(57)【要約】本発明は、ＦＴＬＤ及びＡＬＳ等の神経変性疾患の患者脳に見られる、ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）由来の細胞内封入体を形成する形質転換細胞（細胞モデル）を提供する。本発明の形質転換細胞は、宿主細胞において機能するプロモーター、及び変異型ＴＤＰ−４３遺伝子が導入されたものであることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞において機能するプロモーター、及び変異型ＴＤＰ−４３遺伝子が導入された形質転換細胞。
【請求項２】
変異型ＴＤＰ−４３が、細胞内封入体形成活性を有するものである、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
変異型ＴＤＰ−４３が、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質である、請求項１記載の細胞。
（ａ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列において第７８番目〜第８４番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列において第１８７番目〜第１９２番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列において第７８番目〜第８４番目及び第１８７番目〜第１９２番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内封入体形成活性を有するタンパク質
【請求項４】
変異型ＴＤＰ−４３が、以下の（ａ）〜（ｄ）のタンパク質である、請求項１記載の細胞。
（ａ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列のうちの第１６２番目〜第４１４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列のうちの第２１８番目〜第４１４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列のうちの第１番目〜第１６１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内封入体形成活性を有するタンパク質
【請求項５】
変異型ＴＤＰ−４３が、ＣＦＴＲエキソン９スキッピング活性を有しないものである、請求項３又は４記載の細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞の形質転換細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
哺乳動物細胞が、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞又は神経芽細胞である、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項９】
細胞活性が、細胞活性が増殖能、生存能、並びに変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体の形成率、細胞内形成数及び大きさからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１０】
神経変性疾患が、前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
神経変性疾患が、ＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として変異型ＴＤＰ−４３の細胞内封入体形成抑制剤をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
細胞活性が、細胞活性が増殖能、生存能、並びに変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体の形成率、細胞内形成数及び大きさからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法。
【請求項１５】
細胞活性が、神経突起伸張能、増殖能及び生存能からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
神経変性疾患が、前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
神経変性疾患が、ＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
メチレンブルー及び／又はディメボンを含む、神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１９】
神経変性疾患が、前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
神経変性疾患が、ＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患である、請求項１８又は１９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内（細胞質内又は核内）にＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）由来の封入体（凝集体）を形成する形質転換細胞、すなわちＴＤＰ−４３蓄積細胞モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの神経変性疾患では、神経細胞内に蓄積するタンパク質性の異常構造物が患者脳に見出されており、その異常構造物の形成が発症と密接に関連していると考えられている。前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）や筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患では、患者脳の神経細胞内にユビキチン陽性の封入体が出現し（図１）、その出現部位と神経細胞の脱落部位に相関が認められることから、この細胞内封入体が出現することにより神経細胞死が引き起こされ、最終的に発症に至ると考えられている。本発明者らは、最近の研究により、ＦＴＬＤやＡＬＳ患者脳に見られる細胞内封入体の主要構成成分として、ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）という核タンパク質を同定した（Ａｒａｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＤＰ−４３  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔａｕ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，ｖｏｌ．３５１（３），ｐ．６０２−６１１；Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ＴＤＰ−４３  ｉｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，ｖｏｌ．３１４（５７９６），ｐ．１３０−１３３）。ＴＤＰ−４３は、核に局在するタンパク質で、転写制御などに関与すると考えられているが（Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＴＤＰ−４３  ａｎｄ  ＳＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＦＴＲ  ｅｘｏｎ  ９  ｓｋｉｐｐｉｎｇ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１，ｖｏｌ．２０（７），ｐ．１７７４−１７８４）、実際の機能については余りよく分かっていない。
進行が非常に早い神経難病であるＡＬＳにおいて、家族性の占める割合は５〜１０％程度であり、その他大多数は弧発性であると推定されている。家族性ＡＬＳのうち、約２０％がｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １（ＳＯＤ１）の遺伝子異常を伴うケースである（Ｄｅｎｇ  ＨＸ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｃｕ，Ｚｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２６１，ｐ．１０４７−１０５１；Ｒｏｓｅｎ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｕ／Ｚｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３６２，ｐ．５９−６２）。ＳＯＤ１の異常と発症との関連について様々な報告がなされているが、一方で、孤発性ＡＬＳとは神経病理像が異なっていることも指摘されている。すなわち、孤発性ＡＬＳ患者脳ではＴＤＰ−４３陽性の封入体がほぼ全例に認められるが（Ｇｅｓｅｒ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ−ｂｒａｉｎ  ｍａｐ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ＴＤＰ−４３  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００８，Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．，ｖｏｌ．６５，ｐ．６３６−６４１；Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｐｏｒａｄｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｔｗｏ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｓｈｏｗｎ  ｂｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＤＰ−４３−ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｄ  ｇｌｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ，２００８，Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１１６，ｐ．１６９−１８２）、ＳＯＤ１変異を有する家族性ＡＬＳ患者脳に認められるユビキチン陽性封入体は、抗ＴＤＰ−４３抗体で染色されないのである（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ＩＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ＴＤＰ−４３  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＳＯＤ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，２００７，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，ｖｏｌ．６１，ｐ．４２７−４３４；Ｔａｎ  ＣＦ  ｅｔ  ａｌ，ＴＤＰ−４３  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＳＯＤ１  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ，２００７，Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１１３，ｐ．５３５−５４２）。これらの事実は、ＳＯＤ１変異を有する家族性ＡＬＳには、その他の家族性ＡＬＳ及び大多数の弧発性ＡＬＳとは異なる発症メカニズムが存在することを示している。上述したＡＬＳ患��におけるＴＤＰ−４３遺伝子変異の発見を合わせて考慮すると、大多数のＡＬＳの発症過程においてＴＤＰ−４３の異常が一次的な要因であり、その細胞内凝集と発症とは密接に関連していること考えられる。
したがって、ＴＤＰ−４３タンパク質がどのような機構によって細胞内で蓄積し、細胞障害性を発揮するのかについて、そのメカニズムを解明すること、すなわちＴＤＰ−４３の細胞内封入体形成の機構やこの封入体による神経変性機構を解明することは、ＡＬＳ及びＦＴＬＤの発症メカニズムの解明（病因解明）だけでなく、これらの治療薬及び治療方法等の開発にも大きく貢献できると考えられる。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、ＦＴＬＤ及びＡＬＳ等の神経変性疾患の患者脳に見られる、ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）由来の細胞内封入体（凝集体）を形成する形質転換細胞を提供することにある。また、本発明は、当該形質転換細胞を用いた神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法や、神経変性疾患の治療薬の副作用の検定方法を提供することも目的とする。さらに、本発明は、神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供することも目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行い、ＦＴＬＤ及びＡＬＳの患者脳に見られるＴＤＰ−４３細胞内封入体を実験室レベルで再現する培養細胞の構築に取り組んだ。
患者脳に見られる細胞内封入体では、ＴＤＰ−４３は核内又は細胞質内に蓄積する（図１）。本来核タンパク質であるＴＤＰ−４３が細胞質に蓄積するということは、ＴＤＰ−４３が細胞内で局在変化することを意味する。そこで、本発明者は、ＴＤＰ−４３の核移行シグナルの同定を行い、その欠損変異体（変異型ＴＤＰ−４３タンパク質）などを作製した。また、近年神経変性疾患との関連が指摘されているプロテアソームにも着目し、変異型ＴＤＰ−４３タンパク質の発現とプロテアソーム活性の阻害処理とを組み合わせることにより、結果的に、核内および細胞質内にＴＤＰ−４３封入体を形成させることに成功した。また、患者脳に蓄積するＴＤＰ−４３の特徴として、ＴＤＰ−４３全長だけでなく、ＴＤＰ−４３断片も界面活性剤に不溶性の画分に回収されることから、本発明者はこの断片に着目し、各種ＴＤＰ−４３断片とＧｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）との融合タンパク質を発現させた。その結果、いくつかの融合タンパク質の発現細胞において、ＴＤＰ−４３細胞内封入体を形成させることに成功した。さらに、本発明者は、上述のＴＤＰ−４３細胞内封入体を形成し得る細胞を用いて当該封入体形成抑制効果を有する化合物を検索し、実際に特定の低分子化合物が当該効果を有することを見出した。本発明は、このようにして完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）宿主細胞において機能するプロモーター、及び変異型ＴＤＰ−４３遺伝子が導入された形質転換細胞。
本発明の形質転換細胞において、変異型ＴＤＰ−４３としては、例えば、細胞内封入体形成活性を有するものが挙げられる。
また、変異型ＴＤＰ−４３としては、例えば、以下の（１ａ）〜（１ｄ）のタンパク質、又は、以下の（２ａ）〜（２ｄ）のタンパク質が挙げられる。
（１ａ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列において第７８番目〜第８４番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（１ｂ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列において第１８７番目〜第１９２番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（１ｃ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列において第７８番目〜第８４番目及び第１８７番目〜第１９２番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（１ｄ）アミノ酸配列（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内封入体形成活性を有するタンパク質
（２ａ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列のうちの第１６２番目〜第４１４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（２ｂ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列のうちの第２１８番目〜第４１４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（２ｃ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列のうちの第１番目〜第１６１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（２ｄ）アミノ酸配列（２ａ）、（２ｂ）又は（２ｃ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内封入体形成活性を有するタンパク質
さらに、変異型ＴＤＰ−４３としては、例えば、ＣＦＴＲエキソン９スキッピング活性を有しないものが挙げられる。
本発明の形質転換細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の形質転換細胞が挙げられ、具体的には、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞又は神経芽細胞が挙げられる。
（２）上記（１）に記載の細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として、神経変性疾患の治療薬、及び変異型ＴＤＰ−４３の細胞内封入体形成抑制剤をスクリーニングする方法。
本発明のスクリーニング方法において、細胞活性としては、例えば、増殖能、生存能、並びに変異型ＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成率、細胞内形成数及び大きさが挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法において、神経変性疾患としては、例えば、前頭側頭葉変性症及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられ、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患（ＴＤＰ−４３の細胞内蓄積に伴う疾患）が挙げられる。
（３）上記（１）に記載の細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法。
本発明の副作用の検定方法において、細胞活性としては、例えば、神経突起伸張能、増殖能及び生存能が挙げられる。
また、本発明の副作用の検定方法において、神経変性疾患としては、例えば、前頭側頭葉変性症及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられ、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患（ＴＤＰ−４３の細胞内蓄積に伴う疾患）が挙げられる。
（４）メチレンブルー及び／又はディメボンを含む、神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物。
本発明の医薬組成物において、神経変性疾患としては、例えば、前頭側頭葉変性症及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられ、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患（ＴＤＰ−４３の細胞内蓄積に伴う疾患）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＦＴＬＤ又はＡＬＳ患者脳に見られるＴＤＰ−４３細胞内封入体を示す図である。左図が核内、右が細胞質内に形成された封入体である。
図２は、野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。核移行シグナル配列（ＮＬＳ１）および核移行シグナル類似配列（ＮＬＳ２）の部分に下線を付した。なお、実施例中に記載の「アミノ酸残基番号」は、すべてこの図２（又は配列番号２）に示されるアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸残基の位置及びアミノ酸配列領域を示すものである。また、所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列がどれであるかは、配列番号１に示される塩基配列（アミノ酸配列も併記）を参照することで特定することができる。
図３は、ＴＤＰ−４３核移行シグナル（ＮＬＳ）同定の方法を示した模式図である。
図４は、各種ＴＤＰ−４３を発現した細胞を共焦点レーザー顕微鏡により観察した結果を示す図である。
図５は、各種ＴＤＰ−４３の発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）処理の有無の効果を示す図である。市販の抗体（ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ）による染色像である。
図６は、ΔＮＬＳ１発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）処理の有無の効果を示す図である。抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）および抗ユビキチン抗体（ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）による染色像である。
図７は、ΔＮＬＳ２発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）処理の有無の効果を示す図である。抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）および抗ユビキチン抗体（ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）による染色像である。
図８は、ΔＮＬＳ１＆２発現細胞に対するプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）処理の有無の効果を示す図である。抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）および抗ユビキチン抗体（ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）による染色像である。
図９は、ＧＦＰが融合した野生型ＴＤＰ−４３および各種ＴＤＰ−４３断片の模式図である。
図１０は、ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＴＤＰ−４３  ＷＴ発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。ＧＦＰの蛍光およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる染色像である。
図１１は、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。ＧＦＰの蛍光およびａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０またはａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる染色像である。
図１２は、ＧＦＰ−ＴＤＰ  ２１８−４１４発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。ＧＦＰの蛍光およびａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０またはａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる染色像である。
図１３は、ＧＦＰ−ＴＤＰ  ２７４−４１４およびＧＦＰ−ＴＤＰ  ３１５−４１４発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。ＧＦＰの蛍光およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる染色像である。
図１４は、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １−１６１およびＧＦＰ−ＴＤＰ  １−２１７発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。ＧＦＰの蛍光およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる染色像である。
図１５は、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １−２７３およびＧＦＰ−ＴＤＰ  １−３１４発現細胞の共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。ＧＦＰの蛍光およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる染色像である。
図１６は、ＣＦＴＲエキソン９スキッピングアッセイの方法を示す模式図である。
図１７は、ＣＦＴＲエキソン９スキッピングアッセイの結果を示す図である。
図１８は、ＣＦＴＲエキソン９スキッピングアッセイの結果を示す図である。
図１９は、低分子化合物（メチレンブルー）によるＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制効果について、共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。上段はＴＤＰ−４３  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２についての結果であり、下段の３つは、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４についての結果である。
図２０は、低分子化合物（メチレンブルー）によるＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制効果について、封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。左のグラフはＴＤＰ−４３  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２についての結果であり、右のグラフは、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４についての結果である。グラフの横軸は、メチレンブルー及びディメボンの濃度であり、縦軸は、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成細胞の割合である。
図２１は、低分子化合物（ディメボン）によるＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制効果について、共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
図２２は、低分子化合物（ディメボン）によるＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制効果について、封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。左のグラフはＴＤＰ−４３  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２についての結果であり、右のグラフは、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４についての結果である。グラフの横軸は、メチレンブルー及びディメボンの濃度であり、縦軸は、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成細胞の割合である。
図２３は、低分子化合物（メチレンブルー及びディメボン）による、ＴＤＰ−４３  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２に対するＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制効果について、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。グラフの横軸は、メチレンブルー及びディメボンの濃度であり、縦軸は、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成細胞の割合である。
図２４は、低分子化合物（メチレンブルー及びディメボン）による、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４に対するＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制効果について、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成細胞の割合を定量測定した結果を示す図である。グラフの横軸は、メチレンブルー及びディメボンの濃度であり、縦軸は、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成細胞の割合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００８−１０１８９９号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．本発明の概要
アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患では、神経細胞内にユビキチン陽性のタンパク質封入体が形成される。前頭側頭葉変性症（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＦＴＬＤ）や、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）等の神経変性疾患では、これまで、患者脳に特徴的に認められるユビキチン陽性封入体の主要構成成分が明らかとなっていなかったが、最近の研究により、ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）という特定の核内タンパク質が上記封入体の主要構成成分として同定された（Ａｒａｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＤＰ−４３  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔａｕ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，ｖｏｌ．３５１（３），ｐ．６０２−６１１；Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ＴＤＰ−４３  ｉｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，ｖｏｌ．３１４（５７９６），ｐ．１３０−１３３）。ＴＤＰ−４３は、不均一核内リボ核酸タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｎＲＮＰ）の一種であり、核に局在し、ＲＮＡや他のｈｎＲＮＰと結合して、ＲＮＡの安定化や選択的スプライシング、転写調節などのプロセスに関与するタンパク質であると考えられている（Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＴＤＰ−４３  ａｎｄ  ＳＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＦＴＲ  ｅｘｏｎ  ９  ｓｋｉｐｐｉｎｇ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１，ｖｏｌ．２０（７），ｐ．１７７４−１７８４）。しかしながら、どのようなメカニズムでＴＤＰ−４３が神経細胞内で蓄積するのか、蓄積したＴＤＰ−４３に細胞毒性はあるか、及びどのようなメカニズムで細胞死が誘導されるのか、などといった点は、全く明らかになっていなかった。
本発明者は、これらの点の解明には、培養細胞等を用いたＴＤＰ−４３蓄積細胞モデルが必要であると考え、そのようなモデル系の開発に取り組んだ。その結果、種々の変異体（変異型ＴＤＰ−４３タンパク質）やＴＤＰ−４３タンパク質の断片を含む融合タンパク質を細胞に発現させ、場合によってはその細胞にプロテアソーム阻害処理を行うことにより、細胞内にＴＤＰ−４３封入体を形成させ、ＴＤＰ−４３を蓄積させることに成功した。
このモデル系を用いることにより、細胞内ＴＤＰ−４３蓄積を抑制する薬剤や遺伝子等のスクリーニングが可能となり、またトランスジェニック動物の作製にも利用できると考えられ、ＦＴＬＤやＡＬＳの新たな治療薬及び治療方法の開発に極めて有用なものであると考えられる。
２．形質転換細胞（細胞モデル）
本発明の形質転換細胞は、宿主細胞において機能するプロモーター、変異型ＴＤＰ−４３遺伝子が導入された細胞（以下、「変異型ＴＤＰ−４３形質転換細胞」と言うことがある。）である。本発明の形質転換細胞は、細胞内（細胞質内又は核内）封入体の主要構成成分となる変異型ＴＤＰ−４３を発現するものであり、ＦＴＬＤやＡＬＳ等の神経変性疾患の細胞モデルとして有用なものである。
（１）形質転換細胞の作製方法の概要
通常、所望の宿主細胞において外来の目的タンパク質（本発明では変異型ＴＤＰ−４３）を過剰発現させるためには、まず、目的タンパク質遺伝子を発現ベクターに組み込んだ組換えベクターを構築することが必要である。この際、発現ベクターに組込む遺伝子には、予め、宿主細胞において機能するプロモーターを連結しておくことが好ましく、そのほか、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、及び選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから目的タンパク質遺伝子に含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、特に限定はされない。
発現ベクターに目的タンパク質遺伝子を組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、レトロウイルスベクター、人工染色体ＤＮＡなど、特に限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
次いで、構築した組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、目的タンパク質を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換」とは、宿主細胞に外来遺伝子を導入することを意味し、具体的には、宿主細胞にプラスミドＤＮＡ等を導入して（形質転換）外来遺伝子を導入すること、及び、宿主細胞に各種ウイルス及びファージを感染させて（形質導入）外来遺伝子を導入することをいずれも含む意味である。
宿主細胞としては、組換えベクターが導入された後、目的タンパク質を発現することができるものであれば、特に限定はされず、適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス及びラット等の各種哺乳動物由来の動物細胞や、場合によっては酵母細胞などを用いることもできる。当該動物細胞としては、例えば、ヒト繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、神経芽細胞、中枢神経系細胞及び末梢神経系細胞等を用いることができ、本発明においては、特に神経芽細胞、中枢神経系細胞及び末梢神経系細胞等の神経細胞が好ましい。一方、酵母としては、限定はされないが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が好ましく挙げられる。
形質転換細胞を得る方法、すなわち組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、特に限定はされず、宿主細胞と発現ベクターとの種類の組み合わせを考慮して、適宜選択することができるが、例えば、リポフェクション法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、並びに、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
得られる形質転換細胞においては、組換えベクターに含まれる遺伝子のコドン型は、実際に用いた宿主細胞のコドン型と一致していてもよいし、異なっていてもよく、限定はされない。
以上に概要を述べた、形質転換細胞の作製方法は、本発明の形質転換細胞（変異型ＴＤＰ−４３形質転換細胞）の作製においても任意に適用できる。
（２）変異型ＴＤＰ−４３形質転換細胞
本発明の形質転換細胞において、目的タンパク質である変異型ＴＤＰ−４３の発現態様は、宿主細胞において安定発現する態様であってもよいし、一過性発現する態様であってもよく、特に限定はされない。ここで、本発明でいう「安定発現」とは、宿主細胞の染色体内に組み込まれた遺伝子（染色体内遺伝子）に基づく恒常的な発現を意味し、一方、「一過性発現」とは、宿主細胞内の染色体に組み込まれていない遺伝子（プラスミド等の染色体外遺伝子）に基づく非恒常的な発現を意味する。
本発明の形質転換細胞において、宿主細胞としては、限定はされないが、哺乳動物細胞がより好ましい。哺乳動物細胞としては、ヒト由来細胞であっても非ヒト由来細胞であってもよく、限定はされない。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ラビット、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等の哺乳類動物が好ましく挙げられ、中でも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物がより好ましく、特に好ましくはマウス及びラットである。また、動物細胞の細胞種としては、限定はされないが、神経芽細胞、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞等が特に好ましい。
宿主細胞に目的タンパク質遺伝子（変異型ＴＤＰ−４３遺伝子）を導入するには、前述したように、通常、これら遺伝子を含む組換えベクターを用いるが、この際、宿主細胞内で安定発現させる場合は、染色体ＤＮＡと組換え可能な公知の発現ベクター（安定発現ベクター）を用いることが好ましく、一過性発現をさせる場合は、染色体ＤＮＡとの組換えがなく細胞内で自立複製が可能な公知の発現ベクター（一過性発現ベクター）を用いることが好ましい。なお、安定発現又は一過性発現をさせる場合に用いるベクターとしては、安定発現ベクターと一過性発現ベクターとの両方の機能を有するベクターを適宜用いてもよい。安定発現ベクターは、動物細胞用のものとして、例えば、ｐＣＥＰ４ベクター及びｐＴａｒｇｅｔベクターなどの公知のベクターを用いることができ、酵母細胞用のものとして、公知の各種ベクターを用いることができる。また、一過性発現ベクターは、動物細胞用のものとして、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター、ｐｃＤＮＡ３（＋）ベクター、ｐｃＤＮＡ３（−）ベクター、ｐＥＧＦＰ−Ｃｌベクター（ＧＦＰ（詳しくはＥＧＦＰ）融合タンパク質発現用ベクター）、ｐＣＥＰ４ベクター、及びｐＴａｒｇｅｔベクターなどの公知のベクターを用いることができ、酵母細胞用のものとして、公知の各種ベクターを用いることができる。
なお、上記各種発現ベクターとしては、宿主細胞において機能するプロモーターを含むものを公知のものから適宜選択して利用し、当該プロモーターにより宿主細胞における目的タンパク質遺伝子の発現制御を行うようにする。宿主細胞において機能するプロモーターの制御下にある変異型ＴＤＰ−４３遺伝子を導入することができる発現ベクターが好ましい。ここで、「プロモーターの制御下にある」とは、当該プロモーターが機能して変異型ＴＤＰ−４３遺伝子が宿主細胞において発現され得るように、すなわち、当該プロモーターがこれら遺伝子に作用可能なように、連結されたものであることを意味する。
具体的に、中枢神経系細胞において機能するプロモーターとしては、限定はされないが、例えば、Ｔｈｙ−１プロモーター（脳特異的）、Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｏｌａｓｅプロモーター（脳特異的）及びＴα１プロモーター（脳特異的）及びプリオンプロモーター（脳特異的）等の中枢神経細胞用プロモーター、並びに、グリア細胞など中枢神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターが挙げられる。中枢神経系細胞において機能するプロモーターは、中枢神経細胞用プロモーターとしての機能と、中枢神経系に存在し得る各種細胞用プロモーターとしての機能とを両方有するものであってもよい。また、末梢神経系細胞において機能するプロモーターとしては、限定はされず、末梢神経細胞用の公知のプロモーター、及び末梢神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターが挙げられる。末梢神経細胞用の公知のプロモーターとしては、中枢神経細胞用プロモーターとして上記列挙したものを同様に使用することができ、また末梢神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターとしては、中枢神経系に存在し得る各種細胞用の公知のプロモーターが同様に使用することができる。末梢神経系細胞において機能するプロモーターは、末梢神経細胞用プロモーターとしての機能と、末梢神経系に存在し得る各種細胞用プロモーターとしての機能とを両方有するものであってもよい。さらに、神経芽細胞において機能するプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター等の公知のプロモーターが挙げられる。
発現ベクターに挿入する変異型ＴＤＰ−４３遺伝子は、例えば、以下の通り作製することができる。
具体的には、まず、ヒトのｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により野生型ＴＤＰ−４３遺伝子断片を得て、この遺伝子断片を用いて野生型ＴＤＰ−４３遺伝子をスクリーニングする。野生型ＴＤＰ−４３遺伝子には、必要により、エピトープタグ等をコードするＤＮＡを連結しておいてもよい。スクリーニングした野生型ＴＤＰ−４３遺伝子は、組換えＤＮＡ技術を用いて、適当なプラスミドベクターに挿入しておいてもよい。あるいは、上記スクリーニングをする代わりに、予め野生型ＴＤＰ−４３遺伝子が挿入された市販のプラスミドベクターを使用してもよい。
野生型ヒトＴＤＰ−４３遺伝子の塩基配列情報（配列番号１）は、公知のデータベースから容易に入手することができ、例えば、米国生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて「アクセッション番号：ＮＭ＿００７３７５」として公表されている。配列番号１において、野生型ヒトＴＤＰ−４３のコード領域（ＣＤＳ）は第１３５番目〜第１３７９番目であるため、配列番号１に示す全長配列の代わりに上記コード領域を使用することも可能である。
次いで、野生型ＴＤＰ−４３遺伝子の塩基配列に変異を加えて、変異型ＴＤＰ−４３をコードする変異型ＴＤＰ−４３遺伝子を得る。ここで、本発明でいう変異型ＴＤＰ−４３とは、細胞内封入体形成活性を有するタンパク質を意味する。「細胞内封入体形成活性」とは、自己、すなわち変異型ＴＤＰ−４３同士が主要構成成分となって互いに凝集し、細胞内（細胞質内又は核内）において封入体を形成する活性（例えば、封入体の形成率、細胞内形成数及び大きさ）を意味し、本来凝集して封入体を形成しにくい野生型ＴＤＰ−４３に比べて、変異型ＴＤＰ−４３同士の凝集の程度が高いと認められる物性であればよい。
本発明でいう変異型ＴＤＰ−４３としては、具体的には、以下の（１ａ）〜（１ｄ）のタンパク質が好ましく挙げられる。
（１ａ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋデータベース「アクセッション番号：ＮＭ＿０３１２１４」）において第７８番目〜第８４番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（１ｂ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）において第１８７番目〜第１９２番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（１ｃ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）において第７８番目〜第８４番目及び第１８７番目〜第１９２番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（１ｄ）アミノ酸配列（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）において１若しくは数個（好ましくは１個〜１０個程度、より好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内封入体形成活性を有するタンパク質
また、本発明でいう変異型ＴＤＰ−４３としては、以下の（２ａ）〜（２ｄ）のタンパク質も具体例として好ましく挙げられる。
（２ａ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）のうちの第１６２番目〜第４１４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（２ｂ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）のうちの第２１８番目〜第４１４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（２ｃ）野生型ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）のうちの第１番目〜第１６１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
（２ｄ）アミノ酸配列（２ａ）、（２ｂ）又は（２ｃ）において１若しくは数個（好ましくは１個〜１０個程度、より好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内封入体形成活性を有するタンパク質
ここで、上記（２ａ）〜（２ｄ）のタンパク質は、野生型ＴＤＰ−４３の断片を含むものであると言えるが、当該断片のみからなるタンパク質であってもよいし、他のタンパク質（例えばＧＦＰ等のレポータータンパク質）との融合タンパク質であってもよく、限定はされない。なお、当該融合タンパク質をコードする遺伝子の構築は、公知の塩基配列情報及び遺伝子組換え技術により当業者であれば容易に行うことができる。
本発明でいう変異型ＴＤＰ−４３は、嚢胞性線維症の原因遺伝子である嚢胞性線維症膜貫通調節因子（Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：ＣＦＴＲ）遺伝子（配列番号１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００４９２）のエキソン９のスキッピング活性を有しないものであることが好ましい。従来より、野生型ＴＤＰ−４３の機能として、ＣＦＴＲエキソン９をスキップさせる活性が報告されているが（Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲））、本発明でいう変異型ＴＤＰ−４３、特に上記（１ａ）〜（１ｄ）及び（２ａ）〜（２ｄ）のタンパク質は、当該スキッピング活性を有しないため、ＴＤＰ−４３による細胞内封入体形成と、ＴＤＰ−４３の機能低下との関連性は高いものと言える。なお、配列番号１６に示されるＣＦＴＲ遺伝子（ＮＭ＿０００４９２）の塩基配列においては、エキソン１０領域が、“Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲）”でいうエキソン９領域に対応するものとなる。従って、本願明細書でいう「エキソン９のスキッピング活性」とは、便宜上、“Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲）”での表記（名称）を同様に使用したものであり、配列番号１６に示される塩基配列を基準にする場合は、実質的には、「エキソン１０のスキッピング活性」を意味することとなる。この点については、本願明細書、特許請求の範囲、図面の記載のすべてにおいて同様に解釈されるものとする。なお、上記エキソン１０は、配列番号１６に示される塩基配列中の第１３４２番目〜第１５２４番目の塩基からなる塩基配列である。
上記の変異型ＴＤＰ−４３をコードする遺伝子（変異型ＴＤＰ−４３遺伝子）は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
また、変異型ＴＤＰ−４３遺伝子は、後述する実施例に記載のように、野生型ＴＤＰ−４３をコードする塩基配列を含むＤＮＡ等をテンプレートとして、当該遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、適当な条件下でＰＣＲを行うことにより、調製することもできる。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないが、正確性の高いＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、例えば、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さや種類等により適宜設定すればよいが、例えば、サイクル条件であれば「９０〜９８℃で５〜３０秒（熱変性・解離）→５０〜６５℃で５〜３０秒（アニーリング）→６５〜８０℃で３０〜１２００秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０〜２００サイクル行う条件が好ましい。
さらに本発明においては、上記のようにして得られた変異型ＴＤＰ−４３遺伝子の塩基配列またはそのコード領域の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内封入体形成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を使用することもできる。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が１００〜９００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、その相補配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、変異型ＴＤＰ−４３を発現することを特徴とするが、発現をするクローンの選択や、目的タンパク質の発現の検出及び定量は、ウエスタンブロット法等の公知の方法により行うこともできる。
本発明の形質転換細胞は、変異型ＴＤＰ−４３を発現することのみで、その細胞内（細胞質内又は核内）封入体を形成し得るものであるが、場合によっては、変異型ＴＤＰ−４３を発現させた細胞をプロテアソーム阻害剤で処理することにより、当該封入体の形成が認められるものも含まれる。本発明において使用されるプロテアソーム阻害剤としては、限定はされないが、例えば、ＭＧ１３２、ラクタシスチン、ＩＥＡＬ、ＭＧ１１５などが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、ヒトのＦＴＬＤ又はＡＬＳ等の神経変性疾患の患者脳に見られる細胞内（細胞質内又は核内）封入体に酷似した封入体が形成されたものが好ましく、これら神経変性疾患の治療薬や治療方法を開発するための細胞モデルとして極めて有用なものである。
３．神経変性疾患の治療薬等のスクリーニング方法
本発明においては、前記２．項に記載した形質転換細胞を用いた神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られる神経変性疾患の治療薬を提供することもできる。当該スクリーニング方法は、詳しくは、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするというものである。当該スクリーニング方法において、神経変性疾患としては、限定はされないが、例えば、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病及びプリオン病等が挙げられるが、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患（ＴＤＰ−４３の細胞内蓄積に伴う疾患）が好ましく挙げられる。
ここで、本発明の形質転換細胞の細胞活性としては、限定はされず、該形質転換細胞の機能及び特性等に関わる種々の活性を挙げることができる。種々の活性の測定方法は、公知の方法が採用できる。上記スクリーニング方法においては、測定対象とする細胞活性が、例えば、神経突起伸張能、生存能、増殖能、並びに変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体の形成率、細胞内形成数及び大きさ（変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成活性）等であることが好ましい。
例えば、本発明の形質転換細胞が、脳神経細胞等の各種神経細胞や神経芽細胞に由来するものであるときは、これら形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、神経突起伸張能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、高い伸長率（伸長速度）を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。
また、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、増殖能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、高い増殖率（増殖速度）を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。同様に、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、生存能の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、長い寿命又は高い生存率を有すると評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。
さらに、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、変異型ＴＤＰ−４３を主要構成成分とする細胞内封入体の形成率（細胞個数基準）の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、形成率が低いと評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。同様に、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、細胞あたりの上記細胞内封入体の形成数の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、個数が少ないと評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。また同様に、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、上記細胞内封入体の大きさに関する測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、初めから小さいか又はそれ以上大きくなりにくいと評価できれば、候補物質を神経変性疾患の治療薬として選択することができる。
一方、本発明は、前記２．項に記載した形質転換細胞を用いた変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成抑制剤のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られる変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成抑制剤を提供することもできる。当該スクリーニング方法は、詳しくは、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させて当該細胞内における上記封入体形成活性（実質的には、当該形成の抑制活性）を測定し、得られる測定結果を指標として変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成抑制剤をスクリーニングするというものである。当該スクリーニング方法において、変異型ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成活性は、細胞内封入体の形成率、細胞内形成数及び大きさ等を基準にして測定されるものであることが好ましい。
本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、変異型ＴＤＰ−４３を主要構成成分とする細胞内封入体の形成率（細胞個数基準）の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、形成率が低いと評価できれば、候補物質を当該封入体形成抑制剤として選択することができる。同様に、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、細胞あたりの上記細胞内封入体の形成数の測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、個数が少ないと評価できれば、候補物質を当該封入体形成抑制剤として選択することができる。また同様に、本発明の形質転換細胞に候補物質を接触させた場合に、上記細胞内封入体の大きさに関する測定結果が、候補物質を接触させない細胞と比較して、初めから小さいか又はそれ以上大きくなりにくいと評価できれば、候補物質を当該封入体形成抑制剤として選択することができる。
４．副作用の検定方法
本発明においては、前記２．項に記載した形質転換細胞を用いた神経変性疾患の治療薬の副作用を検定する方法を提供することもできる。当該検定方法は、詳しくは、本発明の形質転換細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させて当該細胞の細胞活性を測定し、得られる測定結果を指標として神経変性疾患の治療薬の副作用を検定するというものである。当該検定方法において、神経変性疾患としては、例えば、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病及びプリオン病等が挙げられるが、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う疾患（ＴＤＰ−４３の細胞内蓄積に伴う疾患）が好ましく挙げられる。
ここで、本発明の形質転換細胞の細胞活性としては、限定はされず、該形質転換細胞の機能及び特性等に関わる種々の活性を挙げることができる。種々の活性の測定方法は、公知の方法が採用できる。上記検定方法においては、測定対象とする細胞活性が、例えば、神経突起伸張能、増殖能及び生存能であることが、特に好ましい。
例えば、本発明の形質転換細胞が、脳神経細胞等の各種神経細胞や神経芽細胞に由来するものであるときは、これら細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、神経突起伸張能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞と比較して、同等又は高い伸長率（伸長速度）を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。
また、本発明の形質転換細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、増殖能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞と比較して、同等又は高い増殖率（増殖速度）を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。同様に、本発明の形質転換細胞に神経変性疾患の治療薬を接触させた場合に、生存能の測定結果が、当該治療薬を接触させない細胞と比較して、同等若しくは長い寿命又は同等若しくは高い生存率を有すると評価できれば、当該治療薬が副作用を有しないと判断することができる。
５．治療用及び予防用医薬組成物
本発明の神経変性疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物は、前述したように、有効成分としてメチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）及び／又はディメボン（Ｄｉｍｅｂｏｎｅ）といった低分子化合物を含むことを特徴とする医薬組成物である。メチレンブルー及びディメボンは、神経変性疾患、例えば、前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う神経変性疾患に対して、ＴＤＰ−４３細胞内封入体の形成を効果的に抑制することができるため、当該疾患の治療及び予防に有用なものである。
なお、本発明は、被験者（神経変性疾患若しくはその恐れのある患者、又は健常者）にメチレンブルー及び／又はディメボンを投与することを特徴とする神経変性疾患の治療及び／又は予防方法を含むものである。また、本発明は、神経変性疾患の治療及び／又は予防のための薬剤の製造ためのメチレンブルー及び／又はディメボンの使用を含むものであり、さらには、メチレンブルー及び／又はディメボンを含むことを特徴とする神経変性疾患の治療及び／又は予防用キットを提供することもできる。
本発明の医薬組成物等においては、メチレンブルー及びディメボンと同様に、エキシフォン、ゴシペチン及びコンゴレッド等の低分子化合物も、ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成抑制効果を有する有効成分として、使用することができる。
（１）有効成分の配合割合
本発明の医薬組成物において、有効成分であるメチレンブルー及びディメボンの配合割合は特に限定はされないが、例えば、神経変性疾患の治療用医薬組成物（神経変性疾患治療薬）である場合、メチレンブルーは、０．０１〜３０重量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％であり、ディメボンは、０．０１〜３０重量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％である。また、本発明の医薬組成物においては、メチレンブルー及びディメボンは、いずれか一方のみ用いてもよいし（単剤処理）、両者を併用してもよく（併用処理）、限定はされない。メチレンブルー及びディメボンの併用の場合、本発明の医薬組成物におけるこれら有効成分の合計配合割合は、０．０１〜３０重量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％である。
（２）その他の成分
本発明の医薬組成物は、有効成分であるメチレンブルー及びディメボン以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で、他の構成成分を含んでいてもよく、限定はされず、例えば、後述するような薬剤製造上一般に用いられるもの等を含むことができる。
（３）用法、用量
本発明の医薬組成物の体内への投与は、例えば、非経口または経口等の公知の用法で行うことができ、限定はされないが、好ましくは非経口である。
これら各種用法に用いる製剤（非経口剤や経口剤等）は、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。
本発明の治療用及び予防用医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数（／１日）、投与期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。
本発明の医薬組成物を、非経口剤又は経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分を、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり０．１〜５０ｍｇ服用できる量であることが好ましく、より好ましくは０．５〜２０ｍｇであり、さらに好ましくは１〜１０ｍｇである。
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等）、充填材（乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（各種でんぷん等）、および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
経口剤の投与量（１日あたり）は、一般には、前述した有効成分を、適用対象（被験者；患者）の体重１ｋｇあたり０．１〜１００ｍｇ服用できる量であることが好ましく、より好ましくは０．５〜５０ｍｇであり、さらに好ましくは１〜１０ｍｇである。経口剤中の有効成分の配合割合は、限定はされず、１日あたりの投与回数等を考慮して、適宜設定することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
（１）材料及び方法
各種プラスミドベクターの構築
ｐＲｃ−ＣＭＶベクター（Ｂｕｒａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲）参照）のＣＭＶプロモーター下流のＮｏｔ  Ｉサイト及びＡｐａ  Ｉサイト間にヒトＴＤＰ−４３遺伝子（配列番号１）が挿入されたベクター（ｐＲｃ−ＣＭＶ−ＴＤＰ−４３）を鋳型として、ＰＣＲ法により、ヒトＴＤＰ−４３遺伝子のコード領域を増幅した。当該ＰＣＲは、下記のプライマーセットを使用し、下記の反応液組成及び反応条件で行った。
＜プライマーセット＞
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000002
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000003
＜反応液組成＞
2009125646.tif 000004
＜反応条件＞
「９５℃で３０秒間の熱変性・解離→５０℃で３０秒間のアニーリング→７２℃で１２０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計３０サイクル。
上記ＰＣＲにより得られた増幅断片を、ｐｃＤＮＡ３（＋）ベクター（インビトロジェン社）のＭＣＳのＢａｍＨＩサイトおよびＸｂａＩサイト間に挿入し、ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３  ＷＴベクターを作製した。
次いで、ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３  ＷＴを鋳型とし、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラテジーン社）を用いて、ＴＤＰ−４３の核移行シグナル（ＮＬＳ１，アミノ酸残基番号：７８−８４，図２参照）の欠損変異体、核移行シグナル類似配列（ＮＬＳ２，アミノ酸残基番号：１８７−１９２，図２参照）の欠損変異体、およびこれら両方の欠損変異体をコードする塩基配列を有するプラスミドベクターを、それぞれ作製した。各ベクターの名称及び概要を以下に列挙した。
・ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３  ＷＴ：
野生型ＴＤＰ−４３（アミノ酸残基番号：１−４１４（全長））をコード。
・ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３−ΔＮＬＳ１：
ＮＬＳ１欠損変異体（アミノ酸残基番号：７８−８４を欠損）をコード。
・ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３−ΔＮＬＳ２：
ＮＬＳ２欠損変異体（アミノ酸残基番号：１８７−１９２を欠損）をコード。
・ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３−ΔＮＬＳ１＆２：
ＮＬＳ１及びＮＬＳ２の両欠損変異体（アミノ酸残基番号：７４−８４及びアミノ酸残基番号：１８７−１９２を欠損）をコード。
さらに、野生型ＴＤＰ−４３又はその一部と、ＧＦＰとの融合タンパク質をコードする塩基配列を有するプラスミドベクターを作製した。具体的には、まず、ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ４３  ＷＴを鋳型として、ＰＣＲ法により、野生型ＴＤＰ−４３をコードする塩基配列の全部又は所望の一部を増幅した。当該ＰＣＲは、下記のいずれがのプライマーセットを使用し、下記の反応液組成及び反応条件で行った。
＜プライマーセット＞
・野生型ＴＤＰ−４３（アミノ酸残基番号：１−４１４）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000005
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000006
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１６２−４１４）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000007
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000008
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：２１８−４１４）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000009
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000010
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：２７４−４１４）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000011
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000012
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：３１５−４１４）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000013
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000014
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−１６１）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000015
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000016
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−２１７）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000017
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000018
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−２７３）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000019
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000020
・ＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−３１４）をコードする塩基配列の増幅用
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000021
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000022
＜反応液組成＞
2009125646.tif 000023
＜反応条件＞
「９５℃で３０秒間の熱変性・解離→５５℃で３０秒間のアニーリング→７２℃で１２０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計３０サイクル。
上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を、それぞれｐＥＧＦＰ−Ｃｌ（クロンテック社；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ５５７６３）のＭＣＳのＢａｍＨＩサイトおよびＸｈｏＩサイト間に挿入し、ＧＦＰとの融合タンパク質をコードする塩基配列を有するプラスミドベクターを、それぞれ作製した。各ベクターの名称及び概要を以下に列挙した。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３  ＷＴ：
ＧＦＰと野生型ＴＤＰ−４３（アミノ酸残基番号：１−４１４（全長））との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１６２−４１４）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  ２１８−４１４：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：２１８−４１４）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  ２７４−４１４：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：２７４−４１４）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ３１５−４１４：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：３１５−４１４）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  １−１６１：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−１６１）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  １−２１７：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−２１７）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  １−２７３：
ＧＦＰとＴＤＰ４３の一部（アミノ酸残基番号：１−２７３）との融合タンパク質をコード。
・ＧＦＰ−ＴＤＰ  １−３１４：
ＧＦＰとＴＤＰ−４３の一部（アミノ酸残基番号：１−３１４）との融合タンパク質をコード。
ＴＤＰ−４３の機能解析を行うために、嚢胞性線維症の原因遺伝子である嚢胞性線維症膜貫通調節因子（Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：ＣＦＴＲ）のエキソン９およびその前後のイントロンを含む領域をコードするプラスミドベクターを作製した。すなわち、ヒト健常者由来の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いて、ＣＦＴＲ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００４９２）の塩基配列（配列番号１６）中のエキソン１０（“Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲）”でいうエキソン９に対応）の上流側２２１番目の塩基から当該エキソン１０の下流側２６６番目の塩基までの計６７０塩基（配列番号１６に示される塩基配列中の第１１３０番目〜第１７９０番目の塩基）からなる塩基配列領域を増幅した。当該ＰＣＲは、下記のプライマーセットを使用し、下記の反応液組成及び反応条件で行った。
＜プライマーセット＞
Ｆプライマー：
2009125646.tif 000024
Ｒプライマー：
2009125646.tif 000025
＜反応液組成＞
2009125646.tif 000026
＜反応条件＞
「９５℃で３０秒間の熱変性・解離→６０℃で３０秒間のアニーリング→７２℃で１２０秒間の合成・伸長」を１サイクルとするサイクル条件で、計３５サイクル。
上記ＰＣＲにより得られた増幅断片を、ｐＳＰＬ３ベクター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ１９８６７）のＭＣＳのＥｃｏＲＩサイトおよびＸｈｏＩサイト間に挿入して、ｐＳＰＬ３−ＣＦＴＲｅｘ９ベクターを作製した。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培養およびプラスミドベクターの導入
神経芽細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、１０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件のインキュベーター中で培養した。
上記の各種プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３系又はｐＥＧＦＰ系，１μｇ）は、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入した。総プラスミド量の３倍容量のＦｕＧＥＮＥ６をプラスミドと混合し、１５分間室温で静置した後、細胞液に混合した。２〜３日間培養を行い、細胞ライセートの調製又は免疫組織染色などに用いた。
共焦点レーザー顕微鏡による観察
カバーガラス上で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に、各種発現ベクター（１μｇ）を混合して、ＦｕＧＥＮＥ６の存在下で添加した。２日間の培養の後、細胞の固定又はプロテアーゼ阻害剤処理を行った。プロテアーゼ阻害剤処理では、細胞に終濃度で２０μＭ  ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）又はｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−ｌｅｕｃｙｌ−ｌｅｕｃｉｎａｌ（ｚＬＬ：カルパイン阻害剤）を添加し、３７℃で６時間培養を行った。その後、細胞は４％パラホルムアルデヒド溶液中で固定した。固定した細胞は、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理したのち、５％牛血清アルブミン溶液でブロッキングして、一次抗体と３７℃で１時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、蛍光標識した二次抗体と３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄したのち、細胞はＴＯ−ＰＲＯ−３（インビトロジェン社，３，０００倍希釈）と３７℃で１時間反応させて核染色を行った。これをスライドガラス上で封入したのち、共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス社）で解析した。
使用した一次抗体および蛍光標識した二次抗体は、以下の通りである。
・一次抗体：
ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社，１：１０００希釈）；
ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０（ＴＤＰ−４３の第４０９番目及び第４１０番目のＳｅｒ残基が共にリン酸化されたペプチドを抗原として得られた抗体（ＴＤＰ−４３凝集物に特異的に結合する抗体），１：５００希釈）；
ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＭＡＢ１５１０，ＣＨＥＭＩＣＯＮ社，１：５００希釈）
・蛍光標識二次抗体：
ＦＩＴＣ標識した抗ウサギＩｇＧ（抗ウサギイムノグロブリン，ＦＩＴＣ標識，製品番号：Ｆ９８８７，シグマ社，１５００希釈）；
ローダミン標識した抗マウスＩｇＧ（抗マウスイムノグロブリン，ＴＲＩＴＣ標識，製品番号：Ｔ２４０２，シグマ社，１：５００希釈）
なお、上記一次抗体のａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０抗体は、以下のようにして作製した。
（ｉ）抗原の調製
抗原となるペプチドとして、ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（配列番号２）におけるアミノ酸残基番号４０５−４１４のアミノ酸のＮ末端にシステインを付加した配列を有し、かつセリン残基がリン酸化されているペプチド
（ＣＭＤＳＫＳ（ＰＯ３Ｈ２）Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）ＧＷＧＭ（配列番号１９））を、固相法により合成した（シグマジェノシス、又はサーモクエスト）。ここで、当該ペプチド中、Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）はリン酸化セリンを表す。また、カラム作製、コントロール等に使用するため、非リン酸化ペプチド（ＭＤＳＫＳＳＧＷＧＭ（配列番号２０）；配列番号２に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号４０５−４１４）も合成した。
（ｉｉ）免疫
上記合成ペプチドをＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ又はＫＬＨと定法に従ってコンジュゲートし、抗原として用いた。抗原ペプチドを含有する１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩水溶液と１ｍｌのフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）を合わせ、超音波処理によってエマルジョン化し、ウサギ（ニュージーランドホワイト、体重２．５ｋｇ、雌）の背中に数カ所以上に分けて免疫した。初回免疫から２週間後に０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを合わせ、超音波処理によりエマルジョン化したものを追加免疫した。免疫から１週間後に採血を行い、採取した血液は室温で１時間静置後、４℃で一晩静置し、５０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行い、抗血清を得た。
（ｉｉｉ）抗体の精製
抗体を精製するため、ホルミルセルロファイン（生化学工業社）又はトヨパールＡＦトレシル６５０Ｍ（東ソー社）約２ｍｌに対し、前記非リン酸化合成ペプチド約２ｍｇを反応させたカラムを作製した。抗血清２ｍｌをこのカラムにおいて１０〜２０時間循環させ、カラムに吸着されなかった抗体を、抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）とした。
エキソンスキッピングアッセイ
各種のＴＤＰ−４３変異体の機能を調べるために、嚢胞性線維症の原因遺伝子である嚢胞性線維症膜貫通調節因子（Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：ＣＦＴＲ）のエキソン９のスキッピングアッセイを行った。６ウェルプレートに播種したｃｏｓ７細胞に、０．５μｇのｐＳＰＬ３−ＣＦＴＲｅｘ９および１μｇの各種ＴＰＤ−４３発現ベクターを混合して、ＦｕＧＥＮＥ６の存在下で添加した。そのまま２日間培養を行った後、細胞を回収して、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社のＥｘｏｎ  Ｔｒａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍの使用説明書に従って試料を調製し、１．３％アガロースゲルを用いた電気泳動により解析した。
低分子化合物の添加による細胞内封入体形成の抑制
細胞としてはヒト神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用い、各種ＴＤＰ−４３変異体のうち強い細胞内封入体形成が認められたｐＥＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）およびｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２（ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２）を用いて、上記封入体形成の阻害剤の検索を行った。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞への遺伝子導入は、前述した「ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培養およびプラスミドベクターの導入」に記載の方法に従い、各種プラスミド１μｇを３倍容量のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６：３μｌ）により細胞に導入した。
候補阻害剤による処理は、遺伝子導入から２時間後に開始した。候補阻害剤としては、メチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）およびディメボン（Ｄｉｍｅｂｏｎｅ）について検討した。メチレンブルーはＤＭＳＯに溶解し、終濃度が０μＭ、０．０５μＭ及び０．１μＭになるように培養液に添加することにより処理を開始した。一方、ディメボンは滅菌水に溶解し、終濃度が０μＭ、２０μＭおよび６０μＭになるように培養液中に添加することにより処理を開始した。なお、メチレンブルーの濃度は細胞増殖へのダメージがない濃度条件をあらかじめ検討し、上記濃度に決定した。一方、ディメボンの濃度については参考文献（Ｊｕｎ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，２００８，ｖｏｌ．３，ｐ．１５）を参考にし、調製法（滅菌水に懸濁）については試薬提供者の指示に従った。
候補阻害剤の添加から３日後、前述した「共焦点レーザー顕微鏡による観察」に記載の方法に従い、細胞の状態を観察した。候補阻害剤処理から３日後の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００にて膜透過処理を行った後、５％牛血清アルブミン溶液でブロッキングし、一次抗体と３７℃で１時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、蛍光標識した二次抗体と３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、細胞はＴＯ−ＰＲＯ−３（インビトロジェン社，３，０００倍希釈）と３７℃で１時間反応させて核染色を行った。これをスライドガラス上で封入して、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）で解析した。なお、今回使用した一次抗体および蛍光標識した二次抗体は、以下の通りである。
ｐＥＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）に対して
一次抗体：
・ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０（ＴＤＰ−４３の第４０９番目および第４１０番目のアミノ酸残基のＳｅｒが共にリン酸化されたペプチドを抗原として得られた抗体であって、ＴＤＰ−４３凝集物に特異的に結合する抗体（本発明者により作製），１：５００希釈）
蛍光標識二次抗体：
・Ａｌｅｘａ−５６８標識した抗マウスＩｇＧ（１：５００希釈）
共焦点レーザー顕微鏡による観察像：
ＴＤＰが緑色（ベクター由来のＧＦＰ）、リン酸化ＴＤＰが赤色で確認される。
ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２（ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２）に対して
一次抗体：
・ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０（ＴＤＰ−４３の第４０９番目および第４１０番目のアミノ酸残基のＳｅｒが共にリン酸化されたペプチドを抗原として得られた抗体であって、ＴＤＰ−４３凝集物に特異的に結合する抗体（本発明者により作製），１：５００希釈）
・ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＭＡＢ１５１０，ＣＨＥＭＩＣＯＮ社，１：５００希釈）
蛍光標識二次抗体：
・Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識した抗ウサギＩｇＧ（シグマ社、１：５００希釈）
・Ａｌｅｘａ−５６８標識した抗マウスＩｇＧ（１：５００希釈）
共焦点レーザー顕微鏡による観察像：
リン酸化ＴＤＰが緑色、ユビキチンが赤色で確認される。
共焦点レーザー顕微鏡による検鏡に際しては、細胞内封入体のみが検出できるようにレーザー出力（緑）を設定した（図１９及び２１）。
ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２（ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２）では、リン酸化ＴＤＰ（緑）の強度と細胞数を示すＴＯ−ＰＲＯ−３（青）の強度とを、ｐＥＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）では、ＴＤＰ（緑）の強度と細胞数を示すＴＯ−ＰＲＯ−３（青）の強度とを、それぞれＬＳＭ５  Ｐａｓｃａｌ  ｖ４．０ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いてそれぞれ算出し、全細胞数（青）に対する封入体形成細胞数（緑）の割合（Ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ（％））を求め、グラフに表した。その結果を、図２０及び２２（メチレンブルー又はディメボンの単剤処理）、並びに図２３及び２４（メチレンブルー及びディメボンの併用処理）に示した。
（２）結果及び考察
核移行シグナル（ＮＬＳ）の同定
ＴＤＰ−４３のＮＬＳの同定を行った。ＮＬＳは、一般的に、塩基性アミノ酸が数残基連なった配列として知られている（図３）。最もよく知られているＮＬＳとして、ＳＶ４０のＴ抗原に存在する配列（ＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号２１）が知られており、この配列を基にＴＤＰ−４３アミノ酸配列（図２）より、ＮＬＳ配列の検索を行った。その結果、２カ所の候補配列を見いだし（図２：ＮＬＳ１およびＮＬＳ２）、ＮＬＳを同定するために、ＮＬＳ候補配列（ＮＬＳ１：７８−８４残基，ＮＬＳ２：１８７−１９２残基）をそれぞれ欠損させた変異体（ΔＮＬＳ１およびΔＮＬＳ２）を作製し、野生型と共にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に一過性に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡により観察した（図３）。その結果、図４に示したように、野生型の発現は核に認められたが、ΔＮＬＳ１の発現は核ではなく、細胞質に認められた。また、ΔＮＬＳ２の発現は核に認められたが、野生型の場合とは異なり、核内に顆粒状の構造物として検出された。以上のことから、ＮＬＳ１のアミノ酸配列（図２）が核移行シグナルであることが分かった。しかしながら、野生型を含め、いずれの変異体を発現させても、発現させただけでは細胞内封入体は形成されないことも分かった。また、市販の抗体（ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ）では、プラスミドによる外来のＴＤＰ−４３だけでなく、細胞に元々存在する内在性ＴＤＰ−４３もよく染色されることが分かった（図４のｎｏｎｅ：ｐｃＤＮＡ３（＋）ベクターそのものをトランスフェクトした場合）。
核内封入体の出現
次に、野生型ＴＤＰ−４３や各種欠損変異体をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現させ、発現細胞をプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で処理し、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。各種プラスミドをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にトランスフェクションした後、３７℃で４８時間インキュベートし、そこに２０μＭのＭＧ１３２を添加して、さらに３７℃で６時間インキュベートした。細胞を固定した後に、市販のＴＤＰ−４３ポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ）で染色したところ、図５に示したように、野生型ＴＤＰ−４３やＮＬＳ１欠損変異体の発現細胞では、未添加の場合（図５：上）と比較して、特に顕著な差は見られなかったが、ＮＬＳ２欠損変異体の発現細胞では、ＭＧ１３２処理により核内に封入体が認められた。また、ＭＧ１３２に構造が類似したカルパイン阻害剤であるｚＬＬ処理を行ってみたが、特に発現パターンの変化は見られなかった（データは示さず）。
この核内封入体が、ＦＴＬＤ又はＡＬＳ患者脳で見られる核内封入体と同じ性質を有するかどうかを調べる目的で、前述のリン酸化ＴＤＰ−４３特異抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）および抗ユビキチン抗体（ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）による染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。その結果、ＭＧ１３２未処理の試料において、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０抗体に陽性な核内の顆粒状の構造物が検出できたが、ａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎでは何も染色されなかった（図６：左）。この結果より、リン酸化ＴＤＰ−４３特異抗体であるａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０は、正常の細胞に存在する内在性ＴＤＰ−４３を全く検出しないことが再確認できた。一方、ＭＧ１３２処理した試料においては（図６：右）、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎのどちらにも陽性な核内封入体が出現し、その直径は約１０μｍであることが確認された。この結果より、ＮＬＳ２欠損変異体の発現細胞にＭＧ１３２処理した場合に出現する核内封入体は、ＦＴＬＤ又はＡＬＳ患者脳で見られる核内封入体（図１：左）と同様に、リン酸化およびユビキチン化されており、その大きさもほぼ同じであることが分かった。
細胞質封入体の出現
核移行シグナルを除去したＮＬＳ１欠損変異体を発現させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＭＧ１３２処理を行い、市販のＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ）で染色を行った場合には、図５（ΔＮＬＳ１）に示したように、細胞質封入体は認められなかったので、次にリン酸化ＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）での染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰではＭＧ１３２処理後においても細胞質封入体は見られなかったが（図５：ΔＮＬＳ１）、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０による染色により、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０陽性の細胞質封入体が観察できた（図７：右）。図６の核内封入体と同様に、この細胞質封入体も、わずかではあるがａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ陽性であった。またこの細胞質封入体の直径は、約１０μｍであった。また、カルパイン阻害剤であるｚＬＬを同様に処理してみたが、細胞内封入体は全く見られず、未処理の場合と全く同様な結果であった（データは示さず）。
さらに、ＮＬＳ１及びＮＬＳ２の両配列を除去した欠損変異体（ΔＮＬＳ１＆２）を発現させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎによる免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。その結果、図８に示したように、ΔＮＬＳ１＆２発現細胞では、ＭＧ１３２処理無しで、すなわちプラスミドを発現させただけで、細胞質にａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０及びａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体に陽性な細胞質封入体が認められた。これらの細胞質封入体の直径は、約１０μｍであった。
ＧＦＰ融合タンパク質の発現
本発明者らにより、ＦＴＬＤ患者脳より、界面活性剤に不溶性の画分を調製し、市販のポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ）でイムノブロットを行うと、２０〜３５ｋＤａ付近にバンドが認められ、これらは正常コントロール脳より調製した同じ画分においては全く認められないことが明らかにされている（Ａｒａｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，ｖｏｌ．３５１（３），ｐ．６０２−６１１（前掲）；Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，ｖｏｌ．３１４（５７９６），ｐ．１３０−１３３（前掲））。このことは、患者脳においては、全長ＴＤＰ−４３だけでなく、ＴＤＰ−４３の部分断片が高度に不溶化し、蓄積していることを示している。そこで、種々のＴＤＰ−４３断片を発現させるプラスミドを作製して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入し、当該断片を発現させた。まず、常法に従い、ｐｃＤＮＡ３（＋）ベクターにＴＤＰ−４３の１６２−４１４残基目までのＣ末端側断片を導入し（ｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰΔＮ１６１）、ＦｕＧＥＮＥ６にて細胞にトランスフェクトした。３７℃で２日間インキュベートした後、細胞を回収してａｎｔｉ−ＴＡＲＤＢＰ抗体によるイムノブロット解析を行ったが、その発現は全く認められなかった（データは示さず）。そこで、次に、ＴＤＰ−４３の１６２−４１４残基の断片のＮ末端側にＧＦＰタグを融合させた融合体タンパク質（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）を細胞に発現させたところ、その発現は認められた（図１１）。したがって、野生型ＴＤＰ−４３および各種ＴＤＰ−４３断片をＧＦＰのＣ末端側に融合させたタンパク質をコードするプラスミドを作製し（図９）、これらをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現させ、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０あるいはａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体による染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡観察を行った。
その結果を図１０〜１５に示した。まず、ＧＦＰのみを発現させた場合（図１０：左）、核および細胞質における典型的なＧＦＰの発現パターンが確認できた。次に、ＧＦＰ−ＴＤＰ  ＷＴを発現させた場合（図１０：右）、その発現は核にのみ認められた。したがって、ＧＦＰタグが結合することによる人為的な影響によって、ＧＦＰが融合したＴＤＰ−４３の発現パターンが変化することは無いことが分かった。ＴＤＰ−４３のＮ末端側の１６１残基を除去したＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４を発現させた場合（図１１）は、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体に陽性な細胞内封入体が出現した。この封入体は、ＧＦＰ−ＴＤＰ  ２１８−４１４を発現させた場合にも認められた（図１２）。しかし、さらにＮ末端側を除去したＧＦＰ−ＴＤＰ  ２７４−４１４あるいは３１５−４１４を発現させた細胞においては、このような細胞内封入体は全く認められなかった（図１３）。したがって、ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４およびＧＦＰ−ＴＤＰ  ２１８−４１４変異体を細胞に発現させると、患者脳に特徴的に認められる、リン酸化およびユビキチン化ＴＤＰからなる細胞内封入体に類似した異常構造物が出現することが分かった。
同様に、Ｃ末端側を除去した変異体を作製し、これらも細胞に一過性に発現させた。その結果、１６２残基目以降を除去したＧＦＰ−ＴＤＰ  １−１６１を発現した場合にのみ、ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０およびａｎｔｉ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ陽性の顕著な細胞内封入体を観察することができた。その他のＮ末端断片を発現させても、特に細胞内封入体は認められなかった（図１４，１５）。なお、Ｃ末端側を除去した変異体を発現させた場合の解析では、それらの変異体にリン酸化部位（４０９番目及び４１０番目のＳｅｒ）が存在しないため、抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ４０９／４１０）は使用しなかった。
以上の結果より、種々のＴＤＰ−４３変異体あるいはＧＦＰが融合したＴＤＰ−４３タンパク質を細胞に発現させ、場合によっては、プロテアソーム阻害処理と組み合わせることによって、培養細胞内に、患者脳に特徴的に見られる異常な細胞内封入体を再現することに成功した。
ＣＦＴＲエキソン９スキッピングアッセイ
上記の細胞内封入体が出現したＴＤＰ−４３変異体あるいはＧＦＰ融合タンパク質が、野生型ＴＤＰ−４３と機能的に異なるかどうかを調べるために、ＴＤＰ−４３によるＣＦＴＲエキソン９スキッピングアッセイを行った。
ＴＤＰ−４３の機能として、ＣＦＴＲエキソン９をスキップさせる活性が報告されている（Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲））。すなわち、嚢胞性線維症の一種である先天性両側完全精管欠損症と呼ばれる病気は、ＣＦＴＲのエキソン９の欠失による未成熟ＣＦＴＲの機能異常により発症することが知られている（Ｂｕｒａｔｔｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００１（前掲））。このエキソン９の欠失にＴＤＰ−４３が関与していることが報告されており、ＣＦＴＲのエキソン９の上流のイントロン内に存在する特定の塩基（ＴＧ及びＴ）のリピート配列にＴＤＰ−４３が結合し、エキソン９のスキッピングがなされる。このようなＴＤＰ−４３のＣＦＴＲエキソン９のスキッピング活性に注目し、この活性を指標に野生型と各種変異体を比較した。
簡単なスキームを図１６に示した。前述したように、ＣＦＴＲエキソン９の上流のイントロンを含む領域を正常健常者よりクローニングし、ｐＳＰＬ３ベクターに挿入し、ｐＳＰＬ３−ＣＦＴＲ  ｅｘ９ベクターを作製した。これを、各種ＴＤＰ−４３変異体あるいはＧＦＰ融合体と共にｃｏｓ７細胞に発現し、発現細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲ解析を行った。
発現細胞内において、エキソン９がスキップされる場合は、１１７ｂｐのバンドが検出され、エキソン９がスキップされない場合は、３６１ｂｐのバンドが検出されることになる（図１６）。発現細胞の試料をＰＣＲ解析し、アガロースゲル電気泳動を行った結果、ＮＬＳ１欠損変異体、ＮＬＳ２欠損変異体、及びＮＬＳ１＆２欠損変異体を発現させた場合は、野生型ＴＤＰ−４３を発現させた場合とは異なり、エキソン９がスキップされたバンドは全く検出されなかった（図１７）。すなわち、細胞内封入体の形成が観察された３種類の変異体には、ＣＦＴＲエキソン９のスキッピング活性が存在しないことが分かった。同様に、ＧＦＰ融合タンパク質とｐＳＰＬ３−ＣＦＴＲ  ｅｘ９とを共発現させた場合には、細胞内封入体が認められたＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４、ＧＦＰ−ＴＤＰ  ２１８−４１４、及びＧＦＰ−ＴＤＰ  １−１６１の３種類において、ＣＦＴＲエキソン９スキッピング活性は認められなかった（図１８）。野生型ＴＤＰ−４３のＧＦＰ融合体（ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３  ＷＴ）の発現では、ＣＦＴＲエキソン９スキッピング活性が認められていることから（図１８）、これらの結果は、ＧＦＰを融合したことによる人為的な効果ではないことも分かった。
以上の結果より、ＴＤＰ−４３の欠損変異体およびＧＦＰ融合体において、細胞内封入体形成が認められた変異体にはＣＦＴＲエキソン９スキッピング活性がなく、ＴＤＰ−４３による細胞内封入体形成は、その機能低下と関連することが示された。この結果は、ＴＤＰ−４３の細胞内封入体形成のメカニズムの解明に大きく貢献するものであり、かつＦＴＬＤやＡＬＳ発症機構ならびにそれらの治療薬の開発につながるものと考えられた。
低分子化合物によるＴＤＰ−４３細胞内封入体形成の抑制
細胞内封入体形成が認められたｐＥＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４（ＧＦＰ−ＴＤＰ  １６２−４１４）およびｐｃＤＮＡ３−ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２（ＴＤＰ  ｄｅｌｔａＮＬＳ１＆２）を用いて、封入体形成を抑制する低分子化合物の検索を行った結果、どちらの欠損変異体においてもメチレンブルーでは０．０５μＭという低濃度において阻害効果が確認され、その効果は濃度依存的に増強した（図１９及び２０）。一方、ディメボンも２０μＭにおいて阻害効果が確認され、その効果は濃度依存に増強した（図２１及び２２）。さらに、メチレンブルー及びディメボンを併用し、両者を同時に添加すると、その効果はさらに増強し、メチレンブルー０．０２５μＭおよびディメボン５〜１０μＭという低濃度においても、未処理時に比べて７０〜８５％ほどの阻害効果が認められた（図２３及び２４）。このことから、メチレンブルー及びディメボンは、神経変性疾患、特にＴＤＰ−４３の細胞内封入体の形成に伴う神経変性疾患の治療薬の有効成分として有用なものであると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、ＦＴＬＤやＡＬＳ等の神経変性疾患の患者脳に見られる、ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）の細胞内封入体を形成する形質転換細胞（細胞モデル）を提供することができる。また、そのようなＴＤＰ−４３細胞内封入体の主要構成成分となる変異型ＴＤＰ−４３タンパク質やＴＤＰ−４３タンパク質断片を提供することができる。
本発明により提供される細胞モデルで形成されるＴＤＰ−４３細胞内封入体は、上記患者脳に見られる封入体と非常によく似た性質を有しており、大きさだけでなく、抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体及び抗ユビキチン抗体に陽性のものである。本発明の形質転換細胞は、ＴＤＰ−４３の核内又は細胞質内蓄積を抑制する化合物や遺伝子などのスクリーニング、並びにＦＴＬＤやＡＬＳ等の神経変性疾患に対する新規治療薬等の開発に用いることができる点で、極めて有用なものであり、実際に、本発明者により、当該形質転換細胞を用いてＴＤＰ−４３細胞質内蓄積（ＴＤＰ−４３細胞内封入体形成）を抑制する化合物（メチレンブルーやディメボン）が見出された点でも、極めて実用性に優れたものである。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：リン酸化合成ペプチド
配列番号１９：Ｓｅｒはリン酸化されたセリン残基を表す（存在位置：６、７）。
配列番号２０：合成ペプチド
［配列表］
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【図２】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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