(57)【要約】  本発明の方法は、カリウムイオン存在下においてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出することを目的とする。  本発明の方法は、カリウムイオン存在下において、チオフラビンＴが、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させたときに強い蛍光を発する現象を利用し、標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかどうかを判定する。本発明の方法においては、カリウムイオンおよび標的ＤＮＡを含有する第１試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成される条件に維持した後、チオフラビンＴを添加して第１蛍光強度値を測定する。標的ＤＮＡを含有する第２試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが不安定化される条件に維持し、チオフラビンＴを添加して第２蛍光強度値を測定し、これらの値の差が０以上であれば、標的ＤＮＡはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると判定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘをカリウムイオン存在下で形成しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する方法：
カリウムイオン、チオフラビンＴ、および前記標的ＤＮＡを含有する第１試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下で維持する工程、
ラムダ１の波長における第１蛍光強度値Ａを測定する工程、ここで
前記第１蛍光強度値Ａは、前記第１試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、
ラムダ１は、４６５ナノメートル以上５０５ナノメートル以下であり、
チオフラビンＴおよび前記標的ＤＮＡを含有する第２試料溶液を、前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件下に維持する工程、
前記ラムダ１の波長における第２蛍光強度値Ｂを測定する工程、ここで
前記第２蛍光強度値Ｂは、前記第２試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、および
以下の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していると判定される工程：
前記第１蛍光強度値Ａ−前記第２蛍光強度値Ｂ＞０。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１蛍光強度値−前記第２蛍光強度値≦０の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していないと判定される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件は、リチウム存在下の条件である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記ラムダ１が４８５ナノメートルである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡの高次構造の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのテロメアＤＮＡは、５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）と５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’ （配列番号：２、配列番号１の相補鎖）からなる二本鎖ＤＮＡが繰り返された配列と、その最末端に５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）のみが繰り返された一本鎖ＤＮＡを含む。この５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）が繰り返された配列は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる四重鎖ＤＮＡ構造を形成できる。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、４つのグアニンがＧ−ｑｕａｒｔｅｔと呼ばれる構造を形成し、それがπ−πスタッキング相互作用により積み重なった構造である（図１）。このＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは細胞の癌化や寿命に関連していると考えられているため、近年精力的に研究されている。【０００３】
また最近行われたコンピュータによるゲノムワイド解析は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられる配列が、ゲノムＤＮＡ中にテロメアＤＮＡ以外にも多数存在することを示した。それらの多くは、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｍｙｃ、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含む癌原因遺伝子のプロモーター領域に存在する。したがって、これらＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられる配列についても研究が行われている。以上の事実は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが細胞の活動において重要な役割を果たしている可能性を示唆している。【０００４】
以上の背景のもと、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられるＤＮＡが、本当にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを簡便に解析する技術が必要とされている。特に、細胞内のカリウムイオン濃度はおよそ１００−１５０ｍＭであるため、このカリウムイオン濃度条件下でＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの形成を解析できる技術が必要である。そのために、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡと比べて、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応した際に格段に強い蛍光を発する化合物（以下、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブと呼ぶ）の探索が行われてきた。言い換えれば、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブは、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡと反応してもほとんど蛍光を発しないが、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応すると強い蛍光を発する性質を持っていなければいけない。【０００５】
近年、最も精力的に研究されているＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブの一つは、ベンゾチアゾール誘導体である。ベンゾチアゾール誘導体の研究が盛んな理由は、ベンゾチアゾール誘導体は水溶性が高く、蛍光強度変化が非常に大きいためである。たとえば、非特許文献１ではＣｙａｎ４０（化１）およびＣｙａｎ２（化２）を用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出技術が報告されている。この報告では、カリウムイオンが存在しない条件下で、Ｃｙａｎ２とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを反応させた場合、二本鎖ＤＮＡ反応させた場合と比べて、優位に強い蛍光が発せられることが示されている。しかし、１００ｍＭカリウムイオン存在下では、Ｃｙａｎ２とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを反応させてもほとんど蛍光が検出されないことも示されている。したがって、Ｃｙａｎ２は、カリウムイオン存在下におけるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出には使えない。また非特許文献２では、チアゾールオレンジ（化３）（以下、ＴＯと呼ぶ）を用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出技術が報告されている。この報告の中で、ＴＯは、１００ｍＭカリウムイオン存在下で、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させると強い蛍光を発することが示されている。しかし、同じ条件下でＴＯを二本鎖ＤＮＡと反応させた場合、ＴＯは、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させた場合よりも、より強い蛍光を発することも示されている。したがって、１００ｍＭカリウムイオン存在下で、ＴＯを用いてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出することはできない。【０００６】
【化１】
2013021536.tif 000002
【０００７】
【化２】
2013021536.tif 000003
【０００８】
【化３】
2013021536.tif 000004
【０００９】
以上のように、近年、ベンゾチアゾール誘導体をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブとして用い、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する技術の開発行われている。しかし、細胞内条件と同様にカリウムイオンが存在する条件下で特異的にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できる技術は知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J.Flucresc.,2011,21(1),223-230
【非特許文献２】J.Am.Chem.Soc.,2006,128(36),11890-11893.
【非特許文献３】J.Am.Chem.Soc.,2006,128(30),9963-9970.
【非特許文献４】Nucleic Acids Res.,2006,34(19),5715-5719.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
カリウムイオン存在下で、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられるＤＮＡが、本当にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを簡便に解析する技術は非常に有用である。そのため、ベンゾチアゾール誘導体を用いたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出技術の研究が精力的になされているが、カリウムイオン存在下で特異的にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できる技術は開発されていなかった。そこで本発明者は鋭意検討した結果、カリウムイオン存在下において、チオフラビンＴ（化４）が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させたときに強い蛍光を発することを見出した。この蛍光強度は、チオフラビンＴを二本鎖ＤＮＡや一本鎖ＤＮＡと反応させた場合と比べ、優位に大きい。したがって、本発明によりカリウムイオン存在下においてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できることを見出した。【００１２】
【化４】
2013021536.tif 000005
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決する本発明は、
標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘをカリウムイオン存在下で形成しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する方法である：
カリウムイオン、チオフラビンＴ、および前記標的ＤＮＡを含有する第１試料溶液をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下で維持する工程、
ラムダ１の波長における第１蛍光強度値Ａを測定する工程、ここで
前記第１蛍光強度値Ａは、前記第１試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、
ラムダ１は、４６５ナノメートル以上５０５ナノメートル以下であり、
チオフラビンＴおよび前記標的ＤＮＡを含有する第２試料溶液を、前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件下に維持する工程、
前記ラムダ１の波長における第２蛍光強度値Ｂを測定する工程、ここで
前記第２蛍光強度値Ｂは、前記第２試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、および
以下の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していると判定される工程：
前記第１蛍光強度値Ａ−前記第２蛍光強度値Ｂ＞０。【００１４】
本発明の方法では、前記第１蛍光強度値−前記第２蛍光強度値≦０の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していないと判定されることが好ましい。【００１５】
本発明の方法では、前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件は、リチウム存在下の条件であることが好ましい。【００１６】
本発明の方法では、前記ラムダ１が４８５ナノメートルであることが好ましい。【００１７】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、カリウムイオン存在下において、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的かつ定量的に検出する方法、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるＤＮＡを特異的かつ定量的に検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を説明するための図を示す。
【図２】図２は、本実施の形態における、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法を説明するための図を示す。
【図３】図３は、比較例１における、０ｍＭ−ＫＣｌ存在下での蛍光スペクトル結果と、各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図４】図４は、比較例１における、５０ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図５】図５は、比較例１における、１００ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図６】図６は、比較例１における、１５０ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図７】図７は、比較例１における、５００ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図８】図８は、実施例１における、０ｍＭ−ＫＣｌ存在下での蛍光スペクトル結果と、各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図９】図９は、実施例１における、５０ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図１０】図１０は、実施例１における、１００ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図１１】図１１は、実施例１における、１５０ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図１２】図１２は、実施例１における、５００ｍＭ−ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図１３】図１３は、実施例２における、蛍光スペクトル結果と、Ｇ−ＤＮＡ２の濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図１４】図１４は、実施例３における、蛍光スペクトル結果と、Ｇ−ＤＮＡ３の濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。
【図１５】図１５は、実施例４における、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃの存在状態を示す図を示す。
【図１６】図１６は、実施例４における、４８５ｎｍにおける蛍光強度値の差を示すグラフを示す。
【図１７】図１７は、実施例５における、４８５ｎｍにおける蛍光強度値の差を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
本実施の形態では、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法について、図２を用いて説明する。
【００２２】
本実施の形態では、以下の工程が実施される。
（工程１）カリウムイオンと標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液１を調製する。カリウムイオンと標的ＤＮＡとチオフラビンＴを混合する順番は問わない。
（工程２）工程１の後、この試料溶液１をＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置く。
（工程３）工程２の後、この試料溶液１中のチオフラビンＴ由来の蛍光強度値（Ａ）を測定する。
（工程４）標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液２を、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件下に置く。
（工程５）工程４の後、試料溶液２中のチオフラビンＴ由来の蛍光強度値（Ｂ）を測定する。蛍光強度値ＡとＢは、同じ波長の蛍光強度値である。
（工程６）Ａ−Ｂ＞０の場合、標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下でＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成すると判断する。
【００２３】
上記手順では、工程１において、試料溶液１中にチオフラビンＴが加えられる。しかし、必ずしも工程１において、試料溶液１中にチオフラビンＴが加えられる必要はない。工程３までに、試料溶液１中にチオフラビンＴが加えられればよい。また、上記手順では、工程４において、試料溶液２中にチオフラビンＴが加えられる。しかし、必ずしも工程４において、試料溶液２中にチオフラビンＴが加えられる必要はない。工程５までに、試料溶液２中にチオフラビンＴが加えられればよい。
【００２４】
本発明者は、チオフラビンＴをＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させた場合、４８５ｎｍ付近に極大蛍光波長を有する強い蛍光が観察されることを発見した。また一方で、チオフラビンＴを一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡと反応させた場合には、蛍光はまったく観察されないか、観察されても極めて小さいことも発見した。言い換えれば、本発明者はチオフラビンＴがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的な蛍光プローブであることを発見した。したがって、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する場合と形成しない場合では、それぞれ次のとおりになる。
【００２５】
（１）カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する場合
上記工程１〜２の後に、標的ＤＮＡはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているため、上記工程３ではチオフラビンＴ由来の強い蛍光が確認される。しかし、上記工程４の後では、標的ＤＮＡの一部または全部が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを形成するため、上記工程５ではチオフラビンＴ由来の蛍光はまったく認められないか、認められたとしても、その蛍光強度値は、上記工程３で得られた値よりは明らかに小さい。したがって、上記工程６で得られる値は０より大きい。
【００２６】
（２）カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しない場合
上記工程１〜２の後においても、上記工程４の後においても、標的ＤＮＡはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していないため、上記工程３と上記工程５で測定されるチオフラビンＴ由来の蛍光強度は実質同じである。したがって、上記工程６で得られる値は実質０である。
【００２７】
上記工程４における、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件とは、例えばリチウムイオンが存在する条件である。リチウムイオン存在下では、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造は不安定化することが知られている。また他のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件は、高温条件である。高温条件下（〜１００℃）では、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造は不安定化することが知られている。上記工程４における、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件は、ここに挙げた例に限られない。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件であればよい。
【００２８】
また、上記工程３と上記工程５で用いられる励起光の波長は、チオフラビンＴの吸収帯の範囲内であればいずれの波長でもよい。しかし、チオフラビンＴの極大励起波長が４５０ｎｍ付近であるため、上記工程３と上記工程５で用いられる励起光の波長は、４５０ｎｍ付近が望ましい。
【００２９】
［実施例］
以下に記載する実施例および比較例で用いられるＤＮＡは、全て北海道システム・サイエンス株式会社より購入された。またチオフラビンＴはシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。またチアゾールオレンジは和光純薬工業（株）より購入された。また蛍光強度解析には、サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  ｆｌａｓｈを用いた。
【００３０】
（比較例１）
本比較例１では、代表的なベンゾチアゾール誘導体であるチアゾールオレンジを用いて、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと二本鎖ＤＮＡの検出を行った。本比較例で用いられたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、５’−ＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：３）のヒトテロメア配列のＤＮＡからなる（以降、この配列のＤＮＡをＧ−ＤＮＡ１と呼ぶ）。また本比較例で用いられた二本鎖ＤＮＡの配列は、５’−ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴ−３’ （配列番号：４）であった（以降、この配列のＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ１と呼ぶ）。これら二種類のＤＮＡを用いて、以下のとおり実験を行った。まず表１に示す反応溶液を調製した。
【００３１】
【表１】
2013021536.tif 000006
【００３２】
Ｘは０、５０、１００、１５０、または５００であった。また、Ｙは０、１０、または５０であった。次に、この反応溶液を９０℃で２分間保温した後、０．５℃／分の降温速度で２５℃まで降温させた。以上の工程後、Ｇ−ＤＮＡ１はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することがすでに知られている。同様にＤｕｐｌｅｘ１は分子内二本鎖構造を形成することが知られている。その後、この反応溶液について蛍光強度解析を行った。励起光波長は５０１ｎｍであった。結果を図３に示す。図３（Ａ）はＫＣｌ濃度が０ｍＭの際の蛍光スペクトル結果である。図３（Ｂ）は、この蛍光スペクトル結果をもとに、各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をグラフ化したものである。同様に、図４〜７はそれぞれ、５０、１００、１５０、および５００ｍＭ−ＫＣｌ存在下における、各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をグラフ化したものである。以上の結果より、チアゾールオレンジはＧ−ＤＮＡ１と反応させると蛍光を発するが、Ｄｕｐｌｅｘ１と反応させた場合も同程度かあるいはそれ以上に蛍光を発することが分かる。すなわち、これらの結果はチアゾールオレンジのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が全くないことを示している。したがって、標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かの解析にはチアゾールオレンジを用いることはできない。
【００３３】
（実施例１）
本実施例１では、比較例１と同様に、Ｇ−ＤＮＡ１とＤｕｐｌｅｘ１の検出を行った。ただし、ＴＯの代わりにチオフラビンＴ（濃度は１μＭ）を用いた。また、１００ｍＭ−ＫＣｌの条件下においてのみ、測定対象ＤＮＡとして、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：５）（以降、この配列からなるＤＮＡをＴ２１と呼ぶ）を用いた。Ｔ２１は一本鎖ＤＮＡとして溶液中で存在することが分かっている。また、励起光波長は５０１ｎｍではなく、４５０ｎｍであった。それ以外については、比較例１と同じ実験を行った。
【００３４】
結果を図８に示す。図８（Ａ）はＫＣｌ濃度が０ｍＭの際の蛍光スペクトル結果を示す。図８（Ｂ）はこのスペクトル結果をもとに、各ＤＮＡ濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。同様に、図９〜１２はそれぞれ、５０、１００、１５０、および５００ｍＭ−ＫＣｌ存在下における、各ＤＮＡ濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。以上の結果より、いずれの濃度のＫＣｌ存在下においても、チオフラビンＴをＧ−ＤＮＡ１と反応させると蛍光を発することが分かる。しかし、チオフラビンＴをＤｕｐｌｅｘ１やＴ２１と反応させた場合は、ほとんど蛍光を発しないことが分かる。すなわち、これらの結果はチオフラビンＴのＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が極めて高いことを示している。したがって、チオフラビンＴを用いることで、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成でるか否かを判断できることが示された。
【００３５】
（実施例２）
実施例１では、チオフラビンＴを用いて、Ｇ−ＤＮＡ１からなるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。Ｇ−ＤＮＡ１は（３＋１）型のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成することが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。本実施例２では、チオフラビンＴを用いて、異なる構造のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。本実施例２では、５’−ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ−３’（配列番号：６）の配列のＤＮＡが形成するＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを測定対象ＤＮＡとした（以降、この配列からなるＤＮＡをＧ−ＤＮＡ２と呼ぶ）。また、ＫＣｌの濃度は１００ｍＭのみであった。それ以外は、実施例１と同じ実験を行った。この実験条件では、Ｇ−ＤＮＡ２はアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。
【００３６】
結果を図１３に示す。図１３（Ａ）は蛍光スペクトル結果を示す。図１３（Ｂ）はこの結果をもとに、Ｇ−ＤＮＡ２の濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。以上の結果より、チオフラビンＴをＧ−ＤＮＡ２と反応させると蛍光を発することが分かる。したがって、チオフラビンＴを用いて、アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できることが示された。
【００３７】
（実施例３）
実施例１および２ではそれぞれ、チオフラビンＴを用いて、（３＋１）形のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとアンチパラレル型のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。そこで本実施例３ではチオフラビンＴを用いて、実施例１、２と異なる、パラレル型のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。本実施例３では、５’−ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ−３’（配列番号：７）の配列のＤＮＡが形成するＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを測定対象ＤＮＡとした（以降、この配列からなるＤＮＡをＧ−ＤＮＡ３と呼ぶ）。また、ＫＣｌの濃度は１００ｍＭのみであった。それ以外は、実施例１と同じ実験を行った。この実験条件では、Ｇ−ＤＮＡ３はパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。
【００３８】
結果を図１４に示す。図１４（Ａ）は蛍光スペクトル結果を示す。図１４（Ｂ）はこの結果をもとに、Ｇ−ＤＮＡ３の濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。以上の結果より、チオフラビンＴをＧ−ＤＮＡ３と反応させると蛍光を発することが分かる。したがって、チオフラビンＴを用いて、パラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できることが示された。
【００３９】
（実施例４）
Ｇ−ＤＮＡ２と５’−ＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣ−’（配列番号：８、Ｇ−ＤＮＡ２の相補鎖）（以降、このＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ−Ｃと呼ぶ）は、リチウムイオン存在下のようなＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件下では、互いに相補的に結合して二本鎖ＤＮＡを形成する。しかし、カリウムイオン存在下では、Ｇ−ＤＮＡ２はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成し、Ｄｕｐｌｅｘ−Ｃは一本鎖ＤＮＡの状態で存在する（図１５）。本実施例４では、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃを混合したＤＮＡ試料が、カリウムイオン存在下ではＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できることを、カリウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度と、リチウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度の差によって判別できるか否かについて検討した。
【００４０】
実験手順は以下のとおりであった。まず表２に示す反応溶液１を調製した。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
同様に、反応溶液２を調製した。反応溶液２の組成は、反応溶液１のＫＣｌをＬｉＣｌに変えた以外は、反応溶液１と同じ組成である。これらの反応溶液を９０℃で２分間保温した後、０．５℃／分の降温速度で２５℃まで降温させた。以上の工程後、反応溶液１中のＧ−ＤＮＡ１の大半はＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成し、Ｄｕｐｌｅｘ−Ｃは一本鎖ＤＮＡ状態で存在することがすでに知られている。一方、反応溶液２中では、リチウムイオンが存在しているため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造は不安定化し、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃの大半が互いに相補的に結合し、二本鎖ＤＮＡを形成することが知られている。その後、これらの反応溶液について４８５ｎｍにおける蛍光強度解析を行った。励起光波長は４５０ｎｍであった。
【００４３】
また同様に比較実験として、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃの代わりに、５’−ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ−３’（配列番号：９）（以降、このＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ−ＡＧＡと呼ぶ）と５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’（配列番号：１０、配列番号９の相補鎖）（以降、このＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ−ＴＣＴと呼ぶ）を用いた以外は、全く同じ実験を行った。Ｄｕｐｌｅｘ−ＡＧＡとＤｕｐｌｅｘ−ＴＣＴは互いに相補的である。またいずれもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できない。したがって、リチウムイオン存在下でもカリウムイオン存在下でも、これらＤＮＡは互いに相補的に結合して、二本鎖ＤＮＡを形成する。
【００４４】
結果を図１６に示す。図１６中の右側のバーは、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃを用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ３０であり、０より大きかった。一方、左側のバーは、Ｄｕｐｌｅｘ−ＡＧＡとＤｕｐｌｅｘ−ＴＣＴを用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ０であった。以上の結果は、チオフラビンＴを用いて、標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下でＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを判断できることを示している。
【００４５】
（実施例５）
Ｇ−ＤＮＡ１は、カリウムイオン存在下では、そのほとんどがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。一方、Ｇ−ＤＮＡ１は、リチウムイオン存在下では、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化されるため、その一部は一本鎖ＤＮＡ状態で存在する。本実施例５では、Ｇ−ＤＮＡ１を含む試料溶液中において、チオフラビンＴを用いて、カリウムイオン存在下でＧ−ＤＮＡ２から形成されるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できるか否かについて検討した。本実施例５では、Ｇ−ＤＮＡ１が、カリウムイオン存在下ではＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できることを、カリウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度と、リチウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度の差によって判別できるか否かについて検討した。
【００４６】
実験手順は、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃの代わりにＧ−ＤＮＡ１を用いた以外は実施例４と全く同じであった。また、比較実験としては、Ｇ−ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ−Ｃの代わりにＴ２１を用いた実験を行った。Ｔ２１は、リチウムイオン存在下でもカリウムイオン存在下でも、一本鎖ＤＮＡの状態で存在する。
【００４７】
結果を図１７に示す。図１７中の右側のバーは、Ｇ−ＤＮＡ１を用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ６であり、０より大きかった。一方、左側のバーは、Ｔ２１を用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ０であった。以上の結果は、チオフラビンＴを用いて、標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下でＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを判断できることを示している。
【００４８】
以上まとめると、本発明者は、従来のベンゾチアゾール誘導体では達成できなかったＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出を、チオフラビンＴを用いれば達成できることを世界で初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００４９】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出方法は、バイオテクノロジー分野における分析方法として有用である。
【符号の説明】
【００５１】
１  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ
２  Ｇカルテット面
３  金属イオン
４  Ｇカルテット面の化学構造
５  容器
６  カリウムイオンと標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液１
７  標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液２
８  二本鎖ＤＮＡ中のＤｕｐｌｅｘ−Ｃ
９  二本鎖ＤＮＡ中のＧ−ＤＮＡ２
１０  一本鎖ＤＮＡ状態のＤｕｐｌｅｘ−Ｃ
１２  Ｇ−ＤＮＡ２により形成されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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