(57)【要約】  ケラチノサイトにおけるメラニン量調節、皮膚又は毛髪色制御、あるいはケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤若しくは皮膚又は毛髪色制御剤の選択においてオートファジーの活性を利用すること。
2013162012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程。
【請求項２】
以下の場合に、前記被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる作用があると評価される、請求項１記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
【請求項３】
以下の場合に、前記被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を低下させる作用があると評価される、請求項１記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
【請求項４】
下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程。
【請求項５】
以下の場合に、前記被験物質が皮膚又は毛髪色を暗色化する作用があると評価される、請求項４記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
【請求項６】
以下の場合に、前記被験物質が皮膚又は毛髪色を明色化する作用があると評価される、請求項４記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
【請求項７】
メラニン量調節が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節方法。
【請求項８】
前記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程によりケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程である、請求項７記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
【請求項９】
前記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程によりケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程である、請求項７記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
【請求項１０】
皮膚又は毛髪色制御を所望する被験体のケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、被験体における皮膚又は毛髪色制御方法。
【請求項１１】
前記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により皮膚色を暗色化させる工程である、請求項１０記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
【請求項１２】
前記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により皮膚色を明色化させる工程である、請求項１０記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
【請求項１３】
前記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により毛髪色を暗色化させる工程である、請求項１０記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
【請求項１４】
前記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により毛髪色を明色化させる工程である、請求項１０記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
【請求項１５】
非治療的方法である、請求項７〜１４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節、及び皮膚又は毛髪の色の制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や毛髪の色を決定する因子として様々なものが報告されているが、その中でも、表皮に存在するメラニンの量や質が皮膚や毛髪の色に大きく寄与すると考えられている。すなわち、皮膚や毛髪の色の形成は色素細胞（メラノサイト）中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮や毛包のケラチノサイトへと転送されて表皮や毛髪全体へと広がることに大きく影響を受けるとされる。そのメラノサイトにより産生されるメラニンは、個体の皮膚や毛髪の色に関連する因子として古くから知られている。【０００３】
メラニン生合成に関わる細胞であるメラノサイトは、エンドソームに由来する特有のリソソーム関連オルガネラであるメラノソームを含んでいる。このメラノソームにおいては、チロシンを前駆体とする触媒経路を介してメラニンが合成される。メラノソームは、主にトランスゴルジネットワークから選別された様々な遺伝子産物を受け取り、その結果としてリソソームと共通の性質（例えば、内部の低ｐＨ）を有する。にもかかわらず、一連のメラニン合成酵素及びそれに関連するチロシナーゼ、ドーパクロムトートメラーゼ、Ｐｍｅｌ−１７（ＧＰ１００）を含む構造タンパク質はメラノソームのみに受け渡され、結果として、メラノソームはメラニンを合成する特異な性質を有する。皮膚色発生の過程においては、Ｒａｂファミリーメンバー等の種々の膜輸送因子に制御されて色素性メラノソームが成熟し、続いて、成熟したメラノソームは樹状突起に移され、隣接するケラチノサイトに転送される。【０００４】
従来の皮膚美白剤は主に、メラノサイトにおけるメラニン産生を標的として開発されてきた。例えば、非特許文献１では、メラニン前駆体であるチロシンからメラニンへの変換に関わる酵素であるチロシナーゼの酵素活性を阻害し、メラニン産生を抑制する作用を有する皮膚美白剤として、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸等が報告されている。【０００５】
一方、皮膚色の違いによって、ケラチノサイトにおけるメラニンの存在様式や成熟状態に差異が認められることも報告されている（非特許文献２）。つまり、ケラチノサイト内でのメラニン動態が、皮膚色の決定に何らかの役割を担っている可能性が考えられる。これまでの報告では、ケラチノサイトにおけるメラニンの取り込み（貪食）に、レセプター分子であるＰＡＲ−２が関与すること、及びその活性調節による皮膚色制御の可能性が示唆されている（非特許文献３〜８）。また、ケラチノサイトに転送された後のメラニンのケラチノサイト内での局在に、タンパク質分子であるＤｙｎｅｉｎやＤｙｎａｃｔｉｎが関与すること（非特許文献９及び１０）、さらには、糸状仮足（Ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）と呼ばれる細胞構造の形成に関わるタンパク質分子であるＭｙｏＸが、メラノサイトからケラチノサイト、及びケラチノサイトからケラチノサイトへの両メラニン転送に関与していることも示唆されている（非特許文献１１）。しかしながら、メラノサイトで産生されたメラニン（メラノソーム）のケラチノサイトによる取り込み、輸送及び代謝の機序については、未だ充分明らかにされておらず、その皮膚色に対する役割も検証されていない。
また最近では、異なる民族に由来するケラチノサイトを用いた検討から、取り込まれたメラニンの代謝能に民族差があることも示唆されている（非特許文献１２）。非特許文献１２では、蛍光物質で標識したメラニンを表皮細胞に取り込ませた後に、表皮細胞内の蛍光の消退を解析する評価系を用いて、メラニンが白人由来の表皮細胞で分解されやすいことを報告している。しかしながら、分解に寄与するメカニズムや特定の因子については何ら言及されてはいない。【０００６】
オートファジー（自食作用）とは、一般的に、オルガネラ等の細胞内物質をリソソームに移送し、分解するプロセスをいう（非特許文献１３〜１５)。オートファジーにはいくつかのタイプが知られている。そのうち最も研究されている主な経路はマクロオートファジーであり、通常はオートファジーというと、マクロオートファジーを指す。オートファジーは、飢餓、低酸素、エネルギー枯渇、小胞体ストレス、高温等の各種生理的ストレス、ホルモン刺激、薬物（ラパマイシン、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジピン、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、ベラパミル、ミノキシジル、クロニジン等）、免疫シグナル、細菌、ウイルス及び寄生虫による感染、ならびに、急性膵炎、心疾患などの疾患によって惹起される。オートファジーに関連する現象は、酵母、哺乳類などの幅広い種で観察されていることから、生物にとって非常に重要な役割を担っていると考えられる。実際、現在までに、オートファジーが、癌、神経変性疾患、炎症、免疫、老化などに関与していることが報告されている（非特許文献１６）。【０００７】
オートファジーは、オートファゴソームと呼ばれる特別なオルガネラを介して起こる一連のプロセスからなる。オートファジー経路においては、最初に、細胞質に隔離膜又はファゴフォアと呼ばれる小さな胞が発生する。ファゴフォアは徐々に伸長して細胞質の一部を包み込み、二重膜を有する袋状構造であるオートファゴソームを形成する。次いで、オートファゴソーム外膜はリソソームと融合してオートリソソームを形成し、その中で、内部の物質はオートファゴソーム内膜とともに分解される。オートファジーによって生じた分解産物は、細胞内で再利用される。オートファジー経路には、ファゴフォアの発生と伸長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、及びオートリソソームの形成と内部物質の分解など複数のステップが介在し、しかも各ステップにおいて、多くの因子が関与している。主な因子は、ＡＴＧ（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と総称される、ファゴフォア及びオートファゴソームの形成に関与しているタンパク質である。３０種以上のＡＴＧがこれまでに報告されている（非特許文献１１）。【０００８】
しかし、ケラチノサイト内におけるメラニン動態、例えば、メラニン取り込み、蓄積、分解等にオートファジーが関与することはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】美白戦略（南江堂）ＩＶ．，美白剤の薬理と臨床，ｐ９５−１１６
【非特許文献２】Ｔｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １４９：４９８−５０５
【非特許文献３】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ２１：１７２−１８３
【非特許文献４】Ｂａｂｉａｒｚ−Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １７：２４１−２５１
【非特許文献５】Ｓｅｉｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１５：１６２−１６７
【非特許文献６】Ｓｅｉｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２５：２５−３２
【非特許文献７】Ｓｅｉｂｅｒｇ（２００１）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １４：２３６−２４２
【非特許文献８】Ｐａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１６：５８７−５９５
【非特許文献９】Ｂｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２１：８１３−８２０
【非特許文献１０】Ｂｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２７：１７３６−１７４４
【非特許文献１１】Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２４：３７５６−３７６９
【非特許文献１２】Ｅｂａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３１：１２２６−１２３３
【非特許文献１３】Ｌｅｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ（２００８）Ｃｅｌｌ  １３２：２７−４２
【非特許文献１４】Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１０６９−１０７５
【非特許文献１５】Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：７８０−７８６
【非特許文献１６】Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４０：３１３−３２６
【非特許文献１７】Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ３：５４２−５４５
【非特許文献１８】Ｋｉｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ：５０５−５１６
【発明の概要】
【００１０】
一態様において、本発明は、以下、
下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程、
を提供する。
別の態様において、本発明は、以下、
下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程、
を提供する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、メラニン量調節が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、皮膚又は毛髪色制御を所望する被験体のケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、被験体における皮膚又は毛髪色制御方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リソソーム阻害によるメラニン蓄積。Ａ：ウエスタンブロッティング解析。Ｂ：ウエスタンブロッティング結果に基づく定量解析；データは平均±SD（各N=3）、*，p<0.05（ＡＮＯＶＡ，Ｈｏｌｍ  ｔｅｓｔ）。
【図２】皮膚色の異なる人種間でのオートファジー関連因子の発現の違い。
【図３】皮膚色の異なる人種間でのオートファジー活性の違い。Ａ：ウエスタンブロッティング解析。Ｂ：ウエスタンブロッティングの結果に基づくｐ６２とＬＣ３の定量発現解析；データは平均±SD、**，p<0.01；*，p<0.05（ＡＮＯＶＡ，Ｈｏｌｍ  ｔｅｓｔ）。
【図４】皮膚色の異なる人種間でのメラノソーム取り込み後のオートファジー活性の違い。Ａ：ウエスタンブロッティング解析。Ｂ：ウエスタンブロッティングの結果に基づく定量発現解析；データは平均±SD、**，p<0.01；*，p<0.05（ＡＮＯＶＡ，Ｈｏｌｍ  ｔｅｓｔ）。
【図５】オートファジー関連因子の発現抑制によるメラノソーム蓄積の増加。Ａ及びＢ：ウエスタンブロッティング解析。Ｃ：ＡＴＧ７発現抑制細胞におけるメラニン蓄積。
【図６】オートファジー関連因子の発現抑制によるメラノソーム蓄積の増加。
【図７】オートファジー関連因子の発現抑制によるメラノソーム蓄積の増加。
【図８】オートファジー抑制因子ｍＴＯＲの発現抑制がオートファジー及びメラノソーム蓄積に与える影響。Ａ：ウエスタンブロッティング解析。Ｂ：ウエスタンブロッティングの結果に基づく定量解析；データは平均±SD（各N=3）、**，p<0.01；*，p<0.05（ＡＮＯＶＡ，Ｈｏｌｍ  ｔｅｓｔ）。
【図９】ケラチノサイトのメラニン含量に対するオートファジー調節の影響。オートファジー誘導剤存在下での培養後における培養物の写真（Ａ）およびウエスタンブロッティング解析（Ｂ）。オートファジー阻害剤存在下での培養後における培養物の写真（Ｃ）およびウエスタンブロッティング解析（Ｄ）。
【図１０】オートファジー調節剤とともに培養された皮膚の明度（Ｌ＊値）；データは平均±SD（各N=3）**，p<0.01；*，p<0.05（ＡＮＯＶＡ，Ｈｏｌｍ  ｔｅｓｔ）。
【図１１】本発明の選択方法により選択されたメラニン量調節剤による皮膚色制御。Ａ：メラニン量、Ｂ：細胞呼吸活性。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節、及び皮膚又は毛髪色制御に関わる因子に関する。また本発明は、当該因子を用いてケラチノサイトにおけるメラニン量を調節する方法、皮膚又は毛髪色を制御する方法、及び当該因子を用いてケラチノサイトにおけるメラニンの量調節剤、又は皮膚若しくは毛髪色制御剤を評価又は選択する方法に関する。
【００１４】
本発明者らは、ケラチノサイト内のメラニン量調節に関わる因子を探索したところ、オートファジーの活性がケラチノサイトにおけるメラニン量に関係すること、及びオートファジーの活性と皮膚色との間に高い相関性があることを確認した。これらの結果から、本発明者らは、オートファジーの活性を利用すれば、ケラチノサイトのメラニン量や、皮膚又は毛髪色を制御可能であることを見出した。
【００１５】
本発明によれば、ケラチノサイト内のメラニンの量を調節して、皮膚又は毛髪色を制御することができる。また本発明によれば、オートファジーの活性を指標として、皮膚又は毛髪色を制御することができる素材を評価又は選択することができるため、皮膚又は毛髪色制御剤、例えば、美白剤、タンニング剤、毛髪カラーリング又はブリーチング剤、白髪染め等を開発することができる。
【００１６】
本明細書において、「オートファジーの活性」とは、オートファジー経路の各ステップ、例えば、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、オートリソソーム内部における物質の分解、等の活動をいう。
オートファジー活性は、例えば、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性に反映されており、これらの発現若しくは活性を検出又は決定することによって測定することができる。オートファジー関連遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性は、当該分野で通常使用される任意の解析方法によって測定することができる。遺伝子発現解析方法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられる。遺伝子にコードされるタンパク質の発現若しくは活性の解析方法又は定量の方法としては、ウエスタンブロッティング法、免疫染色法、蛍光染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「オートファジー関連遺伝子」とは、オートファジー経路の各ステップ、例えば、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、オートリソソーム内部における物質の分解、等に関与するタンパク質をコードする遺伝子であり得る。また、本明細書において、「オートファジー関連遺伝子にコードされる分子」としては、上記オートファジー経路の各ステップに関与する遺伝子にコードされるタンパク質及びｍＲＮＡが挙げられ得る。
【００１８】
例えば、哺乳類のオートファジーにおいて、ファゴフォアの発生に関与する分子としては、ＡＴＧ１（又はＵＬＫ１若しくはＵＬＫ２）、ＡＴＧ１３、ＡＴＧ１７、ＡＴＧ２９、ＡＴＧ３１、ＡＴＧ１０１、ＦＩＰ２００、ＶＰＳ３４、ＶＰＳ１５（又はｐ１５０）、ＡＴＧ６（又はＶＰＳ３０若しくはＢｅｃｌｉｎ１）、ＡＴＧ１４、Ａｍｂｒａ１、ＡＴＧ２、ＡＴＧ９、ＡＴＧ１８（又はＷＩＰＩ１−４）、ＤＦＶＰ１、ＶＭＰ１等が挙げられる。このうち、ＡＴＧ１（又はＵＬＫ１若しくはＵＬＫ２）、ＡＴＧ１３、ＡＴＧ１７、ＡＴＧ２９、ＡＴＧ３１、ＡＴＧ１０１、ＦＩＰ２００は、ＵＬＫ／Ａｔｇ１  ｃｏｍｐｌｅｘとして、ファゴフォア初期形成に関与していると考えられている（非特許文献１６）。一方、ＶＰＳ３４、ＶＰＳ１５、ＡＴＧ６、ＡＴＧ１４、Ａｍｂｒａ１は、Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘとして、主に小胞体上でＰＩ（３）Ｐ（ホスファチジルイノシトール３−リン酸）を生成する（非特許文献１６）。
【００１９】
ファゴフォアの成長とオートファゴソームの形成に関与する分子としては、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１０、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６（又はＡＴＧ１６Ｌ１）、ＡＴＧ３、ＡＴＧ４（又はＡＴＧ４Ａ−Ｄ）、ＡＴＧ８（又はＬＣ３、ＧＡＴＥ−１６若しくはＧＡＢＡＲＡＰ）、ｐ６２等が挙げられる。このうち、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１０、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６は、Ａｔｇ１２−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを形成している。この系は、ファゴフォアの外側に存在しており、ファゴフォア伸長に重要であると考えられている（非特許文献１６）。ＬＣ３、ＡＴＧ３、ＡＴＧ４、ＡＴＧ７は、ＬＣ３／Ａｔｇ８−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを形成している。この系は、ファゴフォアの伸長と膜の閉鎖に関与していると考えられている（非特許文献１６）。ＬＣ−３は酵母Ａｔｇ８の哺乳類ホモログで、ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩの形態が存在する。そのうちＬＣ３−ＩＩは、細胞質局在型のＬＣ３−Ｉにホスファチジルエタノールアミンが共有結合したもので、それによってオートファゴソーム膜上に局在する。ＬＣ３−ＩＩ量はオートファゴソーム数に比例することから、オートファジーの指標として知られている（非特許文献１７）。例えば、ヒドロキシクロロキンなどのオートファジー阻害剤や、Ｅ−６４−Ｄ又はペプスタチンＡなどのタンパク質分解阻害剤を添加し、ＬＣ３−ＩＩタンパク質の蓄積量を測定することで、オートファジー活性を定量的に評価することが可能である。あるいは、ＬＣ３−ＩＩのタンパク質量をサンプル毎に検出し、ｐ６２など他に知られているオートファジーのマーカーと組み合わせることで、オートファジー活性を評価することができる（非特許文献１７）。ｐ６２はオートファゴソーム形成部位に局在し、ＬＣ３と相互作用するタンパク質であり、オートファジーの標的タンパク質をオートファゴソームへとリクルートする機能を有している。またｐ６２は、Ｎｂｒ１とともにオートファジー選択的な基質として知られている（非特許文献１８）。
【００２０】
オートファゴソームとリソソームとの融合に関与する分子としては、ＵＶＲＡＧ（又はＶＰＳ３８）やＲＡＢ７等が挙げられる。ＵＶＲＡＧは、オートファゴソームとリソソームとの融合過程を促進する分子として知られている。
【００２１】
本明細書において、「オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子」は、好ましくは、ＡＴＧ７、ＲＡＢ１１Ａ、ＣＬＩＰ−１７０、Ｒｕｂｉｃｏｎ及びＲＡＢ７Ｂからなる群から選択される遺伝子及び当該遺伝子にコードされる分子を含まない。
【００２２】
「オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子」の例を下記表１に示す。これらは、公知のデータベースに登録されている遺伝子及びタンパク質である。しかしこれらの遺伝子及び分子の、ケラチノサイト内でのメラニン動態における関与は従来知られていなかった。
【００２３】
【表１】
2013162012.tif 000003
【００２４】
本明細書において、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子は、それらのホモログを含み得る。例えば、本発明においては、表１の遺伝子又はタンパク質の代わりに、それらのホモログが使用され得る。本明細書において、ある遺伝子又はタンパク質と配列同一性が高く且つ同等の機能を有し、好ましくは進化的な起源が共通する遺伝子又はタンパク質を、当該遺伝子又はタンパク質の「ホモログ」という。例えば、あるオートファジー関連遺伝子と塩基配列において６０％以上、好ましくは８０％以上同一であり、且つオートファジー経路の各ステップ、例えば、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、オートリソソーム内部における物質の分解、等に関与するタンパク質をコードする遺伝子であって、好ましくは進化的に同一の起源に由来する遺伝子は、当該オートファジー関連遺伝子のホモログである。また例えば、上記オートファジー関連遺伝子のホモログ遺伝子にコードされ、且つ当該オートファジー関連遺伝子がコードするタンパク質が関与するオートファジー経路のステップに関与するタンパク質は、当該オートファジー関連遺伝子にコードされるタンパク質のホモログである。
【００２５】
本明細書において、アミノ酸配列又は塩基配列に関する「同一性」とは、２つのアミノ酸配列又は塩基配列を整列（アラインメント）したときに両方の配列において同一のアミノ酸残基又は塩基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基又は塩基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出される値をいう。
【００２６】
本発明において、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子は少なくとも１つが使用されればよい。言い換えれば、当該遺伝子又は分子は、各々単独で使用されてもよいが、任意の２種以上の組み合わせで使用されてもよい。例えば、本発明において使用されるオートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子は、表１に列挙した遺伝子又はそれにコードされるｍＲＮＡやタンパク質からなる群より選択されるオートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子のうちの少なくとも１つであればよい。より詳細には、本発明においては、表１に列挙した遺伝子又はそれにコードされるｍＲＮＡやタンパク質が各々単独で使用されてもよく、又は任意の２種以上の当該遺伝子の組み合わせが使用されてもよく、任意の２種以上の当該遺伝子にコードされるｍＲＮＡの組み合わせが使用されてもよく、任意の２種以上の当該遺伝子にコードされるタンパク質の組み合わせが使用されてもよく、あるいは、それらの遺伝子、ｍＲＮＡ及びタンパク質からの任意の２種以上の組み合わせが使用されてもよい。
【００２７】
後記実施例に例示するように、明色の皮膚を有する人種の皮膚由来のケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、暗色の皮膚を有する人種の皮膚由来のケラチノサイトに比べて高かった（図２〜４）。また後記実施例に例示するように、オートファジー関連タンパク質ＡＴＧ７、ＡＴＧ１３、ＡＴＧ５、ＲＡＢ１１Ａ及びＵＶＲＡＧの発現阻害により、ケラチノサイトに取り込まれた後のメラノソームの分解が抑制され（図５〜８）、一方、オートファジー誘導剤および阻害剤により、培養皮膚モデルが明色化及び暗色化した（図９〜１０）。すなわち、オートファジーの活性は、ケラチノサイト内のメラニン量の調節や皮膚及び毛髪色の制御に寄与していることが示された。
【００２８】
メラニンのケラチノサイト内での動態、例えば、メラノサイトから転送されるメラニンの取り込み、輸送、局在、蓄積、排出、分解等は、主にケラチノサイトにより構成される皮膚表皮層や、毛包の毛母細胞若しくはシャフトを構成する毛皮質細胞でのメラニンの量及び分布に深く関与し、ひいては、皮膚及び毛髪の色に影響を及ぼす。
ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を変化させることによって、ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節することができ、それによって皮膚表皮層や毛包の毛母細胞やさらにはシャフトを構成する毛皮質細胞におけるメラニン量及び分布を調節し、結果として皮膚及び毛髪の色を制御することができる。
【００２９】
例えば、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性低下は、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させ、細胞の色を暗色化させる。逆にケラチノサイトにおけるオートファジーの活性増強により、当該ケラチノサイトのメラニン量は低下し、細胞の色は明色化する。したがって、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することにより、皮膚及び毛髪の色は明るくなる。逆に、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を減少させることにより、皮膚及び毛髪の色は暗くなる。
【００３０】
細胞のオートファジーの活性を変化させる手段の一つの例としては、当該細胞において上述のオートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性を変化させる方法が挙げられる。
【００３１】
例えば、ケラチノサイトにおける、上記オートファジー関連遺伝子及びそれにコードされる分子のうち、オートファジーの活性化に関与する遺伝子及び分子の発現低下は、オートファジーの活性を低下させるので、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させ、細胞の色を暗色化させる。逆にこれらの遺伝子及び分子の発現増加により、オートファジーの活性は増強するので、ケラチノサイトのメラニン量は低下し、細胞の色は明色化する。
したがって、ケラチノサイトにおいてオートファジーの活性化に関与する遺伝子又は分子の発現若しくは活性を増加させることにより、皮膚及び毛髪の色は明るくなる。逆に、当該遺伝子又は分子の発現若しくは活性を減少させることにより、皮膚及び毛髪の色は暗くなる。
【００３２】
また例えば、ケラチノサイトにおける、上記オートファジー関連遺伝子及びそれにコードされる分子のうち、オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子及び分子の発現増加は、オートファジーの活性を低下させるので、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させ、細胞の色を暗色化させる。逆にこれらの遺伝子及び分子の発現低下により、オートファジーの活性は増強するので、ケラチノサイトのメラニン量は低下し、細胞の色は明色化する。
したがって、ケラチノサイトにおいてオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又は分子の発現若しくは活性を低下させることにより、皮膚及び毛髪の色は明るくなる。逆に、当該遺伝子又は分子の発現若しくは活性を増加させることにより、皮膚及び毛髪の色は暗くなる。
【００３３】
オートファジーの活性化に関与する遺伝子、オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子、及びそれらの遺伝子にコードされる分子は、遺伝子又は分子の発現がオートファジーの活性に及ぼす影響を通常の手段で調べることによって、同定することができる。
例えば、作用機序未知のオートファジー誘導剤又はオートファジー阻害剤を投与して、オートファジー活性を亢進又は低下させたときに発現が変化する遺伝子又は分子を決定し、それらの遺伝子又は分子を過剰発現又は発現抑制したときのオートファジーの活性の変化を調べることによって、オートファジーの活性化又は活性抑制に関与する遺伝子又は分子を同定することができる。あるいは、オートファジーとの関連が既知の遺伝子又は分子の場合、それらの遺伝子又は分子を過剰発現又は発現抑制したときのオートファジーの活性の変化を調べるだけでよい。
【００３４】
例えば、後述の実施例で用いられているＬＣ３（例えば、ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩ）、ｐ６２、ＣＯＸ−ＩＶ、ならびにＡＴＧ５、ＡＴＧ１３、ＲＡＢ１１Ａ、ＵＶＲＡＧ遺伝子及びそれらにコードされるｍＲＮＡやタンパク質は、オートファジーの活性化又は活性抑制に関与する遺伝子及び分子の例である。また上述した表１に列挙した遺伝子若しくはタンパク質、又はそれらのホモログも、オートファジーの活性化又は活性抑制に関与する遺伝子及び分子の例である。
【００３５】
上記オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現又は活性を変化させることによって、ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節し、皮膚又は毛髪の色を制御することができる。言い換えれば、上記オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子は、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節のため、又は皮膚又は毛髪色制御のために使用することができる。あるいは、上記オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子は、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節のため、又は皮膚若しくは毛髪色制御のための剤の製造において使用することができる。
【００３６】
オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性は、当該分野で通常使用される任意の手段で変化させるとよい。当該遺伝子の発現、又は当該分子の発現若しくは活性を変化させる手段として、例えば、遺伝子発現を変化させる手段としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ等による遺伝子ノックダウン、特異的プロモーターによる標的遺伝子の転写活性化、ベクターを用いた外部からの遺伝子の導入、その他遺伝子の発現を変化させる作用を有する任意の物質の添加等が挙げられる。このうち、当該遺伝子の発現を変化させる作用を有する任意の物質の添加が好ましい。
【００３７】
遺伝子を導入するためのベクターの例としては、培養細胞用のベクターとしてＣＭＶプロモーター又はＥＦ１αプロモーターを組み込んだ各種遺伝子発現ベクターが挙げられ、培養細胞及び組織用のベクターとしてアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターを用いた遺伝子導入の手順は当業者によく知られている。例えば、レンチウイルスベクターを用いた皮膚への遺伝子導入手順は、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７  Ａｐｒ，１４（８）：６４８−５６に記載されている。また、これらのベクターを利用した遺伝子導入用キットが市販されている。オートファジー関連遺伝子を組み込んだ上記ベクターを細胞に導入することにより、当該細胞内でオートファジー関連遺伝子が過剰発現され、オートファジー活性が変化する。
【００３８】
ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の機序に基づいて、配列特異的にｍＲＮＡ分解を導くことにより標的遺伝子の発現を特異的に阻害する手法である。ｓｉＲＮＡは、哺乳類を含む種々の生物のインビボ遺伝子ノックダウンにも利用されている（例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００３，９：３４７−３５１；ＭｃＣａｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：３８−３９；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，３２：１０７−１０８；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２，２０：１００６−１０１０などを参照）。標的特異的に合成されたｓｉＲＮＡは購入することができ、またｓｉＲＮＡトランスフェクション用のキットは、ＱＵＩＡＧＥＮ、タカラバイオ株式会社などの多くの業者により販売されている。
【００３９】
上記オートファジー関連遺伝子にコードされる分子としては、当該遺伝子にコードされるｍＲＮＡ及びポリペプチドが挙げられる。ここで、「分子の発現若しくは活性の変化」とは、分子全体での発現若しくは活性を変化させる任意の状態、例えば、分子の発現量の変化、分子の分解速度の変化、分子の活性化率の変化、分子の不活性化率の変化等を含み得るが、好ましくは分子の発現量の変化を意味する。分子の発現若しくは活性を変化させる手段としては、上述の遺伝子発現を変化させる手段、タンパク質発現を変化させる手段、分子の酵素活性等を変化させる手段、分子とその標的因子との相互作用を変化させる手段、分子が作用を及ぼすシグナル経路を変化させる手段などが挙げられる。このうち、遺伝子発現を変化させる手段、タンパク質発現を変化させる手段などが好ましい。
【００４０】
オートファジーの活性を変化させる手段の別の例としては、オートファジー誘導剤又はオートファジー阻害剤の投与等が挙げられる。公知のオートファジー誘導剤としては、ラパマイシンに代表されるｍＴＯＲシグナル阻害剤、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジピン、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、ベラパミル、ミノキシジル、クロニジン、ＰＰ２４２、又はＭＧ−１３２等のプロテアソーム阻害剤等が挙げられる。公知のオートファジー阻害剤としては、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、バフィロマイシンＡ１、ＰＩ３キナーゼ阻害剤である３−メチルアデニンやワルトマニン等が挙げられる。
【００４１】
オートファジーの活性を変化させる手段のさらに別の例としては、上述したオートファジー誘導又は阻害剤の標的因子を活性化又は抑制すること、及び上記表１記載のオートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現に影響を与える因子を活性化又は抑制することが挙げられる。例えば、上述したオートファジー誘導剤ラパマイシンは、細胞タンパク質ｍＴＯＲの活性を抑制する。ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、ラパマイシンの標的として発見されたタンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ（セリン−スレオニンキナーゼ）の一種である。ｍＴＯＲはまたオートファジー誘導を抑制する作用を有することが知られている（Nat Genet. 2004 Jun;36(6):585-95）。後述する実施例８に示すとおり、ｍＴＯＲを抑制することにより、細胞のオートファジー活性が上昇し、メラニン量は減少した。
【００４２】
本発明において、オートファジーの活性を変化させる被験体としては、天然の又は遺伝子工学的に改変された、上記遺伝子のうちの少なくとも１を発現する能力を有し、メラニン量調節が所望されるケラチノサイト、ならびにそれを含む培養物、組織、器官及び動物が挙げられる。上記ケラチノサイトとしては、皮膚や毛包に存在するケラチノサイトが好ましく、表皮ケラチノサイト、毛母細胞及び毛皮質細胞がより好ましい。上記ケラチノサイトを含む培養物、組織、器官としては、培養ケラチノサイト、ならびに表皮組織、毛包組織、皮膚及びそれらの培養物が好ましい。上記動物としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物が好ましく、非ヒト哺乳動物としては、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウマなどが挙げられる。
【００４３】
一態様において、上記本発明によるメラニン量調節、又は皮膚若しくは毛髪色制御は、上記ケラチノサイト、又はそれを含む培養物、組織若しくは器官を被験体として行われ得る。好ましくは、被験体は、培養ケラチノサイト、培養皮膚組織、培養表皮、又は培養毛包である。別の一態様において、上記本発明によるメラニン量調節、又は皮膚若しくは毛髪色制御においては、ケラチノサイトのメラニン量の調節、又は皮膚若しくは毛髪色の制御を所望する動物が被験体であり得る。
【００４４】
また別の一態様において、当該メラニン量調節又は皮膚若しくは毛髪色制御は、美容目的又は審美的な目的で、例えば、皮膚の美白若しくはタンニング、毛髪のカラーリング（ライトニング若しくは暗色化）又はブリーチング、ブリーチング後の色戻し、白髪染め等の目的により、好ましくはエステティシャン、美容師、理容師、トリマー等の非医療従事者によって、非治療的に行われ得る。本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
【００４５】
本発明の例示的実施態様は、メラニン量増加が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加方法である。
本発明の別の例示的実施態様は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。
【００４６】
当該態様の一実施形態は、メラニン量増加が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加方法である。
別の実施形態は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。
また別の実施形態は、メラニン量増加が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加方法である。
また別の実施形態は、メラニン量低減が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の低減方法である。
【００４７】
本発明の別の例示的実施態様は、皮膚色褐色化又は暗色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の皮膚色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚タンニングが可能になる。
本発明の別の例示的実施態様は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。
【００４８】
当該態様の一実施形態は、皮膚色褐色化又は暗色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の皮膚色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚タンニングが可能になる。
別の実施形態は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。
また別の実施態様は、皮膚色褐色化又は暗色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の皮膚色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚タンニングが可能になる。
また別の実施形態は、皮膚色明色化を所望する被験体の皮膚ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の皮膚色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、皮膚美白が可能になる。
【００４９】
本発明のさらに別の例示的実施態様は、毛髪色褐色化又は暗色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の毛髪色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、ブリーチ後の髪の色戻し又は白髪染めが可能になる。
本発明の別の例示的実施態様は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。
【００５０】
当該態様の一実施形態は、毛髪色褐色化又は暗色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の毛髪色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、ブリーチ後の髪の色戻し又は白髪染めが可能になる。
別の実施形態は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。
また別の実施形態は、毛髪色褐色化又は暗色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程を含む、被験体の毛髪色を褐色化又は暗色化する方法である。この方法によれば、例えば、ブリーチ後の髪の色戻し又は白髪染めが可能になる。
また別の実施形態は、毛髪色明色化を所望する被験体の毛包ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制することによって、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程を含む、被験体の毛髪色を明色化する方法である。この方法によれば、例えば、髪のライトニング又はブリーチングが可能になる。
【００５１】
オートファジーの活性を変化させる物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節し、皮膚又は毛髪の色を制御することができる物質である。したがって、本発明はまた、オートファジーの活性を利用した、物質のケラチノサイトのメラニン量調節作用又は皮膚若しくは毛髪色制御作用の評価方法、ならびにケラチノサイトのメラニン量調節剤、又は皮膚若しくは毛髪色制御剤の評価又は選択方法を提供する。
【００５２】
本発明による、ケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法は、細胞に被験物質を投与する工程；当該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び、当該測定の結果に基づいて、当該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程、を含む。
【００５３】
被験物質を投与する細胞は、オートファジー活性を有する限り、天然の細胞でも又は遺伝子工学的に改変された細胞でもよく、培養細胞、又は動物の組織若しくは器官培養物に由来する細胞が好ましく、培養ヒト細胞がより好ましい。また好ましくは、細胞は皮膚細胞であり、より好ましくは表皮細胞又は毛包細胞であり、さらに好ましくはケラチノサイトである。好ましい細胞の具体的な例としては、ヒト由来培養表皮細胞（例えば、ヒト正常表皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）、又はヒト組織培養毛包細胞である。
【００５４】
被験物質の種類は天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。投与の形態は、被験物質に依存して、任意の形態であり得る。
【００５５】
オートファジーの活性は、例えば、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の発現若しくは活性、あるいは当該分子の細胞内での量を調べることによって、測定することができる。当該遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性、あるいは当該分子の細胞内での量は、当該分野で通常使用される任意の解析方法によって測定することができる。遺伝子発現解析方法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられる。遺伝子にコードされるタンパク質の発現若しくは活性の解析方法、又は定量の方法としては、ウエスタンブロッティング法、免疫染色法、蛍光染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等が挙げられる。
【００５６】
測定したオートファジー活性に基づいて、被験物質の投与によるオートファジーの活性の変化を評価することができる。例えば、被験物質の投与前後にオートファジーの活性を測定し、必要に応じて測定値を定量化した後、投与前後の結果を比較することができる。また例えば、被験物質の投与群と、非投与群若しくは対照物質投与群のオートファジー活性を測定し、必要に応じて測定値を定量化した後、結果を投与群と非投与群、又は投与群と対照物質投与群との間で比較することができる。さらに、異なる濃度の被験物質を投与してオートファジー活性を測定し、被験物質の濃度による測定結果の差を調べることもできる。
【００５７】
上記オートファジー活性の測定結果に基づいて、被験物質のケラチノサイトにおけるメラニン量の調節作用を評価することができる。オートファジーの活性に影響を及ぼすと評価された被験物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節作用を有する物質であると判断され、あるいはケラチノサイトにおけるメラニン量の調節のために使用できるケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤として選択され得る。したがって、本発明におけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法は、被験物質の評価結果に基づいて、当該被験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤として選択する工程をさらに含み得る。
【００５８】
例えば、オートファジーの活性を抑制する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量増加剤として選択される。このような物質としては、オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する物質が挙げられる。当該剤は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させて皮膚又は毛髪色を褐色化又は暗色化する、皮膚又は毛髪色の褐色化又は暗色化剤（例えば、皮膚タンニング剤、毛髪暗色化剤、ブリーチ後の髪の色戻し剤、白髪染め剤等）として使用することができる。
一方、オートファジーの活性を増強する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量低下剤として選択される。このような物質としては、オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する物質、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質が挙げられる。当該剤は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させて皮膚又は毛髪色を明色化する、皮膚又は毛髪色の明色化剤（例えば、皮膚美白剤、髪のライトニング又はブリーチング剤等）として使用することができる。
【００５９】
本発明はまた、皮膚又は毛髪色制御剤の選択方法を提供する。当該方法は、細胞に被験物質を投与する工程；当該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び、当該測定の結果に基づいて、当該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程、を含む。当該方法で使用される細胞、被験物質、遺伝子又は分子の発現又は活性の測定方法、及び該測定結果の評価方法は、上述と同様である。
【００６０】
上記オートファジー活性の測定結果に基づいて、被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価することができる。オートファジーの活性に影響を及ぼすと評価された被験物質は、皮膚又は毛髪色制御作用を有する物質であると判断され、あるいは皮膚又は毛髪色の制御に使用できる皮膚又は毛髪色制御剤として選択され得る。したがって、本発明における皮膚又は毛髪色制御剤の評価又は選択方法は、被験物質の評価結果に基づいて、当該被験物質を皮膚又は毛髪色制御剤として選択する工程をさらに含み得る。
【００６１】
例えば、オートファジーの活性を抑制する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させて皮膚又は毛髪色を褐色化又は暗色化する、皮膚又は毛髪色の褐色化又は暗色化剤（例えば、皮膚タンニング剤、毛髪暗色化剤、ブリーチ後の髪の色戻し剤、白髪染め剤等）として選択される。このような物質としては、オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する物質が挙げられる。
一方、オートファジーの活性を増強する物質は、ケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させて、皮膚又は毛髪色を明色化する、皮膚又は毛髪色の明色化剤（例えば、皮膚美白剤、髪のライトニング又はブリーチング剤等）として選択される。このような物質としては、オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する物質、及びオートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する物質が挙げられる。
【００６２】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、方法、あるいは用途を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００６３】
＜１＞下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程。
【００６４】
＜２＞下記工程を含む被験物質のケラチノサイトにおけるメラニン量調節作用を評価する方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のケラチノサイトにおけるメラニン量調節作用を評価する工程。
【００６５】
＜３＞前記評価の結果に基づいて、前記被験物質をケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤として選択する工程をさらに含む、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
【００６６】
＜４＞以下の場合に、上記被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる作用があると評価される、＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
【００６７】
＜５＞以下の場合に、上記被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を低下させる作用があると評価される、＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
【００６８】
＜６＞下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程。
【００６９】
＜７＞下記工程を含む被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程。
【００７０】
＜８＞前記評価の結果に基づいて、前記被験物質を皮膚又は毛髪色制御剤として選択する工程をさらに含む、＜６＞又は＜７＞記載の方法。
【００７１】
＜９＞以下の場合に、上記被験物質が皮膚又は毛髪色を暗色化する作用があると評価される、＜６＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
【００７２】
＜１０＞以下の場合に、上記被験物質が皮膚又は毛髪色を明色化する作用があると評価される、＜６＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
【００７３】
＜１１＞メラニン量調節が所望されるケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、ケラチノサイトにおけるメラニン量の調節方法。
【００７４】
＜１２＞上記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程によりケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる工程である、＜１１＞記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
【００７５】
＜１３＞上記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程によりケラチノサイトにおけるメラニン量を減少させる工程である、＜１１＞記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
【００７６】
＜１４＞皮膚又は毛髪色制御を所望する被験体のケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を調節する工程を含む、被験体における皮膚又は毛髪色制御方法。
【００７７】
＜１５＞上記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により皮膚色を暗色化させる工程である、＜１４＞記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
【００７８】
＜１６＞上記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により皮膚色を明色化させる工程である、＜１４＞記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
【００７９】
＜１７＞ケラチノサイトが皮膚ケラチノサイトである、＜１５＞又は＜１６＞記載の方法。
【００８０】
＜１８＞上記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により毛髪色を暗色化させる工程である、＜１４＞記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程。
【００８１】
＜１９＞上記オートファジーの活性を調節する工程が、以下の工程により毛髪色を明色化させる工程である、＜１４＞記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を増強する工程；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性を抑制する工程。
【００８２】
＜２０＞ケラチノサイトが毛包ケラチノサイトである、＜１８＞又は＜１９＞記載の方法。
【００８３】
＜２１＞非治療的方法である、＜１１＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の方法。
【００８４】
＜２２＞ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節するための、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の使用。
【００８５】
＜２３＞メラニン量を増加又は減少させるための、＜２２＞記載の使用。
【００８６】
＜２４＞皮膚又は毛髪色を制御するための、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子の使用。
【００８７】
＜２５＞皮膚又は毛髪色を暗色化又は明色化するための、＜２４＞記載の使用。
【００８８】
＜２６＞非治療的使用である、＜２２＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の使用。
【００８９】
＜２７＞ケラチノサイトにおけるメラニン量を調節において使用されるための、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子。
【００９０】
＜２８＞メラニン量の増加又は減少において使用されるための＜２７＞記載の遺伝子又は分子。
【００９１】
＜２９＞皮膚又は毛髪色の制御において使用されるための、オートファジー関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされる分子。
【００９２】
＜３０＞皮膚又は毛髪色の暗色化又は明色化において使用されるための＜２９＞記載の遺伝子又は分子。
【００９３】
＜３１＞オートファジーの活性が、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解からなる群より選択される、＜１＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
【００９４】
＜３２＞オートファジーの活性が、ファゴフォアの発生、ファゴフォアの成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解からなる群より選択される、＜２２＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の使用。
【００９５】
＜３３＞オートファジー関連遺伝子が、オートファジーにおけるファゴフォアの発生、ファゴフォアの成長、オートファゴソームの形成、オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内部における物質の分解からなる群より選択されるステップに関与する遺伝子である、＜２７＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の遺伝子又は分子。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。【００９７】
試料
（正常ヒト新生児包皮由来ケラチノサイト；ＮＨＥＫｓ）
正常ヒト新生児包皮由来ケラチノサイト（ＮＨＥＫｓ）はＫＵＲＡＢＯより購入した。細胞を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で２４時間培養した。培地は、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（ＫＵＲＡＢＯ）［１０μｇ／ｍｌインスリン、０．１μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ、及び０．４％（ｖ／ｖ）ウシ脳下垂体抽出物（ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ；ＢＰＥ）添加］を用いた。培養後、ＢＰＥとｈＥＧＦを除いた培地でさらに２４時間培養して、以下の実験に用いた。
（メラノソーム）
メラノーマＭＮＴ−１細胞は、Ｄｒ． ＰｉｅｄＧｉｏｒｇｉｏ  Ｎａｔａｌｉ  （Ｒｅｇｉｎａ  Ｅｌｅｎａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｒｏｍｅ，  Ｉｔａｌｙ）の好意により提供された。ＭＮＴ−１細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地［１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１０％（ｖ／ｖ）ＡＩＭ−Ｖ  ｍｅｄｉｕｍ添加］で培養し、その後該細胞からメラノソームを単離した。
（新生児包皮由来ケラチノサイト；ＮＨＥＫｓ）
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人ドナーの新生児包皮は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（フィラデルフィア）から入手し、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ  （ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２１：２８２９−２８３９，  ２００７）に記載の方法に従ってＮＨＥＫｓを調製した。すなわち、包皮をディスパーゼ処理することで表皮と真皮を分離し、表皮シートを０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液中３７℃で１０分間処理することで細胞を単離し、専用培地を用いて；ＮＨＥＫｓを初代培養した。
（三次元培養ヒト皮膚モデル）
三次元（３Ｄ）培養ヒト皮膚モデル（３Ｄ−ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ；３Ｄ−ＨＳＳｓ）は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏ．から購入し（ＭＥＬ−３００Ａ又はＢ）、製品マニュアルに従って、ＥＰＩ−１００ＮＭＭ−１１３  ｍｅｄｉｕｍ（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏ．）中で３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。【００９８】
参考例１  メラニン分解におけるリソソーム機構の関与
培養ＮＨＥＫｓは、ＭＮＴ−１細胞由来単離メラノソームとともに、リソソーム阻害剤であるＥ−６４−Ｄ及びペプスタチンＡ（各２０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で培養した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、さらにＥ−６４−Ｄ及びペプスタチンＡ（各２０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解し、超音波でホモジェナイズして、上清を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した。分離したサンプルをＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、メラノソームタンパク質Ｐｍｅｌ−１７に特異的抗体（ｃｌｏｎｅ  ＨＭＢ−４５、ＤＡＫＯ  Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。
ウエスタンブロッティングでは、上記ＰＶＤＦ膜をＰｍｅｌ−１７特異的抗体（２０００倍希釈）とともにインキュベートし、洗浄して、２次抗体とインキュベートした。２次抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ又はペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（５０００倍希釈、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）を用いた。バンドは、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）で可視化した。次いで、内部標準としてロードしたβ−アクチンに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で膜を再ブロットし、ロードしたタンパク質量を標準化した。
一部のデータについては、ウエスタンブロッティング解析で得られたＰｍｅｌ−１７の各バンドのβ−アクチンのバンドに対する相対強度を求め、メラニン蓄積量を定量化した。
結果を図１に示す。リソソーム阻害剤の添加により、ＮＨＥＫｓにメラノソームが蓄積した。この結果より、ＮＨＥＫｓにおけるメラノソーム分解にリソソームの活性が関与していることが示唆された。【００９９】
実施例１  皮膚色の異なる人種間でのオートファジー関連因子の発現の違い
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の新生児包皮由来ケラチノサイト（ＮＨＥＫｓ）における、オートファジー関連因子ＡＴＧ７又はＡＴＧ１３の発現量を調べた。
ＮＨＥＫｓは、２日間培養した後、参考例１と同様の手順で、ＡＴＧ７特異的抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）又はＡＴＧ１３特異的抗体（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図２に示す。明色の皮膚を有するコーカシアン系アメリカ人由来のＮＨＥＫｓは、暗色の皮膚を有するアフリカ系アメリカ人由来のＮＨＥＫｓと比べて、オートファジー関連因子の発現が高かった。【０１００】
実施例２  皮膚色の異なる人種間でのオートファジー活性の違い
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の新生児包皮由来ケラチノサイト（ＮＨＥＫｓ）における、オートファジーの活性を調べた。
ＮＨＥＫｓは、オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ、１０μＭ）の存在下又は非存在下で４８時間培養し、参考例１と同様の手順で、オートファジーの基質であるｐ６２特異的抗体（２０００倍希釈、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、又はＬＣ３特異的抗体（２０００倍希釈、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，又はＣｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。なお、ＬＣ３タンパク質としては、ＬＣ３-Ｉ及びＬＣ３−Ｉにホスファチジルエタノールアミンが付加されオートファゴソームに局在するＬＣ３−ＩＩを検出した。ウエスタンブロッティングの各バンドのβ−アクチンのバンドに対する相対強度を求め、オートファジー活性を定量化した。
結果を図３に示す。オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン存在下において、コーカシアン系アメリカ人由来のＮＨＥＫｓは、アフリカ系アメリカ人由来のＮＨＥＫｓと比べて、ｐ６２及びＬＣ３−ＩＩの蓄積量が多く、高いオートファジー活性を有することが示された。【０１０１】
実施例３  皮膚色の異なる人種間でのメラノソーム取り込み後のオートファジー活性の違い。
コーカシアン系アメリカ人及びアフリカ系アメリカ人の新生児包皮由来ケラチノサイト（ＮＨＥＫｓ）を、ＭＮＴ−１細胞由来単離メラノソームとともに０、４、８、２４又は４８時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、参考例１と同様の手順で、ＬＣ３特異的抗体、又はＣＯＸ−ＩＶ特異的抗体（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。ウエスタンブロッティングの各バンドをβ−アクチンに対して標準化し、相対強度を求めた。
結果を図４に示す。コーカシアン系アメリカ人由来のＮＨＥＫｓは、メラノソームによりＬＣ３−ＩＩ量が増加し、また、オートファジー活性により分解されるマーカーの一つとして知られるＣＯＸ−ＩＶ量は減少したことから、オートファジー活性が高く、メラニンを積極的に分解するようになっていることが示唆される。一方、アフリカ系アメリカ人由来のＮＨＥＫｓは、メラノームによりＬＣ３-ＩＩ量が減少しており、オートファジー活性が抑制されていることから、メラニンを積極的に蓄積するようになっていることが示唆される。以上のことから、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性が皮膚のメラニン量、および皮膚色と関係していることが考えられる。【０１０２】
実施例４  オートファジー関連因子の発現抑制によるケラチノサイトにおけるメラノソーム蓄積の増加
ＮＨＥＫｓに、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて、製品マニュアルに従い、１０ｎＭのＡＴＧ７特異的ｓｉＲＮＡ、ＡＴＧ１３特異的ｓｉＲＮＡ、ＵＶＲＡＧ特異的ｓｉＲＮＡ、又は非特異的ｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクトした。４８時間後、ＭＮＴ−１細胞由来単離メラノソームを添加し、２４時間培養した。培養物をＰＢＳで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに２４時間培養した後、参考例１と同様の手順で、ＡＴＧ７特異的抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、ＬＣ３特異的抗体（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．又はＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ｐ６２特異的抗体（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）又はメラノソームタンパク質であるＰｍｅｌ１７に特異的な抗体（ｃｌｏｎｅ  ＨＭＢ−４５、ＤＡＫＯ  Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。結果を図５Ａ及びＢに示す。ＡＴＧ７、ＡＴＧ１３及びＵＶＲＡＧの特異的な発現阻害により、ケラチノサイトにおいてオートファジーの基質であるｐ６２が蓄積し、Ｐｍｅｌ１７の量が顕著に増加した。
ＮＨＥＫｓに１０ｎＭのＡＴＧ７特異的ｓｉＲＮＡ又は非特異的ｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクトし、ＮＨＥＭｓと共に７日間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄後に乾燥し、ＳｏｌｖａｂｌｅＴＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で溶解させ、吸光度計（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０；  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によりメラニン量を測定した。結果を図５Ｃに示す。ＡＴＧ７発現阻害によりケラチノサイトとメラノサイトとの共培養におけるメラニン量が増加した。
これらの結果は、オートファジーがケラチノサイトにおけるメラノソーム分解に寄与していることを示唆する。【０１０３】
実施例５  オートファジー関連因子の発現抑制によるケラチノサイトにおけるメラノソーム蓄積の増加
ＮＨＥＫｓに、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて、製品マニュアルに従い、１００ｐＭ、１ｎＭ、又は１０ｎＭのＲＡＢ１１Ａ特異的ｓｉＲＮＡ又はＡＴＧ７特異的ｓｉＲＮＡ、あるいは１０ｎＭの非特異的ｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクトした。４８時間後、ＭＮＴ−１細胞由来単離メラノソームを添加し、２４時間培養した。培養物をＰＢＳで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに２４時間培養した後、参考例１と同様の手順で、ＲＡＢ１１Ａ特異的抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｃｏｒｐ．）、ＡＴＧ７特異的抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、又はＰｍｅｌ１７特異的な抗体（ｃｌｏｎｅ  ＨＭＢ−４５、ＤＡＫＯ  Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図６に示す。Ｐｍｅｌ１７量は、ＲＡＢ１１Ａ及びＡＴＧ７のｓｉＲＮＡ濃度に依存して増加した。この結果は、ケラチノサイトのオートファジー活性レベルとメラニン蓄積との間に負の相関があることを示唆する。【０１０４】
実施例６  オートファジー関連因子の発現抑制によるケラチノサイトにおけるメラノソーム蓄積の増加
培養ＮＨＥＫｓに、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて、製品マニュアルに従い、１０ｎＭのＡＴＧ５特異的ｓｉＲＮＡ、ＵＶＲＡＧ特異的ｓｉＲＮＡ、又は非特異的ｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクトした。４８時間後、ＭＮＴ−１細胞由来単離メラノソームを添加し、２４時間培養した。培養物をＰＢＳで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに２４時間培養した後、参考例１と同様の手順で、Ｐｍｅｌ１７特異的抗体（ｃｌｏｎｅ  ＨＭＢ−４５、ＤＡＫＯ  Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図７に示す。ＡＴＧ５又はＵＶＲＡＧの特異的阻害により、Ｐｍｅｌ１７（ｃｌｏｎｅ；ＨＭＢ４５）の量が顕著に増加した。この結果は、ＮＨＥＫｓにおけるメラノソーム分解にオートファジー関連因子が寄与していることを示唆する。【０１０５】
実施例７  オートファジー活性化によるケラチノサイトにおけるメラノソーム蓄積の増加
オートファジー抑制因子であるｍＴＯＲの抑制がメラニン蓄積に与える影響を調べた。培養ＮＨＥＫｓに、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて、製品マニュアルに従い、１０ｎＭのｍＴＯＲ特異的ｓｉＲＮＡ又は非特異的ｓｉＲＮＡ（対照）をトランスフェクトした。２４時間後、ＭＮＴ−１細胞由来単離メラノソームを添加し、２４時間培養した。培養物をＰＢＳで洗浄して細胞に取り込まれなかったメラノソームを洗浄し、さらに２４時間培養した後、参考例１と同様の手順で、ＬＣ３特異的抗体（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．又はＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＰｍｅｌ１７特異的な抗体（ｃｌｏｎｅ  ＨＭＢ−４５、ＤＡＫＯ  Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロッティング解析を行った。ウエスタンブロッティングの各バンドをβ−アクチンに対して標準化し、相対強度を求めた。
結果を図８に示す。オートファジー抑制因子であるｍＴＯＲの特異的阻害でオートファジー活性が亢進したため、ＬＣ３−ＩＩ量が増加し、Ｐｍｅｌ１７は顕著に低下した。この結果から、ｍＴＯＲは、オートファジー機構を介してメラニン蓄積量に影響していることが示唆された。【０１０６】
実施例８  三次元培養ヒト皮膚モデル（３Ｄ−ＨＳＳｓ）のメラニン含量に対するオートファジー調節の影響
３Ｄ−ＨＳＳｓ（three-dimensional human skin substitutes、ＮＨＥＫ及びＮＨＥＭを含む再構成表皮モデル）は、オートファジー誘導剤であるベラパミル（１０μＭ）又はラパマイシン（１μＭ）とともに１４日間培養した。培地は１日おきに交換した。培養後、参考例１と同様の手順で、ｐ６２特異的抗体（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＬＣ３特異的抗体（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．又はＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるウエスタンブロッティング解析を行った。
また、３Ｄ−ＨＳＳｓをエンドセリン−１及びＳＣＦ存在下でオートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ、１０μＭ）とともに１４日間培養し、ウエスタンブロッティング解析を行った。
結果を図９に示す。オートファジー誘導剤により、３Ｄ−ＨＳＳｓの暗色化が抑えられた（図９Ａ、培養１４日後）。またオートファジー活性の指標因子であるＬＣ３−ＩＩの量が増加し、オートファジーにより分解を受ける基質タンパク質ｐ６２の量が減少した（図９Ｂ、培養６日後）。一方、オートファジー阻害剤であるＨＣＱにより、３Ｄ−ＨＳＳｓは暗色化し、またｐ６２の量が増加した（図９Ｃ、Ｄ）。【０１０７】
実施例９  ヒト皮膚色に対するオートファジー調節の影響
アフリカ系アメリカ人から皮膚組織を採取し、オートファジー誘導剤ベラパミル（１０μＭ）若しくはラパマイシン（１μＭ）、又はオートファジー阻害剤ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ、１０μＭ）の存在下又は非存在下で培養した。８日培養後に、培養皮膚の明度（Ｌ＊値）を色差計（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；ｃｙｂｅｒＤＥＲＭ社）により測定した。結果を図１０に示す。オートファジー誘導剤とともに培養された皮膚のＬ＊値は上昇した（すなわち、皮膚色が明るくなった）一方で、オートファジー阻害剤とともに培養された皮膚のＬ＊値は低下した（すなわち、皮膚色が暗くなった）。【０１０８】
実施例１０  メラニン量調節剤の評価又は選択  培養ＮＨＥＫｓに、試験物質を添加して７２時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解し、超音波でホモジェナイズして上清を回収した。回収した上清中のＲＡＢ１１Ａ又はＡＴＧ７量についてウエスタンブロッティング解析を行った。同様の手順にて試験物質非添加で培養した細胞（対照）についてＲＡＢ１１Ａ又はＡＴＧ７量を測定した。対照に比べてＲＡＢ１１Ａ又はＡＴＧ７の量を３０％以上抑制した試験物質を、メラニン量増強剤の候補物質として選択した。その結果、１５種類の試験物質が候補物質として選択された。
選択した候補物質のメラニン量調節活性を調べた。ＮＨＥＫ及びＮＨＥＭを含む３Ｄ−ＨＳＳｓの上部（角層側）のみに上記で選択した候補物質を添加して１４日間培養した。培養後、組織を水酸化ナトリウム（２Ｎ）水溶液で可溶化することにより、組織中のメラニン量を測定した。同様に候補物質を添加して培養した３Ｄ−ＨＳＳｓの細胞呼吸活性を、アラマーブルー法によって測定することにより、候補物質の細胞毒性を調べた。２種類の候補物質サンプルＡ及びＢについての結果を図１１に示す。候補物質がメラニン量増強活性を有することが確認された。また細胞呼吸活性の結果より、これらの候補物質に細胞毒性がないことが確認された。【０１０９】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。  本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月19日(2014.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むケラチノサイトにおけるメラニン量調節剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性の変化を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質のメラニン量調節作用を評価する工程。
【請求項２】
以下の場合に、前記被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させる作用があると評価される、請求項１記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
【請求項３】
以下の場合に、前記被験物質がケラチノサイトにおけるメラニン量を低下させる作用があると評価される、請求項１記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
【請求項４】
下記工程を含む皮膚又は毛髪色制御剤の評価又は選択方法：
細胞に被験物質を投与する工程；
該細胞におけるオートファジーの活性を測定する工程；及び
該測定の結果に基づいて、該被験物質の皮膚又は毛髪色制御作用を評価する工程。
【請求項５】
以下の場合に、前記被験物質が皮膚又は毛髪色を暗色化する作用があると評価される、請求項４記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合。
【請求項６】
以下の場合に、前記被験物質が皮膚又は毛髪色を明色化する作用があると評価される、請求項４記載の方法：
(i) オートファジーの活性化に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が増強された場合；又は
(ii) オートファジーの活性抑制に関与する遺伝子又はそれにコードされる分子の発現若しくは活性が抑制された場合。
【国際調査報告】
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