(57)【要約】  ＣＤＨ３発現細胞に対し細胞障害活性を有する抗ＣＤＨ３抗体であって、ヒト以外の動物由来の抗体と比べて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される遺伝子組み換え抗体を提供することを課題とする。本発明は、ヒトＣＤＨ３の細胞外領域である配列番号３８で示されるアミノ酸配列の第１０８位〜第１３１位、また第５５１位〜第６５４位に存在するエピトープに対して特異的に反応し、ＣＤＨ３発現細胞に対して細胞障害活性を有する、遺伝子組換え抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤＨ３の細胞外領域である配列番号３８で示されるアミノ酸配列の第１０８位〜第１３１位、また第５５１〜第６５４に存在するエピトープに対して特異的に反応し、ＣＤＨ３発現細胞に対して細胞障害活性を有する、遺伝子組換え抗体。
【請求項２】
細胞障害活性が、細胞に対する増殖抑制活性、または抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）である、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項３】
遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、又はヒト抗体である、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項４】
抗体重鎖可変領域（HV）相補性決定領域CDR１、CDR2、CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３の何れかのアミノ酸配列を含む、及び/または軽鎖可変領域（LV）相補性決定領域CDR1、 CDR2、 CDR3としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０、３４〜３６の何れかのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３に記載の遺伝子組み換え抗体。
【請求項５】
下記（１）から（６）から選択される請求項１〜４に記載の遺伝子組み換え抗体。
（１）それぞれ配列番号１〜３で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号４〜６で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（２）それぞれ配列番号７〜９で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号１０〜１２で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（３）それぞれ配列番号１３〜１５で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号１６〜１８で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（４）それぞれ配列番号１９〜２１で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号２２〜２４で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（５）それぞれ配列番号２５〜２７で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号２８〜３０で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（６）それぞれ配列番号３１〜３３で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号３４〜３６で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
【請求項６】
配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７，３１〜３３の何れか１以上のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、請求項1また２に記載の遺伝子組み換え抗体と同等なＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を有する、請求項３に記載の遺伝子組み換え抗体。
【請求項７】
配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０、３４〜３６の何れか１以上のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、請求項1また２に記載の遺伝子組み換え抗体と同等なＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を有する、請求項３に記載の遺伝子組み換え抗体。
【請求項８】
遺伝子組換え抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体。
【請求項９】
ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG１クラスの定常領域からなる、請求項８に記載の遺伝子組み換え抗体。
【請求項１０】
遺伝子組み換え抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１から９のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１から８のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体を生成蓄積させ、培養物から遺伝子組み換え抗体を採取することを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体を有効成分とする細胞傷害剤。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体を有効成分とするヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬。
【請求項１７】
ＣＤＨ３高発現疾患は癌である、請求項１６に記載の治療薬。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え抗体を有効成分とするヒトＣＤＨ３高発現疾患の診断薬。
【請求項１９】
ＣＤＨ３高発現疾患は癌である、請求項１８に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤＨ３の細胞外領域と反応し、かつ特定のエピトープを認識し、細胞障害活性を有する遺伝子組み換え抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。【０００３】
癌における分子治療薬の標的となりうる分子として、ＣＤＨ３が挙げられる（非特許文献１及び２）。ＣＤＨ３は、カルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（非特許文献３）。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピート（ＥＣｓ）を持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、１２０種類以上のタンパク質が存在し、多細胞構造の維持に重要な役割を果たしている。ＣＤＨ３は、そのカドヘリンスーパーファミリーのメンバーに属する。【０００４】
正常組織と比較し、癌組織においてＣＤＨ３の発現が上昇することが報告されている（非特許文献１、２及び４）。ＣＤＨ３の発現が高い癌細胞に対しては、抗ヒトＣＤＨ３抗体に抗癌剤を結合させた薬剤や、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する抗体を癌の治療に用いることが検討されている（特許文献１から３）。【０００５】
近年、分子標的薬として多くの癌治療用抗体医薬が実際に上市され治療効果を上げている。その主な作用機序は、細胞生存、増殖に関わるシグナルの阻害や、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などを挙げられた。【０００６】
一般にヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献５から８）、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速めたりをし（非特許文献６、９及び１０）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献１１及び１２）。【０００７】
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体である（非特許文献１３）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域中にあるＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（非特許文献１４）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体等のヒト以外の動物由来の抗体と比べ、ヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べ血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている（非特許文献１５）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びたことが報告されている（非特許文献１６）。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体と比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、抗体のＦｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）や抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）等の細胞傷害活性が治療効果に重要である。マウス抗体とくらべ、ヒト抗体のＦｃ領域がヒト補体成分や、ヒト免疫系エフェクター細胞の表面にあるＦｃ受容体との親和性が高いため、より治療効果を期待できる。例えば、ＧＤ２に対するマウス抗体のＦｃ領域をヒト抗体のＦｃ領域に変換したヒト型キメラ抗体は、ヒトエフェクター細胞による腫瘍細胞傷害活性が上昇することが報告されており（非特許文献１７）、また、ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体についても同様の結果が報告されている（非特許文献１８）。以上の結果より、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、ヒト以外の動物由来の抗体より、遺伝子組み換え抗体の方が望ましいことを示される。【０００８】
更に、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（非特許文献１９）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（非特許文献２０）等の、より分子量の小さい抗体の断片の作製が可能となっている。これらの断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（非特許文献２１）。これらの断片についても、ヒトへの臨床応用の場合には、遺伝子組み換え抗体由来の方が、より望ましいと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０９７３９５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／１０２５２５号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１０／１２６１３７号公報）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.,１４（２０）,６４８７（２００８）
【非特許文献２】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９，２１４（２００７）
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ ２８：２１７−２２４,１９８２
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ,８９（１０）,２０５３（２０００）
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４）
【非特許文献６】Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）
【非特許文献７】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８）
【非特許文献８】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１２４２（１９８５）
【非特許文献９】Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５）
【非特許文献１２】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６）
【非特許文献１３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１（１９８４）
【非特許文献１４】Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２（１９８６）
【非特許文献１５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４２２０（１９８９）
【非特許文献１６】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，１３５２（１９９１）
【非特許文献１７】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１３８２（１９９０）
【非特許文献１８】Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３（１９８８）
【非特許文献１９】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８）
【非特許文献２０】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５）
【非特許文献２１】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＣＤＨ３発現細胞に対し細胞障害活性を有する抗ＣＤＨ３抗体であって、ヒト以外の動物由来の抗体と比べて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される遺伝子組み換え抗体を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＣＤＨ３に対するマウスモノクローナル抗体ＰＰＡＴ−０５７−０６、ＰＰＡＴ−０５７−１７、ＰＰＡＴ−０５７−１３、ＰＰＡＴ−０５７−２３、ＰＰＡＴ−０５７−２７、ＰＰＡＴ−０５７−１２を生産するハイブリドーマより抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡおよびＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを取得し、それらのＶ領域のＣＤＲが新規なアミノ酸配列を有することを見出した。当該新規ＣＤＲを有するＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、それぞれにヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域およびヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡと接続した。当該接続した遺伝子をそれぞれに動物細胞用発現ベクターに組み込み、キメラ化抗体発現ベクターを構築した。当該発現ベクターを動物細胞へ導入することにより抗ＣＤＨ３キメラ抗体を発現させ、精製した。該抗体がヒトＣＤＨ３に特異的に反応し、かつ抗原陽性細胞株に対し細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を示し、担癌マウスにおいて腫瘍縮小効果を果たした。以上のことより、当該抗体のヒト生体内での使用における有用性を示し、本発明を完成させた。【００１３】
即ち、本発明によれば、ヒトＣＤＨ３の細胞外領域である配列番号３８で示されるアミノ酸配列の第１０８位〜第１３１位、また第５５１〜第６５４に存在するエピトープに対して特異的に反応し、ＣＤＨ３発現細胞に対して細胞障害活性を有する、遺伝子組換え抗体が提供される。【００１４】
好ましくは、細胞障害活性は、細胞に対する増殖抑制活性、または抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）である。
好ましくは、遺伝子組換え抗体は、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、又はヒト抗体である。【００１５】
好ましくは、本発明の遺伝子組み換え抗体は、抗体重鎖可変領域（HV）相補性決定領域CDR１、CDR2、CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３の何れかのアミノ酸配列を含む、及び/または軽鎖可変領域（LV）相補性決定領域CDR1、 CDR2、 CDR3としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０、３４〜３６の何れかのアミノ酸配列を含む。【００１６】
好ましくは、本発明の抗体は、下記（１）から（６）から選択される遺伝子組み換え抗体である。
（１）それぞれ配列番号１〜３で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号４〜６で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（２）それぞれ配列番号７〜９で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号１０〜１２で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（３）それぞれ配列番号１３〜１５で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号１６〜１８で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（４）それぞれ配列番号１９〜２１で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号２２〜２４で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（５）それぞれ配列番号２５〜２７で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号２８〜３０で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。
（６）それぞれ配列番号３１〜３３で示されたアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域（HV） のCDR1、CDR2、CDR3及び、配列番号３４〜３６で示されたアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域（LV） のCDR1、CDR2、CDR3を含む遺伝子組変え抗体。【００１７】
好ましくは、本発明の抗体は、配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３の何れか１以上のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、上記した本発明の遺伝子組み換え抗体と同等なＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を有する。
好ましくは、本発明の抗体は、配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０、３４〜３６の何れか１以上のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、上記した本発明の遺伝子組み換え抗体と同等なＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を有する。【００１８】
好ましくは、本発明の遺伝子組換え抗体は、ヒト抗体の定常領域を含む。
好ましくは、ヒト抗体の定常領域は、ヒト抗体IgG１クラスの定常領域からなる。
好ましくは、遺伝子組み換え抗体は、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である。【００１９】
本発明によれば、上記した本発明の遺伝子組み換え抗体をコードするＤＮＡが提供される。
本発明によれば、上記した本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターが提供される。
本発明によれば、上記した本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株が提供される。
本発明によれば、上記した本発明の形質転換株を培地に培養し、培養物中に本発明の遺伝子組み換え抗体を生成蓄積させ、培養物から遺伝子組み換え抗体を採取することを含む、本発明の遺伝子組み換え抗体の製造方法が提供される。【００２０】
本発明によれば、上記した本発明の遺伝子組み換え抗体を有効成分として含有する細胞傷害剤が提供される。
本発明によれば、上記した本発明の遺伝子組み換え抗体を有効成分として含有するヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬が提供される。
好ましくは、ＣＤＨ３高発現疾患は癌である。
本発明によれば、上記した本発明の遺伝子組み換え抗体を有効成分として含有するヒトＣＤＨ３高発現疾患の診断薬が提供される。
好ましくは、ＣＤＨ３高発現疾患は癌である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の抗ＣＤＨ３抗体は、ヒトＣＤＨ３の細胞外領域を認識し、細胞障害活性を有する組み換え遺伝子抗体であることが特徴とする。遺伝子の組み換え技術を利用し、ヒトへ免疫原性が低く、かつ細胞障害活性を有する抗体を作製できる。本発明の遺伝子組み換え抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体と比べて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。本発明の抗ヒトＣＤＨ３組み換え遺伝子抗体をＣＤＨ３が発現する癌に投与することにより抗癌作用を発揮することができる。即ち、本発明の抗ヒトＣＤＨ３組み換え遺伝子抗体は、抗癌剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＣＤＨ３（ＣＤＨ３）のシグナル及びプロペプチド配列を除いた成熟タンパク質の配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。ａ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０.０１μｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０．１μｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体１μｇ／ｍｌ
【図３】図３は、ＰＰＡＴ−０５７−１７抗体と各細胞株とのフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８。ａ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．０１μｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．１μｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体１μｇ／ｍｌ。
【図４】図４は、ＣＤＨ３タンパク質断片１から５のＣＤＨ３細胞外領域との対応を示す。
【図５】図５は、ＣＤＨ３タンパク質断片の発現結果を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５
【図６】図６は、ＣＤＨ３タンパク質断片と抗体のウェスタンブロット法による反応を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５
【図７】図７は、キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃと各細胞株とのフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８。ａ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体０．１μｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体１μｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉ−ＣＤＨ３抗体１０μｇ／ｍｌ。
【図８】図８は、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７及びキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃのin vitroのＡＤＣＣ活性を示す。
【図９】図９は、各キメラ抗体のin vitroのＡＤＣＣ活性を示す。
【図１０】図１０は、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７及びキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃのin vivo抗腫瘍効果を示す。
【図１１】図１１は、F(ab')2の純度（A,B）及びin vivo腫瘍増殖抑制効果（C）を示す。A: 高速液体クロマトグラフィー(High performance liquid chromatography, HPLC)B: SDS-PAGEC: 抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７由来のF(ab')2のin vivo腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図１２】図１２は、キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃのin vivo抗腫瘍効果を示す。
【図１３】図１３は、キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃのin vivo抗腫瘍効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の抗体は、ＣＤＨ３の細胞外領域を認識し、かつＣＤＨ３発現細胞に対し細胞障害活性を有する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片であり、特に、配列番号３８に示されるアミノ酸配列の１０８〜１３１番目、また５５１〜６５４番目の領域に特異的に反応する抗体である。
【００２４】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨとも表記する）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＶＬとも表記する）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも表記する）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも表記する）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００２５】
本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトＣＤＨ３に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した。これらの遺伝子をそれぞれにヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードするｃＤＮＡと接続し、動物細胞用発現ベクターにそれぞれを組み込み、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、取得したＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入して動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００２６】
（モノクローナル抗体の作製）
モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、カドヘリン又はその部分ペプチドであるＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインが好ましい）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００２７】
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば  Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００２８】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6〜１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5〜２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００２９】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００３０】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、カドヘリンのＥＣ１の上流領域、ＥＣ４またはＥＣ５ドメインと結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００３１】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩー１６４０培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％  ＣＯ2濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００３２】
腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３３】
（ヒト型キメラ抗体）
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００３４】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
【００３５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＣＤＨ３に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００３６】
タンパク質発現に使用する宿主細胞系は、抗体生産系では哺乳動物起源のものが多い。該生産者は発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
【００３７】
好ましくは、宿主細胞系はｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである。Ｕｒｌａｎｄ，  Ｇ．  ら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇａｍｍａ  ｒａｙｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｌｏｃｕｓ：  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ，  Ｓｏｍａｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｖｏｌ．  １２，  １９８６，  ｐ５５５５-５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．  ら、Ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  ２７６，  １９７８，  ｐ２６９-２７０  をそれぞれ参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って達成できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるがそれらに限定されない。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照のこと。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
【００３８】
ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００３９】
これらのアミノ酸配列において、１又は数個（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入され、かつ上述した性質を有するヒトＣＤＨ３と特異的に反応する抗体または抗体断片も本発明の範囲に包含さる。
【００４０】
好ましい態様によれば、本発明の遺伝子組み換え抗体は、抗体重鎖可変領域（HV）相補性決定領域CDR１、CDR2、CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、３１〜３３の何れかのアミノ酸配列を含む、及び/または軽鎖可変領域（LV）相補性決定領域CDR1、 CDR2、 CDR3としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０，３４〜３６の何れかのアミノ酸配列を含む。
これらのアミノ酸配列において、１または数個（好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、上記の本発明の遺伝子組み換え抗体と同等なＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を有する遺伝子組み換え抗体変異体も本発明の範囲内である。また、これらのアミノ酸配列と高い同一性を有し、上記の本発明の遺伝子組み換え抗体と同等なＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を有する遺伝子組み換え抗体変異体も本発明の範囲内である。なお、本発明において高い同一性とは、通常アミノ酸配列において７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性を有する場合をいう。この同一性の決定は、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．及びＬｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．が記載したアルゴリズムによる（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）。
【００４１】
また、本発明において、上述したアミノ酸配列における欠失、付加、置換及び／または挿入により、または同一性％により規定される遺伝子組み換え抗体変異体に関して、ＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性が「同等」というときは、特に記載した場合を除き、その変異体が由来する元の遺伝子組み換え抗体の、いずれかのＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性を１００％としたときに、６０％以上、より特定すると７０％以上、さらに特定すると８０％以上の活性を有する場合をいう。ＣＤＨ３発現細胞に対する細胞障害活性の測定に関しては、複数の手段が知られているが、いずれか一の手段において上述した活性を有することが確認できれば、「同等」ということができる。
【００４２】
本発明のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。
【００４３】
（抗体の断片）
本発明の遺伝子組換え抗体は、抗体断片でもよい。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、およびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４４】
本発明のＦａｂは、ＣＤＨ３に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
【００４５】
Ｆ（ａｂ'）2は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４６】
本発明のＦ（ａｂ'）2は、ＣＤＨ３に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
【００４７】
Ｆａｂ'は、上記Ｆ（ａｂ'）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ'は、ＣＤＨ３に特異的に反応するＦ（ａｂ'）2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ'断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＦａｂ'を発現させ、製造することができる。
【００４８】
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のＣＤＨ３に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００４９】
本発明のｓｃＦｖは、ＣＤＨ３に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
【００５０】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明のＣＤＨ３に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００５１】
本発明のｄｓＦｖは、ＣＤＨ３に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
【００５２】
（ＣＤＲを含むペプチド）
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＨ３に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
【００５３】
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００５４】
（ＣＤＨ３発現細胞に対する反応性）
ＣＤＨ３発現細胞に対する反応性を検討するためには、細胞表面に発現されているＣＤＨ３をフローサイトメーターよる検定などがあげられる。
フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ＣＤＨ３抗体（通常最終濃度が０．１〜１０μｇ／ｍｌ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。
【００５５】
（細胞障害活性）
細胞障害活性としては、in vitro,in vivoのいずれのＡＤＣＣ活性,ＣＤＣ活性,細胞増殖阻害があげられる。
抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）,ＣＤＣは、公知の方法で測定することが可能である（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））。たとえば、ＡＤＣＣ活性は、抗体の存在下で、抗原であるＣＤＨ３を発現する標的細胞と、ヒトあるいはその他の動物より採取した末梢血単核球、単球、マクロファージ、顆粒球等のエフェクター細胞を接触させ、障害された標的細胞の度合いを検出し、これを定量することにより測定することができる。障害された標的細胞の度合いは、51Ｃｒ遊離法、標的細胞の酵素活性を検出する方法、フローサイトメーターによる検出法などによって検出することができる。ＡＤＣＣ活性測定系における本発明の医薬の効果は、ＡＤＣＣ活性測定系中に薬剤を添加するか、あるいは標的細胞、またはエフェクター細胞、またはその両者にあらかじめこれらの薬剤を一定期間曝露してＡＤＣＣ活性に与える影響を観察することにより、測定することができる。
【００５６】
細胞増殖阻害は、in vitroで細胞の増殖を遅くすることであってもよいし、in vivoで腫瘍細胞の増殖を遅くすることてもよい。たとえば、in vitroで，通常の増殖測定法（Blood,１０４（４）１１３７（２００４）; J Biol Chem.,２７９（４）,２８５６（２００４））に記載の方法などにより測定することができる。In vivoの動物モデルとしては、ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移植した異種移植モデル、培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した同系移植モデルなどがあげられる。
【００５７】
異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。
【００５８】
（細胞傷害剤、並びにヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬及び診断薬）
本発明の抗体は、高い細胞傷害活性を示すことから、細胞傷害剤として使用することができる。さらに、本発明の抗体は、ヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬又は診断薬として使用することができる。本発明の細胞傷害剤及びヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬は、例えばカドヘリンを発現しているがん細胞と接触させることによりがん細胞を傷害することができる。ヒトＣＤＨ３高発現疾患としては、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、肺癌、移行上皮癌、膵臓癌、肝癌、腎癌、胆道癌、甲状腺癌、頭頚部癌、食道癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、胃癌、前立腺癌、膀胱癌、骨肉腫又は軟組織肉腫などがあげられる。
【００５９】
本発明の細胞傷害剤、治療薬及び診断薬には、本発明の抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の細胞傷害剤、治療薬及び診断薬としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の細胞傷害剤、治療薬及び診断薬の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００６０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
配列番号３７に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへＴ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。【００６２】
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。【００６３】
ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図２に示す。【００６４】
実施例２：可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号３８の１−６５４に相当）を増幅するように設計されたフォワードプライマー （配列番号３９：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ、（ｈＣＤＨ３ＦｕｌｌＦＷ））とリバースプライマー （配列番号４０：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ、（ｈＣＤＨ３ＳｏｌｂＲＶ））を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃−１５秒、５５℃−３０秒、６８℃−９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。【００６５】
その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。【００６６】
このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。【００６７】
（２）可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5 個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。【００６８】
可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。【００６９】
実施例３：抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ  Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４あるいはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。【００７０】
（２）抗ＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
抗ＣＤＨ３抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリで行った。【００７１】
すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ'）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞にて強い反応が認められるハイブリドーマを選抜した。このようにして、マウス抗体ＰＰＡＴ−０５７−０６、ＰＰＡＴ−０５７−１７、ＰＰＡＴ−０５７−１３、ＰＰＡＴ−０５７−２３、ＰＰＡＴ−０５７−２７、ＰＰＡＴ−０５７−１２を産生するハイブリドーマを得た。マウス抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７を産生するハイブリドーマ細胞（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８６５）は、２０１０年１月２０日に、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にブダペスト条約の下で寄託されている。なお、特願２０１１−１４０４０７に記載されているマウス抗体ＰＰＡＴ−０５７−１２を産生するハイブリドーマは、本願におけるマウス抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７を産生するハイブリドーマ細胞と同一である。即ち、特願２０１１−１４０４０７に記載されているマウス抗体ＰＰＡＴ−０５７−１２は、本願においてはマウス抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７と番号を付け直した。【００７２】
当該ハイブリドーマより得られたＰＰＡＴ−０５７−１７抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ−Ｈ３５８との典型的な反応結果を図３に示す。【００７３】
実施例４：ＣＤＨ３タンパク質断片による抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の認識部位の同定
抗ＣＤＨ３抗体の認識部位の同定は、ＣＤＨ３蛋白質断片とのウェスタンブロット法により行った。各ＣＤＨ３断片間で十分に配列が重複するように断片１から５を設計した（図４）。【００７４】
（１）ＣＤＨ３タンパク質断片の発現ベクターの作製
実施例１の全長ＣＤＨ３ｃＤＮＡをテンプレートとし、後述のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラッド社）を用い、条件は９８℃−１０秒、６０℃−１０秒、７２℃−３０秒、３５サイクルで行なった。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近いバンドを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キットを用いて、目的のＣＤＨ３ｃＤＮＡ断片を得た。【００７５】
このＣＤＨ３断片を大腸菌発現ベクターｐＣｏｌｄ（登録商標）ＴＦ（タカラバイオ社）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＣｏｌｄＴＦにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、各断片を発現するための発現ベクターを得た。
以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、各断片を得た。【００７６】
断片１（配列番号３８の１０８位−２３６位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＧ（配列番号：４１）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号：４２）【００７７】
断片２（配列番号３８の１３２位−３４８位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号：４３）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＡ（配列番号：４４）【００７８】
断片３（配列番号３８の２３７位−４６１位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号：４５）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧ（配列番号：４６）【００７９】
断片４（配列番号３８の３４９位−５５０位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧ（配列番号：４７）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＴＧ（配列番号：４８）【００８０】
断片５（配列番号３８の４６２位−６５４位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＧ（配列番号：４９）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号：５０）【００８１】
（２）ＣＤＨ３タンパク質断片の発現
（１）のＣＤＨ３断片の発現ベクターを使用して、常法により大腸菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ（登録商標）２（メルク社）を形質転換し、ＬＢ培地中で培養。６００ｎｍの吸光値が０．４となった段階で、３０分間氷冷し、イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）濃度を０．５ｍＭとし、２０℃で１８時間培養後、回収した。【００８２】
ＣＤＨ３タンパク質断片の発現は、大腸菌培養液を電気泳動後、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（キアゲン社）によるウェスタンブロット法を実施し、予想された位置にバンドが存在する事で確認した。
即ち、上述した大腸菌培養液量の１／１０量に相当する泳動緩衝液を加え、還元条件下５−２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、イモビロン（登録商標）Ｐ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、１０％ブロックエース（登録商標）（雪印乳業社）入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ（登録商標）−Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線フィルムＲＸ−ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を図５に示す。【００８３】
（３）ＣＤＨ３タンパク質断片を用いた抗体認識部位の同定
上述の各ＣＤＨ３タンパク質断片を発現させた大腸菌溶解物を還元条件下、５−２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いて、イモビロンＰ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、短冊状に等間隔で切断し、１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗体（ＰＰＡＴ−０５７−０６、ＰＰＡＴ−０５７−１７、ＰＰＡＴ−０５７−１３、ＰＰＡＴ−０５７−２３、ＰＰＡＴ−０５７−２７、ＰＰＡＴ−０５７−１２抗体を含む）を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線Ｆｉｌｍ  ＲＸ−ｕ（富士フイルム社）にて検出した。その結果、ＰＰＡＴ−０５７−０６、ＰＰＡＴ−０５７−１７、ＰＰＡＴ−０５７−２３、ＰＰＡＴ−０５７−１２、ＰＰＡＴ−０５７−１３抗体は、断片１と反応し、断片２から５とは反応しないことから、配列番号３８で示されるアミノ酸配列の第１０８位〜第１３１位に存在するエピトープに対して特異的に反応することが示された。ＰＰＡＴ−０５７−２７抗体は、断片１から断片４と反応しない、断片５とは反応することから、配列番号３８で示されるアミノ酸配列の第５５１位〜第６５４位に存在するエピトープに対して特異的に反応することが示された。【００８４】
実施例５：ＣＤＨ３に対するキメラ抗体の作製
それぞれＰＰＡＴ−０５７−０６、ＰＰＡＴ−０５７−１７、ＰＰＡＴ−０５７−１３、ＰＰＡＴ−０５７−２３、ＰＰＡＴ−０５７−２７、ＰＰＡＴ−０５７−１２を産生するハイブリドーマを用いて、ヒトＣＤＨ３に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡを以下のようにクローン化し、マウス可変領域とヒト抗体遺伝子の定常域と接続してキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−０６Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−１３Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−１２Ｃを作製した。【００８５】
（１）マウスモノクローナル抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７の可変領域遺伝子のクローニング
(i)ハイブリドーマからのＲＮＡの精製
ＰＰＡＴ−０５７−１７を産生するハイブリドーマ細胞（受託番号ＮＩＴＥ    ＢＰ−８６５）から、細胞質に存在するＲＮＡをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, １73, p93-95 (１988)により記載されている方法（ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のＴＮＥ緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; １% NP-40; １50 mM NaCl; １ mM EDTA, pH 8.0を用いた）に従って単離した。具体的に、５ｘ１０6個のハイブリドーマ細胞を０．２ｍＬのＴＮＥ緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約０．２ｍＬ細胞質上清に０．２ｍＬの抽出緩衝液(１0 mM Tris-HCl, pH7.5; 0.35 M NaCl; １%(w/v) SDS; １0 mM EDTA, pH 8.0; 7 M 尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたＲＮＡ溶液にキャリアとしてグリコーゲン（ロッシュ、Ｃａｔ Ｎｏ． ９０１３９３）を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にＲＮＡ沈殿物を、細胞質ＲＮＡ濃度が０．５〜２マイクログラム／マイクロリットルになるように１０〜５０マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて溶解した。【００８６】
（ii） ハイブリドーマから調製したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製
一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように調製した細胞質ＲＮＡの０．５〜３マイクログラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ， ｐＨ ８．３（室温）； ７５ｍＭ ＫＣｌ； ３ｍＭ ＭｇＣｌ2； １０ｍＭ ＤＴＴ、１００ナノグラムのランダムプライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（逆転写酵素、インビトロジェン社）を含む２０マイクロリットル反応混合液を調製し、４２°Ｃで５０分間インキュベートした。このように合成したｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の鋳型として直接使用した。【００８７】
（iii）抗ＣＤＨ３抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
実験に用いたプライマーはすべて北海道システム・サイエンス株式会社で合成した。
（マウスＬ鎖可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー）
５’末端においてＦＲ１部分と相同性を有するＤＮＡプライマーと３'  末端においてマウスＬ鎖内のＪ鎖遺伝子と相同性を有する４セットプライマー  （１）、あるいは、５'  末端においてＬ鎖シグナル部分（７セットプライマー）  と３'  末端においてＫＣ部分（ＫＶＬアンチセンスプライマー）  と相同性を有するプライマーセット  （２）  の２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＬ鎖可変域ＤＮＡを単離し、遺伝子の配列を解析した。この遺伝子からＬ鎖可変域のアミノ酸配列を得られた（配列番号５１）。プライマー配列は次のとおりであった。【００８８】
（マウスＬ鎖可変領域クローニング４セットセンスプライマー）
「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  −Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ-  ，  Ｂａｒｂａｓ  Ｂｕｒｔｏｎ  Ｓｃｏｔｔ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ」  ＰＲＯＴＯＣＯＬ  ９．５を参考にＳｅｎｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  １７種、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３種を北海道システムサイエンスで合成した。【００８９】
ＶＫセンス（ＦＲ１部分）下記１７のプライマーの混合物をＶＫセンスプライマーとして使用した。
配列番号５２：５’-ＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ-３’（縮重度２）
配列番号５３：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度４）
配列番号５４：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号５５：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号５６：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号５７：５’-ＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度１６）
配列番号５８：５’-ＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ-３’（縮重度１２）
配列番号５９：５’-ＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ-３’（縮重度４）
配列番号６０：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度４）
配列番号６１：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号６２：５’-ＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ-３’（縮重度１６）
配列番号６３：５’-ＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ-３’（縮重度１６）
配列番号６４：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ-３’（縮重度１２）
配列番号６５：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ-３’（縮重度４）
配列番号６６：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ-３’（縮重度４）
配列番号６７：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ-３’（縮重度２）
配列番号６８：５’-ＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ-３’（縮重度２）【００９０】
Ｊアンチセンス（４セットプライマー）
Ｊ１  ／  Ｊ２アンチセンスプライマー  （１）
配列番号６９：５’-ＧＧＳＡＣＣＡＡＲＣＴＧＧＡＡＡＴＭＡＡＡ-３’（縮重度：８）【００９１】
Ｊ４アンチセンスプライマー  （２）
配列番号７０：５’-ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ-３’【００９２】
Ｊ５アンチセンスプライマー（３）
配列番号７１：５’-ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ-３’
Ｊ１  ／  Ｊ２，  Ｊ４，  Ｊ５アンチセンスプライマー混合物  （４）【００９３】
（マウスＬ鎖可変領域クローニング７セットプライマー）
ＶＫセンス（シグナルペプチド部分）
このプライマーはノバジェン社のマウスＩｇ-プライマーセット（  Ｎｏｖａｇｅｎ；  Ｍｅｒｃｋ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ６９８３１-３）を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。【００９４】
Ａセットセンスプライマー
配列番号７２：５’-ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴ-３’
Ｂセットセンスプライマー
配列番号７３：５’-ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ-３’
Ｃセットセンスプライマー
配列番号７４：５’-ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴ-３’
Ｄセットセンスプライマー（下記２種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号７５：５’-ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ-３’
配列番号７６：５’-ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ-３’
Ｅセットセンスプライマー（下記３種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号７７：５’-ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴ-３’
配列番号７８：５’-ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ-３’
配列番号７９：５’-ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ-３’
Ｆセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号８０：５’-ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧ-３’
配列番号８１：５’-ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧ-３’
配列番号８２：５’-ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ-３’
配列番号８３：５’-ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ-３’
Ｇセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号８４：５’-ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ-３’
配列番号８５：５’-ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴ-３’
配列番号８６：５’-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ-３’
配列番号８７：５’-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ-３’
ＫＶＬアンチセンスプライマー
配列番号８８：５’-ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ-３’【００９５】
（マウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー）
５'  末端においてマウスＨ鎖シグナル部分（４セットプライマー）  と相同性を有するプライマーと３'  末端においてＫＣ部分と相同性を有するプライマー、あるいは、５'  末端においてＦＲ１部分と相同性を有する１セットのプライマーと３'  末端においてマウスＨ鎖の定常領域（ＩＧＨＣ）と相同性を有する２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＨ鎖可変域ＤＮＡを単離し、遺伝子の配列を解析した。この遺伝子からＨ鎖可変域のアミノ酸配列を得られた（配列番号８９）。プライマー配列は次のとおりであった。【００９６】
マウスＨ鎖可変領域クローニングプライマー
ＶＨセンス（シグナル部分：４セットプライマー）
このプライマーはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．），  Ｕｎｉｔ  ２．１２  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖ  ＲｅｇｉｏｎｓのＴａｂｌｅ  ２．１２．２を参考にした。
配列番号９０：５’-ＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣＴＴ-３’（縮重度：３２）
配列番号９１：５’-ＡＴＧＲＡＣＴＴＣＧＧＧＹＴＧＡＧＣＴＫＧＧＴＴＴＴ-３’（縮重度：８）
配列番号９２：５’-ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ-３’
配列番号９３：５’-ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹ-３’（縮重度：３２）【００９７】
マウスＨ鎖可変領域クローニングプライマー
ＶＨセンス（ＦＲ１部分）
このプライマーはＴａｎら、"Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD28１, Journal of Immunology １69 (2002) p１１１9-１１25のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
配列番号９４：５’-ＳＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＫＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ-３’（縮重度：２５６）【００９８】
ＶＨアンチセンス（３，  ４に共通のアンチセンスプライマー）
マウスＩｇＧすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
配列番号９５：５’-ＣＡＳＣＣＣＣＡＴＣＤＧＴＣＴＡＴＣＣ-３’（縮重度：６）【００９９】
（２）キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの一過性発現ベクターの作製
発現プラスミドの作製：
ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  （Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，  ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｉｏ-Ｒａｄ）  を用いたＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７のＬ鎖、Ｈ鎖それぞれの可変領域を配列番号５２〜９５に示されたプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントはサブクローニングベクターｐＧＥＭ  （プロメガ社）  に組み込んで、このベクターのＴ７、ＳＰ６ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。【０１００】
キメラ抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖、および、Ｈ鎖の可変域塩基配列はＩＭＧＴ／Ｖ-ＱＵＥＳＴ  Ｓｅａｒｃｈ  ｐａｇｅ  （ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ）  で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。【０１０１】
上記キメラ抗ＣＤＨ３抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ２は配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むものであった。【０１０２】
上記と同様な方法で、それぞれＰＰＡＴ−０５７−０６、ＰＰＡＴ−０５７−１３、ＰＰＡＴ−０５７−２３、ＰＰＡＴ−０５７−２７、ＰＰＡＴ−０５７−１２のハイブリドーマから抗体可変領域のクローニングも行った。その結果、ＰＰＡＴ−０５７−０６Ｃ重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるアミノ酸配列を含むものであった。ＰＰＡＴ−０５７−１３Ｃ重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３、１４、１５で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１６、１７、１８で示されるアミノ酸配列を含むものであった。ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃ重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９、２０、２１で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２２、２３、２４で示されるアミノ酸配列を含むものであった。ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃ重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２５、２６、２７で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２８、２９、３０で示されるアミノ酸配列を含むものであった。ＰＰＡＴ−０５７−１２Ｃ重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３１、３２、３３で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４、３５、３６で示されるアミノ酸配列を含むものであった。【０１０３】
次に、クローン化された抗ＰＰＡＴ−０５７−１７抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、キメラＬ鎖発現ベクターにはヒトＣｋ領域をコードする遺伝子を、キメラＨ鎖発現ベクターにはヒトＣｇ１領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子をデザインして、これらＬ鎖、Ｈ鎖キメラ抗体遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって全長人工合成した。その際、ＣＨＯ生産細胞での遺伝子発現が有利なようにコドン使用頻度の最適化  （Ｋｉｍら、Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ-ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  （ＥＰＯ）  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｇｅｎｅ，  １９９，  １９９７，  ｐ２９３-３０１の方法に従った）  をおこなった。具体的には、Ｌ鎖の場合、効率的な翻訳のために必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．，  Ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｓｉｘ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡＵＧ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｃｏｄｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６，  ｐ９４７-９５０，  １９８７）、マウスＩＧＫＶ（k鎖可変領域）遺伝子のシグナルペプチド、抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖のＶ領域、ヒトＫＣ（k鎖定常域）の順に遺伝子を並列し、その両端には制限酵素部位（５'  側にＮｈｅＩ，  ３'  側にＥｃｏＲＩ）を付加した。キメラＨ鎖も同様に作製した。これら人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗ＣＤＨ３キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ，  Ｈ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨを得た。【０１０４】
（３）キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの安定発現ベクターの作製
遺伝子操作された抗体遺伝子をＣＨＯ細胞を用いて高レベルで発現させるために、ＣＭＶプロモーター配列に連結し、ポリＡシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。【０１０５】
キメラ抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧＧＳ発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫに、ＣＭＶプロモーターとポリＡシグナルを有したｄｈｆｒ遺伝子を組み込むことである。ＣＭＶプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列をもつマウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡシグナルをそれぞれＰＣＲ法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をＰＣＲ法で接続するとともに両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ-ＣＭＶプロモーター-Ｋｏｚａｋ-ｄｈｆｒ-ポリＡ-ＨｉｎｄＩＩＩという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、あるいは、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んでｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をＣＡＧプロモーターで、ｄｈｆｒ遺伝子をＣＭＶプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ抗体を生産することができた。【０１０６】
（４）キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃを生産するＣＨＯ細胞株の樹立
ＣＨＯ ｄｈｆｒ（-）細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p42１6-4220, １980)を用いて、２種類のプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のＰｖｕＩでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした）すなわち、キメラ抗ＣＤＨ３Ｌ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクター、および、キメラ抗ＣＤＨ３Ｈ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のＡｍａｘａでおこなった。ＤＮＡ（Ｌ鎖、Ｈ鎖各プラスミドにつき０．００２ｍｇ／試料）を３ｘ１０ｅ３ 細胞の０．１ｍＬのＡｍａｘａエレクトロポレーションＣＨＯ用緩衝液に加えてパルスを与えた。【０１０７】
エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析済みＦＢＳを含有し、ＨＴ（Ｈ，  ヒポキサンチン  ：  Ｔ，  チミジン）を含まないＩｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）に加えた。遺伝子導入から３日後、１０％透析ＦＢＳ、２ ｍＭ Ｌ-グルタミン、ＨＴを含まないＩＭＤＭに培地を交換して１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、Ｇ４１８で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。０．２５ｍＭ、１ｍＭの２ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、１リットルあたり約５０〜１００ｍｇのキメラＣＤＨ３抗体を生産する細胞株を樹立できた。
上記と同様な方法で、それぞれキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−０６Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−１３Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃ、ＰＰＡＴ−０５７−１２Ｃを生産する細胞株を樹立した。【０１０８】
（５）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメラ抗体の定量
遺伝子導入したＣＨＯ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：ＡＱＩ，  Ｃａｔ  Ａ-１１０ＵＤ）でコートした。ブロックした後、抗ＣＤＨ３キメラ抗体産生ＣＨＯ細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，  Ｃａｔ．  Ａ-１１０ＰＤ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして４５０  ｎｍにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧを用いた。【０１０９】
実施例６：キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの抗原結合活性の測定
精製したキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの抗原結合活性の測定は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）、またＣＤＨ３の陽性発現肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８を用いてフローサイトメトリで行った。【０１１０】
それぞれの細胞株を２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、精製したキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃをそれぞれの濃度で添加し、４℃で６０分間反応させた。ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ヒトＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ'）2（インビトロジェン社）４μｇ/ｍｌを加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施した。その結果、図７に示したように、キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７ＣはＣＤＨ３発現細胞株への強い反応性が認められた。【０１１１】
実施例７：キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の測定
ＡＤＣＣ活性の測定は、EuTDA cytotoxicity assay kits (PerkinElmer, Cat.AD0116)を用いた。
（１）エフェクター細胞の調製
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  Ｊｃｌマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。【０１１２】
（２）標的細胞の調製
標的細胞として、ＣＤＨ３陽性発現肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０6個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＢＡＴＤＡ５μｌ/ｍｌを添加し、３７℃で２５分間培養した。この細胞を培地で４回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。【０１１３】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞にそれぞれ０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度になるよう調製した抗体溶液（抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７又はキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃ）を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベートした。次いで、エフェクター細胞１００μＬ（４ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で３時間培養した。培養上清を回収し、培養上清２０μＬを蛍光測定プレートへ移し、Eu solution１００μｌを添加し、室温で１５分間反応させた後、プレートの各ウェル中の蛍光量を蛍光プレートリーダーで測定した。【０１１４】
このとき、細胞傷害活性は以下の式で求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの蛍光量
Ｂ：標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、 １０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの蛍光量
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの蛍光量
以上の式でADCC活性を算出した。結果は図８で示した。【０１１５】
実施例８：キメラ抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の測定
ＡＤＣＣ活性の測定は、標的細胞に膀胱癌細胞株ＢＦＴＣ９０５を、エフェクター細胞にはマウス骨髄細胞を使用し、ＰＲＯＭＥＧＡ社製キット、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて測定した。【０１１６】
（１）エフェクター細胞の調製
C.B-17/Icr-scidマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、５０ｎｇ/ｍＬリコンビナントヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）および１０ｎｇ／ｍＬリコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）添加１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で６日間培養した。測定当日に骨髄細胞を回収し、測定Ｂｕｆｆｅｒ（フェノールレッド不含２．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）で０．９×１０7cells/ｍＬに調製し、エフェクター細胞溶液とした。【０１１７】
（２）標的細胞の調製
標的細胞として、ＣＤＨ３陽性発現膀胱癌細胞株ＢＦＴＣ９０５細胞を用いた。細胞をプレートから剥離後、０．７５ｘ１０5個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、96ウェルＵ底プレートに１００μL/ウェルで分注した。翌日測定Ｂｕｆｆｅｒ（フェノールレッド不含２．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）で洗浄後、測定Ｂｕｆｆｅｒ５０μL/ウェルを添加した。【０１１８】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
抗体液は測定Ｂｕｆｆｅｒで１２μg/ｍＬに調製し、標的細胞をまいたプレートに２５μL/ｗｅｌｌを添加して５％ＣＯ２インキュベーター中で３０分間おいた。調製したエフェクター細胞を２５μＬ /ウェルで添加した（最終抗体濃度３μｇ/ｍＬ、エフェクター細胞：標的細胞  ＝  31：1）。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに４時間静置後、上清５０μL/ウェルを回収し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙにて測定した。結果は図９で示した。【０１１９】
実施例９：ゼノグラフトモデルにおけるキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの抗腫瘍効果
キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃの抗腫瘍効果を、ヒト肺癌由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８を移植したゼノグラフトで確認した。【０１２０】
ＮＣＩ−Ｈ３５８は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０6個／マウスとなるように移植した。
ＮＣＩ−Ｈ３５８移植マウスを４群に分け（ｎ＝８）、各群に、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７又はキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃを、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、陰性コントロールとしてＰＢＳを０．２ｍＬ／２０ｇ尾静脈より投与した。投与は、平均腫瘍径が８０ｍｍ3となった時点で開始し、週２回（３日または４日毎）、合計８回行った。【０１２１】
投与日に腫瘍サイズおよび体重を測定した。最終投与の後さらに１週間観察し、体重、腫瘍体積、腫瘍重量の測定を行った。その結果は図１０に示す。ＰＢＳ投与群と比較し、キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７Ｃは、すべての群において抗腫瘍効果を示した。【０１２２】
実施例１０：F(ab')2のin vivo腫瘍増殖抑制効果
(１)F(ab')2の調製
抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７、また、陰性コントロール抗体を透析バーファー（５ｍM Tris-HCl, 150  mM  NaCl、ｐH７．５）で一晩透析し、最終濃度を５ｍｇ/mlするように調整する。続いて、同容積の消化バーファー（0.2M Sodium citrate buffer, pH4）を加え、更に0.25mg/ml Pepsin (Roche)を入れ、37℃で2時間ペプシン消化を行った。十分の一容積の2M Tris-HCl buffer (pH 8.2)の添加によりペプシン消化反応を停止させ、ゲル濾過によりF(ab')2を精製した。最後、20mM Na2PO4. 2H2O, 150mM NaClのバーファーに置換し、Mustang E membrane（Pall life sciences, Port Washington,NY）によりendotoxinを除去した。高速液体クロマトグラフィー(High performance liquid chromatography, HPLC)及びSDS-PAGEの結果により精製したF(ab')2の純度は９９％以上であることを分かった（図１１、A及びB）。【０１２３】
（２）F(ab')2のin vivo 腫瘍増殖抑制効果
ＮＣＩ−Ｈ３５８は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０6個／マウスとなるように移植した。
ＮＣＩ−Ｈ３５８移植マウスを４群に分けた（ｎ＝８）。IgG抗体とF（ab’）2の半減期の違いを考慮し、各群に、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７IgG、陰性コントロール抗体IgGをそれぞれ１．５ｍｇ／ｋｇで、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７F（ab’）2、また陰性コントロールF（ab’）2を  １ｍｇ/ｋｇで  尾静脈より投与した。投与は、平均腫瘍径が１００ｍｍ３となった時点で開始した。IgG抗体は週２回、合計８回を投与した。F(ab')2は週3回、合計12回を投与した。【０１２４】
投与日に腫瘍サイズおよび体重を測定した。最終投与後体重、腫瘍体積、腫瘍重量の測定を行った。結果は図１１Cに示す。陰性陰性コントロールF（ab’）2投与群と比較し、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７のF（ab’）2は、腫瘍増殖抑制効果を示した。この結果から、抗体ＰＰＡＴ−０５７−１７はＡＤＣＣ非依存性の腫瘍増殖抑制作用があることを示した。【０１２５】
実施例１１  ゼノグラフトモデルにおけるキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃの抗腫瘍効果
キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃの抗腫瘍効果を、ヒト膀胱癌由来細胞株ＢＦＴＣ９０５を移植したゼノグラフトで確認した。
膀胱がん細胞株ＢＦＴＣ９０５細胞を１０％ＦＢＳ添加したＤ−ＭＥＭ培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を５×１０7/ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。この細胞懸濁液を、Ｃ．Ｂ−１７-scidマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に移植した。移植後、週二回ノギスにより腫瘍径を測定し、腫瘍平均体積が１５０ｍｍ3前後に到達した時点で、腫瘍体積に対する無作為化割付により、マウスを１群あたり５匹、２群になるよう割付けを行った。１群にはＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃ抗体を１ｍｇ/ｋｇで尾静脈投与し、残りの１群には陰性コントロールとして、０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計５回行った。投与後も割付け前と同様に、週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は最終測定日の腫瘍体積の平均について、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行った。【０１２６】
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）2×  長径  ×  ０．５
また、無作為化割付および、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定は生物実験データ統計解析ソフトＥＸＳＵＳ（株式会社シーエーシー）を用いて行った。【０１２７】
各群の腫瘍体積の平均値の経時的変化を図１２に示す。図に示したように、腫瘍の増殖は、ＰＰＡＴ−０５７−２７Ｃ抗体により抑制された。図中、＊＊＊はＰ＜０．００１で有意差があったことを示す。【０１２８】
実施例１２  ゼノグラフトモデルにおけるキメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃの抗腫瘍効果
キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃの抗腫瘍効果を、ヒト肺癌由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ１６５０を移植したゼノグラフトで確認した。
非小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞を１０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を５×１０7/ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。この細胞懸濁液を、Ｃ．Ｂ−１７-scidマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に移植した。移植後、週二回ノギスにより腫瘍径を測定し、腫瘍平均体積が１５０ｍｍ3前後に到達した時点で、腫瘍体積に対する無作為化割付により、マウスを１群あたり６匹、２群になるよう割付けを行った。１群にはＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃ抗体を１.５ｍｇ/ｋｇで尾静脈投与し、残りの１群には陰性コントロールとして、０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週１回、合計２回行った。投与後も割付け前と同様に、週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は最終測定日の腫瘍体積の平均について、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定により判定した。【０１２９】
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）2×  長径  ×  ０．５
また、無作為化割付および、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定は生物実験データ統計解析ソフトＥＸＳＵＳ（株式会社シーエーシー）を用いて行った。【０１３０】
各群の腫瘍体積の平均値の経時的変化を図１３に示す。図に示したように、腫瘍の増殖は、ＰＰＡＴ−０５７−２３Ｃ抗体により抑制された。図中、＊はＰ＜０．０５で有意差があったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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