(57)【要約】  本発明は、細菌性病害に対して極めて有効な防除剤を提供する。本発明のクオラムセンシング阻害剤及び農園芸用細菌性病害防除剤は、一般式（１）【化１】2009063901.tif 000030[式中、Ｒ１はＣ１−５アルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ２は水素原子又はＣ１−５アルキル基を示す。但し、Ｒ２が水素原子を示す場合、Ｒ１はメチル基であってはならない。]で表されるピリミジノン化合物を含有する。
2009063901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2009063901.tif 000026
[式中、Ｒ１はＣ１−５アルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ２は水素原子又はＣ１−５アルキル基を示す。但し、Ｒ２が水素原子を示す場合、Ｒ１はメチル基であってはならない。]
で表されるピリミジノン化合物を含有するクオラムセンシング阻害剤。
【請求項２】
Ｒ１がＣ２−５アルキル基、Ｒ２が水素原子を示すピリミジノン化合物を含有する、請求項１に記載のクオラムセンシング阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１がＣ１−３アルキル基、Ｒ２がＣ１−５アルキル基を示すピリミジノン化合物を含有する、請求項１に記載のクオラムセンシング阻害剤。
【請求項４】
一般式（１）
【化２】
2009063901.tif 000027
[式中、Ｒ１はＣ１−５アルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ２は水素原子又はＣ１−５アルキル基を示す。但し、Ｒ２が水素原子を示す場合、Ｒ１はメチル基であってはならない。]
で表されるピリミジノン化合物を含有する農園芸用細菌性病害防除剤。
【請求項５】
Ｒ１がＣ２−５アルキル基、Ｒ２が水素原子を示すピリミジノン化合物を含有する、請求項４に記載の農園芸用細菌性病害防除剤。
【請求項６】
Ｒ１がＣ１−３アルキル基、Ｒ２がＣ１−５アルキル基を示すピリミジノン化合物を含有する、請求項４に記載の農園芸用細菌性病害防除剤。
【請求項７】
一般式（１）
【化３】
2009063901.tif 000028
[式中、Ｒ１は直鎖もしくは分枝鎖状のＣ２−５アルキル基を示し、Ｒ２は水素原子を示す。]
で表されるピリミジノン化合物。
【請求項８】
Ｒ１が直鎖状のＣ２−５アルキル基を示す、請求項７に記載のピリミジノン化合物。
【請求項９】
一般式（１）
【化４】
2009063901.tif 000029
[式中、Ｒ１は直鎖状のＣ１−３アルキル基を示し、Ｒ２はメチル基を示す。]
で表されるピリミジノン化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クオラムセンシング阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の細菌には自らの細菌数を感知しその病原性の発現を制御する遺伝子ネットワーク（クオラムセンシング）が存在し、日和見感染菌に代表される多くの細菌はクオラムセンシングを利用することで、宿主の防御機構や敵対生物からの攻撃に耐えられるだけの細菌数を確保した後、毒素などの病原性の発現を行うという、集団レベルでの活動を行うことが知られている。【０００３】
一方、細菌性の植物病害は、難防除病害として知られている。一般に市販されているカビ（糸状菌）による植物病害に有効な薬剤は、その大半が細菌性病害に対して有効でなく、僅かに無機又は有機の銅剤、ストレプトマイシン剤、オキソリニック酸、生物農薬等が細菌性病害防除剤として使用されるに止まっている。しかも、これら防除剤を使用しても、作物によっては必ずしも満足できる防除効果が得られていない。さらに、近年、オキソリニック酸の耐性モミ枯細菌病菌の発生が報告される等、細菌性植物病害の防除がますます困難な状況となってきている。なお、細菌性植物病害の原因菌の一種であるモミ枯細菌は、稲に感染後はクオラムセンシングを利用して一斉に毒素を排出し、病害を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。【０００４】
特許文献１には、ある種のピリミジノン化合物が中枢神経系興奮剤として使用できることが報告されている。しかしながら、該文献には、細菌性植物病害に対する該ピリミジノン化合物の防除効果について一切記載されておらず、事実、後記試験例１から明らかなように、該文献に具体的に記載されているピリミジノン化合物は細菌性病害に対して防除効果を全く有していない。【０００５】
特許文献２には、ある種のピリミジノン化合物が鎮痛作用を有していることが記載されているが、該文献には、細菌性植物病害に対する該ピリミジノン化合物の防除効果について一切教示していない。【０００６】
特許文献３には、ある種のアミド化合物が細菌類のバイオフィルム（生物膜）形成を調整する作用を有することが報告されている。しかしながら、該文献には、細菌性植物病害に対する該アミド化合物による防除効果について一切記載されておらず、事実、後記試験例から明らかなように、該文献記載のアミド化合物は細菌性病害に対して防除効果を有していない。【０００７】
細菌性植物病害に有効な薬剤の種類が不足している今日において、細菌性植物病害に対して優れた防除効果を有する薬剤の開発が強く要望されているのが実情である。
【特許文献１】特開昭４８−３６１９３号公報
【特許文献２】特開昭５４−４８７９５号公報
【特許文献３】特表２００６−５１２２９０号公報
【非特許文献１】Molecular  Microbiology, 54（4）, 921-934（2004）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細菌性病害に対して極めて有効な防除剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、ある種のピリミジノン化合物が、ある種の細菌類のクオラムセンシングを阻害する効果を有し、より具体的には、細菌の毒素産生を抑制する作用、細菌のバイオフィルムの形成を阻害する作用、及び既に形成されたバイオフィルムを剥離除去する作用を有しており、上記課題を解決できることを見出した。本発明は、この様な知見に基づき完成されたものである。【００１０】
本発明は、一般式（１）【００１１】
【化１】
2009063901.tif 000003
【００１２】
[式中、Ｒ１はＣ１−５アルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ２は水素原子又はＣ１−５アルキル基を示す。但し、Ｒ２が水素原子を示す場合、Ｒ１はメチル基であってはならない。]
で表されるピリミジノン化合物を含有するクオラムセンシング阻害剤を提供する。【００１３】
本発明は、上記一般式（１）で表されるピリミジノン化合物を含有する農園芸用細菌性病害防除剤を提供する。【００１４】
本発明は、上記一般式（１）で表されるピリミジノン化合物を含有するバイオフィルム形成阻害剤を提供する。【００１５】
本発明は、上記一般式（１）で表されるピリミジノン化合物を含有するバイオフィルム剥離剤を提供する。【００１６】
上記一般式（１）において、Ｃ１−５アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−メチル−ｎ−ブチル、２−メチル−ｎ−ブチル、３−メチル−ｎ−ブチル、１，１−ジメチル−ｎ−プロピル、１，２−ジメチル−ｎ−プロピル、２，２−ジメチル−ｎ−プロピル、１−エチル−ｎ−プロピル基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を挙げることができる。【００１７】
本発明の有効成分である上記一般式（１）で表されるピリミジノン化合物は、Ｒ１が直鎖もしくは分枝鎖状のＣ２−５アルキル基、Ｒ２が水素原子を示すピリミジノン化合物が好ましい。特に、Ｒ１が直鎖状のＣ３−５アルキル基、Ｒ２が水素原子を示す一般式（１）で表されるピリミジノン化合物が好ましい。【００１８】
また、本発明の有効成分である上記一般式（１）で表されるピリミジノン化合物は、Ｒ１が直鎖もしくは分枝鎖状のＣ１−３アルキル基、Ｒ２が直鎖もしくは分枝鎖状のＣ１−５アルキル基を示すピリミジノン化合物が好ましく、Ｒ１が直鎖状のＣ１−３アルキル基、Ｒ２がメチル基を示すピリミジノン化合物がより好ましい。【００１９】
本発明の有効成分である上記一般式（１）で表されるピリミジノン化合物は、例えば、下記反応式−１に示す方法に従い、化合物（２）と化合物（３）とを、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等）等の溶媒中、還流下に反応させることにより製造され、具体的には後述する製造例に準じて製造することができる。【００２０】
反応式−１【００２１】
【化２】
2009063901.tif 000004
【００２２】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、前記に同じ。Ｒ３はＣ１−５アルキル基を示す。］【００２３】
本発明のピリミジノン化合物は、エルヴィニア属、シュードモナス属又はキサントモナス属に属する細菌、例えば、イネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、イネもみ枯細菌病菌（Pseudomonas glumae）、イネ苗立枯細菌病菌（Pseudomonas plantarii）、キュウリ斑点細菌病菌（Pseudomonas syringae）、カンキツかいよう病菌（Xanthomonas campestris pv. citri）、リンゴ火傷病菌（Erwinia amylovora）、モモ/アンズ穿孔細菌病菌（Xanthomonas campestris pv. pruni）、ウメかいよう病菌（Pseudomonas syringae pv.morsprunorum）、キャベツ黒腐病（Xanthomonas campestris）、アブラナ科野菜の黒斑細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola）、はくさい軟腐病菌（Erwinia carotovora）、レタス腐敗病（Pseudomonas cicihorii，P. marginars，P. viridiflava）、コンニャクの腐敗病菌（Erwinia carotovora subsp. cartovora）、トマト／なす青枯病菌（Pseudomonas solanacearum）等による病害に対して有効であり、シュードモナス属、特にイネもみ枯細菌病菌に対して優れた防除効果を発揮する。【００２４】
本発明のピリミジノン化合物は、イネもみ枯れ細菌病害菌の毒素産生を阻害する効果を有している（後記試験例９参照）。また、イネもみ枯れ細菌病害菌は、クオラムセンシングにより細菌の酸素耐性機構に関わっているａｈｐＦ（alkyl hydroperoxide reductase subunit F）と呼ばれる酵素産生を調整しており、それ故、本発明のピリミジン化合物は、イネもみ枯れ細菌病害菌のａｈｐＦ発現量を阻害し、空気酸化によりもみ枯れ細菌病害菌を自滅させる効果を有している。【００２５】
一般式（１）のピリミジノン化合物を農園芸用細菌性病害防除剤として使用する場合、他の成分を加えずにそのまま防除剤として使用しても良いが、例えば、固体状、液体状、ガス状等の各種担体と混合し、更に必要に応じて界面活性剤、固着剤、分散剤、安定剤等の製剤用補助剤等を添加して、乳剤、水和剤、ドライフロアブル剤、フロアブル剤、水溶剤、粒剤、微粒剤、顆粒剤、粉剤、塗布剤、スプレー用製剤、エアゾール製剤、マイクロカプセル製剤、燻蒸用製剤、燻煙用製剤等の各種製剤形態に製剤して用いても良い。【００２６】
これらの製剤において、有効成分である一般式（１）のピリミジノン化合物の含有量は、その製剤形態、使用場所等の各種条件に応じて、幅広い範囲から適宜選択すれば良いが、製剤全体量に対して、通常０．０１〜９５重量％程度、好ましくは０．１〜５０重量％程度とすれば良い。【００２７】
本発明の製剤中に混合され得る固体状の担体としては、例えば、カオリンクレー、珪藻土、ベントナイト、フバサミクレー、酸性白土等の粘土類、タルク類、セラミック、セライト、石英、硫黄、活性炭、炭酸シリカ、水和シリカ等の無機鉱物、化学肥料等の微粉末、粒状物等が挙げられる。【００２８】
また、本発明の製剤中に混合され得る液体状の担体としては、例えば、水、アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、灯油、軽油等の脂肪族乃至脂環式炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン等の芳香族炭化水素；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル；アセトニトリル、イソブチロニトリル等のニトリル；ジイソプロピルエーテル、ジオキサン等のエーテル；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の酸アミド；ジクロロメタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素；ジメチルスルホキシド、大豆油、綿実油等の植物油等が挙げられる。【００２９】
本発明の製剤中に混合され得るガス状の担体としては、一般に噴射剤として用いられているものを用いればよく、例えば、ブタンガス、液化石油ガス、ジメチルエーテル、炭酸ガス等が挙げられる。【００３０】
製剤中に混合され得る界面活性剤としては、例えば、ボリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリエチレンソルビタンアルキルエステル等の非イオン界面活性剤；アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホサクシネート、アルキルサルフェート、ポリオキシエチレンアルキルサルフェート、アリルスルホネート、リグニン亜硫酸塩等の陰イオン界面活性剤等が挙げられる。【００３１】
固着剤及び分散剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、多糖類（澱粉、アラビアガム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、糖類、合成水溶性高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸類等）等が挙げられる。【００３２】
安定剤としては、例えば、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＢＨＴ（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）、ＢＨＡ（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノールと３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノールとの混合物）、植物油、鉱物油、界面活性剤、脂肪酸又はそのエステル等が挙げられる。【００３３】
本発明の製剤は、有機染料及び／又は無機染料を用いて着色しても良い。【００３４】
本発明の製剤は、そのまま用いても良いし、水等の溶媒で希釈して用いても良い。粒剤、粉剤等の場合は、通常、希釈することなくそのまま使用される。また、乳剤、水和剤、フロアブル剤等を水等の溶媒で希釈して使用する場合には、通常、有効成分濃度が０．０００１〜１００重量％程度、好ましくは０．００１〜１０重量％程度となるようにすれば良い。【００３５】
本発明の農園芸用細菌性病害防除剤は、他の除草剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、殺菌剤、植物成長調節剤、共力剤、土壌改良剤等と予め混合して製剤化しても良い。また、本発明の製剤と上記各剤とを、使用の際に併用しても良い。【００３６】
本発明の農園芸用細菌性病害防除剤を栽培植物に施用する方法としては、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、液面散布、施設内施用、土壌混和施用、土壌潅中施用、表面処理（種子粉衣、塗布処理等）、育苗箱施用、単花処理、株元処理等の方法を挙げることができる。従来、細菌性植物病害に対しては予防的に種子処理（消毒）されることが多いが、本発明の農園芸用細菌性病害防除剤は、発生が観察された時点で茎葉散布によっても効果を発現することができ、多様な処理方法を選択できる。【００３７】
本発明の農園芸用細菌性病害防除剤に使用されるピリミジノン化合物の施用量は、特に制限されず、製剤の形態、施用方法、施用時期、施用場所、施用作物の種類、細菌の種類等の各種条件に応じて広い範囲から適宜選択されるが、通常、１００ｍ２あたり０．１ｇ〜１０００ｇ程度、好ましくは１０〜５００ｇ程度である。また、乳剤、水和剤、フロアブル剤等を水で希釈して用いる場合は、その施用濃度は、通常１〜１０００ｐｐｍ程度、好ましくは１０〜５００ｐｐｍ程度である。粒剤、粉剤等は、通常、希釈することなく製剤のままで施用される。【００３８】
本発明のクオラムセンシング阻害剤は、農園芸用細菌性病害菌に対する防除効果に止まらず、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、歯周病原性細菌（Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Eikenella corrodens、Campyrobacter rectus、Fusobacterium necleatum、Treponema denticola、Actinomyces naeslundii、Streptococcus mutans）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）及び類鼻疽菌（Burkholderia mallei）等に対しても防除効果を発現することができる。【００３９】
緑膿菌及び歯周病原性細菌は、クオラムセンシングによりバイオフィルム（「生物膜」とも呼ばれる）を形成することが知られている。バイオフィルムは、微生物が分泌生成する粘液質のフィルムで、その中に複数種類の微生物が共存して複合体（群生）を形成し、固体の表面に付着した状態のものをいう。言い換えれば、バイオフィルムは、微生物が分泌排泄するスライムで囲まれた微生物の集合体である。本発明のピリミジン化合物は、緑膿菌もしくは歯周病原性細菌が行うバイオフィルムの形成を阻害する効果（バイオフィルム形成阻害効果）又は既に形成されたバイオフィルムを剥離除去する効果（バイオフィルム剥離効果）を有している。一方、鼻疽菌及び類鼻疽菌は、もみ枯れ細菌病害菌と同様に明確なバイオフィルム形成は行わないが、クオラムセンシングにより毒素産生を調整している。本発明のピリミジン化合物は、鼻疽菌及び類鼻疽菌のクオラムセンシングを阻害する効果を有している。【００４０】
バイオフィルム形成を阻害し、更にはその形成したバイオフィルムを除去剥離するという特有の効果を有するため、適用範囲が広範囲に亘り、中でも難治性のバイオフィルム感染症に対して有効に使用することができ、当該感染症の根本的治療への多大な貢献が期待できる。【００４１】
例えば、緑膿菌は自然環境中に常に存在しており、わずかな有機物と水分があれば増殖してバイオフィルムを形成するため、院内感染、菌交代症、日和見感染等を起こす原因となったり、水道管等の配管、貯水槽内等の衛生環境の悪化原因となっている。また、歯周病原性細菌が形成するプラークはバイオフィルムの形態をとっており、う蝕、歯周病、歯槽膿漏等の口腔内疾患及び口臭等の病因となっており、かかるプラークを除去することが口腔衛生及びこれらの口腔内疾患の治療において重要であることは従来より周知となっているが、バイオフィルムは、殺菌剤等の薬剤に対して防御膜のような働きがあり、その薬剤の効力が発揮されにくいという問題がある。【００４２】
本発明のクオラムセンシング阻害剤を使用することにより、病院施設；家庭、工場等の配管；貯水槽内等で緑膿菌のバイオフィルム形成を阻害し、また既に形成したバイオフィルムの除去を促進して、衛生環境を整え、院内感染、その他種々の障害を効果的に予防又は治療することが可能となる。また、本発明のクオラムセンシング阻害剤は、歯、歯肉、口腔内の歯科材料等で歯周病原性細菌のバイオフィルムの形成を阻害し、また表面に付着形成したバイオフィルムの除去を促進して、う蝕等の歯科疾患、歯周炎、歯槽膿漏等の歯周疾患、口内炎等の口腔内疾患等を効果的に予防又は治療することが可能となる。【００４３】
一般式（１）で表されるピリミジノン化合物は、後述する試験例で示すようにバイオフィルムの除去作用及びバイオフィルム形成阻害作用を有する。従って、一般式（１）で表されるピリミジノン化合物は、バイオフィルムの除去剥離又は形成阻害を目的に使用される組成物（バイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤）の有効成分として有用である。【００４４】
一般式（１）で表されるピリミジノン化合物は、バイオフィルムを形成する細菌及び形成したバイオフィルムに対して有効であるが、特に緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）や歯周病原性細菌及びそれらが形成するバイオフィルムに対して優れたバイオフィルム剥離効果及びバイオフィルム形成阻害効果を発揮する。【００４５】
従って、一般式（１）で表されるピリミジノン化合物を有効成分とするバイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤を提供する（以下、これらバイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤を総称して、「製剤」ともいう）。【００４６】
本製剤は、一般式（１）で表されるピリミジノン化合物だけからなるものであってもよいし、又は、任意の担体や添加剤と組み合わせて、従来公知の方法で所望の用途に適した形態に調製した組成物であってもよい。本製剤の形態としては、制限されないが、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤、粉末シロップ剤及びカプセル剤（硬カプセル及び軟カプセル）等の固体状の製剤；クリーム、軟膏及びジェル等のペースト状又はゲル状の製剤；液剤、懸濁剤、乳液剤、シロップ、エリキシル剤、噴霧剤及びエアゾール等の液体状の製剤、等とすることができる。【００４７】
本製剤に配合する一般式（１）で表されるピリミジノン化合物の割合としては、バイオフィルム除去剥離作用又はバイオフィルム形成阻害作用を発揮する割合であれば特に制限されず、製剤１００重量％中、０.００１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．０５〜１０重量％の範囲で適宜設定調製することができる。【００４８】
本製剤は、一般式（１）で表されるピリミジノン化合物を、バイオフィルム除去剥離効果又はバイオフィルム形成阻害効果を発揮する割合で含むものであればよく、この効果を妨げない範囲で他成分を配合することもできる。かかる他成分は、バイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤の使用目的や使用対象の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、制限されないが、かかる他成分には、賦形剤、結合剤、分散剤、増粘剤、滑沢剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤等の一般に製剤の製造に使用される担体のほか、抗生物質、抗菌剤、殺菌剤、防腐剤、ビルダー、漂白剤、酵素、キレート剤、消泡剤、着色料（染料、顔料等）、柔軟剤、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、香料、矯味剤、矯臭剤、溶媒等が含まれる。【００４９】
本製剤は、一般式（１）で表されるピリミジノン化合物に加えて、例えば塩酸ミノサイクリン等のテトラサイクリン系殺菌剤、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム等のカチオン性殺菌剤、マクロライド系抗生物質等の抗菌又は殺菌剤を含有することが好ましい。【００５０】
また本製剤には、かかる抗菌又は殺菌剤の活性を向上させる化合物、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸；ファルネソール、トランスグルコシダーゼ、ＣＧＴａｓｅ等のデンプン改変酵素、α−アミラーゼ等のデンプン加水分解酵素の酵素を併用して配合することもできる。【００５１】
本製剤は、バイオフィルムが形成され、当該バイオフィルムの形成によって障害を生じる場所に対して広く適用することができる。【００５２】
使用方法としては、産業用設備や循環式浴槽等におけるバイオフィルムに対しては、懸濁剤、水和剤、水溶剤を配管等に循環させたり、局所的にスプレーする方法やタンクや浴槽等に高濃度液や錠剤、粉剤、粒剤等の固形剤を投入してタンク内等の水で希釈又は溶解して施用する方法等が考えられる。また、医薬として使用する場合には、経口、非経口又は局所投与に適したいずれかの適当な形、特に口腔用の場合には洗口剤とすることができる。【００５３】
本製剤の使用量は、使用する場所、剤形、特に徐放性剤の場合等によって異なるため、一概に規定することはできないが、例えば本製剤をバイオフィルム感染症の予防又は治療目的で使用する場合、適当な1日の投与量としては、上記本発明のアミド化合物又はその塩の投与量に換算して、通常、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ程度の範囲で適宜設定調整することができる (例えば、ヒトの場合には総量およそ３００ｍｇ)。【００５４】
本発明は、上記バイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤を含有する口腔用組成物を提供する。本発明は、一般式（１）で表されるピリミジノン化合物を有効成分とするバイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤が、特に口腔内細菌が有する口腔内細菌が形成するバイオフィルムを除去剥離する作用又は口腔内細菌のバイオフィルム形成能を阻害する作用を有することに基づくものである。【００５５】
ここで本発明が対象とする口腔用組成物としては、練歯磨剤、粉歯磨剤、液状歯磨剤、潤製歯磨剤等の歯磨剤；トローチ状、錠剤状、液状、ガム状、グミ状、フィルム状等の口中清涼剤や洗口剤；クリーム状、軟膏状又はジェル状の形態を有する歯肉用の製剤；トローチ；チューインガム；液状又は粉末や錠剤のうがい薬；錠剤や発泡剤等の義歯や歯科材料用の洗浄剤等が含まれる。【００５６】
口腔用組成物に配合するバイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤の割合としては、バイオフィルム剥離剤又はバイオフィルム形成阻害剤の有効成分である一般式（１）で表されるピリミジノン化合物の含有量（総量）が、組成物１００重量％中に０．００１〜９９重量％以上、好ましくは０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．０５〜１０重量％の割合を挙げることができる。【００５７】
本口腔用組成物 には、その種類や形態に応じて、上記成分に加えて、必要により以下の成分を通常の使用量の範囲内で配合することができる。【００５８】
＜研磨剤＞
シリカゲル、沈降性シリカ、火成性シリカ、含水ケイ酸、無水ケイ酸、ケイ酸チタニウム、ゼオライト、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤；第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム二水和物、第二リン酸カルシウム無水和物、ピロリン酸カルシウム、第三リン酸マグネシウム、第三リン酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ケイ酸ジルコニウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、不溶性メタリン酸カルシウム、酸化チタン、及び合成樹脂系研磨剤等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。かかる研磨剤を配合する場合（例えば、歯磨剤等）、配合量は特に制限されないが、口腔用組成物１００重量％中に３〜８０重量％、好ましくは１０〜５０重量％の範囲を例示することができる。【００５９】
＜湿潤剤又は粘稠剤＞
グリセリン、濃グリセリン、ジグリセリン、エチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；キシリトール、マルチトール、ラクトール等の糖アルコール等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。【００６０】
＜粘結剤＞
アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルシウム含有アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等のアルギン酸塩及びその誘導体；カラギーナン（ι、λ、κ）、キサンタンガム、トラガントガム、カラヤガム、アラビアガム、ローカストビーンガム、グァーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシエチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ゼラチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、カーボポール、シリカゲル、アルミニウムシリカゲル、増粘性シリカ等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。かかる粘結剤を配合する場合（例えば、歯磨剤等）、配合量は特に制限されないが、口腔用組成物１００重量％中に０.１〜１０重量％程度の範囲を例示することができる。【００６１】
＜発泡剤＞
ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、アルキルスルホコハク酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸モノグリセリンスルホン酸ナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウム、N-アシルグルタメート等のN-アシルアミノ酸塩、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、マルチトール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。【００６２】
＜界面活性剤＞
界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤のいずれもが使用できる。【００６３】
アニオン界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、Ｎ−ミリストイルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−パルミトイルグルタルミン酸ナトリウム等のＮ−アシルグルタメート、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルタウリンナトリウム等のＮ−アシルタウレート等が挙げられる。ノニオン界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステル、ラクトール脂肪酸エステル等の糖アルコール脂肪酸エステル、アルキロールアマイド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ラウリル酸モノ又はジエタノールアミド等の脂肪酸ジエタノールアミド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プルロニック等が挙げられる。また、両性イオン界面活性剤としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、Ｎ−ラウリルジアミノエチルグリシン、Ｎ−ミリスチルジアミノエチルグリシン等のＮ−アルキルジアミノエチルグリシンあるいはＮ−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリンベタインナトリウム等が挙げられる。これらの界面活性剤は単独で使用してもよく、また２種以上を併用してもよい。【００６４】
＜甘味剤＞
サッカリンナトリウム、アスパルテーム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン、グリチルチリン、ソーマチン等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。【００６５】
＜防腐剤＞
メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類；安息香酸ナトリウム、フェノキシエタノール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。【００６６】
＜香料成分＞
１−メントール、アネトール、メントン、シネオール、リモネン、カルボン、メチルサリシレート、エチルブチレート、オイゲノール、チモール、ｎ−デシルアルコール、シトロネロール、α−テレピネオール、シトロネリルアセテート、リナロール、エチルリナロール、ワニリン、チモール、ペパーミント、シンナミックアルデヒド、トランス-２-ヘキセナール等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。なお、これらの成分は純品（精製物）として用いることもできるが、これに限らず、これらを含有する精油等の粗精製物の状態で配合することもできる（例えば、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、桂皮油、ピメント油、桂葉油、シソ油、冬緑油、チョウジ油、ユーカリ油等）。【００６７】
また、上記香料成分に加え、脂肪族アルコールやそのエステル、テルペン系炭化水素、フェノールエーテル、アルデヒド、ケトン、ラクトン等の香料成分や精油を本発明の効果を妨げない範囲で配合してもよい。香料成分を配合する場合、その配合量としては、口腔用組成物全体１００重量％中０．０２〜２重量％の範囲を例示することができる。【００６８】
＜抗菌成分＞
銀、銅及び亜鉛等の抗菌性金属又はその水難溶性金属塩（例えば、酸化銀、塩化銀、炭酸銀、リン酸銀、水酸化銅、グルコン酸銅、酸化亜鉛、クエン酸亜鉛、ステアリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛、水酸化亜鉛、シュウ酸亜鉛、リン酸亜鉛等）；銅クロロフィル、セチルピリジウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、トリクロサン、ヒノキチオール、塩化リゾチーム等。【００６９】
＜防腐成分＞
各種パラベン、安息香酸ナトリウム、トリクロサン等の非イオン性抗菌剤；塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性抗菌剤等。【００７０】
＜口腔用有効成分＞
塩化リゾチーム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール，ポリビニルピロリドン、ヒノキチオール、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩類、クロルヘキシジン塩類、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ビサボロール、トリクロサン、イソプロピルメチルフェノール、酢酸トコフェロール、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、アルミニウムヒドロキシルアラントイン、乳酸アルミニウム、ジヒドロコレステロール、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸塩類、銅クロロフィリン塩、塩化ナトリウム、グァイアズレンスルホン酸塩、デキストラナーゼ、塩酸ピリドキシン、トラネキサム酸、塩化ナトリウム、ビタミンＣやＥ、各種酵素（例えば、デキストラナーゼ、アミラーゼ、プロテナーゼ、ムタナーゼ、ペクチナーゼ等）、アズレン、ポリリン酸塩等の歯石予防剤、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン等のタバコヤニ除去剤、乳酸アルミニウム、硝酸カリウム等の近く過敏予防剤等。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。【００７１】
＜その他＞
青色１号等の色素、酸化チタン等の顔料、ジブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤、チャ乾留液、グルタミン酸ナトリウム等の矯味剤等。【００７２】
なお、本口腔用組成物は、常法に従って製造することができ、その製造方法は特に限定されるものではない。また、得られた練歯磨剤等の口腔用組成物は、アルミニウムチューブ、ラミネートチューブ、ガラス蒸着チューブ、プラスチックチューブ、プラスチックボトル、エアゾール容器等に充填された形で製造され、また販売され、使用時にそれから取りだして使用することができる。【００７３】
本口腔用組成物によれば、口腔内細菌による口腔内でのバイオフィルム形成を抑制し、また形成されたバイオフィルムを除去することができるため、細菌叢の生成を防止し、また抗菌剤を同時に配合する場合には当該抗菌効果を高めることによって、プラーク形成抑制効果及び抗菌効果に優れた口腔用組成物を提供することができる。従って、本発明の口腔用組成物は、う蝕（虫歯）、歯周炎や歯周疾患（例えば、歯槽膿漏等）の口腔用疾患の予防又は治療に有効に利用することができる。また本発明の口腔用組成物は、う蝕（虫歯）、歯周炎や歯周疾患（例えば、歯槽膿漏等）の原因とする口臭の予防又は除去に有効に利用することができる。
【発明の効果】
【００７４】
一般式（１）のピリミジノン化合物は、難防除である細菌性植物病害に対して優れた防除効果を有している。一般式（１）のピリミジノン化合物は、特に、もみ枯細菌等の毒素産生を極めて効果的に抑制できる。従って、一般式（１）のピリミジノン化合物は、農園芸用細菌性病害防除剤として好適に使用され得る。【００７５】
更に、一般式（１）のピリミジノン化合物は、緑膿菌、歯周病原性細菌等のクオラムセンシングに作用し、バイオフィルム形成阻害剤又はバイオフィルム剥離剤として好適に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、試験例２において、２４時間及び３６時間培養後の培養液中に存在する生菌数を示すグラフである。
【図２】図２は、試験例３において、化合物（１）の供試濃度毎の培養時間と生菌数との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、試験例４において、化合物（１）についての供試濃度（μＭ）と毒素量（μｇ／ｍｌ）との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、試験例７及び試験例８で使用されるフローセルシステムを示す概略図である。
【図５】図５は、試験液を用いた場合のバイオフィルム形成状況を対照試験液用いた場合のバイオフィルムの形成状況（control）と対比した試験例７の結果を示す図面である。
【図６】図６は、試験例９において、化合物（１）及び比較化合物（５）についての供試濃度（μＭ）と毒素量（μｇ／ｍｌ）との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７７】
１：培地瓶（Ｎｕｎｃ社製品）
２：ポンプ（４チャンネルペリスタポンプ、ISMATEC社製品ＩＳＭ９３５）
３：空気除去部（コック付きガラスカラムを転用）
４：ガラスセル（観察用ガラスキャピラリ１ｍｍ×１ｍｍ×１４ｍｍ、ＢｉｏＳｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製品ＦＣ９１）
５：廃液タンク（Ｎｕｎｃ社製品）
６：シリコンチューブ（φ１．５ｍｍ）
７a、７b：三方活栓（テルモ社製品）
８a、８b：メンブレンフィルター（０．４４μｍ、ミリポア社製品）
９：培地
１０：廃液
【実施例】
【００７８】
以下に、一般式（１）のピリミジノン化合物の製造例及び試験例を挙げて、本発明を一層明らかにするが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７９】
製造例１  ２−ｎ−プロピル−９−ヒドロキシ−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（１）」という）の合成
３−ヒドロキシ−２−アミノピリジン３．１３ｇ（２８．５ｍｍｏｌ）及び３−オキソヘキサン酸エチルエステル４．５０ｇ（２８．５ｍｍｏｌ）をキシレン１５ｍｌに溶解し、得られる溶液を室温で約１２時間撹拌した後、加温して還流下に約１６時間反応させた。反応液を冷却した後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製して、化合物（１）を得た。【００８０】
【化３】
2009063901.tif 000005
【００８１】
収量：３．８ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）
収率：６５％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．０１ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．７６ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．６６ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．３２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１４ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．２６ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），８．５３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【００８２】
製造例２  ９−ヒドロキシ−２−ｎ−ペンチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（２）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソオクタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（２）を得た。【００８３】
【化４】
2009063901.tif 000006
【００８４】
収量：３．０ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）
収率：４６％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．９２ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．３７ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ），１．７４ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．６７ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．３２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．２６ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），８．５２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【００８５】
製造例３  ３−エチル−９−ヒドロキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（３）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに２−アセチルブタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（３）を得た。【００８６】
【化５】
2009063901.tif 000007
【００８７】
収量：３．７ｇ（１８．０ｍｍｏｌ）
収率：６３％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．２２ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），２．５５ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），２．７７ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），７．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１０ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．３１ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），８．５１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【００８８】
製造例４  ３−ｎ−ブチル−９−ヒドロキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（４）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに２−アセチルヘキサン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（４）を得た。【００８９】
【化６】
2009063901.tif 000008
【００９０】
収量：４．４ｇ（１８．８ｍｍｏｌ）
収率：６６％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．９８ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．４５ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），１．５６ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．５２ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），２．７２ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．９９ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．０６ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．２８ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），８．４８ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【００９１】
製造例５  ９−ヒドロキシ−２−イソプロピル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（５）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソ−４−メチル−ペンタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（５）を得た。【００９２】
【化７】
2009063901.tif 000009
【００９３】
収量：１．９ｇ（９．１ｍｍｏｌ）
収率：３２％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．３０ｐｐｍ（ｍ，６Ｈ），２．９７ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），６．１８ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．３４ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），８．５０ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【００９４】
製造例６  ９−ヒドロキシ−２−ｔｅｒｔ−ブチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（６）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソ−４、４−ジメチル−ペンタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（６）を得た。【００９５】
【化８】
2009063901.tif 000010
【００９６】
収量：４．７ｇ（２１．７ｍｍｏｌ）
収率：７６％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．３９ｐｐｍ（ｍ，９Ｈ），６．５３ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１６ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．４９ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），８．５２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【００９７】
製造例７  ９−ヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（７）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソ−３−フェニル−プロパン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（７）を得た。【００９８】
【化９】
2009063901.tif 000011
【００９９】
収量：５４７ｍｇ（２．３ｍｍｏｌ）
収率：８％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：７．００ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．１０ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．２１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．５２ｐｐｍ（ｍ，３Ｈ），８．０８ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），８．５８ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１００】
製造例８  ９−ヒドロキシ−２−エチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（８）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソペンタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（８）を得た。【０１０１】
【化１０】
2009063901.tif 000012
【０１０２】
収量：２．６ｇ（１３．７ｍｍｏｌ）
収率：４８％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．３３ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），２．６１ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．２８ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），６．８５ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．０４ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），８．５２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１０３】
製造例９  ９−ヒドロキシ−２−ｎ−ブチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（９）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソヘプタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（９）を得た。【０１０４】
【化１１】
2009063901.tif 000013
【０１０５】
収量：２．４ｇ（１１．１ｍｍｏｌ）
収率：３９％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．９６ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．４１ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），１．７３ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．６８ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．３２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１５ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），８．５２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１０６】
製造例１０  ９−ヒドロキシ−２−イソブチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（１０）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに５−メチル−３−オキソヘキサン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（１０）を得た。【０１０７】
【化１２】
2009063901.tif 000014
【０１０８】
収量：３．７ｇ（１６．８ｍｍｏｌ）
収率：５９％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．９７ｐｐｍ（ｍ，６Ｈ），２．１８ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），２．５４ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．３０ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０４ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１０ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），８．５３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１０９】
製造例１１  ２−ｓｅｃ−ブチル−９−ヒドロキシ−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（１１）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに４−メチル−３−オキソヘキサン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（１１）を得た。【０１１０】
【化１３】
2009063901.tif 000015
【０１１１】
収量：２．６ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）
収率：４１％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．８９ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．２８ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．６２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），１．７８ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），２．６７ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），６．３３ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．１１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），８．５２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１１２】
製造例１２  ９−ヒドロキシ−２−（２−ペンチル）−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「化合物（１２）」という）の合成
３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに４−メチル−３−オキソヘプタン酸エチルエステルを使用する以外は製造例１と同様に操作して、化合物（１２）を得た。【０１１３】
【化１４】
2009063901.tif 000016
【０１１４】
収量：１．９ｇ（８．０ｍｍｏｌ）
収率：２８％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．９０ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．２９ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ），１．５５ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），１．７３ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），２．７７ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），６．３２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．０９ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），８．５２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１１５】
比較製造例１  ２−ｎ−プロピル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「比較化合物（１）」という）の合成
３−ヒドロキシ−２−アミノピリジンの代わりに２−アミノピリジンを使用し、反応溶媒をキシレンの代わりにポリリン酸を使用する以外は製造例１と同様に操作して、比較化合物（１）を得た。【０１１６】
【化１５】
2009063901.tif 000017
【０１１７】
収量：１．３ｇ（６．８ｍｍｏｌ）
収率：２４％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．００ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．８０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．６７ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．３６ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．１１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．６１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．７４ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），９．０５ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１１８】
比較製造例２  ２−ｎ−ペンチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「比較化合物（２）」という）の合成
３−ヒドロキシ−２−アミノピリジンの代わりに２−アミノピリジンを使用し、３−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに３−オキソオクタン酸エチルエステルを使用し、反応溶媒をキシレンの代わりにポリリン酸を使用する以外は製造例１と同様に操作して、比較化合物（２）を得た。【０１１９】
【化１６】
2009063901.tif 000018
【０１２０】
収量：１．７ｇ（８．０ｍｍｏｌ）
収率：２８％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：０．８９ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ），１．３６ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ），１．７４ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．６７ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），６．３７ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．１１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．６０ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），７．７１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），９．０２ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１２１】
比較製造例３  ９−メトキシ−２−ｎ−プロピル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（以下この化合物を「比較化合物（３）」という）の合成
３−ヒドロキシ−２−アミノピリジンの代わりに３−メトキシ−２−アミノピリジンを使用し、反応溶媒をキシレンの代わりにポリリン酸を使用する以外は製造例１と同様に操作して、比較化合物（３）を得た。【０１２２】
【化１７】
2009063901.tif 000019
【０１２３】
収量：１．６ｇ（７．４ｍｍｏｌ）
収率：２６％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：１．００ｐｐｍ（ｍ，３Ｈ），１．７９ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．７４ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），４．０６ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），６．３９ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ），７．００ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），８．６９ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）。【０１２４】
試験例１
もみ枯細菌（Pseudomonas（＝Burkholderia） glumae）をＬＢ培地（ＢＤ社製  Difco LB Broth：tryptone １０．０ｇ，Yeast Extract ５．０ｇ，Sodium Chloride １０．０ｇ）に接種し、３７℃で一晩培養した。培養した菌液を遠心機にかけて集菌した後、２回新しいＬＢ培地で洗浄し、化合物（１）の４０μＭもしくは６０μＭの０．４％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液又は比較試験用に化合物（１）を含まない０．４％ＤＭＳＯを加えたＬＢ培地を加えて１２又は２４時間振とう培養した。各菌液を０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、細菌を取り除いた０．５ｍｌの上清液に０．５ｍｌの酢酸エチルを加え、クオラムセンシング（ＱＳ）シグナル分子を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を減圧濃縮し、残渣を再度２０μｌのメタノールに溶解し、これを試験液とした。【０１２５】
１μｌの試験液をＴＬＣにスポットし、展開溶媒：メタノール／水＝７０／３０の条件でＱＳシグナル分子であるＣ６−ＨＳＬとＣ８−ＨＳＬを分離した。展開後はＴＬＣ板をよく乾燥し、予めＬＢ培地培養したＱＳシグナル分子検出細菌（Chromobacterium violaceum CV026株）と寒天を含んだ培養液をＴＬＣ板に塗布して、Ｃ６−ＨＳＬとＣ８−ＨＳＬの検出を行った。Chromobacterium violaceumはＱＳを利用して紫色の色素（violacein）を産生する細菌として知られており、CV026株を用いるとＱＳシグナル分子の検出の利用に用いることができる（Microbiology, (1997), 143, 3703-3711、(2004), 54(4), 921-934、(2007), 64(1), 165-179）。検出細菌塗布後、２８℃で一晩培養し、violaceinによる検出を行った。定量には予め化学合成したＣ６−ＨＳＬとＣ８−ＨＳＬからviolacein産生の検量線を作成し、その検量線からそれぞれのＱＳシグナル分子の産生量を求めた。結果を表１に示す。【０１２６】
【表１】
2009063901.tif 000020
【０１２７】
試験例２
もみ枯細菌をＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心機にかけて集菌した後、菌体を新しいＬＢ培地で２回洗浄した。その菌体に新しいＬＢ培地を加え、約３．０×１０５ｃｆｕ／ｍｌに調整した後、製造例１〜５で製造した化合物（１）、化合物（２）、化合物（３）、化合物（４）、化合物（５）、化合物（８）及び化合物（９）をそれぞれ最終濃度が１００μＭ濃度となるように加えて３６時間振とう培養した。２４時間及び３６時間におけるその培養液中に存在する生菌数を次の方法で求めた。即ち、培養液を一部抜き取り１千倍希釈した後にＬＢ培地寒天プレートに撒き、そのコロニー数を数えて換算した。【０１２８】
また、比較試験として、参考例１〜３で製造した比較化合物（１）〜（３）及び上記特許文献１に記載の下記化合物（比較化合物（４））を用い、同様に試験を行い、生菌数を求めた。結果を図１に示す。【０１２９】
【化１８】
2009063901.tif 000021
【０１３０】
図１から、本発明のピリミジノン化合物（化合物（１）〜化合物（５）、化合物（８）及び化合物（９））は、もみ枯細菌に対して優れた防除活性を発現し、３６時間培養後ではもみ枯細菌を殆ど死滅できること及び比較化合物（１）〜比較化合物（４）は、もみ枯細菌に対して防除活性を殆ど発現していないことが分かる。【０１３１】
試験例３
もみ枯細菌をＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心機にかけて集菌した後、菌体を新しいＬＢ培地で２回洗浄した。その菌体に新しいＬＢ培地を加え、約３．０×１０５ｃｆｕ／ｍｌに調整した後、製造例１で製造した化合物（１）を最終濃度が所定濃度（０、８０及び１００μＭ）となるように加えて４０時間振とう培養した。所定時間後（２０、２４、２８、３２、３６及び４０時間後）におけるそれぞれの培養液中に存在する生菌数を次の方法で求めた。即ち、培養液を一部抜き取り１千倍希釈した後にＬＢ培地寒天プレートに撒き、そのコロニー数を数えて換算した。結果を図２に示す。【０１３２】
図２から、本発明のピリミジノン化合物（化合物（１））は、もみ枯細菌に対して優れた防除活性を有していることが分かる。【０１３３】
試験例４
もみ枯細菌をＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心機にかけて集菌した後、菌体を新しいＬＢ培地で２回洗浄した。その菌体に新しいＬＢ培地を加え、次いで製造例１で製造した化合物（１）を最終濃度が所定濃度（０、２０、４０、６０、８０及び１００μＭ）となるように加えて２０時間振とう培養した。その培養液中に菌体が産生する毒素（toxoflavin）量を以下の手順で求めた。【０１３４】
各培養液を０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、濾液を１ｍｌ採り、クロロホルム１ｍｌを加えて、抽出した。得られたクロロホルム層を減圧濃縮し、残渣に８０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液を加えて溶解させた。その溶解液の吸光度（２６０ｎｍ）を測定し、化学合成された毒素標品から得られた検量線から毒素量を算出した。【０１３５】
結果を図３に示す。【０１３６】
図３から、製造例１で製造した化合物（１）をもみ枯細菌に加えた場合、細菌が産生する毒素量は、化合物（１）の濃度を高くするに従い顕著に減少することが分かる。【０１３７】
試験例５
化合物（１）のジメチルホルムアミド１０００ｐｐｍ溶液を所定濃度（５０、１００及び２００μＭ）となるように水で希釈して試験液を調製した。一方、もみ枯細菌をＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養して、感染用培養液を調製した。【０１３８】
温室で開花時期まで栽培したイネ（韓国品種、Milyang 23）に、各試験液を１０ｍｌ噴霧した。１時間後、そのイネに感染用培養液を噴霧し、７日間栽培後のもみ枯細菌病の発症状態を評価した。【０１３９】
評価は、１株から任意に穂１本、計３本を採り、個々の花房（子実）において、もみ枯細菌の産生する毒素（toxoflavin）によって病害の発症した（茶色く変色した）部分の占める割合を目視で以下の基準によって評点し、全花房中の各評点の割合を示すことで発症状態を示した。【０１４０】
（評点の基準）
発症した部分の占める割合が
０．１％未満のとき：０
０．１％以上２０％未満のとき：１
２０％以上４０％未満のとき：２
４０％以上６０％未満のとき：３
６０％以上８０％未満のとき：４
８０％以上１００％のとき：５【０１４１】
この評価では、同じ条件を３個用意して行い、３回繰り返して再現性を確認した。また、比較試験として、試験液を水に代えて同様に処理した。更に、ブランクとして、試験液及び感染用培養液を水に代えて同様に処理した。
結果を表２に示す。【０１４２】
【表２】
2009063901.tif 000022
【０１４３】
表２から次のことがわかる。化合物（１）を含む試験液をイネに噴霧した場合、そのイネにもみ枯細菌を含む感染用培養液を噴霧した場合でも、もみ枯細菌病の発生を抑えることができた。一方、イネに水を噴霧した後に、もみ枯細菌を含む感染用培養液を噴霧した比較試験の場合、多くのイネでもみ枯菌病が発生した。【０１４４】
試験例６
試験例５と同様にして試験液及び感染用培養液を調製した。温室で開花時期まで栽培したイネ（韓国品種、Milyang 23）に、感染用培養液を噴霧し、１時間後、各試験液を１０ｍｌ噴霧した。そのイネに７日間栽培後のもみ枯細菌病の発症状態を試験例４と同様に評価した。また、比較試験として、試験液を水に代えて同様に処理した。更に、ブランクとして、試験液及び感染用培養液を水に代えて同様に処理した。結果を表３に示す。【０１４５】
【表３】
2009063901.tif 000023
【０１４６】
表３から次のことが分かる。イネにもみ枯細菌を含む感染用培養液を噴霧した後に、化合物（１）を含む試験液をイネに噴霧した場合も、上記試験例４と同様に、もみ枯細菌病の発生を抑えることができた。一方、イネにもみ枯細菌を含む感染用培養液を噴霧した後に、イネに水を噴霧した比較試験の場合、多くのイネでもみ枯菌病が発生した。【０１４７】
試験例７
図４に示すフローセルシステムを用いて、上記製造例２で製造した化合物（２）の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）バイオフィルム形成阻害作用を評価した。【０１４８】
＜フローセルシステム＞
培地瓶（１）、ペリスタポンプ（２）、ガラスセル（４）及び廃液瓶（５）をシリコンチューブ（６）で結び、培地瓶（１）中の培地（９）をペリスタポンプ（２）によってガラスセル（４）内に送ることができる。ペリスタポンプ（２）と活栓（７ａ）との間には、混入する空気を除去する空気除去部（３）を備えている。本フローセルシステムに用いる器具はあらかじめガンマ線滅菌又はオートクレーブ滅菌したものを用いた。【０１４９】
後述するように、ガラスセル（４）内で細菌を培養してセルの内壁にバイオフィルムを形成させ、そこに上記の各アミド化合物を含有する試験液を流したときのバイオフィルムの様子を観察することによって、当該化合物のバイオフィルム形成阻害作用を評価することができる。なお、バイオフィルムの様子は、蛍光共焦点顕微鏡（Leica TCS SP2, ライカ社製）で観察することができる。【０１５０】
＜材料＞
細菌：緑膿菌PAO1株に、エレクトロポレーション法によってpTdk-LVAgfpプラスミドを導入してGreen Fluorescent Proteinを発現するように形質転換した緑膿菌PAO1株（以下、「gfp発現PAO1株」と称す。）を用いた（Teresa R. De Kievit et al., Applied and Environmental Microbiology, Apr. 2001, p.1865-1873参照）。【０１５１】
培地：前培養には３０ｍＭグルコース含有ＦＡＢ培地、本培養には０.３ｍＭグルコース含有ＦＡＢ培地を用いた。【０１５２】
グルコース含有ＦＡＢ培地：３０ｍＭグルコースあるいは０．３ｍＭグルコース、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、３３．７ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物、２２．１ｍＭリン酸二水素カリウム、５１．７ｍＭ塩化ナトリウム、０．４７ｍＭ塩化マグネシウム、０．０８ｍＭ塩化カルシウム及び下記０．１％トレースメタルソリューションで構成される水溶液に、２００μｇ／ｍｌのカルベシニリンを加えて調製した。【０１５３】
トレースメタルソリューション：１．１６ｍＭ硫酸カルシウム二水和物、０．７２ｍＭ硫酸鉄七水和物、０．０８ｍＭ硫酸マンガン一水和物、０．０８ｍＭ硫酸銅五水和物、０．０７ｍＭ硫酸亜鉛七水和物、０．０４ｍＭ硫酸コバルト七水和物、０．０４ｍＭ過マンガン酸ナトリウム一水和物、及び０．０８ｍＭホウ酸を含有する水溶液。【０１５４】
菌液：３０ｍＭグルコース含有ＦＡＢ培地に、gfp発現PAO1株を植え付け、３７℃恒温漕中で一晩振盪培養して得たオーバーナイトカルチャー液を、ＯＤ590＝０．１となるように３０ｍＭグルコース含有ＦＡＢ培地で希釈して調製した。【０１５５】
試験液及び対照試験液：
試験液：実施例２で製造した化合物（２）を、１００μＭのＤＭＳＯ溶液とし、次いで化合物の濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように、０．３ｍＭグルコース含有ＦＡＢ培地に加えて試験液とした。
対照試験液：上記化合物を含まないＤＭＳＯを用いて試験液と同様に調製して対照試験液とした。【０１５６】
＜試験方法＞
フローセルシステム系内を７０容量％エタノールで満たし、１２時間以上静置して系内を滅菌した。次いでフローセルシステム系内にペリスタポンプ（２）でメンブレンフィルター（８a）を通過した空気を送って、系内を乾燥させた後、０．３ｍＭグルコース含有ＦＡＢ培地で満たした。菌液５００μｌをガラスセル（４）内に上面から注射器を用いて注入し、３方活栓（７ａ，７ｂ）を閉めてガラスセルを密栓して室温で１時間静置培養した。【０１５７】
静置培養後、２箇所の３方活栓（７ａ，７ｂ）を開き、各試験液又は対照試験液を流速２００μL／分で流して、ガラスセル内壁に付着した緑膿菌（gfp発現PAO1株）がバイオフィルムを形成する様子を、ガラスセルの上方から蛍光共焦点顕微鏡で三次元的に経時観察した（１時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、８４時間後）。なお、試験液及び対照試験液は、３６時間ごとに新鮮なものに取り替えた。【０１５８】
試験液を用いた場合のバイオフィルムの形成状況を、対照試験液を用いた場合のバイオフィルムの形成状況（control試験）と対比した結果を、図５に示す。なお、図５は、ガラスセル内壁に付着した緑膿菌（gfp発現PAO1株）の状態を、ガラスセル内壁表面図と断面図（横断面と縦断面）から三次元的に示したものである。【０１５９】
結果からわかるように、対照試験液を用いたcontrol試験では、緑膿菌（gfp発現PAO1株）は厚みのある巨大なバイオフィルムを形成していたが、試験液を用いた場合にはいずれもこうしたバイオフィルムの形成は認められなかった。このことから、化合物（２）に、バイオフィルム形成阻害作用又は形成されたバイオフィルムを除去する作用があるものと認められる。【０１６０】
試験例８
図４のフローセルシステムを用いて上記製造例２で製造した化合物（２）の歯周病原性細菌バイオフィルム形成阻害作用を評価した。【０１６１】
＜材料＞
細菌：歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalis 381株（臨床株）を用いた。
培地：ヘミン５μｇ／Ｌ及びメナジオン１μｇ／Ｌを含むＧＡＭ培地を用いた。
菌液：前記ＧＡＭ培地に、当該菌株を植え付け、定常期（ＯＤ550＝１．８）まで培養し、前記ＧＡＭ培地で約２０倍に希釈した。
試験液及び対照試験液：
試験液：化合物（２）を、１００μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させてＤＭＳＯ溶液とし、次いで化合物の濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように、前記菌液に加えて試験液とした。
対照対象液：化合物（２）を含まないＤＭＳＯを用いて試験液と同様に調製して対照試験液とした。【０１６２】
＜試験方法＞
フローセルシステムのガラスセル（４）をステンレスセル（３ｘ７ｘ１２０ｍｍ）に替え、当該セル内にハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ディスク（直径６ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を１０個設置した。ＨＡディスクは一晩唾液処理したものを用いた。【０１６３】
試験液又は対照試験液を流速８ｍｌ／分で１４日間流した。なお、試験液及び対照試験液は、２日ごとに新鮮なものに取り替えた。【０１６４】
培養終了後、滅菌蒸留水３００μｌ中にＨＡディスクを浸漬し、４℃で３０分間超音波処理して、ＨＡディスクに形成したバイオフィルムを剥ぎとり、蒸留水中に懸濁させた。当該懸濁液１００μＬをとり、濁度を吸光度計（型式Ｃ07500 colorimeter、フナコシ社製）で測定（測定波長：５５０ｎｍ）した。【０１６５】
得られたＯＤ値の中で、最大値と最小値を除外して平均ＯＤ値を求めた。
また、対象試験液を用いた試験での濁度を平均対照ＯＤ値とし、同様に平均値を求め、下記式よりバイオフィルム形成阻害率（阻害率）を求めた。
阻害率（％）＝１００−｛（平均ＯＤ値）／（平均対照ＯＤ値）｝×１００
結果を表４に示す。【０１６６】
【表４】
2009063901.tif 000024
【０１６７】
試験例９
もみ枯細菌（Pseudomonas（＝Burkholderia） glumae）をＬＢ培地（ＢＤ社製  Difco LB Broth：トリプトン１０．０ｇ，酵母エキス５．０ｇ，塩化ナトリウム１０．０ｇ）に接種し３７℃で一晩培養した。培養液を遠心機にかけて集菌した後、菌体を新しいＬＢ培地で２回洗浄した。その菌体に新しいＬＢ培地を加え、次いで製造例１で製造した化合物（１）を最終濃度が所定濃度（０、２０、４０、６０、８０及び１００μＭ）となるように加えて２０時間振とう培養した。その培養液中に菌体が産生する毒素（toxoflavin）量を以下の手順で求めた。【０１６８】
各培養液を０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、濾液を１ｍｌ採り、クロロホルム１ｍｌを加えて、抽出した。得られたクロロホルム層を減圧濃縮し、残渣に８０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液を加えて溶解させた。その溶解液の吸光度（２６０ｎｍ）を測定し、化学合成された毒素標品から得られた検量線から毒素量を算出した。【０１６９】
また、比較試験として、上記特許文献３に記載の下記化合物（比較化合物（５））を用い、同様に試験した。結果を図６に示す。【０１７０】
【化１９】
2009063901.tif 000025
【０１７１】
図６から分かるように、製造例１で製造した本発明のアミド化合物（１）をもみ枯細菌に加えた場合、細菌が産生する毒素量は、アミド化合物（１）の濃度を高くするに従い顕著に減少した。一方、比較化合物（５）をもみ枯細菌に加えた場合には、比較化合物（５）の濃度を高めても、細菌が産生する毒素量はほとんど変化しなかった。
【図１】
2009063901.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2009063901.tif 000038
2009063901.tif 000039
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