(57)【要約】  この出願は、芽胞形成菌の発芽誘起方法、具体的には、フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を用いて、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス(Geobacillus)属及びエアリバチルス(Aeribacillus)属からなる群から選択される芽胞形成菌の発芽を誘起させることを含む、芽胞形成菌の発芽誘起方法、及び発芽誘起剤、並びに、芽胞子形成菌の発芽用キットに関する。
2013035804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を用いて、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス(Geobacillus)属及びエアリバチルス(Aeribacillus)属からなる群から選択される芽胞形成菌の発芽を誘起させることを含む、芽胞形成菌の発芽誘起方法。
【請求項２】
前記化合物が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、もしくはクマル酸、又はそれらの塩である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、又はバチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダスである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物の有効濃度が1〜4000ppmである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を含む、バチルス属、ジオバチルス属又はエアリバチルス属に属する芽胞形成菌の発芽誘起剤。
【請求項６】
前記化合物が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、もしくはクマル酸、又はそれらの塩である、請求項5に記載の発芽誘起剤。
【請求項７】
前記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、又はバチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダスである、請求項5又は6に記載の発芽誘起剤。
【請求項８】
バチルス属、ジオバチルス属及びエアリバチルス属からなる群から選択される芽胞形成菌体及び/又はその芽胞と、請求項5〜7のいずれか1項に記載の発芽誘起剤とを含む、芽胞形成菌の発芽用キット。
【請求項９】
前記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、バチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダス、である、請求項8に記載の発芽用キット。
【請求項１０】
前記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)、バチルス ズブチルス NBRC12195株、バチルス ズブチルス NBRC14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC3032株、バチルス コアギュランス NBRC12583株、バチルス コアギュランス NBRC3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC 13737株、又はエアリバチルス パリダス TK6004株(FERM BP-08597)である、請求項8又は９に記載の発芽用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス(Bacillus)属細菌等の芽胞形成菌の発芽誘起のための方法、剤及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属細菌などの芽胞形成菌は、芽胞を形成した状態で耐熱性、耐乾燥性、植物病虫害防除能などの環境抵抗性を有し、また家畜、家禽、魚類などの整腸作用などの性質を有するため、特に農業分野での利用が考えられている（特許文献1）。例えば、バチルス属細菌を未発酵有機物とともに土壌に投入することによって、ストレプトミセス属の植物病原菌が原因となる土壌病害を防除することが報告されている（特許文献2）。さらに、バチルス属細菌は、有機性廃棄物の堆肥化に寄与することが知られており、またジオバチルス属細菌を天然由来増粘性多糖類及び吸水性繊維質材料と混合して堆肥化調整剤として使用し適度の硬さの堆肥原料とすることが提案されている（特許文献3）。【０００３】
芽胞形成菌は、芽胞の形態で長期間休眠状態を維持しているが、一旦発芽が誘起されると菌が栄養細胞となり増殖する。このような発芽の促進方法に関して、例えば特許文献4には、バチルス ズブチルス(Bacillus subtilis)の発芽性因子として、Ala、Val、Asn、Glnなどのアミノ酸を含む、胞子発芽率を増大させる胞子発芽培地が開示されている。また、特許文献5には、バチルス ズブチルスの胞子及び胞子発芽促進剤を配合した農園芸用殺菌剤組成物が開示されている。特許文献6には、バチルス属細菌を含む汚泥と発芽促進剤を混合して、有機性廃水を処理する方法が開示されている。【０００４】
さらにまた、本発明と関係するフェノール骨格を有する化合物の利用について、特許文献7には、グアイアコール産生菌の検出法として、メトキシフェノール骨格を有する化合物（バニリン、バニリン酸、フェルラ酸）を使用することが記載されている。また、非特許文献1にはバチルス ズブチルスの生育において、バニリン、バニリン酸及びフェルラ酸が利用されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-236286号公報
【特許文献２】特開2007-153873号公報
【特許文献３】特許第4272251号公報
【特許文献４】特表2001-511356号公報
【特許文献５】特開平8-175921号公報
【特許文献６】特開2001-286884号公報
【特許文献７】特開2011-19506号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】G. Gurujeyalakshmi and A. Mahadevan, Current Microbiology, 1987; 16:69-73
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、芽胞形成菌の発芽を誘起する方法、剤及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは今回、フェノール骨格を有する化合物が芽胞形成菌の発芽を誘起することを見出し、これによって本発明を完成した。【０００９】
本発明は、以下の特徴を包含する。【００１０】
本発明は、第1の態様において、フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を用いて、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス(Geobacillus)属及びエアリバチルス(Aeribacillus)属からなる群から選択される芽胞形成菌の発芽を誘起させることを含む、芽胞形成菌の発芽誘起方法を提供する。【００１１】
その実施形態において、上記化合物が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、もしくはクマル酸、又はそれらの塩であることを特徴とする。【００１２】
別の実施形態において、上記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、又はバチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダスであることを特徴とする。【００１３】
別の実施形態において、上記化合物の有効濃度が、1〜4000ppmである。【００１４】
本発明はまた、第2の態様において、フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を含む、バチルス属、ジオバチルス属又はエアリバチルス属に属する芽胞形成菌の発芽誘起剤を提供する。【００１５】
その実施形態において、上記化合物が、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、もしくはクマル酸、又はそれらの塩であることを特徴とする。【００１６】
別の実施形態において、上記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、又はバチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダスであることを特徴とする。【００１７】
本発明はまた、第3の態様において、バチルス属、ジオバチルス属及びエアリバチルス属からなる群から選択される芽胞形成した菌体及び/又はその芽胞と、上記の発芽誘起剤とを含む、芽胞形成菌の発芽用キットを提供する。【００１８】
その実施形態において、上記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、又はバチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダスであることを特徴とする。【００１９】
別の実施形態において、上記芽胞形成菌が、バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)、バチルス ズブチルス NBRC12195株、バチルス ズブチルス NBRC14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC3032株、バチルス コアギュランス NBRC12583株、バチルス コアギュランス NBRC3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC13737株、又はエアリバチルス パリダス TK6004株((バチルス パリダス TK6004(寄託番号FERM BP-08597)と同一菌株)であることを特徴とする。【００２０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-196153号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、栄養成分に関係なく目的の芽胞形成菌の発芽を誘起することができるため、栄養型に変化した菌がその後に必要な栄養成分を得ることにより、すみやかに増殖することができ、堆肥化を促進する場合や芽胞形成菌の製造などに有利である。また、栄養成分を加えるのではないので敷料や食品中に含まれる有害な芽胞形成菌の発芽のみを誘起することにより、効率良く殺菌できるなどの利点が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】バチルス ズブチルスC-3102株（FERM BP-1096）を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸（Ferulic acid）又はバニリン酸(Vanillic acid)を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。発芽が誘起されるとOD630の値が低下する。
【図１−２】バチルス リケニフォルミス NBRC12200株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−３】バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィNBRC101239株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−４】ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC13737株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−５】エアリバチルス パリダス TK6004株(バチルス パリダス TK6004(FERM BP-08597)と同一菌株)を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−６】バチルス リケニフォルミス NBRC12195株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−７】バチルス リケニフォルミス NBRC14206株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−８】バチルス アミロリキファシエンス NBRC3022株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−９】バチルス アミロリキファシエンス NBRC3032株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−１０】バチルス コアギュランス NBRC12583株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図１−１１】バチルス コアギュランス NBRC3887株を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸又はバニリン酸を含有する蒸留水、対照であるL-アラニン(「L-Ala」）を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【図２−１】バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)の発芽に及ぼすフェルラ酸濃度の影響を示す図である。
【図２−２】バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)の発芽に及ぼすバニリン酸濃度の影響を示す図である。
【図３】バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)を芽胞形成培地で3日間培養したのち、菌体を、本発明の発芽誘起剤であるフェルラ酸、バニリン酸又はp-クマル酸を含有する蒸留水、或いは陰性対照である蒸留水（「D.W.」）に懸濁し37℃、150rpmで振とうしたときのOD630の値の経時的変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
＜発芽誘起方法＞
本発明は、フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を用いて、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス(Geobacillus)属又はエアリバチルス(Aeribacillus)属からなる群から選択される芽胞形成菌の発芽を誘起させることを含む、芽胞形成菌の発芽誘起方法を提供する。
【００２５】
フェノール骨格を有する化合物は、メトキシフェノール骨格を有する化合物を含み、例えば次式：
【化１】
2013035804.tif 000003
【００２６】
［式中、Rは、-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3のアルキル基又はC1-C3のアルケニル基であり、該アルキル基及びアルケニル基は、-OH、-C(O)H又はCOOHで置換されていてもよい］
で表される化合物又はそれらの塩である。この化合物は、本出願人の特開2011-19506号公報にも記載されている。
【００２７】
上記化合物として、芽胞形成菌の発芽を誘起する限り、いかなる化合物も包含するが、非限定的に、例えばバニリン（R: -C(O)H）、バニリン酸（R: -COOH）、フェルラ酸（R: -CH=CH-COOH）、グアイアコール（R: -H）、4-ハイドロキシ -3-メトキシフェニルアクリルアルデヒド（R: -CH=CH-C(O)H）、4-ハイドロキシ-3-メトキシフェニルプロピオン酸（R: -CH2CH2COOH）、4-ハイドロキシ-3-メトキシフェニルメチルアルコール（R: -CH2OH）、メトキシハイドロキノン（R: -OH）、4-ハイドロキシ-3-メトキシフェニルアセトアルデヒド（R: -C(O)CH3）、及び4-ビニルグアイアコール（R: -CH2=CH2）、並びにそれらの塩を挙げることができる。これらの化合物はすべて、微生物により産生される代謝産物である。好ましい化合物は、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸又はそれらの塩である。
【００２８】
或いは、フェノール骨格を有する化合物は、ヒドロキシ桂皮酸、例えばo-、m-又はp-クマル酸、或いはその塩である。
【００２９】
上記化合物の塩は、例えば、Na、Kなどのアルカリ金属塩、アンモニアや有機アミン類とのアンモニウム塩などである。有機アミンには、例えば脂肪族アミン、芳香族アミンなどが含まれる。
【００３０】
芽胞形成菌は、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス(Geobacillus)属及びエアリバチルス(Aeribacillus)属からなる群から選択される。
【００３１】
バチルス属に属する細菌には、非限定的に、例えばバチルス ズブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス アミロリキファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス プミルス（Bacillus pumils）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス ハロデユランス（Bacillus halodurans）、納豆菌(バチルス ズブチルス ナットウ：Bacillus subtilis natto)、バチルス アシディコーラ（Bacillus acidicola）、バチルス アシドプルリティカス（Bacillus acidopullulyticus）、バチルス アシドボランス（Bacillus acidovorans）、バチルス アエオリウス（Bacillus aeolius）、バチルス アエスチャリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス アガラドヘレンス（Bacillus garadhaerens）、バチルス アキバイ（Bacillus akibai）、バチルス アルカリイヌリナス（Bacillus alcaliinulinus）、バチルス アルカリフィルス（Bacillus alcalophilus）、バチルス アルギコーラ（Bacillus algicola）、バチルス アルカリトレランス（Bacillus alkalitolerans ）、バチルス アルカロガヤ（Bacillus alkalogaya）、バチルス アルベアユエンシス（Bacillus alveayuensis）、バチルス アミリエンシス（Bacillus amiliensis）、バチルス アミノボランス（Bacillus aminovorans）、バチルス アクイマリス（Bacillus aquimaris）、バチルス アルブチニボランス（Bacillus arbutinivorans）、バチルス アレノシイ（Bacillus arenosi）、バチルス アルセニシセレナティス（Bacillus arseniciselenatis）、バチルス アルセニカス（Bacillus arsenicus ）、バチルス アーヴァイ（Bacillus arvi）、バチルス アサヒイ（Bacillus asahii）、バチルス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus ）、バチルス アキサクィエンシス（Bacillus axarquiensis）、バチルス アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス バディウス（Bacillus badius）、バチルス バエクリュンエンシス（Bacillus baekryungensis）、バチルス バーバリカス（Bacillus barbaricus）、バチルス バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス ベンゾボランス（Bacillus benzoevorans）、バチルス ボゴリエンシス（Bacillus bogoriensis）、バチルス ボロフィリカス（Bacillus borophilicus）、バチルス ボロトレランス（Bacillus borotolerans）、バチルス カルドリティカス（Bacillus caldolyticus ）、バチルス カルドテナックス（Bacillus caldotenax）、バチルス カルドベロックス（Bacillus caldovelox）、バチルス カーボニフィルス（Bacillus carboniphilus）、バチルス カザマンセンシス（Bacillus casamancensis）、バチルス カテニュロータス（Bacillus catenulatus）、バチルス セルロシリティカス（Bacillus cellulosilyticus）、バチルス スフェリカス（Bacillus sphericus）、バチルス チュリンゲンシス（Bacillusthuringiensis）、バチルス クローシィ(Bacillus clausii)などが含まれる。
【００３２】
ジオバチルス属に属する細菌には、非限定的に、例えばジオバチルス アナトリカス（Geobacillus anatolicus）、ジオバチルス カウエ（Geobacillus kaue）、ジオバチルス カルドプロテオリティカス（Geobacillus caldoproteolyticus）、ジオバチルス カルドキシロシリティカス（Geobacillus caldoxylosilyticus）、ジオバチルス デビリス（Geobacillus debilis ）、ジオバチルス ガーゲンシス（Geobacillus gargensis）、ジオバチルス コーストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、ジオバチルス ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、ジオバチルス サーモカテニュロータス（Geobacillus thermocatenulatus ）、ジオバチルス サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）、ジオバチルス サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius )、ジオバチルス サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）、ジオバチルス ウラリカス（Geobacillus uralicus）、ジオバチルス ウゼネンシス（Geobacillus uzenensis ）、ジオバチルス バルカニ（Geobacillus vulcani）などが含まれる。
【００３３】
エアリバチルス属に属する細菌には、非限定的に、例えばエアリバチルス パリダス(Aeribacillus pallidus)が含まれる（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2010), 60, 1600-1604）。
【００３４】
上に例示した菌は、芽胞形成菌であることが公知のものである（特開2007-236286号公報及び特開2007-332128号公報、等）。
【００３５】
後述の実施例では、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、バチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、及びエアリバチルス パリダス、具体的には、バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)、バチルス ズブチルス NBRC 12195株、バチルス ズブチルス NBRC 14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC 12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC 101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3032株、バチルス コアギュランス NBRC 12583株、バチルス コアギュランス NBRC 3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC 13737株、又はエアリバチルス パリダス TK6004株(FERM BP-08597)を選択し、それらの菌株の芽胞の形成と発芽について検討した。
【００３６】
上記の芽胞形成菌において芽胞を形成するための培養では、バチルス属細菌、ジオバチルス属細菌又はエアリバチルス属細菌が利用可能な窒素源と炭素源を使用するとよい。窒素源として、例えば、肉エキス、酵母エキス、ペプトンなどのタンパク質、硝酸塩やアンモニウム塩などの無機窒素源、アミノ酸類、ペプチド類、コーンスティープリカーなどが挙げられる。炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、マルトース等の糖類、デンプン、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質などが挙げられる。培地のpHは、菌の種類に応じて最適pHが選択されるべきであるが、例えばpH 7.0〜9.0の範囲である。
【００３７】
培養温度は、通常約25〜40℃であるが、耐熱性であれば40℃を超えてもよい。
【００３８】
培養は、通常、好気的条件下で、バッチ式培養、撹拌培養もしくは振とう培養で行いうる。
【００３９】
上記の手法で芽胞を形成した菌体をろ過、遠心分離などの分離手段で分離したのち、発芽用培地に投入し発芽を誘起する。発芽用培地は、上記の芽胞形成培地と同様でよいが、発芽用培地には、フェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上が添加される。好適な該化合物は、メトキシフェノール骨格を有する化合物、例えばバニリン、バニリン酸もしくはフェルラ酸、又はそれらの塩である。或いは、フェノール骨格を有する化合物の他の例が、ヒドロキシ桂皮酸、例えばo-、m-もしくはp-クマル酸、好ましくはp-クマル酸、又はそれらの塩である。フェノール骨格を有する化合物の培地中の有効濃度は、発芽を誘起する限りいずれの濃度も使用可能であるが、上記化合物の溶解度や、微生物の生育に及ぼす悪影響を鑑みて、例えば1〜4000ppm、又は5〜3000ppm、好ましくは10〜2000ppm、又は10〜1000ppm、もしくは10〜600ppm、さらに好ましくは100〜600ppmである。具体的には、フェルラ酸では1〜3900ppm、又は5〜3000ppm、好ましくは10〜2000ppm0〜1000ppm、もしくは10〜600ppm、さらに好ましくは100〜600ppmであり、バニリンでは1〜3050ppm、又は5〜3000ppm、好ましくは10〜2000ppm、又は10〜1000ppmであり、もしくは10〜600ppm、バニリン酸では1〜3400ppm、又は5〜3000ppm、好ましくは10〜2000ppm、例えば10〜1800ppm、又は10〜1000ppm、もしくは10〜600ppm、さらに好ましくは100〜600ppmの範囲の濃度を使用できる。クマル酸についても、同様の濃度範囲、すなわち1〜4000ppm、又は5〜3000ppm、好ましくは10〜2000ppm、又は10〜1000ppm、もしくは10〜600ppm、さらに好ましくは100〜600ppmで有効である。
【００４０】
発芽の際、一般的にグルコースなどの炭素源やL-Alaなどのアミノ酸があると良いと言われているため、発芽用培地は、芽胞形成培地（ニュートリエント培地）、TS培地など、適度な炭素源を含む組成のものならばどんなものでも発芽が誘起できると考えられる。また、芽胞の形成率が悪いと発芽誘起効果が確認しづらくなるため、発芽試験を行う前に芽胞が形成されていることをグラム染色法、及びヒートショック（65℃、35分間）処理後、培養することにより確認するとよい。
【００４１】
バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、もしくはクマル酸、又はそれらの塩で発芽を誘起することができる芽胞形成菌は、バチルス属、ジオバチルス属又はエアリバチルス属に属する芽胞形成菌、例えば上に例示した菌種から選択されうる。とりわけ好ましい菌種は、バチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、バチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、及びエアリバチルス パリダスであり、さらに具体的には、非限定的に、バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)、バチルス ズブチルス NBRC 12195株、バチルス ズブチルス NBRC 14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC 12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC 101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3032株、バチルス コアギュランス NBRC 12583株、バチルス コアギュランス NBRC 3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC 13737株、又はエアリバチルス パリダス TK6004株(FERM BP-08597)である。
【００４２】
芽胞が発芽したかどうかは、培養液のOD630（630nmの濁度）値を測定し、その低下に基づいて判定することができる（文献Microbiology (1950), 4, 3, 330-338）。簡単に説明すると、培養後、蒸留水で洗浄した菌体を蒸留水でOD630=1.0となるように希釈したものを等量の発芽誘起溶液と混合して、UV分光光度計を用いて630nmの濁度を室温で測定する。
【００４３】
＜発芽誘起剤＞
本発明はさらに、上記のフェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を含む、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス(Geobacillus)属又はエアリバチルス(Aeribacillus)属に属する芽胞形成菌の発芽誘起剤を提供する。
【００４４】
該化合物の好適例は、上記のとおり、バニリン、バニリン酸、フェルラ酸、もしくはクマル酸、又はそれらの塩である。
【００４５】
発芽誘起剤は、固体形態であってもよいし液体形態であってもよい。固体形態の場合、該化合物自体であってもよいし、或いは農業上使用可能な担体もしくは賦形剤と混合し、粉末、ペレット、顆粒などの任意の形態とし得る。また、液体形態の場合、発芽誘起剤は、水、有機溶剤（EtOH、DMSO、アセトン、アセトニトリルなど）等の溶剤に溶解、懸濁又は乳化した形態としうるし、また場合により、濃縮形態として、使用前に希釈可能なようにしてもよい。発芽誘起剤には、必要に応じて、界面活性剤、懸濁剤、着色剤、安定化剤などの農業上使用可能な添加剤が含まれていてもよい。
【００４６】
発芽誘起剤中の上記のフェノール骨格を有する化合物の濃度は、特に限定されないが、例えば約1〜100重量％である。
【００４７】
発芽誘起させるときの上記化合物の濃度は、例えば1〜4000ppm、又は5〜3000ppm、好ましくは10〜2000ppm、又は10〜1000ppm、もしくは10〜600ppm、さらに好ましくは100〜600ppmであるように調整される。
【００４８】
＜キット＞
本発明はさらに、バチルス属、ジオバチルス属及びエアリバチルス属からなる群から選択される芽胞形成した菌体及び/又はその芽胞と、上記のフェノール骨格を有する化合物の1種又は2種以上を含む上記発芽誘起剤とを含むキットを提供する。
【００４９】
芽胞形成した菌体は、上記の芽胞形成のための培養によって得ることができる。キットに含有させる芽胞形成菌は、例えば土壌改良剤、堆肥化促進剤、汚泥処理剤などの有用物質として利用可能な菌が好ましく、例えばバチルス ズブチルス、バチルス リケニフォルミス、バチルス アミロリキファシエンス、バチルス コアギュランス、ジオバチルス ステアロサーモフィラス、又はエアリバチルス パリダスなどの菌種を挙げることができる。
【００５０】
上記菌種には、以下のものに限定されないが、例えばバチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)、バチルス ズブチルス NBRC 12195株、バチルス ズブチルス NBRC 14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC 12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC 101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3032株、バチルス コアギュランス NBRC 12583株、バチルス コアギュランス NBRC 3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC 13737株、又はエアリバチルス パリダス TK6004株(FERM BP-08597)などが含まれる。特に好適な菌は、バチルス属の細菌であり、より好ましくはバチルス ズブチルス、例えばバチルス ズブチルスC-3102株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3022株、などであり、或いはエアリバチルス属の細菌であり、より好ましくはエアリバチルス パリダス、例えばエアリバチルス パリダス TK6004株(FERM BP-08597)、などである。
【００５１】
芽胞形成した菌体及び/又はその芽胞は、凍結乾燥などの乾燥手段によって乾燥された形態であることが好ましいが、湿潤形態であってもよい。
【００５２】
処理が必要な液体状又は固体状の物質（例えば、培地）に、上記キットに含まれる菌体及び/又は芽胞と発芽誘起剤とを混合したのち投入することができる。それらを同時に添加した場合は、目的菌の管理がし易い。しかし、土壌や敷料、汚泥等への芽胞形成菌と発芽誘起剤の添加順に特に決まりは無く、発芽誘起剤は目的物中に含まれる芽胞形成菌や、予め添加した芽胞形成菌に用いても良い。投入後、適度の培養条件を保持することで、芽胞が発芽し、菌体は栄養型となり増殖することができる。
【００５３】
本発明の発芽誘起方法、剤及びキットは、それらを利用して、飲料や食品の汚染原因となる芽胞形成菌を発芽させて殺菌することができる。さらには、敷料（稲わら、オガクズ、籾殻、等）の利用において、汚染原因となる芽胞形成菌を発芽させることによって、加熱や殺菌剤での処理により容易に殺菌することもできる。さらに、悪臭の原因菌が含まれる生活廃棄物等に対して、芽胞形成菌及び本発明の発芽誘起剤を組合せて添加することで、有用菌の増殖を優位にして悪臭の原因菌の増殖を抑制することもできる。
【００５４】
＜寄託微生物＞
明細書に記載された寄託微生物は、以下のとおりである。
【００５５】
バチルス ズブチルスC-3102株(FERM BP-1096)、バチルス ズブチルス NBRC 12195株、バチルス ズブチルス NBRC 14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC 12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC 101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3032株、バチルス コアギュランス NBRC 12583株、バチルス コアギュランス NBRC 3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC 13737株、及びエアリバチルス パリダス TK6004株(FERM BP-08597)
バチルス ズブチルスC-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)及びエアリバチルス パリダス TK6004株(国際寄託番号FERM BP-08597)は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1-1 中央第6）に、それぞれ昭和60年（1985年）12月25日付けで、平成14年（2002年）8月22日付けで、ブダペスト条約の規定に基づき国際寄託され、現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）で保管・管理されている。
【００５６】
バチルス ズブチルス NBRC 12195株、バチルス ズブチルス NBRC 14206株、バチルス リケニフォルミス NBRC 12200株、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ NBRC 101239株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3022株、バチルス アミロリキファシエンス NBRC 3032株、バチルス コアギュランス NBRC 12583株、バチルス コアギュランス NBRC 3887株、ジオバチルス ステアロサーモフィラス NBRC 13737株については、製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NBRC)（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）から分譲されたものである。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例に限定されない。【００５８】
＜実施例1＞
（芽胞菌液の調製）
TS培地（Difco社、Trypticase Soy Broth）に表1に示した11菌株のそれぞれを接種し、ジオバチルス ステアロサーモフィラスNBRC13737及びエアリバチルス パリダスTK6004（FERM BP-08597）は50℃、それ以外の9株は37℃でコロニーが得られるまで培養した。その後、11菌株のシングルコロニーを白金耳で一白金耳分掻き取り、滅菌水500 μLに懸濁した。ニュートリエント寒天培地（Difco社、Nutrient Broth）8.0 gを水1000 gに溶解し、高圧蒸気滅菌（121℃、15分間）を実施し、平板培地を作製した。懸濁液をそれぞれ100 μLずつニュートリエント寒天培地に塗沫して、37℃で3日間培養した。【００５９】
次に、白金耳により菌体を500μLの滅菌水に懸濁し、菌液を65℃、35分間のヒートショックに供した。ヒートショック処理菌液とヒートショック未処理菌液をそれぞれ100μLずつTS培地に塗沫して、50℃または37℃で1日間培養した。培養の結果、ヒートショック処理菌液においてもコロニー形成が確認されたことから、11菌株全てにおいて芽胞が形成されていることが確認された。また、グラム染色法により染色されなかったことからも芽胞が形成されたことが確認された。【００６０】
芽胞形成確認後、コンラージ棒を用いて、菌体を掻き集め、滅菌した蒸留水10 mlに懸濁して遠心分離（8340 x g、4℃、15分間）した。上清を除去した後、菌体を滅菌水10 mLで2回洗浄した。菌体洗浄後、5 mLの滅菌水に懸濁し、滅菌したキムワイプにて懸濁液をろ過した。ろ液を遠心分離（8340 x g、4℃、15分間）し、上清を除去した後、630 nmでの濁度が1.0となるように滅菌水で調整した。【００６１】
使用した菌株は、表1に示した11株である。
【表１】
2013035804.tif 000004
【００６２】
（発芽誘起剤の調製）
フェルラ酸、バニリン酸またはL-アラニン0.3 gをそれぞれ、70℃に熱した蒸留水500 mlに混合した。プロペラ付きの撹拌棒で撹拌しながら溶解し、フィルター滅菌（0.45μm）を行って600 ppmの各溶液を作製した。【００６３】
（発芽誘起効果の確認）
各溶液500 μLと各芽胞菌液を500μL混合した。各混合溶液のフェルラ酸、バニリン酸又はL-アラニン濃度は300 ppmである。混合時点を反応開始（0分）とし、37℃にて振とう（150rpm）しながら反応開始10、20、30、40、50、60、90、120、180分後の濁度（630nm）を測定した。【００６４】
なお、芽胞が発芽することで、630nmでの濁度が低下するため、発芽率を確認するために630nmの濁度を用いられることが知られている。【００６５】
（結果）
バチルス ズブチルスC-3102（FERM BP-1096）、バチルス リケニフォルミス(NBRC12200、NBRC12195、NBRC14206)、バチルス アミロリキファシエンス（NBRC3022、NBRC3032）、バチルス コアギュランス（NBRC12583、NBRC3887）、ジオバチルス ステアロサーモフィラス(NBRC13737)、エアリバチルス パリダスTK6004（FERM BP-08597）では、フェルラ酸及びバニリン酸のどちらを混合した場合にも濁度の低下が起こり、発芽が確認された。また、バチルス ズブチルス サブスピーシーズ スピジゼニィ(NBRC101239)では、フェルラ酸を混合した場合に発芽が確認された。【００６６】
実施例1の結果を下記の表2〜12及び図1-1〜図1-11に示す。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
2013035804.tif 000015
【００６７】
＜実施例2＞
（発芽誘起剤の濃度調整）
フェルラ酸0.01、0.1、0.3、0.6 g、及びバニリン酸0.01、0.1、0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 gをそれぞれ70℃、500 mlの蒸留水と混合して、20、200、600、1200 ppmのフェルラ酸溶液、20、200、600、1200、2400、3600 ppmのバニリン酸溶液を作製した。【００６８】
次に、実施例１で用いたバチルス ズブチルスC-3102株（FERM BP-1096）の菌液500μLと上記フェルラ酸、またはバニリン酸溶解液500μLを混合し、表２に示すフェルラ酸（10〜600 ppm）、またはバニリン酸濃度（10〜1800 ppm）となるように調整した。反応開始時のフェルラ酸の濃度は10、100、300、600 ppm、バニリン酸の濃度は10、100、300、600、1200、1800 ppmとなっている。【００６９】
実施例１と同様に菌液とフェルラ酸またはバニリン酸溶解液を混合した時点を反応開始（0分）とし、37℃にて振とう（150 rpm）しながら反応開始10、20、30、40、50、60、90、120、180分後の吸光度（630 nm）を測定した。【００７０】
（結果）
実施例2の結果を下記の表13及び表14、並びに図2-1及び図2-2に示す。10〜600 ppmのフェルラ酸及び10〜1800 ppmのバニリン酸を添加して発芽誘起を行った場合、バチルス ズブチルス C-3102株ではどの濃度でも同程度に発芽誘起されることが示された。このことから、10 ppm以上600 ppm以下のフェルラ酸及び10 ppm以上1800 ppm以下のバニリン酸については、バチルス属細菌と同様にジオバチルス属細菌及びエアリバチルス属細菌に対して同様の発芽誘起効果をもつことが示唆される。
【表１３】
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【表１４】
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【００７１】
＜実施例3＞
（発芽誘起剤の調製）
フェルラ酸、バニリン酸またはp-クマル酸0.3 gをそれぞれ、70℃に熱した蒸留水500 mLに混合した。プロペラ付きの撹拌棒で撹拌しながら溶解し、フィルター滅菌（0.45μm）を行って600 ppmの各溶液を作製した。【００７２】
（発芽誘起効果の確認）
次に、実施例1と同様の方法で作製したバチルス ズブチルスC-3102（FERM BP-1096）の菌液500μLと上記フェルラ酸、バニリン酸およびp-クマル酸溶液をそれぞれ500μL混合し、各混合溶液のフェルラ酸、バニリン酸又はp-クマル酸濃度が300 ppmとなるように調整した。混合時点を反応開始（0分）とし、37℃にて振とう（150rpm）しながら反応開始10、20、30、40、50、60、90、120、180分後の濁度（630nm）を測定した。【００７３】
（結果）
実施例3の結果を下記の表15、並びに図3に示す。300 ppmのフェルラ酸、バニリン酸、およびp-クマル酸を添加して発芽誘起を行った場合、バチルス ズブチルスC-3102の濁度の低下が起こり、発芽することが確認された。このことから、フェルラ酸、バニリン酸、p-クマル酸をはじめとしたシフェノール骨格を有する化合物では、その種類に関わらず、発芽誘起効果をもつことが示唆される。
【表１５】
2013035804.tif 000018
【００７４】
＜実施例4＞
（本発明においてフェラル酸及びバニリン酸が栄養成分として利用されないことの証明）
本実施例では、フェラル酸又はバニリン酸をC-3102株の芽胞液に混合し長時間培養したとき、増殖が見られるか否かを調べるための実験である。【００７５】
C-3102株をNutrient plateにて3日間37℃で培養したのち、コンラージ棒にて菌体を掻き集め、実施例1と同様に芽胞液を調製した(OD630=1.0)。このC-3102株芽胞液500μLを、600ppmのフェラル酸溶液又はバニリン酸溶液500μLと混合し、24時間までの濁度(630nm)の変化を調べた。結果を表16に示す。
【表１６】
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【００７６】
表から明らかなように、フェルラ酸溶液またはバニリン酸溶液にて長時間培養しても、濁度の上昇（C-3102株の増殖）は確認されなかった。上記の実施例で示したように、発芽が誘起されると濁度が減少する（すなわち、胞子の膜が分解されることで、光屈折性が低下し、濁度が低下する）。一方、誘起した栄養細胞が増殖すれば、単純に濁度が上がると考えられる。表の結果は、24時間フェルラ酸混合液又はバニリン酸混合液を観察したが、濁度の増加は見られなかったことから、フェルラ酸及びバニリン酸は、芽胞誘起効果は有するが、単独では栄養成分としては不適であることを示している。【００７７】
なお、上記の結果を考慮すると、非特許文献1（G. Gurujeyalakshmi and A. Mahadevan, Current Microbiology, 1987; 16:69-73）では、フェラル酸を含有する培地で、菌数が増加することを記載しているが、芽胞化処理が行われていないため、この文献は発芽誘起効果を示していない。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、農業分野で有効なバチルス属細菌などの芽胞形成菌の発芽を促進誘起することによって、栄養成分に接触した際の増殖性を増し、菌本来の機能もしくは働きを増大することができるし、一方、食品の変敗の原因である芽胞形成菌の発芽を促進し殺菌を容易にすることができる。【００７９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
2013035804.tif 000021
【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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