(57)【要約】  本発明は、ヒト・オステオポンチンの発現をより特異的に、かつ強力に抑制するためのｓｉＲＮＡ、それを含む組成物及び医薬品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡ、それらの相補鎖、又はそれらの誘導体。
【請求項２】
配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡと、その各々の相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はその誘導体。
【請求項３】
請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡまたはその誘導体を含む、オステオポンチンの発現を抑制するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡまたはその誘導体を有効成分として含む、オステオポンチンの発現を抑制するための医薬。
【請求項５】
請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡまたはその誘導体を有効成分として含む、オステオポンチンの亢進に起因する疾患の処置のための医薬。
【請求項６】
上記オステオポンチンの亢進に起因する疾患が、腫瘍、肝炎、動脈硬化、多発性硬化症、関節炎、リウマチ、又は肺繊維症である、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
請求項１に記載のＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・オステオポンチンの発現抑制ためのｓｉＲＮＡに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物は、細胞−組織−器官−個体と段階的に構成され、最小単位の細胞同士が付着したり、細胞外の物質に付着することにより形成されている。組織の構築には、細胞−細胞間の接着と同時に細胞―細胞外マトリックスとの接着がある。このような細胞間の接着には、細胞外マトリックス、膜に存在する細胞接着分子および細胞接着分子の細胞内の連結物としての細胞骨格が重要な役割を果たしている。細胞―細胞外マトリックス間接着に関与する細胞接着分子は、細胞外マトリックスが結合することにより、細胞の分化、シグナル伝達の役割を担っている。従って、細胞接着分子と細胞外マトリックスの接着機構を解析することにより、種々の疾患におけるメカニズムの解明、さらには治療に繋がる。【０００３】
細胞外マトリックスの一種であるオステオポンチン（ＯＰＮ）は、分子量約４１ｋＤａの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、分子中央部にはαｖ等のインテグリンとの接着に重要なＧＲＧＤＳ配列が存在し、その直後にはトロンビン開裂部位（Ｒ１６８Ｓ１６９）が存在する。また、ＧＲＧＤＳ配列直後に存在するＳＶＶＹＧＬＲ配列はα９β１、α４β１、α４β７という炎症に関与するインテグリンと結合する。【０００４】
ＯＰＮは細胞接着、細胞遊走、一酸化窒素（ＮＯ）産生の制御、免疫系への関与など多彩な機能が報告されてきており、癌転移、リウマチ関節炎や多発性硬化症などの慢性炎症疾患、自己免疫疾患など多くの難治疾患病態と関与することが示されている。【０００５】
特に、炎症性疾患に関しては、直接的な関与が示唆されている。ＯＰＮの受容体であるα９インテグリンは好中球上に発現しており、α４インテグリンはリンパ球上に発現していることから、ＯＰＮ機能を抑制することにより好中球を初めとする白血球の遊走を抑制することが考えられ、抗炎症作用が期待されている。【０００６】
事実、ＯＰＮ欠損マウスは、腫瘍、リウマチ関節炎、多発性硬化症（ＥＡＥ）、動脈硬化等の疾患に対し抵抗性を示すことが報告されている（非特許文献１〜４）。また、ＯＰＮに対する中和抗体を用いて、リウマチ関節炎が緩解した報告もある（非特許文献５）。【０００７】
そこで、ＯＰＮ機能を阻害することにより、治療効果を期待することができると考え、新規分子特異的ノックダウン法であるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA interference）法の治療への応用を検討した。【０００８】
ＲＮＡｉ法とは、短い干渉ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA））を用いて、特定遺伝子の発現を遺伝子レベルで速やかに発現抑制する技術である（非特許文献６及び７）。ＯＰＮのｍＲＮＡ配列から、ターゲットとなる配列を複数選択し、そのｓｉＲＮＡを合成し、ＯＰＮをノックダウンさせることにより疾患治癒に結びつけようと考えた。【０００９】
特許文献１には、オステオポンチンの部分をコードするＲＮＡのＩＬ−１βに関与する結合組織疾患の治療における使用が記載されている。しかし、ｓｉＲＮＡとしての使用については、何ら開示されていない。【００１０】
特許文献２には、ＦＧＦＲ（線維芽細胞増殖因子レセプター：fibroblast growth factor receptors）のｓｉＲＮＡ及びＦＧＦＲがＯＰＮ遺伝子の発現を亢進していることが記載されている。しかし、ＯＰＮのｓｉＲＮＡについては、何らの開示も示唆もない。【００１１】
また、二本鎖ＲＮＡを、ベクターを用いてインビトロで産生させ、これをＲＮａｓｅIII核酸分解酵素ファミリーの一つであるｄｉｃｅｒを用いて切断したｓｉＲＮＡの集団からなる遺伝子操作用のキットが市販されている（ＳｕｐｅｒＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＳＰＰ１  ｓｉＲＮＡキット（Secreted phosphoprotein 1(osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1)）非特許文献８）。しかし、このキットは、遺伝子発現の研究のために、ｓｉＲＮＡを用いて特定遺伝子の発現を阻害するためのものであり、ｓｉＲＮＡの医薬用途については何ら開示されていない。また、上記製造方法によって得られたｓｉＲＮＡは、分子特異的ではない短いＲＮＡフラグメントをも含んでいることから、遺伝子ノックダウンの特異性が低いという欠点もあった。【００１２】
最近、オステオポンチンの亢進に起因する疾患の処置のための医薬等として有用なＯＰＮのｓｉＲＮＡとして、マウス、ラットおよびヒトのＯＰＮのｍＲＮＡからｓｉＲＮＡが見出されている（特許文献３）。
【特許文献１】特開平８−１９１６９３
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１４３６７６Ａ１号明細書
【特許文献３】特開２００５−３２３５９１
【非特許文献１】Nemoto H, Rittling SR, Yoshitake H, Furuya K, Amagasa T, Tsuji K, Nifuji A, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency reduces experimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues. J Bone Miner Res. 16:652-9, 2001.
【非特許文献２】Yumoto K, Ishijima M, Rittling SR, Tsuji K, Tsuchiya Y, Kon S, Nifuji A, Uede T, Denhardt DT, Noda M.  Osteopontin deficiency protects joints against destruction in anti-type II collagen antibody-induced arthritis in mice.  Proc Natl Acad Sci U S A. 99:4556-4561, 2002.
【非特許文献３】Chabas D, Baranzini SE, Mitchell D, Bernard CC, Rittling SR, Denhardt DT, Sobel RA, Lock C, Karpuj M, Pedotti R, Heller R, Oksenberg JR, Steinman L. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease.Science. 294:1731-5, 2001.
【非特許文献４】Matsui Y, Rittling SR, Okamoto H, Inobe M, Jia N, Shimizu T, Akino M, Sugawara T, Morimoto J, Kimura C, Kon S, Denhardt D, Kitabatake A, Uede T.  Osteopontin Deficiency Attenuates Atherosclerosis in Female Apolipoprotein E-Deficient Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:1029-34, 2003.
【非特許文献５】Yamamoto N, Sakai F, Kon S, Morimoto J, Kimura C, Yamazaki H, Okazaki I, Seki N, Fujii T, Uede T. Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 112:181-8, 2003.
【非特許文献６】Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.  Nature. 391:806-11, 1998.
【非特許文献７】Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411:494-8, 2001.
【非特許文献８】ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ社、ＳｕｐｅｒＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（登録商標）製品説明、［平成１６年３月２２日検索］。インターネット＜ＵＲＬ：http://www.superarray.com/sirnaqa.php＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような状況下で、従来のｓｉＲＮＡよりもさらにヒト・オステオポンチンの亢進に起因するヒトの疾患の治療に有効なｓｉＲＮＡの開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者は、鋭意研究を行い、ヒト・オステオポンチンの発現を既知のｓｉＲＮＡより特異的に、かつ強力に抑制するｓｉＲＮＡを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはそれを含む組成物及び医薬を提供する。【００１５】
（１）配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡ、それらの相補鎖、又はそれらの誘導体。
（２）配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡと、その各々の相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はその誘導体。
（３）上記（２）に記載の二本鎖ＲＮＡ又はその誘導体を含む、オステオポンチンの発現を抑制するための医薬組成物。
（４）上記（２）に記載の二本鎖ＲＮＡを有効成分として含む、オステオポンチンの発現を抑制するための医薬。
（５）上記（２）に記載の二本鎖ＲＮＡ又はその誘導体を有効成分として含む、オステオポンチンの亢進に起因する疾患の処置のための医薬。
（６）上記オステオポンチンの亢進に起因する疾患が、腫瘍、肝炎、動脈硬化、多発性硬化症、関節炎、リウマチ、又は肺繊維症である、上記（５）に記載の医薬。
（７）上記（１）に記載のＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のｓｉＲＮＡは、従来のヒトＯＰＮ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡと比較して、異なるヒトＯＰＮのｍＲＮＡの部位を対象部位とし、ヒトのＯＰＮの遺伝子をノックダウンする効果が顕著に高い。したがって、ヒト・オステオポンチンの亢進に起因する疾患の治療のための医薬等としてより適している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡのターゲット配列およびその位置、ならびに本発明のｈＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ（ｈＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ−５，７，８，９，１０）を示す。
【図２】実施例に用いたヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡの配列を示す。
【図３】ヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡによるHT1080細胞におけるOPN分泌抑制効果を示すグラフである。
【図４】ヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡによるNRC-12細胞におけるOPN分泌抑制効果を示すグラフである。
【図５】ヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡによるG361細胞におけるOPN分泌抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。【００１９】
本発明は、１つの実施形態において、ヒトのオステオポンチン遺伝子に由来する配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡ、それらの相補鎖、又はそれらの誘導体を提供する。なお、本明細書中、これらのＲＮＡまたはその誘導体を「本発明のＲＮＡ」と呼ぶことがある。【００２０】
本明細書中、「オステオポンチン」または「ヒト・オステオポンチン」とは、分泌性リン酸タンパク質１(secreted phospho protein 1)とも呼ばれる骨のマトリックスに含まれる接着タンパク質の一種であって、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒト・オステオポンチンタンパク質を意味する。オステオポンチンは、インテグリンと結合するＲＧＤ配列を有し、破骨細胞と骨芽細胞の両方を骨組織周辺に接着させる作用を有する。また、オステオポンチンは、強く陰性に荷電しており、ヒドロキシアパタイトを沈着させ、骨のカルシウムを保持する作用を有する。【００２１】
ヒト・オステオポンチン遺伝子の塩基配列を、配列番号２に示す。【００２２】
図１に、ヒト・オステオポンチン遺伝子の塩基配列と、本発明のｓｉＲＮＡの標的配列とを示す。【００２３】
本明細書中、あるＲＮＡ配列に対して「その相補鎖」という場合、所定の塩基配列を有するＲＮＡに対して、Ａ：ＵおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるＲＮＡを意味する。ＤＮＡの相補的二本鎖のうち、タンパク質をコードしている鎖、すなわち、ｍＲＮＡと同一の配列を有する鎖がセンス鎖であり、センス鎖と塩基的に相補的な関係にある配列を有する鎖がアンチセンス鎖である。【００２４】
本明細書中、ＲＮＡについて「その誘導体」という場合、ＲＮＡの安定性を向上させるための修飾が施されたそのＲＮＡの誘導体のことを意味する。そのような誘導体の例としては、例えば、３’側にｄＴを数個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２又は３個、最も好ましくは２個付加させた、３’オーバーハング型誘導体、ポリエチレングリコール、コレステロール、あるいは2'-o-methyl等で修飾した誘導体、いわゆるタンデムタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込むための、２つのプロモーター、例えばＵ６プロモーター、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを結合させた誘導体、具体的には、Ｕ６プロモーター、センスＲＮＡ、５個のＴ、Ｕ６プロモーター、アンチセンスＲＮＡ、５個のＴを結合させた誘導体、いわゆるステムループタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込み、ショートヘアピンＲＮＡを介して、ｓｉＲＮＡを産生するための、プロモーター、例えばＵ６プロモーター、センスＲＮＡ、ループ配列及びアンチセンスＲＮＡを結合させた誘導体、具体的には、Ｕ６プロモーター、センスＲＮＡ、ループ配列、例えば、ｇｔｇｔｇｃｔｇｔｃｃ、アンチセンスＲＮＡを結合させた誘導体等が挙げられる。【００２５】
本発明はまた、別の実施形態において、配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡと、その各々の相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はその誘導体を提供する。【００２６】
本明細書中、「ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）」とは、２１〜２７bpからなる二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉（RNA interference: RNAi）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡをいう。また、ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡにより、そのＲＮＡと相同的な配列を有する遺伝子の発現が抑制される現象をいう。【００２７】
ＲＮＡｉは、特定配列を有する遺伝子を破壊することができることから、遺伝子機能の解析や特定遺伝子の発現抑制に有用である。また、細胞への導入量が少量の割に比較的長時間効果が持続するという特徴を有する。【００２８】
本発明のヒトのオステオポンチン遺伝子に由来する配列番号３、４、５、６又は７に示す配列からなるＲＮＡと、その各々の相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はその誘導体は、このようなＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡとして使用することができる。本明細書中、これらのｓｉＲＮＡまたはその誘導体を、「本発明のｓｉＲＮＡ」または「本発明のヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ」と呼ぶことがある。【００２９】
本発明のｓｉＲＮＡは、常法によって合成することができ、市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型で行うことができる。【００３０】
本発明は、別の実施形態において、本発明のＲＮＡを担持するｓｉＲＮＡ発現ベクターを提供する。本発明のベクターは、本発明のｓｉＲＮＡを標的細胞中で発現させることに使用され得る。【００３１】
本発明のｓｉＲＮＡ発現ベクターは、常法にしたがって調製することができる。タンデムタイプの場合は、ＰＣＲによってセンス、アンチセンス配列を含むプライマーによりプロモーター部分を増幅し、増幅断片を制限酵素で切断後、ベクターのプロモーター、例えばＵ６プロモーターの下流に挿入することにより調製できる。ステムループの場合、センス−ループ−アンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを合成アニールさせ、ベクターのプロモーター、例えばＵ６プロモーターの下流に挿入することにより調製できる。【００３２】
本発明は、別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを含むオステオポンチンの発現を抑制するための組成物を提供する。本発明は、さらに別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを有効成分として含むオステオポンチンの発現を抑制するための医薬、または本発明のｓｉＲＮＡを有効成分として含むオステオポンチンの亢進に起因する疾患の処置のための医薬を提供する。【００３３】
さらに、本発明のｓｉＲＮＡを含む組成物は、そのままもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製し、ヒトの疾患の処置に使用することができる。本発明のｓｉＲＮＡは、オステオポンチンの発現を抑制する効果を有するため、本発明のｓｉＲＮＡを有効成分として含む医薬組成物は、オステオポンチンの発現の亢進に起因する疾患、代表的には、腫瘍、肝炎、動脈硬化、多発性硬化症、関節炎、リウマチ、又は肺繊維症の処置に使用することができる。本発明の医薬組成物は、生体内での安定性や体内へのデリバリー方法として、リポソームなどのデリバリー担体、部位特異的な抗体又は細胞種特異的な機能性ペプチドとの結合などの技術が応用できる。また、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。【００３４】
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３５】
（オリゴヌクレオチドの調製）
リボヌクレオシド３'-ホスホロアミダイト（ＧＬＥＮリサーチ）を用いて、ＤＮＡ自動合成機（Applied Biosystem Model３９４A）でオリゴリボヌクレオチドを合成した。各ＲＮＡ断片は１μmolスケールで合成した。合成終了後、合成したオリゴヌクレオチドが結合したＣＰＧ（Controlled Pore Glass）を濃アンモニア水：エタノール（３：１v／v）混液で室温２時間処理してオリゴリボヌクレオチドをＣＰＧ樹脂から切り出し、更に５５℃で１６時間加温した。なお、陽性の対照としてｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡ−４およびｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡ−６、陰性の対照として、下記の構造を有する、それぞれのｓｉＲＮＡ配列と異なるＧＣ含量５２％および４７％のスクランブル配列であるＳｃｒ．Ｃｏｎｔ．Ｃ８およびＳｃｒ．Ｃｏｎｔ．Ｃ９を合成した。
Ｓｃｒ．Ｃｏｎｔ．Ｃ８ : 5'- ACTCTATCTGCACGCTGAC -3'(配列番号１０）
Ｓｃｒ．Ｃｏｎｔ．Ｃ９ : 5'- ATTGTATGCGATCGCAGAC -3'(配列番号１１）【００３６】
溶媒を留去し、残渣に１mlの１Ｍ  ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）／ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液を加え、３７℃で１６時間攪拌した。これに５mlの０.１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ  ７.０）を加えた後、Ｃ１８（ウォーターズ社製）オープンカラムクロマトグラフィーで分離した（カラムサイズ１.５×１２cm：５-４０％アセトニトリル、５０mMトリエチルアンモニウムビカルボネート水溶液の溶媒を用いた濃度勾配により溶出した）。約３０％濃度のアセトニトリルで溶出されるジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを集め、これに５mlの０.０１Ｎ塩酸を加え、１５分間攪拌し、ジメトキシトリチル基を除去した。０.１Ｎアンモニア水で中和し、水層を酢酸エチルで洗浄し、溶媒留去後、滅菌水１mlに溶解した。この画分中のオリゴリボヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで分離して分取後、さらにイオン交換ＨＰＬＣで分離・分取し、精製した。得られたオリゴヌクレオチドを後述の実験に供した。【００３７】
（逆相およびイオン交換ＨＰＬＣの条件）
逆相ＨＰＬＣ
カラム：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラム、Φ３.９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）
溶媒：Ａ溶液 ５％ アセトニトリル／０.１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）；
Ｂ溶液 ２５％ アセトニトリル／０.１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）。
イオン交換ＨＰＬＣ
カラム：TSKgel DEAE ２SWカラム、４.６×２５０mm、東ソー（株）製
溶媒：Ａ溶液 ２０％ アセトニトリル；
Ｂ溶液  ２０％ アセトニトリルを含む２Ｍ ギ酸アンモニウム。【００３８】
（培養細胞へのＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ導入方法）
リポフェクトアミン２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いるリポフェクション法により、２４穴プレート中で増殖させた対数増殖期の培養細胞に、ＯＰＮ  ｓｉＲＮＡを導入した。培養細胞として、内在性にＯＰＮが発現しているHT1080細胞、NRC-12細胞、G361細胞を用いた。なお、HT1080細胞は線維肉腫細胞、NRC-12細胞は腎癌細胞、G361細胞はメラノーマ細胞である。【００３９】
Opti-MEM I培地（invitrogen）５０μLにリポフェクトアミン２０００の２μLを加え、５分間放置した。別のチューブで、TIL培地５０μLにｓｉＲＮＡ  ０．８μｇを加えた。両チューブの内容物を混ぜ、２０分放置し、ｓｉＲＮＡ−リポフェクトアミン２０００複合体を調製した。細胞をTIL培地で洗浄後、TIL培地５００μLを加え、さらにｓｉＲＮＡ−リポフェクトアミン２０００複合体を加え、これを２４時間培養した。次いで、上清を回収し、ＥＬＩＳＡにて上清中におけるＯＰＮ発現量を定量した。【００４０】
（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果は、細胞から分泌されるＯＰＮの濃度をヒト・オステオポンチン測定ＥＬＩＳＡキット（免疫生物研究所）で測定し、ＯＰＮ分泌の抑制で調べた。【００４１】
（ＯＰＮ  ｓｉＲＮＡの治療効果）
上記ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＨＴ１０８０（Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＲＣ−１２細胞、Ｇ３６１細胞において、本発明のヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡの転移抑制能を調べた。使用したヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、以下の表１に示す通りである（3’末端のｄＴは省略した）。
【表１】
2009147742.tif 000002
【００４２】
図２に、本実施例で用いたｓｉＲＮＡの配列をより具体的に示した。【００４３】
なお、コントロールとして、それぞれのｓｉＲＮＡ配列と異なるＧＣ含量５２％のスクランブル配列であるＳｃｒ．Ｃｏｎｔ．Ｃ８、ＧＣ含量４７％のスクランブル配列であるＳｃｒ．Ｃｏｎｔ．Ｃ９、およびリポフェクトアミン２０００のみから成るＬｉｐｏ．Ｃｏｎｔ．を用いた。【００４４】
図３〜５に、この実験の結果を示す。本発明のヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ（ｈＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ−５，７，８，９，１０）は、ＨＴ１０８０（図３）、ＮＲＣ−１２（図４）、およびＧ３６１（図５）の全ての細胞株において、従来技術のヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ（ｈＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ−４，６）よりも顕著に高いＯＰＮのノックダウン効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
このように、本発明のヒトＯＰＮ  ｓｉＲＮＡは、従来技術のＯＰＮ  ｓｉＲＮＡよりも有意に高いＯＰＮの分泌抑制効果を示すことから、ヒト・オステオポンチンの亢進に起因する疾患の治療のための医薬として有利に使用され得る。
【図１】
2009147742.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009147742.tif 000008
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