(57)【要約】  アルツハイマー病の治療薬を提供する。  前記治療薬は、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞（エクソソーム）を含み、前記膜小胞（エクソソーム）は、ネプリライシン（Neprilysin）を含むことを特徴とする。本発明者の研究により、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から分泌されるエクソソームには、アルツハイマー病の病原タンパク質であるアミロイドβを分解するネプリライシンが含まれることが明らかになった。ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から分泌されたエクソソームを、アルツハイマー病のモデルマウスの脳に投与するとアミロイドβの生成が抑制された。
2013039000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の予防または治療のための医薬品であって、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞を含むことを特徴とする医薬品。
【請求項２】
前記膜小胞が、ネプリライシン（Neprilysin）を含むことを特徴とする請求項１記載の医薬品。
【請求項３】
アルツハイマー病の予防または治療のための方法であって、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞を、アルツハイマー病患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記膜小胞が、ネプリライシン（Neprilysin）を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防または治療のための医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、世界中で最も多くみられる老年期の痴呆症であり、進行性の認知障害（記憶障害、見当識障害、学習障害、空間認識障害など）を特徴とする。アルツハイマー病では、大脳皮質にアミロイド斑が見られ、アミロイド斑の主成分はアミロイドβである。アルツハイマー病に対しては種々の治療薬が提案されているが（例えば、特許文献１）、現在のところ、有効な治療薬は存在していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１２６８４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、アルツハイマー病の有効な予防または治療のための医薬品及び予防または治療のための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の医薬品は、アルツハイマー病の予防または治療のための医薬品であって、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞を含むことを特徴とする。【０００６】
本発明の方法は、アルツハイマー病の予防または治療のための方法であって、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞を、アルツハイマー病患者に投与することを特徴とする。【０００７】
前記膜小胞は、ネプリライシン（Neprilysin）を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者は、アミロイドβを分解するネプリライシンが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞に存在することを突き止め、前記膜小胞を投与すれば、アミロイドβを分解し、アルツハイマー病を予防または治療することが可能であることを突き止め、本発明に到達した。本発明によれば、アルツハイマー病に有効な予防または治療のための医薬品及び予防または治療のための方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞（ｅｘｏｓｏｍｅ）がネプリライシンを含むことを示す電気泳動写真である。
【図２】図２は、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞（ｅｘｏｓｏｍｅ）中のネプリライシンの活性を示すグラフである。
【図３】図３は、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞（ｅｘｏｓｏｍｅ）を投与したマウスにおいて、アミロイドβが消滅したことを示す組織写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、脂肪組織由来間葉系幹細胞は、特に制限されず、例えば、アルツハイマー病患者由来のものであってもよいし、アルツハイマー病患者以外のヒトのものであってもよい。例えば、治療対象のアルツハイマー病患者から脂肪組織由来間葉系幹細胞を採取し、これを用いて、本発明の医薬品を調製してもよいし、別人の脂肪組織由来間葉系幹細胞を採取し、これを用いて、治療対象のアルツハイマー病患者用の本発明の医薬品を調製してもよい。
【００１１】
本発明において、前記膜小胞は、脂肪組織由来間葉系幹細胞が分泌する膜状物質であって、その大きさは、例えば、直径５〜２００ｎｍ、好ましくは１０〜１００ｎｍである。前記膜小胞は、例えば、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）である。前記エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、例えば、細胞内膜の小胞の中でも、細胞外に分泌されるナノオーダーの小胞である。
【００１２】
本発明において、ネプリライシンを含む膜小胞は、例えば、脂肪組織由来間葉系幹細胞を培養することで製造できる。培養した脂肪組織由来間葉系幹細胞からの前記膜小胞の回収方法は、特に制限されず、例えば、細胞外に放出された膜小胞に関しては、培養上清を回収することで実施してもよいし、細胞内に存在する膜小胞に関しては、細胞を粉砕して回収してもよい。
【００１３】
前記膜小胞の回収は、例えば、フィルターろ過、遠心分離等によって行うことができる。前記膜小胞は、例えば、その直径に基づいて分画可能であり、具体例として、前記エクソソームは、例えば、３０〜１００ｎｍの直径に基づいて分画可能である。回収方法の具体例は、例えば、培養液を遠心処理（例えば、５００×ｇ、１０分）して上清を回収し、前記上清をろ過後（例えば、０．２２μｍのフィルター使用）、この上清を超遠心処理（例えば、１００，０００×ｇ〜１２０，０００×ｇ、７０分）し、沈殿画分として回収する方法等があげられる。また、さらに、ショ糖等の比重担体を用いて密度勾配をつくり、密度勾配遠心を行ってもよい。また、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００７  Ｊｕｎ；９（６）：ｐ．６５４−６５９およびＥｐｕｂ  ２００７  Ｍａｙ  ７．、ＰＭＩＤ：  １７４８６１１３等の文献を参照して、回収できる。
【００１４】
本発明において、前記膜小胞の投与方法は、特に制限されず、例えば、注射による投与、経皮投与、経口投与等があげられる。また、注射による投与は、例えば、皮下注射、静脈注射等であってもよい。投与量は、患者の体の大きさ、年齢、性別、病状の進行状況等により適宜決定される。
【実施例】
【００１５】
次に、本発明の実施例について説明する。但し、本発明は、下記の実施例により、なんら制限および限定されない。【００１６】
（ネプリライシンの存在の確認）
下記の方法により、脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞に、ネプリライシンが存在することを確認した。【００１７】
ヒト脂肪組織に由来する間葉系幹細胞（１×１０６個／２０ｍｌ）を無血清培地にて７２時間培養後、培養上澄を回収した。この培養上澄を、２，０００×ｇで１０分間遠心して細胞の破砕物等を排除した後、さらに１００，０００×ｇ（４℃）にて７０分間超遠心後、上澄を捨てて、生理食塩水を加えて沈殿させ、この沈殿画分をエクソソーム画分とした。このエクソソーム画分を２００ｍｌ総量で溶解し、超遠心にてエクソソーム画分を精製し，Bradford法でタンパク量を定量し，１wellにつき１０ｍｇのタンパク相当量をWestern  Blotに用いた。Miniprotean  TgX  gel  4−15%(Biorad)を用いてPAGEを行った後、PVDF  membraneに転写し、４℃で一晩ブロッキングを行った（Nacalai  Blocking  solution）。次に、室温で1時間、一次抗体反応を行った（Mouse  monoclonal  anti  CD10,  ab951,  1:1000)。続いて室温で1時間、二次抗体反応を行った（Sheep  anti  mouse  Ig  HRP  conjugated,  1:5000）。最後に、Immunostar(Wako)を用いて発色反応（室温5分）を行い、ブロッティング画像を撮影した。【００１８】
前記ブロッティングの結果を、図１の写真に示す。図１の写真において、矢印で示すのが、ネプリライシンを示すバンドである。この結果から、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞（エクソソーム）に、ネプリライシンが存在することが確認できた。【００１９】
（ネプリライシンの活性の確認）
次に、前述の手法で得られた膜小胞（エクソソーム）中のネプリライシンの活性を、下記の方法で確認した。【００２０】
前記エクソソーム画分を、assay  buffer(100mM  Tris,  50mM  NaCl,  10mg/mL  ZnCl2,  pH=7.5)に溶解してサンプルを調製した。また、recombinant  human  Neprilysin(R&D)を0.31ng−10ngの範囲の各濃度に調整したものをStandardとして用いた。氷上にて、6μg/wellおよび30μg/wellでサンプルを96well  black  plateにアプライした。続いて、20mM基質および10mg/mL  thiorphan(±)を含むassay  bufferを各wellに等量（50mL）加えて測定を開始した。測定にあたっては，３７℃でインキュベーションの下、５分ごとに蛍光強度を測り、酵素反応のkineticsを観察した。【００２１】
ネプリライシン活性の測定には，蛍光発生基質Mca-RPPGFSAFK(Dnp)を用いた。この基質はネプリライシンの以外の数種類の酵素の基質にもなる。そこで、ネプリライシンの活性の測定では、同時にネプリライシンの特異的な阻害剤thiorphanを加えた系を用意し、ネプリライシン以外の酵素による活性も測定した。ネプリライシンの活性は下記の式で評価した。
ネプリライシン活性＝蛍光強度（阻害剤無し）−蛍光強度（阻害剤あり）
【００２２】
図２のグラフに、ネプリライシン活性測定の結果を示す。ネプリライシン活性の測定は、蛍光発生基質を添加後、１２０分にわたって観察して行った。蛍光発生基質を含む液に、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（hAT-MSC）由来のエクソソームを加えて37℃でインキュベートした結果、蛍光強度が経時的に増加していることが観察され、エクソソームが酵素活性を持つことが確認された。一方、ネプリライシン（NEP）特異的な阻害剤を加えた系では蛍光強度の増加が著しく減少したことから、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（hAT-MSC）由来エクソソームがネプリライシン（NEP）活性を有することが明らかとなった。また、組換ヒトネプリライシン（rhNEP）の希釈系列との比較から、このエクソソーム由来のネプリライシン（NEP）活性は、1.25ngのrhNEPの活性とほぼ同等であることが分かった。【００２３】
（膜小胞投与マウスによるアミロイドβ生成抑制）
下記に示す手法により、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の膜小胞を、アルツハイマー病のモデルマウスに投与することで、アミロイドβの生成抑制を確認した。【００２４】
前記手法により調製したエクソソーム画分を、２００ｍｌ総量で溶解、これを即座にマウス（アルツハイマーモデルマウス、生後１ヶ月）に尾静脈から投与した。対照としては、同腹のアルツハイマーモデルマウスに２００ｍｌの生理食塩水を静脈投与した。この操作を、７日おきに３回施行し、最後の投与の７日後に動物を安楽死させ、脳を回収し、固定した後、海馬、大脳、視床を中心に切片を作製、アミロイドβのプラークの染色を抗アミロイドベータ抗体にて実施した。なお、回収され、投与されたエクソソームの一部は、タンパク質を抽出し、エクソソームマーカーであるCD63抗原の存在をウエスタン法で確認した。【００２５】
図３の写真に、膜小胞投与によるアミロイドβ生成抑制を示す。同図に示すように、膜小胞を投与したモデルマウスの脳では、アミロイドβの生成が抑制されたことが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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