(57)【要約】  本発明の目的は、核酸分析方法において、一度に解析できる核酸の種類が千種類以上という網羅性と、ダイナミックレンジが４桁以上の定量性を有する、簡便な核酸分析方法を提供することにある。特に、解析対象の核酸が１万種以下である、非翻訳ＲＮＡやマイクロＲＮＡの解析に極めて有効な解析方法を提供するものである。  本発明は、解析対象の核酸断片群を一分子ずつ用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出することで、ＰＣＲ等の増幅反応を用いることなく、解析対象の核酸の種類と存在量を網羅性と定量性を兼ね備え、一分子の感度及び分解能で、簡便，迅速に核酸分析を行うことができる。
2013011611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象の核酸断片群を用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出し、前記蛍光体の個数を計数することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項２】
解析対象の核酸断片群を一分子ずつ用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項３】
解析対象の核酸分子群を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を、前記解析対象の核酸分子群とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記蛍光体の蛍光を測定する工程を含むことを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項４】
解析対象の核酸分子群を、一分子ずつ、支持基体上の異なる位置に固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記支持基体上の核酸断片群とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記蛍光体の蛍光を測定する工程を含むことを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項５】
解析対象の核酸断片群を、微粒子上に、微粒子一つあたり前記核酸断片を一分子ずつ固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を、前記微粒子上の核酸断片とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記微粒子を支持基体上に固定する工程と、前記蛍光体の蛍光を測定する工程を含むことを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項６】
請求項１において、解析対象の核酸断片群は、個々の核酸試料ごとに壁で隔離されてはいない状態で、すべての核酸断片群が、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を含む同一の溶液と反応することで、ハイブリダイゼーションさせることを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項７】
請求項１において、前記蛍光体標識が、解析対象の核酸の種類ごとに、配合割合が異なった複数種類の蛍光体を含む微粒子であることを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項８】
請求項７において、特定の核酸種以外の核酸種に対しては同一の蛍光体標識を用い、前記核酸分子ごとに蛍光輝点数を計数した上で、総輝点数に対する特定の核酸種ごとの輝点数の比を算出することで、前記特定の核酸種ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項９】
請求項７において、解析対象の核酸断片群に対して共通の蛍光体標識を施し、前記蛍光体とは異なる蛍光体で標識された既知の塩基配列を有する核酸分子をハイブリダイゼーションする工程を含み、前者と後者の蛍光体の輝点数の比を算出することで、前記解析対象の核酸断片の種類ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項１０】
解析対象の核酸断片群を一分子ずつ固定した微粒子を用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした前記核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項１１】
請求項１０において、解析対象の核酸断片群を一分子ずつ固定した前記微粒子が磁気微粒子であり、前記蛍光体標識が、解析対象の核酸の種類ごとに、配合割合が異なった複数種類の蛍光体を含む微粒子であり、ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイゼーションしなかった前記蛍光体標識された核酸分子と前記磁気微粒子を分離した後、前記磁気微粒子上の核酸分子とハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項１２】
請求項１０において、特定の核酸種以外の核酸種に対しては同一の蛍光体標識を用い、前記核酸分子ごとに蛍光輝点数を計数した上で、総輝点数に対する特定の核酸種ごとの輝点数の割合を算出することで、前記特定の核酸種ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項１３】
請求項１０において、解析対象の核酸分子群に対して同一の蛍光体標識を施し、前記蛍光体とは異なる蛍光体で標識された既知の塩基配列を有する核酸分子をハイブリダイゼーションする工程を含み、前者と後者の蛍光輝点数の比を算出することで、前記解析対象の核酸の種類ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項１４】
解析対象の核酸分子群を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する手段と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を、前記解析対象の核酸分子群とハイブリダイゼーションする手段と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記蛍光体の蛍光を測定する手段を具備することを特徴とする核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析方法及び核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸解析方法として、試料中に含まれる核酸の種類と量を簡便に解析する方法が開発されている。例えば、非特許文献１に記載されているように、ＤＮＡマイクロアレイでは、既知の遺伝子の配列を識別し得る配列を有する合成ＤＮＡを多種類、支持基体上の所定の箇所に固定しておき、蛍光体標識を施した、核酸試料あるいは核酸試料の逆転写物や増幅産物を前記支持基体上にハイブリダイゼーションした後、蛍光スキャナーにより蛍光画像を取得し、どの遺伝子が、どれだけの量発現しているかを蛍光強度から解析することができる。また、非特許文献２に記載されているように、核酸の増幅反応であるＰＣＲを用い、増幅曲線を求め、一定量の増幅産物が得るのに必要な反応回数を試料間で比較する、定量ＰＣＲ法も核酸解析方法として用いられている。さらに、非特許文献３に記載されているように、微粒子を含んだエマルジョン中でＰＣＲ反応を行い、増幅産物をつけた微粒子を支持基体上に多数固定した上で、ＤＮＡの伸長反応を行い、蛍光体標識したヌクレオチドを取り込ませ、蛍光観察することで並列性高く塩基配列解析を行う、所謂、次世代シーケンス法も実用化されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Science 1995, Vol. 270, pp 467-470.
【非特許文献２】Nucleic Acid Research, 1992, Vol. 20, pp 4939.
【非特許文献３】Genome Research 2008, Vol. 18, pp 1051-1063.
【非特許文献４】Nature Methods, 2009, Vol. 6, pp 474-476.
【非特許文献５】Nature Methods 2010, Vol. 7, pp 687-692.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
疾患関連遺伝子を探索する方法として、健常者と特定の疾患患者の核酸試料を比較して疾患患者において有意に発現量が高いあるいは低い遺伝子を探し出す方法が常套手段として用いられている。そのような方法として、まず、マイクロアレイで、発現量の異なる候補遺伝子を選定し、次に、それら候補遺伝子に関して定量ＰＣＲを用いて発現量の差を厳密に確認する方法が一般的である。それは、マイクロアレイは一度に解析できる遺伝子数が数万以上と探索する遺伝子の網羅性が高いが、ダイナミックレンジが２〜３.５桁程度と定量性が低いという特徴を持ち、一方、定量ＰＣＲ法は、ダイナミックレンジが６〜７桁と定量性が高いが、一度に解析できる遺伝子数が４００程度と網羅性が低いという特徴を有することから、お互いの良い点を組み合わせた結果によるものである。したがって、試料間の発現比較解析を行うためには、マイクロアレイと定量ＰＣＲの２段階の実験をせねばならないという問題点があった。一方、次世代シーケンサでは、一度に解析できる核酸断片数は数億から数十億本であり、同一配列の核酸断片数をカウントすることで発現量を決めることができることからダイナミックレンジは８桁以上あることになる。２万種以上が存在するメッセンジャーＲＮＡの網羅的な発現解析には適しているが、非翻訳ＲＮＡや数十塩基以下のマイクロＲＮＡなど存在する種類の数が２千種以下の核酸の発現量を解析するにはオーバースペックとなり、一回の解析に掛かる試薬等のランニングコストや数十時間かかる解析時間の長さが問題となる。【０００５】
また、非特許文献４に指摘されているように、定量ＰＣＲや次世代シーケンサで発現解析を行う場合には、核酸試料に対してＰＣＲによる増幅をかけることになるが、増幅効率はＧＣ含有量など塩基配列に依存するため、試料のすべての核酸が同じ増幅効率で増幅されず、核酸のポピュレーションにバイアスがかかり、個々の核酸分子の存在量の分布が正しく解析されないという問題がある。【０００６】
本発明の目的は、核酸分析方法において、ＰＣＲ等の増幅反応を用いずに、一度に解析できる核酸の種類が千種類以上という網羅性と、ダイナミックレンジが４桁以上の定量性を有する、簡便な核酸分析方法を提供することにある。特に、解析対象の核酸が１万種以下である、非翻訳ＲＮＡやマイクロＲＮＡの解析に極めて有効な解析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料の核酸分子を空間的に分離された位置に、一分子ずつ固定した上で、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記試料の核酸分子群とハイブリダイゼーションを行い、蛍光画像を取得することで、一分子の感度及び分解能で核酸分子の種類と発現量を解析する方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＰＣＲ等の増幅反応を用いることなく、解析対象の核酸の種類と存在量を網羅性と定量性を兼ね備え、一分子の感度及び分解能で、簡便，迅速に核酸分析を行うことができる。【０００９】
また、本発明の方法は、核酸試料のみならず、タンパク質などの核酸試料以外の生体分子の解析にも、捕捉分子として抗体などを用いることで、適用できる。複数の生体分子種から構成される生体分子試料に対しては、解析対象の生体分子を支持基体上の規則性を有する位置に、各固定箇所一箇所に前記生体分子を一分子ずつ固定し、特定の生体分子に吸着することが既知である検出用の生体分子を前記支持基体上に固定した生体分子試料と反応させ、前記検出用の生体分子を検出することで、核酸試料の場合と同様に分析することができる。したがって、解析対象の生体分子の種類と存在量を網羅性と定量性を兼ね備え、一分子の感度及び分解能で、簡便，迅速に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施例の解析方法の一例を説明するための図。
【図２】本実施例の解析方法に用いるデバイスの構成の一例を説明するための図。
【図３】本実施例の解析方法に用いるデバイスの製造方法の一例を説明するための図。
【図４】本実施例の一分子固定微粒子の作製方法の一例を説明するための図。
【図５】本実施例の解析方法の一例を説明するための図。
【図６】本実施例の解析方法の一例を説明するための図。
【図７】本実施例の核酸分析装置の一例を説明するための図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
実施例では、解析対象の核酸断片群を用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出し、前記蛍光体の個数を計数することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１２】
また、実施例では、解析対象の核酸断片群を一分子ずつ用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１３】
また、実施例では、解析対象の核酸分子群を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を、前記解析対象の核酸分子群とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記蛍光体の蛍光を測定する工程を含むことを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１４】
また、実施例では、解析対象の核酸分子群を、一分子ずつ、支持基体上の異なる位置に固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記支持基体上の核酸断片群とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記蛍光体の蛍光を測定する工程を含むことを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１５】
また、実施例では、解析対象の核酸断片群を、微粒子上に、微粒子一つあたり前記核酸断片を一分子ずつ固定する工程と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を、前記微粒子上の核酸断片とハイブリダイゼーションする工程と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記微粒子を支持基体上に固定する工程と、前記蛍光体の蛍光を測定する工程を含むことを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１６】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、解析対象の核酸断片群は、個々の核酸試料ごとに隔離された微小容器内にはなく、すべての核酸断片群が、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を含む同一の溶液と反応することで、ハイブリダイゼーションさせることを特徴とする、核酸分析方法。
【００１７】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、前記蛍光体標識が、解析対象の核酸の種類ごとに、配合割合が異なった複数種類の蛍光体を含む微粒子であることを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１８】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、特定の核酸種以外の核酸種に対しては同一の蛍光体標識を用い、前記核酸分子ごとに蛍光輝点数を計数した上で、総輝点数に対する特定の核酸種ごとの輝点数の比を算出することで、前記特定の核酸種ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００１９】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、解析対象の核酸断片群に対して共通の蛍光体標識を施し、前記蛍光体とは異なる蛍光体で標識された既知の塩基配列を有する核酸分子をハイブリダイゼーションする工程を含み、前者と後者の蛍光体の輝点数の比を算出することで、前記解析対象の核酸断片の種類ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００２０】
また、実施例では、解析対象の核酸断片群を一分子ずつ固定した微粒子を用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした前記核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００２１】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、解析対象の核酸断片群を一分子ずつ固定した前記微粒子が磁気微粒子であり、前記蛍光体標識が、解析対象の核酸の種類ごとに、配合割合が異なった複数種類の蛍光体を含む微粒子であり、ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイゼーションしなかった前記蛍光体標識された核酸分子と前記磁気微粒子を分離した後、前記磁気微粒子上の核酸分子とハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００２２】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、特定の核酸種以外の核酸種に対しては同一の蛍光体標識を用い、前記核酸分子ごとに蛍光輝点数を計数した上で、総輝点数に対する特定の核酸種ごとの輝点数の割合を算出することで、前記特定の核酸種ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００２３】
また、実施例では、前記核酸分析方法において、解析対象の核酸分子群に対して同一の蛍光体標識を施し、前記蛍光体とは異なる蛍光体で標識された既知の塩基配列を有する核酸分子をハイブリダイゼーションする工程を含み、前者と後者の蛍光輝点数の比を算出することで、前記解析対象の核酸の種類ごとの存在量を評価することを特徴とする、核酸分析方法を開示する。
【００２４】
また、実施例では、解析対象の核酸分子群を、一分子ずつ、空間的に分離された位置に固定する手段と、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を、前記解析対象の核酸分子群とハイブリダイゼーションする手段と、前記ハイブリダイゼーションの工程後に、前記蛍光体の蛍光を測定する手段を具備することを特徴とする核酸分析装置を開示する。
【００２５】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
本実施例のデバイスの構成及び解析方法を、図１を用いて説明する。【００２７】
本実施例のデバイス構成は以下の通りである。支持基体１０１の上に接着パッド１０２が形成してある。支持基体１０１としては、石英等のガラス基板やシリコンウエハなどを用いることができる。接着パッド１０２としては、支持基体１０１と異なる材質であればよく、金属あるいは金属の酸化物を用いることができる。接着パッドの作製方法は実施例３で詳細を述べる。接着パッド１０２は支持基体１０１上に規則性を持って形成されていることが好ましいが、詳細は実施例３で述べる。接着パッド１０２の上には微粒子１０３が固定されている。接着パッド１つ当たり固定される微粒子数は１個である。微粒子１０３には、捕捉分子１０４が結合分子１０５を介して一分子のみ固定されている。解析対象の核酸断片１０６の種類に依存して、捕捉用タグ分子１０７，捕捉分子１０４，結合分子１０５にはいろいろな組合せの分子群を用いることができる。例えば、解析対象の核酸断片１０６がＲＮＡの逆転写物である場合には、捕捉用タグ分子１０７は逆転写反応時のプライマＤＮＡを用いることができ、捕捉分子１０４として捕捉用タグ分子１０７の相補配列を有する核酸分子を用いることができる。あるいは、捕捉用タグ分子１０７として末端にビオチンを有する核酸分子とし、捕捉分子１０４として末端にアビジンを有する分子を用いることもできる。結合分子１０５には炭素数１０程度以下のアルカン分子を用いることができ、化学結合を介して捕捉分子１０４に結合し、反対側の末端にはビオチンがついているものを用いることができる。その場合、微粒子１０３の表面にはアビジン，ストレプトアビジンなどが修飾されていることが望ましい。捕捉用タグ分子１０７と捕捉分子１０４の反応は、両者が相補配列を有する核酸分子の場合には、ハイブリダイゼーションが好ましい。また、ライゲーションにより両者を化学結合で結びつける方法を用いることも好ましい。結果として、支持基体１０１上には、規則的な配置で、解析対象の核酸断片１０６が一分子ずつ孤立した状態で固定されることになる。【００２８】
次に、固定した解析対象の核酸断片１０６の種類の同定と存在数を求める。蛍光体標識付核酸分子１０８を解析対象の核酸断片１０６を固定した基板に反応させる。解析対象の核酸断片１０６と相補な核酸配列を蛍光体標識付核酸分子１０８は含むことになる。蛍光体標識には、Ｃｙ３やＣｙ５などの通常の蛍光色素分子やＺｎ−Ｓｅなどからなる半導体微粒子を用いることができる。識別すべき解析対象の核酸断片１０６の数が多い場合には、蛍光体標識として、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。例えば、２種類の蛍光体の含有量を各々１０種のレベルとし、２種類の蛍光体の含有量のレベルを変えて混合することで、１００種類の蛍光ビーズを作製することができ、蛍光体の数を３種類とすれば、１０００種類の識別が可能なビーズセットを容易に作ることができる。例えば、ルミネックス社から２波長のレーザ光で励起することで１００種類の識別ができる蛍光ビーズセットが市販されている。これらの蛍光ビーズの表面を化学修飾し、核酸分子と結合させることで蛍光体標識付核酸分子１０８を作製することができる。ハイブリダイゼーション後、適切な非特異吸着物の洗浄後、蛍光検出を行うことで、解析対象の核酸断片１０６の分析を行う。蛍光体標識にＣｙ３やＣｙ５などの通常の蛍光色素分子を一分子だけ付けた蛍光体標識付核酸分子１０８の場合には、基板上の解析対象の核酸断片１０６を固定した箇所から、一分子蛍光が観察されることになる。この場合、蛍光が微弱であるため、ＥＭ−ＣＣＤなど高感度の蛍光検出機が必要となる。蛍光体として蛍光ビーズを用いた場合には、一分子蛍光よりも強い蛍光が発せられるため、通常のＣＣＤでも十分検出できる。接着パッド１０２は支持基体１０１上に規則性高く、例えば格子状に形成されるため、蛍光画像においても、規則性を持った位置に蛍光の輝点が観測される。そのため、非特異的に蛍光体標識付核酸分子１０８が支持基体１０１上に付着しても、蛍光画像の輝点位置から容易に識別・除去することができる。この点は、微量な試料の解析，微弱な蛍光観察において、実際上、非常に有用な特徴である。蛍光体あるいは蛍光ビーズの識別には、回折格子を用いて発光スペクトルを分光してＣＣＤの感光面に照射し、波長方向に分けた各画素の強度を調べることで、蛍光体あるいは蛍光ビーズの種類を識別できる。あるいは、反射特性に大きな波長依存性を持たせたダイクロイックミラーを用いて、反射光と透過光の比率を用いて、蛍光体あるいは蛍光ビーズの種類を識別することもできる。個々の輝点の識別を行った後、それらを集計することで、解析対象の核酸断片１０６の種類と輝点数、すなわち、存在量の情報を最終的に得ることができる。例えば、接着パッド１０２を１μｍピッチで作製した場合、１mm各の中に１０6個の接着パッドが存在するので、最大総分子数１０6の中で所定の種類の解析対象の核酸断片が何分子存在するかを調べることができる。【００２９】
以下、具体的な解析対象としてマイクロＲＮＡを例に取り、詳細を説明する。【００３０】
解析対象がマイクロＲＮＡの場合には、既知のマイクロＲＮＡの塩基配列データベース（例えばhttp://www.microrna.org/）から、個々のマイクロＲＮＡ分子の配列データを取得できる。これを基に、逆転写用のプライマを設計できる。プライマの塩基長は１０〜１５塩基程度が好ましく、５′端に捕捉用タグ分子１０７として１０塩基のＤＮＡを持たせる。例えば、ヒトマイクロＲＮＡを対象とし、１０００種類のプライマを設計・合成する。合成した１０００種類のプライマを等量ずつ混ぜたプライマのカクテルを作製し、トータルＲＮＡを対象に、逆転写用プライマのカクテル、逆転写酵素を混合後、３７−４０℃の環境下で逆転写反応を起こし、ｃＤＮＡを合成することで解析対象の核酸断片１０６と捕捉用タグ分子１０７を結合させたものを得る。あるいは、解析対象の核酸断片１０６としてＲＮＡ、捕捉用タグ分子１０７として１０塩基程度のＲＮＡを用い、両者をＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて結合させることで解析対象の核酸断片１０６に捕捉用タグ分子１０７を結合させることもできる。基板には、予め、捕捉用タグ分子１０７の１０塩基の核酸に対する相補鎖ＤＮＡを捕捉分子１０４として一分子固定しておく。微粒子１０３に対する捕捉分子１０４の一分子固定に関しては、実施例４に詳細を記載した。ｃＤＮＡ（解析対象の核酸断片１０６と捕捉用タグ分子１０７を結合させたもの）を基板上で常套手段によりハイブリダイゼーションを行うことで、解析対象の核酸断片１０６を基板上に固定する。【００３１】
前記と同様に、既知のマイクロＲＮＡの塩基配列データベースから、個々のマイクロＲＮＡ分子の配列データを取得し、この配列と同じ塩基配列で、５′端にビオチンを修飾した合成オリゴを１０００種類合成する。【００３２】
蛍光ビーズに使う蛍光体として、例えば、Ｃｙ５，Ｃｙ５.５，Ｃｙ３を用いることができ、励起光には５３２ｎｍ，６３３ｎｍの２種類で対応できる。各色素の濃度比が異なる溶液を作製し、スチレンモノマーからポリスチレンビーズを合成する段階で混合することで、所定の色素混合比のポリスチレンビーズを作製できる。ポリスチレン表面にアビジン等の修飾を施すには、アクリル酸／メタクリル酸とスチレンの共重合反応を用いることでビーズ表面にカルボキシル基を導入しておき、アビジンのアミノ基とカルボジイミドを架橋剤として反応させることで容易に修飾できる。【００３３】
アビジン修飾した蛍光ビーズと５′端にビオチンを修飾した合成オリゴを反応させることで、蛍光体標識付核酸分子１０８を合成することができる。【００３４】
次に、解析対象の核酸断片１０６を固定した基板に、蛍光体標識付核酸分子１０８を通常の方法を用いてハイブリダイゼーションさせる。【００３５】
ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄液で洗浄後、蛍光画像を取得し、各接着パッドの蛍光輝点がどの種類の蛍光ビーズに相当するかを識別した上で輝点を計数することで、各種マイクロＲＮＡの存在量を解析することができる。【００３６】
検出できる核酸種の数は、識別し得る蛍光ビーズの数に依存する。マイクロＲＮＡの種類として凡そ１０００種類が存在すると、１０００種類の蛍光ビーズを作製すればよく、前述のように、蛍光体の含有量を各々１０種のレベルとし、３種類の蛍光体の含有量のレベルを変えて混合することで、１０００種類の識別が可能なビーズセットを容易に作ることができ、全マイクロＲＮＡ種のすべてを一度に検出することができる。また、特定のマイクロＲＮＡだけの発現量を調べたい時には、特定のマイクロＲＮＡ種に対応した蛍光体標識付核酸分子１０８を作製し、蛍光ビーズもその数だけ用意する。特定のマイクロＲＮＡ種以外のマイクロＲＮＡ種に対しては、それら以外で同一の蛍光ビーズを用いることで、蛍光ビーズの種類として１０００種類を用意しなくとも、全マイクロＲＮＡの存在量を輝点の計数値として知ることができ、また、特定のマイクロＲＮＡの全マイクロＲＮＡに対する存在比を求めることができる。【００３７】
あるいは、捕捉用タグ分子１０７に、蛍光体標識付核酸分子１０８とは異なる発光波長あるいは発光強度を有する蛍光色素標識を予め施しておき、捕捉用タグ分子１０７に標識した蛍光色素による蛍光輝点数を全核酸試料分子数に相当するもの、各種の蛍光体標識付核酸分子１０８に標識した蛍光体の蛍光輝点数を各種の核酸試料分子数に相当するものと判断し、両者の輝点数の比を各種の核酸試料分子の存在比率と判断することも、特定の核酸分子だけの発現量を調べたい時には、極めて、有効である。【００３８】
さらに、本発明の方法は、核酸試料のみならず、タンパク質などの核酸試料以外の生体分子の解析にも、捕捉分子１０４を最適化することで、適用できる。複数の生体分子種から構成される生体分子試料に対しては、解析対象の生体分子を支持基体上の規則性を有する位置に、適切な抗体などを捕捉分子１０４に用いることで各固定箇所一箇所に前記生体分子を一分子ずつ固定し、特定の生体分子に吸着することが既知である検出用の生体分子を前記支持基体上に固定した生体分子試料と反応させ、前記検出用の生体分子を検出することで、核酸試料の場合と同様に分析することができる。したがって、解析対象の生体分子の種類と存在量を網羅性と定量性を兼ね備え、一分子の感度及び分解能で、簡便，迅速に分析することができる。【００３９】
上記実施例では、解析対象のＤＮＡ試料を一分子ずつ基板上に固定した例を示したが、一分子ずつ固定したほうが、計数する上で容易ではあるが、一分子ずつ固定することは必須の条件ではなく、二個あるいは三個ずつ固定されても、計数ができさえすれば、解析対象のＤＮＡ試料の種類と存在量を解析するという、本発明の目的が達成されることは言うまでもない。
【実施例２】
【００４０】
本実施例のデバイスの構成を、図２を用いて説明する。支持基体２０１の上に接着パッド２０２が規則正しく、例えば図２に示すように格子状に形成されている。接着パッド２０２と微粒子２０３は、線状分子２０５を介して化学結合あるいは化学的相互作用により結ばれている。線状分子２０５の末端の官能基２０６と、接着パッド２０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基２０６は、支持基体２０１との相互作用が弱く、接着パッド２０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、支持基体２０１としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド２０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基２０６には、支持基体２０１と接着パッド２０２との組合せを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子２０５は、微粒子２０３と接着パッド２０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子２０５の末端の官能基２０７は、微粒子２０３との接着性をもたらす。また、線状分子２０５として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基２０６を有する側鎖と官能基２０７を持つ側鎖を併せ持つものを用いることができる。微粒子２０３としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。官能基２０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基２０７としてビオチンを用いることができる。さらに、微粒子２０３として、ポリスチレンなどの高分子材料からなる微粒子を用いることもできる。高分子材料の場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十ｎｍから数μｍまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定する捕捉分子２０４の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、捕捉分子２０４を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。【００４１】
捕捉分子２０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基２０７と同様に予め修飾しておき、微粒子２０３と反応させておく。一つの微粒子２０３に固定する捕捉分子２０４は一分子であることが好ましく、接着パッド２０２の上には捕捉分子２０４が一分子だけ固定されることになる。【００４２】
簡便な蛍光検出でプローブを識別する場合回折限界を考慮するとプローブ間が１μｍ程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子２０３のサイズは１μｍ以下であることが適している。【００４３】
接着パッド２０２を支持基体２０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると１μｍ以上が好ましい。【００４４】
接着パッド２０２を支持基体２０１上に形成した後、微粒子２０３と接着パッド２０２を結ぶ線状分子２０５を供給し、接着パッド２０２上に線状分子２０５を固定する。この際、支持基体２０１上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子２０５を供給する前に、支持基体２０１との接着力の強い材料を支持基体２０１上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。次に、捕捉分子２０４を固定した微粒子２０３を基板上に供給して、微粒子２０３を接着パッド２０２上に固定させることにより、核酸分析用デバイスを完成する。【００４５】
接着パッド２０２上に微粒子２０３を固定させる際、一つの接着パッド２０２に複数個の微粒子２０３が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド２０２には、１個の微粒子２０３を固定させねばならない。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド２０２の直径ｄが微粒子２０３の直径Ｄに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド２０２に１個の微粒子２０３を固定できることを見出した。接着パッド２０２に比べて同等以上の大きさの微粒子２０３が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子２０３がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド２０２の直径ｄが微粒子２０３の直径Ｄに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が１個になることが判明した。したがって、微粒子２０３の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド２０２の直径ｄが微粒子２０３の直径Ｄに比べて小さいことが好ましく、微粒子２０３の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド２０２の直径ｄは必ずしも微粒子２０３の直径Ｄよりも小さくなくても良いことが明らかとなった。【００４６】
米国特許第６８５９５７０号公報において、光ファイバーをバンドル化した先端部の個々の光ファイバーに穴（微小容器）を設けて、解析対象の生体分子を捕獲するための抗体をつけた微粒子を個々の穴に入れて、穴ごとに光ファイバーで蛍光を検出する方法が開示されている。本発明では、微粒子を格子状に並べる場合でも、このような穴（微小容器）は必要ではなく、穴に微粒子を入れるとかえって洗浄工程に時間を要するなどの問題を発生してしまう。したがって、本発明では、本実施例に記載したように、接着パッドを用いて支持基体上に格子状に並べて固定する方法が好ましい。
【実施例３】
【００４７】
本実施例のデバイスの製造方法を、図３を用いて説明する。平滑な支持基体３０１上に電子線用ポジ型レジスト３０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ−５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径１５ｎｍのスルーホールを形成する。並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、スルーホールは１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ，歩留まりの高さ、及び並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると、適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（接着パッド）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着パッド３０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着パッド３０３に線状分子３０４を反応させる。接着パッド３０３が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子末端の官能基３０５としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の反対側の官能基３０６には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を接着パッドと反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着パッドを形成した以外の支持基体表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチドに対する吸着防止を実現するには負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子３０７でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液（ｐＨ５〜ｐＨ６程度）で処理することにより、エポキシ基を開環させＯＨ基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。【００４８】
微粒子３０８表面には、予めアビジン３０９を修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が１５〜２０ｎｍである製品名「Ｑｄｏｔ（Ｒ）ストレプトアビジン標識」（インビトロジェン社製）を利用することができる。また、微粒子として、ポリスチレンビーズを用いることもできる。例えば、直径が４０ｎｍである製品名「フルオスフィア  ニュートラビジン修飾」（インビトロジェン社製）を利用することができる。捕捉分子３１０としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子３０８上に固定できる。捕捉分子３１０を固定した微粒子３０８を接着パッド３０３上に固定することにより、本実施例の核酸分析用デバイスを製造することができる。
【実施例４】
【００４９】
本実施例では、捕捉分子を一分子だけ固定した微粒子の製造方法の一例を、特に、微粒子一個につき一分子の捕捉分子を固定する方法を図４を用いて説明する。微粒子４０１の表面に捕捉分子４０４を捕捉するための結合サイト４０２を結合させておく。例えば、結合サイトとしてストレプトアビジンを用いることができ、市販のストレプトアビジンコート微粒子（インビトロジェン社製）を微粒子として用いることができる。捕捉分子４０４には予め、結合サイト４０３を修飾しておく。結合サイト４０３には微粒子４０１表面の結合サイト４０２と容易に結合するものを選択する。例えば、結合サイト４０２として前記のストレプトアビジンを用いた場合には結合サイト４０３としてビオチンを用いる。結合サイト４０３を末端修飾したオリゴを合成することで容易に末端に結合サイト４０３をもつ捕捉分子４０４を合成できる。次に、微粒子４０１と捕捉分子４０４を反応させることで、捕捉分子４０４を微粒子４０１に結合させる。微粒子４０１一個につき一分子の捕捉分子４０４を固定するには、単位体積中の捕捉分子４０４の分子数を微粒子４０１の個数よりも小さくすることが好ましい。微粒子４０１よりも捕捉分子４０４が過剰にあると微粒子４０１一個当たりの捕捉分子数が一分子よりも多くなる可能性が高いからである。発明者らが検討した結果では、微粒子４０１の数を捕捉分子４０４の数よりも１０倍多くして反応させると、凡そ９０％の微粒子４０１には捕捉分子４０４は捕捉されず、約９％の微粒子４０１には捕捉分子４０４が一分子捕捉されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果と良く一致している。したがって、捕捉分子４０４を捕捉した微粒子４０１のみを捕集すれば、捕集した微粒子４０１のうち９０％以上は捕捉分子４０４を一分子のみ捕捉した微粒子４０１となる。捕集方法として、例えば、磁気微粒子４０７に捕捉分子４０４を結合させて磁石で捕集することができる。捕捉分子４０４の末端配列と相補な配列を持ち末端に結合サイト４０６が修飾されたオリゴヌクレオチド４０５を用意し、結合サイト４０６と結合する結合サイト４０８を予め、磁気微粒子４０７の表面にコートしておく。こうして作製した磁気微粒子４０７を用いることで捕捉分子４０４を一分子を捕捉した微粒子４０１を９０％以上と高い割合で分離，収集することができる。磁気微粒子４０７から微粒子４０１を単離するには、例えば、捕捉分子４０４とオリゴヌクレオチド４０５の二本鎖を分離するディネイチャー処理（高温処理）を用いることができる。単離した微粒子４０１は実施例２に記載した方法を用いることで、支持基体上の所定の配置に固定することができ、本実施例の捕捉分子４０４を一分子だけ固定した核酸分析用デバイスを製造することができる。【００５０】
さらに、捕捉分子を一分子だけ捕捉した微粒子の割合を高めるには、電気泳動法を用いることが有効である。すなわち、微粒子に捕捉された核酸の分子数により、微粒子上の電荷量が異なることを利用し、核酸を捕捉したままの状態で微粒子をゲル、例えばアガロース中を泳動させることで、電荷量すなわち捕捉された核酸分子数の違いにより泳動パターンを分離させる。核酸が捕捉されない微粒子は移動距離がもっとも短く、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子が次に移動距離の短いところにバンドを形成する。したがって、このバンドを切り出すことで、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子を純度高く、得ることができる。
【実施例５】
【００５１】
本実施例のデバイスの構成及び解析方法を、図５を用いて説明する。解析対象の核酸断片５０１に蛍光色素５０３が標識された捕捉用タグ分子５０２を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め解析対象の核酸断片５０１と捕捉用タグ分子５０２にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、解析対象の核酸断片５０１がマイクロＲＮＡの場合には、捕捉用タグ分子５０２を１０−２０塩基長程度のＲＮＡ分子とし、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いる方法が有効である。解析対象の核酸断片５０１に蛍光色素５０３が標識された捕捉用タグ分子５０２を結合させた後、蛍光体５０５で標識された核酸分子５０４とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子５０４は個々の解析対象の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識分子で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±３℃程度に抑えることが好ましい。また、標識分子同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、一番高い相同性を７０％以下、より好ましくは６０％以下に抑えることが好ましい。次に、実施例４に記載した方法を用いて、微粒子５０８に捕捉分子５０６を結合分子５０７を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、微粒子５０８上に、解析対象の核酸断片５０１と蛍光体５０５で標識された核酸分子５０４のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体５０５には、実施例１で述べたように、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。【００５２】
次に、このハイブリッドを形成した微粒子５０８を支持基体５１０に形成しておいた接着パッド５０９上に固定する。固定反応条件は実施例１に記載した条件を適用することができる。最後に、蛍光色素５０３と蛍光体５０５の蛍光を検出器５１１で測定し、蛍光色素５０３と、各蛍光体５０５の種類ごとの輝点数を算出する。蛍光色素５０３の輝点数は、解析対象の核酸断片５０１の総数に対応し、各蛍光体５０５の種類ごとの輝点数は各種類の解析対象の核酸断片数に相当する。したがって、両者の比を算出することで、解析対象の総核酸断片数に対する各核酸断片数の割合を算出することができる。この比を算出することは、試料間の発現比較解析をする場合に特に有用である。例えば、健常者と特定の疾患の患者間で発現量の異なるマーカー遺伝子を探索する場合、両試料間で発現量の等しい遺伝子を見つけ出して、その発現量で規格化することが必要になるが、両試料間で発現量の等しい遺伝子を見つけることは実際上非常に困難である。特に、定量ＰＣＲでは大きな問題であることが非特許文献５に指摘されている。これに対して、本実施例の方法では、全体に対する割合が個々の試料分子に対して簡便に算出されるため、健常者と患者の比較も直接、全試料分子数に対する割合で比較することができる。この点は、特に、臨床検体での核酸分子の比較解析には有用となる。
【実施例６】
【００５３】
本実施例の解析方法を、図６を用いて説明する。解析対象の核酸断片６０１に蛍光色素６０３が標識された捕捉用タグ分子６０２を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め解析対象の核酸断片６０１と捕捉用タグ分子６０２にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、解析対象の核酸断片６０１がマイクロＲＮＡの場合には、捕捉用タグ分子６０２を１０−２０塩基長程度のＲＮＡ分子とし、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いる方法が有効である。解析対象の核酸断片６０１に蛍光色素６０３が標識された捕捉用タグ分子６０２を結合させた後、蛍光体６０５で標識された核酸分子６０４とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子６０４は個々の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識分子で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±３℃程度に抑えることが好ましい。また、標識分子同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、一番高い相同性を７０％以下、より好ましくは６０％以下に抑えることが好ましい。次に、実施例４に記載した方法を用いて、微粒子６０８に捕捉分子６０６を結合分子６０７を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、微粒子６０８上に、解析対象の核酸断片６０１と蛍光体６０５で標識された核酸分子６０４のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体６０５には、実施例１で述べたように、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。【００５４】
次に、このハイブリッドを形成した微粒子６０８を流路６０９中に流し、励起光を照射することで、蛍光色素６０３の蛍光と蛍光体６０５の蛍光強度を検出器６１０で測定する。流路６０９の直径を、微粒子６０８の直径の２倍以下とすることで、同時に複数個の蛍光色素６０３の蛍光を測定することなく、一個一個の微粒子６０８を識別して蛍光を測定できるため好ましい。蛍光色素６０３の蛍光輝点数をカウントし、総核酸断片数に相当する値を得る。一方、蛍光色素６０３の蛍光と蛍光体６０５の蛍光が同時に測定された場合にのみ、特定の蛍光体の輝点をカウントし、各種類の核酸断片数に相当する値を得る。両者の比を算出することで、総試料分子数に対する各試料分子数の割合を算出することができる。本実施例の方法では、個々の遺伝子の発現量が全遺伝子の発現量に対する発現量の比で得られるため、異なる試料間、例えば健常者と患者試料の比較も直接、比較することができる。この点は、特に、臨床検体での核酸分子の比較解析には有用となる。さらに、微粒子６０８の散乱光を検出し、蛍光測定と組み合わせることで識別精度を向上させることもできる。【００５５】
流路６０９として円形流路を例として開示したが、流路６０９として薄い平面流路を用いることで、蛍光色素６０３の蛍光と蛍光体６０５の蛍光、さらに微粒子６０８の散乱光を２次元的に検出することを可能とし、検出スピード及び感度の向上を図ることもできる。【００５６】
微粒子６０８としてポリスチレンなどの高分子からなる微粒子を用いることも、また、高分子中に磁性金属粉体を含有したような磁気微粒子を用いることができる。特に、磁気微粒子を用いた場合には、反応後の微粒子６０８を流路６０９に流す前に、反応液中に残っている微粒子６０８に固定されていない未反応の、蛍光色素６０３が標識された捕捉用タグ分子６０２や、蛍光体６０５で標識された核酸分子６０４を、容易に取り除くことができ、蛍光色素６０３の蛍光と蛍光体６０５の蛍光が同時に測定された場合にのみ、特定の蛍光体の輝点をカウントする際に、測定が容易になるという大きなメリットがあり、好ましい。
【実施例７】
【００５７】
本実施例では、核酸分析用デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図７を参照しながら説明する。【００５８】
本実施例の核酸分析装置は、核酸分析用デバイス基板に対して、解析対象の核酸試料溶液，蛍光標識付分子溶液及び洗浄液を供給する手段と、核酸分析用デバイス基板においてハイブリダイゼーションを行うための温度調節手段と、核酸分析用デバイス基板に光を照射する手段と、蛍光標識付分子の蛍光体の蛍光を測定する発光検出手段、を備える。より具体的には、核酸分析用デバイス基板７０１を温調プレート７０３上に置き、流路７０４を設けた流路形成部材７０２をその上に貼り合せることで反応チャンバを形成する。流路形成部材７０２には、例えばＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用することができる。【００５９】
注入口には送液ユニット７０５が接続されており、送液ユニット７０５中に保管されている、解析対象の核酸試料溶液，蛍光標識付分子溶液及び洗浄液が順次、核酸分析用デバイス基板７０１へ供給される。解析対象の核酸試料溶液及び蛍光標識付分子溶液が核酸分析用デバイス基板７０１へ供給された後、流路７０４中で溶液は核酸分析用デバイス基板７０１上に保持され、温調プレート７０３で３０℃から８０℃の温度範囲で核酸分析用デバイス基板７０１上の反応液の温度がコントロールされてハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーション後、送液ユニット７０５から洗浄液が核酸分析用デバイス基板７０１に供給され、未反応物が洗浄される。【００６０】
洗浄後、蛍光検出が行われる。励起光源は、用いる蛍光体の種類によって適切なものを選択できる。例えば、蛍光ビーズに使う蛍光体として、Ｃｙ５，Ｃｙ５.５，Ｃｙ３を用いる場合には、励起光には５３２ｎｍ（ＹＡＧレーザ），６３３ｎｍ（Ｈｅ−Ｎｅレーザ）の２種類で対応できる。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０７およびＨｅ−Ｎｅレーザ光源（波長６３３ｎｍ，出力２０ｍＷ）７１３から発振するレーザ光をダイクロイックミラー７１４によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、ダイクロイックミラー７０９によって対物レンズ７０６に導き、核酸分析用デバイス基板７０１上に照射される。蛍光標識付分子から発せられる蛍光は、励起光と同軸光路を逆に進み、対物レンズ７０６で集められた後ダイクロイックミラー７０９を通過し、結像レンズ７１１により２次元ＣＣＤカメラ７１２の感光面上に結像される。励起光の散乱光は光学フィルタ７１０によって除去される。【００６１】
上記のように、送液ユニット，温調プレート，励起光源及び蛍光検出ユニットで核酸分析装置を組上げることにより、自動でハイブルダイゼーションによる核酸分析を行うことが可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【符号の説明】
【００６２】
１０１，２０１，５１０  支持基体
１０２，２０２，３０３，５０９  接着パッド
１０３，２０３，３０８，４０１，５０８，６０８  微粒子
１０４，２０４，３１０，４０４，５０６，６０６  捕捉分子
１０５，５０７，６０７  結合分子
１０６，５０１，６０１  解析対象の核酸断片
１０７，５０２，６０２  捕捉用タグ分子
１０８  蛍光体標識付核酸分子
２０５，３０４  線状分子
２０６，２０７  官能基
３０１  平滑な支持基体
３０２  電子線用ポジ型レジスト
３０５，３０６  線状分子末端の官能基
３０７  非特異吸着防止用分子
３０９  アビジン
４０２，４０３，４０６，４０８  結合サイト
４０５  オリゴヌクレオチド
４０７  磁気微粒子
５０３，６０３  蛍光色素
５０４，６０４  核酸分子
５０５，６０５  蛍光体
５１１，６１０  検出器
６０９，７０４  流路
７０１  核酸分析用デバイス基板
７０２  流路形成部材
７０３  温調プレート
７０５  送液ユニット
７０６  対物レンズ
７０７  ＹＡＧレーザ光源
７０８  レンズ
７０９，７１４  ダイクロイックミラー
７１０  光学フィルタ
７１１  結像レンズ
７１２  ２次元ＣＣＤカメラ
７１３  Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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