(57)【要約】  認知障害、特に好ましくはアルツハイマー病の予防又は治療に有用な認知障害改善剤の提供。ローヤルゼリーを有効成分として含む、認知障害改善剤。
2009154197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーを有効成分として含む、認知障害改善剤。
【請求項２】
ノビレチン若しくはその類縁体又は柑橘類エキス、及びローヤルゼリーを有効成分として含む、認知障害改善剤。
【請求項３】
ノビレチン若しくはその類縁体及びローヤルゼリー、さらに、紅景天エキス、イチョウ葉エキス及びフェルラ酸を有効成分として含む認知障害改善剤。
【請求項４】
２’−ヒドロキシ−３’，４’，５’，６’−テトラメトキシアセトフェノンを４−ベンジルオキシ−３−メトキシベンズアルデヒドと反応させ３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンを得る工程、
得られた３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンをヨウ素の存在下で反応させ３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンを得る工程、及び
得られた３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンを水素及びパラジウム炭素の存在下で反応させ２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシクロメン−４−オンを得る工程を含む、４−脱メチル化ノビレチンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノビレチン若しくはその類縁体又は柑橘類エキス、及びローヤルゼリーを有効成分として含む、認知障害改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会となりつつある我が国において高齢に起因する集中力、記憶力、整理能力、計画能力、問題解決能力などの認知障害、特にその代表的な疾患であるアルツハイマー病の予防および治療が重大な問題となってきている。【０００３】
多くの柑橘類に含まれるポリメトキシフラボノイドの一つであるノビレチンは、記憶を司る情報伝達促進作用があること、学習障害の亢進を抑制することが報告されており、アルツハイマー病等の認知障害改善剤として有用であることが知られている（特許文献１及び２）。【０００４】
ローヤルゼリー（Royal jelly）は、ミツバチの若い働き蜂の咽頭腺からの分泌物であり、女王蜂となる幼虫や成虫となった女王蜂の食物として給餌される。働き蜂の４０倍も長生きする女王蜂の生涯において唯一のエネルギー源である。また、蜂蜜とは比較にならないほど多くのビタミン類、ミネラル、アミノ酸が含まれており、高タンパクで様々な栄養素を含んでいることが知られている。しかし、ローヤルゼリーの認知障害に対する効果は、未だ知られていない。【０００５】
【特許文献１】特開２００２−６０３４０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５−０８２３５１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、認知障害、特に好ましくはアルツハイマー病の予防又は治療に有用な認知障害改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ノビレチン若しくはその類縁体又は柑橘類エキス、及びローヤルゼリーを有効成分として含む組成物が、学習障害モデルに対して極めて優れた効果を示すことを初めて見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち本発明は、
［１］ローヤルゼリーを有効成分として含む、認知障害改善剤、
［２］ノビレチン若しくはその類縁体又は柑橘類エキス、及びローヤルゼリーを有効成分として含む、認知障害改善剤、
［３］ノビレチン若しくはその類縁体及びローヤルゼリー、さらに、紅景天エキス、イチョウ葉エキス及びフェルラ酸を有効成分として含む認知障害改善剤、
［４］２’−ヒドロキシ−３’，４’，５’，６’−テトラメトキシアセトフェノンを４−ベンジルオキシ−３−メトキシベンズアルデヒドと反応させ３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンを得る工程、
得られた３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンをヨウ素の存在下で反応させ３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンを得る工程、及び
得られた３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノンを水素及びパラジウム炭素の存在下で反応させ２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシクロメン−４−オンを得る工程を含む、４−脱メチル化ノビレチンを製造する方法
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＥＲＫリン酸化に対するローヤルゼリー及びノビレビンの影響を示す。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）である。*は、溶媒に対して、ｐ＜０．０５であり、***は、ｐ＜０．００１である（ｎ＝３）。横軸の、Ｖｅｈは、溶媒であり、Ｎｂ３０は、３０μMノビレチンであり、ＲＪ１／２００及びＲＪ１／１００は、それぞれ、２００倍及び１００倍希釈したローヤルゼリーであり、ＲＪ１／２００＋Ｎｂ３０及びＲＪ１／１００＋Ｎｂ３０は、それぞれ、２００倍及び１００倍希釈したローヤルゼリー＋３０μMノビレチンである。縦軸は、全ＥＲＫに対するリン酸化ＥＲＫの相対値である。
【図２】図２は、ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＥＲＫリン酸化のローヤルゼリー誘導刺激に対するノビレチンの増強効果を示す。少なくとも３回の独立した試験から得られた代表的な結果を示す（上部）。縦軸の数値は、ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＥＲＫリン酸化に対する濃度測定値であり、対象群（０．１％ＤＭＳＯ）の数値に対する相対値で示した。*は、溶媒に対して、ｐ＜０．０５であり、**は、ｐ＜０．０１であり、***は、ｐ＜０．００５である。##は、３０μMノビレチンに対して、ｐ＜０．０１であり、###は、ｐ＜０．００５である。+は、４００倍希釈ローヤルゼリーに対して、ｐ＜０．０５であり、+++は、ｐ＜０．０１である。数値は、平均±標準誤差（ｎ＝３）である。Ｖｅｈは、溶媒であり、Ｎｂ３０は、３０μMノビレチンであり、ＲＪ１／４００、ＲＪ１／２００及びＲＪ１／１００は、それぞれ、４００倍、２００倍及び１００倍希釈したローヤルゼリーであり、ＲＪ１／４００＋Ｎｂ３０、ＲＪ１／２００＋Ｎｂ３０及びＲＪ１／１００＋Ｎｂ３０は、それぞれ、４００倍、２００倍及び１００倍希釈したローヤルゼリー＋３０μMノビレチンである。
【図３】図３は、ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼすローヤルゼリー（ＲＪ）とノビレチン（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）の併用効果を示す。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝４）である。＊は、ＲＪに対してｐ＜０．０５であり、＊＊は、ＲＪに対してｐ＜０．００１である。
【図４】図４は、ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼすローヤルゼリーおよび柑橘類エキスの併用効果を示す。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝４）である。＊は、コントロールに対してｐ＜０．０５であり、＊＊は、柑橘類エキスに対してｐ＜０．００１である。
【図５】図５は、培養ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写に対するノビレチンの濃度異存効果を示す。細胞を８×１０４／４８ウェルプレートの密度で播種し、プレートを１０−１４日間維持した。次いで、細胞をＣＲＥ依存的転写を示すルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いて１６時間トランスフェクションした。トランスフェクションの後、細胞を異なる濃度の４−脱メチル化ノビレチンで８時間処理した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝６）である。＊は、コントロールに対してｐ＜０．０５であり、＊＊は、コントロールに対してｐ＜０．００１である。
【図６】図６は、培養ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写に対する４−脱メチルノビレチンの濃度異存効果を示す。細胞を８×１０４／４８ウェルプレートの密度で播種し、プレートを１０−１４日間維持した。次いで、細胞をＣＲＥ依存的転写を示すルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いて１６時間トランスフェクションした。トランスフェクションの後、細胞を異なる濃度の４−脱メチル化ノビレチンで８時間処理した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝６）である。＊は、コントロールに対してｐ＜０．０５であり、＊＊は、コントロールに対してｐ＜０．００１である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いることができるノビレチンには、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボン、その薬学的に許容され得る塩、それらの水和物又は溶媒和物が含まれる。【００１１】
本発明のノビレチンは、当業者に周知の方法を用いて化学的に合成することができる。また、ミカン科植物から抽出することもできる。本発明では、ノビレチンを含むミカン科植物の抽出物を用いることもできる。例えば、ノビレチンの類縁体である４’-ヒドロキシ−５，６，７，８，３’−ペンタメトキシフラボン（４−脱メチル化ノビレチン）、その薬学的に許容され得る塩、それらの水和物又は溶媒和物が含まれる。【００１２】
【化１】
2009154197.tif 000003
【００１３】
ミカン科植物としては、ヒラミレモン（Citrus depressa）、ウンシュウミカン（Citrus unshiu）、オオベニミカン（Citrus tangerina）、コベニミカン（Citrus erythrosa）、ダイダイ（Citrus aurantium）、地中海マンダリン（Citrus deliciosa）、ザボン（Citrus grandis）、ヒラキシュウ（Citrus kinokuni）、ポンカン（Citrus reticulata）、タチバナ（Citrus tachibana）、サンキツ（Citrus sunki）などを挙げることができる。【００１４】
本発明に用いられるミカン科植物の抽出物は、採取後の生の状態または乾燥された状態のいずれの状態から抽出されたものであってもよい。部位としては、成熟したまたは未成熟の、果実、果皮、種子、葉、葉柄、枝、根、花などを挙げることができる。好ましくは果実、果皮である。【００１５】
本発明に用いることができるローヤルゼリーは、特に限定されることなく、市販されているローヤルゼリーを用いることができる。好ましくは、ジャパンローヤルゼリー社の製品を挙げることができる。本発明において、特に記載していない場合はローヤルゼリー凍結乾燥末（ＦＤ末）とする。【００１６】
本発明においては、ノビレチンの含有量は、０．００２５重量％〜２．００重量％、好ましくは０．００５重量％〜１．５０重量％、より好ましくは０．０１重量％〜１．００重量％である。一方、ノビレチンを１０％含むエキスを使用した場合は、０．０２５重量％〜２０．０重量％、好ましくは０．０５重量％〜１５．０重量％、より好ましくは０．１重量％〜１０．０重量％である。また、ローヤルゼリーの含有量は、ローヤルゼリーＦＤ末として、３重量％〜６０重量％、好ましくは５重量％〜４５重量％、より好ましくは１０重量％〜３０重量％である。【００１７】
本発明においては、ノビレチン含有量とローヤルゼリー含有量との比率は、２：３〜１：２４０００、好ましくは、３：１０〜１：９０００、より好ましくは１：１０〜１：６００である。一方、ノビレチンを１０％含むエキスを使用した場合は、２０：３〜１：２４００、好ましくは、３：１〜１：９００、より好ましくは１：１〜１：６０である。【００１８】
本発明の認知障害改善剤は、医薬品、医薬部外品または食品などに配合することができる。また、本発明の神経突起伸長剤は経口投与または非経口投与のいずれにおいても使用することができる。【００１９】
医薬品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などが挙げられる。これら医薬品は、通常の医薬製造における添加剤を使用して製造することができる。【００２０】
本発明の認知障害改善剤の投与量は特に限定されないが、たとえば、経口投与の場合には一日あたり１０〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、非経口投与の場合には一日あたり２〜６ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２〜３ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回または２〜３回に分けて投与することができ、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。【００２１】
添加剤の具体例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、これらを単独または適宜組合わせて使用することができる。これら医薬品は、日本薬局方の記載に従い、各々の医薬品の形態に適した方法で製造することができる。また、香味料、着色料、甘味料など適宜使用することもできる。これら添加剤の含有量は当業者に適切に選択され得る。【００２２】
医薬部外品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、ドリンク剤などが挙げられる。これら医薬部外品は、通常の医薬部外品製造における添加剤を使用して製造することができる。さらに、これら医薬部外品は、例えばビタミン類などの他の有効成分を含有することもできる。また、甘味料、香味料、着色料、酸化防止剤などの添加剤を単独または適宜組み合わせて使用することもできる。これら医薬部外品は、当業者に周知の方法で製造することができる。【００２３】
食品の形態としては、麺、パスタ、顆粒、錠果、ゼリー、液体（飲料）などが挙げられる。これら食品は、様々な食品材料を適宜使用して製造することができる。食品材料の具体例は、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆粉、海藻粉、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどであり、これらを単独または適宜組み合わせて使用することができる。必要に応じて水などの使用により所望の形状にすることができる。さらに、香味料、着色料、甘味料、食用油、ビタミン類などを適宜添加することもできる。【００２４】
以下に本発明を実施例で具体的に説明するが、これはその代表例を示すものであって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
ｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ依存的シグナル伝達経路は、脳の記憶・学習能力と密接に関連することが証明されている。近年、脳内におけるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の蓄積に起因する神経の変性・脱落に加えて、可溶性Ａβによる神経細胞死を伴わないシナプス可塑性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）における記憶障害の原因の一つと理解されるようになってきた。例えば、学習および記憶形成の細胞機構の一つと考えられている海馬グルタミン酸シナプスにおける神経伝達の長期増強（ＬＴＰ）は、シナプス可塑性の代表的な例である。ＡβはＰＫＡ／ＣＲＥＢシグナル伝達を阻害して、このＬＴＰの発生を抑制することが知られている。つまり、このようなＡβによるシグナル伝達阻害を改善または抑制する生理活性物質を含有する食品は、ＡＤの改善・予防に有用であると考えられる。【００２６】
そこで、神経細胞のモデル細胞と考えられているＰＣ１２Ｄ細胞における、ローヤルゼリーのＥＲＫの活性に対する効果、およびローヤルゼリーとノビレチンの併用のＥＲＫの活性に対する効果を、「ローヤルゼリーＦＤ末」の水溶性成分のＥＲＫのリン酸化への影響を指標にして、ウエスタンブロット法で検討した。【００２７】
１．実験方法
ＰＣ１２Ｄ細胞の培養
ＰＣ１２Ｄ細胞（愛知県コロニー研究所）は、非働化（５６℃、３０分）した５％ウマ血清（ＨＳ：Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：ＣＥＬＬｅｃｔ）、ペニシリン（５０単位／mL）およびストレプトマイシン（５０μｇ／mL）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、継代培養した。細胞は３７℃に保温した９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２を含むインキュベーター中で培養した。なお、本実験では、ＨＳが２％、ＦＣＳが１％になるように調整した培地を薬物の希釈に使用した。【００２８】
「ローヤルゼリーＦＤ末」ストック水溶液（２５％（ｗ／ｖ））の調製
滅菌したスパーテルを用いて、滅菌済の２mlチューブに０．２５ｇの「ローヤルゼリーＦＤ末」（ジャパンローヤルゼリー株式会社）を秤量した。その後、クリーンベンチ内で、滅菌済ＰＢＳ（−）を加えて、容量を１mlとした。攪拌後、冷蔵庫に移し、１時間毎に攪拌を繰り返し、一晩冷蔵庫内で静置した。翌日、攪拌した後、１２０００×ｇ、４℃で、１０分間遠心した。その上清をフィルター滅菌し、分注後−２０℃で凍結保存した。【００２９】
ウェスタンブロッティング
３５mmディッシュに、ＰＣ１２Ｄ細胞を１×１０６細胞／ディッシュで播種し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養後、薬物で処理した。薬物処理した細胞を９０μlの細胞可溶化液（１mMＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１０mMＮａＦ、１０nMカリクリン、３２０nMオカダ酸、１mMオルトバナジン酸ナトリウム、１mMｐ−ＡＰＭＳＦ、１０μｇ／mlペプスタチン、１０μｇ／mlアンチペイン、１０μｇ／mlロイペプチン、１０μｇ／mlキモスタチン、１０μｇ／mlホスフォラミドン、１０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））で可溶化した後に、１．５mlチューブに回収し、９５℃で５分間加熱した。さらに、氷水中で５分間超音波処理した後に、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を回収し、タンパク質を定量した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロット法によりＰＶＤＦメンブレンにタンパク質を転写し、ブロッキングバッファー（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mMＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％スキムミルク；ｐＨ７．４）を用いて２時間ブロッキングした。その後、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。さらに、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈したＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体と室温で２時間インキュベートし、再度ＴＢＳＴで洗浄した。バンドの検出にはＥＣＬ法を用いた。リプロービングは、ストリッピングバッファー（６２．５mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、１００mMβ−メルカプトエタノール；ｐＨ７．４）を用いて抗体を除去し、その後内部標準タンパク質を検出した。【００３０】
データ解析
実験値を平均値±標準誤差で表示した。統計処理はスチューデントのｔ検定、分散分析およびダネット検定を用い、危険率５％未満の場合を有意差ありと判定した。【００３１】
２．結果
ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＥＲＫリン酸化に対するローヤルゼリーおよびノビレチンの効果
ＰＣ１２Ｄ細胞を１×１０６細胞／３．５ｃｍディッシュの細胞密度で播種し、一晩培養し、種々の薬物を含む低血清培地で１５分間処理して、細胞可溶化液で細胞を溶解させて、細胞抽出液を得た。ウエスタンブロット法を用いて、この細胞抽出液中のｐ−ＥＲＫおよび全ＥＲＫの発現量を分析した。なお、ローヤルゼリー溶液は、２５％溶液を調製後、低血清培地で希釈して実験に供した。【００３２】
その結果、ＰＣ１２Ｄ細胞において、ローヤルゼリーは、４００倍から１００倍希釈（０．０６２５−０．２５％（w/v））の濃度において、記憶・学習の細胞機構の１つであるシナプス伝達の長期増強に重要な役割を果すことが知られているｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ依存的シグナル伝達経路の重要な構成分子であるＥＲＫのリン酸化を顕著に促進した（図１及び図２）。一方、３０μMノビレチン処理群においては、ＥＲＫのリン酸化の弱い促進作用が認められた（図２）。【００３３】
ＰＣ１２Ｄ細胞におけるローヤルゼリー誘導性のＥＲＫリン酸化の促進に対するノビレチンの効果
さらに、非常に興味深い結果が得られた。すなわち、単独ではＥＲＫのリン酸化の弱い促進作用しか示さなかった３０μMノビレチンは、ローヤルゼリーの顕著なＥＲＫのリン酸化促進活性をさらに増強することが判明した。このことは、ローヤルゼリーとノビレチンの併用が記憶・学習と密接に関連するｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ依存的シグナル伝達を顕著に促進する可能性を強く示すものである（図２）。【００３４】
Ｃ１２Ｄ細胞における、ローヤルゼリー単独、またはローヤルゼリーとノビレチンの併用のｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ依存的シグナル伝達に対する作用の検討を行った。ＰＣ１２Ｄ細胞の培養、「ローヤルゼリーＦＤ末」ストック水溶液（２５％（ｗ／ｖ））の調製は上記に記載の方法で行った。【００３５】
１．実験方法
ラット海馬神経細胞初代培養
妊娠ＳＤラット（Ｅ１８）をエーテル麻酔した後、頚椎脱臼させた。その後、腹部を７０％ＥｔＯＨで消毒後、腹部正中切開により胎児を摘出した。さらに、ラット胎仔から脳を摘出し、実態顕微鏡下で海馬を分離した。海馬神経細胞の培養は、住友ベークライト社製のSUMITOMO Nerve-Cell Culture Systemを用いて行った。パパイン酵素を含む分散液（SUMILON）で海馬組織を分散させ、１，０００ｒｐｍで４分間遠心した後、上清を除去した。ペレットを分散液（SUMILON）中で分散させ、さらにピペッティングにより十分に分散した細胞に除去液（SUMILON）を加え、８００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去した。ペレットをNeurobasal 培地（フェノールレッド不含Neurobasal 培地 500 ml、５０×B-27 Supplement １０ｍ１、 ０．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．００５％ペニシリン−ストレプトマイシン）を用いて懸濁し、ポリリジンコーティングした４８ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルで播種し、培養１日後に、ＰＢＳで洗浄した後に新しい培地に交換し、その後は２−３日おきに培地半量交換により１０μＭＡｒａＣ含有培地にて培養した。【００３６】
トランスフェクションおよびレポータージーンアッセイ
ＰＣ１２Ｄ細胞を４８ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルで播種し、増殖培地で２４時間培養後、ｐＣＲＥのレポータージーンプラスミド（ホタル・ルシフエラーゼ）を０．１μｇ／ウェル、内標準用のｐＲＧ−ＴＫプラスミド（ウミ・シイタケルシフエラーゼ）を０．０１μｇ／ウェルの濃度でリポフェクタミン（商標）２０００試薬（invitrogen）を用いてコトランスフェクションした。トランスフェクション１６時間後に種々の薬物を添加した培地に交換した。種々の濃度の薬物を含む培地で５時間処理した後、培地を吸引し、Passive Lysis Buffer（Dual-Luciferase Reportor Assay System Cat.# E1960 (Promega)）を細胞に加えて溶解して回収した。なお、ホタル及びウミシイタケルシフエラーゼの活性はDual-Ruciferase Reporter Assay System (Promega)を用いてルミノメーター（Mini Lumat LB9506(BERTHOLD)）で測定した。
他方、上記の方法で調製した海馬神経細胞をNeurobasal培地で１０−１４日間培養後、レポータープラスミド（０．１μｇ／ウェル）、ウミシイタケｐＲＧ−ＴＫプラスミド（０．０１μｇ／ウェル）をリポフェクション法にてトランスフェクトし、一定時間薬物処置した。転写活性の測定はPromega社製のDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay Systemを用いて行った。【００３７】
統計学的解析
レポータージーンアッセイで得られた結果をone-way ANOVA （Tukey）を用いて評価した。有意水準を両側５％として検定し、ｐ＜０．０５を有意とした。【００３８】
ＰＣ１２Ｄ細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼすローヤルゼリー（ＲＪ）とノビレチンの併用効果を検討した。【００３９】
図３に示すとおり、ローヤルゼリー単独でもＰＣ１２Ｄ細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼす影響を示すが、１５μＭノビレチンあるいは３０μＭノビレチンを併用するとその効果はより高まり、１５μＭノビレチンよりも添加量を増やした３０μＭノビレチンを併用した試験区の方がＣＲＥ依存的転写に及ぼす影響が高くなることが分かった。【００４０】
次にＰＣ１２Ｄ細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼすローヤルゼリーおよび柑橘類エキスの併用効果を検討した。【００４１】
図４に示すとおり、ローヤルゼリー単独でもＰＣ１２Ｄ細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼす影響を示すが、ノビレチンを含む柑橘類エキスを併用した場合に、よりＣＲＥ依存的転写に及ぼす影響が高まることが分かった。【００４２】
さらに、初代培養ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写に及ぼすノビレチンの効果を検討した。【００４３】
ＣＲＥ依存的な転写に及ぼすノビレチンの効果についてレポータージーンアッセイ法を用いて検討した結果、海馬神経細胞においてノビレチンは濃度依存的にＣＲＥ  依存的な転写を促進した。【００４４】
図５に示すように、ＣＲＥ依存的な転写に及ぼすノビレチンの効果についてレポータージーンアッセイ法を用いて検討した結果、海馬神経細胞においてノビレチンは濃度依存的にＣＲＥ依存的な転写を促進した。また、図６に示すように、４−脱メチルノビレチンもノビレチンと同様に濃度依存的にＣＲＥ依存的な転写を促進した。【００４５】
以下に４−脱メチルノビレチンの製造方法の例を示す。ただし、４−脱メチルノビレチンの製造方法は記載の方法に限るものではない。【００４６】
４−脱メチル化ノビレチンの有機合成のスキームを下記に示した。【００４７】
【化２】
2009154197.tif 000004
【００４８】
３，４，５−トリメトキシフェノール（２）
３，４，５−トリメトキシベンズアルデヒド（２．０ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０．４ｍｌ，０．５Ｍ）溶液に、氷冷下濃硫酸（０．５４ｍｌ，１０．２ｍｍｏｌ）を加えた後、３０％過酸化水素水溶液（３．５ｍｌ，３０．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。室温にて１５分攪拌後、氷冷下１０％水酸化ナトリウム水溶液と亜硫酸ナトリウムを加え、反応を停止した。ＡｃＯＥｔにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（５：６ｖ／ｖ）溶出部より３，４，５−トリメトキシフェノール（１．０８ｇ，７．０ｍｍｏｌ，５８％）を無色固体として得た。【００４９】
無色プレート(AcOEt/ヘキサン): mp 145-147 ℃. IR (CHCl3) : 3303, 1612, 1129 cm-1. 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ : 6.09 (2H, s), 5.90 (1H, s), 3.79 (3H, s), 3.76 (6H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 153.6, 152.7, 131.4, 93.0, 61.0, 55.9. MS m/z : 184 (M+). HRMS Calcd. for C9H12O4 : 184.0736. Found : 184.0715.【００５０】
１，２，３，４，５−ペンタメトキシベンゼン（３）
３，４，５−トリメトキシフェノール（０．１０ｇ，０．５４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．６ｍｌ，０．１５Ｍ）溶液に、室温下２−ヨードキシ安息香酸（ＩＢＸ）（１６０ｍｇ，５．７ｍｍｏｌ）を加え、３０分攪拌した。１０％Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を加えた後、系内を水素雰囲気に置換し１日間攪拌した。系内をアルゴン雰囲気に戻した後、炭酸カリウム（２２０ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）と硫酸ジメチル（０．１３ｍｌ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、さらに３時間室温にて攪拌後、反応溶液をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をＥｔ２Ｏにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（５：７ｖ／ｖ）溶出部より１，２，３，４，５−ペンタメトキシベンゼン（４２ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３４％）を無色固体として得た。【００５１】
無色針状(ヘキサン) : mp 59-61℃. IR (CHCl3) : 1108 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 6.30 (1H, s), 3.95 (3H, s), 3.85 (6H, s), 3.83 (6H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 149.1, 147.9, 136.7, 93.7, 61.4, 61.3, 56.5. MS m/z : 228 (M+). HRMS Calcd. for C11H16O5 : 228.0998. Found : 228.0983. Anal. Calcd. for C11H16O5 : C, 57.88. H, 7.07. Found : C, 57.77. H, 7.00.【００５２】
１，２，３，５−テトラメトキシベンゼン（６）
２，６−ジメトキシ［１，４］ベンゾキノン（１０ｇ，５８．８ｍｍｏｌ）をラネーＮｉ（３．５ｇ）のＭｅＯＨ（１００ｍｌ，０．５９Ｍ）溶液に加え、室温、水素雰囲気下で６時間攪拌した。反応溶液をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去することで粗２，６−ジメトキシベンゼン−１，４−ジオールを得た。
粗２，６−ジメトキシベンゼン−１，４−ジオール（＜５８．８ｍｍｏｌ）のアセトン（１００ｍｌ，＜０．５９Ｍ）溶液に、炭酸カリウム（４１ｇ，２９７ｍｍｏｌ）と硫酸ジメチル（１４ｍｌ，１４７ｍｍｏｌ）を加え、さらに３時間加熱還流にて攪拌した。ＡｃＯＥｔにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（１：２ｖ／ｖ）溶出部より１，２，３，５−テトラメトキシベンゼン（１１．５ｇ，１５８．１ｍｍｏｌ，９９％）を無色油状として得た。【００５３】
無色油状 IR (CHCl3) : 2931, 1594, 1506, 1129 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 6.15 (2H, s), 3.85 (6H, s), 3.79 (3H, s), 3.79 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 156.2, 153.7, 132.4, 91.7, 61.0, 56.1, 55.5. MS m/z : 198 (M+). HRMS Calcd. for C10H14O4 : 198.0892. Found : 198.0885.【００５４】
２’−ヒドロキシ−３’，４’，６’−トリメトキシアセトフェノン（７）
１，２，３，５−テトラメトキシベンゼン（１１．５ｇ，５８．１ｍｍｏｌ）のＥｔ２Ｏ（２００ｍｌ，０．２９Ｍ）溶液に、ＡｌＣｌ３（２６ｇ，１９２ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加えた。その後、ＡｃＣｌ（５．４ｍｌ，７５．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温にて２時間攪拌した。氷冷下水をアルミニウムが溶解するまで加えることで反応を停止させた。Ｅｔ２Ｏにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（１：１ｖ／ｖ）溶出部より２’−ヒドロキシ−３’，４’，６’−トリメトキシアセトフェノン（１１．１ｇ，４９．１ｍｍｏｌ，８５％）を黄色固体として得た。【００５５】
黄色針状(AcOEt) : mp 114-116 ℃. IR (CHCl3) : 1626, 1587, 1126 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 13.80 (1H, s), 5.97 (1H, s), 3.94 (3H, s), 3.90 (3H, s), 3.82 (3H, s), 2.62 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 203.7, 159.0, 158.8, 158.4, 130.5, 106.3, 86.4, 60.7, 55.9, 55.5, 33.2. MS m/z : 226 (M+). HRMS Calcd. for C11H14O5 : 226.0841. Found : 226.0829. Anal. Calcd. for C11H14O5 : C, 58.40. H, 6.24. Found : C, 58.37. H, 6.18.【００５６】
２’−ヒドロキシ−３’，４’，５’，６’−テトラメトキシアセトフェノン（９）
２’−ヒドロキシ−３’，４’，６’−トリメトキシアセトフェノン（１０．８ｇ，４７．７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１３０ｍｌ，０．３７Ｍ）溶液に、氷冷下１０％水酸化ナトリウム水溶液（４０ｍｌ，４８ｍｍｏｌ）を加えた後、６％過酸化水素水溶液（８２ｍｌ，１４３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。室温にて３０分攪拌後、氷冷下１０％塩酸と亜硫酸ナトリウムを加え、反応を停止した。ＡｃＯＥｔにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去することで粗３，４，６−トリメトキシベンゼン−１，２−ジオールを無色固体として得た。【００５７】
粗３，４，６−トリメトキシベンゼン−１，２−ジオールのアセトン（１５０ｍｌ）溶液に、炭酸カリウム（１７０ｇ，１．２ｍｏｌ）と硫酸ジメチル（２２ｍｌ，２３９ｍｍｏｌ）を加えた後に、３時間加熱還流した。ＡｃＯＥｔにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（５：７ｖ／ｖ）溶出部より１，２，３，４，５−ペンタメトキシベンゼン（１１．５ｇ，１５８．１ｍｍｏｌ，９９％）をジメチル硫酸との分離不能な混合物として得た。【００５８】
粗１，２，３，４，５−ペンタメトキシベンゼンのＥｔ２Ｏ（３００ｍｌ）溶液に、ＡｌＣｌ３（４２ｇ，３１３ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加えた。その後、ＡｃＣｌ（１４ｍｌ，１８７．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温にて２時間攪拌した。氷冷下水をアルミニウムが溶解するまで加えて反応を停止させた。Ｅｔ２Ｏにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（１：３ｖ／ｖ）溶出部より２’−ヒドロキシ−３’，４’，５’，６’−テトラメトキシアセトフェノン（４．５ｇ，１７．６ｍｍｏｌ，３７％）を黄色油状として得た。【００５９】
黄色油状. IR (CHCl3) : 2985, 1621, 1409, 1064 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 13.12 (1H, s), 4.08 (3H, s), 3.96 (3H, s), 3.86 (3H, s), 3.81 (3H, s), 2.68 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 204.2, 154.6, 153.7, 151.4, 138.0, 136.8, 110.4, 61.3, 61.2, 61.1, 61.0, 32.2. MS m/z : 256 (M+). HRMS Calcd. for C12H16O6 : 256.0947. Found : 256.0963.【００６０】
３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノン（１０）
４−ベンジルオキシ−３−メトキシベンズアルデヒド（３４０ｍｇ，１．４１ｍｍｏｌ）と２’−ヒドロキシ−３’，４’，５’，６’−テトラメトキシアセトフェノン（２４０ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（５．０ｍｌ，０．１９Ｍ）溶液に、室温下５０％水酸化カリウム水溶液（０．３７ｍｌ，３．３ｍｍｏｌ）を滴下した。２４時間攪拌後、氷冷下１０％塩酸を加えることで反応を停止させ、ＡｃＯＥｔにて抽出した。有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（１：２ｖ／ｖ）溶出部より３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノン（０．３２ｇ，０．６６ｍｍｏｌ，７１％）を黄色固体として得た。【００６１】
黄色針状 (AcOEt/ヘキサン) : mp 99-100 ℃. IR (CHCl3) : 1626, 1509, 1408, 1259, 1055 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 13.26 (1H, s), 7.82 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.78 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.45-7.31 (5H, m), 7.17 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.16 (1H, s), 6.90 (1H, d, J = 8.4 Hz), 5.21 (2H, s), 4.09 (3H, s), 3.95 (3H, s), 3.89 (3H, s), 3.87 (3H, s), 3.86 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 193.3, 154.8, 153.2, 150.7, 150.4, 149.6, 144.0, 138.3, 137.1, 136.4, 128.5, 128.4, 127.9, 127.1, 124.2, 122.8, 113.4, 111.0, 110.9, 70.8, 62.2, 61.6, 61.3, 61.0, 56.0. Anal. Calcd. for C22H28O8 : C, 67.49. H, 5.87. Found : C, 67.28. H, 5.83.【００６２】
２−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシクロメン−４−オン（１１）【００６３】
３−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラメトキシフェニル）−プロペノン（９５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１．５ｍｌ，０．１３Ｍ）溶液に、室温下ヨウ素（３ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を加え、１５０度にて１．５時間攪拌した。氷冷下亜硫酸ナトリウムを加えて反応を停止した。Ｅｔ２Ｏにて抽出した有機層をブラインで洗浄後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ／ヘキサン（３：１ｖ／ｖ）溶出部より２−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシクロメン−４−オン（７９ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ，８３％）を黄色固体として得た。【００６４】
淡黄色プレート (AcOEt/ヘキサン) : mp 109-111 ℃. IR (CHCl3) : 1641, 1514, 1361 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.49-7.32 (7H, m), 6.99 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.60 (1H, s), 5.24 (2H, s), 4.10 (3H, s), 4.01 (3H, s), 3.98 (3H, s), 3.95 (6H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 177.2, 160.8, 151.3, 150.9, 149.7, 148.3, 147.6, 144.0, 137.9, 136.2, 128.6, 128.0, 127.1, 124.2, 119.4, 114.8, 113.4, 108.9, 106.9, 70.9, 62.3, 62.0, 61.8, 61.7, 56.1. Anal. Calcd. for C27H26O8 : C, 67.77. H, 5.48. Found : C, 67.55. H, 5.58.【００６５】
２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシクロメン−４−オン（１２，Ｇ０１０）
２−（４−ベンジルオキシ−３−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラメトキシクロメン−４−オン（７９ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）をＰｄ／Ｃ（８ｍｇ）のＥｔＯＨ（２ｍｌ，０．０８Ｍ）溶液に加え、室温、水素雰囲気下で２時間攪拌した。反応溶液をセライトろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ＡｃＯＥｔ溶出部よりＧ０１０（６４ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ，９９％）を黄色固体として得た。【００６６】
無色プリズム(AcOEt/ヘキサン) : mp 155-156℃. IR (CHCl3) : 3201, 1634, 1515, 1355, 1076 cm-1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.53 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.40 (1H, s), 7.05 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.60 (1H, s), 6.13 (1H, m), 4.09 (3H, s), 4.04 (3H, s), 3.97 (3H, s), 3.93 (6H, s). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ : 177.4, 161.2, 151.4, 149.1, 148.3, 147.6, 147.0, 144.0, 138.0, 123.4, 120.2, 115.1, 114.7, 108.2, 106.5, 62.2, 61.9, 61.7, 61.6, 56.0. Anal. Calcd. for C20H20O8 : C, 61.85. H, 5.19. Found : C, 61.72. H, 5.29.【００６７】
上記合成方法について、Ｉ２／ＤＭＳＯを用いた２’−ヒドロキシカルコンからフラボンへの酸化的環化反応（フラボン骨格合成）は、A. M. S. Silva, D. C. G. A. Pinto, J. A. S. Cavaleiro, Tetrahedron Lett, 1994, 35, 5899-5902に、化合物１から２への変換（芳香族アルデヒドのフェノールへの酸化）については、M. Matsumoto, H. Kobayashi, Y. Hotta, J. Org. Chem. 1984, 49, 4740に、化合物２から３への変換（フェノールからのカテコールの合成）については、D. Magdziak, A. A. Rodriguez, R. W. Van De Water, T. R. R. Pettus, Org. Lett. 2002, 4, 285-288に、化合物３の別途合成（スキーム２, 化合物４からの化合物３の合成）については、M. Tsukayama, Y. Kawamura, T. Ishizuka, S. Hayashi, F. Torii, Heterocycles 2003, 60, 2775-2784に、そして、化合物９の合成（Friedel-Craftsアセチル化）については、M. Tsukayama, E. Kusunoki, M. M. Hossain, Y. Kawamura, S. Hayashi, Heterocycles 2007, 71, 1589-1600に、それぞれ、記載されている。【００６８】
本発明品を健康食品として使用する場合に配合する成分の推奨量を示す。下記に認知症に効果があるとされる健康食品素材の１日摂取推奨量を示す。ただし、健康食品は食品の一部なので限るものではない。【００６９】
【表１】
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【００７０】
本発明品を健康食品として使用する場合の一例を示す。ローヤルゼリーとノビレチンを必須とするが、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、紅景天エキス末、ホスファチジルセリン、フェルラ酸などを含んでいても良い。健康食品の形態は問わないが、糖衣錠としての例を下記に示す。【００７１】
【表２】
2009154197.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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