(57)【要約】  本発明の目的は、miR-140の発現を制御するDNA、該DNAを含むレポーターベクター、該レポーターベクターを導入した細胞及び動物、並びにmiR-140の発現を制御する薬剤のスクリーニング系等を提供し、また、当該スクリーニング系を用いて変形性関節症や椎間板変性症のような軟骨疾患の新しい治療薬の開発に寄与することにある。  本発明のDNA配列は、任意の遺伝子をmiR-140が発現する部位に発現させることができる他、miR-140の発現を調節する薬剤のスクリーニングにも利用することができる。また、本発明のスクリーニング系で選択された薬剤は、軟骨の異常を伴う軟骨疾患の治療薬として期待される。
2013151058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-140の発現を制御する活性を有する、下記（a）乃至（g）のいずれかに記載のDNA。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号３又は４に記載の塩基配列からなるDNA。
（c）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号５又は６に記載の塩基配列からなるDNA。
（d）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号７乃至１０、４０及び４１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
（e）上記（a）に記載のDNAの塩基配列において１個又は２個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている塩基配列からなるDNA。
（f）上記（a）又は（e）に記載のDNAの塩基配列を２乃至５回の繰り返し配列として含むDNA。
（g）上記（b）乃至（d）及び（f）のいずれかに記載のDNAの塩基配列において１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により、該DNAに対して60%以上の相同性の範囲内で修飾された塩基配列からなるDNA。
【請求項２】
請求項１記載の（a）又は（e）に記載のDNA。
【請求項３】
請求項１記載の（f）に記載のDNA。
【請求項４】
請求項１記載の（b）又は（g）に記載のDNA。
【請求項５】
請求項１記載の（c）又は（g）に記載のDNA。
【請求項６】
請求項１記載の（d）又は（g）に記載のDNA。
【請求項７】
請求項１、４乃至６のいずれか一項の（g）に記載のDNAに対する相同性の範囲が65%以上であるDNA。
【請求項８】
請求項１、４乃至６のいずれか一項の（g）に記載のDNAに対する相同性の範囲が70%以上であるDNA。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAの下流にレポーター遺伝子が機能的に結合している、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
レポーター遺伝子が、LacZ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、LacZ、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項９乃至１２のいずれか一項に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１４】
細胞が293T細胞、ATDC5細胞、SW1353細胞、初代培養軟骨細胞、間葉系幹細胞及び胚性肝細胞（ES細胞）の中から選ばれるいずれかの細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項９乃至１２のいずれか１項に記載のベクターが導入された動物（ヒトを除く）。
【請求項１６】
動物（ヒトを除く）がマウス又はラットである請求項１５に記載の動物。
【請求項１７】
請求項１３又は１４に記載の細胞を用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（a）請求項１３又は１４に記載の細胞に、薬剤を接触させる工程、
（b）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該レポーター活性を増加又は低下させる薬剤を選択する工程、を含む該方法。
【請求項１９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAを用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（a）請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAにL-Sox5、Sox6及び／又はSox9タンパク質を接触させる工程、
（b）該DNAと該タンパク質の結合を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該DNAと該タンパク質の結合を増強又は減弱させる活性を有する薬剤を選択する工程、を含む該方法。
【請求項２１】
工程（b）の検出がゲルシフトアッセイである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７乃至２１のいずれか一項に記載の方法で選択された薬剤。
【請求項２３】
薬剤が合成化合物である請求項２２に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、miR-140の発現を制御するDNA、該DNAを含むレポーターベクター、該レポーターベクターを導入した細胞及び動物、並びに該DNAを利用した薬剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロRNA（miRNA）は、20〜23塩基からなる、タンパク質に翻訳されない小さなRNAであり、ヒトゲノム上では、これまで1,000種類以上のmiRNAが同定されている。miRNAは、ゲノムより数百〜数千塩基長のPrimary-miRNA（pri-miRNA）として転写された後、DroshaとDGCR8という酵素によってステムループ構造の70塩基対程度のprecursor miRNA（pre-miRNA）に切り出され、さらに、Dicer及びTRBP/PACTによって20〜23塩基対の二本鎖RNAとして生成される。生成されたmiRNAは、RNA-induced silencing complex（RISC）というタンパク複合体に取り込まれ、主に3’側非翻訳領域に標的となる相補的な配列を持つmRNAに結合してRISCの機能ドメインとなるArgonauteの活性を介して標的mRNAの発現を抑制する。一つのmiRNAに対して数百種類のmRNAが3'側非翻訳領域に相補的な配列を有しており、miRNAは同時に複数の遺伝子発現を制御することができる。いくつかのmiRNAは組織特異的な発現様式を示し、その組織や臓器の発生に関与し、免疫、発癌、老化などの医学における重要な機構を制御することが明らかとなってきている。【０００３】
miR-140は、マウス発生期において軟骨形成領域特異的に発現することが報告されているmiRNAの一つであり、WW domain containing E3
ubiquitin protein ligase 2（Wwp2）遺伝子の第16イントロンにコードされている。miR-140は、間葉系細胞からの軟骨分化に伴い特異的に発現が上昇する。また、miR-140が欠失したノックアウトマウスは内軟骨性骨化における軟骨細胞増殖に異常が起こるなど、miR-140は軟骨の分化と恒常性維持に重要な役割を果たしている。また、関節の軟骨変性疾患である変形性関節症において、軟骨細胞におけるmiR-140の発現が特異的に減少しており、miR-140ノックアウトマウスが変形性関節症様の病態を示すことや、miR-140を過剰発現させたトランスジェニックマウスが変形性関節症に耐性を示すことから、miR-140は軟骨変性疾患の発症にも深く関与している。したがって、miR-140の発現を制御する活性を持つ薬剤は、変形性関節症や椎間板変性症などの軟骨変性疾患の治療薬として期待される。しかしながら、miR-140がどのような発現制御を受けているのか、そのメカニズムが明らかではなかったことから、その発現を制御する活性を有する薬剤をスクリーニングすることは困難であった。【０００４】
ところで、軟骨分化の制御には、転写因子の一つであるSox9が重要な役割を果たしている。軟骨の形成過程において、Sox9はすべての軟骨前駆細胞と軟骨細胞に発現しているが、その発現は肥大軟骨細胞では劇的に減少する。軟骨の主要な構成成分である2型コラーゲン（Col2a1）やアグリカン（Agc1）などの構造遺伝子の発現制御領域には、Sox9が結合するコンセンサス配列（A/T）（A/T）CAA（T/A）Gが存在し、Sox9がこの領域に結合することにより、それぞれの遺伝子の発現が誘導され、軟骨分化が促進されている。さらに、軟骨分化において、他の転写因子であるL-Sox5とSox6がSox9と協調的に働き、軟骨分化を増強することが知られていたが、その標的となる遺伝子はCol2a1とAgc1以外には明らかにはされておらず、それらがSox9の機能を増強する制御機構は解明されていなかった。【０００５】
非特許文献１においてYangらは、Wwp2遺伝子の第10イントロンにpri-miR140の転写開始点が存在し、pri-miR140の上流2kbpを用いたルシフェラーゼレポーターベクターを構築して、当該領域でmiR-140がSox9による発現制御を受けることを報告している。さらに、当該領域の中に２箇所のSox9結合サイト、pri-miR140上流-824bpのCAGGCTTCCTTTGT及び-200bpのTAAAGGTGCTTTGTを見出し、-200bpの結合サイトに変異を導入するとレポーター活性が顕著に低下することを明らかにしている。しかしながら、非特許文献１にはSox9とSox5及びSox6との協調作用は記載されておらず、またそれらの結合領域及び当該領域を結合したレポーターベクターを薬剤のスクリーニングに応用することは記載も示唆もされていない。また、前記２箇所のSox9結合サイト以外の当該領域のDNA配列は非特許文献１には開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yang,J et al.MiR-140 is co-expressed with Wwp2-C transcript and activated by Sox9 totarget Sp1 in maintaining the chondrocyte proliferation.（2011）. FEBS Letter 585, 2992-2997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、miR-140の発現を制御するDNA、該DNAを含むレポーターベクター、該レポーターベクターを導入した細胞及び動物、並びにmiR-140の発現を制御する薬剤のスクリーニング系等を提供することにある。また、当該スクリーニング系を用いて変形性関節症や椎間板変性症のような軟骨変性疾患の新しい治療薬の開発に寄与することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Rapid amplification of cDNA ends（RACE）法によりpri-miR-140の転写開始点（Transcription Start Site：TSS）がWwp-2遺伝子の第10イントロンに存在することを独自に見出し、TSSの上流約3kbpの領域（miR140-3k、配列番号１０）を、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼを有するpGL4.12 luc2CPベクターにクローニングしてレポーターベクターpGL4-miR140-3kを作製した。pGL4-miR140-3kをSox9発現ベクターと共に293T細胞に遺伝子導入してレポーター活性を測定したところ、遺伝子導入したSox9発現ベクターの量に依存してルシフェラーゼ活性が増加したことから、当該DNAにSox9の制御を受ける領域が存在することが示唆された（図１）。次いで、Sox9、L-Sox5、Sox6の発現ベクターの組み合わせを検討したところ、L-Sox5とSox6はSox9によるレポーター活性の増加をさらに増強したことから、L-Sox5及びSox6はSox9と協調してmiR-140の発現を制御していることが明らかとなった（図２）。pGL4-miR140-3kのレポーターをルシフェラーゼからLacZに組み換えて作製したレポーターベクターpGL4-miR140-LacZを用いて作製したトランスジェニックマウスは、E12.5日齢及びE15.5日齢の胎児において、前肢や後肢の他、肋骨や脊椎の軟骨組織にLacZ活性を示すX-gal染色によって染色され、この領域が軟骨特異的に発現するmiR-140の発現制御領域であることが明らかとなった（図８）。【０００９】
miR140-3kにおいてSoxによる制御を受ける領域を限定するため、miR-140のTSSの上流-1kbp、-0.8kbp、-0.7kbp、-0.6kbp、-0.5kbp、-0.4kbp及び-0.3kbpの領域をpGL4.12 luc2CPベクターにクローニングしてレポーターベクターを作製し（図３、左側）、L-Sox5、Sox6、Sox9によるルシフェラーゼ活性の増加について検討したところ、pGL4-miR140-1kはpGL4-miR140-3kと同等のルシフェラーゼ活性の増加が観察された（図３、右側）。pGL4-miR140-0.8k 及びpGL4-miR140-0.7kではL-Sox5、Sox6及びSox9を遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性がpGL4-miR140-3kと比較して低下したが、Sox9のみを遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性はpGL4-miR140-3kと同等であった（図３、右側）。pGL4-miR140-0.6k、pGL4-miR140-0.5k、pGL4-miR140-0.4k及びpGL4-miR140-0.3kのSox9のみを遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性は顕著に低下した（図３、右側）。この結果から、TSSから上流-936〜-652bpのDNA配列（配列番号５）はL-Sox5、Sox6、Sox9によるmiR-140の発現制御に重要な領域であり、特に-739〜-652bpの間の配列（miR140-PSB、配列番号３）にこれらによる制御に必須の配列が存在することが示唆された。この-739〜-652bpの配列を精査した結果、Sox9が結合するコンセンサス配列のパリンドロミックな相同配列を見出した（図４の枠内の最上段、配列番号１）。【００１０】
上記、miR140-PSBのパリンドロミックな配列にSite
directed mutagenesis法により変異を導入してレポーターベクターを作製したところ、L-Sox5、Sox6、Sox9によるmiR140-PSBのルシフェラーゼ活性の増加が変異の導入により消失した（図５）。さらに、miR140-PSBのパリンドロミックな配列に同様な変異を導入したラジオアイソトープ（RI）標識プローブを合成してElectrophoretic Mobility Sift Assay（EMSA）によりSox9との結合性を検討したところ、パリンドロミックなSox9結合配列の5’側に変異を導入した場合はバンドのシフトが観察されたが、3’側又は両側に変異を導入した場合はバンドのシフトは消失した。以上の結果から、本発明において同定したパリンドロミックな配列にSox9が結合してmiR-140の発現を制御していることが明らかとなった（図６）。本発明において同定したSox9結合配列は、これまでにコンセンサス配列として報告されているSox9結合配列とは異なる新規なものであった。【００１１】
なお、マウスのTSSから上流-936bpから-652bpのDNA配列（配列番号５）をヒトの相同配列（配列番号６）と比較（アラインメント）した結果、両配列の相同性は71.5%（330塩基中236塩基が一致）であった（図７）。そのうち、本発明において同定したSox結合配列（図７の枠内、配列番号１及び配列番号２）は、17塩基中16塩基（94.1%）が一致した。また、上述のmiR140-PSBの87bpの領域（配列番号３）のヒトの相同配列（配列番号４）との相同性は72.2%（90塩基中65塩基が一致）であった。【００１２】
前記のヒトの相同配列を含むヒトのTSSから上流-3Kbp及び-0.7kbpの領域をヒトのゲノム遺伝子からクローニングして上述のマウスの遺伝子領域と同様にしてレポーターベクターを作製し、L-Sox5、Sox6、Sox9によるルシフェラーゼ活性の増加について検討したところ、対応するマウスのレポーターベクターと同様な結果が得られた（図９）。【００１３】
本発明は、以上のような知見に基づいてなされたものであり、miR-140の発現を制御するDNA、該DNAを含むレポーターベクター、該レポーターベクターを導入した細胞及び動物、並びに該DNAを利用した薬剤のスクリーニング方法等を提供するものである。より具体的には、
（１）miR-140の発現を制御する活性を有する、下記（a）乃至（g）のいずれかに記載のDNA。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号３又は４に記載の塩基配列からなるDNA。
（c）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号５又は６に記載の塩基配列からなるDNA。
（d）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号７乃至１０、４０及び４１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
（e）上記（a）に記載のDNAの塩基配列において１個又は２個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている塩基配列からなるDNA。
（f）上記（a）又は（e）に記載のDNAの塩基配列を２乃至５回の繰り返し配列として含むDNA。
（g）上記（b）乃至（d）及び（f）のいずれかに記載のDNAの塩基配列において１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により、該DNAに対して60%以上の相同性の範囲内で修飾された塩基配列からなるDNA。
（２）（１）記載の（a）又は（e）に記載のDNA。
（３）（１）記載の（f）に記載のDNA。
（４）（１）記載の（b）又は（g）に記載のDNA。
（５）（１）記載の（c）又は（g）に記載のDNA。
（６）（１）記載の（d）又は（g）に記載のDNA。
（７）（１）、（４）乃至（６）のいずれか一項の（g）に記載のDNAに対する相同性の範囲が65%以上であるDNA。
（８）（１）、（４）乃至（６）のいずれか一項の（g）に記載のDNAに対する相同性の範囲が70%以上であるDNA。
（９）（１）乃至（８）のいずれか一項に記載のDNAを含むベクター。
（１０）（１）乃至（８）のいずれか一項に記載のDNAの下流にレポーター遺伝子が機能的に結合している、（９）に記載のベクター。
（１１）レポーター遺伝子が、LacZ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである（１０）に記載のベクター。
（１２）レポーター遺伝子が、LacZ、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである（１１）に記載のベクター。
（１３）（９）乃至（１２）のいずれかに記載のベクターが導入された細胞。
（１４）細胞が293T細胞、ATDC5細胞、SW1353細胞、初代培養軟骨細胞、間葉系幹細胞及び胚性肝細胞（ES細胞）のなかから選ばれるいずれかの細胞である（１３）に記載の細胞。
（１５）（９）乃至（１２）のいずれかに記載のベクターが導入された動物（ヒトを除く）。
（１６）動物（ヒトを除く）がマウス又はラットである（１５）に記載の動物。
（１７）（１３）又は（１４）に記載の細胞を用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
（１８）miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（a）（１３）又は（１４）に記載の細胞に、薬剤を接触させる工程、
（b）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該レポーター活性を増加又は低下させる薬剤を選択する工程、を含む該方法。
（１９）（１）乃至（８）のいずれかに記載のDNAを用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
（２０）miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（a）（１）乃至（８）のいずれかに記載のDNAにL-Sox5、Sox6及び／又はSox9タンパク質を接触させる工程、
（b）該DNAと該タンパク質の結合を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照値と比較して、該DNAと該タンパク質の結合を増強又は減弱させる活性を有する薬剤を選択する工程、を含む該方法。
（２１）工程（b）の検出がゲルシフトアッセイである（２０）記載の方法。
（２２）miR-140の発現を制御する塩基配列を有するDNAをレポーター遺伝子の上流に機能的に結合したベクターを導入した細胞を用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
（２３）miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法が、
（a）細胞に、薬剤を接触させる工程、
（b）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該レポーター活性を増加又は低下させる薬剤を選択する工程、を含む（２２）に記載の方法。
（２４）miR-140の発現を制御する塩基配列を有するDNAを用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
（２５）miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法が、
（a）DNAにL-Sox5、Sox6及び／又はSox9タンパク質を接触させる工程、
（b）該DNAと該タンパク質の結合を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該DNAと該タンパク質の結合を増強又は減弱させる活性を有する薬剤を選択する工程、を含む（２４）に記載の方法。
（２６）工程（b）の検出がゲルシフトアッセイである（２５）に記載の方法。
（２７）miR-140の発現を制御する塩基配列を有するDNAをレポーター遺伝子の上流に機能的に結合したベクターを導入した動物（ヒトを除く）を用いた、miR-140の発現に対する薬剤の研究、判定又は評価方法。
（２８）DNAが、下記（a）乃至（c）のいずれかに記載のDNAである（２２）乃至（２７）のいずれかに記載の方法。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列からなるDNA。
（b）（a）に記載のDNAの塩基配列において１又は２の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている塩基配列からなるDNA。
（c）（a）又は（b）に記載のDNAの塩基配列を２乃至５回の繰り返し配列として含むDNA。
（２９）DNAが、下記（a）又は（b）に記載のDNAである（２２）乃至（２７）のいずれかに記載の方法。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号３又は４に記載の塩基配列からなるDNA。
（b）（a）に記載のDNAの塩基配列において１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により、該DNAに対して60%以上の、好ましくは65%以上、さらに好ましくは70%以上の相同性の範囲内で修飾された塩基配列からなるDNA。
（３０）DNAが、下記（a）又は（b）に記載のDNAである請求項（２２）乃至（２７）のいずれかに記載の方法。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号５又は６に記載の塩基配列からなるDNA。
（b）（a）に記載のDNAの塩基配列において１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により、該DNAに対して60%以上、好ましくは65%以上、さらに好ましくは70%以上の相同性の範囲内で修飾された塩基配列からなるDNA。
（３１）DNAが、下記（a）又は（b）に記載のDNAである（２２）乃至（２７）のいずれかに記載の方法。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含み、配列番号７乃至１０、４０及び４１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
（b）（a）に記載のDNAの塩基配列において１又は２の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている塩基配列からなるDNA。
（３２）レポーター遺伝子が、LacZ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである（２２）、（２３）又は（２７）のいずれかに記載の方法。
（３３）レポーター遺伝子が、LacZ、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである（３２）に記載の方法。
（３４）細胞が、293T細胞、ATDC5細胞、SW1353細胞、初代培養軟骨細胞、間葉系幹細胞及び胚性肝細胞（ES細胞）のなかから選ばれるいずれかの細胞である（２２）又は（２３）に記載の方法。
（３５）動物（ヒトを除く）が、マウス又はラットである（２７）に記載の方法。
（３６）（１７）乃至（３５）のいずれかに記載の方法で選択された薬剤。
（３７）薬剤が合成化合物である（３６）に記載の薬剤、を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るmiR-140の発現を制御する活性を有するDNA配列は、任意の遺伝子をmiR-140が発現する部位に発現させることができる他、miR-140の発現を調節する薬剤のスクリーニングに利用することができる。また、本発明のスクリーニング系で選択された薬剤は、軟骨の異常を伴う変形性関節症や椎間板変性症などの軟骨疾患の治療薬として有用であることが期待されることから、本発明は産業上非常に有用性が高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、pGL4-miR140-3k又はビークルベクターのpGL4を遺伝子導入した293T細胞のルシフェラーゼ活性に対して、共に遺伝子導入したSox9発現ベクター量の影響を評価した結果である。
【図２】図２は、pGL4-miR140-3kを遺伝子導入した293T細胞のルシフェラーゼ活性に対して、共に遺伝子導入したL-Sox5、Sox6及び／又はSox9発現ベクターの組み合わせの影響を評価した結果である。
【図３】図３は、左側が作製したレポーターベクターであり、右側がこれらを用いて遺伝子導入した293T細胞のルシフェラーゼ活性を評価した結果である。
【図４】図４は、Sox9結合コンセンサス配列と相同なパリンドロミック配列と、これに導入した変異を示した図である。
【図５】図５は、Sox9結合コンセンサス配列と相同なパリンドロミック配列又はこれに変異を導入したレポーターベクターのルシフェラーゼ活性を評価した結果である。
【図６】図６は、Sox9結合コンセンサス配列と相同なパリンドロミック配列と、これに変異を導入したプローブに対するSox9との結合活性を評価した結果である。
【図７】図７は、マウスのmiR-140発現制御領域とヒトの相同配列を比較（アラインメント）した結果である。
【図８】図８は、pGL4-miR140-LacZを導入したトランスジェニックマウスにおけるLacZの発現を評価した結果である。
【図９】図９は、pGL4、pGL4-hgmiR140-3k又はpGL4-hgmiR140-0.7kを遺伝子導入した293T細胞のルシフェラーゼ活性に対して、共に遺伝子導入したL-Sox5、Sox6及び／又はSox9発現ベクターの組み合わせの影響を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、miR-140の発現を制御するDNA、該DNAを含むレポーターベクター、該レポーターベクターを導入した細胞及び動物、並びに該DNAを利用した薬剤のスクリーニング方法等に関する。
【００１７】
本発明は、miR-140の発現を制御するDNAを提供する。当該DNAは、最小単位としてmiR-140の発現制御領域のSox9結合配列である配列番号１又は２の配列を、好ましくは配列番号３又は４を、より好ましくは配列番号５又は６の配列を含むものであり、あるいは、後述する配列番号７乃至１０、４０及び４１のいずれかのDNAであってもよい。また、本発明DNAは、配列番号１乃至６のDNAに１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により、該DNAに対して60%以上、好ましくは65%以上、さらに好ましくは70%以上の相同性の範囲内で修飾された塩基配列からなるDNAであってもよい。さらに、本発明DNAは、配列番号７乃至１０、４０及び４１のいずれかのDNAに１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入された塩基配列からなるDNAであってもよい。これらのDNAは、種に拘らず動物全般から取得することができるが、好ましくは哺乳動物から取得することができ、さらに好ましくはマウス又はヒトから取得することができる。
【００１８】
本発明は、前記DNAを含むベクターを提供する。当該ベクターは、プラスミドやウイルスなど、いかなる種類のものであってもよいが、前記DNA配列を含むベクターであって、大腸菌及び/又は哺乳動物細胞中で自立的に複製され、大腸菌及び/又は哺乳動物細胞中で機能する汎用の選択マーカーを有するものである。また、Sox9結合配列である配列番号１又は２の配列をDNAとして適用する場合には、必要に応じて繰り返し配列としてベクターに用いても良い。
【００１９】
前記選択マーカーとしては特に限定されるものではないが、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンなどに対する薬剤耐性遺伝子を好適に選択することができる。
【００２０】
本発明は、前記DNAの下流に汎用されるレポーター遺伝子が機能的に結合したベクター（レポーターベクター）を提供する。
【００２１】
前記レポーター遺伝子としては、特に限定されるものではないが、Venus、AcGFP1、AmCyan1、AsRed、BFP、CFP、dsRed、EBFG、ECFP、EGFP、EYFP、FlAsH、GFP、HcRed1、mBanana、mCherry、mOrange、mRFP1、mPlum、mRaspberry、mStrawberry、PhiYFP、RFP、tdTomato、YEP、ZsGreen1、ZsYellow1などの蛍光タンパク質遺伝子、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、Metridiaルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼ、Cypridinaルシフェラーゼなどのルシフェラーゼ遺伝子、LacZ、β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、カタラーゼなどの酵素遺伝子を好適に挙げることができる。
【００２２】
本発明は、前記レポーターベクターを導入した細胞を提供する。該レポーターベクターを導入する細胞としては、特に限定されるものではないが、動物組織から分離した初代培養細胞、汎用される樹立株細胞などを選択することができ、好ましくは293T細胞、ATDC5細胞、SW1353細胞、初代培養軟骨細胞、間葉系幹細胞、胚性肝細胞（ES細胞）などから選ぶことができる。
【００２３】
細胞へのレポーターベクターの導入は、特に限定されるものではないが、例えば、エロクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法など一般に汎用されている方法で行うことができる。
【００２４】
本発明は前記レポーターベクターを導入した動物を提供する。前記レポーターベクターを導入する動物としては、特に限定されるものではないが、トランスジェニック動物を作製可能なヒトを除く全ての動物を選択できるが、好ましくはマウス、ラットなどを選択することができる。
【００２５】
前記動物は、例えば、前記レポーターベクターを導入したES細胞を作製し、受精卵前核インジェクション法により該ES細胞を受精卵に注入するなど、公知の方法により作製することができる。
【００２６】
前記動物は、in vivoでの薬剤のmiR-140の発現に対する効果を評価するために有用である。具体的には、評価対象の薬剤を投与した当該動物の軟骨組織におけるmiR-140の発現をレポーター活性により評価することができる。この活性の強い、薬剤は軟骨疾患治療剤として効果が期待できる。
【００２７】
本発明は、前記細胞を用いたmiR-140の発現を調節する薬剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、当該細胞を薬剤と接触させて一定時間放置した後、細胞のレポーター活性を測定し、当該薬剤の非存在下で検出した陰性対照と比較することにより、当該薬剤のmiR-140の発現を増加又は低下させる活性を有する薬剤を選択することができる。この場合、L-Sox5、Sox-6及び／又はSox9を当該細胞に共発現させても良い。薬剤としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、動物組織抽出物、発酵微生物生産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、発現ベクター、合成化合物（低分子化合物及び高分子化合物を含む）、天然化合物などが挙げられる。
【００２８】
本発明は、前記DNAを用いたmiR-140の発現を調節する薬剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、当該DNAにL-Sox5、Sox6及び／又はSox9タンパク質を被験物質の共存下で接触させ、該DNAと該タンパク質の結合を検出し、薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該DNAと該タンパク質の結合を増強又は減弱させる活性を有する薬剤を選択することができる。薬剤としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、動物組織抽出物、発酵微生物生産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、発現ベクター、合成化合物（低分子化合物及び高分子化合物を含む）、天然化合物などが挙げられる。
【００２９】
前記の該DNAと該タンパク質の結合は、Electrophoretic Mobility Sift Assay（EMSA）法により検出することができる。すなわち、ラジオアイソトープやジゴキシゲニン、ビオチンなどで標識した該DNAをプローブとし、該タンパク質を接触させた後、電気泳動して、プローブのバンドのシフトとして結合活性を検出する。このとき、該タンパク質に対する抗体を更に接触させてスーパーシフトを検出することもできる。EMSA法はゲルシフトアッセイとも呼称される。
【００３０】
本発明は、前記スクリーニング方法により選択される薬剤を提供する。miR-140は軟骨分化や軟骨の恒常性維持に重要な役割を果たしていることから、該スクリーニング方法により選択される薬剤は、本発明のスクリーニング方法により選択される薬剤は変形性関節症や椎間板変性疾患などの軟骨疾患の治療薬として有用である可能性がある。
【実施例】
【００３１】
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３２】
実施例１．Sox9によるmiR-140の発現制御の検出
（１）レポーターベクターの作製
KpnI切断サイトを含むForward primer：AAGGTACCACTGTTCAGAAGGAGACTACTCTGTC（配列番号１１）とXhoI切断サイトを含むReverse primer：GCACTCGAGACCGACCTCTGCTCAGCTC（配列番号１２）を使用し、C57BL/6マウスの培養軟骨細胞のゲノムDNAを鋳型としてPolymerase Chain Reaction（PCR）を行いmiR-140の転写開始点から上流3kbpの領域のDNA断片（配列番号１０）を増幅した。すなわち、DNAポリメラーゼとしてPrimeStar HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、1×PCR反応液、0.2mmol/L
dNTP、0.2μmol/L の各プライマー、0.5UのPrimeStar HS DNA polymerase、10ngのゲノムDNAを含む反応液を調製し、98℃で2分間加熱後、98℃で10秒間、60℃で5秒間及び72℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で7分間処理してPCRを行った。増幅したDNA断片は、1×M buffer中でKpnIとXhoIで制限酵素処理した。レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を持つpGL4.12 luc2CPベクター（Promega社製）を同様に制限酵素処理した。DNA ligation kit（タカラバイオ株式会社）を使用して、増幅したDNA断片とpGL4.12 luc2CPベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニングした大腸菌を培養してプラスミドDNAを精製し、レポーターベクターpGL4-miR140-3kを得た。【００３３】
（２）レポーターアッセイ
48ウェルプレートの各ウェルに293T細胞を5×104個撒き、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM培地を用いて、37℃、5%CO2の条件に設定したインキュベーター中で培養した。24時間後、10μlのOPTI-MEM培地（Life technologies社製）に0、50、100又は400ngのpcDNA3-HA-Sox9（Sox9の発現ベクター）及びpcDNA3（ビークルベクター）を合計800ngとなるように加え、100ngのpGL4.12（ビークルベクター）或いはpGL4-miR140-3k、10ngのHSVチロシンキナーゼ（TK）プロモーターの下流にウミシイタケルシフェラーゼを持つベクターであるpRL-TK（Promega社製）及び1μlのFuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を加えて30分間室温でインキュベーションした後、培養した細胞に加えて遺伝子導入した。さらに48時間後、培養液を除き、化学発光基質のDual-Glo Luciferase Reagent（Promega社製）を40μl加えて10分間反応させた。96ウェルプレートに移し、pGL4.12あるいはpGL4-miR140-3k由来のルシフェラーゼ活性を化学発光測定装置であるWallac
1420 ARVOx（Amersham社製）にて測定した。測定後、Dual-Glo Stop & Glo Reagent（Promega社製）を20μl加えて10分間室温でインキュベーションし、pRL-TK由来のルシフェラーゼ活性を測定した。それぞれのデータはpGL4.12あるいはpGL4-miR140-3k由来のルシフェラーゼ活性をpRL-TK由来のルシフェラーゼ活性で割り算して標準化し、独立に行った3実験の平均と標準偏差を算出した。【００３４】
（３）結果
本実施例の結果を図１に示した。miR-140の発現開始点から上流3kbpの領域のDNA断片（配列番号１０）を含むレポーターベクターであるpGL4-miR140-3k（図１の上段）を遺伝子導入した細胞では、同時に遺伝子導入したSox9発現ベクターの量に依存してルシフェラーゼ活性が増加した（図１の下段右側のグラフ）。それに対し、miR-140の発現開始点から上流3kbpの領域のDNA断片を含まないビークルベクターであるpGL4.12を遺伝子導入した細胞では、ベクター量を増やしてもルシフェラーゼ活性は増加しなかった（図１の下段左側のグラフ）。以上の結果から、本実施例において取得した配列番号９の配列を有するDNA断片、当該DNA断片を組み込んだレポーターベクター及び当該レポーターベクターを導入した細胞は、Sox9発現ベクターによるmiR-140の発現制御に対する作用を評価するために有用であることがわかった。【００３５】
実施例２．Sox5、Sox6及びSox9によるmiR-140の発現制御
（１）レポーターアッセイ
48ウェルプレートの各ウェルに293T細胞を5×104個撒き、10%のFBSを含むDMEM培地を用いて、37℃、5%CO2の条件に設定したインキュベーター中で培養した。24時間後、10μlのOPTI-MEM培地にpcDNA3-HA-Sox5（L-Sox5の発現ベクター）、pcDNA3-HA-Sox6（Sox6の発現ベクター）及び／又はpcDNA3-HA-Sox9の各50ng及びpcDNA3を合計150ngとなるように適宜加え、100ngのpGL4.12あるいは実施例１で得たpGL4-miR140-3k及び10ngのpRL-TKと1μlのFuGENE HD Transfection Reagentを加えて30分間室温でインキュベーションした後、培養した細胞に加えて遺伝子導入した。遺伝子導入の24時間後に実施例１（２）と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。【００３６】
（２）結果
本実施例の結果を図２に示した。pGL4-miR140-3kを遺伝子導入した細胞にビークルベクターであるpcDNA3とL-Sox5発現ベクター又はSox6発現ベクターのみ及びL-Sox5発現ベクターとSox6発現ベクターを共に遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性は増加しなかった。同様にSox9発現ベクターを遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性は、ビークルベクターであるpcDNA3を遺伝子導入した場合と比較して高かったが、その差はわずかであった。しかし、Sox9発現ベクターと共にL-Sox5発現ベクター又はSox6発現ベクターを遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性は、Sox9発現ベクターのみの場合と比較して顕著に増加した。また、Sox9発現ベクター、L-Sox5発現ベクター及びSox6発現ベクターを全て遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性は、上述のSox9発現ベクターとL-Sox5発現ベクター又はSox6発現ベクターを遺伝子導入した細胞と比較して更に高かった。それに対し、ビークルベクターであるpGL4.12を遺伝子導入した細胞では、いずれの組み合わせのSoxを遺伝子導入してもルシフェラーゼ活性は増加しなかった。以上の結果から、本実施例において使用した配列番号１０の配列を有するDNA断片、当該DNA断片を組み込んだレポーターベクター及び当該レポーターベクターを導入した細胞は、Sox9発現ベクター、L-Sox5発現ベクター及びSox6発現ベクターの組み合わせによるmiR-140の発現制御に対する作用を評価するために有用であることがわかった。【００３７】
実施例３．miR-140の発現制御領域の解析
（１）レポーターベクターの作製
XhoI切断サイトを含む表１のForward
primerのいずれかと、BglIIサイトを含むReverse
primer：GCAAGATCTACCGACCTCTGCTCAGCTC（配列番号２０）を使用し、pGL4-miR140-3kを鋳型としてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。すなわち、1×PCR反応液、0.2mmol/L dNTP、0.2μmol/L
の各プライマー、0.5UのPrimeStar HS DNA
polymerase、10ngのpGL4-miR140-3kを含む反応液を調製し、98℃で2分間加熱後、98℃で10秒間、60℃で5秒間及び72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で7分間処理してPCRを行った。増幅したDNA断片は、1×H buffer中でXhoIとBglIIで制限酵素処理した。レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を持つpGL4.12 luc2CPベクターを同様に制限酵素処理した。ligation mixを使用して増幅したDNA断片とpGL4.12 luc2CPベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニング後の大腸菌を培養してプラスミドDNAを精製し、表１のレポーターベクターを得た（図３の左側）。【００３８】
【表１】
2013151058.tif 000003
【００３９】
（２）レポーター活性の測定
実施例２（１）と同様にして前記レポーターベクターのルシフェラーゼ活性を測定した。実施例１で作製したpGL4-miR140-3kも同時に測定した。【００４０】
（３）結果
本実施例の結果を図３（右側のグラフ）に示した。pGL4-miR140-1kはpGL4-miR140-3kと同等のルシフェラーゼ活性を有していた。pGL4-miR140-0.8k 及びpGL4-miR140-0.7kではL-Sox5、Sox6及びSox9を遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性がpGL4-miR140-3kと比較して低下したが、Sox9のみを遺伝子導入した細胞のルシフェラーゼ活性はpGL4-miR140-3kと同等であった。pGL4-miR140-0.6k、pGL4-miR140-0.5k、pGL4-miR140-0.4k及びpGL4-miR140-0.3kのルシフェラーゼ活性は、L-Sox5、Sox6及びSox9を遺伝子導入した細胞、Sox9のみを遺伝子導入した細胞共に顕著に低下した。以上の結果から、本実施例において活性を有していた配列番号７〜１０の配列を有するDNA断片、当該DNA断片を組み込んだレポーターベクター及び当該レポーターベクターを導入した細胞は、Sox9発現ベクター、L-Sox5発現ベクター及びSox6発現ベクターの組み合わせによるmiR-140の発現制御に対する作用を評価するために有用であることがわかった。さらに、miR-140の転写開始点から上流-936から-652bpのDNA配列（配列番号５）はL-Sox5、Sox6及びSox9によるmiR-140の発現制御に必須の領域であり、特に-739から-652bpの間の配列（配列番号３）にこれらによる発現制御に必須の領域が存在することが示唆された。そこで、-739から-652bpの配列を精査しSox9が結合するコンセンサス配列のパリンドロミックな相同配列を見出した（図４の枠内の最上段、配列番号１）。【００４１】
実施例４．Sox結合領域によるmiR-140の発現制御
（１）pGL4-miR140-PSBの作製
XhoI切断サイトを含むForward primer：GAACTCGAGGTATTTGCACAAGGCTGGAC（配列番号１５）とBglIIサイトを含むReverse primer：GCAAGATCTAGACCTGGCTGGCTCCAT（配列番号２１）及び鋳型としてpGL4-miR140-0.7kを使用し、実施例３（１）と同様にして図４（上段）のレポーターベクターpGL4-miR140-PSBを得た。【００４２】
（２）Site-directed mutagenesis法
前記のSox9結合配列に変異を導入したレポータープラスミドをSite-directed mutagenesis法により作製した。すなわち、1×PCR buffer、0.2mmol/LのdNTP、1UのNative Pfu
DNA polymerase及び表２の組み合わせの各プライマーを含む反応液中に、miR140-PSB-mut1、mut2作製時は20ngのpGL4-miR140-PSB、mut3作製時は20ngのpGL4-miR140-PSB-mut1を鋳型とし、95℃で2分処理後、95℃で30秒、50℃で1分、68℃で10分を18サイクルの条件でPCRを行った。PCR産物にDnpIを加えて37℃で1時間制限酵素処理した。pGL4.12 luc2CPベクターを同様に制限酵素処理した。ligation mix（タカラバイオ社製）を使用して増幅したDNA断片とpGL4.12 luc2CPベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニング後の大腸菌を培養してプラスミドDNAを精製し、表２及び図４（上段）のレポーターベクターを得た。【００４３】
【表２】
2013151058.tif 000004
【００４４】
（３）レポーターアッセイ
実施例２（１）と同様にして前記レポーターベクターのルシフェラーゼ活性を測定した。【００４５】
（４）結果
本実施例の結果を図４に示した。Sox9結合配列を含むmiR140-PSB（配列番号３）を結合したレポーターベクターを導入した細胞では、L-Sox5、Sox6及びSox9を遺伝子導入することによりルシフェラーゼ活性が増加したが、Sox9結合配列に変異を導入したレポータープラスミドであるmiR140-PSB-mut1、miR140-PSB-mut2及びmiR140-PSB-mut3では、L-Sox5、Sox6及びSox9を遺伝子導入しても、いずれもルシフェラーゼ活性の増加は認められなかった。したがって、上述のSox9結合配列は、miR-140のSoxによる発現調節に必須であることが明らかとなった。また、本実施例において取得したmiR140-PSB（配列番号３）の配列を有するDNA断片、当該DNA断片を組み込んだレポーターベクター及び当該レポーターベクターを導入した細胞は、Sox9発現ベクターによるmiR-140の発現制御に対する作用を評価するために有用であることがわかった。【００４６】
実施例５．Sox結合配列のSox9結合活性
（１）プローブの作製
表３に示した配列のセンスオリゴとアンチセンスオリゴを合成した。1×Protruding End Kinase buffer、0.4μmol/Lのセンスオリゴ或いはアンチセンスオリゴ、1UのT4 Polynucleotide Kinase（Toyobo社製）の反応液中にP32γATPを加えて37℃、1時間反応させた。それぞれの反応を終えたセンスオリゴとアンチセンスオリゴを混和し、99℃で10秒インキュベーションした後、1時間かけて徐々に室温に戻して、ラジオアイソトープ（RI）標識された二本差DNAを作製した。RI標識プローブはProbeQuant G-50 Micro Columnで精製して使用した。【００４７】
【表３】
2013151058.tif 000005
【００４８】
（２）Electrophoretic Mobility Sift Assay（EMSA）
20mmol/LのHEPES（pH7.9）、10%のGlycerol、50mmol/LのKCl、0.05%のNP-40、0.5mmol/LのEDTA、0.5mmo/LのDTT、1mmol/LのPMSF及び0.25μgのPoly dG-dCを含む反応液にリコンビナントSox9（rSox9）及び／又は抗Sox9抗体（Millipore社製）を0.1μg適宜加えて30分室温でインキュベーションした。その後、RI標識した前記プローブを加え、30分室温でインキュベーションした後、4%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、泳動後、画像解析装置であるFLA-7000（富士フィルム社製）を使用してRIを検出した。【００４９】
（３）結果
本実施例の結果を図６に示した。miR-140-PSBプローブでは、rSox9とインキュベーションするとバンドのシフトが観察され、更に抗Sox9抗体とインキュベートすることによりバンドのスーパーシフトが観察された。パリンドロミックなSox9結合配列の左側に変異を導入したmiR-140-PSB-mut2をプローブとした場合、バンドのシフトが観察されたが、右側又は両側に変異を導入したmiR-140-PSB-mut1とmiR-140-PSB-mut3をプローブとした場合、バンドのシフトは消失した。以上の結果から、配列番号１のパリンドロミックなSox9結合配列は、Sox9の結合に必須であることが明らかとなった。また、配列番号１の配列を有するDNAは、Sox9との結合活性を評価するためのプローブとして有用であることがわかった。【００５０】
実施例５．miR-140の発現制御領域のマウスとヒトの配列比較
配列番号５のマウスのDNA配列をヒトの相同配列（配列番号６）と比較（アラインメント）した結果を図７に示した。配列は、The European Molecular Biology Open Software Suiteが提供する配列比較ソフトであるEMBOSS needle（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）により比較した。両配列の相同性は71.5%（330塩基中236塩基が一致）であった。そのうち、本発明において同定したSox結合配列（図７の枠内、配列番号１及び２）は、17塩基中16塩基（94.1%）が一致した。また、上述のmiR140-PSBの87bpの領域（配列番号３）のヒトの相同配列（配列番号４）との相同性は72.2%（90塩基中65塩基が一致）であった。したがって、本実施例において明らかにしたmiR-140発現制御領域のヒト相同配列のDNA断片、当該DNA断片を組み込んだレポーターベクター及び当該レポーターベクターを導入した細胞は、miR-140の発現制御に対する薬剤の作用を評価するために有用である。【００５１】
実施例６．トランスジェニックマウスにおけるmiR-140の発現制御
（１）レポータープラスミドの作製
HindIII切断サイトを含むForward
primer：CCAAGCTTGGCCGCAGACCGTGCATCATGA（配列番号３６）とNcoIサイトを含むReverse primer：CATGCCATGGCATGCAGCTTGGGCCCTCGAG（配列番号３７）を使用し、10ngのpAxCAiLacZ（タカラバイオ社製）を鋳型としてPCRを行った。すなわち、PrimeStar HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）を使用し、1×PCR反応液、0.2mmol/LのdNTP、0.2μmol/Lの各プライマー、0.5UのPrimeStar HS DNA polymerase及び10ngのゲノムDNAを含む反応液を98℃で2分間後、98℃で10秒間、60℃で15秒間、72℃で4分間を25サイクル及び72℃で5分間の条件でPCRを行い、LacZのDNA断片を増幅した。DNA断片は1×M buffer中で制限酵素であるHindIIIとNcoIにより制限酵素処理した。pGL4.12 luc2CPを同様に制限酵素処理した。ligation mix（タカラバイオ社製）を使用して増幅したDNA断片とpGL4.12 luc2CPベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニング後の大腸菌を培養してプラスミドDNAを調製し、レポーターベクターpGL4-LacZを得た。【００５２】
pGL4-miR140-3kをNotIとXhoIで酵素処理し、目的のmiR140-3kを含むDNA断片をMinElute Gel Extraction kitにて精製した。pcDNAを同様に処理した。ligation mixを使用して増幅したDNA断片とpcDNA3ベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニング後の大腸菌を培養してプラスミドDNAを調製し、目的のDNA断片をクローニングしたベクターを得た。作製したベクターをKpnIとXbaIで制限酵素処理し、目的のDNA断片をMinElute Gel Extraction kitにより精製した。pGL4-LacZをKpnIとNheIで制限酵素処理し、MinElute Gel Extraction kitにより精製した。ligation
mixを使用して増幅したDNA断片とpGL4-LacZベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニング後の大腸菌を培養してプラスミドDNAを精製し、レポーターベクターpGL4-miR140-3k-LacZを得た。【００５３】
（２）トランスジェニックマウスの作製
作製したレポーターベクターをKpnIとNcoIで制限酵素処理し、miR140-3k-LacZのDNA断片を取得した（図８の上段）。このDNA断片をES細胞に導入し、受精卵前核インジェクション法によりトランスジェニックマウスを作製した。【００５４】
（３）in situ染色
トランスジェニックマウスの羊膜よりゲノムDNAを取得し、Forward primer：GGTGCTTTGTGAAGGGAAAG（配列番号３８）とreverse primer：GTTGCACCACAGATGAAACG（配列番号３９）を使用してPCRを行い、レポーターベクターを有する個体を選択した。すなわち、1×Green GoTaq Flexi buffer、0.25mmol/LのMgCl2、0.16mmol/LのdNTP、0.2mmol/Lの各プライマー及び0.6UのGoTaq Hot Start Polymeraseを含む反応液を調製しPCRを行った。選択した個体は1%のパラホルムアルデヒド、0.2%のグルタールアルデヒド及び0.02%のNP-40を含むリン酸緩衝生理食塩液（PBS）中で、4℃で30分間固定した。1mmol/LのMgCl2を含むPBSで洗浄後、0.01%のSodium Deoxycholate、0.02%のNP-40、1mol/LのMgCl2、5mmol/LのK4Fe(CN)6、5mmol/LのK3Fe(CN)6及び0.1%の X-Galを含むPBSに浸し、37℃で16時間インキュベーションして発色した。【００５５】
（４）結果
本実施例の結果を図８に示した。E12.5日齢及びE15.5日齢の胎児において、前肢、後肢の他、肋骨や脊椎の軟骨組織がLacZ活性を示すX-gal染色によって染色され、この領域が軟骨特異的に発現するmiR-140の発現制御領域であることが明らかとなった。したがって、本実施例において作製されたトランスジェニックマウスは、miR-140の発現を制御する薬剤の活性を評価するために有用である。【００５６】
実施例７．ヒトのmiR-140発現制御領域の機能確認
（１）レポーターベクターの作製
HindIII切断サイトを含むForward
primer：CCCAGCTTGGGACTCCAAATTGCATTATCGAGAAAC（配列番号４２）とNcoIサイトを含むReverse primer：CATGCCATGGCATGAGTGCCTCCGCTCAGCTCCG（配列番号４３）を使用し、ヒトの培養軟骨細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、ヒトmiR-140転写開始点から上流3kbpの領域のDNA断片（配列番号４０）を増幅した。すなわち、1×PCR反応液、0.2mmol/L
dNTP、0.2μmol/L の各プライマー、0.5UのPrimeStar HS DNA polymerase、10ngのゲノムDNAを含む反応液を調製し、98℃で2分間加熱後、98℃で10秒間、60℃で5秒間及び72℃で3分間のサイクルを35回繰り返した後、72℃で7分間処理してPCRを行った。増幅したDNA断片は、1×M buffer中でHindIIIとNcoIで制限酵素処理した。レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を持つpGL4.12 luc2CPベクターを同様に制限酵素処理した。ligation mixを使用して増幅したDNA断片とpGL4.12 luc2CPベクターをライゲーションし、コンピテントセルとした大腸菌に形質転換してDNA断片が組み込まれたベクターをクローニングした。クローニング後の大腸菌を培養してプラスミドDNAを精製し、レポーターベクターpGL4-hgmiR140-3kを得た。【００５７】
また、HindIII切断サイトを含むForward
primer：CCCAAGCTTGGGGTTTTCTCAAGCCGACACTGAGC（配列番号４４）とNcoIサイトを含むReverse primer：CATGCCATGGCATGAGTGCCTCCGCTCAGCTCCG（配列番号４５）を使用し、pGL4-hgmiR140-3kを鋳型としてPCRを行い、ヒトmiR-140転写開始点から上流0.7kbpの領域のDNA断片（配列番号４１）を増幅した。すなわち、1×PCR反応液、0.2mmol/L dNTP、0.2μmol/L の各プライマー、0.5UのPrimeStar HS DNA polymerase、10ngのゲノムDNAを含む反応液を調製し、98℃で2分間加熱後、98℃で10秒間、60℃で5秒間及び72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で7分間処理してPCRを行った。増幅したDNA断片を同様にしてクローニングし、レポーターベクターpGL4-hgmiR140-0.7kを得た。【００５８】
（２）レポーター活性の測定
実施例２（１）と同様にして前記レポーターベクターのルシフェラーゼ活性を測定した。【００５９】
（３）結果
本実施例の結果を図９に示した。実施例５で明らかにしたヒトの相同配列を含む、ヒトのpri-miR-140転写開始点の上流領域をクローニングしたレポーターベクターであるpGL4-hgmiR140-0.7ｋ又はpGL4-hgmiR140-3kを導入した細胞でも、それに対応するマウスのpri-miR-140転写開始点の上流領域をクローニングした実施例３のpGL4-miR140-0.7ｋ又はpGL4-miR140-3kと同様に、Sox9を遺伝子導入することによりルシフェラーゼ活性が増加し、L-Sox5及び／又はSox6をさらに遺伝子導入することによりさらにルシフェラーゼ活性が増強された。以上の結果から、実施例５で明らかにしたヒトの相同配列は、ヒトのmiR-140発現制御領域として機能することが示され、配列番号４０又は４１の配列を有する遺伝子断片、当該DNAを組み込んだレポーターベクター及び当該レポーターベクターを導入した細胞は、ヒトのmiR-140の発現制御に対する薬剤の作用を評価するために有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、miR-140の発現を制御する活性を有するDNA、該DNAを含むレポーターベクター、該レポーターベクターを導入した細胞及び動物、並びにmiR-140の発現を制御する薬剤のスクリーニング系等が提供される。該DNA配列は、任意の遺伝子をmiR-140が発現する部位に発現させることができる他、miR-140の発現を調節する薬剤のスクリーニングにも利用することができる。また、該スクリーニング系で選択された薬剤は、軟骨の異常を伴う変形性関節症や椎間板変性症などの軟骨疾患の治療薬として期待されることから、本発明は産業上非常に有用性が高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月3日(2014.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-140の発現を制御する活性を有する、下記（a）乃至（g）のいずれかに記載のDNA。
（a）配列番号１又は２に記載の塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号３又は４に記載の塩基配列からなるDNA。
（c）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号５又は６に記載の塩基配列からなるDNA。
（d）配列番号１又は２に記載の塩基配列を含む配列番号７乃至１０、４０及び４１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
（e）上記（a）に記載のDNAの塩基配列において１個又は２個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されている塩基配列からなるDNA。
（f）上記（a）又は（e）に記載のDNAの塩基配列を２乃至５回の繰り返し配列として含むDNA。
（g）上記（b）乃至（d）及び（f）のいずれかに記載のDNAの塩基配列において１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入により、該DNAに対して60%以上の相同性の範囲内で修飾された塩基配列からなるDNA。
【請求項２】
請求項１記載の（a）又は（e）に記載のDNA。
【請求項３】
請求項１記載の（f）に記載のDNA。
【請求項４】
請求項１記載の（b）又は（g）に記載のDNA。
【請求項５】
請求項１記載の（c）又は（g）に記載のDNA。
【請求項６】
請求項１記載の（d）又は（g）に記載のDNA。
【請求項７】
請求項１、４乃至６のいずれか一項の（g）に記載のDNAに対する相同性の範囲が65%以上であるDNA。
【請求項８】
請求項１、４乃至６のいずれか一項の（g）に記載のDNAに対する相同性の範囲が70%以上であるDNA。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAの下流にレポーター遺伝子が機能的に結合している、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
レポーター遺伝子が、LacZ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、LacZ、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパクである請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項９乃至１２のいずれか一項に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１４】
細胞が293T細胞、ATDC5細胞、SW1353細胞、初代培養軟骨細胞、間葉系幹細胞及び胚性肝細胞（ES細胞）の中から選ばれるいずれかの細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項９乃至１２のいずれか１項に記載のベクターが導入された動物（ヒトを除く）。
【請求項１６】
動物（ヒトを除く）がマウス又はラットである請求項１５に記載の動物。
【請求項１７】
請求項１３又は１４に記載の細胞を用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（a）請求項１３又は１４に記載の細胞に、薬剤を接触させる工程、
（b）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該レポーター活性を増加又は低下させる薬剤を選択する工程、を含む該方法。
【請求項１９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAを用いた、miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
miR-140の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（a）請求項１乃至８のいずれか一項に記載のDNAにL-Sox5、Sox6及び／又はSox9タンパク質を接触させる工程、
（b）該DNAと該タンパク質の結合を検出する工程、及び
（c）薬剤の非存在下で検出した対照と比較して、該DNAと該タンパク質の結合を増強又は減弱させる活性を有する薬剤を選択する工程、を含む該方法。
【請求項２１】
工程（b）の検出がゲルシフトアッセイである請求項２０記載の方法。
【国際調査報告】
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