(57)【要約】成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法として、基本的に成体神経幹細胞で用いられる樹立方法を適用した成体膵臓幹細胞の樹立方法及び神経細胞への分化誘導剤を用いた各膵臓細胞への分化方法を確立した。また、得られた成体膵臓幹細胞と共に神経細胞分化誘導剤を用いる、各種膵臓細胞再生治療用キット、特にインシュリン産生β細胞前駆細胞と共に、神経細胞分化誘導剤を用いる神経再生治療用キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体由来の膵臓組織からの膵臓幹細胞の樹立方法であって、下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む成体膵臓幹細胞の樹立方法；
（ａ）膵臓幹細胞を含む膵臓組織を、コラゲナーゼを含む神経幹細胞用培養培地に懸濁する工程、
（ｂ）膵臓幹細胞を、神経幹細胞培養用ディッシュに播種し、神経幹細胞用培養培地を加えて培養する工程。
【請求項２】
前記培養工程において、まずFCS及びFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で膵臓幹細胞を増殖させ、次いでFCSを除いたFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で培養することを特徴とする、請求項１に記載の成体膵臓幹細胞の樹立方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の樹立方法により得られた成体膵臓幹細胞であって、sox-2遺伝子を発現している成体膵臓幹細胞。
【請求項４】
成体膵臓幹細胞を、FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する方法。
【請求項５】
成体膵臓幹細胞を神経細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をβ細胞及びδ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
【請求項６】
成体膵臓幹細胞を、抑制性のインターニューロンを作製する神経細胞分化条件下で培養することでδ細胞の含有度を高めることを特徴とする、請求項５に記載の分化誘導方法。
【請求項７】
成体膵臓幹細胞を、アストロサイト細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をα細胞及びγ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
【請求項８】
成体膵臓幹細胞を、オリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化条件下で培養することでγ細胞含有度を高めることを特徴とする、請求項７に記載の分化誘導方法。
【請求項９】
請求項３に記載の成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
【請求項１０】
さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、請求項９に記載の膵臓細胞再生移植用キット。
【請求項１１】
生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
【請求項１２】
成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、膵臓患部に導入することを特徴とする、膵臓再生移植治療方法。
【請求項１３】
RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を有効成分として含む、糖尿病治療用組成物。
【請求項１４】
さらに、生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞を含む、請求項１３に記載の糖尿病治療用組成物。
【請求項１５】
前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の糖尿病治療用組成物。
【請求項１６】
成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、神経細胞再生移植用キット。
【請求項１７】
さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の神経細胞再生移植用キット。
【請求項１８】
前記神経細胞分化誘導剤が、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の神経細胞再生移植用キット。
【請求項１９】
成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、神経組織患部に導入することを特徴とする、神経組織再生治療方法。
【請求項２０】
生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と共に、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、神経性疾患治療用組成物。
【請求項２１】
前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の神経性疾患治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成体膵臓幹細胞の樹立・培養・分化方法及び成体膵臓幹細胞を用いた膵臓組織再生用及び神経組織再生用の移植治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄幹細胞や間葉系幹細胞の移植は、既に臨床応用が始められているが、その標準化、単一化において非常に厳密な制御が必要となる。我々「成体」の各臓器には、臓器に必要な細胞群を産み出す源となる幹細胞が存在している。ただ、胎生幹細胞やES細胞の研究に比べ、「成体」の幹細胞の研究自体の歴史はまだ浅く、各臓器の「成体幹細胞」の確立もしっかり統一されていない。また、分化を左右する遺伝子の調節機構の違いについて、胎生幹細胞と詳細に比較解析されている例も少ない。今後、成体組織幹細胞の再生医療への利用開発を促すためには、その分子機構の基礎研究がさらに発展する必要がある。
安全な再生医療を考えた場合、増殖性の極端に高い胎生期から樹立された細胞（胎生幹細胞）やES細胞を用いるより、「成体」から樹立された「成体組織幹細胞」は、標的となる各臓器部位で、制御分子機構や細胞応答性がより生体環境に馴染んだ幹細胞であるため、ガン化などのリスクファクターが少ない利点があり、とりわけ「成体」由来の「自己幹細胞」を用いた方が、患者に負担も低く免疫拒絶性も無い、自然で効果的な医療が行えると考えられる。
現在までに種々の組織由来の組織幹細胞が報告され、血液幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、心筋幹細胞、骨格筋幹細胞などと共に、脳の神経幹細胞も、既に国際的、学術的にも確立された成体幹細胞である（非特許文献１など）。
ヒトからマウス等、下等動物に至るまで、「成体」神経幹細胞の存在が国際学術誌に多数報告されている。成体脳内での神経新生は従来不可能だと考えられていたが、成体の脳内にも日々分裂を繰り返し、神経新生を繰り返している神経幹細胞が存在する領域が保持されていることが分かった。最近の研究から、胎生神経幹細胞と成体神経幹細胞からの分化制御機構で、細胞外シグナル分泌には幾らか相同性があるが、そのシグナルに応答して細胞内で発現し、実際に分化開始を誘導する上で、中心となる遺伝子の発現制御機構が違うという重要な事実が、徐々に明らかになってきた。
成体の神経幹細胞の存在が1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。神経幹細胞からは、成熟神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞の３種が分化して形成される。
この分化能力を備えた神経幹細胞は胎生期にも存在する。この胎生神経幹細胞から神経新生を起こす代表転写遺伝子例はNeurogeninという遺伝子である。一方、成体の「神経新生」を起こす代表転写遺伝子はNeuroD1/beta2であり、この遺伝子が無いと、成体の脳内で神経新生を起こす領域のみが限定して欠損する。
さらに、成熟神経細胞まで分化全過程に必要な、神経特異的遺伝子群の発現を「活性化」調節する転写因子が、成体脳ではNRSF/REST転写遺伝子なのだが、胎生期では神経細胞以外に発現されることにより、「活性化」ではなく「抑制」している。発現される転写因子の種類や時期、遺伝子の発現調節機構自体も全く違うため、「成体期」と「胎生期」の幹細胞・分化制御は明確に区別できる。
このように、現在では、成体神経幹細胞につては、その樹立方法、未分化状態に維持した培養方法、及び各種の成熟した神経細胞、グリア細胞への分化方法はほぼ確立しているといえる。【０００３】
しかしながら、膵臓幹細胞については、糖尿病患者など、インシュリン産生膵臓細胞に分化し得る膵臓幹細胞への臨床的期待が大きいにもかかわらず、確立した樹立細胞としては胎児性（ES)幹細胞のみである。唾液腺由来の成体幹細胞の報告はある（非特許文献２）ものの、当該報告中では、多能性を有していることの確認実験はなく、樹立細胞としての要件も不十分である。
また、従来、膵臓幹細胞を、インシュリン産生性のβ細胞をはじめ、α細胞、γ細胞、δ細胞へと分化させるためには、それぞれES細胞から誘導分化させる手法（非特許文献３）などの手法が用いられていたが、分化能が限られていたり、高度なテクニックを要したり、増殖能の違いから生じるガン化などの欠点があった。
そこで、膵臓組織における再生医療においては、患者への負担も低く免疫拒絶性も無い「自己幹細胞」も視野に入れた、膵臓への移植が可能であり、かつ各種膵臓細胞へ分化可能な成体幹細胞の安定的な提供が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gage,F. H. et al., Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cellstransplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 11879-11883(1995).
【非特許文献２】Suzuki, A., Nakauchi, H. & Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes 53, 2143-2152 (2004).
【非特許文献３】Kume, S. Stem-cell-based approaches for regenerative medicine. Dev Growth Differ. 2005 Aug;47(6):393-402.
【非特許文献４】Hsieh, J. et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. J. Cell Biol. 164, 111-122 (2004).
【非特許文献５】Kuwabara, T., Hsieh, J., Nakashima, K., Taira, K. & Gage, F. H. A small modulatory dsRNA specifies the fate of adult neural stem cells. Cell 116, 779-793 (2004).
【非特許文献６】Nakashima, K et al., Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science 284, 479-482.
【非特許文献７】D'Amour K.A. & Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 11866-11872 (2003).
【非特許文献８】Habener, J. F., Kemp, D. M. & Thomas M. K. Minireview: transcriptional regulation in pancreatic development. Endocrinology 146, 1025-1034 (2005).
【非特許文献９】Clevers H., Wnt/β-Catenin Signaling in Development and Disease. Cell 127,469-480 (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、成体膵臓幹細胞を確実に効率よく樹立できる方法及び当該手法で樹立した成体膵臓幹細胞を提供することであり、また、得られた成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する培養方法、及び各種成熟膵臓細胞へ分化させる方法を提供することであり、当該成体膵臓幹細胞を用いた膵臓組織の再生治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、脳内での学習機能に必要なインシュリン産生能を有する神経細胞と、膵臓内で血糖値低下に必要なインシュリン産生能を有する膵臓細胞との間の性質の共通性に着目し、胎生期の発生段階では前者は外胚葉系、後者は内胚葉系という遠い隔たりのある細胞ではあるが、成体幹細胞としての制御機構などにおいて類似している可能性があると考え、鋭意研究の結果、神経幹細胞で用いられる樹立方法を基本とした膵臓幹細胞の樹立方法を成功させ、はじめて確実な成体組織幹細胞としての要件を備え、糖尿病など各種膵臓細胞の移植治療用に用いることのできる膵臓幹細胞についての本発明を完成させた。
また、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させる際にも、神経幹細胞から各種神経系細胞へ分化させるための方法が転化応用できること、つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を使用すればよいことを見出し、膵臓幹細胞の各種膵臓細胞への効率的な分化方法も確立することができた。
さらに、本発明の成体膵臓幹細胞と、同時に樹立・培養した成体神経幹細胞との分子基盤の詳細な比較解析から、両者の分化制御因子群に非常に高い類似性・相補性があることを明らかにした。さらに、神経幹細胞と膵臓幹細胞とが、樹立、培養工程のみならず、分化工程においてもきわめて類似した挙動を示すという知見を踏まえ、膵臓幹細胞を神経組織に移植した場合も、神経細胞分化誘導剤又はグリア細胞分化誘導剤を併用することで、神経系細胞又はグリア細胞に分化し、神経幹細胞を膵臓組織に移植した場合は、反対にβ細胞等の各膵臓細胞に分化するという仮説を立て、トランスジェニックマウスを用いた実験系で当仮説を立証した。
本発明で得られた成体膵臓幹細胞を用いた膵臓の再生移植治療用キットと共に、当該成体膵臓幹細胞を用いた脳、脊髄など中枢神経系又は末梢神経系細胞又はグリア系細胞の再生移植治療用キットについての発明を完成した。なお、同時に成体神経幹細胞を用いた糖尿病用の再生移植医療についての発明も完成し、本願と同日付で別出願をしている（特願2008-168187号）。【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕  成体由来の膵臓組織からの膵臓幹細胞の樹立方法であって、下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む成体膵臓幹細胞の樹立方法；
（ａ）膵臓幹細胞を含む膵臓組織を、コラゲナーゼを含む神経幹細胞用培養培地に懸濁する工程、
（ｂ）膵臓幹細胞を、神経幹細胞培養用ディッシュに播種し、神経幹細胞用培養培地を加えて培養する工程。
〔２〕  前記培養工程において、まずFCS及びFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で膵臓幹細胞を増殖させ、次いでFCSを除いたFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で培養することを特徴とする、前記〔１〕に記載の成体膵臓幹細胞の樹立方法。
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載の樹立方法により得られた成体膵臓幹細胞であって、sox-2遺伝子を発現している成体膵臓幹細胞。
〔４〕  成体膵臓幹細胞を、FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する方法。
〔５〕  成体膵臓幹細胞を神経細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をβ細胞及びδ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
〔６〕  成体膵臓幹細胞を、抑制性のインターニューロンを作製する神経細胞分化条件下で培養することでδ細胞の含有度を高めることを特徴とする、前記〔５〕に記載の分化誘導方法。
〔７〕  成体膵臓幹細胞を、アストロサイト細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をα細胞及びγ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
〔８〕  成体膵臓幹細胞を、オリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化条件下で培養することでγ細胞含有度を高めることを特徴とする、前記〔７〕に記載の分化誘導方法。
〔９〕  前記〔３〕に記載の成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
〔１０〕  さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔９〕に記載の膵臓細胞再生移植用キット。
〔１１〕  生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓β細胞再生移植用キット。
〔１２〕  成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、膵臓患部に導入することを特徴とする、膵臓再生移植治療方法。
〔１３〕  RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を有効成分として含む、糖尿病治療用組成物。
〔１４〕  さらに、生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞を含む、前記〔１３〕に記載の糖尿病治療用組成物。
〔１５〕  前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔１４〕に記載の糖尿病治療用組成物。
〔１６〕  成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、神経細胞再生移植用キット。
〔１７〕  さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔１６〕に記載の神経細胞再生移植用キット。
〔１８〕  前記神経細胞分化誘導剤が、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種を含むことを特徴とする、前記〔１７〕に記載の神経細胞再生移植用キット。
〔１９〕  成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、神経組織患部に導入することを特徴とする、神経組織再生治療方法。
〔２０〕  生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と共に、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、神経性疾患治療用組成物。
〔２１〕  前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔２０〕に記載の神経性疾患治療用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、多能性を有する成体膵臓幹細胞を確実に効率よく樹立できる手法を確立することができた。また、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞は、糖尿病など各種膵臓細胞の移植治療に用いることができるばかりか、中枢神経系の神経再生のための移植治療用細胞としても用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Sox2-EGFPを導入したトランスジェニックマウスの成体の膵臓（膵島）と脳（海馬）。上段:両臓器とも、インシュリンを産生している細胞（点線で囲った箇所）に接して、未分化のSox2陽性細胞（GFP発現陽性、矢印）、すなわち成体幹細胞が存在している。下段:分化したβ細胞と神経細胞は共に、インシュリンを産生し、かつ神経細胞に分化したことを示すNRSF/REST転写因子陽性である共通点を持つ（左では、核内でNRSF/REST転写因子が発現し、その周りの細胞質内でインシュリンが発現している様子がわかる。矢印で示した細胞）。
【図２】樹立した膵臓幹細胞の写真。１段目左は、樹立時の培地として、10％FCSを、１段目右及び２段目は、FGF／EGFを、３段目はFCSを用いた場合を示す。最下段は、一定期間培養後、継代した細胞（P1）をFGF2のみで培養した場合、未分化性と増殖能を保持している。
【図３Ａ】膵臓幹細胞の分化。未分化状態（FGF2存在下）から、神経分化条件（上矢印）とグリア・アストロサイト分化条件（下矢印）下で、膵臓内分泌系の各種マーカーが出現した。分化マーカーとして、β細胞（インシュリン、C-peptide）、α細胞（グルカゴン）、δ細胞（ソマトスタチン）、γ細胞（Pancreatic polypeptide）を用いたところ、神経細胞分化条件では、インシュリン、C-peptideが及びソマトスタチンの発現が確認され、グリア・アストロサイト分化条件下ではPP及びグルカゴンの発現を観察した。
【図３Ｂ】膵臓幹細胞から抽出したRNAを用いたRT-PCR解析。P列は未分化状態、N列は神経分化誘導条件、A列はアストロサイト分化誘導条件を示す。成体の、膵臓中の幹細胞と海馬中の幹細胞での分化の状態を観察したところ、後者でも膵臓内分泌系の全ての分化経路マーカー遺伝子が検出され、両臓器内での挙動が一致していた。なお、ここでβtubulinn  IIIは微小管（神経軸索）の主要タンパク質、GFAPはグリア細胞繊維性酸性タンパク質、Wnt3はアストロサイトが産生する神経細胞分化因子の一種である。
【図３Ｃ】膵臓のδ細胞（ソマトスタチン）、γ細胞（Pancreatic polypeptide）の分布と脳内での分布。同じ抗体を用いた免疫組織染色。上段では、γ細胞での分化マーカー（PP）の発現と、オリゴデンドロサイトでの分化マーカー（GSTπ）の発現細胞が一致しており（矢印で示した細胞）、下段では、δ細胞分化マーカー（ソマトスタチン）の発現と神経細胞（抑制系）分化マーカー（ソマトスタチン、海馬Hilus領域内で見られるインターニューロンに発現される典型的抑制ニューロンマーカー）の発現が一致している。
【図３Ｄ】各種神経分化促進薬剤の投与で、樹立した膵臓幹細胞内でインシュリンプロモーター活性が上昇した。レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子をインシュリンプロモーターの下流に連結したアッセイ系で解析した。N2+はコントロール。
【図３Ｅ】分化誘導後の膵臓幹細胞。未分化状態（FGF2存在下）から、神経分化条件（上矢印）とグリア・アストロサイト分化条件（下矢印）下で、膵臓内分泌系の各種マーカーが出現した。β細胞（インシュリン、C-peptide）、α細胞（グルカゴン）、δ細胞（ソマトスタチン）、γ細胞（Pancreatic polypeptide）。
【図４Ａ】Wnt3を産出するα細胞。α細胞（グルカゴンの染色）は脳内でWnt3を産生し、神経新生を促進するアストロサイト細胞（GFAP陽性）と同じ機能をもつ。α細胞はWnt3を産生することによって、神経前駆細胞に対応する前駆細胞を一旦分化させ、次いでβ細胞新生を促進しており、神経細胞のアストロサイトと同じような働きをすることがわかる（以下のＢ〜Ｇより）。
【図４Ｂ】新生したβ細胞はNeuroD1(ND1)陽性。脳内で新生した神経前駆細胞がNeuroD1陽性であるのと同じ特徴を持つ。
【図４Ｃ】出生当日の膵臓と脳。盛んに新生している細胞群はともに、NeuroD1陽性。
【図４Ｄ】成体膵臓内で分裂している新生細胞（BrDU陽性：分裂細胞のクロマチン染色）はNeuroD1陽性。棒グラフは、BrDUとND1とが共に陽性である細胞が70％以上であることを示している。
【図４Ｅ】膵臓幹細胞をβ細胞新生状態（神経誘導条件下; N）に誘導すると、Wntシグナリングの重要タンパク質であるβカテニンが安定化され蓄積する。P；未分化状態、A；アストロサイト誘導条件下。なお、神経幹細胞の場合、蓄積されたβカテニンは、核内に入りND1プロモーターのTCF/LEFサイトに結合してND1発現を促し、神経前駆細胞に分化させる。
【図４Ｆ】膵臓幹細胞に対して、Wnt3又はGSK3beta-inhibitorを試薬として添加した場合、Wnt/βcateninシグナリングの活性化によりでインシュリン遺伝子の発現が上昇する。対照的に、DnWnt（ドミナントネガティブWnt）又はβcateninのshRNAを添加して、Wnt/βcateninシグナリングを不活性化するとインシュリン遺伝子の発現が起きない。
【図４Ｇ】膵臓幹細胞において、Wnt3を添加するとNeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位へのβcateninの結合が起こり、結果としてクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）が誘導される（左）。Wnt3によって活性化されたNeuroD1は、インシュリン遺伝子の活性化を起こす。インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box）へNeuroD1が直接結合し、クロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3を誘導する）を導くことを示している（右）。
【図５Ａ】膵臓幹細胞の脳神経系への移植。実験概要。成体膵臓幹細胞（GFP陽性）をラット脳（海馬の顆粒細胞層）にインジェクションする。
【図５Ｂ】膵臓幹細胞の脳神経系への移植。脳内へ移植された膵臓幹細胞（緑、蛍光GFP発現）が、神経幹細胞の分化に同調して分化していく様子がインジェクション箇所からの位置変化として観察できる。上段は、インジェクション付近の海馬の顆粒細胞層で、神経前駆細胞であることを示す遺伝子マーカー、NeuroD1（赤）を発現する細胞と一致し、中段の神経細胞初期マーカーであるTUJ1（マゼンタ）の発現細胞と一致する。また下段では成熟神経細胞マーカーであるNeuN陽性（赤）細胞とも一致したことを示している。
【図６Ａ】神経幹細胞の膵臓への移植（参考例の説明）。Fisher344ラットへのマイクロインジェクションの結果。膵臓へ移植された神経幹細胞（緑、蛍光GFP発現）が、インシュリン陽性（赤、上、中段）であることを示している。また、新規のインシュリン産生を示すC-peptide抗体でも陽性（下段）。
【図６Ｂ】神経幹細胞の膵臓への移植（参考例の説明）。神経細胞を膵臓に移植する実験概要。コラーゲンシート上でも成体神経幹細胞、ニューロブラストの培養が可能であり（左及び中央の写真）、ニューロブラストの条件でインシュリン産生の活性が高いことを、ルシフェラーゼアッセイで確認した（右の棒グラフ）。
【図６Ｃ】神経幹細胞の膵臓への移植（参考例の説明）。糖尿病ラットへの神経幹細胞の移植。尾静脈から採血された血液を用いて、グルコメーター／グルコカード（簡易血糖値検査機）で測定した血糖値の変遷を記録したグラフ。◇；健康体ラット、○；糖尿病ラット（GKラット）に整理食塩水をインジェクションしたコントロール。●；糖尿病ラットにコラーゲンシートのみを移植したコントロール。□；糖尿病ラットに神経幹細胞をマイクロインジェクションしたグループ。■；糖尿病ラットにニューロブラストをマイクロインジェクションしたグループ。△；糖尿病ラットに、コラーゲンシート上の神経幹細胞を移植したグループ。▲；糖尿病ラットに、コラーゲンシート上のニューロブラストを移植したグループ。
【図７】（模式図）神経幹細胞からの分化と膵臓幹細胞からの分化制御機構の相関図。
【図８】（参考図）コラーゲンシート上の神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植し、インシュリン産生β細胞に分化したこと、及びそのことによるモデルラットの血糖値が低下したことを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．成体神経幹細胞と成体膵臓幹細胞について
成体幹細胞の中で、神経幹細胞は国際的、学術的にも確立されている。1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。
本発明者らは、内分泌器官である「成体」の膵臓にも、成体神経幹細胞と同じ未分化マーカー遺伝子（Sox2）を発現する膵臓幹細胞が存在することを明らかにさせた（図１）。Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子である。トランスジェニックマウスを用いた動物個体の脳と膵臓で、その発現を確認した（Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結した遺伝子改変マウス内で、Sox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発する）。重要なこととして、両臓器の神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることである（図１、上図、赤がインシュリン抗体陽性、緑がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞）。神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており（マゼンタ）、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン（緑）を発現していることが分かる（図１、下段）。
【００１１】
２．本発明における「成体膵臓幹細胞」について
本発明において樹立された「成体膵臓幹細胞」は、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞への分化能を有し、かつ多能性を有するものである。未分化状態では、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞いずれの性質も示さず、各細胞に対応した分化処理を施すことにより、各細胞に分化する。α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞への分化は、例えば、α細胞は「グルカゴン」、β細胞は「インシュリンのC-peptide」、δ細胞は「ソマトスタチン」、γ細胞は「Pancreatic  polypeptide（PP）」などの分化経路マーカーの発現により確認できる（非特許文献８）。また、得られた「膵臓幹細胞」が多能性を有していることは、「sox-2マーカー」により確認することができる。ここで、「sox-2マーカー」とは、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結したものであり、遺伝子改変マウス内でSox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発することで確認できる（非特許文献７）。Sox2遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトSox2遺伝子は、NM_003106（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスSox2遺伝子はNM_011443（Gene Bankアクセッションナンバー）である。Sox2遺伝子は、典型的な多能性を有する未分化細胞であるES細胞でも発現している遺伝子であり、未分化状態を示す幹細胞特異的な遺伝子であるとされ、当該遺伝子の発現は、成体組織幹細胞が樹立されたことを示す最もよい指標となる。本発明の実施例でも、成体膵臓幹細胞の樹立の確認は、Sox2遺伝子を発現していることを確認した実験事実に基づいて行った（図１）。また、Sox2遺伝子発現は、抗Sox2抗体によっても簡単に確認することができ、抗Sox2抗体はすでに市販されているものを用いることができる（例えば、Chemicon社製）。
なお、本発明において「成体膵臓幹細胞」というとき、典型的にはドナーとなるヒトの膵臓組織から得られた「成体膵臓幹細胞」であり、好ましくは再生治療を行う患者自身の「成体膵臓幹細胞」であることが好ましいが、ブタなど異種哺乳類由来の「成体膵臓幹細胞」であってもよい。また、マウス、ラットなどの実験動物由来、又はイヌ、ネコなどの愛玩動物由来の「成体膵臓幹細胞」であってもよい。
【００１２】
３．神経幹細胞の樹立法を用いた成体膵臓幹細胞の樹立法及び培養法
本発明では、成体の膵臓から採取した膵臓細胞から、多能性をもつ成体膵臓幹細胞を樹立したが、その際の樹立法・培養法は、基本的には、成体の神経幹細胞の樹立法・培養法（非特許文献１）を転化応用したものである。樹立した成体膵臓幹細胞は未分化状態を示す成体幹細胞特異的な遺伝子を発現する。未分化状態を保つ成体膵臓幹細胞は、ES細胞でも発現するSox2遺伝子を発現している（図１）。
具体的な手法は以下の通りであり、基本的には、上記成体神経幹細胞の樹立法・培養法に従って行った。膵臓細胞に適用するにあたっての改善点をあわせて記載する。
【００１３】
４．成体組織からの幹細胞含有細胞成分の採取
成体神経幹細胞樹立の際には、神経幹細胞存在領域をマイクロダイセクションしたのち、迅速にトリプシン酵素処理下で細胞を分散させ、次いで、37℃のCO2インキュベーター内で神経細胞培養用培地中に細胞を懸濁し、培地による洗浄を繰り返し、遠心により、神経幹細胞を含有する神経由来の細胞成分を採取する。ここで、神経細胞培養用培地としては、典型的には［DME/F12，high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］が用いられる。
一方、膵臓の場合は、トリプシン処理では効率よい細胞の分散が行えなかったため、コラゲナーゼ処理を施すことで細胞を分散させ、また洗浄の際にも、コラゲナーゼ入り神経細胞培養用培地を用いて細胞を洗浄する。
その際のコラゲナーゼ添加量は、1 mg/mLコラゲナーゼ含有の神経培養培地で調整した溶液を10-30 mLのボリュームで使用し、上述の37℃のCO2インキュベーター内での培養およびその後の繰り返し洗浄に使用するのが好ましい。
【００１４】
５．膵臓幹細胞を含有した細胞成分の培養と膵臓幹細胞の樹立
成体神経幹細胞の培養法と基本的には同じ条件下で行う。すなわち、例えば、典型的な神経幹細胞用培地である［DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］を用いることができる。（非特許文献１など）
細胞増殖能を上昇させるためには、上記神経幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添加することが好ましい。例えば、FCSを濃度1〜10％、好ましくは5％で添加すると共に、FGF2を10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期特有の培養方法を続ける。
さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約５〜８日間、好ましくは７日間培養することで十分増殖させた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加した神経幹細胞用培地（好ましいFGF2の添加量は、10〜100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。）で培養すれば、成人膵臓幹細胞の未分化状態を維持し続けることができる。
これらの手法は神経幹細胞の樹立の際にも用いられる方法の１つである。しかし、神経幹細胞の場合は、FGF2と同様にEGF2にも未分化状態の維持効果があるが、膵臓幹細胞の場合は、EGF2を添加してもあまり効果が見られない。
なお、一般に、神経幹細胞など、各種幹細胞が樹立されたことは、上述のように、Sox2遺伝子が発現していることを確認して、未分化状態を示すことを確認する。膵臓幹細胞の場合、膵臓細胞が分化した状態で発現が上昇するインシュリンやグルカゴン遺伝子の発現が認められないことも同時に確認できる（図３AおよびB）。
【００１５】
６．幹細胞の分化誘導と分化経路マーカーについて
成体神経幹細胞を分化させる際の手法として、神経分化誘導法やグリアへの分化誘導法など、各種神経細胞への分化方法が既に確立されている（非特許文献１、４−６など）。
本発明において、成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させるために、各種神経細胞への分化方法を適用する。このように、成体神経幹細胞の分化方法が成体膵臓幹細胞の分化方法を転化応用すれば良いことを本発明者らが今回始めて実証した。つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件が適用できる。
具体的には、以下の通りである。
【００１６】
（ａ）インシュリン産生能を有するβ細胞への分化
神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、インシュリン産生能を有するβ細胞に分化させることができる。基本的には、非特許文献４又は５に記載の神経細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、［RA+FSK+KCl］添加培地が用いられ、例えば、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid (RA, シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）及び40 mMのKCl（WAKO社製）を添加する。また、本実施例中では、神経細胞分化誘導剤として典型的に用いられる「RA+FSK+KCl」を添加する以外に、レチノイン酸（RA）単独、またはレチノイン酸＋フォスフォコリン（RA＋FSK）でも、さらにヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤の一種であるバルプロ酸（VPA）、メチル化酵素阻害剤の5AzaCもインシュリンプロモーターを活性化することを確認した（図４Ａ）。
また、脳内の神経新生領域で発現する分泌タンパク質として知られるWnt3もしくはその遺伝子又はWnt3のシグナリング促進物質を用いることでも、成体膵臓幹細胞をインシュリン産生性のβ細胞へ効率的に分化することができることを本発明において、初めて実証できた。すなわち、成体膵臓幹細胞の培地にWnt3aもしくはその活性化剤を添加するか、当該細胞内にWnt3a遺伝子を導入することでインシュリンを産生できるように分化させることができる。Wnt3aについては、下記７．で詳細に述べる。
成体膵臓幹細胞がβ細胞に分化したことを確認するためには、β細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「インシュリン」発現を抗体で確認すればよい。インシュリンが新しく生成する反応由来の「C-peptide」で発現を新規のインシュリン産生を同時に確認することもできる。例えば、インシュリン検出用の「guinea pig anti-Insulin（1:300；Sigma社製)」又はC-peptide検出用の「goat anti-C-peptide (1:250，Linco Research社製)」が好適に用いられる。また、インシュリン又はC-peptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる（図３B）。
【００１７】
（ｂ）δ細胞への分化
成体膵臓幹細胞に対して、β細胞の場合と同様の神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、δ細胞にも分化させることができるが、δ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞から抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件を適用する。基本的には、非特許文献４、５に記載の神経分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）、追加的に40 mMのKCl（WAKO社製）を添加する。
成体膵臓幹細胞がδ細胞に分化したことを確認するためには、δ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「ソマトスタチン」発現を確認すればよい。例えば、ソマトスタチン検出用の「rat anti-Somatostatin (1:300、Chemicon社製)」抗体が好適に用いられる。また、ソマトスタチンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
【００１８】
（ｃ）α細胞への分化
神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、α細胞に分化させることができる。基本的には、非特許文献４−６に記載のアストロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、5%FCSまたはLIF（50 ng/mL；WAKO社製)とBMP2(50 ng/mL；WAKO社製)を添加する。
成体膵臓幹細胞がα細胞に分化したことを確認するためには、α細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「グルカゴン」発現を確認すればよい。例えば、グルカゴン検出用の「mouse anti-Glucagon (1:300、Immuno社製)」抗体での検出が好適に用いられる。また、グルカゴンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
【００１９】
（ｄ）γ細胞への分化
成体膵臓幹細胞に対して、α細胞の場合と同様の神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、γ細胞にも分化させることができるが、γ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を適用する。基本的には、非特許文献４〜６に記載のグリア細胞、非特許文献４のオリゴデンドロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加培地に、1%FCSまたはIGF1 (500 ng/mLが好適。使用範囲として20−1000 ng/mL)を添加する。
成体膵臓幹細胞がγ細胞に分化したことを確認するためには、γ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「Pancreatic polypeptide」発現を確認すればよい。例えば、Pancreatic polypeptide検出用の「guinea pig anti-Pancreatic polypeptide (1:100、Linco Research社製)」抗体が好適に用いられる。また、Pancreatic polypeptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
【００２０】
７．Wnt3a及びWnt3シグナル伝達機構（Wnt3／βcateninシグナリング）の促進物質について
Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞（GFAP陽性）が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストという神経新生細胞（NeuroD1陽性）を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞（GFAP、Glucagon陽性）で発現していることが分かった（実施例４−２、図４A）。
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る（図４B−D）。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下（ニューロブラスト産生状態）に置くと２４時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した（図４E）。
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した（図４F）。
図４Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化（試薬）でインシュリン遺伝子の発現が上昇し（Wnt3，GSK3beta-inhibitor）、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化（DnWnt;ドミナントネガティブWnt，βcatenin shRNA）でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化（インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box））部位へ、直接結合し、クロマチン（染色体）の活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）を誘導する）を導くことを示した（図４G）。
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。
したがって、Wnt3a自身及びWnt/βcateninシグナリングを活性化する物質は、成体膵臓幹細胞を前駆β細胞、さらにはβ細胞へと分化させるβ細胞分化誘導剤となると同時に、インシュリン遺伝子発現を活性化することができることから、これらの物質を、インシュリン産生増強用医薬組成物、糖尿病用治療薬（下記８．で詳細に述べる。）として用いることができる。具体的には、Wnt3a自身、GSK3βインヒビター、リチウム塩（リチウムはWntシグナルを特異的に活性化することで知られている）、及びβカテニンを用いることができる。なお、β細胞への分化効果、インシュリン産生増強効果のいずれに関しても、神経細胞の分化誘導剤として知られるRA（＋FA,KCl）、AzaCとVPAもWnt3aやWntシグナル活性化剤と同様な作用がある（図３D）。
【００２１】
Wntは、細胞外に分泌され、細胞間のシグナル伝達を司るタンパク質として複数種類（哺乳類では１９種類）存在し、線虫、ショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を超えて保存されている。ノックアウトマウスの解析によりWntは発生初期における体軸形成や器官形成に必須な、生物学的に重要なタンパク質である。Wntにより活性化される細胞内シグナル伝達機構には、（１）βカテニン経路、（２）平面内細胞極性（PCP)経路(細胞骨格制御）、及び（３）Ca2+経路(細胞運動制御）の３種類が存在するが、本発明において「Wntシグナル伝達機構」又は「Wnt/βcateninシグナリング」というときは、βカテニン転写因子（非特許文献８）を介した「βカテニン経路」を指す。
Wnt3aは、典型的なWntであり、幹細胞、特に造血幹細胞の増殖および自己再生を含む多数の発達イベントに関与することが知られており、本発明において、成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を誘導する物質であることが見出された。
Wnt3aをインシュリン産生β細胞への分化誘導剤として用いる場合、成体の膵臓組織に対して、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を含む発現ベクターなどを直接導入することも考えられるが、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を常法により作用させた成体膵臓幹細胞、β前駆細胞を膵臓組織に移植する手法が好ましい。
その際に用いるWnt3aタンパク質としては、生体試料から精製されたもの、化学合成されたものや遺伝子組み換えによって製造されたものを用いることができ、市販Wnt3aを用いることもできる。Wnt3aは保存性が高いので、由来の生物種はいずれのものであってもよいが、医薬製剤として用いる場合は対象生物種と同一の生物種由来のものが好ましい。また、Wnt3aタンパク質におけるWntシグナル伝達機構に関与する領域は古くから研究され、ほぼ解明されており（非特許文献９）、当該領域が含まれていれば、Wnt3aタンパク質及びその遺伝子の全長でなく部分配列であってもよい。
Wnt3a遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV) ベクターやレンチウイルスベクター）を用いて導入することができる。
なお、「Wnt3a遺伝子」というとき、Wnt3aタンパク質をコードするDNA又はmRNAを指し、Wnt3a遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトWnt3a遺伝子は、NM_033131（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスWnt3a遺伝子はNM_009522（Gene Bankアクセッションナンバー）である。
また、公知のWnt3a活性化剤（Wnt3aの活性を増加させるような化合物やWnt3a 転写を活性化するような化合物）、例えば、Wntのシグナル伝達機構を促進することが知られているグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）インヒビターであるAR-A014418（J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46, p45937-45945, 2003）やCT 99021 - CHIR 99021（Axon Ligands社製やSTEMGENT社製）、リチウム塩(Lithium Chloride, Wakoやシグマ社製；)βカテニン（Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.97. 4262-4266, 2000 ）を用いることができる。また、図３Ｄに示されるインシュリン遺伝子発現増強効果が確認された、レチノイン酸（RA）は単独でも、フォスフォコリン（FSK）と共に、さらにKCl塩と共に用いることができ、神経分化誘導剤のバルプロ酸ナトリウム（VPA）や５AzaCも用いられる。
なお、本発明の実施例４で用いた、Wnt3aのドミナントネガティブタンパク質（dnWnt）は、Wnt3aの作用領域を改変して機能不全タンパク質をコードする遺伝子をレンチウイルスベクター（Lie DC et al. Nature 437, 1370-1375. (2005)）に組み込み発現させたものを用いている。
【００２２】
８．成体膵臓幹細胞を用いた、膵臓細胞移植治療方法について
成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。市販のコラーゲンシート（例；コラーゲンビトリゲル（旭テクノグラス株式会社））などの生体適合性シート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤（すなわち、神経系細胞分化を促進する薬剤）処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の膵臓に移植して戻す方法が考えられる。例えば重度の合併症を起こす前の糖尿病患者などが対象としてあげられる。患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。β細胞分化を促す薬剤処理として、上記６．（ａ）記載の神経分化を促進する薬剤（1μMのretinoic acid（RA、シグマ社製）、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製））や、上記７．記載のWntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子（Wnt3A，beta-catenin，GSK3betaインヒビター、リチウム塩など）、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤（抗てんかん薬として知られるVPA；バルプロ酸ナトリウム、TSA；トリコスタチンA）なども用いることができる（図３D）。
また、シートを用いる手法の他、成体膵臓幹細胞を、遠心分離した細胞単独で、又は上記神経分化を促進もしくは誘導する薬剤を含有する培養液と共に、注射器などにより膵臓組織（患部）に直接注入する手法を採ることもできる。
【００２３】
９．インシュリン増強用医薬組成物、糖尿病治療用組成物、又は神経疾患治療用組成物としての製剤化、及び投与方法
特に、インシュリンを産生するβ細胞への分化作用のある、RA（＋FSK,KCl）、VPA、5AzaCなどの神経分化誘導剤、Wnt3aもしくはその活性化剤（GSK3βインヒビター、リチウム塩）、又はIGFBP-4インヒビターは、分化後のインシュリン産生も増強できるので、糖尿病用治療薬として有効であり、Ｉ型糖尿病用、II型糖尿病用のいずれにも効果が期待できる。
本発明の医薬組成物は、移植用の膵臓幹細胞と共に膵臓の患部に直接注入するか、又はin vitroで膵臓幹細胞又はそれを分化させた前駆β細胞などに注入して移植する方法を用いることもできる。一般的には、コラーゲンシートなど移植用の生体適合性シート上で膵臓幹細胞を上記分化誘導剤と共に培養し、β前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植するのが最も効率的であるので、その際の培地中に添加するか、その膵臓幹細胞に導入するのが一般的である。本発明で生体適合性シートというとき、典型的にはコラーゲンシートであるが、コラーゲンマトリックスやコラーゲンスポンジを用いることもでき、その際の材質としては生体適合性材料製、例えば周知の生体適合性合成樹脂製であってもよい。
したがって、本発明でインシュリン増強用医薬組成物、糖尿病再生治療用組成物というとき、単に上述のβ細胞分化誘導剤を有効成分とする医薬組成物のみならず、移植用シート上の成体膵臓幹細胞も含めた移植用キットを含む場合も包含し、さらに、成体膵臓幹細胞をあらかじめ移植用シート上で、上述のβ細胞分化誘導剤存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させた状態の移植用シート上の細胞を含めることもある。反対に、成体膵臓幹細胞をあらかじめβ前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植する場合には、上述のインシュリン産生増強効果のあるβ細胞分化誘導剤を同時に患部に導入することは好ましいが必須ではないので、その場合は、β前駆細胞及び移植用シートを含む組成物を、インシュリン増強用医薬組成物、糖尿病治療用組成物と呼ぶこともできる。
さらに、成体膵臓幹細胞は、下記１０．で述べるように、成体神経幹細胞に代えて、神経組織の再生用移植治療に用いることができるので、上記のインシュリン増強用医薬組成物、又は糖尿病治療用組成物は、すべて神経系疾患治療用の神経組織の再生治療用組成物として用いることができる。
そして、いずれの場合も、好ましくは通常の注射製剤などと同様、無菌の水溶液に溶解、又は懸濁し、薬学的に許容される安定化剤、等張化剤、緩衝剤などが配合される。また、遺伝子製剤の場合は、常法に従い、核内に遺伝子を運搬するためのキャリアが併用されることが好ましい。生理学的に受容可能なキャリアとしては、リポフェクタミン（Invitrogen社）などの遺伝子導入用カチオン性脂質などがある。
遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を用いて導入する。
また、公知のインシュリン製剤又はアディポネクチン製剤などの公知インシュリン産生増強剤を併用することもできる。
本発明の医薬有効投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり1μｇ/kg〜10mg/kgである。
【００２４】
１０．成体膵臓幹細胞を用いた、神経系再生用移植治療方法について
成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を部分結紮して抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。コラーゲンシート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の神経疾患部位に移植して戻す方法が考えられる。また、コラーゲンシートを用いずに、この細胞培養物を神経損傷部位に直接インジェクションする方法も考えられる。上述と同様、患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。神経分化を促す薬剤処理として、上述の神経分化を促進する薬剤（1μMのretinoic acid（RA、シグマ社製）、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製））や、Wntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子（Wnt3A，beta-catenin，GSK3betaインヒビターなど）、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤（抗てんかん薬として知られるVPA；バルプロ酸ナトリウム、TSA；トリコスタチンA）なども用いることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。【００２６】
（実施例１）成体内の神経幹細胞及び膵臓幹細胞の存在の確認
Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子であり、多能性を有する幹細胞の存在を確認するマーカーとなる。脳内の神経幹細胞存在領域として広く知られている海馬領域でのSox2遺伝子の発現も周知であった。この実施例１では、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結し、導入したトランスジェニックマウスを観察したところ、当該マウスの脳と膵臓で、その発現を確認した。その際の組換えベクターの製法、導入量などの実験条件は、非特許文献５に従った。また、同時に、両臓器の分化した神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることも確認した（図１、上図、点線枠内がインシュリン抗体陽性、矢印で示した細胞がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞）。神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており（下段、矢印。細胞核内）、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン（同、矢印で示した細胞。細胞質でインシュリン産生）を発現していることが分かる（図１、下段）。【００２７】
（実施例２）膵臓からの幹細胞含有細胞成分の採取
Fisher344成体ラット（７週齢）から成体膵臓を取り出し、ブレードカッターにより十分なマイクロダイセクションを施した後、コラゲナーゼを添加した神経幹細胞培養用培地［DME/F12, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］中で、３７℃のCO2インキュベーター内で３０分から４５分間、定期的に撹拌しながら細胞を懸濁した。次いで、細胞成分を遠心処理で集め（遠心数1000rpm、２分）、新たなコラゲナーゼ入り神経幹細胞培養用培地で洗浄し、当該培地中で撹拌懸濁する、という工程を計３回繰り返した。【００２８】
（実施例３）膵臓幹細胞の樹立
実施例２の方法により、1000rpmで２分間遠心後の細胞成分を、神経幹細胞を培養する際に用いる、特殊コートを施した培養用ディッシュ［市販の細胞培養用ディッシュ／プレートを、PORN（poly-L-ornithine）で２４時間室温でコート（第１コート）し、その後滅菌済み超純水で２回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第２コート液で３７℃のCO2インキュベーター内で２４時間コートしたもの］に撒いた。
細胞増殖を上昇させるため、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。最も増殖が促進された、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地での培養は、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。これは神経幹細胞の樹立の際に用いられる方法で、一旦増殖を開始させた神経幹細胞は20ng/mLのFGF2存在下で未分化性を効率よく維持できる知見に基づく。しかし、同様に神経幹細胞の未分化維持に効果があるとされるEGF2については、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても、FGF2の場合のような効果は見られなかった（図示せず）。
樹立した成体膵臓幹細胞は20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地（DME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加）で培養し、継代可能であることも確認した（図２、P１）。【００２９】
（実施例４）成体膵臓幹細胞の分化制御機構の解析
実施例３で樹立した成体膵臓幹細胞を用いて、分化制御機構の解析を行った。神経幹細胞はSox2遺伝子を発現し、多能性を保持した未分化状態に保つことができる。樹立した膵臓幹細胞を、神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った（図３A）。
FGF２存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体（guinea pig anti-Insulin；1:300；Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体（mouse anti-Glucagon；1:300，Immuno社製、以下同様。)を用いる免疫染色法で確認した。【００３０】
次いで、膵臓幹細胞を神経分化条件下（非特許文献４、５)の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid（RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地（RA＋FSK＋KCl）を用いて培養すると、β細胞への分化が促進され、インシュリン遺伝子の発現の上昇とともに、細胞表面に神経突起のようなプロセスを伸長させた。
δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体（rat anti-Somatostatin；1:300，Chemicon社製、以下同様。）で確認できた。
一方、細胞をアストロサイト分化条件下（非特許文献４〜６による。）のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF（WAKO社製）及び50 ng/mLのBMP（WAKO社製）を含む培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した（抗Glucagon抗体により確認）。この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件（500ng/mL IGF-I（WAKO社製）入りのDME/F12, high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地）を用いる。
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、未分化、β細胞誘導、α細胞への誘導が行えること、その条件が神経幹細胞の未分化性の維持（FGF２存在下）、神経分化誘導（RA＋FSK＋KCl）、アストロサイト分化誘導（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）条件を疑似する条件で行えることを実証した（図３B）。【００３１】
さらに、未分化状態ではα細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞の指示マーカーが陰性であることに比較し、分化誘導下では対照的に全ての分化経路マーカーの発現が上昇することから、樹立した細胞が膵臓幹細胞の多能性を保持していることを示した。図３Cの免疫組織染色解析により、δ細胞（ソマトスタチン）は脳神経でのInterneuron（興奮性の神経刺激を抑制する神経）に特異的な分布を示し、δ細胞が神経誘導条件下で発現が上昇する背景が判明した。さらに、γ細胞（Pancreatic polypeptide）は、脳神経でオリゴデンドロサイトのマーカーであるGSTπと疑似する分布を示し、γ細胞がグリア細胞誘導条件下で発現が上昇する背景も判明した。これらの知見は、脳神経の細胞群（神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞）と膵臓内分泌系の細胞群（膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞）の発現する遺伝子に非常に高い相関が有る学術的意義を示しており、β細胞誘導には、従来の神経促進／誘導薬が転化使用できることを示唆している。レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子をインシュリンプロモーターの下流に連結したアッセイ系で解析したところ、実際に、RA＋FSK＋KClという神経分化促進条件のみでなく、RA単独、RA＋FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの他の神経分化促進薬剤を用いた場合でもインシュリンプロモーターの活性が上昇することが、本発明の膵臓幹細胞培養系（神経幹細胞培養用培地中）での培養により確認できた（図３D）。【００３２】
（実施例４）成体内の神経幹細胞及び膵臓幹細胞の培養工程と分化工程の類似性
（４−１）未分化状態を維持した培養工程
Sox2遺伝子は未分化状態を保つ機能をもつが、FGF2というgrowth factor存在下で培養することで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞のいずれもの未分化状態が維持される。神経幹細胞と膵臓幹細胞を、神経幹細胞を培養する条件で培養し、細胞からtotal RNAを抽出、精製し、RT-PCR（mRNAの発現を調べる分子生物学的手法）を行った結果を図３Bに示す。具体的な培養条件は、DME/F12培地中, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加という条件で、ともに、特殊コート［市販の細胞培養用ディッシュ／プレートを、PORN（poly-L-ornithine）で２４時間室温でコート（第１コート）、その後滅菌済み超純水で２回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第２コート液で、３７℃CO2インキュベーター内で２４時間コートしたもの］を施した培養用ディッシュ上で培養した。この条件で、両細胞はFGF2というgrowth factor存在下でSox2遺伝子を発現する（図３B、上から２段目）。
細胞増殖を上昇させるため、両細胞に対して、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。一旦増殖を開始させた神経幹細胞については、10％FCSに加えて20ng/mLのFGF2を存在させることで、未分化性を効率よく維持できる。膵臓幹細胞培地についても最も増殖が促進されたクローンに対し、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養した。両者とも、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。なお、神経幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF2を用いても同様に未分化維持に効果があるが、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても効果は見られなかった（図示せず）。
樹立した成体膵臓幹細胞について、20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地(DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加)で培養し、継代可能であることも上記実施例３において確認した（図２、P１）。【００３３】
（４−２）分化制御機構の解析
成体神経幹細胞と共に成体膵臓幹細胞が樹立できたため、両者の分化制御機構の解析を行った。
多能性を保持した未分化状態に保つことはSox2遺伝子の発現により確認できるので、非特許文献４、５に記載される公知の神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、樹立した神経幹細胞及び膵臓幹細胞について、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った（図３A）。
FGF2存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体（guinea pig anti-Insulin；1:300；Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体（mouse anti-Glucagon ；1:300，Immuno社製、以下同様。）を用いる免疫染色法で確認した。
次いで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞を神経分化条件下（非特許文献４、５）の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）及び40 mMのKCl（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地（RA+FSK+KCl）を用いて培養すると、β細胞への分化が促進され、インシュリン遺伝子の発現の上昇とともに、細胞表面に神経突起のようなプロセスを伸長させた。両成体幹細胞を神経分化に導く条件（RA+FSK+KCl）下で培養すると、Insulin，β-III tubulin、ソマトスタチン遺伝子の発現が上昇する。
両細胞で、δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体（rat anti-Somatostatin；1:300, Chemicon社製、以下同様。）で確認できた。ソマトスタチンは、膵臓ではδ細胞だが（図３C、下段左、実線で示した細胞。点線の矢印はGlucagon陽性のα細胞）、脳神経系では神経伝達の上で、刺激に対して抑制性の機能を示すinterneuron（インターニューロン）という神経細胞の一種に相当することが分かった（図３C、下段右、海馬のHilus領域内の矢印で示した細胞）。
一方、両細胞をアストロサイト分化条件下（非特許文献４〜６による。）のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF（WAKO社製）及び50 ng/mLのBMP（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した（抗Glucagon抗体により確認）。この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件（500ng/mL IGF-I（WAKO社製）入りのDME/F12、high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地）を用いる。このように、両成体幹細胞を、グリア細胞に分化させる条件下（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）で培養すると、グルカゴン（α細胞のマーカー遺伝子）、GFAP（アストロサイト細胞のマーカー遺伝子）、Pancreatic polypeptide（γ細胞のマーカー遺伝子）という遺伝子が上昇することが分かった（図３B）。Pancreatic polypeptide、膵臓ではγ細胞だが（図３C、上段左、実線で示した細胞。点線の矢印はGlucagon陽性のα細胞）、脳神経系ではオリゴデンドロサイト細胞に特異的なGSTπという抗体で共に染色されることが分かった（図３C、上段右、矢印で示した細胞）。
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、成体膵臓幹細胞の未分化状態の維持、β細胞（δ細胞）への誘導、及びα細胞（γ細胞）への誘導が、それぞれ神経幹細胞の未分化性の維持（FGF２存在下）、神経分化誘導（RA+FSK+KCl）、及びアストロサイト分化誘導（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）条件を疑似する条件で行えることを実証した（図３B）。【００３４】
（４−３）成体膵臓幹細胞の成熟膵臓細胞への分化誘導
実施例３で樹立した膵臓幹細胞に対して、さらに詳細な分子制御機構の解析を行った。Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞（GFAP陽性）が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストと言う神経新生細胞（NeuroD1陽性）を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞（GFAP、Glucagon陽性）で発現していることが分かった（図４A、矢印で示した細胞）。
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る（図４B−D）。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下（ニューロブラスト産生状態）に置くと２４時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した（図４E）。
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した（図４F）。
図４Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化（試薬）でインシュリン遺伝子の発現が上昇し（Wnt3，GSK3beta-inhibitor）、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化（DnWnt;ドミナントネガティブWnt，βcatenin shRNA）でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化（インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box））部位へ、直接結合し、クロマチン（染色体）の活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）を誘導する）を導くことを示した（図４G）。
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。【００３５】
（参考例１）神経幹細胞から成熟膵臓細胞への分化誘導
細胞抽出RNAを用いたRT-PCR（図３B）以外にも、免疫組織染色解析（図３A）からも、脳神経の細胞群（神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞）と膵臓内分泌系の細胞群（膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞）の発現する遺伝子に非常に高い相関が有ることが示された。さらに、図３Fに示すように、インシュリンを産生するβ細胞への分化誘導には、従来の神経促進／誘導薬が転化使用できることが分かった。上述したRA＋FSK＋KClという神経分化促進条件のみでなく、他の神経分化促進薬剤（RA単独、RA＋FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの薬剤）でもインシュリンプロモーターの活性が上昇することが膵臓幹細胞培養系で明らかになった（図３D）。
これは、神経分化を促進する試薬、または神経疾患の治療薬の、膵臓疾患への転化応用の可能性が高いことを示す。【００３６】
（実施例５）成体膵臓幹細胞の、脳神経疾患へ効果的な移植応用
膵臓幹細胞が、膵臓内分泌系β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞に分化することに加え、神経細胞と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、学習機能の向上等に必要とされていることなどから、膵臓幹細胞と神経幹細胞との間に互換性がある可能性を想定し、樹立した膵臓幹細胞が脳内神経系に組み込まれるかどうかを調べた。移植する膵臓幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP（蛍光を発するタンパク質）を選択した。GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた膵臓幹細胞株を作製した。106-107個の細胞を、Fisher344成体ラット（７−８週齢）の脳海馬領域に、Stereotaxic脳固定装置を用いてマイクロインジェクションした(図５A)。５週間飼育後、脳を抽出してGFPを発現している膵臓幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体膵臓幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った脳内の神経系に効率よく取り込まれること、神経細胞に転移分化できることがin vivoで示された（図５B）。
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内（学習機能）と膵臓（血糖値低下）の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、その相互利用が双方で可能であることが実際にin vivoで証明された。【００３７】
（参考例２）神経幹細胞の膵臓への移植応用
膵臓幹細胞からのβ細胞分化制御が、神経幹細胞からの神経細胞分化制御と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、本来学習機能の向上等に必要とされていることなどから、神経幹細胞が膵臓の内分泌系に組み込まれるかどうか（転移分化）、移植実験を行った。移植する神経幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP（蛍光を発するタンパク質）を選択した。GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた神経幹細胞株を作製した。107-108個の細胞を、Fisher344成体ラット（７−８週齢）の膵臓にマイクロインジェクションした（図５A）。５週間飼育後、膵臓を抽出してGFPを発現している神経幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体神経幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った膵臓内分泌系に効率よく取り込まれること、インシュリンを産生するβ細胞に転移分化できることがin vivoで示された（図６C）。【００３８】
(参考例３)糖尿病等膵臓疾患を標的とした再生医療への応用
さらに、糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植した。効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い（図６B）、神経幹細胞、ニューロブラスト（神経分化の初期状態）の培養が問題なく行えること、およびコラーゲンシート上でも、インシュリンプロモーター活性が神経分化誘導条件下で、上昇することを確認した（図６B、右グラフ）。この神経幹細胞などを培養したコラーゲンシートを糖尿病のモデルラットの膵臓に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図６Cに示す。図６Cから分かるように、神経幹細胞、ニューロブラストを移植した全ての系で、手術後に血糖値の低下が確認された。さらに、コラーゲンシートが無い場合に比べ、コラーゲンシート上のニューロブラストを移植したケースが、最も効率の良い血糖値の低下が見られた。
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内（学習機能）と膵臓（血糖値低下）の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、神経幹細胞の糖尿病治療への利用が可能であることが実際に疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。【００３９】
（参考例４）糖尿病等膵臓疾患を標的とした再生医療への応用(長期間試験)
糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植した。前記参考例３と同様に、効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い（図６B、同様）、図６Cの短期間試験で効果的な血糖値低下作用を示したニューロブラスト（神経分化の初期状態）の移植で試験を開始した。コラーゲンシート上にニューロブラストを培養し、複数枚数（３シート、t2×10の8乗個の細胞数に最終的に相当）重ねたものを糖尿病のモデルラットの膵臓の膵島部に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図に示す。図６Cと同様、ニューロブラストを移植した系で、手術後に血糖値の低下が確認された。さらに、この効果は３ヶ月の長期の試験に対しても有用であることが判明した。
以上の研究成果から、成体神経幹細胞の培養系の糖尿病治療への利用が、疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。（図８）
また、本参考例により、成体神経幹細胞であっても、本発明の神経分化誘導剤を用いて前駆β細胞に分化させた後に、膵臓組織への移植を行うことの治療上の有効性が確認されたのであるから、成体膵臓幹細胞と成体神経幹細胞との間は完全に互換性があることが証明できたことになる。つまり、成体膵臓幹細胞に対しても、この参考例４と同様な手法、すなわち、コラーゲンシート上で神経細胞分化誘導剤により前駆β細胞にまで分化させた状態で、糖尿病患者もしくは神経性疾患患者の膵臓組織もしくは神経組織に対する移植治療を行えば、同様の治療効果が十分に期待できることである。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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