(57)【要約】  本発明は、生理活性物質結合基を用いず、生理活性物質を固定化後に生理活性物質結合基を不活性化する工程が不要でありながら、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、且つ、生理活性物質に対して非特異的吸着が少なくてＳＮ比が高い生理活性物質の固定化方法を提供することを目的とする。  本発明は、基体と当該基体表面に非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する化合物とを有する固定化用基体の前記化合物側の表面上に、リン酸塩濃度が０．１Ｍ以上のリン酸塩緩衝液に生理活性物質を溶解した溶液を接触させることにより、前記生理活性物質を前記固定化用基体表面に固定化する、生理活性物質の固定化方法により、上記課題を解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と当該基体表面に非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する化合物とを有する固定化用基体の前記化合物側の表面上に、リン酸塩濃度が０．１Ｍ以上のリン酸塩緩衝液に生理活性物質を溶解した溶液を接触させることにより、前記生理活性物質を前記固定化用基体表面に固定化する、生理活性物質の固定化方法。
【請求項２】
非特異的吸着を抑制する親水性基が、アルキレングリコール残基及び／又はホスホリルコリン基である、請求の範囲第１項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項３】
前記化合物が、アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）を有する高分子化合物である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項４】
前記アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）が、下記の一般式［１］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものである、請求の範囲第３項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【化１】
2009113158.tif 000015
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す。Ｘはアルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する基を示す。）
【請求項５】
前記アルキレングリコール残基を有する繰り返し単位（Ａ）が、下記の一般式［１’］で表されるアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものである、請求の範囲第４項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【化２】
2009113158.tif 000016
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｔは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＴは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項６】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである、請求の範囲第５項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項７】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である、請求の範囲第６項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項８】
前記高分子化合物が、架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）を有する、請求の範囲第３項〜第７項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項９】
前記架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求の範囲第８項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１０】
前記架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）が、下記の一般式［２］で表されるアルコキシシリルを有するエチレン系不飽和重合性モノマーである請求の範囲第８項又は第９項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【化３】
2009113158.tif 000017
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項１１】
前記化合物が、生理活性物質結合基を含有する、請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１２】
前記生理活性物質結合基を含有する化合物が、下記の一般式［３］で表される活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導された、生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）を有する高分子化合物である、請求の範囲第１１項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【化４】
2009113158.tif 000018
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項１３】
前記生理活性物質結合基がｐ−ニトロフェニルエステル基である、請求の範囲第１２項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１４】
前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が５Ｍ以下である、請求の範囲第１項〜第１３項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１５】
前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、糖タンパク、又は糖鎖である、請求の範囲第１項〜第１４項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１６】
前記基体がプラスチックからなる、請求の範囲第１項〜第１５項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１７】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである、請求の範囲第１６項に記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１８】
前記基体がガラスからなる、請求の範囲第１項〜第１５項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【請求項１９】
前記基体の形状が、スライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である、請求の範囲第１項〜第１８項のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。【０００３】
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したものを総称する。【０００４】
しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板や粒子において蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。【０００５】
プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。【０００６】
固定化する方法としては２通りの方法が実施されている。その一つは蛋白質の物理的吸着による固定化の方法である。この方法では、基材表面が蛋白質を吸着しやすいために、蛋白質を固定化した後に抗原や２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまい、２次抗体と反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオアッセイ用基材が求められている。【０００７】
もう一つが官能基を用いて蛋白質を表面に結合する方法である。蛋白質が吸着しにくいマトリクス形成成分に蛋白質と反応する官能基を導入し、これを介して蛋白質を固定化する（たとえば、特許文献２）。しかしながら、特許文献２に開示されているような生理活性物質を固定化する方法によっても、目的とする生理活性物質の固定化能力が不十分な場合や非特異的吸着が多くてＳＮ比が不十分な場合があった。また、蛋白質と反応する官能基を用いる場合には、蛋白質を固定化する工程と、固定化後に蛋白質と反応する官能基を不活性化する工程とが必要なため、次の工程に入るまでの時間がかかる問題があった。そのため、蛋白質と反応する官能基を用いない方法も望まれていた。【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特表２００４−５３１３９０号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第一の課題は、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、且つ、生理活性物質に対して非特異的吸着が少なくてＳＮ比が高い、生理活性物質の固定化方法を提供することである。
本発明の第二の課題は、前記第一の課題に加えて、生理活性物質結合基を用いず、生理活性物質を固定化後に生理活性物質結合基を不活性化する工程が不要である生理活性物質の工程化方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
（１）基体と当該基体表面に非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する化合物とを有する固定化用基体の前記化合物側の表面上に、リン酸塩濃度が０．１Ｍ以上のリン酸塩緩衝液に生理活性物質を溶解した溶液を接触させることにより、前記生理活性物質を前記固定化用基体表面に固定化する、生理活性物質の固定化方法、
（２）非特異的吸着を抑制する親水性基が、アルキレングリコール残基及び／又はホスホリルコリン基である、（１）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（３）前記化合物が、アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）を有する高分子化合物である、（１）又は（２）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（４）前記アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）が、下記の一般式［１］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものである、（３）に記載の生理活性物質の固定化方法、【００１１】
【化１】
2009113158.tif 000002
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す。Ｘはアルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する基を示す。）
（５）前記アルキレングリコール残基を有する繰り返し単位（Ａ）が、下記の一般式［１’］で表されるアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものである、（４）に記載の生理活性物質の固定化方法、【００１２】
【化２】
2009113158.tif 000003
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｔは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＴは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
（６）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーがメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである、（５）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（７）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である、（６）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（８）前記高分子化合物が、架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）を有する、（３）〜（７）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
（９）前記架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である、（８）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（１０）前記架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）が、下記の一般式［２］で表されるアルコキシシリルを有するエチレン系不飽和重合性モノマーである、（８）又は（９）に記載の生理活性物質の固定化方法、【００１３】
【化３】
2009113158.tif 000004
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
（１１）前記化合物が、生理活性物質結合基を含有する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
（１２）前記生理活性物質結合基を含有する化合物が、下記の一般式［３］で表される活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導された、生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）を有する高分子化合物である、（１１）に記載の生理活性物質の固定化方法、【００１４】
【化４】
2009113158.tif 000005
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
（１３）前記生理活性物質結合基がｐ−ニトロフェニルエステル基である、（１２）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（１４）前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が５Ｍ以下である、（１）〜（１３）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
（１５）前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、糖タンパク、又は糖鎖である、（１）〜（１４）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
（１６）前記基体がプラスチックからなる、（１）〜（１５）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
（１７）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである、（１６）に記載の生理活性物質の固定化方法、
（１８）前記基体がガラスからなる、（１）〜（１５）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
（１９）前記基体の形状が、スライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である、（１）〜（１８）のいずれかに記載の生理活性物質の固定化方法、
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生理活性物質結合基を用いず、生理活性物質を固定化後に生理活性物質結合基を不活性化する工程が不要でありながら、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、且つ、生理活性物質に対して非特異的吸着が少なくてＳＮ比が高い生理活性物質の固定化方法を提供することができる。
本発明においては、生理活性物質結合基を用いても良いが、その場合にも従来に比べて目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、且つ、生理活性物質に対して非特異的吸着が少なくてＳＮ比が高い生理活性物質の固定化方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の生理活性物質の固定化方法は、基体と当該基体表面に非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する化合物とを有する固定化用基体の前記化合物側の表面上に、リン酸塩濃度が０．１Ｍ以上のリン酸塩緩衝液に生理活性物質を溶解した溶液を接触させることにより、前記生理活性物質を前記固定化用基体表面に固定化する方法である。【００１７】
本発明の生理活性物質の固定化方法によれば、非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する化合物を有する固定化用基体の前記化合物側の表面上に、リン酸塩濃度が０．１Ｍ以上のリン酸塩緩衝液に生理活性物質を溶解した溶液を接触させることにより、生理活性物質結合基を用いなくても、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、且つ、生理活性物質に対して非特異的吸着が少なくてＳＮ比が高くすることができる。本発明においては、従来用いられてきたリン酸緩衝生理食塩水と比べてリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上と著しく濃度が高いリン酸塩緩衝液を用いることにより、ホスホリルコリン基やアルキレングリコール残基などの非特異的吸着を抑制する親水性基が膨潤したりゲル化を起こし、生理活性物質が物理的に取り込まれやすくなるため、生理活性物質結合基を用いなくても生理活性物質を固定化する能力が高くなっていると推定される。生理活性物質結合基を用いない場合には、生理活性物質を固定化後、生理活性物質結合基を不活性化する工程が不要であるというメリットがある。【００１８】
本発明に使用する基体の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。【００１９】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、飽和環状ポリオレフィン、スチレン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。【００２０】
基体表面と表面に被覆乃至付着される化合物との密着性を高めるために、基体表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。【００２１】
当該基体表面に被覆乃至付着させる化合物は、非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する。非特異的吸着を抑制する親水性基は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を有すれば、特に限定されないが、アルキレングリコール残基及び／又はホスホリルコリン基が好適に用いられる。なおここで、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端又は両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。【００２２】
アルキレングリコール残基及び／又はホスホリルコリン基を含有する化合物としては、各種の化合物が挙げられるが、アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）を有する高分子化合物であることが好ましい。上記のような高分子化合物は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を持つポリマーで、アルキレングリコール残基及び／又はホスホリルコリン基が生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たす。このような高分子化合物の場合、特許文献２のような蛋白質が吸着しにくい低分子のマトリクス形成成分を使用した場合に比べて非特異的吸着を抑制する機能が優れていて、バックグラウンドが低くなりやすい。中でも、アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）及び架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）を有する高分子化合物（共重合体）であることが好ましい。更に、架橋可能な官能基が基体表面に被覆乃至付着した後に高分子化合物同士を架橋して溶剤への不溶性を付与する役割を果たし、基体洗浄による信号低下を低減することができる。【００２３】
アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）は、下記の一般式［１］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものであることが好ましい。【００２４】
【化５】
2009113158.tif 000006
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す。Ｘはアルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する基を示す。）【００２５】
中でも、本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、特に構造を限定しないが、下記の一般式［１’］で表されるアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものであることが好ましい。【００２６】
【化６】
2009113158.tif 000007
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｔは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＴは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）【００２７】
式中のアルキレングリコール残基Ｔの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｔの繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。各種ｐの混合物が用いられる場合には、重合体としては、ｐは平均値として特定される。繰り返し数２以上の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｔの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。【００２８】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール （メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。中でも特にエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００であるメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。【００２９】
一方、一般式［１］でホスホリルコリン基を有する単量体としては、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
ホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）を有する場合には、ホスホリルコリン基が両性イオンであるため、後述する架橋可能な官能基を有する繰り返し単位がなくても基体との密着性等が優れている。【００３０】
アルキレングリコール残基を有する繰り返し単位（Ａ）は、高分子化合物中の組成比が２５〜９９ｍｏｌ％であることが好ましく、更に６０〜９８ｍｏｌ％であることが好ましく、特に７０〜９７ｍｏｌ％であることが好ましい。
また、ホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）は、高分子化合物中の組成比が２〜５０ｍｏｌ％であることが好ましく、更に５〜４５ｍｏｌ％であることが好ましく、特に１０〜４０ｍｏｌ％であることが好ましい。【００３１】
架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）は、架橋可能な官能基の反応が重合体を合成中に進行しないように導入されたものであれば特に制限されるものではない。架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを用いて高分子化合物としても良いし、高分子化合物を製造した後に、例えば水酸基とグリシジル基の組み合わせを用いるなど適宜反応性官能基を用いて、架橋可能な官能基を高分子化合物に導入しても良い。【００３２】
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、(メタ)アクリル基、グリシジル基などが用いられるが、架橋処理が容易なことから加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、グリシジル基が好ましく、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。【００３３】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、なかでもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。【００３４】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して、または直接結合した一般式［２］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。【００３５】
【化７】
2009113158.tif 000008
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）【００３６】
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００３７】
架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）は、高分子化合物中の組成比が１〜２０ｍｏｌ％であることが好ましく、更に２〜１５ｍｏｌ％であることが好ましく、特に２〜１０ｍｏｌ％であることが好ましい。【００３８】
本発明に用いられる化合物は、生理活性物質結合基を含有していても良い。生理活性物質結合基を含有する化合物の態様としては、更に、生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）を有する高分子化合物であることが好ましい。生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）を有する高分子化合物においても、アルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）、更には、架橋可能な官能基を有する繰り返し単位（Ｂ）を有することが好ましい。生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）を有する高分子化合物がアルキレングリコール残基又はホスホリルコリン基を有する繰り返し単位（Ａ）を有する場合、特許文献２のような蛋白質が吸着しにくい低分子のマトリクス形成成分を使用した場合に比べて非特異的吸着を抑制する機能が優れていて、バックグラウンドが低くなりやすい。【００３９】
生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）は、下記の一般式［３］で表される活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーから誘導されたものであることが好ましい。【００４０】
【化８】
2009113158.tif 000009
（式中Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）【００４１】
生理活性物質結合基Ｗとしては、ｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル基、アルデヒド基、アミノ基、エポキシ基、等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより低いｐＨにて生理活性物質を固定化できるため好ましい。【００４２】
生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）を含む場合の生理活性物質結合基を有する繰り返し単位（Ｃ）は、高分子化合物中の組成比が０．１〜７０ｍｏｌ％であることが好ましく、更に１〜２０ｍｏｌ％であることが好ましく、特に２〜１０ｍｏｌ％であることが好ましい。【００４３】
本発明に好適に使用される上記高分子化合物は、更に、他の繰り返し単位を含んでいても良い。例えば、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合させてもよく、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしてはメタクリル酸の炭素数１〜１５のアルキルエステルが好ましく用いられ、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどを挙げることができる。ｎ―ブチルメタクリレートもしくはｎ−ドデシルメタクリレートもしくはｎ−オクチルメタクリレートが好ましい。【００４４】
本発明に使用する高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、更に必要に応じて使用する他のエチレン系不飽和重合性モノマーを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。【００４５】
溶媒としては、それぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基体に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基体を変性させないため好ましい。【００４６】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。【００４７】
本発明に使用する高分子化合物の化学構造は、少なくとも非特異的吸着を抑制する親水性基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが重合されたものであれば、当該高分子化合物が共重合体の場合の結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。【００４８】
本発明に使用する高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。【００４９】
基体表面への化合物の被覆は、例えば有機溶剤に化合物を０．００１〜１０重量％濃度になるように溶解した溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。架橋可能な官能基を有する高分子化合物を用いる場合には、その後、架橋可能な官能基に応じた任意の方法で高分子化合物の主鎖同士を架橋させる。架橋可能な官能基が加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有する場合の高分子化合物の被覆については、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。含有される水により加水分解が生じ、該高分子化合物中にシラノール基が生成し、さらに加熱することにより主鎖同士が結合され、高分子化合物が不溶になる。
含水量が少ないとシラノール基の生成が不十分で、架橋結合が弱くなる。一方、含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が含有されていれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量が約０．０１〜１５重量％程度のものが好ましい。【００５０】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中で化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。【００５１】
本発明に用いられる化合物を溶解した溶液を基体表面に塗布した後、乾燥させる工程において、化合物がシラノール基を有する場合には、化合物中のシラノール基は他の化合物中のシラノール基、水酸基、アミノ基等と脱水縮合して架橋を形成する。さらに基体表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基体表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基体表面に被覆乃至付着された化合物は容易に溶解したり、基体から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。化合物が熱により変性されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。【００５２】
前記非特異的吸着を抑制する親水性基を含有する化合物を前記基体表面に塗布して被覆乃至付着することで、容易に生理活性物質の非特異的吸着が抑制された生理活性物質固定化用基体を作製できる。さらに前記化合物が架橋可能な官能基を有する場合には、該化合物を架橋することで、基体上の化合物に不溶性を付与することができる。これらのことより、該化合物を塗布した固定化用基体はエライザ用プレート、プロテインチップ用基板に好適に用いることができる。【００５３】
本発明の固定化方法を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、糖タンパク、糖鎖などがある。【００５４】
本発明に使用するリン酸塩緩衝液は、各種リン酸塩が０．１Ｍ以上の高濃度で溶解しているものを用いる。好ましくは５．０Ｍ以下、より好ましくは４．０Ｍ以下であり、更に好ましくは０．６Ｍ以上２．４Ｍ以下、もっとも好ましくは０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下である。濃度が下限値未満では生理活性物質が十分に固定化できずシグナルが検出されないという問題が発生する恐れがある。一方、濃度が上限値を超えると生理活性物質が変性を起こし生理活性物質が特異的な反応を起こさず機能しないという問題が発生する恐れがある。【００５５】
本発明に使用するリン酸塩は、特に限定されるものではないが、リン酸アルミニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムリン酸ナトリウム、リン酸インジウム、リン酸サマリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸水素バリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸二カリウムリン酸二水素２−アミノエチル、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素マンガン、リン酸二水素リチウム、リン酸二バリウム、リン酸ヒドロキシアンモニウム、リン酸尿素、リン酸リチウム、リン酸ジフェニル、リン酸トリエチル、リン酸トリオクチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリブチル、リン酸トリメチル、リン酸ホウ素、リン酸マグネシウム、などが挙げられる。特に好ましくはリン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。【００５６】
前記高濃度リン酸塩緩衝液に生理活性物質を溶解した溶液を、前記固定化用基体に接触させることにより、容易に生理活性物質を固定化できる。【００５７】
生理活性物質を溶解した溶液を前記固定化用基体表面に接触させる方法は、基体の形状にさまざまであるが、たとえば９６穴プレートの場合は溶液をそれぞれのウェルに分注するだけでよい。スライド形状の場合は点着により接触することが好ましい。
【実施例】
【００５８】
（高分子化合物の合成例１）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００  Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ  GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ  和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１３ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．４ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。【００５９】
（高分子化合物の合成例２）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約４７５  Aldrich製）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ  GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．９５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ  和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。【００６０】
【表１】
2009113158.tif 000010
【００６１】
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）    
０．０１molのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００（ｎ＝４）  日本油脂(株)製）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作成しておいた０．０１molのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Aldrich製）と０．０１molのトリエチルアミン（和光純薬(株)製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１ｈｒ反応させた後、室温でさらに２ｈｒ溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。【００６２】
（高分子化合物の合成例３）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ブチルメタアクリレート（ＢＭＡ）、ＭＥＯＮＰをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．７０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにＡＩＢＮを０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で３時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、１．４６および１．６５ｐｐｍ付近に現れるＢＭＡのメチレンに帰属されるピーク、３．３４ｐｐｍ付近に現れるＭＰＣのトリメチルに帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表２に結果を示した。【００６３】
（高分子化合物の合成例４）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００  Aldrich製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ  GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ  和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１６ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表２に結果を示した。【００６４】
【表２】
2009113158.tif 000011
【００６５】
（固定化用基体の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を96穴プレート形状（1ウェルの寸法：底面直径６．４ｍｍ×高さ１１ｍｍ）に加工して基体を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基体表面に酸化処理を施した。この基体を高分子化合物の合成例１〜４にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬後、６５℃で４時間加熱乾燥することにより、基体表面に合成例１〜４にて得られた高分子化合物を含む層を導入した。合成例１の高分子化合物を用いて作製された固定化用基体を固定化用基体１、合成例２の高分子化合物を用いて作製された固定化用基体を固定化用基体２、合成例３の高分子化合物を用いて作製された固定化用基体を固定化用基体３、合成例４の高分子化合物を用いて作製された固定化用基体を固定化用基体４とする。【００６６】
（実験１）：１次抗体の固定化とリン酸塩濃度の関係を調べた。
《実施例１》
（固定化溶液の調製）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。【００６７】
（固定化処理）
工程１
作製した固定化溶液を固定化用基体１に１００ｕｌ／ウェルの割合で分注し、室温で４時間静置した。固定化反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。【００６８】
工程２
その後、吸着防止処理を行わなかった。【００６９】
工程３（抗原抗体反応１）
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウス  IgG2aを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液を作製した。これらの希釈溶液および抗原であるマウス  IgG2aを含まない１０％ＦＢＳ溶液を３７℃にて２時間、固定化用基体と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。【００７０】
工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウス  IgG2aをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と固定化用基体とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。【００７１】
工程５（発色）
最後にＨＲＰ発色試薬である、ＴＭＢＺ発色キット（住友ベークライト株式会社製）を用いて発色反応を行った。【００７２】
発色反応を行った。基板について４５０ｎｍの吸光量測定を行った。吸光量の測定には、ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーを用いた。
シグナル強度の結果を表３に示す。【００７３】
《比較例１》
（固定化溶液の調整）
０．０５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
以下実施例１と同様な工程により評価した。結果を表３に示す。【００７４】
実施例１および比較例１を比較することにより、高濃度リン酸塩緩衝液を使用した実施例１は抗原の量に応じたシグナルが検出でき、１次抗体を固定化できることが確認できた。【００７５】
【表３】
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【００７６】
（実験２）：固定化用基体２とノンコート基体との比較を行った。
《実施例２》
固定化用基体として固定化用基体２を用いた。実験操作は実施例１と同様の操作を行った。結果を表４に示す。【００７７】
《比較例２》
基体として酸素プラズマ後の基体を高分子化合物を塗布せずに用いた。実験操作は実施例１と同様の操作を行った。結果を表４に示す。【００７８】
実施例２および比較例２を比較することにより、高濃度リン酸塩緩衝液を使用することでアルキレングリコール残基を有さない表面に対しても、１次抗体の固定化は可能であるが、アルキレングリコール残基を有さない基板を用いた比較例２はバックグランドが高く抗原濃度とシグナルの検出範囲が狭いことがわかった。アルキレングリコール残基を有する基板を用いた実施例２ではバックグランドの上昇がなく、広い検出範囲を示すことがわかった。【００７９】
【表４】
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【００８０】
（実験３）：固定化用基体３及び固定化用基体４を用いて、１次抗体の固定化とリン酸塩濃度の関係を調べた。
《実施例３、４》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。【００８１】
（固定化処理）
実施例１の工程２の代わりに、下記の工程２を行った以外は、実施例１と同様の工程１、工程３、工程４、工程５を行った。シグナル強度の結果を表５に示す。
工程２
工程１の後、基板を０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りのＭＥＯＮＰ部を失活させた。【００８２】
《比較例３、４》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのホウ酸（和光純薬製：０２７−０２１９１）水溶液中(pH8.5)に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
以下実施例３、４と同様な工程により評価した。結果を表５に示す。【００８３】
《比較例５，６》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液のかわりに０．０５Ｍのリン酸水素二カリウム水溶液を用いた以外は実施例３、４と同様に操作した。結果を表５に示す。【００８４】
実施例３、４および比較例３、４を比較することにより、リン酸塩溶液を使用した実施例３、４が抗原の量に応じたシグナルが検出できたため１次抗体を固定化できることが確認できた。また実施例３、４および比較例５、６を比較することにより、リン酸塩濃度が高い方がより高いシグナルが得られることが確認できた。【００８５】
【表５】
2009113158.tif 000014
【国際調査報告】
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2009113158.tif 000020
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