(57)【要約】  下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖プライマー。  一般式（Ｉ）；Ｌａｃ−Ｏ−Ｃｋ：ｍ（ｎ）  （式（Ｉ）において、前記Ｃｋはアルケニル鎖を表わし、ｍは二重結合の総数を表わし、ｎは前記アルケニル鎖中の二重結合の位置を表わす。ここで、ｋは８〜１４の整数であることが好ましく、１２又は１３であることが特に好ましい。また、ｍが１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−２を満たす一つの整数であり、ｍが２≦ｍ≦ｋ−１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−１を満たす複数の整数である。）  本発明の糖鎖プライマーを用いて合成された糖鎖は、糖鎖アレイの製造や、糖ペプチドの合成等に用いることができる。
2009078462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の二重結合を含む、アルケニル鎖を有する、下記一般式(Ｉ)で表される糖鎖プライマー。
式（Ｉ）；Ｌａｃ−Ｏ−Ｃｋ：ｍ（ｎ）
（式（Ｉ）において、Ｃｋはｋ個のＣを有するアルケニル鎖を表わし、ｍは二重結合の総数を表わし、ｎは前記アルケニル鎖中の二重結合の位置を表わす。ここで、ｋは８〜１４の整数であり、ｍが１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−２を満たす一つの整数であり、ｍが２≦ｍ≦ｋ−１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−１を満たす複数の整数である。）
【請求項２】
糖鎖を合成する方法であって、
糖鎖合成細胞に請求項１に記載の糖鎖プライマーを投与して、
前記細胞と前記糖鎖プライマーとを反応させること、
を特徴とする糖鎖合成方法。
【請求項３】
糖鎖を酸化する方法であって、
請求項２に記載の方法を用いて糖鎖を合成する工程と、
前記工程で合成した糖鎖とオゾンとを反応させる工程と、
を包含することを特徴とする糖鎖酸化方法。
【請求項４】
糖鎖アレイを製造する方法であって、
請求項３に記載の方法を用いて糖鎖を酸化する工程と、
前記工程で酸化した糖鎖と還元剤とを反応させる工程と、
前記工程で還元した糖鎖を基板へ付着させる工程と、
を包含することを特徴とする糖鎖アレイ製造方法。
【請求項５】
糖ペプチドを合成する方法であって、
請求項３に記載の方法を用いて糖鎖を酸化する工程と、
前記工程で酸化した糖鎖と還元剤とを反応させる工程と、
前記工程で還元した糖鎖とペプチドとを反応させる工程と、
を包含することを特徴とする糖ペプチド合成方法。
【請求項６】
請求項４の方法によって製造された糖鎖アレイ。
【請求項７】
請求項５の方法によって合成された糖ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規糖鎖プライマー及びそのプライマーの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、個体の発生、細胞分化、細胞増殖、アポトーシス、組織形成、免疫、血液型抗原、毒素やウイルスの受容体、癌化、疾病、細胞機能の発現、又は細胞間相互作用等の様々な場面において、シグナルやマーカー分子として重要な役目を果たしているため、バイオテクノロジーや医薬品開発の分野において、糖鎖の需要が高まっている。特に、糖鎖は、医薬品、診断薬、糖鎖チップ等への応用が見込まれている。【０００３】
近年、細胞の機能を利用して糖鎖を作ることができる糖鎖プライマー（Saccharide Primer）が開発された（特開2000−247992号公報及び特開2005−117918号公報）。一般に、糖鎖プライマーは、糖−アルキル、糖−アミド−アルキルまたは糖−アミノ酸−アルキルという構造を有するが、アルキル基が修飾された糖鎖プライマーが開発されており、例えば、遊離末端に官能基としてアジド基が導入された糖鎖プライマー（特開2000−247992号公報）や、遊離末端に重合性のビニル基が導入された糖鎖プライマー（Hatanaka, K., Kobayashi, M., and Kasuya, M. C., Seisan Kenkyu 56, 234-238 (2004)）や、アルキル基内にアジド基を有する糖鎖プライマー（Kasuya, M. C. Z., Kobatashi, M., Watanabe, Y., Sato, T., and Hatanaka, K., Chemistry & Biodiversity 2, 1063-1078 (2005)）等が記載されている。【０００４】
しかしながら、これらの糖鎖プライマーは、糖鎖と官能基との間に長いアルキル鎖を有するため、高い疎水性を示していた。そのため、これらの糖鎖プライマーを用いて合成された糖鎖は、他の物質と非特異的に結合し、実験等の用途に用いることが困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、細胞内で効率よく糖鎖を合成させることができ、かつ、合成後の糖鎖を簡単に様々な用途に用いることができる、糖鎖プライマーを開発する必要があった。【０００６】
本発明は、その条件を満たすような新規糖鎖プライマー及びそのプライマーの使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施例に示す通り、本発明者らは、下記化学式（ＩＩ）
（ＩＩ）：
2009078462.tif 000003
に表す糖鎖プライマーＬａｃ−Ｏ−Ｃ13：１（２）を作製し、この糖鎖プライマーをマウスメラノーマ細胞（B16細胞）に投与したところ、B16細胞を培養する培地において、従来のプライマー（アルキル鎖に二重結合を有さないＬａｃ−Ｏ−Ｃ12糖鎖プライマー）と同等以上の糖鎖の伸長が行なわれていた。さらに、培地に存在する合成された糖鎖とオゾンとを反応させると、合成された糖鎖に含まれる上記化学式（ＩＩ）のアルケニル鎖の二重結合がオゾンによる酸化反応によって開裂し、その結果、開裂した位置にアルデヒド基を導入することによって、この糖鎖を基板へ付着させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明にかかる糖鎖プライマーは、アルキル鎖末端以外の箇所に一つ以上の二重結合を含む、アルケニル鎖を有する、下記一般式(Ｉ)で表される糖鎖プライマーである。  
式（Ｉ）；Ｌａｃ−Ｏ−Ｃｋ：ｍ（ｎ）
（一般式（Ｉ）において、前記Ｃｋはｋ個のＣを有するアルケニル鎖を表わし、ｍは二重結合の総数を表わし、ｎは前記アルケニル鎖中の二重結合の位置を表わす（すなわち、Ｌａｃ−Ｏに直接結合するＣを１として、順にＣに番号を付した場合のｎ番目のＣと（ｎ＋１）番目のＣの間の二重結合をｎと表わす）。ここで、ｋは８〜１４の整数であり、ｍが１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−２を満たす一つの整数であり、ｍが２≦ｍ≦ｋ−１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−１を満たす複数の整数である。）  
ここで、ｋは１２又は１３であることが好ましい。【０００９】
さらに、本発明にかかる糖鎖合成方法は、糖鎖を合成する方法であって、糖鎖合成細胞に前記糖鎖プライマーを投与して、前記細胞と前記糖鎖プライマーとを反応させることを特徴とする。【００１０】
また、本発明にかかる糖鎖酸化方法は、糖鎖を酸化する方法であって、前記方法を用いて糖鎖を合成する工程と、前記工程で合成した糖鎖を冷却し、冷却した前記糖鎖にオゾンを加える工程とを包含することを特徴とする。【００１１】
さらに、本発明にかかる糖鎖アレイ製造方法は、糖鎖アレイを製造する方法であって、前記方法を用いて糖鎖を酸化する工程と、前記工程で酸化した糖鎖と還元剤とを反応させる工程と、前記工程で還元した糖鎖を基板へ付着させる工程とを包含することを特徴とする。この方法を用いて作製された糖鎖アレイも、本発明の範囲に属する。【００１２】
また、本発明にかかる糖ペプチド合成方法は、糖ペプチドを合成する方法であって、前記方法を用いて糖鎖を酸化する工程と、前記工程で酸化した糖鎖と還元剤とを反応させる工程と、前記工程で還元した糖鎖とペプチドとを反応させる工程とを包含することを特徴とする。この方法を用いて合成された糖ペプチドも、本発明の範囲に属する。【００１３】
なお、本明細書において「糖鎖合成細胞」とは、糖鎖生合成経路を有している細胞のことをいい、その細胞の種類は特に限定されない。【００１４】
本発明により、効率よく糖鎖を合成させることができ、かつ、合成後の糖鎖を簡単に様々な用途に用いることができる新規糖鎖プライマー、及びそのプライマーの使用方法を提供することができる。【００１５】
＝＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝＝
なお、本出願は、２００７年１２月１８日出願の日本国出願番号特願２００７−３２５８０４を基礎とする優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施例において、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranosideの合成スキームを示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、Lactose octaacetate (Ac-Lac)の合成スキームを示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(2, 3, 4,6-tetra-O-acettyl-β-D-galactopyranosyl)-2, 3, 6-tri-O-acetyl-D-glucopyranoside (Ac-Lac-C13:1(2))の合成スキームを示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-D-glucopyranoside (Lac-C13:1(2))の合成スキームを示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、B16細胞に糖鎖プライマーを投与したときに生成された生成物をHPTLCにより分析した結果を示す図である。（a）は培地画分を、(b)は細胞画分を示す。レーン1、2はコントロールを、レーン3、4はLac-C12糖鎖プライマーを、レーン5、6はLac-C13:1(2)糖鎖プライマーを示す。（a）、（b）共にレゾルシノール染色を行った結果を示す。
【図６】本発明の一実施例において、デンシトメータによる糖脂質の定量結果を示す図である。培地画分中の糖鎖伸長生成物の量を比較した。
【図７】本発明の一実施例において、Lac-C13:1(2)糖鎖プライマーのオゾン酸化反応スキームを示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、各試料の蛍光強度を示す図である。なお、励起波長は410nmである。
【図９】本発明の一実施例において、糖鎖を固定化するまでの概略を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例において、PBS中で糖鎖を固定化したときの、ECAレクチンのラクトースへの結合を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾した方法や改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００１９】
＝＝＝新規糖鎖プライマー＝＝＝
本発明の糖鎖プライマーは、アルキル鎖末端以外の箇所に一つ以上の二重結合を含む、アルケニル鎖を有する糖鎖プライマーであって、下記一般式（Ｉ）
一般式（Ｉ）；Ｌａｃ−Ｏ−Ｃｋ：ｍ（ｎ）
で表される。上記一般式（Ｉ）において、Ｃｋはｋ個のＣを有するアルケニル鎖を表わし、ｍは二重結合の総数を表わし、ｎは前記アルケニル鎖中の二重結合の位置を表わす（すなわち、Ｌａｃ−Ｏに直接結合するＣを１として、順にＣに番号を付した場合のｎ番目のＣと（ｎ＋１）番目のＣの間の二重結合をｎと表わす）。ここで、Ｃｋは直鎖アルケニル鎖であっても分枝アルケニル基であっても良いが、直鎖アルケニル鎖であることが好ましい。また、ｋは特に限定されないが、ｋは８〜１４の整数であることが好ましく、１２又は１３であることが特に好ましい。また、ｍが１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−２を満たす一つの整数である。さらに、ｍが２≦ｍ≦ｋ−１の場合、ｎは１≦ｎ≦ｋ−１を満たす複数の整数であり、特に２を含むこと（例えば、ｎ＝２あるいはｎ＝２，５など)が好ましい。【００２０】
上記一般式（Ｉ）において、−Ｏ−Ｃｋは、Ｌａｃ（ラクトース）を構成するＤ-グルコースの１位の位置の炭素に結合することが好ましい。【００２１】
上記一般式（Ｉ）において、Ｌａｃと−Ｏ−Ｃｋとの結合は、α結合であっても、β結合であっても良い。従って、糖鎖プライマーとして使用する際、プライマーに、α結合を有するα体とβ結合を有するβ体との一方のみが含有されていても、両方が含有されていても良く、混合物である場合の混合比は、特に限定されない。【００２２】
このような糖鎖プライマーの一例として、実施例では、下記化学式（ＩＩ）
2009078462.tif 000004
で表される糖鎖プライマーＬａｃ−Ｏ−Ｃ13：１（２）を用いた。【００２３】
＝＝＝糖鎖プライマーの合成方法＝＝＝
上述の糖鎖プライマーは、当業者に公知の技術を用いて合成することができる。例えば、糖鎖プライマーの糖鎖部分となるラクトース（図１の１に対応）を、ピリジン溶媒下で無水酢酸と反応させて、オクタアセチルラクトース（図１の２に対応）を合成する。次いで、禁水条件下で、ジクロロメタン溶媒中でtrans-2-tridecen-1-ol等の二重結合を有するアルコールとオクタアセチルラクトースとをグリコシル化反応させて（図１の３に対応）、この反応によって生じた化合物を脱アセチル化して、目的の糖鎖プライマー（図１の４に対応）を得ることができる。ここで用いるアルコールが有する炭素数は特に限定されないが、Ｃ8〜Ｃ14の炭素数を有する一価アルコールが好ましく、Ｃ12又はＣ13の一価アルコールがより好ましい。【００２４】
その他、酵素法等の方法を用いて、糖鎖プライマーを合成してもよい。【００２５】
＝＝＝糖鎖の合成方法＝＝＝
一般に、糖鎖生合成経路を有している糖鎖合成細胞に糖鎖プライマーを投与すると、この糖鎖プライマーが細胞中に入って細胞中の糖転移酵素と反応し、その結果、糖鎖の伸長が起きることが知られている。【００２６】
以下の実施例に示す通り、本発明の糖鎖プライマーと糖鎖合成細胞とを反応させれば、効率よく糖鎖を合成できる。【００２７】
ここで、糖鎖合成細胞としては、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母等の糖鎖合成に関与する遺伝子を有する真核細胞が挙げられる。  
培養細胞は、初代培養細胞であっても、株化された培養細胞であってもよく、培養条件下で培養された細胞であればあらゆる細胞が含まれ、培養回数・培養時間・トランスファー回数などによって限定されることはない。株化された培養細胞としては、サル腎臓細胞COS7、ヒト白血病由来細胞HL60、イヌ腎臓細胞MDCK等が挙げられ、マウスメラノーマ細胞（例えば、B16細胞等）を使用することが特に好ましい。  
生体から採取された細胞は、増殖する細胞であることが好ましく、癌細胞であることが特に好ましい。【００２８】
上記糖鎖合成細胞に糖鎖プライマーを投与すれば、この細胞と糖鎖プライマーとが反応し、その結果、所望の糖鎖を得ることができる。具体的には、まず、培養している糖鎖合成細胞（例えば、B16細胞）の培地中に、糖鎖プライマーを50μMの濃度で添加し、37℃で約2日間培養する。その間、糖鎖プライマーが細胞に取り込まれ、その糖鎖プライマーに糖が付加され、多様な種類の糖鎖が培養液中に産生される。そして、この培養液から、例えばレクチンカラムや市販の糖鎖精製キットなど、当業者に公知の方法を用いて糖鎖を精製すればよい。【００２９】
なお、合成される糖鎖の種類を増やしたい場合には、用いる糖鎖合成細胞や糖鎖プライマーの種類を増やすことで、糖鎖プライマーと糖鎖合成細胞との組合せを増やせばよい。【００３０】
＝＝＝アルデヒド基の導入＝＝＝
本発明の糖鎖プライマーは、アルキル鎖末端以外の箇所に一つ以上の二重結合を含む、アルケニル鎖を有する。そのため、この糖鎖プライマーを糖鎖合成細胞に投与して糖鎖を合成すれば、アルキル鎖に二重結合を含む、アルケニル鎖を有する糖鎖を合成することができる。この二重結合に対し、有機化合物の炭素−炭素間の二重結合を切断する酸化反応を起こす強力な酸化剤であるオゾンを反応させると、合成された糖鎖を効率よく酸化することができる。オゾンは、無声放電などを利用したオゾン発生装置に、酸素を入れて発生させることができるため、安価でかつ簡便に糖鎖を酸化することが可能になる。【００３１】
オゾンによる酸化反応は、合成された糖鎖の機能を維持できれば、特に限定されず、当業者に公知の技術を用いて行うことができる（例えば、F. Helling, A. Shang, M. Calves, S. Zhang, S. Ren, R. K. Yu, H. F. Oettgen, and P. O. Livingston, Cancer Res 54, 197-203 (1994)を参照のこと）。具体的には、合成された糖鎖をメタノール、ジクロロメタン、酢酸等の溶媒に溶解して、−78℃に冷却し、オゾン発生装置で発生させた2％オゾンガスを吹き込む（バブリングさせる）ことで酸化反応を行うことができる。この反応において、オゾンは有機塩素化合物を生成しないため、糖鎖プライマーを用いて合成した糖鎖の酸化反応にオゾンを用いることにより、従来の酸化反応とは異なり、不純物が少なく、かつ、純度の高い糖鎖酸化物を得ることが可能になる。【００３２】
このようにして酸化させた糖鎖と還元剤（例えば、ジメチルスルフィド、亜鉛（酢酸溶媒中の場合）、トリフェニルホスフィン等）とを反応させると、合成された糖鎖において、アルキル基内に二重結合が存在した位置にアルデヒド基（−ＣＨ＝Ｏ）を導入することができる。導入したアルデヒド基は、強い還元性を有し、高い反応性があるため、合成された糖鎖は、その後の様々な反応を通じて、広く利用することができる。また、同時に末端のアルキル鎖が切除されるので、糖鎖から、その後の利用を阻害し得る疎水性を有する部分を除去することができる。【００３３】
なお、合成された糖鎖において、アルキル基内に複数の二重結合が存在するとき、還元剤と完全に反応させることにより、糖鎖内のもっとも糖部側に近い二重結合より末端側のアルケニル基が切除される。【００３４】
＝＝＝糖鎖アレイの製造方法＝＝＝
アルデヒド基が導入された糖鎖は、有機溶媒等を使用することなく、容易にかつ強固に帯電性を有する基板等に付着することができるため、例えば、ガラス、ポリスチレン、金等からなる基板を用いて、効率よく糖鎖アレイを作製することができる。  
また、アルデヒド基が導入された糖鎖は、固相担体等に固定化して得られる糖鎖アレイに用いることもできる。  
なお、アルデヒド基が導入された糖鎖は、上述したように長い疎水基を有していないため、これらの糖鎖アレイを用いることにより検出対象物質の非特異的な吸着や結合を抑制することができる。従って、本発明の方法に従って作製された糖鎖アレイは、糖鎖と相互作用する物質との相互作用をより正確に解析することを可能にする。【００３５】
＝＝＝糖ペプチド合成方法＝＝＝
アルデヒド基はアミノ基と結合してアミド基を生じるため、アルデヒド基が導入された糖鎖とペプチドの側鎖のアミノ基とを反応させることにより、糖ペプチドを合成することができる。なお、糖鎖とペプチドとの結合反応は、当業者に公知の技術を用いればよい（例えば、F. Helling, A. Shang, M. Calves, S. Zhang, S. Ren, R. K. Yu, H. F. Oettgen, and P. O. Livingston, Cancer Res 54, 197-203 (1994)を参照のこと）。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。【００３７】
＜実施例１：新規糖鎖プライマーの合成＞
下記化学式（ＩＩ）
2009078462.tif 000005
からなる糖鎖プライマー1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranosideを設計し、以下のように合成した。図１に合成全体のスキームを示す。【００３８】
まず、lactose（図１の１に対応）を、ピリジン溶媒下で無水酢酸と反応させて、lactose octaacetate（図１の２に対応）を合成した。次いで、禁水条件下、ジクロロメタン溶媒中でtrans-2-tridecen-1-olとlactose octaacetateとをグリコシル化反応させ、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranoside（図１の３に対応）を合成した。最後に、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosideを脱アセチル化して、目的の化合物である1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranoside（図１の４に対応）を得た。【００３９】
以下に、各合成ステップの詳細を記載する。なお、以下lactose octaacetateを「Ac-Lac」と、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosideを「Ac-Lac-C13:1(2)」と、1-O-(trans-2-tridecenyl)-4-O-(β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranosideを「Lac-C13:1(2)」と記載する。【００４０】
（１）Ac-Lacの合成
図２にAc-Lacを合成するための、全体のスキームを示す。  
まず、図２の１に記載のlactose（SIGMA社）1.7gを、脱水ピリジン35ml（Wako社）に溶かし、氷浴上で攪拌しながら無水酢酸20ml（Wako社）を滴下した。反応開始から35時間後、反応の終了を薄層クロマトグラフィー（TLC）で確認した。その後、エタノール20mlを滴下して、室温で30分攪拌し、反応を停止させた。溶媒をエバポレーターで減圧留去した後、酢酸エチルに溶解させ、1N HClで2回、NaHCO3飽和水溶液で2回、H2Oで1回、NaCl飽和水溶液で2回の順で分液操作を行った。Na2SO4を加えて3時間激しく攪拌して脱水した後、綿栓濾過によりNa2SO4を除去し、溶媒を減圧留去した。次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径3cm、長さ20cm、Hexane/Ethyl Acetate=2/3）で精製を行い、Ac-Lac（図２の２に対応）を得た。化合物は、1H-NMR及びMALDI-TOF/MS測定により確認した。結果を以下に示す。【００４１】
＜結果＞
・収量2.84g(4.19mmol)
・収率88.2%
・分析
1H-NMR(300MHz, solvent:CDCl3)
δ(ppm):6.70-5.64(d, 1H, Glc-1), 5.47-4.90 (m, 5H, Gal-H4, Gal-H3, Gal-H2, Glc-H3, Glc-H2), 4.47-4.41 (m, 2H, Gal-H1, Gal-H6), 4.15-4.02 (m, 3H, Glc-H6, Gal-H5, Gal-H6), 3.87-3.69 (m, 3H, Glc-H4, Glc-H5, Glc-H6), 2.16-1.97 (m, 24H, acetyl group)
J値から6.25ppmのピークがα体由来、5.64ppmのピークがβ体由来であることがわかった。これらのピーク面積の比からα体とβ体の生成物の比は約1：4であることがわかった。  
MALDI-TOF-MS Exact Mass:678.2 
[M+Na]+ 計算値 701.19 実測値 701.35
[M+K]+  計算値 717.16 実測値 717.43【００４２】
（２）Ac-Lac-C13:1(2)の合成
図３にAc-Lac-C13:1(2)を合成するための、全体のスキームを示す。  
本反応は禁水条件下で行うため、実験前日に10mlシリンジと、シリンジの針を60℃の乾燥機に入れておいた。また、実験前日にモレキュターシーブス4A（Wako, 粉末、MS4A）をスターラーと共に四つ口フラスコに入れ、その容器ごとオーブンで200℃に熱し、デシケータで室温になるまで乾燥させることにより、器具の乾燥とMS4Aの活性化を行った。【００４３】
活性化したMS4Aが入った四つ口フラスコに、Ac-Lac（図３の２に対応）2.15gを入れ、反応系内を窒素置換した。脱水ジクロロメタン42.5ml（Wako社)を加えてAc-Lacを溶解させ、Trans-2-tridecen-1-ol 1.25g（AVOCADO社, 17753）とBF3・Et2O 0.2ml（Wako社, 022-08362）を加えて室温で攪拌した。2時間半後、BF3・Et2Oを0.3ml追加した。5時間後、トリエチルアミン1ml（Wako社）を加えて中和し、反応を終了した。反応液をセライト濾過し、一晩真空乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径6cm×長さ20cm、Hexane/Ethyl Acetate=1/1）で精製し化合物（図３の３に対応、Ac-Lac-C13:1(2)）を得た。この段階で、生成物はβ体のみであった。得られた化合物は、1H-NMR及びMALDI-TOF/MS測定により確認した。結果を以下に示す。【００４４】
＜結果＞
・収量500mg(0.61mmol)
・収率20.3%
・分析
1H-NMR(300MHz, solvent:CDCl3)
δ(ppm):5.70-5.61 (m, 1H,-CH=CH-C10H21), 5.47-5.38 (m, 1H,-CH=CH-C10H21), 5.33-5.32 (t, 1H, Gal-H4), 5.20-5.05 (t, dd, 2H, Glc-H3, Gal-H2), 4.95-4.85 (dd, dd, 2H, Glc-H2, Gal-H3), 4.50-4.44 (m, 3H, Glc-H1, Gal-H1, Gal-H6), 4.14-4.00 (m, 5H-CH2-CH=CH-, Glc-H6, Gal-H5, Gal-H6), 3.86-3.74 (m, 2H, Glc-H4, Glc-H6), 3.58-3.57 (m, 1H, Glc-H5), 2.13-1.98 (m, 23H, -CH=CH-CH2-, acetyl group), 1.30-1.21 (m, 16H, -CH=CH-CH2-C8H16-CH3), 0.88-0.83 (t, 3H, -CH=CH-C9H18-CH3)
MALDI-TOF-MS Exact Mass:816.4
[M+Na]+ 計算値 839.37 実測値 839.11
[M+K]+ 計算値 855.34 実測値 855.20【００４５】
（３）Lac-C13:1(2)の合成
図４にLac-C13:1(2)を合成するための、全体のスキームを示す。  
まず、0.5g のAc-Lac-C13:1(2)（図４の３に対応）をMeOH 15ml （nacalai tesque社）に溶解させ、28% MeONa/MeOH溶液（Wako社, 197-02463）をパスツールピペットで数滴添加し攪拌した。反応を進行させるために、2.5、3.5時間後にもMeONa/MeOHを数滴追加した。5時間半後、反応の終了をTLCで確認し、活性化したアンバーライト（陽イオン交換樹脂、ORGANO社）を加えて反応系を中性にした。アンバーライトを綿栓濾過により除去し、溶媒を減圧留去し、Lac-C13:1(2)（図４の４に対応）を得た。化合物は、1H-NMR及びMALDI-TOF/MS測定により確認した。結果を以下に示す。【００４６】
＜結果＞
・収量300mg(0.57mmol)
・収率93.8%（反応全体での収率は、19.0%）
・分析
1H-NMR(300MHz, solvent:CD3OD)
δ(ppm):5.70-5.61 (m, 1H, -CH=CH-C10H21), 5.54-5.45 (m, 1H, -CH=CH-C10H21), 1.97-1.95 (q, 2H, -CH=CH-CH2-C9H19), 1.29-1.19 (m, 16H, -CH=CH-CH2-C8H16-CH3), 0.82-0.78 (t, 3H, -CH=CH-C9H19-CH3)
MALDI-TOF-MS Exact Mass:522.3 
[M+Na]+ 計算値 545.29 実測値 545.02
[M+K]+ 計算値 561.27 実測値 560.98【００４７】
＜実施例２：新規糖鎖プライマーを用いた、Ｂ16細胞での糖鎖伸長反応＞
本実施例では、糖鎖プライマーLac-C12 (a)及び実施例１で合成したLac-C13:1(2)(b)を用いて、B16細胞での糖鎖伸長反応を測定した。【００４８】
2009078462.tif 000006
【００４９】
（１）生細胞内における糖鎖伸長反応
まず、2.0×106個/培養皿の濃度で播種したB16細胞（GM3を強く発現しているマウスメラノーマ細胞）（(財）ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク）の培地中にLac-C12糖鎖プライマー及びLac-C13:1(2)糖鎖プライマーを添加して、48時間インキュベーションを行った。その後、培地と細胞を遠心分離によって分離し、それぞれの回収物をHPTLCによって分析した。結果を図５に示す。【００５０】
Lac-C13:1(2)糖鎖プライマーを投与した細胞では、培地画分、細胞画分共に生成物Xが確認された。同様に、Lac-C12糖鎖プライマーを投与した細胞においても、培地画分、細胞画分共に生成物X’が確認された。【００５１】
（２）MALDI-TOF-MSによる質量分析
Lac-C13:1(2)糖鎖プライマーの投与によって得られた生成物をTLC Blottingにより単離精製し、MALDI-TOF-MSで質量分析を行ったところ、Xのピークはm/z=812.44であり、Xは糖鎖プライマーにシアル酸が1分子伸長したものであることが分かった。  
さらに、糖鎖伸長生成物Xに関しては、MALDI-PSDスペクトルによる解析も行った。  
得られたPSDスペクトルにおいて、プライマーのナトリウム付加（Lac-C13:1(2)+Na=545.3）のピークとNeuAc+anGal+Na=476.1が確認できたこと、また、NeuAc+Glc-C13:1(2)+Na=649.3が存在しないことより、生成物はNeuAc-Gal-Glc-C13:1(2)、即ち、NeuAc-Lac-C13:1(2)であると決定した。【００５２】
（３）Lac-C13:1(2)糖鎖プライマーとLac-C12糖鎖プライマーの糖鎖伸長効率の比較
さらに、Lac-C12糖鎖プライマーとLac-C13:1(2)糖鎖プライマーのB16細胞内での糖鎖伸長効率と、細胞内への各種糖鎖プライマーの取り込み量をデンシトメータによる定量で比較した。  
その結果、図６に示すように、それぞれの培地画分中の糖鎖伸長生成物の量を比較すると、Lac-C13:1(2)糖鎖プライマーの糖鎖伸長効率は、Lac-C12糖鎖プライマーの糖鎖伸長効率と同等もしくは同等以上であった。【００５３】
＜実施例３：新規糖鎖プライマーのオゾン酸化反応＞
（１）オゾン酸化
図７に、Lac-C13:1(2)糖鎖プライマーとオゾンとの酸化反応を行うための、全体のスキームを示す。  
なお、以下のオゾン酸化の実験手順は、参考文献（F. Helling, A. Shang, M. Calves, S. Zhang, S. Ren, R. K. Yu, H. F. Oettgen, and P. O. Livingston, Cancer Res 54, 197-203 (1994)）を参照した。【００５４】
1mgの Lac-C13:1(2)糖鎖プライマー（Mw=522.63）にメタノール（nacalai tesque社）2mlを加え、超音波照射により完全に溶解させた。次に、ethanol/dry ice bathの中に試料の入った試験管を入れて、-78℃に冷却した。オゾンはオゾン発生装置（エコデザイン社、空冷式、ED-0G-A10）と酸素ボンベ（東横化学社、容量1.5m3）を使って発生させた。酸素ボンベの圧力は0.1MPa、流量を50ml/minとし、試料中で25分間バブリングさせた。反応の終了をTLCで確認した後、窒素ガスを約30分間バブリングさせて過剰のオゾンを反応系から追い出した。過酸化物が反応系内に存在していると考えられたので、それをアルデヒドに還元するために還元剤としてジメチルスルフィド100μl（Wako社） を加え、-78℃で30分、さらに室温で90分激しく攪拌した。その後反応液をHPTLC用に10μlとり、残りは15ml遠心管に移して、4℃で保存した。【００５５】
（２）MALDI-TOF-MSによる質量分析
得られた生成物をTLC Blottingにより単離精製し、MALDI-TOF-MSで質量分析を行ったところm/z=407.16であったことから、生成物はLac-CH2-CHOであることが明らかになった。【００５６】
（３）Fluoral-Pによるアルデヒド基の検出
図８に示すように、Fluoral-Pとオゾン酸化後反応液とを混ぜた溶液Cは、Fluoral-Pのみの溶液Aやオゾン酸化後反応液のみの溶液Bよりも、明らかに強い蛍光強度を示した。この結果より、オゾン酸化によってアルデヒドが反応系内に生成しており、そのアルデヒドとFluoral-Pとの反応によって蛍光を発している事が示された。【００５７】
＜実施例４：オゾン酸化した糖鎖プライマーの基板への固定化と糖鎖認識＞
糖鎖固定化までの概略を図９に示す。【００５８】
（１）糖鎖の基板への固定化
（i）スペーサーの固定化
固定化に用いる基板としては、カルボキシル基を提示したELISAプレート（96穴、MS-8796F、住友ベークライト株式会社）を使用した。アミノ基を提示させるためのスペーサーとしてはアジピン酸ジヒドラジド（nacalai tesque社、No. 01048-12）を使用した。【００５９】
また、スペーサー固定化の際の活性化試薬としては、EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl; PIERCE Biotechnology社 22980)、NHS (N-Hydroxysuccinimide; nacalai tesque社 189-14）を用いた。また、反応の全工程におけるランニングバッファーとしては、PBS(-)（日水製薬社）9.6gをMilliQに溶解させて1Lとしたものを用いた。実験方法は以下の通りである。【００６０】
まず、以下のサンプルを調製した。  
a)固定化反応前処理溶液：200mM酢酸バッファー/EtOH=2/1の比で調製
b)活性化試薬溶液：730mM EDC水溶液/183mM NHS溶液=1/1の比で調製
c)スペーサー溶液：129mMアジピン酸ジヒドラジド水溶液
次に、スペーサーの固定化を行なった。  
プレートに固定化反応前処理溶液60μLを注入した後、活性化試薬溶液10μLを注入し、室温で15分間振盪した（プレートの官能基活性化のため）。次にスペーサー溶液35μLを注入した（終濃度：29mM）後、軽く手で揺すり、室温で1時間放置した。最後に、溶液を除去し、MilliQで5回洗浄した。このようにして、基板にアミノ基を提示させた。【００６１】
（ii）オゾン酸化した糖鎖プライマーの固定化
固定化に使う糖鎖にはLac-C13:1(2)プライマーで得られた糖を酸化したLac-CH2-CHOを用いたが、オゾン酸化反応後は、反応混合物を精製することなく、反応液をそのまま用いた。酸化剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウムNaCNBH3（Aldrich社）を用い、溶液を酸性にするために、1N塩酸を用いた。実験方法は以下の通りである。【００６２】
まず、以下のサンプルを調製した。  
d)固定化反応前処理溶液：PBS(-)又はMeOH
e)Lac-CH2-CHO/MeOH溶液又はNeuAc-Lac-CH2-CHO/MeOH溶液
f)5%NaCNBH3/PBS(-)又はMeOH溶液
g)1N塩酸
次に、固定化反応前処理溶液を40μL、Lac-CH2-CHO/MeOH溶液を10μL、1N塩酸を0.5μL、さらに5％ NaCNBH3を10μL注入し、一晩4℃で振盪し、最後にPBS(-)で5回洗浄した。このようにして、基板に提示されているスペーサーのアミノ基に糖鎖を結合し、糖鎖の基板への固定化を行った。【００６３】
（２）酵素標識法によるLactose認識の評価
基板上に、Lac-CH2-CHOが固定化されていること、及びタンパク質との特異的な結合が可能であることの評価として、ラクトースを認識して結合するレクチンであるビオチン標識ECAレクチン（生化学工業社、No.300418）を用いた。酵素標識アビジンにはStreptavidin Peroxidase Conjugate（CALBIOCHEM 社、No.189733）を用いてELISA法により検出した。図１０にPBS溶媒中で固定化反応を行ったときのレクチン濃度と吸光度の関係を示す。【００６４】
その結果、レクチン濃度に依存して吸光度が増加していることから、Lac-CH2-CHO糖鎖は基板上に固定化されていることが示された。
【図１】
2009078462.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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