(57)【要約】この発明は、植物の成長に関与する遺伝子を解明し、当該遺伝子を利用して成長が促進された形質転換植物を提供する。
2009072676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡが導入された、形質転換植物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
植物の成長を促進させる活性が、根の伸長を促進させる活性である、請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項３】
植物の成長を促進させる活性が、葉面積を増大させる活性である、請求項１または２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
単子葉植物または双子葉植物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項５】
植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換体植物の作出方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項８】
請求項６に記載の組換えベクターを用いて前記ＤＮＡが導入される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長が促進された形質転換植物およびその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の根は、栄養吸収、植物体直立の維持などで重要な役割を担っている。しかし、そのような生理現象に関わる因子は、未知なものが多い。
近年、ＤＮＡ配列は決定されているが機能は未知の遺伝子を総合的に解析できる、Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍと呼ばれる方法が開発された（特許文献１）。この方法は、完全長ｃＤＮＡを高発現型ベクターにつないでシロイヌナズナにベクターを導入し、完全長ｃＤＮＡを高発現させたシロイヌナズナを作製するというものである。このＦｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍは、様々な遺伝子解析に適用可能である。
一方、植物の成長に関する特許出願がいくつかなされており、例えば、植物の根の伸長を制御する遺伝子（特許文献２）、植物の成長を促進させる方法（特許文献３）、植物の成長および収穫量を増大させる方法（特許文献４）などが挙げられる。特許文献２には、シロイヌナズナＴ−ＤＮＡタグラインを利用して、根端で特異的に発現するシロイヌナズナ遺伝子（ＡｔＧＣＮ２０−３）が同定されたことが開示されている。特許文献３には、植物由来のサイクリンＢ２遺伝子を過剰発現させることにより、根などの成長器官の伸長を促進させることが開示されている。特許文献４には、調節配列に結合されたサイクリンタンパク質をコードする核酸を植物に形質転換し、根やシュートの成長の増大を示す形質転換植物を作出することが開示されている。
【特許文献１】再公表２００３／０１８８０８号公報
【特許文献２】特開２００４−１８７５６４号公報
【特許文献３】特開２００４−３０５０５１号公報
【特許文献４】特表２００２−５３１０８３号公報
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、植物の成長に関与する遺伝子を解明し、当該遺伝子を利用して成長が促進された形質転換植物およびその作出方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、イネの完全長ｃＤＮＡを１つずつ高発現させた、イネ完全長ｃＤＮＡ高発現シロイヌナズナライン（イネＦＯＸラインという）を作製し、Ｒｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行い、野生型と比較して根の伸長に変化のあったシロイヌナズナを単離し、該シロイヌナズナに導入されたイネ完全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、植物の成長に関与するＤＮＡを同定し、本発明を完成した。
本発明は、要約すると以下の通りである。
［１］以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡが導入された、形質転換植物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［２］植物の成長を促進させる活性が、根の伸長を促進させる活性である、［１］に記載の形質転換植物。
［３］植物の成長を促進させる活性が、葉面積を増大させる活性である、［１］または［２］に記載の形質転換植物。
［４］単子葉植物または双子葉植物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換植物。
［５］植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、［１］〜［４］のいずれかに記載の形質転換植物。
［６］以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［７］以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換体植物の作出方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［８］［６］に記載の組換えベクターを用いて前記ＤＮＡが導入される、［７］に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−３１５９５３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｒｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙの概略を示す。
図２は、再形質転換されたイネＦＯＸラインの根の伸長を示す。パネルＡはイネＦＯＸライン１（配列番号１、２）、パネルＢはイネＦＯＸライン２（配列番号３、４）を示す。
図３は、再形質転換されたイネＦＯＸラインの根の伸長を示す。パネルＣはイネＦＯＸライン３（配列番号５、６）、パネルＤはイネＦＯＸライン４（配列番号７、８）を示す。
図４は、再形質転換されたイネＦＯＸラインの葉面積の増大を示す。パネルＡはイネＦＯＸライン１（配列番号１、２）、パネルＢはイネＦＯＸライン２（配列番号３、４）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（１）植物の成長の促進に関与するＤＮＡ
本発明に用いる植物の成長の促進に関与するＤＮＡは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７に示すＤＮＡであり、該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８である。これらの配列情報は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において報告されている。配列番号１〜８に対応するＮＣＢＩのアクセッションナンバーを以下に示す。
【表１】
2009072676.tif 000003
上記植物の成長の促進に関与するＤＮＡは、Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍとＲｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを用いてイネの遺伝子について探索した結果、見出された。
Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｈｕｎｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、完全長ｃＤＮＡを植物に導入して高発現させることによりもたらされる形質の変化からＤＮＡの機能を明らかにする方法である（特許文献１参照）。本発明では、植物に導入する完全長ｃＤＮＡとして、イネ完全長ｃＤＮＡを用い、完全長ｃＤＮＡを導入する植物として、シロイヌナズナを用いた。
具体的には、イネの完全長ｃＤＮＡ約１３，０００種類をｃＤＮＡの等量比のプールとして調製し（標準化という）、このｃＤＮＡをプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御領域、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを持ったＴ−ＤＮＡベクターに組み込む。該Ｔ−ＤＮＡベクターをアグロバクテリウムに導入してイネ完全長ｃＤＮＡ発現ライブラリー（イネＦＯＸライブラリーという）を作製する。該アグロバクテリウムを用いてフローラルディッピング法によりシロイヌナズナの形質転換を行い、シロイヌナズナの形質転換ライン（イネＦＯＸライン）を作製する。Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍでは、植物を何億クローンものライブラリーに感染させても、１植物に１〜２クローンしか導入されないので、植物に別々のクローンが導入された形質転換ラインを作製することができる。上記の形質転換されたシロイヌナズナからＴ１種子を回収し、Ｔ１種子を播種して、さらにＴ２世代の種子を回収する。Ｔ２種子は、スクリーニングを行うためＲｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙに供する。
Ｒｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙは、Ｂｒｉｔｔら（１９９３），Ａ  ＵＶ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ（６−４）ｄｉｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：，１５７１−１５７４の文献に記載されている方法であり、本発明では、具体的に以下のようにして行う。
イネＦＯＸラインのＴ２種子と野生型種子をＭＳ寒天培地に播種し、暗処理、春化処理をした後、根が寒天培地表面上を這って伸長するように培地を立てて連続白色光下で生育させ、次に寒天培地を水平に置き、暗所下でＵＶ−Ｂを照射し、その後、立てたプレートを９０度回転させて、根の伸長方向を変え、再び連続白色光下で生育させる。そして、ＵＶ−Ｂ照射後に伸長した根の長さを、野生型とイネＦＯＸラインＴ２植物とで比較し、野生型よりも長く根が伸長したラインをＵＶ−Ｂ耐性候補として単離する。
単離された候補のイネＦＯＸラインについて、導入されたイネ完全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定し、該イネ完全長ｃＤＮＡをシロイヌナズナに再度形質転換し、得られた再形質転換体において根の伸長が促進される表現型が再現されるかを確認する（図１参照）。
このようにして同定されたＤＮＡは、具体的には、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡである。
上記ＤＮＡは、植物の成長を促進させる活性を有するタンパク質をコードする。ここで「植物の成長を促進させる活性」は、野生型に比べて植物の成長を促進させる活性であれば特に限定されず、例えば、根の伸長を促進させる活性および／または葉面積を増大させる活性が挙げられる。植物の成長の促進の程度は、野生型と比べて統計学的に有意であれば限定されない。例えば、本発明の形質転換植物の根の長さが、野生型の根の長さに対して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上長いことが好ましい。また、本発明の形質転換植物の葉面積が、野生型の葉面積に対して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上大きいことが好ましい。
本発明に用いるＤＮＡは、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡでもよい。
本明細書において「配列番号１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、配列番号１に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号１に示す塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよく、あるいは配列番号１に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよいことを意味する。
また、本発明に用いるＤＮＡは、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡでもよい。
本明細書において「配列番号１に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本明細書で使用される塩基配列の「同一性」とは、２つの塩基配列のアラインメントにおいて、同一の塩基数が最大となるように該２つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には総塩基数に対する同一塩基数のパーセンテージ（％）で表される。％同一性は、公知のＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを用いて決定することができる。ＦＡＳＴＡのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総塩基数に加算する。
さらに、本発明に用いるＤＮＡは、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでもよい。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号１に示す塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
あるいは、ストリンジェントな条件は、２〜６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ、１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である。）、室温〜４０℃でハイブリダイゼーションを行い、０．１〜１×ＳＳＣ（好ましくは０．１〜０．２×ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ、５０〜６８℃にて１回または複数回の洗浄を行う条件でもよい。
本発明に用いられるＤＮＡは、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡにより、コードされる。
また、本発明に用いられるＤＮＡは、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、該アミノ酸配列に保存的アミノ酸置換が含まれてもよい。このような置換は、例えば、構造的又は電気的性質の類似するアミノ酸間で起こる。そのようなアミノ酸グループは、（１）酸性アミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；（４）非荷電極性アミノ酸：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン；及び（５）芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンを含む。
本明細書において「配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいことを意味する。
さらに、本発明に用いられるＤＮＡは、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質が植物の成長を促進させる活性を有する限り、上記配列番号に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
本明細書において「配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本明細書で使用されるアミノ酸配列の「同一性」とは、２つのアミノ酸配列（または塩基配列）のアラインメントにおいて、同一のアミノ酸残基数が最大となるように該２つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には総アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基数のパーセンテージ（％）で表される。％同一性は、公知のＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを用いて決定することができる。ＦＡＳＴＡのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総アミノ酸残基数に加算する。
本発明に用いるＤＮＡは、配列番号１〜８のいずれかの配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、該ＤＮＡは、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、該ＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは該ＤＮＡは、化学合成法等の当該技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
上記ＤＮＡまたはアミノ酸の欠失、付加および置換は、上記タンパク質をコードするＤＮＡを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。ＤＮＡに変異を導入するには、例えばＫｕｎｋｅｌ法またはＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等により行うことができ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎ−Ｋ（タカラバイオ株式会社）、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社））等を用いて変異を導入できる。
上記ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、組換えなどの慣用技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
（２）組換えベクター
植物形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターとして、アグロバクテリウムを介して植物に目的ＤＮＡを導入することができるｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクター等が好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ、例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＧ２１１３等が挙げられる。バイナリーベクターとは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列よりなるボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことができる。また、その他のベクターとして、植物にＤＮＡを直接導入することができるｐＵＣ系のベクター、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。さらに、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターが挙げられる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記バイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ間）に、目的ＤＮＡを挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増殖する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５あるいはアグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３３４等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを用いて植物への目的ＤＮＡの導入を行う。
ベクターに目的ＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
また、目的ＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには目的ＤＮＡの上流、内部あるいは下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（ＴｉまたはＲｉプラスミド由来の複製開始点等）、選択マーカー遺伝子等を連結することができる。
プロモーターとしては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体的には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来アクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
エンハンサーとしては、例えば、目的ＤＮＡの発現効率を高めるために用いられ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、転写エンハンサーＥ１２、オメガ配列等が挙げられる。
ターミネーターとしては、プロモーターにより転写されたＤＮＡの転写を終結できる配列であればよく、例えばノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
選択マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げられる。
（３）形質転換植物およびその作出方法
本発明の形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡまたは上記組換えベクターを対象植物に導入することによって作出することができる。本発明において「ＤＮＡの導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的方法により、目的ＤＮＡを上記宿主植物の細胞内に発現可能な形で導入することを意味する。ここで導入されたＤＮＡは、宿主植物のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
ＤＮＡまたは組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法では、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ法）がある。プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）と共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、種子あるいは植物体を用いるｉｎ  ｐｌａｎｔａ法を適用する場合、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物等へのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「新版モデル植物の実験プロトコール  遺伝学的手法からゲノム解析まで（監修  島本功  岡田清孝、秀潤社、２００１年）」等の記載に従って行うことができる。
ＤＮＡが植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、目的ＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロース電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらにマイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的ＤＮＡの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することによっても確認できる。
本発明において形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれでもよく、例えばアブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ等）、イネ科（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等）、ナス科（ナス、タバコ、トマト、ジャガイモ等）等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官・植物組織、これらの切片、未分化のカルス、これを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。また、ｉｎ  ｐｌａｎｔａ法の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。
植物培養細胞を形質転換の対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには、既知の組織培養法により器官または個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば以下のように行うことができる。
まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
カルス誘導は寒天等の固形培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率よくかつ大量に行うことができる。次に継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、さらに完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（たとえばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵等を行うこともできる。
本発明の形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを導入した植物体全体、植物体の一部（例えば葉、花弁、茎、根、花粉等）、植物培養細胞（例えばカルス、プロトプラスト等）、種子のいずれをも包含するものである。また、該植物体の有性生殖または無性生殖により得られる子孫の植物体、およびその子孫植物体の一部、培養細胞、種子も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、形質転換植物から種子、プロトプラスト等の繁殖材料を取得し、それを栽培または培養することによって量産することができる。
上記のようにして得られる形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡの高発現により、植物の成長、特に根の伸長および／または葉面積の増大が促進される。その結果、地中で根が伸長して、耐倒性の増加、耐乾燥性の増大、貧栄養下での植物育成が可能となる。また、葉の成長も促進され、光合成活性の増加が可能となり、最終的に植物体全体の生育を促進し得る。
【実施例１】
【０００６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍによるイネＦＯＸラインの作製
本実施例では、恒常発現型ベクターｐＢＩＧ２１１３Ｎ（Ｔａｊｉ，Ｔ．らＰｌａｎｔ  Ｊ．，２００２．２４（４）：ｐ．ｐ．４１７−４２６及びＢｅｃｋｅｒ，Ｄ．らＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９０．１８（１）：ｐ．２０３）にＳｆｉＩクローニングサイトを導入したｐＢＩＧ２１１３ＳＦを用いて、イネ完全長ｃＤＮＡのスクリーニングを行った。
（ｉ）標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスの作製
イネから完全長ｃＤＮＡをＣＡＰｔｒａｐｐｅｒ法によって作製した。このｃＤＮＡをＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ、あるいはＬａｍｂｄａ  ｐＬＣ−１−ＢのＳｆｉＩ制限酵素部位によって挟まれる部位にクローニングした（参考文献：Ｓｅｋｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１５，７０７−７２０（１９９８））。ベクター配列を用いてｃＤＮＡの５’末端と３’末端の配列を読み、ｃＤＮＡのグルーピングを行い、独立の２０，０００種クローンを同定した（参考文献：Ｓｅｋｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９，２１１−２２０（２００１））。次に、５０ｎｇ／μｌに調製した各クローンから０．５μｌを分取して１本のチューブに混ぜた。この混合液１μｌ分取し、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＤＨ１０Ｂ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に形質転換した。Ａｍｐが含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約２００，０００個混合し、そこからプラスミドを回収した。これを標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスとした。
（ｉｉ）イネＦＯＸライブラリーの作製
２μｇの標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスと、７００μｇのｐＢＩＧ２１１３ＳＦを混ぜてから同時にＳｆｉＩで完全に切断した。切断後、イソプロパノール沈殿により濃縮し、８μｌの水に溶かし１μｌの１０×バッファーと１μｌのＴ４リガーゼを混ぜ、１６℃で１昼夜反応させた。２μｌの反応液を４０μｌのＥｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＤＨ１０Ｂに混ぜて形質転換した。
カナマイシン（Ｋｍ）が含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約１５０，０００個混合し、そこからプラスミド回収をした。回収した２μｌのプラスミド液を、４０μｌのＥｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｅｌｌ  ＧＶ３１０１に混ぜて形質転換した。Ｋｍが含まれる寒天培地上で生育した独立のコロニーを約１５０，０００個ＬＢ液体培地に懸濁し、１５％になるようグリセロールを加え、−８０℃にて保存した。このグリセロール溶液をイネＦＯＸライブラリーとした。
（ｉｉｉ）イネＦＯＸラインの作製
上記イネＦＯＸライブラリーを約２００，０００コロニー生育させ、ディッピング溶液に懸濁させた後、野生型シロイヌナズナ（エコタイプ：コロンビア）のフローラルディッピングを行った。種（Ｔ１種子）を収穫し、ハイグロマイシンを含む貧栄養培地ＢＡＭ上で発芽させ、ハイグロマイシン耐性を示す約２３，０００ラインの植物のみを土に移植した。
（２）イネＦＯＸラインＴ２世代のＲｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙによるスクリーニング
上記（１）（ｉｉｉ）で土に移植した植物から種（Ｔ２種子）を収穫し、Ｔ２種子と野生型の種子を滅菌の後、１．２％寒天培地（ＭＳ培地、Ｂ５ビタミンを含有）上に播種した。播種後、アルミホイルで包んで暗処理し約１週間４℃に置いて春化処理をした後に、根が寒天培地表面上を這って伸長するように培地を立てて、２２℃、連続白色光下で３日間成育させた。根を成育させた寒天培地を水平に置き、暗所下で約２．３Ｗｍ−２のＵＶ−Ｂ（約８ｋＪｍ−２）を照射した。その後、立てたプレートを９０度回転させて根の伸長方向を変え、再び２２℃、連続白色光下で３日間成育させた（図１）。
ＵＶ−Ｂ照射後の３日間で伸長した根の長さを評価した。画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）にて根長を定量的に測定することにより、ＵＶ−Ｂ耐性の有無を判別した。その結果、Ｒｏｏｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙに供した７０３４のイネＦＯＸラインから、４９ラインをＵＶ−Ｂ耐性ライン候補として単離した。
（３）ｃＤＮＡの再クローニングとイネＦＯＸラインに挿入されたイネ完全長ｃＤＮＡの塩基配列決定
上記（２）でスクリーニングされた候補のイネＦＯＸラインからロゼッタ葉約２枚（約２００ｍｇｆｗ）を回収し、ゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液は以下の組成のもの用い、９４℃で０．５分、５５℃で０．５分及び７２℃で４分を１サイクルとして４０サイクルの条件で反応させた。
反応液組成：
プライマー（１００ｐＭ）  ２×０．２５μｌ
ｄＮＴＰ（２００μＭ）              ４μｌ
バッファー（×２）                ２５μｌ
ポリメラーゼ                    ０．５μｌ
ゲノムＤＮＡ                      １０μｌ
蒸留水                            １０μｌ
合計                              ５０μｌ
ＰＣＲのためのプライマーは以下の通りである。
2009072676.tif 000004
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で回収した後に、ｐＢＩＧ２１１３ＳＦと混ぜ、ＳｆｉＩによって完全切断した後にイソプロパノールを用いて沈殿させ、Ｔ４リガーゼを処理後、大腸菌に形質転換した。ＰＣＲ断片が挿入されたプラスミドを選抜して、上記プライマーを用いて挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列を同定した。
（４）根の伸長促進の表現型の確認
上記（３）で得られたイネ完全長ｃＤＮＡを再度導入したシロイヌナズナ形質転換体のＴ２種子と野生型の種子各２０粒前後を滅菌の後、１．２％寒天培地上に播種した。播種後、アルミホイルで包んで暗処理し約１週間４℃に置いて春化処理をした後に、根が寒天培地表面上を這って伸長するように培地を立てて２２℃、連続白色光下で７日間成育させた。その後、植物体の写真を撮り、胚軸と根の境界から根端までの長さを上記画像解析ソフトにより測定した。
根の伸長促進の表現型は、再形質転換体においても再現された。イネＦＯＸライン１〜４の写真および根長のグラフを図２、図３に示す。図２のパネルＡにおいて、野生型の根長は１５．４９ｍｍ（平均）、イネＦＯＸライン１の根長は１８．３６ｍｍ（平均）であった。図２のパネルＢにおいて、野生型の根長は１３．３７ｍｍ（平均）、イネＦＯＸライン２の根長は１８．７６ｍｍ（平均）であった。図３のパネルＣにおいて、野生型の根長は１６．９８ｍｍ（平均）、イネＦＯＸライン３の根長は２２．２５ｍｍ（平均）であった。図３のパネルＤにおいて、野生型の根長は１３．９７ｍｍ（平均）、イネＦＯＸライン４の根長は１６．７８ｍｍ（平均）であった。
また、これらのイネＦＯＸラインに導入されたイネ完全長ｃＤＮＡの配列を配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８に示す。
（５）葉面積の増大の表現型の確認
上記（３）で得られたイネ完全長ｃＤＮＡを再度導入したシロイヌナズナ形質転換体のＴ２種子と野生型の種子を培養土に各々２０〜３０粒播種し、４日間４℃に置いて春化処理を行った。その後、２２℃、１６時間明期で栽培し、明条件での栽培開始後１５日目に植物体の写真撮影を行い、葉面積を上記画像解析ソフトにより測定した。
葉面積の増大の表現型は、再形質転換体においても再現された。イネＦＯＸライン１および２の写真ならびに葉面積のグラフを図４に示す。図４のパネルＡにおいて、野生型の葉面積は３．３０ｍｍ２（平均）、イネＦＯＸライン１の葉面積は５．２２ｍｍ２（平均）であった。図４のパネルＢにおいて、野生型の葉面積は３．３１ｍｍ２（平均）、イネＦＯＸライン２の葉面積は５．１１ｍｍ２（平均）であった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明で機能が解明された遺伝子は、植物の成長、特に根の伸長に関与し、該遺伝子を植物で高発現させることにより、植物の栄養吸収能の増大、すなわち貧栄養条件下で育成することができ、また、耐倒性を増加させ、耐乾燥性を増大させることができる。特に根菜などのように根を主とする作物の食用となる部分を肥大させることで、食用作物としての商品価値を付加することができる。
また該遺伝子は、葉面積の増大にも関与し、該遺伝子を植物で高発現させることにより、地上部での成長を促進することができる。特に葉野菜において地上部の組織量を増加させ、食用部分を増加させることで、食用植物としての商品価値を付加することができる。
このように、形質転換により根の伸長、葉面積の増大に関与する遺伝子を高発現させれば、最終的に植物体全体の生育を促進させた植物を作出できる。形質転換技術が確立されている植物であれば、扱う植物を選ばずに本発明を適用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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