(57)【要約】配列番号：２のアミノ酸配列またはそのバリエーションのアミノ酸配列からなる自家和合性制御因子をコードする塩基配列を含有する核酸、当該自家不和合性制御因子の機能の発現を抑制する抑制剤、自家和合性ソバ属植物およびその製法、プライマーセットならびにプローブを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において、自家不和合性を正に制御する自家不和合性制御因子をコードする単離された核酸であって、
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも５３％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｄ）配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつ植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列を含有する核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸に含まれる遺伝子にコードされる自家不和合性制御因子の機能の発現を抑制する抑制剤であって、
（Ｉ）請求項１に記載の核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子に対して機能欠失型の変異が導入された変異型遺伝子を含む核酸、
（ＩＩ）請求項１に記載の核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、または
（ＩＩＩ）請求項１に記載の塩基配列に基づき設計された２１〜２３塩基対の二本鎖ＲＮＡからなり、ＲＮＡ干渉によって本発明の核酸の発現を抑制するｓｉＲＮＡ
を含有していることを特徴とする、自家不和合性制御因子の抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸を保持する自家不和合性ソバ植物から自家和合性ソバ植物を製造する方法であって、
前記自家不和合性ソバ植物において、前記核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害することを特徴とする、自家和合性ソバ植物の製造方法。
【請求項４】
前記自家不和合性植物に、請求項２に記載の抑制剤を導入して前記遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の製造方法によって得られる自家和合性ソバ植物。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸またはその一部を増幅するプライマーセットであって、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも５３％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｄ）配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつ植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列
からなる群より選ばれた配列における連続した少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基配列を含むプライマーと、
前記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれた配列に相補的な配列における連続した少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基配列を含むプライマーと
を含有するプライマーセット。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を検出するプローブであって、
(i)配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするセンス鎖の配列中の連続した少なくとも２０ヌクレオチドからなる塩基配列Ａまたは前記塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂからなるオリゴヌクレオチド、および
(ii)配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするセンス鎖またはその相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
のいずれかからなるプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自家不和合性制御因子をコードする核酸に関する。さらに詳しくは、本発明は、自家不和合性植物などの品種改良、食品素材などの素材の開発、当該素材の供給などに有用な、自家不和合性制御因子をコードする核酸、前記自家不和合性制御因子の抑制剤、自家和合性ソバ属植物およびその製造方法、プライマーセットならびにプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
普通ソバなどのソバ属植物の種子には、デンプン、ポリフェノールの１種であるルチン、タンパク質、ミネラルなどの栄養成分が豊富に含まれている。したがって、ソバ属植物は、栄養成分の供給源として有用である。また、ソバ属植物は、イネ、麦などのイネ科植物と比べ、土壌などの環境に対する適応性が高く、しかも、栽培期間が短いという優れた性質を有する。なかでも、普通ソバは、病害に対して比較的強いという性質を有する。したがって、ソバ属植物は、イネ、麦などが不作である場合に備えるための救荒植物の１つとして有用である。【０００３】
ところで、イネ科植物は、自家受粉によって結実するため、交配育種が容易であり、交配後に形質を固定しやすいという性質を有する（例えば、特許文献１などを参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２７４７５２号公報、段落番号［００６２］−［００７４］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、普通ソバは、イネ科植物と異なり、他家受粉によって結実する異形自家不和合性植物であるため、収量が少なくなりやすい傾向があり、しかも交配育種を行なうことが困難である。【０００６】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、有用形質の導入などを迅速、かつ効率よく行なうことができる自家和合性を示す植物などの育種などを可能にする、自家不和合性制御因子をコードする核酸および前記自家不和合性制御因子の抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、有用形質の導入などを迅速、かつ効率よく行なうためのソバ属植物を提供することができる自家和合性ソバ属植物およびその製造方法、プライマーセットならびにプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  植物において、自家不和合性を正に制御する自家不和合性制御因子をコードする単離された核酸であって、
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも５３％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｄ）配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつ植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列を含有する核酸、
〔２〕  前記〔１〕に記載の核酸に含まれる遺伝子にコードされる自家不和合性制御因子の機能の発現を抑制する抑制剤であって、
（Ｉ）前記〔１〕に記載の核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子に対して機能欠失型の変異が導入された変異型遺伝子を含む核酸、
（ＩＩ）前記〔１〕に記載の核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、または
（ＩＩＩ）前記〔１〕に記載の塩基配列に基づき設計された２１〜２３塩基対の二本鎖ＲＮＡからなり、ＲＮＡ干渉によって本発明の核酸の発現を抑制するｓｉＲＮＡ
を含有していることを特徴とする、自家不和合性制御因子の抑制剤、
〔３〕  前記〔１〕に記載の核酸を保持する自家不和合性ソバ植物から自家和合性ソバ植物を製造する方法であって、
前記自家不和合性ソバ植物において、前記核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害することを特徴とする、自家和合性ソバ植物の製造方法、
〔４〕  前記自家不和合性植物に、前記〔２〕に記載の抑制剤を導入して前記遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害する、前記〔３〕に記載の方法、
〔５〕  前記〔３〕または〔４〕に記載の製造方法によって得られる自家和合性ソバ植物、
〔６〕  前記〔１〕に記載の核酸またはその一部を増幅するプライマーセットであって、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも５３％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｄ）配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつ植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列
からなる群より選ばれた配列における連続した少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基配列を含むプライマーと、
前記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれた配列に相補的な配列における連続した少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基配列を含むプライマーと
を含有するプライマーセット、ならびに
〔７〕  前記〔１〕に記載の核酸を検出するプローブであって、
(i)配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするセンス鎖の配列中の連続した少なくとも２０ヌクレオチドからなる塩基配列Ａまたは前記塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂからなるオリゴヌクレオチド、および
(ii)配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするセンス鎖またはその相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
のいずれかからなるプローブ
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の自家不和合性制御因子をコードする核酸および前記自家不和合性制御因子の抑制剤によれば、有用形質の導入などを迅速、かつ効率よく行なうことができる自家和合性を示す植物などの育種が可能になる。また、本発明の自家和合性ソバ属植物およびその製造方法、プライマーセットならびにプローブによれば、有用形質の導入などを迅速、かつ効率よく行なうためのソバ属植物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例２において、短花柱植物および長花柱植物それぞれのＤＮＡにおけるイン・シリコで抽出されたコンティグに対応する断片の有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図２】調製例２において、選別されたイオンビーム誘導キメラ植物を示す図面代用写真である。
【図３】実験例３において、イオンビーム誘導キメラ植物の短花柱および長花柱それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ３、ＳＳＣ５、ＳＳＣ７およびＳＳＣ１５それぞれの有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図４】試験例１において、根、茎、葉、雌蕊、雄蕊および花粉それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ７およびＳＳＣ５それぞれの有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図５】試験例２において作製されたソバにおけるＳＳＣ７およびＳＳＣ５の両方を含む領域のコンティグマップを示す。
【図６】試験例３において、長花柱および短花柱それぞれにおけるシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０のホモログの有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図７】試験例４において、普通ソバの短花柱植物および長花柱植物それぞれにおけるＳＳＣ７の有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図８】試験例４において、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の短花柱植物および長花柱植物におけるＳＳＣ７の有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図９】試験例４において、Ｆ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの短花柱植物および長花柱植物それぞれにおけるＳＳＣ７の有無を調べた結果を示す電気泳動図の図面代用写真である。
【図１０】（Ａ）は試験例５において、異形自家不和合性種である普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の長花柱植物および短花柱植物ならびに同形自家和合性系統である「九州ＰＬ４号」それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ７の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を示す図面代用写真、（Ｂ）試験例５において、異形自家不和合性種であるシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の長花柱植物および短花柱植物ならびに同形自家和合性種であるダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ７の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を示す図面代用写真、（Ｃ）試験例５において、異形自家不和合性種であるＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの長花柱植物および短花柱植物それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ７の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を示す図面代用写真である。
【図１１】試験例５において、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の長花柱植物および短花柱植物それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ５の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を示す図面代用写真である。
【図１２】試験例６において、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種におけるＳＳＣ７に対応する遺伝子の構造を調べた結果を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．核酸
本発明の核酸は、植物において、自家不和合性を正に制御する自家不和合性制御因子をコードする単離された核酸であって、
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも５３％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｄ）配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつ植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列を含有することを特徴とする。
【００１１】
前記塩基配列には、自家不和合性制御因子をコードする遺伝子の配列が含まれている。前記塩基配列を有する本発明の核酸を保持する自家不和合性植物または前記核酸が導入された植物では、自家不和合性制御因子が発現することにより、自家不和合性を引き起こすと考えられる。したがって、本発明の核酸を保持する自家不和合性植物において、かかる核酸に含まれる遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害することにより、自家不和合性植物から自家和合性植物を作出することが可能になる。本発明の核酸は、自家不和合性植物、好ましくは自家不和合性ソバ属植物、より好ましくは普通ソバ〔ファゴピラム・エスキュレンタム（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）〕において、自家不和合性を正に制御する。
【００１２】
なお、本明細書において、「ポリペプチドをコードする塩基配列」の用語には、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの塩基配列、ポリペプチドをコードする前駆体ｍＲＮＡの塩基配列、ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡの塩基配列が包含される。また、本明細書において、「核酸」の用語には、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、前駆体ｍＲＮＡ、染色体ＤＮＡなどの天然核酸；ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの人工核酸などが包含される。かかる核酸は、本発明の目的を妨げない範囲で、修飾されていてもよい。さらに、本明細書において、「自家不和合性を正に制御する」とは、植物、好ましくは自家不和合性植物、より好ましくは自家不和合性ソバ属植物、さらに好ましくは普通ソバにおいて、自家不和合性を引き起こすことをいう。
【００１３】
前記（ａ）の塩基配列は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
【００１４】
前記（ａ）の塩基配列としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列、配列番号：１に示される配列と縮重を介して異なる塩基配列、配列番号：３に示される塩基配列、配列番号：３に示される配列と縮重を介して異なる塩基配列などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ここで、配列番号：１に示される塩基配列は、普通ソバの自家不和合性制御因子をコードするｃＤＮＡの塩基配列である。また、配列番号：３に示される塩基配列は、普通ソバの自家不和合性制御因子をコードする染色体ＤＮＡの塩基配列である。
【００１５】
前記（ｂ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列を含有する核酸は、前記（ａ）を含有する核酸の変異体（以下、「変異型核酸」ともいう）である。かかる変異型核酸によってコードされるポリペプチドは、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドである。前記「植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチド」は、好ましくは自家不和合性植物、より好ましくは自家不和合性ソバ属植物、さらに好ましくは普通ソバにおいて、自家不和合性を引き起こすポリペプチドである。
【００１６】
前記（ｂ）の塩基配列を含有する核酸は、配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする。
【００１７】
前記「１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入」は、本発明の目的を阻害しない範囲で、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の内部、Ｃ末端およびＮ末端の少なくともいずれかに存在してもよい。ここで、「１個もしくは数個」とは、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個をいう。
【００１８】
なお、前記置換は、特にソバ属植物において、十分な機能を発現させることが望まれる場合、好ましくは保存的置換である。かかる保存的置換としては、例えば、特定のアミノ酸残基と、当該特定のアミノ酸残基の物理学的性質と類似した物理学的性質を有するアミノ酸残基（以下、本明細書においては、「類似アミノ酸残基」ともいう）との置換などが挙げられる。前記物理的性質としては、例えば、親水性、疎水性、極性、非極性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、グリシン残基およびアラニン残基の相互間での置換、バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基の相互間での置換、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基の相互間での置換、セリン残基およびスレオニン残基の相互間での置換、リジン残基およびアルギニン残基の相互間での置換、フェニルアラニン残基およびチロシン残基の相互間での置換などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１９】
前記（ｃ）の塩基配列を含有する核酸は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも５３％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする。前記配列同一性は、特にソバ属植物において、十分な機能を発現させることが望まれる場合には、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、さらにより一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。
【００２０】
ここで、「配列同一性」は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列（参照配列）に対して、評価対象のアミノ酸配列（クエリー配列）を、Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：３、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）およびＭａｔｒｉｘ：ＢＬＳＵＭ６２の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＬＡＳＴを用いてアライメントして算出された値をいう。
【００２１】
前記（ｄ）の塩基配列を含有する核酸は、配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ植物において、自家不和合性を引き起こすポリペプチドをコードする。
【００２２】
ここで、「配列番号：１または３に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖」とは、配列番号：１または３に示される塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸をいう。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、前記相補鎖と、前記相補鎖に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。前記ストリンジェントな条件は、特にソバ属植物において、自家不和合性を発現させる観点から、ストリンジェンシーが高いほど好ましい。
【００２３】
前記（ａ）を含有する核酸は、例えば、普通ソバの短花柱などから抽出されたＲＮＡから調製することができるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記（ａ）を含有する核酸は、具体的には、例えば、普通ソバの短花柱からＲＮＡを抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、本発明の核酸に基づいて作製された後述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうことなどによって調製することができる。
【００２４】
前記（ｂ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列を含有する核酸は、例えば、ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの方法により、前記（ａ）を含有する核酸に対して、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、挿入などの変異を導入することなどによって調製することができるが、本発明は、かかる方法のみによって限定されるものではない。
【００２５】
核酸にコードされたポリペプチドが、植物において、自家不和合性を引き起こすかどうかは、例えば、下記ステップ（１）〜（４）：
（１）  評価対象の核酸が導入された植物の自家受粉を行なうステップ、
（２）  自家受粉後の植物から経時的に花を採取するステップ、
（３）  採取された花の花粉管を０．１質量％アニリンブルー染色液で染色するステップ、
（４）  蛍光顕微鏡によって花粉管伸長を観察し、自家受粉時の花粉管の長さおよび伸長速度を測定するステップ
を行なうことなどによって評価することができる。ここで、花粉管伸長の阻害および／または花粉管の伸長速度の抑制、より具体的には、花粉管伸長の阻害による自家花粉が受精できない状態が、自家不和合性の指標となる。
【００２６】
植物への核酸の導入は、例えば、イン・プランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）でのアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などによって行なうことことができる。
【００２７】
本発明の核酸は、自家不和合性制御因子をコードすることから、かかる核酸を保持する自家不和合性植物からの自家和合性植物の作出などに有用である。
【００２８】
２．抑制剤
本発明の抑制剤は、本発明の核酸に含まれる遺伝子にコードされる自家不和合性制御因子の機能の発現を抑制する抑制剤であって、
（Ａ）本発明の核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子に対して機能欠失型の変異が導入された変異型遺伝子を含む核酸、
（Ｂ）本発明の核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、または
（Ｃ）本発明の核酸の塩基配列に基づき設計された２１〜２３塩基対の二本鎖ＲＮＡからなり、本発明の核酸の発現を抑制するｓｉＲＮＡ
を含有していることを特徴とする。
【００２９】
本発明の抑制剤は、前記変異型遺伝子を含む核酸、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを含有している点に１つの大きな特徴がある。そのため、本発明の核酸を保持する自家不和合性植物、特に、自家不和合性ソバ属植物に、本発明の抑制剤が導入された場合、前記核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子が破壊されるか、または前記遺伝子の発現が阻害される。したがって、本発明の抑制剤によれば、本発明の核酸に含まれる遺伝子にコードされる自家不和合性制御因子の機能の発現を抑制し、自家和合性を引き起こすことができる。
【００３０】
前記変異型遺伝子は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の機能を失わせる機能欠失型の変異を有する。前記機能欠失型の変異としては、例えば、
(i)  前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列における自家不和合性制御因子の活性部位に対応する部分の欠損、
(ii)  前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列に対してフレームシフトを生じさせる変異（フレームシフト変異）、
(iii)  前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列中のオープンリーディンングフレーム中に終止コドンを生じさせる変異（ナンセンス変異）、
(iv)  スプライシング異常を生じさせて自家不和合性制御因子の機能を欠失させる変異（例えば、イントロンとエキソンとの境界での変異など）、
(v)  前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列中における構成アミノ酸残基を異なる物理化学的性質(例えば、親水性、疎水性、極性、非極性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴など）を有するアミノ酸残基に置換させて自家不和合性制御因子の機能を欠失させる変異、
(vi)  自家不和合性制御因子遺伝子が座上するゲノム領域を失わせる変異、
(vii)  前記(i)〜(vi)の組合せ
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３１】
前記変異型遺伝子を含む核酸の具体例としては、配列番号：３において、５番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：３１２６〜４６０５）に対応する領域中にフレームシフト変異およびナンセンス変異を有する塩基配列からなる核酸；配列番号：３において、３番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：１３４０〜１８４８）に対応する領域と４番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：３００２〜３０５３）に対応する領域との間における２つのダイレクトリピート、５番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：３１２６〜４６０５）に対応する領域中におけるナンセンス変異および３’末端領域における逆位を伴う重複を有する塩基配列からなる核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
前記アンチセンス核酸は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列に対応する標的核酸の配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部からなり、前記標的核酸とのハイブリッドを形成することにより、前記標的核酸にコードされる自家不和合性制御因子の発現を抑制する核酸である。
【００３３】
前記標的核酸としては、例えば、二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられる。かかる標的核酸中における前記アンチセンス核酸による標的領域としては、例えば、５’末端非翻訳領域、翻訳開始コドン、コード領域、翻訳終止コドン、３’末端非翻訳領域などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３４】
前記アンチセンス核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡとＲＮＡとのキメラ化合物のいずれであってもよい。アンチセンス核酸がＤＮＡである場合、当該アンチセンス核酸と標的核酸としてのｍＲＮＡとにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成される。この場合、かかるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、ソバ属植物に内在するＲＮａｓｅ  Ｈによって、分解されることが期待される。また、アンチセンス核酸がＤＮＡである場合、当該アンチセンス核酸と標的核酸としての二本鎖ＤＮＡとの三重鎖が形成される。前記三重鎖が形成された場合、ＲＮＡへの転写が阻害されることが期待される。
【００３５】
また、前記アンチセンス核酸は、本発明の目的を妨げないものであれば、核酸誘導体であってもよい。かかる核酸誘導体としては、例えば、非ヌクレオチド骨格を有するポリマー（例えば、ペプチド核酸）、ＲＮＡ、ＤＮＡなどと構成糖が異なるポリマー、修飾基を有する核酸などや、これらの組み合わせの化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記修飾基としては、例えば、アンチセンス核酸の導入を容易にする官能基、アンチセンス核酸の安定性を向上させる官能基、標的となるｍＲＮＡとの結合安定性を向上させる官能基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３６】
前記アンチセンス核酸の長さは、自家不和合性制御因子の発現を抑制することができる範囲であればよく、特に限定されるものではない。通常、植物への十分な導入効率を確保する観点から、好ましくは５０〜１０００ヌクレオチド長、より好ましくは２００〜５００ヌクレオチド長である。
【００３７】
前記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果によって本発明の核酸の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡである。前記ｓｉＲＮＡは、例えば、下記１）〜５）の条件を満たすように、ｓｉＲＮＡ設計用ソフトウェアなどを用いて設計することができる。
１）  前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列に特異的であること
２）  ガイド鎖の５’末端がアデニン残基またはウラシル残基であること、
３）  パッセンジャー鎖の５’末端がグアニン残基またはシトシン残基であること、
４）  アンチセンス鎖の５’領域にアデニン残基またはウラシル残基の存在量が多くなっていること、
５）  長いＧＣの連続配列がないこと。
【００３８】
本発明の抑制剤においては、前記変異型遺伝子を含む核酸、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡは、プラスミドなどのベクターに組み込まれていてもよい。
【００３９】
本発明の抑制剤は、適切な助剤をさらに含んでいてもよい。前記助剤としては、例えば、前記変異型遺伝子を含む核酸、前記アンチセンス核酸または前記ｓｉＲＮＡを安定的に維持するのに適した緩衝液；植物の細胞への前記変異型遺伝子を含む核酸、前記アンチセンス核酸または前記ｓｉＲＮＡの導入を促進する促進剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の抑制剤が、前記変異型遺伝子を含む核酸、前記アンチセンス核酸または前記ｓｉＲＮＡと適切な助剤とを含むものである場合、かかる抑制剤中の前記変異型遺伝子を含む核酸、前記アンチセンス核酸または前記ｓｉＲＮＡの含有量は、本発明の抑制剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができないことから、本発明の抑制剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００４１】
植物への本発明の抑制剤の導入は、例えば、変異型遺伝子を含むＤＮＡ、アンチセンス核酸を発現しうるＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現しうるＤＮＡを保持する発現プラスミドを、イン・プランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）でのアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などにより導入することなどによって行なうことができる。
【００４２】
植物に導入される本発明の抑制剤の量は、本発明の抑制剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができないことから、本発明の抑制剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００４３】
本発明の抑制剤による効果（すなわち、自家不和合性制御因子の機能の発現を抑制する効果）は、例えば、
下記ステップ（１Ａ）〜（４Ａ）：
（１Ａ）  評価対象の核酸が導入された植物の自家受粉を行なうステップ、
（２Ａ）  自家受粉後の植物から経時的に花を採取するステップ、
（３Ａ）  採取された花の花粉管を０．１質量％アニリンブルー染色液で染色するステップ、および
（４Ａ）  蛍光顕微鏡によって花粉管伸長を観察し、自家受粉時の花粉管の長さおよび伸長速度を測定するステップ
を行なうこと、
下記ステップ（１Ｂ）および（２Ｂ）：
（１Ｂ）  評価対象の核酸が導入された植物の自家受粉を行なうステップ、および
（２Ｂ）  自家受粉後の植物の着粒率を測定するステップ
を行なうことなどによって確認することができる。ここで、前記ステップ（１Ａ）〜（４Ａ）を行なった場合には、花粉管の伸長が見られること、花粉管の長さが自家不和合性ソバ属植物のものよりも長いこと、花粉管の伸長速度が自家不和合性ソバ属植物のものよりも速いことなどが、自家不和合性制御因子の機能の発現が抑制されたことの指標となる。また、前記ステップ（１Ｂ）および（２Ｂ）を行なった場合には、野生型の長柱花植物または短柱花植物の自家受精時の着粒率と比べて高い着粒率を示すことなどが、自家不和合性制御因子の機能の発現が抑制されたことの指標となる。
【００４４】
３．自家和合性ソバ属植物およびその製造方法
本発明の自家和合性ソバ属植物の製造方法は、本発明の核酸を保持する自家不和合性ソバ属植物から自家和合性ソバ属植物を製造する方法であって、
前記自家不和合性ソバ属植物において、前記核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。
【００４５】
本発明の核酸を保持する自家不和合性ソバ属植物において、本発明の核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子が破壊された場合または前記遺伝子の発現が阻害された場合、自家不和合性制御因子が発現しないか、または自家不和合性制御因子の機能が阻害される。これにより、自家不和合性の発現が阻害されることが期待される。したがって、普通ソバなどの自家不和合性ソバ属植物が保持する前記核酸に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害することにより、前記自家和合性ソバ属植物を作出することが可能になる。
【００４６】
前記遺伝子の破壊または前記遺伝子の発現の阻害は、例えば、下記(I)〜(III)などの手法により、行なうことができる。
(I)  本発明の抑制剤を本発明の核酸を保持する自家不和合性ソバ属植物に導入して、本発明の核酸に含まれる遺伝子の機能を破壊または抑制すること；
(II)  重イオンビームを本発明の核酸を保持する自家不和合性ソバ属植物に照射して、本発明の核酸に含まれる遺伝子を欠損させるか、または前記遺伝子に機能欠失型の変異を導入すること；および
(III)  変異原物質を本発明の核酸を保持する自家不和合性ソバ属植物に接触させて、本発明の核酸に含まれる遺伝子を欠損させるか、または前記遺伝子に機能欠失型の変異を導入すること。
【００４７】
前記(I)において、ソバ属植物へのアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、変異型遺伝子を含む核酸などの導入方法としては、例えば、イン・プランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）でのアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４８】
前記(II)において、前記自家不和合性ソバ属植物への重イオンビームの照射に際しては、前記遺伝子の欠損または前記遺伝子への機能欠失型の変異の導入を効率よく行なう観点から、照射後の植物の致死率が５〜２０％となるように、重イオンビームの照射線量および照射時間を設定することが望ましい。通常、前記照射線量は、好ましくは５〜５０Ｇｙ／ｈであり、前記照射時間は、好ましくは１０〜２０時間である。
【００４９】
前記(III)において、前記自家不和合性ソバ属植物への変異原物質の接触に際しては、前記遺伝子の欠損または前記遺伝子への機能欠失型の変異の導入を効率よく行なう観点から、変異原物質との接触後の自家不和合性ソバ属植物の致死率が１５％以上となるように、変異原物質の量を設定することが望ましい。変異原物質としては、例えば、エチルメタンスルフォネートなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記自家不和合性ソバ属植物への変異原物質の接触は、例えば、変異原物質を含有する溶液中に前記自家不和合性ソバ属植物の種子を浸漬させることなどによって行なわれるが、本発明は、かかる手法のみによって限定されるものではない。この場合、前記溶液における変異原物質の濃度は、変異原物質の種類などによって変異誘起性の強さが異なるので、一概に決定することができないことから、変異原物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、変異原物質がエチルメタンスルフォネートである場合、通常、エチルメタンスルフォネート含有溶液のエチルメタンスルフォネートの濃度は、０．１〜１．０質量％であることが望ましい。前記自家不和合性ソバ属植物と変異原物質との接触時間は、変異原物質の種類などによって変異誘起性の強さが異なるので、一概に決定することができないことから、変異原物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、変異原物質がエチルメタンスルフォネートである場合、通常、自家不和合性ソバ属植物（種子）と変異原物質との接触時間は、８〜１６時間程度であることが望ましい。
【００５０】
前記遺伝子の破壊または前記遺伝子の発現の阻害が行なわれた植物は、必要に応じて、生育させればよい。
【００５１】
前記遺伝子の破壊または前記遺伝子の発現の阻害は、例えば、
下記ステップ（１Ａ）〜（４Ａ）：
（１Ａ）  評価対象の核酸が導入された植物の自家受粉を行なうステップ、
（２Ａ）  自家受粉後の植物から経時的に花を採取するステップ、
（３Ａ）  採取された花の花粉管を０．１質量％アニリンブルー染色液で染色するステップ、および
（４Ａ）  蛍光顕微鏡によって花粉管伸長を観察し、自家受粉時の花粉管の長さおよび伸長速度を測定するステップ
を行なうこと、
下記ステップ（１Ｂ）および（２Ｂ）：
（１Ｂ）  評価対象の核酸が導入された植物の自家受粉を行なうステップ、および
（２Ｂ）  自家受粉後の植物の着粒率を測定するステップ
を行なうことなどによって確認することができる。ここで、花粉管の伸長が見られること、花粉管の長さが自家不和合性ソバ属植物のものよりも長いこと、花粉管の伸長速度が自家不和合性ソバ属植物のものよりも速いことなどが、遺伝子が破壊されたことまたは遺伝子の発現が阻害されたことの指標となる。ここで、前記ステップ（１Ａ）〜（４Ａ）を行なった場合には、花粉管の伸長が見られること、花粉管の長さが自家不和合性ソバ属植物のものよりも長いこと、花粉管の伸長速度が自家不和合性ソバ属植物のものよりも速いことなどが、遺伝子が破壊されたことまたは遺伝子の発現が阻害されたことの指標となる。また、前記ステップ（１Ｂ）および（２Ｂ）を行なった場合には、野生型の長柱花植物または短柱花植物の自家受精時の着粒率と比べて高い着粒率を示すことなどが、遺伝子が破壊されたことまたは遺伝子の発現が阻害されたことの指標となる。
【００５２】
このようにして得られた本発明の自家和合性ソバ属植物も本発明に含まれる。本発明の自家和合性ソバ属植物としては、例えば、自家不和合性の普通ソバから作出された自家和合性普通ソバなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５３】
４．本発明の核酸を調製または検出するための試薬
本発明には、本発明の核酸を調製または検出するための試薬も包含される。かかる試薬には、例えば、本発明の核酸またはその一部を増幅するプライマーセット、本発明の核酸に特異的なプローブなどが包含される。
【００５４】
前記プライマーセットは、本発明の核酸またはその一部を増幅するプライマーセットであって、前記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれた配列における連続した少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基配列を含むプライマーと、前記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれた配列に相補的な配列における連続した少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基配列を含むプライマーとを含有することを特徴とする。
【００５５】
前記プライマーセットは、前記塩基配列を含むプライマーを含有しているため、かかるプライマーセットを用いてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなどの核酸増幅法を行なうことにより、本発明の核酸またはその一部を容易に、かつ効率よく増幅することができる。したがって、かかるプライマーセットは、本発明の核酸の調製、検出などに有用である。
【００５６】
前記プライマーセットに含まれるプライマーの長さは、少なくとも１５ヌクレオチド長である。具体的には、前記プライマーの長さは、核酸増幅法において、鋳型に対して特異的なアニーリングを行なう観点から、１５ヌクレオチド長以上、好ましくは２０ヌクレオチド長以上、より好ましくは２５ヌクレオチド長以上、さらに好ましくは２８ヌクレオチド長以上であり、核酸増幅法において、十分なアニーリング効率を確保する観点から、好ましくは３０ヌクレオチド長以下である。
【００５７】
プライマーは、本発明の核酸を高い精度で増幅させる観点から、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列に特異的な配列からなることが望ましい。
【００５８】
なお、本明細書において、「前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列に特異的な配列」とは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列の一部またはその相補配列からなり、かつ他の遺伝子（すなわち、自家不和合性制御因子をコードする遺伝子以外の遺伝子）などの配列には含まれない配列をいう。かかる配列は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴなどのプライマー設計プログラムを用いることにより、デザインすることができる。
【００５９】
また、プライマーのＧＣ含量は、各プライマーと鋳型とのアニーリングを特異的にかつ効率よく行なう観点から、好ましくは４０〜６０％、より好ましくは４５〜５５％である。また、プライマーと鋳型として用いられる核酸とを安定して結合させる観点から、各プライマーの配列中における４種類のヌクレオチドの分布は、略均等であることが望ましい。さらに、プライマーの内部での二次構造の形成を抑制する観点から、前記プライマーセットの各プライマーは、ピリミジン塩基（チミンまたはシトシン）が連続する配列（ポリピリミジン配列）およびプリン塩基（アデニンまたはグアニン）が連続する配列（ポリプリン配列）を含まないように設計されていることが望ましい。
【００６０】
前記プライマーセットの各プライマーは、本発明の核酸中における各プライマー間の距離が適切な距離となるように設計されていることが望ましい。前記距離は、プライマーセットの用途などに応じて異なるので、一概には決定することができないことから、プライマーセットの用途などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、プライマーセットを、本発明の核酸の調製に用いる場合、前記距離は、前記核酸の増幅を高い精度で行なう観点から、自家不和合性制御因子のコード領域を網羅する程度の距離であることが望ましい。また、プライマーセットを、本発明の核酸の検出に用いる場合、前記核酸の検出を迅速、かつ高い精度で行なう観点から、前記距離は、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、より好ましくは２００〜８００ヌクレオチド長、さらに好ましくは５００〜８００ヌクレオチド長、より一層好ましくは７００〜８００ヌクレオチド長である。なお、前記「各プライマー間の距離」とは、一方のプライマーに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基と他方のプライマーに対応する塩基配列の５’末端のヌクレオチド残基との間の距離をいう。
【００６１】
かかるプライマーセットとしては、具体的には、例えば、配列番号：１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１７に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、配列番号：４２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：４３に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、配列番号：６１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：６２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、配列番号：８３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：８４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、配列番号：８７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：８８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００６２】
前記プローブは、本発明の核酸を検出するプローブであって、
(i)配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするセンス鎖の配列中の連続した少なくとも２０ヌクレオチドからなる塩基配列Ａまたは前記塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂからなるオリゴヌクレオチド、および
(ii)配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするセンス鎖またはその相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
のいずれかからなるプローブである。
【００６３】
ここで、「塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂ」とは、塩基配列Ａに完全に相補的な塩基配列をいう。また、(ii)における「ストリンジェントな条件」とは、前記センス鎖またはその相補鎖と、プローブとを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として６０℃以上、さらにストリンジェントな条件として６５℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．２×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として６０℃以上、さらにストリンジェントな条件として６５℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００６４】
前記プローブの長さは、少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは２０〜２００ヌクレオチド長、より好ましくは５０〜２００ヌクレオチド長、さらに好ましくは１００〜２００ヌクレオチド長である。
【００６５】
前記プローブは、本発明の核酸に対する特異性を十分に確保する観点から、配列番号：３の塩基番号：１〜８４、４５１〜６２５、１３４０〜１８４８、３１２６〜４３７０からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列またはこの塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００６６】
以上のように、本発明の核酸は、自家不和合性制御因子をコードする。したがって、本発明の核酸は、かかる核酸を保持する自家不和合性植物、好ましくは自家不和合性ソバ属植物、より好ましくは普通ソバにおいて、自家和合性を獲得するための標的として用いることができる。また、本発明の抑制剤によれば、本発明の核酸を保持する自家不和合性植物、好ましくは自家不和合性ソバ属植物、より好ましくは普通ソバにおいて、自家不和合性制御因子をコードする遺伝子を破壊または前記遺伝子の発現を阻害することができる。したがって、本発明の抑制剤によれば、本発明の核酸を保持する自家不和合性植物から自家和合性植物を得ることができる。さらに、本発明の自家和合性ソバ属植物およびその製造方法によれば、本発明の核酸を有する自家不和合性植物から、有用形質の導入などを迅速、かつ効率よく行なうことができる自家和合性植物を得ることができる。また、本発明のプライマーセットおよびプローブによれば、本発明の核酸を容易に取得または検出することができることから、本発明の核酸を有する自家不和合性植物から、有用形質の導入などを迅速、かつ効率よく行なうことができる自家和合性植物を得ることができる。特に、前記自家不和合性植物が、自家不和合性ソバ属植物、好ましくは普通ソバである場合、自家受粉によって結実する自家不和合性ソバ属植物、好ましくは普通ソバが得られることが期待されるため、収量の増加および交配育種による多様な品種の作出が可能になる。
【実施例】
【００６７】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。【００６８】
（調製例１）
チャン（Ｓ．Ｃｈａｎｇ）ら〔「松からＲＮＡを単離する簡便かつ効率的な方法（Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｉｎｅ  ｔｒｅｅｓ）」、プラント・モレキュラー・バイオロジー・レポーター（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）、第１１巻、ｐｐ．１１３−１１６  （１９９３）〕に記載の方法にしたがい、同胞交配系統の直接的な子孫であるＢＣ1−Ｆ5世代の普通ソバの短花柱植物または長花柱植物の花柱のバルクから全ＲＮＡを抽出した。つぎに、ＲＮＡ生成用キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて前記全ＲＮＡを精製した。その後、精製された全ＲＮＡおよびｍＲＮＡ−Ｓｅｑサンプル調製キット（イルミナ（株）製、商品名：ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてｃＤＮＡを合成し、短花柱植物または長花柱植物のシークエンスライブラリーを構築した。【００６９】
（実験例１）
調製例１で得られた短花柱植物のシークエンスライブラリーを、シーケンサー（イルミナ（株）製、商品名：Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ装置）によって解析した。つぎに、読み取られた配列を、Ｖｅｌｖｅｔプログラム（ゼルビーノ（Ｄ．Ｒ．Ｚｅｒｂｉｎｏ）ら、「Ｖｅｌｖｅｔ：ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈを用いたデ・ノボ・ショートリードアセンブリのためのアルゴリズム（Ｖｅｌｖｅｔ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈｓ）」、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、ｐｐ．８２１−８２９（２００８））でアセンブルし、種々の長さ（６１〜５３３４ｂｐ）の４１５９９個のコンティグを得た。【００７０】
また、調製例１で得られた短花柱植物のシークエンスライブラリーの代わりに調製例１で得られた長花柱植物のシークエンスライブラリーを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、コンティグを得た。【００７１】
短花柱植物のシークエンスライブラリーから得られたコンティグの配列をイン・シリコ・サブトラクション用プログラムで解析して、長花柱で発現するコンティグを差し引くことにより、イン・シリコで１５個のコンティグ（ＳＳＣ１−ＳＳＣ１５）を抽出した。【００７２】
（実験例２）
表１に示されるプライマーセットと、調製例１で合成された短花柱植物または長花柱植物のｃＤＮＡと、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株）製、商品名：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行ない、短花柱植物および長花柱植物それぞれにおける実験例１で得られたコンティグの発現を調べた。なお、ＰＣＲ条件は、９４℃２分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と５５℃５秒間のアニーリングと６８℃５秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行なう条件である。【００７３】
【表１】
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【００７４】
得られた産物を２質量％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネータで可視化した。なお、ローディングコントロールとして、アクチンをコードするＤＮＡを用いた。【００７５】
実験例２において、短花柱植物および長花柱植物それぞれのＤＮＡにおけるイン・シリコで抽出されたコンティグに対応する断片の有無を調べた結果を図１に示す。図中、Ｌは長花柱植物、Ｓは短花柱植物を示す。また、図中、レーン１はＳＳＣ３、レーン２はＳＳＣ５、レーン３はＳＳＣ７、レーン４はＳＳＣ１５を示す。【００７６】
図１に示される結果から、ＳＳＣ３に対応する断片、ＳＳＣ５に対応する断片、ＳＳＣ７に対応する断片およびＳＳＣ１５に対応する断片は、短花柱植物のＤＮＡから増幅されるが、長花柱植物のＤＮＡからは増幅されないことがわかる。したがって、これらの結果から、ＳＳＣ３、ＳＳＣ５、ＳＳＣ７およびＳＳＣ１５は、短花柱に特異的に発現していることがわかる。なお、実験例１で得られたコンティグのうち、ＳＳＣ３、ＳＳＣ５、ＳＳＣ７およびＳＳＣ１５を除くコンティグは、短花柱植物および長花柱植物の両方において発現することが示された。【００７７】
（調製例２）
同胞交配系統の直接的な子孫であるＢＣ1−Ｆ5世代の普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の種子に、７５〜１００Ｇｙの線量範囲で加速20Ｎｅイオン（１３５ＭｅＶ／核子）を照射した。20Ｎｅ10+の線エネルギー付与は、６３．４ｋｅＶ／μｍであった。イオンビーム照射後の種子を閉鎖系実験室で生育させ、Ｍ1植物を得た。１４００個体のＭ1植物について、花の形態を観察し、両方のタイプの花を有するキメラ植物を選別した。【００７８】
調製例２において、選別されたイオンビーム誘導キメラ植物を図２に示す。図中、点線で囲まれた部分は短花柱花、実線で囲まれた部分は長花柱花を示す。【００７９】
（実験例３）
エスカラヴァージュ（Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ，  Ｎ）ら〔「ＡＦＬＰマーカーから推論されるアルペンローゼ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｍ  Ｌ．（ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）））個体群におけるクローン多様性（Ｃｌｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｍ  Ｌ．  （Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ＡＦＬＰ  ｍａｒｋｅｒｓ．）」、モレキュラー・エコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）、１９９８年、第７巻、ｐｐ．９７５−９８２〕に記載の手法を用い、調製例２で得られたイオンビーム誘導キメラ植物の短花柱または長花柱のバルクからＤＮＡを抽出し、精製した。【００８０】
得られたＤＮＡと、ＳＳＣ３、ＳＳＣ５、ＳＳＣ７またはＳＳＣ１５を増幅するプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株）製、商品名：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行ない、イオンビーム誘導キメラ植物の短花柱および長花柱それぞれにおけるＳＳＣ３、ＳＳＣ５、ＳＳＣ７またはＳＳＣ１５の発現を調べた。なお、ＰＣＲ条件は、９４℃２分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と５５℃５秒間のアニーリングと６８℃５秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行なう条件である。【００８１】
得られた産物を２質量％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶイルミネータで可視化した。なお、サイズマーカーとして、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：２５−ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒを用いた。【００８２】
実験例３において、イオンビーム誘導キメラ植物の短花柱および長花柱それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ３、ＳＳＣ５、ＳＳＣ７およびＳＳＣ１５それぞれの有無を調べた結果を図３に示す。図中、Ｌは長花柱、Ｓは短花柱、Ｍはサイズマーカーを示す。また、図中、レーン１はＳＳＣ３、レーン２はＳＳＣ５、レーン３はＳＳＣ７、レーン４はＳＳＣ１５を示す。なお、サイズマーカーにおける１５０ｂｐのバンドは、最も強いラダーバンドである。【００８３】
図３に示された結果から、ＳＳＣ３に対応する断片、ＳＳＣ５に対応する断片、ＳＳＣ７に対応する断片およびＳＳＣ１５に対応する断片は、前記イオンビーム誘導キメラ植物の短花柱のＤＮＡから増幅されることがわかる。また、図３に示された結果から、ＳＳＣ５に対応する断片およびＳＳＣ７に対応する断片は、前記イオンビーム誘導キメラ植物の長花柱のＤＮＡから増幅されないが、ＳＳＣ３に対応する断片およびＳＳＣ１５に対応する断片は前記イオンビーム誘導キメラ植物の長花柱のＤＮＡから増幅されることがわかる。したがって、これらの結果から、ＳＳＣ５およびＳＳＣ７は、短花柱に特異的に発現していることが示唆される。【００８４】
（実験例４）
同胞交配系統の直接的な子孫であるＢＣ1−Ｆ5世代の普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）１３７３個体それぞれの葉からＤＮＡを単離した。その後、ＰＣＲを行ない、１３７３個体それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ５およびＳＳＣ７の有無を調べることにより、ＳＳＣ５およびＳＳＣ７の連鎖解析を行なった。【００８５】
ＰＣＲは、ＳＳＣ７についてフォワードプライマー（5'-GGGGTTGGCAATGAGAAACTAAC-3'（配列番号：３４））およびリバースプライマー（5'-ACGGAATATTTTCATTGCAGATTCA-3'（配列番号：３５））からなるプライマーセットまたはＳＳＣ５についてフォワードプライマー（5'-GACGAATTTGGGATGTAGAGTTTGA-3'（配列番号：３６））およびリバースプライマー（5'-CTTTATGGAATATCCCGGTTGTCTT-3'（配列番号：３７））からなるプライマーセットと、前記ＤＮＡと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いて行なった。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と６０℃５秒間のアニーリングと７２℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【００８６】
その結果、１３７３個体のＢＣ１−Ｆ５世代の普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）から、Ｓ対立遺伝子とＳＳＣ５マーカーおよびＳＳＣ７マーカーとの間の完全遺伝連鎖が確認された。したがって、実験例３および実験例４の結果から、ＳＳＣ５およびＳＳＣ７の周辺におけるイオンビームで誘導された欠失によって、イオンビーム誘導キメラ植物内における短花柱花（Ｓ／ｓ遺伝型）から長花柱花（−／ｓ遺伝型）の表現型の変換が引き起こされることが示唆される。【００８７】
（実施例１）
調製例１で抽出された短花柱植物の全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ（株）製、商品名：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）と、特異的プライマー（5'-CGGATTGATGCCCAGAGAACGAGAG-3'（配列番号：３８））と、ネスティドプライマー（5'-TAGAGGACAGGAGGAACGGGGGTCT-3'（配列番号：３９））とを用い、製造者のプロトコールにしたがい、５’−ＲＡＣＥを行ない、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の転写開始点を決定した。【００８８】
また、調製例１で抽出された短花柱植物の全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ（株）製、商品名：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）と、特異的プライマー（5'-CTGGTTGGAGCTCAAGAGCTGGAGAGT-3'（配列番号：４０））と、ネスティッドプライマー（5'-ATCTGCAATGAAAATATTCCGTTCT-3'（配列番号：４１））とを用い、製造者のプロトコールにしたがって３’−ＲＡＣＥを行ない、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の転写終結点を決定した。【００８９】
得られた転写開始点および転写終結点の情報に基づき、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとして、フォワードプライマー（5'-GGAGAAAGACGCGTTGAGAGTT-3'（配列番号：４２））およびリバースプライマー（5'-ACGAAATTCGAGATTTGATTTTAATAG-3'（配列番号：４３））からなるプライマーセットをデザインした。調製例１で得られた短花柱植物の全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ（株）製、商品名：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）とを用いて、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行ない、、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅させた。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と６０℃５秒間のアニーリングと７２℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【００９０】
得られたＰＣＲ産物を、クローニングキット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、商品名：Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてＴＯＰＯベクターにクローン化した。得られた構築物中のインサートのサイズを確認した後、インサートの塩基配列を、シークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：３１３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて決定した。配列の決定には、プライマーとして、表２に示されるプライマーのうち、5'-GGAGAAAGACGCGTTGAGAGTT-3'（配列番号：４２）、5'-ACGAAATTCGAGATTTGATTTTAATAG-3'（配列番号：４３）、5'-TGGAAAATAAGGCGAATCCT-3'（配列番号：４６）、5'-CAAAGGATCTTCTCGATTCA-3'（配列番号：４８）、5'-CAGCGAACTATCAGCTGCAATC-3'（配列番号：５１）および5'-TGTTGTGCAGCATGTGGAA-3'（配列番号：５２）を用いた。【００９１】
【表２】
2013047736.tif 000003
【００９２】
また、普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の短花柱植物の花柱のＤＮＡと、全長ｃＤＮＡの増幅に用いられたプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行ない、ＳＳＣ７に対応する遺伝子のゲノム領域を増幅させた。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と６０℃５秒間のアニーリングと７２℃３分間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【００９３】
つぎに、表２に示された種々のプライマーと、シークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製、商品名：３１３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）とを用い、ＳＳＣ７に対応する遺伝子のゲノム領域の増幅産物の配列を直接決定した。【００９４】
ＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１、前記全長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：２、ＳＳＣ７に対応するゲノム領域の塩基配列を配列番号：３に示す。【００９５】
（実験例５）
調製例１で抽出された短花柱植物の全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ（株）製、商品名：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）と、特異的プライマー（5'-ACTTGAAGTCGCGCAAGCTTTATGGAAT-3'（配列番号：５３））と、ネスティッドプライマー（5'-TATCCCTCACCATTTCAAACTC-3'（配列番号：５４））とを用い、製造者のプロトコールにしたがって５’−ＲＡＣＥを行ない、ＳＳＣ５に対応する遺伝子の転写開始点を決定した。【００９６】
また、調製例１で抽出された短花柱植物の全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ（株）製、商品名：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）と、特異的プライマー（5'-GACAACCGGGATATTCCATAAAGCTTGC-3'（配列番号：５５））と、ネスティッドプライマー（5'-GCATTTTAGCCTCACTTTTCAG-3'（配列番号：５６））とを用い、製造者のプロトコールにしたがって３’−ＲＡＣＥを行ない、ＳＳＣ５に対応する遺伝子の転写終結点を決定した。【００９７】
転写開始点および転写終結点の情報に基づき、ＳＳＣ５に対応する遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットとして、フォワードプライマー（5'-ATGTCTCCCACAAGCAAGAAATCC-3'（配列番号：５７））およびリバースプライマー（5'-TATATTCTAGCCACAAAACCCAGCA-3'（配列番号：５８））からなるプライマーセットをデザインした。調製例１で得られた短花柱植物の全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ（株）製、商品名：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）とを用いて、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行ない、ＳＳＣ５に対応する遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅させた。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と６０℃５秒間のアニーリングと７２℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【００９８】
得られたＰＣＲ産物を、クローニングキット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、商品名：Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてＴＯＰＯベクターにクローン化した。クローン化されたＰＣＲ産物の塩基配列を、シークエンス用プライマー（5'-ACCTTTCTTACTTGCTCTTGG-3'（配列番号：５９））、シークエンス用プライマー（5'-AACTCTACATCCCAAATTCGTC-3'（配列番号：６０））およびシークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：３１３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて決定した。【００９９】
（試験例１）
普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）品種「北早生」の短花柱植物の根、葉、雌蕊、雄蕊または花粉から全ＲＮＡを単離した。得られた全ＲＮＡと、ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）とを用い、製造者のプロトコールにしたがって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。【０１００】
得られた一本鎖ｃＤＮＡと、ＳＳＣ７についてフォワードプライマー（5'-TGATTTTGCGTATGTATGAGGTTGC-3'（配列番号：６１））およびリバースプライマー（5'-GATTCAGACAAAGGGACAATCCTTGG-3'（配列番号：６２））からなるプライマーセット、ＳＳＣ５についてフォワードプライマー（5'-GTTTTACTGAAAAGTGAGGCTAAAATG-3'（配列番号：１２））およびリバースプライマー（5'-CGACGAATTTGGGATGTAGAGTTTGAA-3'（配列番号：１３））からなるプライマーセットまたはアクチンをコードするＤＮＡについてフォワードプライマー（5'-GGCATCACACTTTCTACAATGAGC-3'（配列番号：６３））およびリバースプライマー（5'-GATATCCACATCACATTTCATGAT-3'（配列番号：６４））からなるプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株）製、商品名：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃２分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と５５℃５秒間のアニーリングと６８℃５秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行なう条件である。【０１０１】
試験例１において、根、茎、葉、雌蕊、雄蕊および花粉それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ７およびＳＳＣ５それぞれの有無を調べた結果を図４に示す。図中、１はＳＳＣ７、２はＳＳＣ５を示す。【０１０２】
図４に示された結果から、ＳＳＣ７に対応する断片は、短花柱植物の雌蕊および雄蕊のＤＮＡからは増幅されるが、葉、根、茎などの栄養組織のＤＮＡからは増幅されないことがわかる。したがって、これらの結果から、ＳＳＣ７に対応する遺伝子は、短花柱植物の雌蕊および雄蕊に特異的に発現しているが、葉、根、茎などの栄養組織では発現していないことがわかる。【０１０３】
これに対して、ＳＳＣ５は、すべての組織のＤＮＡから増幅された。したがって、これらの結果から、ＳＳＣ５に対応する遺伝子は、すべての組織で発現していることがわかる。【０１０４】
（試験例２）
ＢＡＣゲノムライブラリーまたはＴＡＣゲノムライブラリーと、ＳＳＣ７についてフォワードプライマー（5'-TGGAGCTCAAGAGCTGGAGAGTGG-3'（配列番号：１６））およびリバースプライマー（5'-TTCTGTATAGAACGGAATATTTTC-3'（配列番号：１７））からなるプライマーセットまたはＳＳＣ５についてフォワードプライマー（5'-GTTTTACTGAAAAGTGAGGCTAAAATG-3'（配列番号：１２））およびリバースプライマー（5'-CGACGAATTTGGGATGTAGAGTTTGAA-3'（配列番号：１３））からなるプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株）製、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行なうことにより、ＳＳＣ７またはＳＳＣ５を含む陽性クローンを選別した。なお、ＰＣＲ条件は、９４℃３分間のインキュベーションの後、９４℃１０分間の熱変性と６０℃１５秒間のアニーリングと６８℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、最後に６８℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【０１０５】
選別された陽性クローン中のインサートＤＮＡの末端配列を、シークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：３１３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて決定し、つぎのウォーキングステップにおけるＰＣＲのためのプライマーをデザインした。プライマーとして、得られたプライマーを用いたことを除き、前記と同様の操作を行なうことによって染色体ウォーキングを行ない、９個のＢＡＣクローンおよび１個のＴＡＣクローンからなり、ＳＳＣ７およびＳＳＣ５の両方を含む１つのコンティグを得た。染色体ウォーキングに用いられたプライマーの塩基配列を表３に示す。【０１０６】
【表３】
2013047736.tif 000004
【０１０７】
得られたＢＡＣクローンおよびＴＡＣクローンの塩基配列を、シーケンサー〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、商品名：ＦＬＸ  ４５４  シーケンサー〕を用い、製造者のプロトコールにしたがって決定した。ベクターおよび大腸菌夾雑物の塩基配列を除いた後、アセンブラー（４５４ライフサイエンス社製、商品名：ＧＳ  Ｄｅｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｖ２．３）を用いて塩基配列をアセンブルした。アセンブル後の塩基配列から、反復配列マスキングソフトウェア（インスティチュート・フォア・システムズ・バイオロジー（Institute for Systems Biology）製、商品名：ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）を用いて反復配列を除去した。得られた塩基配列について、ホモロジーサーチを行ない、ＳＳＣ７およびＳＳＣ５の両方を含むコンティグ内に存在する遺伝子を同定した。【０１０８】
試験例２において作製されたソバにおけるＳＳＣ７およびＳＳＣ５の両方を含む領域のコンティグマップを図５に示す。図中、矢印は、転写の方向を示す。また、図中、１はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ａｔ２ｇ２６５２０のホモログ、２はＳＳＣ５、３は推定タンパク質ＲＣＯＭ＿０９３８６６０＊のホモログ、４は液胞Ｈ＋−ピロホスファターゼ＊、５はクロロプラストｔｒｎＡ−ＵＧＣ＊のイントロン、６はシステインジスルフラーゼ＊、７は膜内在性トランスポーターファミリータンパク質＊、８はＳＳＣ７、９はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ａｔ３ｇ５５７６０＊のホモログ、１０はフラゲリン−感受性２＊、１１は胚芽欠損２７３４＊。さらに、＊は偽遺伝子を示す。【０１０９】
図５に示された結果から、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の周囲のゲノム領域において、既知遺伝子の塩基配列に相同ないくつかの塩基配列が存在することがわかる。【０１１０】
（試験例３）
図５に示されるように、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の周囲のゲノム領域において、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０遺伝子によりコードされる推定未同定タンパク質の潜在的な機能的ホモログが存在していることが示唆された。【０１１１】
そこで、短花柱または長花柱のｃＤＮＡと、フォワードプライマー（5'-TCCTCTGTGCCGTGGCTGTA-3'（配列番号：８１））、リバースプライマー（5'-ACCGCCGTTGACAGAGCTTC-3'（配列番号：８２））およびＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株）製、商品名：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行ない、長花柱および短花柱におけるシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０のホモログの有無を調べた。なお、ＰＣＲ条件は、９４℃２分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と５５℃５秒間のアニーリングと６８℃５秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行なう条件である。アクチンをコードするＤＮＡをローディングコントロールとして用いた。【０１１２】
試験例３において、長花柱および短花柱それぞれにおけるシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０のホモログの有無を調べた結果を図６に示す。図中、Ｌは長花柱、Ｓは短花柱、１はシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０のホモログを示す。【０１１３】
図６に示された結果から、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０のホモログは、短花柱および長花柱の両方で発現することがわかる。したがって、かかる結果から、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔ２ｇ２６５２０のホモログは、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の異形自家不和合性に重要な役割を果たしていないことが示唆される。【０１１４】
（試験例４）
花モルフとＳＳＣ７またはＳＳＣ５との間の関連性を調べた。まず、表５および表６に示される世界中の普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の在来種のコレクション、表７に示されるシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）または表７に示されるＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの短花柱植物または長花柱植物の全ＤＮＡと、ＳＳＣ７についてフォワードプライマー（5'-GGGGTTGGCAATGAGAAACTAAC-3'（配列番号：３４））およびリバースプライマー（5'-ACGGAATATTTTCATTGCAGATTCA-3'（配列番号：３５））からなるプライマーセットまたはＳＳＣ５についてフォワードプライマー（5'-GTTTTACTGAAAAGTGAGGCTAAAATG-3'（配列番号：１２））およびリバースプライマー（5'-CGACGAATTTGGGATGTAGAGTTTGAA-3'（配列番号：１３））からなるプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いて行なった。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と６０℃５秒間のアニーリングと７２℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【０１１５】
【表４】
2013047736.tif 000005
【０１１６】
【表５】
2013047736.tif 000006
【０１１７】
【表６】
2013047736.tif 000007
【０１１８】
試験例４において、普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の短花柱植物および長花柱植物それぞれにおけるＳＳＣ７の有無を調べた結果を図７、試験例４において、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の短花柱植物および長花柱植物それぞれにおけるＳＳＣ７の有無を調べた結果を図８、試験例４において、Ｆ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの短花柱植物および長花柱植物それぞれにおけるＳＳＣ７の有無を調べた結果を図９に示す。図中、Ｌは、長花柱植物、Ｓは短花柱植物、Ｎは陰性対照、Ｍはサイズマーカー（ジーンダイレックス（ＧｅｎｅＤｉｒｅＸ）社製、商品名：１−ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ）を示す。また、矢頭で示された断片のサイズは１ｋｂを示す。【０１１９】
図７〜９に示された結果から、すべてのソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の短花柱植物のＤＮＡからＳＳＣ７に対応する断片が増幅されるが、長花柱植物のＤＮＡからはＳＳＣ７に対応する断片が増幅されないことがわかる。これらの結果から、ＳＳＣ７に対応する遺伝子は、すべてのソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の短花柱植物のＤＮＡに存在するが、長花柱植物のＤＮＡには存在していないことがわかる。したがって、かかる結果から、ＳＳＣ７に対応する遺伝子は、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の異形自家不和合性系に重要な役割を果たしている可能性があることが示唆される。【０１２０】
これに対して、すべての普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の短花柱植物のＤＮＡからＳＳＣ５に対応する断片が増幅されたが、すべての普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の長花柱植物、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の短花柱植物および長花柱植物のＤＮＡからＳＳＣ５に対応する断片が増幅されなかった。かかる結果から、ＳＳＣ５に対応する遺伝子がソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の異形自家不和合性系に必ずしも必要でないことが示唆される。【０１２１】
（試験例５）
普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）品種「北早生」の短花柱植物またはＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの短花柱植物のＤＮＡと、フォワードプライマー（5'-CACCACCTCCATCACATATT-3'（配列番号：８３））と、リバースプライマー（5'-TTTGCCCATTCAGTTATCCT-3'（配列番号：８４））と、ＤＮＡプローブ合成キット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）製、商品名：ＰＣＲ  Ｄｉｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）とを用い、ＳＳＣ７を検出するためのプローブ（以下、「ＳＳＣ７プローブ」という）を作製した。【０１２２】
また、普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）品種「北早生」の短花柱植物のＤＮＡと、フォワードプライマー（5'-ATGTCTCCCACAAGCAAGAAATC-3'（配列番号：８５））と、リバースプライマー（5'-AAGGGAAGCCCAATAACCTAGTTC-3'（配列番号：８６））と、ＤＮＡプローブ合成キット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）製、商品名：ＰＣＲ  Ｄｉｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）とを用い、ＳＳＣ５を検出するためのプローブ（以下、「ＳＳＣ５プローブ」という）を作製した。【０１２３】
異形自家不和合性種である普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）品種「北早生」、同形自家和合性系統である「九州ＰＬ４号」、異形自家不和合性種であるシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）（Ｃ９１４２）、同形自家和合性系統であるダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）（Ｃ８８１６）または異形自家不和合性種であるＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍ（Ｃ８８４２）のＤＮＡ５μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた産物を０．８質量％アガロースゲル上で分画し、ナイロン製メンブラン（パルコーポレーション（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製、商品名：Ｂｙｏｄｙｎｅ  Ｐｌｕｓ）にブロッティングした。【０１２４】
ＳＳＣ７プローブまたはＳＳＣ５プローブと、ブロッティング後のメンブランと、ハイブリダイゼーション試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）製、商品名：ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ）とを用い、サザンブロット解析を行なった。ハイブリダイゼーションは、４２℃１６時間行なった。ハイブリダイゼーション後のメンブランを、低ストリンジェンシーバッファー（組成：０．５×ＳＳＣおよび０．１質量％ＳＤＳ）を用いて２５℃で５分間２回洗浄し、ついで、高ストリンジェンシーバッファー（組成：０．１×ＳＳＣおよび０．１質量％ＳＤＳ）を用いて６５℃で１５分間２回洗浄した。その後、Ｄｉｇシグナルを、検出用セット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）製、商品名：ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ）を用い、製造者のプロトコールにしたがって検出した。【０１２５】
試験例５において、異形自家不和合性種である普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の長花柱植物および短花柱植物ならびに同形自家和合性系統である「九州ＰＬ４号」のＤＮＡそれぞれにおけるＳＳＣ７の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を図１０（Ａ）、試験例５において、異形自家不和合性種であるシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の長花柱植物および短花柱植物ならびに同形自家和合性種であるダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）それぞれのＤＮＡにおけるＳＳＣ７の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を図１０（Ｂ）、試験例５において、異形自家不和合性種であるＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの長花柱植物および短花柱植物のＤＮＡそれぞれにおけるＳＳＣ７の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を図１０（Ｃ）に示す。図１０（Ａ）中、１は普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の長花柱植物、２は普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の短花柱植物、３は「九州ＰＬ４号」を示す。図１０（Ｂ）中、１はシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の長花柱植物、２はシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の短花柱植物、３はダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）を示す。図１０（Ｃ）中、１はＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの長花柱植物、２はＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの短花柱植物を示す。【０１２６】
また、試験例５において、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の長花柱植物および短花柱植物のＤＮＡにおけるＳＳＣ５の有無をサザンブロット解析によって調べた結果を図１１に示す。図中、１は普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の長花柱植物、２は普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の短花柱植物、３はシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の長花柱植物、４はシャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の短花柱植物を示す。また、図中、星印はハイブリダイゼーションシグナルの予想サイズを示す。【０１２７】
図１０（Ａ）〜（Ｃ）に示された結果から、短花柱植物のＤＮＡにおいては、ＳＳＣ７プローブのハイブリダイゼーションに起因するシグナルが検出されるが、長花柱植物のＤＮＡにおいては、シグナルが検出されないことがわかる。したがって、これらの結果から、ＳＳＣ７に対応する遺伝子は短花柱に特異的に発現していることが示唆される。【０１２８】
一方、図１１に示された結果から、普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の長花柱植物および短花柱植物のＤＮＡにおいては、ＳＳＣ５プローブのハイブリダイゼーションに起因するサイズの異なる複数のシグナルが検出されることがわかる。しかしながら、図１１に示された結果は、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）の長花柱植物および短花柱植物のＤＮＡにおいては、ＳＳＣ５プローブのハイブリダイゼーションに起因するシグナルが検出されないことがわかる。かかる結果から、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）のＤＮＡには、ＳＳＣ５に対応する遺伝子が存在しないか、または普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）のＳＳＣ５に対応する遺伝子から高度に分岐して異なる遺伝子が存在していることが示唆される。【０１２９】
以上の結果から、ＳＳＣ５に対応する遺伝子は、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種の異形自家不和合性系に必ずしも必要でないことが示唆される。【０１３０】
（試験例６）
普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）のＳＳＣ７の塩基配列に基づき、種々のソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種のＳＳＣ７を増幅するためのプライマーセットとして、フォワードプライマー（5'-TTGTGTACAAGCCCTACCCTGGA-3'（配列番号：８７））およびリバースプライマー（5'-AGAAGCGAGTCTCCCATCACAAG-3'（配列番号：８８））からなるプライマーセットをデザインした。【０１３１】
シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）、ダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）またはＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍの短花柱植物の全ＤＮＡと、前記プライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）社製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と５８℃５秒間のアニーリングと７２℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【０１３２】
また、ファウセット（Ｊ．Ａ．Ｆａｗｃｅｔｔ）ら〔「植物界に広範に分布するＳＩＮＥファミリーおよびその進化過程（Ａ  ＳＩＮＥ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｈｉｓｔｏｒｙ）」、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第６１巻、ｐｐ．５０５−５１４（２００６））に記載の方法を用いたインバースＰＣＲを行なうことにより、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）、ダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）またはＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍのＳＳＣ７の隣接領域を得た。【０１３３】
シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）およびＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍから生成されたＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ＤＮＡを、両末端の配列を増幅するようにデザインされたプライマーセット（表７および表８参照）を用いて再増幅した。ダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）のＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ＤＮＡの配列は、図１２に示されるように、長い末端反復配列および逆方向反復を含んでおり、３つの部分で別々に増幅された。【０１３４】
【表７】
2013047736.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2013047736.tif 000009
【０１３６】
シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）およびＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍのＳＳＣ７の正確なエキソン−イントロン接合部を決定するために、短花柱から得られたｃＤＮＡと、表７および表８に示されるＰＣＲ用のプライマーからなるプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とを用いてＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、９８℃３分間のインキュベーションの後、９８℃５秒間の熱変性と６０℃５秒間のアニーリングと７２℃３分間の伸長とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、７２℃５分間のインキュベーションを行なう条件である。【０１３７】
得られたＰＣＲ産物を、クローニングキット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、商品名：Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてＴＯＰＯベクターにクローン化した。得られた構築物中のインサートのサイズを確認した後、インサートの塩基配列を、シークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：３１３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて決定した。配列の決定には、プライマーとして、表７および表８に示される配列決定用のプライマーを用いた。【０１３８】
また、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の機能的意義を決定するために、同形自家和合性種であるダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）および同形自家和合性系統である「九州ＰＬ４号」それぞれのＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ＤＮＡの塩基配列を決定し、３つの異形自家不和合性種（普通ソバ（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、シャクチリソバ（Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍ）およびＦ．ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）のものと比較した。試験例６において、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）種におけるＳＳＣ７に対応する遺伝子の構造を調べた結果を図１２に示す。【０１３９】
図１２に示された結果から、３つの異形自家不和合性種のＳＳＣ７に対応する遺伝子の配列は、６６１〜６７０アミノ酸からなるポリペプチドをコードすることが予測される１９８３〜２０１０ｂｐのオープンリーディングフレームを含む５つのエキソンを有することがわかる。また。図１２に示された結果から、「九州ＰＬ４号」のＳＳＣ７に対応する遺伝子の全長ＤＮＡの塩基配列は、エキソン５におけるフレームシフトをもたらす単一ヌクレオチド欠失を含むことがわかる。さらに、図１２に示された結果から、同形自家和合性種であるダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）は、ＳＳＣ７に対応する遺伝子のエキソン５におけるナンセンス変異、およびＳＳＣ７に対応する遺伝子の５’領域の逆位および３番目のイントロンにおける３２５５ｂｐのレトロトランスポゾンの挿入に付随する重複などのダイナミックな遺伝子変異を有することがわかる。これらの結果から、配列番号：３において、５番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：３１２６〜４６０５）に対応する領域中におけるフレームシフト変異、前記５番目のエキソンに対応する領域中におけるナンセンス変異、３番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：１３４０〜１８４８）に対応する領域と４番目のエキソン（配列番号：３中の塩基番号：３００２〜３０５３）に対応する領域との間における２つのダイレクトリピート、３’末端領域における逆位を伴う重複、これらの組合せなどにより、ＳＳＣ７に対応する遺伝子を破壊することができることが示唆される。【０１４０】
また、これらの結果から、「九州ＰＬ４号」およびダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ）では、ＳＳＣ７に対応する遺伝子が破壊されていることによって自家和合性を示していることが示唆される。したがって、異形自家不和合性は、Ｓ対立遺伝子およびｓ対立遺伝子における機能的なＳＳＣ７に対応する遺伝子（自家不和合性制御因子をコードする遺伝子）の有無によって獲得されうることが示唆される。かかる結果から、ＳＳＣ７に対応する遺伝子を有する自家不和合性ソバ属植物において、ＳＳＣ７に対応する遺伝子を破壊するか、ＳＳＣ７に対応する遺伝子の発現を阻害することによって、自家和合性ソバ属植物を作出することができることが示唆される。【０１４１】
（実施例２）
配列番号：１もしくは３に示される塩基配列に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子に対して機能欠失型の変異が導入された変異型遺伝子を発現可能に保持する核酸、配列番号：１もしくは３からなる核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、または配列番号：１もしくは３に基づいて作製したｓｉＲＮＡを発現可能に保持する核酸を、普通ソバに導入する。【０１４２】
得られた形質転換体の自家受粉を行なう。つぎに、経時的に花を採取し、採取された花の花粉管を０．１質量％アニリンブルー染色液で染色する。その後、蛍光顕微鏡によって花粉管伸長を観察し、自家受粉時の花粉管の長さおよび伸長速度を測定する。また、自家受粉後の着粒率を測定し、野生型の長柱花植物または短柱花植物の自家受精時の着粒率と比較する。その結果に基づいて、花粉管の伸長が見られること、花粉管の長さが自家不和合性ソバ属植物のものよりも長いこと、花粉管の伸長速度が自家不和合性ソバ属植物のものよりも速いことおよび野生型の長柱花植物または短柱花植物の自家受精時の着粒率と比べて高い着粒率を示すことの少なくとも１つを指標とし、自家和合性を示す形質転換体を選別する。【０１４３】
（実施例３）
普通ソバの種子に、重イオンビームを照射し、配列番号：１もしくは３に示される塩基配列に含まれる自家不和合性制御因子をコードする遺伝子を欠損させるか、または前記遺伝子に機能欠失型の変異を導入する。その後、得られた種子を栽培する。その後、得られた成熟植物のうち、前記遺伝子の欠損または前記遺伝子への機能欠失型の変異の導入が確認された成熟植物の自家受粉を行なう。つぎに、経時的に花を採取し、採取された花の花粉管を０．１質量％アニリンブルー染色液で染色する。その後、蛍光顕微鏡によって花粉管伸長を観察し、自家受粉時の花粉管の長さおよび伸長速度を測定する。また、自家受粉後の着粒率を測定し、野生型の長柱花植物または短柱花植物の自家受精時の着粒率と比較する。その結果に基づいて、花粉管の伸長が見られること、花粉管の長さが自家不和合性ソバ属植物のものよりも長いこと、花粉管の伸長速度が自家不和合性ソバ属植物のものよりも速いことおよび野生型の長柱花植物または短柱花植物の自家受精時の着粒率と比べて高い着粒率を示すことの少なくとも１つを指標とし、自家和合性を示す植物を選別する。
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
配列番号：４は、ＳＳＣ１を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：５は、ＳＳＣ１を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：６は、ＳＳＣ２を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：７は、ＳＳＣ２を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：８は、ＳＳＣ３を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：９は、ＳＳＣ３を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：１０は、ＳＳＣ４を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：１１は、ＳＳＣ４を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：１２は、ＳＳＣ５を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：１３は、ＳＳＣ５を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：１４は、ＳＳＣ６を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：１５は、ＳＳＣ６を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：１６は、ＳＳＣ７を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：１７は、ＳＳＣ７を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：１８は、ＳＳＣ８を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：１９は、ＳＳＣ８を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：２０は、ＳＳＣ９を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２１は、ＳＳＣ９を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：２２は、ＳＳＣ１０を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２３は、ＳＳＣ１０を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：２４は、ＳＳＣ１１を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２５は、ＳＳＣ１１を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：２６は、ＳＳＣ１２を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２７は、ＳＳＣ１２を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：２８は、ＳＳＣ１３を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：２９は、ＳＳＣ１３を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：３０は、ＳＳＣ１４を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：３１は、ＳＳＣ１４を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：３２は、ＳＳＣ１５を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：３３は、ＳＳＣ１５を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：３４は、ＳＳＣ７の連鎖解析のためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：３５は、ＳＳＣ７の連鎖解析のためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：３６は、ＳＳＣ５の連鎖解析のためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：３７は、ＳＳＣ５の連鎖解析のためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：３８は、ＳＳＣ７の５’−ＲＡＣＥのための特異的プライマーの配列である。
配列番号：３９は、ＳＳＣ７の５’−ＲＡＣＥのためのネスティッドプライマーの配列である。
配列番号：４０は、ＳＳＣ７の３’−ＲＡＣＥのための特異的プライマーの配列である。
配列番号：４１は、ＳＳＣ７の３’−ＲＡＣＥのためのネスティッドプライマーの配列である。
配列番号：４２は、＃１３＿ｅｓｃ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＦＷ１プライマーの配列である。
配列番号：４３は、＃１３＿ｅｓｃ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＲＶ４６００プライマーの配列である。
配列番号：４４は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＦＷ６６０プライマーの配列である。
配列番号：４５は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＦＷ１２２０プライマーの配列である。
配列番号：４６は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＦＷ１８３０プライマーの配列である。
配列番号：４７は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＦＷ２０２０プライマーの配列である。
配列番号：４８は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＦＷ３０２０プライマーの配列である。
配列番号：４９は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＲＶ２３２０プライマーの配列である。
配列番号：５０は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＲＶ２７１０プライマーの配列である。
配列番号：５１は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３３２０プライマーの配列である。
配列番号：５２は、＃１３＿ｅｓｃ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３９７０プライマーの配列である。
配列番号：５３は、ＳＳＣ５の５’−ＲＡＣＥのための特異的プライマーの配列である。
配列番号：５４は、ＳＳＣ５の５’−ＲＡＣＥのためのネスティッドプライマーの配列である。
配列番号：５５は、ＳＳＣ５の３’−ＲＡＣＥのための特異的プライマーの配列である。
配列番号：５６は、ＳＳＣ５の３’−ＲＡＣＥのためのネスティッドプライマーの配列である。
配列番号：５７は、全長ｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：５８は、全長ｃＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：５９は、シーケンス用プライマーの配列である。
配列番号：６０は、シーケンス用プライマーの配列である。
配列番号：６１は、ＳＳＣ７を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：６２は、ＳＳＣ７を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：６３は、アクチンをコードするＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：６４は、アクチンをコードするＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：６５は、３３０Ｂ５＿ＲＶＮ＿ＦＷ３４プライマーの配列である。
配列番号：６６は、３３０Ｂ５＿ＲＶＮ＿ＲＶ３０２プライマーの配列である。
配列番号：６７は、１１１Ｎ２４＿ＲＶＮ＿ＦＷ５９プライマーの配列である。
配列番号：６８は、１１１Ｎ２４＿ＲＶＮ＿ＲＶ３０６プライマーの配列である。
配列番号：６９は、６２Ｍ１７＿ＲＶＮ＿ＦＷ２１プライマーの配列である。
配列番号：７０は、６２Ｍ１７＿ＲＶＮ＿ＲＶ３３２プライマーの配列である。
配列番号：７１は、３４１Ｄ６＿ＲＶＮ＿ＦＷ３プライマーの配列である。
配列番号：７２は、３４１Ｄ６＿ＲＶＮ＿ＲＶ３６３プライマーの配列である。
配列番号：７３は、７４Ｋ１５＿ＲＶＮ＿ＦＷ５５プライマーの配列である。
配列番号：７４は、７４Ｋ１５＿ＲＶＮ＿ＲＶ４６１プライマーの配列である。
配列番号：７５は、２４４Ｅ２１＿ＲＶＮ＿ＦＷ９１プライマーの配列である。
配列番号：７６は、２４４Ｅ２１＿ＲＶＮ＿ＲＶ３６１プライマーの配列である。
配列番号：７７は、１７６Ｅ２１＿Ｍ４＿ＦＷ３３プライマーの配列である。
配列番号：７８は、１７６Ｅ２１＿Ｍ４＿ＲＶ２４７プライマーの配列である。
配列番号：７９は、２３２Ｇ４＿Ｍ４＿ＦＷ６プライマーの配列である。
配列番号：８０は、２３２Ｇ４＿Ｍ４＿ＲＶ３０７プライマーの配列である。
配列番号：８１は、Ａｔ２ｇ２６５２０を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：８２は、Ａｔ２ｇ２６５２０を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：８３は、ＳＳＣ７プローブを作製するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：８４は、ＳＳＣ７プローブを作製するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：８５は、ＳＳＣ５プローブを作製するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：８６は、ＳＳＣ５プローブを作製するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：８７は、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）のＳＳＣ７を増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：８８は、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）のＳＳＣ７を増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：８９は、＃１３＿ｔａｔ＿Ａ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＦＷ７プライマーの配列である。
配列番号：９０は、＃１３＿ｔａｔ＿Ａ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＲＶ２６４３プライマーの配列である。
配列番号：９１は、＃１３＿ｔａｔ＿Ｂ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＦＷ２２１０プライマーの配列である。
配列番号：９２は、＃１３＿ｔａｔ＿Ｂ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＲＶ６２１０プライマーの配列である。
配列番号：９３は、＃１３＿ｔａｔ＿Ｃ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＦＷ５９４０プライマーの配列である。
配列番号：９４は、＃１３＿ｔａｔ＿Ｃ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＲＶ８０００プライマーの配列である。
配列番号：９５は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ５８０プライマーの配列である。
配列番号：９６は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ６４８０プライマーの配列である。
配列番号：９７は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ７０２２プライマーの配列である。
配列番号：９８は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ７５７６プライマーの配列である。
配列番号：９９は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ１２５０プライマーの配列である。
配列番号：１００は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ１８１０プライマーの配列である。
配列番号：１０１は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ２５８０プライマーの配列である。
配列番号：１０２は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ３４３３プライマーの配列である。
配列番号：１０３は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ４０３０プライマーの配列である。
配列番号：１０４は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＦＷ４５９５プライマーの配列である。
配列番号：１０５は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３７７０プライマーの配列である。
配列番号：１０６は、＃１３＿ｔａｔ＿ｓｅｑ＿ＲＶ５９２０プライマーの配列である。
配列番号：１０７は、＃１３＿ｃｙｍ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＲＶ３８８０プライマーの配列である。
配列番号：１０８は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＦＷ＿１３５０プライマーの配列である。
配列番号：１０９は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＦＷ＿１８２２プライマーの配列である。
配列番号：１１０は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＦＷ５３０プライマーの配列である。
配列番号：１１１は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＦＷ８３０プライマーの配列である。
配列番号：１１２は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＦＷ２２３０プライマーの配列である。
配列番号：１１３は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３１９０プライマーの配列である。
配列番号：１１４は、＃１３＿ｃｙｍ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３３７０プライマーの配列である。
配列番号：１１５は、＃１３＿ｕｒｏ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＦＷ６０プライマーの配列である。
配列番号：１１６は、＃１３＿ｕｒｏ＿ａｍｐ／ｓｅｑ＿ＲＶ４９７０プライマーの配列である。
配列番号：１１７は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑＦＷ＿２３３６プライマーの配列である。
配列番号：１１８は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑ＿ＦＷ６４０プライマーの配列である。
配列番号：１１９は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑ＿ＦＷ１３３０プライマーの配列である。
配列番号：１２０は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑ＿ＦＷ１８２０プライマーの配列である。
配列番号：１２１は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３１６０プライマーの配列である。
配列番号：１２２は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑ＿ＲＶ３８４０プライマーの配列である。
配列番号：１２３は、＃１３＿ｕｒｏ＿ｓｅｑ＿ＲＶ４３６０プライマーの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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