(57)【要約】  培養液中の試料−培養液界面における水分子の配列構造、さらに、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などを高空間分解能で計測する。探針（１）と、試料（３）を載置する試料ホルダ（１１）と、前記探針の位置を変位させる振動子（２）と、前記試料において前記探針により計測される領域に入射するパルスレーザー光（２２，２３）と、前記試料から出力する出力光（２４）の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器（２５）と、前記試料ホルダを移動する走査機構（３１）と、制御装置（２６）とを備え、前記試料の表面の形状や線形・非線形光学特性を計測する走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置により、前記振動子の前記探針位置を周期的に変位させるとともに、前記探針と前記試料の距離に依存する前記出力光強度を最大化することにより探針増強検出効率を最適化する。
2013051094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に入射するパルスレーザー光と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備え、前記試料の表面の形状や線形・非線形光学特性を計測する走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置により、前記振動子の前記探針位置を周期的に変位させるとともに、前記探針と前記試料の距離に依存する前記出力光強度を最大化することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料表面に生じた近接場光中に前記探針を配置して、試料表面近傍の光の電場強度を増幅することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項３】
請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置により、探針増強効果による出力光極大が最大となるように、前記探針位置を調整することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項４】
請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料に対して、前記探針側からパルスレーザー光を入射させ、反射したパルスレーザー光を前記探針側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項５】
請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記探針と対向する位置に、上面に前記試料を設置するプリズムを設け、前記試料に対して、前記プリズム側からパルスレーザー光を入射させ、全反射したパルスレーザー光を前記プリズム側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項６】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光は和周波光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光の第二高調波であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光のラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光はコヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダは、培養液を保持・循環させる機能を有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料は、前記培養液中で培養される生体分子・生体細胞・生体組織などの生体材料であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１２】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に入射するパルスレーザー光と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備え、前記試料の表面の形状や線形・非線形光学特性を計測する走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光は和周波光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１３】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に入射するパルスレーザー光と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備え、前記試料の表面の形状や線形・非線形光学特性を計測する走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光の第二高調波であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１４】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を変位させる振動子と、前記探針に印加される力を検出する検出部と、前記探針に交流電圧と直流電圧を印加する探針用電源と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備え、試料の表面の静電場力分布を計測する走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置により、前記振動子の前記探針位置を周期的に変位させるとともに、前記探針位置と前記探針に印加する交流電圧のタイミングを制御して培養液中の静電場分布計測の感度を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１５】
請求項１４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダは、培養液を保持・循環させる機能を有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１６】
請求項１４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料は、前記培養液中で培養される生体分子・生体細胞・生体組織などの生体材料であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１７】
請求項１４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料は、前記培養液中で培養される神経組織などの生体材料であり、前記試料の静電場分布は神経活動による神経シグナルであることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中の試料−培養液界面における水分子の配向分布、および、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測する走査プローブ顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養液中における生体基板材料への細胞の接着やその後の伸展・分化などの生体反応を計測・評価・制御する場合に、生体分子・生体組織・生体基板材料などの水和現象が重要である。このとき、水和構造は、水を主成分とする培養液中における試料−培養液界面において、試料表面と水分子の相互作用、および、水分子間での水素結合を含む相互作用から形成される三次元構造を示している。人工血管の内壁と赤血球との癒着などに代表されるいわゆる生体適合性は、この水和構造と密接に関連していると考えられている（例えば、非特許文献１）。さらに、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などは、培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの生体反応に関して、特に、重要な特性である。【０００３】
培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの試料−培養液界面を観察・計測する手法として、従来は、光学顕微鏡、および、ラマン分光法、第二高調波法、和周波分光法などの非線形光学顕微鏡が用いられている。特に、和周波分光法では、試料−培養液界面における水和構造に関する水分子の配列構造を計測できる。非線形光学顕微鏡としては、例えば、特許文献１では、プローブとターゲットとの間の相互作用を、界面付近の水分子、溶媒分子、または、標識物質による第二高調波光や和周波光による表面選択性の非線形光学法が開示されている。しかし、これらの光学顕微鏡、および、非線形光学顕微鏡における空間分解能は１００ｎｍよりも大きく、典型的には１μｍ程度である。【０００４】
一方、走査プローブ顕微鏡は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Atomic Force Microscopy)を基礎としている。走査プローブ顕微鏡の一例である、走査ケルビンプローブ顕微鏡では、導電性探針を持ったカンチレバーと試料との間に働く静電場力をカンチレバーのたわみとして検出しながら、探針を試料表面上で走査することにより静電場力分布をマッピングする手法である。探針には静電場力以外に原子間力等も加わっており、静電場力を他の相互作用から分離する必要がある。そのために、まず、カンチレバーを振動させ、探針と試料の接触時に働く原子間力により減少する振動振幅を一定に保つように探針−試料間距離を調整する。これにより試料表面の高さ方向の位置が決定され、そこから一定の距離だけ探針を試料表面から離した状態で、カンチレバーの振動の位相変化から長距離力である静電場力を検出する（例えば、特許文献２）。走査プローブ顕微鏡では、探針をプローブと呼ぶことがある。【０００５】
走査プローブ顕微鏡では、一般的に、凹凸計測で１ｎｍ程度の空間分解能、静電場、および、光計測で１０ｎｍ程度の空間分解能が期待できる。しかし、探針と試料との相互作用領域が探針先端部の直径程度に限定されるために、特に、非線形光学法のようにシグナルが弱い物理量を用いる走査プローブ顕微鏡の実現は一般的に困難である。【０００６】
この弱いシグナルを補償してラマン分光法を走査プローブ顕微鏡で実現するために、探針による表面増強ラマン散乱を用いる探針増強ラマン検出法に関する文献が開示されている。特許文献３では、サンプル表面に発生させたエバネッセント場にプローブを挿入し、プローブ先端でエバネッセント場を散乱させて散乱光を検出する近接場顕微鏡において、表面増強ラマン散乱を効率良く誘起する均一な金属粒子を再現性よくコーティングした近接場顕微鏡用プローブが開示されている。【０００７】
非特許文献２では、先端がナノメートル径の金属探針に光を照射することで、その先端のナノ空間に光を閉じこめることができ、さらにナノ光源として分子を照明することで、分子からのラマン散乱光をナノ空間分解能で検出できることが示されている。とくに、共鳴現象である局在プラズモンポラリトンが探針先端に励起されるので、光の電場強度が増強され、ラマン散乱の散乱断面積が実効的に増大することで、弱散乱性が補償され（探針増強ラマン検出法）、１５ｎｍの空間分解能が実現されると示されている。【０００８】
特許文献４では、試料にレーザー光を集光させてラマン散乱光を発生させ、近接または接触させた探針によりラマン散乱光を増強し散乱させて、散乱された散乱光からラマンスペクトルを検出する、探針増強ラマン検出法を用いた紫外近接場光学顕微鏡が開示されている。このとき、励起レーザー光は紫外・深紫外レーザー光であり、探針先端の材料は励起レーザーの波長で誘電率が−２以下である金属で、例えば、シリコン製の探針の表面に真空蒸着した、膜厚が約２５ｎｍで金属粒子直径が１０〜２０ｎｍであるアルミニウム薄膜が好ましいとしている。【０００９】
しかし、これらの文献において、第二高調波法や和周波分光法を用いた走査プローブ顕微鏡は開示されておらず、また、ラマン分光法による高空間分解能の走査プローブ顕微鏡も開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００４−５３０１０５号公報
【特許文献２】特開２０１１−２７５８２号公報
【特許文献３】特開２００６−７１４４８号公報
【特許文献４】特開２０１０−２８６３９７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】北野博巳，源明誠、高分子、５８巻、２００９年、ｐ．７４
【非特許文献２】井上康志  外、表面科学、２６巻、２００５年、ｐ．６６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの試料−培養液界面における水和構造に関する水分子の配列構造を高空間分解能で計測し、さらに、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などを高空間分解能で計測する走査プローブ顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願において開示される発明のうち代表的なものを挙げれば、次の通りである。【００１４】
本発明の走査プローブ顕微鏡は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に入射するパルスレーザー光と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測するフィルター付検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備え、前記試料の表面の形状や線形・非線形光学特性を計測する走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置により、前記振動子の前記探針位置を周期的に変位させるとともに、前記探針と前記試料の距離に依存する前記出力光強度を最大化することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。【００１５】
また、本発明の走査プローブ顕微鏡は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を変位させる振動子と、前記探針に印加される力を検出する検出部と、前記探針に交流電圧と直流電圧を印加する探針用電源と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備え、試料の表面の静電場力分布を計測する走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置により、前記振動子の前記探針位置を周期的に変位させるとともに、前記探針位置と前記探針に印加する交流電圧のタイミングを制御して培養液中の静電場分布計測の感度を最適化することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、培養液中で生体分子・生体組織・生体基板材料などと培養液の界面にける水や分子との相互作用を高空間分解能で計測することが可能となる。また、培養液中における培養基板、水浄化膜、培養細胞の凹凸や物理情報を高空間分解能で計測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図２Ａ】探針増強効果が無い場合の、検出器出力の探針‐試料間距離依存を示すプロットである。
【図２Ｂ】探針増強効果がある場合の、検出器出力の探針‐試料間距離依存を示すプロットである。
【図２Ｃ】探針の振動とパルスレーザー光の繰り返しを同期させて、探針増強効果を最適化した場合の、検出器出力の探針‐試料間距離依存を示すプロットである。
【図３】本発明の実施例２の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図４】本発明の実施例４の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図５】本発明の実施例４の走査プローブ顕微鏡において、電極部分の一例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、試料表面に生じた近接場光（エバネッセント光）中に探針を配置して、探針からの近接場光と試料からの近接場光とにより試料表面近傍の光の電場強度を増幅することにより微弱なシグナル光を補償する探針増強検出法による走査プローブ顕微鏡において、和周波分光法（ＳＦＧ）、第二高調波法（ＳＨＧ）やその他の線形・非線形光学分光法を用いるときに、探針増強効果が探針−試料間距離に強く依存するために、探針−試料間距離に依存する検出光強度を計測することにより、探針増強効果を最適化することが可能であるという新たな知見に基づくものである。
【００１９】
また、本発明は、探針−試料間に働く静電気力分布を計測する走査プローブ顕微鏡（走査ケルビンプローブ顕微鏡）において、探針に働く静電気力が、探針−試料間距離に強く依存するために、探針−試料間距離に依存する静電場力強度を計測することにより、培養液中においても静電場分布計測の感度を最適化することが可能であるという新たな知見に基づくものである。
【００２０】
本発明を、以下の実施例を用いて詳細に説明する。なお、発明を実施するための形態に記載され、本実施例に未記載の事項は本実施例にも適用することができる。
【実施例１】
【００２１】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態としての、探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。図１は、本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。探針１は振動子２に設置され、試料３との相対位置は振動子２により制御される。探針１は、入射する光中に置かれたときに、先端近傍に近接場光強度が増幅・集中する材料が選択される。また、ラマン分光法や和周波分光法などのようにラマン散乱を用いる場合は、表面増強ラマン散乱を有効に用いることができる、金、銀、銅、アルミなどの金属やそれらの化合物が用いられる。シリコン探針に厚さ１〜２０ｎｍの金薄膜を蒸着した探針は、有効な探針の候補として用いられる。また、本実施例においては、振動子２は主に試料３の垂直方向に振動し、探針１と試料３の距離は３００ｎｍ以下で制御され、また、振動子２の固有振動数は２００ｋＨｚ〜２ＭＨｚが用いられる。本実施例では、振動子２として、長手方向に伸縮する水晶振動子が用いられるが、原子間力顕微鏡などの走査プローブ顕微鏡で一般的に用いられるチューニングフォーク型の水晶振動子、ピエゾ素子による振動子、カンチレバーにピエゾ素子を配置した振動子などを用いることができる。【００２２】
振動子２により探針１は、振動子２の固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で、試料３の表面に対して垂直方向に振動させられる。探針１と試料３との間の相互作用（力）により、振動子２に印加する電圧と振動子２の実際の振動振幅には位相差が生じるが、その位相差は、本実施例では、振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針−試料間の相互作用（力）がわかり、探針−試料間距離がわかる。また、この位相差を一定にしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成でき、試料表面の凹凸が計測できる。探針１と試料３の距離は、一般的には、最近接位置で０ｎｍ（接触）から１００ｎｍの距離まで接近するが、探針１を試料３の内部までめり込ませることも可能である。また、振動子２の振動振幅が一定の量だけ減少するようにしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、探針１と試料３の距離を最近接位置で０ｎｍとすることもできる（タッピングモードＡＦＭ）。探針１は配線４により探針用電源５に接続され、探針１と試料３との間に交流電圧と直流電圧を印加することができる。本実施例では、試料３として、表面処理を行ったポリカーボネートを用い、また、探針１と試料３との間に印加する電圧は用いない。【００２３】
試料ホルダ１１は、培養液注入口１２と培養液回収口１３とを備え、培養液１４を、保持、または、交換できる。培養液１４のかわりに、水、または、溶媒を用いることもできる。【００２４】
探針１が近接する試料３の領域近傍にパルスレーザー光、または、同期して入力する複数のパルスレーザー光を入力し、フィルター付検出器２５で出力光２４の強度を計測する。本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルスレーザー光である第一のパルスレーザー光２２と、波長が２．３〜１０ミクロンで可変の赤外パルスレーザー光である、第二のパルスレーザー光２３を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルスレーザー光２２の周波数と第二のパルスレーザー光２３の周波数との和の周波数（和周波）の強度を計測する。第二のパルスレーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波分光ができる。本実施例では、波数が３２００カイザーのピークと波数が３４００カイザーのピークを比較して、ポリカーボネートと培養液１４との界面における４面体配位した水分子と非対称結合した水分子の配向の割合を議論できる。【００２５】
ＡＦＭを構成して、探針１と試料３が十分に近接している場合には、局在プラズモンポラリトンが探針１の先端に励起され光の電場強度が増強されることに起因する探針増強効果により、和周波の出力光２４の強度が飛躍的に増強される（探針増強和周波分光法）。さらに、探針１により試料３の表面の一部を走査しながら特定の波数における和周波の出力光２４の強度を計測することにより、試料３と培養液１４との界面における水分子の配向の空間分布を高空間分解能でマッピングできる（探針増強走査和周波顕微鏡）。本実施例においては、探針増強効果により和周波の出力光２４は１００００倍に増強され、走査和周波顕微鏡の空間分解能は１０ｎｍとなる。【００２６】
ここで、本実施例の走査プローブ顕微鏡において、探針増強効果を最適化して検出器出力を最大に調整する手法を開示する。探針１、および、試料３の表面に生ずる近接場光（エバネッセント光）は、表面から距離が離れるに従い指数関数的に強度が減少する。したがって、探針増強効果は、探針１と試料３の距離が十分に近い場合だけに期待できる。本実施例においては、探針１と試料３の距離が２０ｎｍ以下であるときに探針増強効果が起こる。振動子２により探針１を１ｎｍ程度の距離で微小振動させ、探針１と試料３の距離（探針−試料間距離）を計測する。制御装置２６により、走査機構３１を制御して探針１と試料３の最近接位置を変化させながら、フィルター付検出器２５の出力を計測する。【００２７】
図２Ａ〜Ｃは、本実施例の走査プローブ顕微鏡により測定された検出器出力の探針‐試料間距離依存を示すプロットである。図２Ａは、探針１と試料３の距離が比較的離れていて探針増強効果が無い場合で、探針‐試料間距離が大きいときに、探針１により遮られるパルスレーザー光が少なくなり、探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大４１を示す。図２Ｂは、探針１と試料３の距離が十分に近く探針増強効果がある場合で、探針‐試料間距離が大きいときには、探針１により遮られるパルスレーザー光が少なくて、探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大４１を示すが、探針‐試料間距離が小さいときには、探針増強効果による出力光極大４２を示す。パルスレーザー光の入射位置、入射角度、出力光角度、複数のパルスレーザー光の同期条件、探針１の材料や形状、振動子２の振動数、振幅、振動子２の振動とパルスレーザー光との同期条件など、探針増強効果を変化させる実験パラメタは、探針増強効果による出力光極大４２を最適化するように設定すれば良い。さらに、図２Ｃでは、通常の測定モードとして、振動子２により探針１を振動させ、探針‐試料間距離が最近接位置になったときに同期してパルスレーザー光を入射する場合に、探針１の振動とパルスレーザー光の繰り返しを同期させて、探針増強効果を最適化する場合を示していて、一例として、パルスレーザー光の繰り返し周波数が、探針１の振動数の１／３の場合を示している。このとき、制御装置２６により、探針１の振動とフィルター付検出器２５の出力の振動の位相差を、適宜、設定する必要があるが、その位相差の値は、図２Ａ，Ｂで示す測定により設定することが本質的に重要である。探針と試料間の距離に応じて、検出器出力は図２Ａおよび図２Ｂのように変化し、さらに、探針増強効果による出力光極大４２の大きさが変化する。出力光極大４２の大きさが大きくなるように、パルスレーザー光の入射位置、入射角度、出力光角度、複数のパルスレーザー光の同期条件、探針１の材料や形状、振動子２の振動数、振幅、振動子２の振動とパルスレーザー光との同期条件など、探針増強効果を変化させる実験パラメタを調整すればよい。
【実施例２】
【００２８】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、全反射法による探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。図３は、本発明の実施例２の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。実施例１の走査プローブ顕微鏡と異なる部分を中心に説明する。本実施例においては、試料３はプリズム２１の上面に設置される。試料ホルダ１１は、底が無いリング状の形状、または、プリズム２１と接する部分の厚みが非常に薄く、かつ、パルスレーザー光を良く透過する材料を用いる。試料３は、厚みが薄く、かつ、パルスレーザー光を良く透過する材料に限定する。プリズム２１の円筒面にほぼ垂直に入力するパルスレーザー光、または、同期して入力する複数のパルスレーザー光は、プリズム上面、または、試料表面において全反射して、出力光２４として散乱される。フィルター付検出器２５で出力光２４の強度を計測する。本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルスレーザー光である第一のパルスレーザー光２２と、波長が２．３〜１０ミクロンで可変の赤外パルスレーザー光である、第二のパルスレーザー光２３を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルスレーザー光２２の周波数と第二のパルスレーザー光２３の周波数との和の周波数（和周波）の強度を計測する。第二のパルスレーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波分光ができる。本実施例では、波数が３２００カイザーのピークと波数が３４００カイザーのピークを比較して、ポリカーボネートと培養液１４との界面における４面体配位した水分子と非対称結合した水分子の配向の割合を測定する。
【実施例３】
【００２９】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、探針増強走査第二高調波顕微鏡、および、その他の線形・非線形光学特性による探針増強走査光プローブ顕微鏡を開示する。本実施例では、実施例１と同様に、図１を用いて説明する。【００３０】
本実施例における探針増強走査第二高調波顕微鏡では、探針１が近接する試料３の領域近傍に波長１０６４ｎｍの赤外パルスレーザー光である第一のパルスレーザー光２２を入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルスレーザー光２２の周波数の２倍の周波数の光強度を計測する。試料３として、培養した神経細胞を用い、ＡＦＭにより神経細胞の凹凸を計測しながら、第二高調波強度をマッピングすることにより、走査第二高調波顕微鏡が構成でき、神経細胞の神経活動強度をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査第二高調波顕微鏡が構成できる。【００３１】
本実施例における探針増強走査ラマン顕微鏡では、探針１が近接する試料３の領域近傍に波長５３２ｎｍの緑色パルスレーザー光である第一のパルスレーザー光２２を入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、ラマン散乱光の光強度を計測する。試料３として、培養した肝細胞を用い、ＡＦＭにより肝細胞の凹凸を計測しながら、ラマン散乱をしらべることにより、肝細胞中の分子やたんぱく質などの組成分布をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査ラマン顕微鏡が構成できる。【００３２】
本実施例における探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡では、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を用いる。探針１が近接する試料３の領域近傍に角振動数が異なる第一のパルスレーザー光２２（角振動数ω１）と、第二のパルスレーザー光２３（角振動数ω２）を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、ＣＡＲＳ光の光強度を計測する。ＡＦＭにより試料３の凹凸を計測しながら、ＣＡＲＳ光の光強度をしらべることにより、試料３の分子やたんぱく質などの組成分布をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡が構成できる。
【実施例４】
【００３３】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、試料の表面の静電場力分布を計測する走査プローブ顕微鏡（走査ケルビンプローブ顕微鏡）を開示する。本実施例では、実施例１と同様の図４、および、電極部分の一例を示す図５を用いて説明する。【００３４】
図５は、本発明の実施例４の走査プローブ顕微鏡において、電極部分の一例を示す概略構成図である。制御装置２６により制御するバイポテンショスタット５１は、探針電極５２、試料電極５３、作用電極５４、参照電極５５を制御する。培養液１４の電位を参照電極５５により計測して、培養液１４に対する探針１の電圧を探針電極５２により印加して、また、培養液１４に対する試料３の電圧を試料電極５３で印加する。このとき、培養液１４と参照電極５５の間に流れる電流はほとんど零である。培養液１４と試料３の間に電流を流し、例えば、化学反応を生じさせるためには、作用電極５４−試料電極５３間の電流を用いる。探針１と試料３の間に電圧を印加する場合は、探針電極５２と試料電極５３の間に電圧を印加する。本発明の実施例の走査プローブ顕微鏡において、走査トンネル顕微鏡を構成する場合は、探針電極５２と試料電極５３の間の電圧、および、電流を印加電圧、および、トンネル電流として用いる。また、試料３に電荷注入を行う場合には電荷注入電極５６を用いる。【００３５】
実施例１と同様に、振動子２を固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で振動させ、試料３の表面に対して垂直方向に探針１を振動させる。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針１と試料３の間の相互作用（力）がわかり、探針−試料間距離がわかる。【００３６】
試料の表面の静電場力分布を計測するためには、探針１と試料３の間に交流電圧、および、直流電圧を足し合わせた電圧信号を印加する。このとき、試料３と探針１の間には、この電圧信号と探針１と試料３の表面の仕事関数の差に応じた静電気力Ｆが加わる。交流電圧の振幅はあらかじめ設定された値であるが、直流電圧の値は次のように決定される。振動子２により探針１と試料３の間の相互作用（力）（力信号）を計測する。交流電圧に同期した同じ周波数の信号を参照信号として、力信号の交流電圧と同じ周波数成分の強度をロックインアンプにより検出する。探針１と試料３との間の距離をｚ、電位差をＶ、誘電率をεとすると、探針１加わる静電気力Ｆは、Ｆ∝εＶ２／ｚ２となる。ロックインアンプから出力される信号は静電気力Ｆの電圧Ｖに関する微分となるため、ｄＦ／ｄＶ∝εＶ／ｚ２となり、距離ｚおよび誘電率εが一定であれば、電位差に比例した値となる。そのため、ロックインアンプからの出力信号がゼロとなるように、直流電圧を調整することにより、探針１と試料３との間の電位差は常にゼロに保たれる。これにより、試料３の表面電位によらず探針１に加わる静電気力Ｆをゼロとすることができる。即ち、探針１と試料３との間の電位差は、静電気力Ｆをゼロにするように調整した直流電圧により計測できる。【００３７】
このとき、力信号ｆを、第二のロックインアンプに入力し、電圧信号の交流電圧に同期した二倍周波数の信号を参照信号として、力信号ｆの二倍周波数成分の強度を検出する。ロックインアンプ出力される信号は力信号ｆの電圧Ｖに関する二回微分となるため、ｄ２ｆ／ｄＶ２∝ε／ｚ２となり、誘電率εが一定であれば、探針１と試料３の間の距離ｚの二乗に反比例した値となる。そのため、第二のロックインアンプからの出力信号を一定にしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、探針１と試料３との距離を一定に保つことができ、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成することができる。これらにより、試料の表面の静電場力分布を計測する走査プローブ顕微鏡（走査ケルビンプローブ顕微鏡）が構成される。【００３８】
このとき、培養液１４と探針１との間で電流が流れるために、静電場力分布の感度が悪くなることがわかった。しかし、実施例１と同様に、制御装置２６により、試料３と探針１の距離に対する電圧信号の交流電圧のタイミングを制御して培養液中の静電場分布計測の感度を最適化できることがわかった。また、交流電圧の周波数に対して静電場分布計測の感度を最適化できることもわかった。これらにより、試料３の静電場分布を高空間分解能で計測することを特徴とする走査プローブ顕微鏡が構成できる。
【実施例５】
【００３９】
本実施例においては、実施例４の走査プローブ顕微鏡による神経細胞の神経シグナル計測法を開示する。【００４０】
試料３として培養した神経細胞を培養液１４中に設置する。試料３の表面に対向する様に振動子２に設置した探針１が設けられる。振動子２により探針１は試料３の表面に対して垂直方向に振動させられる。試料３は試料ホルダ１１を介して走査機構３１上に固定されており、探針１に対して3次元方位方向に移動させることができる。振動子２により探針１は、振動子２の固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で、試料１の表面に対して垂直方向に振動させられる。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針−試料間の相互作用（力）がわかり、探針−試料間距離がわかる。また、この位相差を一定にしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成でき、試料表面の凹凸が計測できる。
神経シグナルの測定においては、試料３の表面と探針１の先端の距離を常に一定に保ちながら行う。神経シグナルは、電荷注入電極５６により神経細胞に電荷を注入することにより神経細胞に生ずる電圧パルスである。神経シグナルの測定には、まず試料３に対して所定の電荷を注入することにより神経細胞に電圧パルスを印加する。このとき、電圧パルスの大きさは５０μＶ〜１００ｍＶ程度である。試料３の所望の位置に探針３を接触、または、接近させ、この電圧パルスを実施例５の走査プローブ顕微鏡により検出する。試料３の多点において電圧パルス計測を行い神経シグナルが伝達されているかを判断することにより、培養された神経細胞の不良箇所を特定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
培養液中で生体分子・生体組織・生体基板材料と培養液との界面を計測・評価することが可能となる、また、培養基板、水浄化膜、培養細胞の評価に適用できる。
【符号の説明】
【００４２】
１  探針
２  振動子
３  試料
４  配線
５  探針用電源
１１  試料ホルダ
１２  培養液注入口
１３  培養液回収口
１４  培養液（水、溶媒）
２１  プリズム
２２  第一のパルスレーザー光
２３  第二のパルスレーザー光
２４  出力光
２５  フィルター付検出器
２６  制御装置 
３１  走査機構
４１  探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大
４２  探針増強効果による出力光極大
５１  バイポテンショスタット 
５２  探針電極 
５３  試料電極 
５４  作用電極 
５５  参照電極 
５６  電荷注入電極 
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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