(57)【要約】  平坦脳波を有し、かつ、対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する非ヒト動物である低血糖脳症モデルに、グルコース及び被験物質を投与する投与工程と、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性からなる群より選択される少なくとも１つの誘発を抑制可能な被験物質を、神経保護剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含む神経保護剤のスクリーニング方法；当該スクリーニング方法に用いる低血糖脳症モデル、及びその製造方法。
2013125722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平坦脳波を有し、かつ、対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する非ヒト動物である低血糖脳症モデルに、グルコース及び被験物質を投与する投与工程と、
脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性からなる群より選択される少なくとも１つの誘発を抑制可能な被験物質を、神経保護剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、
を含む神経保護剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
非ヒト動物の脳波を平坦脳波とし、該平坦脳波の維持時間を１０分間以内に終了させることにより、前記投与工程で用いる前記低血糖脳症モデルを作製する工程を更に含む請求項１に記載の神経保護剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記低血糖脳症モデルは、グルコースの投与によりグルコース再灌流障害が誘発される請求項１又は請求項２に記載の神経保護剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記低血糖脳症モデルは、グルコース再灌流により、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性からなる群より選択される少なくとも１つが誘発される請求項３に記載の神経保護剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記低血糖脳症モデルの血糖値が２５ｍｇ／ｄＬ以下である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の神経保護剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
非ヒト動物の脳波を平坦脳波とし、該平坦脳波の維持時間を１０分間以内とすることを含む低血糖脳症モデルの製造方法。
【請求項７】
非ヒト動物に、糖質を１日あたり２７ｇ／ｋｇ〜３８ｇ／ｋｇで３日間以上摂取させた後、インスリンを投与して平坦脳波とすることを含む請求項６に記載の低血糖脳症モデルの製造方法。
【請求項８】
インスリンの投与量が、１０ＩＵ／ｋｇ〜２０ＩＵ／ｋｇである請求項７に記載の低血糖脳症モデルの製造方法。
【請求項９】
平坦脳波を有し、かつ、
対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する非ヒト動物である請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の製造方法により得られる低血糖脳症モデル。
【請求項１０】
Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを有効成分とする神経保護剤。
【請求項１１】
グルコース及び請求項１０に記載の神経保護剤を少なくとも含有する、低血糖脳症の予防剤又は治療剤。
【請求項１２】
Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを有効成分とする細胞傷害性アルデヒド発生抑制剤。
【請求項１３】
細胞傷害性アルデヒドが、４−ヒドロキシ−２−ノネナールである請求項１２に記載の細胞傷害性アルデヒド発生抑制剤。
【請求項１４】
Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを有効成分とする神経細胞変性抑制剤。
【請求項１５】
請求項１０に記載の神経保護剤を神経保護の必要性を有する対象へ投与することを含む神経保護方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の低血糖脳症の予防剤又は治療剤を、低血糖脳症の予防又は治療の必要性を有する対象へ投与することを含む低血糖脳症の予防方法又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低血糖脳症モデル及びその製造方法、並びに、神経保護剤のスクリーニング方法、及び神経保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
低血糖脳症とは、低血糖による意識障害の状態をいい、インスリン若しくは経口血糖降下剤を用いて糖尿病を治療する際又は、インスリノーマ、アルコール依存症、神経性食思不振症などに起因して生じることが知られている。多くの場合、適切な処置により回復するが、時には後遺症を生じること又は、死に至るなど重篤となることがある。【０００３】
低血糖脳症に対しては、現在のところ血糖補正（グルコース投与）以外に治療法はない。しかしながら、低血糖脳症の病態にグルコースを投与することにより、酸化的ストレスが生じ、これにより神経細胞変性が生じるという問題がある（Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００３，  ２３（３３），  １０６８１−１０６９０；ｄｅ  Ｃｏｕｒｔｅｎ−Ｍｙｅｒｓ  ＧＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２０００，  ２０（１），  ８２−９２；Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２００７，  １１７（４），  ９１０−９１８、参照）。この現象は、グルコース再灌流障害と呼ばれ、血糖補正後の血糖値が高くなるほど障害が高度となることが知られている（Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２００７，  １１７（４），  ９１０−９１８、参照）。【０００４】
前記酸化的ストレスの評価には、様々なバイオマーカーが使用されている。酸化的ストレスの評価に用いられるバイオマーカーとしては、例えば、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）などが挙げられる。４−ＨＮＥは、生体脂質のアラキドン酸のようなω６系高度不飽和脂肪酸から生成される細胞傷害性アルデヒドであり、ミトコンドリア障害をきたし、神経細胞変性を引き起こすことが知られている（Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ，  Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ，  ２００９，  ４４（１０），  ６２５−６３３；Ｋｅｌｌｅｒ  ＪＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  １９９８．  １８（２），  ６８７−６９７、参照）。【０００５】
そのため、低血糖脳症の治療において、血糖補正の際に、神経保護作用を奏する治療の併用又は神経保護剤の投与を行うことが望まれている。このような治療法としては、例えば、グルコース再灌流時のグルタミン酸興奮毒性による神経細胞死の抑制を目的としたピルビン酸投与（Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２００５，  ５４（５），  １４５２−１４５８参照）；グルコース欠乏時の神経細胞の乳酸利用による高次機能保持を目的とした乳酸投与（Ｍａｒａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  １９９４，  ３４３（８８８８），  １６−２０；Ｍａｒａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ２０００，  ４３（６），  ７３３−７４１、参照）；グルコース再灌流時の小胞性亜鉛の放出がもたらすＤＮＡ損傷による神経細胞死の抑制を目的とした亜鉛キレート剤投与（Ｍａｒａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  １９９４，  ３４３（８８８８），  １６−２０；Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ，  ２００４，  １６（３），  ５３８−５４５、参照）；グルコース再灌流障害に伴う酸化的ストレスの緩和を目的とした低体温療法（Ｓｈｉｎ  ＢＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２０１０，  ３０（２），  ３９０−４０２、参照）、一酸化窒素（ＮＯ）合成酵素阻害剤投与（Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２００８，  ２８（１０），  １６９７−１７０６、参照）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤投与（Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２００７，  １１７（４），  ９１０−９１８、参照）などが挙げられる。【０００６】
このような低血糖脳症におけるグルコース再灌流に対する神経保護剤の開発は、従来より動物モデルを用いて行われている。低血糖脳症におけるグルコース再灌流に対する神経保護剤の開発に用いられる動物モデルには、例えば、低血糖昏睡モデル、低血糖非昏睡モデルが挙げられる。
前記低血糖昏睡モデルの具体例としては、血糖低下後に生じる平坦脳波を３０分間以上維持し、中枢神経に高度の低血糖状態を負荷するモデルが知られている（Ｓｕｈ  ＳＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００３，  ２３（３３），  １０６８１−１０６９０；Ａｕｅｒ  ＲＮ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  １９８４，  ３３（１１），  １０９０−１０９８、参照）。【０００７】
前記低血糖非昏睡モデルは、平坦脳波を指標とせず、平坦脳波前に安楽死又はグルコース投与などの試験を行うモデルである（Ｈａｃｅｓ  ＭＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，  ２００８，  ２１１（１），  ８５−９６；Ｈａｃｅｓ  ＭＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１０，  １６５（１），  ２８−３８；Ｔｋａｃｓ  ＮＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２００５，  ２５（１２），  １６４５−１６５５、参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来の神経保護剤における神経保護作用は、十分満足できるものではなかった。前記低体温療法は、有効性及び実現可能性が高いと考えられているものの、電解質異常、感染症などの副作用が多く、また高額の医療費がかかり、医療スタッフへの負担も大きいなどの問題がある。【０００９】
一方、低血糖脳症におけるグルコース再灌流障害に対する神経保護剤の開発に用いられる動物モデルのうち、前記低血糖昏睡モデルは、低血糖に伴う脳神経の明瞭な変化を観察できる反面、呼吸停止は必発で、予め人工呼吸器の装着を行う必要がある。加えて、重篤な低血糖状態を長時間維持する点、及び人工呼吸器を用いる点で、臨床で経験するヒトの低血糖脳症とは病態が異なるという問題がある。また、前記低血糖非昏睡モデルは、低血糖負荷の反応の程度に個体差が大きい点、経過を示す指標として平坦脳波に代わるものが種々用いられている点で問題である。【００１０】
したがって、平坦脳波を低血糖負荷の指標とし、かつ人工呼吸器を使用しない、より生理的な低血糖脳症モデルの確立、該低血糖脳症モデルを用いた神経保護剤のスクリーニング方法、並びに優れた神経保護作用を有する新たな神経保護剤の提供が強く望まれているのが現状である。
本発明は、人工呼吸器を使用することなく生存可能であり、従来の低血糖脳症モデルよりも臨床で経験する病態に近い生理的な低血糖状態を有し、平坦脳波を指標とする低血糖脳症モデル及びその製造方法、並びに、前記低血糖脳症モデルを用い、神経保護剤を効率よく簡便にスクリーニングする神経保護剤のスクリーニング方法、及び優れた神経保護作用を有する神経保護剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の態様を含む。
＜１＞  平坦脳波を有し、かつ、対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する非ヒト動物である低血糖脳症モデルに、グルコース及び被験物質を投与する投与工程と、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性からなる群より選択される少なくとも１つの誘発を抑制可能な被験物質を、神経保護剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含む神経保護剤のスクリーニング方法である。
＜２＞  非ヒト動物の脳波を平坦脳波とし、該平坦脳波の維持時間を１０分間以内に終了させることにより、前記投与工程で用いる前記低血糖脳症モデルを作製する工程を更に含む前記＜１＞に記載の神経保護剤のスクリーニング方法である。
＜３＞  前記低血糖脳症モデルは、グルコースの投与によりグルコース再灌流障害が誘発される前記＜１＞又は＜２＞に記載の神経保護剤のスクリーニング方法である。
＜４＞  前記低血糖脳症モデルは、グルコース再灌流により、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性からなる群より選択される少なくとも１つが誘発される前記＜３＞に記載の神経保護剤のスクリーニング方法である。
＜５＞  前記低血糖脳症モデルの血糖値が２５ｍｇ／ｄＬ以下である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の神経保護剤のスクリーニング方法である。
＜６＞  非ヒト動物の脳波を平坦脳波とし、該平坦脳波の維持時間を１０分間以内とすることを含む低血糖脳症モデルの製造方法である。
＜７＞  非ヒト動物に、糖質を１日あたり２７ｇ／ｋｇ〜３８ｇ／ｋｇで３日間以上摂取させた後、インスリンを投与して平坦脳波とすることを含む前記＜６＞に記載の低血糖脳症モデルの製造方法である。
＜８＞  インスリンの投与量が、１０ＩＵ／ｋｇ〜２０ＩＵ／ｋｇである前記＜７＞に記載の低血糖脳症モデルの製造方法である。
＜９＞  平坦脳波を有し、かつ、対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する非ヒト動物である前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の製造方法により得られる低血糖脳症モデルである。
＜１０＞  Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを有効成分とする神経保護剤である。
＜１１＞  グルコース及び前記＜１０＞に記載の神経保護剤を少なくとも含有する、低血糖脳症の予防剤又は治療剤である。【００１２】
＜１２＞  Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを有効成分とする細胞傷害性アルデヒド発生抑制剤である。
＜１３＞  細胞傷害性アルデヒドが、４−ヒドロキシ−２−ノネナールである前記＜１２＞に記載の細胞傷害性アルデヒド発生抑制剤である。
＜１４＞  Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを有効成分とする神経細胞変性抑制剤である。
＜１５＞  前記＜１０＞に記載の神経保護剤を神経保護の必要性を有する対象へ投与することを含む神経保護方法。
＜１６＞  前記＜１１＞に記載の低血糖脳症の予防剤又は治療剤を、低血糖脳症の予防又は治療の必要性を有する対象へ投与することを含む低血糖脳症の予防方法又は治療方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、人工呼吸器を使用することなく生存可能であり、従来の低血糖脳症モデルよりも臨床で経験する症状により近い生理的な低血糖状態を有し、平坦脳波を指標とする低血糖脳症モデル及びその製造方法、並びに、前記低血糖脳症モデルを用い、神経保護剤を効率よく簡便にスクリーニングする神経保護剤のスクリーニング方法、及び優れた神経保護作用を有する神経保護剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、低血糖脳症モデルの作製における、インスリン投与前後の脳波所見、並びに、血糖値、及び神経学的所見の結果の一例を示す図である。図１Ａの脳波において、縦軸は、振幅（μＶ）を表し、横軸は、持続時間（秒間）を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、低血糖脳症モデルへのグルコース投与後の脳波所見、並びに、血糖値、及び神経学的所見の結果の一例を示す図である。図１Ｂの脳波において、縦軸は、振幅（μＶ）を表し、横軸は、持続時間（秒間）を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、低血糖脳症モデルの作製における低血糖負荷及びグルコース再灌流の投与スケジュールの一例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、低血糖脳症モデルへのグルコース、並びに、ＡＬＤＨ２アゴニスト（ＡＬＤＨ２アゴニスト投与群）又はＤＭＳＯ（対照群）の投与スケジュールの一例を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、大脳の頭頂及び側頭皮質（海馬のレベル）における４−ＨＮＥ陽性細胞を光学顕微鏡で観察した写真の一例である。左：ｓｈａｍ群、中央：平坦脳波２分間群、右：平坦脳波１０分間群。それぞれの写真左下の囲み部は、各写真の一部を拡大して示したものである。スケールバーは、１００μｍを表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａから４−ＨＮＥ陽性細胞を定量した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表し（Ｎ＝３）、「＊」は、Ｐ＝０．００１を表す。
【図４Ａ】図４Ａは、大脳の頭頂及び側頭皮質（海馬のレベル）におけるＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞を光学顕微鏡で観察した写真の一例である。左：ｓｈａｍ群、中央：平坦脳波２分間群、右：平坦脳波１０分間群。それぞれの写真左下の囲み部は、各写真の一部を拡大して示したものである。スケールバーは、１００μｍを表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４ＡからＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞を定量した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表し（Ｎ＝３）、「＊」は、Ｐ＝０．０１８を表す。
【図５Ａ】図５Ａは、大脳の頭頂及び側頭皮質（海馬のレベル）における４−ＨＮＥ陽性細胞を光学顕微鏡で観察した写真の一例である。左：対照群、右：Ａｌｄａ−１投与群。それぞれの写真左下の囲み部は、各写真の一部を拡大して示したものである。スケールバーは、１００μｍを表す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａから４−ＨＮＥ陽性細胞を定量した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表し（Ｎ＝３）、「＊」は、Ｐ＝０．０４２を表す。
【図６Ａ】図６Ａは、大脳の頭頂及び側頭皮質（海馬のレベル）におけるＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞を光学顕微鏡で観察した写真の一例である。左：対照群、右：Ａｌｄａ−１投与群。それぞれ写真左下の囲み部は、各写真の一部を拡大して示したものである。スケールバーは、１００μｍを表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６ＡからＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞を定量した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表し（Ｎ＝３）、「＊」は、Ｐ＝０．００７を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（低血糖脳症モデル）
本発明の低血糖脳症モデル（「低血糖短時間昏睡モデル」と称することもある）は、平坦脳波を有し、かつ、対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する非ヒト動物である。好ましくは、これらの病態の全てを呈する。
本発明者らは鋭意検討した結果、平坦脳波を有し、かつ、低血糖脳症において認められる種々の症状のうち特に、対光反射の消失、瞳孔の拡大、及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つの症状を呈する低血糖脳症モデルが、人工呼吸器を使用することなく生存可能であり、従来の低血糖脳症モデルよりも、臨床で経験する病態により近い生理的な低血糖状態を有するという知見を得た。本発明の低血糖脳症モデルは、特に、ヒトの臨床で経験する病態に近い生理的な低血糖状態を有する。本発明はこの知見に基づくものである。このため、本発明の低血糖脳症モデルは、低血糖脳症の病態の研究、低血糖脳症に関連する疾患の治療又は状態の改善を目的とする薬剤のスクリーニングなどの用途において、従来のモデルよりも有用である。
【００１６】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１７】
本発明における「低血糖脳症モデル」は、臨床により近い生理的な低血糖状態を有する非ヒト動物を意味する。非ヒト動物としては、例えば、鳥類、哺乳類を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等が挙げられる。哺乳類としては、サル等の霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどが挙げられる。これらの中でも、げっ歯類、例えばラットが好ましい。
【００１８】
前記平坦脳波とは、脳波の振幅が１０μＶ以下であり、かつ周期が１／６Ｈｚ以下の脳波の状態をいう。前記脳波は、例えば、公知の脳波計（例えば、ＥＥＧ１００Ｃ、  ＢＩＯＰＡＣ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．製）により測定することができる。
【００１９】
低血糖脳症モデルが呈する症状は、対光反射の消失、瞳孔の拡大及び痙攣からなる群より選択される少なくとも１つであればよく、好ましくは、対光反射の消失、瞳孔の拡大及び痙攣のすべてを呈する。対光反射の消失、瞳孔の拡大及び痙攣のいずれの症状を示さない低血糖脳症モデルは、生理的な低血糖状態を示さない。
【００２０】
対光反射の消失とは、脳神経障害による瞳孔括約筋収縮の消失を意味する。対光反射が消失していることの確認は、常法により行うことができ、例えば、用手的に開眼を１０秒間行い、開眼と同時にペンライトを照射して瞳孔径を観察し、瞳孔が拡大した状態となり，瞳孔径の縮小が認められないことにより行う。瞳孔の拡大とは、意識が正常な状態の瞳孔径と比較して確認可能な大きさに拡大していることを意味する。具体的な大きさは非ヒト動物の種類によって異なるが、例えば、Sprague-Dawleyラットの場合には、３．０ｍｍより大きく拡大することを意味する。瞳孔が拡大していること確認は、常法により行うことができ、例えば、用手的に開眼をさせて、瞳孔径を観察することにより行う。痙攣とは、四肢、体幹又は頸部の不随意的な運動を意味する。痙攣の症状を呈していることの確認は、常法により行うことができ、例えば、四肢、体幹及び頸部における不随意な運動の有無を観察することにより行う。
【００２１】
前記低血糖脳症モデルは、平坦脳波を有し、かつ、対光反射の消失、瞳孔の拡大、痙攣の少なくともいずれかの症状に加えて、他の症状を呈するものであってもよい。他の症状の中でも、グルコースの投与によりグルコース再灌流障害が誘発されることが特に好ましい。
前記グルコース再灌流障害とは、前記低血糖脳症モデルに対してグルコースを投与することにより生じる酸化的ストレスによって引き起こされる神経細胞変性をいう。低血糖脳症モデルでは、前記グルコース再灌流により、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性の少なくともいずれかが誘発されることが好ましい。
【００２２】
したがって、前記低血糖脳症モデルが前記グルコース再灌流障害を誘発したことは、前記細胞傷害性アルデヒド、変性神経細胞に特異的に発現する分子等のマーカーを検出することにより確認することができる。
【００２３】
前記細胞傷害性アルデヒドとしては、特に制限はなく、例えば、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）などが挙げられる。
なお、４−ＨＮＥによる神経障害の機序としては、イオン輸送性アデノシン三リン酸フォスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）の障害、グルコース及びグルタミン酸輸送障害、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＴＰ）結合蛋白の障害などを介することが知られている（Ｂｌａｎｃ  ＥＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，  １９９７，  ６９（２），  ５７０−５８０、及びＫｒｕｍａｎ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  １９９７，  １７（１３），  ５０８９−５１００参照）。
【００２４】
前記変性神経細胞に特異的に発現する分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変性神経細胞結合性蛍光誘導体（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．製）、ＭＤＡアッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂ  Ｉｎｃ．製）等を用いて認識される分子が挙げられる。前記マーカーを検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的手法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の分子生物学的手法などが挙げられる。これらの中でも、免疫染色法が好ましい。前記マーカーの検出には、変性神経細胞結合性蛍光誘導体（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．製）、ＭＤＡアッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂ  Ｉｎｃ．製）等を用いることができる。
【００２５】
前記低血糖脳症モデルにおける血糖値としては、特に制限はなく、動物種などに応じて適宜選択することができる。血糖値としては、例えば、Sprague-Dawleyラットの場合、２５ｍｇ／ｄＬ以下が好ましく、１５ｍｇ／ｄＬ〜２４ｍｇ／ｄＬがより好ましく、１７ｍｇ／ｄＬ〜２０ｍｇ／ｄＬが特に好ましい。前記血糖値が、２５ｍｇ／ｄＬ以下であれば、前記非ヒト動物が低血糖脳症の症状を呈しやすくなり、１５ｍｇ／ｄＬ以上であれば、前記非ヒト動物が低血糖になりすぎて呼吸不全になること又は死亡することなどを回避できる傾向がある。
前記血糖値は、例えば、前記低血糖脳症モデルの血液を、公知の血糖測定器（例えば、Ａｓｃｅｎｓｉａ  ＢＲＥＥＺＥ  ２、Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）により測定することで確認することができる。
【００２６】
前記低血糖脳症モデルは、本発明の低血糖脳症モデルの製造方法により得られることが好ましいが、他の方法によって製造してもよい。
【００２７】
＜用途＞
前記低血糖脳症モデルは、人工呼吸器を使用することなく生存可能であり、生理的な低血糖状態を有し、平坦脳波を指標とするため、低血糖脳症の病態解明、又は神経保護剤の開発に好適に利用可能である。前記低血糖脳症モデルを、種々の用途に用いる場合、通常複数個体を用い、また、このとき該複数個体の性別、体重、年齢、体質等は全て均一であることが好ましい。
【００２８】
（低血糖脳症モデルの製造方法）
本発明の低血糖脳症モデルの製造方法は、非ヒト動物の脳波を平坦脳波とし、該平坦脳波の維持時間を１０分間以内とすることにより低血糖脳症モデルを製造する方法である。これにより、平坦脳波を低血糖負荷の指標とし、かつ人工呼吸器を使用しない、より生理的な低血糖脳症モデルを得ることができる。
【００２９】
本発明の低血糖脳症モデルの製造方法は、具体的には、平坦脳波を出現させる工程、及び、出現した平坦脳波を１０分間以内、維持させる工程を含み、必要に応じて他の工程を含む。
前記非ヒト動物としては、非ヒトであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。非ヒト動物としては、例えば、鳥類、哺乳類を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等が挙げられる。哺乳類としては、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどが挙げられる。これらの中でも、げっ歯類、例えばラットが好ましい。
【００３０】
前記非ヒト動物の脳波を平坦脳波とする方法、即ち、前記非ヒト動物において平坦脳波を出現させる方法としては、例えば、糖質の摂取量を減少させる方法、インスリンを投与する方法、公知の血糖降下剤を投与する方法等が挙げられる。これらの方法は、１種単独で適用してもよく、２種以上を同時又は順次適用してもよい。これらの中でも、糖質の摂取量を減少させる方法、又は、インスリンを投与する方法が好ましく、これらを併用することがより好ましい。
【００３１】
糖質の摂取量を減少させる方法により非ヒト動物の脳波を平坦脳波とする場合、前記非ヒト動物に摂取させる１日あたりの糖質の摂取量は、適用される非ヒト動物の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、Sprague-Dawleyラットの場合、１６ｇ／ｋｇ〜５０ｇ／ｋｇが好ましく、２２ｇ／ｋｇ〜４３ｇ／ｋｇがより好ましく、２７ｇ／ｋｇ〜３８ｇ／ｋｇが特に好ましい。前記糖質の量が、１６ｇ／ｋｇ以上であれば、前記非ヒト動物が低血糖になりすぎることがなく、呼吸不全又は死亡することを回避することができる傾向があり、５０ｇ／ｋｇ以下であれば、前記非ヒト動物における低血糖脳症の症状を引き起こしやすくなる。
【００３２】
前記非ヒト動物に前記糖質を摂取させる期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３日間以上が好ましく、３日間〜５日間がより好ましく、３日間〜７日間が特に好ましい。前記期間が３日間以上であれば、前記非ヒト動物が低血糖脳症の症状を呈しやすくなる傾向があり、平坦脳波の出現時間に個体間でばらつきが生じにくくなる傾向がある。
【００３３】
インスリンの種類は、特に制限はなく、作用発現時間、作用持続時間等の目的に応じて適宜選択することができる。前記インスリンとしては、例えば、超速効型インスリン、速効型インスリン、混合型インスリン、中間型インスリン、持効型インスリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。前記インスリンは、市販品を用いることができる。これらの中でも、超速効型インスリン、又は速効型インスリンが好ましい。
【００３４】
超速効型インスリンの市販品としては、例えば、ノボラピッド（登録商標）（ノボノルディスクファーマ株式会社製）、ヒューマログ（登録商標）（日本イーライリリー株式会社製）、アピドラ（登録商標）（サノフィ・アベンティス株式会社製）などが挙げられる。
速効型インスリンの市販品としては、例えば、ノボリンＲ（登録商標）（ノボノルディスクファーマ株式会社製）、ヒューマリンＲ（登録商標）（日本イーライリリー株式会社製）などが挙げられる。
混合型インスリンの市販品としては、例えば、ノボリン３０Ｒ（登録商標）（ノボノルディスクファーマ株式会社製）、ヒューマリン３／７（登録商標）（日本イーライリリー株式会社製）などが挙げられる。
中間型インスリンの市販品としては、例えば、ノボリンＮ（登録商標）（ノボノルディスクファーマ株式会社製）、ヒューマリンＮ（登録商標）（日本イーライリリー株式会社製）などが挙げられる。
持効型インスリンの市販品としては、例えば、レベミル（登録商標）（ノボノルディスクファーマ株式会社製）、ランタス（登録商標）（サノフィ・アベンティス株式会社製）などが挙げられる。
【００３５】
インスリンの投与量としては、特に制限はなく、使用するインスリンの種類、適用される非ヒト動物の種類等に応じて適宜選択することができる。インスリンの投与量としては、例えば、Sprague-Dawleyラットの場合、１０ＩＵ／ｋｇ〜２０ＩＵ／ｋｇが好ましく、１２ＩＵ／ｋｇ〜１８ＩＵ／ｋｇがより好ましく、１４ＩＵ／ｋｇ〜１６ＩＵ／ｋｇが特に好ましい。前記インスリンの投与量が、１０ＩＵ／ｋｇ以上であれば、前記非ヒト動物が低血糖脳症の症状を呈しやすくなる傾向があり、２０ＩＵ／ｋｇ以下であれば、前記非ヒト動物が低血糖になりすぎることがなく、呼吸不全になること又は死亡することを回避できる傾向がある。
【００３６】
本発明における前記平坦脳波の維持時間とは、前記非ヒト動物が平坦脳波に達した時点（即ち、平坦脳波が出現した時点）を０分間としたとき、その後、平坦脳波が維持される。
【００３７】
前記平坦脳波の維持時間は、１０分間以内である。平坦脳波の維持時間が１０分を超えると、臨床で経験される低血糖脳症に近い病態が得られず、また、前記非ヒト動物が低血糖になりすぎて呼吸不全になること又は死亡することがある。前記平坦脳波の維持時間は、１分間〜１０分間がより好ましく、２分間〜５分間が特に好ましい。前記平坦脳波の維持時間が、１分間以上であれば、前記非ヒト動物が低血糖脳症の症状を呈しやすくなる傾向がある。
【００３８】
脳波を平坦脳波とする条件としては、人工呼吸器を使用すること無く生存可能であり、生理的な低血糖状態を有する低血糖脳症モデルをより効率よく製造可能である点で、非ヒト動物、例えば、Sprague-Dawleyラットの場合、糖質を１日あたり２７ｇ／ｋｇ〜３８ｇ／ｋｇで３日間以上摂取させた後、インスリンを投与して平坦脳波とすることが好ましい。ここでのインスリンの投与量は、１０ＩＵ／ｋｇ〜２０ＩＵ／ｋｇであることが好ましい。
【００３９】
平坦脳波の維持時間は、平坦脳波に達してから１０分間以内の所望の時間の経過後に、例えば、グルコースの投与等による血糖補正、安楽死等により終了することができる。グルコースの投与等により血糖補正することによって平坦脳波の維持時間を終了する場合には、グルコース再灌流障害の試験を引き続き実施することができる。また安楽死させることによって平坦脳波の維持時間を終了する場合には、低血糖脳症の病態についての試験を引き続き実施することができる。
【００４０】
前記低血糖脳症モデルの製造方法により、本発明における低血糖脳症モデルが製造できたことは、血糖値が低下したことなどにより確認することができる。
前記低血糖脳症モデルにおける血糖値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、Sprague-Dawleyラットの場合の血糖値としては、２５ｍｇ／ｄＬ以下が好ましく、１５ｍｇ／ｄＬ〜２４ｍｇ／ｄＬがより好ましく、１７ｍｇ／ｄＬ〜２０ｍｇ／ｄＬが特に好ましい。前記血糖値が、２５ｍｇ／ｄＬ以下であれば、前記非ヒト動物が低血糖脳症の症状を呈しやすい傾向があり、１５ｍｇ／ｄＬ以上であれば、前記非ヒト動物が低血糖になりすぎることがなく、呼吸不全になること又は死亡することなどを回避しやすい傾向がある。
前記血糖値は、例えば、前記低血糖脳症モデルの血液を、公知の血糖測定器（例えば、Ａｓｃｅｎｓｉａ  ＢＲＥＥＺＥ  ２、Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）により測定することで確認することができる。
【００４１】
（神経保護剤のスクリーニング方法）
本発明の神経保護剤のスクリーニング方法は、上述した本発明における低血糖脳症モデルにグルコース及び被験物質を投与する投与工程と、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性の少なくともいずれかの誘発を抑制した被験物質を神経保護剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
本発明の神経保護剤のスクリーニング方法は、平坦脳波を低血糖負荷の指標とし、かつ人工呼吸器を使用しない、従来の低血糖脳症モデルと比較して、より生理的な低血糖脳症モデルを用いて神経保護剤のスクリーニングを行うので、従来のスクリーニング方法よりも、低血糖脳症に対して神経保護作用を有する神経保護剤を精度よくスクリーニング可能となる。
【００４２】
＜投与工程＞
前記投与工程は、本発明の前記低血糖脳症モデルにグルコース及び被験物質を投与する工程である。
【００４３】
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化合物、核酸、タンパク質等が挙げられる。また、臨床で用いられている神経保護剤、新たに開発した製薬、公知の医薬品、薬物等を用いることもできる。
【００４４】
前記被験物質を投与する方法としては、特に制限はなく、前記被験物質の性質又は状態などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、非経口投与法、局所投与法、経腸投与法等が挙げられる。
前記被験物質の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質等に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
グルコースの投与量は、投与対象個体の年齢、体重、体質、などに応じて適宜選択することができる。グルコースの投与量は、例えば、Sprague-Dawleyラットの場合、９．５ｇ／ｋｇ〜１５．５ｇ／ｋｇが好ましく、１１．５ｇ／ｋｇ〜１３．５ｇ／ｋｇがより好ましい。前記グルコースの投与量が、９．５ｇ／ｋｇ以上であれば、再灌流障害が起こりやすい傾向があり、１５．５ｇ／ｋｇ以下であれば、高血糖になりすぎず、高血糖に伴う神経障害により死亡することを回避することができる。
なお、被検物質の投与量とグルコースの投与量との比率については特に制限はなく、被検物質の種類等により適宜変更可能である。
【００４６】
＜スクリーニング工程＞
前記スクリーニング工程は、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性からなる群より選択される少なくとも１つ（以下、「神経障害」と称することがある）の誘発を抑制可能な被験物質を神経保護剤としてスクリーニングする工程である。前記スクリーニング工程は、前記投与工程の後に行われる。
【００４７】
前記被験物質が、前記神経障害の誘発を抑制したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞傷害性アルデヒド、神経細胞変性等のマーカーを検出する方法などが挙げられる。
【００４８】
前記細胞傷害性アルデヒドの種類、前記神経細胞変性のマーカーの種類、前記マーカーを検出する方法などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記低血糖脳症モデルの説明で例示したものが挙げられ、好ましい態様等も同様である。
【００４９】
前記スクリーニング工程では、前記被験物質を投与した低血糖脳症モデルと、前記被験物質を投与していない低血糖脳症モデルと比較して、前記被験物質を投与した低血糖脳症モデルの方が、前記神経障害の誘発を抑制していた場合、該被験物質を神経保護剤としてスクリーニングすることができる。
また、一の被験物質を投与した低血糖脳症モデルと、他の被験物質を投与した低血糖脳症モデルとにおける、前記神経障害の誘発の抑制度合いを比較して、より神経障害の誘発を抑制していた方の被験物質を神経保護剤としてスクリーニングしてもよい。
また、一の被検物質を投与した低血糖脳症モデルと、既知の神経保護剤を投与した低血糖脳症モデルとにおける前記神経障害の誘発の抑制度合いを比較して、既知の神経保護剤よりも効果的な神経保護作用を有する被検物質を、より有効な神経保護剤としてスクリーニングしてもよい。
【００５０】
本発明の神経保護剤のスクリーニング方法は、必要に応じて、前述した投与工程の前に、非ヒト動物の脳波を平坦脳波とし、該平坦脳波の維持時間を１０分間以内に終了させることにより、投与工程で用いる低血糖脳症モデルを製造する工程を含むことができる。低血糖脳症モデルを得る工程には、本発明の低血糖脳症モデルの製造方法において説明した事項をそのまま適用される。これにより、低血糖脳症モデルの製造方法と、神経保護剤のスクリーニング方法とを一貫して実施することができる。
【００５１】
＜用途＞
本発明の神経保護剤のスクリーニング方法は、低血糖脳症に対する神経保護剤、特に、低血糖脳症の治療の際の血糖補正において生じるグルコース再灌流障害に対する神経保護剤のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系として優れる。従って、低血糖脳症治療のために用いられる新たな神経保護剤のスクリーニングの評価に有効かつ効率的に利用可能である。
【００５２】
（神経保護剤）
本発明の神経保護剤は、Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミド（Ａｌｄａ−１）を有効成分として含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００５３】
＜Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミド（Ａｌｄａ−１）＞
Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミド（Ａｌｄａ−１）は、ミトコンドリアＡＬＤＨ２（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ２）の活性を増加させるＡＬＤＨ２アゴニストである。Ａｌｄａ−１は、市販品（例えば、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いることができる。
Ａｌｄａ−１は、アルデヒド脱水素酵素活性化薬として既知の物質であるが、優れた神経保護作用を有するものであることが、新たに見いだされた。Ａｌｄａ−１の該神経保護作用としては、具体的には、脳細胞における細胞傷害性アルデヒドのひとつである４−ＨＮＥの発生の抑制、神経細胞変性の抑制などが挙げられる。
【００５４】
前記神経保護剤におけるＡｌｄａ−１の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記神経保護剤は、Ａｌｄａ−１そのものであってもよい。
【００５５】
＜その他の成分＞
前記神経保護剤における前記その他の成分としては、薬理学的に許容されるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の添加剤、補助剤、水などが挙げられる。
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、その他の成分の種類、目的等に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００５７】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００５８】
前記粘結剤、増粘剤、又は固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００５９】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００６０】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００６１】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００６２】
前記ｐＨ調整剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６３】
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００６４】
＜剤形＞
前記神経細胞保護剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。
前記神経細胞保護剤は、前記剤形などに応じて、公知の方法により製造することができる。
【００６５】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００６６】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００６７】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。これらの中でも、注射剤が特に好ましい。
【００６８】
＜併用＞
前記神経細胞保護剤は、１種単独で使用されてもよく、他の成分を有効成分とする薬物と併用してもよい。また、他の成分を有効成分とする薬物に配合されていてもよい。
前記神経保護剤を、低血糖脳症の予防又は治療の目的で使用する場合は、併用することが好ましく、前記併用する成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グルコースが特に好ましい。
【００６９】
＜投与＞
前記神経保護剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７０】
前記投与方法としては、例えば、経口投与法、非経口投与法、局所投与法、経腸投与法などが挙げられる。これらの中でも、非経口投与法が好ましく、注射による投与法が特に好ましい。
【００７１】
前記投与量としては、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする薬物の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。例えば、有効成分であるＡｌｄａ−１の有効投与量は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜８０ｍｇ／ｋｇ／日を設定し得るが、これに限定されない。
前記投与回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１日１回の投与でもよく、複数回に分けて投与してもよい。
【００７２】
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鳥類、哺乳類を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等が挙げられる。哺乳類としては、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどが挙げられる。これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００７３】
なお、本発明の一態様には、神経保護剤の製造におけるＡｌｄａ−１の使用も包含される。
【００７４】
＜用途＞
前記神経保護剤は、優れた神経保護作用を有するため、神経細胞死又は神経細胞変性を伴う脳障害の予防又は治療に好適に利用可能である。特に、低血糖脳症の治療の際の血糖補正において生じるグルコース再灌流障害による神経細胞変性に好適に利用可能である。
また、前記神経保護剤は、細胞傷害性アルデヒドのひとつである４−ＨＮＥの発生を抑制できることから、細胞傷害性アルデヒド発生抑制剤としても好適に利用可能である。更に、前記神経保護剤は、神経細胞変性を抑制できることから、神経細胞変性抑制剤としても好適に利用可能である。
【００７５】
（低血糖脳症の予防剤又は治療剤）
本発明の低血糖脳症の予防剤又は治療剤は、グルコース及びＮ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミド（Ａｌｄａ−１）を有効成分として含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記低血糖脳症の予防剤又は治療剤は、前記グルコースにより、低血糖状態を回復できるとともに、Ａｌｄａ−１によりグルコース再灌流障害を抑制することができるため、前記グルコースのみで低血糖脳症を治療することに比べ、安全性が高く、低血糖脳症の予防又は治療に有利である。
【００７６】
Ａｌｄａ−１は、前記神経保護剤と同様のものを使用することができる。前記グルコースとしては、特に制限はなく、例えば、市販品を用いることができる。
【００７７】
前記低血糖脳症の予防剤又は治療剤における、グルコース及びＡｌｄａ−１の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７８】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記神経保護剤で例示したものを用いることができ、好ましい態様も前記神経保護剤と同様である。
【００７９】
前記低血糖脳症の予防剤又は治療剤の剤形、投与方法、投与量、投与時期、投与対象などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記神経保護剤で例示した剤形と同様の剤形を適用することができ、好ましい態様も前記神経保護剤と同様である。
【００８０】
なお、本発明の一態様には、低血糖脳症の予防剤又は治療剤の製造におけるＡｌｄａ−１の使用も包含される。
【００８１】
（神経保護方法）
本発明の神経保護方法は、Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミド（Ａｌｄａ−１）を有効成分とする本発明の神経保護剤を、神経保護の必要性を有する対象へ投与することを含む。
ここでの神経保護の必要性を有する対象は、低血糖脳症の治療における血糖補正を行うことを予定している対象などが挙げられる。「対象」としては、例えば、鳥類、哺乳類を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等が挙げられる。哺乳類としては、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどが挙げられ、中でも、ヒトに好適に用いられる。
【００８２】
神経保護方法におけるＡｌｄａ−１の投与形態、投与方法、投与量、投与時期、等については、特に制限はなく、神経保護剤に関して既述した投与形態、投与条件等を挙げることができる。
【００８３】
（低血糖脳症の予防方法又は治療方法）
本発明の低血糖脳症の予防方法又は治療方法は、グルコース及びＮ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを少なくとも含有する低血糖脳症の予防剤又は治療剤を、低血糖脳症の予防又は治療の必要性を有する対象へ投与することを含む。
【００８４】
低血糖脳症の予防方法又は治療方法におけるＡｌｄａ−１の投与形態、投与方法、投与量、投与時期等については、特に制限はなく、低血糖脳症の予防剤又は治療剤に関して既述した投与形態、投与条件等を挙げることができる。
【００８５】
また、Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドは、上述したように、グルコース再灌流障害により発生する脳細胞における細胞傷害性アルデヒドの発生及び神経細胞変性に関連する疾患の治療又は予防方法に適用可能である。このような疾患としては、例えば、高血糖性昏睡を挙げることができ、特に糖尿病性ケトアシドーシス及び高浸透圧性非ケトン性昏睡が挙げられる。本発明は、Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドを含む薬剤を、投与の必要がある対象へ投与することを含む高血糖性昏睡、糖尿病性ケトアシドーシス、又は高浸透圧性非ケトン性昏睡の治療又は予防方法も包含する。
【実施例】
【００８６】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００８７】
（実施例１：低血糖短時間昏睡モデルの作製）
ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、オス、８週齢〜１０週齢、体重２６０ｇ〜３１０ｇ、日本チャールス・リバー株式会社）（Ｎ＝４７）を用いて以下の方法で低血糖短時間昏睡モデルを作製した。
まず、飼料（商品名：ＣＲＦ−１、糖質：５５．３質量％、オリエンタル酵母工業株式会社製）を１匹当たり１日２０ｇ（糖質：３３ｇ／ｋｇ）とし、３日間継続して制限を行った。手術前日のみ、水以外は与えず、一晩絶食させた。ケージ内の飼育数増減によるストレスのための摂食量の変化を防ぐために、１ケージの飼育数を３匹に固定し、１日１回、給餌前に残量を計測し、摂食量に変化がないことを確認した。【００８８】
低血糖負荷は、亜酸化窒素（笑気）７０ｖ／ｖ％、酸素３０ｖ／ｖ％の混合ガスの流量に対し１．０ｖ／ｖ％〜１．５ｖ／ｖ％でハロタンを追加して麻酔を維持し、直腸温をモニターしながら行った。体温は、体温調節マットと送風機、及び温熱ランプにて、３７．０±０．５℃に維持した。手術用顕微鏡の直視下で、左鼠径部を切開後、左大腿静脈を露出し、１質量％ヘパリン生理食塩水を満たしたポリエチレン製カテーテル（ＩＮＴＲＡＭＥＤＩＣ  ＣＬＡＹ  ＡＤＡＭＳ  ポリエチレンチューブＰＥ５０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．製）を留置し、血糖測定の採血に用いた。次に左頚部を切開後、左前顔面静脈を露出し、薬剤の投与に用いるための前記ポリエチレン製カテーテルを留置した。
次に、安静時脳波を下記に示す方法で記録後、速効型インスリン（ノボリンＲ注１００単位／ｍＬ、ノボノルディスクファーマ株式会社製）１５ＩＵ／ｋｇを腹腔内投与することにより、後述するように平坦脳波を発現させ、平坦脳波を所定時期まで維持させることにより、低血糖脳症モデル（低血糖短時間昏睡モデル）を作製した。なお、インスリン投与中は、１５分間毎に採血を行った。【００８９】
＜＜脳波の測定方法＞＞
ラットの除毛した頭部と前頚部の皮脂をアルコール綿にて清拭後、脳波電極用研磨剤（スキンピュア、日本光電工業株式会社製）にて研磨した。次いで、脳波電極用ペースト剤（エレフィックス、日本光電工業株式会社製）を塗布した脳波用皿電極（ＬＥＡＤ１１０Ａ、ＢＩＯＰＡＣ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製）をラットの前頭部（両眼窩の間）と後頭部（両耳孔の間）の頭皮に装着し、脳波導出用電極とした。更に前頚部にも皿電極を装着し、アースとして使用した。電極の装着後、それぞれの電極間接触抵抗が１０ｋΩ以下であること、及び各電極の接触抵抗のばらつきが３ｋΩ以下であることを交流抵抗測定器（Ｍｏｄｅｌ  １０８９ＥＳ  Ｃｈｅｃｋｔｒｏｄｅ、ＵＦＩ  Ｉｎｃ．製）を用いて確認した。脳波測定には、脳波計（ＥＥＧ１００Ｃ、  ＢＩＯＰＡＣ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．製）を使用し、データの取り込み及び解析には、Ａ／Ｄ変換器（ＭＰ１００Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＩＯＰＡＣ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．製）と波形解析ソフトウェア（ＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅ、ＢＩＯＰＡＣ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．製、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．７．２）を用いた。フィルタ設定は、脳波アンプによる０．１Ｈｚ〜１００Ｈｚのバンドパスを用い、Ａ／Ｄ変換のサンプリング周波数は、２００Ｈｚにて行った。【００９０】
＜＜血糖値の測定方法＞＞
血糖値の測定は、血糖測定器（Ａｓｃｅｎｓｉａ  ＢＲＥＥＺＥ  ２、Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社製）を用いて行った。【００９１】
＜＜神経学的所見の評価方法＞＞
神経学的所見として、対光反射、瞳孔異常、及び痙攣について下記に示す方法で評価した。【００９２】
−対光反射−
対光反射は、用手的に閉眼を１０秒間行い、開眼と同時にペンライトを照射して瞳孔径を観察し、下記評価基準に基づき評価した。
［評価基準］
・迅速：瞳孔径の縮小が３秒間以内に生じた。
・緩慢：瞳孔径の縮小に４秒間以上かかった。
・消失：瞳孔径の縮小が認められなかった。【００９３】
−瞳孔異常−
瞳孔異常は、用手的に開眼をさせて、瞳孔径を観察し、下記評価基準に基づき評価した。
［評価基準］
・−    ：瞳孔の拡大は認められない（瞳孔径：２．０ｍｍ以下）。
・＋／−：瞳孔の軽度の拡大が認められた（瞳孔径：２．０ｍｍ超３．０ｍｍ以下）。
・＋    ：瞳孔の拡大が認められた（瞳孔径：３．０ｍｍ超）。【００９４】
−痙攣−
痙攣は、四肢、体幹、及び頸部の不随意な運動を観察し、下記評価基準に基づき評価した。
［評価基準］
・−    ：痙攣が認められなかった。
・＋／−：痙攣がまれに認められた。
・−／＋：痙攣がときどき認められた。
・＋    ：痙攣が常に認められた。【００９５】
＜血糖値、脳波所見、神経学的所見、及び痙攣頻度の評価＞
インスリン投与前後における脳波所見、並びに、血糖値、及び神経学的所見の結果を図１Ａに示す。
［インスリン投与前］
インスリン投与前に観察される安静時脳波は、振幅１０μＶ〜５０μＶ、周期４Ｈｚ〜８Ｈｚの波形であった。血糖値は、１１２．４±２６．１ｍｇ／ｄＬであり、瞳孔に異常はなく、対光反射は迅速であり、痙攣は認められなかった。なお、図１Ａにおいて「Ｎ／Ａ」は該当しないことを表す。【００９６】
［インスリン投与後］
インスリン投与後の脳波は、インスリン投与後６９±２９分間に、振幅１００μＶ〜２００μＶ、周期０．１Ｈｚ〜４Ｈｚの高振幅徐波が出現し、このときの血糖値は、２１．４±４．９ｍｇ／ｄＬであり、対光反射は緩慢であり、瞳孔は軽度の拡大が認められた。このとき痙攣は認められなかった。【００９７】
［平坦脳波］
インスリン投与後、脳波は徐々に振幅、周波数ともに低下し、平坦脳波がインスリン投与後９２±３３分間で出現した。このとき、血糖値は、１８．３±７．８ｍｇ／ｄＬであり、対光反射は消失し、瞳孔は拡大していた。
平坦脳波を２分間維持した場合（以下、「平坦脳波２分間群」と称することがある）、２１匹中１１匹（５２．４％）に痙攣が観察された。また、平坦脳波を１０分間維持した場合（以下、「平坦脳波１０分間群」と称することがある）、平坦脳波中に全例である２６匹中２６匹（１００％）に痙攣が観察された。なお、平坦脳波を１０分間を超えて維持した群では、２６匹中２０匹（７６．９％）に呼吸停止が認められた。
ラットの低血糖時の痙攣については、脳波波形に現れない深部（皮質下又は脳幹）が原因であることが推察される（Ｄｅｌ  Ｃａｍｐｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓ，  ２００９，  ８３，  ２４３−２４８参照）。【００９８】
（試験例１：低血糖短時間昏睡モデルへのグルコース投与）
実施例１で作製した低血糖短時間昏睡モデルの平坦脳波２分間群又は平坦脳波１０分間群に、図２Ａに示す投与スケジュールでグルコースの投与を行った。なお、グルコース投与用の試料としては、グルコースの水溶液（ｐＨ５．６）を用いた。【００９９】
即ち、平坦脳波２分間群（Ｎ＝２１）又は平坦脳波１０分間群（Ｎ＝２６）に、５０質量％グルコース０．２ｍＬを静脈注射した。次いで５０質量％グルコースを２．２ｍＬ／時間で点滴により静脈注射し、５分間毎に５０質量％グルコース０．２ｍＬを３回静脈注射した。更にグルコースの投与開始から１５分間毎に採血を行い、低血糖脳症のグルコース再灌流障害を来す高血糖状態として、２００ｍｇ／ｄＬ〜２５０ｍｇ／ｄＬを目標血糖値として３時間保つよう、５０質量％グルコース０．２ｍＬを適宜追加した。グルコース投与開始３時間後に皿電極及びカテーテルを除去し、皮膚を縫合した後、麻酔を中止し回復させた。【０１００】
＜血糖値、脳波所見、神経学的所見、及び痙攣頻度の評価＞
実施例１と同様の方法で脳波を測定した結果、図１Ｂに示すように、平坦脳波２分間群又は平坦脳波１０分間群にそれぞれ指定された時期にグルコースを投与すると、いずれの群も、インスリン投与前の安静時脳波と同様の脳波が出現し、脳波の回復も認められた（回復脳波）。このときの平坦脳波２分間群の血糖値は、２２７．３±６４．２ｍｇ／ｄＬであり、平坦脳波１０分間群の血糖値は、２４５．８±９２．７ｍｇ／ｄＬであった。また、いずれの群においても、対光反射は迅速で、瞳孔散大も消失し、呼吸は安定していた。
グルコース投与後２４時間における生存率は、平坦脳波２分間群では２１匹中１０匹（４７．６％）であり、平坦脳波１０分間群では２６匹中６匹（２３．１％）であった。しかし、いずれの群においても、痙攣は、ときどきに認められた。【０１０１】
＜脂質酸化物４−ＨＮＥ陽性細胞の評価＞
実施例１において、インスリンの投与を行わなかったこと以外は、同様の処置を施したｓｈａｍ群（Ｎ＝３）、平坦脳波２分間群（Ｎ＝３）、及び平坦脳波１０分間群（Ｎ＝３）の脳細胞における４−ＨＮＥ陽性細胞数を免疫染色法による以下の方法で比較した。なお、前記ｓｈａｍ群、前記平坦脳波２分間群、及び前記平坦脳波１０分間群は、いずれも体重及び食事量における有意差はなかった。【０１０２】
ｓｈａｍ群、平坦脳波２分間群、及び平坦脳波１０分間群に前記同様の方法でグルコースを投与し、該グルコースの投与開始から２４時間後、ラットをハロタンにて安楽死させた。左心室より冷生理食塩水２００ｍＬ及び４質量％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；ＰＦＡ）１００ｍＬで灌流した。取り出した全脳を４質量％ＰＦＡにて４℃で１２時間固定し、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄後、１５質量％スクロース／０．１Ｍ  ＰＢＳ、次いで３０質量％スクロース／０．１Ｍ  ＰＢＳの順で、それぞれ４℃で一晩浸漬し置換した。【０１０３】
脳試料に３ｍｍ間隔で割を入れ、前頭、中心前部、中心後部、後頭の４つの部分に分割し、ＯＣＴコンパウンド（ティシュー・テック、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｉｎｃ．製）にてイソペンタール凍結包埋処理し、−８０℃にて保存した。
脳試料をクリオスタット（Ｃｒｙｏｔｏｍｅ  Ｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ、  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏ．製）にて２０μｍ厚に薄切し、スライドガラスに貼付し、２時間乾燥させた。【０１０４】
このスライドガラスを１００容量％メタノールに溶解した０．３容量％過酸化水素で３０分間浸漬し、ペルオキシダーゼ活性を阻害した。ＰＢＳで洗浄した後、蒸留水で５０倍希釈したマウス・モノクローナル抗４−ＨＮＥ抗体（ＨＮＥＪ−２、日本老化制御研究所（ＪａＩＣＡ）製）を用いて、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、５００倍に希釈したビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（＃ＢＡ−２０００、ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  Ｉｎｃ．製）を室温で２．５時間反応させた後、ビオチン標識２次抗体キット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ、ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  Ｉｎｃ．製）で反応させ、ジアミノベンジジン−４塩酸塩にて染色した。【０１０５】
標本の大脳の頭頂及び側頭皮質（海馬のレベル）を光学顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００Ｗ、株式会社ニコン製）を用いて撮影した。４−ＨＮＥ陽性細胞数は、重複しない上記皮質を０．２５ｍｍ２の範囲で計測した（Ｎ＝３）。【０１０６】
図３Ａに光学顕微鏡で観察した写真の一例を、図３Ｂに４−ＨＮＥ陽性細胞数の結果を示す。ｓｈａｍ群（図３Ａ、左）では、４−ＨＮＥ陽性細胞は認められなかった。平坦脳波２分間群（図３Ａ、中央）では、大脳の前頭から頭頂及び側頭の皮質で、４−ＨＮＥ陽性細胞の出現が認められ、海馬における４−ＨＮＥ陽性細胞の増加は、大脳皮質と比較して軽度ながら認められた（図３Ａ参照）。平坦脳波２分間群における海馬レベルの頭頂及び側頭皮質で、４−ＨＮＥ陽性細胞の出現頻度を計測すると、８３．７±８．５個／０．２５ｍｍ２であった。平坦脳波１０分間群（図３Ａ、右）における４−ＨＮＥ陽性細胞の出現頻度は、更に増加し、１５２．３±１１．７個／０．２５ｍｍ２であった。平坦脳波２分間群と平坦脳波１０分間群との比較では、平坦脳波１０分間群の方が有意に出現頻度は高かった（Ｐ＝０．００１）。
なお、統計解析は、ｔ−検定にて検定し、測定値は、「平均±標準偏差」を表し、Ｐ値が０．０５未満を統計学的有意とした。【０１０７】
＜Ｆｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂによる神経細胞変性の評価＞
前記脂質酸化物４−ＨＮＥ陽性細胞の評価においてイソペンタール凍結包埋処理した試料を、クリオスタットにて２５μｍ厚に薄切し、スライドガラスに貼付し、２時間乾燥させた。
このスライドガラスを０．１Ｍ  ＰＢＳに浸漬した後、５０℃で３０分間乾燥させた。次いで、１質量％ＮａＯＨを含む８０％エタノール溶液に浸漬した後、７０％エタノール溶液に２分間、次いで精製水に２分間浸漬した。更に０．０６質量％過マンガン酸カリウム溶液に１０分間浸漬した後、精製水で２分間洗浄した。【０１０８】
変性神経細胞結合性蛍光誘導体（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．製）を蒸留水で０．０００４質量％に調製した染色液に２０分間浸漬した後、精製水による１分間の洗浄を３回繰り返し、５０℃で１５分間乾燥させた。エタノール、次いでキシレンに浸し、脱水した後封入した。
これを蛍光顕微鏡（励起波長：４８０ｎｍ、蛍光波長：５２５ｎｍ）で観察し、大脳の頭頂及び側頭皮質（海馬のレベル）の神経細胞を観察した。Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞数は、重複しない上記皮質を０．２５ｍｍ２の範囲で計測した（Ｎ＝３）。【０１０９】
図４Ａに光学顕微鏡で観察した写真の一例を、図４ＢにＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞数の結果を示す。ｓｈａｍ群（図４Ａ、左）では、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞は認められなかった。平坦脳波２分間群（図４Ａ、中央）では、大脳の前頭から頭頂及び側頭の皮質で、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞の出現が認められ、平坦脳波２分間群における海馬レベルの頭頂及び側頭皮質で、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞の出現頻度を計測すると、９０．０±３．６個／０．２５ｍｍ２であった。平坦脳波１０分間群（図４Ａ、右）におけるＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞の出現頻度は、更に増加し、１６１．３±３１．４個／０．２５ｍｍ２であった。平坦脳波２分間群と平坦脳波１０分間群との比較では、平坦脳波１０分間群の方が有意に出現頻度は高かった（Ｐ＝０．０１８）。
なお、統計解析は、ｔ−検定にて検定し、測定値は、「平均±標準偏差」を表し、Ｐ値が０．０５未満を統計学的有意とした。【０１１０】
（試験例２：アルデヒド脱水素酵素活性化薬の経静脈的投与）
＜＜Ａｌｄａ−１投与群＞＞
アルデヒド脱水素酵素活性化薬であるＡＬＤＨ２アゴニスト（Ａｌｄａ−１、Ｍｅｒｃｋ（ＫＧａＡ）製）をジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）にて１５ｍｇ／ｍＬに溶解した。
図２Ｂに示す投与スケジュールで、試験例１と同様の方法で作製した平坦脳波２分間群に、調製したＡＬＤＨ２アゴニスト（Ａｌｄａ−１）を投与した。
即ち、平坦脳波２分間群（Ｎ＝３）に、５０質量％グルコース０．２ｍＬと共にＡｌｄａ−１  ８．５ｍｇ／ｋｇを静脈注射した。次いで５０質量％グルコースを２．２ｍＬ／時間で点滴により静脈注射し、５分間毎に５０質量％グルコース０．２ｍＬを３回静脈注射した。更にグルコースの投与開始から１５分間毎に採血を行い、低血糖脳症のグルコース再灌流障害を来す高血糖状態として、２００ｍｇ／ｄＬ〜２５０ｍｇ／ｄＬを目標血糖値として３時間保つよう、５０質量％グルコース０．２ｍＬを適宜追加した。グルコース投与開始３時間後に皿電極及びカテーテルを除去し、皮膚を縫合した後、麻酔を中止し回復させた。【０１１１】
なお、Ａｌｄａ−１の投与量は、ラット心筋虚血での報告（Ｃｈｅｎ  ＣＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，  ２００８．  １４９３−１４９５、及び、Ｐｅｒｅｚ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １７，  ２０１０，  １５９−１６４参照）における至適投与量に倣った。また、試薬の投与は、無作為化して行った。【０１１２】
＜＜対照群＞＞
Ａｌｄａ−１投与群において、Ａｌｄａ−１  ８．５ｍｇ／ｋｇを投与したことに代えて、Ａｌｄａ−１の投与に用いた液量と同量のＤＭＳＯを投与したこと以外は、Ａｌｄａ−１投与群と同様の方法投与を行い、対照群（Ｎ＝３）とした。【０１１３】
＜脂質酸化物４−ＨＮＥ陽性細胞の評価＞
Ａｌｄａ−１投与群及び対照群の脳細胞における脂質酸化物４−ＨＮＥの発現の確認を、試験例１と同様の方法で行った。なお、前記Ａｌｄａ−１投与群及び対照群は、いずれも体重及び食事量における有意差はなかった。【０１１４】
図５Ａに光学顕微鏡で観察した写真の一例を、図５Ｂに４−ＨＮＥ陽性細胞数の結果を示す。Ａｌｄａ−１投与群（図５Ａ、右）の４−ＨＮＥ陽性細胞数は、３８．７±７．０個／０．２５ｍｍ２であり、対照群（図５Ａ、左）の４−ＨＮＥ陽性細胞数は、６７．３±１５．３個／０．２５ｍｍ２であり、Ａｌｄａ−１投与群は、対照群と比較して、４−ＨＮＥ陽性細胞数が有意に減少した（Ｐ＝０．０４２）。
なお、統計解析は、ｔ−検定にて検定し、測定値は、「平均±標準偏差」を表し、Ｐ値が０．０５未満を統計学的有意とした。【０１１５】
＜Ｆｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂによる神経細胞変性の評価＞
Ａｌｄａ−１投与群及び対照群の脳細胞におけるＦｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂの発現の確認を、試験例１と同様の方法で行った。【０１１６】
図６Ａに光学顕微鏡で観察した写真の一例を、図６ＢにＦｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞数の結果を示す。Ａｌｄａ−１投与群（図６Ａ、右）のＦｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞数は、３６．７±５．０個／０．２５ｍｍ２であり、対照群（図６Ａ、左）のＦｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞数は、６８．０±９．２個／０．２５ｍｍ２であり、Ａｌｄａ−１投与群は、対照群と比較して、Ｆｌｕｏｌｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ陽性細胞数が有意に減少した（Ｐ＝０．００７）。
なお、統計解析は、ｔ−検定にて検定し、測定値は、「平均±標準偏差」を表し、Ｐ値が０．０５未満を統計学的有意とした。【０１１７】
本発明の低血糖脳症モデルは、人工呼吸器を使用することなく生存可能であり、生理的な低血糖状態を有し、平坦脳波を指標とするため、低血糖脳症の病態解明、神経保護剤等の薬剤の開発に好適に利用可能である。
また、Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドには、低血糖脳症モデルにグルコースを投与した場合に認められる４−ヒドロキシ−２−ノネナールの発生を抑制する作用、及び、変性神経細胞の発生を抑制する作用が、本発明の低血糖脳症モデルを用いることにより確認された。このため、Ｎ−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−２，６−ジクロロベンズアミドは、神経保護剤、細胞傷害性アルデヒド発生抑制剤、及び神経細胞変性抑制剤として使用することができ、また、グルコースと併用することにより低血糖脳症の予防剤又は治療剤として使用することができる。【０１１８】
２０１２年２月２３日に出願された日本国特許出願第２０１２−０３７４５９号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【国際調査報告】
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