(57)【要約】  シスプラチン系製剤とは異なる態様でＤＮＡに結合し得る新規な白金（II）二核錯体化合物、該化合物の製造方法および該化合物を有効成分として含む抗癌剤を提供する。上記化合物は、下記式（Ｉ）によって表されるテトラゾラト架橋白金錯体化合物であり、ここで、Ａは置換されていてもよいテトラゾラトであり、Ｂは無機または有機のアニオンであり、ｍおよびｎは白金錯体イオンの電荷数およびアニオンの電荷数に対応して決まる整数である。2009090903.tif 000015
2009090903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
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（式中、Ａは置換基を有するまたは有しないテトラゾラトであり、Ｂは有機または無機のアニオンであり、ｍおよびｎは白金錯体部の電荷数および前記Ｂの電荷数に対応して決まる整数である。）；
によって表される白金錯体化合物。
【請求項２】
前記白金錯体部は、前記Ａを構成するテトラゾール環の２位および３位のＮが二つの白金イオンにそれぞれ配位したＮ２，Ｎ３−架橋構造を有する、請求項１に記載の白金錯体化合物。
【請求項３】
前記Ａは置換基を有しないテトラゾラトである、請求項２に記載の白金錯体化合物。
【請求項４】
前記Ａは置換基を有するテトラゾラトであり、該置換基は、炭素数１〜６の炭化水素基、−ＣＨ２ＣＯＯ-および−ＣＨ２ＣＯＯＲｘ（ここで、Ｒｘは炭素数１〜４のアルキル基である。）からなる群から選択されるいずれかである、請求項２に記載の白金錯体化合物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の白金錯体化合物を有効成分として含む、抗癌剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の白金錯体化合物を製造する方法であって、
次式（II）：
【化２】
2009090903.tif 000014
（式中、Ｂは有機または無機のアニオンであり、ｎは前記Ｂの電荷数に対応して決まる整数である。）；
で表される化合物と、置換基を有するまたは有しない１Ｈ−テトラゾールとを、１：１〜１：１．２のモル比で反応させて、Ｎ１，Ｎ２−架橋白金錯体化合物とＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物との混合物を得る工程と、
該混合物に含まれるＮ１，Ｎ２−架橋白金錯体化合物およびＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物のいずれか一方から他方を分離することにより前記白金錯体化合物の少なくともいずれかを精製する工程と、
を包含する、白金錯体化合物製造方法。
【請求項７】
前記白金錯体化合物を精製する工程は、移動相として過塩素酸塩溶液を用いた逆相クロマトグラフィにより行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記過塩素酸が過塩素酸リチウムである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラゾラト架橋型の白金錯体化合物、該白金錯体化合物の製造方法およびその利用に関する。
なお、本出願は２００８年１月１６日に出願された日本国特許出願第２００８−００７３５７号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチン（cis-diamminedichloroplatinum(II)）は塩化物イオン２基とアンミン２基とがシス型に配位した白金（II）一核錯体であり、最も効果的な抗癌剤の一つとして化学療法に広く用いられている。また、シスプラチン療法における副作用または癌細胞の耐性への対処として、カルボプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンのシスプラチン類似体が臨床利用されている。
シスプラチンの作用機序や体内代謝経路には、該錯体が細胞内のＤＮＡ鎖と１，２−鎖内架橋を形成しＤＮＡ鎖に顕著な歪みを生じさせることが関与していると考えられている（非特許文献１）。シスプラチンと類似した構造を有する上記の白金製剤も同様の態様でＤＮＡに結合すると考えられる。【０００３】
一方、これら既存の白金製剤とは異なる薬剤プロファイルを有する白金製剤の開発が望まれている。そのための一つの有効な手段として、既存のシスプラチン系製剤とは作用機序や体内代謝経路において異なる白金錯体化合物を設計することが考えられる。例えば、シスプラチンとは分子構造が大きく異なることによりシスプラチンとは異なる態様でＤＮＡに結合し得る白金錯体（例えば白金多核錯体）によれば、シスプラチン系白金製剤とは異なる薬剤プロファイルが実現されることが期待される。この種の技術に関する従来技術文献として、特許文献１および非特許文献２，３が挙げられる。【０００４】
【特許文献１】国際公開第９６／１６０６８号パンフレット
【非特許文献１】Jamieson, E. R. and Lipperd, S. J. "Structure, Recognition, and Processing of Cisplatin-DNA Adducts" Chem. Rev., 1999, 99, 2467-2498.
【非特許文献２】Kasparkova, J.; Zehnulova, J.; Farrell, N.; and Brabec, V. "DNA interstrand cross-links of the novel antitumor trinuclear platinum complex BBR3464. Conformation, recognition by high mobility group domain proteins, and nucleotide excision repair." J Biol Chem 2002, 277, (50), 48076-48086.
【非特許文献３】Komeda, S.; Lutz, M.; Spek, A. L.; Chikuma, M.; and Reedijk, J. "New antitumor-active azole-bridged dinuclear platinum(II) complexes: synthesis, characterization, crystal structures, and cytotoxic studies." Inorg Chem 2000, 39, (19), 4230-4236.
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、シスプラチン系製剤とは異なる態様でＤＮＡに結合し得る新規な白金（II）二核錯体化合物および該化合物を有効成分として含む抗癌剤を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、かかる錯体化合物の製造方法を提供することである。
【０００６】
本発明によると、次式（Ｉ）：
【化１】
2009090903.tif 000003
によって表される白金錯体化合物が提供される。ここで、Ａは置換されていてもよいテトラゾラトであり、Ｂは有機または無機のアニオンであり、ｍおよびｎは白金錯体部（角括弧内の錯イオン）の電荷数およびアニオンの電荷数に対応して決まる整数である。
【０００７】
なお、本明細書において「テトラゾラト」とは、１Ｈ−テトラゾール系化合物（Ｃ５位に置換基を有するまたは有しない１Ｈ−テトラゾール）の脱プロトン化（Ｎ１位のプロトンの引き抜き）によって得られるアニオン一般を指す用語である。すなわち、１Ｈ−テトラゾール系化合物のＮ１位のプロトンが解離してなるアニオン一般を意味する。
【０００８】
上記式（Ｉ）により表される化合物は、配位中心をなす２つの白金（II）イオンに対するＡの架橋態様によって、Ａを構成するテトラゾール環のＮ１およびＮ２が２つの白金イオンにそれぞれ配位したＮ１，Ｎ２−架橋構造の白金錯体化合物と、該テトラゾール環のＮ２およびＮ３が２つの白金イオンにそれぞれ配位したＮ２，Ｎ３−架橋構造の白金錯体化合物とに大別される。ここに開示される化合物の好ましい一態様は、Ｎ２，Ｎ３−架橋構造の白金錯体化合物である。かかる架橋構造の白金錯体化合物は、抗癌剤その他の薬剤の有効成分としてより有用な（例えば、より高い細胞毒性を発揮する）ものであり得る。なかでも、式（Ｉ）におけるＡが置換基を有しないテトラゾラトであるＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物が特に好ましい。
【０００９】
本発明によると、また、上記式（Ｉ）中のＡが置換基（すなわち、テトラゾール環の５位のＣに結合した置換基）を有するテトラゾラトであるＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物が提供される。該置換基は、直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれであってもよく、該置換期中に更に置換基を備えていてもよい。例えば、炭素数１〜６の炭化水素基、−ＣＨ２ＣＯＯ-および−ＣＨ２ＣＯＯＲｘ（ここで、Ｒｘは炭素数１〜４のアルキル基である。）からなる群から選択されるいずれかであり得る。このような置換基を有するＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物は、高純度のものが得られやすいので好ましい。
【００１０】
また、ここに開示されるいずれかの白金錯体化合物は、シスプラチンの病理学上の利用態様に準じて利用することができる。例えば、上記白金錯体化合物の少なくとも１つを抗癌剤の有効成分の１つとして用いることができる。この場合、上記式（Ｉ）中のＢは薬理学上許容されるアニオンであることが好ましい。
【００１１】
本発明によると、上記式（Ｉ）により表される白金錯体化合物は、次式（II）:
【化２】
2009090903.tif 000004
で表される化合物と、置換基を有するまたは有しない１Ｈ−テトラゾール系化合物とを、１：１〜１：１．２のモル比で反応させることを含む製造方法によって好ましく製造することができる。この工程で、Ｎ１，Ｎ２−架橋白金錯体化合物とＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物との混合物が生じた場合、本発明によると、該混合物に含まれる上記２つの化合物のいずれか一方から他方を分離することにより、上記化合物の少なくともいずれかを精製することができる。
【００１２】
上記製造方法の好ましい一つの態様では、上記混合物から上記化合物の少なくとも一方を分離する工程において、移動相として過塩素酸塩水溶液を用いた逆相クロマトグラフィを用いる。また、該水溶液中の過塩素酸塩は過塩素酸リチウムであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、例１で得られた混合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、例３で得られた５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は、例３で得られた５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、例４で得られた混合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】図５は、例３で得られた５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２の質量スペクトルである。
【図６】図６は、例３で得られた５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルである。
【図７】図７は、例５で得られた５−メチル−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルである。
【図８】図８は、例６で得られた５−エチルアセテート−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルである。
【図９】図９は、例７で得られた５−アセテート−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルである。
【図１０】図１０は、例８で得られた５−フェニル−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルである。
【図１１】図１１は、Ｘ線解析によって得られた上記５−メチルの結晶構造である。
【図１２】図１２は、Ｘ線解析によって得られた上記５−アセテートの結晶構造である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば化合物の合成方法や分離精製方法）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば白金化合物を有効成分とする抗癌剤（薬剤組成物）の調製に関するような一般的事項）は、有機化学、無機化学、薬学、医学、病理学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。【００１５】
ここに開示される白金錯体化合物は、上記式中のＡが１Ｈ−テトラゾール系化合物の脱プロトン化（Ｎ１位のプロトンの引き抜き）によって得られるテトラゾラトである。Ａは、好ましくはＣ５位に水素原子または低級炭化水素基を有するテトラゾラトである。
また、上記式中のＢは特に制限されず、例えば無機酸イオンおよび有機酸イオンから選択される一種または二種以上であり得る。無機酸イオンとしては、例えば、クロリド、ブロミド、ニトラート、ホスファート、スルファート、ペルクロラート等が挙げられる。有機酸イオンとしては、例えば、アセタート、シトラート、ラクタート、マレアート、タルトラート、ベジラート等が挙げられる。なお、上記式（Ｉ）により表される錯体化合物は水和物として存在し得る。したがって、本発明により提供される白金錯体化合物には、上記式（Ｉ）で表される化合物の水和物が包含され得る。【００１６】
上記式中のｍおよびｎは白金錯体部（角括弧内の錯イオン）の電荷数およびＢのアニオンの電荷数に対応して決まる整数である。ここで、各白金（II）イオンの電荷は＋２であり、水酸基の電荷は−１である。従って、例えば、Ａが置換基を持たない或いは電荷を持たない置換基を有するテトラゾラトである場合、テトラゾラト環上の電荷は−１であるため、白金錯体部の電荷数は＋２となる。従って、Ｂの電荷が−２であれば、ｍおよびｎは共に１であり、Ｂの電荷が−１であれば、ｍは１、ｎは２である。【００１７】
ここに開示されるいずれかの白金錯体化合物は、シスプラチンの病理学上の利用態様に準じて利用することができる。この場合、式（Ｉ）中のＢは薬理学上許容されるアニオンであることが好ましい。かかる白金錯体化合物は、例えば、シスプラチンと同様に抗癌剤として利用することができる。本発明に基づく抗癌剤の調製については、本発明による白金錯体化合物の少なくとも１種を有効成分として含有すること以外に特に制限はない。有効成分として、上記白金錯体化合物のいずれか１種のみを含んでもよいし、２種以上を含んでもよい。また、その他の有効成分として、別の抗癌剤、副作用を緩和するような薬剤、および／または抗癌作用を向上させるような薬剤等を含んでもよい。投与方法についても薬理効果が得られる範囲内において特に制限はない。例えば、他の白金製剤同様、該白金錯体化合物を生理食塩水等に溶解させたものを静脈注射により患者に投与することができる。【００１８】
本発明による白金錯体化合物は、適当な溶媒中で式（II）で表される化合物（出発物質）と１Ｈ−テトラゾール系化合物とを１：１〜１：１．２のモル比で反応させることを含む製造方法によって好ましく製造することができる。ここで、１Ｈ−テトラゾール系化合物の使用量が上記モル比よりも多すぎると、副生成物（式（Ｉ）で表される白金錯体化合物以外の生成物、すなわち不純物）が多く生じること等により、目的物の分離精製が困難となることがある。出発物質と１Ｈ−テトラゾール系化合物とを上述した好ましいモル比で反応させることにより、不純物をほとんど含まず取り扱いが容易な生成物（Ｎ１，Ｎ２−架橋白金錯体化合物とＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物との混合物であり得る。）が、典型的には白色粉末状として得られる。特に、式（Ｉ）におけるＡが置換基を有しないテトラゾラトである白金錯体化合物の製造においては、上記出発物質と１Ｈ−テトラゾール系化合物とを上記範囲のモル比で反応させることにより、目的物の収率や分離精製の容易性等の点で顕著な効果が得られる。【００１９】
出発物質と１Ｈ−テトラゾール系化合物とを反応させる際には、典型的には、出発物質を適当な溶媒に溶解させた溶液に１Ｈ−テトラゾール系化合物を添加する。使用できる溶媒としては該出発物質を溶解し得るもので所望の白金錯体化合物の生成を阻害しないものであれば特に制限はないが、好適には水（蒸留水）である。１Ｈ−テトラゾール系化合物は、一度にまたは何度かに分割して添加することができる。該化合物を適当な溶媒（好ましくは出発物質の溶解に用いた溶媒と同様の溶媒）に溶解させた溶液を一度にまたは何度かに分割して添加してもよいし、或いは徐々に滴下してもよい。例えば、上記１Ｈ−テトラゾール系化合物溶液を一度に添加する態様を好ましく採用することができる。【００２０】
得られた反応液は、好ましくは遮光下で攪拌する。この際の温度は該反応を損なわない限り特に制限されないが、好ましくは２５〜５５℃程度であり、より好ましくは３５〜４５℃であり、更に好ましくは約４０℃である。また、反応時間は収率を著しく減少させない範囲で特に制限されないが、好ましくは２４時間〜６４時間であり、より好ましくは３６時間〜５２時間であり、更に好ましくは４０時間〜４８時間である。なお、上記式（II）で表される出発物質（例えば、式[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2で表される化合物）については公知の合成方法に従って合成することができる。例えば、R. Faggiani. R.; B. Lippert. B; Lock, C. J. L.; and Rosenberg, B. "Hydroxo-bridged platinum(II) complexes. 1. Di-μ-hydroxo-bis[diammineplatinum(II)] nitrate, [(NH3)2Pt(OH)2Pt(NH3)2](NO3)2. Crystalline structure and vibrational spectra." J Am Chem Soc 1977, 99, (3), 777-781（以下、「非特許文献４」という。）に記載の合成方法を好ましく採用することができる。【００２１】
上記反応において、１Ｈ−テトラゾール系化合物としては、好ましくはＣ５位に水素原子または低級炭化水素基を有する１Ｈ−テトラゾールを、特に好ましくはＣ５位に水素原子を有する１Ｈ−テトラゾールを用いることができる。Ｃ５位が水素原子の１Ｈ−テトラゾールを用いた場合、上記反応によってＮ１，Ｎ２−架橋白金錯体化合物とＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物との混合物（２つの構造異性体の混合物）が生じ得る。しかし、ここに開示される製造方法に従えば、該混合物はこれらの構造異性体以外に副生成物（不純物）をほとんど含まない。そのため、上記不純物を多く含む混合物に比べて吸湿性が極めて低い等の特性により、取り扱いが容易である。【００２２】
また、一般的に、上記のように構造上非常に類似した異性体の混合物は高度に分離精製することが困難であるところ、本発明によると、該混合物から少なくともいずれか一方の構造異性体を分離することにより、上記混合物に含まれる異性体を効率よく高純度に精製することができる。この分離精製には、例えば、逆相クロマトグラフを用いる。使用するクロマトグラフとしては市販のものを用いることが可能であり、例えば高速液体クロマトグラフまたは中圧分取クロマトグラフ等を好ましく用いることができる。特に好ましくは中圧分取クロマトグラフを用いる。
使用するカラムとしては、目的物の分離精製を可能にするものであれば特に制限はないが、好適にはＯＤＳ（Ｃ１８）カラムを用いる。該ＯＤＳカラムとしては、例えば、山善株式会社の商品名「ウルトラパック」を好ましく採用することができる。【００２３】
移動相としては、混合物から少なくとも一方の構造異性体を分離できれば特に制限はないが、好ましくは過塩素酸塩溶液（典型的には水溶液）を用いる。該過塩素酸塩は、得られた白金錯体化合物を損なわなければ特に制限されないが、好ましくはリチウム塩、ナトリウム塩等であり、リチウム塩の使用が特に好ましい。これにより、精製後の白金錯体化合物の脱塩を簡便に行うことができる。すなわち、分取した溶液を凍結乾燥して得られた白金錯体化合物を少量のアルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール等）により洗浄することにより、過塩素酸塩を容易に除去することができる。過塩素酸塩溶液の濃度は、該溶液のｐＨが凡そ２．５〜３．５（例えば凡そ３．０）となるように設定するとよい。過塩素酸塩溶液として例えば過塩素酸リチウム溶液を用いる場合、該溶液中の過塩素酸リチウム濃度が約０．１Ｍになるように調製すると、ｐＨが上記範囲内となり好適である。その他の事項（カラムのサイズ、流速等）については注入するサンプル量に応じて適宜設定すればよい。【００２４】
また、本発明の製造方法によれば、Ｃ５位に置換基を有するテトラゾラト架橋白金錯体化合物を製造することもできる。該置換基に特に制限はなく、直鎖状、分岐鎖状、環式のいずれであってもよい。特に好ましくは低級炭化水素基である。例えば、炭素数１〜６の低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基等）またはアリール基等（例えばフェニル基）である。また該置換基はさらに置換されていてもよい。例えば、アセテート基やエチルアセテート基等によって置換された低級アルキル基であってもよい。Ｃ５位の置換基の他の例としては、アミノ基（Ｎが＋１の電荷を帯びている又は帯びていないアミノ基であり得る。）、メチルチオ基、カルボキサミド基等が挙げられる。【００２５】
なお、上記製造方法においてＣ５位に置換基を有する１Ｈ−テトラゾールを反応させる場合には、Ｎ２，Ｎ３架橋による構造異性体が主として生成し得る。この場合には、上述した混合物の分離精製工程を省略した製造方法によっても当該異性体を高純度に得ることができ得る。したがって、本明細書により開示される技術には、上記式（Ｉ）におけるＡが置換基を有するテトラゾラトである白金錯体化合物を製造する方法であって、上記式（II）で表される化合物と置換基を有する１Ｈ−テトラゾール系化合物とを１：１〜１：１．２のモル比で反応させることを特徴とする、白金錯体化合物の製造方法が含まれる。ここで使用する１Ｈ−テトラゾール系化合物の有する置換基は、式（Ｉ）中のＡの有する置換基と同一の基であってもよく、式（Ｉ）に示す化合物と１Ｈ−テトラゾール系化合物とを反応させた後に簡単な工程によって上記Ａの有する置換基に変換可能な基であってもよい。【００２６】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
なお、以下に示す例１、例４〜６、例８の出発物質である[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2としては、上記非特許文献４に従って合成したものを用いた。【００２７】
＜例１＞
本例は、式（II）で表される化合物と１Ｈ−テトラゾール（すなわち、置換基を有しない１Ｈ−テトラゾール系化合物）とを１：１．１のモル比で反応させることにより、式（Ｉ）におけるＡが置換基を有しないテトラゾラトである白金錯体化合物を合成した例である。
すなわち、[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2２．０ｇを蒸留水７５ｍＬに溶解させた溶液に１Ｈ−テトラゾール（同仁化学）０．２５２ｇ（１．１当量）を加え、得られた反応液を遮光下４０℃で約４０時間攪拌した。この反応液を、ロータリーエバポレーターを用いて、得られた白金錯体のポリマー化反応を避けるため３０℃以下で減圧濃縮し、残った粗生成物をメタノールおよびジエチルエーテルで洗浄・濾取した後、真空デシケータで乾燥させて白色粉末１．９ｇを得た。この白色粉末の1H-NMRスペクトル（VarianMercury300NMR）を図１に示す。このＮＭＲスペクトルからわかるように、上記白色粉末は、Ｎ１，Ｎ２架橋型の白金錯体化合物[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N1,N2)](NO3)2と、Ｎ２，Ｎ３架橋型の白金錯体化合物[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N2，N3)](NO3)2とを約６．５：３．５のモル比で含む混合物であり、他の不純物はほとんど含まれていなかった。また、上記白色粉末は取扱い容易であった。【００２８】
＜例２＞
例１により得られた混合物（サンプル１）を繰り返し水から再結晶することにより、Ｎ１，Ｎ２架橋型とＮ１，Ｎ２架橋型とのモル比が４：６程度となるまでＮ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物を精製した（サンプル２）。【００２９】
サンプル１、サンプル２および比較例としてシスプラチン（サンプル３）の細胞毒性を以下の手法により評価した。
＜H460非小肺癌細胞に対するインヴィトロ細胞毒性（癌細胞増殖抑制活性）の検討＞
薬物を添加する日の前日に、２４ウェル平底マイクロプレート上にH460非小肺癌細胞を１２，０００〜２０，０００個／ウェルとなるようにプレートした。各サンプル（表１中のサンプル番号参照）のそれぞれを濃度が１００μＭとなるようにＱ−Ｈ２Ｏ水に溶解して各水溶液を用意した。これらの水溶液を希釈して得られた様々な濃度の溶液１ｍＬを各ウェルに注入した。このマイクロプレートを３７℃で２４時間培養した後、２００μＬの臭化２，５−ジフェニル−３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）テトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、３７℃でさらに４時間培養した。ＭＴＴの還元により生成・析出したフォルマザンを溶解するため、各ウェルにジメチルスルフォキシド（DMSO）２００μＬを加えた。マイクロプレートレーダーを用いて各ウェルの５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
各ウェルの吸光度を３回測定し、各実験を少なくとも３回繰り返した。IC50値は薬剤を添加しなかったコントロールと比較して、フォルマザン生成量が５０％となる濃度として算出した。
その結果を表１に示す。Ｎ２，Ｎ３−架橋白金錯体化合物を粗精製してなるサンプル２はより高い細胞毒性を示すことがわかった。【００３０】
【表１】
2009090903.tif 000005
【００３１】
＜例３＞
本例では、例１で得られた混合物をＮ１，Ｎ２架橋型とＮ１，Ｎ２架橋型とに高度に分離精製した。
すなわち、上記混合物を中圧分取クロマトグラフィーにより分離した。当該分離は、山善株式会社の中圧分取クロマトグラフ装置「YFLC-prep」を使用して、以下の条件により行った。
移動相：０．１M過塩素酸リチウム（ｐＨ３．０）
カラム：φ２６ｍｍ×３００ｍｍウルトラパックODSカラム（山善株式会社）
検出波長：２５４ｎｍ
流速：２０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：１回５ｍＬ
それぞれの溶離液を凍結乾燥して得られた白色粉末をジエチルエーテルで洗浄して、Ｎ１，Ｎ２架橋型の白金錯体化合物[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N1,N2)](ClO4)2（以下、５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２という。）０．８６ｇ、および、Ｎ２，Ｎ３架橋型の白金錯体化合物[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N2,N3)](ClO4)2（以下、５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３という。）０．４７ｇを得た。この５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２は、上記式（Ｉ）における置換基Ａが下記式（III）で表される基である白金錯体化合物に該当する。また、５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３は、上記式（Ｉ）における置換基Ａが下記式（IV）で表される基である白金錯体化合物に該当する。
分離精製後の５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２および５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３の収量の和を理論収量で除して算出した最終収率は５６．５％であった。また、分離精製後の５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２（サンプル４）および５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３（サンプル５）の収率は、それぞれ３６．５％および２０．０％であった。【００３２】
【化３】
2009090903.tif 000006
【００３３】
【化４】
2009090903.tif 000007
【００３４】
５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２および５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３の同定に用いた構造分析データ（分離精製後）を以下に記す（NMRスペクトロスコピー：Varian  INOVA  500、質量分析装置：JOEL  JMX-700）。また、５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２および５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３のNMRスペクトルをそれぞれ図２および図３に、これらの質量スペクトルをそれぞれ図５および図６に示す。【００３５】
[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N1，N2)](ClO4)2（５−Ｈ−Ｎ１，Ｎ２）
NMR分析
1H-NMR(D2O，TSP-d4)：δ(ppm）8.84（s，1H，NH)
13C-NMR（D2O，TSP-d4)：δ（ppm）152.6
195Pt-NMR（D2O，Na2PtCl6)：δ（ppm）-2127，-2177
質量分析（ESI)
[M-H+]：542.2（理論値543.1)
[M+ClO4-]：642.8（理論値643.0)
(Ｍ＝[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N1,N2)]2+)【００３６】
[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N2，N3)](ClO4)2（５−Ｈ−Ｎ２，Ｎ３）
NMR分析
1H-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）8.66（s，1H，NH)
13C-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）152.6
195Pt-NMR（D2O，Na2PtCl6)：δ(ppm）-2192
質量分析（ESI)
[M-H+]：542.2（理論値543.1)
[M+ClO4-]：642.8（理論値643.0)
(Ｍ＝[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N2,N3)]2+)【００３７】
＜例４＞
本例では、式（II）で表される化合物と１Ｈ−テトラゾール（すなわち、置換基を有しない１Ｈ−テトラゾール系化合物）とを１：４のモル比で反応させた。すなわち、[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2に対する１Ｈ−テトラゾールの使用量を４当量とした。その他の点は例１と同様にして生成物を得た。この生成物は、図４のＮＭＲスペクトルから明らかなように、Ｎ１，Ｎ２架橋型の白金錯体化合物[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N1,N2)](NO3)2およびＮ２，Ｎ３架橋型の白金錯体化合物[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-N2,N3)](NO3)2の他に、少なくとも１種の副生成物（不純物）を含み、吸湿性が非常に高く取り扱いが困難であった。また、不純物を含む該混合物（粗生成物）の収率は１０％以下であった。仮に実施例１の方法に従って該混合物の分離精製を行うと、構造異性体の総収率はさらにその半分近くまで下がることになる。これは本発明による製造方法に従った場合の約９分の１以下である。【００３８】
＜例５＞
本例では、式（Ｉ）におけるＡがＣ５位にメチル基を有するテトラゾラトである白金錯体化合物を合成した。
すなわち、[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2  １．０ｇを蒸留水３０ｍＬに溶解させた溶液に１Ｈ−５−メチルテトラゾール（アルドリッチ）０．１５０ｇ（１．１等量）を加え、得られた反応液を遮光下４０℃で約４０時間攪拌した。この反応液をロータリーエバポレーターを用いて３０℃以下で減圧濃縮し、残った粗生成物を再結晶（５０％（v/v）２−メチル−２，４−ペンタンジオール水溶液）により精製し、[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-5-methyltetrazolato-N2,N3)](NO3)2  ０．１５ｇを得た。この化合物は、式（Ｉ）におけるＡが下記式（Ｖ）で表される基である白金錯体化合物である。以下、当該化合物を５−メチル−Ｎ２，Ｎ３（サンプル６）という。【００３９】
【化５】
2009090903.tif 000008
【００４０】
この５−メチル−Ｎ２，Ｎ３の同定に用いた構造分析データ（例３と同じ分析機器により測定した）を以下に記す。また、５−メチル−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルを図７に、Ｘ線解析による結晶構造を図１１に示す。【００４１】
NMR分析
1H-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）2.64（s，3H，CH3)
13C-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）10.1，162.2
195Pt-NMR（D2O，Na2PtCl6)：δ(ppm）-2179
質量分析（ESI）
[M-H+]：556.3（理論値557.1）
(Ｍ＝[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-5-methyltetrazolato-N2,N3)]2+)【００４２】
＜例６＞
本例では、式（Ｉ）におけるＡがＣ５位にエチルアセテート基を有するテトラゾラトである白金錯体化合物を合成した。
すなわち、[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2  １．０ｇを蒸留水３８ｍＬに溶解させた溶液にエチル−１Ｈ−テトラゾール−５−アセテート（アルドリッチ）０．２７９ｇ（１．１等量）を加え、得られた反応液を遮光下４０℃で約４８時間攪拌した。この反応液をロータリーエバポレーターを用いて４０℃で減圧濃縮し、得られた白色粉末を２−プロパノールおよびジエチルエーテルで洗浄・濾取した後、真空デシケータで乾燥させ、[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-5-ethylacetate-N2,N3)](NO3)2  ０．８ｇを得た。この化合物は、式（Ｉ）におけるＡが下記式（VI）で表される基である白金錯体化合物である。以下、当該化合物を５−エチルアセテート−Ｎ２，Ｎ３（サンプル７）という。【００４３】
【化６】
2009090903.tif 000009
【００４４】
この５−エチルアセテート−Ｎ２，Ｎ３の同定に用いた構造分析データ（例３と同じ分析機器により測定した）を以下に記す。また、５−エチルアセテート−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルを図８に示す。【００４５】
NMR分析
1H-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）1.28（t，3H，CH3)，4.11（s，2H，CH2)，
4.24（q，2H，CH2)
13C-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）16.1，34.2，65.7，174.0
195Pt-NMR（D2O，Na2PtCl6)：δ(ppm）-2182
質量分析（ESI)
[M-H+]：628.7（理論値629.4)
(Ｍ＝[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-5-ethylacetate-N2,N3)]2+)【００４６】
＜例７＞
本例では、例６で得られた化合物の置換基を簡単な工程により変換することで、式（Ｉ）におけるＡがＣ５位にアセテート基を有するテトラゾラトである白金錯体化合物を合成した。
すなわち、例６で得られた[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-5-ethylacetate-N2,N3)](NO3)2  ０．２ｇを蒸留水５ｍＬに溶解させた溶液に１Ｍの水酸化リチウム溶液３００μＬを加え、得られた反応液を室温で約１０分間攪拌した。この反応液を０．１Ｍ硝酸水溶液でｐＨ７に調節し、ロータリーエバポレータを用いて減圧濃縮した。得られた白色粉末を２−プロパノールおよびジエチルエーテルで洗浄・濾取した後、真空デシケータで乾燥させ、[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-5-acetate-N2,N3)](NO3)2  ０．１５ｇを得た。この化合物は、式（Ｉ）におけるＡが下記式（VII）で表される基である白金錯体化合物である。以下、当該化合物を５−アセテート−Ｎ２，Ｎ３という。【００４７】
【化７】
2009090903.tif 000010
【００４８】
この５−アセテート−Ｎ２，Ｎ３の同定に用いた構造分析データ（例３と同じ分析機器により測定した）を以下に記す。また、５−アセテート−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルを図９にＸ線解析による結晶構造を図１２に示す。【００４９】
NMR分析
1H-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）3.84（s，2H，CH2)
13C-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）37.0，164.1，179.2
195Pt-NMR（D2O，Na2PtCl6)：δ(ppm）-2181【００５０】
質量分析（ESI)
[M-H+]：600.5（理論値600.4)
(Ｍ＝[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-tetrazolato-5-acetate-N2,N3)]+)【００５１】
＜例８＞
本例では、式（Ｉ）におけるＡがＣ５位にフェニル基を有するテトラゾラトである白金錯体化合物を合成した。
すなわち、[{cis-Pt(NH3)2}(μ-OH)]2(NO3)2  １．０ｇを蒸留水４０ｍＬに溶解させた溶液と、１Ｈ−５−フェニルテトラゾール（アルドリッチ）０．２７３ｇ（１．１等量）をメタノール１０ｍＬに溶解した溶液とを混合し、得られた反応液を遮光下４０℃で約４８時間攪拌した。得られた白色の懸濁液をロータリーエバポレーターを用いて３０℃以下で減圧濃縮し、残った粗生成物にメタノール２００ｍＬを加え、メタノール不溶分を濾過により除去した。ろ液を減圧濃縮し、残った白色粉末をジエチルエーテルで洗浄・濾取し、真空デシケータ中で乾燥させた後、再結晶（６０％（v/v)メタノール水溶液）により精製し、[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-5-phenyltetrazolato-N2,N3)](NO3)2  ０．５５ｇを得た。この化合物は、式（Ｉ）におけるＡが下記式（VIII）で表される基である白金錯体化合物である。以下、当該化合物を５−フェニル−Ｎ２，Ｎ３という。【００５２】
【化８】
2009090903.tif 000011
【００５３】
この５−フェニル−Ｎ２，Ｎ３の同定に用いた構造分析データ（例３と同じ分析機器により測定した）を以下に記す。また、５−フェニル−Ｎ２，Ｎ３の質量スペクトルを図１０に示す。【００５４】
NMR分析
1H-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）7.60（1H，p-CH)，7.62（2H，CH)，
8.06（2H，CH)
13C-NMR（D2O，TSP-d4)：δ(ppm）129.4，129.4，132.1，133.7，166.3
195Pt-NMR（D2O，Na2PtCl6)：δ(ppm）-2185
質量分析（ESI)
[M-H+]：618.6（理論値619.4)
(Ｍ＝[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-5-phenyltetrazolato-N2,N3)]2+)【００５５】
サンプル４〜７の細胞毒性を比較対象の白金錯体化合物（サンプル３，８，９）と併せて上述の手法により評価した。その結果を表２に示す。
ここで、表２中のＡＭＰＺ（サンプル８）は式[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-pyrazolato)](NO3)2で表されるピラゾラト架橋白金（II）二核錯体であり、ＡＭＴＡ（サンプル９）は式[{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-1,2,3-triazolato-N1,N2)](NO3)2で表される１，２，３−トリアゾラト架橋白金（II）二核錯体である。これらＡＭＰＺおよびＡＭＴＡは、シスプラチンとは異なる抗癌活性スペクトルを示すことが知られており（非特許文献３）、またＤＮＡ鎖と結合して１，２−鎖内架橋を形成するが結合部分のＤＮＡ鎖に上記のような顕著な歪みを及ぼさないことが観察されている。すなわち、これらのアゾラト架橋白金（II）二核錯体は、上記シスプラチン系製剤のいずれとも異なる態様でＤＮＡに結合すると考えられる。【００５６】
【表２】
2009090903.tif 000012
【００５７】
表２に示す結果から明らかなように、サンプル４〜７のいずれもH460非小肺癌細胞に対してシスプラチンと同程度以上の細胞毒性を示した。また、上記の癌細胞に対する細胞毒性はＡＭＰＺおよびＡＭＴＡと比べ著しく優れていた。本発明による白金化合物は構造上シスプラチン系製剤とは異なる態様でＤＮＡに結合し得る（すなわち、異なる作用機序および体内代謝経路をたどり得る）。さらに、上記の測定結果は、本発明による白金錯体化合物がＡＭＰＺおよびＡＭＴＡとは異なる薬剤プロファイルを有し得ることを示唆するものである。
【図１】
2009090903.tif 000016
【図２】
2009090903.tif 000017
【図３】
2009090903.tif 000018
【図４】
2009090903.tif 000019
【図５】
2009090903.tif 000020
【図６】
2009090903.tif 000021
【図７】
2009090903.tif 000022
【図８】
2009090903.tif 000023
【図９】
2009090903.tif 000024
【図１０】
2009090903.tif 000025
【図１１】
2009090903.tif 000026
【図１２】
2009090903.tif 000027
【国際調査報告】
2009090903.tif 000028
2009090903.tif 000029
2009090903.tif 000030
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