(57)【要約】【課題】生体の酵素に依存することなく薬物放出が可能であり、有効な治療効果が期待できるとともに水溶性を有する生理活性物質の高分子結合体が求められている。【解決手段】ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、一般式（Ｉ）    −Ａｒ−ＣＲ１５Ｒ１６−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｉ）［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１５、Ｒ１６は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］で表わされる置換基が結合している生理活性物質の高分子結合体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、一般式（Ｉ）
−Ａｒ−ＣＲ１５Ｒ１６−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｉ）
［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１５、Ｒ１６は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］
で表わされる置換基が結合している構造を有する生理活性物質の高分子結合体。
【請求項２】
アミノ基を有する生理活性物質がアミノ基を介して結合している請求項１記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項３】
一般式（ＩＩ）
【化１７】
2009116509.tif 000019
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４は一般式（ＩＩＩ）
−Ａｒ１−ＣＲ１７Ｒ１８−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （ＩＩＩ）
［式中、Ａｒ１は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１７、Ｒ１８は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ５は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ａは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは各々０〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは２〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される請求項１又は２に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項４】
Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、Ｒ４の一般式（ＩＩＩ）におけるＡｒ１がポリマーとの結合とＣＲ１７Ｒ１８との結合がオルト位又はパラ位にあるフェニル基であり、ａが１００〜３００の整数であり、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊが各々０〜１００の整数であり、且つｄ＋ｅは１〜１００の整数であり、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊが６〜１００の整数である請求項３記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項５】
Ｒ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基であり、Ｒ４の一般式（ＩＩＩ）におけるＲ１７、Ｒ１８が共に水素原子、Ｒ５が−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７であり、Ｒ６、Ｒ７が共にシクロヘキシル基若しくはイソプロピル基である請求項３又は４に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項６】
一般式（ＩＶ）
【化１８】
2009116509.tif 000020
［式中、Ｒ８は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ９は結合基を示し、Ｒ１０は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ１１は一般式（Ｖ）
−Ａｒ２−ＣＲ１９Ｒ２０−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｖ）
［式中、Ａｒ２は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１９、Ｒ２０は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ１２は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｂは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々０〜２００の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは２〜２００の整数を示すし、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される請求項１又は２に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項７】
Ｒ８が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ９が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ１０が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、Ｒ１１の一般式（Ｖ）におけるＡｒ２がポリマーとの結合とＣＲ１９Ｒ２０との結合がオルト位又はパラ位であるフェニル基であり、ｂが１００〜３００の整数であり、ｋが１〜９０の整数を示し、ｍ、ｎが各々０〜９０の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは６〜９０の整数である請求項６記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項８】
Ｒ８がメチル基、Ｒ９がトリメチレン基、Ｒ１０がアセチル基であり、Ｒ１１の一般式（Ｖ）におけるＲ１９、Ｒ２０が共に水素原子、Ｒ１２が−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４であり、Ｒ１３、Ｒ１４が共にシクロヘキシル基若しくはイソプロピル基である請求項６又は７に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項９】
ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基と、ヒドロキシベンジルアルコール化合物のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、得られたエステル化合物のアルコール性水酸基とカルボキシ基を有する生理活性物質のカルボキシ基とを結合させること、又は該エステル化合物のアルコール性水酸基とアミノ基を有する生理活性物質のアミノ基とをカルボニル基を介して結合させることにより得られる、生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１０】
生理活性物質が抗癌剤である請求項１〜９のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１１】
アミノ基を有する生理活性物質がアンスラサイクリン系抗癌剤である請求項１〜９のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１２】
アンスラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン又はアムルビシンである請求項１１記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１３】
生理活性物質が生理活性ペプチドである請求項１〜９のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１４】
生理活性ペプチドがベスタチン又はその誘導体である請求項１３記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１５】
生理活性物質が抗炎症剤である請求項１〜９のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１６】
カルボキシ基を有する生理活性物質がインドメタシン若しくはエトドラク又はその誘導体である請求項１〜９のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１７】
水中でミセルを形成することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体を有効成分とする医薬品。
【請求項１９】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項２０】
請求項１５に記載の生理活性物質の高分子結合体を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項２１】
ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基と、ヒドロキシベンジルアルコール化合物のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、得られたエステル化合物のアルコール性水酸基とカルボキシ基を有する生理活性物質のカルボキシ基とを結合させること、又は、該エステル化合物のアルコール性水酸基とアミノ基を有する生理活性物質のアミノ基とをカルボニル基を介して結合させることを特徴とする請求項１又は２に記載の生理活性物質の高分子誘導体の製造方法。
【請求項２２】
ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、一般式（ＶＩ）
−Ａｒ−ＣＲ１５Ｒ１６−ＯＨ        （ＶＩ）
［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１５、Ｒ１６は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示す］で表わされる置換基が結合している構造を有する化合物。
【請求項２３】
一般式（ＩＩ）
【化１９】
2009116509.tif 000021
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４は一般式（ＶＩＩ）
−Ａｒ１−ＣＲ１７Ｒ１８−ＯＨ        （ＶＩＩ）
［式中、Ａｒ１は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１７、Ｒ１８は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ５は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ａは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは各々０〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは２〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される化合物。
【請求項２４】
一般式（ＩＶ）
【化２０】
2009116509.tif 000022
［式中、Ｒ８は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ９は結合基を示し、Ｒ１０は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ１１は一般式（ＶＩＩＩ）
−Ａｒ２−ＣＲ１９Ｒ２０−ＯＨ        （ＶＩＩＩ）
［式中、Ａｒ２は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１９、Ｒ２０は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ１２は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｂは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々０〜２００の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは２〜２００の整数を示し、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール構造部分と２以上のカルボン酸を有するポリマー部分とを有するブロック共重合体における該カルボキシ基に、特定のリンカーを介してカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基が結合している生理活性物質の高分子結合体、その用途及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤や抗炎症剤等の生理活性物質、特に水に溶けにくい生理活性物質を高分子担体と結合させて得られる高分子結合体は、生理活性物質自体の生体内薬物動態や水溶性等が改善され、薬物としての有効性の向上が期待されることから盛んに研究されてきた。中でも親水性と疎水性のポリマーが結合したブロック共重合体は、生理活性物質を担持した疎水性ポリマーを内殻とし表面を親水性ポリマーが覆うミセルを形成することによって、生理活性物質の担持量を増やしてもポリマー全体の水溶性を維持できるという特性を有している。【０００３】
特許文献１にはミセルを形成し水溶性を示すポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸のブロック共重合体に薬物を結合した化合物が記載されており、特許文献２にはポリエチレングリコール類とポリグルタミン酸とのブロック共重合体の側鎖カルボキシ基と、カンプトテシン類のフェノール性水酸基とを結合させたカンプトテシン類の高分子誘導体が記載されている。【０００４】
又、特許文献３にはポリエチレングリコールにベンジル脱離反応をする特定のリンカーを介して薬物を結合した化合物が記載されており、特許文献４にはポリエチレングリコールに結合したアスパラギン酸のような分岐アミノ酸にベンジル脱離反応をする特定のリンカーを介して薬物を結合した化合物が記載されている。
【特許文献１】特許第２６９４９２３号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／３９８６９号パンフレット
【特許文献３】特表２００２−５０８４００号公報
【特許文献４】特表２００４−５３２２８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載されているドキソルビシン結合体はブロック共重合体とドキソルビシンが直接アミド結合で結合されているが、アミド結合は化学的に安定な結合様式であり、生体内では加水分解による薬物の放出が極めて遅くその薬効に疑問がある。事実、本願明細書の実施例中、比較例としてドキソルビシンをブロック共重合体に直接結合させてその抗腫瘍効果を測定しているが、抗腫瘍活性は殆ど示さなかった。【０００６】
特許文献２に記載されているカンプトテシン類の高分子誘導体は、通常のフェノール性水酸基よりも加水分解反応性の高いフェノール性水酸基を有する薬物を選択し、そのフェノール性水酸基とポリグルタミン酸のカルボン酸とのエステル体を形成させることで結合した薬物を徐放させている。しかしながらこの方法は、アミノ基やカルボキシ基を有する薬物には適用できない。【０００７】
特許文献３に記載されている高分子結合体から薬物を放出するためには、ポリエチレングリコールとリンカーとの結合を加水分解酵素により分解する必要があるが、生体の加水分解酵素は種差はもとより同一種においても個体差が大きいと考えられており、そのため放出される薬物の効果に個体差を生じることが危惧される。【０００８】
特許文献４に記載されている高分子結合体はブロック共重合体の一部にアスパラギン酸を使用し、そのアスパラギン酸にリンカーが結合しているが、該高分子結合体のアスパラギン酸とリンカーとの結合は特許文献３と同様に加水分解酵素による分解が必要である。従って、薬物の放出には種差及び個体差を生じることが危惧される。又、特許文献４に記載の高分子結合体はミセルを形成せず、担持する薬物量を増加させると水溶性を維持できなくなる虞がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は前記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、ベンジル脱離反応を起こす特定のリンカーを介してカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を結合した化合物が生理的条件下、加水分解酵素に依存することなく生理活性物質を放出することを見出し、本発明を完成した。該化合物では、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸が生理的条件下で５又は６員環の環状イミド構造をとる事によりエステル結合が切断され、次いでベンジル脱離反応が進行して生理活性物質が放出されるものと推察できる。【００１０】
即ち、本発明は以下の（１）〜（２０）に関する。
（１）ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、一般式（Ｉ）
−Ａｒ−ＣＲ１５Ｒ１６−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｉ）
［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１５、Ｒ１６は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］
で表わされる置換基が結合している構造を有する生理活性物質の高分子結合体。
（２）アミノ基を有する生理活性物質がアミノ基を介して結合している上記（１）記載の生理活性物質の高分子結合体。
（３）一般式（ＩＩ）【００１１】
【化１】
2009116509.tif 000002
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４は一般式（ＩＩＩ）
−Ａｒ１−ＣＲ１７Ｒ１８−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （ＩＩＩ）
［式中、Ａｒ１は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１７、Ｒ１８は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ５は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ａは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは各々０〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは２〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（４）Ｒ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ２が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ３が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、Ｒ４の一般式（ＩＩＩ）におけるＡｒ１がポリマーとの結合とＣＲ１７Ｒ１８との結合がオルト位又はパラ位であるフェニル基であり、ａが１００〜３００の整数であり、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊが各々０〜１００の整数であり、且つｄ＋ｅは１〜１００の整数であり、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊが６〜１００の整数である上記（３）記載の生理活性物質の高分子結合体。
（５）Ｒ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基であり、Ｒ４の一般式（ＩＩＩ）におけるＲ１７、Ｒ１８が共に水素原子、Ｒ５が−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７であり、Ｒ６、Ｒ７が共にシクロヘキシル基若しくはイソプロピル基である上記（３）又は（４）に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（６）一般式（ＩＶ）【００１２】
【化２】
2009116509.tif 000003
［式中、Ｒ８は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ９は結合基を示し、Ｒ１０は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ１１は一般式（Ｖ）
−Ａｒ２−ＣＲ１９Ｒ２０−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｖ）
［式中、Ａｒ２は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１９、Ｒ２０は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ１２は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｂは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々０〜２００の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは２〜２００の整数を示し、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（７）Ｒ８が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル基であり、Ｒ９が（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ１０が（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基であり、Ｒ１１の一般式（Ｖ）におけるＡｒ２がポリマーとの結合とＣＲ１９Ｒ２０との結合がオルト位又はパラ位であるフェニル基であり、ｂが１００〜３００の整数であり、ｋが１〜９０の整数を示し、ｍ、ｎが各々０〜９０の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは６〜９０の整数である上記（６）記載の生理活性物質の高分子結合体。
（８）Ｒ８がメチル基、Ｒ９がトリメチレン基、Ｒ１０がアセチル基であり、Ｒ１１の一般式（Ｖ）におけるＲ１９、Ｒ２０が共に水素原子、Ｒ１２が−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４であり、Ｒ１３、Ｒ１４が共にシクロヘキシル基若しくはイソプロピル基である上記（６）又は（７）に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（９）ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基と、ヒドロキシベンジルアルコール誘導体のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、得られたエステル化合物のアルコール性水酸基とカルボキシ基を有する生理活性物質のカルボキシ基とを結合させること、又は該エステル化合物のアルコール性水酸基とアミノ基を有する生理活性物質のアミノ基とをカルボニル基を介して結合させることにより得られる、生理活性物質の高分子結合体。
（１０）生理活性物質が抗癌剤である上記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１１）アミノ基を有する生理活性物質がアンスラサイクリン系抗癌剤である上記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１２）アンスラサイクリン系抗癌剤がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン又はアムルビシンである上記（１１）記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１３）生理活性物質が生理活性ペプチドである上記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１４）生理活性ペプチドがベスタチン又はその誘導体である上記（１３）記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１５）生理活性物質が抗炎症剤である上記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１６）カルボキシ基を有する生理活性物質がインドメタシン若しくはエトドラク又はその誘導体である上記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１７）水中でミセルを形成することを特徴とする上記（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体。
（１８）上記（１）〜（１７）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体を有効成分とする医薬品。
（１９）上記（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載の生理活性物質の高分子結合体を有効成分とする抗癌剤。
（２０）上記（１５）に記載の生理活性物質の高分子結合体を有効成分とする抗炎症剤。
（２１）ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基と、ヒドロキシベンジルアルコール化合物のフェノール性水酸基とをエステル結合させ、該エステル化合物のアルコール性水酸基とカルボキシ基を有する生理活性物質のカルボキシ基とを結合させること、又は、該エステル化合物のアルコール性水酸基とアミノ基を有する生理活性物質のアミノ基とをカルボニル基を介して結合させることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の生理活性物質の高分子誘導体の製造方法。
（２２）ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、一般式（ＶＩ）
−Ａｒ−ＣＲ１５Ｒ１６−ＯＨ        （ＶＩ）
［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１５、Ｒ１６は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示す］で表わされる置換基が結合している構造を有する化合物。
（２３）一般式（ＩＩ）【００１３】
【化３】
2009116509.tif 000004
［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４は一般式（ＶＩＩ）
−Ａｒ１−ＣＲ１７Ｒ１８−ＯＨ        （ＶＩＩ）
［式中、Ａｒ１は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１７、Ｒ１８は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ５は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ａは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは各々０〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは２〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される化合物。
（２４）一般式（ＩＶ）【００１４】
【化４】
2009116509.tif 000005
［式中、Ｒ８は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ９は結合基を示し、Ｒ１０は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ１１は一般式（ＶＩＩＩ）
−Ａｒ２−ＣＲ１９Ｒ２０−ＯＨ        （ＶＩＩＩ）
［式中、Ａｒ２は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１９、Ｒ２０は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示す］
で表わされる置換基を示し、Ｒ１２は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｂは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々０〜２００の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは２〜２００の整数を示し、ポリグルタミン酸の各構成単位の結合順序は任意である］
で表される化合物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の生理活性物質の高分子結合体は、ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、ベンジル脱離反応を惹起する特定のリンカーを介してカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を結合した化合物であり、生理的条件下、生体の加水分解酵素に依存することなく生理活性物質を放出することが可能であるため、個体差に影響されることなく、生理活性物質が有効な効果を発揮することが期待される。又、ポリアスパラギン酸とポリグルタミン酸を使い分けることで、担持させる生理活性物質に適した放出速度に調節することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の生理活性物質の高分子結合体は、ポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基に、一般式（Ｉ）
−Ａｒ−ＣＲ１５Ｒ１６−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｉ）
［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１５、Ｒ１６は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］で表わされる置換基が結合している。【００１７】
本発明の生理活性物質の高分子結合体におけるポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体としては、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸又はその誘導体がアミド結合して主鎖となり、側鎖にカルボキシ基を有する重合体を形成し、ポリエチレングリコール構造部分とブロック共重合体を形成している化合物が好ましい。【００１８】
一般式（Ｉ）中、Ａｒとしては置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基が挙げられ、該置換基としては（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子等が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシ基、臭素原子等が挙げられる。置換基数及び置換基の置換位置は特に限定されない。【００１９】
中でも、−Ａｒ−としては、例えば下記の基が挙げられる。【００２０】
【化５】
2009116509.tif 000006
［式中、Ｎは窒素原子を示し、Ｊは酸素原子又は硫黄原子を示す］【００２１】
特に、無置換のフェニル基である下記式の基【００２２】
【化６】
2009116509.tif 000007
が好ましい。【００２３】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１５、Ｒ１６としては、独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基が挙げられ、「置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基」における（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。「置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基」における置換基としては、例えば、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基等が挙げられる。中でも好ましくは、Ｒ１５、Ｒ１６が共に水素原子である。【００２４】
一般式（Ｉ）中、ＡＨ（Ｈは水素原子）でアミノ基を有する生理活性物質を意味し、特に限定されないが、ポリエチレングリコール構造部分と、ポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基と結合したヒドロキシベンジルアルコール化合物のアルコール性水酸基に、カルボニル基を介してアミノ基を有する生理活性物質のアミノ基が結合している高分子結合体が好ましいことから、該生理活性物質としては一級若しくは二級アミノ基を有する生理活性物質が好ましい。【００２５】
アミノ基を有する生理活性物質は、例えば、アンスラサイクリン系抗癌剤やシチジン系抗癌剤が挙げられ、中でもドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシン、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）、ゲムシタビン等が好ましい。【００２６】
ドキソルビシン【００２７】
【化７】
2009116509.tif 000008
【００２８】
ダウノルビシン【００２９】
【化８】
2009116509.tif 000009
【００３０】
エピルビシン【００３１】
【化９】
2009116509.tif 000010
【００３２】
ピラルビシン【００３３】
【化１０】
2009116509.tif 000011
【００３４】
アムルビシン【００３５】
【化１１】
2009116509.tif 000012
【００３６】
又、一般式（Ｉ）中の生理活性物質は生理活性ペプチド類であってもよい。ペプチド類では末端等のアミノ基又はカルボキシ基を用いて高分子結合体とすることができる。ペプチド類は試験管内では有用な生理活性を示すものの、生体中では加水分解酵素等によって速やかに分解されてしまい効果を示さないものも多い。このようなペプチド類について、本発明の高分子結合体とすることにより生体中でも効果を示すことが期待される。【００３７】
該ペプチド類として、例えば、以下に示すベスタチン、ベスタチンメチルエステル等やグルファニド（Ｇｌｕｆａｎｉｄｅ）、グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）、テルトモチド（Ｔｅｒｔｏｍｏｔｉｄｅ）、ＰＲ１、オクトレオチド（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、ランレオチド（Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、パシレオチド（Ｐａｓｉｒｅｏｔｉｄｅ）等が挙げられる。【００３８】
ベスタチン【００３９】
【化１２】
2009116509.tif 000013
【００４０】
ベスタチンメチルエステル【００４１】
【化１３】
2009116509.tif 000014
【００４２】
一般式（Ｉ）中、Ａとしてのカルボキシ基を有する生理活性物質の残基とは、ＨＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａで生理活性物質を表すことを意味する。該生理活性物質としては特に限定されないが、非ステロイド性抗炎症剤や抗癌剤が挙げられ、例えば、インドメタシン、エトドラク、メフェナム酸、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、メトトレキセート、ＤＭＸＡＡ等が挙げられる。【００４３】
インドメタシン【００４４】
【化１４】
2009116509.tif 000015
【００４５】
エトドラク【００４６】
【化１５】
2009116509.tif 000016
【００４７】
ＤＸＭＡＡ【００４８】
【化１６】
2009116509.tif 000017
【００４９】
本発明の生理活性物質の高分子結合体として、上記一般式（ＩＩ）［式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ４は一般式（ＩＩＩ）
−Ａｒ１−ＣＲ１７Ｒ１８−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （ＩＩＩ）
［式中、Ａｒ１は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１７、Ｒ１８は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］で表わされる置換基を示し、Ｒ５は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ａは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは各々０〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅは１〜２００の整数を示し、且つｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊは２〜２００の整数を示す］で表される化合物が好ましい。【００５０】
一般式（ＩＩ）中のＲ１における（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられ、中でもメチル基が特に好ましい。【００５１】
一般式（ＩＩ）中のＲ２における結合基としては（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基が好ましく、例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等が挙げられ、中でもトリメチレン基が特に好ましい。【００５２】
一般式（ＩＩ）中のＲ３における（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては特に限定されず、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ３）アシル基が挙げられ、例えば、ホルミル基、アセチル基、ｎ−プロピオニル基等が挙げられ、中でもアセチル基が特に好ましい。【００５３】
一般式（ＩＩ）中のＲ４における一般式（ＩＩＩ）中のＡｒ１としては、上記一般式（Ｉ）のＡｒと同じ基が挙げられ、好ましい基も同様である。【００５４】
一般式（ＩＩ）中のＲ４における一般式（ＩＩＩ）中のＲ１７、Ｒ１８としては、上記一般式（Ｉ）のＲ１５、Ｒ１６と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様に水素原子である。【００５５】
一般式（ＩＩ）中のＲ４における一般式（ＩＩＩ）中のＡとしては、上記一般式（Ｉ）のＡと同じ化合物が挙げられ、好ましい化合物も同様である。【００５６】
一般式（ＩＩ）中のＲ５としては、置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である。一般式（ＩＩ）のＲ５として選択される基は、一分子中同一でも異なっていてもよく、又、本発明の高分子結合体に使用されるブロック共重合体において単一であっても、Ｒ５の置換基が分子間で異なる化合物の混合物であってもよい。【００５７】
該置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基としては、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ基、２−ヒドロキシメチルフェノキシ基、４−ヒドロキシメチル−２−メトキシフェノキシ基、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジメトキシフェノキシ基、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ基、２−ヒドロキシメチル−４−ニトロフェノキシ基、２−ヒドロキシメチル−６−メトキシフェノキシ基、２−ヒドロキシメチル−４−ブロモフェノキシ基等が挙げられ、中でも４−ヒドロキシメチルフェノキシ基、２−ヒドロキシメチルフェノキシ基等が好ましい。【００５８】
該（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基としては、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基が挙げられ、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ基が好ましく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等が挙げられ、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基としては、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基が挙げられ、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ１２）アラルキルオキシ基が好ましく、例えば、４−フェニルブトキシ基等が挙げられる。【００５９】
該（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基が挙げられ、直鎖又は分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基又はジ（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基が好ましく、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ（ｎ−ブチル）アミノ基等が挙げられる。【００６０】
該カルボキシ基が保護されたアミノ酸としては、通常のペプチド合成で用いられるカルボキシ基が保護されたアミノ酸が挙げられ、例えば、フェニルアラニンベンジルエステル等が挙げられる。【００６１】
一般式（ＩＩ）のＲ５における−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７［Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である］としては特に限定されないが、シクロヘキシルアミノカルボニルシクロヘキシルアミノ基、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基等が好ましい。【００６２】
本発明の上記一般式（ＩＩ）で表される生理活性物質の高分子結合体におけるポリアスパラギン酸部分には、α−アミノ酸型、β−アミノ酸型、環化したもの等の構成単位があるが、これらの構成単位の結合順は特に限定されず、又、各型のアミノ酸はブロック型に結合してもよいし、ランダム型に結合してもよい。【００６３】
上記一般式（ＩＩ）で表される生理活性物質の高分子結合体におけるポリアスパラギン酸部分の全アスパラギン酸数はｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊで表される。全アスパラギン酸数は、例えば、ブロック共重合体を製造する際に用いたアスパラギン酸誘導体の量から求めることができ、２〜２００個程度であり、好ましくは６〜１００個程度であり、特に好ましくは１５〜９０個程度である。【００６４】
全アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）に対する生理活性物質の結合したアスパラギン酸数（ｄ＋ｅ）の割合は１〜１００％、好ましくは１〜９０％、更に好ましくは２〜６０％である。又、アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ）としては１〜２００個程度、好ましくは１〜１００個程度、特に好ましくは１〜９０個程度である。【００６５】
全アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ）に対するα−アミノ酸型（ｄ＋ｆ＋ｈ）の割合は１０〜１００％であり、好ましくは２０〜１００％であり、β−アミノ酸型（ｅ＋ｇ＋ｉ）の割合は０〜９０％であり、好ましくは０〜８０％である。この割合は、例えば、ポリアスパラギン酸の保護基の脱保護条件等を選ぶことにより適宜変えることができる。【００６６】
上記一般式（ＩＩ）のポリエチレングリコール構造部分の分子量としては３００〜５０００００程度であり、好ましくは５００〜１０００００程度、更に好ましくは１０００〜５００００程度である。上記一般式（ＩＩ）のａとしては５〜１１５００程度の整数であり、好ましくは８〜２３００程度の整数、更に好ましくは１００〜３００程度の整数である。【００６７】
又、本発明の生理活性物質の高分子結合体として、上記一般式（ＩＶ）［式中、Ｒ８は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ９は結合基を示し、Ｒ１０は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、Ｒ１１は一般式（Ｖ）
−Ａｒ２−ＣＲ１９Ｒ２０−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ        （Ｖ）
［式中、Ａｒ２は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒ１９、Ｒ２０は独立して水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ａはカルボキシ基を有する生理活性物質の残基又はアミノ基を有する生理活性物質の残基を示す］で表わされる置換基を示し、Ｒ１２は置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４からなる群から選ばれる置換基を示し、Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｂは５〜１１５００の整数を示し、ｋは１〜２００の整数を示し、ｍ、ｎは各々０〜２００の整数を示し、且つｋ＋ｍ＋ｎは２〜２００の整数を示す］で表される化合物も好ましい。【００６８】
一般式（ＩＶ）中のＲ８における（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、上記一般式（ＩＩ）中のＲ１と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様であり、メチル基が特に好ましい。【００６９】
一般式（ＩＶ）中のＲ９における結合基としては（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン基が好ましく、例えば、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等が挙げられ、中でもトリメチレン基が特に好ましい。【００７０】
一般式（ＩＶ）中のＲ１０における（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては、上記一般式（ＩＩ）中のＲ３と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様であり、アセチル基が特に好ましい。【００７１】
一般式（ＩＶ）中のＲ１１における一般式（Ｖ）中のＡｒ２としては、上記一般式（Ｉ）のＡｒと同じ基が挙げられ、好ましい基も同様である。【００７２】
一般式（ＩＶ）中のＲ１１における一般式（Ｖ）中のＲ１９、Ｒ２０としては、上記一般式（Ｉ）のＲ１５、Ｒ１６と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様に水素原子である。【００７３】
一般式（ＩＶ）中のＲ１１における一般式（Ｖ）中のＡとしては、上記一般式（Ｉ）のＡと同じ化合物が挙げられ、好ましい化合物も同様である。【００７４】
一般式（ＩＶ）中のＲ１２としては、置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４からなる群から選ばれる基を示し、Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である。一般式（ＩＶ）のＲ１２としては、一分子中同一でも異なっていてもよく、又、本発明の高分子結合体に使用されるブロック共重合体において単一であっても、Ｒ１２の置換基が分子間で異なる化合物の混合物であってもよい。【００７５】
該置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基としては、上記一般式（ＩＩ）のＲ５における置換基を有していてもよいヒドロキシメチルフェノキシ基と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様である。【００７６】
一般式（ＩＶ）中のＲ１２における（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、上記一般式（ＩＩ）のＲ５における（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基と同様な基が挙げられる。【００７７】
一般式（ＩＶ）中のＲ１２におけるカルボキシ基が保護されたアミノ酸としては、通常のペプチド合成で用いられるカルボキシ基が保護されたアミノ酸が挙げられ、例えば、フェニルアラニンベンジルエステル等が挙げられる。【００７８】
一般式（ＩＶ）中のＲ１２における−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４［Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である］としては、一般式（ＩＩ）のＲ５における−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様である。【００７９】
本発明の上記一般式（ＩＶ）で表される生理活性物質の高分子結合体におけるポリグルタミン酸部分の全グルタミン酸数はｋ＋ｍ＋ｎで表され、２〜２００個程度であり、好ましくは６〜９０個程度であり、特に好ましくは６〜６０個である。【００８０】
全グルタミン酸数（ｋ＋ｍ＋ｎ）に対する生理活性物質の結合したグルタミン酸数（ｋ）の割合は１〜１００％、好ましくは３〜９０％、更に好ましくは４〜６０％である。又、グルタミン酸数（ｋ）として１〜２００個、好ましくは１〜９０個程度、特に好ましくは２〜３０個程度である。【００８１】
上記一般式（ＩＶ）で表される生理活性物質の高分子結合体におけるグルタミン酸構造の各構成部分は、その結合順は限定されず、又、各型のアミノ酸はブロック型に結合してもよいし、ランダム型に結合してもよい。【００８２】
上記一般式（ＩＶ）のｂとしては５〜１１５００程度の整数であるが、好ましくは８〜２３００程度の整数であり、更に好ましくは１００〜３００程度の整数である。【００８３】
上記一般式（ＩＶ）のポリエチレングリコール構造部分の分子量は３００〜５０００００程度であり、好ましくは５００〜１０００００程度、更に好ましくは１０００〜５００００程度である。【００８４】
本発明の生理活性物質の高分子結合体の分子量は５００〜６０００００程度、好ましくは６００〜１１００００程度、更に好ましくは１１００〜８００００程度である。なお、本発明における分子量とはＧＰＣ法で測定した重量平均分子量である。【００８５】
本発明の生理活性物質の高分子結合体は、水中でポリエチレングリコール構造部分を外殻とするミセルを形成してもよい。【００８６】
本発明の生理活性物質の高分子結合体は、ポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸部分又はポリグルタミン酸部分とを有するブロック共重合体における側鎖カルボキシ基と、アルコール性水酸基を保護したヒドロキシベンジルアルコール化合物のフェノール性水酸基とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させてエステル化合物とし、保護基を脱保護後、該エステル化合物のアルコール性水酸基とカルボキシ基を有する生理活性物質のカルボキシ基とを結合させること、又は、該エステル化合物のアルコール性水酸基とアミノ基を有する生理活性物質のアミノ基とをカルボニル基を介して結合させることを特徴とし、本製造方法も本発明に含まれる。又、ヒドロキシベンジルアルコール化合物の結合した中間体も本発明に含まれる。【００８７】
即ち、例えば、特許第３２６８９１３号公報に記載の方法にて調製されるポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸のブロック共重合体と、ベンジル位のアルコール性水酸基と必要に応じてフェノール性水酸基以外の官能基を保護したヒドロキシベンジルアルコール化合物とを、両者が溶解する有機溶媒、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）又はＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性溶媒中、０〜１８０℃、好ましくは５〜５０℃でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリノン（ＥＥＤＱ）等の脱水縮合剤を用いた反応に付して縮合させる。カルボキシ基を有する生理活性物質を結合させる場合には、その後ベンジル位のアルコール性水酸基の保護基を脱保護し、次いでベンジル位のアルコール性水酸基と必要に応じてカルボキシ基以外の官能基を保護した生理活性物質のカルボキシ基とを上記の溶媒中、上記の脱水縮合剤を用いてエステル結合させ、必要に応じて保護基を脱保護する製造方法である。又、アミノ基を有する生理活性物質を結合させる場合には、ベンジル位のアルコール性水酸基の保護基を脱保護した後、ベンジル位のアルコール性水酸基と必要に応じてアミノ基以外の官能基を保護した生理活性物質のアミノ基とをジサクシニルカーボネート、カルボニルジイミダゾール等を用いて上記の溶媒中、０〜３０℃でカルボニル基を介して縮合させ必要に応じて保護基を脱保護する製造方法である。
又、例えば、特開平５−９５５号公報に記載の方法にて調製されるポリエチレングリコール構造部分とポリグルタミン酸のブロック共重合体を上記のポリエチレングリコール構造部分とポリアスパラギン酸のブロック共重合体に替えて用いる製造方法でもよい。【００８８】
縮合反応の際にはＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の反応補助剤を用いてもよい。【００８９】
又、一般式（ＩＩ）におけるＲ５が基−ＮＲ６ＣＯＮＨＲ７［Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である］である生理活性物質の高分子結合体、あるいは一般式（ＩＶ）におけるＲ１２が基−ＮＲ１３ＣＯＮＨＲ１４［Ｒ１３、Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基である］である生理活性物質の高分子結合体は、上記のカルボジイミド類を縮合剤として用いる反応によっても得られる。【００９０】
一般式（ＩＩ）あるいは（ＩＶ）の化合物中のＲ５あるいはＲ１２が（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はカルボキシ基が保護されたアミノ酸である化合物の製造方法としては、ブロック共重合体のカルボキシ基を通常の縮合反応で用いられる方法にて活性化してから添加したい量の対応するアルコール、対応するアミンやカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を塩基性条件下に反応させる方法、対応するアルコール、対応するアミンやカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を通常の縮合反応で用いられる方法にて活性化させてからポリマーに反応させる方法等も可能である。【００９１】
又、ヒドロキシベンジルアルコール化合物を結合させた後に残余のカルボキシ基を同様の反応で再活性化し、ここに（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アラルキルオキシ基、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又はカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を導入してもよく、或いは異なるアルコール、アミン等を繰り返し反応させて、Ｒ５あるいはＲ１２の種々の置換基の混成体を合成し、次いでヒドロキシベンジルアルコール化合物を縮合させてもよい。【００９２】
ただし、本発明の生理活性物質の高分子結合体の製造方法は上記の方法に限定されるわけではない。【００９３】
本発明の生理活性物質の高分子結合体は、担持する生理活性物質の薬効に相当する疾患を適応症とする医薬として使用される。例えば、抗癌剤、抗炎症剤等である。該高分子結合体は、注射剤、錠剤、散剤等の通常使用されている剤型にて使用され得る。製剤化に当たり通常使用されている薬学的に許容される担体、例えば、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、保存剤、無痛化剤、色素、香料等が使用できる。【００９４】
本発明の生理活性物質の高分子結合体は注射剤としての使用が好ましく、通常、例えば、水、生理食塩水、５％ブドウ糖又はマンニトール液、水溶性有機溶媒（例えば、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモフォア等及びそれらの混合液）並びに水と該水溶性有機溶媒の混合液等が使用される。【００９５】
本発明の生理活性物質の高分子結合体の投与量は、その生理活性物質の特性、患者の性別、年齢、生理的状態、病態等により当然変更され得るが、非経口的に、通常、成人１日当たり、活性成分として０．０１〜５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ／ｍ２を投与する。注射による投与は、静脈、動脈、患部（腫瘍部、炎症部等）等に行われる。
【実施例】
【００９６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
ガウス分布分析は、ＺｅｔａＰｏｔｅｎｔｉａｌ／Ｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｒ  ＮＩＣＯＭＰ  ３８０ＺＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて行った。【００９７】
実施例１  化合物１（分子量５０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が３０のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体と４−（ヒドロキシメチル）フェノールとのフェニルエステル結合体：一般式（ＩＩ）のＲ１＝Ｍｅ（メチル基）、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３＝Ａｃ（アセチル基）、Ｒ４＝４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ基、Ｒ５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＝３０、ａ＝１１３）の合成【００９８】
特許第３２６８９１３号公報に記載された方法によって調製したメトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（アスパラギン酸の重合数３０、１．０ｇ）と特許文献４記載の方法で調製した４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシメチル）フェノール（８４７ｍｇ）をＤＭＦ（８ｍｌ）に溶解し、１５℃にてＤＭＡＰ（４３ｍｇ）、ＤＩＰＣ（１．１１ｍｌ）を加え２０時間撹拌した。反応液にエタノール（１２ｍｌ）、酢酸エチル（１２ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（９６ｍｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した後、沈析物を濾取し、エタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１０ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル（１５ｍｌ）に溶解後、０℃にて４Ｎ−塩酸／ジオキサン（０．３８ｍｌ）を加えて、０℃にて１５分間攪拌した。反応液にエタノール（４５ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（１８０ｍｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥することによって化合物１（８８０ｍｇ）を得た。【００９９】
化合物１に結合した４−（ヒドロキシメチル）フェノール含量は、化合物１に１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて４０℃にて１時間攪拌した後、酢酸を加えて中和し、遊離した４−（ヒドロキシメチル）フェノールをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析することによって求めた。その結果、４−（ヒドロキシメチル）フェノール含量は９．１％（ｗ／ｗ）、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｄ＋ｅの割合は２２．５％であった。【０１００】
本方法によると、Ｒ５としてイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基を付加することができ、その存在比は化合物１を重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められる。イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基がポリアスパラギン酸に占める割合、即ち、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊに対するｆ＋ｇの割合は７．６％であった。その他のアスパラギン酸は遊離カルボン酸（ｈ＋ｉ）あるいは環状構造（ｊ）である。【０１０１】
実施例２  化合物２（化合物１とドキソルビシンの結合体）の合成
実施例１で得られた化合物１（５００ｍｇ）とジサクシニルカーボネート（９３３ｍｇ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解し、１５℃にてトリエチルアミン（０．２５４ｍｌ）を加え２０時間撹拌した。反応液にエタノール（９０ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（３６０ｍｌ）を加え室温にて３０分間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥した。得られた固形物をＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、１５℃にてＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解したドキソルビシン塩酸塩（１１６ｍｇ）とトリエチルアミン（０．０２８ｍｌ）を加え２時間撹拌した。反応液にエタノール（１００ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（４００ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１５０ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥した。得られた固形物をアセトニトリル（３０ｍｌ）及び水（３ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製  ダウエックス５０（Ｈ＋）、５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１０／１（ｖ／ｖ）、１５ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（６０ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後、凍結乾燥することによって化合物２（５６４ｍｇ）を得た。【０１０２】
化合物２に結合したドキソルビシン含量は、化合物２（３．３８ｍｇ）に１Ｎ塩酸（１ｍｌ）を加えて４０℃にて１時間攪拌した後、遊離したドキソルビシンのアグリコン（アドリアマイシノン）をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、ドキソルビシンに同処理を行って得られたアグリコンの検量線と比較することによって求めた。その結果、結合したドキソルビシン含量は１１．５％（ｗ／ｗ）だった。なお、化合物２中、遊離のドキソルビシンは未検出であった。【０１０３】
化合物２の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いてガウス分布分析を行ったところ、平均粒径は２３ｎｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）だった。よって、化合物２は水中でミセルを形成しているものと考えられた。【０１０４】
実施例３  化合物３（分子量１２０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が２３のポリグルタミン酸部分からなるブロック共重合体と４−（ヒドロキシメチル）フェノールとのフェニルエステル結合体：一般式（ＩＶ）のＲ８＝Ｍｅ（メチル基）、Ｒ９＝トリメチレン基、Ｒ１０＝Ａｃ（アセチル基）、Ｒ１１＝４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ基、Ｒ１２＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｋ＋ｍ＋ｎ＝２３、ｂ＝２７３）の合成【０１０５】
特開平５−９５５号公報に記載された方法によって調製したメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（グルタミン酸の重合数２３、１．０ｇ）と特許文献４記載の方法で調製した４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシメチル）フェノール（２９５ｍｇ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し、２７℃にてＤＭＡＰ（１９ｍｇ）、ＤＩＰＣ（０．４８５ｍｌ）を加え、同温にて２０時間撹拌した。反応液にエタノール（２３ｍｌ）、酢酸エチル（２３ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（１８０ｍｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した後、沈析物を濾取し、エタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、２０ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル（１５ｍｌ）に溶解後、０℃にて４Ｎ−塩酸／ジオキサン（０．３８ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した。反応液にエタノール（４５ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（１８０ｍｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥することによって化合物３（１．１ｇ）を得た。【０１０６】
化合物３に結合した４−（ヒドロキシメチル）フェノール含量は、化合物３に１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて４０℃にて１時間攪拌した後、酢酸を加えて中和し、遊離した４−（ヒドロキシメチル）フェノールをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析することによって求めた。その結果、４−（ヒドロキシメチル）フェノール含量は９．４％（ｗ／ｗ）、ｋ＋ｍ＋ｎに対するｋの割合は５３．８％であった。【０１０７】
本方法によると、Ｒ１２としてイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基を付加することができ、その存在比は化合物３を重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基がポリグルタミン酸に占める割合、即ち、ｋ＋ｍ＋ｎに対するｍの割合は３２．０％だった。その他のグルタミン酸は遊離カルボン酸（ｎ）である。【０１０８】
実施例４  化合物４（化合物３とドキソルビシンの結合体）の合成
実施例３で得られた化合物３（５００ｍｇ）とジサクシニルカーボネート（９６６ｍｇ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解し、１５℃にてトリエチルアミン（０．２６３ｍｌ）を加え２０時間撹拌した。反応液にエタノール（９０ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（３６０ｍｌ）を加え室温にて３０分間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥した。得られた固形物をＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、１５℃にてＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解したドキソルビシン塩酸塩（１２０ｍｇ）とトリエチルアミン（０．０２９ｍｌ）を加え２時間撹拌した。反応液にエタノール（１００ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（４００ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１５０ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥した。得られた固形物をアセトニトリル（３０ｍｌ）及び水（３ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製  ダウエックス５０（Ｈ＋）、５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１０／１（ｖ／ｖ）、１５ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（６０ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後、凍結乾燥することによって化合物４（６１１ｍｇ）を得た。【０１０９】
化合物４に結合したドキソルビシン含量は、化合物４（３．１３ｍｇ）に１Ｎ塩酸（１ｍｌ）を加えて４０℃にて１時間攪拌した後、遊離したドキソルビシンのアグリコン（アドリアマイシノン）をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、ドキソルビシンに同処理を行って得られたアグリコンの検量線と比較することによって求めた。その結果、結合したドキソルビシン含量は１７．１％（ｗ／ｗ）だった。なお、化合物４中、遊離のドキソルビシンは未検出であった。【０１１０】
化合物４の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いてガウス分布分析を行ったところ、平均粒径は４３ｎｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）だった。よって、化合物４は水中でミセルを形成しているものと考えられた。【０１１１】
実施例５  化合物５（化合物３とベスタチンメチルエステルの結合体）の合成
実施例３で得られた化合物３（５０ｍｇ）とジサクシニルカーボネート（９７ｍｇ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、１５℃にてトリエチルアミン（０．０２６ｍｌ）を加え２０時間撹拌した。反応液にエタノール（９ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（３６ｍｌ）を加え室温にて３０分間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１０ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥した。得られた固形物をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解し、１５℃にてＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解した特開２００１−１３１０６６号公報に記載のベスタチンメチルエステル塩酸塩（８．８ｍｇ）とトリエチルアミン（０．００３ｍｌ）を加え２時間撹拌した。反応液にエタノール（７．５ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（３０ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した。上清を分離し、更にエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１０ｍｌ）を加えて１５分間攪拌した後、再び上清を分離して残渣を真空乾燥した。得られた固形物をアセトニトリル（５ｍｌ）及び水（０．５ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製  ダウエックス５０（Ｈ＋）、１ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１０／１（ｖ／ｖ）、３ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（６ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後、凍結乾燥することによって化合物５（５５ｍｇ）を得た。【０１１２】
化合物５に結合したベスタチンメチルエステル含量は、化合物５（４．８９ｍｇ）を１モル／ｌのナトリウムメトキシドのメタノール溶液（１ｍｌ）に溶解し室温にて１時間反応させた後、遊離したベスタチンメチルエステルをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、ベスタチンメチルエステルの検量線と比較することによって求めた。その結果、結合したベスタチンメチルエステル含量は１４．６％（ｗ／ｗ）だった。なお、化合物５中、遊離のベスタチンメチルエステルは未検出であった。【０１１３】
化合物５の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いてガウス分布分析を行ったところ、平均粒径は４１ｎｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）だった。よって、化合物５は水中でミセルを形成しているものと考えられた。【０１１４】
実施例６  化合物６（化合物３とエトドラクの結合体）の合成
実施例３で得られた化合物３（５０ｍｇ）とエトドラク（和光純薬社製、１０．８ｍｇ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、１５℃にてＤＭＡＰ（０．５ｍｇ）、ＤＩＰＣ（０．０１２ｍｌ）を加え２０時間撹拌した。反応液にエタノール（１．５ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（６ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した後、沈析物を濾取し、エタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、３ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル（３ｍｌ）及び水（０．３ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製  ダウエックス５０（Ｈ＋）、０．５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１０／１（ｖ／ｖ）、３ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（６ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後、凍結乾燥することによって化合物６（５６ｍｇ）を得た。【０１１５】
化合物６に結合したエトドラク含量は、化合物６（１０．５７ｍｇ）を１モル／ｌの水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）に溶解して室温にて１時間反応させた後、酢酸で中和し、遊離したエトドラクをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、エトドラクの検量線と比較することによって求めた。その結果、結合したエトドラク含量は１１．６％（ｗ／ｗ）だった。なお、化合物６中、遊離のエトドラクは未検出であった。【０１１６】
化合物６の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いてガウス分布分析を行ったところ、平均粒径は４９ｎｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）だった。よって、化合物６は水中でミセルを形成しているものと考えられた。【０１１７】
実施例７  化合物７（化合物３とインドメタシンの結合体）の合成
実施例３で得られた化合物３（５０ｍｇ）とインドメタシン（和光純薬社製、１３．５ｍｇ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、１５℃にてＤＭＡＰ（０．５ｍｇ）、ＤＩＰＣ（０．０１２ｍｌ）を加え２０時間撹拌した。反応液にエタノール（１．５ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（６ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した後、沈析物を濾取し、エタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、３ｍｌ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル（３ｍｌ）及び水（０．３ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製ダウエックス５０（Ｈ＋）、０．５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１０／１（ｖ／ｖ）、３ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（６ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後、凍結乾燥することによって化合物７（５８ｍｇ）を得た。【０１１８】
化合物７に結合したインドメタシン含量は、化合物７（８．５９ｍｇ）を１モル／ｌの水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）に溶解して室温にて１時間反応させた後、酢酸で中和し、遊離したインドメタシンの分解物（脱４−クロロ安息香酸体）をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、インドメタシンから同処理にて得られた同じ分解物の検量線と比較することによって求めた。その結果、結合したインドメタシン含量は１３．３％（ｗ／ｗ）だった。なお、化合物７中、遊離のインドメタシンは未検出であった。【０１１９】
化合物７の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いてガウス分布分析を行ったところ、平均粒径は６１ｎｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）だった。よって、化合物７は水中でミセルを形成しているものと考えられた。【０１２０】
比較例１  比較化合物１（分子量５０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が３０のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体とドキソルビシンとのアミド結合体）の合成
特許第３２６８９１３号公報に記載された方法によって調製したメトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（アスパラギン酸の重合数３０、２４０ｍｇ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解後、３５℃にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（１９７ｍｇ）、ＤＩＰＣ（０．２６７ｍｌ）を加えて３０分間攪拌した。反応液に酢酸エチル（２０ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（１００ｍｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した後、沈析物をろ過し、酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１０ｍｌ）で洗浄して真空乾燥した。得られた沈析物をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、２５℃にてＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解したドキソルビシン塩酸塩（１３０ｍｇ）とトリエチルアミン（０．０３８ｍｌ）を加え２時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２４ｍｌ）及びジイソプロピルエーテル（９６ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した。沈析物をろ過し、酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１０ｍｌ）で洗浄して真空乾燥した。得られた沈析物をアセトニトリル（３０ｍｌ）及び水（３ｍｌ）に溶解後、イオン交換樹脂（ダウケミカル社製  ダウエックス５０（Ｈ＋）、５ｍｌ）に通塔し、アセトニトリル／水（１０／１（ｖ／ｖ）、１５ｍｌ）にて溶出した。得られた溶出画分に水（３６ｍｌ）を加えた後アセトニトリルを減圧下留去し、その後、凍結乾燥することによって比較化合物１（３３８ｍｇ）を得た。【０１２１】
比較化合物１に結合したドキソルビシン含量は、比較化合物１（５．１６ｍｇ）に１Ｎ塩酸（１ｍｌ）を加えて４０℃にて１時間攪拌した後、遊離したドキソルビシンのアグリコン（アドリアマイシノン）をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、同処理を行ったドキソルビシンより得られたアグリコンの検量線と比較することによって求めた。その結果、結合したドキソルビシン含量は３１．６％（ｗ／ｗ）だった。なお、比較化合物１中、遊離のドキソルビシンは未検出であった。【０１２２】
試験例１  酵素非存在下での薬物の放出（ドキソルビシン）
本発明の高分子結合体である化合物２及び化合物４、並びに比較化合物１をそれぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；ｐＨ７．１）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し３７℃にてインキュベートした。該高分子結合体より放出されたドキソルビシンを、ＨＰＬＣにて分析し検量線を用いて定量した。定量値と高分子結合体の薬物含有量から求めた全薬物量との比を図１に示した。【０１２３】
図１から明らかなように、本発明の高分子結合体（化合物２及び化合物４）は加水分解酵素がなくても有意にドキソルビシンを放出した。特に、ポリアスパラギン酸構造部分を持つ化合物２は、グルタミン酸構造部分を持つ化合物４と比較して、より速くドキソルビシンを放出する。なお、化合物２において、ドキソルビシンの放出量が２４時間後に減少しているのは、溶液中に放出されたドキソルビシンが溶液内で一部分解したためと考えられる。一方、アミド結合している比較化合物１は、２４時間でもドキソルビシンの放出を確認できなかった。これらの結果は、本発明の高分子結合体の酵素非存在下での優れた薬物放出性能を示している。【０１２４】
試験例２  酵素非存在下での薬物放出（ベスタチンメチルエステル）
本発明の高分子結合体である化合物５をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；ｐＨ７．１）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し３７℃にてインキュベートした。該高分子結合体より放出されたベスタチンメチルエステルを、ＨＰＬＣにて分析し標準曲線を用いて定量した。定量値と高分子結合体の薬物含有量から求めた全薬物量との比を図２に示した。【０１２５】
図２から明らかなように、本発明の高分子結合体は加水分解酵素がなくても有意にベスタチンメチルエステルを放出した。この結果は、本発明の高分子結合体の酵素非存在下での優れた薬物放出性能を示している。【０１２６】
試験例３  酵素非存在下での薬物の放出（エトドラク、インドメタシン）
化合物６及び７をそれぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；ｐＨ７．１）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し３７℃にてインキュベートした。該高分子結合体より放出されたエトドラクあるいはインドメタシンを、ＨＰＬＣにて分析し検量線を用いて定量した。定量値と高分子結合体の薬物含有量から求めた全薬物量との比を図３に示した。【０１２７】
図３から明らかなように、本発明の高分子結合体は加水分解酵素がなくても有意にエトドラクあるいはインドメタシンを放出した。この結果は、本発明の高分子結合体の酵素非存在下での優れた薬物放出性能を示している。【０１２８】
試験例４  抗腫瘍作用
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６を約２ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いて雌性ＣＤＦ１マウスの背側部皮下に移植した。腫瘍移植後８日目に本発明の高分子結合体（化合物２、化合物４）又は対照薬（比較化合物１、ドキソルビシン塩酸塩）を、各々ドキソルビシン換算で体重当たり同量となるようマウス尾静脈内に単回投与した。各化合物は５％ブドウ糖注射液で溶解し用いた。投与後、腫瘍の長径（Ｌｍｍ）及び短径（Ｗｍｍ）を、ノギスを用いて計測し、腫瘍体積を（ＬｘＷ２）／２により計算して投与開始日の腫瘍体積に対する相対腫瘍体積として表１に示した。【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
対照薬としてのドキソルビシンは３０ｍｇ／ｋｇが致死量であるため、本試験では１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与して抗腫瘍試験を行った。表１から明らかなように、本発明の高分子結合体はドキソルビシンより投与量幅が拡大して、より強い抗腫瘍効果を示している。一方、比較化合物１は、２４０ｍｇ／ｋｇの投与量においても全く抗腫瘍効果を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】化合物２、化合物４及び比較化合物１のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．１、３７℃）中でのドキソルビシンの全結合量に対する放出量の割合を示す
【図２】化合物５のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．１、３７℃）中でのベスタチンメチルエステルの全結合量に対する放出量の割合を示す
【図３】化合物６あるいは化合物７のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．１、３７℃）中でのエトドラクあるいはインドメタシンの全結合量に対する放出量の割合を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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