(57)【要約】  基質特異性が高く、かつ十分な熱安定性を有するとともに、好ましくは大腸菌、酵母、カビ等を宿主細胞とした効率的な生産に適したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を提供する。  配列番号８記載のアミノ酸配列における２１３位、３６８位および５２６位からなる群の１以上に相当する位置におけるアミノ酸置換を有するＦＡＤ−ＧＤＨ。このＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子を大腸菌等の宿主細胞に導入して、培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを取得する。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの好ましい一例としては、ケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列からＮ末端領域に存在するシグナルペプチド領域を欠失させ、さらに前記のアミノ酸置換を有するＦＡＤ−ＧＤＨが挙げられる。  臨床診断等に好適に利用可能な、基質特異性が高く熱安定性に優れたＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に生産できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、以下：
配列番号８記載のアミノ酸配列における２１３位のバリン又はこれに相当するアミノ酸残基、
配列番号８記載のアミノ酸配列における３６８位のスレオニン又はこれに相当するアミノ酸残基、
配列番号８記載のアミノ酸配列における５２６位のイソロイシン又はこれに相当するアミノ酸残基、
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
以下：
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリン、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８７位のスレオニン、
配列番号１記載のアミノ酸配列における５４５位のイソロイシン、
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、請求項１に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
配列番号８で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、以下：
配列番号８記載のアミノ酸配列における２１３位に相当する位置のアミノ酸残基が、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸のいずれかであり、
配列番号８記載のアミノ酸配列における３６８位に相当する位置のアミノ酸残基がアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインのいずれかであり、
配列番号８記載のアミノ酸配列における５２６位に相当する位置のアミノ酸残基が、バリン、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸のいずれかである
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
以下：
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位に相当する位置のアミノ酸残基が、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸のいずれかであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８７位に相当する位置のアミノ酸残基がアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインのいずれかであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列における５４５位に相当する位置のアミノ酸残基が、バリン、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸のいずれかである
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、請求項３に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科、最も好ましくはムコール（Ｍｕｃｏｒ）属由来に分類される微生物に由来する野生型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド領域に相当するアミノ酸領域部分を欠失させたアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、大腸菌において組換え生産を行った際に以下：
作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約７０ｋＤａである、及び
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性に対して、マルトース、Ｄ−ガラクトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであって、大腸菌において組換え生産を行った際に、３５℃、１０分間の熱処理後に３％以上の残存活性を有する、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項７】
以下：
配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
配列番号９で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は
配列番号９で示される塩基配列と９０％以上相同な塩基配列を有し、かつ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ；
からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
以下の工程：
請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを回収する工程
を含む、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
【請求項１２】
請求項１〜５に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする、グルコースアッセイキット。
【請求項１３】
請求項１〜５に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする、グルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質特異性が高く、かつ、熱安定性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、および、それを用いたグルコース測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。【０００３】
一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ−ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。【０００４】
近年、ＰＱＱ−ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ−ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ−キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ−ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５〜３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。【０００５】
上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２〜５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１〜３参照）、さらにＤ−キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。【０００６】
しかし、上記の酵素は、Ｄ−グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、出願人は、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたフラビン結合型ＧＤＨが、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することを見出した（例えば、特許文献５参照）。また、このＧＤＨを用いれば、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能であることを確認した（例えば、特許文献５参照）。このような優れた基質特異性は、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの実用上の優位性を示す大きな特徴である。さらに、出願人は、特許文献５において、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列もあわせて開示し、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列を利用した大腸菌を宿主とする組換え発現についても開示している。【０００７】
一方、大腸菌等の微生物を宿主として有用な酵素を大量生産させる方法が広く知られており、本来の由来微生物中で十分な量の酵素を生産することが難しい場合に、この方法を用いることにより効率的な生産が可能となる例も多くある。出願人もこれを意図して、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列情報に基づき、大腸菌を用いた組換え生産を試みた。しかし、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子を大腸菌で発現させても、発現量が非常に少ないことに加えて、宿主の違いにより糖鎖の付加が起こらないためかと思われるが、本来の由来微生物により生産されるＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、その熱安定性が大幅に低下してしまうことがわかった。そこで本発明者らは、ケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド領域に相当するアミノ酸配列、具体的には、ＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させたＦＡＤ−ＧＤＨが、Ｎ末端領域を欠失させないケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の全長を用いた場合と比較して、大腸菌において効率よくＦＡＤ−ＧＤＨを生産することができることを見出した。しかし、熱安定性の点では、このＮ末端領域を欠失させたＦＡＤ−ＧＤＨでも依然として十分とは言い難かった。
なお、出願人は、特許文献６において、チゴサッカロマイセス属の酵母で発現させたケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨが優れた基質特異性及び耐熱性を有していることを別途見出している。すなわち、Ｎ末端領域を欠失させないケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を酵母で発現させた場合等においては、Ｎ末端領域を欠失させたケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現させた場合と比較すれば、発現されるケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨは耐熱性が優れていることがわかっている。しかしながら、センサーチップの作製時には加熱処理を施す場合が想定され、そのような用途を含む過酷な熱条件に供する可能性を想定すると、酵母で発現させたケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨに関しても、さらなる耐熱性を付与する試みが継続的に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】特許第４４９４９７８号公報
【特許文献３】国際公開第０７／１３９０１３号
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０号公報
【特許文献５】特許第４６４８９９３号公報
【特許文献６】特願２０１０−２６９０５６
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ｉ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，  Ｔ．  Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２６５−２７６  （１９６７）．
【非特許文献３】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  ＩＩ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２７７−２９３  （１９６７）．
【非特許文献４】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  ＩＩＩ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３１７−３２７  （１９６７）．
【非特許文献５】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  ＩＶ．  Ｈｉｓｔｉｄｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３２８−３３５  （１９６７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、基質特異性が高く、かつ十分な熱安定性を有するとともに、好ましくは大腸菌、酵母、カビ等を宿主細胞とした効率的な生産に適したＦＡＤ−ＧＤＨを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ね、基質特異性が高く、かつ十分な熱安定性を有するとともに、好ましくは大腸菌、酵母、カビ等を宿主細胞とした効率的な生産に適したＦＡＤ−ＧＤＨを探索した結果、公知のＦＡＤ−ＧＤＨに変異を導入することにより、基質特異性が高く、かつ十分な熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨが得られることを見出した。さらに、この変異を有し、Ｎ末端の特定部位を欠失したＦＡＤ−ＧＤＨが、大腸菌等を宿主細胞とした効率的な生産という観点においても優れた新規なＦＡＤ−ＧＤＨであることを見出した。さらに、カビや酵母を宿主として、シグナルペプチドを除去しない全長のＦＡＤ−ＧＤＨを生産させる場合にも、上記の変異点の効果が有効であることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］配列番号８で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、以下：
配列番号８記載のアミノ酸配列における２１３位のバリン又はこれに相当するアミノ酸残基、
配列番号８記載のアミノ酸配列における３６８位のスレオニン又はこれに相当するアミノ酸残基、
配列番号８記載のアミノ酸配列における５２６位のイソロイシン又はこれに相当するアミノ酸残基、
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
[２]以下：
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位のバリン、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８７位のスレオニン、
配列番号１記載のアミノ酸配列における５４５位のイソロイシン、
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、［１］に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
[３]配列番号８で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、以下：
配列番号８記載のアミノ酸配列における２１３位に相当する位置のアミノ酸残基が、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸のいずれかであり、
配列番号８記載のアミノ酸配列における３６８位に相当する位置のアミノ酸残基がアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインのいずれかであり、
配列番号８記載のアミノ酸配列における５２６位に相当する位置のアミノ酸残基が、バリン、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸のいずれかである
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
［４］以下：
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３２位に相当する位置のアミノ酸残基が、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸のいずれかであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８７位に相当する位置のアミノ酸残基がアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインのいずれかであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列における５４５位に相当する位置のアミノ酸残基が、バリン、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸のいずれかである
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、［３］に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
［５］ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科、最も好ましくはムコール（Ｍｕｃｏｒ）属由来に分類される微生物に由来する野生型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド領域に相当するアミノ酸領域部分を欠失させたアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、大腸菌において組換え生産を行った際に以下：
作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約７０ｋＤａである、及び
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性に対して、マルトース、Ｄ−ガラクトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼであって、大腸菌において組換え生産を行った際に、３５℃、１０分間の熱処理後に３％以上の残存活性を有する、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
［７］以下：
配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
配列番号９で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は
配列番号９で示される塩基配列と９０％以上相同な塩基配列を有し、かつ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ；
からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
［８］［６］又は［７］に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、ベクター。
［９］［８］記載のベクターを含む、宿主細胞。
［１０］以下の工程：
［９］に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを回収する工程
を含む、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
［１１］［１］〜［５］に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
［１２］［１］〜［５］に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする、グルコースアッセイキット。
［１３］［１］〜［５］に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする、グルコースセンサー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、基質特異性が高く、かつ十分な熱安定性を有するとともに、好ましくは大腸菌、酵母、カビ等を宿主細胞とした効率的な生産に適したＦＡＤ−ＧＤＨを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来となり得る酵素の例示であるＭｕｃｏｒ由来のＦＡＤ−ＧＤＨにおける、シグナルペプチド予想切断部位を示す図である。
【図２】本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来となり得る酵素の例示であるＭｕｃｏｒ由来のＦＡＤ−ＧＤＨとそのＮ末端欠失変異体の一例における、Ｎ末端部分のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、公知の野生型または変異型ＦＡＤ−ＧＤＨ同様、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス  ＋  ＰＭＳ（酸化型）
→  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＩＰ（酸化型）
→  ＰＭＳ（酸化型）  ＋  ＤＣＩＰ（還元型）【００１６】
具体的には、まず、（反応１）において、Ｄ−グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。そして、続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
具体的には、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。【００１７】
【数１】
2012169512.tif 000002
【００１８】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００１９】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号８で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号８記載のアミノ酸配列における２１３位に相当する位置、３６８位に相当する位置、および５２６位に相当する位置から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
好ましくは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおける、上述の２１３位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２１３位に相当する位置でのアミノ酸がアラニン、メチオニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸のいずれかに置換される置換であり、３６８位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、上述の３６８位に相当する位置でのアミノ酸がアラニン、バリン、グリシン、セリン、システインのいずれかに置換される置換であり、５２６位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、上述の５２６位に相当する位置でのアミノ酸がバリン、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン酸のいずれかに置換されている置換である。なお、配列番号８においては、本発明の置換を有さない２１３位のアミノ酸はバリンであり、３６８位のアミノ酸はスレオニンであり、５２６位のアミノ酸はイソロイシンである。【００２０】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載する本発明のＦＡＤ―ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明のＦＡＧ−ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨは、基質特異性が高く、かつ十分な熱安定性を有するとともに、大腸菌、酵母、カビ等を宿主細胞とした効率的な生産に適したＦＡＤ−ＧＤＨであり、産業上有用である。【００２１】
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、上述の２１３位に相当する位置のアミノ酸がアラニン、メチオニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸のいずれかであること、または、３６８位に相当する位置のアミノ酸がアラニン、バリン、グリシン、セリン、システインのいずれかであること、または、５２６位に相当する位置のアミノ酸がバリン、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リジン、ヒスチジンのいずれかであることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、配列番号８記載のタンパク質のように、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質を出発物質として、そこに公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、または、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得ることができる。【００２２】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ−ＧＤＨの例）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、公知のタンパク質を出発物質として、それを改変することにより取得することもできる。特に、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨに望まれる酵素科学的性質と類似点が多い出発物質を利用することは、所望のＦＡＤ−ＧＤＨを取得する上で有利である。
上述のような出発物質の例としては、公知のＦＡＤ−ＧＤＨを挙げることができる。公知のＦＡＤ−ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを取得するための出発物質の一例として好適である。
Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ）もしくはムコール・シルシネロイデス・ｆ・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）が挙げられる。より具体的には、Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ  ＮＩＳＬ０１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ  ＮＩＳＬ０１１１もしくはＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＮＩＳＬ０１１７が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）、アブシジア・ヒアロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）を挙げることができる。より具体的には、Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ  ＮＩＳＬ０２１１、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ  ＮＩＳＬ０２１８を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）を挙げることができる。より具体的には、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＮＩＳＬ９０８２を挙げることができる。なお、上記の菌株はＮＩＳＬ（公益財団法人  野田産業科学研究所）の保管菌株であり、所定の手続きを経ることにより、分譲を受けることができる。【００２３】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、高い基質特異性を有することを特徴とする。具体的には、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨと同様に、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が極めて低いことを特徴とする。具体的には、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースに対する反応性がいずれも２％以下であることを特徴とする。本発明に用いるＦＡＤ−ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。【００２４】
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、上述のようにＤ−グルコースの代わりにマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物を基質として測定を行った際の測定値が非常に低く、さらに、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にグルコース測定値を測定できることを特徴とする。具体的には、それらの夾雑糖化合物が存在しない条件でのＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースから選択される１以上が存在する場合の測定値が９６％〜１０３％であり、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースの３種が同時に存在する場合でも、測定値が９６％〜１０４％であることを特徴とする。このような特性を有するＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合には、測定試料中にマルトースやＤ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在している状況でも、グルコース量を正確に測定することが可能である。
各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。【００２５】
（ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの改変により本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得る際のＮ末端アミノ酸領域の削除）
上述のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを改変して、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得る場合、特に、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを大腸菌等の宿主において生産させる際には、出発物質であるケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在する一定領域のアミノ酸領域、具体的には、シグナルペプチド領域に相当するアミノ酸領域部分を欠失させることにより、大腸菌において発現させた場合の発現量が向上するという効果が得られる。そして、このＮ末端の削除領域を検討するにあたり、シグナルペプチドの予測が有効な手段となり得る。シグナルペプチドの予測は、適当なツールを用いてある程度予測することが可能で、実際には、それらの情報を元に検証することにより、好適な削除領域を決定することができる。このようなシグナルペプチド予測用のツールとしては、例えば、ＷＥＢ上のシグナルペプチド予想プログラム（ＳｉｇｎａｌＰ、「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」）等が知られている。【００２６】
ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの改変により本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得る際の、好ましいＮ末端アミノ酸削除領域の例としては、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドに相当する領域を含むＮ末端領域が挙げられる。具体的には、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨで例示すれば、そのＮ末端に存在し、配列番号１９に示すＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡのアミノ酸配列を含むＮ末端領域をコードするＤＮＡ領域を削除することにより、大腸菌形質転換体によって生産される本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの発現量および／または生産量を顕著に増加させることができる。この領域（Ｎ末端から２０番目まで）は、図１に示される通り、シグナルペプチドである可能性が示唆されている。【００２７】
なお、上述の具体的なアミノ酸配列および削除されるアミノ酸の残基数は限定的なものではなく、本発明で規程される一定の幅を持ったバリエーションを包含し得る。すなわち、「そのＮ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡ（配列番号１９）に相当するアミノ酸配列」とは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨと一定の同一性（例えば、８５％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の同一性）を有するＦＡＤ−ＧＤＨにおいて相当するアミノ酸配列をいう。これらの一定以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ間における、「相当する位置・配列」の対応関係は、既製のアミノ酸の同一性解析用ソフト、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）等を用いて、各種ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列と配列番号１のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列とを比較することにより、容易に知ることができる。【００２８】
本発明者等が見出したケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨと同一性が高いＦＡＤ−ＧＤＨは、現状では他に報告されてはいない。しかし、一般に、互いに同一性が高い酵素タンパク質においては、同一性の高い領域でのタンパク質構造が類似している可能性が高いことから、一定以上のアミノ酸配列同一性を有する複数の酵素の同一性解析によりそれらのアミノ酸配列の対応関係を解析し、一方における特定のアミノ酸の位置またはアミノ酸配列領域に相当する他方のアミノ酸の位置またはアミノ酸配列領域に同様の変異や削除等を導入することによって、酵素の性質に関して同様の効果を与えることができる例も多く知られている。従って、ＦＡＤ−ＧＤＨに関しても、配列番号１で例示された本発明におけるＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端ペプチドの削除領域に関する本発明の知見を利用し、これらのＦＡＤ−ＧＤＨに関しても同様の効果を得るための方策として、その他のＦＡＤ−ＧＤＨにおいて相当する領域のアミノ酸配列を同様に削除する試みを容易に行うことができる。【００２９】
また、本発明におけるＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端ペプチドの削除領域が、必ずしもシグナルペプチド領域のみである必要はない。例えば、Ｎ末端シグナルペプチド領域のみを削除する以外にも、シグナルペプチド領域そのものに加え、シグナルペプチド領域に隣接し、酵素活性に悪影響を及ぼさない範囲の領域までを含む領域を削除することもできる。具体的には、例えば、図２に示すように、ケカビ由来の全長のＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端配列（図中、ＭｐＦｕｌｌ、配列番号１）から、Ｎ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡ（配列番号１９）を削除してもよく（図中、ＭｐＮＳ１、配列番号８）、さらに１残基多く削除された形となるＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱ（配列番号２０）のアミノ酸配列を削除してもよい（図中、ＭｐＮＳ２、配列番号１０）。得られる酵素の酵素科学的諸性質に悪影響を及ぼさない範囲であれば、さらに多くの残基までを削除してもよい。例えば、Ｎ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳ（２７番目のアミノ酸まで、図中に記載なし、配列番号２１）を削除してもよいし、さらに１残基多く削除された形となるＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳＳ（２８番目のアミノ酸まで、図中に記載なし、配列番号２２）のアミノ酸配列を削除してもよい。本発明において重要なのは、Ｎ末端シグナルペプチド領域が実質的に削除されていることであって、Ｎ末端シグナルペプチド領域に加えて若干の領域が併せて削除されているかどうかは本発明の必須要件ではなく、同様の効果を奏する限り、複数のＮ末端領域削除のバリエーションが本発明のＦＡＤ−ＧＤＨに包含される。また、ＦＡＤ−ＧＤＨの由来や宿主によっては、Ｎ末端シグナルペプチド領域とされる領域からわずかに短いＮ末端領域、例えば、１残基ないし数残基短いＮ末端領域を削除する場合に関しても、この削除による効果とＮ末端シグナルペプチド領域とされる領域全体を削除した時の効果、または、Ｎ末端シグナルペプチド領域とされる領域全体を含み、さらに長いＮ末端領域を削除した時の効果との間に実質的な差異が認められない場合には、そのような削除もまた、本発明のバリエーションに包含され得る。【００３０】
Ｎ末端ペプチドの削除方法は限定されないが、公知の手段を用い、例えば、シグナルペプチド切断によりＮ末端となるアミノ酸を開始コドンであるメチオニンに変えて発現させる方法が挙げられる。または、シグナルペプチド切断によりＮ末端となるアミノ酸に開始コドンであるメチオニンを付加することで、シグナルペプチド欠失型のＦＡＤ−ＧＤＨを大腸菌で発現させることも可能である。あるいは、上述の通り、シグナルペプチドを含み若干の隣接領域を含むペプチドを削除することを想定し、想定される領域での切断を行った場合にＮ末端となるアミノ酸を開始コドンであるメチオニンに変えて発現させる方法や、切断によりＮ末端となるアミノ酸に開始コドンであるメチオニンを付加する方法も考えられる。
一定のＮ末端領域を切断する際に、新たにできるＮ末端をメチオニンに置換するか、あるいは置換せずにメチオニンを付加するかによって、得られるＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列は１残基違ってくるが、これはシグナルペプチドの削除によって新たにできるＮ末端がメチオニンでなくなった場合に開始コドンを付与して遺伝子からのタンパク質発現を正常に行わせるために行う操作であって、本発明の必須要件ではない。【００３１】
該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったかどうかは、該配列への変異導入前後における培養液１ｍｌあたりの総活性値を比較して確認することが出来る。なお、シグナルペプチドの欠失の確認には、エドマン分解を用いたＮ末端アミノ酸シーケンスにより確かめることも可能である。シグナルペプチドの予測プログラムとしては、ＰＳＯＲＴ、ＳｉｇｎａｌＰがよく利用されている。それぞれ、ｗｅｂにて「ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／」、あるいは「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」のアドレスから利用することができる。【００３２】
上記のようなＮ末端の欠失を有し、さらに、大腸菌において発現される場合は糖鎖の付加が起こらないことから、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、野生型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨよりも小さい。アミノ酸配列から計算して、あるいは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した場合に、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量は約７０ｋＤａである。【００３３】
なお、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを酵母やカビ等の宿主において生産させる場合には、シグナルペプチド領域を削除することなく、発現を行わせることができる。このような場合、発現するＦＡＤ−ＧＤＨは、全長又はほぼ全長に近い配列を有し得る。このようなＦＡＤ−ＧＤＨにおいても、本発明で特定されるアミノ酸置換の位置に相当する位置のアミノ酸を置換することの効果は同様である。すなわち、本発明は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠失していないＦＡＤ−ＧＤＨにおける同様の変異体をも包含する。【００３４】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおける耐熱性の向上）
本発明の変異型ＦＡＤ−ＧＤＨは、大腸菌において発現させたときに、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、３５℃、１０分間熱処理後の残存活性が３％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上であることを特徴とする。このような高い耐熱性は、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨで規定される所定の耐熱性向上に寄与する所定の位置における特定のアミノ酸残基を有さないＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を大腸菌において発現させて得られるＦＡＤ−ＧＤＨ（本発明において、以降、「野生型ＦＡＤ−ＧＤＨ」）が有し得ないものであり、これにより、耐熱性が向上したＦＡＤ−ＧＤＨを大腸菌等の宿主において生産することが可能となる。このような本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子を含むプラスミドの例として、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ３、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ４、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ５、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ６、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ７、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ８、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ９、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１０、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１２、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１３、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１４、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１５、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１６、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１７、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１８、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１９、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２０、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２２、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２３等が挙げられる。また、このような本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主微生物として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１株を挙げることができる。【００３５】
前述のとおり、本発明の基質特異性が高く、かつ熱安定性に優れたＦＡＤ−ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号８のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号８における所定の位置に相当する位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。【００３６】
ここでいう、例えば、「配列番号８のアミノ酸配列に相当する位置」とは、配列番号８のアミノ酸配列と、配列番号８と同一性（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する他のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列とをアラインさせた場合に、アラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。【００３７】
また、「アラインメントにおける同一の位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。各種ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各ＦＡＤ−ＧＤＨ配列における配列中の同一の位置を決めることが可能である。アラインメントにおける同一の位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性機能に関して類似した効果を有することが推定できる。【００３８】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨとしては、配列番号８のアミノ酸配列において、２１３位、３６８位、及び５２６位の少なくとも１つに相当する位置においてアミノ酸置換を有するＦＡＤ−ＧＤＨが例示され得る。さらに、配列番号８のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＶ２１３Ａ、Ｖ２１３Ｍ、Ｖ２１３Ｃ、Ｖ２１３Ｑ、Ｖ２１３Ｅ、Ｔ３６８Ａ、Ｔ３６８Ｖ、Ｔ３６８Ｇ、Ｔ３６８Ｓ、Ｔ３６８Ｃ、Ｉ５２６Ｖ、Ｉ５２６Ｔ、Ｉ５２６Ｓ、Ｉ５２６Ｐ、Ｉ５２６Ａ、Ｉ５２６Ｙ、Ｉ５２６Ｋ、Ｉ５２６Ｈ、Ｉ５２６Ｆ、Ｉ５２６Ｅからなる群から選ばれる改変ＦＡＤ−ＧＤＨである。【００３９】
ここで、例えば、「Ｖ２１３Ａ」は、２１３位のＶ（Ｖａｌ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。また、「Ｔ３６８Ａ」は、３６８位のＴ（Ｔｈｒ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。さらに、「Ｉ５２６Ｖ」は、５２６位のＩ（Ｉｌｅ）をＶ（Ｖａｌ）に置換することを意味する。【００４０】
なお、本発明において、「配列番号８記載のアミノ酸配列の２１３位のバリンに相当する位置」とは、確定したＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列を、配列番号８に示されるケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列とアラインメント比較した場合に、配列番号８のＦＡＤ−ＧＤＨの２１３位のバリンと同一の位置のアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「アラインメントにおける同一の位置」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
また、「配列番号８記載のアミノ酸配列の３６８位のスレオニンに相当する位置」とは、確定したＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列を、配列番号８に示されるケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号８のＦＡＤ−ＧＤＨの３６８位のスレオニンと同一の位置のアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
さらに、「配列番号８記載のアミノ酸配列の５２６位のイソロイシンに相当する位置」とは、確定したＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列を、配列番号８に示されるケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号８のＦＡＤ−ＧＤＨの５２６位のイソロイシンと同一の位置のアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
例えば、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの全長のアミノ酸配列の例示である配列番号１において、「配列番号８記載のアミノ酸配列の２１３位のバリンに相当する位置」とは、配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のバリンである。また、配列番号１において、「配列番号８記載のアミノ酸配列の３６８位のスレオニンに相当する位置」とは、配列番号１記載のアミノ酸配列の３８７位のスレオニンである。さらに、配列番号１において、「配列番号８記載のアミノ酸配列の５２６位のイソロイシンに相当する位置」とは、配列番号１記載のアミノ酸配列の５４５位のイソロイシンである。このように、配列番号８記載のアミノ酸配列を基準とし、「アラインメントにおける同一の位置」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて、配列番号８とは異なるアミノ酸配列における「相当する位置」を特定することができるので、配列番号８とは異なるアミノ酸配列における「相当する位置」が、実際には、当該異なるアミノ酸配列における何番目のアミノ酸に該当するかは容易に確認できる。このような、配列番号８もしくは配列番号９との同一性を有する配列において、相当する位置の変異を有する変異体についても、本発明の範囲に含まれる。【００４１】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質とし、それを改変することにより本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ−ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。【００４２】
ついで、公知のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。【００４３】
これらの基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子は、取扱い上、各種ベクターに連結（挿入）されていることが、好ましい。例えば、本明細書中に記載の、ケカビ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２等から、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等の試薬を用いることにより、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡを、取得できる。【００４４】
本発明のベクターは、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ−１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等も好ましい。【００４５】
公知のＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質として、本発明の基質特異性が高く熱安定性に優れたＦＡＤ−ＧＤＨを取得する方法として、出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。【００４６】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。【００４７】
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れ、且つ基質特異性の高い改変ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。【００４８】
上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定または確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。【００４９】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られた本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
原核宿主細胞の一例としては、エッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ−１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が利用でき、それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
また、例えば、真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)）を好適に用いることができる。【００５０】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞の選抜）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの生産株を効率よく選抜するためには、例えば、次のような方法を用いてもよい。まず、得られた宿主細胞（形質転換体）がコロニーを形成したＬＢ寒天培地から、滅菌したビロード生地等で新しい寒天培地にレプリカを数枚とり、培養する。レプリカをとった寒天培地のコロニーが十分な大きさになったら、リゾチーム等の溶菌剤に浸した膜を培地に重ねて、室温で１時間ほど静置し、溶菌させる。このとき、溶菌した粗酵素液が膜に吸着する。【００５１】
次いで、粗酵素液を吸着させた前記の膜を、３５℃、１分〜１時間静置した後、ＦＡＤ−ＧＤＨが作用すれば発色する組成とした反応液（グルコース、ＰＭＳ、ＤＣＩＰを含む１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））に浸した膜と重ね合わせ、紫色の発色の度合を観察する。耐熱性を有さない野生型ＦＡＤ−ＧＤＨの場合は、コロニーが発色する度合が少ないが、耐熱性を獲得した本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの場合は、コロニーが発色する度合が多くなる。これを利用し、野生型ＦＡＤ−ＧＤＨ生産株のコロニーの発色度合との比較により、耐熱性が向上したＦＡＤ−ＧＤＨを生産する形質転換体を選抜できる。【００５２】
あるいは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの生産株を効率良く選抜するためには、次の方法によっても良い。まず、変異処理をおこなったプラスミドをもつ宿主細胞（形質転換体）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む１０ｍＭのＴＹ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイースト・エクストラクト、０．５％ＮａＣｌ、（ｐＨ７．０））に植菌し、２５℃で一晩振とう培養を行う。培養終了後、９，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって集めた菌体を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、超音波処理によって改変体ＦＡＤ−ＧＤＨを含む菌体抽出液を得る。次いで、得られた菌体抽出液を酵素希釈液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））にて希釈し、約０．５Ｕ／ｍｌの酵素液（０．２ｍｌ、２本）を調製する。この２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、３５℃、１０分間の加温処理に供し、処理後、各サンプルのＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定する。それぞれ、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、３５℃、１０分間処理後の活性値を比較して残存活性（％）として算出し、変異処理を施していない野生型ＦＡＤ−ＧＤＨ生産株と比べて残存活性（％）が向上している株を選抜することによって、耐熱性が向上したＦＡＤ−ＧＤＨを生産する形質転換体を得ることができる。残存活性（％）を算出するための熱処理温度は、変異体選択の必要に応じ、より過酷な条件を設定してもよい。【００５３】
必要に応じ、このように見出した熱安定性に優れたＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子に対して、さらに変異導入を繰り返し行うことにより、熱安定性に一層優れた改変ＦＡＤ−ＧＤＨ及びその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。【００５４】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの製造）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離することにより、製造すればよい。
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ６〜９に調整することができる。
培養は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。【００５５】
培養終了後、該培養物より本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を得る。【００５６】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。【００５７】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
本発明はまた、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、例えば、このようなグルコースアッセイキットを用いることにより、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。【００５８】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ−ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。【００５９】
この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、たとえば２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。【００６０】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー）
本発明はまた、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。【００６１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。【００６２】
具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ−ＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。【００６３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
１．ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の大腸菌への導入とＧＤＨ活性の確認
ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質とし、これを改変して本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを取得することを目的とし、大腸菌による組換え発現に適したＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を設計した。具体的には、配列番号１のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列を元に、そのコドン使用頻度を大腸菌に適合させた遺伝子配列を設計し、該遺伝子を全合成した。この全合成したＤＮＡの配列を配列番号２に示す。
次いで、この合成ＤＮＡを鋳型とし、Ｎ末領域のプライマー（配列番号３）およびＣ末領域のプライマー（配列番号４）を作製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ）を構築した。
そして、このｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌを、公知のヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入した。常法に従い、プラスミドを抽出し、挿入されたＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、配列番号２と一致し、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は６４１アミノ酸（配列番号１）であった。【００６５】
さらに、ＷＥＢ上のシグナルペプチド予想プログラム（ＳｉｇｎａｌＰ、「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」）を用いて、上記のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの配列全長を解析した。その結果、このＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、Ｎ末端から２０番目のＡｌａと２１番目のＧｌｎの間でシグナルペプチドの切断が起こる可能性が予想された（図１）。この知見に基づき、２０番目のＡｌａまでのＮ末端配列、すなわち、シグナルペプチド領域と推定される領域を欠失させてみることにより、大腸菌での酵素生産量が向上する可能性があることが推測された。そこで、２０番目のＡｌａまで欠失させ、２１番目のＧｌｎにＭｅｔを付加したＦＡＤ−ＧＤＨ（ＮＳ１と称する）をコードする遺伝子を下記の要領で取得した。さらに、２０番目のＡｌａまで欠失させ、２１番目のＧｌｎをＭｅｔに置換したＦＡＤ−ＧＤＨ（ＮＳ２と称する）をコードする遺伝子も、同様に取得した（図１）。【００６６】
まず、ＮＳ１に関し、配列番号５のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとし、配列番号４のプライマーとの組み合わせによるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を行った。次いで、前述のｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌを作製したのと同様の手順にて、ＮＳ１をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１）を構築し、これをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入し、本発明の大腸菌形質転換体を取得した。
また、同様に、ＮＳ２に関し、配列番号６のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号４のプライマーとの組み合わせによるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を行い、ＮＳ２をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２）を構築し、大腸菌形質転換体を取得した。
なお、それぞれの改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列に誤りがないことを確認した。配列番号７は、上記で決定したシグナルペプチド欠失変異体ＮＳ１をコードするＤＮＡ配列を示す。配列番号８はその対応するアミノ酸配列を示す。配列番号９は、上記で決定したシグナルペプチド欠失変異体ＮＳ２をコードするＤＮＡ配列を示す。配列番号１０はその対応するアミノ酸配列を示す。【００６７】
上記の通り取得した各種組換えプラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２をそれぞれ用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２菌体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む１０ｍＬのＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃、４時間振とう培養後、さらに２０℃で一晩、振とう培養を行った。【００６８】
この培養液を、氷冷下にて、超音波破砕器（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｎｉｓｓｅｉ社製）を用いて１０秒間、１回処理して破砕した。破砕液をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清画分を別のエッペンドルフチューブに移しかえて粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法により、得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定し、１ｍｌ培養液あたりのＧＤＨ活性量を比較した結果、野生型の全長ＧＤＨ遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌでは、０．０８１５Ｕ／ｍｌに留まっていた。一方、Ｎ末端のＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡを欠失させＭを付加した改変型ＧＤＨの遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１では４．１０Ｕ／ｍｌ、Ｎ末端のＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡを欠失させ２１番目のＱをＭに置換した改変型ＧＤＨの遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２では３．４３Ｕ／ｍｌの活性が見られた。すなわち、Ｎ末端を特定の長さで欠失した本発明の大腸菌形質転換体（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２）では、シグナルペプチドと予想されるアミノ酸配列を欠失させることにより、そのＧＤＨ生産性が約４２〜５０倍増大することがわかった。
上記の通り、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの配列情報に基づき、大腸菌において生産を行うのに好適な複数のＦＡＤ−ＧＤＨを取得することができた。これを本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得るための出発物質として利用した。【００６９】
２．ＦＡＤ−ＧＤＨの活性測定
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定した。
具体的には、まず、（反応１）において、Ｄ−グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。そして、続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
具体的には、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。【００７０】
【数２】
2012169512.tif 000003
【００７１】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００７２】
３．ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価
ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価は、上述のＦＡＤ−ＧＤＨの活性測定方法に供する前に、所定の条件下で熱処理を行った後の残存活性を元に行った。具体的には、まず、評価対象のＦＡＤ−ＧＤＨを約０．５Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））にて希釈した。この酵素溶液（０．２ｍｌ）を２本用意し、そのうち１本は４℃で保存し、もう１本には、３５℃、１０分間の加温処理を施した。
加温処理後、各サンプルのＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定し、４℃で保存したものの酵素活性を１００としたときの、３５℃、１０分間処理後の活性値を「残存活性（％）」として算出した。この残存活性を、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性評価の指標とした。【００７３】
４．組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１  ＤＮＡの調製および改変
ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ（配列番号７）遺伝子の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１株を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］１００ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を９，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１を抽出して精製し、１００μｇの組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１  ＤＮＡを得た。【００７４】
得られた上記組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１  ＤＮＡ１００μｇのうち２０μｇを用いて、ＸＬ１−ＲＥＤ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）（増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすい）をＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って形質転換し、約５，０００株の形質転換株を得た。
全コロニーからプラスミドＤＮＡを回収するためにＱＩＡＧＥＮ  ｓｏｌ  Ｉ（キアゲン社製）を寒天培地上に加え、スプレッダーでＱＩＡＧＥＮ  ｓｏｌ  Ｉとともにコロニーを掻き集め、ピペットマンで溶液を回収し、以降は通常のプラスミド回収の方法で、改変操作を加えた組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１  ＤＮＡを１００μｇ得た。前記の被改変組換え体プラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１  ＤＮＡ２０μｇを用いてＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換し、約１，０００株の改変を受けたプラスミドを保有する形質転換体を得た。【００７５】
５．熱安定性に優れた改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの探索
上述のようにして得られた各種の形質転換体を、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］に接種し、２０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部を遠心分離（９，０００ｒｐｍで、５分間）して得られた菌体を１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に回収し、定法により超音波破砕後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（粗酵素液）を調製した。この粗酵素液を用いて、上記の熱安定性評価方法に従い、残存活性（％）（処理後の活性／未処理の活性）を算出した。
その結果、変異処理に供さない、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１を含む形質転換体由来のＦＡＤ−ＧＤＨ（以下、野生型）と比較して、残存活性が向上した本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを３種取得した。これら３種のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするプラスミドをｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ３と命名し、各プラスミド中のＦＡＤ−ＦＡＤをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。その結果、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１中には、配列番号８記載のアミノ酸配列の２１３番目のバリンがアラニンに、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２には、配列番号８記載のアミノ酸配列の３６８番目のスレオニンがアラニンに、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ３には、配列番号８記載のアミノ酸配列の５２６番目のイソロイシンンがバリンにそれぞれ置換する変異が導入されていることが明らかとなった。結果を表１に示す。【００７６】
【表１】
2012169512.tif 000004
【００７７】
６．部位特異的変異導入による本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのさらなる取得
次に、前述の知見に基づいて、上記３箇所におけるアミノ酸残基の置換を、それぞれ別のアミノ酸に置き換える試みを行った。具体的には、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１のプラスミドを鋳型として、２１３番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１、１２の合成オリゴヌクレオチド、３６８番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３、１４の合成オリゴヌクレオチド、５２６番目のイソロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５、１６の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、各種の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上述の方法に準じてプラスミドを調整した。得られたプラスミドで市販の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した後、上述の方法に準じて粗酵素液を調製し、熱安定性を評価した。【００７８】
その結果、さらに１７種の熱安定性の向上した変異体が得られた。これら１７種の変異体をコードするプラスミドを、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ４、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ５、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ６、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ７、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ８、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ９、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１０、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１２、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１３、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１４、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１５、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１６、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１７、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１８、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１９、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２０と命名した。これらの各変異体における変異箇所を同定するために、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いてグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ４で配列番号８記載の３６８番目のスレオニンがバリン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ５で配列番号８記載の３６８番目のスレオニンがグリシン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ６では３６８番目のスレオニンがセリン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ７では３６８番目のスレオニンがシステイン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ８では５２６番目のイソロイシンがスレオニン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ９では５２６番目のイソロイシンがセリン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１０では５２６番目のイソロイシンがプロリン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１１では５２６番目のイソロイシンがアラニン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１２では５２６番目のイソロイシンがチロシン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１３では５２６番目のイソロイシンがリジン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１４では５２６番目のイソロイシンがヒスチジン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１５では５２６番目のイソロイシンがフェニルアラニン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１６では５２６番目のイソロイシンがグルタミン酸、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１７では２１３番目のバリンがメチオニン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１８では２１３番目のバリンがシステイン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ１９では２１３番目のバリンがグルタミン、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２０では２１３番目のバリンがグルタミン酸に置換されていることが確認された。
追加で見出された変異体を含めた２０種類の変異体のアミノ酸置換部位と熱安定性に関するデータを表２に示す。【００７９】
【表２】
2012169512.tif 000005
表２に示すとおり、配列番号１の２１３位のバリンをアラニンに、２１３位のバリンをメチオニンに、２１３位のバリンをシステインに、２１３位のバリンをグルタミンに、２１３位のバリンをグルタミン酸に、３６８位のスレオニンをアラニンに、３６８位のスレオニンをバリンに、３６８位のスレオニンをグリシンに、３６８位のスレオニンをセリンに、３６８位のスレオニンをシステインに、５２６位のイソロイシンをバリンに、５２６位のイソロイシンをスレオニンに、５２６位のイソロイシンをセリンに、５２６位のイソロイシンをプロリンに、５２６位のイソロイシンをアラニンに、５２６位のイソロイシンをチロシンに、５２６位のイソロイシンをリジンに、５２６位のイソロイシンをヒスチジンに、５２６位のイソロイシンをフェニルアラニンに、５２６位のイソロイシンをグルタミン酸に置換することにより、熱安定性が向上することがわかった。【００８０】
７．  部位特異的変異の蓄積による熱安定性のさらなる向上
Ｉ５２６Ｔの変異が導入されたｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ８のプラスミドを鋳型として、３６８番目のスレオニンをアラニンに置換するよう設計した配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチドを基に、以下の条件でＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ８  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水を加えて全量を５０μｌとし、「反応液」を調製した。この「反応液」をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、７分３０秒」のサイクルを３０回繰り返した。【００８１】
反応液の一部を、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的の長さのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて処理し、残存する鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号８記載のアミノ酸配列の３６８番目のスレオニンがアラニンに、５２６番目のイソロイシンがスレオニンに置換された改変型ＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２１）を取得した。【００８２】
続いて、Ｖ２１３Ｅの変異が導入されたｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２０のプラスミドを鋳型として、３６８番目のスレオニンをアラニンに置換するよう設計した配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチドを用いて上記と同様の操作を行い、配列番号８記載のアミノ酸配列の２１３番目のバリンがグルタミン酸に、３６８番目のスレオニンがアラニンに置換された改変型ＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２２）を取得した。【００８３】
続いて、Ｖ２１３Ｅ、Ｔ３６８Ａの変異が導入されたｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２２のプラスミドを鋳型として、５２６番目のイソロイシンをスレオニンに置換するよう設計した配列番号４８、４９の合成オリゴヌクレオチドを用いて上記と同様の操作を行い、配列番号８記載のアミノ酸配列の２１３番目のバリンがグルタミン酸に、３６８番目のスレオニンがアラニンに、５２６番目のイソロイシンがスレオニンに置換された改変型ＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２３）を取得した。【００８４】
続いて、上記の手順により得られたｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ８、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２０、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２２、及びｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１−Ｍ２３を各々保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株について、上記５．に準じて粗酵素液を調製し、上述した熱安定活性測定法の熱処理工程を用いて、４０℃で１５分間、４５℃で１５分間の加熱処理後の残存活性（％）を算出した。結果を表３に示す。【００８５】
【表３】
2012169512.tif 000006
【００８６】
表３に示すとおり、複数の変異個所を組み合わせ、部位特異的変異を蓄積することにより、熱安定性のさらなる向上が確認された。【００８７】
８．  酵母発現系におけるケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価
（１）ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ株の作製
特許文献５に記載の方法に準じ、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする配列番号２３のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子（特許文献５ではＭｐＧＤＨ遺伝子と記載）を含む組換え体プラスミド（ｐｕｃ−ＭＧＤ）を取得した。これを鋳型として、配列番号２４、２５の合成ヌクレオチド、Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（ＴａｋａＲａ社製）を用いて、約２ｋｂの「インサート用ＤＮＡ断片」を精製した。
また、Saccharomyces cerevisiaeの発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、制限酵素処理後の反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（ＴａｋａＲａ社製）を用いて、約６ｋｂの「ベクター用ＤＮＡ断片」を精製した。【００８８】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて添付のプロトコールに従って、精製した「インサート用ＤＮＡ断片」および「ベクター用ＤＮＡ断片」を連結し、ＧＡＬ１プロモーター下でＭｐＧＤＨを発現するための組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐを作製した。なお、ＧＡＬ１プロモーターはＤ−ガラクトース誘導性のプロモーターであり、Ｄ−ガラクトースを含み、かつ、Ｄ−グルコースを含まない培地で培養することにより、プロモーター下流の遺伝子発現が誘導される。そして、このｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐが配列番号２の遺伝子配列をコードしていることをマルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）により確認した。その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＹＥ２Ｃ−ＭｐをＩｎｖ−Ｓｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換することにより、配列番号１のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ−Ｍｐ株を取得した。【００８９】
（２）Ｓｃ−Ｍｐ株におけるＧＤＨ活性の確認と熱安定性評価
酵母形質転換株Ｓｃ−Ｍｐ株を、５ｍＬの前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１ｍＬを４ｍＬの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ−ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１６時間培養した。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、前述の酵素活性測定法により、ＧＤＨ活性を測定したところ、培養上清中にＧＤＨ活性が確認された。【００９０】
次にこの培養上清画分を用いて、上記の３．熱安定性評価法に基づき、５０℃、１５分間の加熱処理後の活性を測定したところ、残存活性は４．３％であった。【００９１】
９．  酵母発現系における耐熱性向上効果の検証
上述のようにして見出した耐熱性向上型変異を、配列番号１の相当する部位に導入し、酵母発現系における耐熱性向上効果を検証することにした。なお、上述の耐熱性向上型変異部位Ｖ２１３、Ｔ３６８、Ｉ５２６の配列番号１に相当する部分は、それぞれＶ２３２、Ｔ３８７、Ｉ５４５である。
組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐを鋳型として、配列番号２６、２７の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５５℃、３０秒」−「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。【００９２】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することで形質転換を行い、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に塗布した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のバリンがアラニンに置換された改変型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ａ）を得た。【００９３】
同様にして、表４に示した鋳型プラスミド、配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の２３２位のバリンがシステインに、２３２位のバリンがメチオニンに、２３２位のバリンがグルタミンに、２３２位のバリンがグルタミン酸に、３８７位のスレオニンがアラニンに、３８７位のスレオニンがシステインに、３８７位のスレオニンがセリンに、３８７位のスレオニンがグリシンに、５４５位のイソロイシンがスレオニンに、５４５位のイソロイシンがセリンに、５４５位のイソロイシンがプロリンに、３８７位のスレオニンがアラニン及び５４５位のイソロイシンがスレオニンに、２３２位のバリンがグルタミン酸及び３８７位のスレオニンがアラニン及び５４５位のイソロイシンがスレオニンに置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ５４５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ５４５Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔをそれぞれ取得した。【００９４】
部位特異的変異を導入した上述の改変型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ａ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ５４５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ５４５Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔを用いて、上述と同様にしてＩｎｖ−Ｓｃ株の形質転換及び形質転換株の培養を行って、培養上清中のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。【００９５】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の３．熱安定性評価法に基づき、５０℃、１５分間、及び５５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性を測定した。結果を表４に示す。なお、表中「−」は、データ未取得であることを示す。【００９６】
【表４】
2012169512.tif 000007
このことから、Ｖ２３２位、Ｔ３８７位、Ｉ５４５位に相当する部位における置換導入は、シグナル配列の有無に関わらず、熱安定性向上効果を奏することがわかった。【００９７】
表４に示すとおり、配列番号１のＦＡＤ−ＧＤＨに対するＶ２３２位、Ｔ３８７位、Ｉ５４５位への部位特異的変異導入により、酵母発現系においても耐熱性が向上することが確認された。また、変異を蓄積したＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔではさらに耐熱性が向上していることが確認された。【００９８】
１０．  耐熱性向上型変異体への基質特異性向上型変異の蓄積
（１）基質特異性評価方法
まず、それぞれのケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ発現酵母株における培養上清画分を前述の８．の項目と同様にして取得し、ＧＤＨ活性を測定する。次に、３．の活性測定法の基質をＤ−グルコースに代えて同モル濃度のＤ−キシロースとした系において活性を測定する。これらの測定値を基に、「Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））」を計算し、基質特異性の評価に用いる。このとき、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）が低いほど基質特異性が良いと判断できる。【００９９】
（２）耐熱性向上型変異及び基質特異性向上型変異を導入したＦＡＤ−ＧＤＨ発現酵母株の取得
これまでに発明者らが見出した基質特異性向上型変異をｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔへ導入した。すなわち、配列番号１においてＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔの変異が導入されたｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔに対して、基質特異性向上型変異であるＬ１２１Ｍ、Ｗ５６９Ｙ、Ｓ６１２Ｃ、Ｓ６１２Ｔを導入した。
組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔを鋳型として、配列番号４１、４２の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５５℃、３０秒」−「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。【０１００】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することで形質転換を行い、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に塗布した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２１位のロイシンがメチオニンに、２３２位のバリンがグルタミン酸及び３８７位のスレオニンがアラニン及び５４５位のイソロイシンがスレオニンに置換された改変型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｌ１２１Ｍ）を得た。【０１０１】
同様に、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔを鋳型として、表５に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の２３２位のバリンがグルタミン酸及び３８７位のスレオニンがアラニン及び５４５位のイソロイシンがスレオニンに置換され、且つ５６９位のトリプトファンがチロシン、もしくは、且つ６１２位のセリンがシステイン、もしくは、且つ６１２位のセリンがスレオニンに置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｓ６１２Ｔをそれぞれ取得した。【０１０２】
部位特異的変異を導入した上述の改変型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｗ５６９Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−３Ｔ−Ｓ６１２Ｔを用いて、上述と同様にしてＩｎｖ−Ｓｃ株の形質転換及び形質転換株の培養を行って、培養上清中にＧＤＨ活性があることを確認した。【０１０３】
（３）耐熱性向上型変異及び基質特異性向上型変異を導入したＦＡＤ−ＧＤＨの評価
続いて、ＧＤＨ活性が確認された各種変異体の培養上清を用いて、上記の熱安定性評価法に基づき、５５℃、１５分間及び６０℃１５分間の加熱処理後の残存活性を測定した。さらに、（１）基質特異性評価方法に基づいて、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）を測定した。結果を表５に示す。【０１０４】
【表５】
2012169512.tif 000008
【０１０５】
表５に示すとおり、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５ＴにＷ５６９Ｙ、Ｓ６１２Ｃ、Ｓ６１２Ｔを導入した改変型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨではＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔに比べて基質特異性が向上した。また、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５ＴにＷ５６９Ｙを導入した改変型ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨではＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔに比べて耐熱性も向上した。【０１０６】
１１．  改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ麹菌発現株の作製及び評価
特許文献５の記載のようにして、配列番号１のアミノ酸配列にＶ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙの変異を導入したＦＡＤ−ＧＤＨを発現するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ株を取得、培養し、粗酵素液のＧＤＨ活性を確認した。この粗酵素液を用いて、上記の熱安定性評価法に基づき、５５℃１５分間の加熱処理後の活性を測定したところ、変異導入前のＦＡＤ−ＧＤＨの残存活性は０％であったのに対し、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙの変異を導入したＦＡＤ−ＧＤＨの残存活性は８７.２％であり、熱安定性が向上していた。また、同粗酵素液を用いて、１０．の項目記載の方法に基づきＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）を測定したところ、変異導入前のＦＡＤ−ＧＤＨでは１．４１％であったのに対し、Ｖ２３２Ｅ／Ｔ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ／Ｗ５６９Ｙの変異を導入したＦＡＤ−ＧＤＨでは０．６４％であり、基質特異性も向上していた。【０１０７】
本発明の変異体は十分な熱安定性を有し、酵素の熱失活度合が少ないことにより、酵素の使用量低減や保存期間の延長を可能にし、公知のグルコース測定用酵素を用いた測定方法や測定試薬と比較して、より実用性の高い測定方法や測定試薬、測定キットやセンサの提供が可能となることが期待される。特に、加熱乾燥処理を施す場合が想定される血糖センサ用チップの作製工程等においては、熱安定性に優れた本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは非常に有用と考えられる。また、本発明の各種の熱安定性の向上した変異体は、変異を導入する前の野生型の由来となり、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨと同様に、グルコースへの高い基質特異性を有しており、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にグルコース測定値を測定できるものであった。
【図１】
2012169512.tif 000009
【図２】
2012169512.tif 000010
【配列表】
2012169512000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月11日(2014.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012169512000001.app
【国際調査報告】
2012169512.tif 000011
2012169512.tif 000012
2012169512.tif 000013
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