(57)【要約】  本発明は宿主細胞の染色体外で増幅するベクターＤＮＡ、および当該ベクターを用いた目的遺伝子の増幅方法を提供する。本発明にかかるベクターは、真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備するベクターであって、直鎖状であり、かつ少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であることを特徴としている。本発明のベクターを用いることで、目的遺伝子をＤＭの形態、すなわち染色体外で高度に増幅させることが可能となる。したがって、反復配列依存的な転写抑制を受けることなく、目的遺伝子の増幅コピー数の増加に比例して、目的遺伝子から発現するタンパク質量も増加すると考えられる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備するベクターであって、
直鎖状であり、かつ
少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であることを特徴とするベクター。
【請求項２】
両方の末端がヘアピン構造であることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅するための方法であって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項６】
上記目的遺伝子と、上記ベクターとをシスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記目的遺伝子と、上記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とが哺乳動物細胞に導入されてなる形質転換細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上を含む培地中で、請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１１】
目的遺伝子を増幅するためのキットであって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
目的遺伝子を発現するためのキットであって、
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上とを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類細胞内において目的とする遺伝子を宿主細胞の染色体外にて高度に増幅させるためのベクター、および該ベクターを用いて目的遺伝子を宿主細胞の染色体外にて高度に増幅させるための方法に関する。より具体的には、本発明者らが開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて所望の遺伝子を増幅する際に、宿主細胞の染色体外に組み込まれることなく目的遺伝子を増幅させることができるベクター、および当該ベクターを用いた遺伝子増幅方法に関する。さらに本発明は、上記本発明にかかるベクターを用いた遺伝子発現方法、および当該遺伝子発現方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、哺乳動物の複製開始領域（ＩＲ；Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎ）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ； Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ）とを持つプラスミド（以下「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」という）をヒト由来がん細胞（ＣＯＬＯ ３２０ 大腸がん細胞株、およびＨｅＬａ細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラスティサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅ）あるいはネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ））を利用して選択するだけで、
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（以下、適宜「目的遺伝子」という）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はＩＲ／ＭＡＲプラスミドに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した（特許文献１および非特許文献１参照）。そして、本発明者は当該知見に基づいて、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とを、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来がん細胞（ＣＯＬＯ３２０ 大腸がん細胞株、およびＨｅＬａ細胞株）、ＣＨＯ細胞等）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅあるいはＮｅｏｍｙｃｉｎｅ）を利用して選択するだけで、目的遺伝子を１万コピー程度に増幅できる系（以下、「高度遺伝子増幅系」という）を完成させるに至った。【０００３】
増幅した遺伝子は宿主細胞核内において、染色体外の巨大な環状ＤＮＡであるＤＭ（ダブルマイニュート染色体）あるいは、宿主細胞の染色体に組み込まれた巨大な構造であるＨＳＲ（均一染色領域）の形態で存在する。【０００４】
哺乳動物細胞内においては、ほとんどの場合目的遺伝子はＨＳＲとして増幅する。しかし、ＨＳＲは宿主細胞の染色体に組み込まれた構造であることに加え、目的遺伝子が高度に反復した構造であるため、反復配列依存的な遺伝子の転写抑制を受ける。そのため、目的遺伝子からのタンパク質の発現量が遺伝子増幅数に比例して増加しないという問題があった。【０００５】
現在、タンパク質の大量生産系として広範に用いられている、ＣＨＯ細胞内でＤＨＦＲ遺伝子と目的遺伝子を共に増幅する方法においても増幅構造の形態はＨＳＲであるため、遺伝子の増幅コピー数と目的遺伝子からのタンパク質発現量が比例しないという上記した問題が発生している。【０００６】
一方、目的遺伝子がＤＭ、すなわち宿主細胞の染色体外にて増幅する、あるいはＤＭに組み込まれた上で増幅すると目的遺伝子からのタンパク質発現量は遺伝子増幅コピー数に比例して増加する（特許文献２参照）。しかしながら、ＤＭまたはＨＳＲという遺伝子の増幅形態をコントロールする方法は現在のところ存在していない。
【特許文献１】特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日）
【特許文献２】国際公開第２００６／０５４５６１号パンフレット（国際公開日：平成１８（２００６）年５月２６日）
【非特許文献１】Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.
【発明の開示】
【０００７】
ＩＲ／ＭＡＲプラスミドを用いた高度遺伝子増幅系により、哺乳動物細胞内において一細胞あたりの目的遺伝子数を増幅させることは非常に容易となった。しかしながら、タンパク質の発現量という視点では、上記のごとく、目的遺伝子を含むベクターがＨＳＲの形態で増幅するとベクターＤＮＡの配列が高度に反復することにより転写抑制がかかり、最終目的であるタンパク質の発現に至らないという問題点がある。
【０００８】
一方、目的遺伝子がＤＭの形態、すなわち宿主細胞の染色体外にて増幅する、あるいはＤＭに組み込まれて増幅すると、目的遺伝子からのタンパク質発現量は遺伝子増幅コピー数に比例して増加する（特許文献２参照）。したがって、染色体外で目的遺伝子を増幅することができる方法が望まれていた。しかし、目的遺伝子を含むベクターをＤＭの形態で増幅させる方法は現在までに分かっていなかった。
【０００９】
そこで本発明は、目的遺伝子を含むベクターをＤＭの形態で、すなわち宿主細胞の染色体外で増幅させることを目的としている。より具体的には、宿主細胞の染色体外で増幅するベクターＤＮＡの開発、および当該ベクターを用いた目的遺伝子の増幅方法を提供することを本発明は目的としている。さらに本発明は、上記本発明にかかるベクターを用いた遺伝子発現方法、および当該遺伝子発現方法に用いられるキットをも提供する。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するためにＩＲ／ＭＡＲベクターの構造および形状等について鋭意検討を行ったところ、もっぱら宿主細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅することができるＩＲ／ＭＡＲベクターの構造を特定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。本発明にかかるベクターは、真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備するベクターであって、直鎖状であり、かつ少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であることを特徴としている。
【００１２】
また本発明にかかるベクターは、両方の末端がヘアピン構造であってもよい。
【００１３】
また本発明にかかるベクターは、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００１４】
また本発明にかかるベクターは、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００１５】
一方、本発明にかかる方法は、哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅するための方法であって、上記本発明にかかるベクターと、目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明にかかる方法は、上記目的遺伝子と、上記ベクターとをシスに配置して、哺乳動物細胞に導入する方法であってもよい。また本発明にかかる方法は、上記目的遺伝子と、上記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入する方法であってもよい。
【００１７】
また本発明にかかる形質転換細胞は、上記本発明にかかるベクターと、目的遺伝子とが哺乳動物細胞に導入されてなる形質転換細胞である。
【００１８】
また本発明にかかる目的遺伝子の発現方法は、上記本発明にかかる形質転換細胞を培養する工程を含むことを特徴としている。
【００１９】
また本発明にかかる目的遺伝子の発現方法は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上を含む培地中で、上記本発明にかかる形質転換細胞を培養する工程を含む方法であってもよい。
【００２０】
また本発明にかかるキットは、目的遺伝子を増幅するためのキットであって、上記本発明にかかるベクターを含むことを特徴としている。
【００２１】
また本発明は、上記本発明にかかるベクターと、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上とを含む、目的遺伝子を発現するためのキットをも包含する。
【００２２】
本発明によれば、目的遺伝子をＤＭの形態、すなわち染色体外で増幅させることができる。そのため、宿主細胞に組み込まれたＨＳＲの形態で増幅する場合と異なり、目的遺伝子の増幅に伴い、得られる目的タンパク質の量も増加するというメリットを享受できる。
【００２３】
したがって本発明は、従来の高度遺伝子増幅系の問題点を克服した、目的タンパク質の大量生産系を樹立することができるという効果を奏する。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のベクターの構造模式図であり、Ａは両側ヘアピンＤＮＡであり、Ｂは片側ヘアピンＤＮＡである。ベクター構造図において、黒の実線は一本鎖のＤＮＡを、灰色の部分が相補的なＤＮＡ鎖間に存在する水素結合領域を示す。
【図２】実施例１で用いているベクターの構築方法を示す模式図である。ベクター構造図において、黒の実線は一本鎖のＤＮＡを、灰色の部分が相補的なＤＮＡ鎖間に存在する水素結合領域を示す。
【図３】本発明のベクターを形質転換し、ブラスティサイジンで５週間選択したＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞の間期核メタフェーズスプレッディング標本について、ＦＩＳＨ法によりベクター配列を検出した蛍光顕微鏡像である。
【図４】本発明のベクターを形質転換し、ブラスティサイジンで５週間選択したＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞の分裂期核メタフェーズスプレッディング標本について、ＦＩＳＨ法によりベクター配列を検出した蛍光顕微鏡像である。矢印はベクター配列が検出された箇所の代表例を示す。
【図５】ＩＲとＭＡＲとを持つプラスミド（ｐＳＦＶ  ｄｈｆｒ）、またはＩＲとＭＡＲとを持たないプラスミド(ｐＳＦＶ−Ｖ)をもとに調製した片側ヘアピンＤＮＡを細胞に導入し、間期核に見られるプラスミド配列シグナルの頻度を示したグラフである。シグナル数の量をシグナルが少ない方から順に＋〜＋＋＋までに分類して示す。
【図６】導入するプラスミド形態（閉環環状（スーパーコイル）、直鎖状、片側ヘアピン、両側ヘアピン）が、増幅構造の形成にどのように影響するかを検討した結果を示すグラフである。
【図７】実施例２で用いられる両側にヘアピン構造を有するＩＲ/ＭＡＲプラスミド（「両側ヘアピンＤＮＡ」という）の構築方法を示す模式図である。
【図８】実施例２の結果を示す図であり、（Ａ）は閉環状プラスミドが導入された形質転換細胞のd2EGFP発現量（pΔBM-d2EGFp、図中では「ｃｃｃ」と表記する）と、両側ヘアピンＤＮＡが導入された形質転換細胞のd2EGFP発現量（図中では「hairpin」と表記する）とを示すヒストグラムであり、（Ｂ）は比較対象である閉環状プラスミド（pΔBM-d2EGFp、図中では「ｃｃｃ」と表記する）が導入された形質転換細胞について、d2EGFP発現量をセルソーターで解析した結果を示し、（Ｃ）は両側ヘアピンＤＮＡが導入された形質転換細胞について、d2EGFP発現量をセルソーターで解析した結果を示す。
【図９】実施例３の結果を示す図であり、両側ヘアピンＤＮＡが導入された形質転換細胞（図中では「hairpin」と表記する）、およびヘアピン構造を有しない閉環状プラスミドが導入された形質転換細胞（pΔBM-d2EGFp、図中では「ｃｃｃ」と表記する）について、阻害剤添加後、５日経過したポリクローンの細胞についてセルソーターを用いてＧＦＰの発現量を計測した結果を示すヒストグラムである。なお阻害剤が添加されていない結果は図中「control」で表記されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。【００２７】
＜１.本発明の遺伝子増幅方法＞
本発明の一実施形態は、目的遺伝子を増幅させるための方法に関する。上記方法のことを「本発明の遺伝子増幅方法」と称する。【００２８】
ここで本発明の遺伝子増幅方法は、真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備し、その形状が直鎖状であり、その末端のいずれか一方または両方がヘアピン構造となっているベクター（以下、「本発明のベクター」という）と、有用タンパク質をコードする目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程（以下、「導入工程」という）を含む方法である。【００２９】
ここで「目的遺伝子」とは発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味する。上記目的遺伝子は、特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。目的遺伝子であるポリヌクレオチドは、その塩基配列情報を元にＰＣＲ等の公知の技術を用いて取得すればよい。【００３０】
本発明の遺伝子増幅方法を実施することによって目的遺伝子が、染色体外のダブルマイニュート染色体（以下、適宜「ＤＭ」という）上、および／またはＤＭの形態、すなわち染色体外で増幅される。すなわち増幅構造が形成されていれていれば、目的遺伝子が増幅されていると判断できる。形質転換細胞のクローンにおいて上記増幅構造が形成されたか否かを検出する方法については、特に限定されるものではないが、例えば分裂期の染色体について公知のＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）を行い、哺乳動物細胞へ導入した遺伝子を検出することによって判断し得る。上記判断は、当業者であれば容易に行い得る。なおＦＩＳＨ法を実施する際の具体的な方法については特に限定されるものではなく、従来公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。【００３１】
なお本発明の遺伝子増幅方法には、上記導入工程の他に、目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程（以下、「選抜工程」という）や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞（すなわち形質転換細胞）を培養する培養工程（以下、「培養工程」という）が含まれていてもよい。【００３２】
また、上記形質転換体を培養することによって、目的遺伝子を発現させることができる。すなわち本発明は、目的遺伝子の発現する方法をも包含するといえる。【００３３】
また、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法（以下、「精製工程」という）を本発明の遺伝子増幅方法に合わせることによって、目的遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法を構築することができる。以下、本発明にかかる方法を工程ごとに説明する。【００３４】
〔１−１．導入工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における導入工程は、後に説明する本発明のベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程である。【００３５】
本発明のベクターに含まれる哺乳動物複製開始領域および哺乳動物核マトリックス結合領域は、哺乳動物をはじめとする真核生物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域であれば特に限定されるものではない。上記哺乳動物複製開始領域としては、例えばｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子座由来、β-グロビン遺伝子座由来等の複製開始領域が挙げられる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域（以下、適宜「ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域」については、「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242 (1990)」参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域については、「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988) 」参照のこと。またβ-グロビン遺伝子座の複製開始領域については、「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009 (1998) 」参照のこと。【００３６】
また上記核マトリックス結合領域としては、例えば、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来するポリヌクレオチドが挙げられる。なお、Igκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894 (1993) 」参照のこと。またSV40初期領域の核マトリックス結合領域については、「Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423 (1990) 」参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990 」参照のこと。【００３７】
また、本発明のベクターの末端に存在するヘアピン構造（「ヘアピンループ構造」ともいう）はいかなる手段を用いて達成してもよい。たとえば、本発明のベクターの末端にヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドを連結することによって達成すればよい。ヘアピン構造を構成する塩基配列は、ヘアピン構造を形成し得る塩基配列を有するものであれば特に限定されるものではない。【００３８】
なお本明細書において特に言及しない場合においては、哺乳動物複製開始領域を「ＩＲ」、核マトリクス結合領域を「ＭＡＲ」、ヘアピン構造のオリゴヌクレオチドを「ヘアピンＤＮＡ」と表記する。図１に本発明のベクターの構造模式図を示す。図１のＡは両側ヘアピンＤＮＡであり、Ｂは片側ヘアピンＤＮＡを示す。ベクター構造図において、黒の実線は一本鎖のＤＮＡを、灰色の部分が相補的なＤＮＡ鎖間に存在する水素結合領域を示す。図１に示すベクターには薬剤耐性遺伝子、目的遺伝子、シグナル配列等が含まれていてもよい。【００３９】
本発明の遺伝子増幅方法では、ＩＲ、ＭＡＲ、ヘアピンＤＮＡ末端を有するベクターを用いることを特徴とする。ここでヘアピンＤＮＡの長さは特に限定されるものではないが、一本鎖の段階で少なくとも３０ｂｐ以上であることが好ましい。また、当該一本鎖ＤＮＡが相補的な配列間で水素結合を生じることにより折れ曲がり、二本鎖のヘアピン構造を取った段階で１５ｂｐ以上であることが好ましい。【００４０】
本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程において使用する本発明のベクターは、既述のＩＲ、およびＭＡＲを具備し、直鎖状ＤＮＡの末端にヘアピンＤＮＡを有するベクターであればよいが、当該ベクターには、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列、選択マーカー（マーカータンパク質）としての薬剤耐性遺伝子(ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子等)または緑色蛍光タンパク質遺伝子、有用タンパク質をコードする目的遺伝子等が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、本発明のベクターが導入された哺乳動物細胞を選別できる。【００４１】
また本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程において導入される目的遺伝子は、プロモーターに制御可能に連結されていることが好ましい。上記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が活性化または不活性化されるプロモーター（本明細書においては「転写活性調節型プロモーター」という）であっても、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。「転写活性調節型プロモーター」は、上記特性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品が本発明にかかる方法において利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲａｌｐｈａプロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター等が利用可能である。【００４２】
本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程においては、本発明のベクターと目的遺伝子とを哺乳動物細胞へ同時に導入する。このようにすることによって、目的遺伝子が哺乳動物細胞において高度に増幅される。【００４３】
上記哺乳動物細胞は、ヒト大腸がんＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２０）が特に好ましい。しかし、特に限定されるものではなく、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０２８５、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０４０３等）等の、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０１９１等）、ヒト大腸がんＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ細胞（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２０．１）、ＮＳ０細胞（入手先：例えば、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０２１３）等が挙げられる。なおヒト大腸がんＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞については、「Shimizu, N.et al. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」を参照のこと。【００４４】
なお、本発明のベクターおよび目的遺伝子を哺乳動物細胞に導入する際には、両者が同時に哺乳動物細胞へ導入される態様であれば特に限定されるものではなく、両者を連結して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。ここで前者を「本発明のベクターと目的遺伝子とをシスに配置する」といい、後者を「本発明のベクターと目的遺伝子とをトランスに配置する」という。前者の場合は一の遺伝子構築物を哺乳動物細胞へ導入すればよく、操作が容易であるというメリットがある。一方、後者の場合はそれぞれの遺伝子構築物のサイズを小さくすることができるために、高い遺伝子導入効率を得られるというメリットがある。【００４５】
また遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。また本発明のベクターおよび目的遺伝子の哺乳動物細胞への導入方法は、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。【００４６】
なお本発明のベクターと目的遺伝子とを別の遺伝子構築物として導入する場合には、それぞれの遺伝子構築物に選択マーカーをコードする遺伝子が含まれていることが好ましい。上記ポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞を選抜することができるからである。この時、本発明のベクターに含まれる選択マーカーと、目的遺伝子を含む遺伝子構築物に含まれる選択マーカーとが異なることが好ましいことは言うまでもない。【００４７】
〔１−２．選抜工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「選抜工程」は、目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程である。より詳細には、本工程は、目的遺伝子とベクターとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から後者の細胞を選抜する工程である。なお、薬剤耐性を指標として本工程を行う場合には、哺乳動物細胞を培地で培養する工程が含まれる場合があるが、本工程では目的遺伝子とベクターとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の混合物を培養するのに対して、後述する目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞として既に選抜された細胞を培養する点において、両工程は明らかに相違する。かかる選抜工程によって、哺乳動物細胞に導入された目的遺伝子が高度に増幅された哺乳動物細胞を選抜することができる。【００４８】
上記選抜工程の具体的方法は特に限定されるものではないが、例えば、目的遺伝子とベクターとを哺乳動物細胞へ導入する際に用いた遺伝子構築物に薬剤耐性遺伝子が含まれている場合、その薬剤耐性を利用して目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を選抜すればよい。【００４９】
なお、本発明の遺伝子増幅方法における選抜工程は、ＰＣＲ法やサザンブロット法によって、哺乳動物細胞に含まれる目的遺伝子若しくはベクター、またはそのヌクレオチド断片を検出することによっても行われ得る。また上記薬剤耐性、ＰＣＲ法、サザンブロット法の具体的な方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が適宜利用され得る。【００５０】
〔１−３．培養工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「培養工程」は、上記選抜工程によって既に選抜された哺乳動物細胞（すなわち「形質転換細胞」）を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的遺伝子が導入され且つ高度に増幅された哺乳動物細胞を増殖させることができ、所定の操作（転写誘導操作等）によって、目的遺伝子を発現させることによって、目的遺伝子がコードするタンパク質を生産することができる。【００５１】
上記培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。【００５２】
特に、培養工程を行う際に用いられる培地に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか一つ以上を含ませることによって、目的遺伝子の発現量をさらに向上させることが可能であることを本発明者らは見出した（実施例３を参照のこと）。よって、形質転換細胞を培養することによって目的遺伝子をさらに高発現させるためには、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか一つ以上を培地に含ませることが好ましいといえる。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はヒストンのアセチル化レベルを上昇させることにより、またＤＮＡメチル化阻害剤はＤＮＡメチル化レベルを低下させることにより、目的遺伝子が受けているエピジェネティックな発現抑制を解除することにより、目的遺伝子を高発現させることができる。【００５３】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤は、特に限定されるものではないが、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、butyrate、Trichostatin A（ＴＳＡ）、ＭＳ−２７５、Oxamflatin、ＤＭＳＯなどが挙げられ、ＤＮＡメチル化阻害剤としては、5-aza-2’-deoxycytidine、5-aza-2’-cytidineなどが挙げられる。【００５４】
上記各阻害剤の培地への添加量については、培養される形質転換細胞の増殖に影響を与えない範囲内で、目的遺伝子の発現量が向上する添加量を検討の上、採用すればよい。【００５５】
〔１−４．精製工程〕
本発明における「精製工程」は、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法である。【００５６】
本精製工程におけるタンパク質精製の具体的方法としては、例えば、哺乳動物細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）等の緩衝溶液に懸濁した後、ホモジェナイザーまたは超音波等で細胞を破砕し、遠心分離をして上清を回収する。上記緩衝溶液には、タンパク質の可溶化を促進するための界面活性剤や、タンパク質の立体構造を安定化するための還元剤、タンパク質の分解を防止するためのプロテアーゼインヒビターを適宜添加することもできる。上記界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ(３−[(３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ)−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ]、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｎｉｋｋｏｌ、ｎ―オクチルグリコシド等を利用することができる。また、上記還元剤としては、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ＤＥＴ(ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ)等を利用することができる。また、上記プロテアーゼインヒビターとしては、アプロチニンや、ロイペプチンを利用することができる。【００５７】
上記上清から、目的遺伝子がコードするタンパク質（「目的タンパク質」）をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製することができる。また、精製されたタンパク質溶液を適当な緩衝液に透析することで不要な塩を除去することもできる。上記のタンパク質の精製工程は、タンパク質の分解を抑えるために低温条件下で行われることが好ましい。特に４℃下で精製工程が行われることが好ましい。【００５８】
なお、上記精製工程の具体的方法は、この限りではなく、公知の方法を適宜利用され得る。
＜２.本発明のベクターおよびキット＞
なお本発明は、上記で説示した本発明のベクター、当該ベクターを含むことを特徴とする遺伝子増幅キット（以下「本発明の遺伝子増幅キット」という）、および当該ベクターを含むことを特徴とする遺伝子発現キット（以下「本発明の遺伝子発現キット」という）をも包含する。【００５９】
本発明のベクターに関する説明については、＜１.本発明の遺伝子増幅方法＞の項における本発明のベクターの説明を援用する。【００６０】
また、本発明の遺伝子増幅キットおよび遺伝子発現キットは、上記本発明のベクターを含むことを特徴としている。本発明のキットは、本発明にかかる遺伝子増幅方法を実施し得るものであれば、上記構成に限定されるものではなく、その他の構成を含んでいてもよい。例えば、形質転換を行うために必要な緩衝液、目的遺伝子をベクターに挿入するための制限酵素、バイアル、チューブ類等が本発明のキットに含まれ得る。なお、本発明の遺伝子発現キットにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上をさらに含むことによって、遺伝子の発現量をさらに高発現させることができるキットを構築することができる。
【実施例】
【００６１】
以下に、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６２】
＜実施例１＞
〔実施例１で使用するベクター〕
本実施例で使用する本発明のベクターはＤＨＦＲ遺伝子座由来のＩＲとＭＡＲとを持つプラスミド（ｐＳＦＶ  ｄｈｆｒ）を基に構築した。また、ＩＲとＭＡＲを持たない対照プラスミド（ｐＳＦＶ―Ｖ）についても同様に構築した。なお、これらのプラスミドは、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」にすでに記載したプラスミドＤＮＡである。具体的な本発明のベクターの構築方法を以下に記載する。【００６３】
まず、上記した２つのプラスミドＤＮＡをそれぞれＡｓｅ  IとＭｌｕ  Iの２種類の制限酵素で同時切断することにより直鎖状ＤＮＡを得た。この直鎖状ＤＮＡと、Ａｓｅ I切断部位を有する大過剰モル数のヘアピン構造をした合成オリゴヌクレオチドとを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｋｉｔ （東洋紡社製）を用いてライゲーションを行った。このライゲーション産物を「両側ヘアピンＤＮＡ」と称し、これをさらにＭｌｕ Iで消化したＤＮＡを「片側ヘアピンＤＮＡ」とした。ヘアピン構造をとるオリゴヌクレオチドの合成はＤＮＡ合成受託業者に受注した。本実施例に用いたヘアピンオリゴヌクレオチドの配列を配列番号１（taatatgctgcactgacgtcagtgcagcatat）に示した。これらのプラスミドの構造については図１、その構築方法については図２を参照のこと。【００６４】
〔実験方法〕
上記で作製したプラスミドを用いて以下の実験を行った。【００６５】
本実施例および参考例（「実施例等」という）では、上記プラスミドを細胞に遺伝子導入し、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞を選択し、ＦＩＳＨ法を用いて当該形質転換細胞内の増幅構造の形態を調べた。【００６６】
本実施例等で用いられている遺伝子導入方法については以下の通りである。まず上記方法により構築した「両側ヘアピンＤＮＡ」、「片側ヘアピンＤＮＡ」を細胞へ遺伝子導入した。【００６７】
上記の遺伝子導入される細胞は、ヒト大腸癌細胞株である、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭである。上記細胞株は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の所から取得され、当該記載と同じ条件で培養された。ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭにはｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅によって多くの内在性のＤＭが生じている。【００６８】
上記形質転換細胞を、遺伝子導入から２日後に、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにブラスティサイジンを加えた選択培地で上記細胞を培養することで選択した。選択培地は３日〜５日ごとに培養中の選択培地の半分を、新しく調製した上記選択培地と交換した。【００６９】
上記ＦＩＳＨ法と、ＦＩＳＨ法に用いる導入遺伝子を検出するためのプローブの調製と、メタフェーズスプレッディング標本（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）は、遺伝子導入してから５週間後に、培養中の細胞の一部を回収し、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の方法に従って行われた。また、上記プローブはビオチン化されており、緑色蛍光を発するＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）が結合したストレプトアビジンによって検出することができる。また、赤色蛍光を発するＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）でＤＮＡを対比染色した。ＦＩＳＨ法によって蛍光標識したスライドガラス上の細胞を、蛍光色素を検出するのに適切なフィルタセットと１００倍の対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、ＮＡ１．３０ ｏｉｌ）を設置している倒立蛍光顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて観察し、上記顕微鏡とつながれているＦｕｊｉ ＦｉｎｅＰｉｘ Ｓ１Ｐｒｏ ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ(Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｃｏ.Ｔｏｋｙｏ)を用いて、細胞内での導入遺伝子とＤＮＡの態様の写真をデジタル画像として撮影した。得られた、それぞれの画像は画像解析ソフトＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｐｓｈｏｐ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０Ｊ(Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ)を用いて合成した。【００７０】
構築した本発明のベクター「両側ヘアピンＤＮＡ」、「片側ヘアピンＤＮＡ」をＣＯＬＯ３２０  ＤＭ細胞へ導入した後、５週間ブラスティサイジンにより選択した細胞群についてメタフェーズスプレッディング標本を作成し、ＦＩＳＨ法により本発明のベクターの増幅箇所を可視化した（図３、図４参照）。【００７１】
図３に間期核の像を示す。極めて小さなシグナル（白く見える部分）が、ほぼ全ての間期核で極めて多数見られる。より詳細に本発明のベクターの宿主細胞内における増幅形態を知るために、分裂期細胞において本発明のベクター配列を検出した染色体画像を図４に示す。図４の矢印が示すように、本発明のベクターのシグナルは染色体外に存在すること、および、多くのプラスミドシグナルは、この細胞内にもとから存在していた大きなＤＭに付着するようにして存在していた。【００７２】
本発明のベクターが染色体外で高度に増幅した細胞の頻度を、２回の実験データを基にグラフ化した（図５、６を参照のこと）。図５では、ＩＲとＭＡＲとを持つプラスミド（ｐＳＦＶ  ｄｈｆｒ）、およびＩＲとＭＡＲとを持たないプラスミド(ｐＳＦＶ−Ｖ)をもとに調製した片側ヘアピンＤＮＡを細胞に導入した結果を示す。間期核に見られるプラスミド配列シグナルの概数をもとに、シグナルが少ない方から順に＋〜＋＋＋までに分類し、その頻度をグラフで示した。その結果、極めて高い割合の細胞で染色体外のシグナルが検出されたが、その頻度はＩＲとＭＡＲとを持つプラスミドの方が、ＩＲとＭＡＲとを持たないプラスミドに比べて著しく高かった。また図６では、導入するプラスミドベクターＤＮＡの形態（閉環環状（スーパーコイル）、直鎖状、片側ヘアピン、両側ヘアピン）がどのように増幅構造の形成に影響するかを検討した結果を示す。その結果、閉環環状（スーパーコイル）のベクターでは、発明者がこれまで行った実験の結果と同様にＨＳＲの形成が認められたのに対し、ベクターを直鎖状とした上でその末端をヘアピン構造とすることにより、極めて効率よく染色体外のＤＭが形成されることが示された。【００７３】
＜実施例２＞
実施例２は、特記しない限りにおいて、実施例１と同様の方法を用いて行われた。【００７４】
〔実施例２で使用するベクター〕
本実施例で使用するベクターは、ヒトＤＨＦＲ遺伝子座由来のＩＲおよびＭＡＲを有し、恒常的プロモーター（CMVプロモーター）の制御下に、ＧＦＰ遺伝子を有するプラスミド（pΔBM-d2EGFP）を、Mlu Iで切断したのち、２か所の切断末端にヘアピン構造をとる合成ＤＮＡをライゲーションすることにより、両側にヘアピン構造を有するＩＲ/ＭＡＲプラスミド（「両側ヘアピンＤＮＡ」という）を構築した（図７を参照のこと）。上記ヘアピン構造をとる合成ＤＮＡの配列は、cgcgatatgctgcactgacgtcagtgcagcatat（34bp、配列番号２にその塩基配列を示す）であった。【００７５】
なお上記pΔBM-d2EGFPの作製方法は以下の通りである。上記pΔBM-d2EGFPは、pSFV dhfr（非特許文献１〔Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.〕参照）をもとに構築された。まず、pSFV dhfrをBamH IとMlu Iの２種類の制限酵素で同時切断した。その切断箇所へ、両末端にBamH I、Mlu I切断部位を有し、マルチクローニングサイトを有する直鎖状合成オリゴヌクレオチドを、Ligation high Kit(東洋紡社製)を用いてライゲーションすることにより挿入した。上記直鎖状合成オリゴヌクレオチドは、配列番号３および４に示される塩基配列からなる合成ヌクレオチドをアニーリングすることにより得られた。このプラスミドをpΔBM-linkerと名付けた。マルチクローニングサイトは、BamH I切断末端側からMlu I切断末端の向きで、Kpn I、Asc I、Sal I、Swa I、AsiS I、Sbf I、BamH I切断可能部位を有する。ただし、上記ライゲーション行程において、接着箇所のMlu I切断部位は復元されるが、BamH I切断部位は復元されない。次に、pΔBM-linkerのAsiS IとAsc I部位間に、CMVプロモーターに支配されたd2EGFP遺伝子を組み込むことにより、pΔBM-d2EGFPを作製した。【００７６】
〔実験方法〕
上記の工程により構築した両側ヘアピンＤＮＡを、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ細胞にリポフェクション法により導入した。遺伝子導入２日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する５μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、培養開始から７５日経過したポリクローンの安定な形質転換細胞について、セルソーターを用いてＧＦＰの発現量を計測した。また、比較対象として閉環状プラスミド（pΔBM-d2EGFp）も同様の方法で実験を行った。【００７７】
〔結果〕
図８にその結果を示す。図８（Ｂ）は、比較対象である閉環状プラスミド（pΔBM-d2EGFp、図中では「ｃｃｃ」と表記する）が導入された形質転換細胞について、d2EGFP発現量をセルソーターで解析した結果を示す。図８（Ｃ）は、両側ヘアピンＤＮＡが導入された形質転換細胞について、d2EGFP発現量をセルソーターで解析した結果を示す。図８（Ａ）は、閉環状プラスミドが導入された形質転換細胞のd2EGFP発現量（pΔBM-d2EGFp、図中では「ｃｃｃ」と表記する）と、両側ヘアピンＤＮＡが導入された形質転換細胞のd2EGFP発現量（図中では「hairpin」と表記する）とを示すヒストグラムである。【００７８】
図８によれば、両側ヘアピンＤＮＡが導入された細胞は、ヘアピン構造を有しないＩＲ/ＭＡＲプラスミドに比して明らかにd2EGFP遺伝子の発現量の顕著な増加が見られた（約４倍）。【００７９】
＜実施例３＞
実施例３は、特記しない限りにおいて、実施例１および２と同様の方法を用いて行われた。【００８０】
〔実験方法〕
実施例２で構築した両側ヘアピンＤＮＡを、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ細胞にリポフェクション法により導入した。遺伝子導入２日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する５μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、培養開始後７０日経過したポリクローンの安定な形質転換細胞について、各種ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤：butyrate、Trichostatin A（ＴＳＡ）、ＭＳ−２７５、Oxamflatin、ＤＭＳＯ）またはＤＮＡメチル化阻害剤（5-aza-2’-deoxycytidine：以下「5-aza」と表記する）を加えた。各阻害剤は、細胞培地に対する最終濃度が、butyrate（Sigma社製）は２mM、ＴＳＡ（Sigma社製）は１００nM、ＭＳ−２７５（Alexis Biochemicals社製）は３μＭ、Oxamflatin（Calbiochem社製）は０．１μg/ml、ＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）は１．６容量％、5-aza（Sigma社製）は３μMになるよう加えた。阻害剤添加後、５日経過したポリクローンの細胞についてセルソーターを用いてＧＦＰの発現量を計測した。また、比較対象として閉環状プラスミド（pΔBM-d2EGFp）も同様の方法で実験を行った。【００８１】
〔結果〕
図９にその結果を示す。図９には、両側ヘアピンＤＮＡが導入された形質転換細胞（図中では「hairpin」と表記する）、およびヘアピン構造を有しない閉環状プラスミドが導入された形質転換細胞（pΔBM-d2EGFp、図中では「ｃｃｃ」と表記する）について、各種阻害剤が実験系に添加された結果、および添加されていない結果（図中では「control」と表記する）がそれぞれ示されている。【００８２】
図９の結果によれば、両側ヘアピンＤＮＡによって遺伝子発現量が増加した形質転換細胞をＨＤＡＣ阻害剤やＤＮＡメチル化阻害剤で処理することによって、さらに遺伝子発現量を増加させることが可能であるということが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
上記説示したように、本発明にかかる方法によれば目的遺伝子をＤＭの形態、すなわち染色体外で増幅させることができるため、目的遺伝子の増幅に伴い、目的遺伝子からの目的タンパク質の発現量も増加するというメリットを享受できる。したがって、従来の高度遺伝子増幅系の問題点を克服した、目的タンパク質の大量生産系を樹立することが可能である。それゆえ、所望のタンパク質（例えば、有用タンパク質）を従来法より大量に生産することが可能になるという効果を奏する。【００８４】
したがって、本発明はタンパク質の生産を行う産業、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等種々広範な産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月9日(2009.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅するためのベクターであって、
真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備し、
直鎖状であり、かつ
少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であることを特徴とするベクター。
【請求項２】
両方の末端がヘアピン構造であることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する請求項１ないし３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
哺乳動物細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅するための方法であって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項６】
上記目的遺伝子と、上記、ベクターとをシスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記目的遺伝子と、上記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とが哺乳動物細胞に導入され、
哺乳動物細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅している形質転換細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上を含む培地中で、請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１１】
宿主細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅するためのキットであって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
目的遺伝子を発現するためのキットであって、
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上とを含むことを特徴とするキット。
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月12日(2009.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
専ら哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅するためのベクターであって、
真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備し、
直鎖状であり、かつ
少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であることを特徴とするベクター。
【請求項２】
両方の末端がヘアピン構造であることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する請求項１ないし３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
専ら哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅するための方法であって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項６】
上記目的遺伝子と、上記ベクターとをシスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記目的遺伝子と、上記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とが哺乳動物細胞に導入され、
専ら哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅している形質転換細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上を含む培地中で、請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１１】
専ら哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅するためのキットであって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
専ら哺乳動物細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅および発現するためのキットであって、
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上とを含むことを特徴とするキット。
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月18日(2009.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨＯ細胞または無限増殖能を有する腫瘍細胞である哺乳動物細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅するためのベクターであって、
当該ベクターおよび目的遺伝子が導入された哺乳動物細胞に対する染色体内に目的遺伝子の増幅構造を形成している哺乳動物細胞の割合を１％未満とすることができるベクターであり、
真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備し、
直鎖状であり、かつ
少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であり、かつ当該ヘアピン構造は合成オリゴヌクレオチドからなることを特徴とするベクター。
【請求項２】
両方の末端がヘアピン構造であることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来する、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
ＣＨＯ細胞または無限増殖能を有する腫瘍細胞である哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅するための方法であって、
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項６】
上記目的遺伝子と、上記ベクターとをシスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、目的遺伝子とがＣＨＯ細胞または無限増殖能を有する腫瘍細胞である哺乳動物細胞に導入され、
哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅している形質転換細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上を含む培地中で、請求項８に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項１１】
ＣＨＯ細胞または無限増殖能を有する腫瘍細胞である哺乳動物細胞の染色体外で、目的遺伝子を増幅するためのキットであって、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
ＣＨＯ細胞または無限増殖能を有する腫瘍細胞である哺乳動物細胞の染色体外で目的遺伝子を増幅および発現するためのキットであって、
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のベクターと、
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤のいずれか１つ以上とを含むことを特徴とするキット。
【国際調査報告】
2009048024.tif 000012
2009048024.tif 000013
2009048024.tif 000014
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