(57)【要約】【課題】判定精度の高いＳＮＰ（一塩基多型）判定を行う。【解決手段】遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置１は、近似部４により、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする曲線であるロジスティック曲線に近似する。そして、判定部５は、近似されたロジスティック曲線の特徴点である変曲点やプラトー値、測定された光の強度等を用いて、一塩基多型の判定を行う。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置であって、
遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段と、
前記近似手段により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段と、
を備えることを特徴とするアレル判定装置。
【請求項２】
前記特徴点は、前記近似手段により近似された曲線における変曲点であることを特徴とする請求項１に記載のアレル判定装置。
【請求項３】
前記判定手段は、さらに、前記近似手段により近似された曲線における、光の強度の最大値の指標を用いて一塩基多型の判定を行うことを特徴とする請求項２に記載のアレル判定装置。
【請求項４】
前記判定手段は、前記光学測定結果で示される、観測された光の最大強度をさらに用いて、一塩基多型の判定を行うことを特徴とする請求項２または３に記載のアレル判定装置。
【請求項５】
前記近似手段は、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬それぞれの光学的測定結果を前記所定の曲線に近似し、
前記判定手段は、前記近似手段により前記試薬それぞれについて近似された前記曲線の特徴点を用いて、前記試薬それぞれの反応がポジティブであるかネガティブであるかを判定し、その判定結果から一塩基多型の判定を行う、
ことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかの項に記載のアレル判定装置。
【請求項６】
前記判定手段は、前記特徴点からエンドポイント時間を算出し、算出されたエンドポイント時間において観測された光学的測定結果を用いて一塩基多型の判定を行うことを特徴とする請求項１に記載のアレル判定装置。
【請求項７】
前記判定手段は、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬それぞれのエンドポイント時間における光学的測定結果の比の対数をさらに用いて一塩基多型の判定を行うことを特徴とする請求項６に記載のアレル判定装置。
【請求項８】
遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置であって、
遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段と、
前記近似手段により近似された曲線の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段と、
を備えることを特徴とするアレル判定装置。
【請求項９】
前記近似手段は、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬それぞれの光学的測定結果を前記所定の曲線に近似し、
前記判定手段は、前記近似手段により前記試薬それぞれについて近似された前記曲線の比の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う、
ことを特徴とする請求項８に記載のアレル判定装置。
【請求項１０】
前記特徴点は、前記比の対数におけるピーク値であることを特徴とする請求項９に記載のアレル判定装置。
【請求項１１】
前記曲線は、ロジスティック曲線であることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれかの項に記載のアレル判定装置。
【請求項１２】
前記光学的測定結果は、特定塩基配列に反応するプローブを用いた蛍光反応の測定値であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれかの項に記載のアレル判定装置。
【請求項１３】
前記蛍光反応は、インベーダー（登録商標）法であることを特徴とする請求項１２に記載のアレル判定装置。
【請求項１４】
遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定方法であって、
遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似過程と、
前記近似過程により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定過程と、
を有することを特徴とするアレル判定方法。
【請求項１５】
遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定方法であって、
遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似過程と、
前記過程により近似された曲線の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定過程と、
を有することを特徴とするアレル判定方法。
【請求項１６】
遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置として用いられるコンピュータを、
遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段、
前記近似手段により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段、
として機能させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１７】
遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置として用いられるコンピュータを、
遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段、
前記近似手段により近似された曲線の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段、
として機能させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を同定するためのプローブから光学的に得られた測定結果を利用したＳＮＰ（一塩基多型）のアレル判定装置及び方法、ならびに、コンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムには様々な種類の変異が存在し、ある生物種集団内で１％以上の変異が観察されるものを多型と呼ぶ。ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）は、その多型の中でも、ある生物種集団のゲノム塩基配列中に一塩基が変異した多様性のことである（１％以下の場合は突然変異と呼ぶ。）。ヒトゲノムは３０億の塩基対からなり、平均すると1,000bpに1ヶ所のＳＮＰがあると予想されている。ＳＮＰはタンパクの構造や機能の変化、個人における表現型の差を引き起こしている。【０００３】
近年は、臨床での応用が期待される遺伝子のＳＮＰも近年多く見出されており、薬剤代謝に関与するものや、薬剤の効果の強さに大きく影響するものなどがある。例えば、これらの遺伝子にその酵素活性を低下させるようなＳＮＰがあると、薬剤の血中濃度が長時間に渡って高く保たれ、その結果、効果が強く発現したり、有毒な中間代謝産物が蓄積されたりすることがある。また、薬剤がうまく働くことのできないようなＳＮＰがあると、投薬量を増やすなどの処置が必要となる。そこで、遺伝情報による患者個々の体質に応じた適切な「オーダーメイド医療」のため、投薬前に遺伝子のＳＮＰを検査し、その結果得られた遺伝子の型を適切な薬剤の投薬量等を決定するための情報として活用することが考えられている。これにより、副作用を回避し、効率的な治療効果を得ることが期待されるだけでなく、無用な副作用への対処や不適切な投薬を減らし、医療費削減への効果も期待できる。【０００４】
ＳＮＰの検出法として、従来、制限酵素断片長多型法（Restriction Fragment LengthPolymorphisms：RFLPs）が用いられていたが、近年では、より簡便で汎用性のある手法として、インベーダー（Invader）（登録商標）法、TaqMan PCR 法、シングルヌクレオチドプライマー伸長反応、SNaPshot(R)法、Pyrosequencing(TM)法、Melting Point法、SSCP（Single-stranded conformational polymoriphism analysis）など種々の方法が開発されている。【０００５】
図２６を参照し、特定の塩基配列を同定するためのプローブから光学的に得られた測定結果に基づいてＳＮＰの遺伝型を判定する手法の一つであるインベーダー（登録商標）法について説明する。
インベーダー（登録商標）法では、次の２段階の反応によりＳＮＰを検出している。ＳＮＰ検出を行う対象のＤＮＡであるターゲットＤＮＡ（Target Nucleic Acid）の標的部位に目的の塩基がある場合、第一反応では、ターゲットＤＮＡ、インベーダー（登録商標）オリゴ（Invader Oligo）、シグナルプローブであるアレルオリゴ（Allele Oligo）により形成される３元複合体構造を、クリーベース（登録商標）（Cleavase(R)）と呼ばれる酵素が特異的に認識し、塩基対を形成していないアレルオリゴのフラップ（flap）部分を切断する。なお、アレルオリゴとは、フラップ部位と標的塩基配列を認識する部位から構成されるオリゴヌクレオチドであり、インベーダー（登録商標）オリゴとは、ターゲットＤＮＡにおける標的塩基配列を認識し、１塩基のみアレルオリゴに侵入するオリゴヌクレオチドである。また、クリーベース（登録商標）とは、２種類のオリゴが重なり合った構造（侵入構造）を認識して切断する酵素であり、ＤＮＡ修復酵素の一種である。【０００６】
次の第２反応では、第一反応において遊離したフラップと、ＦＲＥＴプローブであるＦＲＥＴ(TM)カセット（FRET(TM) Cassette）とがハイブリダイズして形成される複合体構造を、第１反応と同一酵素であるクリーベース（登録商標）が切断することにより、蛍光消光から解放された蛍光物質が蛍光を発する。なお、ＦＲＥＴカセットとは、クリーベース（登録商標）によるフラップ断片を認識する部位と蛍光物質(F)と消光物質(Q)を含むプローブであり、蛍光物質(F)と消光物質(Q)の間の配列にフラップ断片が侵入できるように設計されている。蛍光物質(F)と消光物質(Q)が近距離にある場合には消光物質(Q)の消光作用により、蛍光物質(F)は蛍光を発さないが、クリーベース（登録商標）により、蛍光物質(F)が遊離して消光物質(Q)と離れると蛍光物質(F)は蛍光を発する。【０００７】
インベーダー（登録商標）法では、１つのウェル（反応系）に２セットのアレルオリゴ、ＦＲＥＴカセット、２種類の蛍光色素を入れるInvader（登録商標） Biplex Formatにより、ワイルドタイプ（Wild Type）とミュータント（Mutant）を同時に検出可能である。ワイルドタイプとは、１つの生物種において自然集団中で最も高頻度で発生する遺伝子型のことである。それに対し、遺伝子ＤＮＡに何らかの変化が起こると、それにより遺伝形質が変化した遺伝子をミュータントと呼ぶ。【０００８】
通常の生物は、父母由来の２つの対立遺伝子を持つ。両親から同じ種類の遺伝子を引き継いでいる場合はホモ接合と呼ばれ、異なる種類の遺伝子を引き継いでいる場合ヘテロ接合と呼ばれる。上記インベーダー（登録商標）法により検出されるＳＮＰの型は、ワイルドタイプのホモ接合、ミュータントのホモ接合、ワイルドタイプとミュータントのヘテロ接合の３種類である。【０００９】
Invader（登録商標） Biplex Format では、ワイルドタイプとミュータントの遺伝子をそれぞれ２種類の蛍光色素により検出することで、上記３種類のＳＮＰの型を判定する。
例えば、ＦＡＭという蛍光色素を付けたＦＲＥＴカセットに結合し、フラップ断片を生じるアレルオリゴによりワイルドタイプを検出し、ＲＥＤという蛍光色素を付けたＦＲＥＴカセットに結合し、フラップ断片を生じるアレルオリゴによりミュータントを検出するようにプローブをデザインすると、ワイルドタイプのホモ接合ではＦＡＭの蛍光のみ、ミュータントのホモ接合ではＲＥＤの蛍光のみ、ワイルドタイプとミュータントのヘテロ接合ではＦＡＭとＲＥＤ両方の蛍光が検出される。【００１０】
インベーダー（登録商標）法による測定手順を以下に説明する。
（１）血液等のサンプルよりＤＮＡを抽出する。
（２）ＰＣＲ反応によりＤＮＡサンプルを増幅させる。
（３）ディネイチャー（変性）させたＰＣＲ産物にインベーダー（登録商標）試薬、すなわち、各種オリゴ及び酵素クリーベース（登録商標）を混ぜる。
（４）一定温度にてインキュベーションすることでインベーダー（登録商標）反応を行う。
（５）経時的に２種の蛍光値を蛍光測定機器によりそれぞれ測定する。なお、２種類の蛍光色素の発光する波長領域は互いに異なるため、蛍光測定機器にはそれぞれの波長領域を検出するフィルターを２種類付けることにより、測定を行う。【００１１】
一方、非特許文献１には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの測定結果を、シグモイド曲線を用いてフィッティングし、解析する方法が開示されている。
【非特許文献１】Hao Qiu et al., “Gene expression of HIF-1 α and XRCC4 measured in human samples by real-time RT-PCR using the sigmoidal curve-fitting method”, Bio Techniques, 2007, Vol.42, pp.355-362.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
図２７に、上述するインベーダー（登録商標）法を用いた解析データとして得られる結果のパターンの例を示す。インベーダー（登録商標）法では、ＦＡＭとＲＥＤという２種類の蛍光色素であるプローブがＳＮＰの有無を調べたい部位と特異的に反応し、その箇所の塩基がＡ（アデニン）の場合はＦＡＭが蛍光を発し、Ｇ（グアニン）の場合はＲＥＤが蛍光を発する。そして、対立遺伝子がＡＡの場合はＦＡＭの蛍光のみ検出され（ＦＡＭ  
Ｈｏｍｏ）、ＧＧの場合はＲＥＤのみ検出され（ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ）、ＡＧの場合はＦＡＭとＲＥＤ両方が検出される（Ｈｅｔｅｒｏ）。図２７（ａ）〜（ｄ）に示すように、解析結果として４パターンが観測される。同図においては、横軸を時間、縦軸をＦＡＭ、ＲＥＤそれぞれの蛍光強度としている。なお、ここでは、ＦＡＭとＲＥＤの蛍光強度のスケールを同じレベルに設定した場合を示しており、実際に装置から得られる生データは、装置の設定によるが、ＦＡＭとＲＥＤでおおよそ５〜１５倍異なる。図２７（ａ）は、Ｈｅｔｅｒｏの場合であり、ＦＡＭ、ＲＥＤともポジティブな反応曲線となっている。また、図２７（ｂ）は、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏの場合であり、ＦＡＭはポジティブな反応曲線、ＲＥＤはネガティブな反応曲線となっている。図２７（ｃ）は、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏの場合であり、ＲＥＤはポジティブな反応曲線、ＦＡＭはネガティブな反応曲線となっている。図２７（ｄ）のようにＮＧの場合は、ＦＡＭ、ＲＥＤともネガティブな反応曲線となっている。【００１３】
これらのパターンを利用して、従来は、図２８に示すように、エンドポイントＴにおけるＦＡＭとＲＥＤの蛍光強度比によりＳＮＰの遺伝子型の判定を行っていた。図２８（ａ）は、時間ｔにおけるＦＡＭ、ＲＥＤの蛍光強度を示しており、時間ｔがエンドポイントＴのときのＦＡＭの蛍光強度をＦＲ（Ｔ）、ＲＥＤの蛍光強度をＲＲ（Ｔ）とする。図２８（ｂ）は、エンドポイントＴにおけるＦＡＭ蛍光強度ＦＲ（Ｔ）をｘ軸，ＲＥＤ蛍光強度ＲＲ（Ｔ）をｙ軸として（ＦＲ（Ｔ），ＲＲ（Ｔ））をプロットした図であり、２直線ｙ＝ａｘ、ｙ＝（１／ａ）ｘ（同図においては、ａ＝２）を境界として、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏのクラスター（集合体）が形成されている。図２８（ｃ）は、実際の観測結果をプロットした例を示しており、図２８（ｂ）のクラスター分けに従っていることがわかる。【００１４】
インベーダー（登録商標）法の具体的なＳＮＰ判定方法を以下に示す。サンプル（試料）は、血液や抽出ＤＮＡなどを用いる。また、測定によって得るデータの種類には、サンプルデータ（生データ）、補正データ、ネガコン（ＮＣ）データ、ポジコン（ＰＣ）データがある。
サンプルデータ（生データ）は、ＦＡＭとＲＥＤそれぞれのｔ分後の蛍光強度（装置の測定値）であり、時間ｔにおけるＦＡＭの蛍光強度をＦＡ（ｔ）、ＲＥＤの蛍光強度をＲＡ（ｔ）とする。
補正データは、サンプルデータを、あるアルゴリズムによって補正したデータであり、ＦＡＭの蛍光強度ＦＡ（ｔ）を補正したものをＦＲ（ｔ）、ＲＥＤの蛍光強度ＲＡ（ｔ）を補正したものをＲＲ（ｔ）とする。
ネガコン（ＮＣ）データは、サンプルなしで計測したネガティブコントロールのデータであり、サンプル以外の試薬は全て揃っているものを計測する。ネガコンといえども、試薬構成が変化すれば値も変わる。時間ｔにおけるネガコンのＦＡＭの蛍光強度をＦＮ（ｔ）、ＲＥＤの蛍光強度をＲＮ（ｔ）とする。【００１５】
上記のデータを用いたインベーダー（登録商標）法によるＳＮＰ判定手順は、以下となる。【００１６】
（１）時間ｔ＝エンドポイントＴ（例えば、２分）において、サンプルデータのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（Ｔ）及びＲＥＤ蛍光強度ＲＡ（Ｔ）と、ネガコンデータのＦＡＭ蛍光強度ＦＮ（Ｔ）及びＲＥＤ蛍光強度ＲＮ（Ｔ）を取得する。【００１７】
（２）下記の計算により、補正データＦＲ（Ｔ）、ＲＲ（Ｔ）を取得する。分子の（ＦＡ（Ｔ）／ＦＮ（Ｔ））、（ＲＡ（Ｔ）／ＲＮ（Ｔ））は、ネガコン値を引いていることを意味し、分母はＦＡ（Ｔ）とＦＮ（Ｔ）の強度比（スケール）を一致させることを意味している。これは、サンプル値の強度比とネガコンの強度比が一致していることを前提としている。【００１８】
ＦＲ（Ｔ）＝（ＦＡ（Ｔ）／ＦＮ（Ｔ））−１＝（ＦＡ（Ｔ）−ＦＮ（Ｔ））／ＦＮ（Ｔ），ＲＲ（Ｔ）＝（ＲＡ（Ｔ）／ＲＮ（Ｔ））−１＝（ＲＡ（Ｔ）−ＲＮ（Ｔ））／ＲＮ（Ｔ）【００１９】
（３）補正データＦＲ（Ｔ）、ＲＲ（Ｔ）の比Ｒａｔｉｏを以下のように計算し、算出結果によりアレル判定を行う。Ｒａｔｉｏ＜（１／ａ）であればＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、（１／ａ）＜Ｒａｔｉｏ＜ａであればＨｅｔｅｒｏ、Ｒａｔｉｏ＞ａであればＲＥＤ  Ｈｏｍｏと判定する。【００２０】
Ｒａｔｉｏ＝ＲＲ（Ｔ）／ＦＲ（Ｔ）【００２１】
しかし、実際の測定では、ターゲットＤＮＡにおいて、本来ならば蛍光が検出されるはずのない対立遺伝子のみ持つ場合でも蛍光値が徐々に上昇する現象が起こることがあり、この現象を「バックグラウンドの上昇」と呼ぶ。バックグラウンドの上昇は、本来切断するはずのないアレルオリゴにおける特定部位を酵素クリーベース（登録商標）が誤って切断してしまうことに起因すると考えられている。従って、ターゲットＤＮＡの量が過剰になってしまうと、その分誤って切断される確率も高くなってしまうためバックグラウンドの上昇が起こりやすいと言われている。このバックグラウンドの上昇はＳＮＰ判定を誤る原因となる。このようなバックグラウンドの上昇が発生した場合のデータをプロットしたグラフを図２９に示す。同図に太線により示している実測値は、理想曲線から大きく外れている。図２９（ａ）は、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏであるにもかかわらず、ＲＥＤのバックグラウンドが上昇しており、図２９（ｂ）は、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏであるにもかかわらず、ＦＡＭのバックグラウンドが上昇している。【００２２】
また、エンドポイント法を用いた場合、補正データＦＲ（Ｔ）、ＲＲ（Ｔ）の値はネガコンデータＦＮ（Ｔ）、ＲＮ（Ｔ）の値に大きく左右される。上記に示すエンドポイント法において、サンプルデータをネガコンデータで除算を行うのは、ＦＡＭとＲＥＤの強度比（スケール）を一致させることを意味している。これはサンプル値の強度比「ＦＲ（Ｔ）：ＲＲ（Ｔ）」とネガコン値の強度比「ＦＮ（Ｔ）：ＲＮ（Ｔ）」が一致していることが前提である。しかし、ネガコンデータはもともと値が小さく、誤差を生じやすい。図３０は、ＮＣ  Ｒａｔｉｏ＝ＦＮ（Ｔ）／ＲＮ（Ｔ）の時間による変化を示す。同図に示すように、ネガコンデータＮＣ１とネガコンデータＮＣ２は、どちらも実際の強度比がばらついている（ネガコンデータＮＣ１とネガコンデータＮＣ２の試薬構成は異なるため平均値が異なる点について問題ない）。そのため、実際の測定データには、がたつき（ノイズ）が含まれることになる。よって、測定データを用いて直接計算（特に微分や除算などの場合）を行った場合、局所的なノイズに大きな影響を受ける。局所的なノイズを押さえる方法として、平滑化フィルター（Median Filter等）を用いる方法があるが、これにも限界がある。【００２３】
従来のＳＮＰ判定方法では、上記のようなバックグラウンド上昇やノイズが誤判定の原因となってしまう。しかし、先にも述べたように、ＳＮＰの判定は、将来的に医療などにも利用されることが想定されため、その判定精度を高めることが求められている。【００２４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、判定精度の高いＳＮＰ（一塩基多型）判定を行うことのできるアレル判定装置及び方法、ならびに、コンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置であって、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段と、前記近似手段により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段と、を備えることを特徴とするアレル判定装置である。【００２６】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のアレル判定装置であって、前記特徴点は、前記近似手段により近似された曲線における変曲点であることを特徴とする。【００２７】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載のアレル判定装置であって、前記判定手段は、さらに、前記近似手段により近似された曲線における、光の強度の最大値の指標を用いて一塩基多型の判定を行うことを特徴とする。【００２８】
請求項４に記載の発明は、請求項２または３に記載のアレル判定装置であって、前記判定手段は、前記光学測定結果で示される、観測された光の最大強度をさらに用いて、一塩基多型の判定を行う。【００２９】
請求項５に記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれかの項に記載のアレル判定装置であって、前記近似手段は、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬それぞれの光学的測定結果を前記所定の曲線に近似し、前記判定手段は、前記近似手段により前記試薬それぞれについて近似された前記曲線の特徴点を用いて、前記試薬それぞれの反応がポジティブであるかネガティブであるかを判定し、その判定結果から一塩基多型の判定を行う、ことを特徴とする。【００３０】
請求項６に記載の発明は、請求項１に記載のアレル判定装置であって、前記判定手段は、前記特徴点からエンドポイント時間を算出し、算出されたエンドポイント時間において観測された光学的測定結果を用いて一塩基多型の判定を行うことを特徴とする。【００３１】
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載のアレル判定装置であって、前記判定手段は、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬それぞれのエンドポイント時間における光学的測定結果の比の対数をさらに用いて一塩基多型の判定を行うことを特徴とする。【００３２】
請求項８に記載の発明は、遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置であって、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段と、前記近似手段により近似された曲線の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段と、を備えることを特徴とするアレル判定装置である。【００３３】
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載のアレル判定装置であって、前記近似手段は、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬それぞれの光学的測定結果を前記所定の曲線に近似し、前記判定手段は、前記近似手段により前記試薬それぞれについて近似された前記曲線の比の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う、ことを特徴とする。【００３４】
請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載のアレル判定装置であって、前記特徴点は、前記比の対数におけるピーク値であることを特徴とする。【００３５】
請求項１１に記載の発明は、請求項１から請求項１０のいずれかの項に記載のアレル判定装置であって、前記曲線は、ロジスティック曲線であることを特徴とする。【００３６】
請求項１２に記載の発明は、請求項１から請求項１１のいずれかの項に記載のアレル判定装置であって、前記光学的測定結果は、特定塩基配列に反応するプローブを用いた蛍光反応の測定値であることを特徴とする。【００３７】
請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載のアレル判定装置であって、前記蛍光反応は、インベーダー（登録商標）法であることを特徴とする。【００３８】
請求項１４に記載の発明は、遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定方法であって、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似過程と、前記近似過程により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定過程と、を有することを特徴とするアレル判定方法である。【００３９】
請求項１５に記載の発明は、遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定方法であって、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似過程と、前記過程により近似された曲線の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定過程と、を有することを特徴とするアレル判定方法。【００４０】
請求項１６に記載の発明は、遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置として用いられるコンピュータを、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段、前記近似手段により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段、として機能させることを特徴とするコンピュータプログラムである。【００４１】
請求項１７に記載の発明は、遺伝子の一塩基多型を判定するアレル判定装置として用いられるコンピュータを、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬を観測して得た光学的測定結果を、光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線に近似する近似手段、前記近似手段により近似された曲線の対数から得られる特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う判定手段、として機能させることを特徴とするコンピュータプログラムである。
【発明の効果】
【００４２】
請求項１、１４及び１６の発明によれば、従来のようにある一時点における、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬の光学的測定結果ではなく、経時的な光の強度の変化に基づいて一塩基多型の判定を行うことができるため、判定の精度を高めることができる。
請求項２の発明によれば、観測された光の強度が変化するときの時間によって一塩基多型の判定を行うことができるため、判定の精度をより高めることができる。
請求項３の発明によれば、近似された曲線により示される光の強度の最大値の指標によって一塩基多型の判定を行うことができるため、判定の精度をより高めることができる。
請求項４の発明によれば、観測された光の強度の最大値によって一塩基多型の判定を行うことができるため、判定の精度をより高めることができる。
請求項５の発明によれば、異なる特定塩基配列に反応する２種類の試薬を用いた光学的測定結果それぞれを曲線に近似し、これらの曲線の特徴点を用いて試薬それぞれの反応がポジティブであるかネガティブであるかを判定し、その判定結果により、一塩基多型の判定を行うことができる。
請求項６の発明によれば、エンドポイント法を一塩基多型の判定に用いる場合に、最適なエンドポイント時間を求めることが可能になる。
請求項７の発明によれば、２種類の試薬（ＦＡＭ，ＲＥＤ）の蛍光値の比のプロットを、ある直線式ｙ＝ａｘ、ｙ＝（１／ａ）ｘによってクラスタリングして判定結果を求める従来のエンドポイント法に比べ、プロットの対象性が向上し、クラスタリングしやすくなる。
請求項８、１５及び１７の発明によれば、従来のようにある一時点における、遺伝子の特定の塩基配列に反応する試薬の光学的測定結果ではなく、経時的な光の強度の変化に基づいて一塩基多型の判定を行うことができるため、判定の精度を高めることができる。
請求項９の発明によれば、２種類の試薬の光の強度の変化の速さの違いに基づいて一塩基多型の判定を行うことができる。
請求項１０の発明によれば、２種類の試薬の光の強度の変化の速さの違いが最大になったポイントに基づいて一塩基多型の判定を行うことができる。
請求項１１の発明によれば、近似する曲線をロジスティック曲線とすることにより、一塩基多型の判定に利用しやすい特徴点を得ることができる。
請求項１２の発明によれば、特定塩基配列に反応するプローブを用いた蛍光反応により一塩基多型の判定に用いることができる。
請求項１３の発明によれば、インベーダー（登録商標）法による一塩基多型の判定に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、図面を参照して、本発明の一実施の形態について説明する。【００４４】
［１．概要］
本発明の一実施の形態によるアレル判定装置は、特定の塩基配列を同定するためのプローブから光学的に得られた測定結果に基づいて、ＳＮＰの遺伝型を判定する。この手法には、インベーダー（登録商標）（Invader）法、TaqMan法、SNaPshot(R)法、Sniper法等を用いることができる。なお、ここでは、インベーダー（登録商標）法を例にして説明する。【００４５】
本実施の形態によるアレル判定装置は、インベーダー（登録商標）により、試料を観測して得られたＦＡＭ／ＲＥＤによる発光の経時的な測定データを所定の曲線へ近似し、その曲線を表す数式から得られる特徴点や、係数を解析した結果により、ＳＮＰ判定を行う。ここでは、近似する対象の曲線として、ロジスティック曲線を用いる場合を例にして説明する。ＳＮＰの判定には、ロジスティック曲線の特徴点として、主に変曲点Ｔ（曲線の立ち上がり時間に相当する）を使用する。【００４６】
［１．１  反応曲線の特徴］
まず、ポジティブとネガティブの反応曲線の特徴について説明する。図１は、ポジティブの場合と、ネガティブの場合の経時的な蛍光強度の変化を示す反応曲線の典型的なパターンを示す。【００４７】
ポジティブの反応曲線には、図１（ａ）に示すように、以下のような特徴がある。
（１）プラトー値（変化がなくなったときの値）がある一定以上の値を取っている。
（２）蛍光測定曲線が急激に立ち上がるポイントがある。
（３）立ち上がる時間は比較的短い。【００４８】
また、ネガティブの反応曲線には、以下のような特徴がある。
（１）曲線が急激に立ち上がるポイントがなく、また、プラトー値（変化がなくなったときの値）を持たず、０に近い値を横ばいに這っている（図１（ｂ））。
（２）バックグラウンドが上昇している。この場合、徐々にデータが上がり続ける場合もあるが（図１（ｃ））、一見、プラトー（値の変化がない領域）に達しているようなデータもある（図１（ｄ））。しかし、一見、プラトーに達しているよう見える場合の反応曲線であっても、プラトー値は低く、立ち上がりの時間も比較的遅い。【００４９】
ロジスティック曲線のパラメータは、具体的には、反応におけるプラトー値・立ち上がりの時間等を表している。そこで、実際にロジスティック曲線への近似により得られるパラメータを用いたアルゴリズムをＳＮＰ判定に適用することで、誤判定を大幅に減少させることが可能となる。これは、蛍光値が曖昧なデータや、エンドポイントの上昇が生じているネガティブのデータについてエンドポイント法では誤判定をするのに対し、ロジスティック曲線の変曲点を指標とすることで棄却可能となるためである。従って、本実施の形態を用いることで、より誤判定の少ないアレル判定装置の実現が可能となる。【００５０】
［１．２  ロジスティック曲線の特徴］
図２は、ロジスティック曲線を示す図である。
ロジスティック曲線は、生物の成長（例えば人口増加）をモデルとした曲線であり、Ｓ字曲線や、シグモイド曲線の典型パターンとしてよく利用される。ロジスティック曲線のモデルは、以下の式のように表される。ただし、ａは、最大値の指標（ロジスティック曲線の最大値はａに近づく）、ｂは横軸の平行移動、ｃは立ち上がりのスピードを示す。【００５１】
ｙ＝ａ／（１＋ｂｅ−ｃｘ）【００５２】
上記のロジスティック曲線は、変曲点（ｘ，ｙ）＝（（logｂ）／ｃ，ａ／２）をとり、この変曲点で対象な曲線である。また、図３（ａ）は、ａ＝１００、ｃ＝０．３に固定してｂを変化させた場合、図３（ｂ）は、ａ＝１００、ｂ＝１０００に固定してｃを変化させた場合、図３（ｃ）は、ｂ＝１０００、ｃ＝０．８に固定してａを変化させた場合のロジスティック曲線を示す。【００５３】
［１．３  問題点を解決するための対策］
以下に、従来のエンドポイント法を用いたときの問題点を解決するために、本実施の形態によるアレル判定装置において実現する対策について説明する。【００５４】
（対策１）経時データによる処理（リアルタイム処理）；
エンドポイント法では、固定のタイミング（従来の標準プロトコルでは２分後）で計測しているが、経時データを追うことで、最適なタイミングで測定を行うことを可能とする。また、強度比だけでなく、反応曲線における立ち上がりのスピードを比較することが可能になる。リアルタイム処理が困難な場合は、複数の標準サンプルの経時データを後述の方法で解析し、最適な測定時間を調整することもできる。【００５５】
（対策２）ポジコン（または、標準サンプルデータ）の利用；
ＦＡＭとＲＥＤの強度比（スケール）を一致させるために、従来ネガコンデータを利用していることに代えて、ポジコンデータ、または標準サンプルデータを利用する。【００５６】
（対策３）データの近似（ロジスティック曲線のあてはめ）；
経時データ全体を、ロジスティック曲線に近似することにより、ノイズの影響を少なくするとともに、シンプルな計算を可能にする。【００５７】
（対策４）比の計算方法の改良（非対称性の解消）；
従来、Ｒａｔｉｏ＝ＦＲ／ＲＲの値について、パラメータとして傾きがａ，１／ａの直線（例えば、ａ＝５）を境界として判断を行っていた（図２８（ｂ）参照）。そこで、この２つのパラメータに対称性を持たせるため、以下のように対数logを利用する。【００５８】
log（Ｒａｔｉｏ）＝log（ＦＲ／ＲＲ）＝log（ＦＲ）−log（ＲＲ）【００５９】
これにより、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ（ＲＥＤホモ）は、log（Ｒａｔｉｏ）＜−logａ、Ｈｅｔｅｒｏは−logａ＜log（Ｒａｔｉｏ）＜logａ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ（ＦＡＭホモ）は、log（Ｒａｔｉｏ）＞logａとして判定することができる。【００６０】
［２．  アレル判定装置の構成及び実装アルゴリズム］［２．１  装置構成］
図４は、本発明の一実施の形態によるアレル判定装置１の構成を示すブロック図であり、本発明と関係する機能ブロックのみ抽出して示してある。
アレル判定装置１は、測定部２、記憶部３、近似部４、判定部５、出力部６を備える。
測定部２は、光学的な測定を行う手段であり、インベーダー（登録商標）法によるＦＡＭ及びＲＥＤの蛍光強度を得る。記憶部３は、測定部２により測定された蛍光強度のデータや、判定処理の使用する各種データを記憶する。近似部４は、測定部２によって得られた蛍光強度の測定結果から、反応曲線を光の強度及び時間をパラメータとする所定の曲線、ここでは、ロジスティック曲線に近似する。判定部５は、近似部４により近似された曲線の特徴点を用いて、一塩基多型の判定を行う。出力部６は、判定部５による判定結果をディスプレイに表示したり、記録媒体に書き込んだり、あるいは、ネットワークを介して接続されるコンピュータ端末へ送信したりする。【００６１】
［２．２  判定アルゴリズム］［２．２．１  ロジスティックアルゴリズム］
上述した対策に基づいた、本実施の形態のアレル判定装置１が実行するアルゴリズムについて説明する。ここでは、観測値データにより示される蛍光値を非曲線回帰分析してロジスティック曲線に近似し、得られた近似曲線式のパラメータを用いてＳＮＰ判定を行うロジスティックアルゴリズムについて説明する。なお、下記において（ｔ）は、測定開始からの時間ｔにおける値であることを示す。【００６２】
（手順１）測定部２は、観測結果として、下記の時系列データ、すなわち、サンプルデータ（生データ）、ネガコン（ＮＣ）データ、ポジコン（ＰＣ）データを取得し、記憶部３に書き込む。
サンプルデータ（生データ）は、サンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）、ＲＥＤ蛍光強度ＲＡ（ｔ）である。
ネガコン（ＮＣ）データは、ネガコンのＦＡＭ蛍光強度ＦＮ（ｔ）、ＲＥＤ蛍光強度ＲＮ（ｔ）。これは、サンプルなしで計測したネガティブコントロールのデータであり、サンプル以外の試薬は全て同じものを計測したものである。
ポジコン（ＰＣ）データは、ポジコンのＦＡＭ蛍光強度ＦＰ（ｔ）、ＲＥＤ蛍光強度ＲＰ（ｔ）。標準サンプルで計測したポジティブコントロールのデータであり、この計測値は、正常な反応の基準となる。【００６３】
（手順２）近似部４は、（手順１）にて得られたサンプルデータとポジコンデータについて、以下のようにネガコン分のデータ補正を行う。【００６４】
サンプルデータ：
ＦＡＲ（ｔ）＝ＦＡ（ｔ）−ＦＮ（ｔ），
ＲＡＲ（ｔ）＝ＲＡ（ｔ）−ＲＮ（ｔ）
ただし、ＦＡＲ（ｔ）＜０の場合は、ＦＡＲ（ｔ）＝０とする。
ポジコンデータ：
ＦＰＲ（ｔ）＝ＦＰ（ｔ）−ＦＮ（ｔ），
ＲＰＲ（ｔ）＝ＲＰ（ｔ）−ＲＮ（ｔ）
ただし、ＦＰＲ（ｔ）＜０の場合は、ＦＰＲ（ｔ）＝０とする。【００６５】
（手順３）近似部４は、（手順２）において求めたポジコンデータＦＰＲ（ｔ）、ＲＰＲ（ｔ）を用いて、最小二乗法等によりロジスティック曲線ｙ＝ａ／（１＋ｂｅ−ｃｘ）へ近似を行い、各パラメータａ，ｂ，ｃを得る。
ポジコンＦＡＭ：ポジコンデータＦＰＲ（ｔ）を用いてパラメータａ，ｂ，ｃを算出し、これをａＰＦ，ｂＰＦ，ｃＰＦとする。
ポジコンＲＥＤ：ポジコンデータＲＰＲ（ｔ）を用いてパラメータａ，ｂ，ｃを算出し、これをａＰＲ，ｂＰＲ，ｃＰＲとする。【００６６】
（手順４）近似部４は、（手順３）において得られたポジコンパラメータについて、下記の計算を行う。【００６７】
ポジコンＦＡＭ：ｐＦ＝ａＰＦ
ポジコンＲＥＤ：ｐＲ＝ａＰＲ【００６８】
（手順５）近似部４は、（手順２）において求めたサンプルデータＦＡＲ（ｔ）、ＲＡＲ（ｔ）を用いて、最小二乗法等によりロジスティック曲線ｙ＝ａ／（１＋ｂｅ−ｃｘ）への近似を行い、各パラメータａ，ｂ，ｃを得る。
サンプルＦＡＭ：サンプルデータＦＡＲ（ｔ）を用いてパラメータａ，ｂ，ｃを算出し、これをａＡＦ，ｂＡＦ，ｃＡＦとする。
サンプルＲＥＤ：サンプルデータＲＡＲ（ｔ）を用いてパラメータａ，ｂ，ｃを算出し、これをａＡＲ，ｂＡＲ，ｃＡＲとする。【００６９】
（手順６）近似部４、補正データとして、下記を計算する。【００７０】
【数１】
2009054474.tif 000003
【００７１】
（手順７）近似部４は、変曲点を計算する。【００７２】
ＦＡＭの変曲点：ＴＦ＝（logｂＡＦ）／ｃＡＦ
ＲＥＤの変曲点：ＴＲ＝（logｂＡＲ）／ｃＡＲ【００７３】
（手順８）判定部５は、（手順７）で算出した変曲点ＴＦ、ＴＲ（以下、総称して「変曲点Ｔ」と記載）を利用して、判定を行う。【００７４】
近似した曲線について、下記の指標を利用する。【００７５】
Ｓ（ｔ）＝log（ＦＲ（ｔ）／ＲＲ（ｔ））【００７６】
［２．２．２  改良エンドポイントアルゴリズム］
次に、アレル判定装置１において実行される、エンドポイント法を改良したアルゴリズムを説明する。【００７７】
（手順１）測定部２は、標準サンプルについて、リアルタイム計測を行い、測定データを記憶部３に書き込む。必要なサンプル数は、計測値のぶれに依存する。
（手順２）近似部４は、上述した２．２．１に記載のロジスティックアルゴリズムに従って、ロジスティック曲線への近似を行い、各パラメータの推定およびそのばらつき具合を検証する。
（手順３）判定部５は、最適な計測時間Ｔ’を算出する。
（手順４）判定部５は、最適な計測時間Ｔ’をエンドポイントの計測時間として以下のように判定を行う。【００７８】
プラトーａの到達度をαで定式化すると、計測値が、ａ（１−α）に到達する時間は、下記の式のようになる。なお、Ｔ＝（logｂ）／ｃは変曲点の時間である。【００７９】
【数２】
2009054474.tif 000004
【００８０】
例えば、プラトーが９７％の場合はα＝０．０３となる。ｂ＝２００、ｃ＝０．１、α＝０．０３の場合、Ｔ＝１７．７、Ｔ’＝２７．６、Ｔ’／Ｔ＝１.５６となる。これは、変曲点の時間から１．５６倍の時間を計測すれば、プラトーの９７％の値が計測できることを示している。これを図５に示す。【００８１】
実際の計測値は、様々な誤差を含む。誤差がどのような確率分布になるかは、実際の計測値を見て、判断を行う必要がある。仮に、ａ，ｂ，ｃのパラメータが、それぞれ独立にある確率分布に従うとした場合、時間のエンドポイントの計測値は、図６に示すような確率分布を描くと想定される。同図においては、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏと、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ及びＨｅｔｅｒｏの蛍光強度の確率分布とが分離され、ＦＡＭの蛍光強度が観測されない強度範囲であるグレーゾーンが明確である。エンドポイントの測定時に、単純に値の入っている領域で判断するか、ＦＡＭ・ＲＥＤ比をとるべきかは、実際のデータを解析する必要がある。また、試薬および温度条件などを調整し、ＦＡＭが観測されないＲＥＤ  Ｈｏｍｏ領域と、ＦＡＭが観測されるＦＡＭ  Ｈｏｍｏ及びＨｅｔｅｒｏ領域が明確に分離されるようにすべきである。調整が不十分な場合、図７に示すように、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏと、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏの蛍光強度の確率分布とが分離され、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏと、ＦＡＭ  ＨｏｍｏとのＦＡＭのどちらも観測されうる蛍光強度の範囲が現われてしまう。【００８２】
［２．３  判定例］
以下に、アレル判定装置の判定部５において実行される、上記のアルゴリズムを用いたＳＮＰ判定処理について示す。【００８３】
［２．３．１  補正データＦＲ（ｔ）、ＲＲ（ｔ）を用いた判定例］
図８（ａ）に示すＰ１，Ｐ２，Ｐ３は、理想状態において、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏについての補正データＦＲ（ｔ）、ＲＲ（ｔ）の推移をＰ１、Ｐ２、Ｐ３としてプロットしたものを示す。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３はそれぞれ、２本の直線で区切られるＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ領域内にプロットされている。
そこで、アレル判定装置１は、補正データＦＲ（ｔ）、ＲＲ（ｔ）を２軸とする平面において、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏの領域に分割する直線の情報を予め記憶部３に記憶しておき、判定部５は、この記憶している情報を用いて、２．２．１に示すロジスティックアルゴリズムの手順６において算出した補正データＦＲ（ｔ）、ＲＲ（ｔ）がどの領域に属するかを判断し、その属する領域によって、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏのいずれであるかを判断する。
しかし、図８（ｂ）の点線で示すようにバックグラウンドの上昇が起きた場合は、図８（ａ）のＰ４のプロットように、ＦＡＭ  ＨｏｍｏのはずがＨｅｔｅｒｏの領域に入り、判定を誤る原因となってしまう。【００８４】
［２．３．２  指標Ｓ（ｔ）を用いた判定例］
補正データＦＲ（ｔ）、ＲＲ（ｔ）の推移を、２．２．１に示すロジスティックアルゴリズムの（手順８）で算出される指標Ｓ（ｔ）＝log（ＦＲ（ｔ）／ＲＲ（ｔ））で考える。Ｓ（ｔ）の推移をグラフ化すると、理想状態では、図９（ａ）のようになる。同図によれば、Ｓ（ｔ）の値が落ち着いたところ（変化がなくなったところ）でＳ（ｔ）＞ｓならばＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、−ｓ＜Ｓ（ｔ）＜ｓならばＨｅｔｅｒｏ、Ｓ（ｔ）＜−ｓならばＲＥＤ  Ｈｏｍｏという判定が可能になる。【００８５】
しかし、現実的にバックグランドが上がると、Ｓ（ｔ）の推移は図９（ｂ）のようになる。つまり、Ｓ（ｔ）の値が落ち着いたところ（変化がなくなったところ）で判定すると、時間が経過して、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、ＲＥＤ  ＨｏｍｏはＨｅｔｅｒｏのエリアに入ってしまう（図８の場合と全く同様）。そこで、Ｓ（ｔ）の値が最大値もしくは最小値になるピーク値、あるいは、その周辺で判定を行うことを考える。つまり、ＦＡＭとＲＥＤの立ち上がりスピードの差が最大になったところのスピード比Ｓ（ｔ）を見る。具体的には、図９（ｂ）において、グレーゾーンを考慮し、アレル判定装置１の判定部５は、ｓ４＜ｐｅａｋ値ならばＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、ｓ２＜ｐｅａｋ値＜ｓ３ならばＨｅｔｅｒｏ、ｐｅａｋ値＜ｓ１ならばＲＥＤ  Ｈｏｍｏと判定する。なお、このｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４の値は、予め記憶部３に記憶しておく。【００８６】
図１０は、ＲＥＤ／ＦＡＭの観測結果の例を示す。図１０（ａ）はケース１のＦＡＭ  
Ｈｏｍｏの観測結果を、図１０（ｂ）はケース２のＦＡＭ  Ｈｏｍｏの観測結果を、図１０（ｃ）は、ケース３のＨｅｔｅｒｏの観測結果を、図１０（ｄ）は、ケース４のＨｅｔｅｒｏの観測結果を、図１０（ｅ）はケース５のＲＥＤ  Ｈｏｍｏの観測結果を、図１０（ｆ）はケース６のＲＥＤ  Ｈｏｍｏの観測結果を示している。そして、図１１は、図１０（ａ）〜（ｆ）についてのＳ（ｔ）の経時変化を示す図である。図１１においては、ケース１、２ともＦＡＭ  Ｈｏｍｏの場合はＳ（ｔ）のピーク値が大きな正の値を、ケース５、６ともＲＥＤ  Ｈｏｍｏの場合はＳ（ｔ）のピーク値が大きな負の値を取っている。
一方、ケース３のＨｅｔｅｒｏの場合はＳ（ｔ）が０に近い値をとっており、ケース４のＨｅｔｅｒｏの場合は、負側にピークが見受けられるが、その絶対値は小さい。【００８７】
［２．３．３  変曲点ＴＦ、ＴＲを利用した判定例］
ロジスティックアルゴリズムの（手順７）及び（手順８）で算出した変曲点Ｔ（ＴＦ、ＴＲ）を利用した判定の具体例を以下に示す。
変曲点は、近似されたロジスティック曲線から得られたパラメータをもとに、ＦＡＭの変曲点ＴＦは、ＴＦ＝（logｂＡＦ）／ｃＡＦにより、ＲＥＤの変曲点ＴＲは、ＴＲ＝（logｂＡＲ）／ｃＡにより算出される。これらの変曲点ＴＦ、ＴＲは、蛍光強度の立ち上がりの時間に相当する。【００８８】
図１２は、実際のＦＡＭ、ＲＥＤの測定データをロジスティック曲線に近似した場合の変曲点ＴＦ、ＴＲの例を示す。ここでは、図２７（ｂ）に示すようなＦＡＭ  Ｈｏｍｏの観測データをロジスティック曲線に当てはめたものであり、図１２（ａ）は、ＦＡＭの観測データ及び近似されるロジスティック曲線を、図１２（ｂ）は、ＲＥＤの観測データ及び近似されるロジスティック曲線を示している。図１２（ａ）、（ｂ）の横軸のスケールは同じ、縦軸のスケールについて、（ａ）は（ｂ）の４倍である。同図に示すように、変曲点Ｔはポジティブの場合小さい値を取り、ネガティブの場合は大きい値を取る。【００８９】
図１３は、横軸をＦＡＭの変曲点ＴＦ＝Ｔ（ＦＡＭ）、縦軸をＲＥＤの変曲点ＴＲ＝Ｔ（ＲＥＤ）としたグラフであり、図１０（ａ）〜（ｆ）について求めた変曲点ＴＦ、ＴＲをプロットしたものである。この図１３に示すように、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏについて、それぞれ点線で区切った４つのゾーン（ＮＧ領域を含んだ場合）にうまく分かれることがわかる。
そこで、アレル判定装置１は、変曲点ＴＦ、ＴＲを２軸とする平面において、ＲＥＤ  
Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、ＮＧに分割する領域の情報を予め記憶部３に記憶しておき、判定部５は、この記憶している情報を用いて、２．１．１の手順７において算出した変曲点ＴＦ、ＴＲがどの領域に属するかを判断し、その属する領域によって、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、ＮＧのいずれであるかを判断する。【００９０】
［２．３．４  変曲点ＴＦ及びＴＲに加え、様々な指標を組み合わせた判定法］
上述の２．３．３に記載の方法により、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ、Ｈｅｔｅｒｏ、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ、ＮＧに４区画した場合、図１４に示すように、本来ネガティブであるデータのＴと、ポジティブデータのＴが同程度になってしまう場合や、ネガティブデータのＴが０になる場合は、Ｔのみを指標としたＳＮＰのパターン判定は難しいと思われる。そこで、下記のように、他の指標による判定も併せて実行する。【００９１】
（１）変曲点Ｔ（ＴＦ、ＴＲ）はサンプルデータの立ち上がり時間に相当する。変曲点Ｔの立ち上がり時間が早ければポジティブ、遅ければネガティブと判定する。
（２）ＦＡＭサンプルデータの最大値ＭＦ、ＲＥＤサンプルデータの最大値ＭＲを利用する。ＭＦ、ＭＲがある一定以上の値を取る場合、異常値の指標となる。
（３）ロジスティック曲線のパラメータａを利用する。ＦＡＭ、ＲＥＤそれぞれの近似ロジスティック曲線のパラメータａ（ａＡＦ、ａＡＲ）は、最大値の指標となる以外に、正常なポジティブデータの場合、ある一定以下の値をとる。よって、パラメータａそれぞれについて取りうる正常な最大値と比較し、この最大値以下であれば正常と判断する。
（４）ＦＡＭ、ＲＥＤの変曲点Ｔの比Ｔ’を利用する。ＦＡＭ  ＨｏｍｏまたはＲＥＤＨｏｍｏの場合、Ｈｅｔｅｒｏの場合と比較して、ＦＡＭの変曲点Ｔ（ＦＡＭ）とＲＥＤの変曲点Ｔ（ＲＥＤ）が大きく異なる。そこで、比Ｔ’を見ることで、より正確にポジティブ、ネガティブの判定が可能となる。【００９２】
［３．  処理フロー］
次に、上記アルゴリズムを実装するアレル判定装置１の処理フローについて説明する。【００９３】
［３．１  ＳＮＰ判定処理フロー］
図１５は、アレル判定装置１におけるＳＮＰ判定処理の概要のフローを示す図である。
アレル判定装置１の測定部２は、ＳＮＰ判定対象のサンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）及びＲＥＤの蛍光強度ＲＡ（ｔ）、ネガコン（ＮＣ）のＦＡＭ蛍光強度ＦＮ（ｔ）及びＲＥＤの蛍光強度ＲＮ（ｔ）、ポジコン（ＰＣ）のＦＡＭ蛍光強度ＦＰ（ｔ）及びＲＥＤ蛍光強度ＲＰ（ｔ）を観測した得た測定結果のデータを記憶部３に書き込む。近似部４は、記憶部３から、測定結果データ読み出し、２．２．１に記載したロジスティックアルゴリズムを実行することにより、ＦＡＭ、ＲＥＤのそれぞれについて、ロジスティック曲線への近似を行い、各パラメータや指標を算出する（ステップＳ１０１）。なお、ネガコン（ＮＣ）、ポジコン（ＰＣ）を使用しない場合についての各パラメータや指標の算出については、図１９及び図２１に示す。【００９４】
判定部５は、ＦＡＭ、ＲＥＤについて得られたロジスティック曲線の近似式の各パラメータや指標、測定結果データを用いて、ＦＡＭ、ＲＥＤそれぞれについて、ポジティブ（ｐｏｓｉ）であるか、ネガティブ（ｎｅｇａ）であるか、あるいは、判定ＮＧであるかの判定処理を行う（ステップＳ１０２、Ｓ１０３）。アレル判定装置１の判定部５は、ステップＳ１０２、Ｓ１０３において得られたＦＡＭ、ＲＥＤ判定処理結果に基づいてＳＮＰ判定処理を行い（ステップＳ１０４）、出力部６は、判定部５のステップＳ１０４におけるＳＮＰ判定処理の結果を得て、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ／Ｈｅｔｅｒｏ／ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ／ＮＧを出力する（ステップＳ１０５〜Ｓ１０８）。【００９５】
図１６は、図１５のステップＳ１０４におけるＳＮＰ判定処理の論理を示す。判定部５は、ＦＡＭ判定結果、ＲＥＤ判定結果ともポジティブ（ｐｏｓｉ）である場合、ＳＮＰ判定結果がＨｅｔｅｒｏであると判定する。また、ＦＡＭ判定結果がポジティブ（ｐｏｓｉ）、ＲＥＤ判定結果がネガティブ（ｎｅｇａ）であればＳＮＰ判定結果はＦＡＭ  Ｈｏｍｏであると判定し、ＲＥＤ判定結果がポジティブ（ｐｏｓｉ）、ＦＡＭ判定結果がネガティブ（ｎｅｇａ）であればＳＮＰ判定結果はＲＥＤ  Ｈｏｍｏであると判定する。その他の場合、つまり、ＦＡＭ判定結果、ＲＥＤ判定結果のいずれかがＮＧの場合、あるいは、ＦＡＭ判定結果及びＲＥＤ判定結果の両方がネガティブ（ｎｅｇａ）である場合、ＳＮＰ判定結果はＮＧと判定する。【００９６】
［３．２  ポジティブ／ネガティブ判定フロー］
図１７及び図１８は、図１５におけるステップＳ１０２におけるＦＡＭ判定結果、及び、Ｓ１０３におけるＲＥＤ判定結果を得るためのポジティブ／ネガティブ（以下、「ポジネガ」と記載）判定処理フローを示す図である。以下では、ＦＡＭ判定結果を得る場合について説明するが、ＲＥＤ判定結果を得る場合も同様であり、「ＦＡＭ」を「ＲＥＤ」に置き換えて実行すればよい。ただし、パラメータａ，ｂ，ｃ、変曲点Ｔ１は、２．２．１に記載したロジスティックアルゴリズムにより算出した場合、ＦＡＭについては、パラメータａＡＦ，ｂＡＦ，ｃＡＦ、変曲点ＴＦであり、ＲＥＤについては、パラメータａＡＲ，ｂＡＲ，ｃＡＲ、変曲点ＴＲである。【００９７】
アレル判定装置１の判定部５は、図１５のステップＳ１０１において得られたＦＡＭの近似式のパラメータａが０より大きいか否かを判断する（ステップＳ２０１）。パラメータａは、増幅曲線が一定になる値であり、概ね、反応におけるプラトー値に相当する。そこで、ＦＡＭのロジスティック曲線の近似式におけるパラメータａが０以下である場合（ステップＳ２０１：ＮＯ）、正しい測定ができなかったとして判定部５はＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２０２）。【００９８】
一方、パラメータａが０より大きい場合（ステップＳ２０１：ＹＥＳ）、判定部５は、近似されたＦＡＭのロジスティック曲線における変曲点Ｔ１を得る。変曲点Ｔ１は、２．２．１に記載したロジスティックアルゴリズムにより、または、後述する図２０のＴ１算出処理により算出されたものである。判定部５は、変曲点Ｔ１が０より小さいか否かを判断する（ステップＳ２０３）。この変曲点Ｔ１は反応立ち上がりの時間に相当する。そこで、変曲点Ｔ１が０より小さい場合（ステップＳ２０３：ＹＥＳ）、判定部５は、正しい測定ができなかったとしてポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２０４）。【００９９】
変曲点Ｔ１が０以上である場合（ステップＳ２０３：ＮＯ）、判定部５は、ＦＡＭ蛍光強度の測定値の最大値（ｍａｘ値）により分岐を行う（ステップＳ２０５）。
判定部５は、判定対象のサンプルデータについて実際に観測されたＦＡＭ蛍光強度の最大値が異常に小さい、つまり、正常な測定ができたと判定されるＦＡＭ蛍光強度の最小値を示す閾値Ａ１より小さい場合（ステップＳ２０５：ｍａｘ値＜Ａ１）、あるいは、実際に観測されたＦＡＭ蛍光強度の最大値が異常に大きい場合、つまり、正常な測定ができたと判定されるＦＡＭ蛍光強度の最大値を示す閾値Ａ５より大きい場合（ステップＳ２０５：Ｓ５＜ｍａｘ値）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２０６、Ｓ２０７）。【０１００】
また、判定部５は、ＦＡＭ蛍光強度測定値の最大値が、上述する閾値Ａ１以上であり、かつ、ＦＡＭがネガティブであると判定される閾値Ａ２以下である場合（ステップＳ２０５：Ａ１≦ｍａｘ値≦Ａ２）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がネガティブであると判定する（ステップＳ２０８）。これは、理想的な場合、ネガティブな場合の蛍光強度の測定値が、ポジティブな蛍光強度の測定値より十分低いためである。【０１０１】
また、判定部５は、ＦＡＭ蛍光強度測定値の最大値が、上述する閾値Ａ２よりも大きく、ＦＡＭがネガティブである可能性が高いと判定される閾値Ａ３以下である場合（ステップＳ２０５：Ａ２＜ｍａｘ値≦Ａ３）、さらに、ＦＡＭがネガティブであるかの判定処理を行う。変曲点Ｔ１は、ポジティブの場合には、反応がすぐに立ち上がるので小さい値を取るが、ネガティブの場合には、反応はすぐには立ち上がらないため、ある程度大きい値を取る。そこで、判定部５は、変曲点Ｔ１を、ＦＡＭがネガティブであると判定するための閾値Ａ６と比較する（ステップＳ２０９）。変曲点Ｔ１が閾値Ａ６以下である場合（ステップＳ２０９：ＮＯ）、判定部５は、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２１０）。【０１０２】
変曲点Ｔ１が閾値Ａ６より大きい場合（ステップＳ２０９：ＹＥＳ）、さらに、判定部５は、後述する図２２の処理により、ＦＡＭ蛍光強度の測定結果から近似されたロジスティック曲線の変曲点Ｔ（ＦＡＭ）と、ＲＥＤ蛍光強度の測定結果から近似されたロジスティック曲線の変曲点Ｔ（ＲＥＤ）との比であるＴ’を算出する。判定部５は、Ｔ’がネガティブと判定される範囲内であるかを判断する（ステップＳ２１１）。ここでは、Ｔ’が、ＦＡＭがネガティブと判定される閾値Ａ７より小さいかを判断する。判定部５は、Ｔ’が範囲内であると判断した場合、すなわち、閾値Ａ７より小さい場合（ステップＳ２１１：ＹＥＳ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がネガティブであると判定し（ステップＳ２１２）、Ｔ’が範囲内ではない、すなわち、閾値Ａ７以上である場合は（ステップＳ２１１：ＮＯ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２１３）。なお、ＲＥＤの場合、Ｔ’がネガティブと判定される範囲内であるかを判断するには、ＲＥＤがネガティブと判定される閾値Ａ７より大きいかを判断する。【０１０３】
また、判定部５は、ＦＡＭ蛍光強度測定値の最大値が、ＦＡＭがポジティブである可能性が高いと判定される閾値Ａ４以上であり、かつ、上述する閾値Ａ５以下である場合（ステップＳ２０５：Ａ４≦ｍａｘ値≦Ａ５）、さらに、ＦＡＭがポジティブであるかを判定する処理を行う。変曲点Ｔ１は、ポジティブの場合、反応がすぐに立ち上がるので小さい値を取る。そこで、判定部５は、変曲点Ｔ１を、ＦＡＭがポジティブであると判定するための最小値である閾値Ａ８より大きく、ＦＡＭがポジティブであると判定するための最大値である閾値Ａ９より小さいかを判断する（ステップＳ２１４）。変曲点Ｔ１が閾値Ａ８と閾値Ａ９の間の値ではない場合（ステップＳ２１４：ＮＯ）、判定部５は、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２１５）。【０１０４】
変曲点Ｔ１が閾値Ａ８と閾値Ａ９の間の値である場合（ステップＳ２１４：ＹＥＳ）、さらに、判定部５は、ＦＡＭの近似曲線におけるパラメータａが異常に大きな値ではなく、正常な測定ができたと判定される閾値Ａ１０より小さいかを判断する（ステップＳ２１６）。パラメータａが閾値Ａ１０以上であると判断した場合（ステップＳ２１６：ＮＯ）、判定部５は、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２１７）。パラメータａが閾値Ａ１０より小さいと判断した場合（ステップＳ２１６：ＹＥＳ）、判定部５は、後述する図２２において算出された、変曲点Ｔ（ＦＡＭ）と変曲点Ｔ（ＲＥＤ）との比Ｔ’が、ポジティブと判定される範囲内であるかを判断する（ステップＳ２１８）。ここでは、Ｔ’が、ＦＡＭがポジティブと判定される閾値Ａ１１より大きいかを判断する。判定部５は、Ｔ’が範囲内であると判断した場合、すなわち、閾値Ａ１１より大きい場合（ステップＳ２１８：ＹＥＳ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がポジティブであると判定し（ステップＳ２１９）、Ｔ’が範囲内ではない、すなわち、閾値Ａ１１以下である場合は（ステップＳ２１８：ＮＯ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ２２０）。なお、ＲＥＤの場合、Ｔ’がポジティブと判定される範囲内であるかを判断するには、ＲＥＤがポジティブと判定される閾値Ａ１１より大きいかを判断する。【０１０５】
また、判定部５は、ＦＡＭ蛍光強度測定値の最大値が、上述する閾値Ａ３より大きく、上述する閾値Ａ４より小さい場合（ステップＳ２０５：Ａ３＜ｍａｘ値＜Ａ４）、ネガティブとポジティブの両方の可能性があるとして、図１８に示す判定処理を行う。【０１０６】
図１８において、判定部５は、ＦＡＭのロジスティック曲線の近似式における変曲点Ｔ１により分岐を行う（ステップＳ３０１）。変曲点Ｔ１がある一定値より大きければ、ネガティブの可能性が高い。そこで、判定部５は、変曲点Ｔ１が閾値Ａ６より大きい場合（ステップＳ３０１：Ａ６＜Ｔ１）、図１７のステップＳ２１１と同様の条件により、変曲点Ｔ（ＦＡＭ）と変曲点Ｔ（ＲＥＤ）との比Ｔ’が、ネガティブと判定される範囲内であるかを判断する（ステップＳ３０２）。判定部５は、Ｔ’が範囲内であると判断した場合（ステップＳ３０２：ＹＥＳ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がネガティブであると判定し（ステップＳ３０３）、Ｔ’が範囲内ではないと判断した場合（ステップＳ３０２：ＮＯ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果はＮＧであると判定する（ステップＳ３０４）。【０１０７】
また、変曲点Ｔ１がある一定値より小さければ、ポジティブの可能性が高い。そこで、判定部５は、変曲点Ｔ１が、ＦＡＭがポジティブであると判定するための閾値Ａ９より小さい場合（ステップＳ３０１：Ａ９＜Ｔ１）、図１７のステップＳ２１６〜Ｓ２２０と同様の処理を行う（ステップＳ３０５〜Ｓ３０９）。すなわち、ＦＡＭの近似曲線のパラメータａが閾値Ａ１０以上であると判断した場合（ステップＳ３０５：ＮＯ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ３０６）。パラメータａが閾値Ａ１０より小さいと判断した場合（ステップＳ３０５：ＹＥＳ）、Ｔ’がポジティブと判定される範囲内であるかを判断する（ステップＳ３０７）。Ｔ’が範囲内であると判断した場合（ステップＳ３０７：ＹＥＳ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がポジティブであると判定し（ステップＳ３０８）、範囲内ではないと判断した場合は（ステップＳ３０７：ＮＯ）、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ３０９）。【０１０８】
また、判定部５は、変曲点Ｔ１が、上述する閾値Ａ９以上、かつ、上述する閾値Ａ６以下である場合（ステップＳ３０１：Ａ９≦Ｔ１≦Ａ６）、ポジティブかネガティブかの判定不能なグレーゾーンにあるとし、ＦＡＭのポジネガ判定結果がＮＧであると判定する（ステップＳ３１０）。【０１０９】
図１９は、図１５のステップＳ１０１において実行されるアレル判定装置のパラメータａ出力処理であり、ＦＡＭ、ＲＥＤそれぞれについて実行する。
まず、近似部４は、ＦＡＭの場合、ＳＮＰ判定対象のサンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）の測定結果データを、ＲＥＤの場合、ＳＮＰ判定対象のサンプルのＲＥＤ蛍光強度ＲＡ（ｔ）の測定結果データを記憶部３から読み出す（ステップＳ４０１）。近似部４は、読み出したこれらのデータを使用し、最小二乗法等によりＦＡＭ、ＲＥＤのそれぞれについてロジスティック曲線への近似を行い、近似式ｙ＝ａ／（１＋ｂｅ−ｃｘ）における各パラメータを決定する（ステップＳ４０２）。つまり、パラメータａは、ＦＡＭの場合パラメータａＡＦであり、ＲＥＤの場合、パラメータａＡＲである。【０１１０】
近似部４は、ＦＡＭ、ＲＥＤのパラメータａについて、以下の処理を行う。すなわち、近似部４は、パラメータａが正しい測定ができたかを判定するための最小値である閾値Ｂ１と比較する（ステップＳ４０３）。近似部４は、パラメータａが閾値Ｂ１より大きければ（ステップＳ４０３：ＹＥＳ）、正しい測定ができたとして、判定部５にパラメータａを出力し（ステップＳ４０４）、パラメータａが閾値Ｂ１以下であれば（ステップＳ４０３：ＮＯ）、正しい測定ができなかったとして、ＦＡＭについてのａ出力処理を実行しているときにはＦＡＭのポジネガ判定ＮＧを、ＲＥＤについてのａ出力処理を行っているときにはＲＥＤのポジネガ判定ＮＧを、判定部５に出力する（ステップＳ４０５）。【０１１１】
図２０は、図１５のステップＳ１０１において実行されるアレル判定装置のＴ１出力処理であり、ＦＡＭ、ＲＥＤそれぞれについて実行する。以下では、ＦＡＭについて説明するが、ＲＥＤの場合も同様であり、「ＦＡＭ」を「ＲＥＤ」に置き換えて実行すればよい。【０１１２】
近似部４は、記憶部３からＳＮＰ判定対象のサンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）（ＲＥＤの場合は、ＲＥＤ蛍光強度ＲＡ（ｔ））の測定結果データ読み出す（ステップＳ５０１）。近似部４は、読み出したこれらのデータを使用し、最小二乗法等を用いて、ロジスティック曲線への近似を行い、近似式ｙ＝ａ／（１＋ｂｅ−ｃｘ）における各パラメータａ，ｂ，ｃを決定する（ステップＳ５０２）。【０１１３】
近似部４は、パラメータａ，ｂ、ｃが正しい測定ができたかを判定するための範囲内であるかを判断する（ステップＳ５０３）。具体的には、パラメータａがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す閾値Ｃ１と閾値Ｃ２の間であり、かつ、パラメータｂがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す閾値Ｃ３と閾値Ｃ４の間であり、かつ、パラメータｃがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す閾値Ｃ５と閾値Ｃ６の間であるかを判断する。【０１１４】
近似部４は、パラメータａ、ｂ、ｃのうちいずれか１つまたは複数が、正しい測定ができたかを判定するための範囲内にない場合（ステップＳ５０３：ＮＯ）、近似部４は、ａを固定して、ＳＮＰ判定対象のサンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）で示される測定データを用い、最小二乗法等によりロジスティック曲線への近似を行い、パラメータｂ，ｃを決定する（ステップＳ５０４）。ここで、固定すべきパラメータａは、測定対象のサンプルを含まないある集団の、教師データがＦＡＭポジティブである各サンプルについて、経時蛍光測定データを用い、ロジスティック曲線への近似を行って得られたパラメータａの平均値である。このある集団とは、固定するパラメータａ，ｂの値やその他閾値を決定するための母集団であり、ＳＮＰ判定を行う対象のヒトのサンプルはこの母集団に属してはならない。また、教師データとは、シーケンサー等で既にＳＮＰの遺伝型（ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ／Ｈｅｔｅｒｏ／ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ）が分かっているデータのことをいう。【０１１５】
近似部４は、パラメータｂ、ｃが正しい測定ができたかを判定するための範囲内であるかを判断する（ステップＳ５０５）。具体的には、パラメータｂがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す閾値Ｃ３と閾値Ｃ４の間であり、パラメータｃがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す閾値Ｃ５と閾値Ｃ６の間であるかを判断する。【０１１６】
近似部４は、パラメータｂ、ｃのいずれかまたは両方が、正しい測定ができたかを判定するための範囲内にない場合（ステップＳ５０５：ＮＯ）、パラメータａ及びｂを固定し、ＳＮＰ判定対象のサンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）で示される測定データを用い、最小二乗法等によりロジスティック曲線への近似を行い、パラメータｃを算出する（ステップＳ５０６）。このとき、固定するパラメータａは、ステップＳ５０４にて用いたパラメータａであり、固定するパラメータｂは、後述する図２１に示す処理フローによって出力されたパラメータｂの平均値である。【０１１７】
近似部４は、パラメータｃが正しい測定ができたかを判定するための範囲内であるかを判断する（ステップＳ５０７）。具体的には、パラメータｃが上述する閾値Ｃ５と閾値Ｃ６の間であるかを判断する。近似部４は、パラメータｃが正しい測定ができたかを判定するための範囲内にない場合（ステップＳ５０７：ＮＯ）、判定部５にＦＡＭのポジネガ判定ＮＧを出力する（ステップＳ５０８）。【０１１８】
近似部４は、ステップＳ５０３において、パラメータａ、ｂ、ｃとも正しい測定ができたかを判定するための範囲内にあると判断した場合（ステップＳ５０３：ＹＥＳ）、ステップＳ５０５において、パラメータｂ、ｃとも正しい測定ができたかを判定するための範囲内にあると判断した場合（ステップＳ５０５：ＹＥＳ）、ステップＳ５０７において、パラメータｃが正しい測定ができたかを判定するための範囲内にあると判断した場合（ステップＳ５０７：ＹＥＳ）に、算出したパラメータａ，ｂ，ｃを用いて変曲点Ｔを算出する。近似部４は、ＦＡＭの変曲点Ｔが所定の時間内に現われたかを判定するための範囲内にあるかを判断する（ステップＳ５０９）。例えば、変曲点Ｔが閾値Ｃ７より小さいかを判断する。変曲点Ｔが閾値Ｃ７より小さい場合（ステップＳ５０９：ＹＥＳ）、上述した図１７、図１８のポジネガ判定フローにて用いる変曲点Ｔ１を、ＦＡＭのロジスティック曲線の近似式から得られた変曲点Ｔとし、判定部５へ出力する（ステップＳ５１０）。つまり、ＦＡＭの場合は変曲点Ｔ１＝Ｔ（ＦＡＭ）、ＲＥＤの場合は、変曲点Ｔ１＝Ｔ（ＲＥＤ）が出力される。また、変曲点Ｔが閾値Ｃ７以上である場合（ステップＳ５０９：ＮＯ）、図１７、図１８のポジネガ判定フローにて用いる変曲点Ｔ１を閾値Ｃ７とする（ステップＳ５１１）。【０１１９】
図２１は、固定すべきパラメータｂを決定するための出力処理フローを示す。本処理は、測定対象のサンプルを含まない上述したある集団についての、教師データがＦＡＭポジティブであるサンプルそれぞれについて実行する。本処理について算出されたパラメータｂの平均値が、図２０のステップＳ５０６において固定すべきパラメータｂの値となる。【０１２０】
近似部４は、測定対象のサンプルを含まない上述したある集団に含まれる、教師データがＦＡＭポジティブであるサンプルのＦＡＭ蛍光強度ＦＡ（ｔ）（ＲＥＤの場合は、ＲＥＤ蛍光強度ＲＡ（ｔ））の測定結果データ読み出す（ステップＳ６０１）。近似部４は、ステップＳ６０１により取得した測定結果データを用い、当該サンプルについて、最小二乗法等により、パラメータ固定なしでロジスティック曲線への近似を行って、近似式ｙ＝ａ／（１＋ｂｅ−ｃｘ）における各パラメータａ，ｂ，ｃを算出する（ステップＳ６０２）。【０１２１】
近似部４は、ステップＳ６０２で算出されたパラメータａ，ｂ、ｃが正しい測定ができたかを判定するための範囲内であるかを判断する（ステップＳ６０３）。具体的には、パラメータａがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す上述の閾値Ｃ１と閾値Ｃ２の間であり、かつ、パラメータｂがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す上述の閾値Ｃ３と閾値Ｃ４の間であり、かつ、パラメータｃがＦＡＭの近似曲線における正常な範囲を示す上述の閾値Ｃ５と閾値Ｃ６の間であるかを判断する。近似部４は、算出したパラメータａ、ｂ、ｃの全てが、正しい測定ができたかを判定するための範囲内にある場合（ステップＳ６０３：ＹＥＳ）、算出したパラメータｂを出力する（ステップＳ６０５）。【０１２２】
一方、近似部４は、パラメータａ、ｂ、ｃのいずれか１以上が、正しい測定ができたかを判定するための範囲内にない場合（ステップＳ６０３：ＮＯ）、ａを固定して、ステップＳ６０１において読み出したサンプルの測定データを用いて、最小二乗法等によりロジスティック曲線への近似を行い、パラメータｂを決定し（ステップＳ６０４）、この決定したパラメータｂを出力する（ステップＳ６０５）。ここで、固定すべきパラメータａは、測定対象のサンプルを含まない上述するある集団の、教師データがＦＡＭポジティブである各サンプルについて、経時蛍光測定データを用い、ロジスティック曲線への近似を行って得られたパラメータａの平均値である。【０１２３】
図２２は、図１７、図１８のポジネガ判定フローにて用いられるＴ’の算出フローである。近似部４は、２．２．１で算出した変曲点ＴＦ、ＴＲを、または、図２０において求めたＦＡＭ及びＲＥＤのＴ１を、Ｔ（ＦＡＭ）、Ｔ（ＲＥＤ）として用い（ステップＳ７０１）、Ｔ’＝Ｔ（ＲＥＤ）／Ｔ（ＦＡＭ）を算出し、判定部５へ出力する（ステップＳ７０２）。【０１２４】
上記において、各閾値Ａ１〜Ａ１１、Ｂ１、Ｃ１〜Ｃ７は、温度や試料の量などの測定条件に依存する。そのため、実際の測定データの統計から適切な値を決定し、記憶部３内にその値を記憶させておく。【０１２５】
［４．  実験結果］
従来のエンドポイント法によるＳＮＰ判定と、本実施の形態のアレル判定装置１による上記フローにより判定を行ったＳＮＰ判定を用いた実験結果を以下に示す。【０１２６】
［４．１  実験方法］［４．１．１  エンドポイント法アルゴリズム］
従来技術に記載したエンドポイント法では、補正データについてゲタ分を差し引くことと、ＦＡＭ、ＲＥＤのスケール合わせのため、ネガコンを用いていることとしているが、本実証実験ではネガコンを用いていない。そのため、以下に述べる補正データでは、ゲタ分は差し引いていない。スケール合わせには、ネガコンの代わりに蛍光値の低いＲＥＤに任意の値を掛け合わせることで、ＦＡＭ、ＲＥＤの蛍光値を調整した。
従来技術に記載した方法からの変更点を含め、実験に用いたデータ及びアルゴリズムについて以下に述べる。【０１２７】
（１）データ：サンプルデータ（生データ）：ＦＡＭとＲＥＤそれぞれのｔ分後の蛍光強度（装置の測定値）である、ＦＡＭサンプルデータＦＡ（ｔ）、ＲＥＤサンプルデータＲＡ（ｔ）を取得する。
（２）補正データ：Ｔ分後のＦＲ（Ｔ）、ＲＲ（Ｔ）を取得する。
ＦＡＭ：ＦＲ（Ｔ）＝ＦＡ（Ｔ）
ＲＥＤ：ＲＲ（Ｔ）＝ｈ×ＲＡ（Ｔ）
ただし、ｈは、スケール合わせのためのパラメータである。
（３）アルゴリズム
補正データの比Ｒａｔｉｏを計算し、アレル判定を行う。
Ｒａｔｉｏ＝ＦＲ（Ｔ）／ＲＲ（Ｔ）【０１２８】
図２３に示すように、グレーゾーンを、ｂ＜（グレーゾーン）＜ａ、及び、（１／ａ）＜（グレーゾーン）＜（１／ｂ）とし、ＲＥＤ  Ｈｏｍｏは、Ｒａｔｉｏ＜（１／ａ）、Ｈｅｔｅｒｏは（１／ｂ）＜Ｒａｔｉｏ＜ｂ、ＦＡＭ  Ｈｏｍｏは、ａ＜Ｒａｔｉｏとして判定した。【０１２９】
［４．１．２  ロジスティックアルゴリズム］
上述した３．に記載の処理フローとほぼ同様の方法で実験を行った。実験に用いたデータの種類、アルゴリズムの作成についての詳細を以下に記す。【０１３０】
（１）下記の時系列データを取得する。
サンプルデータ（生データ）：ＦＡＭとＲＥＤそれぞれのｔ分後の蛍光強度（アレル判定装置１の測定値）である、ＦＡＭサンプルデータＦＡ（ｔ）、ＲＥＤサンプルデータＲＡ（ｔ）を取得した。【０１３１】
（２）サンプルデータについて、ロジスティック曲線への近似を行い、以下の各パラメータを取得する。
サンプルＦＡＭ：ＦＡＭサンプルデータＦＡ（ｔ）を用いて算出したパラメータａ，ｂ，ｃであるａＡＦ，ｂＡＦ，ｃＡＦ
サンプルＲＥＤ：ＲＥＤサンプルデータＲＡ（ｔ）を用いて算出したパラメータａ，ｂ，ｃであるａＡＲ，ｂＡＲ，ｃＡＲ【０１３２】
（３）（２）においてあてはめをおこなったロジスティック曲線の変曲点を算出する。
ＦＡＭの変曲点：ＴＦ＝（logｂＡＦ）／ｃＡＦ
ＲＥＤの変曲点：ＴＲ＝（logｂＡＲ）／ｃＡＲ【０１３３】
（４）（３）にて算出した変曲点ＴＦ及びＴＲを利用して、判定を実行する。
（５）変曲点ＴＦ、ＴＲのＴ’比を計算する。
変曲点比：Ｔ’＝ＴＲ／ＴＦ（６）サンプルデータの最大値を取得する。
ＦＡＭサンプルデータの最大値：ＭＦ
ＲＥＤサンプルデータの最大値：ＭＲ【０１３４】
（７）変曲点ＴＦ及びＴＲに加え、最大値ＭＦ及びＭＲ、ロジスティック曲線のパラメータａＡＦ及びａＡＲ、ならびに、変曲点ＴＦ、ＴＲの比Ｔ’を利用して、上述した判定フローによって判定を行う。【０１３５】
［４．２  結果］
図２４に、エンドポイントアルゴリズムにおける蛍光値について、横軸にＦＲ（Ｔ）、縦軸にＲＲ（Ｔ）を取ったグラフを示す。ここで示したＳＮＰの遺伝型（ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ／Ｈｅｔｅｒｏ／ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ）は、教師データである。同図において、エンドポイントアルゴリズムではＨｏｍｏとＨｅｔｅｒｏのプロットが重なっている部分が見られる。また、ＮＧと正常なデータのプロットが重なっている場合もあり、アルゴリズムを作成する際のスレショルドの設定が非常に難しいことが分かる。【０１３６】
図２５に、ロジスティックアルゴリズムを使用した場合の変曲点ＴＦ、ＴＲの相関を示す。同図は、横軸にＲＥＤの変曲点ＴＦを、縦軸にＦＡＭの変曲点ＴＲを取ったグラフである。ここでのＳＮＰの遺伝型（ＦＡＭ  Ｈｏｍｏ／Ｈｅｔｅｒｏ／ＲＥＤ  Ｈｏｍｏ）は教師データによるものである。同図に示すように、ＨｏｍｏとＨｅｔｅｒｏのプロットが重なっている部分がなく、クラスタリングされている。
また、教師データとロジスティックアルゴリズムによる判定結果が精度高く一致し、本実験では誤判定は見られなかった。【０１３７】
［５．  その他］
なお、上記においては、ロジスティック曲線への近似を行っているが、ゴンペルツ曲線等の他の曲線を用いてもよい。ゴンペルツ曲線は、Ｓ字曲線であり、以下の数式で与えられる。【０１３８】
【数３】
2009054474.tif 000005
【０１３９】
ａは、次式で与えられる。【０１４０】
【数４】
2009054474.tif 000006
【０１４１】
また、ｂ，ｃはそれぞれ、以下の範囲内におさまる。【０１４２】
０＜ｂ＜１，０＜ｃ＜１【０１４３】
また、ロジスティック曲線の変曲点Ｔに相当する点は、以下のようになる。【０１４４】
【数５】
2009054474.tif 000007
【０１４５】
なお、上述のアレル判定装置１は、内部にコンピュータシステムを有している。そして、アレル判定装置１の近似部４、判定部５、出力部６の動作の過程は、プログラムの形式でコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記憶されており、このプログラムをコンピュータシステムが読み出して実行することによって、上記処理が行われる。ここでいうコンピュータシステムとは、ＣＰＵ及び各種メモリやＯＳ、周辺機器等のハードウェアを含むものである。【０１４６】
また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ポジティブ、ネガティブの反応曲線の典型的パターンを示す図である。
【図２】ロジスティック曲線を示す図である。
【図３】一部のパラメータを固定したときのロジスティック曲線を示す図である。
【図４】本発明の一実施の形態によるアレル判定装置の構成を示すブロック図である。
【図５】改良エンドポイントアルゴリズムのエンドポイント時間を説明する図である。
【図６】理想的な蛍光強度の確率分布を示す図である。
【図７】調整が不十分な場合の蛍光強度の確率分布を示す図である。
【図８】補正データを用いた判定例を示す図である。
【図９】指標Ｓ（ｔ）の推移のモデルを示す図である。
【図１０】ＲＥＤ／ＦＡＭの観測結果の例を示す。
【図１１】図１０の観測結果による指標Ｓ（ｔ）の推移を示す図である。
【図１２】ポジティブ、ネガティブの変曲点の例を示す図である。
【図１３】ＦＡＭの変曲点とＲＥＤの変曲点の関係を示す図である。
【図１４】ＦＡＭの変曲点とＲＥＤの変曲点が近似している場合の例を示す図である。
【図１５】アレル判定装置におけるＳＮＰ判定処理の概要のフローを示す図である。
【図１６】アレル判定装置におけるＳＮＰ判定処理の論理を示す。
【図１７】アレル判定装置におけるポジティブ／ネガティブ判定処理フローを示す図である。
【図１８】アレル判定装置におけるポジティブ／ネガティブ判定処理フローを示す図である。
【図１９】アレル判定装置におけるパラメータａ出力処理フローを示す図である。
【図２０】アレル判定装置における変曲点Ｔ１出力処理フローを示す図である。
【図２１】アレル判定装置におけるパラメータｂ出力処理フローを示す図である。
【図２２】アレル判定装置におけるＦＡＭの変曲点とＲＥＤの変曲点の比Ｔ’の算出処理フローを示す図である。
【図２３】実験において適用したエンドポイント法の判定を示す図である。
【図２４】実験結果で得られたエンドポイント法の蛍光値をプロットした図である。
【図２５】実験結果で得られたロジスティックアルゴリズムの変曲点ＴＦ、ＴＲの相関図である。
【図２６】インベーダー（登録商標）法による測定方法を説明するための図である。
【図２７】解析データの結果パターンの例を示す図である。
【図２８】エンドポイント法を説明する図である。
【図２９】バックグラウンドの上昇を説明する図である。
【図３０】ＦＡＭとＲＥＤの蛍光強度比の時間変化を示す図である。
【符号の説明】
【０１４８】
１…アレル判定装置  ２…測定部（測定手段）  ３…記憶部（記憶手段）  ４…近似部（近似手段）  ５…判定部（判定手段）  ６…出力部（出力手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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