(57)【要約】  特定の等温増幅方法に適したＤＮＡポリメラーゼならびにそれを用いた等温増幅方法を提供する。下記(a)または(b)のタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記(X)に示す第一のプライマーを用いて核酸試料中の標的核酸配列の増幅反応を行う。前記ＤＮＡポリメラーゼの使用により、前記プライマーを用いる増幅反応を、従来よりも短時間で行うことが可能となる。(a)配列番号23で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、(b)配列番号25で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質(X)標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac’)を3’末端部分に含み且つ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B’)を前記配列(Ac’)の5’側に含むプライマー
2009054510.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中の標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いて、前記標的核酸配列の増幅反応を行うことを特徴とする等温増幅方法。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、２５℃〜７５℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、相補鎖置換複製酵素活性を有する、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、逆転写酵素活性を有する、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項８】
前記増幅反応において、第二のプライマーを併用し、
前記第一のプライマーと第二のプライマーとが、形態が異なる非対称型の一対のプライマーである、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項９】
前記第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含むものである、請求の範囲８記載の等温増幅方法。
【請求項１０】
前記増幅反応において、さらに、第三のプライマーを併用し、
前記第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、且つ、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーであり、
前記第三のプライマーは、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーの増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的核酸配列にアニーリングすることができ、これにより前記増幅産物中の標的核酸配列に新たな相補鎖合成起点が提供されるプライマーである、請求の範囲８記載の等温増幅方法。
【請求項１１】
前記増幅反応において、さらに、第二のプライマーを併用し、
前記第一のプライマーと第二のプライマーとが、形態が同じである対称型の一対のプライマーである、請求の範囲１記載の等温増幅方法。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、ＬＡＭＰ法に使用するプライマーセットである、請求の範囲１１記載の等温増幅方法。
【請求項１３】
請求の範囲１記載の等温増幅方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼであって、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、２５℃〜７５℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、相補鎖置換複製酵素活性を有するポリメラーゼである、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼである、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
請求の範囲１記載の等温増幅方法に使用するための等温増幅用キットであって、請求の範囲１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする等温増幅用キット。
【請求項２１】
さらに、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを含む、請求の範囲２０記載の等温増幅用キット。
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【請求項２２】
さらに、第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが、形態が異なる非対称型の一対のプライマーである、請求の範囲２１記載の等温増幅用キット。
【請求項２３】
さらに、第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが、形態が同じである対称型の一対のプライマーである、請求の範囲２１記載の等温増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等温増幅方法およびそれに用いるＤＮＡポリメラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、ライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つであり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法をはじめとして、種々の技術に必須の酵素である。このようなＤＮＡポリメラーゼは、数多くの種類が販売され、それぞれのポリメラーゼは、例えば、反応条件、酵素活性について特徴を持っている。最もよく知られている大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩは、鋳型ＤＮＡとプライマーとから、鋳型と相補的な配列を合成する５’→３’ポリメラーゼ活性と共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。これら３つの酵素活性は、各々異なる構造ドメインと関連することが知られている。すなわち、Ｎ末端側の５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン、中央部の３’→５’エキソヌクレアーゼドメインおよびＣ末端側のポリメラーゼドメインである（例えば、非特許文献１参照）。前記ＤＮＡポリメラーゼＩをズブチリシンで処理して得られる７５ｋＤの大断片（ラージフラグメント）は、クレノウフラグメントとも呼ばれ、前記３つの活性のうち５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。このため、クレノウフラグメントは、ジデオキシ法シークエンス反応や、５’突出末端の平滑化反応等に有用であり、現在では、ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端側小断片を含まない組換えタンパク質として発現、精製されて、市販されている。【０００３】
ＤＮＡの増幅技術としては、一般的にＰＣＲ法が利用されているが、複雑な温度制御が必要であること、これらの複雑な温度制御を行うためのサーマルサイクラーが必要であること、反応時間が数時間かかること等の問題点がある。そこで、ＰＣＲ法に代わるＤＮＡの増幅技術として、ＬＡＭＰ(Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)法（例えば、非特許文献２参照）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献１参照）、三谷らの方法（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献３参照）等が開発されている。これらの反応は、等温での増幅反応が可能であることから、等温増幅法と呼ばれており、ＰＣＲのような複雑な温度制御や、それを実行するサーマルサイクラーが不要である。他方、等温での増幅反応のためには、相補鎖置換複製活性を持ったＤＮＡポリメラーゼ（例えば、特許文献２、特許文献３参照）が必須である。この相補鎖置換複製活性を持ったＤＮＡポリメラーゼは、現在、市場で入手できる種類は少なく、至適温度等の反応条件が限られており、あるいは、反応時間が長いという点等が指摘されている。このため、これらのＤＮＡ増幅方法を用いる検査・診断薬などの開発にも制限となっている。
【特許文献１】特開平１０−３１３９００号公報
【特許文献２】特許第２９７８００１号公報
【特許文献３】特開平０９−２２４６８１号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００４／０４００１９号パンフレット
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００１／０３０９９３号パンフレット
【非特許文献１】Kornberg,  A.,  Baker  TA.  DNA  Replication,  W.H.  Freeman  and  Company,  New  York,  1992.
【非特許文献２】Notomi,  T.  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  2000,  Vol.  28,  No.  12,  e63
【非特許文献３】Mitani,  Y.  et  al.,  Nature  Methods,  2007,  Vol.  4,  No.  3,  257-262
【発明の開示】
【０００４】
現在、等温増幅法に用いられているＤＮＡポリメラーゼは、比較的低温で作用するため、前記増幅反応において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリングの特異性が低い。このため、増幅反応の特異性が低下して副反応物が生じることや、比較的長い目的配列の増幅が難しい等の問題点が指摘されている。また、同じＤＮＡポリメラーゼであっても、適用する等温増幅法の種類によって、例えば、増幅効率が異なるため、それぞれの等温増幅法に適したＤＮＡポリメラーゼが求められている。
【０００５】
そこで、本発明は、特定の等温増幅方法に適したＤＮＡポリメラーゼならびにそれを用いた等温増幅方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明の等温増幅方法は、核酸試料中の標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いて、前記標的核酸配列を増幅することを特徴とする。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【０００７】
本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の等温増幅方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼであって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする。
【０００８】
本発明の等温増幅キットは、本発明の等温増幅方法に使用するための等温増幅用キットであって、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明者らは、ＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製活性を有する熱安定性のアリシクロバチルス・アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「Ａａｃポリメラーゼ」という）が、等温増幅法の中でも後述する特定の方法に適していることを見出し、本発明を完成した。本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼによれば、等温増幅法に使用されている従来のＤＮＡポリメラーゼと比較して、後述する特定の等温増幅法の増幅効率を向上できるため、結果的に、従来よりも短時間で核酸増幅を行うことが可能となる。核酸増幅に要する時間を短縮化できれば、例えば、核酸増幅を利用する一塩基多型（ＳＮＰ）等の解析をより迅速に行うことができ、また、大量の検体であっても、より効率的に解析することが可能である。したがって、本発明は、核酸増幅を利用する核酸解析や臨床検査等の分野に極めて有用である。なお、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼが、特定の等温増幅法に適していることは、本発明者らがはじめて見出したことである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定に用いた標準曲線を示すグラフである。
【図２】本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、６０〜６８℃の温度における相補鎖置換複製酵素活性を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、６８〜７４℃の温度における相補鎖置換複製酵素活性を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図５】本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図６】本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法における、第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を示す模式図である。
【図８】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法における、第二のプライマーの一例を示す模式図である。
【図９】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法の作用機序の一例を示す模式図である。
【図１０】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法の作用機序の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ＞
本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、前述のように、本発明の等温増幅法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼであり、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする。なお、本発明のＤＮＡポリメラーゼを適用する本発明の等温増幅法については、後述する。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質の有するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質【００１２】
本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属の微生物から単離することができ、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(A．acidocaldarius)から、さらに好ましくは、A．acidocaldarius  JCM5260株から単離することができる。本菌株（ＪＣＭ５２６０株）は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より分譲可能である(http://www.jcm.riken.jp/JCM/Ordering_J.shtml)。本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、以下、「本発明のＤＮＡポリメラーゼ」、「本発明のＤＮＡポリメラーゼＩ」、「本発明のＡａｃポリメラーゼ」または「本発明のタンパク質」という場合もある。【００１３】
前記（ａ）の配列番号２３で表されるＤＮＡポリメラーゼは、例えば、A．acidocaldarius  JCM5260株から完全長ＤＮＡポリメラーゼとして単離できる。前記（ｂ）の配列番号２５で表されるＤＮＡポリメラーゼは、前記（ａ）の配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端１個目から３３４個目までのアミノ酸残基が欠失したタンパク質である。このように、配列番号２３のアミノ酸配列において、１〜３３４番目のアミノ酸からなるＮ末端領域を欠失したタンパク質であっても、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有している。また、前記（ｃ）のタンパク質は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１個〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質である。このように前記Ｎ末端領域において、任意のアミノ酸残基が欠失したタンパク質であっても、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有している。欠失するアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１個〜３３４個の範囲である。また、前記Ｎ末端領域において、アミノ酸残基は、連続して欠失してもよいし、不連続で欠失してもよい。【００１４】
また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、前記（ｄ）に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限り、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸残基数の５〜１０％程度をいい、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。【００１５】
また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、下記（ｅ）に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限りにおいて、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上のタンパク質であってもよい。前記相同性は、好ましくは、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９７％以上、９８％以上である。
（ｅ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載のタンパク質の有するアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質【００１６】
タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Altschul，S.F．et al.,  J．Mol．Biol.,  1990,  Vol．215，No.3， 403-410）。【００１７】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性として、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製酵素活性を有し、例えば、さらに、逆転写酵素活性を有する。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、さらに、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。本発明のＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有すれば、例えば、基質を取り込む際のエラーをより減少することが可能である。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、２５〜７５℃のいずれかの温度で活性を示すことが好ましく、より好ましくは３７〜７２℃のいずれかの温度、さらに好ましくは５０〜７０℃のいずれかの温度、特に好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度である。本発明のＤＮＡポリメラーゼの至適温度は、例えば、公知の相補鎖置換複製酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの至適温度（例えば、２０〜３７℃）より高温度である。具体的には、例えば、２５〜７５℃のいずれかの温度で活性を有することが好ましく、より好ましくは、３７〜７２℃のいずれかの温度、さらに好ましくは、５０℃〜７０℃のいずれかの温度、特に好ましくは、５５〜６５℃のいずれかの温度である。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、相補鎖置換複製酵素活性を有する従来のＤＮＡポリメラーゼよりも高温度の反応条件で用いることができる。このため、後述するＳＭＡＰ法やＬＡＭＰ法等を含む本発明における特定の等温増幅法において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのより厳密なアニーリング条件下で使用することが可能である。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性を有する場合、例えば、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成することができ、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法にも利用できる。【００１８】
さらに、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、前述のように、Ｎ末端側アミノ酸残基を欠失させたＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼを含む。欠失させるＮ末端側のアミノ酸残基数は、前述のように、例えば、得られるＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖置換複製酵素活性を有していればよく、特に限定されない。具体例としては、前記Ｎ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントに対応する活性を有するものが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、前記（ｂ）または前記（ｃ）に示すように、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜３３４個の任意の個数の連続したアミノ酸残基が欠失したタンパク質があげられる。Ｎ末端から連続的に欠失するアミノ酸の残基数が相対的に多い場合に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する可能性が相対的に高いと考えられる。また、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端側から、５’→３’エキソヌクレアーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼの順でそれぞれのドメインが配置されている。したがって、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失させる場合は、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さなくなるまで、Ｎ末端側より任意の個数のアミノ酸残基を欠失させることで、前記活性を欠失することができる。なお、配列番号２３のアミノ酸配列においては、６２〜３０６番目の領域が５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン、３９２〜５３６番目の領域が３’→５’エキソヌクレアーゼドメインと考えられるが、本発明は、これに限定されるものではない。本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼとして、大腸菌のクレノウフラグメントに対応する、ＤＮＡポリメラーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性とを有し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の具体例を配列番号２５に示す。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する場合、例えば、遺伝子増幅を行う際に、得られた増幅産物の分解を防止できるという利点を有する。【００１９】
さらに、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失していてもよい。種々のＤＮＡポリメラーゼＩについて、各アミノ酸配列を比較すると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素には、酵素タンパク質の中央部に３つの共通配列モチーフが存在することが知られている。これらのモチーフを除去した酵素を作製することができる。例えば、市販の好熱性細菌由来のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している（Aliotta,  J.M.  et  al.,  Genetic  Analysis:  Biomolecular  Engineering,  Vol.  12,  pp.  185-195,  1996）。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、等温増幅反応に用いた際、プライマーの３’末端を分解することがない。このため、プライマー濃度の低下が十分に防止されることによって、核酸増幅速度がより速くなるという利点がある。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、点突然変異の検出への使用に適している。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼによれば、例えば、プライマーが３’側から分解されることを十分に防止できる。このため、プライマーは、鋳型ＤＮＡの変異箇所を十分に識別でき、例えば、誤って伸長反応が進むことが抑制され、伸長反応の停止による点突然変異の検出がより正確に行うことができる。前述のように、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端側から、５’→３’エキソヌクレアーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼの順でそれぞれのドメインが配置されている。したがって、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失させる場合は、例えば、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、且つ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示さなくなるまで、任意の個数のアミノ酸残基を欠失させることで、前記活性を欠失することができる。また、配列番号２３のアミノ酸配列においては、３９２〜５３６番目の領域が３’→５’エキソヌクレアーゼドメインと考えられるため、例えば、この領域を欠失させてもよい。【００２０】
一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の発現には、例えば、活性中心のアミノ酸側鎖のカルボキシル基に配位する２つの金属イオンが重要であることが示唆されている。そこで、例えば、側鎖にカルボキシル基を持つアミノ酸を活性中心に導入することにより、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼについて、前記酵素活性を増強することも可能である(Park,  Y.  et al.,  Mol  Cells.  Vol.  7,  No.3,  pp.419-424,  1997)。【００２１】
ＤＮＡポリメラーゼの活性測定方法は、制限されず、当業者に周知の種々の方法により測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性は、例えば、文献（Seville  M.  et  al.  Biotechniques  Vol.21,  pp.664-668  (1996)）等に記載されている蛍光定量的な測定方法を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち相補鎖置換複製酵素活性は、例えば、前述の非特許文献１（Kornberg,  A.  and  Baker  TA.  DNA  Replication,  W.H.  Freeman  and  Company,  New  York,  1992.）等に記載されている測定方法を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち逆転写酵素活性は、例えば、市販キット（例えば、EnzChek（商標）  Reverse  Transcriptase  Assay  Kit  (E-22064)  Molecular  Probes  (Invitrogen社製)）を使用し、そのプロトコールに従って測定できる。【００２２】
＜等温増幅法＞
本発明の等温増幅方法は、核酸試料中の標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなる本発明のＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いて、前記標的核酸配列を増幅することを特徴とする。
（Ｘ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー【００２３】
本発明は、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーを使用する等温増幅方法であって、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを使用することが特徴である。したがって、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーと本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼとを使用する以外は、その他の構成や工程、条件等は制限されない。また、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いた等温増幅反応によると、例えば、電気泳動解析時にラダー状の増幅産物が得られることから、本発明のＤＮＡポリメラーゼを適用する等温増幅反応は、例えば、ラダー状の増幅産物を生成する等温増幅反応ということもできる。【００２４】
等温増幅法は、一般に、等温で核酸増幅反応を行う方法である。増幅反応の条件は、特に制限されず、当業者であれば適宜決定できる。反応温度は、例えば、プライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、または、それ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。反応温度の具体例としては、例えば、約２０℃〜約７５℃であり、好ましくは、約３７℃〜約７２℃、より好ましくは、約５０〜７０℃であり、さらに好ましくは約５５〜６５℃である。【００２５】
また、増幅反応の際には、例えば、特異性を向上できることから、さらに、ミスマッチ結合タンパク質を共存させることが好ましい。前記ミスマッチ結合タンパク質（「ミスマッチ認識タンパク質」ともいう）としては、例えば、二重鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のタンパク質が使用できる。また、前記ミスマッチ結合タンパク質は、例えば、二重鎖核酸におけるミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。前記ミスマッチ結合タンパク質としては、例えば、ＭｕｔＳタンパク質（例えば、特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（例えば、特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Green  Fluorescence  Protein）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）、Ｔａｑ  ＭｕｔＳ、これらの類似体等、多くのものが知られている（Radman,M．and  Wagner，R.，Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);   Radman,M．and  Wagner，R.，Sci.Amer.,  1988,pp40-46;  Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989)；  Lahue,R.S.  et  al.,Science  245:160-164(1988);  Jiricny,J.et al,.Nucl.Acids  Res.16:7843-7853(1988);  Su,S.S.et  al.,J.Biol.Chem.263;6829-6835(1988);  Lahue,R.S.et  al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);  Dohet,C.et  al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987);  Jones,M.et al.,Gentics 115:605-610(1987)；  Salmonella typhimuriumのMutS（Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);  HaberL.T. et al.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);  Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985)）；およびPriebe S.D.et al.,J.Bacterilo.170:190-196(1988)等）。本発明においては、例えば、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、酵母由来ミスマッチ結合質が好ましい。【００２６】
また、前記ミスマッチ結合タンパク質は、例えば、ミスマッチを含まない二重鎖核酸への結合を防ぐため、活性化剤により活性化されていることが好ましい。前記活性剤は、特に限定されないが、例えば、ＡＴＰ(アデノシン５’−三リン酸)、ＡＤＰ(アデノシン５’−二リン酸)、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５’−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５’−[β,γ−イミド]三リン酸)等があげられ、この他に、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つであってもよい。活性化は、例えば、前記ミスマッチ結合タンパク質と前記活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。【００２７】
前記ミスマッチ結合タンパク質を使用する場合、例えば、前記ミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合を防ぐため、さらに、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を併用することが好ましい。前記ＳＳＢとしては、特に制限されず、従来公知のタンパク質が使用できる。ＳＳＢの具体例としては、例えば、大腸菌、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、Ｔ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、この他に、他の種に由来するこれらのタンパク質があげられる。この場合、前記ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼなどがあげられ、好ましくは、ＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、または、これらの２種以上の混合物であり、より好ましくは、ＭｕｔＳである。【００２８】
前記（Ｘ）に示す第一のプライマーを使用する等温増幅方法としては、例えば、国際公開第００／２８０８２号パンフレット、Notomi,T  et．al.，Nucleic  Acids  Research（2000），Vol.28，e63．等に開示されているＬＡＭＰ法（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）法、日本国特許第３８６７９２６号公報、特許第３８９７８０５号公報、特許第３９４２６２７号公報およびNATURE  METHODS（Vol.4，No.3，March  2007，pp.257-262）、Mitani  Y.,  Lezhava  A.,  Kawai  Y.,  Kikuchi  T.,  Oguchi-Katayama  A.,  Kogo  Y.,  Itoh  M.,  Miyagi  T.  et  al.  2007.  “Rapid  SNP  diagnostics using asymmetric  isothermal  amplification  and  a  new  mismatch-suppression  technology.”  Nat.  Methods  4(3):  257-262.等に開示されている方法（以下、「SMart  Amplification  Process法」という）等があげられる。【００２９】
本発明の等温増幅方法では、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーに加えて、さらに、第二のプライマーを併用してもよい。前記第一のプライマーと第二のプライマーとは一対のプライマーであることが好ましい。前記一対のプライマーは、例えば、第一のプライマーの形態と第二のプライマーの形態とが異なる非対称型と、第一のプライマーの形態と第二のプライマーの形態とが同じである対称型とがあげられる。以下、前記非対称型の一対のプライマーを含むプライマーセットを、非対称型プライマーセット、前記対称型の一対のプライマーを含むプライマーセットを、対称型プライマーセットともいう。前記非対称型プライマーセットは、例えば、前記SMart  Amplification  Process法に適しており、前記対称型プライマーセットは、例えば、前記ＬＡＭＰ法に適している。【００３０】
本発明の等温増幅方法について、前述のような、非対称型プライマーセットを用いる方法と、対称型プライマーセットを用いる方法とを例にあげて説明する。なお、本発明は、これらに制限されない。【００３１】
SMart  Amplification  Process法
等温増幅方法の中でもSMart  Amplification  Process法は、例えば、優れた特異性で標的核酸配列を増幅できることから、遺伝増幅によって、例えば、遺伝子中における変異、特に一塩基変異の有無や、塩基の欠失または挿入の有無等を判断することが可能である。【００３２】
前記非対称型プライマーセットは、前述のように、第一のプライマーの形態と第二のプライマーの形態とが異なる非対称型の一対のプライマーを有するプライマーセットであり、中でも、前記SMart  Amplification  Process法に適用することが好ましい。このプライマーセットを、以下、「SMart  Amplification  Process用プライマーセット」ともいう。【００３３】
第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を図７に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。第一のプライマーは、配列（Ac'）を含み、さらにその５’側に配列（B'）を含む。配列（Ac'）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B'）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、第一のプライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）との間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図７(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図７(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図７(c)）。【００３４】
上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。【００３５】
本発明の好ましい態様における第一のプライマーの設計基準は、例えば、次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac’）の塩基数Ｘと、標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）とに挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B'）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。【００３６】
以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、例えば、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、例えば、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。【００３７】
また、プライマーを構成する配列（Ac’）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、例えば、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上であり、好ましくは０．００以上、より好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、例えば、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、例えば、１５以上であり、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上であり、また、例えば、１００以下であり、好ましくは７５以下、より好ましくは５０以下とされる。【００３８】
前記第一のプライマーは、例えば、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものであることが好ましい。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac'）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。【００３９】
本発明によるプライマーセットに含まれる前記第二のプライマーは、上述のように、例えば、前記標的核酸配列の相補配列（第一のプライマーがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含み、且つ、相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含むプライマーである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図８に示すようなものであるが、図８に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二のプライマーを構成する配列（Cc'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（D-Dc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Cc'）と折返し配列（D-Dc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。【００４０】
これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる等温増幅反応について考えられる作用機序の一例を、図９および図１０を用いて説明する。なお、図９および図１０では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図９(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図９(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図９(c)）、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図９(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図９(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図９(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図９(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図９(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図９(h)）、そこからの伸長反応により（図１０(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図１０(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図１０(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図１０(l)および(m)）。また、図１０(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図１０(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図１０(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。【００４１】
また、前記SMart  Amplification  Process用プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマー以外に、第三のプライマーを含んでもよい。前記第三のプライマーは、例えば、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーである。本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。【００４２】
第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的核酸配列が増幅された場合には、前述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができるプライマーであることが好ましい。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、等温増幅反応がより迅速に行われるようになる。【００４３】
前記第三のプライマーは、制限されず、１種類でもよいし、例えば、等温増幅反応の迅速性および特異性を向上させるため、２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これらの第三のプライマーは、例えば、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。【００４４】
前記第三のプライマーは、例えば、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる等温増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とする。従って、前記第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、例えば、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。【００４５】
前記第三のプライマーとしては、例えば、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものをあげることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、例えば、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。【００４６】
前記SMart  Amplification  Process用プライマーセットにおいては、例えば、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方、または、前記両方のプライマーが、例えば、蛍光色素等で標識化された標識核酸であってもよいし、前記第三のプライマーが前記標識核酸であってもよい。また、第一のプライマーおよび第二のプライマーのいずれか一方もしくは両方と、第三のプライマーとが、全て前記標識核酸であってもよい。【００４７】
また、本発明の等温増幅方法を、例えば、変異検出方法に適用する場合は、前記SMart  Amplification  Process用プライマーを以下のように設計することが好ましい。すなわち、前記SMart  Amplification  Process用プライマーセットは、目的の部位に変異を有する核酸配列（以下、「変異型核酸配列」という）または前記目的の部位に変異を有さない核酸配列（以下、「野生型核酸配列」という）を、標的核酸配列とし、目的の変異を生じる部位が、配列（A）、配列（B）もしくは配列（C）に含まれるか、または、配列（A）と配列（B）との間もしくは配列（A）と配列（C）との間に配置されるようにプライマーセットを設計することが好ましい。【００４８】
前記プライマーセットとして、目的の部位に変異を有する核酸配列（変異型配列）を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いる場合、例えば、等温増幅反応後における増幅産物の存在が、変異型配列の存在を示し、増幅産物の不在または減少が、変異型配列の不在を示す。一方、目的の部位に変異を有さない核酸配列（野生型配列）を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いる場合、例えば、等温増幅反応後における増幅産物の存在が、変異型配列の不在を示し、増幅産物の不在または減少が、変異型配列の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量と比較して、減少していることを意味する。【００４９】
前記プライマーセットとしては、例えば、前記目的の部位が、前記配列（A）に含まれるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットであれば、例えば、核酸試料中に標的核酸配列（例えば、野生型配列）が含まれる場合、等温増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。一方、核酸試料中に前記標的核酸配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれている場合、等温増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングし難いため、増幅産物が得られないか、または、得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（Ac'）は、前記配列（A）に相補的な配列とすることが好ましい。【００５０】
また、前記プライマーセットとしては、例えば、前記目的部位が、前記配列（C）に含まれるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットであれば、例えば、核酸試料中に標的核酸配列（例えば、野生型配列）が含まれている場合、等温増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。一方、核酸試料中に、前記標的核酸配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれている場合、等温増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングし難いため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第二のプライマーに含まれる配列（Cc'）は、前記配列（C）に相補的な配列とすることが好ましい。【００５１】
また、前記プライマーとしては、例えば、前記目的部位が、前記配列（B）に含まれるように設計されたプライマーセットであることが好ましい。このようなプライマーセットであれば、例えば、核酸試料中に標的核酸配列（例えば、野生型配列）が含まれている場合、等温増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後、前記プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズする。このため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、前述の図７に示した作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方、核酸試料中に前記標的核酸配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれている場合、等温増幅反応における前記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、前記図７に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、第一のプライマーに含まれる配列（B'）は、前記配列（B）と同一の配列とすることが好ましい。【００５２】
また、前記プライマーセットとしては、例えば、前記目的部位が、前記配列（A）と前記配列（B）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットによれば、核酸試料中に標的核酸配列（例えば、野生型配列）が含まれている場合、等温増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行われた後、前記プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、前記図７に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方、核酸試料中に、前記標的核酸配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれている場合、第一のプライマーに含まれる配列（B'）と伸長鎖上の配列（Bc）とが適切な距離を維持していないため、等温増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となる。配列（A）と配列（B）との間に、長い配列の挿入や欠失がある場合等である。従って、この場合、前記図７に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。【００５３】
また、前記プライマーセットとしては、前記目的部位が、前記配列（A）と前記配列（C）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットによれば、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合（例えば、野生型配列）、等温増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行われた後、前記プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、前記図７、図９、図１０に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方、核酸試料中に、前記標的核酸配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれている場合、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。例えば、配列（A）と配列（C）との間における長い配列の挿入により、標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれている場合、等温増幅の速度（効率）が著しく低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により、標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、且つ、この欠失により配列（B）の一部または全部が失われている場合、第一のプライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上にハイブリダイズできないため、ステム−ループ構造の形成が不可能となるか、または困難となる。このため、前記図７、図９、図１０に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。さらに、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により、標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、且つ、この欠失による配列（B）の部分的欠失が生じない場合にも、等温増幅の速度（効率）が低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。【００５４】
ＬＡＭＰ法
前記対称型のプライマーセットは、前述のように、第一のプライマーの形態と第二のプライマーの形態とが同じである対称型の一対のプライマーを有するプライマーセットであり、中でも、前記ＬＡＭＰ法に適用することが好ましい。このプライマーセットを、以下、「ＬＡＭＰ用プライマーセット」ともいう。【００５５】
前記第一のプライマーが、例えば、アンチセンス鎖にアニーリングするよう設計される場合、前記第二のプライマーは、センス鎖にアニーリングするように設計され、前記第一のプライマーが、例えば、センス鎖にアニーリングするよう設計される場合、前記第二のプライマーは、アンチセンス鎖にアニーリングするように設計される。第一のプライマーが、例えば、アンチセンス鎖の標的核酸配列にアニーリングした場合、第二のプライマーは、前記一方のプライマーのアンチセンス鎖におけるアニーリング部位よりも５’側の領域に対応する、センス鎖の領域にアニーリングすることが好ましい。【００５６】
ＬＡＭＰ法は、例えば、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、例えば、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こる。次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応によって、第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。この時、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の構成に起因して伸長鎖の５’末端部分でステム−ループ構造が形成される。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖、もしくは、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の３’末端側についても行われる。そして、これらの反応が繰り返されることにより、標的核酸が増幅される。ＬＡＭＰ法における鋳型は、例えば、３’末端と５’末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニーリングしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型である（「ダンベル型鋳型核酸」ともいう）。ＬＡＭＰ法は、例えば、国際公開第００／２８０８２号パンフレット、国際公開第０１／０３４８３８号パンフレット等に従って行うことができる。【００５７】
＜等温増幅用キット＞
本発明の等温増幅用キットは、本発明の等温増幅方法に使用するためのキットであって、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。本発明によれば、例えば、容易且つ簡便に、前述の本発明の等温増幅方法を行うことができる。本発明の等温増幅キットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含んでいればよく、その他の構成等は制限されない。その他の構成等は、前述の等温増幅方法に応じて適宜決定できる。本発明の等温増幅キットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼの他に、例えば、プライマーやプライマーセット、使用説明書を含んでもよい。前記プライマーやプライマーセットは、前述のものがあげられる。また、本発明の等温増幅用キットは、さらに、例えば、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液；塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物；国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体；酵素安定剤等を含んでもよい。前記酵素安定剤としては、制限されないが、例えば、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類等があげられ、中でも、糖類が好ましく、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、より好ましくは、トレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物である。また、本発明の等温増幅用キットは、さらに、融解温度調整剤を含んでもよい。前記融解温度調整剤としては、例えば、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組合せ等があげられ、好ましくは、ＤＭＳＯである。また、等温増幅方法に供する核酸試料がＲＮＡを含み、これを鋳型とする場合は、例えば、さらに、逆転写酵素を含むことが好ましい。なお、本発明の等温増幅用キットにおいて、これらの試薬の割合等は、制限されず、当業者であれば適宜決定できる。【００５８】
本発明の等温増幅用キットは、さらに、前述のミスマッチ結合タンパク質を含むことが好ましく、あわせて、前記一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含むことが好ましい。【００５９】
本発明の等温増幅用キットにおいて、ＤＮＡポリメラーゼやプライマー等の各試薬は、それぞれ別個に容器に収容されてもよいし、同じ容器に収容されてもよい。また、本発明の等温増幅用キットは、例えば、本発明の等温増幅方法に使用するための、等温増幅用試薬ということもできる。【００６０】
＜等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ＞
近縁のバチルス属微生物では、一般に、ＤＮＡポリメラーゼＩをコードする遺伝子（ｐｏｌＡ遺伝子）の上流にｐｈｏＲ遺伝子が、下流にｍｕｔＭ遺伝子が保存されている。そこで、例えば、保存されている遺伝子の塩基配列を決定し、これに基づいてｐｏｌＡクローニング用プライマーを設計し、遺伝子増幅を行うことによって、例えば、アリシクロバチルス属のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｐｏｌＡ）を単離することができる。以下に具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。【００６１】
まず、バチルス属微生物のｐｈｏＲ遺伝子およびｍｕｔＭ遺伝子の保存領域から、これらの遺伝子を増幅するためのプライマー、または、一対もしくは複数対のプライマーを設計する。これらのプライマーセットを用いて、目的の細菌（例えば、アリシクロバチルス属微生物）のゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれの遺伝子の増幅を行う。そして、得られた増幅産物の塩基配列の決定を行う。【００６２】
種々のバチルス属のゲノム構造から、ｐｈｏＲ遺伝子、ｐｏｌＡ遺伝子およびｍｕｔＭ遺伝子は、いずれも同一方向に転写される。そこで、決定した塩基配列情報に基づいて、ｐｏｌＡクローニング用の特異的なプライマーとして、ｐｈｏＲ遺伝子のセンス鎖と相同的（アンチセンス鎖に相補的）なプライマー（フォワードプライマー）、ｍｕｔＭ遺伝子のアンチセンス鎖に相同的（センス鎖に相補的）なプライマー（リバースプライマー）とを設計する。そして、これらを用いて、前記細菌のゲノムＤＮＡの鋳型として、ｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡを増幅させる。得られた増幅物をクローン化することで、目的の細菌由来のｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。プライマーの長さは、制限されず、種々の実験条件によって適宜調節可能であるが、例えば、１５〜５０塩基長、好ましくは１８〜４０塩基長、最も好ましくは２５〜３５塩基長である。【００６３】
このようなプライマーを用いて、アリシクロバチルス属やその近縁の細菌からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を単離する方法は、例えば、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含むことを特徴とし、さらに下記（Ｅ）工程を有してもよい。
（Ａ）  配列番号１および２のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーと配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ｐｈｏＲ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する工程
（Ｂ）  配列番号６〜８のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９〜１１のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ｍｕｔＭ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する工程
（Ｃ）  前記（Ａ）工程および（Ｂ）工程で増幅した各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で決定した塩基配列に基づいて設計した、前記ｐｈｏＲ遺伝子のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ｍｕｔＭ遺伝子のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程【００６４】
プライマーの長さは、制限されず、種々の実験条件によって適宜調節可能であるが、例えば、１５〜５０塩基長、好ましくは１８〜４０塩基長、最も好ましくは２５〜３５塩基長である。前記（Ａ）工程において、配列番号１および２のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーは、正方向プライマーであり、配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーは、逆方向プライマーである。また、前記（Ｂ）工程において、配列番号６〜８のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーは、正方向プライマーであり、配列番号９〜１１のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーは、逆方向プライマーである。【００６５】
また、前記（Ｄ）工程におけるプライマーセットとしては、例えば、後述する配列番号１２〜１７のいずれかで表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせて用いることができる。また、完全長の翻訳領域を増幅するためのプライマーセットとしては、例えば、後述する配列番号１９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２１で表される塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせが、Ｎ末端領域を欠失するＤＮＡポリメラーゼのコード配列を増幅するためのプライマーセットとしては、例えば、後述する配列番号２０で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２１で表される塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせがあげられる。【００６６】
本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、前述の（ａ）〜（ｄ）に示すＤＮＡポリメラーゼをコードする、下記（ａ’）〜（ｄ’）に示すＤＮＡを含む。
（ａ’）配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ’）配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ’）配列番号２２で表される塩基配列において、５’Ｎ末端から、１個〜３３４個の任意の個数の連続するコドンが欠失した塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ’）前記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれか記載の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００６７】
配列番号２２で表される塩基配列は、例えば、配列番号２３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。また、配列番号２４で表される塩基配列は、例えば、配列番号２５で表されるＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列である。なお、本発明は、これらの配列に限定されない。【００６８】
また、本発明におけるＤＮＡは、例えば、コードするＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限り、前述の（ｅ）に示すＤＮＡポリメラーゼをコードする下記（ｅ’）に示すＤＮＡであってもよい。
（ｅ’）前記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれかで表される塩基配列との相同性が、例えば、８０％以上の塩基配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００６９】
前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することができる。前記相同性は、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。また、配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡであって、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも含む。さらに、本発明は、前記ＤＮＡに対するＲＮＡ、例えば、前記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、もしくは、アンチセンスＲＮＡ等も含む。【００７０】
また、本発明におけるＤＮＡは、例えば、コードするＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限り、下記（ｆ’）に示すＤＮＡであってもよい。
（ｆ’）  前記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００７１】
前記（ｆ’）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。ストリンジェンシーの選択のため、例えば、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化することができる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるために、例えば、ホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である。【００７２】
さらに、本発明におけるＤＮＡは、例えば、配列番号２２または２４で表される塩基配列の縮重変異体も含む。また、本発明は、前述のＤＮＡの相補的な配列からなるＤＮＡも含む。【００７３】
遺伝子に変異を導入する方法は、制限されないが、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法またはギャップ二重鎖(Gapped  duplex)法等の公知手法またはこれに準ずる方法によって行うことができる。また、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば、Mutant-K(TAKARA社製）、Mutant-G(TAKARA社製）等)、LA  PCR  in  vitro  Mutagenesis  シリーズキット（TAKARA社）等を利用することもできる。【００７４】
＜ＤＮＡ単離用のプライマーおよびプローブ＞
つぎに、生物からＤＮＡポリメラーゼを単離するために用いるプライマーおよびプローブについて説明する。前記プライマーおよび前記プローブは、例えば、前述の本発明におけるＤＮＡの断片であり、塩基の数は、例えば、５〜５０である。塩基数の下限は、例えば、５以上であり、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上であり、塩基数の上限は、例えば、５０以下であり、好ましくは３０以下であり、より好ましくは２５以下である。また、好ましい範囲の具体例としては、例えば、１０〜５０であり、より好ましくは１０〜３０、より好ましくは１５〜２５である。増幅させる塩基配列の長さは、特に制限されない。本発明のプライマーの具体例としては、例えば、配列番号１〜２１のいずれかで表されるプライマーがあげられ、いずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。中でも、配列番号１２〜１７で表される少なくとも１つのプライマーをフォワードプライマーとして、配列番号１８で表されるプライマーをリバースプライマーとして、それぞれ組み合わせて使用することが好ましい。ｐｏｌＡ遺伝子の完全長翻訳領域（ＯＲＦ）を単離する際には、例えば、配列番号１９で表されるフォワードプライマーと、配列番号２１で表されるリバースプライマーとを組み合わせて使用することが好ましい。さらに、ｐｏｌＡ遺伝子において、大腸菌のクレノウフラグメントに相当する領域を単離する際には、例えば、配列番号２０で表されるフォワードプライマーと、配列番号２１で表されるリバースプライマーとを組み合わせて使用することが好ましい。【００７５】
（組換えベクター）
つぎに、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの発現に使用できる組換えベクターについて説明する。前記組換えベクターは、本発明における前述のＤＮＡを含むことを特徴とする。前記組換えベクターは、例えば、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結(挿入)することにより得られる。前記ＤＮＡを挿入するためのベクターは、例えば、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）等が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）等が挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等を用いることもできる。【００７６】
ベクターに前記ＤＮＡを挿入する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等があげられる。本発明のＤＮＡは、例えば、それがコードするタンパク質が発現されるように、前記ベクターに組み込まれることが好ましい。そこで、本発明におけるベクターには、例えば、プロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等）の他に、所望により、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列、ＫＯＺＡＫ配列等）等を連結することもできる。前記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。【００７７】
（形質転換体）
本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの製造に使用できる形質転換体について説明する。前記形質転換体は、前記組換えベクターを含むことを特徴とする。前記形質転換体は、例えば、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを発現し得るように、前述のＤＮＡを宿主に導入することにより得られ、具体的には、本発明の組換えベクターを導入することが好ましい。形質転換は、例えば、簡便で効率が良いことから、多くの場合ベクターを用いて行われる。ここで、宿主としては、本発明のタンパク質を発現できるものであれば、特に限定されるものではない。前記宿主としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌等が挙げられる。また、この他に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらに、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞等も挙げられる。あるいは、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。【００７８】
形質転換方法としては、制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Cohen,  S.N.  et  al.  (1972)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  USA  69,  2110-2114)、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等があげられる。【００７９】
＜等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの製造方法＞
本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、前記形質転換体を培養し、得られた培養物からタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を採取することにより製造できる。「培養物」とは、例えば、培養上清の他、培養細胞若しくは培養菌体、または、細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。また、「本発明の形質転換体を培養する方法」は、例えば、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われ、その条件等は、例えば、宿主の種類等に応じて適宜決定できる。【００８０】
培養後、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体内または細胞内に生産される場合には、例えば、菌体または細胞を破砕することにより前記タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体外または細胞外に生産される場合には、例えば、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により前記培養液から菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせて用いることによって、前記培養物から本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を精製することができる。前記単離精製の方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があげられる。また、例えば、精製のために、発現するタンパク質にタグ配列を付加している場合には、前記精製工程の間または後に、プロテアーゼ処理等により、前記タグ配列を除去することもできる。【００８１】
＜抗体＞
さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼに対する抗体について説明する。前記「抗体」には、例えば、好適な任意のフラグメントまたは誘導体も含まれる。このような広義の抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体（diabody）（融合した同一のＦｖフラグメントの２つのコピー）、単鎖抗体、および、２以上の抗体フラグメントから形成される多重特異性（multi-specific）抗体等が含まれる。前記抗体は、例えば、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの精製に用いることができる。前記抗体の製造方法は、制限されず、例えば、従来公知の方法により製造できる。【００８２】
なお、本発明において、例えば、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法は、当該分野の標準的な参考書籍を参照して実施することができる。これらには、例えば、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual  第３版（Sambrook  &  Russell、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、2001）；Current  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、John  Wiley  &  Sons、1987）；Methods  in  Enzymologyシリーズ（Academic  Press）；PCR  Protocols:  Methods  in  Molecular  Biology（Bartlett  &  Stirling編、Humana  Press、2003）；Antibodies：A  Laboratory  Manual（Harlow  &  Lane編、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、1987）等が含まれる。また、本明細書において参照される試薬およびキット類等は、例えば、Sigma社、Aldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Qiagen社、Promega社、Roche  Diagnostics社、Becton-Dickinson社、TaKaRa社（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。【００８３】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８４】
［アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(A．acidocaldarius)ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）のクローニング］
A．acidocaldarius  subsp．Acidocaldarius  JCM5260培養菌体より、定法にてゲノムＤＮＡを調製した。次いで、バチルス属の他種のｐｏｌＡの遺伝子構造では、ｐｏｌＡの上流にｐｈｏＲ、ｐｏｌＡの下流にｍｕｔＭが保存されていることから、各々の遺伝子の保存領域より、以下に示すプライマーを合成した。【００８５】
ｐｈｏＲクローニング用ＰＣＲプライマー
phoRFwd1(x6144)：5'-AARMARYTWGARSARRTKMGVAA-3'（配列番号１）
phoRFwd2(x576)：5'-GTHTCYCATGARYTRAARACDCC-3'（配列番号２）
phoRRev1(x1296)：5'-HCKRTARAAVCGTTCRAADATVC-3'（配列番号３）
phoRRev2(x1728)：5'-GTHCCDCCHGWRTTKCKRCTYCT-3'（配列番号４）
phoRRev3(x6912)：5'-RYHARRTGCTTBACRATYGMHAR-3'（配列番号５）【００８６】
ｍｕｔＭクローニング用ＰＣＲプライマー
mutMFwd1(x96)：5'-TGCCDGAATTACCRGARGTNGAR-3'（配列番号６）
mutMFwd2(x3072)：5'-GMMGRGGMAARTTYYTDYTKTTW-3'（配列番号７）
mutMFwd3(x1728)：5'-GTBWSHCAYYTKMGDATGGAAGG-3'（配列番号８）
mutMRev1(x288)：5'-AAAGAGGTGCATCGTTCCRAAYT-3'（配列番号９）
mutMRev2(x324)：5'-TCBACATADATRTTBCCVAGYCC-3'（配列番号１０）
mutMRev3(x864)：5'-CCBCKYCCBCCAACRACHRTYTT-3'（配列番号１１）【００８７】
なお、前記配列において、Ｒは、グアニンまたはアデニンのプリン塩基を、Ｙは、チミンまたはシトシンのピリミジン塩基を、Ｍは、アデニンまたはシトシンを、Ｋは、グアニンまたはチミンを、Ｓは、グアニンまたはシトシンを、Ｗは、アデニンまたはチミンを、Ｄは、アデニン、グアニンまたはチミンを、Ｈは、アデニン、シトシンまたはチミンを、Ｖは、アデニン、グアニンまたはシトシンを、Ｎは、４種類（グアニン、アデニン、シトシン、チミン）のいずれかの塩基をそれぞれ表す。括弧内の数字は組み合わせによる種類数を表す。また、Fwdは、正方向（フォワード）プライマー、Revは、逆方向（リバース）プライマーを示す。なお、以下の配列についても同様である。【００８８】
調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、正方向（Ｆｗｄ）プライマーおよび逆方向（Ｒｅｖ）プライマーの各組み合わせによりＰＣＲを行って、ＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（商品名、プロメガ社製）にクローン化した。具体的には、正方向プライマーとして、phoRFwd1およびphoRFwd2のいずれかを、逆方向プライマーとして、phoRRev1、phoRRev2およびphoRRev3のいずれかを、それぞれ用いてｐｈｏＲ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。また、ｍｕｔＭ遺伝子についても、正方向プライマーとして、mutMRev1、mutMRev2およびmutMRev3のいずれかを、逆方向プライマーとして、mutMRev1、mutMRev2およびmutMRev3のいずれかを、それぞれ用いて、ＤＮＡ断片を増幅した。そして、得られたそれぞれのＤＮＡ断片をプラスミドにクローニングし、その内部塩基配列を決定した。【００８９】
決定した塩基配列に基づいて、ｐｏｌＡ遺伝子をクローン化するための以下のプライマーを合成した。【００９０】
Aac  cloning  F1：TTTATCCACCTTGAGCGGCACAGACCAGTT（配列番号１２）
Aac  cloning  F2：TTCGCACCTTCCACTGGCTCTCTGCACCGC（配列番号１３）
Aac  cloning  F3：GACGTACTCTCTCCTTCATGGCCTTCGCTC（配列番号１４）
Aac  cloning  F4：AATTTTGTGAACATCATAATCAATTCGTTG（配列番号１５）
Aac  cloning  F5：CCACAAGACGACGCGGGCCGACAAGGGGAA（配列番号１６）
Aac  cloning  F6：TGGCCTTCGCTCGATGAATTTTGTGAACAT（配列番号１７）
Aac  cloning  R1：GGTGAATGCCCTGCTCCCTCAGCCGCTCGG（配列番号１８）【００９１】
調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、Aac  cloning  F1〜F6のいずれかの正方向プライマーと、Aac  cloning  R1の逆方向プライマーとを組み合わせて、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（商品名、プロメガ社製）にクローン化した。そして、プラスミドにクローニングした前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。続いて、決定した塩基配列と、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスＤＮＡポリメラーゼ（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼＩ）遺伝子（ｐｏｌＡ）と推測される塩基配列とに基づいて、以下のプライマー対を設計し、これを用いて、完全長の翻訳領域（ＯＲＦ）部分をＰＣＲにより増幅した。【００９２】
Aac  polA  NdeI:5'-CTTCATGGCCTTCGCcatATGAATTTTGTG-3'（配列番号１９）
Aac  term  KpnI:5'-TCCGGCACGCCGgtaCCCCCCTCACTTGGC-3'（配列番号２１）【００９３】
得られたＰＣＲの増幅産物およびプラスミドｐＹＳＮを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、混合して連結することによりＡａｃＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドｐＡａｃを構築した。【００９４】
さらに、得られたＡａｃＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドｐＡａｃから、ｐｏｌＡ遺伝子の塩基配列を決定した。そして、大腸菌のクレノウフラグメントのＮ末端に相当するＤＮＡ断片を、以下のプライマー対を用いてＰＣＲで増幅した。【００９５】
Aac  Klenow NdeI:5'-CGCGCCATCGCCTGGcatatgGAGCTCGAC-3'（配列番号２０）
Aac  term KpnI:5'-TCCGGCACGCCGgtaCCCCCCTCACTTGGC-3'（配列番号２１）【００９６】
得られたＰＣＲの増幅産物およびプラスミドｐＹＳＮを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、混合して連結することにより、Ｎ末端欠失型ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ（以下、「ΔＮ  ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ」、「ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント」または「ＡａｃＤＮＡポリメラーゼＩ」ともいう）の発現プラスミドｐｄＮＡａｃを構築した。
【実施例２】
【００９７】
［ＡａｃＤＮＡポリメラーゼＩおよびＮ末端欠失型ＡａｃＤＮＡポリメラーゼの発現および精製］
（１）培養、発現、及び粗抽出液調製
ｐＡａｃまたはｐｄＮＡａｃを有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌにて、３７℃一晩培養し、これを前培養液とした。この前培養液５ｍｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養（Orbital  Shaking  Incubator,  FIRSTEK  OSI-502LD）を行った。培養液のＯＤ６００ｎｍ値が０．５付近となった時点で、終濃度１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加した。さらに、３７℃、２００ｒｐｍで１〜２時間振盪培養した。続いて、培養液を遠沈管に移し、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、沈殿を得た。この沈殿を１×ＰＢＳ  ３０ｍｌに懸濁し、再度、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。沈殿を１×ＰＢＳ  ２５ｍｌに懸濁し、一回あたり１０秒間として合計６回、超音波による細胞の破砕を行った（MISONIX  Astrason  Ultrasonic  processor  XL）。超音波破砕後の試料を、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。この上清に、３０％ポリエチレンイミン溶液を終濃度０．１％となるように添加して混合し、氷中で３０分間放置した後、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を粗抽出液とした。【００９８】
（２）陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱを用いて、イオン交換クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の粗抽出液をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約１５カラム容量の０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。回収画分を、限外濾過膜を用いて濃縮・脱塩し、これを陰イオン交換画分とした。【００９９】
（３）ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ヘパリンアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎを用いて、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと同じ溶液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の陰イオン交換画分をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約２２カラム容量の０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。前記回収画分を限外濾過膜を用いて、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有の５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッファー置換を行い、さらに濃縮して、これをヘパリン画分とした。【０１００】
（４）ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  １０ＸＴ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅを用いて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー行った。ランニングバッファーとして、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有の５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述のヘパリン画分をアプライした後、前記ランニングバッファーで溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した後、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮し、保存バッファーにバッファー交換を行った。これを精製酵素標品とした。なお、前記保存バッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％グリセロールとした。
【実施例３】
【０１０１】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定］
インビトロジェン社製Picogreen  dsDNA定量試薬を用いて、Seville  M.  et  al.  Biotechniques  Vol.21,  pp.664-668  (1996)を参考に、前記精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。具体的には、前記Picogreen  dsDNA定量試薬とＴＥ緩衝液とを、体積比１：３４５となるように混合した。そして、この混合液１７３μｌを、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰおよび前記精製酵素標品の混合物２７μｌに添加した。この反応液を室温（３７℃）で５分間放置した後、励起波長４８０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍにて蛍光を測定した。この際、単位（ｕｎｉｔ：６５℃３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを取り込む酵素量）が既知である市販のクレノウフラグメント（市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ；ＮＥＢ社製）についても同様に蛍光測定を行い、その測定値より、相対値としての酵素単位を算出した。以下に測定の一例を示す。なお、標準曲線は、測定ごとに作成し、反応温度は３７℃とした。市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製、以下同様）を標準として、Picogreen  dsDNA定量試薬により、各希釈倍での蛍光強度を測定した。この結果を表１に示す。【０１０２】
【表１】
2009054510.tif 000003
【０１０３】
これらの結果をプロットし、１次直線に回帰したところ、次の式を得た。回帰曲線を図１に示す。下記式において、ｘは、ポリメラーゼ活性のユニット、ｙは、蛍光強度を示す。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、６５℃において３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性画分に取り込む酵素量を１ｕｎｉｔとする。
ｙ＝８．３７１７ｘ＋５５．２９２（Ｒ２＝０．９６７１）【０１０４】
また、測定した精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）は、反応温度（室温３７℃）における蛍光強度が、平均９８．０３（１回目９７．７８９、２回目９８．２６２）を示した。このため、前記回帰直線式より、前記反応温度では、約５．１０ｕｎｉｔと算出された。この結果から、実施例２で得られた精製酵素標品は、ＤＮＡポリメラーゼであることが確認できた。
【実施例４】
【０１０５】
［相補鎖置換型複製活性測定］
前述の非特許文献２（Notomi,  T.  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  2000,  Vol.  28,  No.  12,  e63）に記載された方法に従って、活性測定を行った。まず、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、０．８μｍｏｌ／Ｌ  ＦＩＰ、０．８μｍｏｌ／Ｌ  ＢＩＰ、０．２μｍｏｌ／Ｌ  Ｆ３、０．２μｍｏｌ／Ｌ  Ｂ３の各合成ＤＮＡ、１ｍｏｌ／Ｌベタイン、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２−４ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウムの混合物２０μｌを調製した。これを９５℃で５分間放置し、次いで、氷上で５分間放置した。これに前述の精製酵素標品５μｌを加えて所定の反応温度（６０℃〜７４℃）で１時間放置した後、アガロースゲル電気泳動に供した。この際、単位が既知であるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を同様にして電気泳動に供した。そして、精製酵素表品の電気泳動後の精製物のバンドの濃さと、単位が既知のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの電気泳動後の精製物のバンドの濃さとを比較することにより、相対値としての酵素単位を算出した。なお、ブランクとして、前記精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）に代えて、前記トリス塩酸緩衝液を添加したものについても電気泳動を行った。これらの結果を、図２および図３に示す。【０１０６】
図２および図３は、所定の温度で増幅させた遺伝子増幅産物の電気泳動写真である。両図において、レーン１は分子量マーカー（λ−ＳｔｙＩ）である。図２のレーン２は、ブランク（ＤＮＡポリメラーゼ無添加）の結果を示す。図２の奇数レーン（３、５、７、９、１１、１３）は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを、偶数レーン（４、６、８、１０、１２、１４）は、前記精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）用いて、６０〜６８℃の各温度で反応を行った結果である。図３の偶数レーン（２、４、６、８、１０、１２）は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを、奇数レーン（３、５、７、９、１１、１３）は、前記精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）を添加し、６８〜７４℃の各温度で反応を行った結果である。なお、図中に、各レーンにおける反応温度（℃）を記載する。【０１０７】
図２および図３に示すように、精製酵素標品、すなわち、実施例２で得られたＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントは、相補鎖置換型複製活性を有することが確認された。また、６４℃以下の温度で、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントと同等の活性を示した。さらに、６６℃以上、特に６８℃以上の温度では、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた場合、増幅量が著しく減少するのに対して、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた場合、７２℃まで十分な活性が認められた。この結果より、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントは、高温で安定な酵素であることが示された。
【実施例５】
【０１０８】
[SMart  Amplification  Process法]
SMart  Amplification  Process法（三谷らの方法。例えば、特許文献４（特許第３８６７９２６）、特許文献５参照）に従い、核酸の等温増幅を行った。下記組成を有する反応液１０μｌを調製し、これを６５℃で６０分間反応させた。この反応を、Ｍｘ３０００Ｐ（商品名、Stratagene社製）を用いて、リアルタイムでモニタリングした。比較例としては、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントに代えて、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を、下記反応液において終濃度０．３２ユニット／μｌとなるように添加し、同様にしてリアルタイムでモニタリングを行った。これらの結果を図４に示す。【０１０９】
【表２】
2009054510.tif 000004
【０１１０】
プライマー
SMart  Amplification  Process用プライマーセットとして、以下に示す５種類のプライマーを準備した。第一のプライマーが、Turn-back  Primer（TP）、第二のプライマーが、Folding  Primer（FP）、第三のプライマーが、野生型検出用のBoost  Primer（BPw）、Outer  Primer1（OP1）およびOuter  Primer2（OP2）である。
TP  5'-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'（配列番号２６）
FP  5'-tttatatatatataaaCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'（配列番号２７）
BP  5'-ATCCGGATGTAGGATC-3'（配列番号２８）
OP1  5'-GATGGTGACCACCTCGAC-3'（配列番号２９）
OP2  5'-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3'（配列番号３０）【０１１１】
図４は、等温増幅をリアルタイムでモニタリングした、サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフである。同図において、●が、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた実施例の結果、■が、市販ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた比較例の結果である。同図に示すように、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた実施例（●）によれば、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた比較例（■）よりも速く目的配列が増幅された。なお、増幅物の塩基配列を決定したところ、目的配列が増幅されていることが確認できた。核酸増幅の分野においては、分刻みで増幅時間を短縮することが望まれている。したがって、本発明のＡａｃＤＮＡポリメラーゼによれば、従来のＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅法よりも、十分な短縮化を図ることができるといえる。
【実施例６】
【０１１２】
ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いたSMart  Amplification  Process法により、ヒトＡＬＤＨ２野生型の検出を行った。【０１１３】
（１）核酸試料
ヒトＡＬＤＨ２  Ｈｅｔｅｒｏ型を含む血液１５μlに、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨを３０μl添加した。これを、９８℃で３分間、加熱処理を行った後、氷冷したものを、核酸試料とした。【０１１４】
（２）プライマー
SMart  Amplification  Process用プライマーセットとして、以下に示す５種類のプライマーを準備した。第一のプライマーが、Turn-back  Primer（TP）、第二のプライマーが、Folding  Primer（FP）、第三のプライマーが、野生型検出用のBoost  Primer（BPw）、Outer  Primer1（OP1）およびOuter  Primer2（OP2）である。
TP  5’-CGAGTACGGGCCCACACTCACAGTTTTCAC-3’  （配列番号３１）
FP  5’-TTTATATATATATAAACCGGGAGTTGGGCGAG-3’  （配列番号３２）
BPw  5’-GCAGGCATACACTGA-3’  （配列番号３３）
OP1  5’-CCTGAGCCCCCAGCAGGT-3’  （配列番号３４）
OP2  5’-ACAAGATGTCGGGGAGTG-3’  （配列番号３５）【０１１５】
（３）SMart  Amplification  Process反応
下記組成（２５μｌ当たりの組成）の反応液合計７５μｌを調製し、これを６０℃で１時間反応させた。前記反応中、６０℃の等温状態を維持しながら、Ｍｘ３０００Ｐ（商品名、Stratagene社製）により、反応液の蛍光強度をリアルタイムでモニタリングした。なお、比較例としては、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントに代えて、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）６Ｕを下記反応液に添加し、同様にしてリアルタイムでモニタリングを行った。なお、反応測定は、前記反応液７５μｌを２５μｌずつ３つにわけ、それぞれについて行った。これらの結果を図５に示す。同図は、SMart  Amplification  Process法による等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフであり、●が、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した結果、□が、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した結果である。【０１１６】
【表３】
2009054510.tif 000005
【０１１７】
図５に示すように、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した場合、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した場合と比べて、速く目的配列が増幅された。具体的には、約８〜１２分程度速くプラトーに達することが確認された。具体的には、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた反応系では、３０分以内に増幅が確認された(●)。一方、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた反応系では、３０分以降に増幅が確認された(□)。このことから、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼと比較して、SMart  Amplification  Process法に非常に適した酵素であるといえる。
【実施例７】
【０１１８】
ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いたＬＡＭＰ法により、ヒトＤＩＯ２野生型の検出を行った。【０１１９】
（１）核酸試料
ヒトＤＩＯ２  Ｈｅｔｅｒｏ型を含む血液１５μlに、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨを３０μl添加した。これを、９８℃で３分間、加熱処理を行った後、氷冷したものを、核酸試料とした。【０１２０】
（２）プライマー
ＬＡＭＰ用プライマーセットとして、以下に示す５種類のプライマーを準備した。なお、TPwおよびTRFs2が、非対称型の一対のプライマーである。
TPw    5’-tactggagacGTGAAATTGGGTGAGGATGC-3’  （配列番号３６）
TPFs2  5’-AGAAGGAGGTgtaccattgccactgtt-3’  （配列番号３７）
BP      5’-cacactggaattggggg-3’  （配列番号３８）
OP1    5’-tcagctatcttctcctgg-3’  （配列番号３９）
OP2    5’-TGTGATATTCTCACCTTC-3’  （配列番号４０）【０１２１】
（３）ＬＡＭＰ反応
下記組成（２５μｌ当たりの組成）の反応液合計７５μｌを調製し、これを６０℃で２時間反応させた。前記反応中、６０℃の等温状態を維持しながら、Ｍｘ３０００Ｐ（商品名、Stratagene社製）により、反応液の蛍光強度をリアルタイムでモニタリングした。なお、比較例としては、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントに代えて、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）６Ｕを下記反応液に添加し、同様にしてリアルタイムでモニタリングを行った。なお、反応測定は、前記反応液７５μｌを２５μｌずつ３つにわけ、それぞれについて行った。これらの結果を図６に示す。同図は、ＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフであり、●が、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した結果、□が、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した結果である。【０１２２】
【表４】
2009054510.tif 000006
【０１２３】
図６に示すように、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した場合、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを使用した場合と比べて、増幅速度が速くなることが確認された。具体的には、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた反応系では、３０分以内に増幅が確認された(●)。一方、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた反応系では、Ａａｃよりも遅い時間に増幅が確認され、中には、８０分以降で増幅が確認されたものもあった(□)。このことから、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼと比較して、安定性に優れ、ＬＡＭＰ法に非常に適した酵素であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
以上のように、本発明の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼによれば、等温増幅法に使用されている従来のＤＮＡポリメラーゼと比較して、SMart  Amplification  Process法やＬＡＭＰ法等の特定の等温増幅法の増幅効率を向上できる。このため、従来よりも短時間で核酸増幅を行うことが可能となる。また、核酸増幅に要する時間を短縮化できることから、例えば、核酸増幅を利用する一塩基多型（ＳＮＰ）等の解析をより迅速に行うことができ、また、大量の検体であっても、より効率的に解析することが可能である。したがって、本発明は、核酸増幅を利用する核酸解析や臨床検査等の分野に極めて有用である。
【図１】
2009054510.tif 000007
【図２】
2009054510.tif 000008
【図３】
2009054510.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009054510.tif 000013
【図８】
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【図９】
2009054510.tif 000015
【図１０】
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【配列表】
2009054510000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月17日(2009.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中の標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いて、前記標的核酸配列の増幅反応を行うことを特徴とする等温増幅方法。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、２５℃〜７５℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１記載の等温増幅方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、相補鎖置換複製酵素活性を有する、請求項１または２記載の等温増幅方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、逆転写酵素活性を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求項１から４のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項８】
前記増幅反応において、第二のプライマーを併用し、
前記第一のプライマーと第二のプライマーとが、形態が異なる非対称型の一対のプライマーである、請求項１から７のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項９】
前記第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含むものである、請求項８記載の等温増幅方法。
【請求項１０】
前記増幅反応において、さらに、第三のプライマーを併用し、
前記第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、且つ、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーであり、
前記第三のプライマーは、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーの増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的核酸配列にアニーリングすることができ、これにより前記増幅産物中の標的核酸配列に新たな相補鎖合成起点が提供されるプライマーである、請求項８または９記載の等温増幅方法。
【請求項１１】
前記増幅反応において、さらに、第二のプライマーを併用し、
前記第一のプライマーと第二のプライマーとが、形態が同じである対称型の一対のプライマーである、請求項１から７のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、ＬＡＭＰ法に使用するプライマーセットである、請求項１１記載の等温増幅方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の等温増幅方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼであって、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、２５℃〜７５℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１３記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、相補鎖置換複製酵素活性を有するポリメラーゼである、請求項１３または１４記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の等温増幅方法に使用するための等温増幅用キットであって、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする等温増幅用キット。
【請求項２１】
さらに、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを含む、請求項２０記載の等温増幅用キット。
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【請求項２２】
さらに、第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが、形態が異なる非対称型の一対のプライマーである、請求項２１記載の等温増幅用キット。
【請求項２３】
さらに、第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが、形態が同じである対称型の一対のプライマーである、請求項２１記載の等温増幅用キット。
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月3日(2009.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中の標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いて、前記標的核酸配列の増幅反応を行うことを特徴とする等温増幅方法。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、２５℃〜７５℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１記載の等温増幅方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、相補鎖置換複製酵素活性を有する、請求項１または２記載の等温増幅方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、逆転写酵素活性を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求項１から４のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポリメラーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項８】
前記増幅反応において、第二のプライマーを併用し、
前記第一のプライマーと第二のプライマーとが、形態が異なる非対称型の一対のプライマーである、請求項１から７のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項９】
前記第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含むものである、請求項８記載の等温増幅方法。
【請求項１０】
前記増幅反応において、さらに、第三のプライマーを併用し、
前記第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、且つ、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーであり、
前記第三のプライマーは、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーの増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的核酸配列にアニーリングすることができ、これにより前記増幅産物中の標的核酸配列に新たな相補鎖合成起点が提供されるプライマーである、請求項８または９記載の等温増幅方法。
【請求項１１】
前記増幅反応において、さらに、第二のプライマーを併用し、
前記第一のプライマーと第二のプライマーとが、形態が同じである対称型の一対のプライマーである、請求項１から７のいずれか一項に記載の等温増幅方法。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、ＬＡＭＰ法に使用するプライマーセットである、請求項１１記載の等温増幅方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の等温増幅方法に使用するための等温増幅用キットであって、
ＤＮＡポリメラーゼを含み、
前記ＤＮＡポリメラーゼが、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする等温増幅用キット。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、２５℃〜７５℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３記載の等温増幅用キット。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、相補鎖置換複製酵素活性を有する等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３または１４記載の等温増幅用キット。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性として、逆転写酵素活性を有する等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の等温増幅用キット。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の等温増幅用キット。
【請求項１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の等温増幅用キット。
【請求項１９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の等温増幅用キット。
【請求項２０】
さらに、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを含む、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の等温増幅用キット。
（Ｘ）  標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【請求項２１】
さらに、第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが、形態が異なる非対称型の一対のプライマーである、請求項２０記載の等温増幅用キット。
【請求項２２】
さらに、第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが、形態が同じである対称型の一対のプライマーである、請求項２０記載の等温増幅用キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、等温増幅方法およびそれに用いる等温増幅用キットに関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
そこで、本発明は、特定の等温増幅方法に適したＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅方法、ならびにそれに用いる等温増幅用キットを提供することを目的とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の等温増幅方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼであって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の等温増幅キットは、本発明の等温増幅方法に使用するための等温増幅用キットであって、ＤＮＡポリメラーゼを含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明者らは、ＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製活性を有する熱安定性のアリシクロバチルス・アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「Ａａｃポリメラーゼ」という）が、等温増幅法の中でも後述する特定の方法に適していることを見出し、本発明を完成した。前記等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを用いた本発明の等温増幅方法および等温増幅用キットによれば、等温増幅法に使用されている従来のＤＮＡポリメラーゼと比較して、後述する特定の等温増幅法の増幅効率を向上できるため、結果的に、従来よりも短時間で核酸増幅を行うことが可能となる。核酸増幅に要する時間を短縮化できれば、例えば、核酸増幅を利用する一塩基多型（ＳＮＰ）等の解析をより迅速に行うことができ、また、大量の検体であっても、より効率的に解析することが可能である。したがって、本発明は、核酸増幅を利用する核酸解析や臨床検査等の分野に極めて有用である。なお、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼが、特定の等温増幅法に適していることは、本発明者らがはじめて見出したことである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定に用いた標準曲線を示すグラフである。
【図２】本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、６０〜６８℃の温度における相補鎖置換複製酵素活性を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、６８〜７４℃の温度における相補鎖置換複製酵素活性を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図５】本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図６】本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼおよび市販のＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法における、第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を示す模式図である。
【図８】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法における、第二のプライマーの一例を示す模式図である。
【図９】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法の作用機序の一例を示す模式図である。
【図１０】本発明の一実施形態であるＳＭＡＰ法の作用機序の一例を示す模式図である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
＜等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼ＞
本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、前述のように、本発明の等温増幅法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼであり、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする。なお、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼを適用する本発明の等温増幅法については、後述する。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から、１〜３３４個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質の有するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属の微生物から単離することができ、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(A．acidocaldarius)から、さらに好ましくは、A．acidocaldarius  JCM5260株から単離することができる。本菌株（ＪＣＭ５２６０株）は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より分譲可能である(http://www.jcm.riken.jp/JCM/Ordering_J.shtml)。本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、以下、「本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼ」、「本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼＩ」、「本発明に用いるＡａｃポリメラーゼ」または「本発明に用いるタンパク質」という場合もある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
また、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、前記（ｄ）に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限り、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸残基数の５〜１０％程度をいい、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、下記（ｅ）に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限りにおいて、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上のタンパク質であってもよい。前記相同性は、好ましくは、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９７％以上、９８％以上である。
（ｅ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載のタンパク質の有するアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性として、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製酵素活性を有し、例えば、さらに、逆転写酵素活性を有する。また、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、さらに、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有すれば、例えば、基質を取り込む際のエラーをより減少することが可能である。本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、例えば、２５〜７５℃のいずれかの温度で活性を示すことが好ましく、より好ましくは３７〜７２℃のいずれかの温度、さらに好ましくは５０〜７０℃のいずれかの温度、特に好ましくは５５〜６５℃のいずれかの温度である。本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼの至適温度は、例えば、公知の相補鎖置換複製酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの至適温度（例えば、２０〜３７℃）より高温度である。具体的には、例えば、２５〜７５℃のいずれかの温度で活性を有することが好ましく、より好ましくは、３７〜７２℃のいずれかの温度、さらに好ましくは、５０℃〜７０℃のいずれかの温度、特に好ましくは、５５〜６５℃のいずれかの温度である。従って、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、例えば、相補鎖置換複製酵素活性を有する従来のＤＮＡポリメラーゼよりも高温度の反応条件で用いることができる。このため、後述するＳＭＡＰ法やＬＡＭＰ法等を含む本発明における特定の等温増幅法において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのより厳密なアニーリング条件下で使用することが可能である。また、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性を有する場合、例えば、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成することができ、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法にも利用できる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
さらに、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、前述のように、Ｎ末端側アミノ酸残基を欠失させたＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼを含む。欠失させるＮ末端側のアミノ酸残基数は、前述のように、例えば、得られるＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖置換複製酵素活性を有していればよく、特に限定されない。具体例としては、前記Ｎ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントに対応する活性を有するものが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、前記（ｂ）または前記（ｃ）に示すように、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜３３４個の任意の個数の連続したアミノ酸残基が欠失したタンパク質があげられる。Ｎ末端から連続的に欠失するアミノ酸の残基数が相対的に多い場合に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する可能性が相対的に高いと考えられる。また、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端側から、５’→３’エキソヌクレアーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼの順でそれぞれのドメインが配置されている。したがって、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失させる場合は、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さなくなるまで、Ｎ末端側より任意の個数のアミノ酸残基を欠失させることで、前記活性を欠失することができる。なお、配列番号２３のアミノ酸配列においては、６２〜３０６番目の領域が５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン、３９２〜５３６番目の領域が３’→５’エキソヌクレアーゼドメインと考えられるが、本発明は、これに限定されるものではない。本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼとして、大腸菌のクレノウフラグメントに対応する、ＤＮＡポリメラーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性とを有し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の具体例を配列番号２５に示す。このように、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する場合、例えば、遺伝子増幅を行う際に、得られた増幅産物の分解を防止できるという利点を有する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
さらに、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失していてもよい。種々のＤＮＡポリメラーゼＩについて、各アミノ酸配列を比較すると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素には、酵素タンパク質の中央部に３つの共通配列モチーフが存在することが知られている。これらのモチーフを除去した酵素を作製することができる。例えば、市販の好熱性細菌由来のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している（Aliotta,  J.M.  et  al.,  Genetic  Analysis:  Biomolecular  Engineering,  Vol.  12,  pp.  185-195,  1996）。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、等温増幅反応に用いた際、プライマーの３’末端を分解することがない。このため、プライマー濃度の低下が十分に防止されることによって、核酸増幅速度がより速くなるという利点がある。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、点突然変異の検出への使用に適している。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼによれば、例えば、プライマーが３’側から分解されることを十分に防止できる。このため、プライマーは、鋳型ＤＮＡの変異箇所を十分に識別でき、例えば、誤って伸長反応が進むことが抑制され、伸長反応の停止による点突然変異の検出がより正確に行うことができる。前述のように、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端側から、５’→３’エキソヌクレアーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼの順でそれぞれのドメインが配置されている。したがって、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失させる場合は、例えば、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、且つ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示さなくなるまで、任意の個数のアミノ酸残基を欠失させることで、前記活性を欠失することができる。また、配列番号２３のアミノ酸配列においては、３９２〜５３６番目の領域が３’→５’エキソヌクレアーゼドメインと考えられるため、例えば、この領域を欠失させてもよい。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
＜等温増幅法＞
本発明の等温増幅方法は、核酸試料中の標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなる本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温で、下記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いて、前記標的核酸配列を増幅することを特徴とする。
（Ｘ）標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含み、且つ、前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含むプライマー
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明は、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーを使用する等温増幅方法であって、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを使用することが特徴である。したがって、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーと本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼとを使用する以外は、その他の構成や工程、条件等は制限されない。また、前記（Ｘ）に示す第一のプライマーを用いた等温増幅反応によると、例えば、電気泳動解析時にラダー状の増幅産物が得られることから、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼを適用する等温増幅反応は、例えば、ラダー状の増幅産物を生成する等温増幅反応ということもできる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
＜等温増幅用キット＞
本発明の等温増幅用キットは、本発明の等温増幅方法に使用するためのキットであって、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。本発明によれば、例えば、容易且つ簡便に、前述の本発明の等温増幅方法を行うことができる。本発明の等温増幅キットは、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼを含んでいればよく、その他の構成等は制限されない。その他の構成等は、前述の等温増幅方法に応じて適宜決定できる。本発明の等温増幅キットは、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼの他に、例えば、プライマーやプライマーセット、使用説明書を含んでもよい。前記プライマーやプライマーセットは、前述のものがあげられる。また、本発明の等温増幅用キットは、さらに、例えば、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液；塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物；国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体；酵素安定剤等を含んでもよい。前記酵素安定剤としては、制限されないが、例えば、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類等があげられ、中でも、糖類が好ましく、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、より好ましくは、トレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物である。また、本発明の等温増幅用キットは、さらに、融解温度調整剤を含んでもよい。前記融解温度調整剤としては、例えば、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組合せ等があげられ、好ましくは、ＤＭＳＯである。また、等温増幅方法に供する核酸試料がＲＮＡを含み、これを鋳型とする場合は、例えば、さらに、逆転写酵素を含むことが好ましい。なお、本発明の等温増幅用キットにおいて、これらの試薬の割合等は、制限されず、当業者であれば適宜決定できる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、前述の（ａ）〜（ｄ）に示すＤＮＡポリメラーゼをコードする、下記（ａ’）〜（ｄ’）に示すＤＮＡを含む。
（ａ’）配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ’）配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ’）配列番号２２で表される塩基配列において、５’末端から、１個〜３３４個の任意の個数の連続するコドンが欠失した塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ’）前記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれか記載の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
（組換えベクター）
つぎに、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの発現に使用できる組換えベクターについて説明する。前記組換えベクターは、本発明における前述のＤＮＡを含むことを特徴とする。前記組換えベクターは、例えば、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結(挿入)することにより得られる。前記ＤＮＡを挿入するためのベクターは、例えば、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）等が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）等が挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等を用いることもできる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
（形質転換体）
本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの製造に使用できる形質転換体について説明する。前記形質転換体は、前記組換えベクターを含むことを特徴とする。前記形質転換体は、例えば、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを発現し得るように、前述のＤＮＡを宿主に導入することにより得られ、具体的には、本発明の組換えベクターを導入することが好ましい。形質転換は、例えば、簡便で効率が良いことから、多くの場合ベクターを用いて行われる。ここで、宿主としては、本発明に用いるタンパク質を発現できるものであれば、特に限定されるものではない。前記宿主としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌等が挙げられる。また、この他に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらに、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞等も挙げられる。あるいは、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
＜等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの製造方法＞
本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、前記形質転換体を培養し、得られた培養物からタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を採取することにより製造できる。「培養物」とは、例えば、培養上清の他、培養細胞若しくは培養菌体、または、細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。また、「本発明の形質転換体を培養する方法」は、例えば、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われ、その条件等は、例えば、宿主の種類等に応じて適宜決定できる。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
培養後、本発明に用いるタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体内または細胞内に生産される場合には、例えば、菌体または細胞を破砕することにより前記タンパク質を抽出する。また、本発明に用いるタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体外または細胞外に生産される場合には、例えば、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により前記培養液から菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせて用いることによって、前記培養物から本発明に用いるタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を精製することができる。前記単離精製の方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があげられる。また、例えば、精製のために、発現するタンパク質にタグ配列を付加している場合には、前記精製工程の間または後に、プロテアーゼ処理等により、前記タグ配列を除去することもできる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
＜抗体＞
さらに、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼに対する抗体について説明する。前記「抗体」には、例えば、好適な任意のフラグメントまたは誘導体も含まれる。このような広義の抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体（diabody）（融合した同一のＦｖフラグメントの２つのコピー）、単鎖抗体、および、２以上の抗体フラグメントから形成される多重特異性（multi-specific）抗体等が含まれる。前記抗体は、例えば、本発明に用いる等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼの精製に用いることができる。前記抗体の製造方法は、制限されず、例えば、従来公知の方法により製造できる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
（２）陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（商標）高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ（商標）Ｑを用いて、イオン交換クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の粗抽出液をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約１５カラム容量の０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。回収画分を、限外濾過膜を用いて濃縮・脱塩し、これを陰イオン交換画分とした。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
（３）ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（商標）高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ヘパリンアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ（商標）Ｈｅｐａｒｉｎを用いて、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと同じ溶液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の陰イオン交換画分をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約２２カラム容量の０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。前記回収画分を限外濾過膜を用いて、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有の５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッファー置換を行い、さらに濃縮して、これをヘパリン画分とした。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
（４）ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  １０ＸＴ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅを用いて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー行った。ランニングバッファーとして、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有の５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述のヘパリン画分をアプライした後、前記ランニングバッファーで溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した後、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮し、保存バッファーにバッファー交換を行った。これを精製酵素標品とした。なお、前記保存バッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、５０％グリセロールとした。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定］
インビトロジェン社製Picogreen（登録商標）dsDNA定量試薬を用いて、Seville  M.  et  al.  Biotechniques  Vol.21,  pp.664-668  (1996)を参考に、前記精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。具体的には、前記Picogreen（登録商標）dsDNA定量試薬とＴＥ緩衝液とを、体積比１：３４５となるように混合した。そして、この混合液１７３μｌを、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰおよび前記精製酵素標品の混合物２７μｌに添加した。この反応液を室温（３７℃）で５分間放置した後、励起波長４８０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍにて蛍光を測定した。この際、単位（ｕｎｉｔ：６５℃３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを取り込む酵素量）が既知である市販のクレノウフラグメント（市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ；ＮＥＢ社製）についても同様に蛍光測定を行い、その測定値より、相対値としての酵素単位を算出した。以下に測定の一例を示す。なお、標準曲線は、測定ごとに作成し、反応温度は３７℃とした。市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製、以下同様）を標準として、Picogreen（登録商標）dsDNA定量試薬により、各希釈倍での蛍光強度を測定した。この結果を表１に示す。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
これらの結果をプロットし、１次直線に回帰したところ、次の式を得た。回帰曲線を図１に示す。下記式において、ｘは、ポリメラーゼ活性のユニット、ｙは、蛍光強度を示す。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、６５℃において３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性画分に取り込む酵素量を１ｕｎｉｔとする。
ｙ＝８．３７１７ｘ＋５５．２９２（Ｒ２＝０．９６７１）
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
［相補鎖置換型複製活性測定］
前述の非特許文献２（Notomi,  T.  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  2000,  Vol.  28,  No.  12,  e63）に記載された方法に従って、活性測定を行った。まず、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、０．８μｍｏｌ／Ｌ  ＦＩＰ、０．８μｍｏｌ／Ｌ  ＢＩＰ、０．２μｍｏｌ／Ｌ  Ｆ３、０．２μｍｏｌ／Ｌ  Ｂ３の各合成ＤＮＡ、１ｍｏｌ／Ｌベタイン、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、２−４ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウムの混合物２０μｌを調製した。これを９５℃で５分間放置し、次いで、氷上で５分間放置した。これに前述の精製酵素標品５μｌを加えて所定の反応温度（６０℃〜７４℃）で１時間放置した後、アガロースゲル電気泳動に供した。この際、単位が既知であるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を同様にして電気泳動に供した。そして、精製酵素表品の電気泳動後の精製物のバンドの濃さと、単位が既知のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの電気泳動後の精製物のバンドの濃さとを比較することにより、相対値としての酵素単位を算出した。なお、ブランクとして、前記精製酵素標品（ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント）に代えて、前記トリス塩酸緩衝液を添加したものについても電気泳動を行った。これらの結果を、図２および図３に示す。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
【表２】
2009054510.tif 000017
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
図４は、等温増幅をリアルタイムでモニタリングした、サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフである。同図において、●が、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた実施例の結果、■が、市販ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた比較例の結果である。同図に示すように、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた実施例（●）によれば、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いた比較例（■）よりも速く目的配列が増幅された。なお、増幅物の塩基配列を決定したところ、目的配列が増幅されていることが確認できた。核酸増幅の分野においては、分刻みで増幅時間を短縮することが望まれている。したがって、本発明に用いるＡａｃＤＮＡポリメラーゼによれば、従来のＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅法よりも、十分な短縮化を図ることができるといえる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表３】
2009054510.tif 000018
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
【表４】
2009054510.tif 000019
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
以上のように、前記等温増幅用ＤＮＡポリメラーゼを用いた本発明の等温増幅方法および等温増幅用キットによれば、等温増幅法に使用されている従来のＤＮＡポリメラーゼと比較して、SMart  Amplification  Process法やＬＡＭＰ法等の特定の等温増幅法の増幅効率を向上できる。このため、従来よりも短時間で核酸増幅を行うことが可能となる。また、核酸増幅に要する時間を短縮化できることから、例えば、核酸増幅を利用する一塩基多型（ＳＮＰ）等の解析をより迅速に行うことができ、また、大量の検体であっても、より効率的に解析することが可能である。したがって、本発明は、核酸増幅を利用する核酸解析や臨床検査等の分野に極めて有用である。
【国際調査報告】
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2009054510.tif 000021
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