(57)【要約】  本発明は、造影剤投与前の造影剤腎症の発症リスクを予測するためのマーカーを確立し、それを簡便かつ迅速に検出できる腎症の検査方法およびその検査キットを提供することを課題とする。本発明の腎症の検査方法は、被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする腎症の検査方法。
【請求項２】
前記腎症が、造影剤腎症であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の腎症の検査方法。
【請求項３】
造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の腎症の検査方法。
【請求項４】
前記プローブが、前記Ｌ−ＦＡＢＰに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
【請求項５】
イムノクロマトグラフィー法を用いることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
【請求項６】
前記量子ドットが、シェルを施したＳｉまたはＧｅであることを特徴とする請求の範囲第１項から第５項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
【請求項７】
請求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法に用いることを特徴とする検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、量子ドットにより標識されたプローブを用いるイムノクロマトグラフィー法による腎症の検査方法およびその検査キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、被検試料中に存在する腎臓組織由来の肝臓型脂肪酸結合タンパク質であるＬ−ＦＡＢＰを、量子ドットにより標識された超高感度のプローブを用いたイムノクロマトグラフィー法により、簡便かつ迅速に検出できる検査方法及びそれを用いた検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
造影剤は、血管造影やＣＴ造影などの画像診断において必要不可欠な体内診断薬であって、定期健康診断などでも頻繁に使用され、医療現場に広く普及している。その一方で、造影剤は、造影剤腎症と呼ばれる急性な腎障害を引き起こすことも少なくなく、臨床現場の問題の１つとなっている。【０００３】
とりわけ、糖尿病、心不全などの疾患を有する者および高齢者では造影剤腎症の発症のリスクが高く、このため、造影剤投与の前に腎機能をチェックすることが必要とされている。そうしたチェックにより腎症のリスクをあらかじめ把握し、必要な投与前処置を施すことで、造影剤腎症の発症を回避できる。【０００４】
特許文献１には、腎糸球体への炎症細胞の浸潤と間接的に関連して尿中へ排泄されるシスタチンＣを測定することにより、腎症を早期に診断できる診断キットが開示され、実施例においてＥＬＩＳＡによる検査法が記載されている。【０００５】
また、特許文献２には、腎臓組織由来の脂肪酸結合タンパク質を、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて検出できることが記載されているが、その実施方法については具体的な記載がない。【０００６】
したがって、造影剤投与の前の腎機能を的確に診断し、投与後も腎機能をモニター診断するための決定的な方法は未だ確立されていないのが現状であり、有用な診断・検査方法が望まれている。
【特許文献１】特開平１１−６４３３３号公報
【特許文献２】特開平１１−２４２０２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、造影剤投与前の造影剤腎症の発症リスクを予測するためのマーカーを確立し、それを簡便かつ迅速に検出できる腎症の検査方法およびその検査キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、造影剤投与前における造影剤腎症の発症リスクの判断に対する簡便かつ迅速な検査方法を開発すべく鋭意研究を進めた。その結果、腎組織に由来する脂肪酸結合タンパク質であるＬ−ＦＡＢＰの発現が腎疾患に深く関連し、その発現量が少ないほど腎機能は良好であると判断されることから、Ｌ−ＦＡＢＰをマーカーとして着目し、量子ドットにより標識された超高感度のプローブを用いたイムノクロマトグラフィー法を用いる本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明に係る上記課題は、下記の手段により解決される。【００１０】
１．被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする腎症の検査方法。【００１１】
２．前記腎症が、造影剤腎症であることを特徴とする前記１に記載の腎症の検査方法。【００１２】
３．造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供することを特徴とする前記２に記載の腎症の検査方法。【００１３】
４．前記プローブが、前記Ｌ−ＦＡＢＰに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする前記１項から３のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。【００１４】
５．イムノクロマトグラフィー法を用いることを特徴とする前記１項から４のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。【００１５】
６．前記量子ドットが、シェルを施したＳｉまたはＧｅであることを特徴とする前記１から５のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。【００１６】
７．前記１から６のいずれか一項に記載の腎症の検査方法に用いることを特徴とする検査キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、腎症のマーカーとしての、被検試料中に存在する腎臓組織由来の肝臓型脂肪酸結合タンパク質であるＬ−ＦＡＢＰを、発光寿命の長い量子ドットにより標識されたプローブを用いることにより超高感度で検出する方法を提供することができる。さらに、造影剤投与の前の造影剤腎症の発症リスクを短時間で予測するために、イムノクロマトグラフィー法を用いることによって、簡便かつ迅速に検出できる腎症の検査方法およびその検査キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１中、ａは、イムノクロマトストリップの平面図を表し、ｂは、ａに示されたイムノクロマトストリップの縦断面図を表す。
【符号の説明】
【００１９】
１  粘着シート
２  含浸部材
３  膜担体
３１  捕捉部位
４  吸収用部材
５  試料添加用部材
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の腎症の検査方法は、被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第１項から第７項に係る発明に共通する技術的特徴である。【００２１】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記腎症が、造影剤腎症であることが好ましい。また、当該腎症の検査方法は、造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供する態様であることが好ましい。更に、前記プローブが、前記Ｌ−ＦＡＢＰに特異的に結合する抗体を含む態様であることが好ましい。【００２２】
本発明の腎症の検査方法においては、イムノクロマトグラフィー法を用いることが好ましい。また、前記量子ドットが、シェルを施したＳｉまたはＧｅからなる量子ドットであることが好ましい。【００２３】
本発明の腎症の検査方法は、検査キットにおいて好適に用いることができる。【００２４】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態・態様について詳細な説明をする。【００２５】
＜Ｌ−ＦＡＢＰ＞
本発明の検査方法において、後述する腎症のマーカーとして着目したＬ−ＦＡＢＰ（Ｌｉｖｅｒ  ｔｙｐｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；肝臓型脂肪酸結合タンパク質）とは、細胞内のエネルギー・脂質代謝および疎水性リガンドの輸送を担う、分子量約１４ｋＤａの可溶性タンパク質であり、肝臓、近位小腸および腎近位尿細管に特異的に発現している。Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子発現が、腎障害に応答し誘導されることから、検体として、尿、便、血液（全血または血清・血漿）、体液および腎組織などから採取した被検試料中のＬ−ＦＡＢＰ濃度のごく僅かな増減が、腎障害の程度を反映するものと考えられている。すなわち、従来の尿中α1−ミクログロブリンや尿中ＮＡＧなどの腎症のマーカーが近位尿細管の構造的な障害という“結果”を検出しているのに対し、Ｌ−ＦＡＢＰは腎疾患進行の“原因”となる種々のストレスを反映するものと考えられることから、これまでにない腎疾患早期の診断マーカーとして注目されている。【００２６】
＜腎症＞
腎症の病気分類としては、第１期（腎症前期）、第２期（早期腎症期）、第３期（顕性腎症期）、第４期（腎不全期）および第５期（透析療法期）が一般的であって、早期診断という場合の「早期」とは、第１期または第２期を指すが、第１期において検査し診断できることが好ましい。特に、造影剤の投与前のリスク診断は第１期に行うことが好ましい。【００２７】
本発明において、腎症は、造影剤腎症であってもよく、その造影剤腎症とは、造影剤による腎障害のことであり、造影剤投与後４８時間以内に生じた血清クレアチニンレベルの２５％以上の上昇と定義されている。【００２８】
＜量子ドットにより標識されたプローブ＞
本発明の検査方法において用いられる、量子ドットにより標識されたプローブの「量子ドット」とは、高い量子効率によりバンドギャップ発光を示す半導体ナノ粒子であって、半導体を構成する原子が数百〜数千個集まった直径数ナノメートルの粒子である。半導体ナノ粒子の形状は、球状、棒状、板状、チューブ状などが考えられるが、本発明において用いられる半導体ナノ粒子は、球状または略球状であると考えられ、粒子径はその直径を表している。【００２９】
量子ドットは、量子サイズ効果により高い蛍光発光強度が得られ、また粒径の大きさにより蛍光の発光波長を変えられる。従来の蛍光色素とは異なり、量子ドットは半導体であるため、バンドギャップ以上のエネルギーを有する光の照射により、照射光の波長に関わらず効率よく励起することができる。さらに、量子ドットは良好な光吸収特性を示すことから、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの低輝度の光源によっても励起することができる。したがって、単一の励起光により複数の量子ドットを励起でき、マルチカラーイメージングが簡便に実現できる。【００３０】
本発明において用いられる量子ドットは、該表面が露出した場合、該表面上の多数の欠陥が発光キラーとして働き、発光強度が低下してしまうため、シェルを施すことが好ましい。シェルを施した量子ドットは、コア・シェル構造を有する。つまり、コア部となる中心部ナノ粒子の表面を覆う層をシェル部とする二重構造を有する。該シェル部の材料として、通常はＩＩ族〜ＶＩ族の化合物が好適である。この場合、上記のコア・シェル構造の観点からシェル部がコア部よりもバンドギャップが大きい組成から構成されていることが必要である。また、該コア部は単結晶であることが好ましい。単結晶とすることにより、光学素子、例えば、蛍光体微粒子の場合、高い発光効率が得られるからである。【００３１】
量子ドットは、具体的に、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｃｄ、Ｉｎ、ＳｂおよびＴｅよりなる群から選ばれる、少なくとも1つ以上の元素を含有する粒子が挙げられる。極めて毒性の高い元素であるＣｄ等を用いることを避けたいことから、少なくともＳｉまたはＧｅの元素を含み、Ｓｉまたはその化合物、あるいはＧｅまたはその化合物が好ましい。ＳｉまたはＧｅである量子ドットは、そのサイズが量子閉じ込め効果の生じる領域まで縮小することによりバンドギャップエネルギーが可視領域まで広がって発光現象が見られる。【００３２】
このような量子ドットとしては特に限定されないが、コア部がシリコン核、シェル部が酸化シリコン主体の層であること好ましい。酸化シリコン主体の層とは、酸化ケイ素（ＳｉＯ2）が主成分であるシェル層である。さらにコア部のシリコン核は、単結晶であることが好ましい。このようなコア・シェル構造を有する半導体ナノ粒子では、コア部のＳｉの励起エネルギーは１．１ｅＶ、シェル部の酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の励起エネルギーは、８ｅＶとなり、バンドギャップエネルギーは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳなの粒子（シェル部（ＺｎＳ）３．６ｅＶ；コア部（ＣｄＳｅ）１．７ｅＶ）よりも大きい。またシリコン・シリカ系の量子ドットは、環境への負荷が少なく、生体への適用時には生体安全性にも優れる。【００３３】
上記量子ドットは、各種の公知技術、文献に記載された方法に基づいて製造してもよい。たとえば引用文献１には、材料の融解温度よりも相当に低い温度での反応雰囲気方法および溶液合成方法のいずれかと組合わされた処理技術により、固溶体希土類元素ドープナノ粒子の調製方法が記載されている。具体的には一種類以上の希土類元素でドープされた金属ハロゲン化物のナノサイズ粒子を、ハロゲン化ガスのハロゲン化雰囲気で加熱する方法、あるいは希土類元素塩およびハロゲン化物形成金属の水溶性塩の水溶液からナノ粒子を沈殿させる方法が開示されている。特に希土類元素がドープされたホスト物質のナノ粒子を溶液から調製する溶液法が望ましい。【００３４】
また、コア・シェル構造を有する量子ドットの製造方法は、公知技術、文献に記載された方法に基づく。たとえば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）シェルと金属コア構造のナノコンポジット粒子が、Ｍｕｌｖａｎｅｙら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１２：４３２９〜４３３５頁、１９９６年）およびＡｄａｉｒら（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．＆  Ｅｎｇ．Ｒ．２３：１３９〜２４２頁、１９９８年）によって最初に合成され、報告された。コア・シェル構造を有する、ＳｉＯ2でコーティングされた量子ドットのほとんどは、使用された合成法に基づき２種のカテゴリーに分類される。【００３５】
Ｍｕｌｖａｎｅｙらによって開発された手法は、シリカシェルの形成前にシランカップリング剤の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）による金属クラスター表面の改質を必要とする。ＡＰＳは、ガラス質との親和性に欠けた金属クラスターコアとＳｉＯ2との間の接着促進剤として使用される。Ａｄａｉｒらは、水相を有するシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ／水の三成分系におけるテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の単純な加水分解および縮合によって、金属およびＣｄＳのクラスターをＳｉＯ2でコーティングすることに成功した。この系により、油中に水の小滴が閉じ込められるので、コアとシェルとの両方の厚みが調整可能であるとともに極めて均一なシリカ−シェルコーティングが可能になる。【００３６】
また、量子ドットにより標識されたプローブの「プローブ」としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、脂肪酸、酵素／抗原、アビジン／ビオチン、リボ核酸およびデオキシリボ核酸またはこれらのオリゴマーなどが挙げられ、平衡状態における結合力が強く、特異性および汎用性が高いことから、特に抗体が好ましい。本発明においてプローブとして使用する抗体としては、後述するＬ−ＦＡＢＰと特異的に結合する抗体である抗Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体または抗Ｌ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体を使用できる。【００３７】
半導体ナノ粒子をプローブに標識する方法として、多くの方法が知られているが、具体例として、ＳｉＯ2をシェル層として有する半導体ナノ粒子を抗体に標識させる反応を示す。ＳｉＯ2被覆半導体ナノ粒子を、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させ、引き続きＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレインイミドメチル］シクロヘキサン１−カルボキシレート）活性化を行う。この活性化した半導体ナノ粒子と反応させるために必要となる、タンパク質に結合したチオール基は、リジン残基を含有するタンパク質を２−イミノチオランと反応させることにより形成することができる。この反応において、結合させるタンパク質のリジン側鎖は、２−イミノチオランと開環およびチオアミジンの形成を伴って反応する。その際に形成され、タンパク質と共有結合したチオール基は、次いで、ヘテロマイケル付加反応により、上記半導体ナノ粒子表面に結合したマレインイミド基と反応して、タンパク質としての抗体と上記ＳｉＯ2被覆半導体ナノ粒子の表面にある反応性基との間に共有結合を形成することができる。【００３８】
本発明において用いられる、量子ドットにより標識されたプローブは、シェルを施したＳｉにより標識された抗Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体、シェルを施したＧｅにより標識された抗Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体、シェルを施したＳｉにより標識された抗Ｌ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体およびシェルを施したＧｅにより標識された抗Ｌ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体が好ましい。【００３９】
＜検査方法＞
本発明の検査方法における被検試料は、尿、便、血液（全血または血清・血漿）、体液および腎組織などから採取したものであって、必要ならば、試料溶解液、希釈液、緩衝液、洗浄液などにより前処理することができる。検査の手順として、まず上記被検試料を、量子ドットにより標識されたプローブと混合し結合させる。次に、洗浄などの処置により結合した複合体と遊離のプローブとを分離する。該複合体に励起光を照射し、量子ドットからの蛍光を検出する。その検出は、肉眼でもよく、また蛍光量を定量する機器を使用してもよい。その結果をデータ処理することによって、後述するように造影剤腎症を発症するリスクを予測することができる。【００４０】
上記検出を簡便かつ迅速に行えるように、次のイムノクロマトグラフィー法を利用する態様が望ましい。【００４１】
＜イムノクロマトグラフィー法＞
本発明に好適に用いられるイムノクロマトグラフィー法（以下「イムノクロマト法」ともいう。）は、公知のイムノクロマト法テストストリップ（以下「イムノクロマトストリップ」ともいう。）の構成に準拠して容易に実施できる。【００４２】
一般に、イムノクロマトストリップは、抗原の第１の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第１の抗体と、抗原の第２の抗原決定基にて抗体抗原反応可能かつ標識された第２の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、第１の抗体が膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、第２の抗体が該捕捉部位から離隔した位置で該膜担体にてクロマトグラフィー展開可能なように配置されて構成される。【００４３】
上記第１の抗体および上記第２の抗体は、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、少なくともいずれか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。通常は、第１の抗体および第２の抗体は「ヘテロ」の組み合わせで用いられ、すなわち、抗原上の位置および構造のいずれもが異なる各抗原決定基をそれぞれ認識する第１の抗体および第２の抗体が組み合わせて用いられる。しかしながら、第１の抗原決定基および第２の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第１の抗体および第２の抗体は、「ホモ」の組み合わせのモノクローナル抗体であってよく、すなわち、第１の抗体および第２の抗体の両方に同一のモノクローナル抗体を使用できる。【００４４】
イムノクロマトストリップの具体例（引用文献２の図３に記載）を、図１に示す。図中、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を表している。【００４５】
引用文献２では、上記イムノクロマトストリップの膜担体３を、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターとして作製している。【００４６】
上記膜担体３上の、クロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第１の抗体が固定され、捕捉部位３１が作製される。【００４７】
引用文献２において、上記膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被検試料中に含まれる検体がクロマトグラフィー展開可能であって、かつ上記捕捉部位３１を形成する抗体が固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。【００４８】
含浸部材２は、第１の抗原決定基とは異なる部位に位置する第２の抗原決定基を認識する第２の抗体を含浸した部材からなる。該第２の抗体は、適当な標識物質であらかじめ標識されていることが好ましい。【００４９】
引用文献２では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。【００５０】
上記イムノクロマトストリップはこれに限定されず、当業者は適宜変形・変更を加えてもよい。【００５１】
＜リスクの予測＞
本発明の検査方法によって、造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供することができる。すなわち、前述の検査方法により得られた結果をデータ処理することによって、正常レベルからの逸脱の程度を検出し、問題無し・要観察・腎症発症リスク高い等のリスク評価を行うことができる。【００５２】
＜検査キット＞
本発明の検査方法に使用される検査キットは、腎組織由来のＬ−ＦＡＢＰに結合することができる、量子ドットにより標識されたプローブを用いたマイクロプレート（９６穴マイクロプレート等）、アフィニティビーズ、イムノクロマトストリップなどを必須の構成要素とし、必要に応じて検体を溶解するための溶解液、反応試薬、検出試薬を含んでもよい。さらに、本発明の方法を実施するために必要とされる各種器材または資材、試薬を含んでもよい。該試薬は、試料溶解液、希釈液、緩衝液、洗浄液、反応停止剤、（生成物）抽出液なども含むことができる。【００５３】
さらに、キットの構成要素として、検量線作成用の標準物質、説明書さらに多数検体の同時処理が可能なマイクロプレートおよびその検出装置であるプレートリーダーなどの必要な器材一式なども含んでよい。【００５４】
本発明の検査方法に使用される検査キットの好ましい態様は、少なくとも、腎組織由来のＬ−ＦＡＢＰに結合することができる、量子ドットにより標識された抗体を用いたイムノクロマトストリップ、検体の希釈液、および量子ドットを励起する光源を含む。【００５５】
〔引用文献１〕特開平５−２２４２６１号公報
〔引用文献２〕特開２００６−６７９７９号公報
【実施例】
【００５６】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００５７】
＜被検試料の調製＞
ランダムに選択した被験者４人に対し、造影剤投与前に尿を採取し、造影剤投与し２４時間後にさらに尿を採取した。造影剤投与前の尿を、それぞれ被検試料Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとし、造影剤投与２４時間後の尿を、それぞれ被検試料ａ、ｂ、ｃおよびｄとした。上記被検試料Ａならびにａ、Ｂならびにｂ、ＣならびにｃおよびＤならびにｄは、同一の被験者から採取した尿である。【００５８】
＜量子ドットとしてのシェルを施したＳｉナノ粒子の調製＞
熱処理したＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）をフッ化水素酸中に溶解することによって、Ｓｉの蛍光半導体微粒子（以下「Ｓｉ半導体微粒子」または「Ｓｉコア粒子」ともいう。）を調製した。すなわち、まず、プラズマ化学気相成長（ＣＶＤ）法によりシリコンウエハー上に成膜したＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）を不活性ガス雰囲気中で１１００℃、アニールを行った。これにより、ＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）膜中にＳｉ半導体微粒子（結晶）が析出した。アニール時間を調整することによりサイズの異なるＳｉ微粒子を析出させた。【００５９】
次に、このシリコンウエハーを室温で１％程度のフッ化水素酸で処理することによりＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）膜を除去し、液面に凝集した数ｎｍサイズのＳｉ半導体微粒子を回収した。なお、このフッ酸処理により、半導体微粒子（結晶）表面のＳｉ原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、Ｓｉ結晶を安定化させた。得られたＳｉコア粒子を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分離処理を行い、残留するフッ化水素およびサイズ・構成比率が異なる副生成物を完全に除いた。回収した単分散性のＳｉ半導体微粒子の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、Ｓｉ半導体微粒子からなるコアの周囲にＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）からなるシェル層を形成した。このコア・シェルからなる粒子の平均粒径は３．５ｎｍであった。このコア・シェル粒子に対しシェル表面に末端にアミノ基をもつポリエチレングリコール（分子量：１０００）を導入し、さらにクロスリンカー試薬である４−（マレイミドメチル）−１−シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−１−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ；ＳＭＣＣ）を反応させ末端にマレイミド基を導入し、量子ドット１μＭのＮａＣｌ溶液を調製した。【００６０】
＜量子ドットにより標識された抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体の調製＞
第２の抗体である抗マウスＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体のタンパク質換算質量１μｇ（以下、抗体のタンパク質換算質量を示すとき、単に、その精製タンパク質の質量分析による質量数値で示す。）をジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理後に上記のマレイミド基を末端に導入したコア・シェル量子ドット溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置し、この抗体を量子ドット粒子表面に結合させた後、量子ドット溶液における最終濃度が０．１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」ともいう。）水溶液を加え、この量子ドット粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、量子ドットにより標識された抗マウスＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（以下「量子ドット標識Ｍａｂ」ともいう。）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して量子ドット標識Ｍａｂを沈殿させ、上清液を除いて量子ドット標識Ｍａｂを得た。この量子ドット標識を、１０％サッカロース、１％ＢＳＡおよび０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して量子ドット標識Ｍａｂ溶液を得た。【００６１】
＜量子ドットにより標識された抗体を含むイムノクロマトストリップの作製＞
標記イムノクロマトストリップは、図１に示されるイムノクロマトストリップと同様のものを下記の手順により作製した。【００６２】
Ｌ−ＦＡＢＰと、第２の抗体である量子ドットにより標識した抗マウスＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（以下「量子ドット標識Ｍａｂ」ともいう。）との複合体の捕捉部位として、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜を、クロマトグラフィー展開用膜担体３として用意した。【００６３】
第１の抗体である抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）１．０ｍｇ／ｍｌの溶液０．５μｌを、上記クロマトグラフィー展開用膜担体３上のクロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、Ｌ−ＦＡＢＰと量子ドット標識Ｍａｂとの複合体の捕捉部位３１とした。【００６４】
量子ドット標識Ｍａｂ含浸部材として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、量子ドット標識Ｍａｂ溶液３７．５μｌを含浸し、これを室温で乾燥させて量子ドット標識Ｍａｂ含浸部材２とした。【００６５】
上記膜担体３、上記含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図１同様のイムノクロマトストリップを作製した。【００６６】
〔実施例１〜４〕
被検試料Ａ〜Ｄそれぞれ１００μｌを、作製したイムノクロマトストリップそれぞれの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマトグラフィー展開し、室温で１５分間放置した（実施例１〜４）。上記捕捉部位３１で捕捉されたＬ−ＦＡＢＰと量子ドット標識Ｍａｂとの複合体の捕捉量を、励起光（波長：３５０ｎｍ）を照射したときの赤色蛍光を肉眼で観察した。該捕捉量は、その量に比例して増減する赤色の呈色度合いを肉眼により、−（着色なし）、±（極微弱な着色）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）および＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。同様の試験を３回（Ｎ＝１〜３）繰返し、その結果を表１に示す。【００６７】
＜金コロイド溶液の調製＞
加熱によって沸騰させた超純水９９ｍｌに、１％（ｖ／ｗ）塩化金酸水溶液１ｍｌを加え、さらに、その１分後に１％（ｖ／ｗ）クエン酸ナトリウム水溶液１．５ｍｌを加えて加熱し５分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨ９．０に調整し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして金コロイド溶液を得た。【００６８】
＜金コロイドにより標識された抗マウスＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体溶液の調製＞
第２の抗体である抗マウスＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体のタンパク質換算質量１μｇ（以下、抗体のタンパク質換算質量を示すとき、単に、その精製タンパク質の質量分析による重量数値で示す。）と上記金コロイド溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」ともいう。）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイドにより標識された抗マウスＬ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（以下「金コロイド標識Ｍａｂ」ともいう。）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して金コロイド標識Ｍａｂを沈殿させ、上清液を除いて金コロイド標識Ｍａｂを得た。この金コロイド標識Ｍａｂを１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して金コロイド標識Ｍａｂ溶液を得た。【００６９】
＜金コロイド標識Ｍａｂを含むイムノクロマトストリップの作製＞
標記イムノクロマトストリップは、図１に示されるイムノクロマトストリップと同様のものを下記の手順により作製した。【００７０】
Ｌ−ＦＡＢＰと金コロイド標識Ｍａｂとの複合体の捕捉部位として、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜を膜担体３として用意した。【００７１】
第１の抗体である抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）１．０ｍｇ／ｍｌの溶液０．５μｌを、上記膜担体３におけるクロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、Ｌ−ＦＡＢＰと金コロイド標識Ｍａｂとの複合体の捕捉部位３１とした。【００７２】
金コロイド標識Ｍａｂ含浸部材として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識Ｍａｂ溶液３７．５μｌを含浸し、これを室温で乾燥させて金コロイド標識Ｍａｂ含浸部材２とした。【００７３】
上記膜担体３、上記金コロイド標識Ｍａｂ含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙とを用意した。そして、これらの部材を用いて、図１と同様のイムノクロマトストリップを作製した。【００７４】
〔比較例１〜４〕
被検試料Ａ〜Ｄそれぞれ１００μｌを、作製したイムノクロマトストリップそれぞれの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分間放置した（比較例１〜４）。上記捕捉部位３１で捕捉されたＬ−ＦＡＢＰと金コロイド標識Ｍａｂとの複合体の捕捉量を肉眼で観察した。該捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）の４段階に区分して判定した。同様の試験を３回（Ｎ＝１〜３）繰返し、その結果を表１に示す。【００７５】
〔実施例５〜８〕
また、被検試料ａ、ｂ、ｃおよびｄに含まれるＬ−ＦＡＢＰ量を、あらかじめ作製した蛍光量とＬ−ＦＡＢＰ量との検量線に基づき、本発明の検査方法によって測定した蛍光量からＬ−ＦＡＢＰを定量し、腎症リスクの指針とした。被験試料ａ、ｂ、ｃおよびｄ中のＬ−ＦＡＢＰの定量値を表２に示す。なお、定量値の単位中の「Ｃｒ」は、クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）を表す。【００７６】
【表１】
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【００７７】
【表２】
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【００７８】
実施例１〜４と実施例５〜８との本発明の検査方法による判定結果から、造影剤投与前のＬ−ＦＡＢＰの判定が定量的に出ており、造影剤投与後の腎症リスク度に比例した結果を与えたことから、造影剤腎症の造影剤投与前のリスク診断が充分に可能であることがわかる。しかも、実施例１〜４は、再現性にも優れることがわかる。【００７９】
一方、比較例１〜４では陰性判定がほとんどであり、実施例１〜４によって検出できたＬ−ＦＡＢＰの微量検出が全く不能であり、再現性も悪かった。したがって、比較例１〜４の金コロイド標識抗体を用いた方法では、造影剤投与前診断が困難であることがわかる。【００８０】
よって、量子ドット標識抗体を使用した実施例と、金コロイド標識抗体を使用した比較例との検出性能に著しい差があることから、本発明の検査方法は、造影剤腎症のリスク診断にふさわしい方法であることがわかった。
【図１】
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【国際調査報告】
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