(57)【要約】本発明は、一般式（１）【化１】2013035757.tif 000008（式中、Ｇは6炭糖-6-リン酸残基を示し、Ｌは2価のリンカー基を示す。）で表される化合物を提供する。
2013035757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2013035757.tif 000007
（式中、Ｇは6炭糖-6-リン酸残基を示し、Ｌは2価のリンカー基を示す。）
で表される化合物。
【請求項２】
Ｇが、マンノース-6-リン酸残基、ガラクトース-6-リン酸残基、グルコース-6-リン酸残基またはフルクトース-6-リン酸残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記リンカー基が一般式
-X-(CH2)m-NHCO(CH2)n-NHCO-（XはSまたはOを示す。ｍは2〜6の整数を示す。ｎは2〜6の整数を示す。）で表される、項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含むリポソームと当該リポソームに複合化された生理活性物質を含むマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤。
【請求項５】
前記生理活性物質が肝硬変、肝炎、肝線維症、癌、糖尿病、ライソゾーム病の治療薬である、請求項４に記載の製剤
【請求項６】
前記生理活性物質が薬物、タンパク質または核酸である、請求項４又は５に記載の製剤。
【請求項７】
前記生理活性物質が抗癌剤、プラスミドDNA/RNA、アンチセンスDNA、アプタマー、siRNA、shRNA又はmiRNAである、請求項４〜６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
前記生理活性物質が有機蛍光色素である、請求項４〜６のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、6炭糖-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は先進諸国において死因の上位に挙げられる疾病である。本邦においても1980年頃から最大の死因となっており、今後も癌による死亡者数は増加することが予測されている。それに伴い、世界中で急速に抗癌剤開発が進み、様々な作用機序を有する抗癌剤が臨床において使用されているものの、一部の癌治療においては必ずしも優れた治療効果が認められていない。また、ウイルス性肝炎やアルコール性肝障害等の慢性肝疾患が進行した結果、肝細胞が死滅・減少し線維組織に置換され、肝機能が減衰し、肝硬変に移行することが知られている。本邦においても約40万人程度の患者が存在するが、現在行われている肝硬変の根治療法は肝移植のみである。こうした難治性疾患に対して、低分子医薬品や核酸医薬品により優れた治療効果を達成する為には、疾患に応じた標的細胞に対して選択的かつ効率的に医薬品を送達する技術開発が不可欠である。しかしながら、肝硬変治療における肝星細胞等の組織中存在比率の低い標的細胞や、効率的送達が難しい固形腫瘍内癌細胞等に対して、薬物や核酸化合物を送達することは困難である。従って、肝硬変治療の主たる標的細胞である肝星細胞や癌細胞特異的に低分子医薬品や核酸医薬品を効率的に送達する方法の開発が課題として挙げられる。【０００３】
特許文献1は、創傷または線維性疾患の治癒、特に瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための医薬組成物を開示する。【０００４】
特許文献２は、糖修飾コレステロール誘導体を構成成分とするリポソームとオリゴヌクレオチドとを含む複合体を含有する肝指向性のリポソーム組成物を開示する。
非特許文献1は、肝星細胞に発現しているビタミンA受容体を標的としたリポソームを利用してコラーゲン産生に関与するgp46に対するsiRNAを送達し、肝硬変治療を行うことを開示する。【０００５】
非特許文献２は、マンノース-6-リン酸及び抗癌剤ドキソルビシンを結合したヒト血清アルブミンを利用して、マンノース-6-リン酸受容体を発現する癌細胞に対してドキソルビシンを送達し、癌治療を行うことを開示する。【０００６】
非特許文献３は、マンノース-6-リン酸及び抗癌剤ドキソルビシンを結合したヒト血清アルブミンを利用して、マンノース-6-リン酸受容体を発現する肝星細胞に対してドキソルビシンを送達し、肝硬変治療を行うことを開示する。【０００７】
特許文献１は、マンノース-6-リン酸類縁体は低分子化合物である為、生体内への静脈内投与後、全身組織に拡散し、標的臓器である肝臓への移行性並びに標的細胞である肝星細胞内への到達効率が低い問題があった。【０００８】
特許文献２は、肝星細胞などへの選択的移行特性と到達効率に問題があった。
非特許文献１は、ビタミンA受容体は正常な肝星細胞表面にも発現している為、正常な機能を有する肝星細胞に対して毒性が生じること、ビタミンA修飾リポソームの大量投与又は頻回投与を行った場合に、ビタミンA過剰症が発生する可能性があるなどの問題があった。【０００９】
非特許文献２，３は、アルブミン1分子に対して結合可能なドキソルビシン分子が限られている為、製剤投与量に対して標的細胞に送達されるドキソルビシン量が低く、治療効果発現のために膨大な製剤投与量を要すること、またアルブミンに結合可能な薬物は限られている為、応用範囲が狭いなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表平11-510179
【特許文献２】特開2007-112768
【非特許文献１】Niitsu et. al., Nat. Biotechnol. Vol.26, pp431-442, 2008.
【非特許文献２】Prakash et. al., Int. J. Cancer, Vol.126, pp1966-1981, 2010.
【非特許文献３】Greupink et. al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol.317, pp514-521, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、肝硬変病態時の肝星細胞や癌細胞等のマンノース-6-リン酸受容体発現細胞内への効率的な低分子・タンパク質・核酸化合物送達を行うことを目的とする
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下のマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤を提供するものである。
項１．  一般式（１）【００１３】
【化１】
2013035757.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｇは6炭糖-6-リン酸残基を示し、Ｌは2価のリンカー基を示す。）
で表される化合物。
項２．  Ｇが、マンノース-6-リン酸残基、ガラクトース-6-リン酸残基、グルコース-6-リン酸残基またはフルクトース-6-リン酸残基である、請求項１に記載の化合物。
項３．  前記リンカー基が一般式
-X-(CH2)m-NHCO(CH2)n-NHCO-（XはSまたはOを示す。ｍは2〜6の整数を示す。ｎは2〜6の整数を示す。）で表される、項１又は２に記載の化合物。
項４．  項１〜３のいずれかに記載の化合物を含むリポソームと当該リポソームに複合化された生理活性物質を含む6炭糖-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤。
項５．  前記生理活性物質が肝硬変、肝炎、肝線維症、癌、糖尿病、ライソゾーム病などの治療薬である、項４に記載の製剤
項６．  前記生理活性物質が薬物、タンパク質または核酸である、項４又は５に記載の製剤。
項７．  前記生理活性物質が抗癌剤、プラスミドDNA/RNA、アンチセンスDNA、アプタマー、siRNA、shRNA又はmiRNAである、項４〜６のいずれかに記載の製剤。
項８．  前記生理活性物質が有機蛍光色素である、項４〜６のいずれかに記載の製剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の製剤によれば、生体内に分布するマンノース-6-リン酸受容体発現細胞などの6炭糖-6-リン酸受容体発現細胞に効率的に低分子化合物やタンパク質、核酸化合物を送達することができる。本発明によれば、当該誘導体含有製剤に低分子化合物、タンパク質を核酸化合物と複合体形成後、生体内に投与することにより、肝硬変病態時の肝星細胞や癌細胞等の6炭糖-6-リン酸受容体、特にマンノース-6-リン酸受容体発現細胞内への効率的な薬物・タンパク質・核酸化合物送達を達成できる。ここで薬物とは医薬品、蛍光物質、ペプチド等が挙げられる。タンパク質としては、酵素、ホルモン、サイトカインなどが挙げられる。核酸化合物としては、DNA、RNAが挙げられ、DNAとしてはプラスミドDNAやアンチセンスDNAなどが挙げられ、RNAとしては、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNAなどが挙げられる。核酸化合物の塩基配列は特に限定されない。本発明は、6炭糖-6-リン酸受容体発現細胞、例えば選択的送達が困難であった肝星細胞等のマンノース-6-リン酸受容体発現細胞などの組織内存在比率の低い細胞や癌細胞等に対して、非侵襲条件下で低分子化合物やタンパク質、核酸化合物を送達できる為、本発明に既知・新規医薬品を搭載することにより根治困難である肝硬変、肝炎、肝線維症、癌、糖尿病、ライソゾーム病に対する高機能性製剤としての発展を可能にする。従って本発明は、薬物・遺伝子治療における医薬品送達技術として高い利用可能性を有する。【００１６】
肝硬変、肝炎、肝線維症、癌、糖尿病、ライソゾーム病は国内外に多くの患者が存在する一方、疾患に応じた標的細胞への効率的薬物・核酸送達法がなく、根治を可能にする医薬品研究開発が進んでいない。その標的細胞表面にはマンノース-6-リン酸受容体などの6炭糖-6-リン酸受容体が発現していることが報告されているが、リン酸エステル結合は化学的安定性が乏しく、また疎水性部分のコレステロールと親水性のリン酸基を有する目的化合物は両親媒性である為、従来技術では製剤化可能な6炭糖-6-リン酸修飾誘導体の合成は困難であった。本発明では、上記課題を克服して6炭糖-6-リン酸修飾コレステロール誘導体の合成に成功し、当該誘導体含有製剤により前記疾患の治療への応用を可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体合成経路
【図２】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームの物性評価
【図３】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有エマルションの物性評価
【図４】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームの細胞内取込特性評価
【図５】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームの腫瘍内(左図)及び肝硬変病態時の肝臓内(右図)移行特性
【図６】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体の物性評価
【図７】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体によるsiRNAの腫瘍内移行特性
【図８】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体による腫瘍組織内遺伝子発現抑制効果
【図９】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA複合体による肝臓内gp46発現抑制効果
【図１０】マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA複合体による各種肝硬変マーカー抑制効果
【図１１】ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによるドキソルビシンの肝臓内移行特性
【図１２】ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによる肝硬変マーカー抑制効果
【図１３】ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによるドキソルビシンの腫瘍組織移行特性
【図１４】ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによる抗腫瘍効果
【図１５】インドシアニングリーン（ＩＣＧ）内封Ｍ６Ｐ修飾リポソームの調製。左よりM6P=0％濾過前、後M6P=15%濾過前、後
【図１６】ヘマトポルフィリン（Ｈｐ）内封Ｍ６Ｐ修飾リポソームの調製。左よりM6P=15％濾過後、前M6P=0%濾過後、前
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、以下の一般式（１）の化合物を提供する。
【００１９】
【化２】
2013035757.tif 000004
【００２０】
（式中、Ｇは6炭糖-6-リン酸残基を示し、Ｌは2価のリンカー基を示す。）
一般式（１）の化合物は、コレステロールの3位の水酸基に6炭糖-6-リン酸残基がリンカー基を介して結合した構造を有する。
【００２１】
6炭糖としては、マンノース、ガラクトース、グルコース、フルクトースなどの6位に1級の水酸基（-CH2OH基）を有する6炭糖が挙げられ、6炭糖-6-リン酸残基はその6位の水酸基がリン酸エステルになっている残基である。
【００２２】
2価のリンカー基は6炭糖-6-リン酸の１位とコレステロールの3位の水酸基の間に存在する2価の基であり、6炭糖-6-リン酸の１位とは硫黄原子（S）または酸素原子(O)を介して結合し、コレステロールの3位の水酸基とはエーテル結合(-O-)、エステル結合(-O-CO-)またはウレタン結合(O-CO-NH)により結合する基が挙げられる。
【００２３】
2価のリンカー基は、−Ｘ−Ｒ−Ｙ−で表される基が挙げられ、ここで、
ＸはＯまたはＳであり、
【００２４】
Ｙは-(CH2)-、-(CH2CH2)-、-(CH2CH2CH2)-、-(CH2CH2CH2CH2)-などの炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数3〜6のシクロアルキレン基(例えば1,3-シクロペンチレン基、1,4-シクロヘキシレン基)、アリーレン基（例えば1,3-フェニレン、1,4-フェニレン）、アラルキレン基（例えば1,3-キシリレン、1,4-キシリレン、1,3-ベンジリレン、1,4-ベンジリレン）、-NHCO-、-O-CO-、-CO-などが挙げられ、
【００２５】
Ｒは、Ｙが炭素数1〜6のアルキレン基、炭素数3〜6のシクロアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基の場合には単結合、もしくはR1-R2(ここで、R1は、炭素数1〜6のアルキレン基、炭素数3〜6のシクロアルキレン基、アリーレン基またはアラルキレン基を示し、R2は-NHCO-、-CONH-、-O-、-S-、-NHCOO-、-OCONH-、-CO-、-COO-または-O-CO-を示す。) またはポリエーテル基(例えば、-(CH2CH2O)n1-（n1は1〜20の整数を示す）)を示し、Ｙが-NHCO-、-O-CO-、-CO-のとき、R1もしくはR1-R2-R1(ここで、R1は、同一又は異なって、炭素数1〜6のアルキレン基、炭素数3〜6のシクロアルキレン基、アリーレン基またはアラルキレン基を示し、R2は-NHCO-、-CONH-、-O-、-S-、-NHCOO-、-OCONH-、-CO-、-COO-または-O-CO-を示す。)を示す。
【００２６】
好ましい2価のリンカー基は、一般式-X-(CH2)m-NHCO(CH2)n-NHCO-
（式中、XはSまたはOを示す。ｍは2〜6の整数、好ましくは2又は3を示す。ｎは2〜6の整数、好ましく2又は3を示す。）で表される基を示す。
【００２７】
2価のリンカー基は、具体的には、
-S-(CH2)m-NHCO(CH2)n-NHCO-(ｍ、ｎは1〜6の整数を示す)、-S-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-もしくは-O-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-（n1は1〜20の整数を示す）などが挙げられる。
【００２８】
リポソームの粒径は、30〜200nm程度、好ましくは50〜150nm程度、特に70〜120nm程度である。本発明で使用されるリポソームは、多重層リポソーム、一枚膜リポソームのいずれであってもよい。リポソームは超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法などにより作製され、リン脂質、糖脂質、ステロール類、グリコール類、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質（例えばＰＥＧ-リン脂質）などが含まれる。
【００２９】
本明細書において、「複合化」とは、リポソームと生理活性物質が一体化される(一体的に動く)  ことを意味し、リポソームの内部に生理活性物質を封入する場合、リポソームの脂質膜表面(内表面、外表面)に吸着もしくは結合する場合、脂質膜の内部に生理活性物質の一部が入り込む場合、生理活性物質が脂質膜を貫通する場合などが含まれる。脂質膜と生理活性物質の吸着、結合は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用などにより行われる。例えば、イオン結合は、リポソームの構成要素のカチオンまたはアニオンと、生理活性物質であるアニオンまたはカチオンのイオン結合による結合が挙げられる。
【００３０】
本発明のリポソームに含まれる好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。
【００３１】
その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または合成した炭素鎖n（nは3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、カルジオリピン、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、卵黄レシチン、水素添加卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加大豆レシチンなどが挙げられる。
【００３２】
本発明のリポソームを構成する脂質膜の構成成分として、電荷を有する脂質を含めてもよく、アニオン性脂質として、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどにより製造することができる。
【００３３】
リポソームの脂質膜を構成するアニオン性の脂質膜成分には、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどの負に荷電したリン脂質のほかに、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジン酸、ジセチルリン酸(DCP)、ジラウリルリン酸、ジミリスチルリン酸、ホスファチジルグリセロールリン酸などを挙げることができる。
【００３４】
カチオン性脂質としては、例えば3β-［N-（N’、N'-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC-chol）、1、2-ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、N、N-ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-［1-（2、3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N、N、N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、2、3-ジオレイルオキシ-N-［2（スペルミン−カルボキサミド）エチル］-N、N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）及びN-［1-（2、3-ジミリスチルオキシ）プロピル］-N、N-ジメチル-N-（2-ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）、さらにジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステル、またはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなども挙げられる。
【００３５】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００３６】
アニオン性脂質またはカチオン性脂質は、全脂質量に対し0.1〜15質量％、好ましくは全脂質量に対し1〜10質量％、より好ましくは全脂質量に対し5〜10質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００３７】
リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、脂質膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、デスモステロール、チモステロール、スチグマステロール、ラトステロール、ラノステロール、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、コレスタノール、またはビタミンＤ類、ホルモン類などが挙げられる。
【００３８】
リポソーム中の一般式（１）の化合物の割合は、1〜60重量％程度、好ましくは5〜55重量％程度、より好ましくは10〜50重量％程度、特に15〜45重量％程度である。
【００３９】
リポソームに複合化される生理活性物質としては、核酸、タンパク質、薬物などが挙げられる。核酸としては、DNA、RNAのいずれでもよい。DNAは、遺伝子を発現するものが挙げられ、例えばプラスミド、或いはプロモーターに連結された遺伝子を含む遺伝子構築物、人工遺伝子などが挙げられる。DNAとしては、遺伝子発現プラスミドDNA、アンチセンスDNA、アプタマー、siRNA・shRNAなどのRNAを発現するDNAが挙げられる。RNAとしては、siRNA、アンチセンスRNA、アプタマー、shRNAなどが挙げられる。
【００４０】
核酸、タンパク質、薬物などの生理活性物質は、細胞内に取り込まれたとき、もしくは細胞内で発現されたときに細胞毒性、アポトーシス誘導作用などの細胞に障害を与えるか、細胞死を誘導する作用を有するもの、肝星細胞の線維化を抑制するなどの作用を有するものが挙げられる。
【００４１】
薬物としては、抗ガン剤、抗アレルギー剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、ワクチン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、ペプチドホルモン、酵素、ステロイドホルモン、抗リウマチ薬、抗原、抗体、受容体又はそのリガンドなどが挙げられる。
【００４２】
さらに、薬物は、蛍光物質、例えば有機蛍光色素を含む。有機蛍光色素としては、インドシアニングリーン、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリン、フルオレスカミンなどが挙げられる。有機蛍光色素は、癌細胞の蛍光イメージングに応用できる。
【００４３】
また、薬物は、超音波照射により活性酸素を発生し、癌細胞死を誘導させるsonodynamic therapyヨウの薬物であってもよい。このような薬物としては、インドシアニングリーン、ヘマトポルフィリン、ジアセチルヘマトポルフィリン、フォトフリンII、メソポルフィリン、銅プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ATX-70、ATX-S10、フェオフォルビド−α、フタロシアニンなどが挙げられる。
【００４４】
リポソームの製造法の例を具体的に説明すると、例えば前記したリン脂質、コレステロール等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、これに複合体を含む水溶液、好ましくは緩衝液を加えて攪拌して、複合体を内包したリポソームを得ることができる。当該リポソームを直接、またはいったん凍結乾燥した後に、凍結乾燥処理された本発明のナノ粒子と混合することにより、リポソームとナノ粒子の複合粒子を得ることができる。
【００４５】
本発明のリポソームのゼータ電位は、-30〜50mV程度、好ましくは-20〜30mV程度、より好ましくは-15〜25mV程度である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を示すが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１
[基本的物性評価]
1. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体合成経路(図1)
マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体は下記の工程からなる製造方法にて合成される。リン酸基を合成の最終段階で導入することとし、まずリン酸導入位であるマンノース6位のみを異なる保護基で保護した中間体(8)を合成し、別途合成したコレステロール誘導体(4)との縮合、マンノース6位のリン酸化、脱保護を経て最終目的物(1)を合成した。（式中、THFはテトラヒドロフランを、Pfpはペンタフルオロフェニル基を、WSCは1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを、Acはアセチル基を、Bocはtert-ブチルオキシカルボニル基を、DMFはN,N-ジメチルホルムアミドを、Meはメチル基を、TBDPSはtert-ブチルジフェニルシリル基を、Bzはベンゾイル基を、TFAはトリフルオロ酢酸を、Etはエチル基を、TBAFはテトラ-n-ブチルアンモニウムフルオリドを表す。）【００４７】
＜工程［１］：N-コレステリルオキシカルボニル-3-アミノプロピオン酸 (3)の合成＞
クロロギ酸コレステリル (2) (2.09 g) のテトラヒドロフラン (25 mL) 溶液に室温でβ-アラニン (0.50 g) および10% 炭酸ナトリウム水溶液 (50 mL) を加え、室温で1.5時間攪拌した。反応液を2 M 塩酸で中和した後、分液ロートに移しクロロホルムで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。クロロホルム-メタノール (95 - 5) の混合溶媒で溶出した後、クロロホルム-メタノール (90 - 10) の混合溶媒で溶出して得られた混合物を、再度、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。クロロホルムで溶出した後、クロロホルム-メタノール (80 - 20) の混合溶媒で溶出し化合物 (3) (1.87 g、収率 80%) を得た。 
融点 173.5-174.5 ℃
[α]D -24.0°(c 0.5, クロロホルム)
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5.37 (1H, m, H-6Chol), 5.14 (1H, brs, NH), 4.49 (1H, m, H-3Chol), 3.44 (2H, q, J = 6.0 Hz, NHCH2), 2.61 (2H, m, COCH2), 2.34-2.27 (2H, m, H-4Chol), 2.02-1.79 (5H, m, H-1eqChol, H-2eqChol, H-7eqChol, H-12eqChol, H-16eqChol), 1.60-0.90 (27H, m, CHChol, CH2Chol, CH3Chol), 0.87 (3H, d, J = 6.7 Hz, CH3CH2CH3), 0.86 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.68 (3H, s, H-18Chol).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C31H51NNaO4 [M+Na]+: 524.3710 found; 524.3707.【００４８】
＜工程［２］：N-コレステリルオキシカルボニル-3-アミノプロピオン酸 ペンタフルオロフェニルエステル (4) の合成＞
化合物 (3) (218.0 mg) のジクロロメタン (4 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下室温でペンタフルオロフェノール (98.6 mg) および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド 塩酸塩  (99.9 mg) を加え、室温で6時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、分液ロートに移した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。n-ヘキサン-酢酸エチル (90 - 10) の混合溶媒で溶出し化合物 (4)  (273.6 mg、収率 94%) を得た。 
[α]D-14.7°(c 1.1, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): δ 5.38 (1H, m, H-6Chol), 5.04 (1H, brs, NH), 4.51 (1H, m, H-3Chol), 3.57 (2H, q, J = 6.0 Hz, NHCH2), 2.94 (2H, t, J= 6.0 Hz, COCH2), 2.37-2.26 (2H, m, H-4Chol), 2.03-1.94 (2H, m, H-7eqChol, H-12eqChol), 1.89-1.79 (3H, m, H-1eqChol, H-2eqChol, H-16eqChol), 1.60-0.91 (27H, m, CHChol, CH2Chol, CH3Chol), 0.87 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.86 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.68 (3H, s, H-18Chol).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C37H50F5NNaO4[M+Na]+: 690.3552 found; 690.3551.【００４９】
＜工程［３］：N-(tert-ブチルオキシカルボニル)-3-アミノプロピル2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-1-チオ-β-D-マンノピラノシド (6) の合成＞
1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-1-チオ-β-d-マンノピラノシド (5) (Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 1、832〜837頁、2001年参照) (5.10 g) およびN-(tert-ブチルオキシカルボニル) 3-ブロモプロピルアミン (4.48 g) のN,N-ジメチルホルムアミド (125 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下室温で炭酸セシウム (8.18 g) およびピペラジン (1.30 g) を加えた。室温で2時間攪拌した後、反応液に水を加え分液ロートに移し酢酸エチルで抽出した。有機層を2 M 塩酸、水、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物を酢酸エチルで再結晶化し、さらに母液を再度n-ヘキサン-酢酸エチルの混合溶媒で再結晶化し化合物 (6) (6.06 g、収率 93%) を得た。 
融点 178.0-179.0 ℃
[α]D -50.0°(c 1.0, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): δ 5.51 (1H, dd, J1,2 = 0.9 Hz, J2,3= 3.5 Hz, H-2), 5.25 (1H, t, J3,4= J4,5 = 10.1 Hz, H-4), 5.06 (1H, dd, J2,3 = 3.5 Hz, J3,4 = 10.1 Hz, H-3), 4.77 (1H, brs, H-1), 4.65 (1H, brs, NH), 4.26 (1H, dd, J5,6 = 6.0 Hz, Jgem= 12.3 Hz, H-6), 4.16 (1H, dd, J5,6= 2.4 Hz, Jgem = 12.3 Hz, H-6), 3.70 (1H, ddd, J4,5 = 10.1 Hz, J5,6 = 2.4 Hz, J5,6 = 6.0 Hz, H-5), 3.22 (2H, m, NHCH2), 2.74 (2H, t, J = 7.1 Hz, SCH2), 2.19 (3H, s, Ac), 2.09 (3H, s, Ac), 2.05 (3H, s, Ac), 1.98 (3H, s, Ac), 1.82 (2H, m, CH2CH2CH2), 1.57 (9H, s, tBu).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C22H35NNaO11S [M+Na]+: 544.1823 found; 544.1824.【００５０】
＜工程［４］：N-(tert-ブチルオキシカルボニル)-3-アミノプロピル6-O-tert-ブチルジフェニルシリル-1-チオ-β-D-マンノピラノシド (7) の合成＞
化合物 (6) (1.50 g) のテトラヒドロフラン (30 mL) -メタノール (30 mL) 混合溶液にアルゴン雰囲気下室温で1 Mナトリウムメチラートのメタノール溶液 (0.29 mL) を加えた。室温で1.5時間攪拌した後、反応液をダウエックス-50 (H+) で中和し、ろ過後、減圧濃縮した。得られた粗生成物のN,N-ジメチルホルムアミド (125 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下室温でtert-ブチルジフェニルクロロシラン (0.90 mL) およびイミダゾール (0.47 g) を加えた。室温で1日攪拌した後、tert-ブチルジフェニルクロロシラン (0.15 mL) を加え、室温で1時間攪拌した。反応液をトルエンで希釈し減圧濃縮した後、クロロホルムおよび水で希釈し分液ロートに移し、水層をクロロホルムで抽出した。抽出した有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。クロロホルム-メタノール (97 - 3) の混合溶媒で溶出して化合物 (7) (1.62 g、収率 95%) を得た。 
[α]D-2.7°(c 1.0, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): δ 7.69-7.67 (4H, m, Ar), 7.47-7.38 (6H, m, Ar), 4.65 (1H, brs, H-1), 4.57 (1H, brs, NH), 4.01 (1H, brd, J2,3 = 3.4 Hz, H-2), 3.93 (2H, d, J5,6 = 5.3 Hz, H-6), 3.82 (1H, dd, J3,4 = 9.2 Hz, J4,5 = 9.4 Hz, H-4), 3.58 (1H, dd, J2,3 = 3.4 Hz, J3,4 = 9.2 Hz, H-3), 3.70 (1H, dt, J4,5 = 9.4 Hz, J5,6 = 5.3 Hz, H-5), 3.21-3.14 (3H, m, NHCH2, OH), 2.75-2.65 (3H, m, SCH2, OH), 1.78 (2H, m, CH2CH2CH2), 1.41 (9H, s, OtBu), 1.06 (9H, s, SitBu).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C30H45NNaO7SSi [M+Na]+: 614.2578 found; 614.2577.【００５１】
＜工程［５］：N-(tert-ブチルオキシカルボニル)-3-アミノプロピル2,3,4-トリ-O-ベンゾイル-6-O-tert-ブチルジフェニルシリル-1-チオ-β-D-マンノピラノシド (8) の合成＞     
化合物 (7) (1.62 g) のピリジン (25 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下0 ℃
で塩化ベンゾイル (1.90 mL) を加えた。室温で2.5時間攪拌した後、過剰の水を加えて反応を止め、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し分液ロートに移し、水および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。トルエン-酢酸エチル (83 - 7) の混合溶媒で溶出した後、トルエン-酢酸エチル (90 - 10) の混合溶媒で溶出して化合物 (8)（2.47 g、収率 quant.) を得た。 
[α]D-12.5°(c 1.0, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): δ 8.11-8.09 (2H, m, Ar), 7.88-7.86 (2H, m, Ar), 7.81-7.77 (4H, m, Ar), 7.60-7.51 (4H, m, Ar), 7.47-7.14 (13H, m, Ar), 6.08 (1H, dd, J3,4 = 10.2 Hz, J4,5 = 10.0 Hz, H-4), 5.99 (1H, brd, J2,3 = 3.4 Hz, H-2), 5.56 (1H, dd, J2,3 = 3.4 Hz, J3,4 = 10.2 Hz, H-3), 5.04 (1H, brs, H-1), 4.56 (1H, brs, NH), 3.94-3.83 (3H, m, H-5, H-6), 3.19 (2H, m, NHCH2), 2.79 (2H, m, SCH2), 1.85 (2H, m, CH2CH2CH2), 1.42 (9H, s, OtBu), 1.08 (9H, s, SitBu).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C51H57NNaO10SSi [M+Na]+: 926.3365 found; 926.3364.【００５２】
＜工程［６］：N-(N-コレステリルオキシカルボニル-3-アミノプロピオニル)-3-アミノプロピル2,3,4-トリ-O-ベンゾイル-6-O-tert-ブチルジフェニルシリル-1-チオ-β-D-マンノピラノシド (9) の合成＞
化合物 (8) (162.4 mg) のジクロロメタン (3 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下0℃でトリフルオロ酢酸 (1 mL) をゆっくり加えた。0℃で1時間攪拌した後、反応液を減圧濃縮した。残渣をN,N-ジメチルホルムアミド (2 mL) で溶解し、アルゴン雰囲気下0℃で化合物 (4) (144.2 mg) を加えた。この混合液にトリエチルアミン (0.05 mL) をゆっくり加え、室温で2時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、分液ロートに移し、水および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。トルエン-酢酸エチル (67 - 33) の混合溶媒で溶出して化合物 (9) (228.2 mg、収率 98%) を得た。 
[α]D-96.9°(c 1.0, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): δ8.11-8.09 (2H, m, Ar), 7.89-7.87 (2H, m, Ar), 7.81-7.78 (4H, m, Ar), 7.60-7.51 (4H, m, Ar), 7.44-7.14 (13H, m, Ar), 6.09 (1H, dd, J3,4 = 10.3 Hz, J4,5 = 10.0 Hz, H-4), 5.99 (1H, brd, J2,3 = 3.4 Hz, H-2), 5.68 (1H, brs, CH2CONH), 5.57 (1H, dd, J2,3 = 3.4 Hz, J3,4 = 10.3 Hz, H-3), 5.35 (1H, m, H-6Chol), 5.25 (1H, brs, OCONH), 5.06 (1H, brs, H-1), 4.46 (1H, m, H-3Chol), 3.93 (1H, dd, J5,6 = 4.3 Hz, Jgem = 11.7 Hz, H-6), 3.89-3.85 (2H, m, H-5, H-6), 3.39 (2H, brq, J= 6.1 Hz, NHCH2CH2CO), 3.31 (2H, m, NHCH2CH2CH2S), 2.79 (2H, m, NHCH2CH2CH2S), 2.35-2.26 (4H, m, NHCH2CH2CO, H-4Chol), 2.01-1.81 (7H, m, NHCH2CH2CH2S, H-1eqChol, H-2eqChol, H-7eqChol, H-12eqChol, H-16eqChol), 1.58-0.90 (36H, m, tBu, CHChol, CH2Chol, CH3Chol), 0.87 (3H, d, J = 6.7 Hz, CH3CH2CH3), 0.86 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.67 (3H, s, H-18Chol).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C77H98N2NaO11SSi [M+Na]+: 1309.6553 found; 1309.6556.【００５３】
＜工程［７］：N-(N-コレステリルオキシカルボニル-3-アミノプロピオニル)-3-アミノプロピル2,3,4-トリ-O-ベンゾイル-1-チオ-β-D-マンノピラノシド (10) の合成＞
化合物 (9) (112.3 mg) のテトラヒドロフラン (1 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下0℃で酢酸 (0.05 mL) をゆっくり加えた。この混合液に0℃下1M テトラ-n-ブチルアンモニウム フルオリドのテトラヒドロフラン溶液 (0.35 mL) をゆっくり加え、室温で2日攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、分液ロートに移し、飽和重曹水、水、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。トルエン-酢酸エチル (25 - 75) の混合溶媒で溶出した後、トルエン-酢酸エチル (20 - 80) の混合溶媒、次いでトルエン-酢酸エチル (17 - 83) の混合溶媒で溶出して化合物 (10) (87.3 mg、収率 95%) を得た。 
[α]D-135.6°(c1.0, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): δ 8.08-8.06 (2H, m, Ar), 7.94-7.92 (2H, m, Ar), 7.77-7.75 (2H, m, Ar), 7.61 (1H, dd, J = 7.5, 7.4 Hz, Ar), 7.53-7.22 (8H, m, Ar), 6.55 (1H, brs, CH2CONH), 5.99 (1H, m, H-2), 5.70 (1H, dd, J3,4 = 10.1 Hz, J4,5= 8.8 Hz, H-4), 5.66 (1H, dd, J2,3= 3.2 Hz, J3,4 = 10.1 Hz, H-3), 5.42-5.27 (2H, m, H-6Chol, OCONH), 5.06 (1H, brs, H-1), 4.46 (1H, m, H-3Chol), 3.92-3.84 (3H, m, H-5, H-6), 3.76 (1H, brs, OH), 3.48-3.36 (4H, m, NHCH2CH2CH2S, NHCH2CH2CO), 2.86 (1H, m, NHCH2CH2CH2S), 2.76 (1H, m, NHCH2CH2CH2S), 2.43 (2H, brt, J = 6.1 Hz, NHCH2CH2CO), 2.35-2.24 (2H, m, H-4Chol), 2.01-0.90 (34H, m, NHCH2CH2CH2S, CHChol, CH2Chol, CH3Chol), 0.87 (3H, d, J = 6.7 Hz, CH3CH2CH3), 0.86 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.67 (3H, s, H-18Chol).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C61H80N2NaO11S [M+Na]+: 1071.5375 found; 1071.5375.【００５４】
＜工程［８］：N-(N-コレステリルオキシカルボニル-3-アミノプロピオニル)-3-アミノプロピル6-O-ホスホ-1-チオ-β-D-マンノピラノシド二ナトリウム塩 (1) の合成＞
オキシ塩化りん (0.09 mL) のピリジン (8 mL) 溶液にアルゴン雰囲気下0℃でシリンジポンプを用いて化合物 (10) (251.2 mg) のピリジン (4 mL) 溶液を二時間かけて滴下した（流速 75 μL/分）。滴下後0℃で15分攪拌した後、水 (2.5 mL) を加え0℃で15分攪拌した。反応液を減圧濃縮し乾燥させた後、テトラヒドロフラン (5 mL) およびメタノール (7 mL) に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で1 Mナトリウムメチラートのメタノール溶液 (4.78 mL) を加えた。室温で1日攪拌した後、水で希釈し、透析を行った。この水溶液を凍結乾燥し化合物 (1) (201.4 mg、収率 98%) を得た。 
[α]D+19.1°(c 0.2, 酢酸)
1H-NMR (CD3CO2D): δ 5.40 (1H, brs, H-6Chol), 4.79 (1H, brs, H-1), 4.46 (1H, m, H-3Chol), 4.27 (1H, dd, J5,6 = 6.5 Hz, Jgem = 9.8 Hz, H-6), 4.15 (1H, m, H-6), 4.08 (1H, brd, J2,3= 3.3 Hz, H-2), 3.84 (1H, dd, J3,4= 9.6 Hz, J4,5 = 9.7 Hz, H-4), 3.76 (1H, dd, J2,3 = 3.3 Hz, J3,4 = 9.6 Hz, H-3), 3.57 (1H, m, H-5), 3.45-3.33 (4H, m, NHCH2CH2CH2S, NHCH2CH2CO), 2.75 (2H, m, NHCH2CH2CH2S), 2.52 (2H, m, NHCH2CH2CO), 2.40-2.28 (2H, m, H-4Chol), 2.18-1.84 (7H, m, NHCH2CH2CH2S, H-1eqChol, H-2eqChol, H-7eqChol, H-12eqChol, H-16eqChol), 1.67-0.95 (27H, m, CHChol, CH2Chol, CH3Chol), 0.88 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.88 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH3CH2CH3), 0.72 (3H, s, H-18Chol).
ESI-TOF (高分解能): calcd for C40H68N2O11PS [M]-: 815.4287 found; 815.4286.【００５５】
2. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤の物性評価(図2、図3)
マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体を含有するリポソーム並びにエマルションの作製においては、まず各種構成脂質を様々な比率（図2、図3）でクロロホルム中に溶解し、ナス型フラスコに分取後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧留去して脂質薄膜とし、減圧下で3時間以上乾燥した。これに生理食塩水等の最適水溶液を加え、振盪機を用いた攪拌後、バス型ソニケーターにより10分間超音波処理後、窒素置換下チップ型ソニケーターを用いた3分間の超音波処理を行い、0.45μmの孔径を有するポリカーボネート膜を用いて滅菌濾過を行った。リポソーム並びにエマルション濃度はリン脂質またはコレステロール量を基準に測定した。【００５６】
その後、作製したリポソーム並びにエマルションの物理化学的性質を粒子径並びに表面電荷測定により評価した。その結果、リポソーム、エマルション共に粒子径は全脂質組成で約100nmとなった一方、表面電荷はマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有量に依存して低下した。【００５７】
なお、図2、図3中、M6P-Cholは、図1に従い製造された本発明のマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体である。【００５８】
3. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームの細胞内取込特性評価(図4)
作製したマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームが、標的分子となるマンノース-6-リン酸受容体認識特性を有することを確認し、かつ細胞内への取込機構の検討を行った。まず放射標識体である3H標識-DSPCを用いてマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームを作製し、マンノース-6-リン酸受容体を発現するメラノーマ由来癌細胞株B16BL6を用いて、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームのマンノース-6-リン酸受容体を介した細胞内取込を評価した。3H標識リポソーム添加後2時間培養した結果、細胞内へのリポソームの取込量はマンノース-6-リン酸修飾コレステロール含有量依存的に増加し、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有量15%で最大となった (図4:左)。またマンノース-6-リン酸過剰量添加によりマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームの細胞内取込が阻害されたことから、本リポソーム製剤が細胞膜上のマンノース-6-リン酸受容体を介して細胞内に取り込まれることが明らかとなった(図4:左)。【００５９】
さらにマンノース-6-リン酸受容体発現特性の異なる細胞においても同様の評価を行った結果、マンノース-6-リン酸受容体を高発現するB16BL6、colon-26細胞においてはマンノース-6-リン酸受容体を介した細胞内取込が認められた一方、マンノース-6-リン酸受容体非発現細胞であるRAW264.7、HepG2細胞においてはマンノース-6-リン酸受容体介在性の細胞内取込は認められなかった(図4:右)。【００６０】
4. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームの肝臓・腫瘍内移行特性(図5)
マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム静脈内投与後のB16BL6細胞由来固形腫瘍内並びに肝臓内移行特性を評価した。上記in-vitro実験と同様、放射標識体である3H標識-DSPCを用いてマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームを作製し、マンノース-6-リン酸受容体発現量の高いB16BL6細胞をC57BL/6マウス背部皮下に移植して作製した担癌マウスの腫瘍体積が約300mm3に達した時点で静脈内投与した。製剤の静脈内投与24時間後に腫瘍組織を摘出し、可溶化剤を添加して完全に溶解した後、イソプロパノールと30%過酸化水素水を加え脱色した。さらに塩酸を加えて中和し、シンチレーターを添加して液体シンチレーションカウンターで3Hの放射活性を測定した。得られた放射活性は臓器重量(g)で標準化して評価した。その結果、B16BL6由来担癌マウスへのリポソーム製剤の静脈内投与24時間後、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム投与群において腫瘍組織内への高い移行性が認められた(図5:左)。【００６１】
また、肝硬変モデルマウスの肝星細胞においてはマンノース-6-リン酸受容体が発現誘導されることが知られているため、四塩化炭素溶液（2% in olive oil, 10 mL/kg）をC57BL/6マウス腹腔内に週2回/4週間頻回投与して四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスを作製し、当該肝硬変モデルマウスに対して3H標識リポソーム製剤を静脈内投与し、6時間後に肝臓をコラゲナーゼ灌流により実質細胞（PCs）及び非実質細胞（NPCs）に分画し、各画分の放射活性を細胞数で標準化して評価した。その結果、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム投与群において、肝星細胞含有画分である肝非実質細胞(NPCs)選択的なリポソームの分布が認められた(図5:右)。【００６２】
[siRNA送達への適用]
5. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤の物性評価(図6)
siRNAとの複合体形成可能なカチオン性を有するマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームを作製するために、各種構成脂質を下記構成比率（図6）でクロロホルム中に溶解し、ナス型フラスコに分取後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧留去して脂質薄膜とし、減圧下で3時間以上乾燥した。これに5%グルコース溶液を加え、振盪機を用いた攪拌後、バス型ソニケーターにより10分間超音波処理後、窒素置換下チップ型ソニケーターを用いた3分間の超音波処理を行い、0.45μmの孔径を有するポリカーボネート膜を用いて滅菌濾過を行った。リポソーム濃度はリン脂質またはコレステロール量を基準に測定した。その後、リポソーム/siRNA複合体を形成するため、firefly luciferaseに対するsiRNAとマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有カチオン性リポソームを電荷比1.0:3.1(-:+)として5%デキストロース中で混合して作製した。【００６３】
ここで、firefly luciferase siRNAは以下の配列のものを用いた（A:アデノシン、G:グアノシン、C:シチジン、U:ウリジン、T:チミジンであり、またX：リボヌクレオチド、dX：デオキシリボヌクレオチド（Xは各略号）とする）。【００６４】
firefly luciferase siRNA：センス鎖：CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT
アンチセンス鎖：UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT
作製した製剤の物性を粒子径並びに表面電荷測定により評価した結果、粒子径はsiRNA複合体化に関らず約100nmとなった一方、表面電荷はsiRNA複合体化により低下した。【００６５】
6. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体によるsiRNAの腫瘍内移行特性(図7)、並びに遺伝子発現抑制効果(図8)
マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体静脈内投与による、siRNAの腫瘍組織内移行性を評価した。まず蛍光色素Alexa-488標識したホタルルシフェラーゼに対するsiRNA（firefly luciferase siRNA）を用いてマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体を作製し、当該製剤をB16BL6細胞及びEL4細胞をC57BL/6マウス背部皮下に移植して作製した担癌マウスの腫瘍体積が約300mm3に達した時点で静脈内投与（siRNAとして50μg）した。投与24時間後に腫瘍組織を摘出し、組織破砕液添加並びにホモジナイザーによる溶解後、得られた組織破砕液を液体窒素並びに37℃湯浴中で凍結・融解操作を行った後、遠心分離し、得られた上清中の蛍光強度を測定し、臓器重量(g)で標準化して評価した。その結果、静脈内投与24時間後においてマンノース-6-リン酸受容体発現細胞であるB16BL6由来の固形腫瘍に対しては、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体投与により、siRNAの腫瘍組織内への高い移行性が認められた一方、マンノース-6-リン酸受容体非発現細胞であるEL4由来の固形腫瘍に対して腫瘍組織内へのsiRNA移行性増大は認められず、マンノース-6-リン酸受容体発現癌細胞へのsiRNA移行性増大を達成できた(図7)。【００６６】
次にマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体静脈内投与による、腫瘍組織内における遺伝子発現抑制効果を評価した。ホタルルシフェラーゼ安定発現株であるB16BL6/Luc細胞及びEL4/Luc細胞をC57BL/6マウス背部皮下に移植して作製した担癌マウスに対して、腫瘍体積が約300mm3に達した時点でマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/siRNA複合体（siRNAとして50μg）静脈内投与によりホタルルシフェラーゼに対するsiRNAを送達した。その結果、製剤の静脈内投与24時間後において、マンノース-6-リン酸受容体発現癌細胞であるB16BL6/luc由来固形腫瘍においては高い遺伝子発現抑制効果が認められた一方、マンノース-6-リン酸受容体非発現細胞であるEL4/luc由来固形腫瘍において遺伝子発現抑制効果は認められず、マンノース-6-リン酸受容体発現癌細胞への高いsiRNA移行性に伴い、顕著な遺伝子発現抑制効果が得られることが示された(図8)。【００６７】
7. マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA複合体による四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスにおけるgp46発現抑制効果(図9)、並びに肝硬変治療効果(図10)
肝硬変モデルマウスの肝星細胞ではマンノース-6-リン酸受容体が発現誘導されることが知られているため、四塩化炭素溶液（2% in olive oil, 10 mL/kg）をC57BL/6マウス腹腔内に週2回/4週間頻回投与して四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスを作製し、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA複合体静脈内投与による、四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスにおける肝臓内gp46発現抑制効果を評価した。ここで、gp46はコラーゲン産生に関与するシャペロンタンパク(ヒトにおいてはHSP47)であり、肝硬変病態時において発現誘導されることが報告されており、当該遺伝子の抑制によりコラーゲン産生が抑制され、肝硬変進行の抑制並びに治療が達成される。gp46 siRNAとマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有カチオン性リポソームを電荷比1.0:3.1(-:+)としてマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA複合体を作製し、当該gp46 siRNA複合体（gp46 siRNAとして50μg）を静脈内投与した。【００６８】
ここで、gp46 siRNA並びにscrambled siRNAは以下の配列のものを用いた（A:アデノシン、G:グアノシン、C:シチジン、U:ウリジン、T:チミジンであり、またX：リボヌクレオチド、dX：デオキシリボヌクレオチド（Xは各略号）とする）。【００６９】
gp46 siRNA：センス鎖：GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAGdTdT
アンチセンス鎖：GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAUdTdT
scrambled siRNA：センス鎖：CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAGdTdT
アンチセンス鎖：GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAUdTdT【００７０】
実験の結果、投与24時間後において四塩化炭素誘導肝硬変において発現誘導されるgp46が、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA静脈内投与により、mRNA並びにタンパク質レベルで抑制された(図9)。また、このgp46発現抑制効果はマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有量に依存して増大し、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有量15-20%で最大となった (図9)。【００７１】
さらに、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNAによるgp46発現抑制が、四塩化炭素誘導肝硬変における各種マーカーに及ぼす影響を評価した。ここで、α-平滑筋アクチン(α-smooth muscle actin; α-SMA)は肝硬変病態においてコラーゲン産生に関与する活性化肝星細胞のマーカー分子であり、プロコラーゲン-1(procollagen-1)は肝繊維化・肝硬変に繋がるコラーゲンの前駆体である。また、組織メタロプロテアーゼ阻害物質-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1; TIMP-1)は肝硬変病態において発現誘導され、コラーゲン分解等に関与する組織メタロプロテアーゼの阻害因子である。マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA複合体を電荷比1.0:3.1(-:+)として作製し、gp46 siRNAとして50μgの投与量で頻回静脈内投与（週2回/3週間、この間四塩化炭素は週2回腹腔内投与を継続）を行い、肝臓内のgp46、α-SMA、procollagen-1並びにTIMP-1発現量を評価した結果、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム/gp46 siRNA静脈内投与に伴うgp46の発現抑制に伴い、いずれの因子も顕著抑制されることが明らかとなった(図10)。【００７２】
[抗癌剤送達への適用]
8. ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによるドキソルビシンの肝臓内移行特性(図11)、並びに肝硬変治療効果(図12)
ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム静脈内投与による、ドキソルビシンの肝臓内移行性を正常マウス並びに肝硬変モデルマウスを用いて評価した。ドキソルビシン複合化可能なマンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームを作製するために、各種脂質をクロロホルム中に溶解し、ナス型フラスコに分取後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧留去して脂質薄膜とし、減圧下で3時間以上乾燥した。これに250mM 硫酸アンモニウム水溶液を加え、振盪機を用いた攪拌後、バス型ソニケーターにより10分間超音波処理後、窒素置換下チップ型ソニケーターを用いた3分間の超音波処理を行い、0.45μmの孔径を有するポリカーボネート膜を用いて滅菌濾過を行った。ドキソルビシンの複合化はリモートローディング法を用いて行った。具体的には、作製したリポソーム溶液を、PBS(pH 8.0)を展開溶媒としてSephadex G-25充填カラムを用いてゲル濾過し、外水相をPBS(pH 8.0)に置換したリポソーム溶液とドキソルビシンをリポソーム:ドキソルビシン=10:1(mol/mol)となるように混和し、60℃で1時間振盪して、ドキソルビシンをリポソーム内に封入した。本実験では、比較対象として臨床において抗癌剤として使用されているドキソルビシン内封ポリエチレングリコール修飾リポソーム製剤Doxilを用いた。また、肝硬変モデルマウスは四塩化炭素溶液（2% in olive oil, 10 mL/kg）をC57BL/6マウス腹腔内に週2回/4週間頻回投与して作製した四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスを用いた。【００７３】
ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム（ドキソルビシンとして4mg/kg）を正常マウス並びに四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスに対して静脈内投与し、投与6時間後に腫瘍組織を摘出し、組織破砕液添加並びにホモジナイザーによる溶解後、得られた組織破砕液を液体窒素並びに37℃湯浴中で凍結・融解操作を行った後、遠心分離し、得られた上清中のドキソルビシン由来の蛍光強度を測定し、臓器重量(g)で標準化して評価した。【００７４】
その結果、正常マウス及び肝硬変モデルマウス共に、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームを用いてドキソルビシンを送達することで、顕著に高いドキソルビシン肝臓内移行が認められた。このドキソルビシン肝臓内移行量は、現在臨床において実用化されているドキソルビシン内封ポリエチレングリコール修飾リポソーム製剤(Doxil)と比較しても極めて高いものであり、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームにより肝臓内へのドキソルビシン移行増大を達成できた(図11)。【００７５】
さらに、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム静脈内投与により、四塩化炭素誘導肝硬変において増強するα-平滑筋アクチン(α-smooth muscle actin; α-SMA)並びにプロコラーゲン-1(procollagen-1)に及ぼす影響を評価した。ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームを四塩化炭素誘導肝硬変モデルマウスに対してドキソルビシンとして4mg/kgの投与量で頻回静脈内投与（週2回/3週間、この間四塩化炭素は週2回腹腔内投与を継続）を行い、肝臓内のα-SMA並びにprocollagen-1発現量を評価した結果、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームにより両因子共に発現レベルが抑制されることが明らかとなった(図12)。本結果は、マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによりドキソルビシンが肝星細胞内に導入されていることを示し、当該製剤が肝硬変治療に応用できることが明らかとなった。【００７６】
7. ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによるドキソルビシンの腫瘍組織内移行特性(図13)、並びに抗腫瘍効果(図14)
ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム静脈内投与による、ドキソルビシンの腫瘍組織内移行性をB16BL6及びEL4由来固形腫瘍モデルマウスを用いて評価した。ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム作成方法は上述の通りである。また、固形腫瘍モデルマウスはB16BL6細胞及びEL4細胞をC57BL/6マウス背部皮下に移植して作製した。【００７７】
腫瘍体積が約300mm3に達した担癌マウスに対して、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム（ドキソルビシンとして4mg/kg）を静脈内投与した結果、マンノース-6-リン酸受容体発現細胞であるB16BL6由来の固形腫瘍に対しては、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム投与により、ドキソルビシンの腫瘍組織内への高い移行性が認められた一方、マンノース-6-リン酸受容体非発現細胞であるEL4由来の固形腫瘍に対して腫瘍組織内へのドキソルビシン移行性増大は認められず、マンノース-6-リン酸受容体発現癌細胞へのドキソルビシン移行性増大を達成できた(図13)。【００７８】
さらに、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム静脈内投与による抗腫瘍効果を、B16BL6由来固形腫瘍モデルマウスを用いて評価した。B16BL6細胞をC57BL/6マウス背部皮下に移植して作製した固形腫瘍モデルマウスに対して、腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームをドキソルビシンとして4mg/kgの投与量で単回静脈内投与し、その後の腫瘍体積を経日的に測定した結果、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソーム投与により、B16BL6固形腫瘍に対して顕著な腫瘍増殖抑制効果が認められた一方、未修飾リポソームにおいては認められず、ドキソルビシン内封マンノース-6-リン酸修飾コレステロール誘導体含有リポソームによりマンノース-6-リン酸受容体発現癌細胞特異的な抗腫瘍効果が得られることが明らかとなった(図14)。【００７９】
実施例２
インドシアニングリーンおよびヘマトポルフィリンのマンノース6リン酸(M6P) 修飾リポソームへの内封を行った。
（１）インドシアニングリーン内封マンノース6リン酸(M6P)修飾リポソームの調製
方法
1．インドシアニングリーン(ICG)内封M6P修飾リポソームの調製
以下の組成でクロロホルム中にて脂質を混和したのち、エバポレーターを用いて溶媒を除去した。
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC):Cholesterol:M6P-cholesterol= 60:40-x:x (molar ratio x=0 or 15 total lipid 40mg )
一晩デシケーター中に静置した後、ICG水溶液(1mg/ml in DI water) 4mlを加え、65℃の水浴中で30分間振とうした。その後バスソニケーター中で10分間、チップ型ソニケーターで3分間、それぞれソニケーションしICG内封M6P修飾リポソームを得た。得られたリポソーム溶液は0.45μmのシリンジフィルターで濾過し、以下の実験に用いた。
2．ICG内封M6P修飾リポソームのICG内封率の測定
ICG内封M6P修飾リポソームを、PD-10カラムを用いて濾過し外層を分離した。なお、溶媒としては蒸留水を用いた。その後、1にて調製したリポソーム溶液と、今回外層を分離したリポソーム溶液それぞれについて波長780nmにおける吸光度を測定し、検量線よりそれぞれのICG濃度を求めた。また、これら2つのリポソーム溶液についてリン脂質定量キットを用いて脂質濃度を求め、これら2つの値より脂質あたりのICG濃度およびICG内封率を求めた。【００８０】
結果
得られたリポソームは図１５の様であった。
PD-10カラムによる濾過で外層中のICGが除去され、結果として溶液の色が薄くなっていることがわかる。【００８１】
【表１】
2013035757.tif 000005
【００８２】
内封率は表１の通りとなった。0は未修飾リポソーム、15はM6P-cholesterolを15 mol%含有するM6Pリポソームである。
ICGをM6Pリポソーム中に内封することができたことが確認された。【００８３】
（２）ヘマトポルフィリン内封マンノース6リン酸(M6P)修飾リポソームの調製
方法
1．ヘマトポルフィリン(Hp)内封M6P修飾リポソームの調製
以下の組成でクロロホルム中にて脂質を混和し、Hp溶液(1mg/ml in methanol) 2mlを添加したのち、エバポレーターを用いて溶媒を除去した。
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC):Cholesterol:M6P-cholesterol= 60:40-x:x (molar ratio x=0 or 15 total lipid 20mg )
一晩デシケーター中に静置した後、蒸留水4mlを加え65℃の水浴中で30分間振とうした。その後バスソニケーター中で10分間、チップ型ソニケーターで3分間、それぞれソニケーションしHp内封M6P修飾リポソームを得た。得られたリポソーム溶液は0.45μmのシリンジフィルターで濾過し、以下の実験に用いた。
2．Hp内封M6P修飾リポソームのHp内封率の測定
ICG内封リポソームの際と同様に行った。Hp内封M6P修飾リポソームを、PD-10カラムを用いて濾過し外層を分離した。なお、溶媒としては蒸留水を用いた。その後、1にて調製したリポソーム溶液と、今回外層を分離したリポソーム溶液それぞれについて波長405nmにおける吸光度を測定し、検量線よりそれぞれのHp濃度を求めた。また、これら2つのリポソーム溶液についてリン脂質定量キットを用いて脂質濃度を求め、これら2つの値より脂質あたりのHp濃度およびHp内封率を求めた。
結果
得られたリポソームは図１６の様であった。
ICGと同様にPD-10カラムによる濾過で外層に残るHpが除去され、結果として溶液の色が薄くなっていることがわかる。【００８４】
【表２】
2013035757.tif 000006
【００８５】
内封率は表２の通り。0は未修飾リポソーム、15はM6P-cholesterolを15 mol%含有するM6Pリポソームである。M6Pリポソーム中に内封されていることが分かった。
結論
インドシアニングリーンやヘマトポルフィリンがM6P修飾リポソームに封入できることが明らかとなった。今後、M6Pレセプターを高発現する癌細胞に対する蛍光イメージングやsonodynamic therapyへの応用が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の製剤は、肝硬変治療薬、抗癌剤、細胞選択的薬物・核酸導入試薬（研究用試薬）などとして有用である。
【図１】
2013035757.tif 000009
【図２】
2013035757.tif 000010
【図３】
2013035757.tif 000011
【図４】
2013035757.tif 000012
【図５】
2013035757.tif 000013
【図６】
2013035757.tif 000014
【図７】
2013035757.tif 000015
【図８】
2013035757.tif 000016
【図９】
2013035757.tif 000017
【図１０】
2013035757.tif 000018
【図１１】
2013035757.tif 000019
【図１２】
2013035757.tif 000020
【図１３】
2013035757.tif 000021
【図１４】
2013035757.tif 000022
【図１５】
2013035757.tif 000023
【図１６】
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【配列表】
2013035757000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月18日(2013.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2013035757.tif 000025
（式中、Ｇはマンノース−６−リン酸残基を示し、Ｌは−Ｘ−Ｒ−Ｙ−で表される２価のリンカー基を示し、
ＸはＯまたはＳであり、
Ｙは炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数３〜６のシクロアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＣＯ−を示し、
Ｒは、Ｙが炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数３〜６のシクロアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基の場合には単結合、もしくはＲ１−Ｒ２（ここで、Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数３〜６のシクロアルキレン基、アリーレン基またはアラルキレン基を示し、Ｒ２は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−または−Ｏ−ＣＯ−を示す。）またはポリエーテル基を示し、Ｙが−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＣＯ−のとき、Ｒ１もしくはＲ１−Ｒ２−Ｒ１（ここで、Ｒ１は、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数３〜６のシクロアルキレン基、アリーレン基またはアラルキレン基を示し、Ｒ２は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−または−Ｏ−ＣＯ−を示す。）で表される化合物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記リンカー基が一般式
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＣＯ−（ＸはＳまたはＯを示す。ｍは２〜６の整数を示す。ｎは２〜６の整数を示す。）で表される、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含むリポソームと当該リポソームに複合化された生理活性物質を含むマンノース−６−リン酸修飾コレステロール誘導体含有製剤。
【請求項５】
前記生理活性物質が肝硬変、肝炎、肝線維症、癌、糖尿病、ライソゾーム病の治療薬である、請求項４に記載の製剤
【請求項６】
前記生理活性物質が薬物、タンパク質または核酸である、請求項４又は５に記載の製剤。
【請求項７】
前記生理活性物質が抗癌剤、プラスミドＤＮＡ／ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項４〜６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
前記生理活性物質が有機蛍光色素である、請求項４〜６のいずれかに記載の製剤。
【国際調査報告】
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