(57)【要約】  蛍光検出装置及び蛍光検出方法は、レーザ光を照射した測定対象物から散乱される前方散乱光を受光し、測定対象物が測定点を通過したことを知らせ、かつ、集束した前方散乱光の集束位置を特定するための検知信号を生成する。一方、測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力する。出力した受光信号と生成した検知信号とに基づいて、蛍光強度の値を出力する。生成された検知信号から集光位置を特定し、この特定位置に応じた補正係数を用いて受光信号を補正する。
2009098868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第１の受光部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第２の受光部と、
前記第１の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第２の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記処理部は、前記第１の受光部から出力された検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第２の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記処理部は、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記流路と前記第１の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第１の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられる請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備える請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
さらに、前記第１の受光部にて生成される前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める分析部を備える請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、
測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、
測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を検知する検知信号を生成するステップと、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、
前記検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項７】
前記受光信号を補正するとき、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項６に記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有する請求項６または７に記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
さらに、前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップを有する請求項６〜８のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置及び蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。【０００３】
蛍光検出装置で使用するレーザ光の光強度は、一般的に中心が高く、その外側に行くに従って強度が低下するガウシアン分布を形成する。蛍光検出装置の蛍光を高分解能で正確に測定するには、測定対象物にレーザ光が一定の光強度で照射されることが必要である。このため、測定対象物には、ガウシアン分布を成すレーザ光の光強度が略一定の中心部分を照射する。しかし、流路を流れる測定対象物は、流路内で予め設定された測定点の中心に対して位置ずれすることから、測定対象物の位置ずれを可能な限り抑制することが行われている。また、レーザ光の光束を拡げて、ガウシアン分布の一定の光強度を持つ部分を拡げることも行われている。【０００４】
下記非特許文献１には、フローサイトメータが記載されている。このフローサイトメータにおいて、高い測定分解能を得るには、レーザ光の光強度が安定していること、測定対象物を含ませて流すシース液を調整して流れの径を小さくすること、及びその流れが層流になっていること、が必要であると指摘されている。【０００５】
しかし、高い測定分解能を得、かつ、レーザ光を効率よく使用するには、上述のレーザ光の光強度が安定していること、シース液の流れの径を小さくすること、及びその流れを層流にすること、だけでは十分とはいえない。
例えば、レーザ光の光束を拡げて、測定対象物の測定に用いる一定の強度を備える部分を拡げることはできても、レーザ光の外側の部分は、測定対象物の照射に用いていないため、レーザ光の使用効率が悪い。【０００６】
【非特許文献１】http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple_6-6.html  （２００７年１２月６日検索）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置において、レーザ光の使用効率を高め、得られた測定データを用いて高分解能の結果を得ることのできる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第１の受光部と、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第２の受光部と、前記第１の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第２の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記処理部は、前記第１の受光部から出力された検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第２の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することを特徴とする蛍光検出装置を提供する。【０００９】
前記処理部は、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求めることが好ましい。【００１０】
前記流路と前記第１の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第１の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられることが好ましい。
さらに、補正された受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備えることが好ましい。
さらに、前記第１の受光部にて生成される前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める分析部を備えることも好ましい。【００１１】
さらに、本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を検知する検知信号を生成するステップと、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、前記検知信号から前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。【００１２】
その際、前記受光信号を補正するとき、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求めることが好ましい。【００１３】
さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有することが好ましい。
さらに、前記前方散乱光の散乱光信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップを有することも好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法において、測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせる第１の受光部は、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を備える。このため、処理部では、第１の受光部から出力された検知信号から前方散乱光の集光位置を特定し、この集束位置から、第２の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて受光信号を補正することができる。したがって、ガウシアン分布等の光強度を有するレーザ光であっても、光強度が一定の中心部の他に、その外側の急激に光強度が低下する周辺部を、測定対象物の照射に使用することができるので、レーザ光の使用効率を高めることができる。
また、受光信号を補正するので、分析部で作成する蛍光強度に対する頻度分布において、シャープな（分散が小さい）頻度分布を得ることができる。このため、頻度分布において、２つのピークが近接して存在する場合でも、２つのピークを判別できる程度に、高分解能の結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】本発明の蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。
【図３】本発明の蛍光検出装置に用いられる第１の受光部の一例を示す概略構成図である。
【図４】本発明の蛍光検出装置に用いられる第２の受光部の一例を示す概略構成図である。
【図５】（ａ）〜（ｅ）は、本発明の蛍光検出装置の補正について説明する図である。
【符号の説明】
【００１６】
１０  フローサイトメータ
１２  試料
２０  信号処理装置
２２  レーザ光源部
２２ｒ  Ｒ光源
２２ｇ  Ｇ光源
２２ｂ  Ｂ光源
２３ａ1，２３ａ2，２６ｂ1，２６ｂ2  ダイクロイックミラー
２３ｃ  レンズ系
２４，２６  受光部
２４ａ  集光レンズ
２４ｂ  前方散乱検出ユニット
２４ｃ  遮蔽板
２４ｄ  検出器
２６ａ  集束レンズ
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ３  バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ  光電変換器
２８  処理部
２９  制御部
３０  管路
３１  フローセル体
３２  回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ  レーザドライバ
３５  パワースプリッタ
８０  分析装置
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を詳細に説明する。
図１は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とする細胞等の試料１２に照射し、試料１２中の一部分から発する蛍光を検出して信号処理をする信号処理装置（蛍光検出装置）２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置８０とを有する。【００１８】
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、処理部２８と、制御部２９と、管路３０と、フローセル体３１と、を有する。
処理部２８は、試料１２の蛍光強度の出力値を出力する。制御部２９は、所定の強度でレーザ光を照射させ、各処理の動作の制御管理を行う。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流す。フローセル体３１は、管路３０の端に接続され、試料１２のフローを形成し、このフローの経路にレーザ光の測定点をつくる。
フローセル体３１の出口側には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。【００１９】
レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ1＝４０５ｎｍ、λ2＝５３３ｎｍおよびλ3＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、フローセル体３１中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置が試料１２の測定点となっている。【００２０】
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇ、Ｂ光源２２ｂと、ダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2と、レンズ系２３ｃと、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、パワースプリッタ３５と、を有して構成される。
Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇ、Ｂ光源２２ｂは、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光の、レーザ光を出射する部分で、Ｒ光源２２ｒは、主に赤色のレーザ光Ｒを所定の強度で出射する。Ｇ光源２２ｇは、緑色のレーザ光Ｇを所定の強度で出射する。Ｂ光源２２ｂは、青色のレーザ光Ｂを所定の強度で出射する。
ダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。
レンズ系２３ｃは、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのぞれぞれを駆動する。
パワースプリッタ３５は、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂにそれぞれ分配する。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。【００２１】
ダイクロイックミラー２３ａ1は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ2は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点を通過する試料１２を照射する照射光となる。【００２２】
レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、処理部２８及び制御部２９に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射の強度が調整されるように構成される。【００２３】
Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質等の試料１２に付着されており、測定対象物としてフローセル体３１の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。【００２４】
受光部２４は、管路３０及びフローセル体３１を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、処理部２８及び制御部２９に供給され、処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガー信号として用いられる。【００２５】
図３は、受光部２４の一例の概略の構成を示す概略構成図である。図３では、試料１２の流れる方向が紙面に対して垂直方向である。
受光部２４は、試料１２に当たって前方散乱するレーザ光を集光する集光レンズ２４ａと、集光した光を検出する多チャンネルの前方散乱光検出ユニット２４ｂと、遮蔽板２４ｃと、を有する。【００２６】
集光レンズ２４ａは、試料１２に照射されて前方（レーザ光の進行方向前方、図３中の右側方向）に散乱したレーザ光を集光するために用いられる。
前方散乱光検出ユニット２４ｂは、レーザ光の照射方向と直交し、かつ、試料１２の流れる方向（図３中紙面に垂直方向）と直交する方向に、複数の検出器２４ｄが並列配置されている。検出器２４ｄのそれぞれは、検出信号が処理部２８及び制御部２９に出力されるように接続されている。検出器２４ｄは、例えば、いずれも同じ構成をしたフォトダイオードが用いられる。このように、検出器２４ｄを複数並列配置したのは、試料１２が予め設定された測定点（レーザ光の集束点）の中心に対して位置ずれして通過するときの位置ずれの情報を得るためである。具体的には、試料１２が、図３中、Ｘ方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット２４ｂの中心位置Ａより図中下側の位置（図３中矢印の方向の位置）で集束する。試料１２が、図３中、Ｘ方向と反対側方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット２４ｂの中心位置Ａより図中上側の位置で集束する。この集束位置は、試料１２のＸ方向の位置ずれ量に応じて変化する。したがって、計測した散乱光の最大強度がどの検出器２４ｄで検出されたかによって、集束位置を知ることができる。これより、測定対象の試料１２が測定点に対してどのくらい位置ずれして流れたかを知ることができる。測定した検出器２４ｄの検知信号が処理部２８及び制御部２９に供給される。検知信号は、検出器２４ｄそれぞれから出力されるので、最大値を示す検知信号を特定することで、散乱光の最大強度がどの検出器２４ｄで検出されたか、知ることができる。また、検知信号は、データ処理の開始のためにトリガー信号として用いられる。
遮蔽板２４ｃは、照射されたレーザ光の直接光が検出器２４ｄで受光されないように、この直接光を遮蔽するために用いられる。【００２７】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の光軸に垂直な平面上の、試料１２の流れに直交する方向、すなわち、レーザ光の照射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体３１の流路中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。【００２８】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体３１の流路中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。【００２９】
図４に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２と、バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。【００３０】
バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。【００３１】
光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。【００３２】
制御部２９は、所定の強度でレーザ光を照射させ、受光部２４から供給されたトリガー信号に基づいて処理部２８における各処理の動作の制御管理を行う部分である。
処理部２８は、所定の信号処理を行って蛍光強度の出力値を分析装置８０に出力する部分である。
処理部２８では、受光部２４から供給された検知信号に基づいて所定のデータ処理を開始する。処理部２８は、受光部２４から供給された検出信号のうち、最大の値を取るものが、どの検出器２４ｄからのものであるか特定し、これによって前方散乱光の集束位置を特定し、この特定位置から、受光部２６から出力された受光信号に補正をするための補正係数を求め、この補正係数を用いて受光信号を補正する。
処理部２８は、検出器２４ｄの集束位置からレーザ光の強度を求め、この強度に応じた補正係数を求める処理を一括して行うために、予め記憶されている補正テーブルを用いて補正を行う。この補正テーブルは、試料１２に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けて設定されたものである。【００３３】
図５（ａ）〜（ｅ）は、受光信号に補正を行う必要性を説明する図である。
本発明では、受光信号は、後述する分析装置８０において、図５（ｄ）に示すような蛍光強度に対する試料１２の頻度分布を算出し、この頻度分布から、特定の蛍光が測定されたか否かを判別するために使用する。このとき、蛍光が２種類存在する場合、頻度分布において２つのピークを形成する。この２つのピークの蛍光強度が近接しているとき、この２つのピークが判別できるためには、ピークの幅が狭いこと（分散が小さいこと）が必要である。図５（ｅ）のように、１つのピークのピーク幅が広い（分散が大きい）場合、２つのピークは判別できない。図５（ｅ）は、上述の補正をしない場合の頻度分布である。【００３４】
図５（ａ）に示すように、試料１２の通過する位置Ａ〜Ｃ等に応じて、この位置におけるレーザ光の光強度分布の逆数の分布を持つ補正係数を用い、この補正係数を受光信号に乗算する。試料１２の位置は、図５（ｃ）のように、分布を持ってばらつくが、上述したように補正係数を用いて受光信号を補正するので、補正をしない場合の頻度分布である図５（ｅ）に対して、図５（ｄ）のようにピークの幅が狭くなる。【００３５】
このように、受光信号に対して補正をするのは、図５（ｄ）のようにピークの幅を狭くし、頻度分布における分解能を向上させるためである。
補正は単純に補正係数を受光信号に乗算するものである。これは、蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度に応じて線形的に変化する部分を好適に用いるからである。しかし、本発明ではこれに限定されない。少なくとも蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度と対応関係にあり、この関係を用いて補正係数を定めるとよい。【００３６】
分析装置８０は、処理部２８から供給される補正された受光信号を用いて、図５（ｄ）のような頻度分布を作成し、フローセル体３１の測定点を通過する試料１２中に含まれる生体物質の種類等を特定し、試料１２中に含まれる生体物質の分析を行う装置である。【００３７】
このような蛍光検出装置１０では、試料１２がレーザ光によって照射されたとき、試料１２から発する前方散乱光を、散乱光検出ユニット２４ｂの検出器２４ｄで検出する。検出器２４ｄの生成する検知信号によって、前方散乱光の集束位置がわかるので、この集束位置に基づいて、処理部２８が保有する補正テーブルを用いて補正係数が求められる。この補正係数を受光部２６の受光信号に乗算することにより、受光信号は補正される。
補正された受光信号は、分析装置８０に供給されて、図５（ｄ）に示すような頻度分布が作成される。【００３８】
蛍光検出装置１０では、処理部２８において、レーザ光の光強度の分布を用いた補正テーブルを用いて受光信号の補正を行うので、分析装置８０では、ピーク幅の狭い頻度分布を得ることができる。一方、レーザ光に光強度分布が存在しても、この分布を用いて補正するので、従来のように、一定の光強度を有するレーザ光の中心部のみを蛍光の測定に使用する必要はなく、従来測定に用いられなかったレーザ光の中心部分の外側部分も蛍光の測定に使用することができる。このため、レーザ光を効率よく使用することができる。
又、試料１２の流れる位置を調べることもできる。検出器２４ｄの検出信号から試料１２の位置におけるレーザ光の光強度が既知となっている。一方、前方散乱光の光強度は、試料１２の位置におけるレーザ光の光強度と試料１２のサイズの乗算した結果として得られるものなので、既知のレーザ光の光強度を用いて、測定された試料１２の概略のサイズを知ることもできる。このような測定された試料１２の概略のサイズの算出処理を、分析装置８０は行ってもよい。このとき、受光部２４にて生成される前方散乱光の散乱光信号の強度と、前方散乱光の集束位置とを用いて試料１２のサイズを求める。具体的には、前方散乱光の集束位置は既知となるので、この集束位置から試料１２が通過する測定点の位置ずれを求め、この位置ずれした試料１２の照射されるレーザ光の光強度を知ることができる。このレーザ光の光強度と、前方散乱光の散乱光信号の強度とから試料１２のサイズを求めることができる。【００３９】
以上、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【図１】
2009098868.tif 000003
【図２】
2009098868.tif 000004
【図３】
2009098868.tif 000005
【図４】
2009098868.tif 000006
【図５】
2009098868.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月20日(2009.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第1の受光部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第2の受光部と、
前記第1の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第2の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記処理部は、前記第1の受光部から出力された検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第2の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することを特徴とする蛍光検出装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、
測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、
測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を用いて、検知する検知信号を生成するステップと、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、
前記複数の検出器が出力する前記検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前記前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第1の受光部と、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第2の受光部と、
前記第1の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第2の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記処理部は、前記第1の受光部から出力された検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第2の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
さらに、本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を用いて、検知する検知信号を生成するステップと、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、前記複数の検出器が出力する前記検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前記前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月4日(2010.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第1の受光部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第2の受光部と、
前記第１の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第２の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、
測定対象物のサイズを求める分析部と、を有し、
前記処理部は、前記第1の受光部から出力された検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第2の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正し、
前記分析部は、前記第１の受光部にて生成される前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める、ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記処理部は、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記流路と前記第１の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第１の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられる請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備える請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、
測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、
測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を用いて、検知する検知信号を生成するステップと、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、
前記複数の検出器が出力する前記検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前記前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、
前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項６】
前記受光信号を補正するとき、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有する請求項５または６に記載の蛍光検出方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第1の受光部と、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第2の受光部と、前記第１の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第２の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、測定対象物のサイズを求める分析部と、を有し、
前記処理部は、前記第1の受光部から出力された検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第2の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正し、
前記分析部は、前記第１の受光部にて生成される前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める、ことを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
前記流路と前記第1の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第1の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられることが好ましい。
さらに、補正された受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備えることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
さらに、本発明は、流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を用いて、検知する検知信号を生成するステップと、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、前記複数の検出器が出力する前記検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前記前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有することが好ましい。
【国際調査報告】
2009098868.tif 000008
2009098868.tif 000009
2009098868.tif 000010
2009098868.tif 000011