(57)【要約】【課題】新生児臍帯血ＣＤ３４陽性細胞から樹立した樹状細胞とヒトＣＤ４０リガンド発現Ｌ細胞存在下で新生児臍帯血未熟Ｂ細胞をＩｇＡ産生細胞へ分化誘導する試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験システム系を用いて、母乳に含まれるＩｇＡ産生誘導因子の候補として従来から知られているＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−６と異なる液性因子の存在の可能性を観察した。【解決手段】シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体を含有することを特徴とする。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体を含有することを特徴とするＢ細胞のＩｇＡクラススイッチング剤。
【請求項２】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体をコードするＤＮＡを含有することを特徴とするＢ細胞のＩｇＡクラススイッチング剤。
【請求項３】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体を含有することを特徴とする抗体産生誘導剤。
【請求項４】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする抗体産生誘導剤。
【請求項５】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体を含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項６】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＡ（以下、ＩｇＡと称する。）の産生を誘導するタンパク質に関し、特にこのタンパク質を含有するＢ細胞のＩｇＡのクラススイッチング剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
母乳は、本来の栄養補給源に加えて、乳児の未熟な腸管免疫機能を補完する意味で分泌型ＩｇＡ、補体、リゾチーム、ラクトフェリンなどの感染防御因子が豊富に含まれる。
一方、母乳中には乳児の月齢に伴う腸管免疫機能の成熟を促すと予想される様々な液性因子が存在する。
中でも、腸管免疫機能の主要な液生成分であるＩｇＡの未熟Ｂ細胞からの産生誘導に促進作用を有するサイトカインとしてＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−６等が知られている（非特許文献１）。【０００３】
【非特許文献１】Ｅａｒｌｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７７  （２００４）６７−７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我々は、新生児臍帯血ＣＤ３４陽性細胞から樹立した樹状細胞とヒトＣＤ４０リガンド発現Ｌ細胞存在下で新生児臍帯血未熟Ｂ細胞をＩｇＡ産生細胞へ分化誘導する試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験システム系を用いて、母乳に含まれるＩｇＡ産生誘導因子の候補として従来から知られているＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−６と異なる液性因子の存在の可能性を観察した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記した予備的観察を基に、新生児ナイーブＢ細胞からＩｇＡ産生細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験システム系を用いて、母乳（初乳）から新規なＩｇＡ産生誘導因子の同定を行った。
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラム等から有効分画を得、さらに２次元電気泳動を展開し、質量分析の結果、候補蛋白の一つとしてシンテニン−１（ｓｙｎｔｅｎｉｎ−１）を同定した。
シンテニン−１のＩｇＡ産生誘導活性については今まで報告がない。そこで遺伝子組み換えシンテニン−１を作製し、その作用を確認した。
本発明は、シンテニン−１をＢ細胞のＩｇＡのクラススイッチング剤として利用する方法を提供するものである。
以下、本発明を詳細に説明する。【０００６】
本発明におけるシンテニン−１に関して、具体的には、公知のシンテニン−１（プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）  ９４巻、１３６８３−１３６８８頁、１９９７年）などが挙げられる。
また、（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド（以下、シンテニン−１と略称する）、または（ｉｉ）ポリペプチドが、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記（ｉ）項記載のシンテニン−１が挙げられる。【０００７】
本明細書において、「実質的に同一」とはポリペプチドなどの活性、例えば、リガンド（シンテニン−１）のレセプターへの結合活性、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。
アミノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿入はしばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさないが、こうした場合その置換、欠失、付加あるいは挿入を施されたポリペプチド（いわゆるシンテニン−１改変体など）は、そうした置換、欠失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、例えばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができうる。
非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。
極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。
陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられる。
負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。【０００８】
本発明で用いられるシンテニン−１の製造法を以下にさらに詳細に説明する。
本発明で用いられるシンテニン−１としては、ヒトおよび哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど）の乳または組織・細胞に由来するポリペプチドが挙げられ、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであれば如何なるものであってもよい。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。【０００９】
本発明で用いられるシンテニン−１は、公知の方法もしくはそれに準じた方法、即ち、ヒトや哺乳動物の乳または組織・細胞からポリペプチドを精製する方法によって製造することもできるし、後述のポリペプチド合成法に準じて製造することもできる。
また、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）  ９３巻、１１７８０−１１７８５頁、１９９６年に記載の方法などが挙げられる。
ヒト、哺乳動物の乳または組織・細胞から製造する場合、ヒト、哺乳血動物の乳または組織・細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。【００１０】
本発明で用いられるシンテニン−１は、自体公知のポリペプチドの合成法に従って、あるいはシンテニン−１を含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
すなわち、ポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離方法としては例えば、日本生化学会編、新生化学実験講座１、タンパク質ＩＶ  （１９９２年）などを参考にすればよい。
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせてポリペプチドを精製単離することができる。【００１１】
本発明で用いられるシンテニン−１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。
また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
より具体的には、（１）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの有する配列とハイブリダイズするＤＮＡ、（２）遺伝コードの縮重のため、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの有する配列および（１）に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。
シンテニン−１をコードするＤＮＡとしては例えば配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。【００１２】
本発明で用いられるシンテニン−１をコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
シンテニン−１を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えばポリペプチドの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、生化学実験講座２、核酸の化学Ｉ（東京化学同人，１９７５年に記載の方法などに従って行えばよい。
また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。
クローン化された本発明で用いられるシンテニン−１をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。
該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。【００１３】
本発明で用いられるシンテニン−１の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明で用いられるシンテニン−１をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λ  ファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。【００１４】
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。
特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα（ＭＦα）・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたシンテニン−１をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。【００１５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１、ＪＭ１０３、ＪＡ２２１、ＨＢ１０１、Ｃ６００、ＤＨ１０Ｂ、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４、２０７−２１などが用いられる。【００１６】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる。【００１７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。
ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。【００１８】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞、マウスＢ細胞株ＷＥＨＩ２３１細胞、Ｐ３Ｕ１プラズマサイトなどが用いられる。【００１９】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、６９巻、２１１０頁（１９７２年）やジーン（Ｇｅｎｅ）、１７巻、１０７頁（１９８２年）などに記載の方法に従って行なわれる。【００２０】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１６８巻、１１１頁（１９７９年）などに記載の方法に従って行われる。【００２１】
酵母を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、７５巻、１９２９頁（１９７８年）に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ  ／  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６巻、４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。【００２２】
動物細胞を形質転換するには、例えば、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５２巻、４５６頁（１９７３年）に記載の方法に従って行なわれる。【００２３】
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法［プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、８４巻、７４１３頁（１９８７年）］、リン酸カルシウム法［ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法［エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、１巻、８４１−８４５頁（１９８２年）］等が挙げられる。
このようにして、本発明で用いられるシンテニン−１をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。【００２４】
動物細胞を用いて、本発明で用いられるシンテニン−１を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。
具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。
さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことによりシンテニン−１の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。
また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、シンテニン−１をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。【００２５】
上記の形質転換体を、シンテニン−１をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、シンテニン−１を生成、蓄積せしめることによって、シンテニン−１を製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。【００２６】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１−４３３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２年］が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。【００２７】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、７７巻、４５０５頁（１９８０年）］や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地［プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、８１巻、５３３０頁（１９８４年）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００２８】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９５巻、７８８頁（１９６２年））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。
培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００２９】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｅｉｅｎｃｅ）、１２２巻、５０１頁（１９５２年）］，ＤＭＥＭ培地［ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８巻、３９６頁（１９５９年）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、１９９巻、５１９頁（１９６７年）］、１９９培地［プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、７３巻、１巻（１９５０年）］などが用いられる。
ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。【００３０】
上記培養物から本発明で用いられるシンテニン−１を分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられるシンテニン−１を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりシンテニン−１の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。
緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。【００３１】
培養液中に本発明で用いられるシンテニン−１が分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明で用いられるシンテニン−１の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【００３２】
本発明で用いられるシンテニン−１が遊離体で得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明で用いられるシンテニン−１を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成するシンテニン−１の存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【発明の効果】
【００３３】
シンテニン−１、およびシンテニン−１をコードするＤＮＡはＩｇＡグロブリンのクラススイッチを誘導することから、ＩｇＡ免疫グロブリンのクラススイッチ誘導作用剤、抗体産生誘導剤、免疫賦活剤などとして用いることができる。
したがって、シンテニン−１、およびシンテニン−１をコードするＤＮＡは、ウイルスによる感染症または疾病、細菌または真菌による感染症または疾病、癌、抗体産生低下を伴う免疫不全症などの予防・治療薬などとして用いることができる。【００３４】
例えば、生体内においてＩｇＡグロブリンが減少しているヒトまたは哺乳動物がいる場合に、（イ）シンテニン−１をコードするＤＮＡを該ヒトまたは哺乳動物に投与し、生体内でシンテニン−１を発現させることによって、（ロ）細胞にシンテニン−１をコードするＤＮＡを挿入し、シンテニン−１を発現させた後に、該細胞をヒトまたは哺乳動物に移植することによって、または（ハ）シンテニン−１を該ヒトまたは哺乳動物に投与することなどによって、該ヒトまたは哺乳動物におけるシンテニン−１の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。【００３５】
シンテニン−１をコードするＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物に投与することができる。
シンテニン−１をコードするＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。【００３６】
シンテニン−１を医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば、該シンテニン−１を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって医薬組成物を製造することができる。
これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。【００３７】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。
調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。【００３８】
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。【００３９】
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。【００４０】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。【００４１】
シンテニン−１の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から３００ｍｇ、より好ましくは約３．０から５０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。【００４２】
［配列番号：１］ヒトシンテニン−１のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］ヒトシンテニンの塩基配列を示す。
［配列番号：３］実施例８に記載されるシンテニン−１融合タンパク質を作製するために使用されたＮ端側のプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：４］実施例８に記載されるシンテニン−１融合タンパク質を作製するために使用されたＣ端側のプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：５］実施例８に記載されるラクトアデヘリン融合タンパク質を作製するために使用されたＮ端側のプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：６］実施例８に記載されるラクトアデヘリン融合タンパク質を作製するために使用されたＣ端側のプライマーの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】初乳によるＢ細胞からＩｇＡ分泌細胞への分化誘導。
【図２】活性サンプルによる優先的ＩｇＡ誘導。
【図３】ＩＬ−１０、ｒＴＧＦ−β１、ＩＬ−６、ＩＬ−１βに対する中和抗体による初乳のＩｇＡ誘導能。最初の棒グラフは中和抗体なし、その次からの棒グラフは中和抗体を増量した場合。
【図４】活性サンプル、非活性サンプルに対する、２度目のゲルクロマトグラフィー。矢印は分子量を示す。青色デキストラン（２０００ｋＤａ），  フェリチン（４４０ｋＤａ），  アルブミン（６７ｋＤａ），  オボアルブミン（４３ｋＤａ），  リボ核酸Ａ（１３．７ｋＤａ）
【図５】２次元ゲル電気泳動による解析活性サンプル（Ａ），  非活性サンプル（Ｂ）を２次元ゲル電気泳動で比較した。活性サンプル（Ａ）において３７スポットが認められた。同じ分子量のスポットで異なる等電点を示すものは同一のタンパクと考えられる。
【図６】ＧＳＴ−シンテニン−１によるＩｇＡ誘導。
【図７】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，  １０／３００  ＧＬカラムクロマトグラフィーによるシンテニン−１の溶出パターン。Ａ：活性サンプル、点線領域がＩｇＡ誘導能を有している。Ｂ：非活性サンプルでＡと同じ領域を示している。Ｃ：４４０ｋＤａ以上の領域でシンテニン−１（３２ｋＤａ）を検出。その他の領域ではシンテニン−１は、検出されない。シンテニン−１のバンドは活性サンプルで非常に強く認められた。
【図８】初乳中のシンテニン−１濃度とＩｇＡ誘導能との関連性。ＩｇＡ誘導能を有する初乳にのみシンテニン−１の発現を認めた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
実施例１
［初乳サンプル］
書面で同意を取った満期産の３５人の妊婦から、分娩後７日以内に初乳約１０ｍｌを集め直に−７０℃で保存した。
培養使用時にはサンプルを溶解し遠心（３０００ｒｐｍ，  ３０ｍｉｎ，４℃）後、脂質層と細胞層を取り除き、上澄みだけを透析した。
透析液は、１日間はリン酸緩衝食塩液を、３日間はＲＰＭＩ１６４０を使用し、透析膜は、１０００Ｄａカット膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ  ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
透析後、サンプルを分注し−７０℃で保存した（この研究は富山大学倫理委員会の承認を受けて実施されている）。【００４５】
実施例２
［ナイーブＢ細胞と樹状細胞（ＤＣ）の調整］
臍帯血を満期産の臍帯から採取し、Ｆｉｃｏｌｌ法にて単核細胞（ＭＮＣ）のみを分離した。
このＭＮＣをＥロゼット法にてＴ細胞を除去し、磁気ビーズ（ＭＡＣＳビーズ）にてナイーブＢ細胞を分離した。
このＢ細胞をフローサイトで確認したところ９９％がＩｇＤ＋ナイーブＢ細胞であった。
樹状細胞作製には、まず臍帯血ＭＮＣから磁気ビーズ（ＣＤ３４ＭＡＣＳビーズ）にてＣＤ３４ ＋細胞を分離し、その分離した細胞をｒＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｒＴＮＦ−α（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ｒＳＣＦ  （２５ｎｇ／ｍｌ）で培養する。
１２〜１４日後、これらの細胞の８６％以上がＣＤ１ａを発現する樹状細胞へ分化していた。【００４６】
実施例３
初乳によって臍帯血Ｂ細胞からどのような免疫グロブリンが産生されるかを調べた。
実験は、３５人分の初乳サンプルで行い、免疫グロブリンのサブクラスの陽性細胞のカウントには固層化酵素抗体法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｐｏｔ：ＥＬＩＳＰＯＴを使用した。
臍帯血Ｂ細胞からＩｇ産生細胞を誘導する方法は公知方法に従った（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，１８５：１９０９−１９１８）。
培養は、ＩＭＤＭ  （Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培養液に、５０μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、５μｇ／ｍｌウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ）、５％−ＦＣＳ  （Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、 ゲンタマイシン（０．０８μｇ／ｍｌ）  （ＧＩＢＣＯ）を加えて行った。
９６穴プレートを用い、１×１０５／ｍｌのＢ細胞および１×１０５／ｍｌの樹状細胞（３，４００  ｒａｄ照射）を、３．７５×１０４／ｍｌのＣＤ４０Ｌ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ  （７，５００  ｒａｄ照射）の存在下で、培養液量２００μｌとして培養し、サイトカインｒｈＩＬ−１０（２００ｎｇ／ｍｌ）および初乳（２５％ｖ／ｖ）を加えた。
培養細胞を６日目に回収し、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ陽性細胞数をカウントした。実験は３度繰り返した。
結果を図１に示す。
多くの初乳サンプル（Ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）がナイーブＢ細胞を優先的にＩｇＡ分泌細胞へと分化させた。
反対に、ＩＬ−１０はすべてのサブクラス（ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＧ）の分泌細胞へと分化促進した。【００４７】
実施例４
ＩｇＡ分泌細胞分化誘導能をもつプールした初乳を活性サンプル（ａｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅ）と定義した。
培養は、実施例３と同様に行い、ＩｇＡ分泌細胞分化誘導能を調べた。
すなわち、９６穴プレートを用い、１×１０５／ｍｌのＢ細胞および１×１０５／ｍｌの樹状細胞（３，４００  ｒａｄ照射）を、３．７５×１０４／ｍｌのＣＤ４０Ｌ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ  （７，５００  ｒａｄ照射）の存在下で、培養液量２００μｌとして培養し、サイトカインｒｈＩＬ−１０（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＴＧＦ−β１（０．３ｎｇ／ｍｌ）、ｒＩＬ−６（０．３ｎｇ／ｍｌ）［いずれもＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製］および活性サンプル（２５％ｖ／ｖ）を加えた。
培養細胞を６日目に回収し、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ陽性細胞数をＥＬＩＳＰＯＴでカウントした。
実験は３度繰り返した。
結果を図２に示す。
ｒＩＬ−１０はすべてのサブクラスを同様に促進したが、活性サンプルは選択的にＩｇＡ分泌細胞へと分化させた。
一方、ｒＴＧＦ−β１、ｒＩＬ−６はＩｇＡ分泌細胞へと分化促進しなかった。【００４８】
実施例５
初乳のＩｇＡ誘導能について、ｒＩＬ−１０、ｒＴＧＦ−β１，  ＩＬ−６，ＩＬ−１βに対する中和抗体を用い調べた。
培養は、実施例３と同様に行った。
すなわち、９６穴プレートを用い、１×１０５／ｍｌのＢ細胞および１×１０５／ｍｌの樹状細胞（３，４００  ｒａｄ照射）を、３．７５×１０４／ｍｌのＣＤ４０Ｌ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ  （７，５００  ｒａｄ照射）の存在下で、培養液量２００μｌとして培養し、サイトカインｒｈＩＬ−１０（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＴＧＦ−β１（０．３ｎｇ／ｍｌ）、ｒＩＬ−６（０．３ｎｇ／ｍｌ）［いずれもＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製］および活性サンプル（２５％ｖ／ｖ）  を加えた。
また、中和抗体として、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１βおよび抗ＴＧＦ−β１抗体を活性サンプルに徐々に加えた。
培養細胞を６日目に回収し、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ陽性細胞数をＥＬＩＳＰＯＴでカウントした。実験は３度繰り返した。
結果を図３に示す。
抗ＩＬ−１０、抗ｒＴＧＦ−β１、抗ＩＬ−１β抗体は全く活性サンプルのＩｇＡ誘導能を阻害しなかった。
一方、抗ＩＬ−６抗体は容量依存的に、活性サンプルのＩｇＡ誘導能を部分的に阻害した。【００４９】
実施例６
［初乳中におけるＩｇＡ分泌細胞分化誘導因子の精製］
活性サンプルを炭酸水素アンモニウムで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、１０／３００  ＧＬカラムに通した。
カラムは０．４ｍｌ／分の速さで同じ緩衝液で溶出し、溶出されたタンパクはＵＶモニターで監視した。
タンパクを２４分画（１ｍｌ／分画）に分け、それぞれの分画について、実施例３と同様の方法でＩｇＡ分泌細胞分化誘導能を調べた。
ＩｇＡ分泌細胞分化誘導能を持つ分画を、炭酸水素アンモニウムで平衡化したＵＮＯ  Ｑ１  陰イオン交換カラムに通した。
吸着されたタンパクを０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出し、４５分画のタンパクを回収した。
各分画のタンパクを２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで透析を行い凍結乾燥した。
そして再び各分画においてＩｇＡ分泌細胞分化誘導能を調べ、活性を持つ分画を保存してＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，  １０／３００  ＧＬカラムにもう一度通した。
溶出されたタンパクについてＩｇＡ分泌細胞分化誘導能を調べ、活性を持つ分画を−７０℃で保存した。
一方、ＩｇＡ分泌細胞分化誘導能を持たないプールした初乳を非活性サンプル（ｎｏｎ−ａｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅ）と定義した。
非活性サンプルを用い、上述のタンパク分離を同じように施行して、活性サンプルの分化誘導能を持つ分画と同じ非活性サンプルの分画を−７０℃で保存した。
活性サンプルおよび非活性サンプルから溶出された分画は、ＳＤＳ−電気泳動および銀染色で解析した。
結果を図４に示す。
図４Ａ：ａｃｔｉｖｅサンプル、図４Ｂ  ：ｎｏｎ−ａｃｔｉｖｅサンプルは、炭酸水素アンモニウムで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，  １０／３００  ＧＬカラムに通された。
カラムは０．４ｍｌ／分の速さで同じバッファーで溶出され、溶出されたタンパクはＵＶモニターで監視した。
図４Ｃ：２度目のゲルクロマトグラフィーによるＩｇＡ誘導能。
第５，６分画にＩｇＡ誘導能をもつ物質が存在している。
図４Ｄ：ａｃｔｉｖｅサンプル，  ｎｏｎ−ａｃｔｉｖｅサンプルをＣｙ５で標識して比べたが両者に差はなかった。【００５０】
実施例７
［２次元ゲル電気泳動とタンパク同定］
公知の方法（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ７：７８１−７９５）に準じて行った。
すなわち、活性サンプルと非活性サンプルを、それぞれ蛍光色素（Ｃｙ５およびＣｙ３）で１００ｍｇタンパクに対して２００ｐｍｏｌ染料の割合で標識した。
それぞれのゲルにおける内部標準として蛍光色素Ｃｙ２で２分画プールを標識した。
標識されたサンプルは、２倍希釈のサンプル緩衝液［８Ｍ尿素、４％（Ｗ／Ｖ）ＣＨＡＰＳ、２０ｍｇ／ｍｌ  ＤＴＴ、２％（Ｖ／Ｖ）  固定化ｐＨ勾配（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ，  ＩＰＧ）緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）］でよく混ぜ合わせた。
これらのサンプルを、ＩＰＧストリップ（ｓｔｒｉｐｓ）（２４ｃｍ、ｐＩ  ３−１０）を使用してＭｕｌｔｉＰｈｏｒ  ＩＩ電気泳動器に注入した。
泳動は暗室で４０ＫＶｈｒ、２０℃で行った。
ストリップを１０分間、５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）  グリセロール、６５ｍＭＤＴＴ含有２％−ＳＤＳで平衡化し、さらに１０分間２４０ｍＭヨウ化アセタミド（ｉｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を含んだ同じ緩衝液で平衡化した。
平衡化したストリップを１２％ポリアクリルアミドゲル（２４ｃｍ×２０ｃｍ）に移し、２５ｍＭトリス塩基、０１％ＳＤＳ、１９２ｍＭグリシンおよび０１％ブロムフェノールブルー含有の０．５％低温溶解アガロースを上塗した。
ゲルを１５℃、３Ｗ／ｇｅｌで、Ｅｔｔａｎ  ＤＡＬＴＴＭ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により泳動した。
２−Ｄゲルは、２９２０  ２Ｄ−Ｍａｓｔｅｒ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって直接走査した。
３つの蛍光色素における標準化は露出時間を変化させて５５，０００カウントに対する最大ピクセル値を調節することで行った。
泳動パターンを図５に示す。
ゲルイメージを、Ｄｅｃｙｄｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析するためにｔｉｆ形式ファイルに変換した。
ゲル解析によるサンプル間の相違を見つけるために、蛍光色素（Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５）のイメージを重ね合わせて、目的のスポットと標準化したスポットの濃度比を比べることで、有意にａｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅに高発現しているタンパクを同定した。
このスポット比較と統計は、Ｄｅｃｙｄｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＢＶＡ）ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。
一部のスポットは、自動収集機で２−Ｄゲルから切り出した。
そのゲルを１５時間、３０℃でトリプシン処理し、マススペクトル解析をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＣａｐＬＣ  Ｗａｔｅｒｓ）で行った。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの操作、データの取り込みおよび解析のすべてをＭａｓｓＬｙｎｘ３．２ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で行った。
結果を表１に示す。【００５１】
【表１】
2009054321.tif 000003
【００５２】
活性サンプル（Ａ）、非活性サンプル（Ｂ）を２次元ゲル電気泳動で比較した。
活性サンプル（Ａ）において３７スポットが、非活性サンプルより２倍以上高く発現していた。
同じ分子量のスポットで異なる等電点を示すものは同一のタンパクと考えられるので図５のように円で囲ってある。
その中で太字で示したものだけをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかけてタンパクを同定した。【００５３】
実施例８
［組み換えタンパク］
グルタチオントランフェラーゼ（ＧＳＴ）−シンテニン−１融合タンパクおよびマルトース結合タンパク  （ＭＢＰ）−ラクトアデヘリン融合タンパクを作成するために、ヒトシンテニン−１（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＢＣ０１３２５４）、ヒトラクトアデヘリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｕ５８５１６）のコーディング領域全体を末梢血単核球のｃＤＮＡからＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲ増幅したシンテニン１のフラグメントは、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで処理し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に挿入した。
また、ＰＣＲ増幅したラクトアデヘリンのフラグメントは、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＭＡＬ−Ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）へ挿入した。
ＰＣＲに使用したプライマーは、以下のとおりである。【００５４】
（シンテニン−１）
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＡＡＧＡＣ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣ−３’【００５５】
（ラクトアデヘリン）
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＴＧ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＣＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣ−３’【００５６】
全てのＰＣＲ増幅には、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。
ＤＮＡ配列の確認はＡＢＩ３１０ＤＮＡシークンエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。
ベクターに組み込んだプラスミド（ｐＧＥＸ−５Ｘ−２／シンテニン−１およびｐＭＡＬ−Ｃ２Ｘ／ラクトアデヘリン）でコンピテント細胞（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３））を形質転換した。
形質転換された大腸菌を３７℃、０．１μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。
３時間、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、細胞密度０．５（ＯＤ６００）のタンパクを発現させた。
ＧＳＴ−シンテニン−１を発現した大腸菌を回収し、冷却しながら超音波破砕器（Ａｓｔｒａｓｏｎ  ＸＬ−２０２０、Ｍｉｓｏｎｉｘ）で２０分間、細胞を破砕した。
溶解物を遠心（２０，０００×ｇ、２０分）し、ＧＳＴ−シンテニン−１融合タンパクをグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
ＭＢＰ）−ラクトアデヘリンについても同様の方法で精製した。
それぞれのタンパクの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色とヒトシンテニン−１抗体およびラクトアデヘリン抗体によるウエスタンブロットで確認した。【００５７】
実施例９
Ａ：ＧＳＴ−シンテニン−１を、実施例３に記載したＣＤ４０Ｌ培養システムに添加してナイーブＢ細胞からＩｇＡ分泌細胞へと分化させることができるかを調べた。
結果を図６Ａに示す。
ＧＳＴ−シンテニン−１は、容量依存的にナイーブＢ細胞からＩｇＡ分泌細胞へと分化させることができた。
しかし５μｇ／ｍｌ以上ＧＳＴ−シンテニン−１を増加しても結果は変わらなかった。
Ｂ：ｒＩＬ−１０はすべてのサブクラスを同様に促進したが、ＧＳＴ−シンテニン−１は選択的にＩｇＡ分泌細胞へと分化させた。結果を図６Ｂに示す。
Ｃ：  同じ実験を行い、ＥＬＩＳＰＯＴではなくフローサイトを使用して表面ＩｇＡ（＋）Ｂ細胞数を調べた。
結果は、ＩＬ−１０ほど強くはないが、ＧＳＴ−シンテニン−１はナイーブＢ細胞から表面ＩｇＡ（＋）Ｂ細胞へと分化促進した。
結果を図６Ｃに示す。【００５８】
実施例１０
１０人の初乳について、実施例３と同様にＩｇＡ誘導能を調べ、同時にその初乳中のシンテニン−１の発現をウェスタンブロット法にて調べた。
結果を図８に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
シンテニン−１、およびシンテニン−１をコードするＤＮＡはＩｇＡグロブリンのクラススイッチを誘導することから、ＩｇＡ免疫グロブリンのクラススイッチ誘導作用剤、抗体産生誘導剤、免疫賦活剤などとして用いることができる。
したがって、シンテニン−１、およびシンテニン−１をコードするＤＮＡは、ウイルスによる感染症または疾病、細菌または真菌による感染症または疾病、癌、抗体産生低下を伴う免疫不全症などの予防・治療薬などとして用いることができる。
【図１】
2009054321.tif 000004
【図２】
2009054321.tif 000005
【図３】
2009054321.tif 000006
【図４】
2009054321.tif 000007
【図５】
2009054321.tif 000008
【図６】
2009054321.tif 000009
【図７】
2009054321.tif 000010
【図８】
2009054321.tif 000011
【配列表】
2009054321000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月10日(2009.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体を含有することを特徴とするＢ細胞のＩｇＡクラススイッチング剤。
【請求項２】
シンテニン−１又はシンテニン−１と実質的に同一の改変体をコードするＤＮＡを含有することを特徴とするＢ細胞のＩｇＡクラススイッチング剤。
【国際調査報告】
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