(57)【要約】本発明は、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の同時解析により、簡便、高精度に標的ＤＮＡを検出する方法、及びそのためのキットを提供する。本発明の標的ＤＮＡを検出する方法は、標的塩基配列を有するセンス鎖と、これに相補的なアンチセンス鎖とからなる標的ＤＮＡの検出方法であり、センス鎖とハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと、アンチセンス鎖とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを用い、アンチセンス鎖のうち、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、センス鎖の第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとを、一の反応溶液に同時添加して、標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後、ライゲーション反応及び／又はＰＣＲを行い、産物を検出する。
2009054367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列を有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とからなる標的ＤＮＡを検出する方法であって、前記センス鎖とハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス鎖とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを用いるものであり、前記アンチセンス鎖のうち、前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、前記センス鎖の前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとを、一の反応溶液に同時に添加して、前記標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後、ライゲーション反応及び／又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、産物を検出することを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数が、前記センス鎖と前記第１のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数又は前記アンチセンス鎖と前記第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数よりも多いことを特徴とする請求項１記載の標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項３】
前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドに、それぞれ１以上のミスマッチを導入することを特徴とする請求項２記載の標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項４】
前記標的塩基配列が、ＳＮＰ（一塩基多型）を含む塩基配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項５】
前記センス鎖と、前記センス鎖の前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域とは異なる領域でハイブリダイズする第３のオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖の前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域とは異なる領域でハイブリダイズする第４のオリゴヌクレオチドとを用いるものであり、前記アンチセンス鎖のうち、前記第４のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、前記センス鎖の前記第３のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチド、及び前記第４のオリゴヌクレオチドを、一の反応溶液に同時に添加して、前記標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後、ライゲーション反応及び／又はＰＣＲを行い、産物を検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の標的ＤＮＡの検出方法に用いられるキットであって、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとを有することを特徴とする標的ＤＮＡ検出キット。
【請求項７】
請求項５記載の標的ＤＮＡの検出方法に用いられるキットであって、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチド、前記第４のオリゴヌクレオチドを有することを特徴とする標的ＤＮＡ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション法を応用した方法であって、標的塩基配列を有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を、同時に解析することにより、精度よく標的ＤＮＡを検出する方法、及び該方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、核酸分析による遺伝子検査は、医療、研究、産業への応用に広く用いられている。このような検査は試料中の標的塩基配列を有するＤＮＡの存在の検出を行うものであり、疾患の診断、治療だけでなく、食品検査等の様々な分野において応用されている。特に、ＳＮＰ（一塩基多型）は、癌等の特定の疾患に対する罹り易さや、薬物代謝能等の個体差の主要な一因と考えられており、学術研究においてのみならず、実際の臨床検査においても、ＳＮＰ解析が広く行われている。このため、高精度かつ迅速にＳＮＰを検出し得る方法の開発が盛んである。【０００３】
ＳＮＰを検出する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。例えばあるＳＮＰにおいて、あるアレルに特異的に結合し得るプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ＰＣＲ産物の有無によりＳＮＰを検出する方法や、検出対象であるＳＮＰを３'末端に有するプローブと、該ＳＮＰの５'側の隣の塩基を５'末端に有するプローブを用いて、ライゲーション反応を行い、２つのプローブが結合された一のオリゴヌクレオチドが得られるか否かによりＳＮＰを検出する方法等のように、分子生物学的な酵素反応を用いて、解析対象であるＳＮＰ及びその近傍の塩基配列を解析する方法が汎用されている。【０００４】
このような酵素反応を用いた解析法は、ＳＮＰ解析のように塩基配列のうちのたった１つの塩基の相違のみを解析する場合には、非特異的な反応が生じ易いという問題がある。例えば、臨床検査のように、測定対象である試料が少量である場合や、不純物が多い等の質的な問題がある場合には、しばしば非特異的な反応が生じる結果、解析にエラーが生じてしまう。一方で、医療を目的とした遺伝子解析では、検査の誤りは患者に対して致命的な結果をもたらすおそれが大きく、高い正確性が強く求められている。さらに、臨床検査では、限られた時間のなかで非常に多くの検体を処理する場合が多く、検査の迅速性や作業性の改善も求められている。【０００５】
従来の生化学的な検査では、複数項目の結果の比較により、生化学的な知見から、エラーデータの検出がなされている。ＳＮＰの検出においても、他の検査と同様に、複数の検査結果を比較検討することにより、より精度の高い結果が得られると考えられる。例えば、センス鎖だけではなく、アンチセンス鎖の塩基配列も解析して、両鎖の塩基を検出することにより、塩基の相補性から検査の正確性を高めることができる。【０００６】
その他にも、ＳＮＰ検出の精度を向上させるために、種々の方法が開示されている。例えば、（１）部分的には標的核酸配列と相補するが完全には相補的ではない改変されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＳＮＰの標的のアレルに対するアフィニティーが、対照のアレルに対するアフィニティーよりも高くするようにして、標的のアレルの検出精度を高める方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、（２）特定の塩基配列を有する標的ＤＮＡと特異的に結合するプローブであって、プローブ同士の会合体の安定性よりも該標的ＤＮＡとの会合体の安定性のほうが高くなるように設計したプローブを用いる方法がある。このように、プローブ同士に対するアフィニティーを下げることにより、非特異的な酵素反応等を抑えて、ＳＮＰ検出の精度を向上させることができる。
このようなプローブを擬相補性プローブといい、例えば、２−チオウラシル／２，６−ジアミノプリンの組み合わせを利用する方法（例えば、非特許文献１参照。）や、人工核酸の導入に加えて主鎖をＰＮＡ（ペプチド核酸）に変えた人工的な核酸が提案されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【特許文献１】特表２０００−５１１４３４号公報
【非特許文献１】クツィァビン（Kutyavin）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、第３５巻第３４号、１１１７０〜１１１７６ページ、１９９６年。
【非特許文献２】ロース（Lohse）ら、プロシーディング・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッドステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第９６巻第２１号、１１８０４〜１１８０８ページ、１９９９年。
【非特許文献３】西田ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第３６４巻、７８〜８５ページ、２００７年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
センス鎖を解析するためのプローブと、センス鎖の解析領域に対応するアンチセンス鎖を解析するためのプローブは、必然的に互いに相補的なプローブとなる。したがって、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を解析するために、それぞれを検出するためのプローブを検査対象に同時に添加した場合は、プローブ同士がハイブリダイズし、プローブとセンス鎖又はアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションが阻害されるため、解析反応が失敗することが多いと考えられていた。このため、プローブの競合を防止するために、センス鎖の解析とアンチセンス鎖の解析を、それぞれ単独に行う必要があり、迅速性や作業性の簡便さの点で問題があった。【０００８】
一方、上記（２）の方法によれば、プローブ同士のハイブリダイズ産物の安定性よりも、プローブと標的ＤＮＡとの会合体の安定性をより高くすることができるが、２−チオウラシルや２，６−ジアミノプリン等の修飾核酸や、ペプチド核酸を用いることから、プローブの合成コストが高くなり、多検体を処理する必要がある臨床検査等には好ましくない。また、上記（１）の方法は、塩基配列の識別の特異性の向上を目的とするものであり、上記特許文献１には、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を同時に解析する方法については、一切記載されてはいない。【０００９】
本発明は、ハイブリダイゼーション法を応用した方法であって、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に解析することより、簡便にかつ精度よく標的ＤＮＡを検出する方法、及び該方法に用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、センス鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと、アンチセンス鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを、一の反応溶液に同時に添加してハイブリダイゼーションを行うことにより、センス鎖とアンチセンス鎖を同時に解析できること、及び、前記各オリゴヌクレオチドに適宜ミスマッチを導入することにより、オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡの会合体の熱力学的安定性を、オリゴヌクレオチド同士との会合体よりも高くすることにより、高精度にセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に解析できることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、標的塩基配列を有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とからなる標的ＤＮＡを検出する方法であって、前記センス鎖とハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス鎖とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを用いるものであり、前記アンチセンス鎖のうち、前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、前記センス鎖の前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとを、一の反応溶液に同時に添加して、前記標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後、ライゲーション反応及び／又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、産物を検出することを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数が、前記センス鎖と前記第１のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数又は前記アンチセンス鎖と前記第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数よりも多いことを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドに、それぞれ１以上のミスマッチを導入することを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記標的塩基配列が、ＳＮＰ（一塩基多型）を含む塩基配列であることを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記センス鎖と、前記センス鎖の前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域とは異なる領域でハイブリダイズする第３のオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖の前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域とは異なる領域でハイブリダイズする第４のオリゴヌクレオチドとを用いるものであり、前記アンチセンス鎖のうち、前記第４のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、前記センス鎖の前記第３のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチド、及び前記第４のオリゴヌクレオチドを、一の反応溶液に同時に添加して、前記標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後、ライゲーション反応及び／又はＰＣＲを行い、産物を検出することを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の標的ＤＮＡの検出方法に用いられるキットであって、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとを有することを特徴とする標的ＤＮＡ検出キットを提供するものである。
また、本発明は、前記記載の標的ＤＮＡの検出方法に用いられるキットであって、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチド、前記第４のオリゴヌクレオチドを有することを特徴とする標的ＤＮＡ検出キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的ＤＮＡの検出方法は、センス鎖とアンチセンス鎖を同時に解析できるため、ＳＮＰの検出において、正確性を高めるためにセンス鎖とアンチセンス鎖の双方を解析する場合であっても、多検体を簡便かつ迅速に解析することが可能となる。特に、解析に用いるオリゴヌクレオチドに適宜ミスマッチを導入することにより、オリゴヌクレオチド同士の会合体の熱力学的安定性を低下させることができるため、オリゴヌクレオチドとセンス鎖又はアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションが高効率になされる結果、ＳＮＰの検出精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＤｉｇｉＴａｇ２法を用いた本発明の標的ＤＮＡの検出方法の一態様の概要を示した図である。
【図２】ｒｓ１７８２２９３１の近傍の塩基配列を示した図であり、図中、［Ｃ／Ｔ］がＳＮＰである。
【図３】参考例１において計測した各会合体のＴｍ値を示した図である。図中、左カラムはセンス鎖−Ｃｏｍｍｏｎプローブ会合体のＴｍ値であり、右カラムはＣｏｍｍｏｎプローブ−Ｑｕｅｒｙプローブ会合体のＴｍ値を示している。また、（Ａ）はＣｏｍｍｏｎプローブとＱｕｅｒｙプローブとを用いた場合であり、（Ｂ）はＣｏｍｍｏｎプローブとＱｕｅｒｙ２プローブとを用いた場合であり、（Ｃ）はＣｏｍｍｏｎ２プローブとＱｕｅｒｙ２プローブとを用いた場合である。
【図４】実施例１において、ライゲーション量を測定した結果を示した図である。図中、「サンプル型」とは、用いたＤＮＡサンプルのＳＮＰの型を表したものであり、「ＮＣ」は対照を意味する。また、「プローブ型」とは、用いたプローブが検出対象とするＳＮＰを意味しており、「Ｃ−Ｐｒｏｂｅ」は、５'側センス（Ｃ）プローブ又は５'側アンチセンス（Ｃ）プローブのいずれかを用いたことを示しており、「Ｔ−Ｐｒｏｂｅ」は、５'側センス（Ｔ）プローブ又は５'側アンチセンス（Ｔ）プローブのいずれかを用いたことを示している。
【符号の説明】
【００１４】
１…５'側（センス鎖）プローブ、２…３'側 （アンチセンス鎖）プローブ、３…３'側（センス鎖）プローブ、４…５'側（アンチセンス鎖）プローブ、５…５'側（センス鎖）プローブ１と３'側 （センス鎖）プローブ３が結合したオリゴヌクレオチド、６…３'側（アンチセンス鎖）プローブ２と５'側（アンチセンス鎖）プローブ４が結合したオリゴヌクレオチド
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明における標的塩基配列とは、検出の対象となる塩基配列であって、遺伝子組換え技術等により検出が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列であってもよく、ｍＲＮＡ等の生物のＲＮＡに存在する塩基配列であってもよい。ＳＮＰを有する塩基配列であることが好ましく、ヒトのＳＮＰを有する塩基配列であることがより好ましい。【００１６】
本発明における標的塩基配列を有する標的ＤＮＡは、標的塩基配列を有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とからなる二本鎖ＤＮＡである。該標的ＤＮＡとして、例えば、血液や体液等の生体試料（検体）中に含有されるＤＮＡや、これらの生体試料等から抽出されたＤＮＡであってもよく、これらのＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡであってもよい。また、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。【００１７】
本発明の標的ＤＮＡの検出方法は、標的塩基配列を有するセンス鎖と、前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖とからなる標的ＤＮＡを検出する方法であって、前記センス鎖とハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス鎖とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドとを用いるものであり、前記アンチセンス鎖のうち、前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、前記センス鎖の前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとを、一の反応溶液に同時に添加して、前記標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後、ライゲーション反応及び／又はＰＣＲを行い、産物を検出することを特徴とする。
すなわち、本発明の標的ＤＮＡの検出方法は、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとを、標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせることを特徴とするものであり、ハイブリダイゼーション法を用いた標的核酸の検出方法の精度や作業性を向上させ得る方法である。【００１８】
ここで、アンチセンス鎖のうち、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部分が、センス鎖の第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の少なくとも一部と相補的であるとは、アンチセンス鎖の第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域と、センス鎖の第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域が、部分的に塩基対を形成し得ることを意味する。センス鎖の第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域と、アンチセンス鎖の第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域は、必ずしも完全に塩基対を形成し得る必要はなく、各領域は、それぞれのハイブリダイゼーション効率を考慮して、適宜決定することができる。
つまり、標的ＤＮＡの一部分においては、該一部分のセンス鎖には第１のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、アンチセンス鎖には第２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることになる。本発明においては、このような、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドのような関係を、「表裏の関係」ということがある。【００１９】
このように、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一部は互いに相補的な塩基配列を有しており、これらのオリゴヌクレオチドを一の反応溶液に同時に添加した場合には、ハイブリダイズによりオリゴヌクレオチド同士の会合体を形成し得る。このため、標的ＤＮＡとともに一の反応溶液に添加すると、第１のオリゴヌクレオチドに対して、本来の目的である標的ＤＮＡのセンス鎖と第２のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションにおいて互いに競合する。同様に、第２のオリゴヌクレオチドに対して、本来の目的である標的ＤＮＡのアンチセンス鎖と第１のオリゴヌクレオチドが互いに競合する。しかしながら、このようにオリゴヌクレオチド同士で会合体を形成するものは、反応溶液に添加したオリゴヌクレオチドの一部にすぎない。このため、オリゴヌクレオチド同士で会合体を形成しなかった残りのオリゴヌクレオチドのうち、第１のオリゴヌクレオチドを本来の目的である標的ＤＮＡのうちのセンス鎖と、第２のオリゴヌクレオチドを本来の目的であるアンチセンス鎖と、それぞれハイブリダイズさせることができ、このハイブリダイゼーションを利用して、標的ＤＮＡを検出することができる。【００２０】
また、第１のオリゴヌクレオチドの、センス鎖とハイブリダイズする領域は、センス鎖とハイブリダイズし得る塩基配列を有するものであれば、特に限定されるものではなく、センス鎖と完全に相補的な塩基配列を有する領域であってもよく、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。同様に、第２のオリゴヌクレオチドの、アンチセンス鎖とハイブリダイズする領域も、アンチセンス鎖と完全に相補的な塩基配列を有する領域であってもよく、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。ここで、ミスマッチとは、互いに塩基対を形成しない塩基を意味する。【００２１】
特に、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数が、センス鎖と第１のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数又はアンチセンス鎖と第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体が有するミスマッチの数よりも多くなるように、それぞれのオリゴヌクレオチドにミスマッチを導入することが好ましい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションの安定性は、形成される会合体の連続した塩基対の長さに大きく影響される。形成される会合体の連続した塩基対の長さが短くなるほど、該会合体の熱力学的な安定性が損なわれるためと考えられる。ミスマッチを有する場合には、形成される会合体が、該ミスマッチの箇所で分断されるため、該会合体が熱力学的に不安定になり、ハイブリダイゼーション効率が低下する。したがって、オリゴヌクレオチド同士の会合体が有するミスマッチの数を、オリゴヌクレオチドとセンス鎖又はアンチセンス鎖との会合体が有するミスマッチの数よりも多くすることにより、オリゴヌクレオチド同士のハイブリダイズよりも、センス鎖又はアンチセンス鎖とのハイブリダイズを優先的に行うことができるという擬相補性を持たせることができる。【００２２】
例えば、第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドに、会合体を形成した場合にミスマッチが重ならないように、それぞれ１のミスマッチを導入した場合には、各オリゴヌクレオチドとセンス鎖又はアンチセンス鎖との会合体のミスマッチは１箇所だが、オリゴヌクレオチド同士の会合体のミスマッチは２箇所となるために、それぞれの会合体の安定性に差を設けることができ、各オリゴヌクレオチドに擬相補性を持たせることができる。【００２３】
各オリゴヌクレオチドに導入するミスマッチの数や位置は、擬相補性を維持し得る限り、特に限定されるものではなく、形成され得る３種類の会合体（第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体、センス鎖と第１のオリゴヌクレオチドとからなる会合体、及びアンチセンス鎖と第２のオリゴヌクレオチドとからなる会合体）のＴｍ値（二重鎖融解温度）やハイブリダイゼーション効率等を考慮して、適宜決定することができる。第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドに、それぞれ１以上のミスマッチを、会合体を形成した場合にミスマッチが重ならないように設計して導入することが好ましい。両方のオリゴヌクレオチドにミスマッチを導入することにより、より効果的にオリゴヌクレオチド同士の会合体の熱力学的安定性を低下させることができるためである。但し、導入するミスマッチの数があまりに多くなりすぎると、本来の目的であるセンス鎖又はアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーション効率の低下や、標的ＤＮＡ以外のＤＮＡとのハイブリダイゼーションの促進等を招くおそれがあるため、ミスマッチの数は、オリゴヌクレオチドのセンス鎖等とのハイブリダイズする領域の塩基数の２０％以下であることが好ましい。【００２４】
本発明の第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを構成する塩基は、天然の塩基であってもよく、修飾された塩基等の合成された塩基であってもよいが、天然の塩基であることが好ましい。ハイブリダイゼーション等の標的ＤＮＡの検出反応に対する影響が小さいため、及び、合成塩基を用いた場合よりも簡便かつ安価に合成し得るためである。【００２５】
本発明の第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドは、センス鎖等とのハイブリダイズを阻害しない限り、センス鎖等とハイブリダイズするための領域以外に、付加的な塩基配列を有していてもよい。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。【００２６】
このようなオリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データやＳＮＰデータと、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ,Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. ｈｔｍｌ）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。このようなプライマー設計ツールにより、Ｔｍ値やハイブリダイゼーション効率の計測が簡便に行えるため、より好ましいミスマッチを効率よく導入することができる。公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。また、公知のＳＮＰデータは、例えば、東大医科学研究所の整備した日本人のＳＮＰのデータベースＪＳＮＰ（ｈｔｔｐ：//ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ/ｉｎｄｅｘ＿ｊａ.ｈｔｍｌ）等のデータベースから入手することができる。【００２７】
このようにして設計したオリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。【００２８】
また、本発明の標的ＤＮＡの検出方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡの検出を容易にするために、標識されたものであってもよい。該標識をするための物質は、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。【００２９】
第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとを、標的ＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせた後に、得られた会合体を用いてライゲーション反応やＰＣＲを行い、産物を検出することにより、標的ＤＮＡを検出することができる。該検出方法は、ライゲーション反応やＰＣＲを用いるものであれば、特に限定されるものではなく、ハイブリダイゼーション法を応用した標的核酸の検出方法として、公知の手法を用いることができる。特にＳＮＰの検出に用いられている手法であることが好ましい。【００３０】
また、一の反応溶液中に複数の表裏の関係にあるオリゴヌクレオチドを同時に添加する方法であってもよい。具体的には、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドに加えて、互いに表裏の関係にある第３のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドを用いてもよい。ここで、該第３のオリゴヌクレオチドは、センス鎖と、センス鎖の第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域とは異なる領域でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、該第４のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖と、アンチセンス鎖の第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域とは異なる領域でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。【００３１】
ＰＣＲを行い、産物を検出する方法として、例えば、第１のオリゴヌクレオチドを、センス鎖を鋳型として増幅を行うためのフォワードプライマー、第３のオリゴヌクレオチドを、センス鎖を鋳型として増幅を行うためのリバースプライマー、第４のオリゴヌクレオチドを、アンチセンス鎖を鋳型として増幅を行うためのフォワードプライマー、第２のオリゴヌクレオチドを、アンチセンス鎖を鋳型として増幅を行うためのリバースプライマーとして、一の反応溶液中でＰＣＲを行い、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に増幅し、それぞれの産物を検出することにより、標的ＤＮＡを検出することができる。
また、それぞれの産物の塩基配列を確認することにより、該産物の検出をより高精度に行うこともできる。【００３２】
ライゲーション反応を行い、産物を検出する方法として、例えば、第１のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドを、センス鎖の隣接した領域にハイブリダイズするプローブとし、第２のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドを、アンチセンス鎖の隣接した領域にハイブリダイズするプローブとし、一の反応溶液中でライゲーション反応を行い、産物を検出することにより、標的ＤＮＡを検出することができる。具体的には、第１のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドが結合したオリゴヌクレオチドと、第２のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドが結合したオリゴヌクレオチドが、それぞれ得られるか否かを確認することにより、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に検出することができる。【００３３】
本発明の標的ＤＮＡの検出方法としては、ＳＮＰの検出に優れているＤｉｇｉＴａｇ２法（非特許文献３）を用いることが特に好ましい。【００３４】
図１は、ＤｉｇｉＴａｇ２法を用いた本発明の標的ＤＮＡの検出方法の一態様の概要を示したものである。具体的には、野生型アレルがＣであり、変異型アレルがＴであるＳＮＰの、野生型アレルの塩基配列を標的塩基配列とした場合に、検体ＤＮＡが野生型アレル（標的ＤＮＡ）であるか否かを検出する方法である。例えば、第１のオリゴヌクレオチドとして、３'末端の塩基が野生型アレルのセンス鎖のＳＮＰ（Ｃ）に相補的なＧであり、野生型アレルのセンス鎖とハイブリダイズする領域を３'側に有し、５'側にタグ配列であるｒＥＤを有する５'側（センス鎖）プローブ１を用いる。第２のオリゴヌクレオチドとして、５'末端の塩基が野生型アレルのアンチセンス鎖のＳＮＰ（Ｇ）の５'側隣の塩基に相補的な塩基であり、野生型アレルのアンチセンス鎖とハイブリダイズする領域を５'側に有し、３'側にタグ配列であるｒＤＣＮ２を有する３'側 （アンチセンス鎖）プローブ２を用いる。第３のオリゴヌクレオチドとして、５'末端の塩基が野生型アレルのセンス鎖のＳＮＰ（Ｃ）の５'側隣の塩基に相補的な塩基であり、野生型アレルのセンス鎖とハイブリダイズする領域を５'側に有し、３'側にタグ配列であるｒＤＣＮ１を有する３'側（センス鎖）プローブ３を用いる。第４のオリゴヌクレオチドとして、３'末端の塩基が野生型アレルのアンチセンス鎖のＳＮＰ（Ｇ）に相補的なＣであり、野生型アレルのアンチセンス鎖とハイブリダイズする領域を３'側に有し、５'側にタグ配列であるｒＥＤを有する５'側（アンチセンス鎖）プローブ４を用いる。【００３５】
これら４種類のオリゴヌクレオチドと、ＳＮＰの検出対象である検体ＤＮＡを一の反応溶液に添加し、変性工程とアニール工程を行うと、野生型アレル及び変異型アレルのセンス鎖に５'側（センス鎖）プローブ１と３'側 （センス鎖）プローブ３が、野生型アレル及び変異型アレルのアンチセンス鎖に３'側 （アンチセンス鎖）プローブ２と５'側（アンチセンス鎖）プローブ４が、それぞれハイブリダイズする。ここで、５'側（センス鎖）プローブ１と３'側（アンチセンス鎖）プローブ２、及び、３'側（センス鎖）プローブ３と５'側（アンチセンス鎖）プローブ４も、それぞれハイブリダイズし、会合体を形成する。しかし、各オリゴヌクレオチドに適宜ミスマッチを導入することにより、擬相補性を持たせることができるため、各オリゴヌクレオチドを一の反応溶液に添加した場合であっても、優先的にセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズさせることができる。【００３６】
その後、ＤＮＡリガーゼを反応溶液に添加してライゲーション反応を行うことにより、図１に示すように、検体ＤＮＡが野生型である場合には、５'側（センス鎖）プローブ１と３'側 （センス鎖）プローブ３が結合したオリゴヌクレオチド５と、３'側（アンチセンス鎖）プローブ２と５'側（アンチセンス鎖）プローブ４が結合したオリゴヌクレオチド６が、ライゲーション産物として得られる。これらのライゲーション産物に、さらにｒＥＤと相同的な塩基配列を有するｒＥＤプライマー、ｒＤＣＮ１と相補的な塩基配列を有するＤＣＮ１プライマー、及びｒＤＣＮ２と相補的な塩基配列を有するＤＣＮ２プライマーを用いてＰＣＲを行うと、増幅されたオリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６がＰＣＲ産物として得られる。一方で、検体ＤＮＡが変異型である場合には、これらのプローブが結合したオリゴヌクレオチドはライゲーション産物として得ることができず、ＰＣＲ増幅もなされない。このため、ＰＣＲ産物の有無を測定することにより、検体ＤＮＡのＳＮＰを検出することができる。なお、ライゲーション産物の増幅を、リアルタイムＰＣＲで行うことにより、迅速かつ半定量的にＳＮＰを検出することができる。また、検出を簡便にするために、ＰＣＲに用いられるｒＥＤプライマーやＤＣＮ１プライマー等は蛍光物質等を用いて標識されたものであってもよい。【００３７】
オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６のいずれか一方の増幅のみが検出された場合には、一連の操作に問題があった可能性や、擬陽性である可能性が考えられる。つまり、表裏の関係にあるオリゴヌクレオチドを用いて、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を解析することにより、標的ＤＮＡの検出精度を高めることができる。【００３８】
このように、本発明の標的ＤＮＡの検出方法は、一度の検出反応により、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を迅速に解析し得る。また、得られた２つの解析結果を比較検討して、標的ＤＮＡの検出の有無を判定することにより、標的ＤＮＡ検出の精度及び成功率を向上させることができる。例えば、ある検体において、センス鎖とアンチセンス鎖の解析結果が共に陽性である、つまり標的ＤＮＡが検出されたと解析された場合に限り、該検体は陽性であると判定することにより、擬陽性を可能な限り排除し得るため、標的ＤＮＡの検出精度を向上させることができる。一方、センス鎖とアンチセンス鎖の解析結果のいずれかにおいて陽性と測定されたもの全てを、該検体は陽性であると判定することにより、陽性の可能性のある検体を、取りこぼすことなく全て検出することができるため、標的ＤＮＡの検出成功率を向上させることができる。つまり、ＳＮＰを検出する場合において、精度を向上させる場合には、塩基の相補性を利用して２つの解析結果の論理積をとり、成功率を向上させる場合には、同一多型集団内のシグナル分布に着目して、２つの解析結果の論理和をとることが好ましい。【００３９】
なお、ＰＣＲやＤｉｇｉＴａｇ２法において用いられるＤＮＡポリメラーゼやＤＮＡリガーゼ等の酵素、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、ＰＣＲやＤｉｇｉＴａｇ２法において通常用いられるものを通常用いられる濃度で用いることができる。また、ＰＣＲやライゲーション反応等の反応条件は、用いる酵素の種類やオリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。【００４０】
また、本発明の標的ＤＮＡの検出方法に用いられるオリゴヌクレオチド群を一のキットとすることもできる。例えば、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドとを一のキットとすることができる。前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチド、及び前記第４のオリゴヌクレオチドを有するキットとすることもできる。また、該キットには、ライゲーション反応やＰＣＲのためのＤＮＡリガーゼやＤＮＡポリメラーゼ等の酵素、ヌクレオチド、バッファー等の試薬を含めることが好ましい。さらに、ライゲーション産物やＰＣＲ産物の検出に用いられるプライマーやプローブを含むキットとしてもよい。このようなキットを用いることにより、迅速かつ簡便に標的ＤＮＡを検出することが可能となる。【００４１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４２】
（参考例１）
ヒト１６番染色体上のＳＮＰの一つであり、ＮＣＢＩのアクセッション番号がｒｓ１７８２２９３１であるＳＮＰ（野生型：Ｃ、変異型：Ｔ）に対して、ＤｉｇｉＴａｇ２法を用いたＳＮＰ検出方法にも使用可能なプローブを設計し、ミスマッチの導入による擬相補性効果を調べた。なお、図２はｒｓ１７８２２９３１の近傍の塩基配列を示した図であり、図中、［Ｃ／Ｔ］がＳＮＰである。
標的塩基配列を、ｒｓ１７８２２９３１の野生型アレルのセンス鎖の塩基配列とし、第１のオリゴヌクレオチドを、３'末端の塩基がＳＮＰ（Ｃ）に相補的なＧであり、野生型アレルのセンス鎖とハイブリダイズする塩基配列を有するＣｏｍｍｏｎプローブとし、第２のオリゴヌクレオチドを、５'末端の塩基が野生型アレルのアンチセンス鎖のＳＮＰ（Ｇ）の５'側隣の塩基に相補的な塩基であり、野生型アレルのアンチセンス鎖とハイブリダイズする塩基配列を有するＱｕｅｒｙプローブとして、各プローブの設計を、Ｔｍ値が５８℃となる条件でＶｉｓｕａｌ ＯＭＰ  Ｖｅｒ．６を用いて行った。さらに、Ｃｏｍｍｏｎプローブの５'末端から１０番目の塩基にミスマッチを導入したＣｏｍｍｏｎ２プローブと、Ｑｕｅｒｙプローブの３'末端から４番目の塩基にミスマッチを導入したＱｕｅｒｙ２プローブを設計した。設計された各プローブの塩基配列を表１にそれぞれ示した。【００４３】
【表１】
2009054367.tif 000003
【００４４】
Ｃｏｍｍｏｎプローブと野生型アレルのセンス鎖との会合体、ＣｏｍｍｏｎプローブとＱｕｅｒｙプローブとの会合体の、それぞれのＴｍ値を求めて、ミスマッチの導入の有無による変化を、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ  Ｖｅｒ．６を用いて計測した。結果を図３に示す。図中、左カラムはセンス鎖−Ｃｏｍｍｏｎプローブ会合体のＴｍ値であり、右カラムはＣｏｍｍｏｎプローブ−Ｑｕｅｒｙプローブ会合体のＴｍ値を示している。また、（Ａ）はＣｏｍｍｏｎプローブとＱｕｅｒｙプローブとを用いた場合であり、（Ｂ）はＣｏｍｍｏｎプローブとＱｕｅｒｙ２プローブとを用いた場合であり、（Ｃ）はＣｏｍｍｏｎ２プローブとＱｕｅｒｙ２プローブとを用いた場合である。すなわち、（Ａ）はミスマッチのないプローブを用いた場合であり、（Ｂ）はＱｕｅｒｙプローブのみミスマッチを導入した場合であり、（Ｃ）は両プローブともミスマッチを導入した場合である。【００４５】
この結果、Ｑｕｅｒｙプローブにミスマッチを導入することにより、センス鎖−Ｃｏｍｍｏｎプローブ会合体とＣｏｍｍｏｎプローブ−Ｑｕｅｒｙプローブ会合体のいずれもＴｍ値が低下していた。また、さらにＣｏｍｍｏｎプローブにもミスマッチを導入した場合には、センス鎖−Ｃｏｍｍｏｎプローブ会合体のＴｍ値はほとんど変化しなかったが、競合するＣｏｍｍｏｎプローブ−Ｑｕｅｒｙプローブ会合体のＴｍ値は約４０℃程度も低下していた。すなわち、図３の結果から、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方にミスマッチを導入することにより、各オリゴヌクレオチドの擬相補性をより向上させ得ることが明らかであり、本発明の標的ＤＮＡの検出方法によって、同時に標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の解析が可能であることが示唆される。
【実施例】
【００４６】
図１に示したＤｉｇｉＴａｇ２法を用いた本発明の標的ＤＮＡの検出方法により、ｒｓ１７８２２９３１であるＳＮＰを検出した。
ＤＮＡサンプルとして、野生型ホモ体（Ｃ／Ｃ）、ヘテロ体（Ｃ／Ｔ）、変異型ホモ体（Ｔ／Ｔ）を用いた。また、ＤＮＡサンプルに代えて純水を用いたものを対照とした。
検出用プローブとして、表２記載の６種類のプローブを用いた。表２中、上の３種類はセンス鎖を解析するプローブであり、下の３種類はアンチセンス鎖を解析するプローブである。「５'側センス（Ｃ）」は配列番号５の塩基配列を有するプローブであって、３'末端の塩基がセンス鎖の野生型ＳＮＰに相補的なＧであり、野生型アレルのセンス鎖とハイブリダイズする領域を３'側に有し、５'側にタグ配列であるｒＥＤを有するものであり、「５'側センス（Ｔ）」は配列番号６の塩基配列を有するプローブであって、３'末端の塩基がセンス鎖の変異型ＳＮＰに相補的なＡであり、変異型アレルのセンス鎖とハイブリダイズする領域を３'側に有し、５'側にタグ配列であるｒＥＤ'を有するものであり、「３'側センス」は配列番号７の塩基配列を有するプローブであって、５'末端の塩基がＳＮＰの５'側隣の塩基に相補的な塩基であり、センス鎖とハイブリダイズする領域を５'側に有し、３'側にタグ配列であるｒＤＣＮ２を有するものである。また、「５'側アンチセンス（Ｃ）」は配列番号８の塩基配列を有するプローブであって、３'末端の塩基がアンチセンス鎖の野生型ＳＮＰに相補的なＣであり、野生型アレルのアンチセンス鎖とハイブリダイズする領域を３'側に有し、５'側にタグ配列であるｒＥＤを有するものであり、「５'側アンチセンス（Ｔ）」は配列番号９の塩基配列を有するプローブであって、３'末端の塩基がアンチセンス鎖の変異型ＳＮＰに相補的なＴであり、変異型アレルのアンチセンス鎖とハイブリダイズする領域を３'側に有し、５'側にタグ配列であるｒＥＤ'を有するものであり、「３'側アンチセンス」は配列番号１０の塩基配列を有するプローブであって、５'末端の塩基がアンチセンス鎖のＳＮＰの５'側隣の塩基に相補的な塩基であり、アンチセンス鎖とハイブリダイズする領域を５'側に有し、３'側にタグ配列であるｒＤＣＮ１を有するものである。ここで、５'側センス（Ｃ）プローブ、５'側センス（Ｔ）プローブ、５'側アンチセンス（Ｃ）プローブ、及び５'側アンチセンス（Ｔ）プローブは、参考例１のＱｕｅｒｙ２プローブと同様に、３'末端から４番目の塩基にミスマッチが導入されたプローブである。また、３'側センスプローブは、５'末端から１０番目の塩基に、３'側アンチセンスプローブは、５'末端から１１番目と１６番目の塩基に、それぞれミスマッチが導入されたプローブである。なお、タグ配列であるｒＥＤ、ｒＥＤ'、ｒＤＣＮ１、及びｒＤＣＮ２の塩基配列を表３に示す。【００４７】
【表２】
2009054367.tif 000004
【００４８】
【表３】
2009054367.tif 000005
【００４９】
理論的には、ＤＮＡサンプル中に、野生型アレルのセンス鎖が存在する場合には、ＤｉｇｉＴａｇ２法により、５'側センス（Ｃ）プローブと３'側センスプローブが結合して得られるライゲーション産物が検出される。一方で、ＤＮＡサンプル中に、変異型アレルのセンス鎖が存在する場合には、５'側センス（Ｔ）プローブと３'側センスプローブが結合して得られるライゲーション産物が検出される。同様に、野生型アレルのアンチセンス鎖が存在する場合には、５'側アンチセンス（Ｃ）プローブと３'側 アンチセンスプローブが結合して得られるライゲーション産物が検出され、変異型アレルのアンチセンス鎖が存在する場合には、５'側アンチセンス（Ｔ）プローブと３'側 アンチセンスプローブが結合して得られるライゲーション産物が検出される。【００５０】
まず、配列番号１５の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲにより、ＳＮＰを含むＤＮＡ断片の増幅を行った。具体的には、５μＬの２×ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に対して、５ｎｇのＤＮＡサンプルと、フォワードプライマーとリバースプライマーを最終濃度が０．１μＭとなるようにそれぞれ添加し、１０μＬのＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液を、９５℃で１５秒間処理した後、９５℃で３０秒間、６８℃で６分間の熱サイクルを４０サイクル行うことにより、ＰＣＲを行った。
次に、得られたＰＣＲ産物の１００倍希釈溶液を用いて、表２記載の６種類のプローブを同時に添加して、変性・アニーリングを行った後、ライゲーション反応を行った。具体的には、１μＬのＰＣＲ産物希釈溶液に対して、８ＵのＴａｑ  ｌｉｇａｓｅと、各プローブを最終濃度が３３３ｐＭとなるようにそれぞれ添加し、純水を添加して最終容量が１５μＬである反応溶液を調製した。該反応溶液を、９５℃で１分間の変性処理をした後、５８℃で１５分間処理することにより、各プローブとＤＮＡサンプルをハイブリダイズさせた上で、ライゲーション反応を行った。【００５１】
更にその後、タグ配列ｒＥＤと相同的な塩基配列を有するｒＥＤプライマーと、タグ配列ｒＤＣＮ２と相補的な塩基配列を有するＤＣＮ２プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、５'側センス（Ｃ）プローブと３'側センスプローブが結合して得られたライゲーション産物を検出した。同様にして、タグ配列ｒＥＤ'と相同的な塩基配列を有するｒＥＤ'プライマーとＤＣＮ２プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、５'側センス（Ｔ）プローブと３'側センスプローブが結合して得られたライゲーション産物を検出した。さらに、ｒＥＤプライマーと、タグ配列ｒＤＣＮ１と相補的な塩基配列を有するＤＣＮ１プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、５'側アンチセンス（Ｃ）プローブと３'側 アンチセンスプローブが結合して得られたライゲーション産物を、ｒＥＤ'プライマーとＤＣＮ１プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、５'側アンチセンス（Ｔ）プローブと３'側 アンチセンスプローブが結合して得られたライゲーション産物を、それぞれ検出した。
具体的には、１０μＬの２×ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社製）に対して、１μＬのライゲーション産物と、各プライマーを最終濃度が０．１μＭとなるようにそれぞれ添加し、２０μＬのリアルタイムＰＣＲ溶液を調製した。該リアルタイムＰＣＲ溶液を、９５℃で１０秒間処理した後、９５℃で５秒間、６１℃で７秒間の熱サイクルを６０サイクル行うことにより、リアルタイムＰＣＲを行い、各ライゲーション産物の量を相対的に測定した。【００５２】
図４は得られた測定結果を表した図である。図中、「サンプル型」とは、用いたＤＮＡサンプルのＳＮＰの型を表したものであり、「ＮＣ」は対照を意味する。また、「プローブ型」とは、用いたプローブが検出対象とするＳＮＰ型を意味しており、「Ｃ−Ｐｒｏｂｅ」は、５'側センス（Ｃ）プローブ又は５'側アンチセンス（Ｃ）プローブのいずれかを用いたことを示しており、「Ｔ−Ｐｒｏｂｅ」は、５'側センス（Ｔ）プローブ又は５'側アンチセンス（Ｔ）プローブのいずれかを用いたことを示している。野生型ＳＮＰのセンス鎖を検出するための５'側センス（Ｃ）プローブを用いた場合には、ライゲーション産物量は、ＤＮＡサンプルのＳＮＰ型が野生型ホモ体の場合に最も多く検出され、次いでヘテロ体においても検出されたが、変異型ホモ体や対照では検出されなかった。変異型ＳＮＰのセンス鎖を検出するための５'側センス（Ｔ）プローブを用いた場合には、ライゲーション産物量は、ＤＮＡサンプルのＳＮＰ型が変異型ホモ体の場合に最も多く検出され、次いでヘテロ体でも検出されたが、野生型ホモ体や対照では検出されなかった。アンチセンス鎖の解析でも同様の傾向が観察された。つまり、全ての測定結果において、ＤＮＡサンプルのＳＮＰ型と検出用プローブの型が一致した場合に、不一致の場合に比べて著しくライゲーション産物量が増えており、ライゲーション産物量の多寡に基づくＳＮＰの判定結果と、実際のＳＮＰ型が一致した。したがって、これらの結果から、本発明の標的ＤＮＡの検出方法を用いることにより、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に解析し得ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の標的ＤＮＡの検出方法を用いることにより、ハイブリダイゼーション法を応用し、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に解析することができるため、簡便にかつ精度よく標的ＤＮＡを検出することが可能であることから、特にＳＮＰの検出をはじめとする遺伝子解析等の分野において利用が可能である。
【図１】
2009054367.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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