(57)【要約】本発明は体液から採取したヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）数を定量する方法、および当該方法を行うためのキットに関する。体液からのＨＨＶ数を正確に定量することは、従来、熟練した技術が必要であった。本発明の方法は、体液中のＨＨＶ数について、より簡便で正確かつ効率的な計測を可能にする新規な定量方法を提供する。本発明の方法は、体液中のＨＨＶ数についての継続的な評価に耐えうる方法であることから、疲労の蓄積についての定量的な評価にも適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液をウイルス結合物質と接触させる、ここで、（ｉ）当該ウイルス結合物質は担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、ウイルス結合物質に結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該ウイルス結合物質は担体に直接的に結合しており、それによりウイルス結合物質に結合したウイルスは担体に結合し；
（３）当該担体を（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液をレクチンと接触させる、ここで、（ｉ）当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、レクチンに結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイルスは担体に結合し；
（３）当該担体を（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項３】
唾液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した唾液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスをビーズに結合させ；
（３）当該ビーズを（１）の液から分離し、；
（４）分離したビーズから回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、唾液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項４】
ヒトヘルペスウイルスが、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）またはヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）である、請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
基準ウイルスが、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスである、請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
レクチンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
レクチンが、ＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（４）が、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法によりウイルス数を定量することを含む、請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
唾液から採取したヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）またはヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）の数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した唾液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加して、基準ウイルス濃度が１０〜１００，０００ゲノムコピー／ｍｌになるようにし、ここで当該基準ウイルスはＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスである；
（２）（１）の液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスをビーズに結合させ、ここで当該レクチンはＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択され；
（３）当該ビーズを（１）の液から分離し、；
（４）分離したビーズから回収されたウイルス数を、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法で定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、唾液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液を、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍのナノビーズに直接結合しているウイルス結合物質と接触させて、ウイルスをナノビーズに結合させ；
（３）当該ナノビーズを（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項１１】
体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量するためのキットであって、以下：
ビオチン化レクチン；
ビオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
を含む、前記キット。
【請求項１２】
体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量するためのキットであって、以下：
ビオチン化レクチン；
ビオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
予め濃度が決定されている基準ウイルス；
を含む、前記キット。
【請求項１３】
レクチンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンである、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
レクチンが、ＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択され；そして基準ウイルスが、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ７−由来の組換えウイルスである；請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液をウイルス結合物質と接触させる、ここで、（ｉ）当該ウイルス結合物質は担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、ウイルス結合物質に結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該ウイルス結合物質は担体に直接的に結合しており、それによりウイルス結合物質に結合したウイルスは担体に結合し；
（２）当該担体を（１）の液から分離し、；
（３）分離した担体から回収されたウイルス量を定量する；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
唾液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した唾液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスをビーズに結合させ；
（２）当該ビーズを（１）の液から分離し、；
（３）分離したビーズから回収されたウイルス数を定量する；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体液から採取したヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）数を定量する方法、および当該方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
「疲労」の蓄積は過労死、自殺、生活習慣病など多くの重篤な問題を引き起こす。  しかし、「疲労」に関する科学的、医学的な研究は他の分野に比べて著しく遅れており、「疲労」が個人の健康や社会生活に与える問題は解決の糸口すらない状況である。
「疲労」に対する研究や予防法・治療法の開発が遅れている主な原因としては、「疲労」を客観的に測定する方法がないことが挙げられる。特に、生活や健康に最も大きな影響を持つ「疲労の蓄積」や「中長期的に持続する疲労」に関する測定法は確立されているものが無く、この様な測定法に対するニーズは非常に大きい。
本出願の発明者の一人は、唾液中に再活性化してくるヒトヘルペスウイルスの量を測定することによって疲労の蓄積を測定する方法を開発した（ＷＯ２００６／００６６３４）。これまでの研究から、この方法を利用することで、１週間からそれ以上の期間の様々な種類のストレスによって蓄積した疲労を定量的に測定できることが判っている。なお、この方法においては、試料として唾液が好ましく用いられるが、唾液については、唾液腺に内生ビオチン含量が高いということが知られていた（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，（１９９２）４５（９）：７８８−７９０）。
従来、ウイルスを定量する方法として、ウイルスＤＮＡ量をＰＣＲにより定量する方法（Ｋｉｄｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９０）３２：１３９−１４２）、ダブルネステッドＰＣＲ法（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）により測定する方法（Ｋｏｎｄｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，（１９９３）１６７：１１９７−１２００）などが知られている。また、レトロウイルスの定量については、ウイルスＤＮＡ量を定量的ＰＣＲにより測定する際、標識配列を含むウイルス核酸を含むレトロウイルスを内部標準として用いる方法も開示されている（ＷＯ９５／０３４６８４）。
また、ウイルスタンパク質の量を測定する方法としては、例えば、ウイルスタンパク質に対する抗体を用いた免疫測定法（イムノアッセイ法）がある。代表的な免疫測定法として、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などが挙げられる（Ｇｅｒｎａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９８３）１７：９４２−９４４）。
一方、溶液中のウイルスの濃度を上げ、ウイルスを濃縮する方法として、例えば、超遠心法が挙げられるが、この方法は高価な機器と長い分離時間を要し、作業には多大な労力が必要となる。また、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコールによりウイルスを沈殿させて濃縮する方法があるが、これらの方法には、使用する試薬がその後のウイルス検出のためのＰＣＲを阻害するため、ウイルス沈殿後に試料の精製が必要となるという問題点があった。その他のウイルス濃縮法として、例えばマンノース結合型レクチンが結合した磁性粒子を用いる方法が開示されている（特開２００２−１６５５９１）。また、レトロウイルスの力価を高める、あるいは、検体サンプルからレトロウイルスを単離する方法として、ストレプトアビジンとビオチン化レクチンを利用した方法も開示されている（ＷＯ２００１／０７９４５６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／００６６３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９５／０３４６８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１６５５９１号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００１／０７９４５６号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，（１９９２）４５（９）：７８８−７９０
【非特許文献２】Ｋｉｄｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９０）３２：１３９−１４２
【非特許文献３】Ｋｏｎｄｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，（１９９３）１６７：１１９７−１２００
【非特許文献４】Ｇｅｒｎａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９８３）１７：９４２−９４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明者らが、日常生活の疲労に対する疲労度を定量的に評価するにあたり、体液中のヒトヘルペスウイルス（以下、ＨＨＶと表記する）の量を従来の方法で測定したところ、試料中のＨＨＶ数が、場合によってはヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）で１００コピー／ｍｌ未満、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）でも１００コピー／ｍｌ未満と非常に少なく、測定の途中でウイルスＤＮＡを損失してしまう場合がかなりあり、正確かつ効率的な定量には技術の熟練が必要となることが判明した。そしてこのままでは、ＨＨＶ定量方法をキット化して簡便に大量の試料を定量するのは困難であった。本発明は、従来のウイルス定量法における上記問題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究に努めた結果、ＨＨＶと結合可能な物質を結合した担体を、体液に混和して対象ウイルスと結合させ、当該担体を磁石や遠心処理などにより回収することにより、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＥＬＩＳＡなどの方法で容易に定量できる濃度に調製できることを見出した。
さらに本発明者らは定量の過程で、試料に一定量の基準となるウイルスを加え一連のステップを行うことにより、正確な定量を行うことができることに成功した。この方法においては、基準ウイルスとして変異型ＨＨＶを利用することにより、簡易で一層正確な定量を行うことができた。
本発明は以上の知見に基づき、体液中のＨＨＶについて、より簡便で正確な計測を可能にする新規な定量方法、および本発明の方法を行うためのキットを提供するものである。すなわち、本発明は以下のとおりである。
態様１：  体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液をウイルス結合物質と接触させる、ここで、（ｉ）当該ウイルス結合物質は担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、ウイルス結合物質に結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該ウイルス結合物質は担体に直接的に結合しており、それによりウイルス結合物質に結合したウイルスは担体に結合し；
（３）当該担体を（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
態様２：  体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液をレクチンと接触させる、ここで、（ｉ）当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、レクチンに結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイルスは担体に結合し；
（３）当該担体を（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
態様３：  唾液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した唾液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスをビーズに結合させ；
（３）当該ビーズを（１）の液から分離し、；
（４）分離したビーズから回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、唾液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
態様４：  ヒトヘルペスウイルスが、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）またはヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）である、態様１ないし３いずれか１項に記載の方法。
態様５：  基準ウイルスが、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスである、態様１ないし３いずれか１項に記載の方法。
態様６：  レクチンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンである、態様２または３に記載の方法。
態様７：  レクチンが、ＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択される、態様６に記載の方法。
態様８：  工程（４）が、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法によりウイルス数を定量することを含む、態様１ないし３いずれか１項に記載の方法。
態様９：  唾液から採取したヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）またはヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）の数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した唾液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加して、基準ウイルス濃度が１０〜１００，０００ゲノムコピー／ｍｌになるようにし、ここで当該基準ウイルスはＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスである；
（２）（１）の液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスをビーズに結合させ、ここで当該レクチンはＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択され；
（３）当該ビーズを（１）の液から分離し、；
（４）分離したビーズから回収されたウイルス数を、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、およびＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法で定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、唾液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
態様１０：  体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液を、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍのナノビーズに直接結合しているウイルス結合物質と接触させて、ウイルスをナノビーズに結合させ；
（３）当該ナノビーズを（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量したヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法。
態様１１：  体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量するためのキットであって、以下：
ビオチン化レクチン；
ビオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
を含む、前記キット。
態様１２：  体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量するためのキットであって、以下：
ビオチン化レクチン；
ビオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
予め濃度が決定されている基準ウイルス；
を含む、前記キット。
態様１３：  レクチンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンである、態様１１または１２に記載のキット。
態様１４：  レクチンが、ＳＢＡ（ダイズ由来）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来）からなる群より選択され；そして基準ウイルスが、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ７−由来の組換えウイルスである；態様１３に記載のキット。
態様１５：  体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液をウイルス結合物質と接触させる、ここで、（ｉ）当該ウイルス結合物質は担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、ウイルス結合物質に結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該ウイルス結合物質は担体に直接的に結合しており、それによりウイルス結合物質に結合したウイルスは担体に結合し；
（２）当該担体を（１）の液から分離し、；
（３）分離した担体から回収されたウイルス量を定量する；
を含む、前記方法。
態様１６：  唾液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した唾液にビオチン化レクチンを混和して、ウイルスとビオチン化レクチンを接触させ、さらに、ビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンと結合したウイルスをビーズに結合させ；
（２）当該ビーズを（１）の液から分離し、；
（３）分離したビーズから回収されたウイルス数を定量する；
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、体液中での濃度が非常に低く、そのままでは定量が容易ではなく、熟練を必要とするＨＨＶの定量について、簡易で一層正確な定量が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、タマビジンビーズへのＨＨＶ−６の非特異的吸着について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６がインディケーター細胞であるＭＴ−４細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。左の写真はＨＨＶ−６ウイルス液（原液）をＭＴ−４細胞に作用させた場合を示す。右の写真は、レクチンの非存在下でＨＨＶ−６ウイルス液（原液）をタマビジンビーズと接触させ、タマビジンビーズに吸着したウイルスをＭＴ−４細胞に作用させた場合を示す。
図２は、ＡＢＡ、ＤＳＡ、Ｌｏｔｕｓ、ＭＡＭ、およびＰＨＡ−Ｅ４の各レクチンによるＨＨＶ−６の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６がインディケーター細胞であるＭＴ−４細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。
図３は、ＰＨＡ−Ｌ４、ＵＥＡ−Ｉ、ＳＢＡ、およびＳＳＡの各レクチンによるＨＨＶ−６の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。緑色に光る点は、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６がインディケーター細胞であるＭＴ−４細胞に感染していることを示すもので、点１個が感染性のウイルス粒子１個を表す（各点の明るさの違いは、感染後のウイルス遺伝子発現の差によるものである）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
１．体液中のＨＨＶの定量方法
本発明は、体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液をウイルス結合物質と接触させる、ここで、（ｉ）当該ウイルス結合物質は担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、ウイルス結合物質に結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該ウイルス結合物質は担体に直接的に結合しており、それによりウイルス結合物質に結合したウイルスは担体に結合し；
（２）当該担体を（１）の液から分離し、；
（３）分離した担体から回収されたウイルス量を定量する；
を含む、前記方法を提供する。
また、本発明は、体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量する方法であって、以下の工程：
（１）採取した体液に、予め濃度が決定されている基準ウイルスを添加し；
（２）（１）の液をウイルス結合物質と接触させる、ここで、（ｉ）当該ウイルス結合物質は担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、ウイルス結合物質に結合したウイルスは間接的に担体に結合し、または（ｉｉ）当該ウイルス結合物質は担体に直接的に結合しており、それによりウイルス結合物質に結合したウイルスは担体に結合し；
（３）当該担体を（１）の液から分離し、；
（４）分離した担体から回収されたウイルス数を定量し：そして
（５）回収された基準ウイルス数と（１）で添加した基準ウイルス数とを比較して回収率を評価し、（４）で定量した体液中のヒトヘルペスウイルス数と当該回収率から、体液中から採取したヒトヘルペスウイルス数を決定する；
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の方法の各構成について詳細に説明する。
ウイルス
本発明の方法において定量の対象となるウイルスは、ヒトの疲労を定量できるウイルスであり、具体的にはヒトに感染するヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルス、すなわち、ヒトヘルペスウイルス（以下、ＨＨＶとも表記する）である。好ましくは、ヒトヘルペスウイルス６（ヒトヘルペスウイルス６のバリアントＡおよびＢ：以下、合わせてＨＨＶ−６とも表記する）、ヒトヘルペスウイルス７（以下、ＨＨＶ−７とも表記する）、サイトメガロウイルス（別名ヒトヘルペスウイルス５）及びエプシュタイン・バーウイルス（以下、ＥＢＶとも表記する）からなる群より選択される１以上のウイルスである。より好ましくはＨＨＶ−６及びＨＨＶ−７、さらに好ましくはＨＨＶ−６である。
ヒトヘルペスウイルスは、ヒトに感染する二本鎖ＤＮＡウイルスとされている。ＨＨＶ−６は直径２００ｎｍ程度のウイルスである。
体液
本発明の方法による分析の対象となる体液は、血液、唾液、血清、精液、母乳、咽頭拭い液、脳脊髄液、腹水、汗、涙、尿等、人体から採取される体液であればよいが、唾液が好適である。本明細書において、本発明の方法による分析の対象となる体液は、単に「試料」と記載することもある。
唾液の採取方法としては、咽頭部の粘性液を綿棒で拭い取る方法、唾液を採取管に直接吐き出す方法、唾液採取器具、例えばサリベット（ザルスタット社）等を用いる方法などが挙げられるが、サリベットを用いた方法が好ましい。この場合、綿を口に含み、唾液を綿にしみ込ませることで唾液を採取し、その後唾液のしみこんだ綿を遠心管に移し、遠心することで、唾液を回収すればよい。
また、唾液を採取する前の口腔処理は、例えば、長時間食事をせずに安静にする方法や唾液採取直前に水で口腔内をゆすぐ方法が挙げられるが、唾液採取直前に水で口腔内をゆすぐ方法が好ましい。
また、唾液以外の体液についても、当業者に公知の方法で採取することができる。
なお、採取した体液については、ウイルス粒子やウイルスＤＮＡの定量に影響を及ぼさなければ、測定前に希釈やろ過、遠心など適宜必要に応じた処理を行なっても構わない。あるいは直ちにウイルス定量を行わない場合は、測定までの間必要に応じ、当業者に公知の方法で、冷蔵保存や凍結保存をしてもよい。
ウイルス結合物質
本発明においてウイルス結合物質とは、ＨＨＶに結合可能な物質をいう。ＨＨＶに結合可能な物質には、レクチンや、ＨＨＶに対する抗体などが含まれる。
本明細書において、「レクチン」とは、糖鎖を認識して結合する糖結合性タンパク質をいう。レクチンが結合する糖鎖は、それぞれのレクチンについて特異性がある。
本発明において使用するレクチンは、ＨＨＶと結合可能なものであれば特に限定されないが、定量の対象となるウイルスとの親和性が高く当該ウイルスの回収率が高いものが好ましい。さらに好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンであり、さらに好ましくは、ＳＢＡ（ダイズ由来レクチン。結合糖鎖：Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む糖鎖）、ＳＳＡ（ニホンニワトコ由来レクチン。結合糖鎖：α２−６結合のシアル酸（Ｓｉａα２−６）を含む糖鎖）、ＤＳＡ（チョウセンアサガオ由来レクチン。結合糖鎖：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む糖鎖）、およびＷＧＡ（コムギ胚芽由来レクチン。結合糖鎖：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）またはシアル酸を含む糖鎖）、からなる群より選択されるレクチンである。特に、定量の対象となるウイルスがＨＨＶ−６の場合はＳＢＡとＷＧＡがより好ましい。
本発明において使用するＨＨＶに対する抗体は、ＨＨＶと結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明の一態様においてウイルス結合物質は、担体と直接結合させて使用してもよい。
別の態様において、ウイルス結合物質は間接的に担体と結合させて使用してもよい。間接的な結合の例としては、ビオチンとビオチン結合性タンパク質との結合を介したウイルス結合物質と担体の結合である。より具体的には、ウイルス結合物質をビオチン化するとともに、担体の表面にビオチン結合性タンパク質を結合させ、ビオチンとビオチン結合性タンパク質を結合させることにより、ウイルス結合物質と担体の間接的な結合が達成できる。
担体
本発明において、担体は、固体または不溶性材料（例えば、濾過、沈殿、磁性分離などにより反応混合物から分離することができる材料）である担体であれば特に限定されない。
固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン（登録商標）、ニトロセルロース、アガロース、高架橋球形アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素またはそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。
固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
本発明の一態様において、磁性ビーズは、約１０ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、磁性ビーズは約２５ｎｍ〜約１ｍｍ、約５０ｎｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有する。磁性ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
本発明の一態様において、セファロースなどの高架橋球形アガロースからなるビーズは、約２４μｍ〜約１６５μｍの範囲の直径を有しうる。好ましい態様では、高架橋球形アガロースビーズは約２４μｍ〜約４４μｍの範囲の直径を有する。高架橋球形アガロースビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
疎水性表面を有する固体担体の例には、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社またはＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社から市販されているものなどのポリスチレンラテックスビーズが挙げられる。
シリカ（ＳｉＯ２）−処理またはシリカ（ＳｉＯ２）ベースの固体担体の例には、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能な、超常磁性シリカビーズ等が挙げられる。あるいは、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から市販されているＭ−２８０等も使用されうる。
親水性表面を有する磁性ビーズの例としては、Ｂｉｏｍａｇ（登録商標）カルボキシルの名称でＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されているビーズまたはＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社のビーズ（ＭＣ０２Ｎ／２９２８）などが挙げられる。あるいは、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から市販されているＭ−２７０等が使用されうる。
ウイルス結合物質と担体の直接的結合
本発明の一態様において、ウイルス結合物質と担体は直接結合させて使用することができる。この場合、ウイルスとレクチン結合担体の会合可能性を向上させる観点から、担体はブラウン運動できる程度の大きさのナノビーズである。ナノビーズの好ましい球体直径の範囲は、１０ｎｍ〜１００ｎｍの球体直径、より好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの球体直径である。また、この場合、磁石で簡便に回収できる磁性体を含むことが好ましく、例えば、これに限定されるわけではないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＭＡＣＳ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（直径５０ｎｍ）などの磁性ナノビーズが挙げられる。
ウイルス結合物質の多くはタンパク質であるため、このウイルス結合タンパク質と担体の連結は、当業者に公知のタンパク質と担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、当該カルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、タンパク質と担体を連結することができる。または、例えば、担体表面のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性エステル化された担体とタンパク質とを一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和することにより、担体表面のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。
あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。
ウイルス結合物質と担体の間接的結合
本発明の別の態様において、ウイルス結合物質は間接的に担体と結合させて使用してもよい。
例えば、ウイルス結合物質をビオチン化するとともに、担体の表面にビオチン結合性タンパク質を結合させ、ビオチンとビオチン結合性タンパク質を結合させることにより、ウイルス結合物質と担体の間接的な結合が達成できる。
この場合に担体として、ビーズを好ましく用いることができるが、ビーズの好ましい球体直径の範囲は、０．１μｍ〜１００μｍの球体直径、より好ましくは、０．５μｍ〜１０μｍの球体直径、さらに好ましくは、１μｍ〜５μｍの球体直径である。
本明細書において、「ビオチン」とは、Ｄ−［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸］の一般名称である。ビオチンは、ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、ビタミンＢ７と呼ばれることもあり、あるいは、ビタミンＨ、補酵素Ｒと呼ばれることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合する。
本明細書中において「ビオチン」とは、上記ビオチンの他、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｏｆｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４６６６−４６６８）や、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｉｒｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０８：３４３−３５７）、あるいはビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）やビオチンスルホキシド（ｂｉｏｔｉｎ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）等のビオチン類縁体も含む。
レクチン等のウイルス結合物質をビオチン化する際には、ビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ２−Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ２  Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ３−ＬＣ  Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
このようなビオチン化試薬を用いて、レクチン等のウイルス結合物質に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。
例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、レクチン等のウイルス結合物質に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロライド）のようなカルボジイミドを用いて、レクチン等のウイルス結合物質のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。
また、ビオチンを結合させたレクチン等のウイルス結合物質は、例えばＪ−Ｏｉｌ  Ｍｉｌｌｓ社からビオチン標識レクチンとして購入してもよい。あるいはまた、ビオチン標識キット（例えばこれらに限定するものではないが、Ｐｉｅｒｃｅ社製のＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎや、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２など）を用いて所望のウイルス結合物質にビオチンを結合させて作製してもよい。
あるいはまた、レクチン等のウイルス結合物質の遺伝子を、ビオチン化配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと融合し、この融合遺伝子を発現するベクターを構築、任意の宿主においてビオチン化配列との融合タンパク質として発現させることにより（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９６４０−９６４５）、例えばビオチン化レクチンを作製してもよい。このようなベクターとしてこれに限定されるわけではないが、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅ（商標）タグが含まれるベクターが挙げられる。このうち哺乳類細胞発現用には、ｐｃＤＮＡ（商標）６ベクターが、大腸菌発現用にはｐＥＴ１０４ベクターが、あるいはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現用にはｐＭＴ／ＢｉｏＥａｓｅベクターがある。
本発明において、ビオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（２００２），３６３：６０９−６１７）、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００５），２８０：１３２５０−１３２５５）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（２００７），４０５：３９７−４０５）、タマビジンやこれらの変異体等、ビオチンとビオチン／アビジン結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。特に、タマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。なお、タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見されたビオチン結合性タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７６：１３８３−１３９７）。タマビジンの変異体としては、例えば、高結合能・低非特異結合タマビジン（特願２００８−２０８７６６  未公開）等が挙げられる。
本発明における「タマビジン」は、タマビジン１（アミノ酸配列：配列番号１１、それをコードする核酸配列：配列番号１０）、タマビジン２（アミノ酸配列：配列番号１３、それをコードする核酸配列：配列番号１２）、またはそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のタマビジンは典型的には、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号１０もしくは配列番号１２の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、本発明のタマビジンは、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号１０もしくは配列番号１２の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、およびそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶことがある。
タマビジン１または２の変異体は、配列番号１１または１３のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、場合により、１または数個のアミノ酸を意味してもよい。
タマビジン１または２の変異体はさらに、配列番号１１または１３のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。
本発明において、好ましいタマビジンには、以下のタマビジン改変体が含まれる。（特願２００８−２０８７６６  未公開）。
配列番号１３に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号１３の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号１３の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号１３の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号１３の７３番目のリジン残基
から選択される１または複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
より好ましくは、配列番号１３において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号１３において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号１３において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号１３において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
ビオチン結合性タンパク質と担体の連結は、当業者に公知のタンパク質と担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、当該カルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、タンパク質と担体を連結することができる。または、例えば、担体表面のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性エステル化された担体とタンパク質とを一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和することにより、担体表面のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。
あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。
上記のような結合を用いて、ビオチン結合性タンパク質を担体に固定化する場合、様々な官能基が表面に配置された各種担体が市販されているので、それらを好ましく用いることができる。例えばこれらに限定されるわけではないが、官能基が表面に配置されたマイクロプレートとしては、無水マレイン酸プレートとして例えばＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）Ｍａｌｅｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）が、活性型アミノ基プレートとして例えばＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒＴＭ−Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅｓ／Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ社）が、あるいはカルボキシル基プレートとして例えばＥＬＩＳＡ用プレートＭＳ−８７９６Ｆ（９６ウェル・Ｃタイプ・平底・カルボ）（住友ベークライト社）が挙げられる。また、官能基が表面に配置されたマイクロビーズとしては、高架橋アガロースビーズとして例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  ヘルスケアバイオサイエンス社）が、磁性ビーズとして例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｄｙｎａｌ社）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ビオチン結合性タンパク質と固体担体の連結は、担体に添付された説明書に従えばよい。
あるいはまた、ビオチン結合性タンパク質を固定化した担体としては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄＴＭ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）、Ｎｕｎｃ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  ＷｅｌｌＴＭ  Ｐｌａｔｅｓ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）等のマイクロプレート類、あるいはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌ社）、ＭａｇｎａＢｉｎｄＴＭ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
ビオチンとビオチン結合性タンパク質を使用しない場合には、例えば、ウイルス結合物質にヒスチジンタグ、ＦＬＡＧＴＭタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を結合させるとともに、担体にはそれぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）、抗ＦＬＡＧ抗体、またはグルタチオンを結合させ、それぞれを結合させることにより、ウイルス結合物質と担体を間接的に結合させることもできる。
基準ウイルス
本発明の方法において、定量の対象となるウイルスの回収率は、必ずしも１００％ではなく、また試料や条件によっても微妙に変動するため、回収率は厳密に一定とはならない。一回的にウイルスの概数を得る目的であればこれでも十分である。しかし、中長期の疲労の評価に耐えうるウイルス定量を行うには、一定期間をおいて採取した体液のウイルス量を計測し、継続的にその量を比較していく必要があり、回収率が変動してしまうと、継時に採取・定量したウイルス量の比較が困難となることが問題となる。
これに対して、発明者らは検討の結果、定量対象となるウイルスと回収率が同程度で、かつ、定量対象ウイルスと混在していてもそれぞれのウイルス数を判別して計測できるようなウイルス（以下、「基準ウイルス」という）を系に導入することにより、この問題を解決することに成功した。具体的には、定量しておいた基準ウイルスを当初試料（例えば、唾液）に一定量加えておき、本発明の方法を行った後、当初試料に加えた基準ウイルスの量と回収された基準ウイルスの量に基づいて回収率を評価する。そしてこの回収率を定量対象ウイルスの測定値に乗じて、ウイルス量の測定値を補正することにより、定量対象ウイルスを常に正確に定量することができた。
また、基準ウイルスを試料に加えて測定、回収率を評価し、定量対象ウイルスの測定値を補正する場合、これを一つの測定系の中で行うことが好ましいが、例えば、試料を２つに分け、片方にだけ基準ウイルスを加えて回収率を評価、もう片方で定量対象ウイルスの測定を行い、両者の結果から定量対象ウイルスの測定値を補正しても良い。
なお、本発明の方法において、多数の検体のウイルス定量を行う場合、全ての検体に基準ウイルスを導入して定量することが好ましいが、ウイルス回収率が安定していれば、必ずしもすべての検体について基準ウイルスを導入する必要はなく、適宜基準ウイルス導入を省略してもよい。すなわち、一部の検体に基準ウイルスを導入することにより、系の回収率が安定していることを確認しつつ、その他の検体については基準ウイルスの導入なしにウイルス定量を行ってもよく、このような態様も本発明の方法に含まれる。
基準ウイルスは、定量するウイルスと同様の特徴を有し、かつ、定量するウイルスと容易に区別できなければならない。すなわち、本発明の定量方法において、定量対象となるウイルスと同様にウイルス結合物質と結合し、同様にビーズで回収され、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＥＬＩＳＡなどで容易にかつ対象ウイルスと区別できるように定量できなければならない。
発明者らは、この条件を満たす基準ウイルスとして、定量対象ウイルスがＨＨＶ−６の場合は変異型ＨＨＶ−６、定量対象ウイルスがＨＨＶ−７の場合は変異型ＨＨＶ−７が好適であることを見出した。
変異型ＨＨＶ−６としては、ＨＨＶ−６由来の組換えウイルスであって、ＨＨＶ−６のＵ２〜Ｕ８領域に相当する部位またはＵ２４及びＵ２５領域に相当する部位に、野生型ＨＨＶ−６ゲノム中に存在しない外因性ヌクレオチド配列を有するものが好ましい。また、変異型ＨＨＶ−７としては、ＨＨＶ−７由来の組換えウイルスであって、ＨＨＶ−７のＵ２〜Ｕ８領域またはＵ２４〜２５領域に相当する部位に、野生型ＨＨＶ−７ゲノム中に存在しない外因性ヌクレオチド配列を有するものが好ましい。
ウイルスを、ＰＣＲやＬＡＭＰなどヌクレオチド自体を高感度に検出する系で定量する場合には、外因性ヌクレオチド配列は、定量対象となる野生型ＨＨＶのゲノムやヒトゲノム中に存在しない配列であれば制限はなく、特に構造遺伝子でなくても構わない。この場合外因性ヌクレオチド配列の長さは、特に限定されないが、好ましくは１００塩基以上２０，０００塩基以下であり、さらに好ましくは２００塩基以上１０，０００塩基以下である。また、このような系において、外因性ヌクレオチド配列として構造遺伝子を挿入する場合には、定量対象となるＨＨＶの回収率に影響を与えない（例えば、ＨＨＶ−６糖鎖−レクチン結合に影響を与えない）ようなタンパク質、例えば、蛍光タンパク質（例えばｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰやｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ等が挙げられるがこれらに限定されない）や抗生物質耐性タンパク質（例えばテトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはスペクチノマイシン等に対する耐性タンパク質が挙げられるがこれに限定されない）等、をコードするヌクレオチド配列が好ましい。
また、ウイルスを、ウイルスに対する抗体を用いて定量する場合、例えばＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイによる定量においては、変異型ＨＨＶに、野生型ＨＨＶには存在しない外因性タンパク質を発現させる必要があり、このようなタンパク質は、外因性ヌクレオチド配列によってコードされ、当該ヌクレオチド配列は、定量対象となる野生型ＨＨＶゲノム中に存在しない配列であれば特に制限はないが、ヒトゲノム中に存在しない配列であることが好ましい。また、外因性タンパク質としては、定量対象となるＨＨＶの回収率に影響を与えない、例えば上述のような、蛍光タンパク質や抗生物質耐性タンパク質等が好ましい。あるいはまたアッセイが容易な酵素等も好ましく使用することができる。
このような変異型ＨＨＶ−６の例として、野生型ＨＨＶ−６と区別して計測するためのタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた組換えウイルス（例えば特許第３９２３５０５号を参照）を好ましく利用できる。また、このようなＨＨＶ−７の例として、野生型ＨＨＶ−７と区別して計測するためのタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた組換えウイルス（例えば特開２００７−１５９５８６を参照）を好ましく利用できる。
このような基準ウイルスの試料への添加量は、基準ウイルスの定量ができる量であれば特に制限はないが、例えば変異型ＨＨＶ−６の場合、１ｍｌあたり１０コピー〜１，０００，０００コピー程度、好ましくは１ｍｌ当たり１０コピー〜１００，０００コピー程度、より好ましくは１ｍｌあたり５０コピー〜５０，０００コピー程度、さらに好ましくは１ｍｌあたり１００コピー〜１０，０００コピー程度で定量することができる。
基準ウイルスを用いた定量は、基準ウイルスが上記のような特性を有するため、担体を利用した対象ウイルスの回収や濃縮の基準とするだけではなく、その後のＰＣＲやＬＡＭＰを用いた定量に於ける内部標準、ＥＬＩＳＡ法を用いた定量の基準として、そのまま好ましく用いることができる。
体液とウイルス結合物質の接触
本発明の方法は、体液とウイルス結合物質とを接触させる工程を含む。体液とウイルス結合物質とを接触させる条件は、ウイルスの定量が可能な程度に試料中のウイルスとウイルス結合物質とが結合する条件であれば特に制限されない。接触条件の要素としては、インキュベーション温度およびインキュベーション時間を含む。
また、体液はそのまま、あるいは当該体液に所望の緩衝液等を加えてから、ウイルス結合物質と接触させてもよい。なお、所望の緩衝液等を加えた場合には、加えた緩衝液の量をウイルス量の算出時に考慮する必要がある。
インキュベーション温度の下限は４℃または１０℃であってよく、上限は５０℃、４５℃、４０℃、３７℃、３０℃、２５℃、および２０℃からなる群より選択されてもよい。好ましいインキュベーション温度として、１０℃〜３７℃、１０℃〜２５℃、１０℃〜２０℃、１５℃が挙げられる。
インキュベーション時間の下限は１分、３分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分からなる群より選択されてもよく、上限は一晩、１０時間、８時間、５時間、３時間、２時間、１．５時間、および１時間からなる群より選択されてもよい。好ましいインキュベーション時間として、５分〜２時間、１０分〜１．５時間、３０分〜１時間が挙げられる。
本発明の方法におけるウイルス結合物質と担体とが間接的に結合する態様においては、ウイルス結合物質と体液を接触させる前に、それと同時に、またはその後に、担体に結合可能な分子を介してウイルス結合物質と担体とを接触させて結合させる。ウイルス結合物質と担体を接触させる条件は、ウイルス結合物質が、担体に結合可能な分子を介して担体に十分に結合できる条件であれば特に制限されない。接触条件の要素としては、インキュベーション温度およびインキュベーション時間を含む。上述したウイルスとウイルス結合物質を接触させる条件と同様の条件を適宜選択することができるが、特に好ましいインキュベーション時間としては、１分〜２時間、３分〜１時間、５分〜３０分が挙げられる。
担体の分離
ウイルス結合物質を介して定量対象のウイルスを捕捉した担体は、その担体の性質に応じた当業者に公知の手法により、試料である体液から分離する。
例えば、ビーズなど粒子状の担体については遠心分離とそれに続く上清の除去により、担体の試料からの分離を達成してもよい。担体が磁性ビーズの場合は、磁石を用いて担体を集め、上清を除去することにより、担体を試料から分離してもよい。担体が、薄膜やフィルターなどの形状である場合は、担体を試料から引き上げることにより、あるいは担体に試料を通過させた後、担体を試料から分離してもよい。担体が、マイクロプレートなど、ウェル構造の内部でウイルスを補足するように設計されている場合は、単に試料をウェルから除くことにより担体を試料から分離してもよい。
また、必要に応じて試料から分離した担体に非特異的に結合した物質を除去するために、分離した担体を洗浄する工程を加えてもよい。洗浄工程に用いる洗浄液や温度の条件は、ウイルスおよびウイルス結合物質の間の結合、ならびに／または、ウイルス結合物質と担体の間の結合を維持するという条件が維持される限り、特に限定されない。
好ましくは、洗浄液は緩衝されており、ｐＨ７〜８の緩衝液、例えばＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＢＳ、等を基本とする緩衝液であってよい。また、洗浄液のｐＨは６〜９、好ましくは７〜８、であってもよい。
洗浄温度は、特に限定されないが、洗浄温度の下限は４℃または１０℃であってよく、上限は５０℃、４５℃、４０℃、３７℃、３０℃、２５℃、および２０℃からなる群より選択されてもよい。好ましい洗浄温度として、１０℃〜３７℃、１０℃〜２５℃、１０℃〜２０℃、１５℃が挙げられる。
濃縮ウイルス溶液の定量
定量対象のウイルスを捕捉した担体を、試料である体液から分離および／または洗浄した後、当該担体に当該体液の初期体積よりも少ない量の緩衝液を加える。それにより、回収した試料中のＨＨＶ濃度を体液のＨＨＶ濃度よりも上昇させる。体液の初期体積よりも少ない量は、特に限定されないが、初期体積の１／２、１／１０、１／２０、１／４０、１／６０、１／８０、１／１００であってよい。
定量対象のウイルスを捕捉した担体に加える緩衝液は、その後適用するウイルスの定量方法に応じて適宜選択される。
上述のように回収した試料中のＨＨＶ濃度を体液のそれと比較して上昇させた後は、ウイルス数の定量を行う。本明細書において、「ウイルス数を定量する」とは、試料中に存在するウイルスの量を定量することを意味する。したがって、「ウイルス数を定量する」とは、例えば、絶対的なウイルス数として、ウイルス濃度として、またはウイルス力価として、直接的または間接的に定量することを包含する。ウイルス数の計測方法としては、ウイルスＤＮＡ量を定量する方法、ウイルス粒子に由来する抗原の数を定量する方法があり、公知の定量方法を適宜用いることができる。前者としてはリアルタイムＰＣＲ法などＰＣＲ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８５），２３０：１３５０−１３５４）に基づく方法や、ＬＡＭＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（２０００），２８：Ｅ６３）などを用いたＤＮＡの定量法が挙げられる。後者としてはサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いた抗原タンパク質の定量法が挙げられる。また、所望の感染用細胞にウイルスを感染させ、ウイルス力価として定量する方法もある。
なお、ウイルスＤＮＡ量を測定する場合には、ウイルス外皮タンパク質を破壊する必要がある。そのために、限定するものではないが、適当な緩衝液中において、熱処理や界面活性剤の添加、プロテネースＫ処理、またはそれらの組み合わせなどを好ましく用いることができる。
緩衝液については特に限定されないが、反応させるｐＨが５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは、７．０〜８．０であってよい。ｐＨ７〜８の緩衝液は、例えばＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＢＳ、等を基本とする緩衝液であってよい。熱処理の温度は、特に限定されないが、好ましい熱処理温度として、６０℃〜１００℃、より好ましくは７０℃〜９５℃、さらに好ましくは８０℃〜９５℃であってよく、処理時間は５分〜１時間、好ましくは１０分から３０分である。界面活性剤の種類は、後のウイルス定量測定に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０やＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等が挙げられ、濃度はそれぞれ、０．０１％から１％、好ましくは、０．０５％から０．５％、より好ましくは０．０５％から０．２５％であってよい。熱処理と界面活性剤を組み合わせる場合は、上記条件の範囲で適宜組み合わせることができる。
２．キット
本発明はまた、本発明の方法に基づいて体液から採取したヒトヘルペスウイルス数を定量するためのキットを提供する。
一態様において、本発明のキットは、少なくともビオチン化ウイルス結合物質、ビオチン結合タンパク質を結合した担体、を含む。好ましくは、本発明のキットは、少なくともビオチン化ウイルス結合物質、ビオチン結合タンパク質を結合した担体、および予め濃度が決定されている基準ウイルスを含む。ウイルス結合物質、ビオチン結合タンパク質、担体、および基準ウイルスについては上記に定義したとおりである。
別の態様において、本発明のキットは、少なくともウイルス結合物質が結合したナノビーズ、を含む。好ましくは、本発明のキットは、少なくともウイルス結合物質が結合したナノビーズおよび予め濃度が決定されている基準ウイルスを含む。ウイルス結合物質、ナノビーズおよび基準ウイルスについては、上記に定義したとおりである。
本発明のキットは、さらに本発明の方法において、ウイルスとウイルス結合物質を結合させるための緩衝液、分離したウイルス結合担体を洗浄するための緩衝液、および／または、その後当該担体に加えるための緩衝液を含んでいてもよい。
本発明のキットはまた、ウイルスの定量を行うための試薬および／または緩衝液をさらに含んでいてもよい。例えば、ウイルスの定量方法がＤＮＡ量の定量に基づく方法である場合は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、必要に応じて適切なプローブ、適切な緩衝液等が挙げられる。ウイルスの定量方法が抗原の数の定量に基づく方法である場合は、抗原を認識する抗体、検出のための適切な二次抗体、適切な緩衝液等が挙げられる。
本発明のキットは、各々の試薬が適切な容器に封入されていていてもよい。また、本発明のキットは、それに含まれる試薬等を適切に梱包するためのパッケージをも含んでいてもよい。
また、本発明のキットには適切な使用説明資料が含まれていてもよい。使用説明資料には、非限定的に、パッケージへの使用方法の記載、あるいは、印刷物、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、および光学媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）、等、本発明のキットの使用方法を利用者に伝達可能な媒体が含まれる。また、使用説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスの記載もまた、使用説明資料に含まれる。
【実施例】
【００１０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１  ＨＨＶを検出することのできるレクチンの探索
ビオチン化されたレクチンを培養したＨＨＶ−６溶液と反応させ、タマビジンを結合した磁性ビーズに結合させることによりＨＨＶ−６の濃縮が出来るかどうかを検討した。
１．培養Ｔ細胞からのＨＨＶ−６溶液の作製
ヒト臍帯血由来培養Ｔ細胞にＥＧＦＰを発現する組換えＨＨＶ−６（特許第３９２３５０５号）を感染させ、ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６溶液を作製した。
２．タマビジン磁性ビーズの作製
カルボキシル基で表面をコートされた磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｄｙｎａｌ社）３００μｌを０．０１Ｎ  水酸化ナトリウム  ３００μｌで１０分間洗浄後、さらに超純水３００μｌで１０分間３回洗浄した。洗浄済みの磁性ビーズに、冷超純水で溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロライド（ＥＤＣ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を最終濃度０．２Ｍになるように添加し、３０分間室温で振とうした。その後、冷超純水３００μｌ、続いて５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）３００μｌで磁性ビーズを洗浄し、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）に置換した０．６ｍｇ／ｍｌ  タマビジンを３００μｌ（１８０μｇ）混和した。室温で３０分間振とうさせることにより、共有結合にてタマビジンと磁性ビーズを結合させた。磁石で磁性ビーズを回収し、上清を除去した。次に５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．０）３００μｌでビーズの未反応カルボキシル基を消去後、０．５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液３００μｌで磁性ビーズをブロッキングした。ＰＢＳ緩衝液３００μｌで磁性ビーズを懸濁し、磁性ビーズを完成させた。タマビジン磁性ビーズのビオチン結合活性は、ビーズ懸濁液１ｍｌ当たり１５ｎｍｏｌであった。
３．組換えＨＨＶ−６溶液の濃縮
上記項目１で作製したＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６溶液を利用して、組換えＨＨＶ−６の感染力価を指標にウイルス濃縮を試みた。ビオチン化レクチンは、Ｊ−オイルミルズ社製  ビオチン化レクチン１５種類（Ｃｏｎ  Ａ，ＤＢＡ，ＬＣＡ，ＰＨＡ−Ｅ４，ＰＮＡ，ＲＣＡ１２０，ＵＥＡ−Ｉ，ＷＧＡ，ＡＢＡ，ＤＳＡ，Ｌｏｔｕｓ，ＭＡＭ，ＰＨＡ−Ｌ４，ＳＢＡ，ＳＳＡ）を使用した。
まず、レクチンの探索を行なう前に、バックグランドとなるタマビジンの非特異的吸着の確認を行なった。
最初に、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６液１００μｌ（濃度１０４個／ｍｌ  ＴＥ）、ＰＢＳ５００μｌを混和し、１５℃で１時間、インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、上記項目２で作製したタマビジン磁性ビーズを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間、インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５％  ＢＳＡ  ２００μｌで２回洗浄した。次いでこれを培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清）５００μｌにて懸濁した後、全量を０．５ｍｌのインディケーター細胞（ＭＴ４細胞）と懸濁した。なお、ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６が存在すれば、ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６はインディケーター細胞に感染し、ＨＨＶ−６のＤＮＡが細胞中に入って、その中でウイルスに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子が発現してＧＦＰ蛍光を発するものと考えられる。
上記実験の結果、図１にみられる様に、タマビジンビーズへのＨＨＶ−６の非特異的吸着はほとんどないことが確認された。
次に、各種レクチンを用いたウイルス濃縮が可能かどうかを調べた。
最初に、ＥＧＦＰ組換えＨＨＶ−６液１００μｌ（濃度１０４個／ｍｌ  ＴＥ）、ＰＢＳ  ５００μｌ、ビオチン化レクチン  １０μｇを混和し、１５℃で１時間、インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、上記項目２で作製したタマビジン磁性ビーズを１０μｌ反応液に添加し、さらに１５℃で１時間、インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入った試験管をダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５％  ＢＳＡ  ２００μｌで２回洗浄した。次いでこれを培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清）５００μｌにて懸濁した後、全量を０．５ｍｌのインディケーター細胞（ＭＴ４細胞）と懸濁し、ＥＧＦＰの発現を観察した。ＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６を濃縮できていれば、レクチン−ビオチン−タマビジンを介して磁性ビーズと結合しているＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６はインディケーター細胞に感染し、ＨＨＶ−６のＤＮＡが細胞中に入り、その中でウイルスに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子が発現してＧＦＰ蛍光を発するものと考えられる。
実験の結果、例えば図２、図３に見られるように、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＤＳＡが、あるいはＷＧＡを使用した場合にウイルス原液よりも多くのＥＧＦＰの発現が観察された。このことから、これらのレクチンを使用して効率的にＨＨＶ−６を濃縮できることが示された。
実施例２  基準ウイルスを用いない唾液中ＨＨＶ−６の定量
唾液中のＨＨＶ−６濃度を、基準ウイルスは用いずに、ビオチン化レクチン、タマビジン磁性ビーズを利用して定量した。
１．唾液の採取
被験者からの唾液をサリベット（サリベットコットン、ザルスタット社製）を用いて採取した。被験者は、唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を２度漱いだ後、２分間サリベットの中綿を口腔内に含み、唾液を採取した。
２．従来法を利用したＨＨＶ−６の定量
まず、従来法を利用して唾液中のＨＨＶ−６濃度を定量した。
上記項目１．で採取した唾液４００μｌについて、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１（ＱＩＡＧＥＮ社）とＥＺ１  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＥＺ１  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従い、唾液中のＨＨＶ−６  ＤＮＡを精製した。
得られたＤＮＡを、定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、ＨＨＶ−６  Ｕ６５／６６領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。ＰＣＲに使用した配列は、
プライマー：  ５’−ＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＴＧ−３’（配列番号１）；および
プライマー：  ５’−ＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＡ−３’（配列番号２）；ならびに
ＴａｑＭａｎ  プローブ：  ＦＡＭ  ５’−ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号３）；
であり、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（ロシュ社）を用いて、反応温度９５℃  １０分間  １回、９５℃  ５秒＋６０℃  ３１秒、を４５サイクルでリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、本試験は、ウイルス実験に極めて熟練した実験者によって行なわれた。
以上の結果、唾液１ｍｌ中のＨＨＶ−６ＤＮＡは、１４６１６コピー／ｍｌであった。
３．ビオチン化レクチン、タマビジン磁性ビーズを利用したＨＨＶ−６の定量
上記項目１で採取した唾液４００μｌに、４４μｌの１０倍濃度のＰＢＳ、ビオチン化ＳＢＡ  １ｎｍｏｌを混和し、１５℃で１時間インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、実施例１の項目２で作製したタマビジン磁性ビーズ１００μｌを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ５００μｌで３回洗浄した。ここにＴＥを１０μｌ加え、９８℃１０分間処理した後、マグネットスタンドにおいて、上清を回収し、うち５μｌを定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、上記項目２と同様に、ＨＨＶ−６  Ｕ６５／６６領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。
その結果、溶出液５μｌ中のＨＨＶ−６量は、２９３４コピーと測定された。従って、ＴＥ１０μｌには、ＨＨＶ−６が５８６８コピー存在していたと算出される。これは、もともと唾液４００μｌ中に存在したＨＨＶ−６量なので、１ｍｌ当りに換算すると、１４６７０コピー／ｍｌと計算される。この値は、上記２で従来法で測定した値（１４６１６コピー／ｍｌ）とよく一致していた。この場合、ウイルスの回収率はほぼ１００％と考えることができる。
以上により、ビオチン化ＳＢＡを利用して、ＨＨＶ−６の定量を行なうことができることが示された。
実施例３  基準ウイルスを用いた唾液中ＨＨＶ−６の定量
唾液中のＨＨＶ−６濃度を、ビオチン化レクチン、タマビジン磁性ビーズ、基準ウイルスを利用して定量した。
１．唾液採取方法
被験者からの唾液をサリベット（サリベットコットン、ザルスタット社製）を用いて採取した。被験者は、唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を２度漱いだ後、２分間サリベットの中綿を口腔内に含み、唾液を採取した。
２．従来法を利用したＨＨＶ−６の定量
実施例２の項目２．と同じ方法で、唾液中のＨＨＶ−６の定量を行なった。
なお、本試験は、ウイルス実験に極めて熟練した実験者によって行なわれた。結果を表１に示した。
３．ビオチン化レクチン、タマビジン磁性ビーズ、基準ウイルスを利用したＨＨＶ−６の定量
（１）ビオチン化ＷＧＡを用いたＨＨＶ−６の定量
上記項目１．で採取した唾液４００μｌに、１０００コピーのＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６が含まれるＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６溶液を添加した。次いで、４４μｌの１０倍濃度のＰＢＳ、ビオチン化ＷＧＡ  １ｎｍｏｌを混和し、１５℃で３０分間インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、実施例１で作製したタマビジン磁性ビーズ１００μｌを反応液に添加し、さらに１５℃で３０分間インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ５００μｌで３回洗浄した。次いでプロテネースＫバッファー（ＴＥ中に、１ｍｇ／ｍｌのプロテネースＫ、０．４５％  ＮＰ−４０、０．４５％  Ｔｗｅｅｎ２０を加えたもの）を４０μｌ加えて、５６℃で１時間インキュベーションし、ウイルス粒子を破壊し、ゲノムＤＮＡを遊離させた。さらにマグネットスタンドにおいて、上清を回収した。上清を９８℃で１０分間処理しプロテネースＫを失活させた後、うち５μｌを使って定量ＰＣＲを行なった。定量ＰＣＲでは、ＥＧＦＰ組換えウイルスのみがもつＥＧＦＰ遺伝子と、野生型ＨＨＶ−６には存在するが組換えウイルスでは欠損させてあるＨＨＶ−６  Ｕ５遺伝子を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。
ＥＧＦＰ遺伝子を定量するためのプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブとして、
プライマー：  ５’−ＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡ−３’（配列番号４）；および
プライマー：  ５’−ＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＣＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）；ならびに
ＴａｑＭａｎ  プローブ：  ＦＡＭ  ５’−ＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号６）；
ＨＨＶ−６  Ｕ５遺伝子を定量するためのプライマーとして、
プライマー：  ５’−ＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号７）；および
プライマー：  ５’−ＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＡＡＡＴＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号８）；ならびに’
ＴａｑＭａｎ  プローブ：  ＦＡＭ  ５’−ＡＧＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号９）；
を用いた。リアルタイムＰＣＲ法は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（ロシュ社）を用いて、反応温度９５℃  １０分間  １回、９５℃  ５秒＋６０℃  ３１秒を４５サイクル、で行った。
ＥＧＦＰ遺伝子の上記リアルタイムＰＣＲ法の結果から定量されたＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６数と、当初添加したＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６  １０００コピーの比から、各実験におけるＥＧＦＰ型ＨＨＶ−６の回収率を計算した。この回収率に、上記ＨＨＶ−６  Ｕ５遺伝子の上記リアルタイムＰＣＲ法の結果から測定された野生型ＨＨＶ−６数を乗じて補正し、本方法により定量された値とした。
以上の実験を、異なる３種類の唾液検体を用いて行なった。その結果を表１に示す。
【表１】
2009123347.tif 000002
いずれの唾液検体においても、本発明の方法により得られた野生型ＨＨＶ−６の値と従来法による野生型ＨＨＶ−６の値はよく一致した。これにより唾液について、本発明の方法によりＨＨＶ−６数の定量を簡便に行なうことができることが示された。
実施例４  基準ウイルスを用いない唾液中ＨＨＶ−７の定量
唾液中のＨＨＶ−７濃度を、基準ウイルスは用いずに、ビオチン化レクチン、タマビジン磁性ビーズを利用して定量した。
１．唾液の採取
被験者からの唾液をサリベット（サリベットコットン、ザルスタット社製）を用いて採取した。被験者は、唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を２度漱いだ後、２分間サリベットの中綿を口腔内に含み、唾液を採取した。
２．従来法を利用したＨＨＶ−７の定量
まず、従来法を利用して唾液中のＨＨＶ−７濃度を定量した。
上記項目１．で採取した唾液４００μｌについて、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１（ＱＩＡＧＥＮ社）とＥＺ１  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＥＺ１  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従い、唾液中のＨＨＶ−７  ＤＮＡを精製した。
得られたＤＮＡを、定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、ＨＨＶ−７  Ｕ３７領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。ＰＣＲに使用した配列は、
プライマー：  ５’−ＣＧＧＡＡＧＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１４）；および
プライマー：  ５’−ＣＣＡＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＡＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１５）；ならびに
ＴａｑＭａｎ  プローブ：  ＦＡＭ  ５’−ＣＣＴＣＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号１６）；
であり、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（ロシュ社）を用いて、反応温度９５℃  １０分間  １回、９５℃  ５秒＋６０℃  ３１秒、を４５サイクルでリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、本試験は、ウイルス実験に極めて熟練した実験者によって行なわれた。
以上の結果、唾液１ｍｌ中のＨＨＶ−７ＤＮＡは、２２１７７４コピー／ｍｌであった。
３．ビオチン化ＷＧＡ、タマビジン磁性ビーズを利用したＨＨＶ−７の定量
上記項目１で採取した唾液２５０μｌに、２５０μｌの２倍濃度のＰＢＳ、ビオチン化ＷＧＡ（Ｊ−オイルミルズ社製）２０μｌを混和し、１５℃で１時間インキュベーションを行なった（転倒混和）。次に、実施例１の項目２と同様な方法で作製したタマビジン磁性ビーズ（ただし磁性ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅを使用）５０μｌを反応液に添加し、さらに１５℃で１時間インキュベーションした（転倒混和）。その後、反応液の入ったエッペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、ＰＢＳ  ５００μｌで３回洗浄した。ここに０．０９％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＴＥを４０μｌ加え、９５℃１５分間処理した後、マグネットスタンドにおいて、上清を回収し、うち５μｌを定量ＰＣＲに供試した。定量ＰＣＲでは、上記項目２と同様に、ＨＨＶ−７  Ｕ３７領域を、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。
その結果、唾液１ｍｌ中のＨＨＶ−７量は、２２３９３４コピーと測定された。この値は、上記２で従来法で測定した値（２２１７７４コピー／ｍｌ）とよく一致していた。この場合、ウイルスの回収率は９９％と考えることができる。
以上により、ビオチン化ＷＧＡを利用して、ＨＨＶ−７の定量を行なうことができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明は、体液中のＨＨＶ数について、より簡便で正確かつ効率的な計測を可能にする新規な定量方法および当該方法を行うためのキットを提供する。本発明の方法は、体液中のＨＨＶ数についての継続的な評価に耐えうる方法であることから、疲労の蓄積についての定量的な評価にも適用可能である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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