(57)【要約】  測定に必要な液体試料量（液体試料の必要量）を削減して微量化することが可能であり、かつ、より高精度な測定を行うことができるバイオセンサおよびその製造方法を提供する。クロマトグラフィを利用して、液体試料を、展開層において展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサであって、展開層の厚みを薄くする（２０〜１３５μｍとする）ことにより、液体試料の必要量を減少させる。このように、展開層の厚みを薄くするようにコントロールすることで、分析精度を良好に維持したままで、各々の液体試料における被検査物質の測定に合わせて、液体試料の必要量を減少できる。
2009136476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィを利用して、液体試料を、展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法であって、前記展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要添加量を減少させることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項２】
クロマトグラフィを利用して、液体試料を展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサであって、前記展開層の厚みが、２０〜１３５μｍであることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３】
展開層を支持する支持体と、液体試料を前記展開層に添加するための試料添加部と、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬部と、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬を固定化して保持する試薬固定化部と、を有することを特徴とする請求項２記載のバイオセンサ。
【請求項４】
展開層が、単層または複数層からなることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
免疫クロマトセンサからなることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
ワンステップ測定の免疫クロマトセンサからなることを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
展開層が、多孔質膜からなることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中の被検査物質を展開層へ展開させて測定するバイオセンサに関し、特に、測定に必要な液体試料量を削減するバイオセンサおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年では、在宅医療、および医院や診療所などの地域医療の充実、さらには早期診断、および緊急性の高い臨床検査の増加などに伴い、臨床検査の専門家でなくとも、それを用いて、簡易かつ迅速に、高精度の測定を実施可能である分析装置が要望されるようになってきている。このため、煩雑な操作を伴わず、短時間で信頼性の高い測定を行うことのできる、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）向けの小型分析装置が、脚光をあびている。【０００３】
ＰＯＣＴとは、一般的に、開業医、専門医の診察室、病棟および外来患者向け診療所などの「患者の近いところ」で行われる検査の総称であり、検査結果を即座に医師が判断し、迅速な処置を施し、治療の過程や、予後のモニタリングまでを行うという診療の質の向上に大きく役立つものとして注目されている方法である。このような小型分析装置による検査は、中央検査室での検査に比べて、検体の運搬や、設備にかかるコストや、不要な検査にかかる費用を抑えることができ、トータルの検査費用の削減が可能になるといわれており、ＰＯＣＴ市場は、病院経営合理化の進む米国では、急速に拡大してきており、日本をはじめ世界的にみても成長市場となっていくことが予想されている。【０００４】
免疫クロマトセンサに代表されるような乾式のバイオセンサは、試薬の調整を必要とせず、測定対象となる血液や尿などの液体試料中の被検査物質を分析することが可能なものであり、液体試料中の被検査物質を、簡便かつ迅速に分析する場合に非常に有用なため、ＰＯＣＴの代表として今日多数実用化されている。また、市場からは、いつでもどこでも誰でも測定できるように、液体試料は可能な限り微量であることが要求されている。【０００５】
一般的な免疫クロマトセンサは、液体試料を添加する試料添加部と、複数層からなる展開層と、展開層の終端に備えられた吸水部とにより構成されている。そして、この展開層の一部に、液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬部と、被検査物質あるいは標識試薬と特異的に反応する試薬を固定化している試薬固定化部とを設けている。このような免疫クロマトセンサでは、液体試料を試料添加部に必要量添加し、展開層に液体試料を展開させることにより測定が開始される。また、標識試薬部にて液体試料中の被検査物質と標識試薬とが反応し、試薬固定化部に固定化して保持された試薬が被検査物質あるいは標識試薬と特異的に反応する。そして、試薬固定化部のシグナルに基づいて被検査物質の定性あるいは定量測定が行われる。【０００６】
これまで、免疫クロマトセンサを構成する各部材は、吸水性の材料が用いられているため、実際に展開する容積以上の液体試料量が必要であり、大量の液体試料がなければ測定することができなかった。そのため、液体試料が血液の場合は、上腕採血など痛みを伴う採血にて十分な検体量を採取しなければならないという問題があった。また、試料添加部へ液体試料を添加する場合、一般的には、遠心分離機などを用いて、有形成分である血球と血漿とを分離する操作を行った後に、ディスペンサやスポイトなどの用具を用いて規定量添加しなければならず、過剰量の検体が必要であった。そこで、液体試料量を削減する方法が検討されてきた。【０００７】
測定に必要な液体試料量（液体試料の必要量）を減少させる方法としては、微量の液体試料を大量の希釈液にて希釈したものを添加する方法があるが、操作が煩雑になり、簡易性および迅速性に欠けるという問題があった。また、微量の液体試料を添加した後に大量の展開液を添加する方法があるが、こちらも簡易性および迅速性に欠ける。その他に、バイオセンサを全体的に小型化して、各部材（例えば、試料添加部や展開層）の幅や長さを縮小させて、液体試料の必要量を減少させることが考えられる。しかしながら、このようにバイオセンサの各部材の幅や長さを縮小させることによりコンパクト化しすぎると、バイオセンサの製造が難しくなり、例えば、測定対象箇所である試薬固定化部も小さくなって製造ばらつきが生じやすくなるなど、測定精度が悪化するという課題があった。【０００８】
そこで、近年、この種のバイオセンサにおいて微量な液体試料でも測定可能にする他の方法として、特許文献１に示されるように試料添加部を、液体不透過性の材料により間隙部を形成して構成するものがあり、この方法によれば間隙部へ液体試料が規定量だけ吸引され、吸引された液体試料が損失なく展開層へ十分量展開するため、簡易かつ高精度の測定を実施可能となる。つまり、従来は吸水性の材料で構成されていた試料添加部を、液体不透過性の材料で間隙部を形成する構成としたものであり、これにより、添加した液体試料が試料添加部に残留することなく展開層へ展開可能となった。そのため、これまでのセンサ構成材料では試料添加部に残留してしまっていた液体試料の損失がなくなり、液体試料の必要量を削減できた。ここで、間隙部は、展開層との間に液体試料の流入可能な空間として形成されており、間隙部の体積により流入量を規定することができる。これにより、予め一定体積を定量するなどの煩雑な操作を必要としない、簡易な測定が可能となった。【０００９】
また、特許文献２には、無機塩やアミノ酸、糖類などの細胞収縮剤を担持し、細胞を収縮させた後に細胞成分を分離する、もしくは、細胞を収縮後あるいは収縮しながら細胞成分が混在する状態で展開する方法が開示されており、この方法により、展開層へ展開する液体試料が十分量得られるようになったため、液体試料の前処理や展開液の必要性のない、簡便かつ迅速、高精度な測定が可能となる。つまり、液体試料中の細胞成分が、細胞収縮剤と接触することによって収縮され、クロマト担体上を液体試料が目詰まりすることなく、効率よく展開することができるようになった。細胞収縮剤が試料添加部である間隙部に保持された場合、液体試料が間隙部へ流入すると同時に細胞収縮剤が溶解および拡散し、液体試料中の細胞成分が収縮する。そのため、細胞成分を含む血液などの液体試料を、予め遠心分離などの操作をすることなく、直接、間隙部に添加することでも支障を来たさなくなった。これにより、細胞成分の分離の必要性がなくなり、細胞成分が混在した状態で展開可能となった。例えば、血液では、血球と血漿を分離しなくてよいので、半分以下の添加量で測定することができる。しかしながら、前記の方法によっても、液体試料の削減量には限りがあり、患者の負担を減らすため、より微量の液体試料にて測定したいという市場要求への対応には限界があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ  ０１／９０７５４号公報
【特許文献２】特許第３６５５２８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的な免疫クロマトセンサでは、指先からの穿刺により容易に出る量以上の血液を必要とする場合が多い。ＰＯＣＴ用途のバイオセンサは、簡便かつ迅速に測定できることが求められており、検体の採取方法としては上腕採血などを回避し、ランセット（穿刺、傷口作成用メス）などを用いて指先から痛みを伴うことなく得られる程度の極微量であることが望ましい。【００１２】
液体試料の必要量を減少させる方法としては、特許文献１などに開示された方法がある。部材材料の変更や構成の変更により、液体試料の損失を削減できたため、液体試料の必要量も幾分か削減することができた。これらの方法により、比較的微量な液体試料でも簡易かつ高精度な測定が実現した。従来のクロマトセンサに比べて微量の添加量で測定可能となり、液体試料が血液の場合、指先からの穿刺により得られる血液でも測定可能となった。しかしながら、この方法によっても液体試料の削減量には限界があり、患者の負担を軽減するために極微量にすることは困難であった。【００１３】
本発明は、前記欠点や課題に鑑みてなされたものであり、液体試料の必要量を削減して微量化することが可能であり、かつ、より高精度な測定を行うことができるバイオセンサおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記欠点や課題を解決するために、本発明のバイオセンサの製造方法は、クロマトグラフィを利用して、液体試料を、展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法であって、前記展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量を減少させることを特徴とする。【００１５】
なお、ここでいう展開層とは、多孔質膜や任意の部材にて形成された微細空間など液体試料が展開する流路のことである。また、厚みとは、液体試料が展開する部分の高さであり、例えば、展開層が多孔質膜である場合はその膜厚を指し、μＴＡＳ（micro total analysis systems）やＭＥＭＳ（micro electro mechanical systems）に代表されるような任意の部材にて形成された微細空間である場合は空間の高さを指す。展開層の厚みを薄くすることにより、展開する液体試料の容量が減少することになる。【００１６】
このように、展開層の厚みを薄くするようにコントロールすることで、展開層の体積を削減し、展開に必要な液体試料量がコントロールできることから、各々の液体試料における被検査物質の測定に合わせて、必要な液体試料の添加量を減少させることが可能となる。【００１７】
また、本発明のバイオセンサは、クロマトグラフィを利用して、液体試料を展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサであって、前記展開層の厚みが、２０〜１３５μｍであることを特徴とする。【００１８】
すなわち、従来のバイオセンサでは展開層の厚さは、１５０μｍ前後であったが、これよりも展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量を減少させることができる。【００１９】
なお、ここでいうバイオセンサとは、酵素、抗原、抗体などの特異的反応性を有するたんぱく質や、さらにＤＮＡやＲＮＡなどのリボ核酸等を含む生体物質を利用して、液体試料中に含まれる被検査物質を特異的に検出し、定量、半定量、定性判定するセンサのことである。【００２０】
また、上記のように展開層の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層の厚みに起因するバックグランドが低減するため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度を向上させることができる。また、バイオセンサの幅や長さを無理に縮小しなくても、液体試料の必要量を減少できるので、バイオセンサの取扱いが不便となることがなく、また、測定対象箇所である試薬固定化部も小さくならないので、試薬固定化部の縮小化による被検査物質の測定精度の悪化を生じることもない。【００２１】
また、本発明のバイオセンサは、展開層を支持する支持体と、液体試料を前記展開層に添加するための試料添加部と、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬部と、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬を固定化して保持する試薬固定化部と、を有することを特徴とする。【００２２】
この構成により、液体試料の必要量を減少できるので、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬や、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬の量を従来よりも削減することができる。また、展開層の厚みが薄くなり強度がおちた場合でも、強度の高い支持体を用いることでバイオセンサの取り扱いやすさを良好に維持できる。なお、展開層は、直接支持体上に形成したり、支持体に貼り合わせたりするなど任意の構成を用いてよい。なお、支持体は、紙、金属、ＡＢＳやＰＥＴなどの合成樹脂材料の他、任意の材料を選択可能であるが、好ましくは液体不透過性の材料を用いるとよい。【００２３】
また、本発明のバイオセンサは、展開層を、単層または複数層から構成したことを特徴とし、これにより、単層または複数層から構成した展開層に確実に試薬を保持させた状態で、液体試料を展開させることが可能になり、液体試料の分析において、簡易で迅速な、より正確性の高い分析を行うことができる。【００２４】
また、本発明のバイオセンサを免疫クロマトセンサにより構成してもよい。ここで、免疫クロマトセンサとは、クロマト展開する担体（展開層）上で、抗原抗体反応を利用して液体試料中の被検物質の検出を行うセンサのことである。通常、免疫クロマトセンサでは液体試料の量が多くなるが、展開層の膜厚を薄くすることで微量の液体試料で測定可能な免疫クロマトセンサを提供できる。また、免疫クロマトセンサの使用者が誤判定することのない高い正確性と、いつでもどこでも誰でも使用可能な簡易操作とを実現できる。【００２５】
また、本発明のバイオセンサを、ワンステップ測定の免疫クロマトセンサにより構成してもよい。なお、前記ワンステップ測定とは、液体試料が血液の場合、血液をランセット、あるいは注射器等で採取した後に、血液に対して遠心分離を含めたいかなる前処理を行うことも無く、バイオセンサに添加することである。また血液以外の液体試料の場合でも、細菌溶液の破砕などの前処理を行う必要がないことである。これにより、免疫測定法でありながら、前処理や洗浄などの煩雑な操作を必要としない、簡易で迅速な、より正確性の高い分析を行うことができる。【００２６】
また、本発明のバイオセンサにおいて、展開層は多孔質膜から構成してもよい。これにより、被検査物質を含む液体試料のクロマト展開が毛細管現象で自動的に行われるようになる。また、試薬固定化部においては、多孔質膜を用いることにより三次元での試薬固定が可能となり固定化密度が高くなるため、測定に十分なシグナルを得ることができる。なお、ここで示す多孔質膜とは、被検査物質を含む液体試料のクロマト展開が毛細管現象で自動的に行われる程度の溶液浸透性を持ち、かつ、標識試薬と特異的に反応する試薬などを任意の手段で固定可能なものであればよい。例えば、セルロース類膜（濾紙、ニトロセルロース膜など）、ナイロン膜、ガラス繊維膜、多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレンなど）などがある。好ましくは、ニトロセルロース純品やニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とする多孔質膜を使用するとよいが、その他の材料でも何ら問題はない。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、液体試料を、展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法において、展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量を減少させることができ、また、液体試料を展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサとして、展開層の厚みが、２０〜１３５μｍであるものを用いることにより、液体試料の必要量を減少させることができて、ごく微量の液体試料から、より高精度な被検査物質の分析を簡易、且つ迅速に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施の形態に係るクロマトグラフィを利用したバイオセンサを示す分解斜視図
【図２】同実施の形態に係るクロマトグラフィを利用したバイオセンサを示す斜視図
【図３】同実施の形態に係るバイオセンサ上の試薬固定化部におけるシグナル測定状態を示す斜視図
【図４】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜（展開層）の厚みに応じた液体試料の必要な添加量を示した図
【図５】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度結果を示した図
【図６】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度比（各々の吸光度／吸光度の平均値）結果を示した図
【図７】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜厚毎のＣＶ値結果を示した図
【図８】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜の孔径および膜厚を変更した場合の吸光度比（各々の規格における吸光度の平均値／従来規格における吸光度の平均値）結果を示した図
【図９】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜の孔径および膜厚を変更した場合のＣＶ値結果を示した図
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明のバイオセンサの実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
【００３０】
図１および図２は、本実施の形態１によるクロマトグラフィを利用したバイオセンサを示す分解斜視図および斜視図である。
【００３１】
図１において、１は液体試料が展開するニトロセルロースなどで構成された展開層である。なお、展開層１に使用する材料は、ニトロセルロースに限らず、液体試料を展開可能な流路を形成できる材料であれば、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維等の任意の材料でよい。本実施の形態では展開層が単層の場合を例に挙げて説明する。なお、単層とは一つの層で構成されていることを意味し、複数層とは、複数層が平行あるいは垂直に配置され、該複数層の第１の層に添加された液体試料が、各々の層に順次移動可能なように構成されていることを意味する。
【００３２】
２は展開層１の一部に坦持された標識試薬部を示し、この標識試薬部２には、液体試料の展開により溶出可能な乾燥状態で、液体試料中の被検査物質に対する金コロイド標識抗体（標識試薬）が保持されている。標識試薬は、抗体などの特異的反応物に金コロイドなどの標識物を標識したもので、後述する試薬固定化部３，４における結合を検出する手段として用いられるものであり、前述した金コロイドはほんの一例に過ぎず、金属あるいは非金属コロイド粒子、酵素、タンパク質、色素、蛍光色素、ラテックスなどの着色粒子など、必要に応じて任意に選択可能である。なお、標識試薬部２は、展開層１上に設ける必要はなく、後述する試薬固定化部３，４よりも、液体試料の展開方向の上流側の任意の位置であれば何ら問題ない。
【００３３】
３は第１の試薬固定化部、４は第２の試薬固定化部を示し、これらの第１の試薬固定化部３と第２の試薬固定化部４とは、展開層１における標識試薬部２よりも、液体試料の展開方向の下流側に坦持された状態で設けられている。これらの第１および第２の試薬固定化部３、４に用いられる試薬は、液体試料中の被検査物質に対して特異的反応の可能な抗体などの試薬であり、例えば抗体の場合では、どちらの抗体も前記標識試薬とは異なるエピトープで結合するもので、乾燥状態で固定化されている。さらに、第１の試薬固定化部３に用いる抗体と、第２の試薬固定化部４に用いる抗体とは、液体試料中の被検査物質に対する親和性が異なる抗体により構成されている。
【００３４】
前記第１および第２の試薬固定化部３、４に使用する抗体は、標識試薬、および被検査物質との複合体を形成できれば良く、従って、被検査物質に対するエピトープもしくは親和性は、同じであっても異なっていてもいずれでも良い。さらに、２つの抗体の親和性は異なるが、エピトープが同じでも何ら問題はない。
【００３５】
また、図１では、試薬固定化部が２箇所設けられている例を示しているが、これは必ずしも２箇所である必要はなく、１箇所以上あれば、その目的に応じて自在に選択できる。また、展開層１上の形状についても、ライン状である必要はなく、スポット形状、もしくは、文字形状、鍵型形状など、自由に選択できる。図１における第１の試薬固定化部３と第２の試薬固定化部４とは空間的に離れているが、これらも必ずしも離れている必要はなく、見かけ上一本のライン状に見えるように接触させることも可能である。
【００３６】
５は液体不透過性シート材を示し、ここでは、透明ＰＥＴテープで構成される。該液体不透過性シート材５は、試料添加部６となる微細空間に接続する部分、および前記液体試料の到達する終端を除き、展開層１を密着被覆する構造を持つものである。
【００３７】
このように液体不透過性シート材５により展開層１を被覆することで、試料添加部６以外への点着を遮断して保護すると共に、外部からの汚染を防止する作用を持たせることができるばかりでなく、液体試料の展開時に、液体試料が展開しながら蒸発してしまうことを防ぎ、展開層１上の反応部分である試薬固定化部３、４、および標識試薬部２を必ず液体試料が通過し、前記反応部分において液体試料中の被検査物質との反応を効率よく行うようにすることができる。ここでの外部からの汚染とは、該展開層１上の反応部分に対して不用意に液体試料が接触することや、被験者が手などで直接展開層１に接触することなどを意味する。前記展開層１を被覆する液体不透過性シート５としては、第１の試薬固定化部３や第２の試薬固定化部４の呈色状態を反射光、散乱光または透過光などを用いて測定するので、透明な材料を用いることが好ましく、前記試薬固定化部３、４を覆う部分は、シグナルを測定する部分であるから、少なくとも透過可能な状態に維持しなければならない。
【００３８】
また、より高精度な測定を必要とする場合には、展開層１の上部を、特に前記標識試薬部２、および前記試薬固定化部３，４の部分を含んで密着密閉し、かつ、液体試料の展開方向に対して平行な側面を、同様に密着密閉させる構造をとることもできる。
【００３９】
７は展開層１における開放部である。８は展開層１を支持する基板であり、この基板８はＰＥＴフィルムなどの液体不透過性シート材で構成される。なお、基板８をなす液体不透過性シート材としては、ＰＥＴフィルムの他、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルなどの合成樹脂材料、金属、ガラスなど、任意の材料を用いることが可能である。
【００４０】
前記基板８は展開層１を補強する役割を持つとともに、血液、唾液、尿など感染の危険性のある試料を用いる場合には、それを遮断する作用をも有する。さらには、展開層１が湿潤した場合に光透過性を帯びる場合などにおいては、前記基板８に、光を遮断する効果を持たせることも可能である。基板８は、透明、半透明、不透明のいずれをとってもよいが、光学的に反応度合を測定する際、透過光を用いて測定する場合は透明、反射光を測定する場合は不透明の材料を用いるなど、用途に応じて任意の材料を用いればよい。
【００４１】
９は微細空間形成材であり、この微細空間形成材９は、液体試料が毛細管現象により流入する空間、すなわち試料添加部６となる微細空間を形成する働きを持ち、透明ＰＥＴフィルムを積層させたもので構成される。また、微細空間形成材９は、液体試料添加後のバイオセンサを取扱う際に、液体試料の外部への汚染を保護する役割をも有する。この微細空間形成材９には、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等、液体不透過性の材料を用いることが可能であり、透明もしくは半透明であることが好ましいが、透明でなくて有色であってもよい。不透明の材料の場合には任意の材料で構成できる。
【００４２】
試料添加部６は微細空間形成材９で形成された微細空間であり、前記試料添加部６は、毛細管現象により液体試料を流入させることができる。また、該試料添加部６は前記展開層１と接続された配置とされており、液体試料を該試料添加部６へ流入させることにより、該液体試料の展開層１への展開を開始させることができる。
【００４３】
次に、本実施の形態のバイオセンサを用いた、液体試料中の被検査物質の測定方法について、図１、図２を用いて説明する。
【００４４】
液体試料を、試料添加部６に接触させると、毛細管現象により機械的操作を必要とせずに、自然に液体試料が前記試料添加部６中に流入し、展開層１上を流れて展開する。液体試料の流入量が十分であるかどうかは、微細空間形成材９を透して確認できる。また、液体試料の添加量を、一定量確保する必要がある場合は、前記試料添加部６の微細空間の体積を一定体積とすることで、精度良く添加量を規定することができ、さらに、前記液体試料を一定量以上必要とする場合には、必要量以上の体積を保持させる構造をとることで、これを実現することができる。
【００４５】
前記試料添加部６内には、細胞成分収縮試薬１０を配設している。細胞成分収縮試薬１０は、前記液体試料中において細胞成分を含む場合に設置すべき試薬であり、細胞成分を含まない液体試料を用いる場合には、特に必要ではない。また、細胞成分収縮試薬１０は、細胞を収縮する効果のある塩化カリウムや塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム塩等を含む無機化合物や、グリシン、グルタミン酸等のアミノ酸、プロリン等のイミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖類、グルシトール等の糖アルコール等を用いても、同様に実施可能である。このような細胞成分収縮試薬１０を含む系は、特に液体試料として全血を用いる場合に有効である。
【００４６】
前記試料添加部６に添加されて流入した液体試料は、前記試料添加部６と展開層１との接触部分から、展開層１へと展開する。標識試薬部２に液体試料が到達したとき、標識試薬の溶出が開始される。液体試料中に被検査物質が存在する場合、標識試薬と被検査物質とが反応しながら展開が進み、液体試料は第１の試薬固定化部３に到達する。被検査物質が液体試料中に存在する場合には、その量に応じて、第１の試薬固定化部３に固定化された抗体と、液体試料中の被検査物質と、標識試薬との複合体が形成される。
【００４７】
次に、第２の試薬固定化部４に液体試料が到達し、該液体試料中に前記被検査物質が存在する場合には、前記被検査物質の量に応じて、第２の試薬固定化部４に固定化された抗体と、被検査物質と、標識試薬との複合体を形成する。
【００４８】
前記液体試料は、第２の試薬固定化部４に到達した後、さらに、展開層１における開放部７に到達する。開放部７は、前記液体不透過性シート５がなくて開放されているため、前記液体試料が到達した後、あるいは到達しながら揮発もしくは蒸発する。さらには、開放部７に前記液体試料が滲み出て、開放部７における展開層１の上部にのみ、前記液体試料が、前記試料添加部６の微細空間内の展開層１上部にある液体試料と同じ高さ、もしくは準じた高さまで至る。一般的には、開放部７の代わりに吸水部を設けることが多いが、それは、展開層１に使用する材料に対して、より保水効果、吸水効果の高い多孔質材料を用いることで、液体試料を吸水あるいは吸引し、展開層１上を通過させる働きや、測定時間を短縮できる働きを有するものとすることができる。前記開放部７はそれらと同様の効果を持たせたものであり、特に前記試料添加部６もしくは前記開放部７を用いる手法は、例えば、液体試料が指先からの穿刺による血液などであるように、液体試料が微量である場合に適している。
【００４９】
前記液体試料中の被検査物質の測定値は、前記第１の試薬固定化部３および第２の試薬固定化部４における標識試薬由来のシグナルを測定することで得られる。
【００５０】
図３に、バイオセンサ上の試薬固定化部３、４における標識試薬由来のシグナルを測定している状態のシグナル測定部を示す。ここで、１１は、バイオセンサを用いて液体試料中の被検査物質の濃度を測定して分析する分析装置における、前記展開層１に光を照射するための照射部、１２は前記照射部１１から前記展開層１に照射された光の反射または透過光などの光学的変化を検出する受光部であり、前記シグナル測定部は、これらの照射部１１および受光部１２を利用することによって、試薬固定化部３、４における標識試薬由来のシグナルを測定する。試薬固定化部３、４では、その他の部分に比べてシグナルが上昇し、その強度は、試薬固定化部３、４の呈色度合に応じて変化する。
【００５１】
なお、前記照射部１１としては、可視領域、もしくは近可視領域であることが好ましく、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ；発光ダイオード）、もしくはＬＤ（Ｌａｓｅｒ  Ｄｉｏｄｅ；レーザーダイオード）など必要に応じて選択可能である。
【００５２】
そして、前記シグナル測定部（照射部１１および受光部１２）によって測定された試薬固定化部３、４における標識試薬由来のシグナルを、演算処理することで、被検査物質の測定値を求めることができる。このときに得られる被検査物質の測定値は、前記シグナル測定部にて得た標識試薬由来のシグナルより検量線を用いて得られた該被検査物質の値である。ここで述べる検量線とは、シグナル測定部にて得たシグナルと、液体試料中の被検査物質の値との関係を示した回帰式である。未知の量の被検査物質を含む液体試料を測定する場合に、シグナル測定部にて得られたシグナルを代入することで、その未知液体試料中の被検査物質の測定値を算出することができる。また、シグナルを測定する手段としては、光学的変化、電気的変化や電磁的変化を読み取るものであったり、画像としてとらえるものであったり、任意の手段を用いてよい。
【００５３】
また、前記の反応例は、固定化試薬と標識試薬とに抗体を用いて抗原を検出するための抗原抗体反応を利用したサンドイッチ反応の場合について述べたが、試薬の選択により、競合反応を利用した反応系でも何ら問題はない。
【００５４】
また、特異的な反応を利用したい場合、前記バイオセンサ上の任意の反応を形成する系の試薬成分で構成することにより、抗原抗体反応以外の反応による測定を行うことも可能である。特異的反応をする、ある特定の物質と、それに対する特異結合物質との組合せとしては、抗原とそれに対する抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素とインヒビター、酵素と補因子、酵素と基質、糖鎖を有する化合物とレクチン、ある抗体とその抗体に対する抗体、レセプター分子とそれに対する抗体、特異結合活性が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるいは、他の成分と結合してなる複合性物質を利用した反応系などが例示される。
【００５５】
次に、以下の実施例により、本発明を実施する方法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。
【００５６】
（実施例１．）
（展開層の厚みを薄くした場合の全血ＣＲＰの定量）
ニトロセルロース膜からなる展開層１上に抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１の試薬固定化部３、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２の試薬固定化部４、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬部２を含むバイオセンサである免疫クロマトセンサを製造した。この免疫クロマトセンサを図１，図２に示す。図中、免疫クロマトセンサは、抗体が固定化された第１の試薬固定化部３、第２の試薬固定化部４と、それよりも液体試料を添加する添加部分に近い部分にある、抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体が含有された領域である標識試薬部２と、試料添加部６とを有している。
【００５７】
この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。
【００５８】
ａ）免疫クロマトセンサの調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備した。この抗体溶液は溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜（展開層１）上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に第１の試薬固定化部３である固定化抗体ラインが得られた。
【００５９】
次に同様にして、試料添加部より下流側に２ｍｍ離れた部分に、抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を塗布した。ニトロセルロース膜の厚みは、１４５μｍ、９５μｍ、８５μｍ、７５μｍ、６５μｍ、５５μｍの６種類を用意した。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行った。次に、０．０５％シュクロースモノラウレートを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った後に、ニトロセルロース膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。これにより、ニトロセルロース膜（展開層１）上に第１の試薬固定化部３である第１の固定化抗体ライン、および第２の試薬固定化部４である固定化抗体ラインが得られた。
【００６０】
金コロイドは、還流中の０．０１％塩化金酸１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ８．９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ｃを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ８．９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識試薬）を調製した。前記標識試薬溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識試薬を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ５％スクロース・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識試薬を洗浄単離した。この標識試薬を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が１５０となるように調製して、４℃で貯蔵した。前記標識試薬溶液を溶液吐出装置にセットして、固定化抗ＣＲＰ抗体Ａおよび固定化抗ＣＲＰ抗体Ｂが塗布された乾燥膜上の第１の固定化ライン（第１の試薬固定化部３）および第２の固定化ライン（第２の試薬固定化部４）から離れた、液体試料添加開始方向から順番に、標識試薬、第１の固定化ライン、第２の固定化ラインの位置関係になるように塗布した後に、膜を真空凍結乾燥させた。これによって、試薬固定化部３、４および標識試薬部２を備えた反応層担体が得られた。
【００６１】
次に、調製された標識試薬を含む反応層担体を、厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板８上に貼り付け、標識試薬部２から終端部分にかけて、液体不透過性シート材５としての透明テープを貼り付けた。その後、レーザーを用いて、２．０ｍｍの幅に切断した。切断後、透明テープを貼り付けていない始端部分上に、厚さ１００μｍの透明ＰＥＴを積層させて作製した微細空間形成材９を貼り付け、微細空間（幅２．０ｍｍ×長さ７．０ｍｍ×高さ０．３ｍｍ）から成る試料添加部６を形成した。前記空間形成材９は、予め１０％塩化カリウム水溶液を点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行い、これによって、塩化カリウムが乾燥状態で保持された細胞成分収縮試薬１０を保持する微細空間形成材９を作製したものである。こうして免疫クロマトセンサを製造した。
【００６２】
ｂ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度（被検査物質濃度）が０．０３ｍｇ／ｄＬ、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．３ｍｇ／ｄＬ、１ｍｇ／ｄＬの血液を液体試料として調製した。
【００６３】
ｃ）免疫クロマトセンサ上の呈色度合の測定
展開層１となるニトロセルロース膜の厚みを、従来規格である１４５μｍから１００μｍ以下に変更することで、ニトロセルロース膜（展開層１）の厚みはほぼ３０％以上薄くなる。厚みを薄くすると、容積が減少するため、おのずと測定に必要とされる液体試料量も３０％以上削減することができる。図４に、各々のニトロセルロース膜の厚みに対して必要な液体試料量を示した。例えば、従来使用していた１４５μｍの厚みのものでは液体試料が５μＬ必要であったが、５５μｍの厚みのものでは液体試料の量が２μＬでも試薬固定化部３、４である固定化抗体ラインの位置まで十分到達するようになり、ごく微量での測定が実現できる。
【００６４】
前記免疫クロマトセンサの試料添加部６に、前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を適量添加して、開放部７の方向へと展開処理させて、抗原抗体反応をさせた。そして、該免疫クロマトセンサへの試料添加から５分後に、試薬固定化部３、４における呈色状況を計測した。すなわち、図３に示すように、６３５ｎｍの半導体レーザー光源からなる照射部１１と、受光素子（フォトダイオード）で構成される受光部１２とにより、免疫クロマトセンサを走査し、第１の固定化部３および第２の固定化部４における前記標識試薬結合量を前記展開層１からの反射散乱光を演算処理して、吸光度として結果が得られる。ここでは試薬固定化部３、４が２箇所であり、前記試料添加部６に対して上流側に親和力の高い抗体を使用した。そして、光源（照射部１１）および受光素子（受光部１２）を固定し、免疫クロマトセンサを移動させることにより走査して、得られた波形から、ピーク値（反射吸光度）を読み取った。なお、このような波形を得るために、免疫クロマトセンサを固定して光源および受光素子を移動させて走査することも可能である。
【００６５】
前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血において、各ＣＲＰ濃度につき免疫クロマトセンサ５個で測定を行った（個数Ｎ＝５での測定）。図５は、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度結果を示す。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は個数Ｎ＝５での測定を行った際の吸光度の平均値で、ＣＲＰ濃度別にプロットしたものである。いずれのＣＲＰ濃度においても、ニトロセルロース膜の厚みの違いにより吸光度が変化する傾向は見られなかった。ニトロセルロース膜からなる展開層１の厚みを薄くしても、得られる吸光度が定量測定をするのに十分であることは、図５からも明らかである。ニトロセルロース膜の厚みを薄くしても、定量測定に問題なく、液体試料の量を削減できることがわかる。
【００６６】
このように、液体試料を、展開層１において展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法として、前記展開層１の厚みを薄くすることで、各々の液体試料における被検査物質の測定に合わせて、必要な液体試料の添加量を減少させることが可能となる。具体的には、バイオセンサにおける展開層１の厚みを、従来のもの（１５０μｍ前後、例えば厚み１４５μｍ）よりも薄い２０〜１３５μｍとすることで、液体試料の必要量を従来よりも減少させることができる。
【００６７】
また、上記のように展開層１の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層１の厚みに起因するバックグランドを低減できるため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度を向上させることができる。また、バイオセンサの幅や長さを無理に縮小しなくても、液体試料の必要量を減少できるので、バイオセンサの取扱いが不便となることがなく、かつ、測定対象箇所である試薬固定化部３、４も小さくならないので、試薬固定化部３、４の縮小化による被検査物質の測定精度の悪化を生じることもない。
【００６８】
また、液体試料の必要量を減少することで、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬や、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬との量を従来よりも削減することができるため、製造コストも削減することが可能である。
【００６９】
（実施例２．）
（展開層の厚みを薄くした場合の全血ＣＲＰの定量）
ニトロセルロース膜からなる展開層１上に抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１の試薬固定化部３、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２の試薬固定化部４、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬部２を含むバイオセンサである免疫クロマトセンサを製造した。この免疫クロマトセンサを図１，図２に示す。図中、免疫クロマトセンサは、抗体が固定化された第１の試薬固定化部３、第２の試薬固定化部４と、それよりも液体試料を添加する添加部分に近い部分にある、抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体が含有された領域である標識試薬部２と、試料添加部６とを有している。
【００７０】
この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。
【００７１】
ａ）免疫クロマトセンサの調製
ニトロセルロース膜の厚みは、１４５μｍ、９５μｍ、８０μｍ、６５μｍの４種類を用意した。実施例１と同様の製造方法にて免疫クロマトセンサを作製し、以下の測定を行
った。
【００７２】
ｂ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度（被検査物質濃度）が０．１ｍｇ／ｄＬであり、ヘマトクリット値を２０％、３０％、４０％、５０％とした血液を液体試料として調製した。
【００７３】
ｃ）免疫クロマトセンサ上の呈色度合の測定
前記免疫クロマトセンサの試料添加部６に、前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を適量添加して、開放部７の方向へと展開処理させて、抗原抗体反応をさせた。そして、該免疫クロマトセンサへの試料添加から５分後に、試薬固定化部３、４における呈色状況を計測した。各ヘマトクリット値につき免疫クロマトセンサ５個で測定を行った（個数Ｎ＝５での測定）。図６は、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度比の結果を示す。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は吸光度比で、ヘマトクリット値別にプロットしたものである。なお、吸光度比とは、各ヘマトクリット値における吸光度が、全てのヘマトクリット値における吸光度の平均値に対してどの程度乖離しているかを表すものであり、ニトロセルロース膜の厚み、および、ヘマトクリット値の違いによる測定結果への影響度合が確認できる。前記吸光度比は、（「各ヘマトクリット値における個数Ｎ＝５での測定を行った際の吸光度の平均値」／「全てのヘマトクリット値における吸光度の平均値」）で算出した。膜厚１４５μｍでは、各ヘマトクリット値の吸光度比が非常にばらつき、ヘマトクリット値の影響を大きく受けていることがわかるが、膜厚を薄くすることで吸光度比のばらつきは緩和していった。また、吸光度比が膜厚の違いにより大きく変化する傾向は見られていない。ニトロセルロース膜からなる展開層１の厚みを薄くしても、得られる吸光度が定量測定をするのに十分であることは、図６からも明らかである。ニトロセルロース膜の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量が削減可能となり、かつ、ヘマトクリット値の影響が緩和されて高精度な定量測定を実施できることがわかる。膜厚のコントロールにより、液体試料の必要量の増減を図ることが可能である。
【００７４】
また、図７はニトロセルロース膜厚毎のＣＶ値結果を示すものである。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は各ヘマトクリット値において個数Ｎ＝５で測定した際のＣＶ値で、ヘマトクリット値別にプロットしたものである。膜厚１４５μｍでは、ＣＶが悪く、特にヘマトクリット値が高い場合のＣＶ値の悪化は顕著であるが、膜厚を薄くすることでヘマトクリット値の影響は小さくなり、いずれもＣＶは良好であった。上記の結果より、展開層１の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層１の厚みに起因するバックグランドを低減できるため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度が向上するばかりか、ニトロセルロース膜の厚みが薄くなるにつれ、ヘマトクリット値などの液体試料の特性による液体試料の展開速度のばらつきの差が生じ難くなる。そのため、ニトロセルロース膜の厚みを薄くしたものでは、膜厚１４５μｍの場合に比べてヘマトクリット値の影響を受け難くなり、呈色度合のばらつきが小さくなりＣＶが良くなった。液体試料の添加量を削減しても、感度および精度が向上したセンサを実現することができた。
【００７５】
（実施例３．）
（展開層の膜厚および孔径を変更した場合の全血ＣＲＰの定量）
ニトロセルロース膜からなる展開層１上に抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１の試薬固定化部３、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２の試薬固定化部４、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬部２を含むバイオセンサである免疫クロマトセンサを製造した。この免疫クロマトセンサを図１、図２に示す。図中、免疫クロマトセンサは、抗体が固定化された第１の試薬固定化部３、第２の試薬固定化部４と、それよりも液体試料を添加する添加部分に近い部分にある、抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体が含有された領域である標識試薬部２と、試料添加部６とを有している。この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。
【００７６】
ａ）免疫クロマトセンサの調製
多孔質担体であるニトロセルロース膜の規格が、従来規格である膜厚１４５μｍでかつ孔径５μｍであるものと、膜厚が１３５μｍでかつ孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍであるもの、膜厚が１１５μｍでかつ孔径が３μｍ、５μｍであるもの、膜厚が９５μｍでかつ孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍ、１０μｍであるもの、膜厚が８０μｍでかつ孔径が５μｍ、８μｍ、１０μｍであるもの、膜厚が６０μｍでかつ孔径が５μｍ、８μｍ、１０μｍであるものの１６種類を用意した。実施例１と同様の製造方法にて免疫クロマトセンサを作製し、以下の測定を行った。
【００７７】
ｂ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度（被検査物質濃度）が０．３ｍｇ／ｄＬの血液を液体試料として調製した。
【００７８】
ｃ）免疫クロマトセンサ上の呈色度合の測定
前記免疫クロマトセンサの試料添加部６に、前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を適量添加して、開放部７の方向へと展開処理させて、抗原抗体反応をさせた。そして、該免疫クロマトセンサへの試料添加から５分後に、試薬固定化部３、４における呈色状況を計測した。各々のニトロセルロース膜の規格において免疫クロマトセンサ５個で測定を行った（個数Ｎ＝５での測定）。図８は、ニトロセルロース膜の厚みおよび孔径を変更した場合の吸光度比の結果を示す。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は吸光度比で、孔径別に吸光度比をプロットしたものである。なお、吸光度比とは、各々のニトロセルロース膜の規格での吸光度が、従来規格である１４５μｍにおける吸光度に対してどの程度乖離しているかを表すものであり、ニトロセルロース膜の厚みおよび孔径の違いによる測定結果への影響度合が確認できる。前記吸光度比は、（「各々のニトロセルロース膜の規格における個数Ｎ＝５での測定を行った際の吸光度の平均値」／「従来規格である１４５μｍにおけるＮ＝５測定を行った際の吸光度の平均値」）で算出した。図８からわかるように、ニトロセルロース膜の膜厚および孔径の違いにより吸光度が変化する傾向は見られない。ニトロセルロース膜からなる展開層１の厚みおよび孔径が変化しても、得られる吸光度が定量測定をするのに十分であることは、図８からも明らかである。
【００７９】
また、図９はニトロセルロース膜の規格毎のＣＶ値結果を示したものである。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は個数Ｎ＝５で測定した際のＣＶ値で、孔径別に各ＣＶ値をプロットしたものである。従来規格である膜厚１４５μｍでのＣＶ値に対して、膜厚を薄くすることでＣＶ値は良くなった。特に、１１５μｍ以下でのＣＶ値の良化は顕著であった。上記の結果より、展開層１の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層１の厚みに起因するバックグランド値を低減できるため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度が向上し、呈色度合のばらつきを小さくすることが可能となり、ＣＶが良化した。前記図８および図９からも明らかなように、ニトロセルロース膜の孔径に関係なく、展開層１の厚みを薄くすることで、感度および精度の良化したバイオセンサを実現することができた。
なお、ここで示す孔径とは、ニトロセルロース膜の孔径の平均値を示している。ニトロセルロース膜の断面を走査電子顕微鏡により観察した画像をもとに測定したが、孔径の測定においてこの方法に限らず、バルブポイント法や水銀圧力法など任意の孔径測定方法を用いて測定を行っても何ら問題ない。また、ニトロセルロースのような多孔質担体においては、記載した孔径値の単一な孔で構成されているものではなく、平均孔径に対して大および小の孔径へ分布して種々の孔径の孔が混在している。具体的に説明するため平均孔径の数値をもとに比較例を挙げて説明しており、孔径値については記載した数値に限定されるものではない。
【００８０】
また、上記実施例では、血液中のＣＲＰ濃度の測定例を述べたが、測定される液体試料としては、例えば、水や水溶液、尿、血漿、血清、唾液などの体液、固体および粉末や気体を溶かした溶液などがあり、その用途としては、例えば、血液検査や尿検査、水質検査、便検査、土壌分析、食品分析などがある。また、被検査物質としては、抗体、免疫グロブリン、ホルモン、酵素およびペプチドなどのタンパク質およびタンパク質誘導体や、細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫ならびにそれらの産物および成分などの感染性物質、治療薬および乱用薬物などの薬物および腫瘍マーカーが挙げられる。具体的には、例えば、絨毛性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン、濾胞形成ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン、副腎脂質刺激ホルモン、エストラジオール、前立腺特異抗原、肝炎、ミオグロビン、ＣＲＰ、心筋トロポニン、ＢＮＰ、ＨＢＡ１Ｃ、アルブミン等でも何ら問題はない。また、水質検査や土壌分析などの環境分析、食品分析などにも実施可能である。簡便かつ迅速で、高感度・高性能な測定が実現でき、また、いつでもどこでも誰でも測定が可能であるため、ＰＯＣＴ向けの分析装置としても利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のバイオセンサは、例えば、抗原抗体反応のような任意の反応に基づいて、微量な液体試料中の被検査物質を分析検出し、定量または半定量する際に、簡便かつ迅速で、高感度・高性能な測定に用いることができ、また、いつでもどこでも誰でも測定が可能であるため、ＰＯＣＴ向けの分析装置用のバイオセンサとして有用である。
【図１】
2009136476.tif 000003
【図２】
2009136476.tif 000004
【図３】
2009136476.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2009136476.tif 000008
【図７】
2009136476.tif 000009
【図８】
2009136476.tif 000010
【図９】
2009136476.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月16日(2010.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中の被検査物質を展開層へ展開させて測定するバイオセンサに関し、特に、測定に必要な液体試料量を削減するバイオセンサおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年では、在宅医療、および医院や診療所などの地域医療の充実、さらには早期診断、および緊急性の高い臨床検査の増加などに伴い、臨床検査の専門家でなくとも、それを用いて、簡易かつ迅速に、高精度の測定を実施可能である分析装置が要望されるようになってきている。このため、煩雑な操作を伴わず、短時間で信頼性の高い測定を行うことのできる、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）向けの小型分析装置が、脚光をあびている。
【０００３】
ＰＯＣＴとは、一般的に、開業医、専門医の診察室、病棟および外来患者向け診療所などの「患者の近いところ」で行われる検査の総称であり、検査結果を即座に医師が判断し、迅速な処置を施し、治療の過程や、予後のモニタリングまでを行うという診療の質の向上に大きく役立つものとして注目されている方法である。このような小型分析装置による検査は、中央検査室での検査に比べて、検体の運搬や、設備にかかるコストや、不要な検査にかかる費用を抑えることができ、トータルの検査費用の削減が可能になるといわれており、ＰＯＣＴ市場は、病院経営合理化の進む米国では、急速に拡大してきており、日本をはじめ世界的にみても成長市場となっていくことが予想されている。
【０００４】
免疫クロマトセンサに代表されるような乾式のバイオセンサは、試薬の調整を必要とせず、測定対象となる血液や尿などの液体試料中の被検査物質を分析することが可能なものであり、液体試料中の被検査物質を、簡便かつ迅速に分析する場合に非常に有用なため、ＰＯＣＴの代表として今日多数実用化されている。また、市場からは、いつでもどこでも誰でも測定できるように、液体試料は可能な限り微量であることが要求されている。
【０００５】
一般的な免疫クロマトセンサは、液体試料を添加する試料添加部と、複数層からなる展開層と、展開層の終端に備えられた吸水部とにより構成されている。そして、この展開層の一部に、液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬部と、被検査物質あるいは標識試薬と特異的に反応する試薬を固定化している試薬固定化部とを設けている。このような免疫クロマトセンサでは、液体試料を試料添加部に必要量添加し、展開層に液体試料を展開させることにより測定が開始される。また、標識試薬部にて液体試料中の被検査物質と標識試薬とが反応し、試薬固定化部に固定化して保持された試薬が被検査物質あるいは標識試薬と特異的に反応する。そして、試薬固定化部のシグナルに基づいて被検査物質の定性あるいは定量測定が行われる。
【０００６】
これまで、免疫クロマトセンサを構成する各部材は、吸水性の材料が用いられているため、実際に展開する容積以上の液体試料量が必要であり、大量の液体試料がなければ測定することができなかった。そのため、液体試料が血液の場合は、上腕採血など痛みを伴う採血にて十分な検体量を採取しなければならないという問題があった。また、試料添加部へ液体試料を添加する場合、一般的には、遠心分離機などを用いて、有形成分である血球と血漿とを分離する操作を行った後に、ディスペンサやスポイトなどの用具を用いて規定量添加しなければならず、過剰量の検体が必要であった。そこで、液体試料量を削減する方法が検討されてきた。
【０００７】
測定に必要な液体試料量（液体試料の必要量）を減少させる方法としては、微量の液体試料を大量の希釈液にて希釈したものを添加する方法があるが、操作が煩雑になり、簡易性および迅速性に欠けるという問題があった。また、微量の液体試料を添加した後に大量の展開液を添加する方法があるが、こちらも簡易性および迅速性に欠ける。その他に、バイオセンサを全体的に小型化して、各部材（例えば、試料添加部や展開層）の幅や長さを縮小させて、液体試料の必要量を減少させることが考えられる。しかしながら、このようにバイオセンサの各部材の幅や長さを縮小させることによりコンパクト化しすぎると、バイオセンサの製造が難しくなり、例えば、測定対象箇所である試薬固定化部も小さくなって製造ばらつきが生じやすくなるなど、測定精度が悪化するという課題があった。
【０００８】
そこで、近年、この種のバイオセンサにおいて微量な液体試料でも測定可能にする他の方法として、特許文献１に示されるように試料添加部を、液体不透過性の材料により間隙部を形成して構成するものがあり、この方法によれば間隙部へ液体試料が規定量だけ吸引され、吸引された液体試料が損失なく展開層へ十分量展開するため、簡易かつ高精度の測定を実施可能となる。つまり、従来は吸水性の材料で構成されていた試料添加部を、液体不透過性の材料で間隙部を形成する構成としたものであり、これにより、添加した液体試料が試料添加部に残留することなく展開層へ展開可能となった。そのため、これまでのセンサ構成材料では試料添加部に残留してしまっていた液体試料の損失がなくなり、液体試料の必要量を削減できた。ここで、間隙部は、展開層との間に液体試料の流入可能な空間として形成されており、間隙部の体積により流入量を規定することができる。これにより、予め一定体積を定量するなどの煩雑な操作を必要としない、簡易な測定が可能となった。
【０００９】
また、特許文献２には、無機塩やアミノ酸、糖類などの細胞収縮剤を担持し、細胞を収縮させた後に細胞成分を分離する、もしくは、細胞を収縮後あるいは収縮しながら細胞成分が混在する状態で展開する方法が開示されており、この方法により、展開層へ展開する液体試料が十分量得られるようになったため、液体試料の前処理や展開液の必要性のない、簡便かつ迅速、高精度な測定が可能となる。つまり、液体試料中の細胞成分が、細胞収縮剤と接触することによって収縮され、クロマト担体上を液体試料が目詰まりすることなく、効率よく展開することができるようになった。細胞収縮剤が試料添加部である間隙部に保持された場合、液体試料が間隙部へ流入すると同時に細胞収縮剤が溶解および拡散し、液体試料中の細胞成分が収縮する。そのため、細胞成分を含む血液などの液体試料を、予め遠心分離などの操作をすることなく、直接、間隙部に添加することでも支障を来たさなくなった。これにより、細胞成分の分離の必要性がなくなり、細胞成分が混在した状態で展開可能となった。例えば、血液では、血球と血漿を分離しなくてよいので、半分以下の添加量で測定することができる。しかしながら、前記の方法によっても、液体試料の削減量には限りがあり、患者の負担を減らすため、より微量の液体試料にて測定したいという市場要求への対応には限界があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ  ０１／９０７５４号公報
【特許文献２】特許第３６５５２８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的な免疫クロマトセンサでは、指先からの穿刺により容易に出る量以上の血液を必要とする場合が多い。ＰＯＣＴ用途のバイオセンサは、簡便かつ迅速に測定できることが求められており、検体の採取方法としては上腕採血などを回避し、ランセット（穿刺、傷口作成用メス）などを用いて指先から痛みを伴うことなく得られる程度の極微量であることが望ましい。
【００１２】
液体試料の必要量を減少させる方法としては、特許文献１などに開示された方法がある。部材材料の変更や構成の変更により、液体試料の損失を削減できたため、液体試料の必要量も幾分か削減することができた。これらの方法により、比較的微量な液体試料でも簡易かつ高精度な測定が実現した。従来のクロマトセンサに比べて微量の添加量で測定可能となり、液体試料が血液の場合、指先からの穿刺により得られる血液でも測定可能となった。しかしながら、この方法によっても液体試料の削減量には限界があり、患者の負担を軽減するために極微量にすることは困難であった。
【００１３】
本発明は、前記欠点や課題に鑑みてなされたものであり、液体試料の必要量を削減して微量化することが可能であり、かつ、より高精度な測定を行うことができるバイオセンサおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記欠点や課題を解決するために、本発明のバイオセンサの製造方法は、クロマトグラフィを利用して、液体試料を、展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法であって、前記展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量を減少させることを特徴とする。
【００１５】
なお、ここでいう展開層とは、多孔質膜や任意の部材にて形成された微細空間など液体試料が展開する流路のことである。また、厚みとは、液体試料が展開する部分の高さであり、例えば、展開層が多孔質膜である場合はその膜厚を指し、μＴＡＳ（micro total analysis systems）やＭＥＭＳ（micro electro mechanical systems）に代表されるような任意の部材にて形成された微細空間である場合は空間の高さを指す。展開層の厚みを薄くすることにより、展開する液体試料の容量が減少することになる。
【００１６】
このように、展開層の厚みを薄くするようにコントロールすることで、展開層の体積を削減し、展開に必要な液体試料量がコントロールできることから、各々の液体試料における被検査物質の測定に合わせて、必要な液体試料の添加量を減少させることが可能となる。
【００１７】
また、本発明のバイオセンサは、クロマトグラフィを利用して、液体試料を展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサであって、前記展開層の厚みが、２０〜１３５μｍであることを特徴とする。
【００１８】
すなわち、従来のバイオセンサでは展開層の厚さは、１５０μｍ前後であったが、これよりも展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量を減少させることができる。
【００１９】
なお、ここでいうバイオセンサとは、酵素、抗原、抗体などの特異的反応性を有するたんぱく質や、さらにＤＮＡやＲＮＡなどのリボ核酸等を含む生体物質を利用して、液体試料中に含まれる被検査物質を特異的に検出し、定量、半定量、定性判定するセンサのことである。
【００２０】
また、上記のように展開層の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層の厚みに起因するバックグランドが低減するため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度を向上させることができる。また、バイオセンサの幅や長さを無理に縮小しなくても、液体試料の必要量を減少できるので、バイオセンサの取扱いが不便となることがなく、また、測定対象箇所である試薬固定化部も小さくならないので、試薬固定化部の縮小化による被検査物質の測定精度の悪化を生じることもない。
【００２１】
また、本発明のバイオセンサは、展開層を支持する支持体と、液体試料を前記展開層に添加するための試料添加部と、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬部と、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬を固定化して保持する試薬固定化部と、を有することを特徴とする。
【００２２】
この構成により、液体試料の必要量を減少できるので、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬や、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬の量を従来よりも削減することができる。また、展開層の厚みが薄くなり強度がおちた場合でも、強度の高い支持体を用いることでバイオセンサの取り扱いやすさを良好に維持できる。なお、展開層は、直接支持体上に形成したり、支持体に貼り合わせたりするなど任意の構成を用いてよい。なお、支持体は、紙、金属、ＡＢＳやＰＥＴなどの合成樹脂材料の他、任意の材料を選択可能であるが、好ましくは液体不透過性の材料を用いるとよい。
【００２３】
また、本発明のバイオセンサは、展開層を、単層または複数層から構成したことを特徴とし、これにより、単層または複数層から構成した展開層に確実に試薬を保持させた状態で、液体試料を展開させることが可能になり、液体試料の分析において、簡易で迅速な、より正確性の高い分析を行うことができる。
【００２４】
また、本発明のバイオセンサを免疫クロマトセンサにより構成してもよい。ここで、免疫クロマトセンサとは、クロマト展開する担体（展開層）上で、抗原抗体反応を利用して液体試料中の被検物質の検出を行うセンサのことである。通常、免疫クロマトセンサでは液体試料の量が多くなるが、展開層の膜厚を薄くすることで微量の液体試料で測定可能な免疫クロマトセンサを提供できる。また、免疫クロマトセンサの使用者が誤判定することのない高い正確性と、いつでもどこでも誰でも使用可能な簡易操作とを実現できる。
【００２５】
また、本発明のバイオセンサを、ワンステップ測定の免疫クロマトセンサにより構成してもよい。なお、前記ワンステップ測定とは、液体試料が血液の場合、血液をランセット、あるいは注射器等で採取した後に、血液に対して遠心分離を含めたいかなる前処理を行うことも無く、バイオセンサに添加することである。また血液以外の液体試料の場合でも、細菌溶液の破砕などの前処理を行う必要がないことである。これにより、免疫測定法でありながら、前処理や洗浄などの煩雑な操作を必要としない、簡易で迅速な、より正確性の高い分析を行うことができる。
【００２６】
また、本発明のバイオセンサにおいて、展開層は多孔質膜から構成してもよい。これにより、被検査物質を含む液体試料のクロマト展開が毛細管現象で自動的に行われるようになる。また、試薬固定化部においては、多孔質膜を用いることにより三次元での試薬固定が可能となり固定化密度が高くなるため、測定に十分なシグナルを得ることができる。なお、ここで示す多孔質膜とは、被検査物質を含む液体試料のクロマト展開が毛細管現象で自動的に行われる程度の溶液浸透性を持ち、かつ、標識試薬と特異的に反応する試薬などを任意の手段で固定可能なものであればよい。例えば、セルロース類膜（濾紙、ニトロセルロース膜など）、ナイロン膜、ガラス繊維膜、多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレンなど）などがある。好ましくは、ニトロセルロース純品やニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とする多孔質膜を使用するとよいが、その他の材料でも何ら問題はない。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、液体試料を、展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法において、展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量を減少させることができ、また、液体試料を展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサとして、展開層の厚みが、２０〜１３５μｍであるものを用いることにより、液体試料の必要量を減少させることができて、ごく微量の液体試料から、より高精度な被検査物質の分析を簡易、且つ迅速に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施の形態に係るクロマトグラフィを利用したバイオセンサを示す分解斜視図
【図２】同実施の形態に係るクロマトグラフィを利用したバイオセンサを示す斜視図
【図３】同実施の形態に係るバイオセンサ上の試薬固定化部におけるシグナル測定状態を示す斜視図
【図４】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜（展開層）の厚みに応じた液体試料の必要な添加量を示した図
【図５】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度結果を示した図
【図６】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度比（各々の吸光度／吸光度の平均値）結果を示した図
【図７】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜厚毎のＣＶ値結果を示した図
【図８】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜の孔径および膜厚を変更した場合の吸光度比（各々の規格における吸光度の平均値／従来規格における吸光度の平均値）結果を示した図
【図９】同実施の形態に係るバイオセンサにおいて、ニトロセルロース膜の孔径および膜厚を変更した場合のＣＶ値結果を示した図
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明のバイオセンサの実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
【００３０】
図１および図２は、本実施の形態１によるクロマトグラフィを利用したバイオセンサを示す分解斜視図および斜視図である。
【００３１】
図１において、１は液体試料が展開するニトロセルロースなどで構成された展開層である。なお、展開層１に使用する材料は、ニトロセルロースに限らず、液体試料を展開可能な流路を形成できる材料であれば、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維等の任意の材料でよい。本実施の形態では展開層が単層の場合を例に挙げて説明する。なお、単層とは一つの層で構成されていることを意味し、複数層とは、複数層が平行あるいは垂直に配置され、該複数層の第１の層に添加された液体試料が、各々の層に順次移動可能なように構成されていることを意味する。
【００３２】
２は展開層１の一部に坦持された標識試薬部を示し、この標識試薬部２には、液体試料の展開により溶出可能な乾燥状態で、液体試料中の被検査物質に対する金コロイド標識抗体（標識試薬）が保持されている。標識試薬は、抗体などの特異的反応物に金コロイドなどの標識物を標識したもので、後述する試薬固定化部３，４における結合を検出する手段として用いられるものであり、前述した金コロイドはほんの一例に過ぎず、金属あるいは非金属コロイド粒子、酵素、タンパク質、色素、蛍光色素、ラテックスなどの着色粒子など、必要に応じて任意に選択可能である。なお、標識試薬部２は、展開層１上に設ける必要はなく、後述する試薬固定化部３，４よりも、液体試料の展開方向の上流側の任意の位置であれば何ら問題ない。
【００３３】
３は第１の試薬固定化部、４は第２の試薬固定化部を示し、これらの第１の試薬固定化部３と第２の試薬固定化部４とは、展開層１における標識試薬部２よりも、液体試料の展開方向の下流側に坦持された状態で設けられている。これらの第１および第２の試薬固定化部３、４に用いられる試薬は、液体試料中の被検査物質に対して特異的反応の可能な抗体などの試薬であり、例えば抗体の場合では、どちらの抗体も前記標識試薬とは異なるエピトープで結合するもので、乾燥状態で固定化されている。さらに、第１の試薬固定化部３に用いる抗体と、第２の試薬固定化部４に用いる抗体とは、液体試料中の被検査物質に対する親和性が異なる抗体により構成されている。
【００３４】
前記第１および第２の試薬固定化部３、４に使用する抗体は、標識試薬、および被検査物質との複合体を形成できれば良く、従って、被検査物質に対するエピトープもしくは親和性は、同じであっても異なっていてもいずれでも良い。さらに、２つの抗体の親和性は異なるが、エピトープが同じでも何ら問題はない。
【００３５】
また、図１では、試薬固定化部が２箇所設けられている例を示しているが、これは必ずしも２箇所である必要はなく、１箇所以上あれば、その目的に応じて自在に選択できる。また、展開層１上の形状についても、ライン状である必要はなく、スポット形状、もしくは、文字形状、鍵型形状など、自由に選択できる。図１における第１の試薬固定化部３と第２の試薬固定化部４とは空間的に離れているが、これらも必ずしも離れている必要はなく、見かけ上一本のライン状に見えるように接触させることも可能である。
【００３６】
５は液体不透過性シート材を示し、ここでは、透明ＰＥＴテープで構成される。該液体不透過性シート材５は、試料添加部６となる微細空間に接続する部分、および前記液体試料の到達する終端を除き、展開層１を密着被覆する構造を持つものである。
【００３７】
このように液体不透過性シート材５により展開層１を被覆することで、試料添加部６以外への点着を遮断して保護すると共に、外部からの汚染を防止する作用を持たせることができるばかりでなく、液体試料の展開時に、液体試料が展開しながら蒸発してしまうことを防ぎ、展開層１上の反応部分である試薬固定化部３、４、および標識試薬部２を必ず液体試料が通過し、前記反応部分において液体試料中の被検査物質との反応を効率よく行うようにすることができる。ここでの外部からの汚染とは、該展開層１上の反応部分に対して不用意に液体試料が接触することや、被験者が手などで直接展開層１に接触することなどを意味する。前記展開層１を被覆する液体不透過性シート５としては、第１の試薬固定化部３や第２の試薬固定化部４の呈色状態を反射光、散乱光または透過光などを用いて測定するので、透明な材料を用いることが好ましく、前記試薬固定化部３、４を覆う部分は、シグナルを測定する部分であるから、少なくとも透過可能な状態に維持しなければならない。
【００３８】
また、より高精度な測定を必要とする場合には、展開層１の上部を、特に前記標識試薬部２、および前記試薬固定化部３，４の部分を含んで密着密閉し、かつ、液体試料の展開方向に対して平行な側面を、同様に密着密閉させる構造をとることもできる。
【００３９】
７は展開層１における開放部である。８は展開層１を支持する基板であり、この基板８はＰＥＴフィルムなどの液体不透過性シート材で構成される。なお、基板８をなす液体不透過性シート材としては、ＰＥＴフィルムの他、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルなどの合成樹脂材料、金属、ガラスなど、任意の材料を用いることが可能である。
【００４０】
前記基板８は展開層１を補強する役割を持つとともに、血液、唾液、尿など感染の危険性のある試料を用いる場合には、それを遮断する作用をも有する。さらには、展開層１が湿潤した場合に光透過性を帯びる場合などにおいては、前記基板８に、光を遮断する効果を持たせることも可能である。基板８は、透明、半透明、不透明のいずれをとってもよいが、光学的に反応度合を測定する際、透過光を用いて測定する場合は透明、反射光を測定する場合は不透明の材料を用いるなど、用途に応じて任意の材料を用いればよい。
【００４１】
９は微細空間形成材であり、この微細空間形成材９は、液体試料が毛細管現象により流入する空間、すなわち試料添加部６となる微細空間を形成する働きを持ち、透明ＰＥＴフィルムを積層させたもので構成される。また、微細空間形成材９は、液体試料添加後のバイオセンサを取扱う際に、液体試料の外部への汚染を保護する役割をも有する。この微細空間形成材９には、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料の他、金属、ガラス等、液体不透過性の材料を用いることが可能であり、透明もしくは半透明であることが好ましいが、透明でなくて有色であってもよい。不透明の材料の場合には任意の材料で構成できる。
【００４２】
試料添加部６は微細空間形成材９で形成された微細空間であり、前記試料添加部６は、毛細管現象により液体試料を流入させることができる。また、該試料添加部６は前記展開層１と接続された配置とされており、液体試料を該試料添加部６へ流入させることにより、該液体試料の展開層１への展開を開始させることができる。
【００４３】
次に、本実施の形態のバイオセンサを用いた、液体試料中の被検査物質の測定方法について、図１、図２を用いて説明する。
【００４４】
液体試料を、試料添加部６に接触させると、毛細管現象により機械的操作を必要とせずに、自然に液体試料が前記試料添加部６中に流入し、展開層１上を流れて展開する。液体試料の流入量が十分であるかどうかは、微細空間形成材９を透して確認できる。また、液体試料の添加量を、一定量確保する必要がある場合は、前記試料添加部６の微細空間の体積を一定体積とすることで、精度良く添加量を規定することができ、さらに、前記液体試料を一定量以上必要とする場合には、必要量以上の体積を保持させる構造をとることで、これを実現することができる。
【００４５】
前記試料添加部６内には、細胞成分収縮試薬１０を配設している。細胞成分収縮試薬１０は、前記液体試料中において細胞成分を含む場合に設置すべき試薬であり、細胞成分を含まない液体試料を用いる場合には、特に必要ではない。また、細胞成分収縮試薬１０は、細胞を収縮する効果のある塩化カリウムや塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム塩等を含む無機化合物や、グリシン、グルタミン酸等のアミノ酸、プロリン等のイミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖類、グルシトール等の糖アルコール等を用いても、同様に実施可能である。このような細胞成分収縮試薬１０を含む系は、特に液体試料として全血を用いる場合に有効である。
【００４６】
前記試料添加部６に添加されて流入した液体試料は、前記試料添加部６と展開層１との接触部分から、展開層１へと展開する。標識試薬部２に液体試料が到達したとき、標識試薬の溶出が開始される。液体試料中に被検査物質が存在する場合、標識試薬と被検査物質とが反応しながら展開が進み、液体試料は第１の試薬固定化部３に到達する。被検査物質が液体試料中に存在する場合には、その量に応じて、第１の試薬固定化部３に固定化された抗体と、液体試料中の被検査物質と、標識試薬との複合体が形成される。
【００４７】
次に、第２の試薬固定化部４に液体試料が到達し、該液体試料中に前記被検査物質が存在する場合には、前記被検査物質の量に応じて、第２の試薬固定化部４に固定化された抗体と、被検査物質と、標識試薬との複合体を形成する。
【００４８】
前記液体試料は、第２の試薬固定化部４に到達した後、さらに、展開層１における開放部７に到達する。開放部７は、前記液体不透過性シート５がなくて開放されているため、前記液体試料が到達した後、あるいは到達しながら揮発もしくは蒸発する。さらには、開放部７に前記液体試料が滲み出て、開放部７における展開層１の上部にのみ、前記液体試料が、前記試料添加部６の微細空間内の展開層１上部にある液体試料と同じ高さ、もしくは準じた高さまで至る。一般的には、開放部７の代わりに吸水部を設けることが多いが、それは、展開層１に使用する材料に対して、より保水効果、吸水効果の高い多孔質材料を用いることで、液体試料を吸水あるいは吸引し、展開層１上を通過させる働きや、測定時間を短縮できる働きを有するものとすることができる。前記開放部７はそれらと同様の効果を持たせたものであり、特に前記試料添加部６もしくは前記開放部７を用いる手法は、例えば、液体試料が指先からの穿刺による血液などであるように、液体試料が微量である場合に適している。
【００４９】
前記液体試料中の被検査物質の測定値は、前記第１の試薬固定化部３および第２の試薬固定化部４における標識試薬由来のシグナルを測定することで得られる。
【００５０】
図３に、バイオセンサ上の試薬固定化部３、４における標識試薬由来のシグナルを測定している状態のシグナル測定部を示す。ここで、１１は、バイオセンサを用いて液体試料中の被検査物質の濃度を測定して分析する分析装置における、前記展開層１に光を照射するための照射部、１２は前記照射部１１から前記展開層１に照射された光の反射または透過光などの光学的変化を検出する受光部であり、前記シグナル測定部は、これらの照射部１１および受光部１２を利用することによって、試薬固定化部３、４における標識試薬由来のシグナルを測定する。試薬固定化部３、４では、その他の部分に比べてシグナルが上昇し、その強度は、試薬固定化部３、４の呈色度合に応じて変化する。
【００５１】
なお、前記照射部１１としては、可視領域、もしくは近可視領域であることが好ましく、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ；発光ダイオード）、もしくはＬＤ（Ｌａｓｅｒ  Ｄｉｏｄｅ；レーザーダイオード）など必要に応じて選択可能である。
【００５２】
そして、前記シグナル測定部（照射部１１および受光部１２）によって測定された試薬固定化部３、４における標識試薬由来のシグナルを、演算処理することで、被検査物質の測定値を求めることができる。このときに得られる被検査物質の測定値は、前記シグナル測定部にて得た標識試薬由来のシグナルより検量線を用いて得られた該被検査物質の値である。ここで述べる検量線とは、シグナル測定部にて得たシグナルと、液体試料中の被検査物質の値との関係を示した回帰式である。未知の量の被検査物質を含む液体試料を測定する場合に、シグナル測定部にて得られたシグナルを代入することで、その未知液体試料中の被検査物質の測定値を算出することができる。また、シグナルを測定する手段としては、光学的変化、電気的変化や電磁的変化を読み取るものであったり、画像としてとらえるものであったり、任意の手段を用いてよい。
【００５３】
また、前記の反応例は、固定化試薬と標識試薬とに抗体を用いて抗原を検出するための抗原抗体反応を利用したサンドイッチ反応の場合について述べたが、試薬の選択により、競合反応を利用した反応系でも何ら問題はない。
【００５４】
また、特異的な反応を利用したい場合、前記バイオセンサ上の任意の反応を形成する系の試薬成分で構成することにより、抗原抗体反応以外の反応による測定を行うことも可能である。特異的反応をする、ある特定の物質と、それに対する特異結合物質との組合せとしては、抗原とそれに対する抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素とインヒビター、酵素と補因子、酵素と基質、糖鎖を有する化合物とレクチン、ある抗体とその抗体に対する抗体、レセプター分子とそれに対する抗体、特異結合活性が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるいは、他の成分と結合してなる複合性物質を利用した反応系などが例示される。
【００５５】
次に、以下の実施例により、本発明を実施する方法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。
【００５６】
（実施例１．）
（展開層の厚みを薄くした場合の全血ＣＲＰの定量）
ニトロセルロース膜からなる展開層１上に抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１の試薬固定化部３、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２の試薬固定化部４、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬部２を含むバイオセンサである免疫クロマトセンサを製造した。この免疫クロマトセンサを図１，図２に示す。図中、免疫クロマトセンサは、抗体が固定化された第１の試薬固定化部３、第２の試薬固定化部４と、それよりも液体試料を添加する添加部分に近い部分にある、抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体が含有された領域である標識試薬部２と、試料添加部６とを有している。
【００５７】
この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。
【００５８】
ａ）免疫クロマトセンサの調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備した。この抗体溶液は溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜（展開層１）上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に第１の試薬固定化部３である固定化抗体ラインが得られた。
【００５９】
次に同様にして、試料添加部より下流側に２ｍｍ離れた部分に、抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を塗布した。ニトロセルロース膜の厚みは、１４５μｍ、９５μｍ、８５μｍ、７５μｍ、６５μｍ、５５μｍの６種類を用意した。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行った。次に、０．０５％シュクロースモノラウレートを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った後に、ニトロセルロース膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。これにより、ニトロセルロース膜（展開層１）上に第１の試薬固定化部３である第１の固定化抗体ライン、および第２の試薬固定化部４である固定化抗体ラインが得られた。
【００６０】
金コロイドは、還流中の０．０１％塩化金酸１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ８．９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ｃを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ８．９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識試薬）を調製した。前記標識試薬溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識試薬を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ５％スクロース・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識試薬を洗浄単離した。この標識試薬を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が１５０となるように調製して、４℃で貯蔵した。前記標識試薬溶液を溶液吐出装置にセットして、固定化抗ＣＲＰ抗体Ａおよび固定化抗ＣＲＰ抗体Ｂが塗布された乾燥膜上の第１の固定化ライン（第１の試薬固定化部３）および第２の固定化ライン（第２の試薬固定化部４）から離れた、液体試料添加開始方向から順番に、標識試薬、第１の固定化ライン、第２の固定化ラインの位置関係になるように塗布した後に、膜を真空凍結乾燥させた。これによって、試薬固定化部３、４および標識試薬部２を備えた反応層担体が得られた。
【００６１】
次に、調製された標識試薬を含む反応層担体を、厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板８上に貼り付け、標識試薬部２から終端部分にかけて、液体不透過性シート材５としての透明テープを貼り付けた。その後、レーザーを用いて、２．０ｍｍの幅に切断した。切断後、透明テープを貼り付けていない始端部分上に、厚さ１００μｍの透明ＰＥＴを積層させて作製した微細空間形成材９を貼り付け、微細空間（幅２．０ｍｍ×長さ７．０ｍｍ×高さ０．３ｍｍ）から成る試料添加部６を形成した。前記空間形成材９は、予め１０％塩化カリウム水溶液を点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行い、これによって、塩化カリウムが乾燥状態で保持された細胞成分収縮試薬１０を保持する微細空間形成材９を作製したものである。こうして免疫クロマトセンサを製造した。
【００６２】
ｂ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度（被検査物質濃度）が０．０３ｍｇ／ｄＬ、０．１ｍｇ／ｄＬ、０．３ｍｇ／ｄＬ、１ｍｇ／ｄＬの血液を液体試料として調製した。
【００６３】
ｃ）免疫クロマトセンサ上の呈色度合の測定
展開層１となるニトロセルロース膜の厚みを、従来規格である１４５μｍから１００μｍ以下に変更することで、ニトロセルロース膜（展開層１）の厚みはほぼ３０％以上薄くなる。厚みを薄くすると、容積が減少するため、おのずと測定に必要とされる液体試料量も３０％以上削減することができる。図４に、各々のニトロセルロース膜の厚みに対して必要な液体試料量を示した。例えば、従来使用していた１４５μｍの厚みのものでは液体試料が５μＬ必要であったが、５５μｍの厚みのものでは液体試料の量が２μＬでも試薬固定化部３、４である固定化抗体ラインの位置まで十分到達するようになり、ごく微量での測定が実現できる。
【００６４】
前記免疫クロマトセンサの試料添加部６に、前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を適量添加して、開放部７の方向へと展開処理させて、抗原抗体反応をさせた。そして、該免疫クロマトセンサへの試料添加から５分後に、試薬固定化部３、４における呈色状況を計測した。すなわち、図３に示すように、６３５ｎｍの半導体レーザー光源からなる照射部１１と、受光素子（フォトダイオード）で構成される受光部１２とにより、免疫クロマトセンサを走査し、第１の固定化部３および第２の固定化部４における前記標識試薬結合量を前記展開層１からの反射散乱光を演算処理して、吸光度として結果が得られる。ここでは試薬固定化部３、４が２箇所であり、前記試料添加部６に対して上流側に親和力の高い抗体を使用した。そして、光源（照射部１１）および受光素子（受光部１２）を固定し、免疫クロマトセンサを移動させることにより走査して、得られた波形から、ピーク値（反射吸光度）を読み取った。なお、このような波形を得るために、免疫クロマトセンサを固定して光源および受光素子を移動させて走査することも可能である。
【００６５】
前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血において、各ＣＲＰ濃度につき免疫クロマトセンサ５個で測定を行った（個数Ｎ＝５での測定）。図５は、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度結果を示す。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は個数Ｎ＝５での測定を行った際の吸光度の平均値で、ＣＲＰ濃度別にプロットしたものである。いずれのＣＲＰ濃度においても、ニトロセルロース膜の厚みの違いにより吸光度が変化する傾向は見られなかった。ニトロセルロース膜からなる展開層１の厚みを薄くしても、得られる吸光度が定量測定をするのに十分であることは、図５からも明らかである。ニトロセルロース膜の厚みを薄くしても、定量測定に問題なく、液体試料の量を削減できることがわかる。
【００６６】
このように、液体試料を、展開層１において展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法として、前記展開層１の厚みを薄くすることで、各々の液体試料における被検査物質の測定に合わせて、必要な液体試料の添加量を減少させることが可能となる。具体的には、バイオセンサにおける展開層１の厚みを、従来のもの（１５０μｍ前後、例えば厚み１４５μｍ）よりも薄い２０〜１３５μｍとすることで、液体試料の必要量を従来よりも減少させることができる。
【００６７】
また、上記のように展開層１の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層１の厚みに起因するバックグランドを低減できるため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度を向上させることができる。また、バイオセンサの幅や長さを無理に縮小しなくても、液体試料の必要量を減少できるので、バイオセンサの取扱いが不便となることがなく、かつ、測定対象箇所である試薬固定化部３、４も小さくならないので、試薬固定化部３、４の縮小化による被検査物質の測定精度の悪化を生じることもない。
【００６８】
また、液体試料の必要量を減少することで、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬や、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬との量を従来よりも削減することができるため、製造コストも削減することが可能である。
【００６９】
（実施例２．）
（展開層の厚みを薄くした場合の全血ＣＲＰの定量）
ニトロセルロース膜からなる展開層１上に抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１の試薬固定化部３、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２の試薬固定化部４、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬部２を含むバイオセンサである免疫クロマトセンサを製造した。この免疫クロマトセンサを図１，図２に示す。図中、免疫クロマトセンサは、抗体が固定化された第１の試薬固定化部３、第２の試薬固定化部４と、それよりも液体試料を添加する添加部分に近い部分にある、抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体が含有された領域である標識試薬部２と、試料添加部６とを有している。
【００７０】
この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。
【００７１】
ａ）免疫クロマトセンサの調製
ニトロセルロース膜の厚みは、１４５μｍ、９５μｍ、８０μｍ、６５μｍの４種類を用意した。実施例１と同様の製造方法にて免疫クロマトセンサを作製し、以下の測定を行
った。
【００７２】
ｂ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度（被検査物質濃度）が０．１ｍｇ／ｄＬであり、ヘマトクリット値を２０％、３０％、４０％、５０％とした血液を液体試料として調製した。
【００７３】
ｃ）免疫クロマトセンサ上の呈色度合の測定
前記免疫クロマトセンサの試料添加部６に、前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を適量添加して、開放部７の方向へと展開処理させて、抗原抗体反応をさせた。そして、該免疫クロマトセンサへの試料添加から５分後に、試薬固定化部３、４における呈色状況を計測した。各ヘマトクリット値につき免疫クロマトセンサ５個で測定を行った（個数Ｎ＝５での測定）。図６は、ニトロセルロース膜厚毎の吸光度比の結果を示す。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は吸光度比で、ヘマトクリット値別にプロットしたものである。なお、吸光度比とは、各ヘマトクリット値における吸光度が、全てのヘマトクリット値における吸光度の平均値に対してどの程度乖離しているかを表すものであり、ニトロセルロース膜の厚み、および、ヘマトクリット値の違いによる測定結果への影響度合が確認できる。前記吸光度比は、（「各ヘマトクリット値における個数Ｎ＝５での測定を行った際の吸光度の平均値」／「全てのヘマトクリット値における吸光度の平均値」）で算出した。膜厚１４５μｍでは、各ヘマトクリット値の吸光度比が非常にばらつき、ヘマトクリット値の影響を大きく受けていることがわかるが、膜厚を薄くすることで吸光度比のばらつきは緩和していった。また、吸光度比が膜厚の違いにより大きく変化する傾向は見られていない。ニトロセルロース膜からなる展開層１の厚みを薄くしても、得られる吸光度が定量測定をするのに十分であることは、図６からも明らかである。ニトロセルロース膜の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要量が削減可能となり、かつ、ヘマトクリット値の影響が緩和されて高精度な定量測定を実施できることがわかる。膜厚のコントロールにより、液体試料の必要量の増減を図ることが可能である。
【００７４】
また、図７はニトロセルロース膜厚毎のＣＶ値結果を示すものである。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は各ヘマトクリット値において個数Ｎ＝５で測定した際のＣＶ値で、ヘマトクリット値別にプロットしたものである。膜厚１４５μｍでは、ＣＶが悪く、特にヘマトクリット値が高い場合のＣＶ値の悪化は顕著であるが、膜厚を薄くすることでヘマトクリット値の影響は小さくなり、いずれもＣＶは良好であった。上記の結果より、展開層１の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層１の厚みに起因するバックグランドを低減できるため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度が向上するばかりか、ニトロセルロース膜の厚みが薄くなるにつれ、ヘマトクリット値などの液体試料の特性による液体試料の展開速度のばらつきの差が生じ難くなる。そのため、ニトロセルロース膜の厚みを薄くしたものでは、膜厚１４５μｍの場合に比べてヘマトクリット値の影響を受け難くなり、呈色度合のばらつきが小さくなりＣＶが良くなった。液体試料の添加量を削減しても、感度および精度が向上したセンサを実現することができた。
【００７５】
（実施例３．）
（展開層の膜厚および孔径を変更した場合の全血ＣＲＰの定量）
ニトロセルロース膜からなる展開層１上に抗ＣＲＰ抗体Ａを固定化した第１の試薬固定化部３、および抗ＣＲＰ抗体Ｂを固定化した第２の試薬固定化部４、さらに抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体（標識試薬）を保持した標識試薬部２を含むバイオセンサである免疫クロマトセンサを製造した。この免疫クロマトセンサを図１、図２に示す。図中、免疫クロマトセンサは、抗体が固定化された第１の試薬固定化部３、第２の試薬固定化部４と、それよりも液体試料を添加する添加部分に近い部分にある、抗ＣＲＰ抗体Ｃと金コロイドとの複合体が含有された領域である標識試薬部２と、試料添加部６とを有している。この免疫クロマトセンサは、次のようにして製造した。
【００７６】
ａ）免疫クロマトセンサの調製
多孔質担体であるニトロセルロース膜の規格が、従来規格である膜厚１４５μｍでかつ孔径５μｍであるものと、膜厚が１３５μｍでかつ孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍであるもの、膜厚が１１５μｍでかつ孔径が３μｍ、５μｍであるもの、膜厚が９５μｍでかつ孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍ、１０μｍであるもの、膜厚が８０μｍでかつ孔径が５μｍ、８μｍ、１０μｍであるもの、膜厚が６０μｍでかつ孔径が５μｍ、８μｍ、１０μｍであるものの１６種類を用意した。実施例１と同様の製造方法にて免疫クロマトセンサを作製し、以下の測定を行った。
【００７７】
ｂ）液体試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液に、既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、ＣＲＰ濃度（被検査物質濃度）が０．３ｍｇ／ｄＬの血液を液体試料として調製した。
【００７８】
ｃ）免疫クロマトセンサ上の呈色度合の測定
前記免疫クロマトセンサの試料添加部６に、前記ｂ）工程にて調整したＣＲＰを含む全血を適量添加して、開放部７の方向へと展開処理させて、抗原抗体反応をさせた。そして、該免疫クロマトセンサへの試料添加から５分後に、試薬固定化部３、４における呈色状況を計測した。各々のニトロセルロース膜の規格において免疫クロマトセンサ５個で測定を行った（個数Ｎ＝５での測定）。図８は、ニトロセルロース膜の厚みおよび孔径を変更した場合の吸光度比の結果を示す。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は吸光度比で、孔径別に吸光度比をプロットしたものである。なお、吸光度比とは、各々のニトロセルロース膜の規格での吸光度が、従来規格である１４５μｍにおける吸光度に対してどの程度乖離しているかを表すものであり、ニトロセルロース膜の厚みおよび孔径の違いによる測定結果への影響度合が確認できる。前記吸光度比は、（「各々のニトロセルロース膜の規格における個数Ｎ＝５での測定を行った際の吸光度の平均値」／「従来規格である１４５μｍにおけるＮ＝５測定を行った際の吸光度の平均値」）で算出した。図８からわかるように、ニトロセルロース膜の膜厚および孔径の違いにより吸光度が変化する傾向は見られない。ニトロセルロース膜からなる展開層１の厚みおよび孔径が変化しても、得られる吸光度が定量測定をするのに十分であることは、図８からも明らかである。
【００７９】
また、図９はニトロセルロース膜の規格毎のＣＶ値結果を示したものである。横軸はニトロセルロース膜の厚み、縦軸は個数Ｎ＝５で測定した際のＣＶ値で、孔径別に各ＣＶ値をプロットしたものである。従来規格である膜厚１４５μｍでのＣＶ値に対して、膜厚を薄くすることでＣＶ値は良くなった。特に、１１５μｍ以下でのＣＶ値の良化は顕著であった。上記の結果より、展開層１の厚みを薄くすることで、ノイズとなる展開層１の厚みに起因するバックグランド値を低減できるため、Ｓ／Ｎ比を改善できて、測定精度が向上し、呈色度合のばらつきを小さくすることが可能となり、ＣＶが良化した。前記図８および図９からも明らかなように、ニトロセルロース膜の孔径に関係なく、展開層１の厚みを薄くすることで、感度および精度の良化したバイオセンサを実現することができた。
なお、ここで示す孔径とは、ニトロセルロース膜の孔径の平均値を示している。ニトロセルロース膜の断面を走査電子顕微鏡により観察した画像をもとに測定したが、孔径の測定においてこの方法に限らず、バルブポイント法や水銀圧力法など任意の孔径測定方法を用いて測定を行っても何ら問題ない。また、ニトロセルロースのような多孔質担体においては、記載した孔径値の単一な孔で構成されているものではなく、平均孔径に対して大および小の孔径へ分布して種々の孔径の孔が混在している。具体的に説明するため平均孔径の数値をもとに比較例を挙げて説明しており、孔径値については記載した数値に限定されるものではない。
【００８０】
また、上記実施例では、血液中のＣＲＰ濃度の測定例を述べたが、測定される液体試料としては、例えば、水や水溶液、尿、血漿、血清、唾液などの体液、固体および粉末や気体を溶かした溶液などがあり、その用途としては、例えば、血液検査や尿検査、水質検査、便検査、土壌分析、食品分析などがある。また、被検査物質としては、抗体、免疫グロブリン、ホルモン、酵素およびペプチドなどのタンパク質およびタンパク質誘導体や、細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫ならびにそれらの産物および成分などの感染性物質、治療薬および乱用薬物などの薬物および腫瘍マーカーが挙げられる。具体的には、例えば、絨毛性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン、濾胞形成ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン、副腎脂質刺激ホルモン、エストラジオール、前立腺特異抗原、肝炎、ミオグロビン、ＣＲＰ、心筋トロポニン、ＢＮＰ、ＨＢＡ１Ｃ、アルブミン等でも何ら問題はない。また、水質検査や土壌分析などの環境分析、食品分析などにも実施可能である。簡便かつ迅速で、高感度・高性能な測定が実現でき、また、いつでもどこでも誰でも測定が可能であるため、ＰＯＣＴ向けの分析装置としても利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のバイオセンサは、例えば、抗原抗体反応のような任意の反応に基づいて、微量な液体試料中の被検査物質を分析検出し、定量または半定量する際に、簡便かつ迅速で、高感度・高性能な測定に用いることができ、また、いつでもどこでも誰でも測定が可能であるため、ＰＯＣＴ向けの分析装置用のバイオセンサとして有用である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィを利用して、液体試料を、展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサの製造方法であって、前記展開層の厚みを薄くすることにより、液体試料の必要添加量を減少させることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項２】
クロマトグラフィを利用して、液体試料を展開層へ展開させて該液体試料中の被検査物質を測定するバイオセンサであって、前記展開層の厚みが、２０〜１３５μｍであることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３】
展開層を支持する支持体と、液体試料を前記展開層に添加するための試料添加部と、前記液体試料中の被検査物質と反応する標識試薬部と、前記被検査物質あるいは前記標識試薬と特異的に反応する試薬を固定化して保持する試薬固定化部と、を有することを特徴とする請求項２記載のバイオセンサ。
【請求項４】
展開層が、単層または複数層からなることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
免疫クロマトセンサからなることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
ワンステップ測定の免疫クロマトセンサからなることを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
展開層が、多孔質膜からなることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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