(57)【要約】本発明は、核酸、カチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体（ポリプレックス）を提供し、上記アニオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーと核酸との複合体の表面を覆い、アニオン性ポリマーは、中性ｐＨにおいて負電荷を有しており、弱酸性ｐＨにおいて正電荷を有するように変化することができる。
2009133968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）：
2009133968.tif 000022
〔式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
Ｒ１３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式（Ｉ）
2009133968.tif 000023
（式中、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、ＲａとＲｂとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ｒａ及びＲｂがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合又は二重結合である。）
で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、
ｍ１は１０〜５００の整数を表し、ｍ２は１〜５の整数を表す。〕
で示されるアニオン性ポリマー。
【請求項２】
一級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、下記一般式（１１）：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−Ｘ１１    （１１）
（式中、Ｘ１１は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、ｒは０〜５の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（１２）：
−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ１〕ｔ１−Ｘ１２    （１２）
（式中、Ｘ１２はＸ１１と同義である。ｓ１及びｔ１は、それぞれ独立し、かつ〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ１〕ユニット間で独立して、ｓ１は１〜５の整数を表し、ｔ１は２〜５の整数を表す。）
で示される基である、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。
【請求項３】
一級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、−ＮＨ−ＮＨ２又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２で示されるものである、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で示される化合物が、下記式（Ｉａ）〜（Ｉｇ）で示される化合物のうちの少なくとも１種である、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。
2009133968.tif 000024
【請求項５】
核酸、カチオン性ポリマー及び請求項１〜４のいずれか１項に記載のアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体。
【請求項６】
核酸がプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項５に記載のポリマー複合体。
【請求項７】
カチオン性ポリマーが次式（２）：
2009133968.tif 000025
〔式中、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、Ｒ２３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、ｍ３は１０〜５００の整数を表し、ｍ４は１〜５の整数を表す。〕で示される化合物、
次式（３）：
2009133968.tif 000026
〔式中、Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ３３は、置換されていてもよい炭素数１１〜２７の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、
ｍ５及びｍ６はそれぞれ独立して０〜５００の整数を表し（但し、ｍ５及びｍ６の合計は１０〜５００の整数を表す。）、ｍ７は１〜５の整数を表し、ｍ８は１〜５の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ５＋ｍ６）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
次式（４）：
2009133968.tif 000027
〔式中、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ４３はＲ３３と同義であり、
Ｒ４４は、Ｒ２３と同義であり、
ｍ９及びｍ１０はそれぞれｍ５及びｍ６と同義であり、ｍ１１及びｍ１２はそれぞれｍ７及びｍ８と同義であり、
「／」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物、及び
次式（５）：
2009133968.tif 000028
〔式中、Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ５３及びＲ５４は、Ｒ２３と同義であり、
Ｌ１は、ＮＨ、ＣＯ、下記一般式（１３）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （１３）
（式中、ｐ１は１〜６の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（１４）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （１４）
（式中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨ又はＣＯを表す。ｑ１は１〜６の整数を表す。）
で示される基を表し、
ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５はそれぞれ独立して０〜５００の整数を表し（但し、ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５の合計は１０〜５００の整数を表す。）、ｍ１６及びｍ１７はそれぞれｍ７及びｍ８と同義であり、ｎは０〜５００の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ１３＋ｍ１４＋ｍ１５）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
で示される化合物からなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項６に記載のポリマー複合体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリマー複合体を含む、細胞内への核酸送達デバイス。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリマー複合体を含む、細胞内への核酸送達用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞に核酸を送達することができる非ウイルス性合成ベクターとして、核酸を封入するポリマー複合体（ポリプレックス）に関する。特に、本発明は、核酸、カチオン性ポリマー及びアニオン性ポリマーを含み、アニオン性ポリマーがカチオン性ポリマーと核酸との複合体の表面を覆っている電荷変換型三元系ポリプレックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
非ウイルス性合成ベクター（リポプレックスおよびポリプレックス）を介した標的細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡのデリバリーは、生物学的特性に固有の安全上の問題に直面しているウイルス性ベクターを用いたデリバリーに対する有望な代替方法として広く認識されている［１］。それにもかかわらず、非ウイルス性ベクターの場合でも、送達効率と安全上の問題（特に、化学毒性）とが両立しないことが大きな関心事である。トランスフェクション効率が高いベクターは、多くの場合高い毒性を示す一方で、毒性が低いベクターはトランスフェクション効率が低いことが多い。
Ｂｅｈｒらは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）について仮説を立てた「プロトン−スポンジ」効果によるエンドソーム脱出の概念を、遺伝子デリバリーの分野において導入した。それ以来、塩基度が調整された種々のポリカチオンが、ポリプレックスの構築のために開発されている。しかし、これらのポリカチオンの毒性によって、ポリプレックスは限定された用途でしか使用できない［２］。ポリカチオンの開発が限定的なものであることの主要な理由の一つは、おそらく、デリバリープロセスの異なる各段階において、ポリプレックスの異なる機能が必要とされ、対立する機能が必要とされることである。例えば、ポリプレックス中でアミン密度が高い部分は、エンドソーム膜障害を克服するために重要である。なぜならば、ポリプレックスのプロトン化電位は、エンドソーム緩衝及び膜不安定化の原因となるからである［３］。逆に、ポリプレックスが正に帯電する性質によって、負に帯電した血清成分と非特異的に相互作用を起こして毛細血管で血栓を形成する場合があり、原形質膜の構築が乱れて高い細胞毒性と過剰な免疫応答を誘導する危険性を有している［４］。これらの問題に対する周知の実際的な解決策として、ポリアニオン［５］またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）［６］でポリプレックス表面を覆うことによる正電荷の遮蔽が挙げられる。しかし、主として細胞への取り込みが減少すること、そしてエンドソーム脱出の能力が損なわれることから、トランスフェクション効率が著しく低下することは避けられない。
したがって、トランスフェクションプロセスの間の特定部位における反遮蔽方法（ｄｅｓｈｉｅｌｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）の開発に対して、多くの労力が集中している［７］。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明者らは、ポリプレックス構造に電荷変換型部分を組み込むことによって高トランスフェクション活性と低毒性との両方の特性を発揮するポリプレックスの設計に対する新規アプローチを検討した。マレイン酸アミド誘導体であるｃｉｓ−アコニチン酸アミドおよびシトラコン酸アミドは、中性のｐＨにおいて負電荷を有しているが、弱酸性のｐＨ５．５で速やかに分解され、正に帯電したアミンが露出する［８］。従って、本発明者らが正に帯電したポリプレックスの表面を分解性アミドから誘導されたポリマーで覆うことにより三元系ポリプレックス（ｐＤＮＡ／ポリカチオン／分解性側鎖を有するポリアニオン）を形成する場合、その三元系ポリマーは細胞の外側では中性〜負に帯電した性質を維持する。その一方で、エンドソームの酸性環境では、電荷変換型成分が正に帯電するように変化して、膜の破壊によるポリプレックスのエンドソーム脱出を促進することが予測される。このスキームは、図１において説明される。
本発明は、細胞外ではマイナス電荷を帯び、エンドソームに入るとプラス電荷に電荷変換を行うポリマーを提供することを目的とする。また本発明は、前記ポリマーを含む複合体（ポリプレックス）であって、遺伝子導入効率と安全性との間に存在する問題（ジレンマ）を克服し、低毒性かつ高い遺伝子導入効率を達成し得る三元系ポリプレックスを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、ポリカチオンをシトラコン酸無水物又はｃｉｓ−アコニチン酸無水物と反応させたポリマーは、中性条件下ではマイナス電荷を帯びているのに対し、酸性条件下ではカチオンに荷電が変換され、低毒性かつ高い遺伝子導入効率を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次式（１）で示されるアニオン性ポリマーである。
2009133968.tif 000003
〔式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
Ｒ１３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式（Ｉ）：
2009133968.tif 000004
（式中、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、ＲａとＲｂとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ｒａ及びＲｂがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合又は二重結合である。）
で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、
ｍ１は１０〜５００の整数を表し、ｍ２は１〜５の整数を表す。〕
本発明のアニオン性ポリマーにおいて、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基としては、例えば下記一般式（１１）：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−Ｘ１１    （１１）
（式中、Ｘ１１は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、ｒは０〜５の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（１２）：
−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ１〕ｔ１−Ｘ１２    （１２）
（式中、Ｘ１２はＸ１１と同義である。ｓ１及びｔ１は、それぞれ独立し、かつ〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ１〕ユニット間で独立して、ｓ１は１〜５の整数を表し、ｔ１は２〜５の整数を表す。）
で示される基が挙げられ、−ＮＨ−ＮＨ２又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２で示されるものが好ましい。
また、本発明のアニオン性ポリマーにおいて、前記式（Ｉ）で示される化合物としては、例えば下記式（Ｉａ）〜（Ｉｇ）で示される化合物のうちの少なくとも１種が挙げられる。
2009133968.tif 000005
また、本発明は、核酸、カチオン性ポリマー及び前記アニオン性ポリマーを含むポリマー複合体を提供する。
本発明のポリマー複合体において、核酸としては、例えばプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡが挙げられる。
また、カチオン性ポリマーとしては、次式（２）：
2009133968.tif 000006
〔式中、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、Ｒ２３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、ｍ３は１０〜５００の整数を表し、ｍ４は１〜５の整数を表す。〕で示される化合物、
次式（３）：
2009133968.tif 000007
〔式中、Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ３３は、置換されていてもよい炭素数１１〜２７の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、
ｍ５及びｍ６はそれぞれ独立して０〜５００の整数を表し（但し、ｍ５及びｍ６の合計は１０〜５００の整数を表す。）、ｍ７は１〜５の整数を表し、ｍ８は１〜５の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ５＋ｍ６）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
次式（４）：
2009133968.tif 000008
〔式中、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ４３はＲ３３と同義であり、
Ｒ４４は、Ｒ２３と同義であり、
ｍ９及びｍ１０はそれぞれｍ５及びｍ６と同義であり、ｍ１１及びｍ１２はそれぞれｍ７及びｍ８と同義であり、
「／」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物、及び
次式（５）：
2009133968.tif 000009
〔式中、Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ５３及びＲ５４は、Ｒ２３と同義であり、
Ｌ１は、ＮＨ、ＣＯ、下記一般式（１３）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （１３）
（式中、ｐ１は１〜６の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（１４）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （１４）
（式中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨ又はＣＯを表す。ｑ１は１〜６の整数を表す。）
で示される基を表し、
ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５はそれぞれ独立して０〜５００の整数を表し（但し、ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５の合計は１０〜５００の整数を表す。）、ｍ１６及びｍ１７はそれぞれｍ７及びｍ８と同義である。ｎは０〜５００の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ１３＋ｍ１４＋ｍ１５）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
で示される化合物からなる群から選択されるいずれかの化合物が挙げられる。
さらに、本発明は、前記ポリマー複合体を含む細胞内への核酸送達デバイス又は細胞内への核酸送達用キットを提供する。
本発明のポリマー複合体（ポリプレックス）の好ましい態様において、アニオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーと核酸との複合体の表面を覆っており、アニオン性ポリマーは中性ｐＨにおいて負電荷を有し、弱酸性のｐＨにおいて正電荷を有するように変化することができるものである。
上記アニオン性ポリマーの特定の例としては、図２Ａ（ｃ）に示されるポリマー（詳細には、“ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）”）を挙げることができる。
本発明により、中性条件下ではマイナス電荷を帯びているが酸性条件下ではカチオンに荷電が変換する電荷変換型三元系ポリプレックスが提供される。
遺伝子ベクターの研究分野において、ＨＵＶＥＣのような毒性に敏感な初代細胞に遺伝子導入することは非常に困難である。本発明のポリプレックスは、このような種類の細胞に対してＤＮＡやｓｉＲＮＡなどの核酸を、毒性を惹起することなく高効率でデリバリーすることが可能である。また医学的な観点では、核酸デリバリーの主な障害は効率が低いこと、毒性が高いこと、及び血中で不安定なことが挙げられる。本発明の電荷変換三元系ポリプレックスは、細胞外ではマイナス電荷を帯びているため非常に低毒性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子ベクターとして極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、エンドソーム破壊機能を有する電荷変換型三元系ポリプレックスの概要図である。
図２は、本発明において使用されるポリマーの構造式及び電荷変換を示す図である。
（Ａ）ポリカチオンの構造：（ａ）ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）、（ｂ）ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）（非電荷変換型ポリアニオン）および（ｃ）ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（電荷変換型ポリアニオン）。
（Ｂ）三元系ポリプレックス（ＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ））の電荷変換。
（Ｃ）三元系ポリプレックスの流体力学的直径の変化。白丸（○）はｐＨ５．５における結果を表し、黒丸（●）はｐＨ７．４における結果を表す。
図３は、ポリプレックスの機能を解析した結果を示す図である。
（Ａ）ＢＳＡ溶液中のポリプレックスの安定性。
（Ｂ）種々のベクターのトランスフェクション活性。
（Ｃ）種々のベクターでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣの相対的生存率。
（Ｄ）Ｃｙ５−ラベルＤＮＡの赤色蛍光とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎの緑色蛍光との共局在の比率。
各エラーバーは、標準誤差を意味する。ＥｘＧｅｎ５００（黒色バー）；ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックス（●および濃灰色バー）；ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）三元系ポリプレックス（▼および灰色バー）；ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）三元系ポリプレックス（○および白色バー）。
図４は、ＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡による観察結果を示す図である。
（Ａ）、（Ｂ）  ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックスでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣのＣＬＳＭ像。
（Ｃ）、（Ｄ）  ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）三元系ポリプレックスでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣのＣＬＳＭ像
（Ｅ）、（Ｆ）  ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）三元系ポリプレックスでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣのＣＬＳＭ像。
（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）は、トランスフェクション後３時間の像であり、（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）はトランスフェクション後２４時間の像である。Ｃｙ５（赤色）−ラベルのプラスミドＤＮＡを使用した。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青色）で染色し、後期エンドソームおよびリソソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（緑色）で染色した。各スケールバーは２０μｍである。
図５は、各ポリプレックスのサイズ分布を示す図である。
ＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックス（Ｎ／Ｐ比率＝４）（Ａ）、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）複合体（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）＝２）（Ｂ）、および（ＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）三元系ポリプレックス（Ｎ／Ｐ比率＝４；ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）＝２）のサイズ分布。
図６は、ポリプレックスのゲル遅延アッセイの結果を示す図である。
レーン１  ｐＤＮＡのみ；
レーン２  ｐＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックス（Ｎ／Ｐ比率４）；
レーン３  ｐＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（Ｎ／Ｐ＝４，ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）＝２）；
レーン４  ｐＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（Ｎ／Ｐ＝６，ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）＝２）；
レーン５  ｐＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（Ｎ／Ｐ＝８，ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）＝２）。
図７は、ｐＨ５．５におけるｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックス（●）およびｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）（○）三元系ポリプレックスのゼータ電位の変化を示す図である。
図８は、ルシフェラーゼおよびＶｅｎｕｓ（ＹＦＰ）トランスフェクションアッセイによるトランスフェクション効率と毒性の比較を示す図である。
（Ａ）ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／μｇタンパク質）による相対的なトランスフェクション効率、
（Ｂ）ＭＴＴアッセイによる相対的な細胞生存率、および
（Ｃ）Ｖｅｎｕｓ（＋）細胞カウントの計算による相対的なＶｅｎｕｓ（ＹＦＰ）発現。
黒色バー；ＥｘＧｅｎ  ５００（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｃａｎａｄａ）
網掛けバー；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）
濃灰色バー；ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックス
白色バーｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）三元系ポリプレックス）。
各エラーバーは、標準偏差を意味する。
図９は、種々のトランスフェクション試薬によるＨＵＶＥＣに対するＶｅｎｕｓ（ＹＦＰ）トランスフェクション結果を示す図である。
（Ａ）ＥｘＧｅｎ  ５００、（Ｂ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、（Ｃ）ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックス、および（Ｄ）ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）三元系ポリプレックス。
図１０は、Ｐ［Ｌｙｓ（ＴＦＡ）］ホモポリマーのゲル浸透クロマトグラフィーによる分析結果を示す図である。
図１１は、ｐＤＮＡ／ＰＬＬ  ｐｏｌｙｐｌｅｘおよび三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘの物理化学的評価（粒径およびゼータ電位測定）を行った結果を示す図である。
図１２は、本発明の三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘを用いたときの遺伝子発現活性を試験した結果を示す図である。
図１３は、本発明の三元系ポリプレックスの細胞内取り込みについて、フローサイトメーターによる分析を行った結果を示す図である。
図１４は、共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
図１５は、エンドソーム内にトラップされたポリプレックスを定量的に評価した結果を示す図である。
図１６は、ｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックスによるルシフェラーゼ遺伝子のノックダウン効果とｓｉＲＮＡ導入に伴う細胞毒性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。但し、以下の説明は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の実施の態様は、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の変更および改変をなすことができることが理解される。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願６１／１２６，０７７号（出願日：２００８年４月３０日）の明細書に記載の内容を包含する。
また、本明細書において列挙される全ての文書および刊行物は、あらゆる目的のために、本明細書においてその全体が参考として組み込まれる。
本発明は、核酸、カチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体（ポリプレックス）であって、アニオン性ポリマーは中性ｐＨにおいて負電荷を有し、弱酸性のｐＨにおいて正電荷を有するように変化することができるポリマー複合体である。また、本発明は、上記ポリマー複合体を構成するアニオン性ポリマーも提供する。
１．アニオン性ポリマー
本発明のアニオン性ポリマーは、次式（１）で示されるものであり、電荷変換型ポリマーとして使用される。
2009133968.tif 000010
〔式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
Ｒ１３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式（Ｉ）：
2009133968.tif 000011
（式中、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、ＲａとＲｂとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ｒａ及びＲｂがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合又は二重結合である。）
で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、
ｍ１は１０〜５００の整数を表し、ｍ２は１〜５の整数を表す。〕
本発明のアニオン性ポリマーにおいて、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基としては、例えば下記一般式（１１）又は下記一般式（１２）で示される基が挙げられる。
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−Ｘ１１    （１１）
（式中、Ｘ１１は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、ｒは０〜５の整数を表す。）
−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ１〕ｔ１−Ｘ１２    （１２）
（式中、Ｘ１２はＸ１１と同義である。ｓ１及びｔ１は、それぞれ独立し、かつ〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ１〕ユニット間で独立して、ｓ１は１〜５の整数を表し、ｔ１は２〜５の整数を表す。）
本発明において、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基は、−ＮＨ−ＮＨ２又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２で示されるものが好ましい。
本発明において、前記式（Ｉ）で示される化合物としては、例えば下記式（Ｉａ）〜（Ｉｇ）で示される化合物のうちの少なくとも１種が挙げられる。
2009133968.tif 000012
本発明のポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）に含まれるアニオン性ポリマーの例としては、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）が好ましく挙げられるが、当該ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）の構造は、カチオン性ポリマーであるｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（すなわち、アスパラギン酸骨格にエチレンジアンミンユニットが結合したアミノ酸のポリマー）の側鎖末端のアミノ基にＮ’−ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｙｌ基が結合することにより、アニオン性側鎖を有するポリマーとなったものである。ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）は、疎水性基（例えばＰＬＬ）の一級アミノ基に式Ｉで示される化合物（例えばｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｙｌ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を反応させることによって合成することができる。
一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、式（Ｉ）で示される化合物又はその誘導体との結合は、例えば、前記式（Ｉ）で示される化合物と、アミン化合物のアミノ基とが結合（共有結合）して、下記式（Ｉ’）に示されるような構造をとることでなされる。ここで、誘導体とは、上記一般式（Ｉ）を基本骨格として当該化合物から派生する任意の化合物を指す。例えばＩｃの化合物のＣＯＯＨを例えばアルキル基でしたもの、ＩｂやＩｅに示す化合物のメチル基を他のアルキル基で置換したもの、芳香環又はシクロアルキル環を少なくとも１個のハロゲン原子で置換したものなどが挙げられる。
式（Ｉ）において、置換基には、炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１８アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ基、Ｃ６〜Ｃ１８アリールオキシ基などが含まれる。
2009133968.tif 000013
当該結合に関しては、例えば、前記式（Ｉ）で示される化合物が前記式（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）で示される化合物である場合、当該結合後の上記式（Ｉ’）に示される構造としては、以下の通りとなる。
2009133968.tif 000014
２．カチオン性ポリマー
本発明の複合体の構成成分である特定のカチオン性高分子は、少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子である。
本発明において、カチオン性ポリマー（ポリカチオン）としては、上記ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（上記ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）の基本骨格となるｐＡｓｐ（ＤＥＴ）も含む）には限定はされず、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとして公知のものが全て含まれ、これらは、当業者の技術常識により、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の場合と同様に本発明の実施に利用することができる。ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含まれる。
（１）モノポリマー
カチオン性ポリマー（モノポリマー）としては、例えば次式（２）〜（４）に示される化合物を挙げることができる。
2009133968.tif 000015
〔式中、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、Ｒ２３は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、ｍ３は１０〜５００の整数を表し、ｍ４は１〜５の整数を表す。〕で示される化合物、
次式（３）：
2009133968.tif 000016
〔式中、Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ３３は、置換されていてもよい炭素数１１〜２７の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、
ｍ５及びｍ６はそれぞれ独立して０〜５００の整数を表し（但し、ｍ５及びｍ６の合計は１０〜５００の整数を表す。）、ｍ７は１〜５の整数を表し、ｍ８は１〜５の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ５＋ｍ６）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
次式（４）：
2009133968.tif 000017
〔式中、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、
Ｒ４３はＲ３３と同義であり、
Ｒ４４は、Ｒ２３と同義であり、
ｍ９及びｍ１０はそれぞれｍ５及びｍ６と同義であり、ｍ１１及びｍ１２はそれぞれｍ７及びｍ８と同義であり、
「／」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物が挙げられる。
一般式（２）中、カチオン性基を含む部分となるＲ２は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。−Ｒ２３基としては、例えば、下記一般式（２２）又は下記一般式（２３）で示される基が挙げられ、中でも下記一般式（２３）で示される基が好ましい。
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−Ｘ２１    （２２）
〔式（２２）中、Ｘ２１は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、ｒは０〜５の整数を表す。〕
−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ２〕ｔ２−Ｘ２２    （２３）
〔式（２３）中、Ｘ２２は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。ｓ２及びｔ２は、それぞれ独立し、かつ〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ２〕ユニット間で独立して、ｓ２は１〜５（好ましくは２）の整数を表し、ｔ２は２〜５（好ましくは２）の整数を表す。〕
一般式（２２）及び（２３）中、末端の−Ｘ２１基及び−Ｘ２２基（アミン化合物残基）としては、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び下記式（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に示される基等が好ましく挙げられ、中でも−ＮＨ２が特に好ましい。なお、下記式（ｖｉ）中、Ｙとしては、例えば、水素原子、アルキル基（炭素数１〜６）、及びアミノアルキル基（炭素数１〜６）等が挙げられる。
2009133968.tif 000018
一般式（２）中、−Ｒ２３基としては、具体的には「−ＮＨ−ＮＨ２」又は「−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２」が特に好ましく、中でもエチレンジアミンユニットを含む後者がより好ましい。
一般式（２）中、ｍ３は、限定はされないが、１００〜５００、好ましくは３０〜１５０（より好ましくは６０〜１００）の整数を表し、ｍ４は、限定はされないが、好ましくは１〜５（より好ましくは１〜２）の整数を表す。
脂肪族炭化水素残基が飽和である場合は、炭素数１１〜２７のアルキル基に等価であり、上記アルキル基に加えてペンタコシル基、ヘキサコシル基、ヘプタコシル基等が例示される。不飽和の脂肪族炭化水素残基は、該アルキル基の鎖中の炭素−炭素単結合の１〜５個が炭素−炭素二重結合となっている基に該当する。このような残基（Ｒ）を有するアシル基（ＲＣＯ−）の例としては、限定されるものでないが、ラウリン酸（またはドデカン酸）、ミリスチン酸（またはテトラデカン酸）、パルミチン酸（またはヘキサデカン酸）、パルミトオレイン酸（または９−ヘキサデセン酸）、ステアリン酸（またはオクタデカン酸）、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸（または９，１１，１３−オクタデカトリエン酸）、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸等を挙げることができる。
本発明において、ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ１−１２アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。ステロール誘導体の残基は、好ましくは、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールの３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。さらに好ましくは、コレステロール３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。ステロールオキシカルボニル基のステロールとしては、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等の動植物油起源のものが挙げられる。
上記カチオン性ポリマーは以下のようにして製造することができる。
上記式（２）〜（４）で表されるポリ（アミノ酸）は、例えば、公知のアスパラギン酸エステル由来のＮ−カルボン酸無水物の重合により製造したポリアミノ酸エステルを、Ｒ２３、Ｒ３３及びＲ４４の基のポリアミン残基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリ（アミノ酸）の側鎖にポリアミン残基を導入し、こうして導入したポリアミン部分のアミノ基と、上記脂肪族炭化水素残基を有するアシル基に対応するカルボン酸のカルボキシル基を必要により活性化した後、上記アミノ基に対して活性化カルボン酸の適量を反応させることにより、製造することができる。
（２）ブロックコポリマー
本発明において、カチオン性高分子は、上記の通りポリカチオン部分のみからなるポリマー（ホモポリマー）であってもよいが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分及びポリカチオン部分を有するブロックコポリマー又はグラフトポリマーであってよく、限定はされず、本発明の複合体の用途等によって適宜好ましい態様を選択することができる。
ＰＥＧ及びポリカチオンとしては、その構造（例えば重合度等）は限定されず、任意の構造のものを選択できるが、なかでもポリカチオンとしては、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドであることが好ましい。
本発明のポリプレックスは、核酸とブロックコポリマー中の一部（ポリカチオン部分）とが相互作用してイオンコンプレックスとなるコア部分を形成し、当該ブロックコポリマー中の他の部分（ＰＥＧ部分を含む部分）がコア部分の周囲にシェル部分を形成した状態の、コア−シェル型のミセル状複合体ということができる。
ブロックコポリマーとしては、下記一般式（１）で示されるものが挙げられる。
次式（５）：
2009133968.tif 000019
〔式中、Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれＲ２１及びＲ２２と同義であり、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
Ｒ５３及びＲ５４は、Ｒ２３と同義であり、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。
Ｌ１は、ＮＨ、ＣＯ、下記一般式（１３）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （１３）
（式中、ｐ１は１〜６の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（１４）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （１４）
（式中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨ又はＣＯを表す。ｑ１は１〜６の整数を表す。）
で示される基を表し、
ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５はそれぞれ独立して０〜５００の整数を表し（但し、ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５の合計は１０〜５００の整数を表す。）、ｍ１６は１〜５の整数を表し、ｍ１７は１〜５の整数を表し、ｎは０〜５００の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ１３＋ｍ１４＋ｍ１５）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
ここで、上記一般式（５）のカチオン性高分子中、−Ｒ５３基及び／又は−Ｒ５４基は一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、前記一般式（２）の項で説明したものと同様に適用することができる。例えば、下記一般式（１１）又は下記一般式（１２）で示される基が挙げられ、一般式（１２）で示される基が好ましい。
ここで、一般式（５）の構造式中、繰り返し単位数（重合度）がｎのブロック部分がＰＥＧ部分であり、繰り返し単位数がｍ１３の部分とｍ１４の部分とｍ１５の部分とを合わせたブロック部分（一般式（５）中、［  ］内に示された部分）がポリカチオン部分である。また、ポリカチオン部分の構造中式中の「／」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。例えば、Ａ及びＢというモノマー単位から構成されるブロック部分が、［−（Ａ）ａ−／−（Ｂ）ｂ−／−（Ｃ）ｃ−］と表記されている場合は、ａ個のＡとｂ個のＢとｃ個のＣとからなる合計（ａ＋ｂ＋ｃ）個の各モノマー単位が、ランダムにどのような並び順で連結していてもよいことを意味する（但し、すべてのＡ、Ｂ及びＣは直鎖状に連結している。）。
上記炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。
上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；−ＣＨＯ）に転化することができる。
一般式（５）中、リンカー部分となるＬ１は、ＮＨ、ＣＯ、下記一般式（４）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （４）
〔式（４）中、ｐ１は１〜６（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式（５）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （５）
〔式（５）中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨ又はＣＯを表す。ｑ１は１〜６（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基を表す。
一般式（５）中、ｎは、ＰＥＧ部分の繰り返し単位の数（重合度）を表し、具体的には、０〜５００（好ましくは１００〜４００、より好ましくは２００〜３００）の整数を表す。
また、ポリカチオン部分を構成する各モノマー単位の重合度であるｍ１３、ｍ１４及びｍ１５については、それぞれ互いに独立して、０〜５００（好ましくは０〜１００、より好ましくは１０〜１００、さらに好ましくは２０〜１００、さらにより好ましくは３０〜１００）の整数を表す（但し、ｍ１３、ｍ１４及びｍ１５の合計（ｍ１３＋ｍ１４＋ｍ１５）は、１０〜５００（好ましくは１０〜３００、より好ましくは２０〜２００、さらに好ましくは３０〜１５０、さらに好ましくは４０〜１２０、さらにより好ましくは５０〜１００、特に好ましくは６０〜７０）である。）。
一般式（５）で示されるカチオン性高分子の分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２３，０００〜４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００〜３４，０００である。また、個々のブロック部分については、ＰＥＧ部分の分子量（Ｍｗ）は、８，０００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１０，０００〜１２，０００であり、ポリカチオン部分の分子量（Ｍｗ）は、全体で１５，０００〜３０，０００であることが好ましく、より好ましくは１８，０００〜２２，０００である。
一般式（５）で示されるカチオン性高分子の製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ５１とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ５１と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ  ９６／３２４３４号公報、ＷＯ  ９６／３３２３３号公報及びＷＯ  ９７／０６２０２号公報等に記載のブロックコポリマーのＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。ＰＥＧセグメントのうち−Ｒ５１基と反対側の末端は、一般式（５）において「−Ｌ１」となる部分であり、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、下記一般式（６）：
−（ＣＨ２）ｐ２−ＮＨ２    （６）
〔式（６）中、ｐ２は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式（７）：
−Ｌ２ｂ−（ＣＨ２）ｑ２−Ｌ３ｂ    （７）
〔式（７）中、Ｌ２ｂは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ｂは、ＮＨ２又はＣＯＯＨを表す。ｑ２は１〜６（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
一般式（５）で示されるカチオン性高分子の具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各ブロック部分の側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等で置換又は変換する方法が挙げられる。（例えばＷＯ  ２００７／９９６６０号公報、Ｎ．Ｋａｎａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  １（４）４３９−４４４（２００６）等を参照）。
３．核酸
本発明の複合体において、コア部分の構成成分として内包する核酸は、１つの態様ではプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよく、例えば、目的遺伝子としては、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。また、ｓｉＲＮＡの塩基長は、通常、３０塩基未満（好ましくは１９〜２１塩基）であればよく、限定はされない。
但し、本発明においては、内包する核酸はプラスミドＤＮＡ及びｓｉＲＮＡのみには限定されず、必要に応じて、他の核酸、例えばアンチセンスオリゴＤＮＡ、デコイ核酸（二重鎖ＤＮＡ）、各種ＲＮＡ、各種抑制遺伝子（癌抑制遺伝子等）、並びに化学修飾核酸及び非天然型核酸類縁体（例えばＰＮＡ（ペプチド核酸））を内包することもできる。
ｓｉＲＮＡ等の核酸分子はポリアニオンとなるため、前記ブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と、静電的相互作用により結合（会合）することができる。
４．三元系ポリプレックス
本発明の複合体は、核酸とポリカチオンとでポリプレックスを形成させ、そこに電荷変換型ポリマーである前記アニオン性ポリマー（例えばｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ））を添加することにより得ることができる高分子化合物の複合体であり、三元系ポリプレックス（ポリイオンコンプレックス：ＰＩＣ）とも呼ばれる。
本発明の三元系ポリプレックスは、核酸とポリカチオン部分とが静電的相互作用をしてコア部分を形成し、その外側をアニオン性ポリマー（例えばｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ））が覆う形態となっている。
本発明の三元系ポリプレックスは、例えば、核酸とカチオン性高分子とを任意のバッファー（例えばＴｒｉｓバッファー等）中で混合してポリプレックスを形成させた後に、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）を添加することにより容易に調製することができる。
本発明のＰＩＣの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）による粒径が５〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｎｍである。
また、本発明の三元系ポリプレックスは、例えば、前記カチオン性高分子としてブロックコポリマー中のポリカチオン部分と核酸とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。具体的には、前記カチオン性高分子がさらにポリエチレングリコール部分を含む高分子であって、核酸と前記カチオン性高分子中のポリカチオン部分とがコア部分を形成し、前記カチオン性高分子中のポリエチレングリコール部分が前記コア部分の周囲にシェル部分を形成したものが挙げられる。
本発明の三元系ポリプレックスは、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡやｓｉＲＮＡ）とブロックコポリマーとを任意のバッファー（例えばＴｒｉｓバッファー等）中で混合することにより容易に調製することができるが、ブロックコポリマーと核酸との静電結合の前に、ブロックコポリマーのみがジスルフィド結合をして凝集等しないよう、十分な還元条件下で行うことが好ましい。還元条件は、例えばＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等を添加することにより調整することができる。
ブロックコポリマーと核酸との混合比は、限定はされないが、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（Ｎ）と、核酸中のリン酸基の総数（Ｐ）との比（Ｎ／Ｐ比）が、０．５〜１００であることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０、さらに好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜４、特に好ましくは１〜２である。ブロックコポリマーが一般式（５）のコポリマーである場合のＮ／Ｐ比も、上記と同様に０．５〜１０であることが好ましく、より好ましくは０．５〜４、さらに好ましくは１〜２である。この場合のＮは、ポリカチオン部分の側鎖に含まれる１級アミンと２級アミンの合計数である。
Ｎ／Ｐ比が上記範囲のときは、遊離のポリマーが存在せず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高い発現効率が得られる等の点で好ましい。なお、上記カチオン性基（Ｎ）は、内包する核酸中のリン酸基と静電的に相互作用してイオン結合を形成することができる基を意味する。
本発明の三元系ポリプレックスの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）による粒径が３０〜１５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは５０〜１００ｎｍである。
本発明の三元系ポリプレックスは、中性環境下（ｐＨ７．０〜７．４、好ましくはｐＨ７．４）のバッファー中ではマイナス電荷を帯びているが、酸性環境下（ｐＨ５．０〜６．８、好ましくはｐＨ５．５）のバッファー中ではプラス電荷に電荷が変換する。細胞外のｐＨは７．４であり、三元系ポリプレックスは血清蛋白質存在下でも安定である。しかしながら、一旦細胞に取り込まれてエンドソーム内に局在すると、ｐＨは５．５まで低下して、式（Ｉ）で示される化合物（好ましくはｃｉｓ−アコニチン酸アミドまたはシトラコン酸アミド）は分解され、エンドソーム膜を脆弱化させる機能を有するポリカチオン（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）等）がポリプレックス表面に露出する。このような作用により、電荷変換型三元系ポリプレックスは、例えばＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）等の非常に敏感な細胞に対しても低毒性かつ高い遺伝子導入効率を示す。
５．核酸送達デバイス
本発明においては、上述した三元系ポリプレックス（単に「ポリプレックス」ということもある）を含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の送達デバイスは、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であった核酸を、容易に安定化状態にすることができる。また、細胞内外のｐＨの変化を利用し、ポリプレックスのコア部分に内包した所望の核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用することができる。
例えば、所望のプラスミドまたはｓｉＲＮＡを内包したポリプレックスを含む溶液を被験動物に投与して、体内の標的細胞に取り込ませる。その後、細胞内に取り込まれたポリプレックスがエンドソームから細胞質に移行する。細胞質内のｐＨの変化に応答して、当該結合が開裂し、その結果、内包されている核酸と細胞内に存在するポリアニオンとの置換が促進され、ポリプレックスが解離することにより、所望の核酸を細胞質内に放出することができる。
本発明の送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
本発明の送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。よって本発明は、前記ポリプレックスを含む各種疾患の治療用の医薬組成物、当該医薬組成物を有効成分として含む各種疾患用の遺伝子治療剤、及び、前述したＰＩＣを用いる各種疾患の治療方法（特に遺伝子治療方法）を提供することもできる。
投与の方法及び条件は前記と同様である。また、各種疾患としては、例えば、癌（例えば、肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患、及び中枢系疾患等が挙げられる。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
６．核酸送達用キット
本発明の核酸送達用キットは、前記アニオン性ポリマー又は本発明のポリマー複合体を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば癌細胞等の各種標的細胞に対してｓｉＲＮＡを導入する、ＲＮＡｉを利用した遺伝子治療に好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、ポリマーの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、前記アニオン性ポリマー及びポリマー複合体以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、細胞内に導入する核酸、溶解用又は希釈用等の各種バッファー、溶解用バッファー、各種タンパク質、及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができ、使用目的と使用するポリマーの種類に応じて、適宜選択することができる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸（例えばプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ）をコア部分としたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を調製するために使用され、調製したＰＩＣは、標的細胞への核酸送達デバイスとして有効に用いることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本実施例はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
材料と方法
１．材料
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）、ｎ−ブチルアミン、エチレンジアミン（１，２−ジアミノエタン）、ジエチレントリアミン（ビス（２−アミノエチル）アミン）（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を購入して、使用前に再蒸留した。酢酸および塩酸を購入して、さらに精製することなく使用した（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）。１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ｃｉｓ−アコニチン酸無水物、無水コハク酸、ウシ血清アルブミンをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。β−ベンジル−Ｌ−アスパラテート−Ｎ−カルボキシ−無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を、Ｎｉｐｐｏｎ  ＯｉｌおよびＦａｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から得た。
２．合成
２−１．ＰＢＬＡ（ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラテート））の合成（２）
ｎ−ブチルアミンの末端アミノ基によって開始されるＢＬＡ−ＮＣＡの開環重合によってＰＢＬＡを調製した。ｎ−ブチルアミン（０．０４１７ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１０）に溶解した。８ｍＬのＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１０）中のＢＬＡ−ＮＣＡ（４．６０ｍｍｏｌ）溶液をｎ−ブチルアミンの溶液に添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下３５℃で４８時間撹拌した。得られるポリマーをジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に沈殿させた。粗沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄し、白色粉末として最終生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ測定から、ＢＬＡ単位の重合度（ＤＰ）は、１０２であると計算された。ＪＥＯＬ  ＥＸ  ３００分光計を使用して３００ＭＨｚにおいて全てのＮＭＲスペクトルを記録した。テトラメチルシランからダウンフィールドへの化学シフトをｐｐｍでレポートした。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ０．８７（３Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ１．２７（３Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ２．６９，３．１２（２０６Ｈ，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ４．２８（１０２Ｈ，ＣＯＣＨＮＨ），δ５．０７（２０４Ｈ，ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ），δ７．２７（５１０Ｈ，ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ），δ８．８８（１０２Ｈ，ＣＯＣＨＮＨ）．
２−２．ｐＡｓｐ（ＥＤＡ）（ポリ［（２−アミノエチル）アスパルトアミド］）（３）およびｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（ポリ（２−［（２−アミノエチル）アミノ］エチルアスパルトアミド））（４）の合成
ＰＢＬＡ（０．８０２ｍｍｏｌのベンジルエステル）をＮＭＰ（１０ｍＬ）に溶解した。ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）（４０．１ｍｍｏｌ）を溶液に添加して、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。得られた溶液を１０％酢酸水溶液（３０ｍＬ）に滴下した。中和溶液を０．０１Ｍ塩酸溶液（×３）および蒸留水（×３）に対して４℃で透析した。凍結乾燥の後に、白色粉末のｐＡｓｐ（ＤＥＴ）を塩酸塩として得た。１Ｈ  ＮＭＲにおいてベンジルピークは確認されなかった。ｐＡｓｐ（ＥＤＡ）の合成は、ＤＥＴの代わりにエチレンジアミン（ＥＤＡ）を使用することを除いて、同様に行った。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０，８７（３Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ１．２７（４Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ２．６３（４０８Ｈ，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＯＣＨ２ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），δ２．７６（２０４Ｈ，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），δ２．９４（２０４Ｈ，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），δ３．２０−３．５０（３０８Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）
２−３．ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）（ポリ［（Ｎ’−スクシニル−２−アミノエチル）アスパルトアミド］）（５）およびｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（ポリ（２−［（［Ｎ’−ｃｉｓ−アコニチル］−２−アミノエチル）アミノ］エチルアスパルトアミド））（６）の合成
ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（０．０５５ｍｍｏｌの一級アミン）を０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．０，５０ｍＬ）に溶解した。Ｃｉｓ−アコチニン酸無水物（２．７６ｍｍｏｌ）（Ａｃｏ）を溶液に添加し、０℃で３時間撹拌した。反応混合物をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ＝１０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を用いて精製した（×３蒸留水使用）。凍結乾燥の後に、最終生成物を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲから計算したところ、変換収率は９９％を超えた。ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）の合成は、ＡｃｏおよびｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の代わりにコハク酸無水物（Ｓｕｃ）およびｐＡｓｐ（ＥＤＡ）を用いることを除いて、同様に行った。ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−ｃｉｓＡｃｏ）（Ｄ２Ｏ）の１Ｈ  ＮＭＲ：δ０．８７（３Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ０１．２７（４Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），δ１．７８（２０４Ｈ，ＣＯＣＨＣ（ＣＯＯＮａ）ＣＨ２ＣＯＯＮａ），δ２．６７，δ２．７６，δ２．９４，δ３．２０（９２０Ｈ，ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＣＯＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），δ５．４３−５．７１（１０２Ｈ，ＣＯＣＨＣ（ＣＯＯＮａ）ＣＨ２ＣＯＯＮａ）．
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スキーム：
ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（４）、ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）（５）およびｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（６）の合成スキーム（ａ）ＢＬＡ−ＮＣＡ，ＤＭＦ／ＤＣＭ；（ｂ）ＤＥＴ（またはＥＤＡ），ＮＭＰ；（ｃ）ｃｉｓ−アコニチン酸無水物（またはコハク酸無水物），ｐＨ９．０緩衝液
３．プラスミドＤＮＡの調製
ＣＡＧプロモーターとルシフェラーゼをコードするプラスミドは、ＲＩＫＥＮ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｊａｐａｎ）によって提供された（Ｈ．Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，１９９１，１０８，１９３−１９９）。また、ＳＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ（Ｖｅｎｕｓ）のフラグメント（これは、黄色蛍光タンパク質の変異体であり、Ｆ４６Ｌの変異を含む（Ｔ．Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，２０，８７−９０））はＲＩＫＥＮによって提供され、このフラグメントをｐＣＡｃｃベクターに挿入した（ｐＣＡｃｃ＋Ｖｅｎｕｓ）。コンピテントなＤＨ５  Ｅ．ｃｏｌｉ中でこのプラスミドを増幅させ、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭａｘｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。プラスミド濃度は、２６０ｎｍの吸光度によって決定した。
４．三元系ポリプレックスの形成
種々のＮ／Ｐ比率（４〜８）でｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（１ｍｇ／ｍＬ）とプラスミドＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）とを単純に混合することによって、正のポリプレックスを得た。ここでＮ／Ｐ比率は、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）中のアミン単位のｐＤＮＡのリン酸単位に対する過剰なモル比率として規定される。ＲＴで１５分間インキュベートした後、正のポリプレックスにｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（またはｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ））溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）とｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（またはｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ））との間のモル比率は、１〜４の間で変動させた。ＲＴで１５分以上インキュベーションした後、三元系ポリプレックスを得た。
５．ポリプレックスのＤＬＳ測定（図５および６を参照のこと）
各ポリプレックスを水性緩衝液（ｐＨ５．５酢酸緩衝液（１０ｍＭ）またはｐＨ７．４Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ））中に希釈した。プラスミドＤＮＡの最終濃度は３３μｇ／ｍＬであった。各サンプルを３７℃でインキュベートした後、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（ｇｒｅｅｎ  ｂａｄｇｅ，ＺＥＮ３５００，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｌｔｄ．Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕ．Ｋ．）を使用して６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅイオンレーザーを用いて動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。
ＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）正のポリプレックス（Ｎ／Ｐ比率＝６）およびＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）三元系ポリプレックス（Ｎ／Ｐ  ｒａｔｉｏ＝６）のｐＨ７．４でのＤＬＳ分布を図５．に示す。
６．ゼータ電位測定（図７を参照のこと）
正のポリプレックスおよび三元系ポリプレックスのゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（ｇｒｅｅｎ  ｂａｄｇｅ，ＺＥＮ３５００，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｌｔｄ．Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕ．Ｋ．）を使用して６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅイオンレーザーを用いて、レーザードップラー電気泳動から決定した（検出角度１７３°、温度３７℃）。各複合体を水性緩衝液（ｐＨ５．５酢酸緩衝液（１０ｍＭ）またはｐＨ７．４  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ））中に希釈した。プラスミドＤＮＡの最終濃度は、３３μｇ／ｍＬであった。各サンプルを３７℃でインキュベートした。得られた電気泳動の移動度から、各複合体のゼータ電位をＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ方程式：ζ＝４πηυ／ｅ（式中、ηは溶媒の粘度であり、υは電気泳動移動度であり、そしてｅは溶媒の誘電率である）によって計算した。
７．インビトロトランスフェクション
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をコラーゲンでコーティングした２４ウェル培養プレートにまき、インスリン、ｈＥＧＦ、ＧＡ−１０００、ｈＦＧＦ−ＢおよびＦＢＳ（５％）を含む４００μＬのＥＢＭＴＭ−２中で一晩インキュベートした。４０μＬの各サンプル溶液を培地に添加した（１μｇプラスミドＤＮＡ／ウェル）。２４時間インキュベートした後、培地をサンプルを含まない新しい培地と交換し、その後さらに２４時間インキュベートした。４００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳで細胞を洗浄し、１００μＬのセルカルチャーＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液によって溶解した。溶解物のルシフェラーゼ活性は、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて光ルミッセンス強度から評価した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した溶解物中のタンパク質の量により、得られたルシフェラーゼを正規化した。Ｖｅｎｕｓ（ＹＦＰ）発現の観察は、Ｂｉｏｚｅｅｒｏ  ＢＺ−８０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて４５０−４９０ｎｍ（発光フィルター：５１０−５６０ｎｍ）の励起波長において行った。
８．細胞生存アッセイ（図８および９を参照のこと）
細胞毒性アッセイのために、ＨＵＶＥＣをサンプルと共に２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−９，Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）によって生存率を評価した。製造業者によって提供されたプロトコルに従って、４５０ｎｍにおいて吸光度を読み取ることによって各ウェルを測定した。同時にＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）のみと共にインキュベートしたコントロール細胞に対する相対値（％）として結果を表した。
９．アルブミン溶液中の複合体の安定性
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中（１０ｍＭ，ｐＨ７．４））によって各サンプルを希釈した。最終プラスミド濃度は３３μｇ／ｍＬであり、最終ＢＳＡ濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。３７℃でインキュベートした後、上記に説明したとおりにＤＬＳによって複合体のサイズを測定した。
１０．共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）観察（図４を参照のこと）
ラベルＩＴ核酸ラベリングキット（Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてＣｙ５でｐＤＮＡをラベルした。ＨＵＶＥＣ（３０，０００細胞）を３５ｍｍガラスベースディッシュ（Ｉｗａｋｉ，Ｊａｐａｎ）にまき、インスリン、ｈＥＧＦ、ＧＡ−１０００、ｈＦＧＦ−ＢおよびＦＢＳ（５％）を含む１ｍＬのＥＢＭＴＭ−２中で一晩インキュベートした。培地を新しい培地と交換した後、３μｇ  Ｃｙ５−ラベルｐＤＮＡを含むポリプレックスまたは三元系複合体の溶液１２０μＬ（Ｎ／Ｐ＝６；ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（またはｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）モル比率＝２）をガラスディシュに塗布した。インキュベートの後、培地を除去して細胞をＰＢＳで二回洗浄した。細胞内分布をＣＬＳＭで観察し、その後、酸性の後期エンドソームおよびリソソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色し、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）で染色した。ＬＳＭ  ５１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して（６３×対物レンズ（Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）使用）、ＬｙｓｏＴｒａｋｅｒ、Ｃｙ  ５、およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２について、それぞれ４８８ｎｍ（Ａｒレーザー）、６３３ｎｍ（Ｈｅ−Ｎｅレーザー）および７１０ｎｍ（Ｍａｉ  Ｔａｉレーザー）の励起波長で、ＣＬＳＭ観察を行った。
結果
プラスミドＤＮＡとポリカチオンとの間のポリプレックスを調製した。ポリカチオンとして、本発明者らは、ポリ｛Ｎ−［Ｎ’−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルトアミド｝（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））（図２Ａを参照のこと）を選択した。これは、本発明者らのグループによって、従来のポリカチオン（ＰＥＩを含む）と比較して細胞毒性の低い、エンドソームを破壊し膜を不安定化する部分であることが証明されている［９］。ポリカチオンの量が過剰であるので（Ｎ／Ｐ比率＝４〜８）、ポリプレックスは、およそ＋４０ｍＶのゼータ電位の正の表面電荷を示した。次いで、ポリプレックスに、１〜４モル等価の電荷変換型ポリマーであるポリ（Ｎ−｛Ｎ’−［（Ｎ’’−ｃｉｓ−アコニチル）−２−アミノエチル］−２−アミノエチル｝アスパルトアミド）（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ））（図２Ａを参照のこと）を添加して三元系ポリプレックスを形成した。ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）は、ｃｉｓ−アコニチン酸アミドの分解の後にエンドソームのｐＨにおいてエンドソームを効率的に破壊することもできるｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ａに変化することに注意されたい。各三元系ポリプレックスは、種々の電荷比率において、単峰型のサイズ分布を示し、過剰なｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）の存在下でさえも、動的光散乱（ＤＬＳ）測定で約１３０ｎｍの平均直径を有した。ＤＮＡを含まないｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）とｐＡｓｐ（ＤＥＴ）との間の二元ポリプレックスが形成した可能性もあるが、ＤＮＡを含有する三元系ポリプレックスが形成したことをゲル電気泳動アッセイによって確認した（材料と方法，および図５と６を参照のこと）。
三元系ポリプレックスの電荷変換の挙動は、図２Ｂに示されるゼータ電位の変化からモニタリングした。三元系ポリプレックスは、ｐＨ７．４においておよそ−４０ｍＶのゼータ電位を維持した。しかし、ｐＨ５．５でのゼータ電位は、負から正に段階的に変化し、ｃｉｓ−アコニチン酸アミド部分の分解に起因する電荷変換が実証された。ｐＨ５．５で２時間インキュベートした後、ゼータ電位は０ｍＶに達した。ネガティブコントロールとして、本発明者らは、類似の構造を有する非電荷変換型ポリカチオンであるポリ［（Ｎ’−スクシニル−２−アミノエチル）アスパルトアミド］（ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ））．（図２Ａを参照のこと）を使用した。ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）およびｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）からの三元系ポリプレックスは、ｐＨ５．５とｐＨ７．４でおよそ−４０ｍＶのゼータ電位を維持し、電荷変換の兆候はみられなかった（材料と方法、および図７を参照のこと）。
この電荷変換もまた、三元系ポリプレックスの劇的なサイズ変化を誘導した。図２Ｃに示されるように、三元系ポリプレックスは、ｐＨ７．４においておよそ１３０ｎｍの直径を維持したが、１時間後ｐＨ５．５において、サイズが急に増加した。２時間後、直径が１μｍを超える大きな凝集物が形成された。この凝集が起こる理由は、おそらく、ゼータ電位の測定のデータに示されるとおり、１時間後の部分的な電荷の中和と２時間後の完全な中和（ｐＨ５．５）に起因する反発力の低下によるものである。
インビボでの適用の可能性に関して、血清タンパク質の溶液中でのポリプレックスの安定性に焦点が当てられなければならない。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液において、三元系ポリプレックスは、もとの直径を維持する一方で、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の正のポリプレックスは、１時間インキュベーションの後でも直径が急に増加した（図３Ａを参照のこと）。三元系ポリプレックスの安定性の改善は、おそらく、アニオン性三元系ポリプレックスとＢＳＡとの間の反発力に起因するものであり、将来の全身適用のためのメリットとなり得る。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いてトランスフェクションを行った。ＨＵＶＥＣをトランスフェクトするのは非常に困難であり、毒性に対する感受性も非常に高いので、限られたトランスフェクション試薬しか利用できない［１０］。
ルシフェラーゼｐＤＮＡを用いて得られたトランスフェクションのデータを図３Ｂに要約した。一元ポリプレックスおよび三元系ポリプレックスの両方においてＤＮＡとｐＡｓｐ（ＤＥＴ）との間のＮ／Ｐ比率は６であり、この比率において、これらのポリプレックスは最も高いトランスフェクション効率を示した。２モル等量のｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）およびｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）を添加することによって三元系ポリプレックスを形成した。コントロールのｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）の三元系ポリプレックスは、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の一元ポリプレックスと同様のトランスフェクション効率を示したが、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）の電荷変換型三元系ポリプレックスは、ＥｘＧｅｎ  ５００（市販のトランスフェクション試薬の直鎖状ＰＥＩ）のトランスフェクション効率の１０倍を越えるトランスフェクション効率を示し、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックスよりも２倍高いトランスフェクション効率を示した。三元系複合体の負の表面電荷は細胞の取り込みおよびエンドソーム脱出のために有用なものではないにもかかわらず、図３Ａに示されるとおり血清タンパク質の存在下で複合体の安定性を増し、毒性を低減させることが可能であり、それゆえ、非電荷変換型三元系ポリプレックス（ＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｓｕｃ））は同様のトランスフェクション効率を示すことが可能であった。安定性および低毒性に基づいて電荷変換型エンドソーム破壊部分を三元系ポリプレックスに導入すると（ＤＮＡ／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ））、トランスフェクション効率はさらに上昇した。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ｐＤＮＡを使用したトランスフェクションの結果を、以下に記載の「材料と方法」において要約し（図８および９を参照のこと）、これらも三元系ポリプレックスシステムの適切なトランスフェクション効率を示した。
ＭＴＴアッセイによって測定された細胞毒性を図３Ｃに記載した。Ｎ／Ｐ比率が６および８であるとき（これは、最適なトランスフェクション比率である）、ＥｘＧｅｎ  ５００は生存率が１０％を下回る非常に高い毒性を示し、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックスもまた５０％まで生存率が低下した。生存率が低下したことについての主な原因の一つは、おそらく、ポリプレックスの正の表面電荷が膜毒性を誘導したことである［１１］。しかしながら、細胞の外側で負に帯電した表面を有している三元系ポリプレックスは、両方のＮ／Ｐ比率ともほとんど細胞毒性を示さなかった。
電荷変換型三元系ポリプレックスのエンドソーム脱出の増強を確認するために、Ｃｙ５ラベルのｐＤＮＡを使用して共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって、ポリプレックスの細胞内分布を調査した（図４を参照のこと）。ポリプレックスが酸性の細胞小器官から放出されると、黄色の蛍光は赤色へと変化する。正に帯電したｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックスは、３時間後でさえ顕著なエンドソーム脱出を示し、２４時間後には８０％超のＤＮＡの脱出が示された。３時間後に、両方の三元系ポリプレックスは、低エンドソーム脱出を示した。しかしながら、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）からの電荷変換型三元系ポリプレックスは、２４時間後に正のｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックスにより類似のエンドソーム脱出を示した。一方で、ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ｓｕｃ）からの非電荷変換型ポリプレックスの大部分（４０％超）は、依然としてエンドソーム中にあった。
ＣＬＳＭ像の定量的な分析を図３Ｄに要約する。電荷変換型ポリプレックスは、３時間までは非電荷変換型ポリプレックスと類似した挙動を示したが、７時間後には共局在化の程度が低く、最終的には２４時間後の正のｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ポリプレックスと類似した比率であった。エンドソーム酸性化とその後必要とされる電荷変換を考慮すると、ＣＬＳＭデータは合理的であり、ルシフェラーゼのトランスフェクションデータとも一致する。
要約すると、本発明者らは、細胞外部のｐＨにおいて負電荷を帯び、エンドソームのｐＨにおいて正に変化してエンドソームを破壊する三元系ポリプレックスを開発した。最終的には、本発明者らは、かなり高いトランスフェクション活性と、感受性の高い初代細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低い毒性に到達した。この三元系ポリプレックスシステムのトランスフェクション効率は、適切なリガンドのコンジュゲーション（例えば、インテグリンレセプターへの結合を通じて内在化を活性化するためのＲＧＤペプチド）によってより高めることができる［１２］。エンドソーム破壊部分を有する本発明者らの電荷変換型三元系ポリプレックスの概念は、感受性の高い種々の初代細胞に容易に適用することができ、この概念の効率的で化学毒性のないトランスフェクションは、生物医学の分野で最も重要かつ急を要する問題の一つである。また、負に帯電した血清タンパク質の存在下における三元系ポリプレックスの安定性は、インビボの遺伝子ベクターの開発のためにも有用である。
【実施例２】
【０００７】
実験方法
（１）Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）（ＰＬＬ）ホモポリマーの合成
三方コックを備えたナス型フラスコを真空乾燥させ、アルゴン（Ａｒ）雰囲気下でＬｙｓ（ＴＦＡ）−ＮＣＡ（１．０１ｇ，３．７７ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＭＳＯ（８ｍＬ）を加えて溶解させた。開始剤としてｎ−ブチルアミン（５．４ｍｇ，７３．８μｍｏｌ）をモノマー溶液に加え、３５℃の恒温槽中で４８時間ほど攪拌した。反応終了後、激しく攪拌した過剰量のジエチルエーテル中に重合溶液をゆっくりと滴下していき、ポリマーを沈殿させた。約１時間攪拌を続け、ポリマーがほぼ全てが沈殿した後に、上澄み溶液をデカンテーションにて除去した。沈殿したポリマーは、室温にて減圧乾燥させた。１Ｈ  ＮＭＲによる分析から、連鎖長（リジンの重合度（ＤＰ））は５２であった。
５０ｍｇのＰ［ｌｙｓ（ＴＦＡ）］（ＤＰ：５２）をＭｅＯＨ  ５ｍｌに溶解した後、１Ｎ  ＮａＯＨ  ０．５ｍｌを加え３５℃、６時間撹拌した。反応終了後、透析膜（スペクトラム社製、ＭＷ  ＣｕｔＯｆｆ：６０００〜８０００）を用いて弱酸性のＨＣｌ溶液に対して３回、純粋に対して３回透析を行い、凍結乾燥をしてポリマーを回収した。
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（２）ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ｘ））（ｘ＝ａｃｏ  ａｎｄ  ｓｕｃ）の合成
ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ｘ））（ｘ＝ａｃｏ  ａｎｄ  ｓｕｃ）は、実施例１と同様にして合成した。カチオン性ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の連鎖長（アスパラギン酸ユニット数）は１３３のものを用いた。
（３）ｐＤＮＡ／ＰＬＬ  ｐｏｌｙｐｌｅｘの作成方法および三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘの作成方法
（ｉ）ｐＤＮＡ／ＰＬＬカチオン性ｐｏｌｙｐｌｅｘ
ＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解させたｐＤＮＡ（ＣＡＧ−Ｌｕｃ）とＰＬＬ（ＤＰ＝５２）をＮ／Ｐ＝２になるように混合し、４℃にて一晩静置してｐＤＮＡ／ＰＬＬポリプレックス（２／３ＯＤ）を調整した。
（ｉｉ）三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘ
上述のカチオン性ポリプレックスｐＤＮＡ／ＰＬＬ溶液に対し、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））またはＰＡｓｐ（ＥＤＡ（ｓｕｃ））を所定量添加して４℃にて３時間静置させた後、三元系ポリプレックスを調整した。
（４）三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘの粒径およびゼータ電位測定
三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘの粒径およびゼータ電位測定は、実施例１と同様に行った。
（５）トランスフェクション（Ｈｕｈ−７およびＨＵＶＥＣ）
２４穴ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに１ｗｅｌｌあたり２万個の細胞をまき、２４時間培養後、３１μｌのポリプレックス（ｐＤＮＡ濃度：２／３ＯＤ）を添加した。２４時間細胞とポリプレックスを接触させ、培地（ＤＭＥＭ）の交換を行った後さらに２４時間培養を行った。遺伝子発現活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ法にて評価した。
培養細胞としては、ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ−７）と正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた。
（６）フローサイトメーターによる取り込み量の評価
６穴ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに１ｗｅｌｌあたり４万個の細胞（Ｈｕｈ−７）をまき、２４時間培養後、蛍光色素であるＣｙ５にてラベル化されたｐＤＮＡを用いて調整したポリプレックス（ｐＤＮＡ濃度：２／３ＯＤ）を６０μｌ添加した。２４時間細胞後にポリプレックスを接触させ、２〜３回ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行った。測定はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＢＤ  ＬＳＲＩＩアナライザーを用いた。
（７）共焦点レーザー顕微鏡観察
３５ｍｍシャーレに、細胞（Ｈｕｈ−７）を５万個／ｗｅｌｌまき、２４時間培養後、蛍光色素であるＣｙ５にてラベル化されたｐＤＮＡを用いて調製したポリプレックス（ｐＤＮＡ濃度：２／３ＯＤ）を９０μｌ添加した。２４時間細胞を行い、次いでポリプレックスを接触させた後、５μＭ  Ｌｙｓｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ（２０μＬ）とＨｏｅｃｈｓｔ（１０μＬ）を用いて核およびエンドソームを染色した。測定を行う直前に、３回ＰＢＳ洗浄を行い、２ｍｌの培地を加え観察を行った。共焦点レーザー顕微鏡はカールツァイス社製のＬＳＭ−５１０を用いた。
実験結果
（１）Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）（ＰＬＬ）ホモポリマーの合成
１Ｈ  ＮＭＲによる分析から、脱保護前のポリマーＰ［Ｌｙｓ（ＴＦＡ）］の連鎖長（リジンの重合度（ＤＰ））は５２であった。またゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による分析の結果、オリゴマーなどを含まず、単分散性の高いポリマーであった（図１０）。
脱保護後のポリマーサンプルに対しも、同様に１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＰＣによる分析を行った。
その結果、Ｐ［Ｌｙｓ（ＴＦＡ）］側鎖の保護基ＴＦＡの除去を確認し、さらに水系ＧＰＣによる分析からは主鎖の加水分解などは認められなかった。ポリマーの回収率は７７％であった。
（２）ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］およびＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］の合成
ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］およびＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］は、実施例１と同様にして合成した。
（３）ｐＤＮＡ／ＰＬＬ  ｐｏｌｙｐｌｅｘおよび三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘの物理化学的評価（粒径およびゼータ電位測定）
カチオン性のポリプレックスｐＤＮＡ／ＰＬＬに対して、ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］またはＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］を添加して三元系ポリプレックスの形成を試みた。ゼータ電位測定からは、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ｘ））をｐＤＮＡに対して等倍，２倍，３倍，４倍，５倍モルと順に添加することにより、負の表面電荷を示唆する結果が得られた（図１１）。さらに、光散乱測定からはＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ｘ））の添加量に関わらず、約１１０〜１３０ｎｍの粒径を有するポリプレックスの形成が認められた。これらの結果から、２次凝集などを伴わずに、安定した粒径を有するアニオン性の三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘが形成されたと考えられる。
（５）トランスフェクション（Ｈｕｈ−７およびＨＵＶＥＣ）
ＰＡｓｐ（ＥＤＡ（ｓｕｃ））を添加した三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘにおいては、遺伝子発現活性は何も加えていないカチオン性ｐＤＮＡ／ＰＬＬと同等もしくはそれ以下であった。一方、ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］を添加した三元系ｐｏｌｙｐｌｅｘの遺伝子発現活性は、ｐＤＮＡ／ＰＬＬと比較してＨｕｈ−７に対しては約２０倍、ＨＵＶＥＣでは約１０倍の活性上昇が認められた（図１２）。ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］はｐＨに応答してポリマーの電荷が反転するＣｈａｒｇｅ−Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ機能を有しているため、この特性が発現活性上昇に寄与したと思われる。
（６）フローサイトメーターによる取り込み量の評価
カチオン性ポリプレックスであるｐＤＮＡ／ＰＬＬのみ、そしてこれにＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］またはＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］を添加して得られた２つの三元系ポリプレックスに対する細胞内取り込み評価を行った。フローサイトメーターによる分析の結果、どのポリプレックスにおいてもほぼ同様の取り込み量であった（図１３）。
ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］添加系においては、若干の取り込み量増加が見られたが、この増加量では、２０倍もの遺伝子発現活性上昇を説明できない。つまりポリプレックスの細胞内動態挙動の違いが遺伝子発現活性上昇に反映しているものと予想される。
（７）共焦点レーザー顕微鏡観察
カチオン性ポリプレックスであるｐＤＮＡ／ＰＬＬのみ、そしてこれにＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］またはＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］を添加して得られた２つの三元系ポリプレックスに対する細胞内動態観察を共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。カチオン性ポリプレックスｐＤＮＡ／ＰＬＬおよびＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］を添加した三元系ポリプレックスにおいては、黄色の領域が多く観察されている（図１４）。これはポリプレックスがエンドソーム内にトラップされた状態を反映している。一方で、ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］を添加した三元系ポリプレックスにおいては、赤い領域が多く分布している。これはポリプレックスがエンドソームから脱出し、細胞質中に移行した状態を強く示唆している（図１４）。
またさらに、これらの共焦点レーザー顕微鏡画像を元に、エンドソーム内にトラップされたポリプレックスを定量的に評価した。カチオン性ポリプレックスｐＤＮＡ／ＰＬＬおよびＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］を添加した三元系ポリプレックスにおいては、７０％以上がトラップされたままであった（図１５）。ＰＬＬホモポリマーおよびその誘導体を用いたポリプレックスは、エンドソームから脱出できる性質が非常に乏しい。また、ＰＡｓｐ［ＥＤＡ（ｓｕｃ）］は、酸性ｐＨ応答して電荷を反転させる機能を持ち合わせていないため、三元系ポリプレックス化した場合においても細胞内動態の改善、つまりエンドソームからの脱出効率を向上させることはできなかった。一方、ＰＡｓｐ［ＤＥＴ（ａｃｏ）］を添加した三元系ポリプレックスにおいては、トラップされたままのポリプレックスは約４０％程度であった（図１５）。つまり、ポリプレックスがエンドドームから効率よく脱出していることを示しており、この挙動が遺伝子発現活性の大きな上昇に寄与したと考えられる。
【実施例３】
【０００８】
実験方法
（１）Ｎ−スクシイミジルオクタデカノエートの合成
Ｎ−スクシンイミジルオクタデカノエートの合成は、公知方法［Ｎ．Ｍ．Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｗ．Ｅ．Ｌｉｎｄｓｅｌｌ，Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｎ．Ｐｒｅｓｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６１（２００５）８８７５−８８８７．］に従って行った。ステアリン酸（１．８７ｇ，６．５６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７６ｇ，６．５６ｍｍｏｌ）を８０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＷＳＣ）（１．２５ｇ，６．５６ｍｍｏｌ）と４８時間反応させた。その後、水で洗浄し、ＤＣＭで２回抽出、ＭｇＳＯ２で乾燥することによって白色の粉末を得た（収量１．４ｇ，収率５６％）。ステアリン酸のカルボキシル基の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲによって算出したところ９６％であった。
（２）ステアロイル基導入ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）の合成
ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）（分子量２０，０００）とＤＩＰＥＡをメタノールに溶解し、少量のジクロロメタンに溶解したＮ−スクシンイミジルオクタデカノエートと４℃で２４時間反応させた。反応後、ジエチルエテール中で再沈し、濾過したサンプルをメタノール／水（１：１  ｖ／ｖ）に溶解した後、４℃で０．０１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に対して３回、蒸留水に対して１回透析を行った。その後、凍結乾燥によって回収することによって、側鎖にステアロイル基が１５％、２８％および４５％導入されたｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）（ＰＬＬ−ＳＴ）を合成した。
（３）ｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックスの調製と遺伝子ノックダウン効率の評価及びＭＴＴアッセイ
ｓｉＲＮＡ／ＰＬＬ−ＳＴポリプレックスは、ＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解させたｓｉＲＮＡとＰＬＬ−ＳＴをｓｉＲＮＡのリン酸残基とリシン残基の比が１．４になるように混合し、その後、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））を異なる混合比で混合して４℃にて３時間静置させることにより、三元系ポリプレックスを調製した。
ｓｉＲＮＡ阻害アッセイにおいては、４０，０００個／ｗｅｌｌでＨｕｈ−７細胞を播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００でＧＬ３ルシフェラーゼとＲｅｌｌｉｎａルシフェラーゼを発現するプラスミドを遺伝子導入し、ＧＬ３ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックス（ｓｉＲＮＡ濃度：１００ｎＭ）を加えて４８時間培養した。ｓｉＲＮＡによるＧＬ３ルシフェラーゼの発現阻害効果は、ＧＬ３およびＲｅｌｌｉｎａに対する基質を添加した後のルシフェラーゼ発光量の比（ＧＬ３／Ｒｅｌｌｉｎａ）を算出することにより評価した。
一方、ＭＴＴアッセイにおいては、１０，０００個／ｗｅｌｌでＨｕｈ−７細胞を播種し、ＧＬ３ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックス（ｓｉＲＮＡ濃度：１００ｎＭ）を加えて４８時間培養した。その後、細胞生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。
実験結果
（１）ｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックスの遺伝子ノックダウン効率の評価
ｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックスの遺伝子ノックダウン効率は、ステアロイル基の導入効率の増加に伴って増強され、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））を添加した場合は、混合比が０．７および１．４の時は遺伝子ノックダウン効率が増強されるが、混合比が２．８および５．６の時は遺伝子ノックダウン効率が低下することが確認された（図１６（Ａ））。ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））の混合比が０．７および１．４の時は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）が露出されることによって、ポリプレックスのエンドソーム脱出が促進され、混合比が２．８および５．６の時は、ポリプレックスの表面がアニオン性になることによってその細胞内取り込み量が減少するものと考えられ、その結果として図１６（Ａ）の結果が得られたものと考えられる。
（２）ｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックスの細胞毒性の評価
ｓｉＲＮＡを搭載した三元系ポリプレックスの細胞毒性は、ＰＬＬ−ＳＴのステアロイル基導入率が２８％および４５％であってＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））の混合比が０．７および１．４の三元系ポリプレックスにおいて、増加が認められたが、ＰＬＬ−ＳＴのステアロイル基導入率が１５％の三元系ポリプレックスおよびＰＬＬ−ＳＴのステアロイル基導入率が２８％および４５％であってＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））の混合比が２．８および５．６の三元系ポリプレックスにおいては、減少することが明らかになった（図１６（Ｂ））。これらの結果は、ＰＬＬのステアロイル基の過度の導入はその細胞毒性を増加させうるが、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））の添加によって細胞毒性を低減することができることを示している。
すなわち、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ａｃｏ））を添加し、三元系ポリプレックスを調製することによって、内核を構成するポリカチオンのｓｉＲＮＡ導入活性を維持しつつ、その細胞毒性を低減させることができるものと考えられる。
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明により、電荷変換型三元系ポリプレックスが提供される。本発明のポリプレックスは、核酸を、毒性を惹起することなく高効率で細胞にデリバリーすることが可能であり、遺伝子治療等に極めて有用である。
【図２】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
2009133968.tif 000043
【図１６】
2009133968.tif 000044
【国際調査報告】
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