(57)【要約】本発明は、食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、動物薬、飲料、飼料、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬等として有用な、還元型補酵素Ｑ１０を還元型補酵素Ｑ１０の製造方法を提供することを目的とする。本発明は、酸化型補酵素Ｑ１０を、還元剤にアスコルビン酸類を用いて含水有機溶媒中、ｐＨ５以下で還元することを特徴とする、還元型補酵素Ｑ１０の製造方法である。当該方法により、塩基性物質等を添加せずとも、反応時間を最短化でき、かつ、好ましくない副反応を最小化できるため、高品質な還元型補酵素Ｑ１０を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化型補酵素Ｑ１０を、アスコルビン酸類を用いて還元することによって還元型補酵素Ｑ１０を製造する方法において、反応溶媒として含水有機溶媒を用い、かつ、ｐＨが５以下の条件下で還元反応を実施することを特徴とする還元型補酵素Ｑ１０の製造方法。
【請求項２】
含水有機溶媒が、アルコール類、ケトン類、ニトリル類及びエーテル類からなる群より選ばれる少なくとも１種の有機溶媒と水との混合溶媒である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
アルコール類が、メタノール、エタノール、１−プロパノール及び２−プロパノールからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ケトン類がアセトンである請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
含水有機溶媒中の有機溶媒と水の重量比が、９９／１〜８５／１５の範囲内である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
アスコルビン酸類が、アスコルビン酸、 rhamno−アスコルビン酸、arabo−アスコルビン酸、gluco−アスコルビン酸、fuco−アスコルビン酸、glucohepto−アスコルビン酸、xylo−アスコルビン酸、galacto−アスコルビン酸、gulo−アスコルビン酸、allo−アスコルビン酸、erythro−アスコルビン酸、６−デスオキシアスコルビン酸、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
還元反応におけるアスコルビン酸類の使用量は、酸化型補酵素Ｑ１０を還元型補酵素Ｑ１０に変換しうる有効量である請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
アスコルビン酸類の使用量が、使用する酸化型補酵素Ｑ１０に対して、１倍モル量以上である請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
還元反応後、反応液から還元型補酵素Ｑ１０を晶析し、固液分離して、還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
還元反応後、反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、該有機層より還元型補酵素Ｑ１０の晶析を行い、固液分離して還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
還元反応後、反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、該有機層より溶媒を留去して、還元型補酵素Ｑ１０の油状物もしくは固形物を取得する請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元型補酵素Ｑ１０の製造方法に関する。還元型補酵素Ｑ１０は、酸化型補酵素Ｑ１０と比較して高い経口吸収性を示し、優れた、食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、動物薬、飲料、飼料、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬、ペットフード等として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
広く生物界に分布するベンゾキノン誘導体である酸化型補酵素Ｑ１０は、そのビタミン様の機能からビタミンＱとも呼ばれており、弱った細胞活性を健康な状態に戻す栄養源として身体を若返らせる成分である。一方、還元型補酵素Ｑ１０は、酸化型補酵素Ｑ１０の２電子還元体であり、酸化型補酵素Ｑ１０が橙色結晶であるのに対し、還元型補酵素Ｑ１０は白色結晶である。還元型補酵素Ｑ１０及び酸化型補酵素Ｑ１０は、ミトコンドリア、リソゾーム、ゴルジ体、ミクロソーム、ペルオキシソーム、或いは細胞膜などに局在し、電子伝達系の構成成分としてＡＴＰ産生賦活、生体内での抗酸化作用、膜安定化に関与している事が知られている生体の機能維持に必要不可欠な物質である。【０００３】
還元型補酵素Ｑ１０の製造方法としては、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により補酵素Ｑ１０を得た後、クロマトグラフィーにより流出液中の還元型補酵素Ｑ１０区分を濃縮する方法等により得られることが知られている（特許文献１：特開平１０−１０９９３３号公報）。この場合には、上記還元型補酵素Ｑ１０中に含まれる酸化型補酵素Ｑ１０を、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム（次亜硫酸ナトリウム）等の還元剤を用いて還元した後、クロマトグラフィーによる濃縮を行っても良いこと、また、還元型補酵素Ｑ１０は、既存の高純度補酵素Ｑ１０に上記還元剤を作用させる方法によっても得られることも、該特許公報中に記載されている。【０００４】
また、アスコルビン酸類を用いた酸化型補酵素Ｑ１０の還元型補酵素Ｑ１０への還元方法についても知られている（非特許文献１：J. Am. Chem. Soc., 1990, 116, 9440-9447）。該文献中においては、酸化型補酵素Ｑ１０を、水酸化ナトリウム存在下、エタノール／水の混合溶媒を用いて還元反応を行っている。【０００５】
一方、本発明者らも、アスコルビン酸類を還元剤に用いた酸化型補酵素Ｑ１０の還元反応についていくつかの特許出願を行っており（例えば、特許文献２〜４：ＷＯ０３／００６４０８号公報、ＷＯ０３／００６４０９号公報、ＷＯ０３／０３２９６７号公報）、該特許文献中には、アスコルビン酸類を用いて、酸化型補酵素Ｑ１０を還元できること、溶媒として、水溶性有機溶媒や水を用いてもよいこと、反応促進剤として、塩基性物質や亜硫酸水素塩を添加することが記載されている。【０００６】
しかしながら、これら還元反応における出発物質である酸化型補酵素Ｑ１０と、生成物質である還元型補酵素Ｑ１０は、いずれも水に溶解しないため、還元反応時に水を使用する場合には、通常２相系での反応となり、多量の水が必要となるが、容積効率等の観点から有利になるとは言い難い。また上述したように、アスコルビン酸類を用いた還元反応においては、反応時間を短縮させるために、塩基性物質や亜硫酸水素塩等の反応促進剤を添加することが一般的に提唱されているが、このような反応促進剤を使用した場合、還元型補酵素Ｑ１０を取得する前に上記反応促進剤の除去工程を別途組み込むことも考慮する必要がある。
【特許文献１】特開平１０−１０９９３３号公報
【特許文献２】ＷＯ０３／００６４０８号公報
【特許文献３】ＷＯ０３／００６４０９号公報
【特許文献４】ＷＯ０３／０３２９６７号公報
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 1990, 116, 9440-9447
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したとおり、アスコルビン酸類を還元剤として使用する一般的な還元反応において、塩基性物質の存在下に反応を行うことで反応時間が短縮できるという報告はあるが、本発明者らがその方法を酸化型補酵素Ｑ１０の還元反応に予備的に検討した結果、例えば上記非特許文献１に記載されている条件では、酸化型補酵素Ｑ１０の還元反応は途中までは進行するものの、完全には進行せず、純度の高い還元型補酵素Ｑ１０を得ることができないことが判明した。【０００８】
本発明は上記に鑑み、アスコルビン酸類の他に、ことさら他の添加剤を使用することなく、反応時間を最短化させ、高純度の還元型補酵素Ｑ１０を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが検討した結果、少量の水を混合させた含水有機溶媒を反応溶媒として使用し、かつ、反応溶液のｐＨを５以下にすることにより、上述した反応促進剤を使用せずとも、反応時間を大幅に短縮でき、かつ、純度の高い還元型補酵素Ｑ１０を製造できることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は、酸化型補酵素Ｑ１０を、アスコルビン酸類を用いて還元することによって還元型補酵素Ｑ１０を製造する方法において、反応溶媒として含水有機溶媒を用い、かつ、ｐＨが５以下の条件下で還元反応を実施することを特徴とする還元型補酵素Ｑ１０の製造方法に関する。【００１１】
さらに本発明は、好ましくは、（１）還元反応後、反応液から還元型補酵素Ｑ１０を晶析し、固液分離して、還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する上記製造方法、（２）還元反応後、反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、該有機層より還元型補酵素Ｑ１０の晶析を行い、固液分離して還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する上記製造方法、または、（３）還元反応後、反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、該有機層より溶媒を留去して、還元型補酵素Ｑ１０の油状物もしくは固形物を取得する上記製造方法、に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、還元反応における容積効率の低下を最小化し、後工程で除去が必要な反応促進剤を使用せずとも、還元反応時間を短縮することができるため、簡便に高純度の還元型補酵素Ｑ１０を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、補酵素Ｑ１０とのみ記載した場合は、酸化型、還元型を問わず、両者が混在する場合には混合物全体を表すものである。【００１４】
本発明の製造方法は、還元剤にアスコルビン酸類を、反応溶媒に含水有機溶媒を使用し、かつ、ｐＨが５以下の条件で、酸化型補酵素Ｑ１０の還元反応を実施し、還元型補酵素Ｑ１０を製造することを特徴とする。【００１５】
本発明の製造方法において、原料として用いる酸化型補酵素Ｑ１０は、合成、発酵、天然物からの抽出等により調製したものであってもよく、一般に市販されている既存の高純度補酵素Ｑ１０であってもよい。また、酸化型補酵素Ｑ１０のみを含有するものであってもよく、酸化型補酵素Ｑ１０と還元型補酵素Ｑ１０の混合物であってもよい。【００１６】
本発明の製造方法では、還元反応を行う際の反応溶媒として含水有機溶媒を使用することが必要である。この場合の含水有機溶媒は、水を含有する有機溶媒、すなわち水と有機溶媒の混合溶媒であれば特に限定されないが、水と有機溶媒が相溶状態、つまり均一に混合された状態であるのが好ましい。そのような観点から、上記還元反応において反応溶媒として使用される含水有機溶媒中の有機溶媒は、任意あるいは特定の混合比率下において水と溶解する水溶性の有機溶媒が好ましい。そのような有機溶媒としては特に制限されないが、例えば、アルコール類、ケトン類、ニトリル類、エーテル類等を挙げることができる。【００１７】
上記アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。例えば、炭素数１〜５、特に炭素数１〜４、とりわけ炭素数１〜３、なかでも炭素数２〜３の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、又は、炭素数３の３価アルコールが好ましい。【００１８】
１価のアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等を挙げることができる。【００１９】
好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールであり、より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、さらに好ましくは、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、最も好ましくは、エタノールである。【００２０】
２価のアルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等を挙げることができる。好ましくは、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオールであり、最も好ましくは、１，２−エタンジオールである。【００２１】
３価のアルコールとしてはグリセリン等を好適に用いることができる。【００２２】
上記ケトン類としては、特に制限されず、普通炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができ、好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくは、アセトンである。【００２３】
上記ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数２〜８、特に炭素数２〜６、とりわけ炭素数２〜４のものが好適に用いられる。【００２４】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル等を挙げることができる。【００２５】
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。【００２６】
上記エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。又、普通、炭素数３〜１２、特に炭素数４〜８、とりわけ炭素数４〜８のものが好適に用いられる。【００２７】
具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル等を挙げることができる。【００２８】
好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルであり、より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルであり、さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等であり、最も好ましくは、ジオキサン、テトラヒドロフランである。【００２９】
言うまでもなく、上記有機溶媒は複数を併用しても良い。【００３０】
上記有機溶媒の中でも、沸点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。具体的には、溶解度や反応速度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶媒の乾燥除去や晶析濾液等からの溶媒回収を行いやすいという観点から、例えば、１気圧下の沸点が約３０〜１５０℃の範囲であること、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくいという観点から、例えば、約２０℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約０℃以下の融点を有していること、また、例えば、２０℃において約１０ｃｐ以下の低い粘性を有していること等が挙げられる。特に、工業的な作業上の観点から、常温で揮発し難いものが好ましく、一般に、例えば、沸点が約５０℃以上、更には約５５℃以上のものが好ましい。【００３１】
上記性質、及び価格の点やリサイクルまたは入手のしやすさの観点、そして食品や医薬品用途で使用を考慮した場合、還元反応に使用される有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンが好ましく、メタノール、エタノール、２−プロパノールがより好ましく、エタノールがもっとも好ましい。【００３２】
本発明の製造方法において、還元反応時の反応溶媒である含水有機溶媒中の水の含有量、言い換えれば、含水有機溶媒中の有機溶媒と水との重量比は、反応時間に大きな影響を与える。含水有機溶媒中の有機溶媒と水との重量比は、使用する有機溶媒の種類に影響されるため、一概に規定できないが、有機溶媒に対する水の重量比が小さい場合には、反応時間の短縮効果も小さい。一方、水の重量比が高すぎる場合には、相対的に有機溶媒の重量比が低くなるため、例えば酸化型補酵素Ｑ１０及び／又は還元型補酵素Ｑ１０を含有する層と、水を含有する層が分離し、むしろ反応時間が遅延する傾向が見られる。この２層の分離を抑制するために、含水有機溶媒自体の使用量を増加させることも考えられるが、これは反応時の容積効率等の観点から好ましくない。【００３３】
このような観点から、含水有機溶媒中の水の含有量の上限は、好ましくは約１５重量％、より好ましくは約１３重量％、さらに好ましくは約１０重量％であり、その下限は好ましくは約１重量％、より好ましくは約３重量％、さらに好ましくは約５重量％である。すなわち、含水有機溶媒中の有機溶媒と水との重量比として、好ましくは約９９／１〜８５／１５、より好ましくは約９７／３〜８７／１３、さらに好ましくは約９５／５〜９０／１０の範囲である。このような割合の含水有機溶媒を調製する方法としては特に限定されず、含水有機溶媒中の水は外部添加されたものであってもそうでなくともかまわない。【００３４】
本発明の製造方法において、還元剤として使用するアスコルビン酸類としては、特に制限されず、例えば、アスコルビン酸のみならず、rhamno−アスコルビン酸、arabo−アスコルビン酸、gluco−アスコルビン酸、fuco−アスコルビン酸、glucohepto−アスコルビン酸、xylo−アスコルビン酸、galacto−アスコルビン酸、gulo−アスコルビン酸、allo−アスコルビン酸、erythro−アスコルビン酸、６−デスオキシアスコルビン酸等のアスコルビン酸に類するものを含み、更に、それらのエステル体や塩であってもかまわない。【００３５】
これらは、Ｌ体、Ｄ体、或いは、ラセミ体であっても良い。具体的には、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、Ｄ−arabo−アスコルビン酸等を挙げることができる。本発明の製造方法において、還元剤としては、上記アスコルビン酸類をいずれも好適に使用できるが、生成した還元型補酵素Ｑ１０との分離のしやすさ等を考慮すると、上記のアスコルビン酸類のうち、特に水溶性のもの、具体的には、上記アスコルビン酸類のうち、フリー体や塩が好適に用いられ、最も好ましくは、入手容易性、価格等の観点から、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−arabo−アスコルビン酸等のフリー体である。【００３６】
上記のアスコルビン酸類の使用量は、特に制限されず、原料である酸化型補酵素Ｑ１０をすべて（あるいはほとんど）還元型補酵素Ｑ１０に変換しうる有効量であればよい。一般的に、酸化型補酵素Ｑ１０をすべて還元型補酵素Ｑ１０に変換しうるアスコルビン酸類の有効量は、酸化型補酵素Ｑ１０に対して、１倍モル量以上、好ましくは１．２倍モル量以上である。上限は特に制限されないが、経済性も考慮して、普通１０倍モル量、好ましくは５倍モル量、より好ましくは３倍モル量である。【００３７】
本発明の製造方法において、酸化型補酵素Ｑ１０の還元反応は、ｐＨが５以下、好ましくはｐＨが４以下、より好ましくはｐＨ２〜４の条件で実施される。ここでいうｐＨの値は、還元反応における、反応混合物全体のｐＨ値である。本発明において、少なくとも反応開始時のｐＨが上記範囲となる必要があるが、還元反応中のすべての期間におけるｐＨ値が上記範囲内となるのが好ましい。本発明において上記ｐＨ値を調整する方法としては特に限定されず、酸や塩基を用いてｐＨ値を調整してもよいが、特段のｐＨ調整手段を必要としない場合もある。【００３８】
ｐＨ調整に使用できる酸としては、特に限定されないが、硫酸、塩化水素（塩酸も含む）、燐酸等の無機酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸やトリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸等のカルボン酸やクエン酸、リンゴ酸等の有機酸などを挙げることができる。なかでも、硫酸、塩化水素、燐酸等の無機酸が好ましい。【００３９】
ｐＨ調整に使用できる塩基としては、特に制限されないが、例えば、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、炭酸マグネシウム等のアルカリ土類金属炭酸塩、アンモニア、トリエチルアミン等のアミン等を挙げることができる。これらの中でも、ｐＨの調整を容易にするという観点から、金属（好ましくは、アルカリ金属、アルカリ土類金属等）の炭酸塩、炭酸水素塩、アンモニア、アミン等といった弱塩基が好ましい。【００４０】
本発明の製造方法において、還元反応は、強制流動下に実施するのが好ましい。具体的には、単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約０．０１ｋＷ／ｍ３以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ３以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ３以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法などを利用しても良い。【００４１】
本発明の製造方法において、還元反応は、普通３０℃以上、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上で実施される。還元反応温度の上限は系の沸点以下である。通常、３０〜１５０℃程度、好ましくは４０〜１２０℃程度、より好ましくは５０〜１００℃程度で好適に還元反応は実施できる。【００４２】
本発明の製造方法において、還元反応を実施する際の反応溶媒に対する酸化型補酵素Ｑ１０の初期濃度は、特に制限はないが、一般に、含水有機溶媒１００重量部に対する酸化型補酵素Ｑ１０の重量として、普通約１重量部以上、好ましくは３重量部以上、より好ましくは５重量部以上、とりわけ１０重量部以上である。上限は、特に制限されないが、普通約６０重量部以下、好ましくは５０重量部以下、より好ましくは４０重量部以下、とりわけ３０重量部以下である。一般に、含水有機溶媒１００重量部に対する酸化型補酵素Ｑ１０の重量として約１〜３０重量部、好ましくは約５〜３０重量部、より好ましくは約１０〜３０重量部で好適に実施できる。【００４３】
本発明の製造方法において、還元反応は、使用するアスコルビン酸類の種類や量によって異なり、一律に規定できないが、通常、２４時間以内、好ましくは２０時間以内、より好ましくは１５時間以内、とりわけ１０時間以内に完了させることができる。還元反応終了後の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は、９７／３以上、好ましくは９８／２以上、より好ましくは９９／１以上が期待できる。【００４４】
本発明の製造方法においては、上記還元反応を行った後、引き続き、反応液から還元型補酵素Ｑ１０を単離するのが好ましい。反応液からの還元型補酵素Ｑ１０の単離方法としては、特に制限されないが、例えば、以下の方法を挙げることができる。【００４５】
方法１：反応液から直接還元型補酵素Ｑ１０を晶析し、固液分離して、還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する方法、
方法２：反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を有機層に移行させ、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、必要に応じて有機層の水洗・溶媒置換を行った後、該有機層より還元型補酵素Ｑ１０の晶析を行い、固液分離して、還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する方法、
方法３：反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を有機層に移行させ、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、必要に応じて有機層の水洗・溶媒置換を行った後、該有機層より溶媒を留去して、還元型補酵素Ｑ１０の油状物もしくは固形物を取得する方法。【００４６】
以下に、上記方法１〜３について説明する。【００４７】
上記方法１においては還元反応を行った後、引き続き、反応液から還元型補酵素Ｑ１０の晶析（結晶化）を行う。言うまでもなく、還元型補酵素Ｑ１０を含有する反応液に含有される不純物の除去も兼ねて精製晶析するのが特に効果的である。これにより、共存する不純物、特に、通常除去するのが必ずしも容易ではない構造の類似した類縁化合物（例えば、還元型補酵素Ｑ９、還元型補酵素Ｑ８、還元型補酵素Ｑ７等）を除去することができる。【００４８】
方法１における還元型補酵素Ｑ１０の晶析は、冷却、濃縮、溶媒置換、貧溶媒の使用等の一般的な晶析操作を、単独で用いて、又は、適宜組み合わせて、実施することができる。特に、冷却操作を用いる又は併用する冷却晶析が好ましい。【００４９】
還元型補酵素Ｑ１０の晶析は、強制流動下に実施するのが好ましい。過飽和の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うために、或いは、高品質化の観点から、単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約０．０１ｋＷ／ｍ３以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ３以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ３以上の流動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法などを利用しても良い。【００５０】
晶析に際しては、過飽和の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うために、種晶を添加するのが好ましい。【００５１】
還元型補酵素Ｑ１０の晶析温度（晶析時の冷却温度）は、晶析溶媒の種類や晶析方法にもより異なるので、一律に規定できないが、例えば、好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、とりわけ１５℃以下、なかんずく１０℃以下である。下限は、系の固化温度である。通常、０〜２５℃程度で好適に実施できる。
得られる還元型補酵素Ｑ１０中への各種不純物の混入を最小化する、又は良好な性状のスラリーを得る目的で、晶析時の単位時間当たりの結晶の晶出量を制御することができる。好ましい単位時間当たりの晶出量は、例えば、単位時間当たり全晶出量の約５０％量が晶出する速度以下（即ち、最大で５０％量／時間）であり、好ましくは、単位時間当たり全晶出量の約２５％量が晶出する速度以下（即ち、最大で２５％量／時間）である。尚、冷却晶析における冷却速度は、普通、約４０℃／時間以下であり、好ましくは約２０℃／時間以下である。【００５２】
このようにして得られる還元型補酵素Ｑ１０の結晶は、例えば、遠心分離、加圧濾過、減圧濾過等による固液分離を行い、更に、必要に応じてケーキ洗浄を行って、湿体として取得することができる。また、更に内部を不活性ガスに置換した減圧乾燥器（真空乾燥器）に該湿体を仕込み、減圧下、乾燥することで、還元型補酵素Ｑ１０の結晶を乾体として取得することができるし、乾体として取得するのが好ましい。【００５３】
方法１においては、所望の濃度あるいは性状等で晶析を行うために、必要に応じ、溶媒を追加しても良い。このとき、追加する溶媒としては、特に制限されないが、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類、水等を挙げることができる。そのなかでも特に、１価又は２価のアルコール及び／又はケトン類、好ましくは１価又は２価のアルコール及び／又は水溶性のケトン類、具体的にはメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン等、より好ましくはエタノール、アセトン等の有機溶媒を追加するのが好ましい。該有機溶媒存在下で晶析を行うことにより、スラリー性状や結晶性状の良い還元型補酵素Ｑ１０の結晶を取得することができ好ましい。【００５４】
一方、操作の簡便性等からは、還元反応時に反応溶媒として使用した有機溶媒及び／又は水を追加するのが好ましいことから、従って、方法１においては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン等、好ましくはエタノール、アセトン等の有機溶媒と水の混合溶媒である含水有機溶媒中で還元反応を行い、引き続き晶析を行うのが特に好ましい。【００５５】
晶析時の溶媒中の還元型補酵素Ｑ１０濃度は特に制限されないが、溶媒中での還元型補酵素Ｑ１０の酸化防護効果は、還元型補酵素Ｑ１０の高濃度溶液において更に高まる傾向もあるので、溶媒１００重量部に対する還元型補酵素Ｑ１０含有量として通常１重量部以上、好ましくは２重量部以上の濃度で晶析させるとより効果的である。【００５６】
上記方法２においては、還元反応終了後の反応液に、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層が２層に分離するように、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を有機層に移行させ、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層を取得し、必要に応じ、有機層の水洗・溶媒置換を行った後、該有機層より還元型補酵素Ｑ１０の晶析を行い、固液分離の後に還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する。【００５７】
方法２においては、還元反応に使用したアスコルビン酸類や、デヒドロアスコルビン酸類等の反応時に生じる副生成物を水層に移行させるのが好ましく、また、得られた有機層は水洗して、残存する上記成分をさらに除去するのがより好ましい。【００５８】
上記還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とを２層に分離するために添加する有機溶媒としては、還元反応終了後の反応液に、該有機溶媒、または該有機溶媒と水とを添加したときに水層と還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層とが分層する性質を有しているものであれば、特に制限されない。また、このとき添加する有機溶媒は、還元反応時に反応溶媒として使用した含水有機溶媒中の有機溶媒と同じであってもよく、異なっていてもよい。【００５９】
このような有機溶媒としては、例えば、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。また、還元反応後の反応液（含水有機溶媒溶液）に、さらに水を添加することにより、水層と還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層とに分離するのであれば、有機溶媒を必ずしも使用する必要はない。言うまでもなく、有機溶媒と水の両者を添加しても良い。還元型補酵素Ｑ１０の有機層への移行時、あるいは、該有機層の水洗時において、還元型補酵素Ｑ１０を分子酸素による酸化から防護するという観点から、添加する有機溶媒として、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、ニトリル類のうち、少なくとも一種を用いるのが好ましく、最も好ましくは炭化水素類である。【００６０】
炭化水素類としては、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。特に、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、とりわけ、脂肪族炭化水素が好ましい。【００６１】
上記脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、通常、炭素数３〜２０、好ましくは、炭素数５〜１２のものが用いられる。【００６２】
具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン、２−ペンテン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、１−ヘキセン、シクロヘキセン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２、３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、１−ヘプテン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、１−オクテン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、１−ノネン、デカン、１−デセン、ｐ−メンタン、ウンデカン、ドデカン等を挙げることができる。【００６３】
中でも、炭素数５〜８の飽和脂肪族炭化水素が好ましく、ペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、及びこれらの混合物が好ましく用いられる。【００６４】
上記芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、普通、炭素数６〜２０、特に炭素数６〜１２、とりわけ炭素数７〜１０のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼンであり、より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリンであり、最も好ましくは、クメンである。【００６５】
上記ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。普通、塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素が好ましく、特に塩素化炭化水素が好ましい。炭素数１〜６、特に炭素数１〜４、とりわけ炭素数１〜２のものが好適に用いられる。【００６６】
具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。【００６７】
好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタンであり、より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタンである。【００６８】
上記脂肪酸エステル類としては、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。特に、酢酸エステル、ギ酸エステルが好ましく、とりわけ、酢酸エステルが好ましい。特に制限されないが、一般に、エステル基としては、炭素数１〜８のアルキルエステル又はアラルキルエステル、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステル、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが好ましく用いられる。【００６９】
プロピオン酸エステルとしては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチルを挙げることができる。【００７０】
酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシルであり、より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルであり、最も好ましくは、酢酸エチルである。【００７１】
ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは、ギ酸エチルである。【００７２】
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数３〜２０、特に炭素数４〜１２、とりわけ炭素数４〜８のものが好適に用いられる。【００７３】
具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル等を挙げることができる。【００７４】
好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルであり、より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルであり、さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、テトラヒドロフラン等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフランである。【００７５】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数２〜２０、特に炭素数３〜１２、とりわけ炭素数３〜８のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。【００７６】
好ましくは、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルである。【００７７】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数１〜２０、特に炭素数４〜１２、とりわけ炭素数４〜６の１価アルコールが好ましい。【００７８】
１価のアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等を挙げることができる。【００７９】
好ましくは、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノールであり、より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコールであり、さらに好ましくは、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコールである。【００８０】
２価のアルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等を挙げることができる。【００８１】
３価のアルコールとしてはグリセリン等を挙げることができる。【００８２】
ケトン類としては、特に制限されず、普通炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができ、好ましくは、メチルエチルケトンである。【００８３】
窒素化合物類としては、例えば、ニトロメタン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等を挙げることができる。【００８４】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。【００８５】
方法２において添加される水として、アスコルビン酸類やその他の副生成物等を効率よく水層に移行させる、水層と有機層との混合による乳濁液の生成を回避する、等の観点から、食塩水等の水溶液を用いても良い。また、還元反応終了後の反応液に、上記水との相溶性の低い溶媒を添加するだけで水層と有機層に分離する場合は、必ずしも水を添加しなくともよい。【００８６】
方法２においては、反応液に有機溶媒及び／又は水を添加することで水層と分離して得られた還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層を、必要に応じて水洗した後、そのまま晶析することもできる。この場合、還元反応時に使用する有機溶媒や上記反応後に添加する有機溶媒として、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、ニトリル類のうち、少なくとも一種を用いるのが、晶析時の還元型補酵素Ｑ１０を分子酸素による酸化から防護するという観点から好ましい。【００８７】
言うまでもなく、上記反応後に添加する有機溶媒として、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を用いて還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層を取得した後、他の溶媒に溶媒置換し、その後、晶析を行っても良い。特に、１価又は２価のアルコールあるいはケトン、好ましくは１価又は２価のアルコールあるいは水溶性のケトン（具体的にはメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン等、好ましくはエタノール、アセトン等）と水との混合溶媒を用いて晶析を行った場合には、スラリー性状や結晶性状の良い還元型補酵素Ｑ１０の結晶を取得することができる。この観点からは、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類、水等の溶媒を添加して、好ましくは、還元型補酵素Ｑ１０の酸化防護の観点、及び、還元剤として使用したアスコルビン酸類の除去性の観点から炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、ニトリル類のうち、少なくとも一種の溶媒と水とを添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層を取得し、必要に応じて水洗した後、１価又は２価のアルコールあるいはケトン類に溶媒置換し、晶析するのも好ましい態様である。【００８８】
上記、溶媒置換の方法としては特に制限されないが、溶媒置換の操作を最短化し、還元型補酵素Ｑ１０の酸化型補酵素Ｑ１０への酸化を抑制するという観点から、好ましくは還元型補酵素Ｑ１０の融解温度以上で溶媒を留去し、その後、所望の別の溶媒を添加するのが好ましい。【００８９】
方法２における、上記有機層からの晶析方法やその後の処理は、上記方法１と同様の方法により行うことができる。【００９０】
上記方法３においても、上記方法２と同様、還元反応に使用したアスコルビン酸類及びデヒドロアスコルビン酸類等の反応時に生じる副生成物を水層に移行させるのが好ましく、取得した有機層を水洗して、残存する上記成分をさらに除去するのがより好ましい。その他、添加する有機溶媒及び／又は水の種類や添加方法、還元型補酵素Ｑ１０の有機層への移行、取得した有機層の水洗、溶媒置換等の方法として、上記方法２と同様のものや手法を取ることができる。【００９１】
方法３において、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層より溶媒を留去する方法としては、溶媒が除去された還元型補酵素Ｑ１０が取得できれば、特に制限されず、還元型補酵素Ｑ１０を油状物として取得しても良いし、固形物として取得しても良い。しかしながら、操作を最短化し、還元型補酵素Ｑ１０の酸化型補酵素Ｑ１０への酸化を抑制するという観点、及び、濃縮缶からの払い出し性等の観点からは、還元型補酵素Ｑ１０又は還元型補酵素Ｑ１０を主成分とする濃縮物の融解温度以上（融解温度に幅がある場合は、融解開始温度以上）で溶媒を留去し、還元型補酵素Ｑ１０の油状物として取得するのが好ましい。言うまでもなく、還元型補酵素Ｑ１０を油状物として取得した後に、該油状物を冷却し、固形物とするのも好ましい態様である。【００９２】
上記方法１〜３の中でも、取得した還元型補酵素Ｑ１０の取り扱いやすさ等から、上記方法１または方法２のように結晶として取得するのが好ましく、操作の簡便性等から、上記方法１が特に好ましい。【００９３】
尚、本発明の製造方法は、脱酸素雰囲気下で実施することが、還元型補酵素Ｑ１０を酸化から防護する上で効果的である。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。【００９４】
本発明の製造方法では、酸化型補酵素Ｑ１０を還元型補酵素Ｑ１０へと還元するに際し、反応時間を大幅に短縮することができ、高品質の還元型補酵素Ｑ１０を作業性、経済性良く得ることができる。
【実施例】
【００９５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお本実施例において、ｐＨはｐＨメーターＤ５１（株式会社堀場製作社製）を用いて測定した。また、実施例中の還元型補酵素Ｑ１０の純度、還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比等は、下記ＨＰＬＣ分析により求めたが、本発明における純度の限界値を規定するものではなく、その上限値を規定するものでもない。【００９６】
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム；ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ製），２５０ｍｍ（長さ），４．６ｍｍ（内径）、移動相；Ｃ２Ｈ５ＯＨ：ＣＨ３ＯＨ＝４：３（ｖ：ｖ）、検出波長；２１０ｎｍ、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、還元型補酵素Ｑ１０の保持時間；９．１ｍｉｎ、酸化型補酵素Ｑ１０の保持時間；１３．３ｍｉｎ。【００９７】
（実施例１〜３、比較例１）
表１に示す割合でエタノール（コニシ株式会社製、試薬特級）と水とを混合した１６５ｇの含水エタノール中に、１０ｇの酸化型補酵素Ｑ１０、６ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて攪拌し、還元反応を行った。還元反応開始時の溶液のｐＨと、還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比が９９.５／０.５に到達するのに要した反応時間を表１に示す。尚、比較のため、水を添加していないエタノールを同条件で用いた時の結果も併せて示す。【００９８】
【表１】
2009057611.tif 000002
【００９９】
（実施例４、比較例２）
表２に示すとおり、２−プロパノール（ナカライテスク株式会社製、特級)と水とを重量比で９０／１０の割合で混合した１６５ｇの含水２−プロパノール中に、１０ｇの酸化型補酵素Ｑ１０、６ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて攪拌し、還元反応を行った。還元反応開始時の溶液のｐＨと、還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比が９９.５／０.５に到達するのに要した反応時間を表２に示す。尚、比較のため、含水２−プロパノールの代わりに水を添加していない２−プロパノールを用いた時の結果も併せて示す。【０１００】
【表２】
2009057611.tif 000003
【０１０１】
（実施例５、比較例３）
表３に示すとおり、アセトン（サンライズケミカル株式会社製）と水とを重量比で８５／１５の割合で混合した１００ｇの含水アセトン中に、１０ｇの酸化型補酵素Ｑ１０、６ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、５５℃にて攪拌し、還元反応を行った。還元反応開始時の溶液のｐＨと、２４時間経過後の反応液中の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比を表３に示す。尚、比較のため、含水アセトンの代わりに水を添加していないアセトンを用いた時の結果も併せて示す。【０１０２】
【表３】
2009057611.tif 000004
【０１０３】
（実施例６）
１６５ｇの含水エタノール（エタノール／水重量比＝９４／６）に、１０ｇの還元型補酵素Ｑ１０、６ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて攪拌し、ｐＨ３．５で還元反応を行った。１３時間後、このエタノール溶液を攪拌しながら、１０℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を含冷エタノール（エタノール／水重量比＝９４／６）にて洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９．８ｇを得た（収率９８モル％）。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ１０の純度は９９．４％であった。【０１０４】
（実施例７）
１６５ｇの含水エタノール（エタノール／水重量比＝９０／１０）に、１０ｇの還元型補酵素Ｑ１０、６ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて攪拌し、ｐＨ３．５で還元反応を行った。１３時間後、このエタノール溶液を５０℃まで冷却し、さらにヘキサン１００ｇ、水１００ｇを添加して攪拌したのち静置して、２層に分離させた。水層を除去した後、得られた有機層を攪拌しながら、１０℃／時間の冷却速度で２℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を含冷エタノール（エタノール／水重量比＝９４／６）にて洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、湿結晶を減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥結晶９．５ｇを得た（収率９５モル％）。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ１０の純度は９９．４％であった。【０１０５】
（実施例８）
１６５ｇの含水エタノール（エタノール／水重量比＝９０／１０）に、１０ｇの還元型補酵素Ｑ１０、６ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、７８℃にて攪拌し、ｐＨ３．５で還元反応を行った。１３時間後、このエタノール溶液を５０℃まで冷却し、さらにヘキサン１００ｇ、水１００ｇを添加して攪拌したのち静置して、２層に分離させた。水層を除去した後、得られた有機層を、減圧下、攪拌しながら、内温５０℃にて溶媒留去を行い，無色透明の油状物９．９ｇを得た（収率９９モル％）。なお、減圧操作を除くすべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた油状物の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ１０の純度は９９．２％であった。【０１０６】
（比較例４）
１Ｌのエタノール（コニシ株式会社製、試薬特級）に１０ｇの酸化型補酵素Ｑ１０、４ｇのＬ−アスコルビン酸を加え、５０℃にて攪拌し、酸化型補酵素Ｑ１０及びＬ−アスコルビン酸を溶解させた。溶解後、０．０５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬと水１５０ｍＬを加え、同温にて攪拌し、還元反応を行った。このときの反応液のｐＨは６．３であった。反応開始から５時間後の反応液中の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は９５．８／４．２に達したが、さらに３時間後の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は９５．９／４．１とほとんど変化なかった。７８℃に昇温した後、さらに３時間反応させたが、反応液中の還元型補酵素Ｑ１０／酸化型補酵素Ｑ１０の重量比は９６．１／３．９とほとんど変化なかった。
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月2日(2009.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
(実施例6)
165gの含水エタノール(エタノール/水重量比=94/6)に、10gの酸化型補酵素Q10、6gのL-アスコルビン酸を加え、78℃にて攪拌し、pH3.5で還元反応を行った。13時間後、このエタノール溶液を攪拌しながら、10℃/時間の冷却速度で2℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を含冷エタノール(エタノール/水重量比=94/6)にて洗浄(洗浄に用いた冷溶媒の温度は2℃)して、さらに、湿結晶を減圧乾燥(20〜40℃、1〜30mmHg)することにより、白色の乾燥結晶9.8gを得た(収率98モル%)。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Q10/酸化型補酵素Q10の重量比は99.5/0.5、還元型補酵素Q10の純度は99.4%であった。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
(実施例7)
165gの含水エタノール(エタノール/水重量比=90/10)に、10gの酸化型補酵素Q10、6gのL-アスコルビン酸を加え、78℃にて攪拌し、pH3.5で還元反応を行った。13時間後、このエタノール溶液を50℃まで冷却し、さらにヘキサン100g、水100gを添加して攪拌したのち静置して、2層に分離させた。水層を除去した後、得られた有機層を攪拌しながら、10℃/時間の冷却速度で2℃まで冷却し、白色のスラリーを得た。得られたスラリーを減圧ろ過し、湿結晶を含冷エタノール(エタノール/水重量比=94/6)にて洗浄(洗浄に用いた冷溶媒の温度は2℃)して、さらに、湿結晶を減圧乾燥(20〜40℃、1〜30mmHg)することにより、白色の乾燥結晶9.5gを得た(収率95モル%)。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた結晶の還元型補酵素Q10/酸化型補酵素Q10の重量比は99.5/0.5、還元型補酵素Q10の純度は99.4%であった。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
(実施例8)
165gの含水エタノール(エタノール/水重量比=90/10)に、10gの酸化型補酵素Q10、6gのL-アスコルビン酸を加え、78℃にて攪拌し、pH3.5で還元反応を行った。13時間後、このエタノール溶液を50℃まで冷却し、さらにヘキサン100g、水100gを添加して攪拌したのち静置して、2層に分離させた。水層を除去した後、得られた有機層を、減圧下、攪拌しながら、内温50℃にて溶媒留去を行い,無色透明の油状物9.9gを得た(収率99モル%)。なお、減圧操作を除くすべての操作は窒素雰囲気下で実施した。得られた油状物の還元型補酵素Q10/酸化型補酵素Q10の重量比は99.5/0.5、還元型補酵素Q10の純度は99.2%であった。 
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月4日(2010.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化型補酵素Ｑ１０を、アスコルビン酸類を用いて還元することによって還元型補酵素Ｑ１０を製造する方法において、反応溶媒として、有機溶媒と水の重量比が９９／１〜８５／１５の範囲内である含水有機溶媒を用い、かつ、ｐＨが２〜４の条件下で還元反応を実施することを特徴とする還元型補酵素Ｑ１０の製造方法。
【請求項２】
含水有機溶媒が、アルコール類、ケトン類、ニトリル類及びエーテル類からなる群より選ばれる少なくとも１種の有機溶媒と水との混合溶媒である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
アルコール類が、メタノール、エタノール、1−プロパノール及び2−プロパノールからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ケトン類がアセトンである請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
アスコルビン酸類が、アスコルビン酸、rhamno−アスコルビン酸、arabo−アスコルビン酸、gluco−アスコルビン酸、fuco−アスコルビン酸、glucohepto−アスコルビン酸、xylo−アスコルビン酸、galacto−アスコルビン酸、gulo−アスコルビン酸、allo−アスコルビン酸、erythro−アスコルビン酸、6−デスオキシアスコルビン酸、それらのエステル及びそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
還元反応におけるアスコルビン酸類の使用量が、酸化型補酵素Ｑ１０を還元型補酵素Ｑ１０に変換しうる有効量である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
アスコルビン酸類の使用量が、使用する酸化型補酵素Ｑ１０に対して、１倍モル量以上である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
還元反応後、反応液から還元型補酵素Ｑ１０を晶析し、固液分離して、還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
還元反応後、反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、該有機層より還元型補酵素Ｑ１０の晶析を行い、固液分離して還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得する請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
還元反応後、反応液に、有機溶媒及び／又は水を添加して、還元型補酵素Ｑ１０を含有する有機層と水層とに分離させて有機層を取得し、該有機層より溶媒を留去して、還元型補酵素Ｑ１０油状物もしくは固形物を取得する請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2009057611.tif 000005
2009057611.tif 000006
2009057611.tif 000007
2009057611.tif 000008