(57)【要約】本発明は、濃度の低いウイルス液中のウイルスやウイルスベクターを、より簡便に濃縮することを可能にする新規な方法および当該方法を行うためのキットを提供する。濃度の低いウイルス液から効率よくウイルスを濃縮することは、従来、煩雑な操作や、高価な機器、あるいは熟練した技術が必要であった。本発明の方法は、ウイルスベクターの感染能を維持しつつ濃縮することを容易にするものであるので、ウイルスベクターを用いる遺伝子治療やワクチン治療などの分野において安全で簡便なベクター濃縮技術としても適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液にレクチンを接触させ、ウイルスとレクチンを結合させる、ここで、（ｉ）当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、レクチンに結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイルスは担体に結合し；
（２）担体をウイルス含有液から分離し；
（３）回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液から担体を分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合した担体を添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスを担体に結合させ；
（２）担体をウイルス含有液から分離し；
（３）回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液から担体を分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法。
【請求項３】
ウイルスが、エンベロープを有するウイルスまたは当該ウイルス由来のウイルスである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスが、レンチウイルスまたはヘルペスウイルスである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
レクチンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖に結合するレクチンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
レクチンが、ＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
レクチンがＷＧＡ（コムギ胚芽由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がキトオリゴ糖である；または、レクチンがＳＢＡ（ダイズ由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖である；請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスがレンチウイルスであり、レクチンがＷＧＡ（コムギ胚芽由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がキトオリゴ糖である；または、ウイルスがレンチウイルスであり、レクチンがＳＢＡ（ダイズ由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖である；請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液に、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍのナノビーズに直接結合しているレクチンを接触させ、ウイルスをナノビーズに結合させ、；
（２）ナノビーズをウイルス含有液から分離し；
（３）回収したナノビーズを糖を含む溶出液で処理して、該ナノビーズからウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液からナノビーズを分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法によりウイルスを濃縮するためのキットであって、ビオチン化レクチン、ビオチン結合タンパク質ビーズ、および担体からウイルスを溶出するための糖、を含む、前記キット。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法によりウイルスを濃縮するためのキットであって、以下：
（ａ）ビオチン化ＷＧＡ、ビオチン結合タンパク質、およびキトオリゴ糖；または
（ｂ）ビオチン化ＳＢＡ、ビオチン結合タンパク質、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖；
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスやウイルスベクターについて、その感染能を維持しつつ濃縮する新規な方法および当該方法を行うためのキットに関する。本発明は、レトロウイルスベクターやヘルペスウイルスベクターなどの遺伝子治療やワクチンなどに有用なベクターの安全で簡便な濃縮技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、遺伝子治療やワクチン治療を目的に、さまざまなウイルスベクターが開発され、その成果が期待されている。しかし、ウイルスベクター濃度が低いと、十分に望んだ効果が得られないため、濃度を調整する必要がある。遺伝子治療分野では、細胞への遺伝子導入効率が治療の成否を左右するため、遺伝子導入効率の高いウイルスベクターが使われる。しかし、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターなどでは力価の高いウイルスが得られないため、充分な遺伝子導入効率が得られていない。このため様々なウイルス濃縮技術や、それらを利用した製品が開発されているが、実用的には未だ様々な問題点を含むのが現状である。
溶液中のウイルスの濃度を上げ、ウイルスを濃縮する方法としては、例えば、超遠心分離法が挙げられる。しかし、この方法は高価な機器と長い分離時間を要し、作業には多大な労力が必要となるものである。また、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコールによりウイルスを沈殿させて濃縮する方法もあるが、これらの方法は、使用する試薬や沈殿する他の成分が感染細胞に有害になるなど、その後の手順を阻害する恐れがある。そのため、ウイルス沈殿後に試料の精製を行なわねばならず、多大な労力が必要となるという問題点がある。また、抗体を用いてウイルス粒子そのものを濃縮する方法も開発されている（特開２００２−７８４８５）。しかし、この方法では、ウイルス表面のタンパク質機能を阻害して、ウイルスの感染性に影響を与えるおそれがある。例えば、ウイルス粒子を抗体から分離する場合には、強い酸性条件（例えばｐＨ２〜３）を用いる必要があり、これがウイルス粒子に不具合を生じさせるおそれがあった。
この他のウイルス濃縮法として、例えばマンノース結合型レクチンが結合した磁性粒子を用いる方法が開示されている（特開２００２−１６５５９１）。
さらには、レトロウイルスの力価を高め、あるいは、検体サンプルからレトロウイルスを単離する方法として、ストレプトアビジンとビオチン化レクチンを利用した方法も開示されている（ＷＯ２００１／０７９４５６）。しかし、上記いずれの文献中でも、ウイルスは担体と結合したまま用いられており、ウイルス自体を単離できていない。従って、これらの方法で濃縮したウイルスの用途は、限定されたものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−０７８４８５号公報
【特許文献２】特開２００２−１６５５９１号公報
【特許文献３】国際出願公開第ＷＯ２００１／０７９４５６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
体液中のウイルスを定量する場合、濃度が低く、既存方法の検出限界以下である場合、定量できないことがある。また、ウイルスベクターを遺伝子治療やワクチン治療等に利用する場合に、ウイルスベクター濃度が薄いと望ましい効果が得られないため、濃度を調整することが必要になる。
本発明は、溶液中のウイルスやウイルスベクターを簡潔な方法で濃縮することができる方法を提供することを目的とする。本発明の目的はまた、濃度の低いウイルス溶液から、ウイルスやウイルスベクターを、その感染能を維持しつつ、簡易に濃縮し、かつ単離された状態で取得する方法を提供することにもある。本発明は特に、レトロウイルスベクターやヘルペスウイルスベクターなどの遺伝子治療やワクチンなどに有用なウイルスベクターを安全に、かつ簡便に濃縮する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を行った結果、溶液中のウイルスやウイルスベクターを簡潔な方法で濃縮することができる技術を開発した。より具体的には、本発明者らは、所望のウイルス含有液にレクチンを結合させ、さらにウイルス−レクチン複合体を担体と結合させた後、ウイルスを結合した当該担体を分離・回収し、糖を加えることで、対象ウイルスのみを、感染能を失わせることなく、当該担体から適量の溶液中に溶出し、最初のウイルス含有液の濃度よりも高い濃度に調製することに成功した。
また、本発明者らは、ヒトヘルペスウイルスについては、レクチンとして、ＳＢＡ（ダイズ由来、結合する糖鎖：Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む糖鎖）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来、結合する糖鎖：α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）を含む糖鎖）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来、結合する糖鎖：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む糖鎖）、ＷＧＡ（コムギ胚芽由来、結合する糖鎖：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）またはシアル酸を含む糖鎖）を使用することにより、ウイルスベクターの回収率が顕著に高くなることを見出した。
また、レンチウイルスベクターについては、レクチンとしてＷＧＡ又はＳＢＡを使用することにより、ウイルスベクターの回収率が顕著に高くなることを見出した。
さらに、本発明者らは、上記の方法で回収したウイルスやウイルスベクターが結合した担体を、適切な糖で処理することにより、ウイルスベクター結合担体からウイルスベクターを溶出することに成功した。驚くべきことに、このようにして単離されたウイルスは、感染能を維持したままであった。また、本発明者らは、このようなウイルスやウイルスベクターを溶出するための糖として、レクチンがＷＧＡのときはキトオリゴ糖、レクチンがＳＢＡのときはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖、を使用することが好ましいことを見出した。
本発明は以上の知見に基づき、ウイルスやウイルスベクターについて、感染能を維持しつつ、簡易に濃縮することを可能にする新規な濃縮方法を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
態様１：  ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液にレクチンを接触させ、ウイルスとレクチンを結合させる、ここで、（ｉ）当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、レクチンに結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイルスは担体に結合し；
（２）担体をウイルス含有液から分離し；
（３）回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液から担体を分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法。
態様２：  ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合した担体を添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスを担体に結合させ；
（２）担体をウイルス含有液から分離し；
（３）回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液から担体を分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法。
態様３：  ウイルスが、エンベロープを有するウイルスまたは当該ウイルス由来のウイルスである、態様１または２に記載の方法。
態様４：  ウイルスが、レンチウイルスまたはヘルペスウイルスである、態様１または２に記載の方法。
態様５：  レクチンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖に結合するレクチンである、態様１または２に記載の方法。
態様６：  レクチンが、ＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択される、態様５に記載の方法。
態様７：  レクチンがＷＧＡ（コムギ胚芽由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がキトオリゴ糖である；または、レクチンがＳＢＡ（ダイズ由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖である；態様１または２に記載の方法。
態様８：  ウイルスがレンチウイルスであり、レクチンがＷＧＡ（コムギ胚芽由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がキトオリゴ糖である；または、ウイルスがレンチウイルスであり、レクチンがＳＢＡ（ダイズ由来）であり、ウイルスの溶出に用いる糖がＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖である；態様１または２に記載の方法。
態様９：  ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液に、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍのナノビーズに直接結合しているレクチンを接触させ、ウイルスをナノビーズに結合させ、；
（２）ナノビーズをウイルス含有液から分離し；
（３）回収したナノビーズを糖を含む溶出液で処理して、該ナノビーズからウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液からナノビーズを分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法。
態様１０：  態様２に記載の方法によりウイルスを濃縮するためのキットであって、ビオチン化レクチン、ビオチン結合タンパク質ビーズ、および担体からウイルスを溶出するための糖、を含む、前記キット。
態様１１：  態様２に記載の方法によりウイルスを濃縮するためのキットであって、以下：
（ａ）ビオチン化ＷＧＡ、ビオチン結合タンパク質、およびキトオリゴ糖；または
（ｂ）ビオチン化ＳＢＡ、ビオチン結合タンパク質、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはこれを含む糖；
を含む、前記キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、溶液中のウイルスやウイルスベクターについて、感染能を維持しつつ、簡易に濃縮することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、タマビジンビーズへのＨＨＶ−６の非特異的吸着について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６がインディケーター細胞であるＭＴ−４細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。左の写真はＨＨＶ−６ウイルス液（原液）をＭＴ−４細胞に作用させた場合を示す。右の写真は、レクチンの非存在下でＨＨＶ−６ウイルス液（原液）をタマビジンビーズと接触させ、タマビジンビーズに吸着したウイルスをＭＴ−４細胞に作用させた場合を示す。
図２は、ＡＢＡ、ＤＳＡ、Ｌｏｔｕｓ、ＭＡＭ、およびＰＨＡ−Ｅ４の各レクチンによるＨＨＶ−６の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６がインディケーター細胞であるＭＴ−４細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。
図３は、ＰＨＡ−Ｌ４、ＵＥＡ−Ｉ、ＳＢＡ、およびＳＳＡの各レクチンによるＨＨＶ−６の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６がインディケーター細胞であるＭＴ−４細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。
図４は、レクチンとタマビジンビーズによる唾液中のＨＨＶ−６の濃縮の度合いを示すグラフである。
図５は、レクチンとタマビジンビーズを用いて、唾液中のＨＨＶ−６の濃縮および糖による溶出を行った際のＨＨＶ−６の濃縮の度合いを示すグラフである。
図６は、レクチンとタマビジンビーズによるレンチウイルスベクターの濃縮について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えレンチウイルスベクターがインディケーター細胞である２９３細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。
図７は、レクチンとタマビジンビーズによるレンチウイルスベクターの濃縮の度合いを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
１．ウイルスを濃縮する方法
本発明は、ウイルスを濃縮する方法であって、以下の工程：
（１）ウイルス含有液にレクチンを接触させ、ウイルスとレクチンを結合させる、ここで、（ｉ）当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、レクチンに結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイルスは担体に結合し；
（２）担体をウイルス含有液から分離し；
（３）回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウイルスを溶出する、ここで当該溶出液は（１）のウイルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
（４）（３）の溶出液から担体を分離して、ウイルス濃縮液を得る；
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の方法の各構成について詳細に説明する。
ウイルス
本発明の方法において濃縮の対象となるウイルスは、エンベロープを有するウイルスまたは当該ウイルス由来のウイルスベクターである。好ましい態様において濃縮対象のウイルスは、ボックスウイルス、ボックスウイルス由来ベクター、トガウイルス、トガウイルス由来ベクター、コロナウイルス、コロナウイルス由来ベクター、フラビウイルス、フラビウイルス由来ベクター、レトロウイルス、レトロウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス、及びヘルペスウイルス由来ベクターからなる群より選択されてもよい。別の好ましい態様において濃縮対象のウイルスは、レンチウイルス、レンチウイルス由来ベクター、ヒトヘルペスウイルス６（ヒトヘルペスウイルス６のバリアントＡおよびＢ：以下合わせてＨＨＶ−６と表記する）、ＨＨＶ−６由来ベクター、ヒトヘルペスウイルス７（以下、ＨＨＶ−７と表記する）、ＨＨＶ−７由来ベクター、サイトメガロウイルス（別名ヒトヘルペスウイルス５）、ＨＨＶ−５由来ベクター、エプシュタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、またはＥＢＶ由来ベクターであってもよく、さらに好ましくはレンチウイルス、レンチウイルス由来ベクター、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−６由来ベクター、ＨＨＶ−７またはＨＨＶ−７由来ベクターであってもよい。
ウイルス含有液
本明細書において「ウイルス含有液」とは、本発明の方法において濃縮の対象となるウイルスを含有する材料である。したがってウイルス含有液は、例えば緩衝液中に濃縮の対象となるウイルスまたはウイルスベクターを含むものであってもよく、あるいは体液であってもよい。本明細書において、「ウイルス含有液」を単に試料と記載することもある。
濃縮の対象となるウイルスまたはウイルスベクターを含む液は、当業者に公知の手法により調製することができる。
本明細書において体液とは、非限定的に、唾液、血液、血清、精液、脳脊髄液、咽頭拭い液、母乳、腹水、汗、涙および尿からなる群より選択されても良い。体液は当業者に公知の方法で採取することができる。また、採取した体液については、ウイルス粒子の感染能に影響を及ぼさなければ、必要に応じた処理を行っても構わない。
レクチン
本明細書において、「レクチン」とは、糖鎖を認識して結合する糖結合性タンパク質をいう。レクチンが結合する糖鎖は、それぞれのレクチンについて特異性がある。
本発明の方法において用いるレクチンは、ウイルスに結合可能なものであれば特に限定されない。好ましいレクチンの例としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンであり、さらに好ましくは、ＳＢＡ（ダイズ由来レクチン。結合糖鎖：Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む糖鎖）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来レクチン。結合糖鎖：α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）を含む糖鎖）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来レクチン。結合糖鎖：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む糖鎖）、またはＷＧＡ（コムギ胚芽由来レクチン。結合糖鎖：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）またはシアル酸を含む糖鎖）等のレクチンが挙げられる。
特にヒトヘルペスウイルスまたはヒトヘルペスウイルス由来ベクターの濃縮のためには、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＤＳＡまたはＷＧＡをより好ましく用いることができる。レンチウイルスまたはレンチウイルス由来ベクターの濃縮のためには、ＳＢＡまたはＷＧＡをより好ましく用いることができる。
本発明の一態様においてレクチンは担体と直接結合させて使用してもよい。
別の態様において、レクチンは間接的に担体と結合させて使用してもよい。間接的な結合の例としては、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の結合を介したレクチンと担体の結合である。より具体的にはレクチンをビオチン化するとともに、担体の表面にビオチン結合性タンパク質を結合させ、ビオチンとビオチン結合性タンパク質を結合させることにより、レクチンと担体の間接的な結合が達成できる。
担体
本発明において、担体は、固体または不溶性材料（例えば、濾過、沈殿、磁性分離などにより反応混合物から分離することができる材料）である担体であれば特に限定されない。
固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン（登録商標）、ニトロセルロース、アガロース、高架橋球形アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素またはそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。
固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
本発明の一態様において、磁性ビーズは、約１０ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、磁性ビーズは約２５ｎｍ〜約１ｍｍ、約５０ｎｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有する。磁性ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
本発明の一態様において、セファロースなどの高架橋球形アガロースからなるビーズは、約２４μｍ〜約１６５μｍの範囲の直径を有しうる。好ましい態様では、高架橋球形アガロースビーズは約２４μｍ〜約４４μｍの範囲の直径を有する。高架橋球形アガロースビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
疎水性表面を有する固体担体の例には、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社またはＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社から市販されているものなどのポリスチレンラテックスビーズが挙げられる。
シリカ（ＳｉＯ２）−処理またはシリカ（ＳｉＯ２）ベースの固体担体の例には、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能な、超常磁性シリカビーズ等が挙げられる。あるいは、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から市販されているＭ−２８０等も使用されうる。
親水性表面を有する磁性ビーズの例としては、Ｂｉｏｍａｇ（登録商標）カルボキシルの名称でＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されているビーズまたはＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社のビーズ（ＭＣ０２Ｎ／２９２８）などが挙げられる。あるいは、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から市販されているＭ−２７０等が使用されうる。
レクチンと担体の直接的結合
本発明の一態様において、レクチンと担体は直接結合させて使用することができる。この場合、ウイルスとレクチン結合担体の会合可能性を向上させる観点から、担体はブラウン運動できる程度の大きさのナノビーズである。ナノビーズの好ましい球体直径の範囲は、１０ｎｍ〜１００ｎｍの球体直径、より好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの球体直径である。また、この場合、磁石で簡便に回収できる磁性体を含むことが好ましく、例えば、これに限定されるわけではないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＭＡＣＳ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（直径５０ｎｍ）などの磁性ナノビーズが挙げられる。
レクチンと担体の連結は、当業者に公知のタンパク質と担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、当該カルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、タンパク質と担体を連結することができる。または、例えば、担体表面のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性エステル化された担体とタンパク質とを一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和することにより、担体表面のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。
あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。
レクチンと担体の間接的結合
本発明の別の態様において、レクチンは間接的に担体と結合させて使用してもよい。例えば、レクチンをビオチン化するとともに、担体の表面にビオチン結合性タンパク質を結合させ、ビオチンとビオチン結合性タンパク質を結合させることにより、レクチンと担体の間接的な結合が達成できる。
この場合に担体として、ビーズを好ましく用いることができるが、ビーズの好ましい球体直径の範囲は、０．１μｍ〜１００μｍの球体直径、より好ましくは、０．５μｍ〜１０μｍの球体直径、さらに好ましくは、１μｍ〜５μｍの球体直径である。
本明細書において、「ビオチン」とは、Ｄ−［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸］の一般名称である。ビオチンは、ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、ビタミンＢ７と呼ばれることもあり、あるいは、ビタミンＨ、補酵素Ｒと呼ばれることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合する。
本明細書中において「ビオチン」とは、上記ビオチンの他、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｏｆｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４６６６−４６６８）や、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｉｒｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０８：３４３−３５７）、あるいはビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）やビオチンスルホキシド（ｂｉｏｔｉｎ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）等のビオチン類縁体も含む。
レクチンをビオチン化する際には、ビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ２−Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ２  Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ３−ＬＣ  Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
このようなビオチン化試薬を用いて、レクチンに、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。
例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、レクチンに添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）のようなカルボジイミドを用いて、レクチンのカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。
また、ビオチンを結合させたレクチンは、例えばＪ−Ｏｉｌ  Ｍｉｌｌｓ社からビオチン標識レクチンとして購入してもよい。あるいはまた、ビオチン標識キット（例えば、これらに限定するものではないが、Ｐｉｅｒｃｅ社製のＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎや、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２など）を用いて所望のレクチンにビオチンを結合させて作製してもよい。
あるいはまた、レクチンの遺伝子を、ビオチン化配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと融合し、この融合遺伝子を発現するベクターを構築、任意の宿主においてビオチン化配列との融合タンパク質として発現させることにより（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９６４０−９６４５）、ビオチン化レクチンを作製してもよい。このようなベクターとしてこれに限定されるわけではないが、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅ（商標）タグが含まれるベクターが挙げられる。このうち哺乳類細胞発現用には、ｐｃＤＮＡ（商標）６ベクターが、大腸菌発現用にはｐＥＴ１０４ベクターが、あるいはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現用にはｐＭＴ／ＢｉｏＥａｓｅベクターがある。
本発明において、ビオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（２００２），３６３：６０９−６１７）、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００５），２８０：１３２５０−１３２５５）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（２００７），４０５：３９７−４０５）、タマビジンやこれらの変異体等、ビオチンとビオチン／アビジン結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。特に、タマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。なお、タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見されたビオチン結合性タンパク質である（ＷＯ  ０２／０７２８１７；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７６：１３８３−１３９７）。タマビジンの変異体としては、例えば、高結合能・低非特異結合タマビジン（特願２００８−２０８７６６  未公開）等が挙げられる。
本発明における「タマビジン」は、タマビジン１（アミノ酸配列：配列番号５、それをコードする核酸配列：配列番号４）、タマビジン２（アミノ酸配列：配列番号７、それをコードする核酸配列：配列番号６）、またはそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のタマビジンは典型的には、配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、本発明のタマビジンは、配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、およびそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶことがある。
タマビジン１または２の変異体は、配列番号５または７のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、場合により、１または数個のアミノ酸を意味してもよい。
タマビジン１または２の変異体はさらに、配列番号５または７のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウエブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。
本発明において、好ましいタマビジンには、以下のタマビジン改変体が含まれる。（特願２００８−２０８７６６  未公開）。
配列番号７に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号７の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号７の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号７の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号７の７３番目のリジン残基
から選択される１または複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
より好ましくは、配列番号７において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
ビオチン結合性タンパク質と担体の連結は、当業者に公知のタンパク質と担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、当該カルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、タンパク質と担体を連結することができる。または、例えば、担体表面のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性エステル化された担体とタンパク質とを一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和することにより、担体表面のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。
あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。
上記のような結合を用いて、ビオチン結合性タンパク質を担体に固定化する場合、様々な官能基が表面に配置された各種担体が市販されているので、それらを好ましく用いることができる。例えばこれらに限定されるわけではないが、官能基が表面に配置されたマイクロプレートとしては、無水マレイン酸プレートとして例えばＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）Ｍａｌｅｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）が、活性型アミノ基プレートとして例えばＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒＴＭ−Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅｓ／Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ社）が、あるいはカルボキシル基プレートとして例えばＥＬＩＳＡ用プレートＭＳ−８７９６Ｆ（９６ウェル・Ｃタイプ・平底・カルボ）（住友ベークライト社）が挙げられる。また、官能基が表面に配置されたマイクロビーズとしては、高架橋アガロースビーズとして例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）が、磁性ビーズとして例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｄｙｎａｌ社）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ビオチン結合性タンパク質と固体担体の連結は、担体に添付された説明書に従えばよい。
あるいはまた、ビオチン結合性タンパク質を固定化した担体としては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄＴＭ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥＥ社）、Ｎｕｎｃ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ９６  Ｍｉｃｒｏ  ＷｅｌｌＴＭ  Ｐｌａｔｅｓ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）等のマイクロプレート類、あるいはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌ社）、ＭａｇｎａＢｉｎｄＴＭ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
ビオチンとビオチン結合性タンパク質を使用しない場合には、例えば、レクチンにヒスチジンタグ、ＦＬＡＧＴＭタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を結合させるとともに、担体にはそれぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）、抗ＦＬＡＧ抗体、またはグルタチオンを結合させ、それぞれを結合させることにより、レクチンと担体を間接的に結合させることもできる。
ウイルス含有液とレクチンの接触
本発明の方法は、ウイルス含有液とレクチンとを接触させる工程を含む。ウイルス含有液とレクチンとを接触させる条件は、ウイルス含有液中のウイルスとレクチンとが結合する条件であれば特に制限されない。接触条件の要素としては、ウイルス含有液の組成、インキュベーション温度およびインキュベーション時間を含む。
ウイルス含有液の組成は、ウイルス含有液中のウイルスとレクチンとが結合する条件を維持する限り、特に制限されない。好ましいウイルス含有液は、ｐＨ７〜８の緩衝液、例えばＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＢＳ、等を基本とする緩衝液であってよい。また、ウイルス含有液のｐＨは、６〜９、好ましくは７〜８であってもよい。
ウイルス含有液が体液であれば、そのまま、あるいは当該体液を、所望の緩衝液等を加えてから、レクチンと接触させてもよい。
インキュベーション温度の下限は４℃または１０℃であってよく、上限は５０℃、４５℃、４０℃、３７℃、３０℃、２５℃、および２０℃からなる群より選択されてもよい。好ましいインキュベーション温度として、１０℃〜３７℃、１０℃〜２５℃、１０℃〜２０℃、１５℃が挙げられる。
インキュベーション時間の下限は１分、３分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分からなる群より選択されてもよく、上限は一晩、１０時間、８時間、５時間、３時間、２時間、１．５時間、および１時間からなる群より選択されてもよい。好ましいインキュベーション時間として、５分〜一晩、５分〜５時間、１０分〜２時間が挙げられる。
本発明の方法におけるレクチンと担体とが間接的に結合する態様においては、レクチンとウイルス含有液を接触させる前に、それと同時に、またはその後に、担体に結合可能な分子を介してレクチンと担体とを接触させて結合させる。レクチンと担体を接触させる条件は、レクチンが、担体に結合可能な分子を介して担体に十分に結合できる条件であれば特に制限されない。接触条件の要素としては、インキュベーション温度およびインキュベーション時間を含む。上述したウイルスとレクチンを接触させる条件と同様の条件を適宜選択することができるが、特に好ましいインキュベーション時間としては、１分〜２時間、３分〜１時間、５分〜３０分が挙げられる。
担体の分離
レクチンを介して濃縮対象のウイルスを捕捉した担体は、その担体の性質に応じた当業者に公知の手法により、試料であるウイルス含有液から分離し、回収する。
例えば、ビーズなど粒子状の担体については遠心分離とそれに続く上清の除去により、担体の試料からの分離を達成してもよい。担体が磁性ビーズの場合は、磁石を用いて担体を集め、上清を除去することにより、担体を試料から分離してもよい。担体が、薄膜やフィルターなどの形状である場合は、担体を試料から引き上げることにより、あるいは担体に試料を通過させた後、担体を試料から分離してもよい。担体が、マイクロプレートなど、ウェル構造の内部でウイルスを補足するように設計されている場合は、単に試料をウェルから除くことにより担体を試料から分離してもよい。
また、必要に応じて試料から分離した担体に非特異的に結合した物質を除去するために、分離した担体を洗浄する工程を加えてもよい。洗浄工程に用いる洗浄液や温度の条件は、ウイルスおよびレクチンの間の結合、ならびに／または、レクチンと担体の間の結合を維持するという条件が維持される限り、特に限定されない。
好ましくは、洗浄液は緩衝されておりｐＨ７〜８の緩衝液、例えばＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＢＳ、等を基本とする緩衝液であってよい。また、洗浄液のｐＨは６〜９、好ましくは７〜８、であってもよい。
洗浄温度は、特に限定されないが、洗浄温度の下限は４℃または１０℃であってよく、上限は５０℃、４５℃、４０℃、３７℃、３０℃、２５℃、および２０℃からなる群より選択されてもよい。好ましい洗浄温度として、１０℃〜３７℃、１０℃〜２５℃、１０℃〜２０℃、１５℃が挙げられる。
糖を用いた溶出
本発明の方法は、レクチンを介して担体に捕捉されたウイルスを、糖を含む溶出液を用いて担体から溶出する工程を含む。レクチンとウイルスが結合したままでは、ウイルスの種類によってはウイルスの感染能に悪影響を及ぼす場合もあることが想定される。さらに、遺伝子治療に用いるウイルスベクターを濃縮するにあたっては、担体からウイルスベクターを溶出して単離することは不可欠である。
本明細書において、担体からウイルスを溶出するとは、担体に捕捉されたウイルスを、糖鎖−レクチン結合を解離させることによりウイルスを該担体から脱離させて、該担体から遊離した状態にすることを意味する。また、本明細書において、担体からウイルスを溶出するとは、少なくとも担体に捕捉されたウイルスの一部が担体から脱離して遊離した状態となることを意味し、必ずしも担体に捕捉されたすべてのウイルスが遊離した状態になることを意味しない。
また、本明細書において、担体からウイルスを溶出して単離する場合の「単離する」という文言は、担体に捕捉されたウイルスを該担体から脱離させて、該担体から遊離した状態にし、そして該担体の成分を除いた状態にすることを意味する。したがって、本明細書において、「単離されたウイルス」とは、少なくとも担体の成分を含まないことを意味し、必ずしもウイルスの純度の程度を規定するものではない。
本発明者らは、レクチンに結合したウイルスを、適切な糖を含む溶液で処理することにより、ウイルスの感染能を失わせることなく、担体から溶出して単離することができることを見出した。よって、本発明の方法において、レクチンに結合したウイルスは糖を使用することにより、溶出することができる。ウイルス結合レクチンからウイルスを溶出可能な糖は、そのレクチンが結合する糖を有する単糖類、二糖類、オリゴ糖または配糖体、から選択される。
ウイルスを捕捉したレクチンからウイルスを溶出するための糖の具体的なものとしては、例えば、ＳＢＡに対してはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを、ＳＳＡに対してはラクトースを、ＤＳＡにはキトオリゴ糖を、ＷＧＡにはキトオリゴ糖やＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが挙げられ、それぞれ好ましく利用することができる。
糖を含む溶出液は、ｐＨ７〜８の緩衝液、例えばＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＢＳ、等を基本とする緩衝液であってよい。また、糖を含む溶出液のｐＨは５〜９、好ましくは７〜８、であってもよい。
糖を含む溶出液中の糖の濃度は、０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜０．５Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ〜０．３Ｍである。または、０．１％〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５％〜２％（ｗ／ｖ）である。
溶出処理の温度は、特に限定されないが、室温、または、洗浄温度の下限は４℃または１０℃であってよく、上限は５０℃、４５℃、４０℃、３７℃、３０℃、２５℃、および２０℃からなる群より選択されてもよい。好ましい洗浄温度として、室温、１０℃〜３７℃、１０℃〜２５℃、１０℃〜２０℃、１５℃が挙げられる。
溶出処理の時間は、特に限定されないが、３０秒〜１日、好ましくは５分〜２時間、さらに好ましくは、１分〜３０分、であってもよい。
また、ウイルスの溶出のために用いる溶出液の量は、本発明の方法において当初に用いたウイルス含有液の容積よりも少ない量であれば特に限定されない。好ましくは、当初のウイルス含有液の量の１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００または１／５００であってよい。
なお、担体からの溶出に糖を使用しない場合は、溶出液のｐＨを酸性（好ましくはｐＨ１〜５）、またはアルカリ性（好ましくはｐＨ９〜１１）にすることによっても、ウイルスを溶出することができる。
ウイルス濃縮液の取得
ウイルス濃縮液は、担体に対して溶出液を作用させた後、担体を除去することにより得る。
溶出液で処理した後、溶出液中の担体は、その担体の性質に応じた当業者に公知の手法により、溶出液から分離し、除去する。例えば、ビーズなど粒子状の担体については遠心分離とそれに続く上清の回収により、ウイルス濃縮液を得てもよい。担体が磁性ビーズの場合は、磁石を用いて担体を集め、上清を回収することにより、ウイルス濃縮液を得てもよい。担体が、薄膜やフィルターなどの形状である場合は、担体を溶出液から引き上げることにより、あるいは担体に試料を通過させた後、担体を分離してもよい。担体が、マイクロプレートなど、ウェル構造の内部でウイルスを補足するように設計されている場合は、単に溶出液をウェルから回収することによりウイルス濃縮液を得てもよい。
２．キット
本発明はまた、本発明の方法に基づいて、ウイルス含有液中のウイルスを濃縮するためのキットを提供する。
一態様において、本発明のキットは、少なくともビオチン化レクチン、ビオチン結合タンパク質を結合した担体、および溶出のための糖を含む。レクチン、ビオチン結合タンパク質、担体、および溶出用の糖については上記に定義したとおりである。
別の態様において、本発明のキットは、少なくともレクチンが結合したナノビーズ、および溶出用の糖を含む。レクチン、ナノビーズおよび溶出のための糖については、上記に定義したとおりである。
本発明のキットは、さらに本発明の方法において、ウイルスとレクチンの結合のための緩衝液、分離したウイルス結合担体を洗浄するための緩衝液、および／または、担体からウイルスを溶出する際に用いるための緩衝液を含んでいてもよい。
本発明のキットは、各々の試薬が適切な容器に封入されていていてもよい。また、本発明のキットは、それに含まれる試薬等を適切に梱包するためのパッケージをも含んでいてもよい。
また、本発明のキットには適切な使用説明資料が含まれていてもよい。使用説明資料には、非限定的に、パッケージへの使用方法の記載、あるいは、印刷物、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、および光学媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）、等、本発明のキットの使用方法を利用者に伝達可能な媒体が含まれる。また、使用説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスの記載もまた、使用説明資料に含まれる。
【実施例】
【０００９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１  ＨＨＶ−６を濃縮することのできるレクチンの探索
ビオチン化されたレクチン１５種類（Ｃｏｎ  Ａ，ＤＢＡ，ＬＣＡ，ＰＨＡ−Ｅ４，ＰＮＡ，ＲＣＡ１２０，ＵＥＡ−Ｉ，ＷＧＡ，ＡＢＡ，ＤＳＡ，Ｌｏｔｕｓ，ＭＡＭ，ＰＨＡ−Ｌ４，ＳＢＡ，ＳＳＡ）を、培養したＨＨＶ−６溶液と反応させ、タマビジンを結合した磁性ビーズに結合させることによりＨＨＶ−６の濃縮が出来るかどうかを検討した。
１．培養Ｔ細胞からのＨＨＶ−６溶液の作製
ヒト臍帯血由来培養Ｔ細胞にＥＧＦＰを発現する組換えＨＨＶ−６（特許第３９２３５０５号）を感染させ、ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６溶液を作製した。
２．タマビジン磁性ビーズの作製
カルボキシル基で表面がコートされた磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ、Ａｃｉｄ、Ｄｙｎａｌ社）３００μｌを、０．０１Ｎ  水酸化ナトリウム  ３００μｌで１０分間洗浄後、さらに超純水３００μｌで１０分間３回洗浄した。洗浄済みの磁性ビーズに、冷超純水で溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロライド（ＥＤＣ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を最終濃度０．２Ｍになるように添加し、３０分間、室温で振とうした。その後、冷超純水３００μｌ、続いて５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）３００μｌで磁性ビーズを洗浄し、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）に置換した０．６ｍｇ／ｍｌ  タマビジンを３００μｌ（１８０μｇ）混和した。室温で３０分間振とうさせることにより、共有結合にてタマビジンと磁性ビーズを結合させた。磁石で磁性ビーズを回収し、上清を除去した。次に５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌでビーズの未反応カルボキシル基を消去後、０．５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液３００μｌで磁性ビーズをブロッキングした。ＰＢＳ緩衝液３００μｌで磁性ビーズを懸濁し、磁性ビーズを完成させた。ストレプトアビジンについても同様に磁性ビーズを作成した。
３．組換えＨＨＶ−６溶液の濃縮
１で作製したＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６溶液を利用して、組換えＨＨＶ−６の感染力価を指標にウイルス濃縮がなされているかを確かめた。ビオチン化レクチンは、Ｊ−オイルミルズ社製レクチン１５種類（Ｃｏｎ  Ａ，ＤＢＡ，ＬＣＡ，ＰＨＡ−Ｅ４，ＰＮＡ，ＲＣＡ１２０，ＵＥＡ−Ｉ，ＷＧＡ，ＡＢＡ，ＤＳＡ，Ｌｏｔｕｓ，ＭＡＭ，ＰＨＡ−Ｌ４，ＳＢＡ，ＳＳＡ）を使用した。
まず、レクチンの探索を行なう前に、バックグランドとなるタマビジンの非特異的吸着の確認を行なった。
最初に、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６液１００μｌ（ウイルス濃度１０４／ｍｌ  ＴＥ）、ＰＢＳ  ５００μｌを混和し、１５℃で１時間、インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、上記２で作製したタマビジン磁性ビーズを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間、インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５％  ＢＳＡ  ２００μｌで２回洗浄した。次いでこれを培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清）５００μｌにて懸濁した後、全量を０．５ｍｌのインディケーター細胞（ＭＴ４細胞）と懸濁した。ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６が存在すれば、ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６はインディケーター細胞に感染し、ＨＨＶ−６のＤＮＡが細胞中に入って、その中でウイルスに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子が発現してＧＦＰ蛍光を発するものと考えられる。なお、本実験においては、ビーズが結合したままのウイルスと感染細胞とはともに液底に沈んでいるため、通常、問題となりうるウイルスと感染細胞との会合確率の低下は問題とならず、却って局所におけるウイルス濃度が非常に高くなるため、感染効率は向上すると考えられる。
上記実験の結果、図１にみられる様に、タマビジンビーズへのＨＨＶ−６の非特異的吸着はほとんどないことが確認された。
次に、各種レクチンを用いたウイルス濃縮が可能かどうかを調べた。
最初に、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６液１００μｌ（ウイルス濃度１０４／ｍｌ  ＴＥ）、ＰＢＳ  ５００μｌ、ビオチン化レクチン１０μｇを混和し、１５℃で１時間、インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、上記２で作製したタマビジン磁性ビーズを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５％  ＢＳＡ  ２００μｌで２回洗浄した。次いでこれを培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清）５００μｌにて懸濁した後、全量を０．５ｍｌのインディケーター細胞（ＭＴ４細胞）と懸濁し、ＥＧＦＰの発現を観察した。なお、ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６を濃縮できていれば、レクチン−ビオチン−タマビジンを介して磁性ビーズと結合しているＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６はインディケーター細胞に感染し、ウイルスに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子が発現してＧＦＰ蛍光を発するものと考えられる。
実験の結果、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＤＳＡ、ＷＧＡを使用した場合に、ウイルス原液よりも多くのＥＧＦＰの発現が観察された。結果の一部を図２、図３に示した。このことから、これらのレクチンを使用して効率的にＨＨＶ−６を濃縮できることが示された。
実施例２  唾液中ＨＨＶ−６の濃縮
唾液中のＨＨＶ−６について、レクチン化ビオチン、タマビジン磁性ビーズを利用して濃縮を試みた。
１．唾液の採取
被験者からの唾液をサリベット（サリベットコットン、ザルスタット社製）を用いて採取した。被験者は、唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を２度漱いだ後、２分間サリベットの中綿を口腔内に含み、唾液を採取した。
２．ＨＨＶ−６の定量
まず、唾液中のＨＨＶ−６濃度を定量した。
上記項目１．のように採取した唾液４００μｌについて、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１（ＱＩＡＧＥＮ社）とＥＺ１  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＥＺ１  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従い、唾液中のＨＨＶ−６ＤＮＡを精製した。
得られたＤＮＡを、定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、ＨＨＶ−６Ｕ６５／６６領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。ＰＣＲに使用したプライマーおよびプローブの配列は、
プライマー：  ５’−ＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＴＧ−３’（配列番号１）；および
プライマー：  ５’−ＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＡ−３’（配列番号２）；ならびに
ＴａｑＭａｎプローブ：  ＦＡＭ  ５’−ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣ−３’  ＴＡＭＲＡ（配列番号３）
であり、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（ロシュ社）を用いて、反応温度９５℃１０分間１回、９５℃５秒＋６０℃３１秒、を４５サイクルでリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、本試験は、ウイルス実験に極めて熟練した実験者によって行なわれた。
その結果、唾液１ｍｌ中のＨＨＶ−６ＤＮＡは、１４６１６コピー／ｍｌであった。従って唾液５μｌに含まれるＨＨＶ−６は、７３．０８コピーと算出された（図４：精製前）。
３．ビオチン化レクチン、タマビジン磁性ビーズを利用したＨＨＶ−６の濃縮
上記項目１．のように採取した唾液４００μｌに、４４μｌの１０倍濃度のＰＢＳ、ビオチン化ＳＢＡ  １ｎｍｏｌを混和し、１５℃で１時間インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、実施例１で作製したタマビジン磁性ビーズ１００μｌを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ５００μｌで３回洗浄した。ここにＴＥを１０μｌ加え、９８℃で１０分間処理した後、マグネットスタンドにおいて、上清を回収し、うち５μｌを定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、本実施例の上記項目２．と同様に、ＨＨＶ−６  Ｕ６５／６６領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。
以上の実験の結果、ビオチン化ＳＢＡとタマビジン磁性ビーズを利用した場合、定量ＰＣＲに供試した溶出液５μｌ中のＨＨＶ−６量は、２９３４コピーと測定された（図４）。本実施例の上記項目２．の結果と比較すると、ビオチン化ＳＢＡとタマビジン磁性ビーズを用いることで、ＨＨＶ−６溶液をおよそ４０倍に濃縮することができた。同様にビオチン化ＳＳＡを用いた場合には約１５倍の濃縮効率であった。一方、ビオチン化レクチンを加えない試験区に含まれるＨＨＶ−６量は４０コピー以下であり、濃縮されていなかった（図４）。
４．ビオチン化レクチン及びタマビジン磁性ビーズを利用したＨＨＶ−６の濃縮と糖鎖による溶出
上記項目１．のように採取した唾液１ｍｌに、１００μｇのビオチン化ＳＢＡまたはビオチン化ＷＧＡを添加した後、実施例１で作製したタマビジン磁性ビーズ５０μｌを反応液に添加し、１５分間、室温で転倒混和することにより、結合させた。これを、ダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、０．５％  ウシ血清アルブミン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ入りＰＢＳで２回洗浄後、２０μｌの溶出液（ＰＢＳ  ＋２％  ウシ胎児血清に溶出用の糖鎖を加えたもの）で溶出処理した。溶出液中の溶出用の糖は、ビオチン化ＳＢＡを用いた系においてはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（０．２Ｍ）を、ビオチン化ＷＧＡを用いた系においてはキトオリゴ糖（１％）を用いた。その後、溶出処理を行った溶出液の入った試験管をダイナビーズ用マグネットスタンドに立てて、タマビジン磁性ビーズを集め、上清を回収した。このようにして得られた回収液の５μｌを定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、上記項目２．と同様に、ＨＨＶ−６  Ｕ６５／６６領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。
以上の実験の結果、ビオチン化ＳＢＡとタマビジン磁性ビーズを利用してＨＨＶ−６を集めてＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンで溶出した場合、精製前のウイルス濃度と比較して２．７倍の濃縮効率であった。また、ビオチン化ＷＧＡとタマビジン磁性ビーズを利用してＨＨＶ−６を集めてキトオリゴ糖で溶出した場合、精製前のウイルス濃度と比較して４．７倍の濃縮効率であった（図５）。
実施例３  レクチンを用いたレンチウイルスベクターの濃縮
（１）濃縮
レンチウイルスとして、ＨＩＶ  ｂａｓｅの遺伝子と、ＶＳＶ−Ｇのエンベロープを持つレンチウイルスベクターにＥＧＦＰ遺伝子を組み換えたものを使用した（独立行政法人理化学研究所の三好浩之先生から分与された）。ビオチン化レクチンはＪ−オイルミルズ社製ビオチン化レクチン１５種類（Ｃｏｎ  Ａ，ＤＢＡ，ＬＣＡ，ＰＨＡ−Ｅ４，ＰＮＡ，ＲＣＡ１２０，ＵＥＡ−Ｉ，ＷＧＡ，ＡＢＡ，ＤＳＡ，Ｌｏｔｕｓ，ＭＡＭ，ＰＨＡ−Ｌ４，ＳＢＡ，ＳＳＡ）を使用した。
最初に、ＥＧＦＰ組換えレンチウイルス液１００μｌ（ウイルス濃度１０２／ｍｌ  ＴＥ、なお、濃縮効果を観察するために、力価の低いウイルスを使用した。）、ＰＢＳ  ５００μｌ、ビオチン化レクチン１０μｇを混和し、１５℃で１時間インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、実施例１で作製したタマビジン磁性ビーズを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５％ＢＳＡ  ２００μｌで２回洗浄した。次いでこれを培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清）５００μｌにて懸濁した後、全量をインディケーター細胞（２９３細胞）に感染させ、ＥＧＦＰ発現によってウイルスの感染力価を測定した。
その結果、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを持つレンチウイルスベクターが、ＷＧＡまたはＳＢＡを利用した場合に、感染性を失うことなく充分に濃縮されることが分かった（図６）。なお、原液のウイルスではＥＧＦＰ発現細胞はほとんど見られなかった。
（２）濃縮率の定量
次に、濃縮率の定量を行った。１ｍｌのＥＧＦＰ組換えレンチウイルス溶液（力価：１０３／ｍｌ）に、２００μｇのビオチン化ＳＢＡまたはビオチン化ＷＧＡを添加した後、１００μｌのタマビジン磁性ビーズを添加し１５分間、室温で転倒混和することにより、結合させた。これを、ダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、０．５％  ウシ血清アルブミン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ入りＰＢＳで２回洗浄後、１００μｌの溶出液（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清に溶出用の糖を加えたもの）で溶出処理した。溶出液中の溶出用の糖は、ＳＢＡでは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（０．２Ｍ）、ＷＧＡではキトオリゴ糖（１％）を用いた。その後、溶出処理を行った溶出液の入った試験管をダイナビーズ用マグネットスタンドに立ててタマビジン磁性ビーズを集め、上清を回収した。このようにして得られた回収液について、ウイルス力価をインディケーター細胞（ＨｅＬａ細胞）に３７℃で１時間吸着させることにより、感染させ、１日後のＥＧＦＰ発現細胞数によって感染ウイルス力価を計測した。
その結果、ビオチン化ＳＢＡを用いた系では回収率５６％、ビオチン化ＷＧＡを用いた系では回収率９８％でウイルスを回収することができた。濃縮率はそれぞれ５．６倍、９．８倍となった（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明は、濃度の低いウイルス溶液中のウイルスやウイルスベクターを、より簡便に濃縮することを可能にする新規な方法および当該方法を行うためのキットを提供する。本発明の方法は、ウイルスやウイルスベクターの感染能を維持しつつ濃縮することを容易にするものであるので、例えば、ウイルスベクターを用いる遺伝子治療やワクチン治療などの分野における、安全で簡便なベクターの濃縮技術としての活用が期待される。より具体的には、本発明の方法は、従来の方法のような煩雑なカラム操作や超遠心などが不要な簡便な方法であるため、自動化やハイスループットなシステムへの応用も期待できる。
［配列表］
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【国際調査報告】
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