(57)【要約】  下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが心機能改善作用を有することを見出した。当該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩は心疾患治療薬の有効成分として有用である。また、当該ペプチドを分泌する心疾患治療用細胞シートを心疾患を発症した心臓に移植すれば、当該ペプチドを長期にわたり標的部位に作用させることができる。Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６      （Ｉ）Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７      （ＩＩ）Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６      （ＩＩＩ）Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ      （ＩＶ）（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
2012172887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する心疾患治療薬。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
【請求項２】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列である請求項１に記載の心疾患治療薬。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１または２に記載の心疾患治療薬。
【請求項４】
前記ペプチドの総アミノ酸残基数が５０以下である請求項１〜３のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項５】
前記ペプチドを分泌する細胞を含む請求項１〜４のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項６】
前記ペプチドを分泌する細胞シートを含む請求項１〜４のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項７】
心疾患が、虚血性心疾患または心筋症である請求項１〜６のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項８】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチドを分泌することを特徴とする心疾患治療用細胞シート。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
【請求項９】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列である請求項８に記載の細胞シート。
【請求項１０】
前記ペプチドが、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む請求項８または９に記載の細胞シート。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列および分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドである請求項１０に記載の細胞シート。
【請求項１２】
細胞が、筋芽細胞、平滑筋細胞、間葉系細胞または脂肪細胞である請求項８〜１１のいずれかに記載の細胞シート。
【請求項１３】
心疾患が、虚血性心疾患または心筋症である請求項８〜１２のいずれかに記載の細胞シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患治療薬および心疾患治療用細胞シートに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患は世界における死亡原因の上位に位置しており、その患者数は今後も増加すると考えられている。心臓のポンプ機能が低下し、体に十分な血液を拍出できなくなる病態をさす心不全は、さまざまな心臓の病気が原因となって引き起こされる。そしてその発病率と有病率は高齢化に伴い年々増加している。薬物治療と外科的治療の進歩にもかかわらず、心不全患者の予後は依然として厳しい状況にあり、新しい治療法の開発が待ち望まれている。虚血性心疾患の一種である心筋梗塞は、心筋を栄養している冠動脈の血流が一定時間以上減少もしくは途断し、その灌流領域の心筋が壊死に陥る疾患である。壊死した部分は最終的には瘢痕組織に置換されるが、瘢痕部分は収縮力がなく、徐々に心機能が低下する。近年、このような病態に対して細胞移植、遺伝子治療、サイトカインや血管新生因子を用いた新たな治療法の研究が進められている。【０００３】
しかし、従来から研究・治療に用いられているＨＧＦ（hepatocyte growth factor）やＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）等の増殖因子は、数百個のアミノ酸からなる抽出タンパク質や組み換えタンパク質であり、感染症や副作用の点で想像し得ない問題をはらんでいる。一方、アミノ酸が１０個前後結合したペプチドは、種々の増殖因子と比較して抗原性の点から副作用が起こりにくく、安全性が高く、代謝が容易であり、ペプチドのデザインが簡単で高効率な合成法や検定法が確立されているといった利点を有している。それゆえ、心機能改善能を有するペプチドの発見、開発が期待されている。【０００４】
本発明者らは、細胞外基質の一種であるオステオポンチン（ＯＰＮ）内に存在する７アミノ酸（ＳＶＶＹＧＬＲ）からなるペプチドが、血管新生作用を有していることを明らかにし、その血管新生作用は、血管新生因子の中心的役割を担うＶＥＧＦと同等に高いものであることを見出している（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２参照）。また、本発明者らは、該ペプチドが間葉系細胞の増殖促進作用を有することを見出している（特許文献２参照）。しかし、該ペプチドが心機能改善能を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００３／０３０９２５号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００８／０２６６３４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hamada Y, Norihara Y, Okazaki M, Fujitani W,  Matsumoto T, Matsuura N and Takahashi J. Angiogenic activity of osteopontin-derived peptide SVVYGLR. Biochem Biophys Res Commun 2003; 310: 153-160.
【非特許文献２】Hamada Y, Yuki K, Okazaki M, Fujitani W, Matsumoto T, Hashida K, Kobashi M, Matsuura N and takahashi J. Osteopontin-derivsd peptide SVVYGLR induces angiogenesis in vivo. Dent Mater J 2004; 23: 650-665.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、心機能改善能を有するペプチドを見出し、これを有効成分として含有する心疾患治療薬および当該ペプチドを分泌する心疾患治療用細胞シートを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する心疾患治療薬。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
［２］式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列である前記［１］に記載の心疾患治療薬。
［３］前記ペプチドが、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである前記［１］または［２］に記載の心疾患治療薬。
［４］前記ペプチドの総アミノ酸残基数が５０以下である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の心疾患治療薬。
［５］前記ペプチドを分泌する細胞を含む前記［１］〜［４］のいずれかに記載の心疾患治療薬。
［６］前記ペプチドを分泌する細胞シートを含む前記［１］〜［４］のいずれかに記載の心疾患治療薬。
［７］心疾患が、虚血性心疾患または心筋症である前記［１］〜［６］のいずれかに記載の心疾患治療薬。
［８］下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチドを分泌することを特徴とする心疾患治療用細胞シート。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
［９］式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列である前記［８］に記載の細胞シート。
［１０］前記ペプチドが、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む前記［８］または［９］に記載の細胞シート。
［１１］前記ペプチドが、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列および分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドである前記［１０］に記載の細胞シート。
［１２］細胞が、筋芽細胞、平滑筋細胞、間葉系細胞または脂肪細胞である前記［８］〜［１１］のいずれかに記載の細胞シート。
［１３］心疾患が、虚血性心疾患または心筋症である前記［８］〜［１２］のいずれかに記載の細胞シート。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、心機能改善能を有するペプチドを有効成分として含有する心疾患治療薬および当該ペプチドを分泌する心疾患治療用細胞シートを提供することができる。本発明の心疾患治療薬は、有効成分がペプチドであるので、抗原性の点から副作用が起こりにくく、安全性が高いという利点を有する。本発明の心疾患治療用細胞シートは、これを心疾患を発症した心臓に移植すれば、本発明の心疾患治療薬の有効成分であるペプチドを、長期にわたり標的部位に作用させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】術後３、６、９週目の左室内径短縮率（％ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、左室内腔面積変化率（ＦＡＣ）を評価した結果を示す図である。
【図２】術後３、６、９週目に採取した心臓の左心室のヘマトキシリン・エオジン染色像およびシリウスレッド染色像を示す図である。
【図３】術後３、６、９週目の心筋梗塞周辺部の心筋線維化率を評価した結果を示す図であり、（Ａ）は心筋のシリウスレッド染色像であり、（Ｂ）は心筋線維化率の解析結果を示す図である。
【図４】術後３、６、９週目の心筋梗塞周辺部の心筋細胞横径を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はＰＡＳ染色像であり、（Ｂ）は心筋細胞横径の測定結果を示す図である。
【図５】術後３、６、９週目の心筋梗塞周辺部の毛細血管密度を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はＶｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒに対する抗体を用いた免疫組織化学染色像であり、（Ｂ）は毛細血管密度の測定結果を示す図である。
【図６】合成したペプチドを高速液体クロマトグラフ質量分析計で検定したチャートである。
【図７】単離した筋芽細胞の写真であり、左が位相差顕微鏡画像、右が蛍光顕微鏡画像である。
【図８】ペプチド発現用レンチウイルスベクターを感染させた筋芽細胞における目的ペプチドのｍＲＮＡ発現を確認した結果を示す図である。
【図９】ペプチド発現用レンチウイルスベクターを感染させた筋芽細胞における目的ペプチドの発現および分泌を確認した結果を示す図であり、（Ａ）は既知濃度のペプチドを段階希釈したドットブロッティングの結果であり、（Ｂ）はペプチド発現用レンチウイルスベクター感染細胞培養上清のドットブロッティングの結果であり、（Ｃ）は（Ｂ）の濃さを数値化して示した表である。
【図１０】細胞シート移植後２，４，６および８週目の左室駆出率（ＥＦ）を示す図である。
【図１１】細胞シート移植後２，４，６および８週目の左室内径短縮率（％ＦＳ）を示す図である。
【図１２】細胞シート移植後８週目の左室拡張末期容量（ＥＤＶ）を示す図である。
【図１３】細胞シート移植後８週目の左室内径短縮率（％ＦＳ）を示す図である。
【図１４】細胞シート移植後８週目の心体重比（ＨＷ／ＢＷ）を示す図である。
【図１５】細胞シート移植後８週目の左心室腔の拡張および梗塞部位の左心室壁厚を評価した結果を示す図であり、（Ａ）は心臓のマッソントリクローム染色像、（Ｂ）は左心室腔の径の評価結果を示す図、（Ｃ）は梗塞部の左心室壁厚の評価結果を示す図である。
【図１６】細胞シート移植後８週目の心筋梗塞周辺部の心筋線維化率を評価した結果を示す図であり、（Ａ）は心筋のシリウスレッド染色像であり、（Ｂ）は心筋線維化率の解析結果を示す図である。
【図１７】細胞シート移植後８週目の心筋梗塞周辺部の心筋細胞横径を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はＰＡＳ染色像であり、（Ｂ）は心筋細胞横径の測定結果を示す図である。
【図１８】細胞シート移植後８週目の心筋梗塞周辺部の毛細血管数をカウントした結果を示す図であり、（Ａ）はＶｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒに対する抗体を用いた免疫組織化学染色像であり、（Ｂ）は毛細血管密度の測定結果を示す図である。
【図１９】細胞シート移植後８週目の心室におけるｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（ＳＭＡ）陽性細胞の分布を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔心疾患治療薬〕
本発明の心疾患治療薬は、心機能改善作用を有するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。このようなペプチドとしては、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
なお、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）は、ＴｙｒまたはＰｈｅまたはＴｒｐを意味する。
【００１２】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）において、Ｘ１は特に限定されないが、例えば、セリン、アラニン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニンが好ましい。Ｘ２は特に限定されないが、例えば、バリン、アラニン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニンが好ましい。Ｘ３は特に限定されないが、例えば、バリン、アラニン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニンが好ましい。Ｘ５は特に限定されないが、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニンが好ましい。Ｘ６は特に限定されないが、例えば、ロイシン、アラニン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニンが好ましい。Ｘ７は特に限定されないが、例えば、アルギニン、アラニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニンが好ましい。
【００１３】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列として、好ましくは、以下の配列番号１〜６の配列が挙げられる。
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１）
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号２）
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号３）
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号４）
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号５）
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号６）
【００１４】
本発明の心疾患治療薬の有効成分となるペプチドは、上記式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表されるいずれかのアミノ酸配列を有するものであればよく、これら以外のアミノ酸配列を有していてもよい。本発明の心疾患治療薬の有効成分となるペプチドのサイズは特に限定されないが、取り扱いの簡便さ、製造効率、抗原性等の副作用の観点から、総アミノ酸残基数が約５０以下であることが好ましい。より好ましくは約３０残基以下、さらに好ましくは約２０残基以下、特に好ましくは約１０残基以下である。下限は６残基であり、好ましくは７残基以上である。
【００１５】
本発明の心疾患治療薬の有効成分となるペプチドとしては、配列番号１〜６で表されるアミノ酸配列または以下の配列番号７〜９で表されるアミノ酸配列を有し総アミノ酸残基数が２０以下のペプチドが好ましい。
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号７）
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８）
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号９）
なかでも、配列番号１、２または７で表されるアミノ酸配列を含み総アミノ酸残基数が２０以下のペプチドがより好ましく、配列番号１、２または７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがさらに好ましい。
【００１６】
本発明のペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。
【００１７】
得られたペプチドが心機能改善作用を有することは、例えば、実施例に示すように、心疾患モデルラットを用いて評価することにより確認できる。具体的には、心疾患モデルラットにペプチドを投与して一定期間後に心エコー像を記録し、心機能を評価することにより確認することができる。評価する心機能は特に限定されないが、例えば、左室内径短縮率（％Fractional shortening; ％ＦＳ）、左室駆出率（Ejection fraction; ＥＦ）、左室拡張末期容積（LV end-diastolic volume; ＥＤＶ）、左室収縮末期容積（LV end-systolic volume; ＥＳＶ）などが挙げられる。投与後の評価時期は特に限定されないが、約３週間経過以後が好ましく、約４週間経過以後がより好ましく、約５週間経過以後がさらに好ましい。ペプチドを投与していない個体の心機能と比較してペプチドを投与した個体の心機能が改善されていれば、当該ペプチドは心機能改善作用を有すると判断できる。また、例えば、新生児ラットまたはアダルトラットから心筋細胞を単離し、単離心筋細胞にペプチドを添加し、細胞の形態や、肥大マーカーなどのタンパク発現量の変化、心筋細胞の生存性などをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することにより確認できる。
【００１８】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されたものでもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基などが挙げられる。好ましくは、トリプトファンまたはフェニルアラニンのベンゼン環が置換基で修飾されていることであり、より好ましくは、配列番号１〜９で表されるアミノ酸配列中のトリプトファンまたはフェニルアラニンのベンゼン環が置換基で修飾されていることである。
【００１９】
本発明のペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。
【００２０】
さらに、本発明のペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。
【００２１】
本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していてもよく、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属との塩、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２２】
治療対象の心疾患は特に限定されず、心機能の改善により治療効果を奏する心疾患であればよい。具体的には、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、心筋症（肥大型心筋症、２次性心筋肥大、拡張型心筋症、拘束型心筋症など）、心筋炎、心不全、心内膜炎（細菌性心内膜炎など）、心臓弁膜症（僧帽弁閉鎖不全など）、心膜炎（急性心膜炎、慢性収縮性心膜炎など）、先天性心疾患（心房中隔欠損、心室中隔欠損など）、心臓性喘息、肺性心などが挙げられる。好ましくは虚血性心疾患、心筋症および心不全であり、より好ましくは心筋症および心不全である。
【００２３】
本発明の心疾患治療薬は、上記の心機能改善作用を有するペプチドを有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２４】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００２５】
また、本発明の心疾患治療薬は、有効成分の心機能改善作用を有するペプチドをキャリアに結合した形態としてもよい。キャリアとしては、特に限定されるものではなく、人工臓器等に用いられる樹脂、タンパク質等の生体高分子などが挙げられる。さらに、本発明の心疾患治療薬は、有効成分の心機能改善作用を有するペプチドを分泌する細胞を含む形態としてもよい。好ましくは、有効成分の心機能改善作用を有するペプチドを分泌する細胞シートを含む形態である。当該細胞および細胞シートについては後述する。
【００２６】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
投与量は、投与対象、対象疾患、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、心筋症治療の目的で本発明の心疾患治療薬を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成分を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、有効成分の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、心筋症治療の目的で本発明の心疾患治療薬を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき有効成分を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好ましい。
【００２７】
本発明は、さらに以下の発明を包含する。
（ａ）哺乳動物に対して、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチド、またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする心疾患の治療方法。
（ｂ）心疾患治療薬を製造するための、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチド、またはその薬学的に許容される塩の使用。
（ｃ）心疾患の治療に使用するための、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有し、かつ心機能改善作用を有するペプチド、またはその薬学的に許容される塩。
【００２８】
本発明の心疾患治療薬は、心筋梗塞モデルラットにおいて、梗塞心筋周囲への単回投与後９週目においても心機能の改善を維持していることが実証されている（実施例１参照）。一方、虚血性心疾患に対して公知の血管新生促進因子であるＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）を遺伝子導入し、新生血管を誘導する血管新生療法が構築されているが（Rissanen TT, et al., Adv Genet. 117-167, 2004、Miyagawa S, et al., Transplantation. 81:902-907, 2006、Rissanen TT, et al., FASEB. 10, 2002）、短期間では心機能の改善が認められるものの、長期的にみると十分に心機能を改善できるまでには至っていないのが現状である。したがって、本発明の心疾患治療薬は、心機能改善効果が長期にわたり維持される点で、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ等の公知の血管新生促進因子より優れた心疾患治療薬である。
【００２９】
〔心疾患治療用細胞シート〕
本発明の心疾患治療用細胞シートは、上記した本発明の心疾患治療薬の有効成分である心機能改善作用を有するペプチドを分泌することを特徴とする。心機能改善作用を有するペプチドについては上述のとおりであり、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられ、式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列として、好ましくは、配列番号１〜６の配列が挙げられる。
【００３０】
本発明の心疾患治療用細胞シートから分泌される心機能改善作用を有するペプチドは、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含むことが好ましい。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合されたタンパク質またはペプチドを、細胞膜透過させる役割を担うペプチド領域を意味する。したがって、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含むことにより、心機能改善作用を有するペプチドを細胞外に分泌することが可能となる。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当技術分野において周知であり、報告されている（例えば、von Heijine G (1988) Biochim. Biohys. Acra 947: 307-333、von Heijine G (1990) J. Membr. Biol. 115: 195-201など参照）。また、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。本発明において好適な分泌シグナルペプチドは、哺乳動物細胞、なかでもヒト細胞で機能し得る分泌シグナルペプチドである。例えば、Ｉｇκ鎖リーダー配列、ミツバチメリチンシグナル配列、αファクター分泌シグナルなどが挙げられる。分泌シグナルペプチドのアミノ酸配は、心機能改善作用を有するペプチドのＮ末端側に配置されることが好ましい。
【００３１】
本発明の心疾患治療用細胞シートから分泌されるペプチドとしては、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列および分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドであることが好ましい。分泌されるペプチドの総アミノ酸残基数が約１００以下であることが好ましい。より好ましくは約７０残基以下、さらに好ましくは約５０残基以下、特に好ましくは約４０残基以下である。下限は特に限定されないが、心機能改善作用を有するペプチドの下限である６残基に分泌シグナルペプチドのアミノ酸残基数を加えた数が下限となる。
【００３２】
本発明の心疾患治療用細胞シートは、心機能改善作用を有するペプチドを分泌する細胞を培養することにより作製することができる。心機能改善作用を有するペプチドを分泌する細胞は、心機能改善作用を有するペプチド（分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む）をコードするポリヌクレオチドが挿入された組換え発現ベクターを適当な細胞に導入することにより作製することができる。以下、心機能改善作用を有するペプチドを分泌する細胞および本発明の心疾患治療用細胞シートの作製方法について説明する。
【００３３】
心機能改善作用を有するペプチドを分泌する細胞（以下「ペプチド分泌細胞」という）の作製に用いる細胞は特に限定されないが、既に心臓への細胞シート移植の実績がある細胞が好ましく、具体的には、筋芽細胞（Ghostine S, Carrion C, Souza LC, Richard P, Bruneval P, Vilquin JT, Pouzet B, Schwartz K, Menasche P, Hagege AA：Long-term efficacy of myoblast transplantation on regional structure and function aftermyocardial infarction. Circulation. 106:Ｉ-131-Ｉ-136, 2002.）、平滑筋細胞（Yoo KY, LiRK, Weisel RD, Mickle DAG, Li GM, Kim EJ, Tomita S, Yau TM：Autologous smooth muscle cell transplantation improved heart function in dilated cardiomyopathy. Ann Thorac Surg 70: 859-865, 2000.など）、間葉系細胞（Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA, Senechal G, Meyers J, Redmond JM, Pittenger MF, Martin BJ, Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects. Ann Thorac Surg 73:1919-25,2002）、脂肪細胞（Valina C, Pinkernell K, Song YH, Bai X, Sadat S, Campeau RJ, Le Jemtel TH, Alt E. Intracoronary administration of autologous adipose tissue-derived stem cells improves left ventricular function, perfusion, and remodelling after acute myocardial infarction. Eur Heart J. 28:2667-77,2007.）が挙げられる。
【００３４】
組換え発現ベクターは、公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。発現ベクターは、宿主となる細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターを選択すればよい。例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例えば、ｐＡ−１１、ｐｘＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなど）などが挙げられる。このような発現ベクターに、心機能改善作用を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、目的の組換え発現ベクターが作製できる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、当該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、二本鎖ＤＮＡ、特にｃＤＮＡである。心機能改善作用を有するペプチド（分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む）をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、当該ペプチドのアミノ酸配列に基づいて適宜設計することができる。また、当該ポリヌクレオチドは、化学合成により作製することができる。組換え発現ベクターを細胞に導入する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法などが挙げられる。ウイルスベクターの場合は、細胞にウイルスを感染させればよい。組換え発現ベクターを導入した細胞の中から、ペプチド分泌細胞を選択する。ペプチド分泌細胞は目的ペプチドを安定して発現する細胞であることが好ましい。
【００３５】
得られたペプチド分泌細胞を適当な培養皿を用いてコンフルエントに培養した後、シート状態を維持したまま細胞を剥がすことにより、本発明の心疾患治療用細胞シートが作製できる。好ましくは、温度応答性高分子であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを被覆した培養皿を用いてコンフルエントに培養し、低温処理後、剥離する方法である（医学のあゆみ、１９５、２０３−２０４（２０００）参照）。当該温度応答性高分子を被覆した培養皿を用いる方法により、細胞および細胞外基質より構成される三次元構造を持った細胞シートを作製することができる。
【００３６】
本発明の心疾患治療用細胞シートが分泌する心機能改善作用を有するペプチドの量は特に限定されない。本発明の心疾患治療用細胞シートは、心機能改善作用を有するペプチドの分泌量が目的の分泌量となるように、シートを複数層に重ねることができる。移植した細胞シートは約２週間程度で徐々に細胞移植部位から脱落していくと考えられる。また、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳＶＶＹＧＬＲペプチドの心機能改善作用は２０〜１００ｎｇの量で発揮されることがわかっている。したがって、移植してから２週間以内に２０〜１００ｎｇまたはそれ以上のペプチドを分泌可能な細胞シートが好ましい。
【００３７】
自己筋芽細胞シートの移植に関しては、種々の心疾患モデル動物を用いた実験で優れた治療成績を示している（Miyagawa S, et al., Transplantation. 80:1586-95, 2005、Memon IA, et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 130: 1333, 2005、Kondoh H, et al., Cardiovasc Res. 69: 466, 2006、Hata H, et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 132: 918, 2006）。しかし、長期間にわたり術後の心機能を追跡するとその効果が漸減してくることが細胞シート移植の欠点であった。
本発明の心疾患治療用細胞シートは、従来の細胞シートの欠点を克服し、細胞シート移植後８週目においても心機能の改善効果を維持していることが実証されている（実施例３および４参照）。また、本発明の心疾患治療用細胞シートは、心機能改善効果と血管新生作用の両方を有することから、より持続的に心機能を改善できることが期待できる。したがって、心筋梗塞などの虚血性心疾患のみならず、心筋症の治療に極めて有用であると考えられる。さらに細胞シートを用いることで、インジェクション法による単回投与と異なり、シート移植部位から継続的にペプチドが分泌され、その効果を持続させることができる。また、インジェクション法は不整脈の誘因となることが知られているが、細胞シートの移植ではそのような報告はない。したがって、本発明の心疾患治療用細胞シートを用いれば、周知の細胞シートによる心疾患治療に、心機能改善作用を有するペプチドを併用でき、相乗的な治療効果が期待できる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３９】
〔実施例１：ラット心筋梗塞モデルを用いたペプチドの評価〕
（１）実験方法
（１−１）ペプチドの合成
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、多種品目固相法自動ペプチド合成装置（PSSM-8; 島津製作所）を用いてＦｍｏｃ法により合成した。より詳細には、ポリエチレングリコールとポリスチレンのグラフト共重合レンジＴｅｎｔａｇｅｌ（粒径80μm）を支持体とし、高効率固相法にて合成した。得られた合成ペプチドを、高速液体クロマトグラフ質量分析計（LCMS;島津製作所）にて検定し、質量理論値と一致する単一成分であることを確認した（図６参照）。以下、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを「ＷｉＤａ」と表記する。【００４０】
（１−２）ラット心筋梗塞モデルの作製
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（８週齢、雄、体重約300g）をイソフルランにより吸入麻酔し、気管内挿管し、人工換気下にて術中管理した。心拍動部肋間より開胸、左冠状動脈前下行枝を確認後、６−０の非吸収糸（ナイロン糸）を用い左心耳の高さにて結紮した。心電図においてＳＴ上昇を確認し、梗塞とした。その後ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＷｉＤａ（100ng/ml）０．１ｍｌを梗塞心筋周囲へ投与し、術野を連続縫合にて閉創した。治癒モデルとしてペプチド投与後３週の短期治療モデル、６週および９週の長期治療モデルを設定した。また、ＷｉＤａ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＰＢＳ投与）の他に、開胸と閉創のみを行ったＳｈａｍ群を設けた。【００４１】
（１−３）心機能評価
術後２１日目（３週）、４２日目（６週）、そして６３日目（９週）に心エコーを用いて左心室機能評価を行った。ラットをイソフルラン吸入麻酔後、超音波診断装置ＳＯＮＯＳ５５００（Aglient Technologies, Palo Alto, CA）を用いて心エコー像を記録し、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室拡張末期内腔面積（ＬＶＥＤＡ）、左室収縮末期内腔面積（ＬＶＥＤＳ）を得た。これらの値より、左室内径短縮率（％Fractional shortening; ％ＦＳ）、左室駆出率（Ejection fraction; ＥＦ）、左室内腔面積変化率（Fractional area change; ＦＡＣ）を算出した（Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi M, Mitsui Y, Yazaki Y, Goto K, Masaki T. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature 1988; 332: 411-5.）。
ＬＶ％ＦＳ＝［（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ］×１００
ＬＶＥＦ（％）＝［（ＬＶＤｄ３−ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３］×１００
ＬＶＦＡＣ（％）＝［（ＬＶＥＤＡ−ＬＶＥＤＳ）／ＬＶＥＤＡ］×１００【００４２】
（１−４）組織学的評価
術後２１日目（３週）、４２日目（６週）、そして６３日目（９週）に心臓を摘出し、１０％緩衝ホルマリンで４８時間固定を行った。両心房を除去後、パラフィン包埋し、厚さ３μmに薄切した。薄切した切片をヘマトキシリン・エオジンで染色し、梗塞壁の厚さ比較を行った。
また心筋線維化率を測定するため、膠原線維を特異的に赤色に染め出すシリウスレッド染色を行った。心筋線維化の測定は梗塞巣境界部を観察し（×200）、ＡＣＴ−２Ｕソフトウェア（NIKON)にて画像を取り込んだ。画像はＷｉｎＲｏｏｆソフトウェア（MITANI CORPORATION）により解析した。結果は、１視野あたりの線維化率で表示した。
また心筋細胞の横経（cell size）を測定することを目的にＰｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ／Ｓｃｈｉｆｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＡＳ）染色を行った。染色後は光学顕微鏡にて観察を行い（×400）、梗塞境界部と左室後壁部において核を認める１００個の細胞を無作為に選択し、ＡＣＴ−２Ｕソフトウェアにて画像を取り込み、画像はＷｉｎＲｏｏｆソフトウェアにより解析した。解析法としては、心筋細胞の核を横断する短径を測定し、細胞横径とした。【００４３】
血管内皮細胞を有する毛細血管数をカウントするために、血管内皮細胞のマーカーであるＶｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒに対する抗体（Anti-Human Von Willebrand factor, DAKO）を用いて免疫組織化学染色を行った。脱パラフィンをした切片をアルコールで脱水し、熱処理を行って、抗原賦活を行った。その後、０．１％過酸化水素液で内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。５％スキムミルクでブロッキング後、抗Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ抗体と４℃で一晩反応させた。
切片をＰＢＳ−Ｔで洗浄後、二次抗体としてビオチン化標識抗Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（Anti-Rabbit Ig, biotinyated species-specific whole antibody、DAKO）と反応させた。ＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Streptavidin-Horseradish peroxidase conjugate、GE Healthcare）によるＬＳＡＢ（Labeled Streptavidin Biotinyated Antibody）法を用いて、ＤＡＢ（Diamino benzidine）にて発色させた。染色後、光学顕微鏡（×400）にて無作為に１５視野を選択し、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ陽性の血管内皮細胞を有する毛細血管数をカウントし、毛細血管密度とした。【００４４】
（１−５）統計解析
すべての統計学的数値は、平均値±標準偏差もしくは平均値±標準誤差で表した。これまでの各実験のＣｏｎｔｒｏｌとの結果を比較するため、ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用い、ｐ＜０．０５をもって有意とした。【００４５】
（２）結果
（２−１）心機能評価
ＷｉＤａが左心室機能の回復に与える影響を検討するために、心エコーを用いて左心室機能指標である左室内径短縮率（％ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、左室内腔面積変化率（ＦＡＣ）を評価した。結果を図１に示した。
まずＷｉＤａ投与後の短期的効果を術後３週目の時点で評価したところ、左室内径短縮率（％ＦＳ、図１ａ）、駆出率（ＥＦ、図１ｂ）、左室内腔面積変化率（ＦＡＣ、図１ｃ）のすべての項目においてＷｉＤａ群はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に高かった（％ＦＳ；ｐ＝０．００５、ＥＦ；ｐ＝０．００５、ＦＡＣ；ｐ＝０．００２）。続いてＷｉＤａが虚血心筋に与える長期的な効果を術後６週目および９週目の時点で評価した。まず左室内径短縮率（％ＦＳ、図１ｄｇ）と駆出率（ＥＦ、図１ｅｈ）の評価を行ったところ、６週および９週モデルともにＣｏｎｔｒｏｌ群と比較するとＷｉＤａ群で有意に高かった。また、左室内腔面積変化率（ＦＡＣ、図１ｆｉ）の評価を行ったところ、９週モデルでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対しＷｉＤａ群は有意に改善していた。一方、６週モデルではＣｏｎｔｒｏｌ群とＷｉＤａ群との間に有意な差は認められなかったものの、ＷｉＤａ群はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較し改善傾向がみられた（ｐ＝０．１４５）。【００４６】
（２−２）組織学的検討
（ａ）梗塞巣に与える影響
心筋梗塞とは、心筋を栄養している冠動脈の血流が途断し、その灌流領域の心筋が壊死に陥ることである。壊死した部分は膠原線維に置換され、その結果心機能が低下すると考えられている。そこで、ＷｉＤａが梗塞巣にいかなる影響を与えるのか検討するため、各群各週に摘出した心臓の切片にヘマトキシリン・エオジン染色（以下「ＨＥ染色」という）および膠原線維を特異的に染め出すシリウスレッド染色を行った。
結果を図３に示した。図２ａ〜ｇの各１対の写真のうち、左がＨＥ染色像、右がシリウスレッド染色像である。また、図中、スケールバーは１０００μｍを表す。図２ａ（Ｓｈａｍ群）は３週の結果のみを示した。図２ｂ〜ｇのシリウスレッド染色像において、３週、６週および９週モデルともにＣｏｎｔｒｏｌ群では左室前壁から後壁にかけての壁厚が薄くなり、膠原線維が多く認められていたのに対して、ＷｉＤａ群の左心室壁厚は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して厚く保たれていた。
左心室腔の拡張に関しては、図２ｂ〜ｇのＨＥ染色像において、３週、６週および９週モデルともにＣｏｎｔｒｏｌ群では左心室腔が徐々に拡張していたのに対して、ＷｉＤａ群ではＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して、拡張が抑制されていた。【００４７】
（ｂ）梗塞境界部の正常心筋組織に与える影響
心筋梗塞後の治癒過程は、梗塞境界部の正常心筋に負荷がかかり、細胞の肥大や心筋の線維化が進行する。そこでＷｉＤａの心筋梗塞周辺部の正常心筋細胞への影響を検討するために、シリウスレッド染色による心筋線維化率の評価とＰＡＳ染色による心筋細胞横径の測定を行った。
シリウスレッド染色像および心筋線維化率の結果を図３（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は心筋のシリウスレッド染色像であり、スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）は心筋線維化率の解析結果を示すグラフである。心筋線維化率は３週モデルにおいてはＣｏｎｔｒｏｌ群とＷｉＤａ群との間に有意差は認められなかった（図３（Ｂ）ａ）。一方６週および９週モデルでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＷｉＤａ群では有意に低下していた（６週；図３（Ｂ）ｂ、ｐ＝０．０００４１、９週；図３（Ｂ）ｃ、ｐ＝０．０００５４）。【００４８】
ＰＡＳ染色像および心筋細胞横径の測定結果を図４（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は梗塞境界部のＰＡＳ染色像であり、スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）は心筋細胞横径の測定結果を示すグラフであり、白抜きは左室後壁部の結果、黒塗りは梗塞境界部の結果である。梗塞境界部において３、６および９週モデルのいずれにおいても、心筋細胞横径はｓｈａｍ群と比較してＣｏｎｔｒｏｌ群、ＷｉＤａ群で有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。またＣｏｎｔｒｏｌ群とＷｉＤａ群との比較では３週モデルでは有意差は認められなかったが、６週および９週モデルではＷｉＤａ群が有意に低かった（６週；ｐ＝０．００１９、９週； ｐ＝０．０００１７）。一方、左室後壁部についても同様の評価を行ったところ３週、６週および９週モデルのいずれにおいてもＣｏｎｔｒｏｌ群とＷｉＤａ群との比較では、有意な差は認められなかった。【００４９】
（ｃ）虚血心筋組織における血管新生能の評価
ＷｉＤａによる血管新生が、心筋組織で誘導されているのかを検討するために、毛細血管密度の測定を行った。血管内皮細胞のマーカーであるＶｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒに対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行い、毛細血管数をカウントした。
結果を図５（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は梗塞境界部の免疫組織化学染色像であり、スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）は毛細血管密度の測定結果を示すグラフであり、白抜きは左室後壁部の結果、黒塗りは梗塞境界部の結果である。梗塞境界部において３週、６週および９週モデルのいずれにおいてもＳｈａｍ群およびＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して、ＷｉＤａ群では毛細血管密度の著明な増加が認められた（ｐ＜０．０００１）。一方、Ｓｈａｍ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＷｉＤａ群の左室後壁部における毛細血管密度に有意な差は認められなかった。【００５０】
（３）考察
現在までに虚血性心疾患モデルに対する治療・研究は多数行われおり、種々の効果が報告されている。しかし、心筋梗塞の治療効果を考える上で最も重要なことは、心機能の回復が認められるか否かである。そこで本研究においては、ＷｉＤａによる左心室の機能改善効果に注目した。ＷｉＤａが、梗塞により失われた心機能を改善させるか否かを心エコーにて評価した結果、３週モデルでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較し、ＷｉＤａ群で有意な心機能の改善が認められた。またＳｈａｍ群と比較し、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＷｉＤａ群では心機能が有意に低かった。この結果から、心機能は心筋梗塞作製後一時的に著しく低下するが、心筋梗塞直後に投与したＷｉＤａが何らかの機能を発揮し、心機能が大きく改善されたと考えられた。さらに６週モデル、９週モデルにおいても同様の効果が認められた。６週および９週の治療長期モデルにおける結果より、ＷｉＤａは持続的に心機能低下の抑制に関与することが示唆された。また、心筋梗塞モデルにおいて、投与したＷｉＤａによって、梗塞壁厚のひ薄化、心筋線維化および心筋細胞の肥大が有意に抑制されていた。また、これらは６週および９週の長期モデルにおいても有意な抑制が認められた。心筋梗塞の治癒過程では、梗塞境界部の正常心筋の仕事量が増加し、梗塞周辺部の細胞肥大や心筋線維化が徐々に進行する。本研究の結果から、ＷＩＤＡが梗塞周辺部の正常細胞への負荷減少に働き、心筋線維化および心筋細胞の肥大を抑制したと考えられ、ＷｉＤａが梗塞後の左心室リモデリングの抑制作用を有することが示唆された。【００５１】
すでに、血管新生促進作用を有するＨＧＦの心筋梗塞モデルに対する検討が行われており、ＨＧＦは血管新生促進作用に加え心機能改善作用も有していることが明らかとなっている（[1]Jin, H. et ai., Curr Pharm Des 2004; 10: 2525-33. [2]Chen XH, et ai., J Card Fail 2007; 13: 874-83. [3]Li Y, et ai., Circulation 2003; 107: 2499-506. [4]Ueda H, et ai., Cardiovasc Res 2001; 51: 41-50.）。心筋梗塞モデルに対するＨＧＦを用いた遺伝子治療の治療効果についての報告では、左心室機能が治療後４週の時点では左室内径短縮率（％ＦＳ）２０％、駆出率（ＥＦ）４２％と改善効果が認められたが、その後は低下傾向が認められた（Miyagawa S. et ai., Circulation 2002; 105: 2556-2561.）。一方、本研究では、心筋梗塞モデル作製直後にＷｉＤａ（100ng/ml）の一回投与のみを行ったにも関わらず、３週モデルの左心室機能は、左室内径短縮率（％ＦＳ）２５％、駆出率（ＥＦ）５０％であり、ＨＧＦ遺伝子治療で得られる効果と同等以上の効果が得られることが明らかになった。さらにこの効果が６週後、９週後まで持続した。ＷｉＤａは、７つのアミノ酸残基で構成される低分子ペプチドであり、その半減期は短いと考えられる。しかしながら、虚血部周辺心筋へのＷｉＤａの一回投与により、左心室機能が劇的に改善され、さらにその効果は長期間持続した。このことからも、ＷｉＤａは、虚血により失われた心機能を著明に改善させる効果を有していることがわかった。【００５２】
急性心筋梗塞モデルに対して、ＨＧＦ以外にも公知の血管新生促進因子やサイトカイン等を用いた治療研究が数多くなされているが、そのどれもが投与３週目において心機能改善およびリモデリング抑制効果を示す。しかし、投与６週、９週と経時的にその効果を検討すると、治療効果が著しく低下し、十分な治療法となり得ないのが現状である。それに対し、本ペプチドを急性心筋梗塞モデルに投与したところ、投与３週目での心機能改善、リモデリング抑制はもちろんのこと、投与６週目、９週目の評価においても、心機能改善効果およびリモデリング抑制効果が持続されていた。よって、ＷｉＤａは急性心筋梗塞に対して投与６週、９週と長期的に治療効果を示す新しいペプチド薬として利用できると期待される。【００５３】
また、心筋梗塞モデルにおいても、ＷｉＤａの血管新生作用により新生血管が誘導されているのか検討するために、組織学的検討を行った。毛細血管密度を測定したところ、３、６および９週モデルのすべてにおいて、梗塞境界部においてＳｈａｍ群およびＣｏｎｔｒｏｌ群に対し、ＷｉＤａ群で著明に毛細血管数が増加していた。また、６週および９週の長期モデルにおいて認められた毛細血管数の増加は、治療後３週目の短期モデルで認められたものとほぼ同程度の増加であったことから、ＷｉＤａにより誘導された新生血管は、構造的、機能的に安定化し、長期的に心筋への栄養血管として残存することが示唆された。現在、虚血性心疾患に対する治療研究で用いられている血管新生因子としては、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）などが知られている（[1]Hader HKh, et ai., Circ Res 2008; 103: 1300-1308. [2]Rissanen TT, et ai., Adv Genet 2004; 52: 117-167. [3]Rissanen TT, et ai., The FASEB Journal 2003; 17: 100-102. [4]Hao X, et ai., BiochemBiophys Res Commun 2004; 322: 292-6.）。しかしこれらの因子は浮腫や炎症反応などの副作用が懸念されている。今回の心筋梗塞モデルにおいて、ＷｉＤａは、虚血心筋組織に対して、先行研究の血管新生作用からさらに構造的、機能的に安定化した栄養血管を誘導した。よってＷｉＤａは、これまでの新生血管の早期退縮や浮腫などの副作用を克服できる新たな因子であるといえる。
上記の本研究成果から、ＷｉＤａは従来公知の血管新生作用のみならず、心機能を著名に改善させる何らかの機能を発揮したものと考えられた。【００５４】
〔実施例２：ＷｉＤａ分泌筋芽細胞シートの作製〕
（１）実験方法
（１−１）筋芽細胞単離
３週齢のＬｅｗｉｓラットから前頸骨筋を採取し、冷ＨＢＳＳ（Hanks balanced salt solution）で洗い、トリプシン（Invitrogen life Technologies, Carlsbad, CA, USA）を加えた後、線維芽細胞の混在を防ぐため腱や線維組織、脂肪組織などを丁寧に除去した。トリプシンで細かくミンスし、０．２％タイプＩＩコラゲナーゼ（Worthingto Biochemical corporation, Lakewood, NJ, USA）で４５分酵素処理を行った。遠心・濾過後、線維芽細胞を接着させるためにコラーゲンタイプＩ（Nitta Gelatin Inc, Osaka, Japan）コートディッシュ（10μg/ml）に播種した。５％ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベート後、上清を再度コラーゲンタイプＩコートディッシュ（10μg/ml）に播種し、さらに２４時間後、上清をマトリゲル（Becton Dickinson Bioscience, Flanklin Lakes, NJ, USA）コートディッシュ（0.5mg/ml）に播種しなおし、ここで接着した細胞を筋芽細胞として用いた。メディウムとして、２０％ＦＢＳ（fetal bovine serum、Biowest, Minami, FL, USA）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｏｔｉｃ（Invitrogen life Technologies）、およびオルガドロン（Nihonoruganon，Osaka, Japan）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle’s medium）（Nihonseiyaku, Toky, Japan）を使用した。実験には継代数が１〜４までの細胞を用いた。【００５５】
（１−２）免疫蛍光染色
前頸骨筋より単離した細胞が筋芽細胞であることを確かめるために、筋肉細胞に存在しているＤｅｓｍｉｎの発現を免疫蛍光染色により確認した。単離細胞をマトリゲルコートの１２ｍｍ径のカバーガラス（Matsunami Glass IND LTD, Tokyo, Japan）に播種し、細胞接着後、４％ＰＦＡ（para formaldehyde）／ＰＢＳ（phosphate buffered solution）溶液で固定、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ溶液で処理し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体として抗Ｄｅｓｍｉｎ抗体（Sigma, St. Louis, MO, USA）を室温１時間、二次抗体としてＦＩＴＣ標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（DAKO, Glostrup, Denmark）を室温30分間反応させ、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）含有水溶性封入剤（Invitrogen life Technologies）で封入した。その後、蛍光顕微鏡（ECLIPSE E600,Nikon）で観察を行った。【００５６】
（１−３）遺伝子構築
Ｎ末端側に分泌シグナル（Ｉｇκ鎖リーダー配列）を、Ｃ末端側にＨＡタグを付加したＷｉＤａをコードするＤＮＡを構築した。すなわち、以下の４つのＤＮＡをＤＮＡ合成装置で合成し、これらをつなぎ合わせることで、目的のＤＮＡ断片を得た。
foward1; 5’-GCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGT-3’（配列番号１０）
foward2; 5’-TCCACTGGTGACGCGGCCCAGCCGGCCAGTGTGGTTTATGGACTGAGGCTCGAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAAC-3’（配列番号１１）
reverse1; 5’-TCGAGTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTCGAGCCTCAGTCCATAAACCACACT-3’（配列番号１２）
reverse2; 5’-GGCCGGCTGGGCCGCGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGGCG-3’（配列番号１３）
得られたＤＮＡ断片を、ＮｈｅＩとＸｈｏＩで制限酵素処理したレンチウイルスベクターｐＣＳ−ＣＧにライゲーションし、正しい塩基配列のＤＮＡ断片が組み込まれていることをシークエンスで確認した。ＷｉＤａをコードするＤＮＡ組み込んだｐＣＳ−ＣＧを、以下「ＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧ」と表記する。【００５７】
（１−４）遺伝子導入
（ｉ）レンチウイルスの産生
コラーゲンをコートした１０ｃｍディッシュにヒト腎上皮由来細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８０％コンフルエントの状態で用意した。遺伝子導入はリン酸カルシウム法で行った。ＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧ（20μg）、ならびにｐＭＤ２.Ｇ、pＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（各10μg）の３つのパッケージングベクターを滅菌水で４５０μｌに調製した後、２．５Ｍ ＣａＣｌ２を５０μｌ加え混合した。この溶液を攪拌しながら、５００μｌの２×ＨＢＳ（pH7）を加え、室温で１０分間インキュベートし、リン酸カルシウムとＤＮＡの複合体を作製した。各ディッシュのメディウムを１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに交換し、ＤＮＡ複合体を培養上清中に加え、遺伝子導入した。１２時間後にメディウムを１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ ６ｍｌに交換し、遺伝子導入から４８時間後と７２時間後にウイルス含有上清を回収した。回収したウイルス含有上清を０．４５μｍのフィルター（Millipore, Billerica, MA, USA）に通して浮遊細胞等を除去し、Ｌｅｎｔｉ−ＸＴＭ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA）で濃縮した。発現検討のネガティブコントロールとして用いるｐＣＳ−ＣＧの空ベクターを遺伝子導入したウイルス含有上清（mock）も同様に回収した。【００５８】
（ｉｉ）レンチウイルスベクターの感染
感染前日に３５ｍｍディッシュに単離筋芽細胞を、感染時４×１０４個／ディッシュになるように播種しておく。感染時に、メディウムをｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Sigma）８μｇ／ｍｌを含む無血清ＤＭＥＭ ５００μｌに交換し、そこに回収したウイルス含有上清を滴下し、４時間後に５００μｌの２０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養し、感染させた。感染４８時間後に各実験に適したメディウムに交換し、９６〜１２０時間後に実験に使用した。【００５９】
（１−５）ＲＴ−ＰＣＲ
ＷｉＤａのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で検討した。感染４８時間後に２０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭにメディウムを交換し、感染１２０時間後にＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡ１ Ｓｕｐｅｒ Ｇ（nacalai tesque, Kyoto, Japan）を１ｍｌ加えた。５分後、スクレーパーで細胞を剥離し、１．５ｍｌチューブに移した後、クロロホルムを２００μｌ加えて激しく混和した。それを遠心（12000rpm、15分、4℃）し、上清４００μｌを新しい１．５μｌチューブに移した。そこにイソプロパノールを等量加え転倒混和し、室温で１０分間インキュベートした後、遠心（12000rpm、10分、4℃）した。遠心後、上清を取り除き、抽出したＲＮＡのペレットを７５％エタノールで洗浄し、遠心（8500rpm、5分、4℃）した。遠心後、上清を除き、乾燥させた。得られたトータルＲＮＡをＤＥＰＣ（diethypyrocarbonate）水２０μｌに懸濁し、氷上に１５分静置し溶解させた。その後２６０ｎｍにおける吸光度を測定、濃度を求めた。
ＲＮＡ量が５μｇ、液量が１５μｌになるように調製し、熱処理（95℃ 2分）したものに５×ＡＭＶ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、５０μＭ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ １μｌ、ＲＮａｓｉｏｎ １μｌ、ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Sigma）１μｌを加え、４２℃ ６０分、 ６５℃ １０分、４℃の反応条件で逆転写反応を行った。
逆転写により得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用いた。使用したプライマーを以下に示す。なお、インターナルコントロールとしてＧＡＰＤＨ（Glycelaldehyde-3-phospate dehydrogenase）を用いた。
SVVYGLR(forward); 5’-CTAGCGCCACCATGGAGACAGACA-3’（配列番号１４）
SVVYGLR(reverse); 5’-AGCGTAATCTGGAACATCGTATGG-3’（配列番号１５）
GAPDH(forward); 5’-ACTGGCGTCTTCACCACCAT-3’（配列番号１６）
GAPDH(reverse); 5’-AGTGAGCTTCCCGTTCAGCT-3’（配列番号１７）【００６０】
（１−６）ＷｉＤａ産生および分泌の確認
感染させた筋芽細胞内でのＷｉＤａの産生・分泌をＤｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法で検討した。感染４８時間後に無血清ＤＭＥＭにメディウムを交換し、７２時間後に培養上清を回収し、遠心（12,000rpm 5分 4℃）した。回収した培養上清とＷｉＤａ−ＨＡペプチドを段階希釈（12.5μg/ml〜0.2ng/ml）したものそれぞれ１００μｌを、４℃で１晩マイクロプレートに固相化し、５％スキムミルクでブロッキングを行った。１次抗体として高ＨＡポリクローナル抗体、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用い、Ｓｕｐｅｒ ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏで発光させ、現像、解析した。Ｉｍａｇｅ Ｊにフィルムの画像を取り込み、各ｗｅｌｌのＤｏｔの濃淡を数値化し、検討および評価した。【００６１】
（１−７）細胞シート作製
感染７２時間後に、３５ｍｍの温度応答性培養皿（Cell Seed, Tokyo, Japan）に３×１０６個／ディッシュの感染細胞を播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞を播種してから１６時間後にディッシュを室温で３０分静置し、細胞をシート状に剥がした。【００６２】
（２）結果
（２−１）筋芽細胞の確認
前頸骨筋より単離した細胞が、筋芽細胞であることを確認するため、筋肉細胞に存在しているＤｅｓｍｉｎの発現を免疫蛍光染色により検討した。結果を図７に示した。左が位相差顕微鏡による写真であり、右が蛍光顕微鏡による写真である。蛍光顕微鏡写真では、Ｄｅｓｍｉｎが緑色に染まり、核が青色に染まる。観察の結果、９割以上の細胞がＤｅｓｍｉｎ陽性であり、高純度の筋芽細胞が単離できたことが確認できた。【００６３】
（２−２）ＷｉＤａ ｍＲＮＡの発現確認
結果を図８に示した。図８中、ＷＴは野生型（ウイルス非感染）筋芽細胞、ｍｏｃｋは空ベクター感染筋芽細胞、ＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧはＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧ感染細胞をそれぞれ表す。図８から明らかなように、ＷｉＤａのｍＲＮＡは、ＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧ感染細胞のみから検出された。【００６４】
（２−３）ＷｉＤａ産生および分泌の確認
結果を図９に示した。（Ａ）は既知濃度のＷｉＤａ−ＨＡペプチドを段階希釈したドットブロッティングの結果であり、（Ｂ）はＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧ感染細胞培養上清のドットブロッティングの結果であり、（Ｃ）は（Ｂ）の濃さを数値化して示した表である。図９に示した結果から、ＷｉＤａ／ｐＣＳ−ＣＧ感染細胞培養でＷｉＤａが産生され、分泌されていることが確認できた。また、その濃淡度合の差と図９Ａの段階希釈したドットの濃淡度合の比較から、７２時間で約３．１２５〜６．２５ｎｇ／ｍｌのＷｉＤａが分泌されていると算定した。【００６５】
〔実施例３：ラット心不全モデルを用いたＷｉＤａ分泌筋芽細胞シートの評価Ｉ〕
（１）実験方法
（１−１）ラット心不全モデルの作製
Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕラット（８週齢、メス）をイソフルランで吸入麻酔し抑制状態とした。その後、気管内挿管し、人工換気下で術中管理した。心拍動部肋間より開胸し、開創器を用いて視野を確保した。肺をガーゼで保護した後、左冠状動脈前下降枝を７−０の非吸収糸（ナイロン糸）で左心耳の高さで結紮し、左室前壁に心筋梗塞を作製した。結紮後２週目に心エコーを撮り、左室駆出率（ＥＦ）が４５〜３５％のものを心筋梗塞モデルラットとして実験に用いた。また結紮後２週目に再開胸し、ＷｉＤａを分泌する筋芽細胞シート（以下「ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ」と表記する）、野生型の筋芽細胞シート（以下「ＷＴ−ｒＳｋＭ」と表記する）を梗塞部位に移植した。細胞シート移植を行わないものをＣｏｎｔｒｏｌとした。細胞シートはいずれも３層で構成した。このモデルは左冠状動脈前下降枝を結紮後２週目に治療を開始するものである。２週目での左心室前壁の運動能は低下しており、このまま未治療状態では、さらに経時的に左心室壁運動が低下し、著しく左心室壁機能が障害される。左心室壁にかかる圧負荷も上昇し、左心室腔も徐々に拡張し、心不全を起こしている状態であると言える。【００６６】
（１−２）心機能評価
細胞シート移植後２、４、６および８週目に心エコーを用いて左心室機能評価を行った。ラットをイソフルラン吸入麻酔後、超音波診断装置ＳＯＮＯＳ５５００（Aglient Technologies, Palo Alto, CA）を用いて心エコー像を記録し、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室拡張末期内腔面積（ＬＶＥＤＡ）、左室収縮末期内腔面積（ＬＶＥＤＳ）を得た。これらの値より、左室内径短縮率（％Fractional shortening; ％ＦＳ）、左室駆出率（Ejection fraction; ＥＦ）、左室拡張末期容積（LV end-diastolic volume; ＥＤＶ）、左室収縮末期容積（LV end-systolic volume; ＥＳＶ）を算出した。
ＬＶ％ＦＳ＝［（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ］×１００
ＬＶＥＦ（％）＝［（ＬＶＤｄ３−ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３］×１００
ＥＤＶ（ｍｌ）＝ＬＶＩＤｄ３×（０．９８×ＬＶＩＤｄ＋５．９）
ＥＳＶ（ｍｌ）＝ＬＶＩＤｓ３×（１．１４×ＬＶＩＤｓ＋４．１８）【００６７】
（１−３）心体重比（ＨＷ／ＢＷ）
細胞シート移植後８週目ラットの体重を測定し、心臓を摘出した。摘出した心臓の重さを測定し、心体重比（heart weight/body weight）を算出した。【００６８】
（１−４）組織学的評価
シート移植後８週目に心臓を摘出し、１０％緩衝ホルマリンで４８時間固定を行った。両心房を除去後、パラフィン包埋し、薄切してＨＥ染色を行った。
左心室腔の拡張と梗塞部位の左心室壁厚を検討するため、マッソントリクローム染色を行った。左心室腔の大きさは腔を直行する径の平均で評価し、左心室壁厚は梗塞部の左心室壁厚の正常部位（左室後壁部）の壁厚に対する割合で評価した。
また、心筋線維化率を評価するため、膠原線維を特異的に赤色に染め出すシリウスレッド染色を行った。心筋線維化の測定は梗塞境界部を、光学顕微鏡を用いて対物２０倍で観察し、ＡＣＴ−２Ｕソフトウェア（NIKON）に取り込んだ画像を画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊにより解析した。評価は、１視野あたりの線維化率で示した。
心筋細胞の横径を評価するために、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ／Ｓｃｈｉｆｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＡＳ）染色を行った。染色後は光学顕微鏡にて対物４０倍で観察を行い、梗塞境界部と左室後壁部において核を認める細胞を無作為に１００個選択し、核を横断する短径を細胞横径とした。【００６９】
血管内皮細胞を有する毛細血管数をカウントするために、血管内皮細胞のマーカーであるＶｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒに対する抗体（Anti-Human Von Willebrand factor, DAKO）を用いて免疫組織化学染色を行った。脱パラフィンをした切片をアルコールで脱水し、熱処理を行って、抗原賦活を行った。その後、０．１％過酸化水素液で内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。５％スキムミルクでブロッキング後、抗Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ抗体と４℃で一晩反応させた。
切片をＰＢＳ−Ｔで洗浄後、二次抗体としてビオチン化標識抗Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（Anti-Rabbit Ig, biotinyated species-specific whole antibody、DAKO）と反応させた。ＨＲＰ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Streptavidin-Horseradish peroxidase conjugate、GE Healthcare）によるＬＳＡＢ（Labeled Streptavidin Biotinyated Antibody）法を用いて、ＤＡＢ（3,3-diaminobenzidine、Sigma, St. Louis, MO, USA）にて発色させた。染色後、対物４０倍で光学顕微鏡を用いて観察し、梗塞境界部と左室後壁部で無作為に２４誌野を選択し、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ陽性の血管内皮細胞を有する毛細血管数をカウントした。評価は１視野あたりの血管数（個／high power field）で示した。【００７０】
（１−５）統計解析
すべての統計学的数値は、平均値±標準偏差もしくは平均値±標準誤差で表した。
心機能評価（ＥＦ、％ＦＳ）に関しては、まず重複測定−分散分析法（repeated meatureANOVA）で解析し、その後、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いて一元配置分散分析法（one-factor ANOVA）で検定を行い、それぞれのタイムポイントにおける有意差を調べた。ｐ＜０．０５をもって有意とした。
他の統計学的数値については、ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用い、ｐ＜０．０５をもって有意とした。【００７１】
（２）結果
（２−１）ＥＦ（左室駆出率）、％ＦＳ（左室内径短縮率）を指標とした心機能評価
細胞シート移植後２、４、６および８週目のＥＦを図１０に、細胞シート移植後２、４、６および８週目の％ＦＳを図１１にそれぞれ示した。細胞シート移植前（図中base line）では各群間のＥＦおよび％ＦＳに有意な差はなかった。梗塞部への細胞シート移植後２、４、６および８週目で、ＷＴ−ｒＳｋＭ群およびＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して、ＥＦおよび％ＦＳともに心機能の有意な改善効果が認められた（ｐ＜０．０５）。さらに、移植後２、６および８週目では、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＷＴ−ｒＳｋＭ群と比較して、ＥＦおよび％ＦＳともに心機能の有意な改善効果が認められた（ｐ＜０．０５）。【００７２】
（２−２）ＥＤＶ（左室拡張末期容量）、ＥＳＶ（左室収縮末期容量）を指標とした心機能評価
細胞シート移植後８週目のＥＤＶを図１２に、細胞シート移植後８週目のＥＳＶを図１３にそれぞれ示した。ＥＤＶでは、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＣｏｎｔｒｏｌ群およびとＷＴ−ｒＳｋＭ群比較して有意な低下が認められた。ＥＳＶでも、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＣｏｎｔｒｏｌ群およびとＷＴ−ｒＳｋＭ群比較して有意な低下が認められた。ＥＤＶおよびＥＳＶともに、Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には、有意な差は認められなかった。【００７３】
（２−３）心体重比（ＨＷ／ＢＷ）
結果を図１４に示した。ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＣｏｎｔｒｏｌ群およびとＷＴ−ｒＳｋＭ群比較して有意な低下が認められた。Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には、有意な差は認められなかった。【００７４】
（２−４）組織学的検討
（ａ）左心室腔の拡張と梗塞部の左心室壁の組織学的評価
結果を図１５（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示した。（Ａ）は心臓のマッソントリクローム染色像であり、スケールバーは１０００μｍを表す。（Ｂ）は梗塞部の左心室壁厚の評価結果を示すグラフである。（Ｃ）は左心室腔の径の評価結果を示すグラフである。
図１５（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群では梗塞部位の左心室壁がひ薄化していたのに対し、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群では左心室壁が厚く保たれていた。統計解析を行うと、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＣｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群と比較し有意に梗塞部の左心室壁が厚かった（ｐ＜０．０１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には有意な差はなかった。
また、図１５（Ａ）および（Ｃ）から明らかなように、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群はＣｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群と比較して、有意に左心室腔の拡張が抑制されていた（ｐ＜０．０５）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には有意な差はなかった。【００７５】
（ｂ）梗塞周囲部の心筋組織に与える影響の組織学的評価
梗塞周囲部の正常心筋組織に与える影響を検討するため、シリウスレッド染色による心筋線維化率の評価とＰＡＳ染色による細胞横径の測定を行った。
シリウスレッド染色像および心筋線維化率の結果を図１６（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は心筋のシリウスレッド染色像であり、スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）は心筋線維化率の解析結果を示すグラフである。ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群の心筋線維化率は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群と比較して有意に低かった（ｐ＜０．０１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には有意な差はなかった。【００７６】
ＰＡＳ染色像および心筋細胞横径の測定結果を図１７（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は梗塞境界部のＰＡＳ染色像であり、スケールバーは５０μｍを表す。（Ｂ）は心筋細胞横径の測定結果を示すグラフであり、白抜きは左室後壁部の結果、黒塗りは梗塞境界部の結果である。ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群の梗塞境界部における心筋細胞横径は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群と比較して有意に低かった（ｐ＜０．０１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には有意な差はなかった。左室後壁部の心筋細胞横径は、いずれの群間にも有意な差はなかった。【００７７】
（ｃ）血管新生促進作用の検討
Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒに対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行い、毛細血管数をカウントした結果を図１８（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は梗塞境界部の免疫組織化学染色像であり、スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）は毛細血管密度の測定結果を示すグラフであり、白抜きは左室後壁部の結果、黒塗りは梗塞境界部の結果である。ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群の梗塞境界部における毛細血管数は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群と比較して有意に増加していた（ｐ＜０．０１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＷＴ−ｒＳｋＭ群の間には有意な差はなかった。左室後壁部おける毛細血管密度は、いずれの群間にも有意な差はなかった。【００７８】
（３）考察
実施例１（インジェクション法によるペプチド投与実験）では、左室前下降枝を結紮した直後にペプチドを投与し、急性心筋梗塞に対する治療効果を評価した。それに対して、実施例３（ＷｉＤａ分泌筋芽細胞シート移植）では、左室前下降枝結紮後２週間目に細胞シートを移植した。左室前下降枝結紮後２週間目の時点は、急性心筋梗塞が進行し心不全を起こしている段階である。すなわち、実施例３は、心不全治療におけるＷｉＤａの有用性を評価したものである。実施例３と同様に、筋芽細胞シートに公知の血管新生因子であるＨＧＦを遺伝子導入して心不全モデルラットに移植した研究では、リモデリング抑制効果は認められたものの、持続的な心機能の改善は認められなかった（Siltanen A, Kitabayashi K, Lakkisto P, Makela J, Patila T, Ono M, Tikkanen I, Sawa Y, Kankuri E, Harjula A. hHGF Overexpression in Myoblast Sheets Enhances Their Angiogenic Potential in Rat Chronic Heart Failure. PLoS One. 2011,26;6:e19161.）。それに対して、ＷｉＤａ分泌筋芽細胞シート移植では心不全モデルラットに対してもシート移植後２週目以降の４、６、８週目においても心機能改善、リモデリング抑制効果を示した。このことからＷｉＤａは急性心筋梗塞だけでなく、心不全状態に対しても有用な治療薬になり得るといえる。【００７９】
〔実施例４：ラット心不全モデルを用いたＷｉＤａ分泌筋芽細胞シートの評価ＩＩ〕
実施例３の（１−１）と同様にしてＦ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕラット（８週齢、メス）を用いてラット心不全モデルを作製した。シート移植後８週目に心臓を摘出し、１０％緩衝ホルマリンで４８時間固定を行った。両心房を除去後パラフィン包埋し、薄切した。ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（ＳＭＡ）陽性細胞の分布を検討するために、抗ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ抗体を用いて免疫組織化学染色を行い、光学顕微鏡で観察した。【００８０】
結果を図１９に示した。図１９の上段は４０倍の観察像であり、スケールバーは５００μｍを表す。下段は２００倍の観察像であり、スケールバーは１００μｍを表す。図１９から明らかなように、ＷｉＤａ−ｒＳｋＭ群で梗塞部にＳＭＡ陽性細胞の集積が認められた。一方、ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＷＴ−ｒＳｋＭ群ではＳＭＡ陽性細胞はほとんど認められなかった。平滑筋細胞や筋線維芽細胞などのＳＭＡ陽性細胞は、収縮性を有している。このことから筋芽細胞シートから分泌されたＷｉＤａペプチドにより、梗塞領域にＳＭＡ陽性細胞が有意に増加し、増加したＳＭＡ陽性細胞が梗塞壁に収縮性を与えることで、心機能の有意な改善につながったと考えられる。【００８１】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月11日(2013.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、心不全心におけるｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ陽性細胞集積促進剤。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
【請求項２】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列である請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１または２に記載の剤。
【請求項４】
前記ペプチドの総アミノ酸残基数が５０以下である請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項５】
前記ペプチドを分泌する細胞を含む請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
前記ペプチドを分泌する細胞シートを含む請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを分泌し、心不全心におけるｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ陽性細胞集積促進作用を有することを特徴とする細胞シート。
Ｘ１−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６  （Ｉ）
（式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７  （ＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６  （ＩＩＩ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
Ｘ２−Ｘ３−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ／Ｔｒｐ）−Ｘ５−Ｘ６−Ａｒｇ  （ＩＶ）
（式中Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５およびＸ６は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
【請求項９】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列が、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列である請求項８に記載の細胞シート。
【請求項１０】
前記ペプチドが、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含む請求項８または９に記載の細胞シート。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１、２もしくは７で表されるアミノ酸配列および分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドである請求項１０に記載の細胞シート。
【請求項１２】
細胞が、筋芽細胞、平滑筋細胞、間葉系細胞または脂肪細胞である請求項８〜１１のいずれかに記載の細胞シート。
【国際調査報告】
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