(57)【要約】  ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することが可能なｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、及び前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することを目的とする。  （ａ）配列番号：１〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子；前記二本鎖核酸分子を含む、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかに対する癌細胞増殖抑制剤；並びに、前記癌細胞増殖抑制剤を含む、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかに対する医薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、
を含むことを特徴とする二本鎖核酸分子。
【請求項２】
センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１５のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３】
センス鎖が、配列番号：２、及び、配列番号：１５のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である請求項２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの少なくともいずれかである請求項１から３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡである請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項８】
前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、請求項１から５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項６に記載のＤＮＡ、及び、請求項７に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、請求項８に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の予防乃至治療に好適な、ｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、並びに、前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、男性に特異的ながんであり、我が国においては、特に近年、増加傾向が著しいことが報告されている。前立腺癌は、男性ホルモン（アンドロゲン）と深い関係があることが知られている。
また、膀胱癌は、前立腺癌と同じく増加傾向にあり、特に、女性に比べて男性において多く発症することが特徴として知られている。
従来、これらの泌尿器系のがんに対し、外科的に臓器を摘出する治療方法が行われている。前立腺癌に対しては、抗アンドロゲン製剤を投与する治療方法が行われている。しかしながら、臓器を摘出する治療方法では、患者のＱＯＬが著しく低下してしまうことが問題となる。また、抗アンドロゲン製剤を用いた治療方法では、治療過程において耐性を獲得しやすいため、予後が非常に悪いことが問題となっている。
また、同じく泌尿器系のがんである腎癌も最近増加しているが、放射線治療や抗がん剤治療の奏功率が低い。一方、女性ホルモンであるエストロゲンが増悪因子として作用する乳癌や子宮癌も近年著しく増加しているが、治療薬に対して抵抗性を獲得して難治性となるものが多く存在している。さらに、肺癌、大腸癌、肝癌、皮膚癌も治療が困難で臨床上の大きな課題となり、同様の問題点を有している。
このような従来の治療方法における諸問題を克服するため、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の作用機序を解明し、その機構に根ざした、新たな分子標的の開発が望まれている。【０００３】
一方、近年、１８〜２９塩基程度の小分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を細胞内に導入することにより、配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制することのできるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の技術を、癌治療に応用する試みが広く行われている。実際に、癌に関与する遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡを用いることにより、癌細胞の増殖を抑制できることも多く報告されている（例えば、特許文献１〜２、非特許文献１参照）。
前記非特許文献１では、癌細胞の免疫系からの回避に関与すると考えられているＥＢＡＧ９遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＢＡＧ９Ｃ）が、マウス腎細胞癌Ｒｅｎｃａの腫瘍形成を効果的に抑制できることが、本発明者らにより報告されている。【０００４】
しかしながら、ＲＮＡｉの技術において、標的遺伝子に対する発現抑制効果は、ｓｉＲＮＡの塩基配列、及び、ｓｉＲＮＡが導入される組織や細胞の種類に応じて、大きく変化しうることが一般に知られている（例えば、非特許文献２〜４参照）。
例えば、本発明者らは、前記ｓｉＥＢＡＧ９Ｃが、腎細胞癌だけでなく、前立腺癌及び膀胱癌の癌細胞の増殖に対しても、抑制効果を有するかどうかを検証した。その結果、前記ｓｉＥＢＡＧ９Ｃは、前立腺癌及び膀胱癌の癌細胞に対して若干の抑制効果を有するものの、充分な抑制効果を示すまでには至らないことを明らかとしている（実施例参照、後述）。【０００５】
また、ｓｉＲＮＡでは、標的遺伝子以外の全ての遺伝子配列に対して完全に異なる標的配列を選定することは難しく、オフターゲット効果と呼ばれる非特異的な遺伝子発現抑制の問題がある。【０００６】
したがって、ＲＮＡｉの技術を、実際の前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の治療に応用するためには、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌に対して顕著な抑制効果を有する優れたｓｉＲＮＡを開発することが必要であり、標的遺伝子の選択から詳細な塩基配列の選択に至るまで、更なる検討が望まれているのが現状である。【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５００９１６号公報
【特許文献２】特表２００６−５２８６１８号公報
【非特許文献１】Ｏｇｕｓｈｉ  Ｔ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ，Ｕｒａｎｏ  Ｔ，Ｈｏｒｉｅ−Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｊ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｏｕｃｈｉ  Ｙ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ９  ｉｓ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：３７００−３７０６，２００５．
【非特許文献２】Ｋｕｍｉｋｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｙｕｋｉ  Ｎａｉｔｏ，Ｆｕｍｉｔａｋａ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｈｉｒｏｋｏ  Ｏｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉ，Ａｙａ  Ｊｕｎｉ，Ｒｙｕ  Ｕｅｄａ，ａｎｄ  Ｋａｏｒｕ  Ｓａｉｇｏ１ａ；Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｃｋ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２：９３６−９４８．
【非特許文献３】Ｐｅｔｒ  Ｐａｎｃｏｓｋａ，Ｚｄｅｎｅｋ  Ｍｏｒａｖｅｋ，ａｎｄ  Ｕｔｅ  Ｍ．Ｍｏｌｌ；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｇｌｏｂａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｅｕｌｅｒｉａｎ  ｇｒａｐｈ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２：１４６９−１４７９．
【非特許文献４】Ｏｌｇａ  Ｍａｔｖｅｅｖａ，Ｙｕｒｙ  Ｎｅｃｈｉｐｕｒｅｎｋｏ，Ｌｅｏ  Ｒｏｓｓｉ，Ｂａｒｒｙ  Ｍｏｏｒｅ，Ｐａｌ  Ｓａｅｔｒｏｍ，Ａｌｅｋｓｅｙ  Ｙ．  Ｏｇｕｒｔｓｏｖ，Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，ａｎｄ  Ｓｖｅｔｌａｎａ  Ａ．Ｓｈａｂａｌｉｎａ；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｎｅｗ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７；３５：ｅ６３．
【非特許文献５】Ｋａｔｈｙ  Ｑ．Ｌｕｏａ  ａｎｄ  Ｄｏｎａｌｄ  Ｃ．Ｃｈａｎｇ；Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１８（２００４）  ３０３−３１０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することが可能なｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、及び前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らが作製した特定の配列を有するｓｉＲＮＡが、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有しており、これらの遺伝子の発現抑制を介して、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することができるという知見である。また、このようなｓｉＲＮＡを、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌を予防乃至治療するための医薬の有効成分として好適に利用できるという知見である。【００１０】
ＡＰＰ遺伝子は、アルツハイマー病患者の脳に蓄積するアミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子として知られているが、前立腺癌、膀胱癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌においてＡＰＰ遺伝子が発現すること、更には、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の腫瘍形成にＡＰＰ遺伝子が関与することは、従来知られていない。ＡＰＰ遺伝子は肺癌細胞で発現していること、及び大腸癌細胞においてはＡＰＰ遺伝子の発現が細胞の増殖に関与することが報告されている。しかしながら、ＡＰＰ遺伝子による癌細胞増殖促進のメカニズムは明らかではなく、加えてＡＰＰ遺伝子を標的とした前立腺癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の治療は従来行われていない。
ＥＢＡＧ９遺伝子は、癌細胞の免疫系からの回避に関与すると考えられているが、膀胱癌において発現することは従来知られておらず、ＥＢＡＧ９遺伝子を標的とした前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の治療は従来行われていない。
本発明者らは、今回、ＡＰＰ遺伝子が、前立腺癌、膀胱癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌において発現していること、ＥＢＡＧ９遺伝子が、膀胱癌において発現していること、及び、ＡＰＰ遺伝子、及びＥＢＡＧ９遺伝子の発現を効率よく、かつ特異的に抑制するｓｉＲＮＡを新たに見出した。また、本発明者らは、これらのｓｉＲＮＡを、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）、膀胱癌細胞株（ＥＪ）をヌードマウスに皮下移植した腫瘍増殖モデルにおいて形成された癌に投与することによって、それぞれの癌の増殖を著しく抑制することが可能となること、及び、これらのｓｉＲＮＡを、肺癌細胞株（Ａ５４９）、大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１）、肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、子宮癌株（Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ．７４）、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）、メラノーマ細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ  ２８）、及び腎癌細胞株（ＶＭＲＣ−ＲＣＺ）に投与することによって、それぞれの細胞を著しく抑制することが可能となることを見出した（実施例参照、後述）。これらの結果は、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子が、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の増殖に関わっており、これらの癌に対する新たな分子標的となり得ることを示すものである。
本発明者らが作製したｓｉＲＮＡは、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌を予防乃至治療するための新たな医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。また、これらのｓｉＲＮＡは、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌が発症乃至進展するメカニズムを解き明かし、これらの病態の更なる解明に役立つことも期待される。【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、
を含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞  センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１５のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜３＞  センス鎖が、配列番号：２、及び、配列番号：１５のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜２＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜４＞  二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜５＞  二本鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡである前記＜４＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜７＞  前記＜６＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜８＞  前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜６＞に記載のＤＮＡ、及び、前記＜７＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜９＞  前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための方法であって、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜６＞に記載のＤＮＡ、及び、前記＜７＞に記載のベクターの少なくともいずれかを作用させることを特徴とする方法である。
＜１０＞  前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、前記＜８＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
＜１１＞  前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための方法であって、個体に、前記＜８＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を投与することを特徴とする方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することが可能なｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、及び前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ａ及びｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図２】図２は、ＥＪ細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＥＪ細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１及びｓｉＥＢＡＧ９Ｃの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＥＪ細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１及びｓｉＥＢＡＧ９Ｃの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図４】図４は、ＬＮＣａＰ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの増殖抑制効果を示したグラフである。
【図５】図５は、ＥＪ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの増殖抑制効果を示したグラフである。
【図６】図６は、ＬＮＣａＰ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の増殖抑制効果を示したグラフである。
【図７】図７は、ＥＪ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の増殖抑制効果を示したグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、Ａ５４９細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ａ５４９細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＤＬＤ−１細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＤＬＤ−１細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＭＣＦ−７細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＭＣＦ−７細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞におけるＡＰＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＡＰＰ−Ｂの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞におけるＥＢＡＧ９蛋白質発現に対する、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１５】図１５は、Ａ５４９細胞におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１６】図１６は、ＤＬＤ−１細胞におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１７】図１７は、ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１８】図１８は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１９】図１９は、ＭＣＦ−７細胞におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【図２０】図２０は、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【図２１】図２１は、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞におけるｓｉＡＰＰ−Ｂの細胞増殖抑制効果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（二本鎖核酸分子）
本発明の二本鎖核酸分子は、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であり、（ａ）配列番号：１〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。
なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子をいう。【００１５】
＜ＡＰＰ遺伝子、ＥＢＡＧ９遺伝子＞
前記したように、前記ＡＰＰ遺伝子は、アルツハイマー病患者の脳に蓄積するアミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子として知られている。前記ＥＢＡＧ９遺伝子は、癌細胞の免疫系からの回避に関与すると考えられている遺伝子である。前記ＡＰＰ遺伝子及び前記ＥＢＡＧ９遺伝子の塩基配列は、例えば、ヒト、マウス、チンパンジー、イヌ、ラットなどにおいて公知であり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる（例えば、ヒトＡＰＰ遺伝子：ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００４８４．２（Ｖａｒｉａｎｔ１）、ＮＭ＿２０１４１３．１（Ｖａｒｉａｎｔ２）、ＮＭ＿２０１４１４．１（Ｖａｒｉａｎｔ３）、ヒトＥＢＡＧ９遺伝子：ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００４２１５．３（Ｖａｒｉａｎｔ１）、ＮＭ＿１９８１２０．１（Ｖａｒｉａｎｔ２））。
本発明において、前記ＡＰＰ遺伝子、前記ＥＢＡＧ９遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、本明細書中において前記ＡＰＰ遺伝子、前記ＥＢＡＧ９遺伝子を、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と称することがある。
なお、参考として、ヒトの前記ＡＰＰ遺伝子配列を配列番号：２４に、ヒトの前記ＥＢＡＧ９遺伝子配列を配列番号：２５に示す。【００１６】
＜センス鎖、アンチセンス鎖＞
前記したように、本発明者らは、鋭意検討の結果、前記ＡＰＰ遺伝子、前記ＥＢＡＧ９遺伝子のｍＲＮＡ配列の中でも、ある特定の標的配列（配列番号：１〜配列番号：２１）に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子が、前記ＡＰＰ遺伝子、前記ＥＢＡＧ９遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有することを見出した。したがって、本発明の二本鎖核酸分子は、（ａ）配列番号：１〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むものである。
ここで、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよいし、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖であってもよい。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズすることで前記二本鎖核酸分子を形成することができる。
なお、前記配列番号：１〜配列番号：２１のうち、配列番号：１〜配列番号：１４はヒトＡＰＰ遺伝子配列（配列番号：２４）の一部であり、配列番号：１５〜配列番号：２１はヒトＥＢＡＧ９遺伝子配列（配列番号：２５）の一部である。【００１７】
中でも、前記二本鎖核酸分子としては、前記センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号１５のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることが好ましく、配列番号：２及び配列番号１５のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることが特に好ましい。
前記センス鎖が、前記好ましいセンス鎖以外のセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の前記標的遺伝子に対する発現抑制効果が弱くなる場合がある。一方で、前記センス鎖が、前記特に好ましいセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の使用量が少量であっても、前記標的遺伝子に対する強い発現抑制効果が得られる点で、有利である。【００１８】
＜種類＞
前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラなどが挙げられるが、中でも、二本鎖ＲＮＡが好ましい。
ここで、「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいい、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。【００１９】
前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であることが特に好ましい。ここで、ｓｉＲＮＡとは、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、前記したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、かつ前記標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。【００２０】
また、前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であってもよい。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
前記ｓｈＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。【００２１】
＜修飾＞
また、前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。例えば、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を付与し、培養液中や生体中における安定性を向上させる等の目的から、前記二本鎖核酸分子に、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾等を施すことができる。また、例えば、細胞への導入効率を高める等の目的から、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。なお、前記二本鎖核酸分子にこのような修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。【００２２】
＜入手方法＞
前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、前記ｓｉＲＮＡは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、アニーリング済の二本鎖ｓｉＲＮＡの市販品を入手することもできるし、ｓｉＲＮＡ合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。【００２３】
（ＤＮＡ、ベクター）
本発明のＤＮＡは、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡを含むベクターである。【００２４】
＜ＤＮＡ＞
前記ＤＮＡとしては、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ  ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。【００２５】
＜ベクター＞
前記ベクターは、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、その種類としては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。また、前記ベクターは、前記二本鎖核酸分子を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。前記二本鎖核酸分子の発現様式としては、特に制限はなく、例えばｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）や、ｓｈＲＮＡとしての一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等を選択することができる。
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。【００２６】
前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸分子を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。【００２７】
（癌細胞増殖抑制剤）
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤（腫瘍増殖抑制剤）であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含んでなり、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。【００２８】
＜二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター＞
前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とするＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現を効果的に抑制することができるので、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための前記癌細胞増殖抑制剤の有効成分として好適である。また、前記ＤＮＡ、ベクターの詳細としても、前記した本発明のＤＮＡ、ベクターの項目に記載した通りである。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤としては、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。【００２９】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００３０】
＜癌細胞＞
前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる細胞は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかであり、これらの癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌を患う患者の体内に存在する細胞であってもよい。
前記体外で培養されている前立腺癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＮＣａＰ細胞（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＰＣ−３細胞（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＤＵ１４５細胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている膀胱癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＪ細胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、Ｔ２４細胞（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、Ｊ８２細胞（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている肺癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａ５４９細胞（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ由来）、Ｌｕ−１４１細胞（Ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＰＣ−１４細胞（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている大腸癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＬＤ−１（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＢＭ３１４細胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＣＡＣＯ−２（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている肝癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨｅｐＧ２細胞（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＨｕＨ−７細胞（ｈｅｐａｔｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている子宮癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ．７４（ヒト子宮内膜癌由来）、ＨＥＣ−１細胞（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＪＨＵＥＭ−３細胞（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている乳癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＣＦ−７細胞（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＺＲ−７５細胞（ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている皮膚癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ由来）、ＣＯＬＯ  ６７９細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ由来）、Ｃ３２細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
前記体外で培養されている腎癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＫＭＲＣ−１細胞（Ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、Ｃａｋｉ−２細胞（ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。【００３１】
＜作用＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに対して作用させる前記癌細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１ｘ１０６個の細胞数に対し、有効成分（二本鎖核酸分子）の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。【００３２】
＜癌細胞増殖抑制方法＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに作用させることにより、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに作用させることを特徴とする、癌細胞の増殖抑制方法（腫瘍増殖抑制方法）にも関する。【００３３】
（医薬）
本発明の医薬は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であり、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。【００３４】
＜癌細胞増殖抑制剤＞
前記癌細胞増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤の項目に記載した通りである。前記癌細胞増殖抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とするＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を効果的に抑制することができる。即ち、前記癌細胞増殖抑制剤は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬として好適に利用可能である。
前記医薬中の前記癌細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬としては、前記癌細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。【００３５】
ここで、前記医薬の有効成分となる前記二本鎖核酸分子としては、非修飾の状態の二本鎖核酸分子そのものを用いてもよいが、適切に予防乃至治療効果が得られるよう、生体への投与に適した形態の二本鎖核酸分子を用いることが好ましい。
例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性を高めることができる点で、修飾が施されていることが好ましい。前記二本鎖核酸分子に施し得る修飾の種類としては、特に制限はなく、例えば、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾などが挙げられる。また、標的細胞への導入効率を高める等の目的から、例えば、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともまた好ましい。前記二本鎖核酸分子に前記修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、前記二本鎖核酸分子は、標的細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としても、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。【００３６】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００３７】
＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。【００３８】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。【００３９】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。【００４０】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。【００４１】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。【００４２】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。【００４３】
＜投与＞
前記医薬は、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかの予防乃至治療に好適である。したがって、前記医薬は、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかに罹患した患者に投与することにより好適に使用することができる。【００４４】
前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。【００４５】
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分（二本鎖核酸分子）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分（二本鎖核酸分子）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。【００４６】
前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分（二本鎖核酸分子）の量として、１〜１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。【００４７】
前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。中でも、前記医薬は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、腎癌細胞の増殖を阻害し、前記癌細胞の増殖による腫瘍の増大を防ぐ効果に優れることから、前記医薬は前記疾患の出来る限り早期の段階に投与されることが望ましいと考えられる。【００４８】
＜予防／治療方法＞
前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤を含むので、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを患う個体に投与することにより、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、腎癌細胞の増殖を効果的に抑制し、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記癌細胞増殖抑制剤を投与することを特徴とする、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかに対する予防乃至治療方法にも関する。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００５０】
（実施例１：二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の作製）
ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための本発明の二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、以下のようにして準備した。
ＡＰＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＰＰ−Ａ，ｓｉＡＰＰ−Ｂ）と、ＥＢＡＧ９遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１）は、それぞれのｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列（以下に記載）とその相補的な配列を、３’末端が２塩基オーバーハングするようなＲＮＡの二本鎖として合成した（ＲＮＡｉ社）。また、ＥＢＡＧ９遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＢＡＧ９Ｃ）は、ｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列（以下に記載）とその相補的な配列からなるＲＮＡの二本鎖であり、３’末端に２塩基のオーバーハングを有するもので、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社より購入した。前記ｓｉＥＢＡＧ９Ｃについては、本発明者らにより既に報告されている（Ｏｇｕｓｈｉ  Ｔ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ，Ｕｒａｎｏ  Ｔ，Ｈｏｒｉｅ−Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｊ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｏｕｃｈｉ  Ｙ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ９  ｉｓ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：３７００−３７０６，２００５．）。
また、ネガティブコントロールとして使用したｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）は、ＲＮＡｉ社にて合成した。【００５１】
それぞれのｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列、及び対応する配列番号を以下に示す。
ｓｉＡＰＰ−Ａ：  ５’−ＧＡＵＣＣＡＵＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＣＣ−３’（配列番号：１）
ｓｉＡＰＰ−Ｂ：  ５’−ＧＵＵＣＣＵＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡＡＡＵＵＣ−３’（配列番号：２）
ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１：  ５’−ＣＵＣＡＵＵＣＣＵＡＡＡＧＡＧＡＵＵＡＡＵ−３’（配列番号：１５）
ｓｉＥＢＡＧ９Ｃ：  ５’−ＡＡＧＡＡＧＡＵＧＣＡＧＣＣＵＧＧＣＡＡＧ−３’（配列番号：２２）
ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ：  ５’−ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ−３’（配列番号：２３）【００５２】
（実施例２：ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける標的遺伝子発現抑制効果の検討）
前記実施例１で得られた各ｓｉＲＮＡを、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌由来の培養細胞にトランスフェクションし、４８時間後に蛋白質サンプルを回収してウエスタンブロット解析を行うことにより、各ｓｉＲＮＡの、各培養細胞におけるＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。実験方法の詳細を以下に示す。【００５３】
［細胞］
前記細胞として、以下の細胞を使用した。
前立腺癌細胞  ・・・  ヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）
膀胱癌細胞  ・・・  ヒト膀胱癌由来ＥＪ細胞（入手元：ＪＣＲＢ細胞バンク、Ｎｏ．ＪＣＲＢ０７１０）
肺癌細胞  ・・・  Ａ５４９細胞（入手元：ＪＣＲＢ細胞バンク、Ｎｏ．ＪＣＲＢ００７６）
大腸癌細胞  ・・・  ＤＬＤ−１細胞（入手元：ＪＣＲＢ細胞バンク、Ｎｏ．ＪＣＲＢ９０９４）
肝癌細胞  ・・・  ＨｅｐＧ２細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＨＢ−８０６５）
乳癌細胞  ・・・  ＭＣＦ−７細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＨＴＢ−２２）
皮膚癌細胞（メラノーマ細胞）  ・・・  ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞（入手元：ＲＣＢ細胞バンク、Ｎｏ．ＲＣＢ１９３０）
腎癌細胞  ・・・  ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞（入手元：ＪＣＲＢ細胞バンク、Ｎｏ．ＪＣＲＢ０８２７）
子宮癌細胞  ・・・  ヒト子宮内膜癌由来Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４（国立霞ヶ浦病院  西田正人氏より供与いただいた。）【００５４】
［細胞培養］
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク）で、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。
ＥＪ細胞、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞、及びヒト子宮内膜癌由来Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４は、１０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂａｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）で、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。【００５５】
［トランスフェクション］
６穴プレートに、コンフルエントの３０〜５０％の細胞密度となるように各細胞をまき、その翌日に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付されるプロトコールに従ってｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、ｓｉＡＰＰ−Ａ及びｓｉＡＰＰ−Ｂは培地中に５０ｎＭ、又は２００ｎＭとなるように調整した。ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１及びｓｉＥＢＡＧ９Ｃは、培地中に０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、又は２００ｎＭとなるように調整した。
ｓｉＲＮＡ添加４８時間後に、４×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．５、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４％  ＳＤＳ、４％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて細胞を回収し、１００℃で１５分間ボイルした。得られたサンプルのＯＤ２８０ｎｍを測定し、ＢＳＡの検量線を用いて蛋白質濃度を算出した。【００５６】
［ウエスタンブロット解析］
タンパク質の質量を同一にしたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へブロッティングした。蛋白質の検出は、１次抗体として、ＡＰＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）或いはＥＢＡＧ９抗体を、２次抗体として、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により行った。前記ＥＢＡＧ９抗体としては、本発明者により作製された抗体を用いた（Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｆ，Ｉｋｅｄａ  Ｋ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｏ，Ｈｉｒｏｉ  Ｈ，Ｍｏｍｏｅｄａ  Ｍ，Ｔａｋｅｔａｎｉ  Ｙ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＥＢＡＧ９，ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００１；２８４（１）：２−１０．）
その後、Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７、２％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて抗体を除去後、ローディングコントロールとして、一次抗体β−ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ）、二次抗体ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。【００５７】
〔結果〕
本実施例２の結果を、図１〜図３Ｂ、及び図８Ａ〜図１４Ｂに示す。
ＡＰＰの蛋白質発現については、ＬＮＣａＰ細胞では、ｓｉＡＰＰ−Ａ及びｓｉＡＰＰ−Ｂにおいて共に高いノックダウン効果が認められた（図１）。特に、ｓｉＡＰＰ−Ｂにおいて、ノックダウン効果は高く、ＡＰＰの発現を示すバンドは完全に消失した。
ＥＪ細胞においても、ｓｉＡＰＰ−Ｂにおいて高いノックダウン効果が認められた（図２）。また、ｓｉＡＰＰ−Ａにおいても、高いノックダウン効果が認められた（図示せず）。
また、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４、ＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞においても、ｓｉＡＰＰ−Ｂにおいてノックダウン効果が認められた（図８Ａ、図９Ａ、図１０Ａ、図１１Ａ、図１２Ａ、図１３Ａ、図１４Ａ）。【００５８】
ＥＢＡＧ９の蛋白質発現については、ＥＪ細胞では、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１において高いノックダウン効果が認められた（図３Ａ）。
更に、それぞれのｓｉＲＮＡを０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭの濃度でトランスフェクションしたサンプルにおいて、ＥＢＡＧ９の発現量を定量化し、検量線を用いて解析したところ、ＥＢＡＧ９の発現量を５０％に抑制するｓｉＲＮＡの濃度は、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１で１．３ｎＭであったが、ｓｉＥＢＡＧ９Ｃは９．４ｎＭであり、約１０倍の差が認められた（図３Ｂ）。したがって、ＥＢＡＧ９のノックダウン効果は、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１の方が、ｓｉＥＢＡＧ９Ｃより、顕著に優れていることが明らかとなった。
また、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４、ＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞においても、ｓｉＢＡＧ９ＮＥＷ−１においてノックダウン効果が認められた（図８Ｂ、図９Ｂ、図１０Ｂ、図１１Ｂ、図１２Ｂ、図１３Ｂ、図１４Ｂ）。
また、ＥＢＡＧ９に対するｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腎癌の腫瘍形成を抑制することが報告されており（Ｏｇｕｓｈｉ  Ｔ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ，  Ｕｒａｎｏ  Ｔ，  Ｈｏｒｉｅ−Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，  Ｋｕｍａｇａｉ  Ｊ，  Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｏｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｓ：  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ９  ｉｓ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：３７００−３７０６，  ２００５．）、ＥＢＡＧ９のノックダウン効果がｓｉＥＢＡＧ９Ｃより顕著に優れているｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１は、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌においても、腫瘍の増殖を抑制することが示唆された。【００５９】
（実施例３：ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果の検討）
前記実施例１で得られた各ｓｉＲＮＡについて、ヌードマウスの皮下に移植した腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を検討した。実験方法の詳細を以下に示す。なお、細胞培養は、前記実施例２と同様の手法により行った。【００６０】
［ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験］
−ＡＰＰ遺伝子の発現抑制を介した腫瘍増殖抑制実験−
５週齢、オスのヌードマウスＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ（日本クレア）を各群１０匹ずつ用意し、皮下に腫瘍細胞を移植した。移植する細胞は、ＬＮＣａＰ細胞（３×１０６ｃｅｌｌｓ／匹）若しくはＥＪ細胞（３×１０６ｃｅｌｌｓ／匹）と、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを混合し、合計１５０μｌ／匹となるように調整した。
移植後１週目から週２回、ｓｉＡＰＰ−Ｂ若しくはｓｉＣｏｎｔｒｏｌを皮下の腫瘍に直接注入した。注入するｓｉＲＮＡ  ５μｇ／匹に、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）４μｌ／匹、及び、ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭを混合し、ｔｏｔａｌ  ５０μｌ／匹に調整した。
移植から７．５週後までの間、腫瘍径を週２回計測し、腫瘍体積を〔０．５×長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）〕の式により算出した。結果を図４及び図５に示す。【００６１】
−ＥＢＡＧ９遺伝子の発現抑制を介した腫瘍増殖抑制実験−
５週齢、オスのヌードマウスＢＡＬＢ／  ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ（日本クレア）を各群４匹ずつ用意し、皮下に腫瘍細胞を移植した。移植する細胞は、ＥＪ細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ／匹）と、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを混合し、合計１００μｌ／匹となるように調整した。移植後から腫瘍径を週２回計測し、腫瘍体積を〔０．５×長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）〕の式により算出した。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点から週２回、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１若しくはｓｉＣｏｎｔｒｏｌを、皮下の腫瘍に直接注入した。注入するｓｉＲＮＡ  １０μｇ／匹に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ２μｌ／匹、及び、ＲＰＭＩ  １００μｌ／匹を混合し、投与した。ｓｉＲＮＡを投与してから４週後までの間、腫瘍径を週２回計測し、腫瘍体積を〔０．５×長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）〕の式により算出した。結果を図６及び図７及びに示す。【００６２】
〔結果〕
ＬＮＣａＰ細胞においては、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群では、腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、ｓｉＡＰＰ−Ｂ群では、腫瘍体積は著しく小さくなり、移植後８週での腫瘍体積は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群の体積のおよそ六分の一ほどにまで抑制された（図４）。また、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１群では、腫瘍体積は減少し、移植後６週での腫瘍体積は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群の体積のおよそ二分の一ほどにまで抑制された（図６）。
ＥＪ細胞においては、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群では、腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、ｓｉＡＰＰ−Ｂ群では、腫瘍体積は著しく小さくなり、移植後５週での腫瘍体積は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群の体積のおよそ三分の一ほどにまで抑制された（図５）。また、ｓｉＥＢＡＧ９ＮＥＷ−１群では、腫瘍体積は減少し、移植後４週での腫瘍体積は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群の体積のおよそ二分の一以下にまで抑制された（図７）。【００６３】
（実施例４：ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
Ａ５４９細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ．７４、ＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞に、前記実施例１で得られたｓｉＡＰＰ−Ｂ、又はｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクションし、その後の細胞増殖速度を測定することにより、ｓｉＡＰＰ−Ｂの、各培養細胞における細胞増殖抑制効果を検討した。実験方法の詳細を以下に示す。【００６４】
ｓｉＡＰＰ−Ｂ、又はｓｉＣｏｎｔｒｏｌのトランスフェクション前日に各細胞を２４穴プレートに、１穴当たり４，０００個ずつまいた。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＮ(Ｇｉｂｃｏ)２５０μｌ／穴と、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μｌ／穴を混合し、５分間、３７℃でインキュベートした。前記インキュベートした溶液を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＮ  ２５０μｌ／穴とｓｉＲＮＡ(最終濃度２００ｎＭ)との混合液に加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートした後、２４穴プレートに添加した。
ｓｉＲＮＡ添加１日後、及び２日後に、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ、ナカライテスク）を用いて呈色反応を行い、吸光度（４５０ｎｍ）を測定して細胞数を定量化した。
なお、細胞培養は、前記実施例２と同様の手法により行った。【００６５】
［結果］
本実施例４の結果を図１５〜図２１に示す。
図１５〜図２１に示されるように、Ａ５４９細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ.７４、ＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−ＭＥＬ  ２８細胞、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ細胞のいずれの細胞においても、ｓｉＡＰＰ−Ｂをトランスフェクションしたことにより、有意に細胞の増殖が抑制された。そのため、ｓｉＡＰＰ−Ｂは、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌においても、腫瘍の増殖を抑制すると考えられた。【００６６】
以上の実施例１〜実施例４により、本発明の二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）が、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌におけるＡＰＰ遺伝子、ＥＢＡＧ９遺伝子の発現に対して高い抑制効果を有することが示された。特に、ＡＰＰ遺伝子が前立腺癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の腫瘍形成に関与することは、従来知られていなかったが、実施例１〜実施例４によりはじめて明らかとなった。
更に、これらの二本鎖核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示されたことから、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌を予防乃至治療するための医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の二本鎖核酸分子は、ＡＰＰ遺伝子及びＥＢＡＧ９遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介し、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の増殖を効果的に抑制することができるので、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌に対する優れた医薬の有効成分として有用である。また、本発明の二本鎖核酸分子を有効成分とする医薬は、特に、前立腺癌に対する医薬として用いる場合に、アンドロゲンに作用する抗アンドロゲン製剤等の従来の薬剤と比較して、よりアンドロゲン作用経路の下流において作用するため、より副作用の少ない医薬となり得ることが期待される。
【図１】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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