(57)【要約】  ロドビュルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）に属する微生物を用いるＲＮＡの製造方法であって、（１）前記ＲＮＡを転写可能なＤＮＡを含む発現ベクターで前記微生物を形質転換する工程、（２）得られた形質転換体を培養する工程、及び（３）菌体外に生成されたＲＮＡを回収する工程を含む、ＲＮＡの製造方法、並びに、新規プロモーターを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドビュルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）に属する微生物を用いるＲＮＡの製造方法であって、
（１）前記ＲＮＡを転写可能なＤＮＡを含む発現ベクターで前記微生物を形質転換する工程、
（２）得られた形質転換体を培養する工程、及び
（３）菌体外に生成されたＲＮＡを回収する工程
を含む、ＲＮＡの製造方法。
【請求項２】
前記微生物が、ロドビュルム  スルフィドフィラム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（Ａ）配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列を含み、且つ、ロドビュルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）に属する微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、且つ、前記微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ；及び
（Ｃ）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる塩基配列を含み、且つ、前記微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。
【請求項６】
前記発現ベクターとして、請求項４に記載の発現ベクターを使用する、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ製造方法及び新規プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡは自身の配列に依存して様々な機能を発揮することが知られている。例として、ある物質に対して特異的結合能を有する抗体様の機能を有するＲＮＡアプタマー、酵素として働くＲＮＡであるリボザイム、高等生物の内因性因子と共役して特定の遺伝子発現を抑えるＲＮＡｉシステムで働くノンコーディングＲＮＡなどが挙げられる。これら機能的ＲＮＡは実際に医療、工学の分野において幅広く利用されつつあり、機能的ＲＮＡの大量合成は急務と考えられる。
現在のところ、これら機能的ＲＮＡの人工的な合成は専ら化学合成もしくは試験管内転写によりなされている。【０００３】
一方、海洋性光合成細菌であるロドビュルム属に属する微生物が、増殖と共にフロックと呼ばれる菌の凝集体を形成し、その際同時に菌体外に核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を生成し、フロックの形成に利用していることが知られている。例えば、非特許文献１には、ロドビュルム属に属する微生物（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．ＰＳ８８株）が、核酸分泌をフロック形成に利用していることが開示されている。また、非特許文献２には、ロドビュルム  スルフィドフィラム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）の菌体外分泌核酸の配列を決定したところ、ＲＮＡに関しては、各種ｔＲＮＡ（全長）、並びに１６Ｓ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡ（断片）であり、これらのＲＮＡは、修飾や分解せずに菌体内に存在するものと同様のものであることが開示されている。しかしながら、分泌が確認されたのは前記宿主由来のｔＲＮＡ及びｒＲＮＡのみであって、任意のＲＮＡ、例えば、外来性ＲＮＡ（前記宿主が通常保持しない遺伝子の転写産物）が分泌されるか否かは不明であった。【０００４】
ところで、外来性ＲＮＡの分泌に関連して、本発明者は、以前、大腸菌を用いる外来性ＲＮＡのインビボ発現を試みたことがあった。具体的には、キイロショウジョウバエ（Drosophila）のイニシエーターメチオニンｔＲＮＡを大腸菌で発現させようと意図した実験を行ったが、インビボ発現ができないことが判明した。私信ではあるが、イニシエーターｔＲＮＡの世界的権威であるマサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）のUttam RajBhandary教授も我々と同様に大腸菌では真核生物のイニシエーターｔＲＮＡは発現できないということをコメントしており、本発明者が知る限り、文献的にもそれに成功した報告を目にしたことはない。【０００５】
本発明者が実施した実験の概略は、以下のとおりである。まず、市販のプラスミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ製）［インビボでイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）依存的にｌａｃ  Ｚを発現することができるプラスミド］を出発材料として、ｌａｃ  ＺのＳＤ（Shine-Dalgarno）配列とイニシエーションコドンＡＴＧを欠失させたプラスミドベクター（以下、ｐＤＥＬＴと称する）を作成した。このプラスミドベクターは、ＩＰＴＧで発現誘導したＲＮＡがリボソームと相互作用できないため、ノンコーディング（non-coding）ＲＮＡを発現させるのに適したベクターである。このベクターにショウジョウバエのイニシエーターメチオニンｔＲＮＡ遺伝子を導入し、外来性ＲＮＡの大腸菌でのインビボ発現を試みたが、まず、このｔＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミド（を持つコロニー）が得られなかった。比較のために、別の市販のプラスミドベクターｐＧＥＭ−２（ｌａｃ  Ｚを持たないため、ＤＮＡ配列を導入しても、導入した配列がインビボでは転写されない）を用いたところ、容易に、このｔＲＮＡ遺伝子をクローニングすることができた。これらの結果は、ベクターｐＧＥＭ−３Ｚ由来のベクターｐＤＥＬＴの場合、ＩＰＴＧ依存とはいうものの、リーキーな転写が起こる可能性があり、わずかでも転写されると何か大腸菌に不具合が起こるものと思われる。その他にも、ｔＲＮＡ断片等、どのような方法を用いても、ベクターｐＤＥＬＴにクローニングできない配列があることを確認している。なお、これらの断片の場合でも、逆方向（すなわち、マイナス鎖が転写される方向）のクローンは取得可能であった。【０００６】
本発明者が過去に実施した上記実験あるいは本分野の世界的権威の上記コメントによれば、宿主と異なる外来性ＲＮＡの場合、どのようなＲＮＡでも簡単にクローニングと発現ができるわけではないことを示している。【０００７】
【非特許文献１】「アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）」，（独国），1998年，第50巻，p.682-691
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）」，（日本国），2006年，第139巻，第4号，p. 805-811
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在用いられている前記の各ＲＮＡ合成方法は、産業的応用における大量合成を考えた際、化学合成におけるＲＮＡ合成では最大鎖長は３０塩基程度と短く、また化学合成及び試験管内転写においてもリボヌクレアーゼフリー（RNase free）の環境が必要とされ、合成の簡便さにおいて適していないと考えられる。またＲＮＡを合成する際、これらの方法はコストの面において極めて高価であることから、ＲＮＡの大量合成には適していないという問題点が考えられる。【０００９】
従って、本発明の課題は、従来技術のこれらの欠点を解消し、大量合成に適した、簡易で安価なＲＮＡ製造方法を提供することにある。
なお、これまで、ＲＮＡを菌体外で生成させることを目的としてインビボで発現させる系は、本発明者が知る限り、全く知られておらず、その発想自体全くないものであった。また、先述のとおり、非特許文献２には、自然現象として、宿主由来のＲＮＡが菌体外に分泌されることが開示されているが、任意のＲＮＡ、特に外来性ＲＮＡが分泌されるか否かは不明であり、本発明以前には、ＲＮＡの菌体外生産系に利用するとの発想も全くなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題は、本発明による、ロドビュルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）に属する微生物を用いるＲＮＡの製造方法であって、
（１）前記ＲＮＡを転写可能なＤＮＡを含む発現ベクターで前記微生物を形質転換する工程、
（２）得られた形質転換体を培養する工程、及び
（３）菌体外に生成されたＲＮＡを回収する工程
を含む、ＲＮＡの製造方法により解決することができる。
本発明の製造方法の好ましい態様によれば、前記微生物が、ロドビュルム  スルフィドフィラム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。【００１１】
また、本発明は、
（Ａ）配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列を含み、且つ、ロドビュルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）に属する微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、且つ、前記微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ、及び
（Ｃ）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる塩基配列を含み、且つ、前記微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡ；
前記ＤＮＡを含む、発現ベクター；
前記発現ベクターを含む、形質転換体
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、増殖と共に菌体外に大量に核酸を生成する海洋性光合成細菌（特にロドビュルム  スルフィドフィラム）を宿主とし、この光合成細菌に、目的ＲＮＡ（例えば、前記宿主が通常持たない異種生物のＲＮＡまたは生物界に見いだされていない人工ＲＮＡ）配列と同様のＤＮＡ配列を組み込んだベクタープラスミドを導入して形質転換して、得られた形質転換体を用いることにより導入した任意のＤＮＡの配列に応じて、様々なＲＮＡを生産することができる。例えば、化学合成法では合成できなかった長鎖のＲＮＡを生産することもできるし、あるいは、異種生物のＲＮＡ又は人工ＲＮＡを生産することもできる。
また、本発明によれば、形質転換体を培養することによりＲＮＡを培養液中に合成することができるため、化学合成や試験管内転写によりＲＮＡを合成するよりも簡易で、安価な人工ＲＮＡの生産方法として工業的に有利に利用することができる。例えば、化学合成法と比較すると、１／１０以上の低コストで製造可能である。
本発明で使用する海洋性光合成細菌（特にロドビュルム  スルフィドフィラム）は有害性がなく、その点でも優れている。
更に、本発明の新規プロモーターは、公知プロモーターと比較して、極めて高い転写活性を示し、本発明のＲＮＡ製造方法にも好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で使用したベクタープラスミドｐＰＳ１００の構造を模式的に示す概念図である。
【図２】実施例１において、合成されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のｍＲＮＡが菌体外に存在するか否かの確認を行った電気泳動の結果を示す図面である。
【図３】実施例２で使用したベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３の構造を模式的に示す概念図である。
【図４】実施例２において、ベクタープラスミドに組み込んだインサート配列（プラスミドの配列も含む）の塩基配列及び構造を示す説明図である。
【図５】実施例２において、合成されたストレプトアビジンＲＮＡアプタマーが菌体外に存在するか否かの確認を行った電気泳動の結果を示す図面である。
【図６】ｒｒｎプロモーターの塩基配列（配列番号９）および配列中の特徴的構造を示す説明図である。
【図７】実施例４で使用したベクタープラスミドｐＲ２の構造と、前記プラスミドに組み込んだｒｒｎプロモーターの塩基配列を示す説明図である。
【図８】ｐｕｆプロモーターおよびｒｒｎプロモーターによるβ−ガラクトシダーゼ活性を比較した結果を示すグラフである。
【図９】実施例５で使用したベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３ｔのインサート配列を示す説明図である。
【図１０】実施例５で使用したベクタープラスミドｐＲＳＡのインサート配列を示す説明図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の製造方法は、
（１）製造対象ＲＮＡを転写可能なＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
（２）得られた形質転換体を培養する工程、及び
（３）菌体外に生成されたＲＮＡを回収する工程
を含む。【００１５】
本発明では、宿主として、増殖と共に菌体外に大量に核酸を生成する海洋性光合成細菌であるロドビュルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）に属する微生物、好ましくはロドビュルム  スルフィドフィラム（Ando, T. et al, J. Biochem. Vol. 139（4）, 805-811, 2006）を使用する。ロドビュルム  スルフィドフィラムは、増殖と共にフロックと呼ばれる菌の凝集体を形成し、その際同時に菌体外に核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を生成し、フロックの形成に利用している。この菌体外に生成されたＲＮＡは修飾や分解せずに前記宿主の菌体内に存在するものと同様のものであるため、ベクタープラスミドにコードされている配列から転写されるＲＮＡも同様にそのまま菌体外に生成される。【００１６】
本発明の製造方法により製造することのできるＲＮＡとしては、宿主に対する外来性ＲＮＡ、すなわち、製造に使用する宿主に由来する天然ＲＮＡでない限り、特に限定されるものではなく、宿主以外の生物由来の天然ＲＮＡ、あるいは、人工ＲＮＡを製造することができ、特に、機能性ＲＮＡが好ましい。より具体的には、ＲＮＡとして、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、酵素として働くＲＮＡであるリボザイム、高等生物の内因性因子と共役して特定の遺伝子発現を抑えるＲＮＡｉシステムで働くノンコーディングＲＮＡ、ｓｉＲＮＡに属するＲＮＡを製造することができ、特にＲＮＡアプタマー（例えば、５０〜２００ｎｔ）、リボザイム、ｓｉＲＮＡ（例えば、１５〜２５ｎｔ）であることが好ましい。ＲＮＡの長さも、特に限定されるものではないが、通常、１５ｎｔ以上であれば製造可能であり、好ましくは１００ｎｔ以上である。また、長さの上限は、通常、３０００ｎｔ以下であれば製造可能であり、好ましくは２００ｎｔ以下である。本発明の製造方法によれば、高次構造の有無にかかわらず、外来性ＲＮＡを製造することができるが、より好ましくは高次構造を持つものである。なお、本明細書において「機能性ＲＮＡ」とは、構造的機能性ＲＮＡ、すなわち、天然ＲＮＡ又は人工ＲＮＡを問わず、そのＲＮＡ自体の三次構造等により機能を発揮することのできるＲＮＡを意味し、例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイム、ＲＮＡｉシステムで働くノンコーディングＲＮＡ、ｓｉＲＮＡに属するＲＮＡを挙げることができる。機能性ＲＮＡと相対する概念としては、ポリペプチドをコードする配列情報として機能するｍＲＮＡが挙げられる。【００１７】
本発明で用いる発現ベクターとしては、形質転換して得られる形質転換体中で、製造対象ＲＮＡを転写することのできる発現ベクターである限り、特に限定されるものではなく、例えば、目的ＲＮＡ配列を転写させるために光合成細菌由来のプロモーター配列（例えば、ｐｕｆプロモーター配列など）を組込み、この配列に続いて目的ＲＮＡの配列を組み込んだベクタープラスミドを挙げることができる。【００１８】
例えば、まず、目的ＲＮＡと同様の配列をもつＤＮＡ断片、すなわち、目的ＲＮＡを転写可能な配列を有するＤＮＡ断片を調製する。続いて、このＤＮＡ断片と、プロモーター配列を含んだベクタープラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し得られるベクターＤＮＡ断片とを、ＤＮＡリガーゼにより結合させ、目的ＲＮＡが転写される組換えＤＮＡを形成することができる。【００１９】
また、本発明で用いるベクタープラスミドＤＮＡ断片としては、光合成細菌由来のｐｕｆプロモーターが含まれているｐＰＳ００１又はｐＰＳ１００（Masuda, S. et al., J. Bacteriol., Vol. 182, No 10, 2778-2786, 2000）を制限酵素で切断処理した断片などを用いることができる。これらのベクタープラスミド以外にも、ｐｕｆプロモーター若しくは本発明で用いる宿主に対応したプロモーターを含むものであれば、使用することが可能である。【００２０】
本発明の製造方法で用いるプロモーターとして、本発明のＤＮＡを使用することができる。本発明のＤＮＡは、
（Ａ）配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列を含み（好ましくは、配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列からなり）、且つ、ロドビュルム属に属する微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、且つ、前記微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ；及び
（Ｃ）配列番号９で表される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる塩基配列を含み、且つ、前記微生物においてプロモーター活性を示すＤＮＡ
からなる群から選択することができる。【００２１】
或るＤＮＡがロドビュルム属に属する微生物（好ましくはロドビュルム  スルフィドフィラム）においてプロモーター活性を示すか否かは、本技術分野において通常使用されているプロモーター活性の評価方法に基づいて判定することができる。例えば、後述の実施例４に具体的に示すように、判定対象であるＤＮＡの制御下にレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を配置した発現ベクターを構築し、この発現ベクターで宿主を形質転換した後、得られた形質転換体におけるレポータータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の量又は活性を測定することにより、プロモーター活性の有無及び程度を判断することができる。【００２２】
配列番号９で表される塩基配列（図６参照）は、ロドビュルム  スルフィドフィラムの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の上流配列であり、ロドビュルム属に属する微生物においてプロモーター活性を示す。図６に示す塩基配列（すなわち、配列番号９で表される塩基配列）において、太字で示す塩基Ａ（配列番号９における２７６番の塩基）は、転写開始点であり、二重下線で示す「ＴＴＧＣＧＧ」（同２４０〜２４５番）及び「ＴＡＧＡＣＡ」（同２６３〜２６８番）は、それぞれ、転写開始点の５’上流領域に存在する−３５部位及び−１０部位である。また、下線及び斜体で示す配列（３箇所；同１２０〜１３５番、２０６〜２１９番、２２５〜２３９番）は、ＦＩＳ結合部位である。【００２３】
本発明のＤＮＡには、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、ロドビュルム属に属する微生物においてプロモーター活性を示す限り、配列番号９で表される塩基配列の部分配列や、配列番号９で表される塩基配列又はその部分配列の類似配列、更には、それら（すなわち、配列番号９で表される塩基配列若しくはその部分配列、又はそれらの類似配列）を含む配列が含まれる。
なお、これらの類似配列には、例えば、配列番号９で表される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる塩基配列も含まれる。本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、一般的なハイブリダイゼーション反応後、低塩濃度かつ高温条件下（６０〜６８℃程度）で洗浄した状態を意味し、具体的には、一般的なハイブリダイゼーション反応を、（Ｔｍ値−２５℃）〜（Ｔｍ値−２０℃）の温度で行い、その後、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ［１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］溶液中において、６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行った状態を意味する。これにより、約８０〜１００％のホモロジーを有する塩基配列がハイブリダイズすることができる。【００２４】
プロモーター領域において、そのプロモーター活性に重要な領域は当業者に周知であり、例えば、−３５部位、−１０部位、ＦＩＳ結合部位（特に−３５部位付近のＦＩＳ結合部位）、転写開始点を挙げることができる。これらの重要領域を除いた領域において、１又は複数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を行ったり、あるいは、末端に別の塩基配列を連結しても、プロモーター活性に大きな影響を与えない可能性が高い。従って、このような操作により得られた類似配列は、本発明の実施に充分なプロモーター活性を示す限り、本発明のＤＮＡに含まれる。また、前記の各重要領域であっても、塩基の欠失、置換、及び／又は付加を行ってもプロモーター活性を示す場合があり、このような類似配列も、プロモーター活性を示す限り、本発明のＤＮＡに含まれる。【００２５】
本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡを含み、且つ、発現対象遺伝子をそのプロモーター活性の制御下に配置することができる、あるいは、配置している限り、特に限定されるものではない。また、該プロモーター領域を発現対象遺伝子の前に複数連結しても良いし、該プロモーター領域及び発現対象遺伝子配列を連結した配列を複数連結しても良い。また、該プロモーター領域及び発現対象遺伝子配列を連結した配列の間に翻訳調節領域を連結することもできる。本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡ、すなわち、プロモーター配列に加えて、所望により、例えば、薬剤耐性遺伝子、接合に必要なＭｏｂサイト、ターミネーター配列などを含むことができる。【００２６】
構築されたベクタープラスミドで宿主を形質転換させる方法については、公知の形質転換方法、例えば、接合伝達法（Simon, B. et al, Bio/Technology., Vol. 1, 37-45, 1983）、塩化カルシウム法（Mandel,M. et al, J.Mol. Biol., Vol. 53, 159-162, 1970）等を用いることができる。ロドビュルム  スルフィドフィラムへの組換えＤＮＡの導入は、主に、接合伝達により行うことができる。【００２７】
形質転換に用いる宿主の培養、あるいは、得られた形質転換体の培養は、それ自体、公知の方法により実施することができる。ロドビュルム  スルフィドフィラムの場合、例えば、表１に示すＭＹＳ（２％ＮａＣｌ含）培地（表１に示すＳＬ８の組成は表２に示す）を用いることができる。また、用いたベクターＤＮＡ断片が、各種の抗生物質耐性遺伝子をコードしているものであれば、培地中に、相当する抗生物質を適量加えることで、組換えＤＮＡをより安定的に保持することができる。【００２８】
【表１】
2009063969.tif 000002
【００２９】
【表２】
2009063969.tif 000003
【００３０】
得られた形質転換体を培養することにより、培養液中に目的ＲＮＡが生成される。培養液中の目的ＲＮＡは、公知方法により回収し、必要に応じて更に精製することもできる。例えば、形質転換体を含む培養液を遠心分離することにより、菌体と培養液とを分離することができる。培養液中の核酸は、例えば、エタノール沈殿法により回収することができる。得られた核酸は、所望により、タンパク質除去処理（例えば、フェノール／クロロホルム抽出）、ＤＮＡ除去処理（例えば、ＤＮアーゼ処理）等を実施することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３２】
《実施例１：β−ガラクトシダーゼ遺伝子のｍＲＮＡの菌体外での検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドでロドビュルム  スルフィドフィラムを形質転換し、その形質転換体の菌体外において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のｍＲＮＡが検出されることを確認した。【００３３】
（１）ロドビュルム  スルフィドフィラムの形質転換
光合成細菌由来のｐｕｆプロモーター制御下におかれたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ；ｍＲＮＡの塩基長＝３０７５ｎｔ）が組み込まれているベクタープラスミドｐＰＳ１００（Masuda, S. et al., J. Bacteriol., Vol. 182, No 10, 2778-2786, 2000）をエレクトロポレーション法［１．８ｋＶ；E. coli Pulser（BIO RAD社製）］により大腸菌Ｓ１７−１（Simon, R. et al., Bio/Technology Vol. 1, 37-45, 1983）に導入した。ベクタープラスミドｐＰＳ１００の構造を図１に示す。図１において、Ｔｅｔｒはテトラサイクリン耐性遺伝子であり、Ｓｍｒ、Ｓｐｒはストレプトマイシン耐性遺伝子及びスペクチノマイシン耐性遺伝子である。【００３４】
得られた大腸菌Ｓ１７−１の形質転換体（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）と、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）とを、１：５の割合で混合し、ＬＢプレートにスポットして３０℃、暗条件下に１６時間インキュベートした。得られた形質転換体については、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＰＳ１００）と命名した。【００３５】
（２）菌体外におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のｍＲＮＡの確認
前記（１）で得られた形質転換体［ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＰＳ１００）］を、ＭＹＳ（２％ＮａＣｌ含）液体培地（表１、表２）に２０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加して調製した培地５０ｍＬに接種し、３０℃、嫌気明条件で２日間培養した後、菌体を遠心回収し、培養液と菌体を分離した。この培養液をフィルター滅菌（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＭＩＬＬＥＸＴＭＧＰ０．２２μｍ）後、エタノール沈殿し、菌体外核酸を回収した。【００３６】
得られた菌体外核酸から、ＲＮＡ精製キット［RNeasy kit（QIAGEN社）］を用いて菌体外ＲＮＡの調製を行った。得られた菌体外ＲＮＡ溶液について、ＤＮアーゼＩ処理［０．０２ユニット／μＬ  ＤＮアーゼＩ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２］を３７℃で１時間行い、更に、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりＲＮＡを調製した。【００３７】
得られたＲＮＡを、逆転写−ＰＣＲ用試薬［ThermoScriptTM RT-PCR System（invitrogen社）］を用いて逆転写を行った。逆転写の際、プライマーとして、表３に示すｌａｃＺ−Ｒプライマー（配列番号１）を用いた。逆転写反応の前処理として、菌体外ＲＮＡとプライマーの混合液を６５℃、５分間のインキュベートを行った。５０℃で３０分間、８５℃で５分間の逆転写反応により得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は熱変性；９４℃で１分間、アニーリング；５５℃で１分間、伸長；７２℃で１分間を１サイクルとして、３０サイクル行った。プライマーとして、表３に示すｌａｃＺに特異的なプライマーである、ｌａｃＺ−Ｒプライマー（配列番号１）及びｌａｃＺ−Ｌプライマー（配列番号２）を用いた。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（３０７６ｂｐ）の第２７１７番〜第２８８８番の塩基からなる領域（１７２ｂｐ）が増幅可能である。【００３８】
【表３】
2009063969.tif 000004
【００３９】
ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動により菌体外におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のｍＲＮＡの有無の確認を行った。なお、対照として、形質転換前の宿主であるロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４についても、同様の操作を実施した。また、菌体内のｍＲＮＡの有無の確認を行うために、遠心回収した菌体（宿主および形質転換体）についても、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
結果を図２に示す。図２における各レーンは以下のとおりである。
レーン１：１００ｂｐマーカー
レーン２：宿主（ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４）の菌体外ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物
レーン３：宿主の菌体内ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物
レーン４：形質転換体［ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＰＳ１００）］の菌体外ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物
レーン５：形質転換体の菌体内ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物
レーン６：β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＰＣＲ産物【００４０】
《実施例２：ストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの菌体外での検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ストレプトアビジンＲＮＡアプタマー（例えば、Srisawat C. and Engelke D. R., RNA 7, 632-641, 2001参照）を発現可能なプラスミドでロドビュルム  スルフィドフィラムを形質転換し、その形質転換体の菌体外において、ストレプトアビジンＲＮＡアプタマーが検出されることを確認した。【００４１】
（１）ロドビュルム  スルフィドフィラムの形質転換
ベクターｐＣＦ１０１０（Lee
J.K. and Kaplan S., J.B.C 270(35), 20453-20458, 1995）に、光合成細菌由来のｐｕｆプロモーター制御下におかれた５’側リボザイム配列（配列番号４における第３０番〜第８２番の塩基からなる配列）、ストレプトアビジンアプタマー配列（配列番号４における第８９番〜第１３６番の塩基からなる配列）、３’側リボザイム配列（配列番号４における第１４３番〜第２０８番の塩基からなる配列）がこの順で且つ連続して組み込まれているベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３を構築した。【００４２】
ベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３の構造を図３に、ベクタープラスミドに組み込んだインサート配列（プラスミドの配列も含む）の塩基配列（配列番号３及び配列番号４）を図４に、それぞれ示す。ベクタープラスミドに組み込んだインサート配列は、自己切断型のリポザイム配列でアプタマー配列を挟む構造をとっており、インサート配列が転写されると、ＲＮＡアプタマーが切り出される。【００４３】
構築したベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３をエレクトロポレーション法［１．８ｋＶ；E. coli Pulser（BIO RAD社製）］により大腸菌Ｓ１７−１（Simon, R. et al., Bio/Technology Vol. 1, 37-45, 1983）に導入した。
得られた大腸菌Ｓ１７−１の形質転換体（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）と、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）とを、１：５の割合で混合し、ＬＢプレートにスポットして３０℃、暗条件下に１６時間インキュベートした。得られた形質転換体については、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＣＦ−Ｐ５Ａ３）と命名した。【００４４】
（２）菌体外におけるストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの確認
前記実施例１（２）に記載の手順に従って、前記（１）で得られた形質転換体［ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＣＦ−Ｐ５Ａ３）］を培養し、菌体外核酸を回収し、菌体外ＲＮＡを調製した。【００４５】
得られたＲＮＡを、逆転写−ＰＣＲ用試薬［ThermoScriptTM RT-PCR System（invitrogen社）］を用いて逆転写を行った。逆転写の際、プライマーとして、表４に示すＡｐｔ−Ｒ−Ｅｔプライマー（配列番号６）を用いた。逆転写反応の前処理として、菌体外ＲＮＡとプライマーの混合液を６５℃、５分間のインキュベートを行った。５０℃で３０分間、８５℃で５分間の逆転写反応により得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、熱変性；９４℃で３０秒間、アニーリング；５７．５℃で３０秒間、伸長；７２℃で３０秒間を１サイクルとして、５サイクル行った後、更に、熱変性；９４℃で３０秒間、アニーリング；６０．９℃で３０秒間、伸長；７２℃で３０秒間を１サイクルとして、２５サイクル行った。プライマーとして、表４に示すＡｐｔ−Ｌ−Ａプライマー（配列番号５）及びＡｐｔ−Ｒ−Ｅｔプライマー（配列番号６）を用いた。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ストレプトアビジンＲＮＡアプタマー（図４において太字で示す配列；６５ｂｐ）が増幅可能である。【００４６】
【表４】
2009063969.tif 000005
【００４７】
ＰＣＲ後、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、菌体外におけるストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの存在の有無の確認を行った。なお、対照として、形質転換前の宿主であるロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４、及び同種の別の株（ＤＳＭ２３５１）についても、同様の操作を実施した。また、菌体内のＲＮＡの有無の確認を行うために、遠心回収した菌体（宿主および形質転換体）についても、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。【００４８】
結果を図５に示す。図５において、レーンＭは、１００ｂｐマーカーである。記号「ｉｎ」及び「ｅｘ」は、それぞれ、菌体内及び菌体外であることを意味し、「ＲＴ」及び「−」は、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＲＮＡのＰＣＲであることを意味する。
図５に示すとおり、菌体内及び菌体外のいずれも、ベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３を含む形質転換体のみで、６５ｂｐのバンドが確認された。【００４９】
《実施例３：ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４株由来ｒｒｎプロモーターの探索》
以下に示す手順に従って、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４株由来ｒｒｎプロモーターの探索を行った。【００５０】
（１）ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４のゲノムＤＮＡ調製
ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４を、ＭＹＳ（２％ＮａＣｌ含）液体培地（表１、表２）５０ｍＬに接種し、３０℃にて定常期まで培養した後、菌体を遠心回収した。回収した菌体を２．５％ＮａＣｌ溶液５ｍＬで洗浄後、１ｍＬずつ分注した。さらに菌体を遠心回収し、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）を含むＴＥ溶液２５０μＬに懸濁し、１０分間室温にてインキュベートした。この溶液にＳＴＥ溶液（０．５％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）２０μＬを加え、プロテイナーゼＫ（３０μｇ／μＬ）溶液２μＬを加えた後、３０分間室温でインキュベートした。その後フェノール／クロロホルム抽出し、溶液１００μＬに５Ｍ  ＮａＣｌ溶液６μＬを加えエタノール沈殿した。その後７０％エタノールで洗浄、風乾し、ＲＮアーゼＡ（０．０１μｇ／μＬ）を含むＴＥ溶液１００μＬを加え、３７℃、一晩インキュベートしＲＮＡを分解した。ＲＮアーゼ処理した溶液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。【００５１】
（２）インバースＰＣＲによる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子上流配列の増幅および塩基配列決定
上記（１）で調製したゲノムＤＮＡ５μｇについて、制限酵素ＢｓｓＨII処理［１ユニット／μＬ  ＢｓｓＨII、１０ｍＭ  Ｔｒｉs-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ］を５０℃で一晩行い、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により断片化したゲノムＤＮＡを回収した。断片化したゲノムＤＮＡについて、溶液１５０μＬ中でライゲーション反応［０．００１μｇ／μＬ  ＤＮＡ、５ユニット／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ］を１６℃で一晩行った。このライゲーション溶液１０μＬを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、熱変性；９４℃で１分間、アニーリング；４７℃で１．５分間、伸長；７２℃で２分間を１サイクルとして、３サイクル行い、その後、熱変性；９４℃で１分間、アニーリング；５７℃で１．５分間、伸長；７２℃で２分間を１サイクルとして、３２サイクル行った。プライマーとしてＥｃｏＲＩ２６−８［5’-atgaattctgttaggcctgccgccagc-3’（配列番号７）：下線はEcoRIサイト］及びＢａｍＨＩ２９８−３１７［5’-acggatccgaaggaatcttggacaatg-3’（配列番号８）：下線はBamHIサイト］を用いた。このＰＣＲにより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子上流の塩基配列（１５００ｂｐ程度）を増幅可能である。このＰＣＲ産物について、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ処理［０．６ユニット／μＬ  ＥｃｏＲＩ、０．５ユニット／μＬ  ＢａｍＨＩ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ］を３７℃で一晩行った。このＰＣＲ産物の塩基配列決定を行うため、ベクタープラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ社）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ処理を３７℃で行い、制限酵素処理したＰＣＲ産物とｐＧＥＭ−３Ｚについてライゲーション反応を１６℃で行った。このライゲーションしたプラスミドＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、エレクトロポレーション法［１．８ｋＶ；Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）］により大腸菌ＪＭ１０９へベクタープラスミドを導入した。得られた形質転換体（大腸菌ＪＭ１０９）からプラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法（Birnboin, H. C. and Doly, J., Nucleic Acids Research, vol. 7, No. 6,
1513-1523, 1979）により回収し、市販キット［Thermo Sequenase Cycle
Sequencing Kit (USB corporation)］ に従い、Ｍ１３プライマー (forward
or reverse) (IRD800) を用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子上流の塩基配列の決定を行った。【００５２】
決定した塩基配列の内、プロモーター領域の配列（配列番号９）を図６に示す。図６において、太字で示す塩基Ａは、転写開始点であり、二重下線で示す「ＴＴＧＣＧＧ」及び「ＴＡＧＡＣＡ」は、それぞれ、転写開始点の５’上流領域に存在する−３５部位及び−１０部位である。また、下線及び斜体で示す配列（３箇所）は、ＦＩＳ結合部位である。【００５３】
塩基配列を決定後は、プライマーｒｒｎ−２Ｌ［5’-TTGGTTGCGGCCGCTCTGGCGCTTCGATTCC-3’（配列番号１０）；下線部はNotIサイト］とプライマーｒｒｎ−Ｒ［5’-TTAATGCATGAATTCATTTCTACTTGGCGCCG-3’（配列番号１１）；下線部はEcoT22Iサイト］を用い、本菌のゲノムを鋳型としＰＣＲにより、ｒｒｎプロモーター部位を増幅した。ＰＣＲ反応は、変性反応９４℃で１分間、アニーリング反応５０．５℃で３０秒間、伸長反応７２℃で１分間を１サイクルとして１０サイクル行った後、変性反応９４℃で３０秒間、アニーリング反応５６．８℃で３０秒間、伸長反応７２℃で１分間を１サイクルとして２０サイクル行った。
その後、ベクタープラスミドｐＣＦ１０１０（Lee J.K. and Kaplan S., J.B.C 270(35), 20453-20458, 1995）のＮｏｔＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉサイト間に、ＰＣＲにより増幅したｒｒｎプロモーター部位をライゲーションにより組込んだ。このベクタープラスミドをｐＲ２とした。ｐＲ２の構造図とインサートの配列（ｒｒｎプロモーターの配列：配列番号１２）を、図７に示す。【００５４】
《実施例４：ｐｕｆプロモーターおよびｒｒｎプロモーターによるβ−ガラクトシダーゼ活性の比較》
本実施例では、以下に示す手順に従って、大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドでロドビュルム  スルフィドフィラムを形質転換し、その形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、各プロモーター（ｐｕｆプロモーター、ｒｒｎプロモーター）の活性を比較した。現在、ロドビュルム  スルフィドフィラムにおいて開示されており使用可能なプロモーターはｐｕｆプロモーター（Masuda, S. et al., J. Bacteriol., Vol. 182, No 10, 2778-2786, 2000）のみである。【００５５】
（１）ロドビュルム  スルフィドフィラムの形質転換
光合成細菌由来のｐｕｆプロモーター制御下におかれたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ；ｍＲＮＡの塩基長＝３０７５ｎｔ）が組み込まれているベクタープラスミドｐＰＳ１００、前記実施例３で構築した、光合成細菌由来のｒｒｎプロモーター制御下におかれたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれているベクタープラスミドｐＲ２をエレクトロポレーション法［１．８ｋＶ；E. coli Pulser（BIO RAD社製）］により大腸菌Ｓ１７−１（Simon, R. et al., Bio/Technology Vol. 1, 37-45, 1983）に導入した。【００５６】
得られた大腸菌Ｓ１７−１の形質転換体（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）と、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）とを、１：５の割合で混合し、ＬＢプレートにスポットして３０℃、暗条件下に１６時間インキュベートした。得られた形質転換体については、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＰＳ１００）及びロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＲ２）と命名した。【００５７】
（２）β−ガラクトシダーゼ活性の測定
前記（１）で得られた形質転換体［ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＰＳ１００）またはロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＲ２）］を、ＭＹＳ（２％ＮａＣｌ含）液体培地（表１、表２）に２０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加して調製した培地５０ｍＬに接種し、３０℃、対数増殖期まで培養した後、濁度（ＯＤ６００）を測定した。その後菌液１０μＬを回収し、菌体を遠心回収した。この菌体にＺバッファー（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）０．６４ｍＬを加え懸濁後、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）を含むＺバッファー０．１６ｍＬを加え懸濁し、３７℃で５分間保温した。その後１０％トリトンＸ−１００（８μＬ）を加え懸濁し氷冷した。この溶液を遠心分離し、上清を２分間３０℃で保温した。この溶液にｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（４ｍｇ／ｍＬ）を含むＺバッファー０．２ｍＬを加えた。この時間を０とし、一定時間反応させた後、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（０．４ｍＬ）を加え反応を停止した。その後この溶液のＡ４２０を測定しβ−ガラクトシダーゼの活性を次式により算出した。
β−ガラクトシダーゼ活性（Ｍｉｌｌｅｒ  ｕｎｉｔｓ）＝１０００×Ａ４２０／（ｔ×ＯＤ６００×Ｖ）
［ｔは反応時間（分）、Ｖは菌液の量（ｍＬ）（今回は１０μＬなのでＶ＝０．０１）］【００５８】
なお、対照として、プロモーターを含まないプラスミドｐＣＦ１０１０を保持したロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４についても、同様の操作を実施した。
結果を図８に示す。図において記号「ｐＣＦ１０１０」、「ｐＰＳ１００」、「ｐＲ２」は、各々のプラスミドを保持したロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４であることを意味し、各々の記号の下に示した数値はβ−ガラクトシダーゼ活性値を意味する。
図８に示すとおりｒｒｎプロモーターはｐｕｆプロモーターよりも１００倍程度活性が高いことが判明した。【００５９】
《実施例５：ストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの菌体外での検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ストレプトアビジンＲＮＡアプタマー（例えば、Srisawat C. and Engelke D. R., RNA 7, 632-641, 2001参照）を発現可能なプラスミドでロドビュルム  スルフィドフィラムを形質転換し、その形質転換体の菌体外において、ストレプトアビジンＲＮＡアプタマーが検出されることを確認した。【００６０】
（１）ロドビュルム  スルフィドフィラムの形質転換
ベクターｐＣＦ１０１０（Lee
J.K. and Kaplan S., J.B.C 270(35), 20453-20458, 1995）に、光合成細菌由来のｐｕｆプロモーターもしくはｒｒｎプロモーター制御下におかれた５’側リボザイム配列、ストレプトアビジンアプタマー配列、３’側リボザイム配列、ｐｕｆターミネーター（Masuda, S. et al. J. Biol. Chem. 247, 10795-10801, 1999参照）がこの順で且つ連続して組み込まれているベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３ｔもしくはｐＲＳＡを構築した。ベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３ｔのインサート配列（配列番号３、配列番号１３、配列番号１４）を図９に、ベクタープラスミドｐＲＳＡのインサート配列（配列番号１５、配列番号１６、配列番号１４）を図１０にそれぞれ示す。ベクタープラスミドに組み込んだインサート配列は、自己切断型のリボザイム配列でアプタマー配列を挟む構造をとっており、インサート配列が転写されると、ＲＮＡアプタマーが切り出される。【００６１】
構築したベクタープラスミドｐＣＦ−Ｐ５Ａ３ｔおよびｐＲＳＡをエレクトロポレーション法［１．８ｋＶ；E. coli Pulser（BIO RAD社製）］により大腸菌Ｓ１７−１（Simon, R. et al., Bio/Technology Vol. 1, 37-45, 1983）に導入した。
得られた大腸菌Ｓ１７−１の形質転換体（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）と、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（１．０×１０１０細胞／ｍＬ）とを、１：５の割合で混合し、ＬＢプレートにスポットして３０℃、暗条件下に１６時間インキュベートした。得られた形質転換体については、ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＣＦ−Ｐ５Ａ３ｔ）およびロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＲＳＡ）と命名した。【００６２】
（２）菌体外におけるストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの確認
前記実施例に記載の手順に従って、前記で得られた形質転換体［ロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＣＦ−Ｐ５Ａ３ｔ）およびロドビュルム  スルフィドフィラムＤＳＭ１３７４（ｐＲＳＡ）］を培養し、菌体外核酸を回収し、菌体外ＲＮＡを調製した。
調製したＲＮＡをＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋メンブレン（GE Healthcare社製）にスポットし、ドットブロット法によりストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの検出を行った。プローブは市販キット（PCR DIG Probe Synthesis Kit; Roche社製）を用いて調製した。プローブ調製の際、プライマーとしてＡｐｔ−Ｒ−Ｅｔプライマー（配列番号５）およびＡｐｔ−Ｌ−Ａプライマー（配列番号６）を用いた。調製したプローブを用いてメンブレン上にスポットしたＲＮＡとハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション反応の前処理として、調製したプローブを９５℃、５分間保温した後、氷冷して変性させた。ハイブリダイゼーションの反応は、５０℃でＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Roche社製）溶液中で１６時間行った。ハイブリダイゼーション反応後、メンブレンを低ストリンジェンシーバッファー（0.1% SDS、2×SSC）中で室温５分間洗浄した。洗浄は２回行った。低ストリンジェンシーバッファーで洗浄後、高ストリンジェンシーバッファー（0.1% SDS、0.1×SSC）中で５０℃にて１５分間洗浄した。洗浄は２回行った。高ストリンジェンシーバッファーで洗浄後、市販キット（DIG Nucleic Acid Detection Kit; Roche社製)を用いてストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの検出を行った。
ｐｕｆプロモーターもしくはｒｒｎプロモーターのいずれの場合にも、菌体外におけるストレプトアビジンＲＮＡアプタマーの存在が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
菌体外へのＲＮＡ生産能を有する形質転換体を用いる、本発明のＲＮＡ製造方法は、新たに導入したＤＮＡ配列の種類に応じて様々なＲＮＡ（特に人工ＲＮＡ）を簡易的に合成することができるものであり、様々な人工ＲＮＡの簡易的で大量合成に利用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列表の配列番号１、２、５−８、１０、１１の各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号３、４、１２−１６の各塩基配列は、インサート配列である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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