(57)【要約】  本発明は、アルギン酸産生能を有する藻類の、工業的かつ効率的な培養方法と、工業的に有利なアルギン酸含有組成物の製造方法を提供することを課題とする。本発明に係る藻類の培養方法は、パラクロレラ（Parachlorella）属に属し且つアルギン酸産生能を有する藻類を、従属栄養的に培養する工程を含むことを特徴とする。また、本発明に係るアルギン酸含有組成物の製造方法は、当該培養方法によって得られる藻類の培養物から、アルギン酸含有組成物を取得する工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラクロレラ（Parachlorella）属に属し且つアルギン酸産生能を有する藻類を、従属栄養的に培養する工程を含むことを特徴とする藻類の培養方法。
【請求項２】
パラクロレラ（Parachlorella）属に属する藻類が、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
平均照度が７００Ｌｕｘ未満の暗条件下で藻類を培養する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
液状培地で藻類を培養し、且つ、当該液状培地中の有機化合物の総使用量を、培養開始時点の当該液状培地量１Ｌに対し、炭素原子の重量に換算して２．５ｇ以上にする請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の方法によって得られる藻類の培養物から、アルギン酸含有組成物を取得する工程を含むことを特徴とするアルギン酸含有組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を乾燥したものであり、１ｋｇあたりのアルギン酸含量が４０ｇ以上であることを特徴とする藻体乾物。
【請求項７】
請求項５に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する汚泥削減剤。
【請求項８】
請求項５に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する有害物質吸着剤。
【請求項９】
請求項５に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する飼料。
【請求項１０】
請求項５に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する食品。
【請求項１１】
請求項５に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラクロレラ属に属し、且つ、アルギン酸産生能を有する藻類の培養方法に関する。また、本発明は、工業的に有利なアルギン酸含有組成物の製造方法に関する。さらに本発明は、当該製造方法で得られたアルギン酸含有組成物から得られる藻体乾物、当該アルギン酸含有組成物を含む汚泥削減剤、有害物質吸着剤、飼料、食品および医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は、褐藻類や一部の紅藻の細胞間及び細胞壁に含まれる粘性多糖類であり、２種類のウロン酸、すなわちＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸が種々の割合で結合しているポリウロニド多糖である。アルギン酸又はその塩は、増粘安定剤、ゲル化剤として、食品添加物、医薬品、化粧品、歯科用材料等に広く利用されているだけでなく、食物繊維の一種であることから機能性食品としても注目されている。さらに、アルギン酸の中でも特に、アルギン酸オリゴマーと称される低分子量のアルギン酸は、種々の生理活性を有することが報告されている（非特許文献１）。【０００３】
従来、アルギン酸やその塩は、コンブ、ワカメ等の褐藻類より抽出、精製することで工業的に製造されてきた。しかし、これら褐藻類を原料とする製法には、原料の安定供給に問題がある。また、アルギン酸オリゴマーの製法としては、褐藻類から得られる高分子量のアルギン酸を原料として、アルギン酸分解能を有する酵素又は細菌を作用させて低分子量化する方法（特許文献１、２）や、該高分子量のアルギン酸を加圧下に熱処理して低分子量化する方法（特許文献３、４）等が知られている。 しかし、前者の方法は、酵素又は細菌を使用するために多大なコストがかかるうえ、低濃度の水溶液で長時間反応を行う必要があることから、工業的に不利である。また、後者の加圧熱処理法にも、高価な圧力容器を必要とするという設備上の問題がある。【０００４】
最近、アルギン酸、特に比較的低分子量のアルギン酸の産生能を有する新規なパラクロレラ属の藻類が見いだされ、これを培養することで、その培養液からアルギン酸を得る方法が報告されている（特許文献５）。さらに、当該アルギン酸を含有する藻類の藻体乾燥物を用いた、汚泥削減方法も報告されている（特許文献６）。これら特許文献には、当該新規藻類は光要求性と記載され、実際に開示されている当該藻類の培養方法はいずれも、当該藻類の光合成能を利用した独立栄養的培養である。【０００５】
藻類は、一般に、その光合成能を利用した独立栄養的培養が可能である。独立栄養的培養は、日光等の自然光が利用でき、炭素源やエネルギー源を培地に添加する必要がないという利点を有している一方、天候、季節等により光の照射量が変化し、また設備面では培養液が微生物等の汚染を受けやすいという問題も有している。これらの問題を解決するために、完全閉鎖系で電気照明などの人工光を照射して培養する方法もあるが、高価な設備が必要な上、多量の電気エネルギーが必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−３０３４６８号公報
【特許文献２】特開平５−１５３８７号公報
【特許文献３】特開平６−７０９３号公報
【特許文献４】特開２００６−３２０３２０号公報
【特許文献５】ＷＯ２０１０−０２４３６７号公報
【特許文献６】特許第４５７３１８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本食品化学学会誌  17巻  27-35頁（2010年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の状況を鑑み、本発明では、アルギン酸産生能を有する藻類の、工業的かつ効率的な培養方法の提供を課題とする。さらには、アルギン酸含有組成物の工業的に有利な製法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、従来、光を必要とする独立栄養的な培養方法しか知られていないアルギン酸産生能を有するパラクロレラ属に属する藻類が、意外にも従属栄養的に高効率で培養し得ること、さらには、従属栄養的に培養した当該藻類の培養物が、独立栄養的に培養した場合よりも多量のアルギン酸を蓄積し得ることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
本発明を以下に示す。【００１１】
［１］  パラクロレラ（Parachlorella）属に属し且つアルギン酸産生能を有する藻類を、従属栄養的に培養する工程を含むことを特徴とする藻類の培養方法。【００１２】
［２］  パラクロレラ（Parachlorella）属に属する藻類が、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９である、上記［１］に記載の方法。【００１３】
［３］  平均照度が７００Ｌｕｘ未満の暗条件下で藻類を培養する上記［１又は［２］に記載の方法。【００１４】
［４］  液状培地で藻類を培養し、且つ、当該液状培地中の有機化合物の総使用量を、培養開始時点の当該液状培地量１Ｌに対し、炭素原子の重量に換算して２．５ｇ以上にする上記［１］〜［３］の何れかに記載の方法。【００１５】
［５］  上記［１］〜［４］の何れかに記載の方法によって得られる藻類の培養物から、アルギン酸含有組成物を取得する工程を含むことを特徴とする、アルギン酸含有組成物の製造方法。【００１６】
［６］  上記［５］に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を乾燥したものであり、１ｋｇあたりのアルギン酸含量が４０ｇ以上であることを特徴とする藻体乾物。【００１７】
［７］  上記［５］に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する汚泥削減剤。【００１８】
［８］  上記［５］に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する有害物質吸着剤。【００１９】
［９］  上記［５］に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する飼料。【００２０】
［１０］  上記［５］に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する食品。【００２１】
［１１］  上記［５］に記載の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物を含有する医薬品。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、培養中に光を供給することなく、汎用的な微生物培養槽を使用して、アルギン酸産生能を有する藻類を効率的に増殖させることが可能となり、さらには、工業的且つ効率的なアルギン酸含有組成物の製造方法が提供できる。本発明の方法で得られるアルギン酸含有組成物は、アルギン酸を多く含み、汚泥削減剤、有害物質吸着剤、飼料、食品、または、医薬品の原料として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に係る藻類の培養方法は、アルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養する工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明において使用する藻類は、アルギン酸産生能を有し、且つ、パラクロレラ属に属する藻類である。
【００２５】
パラクロレラ属藻類は、かつてトレボキシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）のクロレラ属に分類されていたが、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよび１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いた分子系統学的解析によれば、トレボキシア藻綱に属する他のクロレラ属藻類とは別のグループを形成するものであるため、クロレラ属藻類とは異なる独立した属として認められたものである。
【００２６】
パラクロレラ属に属する藻類としては、例えば、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）、パラクロレラ・ケセリ（Parachlorella kessleri）、パラクロレラ・バイエリンキー（Parachlorella beijerinckii）等の藻類が挙げられるが、これらに限定されず、生物学的種が同定されていない藻類についても、パラクロレラ属またはその類縁に属し且つアルギン酸産生能を有する限りにおいて、本発明に使用し得る。
【００２７】
ここで、パラクロレラ属の類縁に属する藻類は、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよび１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いた分子系統学的解析により得られる分子系統樹においてパラクロレラ属に隣接する属に属する藻類をいう。すなわち、アルギン酸産生能を有し、且つ、クロステリオプシス（Closteriopsis）属、ディクロスター（Dicloster）属、またはマリニクロレラ（Marinichlorella）属に分類される藻類であれば、本発明において用いることができる。
【００２８】
また、本発明で使用する藻類は、従来、従属栄養的に培養できることが知られていないものであってもかまわない。すなわち、光合成能を有し、従来、独立栄養的に培養されていたものであっても、従属栄養的に培養可能であり且つアルギン酸産生能を有するものであれば、本発明で用いることができる。
【００２９】
一般的に、パラクロレラ属藻類は、野外で採取した淡水サンプルから、一般的な培地を使った継代培養により藻類のコロニーを分離し、最終的に分子系統学的解析により属種を特定することにより得ることができる。
【００３０】
本発明において使用する藻類は、アルギン酸の産生能を有する。アルギン酸は、パラクロレラ属藻類から細胞外へ分泌されるものであってもよいし、細胞内に蓄積されるものであってもよい。パラクロレラ属藻類の培養液または当該培養液のホモジェネートからアルギン酸が検出された場合には、当該パラクロレラ属藻類はアルギン酸産生能を有するものと判断する。
【００３１】
アルギン酸は、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸が任意に重合したものである。通常、その重合度、すなわちアルギン酸を構成する単糖単位の数は８０以上、１１００以下程度であり、分子量は１５，０００以上、２００，０００以下程度である。しかし、本発明においては、より低分子量のいわゆるアルギン酸オリゴマーもアルギン酸に含めるものとする。アルギン酸オリゴマーの重合度は３以上、１０以下程度であり、分子量は５００以上、２０００以下程度である。
【００３２】
本発明において、アルギン酸とは、遊離のアルギン酸だけでなくその塩（ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩など）も含まれる。本発明の培養方法によって生産されたアルギン酸は、例えば、ナフトレゾルシノール呈色反応法（食品衛生学雑誌第３９巻５号２９７頁（1998年））を用いて定量し得る。また、本発明においては、アルギン酸の定量値として、アルギン酸ナトリウム量に換算した量として表示する。
【００３３】
本発明において使用する藻類の好ましい具体例としては、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株を挙げることができる。ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：  日本国  茨城県つくば市１丁目１番地１  中央第６
（ｉｉ）  受託日：  ２００８年２月２８日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５１３
（ｉｖ）  国際受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９
（ｖ）  国内寄託から国際寄託への移管日：  ２００８年５月２３日
本発明においてはアルギン酸産生能を有し且つパラクロレラ属に属する藻類として、上記パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株以外に、その変異株や交雑株なども好適に利用できる。
【００３４】
本発明で用い得るＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株の変異株とは、何らかの変異を表したＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株であって、アルギン酸産生能を維持しているものをいう。また、本発明で用い得るＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株の交雑株とは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株と分類上同種であるが、類縁関係が比較的遠い株とＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株とを交配して得た株であり、アルギン酸産生能を維持しているものをいう。
【００３５】
なお、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株は、一般的なクロレラ属藻類に比べて乾燥重量当たり２倍以上のクロロフィルを含んでおり、光合成能力が非常に高いため、従来、当然に独立栄養的に培養されていた。しかし本発明者らは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９株をあえて従属栄養的に培養することにより、アルギン酸を極めて効率的に産生せしめ得ることを見出した。
【００３６】
本発明において、従属栄養的に培養するとは、暗条件下において、エネルギー源および／または炭素源として有機化合物を含有する培地を用いて、培養することを意味する。但し、培地中にエネルギー源および／または炭素源として利用されるのに十分な量の有機化合物が含まれており、光合成を必要としない条件であれば、明条件下で培養してもかまわない。
【００３７】
本発明における暗条件下とは、藻類細胞の増殖に必要な量の光を培養液に照射しない条件を意味する。具体的には、培養液中の平均照度が７００Ｌｕｘ未満、好ましくは３００Ｌｕｘ未満、より好ましくは１００Ｌｕｘ未満、さらに好ましくは１０Ｌｕｘ未満、さらに好ましくは１Ｌｕｘ未満である条件を指す。また、一般に使用される遮光手段を利用したり、従属栄養的培養で一般的に使用される培養槽を用いることで、上記平均照度の条件を事実上満たす培養を実施することもできる。なお、培地および増殖する藻類細胞により光が減衰するため、培養液中の照度は光源からの距離、藻類細胞の密度等に依存して変化するが、培養液中の平均照度は、例えば、培養中と同様の環境に置かれた培養液中の複数箇所の照度を測定し、その平均値として算出し得る。照度の測定は、少なくとも培地の表面と最深部を含む２箇所以上、１２箇所以下で測定することが好ましい。
【００３８】
本発明において、アルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養する際にエネルギー源および／または炭素源として用いられる有機化合物は、当該藻類が資化可能な有機化合物であれば特に限定されないが、例えば、グルコース、ガラクトース、シュクロース、キシロース、マルトース、セロビオース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、種々のオリゴ糖、デンプン等の炭水化物類；メタノール、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のアルコール類；クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸等の有機酸類；グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、プロリン、リジン、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、トリプトファン、スレオニン、メチオニン等のアミノ酸類；その他植物油脂や脂肪酸などの油脂類等が挙げられる。これらの有機化合物は、単独で用いても、任意の組合せで用いてもよい。また、これらの有機化合物は必ずしも精製されたものを用いる必要はなく、糖蜜、乳清、澱粉加水分解物等の未精製原料もエネルギー源および／または炭素源として用い得る。
【００３９】
本発明において、アルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養する際、エネルギー源および／または炭素源として培地に添加する有機化合物の総量（培養中に培地の追加や流加を行う場合はその合計量）は、従属栄養的培養が可能な量であれば特に限定されないが、当該有機化合物に含まれる炭素原子の重量に換算して、培養開始時点の培地液量１Ｌに対して、例えば２.５ｇ以上、好ましくは３ｇ以上、より好ましくは５ｇ以上、さらに好ましくは８ｇ以上、さらにより好ましくは１０ｇ以上、特に好ましくは５０ｇ以上である。
【００４０】
本発明において、アルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養する際に用いられる培地は、アルギン酸産生能を有する藻類が従属栄養的に増殖可能である限り特に限定されないが、エネルギー源および／または炭素源として用いる上記の有機化合物以外に、例えば、窒素源、リン源、ミネラル類などから構成されるもので、ビタミン類や消泡剤、ｐＨ調整剤等をさらに含んでもよい。前記窒素源としては、例えば、アンモニアおよびその塩、尿素、硝酸およびその塩、アミノ酸類等が挙げられる。前記リン源としては、例えば、リン酸およびその塩、ポリリン酸等が挙げられる。前記ミネラル類としては、例えば、マンガン、亜鉛、銅、ナトリウム、カリウム、鉄、カルシウム、および、モリブデン等の金属の塩の他、ホウ酸等が挙げられる。前記ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸、ビオチン、および、これらの前駆体や誘導体が挙げられる。窒素源、リン源、ミネラル類、ビタミン類、および、その他の培地成分は、必ずしも精製されたものを用いる必要はなく、例えば酵母エキス、ペプトン等の天然成分も利用出来る。また、上記成分は、任意の組合せで用い得る。
【００４１】
本発明において、アルギン酸産生能を有する藻類の従属栄養的培養は、上述のエネルギー源および／または炭素源となる有機化合物、窒素源、ミネラル類、ビタミン類、その他の成分から構成される培地を入れた容器に、アルギン酸産生能を有する藻類を接種し、好ましくは通気および／または撹拌しながらインキュベートすることにより実施し得る。培養温度は１０℃〜５０℃の範囲が好ましく、２０℃〜４０℃の範囲がより好ましく、２５℃〜３０℃の範囲がさらに好ましい。培養温度が１０℃未満、または、５０℃を超える条件では、アルギン酸産生能を有する藻類の増殖速度が著しく低下するので、工業的な培養としては適さない。培養中のｐＨは３．０〜１０．０の範囲が好ましく、４．０〜９．０の範囲がより好ましく、５．０〜８．０の範囲がさらに好ましい。培養中のｐＨが３．０未満、または、ｐＨが１０．０を超える条件では、アルギン酸産生能を有する藻類の増殖速度が著しく低下するので、工業的な培養としては適さない。
【００４２】
本発明において、アルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養する際に用いる上記培地の成分は、培養開始前に一括して添加しても、培養中に分割および／または連続的に添加してもよい。しかしながら、エネルギー源および／または炭素源となる有機化合物は、培養液中の藻類細胞密度を高めるために多量に必要となるため、分割および／または連続的に添加することが好ましい。この場合、エネルギー源および／または炭素源として用いる有機化合物の培養液中の濃度は、当該有機化合物に含まれる炭素原子の重量に換算して３２ｇ／Ｌ以下に維持することが好ましく、より好ましくは１６ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは８ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４ｇ／Ｌ以下である。
【００４３】
本発明の方法で得られるアルギン酸産生能を有する藻類の培養液は、必要に応じて、引き続き、エネルギー源および／または炭素源となる有機化合物を含まない培地で培養することもできる。このときは暗条件下でも明条件下でもどちらでもかまわない。当該２段階培養を経た培養物は、特に、汚泥削減剤または有害物質吸着剤の原料として好適に用い得る。
【００４４】
また、本発明で用いる藻類の量を確保することを目的として、当該藻類を前培養してもよい。かかる前培養は、暗条件下でも明条件下でもどちらの条件下で行ってもかまわない。
【００４５】
本発明の培養方法によれば、従来の独立栄養培養法に比べて培養液あたりの藻体収量を大幅に高めることができ、アルギン酸の収量を向上させることができる。本発明の方法で得られる、アルギン酸産生能を有する藻類の培養液は、培養終了時点において培養液１Ｌあたり、好ましくは２ｇ以上、より好ましくは３ｇ以上、さらに好ましくは５ｇ以上、さらにより好ましくは１０ｇ以上、特に好ましくは５０ｇ以上の藻体乾物を含み得る。
【００４６】
なお、培養液中の藻体乾物濃度は、例えば、以下の方法で測定できる。一定量の培養液を採取し、遠心分離して培養上清を除く。得られた藻体を培養液と等量の水に再懸濁し、再度遠心分離して洗浄液を除く。水洗した藻体を恒量となるまで乾燥し、重量を求める。乾燥藻体の恒量重量を採取した培養液量で除して、藻体乾物濃度を算出する。
【００４７】
更に、驚くべきことに、本発明の培養方法によれば、藻体あたりのアルギン酸生産性をも高めることができる。本発明の培養方法によれば、アルギン酸ナトリウム量換算で、藻体乾物１ｋｇあたりの生産性は、通常４０ｇ以上、好ましくは５０ｇ以上、より好ましくは１００ｇ以上、特に好ましくは１５０ｇ以上である。
【００４８】
本発明の培養方法によれば、上述の培養液あたり藻体収量の向上と、藻体あたりのアルギン酸生産性の向上とが相俟って、従来の独立栄養培養法と比べ、培養液あたりのアルギン酸生産性が飛躍的に向上する。本発明の培養方法では、培養終了時点において培養液１Ｌあたり、アルギン酸ナトリウム量に換算して、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは５００ｍｇ以上、さらにより好ましくは１０００ｍｇ以上、特に好ましくは５０００ｍｇ以上のアルギン酸を蓄積し得る。
【００４９】
また、本発明は、上記本発明の培養方法によって得られる培養物から、アルギン酸含有組成物を取得する工程を含むことを特徴とする、アルギン酸含有組成物の製造方法でもある。言い換えれば、パラクロレラ属に属し且つアルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養し、得られた培養物を利用するアルギン酸含有組成物の製造方法もまた本発明の範疇である。
【００５０】
本発明におけるアルギン酸含有組成物は、アルギン酸および／またはその塩を含有する組成物であれば特に限定されず、アルギン酸以外に藻類由来の成分や藻体あるいはその破砕物などを含有するものであってもかまわないし、藻体などを除去してアルギン酸自体を高純度に含有するものでもかまわない。すなわち、本発明の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物としては、例えば、アルギン酸産生能を有する藻類を培養して得られる培養液そのもの、当該培養液から得られる藻体、培養液中の藻体濃度を高めた濃縮培養液、および／または、当該培養液から藻体を除去した培養上清等のいずれも該当する。また、当該培養液、藻体、濃縮培養液および／または培養上清に、必要に応じて乾燥、精製等の処理を施すことにより、アルギン酸および／またはその塩の含有量を高めた、当該処理物も、本発明の製造方法で得られるアルギン酸含有組成物に含まれる。なお、アルギン酸含有組成物を、後述する汚泥削減剤又は有害物質吸着剤として利用する場合は、アルギン酸含有組成物としてアルギン酸以外に藻体あるいはその破砕物などを含有するものが好ましい。
【００５１】
本発明において、アルギン酸産生能を有する藻類を従属栄養的に培養して得られる培養物から、アルギン酸含有組成物を取得する方法は特に限定されないが、例えば、上記本発明の培養方法で培養することによりアルギン酸を含有する培養液が得られ、該培養液に遠心分離、濾過等の操作を施すことによりアルギン酸を含有する培養上清、濃縮培養液、および／または、藻体を分取することが出来る。これら培養液、培養上清、濃縮培養液、および／または、藻体を、必要に応じて、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧乾燥等の手法により乾燥することも出来る。さらに、公知の手法を単独または組み合わせて用いることにより、培養液、培養上清、濃縮培養液、藻体、および／または、それらの乾燥物から、より高濃度のアルギン酸含有組成物を製造できる。例えば、培養上清に硫酸等の酸を添加し、不溶化したアルギン酸を遠心分離、濾過等の手法で分取する方法、培養上清に塩化カルシウム等の金属塩を添加し、ゲル化したアルギン酸を遠心分離、濾過等の手法で分取する方法、培養上清にエタノール、アセトン、イソプロパノール等の水溶性有機溶媒を添加し、不溶化したアルギン酸を遠心分離、濾過等の手法で分取する方法等を用い得る。また、例えば、藻体を炭酸ナトリウム水溶液等のアルカリ性水溶液で洗浄および／または抽出し、遠心分離、濾過等の手法で不溶物を除去することで、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸塩を藻体から分取し得る。さらに、分取したアルギン酸塩の水溶液を、例えば、前述の培養上清の場合と同様に処理することで、より高濃度のアルギン酸含有組成物を製造できる。
【００５２】
さらに、本発明は、上記本発明の製造方法によって得られるアルギン酸含有組成物を含有する汚泥削減剤または有害物質吸着剤にも関する。
【００５３】
本発明において、汚泥削減剤とは、活性汚泥法による有機排水の処理において、活性汚泥に添加することで、最終的に生じる余剰汚泥の量を低減する効果のある組成物を指す。
【００５４】
本発明に係る汚泥削減剤の使用条件は適宜調整すればよいが、例えば、汚泥１トンに対して、本発明に係る汚泥削減剤を、乾燥状態に換算して２０ｇ以上、２００ｇ以下程度添加すればよい。添加後は、十分な溶存酸素量を確保するために混合物を攪拌するかバブリングすることが好ましい。処理温度は常温でかまわない。処理時間は、処理すべき汚泥の量などにもよるが、１０時間以上、１０日間以下とすることができる。
【００５５】
有害物質吸着剤とは、汚染物と接触せしめることにより汚染物中の有害物質を吸着し、その後、汚染物から分離することで、汚染物中の有害物質の一部または全部を除去するために使用される組成物を指す。有害物質としては、例えば、セシウム１３７、セシウム１３４、ストロンチウム８９、ストロンチウム９０、ストロンチウム９１、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３等の放射性元素；鉛、銅、カドミウム、砒素等の重金属類；これらを含む化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に係る有害物質吸着剤の使用条件は、上記汚泥削減剤の使用条件に準じて調整すればよい。
【００５６】
本発明において、アルギン酸含有組成物を含有する汚泥削減剤または有害物質吸着剤を製造する方法は特に限定されないが、例えば、本発明の培養方法によって得られる培養物を、必要に応じてさらにエネルギー源および／または炭素源となる有機化合物を含まない培地で培養し、その後濃縮や乾燥を行うことで本発明の製造方法により得られるアルギン酸含有組成物とし、それをそのまま、あるいは適宜加工して利用できる。
【００５７】
また、本発明は、上記本発明の製造方法によって得られるアルギン酸含有組成物を含有する飼料、食品、または、医薬品にも関する。
【００５８】
本発明において、食品とは、栄養素の摂取や嗜好を目的としてヒトが摂取する物をいい、常食される一般食品以外に、栄養補助剤や特定保険用食品などのサプリメント、食品添加物等も包含される。
【００５９】
本発明における飼料とは、栄養素の摂取を主な目的としてヒト以外の生物が摂取する物をいう。例えば、魚類、甲殻類、貝類等の水産動物；ニワトリ、ウズラ、アヒル等の家禽類；牛、豚、羊等の畜産動物；犬、猫等の愛玩動物等に与える飼料、飼料添加物、またはサプリメント等を指すが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明における医薬品とは、ヒトやその他の動物の疾患や症状を予防または治療に用いるものをいう。
【００６１】
本発明の製造方法によって得られるアルギン酸含有組成物は、粉末剤、錠剤、カプセル剤等に適宜加工したり、食品原料や飼料原料と混合することで、これら飼料、食品、医薬品として利用できる。本発明のアルギン酸含有組成物を含有する飼料、食品、または、医薬品は、アルギン酸の物理的性質を利用して食品や製剤に粘性やとろみをつけるのに用いたり、食物繊維を含有する組成物としても利用出来る他、高血圧の予防・治療、血中コレステロールの抑制作用や血糖値の上昇抑制作用、便秘解消、動脈硬化の予防・治療などの目的として利用することも出来る。さらに、アルギン酸摂取によるストロンチウムの体外排泄作用を利用して、ストロンチウム８９、ストロンチウム９０、ストロンチウム９１などの放射性ストロンチウムの体内残留防止剤としても利用できる。
【００６２】
本願は、２０１１年９月９日に出願された日本国特許出願第２０１１−１９７２１２号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１１年９月９日に出願された日本国特許出願第２０１１−１９７２１２号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明する。なお、本実施例において、培養液の藻体乾物含量およびアルギン酸濃度は、特に断りのない限りにおいて、以下のように測定した。【００６４】
培養液の藻体乾物含量
一定量の培養液を３０００×Ｇで遠心分離後に上清を除去した。次に、沈殿した藻体を５ｍＬの水に再懸濁して同様に遠心分離後に上清を除去した。さらに、水洗後の藻体を１１０℃で８時間乾燥して恒量とした後秤量し、培養液１Ｌあたりに含まれる藻体乾物重量を算出した。【００６５】
培養液中のアルギン酸濃度
培養液を水で適宜希釈し、該希釈培養液１ｍＬに銅−塩酸試液２ｍＬ及びナフトレゾルシノール試液１ｍＬを加え、沸騰水浴中で６５分間加熱した。該銅−塩酸試液は、濃塩酸４０ｍＬに２．５％硫酸銅水溶液１ｍＬ及び水９ｍＬを加えて調製した。また、該ナフトレゾルシノール試液は、１，３−ジヒドロキシナフタレン１００ｍｇを水２５ｍＬに溶解して調製した。これを氷水中で冷却し、酢酸ブチル４ｍＬを加えて撹拌した後、遠心分離した。酢酸ブチル層を孔径０．４５μｍのフィルター（コスモナイスフィルターＳ；ナカライテスク製）でろ過し、５６６ｎｍで比色定量した。アルギン酸ナトリウム３００〜４００ｃＰ（和光純薬工業製）を標準品として作成した検量線を用いて、サンプル中のアルギン酸濃度をアルギン酸ナトリウム換算で算出した。【００６６】
実施例１
グルコース２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．０１ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物５ｍｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液１ｍＬ／Ｌ（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成：ホウ酸２．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物１．８１ｇ／Ｌ、硫酸銅四水和物０．０８ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．２２ｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム四水和物０．１７１ｇ／Ｌ）からなる培地（ｐＨ６．５）１００ｍＬを入れた振盪フラスコを殺菌後、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９を接種し、アルミホイルで遮光した後、３０℃で７２時間振盪培養した。培養終了後、当該培養液の藻体乾物含量を測定したところ、９．０ｇ／Ｌであった。また、当該培養液中のアルギン酸濃度を測定したところ、アルギン酸ナトリウム換算で０．５２ｇ／Ｌであった。すなわち、藻体乾物１ｋｇあたりのアルギン酸生産量は５８ｇであった。【００６７】
実施例２
実施例１と同組成の培地１００ｍＬを入れた振盪フラスコを殺菌後、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９を接種し、アルミホイルで遮光した後、暗所において３０℃で７２時間振盪し、前培養を実施した。次に、グルコース１０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２０ｍｇ／Ｌ、尿素３．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物１０ｍｇ／Ｌ、クエン酸０．１ｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成は実施例１と同じ）１ｍＬ／Ｌ、アデカノールＬＧ１０９（株式会社ADEKA製）０．１ｇ／Ｌからなる培地２０００ｍＬを入れた５Ｌ容ジャーファーメンターを殺菌後、上記の前培養液２００ｍＬを接種し、アルミホイルで遮光した後、内温３０℃、通気量２Ｌ／分、撹拌数４５０ｒｐｍ、ｐＨ６〜７で１４３時間培養した。ｐＨは、下限を３０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム水溶液で、上限を１５％（ｗ／ｗ）の硫酸水溶液でコントロールした。また、培養開始の２３時間後から、殺菌した流加用培地を培養液に流加した。流加用培地は、培養液中のグルコース濃度が２０ｇ／Ｌを超えないように添加速度を適宜調節し、培養終了までに合計５６０ｍＬを培養液に添加した。流加用培地の組成は、グルコース５７０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１．２５ｇ／Ｌ、尿素４２ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物７００ｍｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液１０ｍＬ／Ｌ、クエン酸４．５ｇ／Ｌである。【００６８】
培養終了後、当該培養液の藻体乾物含量を測定したところ、５４．３ｇ／Ｌであった。また、当該培養液中のアルギン酸濃度を測定したところ、アルギン酸ナトリウム換算で３．４ｇ／Ｌであった。すなわち、藻体乾物１ｋｇあたりのアルギン酸生産量は６３ｇであった。【００６９】
実施例３
グルコース１１１ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）、硝酸カリウム５０ｍＭ、リン酸二水素カリウム９．２ｍＭ、リン酸水素二カリウム０．５７ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化ナトリウム３１ｍＭ、ＥＤＴＡ０．１４ｍＭ、硫酸鉄０．１１ｍＭ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成は実施例１と同じ）１ｍＬ／Ｌからなる培地１００ｍＬを入れた振盪フラスコを殺菌後、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９を接種し、アルミホイルで遮光した後、３０℃で７２時間振盪培養した。当該培養液を遠心分離し、上清を除去した後、無機塩培地（硝酸カリウム２．５ｍＭ、リン酸二水素カリウム１．３ｍＭ、硫酸マグネシウム０．３ｍＭ、塩化ナトリウム０．４３ｍＭ、塩化カルシウム０．２３ｍＭ、リン酸二水素アンモニウム１．７ｍＭ、塩化鉄０．０４７ｍＭ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液２ｍＬ／Ｌ）１００ｍＬに再懸濁し、さらに３０℃で１６時間振盪した。培養終了後、当該培養液の藻体乾物含量を測定したところ、３．５ｇ／Ｌであった。また、当該培養液中のアルギン酸濃度を測定したところ、アルギン酸ナトリウム換算で０．１４ｇ／Ｌであった。すなわち、藻体乾物１ｋｇあたりのアルギン酸生産量は４０ｇであった。【００７０】
比較例１：独立栄養培養
硝酸カリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１７．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム２０ｇ／Ｌ、塩化鉄６．５ｍｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液２ｍＬ／Ｌ（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成は実施例１と同じ）からなる培地（ｐＨ６．５）１０００ｍＬを入れたフラスコを殺菌後、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９を接種し、約７０００Ｌｕｘの照度下、２５℃で９日間、撹拌培養した。培養終了後、当該培養液の藻体乾物含量を測定したところ、６７ｍｇ／Ｌであった。また、当該培養液中のアルギン酸濃度を測定したところ、アルギン酸ナトリウム換算で２.３ｍｇ／Ｌであった。すなわち、藻体乾物１ｋｇあたりのアルギン酸生産量は３４ｇであった。【００７１】
実施例４
グルコース２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．０１ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物５ｍｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液１ｍＬ／Ｌ（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成：ホウ酸２．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物１．８１ｇ／Ｌ、硫酸銅四水和物０．０８ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．２２ｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム四水和物０．１７１ｇ／Ｌ）からなる培地（ｐＨ６．５）４００ｍＬを入れた２Ｌ容振盪フラスコを殺菌後、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９を接種し、アルミホイルで遮光した後、３０℃で４８時間振盪培養して、前培養液を得た。【００７２】
酵母エキス３ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．６５ｇ／Ｌ、クエン酸２．４ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物０．３６ｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液１ｍＬ／Ｌ（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成：ホウ酸２．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物１．８１ｇ／Ｌ、硫酸銅四水和物０．０８ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．２２ｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム四水和物０．１７１ｇ／Ｌ）からなる培地（ｐＨ６．０）１０Ｌを、３０Ｌ容ジャーファーメンター内で蒸煮殺菌した。これに上記の前培養液を接種し、通気量１８Ｌ／分、３０℃、ｐＨ６．０の条件で、１２０時間培養した。培養中は、殺菌した５５重量％グルコース水溶液合計５．４ｋｇを連続的に添加し、培養液の溶存酸素濃度が０．１ｐｐｍ以上になるよう撹拌数を調整した。また、培養液のｐＨ調整には２５重量％アンモニア水を使用した。【００７３】
培養終了後、当該培養液の藻体乾物含量を測定したところ、９３．０ｇ／Ｌであった。また、当該培養液中のアルギン酸濃度を測定したところ、アルギン酸ナトリウム換算で１５．８ｇ／Ｌであった。すなわち、藻体乾物１ｋｇあたりのアルギン酸生産量は１７０ｇであった。【００７４】
実施例５
実施例２で得たパラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９の培養液を凍結乾燥、噴霧乾燥、または、ドラム乾燥して、アルギン酸含有組成物を得た。凍結乾燥は凍結乾燥機ＦＤ−１型（東京理化器械株式会社）を用いて、噴霧乾燥はミニスプレードライヤーＢ−２９０型（ビュッヒ社）、ドラム乾燥はダブルドラム型ドライヤ（φ４００×Ｌ５００ｍｍ；カツラギ工業株式会社）をそれぞれ用いて実施した。得られた乾燥物中のアルギン酸含量を測定した結果、凍結乾燥品は１６．４重量％、噴霧乾燥品は１５．７重量％、ドラム乾燥品は１５．２重量％であった。【００７５】
比較例２：独立栄養培養
リン酸二水素カリウム１７５ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム２００ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７５ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム２５ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２５ｍｇ／Ｌ、硝酸カリウム２５０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物５ｍｇ／Ｌ、Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液１ｍＬ／Ｌ（Ａｒｎｏｎ’ｓ  Ａ５溶液の組成：ホウ酸２．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物１．８１ｇ／Ｌ、硫酸銅四水和物０．０８ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．２２ｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム四水和物０．１７１ｇ／Ｌ）からなる培地（ｐＨ７．０）５００ｍＬを入れた１Ｌ容三角フラスコに、パラクロレラ・バイノス（Parachlorella sp. binos）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６９を接種後、約７０００Ｌｕｘの照度下、２５℃で、１０日間、炭酸ガスによるバブリングを行い、培養した。培養終了後、当該培養液の藻体乾物含量を測定したところ、８５０ｍｇ／Ｌであった。また、当該培養液中のアルギン酸濃度を測定したところ、アルギン酸ナトリウム換算で２６.１ｍｇ／Ｌであった。すなわち、藻体乾物１ｋｇあたりのアルギン酸生産量は３１ｇであった。【００７６】
以上の実施例および参考例の結果から、アルギン酸産生能を有するパラクロレラ属に属する藻類を従属栄養的に培養することにより、当該藻類を独立栄養的に培養した場合と比較して、培養容積当たりのアルギン酸の生産量が飛躍的に向上することが分かる。また同時に、培養で生産される藻体乾物重量に対するアルギン酸の生産量も向上することが分かる。
【国際調査報告】
2013035797.tif 000002
2013035797.tif 000003
2013035797.tif 000004
2013035797.tif 000005
2013035797.tif 000006
2013035797.tif 000007