(57)【要約】【課題】優れた抗癌作用を有する新規化合物及び温熱治療上有用な薬剤及び該薬剤を用いた温熱治療方法を提供する。【解決手段】式（１）；【化１】2009133618.tif 000012（式（１）中、Ｒ1は、アルキル基、シアノ基、アシル基、水酸基であり、Ｒ2はＳｉＲ3で表される基であり、ここでＲは炭素数１ないし４の直鎖又は分枝アルキル基であり、３個のＲはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。）で表される化合物及び該化合物を有効成分として含有する温熱治療用薬剤。【選択図】なし
2009133618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）；
【化１】
2009133618.tif 000010
（式（１）中、Ｒ1は、アルキル基、シアノ基、アシル基、水酸基であり、Ｒ2はＳｉＲ3で表される基であり、ここでＲは炭素数１ないし４の直鎖又は分枝アルキル基であり、３個のＲはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。）
で表される化合物。
【請求項２】
式（１）；
【化２】
2009133618.tif 000011
（式（１）中、Ｒ1は、シアノ基又は水酸基であり、Ｒ2はＳｉＲ3で表される基であり、ここでＲはイソプロピル基である。）
で表される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する抗癌用薬剤。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する温熱治療用薬剤。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有するアポトーシス増強剤。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する薬剤を用いた癌治療方法。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する薬剤を用いた温熱治療方法。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する薬剤を用いたアポトーシス増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物ベンゾシクロブテン誘導体を有効成分として含有する温熱アポトーシス増強活性剤に関する。詳細には、上記化合物を含有する、温熱アポトーシス増強活性が有効な癌に対する有効な治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、温熱療法が癌治療の1つの方法として用いられてきた。この温熱療法は細胞の温度に対する抵抗性と正常組織と癌細胞の血管構造の違いから可能になっている。即ち、癌組織は急速に発育するために必要な酸素やエネルギーを多量に必要とするため新生血管が増殖している。これは、通常の神経支配を受けていないため、組織が高温環境に曝された場合でも血流を増加させ蓄積された熱を逃すことができない。ゆえに、癌細胞は温度４３ないし４５℃で活動を停止し壊死することが知られている。【０００３】
種々の組織学的悪性腫瘍に対する局所温熱療法は、抗腫瘍効果において有望な展開を示している。即ち、悪性腫瘍に対する温熱及び化学療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）との併用は、副作用が少なく繰り返し治療が可能であり、他の治療法と併用することでその効果を向上させ、治療が困難な腫瘍にも有効であるとして注目されている。これは癌細胞が熱の影響を受けてアポトーシスを起こしやすいことを利用したものであり、これを促進する薬物は有望な抗癌薬候補となり得る。また、種々の固形腫瘍に対する放射線又は化学療法に温熱を併用することは、非常に効果的であるとされてきている（非特許文献１）。しかしながら、腫瘍細胞の根絶は、生物学的及び技術的な困難を伴うため、必ずしも十分に達成されるものではない。これらの困難を克服するため、温熱誘発アポトーシスを増強する画期的薬剤、いわゆる「温熱増感剤」の危急な開発が求められている。【０００４】
【非特許文献１】西日本新聞２００６年９月４日特集記事“患者に優しいがん温熱療法  症状緩和しＱＯＬ向上”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた抗癌作用を有する新規化合物の及び温熱治療上有用な薬剤及び該薬剤を用いた温熱治療方法の提供を課題とする。【０００６】
具体的には本発明は、常温で毒性を示さない一方、温熱条件下で細胞毒性を示す温熱増感剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、下記新規化合物が、抗癌作用及び温熱療法に優れた効果を有することを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
即ち、本発明は、以下を提供する。
（１）式（Ｉ）；
【化１】
2009133618.tif 000003
（式（Ｉ）中、
Ｒ1は、アルキル基、シアノ基、アシル基、水酸基であり、
Ｒ2はＳｉＲ3で表される基であり、ここでＲは炭素数１ないし４の直鎖又は分枝アルキル基であり、３個のＲはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。）
で表される化合物である。
（２）式（Ｉ）；
【化２】
2009133618.tif 000004
（式（Ｉ）中、
Ｒ1は、シアノ基又は水酸基であり、
Ｒ2はＳｉＲ3で表される基であり、ここでＲはイソプロピル基である。）
で表される（１）に記載の化合物。
（３）（１）に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
（４）（１）に記載の化合物を有効成分として含有する抗癌用薬剤。
（５）（１）に記載の化合物を有効成分として含有する温熱治療用薬剤。
（６）（１）に記載の化合物を有効成分として含有するアポトーシス増強剤。
（７）（１）に記載の化合物を有効成分として含有する薬剤を用いた癌治療方法。
（８）（１）に記載の化合物を有効成分として含有する薬剤を用いた温熱治療方法。
（９）（１）に記載の化合物を有効成分として含有する薬剤を用いたアポトーシス増強方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のベンゾシクロブテン誘導体は、癌治療のための新しい化学療法剤創製を可能とする。
また、本発明のベンゾシクロブテン誘導体は、癌の温熱療法への応用として新しい温熱治療用薬剤を可能とする。
本発明の新規化合物は、温熱療法において優れた抗癌作用を有し、医薬品として有効利用することができる。また、必要であれば大量生産することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ミトコンドリアカスパーゼ経路及び［Ｃａ2+］i依存性経路を示す模式図である。
【図２】図２は、細胞を温熱（４４℃、２０分間）で処理した後又は処理なしで、３７℃において６時間恒温培養したときの、ベンゾシクロアルケン誘導体１０μＭ濃度でのＤＮＡ断片化に対する効果を示したものである。
【図３】図３は、細胞を温熱（４４℃、２０分間）で処理した後又は処理なしで、３７℃において６時間恒温培養したときのＢＣ２の濃度変化に伴うＤＮＡ断片化に対する効果について示したものである。
【図４】図４は、細胞を温熱（４４℃、２０分間）で処理した後又は処理なしで、３７℃において６時間恒温培養したときのＢＣ４の濃度変化に伴うＤＮＡ断片化に対する効果について示したものである。
【図５】図５は、温熱誘発ＤＮＡ断片化の増強効果及び光学異性体での効果の比較を示した図である。
【図６】図６は、温熱誘発ＤＮＡ断片化の増強効果及び光学異性体での効果の比較を示した図である。
【図７】図７は、ＢＣ２又はＢＣ４について温熱処理単独及び薬剤との併用処理後の細胞形態変化を、光学顕微鏡を用いて、ギムザ法で試験したものである。
【図８】図８は、アネキシンＶ／ＦＩＴＣ及びＰＩの二重染色を利用したフローサイトメトリーにより、アネキシンＶ／ＦＩＴＣのみで染色された早期アポトーシス細胞の比率を示す図である。
【図９】図９は、ＨＥ染色法を用いた評価での細胞内スーパーオキシドレベルを表す図である。
【図１０】図１０は、臭化エチジウム（酸化型ＨＥ）染色細胞の分布を示す（白抜き：無処理の細胞、灰色：温熱単独処理の細胞、黒色：薬剤併用処理の細胞）。
【図１１】図１１は、細胞のフラクションのスーパーオキシド量（％）を示す。
【図１２】図１２は、ＢＣ２又はＢＣ４の存在下温熱処理による細胞内ＭＭＰ変化についてのＴＭＲＭ染色によるフローサイトメトリー測定結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＢＣ２又はＢＣ４の存在下温熱処理による細胞内カスパーゼ-３活性変化についてのＦＩＴＣ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫによるフローサイトメトリー測定結果を示す図である。
【図１４】図１４は、ＢＣ２又はＢＣ４の存在下温熱処理による細胞内カスパーゼ-８活性変化のフローサイトメトリー測定結果を示す図である。
【図１５】図１５は、アポトーシス関連タンパク質の分析のため、ＢＣ２、温熱、及びこれらの併用処理後６時間の細胞を収集したＢｉｄ、Ｂｃｌ-２、Ｂａｘ及びβ-アクチンの発現を示す図である。
【図１６】図１６は、アポトーシス関連タンパク質の分析のために、ＢＣ４、温熱及びこれらの併用処理後６時間の細胞を収集した結果（Ｂｉｄ、Ｂｃｌ-２、Ｂａｘ及びβ-アクチン発現）を示す図である。
【図１７】図１７は、２０μＭ濃度の薬剤単独処理と温熱併用処理後６時間の、細胞中のＡＴＰ濃度を測定した結果を示す図である。
【図１８】図１８は、Ｕ９３７細胞において温熱処理（４４℃、２時間）後６時間でのＨｓｐ７０の誘導結果を示す図である。
【図１９】図１９は、Ｆａｓの表面化の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、温熱単独処理及びＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理の場合における［Ｃａ2+］iを示す細胞のＦｕｒａ-2蛍光のデジタルイメージングを示す図である。
【図２１】図２１は、５回の実験から任意に選択した１００個の細胞中の、温熱単独処理及びＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理後の［Ｃａ2+］iのヒストグラムを示す図である。
【図２２】図２２は、細胞を処理して、５０μＭ  ＢＡＰＴＡ-ＡＭの存在下で６時間恒温培養を行った、ＢＡＰＴＡ-ＡＭ存在下におけるＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用により誘起されるＤＮＡ断片化の阻害率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明のベンゾシクロブテン誘導体及びその治療剤について詳述する。【００１２】
アポトーシスは、遺伝子で制御された細胞死であり、全ての組織中で起こる生理現象であり、また成長と恒常性維持にとって重要なものである。アポトーシスは、温熱誘導による細胞子のひとつのメカニズムとして提唱されている。最近、人リンパ腫細胞株Ｕ９３７の温熱誘発アポトーシスは、細胞内スーパーオキシドの派生と細胞内カルシウム濃度［Ｃａ2+］iの増加に関連していることが報告されている。加えて、温熱誘発アポトーシスは、温度依存性フリーラジカル発生剤や細胞内過酸化水素発生剤６-ホルミルプテリンによるＵ９３７細胞内での過剰な酸化ストレスによって増強される。従って、活性酸素種（ＲＯＳ）は、温熱誘発アポトーシスの細胞内メディエーターとして、重要な役割を演じている。【００１３】
そこで、発明者らは、ＴＩＰＳ基を有する幾つかのベンゾシクロブテン誘導体について、新たな生物活性の発見を求めて検討を行った結果、ＴＩＰＳ基を有する新規合成薬剤フラン融合四環系化合物が、Ｕ９３７細胞中でのスーパーオキシド及び過酸化水素を誘導することを見出した。ベンゾシクロブテン誘導体はレドックスアクティブな化学構造を含んでいるため、細胞内ＲＯＳ発生を誘起する可能性が考えられる。【００１４】
本発明の化合物は、以下に示す式（１）、
【化３】
2009133618.tif 000005
（式（Ｉ）中、
Ｒ1は、アルキル基、シアノ基、アシル基、水酸基であり、
Ｒ2はＳｉＲ3で表される基であり、ここでＲは炭素数１ないし４の直鎖又は分枝アルキル基であり、３個のＲはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。）
で表される化合物である。
以下に、本発明の化合物の好ましい例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【化４】
2009133618.tif 000006
【００１５】
本発明のベンゾシクロブテン誘導体（ＢＣｓ）の温熱アポトーシスに対する効果は、ベンゾシクロブテン誘導体に特異的なものであると考えられる。これは、ベンゾシクロペンテン（５員環、ＢＣ６）、ベンゾシクロヘキセン（６員環、ＢＣ７）の同族体や開環型の類似体（ＢＣ１）がＤＮＡ断片化について活性を示さなかったことから考えられる。本発明のベンゾシクロブテン誘導体であるＢＣ２及びＢＣ４の温熱誘発アポトーシス増強効果は、高度に歪みのかかった４員環が特徴であるベンゾシクロブテン骨格の化学的物理的性質に関連するものと思われる。これらの化合物の最も重要の特徴のひとつとして、光や熱といった物理的刺激で誘発される４π電子環状反応を経由する、ベンゾシクロブテン、オルトキノジメタン（ＱＭｓ）の相互変換が挙げられる。
【化５】
2009133618.tif 000007
これらのＱＭｓは様々な有機分子に対して極めて高い反応性を示すことが知られており、これらの化学種は、たとえ極低濃度でしか存在しないとしても、細胞内分子と相互作用することが考えられる。【００１６】
そこで、ＢＣ４の両方の光学活性エナンチオマー（ＢＣ４-Ｓ及びＢＣ４-Ｒ）を調製し、これらエナンチオマーの生物活性をラセミ体であるＢＣ４と比較した。１０μＭ及び２０μＭ濃度において、ラセミ体ＢＣ４とその２種の光学活性体（ＢＣ４-Ｓ及びＢＣ４-Ｒ）が示すＤＮＡ断片化のパーセンテージは、いずれの場合も同様であった。このことは、本発明のベンゾシクロブテン誘導体（ＢＣｓ）と温熱の併用で発生した高反応性ＱＭｓが実質的な生物活性分子となっている可能性を示唆するものである（図５及び図６）。【００１７】
温熱条件下でのアポトーシス誘導活性の強さはＢＣ２とＢＣ４でほぼ同等であるが、ＢＣ４は、温熱処理なしでも比較的高濃度で（５０μＭ）強い活性を発現している（図３及び図４）。【００１８】
活性酸素種（ＲＯＳ）で引き起こされる細胞内酸化ストレスは、アポトーシス誘発において引き金の役割を果たす。細胞に対する熱的ストレスは、様々な細胞種及び腫瘍組織内のスーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素といったＲＯＳを誘発する。最近発明者らは、Ｕ９３７細胞の温熱誘発アポトーシスが、細胞内スーパーオキシド生成の増大に関連する幾つかの薬剤により増強されるという知見を見出している。温熱による細胞内ＲＯＳの増大は、温熱誘発細胞障害の主要なメカニズムであり、癌治療における温熱療法の合理性を示す一つの理由と考えられている。細胞内スーパーオキシド発生剤であるＢＣ２及びＢＣ４は、そのような温熱誘発アポトーシスに対する適切な化学増感剤となり得る。【００１９】
細胞内システインプロテアーゼの一種であるカスパーゼは、アポトーシスを起こす主要な実行因子である。カスパーゼ活性化に繋がる２つの経路が、これまでに知られている。外因性の経路としてＦａｓのような細胞表面レセプターの相互作用があり、カスパーゼ-８により制御され、これは順に下方のエフェクターカスパーゼを活性化する。内因性の経路は、ミトコンドリア膜の透過性の亢進とシトクロムｃを含むミトコンドリアタンパク質の放出を必要とする。シトクロムｃはＡｐｓｆ-１と共に機能してカスパーゼ-９の活性化を誘発し、その結果アポトーシスのカスパーゼカスケードを開始する。これら２つのアポトーシス経路は、カスパーゼ-８により介在されるＢｉｄの開裂がミトコンドリア経路活性化の引き金となることで、相互に結びついている。【００２０】
本発明のベンゾシクロアルケン誘導体（ＢＣｓ）は、ＭＭＰの低下、シトクロムｃのサイドゾルへの放出、カスパーゼ-８とカスパーゼ-３の活性化を示す細胞数の増大が観察された。これらの結果は、ＢＣ２及びＢＣ４の温熱誘発アポトーシス増強効果が、カスパーゼ依存性ミトコンドリア経路の活性化に起因することを示す。【００２１】
Ｂｃｌ-２に属するタンパク質は、ミトコンドリアとの相互作用によりプロアポトーシス又はアンチアポトーシス過程に関わっている。その中で、Ｂｃｌ-２とＢｃｌ-ＸＬはアンチ-アポトーシスに、ＢａｘとＢｉｄはプロアポトーシスに関わることが知られている。
Ｕ９３７細胞中のＢｃｌ-２又はＢｃｌ-ＸＬの過剰発現は、幾つかの周辺刺激で誘発されるアポトーシスを阻害し得ることが報告されている。本発明の化合物は、ウェスタンプロット分析で示されたようにＢｃｌ-２とＢａｘの発現に変化はなかった。しかしながら、Ｂｉｄの発現は併用処理によって有意に減少した。Ｂｉｄは、カスパーゼ-８により開裂されるＢＨ３ドメインを含んだプロ-アポトーシスＢｌｃ-２属であり、カルボキシ末端フラグメントとしての開裂Ｂｉｄは、ミトコンドリアに移動して、シトクロムｃの放出を誘発させる。これはＢａｘよりも５００倍強い。これらのデータは、活性化カスパーゼ-８によるＢｉｄの活性化がアポトーシス増強におけるミトコンドリア経路活性化に寄与するメカニズムの１つであることを示唆している。【００２２】
Ｆａｓの活性化が、ＲＯＳに関連するアポトーシス誘発に関わっている。
Ｆａｓ／ＴＮＦ-Ｒ１は、カスパーゼカスケードの直接的活性化、あるいはカスパーゼカスケードの直接的活性化、あるいはカスパーゼ-８とＢｉｄの活性化によるミトコンドリアを通してアポトーシスの引き金となり得る。今回の研究では、アポトーシス増強におけるスーパーオキシドの関与が、部分的にＦａｓの活性化で仲介されていることが示された。【００２３】
Ｆａｓの活性化は、Ｈｓｐ７０発現の下向き制御に関連していることが知られている。アポトーシスシグナルの下流におけるミトコンドリアでは、Ｈｓｐ７０はＡｐａｆ-１に結合することでプロカスパーゼ-９の漸増を阻害し、その結果カスパーゼ-３の活性化を阻害する。本発明のＢＣ２及びＢＣ４は、温熱で誘発されるＨｓｐ７０の発現を有意に減弱させた。したがって、Ｈｓｐ７０もアポトーシス増強に関わっていると思われる。加えてカスパーゼ-８とＢｉｄの活性化は、アポトーシス増強に対するＦａｓの寄与もまた部分的にミトコンドリア機能障害に起因することを示している。【００２４】
核アポトーシスに先んじて起こるＭＭＰの低下は、ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＰＴ）小孔の開孔で媒介されると報告されている。酸化的ストレスを含めた多くのアポトーシス誘発エフェクターは、ＰＴ小孔の開孔を誘発し得る。従って、ＢＣ２又はＢＣ４を併用した温熱処理は、ＰＴ小孔の開孔を介してＭＭＰの低下を引き起こすと考えられる。ＭＭＰは、ＡＴＰ合成や他の代謝活動に用いられる電気化学的なポテンシャルを意味しており、そこにはミトコンドリア中のＣａ2+ホメオスタシス維持も含まれる。Ｃａ2+ホメオスタシスを制御する異なったＣａ2+輸送系にエネルギーが必要とされるため、ＭＭＰの低下とそれによるＡＴＰの消耗は必然的に細胞内Ｃａ2+ホメオスタシスの崩壊を生じさせる。発明者らは以前に、［Ｃａ2+］iの増大が、細胞内スーパーオキシド生成の増大に関連するいくつかの薬剤による、温熱誘発アポトーシスの増強に関わっていることを示してきた。ＢＣ２又はＢＣ４と温熱併用処理後の細胞内［Ｃａ2+］i濃度増大、及びＣａ2+キレーター（ＢＡＰＴＡ-ＡＭ）によるＤＮＡ断片化の抑制は、Ｃａ2+依存性経路がＢＣ２及びＢＣ４による温熱誘発アポトーシスの増強に関わっていることを示唆している。【００２５】
以上より、本発明のベンゾシクロブテン誘導体は、毒性のない濃度において温熱誘発アポトーシスを有意に増強した。この増強効果は、スーパーオキシド生成に起因していると考えられる。従って、ＢＣ２とＢＣ４は、細胞内ＲＯＳを解した温熱誘発アポトーシスの有用な増感剤となり得る。【００２６】
この増強機構を図１に示す。この増強作用の分子機構は、ミトコンドリアカスパーゼ経路及び［Ｃａ2+］i依存経路によるものである。
細胞内ＲＯＳにより、細胞表面への発現が増加したＦａｓは、ミトコンドリアの機能障害とＨｓｐ７０の低下を仲介することにより、アポトーシスの増加に寄与すると考えられる。【００２７】
次に、本発明のベンゾシクロブテン誘導体の温熱治療のための薬剤について詳述する。【００２８】
本発明のベンゾシクロブテン誘導体は、Ｍａｔｓｕｙａ，Ｙ．等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６９巻２３号、７９８９−７９９３頁（２００４年）に記載の化合物等を用い、当業者に知られた方法により合成される。化合物の合成スキームを以下に示す。
【化６】
2009133618.tif 000008
【００２９】
本発明は、式（１）で表される化合物の有効量を含有する医薬組成物又は獣医薬組成物を提供する。
本発明の化合物の投与形態としては、注射剤（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注射）等による非経口投与を挙げることができる。【００３０】
本発明の化合物を含有する上記の医薬的又は獣医薬的組成物は、全組成物の重量に対して、本発明に係る化合物を約０．０１％以上、好ましくは約０．１以上を含有する。【００３１】
本発明の化合物に、又は該化合物を含有する組成物に加えて、他の医薬的に又は獣医薬的に活性な化合物を含ませることができる。
また、これらの組成物は、本発明の化合物の複数を含ませることができる。
本発明の化合物は、製薬の慣用手段によって投与用に製剤化される。【００３２】
注射剤は、例えば水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール；界面活性剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素添加ヒマシ油のポリオキシエチレンエーテル、レシチン；保存剤、例えばパラオキシ安息香酸のエステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩等を使用して調製される。【００３３】
本発明の化合物は、その抗癌作用に基づき、癌の予防薬又は治療薬に有用である。癌の例としては、例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、消化器癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、尿管腫瘍、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、睾丸腫瘍甲状腺癌、膵臓癌、直腸癌、結腸癌、咽頭癌、喉頭癌、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、血液腫瘍、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００３４】
本発明の化合物に係る薬剤は、がんの温熱療法と組合わせて用いられる。本発明の薬剤は、腫瘍組織の温熱療法に先立って投与されるか、腫瘍組織の温熱療法の際に投与することができ、好ましくは、腫瘍組織の温熱療法に先立って投与される。いずれの場合も、本発明の薬剤によるアポトーシス増強活性により、高い腫瘍治療効果が得られる。【００３５】
本発明の温熱治療用薬剤は、本発明の式（１）で表される化合物を含むことを特徴とし、例えば温熱治療用薬剤として有用である。本発明の温熱治療用薬剤の組成は、上記癌治療用薬剤と同様に適用し得る。【００３６】
本発明のアポトーシス増強剤は、本発明の式（１）で表される化合物を含むことを特徴とし、例えば温熱治療用薬剤として有用である。本発明のアポトーシス増強剤の組成は、上記癌治療用薬剤と同様に適用し得る。【００３７】
本発明の抗癌剤を用いた癌治療方法は、本発明の式（１）で表される化合物を含むことを特徴とし、例えば、温熱治療用薬剤として有用である。本発明の癌治療方法は、本発明の抗癌剤を投与し温熱治療を行うことからなる。【００３８】
本発明の温熱治療用薬剤を用いた癌の温熱治療方法は、本発明の式（１）で表される化合物を含む薬剤を投与し温熱治療を行うことを特徴とする。本発明の癌の温熱治療方法は、本発明の温熱治療用薬剤を投与し温熱治療を行うことからなる。【００３９】
本発明のアポトーシス増強剤を用いた癌治療方法は、本発明の式（１）で表される化合物を含む薬剤を投与し温熱治療を行うことを特徴とする。本発明の癌治療方法は、本発明の温熱治療方法と同様である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明について、実施例を挙げて詳述するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００４１】
薬剤について
本発明のベンゾシクロアルケン誘導体（ＢＣ２、ＢＣ３、ＢＣ４及びＢＣ５）及び比較化合物（ＢＣ１、ＢＣ６及びＢＣ７）を下記に示す。以下それぞれの化合物をＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３、ＢＣ４、ＢＣ５、ＢＣ６及びＢＣ７と表記するものとする。【００４２】
【化７】
2009133618.tif 000009
【００４３】
４-（トリイソプロピルシリルオキシ）ベンゾシクロブテン-１-カルボニトリル（２（ＢＣ２））の合成
アルゴン雰囲気下、化合物１（１８６ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８．０ｍＬ）溶液に、０℃でトリエチルアミン（０．２７ｍＬ，１．９５ｍｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳＯＴｆ）（０．４２ｍＬ，１．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。その後、ジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、ジクロロメタン層を３％塩酸水溶液、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して溶媒を留去した。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテル＝４：１）で精製し、黄色油状物質として化合物２（３６１ｍｇ，９４％）を得た。【００４４】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．１０（１８Ｈ，ｄ，Ｊ=６．９Ｈｚ），１．１６-１．３１（３Ｈ，ｍ），３．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=２．７Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），３．５９(１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=５．５Ｈｚ，１４．０Ｈｚ)，４．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=２．７Ｈｚ，５．５Ｈｚ），６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ=０．６Ｈｚ），  ６．８１（１Ｈ， ｄｄ，Ｊ=１．６Ｈｚ，８．２Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ=８．２Ｈｚ）；
13Ｃ-ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１２．７，１７．９，２８．０，３５．６，１１４．９，１１９．９，１２０．５，１２３．６，１３０．５，１４３．３，１５７．３；
ＩＲ（ｎｅａｔ）：２２３８ｃｍ-1；
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３０１（Ｍ+）；  ＨＲＭＳ  Ｃ18Ｈ27ＮＯＳｉとしての計算値：３０１．１８６２，観測値３０１．１８７７．【００４５】
４-（トリイソプロピルシリルオキシ）ベンゾシクロブテン-１-カルボアルデヒド（３（ＢＣ５））の合成
アルゴン雰囲気下、化合物２（６８８ｍｇ，２．２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に−７８℃で水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）（１Ｍ  ヘキサン溶液，３．０ｍＬ，３．００ｍｍｏｌ）を加え、６０分攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて反応を停止し、室温で１０分間攪拌した後、セライトろ過を行い、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後溶媒を留去した。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテル＝３：１）で精製し、黄色油状物質として化合物３（５５１ｍｇ，７９％）を得た。【００４６】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．３０（１８Ｈ，ｄ，Ｊ=７．１Ｈｚ），１．２１-１．２８（３Ｈ，ｍ），３．３２-３．３６（２Ｈ，ｍ），４．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=３．８Ｈｚ，７．７Ｈｚ），  ６．７１（１Ｈ，ｓ），６．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，８．２Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ=８．２Ｈｚ），  ９．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ=３．６Ｈｚ）；
13Ｃ-ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１２．７，１８．０，３０．２，５２．９，１１５．０，１１９．８，１２４．１，１３２．３，１４４．７，１５６．７，１９９．８；
ＩＲ（ｎｅａｔ）：１７２０ｃｍ-1；
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３０４（Ｍ+）；  ＨＲＭＳ  Ｃ18Ｈ28Ｏ2Ｓｉとしての計算値：３０４．１８５９，観測値３０４．１８１８．【００４７】
４-（トリイソプロピルシリルオキシ）ベンゾシクロブチ-１-イル  ホルメート（４（ＢＣ３））の合成
アルゴン雰囲気下、化合物３（５５１ｍｇ，１．８１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液に、０℃でｍ-クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）（７９０ｍｇ，４．５８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加えて希釈し、ジクロロメタン層を１０％炭酸カリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した後、溶媒を留去した。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、黄色油状物質として化合物４（３２０ｍｇ，５５％）を得た。【００４８】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．１０（１８Ｈ，ｄ，Ｊ=６．９Ｈｚ），１．１９-１．３１（３Ｈ，ｍ），３．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ=１５．０Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=４．４，１５．０Ｈｚ）， ５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ=４．４Ｈｚ），６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ=１．１Ｈｚ），６．７０-６．７９（１Ｈ，ｍ）， ７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ=８．０Ｈｚ）８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ=１．１Ｈｚ）；
13Ｃ-ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１２．８，１８．０，３８．３，７０．７，１１４．５，１２０．０，１２４．８，１３５．３，１４３．１，１５７．９，１６０．８；
ＩＲ（ｎｅａｔ）：１７２８ｃｍ-1；
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３２０（Ｍ+）；  ＨＲＭＳ  Ｃ18Ｈ28Ｏ3Ｓｉとしての計算値：３２０．１８０８，観測値３２０．１８０５．【００４９】
４-（トリイソプロピルシリルオキシ）ベンゾシクロブテン-１-オール（５（ＢＣ４））の合成
化合物４（２４ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）のメタノール／アセトン溶液（１：１，６．０ｍＬ）を−１０℃に冷却し，炭酸カリウム（３４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌した。反応液に水を加えてエーテルで抽出した後、エーテル層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を留去した。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテル＝２：１）で精製し、黄色油状物質として化合物５（１７ｍｇ，７７％）を得た。【００５０】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．１０（１８Ｈ，ｄ，Ｊ=６．９Ｈｚ），１．１８-１．３０（３Ｈ，ｍ），２．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=０．６Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），３．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=４．４Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），５．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=１．６Ｈｚ，４．４Ｈｚ），６．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ=１．１Ｈｚ）６．７３-６．７７（１Ｈ，ｍ），７．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ=８．０Ｈｚ）；
13Ｃ-ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１２．８，１８．０，４１．９，７０．３，１１５．０，１１９．５，１２３．４，１３９．７，１４２．７，１５７．３；
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２９８ｃｍ-1；
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２９０（Ｍ+）；  ＨＲＭＳ  Ｃ17Ｈ28Ｏ2Ｓｉとしての計算値：２９２．１８５９，観測値２９２．１８３２．【００５１】
４-（トリイソプロピルシリルオキシ）ベンゾシクロブテン-１-オン（６（ＢＣ８））の合成
アルゴン雰囲気下、ジメチルスルホキシド（０．０４０ｍＬ，０．０５６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２．０ｍＬ）溶液に−７８℃で塩化オキサリル（０．０３０ｍＬ，０．０３４ｍｍｏｌ）を加えて１０分間攪拌した。ここに、化合物５（４７ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２．０ｍＬ）溶液を加えて５０分間攪拌し、トリエチルアミン（０．１２ｍＬ，０．８６ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温した。５０分攪拌した後、ジクロロメタンで反応液を希釈し、ジクロロメタン層を３％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して溶媒を留去した。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテル＝４：１）で精製し、黄色油状物質として化合物６（３５ｍｇ，７５％）を得た。【００５２】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．１１（１８Ｈ，ｄ，Ｊ=６．９Ｈｚ），１．２３-１．３５（３Ｈ，ｍ），３．８６（２Ｈ，ｓ），６．８７-６．９１（１Ｈ，ｍ），６．９６-６．９７（１Ｈ，ｍ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ=８．２Ｈｚ）；
13Ｃ-ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１２．８，１７．９，５１．１，１１４．５，１２１．９，１２２．６，１３９．９，１５３．０，１６２．４，１８６．３；
ＩＲ（ｎｅａｔ）：１７６３ｃｍ-1；
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２９０（Ｍ+）；  ＨＲＭＳ  Ｃ17Ｈ26Ｏ2Ｓｉとしての計算値：２９０．１７０２，観測値２９０．１７４７．【００５３】
ベンゾシクロブテン-１，４-ジオール（７（ＢＣ９））の合成
アルゴン雰囲気下、化合物５（２０ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．５ｍＬ）溶液に、０℃においてテトラブチルアンモニウムフルオライド（１Ｍ  テトラヒドロフラン溶液，０．０９ｍＬ，０．０９ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で４０分攪拌した。その後、飽和塩化アンモニウム水溶液で反応を停止し、ジクロロメタンを加えて分液後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後溶媒を留去した。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精製し、白色固体物質（融点１３５-１３７℃）として化合物７（８ｍｇ，７１％）を得た。【００５４】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，アセトン-ｄ6）δ：２．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=０．８Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ=４．４Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），４．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ=７．７、Ｈｚ），５．０８-５．１１（１Ｈ，ｍ），６．６０-６．６１（１Ｈ，ｍ），６．６５-６．６９（１Ｈ，ｍ），６．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ=８．０Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，ｓ）；
13Ｃ-ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４１．９，７０．２，１１０．９，１１５．０，１２３．８，１４０．４，１４３．８，１５９．１；
ＩＲ（ＫＢｒ）：３１６０ｃｍ-1；
ＭＳ：ｍ／ｚ  １３６（Ｍ+）；  ＨＲＭＳ  Ｃ8Ｈ8Ｏ2としての計算値：１３６．０５２４，観測値１３６．０５１５．【００５５】
本発明のベンゾシクロブテン化合物は、最初にジメチルスルホキシドに溶解して実験に用いる濃度に調製した。【００５６】
実験方法の概要
細胞としてヒトリンパ腫細胞株のＵ９３７を用いた。アポトーシス誘導因子として、温熱処理（４４℃、２０分）を用いた。アポトーシスの関連指標として、ギムザ染色による核の形態学的変化を調べ、生化学的手法によるＤＮＡの断片化の測定を実施した。カスパーゼ−８、カスーパーゼ-３の活性化は各測定用キットを使用した。さらに、フローサイトメトリーを用いホスファチジルセリンの細胞膜表面発現、Ｆａｓの発現ミトコンドリア膜電位の低下、及び細胞内スーパーオキシドの産生を検討した。アポトーシス関連タンパク質の変化（Ｂｉｄ、シトクロムｃ、ＨＳＰ７０等）はウエスタンブロット法により調べ、細胞内カルシウムイオン濃度の変化についてはＦｕｒａ-２-ＡＭを用いて、蛍光画像解析法により検討した。【００５７】
実験方法
１．細胞とその培養
ヒトリンパ腫細胞Ｕ９３７は、日本ヒューマンサイエンス研究資源バンク（日本、東京）より入手し、１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＲＭＩ培地中で、５％ＣＯ2及び９５％空気気流下、３７℃で保存した。【００５８】
２．温熱処理法
約１ｘ１０6細胞／ｍＬを含んだ細胞浮遊液を、ベンゾシクロアルケン誘導体で３７℃において４０分間前処理し、その後、４４℃、２０分間温熱処理に付した。
温熱処理は、培地（３ｍＬ）を含んだプラスチック培養チューブを、４４℃の水浴（型式ＮＴＴ-１２００、ＥＹＥＬＡ製、日本、東京）に２０分間浸す方法で行った。試験チューブ中培地の温熱処理中の温度は、直径０．８ｍｍの熱電対を接続したデジタル温度計（型番号７５６３、横河電機会社製、日本、東京）によりモニターした。処理後、細胞を３７℃において６時間恒温培養し、採取してアポトーシスの評価に付した。【００５９】
３．ＤＮＡ断片化測定
ＤＮＡ断片化定量アッセイは、ＳｅｌｌｉｎｓとＣｏｈｅｎによる方法に改良を加えて行った。即ち、細胞を細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、ｐＨ  ７．５）で処理し、１３，０００ｘｇで１０分間遠心分離を行った。続いて、上清中及び生じたペレット中のそれぞれのＤＮＡサンプルを４℃にて１２．５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中で沈殿させ、５％ＴＣＡ中９０℃、２０分の処理で加水分解した後、ジフェニルアミン試薬を用いて定量した。それぞれのサンプル中の断片化ＤＮＡのパーセンテージは、上清中のＤＮＡ量をそのサンプルの全ＤＮＡ量（上清＋ペレット）で除して算出した。【００６０】
４．アポトーシスの形態学的検出
細胞中の形態変化は、ギムザ染色により試験した。３７℃で６時間恒温培養後、細胞を遠心分離により採取し、ダルベッコ製リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。それから細胞をメタノール-酢酸（３：１）で固定し、ガラススライド上に広げた。乾燥後、５％ギムザ溶液（ｐＨ  ６．８）で１０分間染色した。細胞収縮と共に核の変化（クロマチンの凝縮及び断片化、アポトーシス小体）が生じた細胞を、アポトーシス細胞として検出した。アポトーシス細胞のパーセンテージは、任意のエリア中の１サンプルにつき少なくとも１，０００細胞をカウントして決定した。【００６１】
５．アネキシンＶ及びＰＩ染色のフローサイトメトリー検出によるアポトーシスアッセイ
フローサイトメトリーはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びフルオレセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベルされたアネキシンＶ（イムノテック、フランス、マルセイユ）の２種類の蛍光試薬を用いて行い、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）発現をアポトーシスの指標として検出した。処理後、残存した無傷の細胞を３７℃において６時間培養後、集めて４℃に冷却したＰＢＳで洗浄、そして１，２００ｒｐｍで３分間遠心した。生じたペレットを、アネキシンＶ-ＦＩＴＣキットのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを用いて、１０5細胞／ｍＬに調節した。ＦＩＴＣラベルされたアネキシンＶ（５μＬ）とＰＩ（５μＬ）を上記懸濁液４９０μＬに加え、ゆっくりと混和させた。暗所にて４℃において１０分間恒温培養した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ、ベックマン-コルター製、米国フロリダ州、マイアミ）で分析した。【００６２】
６．ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）
カチオン性蛍光試薬であるテトラメチルローダミン  メチルエステル（ＴＭＲＭ）は、ＭＭＰに応じてミトコンドリア中に蓄積され、ＭＭＰの消失で放出される。処理後、細胞を３７℃において６時間恒温培養し、集めてＰＢＳで洗浄し、そして１，２００ｒｐｍで３分間遠心した。それから細胞を、１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（１ｍＬ）中で、１０ｎＭ  ＴＭＲＭを用いて３７℃において１５分間染色し、次いで、すぐに赤色ＴＭＲＭ蛍光（励起波長：４８８ｎｍ、放出波長：５７５ｎｍ）をフローサイトメトリーにより測定した。  低ＭＭＰを示した細胞のパーセンテージは、ＴＭＲＭ対数スケールの０．１-１２低領域に落ち込んだ細胞のカウントにより算出した。【００６３】
７．細胞内カスパーゼ-３及びカスパーゼ-８活性の評価
製造会社（ＭＢＬ、日本、名古屋）の推奨した方法に従い、ＣａｓｐＧＬＯＷTM（登録商標）フルオレセイン活性カスパーゼ-３染色キットにより、細胞内カスパーゼ-３活性をモニターした。アッセイには、ＦＩＴＣと複合したカスパーゼ-３阻害剤ＤＥＶＤ-ＦＭＫ（ＦＩＴＣ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ）をｉｎ  ｓｉｔｕ蛍光マーカーとして用いた。ＦＩＴＣ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫは、細胞浸透性に優れ、無毒性であり、アポトーシス細胞中の活性化カスパーゼ-３と非可逆的に結合する。ＦＩＴＣラベルは、アポトーシス細胞中の活性化カスパーゼをフローサイトメトリーにより検出するためである。所定の方法で細胞（１ｘ１０6／ｍＬ）中にアポトーシスを誘発し、その誘発培地及びコントロール培地のそれぞれを３００μＬずつ等分してミクロチューブに分割した。次にそれぞれのチューブにＦＩＴＣ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫ（１μＬ）を加え、５％  ＣＯ2を含んだインキュベーターで３７℃において０．５時間恒温培養した。細胞を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除き、０．５ｍＬの洗浄緩衝液中に細胞を再懸濁させて再び遠心分離を行った。次いで、５００μＬの洗浄緩衝液中に細胞を再懸濁させて、サンプルを氷上に置き、ＦＬ-１チャンネルを用いたフローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ、ベックマン-コルター製、米国フロリダ州、マイアミ）にて分析を行った。
カスパーゼ-８の測定は、ＦＬＩＣＥ／カスパーゼ-８  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅアッセイキット（ＭＢＬ製、日本、名古屋）を用いて行った。このアッセイは、ラベルされた基質ＩＥＴＤ-ｐＮＡから解離されたクロモフォア（ｐＮＡ、パラニトロアニリド）の分光光度測定による検出を基盤としたものである。ｐＮＡの光放射は、４００ｎｍでの分光光度測定により定量可能である。細胞を採取して分離し、タンパク質を分離した。その試料（１００μｇ）を、１０ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）５０μＬと混合し、ＩＥＴＤ-ｐＮＡ基質を最終濃度２００μＭとなるように加えた。その混合物を３７℃で２時間恒温培養し、その活性を分光光度計（ベックマン・インスツルメント社製、米国カルフォルニア州、フラトン）を用いて４００ｎｍで測定を行った。【００６４】
８．ウエスタンブロット分析
細胞を集めて冷却したＰＢＳで洗浄し、密度１０6細胞／５０μＬにて細胞溶解緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ，  １％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ-４０（ｖ／ｖ）、１％  デオキシコール酸ナトリウム、０．０５％ＳＤＳ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル）に２０分間溶解させた。短時間の超音波処理の後、その溶解物を４℃において１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上清中のタンパク濃度をバイオラッド社製タンパク質アッセイシステムを用いて測定を行った。タンパク質溶解物の試料（３０μｇ）を、５μＬのＳＤＳ-ｌｏａｄｉｎｇ緩衝液（６２．５ｍＭ  トリス-ＨＣｌ、２０％  ＳＤＳ、５％  ２-メルカプトエタノール、１０％  グリシン、０．００１％  ブロモフェノールブルー）と混合した後、９６℃において５分間煮沸させ、 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品株式会社、日本、東京）電気泳動を行い、その後ニトロセルロース膜（アマシャムバイオサイエンス社製、英国、バッキンガムシーレ）へ移動させた。  ウエスタンブロット分析を行い、Ｂｃｌ-２、Ｂａｘ、Ｂｉｄ及びβ-アクチンの発現を、それぞれ抗Ｂｃｌ-２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗Ｂａｘポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、抗Ｂｉｄ  ｐＡｂ、抗Ｈｓｐ７０  ｍＡｂ（サンタクルツバイオテクノロジー社製、米国カルフォルニア州、サンタクルツ）及び抗β-アクチン  ｍＡｂ（シグマ社製）を用いて検出した。Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と複合した抗ウサギ及び抗マウスＩｇＧｓを用いて、ＥＣＬシステム（アマシャムバイオサイエンス社製、英国、バッキンガムシーレ）によりバンドシグナルを可視化し、Ｘ線フィルムに記録した。バンド密度は、Ｖｉｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ社のバイオ-プロファイルシステムのＢＩＯ-ＩＤ解析ソフトにより評価した。
サイトゾル抽出物の調製については、細胞を採取し、２０ｍＭ  ＨＥＲＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍＬ  アプロチニン、１０μｇ／ｍＬ  ペプスタチン、及び２５０ｍＭ  スクロースを含んだ氷冷液に懸濁した。そしてダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーを用いて粉砕し、サンプルを４℃において１，５００ｘｇで５分間遠心分離して、核と粉砕されていない細胞を除去した。その上清を４℃において１０５，０００ｘｇで３０分間遠心分離して、生じた上清を可溶性サイトゾル画分として用いた。サイトゾル画分中のタンパク質を、上記と同じ方法にて検討した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥに従いウエスタンブロットを行い、アンチ-シトクロムｃ  ｐＡｂ（サンタクルツバイオテクノロジー社製、米国カルフォルニア州、サンタクルツ）を用いてサイトゾルへのシトクロムｃの放出を検出した。【００６５】
９．細胞内スーパーオキシドの測定
スーパーオキシド発生の測定に際してはヒドロエチジン（ＨＥ、モレキュラープローブ社製、米国オレゴン州、ユージーン）を用い、Ｇｏｒｍａｎらが採用している方法により測定した。ＨＥは、ＲＯＳ（より正確にはスーパーオキシドアニオンラジカル種）の存在下容易に細胞内で酸化されて蛍光物質エチジウム（Ｅｔｈ）を生成する無蛍光の前駆物質であり、その赤色蛍光により検出が可能である。細胞を５μＭ  ＨＥと３７℃において１５分間恒温培養し、細胞内スーパーオキシドレベルをフローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ、ベックマン-コルター社製、米国フロリダ州、マイアミ）で評価した（励起波長：４８８ｎｍ、放出波長：６００ｎｍ）。【００６６】
１０．細胞表面のＦａｓのフローサイトメトリー検出
細胞（２ｘ１０5）をＰＢＳで２回洗浄し、２．５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣラベルされた抗Ｆａｓモノクローナル抗体（クローン：ＵＢ３、ＭＢＬ，日本、名古屋）を含んだ洗浄緩衝液２０μＬ中に懸濁し、３７℃において３０分間恒温培養し、フローサイトメトリーで分析した。【００６７】
１１．細胞ＡＴＰの測定
ＡＴＰの測定は、ＡＴＰ測定キット（キッコーマン社製、日本、東京）を利用したルシフェリン-ルシフェラーゼ法により、製造会社のマニュアルに従い行った。細胞（１ｘ１０6個）を所定の方法で処理し、その処理細胞及び対照細胞の一部（１，０００-２，０００細胞／アッセイ）を３時間で分別回収した。それらをＰＢＳで洗浄して細胞溶解緩衝液中に溶解させ、次いでルシフェリン  ルシフェラーゼ反応を行い、ＴＤ-２０／２０ルミノメーター（ターナーデザイン製、米国カルフォルニア州、サニーベール）で測定を行った（３回繰り返し）。ＡＴＰ含有量は、フェムトモル／細胞で示した。【００６８】
１２．単一細胞内のカルシウムイオン濃度測定
細胞を遠心分離により収集し、Ｈｅｐｅｓ-ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ（ＨＲ）緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．１３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５．５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ-ＫＯＨ、ｐＨ  ７．４）で洗浄した。０．２％ウシ胎児血清アルブミン（シグマ社製）、Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌアミノ酸（フローラボラトリーズ社製、英国、アイルバイン）、及び２ｍＭ  Ｌ-グルタミンを含むｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ＨＲ緩衝液を調製した。発色部を組み込むため、細胞をｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔｅｄ  ＨＲ緩衝液中に１ｘ１０5個／細胞となるように懸濁させ、５μＭ  Ｆｕｒａ-２-ＡＭ（同仁化学研究所製）で２５℃において３０分間処理を行った。このＦｕｒａ-２-ＡＭが組み込まれた細胞を、ＨＲで１度、次いで成長培地で２度洗浄した。遠心分離を行った後、細胞をＢＣ２又はＢＣ４を含む及び含まない培地を入れたチューブに移し替えた。温熱処理の後、細胞をＨＲで洗浄しＦｕｒａ-２蛍光のデジタルイメージを記録するため、倒立培養顕微鏡を連結したデジタルイメージプロセッサー（Ａｒｇｕｓ  ５０/Ｃａ、浜松ホトニクス社製、日本、浜松）で観察し分析した。励起波長が３４０ｎｍ励起及び３８０ｎｍ励起における５１０ｎｍでの蛍光発光の比Ｆ（３４０/３８０）を、単一細胞中の［Ｃａ2+］iの指標として用いた。個々の細胞のＦｕｒａ-２擬似カラーイメージ（図２０）と、薬剤処理後０時間でのＦ（３４０/３８０）の平均±ＳＤ値を得た。【００６９】
実験結果は、平均±標準偏差で表記した。有意差はＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ-検定で評価し、ｐ値＜０．０５を想定した。全ての実験は３回繰り返し行った。【００７０】
実施例１
ＢＣ類の温熱誘発アポトーシスに対する効果
ＢＣ類の温熱誘発アポトーシスを増強する効果について調べるため、ベンゾシクロアルケン誘導体単独又は温熱との併用で処理した時のＤＮＡ断片化について検討した。
細胞を上記の温熱（４４℃、２０分間）で処理した後又は処理なしで、３７℃において６時間恒温培養し、ベンゾシクロアルケン誘導体１０μＭ濃度でのＤＮＡ断片化に対する効果を測定した。結果を図２ないし図５に示す。【００７１】
図２により、温熱処理によりＤＮＡ断片化に対する効果が示されたが、特にＢＣ２またはＢＣ４と温熱との併用処理は、温熱６時間後のＤＮＡ断片化の大きな増強を示した。【００７２】
図３及び図４は、細胞を温熱（４４℃、２０分間）で処理した後又は処理なしで、３７℃において６時間恒温培養したときのＢＣ２及びＢＣ４の濃度変化に伴うＤＮＡ断片化に対する効果について示したものである。異なった濃度のＢＣ２又はＢＣ４による温熱誘発ＤＮＡ断片化の増強効果が観察された。【００７３】
ＢＣ２またはＢＣ４は２０μＭの濃度では毒性を示さず、ベンゾシクロアルケン誘導体の中で最大効果を示した化合物なので、以降の実験はこの２つの化合物を２０μＭの濃度で用いることにした。【００７４】
実施例２
光学異性体の違いによる効果
ＢＣ４を用い、ＢＣ４の光学異性体それぞれに変えた以外は上記と同様の方法を用いて、温熱誘発ＤＮＡ断片化の増強効果の、光学異性体による違いを調べた。結果を図５及び図６に示す。
ラセミ体としてのＢＣ４とその光学活性体（ＢＣ４-Ｓ及びＢＣ４-Ｄ）いずれの場合も、温熱誘発ＤＮＡ断片化の増強効果は、ラセミ体としてのＢＣ４とその光学活性体（即ちＢＣ４-Ｓ及びＢＣ４-Ｄ）いずれの場合も、１０μＭ及び２０μＭ濃度できわめて類似していた。【００７５】
実施例３
ＢＣ２又はＢＣ４について温熱処理単独及び薬剤との併用処理後の細胞形態変化を、光学顕微鏡を用いて、ギムザ法で試験した。結果を図７に示す。【００７６】
細胞を温熱とＢＣ２又はＢＣ４との併用処理した時のクロマチン凝縮や核の断片化といった典型的な形態変化は、温熱単独処理のみを行った細胞よりも顕著であった。【００７７】
アネキシンＶ／ＦＩＴＣ及びＰＩの二重染色を利用したフローサイトメトリーにより、アネキシンＶ／ＦＩＴＣのみで染色された早期アポトーシス細胞の比率は、併用処理後の方が温熱単独処理した場合よりも有意に大きいことが明らかとなった。対象的に、アネキシンＶ／ＦＩＴＣ及びＰＩの両方に染まったに二次的ネクローシスのパーセンテージは、両者で有意な差はなかった。結果を図８に示す。【００７８】
実施例４
ＢＣ２，ＢＣ４及び温熱によるＲＯＳ及び酸化的ストレスの誘導
最近の研究報告によれば、細胞内ＲＯＳがアポトーシス誘導に重要な役割を果たしている。本発明では、ＨＥ染色法を用いた細胞内スーパーオキシドレベルの評価を行った。結果を図９に示す。【００７９】
ＢＣ２及びＢＣ４が、単独で多くの細胞中のスーパーオキシドレベルの急激な上昇を引き起こし、それは薬剤処理後０．５時間後と１時間後に観察されることを示した。最大値には、薬剤処理後２時間で到達した。【００８０】
また、図１０に臭化エチジウム（酸化型ＨＥ）に染められた細胞の分布を示す（白抜き：無処理の細胞、灰色：温熱単独処理の細胞、黒色：薬剤併用処理の細胞）。
臭化エチジウムに対する蛍光強度が強い細胞ほど、スーパーオキシドが多く発生している細胞と考えることができる。【００８１】
上記のスーパーオキシド量が増大した細胞のフラクション（％）の比較を行った。
結果を図１１に示す（コントロール：０．９±０．５、ＢＣ２又はＢＣ４の単独処理：それぞれ１６．８±１０．３と２１．３±５．５、温熱単独処理：１０．７±３．０、温熱処理とＢＣ２又はＢＣ４の併用処理：それぞれ３８．９±１０．５と４４．８±８．８）。【００８２】
実施例５
カスパーゼ依存性ミトコンドリア経路の検出
ミトコンドリアの機能障害とカスパーゼの活性化は、アポトーシスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。アポトーシスにおけるカスパーゼ依存性ミトコンドリア経路が、ベンゾシクロアルケン誘導体による温熱誘導アポトーシスの増強に関係しているかどうかを検討するため、ＭＭＰ変化と細胞内カスパーゼ-３及びカスパーゼ-８活性の測定を行った。細胞をＢＣ２又はＢＣ４の存在下に温熱処理を行い、３７℃において６時間恒温培養し、ＴＭＲＭ染色によるフローサイトメトリー測定を行った。結果を図１２に示す。温熱処理細胞においてＭＭＰ低下細胞が観察されるようになり、ＢＣ２又はＢＣ４の共存により更に顕著にその割合が増大した。【００８３】
温熱処理による細胞内カスパーゼ-３活性の増大は、ＦＩＴＣ-ＤＥＶＤ-ＦＭＫによるフローサイトメトリー測定から、ＢＣ２又はＢＣ４の存在下で有意に増強された。結果を図１３に示す。【００８４】
上記と同様な温熱処理による細胞内カスパーゼ-８活性増大の増強効果が、ＢＣ２又はＢＣ４の存在下で認められた。結果を図１４に示す。【００８５】
実施例６
アンチアポトーシス又はプロアポトーシス機能を有するＢｃｌ-２ファミリータンパクは、シトクロムｃを含むミトコンドリア内アポトーシス因子やアポトーシス誘起因子（ＡＩＦ）の放出を制御し得る。アポトーシス関連タンパク質の分析のため、温熱処理後６時間の細胞を収集した。結果を図１５及び図１６に示す。その結果、図１５により、Ｂｉｄの発現は併用処理後に有意に減弱する一方、それは、ＢＣ２、ＢＣ４、又は温熱の単独処理細胞では顕著なままであることが明らかとなった。【００８６】
併用処理後にシトクロムｃ発現の有意の増大が観察された一方、ＢＣ２、ＢＣ４、又は温熱の単独処理ではシトクロムｃの放出は観察されなかった。結果を図１６に示す。【００８７】
以上の結果より、温熱誘発アポトーシスのＢＣ２又はＢＣ４による増強効果が、ミトコンドリア機能障害、Ｂｉｄの活性化、及び続いて起こるカスパーゼの活性化に関連していることを示唆している。【００８８】
実施例７
アポトーシスは、細胞内ＡＴＰ濃度に強く依存することが知られており、また我々が得た結果が、ミトコンドリアが温熱誘発アポトーシスのＢＣ２又はＢＣ４による増強効果に関係していることを示している。２０μＭ濃度の薬剤単独処理と温熱併用処理した細胞中のＡＴＰ濃度を、処理後６時間で測定した。結果を図１７に示す。【００８９】
コントロール細胞が１．６フェムトモルＡＴＰ／細胞の値を示したのに対し、ＢＣ２及びＢＣ４は６時間前処理で、それぞれ４０％及び２０％のＡＴＰ量減弱を引き起こし、また温熱単独でもＡＴＰ減少が認められた。しかし一方、ＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理の場合、温熱処理６時間後にＡＴＰ量のより顕著な減弱を示した、これらの結果はＢＣ２又はＢＣ４と温熱がミトコンドリアＡＴＰ合成を阻害していることを示唆している。【００９０】
実施例８
Ｈｓｐ７０の発現とＦａｓの表面化
Ｈｓｐ７０は、アポトーシスシグナルの下流におけるミトコンドリアでの細胞死を減弱させることから、Ｈｓｐ７０の誘導効果についても検討を行うこととした。Ｕ９３７細胞において、温熱処理（４４℃、２時間）を６時間行い、結果を図１８に示す。温熱処理（４４℃、２時間）後６時間でＨｓｐ７０は顕著に誘導されたが、ＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理ではその誘導が抑制された。【００９１】
誘導Ｈｓｐ７０の下向き調節は細胞死の誘発と同義であり、即ち、それが細胞死を助長することを示している。Ｆａｓの表面化の結果を図１９に示す。図１９より、温熱処理単独で９．３±１．５％であったのに対し、ＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理ではそれぞれ１９．２±２．０％及び１６．２±１．６％と、顕著な増大が見られた。【００９２】
これらの結果は、Ｆａｓの表面化とＨｓｐ７０の減少が、アポトーシス増強に寄与していることを示している。【００９３】
実施例９
Ｃａ2+依存性経路の分析
Ｕ９３７細胞は、Ｃａ2+依存性アポトーシス経路を有することが報告されているため、温熱単独処理及びＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理直後の［Ｃａ2+］iの変化を調べるべく、Ｆｕｒａ-２蛍光のデジタルイメージングを行った。結果を図２０に示す。３７℃の温度条件下ではＢＣ２、ＢＣ４処理の有無に拘らず、細胞中［Ｃａ2+］iの変化は観察されなかった。しかしながら、温熱処理を行った場合には多くの細胞で［Ｃａ2+］iの増大が認められ、ＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理の場合には、高い［Ｃａ2+］iを示す細胞が更に増加するようになった。【００９４】
即ち、化合物単独の投与では観察されなかった細胞内のＣａ2+濃度の増加も見られたことから、本発明の化合物は、がん細胞の温熱誘発アポトーシスを強く誘導することが示された。【００９５】
５回の実験から任意に選択した１００個の細胞中の、温熱単独処理、及びＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用処理後の［Ｃａ2+］iのヒストグラム作成した。結果を図２１に示す。【００９６】
実施例１０
ＢＣ２及びＢＣ４の温熱誘発アポトーシス増強効果に対するＣａ2+の役割を検討するため、フリーのＣａ2+イオンキレーターであるＢＡＰＴＡ-ＡＭを用いて検討を行った。細胞を処理して、５０μＭ  ＢＡＰＴＡ-ＡＭの存在下で６時間恒温培養を行った。結果を図２２に示す。ＢＡＰＴＡ-ＡＭはＢＣ２又はＢＣ４と温熱の併用により誘起されるＤＮＡ断片化について、７１．２％又は６８．６％の阻害率を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明のベンゾシクロブテン誘導体は、癌治療のための癌の温熱療法への応用として新しい温熱治療用薬剤を可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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