(57)【要約】  生物が本来持つ匂い物質に対する選択性および特異性を水晶振動子（４）やＳＡＷ素子に付与した匂い検知および識別のシステムを有し、気相状態のサンプルを測定できるケミカルセンサに関する。嗅覚受容体のアミノ酸配列の少なくとも一部分を選択し、一部分と相同性を有するように模倣してなるポリペプチドを用いた感応膜（２０）を含むケミカルセンサに関する。ケミカルセンサにおいて、感応膜（２０）を含む圧電振動体を備えていることが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅覚受容体のアミノ酸配列の少なくとも一部分を選択し、前記一部分と相同性を有するように模倣してなるポリペプチドを用いた感応膜（２０）を含むケミカルセンサ。
【請求項２】
前記感応膜（２０）を含む圧電振動体を備えた請求の範囲１に記載のケミカルセンサ。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、気相中のターゲット分子を吸着し、
前記ポリペプチドと前記ターゲット分子とが吸着したことを信号として感知する請求の範囲１に記載のケミカルセンサ。
【請求項４】
前記ターゲット分子は、前記ポリペプチドが模倣した前記アミノ酸配列を有する前記嗅覚受容体が特異的に反応する分子である請求の範囲３に記載のケミカルセンサ。
【請求項５】
前記ポリペプチドの配列は、
一の前記嗅覚受容体の前記アミノ酸配列と、別の嗅覚受容体のアミノ酸配列の対応予測部分とを比較して同一でない部分を選択してなる請求の範囲１に記載のケミカルセンサ。
【請求項６】
前記ポリペプチドの長さが、前記嗅覚受容体のアミノ酸配列における膜貫通部位としてのアルファヘリックス構造部位の長さ以下である請求の範囲１に記載のケミカルセンサ。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、前記嗅覚受容体の前記アミノ酸配列の中から一部分、またはアミノ酸配列が連続しない二部分以上を模倣した１種類以上からなる請求の範囲１に記載のケミカルセンサ。
【請求項８】
複数の前記ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への相対的な向きが生体における前記嗅覚受容体内における向きと同じになるように配向され、前記感応膜（２０）として用いられる請求の範囲１に記載のケミカルセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の匂い官能の機能を担う嗅覚受容体を模倣し、利用したケミカルセンサに関するものであり、さらに詳しくは、生活環境測定、化学工業、食品管理、医療検査において化学物質等の計測および識別等に使用されるケミカルセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
圧電振動子体は、その表面への物質の付着または吸着により、物理的振動特性に影響を受け、電気特性が変化する。その特性を利用して、圧電振動子である水晶振動子はドライプロセスにおける装置内の汚染モニターなどに適用されている。【０００３】
生物においての匂い物質の検知および識別は、嗅覚組織の嗅覚細胞がその機能を担っており、その嗅覚細胞は脂質二重膜で覆われていることから、水晶振動子の表面に脂質膜を塗付して、嗅覚細胞の匂い識別機能を模倣する試みが行なわれている（『匂いの応用工学』  栗岡豊  外池光雄編集  朝倉書店  ２１０ページ（非特許文献１）等参照）。【０００４】
その試みでは、水晶振動子の電極面に脂質などの膜を塗付して、脂質膜への物質の吸着による共振振動周波数の変化を指標とした物質の検知測定が行われている。さらに、多数の水晶振動子を用いて、塗付する脂質の種類と、吸着する物質の特性差を利用して、その吸着応答パターンから、吸着できる物質の種類を識別することが検討されている。【０００５】
特許第３０５７３２４号公報（特開平４−１２１６５１号公報（特許文献１））に開示されているように、脂質を用いた膜を塗付して水晶振動子を用いて、物質の吸着に伴う共振周波数変化だけでなく、インピーダンスの測定や膜の電位変化を同時に測定することにより、少ない数の水晶振動子で物質の識別が検討されている。【０００６】
しかし、脂質膜による匂い物質の選択性における特異性が低いため、水晶振動子から取り出す信号を複数としても、匂い物質の種類や濃度の条件組合せを識別することや、匂い物質が混合された場合の識別は難しい。また、水晶振動子から取り出す信号を複数とすれば、その信号取り出しのための電気回路も複雑になり、装置が高価になる。【０００７】
嗅覚細胞の脂質膜中には、嗅覚受容体とよばれる、匂い物質を結合するタンパク質の存在が明らかにされ、かつ、嗅覚受容体は、多種類存在することが明らかにされてきている（Ｂｕｃｋ，  Ｌ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ａｘｅｌ，  Ｒ．  （１９９１）．  Ｃｅｌｌ  ６５，  １７５−１８７．（非特許文献２）等参照）。それら多種類の嗅覚受容体のアミノ酸配列については、遺伝子情報からの解析研究により明らかにされており、ＥＭＢＬやＧｅｎｂａｎｋなどの遺伝子データベース内に収録されて、インターネット上で公開されている。【０００８】
遺伝子組換え技術を応用して、嗅覚受容体の遺伝子をマウスの細胞で操作する試みが行われ、ハーブの香りの主成分であるオイゲノールを吸着応答する嗅覚受容体が解明されている（Ｋｅｎｔａｒｏ  Ｋａｊｉｙａら、（２００１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１（１６）：６０１８−６０２５（非特許文献３）等参照）。【０００９】
嗅覚細胞での嗅覚受容体の立体構造は、そのアミノ酸配列の特徴から、膜を貫通する７本のアルファへリックスが寄り集まった構造であると推測されている（非特許文献２等参照）。嗅覚受容体は、嗅覚細胞の細胞脂質膜中に存在する、分子量が３万以上の高分子の膜タンパク質であるが、その一部は、細胞外の水中に露出し、一部は脂質膜内に存在し、一部は、細胞内の細胞液中に露出していると考えられ、その機能を人工的に再構成するためには、脂質膜中に存在させながら、一部分は、水中に露出させる必要がある。【００１０】
嗅覚受容体を人為的に造り出すために、組換え嗅覚受容体を培養細胞や組換え動物に発現させる試みが行なわれているが、発現する嗅覚受容体の量は多くなく、その利用はもとより、その機能の解析に用いることも難しい。特開平５−２３２００６号公報（特許文献２）に記載されるように、他に嗅覚受容体を利用する試みとしては、生物の嗅覚組織から嗅覚受容体を抽出回収して、水晶振動子に塗付し、物質への応答を測定する試みがある。【００１１】
しかし、抽出回収した嗅覚受容体は、嗅覚組織全体に発現している嗅覚受容体の全種類が少量ずつ混合されたものであり、また、嗅覚受容体以外の成分も混入する可能性があり、匂い識別のセンサーに用いることは難しい。また、抽出回収した嗅覚受容体は、その純度を規定することが難しく、水晶振動子に規定量塗布しても、嗅覚受容体１分子に匂い物質１分子が結合する量論的な応答は期待できない。【００１２】
ここで、匂い物質と嗅覚受容体との特異的な結合反応の他に、生物由来のタンパク質の特異的な結合反応として、抗原抗体反応が知られている。【００１３】
特許第３８９２３２５号公報（特開２００２−３５０４４５号公報（特許文献３））に開示されているように、液体中の対象物質を検知するため、対象物質を抗原とする抗体にアルファヘリックスのポリペプチドを結合して作製した複合体を、水晶振動子や表面弾性波（以下、ＳＡＷという）素子に単分子層として成膜することが検討されている。その単分子層は、モルフォ蝶翅の鱗粉の発色基本原理である多層薄膜干渉理論に基づく構造性発色を起こすことが期待されて成膜されている。【００１４】
特許文献３において、その複合体におけるアルファヘリックスのポリペプチドの役割は、抗体と水晶振動子またはＳＡＷ素子をつなぐことと、金などの面への単分子配向の結合を行なうことである。抗体は、水溶液中の抗原に対して結合反応を行う機能を有するが、気相中の物質には反応しない。また、１種類の抗体は、１種類の抗原を動物に免疫して作製できるものであるが、多様で多種類の匂い物質に対する抗体を作製することは、多大な労力を要し、実現することは困難である。
【特許文献１】特許第３０５７３２４号公報（特開平４−１２１６５１号公報）
【特許文献２】特開平５−２３２００６号公報
【特許文献３】特許第３８９２３２５号公報（特開２００２−３５０４４５号公報）
【非特許文献１】『匂いの応用工学』  栗岡豊  外池光雄編集  朝倉書店  ２１０ページ
【非特許文献２】Ｂｕｃｋ，  Ｌ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ａｘｅｌ，  Ｒ．  （１９９１）．  Ｃｅｌｌ  ６５，  １７５−１８７．
【非特許文献３】Ｋｅｎｔａｒｏ  Ｋａｊｉｙａら、（２００１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１（１６）：６０１８−６０２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ここで、生体内の受容体のアミノ酸配列の一部を模倣したポリペプチドを利用したケミカルセンサは見られなかった。また、匂い物質に対する嗅覚受容体の利用は実用化が難しかった。生物が持つ匂い物質に対する選択性および特異性の機能を担う嗅覚受容体の利用は、水晶振動子などのデバイス表面上での高分子の膜タンパク質としての再構成が難しいためである。そこで、上述したような脂質膜を塗付した水晶振動子や、ＳＡＷ素子を利用した匂い物質の識別方法が検討されている。しかし、脂質膜の匂い物質に対する選択性および特異性が低いので、水晶振動子からの信号の取り出しを複数化しても、脂質膜の成分の異なる多数のセンサ素子を用いる必要があった。【００１６】
また、上述の通り、匂い物質に対する嗅覚受容体の利用は実用化が難しく、従来のセンサにおいては、ウェットな状態のサンプルの測定のみしか適さないとの問題があった。【００１７】
以上の問題を鑑みて本発明は、生物が本来持つ匂い物質に対する選択性および特異性を水晶振動子やＳＡＷ素子に付与した匂い検知および識別のシステムを有し、液相状態のサンプルだけではなく、気相状態のサンプルを測定できるケミカルセンサを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の課題を解決するために、本発明では、たとえば水晶振動子やＳＡＷ素子などの圧電振動子に、嗅覚受容体の一部を模倣したポリペプチドを成膜して、生物が本来持つ匂い物質に対する選択性および特異性を付与できるようにした。【００１９】
つまり、本発明は、嗅覚受容体のアミノ酸配列の少なくとも一部分を選択し、一部分と相同性を有するように模倣してなるポリペプチドを用いた感応膜を含むケミカルセンサに関する。【００２０】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、感応膜を含む圧電振動体を備えていることが好ましい。【００２１】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、ポリペプチドは、気相中のターゲット分子と吸着し、ポリペプチドとターゲット分子とが吸着したことを信号として感知することが好ましい。【００２２】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、ターゲット分子は、ポリペプチドが模倣したアミノ酸配列を有する嗅覚受容体が特異的に反応する分子であることが好ましい。【００２３】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、ポリペプチドの配列は、一の嗅覚受容体のアミノ酸配列と、別の嗅覚受容体のアミノ酸配列の対応予測部分とを比較して同一でない部分を選択してなることが好ましい。【００２４】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、ポリペプチドの長さが、嗅覚受容体のアミノ酸配列における膜貫通部位としてのアルファヘリックス構造部位の長さ以下であることが好ましい。【００２５】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、ポリペプチドは、嗅覚受容体のアミノ酸配列の中から一部分、またはアミノ酸配列が連続しない二部分以上を模倣した１種類以上からなることが好ましい。【００２６】
また、本発明のケミカルセンサにおいて、複数のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への相対的な向きが生体における嗅覚受容体内における向きと同じになるように配向され、感応膜として用いられることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、生物が本来持つ匂い物質に対する選択性および特異性を水晶振動子やＳＡＷ素子に付与した匂い検知および識別のシステムを有し、液相状態のサンプルだけではなく、気相状態のサンプルを測定できるケミカルセンサを提供することができる。【００２８】
また、本発明にかかるケミカルセンサは、反応が可逆性を有するために、使い捨てることなく、連続使用をすることができ、ウェットな状態だけでなく、ドライの状態で気相センサとして使用することができるため、ケミカルセンサの使用の幅が広げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ポリペプチドが成膜された感応膜を含む圧電振動体（水晶振動子）を用いて、ターゲット分子への応答信号の測定を行なうことができるケミカルセンサを示す模式的な断面図である。
【図１Ｂ】図１Ａにおける圧電振動体を拡大した模式図である。
【図２】オイゲノールをガラス製の容器内に封入したときの実施例１および比較例１における水晶振動子の周波数変化を示す。
【図３】ベンゼンをガラス製の容器内に封入したときの実施例１および比較例１における水晶振動子の周波数変化を示す。
【図４】キシレンをガラス製の容器内に封入したときの実施例１および比較例１における水晶振動子の周波数変化を示す。
【図５】オイゲノールをガラス製の容器内に封入したときの実施例１および実施例２における水晶振動子の周波数変化を示す。
【図６】オイゲノールの濃度が０．１ｍｇ／Ｌで暴露されたときのＳＡＷ素子の信号（共振振動数）変化を示す。
【符号の説明】
【００３０】
１  ガラス製の容器、２  ブチルゴム栓、３  ガラス製容器の底板、４  水晶振動子、５  発振回路、６  電源コード、７  直流電源、８  同軸ケーブル、９  周波数カウンタ、２０  感応膜、２１  圧電振動板、２２  引き出し電極、２５  励振電極、３０  金属端子。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、嗅覚受容体のアミノ酸配列の少なくとも一部分を選択し、その一部分と相同性を有するように模倣してなるポリペプチドを用いた感応膜を含むケミカルセンサに関する。該ケミカルセンサは、たとえば、該ポリペプチドと該ポリペプチドに特異的に結合するターゲット分子とが結合した際に、これを信号として感知することができるものである。たとえば、本発明におけるケミカルセンサの形態としては、該ポリペプチドを含みもしくは該ポリペプチドから形成された感応膜を、圧電振動体などに成膜してなるセンサを挙げることができる。【００３２】
ここで、本発明におけるケミカルセンサは、ポリペプチドを用いた感応膜を含む。該感応膜は、ポリペプチドから形成される膜であり、該ポリペプチド以外の材料を適宜含むものであってもよい。【００３３】
本発明におけるケミカルセンサにおいて備える該ポリペプチドの配列については、該嗅覚受容体の構造およびアミノ酸配列に基づいて選択される。なお、本発明におけるアミノ酸配列の相同性は、解析ソフトを用いて測定されるものであり、解析ソフトには、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｌ，  Ｊ，Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を用いることができる。なお、タンパク質において一般的に３０％程度の配列の一致が見られた場合、相同性を有すると言われている。【００３４】
嗅覚受容体のアミノ酸配列情報については、インターネット上で公開されている遺伝子データベースから該当する遺伝子情報を得ることができる。遺伝子データベースとしては、欧州分子生物学研究所が運営管理するＥＭＢＬデータベースや米国生物工学情報センターが提供するＧｅｎＢａｎｋデータベースを利用することができる。また、生物体の嗅覚組織から回収したｍＲＮＡを基に遺伝子ライブラリを作製し、そのライブラリの中の遺伝子について、遺伝子配列解析装置などを用いて解析した結果を用いてもよい。【００３５】
以下、まず嗅覚受容体の構造について説明し、次に、本発明において選択されるポリペプチドについて説明する。そして、次に該ポリペプチドを有するケミカルセンサの好ましい一実施形態について詳述する。【００３６】
＜嗅覚受容体の構造＞
Ｎ末端からＣ末端までアミノ酸が連結したタンパク質である嗅覚受容体は、嗅覚細胞において、膜貫通部位としてのアルファヘリックス構造部位を７つ保持している構造であると推定されている。以下、本明細書において、単にアルファヘリックス構造部位というときは、膜貫通部位であるものとする。【００３７】
該嗅覚受容体の構造によると、嗅覚受容体のＮ末端は、嗅覚細胞（以下、単に細胞ともいう）の細胞膜の細胞外の水に露出しており、嗅覚受容体のＮ末端から数えて、第１番目のアルファへリックス構造部位が細胞膜中に存在し、該第１番目アルファヘリックス構造部位のＣ末端側が、嗅覚細胞の細胞膜の細胞内の細胞質液に露出している。嗅覚受容体のＮ末端から数えて、第２番目のアルファヘリックス構造部位が、細胞内から、細胞膜中に存在し、第２番目のアルファヘリックス構造部位のＣ末端側が嗅覚細胞の細胞外の水に露出している。【００３８】
嗅覚受容体のＮ末端から数えて、第３番目のアルファヘリックス構造部位は、細胞外から、細胞膜中に存在し、第３番目のアルファヘリックス構造部位のＣ末端側が嗅覚細胞の細胞内の細胞質液に露出している。第４番目のアルファヘリックス構造部位は、そのＮ末端側が細胞内に位置し、細胞の細胞膜を貫通して、Ｃ末端側が細胞外に露出し、第５番目のアルファヘリックス構造部位は、そのＮ末端側が細胞外に位置し、細胞の細胞膜を貫通して、Ｃ末端側が細胞内に露出し、第６番目のアルファヘリックス構造部位は、そのＮ末端側が細胞内に位置し、細胞の細胞膜を貫通して、Ｃ末端側が細胞外に露出し、第７番目アルファヘリックス構造部位は、そのＮ末端側が細胞外に位置し、細胞の細胞膜を貫通して、Ｃ末端側が細胞内に露出して、嗅覚受容体のＣ末端は、細胞内に存在する。【００３９】
これら７つのアルファヘリックス構造部位は、嗅覚細胞の細胞膜平面上で寄り集まり、受容体の機能を果たす。【００４０】
これらのアルファヘリックス構造部位において、Ｎ末端側からＣ末端側へのアルファヘリックス構造部位の方向についてみると、嗅覚受容体のＮ末端から、数えての順番で並ぶ２つのアルファヘリックス構造部位は、細胞膜の貫通する方向が逆となる。【００４１】
＜ポリペプチドおよび感応膜＞
本発明におけるポリペプチドは、該嗅覚受容体におけるアミノ酸配列の一部分、より好ましくは、アルファヘリックス構造部位のアミノ酸配列を有するものである。上述の嗅覚受容体のアミノ酸配列を読み取り、本発明のケミカルセンサが有するポリペプチドのアミノ酸配列として選択、利用することができる。該ポリペプチドは、人工的に化学合成して、嗅覚受容体を模倣した分子として、生物が本来持つターゲット分子に対する選択性および特異性を有するため、該ポリペプチドを有するケミカルセンサは、ターゲット分子に対する選択性および特異性が付与される。なお、該化学合成は、公知の方法を適宜採用することができる。【００４２】
ポリペプチドは、嗅覚受容体のアミノ酸配列の中から一部分、またはアミノ酸配列が連続しない二部分以上を模倣した１種類以上からなることが好ましい。つまり、該ポリペプチドは、アルファヘリックス構造部位のアミノ酸配列を持たせることが好ましく、７部分からなるアルファヘリックス構造部位のいずれのアミノ酸配列を保持させて組み合わせてもよい。【００４３】
そして、該ポリペプチドは、気相中のターゲット分子と吸着する。ここで、ターゲット分子とは、たとえば匂い分子であり、該ポリペプチドを有するケミカルセンサで検知したい分子とすることができる。【００４４】
また、該ターゲット分子は、該ポリペプチドが模倣したアミノ酸配列を有する嗅覚受容体が特異的に反応する分子であることが好ましい。ターゲット分子の設定が容易となり、結果として、ケミカルセンサの設計が容易となるためである。【００４５】
また、ポリペプチドの配列は、一の嗅覚受容体のアミノ酸配列と、これとは別の嗅覚受容体のアミノ酸配列との対応予測部分とを比較して同一でない配列を選択することができる。つまり、複数の嗅覚受容体のアミノ酸配列を横並びで比較して相同性を見たうえで、同じアミノ酸配列が並んでいない部分、あるいは、配列中に同じアミノ酸配列あるいは同じアミノ酸が少ない部分、つまり、アミノ酸配列どうしの相同性が低い部分を選択して、本発明のポリペプチドの配列を選択することができる。なお、このときアミノ酸配列どうしの相同性が低い部分とは、１塩基以上異なるアミノ酸配列の部分をいうものとする。【００４６】
また、ポリペプチドの長さが、嗅覚受容体のアミノ酸配列におけるアルファヘリックス構造部位の長さ以下であることが好ましい。嗅覚受容体における細胞膜の厚み（約５ｎｍ）を膜貫通するアルファヘリックス構造部位はアミノ酸３．６残基で１回転の螺旋形状である。そして、アミノ酸は１個分で、長さ方向に０．１５ｎｍであるため、該アルファヘリックス構造部位は、３４個程度のアミノ酸で構成される。したがって、本発明におけるポリペプチドは、３４残基以下のアミノ酸鎖の長さのポリペプチドであり、４残基以上のアミノ酸鎖の長さのポリペプチドであることが好ましい。３４残基のアミノ酸鎖である場合には、該アルファへリックス構造部位の全体を構築することが可能である。また、該ポリペプチドは、４残基以上である場合には、一定の構造を保ち、かつ、嗅覚受容体においてもともと水環境ではない部分（脂質）に存在する該アルファへリックス構造部位に由来するために、気相センサに用いることができ、ドライな状態で上記ターゲット分子と反応することができるからである。【００４７】
また、複数のポリペプチド、特に複数種のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への相対的な向きが生体における嗅覚受容体内における向きと同じになるように感応膜に配向された設定されていることが好ましい。具体的には、嗅覚受容体のＮ末端から数えて、第１番目のアルファヘリックス構造部位、および、第３番目のアルファヘリックス構造部位、および、第５番目のアルファヘリックス構造部位、および、第７番目のアルファヘリックス構造部位の奇数番目のアルファヘリックス構造部位由来のアミノ酸配列を持つポリペプチドは、互いに、Ｎ末端側からＣ末端側の方向が同じになるように配向するように設定される。そして、同様に、嗅覚受容体のＮ末端から数えて、第２番目のアルファヘリックス構造部位、および、第４番目のアルファヘリックス構造部位、および、第６番目のアルファヘリックス構造部位の偶数番目のアルファヘリックス構造部位由来のアミノ酸配列を持つポリペプチドは、互いに、Ｎ末端側からＣ末端側の方向が同じになるように配向する。【００４８】
そして、さらに、それら奇数番目のアミノ酸配列を持つポリペプチドと、それら偶数番目のアミノ酸配列を持つポリペプチドは、互いに、Ｎ末端側からＣ末端側の方向が逆になるように配向することが望ましい。【００４９】
また、嗅覚受容体は、アルファヘリックス構造部位が、細胞膜平面上で寄り集まって機能すると考えられ、本発明では、それを模倣するため、ポリペプチド間のすき間を作らないように、各ポリペプチドを設置することが好ましい。【００５０】
＜実施形態１＞
以下、本願の図面において、同一の符号は、同一部分または相当部分を表わすものとする。また、図面における長さ、大きさ、幅などの寸法関係は、図面の明瞭化と簡略化のために適宜に変更されており、実際の寸法を表してはいない。【００５１】
図１Ａは、ポリペプチドが成膜された感応膜を含む圧電振動体（水晶振動子）を用いて、ターゲット分子への応答信号の測定を行なうことができるケミカルセンサを示す模式的な断面図である。図１Ｂは、図１Ａにおける圧電振動体を拡大した模式図である。【００５２】
以下、図１Ａおよび図１Ｂに基づいて説明する。
ガラス製の容器１は、ブチルゴム栓２ができる筒の部分を持ち、ガラス製容器の底板３と組合せて、ガラス製の容器１内を密封できる。ガラス製の容器１内には、圧電振動体としての水晶振動子４と、その水晶振動子４を発振させるための発振回路５とが挿入されている。そして、発振回路５には、直流電源７から、ブチルゴム栓２を貫通する電源コード６を通じて、発振回路５に電力を供給される。また、水晶振動子４の共振周波数信号を、発振回路５から、ブチルゴム栓２を貫通する同軸ケーブル８を通して、周波数カウンタ９に伝達することで水晶振動子４の共振周波数を計測できる。発振回路５は、ポリペプチドを用いて成膜した水晶振動子４と、ベータメルカプトエタノールを用いて成膜した水晶振動子４とを同時に発振させることができる。【００５３】
水晶振動子４は、圧電振動板２１の両表面に設けられた励振電極２５上にポリペプチドを成膜することで形成された感応膜２０を備える。そして、励振電極２５は引き出し電極２２および金属端子３０によって電気的に発振回路５と接続されている。【００５４】
本実施形態では、嗅覚受容体の細胞膜内でのアルファヘリックス構造部位のＮ末端側からＣ末端側への方向性を模倣したポリペプチドを構成して、水晶振動子やＳＡＷ素子に対して、生物が本来持つ匂い物質（ターゲット分子）に対する選択性および特異性を付与できる。【００５５】
本実施形態におけるポリペプチドは、上述のものを用いることができる。
ここで、チオールを持つアルカン化合物は、金と容易に共有結合を形成し、金の表面に単分子膜を形成することが知られている。本実施形態においても、金とチオールの反応を利用してもよく、チオールの化合物とポリペプチドをつなぐ手法を利用して、ポリペプチドを水晶振動子やＳＡＷ素子の電極面に成膜する方法として用いてもよい。【００５６】
チオールとポリペプチドとの反応は、水晶振動子やＳＡＷ素子の電極面を金とすることで、容易に操作できるが、金以外の銀などの貴金属も条件を整えて利用できる。【００５７】
チオールの化合物とポリペプチドとをつなぐ方法としては、８―アミノ−１−オクタンチオール（８―Ａｍｉｎｏ―１―ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）などのチオール基とアミノ基を同一分子内に持つ化合物を用いて、まず、電極表面の金にチオールを反応させ単分子膜形成をさせて、電極表面にアミノ基を導入させて、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド  エステル（Ｎ―ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）などのアミノ基と反応し共有結合を形成する反応部分を２つ持つジスクシニミジルスベレート（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＤＳＳ））などの化合物を用いて、電極表面上のアミノ基と、アミノ基を持つポリペプチドとを連結させてもよい。【００５８】
あるいは、成膜に用いるポリペプチドについては、嗅覚受容体の膜貫通のアルファヘリックス部分のアミノ酸配列を持つポリペプチドに対して、システインなどのチオール基を持つアミノ酸をＮ末端またはＣ末端に付けたポリペプチドを作製し、チオール基とアミノ基を持つ化合物を用いて、金の電極表面にチオールを反応させ、電極表面にアミノ基を導入させて、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド  エステルなどのアミノ基と反応し共有結合を形成する反応部分と、マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）などのチオール基と反応し共有結合を形成する反応部分を持つサルフォスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイジドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ―４―（Ｎ―ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ―１―ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などの化合物を用いて、電極表面上のアミノ基と、システインなどのチオール基を持つアミノ酸を末端に付けたポリペプチドとを連結させてもよいが、これらの方法に限定されるものではない。【００５９】
嗅覚受容体を模倣し合成したポリペプチドを用いて、選択性および特異性を付与できる膜を、水晶振動子やＳＡＷ素子の電極表面に形成させるために、金と硫黄の反応を利用する方法でなくても、水晶振動子やＳＡＷ素子の電極表面に、アミノ基やチオール基などの官能基を導入し、その官能基とポリペプチドを結合させる他の共有結合の作成方法であるアルキル化法やジアゾ法、チオール・ジスルフィド形成反応やシッフ塩基形成法やキレート結合法やトシルクロリド法やビオチンアビジンの結合形成など当該分野の当業者が容易になしうる方法や公知の方法、さらにはそれらを適宜選択して組み合わせた方法が適用できる。【００６０】
嗅覚受容体は、膜貫通のアルファヘリックスが、細胞膜平面上で寄り集まって機能すると考えられ、本発明では、それを模倣するため、ポリペプチド間のすき間を作らないように、チオール基とアミノ基を持つ化合物のみを水晶振動子やＳＡＷ素子の金の電極表面に反応させることができる。【００６１】
また、本発明では、電極表面でのポリペプチドの間隔を変える操作として、電極表面への単分子膜形成反応操作において、８―アミノ−１−オクタンチオールなどのチオール基とアミノ基を持つ化合物に、ベータメルカプトエタノール（ｂｅｔａ―ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）などのチオール基と水酸基を持つ化合物、または、官能基としてチオール基のみを持つオクタンチオール（ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）などの化合物を混合して反応させることができ、電極表面での応答性を変えることができる。【００６２】
以上説明したように、本実施形態によれば、生物の持つ嗅覚の特性と担う嗅覚受容体を模倣し、圧電体に成膜することより、生物の持つ嗅覚を模倣した匂い物質のケミカルセンサを構築することができる。該ケミカルセンサにより、生活臭、香料、悪臭物質、芳香剤、医薬品、食品成分等の幅広い標的物質を検出することができ、かつ、それらの機能を電子回路や電子機器などに容易に組み込むことができる。【００６３】
そして、従来技術の課題であった匂い物質の識別を、数多くない素子で行なうことができ、また、簡易な発振回路などで駆動できて、複数の電気特性を計測する回路構成を必要としない。【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例］
＜実施例１＞
本実施例において利用する嗅覚受容体のアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ａ）をコードする遺伝子として、ＥＭＢＬデータベースからファイルＩＤ番号ＡＢ０６１２２８の情報を得た。同時に、ＥＭＢＬデータベースから該嗅覚受容体とは別の嗅覚受容体のアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ｂ）をコードする遺伝子として、ファイルＩＤ番号ＡＹ３１７３５５を得た。そして、ファイルＩＤ番号ＡＢ０６１２２８とファイルＩＤ番号ＡＹ３１７３５５との配列比較を行なった。なお、ファイルＩＤ番号ＡＢ０６１２２８にコードされたアミノ酸配列を持つ嗅覚受容体は、ハーブの一種であるクミンの香りの主成分であるオイゲノールに反応することが確認されている。【００６５】
本実施例に用いられるポリペプチドの配列は、嗅覚受容体のアミノ酸配列Ａと、これとは別の嗅覚受容体のアミノ酸配列Ｂとの対応予測部分とを比較して同一でない配列を選択することとした。つまり、複数の嗅覚受容体のアミノ酸配列を横並びで比較して相同性を見たうえで、同じアミノ酸配列が並んでいない部分、あるいは、配列中に同じアミノ酸配列あるいは同じアミノ酸が少ない部分、つまり、アミノ酸配列どうしの相同性が低い部分（このとき相同性が低い部分とは、１塩基以上異なるアミノ酸配列部分をしめすものとする）を選択して、本発明のポリペプチドの配列を選択することとした。【００６６】
ここで、アミノ酸配列ＡのＮ末端から２００残基目から１５残基のアミノ酸配列である「ＬＦＶＦＡＴＦＮＥＩＳＴＬＬＩ（配列番号３）」は、アミノ酸配列ＢのＮ末端から２００残基目から１５残基のアミノ酸配列である「ＭＧＶＡＮＶＩＦＬＧＶＰＶＬＦ（配列番号４）」とは、１５残基のアミノ酸配列のうち２残基が同じだけで、１３残基異なっていることを確認した。【００６７】
さらに、アミノ酸配列ＡのＮ末端から２４９残基目から１２残基のアミノ酸配列である「ＩＴＩＦＨＧＴＩＬＦＬＹ（配列番号５）」は、アミノ酸配列ＢのＮ末端から２４９残基目から１２残基のアミノ酸配列である「ＶＩＩＦＹＧＴＩＬＦＭＹ（配列番号６）」とは、１２残基のアミノ酸配列のうち８残基が同じで、４残基異なっていることを確認した。【００６８】
そして、ファイルＩＤ番号ＡＢ０６１２２８にコードされたアミノ酸配列Ａにおいて、推測されている嗅覚受容体の構造から、膜貫通部位であるアルファヘリックス構造部位を予測した。そして、Ｎ末端から数えて２００番目のアミノ酸がある付近のアミノ配列部分が、Ｎ末端から５番目の膜貫通部位に該当することを予測した。また、Ｎ末端から数えて２５０番目のアミノ酸がある付近のアミノ酸配列部分が、Ｎ末端から６番目の膜貫通部位に該当することを予測した。また、ファイルＩＤ番号ＡＹ３１７３５５にコードされたアミノ酸配列Ｂにおいても同様にＮ末端から数えて２００番目のアミノ酸がある付近のアミノ配列部分が、Ｎ末端から５番目の膜貫通部位に該当することを予測した。また、Ｎ末端から数えて２５０番目のアミノ酸がある付近のアミノ酸配列部分が、Ｎ末端から６番目の膜貫通部位に該当することを予測した。【００６９】
以上から、アミノ酸配列ＡのＮ末端から２００残基目から１５残基のアミノ酸配列である「ＬＦＶＦＡＴＦＮＥＩＳＴＬＬＩ（配列番号３）」からなるポリペプチドと、アミノ酸配列ＡのＮ末端から２４９残基目から１２残基のアミノ酸配列である「ＩＴＩＦＨＧＴＩＬＦＬＹ（配列番号５）」からなるポリペプチドとを、水晶振動子に成膜するポリペプチドとして選択した。【００７０】
また、成膜されたポリペプチドの配向が嗅覚受容体内と同じとなるように、アミノ酸配列ＡのＮ末端から２００残基目から１５残基のアミノ酸配列である「ＬＦＶＦＡＴＦＮＥＩＳＴＬＬＩ（配列番号３）」からなるポリペプチドは、Ｃ末端側を電極面側に配向させるため、そのＣ末端にシステイン残基を加えて、配列を「ＬＦＶＦＡＴＦＮＥＩＳＴＬＬＩＣ（配列番号１）」（以下、ポリペプチド１）として、ペプチド固相合成法（Ｆｍｏｃ合成法）を用いて、ポリペプチド合成をした。一方、アミノ酸配列ＡのＮ末端から２４９残基目から１２残基のアミノ酸配列である「ＩＴＩＦＨＧＴＩＬＦＬＹ（配列番号５）」からなるポリペプチドは、Ｎ末端側を電極面側とするために、そのＮ末端にシステイン残基を加えて、配列を「ＣＩＴＩＦＨＧＴＩＬＦＬＹ（配列番号２）」（以下、ポリペプチド２）として、同様にポリペプチド合成をした。【００７１】
ポリペプチド１：ＬＦＶＦＡＴＦＮＥＩＳＴＬＬＩＣ（配列番号１）
ポリペプチド２：ＣＩＴＩＦＨＧＴＩＬＦＬＹ（配列番号２）
そして、２４ＭＨｚの共振周波数の特性をもつ水晶振動子の金電極面にプラズマ処理を施し、金電極面に付着した有機物や硫黄物などを除去した。また、８―アミノ−１−オクタンチオールを濃度１ｍＭとなるようにエタノールに溶解したアルカンチオール溶液を作製した。そして、速やかに、プラズマ処理後の水晶振動子を該アルカンチオール溶液に浸漬し、そのまま３０分間室温で保持した。【００７２】
その後、該アルカンチオール溶液を水晶振動子から除去し、エタノールにより、３度、水晶振動子の電極面の洗浄を実施した。さらに、その洗浄後、水晶振動子からエタノールを除去し、滅菌蒸留水により３度、該電極面を洗浄した。【００７３】
次に、リン酸と生理食塩水成分とを含む緩衝液であるＰＢＳ（０．１Ｍ−ＮａＰＯ4、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に対して、サルフォスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイジドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートが５０μＭとなるように溶解させた溶液を調製した。その後、該溶液に水晶振動子を浸漬し、そのまま室温で３時間保持した。その後、反応溶液を水晶振動子から除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。【００７４】
ここで、合成したポリペプチド１およびポリペプチド２を、ジメチルスルホキシドに溶解し、還元剤であるトリス［２−カルボキシエチル］フォスフィン（Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）でシステインを還元し、ＰＢＳを用いて、それぞれのポリペプチドの濃度が１００μＭとなるよう調製したポリペプチド溶液を調製した。サルフォスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイジドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを反応させて、洗浄した水晶振動子を、ポリペプチド溶液に浸漬して、室温で、６時間静置した。【００７５】
その後、ポリペプチド溶液を除去して、該水晶振動子をＰＢＳで３回洗浄し、続いて、エタノールで３回洗浄した。エタノールを除去後、滅菌蒸留水で３回洗浄し、室温で風乾し、ポリペプチド１およびポリペプチド２で成膜された水晶振動子とした。【００７６】
＜比較例１＞
プラズマ処理した水晶振動子を、８―アミノ−１−オクタンチオールの代わりにベータメルカプトエタノールを濃度１ｍＭとなるようにエタノールに溶解した溶液に３０分間、室温で浸漬し、エタノールにより、３度、水晶振動子の電極面の洗浄、滅菌蒸留水により３度、電極面を洗浄したものを対照の水晶振動子として実験に用いた。【００７７】
≪検討方法≫
実施例１における水晶振動子および比較例１における水晶振動子は、それぞれインバーターＩＣを用いた発振回路に接続され、周波数カウンターを用いて、それぞれの発振周波数を測定した。詳しい該測定方法について、以下、図１Ａ、図１Ｂに基づいて説明する。【００７８】
ガラス製の容器１は、ブチルゴム栓２ができる筒の部分を持ち、ガラス製容器の底板３と組合せて、ガラス製の容器１内を密封できるようにした。ガラス製の容器１内には、圧電振動体としての水晶振動子４と、その水晶振動子４を発振させるための発振回路５とを挿入した。そして、発振回路５には、直流電源７から、ブチルゴム栓２を貫通する電源コード６を通じて、発振回路５に電力を供給した。また、水晶振動子４の共振周波数信号を、発振回路５から、ブチルゴム栓２を貫通する同軸ケーブル８を通して、周波数カウンタ９に伝達することで水晶振動子４の共振周波数を計測した。【００７９】
なお、水晶振動子４は、圧電振動版２１の両表面に設けられた金電極からなる励振電極２５上にポリペプチドを成膜されて感応膜２０が形成されている状態である。【００８０】
ブチルゴム栓２を通じて、注射筒と注射針を用いて、匂い物質をガラス製の容器１内に挿入した。そして、ガラス製の容器１内に実施例１における水晶振動子を接続して、発振回路５に電力を供給して、水晶振動子４を発振させた。【００８１】
次に、オイゲノールをガラス製の容器１内に、容器内の濃度が１ｍｇ／Ｌとなるように封入し、その封入によって変化した水晶振動子の共振周波数を周波数カウンタで計測した。オイゲノールは芳香環構造を分子内に持つ化合物である。【００８２】
≪評価結果１≫
図２は、オイゲノールをガラス製の容器１内に封入したときの水晶振動子の周波数変化を示す。横軸が封入してからの時間（応答時間）を示し、縦軸が共振周波数（共振振動数変化）を示す。また、白抜きのドットが比較例１による結果であり、黒塗りのドットが実施例１による結果である。【００８３】
オイゲノールの封入により、実施例１における水晶振動子の共振周波数は、応答時間に伴って徐々に低くなっていることが分かった。これは、実施例１における水晶振動子の電極面に、オイゲノールが吸着反応したことを示している。一方、比較例１における水晶振動子の共振周波数は、オイゲノールの封入により変化しなかった。これは、比較例１における水晶振動子の電極面には、オイゲノールは吸着反応しなかったことを示している。【００８４】
≪評価結果２≫
ここで、オイゲノールは芳香環構造を分子内に持つ化合物であるが、ベンゼンやキシレンも芳香環構造の化合物であり、該オイゲノールと化学構造として類似性がある。そこで、このベンゼンおよびキシレンをガラス製の容器１内に、容器内の濃度が１ｍｇ／Ｌとなるように封入し、その封入によって変化した水晶振動子の共振周波数を周波数カウンタで計測した。【００８５】
図３は、ベンゼンをガラス製の容器１内に封入したときの水晶振動子の周波数変化を示す。横軸が封入してからの時間（応答時間）を示し、縦軸が共振周波数（共振振動数変化）を示す。また、白抜きのドットが比較例１による結果であり、黒塗りのドットが実施例１による結果である。【００８６】
図３に示されるように、実施例１および比較例１における水晶振動子の共振周波数の双方が、ベンゼンの封入による変化を示さなかった。これは、実施例１および比較例１における水晶振動子の電極面には、ベンゼンは吸着反応しなかったことを示している。【００８７】
図４は、キシレンをガラス製の容器１内に封入したときの水晶振動子の周波数変化を示す。横軸が封入してからの時間（応答時間）を示し、縦軸が共振周波数（共振振動数変化）を示す。また、白抜きのドットが比較例１による結果であり、黒塗りのドットが実施例１による結果である。【００８８】
図４に示されるように、実施例１および比較例１における水晶振動子の共振周波数の双方が、キシレンの封入による変化を示さなかった。これは、実施例１および比較例１における水晶振動子の電極面には、ベンゼンは吸着反応しなかったことを示している。【００８９】
以上の図２〜図４の結果から、実施例１における水晶振動子は、オイゲノールに対して吸着反応を起こし、オイゲノールと類似の芳香環構造を持つベンゼンおよびキシレンには、応答しないことが示された。【００９０】
つまり、オイゲノールに対する嗅覚受容体のアミノ酸配列から導いて、その一部である膜貫通部位を模倣して合成したポリペプチドを成膜した水晶振動子は、オイゲノールのみへの吸着応答ができ、類似のベンゼンやキシレンとオイゲノールとを識別できることが示された。【００９１】
＜実施例２＞
実施例１におけるプラズマ処理後の水晶振動子を該アルカンチオール溶液に浸漬する代わりに、プラズマ処理後の水晶振動子を別の溶液に浸漬し、そのまま３０分間室温で保持した。該別の溶液は、８―アミノ−１−オクタンチオールにベータメルカプトエタノールを等モル量混合し、濃度がそれぞれ０．５ｍＭとなるように溶液を調製したものとした。【００９２】
上記以外の工程においては、実施例１と同様に行なった。そして、実施例２における水晶振動子を作製した。【００９３】
実施例１における水晶振動子および実施例２における水晶振動子についてその両者のオイゲノールへの応答差を測定し、評価した。該測定は、上述の方法と同様にして行なった。【００９４】
≪評価結果３≫
図５は、オイゲノールをガラス製の容器１内に封入したときの水晶振動子の周波数変化を示す。横軸が封入してからの時間（応答時間）を示し、縦軸が共振周波数（共振振動数変化）を示す。また、白抜きのドットが実施例２による結果であり、黒塗りのドットが実施例１による結果である。【００９５】
オイゲノールの封入により、実施例２における水晶振動子の共振周波数は、応答時間に伴って徐々に低くなっていることが分かった。しかし、実施例１における水晶振動子の共振周波数の変化と比較して、変化が緩やかであった。これにより、実施例１における水晶振動子と実施例２における水晶振動子は、応答性が異なっていて、金電極に対するアルカンチオールの成分条件により、水晶振動子の応答性を変えることができることが示された。【００９６】
＜実施例３＞
実施例１における水晶振動子に対するポリペプチド１およびポリペプチド２の成膜方法を利用して、ＳＡＷ素子に対して同様にポリペプチド１およびポリペプチド２を成膜した。そして、成膜後のＳＡＷ素子についてオイゲノールへの応答を測定、確認した。【００９７】
ＳＡＷ素子の発振周波数は、発振回路での発振周波数を分周した信号を周波数カウンタで計測した。【００９８】
≪評価結果４≫
図６は、オイゲノールの濃度が０．１ｍｇ／Ｌで暴露されたときのＳＡＷ素子の信号（共振振動数）変化である。横軸が封入してからの時間（応答時間）を示し、縦軸が共振周波数（共振振動数変化）を示す。【００９９】
オイゲノールに暴露されると、電極面での吸着反応が起きて、周波数が低下することがわかった。【０１００】
以上より、オイゲノールに対する嗅覚受容体のアミノ酸配列から導いて、その一部である膜貫通部位を模倣して合成したポリペプチドを用い、成膜したＳＡＷ素子は、オイゲノールへの吸着応答ができることが示された。【０１０１】
また、圧電振動子は水晶振動子でなくても、表面弾性波の素子でも、ポリペプチドを成膜した素子が、匂い物質に応答することが示された。【０１０２】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により、生物の嗅覚を模倣したケミカルセンサを電子素子部品として製造することができ、テレビや調理器具などの家電製品や携帯電話などの通信機器などに、嗅覚感覚を付与することができ、新機能の電化製品群が開発され製品化されることが期待される。【０１０４】
本発明により、ロボットなどに応用して、生物の嗅覚類似の機能を付与した、人間の感覚に近いロボットの製品化が期待される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2009096304000001.app
【国際調査報告】
2009096304.tif 000010
2009096304.tif 000011
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