(57)【要約】カーボン電極を製造する工程は、バインダ剤を含まない溶媒に、ナノカーボンを添加し、分散させた液体（カーボンナノチューブ分散液）を作成する工程と、ナノカーボンが分散した前記液体を、基板１２上に塗布して、ナノカーボン層を形成する工程と、ナノカーボン層に対して、抗体または酵素を固定化する工程とを含む。
2009133679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バインダ剤を含まない溶媒に対し、ナノカーボンを添加して、ナノカーボンを含有する液体を作成する工程と、
前記ナノカーボンを含有する前記液体を、基板上に塗布して、ナノカーボン層を形成する工程と、
前記ナノカーボン層に対して、抗体または酵素を固定化する工程とを含むバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記液体は、前記ナノカーボンと、前記溶媒とからなるバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記ナノカーボンを前記溶媒に添加する工程の前段で、
酸またはアルカリ溶液を用いて、前記ナノカーボンを洗浄する工程を実施するバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
抗体または酵素を固定化する前記工程の後段で、
前記ナノカーボン層を高分子膜で被覆する工程を実施するバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記ナノカーボンは、カーボンナノチューブであるバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記基板および前記ナノカーボン層が光透過性であるバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載のバイオセンサ用電極の製造方法を含むバイオセンサの製造方法であり、
前記基板の前記ナノカーボン層の下方の位置には、位置あわせ用のマークが形成されており、
前記バイオセンサ用電極を実装基板に実装する工程を含み、
前記バイオセンサ用電極を実装基板に実装する前記工程では、前記バイオセンサ用電極の基板の位置あわせマークと、前記実装基板に形成された位置あわせマークとを用いて位置あわせを行い、前記バイオセンサ用電極を前記実装基板に実装するバイオセンサの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のバイオセンサの製造方法において、
前記ナノカーボン層を作用極とし、
前記基板上に、参照電極および対極を形成する工程を含むバイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ用電極の製造方法およびバイオセンサの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、カーボン電極には、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）等のナノカーボンが使用されている。ナノカーボンは、優れた電気伝導性を有するとともに、ナノ構造に由来して生体分子との電子移動反応が促進されることから、バイオセンサの高感度化を図る点で期待されている。
このようなカーボン電極は、以下のような製造方法により製造されている。
特許文献１には、界面活性剤と、高分子電解質溶液との混合物により、カーボンナノチューブをミセル化して、水溶媒中に分散させた後、ミセルを分解して、カーボンナノチューブを薄膜化する方法が開示されている。
また、特許文献２には、カーボンナノチューブを光造形用樹脂に分散させて、この光造形用樹脂を光照射により、硬化させて、電極を形成する点が開示されている。
さらに、特許文献３には、乾式法により、カーボンナノチューブの膜を形成する方法が開示されている。具体的には、基板の触媒担持面に原料ガスを吹き付けて、カーボンナノチューブを触媒担持面において成長させる。【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１３６６４５号公報
【特許文献２】特開２００６−２６０９３８号公報
【特許文献３】特開２００７−１２６３１８号公報
【発明の開示】
【０００４】
近年、バイオセンサの性能向上（たとえば、測定精度の向上）が求められているが、特許文献１〜３で開示された方法により製造された電極を用いた場合、このような要求に応えることが難しい。
これは、以下のような理由によるものと考えられる。
特許文献１，２で開示された製造方法では、カーボンナノチューブを樹脂等の高分子材料中に分散させている。この高分子材料は、カーボンナノチューブ同士を固定化するためのバインダ材としての役割を果たす。しかしながら、各カーボンナノチューブ間に高分子材料が入り込んだ構造となるため、カーボンナノチューブ間の抵抗値が高くなってしまう。その結果、バイオセンサの感度が低下してしまう。
一方、特許文献３に開示された製造方法では、高分子材料を使用しないものの、基板に担持された触媒がバイオセンサの感度に悪影響を及ぼす。
【０００５】
本発明は、バイオセンサの性能を向上させることができるバイオセンサ用電極の製造方法およびバイオセンサの製造方法を提供するものである。
【０００６】
本発明によれば、バインダ剤を含まない溶媒に、ナノカーボンを添加した液体を作成する工程と、前記ナノカーボンを含有する前記液体を、基板上に塗布して、ナノカーボン層を形成する工程と、前記ナノカーボン層に対して、抗体または酵素を固定化する工程とを含むバイオセンサ用電極の製造方法が提供される。
ここで、ナノカーボンとは、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、カーボンナノコーン、カーボンナノフィラメント、フラーレンのいずれかである。
また、本発明によれば、上述したバイオセンサ用電極の製造方法を含むバイオセンサの製造方法であり、前記基板の前記ナノカーボン層の下方の位置には、位置あわせ用のマークが形成されており、前記バイオセンサ用電極を実装基板に実装する工程を含み、前記バイオセンサ用電極を実装基板に実装する前記工程では、前記バイオセンサ用電極の基板の位置あわせマークと、前記実装基板に形成された位置あわせマークとを用いて位置あわせを行い、前記バイオセンサ用電極を前記実装基板に実装するバイオセンサの製造方法も提供できる。
【０００７】
本発明によれば、バイオセンサの性能を向上させることができるバイオセンサ用電極の製造方法およびバイオセンサの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【０００９】
【図１】本発明の一実施形態にかかるバイオセンサを示す断面図である。
【図２】カーボンナノチューブ、抗体の状態を模式的に示す図である。
【図３】バイオセンサ本体と、実装基板とを示す平面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１〜図３を用いて、本実施形態について説明する。
図１には、本実施形態のバイオセンサ１が開示されている。
このバイオセンサ１は、基板１２、この基板１２上に形成された作用極１３、対極１４、および参照極１５を備えるバイオセンサ本体１１と、実装基板１６とを有する。
なお、基板１２と、作用極１３とで本発明のバイオセンサ用のカーボン電極が構成される。【００１１】
基板１２は、絶縁基板であり、光透過性の基板である。基板１２としては、ガラス、プラスチック等であり、材質は特に限定されないが、強度と光透過性の高いガラスが好ましい。本実施形態において、光透過性とは可視光を透過することをいい、この光透過性の物体を介して反対側が肉眼で視認できる程度に光を透過すればよい。具体的には、可視光の光線透過率が７０％以上であることが好ましい。【００１２】
作用極１３は、基板１２上に形成されたカーボンナノチューブの薄膜（ナノカーボン層）１３１と、薄膜１３１を覆うように設けられた抗体および酵素を含む層１３２と、層１３２上に設けられ薄膜１３１を被覆するように設けられた高分子膜１３４とを備える。【００１３】
薄膜１３１は、カーボンナノチューブが堆積することで成膜されたものである。カーボンナノチューブ同士は、図２に示すように、直接接触するようにして交差している。図２においては、符号１３１Ａがカーボンナノチューブを示しており、点線Ａは、カーボンナノチューブ１３１Ａの交点を示している。
なお、薄膜１３１上に高分子膜１３４を設けているため、一部のカーボンナノチューブ１３１Ａ間（全カーボンナノチューブのうち、１％未満のカーボンナノチューブ）に高分子が介在することがあるが、ほとんどのカーボンナノチューブ１３１Ａ（全カーボンナノチューブのうち、９９％以上のカーボンナノチューブ）同士は直接接触している。
また、カーボンナノチューブ１３１Ａは、基板１２に対し直接接触しており、薄膜１３１は物理的に基板１２に固定された（吸着した）状態となっている（図２の点線Ｂ参照）。
なお、薄膜１３１上に高分子膜１３４を設けているため、一部のカーボンナノチューブ１３１Ａと基板１２との間に高分子が介在することがあるが、ほとんどのカーボンナノチューブ１３１Ａは基板１２に直接接触している。【００１４】
カーボンナノチューブとしては、種々のものが使用できるが、たとえば、レーザアブレーション法、ＣｏＭｏＣＡＴ法（アメリカ合衆国オクラホマ大学の手法）、直噴熱分解合成法、ハイ・プレッシャー・カーボン・モノキシド・プロセス法で生成される種類が好ましく用いられる。コストの面からレーザアブレーション法がより好ましい。
この薄膜１３１は、光透過性であり、薄膜１３１を介して基板１２を視認することができる程度の透過性があればよい。具体的には、可視光の光線透過率が７０％以上であることが好ましい。【００１５】
カーボンナノチューブとしては、直径０．８〜１．３ｎｍの直径、長さ数μｍのものが、品質、基板１２からのはがれにくさ等の観点から好ましく用いられる。【００１６】
薄膜１３１の厚みは、１０ｎｍ以上、１μｍ以下が好ましい。より好ましくは２０ｎｍ以上、５０ｎｍ以下である。薄膜１３１の厚みが薄すぎると、導電率が低下するため、抗体や酵素の固定化量が低くなるなどの観点から好ましくはない。また、厚すぎると、光の透過率が低下するため、好ましくはない。【００１７】
図１に示す抗体および酵素を含む層１３２は、抗体および酵素を薄膜１３１上に固定したものである。
抗体の固定化方法はカーボンナノチューブの薄膜１３１に予め固定化タンパク質の処理を施しておき、続いて抗体を含む溶液を接触させればよい。たとえば、図２に示すように固定化タンパク質１３２Ｃを介して、抗体１３２Ａがカーボンナノチューブ１３１Ａに固定化される。
固定化タンパク質は抗体をカーボンナノチューブに固定化するための機能を有する。
具体的な固定化タンパク質としては、電気化学的に活性なアミノ酸であるトリプトファンやチロシンを含むタンパク質を用いればよく、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG等が好ましく用いられる。また、測定対象物質に前述の電気化学的に活性なアミノ酸が含まれていれば、固定化タンパク質にこれらのアミノ酸が含まれなくてもよいことはいうまでもない。また、測定対象物質および固定化タンパク質の両者に含まれなくても、測定時に用いる溶液中に電気化学的に活性なアミノ酸が含まれていてもよい。これらの選択は適宜、測定対象物質によって変えることが可能である。用いる抗体としては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体、トリニトロトルエン抗体など、測定対象物質の分子量が大きい抗原から小さい抗原まで幅広く適用することが可能である。【００１８】
酵素の固定化方法は、アルブミンとグルタルアルデヒドの架橋反応を利用した方法が、低コストで製作可能であることから好ましく用いられる。用いる酵素としてはグルコース酸化酵素、乳酸酸化酵素、尿酸酸化酵素など主として酸化酵素が用いられるが、メデエーター等を用いて脱水素酵素を用いることも可能である。
なお、層１３２は、抗体および酵素を含む層であるとしたが、抗体あるいは酵素のいずれか一方のみを有する層であってもよい。【００１９】
図１、図２に示すように、高分子膜１３４は、層１３２および薄膜１３１を上面側から覆うものであり、薄膜１３１を基板１２に対し、強固に固定するために設けられている。また高分子膜１３４は、抗体等が薄膜１３１に対し固定化するのを補強するための役割も果たす。
高分子膜１３４としては、たとえば、ポリビニルアルコール、ポリアセチレン、ポリチオフェン、アルブミンやゼラチンなどのタンパク質等があげられる。
なかでも、安価であり、また溶液の調整が容易であるという点から、ポリビニルアルコールを使用することが好ましい。【００２０】
対極１４は、作用極１３に対向するように配置され、たとえば、白金を含んで構成される。参照極１５は、たとえば、銀を含んで構成される。対極１４、参照極１５はいずれも基板１２上に形成されている。【００２１】
図１に示すように、以上のような構成のバイオセンサ本体１１は、実装基板１６に実装されている。
実装基板１６は、絶縁性基板であり、たとえば、フレキシブル基板である。この実装基板１６は、耐水性、耐熱性、耐薬品性に優れた材料であることが好ましく、低コストで製作できるプラスチックスが好ましい。【００２２】
実装基板１６上には配線（図示略）が形成され、バイオセンサ本体１１は、ボンディングワイヤＷを介して前記配線に接続される。ボンディングワイヤ部分には、封止剤Ｅが設けられる。【００２３】
ボンディングワイヤＷの材料は白金、金、アルミニウムが適宜選択され、安価なアルミニウムが好ましく用いられる。
封止剤Ｅは、ボンディングワイヤＷ、さらには、ボンディングワイヤＷおよびバイオセンサ本体１１の接続部分を、防水し、破損から保護できる材料を用いれば特に限定されない。信頼性の観点からシリコーン樹脂が好ましく用いられる。
バイオセンサ本体１１は実装基板１６を介して電気的化学測定装置に接続されることとなる。【００２４】
次に、以上のようなバイオセンサ１の製造方法について説明する。
本実施形態のバイオセンサ１の製造方法は、バイオセンサ本体１１を製造する工程と、バイオセンサ本体１１を実装基板１６上に実装する工程とを含んでいる。
バイオセンサ本体１１の製造方法は、作用極１３および基板１２を備えるカーボン電極を製造する工程と、対極１４および参照極１５を製造する工程を含む。【００２５】
はじめに、カーボン電極を製造する工程の概要について説明する。
カーボン電極を製造する工程は、バインダ剤を含まない溶媒に、ナノカーボン（カーボンナノチューブ）を添加し、分散させた液体（カーボンナノチューブ分散液）を作成する工程と、ナノカーボンが分散した前記液体を、基板１２上に塗布して、ナノカーボン層（薄膜１３１）を形成する工程と、ナノカーボン層に対して、抗体または酵素を固定化する工程とを含む。
ここで、バインダ剤とは、ナノカーボン同士を接着するためのものであり、たとえば、高分子樹脂等の高分子材料である。【００２６】
次に、カーボン電極を製造する工程について、詳細に説明する。
まず、カーボンナノチューブを用意し、酸またはアルカリ溶液を用いて、カーボンナノチューブを洗浄する。具体的には、カーボンナノチューブを酸またはアルカリの溶液中に分散させて、洗浄する。
酸溶液としては、ｐＨが４以下であるものが好ましく、たとえば、硝酸や、塩酸等があげられる。酸溶液の硝酸、塩酸等の濃度としては０．０１Ｍ以上１Ｍ以下が好ましい。アルカリ溶液としては、ｐＨが８以上であることが好ましく、たとえば、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。濃度としては０．０１Ｍ以上３Ｍ以下が好ましい。
カーボンナノチューブには、カーボンナノチューブの製造過程において、使用した触媒がわずかながら付着していることがある。このような触媒は、バイオセンサの感度に影響を及ぼす場合がある。
そこで、本工程を設けることで、カーボンナノチューブに付着した触媒が除去され、バイオセンサの感度の低下を防止することができる。
なお、触媒が除去されているかどうかの確認は、たとえば、ＥＤＸ（energy dispersive X-ray spectrometry）で確認することができる。【００２７】
次に、カーボンナノチューブ同士を接着するためのバインダ剤を含まない溶媒に、カーボンナノチューブを分散させ、カーボンナノチューブ分散液を作成する。
溶媒としては、有機溶媒が使用でき、有機溶媒としては、ジクロロエタン、ジメチルスルホン、アセトン、エーテル、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）等が好ましい。なかでも、カーボンナノチューブの分散性が良好なジクロロエタンを使用することが好ましい。
溶媒中にカーボンナノチューブを分散させる方法としては、スターラーで溶媒を撹拌しても良いが、超音波で処理することによって分散させる方法（超音波による攪拌）を使用すれば効率よくカーボンナノチューブを溶媒中に分散させることができる。なかでも、ジクロロエタンを使用し、さらに、超音波での攪拌を行うことで、より効果的にカーボンナノチューブを溶媒中に分散させることができる。
ここで、カーボンナノチューブ分散液は、カーボンナノチューブと、溶媒とのみからなるものであり、バインダ剤、さらには、界面活性剤等を含まない。【００２８】
次に、ナノカーボンが分散した溶媒（カーボンナノチューブ分散液）を、基板１２上に塗布して、カーボンナノチューブの薄膜１３１を形成する。塗布方法はスピンコート法、デップコート法が好ましく用いられるが、薄膜１３１の膜厚を効率よく厚くできる点からデップコート法が好ましい。スピンコート法を適用する場合でも、塗布回数を増やすことでデップコート法と同様にカーボンナノチューブの薄膜１３１を厚くすることが可能である。【００２９】
その後、溶媒を蒸発させ、カーボンナノチューブの薄膜１３１に対して、酵素、抗体を固定化し、層１３２を形成する。
酵素、抗体の固定化方法は前述した通りである。【００３０】
次に、高分子膜１３４を成膜する。
具体的には、高分子を含む溶液（たとえば、ポリビニルアルコール溶液）を層１３２上に塗布する。
その後、基板１２上に対極１４および参照極１５を形成する。
以上の工程により、バイオセンサ本体１１が製造される。【００３１】
次に、図３を参照して、バイオセンサ本体１１を実装基板１６に実装する工程について説明する。
まず、あらかじめ、バイオセンサ本体１１の基板１２に位置あわせ用のマークを形成しておく。位置合わせマークＭ１を形成する方法としては、予め金や銀などの金属をスパッタリングなどで形成し、パターニングをしてもよいが、ガラスカッターなどで傷を付けておいてもよい。基板１２のサイズが小さい場合には前者が好ましく、基板１２のサイズが大きい場合には後者が好ましい。
なお、位置合わせマークＭ１を形成する工程は、基板１２に対し、電極を形成する前段で行う。電極を形成した状態においては、位置合わせマークＭ１は、作用極１３のカーボンナノチューブの薄膜１３１等に覆われた状態となる。【００３２】
一方で、実装基板１６にも位置合わせマークＭ２を形成しておく。実装基板１６に配線を形成する際に、配線と同じ材料で位置合わせマークをパターニングすることが好ましいが、位置合わせマークＭ２としては、これに限られるものではない。【００３３】
次に、実装基板１６表面に形成された位置合わせマークＭ２と、基板１２に形成された位置合わせマークＭ１とを一致させて、実装基板１６上にバイオセンサ本体１１を設置する。
ここで、基板１２は光透過性であり、また、カーボンナノチューブの薄膜１３１、さらには、高分子膜１３４も光透過性であるため、本実施形態では、位置あわせを容易に実施することができる。
その後、ボンディングワイヤＷを用いて実装基板１６とバイオセンサ本体１１とを電気的に接続するとともに、接続箇所を封止剤で封止する。【００３４】
次に、本実施形態の作用効果について説明する。
従来のカーボン電極の製造方法では、カーボンナノチューブを樹脂等の高分子材料中に分散させ、この高分子材料を基板上に塗布していたため、カーボンナノチューブ間に高分子材料が入り込み、カーボンナノチューブ間の抵抗値が高くなってしまう。
これに対し、本実施形態では、バインダ剤を含まない溶媒中にカーボンナノチューブを分散させて、この溶媒を基板１２上に塗布することで、薄膜１３１を形成している。
従って、薄膜１３１中のカーボンナノチューブ同士が、直接接触しやすくなり、カーボンナノチューブ間の抵抗値が高くなってしまうことを防止できる。これにより、本実施形態のカーボン電極を用いたバイオセンサの性能を向上させることができる。【００３５】
また、従来のカーボン電極の製造方法では、基板に触媒を担持させて、カーボンナノチューブの薄膜を形成している。この方法においては、触媒として、一般に、鉄、コバルト、ニッケル等が使用されるが、このような触媒はバイオセンサの感度を低下させる。これは、電流−電位測定、もしくは定電位測定において、触媒が干渉電流を発生させるためである（例えば、Fe→Fe2+ + 2e-）。このようなカーボン電極では、基板に触媒を担持させて、カーボンナノチューブの薄膜を形成しているため、カーボンナノチューブの薄膜を形成した後、酸やアルカリの溶液で触媒を除去しようとしても、カーボンナノチューブの薄膜により、酸やアルカリの溶液が基板表面まで浸透しにくい。そのため、触媒を除去することは困難である。
これに対し、本実施形態では、基板１２上にカーボンナノチューブを分散させた溶媒を塗布することで、薄膜１３１を形成しており、従来のように基板に触媒を担持させて、カーボンナノチューブの薄膜を形成していない。そのため、バイオセンサの性能を向上させることができる。
特に、本実施形態では、カーボンナノチューブを、酸あるいはアルカリの溶液にて洗浄し、カーボンナノチューブの製造工程で付着した触媒を除去しているので、確実に触媒を除去でき、より一層バイオセンサの性能を向上させることができる。【００３６】
さらに、本実施形態では、カーボンナノチューブの薄膜１３１を覆うように高分子膜１３４を形成している。この高分子膜１３４により薄膜１３１が基板１２からはがれてしまうことを防止できる。なお、高分子膜１３４は、薄膜１３１を形成した後、薄膜１３１上に塗布しているため、カーボンナノチューブ間に高分子が入り込んでしまうことはほとんどない。【００３７】
また、本実施形態では、カーボンナノチューブの薄膜１３１を湿式法により成膜しているため、薄膜１３１は光透過性である。また、本実施形態では、基板１２も光透過性である。そのため、基板１２の薄膜１３１の下方となる部分に形成された位置合わせマークＭ１と、実装基板１６に形成された位置合わせマークＭ２とを用いて、実装基板１６に対するバイオセンサ本体１１の位置を正確にあわせることができる。【００３８】
なお、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。
たとえば、前記実施形態では、一つの基板１２上に、作用極１３、対極１４、参照極１５をそれぞれ１つずつ形成したが、これに限らず、大判の基板を用意し、作用極、対極、参照極のセットを多数形成した後、基板を切断することで、バイオセンサ本体１１を製造してもよい。
さらには、前記実施形態では、カーボンナノチューブを酸あるいはアルカリの溶液で洗浄して、触媒を除去していたが、この工程はなくてもよい。このようにすることで、バイオセンサの製造工程を簡略化することができる。【００３９】
また、前記実施形態では、カーボン電極を構成する薄膜１３１に、カーボンナノチューブを使用したが、カーボン電極に使用されるカーボンは、ナノカーボンであればよく、カーボンナノホーン、カーボンナノコーン、カーボンナノフィラメント、フラーレンであってもよい。
この出願は、２００８年４月３０日に出願された日本出願特願２００８−１１８４８３号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【実施例】
【００４０】
次に、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板（光透過性の基板）を用意し、硝酸−過酸化水素の溶液中で５分間の超音波洗浄を行った。つづいて、ガラス基板の中心に菱形の印を位置あわせマークとして２箇所スパッタリングで形成した。位置あわせマークの材料は白金であり、位置あわせマークのサイズ２００μｍ四方である。
続いて、ＣｏＭｏＣＡＴ製カーボンナノチューブを１，２−ジクロロエタン中に分散させた。分散にあたっては、２時間の超音波処理を行い、カーボンナノチューブ濃度１０ｐｐｍの溶液を作成した。カーボンナノチューブのサイズは０．８〜１．６ｎｍの直径、数μｍの長さである。
このカーボンナノチューブが分散した溶液は、バインダ剤や、界面活性剤を含まず、カーボンナノチューブと、溶媒とからなるものである。
つぎに、ガラス基板を前記溶液に浸し、ディップコーターにて引き上げて（引き上げ速度：０．２ｍｍ／ｓｅｃ）基板表面にカーボンナノチューブをコーティングした。この引き上げ作業を１０回と２０回実施し、厚さが約１０ｎｍのカーボンナノチューブの薄膜のカーボン電極を製作した。
次に、グルコース酸化酵素と１ｖ／ｖ％のグルタルアルデヒドを含む２２．５ｗ／ｖ％のアルブミン溶液を３０００ｒｐｍでスピンコートし、カーボンナノチューブの薄膜に対し、酵素を固定化した。ここで、ガラス基板上に形成された位置あわせマークは、カーボンナノチューブの薄膜により被覆されていたが、目視で確認でき、カーボンナノチューブの薄膜は光透過性であった。
また、基板上に参照極と、白金対極とを形成し、グルコースバイオセンサ本体を製作した。
その後、菱形の位置あわせマークを銅で２箇所形成した１５×１００×０．２ｍｍのポリイミド樹脂製のプリント基板（実装基板）を用意した。
次に、実態顕微鏡を用いて両方の目合わせの印が重なるように前述のバイオセンサ本体をプリント基板に実装した。つづいて、ワイヤーボンディングで実装基板とバイオセンサ本体とを接続し、接続部分およびワイヤーボンディング全体をシリコーン樹脂で封止した。
このようにして製造されたバイオセンサを用いて、３電極法で溶液（グルコース濃度1mM）中のグルコース測定を行った。【００４１】
（実施例２）
１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板（光透過性の基板）を用意し、硝酸−過酸化水素の溶液中で５分間の超音波洗浄を行った。つづいて、ガラス基板の中心に菱形の印を位置あわせマークとして２箇所スパッタリングで形成した。材料は白金、サイズ２００μｍ四方である。
続いて、レーザーアブレーション製カーボンナノチューブを１，２−ジクロロエタン中に分散させた。分散方法としては、２時間、超音波処理を施した。そして、カーボンナノチューブの濃度が１０ｐｐｍの溶液を作成した。カーボンナノチューブのサイズは約１．３ｎｍの直径、数μｍの長さである。このカーボンナノチューブが分散した溶液は、バインダ剤や、界面活性剤を含まず、カーボンナノチューブと、溶媒とからなるものである。
つづいて、ガラス基板を溶液に浸し、ディップコーターにて引き上げて（引き上げ速度：０．２ｍｍ／ｓｅｃ）基板表面にカーボンナノチューブをコーティングした。この引き上げ作業を２０回実施し、厚さが約１６ｎｍのカーボンナノチューブの薄膜のカーボン電極を製作した。
つぎに、カーボン電極を1 mg/０．２ｍｌのヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体(ハイテスト社製のマウス免疫のモノクローナル抗体)の溶液に１時間浸漬した。そして、３ｍＭの１，３−ジアミノベンゼン(アルドリッチ(株)社製、ＵＳＡ、pH７．４のリン酸緩衝液および０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む)中に浸漬し、０から０．８Ｖを２ｍＶ／ｓで１００回掃引し、そして０．６５Ｖで５時間印加し、前述の抗体を固定化した。つづいて、１ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール中に１時間浸漬し、抗体の表面をポリビニルアルコールで被覆した（カーボンナノチューブの薄膜は抗体の層を介してポリビニルアルコールで被覆されることとなる）。ここで、ガラス基板上に形成された位置あわせマークは、カーボンナノチューブの薄膜、抗体の層、ポリビニルアルコール層により被覆されていたが、目視で確認でき、カーボンナノチューブの薄膜は光透過性であることがわかる。
その後、菱形の位置あわせマークを銅で２箇所形成した１５×１００×０．２ｍｍのポリイミド樹脂製のプリント基板（実装基板）を用意した。
次に、実態顕微鏡を用いて両方の目合わせの印が重なるように前述のバイオセンサ本体をプリント基板に実装した。つづいて、ワイヤーボンディングで実装基板とバイオセンサ本体とを接続し、接続部分およびワイヤーボンディング全体をシリコーン樹脂で封止した。
このようにして製造されたカーボン電極を作用極として、ガラス参照極と白金対極を用いて、方形波ボルタンメトリ法で溶液中の絨毛性ゴナドトロピン濃度（30nM）を測定した。測定条件は0.1-1.2 V掃引範囲、40 mVのパルス電位、4 Hzの周波数、10 mVのステップ電位である。【００４２】
（実施例３） 
１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板（光透過性の基板）を用意し、硝酸−過酸化水素の溶液中で５分間の超音波洗浄を行った。つづいて、ガラス基板の中心に菱形の印を位置あわせマークとして２箇所スパッタリングで形成した。位置あわせマークの材料は白金であり、位置あわせマークのサイズ２００μｍ四方である。 
続いて、ＣｏＭｏＣＡＴ製カーボンナノチューブを1 Mの塩酸溶液中に入れ、１時間の超音波洗浄処理を行った。そして、ガラスフィルターでカーボンナノチューブをすくい上げ、純水で十分にカーボンナノチューブをすすぎ、塩酸を完全に取り除いた。これにより、カーボンナノチューブに付着していた触媒が除去された。
続いて、１，２−ジクロロエタン中に前述のカーボンナノチューブを入れ、２時間の超音波処理で十分に分散させ、カーボンナノチューブ濃度１０ｐｐｍの溶液を作成した。カーボンナノチューブのサイズは０．８〜１．６ｎｍの直径、数μｍの長さである。このカーボンナノチューブが分散した溶液は、バインダ剤や、界面活性剤を含まず、カーボンナノチューブと、溶媒とからなるものである。
つぎに、ガラス基板を前記溶液に浸し、ディップコーターにて引き上げて（引き上げ速度：０．２ｍｍ／ｓｅｃ）基板表面にカーボンナノチューブをコーティングした。この引き上げ作業を１０回と２０回実施し、厚さが約１０ｎｍのカーボンナノチューブの薄膜のカーボン電極を製作した。 
次に、グルコース酸化酵素と１ｖ／ｖ％のグルタルアルデヒドを含む２２．５ｗ／ｖ％のアルブミン溶液を３０００ｒｐｍでスピンコートし、カーボンナノチューブの薄膜に対し、酵素を固定化した。ここで、ガラス基板上に形成された位置あわせマークは、カーボンナノチューブの薄膜により被覆されていたが、目視で確認でき、カーボンナノチューブの薄膜は光透過性であった。
また、基板上に参照極と、白金対極とを形成し、グルコースバイオセンサ本体を製作した。
その後、菱形の位置あわせマークを銅で２箇所形成した１５×１００×０．２ｍｍのポリイミド樹脂製のプリント基板（実装基板）を用意した。 
次に、実態顕微鏡を用いて両方の目合わせの印が重なるように前述のバイオセンサ本体をプリント基板に実装した。つづいて、ワイヤーボンディングで実装基板とバイオセンサ本体とを接続し、接続部分およびワイヤーボンディング全体をシリコーン樹脂で封止した。 
このようにして製造されたバイオセンサを用いて、３電極法で溶液（グルコース濃度1mM）中のグルコース測定を行った。【００４３】
（実施例４） 
１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板（光透過性の基板）を用意し、硝酸−過酸化水素の溶液中で５分間の超音波洗浄を行った。つづいて、ガラス基板の中心に菱形の印を位置あわせマークとして２箇所スパッタリングで形成した。位置あわせマークの材料は白金であり、位置あわせマークのサイズ２００μｍ四方である。 
続いて、ＣｏＭｏＣＡＴ製カーボンナノチューブを０．５ Mの水酸化ナトリウム溶液中に入れ、１時間の超音波洗浄処理を行った。そして、ガラスフィルターでカーボンナノチューブをすくい上げ、純水で十分にカーボンナノチューブをすすぎ、水酸化ナトリウム溶液を完全に取り除いた。これにより、カーボンナノチューブに付着していた触媒が除去された。
続いて、１，２−ジクロロエタン中に前述のカーボンナノチューブを入れ、２時間の超音波処理で十分に分散させ、カーボンナノチューブ濃度１０ｐｐｍの溶液を作成した。カーボンナノチューブのサイズは０．８〜１．６ｎｍの直径、数μｍの長さである。このカーボンナノチューブが分散した溶液は、バインダ剤や、界面活性剤を含まず、カーボンナノチューブと、溶媒とからなるものである。
つぎに、ガラス基板を前記溶液に浸し、ディップコーターにて引き上げて（引き上げ速度：０．２ｍｍ／ｓｅｃ）基板表面にカーボンナノチューブをコーティングした。この引き上げ作業を１０回と２０回実施し、厚さが約１０ｎｍのカーボンナノチューブの薄膜のカーボン電極を製作した。 
次に、グルコース酸化酵素と１ｖ／ｖ％のグルタルアルデヒドを含む２２．５ｗ／ｖ％のアルブミン溶液を３０００ｒｐｍでスピンコートし、カーボンナノチューブの薄膜に対し、酵素を固定化した。ここで、ガラス基板上に形成された位置あわせマークは、カーボンナノチューブの薄膜により被覆されていたが、目視で確認でき、カーボンナノチューブの薄膜は光透過性であった。
また、基板上に参照極と、白金対極とを形成し、グルコースバイオセンサ本体を製作した。 
その後、菱形の位置あわせマークを銅で２箇所形成した１５×１００×０．２ｍｍのポリイミド樹脂製のプリント基板（実装基板）を用意した。 
次に、実態顕微鏡を用いて両方の目合わせの印が重なるように前述のバイオセンサ本体をプリント基板に実装した。つづいて、ワイヤーボンディングで実装基板とバイオセンサ本体とを接続し、接続部分およびワイヤーボンディング全体をシリコーン樹脂で封止した。 
このようにして製造されたバイオセンサを用いて、３電極法で溶液（グルコース濃度1mM）中のグルコース測定を行った。 【００４４】
（比較例１） 
１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板を用意し、硝酸−過酸化水素の溶液中で５分間の超音波洗浄を行った。つづいて、ガラス基板の中心に菱形の印を位置あわせマークとして２箇所スパッタリングで形成した。位置あわせマークの材料は白金であり、位置あわせマークのサイズ２００μｍ四方である。 
続いて、ＣｏＭｏＣＡＴ製カーボンナノチューブを１，２−ジクロロエタン中に分散させ、さらに、２時間の超音波処理で分散させた。続いて、高分子電解質溶液であるデュポン社製の5 w/v%のNafion（登録商標）溶液中にカーボンナノチューブを入れ、さらに２時間の超音波洗浄処理を行い、濃度１０ｐｐｍのNafion（登録商標）−カーボンナノチューブ溶液を作成した。カーボンナノチューブのサイズは０．８〜１．６ｎｍの直径、数μｍの長さである。 
つぎに、ガラス基板を前記溶液に浸し、ディップコーターにて引き上げて（引き上げ速度：０．２ｍｍ／ｓｅｃ）基板表面にNafion（登録商標）−カーボンナノチューブをコーティングした。この引き上げ作業を１０回と２０回実施し、厚さが約１μｍのNafion（登録商標）−カーボンナノチューブの薄膜のカーボン電極を製作した。 
次に、グルコース酸化酵素と１ｖ／ｖ％のグルタルアルデヒドを含む２２．５ｗ／ｖ％のアルブミン溶液を３０００ｒｐｍでスピンコートし、Nafion（登録商標）−カーボンナノチューブの薄膜に対し、酵素を固定化した。 
また、基板上に参照極と、白金対極とを形成し、グルコースバイオセンサ本体を製作した。 
その後、菱形の位置あわせマークを銅で２箇所形成した１５×１００×０．２ｍｍのポリイミド樹脂製のプリント基板（実装基板）を用意した。 
次に、実態顕微鏡を用いて両方の目合わせの印が重なるように前述のバイオセンサ本体をプリント基板に実装した。つづいて、ワイヤーボンディングで実装基板とバイオセンサ本体とを接続し、接続部分およびワイヤーボンディング全体をシリコーン樹脂で封止した。 
このようにして製造されたバイオセンサを用いて、３電極法で溶液（グルコース濃度1mM）中のグルコース測定を行った。 【００４５】
（比較例２）
１０×１０×０．７ｍｍのガラス基板を用意し、硝酸−過酸化水素の溶液中で５分間の超音波洗浄を行った。つづいて、鉄／コバルトの微粒子からなる合成触媒をスパッタリングで基板表面に形成した。 
続いて、カーボンナノチューブの原料ガスとしてエタノールを前述の基板表面に噴霧してカーボンナノチューブを成長させた。このときの反応条件はカーボンナノチューブ成長雰囲気が８５０℃、原料ガスが５０℃、噴霧速度が５００ｍｌ／分、反応時間が１０秒、である。そして、１μｍのカーボンナノチューブの薄膜のカーボン電極を製作した。 
次に、グルコース酸化酵素と１ｖ／ｖ％のグルタルアルデヒドを含む２２．５ｗ／ｖ％のアルブミン溶液を３０００ｒｐｍでスピンコートし、カーボンナノチューブの薄膜に対し、酵素を固定化した。 
また、基板上に参照極と、白金対極とを形成し、グルコースバイオセンサ本体を製作した。 
つづいて、基板の側面を前述のポリイミド樹脂の位置合わせマークに合わせ、基板をポリイミド樹脂に実装した。 
次に、実態顕微鏡を用いて両方の目合わせの印が重なるように前述のバイオセンサ本体をプリント基板に実装した。つづいて、ワイヤーボンディングで実装基板とバイオセンサ本体とを接続し、接続部分およびワイヤーボンディング全体をシリコーン樹脂で封止した。 
このようにして製造されたバイオセンサを用いて、３電極法で溶液（グルコース濃度1mM）中のグルコース測定を行った。【００４６】
（結果）
実施例１から比較例２までの結果を表１に示す。
評価した項目は、以下の通りであり、各項目を５点満点で評価した。
（１）バックグラウンドの電流出力値を示すベース電流値
ベース電流値が１μＡを超える場合                      １点
ベース電流値が５００ｎＡを超え、１μＡ以下の場合      ２点
ベース電流値が２００ｎＡを超え、５００ｎＡ以下の場合  ３点
ベース電流値が５０ｎＡを超え、２００ｎＡ以下の場合    ４点
ベース電流値が５０ｎＡ以下の場合                      ５点
（２）1 mMグルコースあるいは30 nM絨毛性ゴナドトロピンを測定する際のノイズに対する電流出力値を示すシグナル／ノイズの平均値
シグナル／ノイズの平均値が１未満の場合              １点
シグナル／ノイズの平均値が１以上、２未満の場合      ２点
シグナル／ノイズの平均値が２以上、５未満の場合      ３点
シグナル／ノイズの平均値が５以上、２０未満の場合    ４点
シグナル／ノイズの平均値が２０以上の場合            ５点
（３）１mMグルコースあるいは30 nM絨毛性ゴナドトロピンの各溶液をそれぞれ１０回繰り返して測定したときのばらつきを示す測定精度（Ｃ．Ｖ．（％））
ただし、絨毛性ゴナドトロピンの測定ではスターラーで撹拌中の10mMのグリシン溶液中にセンサを30秒間浸漬してから再測定する操作を１０回繰り返した。
測定精度（Ｃ．Ｖ．（％））は、以下のようにして算出される。
Ｃ．Ｖ．(％)＝(電流値の標準偏差／電流値の平均値)×１００
測定精度が１５％を超える場合                        １点
測定精度が１０％以上、１５％以下の場合              ２点
測定精度が６％以上、１０％未満の場合                ３点
測定精度が３％以上、６％未満の場合                  ４点
測定精度が３％未満の場合                            ５点【００４７】
【表１】
2009133679.tif 000003
【００４８】
表１より、本発明によるセンサの優位性が確認された。なお、実施例１，３，４ではポリビニルアルコール溶液によるカーボンナノチューブの薄膜の被覆を行っていないが、カーボンナノチューブの薄膜が基板からはがれてしまうことはなかった。
【図１】
2009133679.tif 000004
【図２】
2009133679.tif 000005
【図３】
2009133679.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月24日(2010.9.24)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ用電極の製造方法、バイオセンサの製造方法、およびバイオセンサに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バインダ剤を含まない溶媒に対し、ナノカーボンを添加して、ナノカーボンを含有する液体を作成する工程と、
前記ナノカーボンを含有する前記液体を、基板上に塗布して、ナノカーボン層を形成する工程と、
前記ナノカーボン層に対して、抗体または酵素を固定化する工程とを含むバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記液体は、前記ナノカーボンと、前記溶媒とからなるバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記ナノカーボンを前記溶媒に添加する工程の前段で、
酸またはアルカリ溶液を用いて、前記ナノカーボンを洗浄する工程を実施するバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
抗体または酵素を固定化する前記工程の後段で、
前記ナノカーボン層を高分子膜で被覆する工程を実施するバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記ナノカーボンは、カーボンナノチューブであるバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のバイオセンサ用電極の製造方法において、
前記基板および前記ナノカーボン層が光透過性であるバイオセンサ用電極の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載のバイオセンサ用電極の製造方法を含むバイオセンサの製造方法であり、
前記基板の前記ナノカーボン層の下方の位置には、位置あわせ用のマークが形成されており、
前記バイオセンサ用電極を実装基板に実装する工程を含み、
前記バイオセンサ用電極を実装基板に実装する前記工程では、前記バイオセンサ用電極の基板の位置あわせマークと、前記実装基板に形成された位置あわせマークとを用いて位置あわせを行い、前記バイオセンサ用電極を前記実装基板に実装するバイオセンサの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のバイオセンサの製造方法において、
前記ナノカーボン層を作用極とし、
前記基板上に、参照電極および対極を形成する工程を含むバイオセンサの製造方法。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか１項に記載のバイオセンサ用電極の製造方法により得られるバイオセンサ用電極を備える、または請求項７または８に記載のバイオセンサの製造方法により得られる、バイオセンサ。
【国際調査報告】
2009133679.tif 000007
2009133679.tif 000008
2009133679.tif 000009
2009133679.tif 000010