(57)【要約】  本発明は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に効率的に発現する方法を提供する。本発明は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する方法であって、以下の工程を具備する：（ａ）クロルプロマジンを含有する培地に細胞を接触させる工程、ここで前記細胞は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および受容体輸送タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトされており、（ｂ）工程（ａ）の後、前記培地を前記細胞から分離して、前記培地を除去する工程、および（ｃ）工程（ｂ）の後、クロルプロマジンを含有しない培地を用いて前記細胞を培養して、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する方法であって、以下の工程：
（ａ）  クロルプロマジンを含有する培地に細胞を接触させる工程、ここで
前記細胞は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および受容体輸送タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトされており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記培地を前記細胞から分離して、前記培地を除去する工程、および
（ｃ）  工程（ｂ）の後、クロルプロマジンを含有しない培地を用いて前記細胞を培養して、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５をコードするベクターおよび前記受容体輸送タンパク質をコードするベクターが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において、前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および前記受容体輸送タンパク質の両者をコードするベクターが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）において、前記クロルプロマジンの濃度は１０μｇ／ｍｌ以上２５μｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、前記細胞は０．５〜２０時間静置される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は、配列番号：１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５のＮ末端が、アミノ酸配列（配列番号：１８）によって修飾されている、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嗅覚受容体は、三量体Ｇタンパク質結合型受容体（以下、「ＧＰＣＲ」という）である。より具体的には、嗅覚受容体は、三量体Ｇタンパク質結合型７回膜貫通型受容体の１種である。【０００３】
図５は、細胞膜への匂い分子の刺激が電気信号に変換されるメカニズムを示す。【０００４】
嗅覚受容体は、細胞膜上に発現している膜タンパク質である。当該細胞膜は、主に、脂質二重膜からなる。脂質二重膜は、各層が高密度に並んだリン脂質分子からなる二層の構造を有している。この脂質二重膜が、図５の中央に模式的に示されている。図５において、脂質二重膜の上側が細胞外側であり、他方、脂質二重膜の下側が細胞内側である。当該嗅覚受容体の近傍に、三量体Ｇタンパク質が配置されている。【０００５】
当該三量体Ｇタンパク質は、αサブユニット（Ｇαｏｌｆ）、βサブユニット（Ｇβ）、およびγサブユニット（Ｇγ）から構成されるヘテロ三量体である。細胞は、アデニル酸シクラーゼを含有する。図５では、アデニル酸シクラーゼは、記号「ＡＣ」で記述されている。アデニル酸シクラーゼは、正確には、膜貫通型タンパク質である。タンパク質ＲＴＰ１Ｓ（配列番号：０１、Gen Bank Accession No: EU070411）は、嗅覚受容体が細胞膜に発現することを補助する機能を有する。なお、このタンパク質ＲＴＰ１Ｓは、上記メカニズムとは直接的には関連しない。【０００６】
次に、上記メカニズムが説明される。匂い分子が当該嗅覚受容体に結合する。当該結合は、三量体Ｇタンパク質をαサブユニット（Ｇαｏｌｆ）とβγ複合体とに分離させる。当該βγ複合体は、サブユニットＧβおよびＧγからなる。分離したＧαｏｌｆは、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を活性化させる。活性化したアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）に変換する。【０００７】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、イオンチャネル（具体的には、例えば、環状ヌクレオチド感受性イオンチャネル（ＣＮＧ））を活性化する。当該活性化は、細胞内から細胞外へ、または細胞外から細胞内へイオンが輸送されることをもたらす。このイオンの輸送の度合いが、電気信号として測定され得る。【０００８】
マウス嗅覚受容体は、認識される匂い分子に応じて様々な嗅覚受容体を含む。マウス嗅覚受容体の例は、マウス嗅覚受容体の例は、マウスオイゲノール認識嗅覚受容体ｍＯＲＥＧ、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１６８、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５、またはマウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ６０９である。【０００９】
マウスオイゲノール認識嗅覚受容体ｍＯＲＥＧは、オイゲノールを認識する。言い換えれば、マウスオイゲノール認識嗅覚受容体ｍＯＲＥＧは、オイゲノールによって刺激される。オイゲノールは、マウスオイゲノール認識嗅覚受容体ｍＯＲＥＧに対して匂い分子として機能する。マウスオイゲノール認識嗅覚受容体ｍＯＲＥＧは、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ７３と言われる。【００１０】
マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１６８は、２−ペンタノンを認識する。言い換えれば、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１６８は、２−ペンタノンによって刺激される。２−ペンタノンは、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１６８に対して匂い分子として機能する。【００１１】
マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は、シクロヘキサノンを認識する。言い換えれば、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は、シクロヘキサノンによって刺激される。シクロヘキサノンは、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５に対して匂い分子として機能する。【００１２】
マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ６０９は、バニリン酸を認識する。言い換えれば、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ６０９は、バニリン酸によって刺激される。バニリン酸は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ６０９に対して匂い分子として機能する。【００１３】
非特許文献１は、ＲＴＰ１Ｓのような受容体輸送タンパク質（以下、「ＲＴＰ」という）を用いて、嗅覚受容体を細胞膜に発現する方法を開示している。【００１４】
より具体的には、嗅覚受容体をコードする遺伝子配列を含有するベクターおよびＲＴＰをコードする遺伝子配列を含有するベクターを用いて細胞がトランスフェクトされる。この細胞がインキュベートされ、その細胞膜に嗅覚受容体が発現される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Saito, H., M. Kubota, et al. (2004). "RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors." Cell 119(5): 679-691.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
後述される比較例１において実演されるように、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５およびＲＴＰをコードする遺伝子配列を用いて細胞がトランスフェクトされても、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は細胞膜に効率的に発現されない。
本発明の目的は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に効率的に発現する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  クロルプロマジンを含有する培地に細胞を接触させる工程、ここで
前記細胞は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および受容体輸送タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトされており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記培地を前記細胞から分離して、前記培地を除去する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、クロルプロマジンを含有しない培地を用いて前記細胞を培養して、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に発現する。
工程（ａ）において、前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５をコードするベクターおよび前記受容体輸送タンパク質をコードするベクターが用いられ得る。
工程（ａ）において、前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および前記受容体輸送タンパク質の両者をコードするベクターが用いられ得る。
工程（ａ）において、前記クロルプロマジンの濃度は１０μｇ／ｍｌ以上２５μｇ／ｍｌ以下であり得る。
工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、前記細胞は０．５〜２０時間静置され得る。
前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は、配列番号：１９に示されるアミノ酸配列からなり得る。
前記マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５のＮ末端が、アミノ酸配列（配列番号：１８）によって修飾され得る。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５を細胞膜に効率的に発現する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、プラスミド（ＲＴＰ１Ｓ）を調製する手法を示す。
【図２】図２は、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−ｍＯＲＥＧ）を調製する手法を示す。
【図３】図３は、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−Ｏｌｆｒ１５）を調製する手法を示す。
【図４】図４は、本発明の手法を概念的に示す。
【図５】図５は、細胞膜への匂い分子の刺激が電気信号に変換されるメカニズムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態が説明される。
マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は、配列番号：１９により表されるアミノ酸配列からなる。マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５が細胞膜に効率的に発現される限り、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５のＮ末端はアミノ酸配列により修飾され得る。このアミノ酸配列の例は、Ｒｈｏタグ（配列番号：１０）−ｍｙｃエピトープタグ（配列番号：１３）を具備するアミノ酸配列（配列番号：１８）である。Ｒｈｏタグ（配列番号：１０）およびｍｙｃエピトープタグ（配列番号：１３）の間にはリンカが含まれ得る。同様に、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５が細胞膜に効率的に発現される限り、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５のＣ末端もまた、アミノ酸配列により修飾され得る。
【００２１】
（工程（ａ））
図４に示されるように、クロルプロマジンを含有する培地に細胞が接触される。好ましくは、液体培地が用いられる。後述されるように、これらの細胞は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および受容体輸送タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトされている。
【００２２】
具体的には、これらの細胞を含有する容器に、クロルプロマジンを含有する液体培地が添加される。細胞の好適な例は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００２３】
最初に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する培養液が容器に添加された後、培養液が除去される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、培養液を含有する容器の内部で、容器の内壁に自発的に吸着することが知られている。そのため、図４の最上部に示されるように、培養液の除去後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は容器の内壁に残る。この容器に、クロルプロマジンを含有する液体培地が添加される。
【００２４】
これに代えて、クロルプロマジンを含有する液体培地および細胞が混合され、クロルプロマジンを含有する液体培地に細胞が接触され得る。
【００２５】
工程（ａ）の前に、細胞は、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および受容体輸送タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトされる。より詳細には、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５および受容体輸送タンパク質をコードする遺伝子配列を具備するベクターが細胞に導入される。１つのベクターが、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５をコードする遺伝子配列および受容体輸送タンパク質をコードする遺伝子配列の両方を具備し得る。これに代えて、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５をコードする遺伝子配列を具備する第１ベクターおよび受容体輸送タンパク質をコードする遺伝子配列を具備する第２ベクターが、細胞に導入され得る。ベクターの例は、プラスミドまたはバクテリオファージである。
【００２６】
受容体輸送タンパク質の例は、配列番号：０１により表されるタンパク質ＲＴＰ１Ｓである。
【００２７】
（工程（ｂ））
工程（ａ）の後、液体培地が細胞から分離されて、液体培地を除去する。図４に示されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が用いられる場合、培養液が容器から除去される。濾過または遠心分離により液体培地は細胞から分離され、除去され得る。
【００２８】
（工程（ｃ））
工程（ｂ）の後、クロルプロマジンを含有しない培地に細胞が接触される。好ましくは、クロルプロマジンを含有しない液体培地に細胞が浸漬される。図４に示されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が用いられる場合、クロルプロマジンを含有しない液体培地が容器に添加される。これに代えて、クロルプロマジンを含有しない液体培地および細胞が混合され、クロルプロマジンを含有しない液体培地に細胞が浸漬され得る。
【００２９】
このようにして、クロルプロマジンを含有する液体培地が、クロルプロマジンを含有しない液体培地により置換される。言い換えれば、工程（ａ）において用いられた培地は、クロルプロマジンを含有しない培地により交換される。
【００３０】
この後、細胞は培養され、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５をその細胞膜に発現する。
通常、細胞が培養されると、タンパク質は細胞内に発現する。しかし、本発明では、発現されたマウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５は、細胞膜に局在化している。
【実施例】
【００３１】
以下、実施の形態を裏付ける実施例が説明される。【００３２】
（実施例１）
表１は、実施例１において用いられたプライマーを示す。【００３３】
【表１】
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【００３４】
（プラスミド（ＲＴＰ１Ｓ）の調製）
図１に示されるように、ＲＴＰ１Ｓを発現するためのプラスミド（以下、プラスミド（ＲＴＰ１Ｓ）という）は、以下のように調製された。【００３５】
まず、非特許文献２に開示される方法に従って、マウス嗅覚受容体から全ＲＮＡが調製された。
［非特許文献２］
Y. Uriu et. al., "Rab3-interacting Molecule γ Isoforms Lacking the Rab3-binding Domain Induce Long Lasting Currents but Block Neurotransmitter Vesicle Anchoring in Voltage-dependent P/Q-type Ca2+ Channels.", Journal of Biological Chemistry 285(28): 21750-21767.【００３６】
次に、マウス嗅覚受容体のｃＤＮＡライブラリが、逆転写反応により全ＲＮＡから得られた。【００３７】
ｃＤＮＡライブラリに含まれるＲＴＰ１Ｓをコードする標的ＤＮＡ配列が、プライマー１（配列番号：０２）およびプライマー２（配列番号：０３）を用いるＰＣＲ法により増幅された。【００３８】
その後、ＲＴＰ１Ｓをコードする標的ＤＮＡ配列（配列番号：２２）は、クローニングベクターにライゲーションされた。【００３９】
ＲＴＰ１Ｓをコードする標的ＤＮＡ配列は、上記クローニングベクター、プライマー３（配列番号：０４）、およびプライマー４（配列番号：０５）を用いるＰＣＲ法によって増幅された。プライマー３（配列番号：０４）およびプライマー４（配列番号：０６）は、それぞれ制限酵素サイトＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを有していた。このようにして、制限酵素サイトＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩをそれぞれ５’末端および３’末端に有する標的ＤＮＡ配列（配列番号：２３）が得られた。以下、この標的ＤＮＡ配列は、「ＥｃｏＲＩ−ＲＴＰ１Ｓ−ＳａｌＩ」と言われる。【００４０】
標的ＤＮＡ配列は、哺乳動物発現用ベクターにライゲーションされた。この哺乳動物発現用ベクターは、前もって、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによって処理されていた。このようにして、プラスミド（ＲＴＰ１Ｓ）が調製された。【００４１】
（プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−Ｏｌｆｒ１５）の調製）
図２および図３に示されるように、Ｏｌｆｒ１５を発現するためのプラスミド（以下、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−Ｏｌｆｒ１５）という）は、以下のように調製された。【００４２】
まず、ｍＯＲＥＧをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ０６１２２８．１、配列番号：２４）が、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ法により増幅された。このＰＣＲ法では、プライマー７（配列番号：０６）およびプライマー８（配列番号：０７）が用いられた。増幅された遺伝子がクローニング用のプラスミドへライゲーションされ、ｍＯＲＥＧをコードする遺伝子をクローニングした。【００４３】
次に、ＰＣＲ法により、ｍＯＲＥＧをコードする遺伝子の５’末端にＲｈｏタグをコードする遺伝子配列が付加された。Ｒｈｏタグ（配列番号：１０）をコードする遺伝子配列は６０個の塩基を有するため、Ｒｈｏタグの付加は２つの工程（すなわち、第１工程および第２工程）に分割された。【００４４】
第１工程では、上記ｍＯＲＥＧをコードするプラスミド、プライマー８（配列番号：０７）、およびプライマー９（配列番号：０８）を用いるＰＣＲ反応が行われ、ｍＯＲＥＧをコードする遺伝子の５’末端に３１塩基が付加された遺伝子断片（配列番号：２５）が得られた。プライマー９が、当該３１塩基を有していた。【００４５】
同様に、第２工程では、第１工程により得られた遺伝子断片、プライマー８（配列番号：０７）、およびプライマー１０（配列番号：０９）を用いるＰＣＲ反応が行われ、追加の２９塩基が５’末端に付加された。プライマー１０（配列番号：０９）が当該追加の２９塩基を有していた。プライマー１０（配列番号：０９）は、制限酵素サイトＥｃｏＲＩも有していた。【００４６】
このようにして、Ｒｈｏタグ（配列番号：１０）をコードする遺伝子配列（６０塩基）がｍＯＲＥＧ遺伝子の５’末端に付加され、Ｒｈｏ−ｍＯＥＲＧ遺伝子断片（配列番号：２６）を得た。このＲｈｏ−ｍＯＥＲＧ遺伝子断片（配列番号：２６）が哺乳動物発現プラスミドのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイトへライゲーションされた。このようにして、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ）を得た。【００４７】
得られたプラスミド（Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ）および２つのプライマーセットを用いて、２つの遺伝子断片を増幅させた。【００４８】
一方の遺伝子断片は、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ）、プライマー１１（配列番号：１１）、およびプライマー１２（配列番号：１２）を用いたＰＣＲ法により増幅された。プライマー１２（配列番号：１２）は、ｍｙｃエピトープタグ（配列番号：１３）をコードする遺伝子配列のアンチセンス鎖および制限酵素サイトＥｃｏＲＩを有していた。このようにして、Ｒｈｏタグの３’末端にｍｙｃエピトープタグ（配列番号：１３）をコードする遺伝子配列のアンチセンス鎖が付加された当該一方の遺伝子断片が増幅された。【００４９】
他方の遺伝子断片は、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍＯＲＥＧ）、プライマー１３（配列番号：１４）、およびプライマー１４（配列番号：１５）を用いたＰＣＲ法により増幅された。プライマー１３（配列番号：１４）は、ｍｙｃエピトープタグの一部および制限酵素サイトＥｃｏＲＩを有していた。このようにして、ｍＯＲＥＧをコードする遺伝子の５’末端にｍｙｃエピトープタグ（配列番号：１３）をコードする遺伝子配列の一部が付加された当該他方の遺伝子断片が増幅された。【００５０】
このようにして増幅されたこれら２つの遺伝子断片が混合された。プライマー１１（配列番号：１１）およびプライマー１４（配列番号：１５）を用いるオーバーラップエクステンションＰＣＲ法により、これら２つの遺伝子断片が連結された。連結された遺伝子断片（配列番号：２７）は、制限酵素ＮｈｅＩおよび制限酵素ＳａｌＩによって予め処理された哺乳動物発現用プラスミドにライゲーションされた。このようにして、図２の下方に示されるようなプラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−ｍＯＲＥＧ）が得られた。【００５１】
図３に示されるように、Ｏｌｆｒ１５をコードする遺伝子断片（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＣ１４６５３１）が、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ法により増幅された。このＰＣＲ法では、プライマー５（配列番号：１６）およびプライマー６（配列番号：１７）が用いられた。プライマー５およびプライマー６は、それぞれ、制限酵素サイトＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを有していた。このようにして、遺伝子断片（配列番号：２８）が得られた。【００５２】
この遺伝子断片が、クローニング用プラスミドにライゲーションされ、プラスミドを得た。このクローニング用プラスミドは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによって前もって処理されていた。このクローニング用プラスミドは、制限酵素サイトＮｈｅＩを有していた。【００５３】
このプラスミドは、制限酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて処理された。【００５４】
一方、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−ｍＯＲＥＧ）が、制限酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて処理され、Ｒｈｏタグ−ｍｙｃエピトープタグをコードする遺伝子断片（配列番号：２９）を得た。この遺伝子断片（配列番号：２９）は上記プラスミドにライゲーションされた。このようにして、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−Ｏｌｆｒ１５）を得た。プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−Ｏｌｆｒ１５）は、遺伝子配列（配列番号：２１）を含有していた。【００５５】
（細胞の調製）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する液体培地が、ペトリ皿に添加された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、自発的にペトリ皿の内壁に接着した。
液体培地は、表２に示される試薬を含有していた。【００５６】
【表２】
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【００５７】
ペトリ皿に、プラスミド（ＲＴＰ１Ｓ）、プラスミド（Ｒｈｏ−ｍｙｃ−Ｏｌｆｒ１５）、およびメンブレンマーカーをコードするプラスミド（エヴロゲンより購入、商品名：pMkate2）が添加され、これら３つのプラスミドによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞はリポフェクション法によりトランスフェクトされた。液体培地は、３７℃の温度下で５％ＣＯ２を含む空気雰囲気下で保持された。このようにして、図４の最上部に示されるように、形質転換されたＨＥＫ２９３細胞および液体培地を含有する容器が用意された。【００５８】
（クロルプロマジンとの接触）
トランスフェクションから２４時間後、クロルプロマジンを含有する液体培地を容器に添加した。クロルプロマジンは、２５μｍ／ｍＬの濃度を有していた。この液体培地は、表２に示される試薬も含有していた。このようにして、ＨＥＫ２９３細胞は２０時間（以下、この時間は「浸漬時間」という）、クロルプロマジンを含有する液体培地に浸漬された。【００５９】
（液体培地の交換）
その後、液体培地は除去された。次いで、クロルプロマジンを含有しない液体培地（表２参照）を容器に添加した。このようにして、液体培地が交換された。【００６０】
（嗅覚受容体の細胞膜上での発現）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は培養され、その細胞膜上にマウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５（配列番号：２０）を発現させた。このマウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５（配列番号：２０）は、配列番号：１９により表されるアミノ酸配列のＮ末端がＲｈｏタグ（配列番号：１０）−ｍｙｃエピトープタグ（配列番号：３０）を具備するアミノ酸配列（配列番号：１８）に修飾されたアミノ酸配列からなる。【００６１】
（評価）
液体培地の交換から４時間後、マウス嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５の細胞膜上での分布が非特許文献２に開示された免疫蛍光法に従って評価された。具体的には、以下の式に従って細胞膜上での発現率および細胞生存率が算出された。
（細胞膜上での発現率）＝（細胞膜上の蛍光強度）／（１つの細胞全体の蛍光強度）
（細胞生存率）＝（免疫蛍光法を実施する際に生存している細胞の数）／（免疫蛍光法を実施する際の全細胞数）【００６２】
より具体的には、１０個以上の細胞の発現率および細胞生存率が計算された。次いでそれらの率の各平均値が計算された。より正確には、表３に記載された「細胞膜上での発現率」および「細胞生存率」は、これらの平均値である。【００６３】
（比較例１）
クロルプロマジンを含有しない液体培地を容器に添加したこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。結果は表３に示される。【００６４】
（比較例２）
プラスミド（RTP1S）が用いられなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。結果は表３に示される。【００６５】
（比較例３）
クロルプロマジンに代えてフェニルアルシンオキシド（１．７μｇ／ｍＬ）が用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。結果は表３に示される。【００６６】
（比較例４）
クロルプロマジンに代えてスクロース（２５０ｍＭ）が用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。結果は表３に示される。【００６７】
（実施例２〜１６）
クロルプロマジンの濃度および浸漬時間が表４に示されるように変更されたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。結果は表４に示される。【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４】
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【００７０】
表３から明らかなように、クロルプロマジンが添加された場合には、嗅覚受容体Ｏｌｆｒ１５の細胞膜上での発現率が増加する。
当業者は、表４に基づいて、クロルプロマジンの濃度および浸漬時間を適切に選択し得るであろう。クロルプロマジンの好適な濃度は１０μｇ／ｍｌ以上２５μｇ／ｍｌ以下である。好適な浸漬時間は０．５時間以上２０時間以下である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の方法は、人工嗅覚素子、化合物センサー、および匂い分子の吸着膜の製造に用いられ得る。
【図１】
2013061487.tif 000007
【図２】
2013061487.tif 000008
【図３】
2013061487.tif 000009
【図４】
2013061487.tif 000010
【図５】
2013061487.tif 000011
【配列表】
2013061487000001.app
【国際調査報告】
2013061487.tif 000012
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2013061487.tif 000014