(57)【要約】非特異的付着性又は凝集性がない又は弱い微生物に対して、非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する手段を提供する。本発明は、標的微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法であって、非特異的付着性を有する微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを、該標的微生物に導入することを含む方法に関する。
2009104281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法であって、
非特異的付着性を有する微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを、該標的微生物に導入することを含む、前記方法。
【請求項２】
非特異的付着性を有する微生物がＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡである、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
標的微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が大腸菌である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡとともに、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入する、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の方法：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを標的微生物に導入する、請求の範囲第６項記載の方法：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、宿主微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有するＤＮＡ。
【請求項８】
請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の方法によって得られる、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
【請求項９】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載のＤＮＡが導入された、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
【請求項１１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌である、請求の範囲第１０項記載の微生物。
【請求項１２】
大腸菌である、請求の範囲第１１項記載の微生物。
【請求項１３】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質。
【請求項１４】
微生物の培養方法であって、
請求の範囲第８項、第１０項、第１１項又は第１２項記載の微生物を、担体に付着させる、及び／又は凝集させることにより、該微生物を回収することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法、該方法に用いるＤＮＡ、該ＤＮＡによってコードされる蛋白質、該方法によって得られる微生物、及び該微生物の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は優れた触媒作用による物質変換能力を有している。そのため、醸造や発酵食品の生産、廃水や排ガス処理などの分野で広く利用されてきた。最近では、遺伝子組換え微生物による医薬品の生産、バイオエタノールの発酵生産から、微生物を利用した化学品の合成まで実施、又は研究されるようになり、微生物利用技術は重要な産業技術となっている。しかし、反応の担い手である微生物細胞を生産するには、培地やエネルギーなどのコストがかかる。また、微生物反応は水溶液中で行われることが多く、物質生産後は微生物を反応液から分離する必要がある。分離方法としては、従来、遠心分離やろ過が主たる手法であった。
分離を容易にし、また貴重な微生物細胞を連続的にあるいは反復して利用するために、微生物細胞の固定化や自己凝集が有効であるとされてきた。従来の固定化技術として、アルギン酸などのゲルを利用した包括固定法と、多孔質担体の表面に吸着させる表面固定法がある。しかし、包括固定法には、酸素や基質のゲル内部への輸送が律速になる場合が多いこと、ゲルの機械的強度が弱く攪拌などによって破壊されやすいこと、微生物細胞がゲル内部から漏れてくることなどの欠点がある。また、従来の表面固定法は、目的の微生物を表面に集積させるという方法ではなく、多孔質担体などを雑多な微生物が沢山存在する廃水処理や環境浄化の現場に投入して、付着しやすい微生物をバイオフィルムとして表面に担持させているに過ぎない。すなわち、好きな微生物を固体表面に自由に付着させる技術は存在しない。一方、凝集については、高分子ポリマーなどの凝集沈殿剤を利用する方法が廃水処理で広く使われているほか、もともと凝集性の微生物をスクリーニングして利用するといった方法がとられているが、非凝集性の微生物細胞、特に細菌を、自発的に凝集させる技術は存在しない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、非特異的付着性又は凝集性がない又は弱い微生物に対して、非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、非特異的付着性を有する微生物から付着関連遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子がオートトランスポーターアドヘシン遺伝子であること、並びに該遺伝子を標的微生物に導入することにより、該微生物に対して、非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）標的微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法であって、
非特異的付着性を有する微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを、該標的微生物に導入することを含む、前記方法。
（２）非特異的付着性を有する微生物がＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌である、（１）記載の方法。
（３）オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４）標的微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が大腸菌である（４）記載の方法。
（６）オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡとともに、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを標的微生物に導入する、（６）記載の方法：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、宿主微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有するＤＮＡ。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって得られる、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
（９）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１０）（９）記載のＤＮＡが導入された、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
（１１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌である、（１０）記載の微生物。
（１２）大腸菌である、（１１）記載の微生物。
（１３）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質。
（１４）微生物の培養方法であって、
（８）、（１０）、（１１）又は（１２）記載の微生物を、担体に付着させる、及び／又は凝集させることにより、該微生物を回収することを含む、前記方法。
本発明によって、非特異的付着性又は凝集性がない又は弱い微生物に対して、非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強することが可能になる。それにより、微生物反応において、微生物の分離が容易になり、貴重な微生物細胞を効率的に回収して連続的に又は反復して利用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１で得られた配列断片の位置関係を示す。
図２は、実施例１でのクローニングとシークエンスの結果得られた全塩基配列を示す。
図３は、ＡａｄＡのアミノ酸配列を示す。
図４は、オートトランスポーターアドヘシンのシグナルペプチド、ヘッドドメイン、ネックドメイン、メンブレンアンカードメインのドメインそれぞれについてＣｌｕｓｔａｌＷを用いてマルチプルアラインメントを作成し、配列を比較した結果を示す。
図５は、Ｔｏｌ５−ＯｍｐＡの配列と相同性を示した外膜蛋白質の配列とを比較した結果を示す。
図６は、ａａｄＡ遺伝子及びａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組み込んだことによる形態の変化を光学顕微鏡で観察した結果を示す。
図７は、ポリウレタン表面に付着するＤＨ５α：：ａａｄＡの電子顕微鏡写真を示す。
図８は、ポリウレタン表面に付着するＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡの電子顕微鏡写真を示す。
図９は、ポリウレタン表面上に存在するＤＨ５α（ＷＴ）の電子顕微鏡写真を示す。
図１０は、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡ、ＤＨ５α：：ａａｄＡ及びＤＨ５αＷＴの培養液の写真を示す。
図１１は、ＤＨ５α：：ａａｄＡ及びＤＨ５αＷＴの自己凝集試験の結果を示す。
図１２は、実施例１で用いたプライマーについてまとめた表を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の方法は、非特異的付着性を有する微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡ（オートトランスポーターアドヘシン遺伝子）を該標的微生物に導入することを特徴とする。
病原性微生物などには、特定の生物界面（例えば、特定の細胞、生物又はその組織の表面）に付着してコロニーを形成するものが存在するが、本発明における非特異的付着性を有する微生物は、特定の生物界面に限られることなく、担体などの非生物界面を含めて、任意の生物界面及び非生物界面に付着する能力を有する微生物をさす。非特異的付着性を有する微生物は、例えば、ガラス、プラスチック及び金属等の担体に付着しうる。
非特異的付着性を有する微生物としては、グラム陰性細菌、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属細菌、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌などが挙げられる。本発明では、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌が特に好適である。
非特異的付着性を有する微生物の具体例としては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｔｏｌ５株が挙げられる。当該菌株は、排ガス処理リアクターから分離されたトルエン分解能を有する株であり、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１８８として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に寄託されている。
微生物の非特異的付着性は、クリスタルバイオレット染色による付着試験（ＣＶ付着試験）を用いて評価することができる。具体的には、菌体培養液を遠心分離にかけ、培養上清を除き、無機塩培地を菌体ペレットに加え、超音波処理により菌体懸濁液を得、菌体懸濁液の濁度ＯＤ６６０を一定（０．５以下）になるように培地で調整し、４８穴のプラスチック製プレートの各ウェルに懸濁液を１ｍｌずつ添加し、微生物の至適温度で２時間インキュベートし、ウェル中の懸濁液をピペットで全て除き、１ｍｌの無機塩培地でウェルを洗浄後、風乾し、１％のクリスタルバイオレット水溶液をウェルに加え、室温で１５分間インキュベートし、ピペットでクリスタルバイオレットを除き、１ｍｌの無機塩培地でウェルを２回洗浄後、風乾し、１ｍｌの無機塩培地を加えてウェル内壁に付着していた染色菌体を剥がし、超音波処理により分散させ、吸光度Ａ５９０を測定する。そして、吸光度Ａ５９０が０．１５以上、好ましくは０．１８以上、より好ましくは０．２以上の微生物は、非特異的付着性を有する微生物と評価することができる。
オートトランスポーターアドヘシンとは、グラム陰性細菌の持つ粘着性ナノファイバーとして報告されている蛋白質であり、宿主の組織や細胞表層分子、細胞外マトリックスと特異的に相互作用することが知られているが、種々の固体表面に非特異的に粘着するという報告はない。オートトランスポーターアドヘシンは、付着、浸入、細胞毒性、血清耐性、細胞間伝播といった機能を持つと言われている。オートトランスポーターアドヘシンは、Ｎ末端シグナルペプチド、内部パッセンジャードメイン、Ｃ末端トランスロケータードメインという共通の領域編成を持っている。その中でもＣ末端トランスロケータードメインはこの属を定義するドメインである。オートトランスポーターアドヘシンの分泌はシグナルペプチドによって開始され、Ｓｅｃシステムによる内膜の通過から始まる。続いて、トランスロケータードメインが外膜へ挿入され、βバレル構造を形成する。最終的にパッセンジャードメインは外膜を通過し菌体表面へその姿を現す。オートトランスポーターアドヘシンは、単量体オートトランスポーターアドヘシンと三量体オートトランスポーターアドヘシンに分類される（Ｓｈａｎｅ  Ｅ．Ｃｏｔｔｅｒ，Ｎｅｅｒａｊ  Ｋ．Ｓｕｒａｎａ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｗ．Ｓｔ  ＧｅｍｅＩＩＩ  ２００５．Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１３：１９９−２０５）。単量体オートトランスポーターアドヘシンのトランスロケータードメインは、１４の膜貫通逆平行βシートと膜貫通αヘリックスからなる親水性の経路であるβバレル構造を、一つのサブユニットから形成していると考えられている。しかし三量体オートトランスポーターアドヘシンのトランスロケータードメインは、外膜中で熱に安定でＳＤＳに強い三量体を形成しており、４つのβシートを持つサブユニットがオリゴマー化し三つのサブユニットから１２ストランドのβバレル構造を形成していることが知られている。また、多くの通常オートトランスポーターアドヘシンは分子内シャペロン領域を有するが、三量体オートトランスポーターアドヘシンサブファミリーにはそれは存在しない。さらに、事実上全ての単量体オートトランスポーターアドヘシンのパッセンジャードメインはトランスロケータードメインと非共有結合でバクテリア表面につながれるか、細胞外に放出されるのに対し、全ての三量体オートトランスポーターアドヘシン蛋白質ではパッセンジャードメインはトランスロケータードメインと共有結合でつながれたままであると考えられている。
三量体オートトランスポーターアドヘシンは、ＴＡＡ（トリメリックオートトランスポーターアドヘシン）と略称され、共通オリゴマー構造のコイルドコイルをつくる新しいクラスとしてＯｃａファミリー（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  Ａｄｈｅｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ）とも呼ばれている（Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ，Ｎｉｋｏｌａｕｓ  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  Ａ．Ｊａｃｏｂｉ，Ｋｏｎｒａｄ  Ｔｒｕｅｌｚｓｃｈ，Ｈａｒａｌｄ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｊｕｒｇｅｎ  Ｈｅｅｓｅｍａｎｎ  ２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ａｄｈｅｓｉｎ  ＹａｄＡ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：３７３５−３７４４）。
本発明では、三量体オートトランスポーターアドヘシンが好ましい。三量体オートトランスポーターアドヘシンとしては、例えば、Ｙｅｒｓｉｎａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのアドヘシンであるＹａｄＡ（Ｙｅｒｓｉｎａ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ）（Ｅｌ  Ｔａｈｉｒ  Ｙ，Ｓｋｕｒｎｉｋ  Ｍ．２００１．ＹａｄＡ，ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ａｄｈｅｓｉｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：２０９−２１８）、髄膜炎を引き起こすＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｒｕｅｎｚａｅのＨｉａ（Ｓｔ  Ｇｅｍｅ  ＪＷ  ３ｒｄ，Ｃｕｔｔｅｒ  Ｄ．２０００．Ｔｈｅ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｈｉａ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｒｅｍａｉｎｓ  ｕｎｃｌｅａｖｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｌｌｙ  ｃｅｌｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：６００５−１３）、歯周病の原因となるＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓのＥｍａＡ（Ｍｉｎｔｚ，Ｋ．Ｐ．２００４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｈｅｓｉｎ，ＥｍａＡ，ｗｈｉｃｈ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１５０，２６７７−２６８８）、呼吸器感染症の主要な病原菌であるＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのＵｐｓＡ１、Ａ２（Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅ  ＥＲ，Ｃｏｐｅ  ＬＤ，Ａｅｂｉ  Ｃ，Ｌａｔｉｍｅｒ  ＪＬ，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ＧＨ  Ｊｒ，Ｈａｎｓｅｎ  ＥＪ．２０００．Ｔｈｅ  ＵｓｐＡ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ＵｓｐＡ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１３６４−７３）、猫ひっかき病の原因となるＢａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅのＢａｄＡ（Ｒｉｅｓｓ  Ｔ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ＳＧ，Ｌｕｐａｓ  Ａ，Ｓｃｈａｌｌｅｒ  Ｍ，Ｓｃｈ▲ａ▼ｆｅｒ  Ａ，Ｋｙｍｅ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ，Ｗ▲ａ▼ｌｚｌｅｉｎ  ＪＨ，Ｅｈｅｈａｌｔ  Ｕ，Ｌｉｎｄｒｏｏｓ  Ｈ，Ｓｃｈｉｒｌｅ  Ｍ，Ｎｏｒｄｈｅｉｍ  Ａ，Ａｕｔｅｎｒｉｅｔｈ  ＩＢ，Ｋｅｍｐｆ  ＶＡ．，．２００４．Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ａｄｈｅｓｉｎ  ａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００：１２６７−７８）、髄膜炎菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのＮａｄＡ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ  Ｂ，Ａｄｕ−Ｂｏｂｉｅ  Ｊ，Ｄｉ  Ｍａｒｃｅｌｌｏ  Ｆ，Ｃｉｕｃｃｈｉ  Ｌ，Ｍａｓｉｇｎａｎｉ  Ｖ，Ｔａｄｄｅｉ  Ａ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，Ｐｉｚｚａ  Ｍ，Ａｒｉｃ▲ｏ▼  Ｂ．２００５．Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｎａｄ���  ｉｓ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｖａｓｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｄ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：６８７−９８）、植物病原性細菌であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅのＸａｄＡ（Ｒａｙ  ＳＫ，Ｒａｊｅｓｈｗａｒｉ  Ｒ，Ｓｈａｒｍａ  Ｙ，Ｓｏｎｔｉ  ＲＶ．２００２．Ａ  ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｆｉｍｂｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｕｍ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：６３７−４７）などが挙げられる。
好ましいオートトランスポーターアドヘシンの例として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、該蛋白質と機能的に同等の蛋白質が挙げられる。機能的に同等の蛋白質とは、当該蛋白質が配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等の蛋白質としては、配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質が挙げられる。さらに、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質、換言すれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列から数十から数百、場合によっては千以上の連続するアミノ酸配列を１箇所又は数箇所削ったアミノ酸配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性が失われない欠損蛋白質が挙げられる。
１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０  ６４７８−６５００，１９８２）により、該蛋白質をコードするＤＮＡの配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）を改変することにより実施することができる。
ここで、蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、異なるアミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）又はアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。従って、アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、シグナルペプチド、ヘッドドメイン、ネックドメイン、ストークドメイン、及びメンブレンアンカードメインを有する三量体オートトランスポーターアドヘシンであることから、アミノ酸の変異は当該ドメイン構造を維持するものであることが好ましい。配列番号２で表されるアミノ酸配列において、シグナルペプチドは１〜５７位のアミノ酸に相当し、ヘッドドメインは１０８〜２６９位及び２９９７〜３１４８位のアミノ酸に相当し、ネックドメインは２９６〜３１９位及び３１４９〜３１７２位のアミノ酸に相当し、ストークドメインは４０６〜２９６６位及び３１７３〜３５３７位のアミノ酸に相当し、メンブレンアンカードメインは３５３８〜３６３０位のアミノ酸に相当する。
数個とは、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個をいう。機能的に同等の蛋白質は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性（又は同一性）を指す。
配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部からなる蛋白質において、削ることが可能な数十から数百の連続するアミノ酸配列とは、好ましくは片方又は両方のストークドメイン、片方のヘッドドメイン、片方のネックドメインに相当する配列部位で、そのうちの一つの連続配列又は複数の連続配列を削ってもよい。より好ましくは前述した各ドメインの部位のうちアミノ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域（１０８〜２９６６位）又はカルボキシ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域（２９９７〜３５３７位）を削るのが好ましい。さらに好ましくはストークドメインに複数見られる繰り返し領域を、繰り返しがなくなって各一回ずつ出てくるように削るのが好ましい。最も好ましくはストークドメインに複数見られる繰り返し領域のどれか一箇所を削ることが好ましい。
好ましいオートトランスポーターアドヘシン遺伝子、すなわち、オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡの例としては、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、及び該ＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡが挙げられる。配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性（又は同一性）を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。あるいは、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。さらに、配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、換言すれば、配列番号１で表される塩基配列から数十から数千の連続する塩基配列を１箇所又は数箇所削った塩基配列からなり、それによって翻訳される蛋白質が非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性が失われない欠損遺伝子のＤＮＡが挙げられる。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで洗浄する条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳで洗浄する条件である。
塩基配列における変異も、シグナルペプチド、ヘッドドメイン、ネックドメイン、ストークドメイン及びメンブレンアンカードメインからなる当該ドメイン構造を維持するものであることが好ましい。配列番号１で表される塩基配列において、シグナルペプチドは１〜１７１位の塩基に相当し、ヘッドドメインは３２２〜８０７位及び８９８９〜９４４４位の塩基に相当し、ネックドメインは８８６〜９５７位及び９４４５〜９５１６位の塩基に相当し、ストークドメインは１２１６〜８８９８位及び９５１７〜１０６１１位の塩基に相当し、メンブレンアンカーはドメイン１０６１２〜１０８９０位の塩基に相当する。
配列番号１で表される塩基配列の一部からなるＤＮＡにおいて、削ることが可能な数十から数百の連続する塩基配列とは、好ましくは片方あるいは両方のストークドメイン、片方のヘッドドメイン、片方のネックドメインをコードする配列部位で、そのうちの一つの連続配列又は複数の連続配列を削ってもよい。より好ましくは前述した各ドメインの部位のうちアミノ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域をコードする領域（３２２〜８８９８位）又はカルボキシ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域をコードする領域（８９８９〜１０６１１位）を削るのが好ましい。さらに好ましくはストークドメインのコード領域に複数見られる繰り返し領域を、繰り返しがなくなって各一回ずつ出てくるように削るのが好ましい。最も好ましくはストークドメインのコード領域に複数見られる繰り返し領域のどれか一箇所削ることが好ましい。
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡとともに、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを標的微生物に導入することにより、標的微生物の非特異的付着性及び／又は凝集性さらに向上させることができる。配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌などが有する外膜蛋白質ＯｍｐＡ遺伝子と相同性を有することから、外膜蛋白質をコードするものである。配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等の遺伝子を導入してもよい。配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡとしては、配列番号３で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。あるいは、配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。
非特異的付着性を有する微生物に由来する、オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを含むオペロンを標的微生物に導入してもよい。例えば、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡを標的微生物に導入することにより、オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡとともに上記外膜蛋白質をコードするＤＮＡを標的微生物に導入することができる。該オペロンと機能的に同等のオペロンを導入してもよい。機能的に同等のオペロンとしては、配列番号５で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなり、宿主微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有するＤＮＡからなるオペロンが挙げられる。
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを導入する標的微生物としては、特に制限されないが、例えば、非特異的付着性及び／又は凝集性がない又は弱い微生物が挙げられる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌、例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓなどが挙げられる。
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを標的微生物に導入して形質転換することにより、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物が得られる。典型的には、オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを適当なベクターに連結し、該ベクターで標的微生物（宿主微生物）を形質転換することにより、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物を得ることができる。具体的には、宿主微生物に該ＤＮＡを多コピーにて導入したり、構成的に発現するプロモーター支配下に該ＤＮＡを連結したり、又は誘導酵素系プロモーター支配下に該ＤＮＡを連結したりして、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物を得ることができる。オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡとともに外膜蛋白質をコードするＤＮＡを導入する場合、及びオートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡを含むオペロンを導入する場合も同様である。
まず、目的のＤＮＡをベクター中に連結し、組換えベクターを製造する。上記ベクターには、宿主細胞で自律的に増殖し得るファージ、コスミド、人工染色体又はプラスミドが使用されるほかに、例えば、プラスミドを発現カセットとして染色体に導入するような場合にはその発現カセットの構築に必要な宿主（例えば、大腸菌）での自律複製能は必要だが、その発現カセットを導入する宿主（例えば、酵母）での自律複製能は必ずしも必要でない。これらの組換えベクターは例えば、大腸菌と酵母の両方で使用可能なように設計したシャトルベクター等も使用可能である。
プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ２１ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）、ｐＥＴ３９ｂ（＋）、ｐＥＴ４０ｂ（＋）、ｐＥＴ４３．１ａ（＋）、ｐＥＴ４４ａ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、また酵母でもピキア・パストリス用のプラスミド（例えば、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＦＬＤ）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。また、クローニング、シークエンス確認用にｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）などの市販のクローニング用ベクターを用いてもよい。
ベクターにＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。例えば、目的のＤＮＡは、通常知られている方法により合成することができ、ベクターに組み込むため、適当な制限酵素の切断部位を両末端に含むように、プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅してもよい。ＰＣＲ反応の条件は、当業者が適宜決定することができる。
その他、組換えベクターには、プロモーター及び本発明のＤＮＡに加えて、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。選択マーカーの例としては、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
プロモーターは、特に制限されず、宿主微生物に応じて当業者が適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーターなどが使用できる。配列番号２８で表される塩基配列からなるプロモーター、及びそれと機能的に同等のプロモーター、例えば、配列番号２８で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるプロモーターも好適に用いられる。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作成する。好ましくは市販のライゲーションキット、例えば、ライゲーションｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。
クローニング、連結反応、ＰＣＲ等を含む組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されるものを利用することができる。
得られたベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法及びそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらに例えばエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
標的微生物への組換えベクターの導入方法は、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が挙げられる。
目的のＤＮＡを含む形質転換微生物は、その組換えベクターが有するマーカー遺伝子により、例えば、アンピシリン、カナマイシンなどの抗生物質を含むＬＢ培地寒天プレート上でコロニーを形成することにより選抜することができるが、クローニングされた宿主微生物が組換えベクターにより形質転換されたものかどうかを確認するため、一部を用いて、ＰＣＲ法によるインサートの増幅確認、又はシーケンサーを用いたダイデオキシ法による配列解析をしてもよい。自律複製可能なプラスミドを導入する形式の他に、染色体の遺伝子と相同な領域をベクター内に配置し、相同組換えを起こさせて目的遺伝子を導入させる染色体組み込み型の導入方法を使用してもよい。
得られた形質転換微生物を培地で培養する方法は、標的微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。具体的には、Ｍ９培地、Ｍ９Ｇ培地、ＢＳ培地、ＬＢ培地、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地、肉エキス培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、ＰＤＡ培地等が挙げられる。
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコースなどの糖類、グリセリンなどのポリオール類、メタノールなどのアルコール類、又はピルビン酸、コハク酸若しくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミンなどのアルキルアミン類、又はアンモニア若しくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３７℃、特に好ましくは１５〜３７℃で行う。培養期間中、培地のｐＨは宿主の発育が可能で、オートトランスポーターアドヘシンの活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ４〜８程度の範囲である。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のようにして、非特異的付着性及び／又は凝集性（自己凝集性）が付与又は増強された微生物を得ることができる。得られた微生物の非特異的付着性については、上記クリスタルバイオレット染色による付着試験（ＣＶ付着試験）により評価することができ、凝集性については、例えば、以下のように評価できる。菌体培養液を遠心分離にかけ、培養上清を除き、無機塩培地を菌体ペレットに加え、超音波処理により菌体懸濁液を得、菌体懸濁液の濁度ＯＤ６６０を一定になるように培地で調整し、この時のＯＤ６６０を初期ＯＤ６６０とし、ガラス遠沈管の中の菌体懸濁液を室温で静置することで、形成された細胞自己凝集体を沈降させ、上清のＯＤ６６０の時間変化を測定する。そして、ＯＤ６６０の減少が初期ＯＤ６６０の１０％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上の微生物は、凝集性を有する微生物と評価することができる。
得られた微生物を培養後、通常知られている方法、例えば、菌体又は細胞を機械的方法、リゾチームなどを用いた酵素的方法又は界面活性剤などを用いた化学的処理によって破壊することより、オートトランスポーターアドヘシン蛋白質を単離することもできる。
本発明は、伝統的な発酵産業や廃棄物処理にそのまま利用できるだけでなく、バイオマスエネルギーの生産や微生物細胞を用いるグリーンバイオテクノロジーに極めて有効である。特にエネルギーや化学品の生産は低コストが求められており、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強することにより、固定化及び自己凝集させることは、生産プロセスの効率化に直結し、これらの産業の発展の基盤に成り得る。
【実施例】
【０００６】
実施例１  付着関連遺伝子の解析
１−１  付着性低下変異株Ｔ１及びインバースＰＣＲ用プライマーの作成
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｔｏｌ５株の付着関連遺伝子を解析するため、トランスポゾンランダム挿入法を用いて付着性低下変異株を作成した。Ｔｏｌ５ＷＴ（Ｔｏｌ５野生株）をレシピエント細胞、トランスポゾンベクターを持つＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１をドナー細胞として、２８℃で２２〜２４時間接合した。トルエンとテトラサイクリンを含む培地で選択培養し、得られた株の付着試験を行った。その結果、付着性が低下した株をいくつか得ることに成功した。それらのゲノムＤＮＡを採取し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理したものを鋳型として、ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｅｔＡをプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、約５ｋｂの位置に強くバンドが検出された株があり、それを付着性低下株Ｔ１とした。Ｔ１株の表面構造を電子顕微鏡で観察したところ、アペンデージ（細胞表層の突起物）を欠損している様子が観察された。
続いて、Ｔ１株のトランスポゾン挿入部位を解析するために、サザンハイブリダイゼーションで検出された約５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出した。このフラグメントをＴ１−５ｋｂとした。Ｔ１−５ｋｂをｐＵＣ１１８ベクターに組み込み、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αへクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡのインサート部分の両端をシークエンスした結果、Ｔ１−５ｋｂの内部にＴｎ５の配列の他にＴｏｌ５ＷＴ株由来の塩基配列６８ｂｐの存在を確認した（配列番号６）。
１−２  付着関連遺伝子のクローニング
付着性低下変異株Ｔ１のトランスポゾン挿入部位の塩基配列を解析するため、Ｔ１の解析によって明らかとなった挿入部位６８ｂｐの配列をもとに、ＷＴ株の染色体ＤＮＡのインバースＰＣＲを試みた。まずＴｏｌ５野生株をＢＳ培地で培養し、ＤＮＡ抽出・ＲＮａｓｅ処理を行った。得られたゲノムＤＮＡを、ｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトに存在するＨｉｎｄＩＩＩ以外の制限酵素（ＡｃｃＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ）で処理し、アガロースゲル電気泳動（以下Ｅ．Ｐ．）で確認した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩはＴ１の解析時に使用しており、６８ｂｐ内にＨｉｎｄＩＩＩサイトを確認しているため目的領域を得るためには不適切と判断し、ここでは除外した。Ｅ．Ｐ．の結果、ゲノムと同等の高分子量の位置にバンドが残っているものは、制限酵素反応箇所が少なくフラグメントの長さが長すぎるため適当でない。また、低分子量バンドが出ているものはフラグメントが短くなりすぎており、シークエンスしても得られる配列情報が少ないため適当でない。従って、１，５００ｂｐ〜５，０００ｂｐにシグナルが出ているＨｉｎｃＩＩを選択し、ゲノムＤＮＡをＨｉｎｃＩＩ処理した（Ｔｏｌ５／ＨｉｎｃＩＩ）。ＤＮＡの精製を行ったＴｏｌ５／ＨｉｎｃＩＩをセルフライゲーション（自己環化）させるようにライゲーションした（Ｔｏｌ５／ＨｉｎｃＩＩ／ｃｉｒｃｕｌａｒ）。続いてそれを鋳型としてインバースＰＣＲを行った。ＨｉｎｃＩＩ処理したベクターにライゲーションするため、ＨｉｎｃＩＩリンカーをつけたプライマーを用いた。条件は下記の通りである。得られた５ｋｂのＰＣＲ産物をＴｏｌ５−５ｋｂとした。
2009104281.tif 000003
得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理した。この操作は、クローニングの成功率を高めるため断片を短くすること、そしてリンカーをＨｉｎｃＩＩ切断面にすることを目的としている。それぞれのサンプルを分取するため、アガロースゲルからのＤＮＡ抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を行った。２．８ｋｂ断片及び１．８ｋｂ断片をそれぞれＴｏｌ５−２．８ｋｂ及びＴｏｌ５−１．８ｋｂとした。Ｔｏｌ５−２．８ｋｂ及びＴｏｌ５−１．８ｋｂをベクターとライゲーションさせた。その後、トランスフォーメーション（化学法；青白コロニー選別法）を行った。白コロニーをピックアップし、ＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドＤＮＡ少量抽出を行った。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理し、Ｅ．Ｐ．で確認した。制限酵素処理の結果、ベクター＋２．８ｋｂ及び１．８ｋｂという理想的なバンドが得られた。また、ＰＣＲでフラグメントの大きさと挿入方向を確認した。条件を以下に示す。
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ＰＣＲの結果、Ｔｏｌ５−２．８ｋｂにおいてはｐＵＣ１１８Ｒ×Ｔ１−５ｋｂ  Ｒ３のプライマーペアで２．８ｋｂの断片が増幅し、Ｔｏｌ５−１．８ｋｂにおいてはｐＵＣ１１８Ｆ×Ｔ１−５ｋｂ  ＲＣのプライマーペアで１．８ｋｂの断片が増幅した。この結果より挿入断片の大きさを確認するとともに、断片挿入の方向を決定することに成功した。これら２株をシークエンスした。シークエンスはプライマーウォーキング法によった。しかしシーケンサーのシグナルが乱れ、またコンピュータによるアッセンブリーにおいても、オーバーラップ領域と思われる部位でも一致しない塩基が出るなどの問題が生じた。解析の結果、配列中に長い複数の繰り返し配列があることがわかった。そのため、アッセンブリー後の長さも目的の挿入断片の長さである２．８ｋｂ又は１．８ｋｂに満たないなどの困難も生じた。そこでプライマーの設計とシークエンスを繰り返し、ようやく挿入断片の長さ分の塩基配列の決定に至った。しかしながら、このような繰り返し配列のため、結果の信頼性が低かった。そこでシークエンスの確実性を高めるため、Ｔｏｌ５−５ｋｂを直接クローニングして再度シークエンスすることとした。ＴＡクローニングを行うために、Ｔａｑ系で正確性が高いＤＮＡポリメラーゼＥａｓｙ−Ａを用いてＰＣＲし、Ｔｏｌ５−５ｋｂを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
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得られたＰＣＲ産物を用いてＴＡクローニングを行った。トランスフォーメーションは化学法で行い、ＬＢ／Ｋｍ寒天培地にスプレッディングした。コロニーをＬＢ／Ｋｍ液体培地に培養し、培養後プラスミドＤＮＡの抽出を行った。インサートを確認するため、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した。その結果、ベクターと５ｋｂのフラグメントの存在を確認できた。さらに、ＰＣＲにより挿入断片の大きさを確認した。条件を以下に示す。
2009104281.tif 000006
ＰＣＲの結果、インサートのバンド５ｋｂを確認できた。これをシークエンス解析した。シークエンスは再びプライマーウォーキング法によったが、リピート構造のため再び困難を極めた。先の１．８ｋｂと２．８ｋｂの配列情報を基に、慎重にプライマー設計とシークエンスを繰り返し、手間と時間をかけた末に、巨大なリピート構造を持つ４９０７ｂｐの配列を得ることに成功した。このＴｏｌ５−５ｋｂの配列とＴｏｌ５−２．８ｋｂ及びＴｏｌ５−１．８ｋｂの配列は完全に一致したことで、シークエンスの確実性は高まった。得られたＴｏｌ５−５ｋｂの配列を配列番号７に示す。この配列をもとに翻訳蛋白質をＢＬＡＳＴによりホモロジー検索にかけたところ、他の細菌で報告されているオートトランスポーターアドヘシンと２０〜３０％の相同性を示す４０２６ｂｐのＯＲＦを発見し、トランスポゾンもこのＯＲＦ内に挿入されていた。これによって、Ｔｏｌ５株の高い付着性とアペンデージの生産に関与するＯＲＦの存在を明らかにすることができた。しかしこのＯＲＦはＴｏｌ５−５ｋｂの３’末端で途切れており、全ＯＲＦを明らかにするにはＴｏｌ５−５ｋｂに続く下流域を新たにクローニングする必要があった。また、細菌の粘着に関わるオートランスポーターアドヘシンがホモロジー検索で示されたとは言え、相同性は低く、このグループを特定する決め手となるカルボキシ末端のメンブレンアンカードメインも現れていないことから、部分的に配列の似た別の蛋白質である可能性も十分に考えられた。
得られたシーケンスの結果を基にさらに下流の配列情報を得るため、サザンハイブリダイゼーションによる特定断片の取得を試みた。ＤＩＧラベルされたプローブ作成のため、リピート部分を避けてプライマーを作成した。そのプライマーを用いて、Ｔｏｌ５株の染色体ＤＮＡを鋳型にして目的バンド１６０ｂｐを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
2009104281.tif 000007
複数のバンドが増幅されたことから、解析した部分においては繰り返しのなかったプローブの配列部分も、未解析の下流領域でさらにリピートしていることが推定されたが、シークエンスを進めるために１６０ｂｐの目的バンドのみをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで切り出した。それを鋳型に、ＰＣＲを利用してプローブを作成した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
2009104281.tif 000008
得られたプローブを用いて、Ｔｏｌ５株の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で処理した消化物に対しサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素ＰｓｔＩの消化物において３ｋｂと２．３ｋｂの位置にプローブがハイブリダイズしたシグナルが検出された。そこでこれら二つのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）した。これらをＴｏｌ５−３ｋｂ及びＴｏｌ５−２．３ｋｂとした。切り出したＤＮＡとＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１１８をライゲーションした。得られた組換えベクターで、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した（化学法；青白コロニー選別法）。さらにコロニーハイブリダイゼーションにより、これら断片が導入された形質転換体を選別した。その結果、シグナルが出たのはＴｏｌ５−３ｋｂを導入したコロニーのみであった。シグナルが出た部分のコロニー（Ｔｏｌ５−ＣＣ，−Ｃ１，−Ｃ２，−Ｃ３）をピックアップし、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地で培養した後、プラスミドＤＮＡ少量抽出を行った。それぞれに対して制限酵素ＰｓｔＩで処理した。それをサザンハイブリダイゼーションすると、Ｔｏｌ５−ＣＣ、−Ｃ２、−Ｃ３にシグナルが出た。これらのシークエンスを行った。インサートの両端のシークエンスの結果、既知配列と一致する断片は存在しなかった。また、これらの配列はそれぞれ異なっていた。すなわち、先に塩基配列を決定した５ｋｂ領域（Ｔｏｌ５−５ｋｂ）に続く下流域のクローニングは失敗した。この時点ではその原因を特定することはできなかった。しかし、Ｔｏｌ５株の染色体ＤＮＡを鋳型にして行ったサザンハイブリダイゼーションで出た複数のシグナルから無理やり一つを選んで断片を切り出し、これからプローブを作成した点に問題があったのではないかと考えた。そこでこれらのクローニング株は一時保留とし、Ｔｏｌ５−５ｋｂに連続する断片の取得を目指した。
鋳型をＴｏｌ５染色体からｐＵＣ１１８：：Ｔｏｌ５−５ｋｂプラスミドＤＮＡに変更して、ＰＣＲ法により新しいＤＩＧ標識プローブを作成した。このプラスミドはプローブ領域を一箇所しか含まないため、ＤＩＧ標識された増幅断片も１本になると考えた。ＰＣＲ条件を以下に示す。
2009104281.tif 000009
予想通り増幅された断片は目的の大きさ（１６０ｂｐ）のもののみであり、純度の高い新しいプローブを作成することに成功した。このプローブを用いて、前述のＴｏｌ５−３ｋｂ及びＴｏｌ５−２．３ｋｂを含むベクターで形質転換操作後に得たプレートに対し、コロニーハイブリダイゼーションを行った。シグナルを出したと思われるコロニーをピックアップし、プレートに培養して再度コロニーハイブリダイゼーションして確認した。シグナルが出た部分のコロニー（３ｋｂのＮｏ．３及び２．３ｋｂのＮｏ．６，１２，１３，２１，２２）をピックアップし、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地で培養した後、プラスミドＤＮＡ少量抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで処理した。その結果、各プラスミドは目的の３ｋｂ（Ｎｏ．３）又は２．３ｋｂ（Ｎｏ．６，１２，１３，２１，２２）を含んでおり、それら挿入断片は全て１６０ｂｐのプローブとハイブリダイズした。これら断片がもし期待どおりにＴｏｌ５−５ｋｂに続く下流域を含むのなら、ＰｓｔＩサイトとＨｉｎｃＩＩサイトに挟まれた約１．５ｋｂの塩基配列をＴｏｌ５−５ｋｂと重複する領域として含むはずである。よってマルチクローニングサイトのＰｓｔＩサイトにこれら断片を挿入した前述のプラスミドを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理すれば、１．５ｋｂの重複断片にマルチクローニングサイトのごく一部が付加された約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が得られるはずである。そこでＮｏ．３，６，２２のプラスミドをＨｉｎｃＩＩで消化したところ、いずれからも約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。しかしその大きさはそれぞれ若干異なっていた。この中で、１．５ｋｂ断片の他、３．１ｋｂのベクター断片を含むと思われる３．３ｋｂ断片と６００ｂｐの断片に切断されたＮｏ．６のプラスミドを、まずはシークエンスすることとした。しかし、これまでのシークエンスやサザンハイブリダイゼーションの結果より、繰り返し配列の部分が多く、現在ハイスループットの手法として定着しているプライマーウォーキング法では、複数の部分にアニーリングして正しくシーケンスできないことが考えられた。また、コンピュータでのアッセンブリーにも支障が生じると想定された。すなわち、Ｔｏｌ５−５ｋｂの時に経験した困難が繰り返されるおそれがあった。そこで今回は、プライマーウォーキング法ではなく、手間と時間はかかるがディレーションミュータントシリーズを作成することとした。Ｎｏ．６に挿入された２．３ｋｂのＴｏｌ５のＤＮＡ断片を先の１．５ｋｂの重複断片の側から順次削ったミュータントを作成するため、このプラスミドを３’突出のＳａｃＩと５’突出のＸｂａＩで処理後、エキソヌクレアーゼＩＩＩで消化した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを作用させる時間をずらした一連の試料を作ることで、削られた長さの異なるディレーション産物を得た。その後さらにＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅによる末端平滑化とＫｌｅｎｏｗフラグメントによる末端修復を行い、最後にブラントエンドライゲーションに処すことにより、ディレーションプラスミドシリーズを得た。エタノール沈殿による精製後、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化によって消滅しているはずのＸｂａＩで処理することにより未反��のプラスミドの影響を排し、このＤＮＡで大腸菌ＤＨ５αを形質転換することでディレーションミュータントシリーズを得た。形質転換体コロニーを多数拾い上げて培養し、抽出したプラスミドを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理した。シーケンスの１パスの大きさ（８００ｂｐ〜）を考慮して適切な間隔でディレーションミュータントを選択してそれぞれシークエンスした。各シークエンス結果をつなぎ合わせ、２２８０ｂｐの塩基配列を決定した。この配列を配列番号８に示す（Ｔｏｌ５−Ｎｏ．６）。Ｔｏｌ５−Ｎｏ．６はＴｏｌ５−５ｋｂと重複する約１．５ｋｂの配列を含んでおり、これによってＴｏｌ５−５ｋｂに続く約７５０ｂｐの塩基配列を決定することができた。これによって、先述したオートトランスポーターアドヘシンと低い相同性を示す蛋白質をコードするＯＲＦは４７０７ｂｐに延び、それによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列も１５６９残基となった。しかしそれでもＯＲＦは終結しておらず、３’末端で切れていた。よってＴｏｌ５−Ｎｏ．６につながる下流域もさらにクローニングせねばならなくなった。またＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓのＥｍａＡと最も高い相同性を示したが、それでもアミノ酸レベルで２６％と低い相同性であり、メンブレンアンカードメインのコード領域に達していないので、ＴＡＡファミリーに属する蛋白質であるとは結論付けられなかった。いずれにしても、トランスポゾンの挿入により破壊された付着関連遺伝子のコードする蛋白質は非常に巨大で、しかも長い繰り返し配列が複雑に入り乱れる、新規の粘着蛋白質であると推定された。
Ｔｏｌ５−Ｎｏ．６に続く下流域の配列情報を得るため、新しく明らかになった配列を基に再びリピートを避けて１５８ｂｐのプローブを、Ｔｏｌ５−Ｎｏ．６の入ったプラスミドを鋳型に、ＰＣＲ法により作成した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
2009104281.tif 000010
合成したプローブ領域のすぐ上流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトが存在したので、Ｔｏｌ５の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、Ｅ．Ｐ．を行い、さらに１５８ｂｐプローブによりサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、またしても３つのシグナルが確認されたので、全てのシグナル部分をアガロースゲルから切り出し、ＤＮＡを抽出した（ＤＥＡＥペーパー）。分子量の大きい順に、Ｔｏｌ５−Ｂ（２５００ｂｐ）、Ｔｏｌ５−Ｍ（１２００ｂｐ）、Ｔｏｌ５−Ｓ（６００ｂｐ）とした。切り出したＤＮＡとＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＵＣ１１８をライゲーションした。ライゲーション後のＤＮＡを精製し、続いてトランスフォーメーション（エレクトロポレーション；青白コロニー選別法）を行った。コロニーが形成されたプレートを、先の１５８ｂｐのプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションに処した。シグナルが出た部分のコロニーをピックアップし、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地で培養した。プラスミドＤＮＡ少量抽出を行い、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理して挿入断片の長さを確認したところ、２５００ｂｐ、１２００ｂｐ、６００ｂｐの長さのＴｏｌ５株ＤＮＡ断片の挿入が確認されたので、これらプラスミドをシークエンスした。Ｍ断片及びＳ断片は短いため、１パスシーケンスにより、それぞれ１１８５ｂｐ及び６０３ｂｐの塩基配列を決定できた。また、Ｂ断片のシークエンスのために、ディレーションミュータントを作成した。Ｂ断片を含むプラスミドを３’突出のＳａｃＩと５’突出のＸｂａＩで処理後、エキソヌクレアーゼＩＩＩで消化した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを作用させる時間をずらした一連の試料を作ることで、削られた長さの異なるディレーション産物を得た。その後さらにＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅによる末端平滑化とＫｌｅｎｏｗフラグメントによる末端修復を行い、最後にブラントエンドライゲーションに処すことにより、ディレーションプラスミドシリーズを得た。エタノール沈殿による精製後、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化によって消滅しているはずのＸｂａＩで処理することにより未反応のプラスミドの影響を排し、得られたＤＮＡ試料で大腸菌ＤＨ５αを形質転換することでディレーションミュータントシリーズを得た。形質転換体コロニーを多数拾い上げて培養し、抽出したプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで二重消化した。シーケンスの１パスの大きさ（８００ｂｐ〜）を考慮して適切な間隔でディレーションミュータントを選択してそれぞれシークエンスした。各シークエンス結果をつなぎ合わせ、２５４０ｂｐのＢ断片の塩基配列を決定した。決定したＴｏｌ５−Ｂ、Ｔｏｌ５−Ｍ、Ｔｏｌ５−Ｓの配列を配列番号９〜１１にそれぞれ示す。このうちＴｏｌ５−Ｍ断片はＴｏｌ５−Ｎｏ．６と１００％配列が一致する重複領域として、５３３ｂｐの塩基配列を含んでいた。しかし同じＨｉｎｄＩＩＩ断片であるＴｏｌ５−Ｂ、−Ｍ、−Ｓの各断片は互いに重複領域を含んでおらず、−Ｍ断片がＴｏｌ５−Ｎｏ．６に続くことが推定されただけで、他の二つの断片の位置関係はわからなかった。これら断片はお互いにほとんど同じ塩基配列領域を含んでおり、１５８ｂｐのプローブ領域もそこに位置していた。すなわちこれら断片も繰り返し配列を形成する巨大な断片の一部であると推定された。Ｔｏｌ５−Ｍ断片の重複によってＯＲＦは５３５８ｂｐに延び、それによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列も１７８５残基となった。しかしそれでもＯＲＦは終結しておらず、３’末端で切れていた。よってＴｏｌ５−Ｍ断片につながる下流域の塩基配列もさらに明らかにせねばならなくなった。最も高い相同性を示したのはやはりＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓのＥｍａＡであったが、アミノ酸レベルで２５％の相同性しか示さず、未だメンブレンアンカードメインのコード領域に達していなかったので、同ファミリーに属する蛋白質であるかどうかは依然判然としない状態であった。
ここで、最初にＴｏｌ５−５ｋｂに続く下流域をクローニングしようとしてサザンハイブリダイゼーションにより得たが、Ｔｏｌ５−５ｋｂにつながらなかったＴｏｌ５のＤＮＡ断片、Ｔｏｌ５−ＣＣ、Ｔｏｌ５−Ｃ２を改めてシークエンスすることにした。ともに繰り返し配列を含むことが想定されるため、それぞれディレーションミュータントを作成した。プラスミドを３’突出のＳａｃＩと５’突出のＸｂａＩで処理後、前述と同じ手順によりディレーションミュータントシリーズを作成し、シークエンスを行ってつなぎ合わせ、Ｔｏｌ５−ＣＣとＴｏｌ５−Ｃ２の塩基配列を決定した。得られたＴｏｌ５−Ｃ２、Ｔｏｌ５−ＣＣの配列を配列番号１２及び１３に示す。
Ｔｏ１５−Ｂ，Ｍ，Ｓ断片及びＴｏｌ５−ＣＣ，Ｃ２断片の配列の重複解析によって、位置関係を決定した。配列が１００％一致するところのみを重複とした。１５８ｂｐプローブによるサザンハイブリダイゼーションで検出されたシグナルは３つであったが、重複解析及びＴｏｌ５−Ｃ２の解析の結果より、実際は４つの断片であったことが判明した。４つ目の断片はＴｏｌ５−Ｓと大きさ及び配列がほぼ同じであったため、約６００ｂｐのシグナルに重なって存在していたことになる。その領域をＴｏｌ５−Ｓ’とした。以上を整理すると、Ｔｏｌ５−Ｍ、Ｔｏｌ５−Ｓ’、Ｔｏｌ５−Ｓ、Ｔｏｌ５−Ｃ２、Ｔｏｌ５−Ｂ、Ｔｏｌ５−ＣＣ断片の順に重複しながら並ぶことが明らかとなった。その結果、ＯＲＦは１０７９８ｂｐに延び、それによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列も３５９８残基となった。しかしそれでもＯＲＦは終結しておらず、３’末端で切れていた。よってＴｏｌ５−ＣＣにつながる下流域もさらにクローニングせねばならなくなった。最も高い相同性を示したのはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍのＴＡＡであったが、アミノ酸レベルで２５％の相同性しか示さなかった。メンブレンアンカードメインの配列を一部含んでいるようではあったが、全てが含まれているわけではなく、この部分の高次構造の予測も不可能であったので、この時点でもＴＡＡファミリーに属すると結論することはできなかった。またその大きさも既報のＴＡＡでは最大であったＢａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅのＢａｄＡ（３０３６アミノ酸）よりもずっと大きいことも明らかとなった。
これまでのシーケンスの結果、Ｔｏｌ５−ＣＣのＣ末端領域はリピート配列が認められなかった。したがってＣ末端領域で５０７ｂｐのプローブを作成し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理したＴｏｌ５株のＤＮＡを鋳型にしてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、５ｋｂの位置にシグナルが検出され、この断片をＴｏｌ５−Ｃ５ｋｂとした。このＤＮＡをアガロースゲルから切り出し抽出（ＤＥＡＥペーパー）し、それをＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１１８ベクターとライゲーションしてトランスフォーメーション（エレクトロポレーション；青白コロニー選別法）を行った。白コロニーをピックアップし、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地で培養した。液培地中の菌体からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理してインサートを確認した。Ｔｏｌ５−Ｃ５ｋｂ内にはリピート構造がないと推察し、プライマーウォーキングで配列を決定した。得られたＴｏｌ５−Ｃ５ｋｂの配列を配列番号１４に示す。Ｔｏｌ５−Ｃ５ｋｂはＴｏｌ５−ＣＣの配列と重複しており、Ｔｏｌ５−ＣＣにつながる下流域であることが判明した。そしてこれがつながったことで、１０，８９３ｂｐ（配列番号１）にも及ぶ巨大なＯＲＦが完結し、それによってコードされる３，６３０アミノ酸（配列番号２）からなる巨大蛋白質が明らかとなった。これがトランスポゾンの挿入によって破壊された付着に関連した遺伝子の本体である。ここまでに示した配列断片の位置関係を図１に示す。こうして粘着に関連した蛋白質をコードする巨大なＯＲＦを含むＴｏｌ５株の遺伝子断片１５０１１ｂｐの塩基配列が決定された。
１−３  付着関連遺伝子の配列
各種クローニング株をシークエンスした結果得られた配列断片をつなぎ合わせる操作は、ＧＥＮＥＴＹＸを用いて行った。多くの複雑なリピート構造を持つ遺伝子であることが判明したため、配列と配列をつなぎ合わせる際には配列が１００％一致する場合のみを重複部分とみなした。本実施例でのクローニングとシークエンスの結果得られた全塩基配列を図２及び配列番号１５に示す。
１−４  バイオインフォマティクス解析
塩基配列の中でどの領域が蛋白質をコードしているかを検索する必要がある。ＯＲＦ  ｆｉｎｄｅｒ及びＧｅｎｅＭａｒｋを用いて、蛋白質をコードする領域を予測した。その結果、取得した遺伝子の中にＯＲＦが４つ存在すると推察された。トランスポゾンが挿入されていたのは前述の巨大ＯＲＦであり、このＯＲＦがコードする蛋白質が付着因子であると言える。また、５’末端及び３’末端のＯＲＦは終止コドンが確認されていないため、途中で切れていることになる。蛋白質をコードする場合、開始コドンの上流にはリボソーム結合部位及びプロモーター部位が存在する。それらの配列は保存されていることが多いため、付着関連遺伝子の巨大ＯＲＦについてプロモーター部位の存在を検索した。その結果、それらの存在が確認された。以下にその領域を示す。これにより、開始コドンは９２５の位置ではなく９４９の位置のものが正しいと予測された。
2009104281.tif 000011
各ＯＲＦについて、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った。その結果、付着関連の巨大ＯＲＦがコードする巨大な蛋白質全体にわたって相同性を示す蛋白質は存在しなかった。しかし、部分的には、ＴＭファミリーに属する蛋白質と相同性を示す領域を含んでいた。
ＴＡＡファミリーに属する蛋白質はシグナルペプチド、ヘッドドメイン、ネックドメイン、ストークドメイン、メンブレンアンカードメインというドメインを有している。そこで、各ドメインそれぞれについてＣｌｕｓｔａｌＷを用いてマルチプルアラインメントを作成し、配列を比較した。その結果を図４に示す。メンブレンアンカーについては、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎを用いて二次構造予測した結果も合わせて示した。比較対象はＴＡＡファミリーのメンバーである。その結果、シグナルペプチド、ヘッドドメイン、ネックドメインではＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓのＥｍａＡの各ドメインと最も相同性が高く、それぞれ３４％、４４％、５２％の相同性を示した。また、ＴＭファミリーの中では最も研究がなされこの蛋白質ファミリーのプロトタイプとも言えるＹｅｒｓｉｎａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのＹａｄＡとは、それぞれ、１１％、２３％、４０％の相同性を示した。メンブレンアンカーについてはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓのオートトランスポーターアドヘシンと４８％の、ＹａｄＡと２５％の相同性を示した。一方、２５９１アミノ酸からなるストークドメインについては、部分的にはＴＡＡファミリーのメンバーと相同性を示すことがＢＬＡＳＴ解析によって示されたがその相同性は低かった。例えば最も高い相同性を示したのはＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓのＹａｄＡ様蛋白質であるが、２５９１アミノ酸のうちの８００アミノ酸の部分がこの蛋白質と３３％の相同性を示したに過ぎない。以上、各ドメインでは相同性のある蛋白質としてＴＡＡファミリーの蛋白質がＢＬＡＳＴ解析によって示されたが、それらの相同性は高いレベルではない。しかし、ＴＡＡファミリーを最も特徴づけるのは、メンブレンアンカードメインの立体構造である。ＴＡＡはホモ三量体であり、各ポリペプチド鎖は１つのαヘリックスと４つのβストランドを有し、これが三本集まって１２βストランドとなり、グラム陰性細菌の外膜中にβバレル構造を形成して蛋白質分泌用のトンネルとなる。そこでＴｏｌ５の付着関連蛋白質のメンブレンアンカー相当領域のアミノ酸配列から二次構造を予測したところ、１つのαヘリックスと４つのβストランドを有していることが推定された。このことと各ドメインの並びなどを考え合わせると、Ｔｏｌ５株の付着蛋白質はＴＡＡファミリーに属する新規蛋白質であると推定され、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌のアドヘシンを意味するＡａｄＡと命名した。ＡａｄＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ＡａｄＡのアミノ酸配列を図３及び配列番号２に示す。ＡａｄＡは１０，８９３ｂｐの遺伝子でコードされる３，６３０アミノ酸で構成されている。ＡａｄＡは既報のＴＭファミリーの蛋白質よりずっと大きく、複数の長い繰り返し構造が複雑に配置するストークドメインは他の蛋白質とも相同性が低く、またヘッドドメインとネックドメインが、アミノ末端側だけでなくメンブレンアンカードメインのあるカルボキシ末端寄りにも存在するなど、既報のメンバーと比べて特異なＴＡＡである。この特異性がＴｏｌ５株の付着性の高さや非特異的付着能を与えているかどうかについては、現時点ではわからない。ただこれまで報告されているＴＡＡは全て、病原性細菌が感染する際に宿主の細胞や細胞外マトリックスに特異的に付着するためのものであるし、高い粘着力を示すものなどの報告もない。
ＯＲＦの相同性検索の結果、ａａｄＡ遺伝子のすぐ下流に、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌などが持つ外膜蛋白質ＯｍｐＡと相同性を示す蛋白質のＯＲＦを発見した。これをＴｏｌ５−ＯｍｐＡと命名した。Ｔｏｌ５−ＯｍｐＡの塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｔｏｌ５−ＯｍｐＡは７９５ｂｐの遺伝子でコードされる２６４アミノ酸からなる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてマルチプルアラインメントを作成し、Ｔｏｌ５−ＯｍｐＡの配列と相同性を示した外膜蛋白質の配列と比較した。その結果を図５に示す。大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉのＯｍｐＡと比較すると、Ｃ末端領域では相同性が高いがＮ末端領域では相同性が低い。一方で、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌が持つ外膜蛋白質とは全体にわたって相同性が高い。しかしそれらの機能についての報告はない。ただ、ＡａｄＡのＯＲＦと近接していることからａａｄＡとＴｏｌ５−ｏｍｐＡは同一オペロン上にある可能性が高い。また外膜蛋白質ということなので、Ｔｏｌ５−ｏｍｐＡも付着や粘着性のアペンデージ生産に関わっている可能性がある。
塩基配列を決定したＴｏｌ５株の遺伝子断片１５０１１ｂｐの５’末端に存在するＯＲＦは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１などが有するメチオニル−ｔＲＮＡホルミルトランスフェラーゼと高い相同性を示した。また、３‘末端に存在するＯＲＦは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１などが有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼと高い相同性を示した。どちらの蛋白質も付着に関連した機能を有するという報告はないため、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｔｏｌ５においても付着には関連がないと推定された。
１−５  ＡａｄＡ遺伝子全長のクローニング
これまでのシーケンスが正しいことを確認するために、推定プロモーター部位を含むａａｄＡ全長をＰＣＲにより増幅してその長さを確認した。用いたプライマーＴｏｌ５−ＴＫＤ−Ｆ及びＴｏｌ５−ＴＫＤ−Ｒの領域を以下に示す。
プライマーＴｏｌ５−ＴＫＤ−Ｆ：
2009104281.tif 000012
プライマーＴｏｌ５−ＴＫＤ−Ｒ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）：
2009104281.tif 000013
ＰＣＲの条件は下記の通りである。
2009104281.tif 000014
ＰＣＲの結果、これまでのクローニング及びシークエンスで得られた配列１１，１４５ｂｐ（約１１ｋｂ）に相当するバンドが得られ、これをＴｏｌ５−１１ｋｂとした。続いて得られた産物を用いてＴＡクローニングを行った。トランスフォーメーションはエレクトロポレーションで行い、ＬＢ／Ｋｍ寒天培地にスプレッディングした。形成されたコロニーをＬＢ／Ｋｍ液体培地に培養し、培養後プラスミドＤＮＡの抽出を行った。インサートを確認するため、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した。さらに、ＰＣＲで確認した。条件を以下に示す。
2009104281.tif 000015
制限酵素処理の結果、ベクター及びＡａｄＡの理想的なバンドがシャープに確認できた。また、ＰＣＲの結果からもＡａｄＡの大きさにバンドが確認できた。さらに、プラスミドＤＮＡをシークエンスした結果、挿入した断片の両端の配列が先に決定した塩基配列と完全に一致した。従って、これまでのシーケンスの精度を確認するとともに、推定プロモーター配列を含むａａｄＡ遺伝子約１１ｋｂのクローニングに成功した。
さらに、推定プロモーターを含むａａｄＡ及びＴｏｌ５−ｏｍｐＡを含んだ遺伝子約１２，５０５ｂｐ（約１３ｋｂ）のクローニングを試みた。ＰＣＲで断片を増幅した。条件は下記の通りである。
2009104281.tif 000016
用いたプライマーＴｏｌ５−ａｄ−ｏｐ−Ｒ３の領域を以下に示す。
2009104281.tif 000017
得られた約１３ｋｂの断片をＴｏｌ５−１３ｋｂとし、これを用いてＴＡクローニングを行った。トランスフォーメーションはエレクトロポレーションで行い、ＬＢ／Ｋｍ寒天培地にスプレッディングした。コロニーをＬＢ／Ｋｍ液体培地に培養し、培養後プラスミドＤＮＡの抽出を行った。インサートを確認するため、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した。さらに、ＰＣＲで確認した。条件を以下に示す。
2009104281.tif 000018
制限酵素処理及びＰＣＲからは理論通りの長さのインサートバンドが確認された。このプラスミドＤＮＡをシークエンスした結果、挿入断片の両端の配列は既知の配列と完全に一致した。したがって、推定プロモーターを含むａａｄＡ及びＴｏｌ５−ｏｍｐＡ含む遺伝子、すなわち１１，８５８ｂｐのａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロン（配列番号５）を含む約１３ｋｂの遺伝子のクローニングに成功した。配列番号５で表される塩基配列においては、１〜１０６位がプロモーター／リボソーム結合部位であり（配列番号２９）、１０７〜１０９９９位がａａｄＡ遺伝子であり、１１０６４〜１１８５８位がＴｏｌ５−ｏｍｐＡ遺伝子である。
実施例２  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｔｏｌ５株の付着関連遺伝子を組込んだ大腸菌の性状評価
ａａｄＡ遺伝子及びａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組込んだベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（それぞれＤＨ５α：：ａａｄＡ及びＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡと命名）、そしてコントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α野生株（ＷＴ）の性状を比較した。ａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組込んだベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αは、「ＤＨ５α−ＸＬＴＯＰＯ：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡ」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−４９０（受領日２００８年（平成２０年）２月１９日）として受領されている。
２−１  光学顕微鏡による形態観察
ａａｄＡ遺伝子及びａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組み込んだことによる形態の変化を観察するため、ＤＨ５α：：ａａｄＡ、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡ、ＤＨ５α  ＷＴの３種の株についてグラム染色を施し、光学顕微鏡で観察した。結果を図６に示す。
ａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組み込んだ株ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡでは、菌体の他に菌体間をつなぐ線状の構造物が観察できた。ＥＰＳ（菌体外ポリマー）のようにも見えるこの物質は付着力の付加に関係があると考えられる。ａａｄＡを組み込んだ株ＤＨ５α：：ａａｄＡでは、菌体が細長く、極で連結している様子が観察された。いずれも野生株とは明らかに異なる形態をしており、付着関連遺伝子の導入によって形態が変化したことがわかる。
２−２  電子顕微鏡による形態観察
遺伝子導入による形態の変化をより詳しく観察するため、ＤＨ５α：：ａａｄＡ、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡ、ＤＨ５α  ＷＴの３種の株について走査型電子顕微鏡ＦＥ−ＳＥＭ及び透過型電子顕微鏡ＴＥＭを用いて形態を観察した。ＦＥ−ＳＥＭによる観察の結果を図７〜９に示す。
ＤＨ５α：：ａａｄＡにおいては、菌体が付着しているポリウレタン担体表面と、付着していないポリウレタン担体表面がはっきり分かれている様子が観察された。つまり、凝集体のようなものを形成してその凝集体単位での付着が起こっているように観察された。凝集体内では多量のＥＰＳ様構造物を生産し、多層にわたって菌体同士が積み上げられ付着している様子が観察された。また、ＤＨ５α：：ａａｄＡの菌体の中には形状が細長く変化しているものが比較的多く観察された。これは、光学顕微鏡による観察の結果得られた像と一致した。拡大してみると、細長い形状の中には節目のようなものが確認でき、菌体が極に連なっているような様子が観察された。また、細長く変化した菌体からもアペンデージのような構造物が観察された（図７）。
ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡは非常に多くの菌体がポリウレタン担体へ付着している様子が観察された。その様子は、菌体一つ一つが担体へ付着しているようで、担体表面へ均一に単層のフィルムを形成するかのようであった。また、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡはＥＰＳ様の構造物を生産している様子も観察された。これは、光学顕微鏡での観察と一致する。さらに、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡには菌体と担体とを結ぶアペンデージのようなものが多く観察された（図８）。
２つの組換え株と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＷＴはポリウレタン担体へ付着している菌体がほとんどなく、「付着」というよりも「偶然乗った」かのように見えた。また、アペンデージのような構造物を生産している菌体は少なかった（図９）。
このように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αへＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｔｏｌ５のａａｄＡ遺伝子及びａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組み込むことによってその付着形態を変化させることに成功した。
さらに、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡとＤＨ５α：：ａａｄＡとの間にも違いが観察された。ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡは個々の菌体細胞がばらばらに担体に付着し均一な層を形成していたが、菌体同士で凝集し多層を形成することはなかった。それに対してＤＨ５α：：ａａｄＡは菌体細胞が巨大な凝集体を形成し、担体に多層となって付着していたが、個々の細胞がばらばらに担体に付着する様子は観察されなかった。
２−３  付着試験及び凝集試験
ａａｄＡ及びａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンを組み込んだことによる付着性の変化を確かめるために、クリスタルバイオレット染色による付着試験（ＣＶ付着試験）を行った。付着試験は次の試験法により評価した。
＜付着試験＞
１．菌体培養液を３，４００ｒｐｍ、室温、１０分間遠心分離する。
２．デカントで培地を除き、適量のＭＡＴＳテスト用ＢＳ培地を加える。
３．超音波処理（ＵＤ−２００；ＴＯＭＹ）をＯＵＴＰＵＴ＝５、ＴＩＭＥ＝２０秒で施して菌体を懸濁させ、ＯＤ６６０がおよそ０．２になるように調整する。
４．４８穴マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに懸濁液を１ｍｌずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートする。
５．ウェル中の懸濁液をすべて吸い取る。その際、チップの先端でプレートを擦り取らないように注意する。
６．１ｍｌのＭＡＴＳテスト用ＢＳ培地でウェルを洗浄する。その後プレートを風乾する。
７．１％クリスタルバイオレットをウェルへ加え、室温で１５分間インキュベートする。
８．１％クリスタルバイオレットを全て吸い取り、１ｍｌのＭＡＴＳテスト用ＢＳ培地でウェルを２回洗浄する。その後プレートを風乾する。
９．１ｍｌのＭＡＴＳテスト用ＢＳ培地を加え、超音波処理をＯＵＴＰＵＴ＝４、ＴＩＭＥ＝２０秒で施して染色菌体をＢＳ培地中に分散させる。
１０．Ａ５９０を測定する。
Ｍ９培地で培養した菌体の付着試験の結果を以下に示す。
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付着関連遺伝子を組み込んだ大腸菌は、野生株と比較して固体表面への付着力が向上した。この結果は、付着関連遺伝子を組み込むことで付着能力が低い菌に付着能力を付加することに成功したことを示している。さらに、本研究で取得したａａｄＡ遺伝子及びａａｄＡ−ｏｍｐＡオペロンが微生物の付着に関係していることを証明している。
各株の培養液を観察すると、各株の間で違いが現れていた（図１０）。野生株は均一に白濁するのに対し、ＤＨ５α：：ａａｄＡ−ｏｍｐＡ、ＤＨ５α：：ａａｄＡは肉眼で観察できる程度にわずかに凝集し、透明度を保っていた。
凝集性を定量的に示すため、凝集試験を行った。凝集試験は次の試験法により評価した。
＜自己凝集試験＞
１．  菌体培養液を遠心分離にかけ、培養上清を除いた。
２．  無機塩培地を菌体ペレットに加え、超音波処理により菌体懸濁液を得た。
３．  菌体懸濁液の濁度ＯＤ６６０を一定になるように培地で調整した。この時のＯＤ６６０を初期ＯＤ６６０とした。
４．  ガラス遠沈管の中の菌体懸濁液を室温で静置することで、形成された細胞自己凝集体を沈降させ、上清のＯＤ６６０の時間変化を測定した。
５．  自己凝集率を下記の式により算出した。
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その結果を図１１に示す。
グラフに示したように、ＤＨ５α  ＷＴと比較してＤＨ５α：：ａａｄＡは凝集性が向上していた。この結果は、培養液の透明度、ＦＥ−ＳＥＭ観察の結果と一致する。これらの結果より、ａａｄＡ遺伝子の導入は、菌体細胞に凝集性も与えることが証明された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月7日(2008.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法であって、
オートトランスポーターアドヘシンをコードする以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを、該標的微生物に導入することを含む、前記方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡが、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡである、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
標的微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌である請求の範囲第１項又は第３項記載の方法。
【請求項５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が大腸菌である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするＤＮＡとともに、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入する、請求の範囲第１項及び第３項〜第５項のいずれか１項記載の方法：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを標的微生物に導入する、請求の範囲第６項記載の方法：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、宿主微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有するＤＮＡ。
【請求項８】
請求の範囲第１項及び第３項〜第７項のいずれか１項記載の方法によって得られる、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載のＤＮＡが導入された、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
【請求項１１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌である、請求の範囲第１０項記載の微生物。
【請求項１２】
大腸菌である、請求の範囲第１１項記載の微生物。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質。
【請求項１４】
微生物の培養方法であって、
請求の範囲第８項、第１０項、第１１項又は第１２項記載の微生物を、担体に付着させる、及び／又は凝集させることにより、該微生物を回収することを含む、前記方法。
【請求項１５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法であって、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌に導入することを含む、前記方法。
【請求項１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が大腸菌である請求の範囲第１５項記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月20日(2010.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法であって、
非特異的付着性を有する微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAを、該標的微生物に導入することを含む、前記方法。
【請求項２】
非特異的付着性を有する微生物がAcinetobacter属細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAが、以下の(a)、(b)又は（C）のDNAである、請求項１又は２記載の方法：
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号１で表される塩基配列と70％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項４】
標的微生物がEscherichia属細菌である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Escherichia属細菌が大腸菌である請求項４記載の方法。
【請求項６】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAとともに、以下の(a)又は(b)のDNAを導入する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法：
(a)配列番号３で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号３で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA。
【請求項７】
以下の(a)又は(b)のDNAを標的微生物に導入する、請求項６記載の方法：
(a)配列番号５で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号５で表される塩基配列と70％以上の相同性を有する塩基配列からなり、宿主微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有するDNA。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法によって得られる、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
【請求項９】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNA：
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号１で表される塩基配列と70％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項１０】
請求項９記載のDNAが導入された、非特異的付着性及び／又は凝集性が付与又は増強された微生物。
【請求項１１】
Escherichia属細菌である、請求項１０記載の微生物。
【請求項１２】
大腸菌である、請求項１１記載の微生物。
【請求項１３】
以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質：
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質、
(c)配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部からなり、微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有する蛋白質。
【請求項１４】
微生物の培養方法であって、
請求項８、１０、１１又は１２記載の微生物を、担体に付着させる、及び／又は凝集させることにより、該微生物を回収することを含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項８、１０、１１又は１２記載の微生物を使用することを特徴とする、微生物を用いた化学品の生産方法。
【国際調査報告】
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