(57)【要約】  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程とを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、
第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、
前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出するために、前記蛍光輝点を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定の刺激に応答する前記相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出するために、前記蛍光輝点を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方が該特定のタンパク質であり、他方が被検タンパク質であり、前記蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質を用い、前記蛍光輝点の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を調節する物質をスクリーニングするための方法であって、
被検化合物存在下で、第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、
前記細胞内において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の蛍光強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の蛍光強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の蛍光強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の蛍光強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、
を含む方法。
【請求項７】
前記会合誘導タンパク質が、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
会合誘導タンパク質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）被検タンパク質及びｍＡＧ１を含む融合蛋白質を細胞内に発現させる工程と、
（ｂ）前記被検タンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む融合蛋白質を細胞内に発現させる工程と、
（ｃ）（ａ）に記載の工程においては蛍光輝点が検出されず、（ｂ）に記載の工程においては蛍光輝点が検出された場合に、前記被検タンパク質を会合誘導タンパク質として選択する工程と、
を含む方法。
【請求項９】
前記多量化能を有する蛍光タンパク質が、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ２、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ、Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ1、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ1、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ1、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎ１、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＢ）、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＣ）、ＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ、ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５及びＤｓＲｅｄ２からなる群から選択される少なくとも一の蛍光タンパク質である、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）会合誘導タンパク質をコードするＤＮＡと、該会合誘導タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｂ）多量化能を有する蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、該蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｃ）ｍＡＧ１をコードするＤＮＡと、該蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｆ）（ａ）又は（ｄ）に記載のベクター及び（ｂ）又は（ｅ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｇ）（ｂ）に記載のベクター及び（ｃ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｈ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｉ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｊ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用の検出方法及びその応用、並びに当該方法に用いられるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用の検出方法は、主に２つのグループに分けることができる。一つ目は、生細胞から分離された状態のタンパク質を用いることを特徴とする方法である。例えば、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、タンパク質質量分析法（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、異方性測定法（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）が挙げられる。しかしながら、これらの方法では、実際の細胞内環境と同様の環境で相互作用を検出することは困難である。【０００３】
そこで、二つ目の方法として、生細胞を用いてタンパク質間相互作用の検出を行う方法も開発されている。代表的な方法としては、レポーターの転写活性を検出する酵母ツーハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ）やその変法が挙げられる。その他、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等の酵素の再構成を利用する方法も開発されている。【０００４】
しかしながら、これら方法には、タンパク質間相互作用が発生した位置（タンパク質間相互作用の位置情報）や、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間、該相互作用が消失するまでの時間及び該相互作用の持続時間等（タンパク質間相互作用の時間情報）を検出することができないという問題がある。【０００５】
また、生細胞を用いてタンパク質間相互作用の検出を行う方法として、蛍光タンパク質の再構成を利用する方法もあるが、一度再構成した蛍光タンパク質は解離しないため、タンパク質間相互作用が消失するまでの時間及び該相互作用の持続時間等を検出することができないという問題がある。さらには、タンパク質間相互作用が発生してから、蛍光を発するまでに時間を要するため、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間等を検出することができないという問題もある。【０００６】
さらに、ルシフェラーゼの再構成法を利用する方法もある。かかる方法においては、ルシフェラーゼの再構成と解離とが可逆的に生じるが、再構成したルシフェラーゼによって生じる発光シグナルが弱いため、細胞内での位置情報を得るためには、露光時間を長くする必要があり、ターンオーバーの早いタンパク質間相互作用の位置情報や時間情報を得ることはできない。【０００７】
また、これら蛍光タンパク質やルシフェラーゼ等の再構成を利用する方法においては、かかる再構成が生じてから、シグナルを検出することができるようになるため、例えば、タンパク質間相互作用によって局在が変化するタンパク質を、該相互作用の発生の前後を通して追跡することは困難であるという問題もある。【０００８】
一方、生細胞内でタンパク質間相互作用の検出を行う方法として、分子間の距離に依存したエネルギー転移を検出する蛍光共鳴エネルギー移動法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）が開発されている。この方法は、タンパク質間相互作用が発生した位置情報と時間情報が得られるという利点を有するものの、この方法に用いられるドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質との相互の位置関係が、タンパク質間相互作用の検出において重要であるため、これら蛍光タンパク質と検出の対象となるタンパク質とを繋ぐリンカー（スぺーサー）の最適化を検討する工程が煩雑であり、系の構築が困難であった。さらに、アクセプター蛍光タンパク質を励起してしまうｃｒｏｓｓ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎや、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光を検出するフィルター（吸収フィルター）セットにドナー蛍光タンパク質の蛍光が漏れ込むｂｌｅｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈが発生してしまうため、結果の解析が困難であった。また、２色の蛍光タンパク質（ドナー蛍光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質）を使用するため、検出対象となるタンパク質以外の情報を検出する目的で使用できる蛍光タンパク質が限定されるという問題もあった。【０００９】
近年、Ｔｏｂｉａｓ  Ｍｅｙｅｒらによって、細胞内局在化（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を利用したタンパク質間相互作用の検出方法が報告された（特許文献１）。この方法は、相互作用を検出するタンパク質の一方に細胞内の特定の部位に特異的に結合するタンパク質を融合し、相互作用を検出するタンパク質の他方に蛍光タンパク質等を融合する。そして、これら融合タンパク質を細胞内で発現させ、細胞内の特定の部位における蛍光タンパク質等のシグナルを指標としてタンパク質間相互作用を検出する。【００１０】
また、Ｎｉｂｅｒｔらによって、相互作用を検出するタンパク質の一方にウィルス封入体（ｖｉｒａｌ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成するタンパク質を融合した融合タンパク質を用い、相互作用を検出するタンパク質の他方がウィルス封入体に集積することを指標として、タンパク質間相互作用を検出する方法が報告されている（特許文献２）。【００１１】
しかしながら、これらの細胞内局在化を利用したタンパク質間相互作用の検出方法は、相互作用を検出するタンパク質の一方を強制的（人工的）に細胞内の特定の部位に移行させて拘束するため、本来タンパク質間相互作用が生じる部位、すなわちタンパク質間相互作用に固有な細胞内環境下での検出ができず、タンパク質間相互作用の位置情報が得られない等の問題点がある。また、天然の状態で、細胞内局在化される部位と同じ部位に局在するタンパク質同士の相互作用を検出することもできない。【００１２】
この問題点に対しては、Ｓａｒａ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｂｊｏｒｎらによって、タンパク質が本来機能する細胞内環境下にて相互作用させた上で、薬剤等の刺激を該細胞に与えることにより、相互作用するタンパク質からなる凝集体の形成を誘導し、該凝集体の形成をもって、タンパク質間相互作用を検出する方法（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ−ｔｒａｐ  ｍｅｔｈｏｄ）が報告されている（特許文献３）。【００１３】
しかしながら、この方法は任意の時点において凝集体の形成を誘導するための刺激を細胞に与える必要があり、刺激を与えた後に引き続き相互作用の有無を検出するためには、刺激を与えるために用いた薬剤等を除く必要がある。従って、かかる方法においては、タンパク質間相互作用が発生した時間情報を得ることができず、また、任意の期間に任意の場所にて変化（発生、消失、再発生等）するタンパク質間相互作用は検出できない等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開２０００／０１７２２１号
【特許文献２】国際公開２００６／０９９４８６号
【特許文献３】米国特許７２８２３４７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞内におけるタンパク質間相互作用を、タンパク質間相互作用に固有な細胞内環境下において検出することができ、かつ、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を検出することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、２つのタンパク質（第１のタンパク質及び第２のタンパク質）の相互作用の検出において、第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質の利用を構想した。具体的には、これら２つの融合タンパク質を細胞内に発現させた場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、会合誘導タンパク質同士の会合作用が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた（図１及び２  参照）。そして、前記会合誘導タンパク質として、単量体蛍光タンパク質の一種である、単量体アザミグリーン１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １、ｍＡＧ１）と融合させた場合には細胞内にて拡散して存在し、多量化能を有する蛍光タンパク質と融合させた場合には細胞内にて蛍光輝点（会合体）を形成する性質を有するタンパク質の利用を考えた。【００１７】
そこで、本発明者らは、まず、ｍＡＧ１又は多量化能を有する蛍光タンパク質を融合させた候補タンパク質を細胞内において発現させ、蛍光輝点の形成を指標とした会合誘導タンパク質のスクリーニングを行った（図３及び４  参照）。【００１８】
かかるスクリーニングを行った結果、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインが前記会合誘導タンパク質として利用できることが明らかになった。【００１９】
次いで、本発明者らは、同定したこれらタンパク質を実際にこれら会合誘導タンパク質として、多量化能を有する蛍光タンパク質とを組み合わせて用いることにより、蛍光輝点を指標に任意のタンパク質間相互作用を検出できることを明らかにした。【００２０】
この方法によれば、タンパク質間相互作用を、そのタンパク質相互作用に固有の細胞内環境下において検出することができ、かつ、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報も検出することができる。また、タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定や、タンパク質間相互作用を調製する物質のスクリーニングも可能である。【００２１】
従って、本発明は、タンパク質間相互作用の検出方法及びその応用、並びに当該方法に用いられるためのキットに関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、
第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、
前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程と、
を含む方法。
（２）  前記相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出するために、前記蛍光輝点を検出する、（１）に記載の方法。
（３）  特定の刺激に応答する前記相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出するために、前記蛍光輝点を検出する、（１）に記載の方法。
（４）  特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方が該特定のタンパク質であり、他方が被検タンパク質であり、前記蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する、（１）〜（３）のうちのいずれか一に記載の方法。
（５）  前記相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質を用い、前記蛍光輝点の蛍光強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する、（１）〜（３）のうちのいずれか一に記載の方法。
（６）  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を調節する物質をスクリーニングするための方法であって、
被検化合物存在下で、第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、
前記細胞内において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の蛍光強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の蛍光強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の蛍光強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の蛍光強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、
を含む方法。
（７）  前記会合誘導タンパク質が、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、（１）〜（６）のうちのいずれか一に記載の方法。
（８）  会合誘導タンパク質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）被検タンパク質及びｍＡＧ１を含む融合蛋白質を細胞内に発現させる工程と、
（ｂ）前記被検タンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む融合蛋白質を細胞内に発現させる工程と、
（ｃ）（ａ）に記載の工程においては蛍光輝点が検出されず、（ｂ）に記載の工程においては蛍光輝点が検出された場合に、前記被検タンパク質を会合誘導タンパク質として選択する工程と、
を含む方法。
（９）  前記多量化能を有する蛍光タンパク質が、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ２、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ、Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎ１、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＢ）、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＣ）、ＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ、ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５及びＤｓＲｅｄ２からなる群から選択される少なくとも一の蛍光タンパク質である、（１）〜（８）のうちのいずれか一に記載の方法。
（１０）  下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、（１）〜（９）のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）会合誘導タンパク質をコードするＤＮＡと、該会合誘導タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｂ）多量化能を有する蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、該蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｃ）ｍＡＧ１をコードするＤＮＡと、該ｍＡＧ１と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｆ）（ａ）又は（ｄ）に記載のベクター及び（ｂ）又は（ｅ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｇ）（ｂ）に記載のベクター及び（ｃ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｈ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｉ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｊ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、タンパク質間相互作用をその固有な細胞内環境下において検出することができ、またタンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明のタンパク質間相互作用の検出方法の概念を示す図である。すなわち、第１のタンパク質（Ｂ）及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質（Ａ）及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させた場合に、前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質（Ｂ）と第２のタンパク質（Ａ）との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図２】本発明のタンパク質間相互作用の検出方法の概念を示す図である。すなわち、第１のタンパク質（Ｃ）と第２のタンパク質（Ａ）とが相互作用しない場合において、第１のタンパク質（Ｃ）及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質（Ａ）及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させても、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とは会合せず、拡散した状態にて前記細胞内において各々存在することになるため、蛍光輝点は検出されないということを示す図である。
【図３】本発明にかかる会合誘導タンパク質のスクリーニング方法の概念を示す図である。すなわち、本発明にかかる会合誘導タンパク質は、多量化能を有する蛍光タンパク質と融合させた場合には細胞内にて会合体（蛍光輝点）を形成できることを示す図である。
【図４】本発明にかかる会合誘導タンパク質のスクリーニング方法の概念を示す図である。すなわち、本発明にかかる会合誘導タンパク質は、単量体アザミグリーン１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １、ｍＡＧ１）と融合させた場合には細胞内にて拡散して存在することを示す図である。
【図５】ｐ６２のＰＢ１ドメイン（ｐ６２（ＰＢ１））にｍＡＧ１を融合させたタンパク質（ｍＡＧ１−ｐ６２（ＰＢ１））、及びｐ６２（ＰＢ１）に多量化能を有する蛍光タンパク質としてＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）を融合させたタンパク質（ＡＧ−ｐ６２（ＰＢ１））を培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びＡＧタンパク質からなる融合タンパク質と、ｐ６２（ＰＢ１）及びＦＫＢＰ１２からなる融合タンパク質とを培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ））とＦＫＢＰ１２タンパク質とは、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の存在下において相互作用することが知られている。
【図７】ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びｐ６２（ＰＢ１）からなる融合タンパク質と、ＡＧタンパク質及びＦＫＢＰ１２からなる融合タンパク質とを培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。
【図８】ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びｐ６２（ＰＢ１）からなる融合タンパク質と、ｍＡＧ１タンパク質及びＦＫＢＰ１２からなる融合タンパク質とを培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。
【図９】ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びＡＧタンパク質からなる融合タンパク質（ｍＴＯＲ−ＡＧ）と、ｐ６２（ＰＢ１）タンパク質及びＦＫＢＰ１２からなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２）とを培養細胞内に発現させ、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの非存在下（−）又は存在下（＋）にて、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１０】ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びｍＡＧ１タンパク質からなる融合タンパク質（ｍＴＯＲ−ｍＡＧ１）と、ｐ６２（ＰＢ１）タンパク質及びＦＫＢＰ１２からなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２）とを培養細胞内に発現させ、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの非存在下（−）又は存在下（＋）にて、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１１】ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びＡＧタンパク質からなる融合タンパク質（ｍＴＯＲ−ＡＧ）と、ホモ多量体能を喪失したｐ６２（ＰＢ１）タンパク質変異体及びＦＫＢＰ１２からなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１＿ｎｃ）−ＦＫＢＰ１２）とを培養細胞内に発現させ、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの非存在下（−）又は存在下（＋）にて、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１２】ＭＥＫ５のＰＢ１ドメイン（ＭＥＫ５（ＰＢ１））又はＮｂｒ１のＰＢ１ドメイン（Ｎｂｒ１（ＰＢ１））に、ｍＡＧ１タンパク質又はＡＧタンパク質（多量化能を有する蛍光タンパク質）を融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１３】ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン（ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１））又はＴＦＧのＰＢ１ドメイン（ＴＦＧ（ＰＢ１））に、ｍＡＧ１タンパク質又はＡＧタンパク質を融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１４】ＴＥＬのＳＡＭドメイン（ＴＥＬ（ＳＡＭ））又はＤＧＫｄｅｌｔａ（ＤＧＫｄ）のＳＡＭドメイン（ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ））に、ｍＡＧ１タンパク質又はＡＧタンパク質を融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１５】ＴａｎｋｙｒａｓｅのＳＡＭドメイン（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ））又はＥｐｈＢ２のＳＡＭドメイン（ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ））に、ｍＡＧ１タンパク質又はＡＧタンパク質を融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１６】下記融合タンパク質の組み合わせを培養細胞内に発現させ、ｒａｐａｍｙｃｉｎ存在下において、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である  ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びＡＧタンパク質からなる融合タンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧ）と、ＦＫＢＰ１２タンパク質及びＴＦＧ（ＰＢ１）からなる融合タンパク質（ＦＫＢＰ１２−ＴＦＧ（ＰＢ１））との組み合わせ  ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧと、ＦＫＢＰ１２タンパク質及びＴＥＬ（ＳＡＭ）からなる融合タンパク質（ＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ））との組み合わせ  ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧと、ＦＫＢＰ１２タンパク質及びＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）からなる融合タンパク質（ＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄ（ＳＡＭ））との組み合わせ  ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧと、ＦＫＢＰ１２タンパク質及びＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）からなる融合タンパク質（ＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ））との組み合わせ。
【図１７】本発明にかかる多量化能を有する蛍光タンパク質として、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ、ＫｉｋＧＲ、ＡＧを用いることにより、ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的な、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用を蛍光輝点の形成をもって検出できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１８】ｐ６２（ＰＢ１）に単量体クサビラオレンジ２（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２）を融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の発生の有無を分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１９】ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とが会合して生じる蛍光輝点の蛍光強度は、ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度依存的なものであるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図２０】ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とが会合して生じる蛍光輝点の蛍光強度が、ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度依存的なものであるかどうかを分析した結果を示すグラフである。
【図２１】ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２とが会合して生じる蛍光輝点の蛍光強度が、ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度依存的なものであるかどうかを分析した結果を示すグラフである。
【図２２】ｒａｐａｍｙｃｉｎの存在下、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２とが会合して生じる蛍光輝点の蛍光強度が、ＦＫ５０６の濃度依存的に抑制されるかどうかを分析した結果を示すグラフである。なお、ＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２タンパク質とＲａｐａｍｙｃｉｎとの相互作用を競合的に阻害することにより、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ））とＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用を阻害する。
【図２３】ｐ６２（ＰＢ１）及びｐ５３の一部からなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３）と、ＡＧタンパク質及びＭＤＭ２からなる融合タンパク質（ＡＧ−ＭＤＭ２）とを培養細胞内に発現させ、ナトリン−３（Ｎｕｔｌｉｎ−３）存在下における、蛍光輝点の蛍光強度を分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用に対する阻害剤として知られている。また、図中左下のスケールバーは１０μｍを示す。
【図２４】ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とが会合して生じる蛍光輝点の蛍光強度が、Ｎｕｔｌｉｎ−３の濃度依存的に抑制されるかどうかを分析した結果を示すグラフである。
【図２５】ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とが会合して生じる蛍光輝点の蛍光強度が、Ｎｕｔｌｉｎ−３の濃度依存的に抑制されるかどうかを分析した結果を示すグラフである。
【図２６】ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０及びＡＧ−ｐ６５を発現させた細胞（ＩκＢα（−））と、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０、ＡＧ−ｐ６５及びＩκＢαを発現させた細胞（ＩκＢα（＋））とを観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ｐ５０とｐ６５とはヘテロダイマーを形成し、核内に局在しているが、さらにＩκＢαと相互作用することにより、細胞質に局在することになる。また、図中「ＡＧ」はＡＧ由来の蛍光を検出した結果を示し、「抗ＩκＢα抗体による免疫染色」は当該免疫染色を施した細胞を観察した結果を示し、「重ね合わせ」は、前記「ＡＧ」と、前記「抗ＩκＢα抗体による免疫染色」と、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって核を染色した細胞を観察した結果とを重ね合わせた結果を示す。
【図２７】ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０とＡＧ−ｐ６５とが会合して生じる蛍光輝点の細胞内における局在が、ＩκＢαの当該細胞への導入量（ｐＩκＢα添加量）に応じて変化するかどうかを分析した結果を示すグラフである。
【図２８】ｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４及びＡＧ−ｐ２１を共発現させた細胞（ＡＧ−ｐ２１＋ＰＢ１−ＣＤＫ４）と、ｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４、ＡＧ−ｐ２１及びＣｙｃｌｉｎＤ１（サイクリンＤ１）を発現させた細胞（ＡＧ−ｐ２１＋ＰＢ１−ＣＤＫ４＋ＣｙｃｌｉｎＤ１）とを観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ｐ２１と、ＣＤＫ４及びＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体とは相互作用する。また、図中「ＡＧ」はＡＧ由来の蛍光を検出した結果を示し、「抗ＣｙｃｌｉｎＤ１抗体による免疫染色」は当該免疫染色を施した細胞を観察した結果を示し、「重ね合わせ」は、前記「ＡＧ」と、前記「抗ＣｙｃｌｉｎＤ１抗体による免疫染色」とを重ね合わせた結果を示す。
【図２９】下記融合タンパク質の組み合わせを培養細胞内に発現させ、蛍光輝点の蛍光強度及び局在を分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは２０μｍを示す  ｐ６２（ＰＢ１）及びＳｅｃ５タンパク質の一部からなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５）と、ＡＧタンパク質及びＲａｌＢタンパク質（野生型）からなる融合タンパク質（ＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ））との組み合わせ  ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５と、ＡＧタンパク質及びＲａｌＢタンパク質（非活性型変異型）からなる融合タンパク質（ＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ））との組み合わせ  ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５と、ＡＧタンパク質及びＲａｌＢタンパク質（活性型変異型）からなる融合タンパク質（ＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ））との組み合わせ  なお、Ｓｅｃ５タンパク質はＲａｌＢタンパク質のＧＴＰ活性化型と相互作用することが知られている。また、ＲａｌＢの非活性型変異体  ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）ではその相互作用が減少し、ＲａｌＢの活性型変異体  ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）では増大することが知られている。さらに、ＲａｌＢタンパク質については、そのＣ末端がパルミトイル化されることにより、細胞膜に局在することも明らかになっている。
【図３０】下記融合タンパク質の組み合わせを培養細胞内に発現させ、細胞膜付近のみの蛍光を検出した結果を示す顕微鏡写真である。  ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）との組み合わせ  ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）との組み合わせ  ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）との組み合わせ  ｐ６２（ＰＢ１）とＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）との組み合わせ。
【図３１】ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を共発現した細胞（ＷＴ）と、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３＿Ｗ２３Ｌ及びＡＧ−ＭＤＭ２を共発現させた細胞（Ｗ２３Ｌ）とを観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ｐ５３の２３位のアミノ酸はｐ５３とＭＤＭ２との相互作用界面部位に位置し、ｐ５３におけるＷ２３Ｌ変異は当該相互作用を減弱させる。
【図３２】カルモジュリンタンパク質及びＡＧタンパク質からなる融合タンパク質（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ＡＧ）と、ミオシン軽鎖キナーゼ２の部分配列（Ｍ１３ペプチド）及びｐ６２（ＰＢ１）からなる融合タンパク質（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１））との会合によって生じる蛍光輝点の発生及び消失を、ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）添加前、添加後９０秒後、添加後６２０秒後に観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。また、カルモジュリンとＭ１３ペプチドとの相互作用は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）がリガンド（例えば、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）を受容した際に生じる細胞内カルシウムイオン濃度の一過的な上昇に応答して発生することが明らかになっている。
【図３３】ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＡＧタンパク質と核局在シグナル（ＮＬＳ）とからなる融合タンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳ）と、ＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）との会合によって生じる蛍光輝点の局在を観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、左から数えて、１番目のパネルはｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前の細胞の蛍光画像を示し、２番目のパネルはｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後の細胞の蛍光画像を示し、３番目のパネルはｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後の細胞の蛍光画像と明視野像とを重ね合わせた結果を示す。また、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。
【図３４】ｐ６２（ＰＢ１）及びＨＲａｓタンパク質からなり、Ｃ末端にプレニル化配列を有する融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓ）と、ＡＧタンパク質及びｃＲａｆタンパク質からなる融合タンパク質（ＡＧ−ｃＲａｆ）との会合によって生じる蛍光輝点の局在を観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。
【図３５】ｐ６２（ＰＢ１）及びＳｍａｃタンパク質の一部からなる融合タンパク質（Ｓｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１））と、ＸＩＡＰタンパク質の一部及びＡＧタンパク質からなる融合タンパク質（ＸＩＡＰ−ＡＧ）とが会合して生じる蛍光輝点の局在を観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。
【図３６】ｐ６２（ＰＢ１）及びＢｃｌＸ（Ｌ）タンパク質の一部からなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ））と、ＡＧタンパク質及びＢＡＤタンパク質の一部からなる融合タンパク質（ＡＧ−ＢＡＤ）とが会合して生じる蛍光輝点の局在を観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。
【図３７】ＡＧタンパク質及びＲａｃ１タンパク質からなる融合タンパク質（ＡＧ−Ｒａｃ１）と、ｐ６２（ＰＢ１）及びｐ２１結合ドメインからなる融合タンパク質（ｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤ）との会合によって生じる蛍光輝点が核内に局在していることを示す顕微鏡写真である。なお、図中右下のスケールバーは５μｍを示す。また、Ｒａｃ１タンパク質はグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）により活性型に変換される。そして、活性型のＲａｃ１タンパク質とＰＢＤとは相互作用することが知られている。さらに、ＧＥＦの局在はその種類によって異なるため、Ｒａｃ１タンパク質とＰＢＤとの相互作用は、種類によって異なるＧＥＦの局在に応じた細胞内の領域において生じることになる。
【図３８】ＡＧ−Ｒａｃ１とｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとの会合によって生じる蛍光輝点が細胞の辺縁に局在していることを示す顕微鏡写真である。なお図中、下部パネルは、上部パネル内の白線にて囲んだ領域を拡大したものである。また、上部パネル内右下のスケールバーは５μｍを示し、下部パネル内左上のスケールバーは１μｍを示す。
【図３９】ＡＧ−Ｒａｃ１とｐ６２（ＰＢ１）とを細胞内に発現させた場合には、これらタンパク質は相互作用しないため、蛍光輝点は細胞の辺縁等において検出されないことを示す顕微鏡写真である。なお図中、下部パネルは、上部パネル内の白線にて囲んだ領域を拡大したものである。また、上部パネル内右下のスケールバーは５μｍを示し、下部パネル内左上のスケールバーは１μｍを示す。
【図４０】ＡＧ−Ｒａｃ１とｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとを発現させた細胞を、ゲラニルゲラニル基修飾に対する阻害剤であるメバスタチン非存在下（−）又は存在下（＋）にて観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ゲラニルゲラニル基修飾を阻害することにより、Ｒａｃ１は核内に局在する。また、図中、同一の細胞について、「Ａ」は通常の落射型蛍光倒立顕微鏡にて観察した結果を示し、「Ｂ」は、細胞膜付近のみ励起することのできる、アーク光源全反射蛍光顕微鏡システムにて観察した結果を示す。
【図４１】ＡＧ−Ｒａｃ１とＲｈｏＧＤＩ−ｐ６２（ＰＢ１）とを発現させた細胞を、ゲラニルゲラニル基修飾に対する阻害剤であるメバスタチン非存在下（−）又は存在下（＋）にて観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、Ｒａｃ１タンパク質は、そのゲラニルゲラニル基を介し、ＲｈｏＧＤＩと相互作用する。また、図中、同一の細胞について、「Ａ」は通常の落射型蛍光倒立顕微鏡にて観察した結果を示し、「Ｂ」は、細胞膜付近のみ励起することのできる、アーク光源全反射蛍光顕微鏡システムにて観察した結果を示す。
【図４２】ｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（ＷＴ）及びＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）を発現させた細胞（ＷＴ）と、ｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（Ｇ１２Ｄ）及びＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）を発現させた細胞（Ｇ１２Ｄ）とを、ＥＧＦを添加した後（＋）又は非添加（−）にて、これら細胞の細胞膜付近の蛍光のみを検出した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ＥＧＦ依存的に活性化されたＫＲａｓと、ｃＲａｆとは相互作用する。また、このタンパク質間相互作用により、ｃＲａｆの局在は細胞質から細胞膜に変化する。
【図４３】ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋ−ＡＧとを共発現させた細胞における蛍光輝点の総蛍光強度の、ＡＢＴ−７３７添加後における経時的変化を示すグラフである。なお、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋとはＢＨ３ドメインを介して相互作用するが、このタンパク質間相互作用は、ＡＢＴ−７３７（ＢＨ３模倣薬）によって競合的に阻害される。
【図４４】ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＡＧ−Ｂａｘとを共発現させた細胞における蛍光輝点の総蛍光強度の、ＡＢＴ−７３７添加後の経時的変化を示すグラフである。なお、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｘとはＢＨ３ドメインを介して相互作用するが、このタンパク質間相互作用は、ＡＢＴ−７３７によって競合的に阻害される。
【図４５】ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を安定的に発現している細胞における蛍光輝点の総蛍光強度の、Ｎｕｔｌｉｎ−３添加前後における経時的変化を示すグラフである。なお、グラフのｘ軸はＮｕｔｌｉｎ−３添加時を０とした時間（分）を表わす。
【図４６】ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧ及びｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２を安定的に発現している細胞における蛍光輝点の総蛍光強度の、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前後における経時的変化を示すグラフである。なお、グラフのｘ軸はｒａｐａｍｙｃｉｎ添加時を０とした時間（分）を表わす。
【図４７】ｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ及びＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳを発現している細胞における蛍光輝点の総蛍光強度の、ＥＧＦ及びＵ０１２６添加前後における経時的変化を示すグラフである。なお、ＥＧＦ刺激により細胞内のＥＲＫが活性化されると、ＥＲＫ基質（ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）がリン酸化され、その結果、ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅとＰｉｎ１タンパク質のｗｗドメイン（Ｐｉｎ１（ｗｗ））が相互作用する。さらに、ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６を添加すると、ＥＲＫの活性が低下し、結果的にＥＲＫ基質が脱リン酸化を受け、ＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）との相互作用が解消される。グラフのｘ軸はＥＧＦ添加時を０とした時間（分）を表わす。また、Ｕ０１２６の細胞への添加は、ＥＧＦを添加してから１４分後に行った。
【図４８】ｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓ（ＷＴ）及びＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）を発現している細胞における蛍光輝点の総蛍光強度の、ＥＧＦ添加前後における経時的変化を示すグラフである。なお、グラフのｘ軸はＥＧＦ添加時を０とした時間（分）を表わす。
【図４９】ＡＧ−ｍＣＡＢ、ｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ＫＯ１を発現させた細胞を、Ｒａｍａｍｙｃｉｎ非存在下（−）若しくは存在下（＋）、又は、ＦＫ５０６非存在下（−）若しくは存在下（＋）にて観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお、ＲａｐａｍｙｃｉｎはＦＫＢＰ１２タンパク質に結合して複合体を形成し、さらにこの複合体とｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ））とが結合する。また、ｍＣＡＢ（カルシニューリンＡの一部とカルシニューリンＢの一部とが融合してなるタンパク質）とＦＫＢＰ１２タンパク質とは、ＦＫ５０６を介して相互作用する。図中、「ＡＧ」及び「ＫＯ１」は、ＡＧ及びＫＯ１に由来する蛍光を各々検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法＞
本発明のタンパク質間相互作用を検出するための方法は、
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、
第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、
前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程と、
を含む方法である。
【００２５】
本発明において「タンパク質」とは２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。従って、完全長のタンパク質のみならず、いわゆるオリゴペプチドやポリペプチドをも含む概念である。タンパク質の修飾としては、例えば、リン酸化、グリコシル化、パルミトイル化、プレニル化（例えば、ゲラニルゲラニル化）、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、アミド化が挙げられる。
【００２６】
本発明にかかる「第１のタンパク質」及び「第２のタンパク質」としては、相互作用を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。
【００２７】
本発明にかかる「第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用」には、直接的な相互作用のみならず、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に他の分子（タンパク質、核酸、糖、脂質、低分子化合物等）を介して複合体を形成するような、間接的な相互作用も含まれる。
【００２８】
本発明にかかる「多量化能を有する蛍光タンパク質」は、細胞内において、ｐ６２のＰＢ１ドメイン（ｐ６２（ＰＢ１））と融合させて発現させた場合に、このｐ６２（ＰＢ１）との融合タンパク質どうしが会合し、蛍光輝点を生じさせることのできる蛍光タンパク質である。従って、「多量化能を有する蛍光タンパク質」には、ｐ６２（ＰＢ１）と融合せずとも、ホモ多量体を細胞内において形成することができる蛍光タンパク質のみならず、後述の実施例で示すような、一般的に単量体蛍光タンパク質と考えられているｍＫＯ２等の蛍光タンパク質も含まれる。かかる「多量化能を有する蛍光タンパク質」としては、例えば、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１（ミドリイシ−シアン１、ＭｉＣｙ１）、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（クサビラオレンジ１、ＫＯ１）、ｄＫｅｉｍａ５７０（二量体ケイマ５７０）、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ（二量体ケイマ−レッド、ｄＫｅｉｍａ、ｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ）、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（アザミグリーン、ＡＧ）、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ（キクメ  グリーン−レッド、ＫｉｋＧＲ、ＫｉｋＧＲ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（単量体クサビラオレンジ１、ｍＫＯ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ２（単量体クサビラオレンジ２、ｍＫＯ２）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｅｑＦＰ５７８、ｅｑＦＰ６１１、ＥｏｓＦＰ、ＦＰ４８４、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、ＩＦＰ１．４、ｉＲＦＰ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ（単量体ケイマ−レッド、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１（単量体ミドリイシ−シアン１、ｍＭｉＣｙ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ１（単量体キクメ  グリーン−レッド１、ｍＫｉｋＧＲ１）、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎ１（クサビラ−シアン１、ＫＣｙ１）、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＢ）（二量体アザミグリーン（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＢ））、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＣ）（二量体アザミグリーン（ＡＣ）、ｄＡＧ（ＡＣ））、ＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ（モミジ）、ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５及びＤｓＲｅｄ２が挙げられるが、好ましくは、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ１、ｍＫＯ１、ｍＫｉｋＧＲ１、ＭｉＣｙ１、ＫＣｙ１、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ、ｄＡＧ（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＣ）、ＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ、ＫｉｋＧＲ、ＡＧ、ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５及びＤｓＲｅｄ２である。また、本発明の方法において明瞭な蛍光輝点を検出し易いという観点から、より好ましくは、ＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ、ＡＧ、ＫｉｋＧＲ、ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５、ＤｓＲｅｄ２等のホモ４量体を形成することができる蛍光タンパク質であり、特に好ましくは、ＡＧである。
【００２９】
なお、ｍＫＯ２、ＡＧ、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ、ＫｉｋＧＲ、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ１、ｍＫＯ１、ｍＫｉｋＧＲ１、ＭｉＣｙ１、ＫＣｙ１、ｄＡＧ（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＣ）、ＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ、ＣＯＲ３．０１、ＤｓＲｅｄ２及びＣＯＲ５は、典型的には各々、配列番号：１３３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１０７９１５で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ２０９９６８で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１９３２９３で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ２０９９６９で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１４１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１４３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１４５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１４７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１４９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号：１７２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３０】
これら蛍光タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、蛍光を発することができ、かつ、細胞内にてホモ多量体を形成することができる限り、本発明において用いることができる。
【００３１】
本発明にかかる「会合誘導タンパク質」は、後述の実施例、並びに図３及び４において示す通り、多量化能を有する蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させた場合には、この融合タンパク質同士が会合して生じた蛍光輝点が検出され、単量体アザミグリーン１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １、ｍＡＧ１）と融合させて発現させた場合には、拡散した状態にて細胞内に存在するタンパク質である。
【００３２】
本発明にかかる「会合誘導タンパク質」としては、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインが好ましく、本発明の方法において蛍光輝点をより検出し易いという観点から、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインがより好ましい。
【００３３】
また、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインは、典型的には各々、配列番号：４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１８で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号：２０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３４】
これら「会合誘導タンパク質」のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、それ自身では会合能を有しないが、多量化能を有する蛍光タンパク質と融合した場合には会合体（蛍光輝点）を形成する性質を有する限り、本発明において用いることができる。
【００３５】
本発明にかかる「第１の融合タンパク質」においては、会合誘導タンパク質は、第１のタンパク質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに融合させてもよい。さらに、直接的に第１のタンパク質に融合させてもよく、スぺーサータンパク質を介して間接的に融合させてもよい。また、本発明にかかる「第１の融合蛋白質」には、他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、又は会合誘導タンパク質と第１のタンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、融合タンパク質の精製を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質、さらには、第２の融合タンパク質における多量化能を有する蛍光タンパク質とは異なる波長特性を示す蛍光タンパク質が挙げられる。
【００３６】
本発明にかかる「第２の融合タンパク質」においては、前記「第１の融合タンパク質」と同様に、多量化能を有する蛍光タンパク質は、第２のタンパク質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに融合させてもよい。また、直接的に第２のタンパク質に融合させてもよく、前記スぺーサータンパク質を介して間接的に融合させてもよい。さらに、本発明にかかる「第２の融合タンパク質」には、前記他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。この場合、前記「第１の融合タンパク質」と同様に、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、又は多量化能を有する蛍光タンパク質と第２のタンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。
【００３７】
本発明にかかる「細胞」としては特に制限はなく、真核細胞であってもよく、原核細胞であってもよく、例えば、動物細胞（ＨｅＬａＳ３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞等）、植物細胞、酵母、大腸菌が挙げられる。また、かかる細胞は、生体外で培養した状態（例えば、培地中又は培地上にて生育している細胞）であってもよく、生体内に存在する状態（例えば、第１の融合タンパク質をコードするＤＮＡと第２の融合タンパク質をコードするＤＮＡとが導入されているトランスジェニック動物内の細胞）であってもよい。
【００３８】
本発明にかかる融合タンパク質の前記細胞内における発現は、目的に応じて、一過性の発現であってもよく、恒常的な発現であってもよい。融合タンパク質の細胞における発現は、後述の本発明にかかるベクターを前記細胞に導入することにより行うことができる。細胞にベクターを導入する公知の手法としては、動物細胞に対しては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウィルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等）を利用した方法が挙げられる。また、昆虫細胞に対しては、バキュロウィルスを利用した方法が挙げられる。さらに、植物細胞に対しては、アグロバクテリウム法、電気穿孔法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、酵母に対しては、酢酸リチウム法、電気穿孔法、スフェロプラスト法が挙げられる。さらに、大腸菌に対しては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。
【００３９】
本発明において検出する「蛍光輝点」は、第１の融合タンパク質と第２のタンパク質との会合によって生じるものであり、典型的には、拡散状態で存在している多量化能を有する蛍光タンパク質の蛍光強度よりも高い蛍光強度を有する、０．２〜５μｍの領域である（後述の実施例、並びに図１及び２を参照のこと）。
【００４０】
「蛍光輝点の検出」は、例えば、多量化能を有する蛍光タンパク質に対応した励起フィルター及び吸収フィルターを備えた蛍光顕微鏡による観察、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）等のイメージングサイトメーターによる解析により行うことができる。
【００４１】
本発明の方法においては、細胞において前記蛍光輝点が検出されれば、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していると判定することができ、前記蛍光輝点が検出されなければ、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していないと判定することができる。
【００４２】
＜会合誘導タンパク質のスクリーニング方法＞
本発明にかかる会合誘導タンパク質は、後述の実施例において示す通り、下記（ａ）〜（ｃ）に記載の工程を含むスクリーニング方法によって選択することができる
（ａ）被検タンパク質及びｍＡＧ１を含む融合蛋白質を細胞内に発現させる工程
（ｂ）前記被検タンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む融合蛋白質を細胞内に発現させる工程
（ｃ）（ａ）に記載の工程においては蛍光輝点が検出されず、（ｂ）に記載の工程においては蛍光輝点が検出された場合に、前記被検タンパク質を会合誘導タンパク質として選択する工程。
【００４３】
本発明にかかる「被検タンパク質」としては特に制限はなく、会合誘導能を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。
【００４４】
なお、「ｍＡＧ１」(単量体アザミグリーン１、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １）は、典型的には配列番号：１３５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。さらに、人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、蛍光を発することができ、かつ、単量体の状態にて細胞内に存在し得る限り、本発明に用いることができる。
【００４５】
本発明の会合誘導タンパク質のスクリーニング方法において用いられる、多量化能を有する蛍光タンパク質としては前述の通りである。
【００４６】
本発明にかかる「被検タンパク質及びｍＡＧ１含む融合蛋白質」又は「被検タンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む融合蛋白質」においては、ｍＡＧ１又は多量化能を有する蛍光タンパク質は、被検タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに融合させてもよい。また、直接的に被検タンパク質に融合させてもよく、前記スぺーサータンパク質を介して間接的に融合させてもよい。本発明にかかる「被検タンパク質」には、前記他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、又は、ｍＡＧ１若しくは多量化能を有する蛍光タンパク質と被検タンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。
【００４７】
本発明のスクリーニングにおいては、ｍＡＧ１と融合して細胞内で発現させた場合には蛍光輝点が検出されず、多量化能を有する蛍光タンパク質と融合して細胞内で発現させた場合には蛍光輝点が検出される、被検タンパク質を会合誘導タンパク質として選択する。
【００４８】
＜タンパク質間相互作用の時間情報等を得るための方法＞
後述の実施例、特に実施例１２において示す通り、本発明の方法は、本発明にかかる蛍光輝点の存在又は非存在を指標として、タンパク質間相互作用の発生のみならず、タンパク質間相互作用の消失を検出することができる。また、実施例１９、２４〜２８等において示す通り、かかるタンパク質間相互作用の発生等を経時的に追跡することもできる。さらに、実施例２０〜２２等において示す通り、会合誘導タンパク質や多量化能を有する蛍光タンパク質の局在等に影響を受けることなく、本発明においては細胞内の任意の領域においてタンパク質間相互作用を検出することもできる。
【００４９】
従って、本発明は、本発明にかかる蛍光輝点を検出することによって、タンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出する方法を提供することができる。
【００５０】
このような「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の検出に関して、本発明においては、特に後述の実施例２１において示す通り、タンパク質間相互作用が生じる細胞内の領域をも特定することもできる。
【００５１】
また、後述の実施例１９、２３、２７〜２９等に示す通り、本発明によれば、かかる「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の検出を通して、当該タンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達の発生及び消失、該シグナル伝達の発生若しくは消失するまでの時間並びに該シグナル伝達の持続時間を検出することができ、さらに該シグナル伝達が生じている細胞内の領域をも特定することもできる。
【００５２】
また、後述の実施例において示す通り、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用が特定の刺激に応答して発生又は消失するものであっても、本発明において検出することができる。従って、本発明は、本発明にかかる蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激に応答するタンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出するために、前記蛍光輝点を検出する方法も提供することができる。
【００５３】
本発明にかかる「特定の刺激」とは、タンパク質間相互作用を直接的に又は間接的に誘導又は阻害できる刺激であればよく、また細胞内で生じる内在性因子による刺激（例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の増減、酵素の活性化又は不活性化）であってよく、細胞に与えられる外部からの刺激（例えば、受容体に対するリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）の細胞への投与）であってもよい。
【００５４】
また、特に後述の実施例１９、２４〜２８において示す通り、かかる本発明の方法においては、本発明にかかる蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激の発生若しくは消失、該刺激の発生若しくは消失するまでの時間、又は該刺激の持続時間を検出することもできる。
【００５５】
さらに、後述の実施例１１及び１３等において示す通り、本発明の方法においては、特定の刺激の程度（例えば、特定の刺激が薬剤である場合には、その濃度）に応じたタンパク質間相互作用の増減も検出することができる。従って、特定の刺激が薬剤である場合には、タンパク質間相互作用に対する、その薬剤の５０％効果濃度（ＥＣ５０）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、本発明によって決定することができる。
【００５６】
また、後述の実施例２９において示す通り、本発明の方法においては、同一の細胞において、多種類のタンパク質間相互作用、特定の刺激に各々依存的な多種類のタンパク質間相互作用、ひいてはこれらタンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達を、判別し、検出することができる。
【００５７】
＜特定のタンパク質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法＞
後述の実施例、特に実施例３０において示す通り、本発明においては、任意のタンパク質間相互作用を検出することができる。従って、本発明は、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方を該特定のタンパク質とし、他方を被検タンパク質とすることにより、本発明にかかる蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する方法を提供することができる。
【００５８】
本発明にかかる「被検タンパク質」としては特に制限はない。網羅的に効率良く特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択できるという観点から、ｃＤＮＡライブラリーがコードするタンパク質群を好適に用いることができる。
【００５９】
＜タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定方法＞
後述の実施例に示す通り、本発明において、蛍光輝点の蛍光強度とタンパク質間相互作用の強弱とは相関するものである。従って、本発明によれば、タンパク質相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質を用い、前記蛍光輝点の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する方法を提供することができる。
【００６０】
本発明にかかる「蛍光輝点の蛍光強度」には、一蛍光輝点の蛍光強度のみならず、一定領域内（例えば、一細胞内、蛍光顕微鏡観察における一視野内、一蛍光画像内）に存在する蛍光輝点の総蛍光強度も含まれる。
【００６１】
「第１のタンパク質等に変異が導入されたタンパク質」の調製は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して行うことができる。かかる公知の手法としては、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法が挙げられる。
【００６２】
＜タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニング方法＞
前述の通り、本発明の方法において、蛍光輝点の蛍光強度を指標として、タンパク質間相互作用の強弱を把握することができる。従って、本発明によれば、被検化合物存在下で、第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる工程と、
前記細胞内において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、
を含む方法を提供することができる。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法において使用する被検化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００６４】
また、被検化合物存在下の状態とは、例えば、被検化合物の培地への添加等による被検化合物と本発明にかかる細胞とが接触している状態や、被検化合物が本発明にかかる細胞内に導入された状態が挙げられる。
【００６５】
＜本発明の方法に用いられるためのキット＞
本発明は、上記方法に用いられるためのキットを提供することができる。本発明のキットは、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含むキットである。
【００６６】
（ａ）会合誘導タンパク質をコードするＤＮＡと、該会合誘導タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｂ）多量化能を有する蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、該蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｃ）ｍＡＧ１をコードするＤＮＡと、該蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｆ）（ａ）又は（ｄ）に記載のベクター及び（ｂ）又は（ｅ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｇ）（ｂ）に記載のベクター及び（ｃ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｈ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｉ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｊ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞。
【００６７】
本発明にかかるベクターとしては、本発明にかかる細胞において、挿入されたＤＮＡを発現（転写及び翻訳）するのに必要な制御配列を含むものであればよい。かかる制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、ポリＡテール、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列）が挙げられる。さらに、本発明にかかるベクターにおいては、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等）を含んでいてもよい。また、このような本発明にかかるベクターの態様としては、例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
【００６８】
本発明にかかるベクターにおいてコードされるタンパク質は前述の通り、会合誘導能タンパク質、多量化能を有する蛍光タンパク質、ｍＡＧ１、及びこれらタンパク質との融合タンパク質であるが、かかるタンパク質をコードするＤＮＡの発現の効率をより向上させるという観点から、当該タンパク質を発現させる細胞の種に合わせてコドンを最適化したＤＮＡ（例えば、コドンがヒト化されたＤＮＡ）が、本発明にかかるベクターには、挿入されていてもよい。
【００６９】
前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に記載の「任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」としては、例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニング部位、ＴＡクローニング部位、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング部位が挙げられる。
【００７０】
本発明にかかるベクターの標品においては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
【００７１】
本発明にかかる形質転換細胞は、前述の通り、本発明にかかるベクターを細胞に導入することにより調製することができる。また、本発明にかかる形質転換細胞の標品には、当該細胞の保存、培養に必要な培地、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加又は付属してあってもよい。
【００７２】
本発明にかかる「使用説明書」は、前記ベクターや形質転換細胞を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明の標品に関する情報（例えば、ベクターの塩基配列やクローニングサイト等が示されているベクターマップ等の情報、形質転換細胞の由来、性質、当該細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７４】
（実施例１）
＜会合誘導タンパク質のスクリーニング１＞
タンパク質間相互作用を検出するための系を構築するにあたり、図１及び図２に記載の概念に基づき、図３及び図４に記載の方法にて、本発明にかかる「会合誘導タンパク質」として機能するタンパク質の探索を行った。すなわち、単量体アザミグリーン１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １、ｍＡＧ１）と融合させた場合には細胞内にて拡散して存在し（図４  参照）、一方、多量化能を有する蛍光タンパク質と融合させた場合には細胞内にて蛍光輝点（会合体）を形成できるタンパク質（図３  参照）のスクリーニングを行った。【００７５】
かかるスクリーニングの対象として、先ずＰＢ１（Ｐｈｏｘ  ａｎｄ  Ｂｅｍ１ｐ）ドメインに着目し、ｐ６２のＰＢ１ドメイン（以後、「ｐ６２（ＰＢ１）」とも称する）にｍＡＧ１を融合させたタンパク質、及びｐ６２（ＰＢ１）に多量化能を有する蛍光タンパク質としてＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）を融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、以下に示す方法にて、各々の融合タンパク質による会合、ひいては会合体形成によって生じる蛍光輝点の発生の有無を調べた。なお、ＡＧはホモ４量体化することが知られている。得られた結果を図５に示す。【００７６】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｍＡＧ１を融合するためのプラスミドＤＮＡとして、ｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を用いた。【００７７】
また、ＡＧを融合するためのプラスミド（ｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒ）の作製においては、先ずコドンをヒト化したＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）遺伝子（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域をコードするＤＮＡ（配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を人工的に合成した。下記プライマーセットを用いて、人工的に合成した、コドンをヒト化したＡＧ（ｈＡＧ）遺伝子を鋳型としてＰＣＲにて増幅した
ｈＡＧフォワードプライマー１；５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧ−３’  （配列番号：５７）
ｈＡＧリバースプライマー１；５’−ＡＣＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣ−３’  （配列番号：５８）
そして、得られた増幅産物をＮｈｅＩとＡｇｅＩにて切断し、同じ制限酵素にて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒを作製した。【００７８】
さらに、ｐｈｍＡＧ１−ｐ６２（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ｐ６２（ＰＢ１）の作製においては、先ずｐ６２のＰＢ１ドメイン（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｐ６２（ＰＢ１）フォワードプライマー１；５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣ−３’  （配列番号：５９）
ｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー１；５’−ＡＡＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣ−３’  （配列番号：６０）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−ｐ６２（ＰＢ１）及びｐｈｍＡＧ１−ｐ６２（ＰＢ１）を各々作製した。【００７９】
（培養細胞への遺伝子導入）
ｐｈＡＧ−ｐ６２（ＰＢ１）及びｐｈｍＡＧ１−ｐ６２（ＰＢ１）を導入する培養細胞としてＨｅＬａＳ３細胞を用いた。なお、ＨｅＬａＳ３細胞は、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を含有するＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。また、かかるＨｅＬａＳ３細胞を遺伝子導入の前日に３５ｍｍガラスベースディッシュ（旭硝子社製）に播種した。そして、遺伝子導入の際には、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にｐｈＡＧ−ｐ６２（ＰＢ１）又はｐｈｍＡＧ１−ｐ６２（ＰＢ１）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｒ）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μｌ添加し、攪拌した。次いで、さらに培養液６００μｌと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加し、２２時間後に観察した。【００８０】
（遺伝子導入細胞の観察）
遺伝子導入処理を施したＨｅＬａＳ３細胞は、ハンクス平衡塩液（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（同仁化学社製）からなるｐＨ７．４緩衝液中にて、ＩＸ−７１倒立顕微鏡（オリンパス社製）、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター（オリンパス社製）、ＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラ（浜松ホトニクス社製）を用いて観察した。【００８１】
図５に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）はｍＡＧ１を融合させた場合には細胞内で拡散状態にて存在していた。一方、多量化能を有する蛍光タンパク質であるＡＧを融合させた場合には細胞内において蛍光輝点が検出され、ｐ６２（ＰＢ１）及びＡＧからなる融合タンパク質どうしは会合し、蛍光輝点を形成していることが明らかになった。従って、ｐ６２のＰＢ１ドメインはそれ自身では会合能を有していないが、多量化能を有する蛍光タンパク質と融合した場合には会合体（蛍光輝点）を形成する性質であることが明らかになり、本発明にかかる会合誘導タンパク質として好適に用いることができることが示唆された。【００８２】
（実施例２）
＜タンパク質間相互作用の検出１＞
ｐ６２のＰＢ１ドメインが、本発明にかかる会合誘導タンパク質として好適に用いることができることを実証するため、すなわち図１及び２に記載のモデルにｐ６２のＰＢ１ドメインが適用できることを実証するため、薬剤添加により相互作用を誘発することが可能なタンパク質を用いて、以下に示す方法にて試験した。得られた結果を図６〜８に示す。【００８３】
なお、実施例２において用いたｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）」又は「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）」とも称する）とＦＫＢＰ１２タンパク質とは、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の存在下において相互作用することが知られている（Ｃｈｅｎ  Ｊ  ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、１９９５年５月２３日、９２巻１１号、４９４７〜４９５１ページ  参照）。【００８４】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ＡＧを融合するためのプラスミド（ｐｈＡＧ−ＭＮＬｉｎｋｅｒ）の作製においては、先ずコドンをヒト化したＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）遺伝子を下記プライマーセットを用いて、ｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒを鋳型としてＰＣＲにて増幅した
ｈＡＧフォワードプライマー２；５’−ＧＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧ−３’  （配列番号：６１）
ｈＡＧリバースプライマー２；５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＣ−３’  （配列番号：６２）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐｈＡＧ−ＭＮＬｉｎｋｅｒを作製した。【００８５】
また、ｐ６２（ＰＢ１）を融合するためのプラスミド（ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬｉｎｋｅｒ）の作製においては、先ずｐ６２のＰＢ１ドメイン（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｐ６２（ＰＢ１）フォワードプライマー２；５’−ＧＧＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＴＣ−３’  （配列番号：６３）
ｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー２；５’−ＡＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６４）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬｉｎｋｅｒを作製した。【００８６】
さらに、ｐ６２（ＰＢ１）を融合するためのプラスミド（ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒ）の作製においては、先ずｐ６２のＰＢ１ドメイン（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬｉｎｋｅｒを鋳型として、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｐ６２（ＰＢ１）フォワードプライマー３；５’−ＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＴＣ−３’  （配列番号：６５）
ｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー３；５’−ＡＡＡＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６６）
そして、得られた増幅産物をＮｈｅＩとＡｇｅＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒを作製した。【００８７】
また、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧの作製においては、先ずｍＴＯＲのＦＲＢドメイン（ｍＴＯＲタンパク質の２０２５〜２１１４アミノ酸からなる領域、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）フォワードプライマー；５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＴＣＴＣＧ−３’  （配列番号：６７）
ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）リバースプライマー；５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＣＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＧＡＧＧＴＣＣＣ−３’  （配列番号：６８）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧを作製した。なお、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とＡＧタンパク質とからなる融合タンパク質（「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ＡＧ」とも称する）をコードしている。【００８８】
さらに、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２の作製においては、先ずＦＫＢＰ１２（全長、配列番号：２４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：２３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＦＫＢＰ１２フォワードプライマー；５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣ−３’  （配列番号：６９）
ＦＫＢＰ１２リバースプライマー；５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＣＣＡ−３’  （配列番号：７０）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２を作製した。なお、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２は、ｐ６２（ＰＢ１）とＦＫＢＰ１２タンパク質とからなる融合タンパク質（「ｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２」とも称する）をコードする。【００８９】
また、ｐｈＡＧ−ＦＫＢＰ１２の作製においては、先ずｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒをＮｈｅＩとＡｇｅＩにて切断することにより、ｈＡＧ１遺伝子を調製した。次いで、同じ制限酵素で処理してｐ６２（ＰＢ１）領域を切り出したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２に、ｈＡＧ１遺伝子を挿入することにより、ｐｈＡＧ−ＦＫＢＰ１２を作製した。【００９０】
さらに、ｐｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２の作製においては、先ずｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒをＮｈｅＩとＡｇｅＩにて切断することにより、ｈｍＡＧ１遺伝子を調製した。次いで、同じ制限酵素で処理してｐ６２（ＰＢ１）領域を切り出したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２に、ｈｍＡＧ１遺伝子を挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を作製した。なお、ｐｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２は、ｍＡＧ１タンパク質とＦＫＢＰ１２タンパク質とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２」とも称する）をコードする。【００９１】
さらに、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｐ６２（ＰＢ１）の作製においては、先ずｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬｉｎｋｅｒをＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断することにより、ｐ６２（ＰＢ１）遺伝子を調製した。次いで、同じ制限酵素で処理してｈＡＧ領域を切り出したｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｐ６２（ＰＢ１）を作製した。なお、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｐ６２（ＰＢ１）は、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とｐ６２（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ｐ６２（ＰＢ１）」とも称する）をコードする。【００９２】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ
ｐｈＡＧ−ＦＫＢＰ１２とｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｐ６２（ＰＢ１）との組み合わせ
ｐｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２とｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｐ６２（ＰＢ１）との組み合わせ
また、遺伝子導入細胞の観察も実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。そして、１００ｎＭ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（メルク社製）添加前と添加３００秒後に蛍光画像を撮影した。【００９３】
図６に示した結果から明らかなように、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前ではｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ＡＧは拡散して存在していたが（図６左側のパネル参照）、添加後の細胞においては蛍光輝点が検出された（図６右側のパネル参照）。また、図７に示した結果から明らかなように、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前ではＡＧ−ＦＫＢＰ１２は拡散して存在していたが（図７上部のパネル参照）、添加後の細胞においては蛍光輝点が検出された（図７下部のパネル参照）。従って、ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的なｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用により、自発的にｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ＡＧとｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２とが会合し、またＡＧ−ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ｐ６２（ＰＢ１）とが会合し、各々蛍光輝点が形成されることが明らかになった。【００９４】
一方、図８に示した結果から明らかなように、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１を用いた場合には、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後の細胞において蛍光輝点は検出されず、ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的な会合体の形成は観察されなかった。従って、多量化能を有する蛍光タンパク質と会合誘導タンパク質とを組み合わせて用いなければ、タンパク質間相互作用によって会合体は形成されず、蛍光輝点は検出されないことが明らかになり、図１及び２に記載のモデルは実施可能であることが実証された。【００９５】
（実施例３）
＜タンパク質間相互作用の検出２＞
図１及び２に記載のモデルにｐ６２のＰＢ１ドメインが適用できることを実証するため、前記ｍＴＯＲのＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２とを用いて、以下に示す方法にて試験した。得られた結果を図９〜１１に示す。【００９６】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例２に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した。そして、１００ｎＭ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（メルク社製）添加前と添加３００秒後に蛍光画像を撮影した。【００９７】
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｍＡＧ１とｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐｐ６２（ＰＢ１＿ｎｃ）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ。【００９８】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｍＡＧ１は、実施例２に記載の方法と同様の方法にて、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧから、ｈＡＧをコードするＤＮＡを切り出して、代わりにｈｍＡＧ１をコードするＤＮＡを挿入することにより、調製した。【００９９】
また、ｐｐ６２（ＰＢ１＿ｎｃ）−ＦＫＢＰ１２は、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２を鋳型として、ＡＭＡＰ複数部位特異的変異導入キット（ＡＭＡＰ（ＴＭ）  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を用いて、添付の使用説明書に従って、下記プライマーにより変異を導入することにより調製した。【０１００】
配列番号：１５４に記載のＤＮＡ配列からなるプライマー：５’−ＧＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＧＧＧＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣ−３’。なお、ｐ６２（ＰＢ１＿ｎｃ）は、ｐ６２（ＰＢ１）同士の相互作用が生じる界面に２アミノ酸の変異を導入し、会合誘導能を解消した変異体である。【０１０１】
図９に示した結果から明らかなように、実施例２にて示した結果同様に、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前ではｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ＡＧは拡散して存在していたが（図中上部パネル参照）、添加後の細胞においては蛍光輝点が検出された（図中下部パネル参照）。【０１０２】
一方、図１０に示した結果から明らかなように、実施例２にて示した結果同様に、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１を用いた場合には、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後の細胞においても蛍光輝点は検出されず、ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的な会合体の形成は観察されなかった。【０１０３】
さらに、図１１に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）の代わりに、ホモ多量体を形成することができなくなった変異体であるｐ６２（ＰＢ１＿ｎｃ）を用いた場合においても、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後の細胞においても蛍光輝点は検出されず、ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的な会合体の形成は観察されなかった。【０１０４】
従って、多量化能を有する蛍光タンパク質と会合誘導タンパク質とを組み合わせて用いなければ、タンパク質間相互作用によって会合体は形成されず、蛍光輝点は検出されないことが明らかになり、図１及び２に記載のモデルは実施可能であることが実証された。【０１０５】
なお、かかる本発明のタンパク質間相互作用の検出方法は、タンパク質間相互作用が発生した際に限り、自発的に蛍光輝点が形成される点で、従来のタンパク質間相互作用の検出方法とは全く異なる方法である。【０１０６】
（実施例４）
＜会合誘導タンパク質のスクリーニング２＞
ｐ６２（ＰＢ１）と同様の性質を有する会合誘導タンパク質を見出すために、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、スクリーニングを行った。【０１０７】
このようなスクリーニングの対象として、ＰＢ１ドメインの他にＳＡＭドメインに着目し、各タンパク質由来のＰＢ１ドメイン若しくはＳＡＭドメインにｍＡＧ１を融合させたタンパク質、又は各タンパク質由来のＰＢ１ドメイン若しくはＳＡＭドメインに多量化能を有する蛍光タンパク質としてＡＧを融合させたタンパク質を培養細胞内に発現させ、以下に示す方法にて、各々の融合タンパク質による会合、ひいては会合によって生じる蛍光輝点の発生の有無を調べた。得られた結果を図１２〜１５に示す。【０１０８】
（プラスミドＤＮＡの調製）
各タンパク質由来のＰＢ１ドメイン又はＳＡＭドメインを、蛍光タンパク質のＣ末端側にフレキシブルリンカーを介して融合させて発現させるべく、ｍＡＧ１を融合するためのプラスミドとしてｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒを用い、ＡＧを融合するためのプラスミドとしてｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒを用いた。【０１０９】
すなわち、ｐｈｍＡＧ１−ＭＥＫ５（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ＭＥＫ５（ＰＢ１）の作製においては、先ずＭＥＫ５のＰＢ１ドメイン（ＭＥＫ５タンパク質の１６〜１０９アミノ酸からなる領域、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる領域、「ＭＥＫ５（ＰＢ１）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＭＥＫ５（ＰＢ１）フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＡ−３’  （配列番号：７１）
ＭＥＫ５（ＰＢ１）リバースプライマー；５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧ−３’  （配列番号：７２）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＭＥＫ５（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ＭＥＫ５（ＰＢ１）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＭＥＫ５（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＭＥＫ５（ＰＢ１）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＭＥＫ５（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−ＭＥＫ５（ＰＢ１）」とも称する）をコードしている。【０１１０】
また、ｐｈｍＡＧ１−Ｎｂｒ１（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−Ｎｂｒ１（ＰＢ１）の作製においては、先ずＮｂｒ１のＰＢ１ドメイン（Ｎｂｒ１タンパク質の４〜８５アミノ酸からなる領域、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる領域、「Ｎｂｒ１（ＰＢ１）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｎｂｒ１（ＰＢ１）フォワードプライマー；５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＡＡＡ−３’  （配列番号：７３）
Ｎｂｒ１（ＰＢ１）リバースプライマー；５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＴＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴ−３’  （配列番号：７４）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−Ｎｂｒ１（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−Ｎｂｒ１（ＰＢ１）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＮｂｒ１（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−Ｎｂｒ１（ＰＢ１）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＮｂｒ１（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−Ｎｂｒ１（ＰＢ１）」とも称する）をコードしている。【０１１１】
さらに、ｐｈｍＡＧ１−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）の作製においては、先ずＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン（ＰＫＣｉｏｔａタンパク質の１６〜９９アミノ酸からなる領域、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる領域、「ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）フォワードプライマー；５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＴＣＣＧＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＧ−３’
（配列番号：７５）
ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）リバースプライマー１８；５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＡＡＧＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＴＣＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧ−３’  （配列番号：７６）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）」とも称する）をコードしている。【０１１２】
また、ｐｈｍＡＧ１−ＴＦＧ（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ＴＦＧ（ＰＢ１）の作製においては、先ずＴＦＧのＰＢ１ドメイン（ＴＦＧタンパク質の１０〜９１アミノ酸からなる領域、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列からなる領域、「ＴＦＧ（ＰＢ１）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＴＦＧ（ＰＢ１）フォワードプライマー１；５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡ−３’  （配列番号：７７）
ＴＦＧ（ＰＢ１）リバースプライマー１；５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＡＴ−３’  （配列番号：７８）
そして、得られた増幅産物をＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＴＦＧ（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ＴＦＧ（ＰＢ１）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＴＦＧ（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＴＦＧ（ＰＢ１）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＴＦＧ（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−ＴＦＧ（ＰＢ１）」とも称する）をコードしている。【０１１３】
さらに、ｐｈｍＡＧ１−ＴＥＬ（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−ＴＥＬ（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＴＥＬのＳＡＭドメイン（ＴＦＧタンパク質の３８〜１２４アミノ酸からなる領域、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなる領域、「ＴＥＬ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：１３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＴＥＬ（ＳＡＭ）フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡ−３’  （配列番号：７９）
ＴＥＬ（ＳＡＭ）リバースプライマー；５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴ−３’  （配列番号：８０）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＴＥＬ（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−ＴＥＬ（ＳＡＭ）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＴＥＬ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＴＥＬ（ＳＡＭ）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＴＥＬ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−ＴＥＬ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードしている。【０１１４】
また、ｐｈｍＡＧ１−ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＥｐｈＢ２のＳＡＭドメイン（ＥｐｈＢ２タンパク質の９０５〜９８１アミノ酸からなる領域、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列からなる領域、「ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＣＧＡＴＣＣＣＣＧＡ−３’  （配列番号：８１）
ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）リバースプライマー；５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＧ−３’  （配列番号：８２）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−ＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）」とも称する）をコードしている。【０１１５】
さらに、ｐｈｍＡＧ１−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン（ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質の１０９７〜１１６４アミノ酸からなる領域、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなる領域、「ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：１７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＡＣＡ−３’  （配列番号：８３）
ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）リバースプライマー；５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴ−３’  （配列番号：８４）
そして、得られた増幅産物をＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードしている。【０１１６】
また、ｐｈｍＡＧ１−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＴａｎｋｙｒａｓｅのＳＡＭドメイン（Ｔａｎｋｙｒａｓｅタンパク質の９５２〜１０７８アミノ酸からなる領域、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなる領域、「Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードするＤＮＡ（配列番号：１９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡ−３’  （配列番号：８５）
Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）リバースプライマー；５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡ−３’  （配列番号：８６）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）及びｐｈＡＧ−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）を各々作製した。なお、これらプラスミドＤＮＡは各々、ｍＡＧ１タンパク質とＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ｍＡＧ１−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）」とも称する）及びＡＧタンパク質とＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＡＧ−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードしている。【０１１７】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
プラスミドＤＮＡは、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した。また、遺伝子導入細胞の観察も実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。【０１１８】
図１３、１４及び１５に示した結果から明らかなように、ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）、ＴＦＧ（ＰＢ１）、ＴＥＬ（ＳＡＭ）、ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）及びＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）は、ｍＡＧ１を融合させた場合には拡散し、ＡＧを融合させた場合には蛍光輝点（会合体）を形成した。なお、ＡＧ−ＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）を発現させた細胞においては、蛍光輝点を形成する細胞と形成しない細胞とが混在していたが、ＡＧタンパク質を含むその他の融合タンパク質を発現する細胞においては、全ての細胞にて蛍光輝点が検出された。【０１１９】
一方、図１２及び１５に示した結果から明らかなように、ＭＥＫ５（ＰＢ１）、Ｎｂｒ１（ＰＢ１）及びＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）は、ｍＡＧ１を融合させた場合にも、ＡＧを融合させた場合においても、蛍光輝点の形成を観察することができなかった。【０１２０】
従って、ＴＦＧ（ＰＢ１）、ＴＥＬ（ＳＡＭ）、ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）及びＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）は、本発明にかかる会合誘導タンパク質として利用できることが明らかになった。【０１２１】
（実施例５）
＜タンパク質間相互作用の検出３＞
実施例４において選択した会合誘導タンパク質が、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法に好適に用いることができることを実証するため、以下に示す実施例２に記載の方法と同様の方法にて試験した。得られた結果を図１６に示す。【０１２２】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐＦＫＢＰ１２−ＴＦＧ（ＰＢ１）の作製においては、先ずＴＦＧ（ＰＢ１）遺伝子をｐｈＡＧ−ＴＦＧ（ＰＢ１）から下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＴＦＧ（ＰＢ１）フォワードプライマー２；５’−ＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴ−３’  （配列番号：８７）
ＴＦＧ（ＰＢ１）リバースプライマー２；５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＡＴ−３’  （配列番号：８８）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してｐ６２（ＰＢ１）領域を切り出したｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）に挿入することにより、ｐＦＫＢＰ１２−ＴＦＧ（ＰＢ１）を作製した。なお、ｐＦＫＢＰ１２−ＴＦＧ（ＰＢ１）はＦＫＢＰ１２タンパク質とＴＦＧ（ＰＢ１）とからなる融合タンパク質（「ＦＫＢＰ１２−ＴＦＧ（ＰＢ１）」とも称する）をコードしている。【０１２３】
また、ｐＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＴＥＬ（ＳＡＭ）遺伝子をｐｈＡＧ−ＴＥＬ（ＳＡＭ）から下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した。【０１２４】
ＴＥＬ（ＳＡＭ）フォワードプライマー２；５’−ＡＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡ−３’  （配列番号：８９）
ＴＥＬ（ＳＡＭ）リバースプライマー２；５’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴ−３’  （配列番号：９０）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してｐ６２（ＰＢ１）領域を切り出したｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）に挿入することにより、ｐＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）を作製した。なお、ｐＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）はＦＫＢＰ１２タンパク質とＴＥＬ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードしている。【０１２５】
さらに、ｐＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）遺伝子をｐｈＡＧ−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）から下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）フォワードプライマー２；５’−ＡＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡ−３’  （配列番号：９１）
ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）リバースプライマー２；５’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴ−３’  （配列番号：９２）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してｐ６２（ＰＢ１）領域を切り出したｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）に挿入することにより、ｐＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）を作製した。なお、ｐＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）はＦＫＢＰ１２タンパク質とＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄ（ＰＢ１）」とも称する）をコードしている。【０１２６】
また、ｐＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）の作製においては、先ずＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）遺伝子をｐｈＡＧ−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）から下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）フォワードプライマー２；５’−ＡＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡ−３’  （配列番号：９３）
Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）リバースプライマー２；５’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡ−３’  （配列番号：９４）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してｐ６２（ＰＢ１）領域を切り出したｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）に挿入することにより、ｐＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）を作製した。なお、ｐＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）はＦＫＢＰ１２タンパク質とＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）とからなる融合タンパク質（「ＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）」とも称する）をコードしている。【０１２７】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐＦＫＢＰ１２−ＴＦＧ（ＰＢ１）との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）との組み合わせ。【０１２８】
また、遺伝子導入細胞の観察も実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。そして、１００ｎＭ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（メルク社製）を添加する前に各培養細胞において蛍光輝点が検出されないことを確認し、その添加３００秒後に蛍光画像を撮影した。【０１２９】
図１６に示した結果から明らかように、いずれの融合タンパク質を発現させた場合においても、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前ではｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧは拡散して存在していたが（図示せず）、添加後のいずれの細胞においては蛍光輝点が検出された。すなわち、ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的なｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用により、自発的にｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）等とが会合し、蛍光輝点が形成されることが明らかになった。【０１３０】
従って、ｐ６２（ＰＢ１）のみならず、ＴＥＬ（ＳＡＭ）等といった他のタンパク質由来の他の種類のドメインを会合誘導タンパク質として用いても、タンパク質間相互作用は検出できることが明らかになった。また、かかる結果により、本発明にかかる会合誘導タンパク質のスクリーニング方法として、図３及び４に記載のモデルは実施可能であることが実証された。【０１３１】
（実施例６）
＜タンパク質間相互作用の検出３＞
本発明のタンパク質相互作用の検出方法において、多量化能を有する蛍光タンパク質として、ＡＧタンパク質以外の蛍光タンパク質が適用可能であるかどうかを以下に示す方法にて検証した。得られた結果を図１７に示す。【０１３２】
なお、検証した蛍光タンパク質は、クサビラ  オレンジ１（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ１、ＫＯ１）、二量体ケイマ−レッド（ｄＫｅｉｍａ）及びキクメ  グリーン−レッド（Ｋｉｋｕｍｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｒｅｄ、ＫｉｋＧＲ）であり、各々、ホモ２量体化、ホモ２量体化及びホモ４量体化することが知られている。【０１３３】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＫＯ１の作製においては、先ずｈＫＯ１遺伝子をｐｈＫＯ１−ＭＮ１（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）から下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｈＫＯ１フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＡＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧ−３’  （配列番号：９５）
ｈＫＯ１リバースプライマー；５’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＣＴＣＣ−３’  （配列番号：９６）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してｈＡＧ領域を切り出したｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＫＯ１を作製した。【０１３４】
また、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄの作製においては、先ずｈｄＫｅｉｍａ遺伝子をｐｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断することにより調製した。そして、得られたｈｄＫｅｉｍａ遺伝子を、同じ制限酵素で処理してｈＡＧ領域を切り出したｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄを作製した。【０１３５】
さらに、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＫｉｋＧＲ１の作製においては、先ずｈＫｉｋＧＲ１遺伝子をｐｈＫｉｋＧＲ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断することにより調製した。そして、得られたｈＫｉｋＧＲ１遺伝子を、同じ制限酵素で処理してｈＡＧ領域を切り出したｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｐｈＫｉｋＧＲ１を作製した。【０１３６】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＫＯ１とｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄとｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＫｉｋＧＲ１とｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との組み合わせ。【０１３７】
また、遺伝子導入細胞の観察も実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。なお、ＫＯ１の観察は励起フィルター（ＢＰ５２０−５４０ＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社）、ダイクロイックミラー（ＤＭ５４５ＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）、吸収フィルター（ＢＡ５５５−６００ＨＱ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いた。ｄＫｅｉｍａの観察は励起フィルター（４４０ＡＦ２１、ＯＭＥＧＡ  ＯＰＴＩＣＡＬ社製）、ダイクロイックミラー（４５５ＤＲＬＰ、ＯＭＥＧＡ  ＯＰＴＩＣＡＬ社製）、吸収フィルター（６１０ＡＬＰ、ＯＭＥＧＡ  ＯＰＴＩＣＡＬ社製）を用いた。そして、１００ｎＭ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（メルク社製）を添加する前とその添加３００秒後に蛍光画像を撮影した。【０１３８】
図１７に示した結果から明らかなように、ＡＧタンパク質を用いた場合と同じく、試した全ての蛍光タンパク質において、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前では、各蛍光タンパク質を融合したｍＴＯＲ（ＦＲＢ）は拡散して存在していたが、添加後は蛍光輝点（会合体）を形成した。従って、本発明において、ＡＧタンパク質のみならず、ＫＯ１タンパク質等といった他の多量化能を有する蛍光タンパク質を用いても、タンパク質間相互作用は検出できることが実証された。【０１３９】
（実施例７）
＜多量化能を有する蛍光タンパク質のスクリーニング１＞
本発明のタンパク質相互作用の検出方法において、多量化能を有する蛍光タンパク質として、ＡＧ、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ及びＫｉｋＧＲ以外の蛍光タンパク質が適用可能であるかどうかを以下に示す方法にて検証した。すなわち、単量体クサビラオレンジ２（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ  ２、ｍＫＯ２）と会合誘導タンパク質であるｐ６２（ＰＢ１）とを融合させ、細胞内において発現させた場合に、図３に示すような会合体（蛍光輝点）が形成されるかどうかを調べた。得られた結果を図１８に示す。【０１４０】
先ず実施例１に記載の「ｐｈｍＡＧ１−ｐ６２（ＰＢ１）及びｐｈＡＧ−ｐ６２（ＰＢ１）」と同様に、ｐ６２（ＰＢ１）をコードするＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物をＥｃｏＲIとＮｏｔIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈｍＫＯ２−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐｈｍＫＯ２−ｐ６２（ＰＢ１）を作製した。そして、ｐｈｍＫＯ２−ｐ６２（ＰＢ１）は、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に導入した。また、遺伝子導入細胞の観察も実施例６に記載の方法と同様の方法にて行った。得られた結果を図１８に示す。【０１４１】
図１８に示した結果から明らかなように、ｐｈｍＫＯ２−ｐ６２（ＰＢ１）がコードするタンパク質ｍＫＯ２−ｐ６２（ＰＢ１）どうしは会合し、蛍光輝点を形成した。従って、前述のＡＧ、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ及びＫｉｋＧＲといった、ホモ多量体を細胞内において形成することができる蛍光タンパク質のみならず、一般的に単量体蛍光タンパク質と考えられているｍＫＯ２も、本発明の方法において、多量化能を有する蛍光タンパク質として利用できることが明らかになった。【０１４２】
（実施例８）
＜多量化能を有する蛍光タンパク質のスクリーニング２＞
前記ＡＧ、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ及びＫｉｋＧＲ以外に、ホモ多量体を細胞内において形成することができる蛍光タンパク質として知られているＭｉＣｙ１、ＫＣｙ１、ｄＡＧ（ＡＢ）及びｄＡＧ（ＡＣ）（ホモ２量体化できる蛍光タンパク質）並びにＴＧｕｖ、Ｍｏｍｉｊｉ、ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５及びＤｓＲｅｄ２（ホモ４量体化できる蛍光タンパク質）についても、本発明のタンパク質相互作用の検出方法に利用できることを下記方法にて確認した。【０１４３】
また、ｍＫＯ２のような一般的に単量体蛍光タンパク質と考えられていながらも、本発明の方法に利用できる蛍光タンパク質を見出すべく、下記方法にてスクリーニングを行った。【０１４４】
（タンパク質間相互作用の検出方法）
実施例５及び６に記載の方法と同様の方法にて、ｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２−ＤＧＫｄ（ＳＡＭ）、ＦＫＢＰ１２−ＴＥＬ（ＳＡＭ）又はＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）と、表１に記載の各蛍光タンパク質を融合させたｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とを、ＨｅＬａＳ３細胞内にて発現させ、ラパマイシン添加後の蛍光輝点（会合体）の形成の程度を評価した。なお、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）と各蛍光タンパク質とからなる融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡは、実施例２に記載の方法と同様の方法にて適宜調製した。また、ＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）において、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ１、ｍＫＯ１、ＭｉＣｙ１及びＴＧｕｖの組み合わせに関しては、２９３Ｔ細胞に遺伝子導入を行い試験した。すなわち、２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を含有するＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。また、２９３Ｔ細胞を前記プラスミドＤＮＡを導入する６時間前に８ウェルチャンバー（ｎｕｎｃ社製）に播種した。そして、遺伝子導入の際には、３０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、ＦＫＢＰ１２−Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）をコードするプラスミドＤＮＡ２００ｎｇと、前記蛍光タンパク質及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ）からなる融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ各２００ｎｇとを希釈し、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１．２μｌ添加し、攪拌した。次いで、さらに培養液３００μｌを混合した後、２９３Ｔ細胞に添加し、４８時間後に観察した。得られた結果を表１に示す。表１中、５割以上のＨｅＬａＳ３細胞で蛍光輝点が観察された組み合わせを「＋＋＋」にて示し、５割以下のＨｅＬａＳ３細胞で蛍光輝点が観察された組み合わせを「＋＋」にて示し、ＨｅＬａＳ３細胞よりもタンパク質発現量の高い２９３Ｔ細胞で蛍光輝点が観察された組み合わせを「＋」にて示す。【０１４５】
【表１】
2013084950.tif 000002
【０１４６】
表１に示した結果から明らかなように、ホモ多量体を細胞内において形成することができる蛍光タンパク質は、いずれも本発明の方法に利用できることが確認された。また、ＴＥＬ（ＳＡＭ）及びＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）の結果から、蛍光タンパク質の多量化能が高いほど、タンパク質間相互作用による蛍光輝点（会合体）が形成され易い傾向にあることが見受けられる。さらに、表１に示す通り、ｍＫＯ２以外にも、一般的に単量体蛍光タンパク質と考えられているｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ１、ｍＫＯ１及びｍＫｉｋＧＲ１についても、本発明の方法に利用できることが明らかになった。【０１４７】
（実施例９）
＜タンパク質間相互作用の検出５＞
実施例６〜８にて、本発明の方法に利用できることが確認された多量化能を有する蛍光タンパク質について、会合誘導タンパク質として、ＴＦＧ（ＰＢ１）と組み合わせて用いても、タンパク質間相互作用を検出できることを、以下に示す方法にて確認した。得られた結果を表２に示す。【０１４８】
（タンパク質間相互作用の検出方法）
実施例５及び６に記載の方法と同様の方法にて、ＴＦＧ（ＰＢ１）と、ｍＫｉｋＧＲ１、ｄＡＧ（ＡＣ）、Ｍｏｍｉｊｉ、ＫｉｋＧＲ、ＡＧ，ＣＯＲ３．０１、ＣＯＲ５又はＤｓＲｅｄ２を融合させたｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とを、ＨｅＬａＳ３細胞内にて発現させ、ラパマイシン添加後の蛍光輝点（会合体）の形成の程度を評価した。また、実施例８に記載の方法と同様の方法にて、ＴＦＧ（ＰＢ１）と、ＫＯ１又はｄＡＧ（ＡＢ）を融合させたｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とを、２９３Ｔ細胞内にて発現させ、ラパマイシン添加後の蛍光輝点（会合体）の形成の程度を評価した。得られた結果を表２に示す。表２中、５割以下のＨｅＬａＳ３細胞で蛍光輝点が観察された組み合わせを「＋＋」にて示し、ＨｅＬａＳ３細胞よりもタンパク質発現量の高い２９３Ｔ細胞で蛍光輝点が観察された組み合わせを「＋」にて示す。【０１４９】
【表２】
2013084950.tif 000003
【０１５０】
表２に示した結果から明らかなように、多量化能を有する蛍光タンパク質について、実施例８に示したタンパク質以外の会合誘導タンパク質を組み合わせて用いても、タンパク質間相互作用を検出できることが確認された。【０１５１】
（実施例１０）
＜タンパク質間相互作用の検出６＞
本発明にかかる蛍光輝点（会合体）は、前述の通り、タンパク質間相互作用に起因するものである。そのため、蛍光輝点の蛍光強度は、タンパク質間相互作用の強弱を反映することが考えられる。また、タンパク質間相互作用の検出方法において、該相互作用の強弱を定量化して比較できることは、タンパク質間相互作用の抑制物質（阻害剤）の評価、タンパク質間相互作用を調節する因子の評価に有用である。【０１５２】
そこで、タンパク質間相互作用を誘導する化合物の濃度を変化させ、蛍光輝点（会合体）の蛍光強度が化合物の濃度依存的に変化するか、以下に示す方法にて試験した。【０１５３】
（細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察及び分析）
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とを等量混合し、ＨｅＬａＳ３細胞に実施例１に記載の方法と同様の方法にて導入した。導入してから２４時間後に、細胞を回収し、９６マイクロウェルオプティカルボトムプレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００００細胞数／ウェルとなるように播種した。そして、播種してから２４時間後に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を５．６μｇ／ｍｌとなるように観察用緩衝液にて希釈した溶液をプレートに添加し、さらに３０分間培養した。その後、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業社製）にてプレートを２回洗浄した。次いで、Ｒａｐａｍｙｃｉｎを各濃度に希釈した観察用緩衝液に置換し、１５分後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、和光純薬工業社製）にて固定した。なお、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度は０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１．４ｎＭ、４．１ｎＭ、１２．３ｎＭ、３７．０ｎＭ、１１１．１ｎＭ、３３３．３ｎＭ、１０００ｎＭにて各々使用した。そして、作製したサンプルはＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて観察を行なった。得られた結果の一部を図１９に示す。【０１５４】
また、複数の視野における蛍光画像の解析を行い、各濃度にてＲａｐａｍｙｃｉｎを添加したウェルを撮影した画像の１細胞あたりの蛍光輝点（会合体）の総輝度（総蛍光強度）を計算し、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度との相関を分析した。得られた結果の一部を図２０に示す。なお、図２０中、Ｘ軸は各ウェルに添加したＲａｐａｍｙｃｉｎの濃度を示し、Ｙ軸は一細胞あたりの蛍光輝点（会合体）の総輝度（総蛍光強度）を示し、ドットは実測値を示す。また、そのドットに付したフィッティングカーブ（曲線）はＩｇｏｒ（Ｒ）（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ製）を用い、［Ｄｏｔ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ／Ｃｅｌｌｓ］＝ｙ、［Ｃａｎｃ．（ｎＭ）］＝ｘとして、式：ｙ＝ｂａｓｅ＋（ｍａｘ−ｂａｓｅ）／［１＋（ｘｈａｌｆ／ｘ）＾ｒａｔｅ］にフィッティングさせた関数を表わす。（ｂａｓｅ＝０．００２８７３１、ｍａｘ＝０．１８２３、ｒａｔｅ＝１．４５１６、ｘｈａｌｆ＝４６．９９）。【０１５５】
図１９及び２０に示した結果から明らかなように、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とを発現させた細胞に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用を誘導する化合物  Ｒａｐａｍｙｃｉｎを添加したところ、添加したＲａｐａｍｙｃｉｎの濃度依存的に蛍光輝点の蛍光強度が増加することが明らかになり、該濃度依存的にｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）との会合体が形成されることも示された。【０１５６】
（実施例１１）
＜タンパク質間相互作用の検出７＞
本発明の方法が、タンパク質間相互作用に対する、薬剤の５０％効果濃度（ＥＣ５０）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するのに利用できるかどうかを、以下に示す方法にて評価した。【０１５７】
（プラスミドＤＮＡの調製）
実施例２に記載のｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧとｐＦｕｃｃｉ−Ｓ／Ｇ２／Ｍ  Ｇｒｅｅｎ−Ｈｙｇ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を用い、定法に沿って、薬剤耐性遺伝子をハイグロマイシンＢ耐性遺伝子に変換したｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧ＿Ｈｙｇを作製した。【０１５８】
（安定発現細胞株の作製）
実施例１に記載の方法と同様の方法にて、前記ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧ＿Ｈｙｇと、実施例２に記載のｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２とをＨｅＬａＳ３細胞株に導入し、培養した。【０１５９】
また、前記プラスミドＤＮＡをＨｅＬａＳ３細胞株に導入してから２４時間後に、６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（和光純薬製薬社）及び１５０μｇ／ｍＬ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）を含有する培地に交換した。そして、この培地にて一週間培養して生き残った細胞を、コロニーピックアップ法によりクローン化した。【０１６０】
（遺伝子導入細胞の観察及び分析）
前記クローン化した細胞株を９６ｗｅｌｌプレートに播種した。そして、その翌日にＰＢＳで２回洗った後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を含む観察用緩衝液を各ウェルに播種した細胞株に添加し、３７℃にて１５分間インキュベートすることにより、核染色を行った。【０１６１】
さらに、これら細胞株を観察用緩衝液にて２回洗った後、任意の濃度のＲａｐａｍｙｃｉｎ、又はＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＦＫ５０６を含む観察用緩衝液を各ウェルに添加し、２０分間インキュベートした。【０１６２】
なお、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの添加濃度は０．３９ｎＭ、０．７８ｎＭ、１．５６ｎＭ、３．１３ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５０ｎＭ、２５．００ｎＭ、 ５０．００ｎＭ、
１００．００ｎＭ、２００．００ｎＭ、４００．００ｎＭ又は８００．００ｎＭである。また、ＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２とＲａｐａｍｙｃｉｎとの相互作用を競合的に阻害する物質として知られており、本実施例においては、２０ｎＭ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎを含む緩衝液にて、０．００８μＭ、０．０１６μＭ、０．０３１μＭ、０．０６３μＭ、０．１２５μＭ、０．２５０μＭ、０．５００μＭ、１．０００μＭ、２．０００μＭ、４．０００μＭ、８．０００μＭ又は１６．０００μＭとなるように希釈し、各ウェルに添加した。【０１６３】
各種薬剤を添加してインキュベートした後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、和光純薬工業社製）を各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートすることにより、これら細胞株を固定した。そして、これら細胞株を観察用緩衝液にて３回洗浄した後、各ウェルにつき、蛍光顕微鏡にて３視野の画像を取得した。次いで、それぞれの蛍光画像をｉＣＹ（ｄｅ  Ｃｈａｕｍｏｎｔ  Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、６月２８日、９号、７巻、６９０〜６９６ページ  参照）を用いて解析し、１細胞あたりの蛍光輝点（会合体）の総輝度（総蛍光強度）を計算し、各種薬剤の添加濃度との相関を分析した。Ｒａｐａｍｙｃｉｎのみを添加した結果を図２１に示し、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＦＫ５０６を添加した結果を図２２に示す。【０１６４】
なお、図２１及び２２中、Ｘ軸は細胞株に添加した薬剤濃度を示し、Ｙ軸は一細胞あたりの蛍光輝点（会合体）の総輝度（総蛍光強度）を示し、ドットは実測値を示す。また、そのドットに付したフィッティングカーブ（曲線）はＩｇｏｒ（Ｒ）（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ製）を用いて解析した結果を示すものである。【０１６５】
図２１に示した結果から明らかなように、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２とを安定的に発現させた細胞に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用を誘導する化合物  Ｒａｐａｍｙｃｉｎを添加したところ、添加したＲａｐａｍｙｃｉｎの濃度依存的に蛍光輝点の蛍光強度が増加することが明らかになり、該濃度依存的にｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との会合体が形成されることが示された。さらに、図２１に示したフィッティングカーブに基づき、ｆ（ｘ）＝ｍａｘ＋（ｍｉｎ−ｍａｘ）／（１＋（ｘ／ＥＣ５０）＾ｈｉｌｌ）にて、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２とのタンパク質間相互作用に対するＲａｐａｍｙｃｉｎのＥＣ５０は３．３６ｎＭと算出することができた。
一方、図２２に示した結果から明らかなように、ＦＫ５０６をＲａｐａｍｙｃｉｎ存在下で添加したところ、添加したＦＫ５０６の濃度依存的に蛍光輝点の蛍光強度が減少することが明らかになり、該濃度依存的にｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧとｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２との会合体の形成を阻害することが示された。さらに、図２２に示したフィッティングカーブに基づき、ｆ（ｘ）＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋（ｘ／ＩＣ５０）＾ｈｉｌｌ）にて、ＲａｐａｍｙｃｉｎとＦＫＢＰ１２との相互作用、ひいてはｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２とのタンパク質間相互作用に対するＦＫ５０６のＩＣ５０は０．６８μＭと算出することができた。【０１６６】
（実施例１２）
＜タンパク質間相互作用の検出８＞
実施例１０及び１１と同様の目的にて、本発明の方法において、タンパク質間相互作用に特異的な阻害剤によって、会合体（蛍光輝点）を構成していた融合タンパク質が分散するかどうか、また当該阻害剤の濃度を変化させ、蛍光輝点の蛍光強度が該阻害剤の濃度依存的に変化するかどうか、以下に示す方法にて試験した。【０１６７】
なお、かかる試験において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているナトリン−３（Ｎｕｔｌｉｎ−３）を実施例１２において用いた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ＬＴ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年２月６日、３０３号、５６５９巻、８４４〜８４８ページ  参照）。【０１６８】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３の作製においては、先ずｐ５３の一部（ｐ５３タンパク質の１〜７０アミノ酸からなる領域、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：２５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、Ｕ２ＯＳ細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｐ５３フォワードプライマー；５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＧ−３’  （配列番号：９７）
ｐ５３リバースプライマー４８；５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣ−３’  （配列番号：９８）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＮｏｔＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３を作製した。【０１６９】
また、ｐｈＡＧ−ＭＤＭ２の作製においては、先ずＭＤＭ２の一部（ＭＤＭ２タンパク質の７〜１２５アミノ酸からなる領域、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：２７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、Ｕ２ＯＳ細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＭＤＭ２フォワードプライマー；５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣ−３’  （配列番号：９９）
ＭＤＭ２リバースプライマー；５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧ−３’  （配列番号：１００）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−ＭＤＭ２を作製した。【０１７０】
（細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察及び分析）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とｐｈＡＧ−ＭＤＭ２とを等量混合し、ＨｅＬａＳ３細胞に実施例１に記載の方法と同様の方法にて導入した。導入してから２４時間後に、培養液を除き、０．１９μＭ  Ｎｕｔｌｉｎ−３が含まれた観察用緩衝液を１．５ｍｌ入れ、その１５分後に蛍光画像を撮影した。その後、観察用緩衝液を除き、０．７７μＭ  Ｎｕｔｌｉｎ−３が含まれた観察用緩衝液を１．５ｍｌ入れ、１５分後に再度蛍光画像を撮影した。同様の工程を４．８μＭ、１２μＭ  Ｎｕｔｌｉｎ−３についても実施した。得られた結果を図２３に示す。また、各濃度にてＮｕｔｌｉｎ−３を添加した細胞を撮影した蛍光画像における、蛍光輝点（会合体）の総輝度を計算し、Ｎｕｔｌｉｎ−３の濃度との相関をグラフ化した。得られた結果を図２４に示す。なお、図２４中、Ｘ軸は細胞に添加したＮｕｔｌｉｎ−３の濃度を示し、Ｙ軸は一蛍光画像（一視野）あたりの蛍光輝点の総輝度（総蛍光強度）を示す。【０１７１】
図２３に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とを細胞内に発現させると蛍光輝点が検出された。そして、同一視野において、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用に対する阻害剤（Ｎｕｔｌｉｎ−３）の添加濃度を段階的に上昇させた結果、蛍光輝点（会合体）は徐々に消失していくことが観察され、該会合体を構成していた融合タンパク質が分散していくことが確認された。また、図２４に示した結果から明らかなように、視野内の蛍光輝点の蛍光輝度は阻害剤の濃度に依存して減少した。【０１７２】
（実施例１３）
＜タンパク質間相互作用の検出９＞
実施例１１同様に、本発明の方法が、タンパク質間相互作用に特異的な阻害剤のＩＣ５０を決定するのに利用できるかどうかを、以下に示す方法にて評価した。【０１７３】
（プラスミドＤＮＡの調製）
先ず、実施例１２に記載のｐｈＡＧ−ＭＤＭ２とｐＦｕｃｃｉ−Ｓ／Ｇ２／Ｍ  Ｇｒｅｅｎ−Ｈｙｇ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）とを用い、定法に沿って、薬剤耐性遺伝子をＧ４１８耐性遺伝子からハイグロマイシンＢ耐性遺伝子に変換したｐｈＡＧ−ＭＤＭ２＿Ｈｙｇを作製した。【０１７４】
（安定発現細胞株の作製）
次に、前記ｐｈＡＧ−ＭＤＭ２＿Ｈｙｇと、実施例１２に記載のｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とをＣＨＯ−Ｋ１細胞株に導入した。なお、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を含有するＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＭＩＸＴＵＲＥ  Ｆ−１２  ＨＡＭ（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。【０１７５】
そして、前記プラスミドＤＮＡをＣＨＯ−Ｋ１細胞株に導入してから２４時間後に、１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（和光純薬製薬社）及び２００μｇ／ｍｌ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）を含有する培地に交換した。そして、この培地にて一週間培養して生き残った細胞を、限界希釈法により単一クローン化した。【０１７６】
（遺伝子導入細胞の観察及び分析）
前記単一クローン化した細胞株を、実施例１１に記載の方法と同様の方法にて、核染色した後、任意の濃度のＮｕｔｌｉｎ−３（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を含む観察用緩衝液を各ウェルに添加し、２０分間インキュベートした。なお、Ｎｕｔｌｉｎ−３は最終濃度、０．２μＭ、０．３μＭ、０．６μＭ、０．９μＭ、１．６μＭ、２．６μＭ、４．３μＭ、７．２μＭ、１２．０μＭ、２０．０μＭになるように調製して添加した。【０１７７】
続いて、実施例１１に記載の方法と同様の方法にて、細胞株を固定し、各ウェルにおいて、蛍光顕微鏡に画像を取得し、それぞれの蛍光画像をｉＣＹを用いて解析し、１細胞あたりの蛍光輝点の総輝度を計算し、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加濃度との相関を分析した。得られた結果を図２５に示す。なお、図２５中、Ｘ軸は細胞株に添加した薬剤濃度を示し、Ｙ軸は一細胞あたりの蛍光輝点（会合体）の総輝度（総蛍光強度）を示し、ドットは実測値を示す。また、そのドットに付したフィッティングカーブ（曲線）はＩｇｏｒ（Ｒ）を用いて解析した結果を示すものである。【０１７８】
図には示さないが、実施例１２同様に、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２が安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞においても、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用に起因する蛍光輝点（会合体）が観察された。また、図２５に示す通り、これら会合体の蛍光輝度は阻害剤であるＮｕｔｌｉｎ−３の濃度に依存して減少した。さらに、図２５に示したフィッティングカーブに基づき、ｆ（ｘ）＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋（ｘ／ＩＣ５０）＾ｈｉｌｌ）にて、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用に対するＮｕｔｌｉｎ−３のＩＣ５０は８．９μＭと算出することができた。【０１７９】
以上、実施例１０〜１３に示した結果から、本発明にかかる蛍光輝点の蛍光輝度はタンパク質間相互作用の強弱を反映し、タンパク質間相互作用を定量化できることが実証された。さらに、会合体の形成は可逆的であることも明らかになり、かかる定量化は、固定細胞を用いても（図２０  参照）、生細胞でのライブイメージングによる手法を用いても（図２４  参照）、実施可能であることが示された。また、本発明によれば、実施例１１及び１３に示す通り、薬剤のタンパク質間相互作用に対する濃度依存的な促進反応及び阻害反応を検出することができ、さらに、その薬剤のＥＣ５０及びＩＣ５０の算出が可能であることが明らかになった。従って、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法は、タンパク質間相互作用を調節する物質の評価及びスクリーニングに適用できることが示された。【０１８０】
（実施例１４）
＜タンパク質間相互作用の検出１０＞
ｐ５０とｐ６５とはヘテロダイマーを形成し、ＮＦκＢを構成することが知られている。さらに、ＮＦκＢは炎症性サイトカインの発現調節を担う転写因子として核内で機能するが、ＩκＢαと相互作用することで細胞質に保持され、その転写機能は抑制されることが知られている（Ｍａｒｃ  Ｄ．Ｊａｃｏｂｓら、Ｃｅｌｌ、１９９８年１２月１１日、９５巻、７４９〜７５８ページ  参照）。従って、ｐ５０とｐ６５とを過剰発現させた場合、内在性のＩκＢαとの化学量論的バランスが合わず、前記ヘテロダイマーは主に核内に局在する。一方、ＩκＢαを過剰発現させることで、ＩκＢαをさらに含むヘテロ三量体は細胞質に保持されることになる。【０１８１】
そこで、本実施例においては、ＩκＢαの有無に応じた、ｐ５０及びｐ６５を含む複合体の細胞内における局在の変化を、本発明の方法により検出できるかどうかを、以下に示す方法にて試験した。【０１８２】
先ず、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０及びｐｈＡＧ−ｐ６５を、実施例２に記載の方法と同様の方法にて各々調製した。ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０及びｐｈＡＧ−ｐ６５には、各々配列番号：１５６及び１５８に記載のアミノ酸配列からなる領域をコードするＤＮＡ（各々配列番号：１５５及び１５７）が挿入されている。【０１８３】
また、ｐＩκＢαは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿０６５３９０．１で特定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いて、実施例１に記載の方法と同様の方法にて作製した。【０１８４】
そして、ＨｅＬａＳ３細胞を８ウェルチャンバー（ｎｕｎｃ社製）中の４ウェルに播種し、その翌日、前記プラスミドＤＮＡをこれら細胞に導入した。遺伝子導入には、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０及びｐｈＡＧ−ｐ６５各々１００ｎｇを添加し、更にｐＩκＢαの量を変化させて添加したものを用いた。なお、ｐＩκＢαの添加量は、０ｎｇ（無添加）又は１００ｎｇとし、更にプラスミドＤＮＡの総添加量を統一するために、ｐｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−Ｓ１（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を、３００ｎｇ又は０ｎｇ添加した。次いで、これらＯｐｔｉＭＥＭにポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１．５μｌ各々添加し、攪拌した。さらに培養液２００μｌと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加した。そして、この遺伝子導入を行ってから２２時間後に、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、和光純薬工業社製）により室温で１５分間細胞固定し、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで５分間細胞膜を可溶化したのち、抗ＩκＢα抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用い、免疫染色を行った。更に核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて染色した。そして、免疫染色した細胞を、実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察した。得られた結果を図２６示す。なお、図中「重ね合わせ」は、ＡＧ由来の蛍光を取得した画像（図中左側の２パネル）と、抗ＩκＢα抗体による免疫染色の結果を示す画像（図中真ん中の２パネル）と、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色の結果を示す画像とを重ね合わせた結果を示す。【０１８５】
図２６に示した結果から明らかなように、ＩκＢαを導入しない細胞においては、ｐ５０とｐ６５とからなるヘテロダイマーが核内に形成されていることが確認された。一方、ＩκＢαを導入した際には、ＡＧ由来の蛍光を取得した画像（図中、左下のパネル参照）において検出される蛍光輝点と同一の場所にＩκＢα由来のシグナルが検出され（図中、真ん中下のパネル参照）、ｐ５０及びｐ６５を含む複合体にＩκＢαが含まれていることが確認された。さらに、ＩκＢαの存在下では、ｐ５０及びｐ６５を含む複合体の局在が前記核内から細胞質内に変化することも、本発明の方法によって確認された。【０１８６】
（実施例１５）
＜タンパク質間相互作用の検出１１＞
本実施例においては、実施例１４においても検出したｐ５０及びｐ６５を含む複合体を通して、ＩκＢαの量的バランスに応じた、当該複合体の細胞内における局在の変化を、本発明の方法により定量的に検出できるかどうかを、以下に示す方法にて試験した。【０１８７】
先ず、ＨｅＬａＳ３細胞を８ウェルチャンバー（ｎｕｎｃ社製）中の４ウェルに播種した。そして、その翌日、実施例１３に記載の、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０、ｐｈＡＧ−ｐ６５、ｐＩκＢαをこれら細胞に導入した。遺伝子導入には、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５０及びｐｈＡＧ−ｐ６５各々１００ｎｇを添加し、更にｐＩκＢαの量を変化させて添加したものを用いた。なお、ｐＩκＢαの添加量は、（０）無添加、（１）３３ｎｇ、（２）１００ｎｇ又は（３）３００ｎｇとし、更にプラスミドＤＮＡの総添加量を統一するために、ｐｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−Ｓ１（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を、（０）に３００ｎｇ、（１）に２６７ｎｇ、（２）に２００ｎｇ、（３）に０ｎｇ添加した。次いで、これらＯｐｔｉＭＥＭにポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１．５μｌ各々添加し、攪拌した。さらに培養液２００μｌと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加し、２２時間後に、実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察した。【０１８８】
前記（０）〜（３）の条件にてプラスミドＤＮＡを導入した細胞を、各々１５０個以上撮影し、蛍光輝点の局在に従って、（Ａ）〜（Ｃ）の３通りのグループに分類した。すなわち、蛍光輝点が、（Ａ）細胞質のみにて検出される細胞、（Ｂ）細胞質と核内とにて検出される細胞、（Ｃ）核内のみに検出される細胞、である。そして、各グループに含まれる細胞数の割合を算出し、グラフ化した。得られた結果を図２７に示す。【０１８９】
図２７に示した結果から明らかなように、ＩκＢαの量依存的に細胞質にて検出される蛍光輝点の割合が増加した。このように、本発明によれば、蛍光輝点の局在に従って細胞をグループ分けし、各グループに含まれる細胞数を比較する方法を提供することができる。さらに、実施例１４においても示す通り、本発明の方法によれば、直接的な検出対象である第１のタンパク質及び第２のタンパク質（例えば、ｐ５０及びｐ６５）の相互作用の局在を介して、第３のタンパク質（例えば、ＩκＢα）が当該相互作用に及ぼす影響や、第３のタンパク質の発現量も定量化できることも明らかになった。【０１９０】
（実施例１６）
＜タンパク質間相互作用の検出１２＞
細胞の核内にて、ｐ２１は、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体を認識し、相互作用することが知られている（ＬａＢａｅｒ  Ｊら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９７年４月１日、１１巻７号８４７〜８６２ページ  参照）。そして、かかるヘテロ３量体の形成により、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体によって促進される細胞周期の進行（Ｇ１期からＳ期への移行）が阻害されることも明らかになっている。【０１９１】
そこで、本実施例においては、実施例１４及び１５同様に、３種類の異なるタンパク質からなる複合体の形成を本発明によって検出できるかどうかを以下に示す方法にて試験した。【０１９２】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４、ｐｈＡＧ−ｐ２１及びｐＣｙｃｌｉｎＤ１は、各々Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿００００６６．１、ＮＰ＿０００３８０．１及びＮＰ＿４４４２８４．１で特定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に基づき、実施例１に記載の方法と同様の方法にて作製した。【０１９３】
（培養細胞への遺伝子導入、細胞免疫染色、並びに細胞の観察）
前記プラスミドＤＮＡを導入する培養細胞としてＨｅＬａＳ３細胞を用いた。また、ＨｅＬａＳ３細胞は、実施例１に記載の方法と同様の方法にて培養した。さらに、遺伝子導入においては、８ウェルチャンバー（ｎｕｎｃ社製）の２ウェルにＨｅＬａＳ３細胞を播種し、その翌日に、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、下記組み合わせにて、各々１３０ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクション試薬１μｌを用いて、ＨｅＬａＳ３細胞に導入した。
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４とｐｈＡＧ−ｐ２１とｐＣｙｃｌｉｎＤ１との組み合わせ、
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４とｐｈＡＧ−ｐ２１とｐｈｍＫＧＣ−ＭＮ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）との組み合わせ（なお、ｐｈｍＫＧＣ−ＭＮは、プラスミドの総量を統一させるために添加した）。【０１９４】
そして、遺伝子を導入してから２４時間後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、和光純薬工業社製）により室温で１５分間細胞固定し、  ０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで５分間細胞膜を可溶化したのち、抗ＣｙｃｌｉｎＤ１抗体（株式会社医学生物学研究所製）４μｇ／ｍｌを用い、免疫染色を行った。免疫染色した細胞は実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察した。得られた結果を図２８に示す。【０１９５】
図２８に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４とＡＧ−ｐ２１とを発現させるだけでは多くの細胞で明瞭な会合体（蛍光輝点）は観察されなかった。しかし、ｐ６２（ＰＢ１）−ＣＤＫ４とＡＧ−ｐ２１とに加え、ＣｙｃｌｉｎＤ１を強制的に発現させた場合には、前記ヘテロ３量体の形成に必要な要素の発現を化学量論的に揃えることができ、ほぼすべての細胞にて明瞭な蛍光輝点が観察された。さらにＣｙｃｌｉｎＤ１の免疫染色像から、観察された蛍光輝点にはＣｙｃｌｉｎＤ１が局在していることも確認された。【０１９６】
従って、実施例１４及び１５に示した結果同様に、３量体以上の複合体の形成におけるタンパク質間相互作用を本発明によって検出できることが確認された。【０１９７】
また、本発明によれば、このように、二種のタンパク質（実施例１４及び１５においてはｐ５０及びｐ６５、実施例１６においてはＣＤＫ４及びｐ２１）が、さらに「ある分子」（実施例１４及び１５においてはＩκＢα、実施例１６においてはＣｙｃｌｉｎＤ１）を含み、複合体を形成していると予測される場合に、この二種のタンパク質を各々「会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質」と「多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質」として細胞に発現させ、さらにｃＤＮＡ発現ライブラリーがコードするタンパク質を当該細胞に発現させることによって、蛍光輝点（例えば、蛍光輝点の発生・消失、蛍光輝点の局在の変化）を指標とし、前記「ある分子」（複合体の構成因子）を探索できる。【０１９８】
また、実施例１４〜１６において示した通り、本発明によれば、複合体の構成因子（実施例１４及び１５においてはＩκＢα、実施例１６においてはＣｙｃｌｉｎＤ１）の発現量を蛍光輝点を指標に解析でき、ひいては当該発現量を通して、前記複合体が制御する細胞周期や前記複合体が応答するストレス等といった細胞が面している状態を解析することもできる。【０１９９】
（実施例１７）
＜タンパク質相互作用の検出１３＞
実施例１０〜１３に示した通り、本発明にかかる蛍光輝点の蛍光強度が、タンパク質間相互作用の強弱を反映することが明らかになった。従って、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法において、本発明にかかる蛍光輝点の蛍光強度を指標として、相互作用に重要なアミノ酸を同定することもできることが想定される。そこで、タンパク質間相互作用の減弱又は増強に関与することが知られているアミノ酸変異を用いた試験を、以下に示す方法にて行った。【０２００】
なお、かかる試験において検出対象としたのは、Ｓｅｃ５タンパク質とＲａｌＢタンパク質との相互作用であり、Ｓｅｃ５タンパク質はＲａｌＢタンパク質のＧＴＰ活性化型と相互作用することが知られている（Ｍｏｓｋａｌｅｎｋｏ  Ｓ  ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年１月、４巻、１号、６６〜７２ページ  参照）。ＲａｌＢの非活性型変異体  ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）ではその相互作用が減弱し、ＲａｌＢの活性型変異体  ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）では増強することが知られている（Ｓｈｉｐｉｔｓｉｎ  Ｍ  ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００４年７月、２４巻、１３号、５７４６〜５７５６ページ  参照）。さらに、膜アンカー型タンパク質であるＲａｌＢタンパク質については、そのＣ末端がパルミトイル化されることにより、細胞膜に局在することも明らかになっている。【０２０１】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５の作製においては、先ずＳｅｃ５の一部（Ｓｅｃ５タンパク質の１〜９９アミノ酸からなる領域、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：２９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｓｅｃ５フォワードプライマー；５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣ−３’  （配列番号：１０１）
Ｓｅｃ５リバースプライマー；５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＡＧＴＡ−３’  （配列番号：１０２）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５を作製した。なお、ｐｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５は、ｐ６２（ＰＢ１）とＳｅｃ５の部分タンパク質との融合タンパク質（「ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５」とも称する）をコードする。【０２０２】
また、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）の作製においては、先ずＲａｌＢ（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡ（配列番号：３１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＲａｌＢフォワードプライマー；５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＴＡＡＧ−３’  （配列番号：１０３）
ＲａｌＢリバースプライマー；５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣ−３’  （配列番号：１０４）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）を作製した。なお、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）は、ＡＧタンパク質とＲａｌＢタンパク質との融合タンパク質（「ＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）」とも称する）をコードする。【０２０３】
さらに、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）の作製は、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）を鋳型として、ＡＭＡＰ複数部位特異的変異導入キット（ＡＭＡＰ（ＴＭ）  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を用いて、添付の使用説明書に従って、下記プライマーにより変異を導入した
ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）プライマー；５’−ＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＧＣＡＧＣＣＡ−３’  （配列番号：１０５）。【０２０４】
なお、ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３４に示す。また、該タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：３３に示す。さらに、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）は、ＡＧタンパク質とＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）タンパク質との融合タンパク質（「ＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）」とも称する）をコードする。【０２０５】
また、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）の作製は、ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）を鋳型として、ＡＭＡＰ（ＴＭ）  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、添付の使用説明書に従って、下記プライマーにより変異を導入した
ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）プライマー；５’−ＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＴＴＧＧＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡ−３’  （配列番号：１０６）。【０２０６】
なお、ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３６に示す。また、該タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：３５に示す。ｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）は、ＡＧタンパク質とＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）タンパク質との融合タンパク質（「ＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）」とも称する）をコードする。【０２０７】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した
ｐｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）との組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）との組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）との組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）とｐｈＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）との組み合わせ。【０２０８】
また、遺伝子導入細胞の観察も実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。得られた結果を図２９に示す。さらに、細胞膜付近のみ励起することのできる、アーク光源全反射蛍光顕微鏡システム（オリンパス社製、ＩＸ７１−ＡＲＣＥＶＡ）を用い画像を取得した。得られた結果を図３０に示す。【０２０９】
図２９に示した結果から明らかなように、Ｃ末端がパルミトイル化されたＲａｌＢタンパク質は細胞膜に局在するため、野生型のＲａｌＢタンパク質（ＲａｌＢ（ＷＴ））を発現させた場合には、細胞膜付近においてＳｅｃ５タンパク質との相互作用に由来する蛍光輝点が検出された。一方、ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）とを共発現させた細胞においては、蛍光輝点が検出されず、前述の通り、ＲａｌＢの非活性型変異体  ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）では、Ｓｅｃ５タンパク質との相互作用が減弱していることが確認された。また、ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）を共発現させた細胞ではｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）を共発現させた細胞より蛍光強度（輝度）の高い蛍光輝点が検出され、前述の通り、ＲａｌＢの活性型変異体  ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）では、Ｓｅｃ５タンパク質との相互作用が増強していることも確認された。【０２１０】
また、図３０に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（ＷＴ）とを共発現した細胞において、会合体が観察された。図３０に示した結果は、細胞膜付近のみ励起することのできる観察系を用いた結果である。従って、図２９に示した結果同様に、細胞膜付近における野生型のＲａｌＢタンパク質とＳｅｃ５タンパク質との相互作用を、本発明の方法により検出できることが実証された。【０２１１】
また、図３０に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）とを共発現した細胞ではより顕著な会合体の形成が観察された。一方、ｐ６２（ＰＢ１）−Ｓｅｃ５とＡＧ−ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）とを共発現させた細胞においては会合体が観察されなかった。従って、図２９に示した結果同様に、本発明の方法によって、ＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）におけるＳｅｃ５タンパク質との相互作用の減弱、及び、ＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）における当該相互作用の増強を検出できることが実証された。【０２１２】
（実施例１８）
＜タンパク質相互作用の検出１４＞
実施例１７同様に、タンパク質間相互作用の減弱に関与することが知られているアミノ酸変異を用いた試験を、以下に示す方法にて行った。【０２１３】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３＿Ｗ２３Ｌは、実施例１２に記載のｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３に配列番号：１５９に記載の塩基配列（５‘−ＡＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧＴ−３’）からなるプライマーを用い、実施例１７に記載の方法と同様の方法にて変異を導入することにより調製した。【０２１４】
なお、ｐ５３の２３位のアミノ酸はｐ５３とＭＤＭ２との相互作用界面部位に位置し、さらに、ｐ５３における「Ｗ２３Ｌ」変異は当該相互作用を減弱させる変異として知られている（文献Ｚｏｎｄｌｏ  ＳＣ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、２００６年１０月３日、４５巻、３９号、１１９４５〜１１９５７ページ参照）。【０２１５】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
実施例１に記載の方法と同様の方法にて、下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを細胞に導入し、当該細胞を観察した。得られた結果を図３１に示す。
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とｐｈＡＧ−ＭＤＭ２との組み合わせ。
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３＿Ｗ２３Ｌ  とｐｈＡＧ−ＭＤＭ２との組み合わせ。【０２１６】
図３１に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とを共発現した細胞では顕著に蛍光輝点（会合体の形成）が観察された（図中、左パネル）。一方、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３＿Ｗ２３ＬとＡＧ−ＭＤＭ２とを共発現させた細胞には会合体が観察されなかった（図中、右パネル）。【０２１７】
従って、実施例１７及び１８に示す通り、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法において、本発明にかかる蛍光輝点の蛍光強度を指標として、相互作用に重要なアミノ酸を同定することができることも明らかになった。特に、本発明の方法によって、タンパク質間相互作用の界面に変異を入れた上で当該相互作用の有無を検出することにより、非常に簡便に当該相互作用に関与しているアミノ酸を特定することができる。すなわち、アラニンスキャン等のタンパク質変異導入法と本発明の方法とを組み合わせることにより、タンパク質相互作用に重要な部位（ホットスポット）を、非常に簡便に探索することができる。【０２１８】
（実施例１９）
＜タンパク質間相互作用の検出１５＞
前述の通り、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法においては、タンパク質間相互作用の発生及び消失を定量的に実時間測定することが可能であることが示された。そこで、本発明の方法を用いて、細胞内の内在性のシグナル伝達が経時的に変化する様子を、該シグナルに応答して発生するタンパク質間相互作用を通じて検出できるかどうかを試験した。【０２１９】
すなわち、本試験において検出対象としたタンパク質間相互作用は、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）とミオシン軽鎖キナーゼ２（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２）の部分配列（Ｍ１３ペプチド、Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ）との相互作用であり、該相互作用は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）がリガンドを受容した際に生じる細胞内カルシウムイオン濃度の一過的な上昇（セカンドメッセンジャー）に応答して発生することが明らかになっている（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ  ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年８月２８日、３８８巻、６６４５号、８８２〜８８７ページ  参照）。そこで、前記相互作用を通じて、細胞内カルシウムイオン濃度の経時的な変化を検出することができるかどうかを、以下に示す方法にて試験した。得られた結果を図３２に示す。【０２２０】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｈＡＧの作製においては、先ずＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ（配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡ（配列番号：３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎフォワードプライマー；５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＣ−３’  （配列番号：１０７）
Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎリバースプライマー；５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣ−３’  （配列番号：１０８）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｈＡＧを作製した。なお、ｐＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｈＡＧは、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタンパク質とＡＧタンパク質との融合タンパク質（「Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ＡＧ」とも称する）をコードする。【０２２１】
また、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１）の作製においては、先ずｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｋｉｎａｓｅ２の一部（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｋｉｎａｓｅ２タンパク質の５６６〜５９１アミノ酸からなる領域、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｍ１３ペプチドフォワードプライマー；５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣ−３’  （配列番号：１０９）
Ｍ１３ペプチドリバースプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧ−３’  （配列番号：１１０）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１）を作製した。なお、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１）は、Ｍ１３ペプチドとｐ６２（ＰＢ１）との融合タンパク質（「Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１）」とも称する）をコードする。【０２２２】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
ｐＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｈＡＧとｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１）とを等量混合し、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に導入した。そして、２００μＭ  ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、和光純薬工業社製）を添加し、経時的に蛍光画像を撮影した。なお、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅは、ＨｅＬａＳ３細胞にも発現しているＧＰＣＲの１種  Ｈ１レセプターのリガンドとして機能することが明らかになっている。【０２２３】
図３２に示した結果から明らかなように、リガンド（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）添加前は、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ＡＧは細胞内に拡散して存在していたが、リガンドを添加してから９０秒後には、蛍光輝点の発生が検出され、Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐ６２（ＰＢ１）との会合体の形成が確認された。しかし、細胞質カルシウムイオン濃度の低下に伴い、４９０秒後には蛍光輝点（会合体）は消失した。【０２２４】
従って、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法を利用することにより、Ｈ１レセプターからのシグナル伝達により、一過的に上昇するカルシウムイオン濃度の実時間測定が可能であることが明らかになった。【０２２５】
また、この実施例１９の結果から、本発明は一過的なタンパク質間相互作用も検出することができ、さらには、タンパク質間相互作用を発生させるセカンドメッセンジャー等の内在性因子、該セカンドメッセンジャー等が寄与するシグナル伝達、及び該シグナル伝達を惹起する細胞外リガンド等の外部からの刺激の検出並びにスクリーニングに適用できることも示された。【０２２６】
（実施例２０）
＜タンパク質間相互作用の検出１６＞
国際公開第２０００／０１７２２１号、国際公開第２００６／０９９４８６号に代表される従来のタンパク質間相互作用の検出方法においては、タンパク質間相互作用によって生じる複合体を構成する一方のタンパク質を強制的（人工的）に細胞内の特定の領域に拘束してしまうため、該相互作用に固有な細胞内環境下での検出ができなかった。しかし、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法は、相互作用した場合に限り自立的に蛍光輝点（会合体）を形成するため、従来の方法が有する前記問題点を解決できることが予測される。そこで、本発明によって、細胞内の任意の領域において相互作用の検出ができるかどうかを、以下に示す方法にて試験した。【０２２７】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳの作製においては、先ずＡＧＮＬＳ遺伝子をｐＮＰ−ＡＧ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）から、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＡＧＮＬＳフォワードプライマー；５’−ＡＡＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧ−３’  （配列番号：１１１）
ＡＧＮＬＳリバースプライマー；５’−ＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＡＣＴＴＣ−３’  （配列番号：１１２）
そして、得られた増幅産物をＡｇｅＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してｈＡＧ領域を切り出したｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＡＧに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳを作製した。なお、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＡＧタンパク質と核局在シグナル（ＮＬＳ）とからなる融合タンパク質（「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳ」とも称する）をコードする。また、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧのＣ末端に核局在シグナルを融合させているので、細胞の核内に局在する。【０２２８】
また、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓの作製においては、先ずＨＲａｓタンパク質をコードするＤＮＡを、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから、下記プライマーセットを用いたＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断した
ＨＲａｓフォワードプライマー；５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣ−３’  （配列番号：１１３）
ＨＲａｓリバースプライマー；５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＡＡＣ−３’  （配列番号：１１４）。【０２２９】
さらに、ＫＲａｓタンパク質由来のプレニル化配列を、下記プライマーセットを用いたＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物をＸｈｏＩとＮｏｔＩにて切断した
ＫＲａｓフォワードプライマー；５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＧ−３’  （配列番号：１１５）
ＫＲａｓリバースプライマー；５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＣＡＴ−３’  （配列番号：１１６）。【０２３０】
そして、このように調製した前記２種のＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩにて処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓ（ＷＴ）を作製した。【０２３１】
さらに、恒常活性型変異体であるＨＲａｓとｐ６２（ＰＢ１）との融合タンパク質をコードするｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓの作製は、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓ（ＷＴ）を鋳型として、ＡＭＡＰ複数部位特異的変異導入キット（ＡＭＡＰ（ＴＭ）  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）を用いて、添付の使用説明書に従って、下記プライマーにより変異を導入した
ＨＲａｓ変異プライマー；５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣ−３’  （配列番号：１１７）。【０２３２】
なお、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓは、ｐ６２（ＰＢ１）とＣ末にＫＲａｓタンパク質由来のプレニル化配列を付加したＨＲａｓ（配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡ（配列番号：４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）とを融合したタンパク質をコードする。また、この融合タンパク質は、プレニル化配列を有することにより、細胞内において翻訳後脂質修飾を受け、細胞膜に局在することになる。【０２３３】
ｐｈＡＧ−ｃＲａｆの作製においては、先ずｃＲａｆの一部（ｃＲａｆタンパク質の５１−１３１アミノ酸からなる領域、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ｃＲａｆフォワードプライマー；５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＣＣＧＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡ−３’  （配列番号：１１８）
ｃＲａｆリバースプライマー７１；５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧ−３’  （配列番号：１１９）
そして、得られた増幅産物をＫｐｎＩとＨｉｎｄIIIにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−ｃＲａｆを作製した。なお、ｐｈＡＧ−ｃＲａｆは、ＡＧタンパク質とｃＲａｆタンパク質の一部との融合タンパク質（「ＡＧ−ｃＲａｆ」とも称する）である。また、当該ｃＲａｆタンパク質の一部とはＨＲａｓタンパク質とは相互作用することは知られている（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｎ  ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年６月２８日、４１１巻、６８４１号、１０６５〜１０６８ページ  参照）。【０２３４】
さらに、ｐＳｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）の作製においては、先ずＳｍａｃの一部（Ｓｍａｃタンパク質の１〜１０アミノ酸からなる領域、配列番号：４６に記載のアミノ酸配列からなる領域）とｐ６２（ＰＢ１）との融合タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬから、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｓｍａｃフォワードプライマー；５’−ＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧ−３’  （配列番号：１２０）
ｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー２；５’−ＡＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧ−３’  （配列番号：６４）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素で処理してリンカー及びｐ６２（ＰＢ１）を切り出したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬに挿入することにより、ｐＳｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）を作製した。なお、ｐＳｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）は、Ｓｍａｃの一部とｐ６２（ＰＢ１）との融合タンパク質（「Ｓｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）」とも称する）をコードする。【０２３５】
また、ｐＸＩＡＰ−ｈＡＧの作製においては、先ずＸＩＡＰの一部（ＸＩＡＰタンパク質の２４３〜３５６アミノ酸からなる領域、配列番号：４８に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：４７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＸＩＡＰフォワードプライマー；５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＴＣ−３’  （配列番号：１２１）
ＸＩＡＰリバースプライマー；５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＧＡＡＴＧＡＧ−３’  （配列番号：１２２）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＸＩＡＰ−ｈＡＧを作製した。なお、ｐＸＩＡＰ−ｈＡＧはＸＩＡＰの一部とＡＧタンパク質との融合タンパク質（「ＸＩＡＰ−ＡＧ」とも称する）をコードする。また、前記Ｓｍａｃの一部と前記ＸＩＡＰの一部とは細胞質内において相互作用することが知られている（Ｌｉｕ  Ｚ  ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年１２月２１−２８日、４０８巻、６８１５号、１００４〜１００８ページ  参照）。【０２３６】
さらに、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）の作製においては、先ずＢｃｌＸ（Ｌ）の一部（ＢｃｌＸ（Ｌ）タンパク質の１〜２０９アミノ酸からなる領域、配列番号：５０に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：４９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＢｃｌＸ（Ｌ）フォワードプライマー；５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＣ−３’  （配列番号：１２３）
ＢｃｌＸ（Ｌ）リバースプライマー；５’−ＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＧＣＴＧ−３’  （配列番号：１２４）
そして、得られた増幅産物をＸｈｏＩとＮｏｔＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）を作製した。なお、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）は、ｐ６２（ＰＢ１）とＢｃｌＸ（Ｌ）の一部との融合タンパク質（「ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）」とも称する）をコードする。【０２３７】
また、ｐｈＡＧ−ＢＡＤの作製においては、先ずＢＡＤの一部（ＢＡＤタンパク質の１０３〜１２７アミノ酸からなる領域、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：５１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＢＡＤフォワードプライマー１；５’−ＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴＴＧＴ−３’  （配列番号：１２５）
ＢＡＤフォワードプライマー２；５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧ−３’  （配列番号：１２６） 
ＢＡＤリバースプライマー；５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＴＣＣＴＣＣＧ−３’  （配列番号：１２７）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−ＢＡＤを作製した。なお、ＡＧタンパク質とＢＡＤの一部との融合タンパク質（「ＡＧ−ＢＡＤ」とも称する）をコードする。また、前記ＢｃｌＸ（Ｌ）の一部と前記ＢＡＤの一部とは、細胞質内において相互作用することが知られている（Ｓａｔｔｌｅｒ  Ｍ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年２月１４日、２７５巻、５３０２号、９８３〜９８６ページ  参照）。【０２３８】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、ＨｅＬａＳ３細胞に各々導入した
ｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳとの組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓとｐｈＡＧ−ｃＲａｆとの組み合わせ
ｐＳｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）とｐＸＩＡＰ−ｈＡＧとの組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とｐｈＡＧ−ＢＡＤとの組み合わせ。【０２３９】
また、遺伝子導入細胞の観察も実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。但し、ｐＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳとを導入した細胞に関しては、１００ｎＭ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎを添加してから３００秒後に蛍光画像と位相差画像とを撮影した。得られた結果を図３３〜３６に示す。【０２４０】
図３３に示した結果から明らかなように、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳとＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とを細胞内に発現させた際に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳは、そのＣ末端に核局在シグナル配列を有することにより、細胞の核内において拡散した状態にて局在した（図３３  左側のパネル参照）。そして、Ｒａｐａｍｙｃｉｎを添加することにより、ＦＫＢＰ１２−ｐ６２（ＰＢ１）とｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧＮＬＳとが会合して生じる蛍光輝点は核内のみにおいて検出された（図３３  右側の２パネル参照）。【０２４１】
また、図３４に示した結果から明らかなように、Ｃ末端にプレニル化配列を有するｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓと、ＡＧ−ｃＲａｆとを細胞内に発現させた際に、プレニル化配列によって、ｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓとＡＧ−ｃＲａｆとが会合して生じる蛍光輝点は細胞膜において検出された。【０２４２】
さらに、図３５に示した結果から明らかなように、Ｓｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）とＸＩＡＰ−ＡＧとを細胞内に発現させた際に、細胞質内において生じることが知られているＳｍａｃタンパク質とＸＩＡＰタンパク質との相互作用を反映し、Ｓｍａｃ−ｐ６２（ＰＢ１）とＸＩＡＰ−ＡＧとが会合して生じる蛍光輝点も細胞質内において検出された。【０２４３】
また、図３６に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＡＧ−ＢＡＤとを細胞内に発現させた際に、細胞質内において生じることが知られているＢｃｌＸ（Ｌ）タンパク質とＢＡＤタンパク質との相互作用を反映し、ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＡＧ−ＢＡＤとが会合して生じる蛍光輝点も細胞質内において検出された。【０２４４】
（実施例２１）
＜タンパク質間相互作用の検出１７＞
実施例２０と同様に、本発明の方法を用いることにより、対象とするタンパク質に固有な細胞内環境下において、タンパク質間相互作用が検出できるかどうかについて、以下に示す方法にて試験した。【０２４５】
なお、本実施例２１においては、Ｒａｃ１タンパク質とＰＢＤ（ｐ２１結合ドメイン）とのタンパク質間相互作用を検出の対象とした。低分子量Ｇタンパク質のＲａｃ１タンパク質は、Ｔｉａｍ１、Ｔｒｉｏ、ＶＡＶ１等のグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）により、不活性型のＧＤＰ結合型から活性型のＧＴＰ結合型に変換される。そして、活性型のＲａｃ１タンパク質と、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃエフェクタータンパク（ｐ２１活性化キナーゼ１：ＰＡＫ１）のＰＢＤとは相互作用することが知られている。また、ＧＥＦの局在はその種類によって異なり、核内や細胞の辺縁（細胞膜近傍）等になる。そのため、Ｒａｃ１タンパク質は細胞内全体に存在しているが、Ｒａｃ１タンパク質の活性化、並びに活性型のＲａｃ１タンパク質とＰＢＤとの相互作用は、種類によって異なるＧＥＦの局在に応じた細胞内の領域において生じることになる（Ｂｅｎａｒｄ  Ｖ  ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、１９９９年５月７日、２７４巻、１９号、１３１９８〜１３２０４ページ  参照）。【０２４６】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１の作製において、先ずＲａｃ１タンパク質（配列番号：５４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡ（配列番号：５３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
Ｒａｃ１フォワードプライマー；５’−ＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧ−３’  （配列番号：１２８）
Ｒａｃ１リバースプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣ−３’  （配列番号：１２９）
そして、得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｈＡＧ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１を作製した。【０２４７】
また、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤの作製において、先ずＰＢＤ（ＰＡＫ１タンパク質の６７〜１５０アミノ酸からなる領域、配列番号：５６に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡ（配列番号：５５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を、ＨｅＬａＳ３細胞のｃＤＮＡライブラリーから、下記プライマーセットを用いて、ＰＣＲにて増幅した
ＰＢＤフォワードプライマー；５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣ−３’  （配列番号：１３０）
ＰＢＤリバースプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＧＣ−３’  （配列番号：１３１）
そして、得られた増幅産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素で処理したｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤを作製した。【０２４８】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、Ｕ２ＯＳ細胞に各々導入した
ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１とｐｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとの組み合わせ
ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１とｐｐ６２（ＰＢ１）−ＭＮＬｉｎｋｅｒとの組み合わせ
得られた結果を図３７〜３９に示す。【０２４９】
図３７及び３８に示した結果から明らかなように、ＡＧ−Ｒａｃ１とｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとを細胞内において発現させた際に、核内（図３７）と細胞の辺縁（図３８）にて、ＡＧ−Ｒａｃ１とｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとの会合による蛍光輝点が検出された。【０２５０】
一方、図３９に示した結果から明らかなように、ＡＧ−Ｒａｃ１と、ＰＢＤを融合していないｐ６２（ＰＢ１）とを細胞内において発現させた際には、蛍光輝点は検出されなかった。【０２５１】
以上の結果より、同一のタンパク質間相互作用を、細胞内の複数種の領域にて検出できることが示された。従って、本発明は、タンパク質間相互作用によって生じる複合体を構成するタンパク質を強制的（人工的）に細胞内の特定の領域に拘束することなく、該タンパク質の局在に応じた固有な細胞内環境下にて、当該タンパク質間相互作用を検出できることが明らかになった。【０２５２】
また、当該タンパク質間相互作用の検出を通じて、活性型（ＧＴＰ結合型）のＲａｃ１タンパク質を本発明において検出できることも示された。さらに、当該活性型のＧＴＰ結合型への変換の検出を通じて、細胞内在性の酵素であるＧＥＦの局在並びに活性も検出できることが実証され、本発明の方法は、タンパク質間相互作用を通じて、内在性因子の活性も検出できることが明らかになった。【０２５３】
（実施例２２）
＜タンパク質間相互作用の検出１８＞
実施例２１に記載の通り、活性型のＲａｃ１タンパク質は、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃエフェクタータンパク（ｐ２１活性化キナーゼ１：ＰＡＫ１）のＰＢＤと相互作用することが明らかになっている。【０２５４】
また、Ｒａｃ１タンパク質は、そのＣ末端がゲラニルゲラニル基修飾（プレニル化）されることによって、その局在が変化することも知られている。さらに、Ｒａｃ１タンパク質は、そのゲラニルゲラニル基を介してＲｈｏＧＤＩと相互作用することも知られている。【０２５５】
そこで、これらのタンパク質間相互作用の局在の変化を本発明の方法によって検出できることを以下に示す方法にて確認した。【０２５６】
先ず、ｐＲｈｏＧＤＩ−ｐ６２（ＰＢ１）は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿００４３００で特定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に基づき、実施例２に記載の方法と同様の方法にて作製した。また、ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１及びｐｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤについては実施例２１に記載の通りである。【０２５７】
そして、下記プラスミドＤＮＡの組み合わせにて等量混合したものを、実施例２と同様の方法により、細胞に導入した。
ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１とｐｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとの組み合わせ
ｐｈＡＧ−Ｒａｃ１とｐＲｈｏＧＤＩ−ｐ６２（ＰＢ１）との組み合わせ。【０２５８】
そして、遺伝子導入後６時間培養した後、ゲラニルゲラニル基修飾に対する阻害剤であるメバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を最終濃度１０μＭとなるように添加し、更に１５時間培養し、観察した。ＡＧ−Ｒａｃ１とｐ６２（ＰＢ１）−ＰＢＤとを共発現させた細胞についての結果を図４０に示し、ＡＧ−Ｒａｃ１とＲｈｏＧＤＩ−ｐ６２（ＰＢ１）とを共発現させた細胞についての結果を図４１に示す。なお、図４０及び４１においては、同一細胞について、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、通常の落射型蛍光倒立顕微鏡を用いて撮影したもの（Ａ）と、実施例１７に記載の方法と同様の方法にて、アーク光源全反射蛍光顕微鏡システムを用いて撮影したもの（Ｂ）とを併せて示す。【０２５９】
図４０の上部２パネルに示した結果から明らかなように、通常の状態では、核内でも核外でもＲａｃ１とＰＢＤとがタンパク質間相互作用していること、すなわちＲａｃ１が活性化状態で存在していることが、本発明の方法によって確認された。【０２６０】
ゲラニルゲラニル基修飾をメバスタチン等の薬剤により阻害するとＲａｃ１は核内に局在することが知られている。この知見に関し、図４０の下部２パネルに示した結果から明らかなように、メバスタチン処理により、Ｒａｃ１とＰＢＤとの相互作用が核内のみにて生じるように変化することも、本発明の方法によって確認された。さらに、当該相互作用の検出を通して、ゲラニルゲラニル基修飾が無い状態であっても、Ｒａｃ１は活性化状態で存在していることも、本発明の方法によって確認された。【０２６１】
また、Ｒａｃ１とＲｈｏＧＤＩとの相互作用に関し、図４１の上部２パネルに示した結果から明らかなように、通常の状態では、核外にてＲａｃ１とＲｈｏＧＤＩとがタンパク質間相互作用していることが、本発明の方法によって確認された。【０２６２】
一方、図４１の下部２パネルに示した結果から明らかなように、メバスタチン処理により、前述の通り、Ｒａｃ１の局在は核内のみとなり、さらには当該Ｒａｃ１はゲラニルゲラニル基修飾は抑制されているため、Ｒａｃ１とＲｈｏＧＤＩとの相互作用が減少することも、本発明の方法によって確認された。【０２６３】
従って、本発明によって、細胞内の複数種の領域において生じるタンパク質間相互作用が、外部からの刺激によって変化する様子を検出することができることが確認された。さらには、タンパク質間相互作用に影響を与えるタンパク質の修飾（例えば、Ｒａｃ１とＲｈｏＧＤＩとの相互作用における、Ｒａｃ１のゲラニルゲラニル基修飾）の有無も検出することができることが確認された。【０２６４】
（実施例２３）
ＫＲａｓとｃＲａｆとの相互作用は、細胞増殖、分化等において重要なシグナル伝達の１つである。また、このタンパク質間相互作用は、上皮成長因子（ＥＧＦ)によって活性化されたＥＧＦ受容体から、Ｇｒｂ２−ＳＯＳを介してシグナルが流れ、その結果、ＫＲａｓが活性化されることにより生じることが明らかになっている。さらに、このタンパク質間相互作用により、ｃＲａｆの局在が細胞質から細胞膜に変化することも知られている。【０２６５】
このように、ＫＲａｓとｃＲａｆとの相互作用は、ＥＧＦ依存的なものであるため、ＥＧＦ非存在下においては生じない。しかし、ＫＲａｓの変異体において、ＥＧＦ非存在下でもｃＲａｆと相互作用することのできる恒常活性化型の変異体（例えば、ＫＲａｓＧ１２Ｄ）も存在しており、さらには、かかる変異体は種々の癌にて検出されている。従って、有効な癌治療法の開発等において、ＫＲａｓ又はその変異体とｃＲａｆとの会合体形成や該会合体の局在等といった、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を検出することは重要である。【０２６６】
そこで、本発明によって、疾患関連変異を有するタンパク質と、その野生型タンパク質とのタンパク質間相互作用における差異を検出できるかどうかを、以下に示す方法にて試験した。【０２６７】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（ＷＴ）は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿００４９７６で特定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に基づき、実施例２に記載の方法と同様の方法にて作製した。【０２６８】
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（Ｇ１２Ｄ）は、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（ＷＴ）に、配列番号：１６０に記載のＤＮＡ配列（５‘−ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧ−３’）
からなるプライマーを用いて実施例１７に記載の方法と同様の方法にて変異を導入した。ｐｈＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）は、配列番号：１６２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１６１）に基づき、実施例２に記載の方法と同様の方法で作製した。なお、ｃＲａｆについては、Ｈａｒｖｅｙ  ＣＤ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２００８年７月４日３２１巻、５８８５号、１３６−１４０ページに記載の方法を参照にして、当該タンパク質の変異体（ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ））を本実施例において用いた。【０２６９】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
前記プラスミドＤＮＡを下記組み合わせにて等量混合し、実施例２に記載の方法と同様の方法にて、Ｃｏｓ−７細胞に導入した。
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（ＷＴ）とｐｈＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）との組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（Ｇ１２Ｄ）とｐｈＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）との組み合わせ。【０２７０】
細胞の観察は、細胞膜付近のみ励起することのできる、アーク光源全反射蛍光顕微鏡システム（オリンパス社製、ＩＸ７１−ＡＲＣＥＶＡ）を用いて行った。また、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（ＷＴ）とｐｈＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）との組み合わせについては、ＥＧＦ無添加時の画像取得後、ＥＧＦ（ＳＩＧＭＡ社製）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで添加し、３７℃で３０分間静置後に再び観察を行った。得られた結果を図４２に示す。【０２７１】
図４２に示した結果から明らかなように、ｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（ＷＴ）とＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）とを共発現させた細胞において、外部からの刺激が無い状態（ＥＧＦ非添加）では、蛍光輝点（会合体の形成）が観察されなかった。しかし、ＥＧＦ添加に伴って細胞膜における会合体の形成が認められた。一方、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＫＲａｓ（Ｇ１２Ｄ）とｐｈＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）との組み合わせでは、外部からの刺激が無い状態であっても細胞膜で会合体の形成が認められた。【０２７２】
従って、本発明によれば、疾患に関連する変異によって生じるタンパク質間相互作用の差異（外部刺激依存性等）を明確に捉えることができるので、疾患に関連するタンパク質等の細胞内動態、機能の解析において、本発明の方法は有効である。【０２７３】
（実施例２４）
＜タンパク質間相互作用の検出２０＞
実施例１９においても示した通り、本発明によりタンパク質間相互作用の経時的変化を検出できることを以下に示す方法にて確認した。【０２７４】
なお、実施例２４において、対象としたタンパク質間相互作用は、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋとの相互作用、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｘとの相互作用である。Ｂａｋ及びＢａｘは共にＢＨ３ドメインを介して、ＢｃｌＸ（Ｌ）と相互作用することが明らかになっているが、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋ  ＢＨ３ドメインとの解離定数は３４０ｎＭであり、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｘ  ＢＨ３ドメインとの解離定数は１３μＭである（Ｓａｔｔｌｅｒ  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、１９９７年２月１４日、２７５巻５３０２号、９８３〜９８６ページ参照）ことが明らかになっている。また、これらタンパク質間相互作用は、ＡＢＴ−７３７（ＢＨ３模倣薬）によって競合的に阻害されることも知られている。【０２７５】
（プラスミドＤＮＡの調製）
ｐＢａｋ−ｈＡＧは、配列番号：１６４に記載のアミノ酸配列からなる領域をコードするＤＮＡ（配列番号：１６３）を用いて、実施例２に記載の方法と同様の方法にて作製した。ｐｈＡＧ−Ｂａｘは、配列番号：１６６に記載のアミノ酸配列からなる領域をコードするＤＮＡ（配列番号：１６５）を用いて、実施例２に記載の方法と同様の方法にて作製した。また、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）については、実施例２０に記載の通りである。【０２７６】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
下記組み合わせにてプラスミドＤＮＡを等量混合したものを、実施例２に記載の方法と同様の方法にて、２９３細胞に遺伝子導入した。
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とｐＢａｋ−ｈＡＧとの組み合わせ
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とｐｈＡＧ−Ｂａｘとの組み合わせ。【０２７７】
そして、これらプラスミドＤＮＡを導入した２９３細胞に、ＡＢＴ−７３７（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を最終濃度１５μＭになるよう添加し、実施例２に記載の方法と同様の方法にて、ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋ−ＡＧとを共発現させた細胞については３０分おきに、ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＡＧ−Ｂａｘとを共発現させた細胞については、画像を５分おきに取得した。得られた画像に基づき、実施例１１に記載の方法と同様の方法にて解析し、時間に対して蛍光輝点（会合体）の総蛍光強度をプロットしたグラフを作製した。なお、グラフのｘ軸は薬剤添加時を０とした時間（分）を表し、ｙ軸は蛍光輝点（会合体）の総蛍光強度を表している。ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋ−ＡＧとを共発現させた細胞についての結果を図４３に、ｐ６２（ＰＢ１）−ＢｃｌＸ（Ｌ）とＡＧ−Ｂａｘとを共発現させた細胞についての結果を図４４に示す。【０２７８】
図４３及び４４に示した結果から明らかなように、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｋとの相互作用、ＢｃｌＸ（Ｌ）とＢａｘとの相互作用、共にこれらタンパク質間相互作用依存的に形成された会合体の総蛍光輝度は、ＡＢＴ−７３７の添加により経時的に減少していった。従って、本発明によれば、蛍光輝点を検出することによって、タンパク質間相互作用の消失するまでの時間を検出できることが実証された。【０２７９】
また、総蛍光輝度が半値を示した時間は、ＢｃｌＸ（Ｌ）及びＢａｋに関してはおよそ８０分であり、ＢｃｌＸ（Ｌ）及びＢａｘに関してはおよそ３５分であった。このように、解離定数が小さいＢｃｌＸ（Ｌ）及びＢａｋ（解離定数：３４０ｎＭ）の方が、ＢｃｌＸ（Ｌ）及びＢａｘ（解離定数：１３μＭ）よりも会合体の減少が遅かったため、前述の通り、本発明によってタンパク質間相互作用の強弱を評価できることが確認された。【０２８０】
（実施例２５）
＜タンパク質間相互作用の検出２１＞
実施例２４においても示した通り、本発明によりタンパク質間相互作用の発生の経時的変化を検出できることを以下に示す方法にて確認した。【０２８１】
先ず、実施例１３に記載の、ｐ６２（ＰＢ１）−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３５ｍｍガラスベースディッシュ（旭硝子社製）に播種した。そして、その翌日、Ｎｕｔｌｉｎ−３（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を最終濃度１０μＭで添加し、実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察し、当該添加の２分前から１５秒おきに画像を取得した。取得した画像は、実施例１１に記載の方法と同様の方法を用いて会合体の総蛍光輝度を解析し、時間に対してプロットしたグラフを作製した。得られた結果を図４５に示す。【０２８２】
図４５に示した結果から明らかなように、Ｎｕｔｌｉｎ−３（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）添加とともに速やかに会合体の総蛍光輝度が減少し、その半値を示した時間はおよそ３分であった。従って、本発明によって、蛍光輝点を検出することによって、タンパク質間相互作用の消失するまでの時間及びその過程を検出できることが確認された。【０２８３】
（実施例２６）
＜タンパク質間相互作用の検出２２＞
上記同様に、本発明によりタンパク質間相互作用の発生の経時的変化を検出できることを以下に示す方法にて確認した。【０２８４】
先ず、実施例１１に記載の、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＡＧ及びｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２を安定的に発現しているＨｅＬａＳ３細胞に、ｒａｐａｍｙｃｉｎを最終濃度２０ｎＭになるよう添加し、実施例１１に記載の方法と同様の方法にて解析した。得られた結果を図４６に示す。【０２８５】
図４６に示した結果から明らかなように、ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後、経過時間と共に会合体の形成が誘導され、その半値を示す時間はおよそ３分であった。従って、本発明によれば、蛍光輝点を検出することによって、タンパク質間相互作用が発生する時間、及びその過程を検出できることが確認された。【０２８６】
（実施例２７）
＜タンパク質間相互作用の検出２３＞
ＥＧＦ刺激により細胞内のＥＲＫが活性化されると、ＥＲＫ基質（ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）がリン酸化され、その結果、ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅとＰｉｎ１タンパク質のｗｗドメイン（Ｐｉｎ１（ｗｗ））とが相互作用することが明らかになっている。さらに、ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６を添加すると、ＥＲＫの活性が低下し、結果的にＥＲＫ基質が脱リン酸化を受け、ＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）との相互作用が解消されることも知られている。【０２８７】
本実施例においては、ＥＲＫの活性化を介し、ＥＧＦによって間接的に誘導されるＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）との相互作用を本発明によって検出できること、また、ＥＲＫの不活性化を介し、Ｕ０１２６によって間接的に抑制されるＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）との相互作用を本発明によって検出できること、さらに、ＥＧＦ刺激依存的なシグナル伝達を本発明によって経時的に検出できることを、以下に示す方法にて確認した。【０２８８】
（プラスミドＤＮＡの調製）
本実施例において、ＥＧＦ刺激依存的なＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）との相互作用を検出するため、該相互作用をＦＲＥＴを利用して検出する系（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄ．Ｈａｒｖｅｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００８年１２月９日、１０５巻、４９号、１９２６４〜１９２６９ページ  参照）を参考にし、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｐ２Ａ−ｈＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳを、配列番号：１６８に記載のアミノ酸配列からなる領域をコードし、化学的に合成されたＤＮＡ（配列番号：１６７）を用いて、実施例２に記載の方法と同様の方法にて作製した。【０２８９】
なお、配列番号：１６８に記載のアミノ酸配列において、１〜１０２位のアミノ酸配列はｐ６２（ＰＢ１）のアミノ酸配列を示す。１０３〜１２８位のアミノ酸配列をリンカー配列を示す。１２９〜１３８位のアミノ酸配列は、ＥＲＫ基質であるヒトＣｄｃ２５Ｃの４３〜５２位のアミノ酸配列を示し、１３９〜１４２位のアミノ酸配列はＥＲＫドッキング部位のアミノ酸配列を示す。１４６〜１６４位のアミノ酸配列はＰ２Ａペプチドのアミノ酸配列を示す。１６５〜３９０位のアミノ酸配列はＡＧのアミノ酸配列を示す。３９１〜４１６位のアミノ酸配列はリンカー配列を示す。４１７〜４７０位のアミノ酸配列はＰｉｎ１（ｗｗ）のアミノ酸配列を示す。４７１〜４８２位のアミノ酸配列はＭＥＫの核排出シグナル（ＮＥＳ）のアミノ酸配列を示す。【０２９０】
また、ｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅとＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳとの間に挿入したＰ２Ａペプチドは、豚テッショウウィルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）由来のＣＨＹＳＥＬ（シス作用性加水分解酵素因子：ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列であり、タンパク質翻訳時にリボソームスキッピングが起こり、当該アミノ酸配列（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）中の最後のプロリンの手前で分裂が起きることが知られている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、２００１年５月８２巻５号１０１３〜１０２５ページ参照）。従って、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｐ２Ａ−ｈＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳを細胞に導入した場合には、結果的にｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅのＣ末端にＰ２Ａペプチドの一部が融合したものと、ＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳのＮ末端にＰ２Ａペプチドの一部が融合したものとが分裂して当該細胞内にて発現することになる。【０２９１】
（培養細胞への遺伝子導入、並びに遺伝子導入細胞の観察）
ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｐ２Ａ−ｈＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて２９３細胞にトランスフェクションした。その翌日、ＥＧＦ（ＳＩＧＭＡ社製）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるよう細胞に添加し、さらにその１４分後、Ｕ０１２６を最終濃度１０μＭになるよう細胞に添加した。また、細胞の観察は、ＥＧＦ添加２分前から開始し、観察画像を１５秒おきに取得した。取得した画像は実施例１１に記載の方法と同様の方法にて蛍光輝点（会合体）の総蛍光輝度を解析し、時間に対してプロットしたグラフを作製した。得られた結果を図４７に示す。【０２９２】
図４７に示した結果から明らかなように、ＥＧＦを添加した後、ｐ６２（ＰＢ１）−ＥＲＫ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅと、ＡＧ−Ｐｉｎ１（ｗｗ）−ＮＥＳとが発現している細胞において、蛍光輝点（会合体）が時間とともに顕著に観察されるようになった。しかし、Ｕ０１２６を添加してからは、当該添加による内在性ＥＲＫの不活性化に応じて生じた、ＥＲＫ基質の脱リン酸化の促進を反映し、緩やかに蛍光輝点が減少していった。【０２９３】
ＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）と相互作用に示す蛍光輝点（会合体）の総蛍光輝度の経時的な変化は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄ．Ｈａｒｖｅｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００８年１２月９日、１０５巻、４９号、１９２６４〜１９２６９ページに記載のＥＲＫ基質とＰｉｎ１（ｗｗ）との相互作用をＦＲＥＴを用いて測定した結果と同程度なものであった。【０２９４】
このように、本発明によれば、蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激によって間接的に誘導又は阻害されるタンパク質間相互作用を検出することができる。また、本発明によれば、シグナル伝達を経時的に検出することもできる。【０２９５】
（実施例２８）
＜タンパク質間相互作用の検出２４＞
上記同様に、本発明によりタンパク質間相互作用の発生の経時的変化を検出できることを、実施例２０に記載のＨＲａｓとｃＲａｆとの相互作用を通して確認した。【０２９６】
すなわち、実施例２０に記載のｐｐ６２（ＰＢ１）−ＨＲａｓ（ＷＴ）と、実施例２３に記載のｐｈＡＧ−ｃＲａｆ（Ｒ５９Ａ）とを、実施例２３に記載の方法と同様の方法にて、細胞に導入し、ＥＧＦ（ＳＩＧＭＡ社製）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるよう添加し、細胞膜付近のみの蛍光シグナルを検出可能な測定装置を使用して観察した。なお、観察は、ＥＧＦ添加の５分前から開始し、添加後３０分まで５分間隔で行い、更に３０分後に行い、得られた画像データに基づき、実施例１１に記載の方法と同様の方法にて解析し、時間に対して蛍光輝点（会合体）の総蛍光強度をプロットしたグラフを作製した。なお、グラフのｘ軸はＥＧＦ添加時を０とした時間（分）を表し、ｙ軸は蛍光輝点（会合体）の総蛍光強度を表している。得られた結果を図４８に示す。【０２９７】
図４８に示した結果から明らかなように、ＥＧＦ添加によって生じるＨＲａｓとｃＲａｆとの相互作用を経時的に検出することができた。【０２９８】
また、前述の通り、ＥＧＦを細胞に添加した場合、該細胞のＥＧＦ受容体から、Ｇｒｂ２−ＳＯＳ複合体を介してシグナルが流れ、その結果ＨＲａｓが活性化され、ｃＲａｆと相互作用することが知られている。従って、図４８に示した結果から、本発明によって、細胞に与えられる外部からの刺激（ＥＧＦ等）に対して細胞内シグナル伝達系路（Ｇｒｂ２−ＳＯＳ複合体を介するシグナル伝達経路等）が活性化する過程を経時的に追跡できることを確認できた。【０２９９】
（実施例２９）
＜タンパク質間相互作用の検出２５＞
前述の通り、ＲａｐａｍｙｃｉｎはＦＫＢＰ１２タンパク質に結合し、さらにこの複合体とｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ））とが結合することが明らかになっている。ｍＴＯＲタンパク質は、タンパク質合成や細胞増殖に関わるシグナル伝達を活性化する機能を有するセリン／スレオニンキナーゼであるが、かかるＦＫＢＰ１２タンパク質とＲａｐａｍｙｃｉｎとの複合体形成により、その機能は阻害されることも明らかになっている。【０３００】
さらに、ＦＫＢＰ１２タンパク質については、触媒サブユニットＡ（カルシニューリンＡ）及び調節サブユニットＢ（カルシニューリンＢ）からなるプロテインホスファターゼ（カルシニューリン）とＦＫ５０６を介して相互作用することが知られている。カルシニューリンは、Ｔ細胞等のシグナル伝達において非常に重要な機能を担っている酵素であるが、かかるＦＫＢＰ１２タンパク質とＦＫ５０６との複合体形成により、その機能は阻害されることも明らかになっている。【０３０１】
そこで、本実施例においては、ＦＫＢＰ１２と、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ）と、カルシニューリンＡ及びカルシニューリンＢとを、同一の細胞内に共発現させ、当該細胞内における、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ依存的に形成されるＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ）との複合体、並びにＦＫ５０６依存的に形成されるＦＫＢＰ１２とカルシニューリンＡ及びカルシニューリンＢとの複合体を、ひいてはこれら複合体が関与するシグナル伝達の阻害を、本発明によって検出、判別することができるかどうかを、以下に示す方法にて試験した。【０３０２】
なお、細胞に発現させる「カルシニューリンＡ及びカルシニューリンＢ」としては、カルシニューリンＡの一部とカルシニューリンＢの一部とが融合してなるｍＣＡＢタンパク質を用いた（Ｃｌｅｍｏｎｓ  ＰＡら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．、２００２年１月、９巻、１号、４９〜６１ページ  参照）。【０３０３】
先ず、ｐｈＡＧ−ｍＣＡＢ、ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２及びｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ｈＫＯ１をＨｅＬａＳ３細胞に導入した。ｐｈＡＧ−ｍＣＡＢは、配列番号；１７０に記載のアミノ酸配列からなる領域をコードし、人工的に合成したＤＮＡ（配列番号：１６９）を用いて、実施例２に記載の方法と同様の方法にて作製した。ｐｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２については実施例２に記載の通りである。ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ｈＫＯ１（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈＫＯ１）については実施例６に記載の通りである。【０３０４】
また、ＨｅＬａＳ３細胞は、実施例１に記載の方法と同様の方法にて培養した。さらに、遺伝子導入においては、８ウェルチャンバー（ｎｕｎｃ社製）の２ウェルにＨｅＬａＳ３細胞を播種し、その翌日に、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、前記プラスミドＤＮＡ各々１３０ｎｇをトランスフェクション試薬１μｌを用いて、ＨｅＬａＳ３細胞に導入した。【０３０５】
そして、その２４時間後、遺伝子導入した細胞を実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察し、これにＲａｍａｍｙｃｉｎ又はＦＫ５０６を最終濃度５００ｎＭになるよう添加し、さらに１５分後観察を行った。得られた結果を図４９に示す。【０３０６】
図４９に示した結果から明らかなように、ＡＧ−ｍＣＡＢ、ｐ６２（ＰＢ１）−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ）−ＫＯ１を発現させた細胞にＲａｐａｍｙｃｉｎを添加することでｍＴＯＲ（ＦＲＢ）とＦＫＢＰ１２との相互作用がＫＯ１由来の蛍光シグナルを発する蛍光輝点として観察された。一方、ＦＫ５０６を添加することでｍＣＡＢとＦＫＢＰ１２との相互作用がＡＧ由来の蛍光シグナルを発する蛍光輝点として観察された。【０３０７】
従って、本発明によって、同一細胞において多種類のタンパク質間相互作用、特に、同一細胞において異なる刺激に依存する多種のタンパク質間相互作用を検出できることが確認された。【０３０８】
また、このように同一細胞においてシグナル伝達に関わる多種のタンパク質間相互作用を検出することによって、同一細胞において多種類のシグナル伝達を検出、判別する方法を、本発明は提供することができる。【０３０９】
さらに、本実施例においても示した通り、生細胞内でタンパク質間相互作用の検出を行う他の方法であるＦＲＥＴとは異なり、アクセプター及びドナーの条件に合致した蛍光タンパク質を選択する必要もなく、アクセプター蛍光タンパク質を励起してしまうｃｒｏｓｓ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ及びアクセプター蛍光タンパク質の蛍光を検出するフィルター（吸収フィルター）セットにドナー蛍光タンパク質の蛍光が漏れ込むｂｌｅｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈを考慮する必要がない。従って、本発明においては、波長特性の異なる多種の蛍光タンパク質を容易に選択し、組み合わせて利用することができる。【０３１０】
（実施例３０）
＜タンパク質間相互作用の検出２６＞
実施例２に記載の方法にて、表３に記載の公知のタンパク質間相互作用を、会合誘導タンパク質としてｐ６２（ＰＢ１）、多量化能を有する蛍光タンパク質としてＡＧタンパク質を用いた本発明の方法にて検出できるかどうかを試験した。【０３１１】
【表３】
2013084950.tif 000004
【０３１２】
その結果、図には示さないが、いずれの組み合わせにおいてもタンパク質間相互作用を蛍光輝点として検出できることが実証され、本発明が汎用的なタンパク質間相互作用の検出方法であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０３１３】
以上説明したように、本発明によれば、タンパク質間相互作用をその固有な細胞内環境下において検出することができ、またタンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を検出することができる。また、本発明においては、タンパク質間相互作用の強弱と蛍光輝点の蛍光強度とが相関しているので、前記蛍光強度を指標として、タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定や、タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニングにもこの方法を利用できる。【０３１４】
したがって、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法等、並びにこれらの方法に用いられるためのキットは、生体内における様々なシグナル伝達や、様々な生体反応の制御等の解明、ひいては疾患メカニズムの解明を通した医薬品等の開発において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０３１５】
配列番号１及び２
＜２２３＞  コドンをヒト化したＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）
配列番号３及び４
＜２２３＞  ｐ６２のＰＢ１ドメイン
配列番号５及び６
＜２２３＞  ＭＥＫ５のＰＢ１ドメイン
配列番号７及び８
＜２２３＞  Ｎｂｒ１のＰＢ１ドメイン
配列番号９及び１０
＜２２３＞  ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン
配列番号１１及び１２
＜２２３＞  ＴＦＧのＰＢ１ドメイン
配列番号１３及び１４
＜２２３＞  ＴＥＬのＳＡＭドメイン
配列番号１５及び１６
＜２２３＞  ＥｐｈＢ２のＳＡＭドメイン
配列番号１７及び１８
＜２２３＞  ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン
配列番号１９及び２０
＜２２３＞  Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメイン
配列番号２１及び２２
＜２２３＞  ｍＴＯＲのＦＲＢドメイン
配列番号２３及び２４
＜２２３＞  ＦＫＢＰ１２
配列番号２５及び２６
＜２２３＞  ｐ５３
配列番号２７及び２８
＜２２３＞  ＭＤＭ２
配列番号２９及び３０
＜２２３＞  Ｓｅｃ５
配列番号３１及び３２
＜２２３＞  ＲａｌＢ
配列番号３３及び３４
＜２２３＞  ＲａｌＢタンパク質Ｑ７２Ｌ変異体
配列番号３５及び３６
＜２２３＞  ＲａｌＢタンパク質Ｓ２８Ｎ変異体
配列番号３７及び３８
＜２２３＞  カルモジュリン
配列番号３９及び４０
＜２２３＞  Ｍ１３ペプチド
配列番号４１及び４２
＜２２３＞  ＨＲａｓ
配列番号４３及び４４
＜２２３＞  ｃＲａｆ
配列番号４５及び４６
＜２２３＞  Ｓｍａｃ
配列番号４７及び４８
＜２２３＞  ＸＩＡＰ
配列番号４９及び５０
＜２２３＞  ＢｃｌＸ（Ｌ）
配列番号５１及び５２
＜２２３＞  ＢＡＤ
配列番号５３及び５４
＜２２３＞  Ｒａｃ１
配列番号５５及び５６
＜２２３＞  ＰＢＤ
配列番号５７
＜２２３＞  人工的に合成されたｈＡＧフォワードプライマー１の配列
配列番号５８
＜２２３＞  人工的に合成されたｈＡＧリバースプライマー１の配列
配列番号５９
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ６２（ＰＢ１）フォワードプライマー１の配列
配列番号６０
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー１の配列
配列番号６１
＜２２３＞  人工的に合成されたｈＡＧフォワードプライマー２の配列
配列番号６２
＜２２３＞  人工的に合成されたｈＡＧリバースプライマー２の配列
配列番号６３
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ６２（ＰＢ１）フォワードプライマー２の配列
配列番号６４
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー２の配列
配列番号６５
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ６２（ＰＢ１）フォワードプライマー３の配列
配列番号６６
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ６２（ＰＢ１）リバースプライマー３の配列
配列番号６７
＜２２３＞  人工的に合成されたｍＴＯＲ（ＦＲＢ）フォワードプライマーの配列
配列番号６８
＜２２３＞  人工的に合成されたｍＴＯＲ（ＦＲＢ）リバースプライマーの配列
配列番号６９
＜２２３＞  人工的に合成されたＦＫＢＰ１２フォワードプライマーの配列
配列番号７０
＜２２３＞  人工的に合成されたＦＫＢＰ１２リバースプライマーの配列
配列番号７１
＜２２３＞  人工的に合成されたＭＥＫ（ＰＢ１）フォワードプライマーの配列
配列番号７２
＜２２３＞  人工的に合成されたＭＥＫ（ＰＢ１）リバースプライマーの配列
配列番号７３
＜２２３＞  人工的に合成されたＮｂｒ１（ＰＢ１）フォワードプライマーの配列
配列番号７４
＜２２３＞  人工的に合成されたＮｂｒ１（ＰＢ１）リバースプライマーの配列
配列番号７５
＜２２３＞  人工的に合成されたＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）フォワードプライマーの配列
配列番号７６
＜２２３＞  人工的に合成されたＰＫＣｉｏｔａ（ＰＢ１）リバースプライマーの配列
配列番号７７
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＦＧ（ＰＢ１）フォワードプライマーの配列
配列番号７８
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＦＧ（ＰＢ１）リバースプライマーの配列
配列番号７９
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＥＬ（ＳＡＭ）フォワードプライマーの配列
配列番号８０
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＥＬ（ＳＡＭ）リバースプライマーの配列
配列番号８１
＜２２３＞  人工的に合成されたＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）フォワードプライマーの配列
配列番号８２
＜２２３＞  人工的に合成されたＥｐｈＢ２（ＳＡＭ）リバースプライマーの配列
配列番号８３
＜２２３＞  人工的に合成されたＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）フォワードプライマーの配列
配列番号８４
＜２２３＞  人工的に合成されたＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）リバースプライマーの配列
配列番号８５
＜２２３＞  人工的に合成されたＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）フォワードプライマーの配列
配列番号８６
＜２２３＞  人工的に合成されたＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）リバースプライマーの配列
配列番号８７
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＦＧ（ＰＢ１）フォワードプライマー２の配列
配列番号８８
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＦＧ（ＰＢ１）リバースプライマー２の配列
配列番号８９
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＥＬ（ＳＡＭ）フォワードプライマー２の配列
配列番号９０
＜２２３＞  人工的に合成されたＴＥＬ（ＳＡＭ）リバースプライマー２の配列
配列番号９１
＜２２３＞  人工的に合成されたＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）フォワードプライマー２の配列
配列番号９２
＜２２３＞  人工的に合成されたＤＧＫｄｅｌｔａ（ＳＡＭ）リバースプライマー２の配列
配列番号９３
＜２２３＞  人工的に合成されたＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）フォワードプライマー２の配列
配列番号９４
＜２２３＞  人工的に合成されたＴａｎｋｙｒａｓｅ（ＳＡＭ）リバースプライマー２の配列
配列番号９５
＜２２３＞  人工的に合成されたｈＫＯ１フォワードプライマーの配列
配列番号９６
＜２２３＞  人工的に合成されたｈＫＯ１リバースプライマーの配列
配列番号９７
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ５３フォワードプライマーの配列
配列番号９８
＜２２３＞  人工的に合成されたｐ５３リバースプライマーの配列
配列番号９９
＜２２３＞  人工的に合成されたＭＤＭ２フォワードプライマーの配列
配列番号１００
＜２２３＞  人工的に合成されたＭＤＭ２リバースプライマーの配列
配列番号１０１
＜２２３＞  人工的に合成されたＳｅｃ５フォワードプライマーの配列
配列番号１０２
＜２２３＞  人工的に合成されたＳｅｃ５リバースプライマーの配列
配列番号１０３
＜２２３＞  人工的に合成されたＲａｌＢフォワードプライマーの配列
配列番号１０４
＜２２３＞  人工的に合成されたＲａｌＢリバースプライマーの配列
配列番号１０５
＜２２３＞  人工的に合成されたＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ）変異プライマーの配列
配列番号１０６
＜２２３＞  人工的に合成されたＲａｌＢ（Ｓ２８Ｎ）変異プライマーの配列
配列番号１０７
＜２２３＞  人工的に合成されたカルモジュリンフォワードプライマーの配列
配列番号１０８
＜２２３＞  人工的に合成されたカルモジュリンリバースプライマーの配列
配列番号１０９
＜２２３＞  人工的に合成されたＭ１３ペプチドフォワードプライマーの配列
配列番号１１０
＜２２３＞  人工的に合成されたＭ１３ペプチドリバースプライマーの配列
配列番号１１１
＜２２３＞  人工的に合成されたＡＧＮＬＳフォワードプライマーの配列
配列番号１１２
＜２２３＞  人工的に合成されたＡＧＮＬＳリバースプライマーの配列
配列番号１１３
＜２２３＞  人工的に合成されたＨＲａｓフォワードプライマーの配列
配列番号１１４
＜２２３＞  人工的に合成されたＨＲａｓリバースプライマーの配列
配列番号１１５
＜２２３＞  人工的に合成されたＫＲａｓフォワードプライマーの配列
配列番号１１６
＜２２３＞  人工的に合成されたＫＲａｓリバースプライマーの配列
配列番号１１７
＜２２３＞  人工的に合成されたＨＲａｓ変異プライマーの配列
配列番号１１８
＜２２３＞  人工的に合成されたｃＲａｆフォワードプライマーの配列
配列番号１１９
＜２２３＞  人工的に合成されたｃＲａｆリバースプライマーの配列
配列番号１２０
＜２２３＞  人工的に合成されたＳｍａｃフォワードプライマーの配列
配列番号１２１
＜２２３＞  人工的に合成されたＸＩＡＰフォワードプライマーの配列
配列番号１２２
＜２２３＞  人工的に合成されたＸＩＡＰリバースプライマーの配列
配列番号１２３
＜２２３＞  人工的に合成されたＢｃｌＸ（Ｌ）フォワードプライマーの配列
配列番号１２４
＜２２３＞  人工的に合成されたＢｃｌＸ（Ｌ）リバースプライマーの配列
配列番号１２５
＜２２３＞  人工的に合成されたＢＡＤフォワードプライマー１の配列
配列番号１２６
＜２２３＞  人工的に合成されたＢＡＤフォワードプライマー２の配列
配列番号１２７
＜２２３＞  人工的に合成されたＢＡＤリバースプライマーの配列
配列番号１２８
＜２２３＞  人工的に合成されたＲａｃ１フォワードプライマーの配列
配列番号１２９
＜２２３＞  人工的に合成されたＲａｃ１リバースプライマーの配列
配列番号１３０
＜２２３＞  人工的に合成されたＰＢＤフォワードプライマーの配列
配列番号１３１
＜２２３＞  人工的に合成されたＰＢＤリバースプライマーの配列
配列番号１３２
＜２２３＞  ＫＯ（クサビラオレンジ）単量体型の塩基配列
配列番号１３３
＜２２３＞  ＫＯ（クサビラオレンジ）単量体型のアミノ酸配列
配列番号１３４及び１３５
＜２２３＞  コドンをヒト化したｍＡＧ１
配列番号１３６及び１３７
＜２２３＞  ｍＭｉＣｙ１
配列番号１３８及び１３９
＜２２３＞  ｍＫｉｋＧＲ１
配列番号１４０及び１４１
＜２２３＞  ＫＣｙ１
配列番号１４２及び１４３
＜２２３＞  ｄＡＧ（ＡＢ）
配列番号１４４及び１４５
＜２２３＞  ｄＡＧ（ＡＣ）
配列番号１４６及び１４７
＜２２３＞  ＴＧｕｖ
配列番号１４８及び１４９
＜２２３＞  モミジ
配列番号１５０及び１５１
＜２２３＞  ＣＯＲ３．０１
配列番号１５２及び１５３
＜２２３＞  ＤｓＲｅｄ２
配列番号１５４、１５９及び１６０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号１５５、１５７、１６１、１６３、１６５、１６７及び１６９
＜２２３＞  人工的に合成されたポリヌクレオチドの配列
配列番号１５６、１５８、１６２、１６４、１６６、１６８及び１７０
＜２２３＞  人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号１７１及び１７２
＜２２３＞  ＣＯＲ５
【図２０】
2013084950.tif 000005
【図２１】
2013084950.tif 000006
【図２２】
2013084950.tif 000007
【図２５】
2013084950.tif 000008
【図２７】
2013084950.tif 000009
【図４３】
2013084950.tif 000010
【図４４】
2013084950.tif 000011
【図４５】
2013084950.tif 000012
【図４６】
2013084950.tif 000013
【図４７】
2013084950.tif 000014
【図４８】
2013084950.tif 000015
【図１】
2013084950.tif 000016
【図２】
2013084950.tif 000017
【図３】
2013084950.tif 000018
【図４】
2013084950.tif 000019
【図５】
2013084950.tif 000020
【図６】
2013084950.tif 000021
【図７】
2013084950.tif 000022
【図８】
2013084950.tif 000023
【図９】
2013084950.tif 000024
【図１０】
2013084950.tif 000025
【図１１】
2013084950.tif 000026
【図１２】
2013084950.tif 000027
【図１３】
2013084950.tif 000028
【図１４】
2013084950.tif 000029
【図１５】
2013084950.tif 000030
【図１６】
2013084950.tif 000031
【図１７】
2013084950.tif 000032
【図１８】
2013084950.tif 000033
【図１９】
2013084950.tif 000034
【図２３】
2013084950.tif 000035
【図２４】
2013084950.tif 000036
【図２６】
2013084950.tif 000037
【図２８】
2013084950.tif 000038
【図２９】
2013084950.tif 000039
【図３０】
2013084950.tif 000040
【図３１】
2013084950.tif 000041
【図３２】
2013084950.tif 000042
【図３３】
2013084950.tif 000043
【図３４】
2013084950.tif 000044
【図３５】
2013084950.tif 000045
【図３６】
2013084950.tif 000046
【図３７】
2013084950.tif 000047
【図３８】
2013084950.tif 000048
【図３９】
2013084950.tif 000049
【図４０】
2013084950.tif 000050
【図４１】
2013084950.tif 000051
【図４２】
2013084950.tif 000052
【図４９】
2013084950.tif 000053
【配列表】
2013084950000001.app
【国際調査報告】
2013084950.tif 000054
2013084950.tif 000055
2013084950.tif 000056
2013084950.tif 000057