(57)【要約】  細胞毒性のない半導体ナノ粒子蛍光体の集合体、及びそれを用いた生体物質標識剤を提供する。本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、ニュートラルレッド法を用いた細胞毒性試験において、１日および１０日培養後のニュートラルレッドの吸光度を５０％にする濃度ＩＣ５０が、いずれも１０００μｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、ニュートラルレッド法を用いた細胞毒性試験において、１日および１０日培養後のニュートラルレッドの吸光度を５０％にする濃度ＩＣ５０が、いずれも１０００μｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
【請求項２】
前記物理化学的表面処理が、溶媒による洗浄処理及び高温熱処理の少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、当該半導体ナノ粒子蛍光体の平均粒径が１〜１０ｎｍであることを特徴とする半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
【請求項４】
前記半導体ナノ粒子蛍光体が、その主要構成成分として、ＳｉまたはＧｅを含有していることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
【請求項５】
請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を用いたことを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞毒性がなく生体標識に適した半導体ナノ粒子蛍光体の集合体、及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の検出機材の高感度化や標識材料の高輝度化によって、単一分子の検出、同定、及び、運動の観察が可能になり、高性能化された検出機材や標識材料は、分析化学、分子生物学及びナノ構造体の解析に大きな役割を果たしてきている。【０００３】
単一分子の観察に使用される標識材料として、蛍光色素やナノ粒子蛍光体が提案されている。特にナノ粒子蛍光体は蛍光色素に比べて、大きさや材質を選択することにより、およそ４００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲で比較的自由に発光ピーク波長を設定することができること、ストークスシフトを広くとることができ、励起光との重なりやバックグラウンドによるノイズ影響を小さくすることで検出能を高めることができること、また褪色が非常に少ないため、長時間の動体観察が可能であることなど、利点が非常に多い。【０００４】
一般に、ナノメートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す物質は「量子ドット」と称されている。このような量子ドットは、半導体原始が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる可能性があると考えられている（例えば特許文献１〜３参照）。【０００５】
しかしながら、量子ドットは、結晶構造をもち、粒径によりバンドギャップが変化するという性質を持ち、バンドギャップの変化に伴い発光波長が変化するため、個々の粒径のばらつきが、直接粒子毎の発光スペクトルのばらつきにつながる。これを回避するには、単一スペクトルの粒子を分級するなど煩雑な操作が必要になるなどの原理的な問題を抱えている。【０００６】
また、実際に利用される粒子蛍光体の集合体は、粒径分布をもっており、各々の粒子の発光スペクトルや輝度にバラつきがあるため、一分子観察を行う際、安定した評価ができないことが課題となっている。【０００７】
一方、小動物を対象としたｉｎ  ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。生体物質を標識する手段として、分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。【０００８】
近年、上記マーカー物質として量子ドットを用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的および／または化学的に吸接合した生体物質標識剤が検討されている（例えば特許文献１参照）。【０００９】
しかしながら、例えば、特許文献１で実質的にその効果も含めて開示されている量子ドットは、（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ型）量子ドットであり、使用されているカドミウム類は、発光半値幅は狭いが、有害重金属であるため、製造プロセスにおいても環境面への悪影響が懸念され、代替材料が求められている。【００１０】
このような状況を鑑み、無毒性・無害性の量子ドットとしてシリコン量子ドットが検討をされている。中でも、高周波スパッタリングを用いる方法は、シリコン量子ドットを粒子単体で分散した溶液として製造でき、注目されている（特許文献２参照）。特許文献２においては、シリコン量子ドットの製造方法として、（ａ）高周波スパッタリング法を用い、基板上にアモルファス酸化ケイ素膜を作製し、（ｂ）上記アモルファス酸化ケイ素膜に熱処理を施し、当該酸化ケイ素膜内に粒子サイズ３．５ｎｍ以下のシリコン量子ドットを形成し、（ｃ）上記酸化ケイ素膜にフッ酸水溶液処理を施して酸化ケイ素を除去して、シリコン量子ドットを露出させ、（ｄ）上記露出したシリコン量子ドットを溶液中に浸漬して溶液処理を施し、付着したフッ酸粒子を除去し、次いで、（ｅ）溶液中のシリコン量子ドットに攪拌処理を施し、シリコン量子ドットを基板から分離、離散させて、シリコン量子ドットが粒子単位で分散した溶液を得る製造方法が開示されている。【００１１】
しかしながら、フッ酸水溶液は、生体への毒性が指摘されており、生体物質標識材料としての応用を考えた場合、その残存による生体への悪影響も懸念されている。
【特許文献１】特開２００３−３２９６８６号公報
【特許文献２】特開２００６−７００８９号公報
【特許文献３】特開２００７−６３３７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、細胞毒性のない半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、本発明者は、特定の毒性評価の指標を向上させる処理を行うことにより、より高輝度で、かつ生体標識として優れている半導体ナノ粒子を得ることができることを見出し、本発明に至った。【００１４】
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。【００１５】
１．物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、ニュートラルレッド法を用いた細胞毒性試験において、１日および１０日培養後のニュートラルレッドの吸光度を５０％にする濃度ＩＣ５０が、いずれも１０００μｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。【００１６】
２．前記物理化学的表面処理が、溶媒による洗浄処理及び高温熱処理の少なくともいずれか一方であることを特徴とする前記１に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。【００１７】
３．前記１又は２に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、当該半導体ナノ粒子蛍光体の平均粒径が１〜１０ｎｍであることを特徴とする半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。【００１８】
４．前記半導体ナノ粒子蛍光体が、その主要構成成分として、ＳｉまたはＧｅを含有していることを特徴とする前記１乃至３のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。【００１９】
５．前記１乃至４のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を用いたことを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の上記手段により、細胞毒性のない半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、ニュートラルレッド法を用いた細胞毒性試験において、１日および１０日培養後のニュートラルレッドの吸光度を５０％にする濃度ＩＣ５０が、いずれも１０００μｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第１項乃至第５項に係る発明に共通する技術的特徴である。【００２２】
なお、本願において、「半導体ナノ粒子蛍光体の集合体」とは、半導体ナノ粒子蛍光体を含有する分散液（溶液、懸濁液を含む。）、半導体ナノ粒子蛍光体からなる粉体、半導体ナノ粒子蛍光体が分散して含有されているシートなどをいう。【００２３】
また、「細胞毒性」とは、薬機第９９号（平成７年６月２７日）厚生省薬務局医療機器開発課長通知に記載された、医療用具又は材料の抽出液を用いた細胞毒性試験の方法に準拠して、Ｖ７９細胞を使用して求めたＩＣ５０値を意味する。また、「ＩＣ５０」とは、後述するニュートラルレッド法を用いた細胞毒性試験において、ニュートラルレッドの吸光度を５０％にする濃度値である。【００２４】
本発明の好ましい態様としては、前記物理化学的表面処理が、溶媒による洗浄処理及び高温熱処理の少なくともいずれか一方である態様である。また、半導体ナノ粒子蛍光体の平均粒径が１〜１０ｎｍであることが好ましい。更に、半導体ナノ粒子蛍光体が、その主要構成成分として、ＳｉまたはＧｅを含有していることが好ましい。【００２５】
上述の態様により、本発明の導体ナノ粒子蛍光体の集合体は生体物質標識剤に好適に用いることができる。【００２６】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態等について詳細な説明をする。【００２７】
（半導体ナノ粒子蛍光体の形成材料）
本発明に係る半導体ナノ粒子蛍光体は種々の半導体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−Ｖ族の半導体化合物又はそれらの原料化合物を用いることができる。【００２８】
II−VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ及びＨｇＴｅを挙げることができる。【００２９】
III−Ｖ族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ及びＡｌＳが好ましい。【００３０】
IV族の半導体の中では、Ｇｅ、Ｐｂ及びＳｉは特に適している。【００３１】
本発明においては、半導体ナノ粒子蛍光体をコア／シェル構造を有する粒子にすることが好ましい。この場合、半導体ナノ粒子蛍光体は半導体ナノ粒子からなるコア粒子と当該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア／シェル構造を有する半導体ナノ粒子蛍光体であって、当該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。【００３２】
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、又はこれらの混合物等が挙げられる。【００３３】
本発明において、特に好ましい半導体材料は、ＳｉまたはＧｅである。なお、必要があればＧａなどのドープ材料を極微量含んでもよい。【００３４】
本発明に係るコアの平均粒径に関しては、１〜１０ｎｍであることが好ましい。【００３５】
なお、本発明において、半導体ナノ粒子蛍光体の平均粒径は本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、本発明において、当該平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とした。ＴＥＭで撮影するクラスター粒子数としては１００個以上が好ましく、１０００個の粒子を撮影するのが更に好ましい。本願においては、１０００個の粒子の算術平均を平均粒径とした。【００３６】
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＧａＳ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、ＳｉＯ2、ＺｎＳである。【００３７】
なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。【００３８】
（半導体ナノ粒子蛍光体の集合体の製造方法）
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体の製造方法としては、従来公知の液相法又は気相法による製造方法を用いることができる。【００３９】
液相法の製造方法としては、沈殿法、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照）。【００４０】
なお、液相法により、半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を製造する場合においては、当該半導体の前駆体を還元反応により還元する工程を有する製造方法であることが好ましい。また、当該半導体前駆体の反応を界面活性剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。なお、本発明に係る半導体前駆体は、上記の半導体材料として用いられる元素を含む化合物であり、たとえば半導体がＳｉの場合、半導体前駆体としてはＳｉＣｌ4などが挙げられる。その他半導体前駆体としては、ＩｎＣｌ3、Ｐ（ＳｉＭｅ3）3、ＺｎＭｅ2、ＣｄＭｅ2、ＧｅＣｌ4、トリブチルホスフィンセレンなどが挙げられる。【００４１】
反応前駆体の反応温度としては、半導体前駆体の沸点以上かつ溶媒の沸点以下であれば、特に制限はないが、７０〜１１０℃の範囲が好ましい。【００４２】
〈還元剤〉
半導体前駆体を還元する還元剤としては、従来周知の種々の還元剤を反応条件に応じて選択し用いることができる。本発明においては、還元力の強さの観点から、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ（ｓｅｃ−Ｃ4Ｈ9）3）及び水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素カリウム、水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤が好ましい。特に、還元力の強さから水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）が好ましい。【００４３】
〈溶媒〉
半導体前駆体の分散用溶媒としては、従来周知の種々の溶媒を使用できるが、エチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、トルエン、デカン、ヘキサンなどの炭化水素類溶媒を使用することが好ましい。本発明においては、特に、トルエン等の疎水性の溶媒が分散用溶媒として好ましい。【００４４】
〈界面活性剤〉
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド（ＴＯＡＢ）、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。【００４５】
なお、液相法による反応は、液中の溶媒を含む化合物の状態により大きく変化する。単分散性の優れたナノサイズの粒子を製造する際には、特に注意を要する必要がある。例えば、逆ミセル反応法では、界面活性剤の濃度や種類により、反応場となる逆ミセルの大きさや状態が変わってくるため、ナノ粒子が形成される条件が限られてしまう。したがって、適切な界面活性剤は溶媒との組み合わせが必要となる。【００４６】
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照）、（３）レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照）、（４）高速スパッタリング法（例えば特開２００４−２９６７８１号参照）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。【００４７】
（物理化学的表面処理）
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であり、下記の細胞毒性指標の条件を満たすことを特徴とする。【００４８】
本発明の半導体ナノ粒子の集合体を得るためには、どのような方法を使用してもよいが、特に表面の状態を物理化学的に制御することが必要である。例えば、粒子表面に付着した不純物を除去する方法、粒子末端の元素、表面の荷電、表面修飾剤の被覆率などをコントロールする方法などが挙げられる。これらを最適に組み合わせることで、所望の毒性評価の値を示す半導体ナノ粒子の集合体を得ることができる。【００４９】
好ましい物理化学的表面処理法補の具体例としては、半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を水やアルコール類で洗浄して毒性物質を除去する方法、半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を高熱の不活性気体雰囲気下におき毒性物質を蒸発・除去する方法などを挙げることができる。【００５０】
（ニュートラルレッド法）
ニュートラルレッドは生細胞膜を通りリソソームに蓄積されるが、細胞膜が損傷を受けるとニュートラルレッドの取り込みが阻害される。すなわち、ニュートラルレッドの取り込み総量が生細胞の数に比例するため、間接的に生細胞数を測定することができる。【００５１】
上述の所定の試験方法により、ニュートラルレッドの吸光度を５０％にする試験物質の濃度（ＩＣ５０）を細胞毒性の指標とした。【００５２】
本発明においては、１日および１０日培養した後のＩＣ５０が、いずれも１０００μｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする。好ましくは、いずれも３０００μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは、１０日後のＩＣ５０が１日後のＩＣ５０より低くならないことである。【００５３】
（応用例）
本発明の半導体ナノ粒子は、種々の技術分野における単一分子分析に応用できる。例えば、上記単一分子観察方法において、異なる発光スペクトルをもつ半導体ナノ粒子で複数種類の分子をそれぞれ標識し、該分子に励起光を照射することによって、同時に複数種類の分子の同定を行うこともできる。なお、適用可能な複数種類の分子としては、化学組成は同じであるが化学構造の異なる構造異性体等も含む。【００５４】
以下において、代表的な応用例について説明する。【００５５】
（生体物質標識剤とバイオイメージング）
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、生体物質蛍光標識剤に適応することができる。また、標的（追跡）物質を有する生細胞もしくは生体に本発明に係る生体物質標識剤を添加することで、標的物質と結合もしくは吸着し、該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的（追跡）物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る生体物質標識剤は、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。【００５６】
〔半導体ナノ粒子蛍光体集合体の親水化処理〕
上述した半導体ナノ粒子蛍光体集合体表面は、一般的には、疎水性であるため、例えば生体物質標識剤として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため、コア／シェル型半導体ナノ粒子のシェルの表面を親水化処理することが好ましい。【００５７】
親水化処理の方法としては例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に表面修飾剤を化学的および／または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。具体的には、例えば、Ｇｅ／ＧｅＯ2型ナノ粒子１０−5ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、シェルの表面を処理することで無機ナノ粒子のシェルの表面をカルボキシル基で修飾することができる。【００５８】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した親水化処理された半導体ナノ粒子蛍光体と分子標識物質とを、有機分子を介して、結合させて得られる。【００５９】
〈分子標識物質〉
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合および／または反応することにより、生体物質の標識が可能となる。【００６０】
該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。【００６１】
〈有機分子〉
本発明に係る生体物質標識剤は、親水化処理された半導体ナノ粒子蛍光体と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。当該有機分子としては半導体ナノ粒子蛍光体と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。【００６２】
具体的には、半導体ナノ粒子蛍光体をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合親水化処理されたナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体物質標識剤となる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００６４】
＜比較例１＞
（ＣｄＳｅナノ粒子蛍光体の調製）
５ｍｌのオクタデセンに３０ｍｇのセレンを添加して攪拌した後、トリオクチルフォスフィン（ＴＯＰ）０．４ｍｌをさらに添加して十分に攪拌する（溶液Ａ）。これとは別に酸化カドミニウム１３ｍｇ、オレイン酸０．６ｍｌ、オクタデセン１０ｍｌを混合し、２２０℃まで昇温する（溶液Ｂ）。溶液Ｂに溶液Ａ１ｍｌをすばやく添加し、２分後に急冷することで、ＣｄＳｅナノ粒子の試料を得た。【００６５】
＜比較例２＞
（液相法によるＳｉナノ粒子蛍光体の調製）
トルエン２００ｍｌにテトラオクチルアンモニウムブロマイド（ＴＯＡＢ）３ｇを溶解する。室温で攪拌しながらＳｉＣｌ4を５ｍｌ滴下し、１時間後に、水素化リチウムアルミニウムをＳｉＣｌ4の２倍モル滴下して還元反応させる。３時間後にメタノール４０ｍｌを添加して、余分な還元剤を失活させたのちに、アリルアミンを白金触媒とともに添加してから、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する。メチルホルムアミドと純水で数回洗浄し、水に分散したＳｉナノ粒子の試料を得た。【００６６】
＜比較例３＞
（気相法によるＳｉナノ粒子蛍光体の調製）
真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをシリコンチップと石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子および分子を半導体基板上に体積し、シリコン原子と酸素原子が混ざったアモルファス酸化ケイ素膜を形成する。【００６７】
得られた酸化ケイ素膜を、アルゴン雰囲気中において、１１００℃まで急速に昇温し１時間の熱処理を行い、膜中のシリコン原子を所定のナノサイズまで凝集させる。【００６８】
得られたシリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜を４０℃のフッ酸蒸気に５分間さらすことで、表面処理を行う。フッ酸処理終了後に純水中に浸漬し、十分に攪拌する。純水での洗浄は数回行い、十分に残留フッ酸を除去する。【００６９】
その後、シリコンナノ粒子蛍光体が露出した酸化ケイ素膜をエタノール中に浸漬し、超音波洗浄器を用いて攪拌処理を行い、エタノールに分散したＳｉナノ粒子蛍光体の試料を得た。【００７０】
＜実施例１＞
比較例３で得られた溶液を濾過することにより、Ｓｉナノ粒子を単離した後、得られたＳｉナノ粒子を１０-1Ｐａの真空中で１００℃の加熱処理を１０分間行った。その後、エタノールを添加して攪拌処理を行い、エタノールに再分散したＳｉナノ粒子蛍光体の試料を得た。【００７１】
＜実施例２＞
フッ酸処理を２分間行った後、純水洗浄、フッ酸処理３分間、純水洗浄と分割して処理を行う以外は、比較例３と同様に行い、エタノールに再分散したＳｉナノ粒子蛍光体の試料を得た。【００７２】
＜実施例３＞
比較例３において、熱処理を９００℃で行った後、得られたシリコン含有酸化ケイ素膜を同様に４０℃のフッ酸蒸気により表面処理を行う。その後、大気雰囲気中５００℃で３０分間の表面酸化処理を行い、さらにアルゴン雰囲気で９００℃で１時間の熱処理を行う。【００７３】
その後、シリコンナノ粒子が露出した酸化ケイ素膜をエタノール中に浸漬し、超音波洗浄器を用いて攪拌処理を行い、エタノールに分散したＳｉナノ粒子蛍光体の試料を得た。【００７４】
（細胞毒性評価）
チャイニーズハムスター由来線維芽細胞Ｖ７９細胞にリン酸緩衝液を加えて１０００ｒｐｍで５分間遠心して洗浄後、５％ウシ胎児血清を含有させたＥａｇｌｅ‘ｓ  ＭＥＭ培地（ＦＢＳ−ＭＥＭ）に浮遊させた。９６穴プレートに９０００個／１００μｌ／ｗｅｌｌの割合で細胞をいれ、３７℃、５％炭酸ガス培養器中で２４時間培養後、上清を除き、得られた半導体ナノ粒子蛍光体を種々の濃度で含有させたＦＢＳ−ＭＥＭを２００μｌずつ加えた。１日および１０日培養後、上清を除き、ニュートラルレッドを５０μｇ／ｍｌの濃度で含有させたＦＢＳ−ＭＥＭを２００μｌずつ加えてさらに３時間培養する。上清を除き、２．５％ホルマリン−１％ＣａＣｌ2溶液を２８０μｌ入れて１分間静置して細胞を固定、洗浄し、上清を捨てた後、１％酢酸−５０％エタノール溶液を１００μｌ加えて、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出した。５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、それぞれの濃度について吸光度の変化を計算し、これを元に各試料について吸光度が５０％になる濃度ＩＣ５０を求めた。【００７５】
また、各半導体ナノ粒子蛍光体について２μｇ／ｍｌを添加し１日培養した結果から、細胞生存率を求めた。【００７６】
（粒径測定）
得られた半導体ナノ粒子のＴＥＭ像を撮影し、各１，０００個の粒子を実測して、分散液中のナノ粒子の平均粒径を求めた。測定結果を表−１に示す。【００７７】
（発光スペクトル）
得られた半導体ナノ粒子溶液について、波長２８０ｎｍの励起光を照射して発生する蛍光スペクトルを測定した。発光スペクトルの半値幅、極大発光波長、相対発光強度を表１に示す。相対発光強度は、比較例１を１００とすることにより求めた。【００７８】
（半導体ナノ粒子蛍光体の表面修飾および生体標識）
得られた半導体ナノ粒子蛍光体の集合体をメルカプトウンデカン酸０．２ｇを溶解した１０ｍｌ純水中に１×１０-5ｇ再分散させ、４０℃、１０分間攪拌することで表面を親水化する。その後、これら半導体ナノ粒子の水溶液それぞれにアビジン２５ｍｇを添加し４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。【００７９】
細胞中の標的タンパク質をビオチン化して固定化したチップ上に上記のアビジンコンジュゲートナノ粒子を滴下・洗浄すると、標的タンパク質に結合したビオチンに、１個のアビジンコンジュゲートナノ粒子が結合し、そのスポットが紫外線照射により半導体ナノ粒子蛍光体に起因する色の発光をする。【００８０】
スポット１００個について、発光したスポットの数をカウントし、その比率を生体標識の認識率として表１に示す。【００８１】
【表１】
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【００８２】
表１に示した結果から明らかなように、本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、細胞毒性が実質上殆ど無い上、蛍光の発光強度が高く、生体標識に適応した場合に認識率が高いことが分かる。
【国際調査報告】
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