(57)【要約】  ミッドカインに結合し、その活性を阻害する疎水性物質付加核酸およびそのナノ粒子を提供すること。  ミッドカインに結合し、その活性を阻害する疎水性物質付加核酸およびそのナノ粒子；さらにプレイオトロフィンに対する結合活性を有することを特徴とする核酸；当該核酸および機能性物質（例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体、又は薬物など）を含む複合体；当該核酸あるいは複合体を含む医薬または試薬；当該核酸あるいは複合体を用いることを特徴とするミッドカインの検出方法；当該ナノ粒子の製造方法など。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインに結合しその活性を阻害することを特徴とする、疎水性物質付加核酸。
【請求項２】
さらにプレイオトロフィンに対する阻害活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
疎水性物質がコレステロールである、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１〜１０のいずれかで表される核酸、あるいは配列番号１〜１０のいずれかで表される核酸に１〜３個の塩基が置換、欠失、付加または挿入した核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸及び機能性物質を含む複合体。
【請求項６】
機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸あるいは請求項５または６に記載の複合体を含む医薬または試薬。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸あるいは請求項５または６に記載の複合体を用いることを特徴とする、ミッドカインを検出する方法。
【請求項９】
核酸に疎水性物質を結合させることを特徴とする、核酸をナノ粒子化する方法。
【請求項１０】
（ａ）核酸に疎水性物質を結合させる工程；
（ｂ）（ａ）で得られた疎水性物質付加核酸を、中性塩溶液に溶解させる工程；
を含んでなる、核酸をナノ粒子化する方法。
【請求項１１】
０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で疎水性物質付加核酸を中性塩溶液に溶解させることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疎水性物質を結合させることを特徴とする、核酸の体内薬物動態を向上させる方法。
【請求項１３】
核酸が、生理活性を有する核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
疎水性物質がコレステロールである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
疎水性物質が結合してなる、核酸ナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸ナノ粒子を含有してなる医薬または試薬。
【請求項１７】
細胞遊走阻害剤である、請求項７または１６に記載の医薬または試薬。
【請求項１８】
調節性Ｔ細胞の増殖促進剤である、請求項７または１６に記載の医薬または試薬。
【請求項１９】
自己免疫性疾患または癌の予防・治療剤である、請求項７または１６に記載の医薬。
【請求項２０】
哺乳動物に対して、請求項１に記載の核酸の有効量を投与することを特徴とする、自己免疫性疾患または癌の予防・治療方法。
【請求項２１】
自己免疫性疾患または癌の予防・治療剤を製造するための、請求項１に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性物質付加核酸及びその使用方法、検出法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：以下、必要に応じて「ＭＫ」と記載する）は、肺性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。【０００３】
ＭＫはその立体構造がＮＭＲにより決定されている（例えば、非特許文献３参照）。ＭＫは、構造上の特徴より主として２つのフラグメントから構成されている。具体的には、例えばヒトＭＫの場合、１〜５２番目のアミノ酸からなるＮ末端側のフラグメント（以下、「Ｎ−フラグメント」という）、６２〜１２１番目のアミノ酸からなるＣ末端側のフラグメント（以下、「Ｃ−フラグメント」という）及びそれらを結合するループ領域（５３〜６１番目のアミノ酸）からなる。それぞれのフラグメントはドメインと塩基性アミノ酸に富むテイルからなる。ドメインは３本の逆βシート構造をとる（以下、１５〜５２番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のドメインを「Ｎ−ドメイン」、６２〜１０４番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のドメインを「Ｃ−ドメイン」という）。また、テイルは自由に動き特定の構造をとらない（以下、１〜１４番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のテイルを「Ｎ−テイル」、１０５〜１２１番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のテイルを「Ｃ−テイル」という）。【０００４】
ＭＫの受容体としては、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼζ（ＰＴＰζ）、ＬＲＰ（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＬＫ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｋｉｎａｓｅ）、インテグリン及びシンデカンなどが知られている。ＭＫは、塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を多く含んだ、正に強く帯電したタンパク質である。Ｃドメインにヘパリン結合部位を持ち、ヘパリンやコンドロイチン硫酸Ｅなど負に帯電した分子と強く結合することで知られている。変異導入解析とＮＭＲ解析の結果、ヘパリンとの結合にはＫ７９、Ｒ８１、Ｋ１０２で構成されるクラスターＩとＫ８６、Ｋ８７、Ｒ８９で構成されるクラスターＩＩが重要であると考えられている。一方、コンドロイチン硫酸Ｅとの結合にはクラスターＩのみが重要であるとする報告がある。クラスターＩのＲ８１をＡに変えると、ヘパリンとの結合能が低下する。その結果、ＰＴＰζへの結合能が低下したり、ＭＫによる神経細胞の突起伸長および移動が阻害される。例えば、シャーレをＭＫでコートしておき、この上にマウス胚の神経細胞をまくと、神経突起が伸長する。この際、神経細胞をヘパリチナーゼで消化すると神経突起の伸長が阻害される。一方、血管内皮細胞を培養しＭＫを添加すると、細胞のプラスミノーゲン活性化酵素の活性が上昇する。この場合も細胞をヘパリチナーゼ消化するとプラスミノーゲンの活性上昇が阻害される。【０００５】
このようにＭＫはグリコサミノグリカンに結合して活性を示す場合が多い。しかし、負に帯電したものはどんなものでもＭＫに結合するわけではない。コンドロイチン硫酸ＥやヘパリンはＭＫに強く結合するが、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはＭＫに結合しないことが知られている。この他、スルファチドやコレステロール−３−硫酸、高濃度ではホスファチジルセリンやホスファチジン酸に結合するが、レシチン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロールなどには結合しない（例えば、非特許文献４参照）。【０００６】
ＭＫは様々な生物活性を有することが知られている。例えば、ヒトの癌細胞においてＭＫの発現が増大していることが知られている。この発現の増大は、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍といった多様な癌で確認されている（例えば、特許文献１及び非特許文献５参照）。また、ＭＫは癌細胞の生存と移動を促進し、血管新生を促し、癌の進展を助けると考えられている。【０００７】
また、ＭＫは炎症像形成の過程で中核を占める分子の一つであることが知られている。例えば、血管に傷害を与えた時の新生内膜の形成と虚血傷害時の腎炎の発症が、ＭＫ遺伝子を欠失させたノックアウトマウスでは軽減されていることが知られている。また、リウマチモデル、手術後の癒着もノックアウトマウスで大きく軽減されることが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３及び特許文献４参照）。このように、ＭＫは、関節炎、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症、手術後の癒着、炎症性大腸炎、乾癬、狼瘡、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患に関与していることが知られている。更に、ＭＫはマクロファージや好中球といった炎症性細胞の移動（遊走）を促進することが知られている。この移動は炎症像の成立に必要なので、ミッドカインが欠失すると炎症に基盤がある病気が起こりにくいと考えられる（例えば、特許文献５参照）。【０００８】
また、進行子宮内膜症の女性の腹腔液において、ＭＫレベルが増加していること、及び、ＭＫが培養子宮内膜間質細胞の増殖を刺激することから、ＭＫが子宮内膜症の発症や進行に関与することが知られている（例えば、特許文献６参照）。【０００９】
また、ＭＫは、血管内膜肥厚作用を有することから、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患に関与することが知られている（例えば、特許文献２参照）。【００１０】
更に、ＭＫは、調節性Ｔ細胞の増殖を抑制することが知られている。このため、ＭＫ阻害剤は多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症など、調節性Ｔ細胞と関係する疾患の治療薬として利用可能である（特許文献７、非特許文献６）。【００１１】
細胞遊走は、癌細胞の浸潤・転移、動脈硬化巣での内膜肥厚、血管新生などの機序に重要であることが知られている。また、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、高血圧などの循環器疾患に、炎症性の細胞の遊走が深く関わっていることが知られている。【００１２】
プレイオトロフィン（ＰＴＮまたはＨＢ−ＧＡＭ；以下、必要に応じて「ＰＴＮ」と記載する）は、ＭＫの唯一のファミリータンパク質であって、ＭＫと約５０％のホモロジーを有している。ＭＫとＰＴＮはともにシステインと塩基性アミノ酸を多く含むタンパク質である。ＭＫとＰＴＮに存在する１０個全てのシステインは保存されており、ＰＴＮもＭＫと同様に、構造上Ｎ−ドメインとＣ−ドメインに分けることができる。ＮＭＲ解析の結果、これら２つの分子の三次元構造は非常によく似ていることがわかっている。それぞれのドメインは三つのβシートから成っており、フレキシブルなリンカー領域でつながれている。コンドロイチン硫酸やヘパリンとの結合に重要だと考えられているＫ７９、Ｒ８１、Ｋ１０２は両タンパク質間で保存されている。Ｋ７９とＲ８１は同一のβシート上に存在するが、Ｋ１０２は別のβシート上に存在する。ＭＫおよびＰＴＮが立体構造を形成すると、これらの塩基性アミノ酸はタンパク質表面近傍に現れる。【００１３】
ＭＫの活性を阻害する物質としては、低分子化合物、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどが考えられ、これらは上記疾患の治療または予防に有用であると考えられるが、既に承認されている医薬品や臨床試験中の医薬品候補品はない。近年、ＭＫに対する高性能なＲＮＡアプタマーが作製され、医薬品候補品として開発が進められている（特許文献７および８参照）。また、ＭＫに対して結合する低分子化合物についても報告されている（非特許文献４参照）。【００１４】
コレステロールが結合した核酸を医薬品化する試みは既に行われている。その多くはｓｉＲＮＡにコレステロールを結合したもので、細胞内へのデリバリー効率が向上する（例えば非特許文献７、８）。また、コレステロールが結合したアプタマーをリポソームに封入することで体内薬物動態が改善する（特許文献９、非特許文献９、１０）。一方でリポソーム製剤化していないコレステロール結合アプタマーはコレステロールが結合していないアプタマーと体内薬物動態が大きく変わらない結果が報告されている（非特許文献１１）。
【特許文献１】特開平６−１７２２１８号公報
【特許文献２】国際公開第２０００／１０６０８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８２１０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０８５６４２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第１９９９／０３４９３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／０１６５７１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００６／３２２６５９号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００８／０５９８７７号パンフレット
【特許文献９】国際公開第１９９６／３４８７６号パンフレット
【非特許文献１】Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：ｐ．１３１２−１３１８
【非特許文献２】Ｔｏｍｏｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６５：ｐ．１０７６５−１０７７０
【非特許文献３】Ｉｗａｓａｋｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，ｐ．６９３６−６９４６
【非特許文献４】Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，ｐ．３４４−３５１
【非特許文献５】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３２，ｐ．３５９−３７１
【非特許文献６】Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：ｐ．３９１５−３９２０
【非特許文献７】Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：ｐ．１７３−１７８
【非特許文献８】Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．６２：ｐ．６２７−６３３
【非特許文献９】ｄｅ  Ｓｍｉｄｔ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：ｐ．４６９５−４７００
【非特許文献１０】Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：ｐ．５７３−５８２
【非特許文献１１】Ｈｅａｌｙ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：ｐ２２３４−２２４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、疎水性物質付加核酸を提供することを目的とする。特に本発明は、ミッドカインの活性阻害能を有する疎水性物質付加核酸およびそのナノ粒子を提供することを目的とする。また、その使用方法、検出方法などを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ミッドカインの活性阻害能を有する疎水性物質付加核酸を作製することに成功した。また当該疎水性物質付加核酸がナノ粒子として存在し得ることが分かった。本発明者らはさらに鋭意検討し、本発明を完成するに至った。【００１７】
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］ミッドカインに結合しその活性を阻害することを特徴とする、疎水性物質付加核酸；
［２］さらにプレイオトロフィンに対する阻害活性を有することを特徴とする、［１］に記載の核酸；
［３］疎水性物質がコレステロールである、［１］または［２］に記載の核酸；
［４］配列番号１〜１０のいずれかで表される核酸、あるいは配列番号１〜１０のいずれかで表される核酸に１〜３個の塩基が置換、欠失、付加または挿入した核酸である、［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸；
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸及び機能性物質を含む複合体；
［６］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［５］に記載の複合体；
［７］［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸あるいは［５］または［６］に記載の複合体を含む医薬または試薬；
［８］［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸あるいは［５］または［６］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ミッドカインを検出する方法；
［９］核酸に疎水性物質を結合させることを特徴とする、核酸をナノ粒子化する方法；
［１０］（ａ）核酸に疎水性物質を結合させる工程；（ｂ）（ａ）で得られた疎水性物質付加核酸を、中性塩溶液に溶解させる工程；を含んでなる、核酸をナノ粒子化する方法；
［１１］０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で疎水性物質付加核酸を中性塩溶液に溶解させることを特徴とする、［１０］に記載の方法；
［１２］疎水性物質を結合させることを特徴とする、核酸の体内薬物動態を向上させる方法；
［１３］核酸が、生理活性を有する核酸である、［１２］に記載の方法；
［１４］疎水性物質がコレステロールである、［９］〜［１３］のいずれかに記載の方法；
［１５］疎水性物質が結合してなる、核酸ナノ粒子；
［１６］［１５］に記載の核酸ナノ粒子を含有してなる医薬または試薬；
［１７］細胞遊走阻害剤である、［７］または［１６］に記載の医薬または試薬；
［１８］調節性Ｔ細胞の増殖促進剤である、［７］または［１６］に記載の医薬または試薬；
［１９］自己免疫性疾患または癌の予防・治療剤である、［７］または［１６］に記載の医薬；
［２０］哺乳動物に対して、［１］に記載の核酸の有効量を投与することを特徴とする、自己免疫性疾患または癌の予防・治療方法；
［２１］自己免疫性疾患または癌の予防・治療剤を製造するための、［１］に記載の核酸の使用。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の疎水性物質付加核酸及び複合体は、自己免疫疾患、癌、術後癒着、子宮内膜症などの種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬などの試薬として有用であり得る。本発明の疎水性物質を付加した核酸及び複合体はまた、ＭＫの精製及び濃縮、並びにＭＫの検出及び定量に有用であり得る。【００１９】
本発明により得られる核酸ナノ粒子は、核酸分子が有する生理活性を保持しているだけでなく、より向上した生理活性と体内薬物動態を有しているので、核酸の活性を強めた核酸医薬、核酸試薬の製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】表面プラズモン共鳴法を用いた核酸１のＭＫに対する結合活性測定の結果を示す図である。
【図２】配列番号１０で表されるコレステロール付加核酸投与による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察結果を示す図である。
【図３】ゲルろ過ＨＰＬＣによる核酸ナノ粒子の分析結果を示す図である。
【図４】非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】核酸ナノ粒子の体内薬物動態が向上していることを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（１）疎水性物質付加核酸
本発明は、ミッドカイン（ＭＫ）との結合活性を有する疎水性物質付加核酸を提供する。また、本発明は、ＭＫの活性を阻害する疎水性物質付加核酸を提供する。【００２２】
上記ＭＫの活性としては、例えば、細胞（例、マクロファージ、好中球、好酸球、血管平滑筋細胞、腫瘍細胞、骨芽細胞、神経細胞及びそれらの前駆細胞）の遊走活性（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２，４５３−４５８；Ｈｏｒｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，４８９−４９５；Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４７４−１２４７９；Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１５８６８−１５８７５など参照）、細胞（例、腫瘍細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、神経細胞、軟骨細胞及びそれらの前駆細胞）の増殖及び分化促進活性（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ａｎｄ  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７，６５２−６５８；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９，３９２−４０２；Ｔａｋｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，８４８６−８４９１など参照）、調節性Ｔ細胞の増殖阻害活性、調節性Ｔ細胞の機能阻害活性、神経細胞の神経突起の伸長促進活性、細胞（例、腫瘍細胞、神経細胞）のアポトーシス阻害活性、細胞（例、腫瘍細胞）の血管新生の誘導活性、筋原細胞のシナプス形成誘導活性、血管内皮細胞の線溶系促進活性、血管平滑筋細胞のＩＬ−８産生促進活性などが挙げられる。【００２３】
本発明の疎水性物質付加核酸は、任意の哺乳動物に由来するＭＫの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得る。【００２４】
上記哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられるが、霊長類およびげっ歯類が好ましく、ヒトが最も好ましい。【００２５】
なお、各種哺乳動物に由来するＭＫのうち、例えばヒトＭＫのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１１７０４に示されている。このうち、ＭＫとして機能する分泌タンパクは２３番目のリジンから１４３番目のアスパラギン酸の１２１アミノ酸で構成される。そのため本明細書中、以下ＭＫのアミノ酸配列においてアミノ酸番号を示す場合、一般に２３番目のリジンを１番目のアミノ酸として表示する。
すなわち、本明細書における「ヒトＭＫ」は、１〜５２番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント、６２〜１２１番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント及びそれらを結合するループ領域からなる。他の哺乳動物由来のＭＫも、同様に分泌シグナルを除いた成熟タンパクを指すものとする。【００２６】
本発明の疎水性物質付加核酸が結合するＭＫ上の位置は特に限定されず、例えば、ＭＫのＮ−フラグメントおよびＣ−フラグメントが挙げられる。１つの疎水性物質付加核酸がＭＫの複数の位置に対して結合活性を有していてもよい。本発明の疎水性物質付加核酸は、ＭＫのいずれかの位置（例えば、Ｎ−フラグメント、Ｃ−フラグメント等）に結合することにより、ＭＫの活性を阻害し得る。【００２７】
本明細書中、疎水性物質付加核酸とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物などの核酸が疎水性物質と結合したものをいう。すなわち、本発明の疎水性物質付加核酸とは、「核酸」部分と、「疎水性物質」部分とが結合した物質のことをいう。「核酸」部分と「疎水性物質」部分とは、「リンカー」部分で結合していてもよい。【００２８】
本発明の疎水性物質付加核酸の、「核酸」部分を構成するヌクレオチドの種類は、疎水性物質付加核酸がＭＫに結合し、ＭＫの活性を阻害する限り特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの自体公知のヌクレオチド、修飾核酸またはそれらの混合物のいずれであってもよく、また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。また、ヌクレオチドの配列自体も特に限定されない。なお上記「修飾核酸」とは、特に示されない限り、下記で示される「置換可能な位置で置換（修飾）されているヌクレオチド」のことをいう。【００２９】
「核酸」部分を構成する各ヌクレオチドは、疎水性物質付加核酸がＭＫに結合し、ＭＫの活性を阻害する限り、置換可能な位置でどのように置換（修飾）されているヌクレオチドであってもよいし、全く置換（修飾）されていないヌクレオチドであってもよい。置換（修飾）される場合、当業者であれば、「置換可能な位置」は明らかであるし、また置換基についても、自体公知の置換基を選択することが可能である。【００３０】
「核酸」部分を構成するヌクレオチドのうち、置換可能な位置で置換（修飾）されているヌクレオチド（本明細書中、修飾核酸と記載する場合がある）としては、好ましくは、各ヌクレオチドが、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位がヒドロキシル基であるヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、同一又は異なって、任意の原子又は置換基で置換されているヌクレオチドである。
上記原子又は置換基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子（例、フッ素原子）、−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）などが挙げられる。【００３１】
本発明の疎水性物質付加核酸の「核酸」部分は、ＭＫに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、さらに各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において置換可能な部位としては、２’位以外には、例えば、糖残基の３’位及び／又は４’位が挙げられる。また、糖残基に相当する部分は必ずしも５炭糖である必要はなく、６炭糖や他の物質であってもよい。【００３２】
置換（修飾）としては、各位のヒドロキシル基が、例えば、フルオロ基、Ｏ−アルキル基（例、Ｏ−メチル基、Ｏ−エチル基）、Ｏ−アリル基、Ｓ−アルキル基（例、Ｓ−メチル基、Ｓ−エチル基）、Ｓ−アリル基、アミノ基（例、−ＮＨ２）で置換されることが挙げられる。他にも、４’位の酸素を硫黄に置換した４’−ＳＲＮＡ、２’位と４’位とをメチレンを介して架橋したＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、３’位の水酸基をアミノ基に置換した３’−Ｎ−ホスホロアミデート核酸などを例として挙げることができる。このような糖残基の置換（修飾）は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５など参照）。【００３３】
本発明の疎水性物質付加核酸の、「核酸」部分は、ＭＫに対する結合性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）がさらに置換（修飾）（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような置換（修飾）としては、例えば、５位ピリミジン改変、６または／および８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。【００３４】
本発明の疎水性物質付加核酸の「核酸」部分において、当該核酸から１つ以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された核酸であっても、当該核酸が有する機能を保持する限り、本発明の核酸に含まれる。核酸が有する機能としては特に限定されないが、例えばＭＫに対する結合活性、ＭＫの阻害活性などが挙げられる。
置換、欠失、付加または挿入されてよい塩基の数は特に限定されないが、通常１〜数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。【００３５】
さらに、本発明の疎水性物質付加核酸の「核酸」部分の一部または全部からなる核酸に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡも、当該核酸が有する機能を保持する限り、本発明のＤＮＡに含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル  第２版（  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、１９８９年）に記載の条件等が挙げられる。【００３６】
また、ヌクレアーゼ及び加水分解などに対して耐性であるように、本発明の疎水性物質付加核酸に含まれるリン酸基がさらに置換（修飾）されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基（ホスホジエステル結合）の一つ以上が、Ｐ（Ｏ）Ｈ（Ｈ−ホスホネート結合）、Ｐ（Ｏ）Ｓ（ホスホロチオエート結合）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ホスホロジチオエート結合）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（ホスホロアミデート結合）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで、Ｒ、Ｒ’およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である。〕し、ボラノホスフェート結合、ホスホロセレネート結合などで置換されていてもよい。
上記置換（修飾）はまた、キャッピングのような３’末端及び５’末端の改変を含んでもよい。【００３７】
上記置換（修飾）はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、核酸、ヌクレオシド、Myristoyl、Lithocholic-oleyl、Docosanyl、Lauroyl、Stearoyl、Palmitoyl、Oleoyl、Linoleoyl、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを「核酸」部分の３’末端または５’末端に付加することにより行うことができる。
このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照することができる。【００３８】
本発明の疎水性物質付加核酸の、「核酸」部分の長さは、疎水性物質付加核酸がＭＫに結合し、ＭＫの活性を阻害する限り特に限定されず、通常、１〜２００ヌクレオチドであり得るが、好ましくは５〜１００ヌクレオチドであり、より好ましくは５〜６０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１０〜４０ヌクレオチドである。
「核酸」部分の総ヌクレオチド数が少なければ、本発明の疎水性物質付加核酸の化学合成及び大量生産がより容易となるため、コスト面でのメリットが大きい。また化学修飾も容易となり、生体内安定性も高く、毒性も低い疎水性物質付加核酸を得ることができる。一方で、「核酸」部分の総ヌクレオチド数が少なすぎると、ＭＫの活性を阻害することができなくなる可能性がある。適切なヌクレオチド数は、当業者であれば目的に応じて適宜決定することが可能である。【００３９】
本発明の疎水性物質付加核酸の「疎水性物質」部分を構成する物質は、疎水性物質付加核酸がＭＫに結合し、ＭＫの活性を阻害する限り、置換可能な位置でどのように置換（修飾）されている物質であってもよい。当業者であれば、「置換可能な位置」は明らかであるし、また置換基についても、自体公知の置換基を選択することが可能である。【００４０】
「疎水性物質」部分を構成する物質としては、例えば、ストロファンチジン、コレスタノール、ステロイドホルモン（テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロンなど）、ステロール類（コレステロール類（例、コレステロール、コレステロールエステル、スチグマステロール、ラノステロール、エルゴステロールなど）、シトステロール、エルゴステロールなど）をはじめとしたステロイド類が挙げられ、好ましくはステロール類であり、更に好ましくはコレステロール類である。またコレステロール類は誘導体化されていてもよく、そのようなコレステロール誘導体としては、水素添加したジヒドロコレステロール、低級または高級脂肪酸とのエステル体が挙げられ、例えば、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、イソステアリン酸コレステリル、ラノリン脂肪酸コレステリル、マカデミアナッツ油脂肪酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、酪酸コレステリルなどが市販されている。また、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどであってもよい。【００４１】
本発明の疎水性物質付加核酸は、「核酸」部分と「疎水性物質」部分とが直接結合してなるものであってもよいし、「核酸」部分と「疎水性物質」部分とを「リンカー」部分で結合してなるものであってもよい。「核酸」部分と「疎水性物質」部分とは、当業者に公知の方法で結合することが可能である。【００４２】
本発明の疎水性物質付加核酸の、「核酸」部分と「疎水性物質」部分とを結合しうる「リンカー」部分としては、疎水性物質付加核酸がＭＫに結合し、ＭＫの活性を阻害する限り特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このようなリンカーとしては、例えば、飽和炭化水素鎖（例、炭素数１２の飽和炭化水素鎖）、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、ペプチドを含むリンカー（例、−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−）、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）m−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−）、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー（例、−ＣＯＮＨ−、−（ＣＨ２）m−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−）、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）m−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−）、ポリエチレングリコールリンカー（例、ペンタエチレングリコールリンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー）、アミダイト体（例、Ｓｐａｃｅｒ９、Ｓｐａｃｅｒ１８））などが挙げられる（各リンカーにおけるｍおよびｎは、任意の整数を示す）。
リンカー部分は、上記で例示したリンカーを枝分かれさせて、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）や蛍光物質などの機能性分子を付加したものであってもよい（これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある）。更に、トロンビン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチドであってもよいし、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。【００４３】
上記「飽和炭化水素鎖」としては、例えば、炭素数が３、６、１２、１８、２４個のものが考えられる。また、枝分かれしたものであってもよい。【００４４】
上記「ヌクレオチド鎖」としては、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−メチル基）で置換（修飾）されているヌクレオチド、ＬＮＡ、リン酸部分が修飾されているもの、核酸塩基部分が修飾されているものなどが挙げられ、さらにそれらの組み合わせであってもよい。リン酸、核酸塩基の修飾としては特に限定されず、当業者に公知の自体公知の修飾が挙げられる。【００４５】
「リンカー」部分と「疎水性物質」部分との結合は、特に限定されず、両部分は当業者に公知の方法で結合することが可能である。
また、「リンカー」部分と「核酸」部分との結合も、特に限定されず、両部分は当業者に公知の方法で結合することが可能である。【００４６】
本発明の疎水性物質付加核酸の「リンカー」部分および「疎水性物質」部分は、「核酸」部分の５’末端側に結合していてもよいし、３’末端側に結合していてもよい。また、「核酸」部分の５’末端および３’末端の両方に結合していてもよい。また、「核酸」部分の途中の配列の核酸塩基またはリボース、リン酸部分に結合してもよい。【００４７】
本発明の疎水性物質付加核酸は、当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。例えば、市販のコレステロールＴＥＧホスホロアミダイト（Glen Research社製）を用いて、核酸合成機を用いて合成した核酸の５’末端にコレステロールを付加することができる。この場合、市販のアミダイト体であるＳｐａｃｅｒ１８（Glen Research社製）などを同時に用いることで、核酸とコレステロールの間に任意のリンカーを加えることもできる。
また、市販の３’−コレステロールＴＥＧ−ＣＰＧ（Glen Research社製）を用いることで、核酸の３’末端にコレステロールを付加することができる。上記と同様に、市販のアミダイト体であるＳｐａｃｅｒ１８（Glen Research社製）などを同時に用いることで、核酸とコレステロールの間に任意のリンカーを加えることができる。
同様の手法を用いることで、途中の配列の核酸塩基やリボース、リン酸部分にコレステロールを付加することもできる。【００４８】
さらに、核酸の末端または途中にアミノ基を付加することで、合成機を用いた核酸合成の後に、コレステロールをカップリング反応により付加することが可能である。
核酸の５’末端にアミノ基を付加するには、市販の５’−ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒＣ６−ＴＦＡ（Glen Research社製）などを用いることができる。
また、核酸の３’末端にアミノ基を付加するには、市販の３’−ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒＣ７−ＣＰＧ（Glen Research社製）などを用いることができる。
核酸の途中にコレステロールを付加するには、核酸塩基中のアミノ基を利用したり、ピリミジンの５位やプリンの６位などにアミノ基を導入することで行うことができる。また、リボースの２’位やリン酸部分にアミノ基を導入してもよい。
コレステロールとアミノ基とのカップリング反応は、コレステロールにＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などの活性基を付加することで容易に行うことができる。これにより、本発明の疎水性物質付加核酸を製造することができる。【００４９】
本明細書中、以下で記載する核酸における各記号は、次の意味を示す。
ｃｈｏｌ      ：コレステロール
ＰＥＧ４０ｋ  ：２０ｋＤａのポリエチレングリコールが２つ結合し、かつポリエチレングリコールが可能な位置で枝分かれした４０ｋＤａのポリエチレングリコール
Ｎ            ：リボヌクレオチド
Ｎ（Ｍ）      ：リボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されたヌクレオチド
Ｎ（Ｆ）      ：リボースの２’位がフルオロ基で修飾されたヌクレオチド
Ｃ６          ：炭素数６の飽和炭化水素鎖リンカー
Ｃ１２        ：炭素数１２の飽和炭化水素鎖リンカー
Ｓ１８        ：Ｓｐａｃｅｒ１８リンカー
ｉｄＴ        ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ修飾【００５０】
本発明の疎水性物質付加核酸の好ましい実施態様としては、配列番号１〜１０で表される核酸、あるいは配列番号１〜１０のいずれかで表される核酸に１〜３個の塩基が置換、欠失、付加または挿入した核酸が挙げられる。当該核酸はさらに置換（修飾）されていてもよく、置換（修飾）として好ましくは、上記した置換（修飾）を挙げることができる。【００５１】
本発明の疎水性物質付加核酸の特に好ましい実施態様としては、以下で示される核酸およびその誘導体：
ｃｈｏｌ−Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）（配列番号１）、
ｃｈｏｌ−Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）（配列番号２）、
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）、
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ、
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ、
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）および
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｃｈｏｌ（以上、配列番号３）、
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号４）、
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ、および
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（以上、配列番号５）、
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴおよび
ＧＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｃｈｏｌ（以上、配列番号６）、
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ、
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｓ１８−ＰＥＧ４０ｋ、
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ、
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ＰＥＧ４０ｋ、
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｃ１２−ＰＥＧ４０ｋ、および
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｃ１２−ＰＥＧ４０ｋ（以上、配列番号７）、
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号８）、
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−ＧＧＧＡ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号９）、ならびに
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号１０）
が挙げられる。【００５２】
本発明はまた、ＭＫの活性（例、ＭＫの細胞遊走活性）を阻害することに加えて、プレイオトロフィンに対する阻害活性を有することを特徴とする疎水性物質付加核酸を提供する。【００５３】
ＭＫノックアウトマウスおよびＰＴＮノックアウトマウスは大きな欠陥なく成育するが、ＭＫとＰＴＮのダブルノックアウトマウスは胎生致死となることから、ＭＫとＰＴＮはその機能を相互に補完していると考えられている。また、各種癌、アルツハイマー病、骨粗鬆症、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスなどでＭＫとＰＴＮの発現がともに上昇していることが知られている。従って、これらの疾患に対してはＭＫだけでなくＰＴＮに対しても阻害活性を有する核酸が有用であると考えられる。【００５４】
本発明のコレステロール付加核酸はＭＫとＰＴＮの両方を阻害するが、コレステロールを取り除くとＭＫとＰＴＮの両方に対して阻害活性がなくなる場合がある（配列番号５、ならびに後述する表１の核酸５−１および核酸５−２参照）。この場合は、コレステロールと核酸の間にある種の酵素により切断されるペプチド配列などを入れることで、ターゲット依存的な副作用が出た場合に、コレステロールを切断してすばやく解毒することができる。また、コレステロール付加核酸はＭＫとＰＴＮの両方を阻害するが、コレステロールが付加されていない核酸ではＭＫは阻害するがＰＴＮは阻害しない場合がある。この場合は、コレステロールのリンカーに切断部位を含めることで、ＭＫとＰＴＮの両方を阻害したり、ＭＫのみを阻害したりするよう調節することができる。このような調節は、当業者であれば容易に行うことができる。【００５５】
本発明の疎水性物質付加核酸および疎水性物質を除去した核酸におけるＭＫおよびＰＴＮの阻害活性は、例えば、後記実施例に示される方法等に従って、それぞれ測定することができる。【００５６】
（２）疎水性物質付加核酸および機能性物質を含む複合体
本発明はまた、本発明の疎水性物質付加核酸および機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体における「疎水性物質付加核酸」と「機能性物質」との間の結合は、例えば共有結合、または非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明の疎水性物質付加核酸と１個以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであってもよい。【００５７】
上記「機能性物質」としては、本発明の疎水性物質付加核酸に何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明の疎水性物質付加核酸が保持し得る特性（例えば、ＭＫへの結合活性を有すること、ＭＫの阻害活性を有すること、ＰＴＮへの阻害活性を有すること、薬物体内動態、ヌクレアーゼ耐性など）を変化（例、増加、減少）させ得るものである限り特に限定されない。【００５８】
機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。
他の機能性物質としては、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類、コレステロール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジン、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビノレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミノマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）などが挙げられる。【００５９】
「疎水性物質付加核酸」と「機能性物質」との間の結合として例示される「共有結合」としては飽和炭素鎖リンカー（例、−（ＣＨ２）ｎ−）、ペプチドを含むリンカー（例、−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−）、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−）、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−）、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−）、ポリエチレングリコールリンカー（例、ヘキサエチレングリコールリンカー））などが挙げられる（各リンカーにおける記号は、上記と同様である）。これらのリンカーは、分子中の可能な位置で枝分かれしたものであってもよい。さらに、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。【００６０】
また、同様に例示される「非共有結合」としては、疎水結合、イオン結合、水素結合、キレート剤を利用した結合、ビオチンとアビジンの結合を利用した結合、抗体を利用した結合、アプタマーを利用した結合、塩基対を利用した結合などが挙げられる。【００６１】
（３）核酸をナノ粒子化する方法
本発明は、疎水性物質を結合させることを特徴とする、核酸をナノ粒子化する方法を提供する。
本明細書において、「ナノ粒子」とは、粒子径を特定するものではないが、一応の目安としてはナノ単位、具体的には約１０〜約１０００ｎｍの粒子径を有する粒子のことをいう。本明細書における「ナノ粒子化」とは、核酸分子を約１０〜約１０００ｎｍの粒子径を有する複数の核酸分子の集合体へと成長させることをいう。本発明のナノ粒子は、核酸に疎水性物質を結合させることで製造される。具体的には、本発明のナノ粒子は、疎水性物質が結合した核酸分子が集合して形成されるものである。【００６２】
本発明の核酸をナノ粒子化する方法において、核酸へ疎水性物質を結合させる方法としては、上記（１）記載の「疎水性物質付加核酸」の製造と同様の方法が挙げられる。また核酸が結合する「疎水性物質」としては、上記（１）記載の疎水性物質と同様のものが挙げられるが、好ましくはコレステロールである。【００６３】
本発明の核酸をナノ粒子化する方法において、疎水性物質が結合する「核酸」としては特に限定されず、自体公知の核酸、例えばアプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸など、それ自体有用な生理活性を有する種々の核酸分子を適用することが可能であるが、好ましくは上記（１）記載の核酸と同様のものを挙げることができる。
当該核酸の塩基数としては、塩基数５〜１００の核酸が好ましく、塩基数１０〜５０の核酸がより好ましく、塩基数１５〜４５の核酸が最も好ましい。【００６４】
本発明の核酸をナノ粒子化する方法としては、核酸に疎水性物質を結合させることを特徴とするものの、それ以外の手法としては特に限定されない。従ってそれ以外の手法については、自体公知の方法を適用することが可能である。【００６５】
本発明の核酸をナノ粒子化する方法としては、好ましくは、
（ａ）核酸に疎水性物質を結合させる工程；
（ｂ）（ａ）で得られた疎水性物質付加核酸を、中性塩溶液に溶解させる工程；
を含んでなる方法が挙げられる。以下、各工程について説明する。【００６６】
（ａ）核酸に疎水性物質を結合させる工程
本工程は、核酸分子に疎水性物質を結合させる工程である。核酸へ疎水性物質を結合させる方法としては、上記（１）記載の「疎水性物質付加核酸」の製造と同様の方法が挙げられる。また疎水性物質としては、上記（１）記載の疎水性物質が挙げられ、好ましくはコレステロールである。また疎水性物質が結合する「核酸」としては特に限定されず、自体公知の核酸、例えばアプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸など、それ自体有用な生理活性を有する種々の核酸分子を適用することが可能であるが、好ましくは上記（１）記載の核酸や、国際公開ＷＯ２００８／０５９８７７に記載のアプタマーと同様のものを挙げることができる。【００６７】
（ｂ）疎水性物質付加核酸を溶解させる工程
本工程は、上記（ａ）で得られた疎水性物質付加核酸を、中性塩溶液に溶解させる工程である。
本工程における「中性塩溶液」の「中性塩」としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどが挙げられる。なかでも塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムが好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。【００６８】
また「中性塩」を溶解する溶液としては、疎水性物質付加核酸が溶解して、核酸ナノ粒子を形成する反応が進行する限り特に限定されず、水、生理食塩水、アルコール（例、メタノール、エタノール）などが挙げられる。溶液中の疎水性物質付加核酸の濃度は、疎水性物質付加核酸が溶解して、核酸ナノ粒子を形成する反応が進行する限り特に限定されず、通常、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。疎水性物質付加核酸の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌより少ないと、核酸分子が集合し難くナノ粒子が適切に製造されず、一方で疎水性物質付加核酸の濃度が１００ｍｇ／ｍｌより大きいと、核酸濃度が大きすぎてゲル化するので、適度な大きさのナノ粒子が製造されない。
溶液中の中性塩濃度については、疎水性物質付加核酸が溶解して、核酸ナノ粒子を形成する反応が進行する限り特に限定されず、通常、１ｍＭ〜１Ｍであり、好ましくは１０ｍＭ〜３００ｍＭである。【００６９】
本工程の溶解に際しては、単に疎水性物質付加核酸を中性塩溶液に加えて溶解すれば足りるが、疎水性物質付加核酸が溶解して核酸ナノ粒子を形成する反応が進行する限り撹拌等の追加の操作を加えても構わない。また当該溶液はその後静置することで核酸ナノ粒子を製造せしめるが、当該静置時間としては特に限定されず、通常、１時間〜９６時間、好ましくは１時間〜４８時間、より好ましくは１時間〜２４時間である。
本工程では中性塩溶液に疎水性物質付加核酸を、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後に、その後好ましくは加熱することで、核酸ナノ粒子の形成を促進することができる。溶解する際の温度としては特に限定されないが、通常、０℃〜１００℃であり、好ましくは１０℃〜４０℃の室温である。また加熱する際の温度も特に限定されないが、通常５０℃〜１００℃、好ましくは６０℃〜９０℃である。また５０℃〜１００℃、好ましくは６０℃〜９０℃の温度で溶解と加熱を同時に行ってもよい。【００７０】
（４）核酸の体内薬物動態を向上させる方法
本発明の方法により得られる核酸ナノ粒子は、ナノ粒子化していない核酸が有する生理活性を維持しているだけでなく、その体内薬物動態を著しく向上させている点で有用である。即ち本発明は、疎水性物質を結合させることを特徴とする、核酸の体内薬物動態を向上させる方法を提供する。本明細書中、「体内薬物動態を向上させる」とは、薬物などとして体内に投与される物質の血中安定性を向上させることをいう。即ち本発明により、体内に投与された核酸の血中安定性を高めることができる。体内薬物動態を向上させる対象としては特に限定されない。
核酸への疎水性物質の結合については、上記（３）記載の通りである。また核酸分子のナノ粒子化の方法についても、上記（３）記載の通りである。
本発明の方法における「核酸」としては、上記（１）記載の核酸が挙げられる。当該核酸に疎水性物質を結合させて核酸ナノ粒子化することで、当該核酸の血中安定性が向上して血液中における滞留時間が著しく増大することから、ＭＫへの阻害効果を維持することが可能となる。【００７１】
なお上記したとおり、本発明は生理活性を有するコレステロール付加核酸そのものをナノ粒子化することで体内薬物動態を向上させるものである。本発明のナノ粒子はそれ自体が生理活性を有する。これは、前記したリポソームのような他のデリバリー剤を使用するものとは異なる。リポソームのような他のデリバリー剤を使用する場合は、原薬そのものの安定性と有効性を確認するだけでなく、それらのデリバリー剤の安全性と有効性も別途確認する必要があり、臨床試験において多大な費用と時間を要することになる。
本発明のコレステロール付加核酸から得られる核酸ナノ粒子は原薬そのものであるので、医薬開発において、時間の短縮、費用の削減につながる。またリポソームに封入した薬剤はリポソームから徐放されて初めて薬効を示すが、本発明の核酸ナノ粒子はそのものが薬効を示すので、即効性が高い点でも有用である。【００７２】
（５）生理活性を有する核酸をナノ粒子化して体内薬物動態を向上させる方法
リポソームは球形の殻状であり、その中に薬物を封入して体内に投与することで、薬物を目的の疾患部位に到達させるデリバリー剤である。一方、本発明はそのようなデリバリー剤を必要とせず、生理活性（薬物活性）を有する核酸そのものをナノ粒子化することで、当該核酸の血中安定性を向上させるものである。疎水性物質付加核酸はナノ粒子化してもその生理活性を維持しているので、ナノ粒子そのものを薬剤として働かせることが可能である。
核酸への疎水性物質の結合については、上記（３）記載の通りである。また核酸分子のナノ粒子化の方法についても、上記（３）記載の通りである。
本発明の方法における「核酸」としては、上記（１）記載の核酸が挙げられる。当該核酸に疎水性物質を結合させて核酸ナノ粒子化することで、体内薬物動態を向上することができ、結果として効果の高い医薬を提供することができる。ここで「生理活性を有する核酸」が有する「生理活性」としては特に限定されず、核酸が有する活性およびそれにより生じうる生理活性、薬物活性、副作用などとして報告される全ての活性が挙げられるが、例えば上記（１）記載の核酸の場合は、ＭＫの阻害活性、調節性Ｔ細胞の増殖活性などを好ましい例として挙げることができる。【００７３】
（６）疎水性物質付加核酸等を含有してなる医薬
本発明の疎水性物質付加核酸、複合体、および核酸ナノ粒子は、医薬として使用され得る。特に本発明の核酸ナノ粒子は、前記したとおり、ナノ粒子そのものが薬剤として働くので、当該医薬の有効成分としても極めて有用である。すなわち本発明は、本発明の疎水性物質付加核酸、複合体、または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）を含む、医薬を提供する。
疎水性物質付加核酸の生理活性により、その医薬としての具体的用途は異なるが、例えば、当該医薬が、本発明のミッドカインに結合してその活性を阻害することを特徴とする疎水性物質付加核酸のときは、細胞遊走の阻害剤、調節性Ｔ細胞の増殖促進剤、調節性Ｔ細胞の阻害機能促進剤、アポトーシス阻害抑制剤、細胞増殖阻害剤、細胞分化阻害剤などが挙げられる。【００７４】
具体的には、自己免疫疾患（例、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）など）、炎症性腸炎（クローン病など）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病など）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病、乾癬、喘息、好中球機能異常など）、癌（例、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューログラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌など）、術後癒着、子宮内膜症、移植時の拒絶反応、アレルギー、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞などの種々の疾患の予防又は治療に使用され得る。【００７５】
特に、ＭＫの細胞遊走活性を阻害することから、多発性硬化症、術後癒着、子宮内膜症、慢性関節リウマチ、血管狭窄、腎炎の予防又は治療に有用である。また、制御性Ｔ細胞の増殖活性から、特に多発性硬化症の予防又は治療に有用である。【００７６】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであってもよい。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００７７】
本発明の医薬は、経口投与に好適な製剤であってもよい。経口投与に好適な製剤としては、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等が挙げられる。【００７８】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。また本発明の医薬は、特に持続性の目的のため、徐放剤と共に使用することができる。徐放剤の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡ、多糖シゾフィランなどが挙げられる。
本発明の医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。【００７９】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤も挙げることができ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。更に注射液剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来より使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。【００８０】
界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。【００８１】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。【００８２】
本発明の医薬における本発明の疎水性物質付加核酸の濃度は、特に制限されないが、濃度を上げることで該核酸の多量体を形成することができる。多量体を形成すると、ヌクレアーゼ耐性が向上したり、排泄が抑制されたりし得る点で有利である。また当該多量体は、濃度を下げて加熱することで容易に単量体にすることができるので、高濃度の多量体として製剤化した後で、目的に応じて、用時希釈および加熱を行うことで単量体として用いてもよい。また本発明の医薬における本発明の核酸ナノ粒子の濃度も特に制限されない。本発明の疎水性物質付加核酸または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）の多量体および単量体は、ともに細胞遊走阻害活性を有している。【００８３】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、製剤自体の特性（腸溶性、持続性、徐放性など）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。【００８４】
本発明の疎水性物質付加核酸、複合体および核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）はまた、試薬（例、診断薬、検査薬など。実験用試薬を含む。）として使用され得る。すなわち本発明は、本発明の疎水性物質付加核酸、複合体または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）を含む、試薬を提供する。【００８５】
当該試薬としては、上記した本発明の疎水性物質付加核酸、複合体または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）が有する機能を利用したものである限り特に限定されない。当該試薬に係る用途としては、上記核酸、複合体または核酸ナノ粒子に係る用途であって、当該分野の当業者に公知の用途が広く適用される。【００８６】
当該試薬が、ＭＫに結合してその活性を阻害することを特徴とするものであるときは、当該試薬の用途として好ましくは、実験用試薬（例、細胞遊走阻害剤、調節性Ｔ細胞の増殖促進剤、調節性Ｔ細胞の抑制機能促進剤、アポトーシス阻害抑制剤、細胞増殖阻害剤、細胞分化阻害剤、インビボイメージング用プローブ、ＭＫの血中濃度測定用プローブ、組織染色用プローブ、ＥＬＩＳＡ用プローブ、ＭＫおよびＰＴＮの精製用分離剤のリガンドなど）、診断薬（例、インビボ診断薬、ＭＫの血中濃度測定薬、組織染色薬、ＥＬＩＳＡ用診断薬など）、および標識剤（例、インビボ標識剤、組織染色用標識剤、ＥＬＩＳＡ用標識剤など）などが挙げられる。
上記の本発明の疎水性物質付加核酸、複合体および核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）の用途として、より好ましくは調節性Ｔ細胞の増殖促進剤、細胞遊走阻害剤、抗癌剤、診断薬、または標識剤としての用途が挙げられる。すなわち本発明は、上記疎水性物質付加核酸、複合体または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）を含む、調節性Ｔ細胞の増殖促進剤、細胞遊走阻害剤、抗癌剤、診断薬あるいは標識剤を提供する。【００８７】
本発明の試薬の使用量は、当業者であれば適宜決定することが可能である。【００８８】
本発明はまた、本発明の疎水性物質付加核酸、複合体および核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。
上記基板としては、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであって、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコーン基板、アルミナ基板などが挙げられ、さらにこれらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものも含まれる。
上記樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＭＫおよびＰＴＮの精製、及びＭＫおよびＰＴＮの検出、定量に有用であり得る。【００８９】
本発明の疎水性物質付加核酸、複合体および核酸ナノ粒子は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明の疎水性物質付加核酸、複合体および核酸ナノ粒子に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。また、ビオチン−ストレプトアビジンの結合、ＧＳＴタグ、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、抗体を利用した結合、核酸のハイブリダイゼーションなどを利用することができる。本発明はまた、このような官能基が導入された疎水性物質付加核酸および核酸ナノ粒子を提供する。【００９０】
本発明はまた、ＭＫおよびＰＴＮの精製及び濃縮方法を提供する。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＭＫを吸着させ、吸着したＭＫを溶出液により溶出させる工程を含んでいてもよい。本発明の固相担体へのＭＫの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＭＫを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入することによりなされる。ＭＫの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶液としては特に限定されないが、当該溶液のｐＨとしては、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８である。中性溶液はまた、例えば、カリウム塩（例、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、表面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０など）、グリセリン、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、尿素、有機溶媒などから選ばれる一つ以上の物質を含むものであり得る。
本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＭＫの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄する工程を含んでいてもよい。当該洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリを含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理する工程を含んでいてもよい。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。【００９１】
本発明はまた、ＭＫおよびＰＴＮの検出または定量方法を提供する。本発明の検出または定量方法は、本発明の疎水性物質付加核酸、複合体または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）を用いることを特徴とする、ＭＫを検出する方法またはＭＫを定量する方法である。ＭＫの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明の疎水性物質付加核酸、複合体または核酸ナノ粒子を用いること以外は、自体公知の免疫学的方法と同様の方法により行うことができる。すなわち、抗体の代わりに本発明の疎水性物質付加核酸、複合体または核酸ナノ粒子を用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、ＭＫの検出及び定量を行うことができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＭＫ量の測定、ＭＫが関連する疾患の診断に有用であり得る。【００９２】
本発明の疎水性物質付加核酸または核酸ナノ粒子は、別の薬物や毒素などを付加することで薬物送達物質として使用することができる。本発明の疎水性物質付加核酸または核酸ナノ粒子（好ましくは、本発明の疎水性物質付加核酸を用いて製造した核酸ナノ粒子）を利用することにより、ＭＫおよびＰＴＮが過剰発現している炎症部位や癌部位に効率よく薬物を送達することが可能になる。従って本発明は、ＭＫおよびＰＴＮが過剰発現している炎症部位や癌部位に効率よく薬物を送達する、ドラッグ・デリバリーシステムを提供する。【００９３】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００９４】
〔実施例１〕細胞遊走活性を阻害するコレステロール付加核酸（１）
ミッドカインは骨芽細胞前駆細胞の細胞浸潤作用を有することが知られている（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１９），１５８６８−１５８７５，２００１）。そこで、以下に示すコレステロール付加核酸がミッドカインの細胞遊走活性を阻害するかどうかについて、ラットの骨芽細胞前駆細胞であるＵＭＲ１０６細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６６１）を用いて調べた。ケモタキセル（膜孔径８μｍ、クラボウ社製）の膜外面に１．５μＭのミッドカイン３０μＬを塗布し、膜外面にミッドカインを固定化した。コレステロール付加核酸５００ｎＭを含む５００μＬの培地（０．３％ウシ血清アルブミン添加、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）を添加した２４穴カルチャープレートに、ミッドカインを固定化したケモタキセルを設置した。ケモタキセルチェンバー内層にはＵＭＲ１０６細胞を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で２００μＬ入れ、３７℃で４時間培養した。ケモタキセルチェンバー内層に残存した細胞を除去し、ミッドカイン塗布面に浸潤し接着した細胞をメタノールで固定した。ケモタキセルチェンバーを１％クリスタルバイオレット水溶液に３０分間浸して細胞を染色した。ケモタキセルチェンバーを蒸留水で洗浄、乾燥した後、２００μＬの１％ＳＤＳと１％ｔｒｉｔｏｎＸ１００の混合液で色素を抽出した。抽出液の１５０μＬを９６穴マイクロプレートに移し、５９０ｎｍの吸光度を測定した。プレイオトロフィンの細胞遊走阻害実験も同様にして行った。【００９５】
実験に用いたコレステロール付加核酸を以下に示す。【００９６】
核酸１
ｃｈｏｌ−Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）（配列番号１）【００９７】
本コレステロール付加核酸はＡとＧの繰返し配列からなる２３ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロールが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されている。また、コレステロールと核酸とは、５つのポリエチレングリコール鎖とアミド結合で結ばれている。【００９８】
核酸２
ｃｈｏｌ−Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）（配列番号２）【００９９】
本コレステロール付加核酸はＣとＵの繰返し配列からなる２３ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロールが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されている。また、コレステロールと核酸とは、５つのポリエチレングリコール鎖とアミド結合で結ばれている。【０１００】
核酸３
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）（配列番号３）【０１０１】
本コレステロール付加核酸はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕからなる２３ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロールが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されている。また、コレステロールと核酸とは、５つのポリエチレングリコール鎖とアミド結合で結ばれている。【０１０２】
核酸３−１
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号３）【０１０３】
本コレステロール付加核酸は核酸３で表される核酸の改変体で、３’末端がｉｄＴ修飾してある。【０１０４】
核酸３−２
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号３）【０１０５】
本コレステロール付加核酸は核酸３で表される核酸の改変体で、コレステロールと核酸とを、炭素数１２の飽和炭化水素鎖、５つのポリエチレングリコール鎖、アミド結合で結んだものである。また、３’末端がｉｄＴ修飾してある。【０１０６】
核酸３−３
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ａ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｕ（Ｈ）Ｇ（Ｈ）Ｃ（Ｈ）（配列番号３）【０１０７】
本コレステロール付加核酸は核酸３の改変体で、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである核酸である。【０１０８】
核酸３−４
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｃｈｏｌ（配列番号３）【０１０９】
本コレステロール付加核酸は核酸３の改変体で、コレステロールが３’末端に付加されたものである。【０１１０】
核酸４
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号４）【０１１１】
本コレステロール付加核酸はＧとＵからなる７ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロール、３’末端にｉｄＴが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されている。また、コレステロールと核酸は炭素数１２の飽和炭化水素鎖、５つのポリエチレングリコール鎖、アミド結合で結ばれている。【０１１２】
核酸５
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号５）【０１１３】
本コレステロール付加核酸はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕからなる３５ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロール、３’末端にｉｄＴが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されている。また、コレステロールと核酸は５つのポリエチレングリコール鎖とアミド結合で結ばれている。【０１１４】
核酸５−１
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号５）【０１１５】
本コレステロール付加核酸は核酸５の改変体で、コレステロールと核酸とを、炭素数１２の飽和炭化水素鎖と５つのポリエチレングリコール鎖とを介してアミド結合で結んだものである。【０１１６】
核酸５−２
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号５）【０１１７】
本コレステロール付加核酸は核酸５の改変体で、コレステロールの代わりにｉｄＴを付加したものである。【０１１８】
核酸５−３
ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧＵ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）（配列番号５）【０１１９】
本コレステロール付加核酸は核酸５の改変体で、両末端の修飾を取除いたものである。ＧとＡはリボヌクレオチドでありＣとＵはリボースの２’位がＦで修飾されているものである。【０１２０】
核酸６
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号６）【０１２１】
本コレステロール付加核酸はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕからなる３９ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロール、３’末端にｉｄＴが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がフルオロ基およびＯ−メチル基で修飾されているものと未修飾のものが混在している。【０１２２】
核酸６−１
ＧＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｃｈｏｌ（配列番号６）【０１２３】
本コレステロール付加核酸は核酸６の改変体で、コレステロールを３’末端に付加し、リボースの２’位の修飾を変えたものである。【０１２４】
核酸６−２
ＰＥＧ４０ｋ−Ｃ６−ＧＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号６）【０１２５】
本核酸は核酸６−１の改変体で、コレステロールを除去して、５’末端にＣ６のリンカーをはさんで４０ｋＤａのＰＥＧを、３’末端にｉｄＴを付加したものである。【０１２６】
核酸６−３
ＰＥＧ４０ｋ−Ｃ１２−ＧＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号６）【０１２７】
本核酸は核酸６−１の改変体で、コレステロールを除去して、５’末端にＣ１２のリンカーをはさんで４０ｋＤａのＰＥＧを、３’末端にｉｄＴを付加したものである。【０１２８】
核酸６−４
Ｓ１８−ＧＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号６）【０１２９】
本核酸は核酸６−１の改変体で、コレステロールを除去して、５’末端にＳ１８を、３’末端にｉｄＴを付加したものである。【０１３０】
核酸７
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号７）【０１３１】
本コレステロール付加核酸は核酸６の改変体で、５’末端のＧを取り除き、リボースの２’位の修飾を変化させたものである。【０１３２】
核酸７−１
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｓ１８−ＰＥＧ４０ｋ（配列番号７）【０１３３】
本コレステロール付加核酸は核酸７の改変体で、３’末端のｉｄＴを取り除き、代わりにＳｐａｃｅｒ１８をはさんで４０ＫＤａの枝分かれしたポリエチレングリコールを付加したものである。【０１３４】
核酸７−２
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号７）【０１３５】
本コレステロール付加核酸は核酸７の改変体で、リボースの２’位の修飾を変えたものである。【０１３６】
核酸７−３
Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）（配列番号７）  【０１３７】
本核酸は核酸７−２の改変体で、末端のコレステロールとｉｎｖｅｒｔｅｄｄＴを除いたものである。【０１３８】
核酸７−４
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ＰＥＧ４０ｋ（配列番号７）【０１３９】
本コレステロール付加核酸は核酸７−１の改変体で、Ｓｐａｃｅｒ１８を取り除いたものである。【０１４０】
核酸７−５
ｃｈｏｌ−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｃ１２−ＰＥＧ４０ｋ（配列番号７）【０１４１】
本コレステロール付加核酸は核酸７−１の改変体で、Ｓｐａｃｅｒ１８の代わりにＣ１２リンカーを用いたものである。【０１４２】
核酸７−６
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−Ｓ１８−ＰＥＧ４０ｋ（配列番号７）【０１４３】
本コレステロール付加核酸は核酸７−２の改変体で、３’末端のｉｄＴを取り除き、代わりにＳｐａｃｅｒ１８をはさんで４０ＫＤａの枝分かれしたポリエチレングリコールを付加したものである。【０１４４】
核酸８
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号８）
本コレステロール付加核酸は２７ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロール、３’末端にｉｄＴが付加されたものである。コレステロールと核酸との間は炭素数１２の飽和炭化水素鎖で結ばれている。ヌクレオチドはリボースの２’位がフルオロ基およびＯ−メチル基で修飾されているものと未修飾のものが混在している。
核酸９
ｃｈｏｌ−Ｃ１２−ＧＧＧＡ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ＡＧＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号９）【０１４５】
本コレステロール付加核酸は４５ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロール、３’末端にｉｄＴが付加されたものである。コレステロールと核酸との間は炭素数１２の飽和炭化水素鎖で結ばれている。ヌクレオチドはリボースの２’位がフルオロ基およびＯ−メチル基で修飾されているものと未修飾のものが混在している。【０１４６】
細胞遊走阻害実験の結果を表１に記す。阻害活性％は核酸を加えないときに移動した細胞の数を１００として、核酸を加えたときに移動した細胞の数を表したものを１００から引いた値である。コレステロールのみの阻害活性も測定したが、核酸の濃度の１００倍加えても阻害活性は見られなかった。一方、核酸５、５−１、５−２、５−３の比較より分かるとおり、コレステロールが付加されていない核酸（核酸５−２、５−３）は阻害活性を示さなかったが、これにコレステロールを付加すると高い阻害活性を示した（核酸５、５−１）。以上より核酸とコレステロールが組み合わさることで、ＭＫの細胞遊走活性が阻害されることが示された。【０１４７】
【表１】
2009063998.tif 000002
【０１４８】
これらの結果より以下のことがわかる。
（１）コレステロールの位置は５’末端であっても３’末端であっても構わない。
（２）コレステロールと核酸をつなぐリンカーの種類は活性に大きく影響しない。
（３）核酸の長さが短いと生理活性が低下する。
（４）ミッドカインを阻害するコレステロール付加核酸は、プレイオトロフィンを阻害する。
（５）コレステロール付加核酸の末端にポリエチレングリコールを付加しても生理活性は低下しない。【０１４９】
〔実施例２〕表面プラズモン共鳴法による結合活性の評価
核酸１、３、３−２、３−３、４、５、５−１、５−３、７、７−１で表されるコレステロール付加核酸のミッドカインに対する結合活性を、表面プラズモン共鳴法により調べた。測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いた。センサーチップにはカルボキシル基が固定化されているＣＭ４チップを用い、アミノカップリングによりミッドカインを固定化した。アミノカップリングはＢＩＡｃｏｒｅ社の仕様書に従って、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ，１１ｍｇ／Ｌ）及びＮ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ，７５ｍｇ／Ｌ）を用いて行った。また、エタノールアミンを用いて未反応カルボキシル基をブロッキングした。ランニングバッファーに１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）の混合液（以下この溶液を、「溶液Ａ」と記載する）を用いた。再生溶液に６Ｍの尿素溶液を用いた。４００ｎＭのコレステロール付加核酸をインジェクションし相互作用を確認した。その結果、測定した全てのコレステロール付加核酸がミッドカインに結合した。それらの結合強度は核酸により異なった。核酸１を用いた場合のセンサーグラムの一例を図１に示す。【０１５０】
〔実施例３〕コレステロール付加核酸を用いたＥＡＥモデルマウスの発症抑制実験
３００μｇのＭｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１１））を５００μｇの結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む不完全Ｆｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔとともにエマルジョン化し、野生型Ｃ５７／ＢＬ６（メス、８週齢）の腰部に皮下投与し、感作した。さらに、感作直後及び４８時間後に３００ｎｇの百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ）を２００μＬのＰＢＳに溶かし、腹腔内投与しＥＡＥを誘導した。以後、毎日以下の基準により臨床症状を評価した。
野生型マウス群（ｎ＝５）および核酸１０で表されるコレステロール付加核酸投与群（ｎ＝５）に対して毎日臨床スコアを付け、臨床症状の評価を行った。臨床スコア値は、０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡を示し、ＭＯＧ３５−５５投与後２８日までの全ての動物の割合を記録した。
なお、核酸１０で表されるコレステロール付加核酸は、次のようなものである。【０１５１】
核酸１０
ｃｈｏｌ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ（配列番号１０）【０１５２】
本コレステロール付加核酸はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕからなる３６ヌクレオチドの核酸で、５’末端にコレステロール、３’末端にｉｄＴが付加されたものである。ヌクレオチドはリボースの２’位がＯ−メチル基で修飾されている。また、コレステロールと核酸は５つのポリエチレングリコール鎖とアミド結合で結ばれている。【０１５３】
核酸１０で表されるコレステロール付加核酸は、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に溶解し、ＭＯＧ３５−５５投与後１４日まで２日に１回の間隔で計８回、その後１日に１回の間隔で計１３回投与した（図２黒四角）。投与量は１ｍｇ／ｋｇとした。コントロール群として１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水を同量同様に投与した（図２黒丸）。
実験の結果、コレステロール付加核酸投与群において１７日目から２１日目までｐ＜０．０５の統計学的有意差を持って臨床症状の軽減が見られた（図２）。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した。以上より、コレステロール付加核酸が多発性硬化症の治療薬として利用できる可能性が示唆された。【０１５４】
〔実施例４〕コレステロール付加核酸のナノ粒子化
コレステロールは疎水性物質である一方、核酸は親水性物質である。このことに鑑み、これらを結合させてなるコレステロール付加核酸は条件によってナノ粒子化すると考えられた。そこで、種々の条件でコレステロール付加核酸を溶解し、ナノ粒子化するか否かについてゲルろ過ＨＰＬＣを用いて調べた。ゲルろ過ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
カラム：東ソーＧ３０００ＳＷＸＬ
溶離液：溶液Ａ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
モード：アイソクラッティック
カラム温度：２５℃
検出波長：２６０ｎｍ【０１５５】
１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に、核酸７を１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したところナノ粒子の形成が確認された（図３Ｄ）。この水溶液を９０℃で１０分加熱したところ、ナノ粒子化が促進された（図３Ｅ）。一方、この水溶液を０．１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度まで１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水で希釈して９０℃で１０分加熱したところ、ゲルろ過ＨＰＬＣのピークが低分子量側にシフトした（このピークを以後モノマーピークと呼ぶ。図３Ｆ）。また、核酸７を１ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したところ、モノマーピークの位置にピークが現れ、ナノ粒子の形成は確認されなかった（図３Ｃ）。同様の実験をコレステロールが付加していない核酸７−７および核酸７−８を用いてそれぞれ行ったところ、ナノ粒子の形成は確認されなかった（図３Ｂ；なお図３Ｂは核酸７−８を１ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に溶解した場合の結果である。）。ここで「コレステロールが付加されていない核酸」である核酸７−７および核酸７−８とは、それぞれ以下のようなものである。【０１５６】
核酸７−７
ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）（配列番号７）
核酸７−８
Ｓ１８−ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）ＧＧＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ（配列番号７）【０１５７】
標準サンプルとしてＡＭＰが４０連続したポリＡをインジェクションしたところ、０．１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の核酸７を加熱したサンプル（図３Ｆ）、核酸７を超純水に溶解したサンプル（図３Ｃ）および核酸７−８（図３Ｂ）と同程度の保持時間を示した（モノマーピーク付近、図３Ａ）。これらの結果は、０．１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の核酸７を加熱したサンプルおよび核酸７を超純水に溶解したサンプルがモノマーであることを示唆している。【０１５８】
次に、ナノ粒子の形成が水溶液中の中和塩の有無と核酸の濃度に依存するかどうか調べた。核酸７を１ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したところ、ナノ粒子の形成は確認されなかった。この溶液を２３時間室温で保持したが、ゲルろ過ＨＰＬＣで高質量側へのピークシフトは見られなかった。一方、核酸７を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したところ、高質量から低質量にかけてブロードなピークが検出され、多様な大きさのナノ粒子が形成していることが確認された。また、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に核酸７を０．１、０．５、１．５、２、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ溶解し、９０℃で１０分加熱したところ、０．１ｍｇ／ｍＬ以外の濃度でナノ粒子の形成が確認された。これらのナノ粒子は中性塩溶液中で少なくとも２４時間安定に存在した。一方、０．１ｍｇ／ｍＬのサンプルは加熱後にモノマーピークの位置にピークが見られた。なお、核酸７を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に室温で溶解したところ、ナノ粒子化することが確認できた。
以上より、核酸ナノ粒子の形成には塩が必要で、加熱することでその形成が促進されることがわかった。また、一度形成したナノ粒子は安定であるが、０．１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度に希釈して加熱することでモノマー化することがわかった。【０１５９】
次に１２％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により核酸７を分析した。核酸７を超純粋と１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水にそれぞれ溶かし０．１ｍｇ／ｍＬとした。これらの溶液を５μＬずつ泳動した。その結果、超純水に溶解した核酸７はモノマーと思われる場所にバンドが見られた（図４）。一方、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に溶解した核酸７はウェルに溜まった状態で、そのほとんどが泳動されなかった。これらの結果はゲルろ過ＨＰＬＣの結果と一致しており、核酸ナノ粒子が塩存在下で形成されやすいことを示している。なお図４中、Ｍはマーカーを、Ｗは超純水に溶解した核酸７を、Ｓは１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に溶解した核酸７をそれぞれ示す。【０１６０】
同様の実験を、核酸３−２を用いて行った。その結果、核酸７と同様に塩存在下でナノ粒子を形成した。この溶液を加熱するとナノ粒子化が促進された。また、超純水中ではナノ粒子は形成されなかった。この溶液を加熱するとモノマーの形成が促進された。【０１６１】
生理活性を有した疎水性物質付加核酸がナノ粒子化しても活性を失っていないことを確認するために、実施例１と同様の方法を適用して細胞遊走阻害実験を行った。１ｍＭ塩化マグネシウムを含む生理食塩水に核酸７を１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、数時間維持した後、生理食塩水で０．０６９ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。このサンプルを２つに分けた（サンプル１および２）。サンプル１はそのまま細胞遊走阻害実験に使用した（ナノ粒子状態）。サンプル２は９０℃で１０分間加熱した後に細胞遊走阻害実験に使用した（非ナノ粒子状態）。実験の結果、サンプル１および２は共に細胞遊走を強く阻害した。
以上より、核酸はコレステロールを付加することでナノ粒子化することが示された。また、ナノ粒子化は塩の有無、核酸の濃度、加熱の有無に依存することがわかった。さらに、ナノ粒子化しても生理活性が保持されていることが示された。【０１６２】
〔実施例５〕ナノ粒子化したコレステロール付加核酸の体内薬物動態
核酸７とコレステロールが付加されていない核酸７−８とをそれぞれ１ｍｇ／ｍＬで生理食塩水に溶解し、Ｃ５７／ＢＬ６／Ｊマウス（雌マウス、８週齢、Ｎ＝３）に１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。核酸７−８は５’末端がＳｐａｃｅｒ１８で修飾されているもので、ヌクレアーゼ耐性は核酸７と変わらないと考えられるものである。【０１６３】
０．２５、１、２、４時間後にそれぞれ血液を採取し、ＥＬＯＳＡ法（ハイブリダイゼーション法）を用いて血液中の残存核酸濃度を測定した。ＥＬＯＳＡ法とは測定対象の核酸と相補的な配列からなる二種類の核酸プローブを用いて生体試料中の核酸を定量する方法で、既に臨床試験等で使用されている一般的な方法である。一つのプローブはプレート（ＤＮＡ固定化用９６ウェルプレート（丸型）キット、住友ベークライト社製）に固定化し、目的の核酸をトラップするために用いた。もう一つのプローブにはＦＡＭを結合し検出用に用いた。感度を上げるために、ＨＲＰが結合した抗ＦＡＭ抗体を使用し、発色基材の吸光度により分析をおこなった。定量は既知濃度のサンプルを用いて作成した検量線を用いて行った。
測定の結果、コレステロールが付加している核酸７はコレステロールが付加していない核酸７−８に比べて血液中の核酸滞留時間が顕著に長く、また血中濃度が高いことが示された（図５）。【０１６４】
ところで、Ｈｅａｌｙらは３２ヌクレオチドの長さのＴＧＦβ−２に対するアプタマーにコレステロールを付加したものをリン酸生理食塩水に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ラットに１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与するという実験を行っている（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１２，２００４，２２３４参照）。そして当該実験においては、ＥＬＯＳＡ法を用いて血中薬物濃度を測定し、薬物動態パラメーターを求めたところ、コレステロール付加アプタマーとコレステロールが付加していないアプタマーではコレステロールが付加していないアプタマーの方の特性がよいことが報告されている。このことは、コレステロールを単に付加しただけでは体内動態は改善されないことを示している。
以上より、核酸に疎水性物質を付加しナノ粒子化することで体内薬物動態を向上させることができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明の疎水性物質付加核酸及び複合体は、自己免疫疾患、癌、術後癒着、子宮内膜症などの種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬などの試薬として有用であり得る。本発明の疎水性物質を付加した核酸及び複合体はまた、ＭＫの精製及び濃縮、並びにＭＫの検出及び定量に有用であり得る。
本発明により得られる核酸ナノ粒子は、核酸分子が有する生理活性を保持しているだけでなく、より向上した生理活性と体内薬物動態を有しているので、核酸の活性を強めた核酸医薬、核酸試薬の製造に有用である。
本出願は、日本で出願された特願2007-295951を基礎としており、それらの内容は本明細書にすべて包含される。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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