(57)【要約】  本発明により、ラウロイルグルタミン酸等特定の界面活性剤の1〜3％水溶液に、高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得、得られた可溶化液を0.1〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸等の特定の界面活性剤を0.02〜0.275％に低下させることにより、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を製造する方法を提供する。本発明によれば、タンパク質から界面活性剤を円滑に脱離すると同時に、タンパク質に天然状態の高次構造を簡便に回復させることができる。
2009136568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を製造する方法において、
（1）Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤の1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
（2）得られた可溶化液を、0.05〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02〜0.5％に低下させる工程、
（3）その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を回収する工程、
を含む、前記製造方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が、Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン又はこれらの塩である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸又はその塩である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸が、ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアルパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（1）と前記工程（2）との間に、前記工程（1）において得られた可溶化液を希釈して、前記界面活性剤の濃度を0.8〜1.5％、pH 6.5〜9.0の希釈液を得、
得られた希釈液を５℃〜40℃において0.5時間以上維持する工程（A）を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程(2)において、前記界面活性剤の濃度及びアルギニン又はアルギニン誘導体の濃度を段階的に又は漸次的に低下させ、５〜４８℃で１時間〜５日間維持する、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
前記アルギニン誘導体が、炭素数１〜６のアシル基を有するアルギニン、アルギニンブチルエステル、アグマチン及びアルギニン酸からなる群から選ばれる請求項１〜６のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質が、遺伝子組み換えタンパク質である請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質が、イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質である請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質が、抗体ドメインの一部を有する抗体断片、ダイアボディまたは小型抗体の人工抗体又はFc融合タンパク質である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体断片が、scFv、Fab、Fab'又は（F(ab')2）である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記Fc融合タンパク質が、サイトカイン、受容体細胞外ドメイン又はペプチドを、抗体Fcドメインに融合させたものである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
天然状態の高次構造を回復させたタンパク質がジスルフィド結合を有するタンパク質の場合、前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質を酸化還元反応させることにより分子内又は分子間ジスルフィド結合を形成させる工程（B）を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１４】
前記工程（B）における前記酸化還元反応を、前記工程（1）で得られた可溶化液又は前記工程（2）で得られた緩衝液中に、酸化還元物質又は銅イオンを添加することにより行う、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
（1）Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
（2）得られた可溶化液を、0.05〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02〜0.5％に低下させる工程、
を含む前記方法。
【請求項１６】
不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を得る方法において、
（1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
（2）得られた可溶化液を0.1〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02〜0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法。
【請求項１７】
不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
（1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
（2）得られた可溶化液を0.1〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02〜0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶化したか又は高次構造を失ったために、活性や安定性を失ったタンパク質に天然状態の高次構造を回復させる方法（リフォールディング方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌等を生産宿主に用いて遺伝子組み換えタンパク質を調製すると、水に不溶性の変性タンパク質が得られることがある。このようなタンパク質は変性タンパク質とも呼ばれる。変性タンパク質は活性や安定性を失っているため、そのタンパク質を医薬品等として用いるには、天然状態の高次構造を有するよう導く必要がある。タンパク質のリフォールディング方法は、このような場合に用いることができる方法として知られている。
しかし、このリフォールディングに使用する試薬や操作方法は、タンパク質ごとに適切に選択する必要があるため、リフォールディングの経験を有さないものにとっては簡単に実行できる技術ではない。また、十分な経験を有している場合でも、タンパク質が複雑な高次構造を持ち、リフォールディングの途中で会合・凝集を起こしやすい場合は、容易には天然状態を獲得できないこともある。【０００３】
これら問題を解決するため、いくつかの新しいリフォールディング方法が提案されてきた。例えば、クロマトグラフィーカラムを用いて会合凝集リスクを下げるカラムリフォールディング法（非特許文献１）、目的物を担体に固定化して会合凝集を抑制する固定化リフォールディング法（非特許文献２）、酸性や塩基性緩衝液を変性剤の代わりに用いて部分変性状態で可溶化するpH抽出法（非特許文献３）、分子シャペロンを共存させる方法（非特許文献４）、逆ミセルを分子シャペロン様に使用する方法（非特許文献５）、界面活性剤のミセルを利用する方法（非特許文献６）、3000気圧を超える超高圧下で変性剤を用いずに抽出する高圧リフォールディング法（非特許文献７）、これらの併用法あるいは変法がこれまでに報告されている。【０００４】
これらの中でもっとも注目を集めた技術は、変性剤抽出したタンパク質を、界面活性剤を含む緩衝液に希釈して会合凝集を抑制しつつ部分的に構造を回復させ、次のステップでシクロデキストリンなどの界面活性剤結合剤を使ってタンパク質から界面活性剤を強制的に脱離させて構造形成を完了させる、多段式リフォールディング法の「人工シャペロン系」であった。この技術の長所は、試行錯誤実験をほとんど必要とせず、決められた方法に従っていくつかの条件を検索するだけで、もっとも深刻な問題である会合凝集を効果的に抑制できるということであるとされていた。この技術でリフォールディングに成功した例も報告され、この方法の変法も引き続き研究されている（非特許文献８）。【０００５】
しかしながら、人工シャペロン系の適用例が増えるに従い、添加された界面活性剤をタンパク質から脱離するのは報告されていたほど簡単ではないこと、適正な操作条件を見出すための煩雑な実験が依然として必要なことなどがわかってきた。又、多段操作がプロセスの煩雑さにつながり、工業生産への利用に制限を与えるとの指摘も出た（非特許文献９）。
このように、もっとも評価の高かった人工シャペロン系ですら、経験を有さない者が、容易かつ効果的にタンパク質をリフォールディングする方法としては不十分であった。【０００６】
他方、アシル化サルコシンを用いてタンパク質をリフォールディングさせる方法が知られているが、アシル化サルコシンは、希釈しただけではタンパク質から脱離できず、特別の方法で除去しなければ、タンパク質の天然状態の高次構造を回復させることができない（非特許文献１０、特許文献１）。強アルカリに調整されたラウロイル-L-グルタミン酸を含む界面活性剤溶液を用いて不溶性ウシ成長ホルモンを可溶化し、限外ろ過法によって界面活性剤濃度を下げてリフォールディングする方法も知られているが（特許文献２）、この方法では成長ホルモン以外のタンパク質の天然状態を効果的に回復することは難しい。また、強度のアルカリ性pHにタンパク質を接触させることでタンパク質に修復不能な、脱アミド反応などの化学変化を起こしてしまう。【０００７】
【特許文献１】EP 0263902 A
【特許文献２】US Patent 6410694
【非特許文献１】A. Jungbauer, W. Kaar, R. Schlegl: Current opinion in Biotechnology 15, 487-494 (2004)
【非特許文献２】M Matsubara, et al.: FEBS LETT., 342, 193-196 (1994)
【非特許文献３】S. M. Singh and A. K. Panda: Journal of Bioscience and Bioengineering 99, 303-310 (2005)
【非特許文献４】D. Rozeman and S. H. Gellman: Journal of Biological Chemistry 271, 3478-3487 (1996)
【非特許文献５】A. J. Hagen, T. A. Hatton, and D. I. C. Wang: Biotechnol Bioeng. 35, 955-965 (1990)
【非特許文献６】G. Zardeneta and P. H. Horowitz: Analytical Biochemistry 223, 1-6 (1994)
【非特許文献７】M. B. Seefeldt, Y. S. Kim, J. Carpenter, T. W. Randolph: Protein Science 14, 2258-2266 (2005)
【非特許文献８】S. Machida, S. Ogawa, S. Xiaohua, T. Takaha, K. Fujii, K. Hayashi: FEBS Lett. 486, 131-135 (2000)
【非特許文献９】H. Lanckriet and A. P. J. Middelberg: Biotechnology Progress 20, 1861-1867 (2004)
【非特許文献１０】Richard Burgess: Methods in Enzymology. 273, 145-149 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、タンパク質から界面活性剤を円滑に脱離すると同時に、タンパク質に天然状態の高次構造を回復させる、簡便なリフォールディング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討した結果、特定の界面活性剤水溶液を用いて変性タンパク質を可溶化し、その可溶化液をアルギニンやアルギニン誘導体を含む緩衝液に希釈するだけで、特定界面活性剤を変性タンパク質から脱離するのと同時に該変性タンパク質に高次構造を回復させることを見出した。
すなわち、本発明は、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を製造する方法において、
（1）Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤の1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
（2）得られた可溶化液を、0.05〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02〜0.5％に低下させる工程、
（3）その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を回収する工程、
を含む、前記製造方法を提供する。【００１０】
本発明はまた、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
（1）Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン、デカン酸又はこれらの塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの混合物からなる群から選択される界面活性剤1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程、
（2）得られた可溶化液を、0.05〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中の前記界面活性剤の濃度を0.02〜0.5％に低下させる工程、
を含む前記方法を提供する。【００１１】
本発明はまた、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質から、その天然状態の高次構造を回復させたタンパク質を得る方法において、
（1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
（2）得られた可溶化液を0.1〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02〜0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法を提供する。【００１２】
本発明はまた、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質に、その天然状態の高次構造を回復させる方法において、
（1）ラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の1〜3％水溶液に、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質をpH 6.5〜9.0において接触させることにより、該タンパク質の可溶化液を得る工程と、
（2）得られた可溶化液を0.1〜1.2Mのアルギニン又はアルギニン誘導体を含有するpH 6.5〜9.0の緩衝液中に添加することにより、得られた混合液中のラウロイルグルタミン酸、ラウロイルアスパラギン酸又はラウロイルイミノジ酢酸の濃度を0.02〜0.275％に低下させる工程とを含む、前記方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、リフォールディングの経験や特別な装置も必要とせず、簡便かつ効果的にタンパク質をリフォールディングすることができる。本発明によればまた、タンパク質が天然状態の高次構造を回復する過程で起こり得るタンパク質の会合・凝集を抑制できる。
如何なる理論にも拘束されるものではないが、通常は、界面活性剤がタンパク質から脱離するのと同時にタンパク質が会合・凝集してしまうが、本発明により、特定の界面活性剤を用いて変性タンパク質を伸ばした後、希釈し、その希釈液にアルギニン又はアルギニン誘導体を添加すると、本発明で用いる特定の界面活性剤がタンパク質から脱離するのと同時に、アルギニン又はアルギニン誘導体がタンパク質の会合・凝集性を抑制することができるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
〔タンパク質〕
本発明において使用できるタンパク質は、不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質である。不溶化したタンパク質と高次構造を失ったタンパク質とは明確には区別できず、その高次構造が天然状態のものと異なるものであれば本発明において使用できる。2次構造が主にα−ヘリックスからなるタンパク質（例えばIL-6）、β−シートからなるタンパク質（例えばscFvやFab）、又は双方からなるタンパク質（例えばトランスグルタミナーゼ）に適用できる。単量体タンパク質（IL-6など）であっても、多量体タンパク質（Fabなど）であっても適用できる。分子内あるいは分子間にジスルフィド結合を有さないタンパク質（例えばトランスグルタミナーゼ）であっても、該結合を有するタンパク質（例えばIL-6、scFv、Fab）であっても適用できる。
例えば、大腸菌などの微生物を生産宿主にして調製された不溶性の遺伝子組み換えタンパク質は、通常、100gの水に対する溶解度が0.001g以下（25℃）であるので、本発明において使用できる。可溶性状態からなんらかのストレスを受けて不溶化したタンパク質でもよい。タンパク質の形態は特に制限されず、例えば顆粒状でも粉末状でも線維状でもよい。タンパク質の一次構造や二次構造の特徴で制限されることはない。単量体かオリゴマー構造のいずれかも関係しない。タンパク質の断片でも使用できる。例えば、重量平均分子量（室温条件下、超遠心分析法や静的光散乱分析法で測定）にして5000ダルトンのものから150000ダルトンのものまで本発明において使用することができる。【００１５】
具体的には、ヒトインターロイキン-6のようなサイトカイン；成長因子、各種ホルモン、分化誘導因子などの特定の高次構造を獲得することで機能を発揮するタンパク質性リガンド；トランスグルタミナーゼなどの酵素；タンパク質性酵素阻害剤；及びイムノグロブリン構造を持つ抗体関連分子があげられる。
抗体関連分子としては、抗体可変領域（Fv、fragment of variable region）、単鎖抗体可変領域（scFv、single chain Fv）、抗原結合部位（Fab、fragment of antigen binding）、抗原結合部位（Fab'）、2価の抗原結合部位（F(ab')2）等の抗体断片；二重特異性を示す単鎖抗体可変領域（bispecific single chain Fv）又はダイアボディ（Diabody）、抗体可変領域と抗体Fcドメインの一部を融合させて2量体化させた人工的な小型抗体（Minibody）等の人工抗体；抗原結合部位又は抗体可変領域を構成するドメインのうちの軽鎖由来か重鎖由来の単独のドメインからなるシングルドメイン抗体（single-domain antibody）、タンパク質やペプチドを抗体Fcドメインに融合させたFc融合タンパク質（Fc Fusion Protein）などがあげられる。
より具体的には、HyHEL-10 scFvのような単鎖抗体可変領域（scFv）、例えばPexelizumab（scFv）、抗原結合部位（Fab）としてAbciximab(商品名、ReoPro)、ranibizumab（商品名、LUCENTIS）又はCertolizumab（商品名、Cimzia）、抗Fluorescein scFv Fc fusionのようなFc融合タンパク質（Fc Fusion Protein）、例えばromiplostim （商品名、Nplate）、rilonacept（商品名、ARCALYST）、abatacept（商品名、ORENCIA）又はalefacept（商品名、AMEVIVE）などが不溶化したか又は高次構造を失ったものがあげられる。特に、抗体断片が好ましい。これら抗体関連分子の構造は、公知論文、例えばHolliger P. and Hudson PJ. Nature Biotechnology 23 (9), 1126-1136 (2005)に詳しく述べられている。
イムノグロブリン構造以外の例えばアンキリンリピートやフィブロネクチンタイプIIIドメインやリポカリンなどを足場構造にして作られた人工的な親和性分子もまた本発明において使用することができる。【００１６】
前記不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質が、イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質であるのが好ましい。
前記イムノグロブリン構造をドメインにもつタンパク質が、抗体ドメインの一部を有する抗体断片、ダイアボディまたは小型抗体の人工抗体又はFc融合タンパク質であるのがより好ましい。
前記抗体ドメインの一部を有する抗体断片は、scFv、Fab、Fab'又は（F(ab')2）であるのが好ましい。
前記Fc融合タンパク質は、サイトカイン、受容体細胞外ドメイン又はペプチドを、抗体Fcドメインに融合させたものであるのが好ましい。【００１７】
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
■  界面活性剤の種類
本発明において、Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン（ラウロイルサルコシン、ラウロイル-Sar）、デカノイルアラニン（ラウロイルアラニン、ラウロイル-Ala）、デカン酸又はこれらの又はこれらの塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド（LTAC）及びこれらの混合物は、不溶化したか又は高次構造を失って非天然形状になったタンパク質を水中で引き伸ばすことのできる界面活性剤（可溶化剤）として機能する。
前記界面活性剤が、Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸、デカノイルサルコシン、デカノイルアラニン又はこれらの塩であるのが好ましい。Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸又はその塩であるのがより好ましい。前記Ｃ8〜Ｃ16のアシル基を有するジカルボン酸が、ラウロイルグルタミン酸（ラウロイル-Glu）、ラウロイルアルパラギン酸（ラウロイル-Asp）又はラウロイルイミノジ酢酸であるのがさらに好ましい。
本発明に用いるラウロイル-Glu、ラウロイル-Asp、ラウロイル-Sar、ラウロイル-Alaは、D体、L体、DL体のいずれであっても良い。不溶化したか又は高次構造を失ったタンパク質がIL-６等のサイトカインやトランスグルタミナーゼ等の酵素の場合、ラウロイル-Glu、ラウロイル-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸、又はこれらの塩、或いはこれらの混合物を用いるのが好ましい。界面活性剤としては、ラウロイル-L-Gluがあらゆる不溶性タンパク質の可溶化力に優れ、希釈されたときにタンパク質に結合し続けることなく容易に除去できることに加えて、高純度のラウロイル-L-Glu試薬を安価に入手できることから、特に好ましい。
■  界面活性剤の濃度
ラウロイル-Glu、ラウロイル-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸、ラウロイル-Sar、ラウロイル-Ala、デカン酸またはLTACは、1〜3％、好ましくは1.5〜2.8％、更に好ましくは1.75〜2.5％の水溶液とする。このような濃度範囲であれば、タンパク質の可溶化効率を十分に高めると共に、その次の操作である希釈の倍率を適度にとどめることができる。
■  ｐＨ
該水溶液の25℃におけるpHは、変性タンパク質の性質に合わせ、pH 6.5〜9.0、好ましくはpH 7.0〜8.5の緩和な条件を選択できる。なお、本発明において、pHは、pH電極を装着したpHメーターにより測定できる。pH調整は、水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて行うことができる。該水溶液として緩衝液を使用してもよい。【００１８】
■  接触温度及び時間
斯様にして調製した界面活性剤水溶液と、変性タンパク質とを接触させて、タンパク質の可溶化液を得る。界面活性剤水溶液に変性タンパク質を添加してもよいし、変性タンパク質に界面活性剤水溶液を添加してもよい。接触は、通常5〜40℃において、好ましくは15 〜40 ℃において放置することにより行うことができる。このような範囲であれば化学反応による切断や酸化などの修飾が最小限に抑制されるので好ましい。放置時間は通常0.1〜3.0時間、好ましくは0.5〜1.0時間である。このような範囲であれば、化学反応による切断や酸化などの修飾が最小限に抑制されるので好ましい。接触中に攪拌してもよい。
変性タンパク質又は可溶化水溶液の量は、可溶化されたタンパク質濃度が1〜20 mg/mlになるように調整すると、続く希釈過程においても極端にタンパク質濃度が低下しないので好ましい。
タンパク質が可溶化されたかどうかは、例えば目視による濁度判定、あるいは280 nmでの紫外線吸収スペクトル法などにより確認することができる。【００１９】
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
■  希釈倍率
続いて、この可溶化液を、添加剤としてアルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液に10〜数10倍程度の希釈倍率で希釈し、タンパク質が天然状態の高次構造を回復するまで、そのまま維持する。希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02〜0.5％、好ましくは0.04〜0.35%、更に好ましくは0.05〜0.30%となるように希釈する。界面活性剤は、この希釈によってタンパク質から直ちに脱離し、タンパク質は高次構造を形成する。希釈は、１段、多段（ステップ勾配）又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
前記タンパク質がIL-６等のサイトカインやトランスグルタミナーゼ等の酵素の場合、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02〜0.275％、好ましくは0.04〜0.125％、更に好ましくは0.05〜0.10％となるように希釈するのが好ましい。
前記タンパク質が抗体断片の場合、中でもscFvの場合、上述したサイトカインや酵素の場合よりも希釈倍率は小さくても良い。具体的には、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02〜0.5％、好ましくは0.05〜0.4％、更に好ましくは0.1〜0.3％となるように希釈するのが好ましい。希釈濃度がこれらより低い場合でも、本発明で規定する範囲内であれば、タンパク質の天然状態の高次構造を回復させることができることは言うまでもない。
前記抗体断片の中でもFab、Fab'及びF(ab')2の場合、一段階で希釈してもよいし、二段階以上の多段階で希釈してもよいが、多段階で希釈した方がリフォールディング率がより向上するので好ましい。一段階で希釈する場合、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02〜0.08 ％、好ましくは0.03〜0.07 ％、更に好ましくは0.04〜0.06 ％となるように希釈するのが好ましい。多段階で希釈する場合、第一段階における希釈は、上述したscFvの場合と同程度の希釈倍率で行うことができる。最終段階における希釈が、希釈後の界面活性剤の濃度を、0.02〜0.08％、好ましくは0.03〜0.07 ％、更に好ましくは0.04〜0.06 ％となるように希釈するのが好ましい。漸次的に希釈してもよい。その場合、希釈後の最終濃度が0.02〜0.08％、好ましくは0.03〜0.07 ％、更に好ましくは0.04〜0.06 ％となるように希釈するのが好ましい。
このような範囲であれば、天然状態の高次構造回復が促進され、タンパク質の安定性も確保されるので好ましい。タンパク質が天然状態の高次構造を回復したかどうかは、CDスペクトルや蛍光スペクトルなどの分光測定、あるいはHPLCなどタンパク質の物理化学的特性を観察する方法、あるいは酵素活性等の高次構造指標により確認することができる。【００２０】
■  添加剤の種類
添加剤として用いるアルギニンはL型でもD型でも良い。塩酸塩等の無機酸との塩、あるいは酢酸塩などの有機酸との塩を形成していてもよい。アルギニン誘導体としては、アセチルアルギニン、N-ブチロイルアルギニン等の炭素数１〜６のアシル基を有するアルギニン；カルボキシル基を除去したアグマチン；αアミノ基の替わりに水酸基を導入したアルギニン酸等があげられる。アルギニン誘導体としては、アシル化アルギニンが好ましく、N-ブチロイルアルギニンがより好ましい。添加剤としてはアルギニン塩酸塩が最も好ましい。【００２１】
■  ｐＨ
緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス塩酸塩等を用いることができる。pHは、天然状態を回復するタンパク質の性質に合ったpHであればよく、概ねpH 6.5〜9.0に収まる中性pHである。従って、工程（2）におけるpHはこの範囲にあればよく、工程（1）におけるpHと異なっていてもよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる。【００２２】
■  添加剤濃度
添加剤濃度は、天然状態を回復するタンパク質の性質に応じて個別に選択されるが、0.05〜1.2M、好ましく0.06〜1.0M、更に好ましくは0.08〜0.8Mである。このような範囲であれば、天然状態の高次構造回復が促進され、続く精製工程を阻害することがないので好ましい。
タンパク質がIL-６等のサイトカインやトランスグルタミナーゼ等の酵素の場合、添加剤濃度は好ましくは0.1〜1.2M、好ましく0.2〜1.0M、更に好ましくは0.4〜0.8Mである。
前記タンパク質が抗体断片、中でもscFvの場合、添加剤濃度は好ましくは0.2〜1.0 M、更に好ましくは0.4 〜0.8 Mである。
前記抗体断片の中でもFab、Fab'及びF(ab')2の場合、添加剤濃度は好ましくは0.05〜0.3M、更に好ましくは0.08〜0.12 Mである。二段階以上に分けて希釈する場合、第一段階における希釈は、上述したscFvの場合と同程度の希釈倍率で行うことができる。最終段階における希釈が、希釈後の添加剤の濃度を、0.05〜0.3 M、好ましくは0.06〜0.2 M、更に好ましくは0.08〜0.12 Mとなるように希釈するのが好ましい。希釈は、１段、多段（ステップ勾配）又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。【００２３】
■  希釈温度・保持時間
希釈は、室温下で実施してもよく、目的タンパク質が天然状態を回復した際の熱安定性が十分に高くない場合は5〜10℃で実施してもよい。たとえば、ヒトインターロイキン-6（rhIL-6）の場合、添加剤溶液で希釈後、室温で1分間程度維持すればよい。トランスグルタミナーゼの場合、室温では2時間以上維持すればよい。5〜10℃で維持する場合は更に長い時間維持する必要がある。
一般に、高めの温度で維持すると維持時間は短くなるが、目的タンパク質が抗体関連分子の場合、IL-6やトランスグルタミナーゼ等のサイトカインの場合よりも低めの温度で長い時間をかけて維持するのが良い。こうすることで、リフォールディング率がより向上する。５〜４８℃で１時間〜５日間維持するのが特に好ましい。
特に、抗体関連分子が抗体断片の場合、中でもscFvの場合は、5 ℃〜15 ℃にて、好ましくは7 ℃から13 ℃にて、更に好ましくは8 ℃〜12 ℃にて、10時間〜24時間、好ましくは12時間〜20時間、更に好ましくは15時間〜18時間維持するのが望ましい。その間の抗体関連分子の会合凝集は抑制されている。
その後、この希釈液を加温し、さらに数時間から数日間維持してもよい。好ましくは15℃〜48 ℃にて、好ましくは20 ℃〜46 ℃にて、更に好ましくは23 ℃〜45 ℃にて、1時間〜5日間、好ましくは1.5時間〜3日間、更に好ましくは2時間〜24時間維持するのが望ましい。【００２４】
抗体断片がFab、Fab'及びF(ab')2の場合、一段階で希釈する場合は5〜15 ℃において、10〜72時間維持するのが好ましい。7〜13 ℃において12〜20時間維持するのがより好ましい。多段階で希釈する場合、第一段階における希釈は5 ℃〜15 ℃にて、好ましくは7 ℃から13 ℃にて、更に好ましくは8 ℃〜12 ℃にて、10時間〜24時間、好ましくは12時間〜20時間、更に好ましくは15時間〜18時間維持するのが望ましい。その間の抗体関連分子の会合凝集は抑制されている。
その後、この希釈液を加温し、さらに数時間から数日間維持してもよい。好ましくは15 ℃〜48 ℃にて、好ましくは20 ℃〜46 ℃にて、更に好ましくは23 ℃〜45 ℃にて、1時間〜5日間、好ましくは1.5時間〜3日間、更に好ましくは2時間〜24時間維持するのが好ましい。温度調節は、１段、多段（ステップ勾配）又はリニア勾配により適宜選択して行うことができる。
漸次的に希釈してもよい。その場合、５〜１５℃に１０〜７２時間かけて希釈するのが好ましい。【００２５】
希釈を数段階に分けて行う場合は、最終段階の希釈の後に希釈倍率を相殺する分だけ、例えば限外ろ過膜により濃縮することで、最終段階の希釈後のタンパク質濃度を0.05〜1.0 mg/mlに、好ましくは0.1〜0.5 mg/mlに、更に好ましくは0.15〜0.3 mg/mlに保ち、Fabを構成する重鎖と軽鎖のジスルフィド結合形成を促進する。【００２６】
なお、従来の抗体関連分子のリフォールディングでは、分子を構成するドメインごとのリフォールディング速度が不ぞろいなため、リフォールディング中に会合凝集が起こりやすく、リフォールディング率は低値にとどまっていた。この問題を解決するために、津本らは段階透析法によるリフォールディング方法（The Journal of Biological Chemistry 278 (11), 8979-8987 (2003)）を提案した。この方法は、変性タンパク質（単鎖抗体可変領域、scFv）溶液中の高濃度のタンパク質変性剤（塩酸グアニジン）を6段階の透析操作によって、ゆっくりと段階的に除去することで、単純な希釈法などでは頻繁に生じた会合凝集によるタンパク質の損失を防ぐことのできた、優れた方法であった。しかし、この方法は6段階もの透析を行うためにリフォールディング操作時間が長く、その間にタンパク質が化学修飾を受けたり、凝集性の高い構造形成中間状態の形成される場合は、逆に会合凝集を促進してしまう懸念もあった。植田らは、津本らの方法を一部改良することで、抗原結合部位（Fab）のリフォールディングを可能としたが（The Journal of Biochemistry 141 (5), 699-707 (2007)、この場合は4段階の透析を行うために130時間という長時間を要した上に、リフォールディング率は最高で24 %であり、効率の良いリフォールディング方法とはいえなかった。
しかし、以上述べたとおり、本発明によると、抗体関連分子のリフォールディングに必要な時間は、ゲルろ過HPLCや電気泳動又は抗体関連分子の活性を測定することで、抗体関連分子ごとに適切に決めることができる。多くの場合は40時間程度であり、段階透析法を代表とする従来の抗体関連分子リフォールディング方法よりも大幅に短縮される。【００２７】
〔任意工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
タンパク質によっては、上記範囲に希釈するのに先立ち、リン酸緩衝溶液等を添加することにより予め希釈してもよい。具体的には、前記工程（1）と工程（2）との間に、界面活性剤の濃度が0.8〜1.5％に、好ましくは1％になるように希釈するのが望ましい。希釈後、好ましくは5〜40℃、より好ましくは5〜30℃、例えば室温で、好ましくは0.5時間以上放置することで、タンパク質の高次構造の回復率を更に高めることができる。可溶化に用いた時間と同程度以上放置すれば十分である。界面活性剤の濃度が0.8〜1％になるように希釈し、得られた希釈液を5〜40℃で30分以上維持するのが特に好ましい。
特に、目的タンパク質が抗体関連分子であって、該抗体関連分子が抗体断片の場合、中でもscFvの場合、5 ℃〜15 ℃にて、好ましくは7 ℃から13 ℃にて、更に好ましくは8 ℃〜12 ℃にて、10時間〜24時間、好ましくは12時間〜20時間、更に好ましくは15時間〜18時間、維持する。維持される間に、抗体関連分子は会合凝集を進行させることなく、天然状態に近づく。
抗体断片がFab、Fab'及びF(ab')2の場合、添加剤としてアルギニン又はアルギニン誘導体を含む緩衝液に希釈し、ラウロイル-Glu濃度を0.05〜0.5 %に、好ましくは0.08〜0.4 %に、更に好ましくは0.1〜0.3 %に、アルギニン濃度を0.6〜1.2 Mに、好ましくは0.7〜1.1 Mに、更に好ましくは0.8〜1.0 Mに調整する。
このとき得られた希釈液の25℃におけるｐＨは、pH 6.5〜9.0の範囲にあればよく、工程（1）におけるpHと異なっていてもよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる【００２８】
この希釈によって高次構造の回復されたタンパク質の濃度は、希釈に用いたタンパク質の量と性質、希釈の倍率と関係して、0.02〜1mg/mlに達する。【００２９】
〔任意工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
タンパク質によっては、単一の分子内に、多量体タンパク質の場合は分子間にジスルフィド結合を有することがある。タンパク質に酸化還元反応をさせてこれらジスルフィド結合の形成を促進すると、リフォールディング率がより向上するので好ましい。
酸化還元反応は、チオール・ジスルフィド交換反応を促進して、分子内や分子間のジスルフィド結合を形成させるための酸化還元物質（例えば、酸化型グルタチオン（GSSG）と還元型グルタチオン（GSH）との混合物、又はシスチンとシステインの混合物、又はシスタミンとシステアミンの混合物、又は酸化型グルタチオンあるいはシスチンとメルカプトエタノールの混合物、など））や、空気酸化を促進するための銅イオンを共存させることにより行うことができるし、タンパク質の酸化還元電位を変化させることにより行うこともできる。酸化還元物質を使用するのが好ましい。
酸化還元反応は、前記工程（1）の後であればいつ行っても良く、例えば前記工程（2）において酸化還元物質を添加剤と共に可溶化液に添加することにより行っても良いし、前記工程（2）において希釈液を得た後に該希釈液に酸化還元物質を添加することにより行っても良い。
酸化還元物質や銅イオンの濃度は、天然状態を回復するタンパク質ごとに適正な濃度に調整される。
このときの25℃におけるｐＨは、pH 6.5〜9.0の範囲にあればよい。pH調整は、例えば塩酸や水酸化ナトリウム等で行うことができる。
液温は、工程（1）で得られる可溶化液の温度と同程度でもよいし、工程（2）で得られる可溶化液の温度と同程度でもよい。酸化還元反応を促進させるには、５〜４８℃程度が好ましい。
酸化還元反応後、５〜４８℃で１時間〜５日間（１２０時間）程度放置してもよい。【００３０】
本発明の方法によれば、リフォールディング率は少なくとも30 ％であり、多くの場合70％に達する。
〔任意工程（C）：精製〕
高次構造を回復したタンパク質は、通常の方法、例えば限外ろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等によって精製することができる。
以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【実施例】
【００３１】
（参考例１）
タンパク質として、遺伝子組み換え大腸菌を用いて調製されたヒトインターロイキン-6（rhIL-6；特許第3200850号）を用いた。該rhIL-6は水不溶性（25℃の水100ｇに対する溶解度：0.001 g以下）であり、その形態は顆粒である。該不溶性顆粒をエッペンドルフチューブ（ポリプロピレン製；エッペンドルフ社）の1本あたりにrhIL-6で4 mgずつ小分け分注した。該不溶性顆粒に含有されるrhIL-6量は、既報（特許第3200850号）に記載された逆相HPLC法によって予め定量しておいた。
ここへ、ラウロイル-L-Glu、ラウロイル-L-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸、デカノイルSar、デカノイルL-Ala、デカン酸又はラウリルトリメチルアンモニウムクロリドの最終濃度が2％になるよう、また、rhIL-6抽出濃度が4mg/mlになるように、予め5 %に調製された界面活性剤と純水（ミリQ水）を適宜添加して最終的に1 mlに調整し、室温で2時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。
比較のために、以下に示す界面活性剤を用いて同様の操作を行った。アニオン性界面活性剤を使用する場合、NaOHを用いて水溶液の濃度をpH 7.0（25℃）に調整した。【００３２】
比較に用いた界面活性剤：ウンデカノイルL-Glu、トリデカノイルL-Glu、ミリストイルL-Glu、ラウロイルDL-Glu、ラウロイルγ-Glu-Glu、ラウロイルα-Glu-Glu、デカノイル-L-Asp、デカノイル-DL-Asp、ミリストイルSar、ラウロイルL-Ala、ミリストイルL-Ala、ラウロイルDL-Ala、ラウロイルGly、ラウロイルL-Val、ラウロイルL-Leu、ラウロイルL-Ile、ラウロイルL-The、ラウロイルL-Phe、ラウロイルL-Tyr、ラウロイルL-Met、ラウロイルL-Gln、ラウロイルL-PCA、ラウロイルL-Pro、ラウロイルL-GABA、ラウロイルL-Cit、ラウリルコハク酸（以上はすべて味の素（株）にて調製）、ラウロイル-Sar（ナカライテスク製）、POE(20)モノオレイン酸ソルビタン（Tween-80；ナカライテスク製）、POE(9,10)ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Triton X-100；ナカライテスク製）、POE(20)モノパルミチン酸ソルビタン（Tween-20；バイオラッド製）、ラウロイル-N-Me-タウリン（ニッコールLMT；日光ケミカル製）、ラウロイル-N-Me-β-Ala（川研ファインケミカル製）、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタン（ソフダゾリンLPB；川研ファインケミカル製）、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ラウリン酸（以上は東京化成製）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬製）、SLES（Sodium laurylethersulfate、エマール 270 D/B；花王製）、ラウリルアミノベタイン（アンヒトール20 AB；花王製）、ミリスチルアミノベタイン（アンヒトール24 AB；花王製）、ラウリルスルホベタイン（SB-12；シグマ・アルギニンドリッチ製）、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（CHAPS；同仁化学研究所製）。【００３３】
各抽出液に、還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンをそれぞれ最終的に10μM、2μMになるよう添加し、室温で終夜放置して分子内ジスルフィド結合を形成させた。ジスルフィド結合の形成は逆相HPLC法（カラム、Vydac 214-TP5410（Separations Group）；溶離液、A/0.1 ％ TFA   B/0.1 ％ TFA + 80 ％アセトニトリル；流速、1 ml/min；溶出条件、30 ％ Bから50 ％ Bまで1.0 ％/minのリニアグラジエント）において、ピーク保持時間の変化を指標に確認した。得られた溶液50μlに、10mM リン酸ナトリウム水溶液950μl（pH 7.0、25℃）を添加して20倍希釈した（最終容量1 ml；最終界面活性剤濃度0.1 ％）。
イオン交換HPLCにてrhIL-6標品（特許第3200850号）と同じ保持時間を示すピークが、天然状態の高次構造を有するrhIL-6であるとわかっている（Biotechnology and Bioengineering 62, 301-310 (1999)）ので、上で希釈した後の水溶液に含まれる天然状態の高次構造を形成しているrhIL-6量をイオン交換HPLCで求めた（カラム、SP-NPR（東ソー製）；溶離液、A/0.01 M 酢酸ナトリウム、ｐH 5.0  B/0.5 M 酢酸ナトリウム、pH 5.5；流速、1 ml/min；溶出条件、20％ Bから70％ Bまで10％/minのリニアグラジエント）。
界面活性剤としてラウロイルL-Gluを用いて可溶化した場合のrhIL-6量を100％として、ラウロイル-L-Asp及びラウロイルインミノジ酢酸を用いて可溶化した場合のrhIL-6量を相対的に示した（図1）。比較用界面活性剤を用いて可溶化した場合のrhIL-6量も同様に相対的に示した（図1）。【００３４】
図１から明らかなように、ラウロイル-Asp又はラウロイルイミノジ酢酸を使用してrhIL-6を可溶化し、天然状態の高次構造を回復させた場合のrhIL-6量は、ラウロイル-Gluを使用してrhIL-6を可溶化し、天然状態の高次構造を回復させた場合のrhIL-6量に遜色がなかった。これら３種の界面活性剤を用いた場合に得られる天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は、比較用界面活性剤を用いた場合に比べて高かった。
タンパク質のリフォールディングに従来用いられることの多かったラウロイル-Sarとセチルトリメチルアンモニウムクロライド（CTAC）を用いた場合に得られる天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は、それぞれ5％、21％と低かった。rhIL-6を含有する不溶性顆粒からrhIL-6を抽出させる力に富むと予想されたラウリルエーテル硫酸Na（SLES）やラウリン酸等のアニオン界面活性剤及び両性界面活性剤を用いた場合に得られる天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は低く、いずれも20％未満であった。タンパク質変性効果が弱いため、リフォールディングに用いられることの多いTween 20、Tween 80、Triton X-100といった非イオン性界面活性剤は、不溶性顆粒からrhIL-6を抽出する力に乏しく、不溶性顆粒を溶解させることがほとんどできなかったため、天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6量は3〜5 ％と低かった。【００３５】
（参考例２）
不溶性顆粒から抽出、可溶化する際のrhIL-6濃度を高めた場合でも、ラウロイル-L-Glu、ラウロイル-L-Asp及びラウロイルイミノジ酢酸が、不溶化rhIL-6の天然状態の高次構造の回復に有効であるかどうかを調べた。比較のために、参考例1にてラウロイル-L-Gluに対して80 ％以上のrhIL-6量を示したラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、同じラウロイル基を持つラウロイル-Sar、ラウロイル-L-Gluにおけるアシル鎖長の効果を確認するためにウンデカノイルL-Glu、トリデカノイルL-Glu及びミリストイルL-Glu、アシル鎖の影響を確認するためにデカン酸を使用した。
参考例１で用いたのと同じrhIL-6の不溶性顆粒を用い、その13 mgをエッペンドルフチューブに小分けした。各界面活性剤を最終濃度が2％となるようエッペンドルフチューブに添加し、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0（25℃）の溶液1mlを得、該溶液をpH 7.0、室温で2時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。抽出濃度は13 mg/mlに調整されたことになる。参考例1と同様に、還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンをそれぞれ最終的に10 μM、2 μMになるよう添加し、室温で終夜放置して分子内ジスルフィド結合を形成させた。
この25μlに10 mM リン酸ナトリウム水溶液（pH 7.0（25℃））975μlを添加して40倍希釈し（最終容量1 ml；最終界面活性剤濃度0.05％）、参考例１に記載したのと同様にして、高次構造を形成しているrhIL-6量をイオン交換HPLCで求めた。結果を図2に示す。【００３６】
図２から明らかなように、ラウロイル-L-Gluを使用した場合に、天然状態の高次構造を回復させたrhIL-6濃度が最も高く、ラウロイルL-Asp、ラウロイルイミノジ酢酸といった、分子内にアミド結合をもつ、一鎖二親水型界面活性剤を使用した場合にも高いrhIL-6濃度を示した。ラウロイル-L-Gluのアシル鎖長をC11（ウンデカノイル）へ短くしたり、C13（トリデカノイル）又はC14（ミリストイル）へ伸ばしたりすると、ラウロイル-L-Gluを使用した場合に比べてrhIL-6濃度が下がったので、アシル鎖長はC12（ラウロイル）が最適であるとわかった。アシル鎖だけのデカン酸を使用した場合にはわずかな量のrhIL-6しか回収できなかった。G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子：Granulocyte colony-stimulating factor；US patent 5849883）や成長ホルモン（EP 0263902 A）のリフォールディングに有効とされたラウロイル-Sarは、ラウロイル-L-Gluに比べて明瞭に劣った。【００３７】
（参考例３）
不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、可溶化するための界面活性剤の濃度を検討した。
参考例１で用いたのと同じrhIL-6の水不溶性顆粒を用い、その12.6 mgをエッペンドルフチューブに小分けした。ラウロイル-L-Gluの最終濃度が1.5％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％、3.00％となるようエッペンドルフチューブに添加し、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0（25℃）の溶液3 mlを得た。該溶液を室温で2時間放置することにより、不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。rhIL-6が完全に抽出されたとすると、rhIL-6の抽出濃度は4.3 mg/mlに調整されたことになる。
抽出後、上清にジチオスレイトール（DTT） 10 mMを添加し、pH 8に調整後、37 ℃で30分間加温してジスルフィド結合を還元した。この上清を逆相HPLC（カラム、Vydac 214-TP5410（Separations Group）；溶離液、A/0.1 ％ TFA   B/0.1 ％ TFA + 80 ％アセトニトリル；流速、1 ml/min；溶出条件、30 ％ Bから50 ％ Bまで1.0 ％/minのリニアグラジエント）に供し、不溶性顆粒から可溶化されたrhIL-6量を測定した（Biotechnology and Bioengineering 62, 301-310 (1999)）。ラウロイル-L-Glu最終濃度が3.00％のときのrhIL-6量を100 ％として、各濃度におけるrhIL-6相対量を図3に示した。
図３から明らかなように、ラウロイル-L-Glu濃度が1.50％の場合、3.00％で抽出及び可溶化した場合のrhIL-6量には及ばないものの、その80 ％弱の抽出量が得られることがわかった。ラウロイル-L-Glu濃度が1.75％以上の場合、3.00％で抽出及び可溶化した場合とほぼ同じ抽出量が得られた。この結果から、rhIL-6と同程度の疎水性を有するタンパク質であれば、1.50％のラウロイル-L-Glu濃度で抽出可能であり、3.00％のラウロイル-L-Glu濃度においても同様に抽出可能とわかった。【００３８】
（参考例４）
工程（2）において、界面活性剤で抽出されたタンパク質を希釈してリフォールディングするときの界面活性剤至適濃度を検討した。rhIL-6は、その高次構造をよく反映した蛍光スペクトルを与えるため、各濃度のラウロイル-L-Glu中でのrhIL-6最大蛍光強度とその波長を追跡することで、リフォールディングに適したラウロイル-L-Glu濃度を決定した。
rhIL-6標品（特許第3200850号）を10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0中で0.075 mg/mlに調整し、室温において、励起波長 295 nm、蛍光波長 315〜420 nmで蛍光スペクトルを測定した（FP-6500分光蛍光光度計、JASCO製）。結果を図4に示した。
ラウロイル-L-Glu濃度が0 ％〜0.1 ％の間は、rhIL-6の最大蛍光波長も蛍光強度もほとんど変化しなかった。このことから、この濃度範囲では、ラウロイル-L-Gluの結合はほとんどなく、仮にわずかに結合したとしても、rhIL-6構造が天然状態から別の状態に変化することはないとわかった。
ラウロイル-L-Glu濃度が0.125 ％〜0.275 ％の間では、最大蛍光波長は徐々に、かつ連続的に紫外側にシフトした。このことから、この濃度範囲では、ラウロイル-L-GluがrhIL-6に結合することで、一定の最大蛍光強度とその波長をもつ構造状態へと変わっていくことがわかった。
ラウロイル-L-Glu濃度が0.967％を越えると、最大蛍光波長が赤外側にシフトした。このことから、この濃度範囲では、rhIL-6の高次構造がよりオープンに、すなわちrhIL-6高次構造が失われ始めたことがわかった。
以上の結果より、ラウロイル-L-Glu濃度を0.1 ％よりも低くなるよう希釈することで、タンパク質の高次構造を完全に天然状態へと導けること、0.125 ％〜0.275 ％に希釈することで、天然状態に近い状態へと導けることがわかった。【００３９】
（参考例５）
参考例４で判明したラウロイル-L-Glu濃度とrhIL-6高次構造との関係が、界面活性剤中に溶解されたrhIL-6状態を開始点とし、そこから段階的に希釈されていく過程（リフォールディング過程）においても、同様に観察されることを確認した。
rhIL-6標品（特許第3200850号）を、2 ％のラウロイル-L-Gluを含む10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））1ml中に溶解させ、3 mg/mlに調整した。この溶液を、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で段階的に希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度が、1.0 ％、0.3 ％、0.1 ％、0.05 ％である希釈列を準備した。各希釈溶液のrhIL-6濃度を0.075 mg/mlに調整した後に、各希釈溶液の蛍光スペクトルを測定し、ラウロイル-L-Glu濃度の変化に伴う最大蛍光波長の変化を追跡した。
比較のために、ラウロイル-L-Gluの代わりにラウロイル-Sarを用いた同様の操作を行った。結果を図5に示した。
ラウロイル-L-Glu濃度が2 〜0.3 ％の間は、最大蛍光波長は340 nm付近であり、rhIL-6高次構造は依然として天然状態と異なる状態にあったが、0.1 ％、0.05 ％では350 nmに達し、この濃度のラウロイル-L-GluによってrhIL-6が実際に天然状態の高次構造を回復できた、すなわちリフォールディングされたとわかった。比較のために実施したラウロイル-Sarでは、rhIL-6の最大蛍光波長は検討した濃度範囲で全く変化せず、リフォールディングは認められなかった。【００４０】
（実施例１）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
参考例１で用いたのと同じrhIL-6の水不溶性顆粒を、2.5 ％ラウロイル-L-Glu水溶液（10 mMリン酸ナトリウム含有、pH 7（25℃））5 mlに添加し、37 ℃で1時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。得られた可溶化液のrhIL-6濃度は6.5 mg/mlであった。
〔工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
得られた可溶化液に、10 μM還元型グルタチオン及び2 μM酸化型グルタチオンを添加後、室温で18時間放置し、分子内ジスルフィド結合を形成させた。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
他方、10 mMリン酸ナトリウム水溶液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩を添加し、アルギニン塩酸塩濃度が0.4 M、0.8 M及び1.2 Mの希釈液（pH 7.0（25℃））を調製した。陰性対照として、添加剤を添加しないこと以外は同様にして調製した希釈液を用意した。
18時間放置後の可溶化液0.1 mlを、これら希釈液で50 倍に希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。
参考例１と同様にして、添加剤濃度とrhIL-6のリフォールディング率との関係をイオン交換HPLCで評価した。結果を表1に示す。【００４１】
（比較例１〜２）
添加剤として、アルギニン塩酸塩に替えてスクロース及びグリセロールを使用したこと以外は実施例１と同様にして、添加剤濃度とrhIL-6のリフォールディング率との関係をイオン交換HPLCで評価した。結果を表1に示す。【００４２】
（比較例３）
特許第3200850号の実施例1に記載の方法に相当する方法で、rhIL-6のリフォールディングを行った。具体的には、実施例１で用いたのと同じrhIL-6の水不溶性顆粒を、6 M塩酸グアニジン（pH 7（25℃））5 mlに添加し、37 ℃で1時間放置することにより、該不溶性顆粒からrhIL-6を抽出し、rhIL-6を可溶化した。得られた可溶化液のrhIL-6濃度は0.88 mg/mlであった。
次いで、得られた可溶化液をセファデックスG-25カラムを用いて10 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0へと緩衝液置換した。実施例１と同様にして、rhIL-6のリフォールディング率をイオン交換HPLCで評価した。結果を表1に示す。【００４３】
【表１】
2009136568.tif 000003
【００４４】
表１の値は、比較例３に示した従来技術によるrhIL-6のリフォールディング率を基準にした相対的な値である。
陰性対照の場合（添加剤無添加の希釈液を使用した場合）、リフォールディング率は従来技術の125 ％となり、優位性は明確であった。
希釈液にアルギニン塩酸塩を0.4 M加えると、リフォールディング率は166 ％に達し、アルギニン塩酸塩濃度を0.8 M、1.2 Mと高くすると、リフォールディング率は174％、176％へと飛躍的に高まった。
一方、タンパク質のリフォールディングを促進すると言われているスクロース又はグリセロールを添加しても、その改善効果はアルギニン塩酸塩の場合に比べて軽微であった（比較例１〜２）。
以上より、ラウロイル-L-Gluでタンパク質を可溶化し、可溶化液を希釈してリフォールディングする際に、アルギニン塩酸塩を希釈液に添加することでタンパク質のリフォールディング率を高められることがわかった。【００４５】
（実施例２）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
ラウロイル-L-Glu水溶液のラウロイル-L-Glu濃度を2.5％に、pHを8.5に変更したこと以外は実施例１と同様にしてrhIL-6を可溶化した。得られた可溶化液のrhIL-6濃度は6.5 mg/mlであった。
〔工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
次いで、実施例１と同様、10μM還元型グルタチオン及び2 μM酸化型グルタチオン存在下で、室温で18時間放置した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
他方、10 mMリン酸ナトリウム水溶液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩又はN-α-ブチロイルアルギニン（Nα-Butyroyl-L-Arginine）を添加し、添加剤濃度が0.4 M又は0.8 Mの希釈液（pH 7.0（25℃））を調製した。なお、N-ブチロイルアルギニンは以下の方法で調製した：アルギニンを水/2-プロパノールに溶解後、反応系をpH 11、10〜15 ℃に調整した。水酸化ナトリウム水溶液にてpH、温度を保持したまま、ブチロイルクロライドを滴下し反応させた。反応終了後、陽イオン交換樹脂にて精製し、白色固体を得た。逆相HPLC、1H-NMRにて構造、純度を確認した。陰性対照として、添加剤を添加しないこと以外は同様にして調製した希釈液を用意した。
室温で18時間放置後の可溶化液0.1 mlを、これら希釈液で40 倍に希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。
実施例１と同様にして、添加剤濃度とrhIL-6のリフォールディング率との関係をイオン交換HPLCで評価した。結果を表２に示す。【００４６】
【表２】
2009136568.tif 000004
【００４７】
表２の値は、比較例３に示した従来技術によるrhIL-6のリフォールディング率を基準にした相対的な値である。
希釈液に添加剤を何も加えなかった場合のリフォールディング率は115％であり、添加剤としてアルギニン塩酸塩を0.4 M又は0.8 M添加すると、リフォールディング率は157 ％、188 ％へと飛躍的に高まった。
一方、添加剤としてN-ブチロイルアルギニンを0.4 M添加するとリフォールディング率は179 ％に達し、希釈液に添加剤を何も加えなかった場合の115 ％の場合や、アルギニン塩酸塩を同濃度（0.4 M）添加した場合に比べ、リフォールディング率は大きく改善された。
N-ブチロイルアルギニンは、中性pH下で両イオン性を示し、総荷電を失うため、仮に0.4 M以上添加されても、これを含む希釈液を希釈することなく、直接にイオン交換クロマトグラフィーに負荷することで、リフォールディングされたタンパク質を精製、回収できるため、アルギニン塩酸塩よりも更に効率的に使用することができるものと考えられる。【００４８】
（実施例３）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
遺伝子組み換え大腸菌を用いて調製したトランスグルタミナーゼ（protein-glutamine、γ-glutamyltransferase, EC 2.3.2.13；US Patent No. 6833258）の水不溶性顆粒を、2.0 ％ラウロイル-L-Glu水溶液（10 mMトリス塩酸塩、20 mM DTT、pH 8.5（25℃））5 mlに添加し、37 ℃で1時間放置することにより、トランスグルタミナーゼを抽出し、可溶化した。得られた可溶化液のトランスグルタミナーゼ濃度は6.98 mg/mlであった。
〔工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
得られた可溶化液0.1 mlを、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で40倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整し、室温で２時間放置した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
希釈液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩を添加した（表３中「１％への希釈なし」）。陰性対照として、添加剤を添加しない希釈液を用意した。可溶化液0.1 mlに、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。
他方、得られた可溶化液0.1 mlを、0.6 M リン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で2倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を1.0 ％に調整し、室温で30分間維持した。次いで、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整し、室温で２時間放置した。希釈液に、添加剤としてアルギニン塩酸塩を添加した（表３中「１％への希釈あり」）。陰性対照として、添加剤を添加しない希釈液を用意した。可溶化液0.1 mlを0.6 M リン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で2倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を1.0 ％に調整し、室温で30分間維持した。次いで、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整し、室温で２時間放置した（希釈液に添加剤を添加せず）。
アルギニン塩酸塩濃度とトランスグルタミナーゼのリフォールディング率との関係をゲルろ過HPLCで確認した（カラム、Superdex 75HR 10/30、GEヘルスケアバイオサイエンス製；展開液、0.2 M リン酸ナトリウム、ｐH 7.0；流速、1 ml/min）。結果を表３に示す。【００４９】
【表３】
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【００５０】
希釈液にアルギニン塩酸塩を添加しなかった場合、１％に希釈してから0.05％に希釈した場合も、１％に希釈せずに0.05％に希釈した場合も、ゲルろ過HPLCで確認されたトランスグルタミナーゼの濃度は50 μg/mlに達しなかった。しかも、この希釈液を室温に保持し続けると、トランスグルタミナーゼは徐々に消失したため、トランスグルタミナーゼの天然状態の高次構造を回復できていなかったことがわかった。
他方、希釈時にアルギニン塩酸塩を0.4、0.8、1.2 M添加しておくと、トランスグルタミナーゼの濃度はアルギニン塩酸塩添加濃度に依存して上昇し、そのまま室温に保持し続けても消失することは無かった。
また、同じアルギニン塩酸塩濃度を添加した場合でも、2.0 ％ラウロイル-L-Glu抽出液を1 ％へと2倍希釈した後に0.05 ％へと希釈した場合、１％に希釈せずに0.05％に希釈した場合に比べて、トランスグルタミナーゼ濃度が高まる傾向を示し、特に、1.2 Mアルギニン塩酸塩を添加した場合のトランスグルタミナーゼ濃度を比較すると、127 μg/mlから151 μg/mlへと明瞭に高まることがわかった。
以上より、希釈時にアルギニン塩酸塩を添加しておくことと、可溶化後に一旦ラウロイル-L-Glu濃度を1 ％へ希釈し、それから更に希釈することで、トランスグルタミナーゼのリフォールディングが効率的に実施できることがわかった。【００５１】
（実施例４）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化、工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
実施例3と同様にして得たトランスグルタミナーゼの可溶化液（トランスグルタミナーゼ濃度6.67 mg/ml）を、0.6 Mリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で2倍希釈し、室温で30分間保持した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈〕
次いで、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0（25℃））で20倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 ％に調整した。0.05 %に調整されたとき、アルギニン塩酸塩が0.8 Mになるように、2回目の希釈（20倍希釈）用のリン酸ナトリウムに予めアルギニン塩酸塩を添加しておいた。
得られた希釈液を、室温で2時間放置した。放置後、希釈液中のトランスグルタミナーゼ濃度を逆相HPLC（Vydac 214-TP54（Separations Group）；溶離液、A/0.1 ％ TFA   B/0.1 ％ TFA + 80 ％アセトニトリル；流速、1 ml/min；溶出条件、30 ％ Bから50 ％ Bまで1.0 ％/分の直線濃度勾配法）を用いて定量した。可溶化液中のトランスグルタミナーゼ濃度を基準とすると、アルギニン塩酸塩添加後のリフォールディング率は77％となった。【００５２】
（比較例４）
US. Patent No.6833258の実施例9に記載の方法に相当する方法で、トランスグルタミナーゼのリフォールディングを行った。具体的には、実施例３で用いたのと同じトランスグルタミナーゼの水不溶性顆粒を、8M 尿素で溶解させ、5 ℃下でpH 4.0へpH調整後に50希釈して尿素濃度を0.16 Mに調整し、2時間後にpHを6.0へ調整することで構造形成させた。実施例４と同様にしてトランスグルタミナーゼ濃度を逆相HPLCで定量した。尿素で溶解した後の溶液中のトランスグルタミナーゼ濃度を基準とすると、pHを6.0に調整後のリフォールディング率は29％であった。【００５３】
実施例４のリフォールディング率は77 ％であり、従来のリフォールディング技術による比較例４の29 ％に比べて飛躍的に高まった。
それぞれのリフォールディング法によって調製されたトランスグルタミナーゼの酵素活性を合成基質法で確認したところ、実施例４で調製されたトランスグルタミナーゼの酵素活性は37.5 U/mg、比較例４で調製されたトランスグルタミナーゼの酵素活性は36.8 U/mgとなり、双方とも天然のトランスグルタミナーゼと同じ比活性と判断される、30 U/mgを上回る酵素活性を有することが示された。【００５４】
（実施例５）
〔タンパク質の調製〕
大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした単鎖抗体可変領域（HyHEL-10 scFv）の生産系を構築した（Gene 129 (1), 129-134 (1993)）。この生産菌を、坂口フラスコを用いてLB培地中で28 ℃、12時間振とう培養し、HyHEL-10 scFvを菌体内に不溶性顆粒として蓄積させた。菌体を集めて超音波破砕後、懸濁液を5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、HyHEL-10 scFv顆粒を回収した。回収されたHyHEL-10 scFv顆粒を1 % Triton X-100水溶液で2回洗浄後、精製水（ミリQ水）で洗浄してTriton X-100を除去した。得られた顆粒約30mgをアセトン1.5 ml中に懸濁させ、脂質成分を溶解除去した。5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、顆粒を回収後、真空ポンプを用いて一晩減圧乾燥し、不溶性顆粒ペレットを得た。【００５５】
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
このペレット15 mgを秤量し、5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na 含有、pH 8.5）を0.5 ml添加した。攪拌均一化した後、直ちに20 mMリン酸Na、pH 8.5を適宜添加し、エッペンチューブの目盛りを使って1.0 mlに調整した。37 ℃で30分間可溶化した。
得られた可溶化液中のHyHEL-10 scFvの 濃度を決定するために、22 ℃下、11000 g、10分間の条件で遠心分離操作を行い、得られた上清（ラウロイル-L-Glu2.5%、pH8.5）の0.2 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の2.4 μlを添加して1.2 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。この溶液を還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10〜20 %T、およびCBB染色）に供し、タンパク質濃度の判明した抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体（WO96/17078）を比較対照にして定量、可溶化されたHyHEL-10 scFv の濃度は6 mg/mlと決定した。【００５６】
〔工程（A）：添加剤溶液による希釈前の希釈〕
工程（1）で得られた可溶化液0.2 mlに、0.3 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して全液量を0.5 mlとした（ラウロイル-L-Glu濃度1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤溶液による希釈、工程（Ｂ）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、種々の濃度のラウロイル-L-Glu溶液0.38mLを準備した。
そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.4ｍLとした（20倍希釈）。20倍希釈時のラウロイル-L-Glu 濃度は0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.3％、0.4％又は0.5％とし、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.12 mg/mlとした。その後、5 ℃で17時間維持した。次いで、23℃で43時間維持した。
〔リフォールディング率の測定〕
その後、ゲルろ過HPLC（カラム：Superdex 75 GL、10 x 300 mm、GEヘルスケアバイオサイエンス製；展開溶媒：0.1 M リン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8；流速：0.8 ml/分；scFvの280 nm吸光係数、2.02 cm2/mg）でHyHEL-10 scFvのリフォールディング率を求めた。図６に、20倍希釈時のラウロイル-L-Glu濃度とリフォールディング率との関係を示した。リフォールディング率はラウロイル-L-Glu濃度に著しく依存し、0.2〜0.5 %でほぼ定量的な値を示すことがわかった。【００５７】
工程（3）において得られた、ラウロイル-L-Gluの20倍希釈溶液（ラウロイル-L-Glu濃度：0.125 %、アルギニン塩酸塩濃度：0.8 M、scFv濃度：0.12 mg/ml）を用いて、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合がリフォールディング率に与える影響を検討した。20倍希釈溶液を5 ℃で17時間維持した後、23 ℃で43時間維持し、非還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10〜20 %T、およびCBB染色）に供して、HyHEL-10のリフォールディング進行度を、酸化型scFvバンド強度を指標に検討した。図７に結果を示した。【００５８】
還元型グルタチオン添加量が酸化型グルタチオンに対して優位な場合（5 mM/1 mM 〜 2 mM/1 mM、レーン番号4〜6）、SDS-PAGE上で易動度の大きく表れる酸化型scFv（リフォールディングされたscFv、図中のレーン8に矢印で示した）が十分に濃くならなかった。一方、酸化型グルタチオンの添加量比を高めると（還元型、酸化型それぞれを1 mM/1 mM ~ 1 mM/3 mM、レーン番号8〜11）、易動度の大きいscFvバンドが濃くなったが、酸化型グルタチオン添加量が高まりすぎるとscFvバンドのフォーカスが鈍り（1 mM /2 mM（レーン番号10）、1 mM /3 mM（レーン番号11））、scFvのジスルフィド結合になんらかの変化が生じたことがわかった。
したがって、HyHEL-10 scFvの場合、還元型と酸化型グルタチオンをそれぞれ1 mM（レーン番号8））添加するのが適切とわかった。【００５９】
（実施例６）
〔タンパク質の調製〕
大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした単鎖抗体可変領域（抗Fluorescein scFv）の生産系を構築した（Journal of Molecular Biology 343, 685-701 (2004)）。この生産菌を、坂口フラスコを用いてLB培地中で28 ℃、12時間振とう培養し、抗Fluorescein scFv を菌体内に不溶性顆粒として蓄積させた。菌体を集めて超音波破砕後、懸濁液を5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、抗Fluorescein scFv顆粒を回収した。回収された抗Fluorescein scFv顆粒を1 % Triton X-100水溶液で2回洗浄後、精製水（ミリQ水）で洗浄してTriton X-100を除去した。得られた顆粒、約30mgをアセトン1.5 ml中に懸濁させ、脂質成分を溶解除去した。5000 g、20分間の条件で遠心分離操作を行い、顆粒を回収後、真空ポンプを用いて一晩減圧乾燥し、不溶性顆粒ペレットを得た。【００６０】
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
このペレット15 mgを秤量し、5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na 含有、pH 8.5）を0.5 ml添加した。攪拌均一化した後、直ちに20 mMリン酸Na、pH 8.5を適宜添加し、エッペンチューブの目盛りを使って1.0 mlに調整した。37 ℃で30分間可溶化した。
可溶化された抗Fluorescein scFv の濃度を決定するために、得られた可溶化液を22 ℃、11000 g、10分間の条件で遠心分離操作を行った。得られた上清（ラウロイル-L-Glu2.5%、pH 8.5）の0.2 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の1.6 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。この溶液を還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10〜20 %T、およびCBB染色）に供して実施例５と同様に定量し、可溶化された抗Fluorescein scFv の濃度は8 mg/mlと決定した。【００６１】
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
この可溶化液0.2 mlに0.3 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.5 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度1.0 %）、攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液0.38ｍLを準備した。
そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.4ｍLとした（20倍希釈）。20倍希釈時、アルギニン塩酸塩濃度0、0.4 M又は0.8 Mに対して、ラウロイル-L-Glu 濃度が0.05％、0.2％又は0.4％の全９種類とし、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.16 mg/mlとした。その後、10 ℃で17時間維持した。次いで、23 ℃において12時間維持した。
〔リフォールディング率の測定〕
その後、実施例５と同様にして、ゲルろ過HPLC（ただし、scFvの280 nm吸光係数、1.30 cm2/mgを使用）で抗Fluorescein scFvのリフォールディング率を求めた。図８に、20倍希釈時のラウロイル-L-Glu濃度、アルギニン塩酸塩濃度とリフォールディング率との関係を示した。図８から、抗Fluorescein scFvリフォールディング率はアルギニン塩酸とラウロイル-L-Gluの双方に著しく依存するとわかった。特に、アルギニン塩酸塩を0.8 Mに、ラウロイル-L-Gluを0.2 %、あるいは0.4 %に設定することで最も高いリフォールディング率を得た。【００６２】
（実施例７）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
実施例６と同様にして抗Fluorescein scFv不溶性顆粒の可溶化液、8 mg/ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %）を得た。該可溶化液0.08 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の0.64 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
この可溶化液0.08 mlに0.12 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.2 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）、攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、種々の濃度のラウロイル-L-Glu溶液0.18mLを準備した。該ラウロイル-L-Glu溶液は、ラウロイル-L-Glu 濃度が0.150％、0.225％、0.300％又は0.375％とした。
そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.4ｍLとした（10倍希釈）。10倍希釈時のアルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はそれぞれ1mM、3mM、scFv濃度は0.32 mg/mlとした。その後、10℃で17時間維持した。
〔リフォールディング率の測定〕
17時間経過後に実施例６と同じゲルろ過HPLCで抗Fluorescein scFvのリフォールディング率を求めた。図９に、10倍希釈時のラウロイル-L-Glu濃度とリフォールディング率との関係を示した。【００６３】
ラウロイル-L-Glu濃度が0.15 %時に比べ、0.225〜0.375 %ではリフォールディング率はラウロイル-L-Glu濃度に依存して高まったが、0.225〜0.375 %間の変化はさほど顕著ではなかった。リフォールディング終了後、ラウロイル-L-Glu を除去する手間を考慮すると、0.3 %程度の添加量が好ましいとわかった。【００６４】
（実施例８）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
実施例６と同様にして抗Fluorescein scFv不溶性顆粒の可溶化液、6 mg/ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %）を得た。該可溶化液0.2 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の1.6 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
この可溶化液0.2 mlに0.3 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.5 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液0.5ｍLに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液4.5mLを添加した（10倍希釈）。10倍希釈時のラウロイル-L-Glu 濃度が0.1％、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.24mg/mlとした。その後、8.5 ℃で17時間維持した。その後、45 ℃で4時間加熱した。
〔リフォールディング率の測定〕
次いで、実施例６と同様にしてゲルろ過HPLCで経時的に抗Fluorescein scFvのリフォールディング率を求めた。その結果を図１０に示した。リフォールディング率は、45 ℃で加熱することによって少なくとも10%となり、4時間加熱することにより20 %を越えた。【００６５】
（実施例９）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
実施例６と同様にして抗Fluorescein scFv不溶性顆粒の可溶化液、6 mg/ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %）を得た。該可溶化液0.05 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の0.4 μlを添加して0.8 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
この可溶化液0.05 mlに0.075 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.125 mlに調整し（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）、攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液0.12ｍLに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液1.08 mLを添加し（10倍希釈）、全量を1.2ｍLとした。10倍希釈時のラウロイル-L-Glu 濃度が0.1％、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、酸化型と還元型グルタチオンの濃度はいずれも1mM、scFv濃度は0.24mg/mlとした。0.4 mlずつ3分割し、それぞれ5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持した。それぞれのリフォールディング率を図１１に示した。
更にそれぞれを0.2 mlずつ2分割し、一方を45 ℃で４時間加熱し、残る一方を23 ℃で24時間維持した後に45 ℃で4時間加熱した。それぞれのリフォールディング率を図１２に示した。【００６６】
5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持した段階では、その温度に応じてリフォールディング率の高まることがわかったが、いずれも10 %を少し超える程度であった。それらを45 ℃で4時間加熱すると、リフォールディング率は加熱前の維持温度に依存して高まった。15 ℃において維持したものが45 ℃加熱後に最も高いリフォールディング率を示したが、10 ℃において維持したものと大差なかった（図１１）。
一方、5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持後、更に23 ℃において24 時間維持し、次いで45 ℃で4時間加熱すると、リフォールディング率は、5 ℃、10 ℃又は15 ℃において18.5時間維持後に直ちに45℃に加熱したときよりも顕著に高まった。その際、最初の維持を10 ℃で行うと、15 ℃で維持した場合よりもリフォールディング率が高まり、最終的に45 %のリフォールディング率を示すことがわかった（図１２）。
以上より、10 ℃で18.5 時間、23 ℃で24時間維持した後に45 ℃で4時間加熱することで、scFvのリフォールディング率が最も高まるとわかった。【００６７】
（実施例１０）
〔タンパク質の調製〕
消化酵素（パパイン）反応用緩衝液（20 mM リン酸ナトリウム、10 mM EDTA）に溶解した抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体（WO96/17078）の約55 mg（18.2mg/ml、3 ml）を20 mM Cysを添加した同緩衝液で2倍希釈し、Cys濃度を10 mMに調整した。ここに、予め活性化処理を施した固定化パパインゲル（ピアース製）の懸濁液2 mlを添加した。37 ℃で14時間振とうし、遠心分離（2000 g、5分間）して固定化パパインゲルを除いた。これを、PBSで平衡化したHiTrap rProtein A FF（GEヘルスケアバイオサイエンス製）に負荷して素通り画分を回収後、限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画30 kDa、ミリポア製）で濃縮して、約30 mg（11.5 mg/ml）のFab（抗原結合部位）を得た。【００６８】
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
得られたFabの0.5 mlに、等量の5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na含有、pH 8.5）を添加して全量を1mlとした（2.5 %ラウロイル-L-Glu溶液）。これを37 ℃で30分間加熱し、可溶化液とした。この可溶化液0.12 mlに、100 mM DTT溶液（pH 7）の1.46 μlを添加して1.2 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した（還元変性Fab、5.75 mg/ml）。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
得られた還元変性Fabの0.12 mlに、0.18 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.3 mlに調整した（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液0.18ｍLを準備した。
そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.02mLずつ添加し、最終的に0.2ｍLとした（10倍希釈）。10倍希釈時、アルギニン塩酸塩濃度0、0.2 M、0.4 M又は0.8 Mに対して、ラウロイル-L-Glu 濃度が0.1％、0.2％又は0.3％の全１２種類とし、酸化型と還元型グルタチオン濃度はそれぞれ1mM及び5 mM、Fab濃度は0.23 mg/mlとした。その後、10 ℃で17時間維持した。次いで、23 ℃において24時間維持した。【００６９】
その後、実施例５と同じ非還元SDS-PAGEでFabバンドを観察した。図１３に結果を示した。アルギニン塩酸塩を全く添加しない場合（レーン番号2）、高分子量の会合凝集体が形成した。一方、アルギニン塩酸塩を0.4 M以上、あるいはラウロイル-L-Gluを0.2 %以上添加すると、会合凝集体の形成は顕著に抑制され（レーン番号8〜13）、両成分を適度に共存させることによってFabの会合凝集を抑制できるとわかった。しかし、目的のFabバンドはいずれの条件でも明瞭には観察されなかった。
これら全１２種類の各サンプルを再び10倍希釈した。希釈後の溶液中のラウロイル-L-Glu濃度は0.05 %、アルギニン塩酸塩濃度は0.08 M、酸化型及び還元型グルタチオン濃度はそれぞれ1mMと5 mMに調整した。その後、5 ℃で3時間維持した。次いで、限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて10 倍濃縮し、8.5 ℃で72時間維持した。つまり、10倍希釈と10倍濃縮が相殺して、この間のFab濃度は最初の希釈時と同じ0.23 mg/mlに維持されたことになる。非還元SDS-PAGEでリフォールディングされたFabのバンドを観察した。【００７０】
図１４に示すとおり、全てのサンプルにおける最終組成が同じにも関わらず、最初の希釈時の組成に応じてFabバンドの鮮明さが大きく変動した。最初の希釈時にアルギニン塩酸塩を添加しないと、2回目の希釈後もFabは殆どリフォールディングされなかった（レーン番号2〜4）。一方、1回目の希釈時にアルギニン塩酸塩を0.4 M（レーン番号8〜10）、あるいは0.8 M（レーン番号11〜13）添加した場合、2回目の希釈後にFabバンドが最も強く観察されたが、1回目希釈時のラウロイル-L-Glu濃度は0.1 %が良く（レーン番号8，11）、0.2％（レーン番号9，12）、0.3 %（レーン番号10，13）と高めるとFabバンドは希薄になった。
以上より、最初の希釈でアルギニン塩酸塩を0.8 Mに、ラウロイル-L-Glu濃度を0.1 %に調整して維持し、次の希釈でアルギニン塩酸塩濃度を0.08 Mに、ラウロイル-L-Glu濃度を0.05 %に調整して維持することで、Fabのリフォールディングがより効率的に行えることがわかった。【００７１】
（実施例１１）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
実施例１０と同様にしてFabの可溶化液（2.5 %ラウロイル-L-Glu溶液）0.4 mlを得た。該可溶化液100 mM にDTT溶液（pH 7）4.85 μlを添加して1.2 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した（還元変性Fab、5.75 mg/ml）。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
得られた還元変性Fabの0.4 mlに0.6 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して1.0 mlに調整した（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％溶液とは別に、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型及び還元型グルタチオンを含む、ラウロイル-L-Glu溶液0.135ｍLを準備した。該ラウロイル-L-Glu溶液のラウロイル-L-Glu 濃度は0.1％、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 M、Fab濃度は0.23 mg/mlであり、酸化型グルタチオン濃度1 mM、2 mM又は5 mMに対して還元型グルタチオン0.5mM、1 mM、2 mM又は5 mMの全６種類とした。
そこに、工程（Ａ）で得られたラウロイル-L-Glu濃度1.0％を0.15mLずつ添加し、最終的に1.5ｍLとした。
その後、10 ℃で17時間維持し、次いで23 ℃で6時間維持した。その後、各希釈液の酸化型および還元型グルタチオンと同じ濃度のグルタチオンを含み、ラウロイル-L-Gluの適宜添加された緩衝液を用いて10倍希釈し、ラウロイル-L-Gluを0.05 %に、アルギニン塩酸塩濃度を0.08 Mに、酸化型グルタチオン濃度1 mM、2 mM又は5 mMに対して還元型グルタチオン0.5mM、1 mM、2 mM又は5 mMの全６種類に調整した。
その後、8.5 ℃で15時間維持した。限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて10 倍濃縮して8.5 ℃で3時間維持し、実施例５と同じ非還元SDS-PAGEでリフォールディングされたFabのバンドを観察した。【００７２】
図１５に示すとおり、還元的な条件下ではFabバンドは形成されず、酸化型グルタチオンの濃度が高めることでFabがリフォールディングされた。scFvとは異なり、Fabのリフォールディングには酸化的な条件が必要であった。以上、レドックス条件を整えることで、最初の希釈開始から41時間程度でFabをリフォールディングできることがわかった。【００７３】
（実施例１２）
〔タンパク質の調製〕
大腸菌BL21株(DE3)を生産宿主とした単鎖抗体可変領域（抗Fluorescein scFv；Journal of Molecular Biology 343, 685-701 (2004)）のFc融合タンパク質（抗Fluorescein scFv Fc fusion）生産系を構築した。この生産菌を、坂口フラスコを用いてLB培地中で28 ℃、12時間振とう培養し、抗Fluorescein scFv Fc fusionを菌体内に不溶性顆粒状に蓄積させた。菌体を集めて超音波破砕後、懸濁液を5000 g、20分間の遠心分離に供して抗Fluorescein scFv Fc fusion不溶性顆粒を回収した。回収された不溶性顆粒を1 % Triton X-100水溶液で2回洗浄後、ミリQ水で洗浄してTriton X-100を除去した。得られた顆粒、約30mgをアセトン1.5 ml中に懸濁させ、脂質成分を溶解除去した。5000 g、20分間の遠心分離に供して顆粒を回収後、真空ポンプを用いて一晩減圧乾燥し、不溶性顆粒ペレットを得た。【００７４】
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
上でえられたペレット15 mgを秤量し、0.5 mlの5 % ラウロイル-L-Glu（20 mM リン酸Na含有、pH 8.5）を添加した。攪拌均一化した後、直ちに20 mMリン酸Na、pH 8.5を適宜添加し、エッペンチューブの目盛りを使って1.0 mlに調整した。37 ℃で30分間可溶化し、可溶化液を得た。
22 ℃下、11000 g、10分間の遠心分離に供した。得られた上清の0.27 mlに100 mM DTT溶液（pH 7）の2.7 μlを添加して1.0 mM DTTに調整後、37 ℃で60分間加温した。この溶液を還元型のSDS-PAGE（Biorad製レディーゲルJ、10〜20 %T、およびCBB染色）に供して実施例５と同様に定量し、可溶化された抗Fluorescein scFv Fc fusionの濃度を3 mg/mlと決定した。しかし、この生産系では培養中に抗Fluorescein scFv Fc fusionの分解が進行し、不溶性顆粒中の抗Fluorescein scFv Fc fusion含量は30 %以下となった。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
得られた還元変性Fabの0.27 mlに0.405 mlの20 mM リン酸Na、pH 8.0を添加して0.675 mlにした（ラウロイル-L-Glu濃度、1.0 %）。攪拌後、5 ℃で30分間維持した。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
工程（A）で得られた液体0.6 mlに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを含む緩衝液5.4 mlを添加して全量を6.0ｍL とした（10倍希釈）。この溶液のラウロイル-L-Glu濃度は0.1 %に、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 Mに、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの濃度はそれぞれ1 mMと5 mMに、抗Fluorescein scFv Fc fusion濃度は0.12 mg/mlにそれぞれ調整した。
その後、10 ℃で17時間維持後、0.3 mlずつ2本に分割し、一方を8.5 ℃で120時間維持し、残る一方を23 ℃で120時間維持した。【００７５】
各温度で維持を開始してから48時間目及び120時間目に、実施例５と同様にして、非還元SDS-PAGEでリフォールディングされた抗Fluorescein scFv Fc fusionバンドを観察した。
図１６に示すとおり、48時間目に抗Fluorescein scFv Fc fusionバンドを観察し（矢印で示した位置）、120時間目には更にそのバンド強度が強まった。10℃において17時間維持後、8.5℃で維持するよりも23℃で維持する方が、48時間維持の場合も120時間維持の場合もバンド強度が強くなった。希釈後に10 ℃で17時間維持した後、23 ℃に高めることでリフォールディングの進行を促進できることわかった。【００７６】
（実施例１３）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
実施例５と同様にしてHyHEL-10 scFvの可溶化液0.3 ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %、scFv濃度、3.0 mg/ml）を得た。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
得られた可溶化液に0.45 mlの20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0を添加し、攪拌後、5 ℃で30分間維持した（ラウロイル-L-Glu、1 %）。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
この0.65 mlに各添加剤を加えた緩衝液、5.85 mlを加えて10倍希釈し、ラウロイル-L-Glu濃度を0.3 %に、アルギニン塩酸塩濃度を0.8 Mに、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの濃度を共に1 mMに、HyHEL-10 scFv濃度を0.12 mg/mlにそれぞれ調整した。10 ℃で17時間維持した後、35 ℃で2時間加熱した。
その後、50 mMリン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH9 8.0で平衡化したPD-10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス製）に負荷して緩衝液を置換し、得られた7.5 mlを8.5 ℃に12時間維持した。
〔工程（C）：精製〕
上で得られた溶液を、限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて15倍濃縮し、0.1 Mリン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8で平衡化されたSuperdex 75 GL（10 mm x 300 mm）に負荷し、精製scFvを分画した。
得られた画分を、実施例５で用いたゲルろ過HPLC及び非還元SDS-PAGEに供し、限外ろ過膜で精製したscFvが高純度であることを確認した。SDS-PAGEでは、実線の矢印で示す位置のscFvに加え、点線の矢印で示す低分子量の成分が見られたが、これは生産宿主に用いた大腸菌由来の残留プロテアーゼによって分解されたscFv断片であり、今回のリフォールディングとは関係がない。上で得られた画分を、さらに多角度光散乱装置を装備したフィールドフローフラクショネーションに供したところ、分子量33334の観測値を得た。これにより、精製scFvが水溶液中で単量体を形成していることを確認した。分析結果を図17に示した。【００７７】
（実施例１４）
〔工程（1）：界面活性剤による変性タンパク質の可溶化〕
実施例６と同様にして抗Fluorescein scFvの可溶化液1.4 ml（ラウロイル-L-Glu濃度、2.5 %、scFv濃度、5.0 mg/ml）を得た。
〔工程（A）：添加剤による希釈前の希釈〕
得られた可溶化液に、2.1 mlの20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0を添加し、攪拌後、5 ℃で30分間維持した（ラウロイル-L-Glu、1 %）。
〔工程（2）：添加剤による希釈、工程（B）：ジスルフィド結合の形成〕
得られた希釈液3.45 mlに、添加剤としてアルギニン塩酸塩、酸化還元物質として酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを含む緩衝液31.05 mlを加えて全量を34.50ｍLとした（10倍希釈）。この溶液のラウロイル-L-Glu濃度は0.3 %に、アルギニン塩酸塩濃度は0.8 Mに、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの濃度はいずれも1 mMに、抗Fluorescein scFv濃度は0.2 mg/mlにそれぞれ調整した。
8.5 ℃で17時間維持後、23 ℃で24時間維持し、さらに45 ℃で4時間加熱した。その後、0.2 Mアルギニン塩酸塩を含むPBSで平衡化させたSephadex G25カラム（5 cm x 10 cm；GEヘルスケアバイオサイエンス製）に負荷して緩衝液を置換し、得られた42 mlを8.5 ℃に12時間維持した。
〔工程（C）：精製〕
このうち35 mlを限外ろ過膜（アミコンウルトラ-15、分子量分画10 kDa、ミリポア製）を用いて3.7倍濃縮し、0.1 Mリン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8で平衡化されたSuperdex 75 pg （2.6 cm x 60 cm）に負荷し、抗Fluorescein scFvを分画した。
得られた画分を、実施例５で用いたゲルろ過HPLC及び非還元SDS-PAGEに供し、抗Fluorescein scFvが高純度であることを確認した。得られた画分をさらに、多角度光散乱装置を装備したフィールドフローフラクショネーションに供したところ、分子量35200の観測値を得た。このことから、抗Fluorescein scFvが水溶液中で単量体を形成していることを確認した。この精製抗Fluorescein scFv（7.9 μM）をさらに、100 mMトリス塩酸塩に溶解した0.6 μM Fluorescein（和光純薬製）溶液に滴下し、23 ℃で1時間維持したのち、Fluorescein蛍光（励起波長、480 nm；蛍光波長、515 nm）を測定した。その結果、抗Fluorescein scFvの滴下量に応じてFluorescein蛍光が減じた。このことから、抗Fluorescein scFvは、目的とする天然状態の構造を再構成できたことがわかった。分析結果を図１８に示した。【００７８】
（比較例５）
従来技術のリフォールディング例として、津本らの段階透析法（The Journal of Biological Chemistry 278 (11), 8979-8987 (2003)）を用いて、HyHEL-10及び抗Fluorescein scFvのリフォールディングを行った。
実施例５及び実施例９で用いたHyHEL-10及び抗Fluorescein scFvの不溶性顆粒（それぞれ8.8 mg、1.83 mgのscFvを含む）を、6M 塩酸グアニジンを含む20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.5のそれぞれ43.75 ml、9.13 mlに懸濁し、37 ℃で30分間可溶化した。
ここへ、最終的に13 mMになるようにDTTを加え、37 ℃で1時間加熱し、SS結合を還元した。このうち0.5 mlを100 mlの透析外液1から6に対して8.5 ℃で順次透析し、65 時間目に透析内液を回収した。【００７９】
透析外液の各組成は以下の通りである：
1．10 mMリン酸ナトリウム、6 M塩酸グアニジン、pH 8
2．10 mMリン酸ナトリウム、3 M塩酸グアニジン、pH 8
3．10 mMリン酸ナトリウム、2 M塩酸グアニジン、pH 8
4．20 mMリン酸ナトリウム、1 M塩酸グアニジン、0.4 Mアルギニン塩酸塩、
1 mM酸化型グルタチオン、1 mM 還元型グルタチオン、pH 8
5．20 mMリン酸ナトリウム、0.5 M塩酸グアニジン、0.4 Mアルギニン塩酸塩、
1 mM酸化型グルタチオン、1 mM 還元型グルタチオン、pH 8
6．20 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0。【００８０】
透析内液を遠心分離し（12000 g、10分間）、得られた上清を、実施例５と同じゲルろ過HPLC（カラム：Superdex 75 GL、10 x 300 mm、GEヘルスケアバイオサイエンス製；展開溶媒：0.1 M リン酸ナトリウム、0.2 Mアルギニン塩酸塩、pH 6.8；流速：0.8 ml/分；HyHEL-10は2.02 cm2/mg、抗Fluorescein scFvは1.3 cm2/mgを定量用吸光係数とした）に負荷してリフォールディング率を求めた。その結果、HyHEL-10は9.9 %、抗Fluorescein scFvは5.5 %と、それぞれ実施例５（定量的なscFv回収率、図６）、実施例９（45 %、図１２）のリフォールディング率を大きく下回った。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】種々の界面活性剤を用いて可溶化したrhIL-6の量（参考例１）を示す。
【図２】種々の界面活性剤を用いて可溶化したrhIL-6の量（参考例２）を示す。
【図３】ラウロイル-L-Glu濃度がrhIL-6可溶化量に与える影響（参考例３）を示す。
【図４】ラウロイル-L-Glu濃度と最大蛍光波長及び最大蛍光強度との関係（参考例４）を示す。
【図５】ラウロイル-L-Glu濃度の変化に伴う最大蛍光波長の変化（参考例５）を示す。
【図６】ラウロイル-L-Glu濃度が HyHEL-10 scFv のリフォールディング率に与える影響（実施例５）を示す。
【図７】酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合が HyHEL-10 scFv のリフォールディング率に与える影響（実施例５）を示す。
【図８】ラウロイル-L-Glu濃度及びアルギニン塩酸塩濃度が、抗Fluorescein scFvのリフォールディング率に与える影響（実施例６）を示す。
【図９】ラウロイル-L-Glu濃度が、抗Fluorescein scFv のリフォールディング率に与える影響（実施例７）を示す。
【図１０】加熱時間が抗Fluorescein scFvのリフォールディング率に与える影響（実施例８）を示す。
【図１１】5℃、10℃又は15℃において18.5時間維持し、それらを更に45℃において4時間維持したときの抗Fluorescein scFvのリフォールディング率（実施例９）を示す。
【図１２】5℃、10℃又は15℃において18.5時間維持し、それらを更に23℃において24時間維持し、それらを更に45℃において4時間維持したときの抗Fluorescein scFvのリフォールディング率（実施例９）を示す。
【図１３】ラウロイル-L-Glu濃度及びアルギニン塩酸塩濃度の変化に伴う抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体のFab バンドの変化（実施例１０）を示す。
【図１４】図１３のレーン番号２〜１３を10倍希釈し、10倍濃縮した場合のFab バンドの変化（実施例１０）を示す。
【図１５】酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合が抗フォンビルブランド因子モノクローナル抗体の Fab バンドに与える影響（実施例１１）を示す。
【図１６】10℃において17時間維持した後、8.5℃又は23℃で48時間又は120時間維持したときの抗Fluorescein scFv Fc fusion バンド（実施例１２）を示す。
【図１７】限外ろ過膜により精製した後のHyHEL-10 scFv のゲルろ過ＨＰＬＣのダイアグラムと HyHEL-10 scFv バンド（実施例１３）を示す。
【図１８】限外ろ過膜により精製した後の抗Fluorescein scFv のゲルろ過ＨＰＬＣのダイアグラムと 抗Fluorescein scFv バンド（実施例１４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１８】
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【図７】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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