(57)【要約】  関節リウマチの新しい診断方法を提供する。血清（全血清、ＨＡＰまたはＬＡＰ）中の糖鎖発現量の定量的発現プロファイルをもとに関節リウマチとの関連性を解析して、関節リウマチの罹患に伴って変動する糖鎖および糖タンパク質を見出し、新たなバイオマーカーとなる血清糖鎖および糖タンパク質を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法。
【請求項２】
No.４５の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法。
【請求項３】
No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、請求項１または２記載の診断方法。
【請求項４】
No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の発現量を指標とする、請求項１から３のいずれかに記載の診断方法。
【請求項５】
糖鎖の血清中発現量を指標とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用。
【請求項７】
No.４５の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用。
【請求項８】
No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の、請求項６から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、糖鎖分析を用いた関節リウマチの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  関節リウマチ（ＲＡ）は関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。ＲＡは、初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。軟骨組織のプロテオグリカンとコラーゲンを分解する多数のタンパク質分解酵素（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ペプチダーゼ等）の濃度上昇がそのような組織において見られることが知られている（非特許文献１、２参照）。さらに、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、種々のサトカイン及び酵素阻害因子もまたＲＡの病因に重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献３，４参照）。  これらのタンパク質は膝、関節部と複雑に関与しながら、慢性的炎症から関節の破壊に至るまで病状を増悪化する。ＲＡ患者の薬物治療には、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）及び生物学的薬剤（抗ＴＮＦレセプター及びＩＬ−１拮抗剤）等が用いられている（非特許文献５−７参照）。しかしながら、懸命の治療にもかかわらず、多くのＲＡ患者の病状は回復せず痛みを感じ続け、骨破壊を受け続ける。期発見と早期治療がＲＡ患者の生活の質を改良する上からも重要である。【０００３】  ＲＡは上記したように重篤にいたる疾患でありながら、現在のＲＡの診断方法は、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の「ＡＣＲ改訂診断基準」に基づくものである。該診断基準は、  １）１時間以上続く朝のこわばり（主に手指）；  ２）３箇所以上の関節腫れ；  ３）手の関節（手関節、中手指節関節、近位指節間接）の腫れ；  ４）対称性の関節（左右同じ関節）の腫れ；  ５）手のエックス線写真の異常所見；  ６）皮下結節、及び  ７）血液検査でリウマチ反応が陽性、であって、このうち、４項目以上満たせばＲＡと診断される。【０００４】  ここで前記７）の血液検査は、血清中のリウマチ因子（ＲＦ）が主として測定される。ＲＦは、ＲＡ患者の血清中に高頻度で出現するＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体である。健常人のＲＦはＩｇＧ以外の種々のタンパクにも反応する、反応性の多様な抗体(polyactive antibody)であるが、ＲＡ患者由来のＲＦはこの反応性の多様な抗体以外にＩｇＧＦｃのみに反応する、単一反応性の抗体(monoactive antibody)が存在する。この単一反応性のＲＦは、反応性の多様な抗体に比べ、ＩｇＧＦｃに対する反応が約１００倍高い。このため、一般には該ＲＦがＲＡ患者の判定の指標として測定される。【０００５】  しかし、ＲＡ患者でも常にＲＦが検出されない血清反応陰性ＲＡも存在し、また健常人でも陽性反応（２％程度）を呈しうることが知られている。リウマチ因子以外の自己抗体の検出の早期診断における有用性も報告されており、そのような自己抗体としては、例えば、抗Ｓａ蛋白抗体、抗核周辺因子(perinuclear factor)抗体、抗ケラチン抗体、抗フィラグリン抗体、抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）抗体などが知られている(非特許文献８参照)。抗ＣＣＰ抗体はＲＡ患者血清の約７６％から検出されるが、リウマチ様症状を呈するがＲＡとは判定されない患者血清でも約４％検出される (非特許文献９および１０参照)。ＲＡ患者の滑膜にはシトルリン化されたタンパクが検出されることから、シトルリンを含むエピトープのＲＡの病原性への関与が指摘されている（非特許文献１１および１２参照）が、シトルリンを含むエピトープは十分に明らかにされていない。【０００６】  他にもＲＡ患者の尿を、液体クロマトグラフィーを用いてＲＡ特有成分のクロマトピークの存在を以ってＲＡであると判定する方法（特許文献１参照）、糖タンパク質から糖鎖を切り出し、該糖鎖を標識した後精製して糖鎖分析用試料を調製し、その調製した試料をＯＤＳ−シリカカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析し、試料の糖鎖組成を求めることにより、糖鎖組成変化に基づきＲＡを診断する方法（特許文献２参照）等が提案されているが、これらの方法は分析用試料の調製が煩雑であり、かつ感度・特異度の点で満足すべきものではなかった。【０００７】
【特許文献１】特開平７−７２１３３号公報
【特許文献２】特開平８−２２８７９５号公報
【非特許文献１】ランデュー・アール等（Landewe R. et al.), Arthritis Rheum, 2004, Vol.50, p.1390-1399）
【非特許文献２】チェトベリコフ・アイ等(Tchetverikov I), An Rheum. Dis., 2003, Vol.62, p.1094-1099
【非特許文献３】クロス・エー等(Cross A, et al.), Arthritis Rheum. 2004, Vol.50, p.1430-1436
【非特許文献４】リープ・ティー等(Raap T., et al.), J.Rheumatol., 2000, Vol.27, p.2558-2565
【非特許文献５】クリミーク・ピー・エー等(Klimiuk PA, et al.), J.Rheumatol., 2004, Vol.31, p.238-242
【非特許文献６】ドーガドス・エム等(Dougados M, et al.), J.Rheumatol., 2003, Vol.30, p.2572-2579
【０００８】
【非特許文献７】デー・エー等(De A, et al.), J.Rheumatol., 2002, Vol.29, p.46-51
【非特許文献８】マルチナス等(Martinus A.M. et al.), Arthritis Research (2002), 4(2), p.87-93
【非特許文献９】ジェラルド等(Gerard A. Schellekens, et al.), J. Clin.Invest, (1998), 101(1), p.273-281
【非特許文献１０】ツィジエ等(ZhiJie Zhou, and Henri-Andre Menard), Current Opinion in Rheumatology (2002) 14(3), p.250-253
【非特許文献１１】ウォルター等(Walter J van Venrooij and Ger J.M. Pruijn), Arthritis Research, (2000), 2(4), p.249-251
【非特許文献１２】クリスチン等(Christine Masson-Bessie, et al.), J. Immunol., (2001), 166(6), p.4177-4184
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  上述の診断法の中で、抗ＣＣＰ抗体は特異度、感度の点から最も有望視されているが、なお特異度は約７６％にとどまる。単独で、または併用により鋭敏にかつ特異性および感度の高い早期診断の可能な、あるいは、予後予測可能な新たなバイオマーカーを開発することが強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者は既に開発された高速網羅的糖鎖エンリッチ技術〔西村等(Nishimura, S, K Niikura, M Kurogochi, T Matsushita, M Fumoto, H Hinou, R Kamitani, H Nakagawa, K Deguchi, N Miura, K Monde, and H Kondo)「ハイスループット・プロテイングライコミクス：化学選択的グリコブロッティングとマルディトフ／トフ質量分析との併用」“High-Throughput Protein Glycomics: Combined Use of Chemoselective Glycoblotting and Maldi-Tof/Tof Mass Spectrometry.” Angew Chem Int Ed Engl 44, no.1 (2004): 91-96〕に基づき調製された血清中糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ等の質量分析技術により各罹患状態の患者血清を大規模解析した。そして各患者の血清中糖鎖の定量的発現プロファイルをもとに各罹患状態を結びつけ、変動する糖鎖を見出し、新たなバイオマーカーとなる血清糖鎖あるいは、変動する糖鎖を有する糖タンパク質あるいは変動する糖鎖の生合成経路に関わる分子群を同定し、感度、特異度の高い診断法を確立するに至った。【００１１】  本発明は、（１）No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、（２）No.７、１８、２５、２９、３８、３１、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、（３）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１）または（2）に記載の方法、（４）糖鎖の血清中発現量を指標とする、上記発明（１）から（３）のいずれかに記載の方法、（５）No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、（６）No.７、１８、２５、２９、３１、３８、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、（７）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（５）または（6）に記載の使用、（８）被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する方法であって、糖鎖を含有する試料を被験動物から採取する工程、および前記試料中におけるNo.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として前記被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する工程を具備する上記方法、（９）被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する方法であって、糖鎖を含有する試料を被験動物から採取する工程、および前記試料中におけるNo.７、１８、２５、２９、３１、３８、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を指標として前記被験動物が関節リウマチに罹患しているか否かを診断する工程を具備する上記方法、（１０）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（８）または（９）に記載の方法、（１１）試料が血清である上記発明（８）から（１０）のいずれかに記載の方法、（１２）被験者から採取した試料において、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２��、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を測定する工程を包含する、該糖鎖の発現量が正常人の範囲内にあるかどうかを解析する方法、（１３）被験者から採取した試料において、No.７、１８、２５、２９、３１、３８、４１、４３および４５よりなる群から選択される一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を測定する工程を包含する、該糖鎖の発現量が正常人の範囲内にあるかどうかを解析する方法、（１４）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１２）または（１３）に記載の方法、（１５）試料が血清である上記発明（１２）から（１４）のいずれかに記載の方法、（１６）（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.１、７、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４、２５、２７、２９、３１、３８、４１、４３、４５、４６および４８よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。（１７）（ｉ）被験サンプルの糖鎖を解析する工程、（ii）健常人および被験サンプルにおける、No.７、１８、２５、２９、３８、３１、４３および４５よりなる群から選択される、一つまたは二つ以上の糖鎖の発現量を比較する工程、を包含する、関節リウマチサンプルを選別する方法。（１８）選択された糖鎖がNo.４５である、上記発明（１６）または（１７）に記載の方法、および（１９）サンプルが血清である上記発明（１６）から（１８）のいずれかに記載の方法、に関する。  本発明はさらに、（１）当該糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、No.４５の糖鎖発現量を指標とする関節リウマチの診断方法、（２）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、（３）当該糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している、No.４５の糖鎖の関節リウマチマーカーとしての使用、（４）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖の、関節リウマチマーカーとしての使用、（５）No.４５の糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１−アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２−ＨＳグリコプロテイン、α１−アシドグリコプロテイン１、α１−アシドグリコプロテイン２、ジンクα２−グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、（６）No.４５の糖鎖組成中のフコースが側鎖に付加している糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１−アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２−ＨＳグリコプロテイン、α１−アシドグリコプロテイン１、α１−アシドグリコプロテイン２、ジンクα２−グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標��する、関節リウマチの診断方法、および、（７）No.４５の糖鎖組成を有し、かつシアリルルイスｘ（NeuNAcα2→3Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc）またはシアリルルイスa（NeuNAcα2→3Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAc）をエピトープとして有する糖鎖によって修飾されたヘモペキシン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、クラステリン、キニノーゲン１、α１−アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＨ、α２−ＨＳグリコプロテイン、α１−アシドグリコプロテイン１、α１−アシドグリコプロテイン２、ジンクα２−グリコプロテイン、プラズマプロテアーゼＣ１インヒビターの発現量を指標とする、関節リウマチの診断方法、に関する。
【発明の効果】
【００１２】  本発明によれば、感度ならびに特異度において従来法を上回る、あるいは相補的な優位性を有した診断法が提供され、関節リウマチ患者の早期診断が可能となる。更には、早期診断の導入により、適確な医療処置を施すことが可能となり、関節リウマチの治療効果および予後の改善に貢献することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明によれば、被験者血清からグリコブロッティング(Glycoblotting)法により血中の全Ｎ−型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより定量的プロファイルを取得する。このとき、内部標準として既知量のオリゴ糖を添加しておけば、そのスペクトル上の面積より、他の血清由来糖鎖量を容易に算出できる。検出されるオリゴ糖は例えば表１に示すとおりである。【００１４】
【表１】
2009096403.tif 000002
2009096403.tif 000003
（表中、Manはマンノース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン、Hexはヘキソース、HexNAcはＮ−アセチルヘキソサミン、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸を表す。）
【００１５】  その後、一つまたは二つ以上の糖鎖発現量または糖鎖発現量の増減から関節リウマチの罹患を推定し、同疾患の診断および予後の管理・予測に有用な方法を得ることができる。  例えば、バイセクティングGlcNAcを持つ４種類の糖鎖（No.７、２５、２９および３８）については、関節リウマチ患者において増加する傾向が見出される。トリシアリル構造を有するNo.４３およびフコースの付加したNo.４５についても関節リウマチ患者において顕著な増加がみられる。また血清中のＮ-結合型糖鎖総量および主要な糖鎖であるNo.３１に関してもリウマチ患者において有意な発現量の増加を認める。一方、No.５の糖鎖が関節リウマチによって増加する傾向のあることは既に報告されているが、No.５にガラクトースが結合したNo.１８は健常人よりもむしろ減少する傾向が見られる。  特にNo.４５は最も有意に健常人とリウマチ患者を識別可能(P<0.0005)で、ＲＯＣカーブは既存の関節リウマチのバイオマーカーであるＲＦよりも明らかに優れており、現在最も有用性が認められている抗ＣＣＰ抗体と比較しても同程度またはそれ以上に有用である。
【実施例１】
【００１６】  関節リウマチ患者１４名および健常人１１名の血清の糖鎖について解析をおこなった。今回用いた血清はすべて性別が女性で、ともに平均年齢が５６歳であった。西村らのグリコブロッティング(GlycoBlotting)法により血中の全Ｎ-結合型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより定量的プロファイルを取得した。  関節リウマチ患者および健常人のＮ−結合型糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを図１に示す。また、健常人および関節リウマチ患者における糖鎖発現量を図２に示す。各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した糖鎖の定量値を用いた。関節リウマチ患者ではNo.７、２５、２９、３１、３８、４３および４５の各糖鎖において発現量の有意な増加が、No.１８の糖鎖においては発現量の有意な減少がそれぞれ認められた。また、血清のＮ−結合型糖鎖の総量についても、関節リウマチ患者における有意な増加が認められた。【００１７】  図３、４は健常人および関節リウマチ患者において、各検体における糖鎖発現分布を示す箱ひげ図であって、統計解析ソフト・スポットファイアー（SpotFire Decision Site for Functional Genomics, Spotfire, Inc.）により作成した。  図５には、既存のＲＡバイオマーカー（ＲＦ、抗ＣＣＰ抗体およびＭＭＰ３）およびNo.４５のＲＯＣ曲線を示す。  ここで、ＲＯＣとは、受信者動作特性（Receiver Operation Characteristic）の略であって、本実施例では患者とそうでない者の２群で、対象となるマーカーを測定し、得られた測定値ごとに、感度、特異度を算出した。「感度」とは「疾患を持っている者について陽性の結果が得られる割合」を、「特異度」とは「疾患を持っていない者について陰性の結果が得られる割合」を、意味する。横軸に「１から特異度を減じた値（偽陽性：false positive，ＦＰ）」を、縦軸に「感度(真陽性true positive, ＴＰ)」をプロットし、点を繋いで得られる曲線がＲＯＣ曲線である。左上の隅に曲線が近いほど、誤診が少なくかつ真性度の高い、即ち診断効率の高い優れたマーカーと判断される。これを定量化したものがＲＯＣ曲線のＡＵＣ(曲線下面積)で、最大値（１）に近いほど優れたマーカーといえる。試験した既存のＲＡバイオマーカー三種および糖鎖No.４５について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表２に示す。【００１８】
【表２】
2009096403.tif 000004
上記のとおり、糖鎖No.４５は最も有意に健常人とリウマチ患者を識別可能(P<0.0005)で、ＲＯＣカーブは既存の関節リウマチのバイオマーカーであるＲＦよりも明らかに優れており、現在最も有用性が認められている抗ＣＣＰ抗体と比較しても同程度またはそれ以上に有用であった。
【実施例２】
【００１９】  血清中に高濃度に含まれる6種類のタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン、アンチトリプシン、ハプトグロビン）に対する抗体カラムを用いて、血清の高濃度タンパク質を含む画分（ＨＡＰ）、およびＨＡＰを除去した中〜低濃度タンパク質を含む画分（ＬＡＰ）を調製し、グリコブロッティング(GlycoBlotting)法によりそれぞれのＮ-結合型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより定量的グライコームプロファイルを健常人と関節リウマチ患者で比較した。  各糖鎖の発現量は、スペクトル上に認められた個々の糖鎖のシグナルの面積を検出された全ての糖鎖のシグナルの面積の和で除した面積比より算出した相対値を用いて比較した。両側t検定で、健常と関節リウマチ患者の個々の糖鎖の発現量を比較した結果、関節リウマチ患者ＨＡＰではNo.２５、４１、および４５の各糖鎖において発現量の有意（ｐ＜０．０１）な増加が、１０、１８、２７の糖鎖においては発現量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。ＬＡＰではNo.４５、４６、４８の各糖鎖において発現量の有意な（ｐ＜０．０１）増加が、No.１、８、１０、１１、１７、１８、２１、２４の糖鎖においては発現量の有意な（ｐ＜０．０１）減少がそれぞれ認められた。有意な発現変動が認められた糖鎖について、健常人および関節リウマチ患者間の糖鎖発現分布を示す箱ひげ図を図６、７に、ＬＡＰで最も有意に罹患に伴い発現量が変動した糖鎖（No.４５）のＲＯＣ曲線を図８に、有意な発現変動が認められた糖鎖について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表３に示す。また、既存のＲＡバイオマーカー３種および糖鎖No.４５について得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣを下表４に示す。【００２０】
【表３】
2009096403.tif 000005
【００２１】
【表４】
2009096403.tif 000006
上記のとおり、糖鎖No.４５は全血清、ＨＡＰ、ＬＡＰいずれを用いた場合にも最も有意に健常人とリウマチ患者を識別可能な糖鎖バイオマーカーであり、ＬＡＰを用いた場合、特に有意に両者の識別が可能であることがわかった。ＲＯＣカーブは既存の関節リウマチのバイオマーカーであるＲＦよりも明らかに優れており、現在最も有用性が認められている抗ＣＣＰ抗体と比較しても同程度またはそれ以上に有用であった。
【実施例３】
【００２２】  健常人とリウマチ患者を最も有意に識別可能な糖鎖No.４５によって修飾されている血清タンパク質を健常人血清から同定した。  血清タンパク質を還元アルキル化後、トリプシン消化し、コンカナバリンＡカラムにアプライした。コンカナバリンＡカラム非吸着画分をニホンニワトコレクチンカラムにアプライし、ラクトースで溶出した。ニホンニワトコレクチンカラム吸着画分を逆相ＨＰＬＣカラムで分画し、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理で糖鎖を遊離させた。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理前後のサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用い解析し、糖鎖No.４５の質量分のシフトが認められたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを得、ＭＡＳＣＯＴで検索した。  糖鎖No.４５を有するタンパク質の同定例を図９に示した。同定した糖鎖No.４５を有するタンパク質および同タンパク質のトリプシン消化物ペプチド配列を下表５に示す。【００２３】
【表５】
2009096403.tif 000007
上記に示した、健常人とリウマチ患者を識別可能な糖鎖No.４５に修飾されるタンパク質は、関節リウマチのバイオマーカーとして有用であることが示唆された。
【実施例４】
【００２４】  関節リウマチ患者１４名および健常人１１名の血清の糖鎖の中で最も有意に関節リウマチ患者と健常人を識別可能であった糖鎖Ｎｏ.４５は、(Hex)3 (HexNAc)3 (Deoxyhexose)1 (NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2の糖組成を有する（表１）が、本糖組成を有する構造には、フコース（Deoxyhexose）の結合位置の多様性等のために複数の構造異性体が存在する。関節リウマチのバイオマーカーとして有用なＮｏ．４５の構造を特定するために、より詳細な構造解析を行った。  実施例１で調製した関節リウマチ患者１４名および健常人１１名のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析用試料を用い、糖鎖Ｎｏ．４５に相当するイオンを親イオンとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ（ＭＳ／ＭＳ）解析を行った。健常人およびＲＡ患者で認められたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ解析の結果得られたフラグメントパターンの例を図１０に示した。還元末端の構造に特徴的なＹイオンが良好に観察されており、図中（２）で示したフラングメントピークは、フコースが糖鎖の還元末端に結合した場合にのみ検出される特徴的なフラグメントであり、（３）で示したフラグメントはフコースが糖鎖の分岐側鎖に結合した場合により高頻度に出現するフラグメントである。図１０に示す通り、フラグメントピーク（２）と（３）の相対的強度は、健常人とＲＡ患者間で異なる傾向が認められたことから、Ｎｏ．４５で表される糖鎖の中でフコース残基の結合位置の分布に健常人とＲＡ患者間に違いがあることが示唆された。フコース残基の結合位置の分布を健常、ＲＡ患者の２群間で定量的に評価するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルよりフラグメントピーク（２）と（３）を含む３つのＹイオンを抽出し、フコース残基の結合位置によらず一定のフラグメントを与えるフラグメントピーク（１）の値に対する相対値として規格化して表５に示した。値として規格化したピーク強度（normalized intensity、表６−１）と規格化したピーク面積(normalized area、表６−２)を用いた。【００２５】
【表６−１】
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【００２６】
【表６−２】
2009096403.tif 000009
【００２７】  （ＭＳ／ＭＳスペクトルより４つのＹイオンについて抽出し、詳細な解析を行った結果であり、データは全て分子量４３３のフラグメントピーク（図１０の（１））の値を１とするように規格化した。値として規格化したピーク強度（normalized intensity、表６−１）と規格化したピーク面積(normalized area、表６−２)を用いた。)  それぞれの値を使って、関節リウマチ患者と健常人のデータの間に分散の差が無いかＦ検定を用いて検定したところ、２群の間に分散の差はないと言えた。そこで、等分散を仮定した両側t検定で、前述の４つのＹイオンに関して差があるか検定したところ、フラグメントピーク（２）とフラグメントピーク（３）の両者において有意差が認められた。この結果から、糖鎖Ｎｏ．４５はフコースの結合部位の異なった構造異性体の混合物であり、その構造異性体の存在比は、関節リウマチ患者と健常人で有意に異なり、ＲＡ患者ではフコース残基が分岐側鎖に結合したものが顕著に増加することが判明した。これは既存の糖鎖の全質量のみを利用して行う測定では検出されないデータであり、ＭＳ／ＭＳを用いることによってはじめて明らかになった構造異性体のバイオマーカー候補である。【００２８】  なお、No.４５の構造の一般式は、下記(I)および(II)で表される。【化１】
2009096403.tif 000010
図中下線部を引いた箇所に構造異性体が存在し得る。すなわち、NeuAcはα2-3またはα2-6結合のいずれかでGalに結合し、Galはβ1-3またはβ1-4結合でGlcNAcに結合する。Fucは分岐側鎖のGlcNAcにα1-3またはα1-4結合で、あるいは還元末端のGlcNAcにα1-6結合する。ただし、Fucの数は4か所の結合部位のうち1ヵ所のみに結合している。全ての構造が天然に存在するわけではないが、上記による構造異性体の総数は1024(23x23x4x2)。
【実施例５】
【００２９】  関節リウマチおよび健常人の血清についてα２，３−シアリダーゼ消化後の糖鎖プロファイルを取得した。すでに血清より糖鎖を遊離したサンプル２０μＬに２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４および５）を１０μＬ加えｐＨを５に調製し、カルビオケム社製のノイラミニダーゼ(α2,3-Neuraminidase, Macrobdella decora,大腸菌組み替え)を２μＬ加え３７℃で１６時間反応を行った。反応後、グリコブロッティング(GlycoBlotting)法により糖鎖プロファイル（図１１）を取得した。その結果、糖鎖Ｎｏ．４５よりシアル酸が一つ切断された化合物が主生成物として観測され、少なくとも一つのシアル酸がα２，３結合していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】  本発明に従って糖鎖分析を行い、特定の糖鎖の増減を検討することで、感度ならびに特異度において従来法を上回る、あるいは相補的な優位性を有した関節リウマチの診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】関節リウマチ患者および健常人の血清より得られたＮ−結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。上段は健常人、下段は関節リウマチ患者の血清由来の糖鎖である。
【図２】健常人（Ctrl）および関節リウマチ患者（ＲＡ）における糖鎖発現量を示す。縦軸は発現糖鎖の絶対濃度、横軸は各糖鎖番号である。
【図３】No.５、７、１８、２５および２９の各糖鎖と全糖鎖について、糖鎖発現分布をそれぞれ関節リウマチ患者（ＲＡ）と健常人（対照）で比較した箱ひげ図である。各グラフの数字は糖鎖番号を表す。縦軸は糖鎖の発現量（μＭ）である。
【図４】No.３１、３８、４３および４５の各糖鎖と全糖鎖について、糖鎖発現分布をそれぞれ関節リウマチ患者（ＲＡ）と健常人（対照）で比較した箱ひげ図である。各グラフの数字は糖鎖番号を表す。縦軸は糖鎖の発現量（μＭ）である。
【図５】ＲＦ、抗ＣＣＰ抗体およびＭＭＰ３（左側）およびNo.４５（右側）のＲＯＣ（受信者動作特性：Receiver Operation Characteristic）曲線を示す。
【００３２】
【図６】健常人（Ctrl）および関節リウマチ患者（ＲＡ）のＨＡＰにおける糖鎖発現分布をそれぞれ関節リウマチ患者（ＲＡ）と健常人（対照）で比較した箱ひげ図である。各グラフの数字は糖鎖番号を表す。縦軸は相対量比（％）である。
【図７】健常人（Ctrl）および関節リウマチ患者（ＲＡ）のＬＡＰにおける糖鎖発現分布をそれぞれ関節リウマチ患者（ＲＡ）と健常人（対照）で比較した箱ひげ図である。各グラフの数字は糖鎖番号を表す。縦軸は相対量比（％）である。
【図８】ＬＡＰにおけるNo.４５のＲＯＣ（受信者動作特性：Receiver Operation Characteristic）曲線を示す。
【図９】糖鎖No.４５を有するタンパク質（ヘモペキシン）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによる同定例を示す。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理でＮ−結合型糖鎖を遊離するときに糖鎖が結合していたアスパラギン（Ｎ）はアスパラギン酸（Ｄ）に変換される。
【図１０】健常人およびリウマチ患者の糖鎖Ｎｏ．４５についてのＭＳ／ＭＳスペクトルであり、（１）、（２）および（３）のフラグメントイオンの構造は、還元末端の試薬（１）、試薬＋Ｎ−アセチルグルコサミン＋フコース（２）および試薬＋Ｎ−アセチルグルコサミン＋Ｎ−アセチルグルコサミン（３）を示す。
【図１１】α２，３−シアリダーゼ処理後の糖鎖プロファイルであり、処理後にシアル酸の切断が見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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