(57)【要約】  １分子検出装置は、貫通孔が設けられた基板と、第１電解液を内部に満たすための第１チャンバと、第２電解液を内部に満たすための第２チャンバと、貫通孔の周囲に設けられた電極対と、貫通孔の一端に固定化されたキメラタンパク質とを備える。キメラタンパク質は、生体分子に作用される標的配列と、標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、標的配列の他端に設けられた第２タンパク質とを有する。キメラタンパク質は第１タンパク質を介して貫通孔の一端に固定化されている。その１分子検出装置は１分子の生体分子を容易に検出することができる。
2013076943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液に含まれた生体分子の１分子検出方法であって、
互いに反対側の第１面と第２面とを有し、前記第１面と前記前記第２面との間を貫通する貫通孔が設けられた基板と、
前記貫通孔の周囲に設けられた電極対と、
前記基板の前記第１面に面し、第１電解液を内部に満たした第１チャンバと、
前記基板の前記第２面に面し、第２電解液を内部に満たした第２チャンバと、
前記貫通孔の一端に固定化されたキメラタンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は、
前記生体分子に作用される標的配列と、
前記標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、
前記標的配列の他端に設けられた第２タンパク質と、
を含み、
前記キメラタンパク質は前記第１タンパク質を介して前記貫通孔の前記一端に固定化されている、１分子検出装置を準備するステップと、
前記第１チャンバへ前記試料溶液を導入するステップと、
前記生体分子を前記標的配列へ作用させることにより前記キメラタンパク質の立体構造に変化をもたらすステップと、
前記キメラタンパク質を介して前記電極対に流れるトンネル電流により前記キメラタンパク質の前記立体構造の前記変化を検出するステップと、
を包含する１分子検出方法。
【請求項２】
前記第１タンパク質は蛍光タンパク質である、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項３】
前記第２タンパク質は蛍光タンパク質である、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項４】
前記第１タンパク質は、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＥＰ、ＢＦＰまたはそれらの変異体である、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項５】
前記第２タンパク質は、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＥＰ、ＢＦＰまたはそれらの変異体である、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項６】
前記第１タンパク質がＣＦＰまたはその変異体であり、前記第２タンパク質がＹＦＰまたはその変異体である、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項７】
前記キメラタンパク質は標的ペプチド成分とリンカー成分とをさらに含み、
前記標的配列は標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインを含み、
前記リンカー成分が前記標的配列と前記標的ペプチド成分とを化学結合し、前記標的配列と前記標的ペプチド成分が前記第１タンパク質または前記第２タンパク質のいずれかに結合する、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項８】
前記生体分子を前記標的配列へ作用させることにより前記キメラタンパク質の前記立体構造に前記変化をもたらすステップは、前記生体分子が前記標的配列へ作用することにより、前記標的ペプチド成分および前記ペプチド結合ドメインの相対的位置を変化させるステップを包含する、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項９】
前記生体分子を前記標的配列へ作用させることにより前記キメラタンパク質の前記立体構造に前記変化をもたらすステップは、前記生体分子が前記標的配列へ作用することにより、前記第１タンパク質および前記第２タンパク質の相対的位置を変化させるステップを包含する、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項１０】
前記キメラタンパク質を介して前記電極対に流れるトンネル電流により前記キメラタンパク質の前記立体構造の前記変化を検出するステップは、前記第１タンパク質および前記第２タンパク質の相対的位置または方向の変化を前記電極対により検出するステップを包含する、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項１１】
前記第１タンパク質および前記第２タンパク質の相対的位置の変化を前記電極対により検出するステップは、前記第１タンパク質および前記第２タンパク質の相対的位置の変化を前記電極対に流れる前記トンネル電流により検出するステップを包含する、請求項１０に記載の１分子検出方法。
【請求項１２】
前記１分子検出装置を準備するステップは、
前記電極対は互いに離れている第１電極と第２電極とを有し、
前記キメラタンパク質の前記第１タンパク質は前記第１電極との間にトンネル電流が流れるように前記貫通孔の前記一端に固定化されており、
前記キメラタンパク質の前記第１タンパク質と前記第２タンパク質のそれぞれは前記第２電極との間にトンネル電流が流れないように位置している、
ように構成された１分子検出装置を準備するステップを包含する、請求項１に記載の１分子検出方法。
【請求項１３】
前記生体分子を前記標的配列へ作用させることにより前記キメラタンパク質の前記立体構造に前記変化をもたらすステップは、前記第２電極と前記第２タンパク質との間にトンネル電流が流れるように、前記生体分子を前記標的配列へ作用させることにより前記キメラタンパク質の前記立体構造を変化させるステップを包含し
前記キメラタンパク質を介して前記電極対に流れるトンネル電流により前記キメラタンパク質の前記立体構造の前記変化を検出するステップは、前記第１電極と前記第２電極との間で前記第１タンパク質と前記第２タンパク質とを介して流れるトンネル電流により前記キメラタンパク質の前記立体構造の前記変化を検出するステップを包含する、請求項１２に記載の１分子検出方法。
【請求項１４】
生体分子の１分子を検出するための１分子検出装置であって、
互いに反対側の第１面と第２面とを有し、前記第１面と前記前記第２面との間を貫通する貫通孔が設けられた基板と、
前記基板の前記第１面に面して、第１電解液を内部に満たすための第１チャンバと、
前記基板の前記第２面に面して、第２電解液を内部に満たすための第２チャンバと、
前記貫通孔の周囲に設けられた電極対と、
前記貫通孔の一端に固定化されたキメラタンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は、
前記生体分子に作用される標的配列と、
前記標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、
前記標的配列の他端に設けられた第２タンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は前記第１タンパク質を介して前記貫通孔の一端に固定化されている、１分子検出装置。
【請求項１５】
前記貫通孔の直径は前記キメラタンパク質の直径よりも大きい、請求項１４に記載の１分子検出装置。
【請求項１６】
前記基板の一部はＳｉＯＮにより被覆されている、請求項１４に記載の１分子検出装置。
【請求項１７】
前記電極対は互いに離れている第１電極と第２電極とを有し、
前記キメラタンパク質の前記第１タンパク質は前記第１電極との間にトンネル電流が流れるように前記貫通孔の前記一端に固定化されており、
前記キメラタンパク質の前記第１タンパク質と前記第２タンパク質のぞれぞれは前記第２電極との間にトンネル電流が流れないように位置している、請求項１４に記載の１分子検出装置。
【請求項１８】
生体分子の１分子を検出するための１分子検出装置であって、
互いに反対側の第１面と第２面とを有し、前記第１面と前記前記第２面との間を貫通する貫通孔が設けられた基板と、
前記基板の前記第１面に面して、第１電解液を内部に満たすための第１チャンバと、
前記基板の前記第２面に面して、第２電解液を内部に満たすための第２チャンバと、
前記貫通孔の周囲に設けられた電極対と、
前記貫通孔の一端に固定化されるように構成されたキメラタンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は、
前記生体分子に作用される標的配列と、
前記標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、
前記標的配列の他端に設けられた第２タンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は前記第１タンパク質を介して前記貫通孔の一端に固定化されるように構成されている、１分子検出装置。
【請求項１９】
請求項１に記載の１分子検出方法を実行する疾病マーカ検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中に含まれる極微量の生体分子を分析するために用いられる、１分子検出方法および１分子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体から採取した試料、例えば血液や尿に含まれる極微量の疾病特有の生体分子を検出することにより、疾病を早期に診断する手法が開発されつつある。その手法を実現する上で、もっとも重要な要素技術は１分子の生体分子検出である。従来の１分子の生体分子を計測する技術には光学的方法と電気的方法がある。【０００３】
光学的に１分子の生体分子を検出する方法の一つとして蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がある。ＦＲＥＴとは、蛍光分子の励起エネルギーが別の（蛍光）分子へ電子の共鳴により直接移動する現象である。両分子間の相対的な位置関係によってエネルギーの移動の効率が変化する。【０００４】
図１８Ａから図１８ＣはＦＲＥＴを利用した従来の１分子検出装置の模式図である。【０００５】
図１８Ａは、２種類以上のタンパク質であるドナー分子１０、アクセプタ分子１１を人工的に結合したいわゆるキメラタンパク質８を示す。図１８Ａでは、ドナー分子１０としてＰＡ−ＧＦＰが用いられ、アクセプタ分子１１としてａｓＣＰが用いられ、生体物質結合性リンカー５２としてＣａＭ−Ｍ１３が用いられている。キメラタンパク質８を光活性化した後に所定の波長の励起光をキメラタンパク質８に照射すると、ドナー分子１０の光活性化蛍光タンパク質が蛍光を発する。蛍光強度の変化は高感度ＣＣＤカメラ９１により検出する。【０００６】
図１８Ｂに示すように測定対象の生体物質の濃度が低い場合には、ドナー分子１０からの蛍光はアクセプタ分子１１である色素タンパク質や弱蛍光タンパク質の影響を受けない。【０００７】
図１８Ｃに示すように測定対象の生体物質の濃度が高くなると、キメラタンパク質８の生体物質結合性リンカー５２部分に生体物質５４が結合してキメラタンパク質８の立体構造が変化する。この場合には、ドナー分子１０からの蛍光はＦＲＥＴによりアクセプタ分子１１に吸収されて、蛍光強度が低下する。【０００８】
ＦＲＥＴでは、タンパク質の有する特異的かつ高感度に生体分子を認識する機能が利用される。そのためＦＲＥＴは極めて有用な手段として広く用いられており、たとえば、イオン、糖、脂質などの低分子の生体分子を定量できる。また、ＦＲＥＴは低分子量ＧＴＰ結合タンパク、リン酸化酵素などの活性を測定できる。【０００９】
一方、電気的に１分子の生体分子を検出する方法としてナノポア法がある。ナノポア法では、たとえばシリコン基板に形成された直径数ｎｍオーダーの貫通孔を用いる。その貫通孔には、貫通孔の対向する位置に一対のナノ電極が形成されている。貫通孔をＤＮＡ分子が通過する時に、一対のナノ電極間にはＤＮＡ分子を介したトンネル電流が流れる。このトンネル電流を検出することにより、ＤＮＡの塩基配列を高速に読み取ることができる。【００１０】
上記の技術に関連する従来の技術が特許文献１〜５及び非特許文献１〜３に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１１−９７９３０号公報
【特許文献２】特開２００７−４０８３４号公報
【特許文献３】特表２００５−５０４２８２号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１１９０５号公報
【特許文献５】特開２００６−１１９１４０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】生物物理  ４６（３）１６４−１６８  （２００６）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０１（３７）  １３４７２−１３４７７  （２００４）
【非特許文献３】ＮＡＮＯ  ＬＥＴＴＥＲＳ  １１  ２７９−２８５  （２０１１）
【発明の概要】
【００１３】
１分子検出装置は、貫通孔が設けられた基板と、第１電解液を内部に満たすための第１チャンバと、第２電解液を内部に満たすための第２チャンバと、貫通孔の周囲に設けられた電極対と、貫通孔の一端に固定化されたキメラタンパク質とを備える。キメラタンパク質は、生体分子に作用される標的配列と、標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、標的配列の他端に設けられた第２タンパク質とを有する。キメラタンパク質は第１タンパク質を介して貫通孔の一端に固定化されている。
【００１４】
その１分子検出装置は１分子の生体分子を容易に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は実施の形態１における１分子検出装置の斜視図である。
【図２】図２は実施の形態１における１分子検出装置の斜視図である。
【図３】図３は実施の形態１における１分子検出装置の基板の正面図である。
【図４Ａ】図４Ａは実施の形態１における基板の拡大図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは実施の形態１における基板の拡大図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは実施の形態１における基板の拡大図である。
【図５Ａ】図５Ａは実施の形態１における１分子検出装置のキメラタンパク質のモデル図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは実施の形態１における１分子検出装置のキメラタンパク質のモデル図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは実施の形態１における１分子検出装置のキメラタンパク質のモデル図である。
【図６Ａ】図６Ａは実施の形態１における基板の貫通孔の近傍の模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは実施の形態１における基板の貫通孔の近傍の模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは実施の形態１における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは実施の形態１における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは実施の形態１における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図８Ａ】図８Ａは実施の形態１における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは実施の形態１における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図９Ａ】図９Ａは実施の形態１における基板の貫通孔の近傍の拡大図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは実施の形態１における基板の貫通孔の近傍の拡大図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは実施の形態１における基板の貫通孔の近傍の拡大図である。
【図１０】図１０は実施の形態２における１分子検出装置の断面図である。
【図１１】図１１は実施の形態２における１分子検出装置の分解斜投影図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは実施の形態２における１分子検出装置の基板の断面図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは実施の形態２における１分子検出装置の基板の断面図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは実施の形態２における１分子検出装置の基板の断面図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは実施の形態２における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは実施の形態２における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは実施の形態２における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは実施の形態２における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは実施の形態２における１分子検出方法を説明する１分子検出装置の斜視図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは実施の形態２における基板の断面図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは実施の形態２における基板の断面図である。
【図１６】図１６は実施の形態３における１分子検出装置の斜視図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは実施の形態３における１分子検出装置の基板の平面図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは実施の形態３における１分子検出装置の基板の平面図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは実施の形態３における１分子検出装置の基板の平面図である。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは実施の形態３における１分子検出装置の基板の平面図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の模式図である。
【図１８Ｂ】図１８ＢはＦＲＥＴの模式図である。
【図１８Ｃ】図１８ＣはＦＲＥＴの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（実施の形態１）
図１と図２は実施の形態１における１分子検出装置１００の斜視図である。１分子検出装置１００は、第１チャンバ１０３と、第２チャンバ１０５と、第１チャンバ１０３と第２チャンバ１０５との間に設けられた基板１０１を備えている。基板１０１は、第１チャンバ１０３に面する面１０１ａと、面１０１ａの反対側で第２チャンバ１０５に面する面１０１ｂとを有する。第１チャンバ１０３と第２チャンバ１０５には第１電解液１０２と第２電解液１０４がそれぞれ収容されるように構成されている。
【００１７】
基板１０１は、無機材料よりなることが好ましく、例えば、絶縁体、半導体、または金属よりなることが好ましい。基板１０１は有機材料よりなっていてもよい。チャンバ１０３、１０５内に収容される電解液１０２、１０４を互いに電気的に絶縁するために、基板１０１の電気抵抗率は１０−５Ωｍ以上であることが好ましく、１０１０Ωｍ以上であることがより好ましい。微細加工の観点から、基板１０１はシリコン、ＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、ゲルマニウム、またはＺｎＯよりなることが好ましい。
【００１８】
容易に取り扱うために、図２において基板１０１の長さ１２０および幅１２１は１ｍｍ以上１０ｃｍ以下であることが好ましい。基板１０１の面１０１ａ、１０１ｂ間の距離である厚み１２２は１μｍ以上１ｃｍ以下であることが好ましい。基板１０１の面１０１ａ、１０１ｂの平均粗さＲａは１ｎｍ以下であることが好ましい。基板１０１の形状は、長方形、円形、台形、多角形であってもよい。
【００１９】
第１電解液１０２は電解質を含む水溶液であることが好ましく、ＫＣｌを含むことが好ましい。もしくは、第１電解液１０２はＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２、ＣｓＣｌ、ＣｄＣｌ２、またはＮａＣｌを含んでもよい。もしくは、第１電解液１０２はＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、またはＥＧＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を含んでもよい。もしくは第１電解液１０２はＮａＣｌ、ＫＯＨ、ＮａＯＨを含んでもよい。
【００２０】
第１電解液１０２の浸透圧は、１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であることが好ましい。細胞の内部の浸透圧は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが知られている。第１電解液１０２の浸透圧は、生理的条件における細胞の内部の浸透圧よりも低いことが好ましい。
【００２１】
第１電解液１０２は水溶性高分子を含むことが好ましく、例えば第１電解液１０２はグルコースを含むことが好ましい。もしくは、第１電解液１０２はＮａ−ＧＴＰ、Ｎａ−ＡＴＰ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、またはＧＤＰを含むことが好ましい。
【００２２】
第１電解液１０２の蒸発を抑制する観点から、第１電解液１０２の粘度は１．３ｍＰａ・ｓ以上２００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。
【００２３】
注入の容易性の観点から、注入される第１電解液１０２の量は１０ｐｌ以上であることが好ましい。第１電解液１０２を第１チャンバ１０３に保持する観点からは、注入される第１電解液１０２の量は２００μｌ以下であることが好ましい。注入される第１電解液１０２の量は１ｎｌ以上２００μｌ以下であることがより好ましい。第１電解液１０２は静止していることが好ましい。第１電解液１０２は流動していてもよい。
【００２４】
トンネル電流を容易に検知する観点から、第１電解液１０２のデバイ長さは１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましい。第１電解液１０２のイオン強度は０．００１以上１以下であることが好ましく、０．０１以上０．１以下であることがより好ましい。
【００２５】
第１チャンバ１０３は基板１０１の面１０１ａに面するように設けられる。第１チャンバ１０３は無機材料により形成されることが好ましい。第１チャンバ１０３は有機材料により形成されていてもよい。第１チャンバ１０３の容量は１０ｐｌ以上２００μｌ以下であることが好ましい。
【００２６】
第２電解液１０４は第１電解液１０２と同じ組成であることが好ましいが、第１電解液１０２と異なる組成であってもよい。
【００２７】
第２電解液１０４は電解質を含む水溶液であることが好ましい。第２電解液１０４はＫＣｌを含むことが好ましい。第２電解液１０４はＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２、ＣｓＣｌ、ＣｄＣｌ２、またはＮａＣｌを含んでいてもよい。もしくは第２電解液１０４はＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、またはＥＧＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を含んでいてもよい。もしくは第２電解液１０４はＮａＣｌ、ＫＯＨ、ＮａＯＨを含んでいてもよい。
【００２８】
第２電解液１０４の浸透圧は１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であることが好ましい。細胞内部の浸透圧は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが知られている。第２電解液１０４の浸透圧は、生理的条件における細胞内部の浸透圧よりも低いことが好ましい。
【００２９】
第２電解液１０４は水溶性高分子を含むことが好ましく、例えばグルコースを含むことが好ましい。もしくは、第２電解液１０４はＮａ−ＧＴＰ、Ｎａ−ＡＴＰ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、またはＧＤＰを含むことが好ましい。
【００３０】
第２電解液１０４の蒸発を抑制する観点から、第２電解液１０４の粘度は１．３ｍＰａ・ｓ以上２００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。
【００３１】
注入の容易性の観点から、注入される第２電解液１０４の量は、１０ｐｌ以上であることが好ましい。第２電解液１０４を第２チャンバ１０５に保持する観点から、注入される第２電解液１０４の量は、２００μｌ以下であることが好ましい。注入される第２電解液１０４の量は、１ｎｌ以上２００μｌ以下であることがより好ましい。第２電解液１０４は静止していることが最も好ましい。第２電解液１０４は流動していてもよい。
【００３２】
トンネル電流を容易に検知する観点から、第２電解液１０４のデバイ長さは、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましい。第２電解液１０４のイオン強度は０．００１以上１以下であることが好ましく、０．０１以上０．１以下であることがより好ましい。
【００３３】
第２チャンバ１０５は基板１０１の面１０１ａの反対側の面１０１ｂに面するように設けられる。第２チャンバ１０５は無機材料により形成されることが好ましい。第２チャンバ１０５は有機材料により形成されていてもよい。第２チャンバ１０５の容量は１０ｐｌ以上２００μｌ以下であることが好ましい。
【００３４】
基板１０１には面１０１ａから面１０１ｂを貫通する貫通孔１０６が設けられている。貫通孔１０６は、基板１０１の面１０１ａに開口する開口部１０６ａと、基板１０１の面１０１ｂに開口する開口部１０６ｂと、開口部１０６ａから開口部１０６ｂまで繋がる内壁面１０６ｃとを有する。基板１０１の面１０１ａ（１０１ｂ）の法線方向から見た貫通孔１０６の形状は円形であることが好ましい。基板１０１の法線方向から見た貫通孔１０６の形状は、楕円形、長方形、台形、閉曲線で囲まれた任意の形状、多角形であってもよい。
【００３５】
図３は基板１０１の正面図である。貫通孔１０６の形状が円形である場合、貫通孔１０６の直径１３０は１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。貫通孔１０６の直径はタンパク質の直径よりも大きいことが好ましい。実施の形態１におけるタンパク質の直径は、流体力学的半径の２倍と定義する。実施の形態１におけるタンパク質の直径は、慣性半径、回転半径、旋回半径、体積半径、ファンデルワールス半径のうちのいずれかの２倍と定義してもよい。
【００３６】
電極対１０７は、貫通孔１０６の一端に設けられる。電極対１０７は２つの電極１０７ａ、１０７ｂを含む。電極１０７ａおよび電極１０７ｂの材料は同じであることが好ましい。電極１０７ａ、１０７ｂの材料は異なっていてもよい。溶液中においてトンネル電流を検出する観点から、電極１０７ａ、１０７ｂは電気化学的な分極電極であることが好ましいが、電気化学的に分極しない不分極電極であってもよい。電極１０７ａ、１０７ｂの材料は金属であってもよい。その場合には、電極１０７ａ、１０７ｂの材料は貴金属であることが好ましく、例えば金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、オスミウムを含むことが好ましい。電極１０７ａ、１０７ｂの材料は電解液に腐食されないことが好ましい。電極１０７ａ、１０７ｂは電解液１０２、１０４へ溶出しない材料よりなることが好ましい。
【００３７】
電極１０７ａ、１０７ｂを用いてトンネル電流を検出する。トンネル電流を検出するために、電極１０７ａと電極１０７ｂとの間にはバイアス電圧が印加されるように構成されている。バイアス電圧は１０ｍＶ以上３００ｍＶ以下であることが好ましい。
【００３８】
図４Ａから図４Ｃは基板１０１の貫通孔１０６の近傍の拡大図である。図４Ａに示すように、電極１０７ａ、１０７ｂの先端部１３１ａ、１３１ｂの形状は貫通孔１０６に向かって突出する凸半円形である。もしくは、図４Ｂに示すように、先端部１３１ａ、１３１ｂの形状は貫通孔１０６に対して凹んでいる凹半円形であってもよい。もしくは、図４Ｃに示すように、先端部１３１ａ、１３１ｂの形状は貫通孔１０６に向かって突出する多角形であってもよい。トンネル電流を検出する観点から、電極１０７ａ、１０７ｂの先端部１３１ａ、１３１ｂの形状が凸半円形である場合、先端部１３１ａ、１３１ｂの曲率半径１４０ａ、１４０ｂは１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましい。トンネル電流による生体分子の検出感度を高めるため、先端部１３１ａ、１３１ｂの曲率半径は１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。電極１０７ａ、１０７ｂの厚みは１ｎｍ以上１００ｎｍ以下が好ましく、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。
【００３９】
電極１０７ａ、１０７ｂの先端部１３１ａ、１３１ｂは貫通孔１０６の開口部１０６ａへ接していることが好ましい。すなわち、先端部１３１ａと先端部１３１ｂとの間隔１４１は貫通孔１０６の開口部１０６ａの直径と同じであることが好ましい。先端部１３１ａ、１３１ｂの間隔１４１は１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。
【００４０】
キメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の周囲に固定化されている。実施の形態１ではキメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の一端に固定化されている。キメラタンパク質とは、遺伝子組み換え技術を用いて作製された癒合遺伝子により人工的に結合する２種類以上の異なるタンパク質よりなる。キメラタンパク質１０８は、Ｃａｍｅｌｅｏｎ等のＦＲＥＴ指示薬であることが好ましい。
【００４１】
図５Ａから図５Ｃはキメラタンパク質１０８のモデル図である。図５Ａに示すように、キメラタンパク質１０８は第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１と標的配列１０９とリンカー成分１５２ａ、１５２ｂとを備える。標的配列１０９は生体分子に特異的に作用される。例えば、標的配列１０９は、例えば生体分子と結合することができる。標的配列１０９は、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存タンパク質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ペプチド、タンパク質キナーゼＣ等の生体分子に特異的に作用され結合するペプチドであることが好ましい。標的配列１０９は、イノシトール−１、４，５−トリホスフェート受容体、レコベリン、嗅覚受容体、ダイオキシン受容体等の受容体であってもよい。
【００４２】
第１タンパク質１１０は、標的配列１０９の一端１０９ａに設けられ、具体的には、リンカー成分１５２ａを介して標的配列１０９の一端１０９ａに結合する。容易に入手できる観点からは、第１タンパク質１１０は、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＥＰ、ＢＦＰまたはそれらの変異体等の蛍光タンパク質であることが好ましい。第１タンパク質１１０は繊維状タンパク質であることが好ましく、球状タンパク質であることがより好ましい。容易にトンネル電流を検知する観点から、第１タンパク質１１０は金属タンパク質であることが好ましい。金属タンパク質とは、タンパク質の内部に金属原子を含むものである。第１タンパク質１１０の変性を抑制するため、第１電解液１０２のｐＨは２以上１１以下であることが好ましく、４以上８以下であることがより好ましい。第１タンパク質１１０の変性を抑制するため、第１電解液１０２の温度は６０度以下が好ましく、４０度以下であることがより好ましい。第１タンパク質１１０はプロトン伝導性を示すことが好ましい。
【００４３】
第２タンパク質１１１は標的配列１０９の他端１０９ｂに設けられ具体的には、リンカー成分１５２ｂを介して標的配列１０９の他端１０９ｂに結合する。容易に入手できる観点からは、第２タンパク質１１１はＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＥＰ、ＢＦＰまたはそれらの変異体等の蛍光タンパク質であることが好ましい。第２タンパク質１１１は繊維状タンパク質であることが好ましく、球状タンパク質であることがより好ましい。トンネル電流を検知する観点から、第２タンパク質１１１は金属タンパク質であることが好ましい。金属タンパク質とは、内部に金属原子を含むタンパク質である。第２タンパク質１１１の変性を抑制するため、第２電解液１０４のｐＨは２以上１１以下であることが好ましく、４以上８以下であることがより好ましい。第２タンパク質１１１の変性を抑制するため、第２電解液１０４の温度は、６０度以下が好ましく、４０度以下であることがより好ましい。第２タンパク質１１１はプロトン伝導性を示すことが好ましい。
【００４４】
トンネル電流を検出する観点から、第１タンパク質１１０がＣＦＰまたはその変異体であり、第２タンパク質１１１がＹＦＰまたはその変異体であることがより好ましい。
【００４５】
図５Ｂは、他のキメラタンパク質１０８のモデル図である。キメラタンパク質１０８は標的ペプチド成分１５１を含み、リンカー成分１５２ｂの代わりにリンカー成分１１５２ｂ、２１５２ｂを含む。標的配列１０９は、標的ペプチド成分１５１と結合するためのペプチド結合ドメイン１５３を含む。リンカー成分２１５２ｂは標的配列１０９と標的ペプチド成分１５１とを化学結合している。リンカー成分１５２ａ、１５２ｂ、１１５２ｂ、２１５２ｂは、１から３０のアミノ酸残基よりなるペプチド成分であることが好ましい。標的配列１０９と標的ペプチド成分１５１は、第１タンパク質１１０または第２タンパク質１１１のいずれかに結合することが好ましい。図５Ｂでは、標的配列１０９はリンカー成分１５２ａにより第１タンパク質１１０へ結合している。標的配列１０９は第２タンパク質１１１へ結合していても良く、この場合には標的配列１０９はリンカー成分１５２ａにより第２タンパク質１１１へ結合していても良い。図５Ｂでは、標的ペプチド成分１５１はリンカー成分１１５２ｂにより第２タンパク質１１１へ結合している。標的ペプチド成分１５１は第１タンパク質１１０へ結合していても良く、この場合には標的ペプチド成分１５１はリンカー成分１１５２ｂにより第１タンパク質１１０へ結合していても良い。
【００４６】
図５Ｃに示すように、生体分子１５４が標的配列１０９へ作用することにより、例えば標的配列１０９へ結合することにより、標的ペプチド成分１５１およびペプチド結合ドメイン１５３の相対的位置または方向を変化させる。これにより、第１タンパク質１１０および第２タンパク質１１１の相対的位置または方向を変化させる。容易にトンネル電流を検出するために、第１タンパク質１１０は第２タンパク質１１１へ接触させるように第１タンパク質１１０および第２タンパク質１１１の相対的位置または方向を変化させてキメラタンパク質１０８を変形させる。また、第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１が互いに離れていてもトンネル電流を第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１との間に流すことができる。この場合には、第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１との間の最も近い箇所の距離は０．１ｎｍ以上１ｎｍ以下であることが好ましい。
【００４７】
図６Ａと図６Ｂは１分子検出装置１００の貫通孔１０６近傍の模式図である。図６Ａは、生体分子１５４がキメラタンパク質１０８へ作用する前の１分子検出装置１００を示す。図６Ａに示すように、第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１との間隔は比較的大きい。言い換えると、第２タンパク質１１１は貫通孔１０６から十分離れている。図６Ｂは、生体分子１５４がキメラタンパク質１０８へ作用した後の１分子検出装置１００を示す。図６Ｂに示すように、第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１との間隔は、図６Ａに示す状態と比較して小さい。第１タンパク質１１０および第２タンパク質１１１により電極１０７ａは電極１０７ｂへ電気的に接続される。
【００４８】
第１タンパク質１１０および第２タンパク質１１１の相対的位置または方向の変化を電極対１０７により検出する。第１タンパク質１１０および第２タンパク質１１１を介して電極１０７ａが電極１０７ｂへ接続されたことを電極対１０７により検出する。具体的には、第１タンパク質１１０および第２タンパク質１１１の相対的位置または方向の変化は、電極対１０７を流れるトンネル電流１６０により検出される。第２タンパク質１１１は電極１０７ａまたは電極１０７ｂへ接触することが好ましい。また、第２タンパク質１１１と電極１０７ｂが互いに離れていてもトンネル電流を第２タンパク質１１１と電極１０７ｂの間に流すことができる。この場合には、第２タンパク質１１１と電極１０７ｂとの最も近い距離は０．１ｎｍ以上１ｎｍ以下であることが好ましい。
【００４９】
生体分子１５４が作用して結合する前のキメラタンパク質１０８は直径Ｒ１を有する。生体分子１５４が作用して結合した後のキメラタンパク質１０８は直径Ｒ２を有する。トンネル電流の検出効率を向上させるために、貫通孔１０６の直径１３０はキメラタンパク質１０８の直径Ｒ１よりも大きい方が好ましいが、直径Ｒ１以下であっても良い。トンネル電流の検出効率を向上させるために、貫通孔１０６の直径１３０はキメラタンパク質１０８の直径Ｒ２よりも大きい方が好ましいが、直径Ｒ２よりも小さくても良い。
【００５０】
１分子検出装置１００について、以下にその動作を説明する。図７Ａから図７Ｃと図８Ａと図８Ｂは１分子検出装置１００の動作を説明するための斜視図である。図９Ａから図９Ｂは１分子検出装置１００の貫通孔１０６の近傍の拡大図である。
【００５１】
（工程Ａ）
まず工程Ａでは、図７Ａに示す１分子検出装置１００を準備する。基板１０１は半導体微細加工を用いて作製することができる。
【００５２】
第１チャンバ１０３は、電子線リソグラフィ、集束イオンビーム、ドライエッチング、ウェットエッチング、イオンミリング、ナノインプリント等の半導体微細加工技術により形成されることが好ましい。第１チャンバ１０３は、ミリング、射出成型により形成することができる。
【００５３】
第２チャンバ１０５は、電子線リソグラフィ、集束イオンビーム、ドライエッチング、ウェットエッチング、イオンミリング、ナノインプリント等の半導体の微細加工技術により形成されることが好ましい。第２チャンバ１０５は、ミリング、射出成型により形成することができる。第２チャンバ１０５は、第１チャンバ１０３と同じ方法により形成されることが最も好ましいが、異なる方法により形成されていてもよい。
【００５４】
貫通孔１０６は、電子線リソグラフィ、集束イオンビーム、ドライエッチング、ウェットエッチング、イオンミリング、ナノインプリント等の半導体微細加工技術により形成されることが好ましい。
【００５５】
電極対１０７は、フォトリソグラフィ、電子線リソグラフィ、レーザーリソグラフィ、抵抗加熱、スパッタ、電子線蒸着、分子線エピタキシー、化学気相蒸着、電解めっき、レーザーアブレーション等の半導体の微細加工技術により形成されることが好ましい。電極対１０７は、スクリーン印刷、ロール印刷、インクジェット印刷、ナノインプリント等の印刷法により形成されていてもよい。
【００５６】
第１電解液１０２が漏出しないために、基板１０１は第１チャンバ１０３へ化学的に接合することが好ましい。例えば、基板１０１は第２チャンバ１０５へ接着剤により接合されている。基板１０１は第１チャンバ１０３へ機械的、物理的手段で接合していてもよい。
【００５７】
第２電解液１０４が漏出しないために、基板１０１は、第２チャンバ１０５へ化学的に接合することが好ましい。例えば、基板１０１は第１チャンバ１０３へ接着剤により接合されている。基板１０１は、第２チャンバ１０５へ機械的、物理的手段で接合していてもよい。
【００５８】
第１電解液１０２は第１チャンバ１０３へピペットにより注入されることが好ましいが、シリンジ、インクジェット装置、ディスペンサにより注入されてもよい。
【００５９】
第２電解液１０４は第２チャンバ１０５へピペットにより注入されることが好ましいが、シリンジ、インクジェット装置、ディスペンサにより注入されもよい。
【００６０】
キメラタンパク質１０８は、貫通孔１０６の一端へ化学的に固定化されることが好ましく、キメラタンパク質１０８は、貫通孔１０６の一端へ化学結合により固定化されることがより好ましい。図９Ａに示すように、キメラタンパク質１０８の第１タンパク質１１０は、貫通孔１０６の一端にあって基板１０１の表面すなわち貫通孔１０６の内壁面１０６ｃに固定化されることが好ましい。電極１０７ａは、基板１０１の面１０１ａ上に位置する面３１０７ａと、面３１０７ａの反対側の面２１０７ａと、面２１０７ａ、３１０７ａの間で２１０７ａ、３１０７ａに繋がる端面１１０７ａとを有する。電極１０７ｂは、基板１０１の面１０１ａ上に位置する面３１０７ｂと、面３１０７ｂの反対側の面２１０７ｂと、面２１０７ｂ、３１０７ｂの間で２１０７ｂ、３１０７ｂに繋がる端面１１０７ｂとを有する。電極１０７ａ、１０７ｂの端面１１０７ａ、１１０７ｂは貫通孔１０６の開口部１０６ａまで延びて、開口部１０６ａに面している。図９Ｂと図９Ｃに示すように、キメラタンパク質１０８の第１タンパク質１１０は、貫通孔１０６の一端にあって、電極対１０７の第１電極１０７ａの表面に固定化されていてもよい。図９Ｂでは、第１タンパク質１１０は第１電極１０７ａの端面１１０７ａに固定化されている。図９Ｃでは、貫通孔１０６の開口部１０６ａの近傍で第１タンパク質１１０は第１電極１０７ａの表面２１０７ａに固定化されている。
【００６１】
キメラタンパク質１０８は、第１タンパク質１１０の一端を介して、貫通孔１０６へ固定化されることが好ましい。キメラタンパク質１０８を貫通孔１０６の一端へ固定化するために、結合性ペプチドが第１タンパク質１１０のその一端に導入されることが好ましい。この場合には、結合性ペプチドが第１タンパク質１１０のＮ末端またはＣ末端へ導入されることが好ましい。結合性ペプチドとしてはシリコン結合性ペプチドやビオチン化ペプチドを用いることができ、アフィニティタグ、ヒスチジンタグ、エピトープタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質を用いることが好ましい。
【００６２】
キメラタンパク質１０８を固定化するために、貫通孔１０６の一端である基板１０１や電極１０７ａの第１タンパク質１１０が固定化される部分は第１タンパク質１１０に親和性の高い材料により被覆されることが好ましい。この場合には、その材料としては、ストレプトアビジン、ニッケル、グルタチオン、マルトース、抗体を用いることが好ましい。その材料は、貫通孔１０６の内壁面１０６ｃ等の基板１０１の表面にのみ被覆されることが好ましく、貫通孔１０６の内壁面１０６ｃにのみ被覆されることがより好ましい。その材料は、電極対１０７の電極１０７ａ、１０７ｂの表面にのみ被覆されていてもよい。その材料は、電極対１０７の電極１０７ａ、１０７ｂのうちの第１タンパク質１１０が固定化される電極にのみ被覆されていてもよい。
【００６３】
図９Ａに示すように、生体分子が作用する前にはキメラタンパク質１０８は軸１０８ａに沿って第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１が配置されている。キメラタンパク質１０８の軸１０８ａを基板１０１に対して所望の角度を保持してキメラタンパク質１０８を固定化するために、貫通孔１０６の一端はＳＡＭ（自己組織化単分子膜）により被覆されることが好ましい。この場合には、ＳＡＭはカルボキシル基、アミノ基を末端に有することが好ましい。
【００６４】
作業効率を高める観点から、第１電解液１０２を第１チャンバ１０３へ注入する前に、キメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の一端へ固定化されることが好ましい。しかし、第１電解液１０２を第１チャンバ１０３へ注入した後に、キメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の一端へ固定化されてもよい。または第１電解液１０２を第１チャンバ１０３へ注入すると同時に、キメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の一端へ固定化されてもよい。
【００６５】
（工程Ｂ）
工程Ｂでは、図７Ｂに示すように生体分子１５４を含む試料溶液が第１チャンバ１０３へ導入される。
【００６６】
生体分子１５４は、血液、リンパ液、髄液、尿、唾液、体液、汗、涙、呼気、組織滲出液など生体から採取される試料に含まれる成分である。生体分子１５４は、動物、植物、細胞、組織、器官から採取される試料に含まれる成分であってもよい。生体分子１５４は、細菌、ウィルス、真菌、寄生虫に含まれる成分であってもよい。
【００６７】
生体分子１５４を含む試料溶液は前処理されることが好ましい。前処理として、例えば、生体分子１５４を含む試料溶液は、検出妨害物質を除去してもよい。また、貫通孔１０６の目詰まりを抑制するため、前処理として、生体分子１５４を含む試料溶液から貫通孔１０６よりも大きなサイズの物質を除去してもよい。
【００６８】
生体分子１５４を含む試料溶液は、第１チャンバ１０３へピペットにより注入されることが好ましいが、第１チャンバ１０３へシリンジ、インクジェット装置、ディスペンサにより注入されてもよい。
【００６９】
（工程Ｃ）
工程Ｃでは、図７Ｃに示すように生体分子１５４が標的配列１０９へ作用し、実施の形態では生体分子１５４は標的配列１０９へ結合する。
【００７０】
生体分子１５４は、標的配列１０９へ拡散により到達することができる。生体分子１５４は、標的配列１０９へ対流により到達してもよい。生体分子１５４が標的配列１０９へ到達する頻度を高めるため、第１電解液１０２を撹拌することが好ましい。第１電解液１０２の温度は熱源により制御されていてもよい。このように、第１電解液１０２は流動することが好ましい。
【００７１】
生体分子１５４は、水素結合、ファンデルワールス力、静電気力、共有結合により標的配列１０９へ結合または作用することが好ましい。
【００７２】
（工程Ｄ）
工程Ｄでは、図８Ａに示すように、工程Ｃで生体分子１５４が作用することでキメラタンパク質１０８の立体構造が変化して、キメラタンパク質１０８が変形する。
【００７３】
キメラタンパク質１０８の立体構造が変化して変形することにより、第１タンパク質１１０と第２タンパク質１１１との相対的距離が変化する。このとき、例えば、第２タンパク質１１１と第１タンパク質１１０との相対距離を小さくすることが好ましい。または、第２タンパク質１１１と第１タンパク質１１０との相対距離が大きくなってもよい。または、第２タンパク質１１１の第１タンパク質１１０に対する方向、すなわち軸１０８ａの基板１０１に対する角度が変化してもよい。
【００７４】
第２タンパク質１１１は、第１タンパク質１１０および／または貫通孔１０６と接触することが好ましい。第２タンパク質１１１は、第１タンパク質１１０および／または電極対１０７の電極１０７ｂと接触することが好ましい。第２タンパク質１１１は、第１タンパク質１１０および／または電極１０７ａと接触してもよい。
【００７５】
（工程Ｅ）
工程Ｅでは、図８Ｂに示すようにキメラタンパク質１０８の立体構造の変化すなわち変形は、電極対１０７に流れるトンネル電流１６０（図６Ｂ）の変化として検出される。
【００７６】
電極対１０７を流れるトンネル電流は、トンネル電流検出部１８１により検出される。検出するトンネル電流は微小なので、トンネル電流検出部１８１は、電流電圧変換回路、浮遊容量、オペアンプ、絶対値回路、目標トンネル電流減算回路、ロックインアンプを含むことが好ましく、トンネル電流検出部１８１として、パッチクランプアンプ装置を用いることが好ましい。トンネル電流検出部１８１により、トンネル電流の振幅、位相、周波数のうちの少なくとも１つが検出される。
【００７７】
浮遊容量に由来する電流を除去するため、正弦波または矩形波の高周波バイアス電圧が、電極対１０７の電極１０７ａ、１０７ｂ間へ印加されることが好ましい。
【００７８】
図１８Ａから図１８Ｃに示すＦＲＥＴでは、（１）１つの蛍光分子から放射されるエネルギーが小さい、（２）光褪色が発生する、（３）ミリ秒から秒の時間間隔で明滅を繰り返すブリンキングが発生するという理由から、ＦＲＥＴにより１分子の生体分子のみを検出するには困難を伴う。
【００７９】
一方、ナノポア法ではトンネル電流を検出するだけで比較的容易に１分子の生体分子を検出できる。しかしトンネル電流の変化値のみから塩基以外の生体分子、例えばペプチド、低分子有機化合物、アミノ酸等を判別するには非常に困難を伴う。
【００８０】
実施の形態１における１分子検出装置１００を用いた１分子検出方法では、１分子の蛍光分子からの微弱かつ不安定な蛍光を検出するのではなく、１分子の生体分子の有無をキメラタンパク質の立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の変化へ変換する（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）。その立体構造の変化をトンネル電流の変化として検知するので、１つの生体分子を容易に検出できる。
【００８１】
（実施の形態２）
図１０と図１１はそれぞれ実施の形態２における１分子検出装置２００の断面図および分解斜投影図である。図１０と図１１において、図１から図９Ｃに示す実施の形態１における１分子検出装置１００と同じ部分には同じ参照符号を付す。
【００８２】
実施の形態２における１分子検出装置２００は、実施の形態１における１分子検出装置１００の、第１チャンバ１０３および第２チャンバ１０５の代わりに第１チャンバと第２チャンバとしてそれぞれ機能するマイクロ流路である第１流路２０３と第２流路２０５を備える。マイクロ流路を用いることにより、微量の試料溶液を分析できる。また、多種類の試料溶液を１分子検出装置２００へ同時に注入できるので、容易に１分子の生体分子を検出できる。
【００８３】
基板１０１は貼りあわされた複数の基板を備え、実施の形態２では第１基板２０１と第２基板２０２とを含む。基板１０１は、複数の基板は同じ材料で構成されることが好ましいが、異なる材料で構成されても良い。第１基板２０１は、互いに反対側の面２０１ａ、２０１ｂを有し、第２基板２０２は、互いに反対側の面２０２ａ、２０２ｂを有する。第２基板２０２の面２０２ａは第１基板２０１の面２０１ｂに貼り合われている。第１基板２０１の面２０１ａは基板１０１の第１面１０１ａであり、第２基板２０２の面２０２ｂは基板１０１の第２面１０１ｂである。電極対１０７の電極１０７ａ、１０７ｂは基板１０１の第１面１０１ａではなく、第１基板２０１の面２０１ｂと第２基板２０２の面２０２ａとの間に設けられている。電極対１０７が第１基板２０１の面２０１ｂや第２基板２０２の面２０２ａの全面を覆う場合には、電極対１０７は第１基板２０１の面２０１ｂと第２基板２０２の面２０２ａに接合し、第１基板２０１の面２０１ｂは電極対１０７を介して第２基板２０２の面２０２ａに対向する。
【００８４】
第１基板２０１と第２基板２０２は絶縁体であることが好ましく、例えば、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、ＳｉＯＮ、酸化アルミナにより形成される。
【００８５】
第１流路２０３は第１基板２０１および第１カバー２０４により形成される。第１流路２０３の両端には、第１電解液１０２を注入するための注入口４０４ａと、注入された第１電解液１０２を排出するための排出口４０４ｂとが設けられている。フィルターが第１流路２０３に設けられることが好ましい。第１カバー２０４は、有機材料から構成されることが好ましく、この場合には、第１カバー２０４はＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）から構成されることが好ましい。第１カバー２０４は、無機材料から構成されても良い。
【００８６】
第１流路２０３の注入口４０４ａと排出口４０４ｂが配列された方向の長さ２０７ａは、１００μｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、５００μｍ以上２ｍｍ以下であることがより好ましい。第１流路２０３の注入口４０４ａと排出口４０４ｂが配列された方向と直角の方向の幅２０７ｂは、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることがより好ましい。第１流路２０３の基板２０１の第１面２０１ａから第１カバー２０４までの高さ２０７ｃは、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることがより好ましい。
【００８７】
基板２０１の第１面２０１ａの法線方向から見て第１流路２０３は直線状に延びていることが好ましいが、任意の曲線状または円形状に延びていてもよい。
【００８８】
第２流路２０５は、第２基板２０２および第２カバー２０６により形成される。第２流路２０５の両端には、第２電解液１０４を注入するための注入口４０６ａと、第２電解液１０４を排出するための排出口４０６ｂとが設けられている。第２カバー２０６は有機材料から構成されることが好ましく、この場合には、第２カバー２０６はＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）から構成されることが好ましい。第２カバー２０６は無機材料から構成されても良い。
【００８９】
第２流路２０５の注入口４０６ａと排出口４０６ｂが配列された方向の長さ２０８ａは、１００μｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、５００μｍ以上２ｍｍ以下であることがより好ましい。第２流路２０５の注入口４０６ａと排出口４０６ｂが配列された方向と直角の方向の幅２０８ｂは、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることがより好ましい。第２流路２０５の基板２０１の第２面２０１ｂから第２カバー２０６までの高さ２０８ｃは、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることがより好ましい。第１流路２０３の寸法は第２流路２０５の寸法と同じであることが好ましいが、異なっていても良い。
【００９０】
基板２０１の第２面２０１ｂの法線方向から見て第２流路２０５は、直線状に延びていることが好ましいが、任意の曲線状または円形状に延びていてもよい。
【００９１】
容易に溶液を注入するために、第１流路２０３および／または第２流路２０５の内壁は親水化処理されることが好ましい。
【００９２】
貫通孔１０６は第１基板２０１の面２０１ａ、２０１ｂおよび第２基板２０２の面２０２ａ、２０２ｂを貫通するように基板１０１（第１基板２０１と第２基板２０２）に設けられている。図１２Ａは基板１０１の断面図である。図１２Ａに示すように、貫通孔１０６の第１基板２０１に開口する開口部１０６ａの直径２１０は、貫通孔１０６の第２基板２０２の開口部１０６ｂの直径２１１と同じである。
【００９３】
図１２Ｂは他の形状を有する貫通孔１０６が設けられた基板１０１の断面図である。容易にキメラタンパク質１０８を固定化するため、あるいは容易にキメラタンパク質１０８の立体構造の変化すなわち変形を生じさせるため、図１２Ｂに示すように、貫通孔１０６の第１基板２０１に開口する開口部１０６ａの直径２１０は、貫通孔１０６の第２基板２０２に開口する開口部１０６ｂの直径２１１よりも大きいことが好ましい。貫通孔１０６の内壁面１０６ｃは段差を有し、第１基板２０１では第１面２０１ａに直角であり、第２基板２０２では第２面１０１ｂに直角である。
【００９４】
図１２Ｃはさらに他の形状を有する貫通孔１０６が設けられた基板１０１の断面図である。容易にキメラタンパク質１０８を固定化するため、あるいは容易にキメラタンパク質１０８の立体構造の変化を生じさせるため、図１２Ｃに示すように、第１基板２０１での開口部１０６ａの直径２１０は、第２基板２０２での開口部１０６ｂの直径２１１よりも大きく。貫通孔１０６の内壁面１０６ｃは段差のない滑らかなテーパー形状を有する。
【００９５】
図１０から図１２Ｃでは１つの貫通孔１０６が基板２０１に設けられる。複数の貫通孔１０６が基板２０１に設けられていてもよい。
【００９６】
容易に溶液を注入するため、貫通孔１０６の内壁面１０６ｃとその近傍の面１０１ａ、１０１ｂは親水化処理されることが好ましい。
【００９７】
１つのキメラタンパク質１０８が、貫通孔１０６の一端に固定化されることが好ましい。２つ以上のキメラタンパク質１０８が、貫通孔１０６の一端に固定化されてもよい。この場合には、固定化される２つ以上のキメラタンパク質１０８は同じ種類であることが好ましいが、異なる種類であってもよい。
【００９８】
第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は、金属イオンを含む金属タンパク質であることが好ましい。この場合には、第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は、銅、ニッケル、鉄、亜鉛、クロム、マンガン、コバルトなどの遷移金属イオンを含む金属タンパク質であることが好ましい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は、金属錯体を含む金属タンパク質であってもよい。この場合には、第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は、銅、ニッケル、鉄、亜鉛、クロム、マンガン、コバルトなどの遷移金属錯体を含む金属タンパク質であることが好ましい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は電子供与タンパク質であってもよい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は電子授与タンパク質であってもよい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は正孔供与タンパク質であってもよい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は正孔授与タンパク質であってもよい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１は、分子内に電子を供与するドナーと電子を授与されるアクセプタを含んでいてもよい。第１タンパク質１１０および／または第２タンパク質１１１へ不純物をドーピングしてもよい。
【００９９】
図１３Ａから図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂは、実施の形態２における１分子検出装置２００を用いた１分子検出方法を示す斜視図である。図１３Ａから図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂにおいて図７Ａから図７Ｃ、図８Ａ、図８Ｂに示す実施の形態１における１分子検出装置１００と同時部分には同じ参照符号を付す。
【０１００】
（工程Ａ）
まず工程Ａでは、図１３Ａに示すように、１分子検出装置２００を準備する。
【０１０１】
生体分子の検出特性の劣化を抑制するため、第１基板２０１および／または第２基板２０２の貫通孔１０６の内壁面１０６ｃを含む表面は、物質Ｘを含むＳｉＯＸからなる非晶質固体層により被覆されることが好ましい。物質Ｘはケイ素よりも電気陰性度が大きい物質であることが好ましく、例えば窒素、リン、フッ素、またはホウ素である。第１基板２０１および／または第２基板２０２の貫通孔１０６の内壁面１０６ｃを含む表面はＳｉＯＮ薄膜で被覆されてもよい。ＳｉＯＮ薄膜はシリコン酸化膜を熱窒化することで形成できる。
【０１０２】
第１チャンバ２０３へ第１電解液１０２を注入口４０４ａから注入して、第１電解液１０２により第１チャンバ２０３を満たす。余剰な第１電解液１０２は排出口４０４ｂから排出される。排出口４０４ｂからは第１チャンバ２０３へ混入した気泡を逃すことができる。
【０１０３】
第１電解液１０２は第１チャンバ２０３へ毛細管力により注入されることが好ましい。
【０１０４】
容易に生体分子１５４をキメラタンパク質１０８へ到達させる観点からは、第１電解液１０２は流動することが好ましい。第１電解液１０２は、１０ｐｌ／分以上１０ｍｌ／分の一定の流速で流動することが好ましいが、時間に対して変化する流速で流動してもよい。検出ノイズの発生を抑制する観点からは、第１電解液１０２は静止することが好ましい。
【０１０５】
第２チャンバ２０５へ第２電解液１０４を注入口４０６ａから注入して、第２電解液１０４により第２チャンバ２０５を満たす。余剰な第２電解液１０４は排出口４０６ｂから排出される。排出口４０６ｂからは、第２チャンバ２０５へ混入した気泡を逃すことができる。
【０１０６】
第２電解液１０４は第２チャンバ２０５へ毛細管力により注入されることが好ましい。
【０１０７】
容易に１分子の生体分子１５４を検出するため、運搬時および／または保存時には、第１チャンバ２０３は第１電解液１０２を満たさないことが好ましい。１分子の生体分子１５４を検出する直前に、第１チャンバ２０３は第１電解液１０２により満たされることが好ましい。運搬時および／または保存時には、第２チャンバ２０５は第２電解液１０４を満たさないことが好ましい。１分子の生体分子１５４を検出する直前に、第２チャンバ２０５は第２電解液１０４により満たされることが好ましい。
【０１０８】
容易に生体分子１５４をキメラタンパク質１０８へ到達させる観点からは、第２電解液１０４は流動することが好ましい。この場合には、第２電解液１０４は、１０ｐｌ／分以上１０ｍｌ／分の一定の流速で流動することが好ましいが、時間に対して変化する流速で流動してもよい。第２電解液１０４の流速は第１電解液１０２の流速よりも大きいことが好ましい。検出ノイズの発生を抑制する観点からは、第２電解液１０４は静止することが好ましい。
【０１０９】
容易に１分子の生体分子１５４を検出するため、運搬時および／または保存時には、キメラタンパク質１０８は、貫通孔１０６の一端に固定化されていないことが好ましい。１分子の生体分子１５４を検出する直前に、キメラタンパク質１０８は、貫通孔１０６の一端に固定化されることが好ましい。
【０１１０】
（工程Ｂ）
工程Ｂでは、図１３Ｂに示すように、生体分子１５４を含む試料溶液が第１チャンバ２０３へ導入される。
【０１１１】
生体分子１５４を含む試料溶液は第１チャンバ２０３へ毛細管力により注入されることが好ましい。
【０１１２】
（工程Ｃ）
工程Ｃでは、図１３Ｃに示すように生体分子１５４が標的配列１０９へ作用する。実施の形態２では生体分子１５４が標的配列１０９へ結合する。
【０１１３】
生体分子１５４は、標的配列１０９へ静電気力により到達することが好ましい。第１チャンバ２０３および第２チャンバ２０５の一端に電極４０１と電極４０２をそれぞれ設け、第１電解液１０２と第２電解液１０４との間に電位差を設けることが好ましい。電極４０１、４０２間に直流電圧を印加して、第１電解液１０２および第２電解液１０４へ直流電圧を印加することができる。電極４０１、４０２間に交流電圧を印加して、第１電解液１０２および第２電解液１０４へ交流電圧を印加してもよい。効率的に生体分子１５４を検出するため、誘電泳動現象により生体分子１５４を貫通孔１０６の近傍へ収集することが好ましい。生体分子１５４を貫通孔１０６の近傍へ収集するために、第１電解液１０２と第２電解液１０４との間に静水圧差を設けることが好ましい。電位差および静水圧差を組み合わせることにより、生体分子１５４を貫通孔１０６の近傍へさらに効率よく収集することができる。重力により生体分子１５４を貫通孔１０６の近傍へ収集してもよい。
【０１１４】
（工程Ｄ）
工程Ｄでは、図１４Ａに示すように工程Ｃによりキメラタンパク質１０８の立体構造が変化する。
【０１１５】
（工程Ｅ）
工程Ｅでは、図１４Ｂに示すようにキメラタンパク質１０８の立体構造の変化は、電極対１０７に流れるトンネル電流の変化として検出される。トンネル電流の変化はトンネル電流検出部１８１により検出される。
【０１１６】
工程Ａから工程Ｅはプログラミングにより自動で行なわれることが好ましい。
【０１１７】
実施の形態２における生体分子の１分子検出装置２００は、基板１０１と、基板１０１の一端に設けられ、第１電解液１０２を内部に満たすための第１チャンバ２０３と、基板１０１の他端に設けられ、第２電解液１０４を内部に満たすための第２チャンバ２０５とを備える。基板１０１は、基板１０１の両面を貫通する貫通孔１０６と、貫通孔１０６の一端に設けられた電極対１０７を有する。貫通孔１０６の一端にキメラタンパク質１０８が固定化されている。キメラタンパク質１０８は、生体分子１５４に作用される標的配列１０９と、標的配列１０９の一端に設けられた第１タンパク質１１０と、標的配列１０９の他端に設けられた第２タンパク質１１１とを有する。キメラタンパク質１０８は第１タンパク質１１０を介して貫通孔１０６の一端に固定化されている。
【０１１８】
実施の形態２における１分子検出装置２００とトンネル電流検出部１８１は、工程Ａ〜工程Ｅの方法を実行する疾病マーカ検査装置２００１として用いることができる。
【０１１９】
図１０と図１１に示す電極対１０７の電極１０７ａ、１０７ｂは第１基板の面２０１ｂもしくは第２基板の面２０２ａの同一面内に設けられている。電極対１０７の電極１０７ａ、１０７ｂは同一面内に設けられていなくてもよい。
【０１２０】
図１５Ａは実施の形態２における他の構造を有する基板１０１の断面図である。図１５Ａにおいて、図１２Ａに示す基板１０１と同じ部分には同じ参照番号を付す。図１５Ａに示す基板１０１は、第２基板２０２に貼り付けられた第３基板１２０２をさらに備える。第３基板１２０２は、第２基板２０２の面２０２ｂに貼り合わされた面１２０２ａと、面１２０２ａの反対側の面１２０２ｂを有する。第３基板１２０２の面２０２ｂは基板１０１の面１０１ｂである。電極１０７ｂは第２基板の面２０２ａと第１基板２０１の面２０１ｂではなく、第２基板の面２０２ｂと第３基板１２０２の面１２０２ａに設けられている。電極１０７ｂが第２基板２０２の面２０２ｂや第３基板１２０２の面１２０２ａの全面を覆う場合には、電極１０７ｂは第２基板２０２の面２０２ｂと第３基板１２０２の面１２０２ａに接合し、第２基板２０２の面２０２ｂは電極１０７ｂを介して第３基板１２０２の面１２０２ａに対向する。電極１０７ａが第２基板２０２を介して電極１０７ｂと対向している。電極１０７ａの端面１１０７ａと電極１０７ｂの端面１１０７ｂは貫通孔１０６の開口部１０６ａ、１０６ｂ間の途中の内壁面１０６ｃに露出している。１つの基板２０２の両面２０２ａ、２０２ｂに電極１０７ａ、１０７ｂがそれぞれ設けられているので、電極１０７ａ、１０７ｂ間の間隔を精密に制御できる。図１５Ａに示すように、トンネル電流１６０は基板１０１の貫通孔１０６の内壁面１０６ｃに対して平行な方向へ流れる。トンネル電流１６０は基板１０１の面に対して傾斜した角度の方向へ流れてもよい。
【０１２１】
図１５Ｂは実施の形態２におけるさらに他の構造を有する基板１０１の断面図である。図１５Ｂにおいて、図１２Ａに示す基板１０１と同じ部分には同じ参照番号を付す。電極１０７ｂは第２電極の面２０２ａと第１基板２０１の面２０１ｂに設けられている。電極１０７ａが第１基板２０１を介して電極１０７ｂと対向している。電極１０７ａの端面１１０７ａは貫通孔１０６の開口部１０６ａに露出し、電極１０７ｂの端面１１０７ｂは貫通孔１０６の開口部１０６ａ、１０６ｂ間の途中の内壁面１０６ｃに露出している。１つの基板２０１の両面２０１ａ、２０１ｂに電極１０７ａ、１０７ｂがそれぞれ設けられているので、電極１０７ａ、１０７ｂ間の間隔を精密に制御できる。図１５Ｂに示すように、トンネル電流１６０は基板１０１の貫通孔１０６の内壁面１０６ｃに対して平行な方向へ流れる。トンネル電流１６０は基板１０１の面に対して傾斜した角度の方向へ流れてもよい。
【０１２２】
以上のように実施の形態２における１分子検出装置２００では、第１チャンバ２０３および第２チャンバ２０５としてマイクロ流路を用いることにより、（１）微量しか入手できないような試料溶液を分析できる、（２）多種類の試料溶液を１分子検出装置へ同時に注入できるので、容易に１分子の生体分子を検出できる。
【０１２３】
なお、生体分子の１分子検出装置２００では、予め第１チャンバ２０３内に第１電解液１０２を満たし、かつ第２チャンバ１０５内に第２電解液１０４を満たしておいてもよい。
【０１２４】
実施の形態２における１分子検出装置２００では、第１チャンバ１０３および第２チャンバ１０５としてマイクロ流路を用いることにより、生体分子１５４がキメラタンパク質１０８へ到達するのに要する時間を短縮できるので、容易に１分子の生体分子を検出できる。
【０１２５】
（実施の形態３）
図１６は実施の形態３における１分子検出装置５００の斜視図である。図１６において、図１に示す実施の形態１における１分子検出装置１００と同じ部分には同じ参照符号を付す。
【０１２６】
実施の形態３における１分子検出装置５００では、複数の貫通孔１０６が基板１０１に設けられている。複数の貫通孔１０６を設けることにより、容易に１分子の生体分子を検出できる。
【０１２７】
全ての貫通孔１０６は同一の形状であることが好ましいが、少なくとも一部の複数の貫通孔１０６は互いに異なる形状であってもよい。基板１０１の面１０１ａの法線方向から見た貫通孔１０６の形状が円形である場合、全ての貫通孔１０６の直径は同一であることが好ましいが、一部の貫通孔１０６の直径は互いに異なっていてもよい。
【０１２８】
貫通孔１０６は基板１０１に配列される。図１７Ａは基板１０１の面１０１ａから見た平面図である。複数の貫通孔１０６は面１０１ａに直線上に１次元的に配列されている。複数の貫通孔１０６は、曲線上、円弧上に配列されていてもよい。
【０１２９】
図１７Ｂは複数の貫通孔１０６の他の配列を示す基板１０１の面１０１ａから見た平面図である。貫通孔１０６は２次元的に配列されていてもよい。貫通孔１０６を多くするために、貫通孔１０６は、図１７Ｂに示すように、三角格子に配列されることが好ましく、これにより貫通孔１０６は高い密度で配列することができる。
【０１３０】
図１７Ｃは複数の貫通孔１０６のさらに他の配列を示す基板１０１の面１０１ａから見た平面図である。貫通孔１０６は、図１７Ｃに示すように、正方格子に配列されていてもよい。図１７Ｄは複数の貫通孔１０６のさらに他の配列を示す基板１０１の面１０１ａから見た平面図である。貫通孔１０６は、図１７Ｄに示すように、円弧上に配列されていてもよい。また、貫通孔１０６は、螺旋上、放射線上、閉曲線上に配列されていてもよい。
【０１３１】
図１７Ａに示すように、隣り合う貫通孔１０６の間隔３０１は１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。隣り合う貫通孔１０６の間隔３０１とは、図１７Ａに示すように、隣り合う貫通孔１０６の最近接の距離である。隣り合う貫通孔１０６の間隔３０１は、貫通孔１０６の直径よりも大きいことが好ましい。隣り合う貫通孔１０６の距離を大きくすることにより、検出時のノイズを低減できる。間隔３０１はキメラタンパク質の直径よりも大きいことが好ましく、これにより、隣り合う貫通孔１０６に固定されたキメラタンパク質１０８の干渉を少なくすることができ、検出時のノイズを低減できる。全ての貫通孔１０６は同一の間隔３０１で配列されていることが好ましいが、一部の複数の貫通孔１０６は異なる間隔３０１で配列されていてもよい。
【０１３２】
１分子検出装置５００は複数の電極対１０７を備える。複数の貫通孔１０６には、図１６に示すように、複数の電極対１０７がそれぞれ設けられている。一部の複数の貫通孔１０６は１つの電極対１０７を共有していてもよい。複数の貫通孔１０６に設けられたそれぞれの電極対１０７は基板１０１の面１０１ａに形成されている。このように、複数の貫通孔１０６に設けられたそれぞれの電極対１０７は同一面上に形成されることが好ましい。複数の電極対１０７は多層で設けられていてもよく、複数の面上に形成されていてもよい。電極対１０７は絶縁膜により被覆されることが好ましい。
【０１３３】
複数の貫通孔１０６には異なるキメラタンパク質１０８を設けることが好ましい。複数の貫通孔１０６に異なるキメラタンパク質１０８を設けることにより、同時に異なる種類の生体分子を検出できる。この目的のためには特に、複数の貫通孔１０６には、異なる標的配列１０９を有するキメラタンパク質１０８を設けることが好ましい。
【０１３４】
複数の貫通孔１０６に互いに異なるキメラタンパク質１０８を設ける場合、複数の貫通孔１０６において複数のトンネル電流を検出できる。複数の貫通孔１０６において検出される複数のトンネル電流は主成分分析されることが好ましい。複数の貫通孔１０６において検出されるトンネル電流を主成分分析することにより、生体分子を同定、定量、クラス分け、分離することができる。
【０１３５】
複数の貫通孔１０６には、同じ第１タンパク質１１０および／または同じ第２タンパク質１１１を有するキメラタンパク質１０８を設けることが好ましい。
【０１３６】
複数の貫通孔１０６には同じキメラタンパク質１０８を設けてもよい。複数の貫通孔１０６に同じキメラタンパク質１０８を設けることにより、生体分子がキメラタンパク質１０８へ結合する機会が増大するので、容易に生体分子を検出できる。
【０１３７】
複数の貫通孔１０６に同じキメラタンパク質１０８を設ける場合、複数の貫通孔１０６において検出される複数のトンネル電流は算術平均されることが好ましい。または、複数の貫通孔１０６に同じキメラタンパク質１０８を設ける場合、少なくとも３つ以上の貫通孔１０６において検出されるトンネル電流が合致した値を真値と判定してもよい。
【０１３８】
複数の貫通孔１０６において検出される複数のトンネル電流は、同時に計測されることが好ましい。この場合、複数の貫通孔１０６には、それぞれトンネル電流検出部１８１を設けることが好ましい。トンネル電流検出部１８１の個数は、貫通孔１０６の個数と同じであることが好ましいが、貫通孔１０６の個数よりも少なくてもよく、さらには１つであってもよい。複数の貫通孔１０６において検出される複数のトンネル電流は、時間差を設けて計測されてもよい。この場合には、複数の貫通孔１０６において検出されるトンネル電流は、トンネル電流検出部１８１をスイッチングすることにより計測される。トンネル電流検出部１８１をスイッチングしてトンネル電流を計測することにより、トンネル電流検出部１８１の数を削減できるので、１分子検出装置１００を小型化できる。
【０１３９】
複数の貫通孔１０６では、それぞれの電極対１０７によってエラーが検出されることが好ましい。このエラーとは、例えば貫通孔１０６の機能不良、電極対１０７の機能不良、貫通孔１０６への気泡混入などであって、１分子検出装置１００に関する機能、形状、動作、工程不良など全ての関連する事項に起因する。エラー検出は、１分子を検出する初期の工程において行われることが好ましい。エラー検出は、工程Ａの後で工程Ｂの前に行われることが好ましい。エラー検出は工程Ｂの後でＣ工程Ｃの前に行われていてもよい。エラーが検出された貫通孔１０６は、データ取得から除外されることが好ましい。
【０１４０】
なお、実施の形態３における複数の貫通孔１０６は実施の形態２における１分子検出装置２００のマイクロ流路に適用することもできる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明にかかる１分子検出装置を用いた１分子検出方法は、化学物質検出装置、生体分子分析装置、大気汚染物質分析装置、水質汚染物質分析装置、残留農薬分析装置、食品成分分析装置、麻薬分析装置、飲酒判定装置、喫煙判定装置、腐敗判定装置、爆薬探索装置、ガス漏れ検知器、火災報知機、不明者探索装置、個人識別装置、空気清浄機などの環境、化学工業、半導体、金融、食品、住宅、自動車、警備、生活、農業、林業、水産、運輸、安全、介護、福祉分野などへ利用できる。さらに、本発明にかかる１分子検出装置および１分子検出方法は、生活習慣病診断装置、尿分析装置、体液分析装置、血液分析装置、血中ガス分析装置、呼気分析装置、ストレス計測器などの医療、製薬、ヘルスケア分野などへも利用できる。
【符号の説明】
【０１４２】
１００    １分子検出装置
１０１    基板
１０２    第１電解液
１０３    第１チャンバ
１０４    第２電解液
１０５    第２チャンバ
１０６    貫通孔
１０７    電極対
１０７ａ    電極（第１電極）
１０７ｂ    電極（第２電極）
１０８    キメラタンパク質
１０９    標的配列
１１０    第１タンパク質
１１１    第２タンパク質
１５１    標的ペプチド成分
１５２ａ    リンカー成分
１５２ｂ    リンカー成分
１５３    ペプチド結合ドメイン
１５４    生体分子
１８１    トンネル電流検出部
１１５２ｂ    リンカー成分
２１５２ｂ    リンカー成分
【図１】
2013076943.tif 000003
【図２】
2013076943.tif 000004
【図３】
2013076943.tif 000005
【図４Ａ】
2013076943.tif 000006
【図４Ｂ】
2013076943.tif 000007
【図４Ｃ】
2013076943.tif 000008
【図５Ａ】
2013076943.tif 000009
【図５Ｂ】
2013076943.tif 000010
【図５Ｃ】
2013076943.tif 000011
【図６Ａ】
2013076943.tif 000012
【図６Ｂ】
2013076943.tif 000013
【図７Ａ】
2013076943.tif 000014
【図７Ｂ】
2013076943.tif 000015
【図７Ｃ】
2013076943.tif 000016
【図８Ａ】
2013076943.tif 000017
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2013076943.tif 000019
【図９Ｂ】
2013076943.tif 000020
【図９Ｃ】
2013076943.tif 000021
【図１０】
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【図１１】
2013076943.tif 000023
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2013076943.tif 000033
【図１６】
2013076943.tif 000034
【図１７Ａ】
2013076943.tif 000035
【図１７Ｂ】
2013076943.tif 000036
【図１７Ｃ】
2013076943.tif 000037
【図１７Ｄ】
2013076943.tif 000038
【図１８Ａ】
2013076943.tif 000039
【図１８Ｂ】
2013076943.tif 000040
【図１８Ｃ】
2013076943.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月11日(2014.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
キメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の周囲に固定化されている。実施の形態１ではキメラタンパク質１０８は貫通孔１０６の一端に固定化されている。キメラタンパク質とは、遺伝子組み換え技術を用いて作製された融合遺伝子により人工的に結合する２種類以上の異なるタンパク質よりなる。キメラタンパク質１０８は、Ｃａｍｅｌｅｏｎ等のＦＲＥＴ指示薬であることが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
図１２Ｃはさらに他の形状を有する貫通孔１０６が設けられた基板１０１の断面図である。容易にキメラタンパク質１０８を固定化するため、あるいは容易にキメラタンパク質１０８の立体構造の変化を生じさせるため、図１２Ｃに示すように、第１基板２０１での開口部１０６ａの直径２１０は、第２基板２０２での開口部１０６ｂの直径２１１よりも大きく、貫通孔１０６の内壁面１０６ｃは段差のない滑らかなテーパー形状を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
図１３Ａから図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂは、実施の形態２における１分子検出装置２００を用いた１分子検出方法を示す斜視図である。図１３Ａから図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂにおいて図７Ａから図７Ｃ、図８Ａ、図８Ｂに示す実施の形態１における１分子検出装置１００と同じ部分には同じ参照符号を付す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
図１５Ｂは実施の形態２におけるさらに他の構造を有する基板１０１の断面図である。図１５Ｂにおいて、図１２Ａに示す基板１０１と同じ部分には同じ参照番号を付す。電極１０７ｂは第２基板２０２の面２０２ａと第１基板２０１の面２０１ｂに設けられている。電極１０７ａが第１基板２０１を介して電極１０７ｂと対向している。電極１０７ａの端面１１０７ａは貫通孔１０６の開口部１０６ａに露出し、電極１０７ｂの端面１１０７ｂは貫通孔１０６の開口部１０６ａ、１０６ｂ間の途中の内壁面１０６ｃに露出している。１つの基板２０１の両面２０１ａ、２０１ｂに電極１０７ａ、１０７ｂがそれぞれ設けられているので、電極１０７ａ、１０７ｂ間の間隔を精密に制御できる。図１５Ｂに示すように、トンネル電流１６０は基板１０１の貫通孔１０６の内壁面１０６ｃに対して平行な方向へ流れる。トンネル電流１６０は基板１０１の面に対して傾斜した角度の方向へ流れてもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
複数の貫通孔１０６では、それぞれの電極対１０７によってエラーが検出されることが好ましい。このエラーとは、例えば貫通孔１０６の機能不良、電極対１０７の機能不良、貫通孔１０６への気泡混入などであって、１分子検出装置１００に関する機能、形状、動作、工程不良など全ての関連する事項に起因する。エラー検出は、１分子を検出する初期の工程において行われることが好ましい。エラー検出は、工程Ａの後で工程Ｂの前に行われることが好ましい。エラー検出は工程Ｂの後で工程Ｃの前に行われていてもよい。エラーが検出された貫通孔１０６は、データ取得から除外されることが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
試料溶液に含まれた生体分子の１分子検出方法であって、
互いに反対側の第１面と第２面とを有し、前記第１面と前記第２面との間を貫通する貫通孔が設けられた基板と、
前記貫通孔の周囲に設けられた電極対と、
前記基板の前記第１面に面し、第１電解液を内部に満たした第１チャンバと、
前記基板の前記第２面に面し、第２電解液を内部に満たした第２チャンバと、
前記貫通孔の一端に固定化されたキメラタンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は、
前記生体分子に作用される標的配列と、
前記標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、
前記標的配列の他端に設けられた第２タンパク質と、
を含み、
前記キメラタンパク質は前記第１タンパク質を介して前記貫通孔の前記一端に固定化されている、１分子検出装置を準備するステップと、
前記第１チャンバへ前記試料溶液を導入するステップと、
前記生体分子を前記標的配列へ作用させることにより前記キメラタンパク質の立体構造に変化をもたらすステップと、
前記キメラタンパク質を介して前記電極対に流れるトンネル電流により前記キメラタンパク質の前記立体構造の前記変化を検出するステップと、
を包含する１分子検出方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
前記キメラタンパク質は標的ペプチド成分とリンカー成分とをさらに含み、
前記標的配列は前記標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインを含み、
前記リンカー成分が前記標的配列と前記標的ペプチド成分とを化学結合し、前記標的配列と前記標的ペプチド成分が前記第１タンパク質または前記第２タンパク質のいずれかに結合する、請求項１に記載の１分子検出方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
（補正後）生体分子の１分子を検出するための１分子検出装置であって、
互いに反対側の第１面と第２面とを有し、前記第１面と前記第２面との間を貫通する貫通孔が設けられた基板と、
前記基板の前記第１面に面して、第１電解液を内部に満たすための第１チャンバと、
前記基板の前記第２面に面して、第２電解液を内部に満たすための第２チャンバと、
前記貫通孔の周囲に設けられた電極対と、
前記貫通孔の一端に固定化されたキメラタンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は、
前記生体分子に作用される標的配列と、
前記標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、
前記標的配列の他端に設けられた第２タンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は前記第１タンパク質を介して前記貫通孔の一端に固定化されている、１分子検出装置。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
（補正後）生体分子の１分子を検出するための１分子検出装置であって、
互いに反対側の第１面と第２面とを有し、前記第１面と前記第２面との間を貫通する貫通孔が設けられた基板と、
前記基板の前記第１面に面して、第１電解液を内部に満たすための第１チャンバと、
前記基板の前記第２面に面して、第２電解液を内部に満たすための第２チャンバと、
前記貫通孔の周囲に設けられた電極対と、
前記貫通孔の一端に固定化されるように構成されたキメラタンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は、
前記生体分子に作用される標的配列と、
前記標的配列の一端に設けられた第１タンパク質と、
前記標的配列の他端に設けられた第２タンパク質と、
を備え、
前記キメラタンパク質は前記第１タンパク質を介して前記貫通孔の一端に固定化されるように構成されている、１分子検出装置。
【国際調査報告】
2013076943.tif 000042
2013076943.tif 000043
2013076943.tif 000044
2013076943.tif 000045