細胞において、PSF1及びSLD5mRNA共に発現がアップレギュレートされており、メラノーマの悪性進行に関与していることが報告された論文がある（Ryu et al., 2007）。われわれのデータは、SLD5高発現細胞を単離しすることで、CSCが濃縮されることををはっきりと示している。正常組織及びガン組織からの幹細胞集団の濃縮には、ヘキスト33342色素の発散に基づいた、サイドポピュレーション（SP）細胞の単離技術が広く用いられてきた（Challen and Little, 2006）。しかしながら、この方法では、組織的に組織中のCSCの局在を認識するのは難しく、われわれの動物実験では、生存細胞及び固定組織からCSCを可視化することに成功し、CSC生存性で増殖性を支持できるニッチ構成細胞を単離することができる。【００６１】
我々は、SLD5のダウンレギュレーションにより、PSF1およびPSF3の内在的な発現が減少されることを明らかにした。われわれの未発表データでは、PSF1もまたPSF3およびSLD5を制御していることを示唆している。これらのデータは、GINS構成体のそれぞれのタンパク質安定性が相互的な方法で制御されていることを示唆している。GINS複合体の不完全な形成は、他のDNA複製複合体のドミナントネガティブ活性及び又は不安定性誘発を持っているかもしれない。よって、SLD5だけの標的は、GINS複合体の生物的機能を阻害するのに、効果的で効率的である。つまり、われわれのデータは、SLD5がガン幹細胞への標的に新規な可能性を持っていることの証拠を提供している。【００６２】
RNAi治療は細胞内の遺伝子の発現レベルに治療的に干渉する新たな手法として浮かび上がってきた。決定的な細胞内経路（腫瘍形成や、アポトーシス、老化、タンパク質安定性及び分解、細胞周期を含む）RNAiを介する遺伝子サイレンシングはいくつかのガン細胞において治療に成功しているものもある（Pai et al., 2006).）。われわれのデータはノックアウト、もしくはノックダウンした内在性SLD5遺伝子の発現で、細胞増殖が阻まれ、急速な細胞増殖能が必要なICM、ガン細胞、及びCSCの細胞内におけるアポトーシスを引き起こした。SLD5の発現のサイレンシングに、siRNA技術を適用するには、進行性のガンを患う患者で価値ある戦略を証明せねばならない。【００６３】
SLD5が化学的/遺伝子療法の特異的な標的であるかどうか確かめるためには、正常成体組織由来の細胞内におけるSLD5の役割を明らかにするべきである。われわれが過去に報告したように、SLD5のみならずPSF1も成体の骨髄、精巣、卵巣に豊富に発現しており、胸腺では弱く発現している（Ueno et a., 2005, Kong et al. 2006）。われわれが解析した限りでは、PSF1は骨髄及び精巣の幹細胞集団で、PSF1の発現が集中している。成体のSLD5+/-マウスを用いたLacZ染色では、骨髄、精巣、卵巣以外でのSLD5の発現は検出できなかった（データ未発表）。その上、SLD5+/-マウスの成体マウスを用いた、スキンフラップによるモデルの創傷治癒では、我々はSLD5(LacZ)陽性の増殖細胞は回復期の皮膚で検出されなかった（データ未発表）。以上のことから、これらのデータはGINSが出生後に細胞分裂が継続的に、旺盛に誘導される幹細胞で使用されることを示している。ほとんどのガン細胞株の細胞はCSCである（Zheng et al., 2007）。これはSLD5およびPSF1の発現が、ほとんどのガン細胞株から確認された、われわれの発見と関連する。まとめると、これらはSLD5が幹細胞レベル役割を果たし、細胞分裂を起こしている成体の成熟細胞ではなんら役割を果たさないことを示唆している。しかしながら、SLD5の発現を局所的に発現抑制を行うことで、成体の正常組織におけるSLD5の機能が明らかになるであろう。この、ガン細胞と、成人の正常組織由来の細胞との間でのSLD5の機能の区別が、新たなガンの治療的な標的を提供するのに必要である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
正常細胞から、がん幹細胞を作成する技術は国内外でまだ成功していない。本発明ではがん幹細胞をSld5遺伝子のプロモーター活性でイメージングでき、がんの中でのがん幹細胞の局在が明確になる。また、ES細胞からスタートしていることもあり、またこれらがん幹細胞を比較的無尽蔵に試験管内で増殖させることができることなどから、がん幹細胞の分子標的の探索、がん幹細胞を殺傷する薬剤のスクリーニングに応用できるなどの理由により、がんのいわゆるこれまでと全く異なるシステムによる、がんの診断、治療法の開発につながる。がん細胞はいわゆる抗がん剤や放射線に感受性を示しても、がん幹細胞はこれらの治療に抵抗性を示すという概念が定説となりつつある。この概念は、がんの再発や転移を説明する上で真実性の高いものである。よって、がん幹細胞の治療薬、診断薬、診断法の開発は従来のがんの治療、診断法を根底からくつがえす、画期的な治療、診断法の発見につながり、経済的波及効果は計り知れない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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