(57)【要約】本発明においては、アミロイドβペプチドのミミックペプチドから、異常アミロイドβペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するペプチドを見出し、これをワクチン又は免疫原として利用する。  本発明は、次式（Ｉ）：  Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ        （Ｉ）で示されるアミノ酸配列、及び次式（ＩＩ）：  Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ        （ＩＩ）で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物を含有する医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ        （Ｉ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩ）：
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ        （ＩＩ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物を含有する医薬組成物。
【請求項２】
次式（Ｉａ）：
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ        （Ｉａ）
（式中、２つのシステイン残基は架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列、
次式（Ｉｂ）：
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ        （Ｉｂ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩａ）：
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ        （ＩＩａ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数９〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物を含有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、前記アミノ酸配列と、次式：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
で示されるＴＡＴ配列とを含む、アミノ酸残基数２０〜３０のペプチドである請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
更にアジュバントを含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アミロイドβ線維化阻害剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アルツハイマー病の予防・治療剤である請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
次式（Ｉ）：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ        （Ｉ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩ）：
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ        （ＩＩ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物からなる免疫原。
【請求項８】
次式（Ｉａ）：
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ        （Ｉａ）
（式中、２つのシステイン残基は架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列、
次式（Ｉｂ）：
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ        （Ｉｂ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩａ）：
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ        （ＩＩａ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数９〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物からなる請求項７記載の免疫原。
【請求項９】
前記ペプチドが、前記アミノ酸配列と、次式：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
で示されるＴＡＴ配列とを含む、アミノ酸残基数２０〜３０のペプチドである請求項７又は８記載の免疫原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防・治療剤として有用なペプチドワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、老人人口の増加に伴い、老人性痴呆症の治療に有効な医薬品の開発が強く望まれている。老人性痴呆症の代表的疾患であるアルツハイマー病は、脳の萎縮、老人斑の沈着及び神経原線維変化を特徴とする神経変性疾患で、アミロイドβペプチドの形状変化と、それに伴う線維化による不溶化分子が神経細胞に沈着し、その毒性により神経細胞の死が誘導され、発症する。
アミロイドβペプチド（Ａβ）はニューロンアミロイド前駆体蛋白質からβセクレターゼなどによる切断で生じる分解物で、Ａβ１−４０とＡβ１−４２の２種が生成するが、Ａβ１−４２の方がより凝集しやすく、疾患及び神経毒性と相関することが報告されている。
アミロイドβペプチドの形状変化及び線維化を阻害できれば、アルツハイマー病の発症を阻止することができる。
国際公開第２００５／１０５９９８号パンフレットには、Ａβ１−４２と特異的に結合し、その線維化反応を阻害する活性を有する一本鎖抗体がアルツハイマー病の予防・治療剤として有用であることが記載されている。
しかしながら、抗体は高分子の蛋白質であるため高価であり、生産、精製工程の煩雑化、あるいは安定性の欠如といった問題を有する。
ヒトにおいて、この免疫反応を誘導する手段は、ワクチンを開発することであるが、この免疫抗原として何を使用するかが最も重要な問題点である。
現在アルツハイマー病の予防及び治療のためにペプチドをワクチンとする試みには、正常なアミロイドβのアミノ酸配列の一部を抗原として用いるという多数の報告（例えば、国際公開第２００６／１２１６５６号パンフレット、Ｇ．Ｇ．Ｋｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ａｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｎｅｕｒｏ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４：ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，ｐ．２５１，２００７）とアミロイドβのミモトープと呼ぶ新規に開発したペプチド配列を抗原として用いる報告（特表２００６−５１５８７６号公報、Ｍ．Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＡＦＦｉＲｉｓ  ｍｉｍｏｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＤ，Ｎｅｕｒｏ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４：ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，ｐ．２５０，２００７）がある。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、アミロイドβペプチドのミミックペプチドから、異常アミロイドβペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するペプチドを見出し、これをワクチン又は免疫原として利用することを目的とする。
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ        （Ｉ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩ）：
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ        （ＩＩ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物を含有する医薬組成物。
（２）次式（Ｉａ）：
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ        （Ｉａ）
（式中、２つのシステイン残基は架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列、
次式（Ｉｂ）：
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ        （Ｉｂ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩａ）：
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ        （ＩＩａ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数９〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物を含有する前記（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記ペプチドが、前記アミノ酸配列と、次式：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
で示されるＴＡＴ配列とを含む、アミノ酸残基数２０〜３０のペプチドである前記（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）更にアジュバントを含有する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）アミロイドβ線維化阻害剤である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）アルツハイマー病の予防・治療剤である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）次式（Ｉ）：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ        （Ｉ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩ）：
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ        （ＩＩ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物からなる免疫原。
（８）次式（Ｉａ）：
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ        （Ｉａ）
（式中、２つのシステイン残基は架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列、
次式（Ｉｂ）：
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ        （Ｉｂ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩａ）：
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ        （ＩＩａ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数９〜３０のペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物からなる前記（７）に記載の免疫原。
（９）前記ペプチドが、前記アミノ酸配列と、次式：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
で示されるＴＡＴ配列とを含む、アミノ酸残基数２０〜３０のペプチドである前記（７）又は（８）に記載の免疫原。
本発明に用いるペプチドは、
次式（Ｉ）：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ        （Ｉ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩ）：
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ        （ＩＩ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８〜３０のペプチドである。
本発明に用いるペプチドは、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列と前記式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列とを含んでいてもよい。
本発明に用いるペプチドとしては、例えば
次式（Ｉａ）：
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ        （Ｉａ）
（式中、２つのシステイン残基は架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列、
次式（Ｉｂ）：
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ        （Ｉｂ）
で示されるアミノ酸配列、及び
次式（ＩＩａ）：
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ        （ＩＩａ）
で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数９〜３０のペプチドが挙げられる。
本発明に用いるペプチドにおいて、前記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列により構成されるペプチドが薬学的に許容されるものであれば特に制限はなく、例えば次式：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
で示されるＴＡＴ配列、ペプチドの溶解性を高めるアミノ酸配列（例えば、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸からなる配列）、細胞膜透過性を促進するアミノ酸配列（例えば、レプチン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、インスリン、トランスフェリンの部分配列；１）Ｗ．Ｍ．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，３６：２９９−３２１，１９９９；２）Ｗ．Ｍ．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｒｏｊａｎ  ｈｏｒｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ｜Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１：１３１−１３９，２００２）が挙げられる。
本発明に用いるペプチドは、公知の方法によって化学合成することができ、例えばペプチド自動合成装置によって合成することができる。この基本的な合成過程はＲ．Ｂ．Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖａｎｃｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２：２２１−２９６（１９６９）に記載の方法を適用できる。この方法は、カルボキシル末端のアミノ酸を樹脂担体に共有結合させておき、α−アミノ基の保護基の除去、保護アミノ酸の縮合を順次繰返して、アミノ末端に向けてペプチド鎖を延長させ目的のアミノ酸配列を有するペプチド樹脂を得ることを原理とするものである。
各アミノ酸の縮合やα−アミノ基の保護基の除去等は、Ｂｏｃ，Ｆｍｏｃ法を利用してほぼ同一の条件でなされ、中間体の精製も行わないため、合成に際しては一般に高度な熟練は要求されない。しかもこの方法は迅速であり、種々のペプチドを合成するに際し、非常に便利な方法である。こうして得られた保護ペプチド樹脂を、例えば無水フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸もしくはトリフルオロ酢酸と種々の添加物の共存下に反応させることにより、ペプチドを樹脂から脱離させることと全保護基の除去を一段階で行うことができる。
樹脂担体としてカルボキシル末端カルボン酸型ペプチド合成用樹脂を用いれば、カルボキシル末端がカルボキシル基であるペプチドを得ることができ、カルボキシル末端アミド型ペプチド合成用樹脂を用いれば、カルボキシル末端カルボン酸がアミド化されたペプチドを得ることができる。
得られたペプチド粗製物は、ペプチドを精製する公知の手段で精製することができる。例えば、ゲル濾過、陽イオン交換樹脂もしくは陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー、更には疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロマトグラフィーなど、種々の原理によるカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明に用いるペプチドは、システイン残基の間で架橋されていてもよい。これらの架橋としては、システイン残基間を直接ジスルフィド架橋してもよく、またスペーサーとしてジスルフィド化合物を用いて、スペーサーを介してジスルフィド架橋してもよい。ジスルフィド架橋は、例えばペプチドの希釈水溶液をＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］で酸化、又は酸性条件下のヨウ素で酸化することにより形成することができる。
本発明に用いるペプチドは種々の塩の形で得ることできる。その塩としては、例えば無機酸や、蟻酸、酢酸、酒石酸、クエン酸などの有機酸との塩、もしくはナトリウムやアンモニアなどの無機塩基や、トリエチルアミン、エチルアミン、メチルアミンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
本発明に用いるペプチド（以下「ミミックペプチド」という。）は、免疫原性を増強するため、タンパク質、多糖類、糖タンパク質等の担体と結合させて用いることが好ましい。担体としては、ヒトに免疫原性を有する分子であれば利用できるが、好ましくはそれ自身がヒトに有害でないとともに、この分子に免疫応答が誘導されても、ヒトに副作用が発生しないものを用いる。好ましい担体としては、細菌やウイルス由来の分子、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳ワクチン、又はこれらの３種混合ワクチン；ＢＣＧワクチン、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＯＭＰＣ）、デキストラン、マンノース、マンナン等が挙げられる。また、本発明の組成物を経口投与する場合は、食品のタンパク質成分にミミックペプチドを結合させてもよく、また遺伝子改変によりこのペプチド配列を含む食品タンパク質を作成し、これを食品として食すことにより経口免疫してもよい。
担体は、本発明に用いるミミックペプチドのアミノ末端、カルボキシル末端、配列途中のアミノ酸残基のいずれに結合させてもよく、また１分子の担体に複数のミミックペプチドを結合又は重合させてもよい。
ミミックペプチドを担体に結合させる方法としては、特に制限はないが、例えば１）共有結合で直接結合させる、２）クロスリンカーで架橋する（例えば、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ペンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法）、３）ビオチンとストレプトアビジン又はアビジンとの結合を利用する等の方法、４）ＤＮＡ配列として直列に融合するよう配置して遺伝子組換え体として作製する手法が挙げられる。ミミックペプチドのビオチン化はアミノ末端、カルボキシル末端、配列途中のアミノ酸残基のいずれでもよい。ペプチドのアミノ基のビオチン化はアミノ酸誘導体を樹脂上で縮合する通常のＨＯＢｔ−ＤＣＣ，ＨＢＴｕ−ＨＯＢｔ方法などで可能である。
ミミックペプチド、又はミミックペプチドと担体の結合物は、アジュバントと混合して投与することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の、ヒトワクチンに利用される公知のものを用いることができる。
本発明の医薬組成物は、異常アミロイドβペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する作用を有し、ワクチンとしてアルツハイマー病の予防・治療に用いることができる。
本発明の免疫原は、異常アミロイドβペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する作用を有し、異常アミロイドβペプチドに特異的な抗体の製造に用いることもできる。
本発明に用いるミミックペプチド、又は該ペプチドと担体との結合物（以下「ワクチン成分」という。）を含有する組成物は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体、賦形剤等と混合した医薬組成物として経口又は非経口的（好ましくは皮下、皮内、点鼻）に投与することができる。
経口投与のための剤形としては、具体的には錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。かかる剤形は、自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例えば錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、マルトース、ショ糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。また、前記のように食品のタンパク質成分にミミックペプチドを結合させた場合及び遺伝子改変によりこの当該ペプチド配列を含む食品タンパク質を作成した場合は、食品として食すこともできる。
非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤、局所徐放剤等が挙げられる。溶液製剤は自体公知の方法、例えば、ワクチン成分を通常、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解、更には乳化して、リポソームに包埋させた状態で調製されうる。ペプチドは生体内でペプチダーゼ等による分解を受け易く、また目的の場所への到達性の問題等があることから、ここに述べたリポソームを含む適切なデリバリー法の活用は好ましい使用形態の一つである。ペプチドのデリバリー法の活用については前記リポソームを用いる方法はその一つであるが、これに限られたものではない。固体製剤は、自体公知の方法、例えば、ワクチン成分にマンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコース等を賦形剤として加え、そのまま凍結乾燥することにより調製されうる。更にこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸やグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、自体公知の方法、例えば、ワクチン成分をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の増粘剤や多糖に溶解した状態で調製されうる。
いずれの製剤においても、安定化剤としてヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクログロブリン、アミノ酸等を添加することができ、また分散剤あるいは吸収促進剤としてワクチン成分の活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を添加することができる。また、微量金属や有機酸塩も必要に応じて加えることができる。
本発明の医薬組成物において、免疫原となるミミックペプチドとしての投与量は、当該ペプチドの活性、患者の年令、体重、疾患の種類又は程度により異なるが、一般には、経口投与では、通常１日０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、皮下投与、皮内投与又は点鼻投与では、通常１日０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は、通常経口投与では１日１〜３回、皮下投与、皮内投与又は点鼻投与では１日１〜２回である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｂ６  ｓｃＦｖに結合したペプチドファージクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
図２は、Ｄ１  ｓｃＦｖに結合した１２ｍｅｒペプチドファージクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
図３は、Ｄ１  ｓｃＦｖに結合したＣ７ＣペプチドファージクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
図４は、ペプチドファージによるＡβ１−４２ペプチドの線維化阻害実験の結果を示す図である。
図５は、Ａβ１−４２の線維化を阻害するＢ６  ｓｃＦｖ、Ｂ７  ｓｃＦｖ又はＤ１  ｓｃＦｖを鋳型として単離したファージクローンの提示するペプチド配列一覧を示す図である。
図６は、ビオチン化したＢ６又はＢ７  ｓｃＦｖ結合性配列とＴＡＴ配列との融合分子を示す図である。
図７は、ＴＡＴとＢ６−Ｌ１の融合ペプチドがＢ６  ｓｃＦｖに認識されることを示す図である。
図８は、ＴＡＴとＢ６−Ｌ１、Ｂ７−Ｃ１５及びＢ７−Ｓ１５それぞれとの融合ペプチドのＡβ１−４２線維化阻害活性の測定結果を示す図である。
図９は、ＴＡＴとＢ６−Ｌ１及びＢ７−Ｃ１５それぞれとの融合ペプチドによるＡβコンホーマー（Ａβオリゴマー及びＡβ線維）の沈降実験の結果を示す図である。
図１０は、Ａβミミックペプチドを免疫したマウスにおける抗Ａβ抗体の誘導実験の結果を示す図である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００７−２７７６３８の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、製造例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
Ｋａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９：５７７−５８３（２００１）及びＳ．Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：４３−４９（２００３）に従って以下の実験を行った。
１．材料及び方法
（１）Ｅ−ｔａｇカラムによるｓｃＦｖの精製
Ａβに結合するｓｃＦｖを発現させるために、Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：４３−４９（２００３））によりｓｃＦｖファージクローンを大腸菌株ＨＢ２１５１に感染させた。得られた培地上清からＥ−ｔａｇカラムＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてアミロイド特異的ｓｃＦｖ（Ｂ６、Ｂ７、Ｄ１、Ｆ１０）を精製した。
Ｂ６ｓｃＦｖ（ＷＯ２００５／１０５９９８のクローンＢ６）のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１に、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
Ｂ７ｓｃＦｖ（ＷＯ２００５／１０５９９８のクローンＢ７）のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号３に、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
Ｄ１ｓｃＦｖ（ＷＯ２００５／１０５９９８のクローンＤ１）のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号５に、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
Ｆ１０ｓｃＦｖ（ＷＯ２００５／１０５９９８のクローンＦ１０）のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号７に、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
（２）ペプチドファージライブラリー
ファージのｇｅｎｅＩＩＩ蛋白のアミノ末端に１２個のランダムなアミノ酸配列を提示したＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）及びファージのｇｅｎｅＩＩＩ蛋白のアミノ末端にシステインとシステインの間に７つのアミノ酸配列を含むペプチドを提示するＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を用いた。
（３）バイオパニング
鋳型となるヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ：Ｂ６、Ｂ７、Ｄ１又はＦ１０）又はコントロールｓｃＦｖ  １μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６）をＭａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅに４℃で６時間コートした。ブロッキング溶液としてそれぞれのウェルを１ｓｔパニングでは０．５％ゼラチン，２ｎｄパニングでは０．２５％ＢＳＡ，３ｒｄパニングでは０．５％ゼラチンを用いて４℃で１４時間ブロックした。１２ｍｅｒ又はＣ７Ｃペプチドファージライブラリーをブロッキング溶液で希釈後（１．５  ｘ  １０１２ｐｆｕ／１００μｌ）３０分静置後、コントロールｓｃＦｖで吸収操作を行った。すなわち、コントロールｓｃＦｖをコートしたウェルを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄しファージ溶液を加え室温で１時間反応させ、コントロールｓｃＦｖと結合しなかったファージ溶液を回収した。このファージ溶液を鋳型とするｓｃＦｖをコートしたウェルに加え室温で１時間反応させた。０．２％ＰＢＳＴを用いて１０回洗浄後１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン塩酸ｐＨ２．２を１００μｌ加え室温で５分置くことにより結合したファージを回収し、ただちに１Ｍトリス塩酸ｐＨ９．１を１５μｌ加え中和した。回収したファージを大腸菌ＥＲ２７３８に感染させ増幅させ、２，３ラウンドのパニングに用いた（１．５  ｘ  １０１２ｐｆｕ／１００μｌ）。
（４）ファージクローンの単離
パニングを２回行った後、回収したファージをＥＲ２７３８に感染させＬＢ／Ｔｅｔ／Ｘ−ｇａｌ  ｐｌａｔｅで培養した。溶菌してできたプラークを再度ＥＲ２７３８に感染させ、ファージクローンを単離した。
（５）ＥＬＩＳＡ
パニングで鋳型としたｓｃＦｖ又はコントロールｓｃＦｖ  ５０ｎｇ／４０μｌ／ｗｅｌｌ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６）をＥＬＩＳＡプレートに４℃で６時間コートした。０．５％ゼラチンを用いて４℃で１３時間ブロックした。０．２％ＰＢＳＴを用いてウェルを３回洗浄後、単離したペプチドファージクローン溶液（約１．６  ｘ  １０１１ｖｉｒｉｏｎｓ／４０μｌ）を加え室温で１時間反応させた。結合したファージは４０μｌのビオチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体（１０００倍希釈）、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（１０００倍希釈）を反応させた後、基質パラニトロフェニルリン酸を用いて検出した。
（６）ＤＮＡ塩基配列解析
特異性の認められたファージクローンをフェノール／クロロホルム処理して除蛋白した後、エタノール沈殿でＤＮＡを精製し、塩基配列決定の鋳型とした。ｐｒｉｍｅｒ−９６ｇＩＩＩ（１ｐｇ／μｌ）５’−ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＡＡ  ＣＧ−３’（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）を用いて、ランダムなペプチド配列が挿入されている領域の遺伝子増幅を行い、ＤＮＡ塩基配列決定を行った。
（７）ペプチド合成
ペプチドは、一般的な固相ペプチド合成法、Ｆｍｏｃ／ＨＢＴｕ＋ＨＯＢｔ法により合成した。ペプチドＢ６−Ｌ１，Ｂ７−Ｃ１５，Ｂ７−Ｓ１５のそれぞれにＴＡＴ配列を連結したペプチドを合成した。なお、Ｂ７−Ｃ１５については、カルボキシル末端側にグリシンを付加したものにＴＡＴ配列を連結した。ちなみにＴＡＴ配列は脳血管関門を通過する機能をもつペプチド配列である（Ｐ．Ｊａｒｖｅｒ  ａｎｄ  Ｕｌｏ  Ｌａｎｇｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ＤＤＴ，９：３９５−４０１，２００４）である。
なお、Ｂ６−Ｌ１，Ｂ７−Ｃ１５，Ｂ７−Ｓ１５のそれぞれの配列のアミノ末端側にＴＡＴ配列を融合したものがＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｓ１５であり、Ｂ６−Ｌ１の配列のカルボキシル末端側にＴＡＴ配列を融合したものがＢ６−Ｌ１−ＴＡＴである。このペプチドの結合を検出するためにペプチドのアミノ末端にビオチンが結合しているペプチド配列として合成した。
Ｂ６−Ｌ１，Ｂ７−Ｃ１５，Ｂ７−Ｓ１５、及びこれらとＴＡＴ配列との融合分子のアミノ酸配列と配列番号との関係は以下のとおりである。
2009054537.tif 000002
（８）アミロイドβ線維化阻害実験
２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０を用いて４０μＭに希釈したＡβ１−４２ペプチドに合成したペプチド（ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，Ｂ６−Ｌ１−ＴＡＴ，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｓ１５）を様々な濃度（１．６５ｎＭ，１６．５ｎＭ，３３ｎＭ）で加えた。０，６，２４時間に１０μｌのサンプルを回収し１１μＭのチオフラビンＴ（Ｓｉｇｍａ）／リン酸バッファー９０μｌを加えマルチラベルプレートカウンター、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用い、４５０ｎｍの励起光により発生する４８２ｎｍの蛍光強度を測定した。
（９）Ａβ線維化阻害ペプチドによるＡβコンホーマー（Ａβオリゴマー及びＡβ線維）の沈降実験
Ａβ１−４２を２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０に４０μＭの濃度で溶解し、その１．５時間目に、４０μＭに調製したＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１又はＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５ペプチドを液量比（１：１）で加え３７℃で１時間反応させた（最終濃度：Ａβ［２０μＭ］／合成ペプチド［２０μＭ］）。反応後、免疫沈降前のサンプルを「沈降前」として一部サンプリングし、残りのサンプルを２０μｇ／μｌに調製したＭ−２８０ストレプトアビジン−マグネットビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）と液量比（１：１）で氷上で１時間反応させた（最終濃度：Ａβ［１０μＭ］／合成ペプチド［１０μＭ］／ビーズ［１０μｇ／μｌ］）。反応後、マグネットによりビーズを沈降させ上清を「上清」とした。沈降したビーズに回収した上清と等液量のＰＢＳを加え「沈殿物」とした。得られた各サンプルを電気泳動し、抗Ａβ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析を行った。
２．結果
（１）Ａβ特異的ｓｃＦｖに結合するペプチドファージクローン
（ａ）Ｂ６  ｓｃＦｖに結合したペプチドファージクローンのＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。無関係のｓｃＦｖ（コントロールｓｃＦｖ）としてＦｖ１Ｅ１というＡβの線維化を阻害しない抗体を用いた。ファージライブラリーは１２ｍｅｒのアミノ酸配列を提示するＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を用いた。実験は前記（５）ＥＬＩＳＡで記したとおりに行った。
（ｂ）Ｄ１  ｓｃＦｖに結合した１２ｍｅｒペプチドファージクローンのＥＬＩＳＡの結果を図２に示す。無関係のｓｃＦｖ（コントロールｓｃＦｖ）としてＭＹ５ＲというＡβの線維化を阻害しない抗体を用いた。ファージライブラリーは１２ｍｅｒのアミノ酸配列を提示するＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を用いた。実験は前記（５）ＥＬＩＳＡで記したとおりに行った。
（ｃ）Ｄ１  ｓｃＦｖに結合したＣ７ＣペプチドファージクローンのＥＬＩＳＡの結果を図３に示す。無関係のｓｃＦｖ（コントロールｓｃＦｖ）としてＭＹ５ＲというＡβの線維化を阻害しない抗体を用いた。ファージライブラリーはシステインとシステインの間に７つのアミノ酸配列を含むペプチドを提示するＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を用いた。実験は前記（５）ＥＬＩＳＡで記したとおりに行った。
（２）Ｂ６結合性ペプチドファージのＡβ１−４２線維化阻害活性
Ｂ６結合性ペプチドファージによるＡβ１−４２ペプチドの線維化阻害実験の結果を図４に示す。Ａβ１−４２線維化阻害実験は前記（８）線維化阻害実験で記したとおりに行った。ｐｅｐＢ６−Ｌ１及びｐｅｐＢ６−Ｌ１０は、Ａβ１−４２の線維化を阻害するＢ６  ｓｃＦｖを鋳型として、それに結合するファージクローンであり、ｐｅｐ１Ｅ１−Ｌ１，１−Ｌ２，１−Ｌ４，１−Ｌ１２は、Ａβ１−４２の線維化を阻害しないＦｖ１Ｅ１  ｓｃＦｖ（ＷＯ２００５−１０５９９８段落００７４〜００７５に記載）を鋳型として単離したファージクローンである。ここで用いたファージクローンの濃度は３．０  ｘ  １０１２ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍｌである。
（３）Ａβ特異的ｓｃＦｖのエピトープ（結合性配列）
Ａβ１−４２の線維化を阻害するＢ６  ｓｃＦｖ、Ｂ７  ｓｃＦｖ又はＤ１  ｓｃＦｖを鋳型として単離したファージクローンの提示するペプチドのアミノ酸配列一覧を図５に示す。ファージライブラリーとしてＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（図５中１２ｍｅｒ＊と略）又はＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃライブラリー（図５中Ｃ７Ｃ＊と略）を使用した。ｐｅｐＢ７−Ｃ１５とｐｅｐＢ６−Ｃ２，Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｃ８，Ｃ９，Ｃ１０，Ｃ１５及びｐｅｐＤ１−Ｃ５，Ｃ７，Ｃ２０は同一の配列であった。番号の前についているＬは１２ｍｅｒのライブラリーから、ＣはＣ７Ｃのライブラリーから単離されたクローンであることを示している。
各ファージクローンの提示するペプチドのアミノ酸配列と配列番号との関係は以下のとおりである。
2009054537.tif 000003
2009054537.tif 000004
（４）ビオチン化したＢ６又はＢ７  ｓｃＦｖ結合性配列とＴＡＴ配列との融合分子
ビオチン化したＢ６  ｓｃＦｖ結合性配列とＴＡＴ配列との融合分子を図６に示す。Ｂ６−Ｌ１，Ｂ７−Ｃ１５，Ｂ７−Ｓ１５のそれぞれの配列のアミノ末端側にＴＡＴ配列を融合したものがＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｓ１５であり、Ｂ６−Ｌ１の配列のカルボキシル末端側にＴＡＴ配列を融合したものがＢ６−Ｌ１−ＴＡＴである。ＴＡＴ配列は脳血管関門を通過する機能をもつペプチド配列である（Ｐ．Ｊａｒｖｅｒ  ａｎｄ  Ｕｌｏ  Ｌａｎｇｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ＤＤＴ，９：３９５−４０２，２００４）。これらのペプチドのアミノ末端をビオチンで標識し、このペプチドの結合を酵素標識したアビジンを用いて定量を行った。
（５）ＴＡＴとＢ６−Ｌ１の融合ペプチドはＢ６  ｓｃＦｖに認識された（図７）。合成ペプチド、ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１あるいはＢ６−Ｌ１−ＴＡＴを２００ｎｇ／ｗｅｌｌの条件でＥＬＩＳＡプレートにコートし、種々の濃度のＢ６  ｓｃＦｖを添加しその結合活性を検討した。コントロールペプチドとして無関係のペプチド（ＧＳＧＧＧＳＣＧＹＷＲＳＥＷＧＬＣＧ）を用いた。Ｂ６  ｓｃＦｖの量依存的な結合反応が確認された。
（６）ＴＡＴとＢ６−Ｌ１，Ｂ７−Ｃ１５，Ｂ７−Ｓ１５それぞれとの融合ペプチドのＡβ１−４２線維化阻害活性
ＴＡＴとＢ６−Ｌ１，Ｂ７−Ｃ１５，Ｂ７−Ｓ１５それぞれとの融合ペプチドのＡβ１−４２線維化阻害活性の測定結果を図８に示す。線維化阻害実験は前記線維化阻害実験で記したとおりに行った。ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，Ｂ６−Ｌ１−ＴＡＴ，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｓ１５は線維化阻害活性があることが明らかとなった。前記のコントロールペプチドは全く阻害活性を示さなかった。
（７）ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５ペプチドによるＡβコンホーマー（Ａβオリゴマー及びＡβ線維）の沈降実験
ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５ペプチドの沈降実験の結果を図９に示す。Ａβ１−４２を２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０に４０μＭの濃度で溶解し、その１．５時間目にビオチン化ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１又はビオチン化ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５ペプチドを加え結合物をストレプトアビジン−マグネットビーズで沈降させた。沈降前はＡβオリゴマーやＡβ線維などのバンドが確認できるが、ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５ペプチドで沈降を行った上清にはＡβオリゴマーやＡβ線維は確認されず、沈殿物の方で確認できた。この結果からＡβ１−４２溶解後１．５時間目に形成されるＡβオリゴマーやＡβ線維とＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１，ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５ペプチドが結合することが明らかとなった。無関係なコントロールペプチドでは沈降反応は認められなかった（図９には示されていない）。
【実施例２】
【０００７】
１．材料・方法
（１）抗原調製と免疫
ＰＢＳで各濃度に調整したストレプトアビジン（６．６μＭ）と実施例１の１．（７）「ペプチド合成」で得たビオチン化ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５、ビオチン化ＴＡＴ−Ｂ７−Ｓ１５又はビオチン化ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１ペプチド（２６．４μＭ）を容量比１：１で混合（全タンパク濃度：５００μｇ／ｍｌ）した後、４℃で一晩反応させストレプトアビジン複合体（ＳＡ−Ａｇ）を作製した。アジュバントである水酸化アルミニウムゲル（２０ｍｇ／ｍｌ）とＳＡ−Ａｇ（５００μｇ／ｍｌ）を容量比１：１で撹拌しながら混合し、水酸化アルミニウムゲルにＳＡ−Ａｇを吸着させた。８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に水酸化アルミニウムゲル／ＳＡ−Ａｇ懸濁液を２００μｌ免疫した（水酸化アルミニウムゲル：２ｍｇ，ＳＡ−Ａｇ：５０μｇ）。第一回目の免疫をＤａｙ  ０とし、Ｄａｙ  １５，３０，６０，９０の計５回、同様の操作で免疫を行った。水酸化アルミニウムゲルに線維化Ａβを混合し免疫したマウスをポジティブコントロールとし、水酸化アルミニウムゲルにＰＢＳを加え、免疫したマウスをネガティブコントロールとした。
（２）血清の採取
Ｄａｙ  １４，２９，５９，７４，１００にマウスの眼底から血液を採取し、等量のＰＢＳと混合した後、６０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い血清成分を採取した（２倍希釈）。
（３）血清中の抗Ａβ抗体の検出
９６穴プラスチックプレートに線維化Ａβ１−４２と可溶性Ａβ１−４２を加え一晩４℃でコートした（５０ｎｇ／４０μｌ／ｗｅｌｌ）。０．５％ゼラチンで２時間のブロックを行い０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳで２００倍に（原液血清に対して）希釈したＤａｙ  ７４血清を加え室温で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳによる洗浄を３回行った後、５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識−抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体を加え、室温で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳによる洗浄を３回行った後、パラニトロフェニルリン酸（２ｍｇ／ｍｌ）を含む基質溶液を加え、４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果は各血清がバックグラウンドである０．５％ゼラチンに対する反応値を差し引いた値で示した。
各血清（各実験群）の０．５％ゼラチンへの非特異的な結合活性（４０５ｎｍにおける吸光度；差し引いたＯＤ値）を以下に示す。
線維化Ａβ（Ａβ）：０．０７；ＴＡＴ−Ｂ７−Ｃ１５：０．０３５；ＴＡＴ−Ｂ６−Ｌ１：０．０２５５；ＴＡＴ−Ｂ７−Ｓ１５：０．０５８；ＰＢＳ：０．０２４；ｎｏｎｅ：０．０１６５
２．結果
Ａβミミックペプチドを免疫したマウスにおいて、線維化Ａβに結合する抗体が誘導されることが確認できた。更に、可溶性Ａβへの結合活性はバックグランドレベルであることから、Ａβミミックペプチドが線維化Ａβの３次元構造を模倣し、線維化Ａβに特異的な抗体を誘導することが明らかとなった。これらの結合活性はポジティブコントロールである線維化Ａβを免疫したマウスと同程度の値であった。結果を図１０に示す。
図１０のｘ軸方向にはマウスを免疫した分子を示し、ｙ軸は抗体反応の強さ（４０５ｎｍにおける吸光度）を示す。Ａβ１−４２  ｓｏｌｕｂｌｅは可溶性Ａβ（正常Ａβ）に対する抗体量、Ａβ１−４２  ｆｉｂｒｉｌは異常の線維化Ａβに対する抗体量を示す。破線は水酸化アルミニウムゲル／ＰＢＳで免疫した血清成分の各Ａβへの非特異的結合値でバックグランドの指標として表示した。
線維化Ａβで免疫すると、若干可溶性Ａβにも反応し、線維化Ａβには強く反応する抗体が産生されている（図１０のｘ軸のＡβ）。他のミミックペプチドによる免疫では、検出される可溶性Ａβに反応する抗体は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）のみを投与して産生されてくる非特異的抗体の量以下であり、線維化Ａβに反応する抗体が、有意に、かつ本物の線維化Ａβを免疫した時と、ほぼ同程度の抗体を誘導していることがわかる。
異常アミロイドβは脳内で神経細胞に毒性を発揮し、自殺死（アポトーシス）を誘導するため、アルツハイマー症の主症状の痴呆が発生する。
本発明のミミックペプチドで誘導された抗体は、正常アミロイド分子には反応しないため、正常自己成分に対する免疫反応が起こらないので副作用が発生しないが、異常アミロイドβペプチド集合体（アミロイドβの線維やオリゴマー、グロブロマー）に結合する。この結果、脳内から病因である異常アミロイド分子が脳内から血中に引き抜かれるとともに、脳内にある貪食細胞のミクログリア細胞にも貪食され、脳内の異常アミロイドβが消失する。したがって、このワクチンで誘導された異常アミロイドβ分子に特異的な抗体は、この殺傷性分子を脳内から排除する。これによりアルツハイマー病の予防、更には治療を達成することができる。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、異常アミロイドβペプチドに特異的な抗体の産生を誘導するワクチン又は免疫原を提供することができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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【国際調査報告】
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