(57)【要約】生体内における酵素反応、タンパク質相互作用等の反応を可視化するためのＭＲＩ用プローブを提供する。常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブであり、前記ＭＲＩ観測核種キャリアーと前記常磁性金属とが連結され、  前記ＭＲＩ観測核種キャリアーが、酵素反応により作用を受ける部位を有し、前記部位に酵素が作用することにより前記ＭＲＩ観測核種キャリアーの構造を変化させ、その結果、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることができ、前記ＭＲＩ観測核種が、Ｆ、ＸｅおよびＨｅからなる群から選択される１以上であるＭＲＩ用プローブが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブであり、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーと前記常磁性金属とが連結され、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーが、酵素反応により作用を受ける部位を有し、
前記部位に酵素が作用することにより前記ＭＲＩ観測核種キャリアーの構造を変化させ、その結果、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることができ、
前記ＭＲＩ観測核種が、Ｆ、ＸｅおよびＨｅからなる群から選択される１以上であるＭＲＩ用プローブ。
【請求項２】
前記常磁性金属が、Ｇｄ３＋、Ｍｎ２＋、Ｄｙ３＋、Ｆｅ３＋、Ｃｅ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｐｍ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｔｍ３＋、およびＹｂ３＋からなる群から選択される１以上である請求項１に記載のＭＲＩ用プローブ。
【請求項３】
前記酵素が、加水分解酵素であり、前記酵素反応により作用を受ける部位が、前記加水分解酵素により作用を受ける構造を有する請求項１または２に記載のＭＲＩ用プローブ。
【請求項４】
前記ＭＲＩ観測核種と、前記常磁性金属とが、常磁性相互作用をしている請求項１〜３のいずれかに記載のＭＲＩ用プローブ。
【請求項５】
前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることにより、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との間の前記常磁性相互作用が変化する請求項４に記載のＭＲＩ用プローブ。
【請求項６】
下記式で表わされる構造を有する請求項１〜５のいずれかに記載のＭＲＩ用プローブ。
【化１】
2009054327.tif 000012
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のＭＲＩ用プローブを用いて検体中の酵素の活性を測定する方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載のＭＲＩ用プローブに検体を反応させ、前記ＭＲＩ用プローブと酵素との反応の結果生じたＭＲＩ用プローブのＭＲＩ観測核種をＭＲＩにより測定し、
前記測定結果から前記酵素の活性を測定する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＭＲＩ用プローブを製造する方法であって、
リンカーと、前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位と、前記常磁性金属と結合する構造部位とを含むＭＲＩ観測核種キャリアーと、常磁性金属とを反応させ、常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブを得る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＲＩ用プローブ、およびそのＭＲＩ用プローブを用いて酵素の活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）は、核磁気共鳴現象を利用して、生体内の内部情報を画像化する方法である。このＭＲＩでは、放射線被爆が無く、かつ良好な組織コントラストで断層画像を得ることが可能である。そのため、ＭＲＩを用いれば、血流に関する情報や生体機能および代謝に関する情報が得られるという利点がある。現在、ＭＲＩにおいては、Ｇｄ錯体などの造影剤を用い、生体内の水分子の１Ｈを画像化する方法が一般的である。近年、観測核種としては、１Ｈのほかに、１９Ｆ、Ｘｅなどについても利用されている。中でも、１９Ｆは、感度およびＳ／Ｎ比の両方が良好であり、観測核種として非常に期待されている。【０００３】
一方、ＭＲＩを用いて、生体内における酵素反応、タンパク質相互作用等の反応を検出するため、ＭＲＩ用プローブが開発されている。例えば、亜鉛イオンにより１Ｈ−ＮＭＲの緩和時間Ｔ１を短縮させるようなＭＲＩ用プローブ（非特許文献１参照）が開発されている。このようなＭＲＩ用プローブは、水分子の緩和時間Ｔ１を短縮させることによってＴ１強調画像におけるＭＲＩシグナルの増強を観察している。【０００４】
また、１９Ｆを分子内に含む化合物を用いてフッ素原子を可視化する１９Ｆ−ＭＲＩに関する研究が近年行われている。しかしながら、これらの研究は、プローブ化合物自身の体内動態や集積化を可視化している例がほとんどであった。酵素反応によって化合物の１９Ｆ−ＮＭＲのケミカルシフトが変化する機能性１９Ｆプローブが報告されている（非特許文献２参照）。【０００５】
しかしながら、様々な生体内反応を可視化するためのＭＲＩ用プローブについては、いまだ開発されていなかった。
【非特許文献１】K. Hanaokaら、J. Chem. Soc., Perkin Trans.2, 2001, p1840-1843.
【非特許文献２】J-X Yuら、Curr. Med. Chem. 2005, 12, p819-848.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、生体内における酵素反応、タンパク質相互作用等の反応を可視化するためのＭＲＩ用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブであり、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーと、前記常磁性金属とが連結され、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーが、酵素反応により作用を受ける部位を有し、
前記部位に酵素が作用することにより前記ＭＲＩ観測核種キャリアーの構造を変化させ、その結果、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることができ、
前記ＭＲＩ観測核種が、Ｆ、ＸｅおよびＨｅからなる群から選択される１以上である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＭＲＩ用プローブは、生体内における酵素反応等の反応を可視化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂと酵素反応をモニターした１９Ｆ ＮＭＲである。（ａ）はＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＴｆｂとＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１９Ｆ ＮＭＲの比較を示したものであり、（ｂ）は酵素反応の１９Ｆ ＮＭＲを時系列に示したものである。
【図２】図２は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂと酵素反応をモニターしたＨＰＬＣである。（ａ）は酵素添加前、（ｂ）は酵素添加後のものである。
【図３】図３は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと酵素反応をモニターした１９Ｆ ＮＭＲである。（ａ）はＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣおよびＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの１９Ｆ ＮＭＲの比較を示したものであり、（ｂ）は酵素反応の１９Ｆ ＮＭＲを時系列に示したものである。
【図４】図４は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと酵素反応をモニターしたＨＰＬＣである。（ａ）は酵素添加前、（ｂ）は酵素添加後のものである。
【図５】図５は、Ｇｄ−ＤＦＰ−ｇａｌと酵素反応をモニターした１９Ｆ ＮＭＲである。（ａ）はＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌとＤＦＰ−ｇａｌの１９Ｆ ＮＭＲの比較を示したものであり、（ｂ）は酵素反応の１９Ｆ ＮＭＲを時系列に示したものである。
【図６】図６は、Ｇｄ−ＤＦＰ−ｇａｌと酵素反応をモニターしたＨＰＬＣである。（ａ）は酵素添加前、（ｂ）は酵素添加後のものである。
【図７】図７は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂと酵素反応をモニターした１９Ｆ ＮＭＲシグナルの画像である。
【図８】図８は、Ｇｄ−ＤＦＰ−ｇａｌと酵素反応をモニターした１９Ｆ ＮＭＲシグナルの画像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、前記のように、常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブである。【００１１】
前記ＭＲＩ観測核種は、Ｆ、ＸｅおよびＨｅからなる群から選択される１以上であり、Ｆが好ましい。１９Ｆは、４０．０４ＭＨｚ／Ｔの高い磁気回転比を有するため、１９Ｆの感度は１Ｈを除くＭＲＩ観測核種より高い。また１９Ｆと１Ｈの磁気回転比が同程度であるため、１９Ｆ ＮＭＲを大部分の１Ｈ ＮＭＲ装置をわずかに改変することにより測定が可能である。そのため、前記ＭＲＩ観測核種としては、１９Ｆが好ましい。また、１９Ｆ原子は大部分は骨と歯において固形塩の形態で集中している。これら内在性の１９Ｆの横緩和時間（Ｔ２）は非常に短く、ＭＲＩシグナルはほとんど検出されない。１９Ｆ含有化合物を動物に処置しても、化合物由来の１９ＦＭＲＩシグナルが、バックグラウンドシグナルからの干渉なしに観測されるのみである。そのため、前記ＭＲＩ観測核種としては、１９Ｆが好ましい。【００１２】
本発明のＭＲＩ用プローブにおいては、前記常磁性金属は、Ｇｄ３＋、Ｍｎ２＋、Ｄｙ３＋、Ｆｅ３＋、Ｃｅ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｐｍ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｔｍ３＋、およびＹｂ３＋からなる群から選択される１以上であるのが好ましい。これらの金属は、近傍に存在するＦ、ＸｅまたはＨｅに強い常磁性相互作用を起こし、これらの核種のＮＭＲにおける縦緩和時間Ｔ１および横緩和時間Ｔ２を短縮させることが可能だからである。【００１３】
本発明のＭＲＩ用プローブにおいては、前記酵素は、加水分解酵素であり、前記酵素反応により作用を受ける部位が、前記加水分解酵素により作用を受ける構造を有するのが好ましい。前記加水分解酵素としては、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ、糖加水分解酵素等が挙げられる。前記プロテアーゼとしては、ペプチド結合を加水分解する酵素であれば、特に限定されない。前記プロテアーゼとしては、特定の配列だけを特異的に切断するという高度な選択性を持つプロテアーゼが好ましい。高度な特異性を持つプロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼ−３、ケキシン、フューリン、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。前記酵素反応により作用を受ける部位は、前記プロテアーゼの種類に応じて種々異なる。前記ヌクレアーゼとしては、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドの糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解する酵素であれば、特に限定されない。【００１４】
本発明のＭＲＩ用プローブにおいては、前記ＭＲＩ観測核種キャリアーは、前記ＭＲＩ観測核種を含み、かつ、酵素反応により作用を受ける部位を有し、かつ、前記部位に酵素が作用することにより前記ＭＲＩ観測核種キャリアーの構造を変化させ、その結果、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることができるＭＲＩ観測核種キャリアーである。前記ＭＲＩ観測核種キャリアーとしては、例えば、置換基を任意に有する−（ＣＨ２）ｎ−で表わされるアルキレン基（式中、ｎは１〜１８の整数）、置換基を任意に有する−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ−（ＣＨ２）ｍ−基（式中、ｎは１〜１８の整数、ｍは１〜１８の整数、Ａｒは２価のアリール基）、置換基を任意に有する−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−基（式中、ｎは１〜１８の整数、ｍは１〜１８の整数、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−である）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−基（式中、ｎは１〜１０の整数）、ぺプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される１以上を含むリンカーと、前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位と、前記常磁性金属と結合する構造部位とを含むＭＲＩ観測核種キャリアーが挙げられる。【００１５】
前記ぺプチドとしては、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは２〜１２個のアミノ酸からなるペプチドである。前記アミノ酸としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはそれらの混合物であってもよい。前記オリゴヌクレオチドとしては、１〜４０個、好ましくは２〜２４個、より好ましくは４〜１６個のヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドである。前記ヌクレオシドとしては、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそれらの混合物であってもよい。【００１６】
前記リンカーとしては、例えば、以下の式で表わされるものが挙げられる。【００１７】
【化２】
2009054327.tif 000002
【００１８】
前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位としては、前記ＭＲＩ観測核種がＦの場合、−Ｆのフッ素原子自身、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｆ等のフッ素原子を含む低級アルキル基、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｆ等のフッ素原子を含む低級アルコキシ基等が挙げられる。また、前記ＭＲＩ観測核種がＸｅの場合、クリプトファンＡ−Ｘｅ錯体等が挙げられる。前記常磁性金属と結合する構造部位としては、ポルフィリン、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、下記式で表わされるもの等が挙げられる。【００１９】
【化３】
2009054327.tif 000003
【００２０】
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーとしては、前記のような構造部位を有するものであれば限定されないが、前記ＭＲＩ観測核種キャリアーの長さ、すなわち、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離が、例えば０〜４０Å、好ましくは０〜２０Å、より好ましくは０〜１０Åである。前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離が近いほど、前記ＭＲＩ観測核種と、前記常磁性金属とが、常磁性相互作用を起こしやすいからである。【００２１】
本発明のＭＲＩ用プローブにおいては、前記ＭＲＩ観測核種と、前記常磁性金属とが、常磁性相互作用をしているのが好ましい。前記のように常磁性相互作用をしている場合、前記ＭＲＩ観測核種のＮＭＲにおける縦緩和時間Ｔ１および横緩和時間Ｔ２を短縮させることが可能だからである。この際、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることにより、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との間の前記常磁性相互作用が変化するのが好ましい。常磁性相互作用が減少すると、短縮されていた前記ＭＲＩ観測核種のＮＭＲにおける縦緩和時間Ｔ１および横緩和時間Ｔ２が固有の長さに戻り、その結果、前記ＭＲＩ観測核種のシグナルが回復するからである。この場合、酵素反応によりＭＲＩ観測核種キャリアーの構造が変化し、その結果、抑制されていたＭＲＩ観測核種のシグナルが、回復する。すなわち、前記ＭＲＩ観測核種のシグナルを測定することにより、前記酵素反応を検出することができる。具体的には、前記ＭＲＩ観測核種のシグナルを測定することにより、前記酵素の活性を測定することができる。このシグナルはＭＲＩ画像により検出されるので、生体内における酵素反応を可視化することができるのである。【００２２】
本発明のＭＲＩ用プローブとしては、以下の構造式で表わされる化合物が好ましい。【００２３】
【化４】
2009054327.tif 000004
【００２４】
前記化合物らは、具体的には、以下のようにして、ＭＲＩ用プローブとして機能する。例えば、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂは、分子内に常磁性金属Ｇｄと、ＭＲＩ核種のＦとを含み、常磁性金属Ｇｄと、ＭＲＩ核種のＦとは連結されている。同一分子内に含まれているので、常磁性金属Ｇｄと、ＭＲＩ核種のＦとは、常磁性相互作用を生じている。その結果、ＭＲＩ核種のＦのシグナルは、抑制される。Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂは加水分解酵素であるカスパーゼ−３により作用を受けて、Ｇｄを含む部分とＦを含む部分とに分解される。このように加水分解酵素により作用されることにより、常磁性金属Ｇｄと、ＭＲＩ核種のＦとは、同一分子内ではなく、別々の分子に含まれることになる。その結果、同一分子内に含まれていたときと比較して、常磁性金属Ｇｄと、ＭＲＩ核種のＦとの距離は著しく広がり、常磁性相互作用は著しく低くなる。そうすると、抑制されていたＭＲＩ核種のＦのシグナルが回復するのである。このシグナルはＭＲＩ画像により検出されるので、カスパーゼ−３の検出にＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂは有用である。【００２５】
【化５】
2009054327.tif 000005
【００２６】
Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣについても、下記に示すように同様である。なお、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣは、ＭＲＩ観測核種であるＦを含む官能基として、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン基を含んでいる。この特定なクマリン基は、７位のアミノ基がアシル化されていると３８０〜４００ｎｍ励起においてほとんど蛍光を発しない。一方、この特定なクマリン基は７位のアミノ基が脱アシル化されると蛍光を発するようになる。従って、カスパーゼ−３によりＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣは加水分解されると蛍光を発するにようになる。そのため、ＭＲＩ観測核種のＦのシグナルと同時に蛍光も測定すれば、カスパーゼ−３の酵素反応を可視化することができる。【００２７】
【化６】
2009054327.tif 000006
【００２８】
Ｇｄ−ＤＦＰ−Ｇａｌについても、下記に示すように同様である。なお、β−ガラクトシダーゼは大腸菌や細胞レベルの遺伝子発現のレポーター酵素の１つである。Ｇｄ−ＤＦＰ−Ｇａｌは、このレポーター酵素を個体レベルで可視化することができるため、遺伝子治療などにおける遺伝子発現の確認に有用である。【００２９】
【化７】
2009054327.tif 000007
【００３０】
本発明のＭＲＩ用プローブを用いて検体中の酵素の活性を測定する方法は、
本発明のＭＲＩ用プローブに検体を反応させ、前記ＭＲＩ用プローブと酵素との反応の結果生じたＭＲＩ用プローブのＭＲＩ観測核種をＭＲＩにより測定し、
前記測定結果から前記酵素の活性を測定する方法である。【００３１】
前記方法において、本発明のＭＲＩ用プローブに検体を反応させる工程は、例えば、本発明のＭＲＩ用プローブを溶媒に溶解させ、そこへ検体を加えることにより行うことができる。前記溶媒は、測定目的の酵素が酵素反応を起こすことが可能な溶媒であれば限定されず、たとえば緩衝液等が挙げられる。前記の反応をさせる工程は、また、測定目的の酵素が酵素反応を起こすことが可能な温度であれば限定されず、例えば５〜４０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。【００３２】
前記ＭＲＩ用プローブと酵素との反応の結果生じたＭＲＩ用プローブのＭＲＩ観測核種をＭＲＩにより測定する工程は、例えば、縦緩和時間Ｔ１を反転回復法等で測定し、横緩和時間Ｔ２をスピンエコー法、ＣＰＭＧ（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）法等で、１９Ｆ ＭＲＩをＲＡＲＥ(Rapid Acquisition with Refocused Echoes)、スピンエコー法、グラジエントエコー法等で、Ｘｅ ＭＲＩをスピンエコー法等で、Ｈｅ ＭＲＩをスピンエコー法等で、測定することにより行うことができる。【００３３】
前記測定結果から前記酵素の活性を測定する工程は、例えば、前記１９Ｆ ＭＲＩ、Ｘｅ ＭＲＩ、Ｈｅ ＭＲＩ等の画像を解析することにより、行うことができる。本発明のＭＲＩ用プローブは、酵素反応により作用を受ける部位を有し、その部位に酵素が作用すると、ＭＲＩ観測核種キャリアーの構造が変化し、その結果、ＭＲＩ用観測核種と常磁性金属との距離を変化させる。そのため、前記検体中に本発明のＭＲＩ用プローブが作用を受ける酵素に対応する酵素が含まれている場合、前記検体のＭＲＩ測定結果を解析することにより、前記酵素の活性を測定することができるのである。【００３４】
本発明のＭＲＩ用プローブの製造方法は、
リンカーと、前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位と、前記常磁性金属と結合する構造部位とを含むＭＲＩ観測核種キャリアーと、常磁性金属とを反応させ、常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブを得る方法である。【００３５】
前記製造方法において、ＭＲＩ観測核種キャリアーは、リンカーと、前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位と、前記常磁性金属と結合する構造部位とを別途または順次合成して、製造することができる。前記ＭＲＩ観測核種キャリアーと常磁性金属との反応工程は、例えば前記ＭＲＩ観測核種キャリアーと常磁性金属を含む塩とを溶媒中、室温で攪拌することで行うことができる。前記常磁性金属を含む塩としては、例えば、ＧｄＣｌ３等が挙げられる。【００３６】
本文において以下の略語を使用する。
ＡｃＯＨ：酢酸
Ａｌａ：アラニン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
ＣＨＡＰＳ：３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチルアミノ］プロパンスルホネート
ＤＩＢＡＬ−Ｈ：ジイソブチルアルミニウムヒドリド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＥＤＴ：エタンジチオール
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ：：Ｎ−Ｆｍｏｃ−β−アラニン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ−ＯＨ：Ｎ−Ｆｍｏｃ−アスパラギン酸ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）：Ｎ−Ｆｍｏｃ−グルタミン酸ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ：Ｎ−Ｆｍｏｃ−バリン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＮＭＭ：Ｎ-メチルモルホリン
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスプロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳＢｒ：トリメチルシリルブロマイド
Ｖａｌ：バリン
ＷＳＣＤ・ＨＣｌ：１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣｌ【００３７】
［実施例］
［材料および機器］
使用した化合物は、東京化成、和光純薬、アルドリッチ、ノバビオケムから市販品を入手した。これらはさらなる精製を行わずに用いた。カスパーゼ−３は、シグマより市販品を入手した。β−ガラクトシダーゼはシグマより市販品を入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーはＢＷ−３００（Fuji Silysia Chemical Ltd.）を用いて行った。【００３８】
ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシランを内部標準として用いて、１Ｈ ＮＭＲは２７０ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲは６４．５ＭＨｚでＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＸ２７０機器を用いて記録した。または、１Ｈ ＮＭＲは４００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲは１００．４ＭＨｚで、トリフルオロ酢酸ナトリウムを内部標準として用いて１９Ｆ ＮＭＲは３７６ＭＨｚでＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００機器を用いて測定した。質量分析は、ＣＩおよびＦＡＢについてはＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＤＸ３０３を用いて測定し、ＥＳＩについてはウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥを用いて測定した。【００３９】
縦緩和時間（Ｔ１）および横緩和時間（Ｔ２）は、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００機器を用いて１９Ｆ ＮＭＲについて３７６ＭＨｚで測定した。ＭＲＩ画像は、標準的口径（５４ｍｍ）、１１．７Ｔマグネットおよび、インサートコイル（直径８ｍｍ）付きＭｉｃｒｏ−５イメージング・プローブ・ヘッドとを備えたブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）Ａｖａｎｃｅ ＤＲＸ−５００スぺクトロメーターで測定した。イメージ収集および処理は、ＰａｒａＶｉｓｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Bruker Biospin）を用いて行った。
【実施例１】
【００４０】
Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの製造
標題化合物は、以下のスキーム１を参照して、以下の工程により製造した。【００４１】
【化８】
2009054327.tif 000008
【００４２】
スキーム１中、(a) WSCD・HCl, HOBt, DMF, (b) TFA, (c) NaHCO3, CH3CN, (d) ブロモ酢酸ベンジルエステル, NaHCO3, CH3CN, (e) H2/Pd, MeOH, (f) Fmoc ペプチド合成: 2, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-β-Ala-OH, ［5］, (g) GdCl3・6H2O, HEPES 緩衝液(pH 7.4)。【００４３】
（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ［ｐ−（トリフルオロメトキシ）ベンジルアミド］−ＯｔＢｕ［１］の製造
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ−ＯＨ（８６５ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）およびｐ−（トリフルオロメトキシ）ベンジルアミン（４０４ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）の無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（４８２ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）およびＨＯＢｔ（３４０ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を０℃で加えた。この混合物を、０℃で２時間アルゴン雰囲気下で攪拌した。前記混合物から溶媒を真空下で除去した後、得られた粗生成物を酢酸エチルに溶解させ、その酢酸エチル溶液を４％ＮａＨＣＯ３水溶液、１０％クエン酸およびブラインで洗浄した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を除去して標題の粗化合物［１］を得た（９９３ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ，収率８１％）。【００４４】
１H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ： 1.42 (s, 9H), 2.60 (dd, J = 6.5, 18.0 Hz, 2H), 4.20 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.42-4.54 (m, 4H), 5.94 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.81 (bs, 2H), 7.14 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.26-7.31 (m, 4H), 7.39 (dd, J = 6.6, 14.2 Hz, 2H); 7.56 (d, J = 7.7 Hz, 2H); 7.62 (dd, J = 4.1, 7.7 Hz, 2H); 
MS (ESI+) m/z : 584 ([M+H]+)。【００４５】
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ［ｐ−（トリフルオロメトキシ）ベンジルアミド］−ＯＨ［２］の製造
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ［ｐ−（トリフルオロメトキシ）ベンジルアミド］−ＯｔＢｕ［１］（９６０ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（２０ｍＬ）に溶解させ、その溶液を室温で２時間攪拌した。その混合物から溶媒を真空下で除去し、粗生成物を得た。その粗生成物を酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合物（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝８：１）から再結晶して、標題化合物［２］を得た（５４７ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ，収率６３％）。【００４６】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：2.71 (dd, J = 5.4, 16.4 Hz, 2H), 4.19-4.42 (m, 8H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.29-7.36 (m, 4H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.71 (dd, J = 3.4, 7.6 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 2H);
MS (ESI+) m/z: 528 ([M+H]+)。【００４７】
（ｃ）１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン臭化水素酸塩［３・ＨＢｒ］の製造
アセトニトリル（２０ｍＬ）中１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（５００ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）およびＮａＨＣＯ３（１．２６ｇ，１５．０ｍｍｏｌ，５．０ｅｑ．）の混合物を０℃でアルゴン雰囲気下に攪拌し、そこヘブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．３０ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）を３０分にわたって滴下して加えた。反応混合物を室温に戻し、アルゴン雰囲気下にさらに２４時間攪拌した。反応混合物中の無機固形物をろ過して除去し、ろ液を減圧下に蒸発させて固形残渣を得た。その残渣をトルエンから再結晶して、標題の化合物［３・ＨＢｒ］を白色結晶として得た（７９４ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ，収率５１％）。【００４８】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz) δ： 1.46 (s, 27H), 2.89-2.92 (m, 12H), 3.10 (s, 4H), 3.29 (s, 2H), 3.38 (s, 4H), 10.04 (brs, 1H); 13C NMR (CDCl3, 100.4 MHz) δ： 28.2, 47.5, 49.2, 51.4, 58.2, 81.6, 169.5, 170.4; 
HRMS (FAB+) m/z: 515.3804 (M+について計算値: 515.3803);
元素分析: C, 52.42; H, 8.13; N, 9.26 (C26H51N4O6について計算: C, 52.43; H, 8.63; N, 9.41)。【００４９】
（ｄ）１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１０−（ベンジルオキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［４］の製造
１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン臭化水素酸塩［３・ＨＢｒ］（５００ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）に，ＮａＨＣＯ３（３５３ｍｇ，４．２０ｍｍｏｌ，５．０ｅｑ．）およびブロモ酢酸ベンジルエステル（０．１７ｍＬ，１．ｌｍｍｏｌ，１．３ｅｑ．）を添加した。その混合物を１００℃で３０分間還流加熱した。反応混合物を冷却し、その後、ろ過した。ろ液を減圧下に蒸発させ、黄色ガム状物質を得た。その物質をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、その溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、標題化合物［４］を得た（５１５ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ，収率９１％）。【００５０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ： 1.46 (s, 27H), 2.41-3.50 (br, 24H), 5.13 (s, 2H), 7.30-7.36 (m, 5H) ;
MS (ESI+) m/z: 663.4 ([M+H]+)。【００５１】
（ｅ）１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１０−酢酸［５］の製造
１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１０−（ベンジルオキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［４］（５１５ｍｇ，０．７７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を添加した。その混合物をＨ２雰囲気下に室温で５時間激しく攪拌した。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下に蒸発させて標題化合物［５］を得た。【００５２】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ：1.47 (s, 27H), 2.21-3.56 (br, 24H);
13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ：28.0, 55.5, 55.9, 56.1, 77.3, 82.2, 82.5, 172.1, 174.2; 
HRMS (ESI+) m/z: 573.3859 (M+について計算値: 573.3863)。【００５３】
（ｆ）ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの製造
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（６４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）、ＰｙＢＯＰ（９８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ,３．０ｅｑ．），ＨＯＢｔ（２５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）およびＤＩＰＥＡ（５０μｌ，０．２７ｍｍｏｌ，４．５ｅｑ．）をＤＭＦに溶解した。その混合物を、前処理した樹脂（２−クロロトリチルクロライド樹脂）を含むペプチド反応容器に入れた。反応混合物を５時間回転させた。反応の間、少量の樹脂をサンプリングし、ニンヒドリン試験をそのサンプルに行った。樹脂上のＦｍｏｃを２０％ピペリジン（ＤＭＦ中）により脱離させ、その後、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（６４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（８０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（７８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（５９ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）および１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１０−酢酸［５］（１０８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）を順次縮合させた。縮合が完了した後、その樹脂をＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨで洗浄し、樹脂から縮合化合物をＥＤＴ（１５０μＬ）、ｍ−クレゾール（１５０μＬ）およびＴＦＡ（４．５ｍＬ）の混合物で０℃で切断した。その後、チオアニソール（７２０μＬ）およびＴＭＳＢｒ（７８０μＬ）を添加し、その混合物を室温で２時間攪拌した。その混合物から溶媒を除去した後、得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した。その残渣を水に溶解させ、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。そのペプチドを逆相ＨＰＬＣ（溶離液は、０．１％蟻酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルの勾配が２０分間で０．１％蟻酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１０：０〜１：９。カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス製）、検出ＵＶ波長：２１５ｎｍ）で精製して、標題のＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂ（保持時間：１５分、４５ｍｇ、収率６４％）を得た。【００５４】
19F NMR (D2Oを含む反応緩衝液, 376 MHz) δ：17.7 (s, 3F);
HRMS (ESI+) m/z: 1107.4478 (M+について計算値: 1107.4452)。【００５５】
（ｇ）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの製造
粗ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）溶液に、ＧｄＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（１ｅｑ．）を添加した後、その混合物を室温で１０時間攪拌した。生成物を逆相ＨＰＬＣ（溶離液は、０．１％蟻酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルの勾配が０〜２０分間で０．１％蟻酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１０：０〜１：９、２０〜２５分間で０．１％蟻酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１：９。カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス製）、検出ＵＶ波長：２１５ｎｍ）で精製して、標題のＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂ（保持時間：２３分、１８ｍｇ、収率４０％）を得た。【００５６】
19F NMR (D2Oを含む反応緩衝液, 376 MHz) δ： 17.7 (s); 
HRMS (ESI-) m/z: 1260.3311 (M-について計算値: 1260.3313)。
【実施例２】
【００５７】
Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの製造
標題化合物は、以下のスキーム２を参照して、以下の工程により製造した。【００５８】
【化９】
2009054327.tif 000009
【００５９】
スキーム２中、（ａ）ＰＯＣｌ３，ピリジン，（ｂ）ＴＦＡ，（ｃ）Ｆｍｏｃペプチド合成：ＡＦＣ−Ａｓｐ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−α−Ａｌａ−ＯＨ，トリス−ｔＢｕ−ＤＯＴＡ，脱保護，（ｄ）ＧｄＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）。【００６０】
（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＡＦＣ  ［１１］の製造
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）を文献（Bissell, E. R.; Larson, D. K.; Croudace, M. C. J. Chem. Eng. Data. 1981, 26, 348-350.）に従い製造した。ＡＦＣ（５０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（９０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン中の溶液に、塩化ホスホリル（２０μＬ，０．２２ｍｍｏｌ）を−１５℃で添加し、その溶液を−１５℃で１５分間攪拌した。その混合物を水（１０ｍＬ）へ注ぎ、ＡｃＯＥｔで抽出した。ＡｃＯＥｔ層を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、１０％クエン酸水溶液およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ＡｃＯＥｔ層を真空下で濃縮し、得られた残渣を１％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題の化合物を得た（１２３ｍｇ、収率９０％）。【００６１】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.42 (s, 9H), 2.64-2.84 (m, 2H), 4.20 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.38-4.41 (m, 2H), 4.64 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 7.26-7.37, (m, 4H), 7.50 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.59-7.70 (m, 4H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 2.0 Hz, 1H,) ; 
MS (ESI+) m/z: 623 [M+H]+。【００６２】
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−ＡＦＣ  ［１２］の製造
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＡＦＣ［１１］（１２３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１０ ｍＬ）に溶解させ、その後、その混合物を２時間室温で攪拌した。その混合物から真空下に溶媒を除去して、標題の化合物を得た（定量的）。【００６３】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 2.71-2.95 (m, 2H), 4.20-4.24 (m, 1H), 4.34-4.44 (m, 2H), 4.66 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 7.26-7.38, (m, 4H), 7.53 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.60-7.72 (m, 4H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 
19F NMR (376 MHz, CD3OD) δA 10.25 (s, 3F); 
MS (ESI+) m/z: 567 [M+H]+。【００６４】
（ｃ）ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−ＡＦＣ［１２］（１１３ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）とＤＩＥＡ（４５μＬ，０．２６ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ．）を無水ＤＭＦ中に溶解させた。その混合物を予備処理された２−クロロトリチルクロライド樹脂とともにペプチド反応容器に入れた。反応混合物を２時間振とうさせ、無水酢酸とＤＩＥＡの混合物（無水酢酸／ＤＩＥＡ＝１／２（ｖ／ｖ））で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１７６ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）およびＰｙＢｏｐ（２７０ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ３．０ｅｑ．）、ＨＯＢｔ（７０ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）およびＮＭＭ（８５μＬ，０．７８ｍｍｏｌ，４．５ｅｑ．）をＤＭＦに溶解させ、その混合物を反応容器に加えた。反応混合物を３時間振とうさせた。反応の間、採った少量の樹脂についてニンヒドリンテストを行って反応の進行を確認した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２２１ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（２１３ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（１６１ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）およびトリス−ｔＢｕ−ＤＯＴＡＳ２  （２９７ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）をＦｍｏｃ固相合成方法に従い、順次、結合させた。なお、トリス−ｔＢｕ−ＤＯＴＡＳ２は、文献（Mizukami, S.; Takikawa, R.; Sugihara, F.; Hori, Y.; Tochio, H.; Walchili, M.; Shirakawa, M.; Kikuchi, K. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 794-795.）に従い、予め製造した。全ての結合の後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とＭｅＯＨで洗浄し、前記樹脂をカクテル（ＥＤＴ（１５０μＬ）、ｍ−クレゾール（１５０μＬ）およびＴＦＡ（４．５ｍＬ）の混合物）中で０℃に攪拌した（生成物の樹脂から切り出し）。その後、そのカクテルにチオアニソール（７２０μＬ）およびＴＭＳＢｒ（７８０μＬ）を添加し、さらに２時間室温で攪拌した。カクテル混合物から溶媒を除去し、得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した。その残渣を水に溶解させ、真空下に凍結乾燥させて標題の粗生成物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（溶離液は、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルの勾配が２０分間で０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１０：０〜１：９．カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス製）、検出ＵＶ波長：２１５ｎｍ）で精製して、純粋な標題のＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（保持時間：19分、58ｍｇ、収率：29％）を得た。【００６５】
19F NMR (376 MHz, D2O) δ10.84 (s, 3F); HRMS (ESI+) m/z: 1145.4113 ([M+H]+について計算値: 1145.4245)。【００６６】
（ｄ）Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの合成
粗ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣを１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、そこへＧｄＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（１．２ｅｑ．）を添加した。その後、その混合物を室温で１２時間攪拌した。得られた生成物を逆相ＨＰＬＣ（溶離液は、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルの勾配が２０分間で０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１０：０〜１：９．カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス製）、検出ＵＶ波長：２１５ｎｍ）で精製して、純粋な標題のＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（保持時間：23分、31ｍｇ、収率：47％）を得た。【００６７】
19F NMR (376 MHz, D2O) δ 10.94 (s, 3F); HRMS (ESI+) m/z: 1300.3224 ([M+H]+について計算値: 1300.3246)。
【実施例３】
【００６８】
Ｇｄ−ＤＭＴＰ−ｇａｌの製造
標題化合物は、以下のスキーム３を参照して、以下の工程により製造した。【００６９】
【化１０】
2009054327.tif 000010
【００７０】
スキーム３中、（ａ）１）ＮａＨ触媒量，２）ＡｃＯＨ，ピペリジン，（ｂ）ＣｕＢｒ２，ＮａＢｒ，ＣＨ３ＣＮ（ｃ）ＤＩＢＡＬＨ，ＴＨＦ（ｄ）１−ブロモ−α−ガラクトース四酢酸塩は、文献に従い製造した，Ｃｓ２ＣＯ３，ＤＭＦ（ｅ）４−ニトロフェニルクロロホルメート，ピリジン，ＣＨ２Ｃｌ２（ｆ）１）１−（２−アミノエチル）−４，７，１０−（トリスカルボキシメチル）−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン）ＴＦＡ塩，トリエチルアミン，ＤＭＦ，２）ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ（ｇ）ＧｄＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ＝７．４。【００７１】
（ａ）エチル４−ヒドロキシ−２−（トリフルオロメチル）ベンゾエート［２１］の製造
４−カルボエトキシ−３−トリフルオロメチルシクロヘキサ−２−エノン（２００ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）のアセトニトリル（４０ｍＬ）溶液に、ＣｕＩＩＢｒ（３８０ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ，２ｅｑ．）およびＮａＢｒ（８６．７ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）を添加した。なお、４−カルボエトキシ−３−トリフルオロメチルシクロヘキサ−２−エノンは、文献（Jean-Pierre Begue,* Daniele Bonnet-Delpon and Anukwadey Dogbeavou Synthetic Communications 1992, 22, 573-579）に従って製造した。その混合物を６０℃で１時間攪拌した。溶媒を真空下に除去し、得られた残渣を酢酸エチルで希釈して、その希釈液を２Ｎ塩酸およびブラインで洗浄した。酢酸エチル溶液をＭｇＳＯ４で乾燥して、真空下に溶媒を除去して粗生成物を得た。その粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して標題化合物を得た（１６７ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ．収率８４％）。【００７２】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 4.36 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 5.47(s, 1H), 7.01 (dd, J = 2.4, 8.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H) ; 
MS (ESI+) m/z: 235 ([M+H]+)。【００７３】
（ｂ）４−ヒドロキシメチル−３−（トリフルオロメチル）フェノール［２２］の製造
化合物［２１］（１２４ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）の無水ＴＨＦ中溶液を０℃まで冷却した。ＤＩＢＡＬ−Ｈ（３．２５ｍｌ，３．２５ｍｍｏｌ，６ｅｑ．トルエン中）をそのＴＨＦ溶液にシリンジを用いて添加し、得られた混合物を０℃で３０分攪拌した。その後、その混合物を室温まで温め、次いで５時間攪拌した。その混合物を１０％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１ｍｌ）に注ぎいれ、ジエチルエーテルで抽出した。その有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下に溶媒を除去して標題化合物（９８  ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ，９７％）を得た。【００７４】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.66 (s, 2H), 6.99 (dd, J = 2.8, 8.4 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.8 Hz), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1H) ; 
MS (ESI-) m/z: 191 ([M-H]-)。【００７５】
（ｃ）化合物［２３］の製造
文献（Jean-Lowis, M., Jean-Yves, W., Alan, L., Mehrnaz, K., Andre, A. P., Jean-Pierre, R. Carbohydrate Res. 1997, 297, 175-180）に従い製造した１−ブロモ−α−ガラクトース四酢酸塩を（１．１ｇ，５．７ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）ＤＭＦ（80mL）に溶解させ、炭酸セシウム（７．４１ｇ，２２．８ｍｍｏｌ，４ｅｑ．）をその溶液に０℃で添加した。ＤＭＦ中の１−ブロモ−α−ガラクトース四酢酸塩（１０．６ｇ，２５．９ｍｍｏｌ，４．５ｅｑ．）をＡｒ雰囲気下で滴下して、その溶液を室温で３時間攪拌した。反応混合物を氷浴中で冷やした２Ｎ塩酸中に注いだ。その混合物をＡｃＯＥｔで抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。有機層をろ過して真空下に溶媒を除去した。得られた残渣をＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標題化合物を得た（１．７ｇ，３．２ｍｍｏｌ，５７％）。【００７６】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.02 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 4.08-4.11 (m, 1H), 4.18-4.20 (m, 2H), 4.82-4.83 (m, 2H), 5.06-5.14 (m, 2H), 5.46-5.52 (m, 2H), 7.19 (dd, J = 2.4, 8.4 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.4 Hz, 1H) ; 
MS (ESI+) m/z: 545 [M+Na]+。【００７７】
（ｄ）化合物［２４］の製造
化合物［２３］（５１３ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）と１滴の無水ピリジンとを無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、その混合物をアルゴン雰囲気下に置いた。その後、４−ニトロフェニルクロロホルメート（５９０ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ，３ｅｑ．）を１度に化合物［２３］の混合物中へ注ぎ込んだ。室温で一晩放置した後、その混合物に水を添加した。分離した有機層を注意深く１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３溶液、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、溶媒を蒸発させた。得られた残渣を２％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標題化合物（４８０ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ，７１％）を得た。【００７８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.02 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.2 (s, 3H), 4.09-4.13 (m, 1H), 4.18-4.19 (m, 2H), 5.11-5.15 (m, 2H)5.43 (s, 2H), 5.47-5.48 (m, 1H), 5.51-5.53 (m, 1H), 7.21 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H), 7.36-7.37 (m, 2H) 7.39 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.4 Hz, 1H) 8.27 (dd, J = 1.2, 9.0 Hz, 2H) ; 
MS (FAB+) m/z: 726 [M+K]+。【００７９】
（ｅ）ＤＦＰ−ｇａｌの製造
化合物［２４］（７６２ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）および１−（２−アミノエチル）−４，７，１０−（トリスカルボキシメチル）−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＴＦＡ塩（８５０ｍｇ，２．１８ｍｍｏｌ，２ｅｑ．）および無水トリエチルアミン（３ｍｌ，２１．８ｍｍｏｌ，２０ｅｑ．）を無水ＤＭＦに溶解させ、アルゴン下に置いた。なお、１−（２−アミノエチル）−４，７，１０−（トリスカルボキシメチル）−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＴＦＡ塩は文献（Joseph A. Duimstra,1 Frank J. Femia,2 and Thomas J. Meade* J. Am. Chem. Soc., 2005, 127 , 12847 -12855）に従い製造した。その混合物を、５０℃で一晩攪拌した。その後、その混合物から真空下に溶媒を除去した。得られた残渣をメタノールに溶解させ、そこへナトリウムメトキシド（２．９ｇ，５４．５ｍｍｏｌ，５０ｅｑ．）を添加した。その後、その溶液を室温で５時間攪拌した。その溶液から真空下に溶媒を除去した後、得られた残渣を逆相ＨＰＬＣ（溶離液は、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルの勾配が２０分間で０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１０：０〜１：９．カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス製）、検出ＵＶ波長：２１５ｎｍ）で精製して、純粋な標題のＤＦＰ−ｇａｌ（保持時間：14分、136ｍｇ、収率：１６％）を得た。【００８０】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ2.87-3.90 (m, 36H), 5.19 (s, 2H), 7.36 (dd, J =  2.6, 8.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J =  2.6 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 9.58, 28.5, 60.8, 62.3, 70.1, 72.1, 74.7, 77.1, 103.0, 115.4, 115.5, 121.0, 131.4, 134.6, 158.0.  
19F NMR (376 MHz, CD3OD ，TFANa) δ14.81 (s, 3F) ; 
HRMS (ESI+) m/z: 770.2769 ([M+H]+について計算値：770.3072)。【００８１】
（ｆ）Gd- DFP-galの製造
粗DFP-galを１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、そこへＧｄＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（１．２ｅｑ．）を添加した。その後、その混合物を室温で１２時間攪拌した。得られた生成物を逆相ＨＰＬＣ（溶離液は、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルの勾配が２０分間で０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ：アセトニトリル＝１０：０〜１：９．カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス製）、検出ＵＶ波長：２１５ｎｍ）で精製して、純粋な標題のGd-DFP-gal（保持時間：16分、38ｍｇ、収率：２３％）を得た。
HRMS (ESI+) m/z: 925.1270 ([M+H]+について計算値：925.2078)。【００８２】
［酵素反応１］
１ｍＭのＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂを、反応緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、５％Ｄ２Ｏ）に溶解した。サンプル（７５０μＬ）をカスパーゼ−３（４．７６ｍＵ）と共に、または無しで、３７℃で２時間インキュベートした。反応の進行は、１９Ｆ  ＮＭＲおよびＨＰＬＣで観察した。前記１９Ｆ  ＮＭＲの結果は図１（ａ）および（ｂ）に示す。図１（ａ）はＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＴｆｂとＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１９Ｆ ＮＭＲの比較を示したものであり、図１（ｂ）は酵素反応の１９Ｆ ＮＭＲを時系列に示したものである。図２は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂと酵素反応をモニターしたＨＰＬＣである。（ａ）は酵素添加前、（ｂ）は酵素添加後のものである。【００８３】
図１（ａ）に示すように、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１９Ｆ ＮＭＲでは、ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１９ＮＭＲで観察された１９Ｆのピークが消失していた。従って、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１９Ｆ核種は、Ｇｄ３＋による強力な常磁性相互作用を受けていることが確認できた。さらに、図１（ｂ）および図２に示すように、時間と共に１９Ｆ ＮＭＲのピークが回復した。従って、本発明のＭＲＩ用プローブは、酵素反応によりＭＲＩ観測核種と常磁性金属との距離が変化したことが確認できた。【００８４】
［酵素反応２］
２５０μＭのＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣを反応緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１０％  グリセロール、５％  Ｄ２Ｏ）に溶解した。サンプル（５００μＬ）をカスパーゼ−３（１．４４ｍＵ）と共に３７℃で３時間インンキュベートした。反応の進行は、ＨＰＬＣで観察した。図３（ａ）はＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣとＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの１９Ｆ ＮＭＲの比較を示したものであり、図３（ｂ）は酵素反応の１９Ｆ ＮＭＲを時系列に示したものである。図４は、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと酵素反応をモニターしたＨＰＬＣである。（ａ）は酵素添加前、（ｂ）は酵素添加後のものである。酵素反応はまた、蛍光測定によっても確認した（プローブ濃度：１０μＭ、カスパーゼ−３：  ０．７２ｍＵ，時間：６０分）。【００８５】
図３（ａ）に示すように、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの１９Ｆ ＮＭＲでは、ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの１９ＮＭＲで観察された１９Ｆのピークが消失していた。従って、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの１９Ｆ核種は、Ｇｄ３＋による強力な常磁性相互作用を受けていることが確認できた。さらに、図３（ｂ）および図４に示すように、時間と共に１９Ｆ ＮＭＲのピークが回復した。従って、本発明のＭＲＩ用プローブは、酵素反応によりＭＲＩ観測核種と常磁性金属との距離が変化したことが確認できた。【００８６】
［酵素反応３］
５００μＭのＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌを反応緩衝液（１０ｍＭ  トリス緩衝塩（ｐＨ  ７．３）および１０ｍＭの塩化マグネシウムおよび５％Ｄ２Ｏ）に溶解した。サンプル（５００μＬ）をβガラクトシダーゼ（５．０３Ｕ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。反応の進行は１９ＦＮＭＲとＨＰＬＣで観察した。図５（ａ）はＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌとＤＦＰ−ｇａｌの１９Ｆ ＮＭＲの比較を示したものであり、図５（ｂ）は酵素反応の１９Ｆ ＮＭＲを時系列に示したものである。図６はＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌとの酵素反応をモニターしたＨＰＬＣである。（ａ）は酵素添加前、（ｂ）は酵素添加後のものである。【００８７】
図５（ａ）に示すように、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌの１９Ｆ ＮＭＲでは、ＤＦＰ−ｇａｌの１９ＮＭＲで観察された１９Ｆのピークが消失していた。従って、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌの１９Ｆ核種は、Ｇｄ３＋による強力な常磁性相互作用を受けていることが確認できた。さらに、図５（ｂ）および図６に示すように、時間と共に１９Ｆ ＮＭＲのピークが回復した。従って、本発明のＭＲＩ用プローブは、酵素反応によりＭＲＩ観測核種と常磁性金属との距離が変化したことが確認できた。【００８８】
［１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間測定］
反応緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ，１０％グリセロール、５％  Ｄ２Ｏ）中、１ｍＭの濃度でＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＴｆｂおよびＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂについて、２５０μＭの濃度でＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣおよびＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣについて、または、反応緩衝液（１０ｍＭ  トリス緩衝塩（ｐＨ７．３）および１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび５％Ｄ２Ｏ）中、５００μＭの濃度でＤＦＰ−ｇａｌおよびＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌについて、それぞれサンプルを調製した。前記サンプルについて、縦緩和時間（Ｔ１）を反転回復法で、横緩和時間（Ｔ２）をスピンエコー法により測定した。その結果を表１に示す。【００８９】
【表１】
2009054327.tif 000011
【００９０】
表１に示すように、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂ、Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣおよびＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌは、酵素反応前はＴ１およびＴ２の両方が短縮しており、酵素反応が進行するとＴ１およびＴ２の両方が回復することが確認できた。【００９１】
［Ｇｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂの１９Ｆ  ＭＲＩ］
１ｍＭのＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂを反応緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＣＨＡＰＳ，１０％グリセロール）中に溶解させてサンプルを調製した。カスパーゼ−３（０．９５  Ｕ／ｍＬ）と共に、または無しで、前記サンプルと、ネガティブ参照（反応緩衝液のみ）をガラスキャピラリー（内径は約１ｍｍ；  Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒｇｅｒａｔｅ）に満たし、それらを内径８ｍｍのＮＭＲチューブに挿入した。【００９２】
ＲＡＲＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｆｏｃｕｓｅｄ  Ｅｃｈｏｅｓ）法を用いて、１Ｈおよび１９Ｆイメージングを行った。１９Ｆイメージングについては、１６×１６ｍｍの撮像視野（ＦＯＶ）、１５ｍｍの実効スライス厚および３２のＲＡＲＥ因子で、マトリックス・サイズは３２×３２（６４×６４までゼロフィリング）で行った。掃引幅は５９５２３．８Ｈｚであり、繰り返し時間（ＴＲ）および実効エコー時間（実効ＴＥ）は、それぞれ２５０ｍｓおよび２８．４ｍｓであった。ガウス型パルスを、励起および再収束について用いた。積算数（ＮＡ）は２０４８であった。酵素反応の進行と共に得られた１９Ｆ ＮＭＲを図７に示す。図７中、１Ｈ ＮＭＲを標準として挙げる。【００９３】
図７に示すように、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂは、酵素が存在しない場合は、１９Ｆ ＮＭＲシグナルが観測されなかった（図７中２段目）。一方、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＯＴＡ−ＤＥＶＤ−Ｔｆｂは、酵素が存在する場合、時間と共に１９Ｆ ＮＭＲシグナルが回復した。従って、本発明のＭＲＩ用プローブは、酵素反応によりＭＲＩ観測核種と常磁性金属との距離が変化し、その酵素反応を可視化できることが確認できた。【００９４】
［Ｇｄ−ＤＦＰ−ｇａｌの１９Ｆ  ＭＲＩ］
１ｍＭのＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌを反応緩衝液（１０ｍＭ  トリス緩衝塩（ｐＨ７．３）および１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび５％Ｄ２Ｏ）中に溶解させてサンプルを調製した。β−ガラクトシダーゼ（１．２Ｕ／ｍＬ）と共に、または無しで、前記サンプルと、ネガティブ参照（反応緩衝液のみ）をガラスキャピラリー（内径は約１ｍｍ；Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒｇｅｒａｔｅ）に満たし、それらを内径８ｍｍのＮＭＲチューブに挿入した。【００９５】
ＲＡＲＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｆｏｃｕｓｅｄ  Ｅｃｈｏｅｓ）法を用いて、１Ｈおよび１９Ｆイメージングを行った。１９Ｆイメージングについては、１６×１６ｍｍの撮像視野（ＦＯＶ）、１５ｍｍの実効スライス厚および３２のＲＡＲＥ因子で、マトリックス・サイズは３２×３２（６４×６４までゼロフィリング）で行った。掃引幅は５９５２３．８Ｈｚであり、繰り返し時間（ＴＲ）および実効エコー時間（実効ＴＥ）は、それぞれ２５０ｍｓおよび２８．４ｍｓであった。ガウス型パルスを、励起および再収束について用いた。積算数（ＮＡ）は２０４８であった。酵素反応の進行と共に得られた１９Ｆ ＮＭＲを図８に示す。図８中、１Ｈ ＮＭＲを標準として挙げる。【００９６】
図８に示すように、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌは、酵素が存在しない場合は、１９Ｆ ＮＭＲシグナルが観測されなかった（図８中２段目）。一方、本発明のＭＲＩ用プローブであるＧｄ−ＤＦＰ−ｇａｌは、酵素が存在する場合、時間と共に１９Ｆ ＮＭＲシグナルが回復した。従って、本発明のＭＲＩ用プローブは、酵素反応によりＭＲＩ観測核種と常磁性金属との距離が変化し、その酵素反応を可視化できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明のプローブは、医学研究試薬、生物学研究試薬、臨床診断薬等にも適用できる。
【図１】
2009054327.tif 000013
【図２】
2009054327.tif 000014
【図３】
2009054327.tif 000015
【図４】
2009054327.tif 000016
【図５】
2009054327.tif 000017
【図６】
2009054327.tif 000018
【図７】
2009054327.tif 000019
【図８】
2009054327.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月29日(2009.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブであり、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーと前記常磁性金属とが連結され、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーが、酵素反応により作用を受ける部位を有し、
前記部位に酵素が作用することにより前記ＭＲＩ観測核種キャリアーの構造を変化させ、その結果、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることができ、
前記ＭＲＩ観測核種が、Ｆであり、
前記ＭＲＩ観測核種キャリアーは、リンカーと、前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位と、前記常磁性金属と結合する構造部位とを含むＭＲＩ観測核種キャリアーであり、
前記リンカーは、ペプチドまたは、−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−基（式中、ｎは１〜１８の整数、ｍは１〜１８の整数、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−である）であり、
前記ペプチドは、２〜１２個のアミノ酸からなるペプチドであり、
前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位は、フッ素原子自身、フッ素原子を含む低級アルキル基、またはフッ素原子を含む低級アルコキシ基であり、
前記常磁性金属と結合する構造部位は、ポルフィリン、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、下記式で表わされるものであり、
【化１】
2009054327.tif 000021
前記酵素が、加水分解酵素であり、
前記ＭＲＩ観測核種と、前記常磁性金属とが、常磁性相互作用をしており、
前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との距離を変化させることにより、前記ＭＲＩ観測核種と前記常磁性金属との間の前記常磁性相互作用が変化するＭＲＩ用プローブ。
【請求項２】
前記常磁性金属が、Ｇｄ３＋、Ｍｎ２＋、Ｄｙ３＋、Ｆｅ３＋、Ｃｅ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｐｍ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｔｍ３＋、およびＹｂ３＋からなる群から選択される１以上である請求項１または９に記載のＭＲＩ用プローブ。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
下記式で表わされる構造を有する請求項１に記載のＭＲＩ用プローブ。
【化２】
2009054327.tif 000022
【請求項７】
請求項１、６または９のいずれかに記載のＭＲＩ用プローブを用いて検体中の酵素の活性を測定する方法であって、
請求項１、６または９のいずれかに記載のＭＲＩ用プローブに検体を反応させ、前記ＭＲＩ用プローブと酵素との反応の結果生じたＭＲＩ用プローブのＭＲＩ観測核種をＭＲＩにより測定し、
前記測定結果から前記酵素の活性を測定する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＭＲＩ用プローブを製造する方法であって、
リンカーと、前記ＭＲＩ観測核種を含む構造部位と、前記常磁性金属と結合する構造部位とを含むＭＲＩ観測核種キャリアーと、常磁性金属とを反応させ、常磁性金属と、ＭＲＩ観測核種を含むＭＲＩ観測核種キャリアーとを含むＭＲＩ用プローブを得る方法。
【請求項９】
前記リンカーは、以下の式で表わされるものであり、
【化３】
2009054327.tif 000023
前記加水分解酵素は、カスパーゼ−３である請求項１に記載のＭＲＩ用プローブ。
【国際調査報告】
2009054327.tif 000024
2009054327.tif 000025
2009054327.tif 000026
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