(57)【要約】  以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドからなる血管新生促進剤。（Ａ）配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチド本発明のバリアント１、２、３、４又は５を含有する治療剤は、例えば、血管新生促進作用を要する疾患の治療などに好適に用いられる
2009096425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドからなる血管新生促進剤。
（Ａ）配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる血管新生促進剤。
（Ａ）配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチド
【請求項３】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる血管新生促進剤。
（Ｃ）配列番号１の３５１番目のＡから１２２３番目のＧで表される塩基配列、配列番号３の３１１番目のＡから１２４６番目のＧで表される塩基配列、配列番号５の３２７番目のＡから８３６番目のＡで表される塩基配列、配列番号７の３００番目のＡから７７０番目のＡで表される塩基配列及び配列番号９で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ）（Ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
ベクターがウイルスベクターである、請求項２又は３記載の血管新生促進剤。
【請求項５】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求項４記載の血管新生促進剤。
【請求項６】
静脈内に投与されることを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の血管新生促進剤。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載の血管新生促進剤を含有してなる、血管新生促進作用を要する疾患の治療用医薬組成物。
【請求項８】
血管新生促進作用を要する疾患の治療剤の製造のための、請求項１に規定のポリペプチドの使用。
【請求項９】
血管新生促進作用を要する疾患の治療剤の製造のための、請求項２又は３に規定のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜６いずれか記載の血管新生促進剤を投与する工程を含む、血管新生促進作用を要する疾患の治療方法。
【請求項１１】
血管新生促進作用を要する疾患の治療または予防に使用するための、請求項１に規定のポリペプチド。
【請求項１２】
血管新生促進作用を要する疾患の治療または予防に使用するための、請求項２又は３に規定のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生促進剤に関する。さらに詳しくは、バソヒビンの特定のスプライシングバリアントからなる血管新生促進剤、該促進剤を含有した血管新生促進作用を要する疾患の治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは、動物の組織又は器官において既存の細静脈、毛細血管からの血管内皮細胞の遊走、増殖及び管腔形成により新しい血管脈が形成される現象をいう。かかる現象は、動物の形態形成期や成長期のみならず、組織等の損傷の治癒、炎症の修復過程や月経周期に伴って生じるものである。血管新生は、例えば、ＶＥＧＦのような血管新生を促進させる作用を持つ内因性因子や、トロンボスポンジンのような血管新生を抑制させる作用を持つ因子の双方の発現バランスによって制御されている。一方、血管新生調節機構のバランスが崩れることによって異常な血管新生を伴う疾患も存在する。したがって、近年、それらの血管新生調節因子を制御することにより種々の疾患の治療への適用が期待されている。【０００３】
血管新生を制御する因子としては、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等が知られており、例えば、心筋梗塞などの虚血性心疾患や閉塞性動脈硬化症、バージャー病などの末梢性血管疾患には、前記因子を用いた血管新生を促進する治療が報告されている（非特許文献１〜３参照）。一方、糖尿病や悪性腫瘍においては、血管増殖が重篤な症状を招くことから、前記因子を用いた血管新生を抑制する治療が報告されている（非特許文献４参照）。【０００４】
また、本発明者らは、非特許文献５及び特許文献１において、血管新生抑制因子の新規物質として、ＡＫ０２２５６７タンパク質、ならびに該タンパク質のスプライシングバリアントである、ＢＣ０５１８５６タンパク質、ＢＣ０５３８３６タンパク質、ＢＣ０２８１９４タンパク質、及びＡＹ８３４２０２タンパク質を報告している。
【非特許文献１】青木  元邦ら、日本臨床、６４巻、４号、２００６年４月
【非特許文献２】牧野  寛史ら、日本臨床、６３巻、３号、２００５年３月
【非特許文献３】牧野  寛史ら、日本臨床、６１巻、増刊号４、２００３年
【非特許文献４】渋谷  正史、生化学、７６巻、１２号、２００４年
【非特許文献５】Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｔ．ら、Arterioscler Thromb Vasc Biol.、２巻、５号、１０５１-１０５７頁、２００６年
【特許文献１】ＷＯ２００６／０７３０５２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、配列番号２、４、６、８又は１０のアミノ酸配列で表されるＡＫ０２２５６７タンパク質のスプライシングバリアントからなる血管新生促進剤、該促進剤を含有する血管新生制御作用を要する疾患の治療用医薬組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、これまで、ＶａｓｏｈｉｂｉｎがＶＥＧＦのような血管新生促進因子等と共存している状況下では、血管新生抑制因子として作用することを明らかにしてきた。しかしながら、前記Ｖａｓｏｈｉｂｉｎの特定のスプライシングバリアント、即ち、配列番号２、４、６、８又は１０のアミノ酸配列で表されるスプライシングバリアントが、癌や脳血管障害等の病態でもある低酸素状態に存在する場合には、驚くべきことに、血管新生促進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、
〔１〕以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドからなる血管新生促進剤、
（Ａ）配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチド
〔２〕以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる血管新生促進剤、
（Ａ）配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチド
〔３〕以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる血管新生促進剤、
（Ｃ）配列番号１の３５１番目のＡから１２２３番目のＧで表される塩基配列、配列番号３の３１１番目のＡから１２４６番目のＧで表される塩基配列、配列番号５の３２７番目のＡから８３６番目のＡで表される塩基配列、配列番号７の３００番目のＡから７７０番目のＡで表される塩基配列及び配列番号９で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ）（Ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
〔４〕ベクターがウイルスベクターである、前記〔２〕又は〔３〕記載の血管新生促進剤、
〔５〕ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである前記〔４〕記載の血管新生促進剤、
〔６〕静脈内に投与されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の血管新生促進剤、
〔７〕前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の促進剤を含有してなる、血管新生促進作用を要する疾患の治療用医薬組成物、
〔８〕血管新生促進作用を要する疾患の治療剤の製造のための、前記〔１〕に規定のポリペプチドの使用、
〔９〕血管新生促進作用を要する疾患の治療剤の製造のための、前記〔２〕又は〔３〕に規定のポリヌクレオチドの使用、
〔１０〕前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の血管新生促進剤を投与する工程を含む、血管新生促進作用を要する疾患の治療方法、
〔１１〕血管新生促進作用を要する疾患の治療または予防に使用するための、前記〔１〕に規定のポリペプチド、ならびに
〔１２〕血管新生促進作用を要する疾患の治療または予防に使用するための、前記〔２〕又は〔３〕に規定のポリヌクレオチド
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の促進剤により、血管新生を促進することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、マウス皮下における低酸素血管新生モデルにおいて血管新生を評価する際に行った施術の写真（図１Ａ）、施術箇所の拡大写真（図１Ｂ）、各切片写真（図１Ｃ）、及び血管新生による血管増幅（図１Ｄ）を示す図である。
【図２】図２は、マウス皮下における低酸素血管新生モデルの血管新生部位において、バリアント５の発現を示す図（図２Ａ）、及びバリアント５の由来細胞を示す図（図２Ｂ）である。
【図３】図３は、ヒトＶａｓｏｈｉｂｉｎ−１又はバリアント５を高発現させたマウスの低酸素血管新生モデルにおける、血管新生による血管増幅を示す図である。
【図４】図４は、バリアント５遺伝子欠損マウス〔バリアント５（＋／−）：ヘテロ欠損マウス、バリアント５（−／−）：ホモ欠損マウス〕の低酸素血管新生モデルにおける、血管新生による血管増幅を示す図である。
【図５】図５は、バリアント５遺伝子導入細胞のバソヒビン発現量比較（図５Ａ）、親細胞とバリアント５遺伝子導入細胞群（ｂｕｌｋ）の内皮細胞増殖アッセイの結果（図５Ｂ）、親細胞とバリアント５遺伝子高発現細胞の内皮細胞増殖アッセイの結果（図５Ｃ）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、血管新生の促進において配列番号２、４、６、８又は１０のアミノ酸配列で表されるタンパク質を用いることに大きな特徴を有し、本発明の血管新生促進剤としては、配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列で表されるポリペプチドからなる促進剤（態様１）と配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、即ち、配列番号１、３、５、７及び９からなる群より選ばれる塩基配列で表されるポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる促進剤（態様２）が例示され、共に血管新生を促進する観点から使用される。なお、配列番号２のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、ＷＯ２００６／０７３０５２において、バソヒビン（Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ）のバリアントとして報告されているＡＫ０２２５６７タンパク質（バリアント１）である。配列番号４、６、８及び１０のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、ＷＯ２００６／０７３０５２において、前記バリアント１の４つのスプライシングバリアントであり、それぞれ、バリアント２、３、４及び５として報告されている。これらのバリアントはバソヒビンと相同性が高いものであることが既に知られている。また、バソヒビンは、腫瘍細胞や間質細胞、マクロファージなどから分泌される血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２等）により血管内皮細胞に発現し、内皮細胞自身にオートクライン的に作用して、血管新生を抑制する物質である。従って、バリアント１〜５は、バソヒビンと相同性が高いことから血管新生抑制に関して優れた効果を奏するものと期待されたが、驚くべきことに、低酸素状態のマウス血管新生モデルに該バリアントのポリヌクレオチドを尾静脈より投与して発現させると逆に血管新生が促進されることが見出され、かかるバリアントあるいは該遺伝子を体外より投与することにより、さらに強く血管新生を促進することができると考えられた。【００１１】
バソヒビンにはバソヒビン１及びバソヒビン２が存在し、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示されているように、バソヒビン１とバソヒビン２は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子であるが、それらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は５８％の相同性を有しており、共に血管新生に対する抑制活性を有する。本発明における配列番号２、４、６、８又は１０のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、及び配列番号１、３、５、７又は９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質はバソヒビン２のバリアントに含まれる。【００１２】
本発明におけるポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、８又は１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、それぞれ、バリアント１、２、３、４、５ともいう）、前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生促進作用を有するポリペプチド、及びそれらの誘導体、ならびにそれらの塩が例示される。【００１３】
本明細書中において、「ポリペプチドの誘導体」とは、例えば、ポリペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、ポリエチレングリコール化又はアセトアセチル化した誘導体等をいう。これらの中でもＮ末端のアセチル化、Ｃ末端のアミド化、Ｃ末端のメチル化は、末端からポリペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性が付与され、また、グリコシル化またはポリエチレングリコール化によっても生体中における安定性が高くなることが期待されるので好ましい。【００１４】
本明細書において、「塩」とは、ポリペプチド又はそれらの誘導体の薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）をいい、例えば、ポリペプチド又はそれらの誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、燐酸塩が望ましい。【００１５】
上記ポリペプチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示された方法に従って調製することができる。【００１６】
また、上記ポリペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、上記ポリペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。【００１７】
本発明におけるポリヌクレオチドとしては、配列番号１、３、５、７又は９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、より詳細には、配列番号１の３５１番目のＡから１２２３番目のＧで表される塩基配列、配列番号３の３１１番目のＡから１２４６番目のＧで表される塩基配列、配列番号５の３２７番目のＡから８３６番目のＡで表される塩基配列、配列番号７の３００番目のＡから７７０番目のＡで表される塩基配列又は配列番号９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドであって、かつ、血管新生促進作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例示される。【００１８】
ここでいう「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ：１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）のみからなる配列は除外される。【００１９】
本明細書において「ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。【００２０】
上記ポリヌクレオチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６に開示された方法に従って調製することができる。また、アミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドやポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２などを用いて行うことができる。【００２１】
態様１の促進剤は、実質的に、前記バリアント１、２、３、４又は５により構成され、態様２の促進剤は前記バリアント１、２、３、４又は５をコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターにより構成される。【００２２】
ベクターは、宿主細胞において自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、バリアント１、２、３、４又は５をコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。本発明に用いられる好適なベクターとしては、後述するベクターが挙げられる。【００２３】
上記ベクターは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示された方法に従って調製することができる。【００２４】
本発明の促進剤は、バリアント１、２、３、４又は５が循環血中を介して送達された部位にて血管新生の促進作用を奏することから、静脈内に投与されることが好ましい。【００２５】
本発明はまた、前記本発明の促進剤を含有してなる、血管新生促進作用を要する疾患の治療用医薬組成物、即ち、治療剤を提供する。【００２６】
本発明において、治療に血管新生促進作用を要する疾患としては、血管新生を促進することにより治療効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、閉塞性末梢血管疾患、虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、脳血管障害、間歇性跛行等が例示される。なかでも、閉塞性動脈硬化症には本発明の治療剤の適用が期待される。【００２７】
本発明の治療剤としては、本発明の促進剤を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。また、本発明の治療剤としては、バリアント１、２、３、４又は５を前記バリアントと同じ用途に使用可能な他の成分、例えば公知の血管新生を促進する作用を有する成分、例えばＶＥＧＦなどと配合することもできる。【００２８】
本発明の治療剤の製造は、前記バリアントが循環血中を介して血管新生促進作用を要する部位に到達できるような剤型を製造できるのであれば、通常、本発明の促進剤を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。なお、医薬用担体は、治療剤の投与形態及び製剤形態に応じて選択することができ、特に限定はない。本明細書において、血管新生促進作用を要する部位とは、上記血管新生促進作用を要する疾患の発症部位を意味する。【００２９】
上記のような各種製剤形態での治療剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる治療剤における本発明の促進剤の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。本発明の治療剤中の本発明の促進剤の含有量としては通常１〜１００重量％程度である。【００３０】
本発明の治療剤は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も前記バリアントを循環血中を介して送達できるのであれば特に限定はなく、例えば内用、外用及び注射により投与することができる。本発明の治療剤を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。【００３１】
本発明の治療剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該治療剤の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。また、投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。【００３２】
本発明はまた、血管新生促進作用を要する疾患の治療剤の製造のための、バリアント１、２、３、４又は５の使用、及び該バリアントをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。ならびに、本発明は、血管新生促進作用を要する疾患の治療又は予防に使用するためのバリアント１、２、３、４又は５、及び該バリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。【００３３】
本発明はまた、被験体に、バリアント１、２、３、４又は５を投与する工程を含む、血管新生促進作用を要する疾患の治療方法を提供する。【００３４】
本明細書中において被験体とは、好ましくは血管新生促進作用を必要とするヒトであるが、ペット動物等であってもよい。【００３５】
また、本明細書中において有効量とは、バリアント１、２、３、４又は５を上記被験体に投与した場合に、かかるバリアントを投与していない被験体と比較して、血管新生促進作用を発揮する前記バリアントの量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。【００３６】
本発明の血管新生促進作用を要する疾患の治療方法においては、有効量のバリアント１、２、３、４又は５をそのまま上記被験体に投与してもよく、また、上記のような治療剤等の医薬として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。【００３７】
本発明の治療方法によれば、前記の本発明の治療剤の対象となる疾患を治療することができ、例えば、血管新生促進作用を要する疾患の治療を行う効果が発揮され得る。【００３８】
また、本発明のバリアント１、２、３、４又は５をコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる血管新生促進剤は、血管新生促進作用を要する疾患の患者における遺伝子治療に使用することができる。【００３９】
本発明のベクターからなる促進剤の患者への導入方法としては、該促進剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。本発明では、ｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。【００４０】
ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器などに応じた適当な投与経路により投与される。例えば、病変の認められる組織に直接局所投与するか又は静脈、動脈、皮下、筋肉内、腹腔内、内視鏡的、エアロゾル的等により投与することも可能である。投与方法としては静脈内又は腹腔内投与が好ましい。また、病変の見られる組織の直接注射も好ましい。核磁気共鳴撮像又はコンピューター断層撮影等の当該技術分野で利用できる任意のものを使用して病変の見られる組織を撮影し、例えば、定位注射により本発明のベクターからなる促進剤を投与することができる。【００４１】
本発明のベクターからなる促進剤を遺伝子治療用ベクターとして用いる場合、前記促進剤の形態としては、上記の各投与形態にあった種々の製剤形態をとることができる。例えば、有効成分であるバリアント１、２、３、４又は５をコードするＤＮＡを含有する注射剤とした場合、当該注射剤は常法により調製することができる。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に制限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウムと無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられ得る。また、常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を粉末化、凍結乾燥等の操作により用事溶解用製剤とすることもできる。【００４２】
前記製剤中のバリアント１、２、３、４又は５をコードするＤＮＡの含有量は、治療目的の疾患、投与部位、投与回数、所望治療期間、患者の年齢、体重等により異なり、適宜調整することができるが、通常患者（体重６０ｋｇとして）においては、一般に、前記バリアントをコードするＤＮＡの重量にして約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。【００４３】
以下に、バリアント１〜５の作製方法および遺伝子治療用ベクターの作成方法等を具体的に記載する。【００４４】
（１）バリアント１〜５の作製方法
バリアント１〜５は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、バリアント１、２、３、４又は５の遺伝子を宿主細胞中で発現させ、作製することができる。【００４５】
バリアント１、２、３、４又は５のタンパク質をコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該タンパク質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該タンパク質の生産率を向上させるうえで有用である。該ＤＮＡ断片、又は全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（発現用プラスミド）を作製する。該発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、バリアント１、２、３、４又は５を生産する形質転換体を得ることができる。【００４６】
宿主細胞としては、原核細胞、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、バリアント１、２、３、４又は５をコードする遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００４７】
（i）原核生物を宿主として用いる場合
バリアント１、２、３、４又は５タンパク質の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、前記バリアントをコードする遺伝子、転写終結配列より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００４８】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（ロシュダイアグノスティックス社製）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、ｐＫＫ２３３-２（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ-１（プロメガ社製）、ｐＱＥ-８（キアゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＡＬ-ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８-１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０））、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ-４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ-６７９８）、ｐＰＡ１（特開昭６３-２３３７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３-２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）等を例示することができる。【００４９】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００５０】
また、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば、６〜１８塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。バリアント１〜５の遺伝子の発現において転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００５１】
宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株等が、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株等が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株等が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株等が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株等が、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株等が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株等が例示される。【００５２】
発現用プラスミドの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８））、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法〔特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）〕に記載の方法等が挙げられる。【００５３】
（ii）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６（ロシュダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）等を用いることができる。【００５４】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー株マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ｈＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００５５】
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）；マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）；サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）；ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）；ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。【００５６】
発現用プラスミドの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３））が挙げられる。【００５７】
（iii）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＦＡＳＴＢａｃ１（インビトロジェン社製）等が、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ等が挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載の方法が用いられる。【００５８】
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含む発現ベクター及び昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりバリアント１、２、３、４又は５を発現することができる。【００５９】
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞等が挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）等が、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）等が例示される。【００６０】
発現用プラスミドの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。リポフェクション法では、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ試薬（インビトロジェン社）を用いることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））等も用いることができる。【００６１】
（iv）形質転換体の培養方法
バリアント１、２、３、４又は５をコードするＤＮＡを組み込んだ発現用プラスミドを保有する形質転換体が、大腸菌、動物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を作製することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を作製することができる。【００６２】
宿主が動物個体の場合、例えば、バリアント１、２、３、４又は５をコードする遺伝子を保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該プラスミドのコードするバリアントを該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、バリアント１、２、３、４又は５を作製することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。【００６３】
宿主が大腸菌等の原核生物である場合、例えば、バリアント１、２、３、４又は５をコードする遺伝子を保有する形質転換体を培地中で培養し、該プラスミドのコードするバリアントを培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、バリアント１、２、３、４又は５を作製することができる。【００６４】
バリアント１、２、３、４又は５の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００６５】
得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００６６】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。【００６７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。【００６８】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【００６９】
形質転換体が大腸菌等の原核生物である場合、かかる培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。【００７０】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００７２】
バリアント１、２、３、４又は５作製用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等が用いられる。【００７３】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下等の条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７４】
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。【００７５】
（ｖ）作製方法
バリアント１、２、３、４又は５は、形質転換体を培養し、培養液から前記バリアントを単離・精製することにより作製することができる。バリアントの単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。【００７６】
バリアント１、２、３、４又は５が溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離等の方法で細胞又は菌体と培地に分離する。バリアント１、２、３、４又は５が宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞又は菌体をＳＴＥ溶液等の適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等で細胞又は菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。【００７７】
バリアント１、２、３、４又は５の分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等を含んでいてもよい。【００７８】
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組み合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）等のリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロース等の疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法等の各種電気泳動法等が例示される。アフィニティークロマトグラフィーは、バリアント１、２、３、４又は５に対する抗体を用いることによっても行うことができる。【００７９】
バリアント１、２、３、４又は５が不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞又は菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等の界面活性剤等の可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈又は透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。【００８０】
また、バリアント１、２、３、４又は５を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５））。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧ等が例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、バリアント１、２、３、４又は５とプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、バリアント１、２、３、４又は５とＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。【００８１】
上記の形質転換体により作製する方法以外には、バリアント１、２、３、４又は５は、公知の方法に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いても生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１））。【００８２】
また、バリアント１、２、３、４又は５は、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）等のペプチド合成機器により化学合成することができる。【００８３】
（２）遺伝子治療用ベクターの作製方法
遺伝子治療用ベクターの作製方法、細胞における発現方法等は上記「バリアント１〜５の作製方法」に記載の発現ベクターと同様である。【００８４】
発現ベクターは安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。遺伝子治療に用いる際には、ヒトを含む哺乳動物の細胞内でタンパク質を発現でき、かつ、安全性の高いＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスベクター又はプラスミドベクターを用いるのが好ましい。遺伝子治療に好ましいウイルスベクターとしては，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等に由来するベクターが挙げられる。遺伝子治療に好ましいプラスミドとしては、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００（１９９１））、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等が挙げられる。【００８５】
なお、バリアント１、２、３、４又は５をコードするＤＮＡにシグナル配列を付加することにより、分泌タンパク質となり、局所投与する必要は必ずしもなく、細胞内で産生、分泌されたタンパク質が遠く離れた標的臓器に作用し、リンパ管新生抑制作用を生ずる。従って、病理組織以外の正常組織内又は正常細胞内への投与も可能である。なお、ヒトに投与する場合は静脈内投与又は筋肉内投与が好ましい。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。【００８７】
バリアント５タンパク質の作製例１
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて調製した全ＲＮＡを鋳型として１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにプライマー・ペア、５’−ＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＧＴ−３’及び５’−ＣＣＡＴＡＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＡＧ−３’を加え、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。合成されたＤＮＡ断片はプラスミドｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングし、シーケンス反応によりインサートの塩基配列を確認した。次に、このプラスミドを鋳型として、プライマー・ペア、５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＧ−３’及び５’−ＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＧＧＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣＣＡ−３’を用いてＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４にクローニングして、３’末端にＦＬＡＧタグを接続させ、さらにこのＤＮＡ断片をバキュロウイルス系用の発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロジェン社製）に挿入した。昆虫細胞での発現にはＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を使用し、操作なども付属のマニュアルに従った。すなわち、構築したプラスミドにより大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃを形質転換し、組換えＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡを得た。次に、このＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡをＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ試薬（インビトロジェン社製）によってＳｆ９細胞に導入し、組換えバキュロウイルス溶液を得た。このウイルス溶液０．５ｍＬを１.５×１０６個／ｍＬ濃度に調整後、５０ｍＬのＳｆ９細胞に感染させるという割合で使用することとした。感染後７６時間培養し、遠心によって細胞を回収した。【００８８】
バリアント５タンパク質の昆虫細胞における発現確認は、このＳｆ９細胞の抽出液とＨＲＰ標識した抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマ社製）を利用したウエスタンブロットによって行った。細胞抽出液は、細胞を５ｍＬのりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１回洗浄した後、５ｍＬのＬｙｓｉｓ溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ａｍｉｃｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｒｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、及び０．１％  ＮＰ４０を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）にて懸濁後、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（ＨＥＡＲＴ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にて超音波処理（１５秒間）を氷冷しながら４回行った後、１４５００ｘｇにて２０分間遠心し、上清に等量のＬｙｓｉｓ溶液を加えたものをライセート溶液とした。タンパク質の精製はライセート溶液を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）にて平衡化した抗ＦＬＡＧ抗体カラムに添加後、同溶液にて洗浄を行い、溶出液（０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む６ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ２．２）（０．５ｍＬ/画分）にて溶出し、ただちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０にて中和（溶出液０．５ｍＬに対し、７μＬ）することによって行った。各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（バイオラッド社製）による染色によりバリアント５タンパク質のバンドが確認された。【００８９】
試験例１〔マウス皮下における低酸素による血管新生誘導モデル〕
Ｔｅｐｐｅｒらにより既に報告されている（Ｂｌｏｏｄ  １０５、ｐ．１０６８−１０７７、２００５）方法に従い、マウス皮下における低酸素による血管新生モデルをｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバリアント５タンパク質の発現および機能解析に用いる妥当性を評価した。【００９０】
即ち、麻酔を施したＣ５７ＢＬ６マウスの背部２ヶ所を並行に切開し、皮下を剥離後２．５ｃｍ×１．２５ｃｍの領域に亘りシリコン・シートを埋めて縫合した（図１Ａ）。その後、剥離された皮膚はシリコン・シートによる血管の遮断のため７日後には低酸素状態になり中央部から壊死が生じており（図１Ｂ）、皮膚の繋がった両端からこの低酸素状態の中央部に向かって血管新生が生じていた。壊死組織の末端から８ｍｍまでの領域を２ｍｍずつ４つに区切り各領域で切片を調製し（図１Ｃ）、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色することにより血管面積を測定したところ、壊死組織の末端から２〜４ｍｍの領域で最も血管面積が広く（図１Ｄ）、この領域で最も血管新生が活性化されていることが示され、かかる血管新生誘導モデルにより血管新生の評価を行えることが判明した。【００９１】
試験例２〔ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバリアント５タンパク質の発現部位〕
試験例１で示した低酸素モデルの皮下組織におけるバリアント５タンパク質の発現を免疫染色により検討した。壊死末端より２ｍｍ以内の領域において抗バリアント５抗体、抗ＣＤ３１（血管内皮細胞マーカー）抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色したところ、バリアント５タンパク質の染色像は単球・マクロファージなど骨髄由来細胞のマーカーであるＣＤ１１ｂの染色像とよく一致していた（図２Ａ）。【００９２】
次に、全身的にｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＧＦＰ）を発現させたマウス（ＧＦＰマウス）の骨髄細胞を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた密度勾配遠心法により精製した後、ガンマ線（９Ｇｙ）を照射した野生型マウス１匹あたり５×１０６個の割合で移植した。この移植マウスを６週間飼育することにより骨髄細胞をＧＦＰマウス由来の細胞と置換させた。試験例１と同様の手法によりこの骨髄移植マウスの背部皮下を低酸素状態にし、壊死末端から２ｍｍ以内の領域においてバリアント５タンパク質の免疫染色を行ったところ、その染色像は骨髄細胞由来と考えられるＧＦＰ染色細胞と一致していた（図２Ｂ）。以上の結果より、バリアント５タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏの血管新生部位において骨髄由来細胞から発現していることが示唆された。【００９３】
試験例３〔ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶａｓｏｈｉｂｉｎ−１及びバリアント５タンパク質の強制発現による効果〕
ヒトＶａｓｏｈｉｂｉｎ−１及びバリアント５をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる目的で、それぞれのｃＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを作成し、２９３細胞株に導入することによりこれらの遺伝子を持ったアデノウイルスを調製した。また陰性対照用にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持ったアデノウイルスを調製した。これらのウイルス（１０９ｐｆｕ）をマウス尾静脈より注射し、肝臓においてβ−ガラクトシダーゼ、Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ−１、バリアント５をそれぞれ大量に発現している状態で、試験例１と同様にして低酸素モデルを作成した。壊死末端より０〜２、２〜４、４〜６、６〜８ｍｍの領域で切片を作成し、それぞれ抗ＣＤ３１抗体および抗α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）抗体で染色した。その結果、Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ−１を高発現させたマウスにおいては、壊死末端から０〜２、２〜４ｍｍの本来血管新生の活発な領域における血管新生が強く抑制されていた。それに対して、バリアント５を高発現させたマウスにおいては、壊死末端から０〜２、２〜４ｍｍの領域ではα−ＳＭＡ陽性の壁細胞に囲まれた成熟血管の数が著しく減少しており、全領域において壁細胞を伴わない未熟な血管の数が増加していた（図３）。【００９４】
試験例４〔バリアント５遺伝子欠損マウスにおける血管新生の抑制〕
米国ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社により作成されたバリアント５遺伝子欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において、試験例１と同様にして低酸素モデルを作成し血管新生を観察した。また陰性対照用にはＣ５７ＢＬ６マウスの野生型を用いた。試験例３と同様に、壊死末端より０〜２、２〜４、４〜６、６〜８ｍｍの領域で切片を作成し、それぞれ抗ＣＤ３１抗体および抗α−ＳＭＡ抗体で染色した。その結果、バリアント５遺伝子欠損マウスにおける全血管数および成熟血管数のいずれもが有意に減少していた。しかも、壊死組織の末端から２〜４ｍｍの領域では、その効果はヘテロ欠損マウスに比べホモ欠損マウスにおいて顕著であった（図４）。従って、バリアント５は血管の増殖および成熟化を促進する活性を有することが示唆された。【００９５】
試験例５〔バリアント５遺伝子導入細胞の細胞増殖アッセイ〕
バリアント５遺伝子を導入する細胞として、マウス膵臓の内皮細胞をＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原によって不死化して得られるＭＳ１細胞を選択し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）より購入した。ＭＳ１細胞は、αＭＥＭ（インビトロジェン社製）に１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）を添加した細胞培地で培養を行った。【００９６】
先ず、発現効率を改善するために、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏプラスミド（インビトロジェン社製）のＣＭＶプロモーターを、ｐＣＡＬＬ２ベクター由来のｃｈｉｃｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎプロモーターに置換えたｐＣＡＬＬ２−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏベクターを作成した。次に、バリアント５発現ベクターを作製するために、バリアント５のｃＤＮＡを上記で得られたｐＣＡＬＬ２−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏのマルチクローニングサイトに挿入した。得られたバリアント５発現ベクターは、ＭＳ１細胞に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、当該試薬に添付のマニュアルに従って遺伝子導入された。遺伝子導入後、ＭＳ１細胞はｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（５００μｇ／ｍＬ）（インビトロジェン社製）で薬剤選択が行われ、バリアント５遺伝子導入細胞群（ｂｕｌｋ）が得られた。得られたｂｕｌｋ細胞は、９６ウェルプレートに１ウェル当り０．３個の細胞と１００μＬの細胞培地が入るように分注され培養された。細胞の増殖が認められたウェルは、より大きなウェルへ移され、さらに培養を継続され、バリアント５遺伝子高発現細胞のクローン（クローン３、クローン１１、クローン１４）が得られた。バリアント５遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を行った結果、バリアント５遺伝子導入細胞群（ｂｕｌｋ）がバリアント５遺伝子を発現していること、及び、クローン３、１１、１４はｂｕｌｋ細胞に比べてバリアント５遺伝子の発現が強いことを確認した（図５Ａ）。【００９７】
ｂｕｌｋ細胞、クローン３、１１、１４及び親細胞であるＭＳ１（ｍｏｃｋ）を、それぞれ１０％ＦＢＳ／αＭＥＭに懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェル当り２×１０３個を加え、７２時間培養を行った。その後、１０μＬのＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ  ＯＮＥ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を各ウェルに加え、マルチプレートリーダー（Ｔｏｓｏｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｂｕｌｋ細胞は、ＭＳ１（ｍｏｃｋ）に比べて１％未満の有意差で増殖が促進されている事が分かった（図５Ｂ）。一方、ｂｕｌｋ細胞に比べてバリアント５遺伝子が高発現であるクローン３、１１、１４はいずれもＭＳ１（ｍｏｃｋ）に比べて１％未満の有意差で増殖が抑制されることが分かった（図５Ｃ）。これらより、バソヒビン２の発現が弱いと内皮細胞（ＭＳ１）の細胞増殖が促進し、バソヒビン２の発現が強いと内皮細胞（ＭＳ１）の細胞増殖が抑制され、バソヒビン２の発現の強弱で内皮細胞の細胞増殖への影響が、正反対になることが判明した。【００９８】
以上の結果より、バソヒビンの血管新生抑制作用と血管新生促進作用について考察を行った。ＷＯ２００６／０７３０５２において、バソヒビン２のバリアントの一つであるバリアント１が、ラットの角膜アッセイにおいて血管新生抑制作用を示すが、角膜アッセイでは角膜に直接バリアント１が投与されていることから、投与箇所においてバリアント１は高濃度であると考えられる。一方、上記試験例３で示されるように、マウスの背部皮下における低酸素による血管新生モデルの系において、バソヒビン２のバリアントの一つであるバリアント５は血管新生促進作用を示すが、上記試験例３では静脈へ投与されたバリアント５発現アデノウイルスは肝臓に集積し、そこで発現したバソヒビン２が血流に乗って背部皮下へ到達すると考えられ、その濃度は比較的低濃度であると考えられる。すなわち、バソヒビン２の発現が弱くバソヒビン２の濃度が低い場合には、内皮細胞の増殖が促され、その結果血管新生促進作用が発揮され、バソヒビン２の発現が強くバソヒビン２の濃度が高い場合には、内皮細胞の増殖が抑制され、その結果血管新生抑制作用が発揮されると推定され、バソヒビン２の相反する生理作用が矛盾なく説明できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明のバリアント１、２、３、４又は５を含有する治療剤は、例えば、血管新生促進作用を要する疾患の治療などに好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列表の配列番号１は、ＡＫ０２２５６７のポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号２は、ＡＫ０２２５６７のポリペプチドである。
配列表の配列番号３は、ＢＣ０５１８５６のポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号４は、ＢＣ０５１８５６のポリペプチドである。
配列表の配列番号５は、ＢＣ０５３８３６のポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号６は、ＢＣ０５３８３６のポリペプチドである。
配列表の配列番号７は、ＢＣ０２８１９４のポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号８は、ＢＣ０２８１９４のポリペプチドである。
配列表の配列番号９は、ＡＹ８３４２０２のポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号１０は、ＡＹ８３４２０２のポリペプチドである。
【図５】
2009096425.tif 000003
【図１】
2009096425.tif 000004
【図２】
2009096425.tif 000005
【図３】
2009096425.tif 000006
【図４】
2009096425.tif 000007
【配列表】
2009096425000001.app
【国際調査報告】
2009096425.tif 000008
2009096425.tif 000009
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