(57)【要約】  本発明は、検出方法であって、被検出物質に結合することができる半導体ナノ粒子標識プローブと該被検出物質との複合体を、該被検出物質に結合することができる固定化捕捉試薬に接触させて、該被検出物質を検出することを特徴とし、微量の被検出物質でも高い検出感度が得られ、簡便かつ目視判定性に優れる、ウイルスなどの被検出物質を検出する検出方法および検出キットが提供できる。
2009072441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質に結合することができる半導体ナノ粒子標識プローブと該被検出物質との複合体を、該被検出物質に結合することができる固定化捕捉試薬に接触させて、該被検出物質を検出することを特徴とする、検出方法。
【請求項２】
上記半導体ナノ粒子が、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｃｄ、Ｉｎ、ＳｂおよびＴｅよりなる群から選ばれる少なくとも１つの元素を含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検出方法。
【請求項３】
上記半導体ナノ粒子が、３以下の比重を有することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の検出方法。
【請求項４】
上記半導体ナノ粒子が、１〜５０ｎｍの平均粒径を有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
上記検出方法が、イムノクロマトグラフィー法であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
上記被検出物質と上記標識プローブとの組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせ、または抗体と抗原との組み合わせであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
上記被検出物質と上記固定化捕捉試薬との組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせ、または抗体と抗原との組み合わせであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
上記被検出物質が、ウイルス由来のタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項９】
上記ウイルスが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、口蹄疫ウィルスもしくは高病原性トリインフルエンザウイルスであることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の検出方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の検出方法に用いられることを特徴とする検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、半導体ナノ粒子を用いた被検出物質の検出方法に関し特に、イムノクロマトグラフィー法を利用する検出方法およびそれに用いられる検出キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、半導体ナノ粒子により標識されたプローブを用いて、インフルエンザウイルスなどのウィルスを検出する方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応の特異性を利用して検体中の被検出物質を検出または定量する方法として、免疫拡散法、酵素測定法、凝集法等の方法論が実用化されている。特に近年、フロースルー法（非特許文献１および特許文献１）やイムノクロマトグラフィー法（ラテラルフロー式およびタンジェンシャルフロー式など（特許文献２および３））による検出方法はその簡便性から急速に普及している。【０００３】
市販されている多くのイムノクロマトグラフィー法は、ストリップ状のメンブレンを有し、メンブレン上の長さ方向の一端に被検出物質（例：抗原）を捕捉するための捕捉試薬（例：抗体）を固定化し、逆の一端に被検出物質に特異的に結合するリガンドを含む標識プローブ（例１：可視可能な金コロイド粒子（特許文献４）、例２：染色された合成高分子ラテックス粒子（特許文献５））をメンブレン上において展開可能に保持して構成されている。被検出物質を含む検体を、標識プローブを保持した側のメンブレン上に所定量供すると、検体がメンブレン上をクロマト展開する際、存在する被検出物質が標識プローブと結合し被検出物質−標識プローブの複合体が形成される。被検出物質−標識プローブ複合体はそのままメンブレン上をクロマト展開し、メンブレン上に固定化された捕捉試薬に捕捉されると捕捉試薬−被検出物質−標識プローブの複合体が捕捉試薬固定化位置に形成される。そして、標識プローブを任意の方法（可視可能な金コロイド粒子の場合、その凝集像）で検出することで、被分析物質の存在を判定することができる。【０００４】
上記可視可能な金コロイド粒子および上記染色された合成高分子ラテックス粒子のいずれをイムノクロマトグラフィー法に利用した場合、感度・再現性が低いため定量性がなく、また被検出物質の存在の有無が判別できるのみであり、効率が悪い。
【特許文献１】特公平７−３４０１６号公報
【特許文献２】特公平７−１３６４０号公報
【特許文献３】特許第２８９０３８４号公報
【特許文献４】特開昭６４−３２１６９号公報
【特許文献５】特開平５−１０９５０号公報
【非特許文献１】“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｅｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｓａ  Ｖｉｃｋｅｒｓ，ｐ．６−８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微量の被検出物質でも高い検出感度が得られ、簡便かつ目視判定性に優れる、ウイルス等の被検出物質を検出する検出方法およびそれに用いられる検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、半導体ナノ粒子により標識されたプローブを用いると、微量の被検出物質でも高い検出感度が得られ、簡便かつ目視判定性に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下に記載した事項により特定される。【０００８】
本発明は、検出方法であって、被検出物質に結合することができる半導体ナノ粒子標識プローブと該被検出物質との複合体を、該被検出物質に結合することができる固定化捕捉試薬に接触させて、該被検出物質を検出することを特徴とするものである。【０００９】
また、本発明は、検出キットであって、上記検出方法に用いられることを特徴とする。【００１０】
上記半導体ナノ粒子は、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｃｄ、Ｉｎ、ＳｂおよびＴｅよりなる群から選ばれる少なくとも1つ以上の元素を含んでもよく、また３以下の比重を有することが好ましい。【００１１】
さらに、上記半導体ナノ粒子は、１〜５０ｎｍの平均粒径を有することが好ましい。【００１２】
本発明の検出方法は、イムノクロマトグラフィー法を好適に用いることができる。【００１３】
上記被検出物質と上記標識プローブとの組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせ、または抗体と抗原との組み合わせであってもよく、また上記被検出物質と上記固定化捕捉試薬との組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせ、または抗体と抗原との組み合わせであってもよい。【００１４】
上記被検出物質は、ウイルス由来のタンパク質であってもよい。【００１５】
さらに、上記ウイルスは、Ａ型、Ｂ型またはＣ型インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、口蹄疫ウィルスもしくは高病原性トリインフルエンザウイルスであってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、発光寿命の長い半導体ナノ粒子により標識されたプローブを用いることにより、微量の被検出物質でも高い検出感度が得られ、簡便かつ目視判定性に優れる、ウイルスなどの被検出物質を検出する方法および検出キットを提供することができる。本発明は、さらにイムノクロマトグラフィー法を用いた場合、さらに迅速な検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１中、ａは、イムノクロマトストリップの平面図を表し、ｂは、ａに示されたイムノクロマトストリップの縦断面図を表す。
【符号の説明】
【００１８】
１  ：粘着シート
２  ：含浸部材
３  ：膜担体
３１：捕捉部位
４  ：吸収用部材
５  ：試料添加用部材
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明について具体的に説明する。【００２０】
本発明は、被検出物質に結合することができる、半導体ナノ粒子により標識されたプローブと該被検出物質との複合体を、該被検出物質に結合することができる固定化捕捉試薬に接触させて被検出物質を検出する検出方法および検出キットである。また、本発明の検出方法は、イムノクロマトグラフィー法を好適に用いることができる。【００２１】
＜被検出物質＞
本発明において、被検出物質としては、特に制限されず、例えば、タンパク質、ポリペプチド、核酸、糖鎖、ウイルス、細胞等が挙げられ、中でも抗原となり得るものが好ましい。具体的には、Ａ型、Ｂ型またはＣ型のインフルエンザウイルス由来のタンパク質（ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、Ｍ２タンパク質およびリボ核タンパク質等）、もしくはノロウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの病原性ウイルス由来のタンパク質、ヒト以外の動物種に感染する病原性ウイルス（例えば、口蹄疫ウィルス、高病原性トリインフルエンザウイルスなど）由来のタンパク質などが挙げられる。中でもＡ型、Ｂ型またはＣ型のインフルエンザウイルス由来のタンパク質に特に好ましく適用できる。【００２２】
＜半導体ナノ粒子標識プローブ＞
本発明の検出方法において用いられる、半導体ナノ粒子標識プローブは、半導体ナノ粒子により標識されたプローブのことを意味し、その「半導体ナノ粒子」とは、高い量子効率によりバンドギャップ発光を示す量子ドットであって、半導体を構成する原子が数百〜数千個集まった直径数ナノメートルの粒子である。半導体ナノ粒子の形状は、球状、棒状、板状、チューブ状などがあるが、本発明において用いられる半導体ナノ粒子は、球状または略球状が好ましい。【００２３】
半導体ナノ粒子は、量子サイズ効果により高い蛍光発光強度が得られ、また粒径の大きさにより蛍光の発光波長を変えられる（粒径とは、半導体ナノ粒子の最大径をいう）。従来の蛍光色素とは異なり、バンドギャップ以上のエネルギーを有する光の照射により、照射光の波長に関わらず効率よく励起することができる。さらに、半導体ナノ粒子は良好な光吸収特性を示すことから、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの低輝度の光源によっても励起することができる。したがって、単一の励起光により複数の半導体ナノ粒子を励起でき、マルチカラーイメージングが簡便に実現できる。【００２４】
本発明において用いられる半導体ナノ粒子は、該表面が露出した場合、該表面上の多数の欠陥が発光キラーとして働き、発光強度が低下してしまうため、シェルを施すことが好ましい。シェルを施した半導体ナノ粒子は、コア・シェル構造を有し、つまりコア部となる中心部ナノ粒子の表面を覆う層をシェル部とする二重構造を有する。該シェル部の材料として、通常はＩＩ族〜ＶＩ族の化合物が好適である。この場合、上記のコア・シェル構造の観点からシェル部がコア部よりもバンドギャップが大きい組成から構成されていることが必要である。また、該コア部は単結晶であることが好ましい。単結晶とすることにより、光学素子、例えば、蛍光体微粒子の場合、高い発光効率が得られるからである。【００２５】
半導体ナノ粒子は、具体的に、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｃｄ、Ｉｎ、ＳｂおよびＴｅよりなる群から選ばれる、少なくとも1つ以上の元素を含有する粒子が挙げられる。極めて毒性の高い元素であるＣｄ等を用いることを避けたいことから、シリコンまたはその化合物、あるいはゲルマニウムまたはその化合物が好ましく、少なくともＳｉまたはＧｅの元素を含むことがより好ましい。ＳｉまたはＧｅからなる半導体ナノ粒子は、そのサイズが量子閉じ込め効果の生じる領域まで縮小することによりバンドギャップエネルギーが可視領域にまで広がって発光現象が見られる。【００２６】
このような半導体ナノ粒子としては特に限定されないが、コア部がシリコン核、シェル部が酸化シリコン主体の層であること好ましい。酸化シリコン主体の層とは、酸化ケイ素（ＳｉＯ2）が主成分であるシェル層である。さらにコア部のシリコン核は、単結晶であることが好ましい。このようなコア・シェル構造を有する半導体ナノ粒子では、コア部のＳｉの励起エネルギーは１．１ｅＶ、シェル部の酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の励起エネルギーは、８ｅＶとなり、バンドギャップエネルギーは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳなの粒子（シェル部（ＺｎＳ）３．６ｅＶ；コア部（ＣｄＳｅ）１．７ｅＶ）よりも大きい。またシリコン・シリカ系の半導体ナノ粒子は、環境への負荷が少なく、生体への適用時には生体安全性にも優れる。【００２７】
上記半導体ナノ粒子は、各種の公知技術、文献に記載された方法に基づいて製造してもよい。たとえば特開平５−２２４２６１号公報には、材料の融解温度よりも相当に低い温度での反応雰囲気方法および溶液合成方法のいずれかと組合わされた処理技術により、固溶体希土類元素ドープナノ粒子の調製方法が記載されている。具体的には一種類以上の希土類元素でドープされた金属ハロゲン化物のナノサイズ粒子を、ハロゲン化ガスのハロゲン化雰囲気で加熱する方法、あるいは希土類元素塩およびハロゲン化物形成金属の水溶性塩の水溶液からナノ粒子を沈殿させる方法が開示されている。特に希土類元素がドープされたホスト物質のナノ粒子を溶液から調製する溶液法が望ましい。【００２８】
また、コア・シェル構造を有する半導体ナノ粒子の製造方法は、公知技術、文献に記載された方法に基づく。たとえば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）シェルと金属コア構造のナノコンポジット粒子が、Ｍｕｌｖａｎｅｙら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１２：４３２９〜４３３５頁、１９９６年）およびＡｄａｉｒら（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．＆  Ｅｎｇ．Ｒ．２３：１３９〜２４２頁、１９９８年）によって最初に合成され、報告された。コア・シェル構造を有する、ＳｉＯ2でコーティングされた半導体ナノ粒子のほとんどは、使用された合成法に基づき２種のカテゴリーに分類される。【００２９】
Ｍｕｌｖａｎｅｙらによって開発された手法は、シリカシェルの形成前にシランカップリング剤の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）による金属クラスター表面の改質を必要とする。ＡＰＳは、ガラス質との親和性に欠けた金属クラスターコアとＳｉＯ2との間の接着促進剤として使用される。Ａｄａｉｒらは、水相を有するシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ／水の三成分系におけるテトラエトキシシラン（ｔｅｔｒａｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ;ＴＥＯＳ）の単純な加水分解および縮合によって、金属およびＣｄＳのクラスターをＳｉＯ2でコーティングすることに成功した。この系により、油中に水の小滴が閉じ込められるので、コアとシェル両方の厚みが調整可能であるとともに極めて均一なシリカ−シェルコーティングが可能になる。【００３０】
また、上記半導体ナノ粒子は、３以下の比重を有することが好ましく、２．５以下の比重を有することがより好ましい。該半導体ナノ粒子が、３以下の比重を有することによって、容易に沈殿せず、溶液中に拡散する結果、反応性（接触確率）が上がるので好ましい。２．５以下の比重であれば、その拡散性はさらに良好である。【００３１】
さらに、該粒子の平均粒径は、１〜５０ｎｍであることが好ましく、１〜２０ｎｍであることがより好ましい。該半導体ナノ粒子が１〜５０ｎｍの平均粒径を有すると、溶液中での拡散に優れ、立体障害になりにくいので好ましい。さらに１〜２０ｎｍとすることによって、生体分子への有効な標識の結合が可能となり検出精度が向上する。【００３２】
また、半導体ナノ粒子標識プローブにおける「プローブ」としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、脂肪酸、酵素／抗原、アビジン／ビオチン、リボ核酸およびデオキシリボ核酸またはこれらのオリゴマーなどが挙げられるが、特に抗体が好ましい。抗体は、平衡状態における結合力が強く、特異性および汎用性が高いので好ましい。【００３３】
なお、上記被検出物質が抗体である場合、該プローブは、該抗体が認識する抗原であってもよい。すなわち、上記被検出物質と上記半導体ナノ粒子により標識されたプローブとの組み合わせは、抗原と抗体の組み合わせ、または抗体と抗原との組み合わせであることが好ましい。【００３４】
半導体ナノ粒子をプローブに標識する方法として、多くの方法が知られているが、具体例として、ＳｉＯ2をシェル層として有する半導体ナノ粒子を抗体に標識させる反応を示す。ＳｉＯ2被覆半導体ナノ粒子を、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させ、引き続きＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレインイミドメチル］シクロヘキサン１−カルボキシレート）活性化を行う。この活性化した半導体ナノ粒子と反応させるために必要となる、タンパク質に結合したチオール基は、リジン残基を含有するタンパク質を２−イミノチオランと反応させることにより形成することができる。この反応において、結合させるタンパク質のリジン側鎖は、２−イミノチオランと開環およびチオアミジンの形成を伴って反応する。その際に形成され、タンパク質と共有結合したチオール基は、次いで、ヘテロマイケル付加反応により、上記半導体ナノ粒子表面に結合したマレインイミド基と反応して、タンパク質としての抗体と上記ＳｉＯ2被覆半導体ナノ粒子の表面にある反応性基との間に共有結合を形成することができる。【００３５】
本発明において用いられる、半導体ナノ粒子標識プローブは、シェルを施したＳｉにより標識されたモノクローナル抗体、シェルを施したＧｅにより標識されたモノクローナル抗体、シェルを施したＳｉにより標識されたポリクローナル抗体およびシェルを施したＧｅにより標識されたポリクローナル抗体が好ましい。【００３６】
＜固定化捕捉試薬＞
本発明において用いられる固定化捕捉試薬とは、以下に限定されないが、例えば、後述するイムノクロマトグラフィー法において、上記被検出物質と上記標識プローブとの複合体を捕捉するために、ストリップ状のメンブレン上に固定化された試薬のことを言う。該捕捉試薬は、該被検出物質に結合することができる。【００３７】
上記固定化補足試薬としては、具体的に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、脂肪酸、酵素／抗原、アビジン／ビオチン、リボ核酸およびデオキシリボ核酸またはこれらのオリゴマーなどが挙げられるが、特に抗体が好ましい。抗体は、平衡状態における結合力が強く、特異性および汎用性が高いので好ましい。【００３８】
なお、上記被検出物質が抗体である場合、該捕捉試薬は、該抗体が認識する抗原であってもよい。すなわち、上記被検出物質と上記固定化捕捉試薬との組み合わせは、抗原と抗体の組み合わせ、または抗体と抗原との組み合わせであることが好ましい。【００３９】
＜検出方法＞
本発明の検出方法において用いられる上記被検出物質を含む検体は、唾液、汗、尿、便、血液（全血または血清・血漿）、またはその他体液などから採取したものであって、必要ならば、試料溶解液、希釈液、緩衝液、洗浄液などにより前処理することができる。検出の手順として、まず上記検体を、半導体ナノ粒子により標識されたプローブと混合し結合させる。次に、必要ならば洗浄などの処置により、結合した複合体と遊離の該標識プローブとを分離する。該複合体に励起光を照射し、半導体ナノ粒子からの蛍光を検出する。その検出は、肉眼でもよく、また蛍光量を定量する機器を使用してもよい。【００４０】
上記検出を簡便かつ迅速に行えるように、次のイムノクロマトグラフィー法を利用する態様が望ましい。【００４１】
＜イムノクロマトグラフィー法＞
本発明に用いられるイムノクロマトグラフィー法（以下「イムノクロマト法」ともいう。）は、既存のイムノクロマト法テストストリップ（以下「イムノクロマトストリップ」ともいう。）の構成に準拠して容易に実施できる。【００４２】
一般に、イムノクロマトストリップは、抗原の第１の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第１の抗体と、抗原の第２の抗原決定基にて抗体抗原反応可能かつ標識された第２の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、第１の抗体が膜担体の所定位置にあらかじめ固定化されて捕捉部位を形成し、第２の抗体が該捕捉部位から離隔した位置で該膜担体にてクロマトグラフィー展開可能なように配置（例えば、含浸形態）されて構成される。【００４３】
上記第１の抗体および上記第２の抗体は、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、少なくともいずれか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。通常は、第１の抗体および第２の抗体は「ヘテロ」の組み合わせで用いられ、すなわち、抗原上の位置および構造のいずれもが異なる各抗原決定基をそれぞれ認識する第１の抗体および第２の抗体が組み合わせて用いられる。しかしながら、第１の抗原決定基および第２の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第１の抗体および第２の抗体は、「ホモ」の組み合わせのモノクローナル抗体であってよく、すなわち、第１の抗体および第２の抗体の両方に同一のモノクローナル抗体を使用できる。【００４４】
イムノクロマトストリップの具体例を、図１に示す。図中、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を表している。【００４５】
図１の例としては、下記の態様が挙げられる。【００４６】
イムノクロマトストリップの膜担体３を、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターとして作製する。【００４７】
上記膜担体３上の、クロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第１の抗体（例：固定化捕捉試薬）が固定され、捕捉部位３１が作製される。【００４８】
上記膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被検出物質がクロマトグラフィー展開可能であって、かつ上記捕捉部位３１を形成する第１の抗体が固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。【００４９】
含浸部材２は、第１の抗原決定基とは異なる部位に位置する第２の抗原決定基を認識する第２の抗体（例：半導体ナノ粒子標識プローブ）を含浸した部材からなる。該第２の抗体は、適当な標識物質であらかじめ標識されていることが好ましい。【００５０】
含浸部材２としては、例えば、ガラス繊維不織布、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類などが使用できる。【００５１】
上記含浸部材２のクロマトグラフィー展開する側の反対方向の上記イムノクロマトストリップの末端には、被検物質を含む検体を添加するために、試料添加用部材５を設けてもよい。また、上記含浸部材２のクロマトグラフィー展開する方向の上記イムノクロマトストリップの末端には、クロマトグラフィー展開した検体を吸収するために、吸収用部材４を設けることが望ましい。吸収用部材４を設けることによって、クロマトグラフィー展開を促進することができる。【００５２】
上記イムノクロマトストリップはこれに限定されず、当業者は適宜変形・変更を加えてもよい。【００５３】
＜検出キット＞
本発明の検出方法に使用される検出キットは、被検出物質に結合することができる半導体ナノ粒子標識プローブを用いた、マイクロプレート（９６穴マイクロプレート等）、アフィニティビーズ、イムノクロマトストリップなどの半導体ナノ粒子標識プローブ含有担体を必須の構成要素とし、必要に応じて検体を溶解するための溶解液、反応試薬、検出試薬を含んでもよい。さらに、本発明の方法を実施するために必要とされる各種器材または資材、試薬を含んでもよい。該試薬は、試料溶解液、希釈液、緩衝液、洗浄液、反応停止剤、（生成物）抽出液なども含むことができる。【００５４】
さらに、検出キットの構成要素として、検量線作成用の標準物質、説明書さらに多数検体の同時処理が可能なマイクロプレートおよびその検出装置であるプレートリーダーなどの必要な器材一式なども含んでよい。【００５５】
本発明の検査方法に使用される検出キットの好ましい態様は、少なくとも、被検出物質に結合することができる、半導体ナノ粒子により標識された抗体を用いたイムノクロマトストリップ、検体の希釈液、および半導体ナノ粒子を励起する光源を含む。
【実施例】
【００５６】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００５７】
（実施例１）
＜Ｓｉナノ粒子の調製＞
ジオクチルエーテル５０ｍｌにオレイン酸１ｍｌとオレイルアミン１ｍｌとを添加し、よく攪拌した後、脱気しながら１００℃まで加熱した。３時間攪拌後、反応容器をアルゴンで満たしながら２００℃まで加熱した。１時間攪拌後、３０秒間でＳｉＣｌ4を１ｍｌ滴下して、その後、３０分間攪拌した。１００℃まで冷却して５時間攪拌後、さらに室温まで冷却し、Ｓｉナノ粒子を得た。Ｓｉナノ粒子の比重は２．３であった。平均粒径は、３．０ｎｍであった。【００５８】
＜Ｓｉナノ粒子標識抗体の調製＞
まず、上述のようにして得られたＳｉナノ粒子に、還元剤としての水素化リチウムアルミニウムおよびアリルアミンを添加し、ジオクチルエーテル中で混合することによって、アミノ基が表面官能基として存在するＳｉナノ粒子を得た。その溶液を濾過して粒子を分取後、洗浄したのち、乾燥させた。得られたＳｉナノ粒子をｐＨ５．０の水溶液に分散させた。これらのアミノ基にチオール反応性を持つマレイミド基を結合させて転換反応を行った。つまり、二価性のクロスリンカー試薬である４−（マレイミドメチル）−１−シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−１−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ；ＳＭＣＣ）を用いて、反応を行った後、ゲルろ過クロマトグラフィーを約６０分間行うことによって、このように活性化されたＳｉナノ粒子から余分なクロスリンカーを除去した。【００５９】
次に、抗体（完全なＩｇＧ分子）にチオール基を生じさせて、上記マレイミド基により活性化されたＳｉナノ粒子を標識するために、抗体に対してジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理を行い、抗体が最初の状態から持つジスルフィド結合を還元させた。この反応後に、ゲルろ過クロマトグラフィーを行うことによって、余分になった還元用試薬ＤＴＴを除去した。このようにして得られたチオール基を有する抗体と上記マレイミド基により活性化されたＳｉナノ粒子とを反応させ、抗体表面上にＳｉナノ粒子を結合させた。Ｓｉナノ粒子表面の反応に関与していない余分なマレイミド基を２−メルカプトエタノールを添加することによってブロッキングした。【００６０】
最後に、Ｓｉナノ粒子が標識されていない抗体をＳｉナノ粒子標識抗体から除去するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（Ｒ）  ２００により充填されたカラムを利用した、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって行った。つまり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（Ｒ）  ２００をカラムに充填し、あらかじめリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によりカラムを平衡化させた後、限外ろ過法によって濃縮された上記混合物をこのカラムにロードした。この混合物をＰＢＳで溶出させ、最終的に１００〜１２０μＬ溶液として回収した。最終的に得られた溶液は、フリーで標識されていない抗体が含有されていない溶液であり、これを最適な濃度に希釈することによって、以下の実施例において用いた。【００６１】
＜イムノクロマトストリップの作製＞
幅５ｍｍ、長さ４０ｍｍの細長い帯状のニトロセルロースフィルターをクロマトグラフィー展開用膜担体として用意した。抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の緩衝液を０．１％トレハロース１０ｍＭクエン酸緩衝液に置換し、適量を膜担体の末端の方に滴下し、乾燥させて捕捉部位とした。【００６２】
また、５×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不繊布にＳｉナノ粒子標識抗体を含浸し、乾燥させてＳｉナノ粒子標識抗体含浸部材とした。【００６３】
次に試料添加用部材である綿布、Ｓｉナノ粒子標識抗体含浸部材、クロマトグラフィー展開用膜担体および吸収用部材である帯状のろ紙のそれぞれを帯状の粘着シートの粘着面の所定位置に貼ってイムノクロマトストリップとした。【００６４】
＜イムノクロマト法による測定＞
市販されているＡ型インフルエンザ由来核タンパク質を展開溶媒（ＰＢＳ）に１８００倍、１０００倍、５００倍に希釈し、検体希釈液とした。なお、ブランクとして展開溶媒のみ用意した。検体希釈液と展開溶媒のみをイムノクロマトストリップの試料添加部材上に滴下した。液が膜担体に展開し、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を吸着させた部分の膜部材から発光する、励起光源３５０ｎｍを照射したときの赤色蛍光を肉眼で観察した。赤色蛍光の発光によって、検体希釈液中のＡ型インフルエンザウイルスの存在が確認される。色の変化がなく膜担体の色のままであれば、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが存在しないことになる。【００６５】
その結果を、表１に示す。表中の記号は、それぞれ下記のとおりである。【００６６】
＋＋＋：強い呈色が認められた。【００６７】
＋＋  ：普通に呈色が認められた。【００６８】
＋    ：ごくわずかに呈色が認められた。【００６９】
−    ：呈色が認められなかった。【００７０】
（実施例２）
＜ＣｄＳｅナノ粒子の調製＞
丸底フラスコにセレンペレット１ｇとトリオクチルホスフィン１１．３ｇとを入れ、Ａｒ雰囲気で１５０℃、１時間攪拌を行った。そこに酸化トリオクチルホスフィン３８．６ｇを加えて、８０℃、４０分間Ａｒ除去を行った。その後、酢酸カドミウム二水和物３．９ｇを加え、Ａｒ除去を行いながら８０℃、４時間撹拌してＣｄＳｅナノ粒子を得た。ＣｄＳｅナノ粒子の比重を測定したら６．８であった。平均粒径は、４．０ｎｍであった。【００７１】
実施例1のＳｉナノ粒子の代わりにＣｄＳｅナノ粒子を用いた他は、実施例１と同様にしてイムノクロマト法により測定した。目視判定を行う際には、３５０ｎｍ励起光を用いた。【００７２】
その結果を、表１に示す。【００７３】
〔比較例１〕
＜金コロイド粒子の調製＞
９９ｍｌの超純水を沸騰させ、塩化金酸水溶液１ｍｌを加えてさらにその後１質量％クエン酸ナトリウム水溶液１．５ｍｌを加え、還流した。その後、室温に放置して冷却し、懸濁液を得た。【００７４】
＜金コロイド標識抗体の調製＞
この懸濁液に炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨ７．６に調整する。ホウ酸溶液で透析、遠心分離して精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体をホウ酸１ｍＬ当り１０μｇとなる割合で加えて調製し、攪拌させながら金コロイドを加えた。濃度３０質量％のＢＳＡを０．１ｍｌ加え、ローテーターで攪拌した。全量を遠心沈降処理し、沈殿している金コロイドと抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の感作されたものとに、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液と１％ＢＳＡと２００ｍＭ塩化ナトリウムとの混合液１ｍｌを加えることによって調製した。【００７５】
実施例1のＳｉナノ粒子の代わりに金コロイドを用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト法により測定した。抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を吸着させた部分の膜部材が金コロイドの色に着色していれば、サンプル中のＡ型インフルエンザウイルスが存在していたと確認される。色の変化がなく膜担体の色のままであれば、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが存在していないことになる。【００７６】
その結果を、表１に示す。【００７７】
〔比較例２〕
比較例１の金コロイドの代わりにＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）を用いた以外は、比較例１と同様にしてイムノクロマト法測定を行い、蛍光リーダー（コスモバイオ社製、ジェニオスプロ）で蛍光を読み取った。【００７８】
その結果を、表１に示す。【００７９】
【表１】
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【００８０】
本発明の方法と装置によれば、蛍光色素の場合のような検出専用装置を必要とすることなく、簡易的に目視で判定をする事ができ、かつ金コロイドを用いた場合と比較して微量の被検出物質でも高い検出感度が得られた。しかも、実施例１と実施例２との比較からわかるように比重３以下のＳｉ粒子を使った場合、より良好な結果が得られた。これは比重の差により特異性の違いが表れた結果であると考えられる。
【図１】
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【国際調査報告】
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