(57)【要約】  羊スクレイピー由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の効率的な増幅方法を提供することを一義的な課題とし、究極的には、スクレイピーに感染した羊の早期発見によるプリオン病の伝播を根絶すること、また、プリオン不活性化方法の開発及びその早期評価を可能にすることであり、正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによる羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃを増幅させるＰＭＣＡ（protein misfolding cyclic amplification）法において、ＰｒＰＣとして、異種動物のＰｒＰＣを使用することを特徴とする羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。
2009145194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによる羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃを増幅させる蛋白質ミスホールディング循環増幅（ＰＭＣＡ：protein misfolding cyclic amplification）法において、ＰｒＰＣとして、異種動物のＰｒＰＣを使用することを特徴とする羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項２】
ソースとして用いる異種動物のＰｒＰＣが、齧歯類のＰｒＰＣである請求項１に記載の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項３】
異種動物である齧歯類が、マウス又はラットである請求項２に記載の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項４】
ソースとして用いるＰｒＰＣが、ＰｒＰＣを含む脳乳剤であり、シードとして用いる羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃが、羊スクレイピー感染動物由来のＰｒＰＳｃを含む体組織である請求項１に記載の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊スクレイピー由来の異常プリオン蛋白質の効率的な試験管内の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常プリオン蛋白質の増殖による疾患として最初に発見されたのが、スクレイピー（Scrapie）という羊にみられる運動機能失調にかかわる疾患であり、脳にスポンジ状の空胞形成が認められるという特徴をもつ。その後、この異常プリオン蛋白質の増殖による疾患として、狂牛病とも称されている牛海綿状脳症（ＢＳＥ：Bovine Spongiform Encephalopathy）、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ：Creutzfeldt Jakob Disease）や、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ：Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome）などが知られている。【０００３】
これらの疾患はウイルス感染によるものではなく、また既知の病原体は発見されておらず、特異的な蛋白質が共通に存在するところから、これが伝達〜感染を引き起こす病原物質と思われ、「蛋白質性感染粒子“プリオン”： proteinaceous infectious particle：prion」が提唱されて、上記した各種の特異的疾患は、プリオン病と称されるようになった。【０００４】
ところで、ヒトのプリオン蛋白質遺伝子は、第２０番染色体上に存在し、プリオン蛋白質は、２３５個のアミノ酸により構成されていることが判明している。感染因子プリオンの主な構成成分はこのプリオン蛋白質と考えられており、感染因子を構成するプリオン蛋白質をスクレイピー型または異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）と称し、正常型のプリオン蛋白質を正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）と称している。
ヒトを含む多くの動物種でプリオン病が認知され、一般的にプロテアーゼ抵抗性の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の蓄積が感染個体に認められることから、このＰｒＰＳｃが主病原体として関与していると考えられている。【０００５】
プリオン病の伝播は、異種の動物間でも起こりえる。例えば、スクレイピーに感染した羊材料の動物飼料への混入により牛に感染してＢＳＥを発症した可能性があり、さらにＢＳＥに感染した牛材料を含む飼料を食した猫に、猫海綿状脳症（ＦＳＥ）が発症したと考えられる。したがって、最近の研究では、特にＢＳＥがヒトへ感染する可能性が濃厚となっていると報告されている（非特許文献１）。【０００６】
スクレイピーは、羊、山羊にみられるプリオン病であるが、１８世紀にヨーロッパにおいて大流行し、我が国でも１９４８年以降、散発的であるが発生が認められている。
ところで、スクレイピー感染羊、すなわち、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）に感染した羊には、他の感染症や代謝病の診断に用いられているような簡便な診断法が応用できず、また潜伏期間が長いことから、スクレイピー感染羊の実用的な生前診断法は確立されていない。さらに、血液などの生体材料に含まれるＰｒＰＳｃ量は極微量であると考えられ、生前診断には、従来法の検出限界をはるかに凌ぐ超高感度な検出技法の開発が必要である。【０００７】
一方、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）は、通常の滅菌処理では不活性化されないという特徴を有している。ＰｒＰＳｃの不活化の確認には、通常、不活性化されたであろうＰｒＰＳｃをマウスなどの実験動物に接種し、発症の有無を確認することで感染性を検出するバイオアッセイ法が用いられる。しかしながら、この方法は実験動物を長期間飼育・観察する必要があり、その結果は数十〜数百日後でないと得られず、膨大な経過観察の手間と費用がかかるという問題がある。
したがって、不活化処理後、残存するＰｒＰＳｃを短期間に検出することができる高感度な方法が開発できれば、プリオン不活性化方法の開発、及びその評価において著しい改善をもたらすことになる。【０００８】
これまで行われている異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の検出方法としては、プリオンに感染した脳乳剤と正常脳乳剤を試験管内で混合し、超音波処理・攪拌培養を繰り返すことによってＰｒＰＳｃを増幅させる方法としてのＰＭＣＡ（蛋白質ミスホールディング循環増幅：protein misfolding cyclic amplification）法が開発され、極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能となった（非特許文献２、特許文献１）。【０００９】
このＰＭＣＡ法で用いられたＰｒＰＳｃは、スクレイピー（ハムスターに順化させた２６３Ｋ株）を感染させたハムスターの脳乳剤であり、これを希釈し、それに正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）として正常なハムスターの脳乳剤を加えて、混合し、試験管内で培養させ、過剰に加えられたＰｒＰＣがＰｒＰＳｃに構造変換されることによりＰｒＰＳｃを増幅させ、これを超音波処理にかけて、凝集しているＰｒＰＳｃを微細化し、再び過剰のＰｒＰＣと培養するという、一連の混合・培養−超音波処理のサイクルを繰り返すことによりＰｒＰＳｃの量を増幅させる方法である。【００１０】
このＰＭＣＡ法は、ハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの増幅には極めて有効なものであり、５サイクルでＰｒＰＳｃの増幅率は平均５８であり、１０サイクルでは、ＰｒＰＳｃサンプルを１万倍以上に希釈しても検出でき、感染ハムスターの血液（非特許文献３）や尿（非特許文献４）といった体液中の極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能であり、潜伏期にある動物の血液細胞からもＰｒＰＳｃを検出することができ（非特許文献５および４）、プリオン病の早期診断法、或いはプリオン不活性化の評価法としての有用性が示されている。【００１１】
しかしながら、提案されたＰＭＣＡ法は、ハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの増幅には極めて有効なものであるが、スクレイピー感染羊の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の増幅に適用すると、十分な増幅が得られないといった問題があり、羊スクレイピーの生前診断法若しくは早期診断法としてはその応用は十分なものではない。
【特許文献１】特公表２００４−５０３７４８号公報
【非特許文献１】Nature, 383: p685-690 (1996)
【非特許文献２】Nature, 411: p810-813 (2001)
【非特許文献３】Nat. Med., 11: p982-985 (2005)
【非特許文献４】J. Gen. Virol., 88: p2890-2898 (2007)
【非特許文献５】Science, 313: p92-94 (2006)
【非特許文献６】FEBS Lett., 579: p638-642 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって本発明は、かかる現状に鑑み、羊スクレイピー由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の効率的な増幅方法を提供することを一義的な課題とし、究極的には、スクレイピーに感染した羊の早期発見によるプリオン病の伝播を根絶すること、また、プリオン不活性化方法の開発及びその早期評価を可能にすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる課題を解決するために、本発明者はこれまで行われているＰＭＣＡ法を改良することにより、羊スクレイピー由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）を効率に増幅させることが可能となり、本発明を完成させるに至った。【００１４】
すなわち、これまで提案されているハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの増幅を可能にするＰＭＣＡ法においては、増幅するＰｒＰＳｃと同種の正常動物（ハムスター）のＰｒＰＣを混合して、ＰｒＰＳｃを増幅させている。
これは一般的に、異種動物間で増幅を行うと、同種動物間に比較して増幅効率が低いか、或いは全く増幅できないからである（非特許文献６）。
本発明者はこの点を改良するべく検討を加え、羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃの増幅を行うに当たって、異種動物の正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとして使用した結果、驚くべきことに、ＰｒＰＳｃの増幅効率が大幅に改善され、従来のＰＭＣＡ法では検出できなかった極微量の羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃをも検出することが可能となることを確認し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
而して本発明は、正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによる羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃを増幅させる蛋白質ミスホールディング循環増幅（ＰＭＣＡ：protein misfolding cyclic amplification）法において、ＰｒＰＣとして、異種動物のＰｒＰＣを使用することを特徴とする羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。【００１６】
具体的には、本発明は、ソースとして用いる異種動物のＰｒＰＣが、齧歯類のＰｒＰＣである上記の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。【００１７】
より具体的には、本発明は、異種動物である齧歯類として、マウス又はラットを用いる上記の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。【００１８】
更に具体的には、本発明は、ソースとして用いるＰｒＰＣが、ＰｒＰＣを含む脳乳剤であり、シードとして用いる羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃが、羊スクレイピー感染動物由来のＰｒＰＳｃを含む体組織である上記の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明方法により、羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃについて、極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能となり、本発明方法による羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃの検出感度は、ＥＬＩＳＡ法などの既存の検出方法と比較して著しく効率的なものであり、増幅反応を適宜繰り返すことにより、バイオアッセイ法を上回る感度が得られる利点を有している。
さらに、従来のバイオアッセイ法によるＰｒＰＳｃの検出には膨大な時間と経費がかかっていたが、これを回避することが可能となり、その実用性、迅速性の面においても優れたものである。【００２０】
したがって、羊スクレイピーの生前診断並びに早期診断を可能にし、その上、羊スクレイピー異常プリオン蛋白質の不活性化の迅速な評価が可能となることから、異常プリオン蛋白質の不活性化方法を確立する一助となる。また、肉骨粉などの飼肥料原材料の安全性評価法、土壌ＰｒＰＳｃ等の環境モニタリング等に応用できる利点を有している。
特に、羊スクレイピーの発生は、日本のみならず、オーストラリアとニュージーランドを除く多くの羊飼育国で確認されており、また、未発生国においても今後の発生のリスクは考慮されるべきであるが、本発明方法は生体（動物）輸入に対する防疫対策、更には輸入羊肉に対する羊スクレイピーの予防対策としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の試験例１に従う、各異種動物ＰｒＰＣソースを添加した結果を示した図である。
【図２】本発明の試験例１に従う、各異種動物ＰｒＰＣソースを添加した結果を示した図である。
【図３】本発明の試験例２に従う、シードとしてのＰｒＰＳｃの添加濃度を検討した結果を示した図である。
【図４】本発明の試験例２に従う、シードとしてのＰｒＰＳｃの添加濃度を検討した結果を示した図である。
【図５】本発明の試験例３に従う、シードとしてのＰｒＰＳｃの添加濃度を検討した結果を示した図である。
【図６】本発明の試験例４に従う、遺伝子型の異なるスクレイピー感染羊由来のＰｒＰＳｃについて、その増幅を検討した結果を示した図である。
【図７】本発明の試験例４に従う、遺伝子型の異なるスクレイピー感染羊由来のＰｒＰＳｃについて、その増幅を検討した結果を示した図である。
【図８】本発明の試験例５に従う、スクレイピー感染羊における血中ＰｒＰＳｃの検出の結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、上記したように、その基本的な態様は、正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を攪拌混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによる羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃを増幅させるＰＭＣＡ法において、ＰｒＰＣとして、異種動物のＰｒＰＣを使用することを特徴とする羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの増幅効率的増幅方法である。【００２３】
ここで使用するソースとしての正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）は、スクレイピー感染羊のＰｒＰＳｃの増幅を図ることから、羊以外の異種動物のＰｒＰＣであり、そのような異種動物のＰｒＰＣとして種々のものを挙げることができるが、具体的には、マウス、ラットなど齧歯類から選択されるＰｒＰＣを挙げることができる。
そのなかでも、特にマウスのＰｒＰＣをソースとして用いることにより、ＰｒＰＳｃの増幅効率を高めることができる。
なお、異種動物であっても、山羊、牛、ブタ、ハムスター、ニワトリ、リスザル、カニクイザルのＰｒＰＣをソースとして用いても、ＰｒＰＳｃの増幅は認められなかった（後記する試験例を参照）。【００２４】
ソースとして用いる正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）としては、これらの異種動物の体組織を用いることができ、好ましくは脳乳剤が使用される。
この脳乳剤は、これら異種動物の脳を乳鉢等によりすりつぶしたもの（ホモジネートしたもの）であるが、より具体的には、正常異種動物の脳を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）−４ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（プロテアーゼインヒビターを含む）でホモジナイズし、１０％（ｗ／ｖ）溶液としたものを用いるのがよい。【００２５】
一方、シードとして用いる羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃとしては、スクレイピー感染羊の体組織が好ましく使用される。そのような体組織としては、スクレイピー感染羊の脳組織、血液組織、尿等、あらゆる体組織を使用することができる。
すなわち、本発明が提供する増幅方法よれば、極微量のＰｒＰＳｃであっても効率的にＰｒＰＳｃを増幅することが可能となる。したがって、この新たなＰＭＣＡ法を活用することにより、極微量の羊スクレイピー由来の異常プリオン蛋白質が存在する試料の検出が可能となり、スクレイピー感染羊検出感度が高まるものであることから、シードとして用いる羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃとしては特に限定されず、スクレイピー感染羊のあらゆる体組織を使用することが可能である。【００２６】
ところで従来のハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃを増幅させるＰＭＣＡ法にあっては、増幅を行う場合にあたって、通常、界面活性剤を添加し異常プリオン蛋白質を可溶化した後にＰｒＰＣとＰｒＰＳｃを混合し、ソースとして用いたＰｒＰＣをＰｒＰＳｃに構造変換させ、増幅を図っている。
本発明のＰＭＣＡ法においても界面活性剤の存在下に行われ、そのような界面活性剤としては、非イオン性の界面活性剤であり、好ましくは、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Triton X-100）、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（NP-40）等が使用されるが、これに限定されるものではない。【００２７】
本発明方法の一般的な操作方法を、以下に説明する。
すなわち、本発明方法にあっては、上記したように、異種動物の正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃをシードとして用い、両者を攪拌混合・培養するが、その培養（インキュベーション）条件は一概に限定されるものではなく、適宜最適な培養条件を選択することができる。具体的には、例えば、３７℃で攪拌しながら１時間程度インキュベートする方法で行うことができる。【００２８】
この攪拌混合・培養により、ソースとして加えられた異種動物のＰｒＣの一部がＰｒＰＳｃに構造変換されるが、その構造変換されたＰｒＰＳｃの凝集体を超音波処理により分散させ、再度過剰に存在するＰｒＣと攪混合拌・培養させるサイクルを繰り返す。
この超音波処理は、通常のＰＭＣＡ法で用いられている超音波処理をそのまま適用することができ特に限定されず、例えば、Ｂｒａｎｓｏｎ社のＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０Ｄ、或いはエレコン社０７０−ＧＯＴを用いて行うことができる。
なお、超音波処理条件としては、用いる装置により一概に限定できないが、例えば、出力を１００％に設定し、０．２秒発振−０．１秒停止、或いは３秒発振−１秒休止のサイクルを５回程度行うのがよい。【００２９】
この攪拌混合・培養−超音波処理のサイクルを繰り返すことにより、ソースとして添加したＰｒＰＣがＰｒＰＳｃに順次構造変換され、その結果、ＰｒＰＳｃの増幅が行われることとなる。
本発明方法にあっては、通常上記のサイクルを用い、２０〜４０サイクルを１回の増幅反応として実施するのがよい。
なお、このサイクル回数は、使用するソースとして用いるＰｒＰＣ、並びにシードとして用いるＰｒＰＳｃの濃度によって異なり、限定されるものではない。【００３０】
ＰｒＰＳｃの増幅（攪拌培養−超音波処理のサイクルの繰り返し）が完了した後、得られた反応物を、蛋白分解酵素を用いて分解処理する、分解処理工程に付す。
一般に、異常プリオン蛋白質はプロテアーゼに抵抗性を示すので、特異的にこの蛋白質を取り出すためには、正常プリオン蛋白質を分解することが要求される。したがって、この分解処理工程は、プリオン蛋白質以外の蛋白質を分解すると共に、正常プリオン蛋白質を分解する工程である。
蛋白質分解酵素としては、プロティナーゼＫ（Proteinase K）を挙げることができ、これを用いて分解することが望ましい。【００３１】
なお、増幅されたＰｒＰＳｃの検出は、ウエスタンブロッティング法で検出することができる。具体的には、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離・泳動後メンブランに転写し、ブロッキング後、ＨＲＰ標識抗Ｔ２抗体で反応させる。次いで、メンブランを洗浄後、Immobilon Westernで発光反応を検出し、増幅されたＰｒＰＳｃを検出・確認することができる。【００３２】
本発明者の検討によれば、１回の増幅（攪拌培養−超音波処理の４０サイクル）反応を５回繰り返すことで、スクレイピー感染羊脳乳剤を１０−１０に希釈しても検出できることが判明した。
したがって、本発明方法は、実用性、迅速性において極めて優れたものであり、羊スクレイピーの診断法、安全性評価法、防疫法として使用される可能性が高く、その応用性は多大なものである。【００３３】
ところで、羊ＰｒＰ遺伝子には、種々のアミノ酸置換をもたらす変異が存在することが知られている。したがって、最近では羊スクレイピー抵抗性の固体を高める方向で、育成羊の選定と交配が行われつつある。
本発明者の検討によれば、遺伝子型の異なる羊に由来するＰｒＰＳｃであっても、本発明方法により、効率的にＰｒＰＳｃの増幅が行えることが判明した（後記する試験例を参照）。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明を、実施例に代わる試験例により、より詳細に説明していくが、本発明はこれらの試験例により何ら限定されるものではない。【００３５】
試験例１：羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの増幅（ソースの検討）
１．方法
ＰＭＣＡ（protein misfolding cyclic amplification）法を用いて、羊スクレイピー由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）を増幅した。
正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）ソースは、同種動物として正常羊、異種動物として山羊、マウス、リスザル、牛、ブタ、ニワトリ、ハムスター、ラット及びカニクイザルの１０％脳乳剤を用いた。
一方、ＰｒＰＳｃシードは、英国由来のスクレイピー感染羊１０％脳乳剤を１０−１に希釈して用いた。
ＰＭＣＡ増幅後、サンプルをプロティナーゼＫで消化し、ウエスタンブロッティング法でプロテアーゼ抵抗性ＰｒＰ（ＰｒＰＲＥＳ）のシグナルを検出した。【００３６】
２．結果
その結果を図１及び図２に示した。図１にはＰｒＰＣのソースとして羊、山羊、マウス、リスザル及び牛の結果を、また図２にはブタ、ニワトリ、ハムスター、ラット及びカニクイザルの結果を示した。
これらの結果から判明するように、ソースとして用いるＰｒＰＣにあっては、同種動物（羊）のＰｒＰＣでは殆ど増幅が認められないのに対して、異種動物のマウスのＰｒＰＣを使用した場合には、効果的なＰｒＰＳｃの増幅が認められた。
なお、異種動物のラットのＰｒＰＣを使用した場合には、シード無添加コントロールに比べて強いシグナルが認められ、マウスに比べると効率は低いものの、増幅が認められた。一方、山羊、牛、ニワトリ、ハムスターのＰｒＰＣをソースとして用いた場合、全くシグナルが認められず、リスザル、ブタ、カニクイザルのＰｒＰＣを使用した場合、シード無添加コントロールのシグナル強度が、感染羊脳乳剤を添加して増幅したサンプルのシグナル強度よりも強く、これら異種動物のＰｒＰＣを使用した場合、特異的なＰｒＰＳｃの増幅は認められなかった。【００３７】
試験例２：羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの増幅（感受性の検討の１）
試験例１の結果から、ソースとして異種動物の中でもマウスＰｒＰＣを使用した場合には、ＰｒＰＳｃの増幅が極めて効果的なものであることが判明した。そこで、シードとして用いる羊スクレイピーのＰｒＰＳｃの濃度と増幅反応の回数が、どの様にＰｒＰＳｃの増幅に影響を与えるものであるかを検討した。【００３８】
［その１］
１．方法
試験例１と同様に、ＰＭＣＡ法を用いて、スクレイピー感染羊由来のＰｒＰＳｃを増幅した。
ＰｒＰＳｃとして、スクレイピー感染羊の脳乳剤を１０−１〜１０−３に希釈して使用した。
ソースとしてのＰｒＰＣは、異種動物のＩＣＲ系マウスＰｒＰＣを使用し、比較対照として同種動物の羊ＰｒＰＣを用いた。
なお、無添加コントロールとして、シード無添加の対照をおいた。【００３９】
２．結果
図３にその結果を示した。図中に示した結果からも判明するように、スクレイピー感染羊の脳乳剤は、１０−３に希釈した場合であっても、４０サイクル／１回の増幅反応を２回行うことで効果的にＰｒＰＳｃの増幅が認められた。
これに対して、同種動物である羊のＰｒＰＣをソースとした場合には、２回の増幅反応でも殆ど増幅が認められないものであった。【００４０】
［その２］
１．方法
上記の１と同様に、ＰＭＣＡ法を用いて、スクレイピー感染羊由来のＰｒＰＳｃを増幅した。
ＰｒＰＳｃとして、スクレイピー感染羊の１０％脳乳剤を１０−１〜１０−８に希釈して使用した。
ソースとしてのＰｒＰＣは、異種動物のＩＣＲ系マウスＰｒＰＣを使用し、無添加コントロールとして、シード無添加の対照をおいた。【００４１】
２．結果
図４にその結果を示した。図中に示した結果からも判明するように、スクレイピー感染羊の脳乳剤は、１０−８に希釈した場合であっても、増幅反応を４回繰り返せば、ＰｒＰＳｃの増幅が良好に行えるものであることが判明し、本発明の特殊性がよく理解される。【００４２】
試験例３：羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの増幅（感受性の検討の２）
上記した試験例２で、マウスＰｒＰＣをソースとして使用し、スクレイピー感染羊の脳乳剤をＰｒＰＳｃとして使用した場合には、脳乳剤をかなり希釈した場合であっても、増幅反応を繰り返すことによりＰｒＰＳｃの効率的は増幅が認められた。
そこで、更に希釈した場合におけるＰｒＰＳｃの増幅を検討した。【００４３】
１．方法
試験例２のその２と同様にして、スクレイピー感染羊の１０％脳乳剤を１０−２〜１０−１４までに希釈して使用した。
ソースとしてのＰｒＰＣは、異種動物のＩＣＲ系マウスＰｒＰＣを使用し、無添加コントロールとして、ソース無添加の対照をおいた。増幅はduplicateで行った。【００４４】
図５にその結果を示した。図中に示した結果からも判明するように、本発明方法により、極微量のＰｒＰＳｃであっても、増幅反応を５回繰り返すことにより、１０−１０に希釈した感染脳乳剤からもＰｒＰＳｃの増幅が認められることが理解される。６〜７回の増幅によるハムスターＰｒＰＳｃの検出限界は１０−１２程度である。ウェスタンブロット解析により、感染羊脳乳剤に存在するＰｒＰＳｃ量は、実験感染ハムスター脳乳剤に含まれるＰｒＰＳｃ量の１／１００〜１／１０００程度と推定され、その点を考慮するとハムスターＰｒＰＳｃの検出限界と同程度の検出感度が本法により得られたことになる。【００４５】
試験例４：羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃの増幅（遺伝子型の異なるＰｒＰＳｃの増幅）
羊ＰｒＰ遺伝子には、種々のアミノ酸置換をもたらす変異が存在することが知られている。特に１３６番目（Ａ，Ｖ）、１５４番目（Ｒ，Ｈ）および１７１番目（Ｒ，Ｑ，Ｈ）の３箇所のアミノ酸の組み合わせはスクレイピーに対する感受性もしくは抵抗性と関連している。そこで、遺伝子型の異なるスクレイピー感染羊由来のＰｒＰＳｃについて、その増幅を検討した。【００４６】
１．方法
使用した遺伝型の異なるスクレイピー感染羊として、英国由来のＡＲＱホモ、Ｖ/ＡＲＱヘテロ、ＡＲ/ＨＱヘテロ、ＡＨＱホモ羊の４種類を用いた。
それぞれの脳乳剤をマウス正常脳乳剤で１／１、１／５、１／２５及び１／１２５に希釈し、増幅を行った。【００４７】
２．結果
図６及び図７にその結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、検討した４種の遺伝子型異なる羊に由来するＰｒＰＳｃであっても、本発明方法により増幅が可能であることが判明した。Ｖ/ＡＲＱヘテロ以外では１回の増幅でシグナルが認められたが、Ｖ/ＡＲＱ型ではシグナルの確認に３回の増幅を要した。各遺伝子型の脳乳剤中のＰｒＰＳｃ量は不明であり、Ｖ/ＡＲＱ型の脳乳剤中のＰｒＰＳｃ量が他に比べて少なかったか、Ｖ/ＡＲＱ型のＰｒＰＳｃの増幅効率が他に比べて低い可能性が考えられた。【００４８】
試験例５：スクレイピー感染羊における血中ＰｒＰＳｃの検出
本発明により、極微量の羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃでも検出でき、感染羊におけるＰｒＰＳｃの体内動態を、従来よりも詳細に解析することが可能になった。
そこで、スクレイピー実験感染羊を用いて、血液からのＰｒＰＳｃ増幅について解析した。【００４９】
１．方法
上記の試験例１と同様にして、ＰＭＣＡ法を用いて、スクレイピー実験感染羊由来のＰｒＰＳｃを増幅した。発症期にある感染羊２頭から採血を行い、遠心分離して白血球分画を得た。２％サルコシルを含むリン酸緩衝液中で、白血球分画を可溶化し、ＰｒＰＳｃシードとして用いた。ソースとしてのＰｒＰＣは、異種動物のＩＲＣ系マウスのＰｒＰＣを使用し、無添加コントロールとして、シード無添加の対照をおいた。【００５０】
２．結果
図８にその結果を示した。
感染羊＃２の白血球分画からは、４回目の増幅でＰｒＰＲＥＳシグナルが明瞭に確認された。感染羊＃１の白血球分画からは５回目の増幅でＰｒＰＲＥＳシグナルが明瞭になった。
なお、図中、Ｎはシードを含まない無添加コントロールを示し、ｎｔは、試験をしなかったことを示す。
本試験例の結果から、本発明による羊スクレイピー由来ＰｒＰＳｃ増幅法は、血液サンプルにおいても有効であることが判明し、スクレイピーの生前診断に応用可能であることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上説明してきたように、本発明が提供する方法により、羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃについて、効果的にその増幅を行うことができ、極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能となった。
本発明方法による羊スクレイピー由来のＰｒＰＳｃの検出感度は、ＥＬＩＳＡ法などの既存の検出方法と比較して著しく効率的なものであり、増幅反応の繰り返しによりバイオアッセイ法を上回る感度が得られるであろう利点を有しており、その実用性、迅速性の面においても優れたものである。【００５２】
したがって、羊スクレイピーの生前診断、早期診断を可能にし、その上、羊スクレイピー異常プリオン蛋白質の不活性化の迅速な評価が可能となることから、異常プリオン蛋白質の不活性化方法を確立する一助となる。また、肉骨粉などの飼肥料原材料の安全性評価法、土壌ＰｒＰＳｃ等の環境モニタリング等、更には、生体（動物）輸入に対する羊スクレイピー防疫対策、更には輸入羊肉に対する予防対策に応用でき、その有用性は極めて多大なものである。
【図１】
2009145194.tif 000003
【図２】
2009145194.tif 000004
【図３】
2009145194.tif 000005
【図４】
2009145194.tif 000006
【図５】
2009145194.tif 000007
【図６】
2009145194.tif 000008
【図７】
2009145194.tif 000009
【図８】
2009145194.tif 000010
【国際調査報告】
2009145194.tif 000011
2009145194.tif 000012
2009145194.tif 000013
2009145194.tif 000014