(57)【要約】  一度の測定で複数のサンプルを同時に検出でき、簡便且つ高感度で特異性の高い塩基変異の検出方法及び検出用キットを提供する。  被検核酸を増幅し、ＤＮＡ増幅産物を得る工程；前記ＤＮＡ増幅産物と、該ＤＮＡ増幅産物の第１の領域に相補的な領域を有する第１の核酸プローブと、該ＤＮＡ増幅産物の第２の領域に相補的な領域を有する第２の核酸プローブと、パルサー法に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブとを反応させ、プローブポリマーを含む検出用複合体を形成させる工程；及び前記検出用複合体に結合したプローブポリマーを検出し、前記ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異の有無を検出する工程；を含み、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域が塩基変位部位を含み且つ塩基変異部位が第１の領域の両末端部以外に位置し、前記第２の核酸プローブは一つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するようにした。
2013085026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検核酸を増幅反応により増幅し、ＤＮＡ増幅産物を得る工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ増幅産物と、該ＤＮＡ増幅産物の第１の領域に相補的な第１の標的配列領域を有する第１の核酸プローブと、該ＤＮＡ増幅産物の第２の領域に相補的な第２の標的配列領域を有する第２の核酸プローブと、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブと、を反応させ、該ＤＮＡ増幅産物、該第１の核酸プローブ、該第２の核酸プローブ、及び該複数種のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーを含む検出用複合体を形成させる工程；及び
（ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出し、前記ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異の有無を検出する工程；
を含む塩基変異の検出方法であって、
前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域が前記塩基変位部位を含み、且つ前記塩基変異部位が、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域の両末端部以外に位置し、
前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする塩基変異の検出方法。
【請求項２】
前記第１の核酸プローブは前記第１の標的配列領域を５’末端又は３’末端に有し、且つ前記第２の核酸プローブは前記第２の標的配列領域を３’末端又は５’末端に有することを特徴とする請求項１記載の塩基変異の検出方法。
【請求項３】
前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることを特徴とする請求項１又は２記載の塩基変異の検出方法。
【請求項４】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の塩基変異の検出方法。
【請求項５】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、
該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の塩基変異の検出方法。
【請求項６】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブであり、
該複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、
各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、
該ダイマーを形成する２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、
前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の塩基変異の検出方法。
【請求項７】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、からなり、
前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、
前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、
前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の塩基変異の検出方法。
【請求項８】
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡ増幅産物の塩基変異の検出に用いられる検出用キットであって、
第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、及び互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを含み、
前記第１の核酸プローブは、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域に相補的な第１の標的配列領域を有し、
前記第２の核酸プローブは、前記ＤＮＡ増幅産物の第２の領域に相補的な第２の標的配列領域を有し、
前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域が塩基変位部位を含み、且つ該塩基変異部位が、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域の両末端部以外に位置し、
前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする検出用キット。
【請求項９】
前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか担体に固定可能な部分が導入されていることを特徴とする請求項８記載の検出用キット。
【請求項１０】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項８又は９記載の検出用キット。
【請求項１１】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、
該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載の検出用キット。
【請求項１２】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブであり、
該複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、
各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、
該ダイマーを形成する２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、
前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載の検出用キット。
【請求項１３】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、からなり、
前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、
前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、
前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基変異の検出方法及び検出用キットに関し、特に、高感度で特異性の高い遺伝子変異および遺伝子多型等の塩基変異の検出方法及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
同一種に属する生物でも、遺伝子の塩基配列には個体間で差異がみられる。これらの配列の差異は、その頻度が１％以上のものを「遺伝子多型」、あるいは単に「多型」と呼び、１％未満のものを「突然変異」または「遺伝子変異」、あるいは単に「変異」と呼ぶ。しばしば、「多型」と「変異」の定義を厳密に区別せずに使用されることもある。多型及び変異の種類は様々で、塩基の置換、塩基の挿入および欠損、特定の塩基配列の繰り返し回数の差異、などがある。また、置換、挿入、欠損、繰り返し配列の塩基数も一塩基から数千塩基の遺伝子単位にまで及ぶ。本発明においては、これら遺伝子多型及び遺伝子変異をあわせて塩基変異と称する。【０００３】
なお、「遺伝子」の言葉は、タンパク質のアミノ酸配列をコードした領域（エキソンとイントロンを含む）を指す狭義の定義と、ＤＮＡ及びそれから転写されたＲＮＡを含めた核酸を総称して指す広義の定義とがある。本発明では、特に明記しない限り、後者の意味で使用することとする。【０００４】
これらの遺伝子の多型及び変異は、ヒトにおいては遺伝病の診断（ウェルナー症候群におけるＷＲＮ遺伝子、種々の家族性腫瘍におけるＲＢ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ｈＭｓｈ２遺伝子等の変異）や疾病への罹患リスクの予測（肥満に関わるβ２ＡＲ、β３ＡＲ、ＵＣＰ１等）、薬剤に対する効果・副作用の予測（抗結核薬イソニアジドに関わるＮＡＴ２遺伝子、抗凝固剤ワーファリンに関わるＶＫＯＲＣ１およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、抗癌剤塩酸イリノテカンに関わるＵＧＴ１Ａ１遺伝子等）、臓器移植や骨髄移植などの適合性の判定（ＨＬＡ遺伝子）など医療分野において益々重要な技術となっている。【０００５】
また、癌などの疾患では、後天的な塩基配列の置換、挿入や欠損の体細胞変異が多くみられ、診断や治療方針の決定に有用である（種々の癌に関わるｐ５３遺伝子、大腸癌や膵臓癌などに関わるＫ−ｒａｓ遺伝子、抗癌剤ゲフィチニブの効果に関わるＥＧＦＲ遺伝子等）。【０００６】
また、個体識別や親子判定などの科学捜査、法医学分野でも応用されている。さらには、農産物の品種鑑定や育種、個体識別、遺伝子組換え産物の鑑定など、日常生活に欠かせない産業分野でも応用されている。【０００７】
このように医療や食品分野において広く利用される遺伝子検査技術は、人の健康や安全、さらには生態系などの環境への影響にも深く影響を及ぼし得ることとなる。したがって、このような遺伝子検査技術には、何よりも高い精度と信頼性が求められる。また、精度と信頼性に加えて、医療という社会福祉や食品という日常品に広く使用されるためには、検査の効率が良いことと検査の実施費用が安価なことも重要な要件である。【０００８】
これまでに、多くの遺伝子変異及び／または遺伝子多型の判定（遺伝子タイピング）法が開発され、報告されている。現在までに、最も信頼性が高いとされているのが、サンガー法による塩基配列決定法（非特許文献１）である。近年、塩基配列決定法は、ＰＣＲ法と組み合わせたサイクルシーケンス法（非特許文献２）とオートシーケンサーによる方法が主流で、高速化、高処理能力化が図られてきた。しかし、装置や試薬が高価な上、いまだ人の手による操作を要する工程が多く、煩雑である。さらに電気泳動から得られた波形データを塩基配列データに変換する作業を自動で行うソフトウエアの精度も概して高くなく、しばしば、人の目視による解析結果の確認作業を要するなど、簡便性、迅速性、効率の点での問題を指摘することができる。【０００９】
他の方法としては、被検試料から増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼによって一塩基または数塩基のヌクレオチドの取り込みを行い、鋳型ＤＮＡの配列に応じて取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することによって遺伝子タイピングを行う、プライマー伸長法あるいはミニシークエンス法と呼ばれる方法（非特許文献３）がある。この方法は、プライマーからＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチドを取り入れる点というで、サンガー法による塩基配列決定法と基本的な原理は同じであり、共通の問題点を指摘することができる。すなわち、プライマー伸長を行う前に残存するＰＣＲプライマーやヌクレオチドの除去、反応液の交換などのためにＰＣＲ産物の精製が不可欠であり、操作が煩雑である。また、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定するための最新の方法として質量分析法が使用されることがあるが、これには非常に高価な質量分析装置を必要とする（非特許文献４）。このように、プライマー伸長法においては、経済性、簡便性、迅速性の点での問題を指摘することができる。【００１０】
より簡便、迅速、安価な遺伝子タイピングの方法として、ハイブリダイゼーションを基盤とした方法が広く利用されている。ハイブリダイゼーションを基盤とした方法は、主にマイクロプレート、メンブレン、ビーズ、スライドガラスなどの固相に、一般的には１５〜２５塩基長程度のプローブを固定させ、これに標的核酸をハイブリダイズさせることによってヘテロディプレックスを形成させ、該ヘテロディプレックス中に塩基対のミスマッチのある場合とない場合との融解温度（以下、「Ｔｍ」という）の差異（以下、「ΔＴｍ」という）を利用し、ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄操作においてミスマッチのあるヘテロディプレックスのみを選択的に解離させ除去する、いわゆるＢ／Ｆ分離と呼ばれる手法に基づくものであり、チトクロームＰ４５０のタイピング試薬、ＧｅｎeＣｈｉｐ  Ｐ４５０（アフィメトリクス社／ロシュ社）から販売されている（非特許文献５）。【００１１】
この際、プローブの鎖長が長くなるとＴｍが高くなり、ΔＴｍが全体のＴｍに占める割合が小さくなるため、この微小なΔＴｍに基づいてミスマッチのある標的核酸とミスマッチのない標的核酸とを洗浄条件の調整によって分離することが困難となることが多い。また鎖長が短くなるとハイブリダイゼーションの特異性が低くなる上に、Ｔｍも低下するため、プローブと標的核酸との結合の親和性も下がり、プローブを安定してハイブリダイズさせられなくなる。そのため、たとえ穏やかな条件下でＢ／Ｆ分離を行ったとしても、ハイブリッドの親和性が低いために、完全マッチした標的核酸とミスマッチのある標的核酸がともに除去されてしまい、結果として完全マッチとミスマッチを区別することが困難となることが多い。【００１２】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、ＰＣＲの伸長反応工程で、一本鎖の鋳型ＤＮＡにＴａｑＭａｎプローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーから伸長反応を続けて、ＴａｑＭａｎプローブのハイブリダイズした領域に到達した際に、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、このＴａｑＭａｎプローブを５’側から分解する（非特許文献６）。ＴａｑＭａｎプローブの５’端には蛍光物質が、３’端には蛍光を吸収するクエンチャーが標識されており、ＴａｑＭａｎプローブが分解されていないときには、蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Resonance Energy Transfer；ＦＲＥＴ）として知られる現象によって、標識蛍光物質の蛍光は抑制されている。しかしながら、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡに配列特異的にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解され、５’端に標識された蛍光物質がＴａｑＭａｎプローブから遊離すると、蛍光を発するようになる。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法では、一塩基の置換、すなわち一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）をも識別することができる。すなわち、鋳型ＤＮＡの配列とＴａｑＭａｎプローブの配列が相補的な場合は、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡにハイブリダイズして、蛍光を発する。しかし、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡとの間で相補的でない塩基対がある場合には、完全に相補的な場合に比べてＴｍ値が低くなるので、ＴａｑＭａｎプローブは鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしない。しかし、このΔＴｍは概して大きくないため、一塩基の差異を精度よく識別することは容易ではなく、従来のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による多型・変異の検出は、特異性の点での問題を指摘することができる。【００１３】
そこで、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による遺伝子タイピングの特異性を向上させるため、ＭＧＢ（Minor Groove Binder）プローブが考案された。ＭＧＢは、ＤＮＡの二重らせん構造の副溝に結合して、ＴａｑＭａｎプローブと鋳型核酸との間のＴｍ値を向上させることによってＴａｑＭａｎプローブと鋳型ＤＮＡとの結合を安定化する（非特許文献７）。ＭＧＢは、ＴａｑＭａｎプローブの３’端に標識されたクエンチャーに結合されている。これにより、ＴａｑＭａｎプローブと鋳型ＤＮＡが完全に相補的にハイブリダイズときのＴｍが向上し、ミスマッチがある場合とのＴｍの差、すなわちΔＴｍを大きくすることができる。その結果、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による遺伝子タイピングの特異性が向上している。ＭＧＢプローブを用いたＴａｑＭａｎ法によるＳＮＰタイピングの性能については、非特許文献８で述べられている。【００１４】
しかしながら、通常、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法では、１つの反応容器内で判定できる遺伝子多型・変異マーカーの種類は１つのみで、複数の遺伝子多型・変異を同一反応容器内で同時に判定することは困難であった。このため、複数種の遺伝子マーカーのタイピングが必要な、ＨＬＡタイピング、品種鑑定、個人・個体鑑定、癌をはじめとする疾病の診断、遺伝病診断、薬剤感受性予測試験、薬剤による副作用発現予測試験等々においては、効率的に使用できない。【００１５】
さらに、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法では、塩基配列特異的なシグナルとバックグランドシグナルの比、すなわちＳ／Ｎ比が低いため、複数（通常数十）のサンプルを同時にアッセイし、そのシグナルの分布から遺伝子タイピングを行うクラスター解析が必要である。クラスター解析を要する遺伝子タイピング法は、少数サンプルのタイピングを行う際にも、複数のコントロールサンプルを同時にアッセイする必要があり、検査の実施費用や操作の効率の点で大きな問題とされている。【００１６】
Ｉｎｖａｄｅｒ法と呼ばれる遺伝子多型・変異検出法（非特許文献９）では、標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが使用されるが、その原理はΔＴｍを利用したものではない点が特徴的である。すなわち、Ｉｎｖａｄｅｒ法では、２種類のプローブが標的核酸に特異的にハイブリダイズしたときに、該標的核酸と該２種類のプローブとで形成する複合体の構造を認識して該プローブの一つを切断するＣｌｅａｖａｓｅと呼ばれるエンドヌクレアーゼが用いられている。該プローブの一つは、蛍光物質とクエンチャーが標識されており、Ｃｌｅａｖａｓｅによって外プローブが切断されたときにのみ、蛍光シグナルを発する。一方、標的核酸に塩基配列の差異が存在する場合には、２種のプローブと形成した複合体の構造に差異が生じ、構造特異的エンドヌクレアーゼであるＣｌｅａｖａｓｅはプローブを切断しないため、蛍光を発しない。この、蛍光シグナルの上昇の有無によって、塩基の差異を識別することができる。【００１７】
しかしながら、Ｉｎｖａｄｅｒ法は遺伝子増幅法ではないため、塩基配列特異的なシグナルを得るのに数時間の反応工程を要する。また、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法と同様、一つの反応容器で判定できる多型・変異マーカーの数は限られており、多くの場合１種類である。さらに、Ｉｎｖａｄｅｒ法も、そのＳ／Ｎ比の低さゆえ、遺伝子タイピングには、しばしばクラスター解析が必要である。【００１８】
また、特許文献１は、オリゴヌクレオチドから高分子構造を形成させ、シグナル増幅法として利用できるＰＡＬＳＡＲ法と、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応を利用した変異遺伝子の検出方法を開示している。ＰＡＬＳＡＲ法は、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブが、互いに認識し合いながら自己集合反応により高分子構造体を形成するシグナル増幅技術であり、酵素反応を必要とせず、等温条件にてシグナルが増幅されることが特徴である。特許文献１では、シグナル増幅用プローブと相補的な領域を有する第１プローブと、捕捉用プローブとを標的ＤＮＡにハイブリダイズさせたときに、捕捉用プローブの末端が標的ＤＮＡの塩基変異部位に位置し、且つ該末端と第１プローブとが隣接する状態で標的ＤＮＡにアニーリングするように構成させており、該標的ＤＮＡの塩基変異部位と該捕捉用プローブが相補的な場合にのみ、リガーゼの働きによって隣接した捕捉用プローブと第１プローブが連結され、この連結されたプローブの存在を、ＰＬＡＳＡＲ法によってシグナル増幅させ、高感度に特異的な配列を一塩基の違いをも区別して検出することを可能せしめている。【００１９】
さらに、特許文献２は、ＰＡＬＳＡＲ法に用いるアシストプローブ及びアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法を開示している。前記特許文献１の方法にターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用いてシグナルプローブポリマーを形成させてターゲット遺伝子を検出することを可能せしめている。【００２０】
しかしながら、特許文献１及び特許文献２記載の方法は、プローブと標的核酸との間の相補性に依存したリガーゼのＤＮＡの結合活性に依存したものである。ＰＡＬＳＡＲ法はその検出感度を高めるものであり、該方法でも十分検出は可能であったが、該方法の遺伝子変異検出の特異性はリガーゼのそれに依存する。すなわち、特許文献１記載の方法で特異性の低いリガーゼを使用すれば、ＰＡＬＳＡＲ法によって非特異的なシグナルが増幅されるという課題があった。また、本来、酵素反応を必要としないことを特徴とするＰＡＬＳＡＲ法に酵素反応を必要とする方法を組み合わせたことにより、操作が多少煩雑になったという課題もあった。【００２１】
一方、核酸、例えばＤＮＡによって高次構造体を形成させ、核酸検出のためのシグナル増幅法として用いることの技術として分岐ＤＮＡ法やデンドリマー法（非特許文献１０）がある。これらの技術は、すでに微生物由来のＤＮＡやＲＮＡを遺伝子増幅せずに検出することを目的に産業化されている。しかしながら、これらのシグナル増幅技術が遺伝子の多型および変異の検出において、どのように有用に利用されるかについては論じられてはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】WO2004/074480号公報
【特許文献２】WO2006/093097号公報
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Sambrook et al. Molecular Cloning, 1898;Second Edition: Chapter 13
【非特許文献２】Gyllensten et al. Biotechniques 1989; 7: 700-708
【非特許文献３】Syvanen et al. Genomics 1990; 9: 119-127
【非特許文献４】Haff et al. Genome Research 1997; 7: 378-388
【非特許文献５】Jain et al. Molecular Diagnostics 2005; 9: 119-127
【非特許文献６】Holland et al. Proceedings of the National Accademiy of Sciences of the United States of America 1991; 88: 7276-7280
【非特許文献７】Kutyavin et al. Nucleic Acids Research 2000; 28: 655-661
【非特許文献８】Dela Vega et al. Mutation Research 2005; 573: 111-135
【非特許文献９】Oliver et al. Mutation Resaearch 2005; 573: 103-110
【非特許文献１０】Lowe et al. Cytometry Part A 2004; 60A: 135-144
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、上記した従来技術の課題点に鑑みて、一度の測定で複数のサンプルを同時に検出でき、簡便且つ高感度で特異性の高い塩基変異の検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、被験核酸の塩基変異部位を含む第１の領域に相補的な領域を有する第１の核酸プローブと、シグナル増幅用プローブと、該シグナル増幅用プローブに相補的な領域及び被験核酸の第１の領域に相補的な領域を有する第２の核酸プローブとを用い、且つ該被験核酸の塩基変異部位が該第１の領域の両末端以外に位置する、即ち、被験核酸と第１の核酸プローブを反応させたときに該被験核酸の塩基変異部位が該第１の核酸プローブの末端に位置しないように構成することにより、酵素によるライゲーション反応を必要とせずに、被験核酸から増幅されたＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異の有無を検出することができることを見出した。【００２６】
即ち、本発明の塩基変異の検出方法は、（ａ）被検核酸を増幅反応により増幅し、ＤＮＡ増幅産物を得る工程；（ｂ）前記ＤＮＡ増幅産物と、該ＤＮＡ増幅産物の第１の領域に相補的な第１の標的配列領域を有する第１の核酸プローブと、該ＤＮＡ増幅産物の第２の領域に相補的な第２の標的配列領域を有する第２の核酸プローブと、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブと、を反応させ、該ＤＮＡ増幅産物、該第１の核酸プローブ、該第２の核酸プローブ、及び該複数種のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーを含む検出用複合体を形成させる工程；及び（ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出し、前記ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異の有無を検出する工程；を含む塩基変異の検出方法であって、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域が前記塩基変位部位を含み、且つ前記塩基変異部位が、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域の両末端部以外に位置し、前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする。【００２７】
本発明の検出用キットは、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡ増幅産物の塩基変異の検出に用いられる検出用キットであって、第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、及び互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを含み、前記第１の核酸プローブは、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域に相補的な第１の標的配列領域を有し、前記第２の核酸プローブは、前記ＤＮＡ増幅産物の第２の領域に相補的な第２の標的配列領域を有し、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域が塩基変位部位を含み、且つ該塩基変異部位が、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域の両末端部以外に位置し、前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする。【００２８】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、前記ＤＮＡ増幅産物の第１の領域と第２の領域は、隣接していてもよく、隣接していなくてもよいものである。【００２９】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、前記第１の核酸プローブは前記第１の標的配列領域を５’末端又は３’末端に有し、且つ前記第２の核酸プローブは前記第２の標的配列領域を３’末端又は５’末端に有することが好ましい。【００３０】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることが好適である。【００３１】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。【００３２】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、第１の例として前記複数種のシグナル増幅用プローブが、第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることが好ましい。【００３３】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、第２の例及び第３の例として前記複数種のシグナル増幅用プローブが、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブであり、該複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該ダイマーを形成する２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であることが好ましい。【００３４】
本発明の塩基変異の検出方法及び本発明の検出用キットにおいて、第４の例及び第５の例として前記複数種のシグナル増幅用プローブが、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、からなり、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、リガーゼ等の酵素を用いた酵素反応を行うこと無く、簡便且つ高感度で特異性の高い塩基変異の検出方法及び検出用キットを提供することができる。また、本発明と、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ、ビーズアレイ技術等の従来の遺伝子検査のプラットフォーム技術とを組み合わせることによって、高感度及び高い特異性に加え、同時に多数の塩基変異を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の塩基変異の検出方法の一例を示す概略説明図であり、（ａ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がない場合の工程（ｂ１）の概略説明図であり、（ｂ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がある場合の工程（ｂ１）の概略説明図である。
【図２】本発明の塩基変異の検出方法の一例を示す概略説明図であり、（ａ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がない場合の工程（ｂ２）の概略説明図であり、（ｂ）及び（ｃ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がある場合の工程（ｂ２）の概略説明図である。
【図３】本発明の塩基変異の検出方法の他の例を示す概略説明図であり、（ａ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がない場合の工程（ｂ１）の概略説明図であり、（ｂ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がある場合の工程（ｂ１）の概略説明図である。
【図４】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第１の例を示す概略説明図である。
【図５】図４記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図６】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第２の例を示す概略説明図である。
【図７】図６記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図８】図６記載の複数種のシグナル増幅用プローブにおける第２ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
【図９】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第３の例を示す概略説明図である。
【図１０】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第４の例を示す概略説明図である。
【図１１】図１０記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１２】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第５の例における２組のダイマープローブを示す概略説明図である。
【図１３】図１２記載の複数種のシグナル増幅用プローブにおける架橋プローブの他の例を示す概略説明図である。
【図１４】図１２記載のダイマープローブ及び図１３記載の架橋プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１５】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第５の例における２組の架橋プローブを示す概略説明図である。
【図１６】プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第６の例を示す概略説明図である。
【図１７】図１６記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１８】図１２、図１５記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１９】実施例１〜３の結果を示すグラフである。
【図２０】実施例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００３８】
図１及び２は、本発明の塩基変異の検出方法の一例を示す概略説明図である。図１（ａ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がない場合の工程（ｂ１）の概略説明図であり、図１（ｂ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がある場合の工程（ｂ１）の概略説明図である。図２（ａ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がない場合の工程（ｂ２）の概略説明図であり、図２（ｂ）及び（ｃ）は、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異がある場合の工程（ｂ２）の概略説明図である。
【００３９】
図１及び図２において、符号１０は工程（ａ）で得られたＤＮＡ増幅産物であり、符号Ｔｘは塩基変位部位である。符号１２は第１の核酸プローブ（以下、捕捉プローブと称する）、符号１４は第２の核酸プローブ（以下、アシストプローブと称する）、符号１６はシグナル増幅用プローブである。
本発明の検出用キットは、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡ増幅産物の塩基変異の検出に用いられる検出用キットであって、捕捉プローブ１２、アシストプローブ１４、及び互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブ１６を含むものである。
本発明において、相補的な塩基配列とは、互いにハイブリダイズすることができる塩基配列であればいかなるものでもよい。また、非相補的な塩基配列とは、互いにハイブリダイズしない塩基配列であればいかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。 
【００４０】
捕捉プローブ１２は、ＤＮＡ増幅産物１０の第１の領域に相補的な第１の標的配列領域を有する核酸プローブであり、ＤＮＡ増幅産物１０の第１の領域は塩基変異部位Ｔｘを該第１の領域の両末端部以外に含んでいる。即ち、図１に示した如く、ＤＮＡ増幅産物１０と捕捉プローブ１２がハイブリダイズしたときに、捕捉プローブ１２の末端にＤＮＡ増幅産物１０の塩基変異部位Ｔｘが位置しないように、構成されている。塩基変異部位Ｔｘが捕捉プローブ１２のいずれかの末端付近に位置する場合、検出の感度または特異性、あるいはその両方を低下させる原因となり得る。捕捉プローブ１２は、その中央部付近に検出対象となる塩基変異部位Ｔｘが位置するように設計することが望ましい。具体的には、塩基変異部位Ｔｘが捕捉プローブ１２の両末端からそれぞれ１塩基以上離れていることが好ましく、３塩基以上離れていることがより好ましく、５塩基以上離れていることがさらに好ましい。
また、捕捉プローブ１２の第１の標的配列領域は、該プローブのいかなる領域でもよいが、好ましくは末端から５塩基以内、更に好ましくは、末端から３塩基以内、最も好ましくは捕捉プローブ１２の末端に位置していることが好ましい。
【００４１】
捕捉プローブは、通常の場合、アミダイド法など公知の方法によって化学的に合成されたオリゴヌクレオチドプローブが使用でき、ＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ、ＰＮＡやＬＮＡなど人工ヌクレオチドも使用することができる。捕捉プローブの鎖長は、反応条件にもよるが７〜３５塩基、より好ましくは１５〜２５塩基程度である。これら化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能である。
【００４２】
捕捉プローブ１２は、担体１３に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることが好適である。検出系に担体を用いる場合は、捕捉プローブの一端を担体に直接又は間接的に結合させて用いる。担体としては、マイクロプレート、メンブレンフィルター、ＤＮＡチップやマイクロアレイに用いられる合成樹脂やガラス製の基板、ビーズアレイに用いられる微細粒子など、従来の遺伝子解析技術やエンザイム・イムノ・アッセイ等に用いられるあらゆる素材および形状からなるものが使用可能である。
【００４３】
なお、図１〜３では、捕捉プローブ１２の５’末端を担体１３に結合させた例を示したが、本発明において、捕捉プローブ１２を担体１３に結合させる部位は特に制限はないものである。捕捉プローブ１２を担体１３に結合させる部位は、捕捉プローブの末端でも、末端以外の内部領域でもよいが、５’または３’末端を利用することが好ましい。
【００４４】
核酸プローブの担体への結合は、化学結合による方法、生物学的相互作用による方法、物理吸着による方法などがあげられる。化学結合による方法では、例えば、カルボキシル基でコートされた担体を用いる場合、オリゴヌクレオチドに標識したアミノ基との間でカップリング反応をさせることができる。生物学的相互作用による方法では、例えば、担体にコートしたストレプトアビジンと、核酸プローブに修飾したビオチンとの間の結合力を利用することができる。また、物理吸着による方法では、例えば、負の電荷を有する固相を用いた場合、オリゴヌクレオチドにアミノ基など正の電荷を有する物質を標識することで、静電気的に担体に吸着させることができる。
【００４５】
アシストプローブ１４は、ＤＮＡ増幅産物１０の第２の領域に相補的な第２の標的配列領域を有し、且つ複数種のシグナル増幅用プローブ１６中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有する核酸プローブである。
アシストプローブ１４の第２の標的配列領域は、アシストプローブ１４の末端に位置していることが好ましい。具体的には、捕捉プローブ１２が第１の標的配列領域を５’末端に有している場合は、アシストプローブ１４は第２の標的配列領域を３’末端に有していることが好ましく、捕捉プローブ１２が第１の標的配列領域を３’末端に有している場合は、アシストプローブ１４は第２の標的配列領域を５’末端に有していることが好ましい。
【００４６】
なお、図１及び２では、ＤＮＡ増幅産物１０の第１の領域と第２の領域とが隣接しており、捕捉プローブ１２とアシストプローブ１４が隣接した状態でＤＮＡ増幅産物１０とハイブリダイズように構成されている例を示したが、本発明において、ＤＮＡ増幅産物１０の第１の領域と第２の領域は隣接していてもよく、隣接していなくてもよく、特に制限はないものである。
【００４７】
図３は、本発明の塩基変異の検出方法の他の例を示す概略説明図である。図３に示した如く、ＤＮＡ増幅産物１０の第１の領域と第２の領域とが隣接しておらず、捕捉プローブ１２とアシストプローブ１４が１塩基以上離れた状態でＤＮＡ増幅産物１０とハイブリダイズように構成されていてもよい。捕捉プローブ１２とアシストプローブ１４が０〜２０塩基離れた状態でＤＮＡ増幅産物１０とハイブリダイズように構成されていることが好ましく、０〜３塩基の範囲がより好ましい。なお、捕捉プローブ１２とアシストプローブ１４が０塩基離れた状態は、図１で示した状態となる。
【００４８】
また、図１〜３では、アシストプローブが、一つのシグナル増幅用プローブの全てと同じ塩基配列（配列ＸＹＺ）を有する例を示したが、本発明において、シグナル増幅用プローブの一つと同じ塩基配列を有し、他のシグナル増幅用プローブと結合可能な領域は、アシストプローブとシグナル増幅用プローブが特異的に結合できる配列であれば特に限定されず、シグナル増幅用プローブの一部と同じ塩基配列を有する配列（例えば、配列Ｘ、配列Ｙ、配列Ｚ、配列ＸＹ、配列ＹＺ、配列ＺＹＺ、配列ＸＹＸまたはこれら配列の部分配列等）を用いてもよい。
【００４９】
アシストプローブも、通常の場合、アミダイド法などによって化学的に合成されたオリゴヌクレオチドプローブが利用できる。ＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ、ＰＮＡやＬＮＡなど人工ヌクレオチドも使用することができる。アシストプローブの鎖長は、反応条件にもよるが、第２の標的配列領域の長さが７〜３５塩基、より好ましくは１２〜２５塩基程度であることが好適である。従って、アシストプローブの全長は、これにシグナル増幅用プローブの一部又は全てに相補的な配列が加わった長さとなる。
【００５０】
複数種のシグナル増幅用プローブ１６は、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な核酸プローブである。図１〜３では、該複数種のシグナル増幅用プローブ１６として、５’末端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む第１のシグナル増幅用プローブ（ＨＣＰ−１）１６ａ、及び５’ 末端部から順に前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む第２のシグナル増幅用プローブ（ＨＣＰ−２）１６ｂを用いた場合の例を示した。
【００５１】
図１〜３では、複数種のシグナル増幅用プローブ１６として、後述する図４で示した３箇所の核酸領域を含む第１のシグナル増幅用プローブ１６ａ及び３箇所の核酸領域を含む第２のシグナル増幅用プローブ１６ｂを用いた例を示したが、本発明方法に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能なものであれば特に限定されない。本発明方法に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブとしては、具体的には、後述する３つの態様（パルサーI、パルサーII及びパルサーIII）が挙げられる。なお、３つの態様（パルサーI、パルサーII及びパルサーIII）を総称してパルサー法という。
【００５２】
（パルサーI）
図４は、プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第１の例を示す概略説明図である。図５は、図４記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるポリマーを示す概略説明図である。
プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブとしては、図４に示した如く、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ１、核酸領域Ｘ２、・・核酸領域Ｘｎのｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する第１のシグナル増幅用プローブ１６ａ、及び５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘ１に相補的な核酸領域Ｘ１’、前記核酸領域Ｘ２に相補的な核酸領域Ｘ２’、・・前記核酸領域Ｘｎに相補的な核酸領域Ｘｎ’のｎ個（ｎ≧３）の核酸領域を有する第２のシグナル増幅用プローブ１６ｂの２種のシグナル増幅用プローブが挙げられる。なお、図４では、ｎが３の場合の例を示した。ｎの数は３以上であれば特に限定されないが、３が好ましい。この図では、ｎが３の場合、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＺである。
【００５３】
該２種のシグナル増幅用プローブ１６ａ及び１６ｂをハイブリダイズさせることにより、図５に示した如く、２種のシグナル増幅用プローブ１６ａ及び１６ｂが自己集合し、核酸プローブのポリマー１８が形成される。
【００５４】
（パルサーII）
プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第２の例は、図６で説明することができる。図７は、図６記載の複数のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブとしては、図６に示した如く、プローブポリマーを形成する複数のダイマープローブ２０ａ及び２０ｂ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブが挙げられる。前記複数のダイマープローブは、複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ前記複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、国際公開第０２／３１１９２号公報記載の核酸プローブが用いられる。
【００５５】
図６は２組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ２０ａ、第２ダイマープローブ２０ｂ）を用いた場合の一例を示した。
図６（ａ）に示した如く、第１ダイマープローブ２０ａは２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ２１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ２１ｂ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第１ダイマー形成用プローブ２１ａは、５’側領域（領域Ａ）、中央領域（領域Ｂ）及び３’側領域（領域Ｃ）の３領域を含み、第２ダイマー形成用プローブ２１ｂは、５’側領域（領域Ｄ）、中央領域（領域Ｂ’）及び３’側領域（領域Ｆ）の３領域を含み、第１ダイマー形成用プローブ２１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ２１ｂは、中央領域（領域Ｂ及びＢ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ及びＦ）及び該５’側領域（領域Ａ及びＤ）が互いに非相補的である。
【００５６】
図６（ｂ）に示した如く、第２ダイマープローブ２０ｂは、２種の一本鎖核酸プローブ（第３ダイマー形成用プローブ２１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ２１ｄ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第３ダイマー形成用プローブ２１ｃは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、第４ダイマー形成用プローブ２１ｄは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、第３ダイマー形成用プローブ２１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ２１ｄは、中央領域（領域Ｅ及びＥ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）及び該５’側領域（領域Ａ’及び Ｄ’）が互いに非相補的である。
なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
【００５７】
第１ダイマープローブ２０ａの５’側領域（領域Ａ及びＤ）は第２ダイマープローブ２０ｂの５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）と相補的であり、第１ダイマープローブ２０ａの３’側領域（領域Ｃ及びＦ）は第２ダイマープローブ２０ｂの３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）と相補的であり、前記第１及び第２ダイマープローブ２０ａ及び２０ｂをハイブリダイズさせることにより、核酸プローブのプローブポリマー２２を形成することができる（図７）。
本発明において、ダイマープローブの代わりに、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブ（図６の２１ａ及び２１ｂ、２１ｃ及び２１ｄ）を用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。
【００５８】
図６では、第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第３ダイマー形成用プローブ２１ｃの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第４ダイマー形成用プローブ２１ｄの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、ダイマープローブは、１つのダイマープローブの５’側領域が他のダイマープローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマープローブの３’側領域が他のダイマープローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
【００５９】
図８は、図６記載の第１ダイマープローブ２０ａと共に用いられる第２ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
図８に示した如く、５’側領域が第１ダイマー形成用プローブ２１ａの５’側領域に相補的な領域（領域Ａ’）であり且つ３’側領域が第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの３’側領域に相補的な領域（領域Ｆ’）であるダイマー形成用プローブ２１ｅと、５’側領域が第２ダイマー形成用プローブ２１ｂの５’側領域に相補的な領域（領域Ｄ’）であり且つ３’側領域が第１ダイマー形成用プローブ２１ａの３’側領域に相補的な領域（領域Ｃ’）であるダイマー形成用プローブ２１ｆと、をハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブ２０ｃを、第２ダイマープローブとして用いることもできる。
【００６０】
また、図６では、２種類のダイマープローブを使用した例を示したが、相補的な領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（国際公開第０２／３１１９２号公報）。
図９は、プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第３の例を示す概略説明図であり、３組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ２０ａ，第２ダイマープローブ２０ｄ，第３ダイマープローブ２０ｅ）を用いた場合の一例を示す概略説明図である。
図９（ａ）において、第１ダイマープローブ２０ａは図６（ａ）と同様に構成されている。
図９（ｂ）において、第２ダイマープローブ２０ｄは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ２１ｇ、２１ｈ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ２１ｇは、５’側領域（領域Ｇ）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、３’側領域（領域Ｃ’）が第１ダイマープローブ２０ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ２１ｈは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｈ）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｄ’）が第１ダイマープローブ２０ａの５’側領域（領域Ｄ）と相補的である。
【００６１】
図９（ｃ）において、第３ダイマープローブ２０ｅは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ２１ｊ、２１ｋ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ２１ｊは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｊ）及び３’側領域（領域Ｈ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ａ’）が第１ダイマープローブ２０ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｈ’）が第２ダイマープローブ２０ｄの３’側領域（領域Ｈ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ２１ｋは、５’側領域（領域Ｇ’）、中央領域（領域Ｊ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｇ’）が第２ダイマープローブ２０ｄの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｆ’）が第１ダイマープローブ２０ａの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である。なお、図中、領域Ｊ’は領域Ｊに相補的な領域である。
【００６２】
即ち、図９において、第１ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域は、第２ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第１ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第２ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域と相補的であるように構成されている。
【００６３】
図９に示した如く、各ダイマープローブの各３’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的とし、且つ各ダイマープローブの各５’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的となるように構成した複数種のダイマープローブを用いて、これら複数種のダイマープローブをハイブリダイズさせることにより、ダイマープローブの集合体であるプローブポリマーが形成される。
なお、本発明において、相補的な関係を有するダイマープローブの組み合わせに特に制限はないが、図９に示した如く、各ダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域が、他の１つのダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域とそれぞれ相補的となるように構成することが好ましい。
【００６４】
（パルサーIII）
図１０は、プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第４の例を示す概略説明図である。図１１は、図１０記載の複数種のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブとしては、図１０に示した如く、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブとが挙げられる。
【００６５】
図１０は、１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１組の一対の架橋プローブを用いた場合の例を示した。
図１０において、（ａ）は１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ３１ａ、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂから形成されるダイマープローブ３０ａである。
図１０（ａ）に示した如く、一対のダイマー形成用プローブは、２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ３１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ３１ｂ）からなり、各ダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂは、中央領域、該中央領域より５’側に位置する５’側領域、及び該中央領域より３’側に位置する３’側領域の少なくとも３領域を含む。図１０中、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示した。第１ダイマー形成用プローブ３１ａと第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの中央領域（領域Ｂ及びＢ’）は互いに相補的であり、第１ダイマー形成用プローブ３１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ３１ｂのそれぞれの５’側領域（領域Ａ及びＤ）及び３’側領域（領域Ｃ及びＦ）の４領域は全て互いに非相補的であり、両者をハイブリダイズさせることにより、１組のダイマープローブ３０ａが形成される。
【００６６】
本発明において、予め一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブを用いてもよく、ダイマー形成用プローブをそのまま用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。
【００６７】
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、前述した１組の場合と同様に各組の一対のダイマー形成用プローブを構成する。複数組の一対のダイマー形成用プローブにより同数組のダイマープローブが形成される。
【００６８】
図１２は、プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第５の例における２組の一対のダイマー形成用プローブの一例及び該一対のダイマー形成用プローブから形成される２組のダイマープローブを示す概略説明図である。図１２において、（ａ）は１組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ４１ａ、第２ダイマー形成用プローブ４１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ４１ａ、４１ｂから形成されるダイマープローブ４０ａであり、（ｂ）は２組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ４１ｃ、第２ダイマー形成用プローブ４１ｄ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ４１ｃ、４１ｄから形成されるダイマープローブ４０ｂである。
図１２中、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示し、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの５’側領域を領域Ｇ、中央領域を領域Ｅ、３’側領域を領域Ｈで示し、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｄの５’側領域を領域Ｉ、中央領域を領域Ｅ’、３’側領域を領域Ｊで示した。各組の第１及び第２ダイマー形成用プローブの中央領域（領域Ｂ及びＢ’、領域Ｅ及びＥ’）はそれぞれ互いに相補的であり、各一対の第１及び第２ダイマー形成用プローブの５’側領域及び３’側領域の４領域（領域Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ、領域Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）は全て互いに非相補的であり、各組の一対のダイマー形成用プローブ４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄをハイブリダイズさせることにより、２組のダイマープローブ４０ａ，４０ｂが形成される。本発明において、パルサーIIIで用いるダイマー形成用プローブの３’側領域及び５’側領域が全て互いに非相補的であることが好ましい。
【００６９】
本発明において、架橋プローブはダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを架橋することができる１種以上の一本鎖核酸プローブであり、少なくとも２領域を含む。該２領域の内、５’側に位置する領域を５’側領域と称し、３’側に位置する領域を３’側領域と称する。本発明において、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的である。該構成とすることにより、架橋プローブは、ダイマー形成用プローブから形成される１種以上の複数のダイマープローブを架橋するように、ダイマー形成用プローブに結合し、プローブの集合体（プローブポリマー）を形成することができる。
【００７０】
１組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、１組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ及び第２ダイマー形成用プローブ）及び１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ及び第２架橋プローブ）は、一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各５’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各３’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成される。
【００７１】
図１０（ｂ）は、図１０（ａ）記載の一対のダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ３２ａ及び第２架橋プローブ３２ｂ）の一例を示す概略説明図である。
図１０（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂと共に用いられる架橋プローブとしては、例えば、図１０（ｂ）に示した如く、第１架橋プローブ３２ａの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり（領域Ａ’）、第１架橋プローブ３２ａの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的であり（領域Ｃ’）、第２架橋プローブ３２ｂの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり（領域Ｄ’）、第２架橋プローブ３２ｂの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である（領域Ｆ’）、一対の架橋プローブが好適である。図１０（ａ）記載のダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂ及び図１０（ｂ）記載の架橋プローブ３２ａ、３２ｂをハイブリダイズさせることにより、プローブポリマー３４を形成することができる（図１１）。
【００７２】
図１０では、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第１架橋プローブ３２ａの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第２架橋プローブ３２ｂの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、１つのダイマー形成用プローブの５’側領域が１つの架橋プローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマー形成用プローブの３’側領域が１つの架橋プローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
【００７３】
図１３は、図１０記載の一対のダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ３２ｃ及び第２架橋プローブ３２ｄ）の他の例を示す概略説明図である。
図１３に示した如く、一対の架橋プローブの他の例として、第１架橋プローブ３２ｃの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり（領域Ａ’）、第１架橋プローブ３２ｃの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的であり（領域Ｆ’）、第２架橋プローブ３２ｄの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ３１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり（領域Ｄ’）、第２架橋プローブ３２ｄの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ３１ｂの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である（領域Ｃ’）、一対の架橋プローブが挙げられる。図１０（ａ）記載のダイマー形成用プローブ３１ａ、３１ｂ及び図１３記載の架橋プローブ３２ｃ、３２ｄをハイブリダイズさせることにより、プローブポリマー３４を形成することができる（図１４）。
【００７４】
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、同数組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。具体的には、ｎ組（ｎは２以上の整数）の一対のダイマー形成用プローブ（即ち、２ｎ個のダイマー形成用プローブ）及びｎ組の一対の架橋プローブ（即ち、２ｎ個の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの５’側領域は、ダイマー形成用プローブの他のいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの３’側領域は、前記ダイマー形成用プローブの他のいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
【００７５】
図１５は、図１２記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄと共に用いられる２組の一対の架橋プローブ４２ａ−４２ｄの一例を示す概略説明図である。図１５において、（ａ）は１組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ４２ａ、第２架橋プローブ４２ｂ）であり、（ｂ）は２組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ４２ｃ、第２架橋プローブ４２ｄ）である。
図１５に示した如く、図１２記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄと共に用いられる架橋プローブとしては、２組の一対の架橋プローブ（即ち、４種の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域が架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各架橋プローブの５’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域が架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、各架橋プローブの３’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
【００７６】
具体的には、図１５に示した如く、１組目の第１架橋プローブ４２ａの５’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり（領域Ａ’）、１組目の第２架橋プローブ４２ｂの５’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり（領域Ｄ’）、２組目の第１架橋プローブ４２ｃの５’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり（領域Ｇ’）、２組目の第２架橋プローブ４２ｄの５’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｄの５’側領域（領域Ｉ）と相補的であり（領域Ｉ’）、１組目の第１架橋プローブ４２ａの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄのいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１５では、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの３’側領域（領域Ｈ）と相補的である場合を示した（領域Ｈ’））、１組目の第２架橋プローブ４２ｂの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ中、１組目の第１架橋プローブ４２ａで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１５では、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｄの３’側領域（領域Ｊ）と相補的である場合を示した（領域Ｊ’））、２組目の第１架橋プローブ４２ｃの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ４２ａ及び４２ｂで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１５では、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である場合を示した（領域Ｃ’））、２組目の第２架橋プローブ４２ｄの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ４２ａ、４２ｂ及び２組目の第１架橋プローブ４２ｃで選択したものを除く１つの３’側領域と相補的である（図１５では、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である場合を示した（領域Ｆ’））、２組の一対の架橋プローブが好適である。ただし、１組目の架橋プローブが図１０、図１３記載の３２ａ−３２ｄのどの架橋プローブとも同一になってはならない。図１２記載のダイマー形成用プローブ４１ａ−４１ｄ及び図１５記載の架橋プローブ４２ａ−４２ｄをハイブリダイズさせることにより、プローブポリマー３４を形成することができる（図１８）。
【００７７】
なお、図１５では、１組目の第１架橋プローブ４２ａの３’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ｃの３’側領域と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ４２ｂの３’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ４２ｃの３’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの３’側領域と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ４２ｄの３’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域と相補的である場合を示したが、各架橋プローブの３’側領域と相補的となるダイマー形成用プローブの３側領域の組み合わせに制限はないものである。
【００７８】
図１６は、プローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの第６の例を示す概略説明図であり、１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１種の一対の架橋プローブの例を示す概略説明図である。図１６（ａ）において、符号３０ｂはダイマープローブであり、３’側領域並びに５’側領域をそれぞれ同一の塩基配列とした２種のダイマー形成用プローブ３１ｃ、３１ｄを用いてダイマーを形成した例を示した。即ち、図１０のダイマープローブ３０ａにおいて、領域Ａと領域Ｄを同一の塩基配列とし（図１６では領域Ａで表す）、領域Ｃと領域Ｆを同一の塩基配列とした（図１６では領域Ｆで表す）ものである。該構成とすることにより、図１６（ｂ）に示した如く、ダイマープローブ３０ｂと共に用いられる一対の架橋プローブは同一となり、１種の架橋プローブ３２ｃが用いられる。図１６記載のダイマー形成用プローブ３１ｃ、３１ｄ及び架橋プローブ３２ｃをハイブリダイズさせることにより、プローブポリマー３４を形成することができる（図１７）。
【００７９】
本発明のプローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブにおいて、各プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、５塩基以上であり、好ましくは８塩基以上、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。
【００８０】
本発明のプローブポリマー形成に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブの各領域の塩基配列は、プローブポリマーが形成されるように所定の領域が相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。
【００８１】
上記シグナル増幅用プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54, 3607-3630.、Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253.、Wahlestedt C et al. PNAS.2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、複数種のシグナル増幅用プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
【００８２】
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００８３】
前記複数種のシグナル増幅用プローブは、標識物質で標識されたものを用いることが好ましい。前記標識物質としては、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。標識物質として好ましくは、Cy3、Alexa532、ビオチン等を挙げることができる。
【００８４】
本発明の塩基変異の検出方法は、本発明の検出用キットを用いた方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むものである。
（ａ）被検核酸を増幅反応により増幅し、ＤＮＡ増幅産物を得る工程；
（ｂ）前記ＤＮＡ増幅産物と、捕捉プローブ（第１の核酸プローブ）と、アシストプローブ（第２の核酸プローブ）と、複数種のシグナル増幅用プローブと、を反応させ、該ＤＮＡ増幅産物、該捕捉プローブ（第１の核酸プローブ）、該アシストプローブ（第２の核酸プローブ）、及び該複数種のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーを含む検出用複合体を形成させる工程；及び
（ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出し、前記ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位における変異の有無を検出する工程。
【００８５】
前記工程（ａ）において、被検核酸とはＤＮＡおよびＲＮＡである。前記増幅反応は、該被験核酸を増幅し、ＤＮＡ増幅産物を得られる反応であれば特に制限はないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好適である。
【００８６】
前記工程（ａ）後、前記（ｂ）工程前に変性操作によってＤＮＡ増幅産物を一本鎖とすることが好ましい。多重鎖核酸を一本鎖に変性させる方法としては、加熱による方法が好適である。核酸溶液の成分やｐＨなどの条件にもよるが、一般的に生理学的な条件では、９０℃以上にて数秒から数分間加熱すれば二本鎖ＤＮＡは変性される。その後、捕捉プローブおよびアシストプローブ存在下にて所定の温度まで下げれば、一本鎖化されたＤＮＡ増幅産物とハイブリダイズさせることができる。また、アルカリ処理も多重鎖核酸の変性には有効であるが、捕捉プローブ及びアシストプローブとハイブリダイズさせるには中和処理が必要である。また、ホルムアミドなどの変性作用を有する化学物質を用いる方法もあるが、毒性もあり、取扱いに注意を要する。これらの点から、加熱による変性が簡便であり一般的である。
【００８７】
前記工程（ｂ）では、図１に示した如く、ＤＮＡ増幅産物１０の塩基変異部位Ｔｘの塩基の種類が異なることによって、捕捉プローブ１２とＤＮＡ増幅産物１０がハイブリダイズすることによって形成されたハイブリッドが、互いに完全にマッチする場合［図１（ａ）］と、ミスマッチ塩基対を含む場合［図１（ｂ）］とが生じ得ることになる。
【００８８】
なお、図１〜３では、ＤＮＡ増幅産物、捕捉プローブ、及びアシストプローブを反応さる工程（ｂ１）後、複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、プローブポリマーを形成させ［工程（ｂ２）］、ＤＮＡ増幅産物、捕捉プローブ、アシストプローブ、及びプローブポリマーを含む検出用複合体を形成させた例を示したが、本発明では、ＤＮＡ増幅産物、捕捉プローブ、アシストプローブ、及び複数種のシグナル増幅用プローブの反応は、同時に行ってもよく、複数段階に分けて行ってもよく特に制限されない。また、複数段階に分けて行う場合はその順番も特に制限はないものである。
【００８９】
本発明においては、捕捉プローブとＤＮＡ増幅産物のハイブリダイズの後に洗浄によるＢ／Ｆ分離を行うことなく、直ちに、あるいはＤＮＡ増幅産物と捕捉プローブ及びアシストプローブのハイブリダイゼーションと同時にプローブポリマー形成反応を行うことで、捕捉プローブとＤＮＡ増幅産物との間に存在する完全マッチ及びミスマッチの検出の感度及び特異性を飛躍的に向上させることができる。
【００９０】
すなわち、工程（ｂ）を行うと、固相・捕捉プローブ・ＤＮＡ増幅産物・アシストプローブ・シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーからなる巨大な検出用複合体が形成される。自己集合反応の進行に伴ってプローブポリマーが巨大化すると、その複合体の熱力学的エネルギーが増大し、不安定な状態となる。やがて、複合体のエネルギーが過剰に大きくなると、より安定な状態へ移るため、結合の最も脆弱な部分が崩壊する。このような複合体の中で最も結合力が脆弱なのはミスマッチのある捕捉プローブとＤＮＡ増幅産物の間の結合である。このように、捕捉プローブとＤＮＡ増幅産物の間にミスマッチがあると、捕捉プローブとＤＮＡ増幅産物が解離するため、固相においてはプローブポリマーによる有意なシグナル増幅は検出されない［図２（ｃ）］。一方、完全に相補的な捕捉プローブとＤＮＡ増幅産物の結合は、自己集合体の形成によってエネルギーが増大しても所定の温度下で十分な結合力を保持しているため、固相・捕捉プローブ・ＤＮＡ増幅産物・アシストプローブ・シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーからなる複合体は安定に維持され、その結果、プローブポリマーによる有意なシグナル増幅を検出することができる［図２（ａ）］。
【００９１】
よって、検出用複合体に結合したプローブポリマーを検出することにより、ＤＮＡ増幅産物の塩基変位部位Ｔｘにおける変異の有無を検出することができる［工程（ｃ）］。プローブポリマーの検出方法は特に限定されず、例えば、蛍光、発光、発色等により検出することが好適である。
【実施例】
【００９２】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【００９３】
（実施例１）
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子の８５７番目のヌクレオチドの多型を標的とし、本発明の変異遺伝子の検出方法によりＳＮＰ検出を行った。
ＮＡＴ２遺伝子の８５７位のアレルは、グアニン（Ｇ）またはアデニン（Ａ）の２種が存在する。そこで、この８５７位を含むＮＡＴ２遺伝子の一部の領域をＰＣＲにて増幅し、そのＰＣＲ産物を標的として、ＳＮＰのタイプを判定する実験を行った。【００９４】
ヒトゲノム検体から、ＮＡＴ２の８５７位のＳＮＰ部位を含む約７００塩基の領域をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーＤＮＡの配列を以下に示す。
5’-CGGTTTTCAGACCACAATGTTAGGA-3’（配列番号１）
5’-TGAGTTGGGTGATACATACACAAGG-3’（配列番号２）【００９５】
ＰＣＲ反応液の組成は、1X Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Buffer（Finnzymes社）、０．０２Ｕ／μＬ  Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、各５００ｎＭプライマーＤＮＡ、各２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、１〜１０ｎｇ／μＬヒトゲノムＤＮＡであり、容量は１０／μＬである。サーマルサイクラーはEppendorf社製epGradient Sを用い、ＰＣＲ反応は９８℃／３０秒の変性反応の後、９９℃／５秒、６２℃／１５秒、７２℃／１５秒のサイクルを４０回行い、最後に７２℃／１分の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応の成否の確認は、２μＬのＰＣＲ産物を２％アガロース（タカラバイオ社）／１Ｘ  ＴＡＥバッファで電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行い、３６５ｎｍの紫外線を照射することで可視化して行った。【００９６】
ＮＡＴ２遺伝子８５７位のＳＮＰを判定するため、第１の核酸プローブとして、ＳＮＰ部位を中央に含むＰＣＲ増幅産物の第１の領域に相補的な第１の標的配列領域からなる、下記塩基配列を有する２種の捕捉プローブを用いた。いずれも５’末端に、固相に共有結合させるためアミノ基を修飾している。
アレルＧ検出用捕捉プローブの塩基配列（5'-T1(G)'-3'）
5’-NH2-ACCTGGTGATG G ATCCCTTAC-3’（配列番号３）
アレルＡ検出用捕捉プローブの塩基配列（5'-T1(A)'-3'）
5’-NH2-ACCTGGTGATG A ATCCCTTAC-3’（配列番号４）【００９７】
下記方法にて捕捉プローブの固相化を行った。固相には、Luminex社のｘＭＡＰ微粒子を用いた。ｘＭＡＰ微粒子にはカルボキシル基が修飾されており、アミノ化されたオリゴヌクレオチドとのカップリング反応によりこれを固相化することができる。１２５０万個／ｍＬのｘＭＡＰ微粒子２００μＬ（２５０万個相当）を１．５ｍＬ微量遠心管にいれ、遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分）を行い、上精の液を除去した。次に、微粒子に２５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ４．５のＭＥＳバッファを添加した。これに１００ｐｍｏｌの捕捉プローブと、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）溶液で１０ｍｇ／ｍＬに溶解したＥＤＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボイミドハイドロクロライド）（Theromo Scientific社）１０μＬを添加し、アズワン社の超音波洗浄装置ＵＳ−１００ＩＩＩを用いて４５ｋＨｚで数秒間ソニケーションを行って微粒子を完全に分散させた。室温（２５℃）にて暗所に３０分置いた後、１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣを添加し、数秒間ソニケーションを行った。さらに室温にて暗所に３０分置いた後０．５ｍＬの０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、数秒間ボルテックスした後、遠心（１０，０００ｒｐｍ、３分）を行い、上精の液を除去した。次いで０．５ｍＬの０．１％  ＳＤＳを添加し、数秒間ボルテックスした後、遠心（１０，０００ｒｐｍ、３分）を行い、上精の液を除去した。これに適量のＴＥバッファを添加し、数秒間ソニケーションを行って分散させた。ビルケルチュルク血球計算盤にて微粒子濃度を計測し、ＴＥバッファにて１０，０００個／ｍＬの濃度に調製した。
なお、アレルＧ検出用の捕捉プローブとアレルＡ検出用の捕捉プローブは、それぞれ異なるＩＤ番号のｘＭＡＰ微粒子に固定した。この互いに異なるＩＤ番号の微粒子に塗布された蛍光色素の色調の違いをLuminex社のサイトフローメーターが区別し、標的物質特異的なシグナルを区別して測定することが可能である。【００９８】
複数種のシグナル増幅用プローブとして、５’末端をＣｙ３で標識した第１のシグナル増幅用プローブ［ＨＣＰ−１］及び５’末端をＣｙ３で標識した第２のシグナル増幅用プローブ［ＨＣＰ−２］を用いた。
ＨＣＰ−１の塩基配列（5'-X-Y-Z-3'）
5’-CATCTCTGCTGGTC-CCACATTCAGACCC-GTTCGCCATAGACG-3’（配列番号５）
ＨＣＰ−２の塩基配列（5'-X'-Y'-Z'-3'）
5’-GACCAGCAGAGATG-GGGTCTGAATGTGG-CGTCTATGGCGAAC-3’（配列番号６）【００９９】
第２の核酸プローブとして、下記塩基配列を有するアシストプローブ−１を用いた。アシストプローブ−１は、ＰＣＲ増幅産物に相補的な領域とＨＣＰ−１の一部と同じ塩基配列（配列ＺＹＺ）を有する核酸プローブであり、且つ捕捉プローブとアシストプローブ−１が隣接した状態でＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズように構成されている。
アシストプローブ−１の塩基配列(5’-T2(0)’-Z-Y-Z-3’)
5’-TATTTAGAATAAGGAA-GTTCGCCATAGACG CCACATTCAGACCC GTTCGCCATAGACG-3’（配列番号７）【０１００】
１００００個／μＬのアレルＧ検出用捕捉プローブ固相済みｘＭＡＰ微粒子：０．２μＬ、１００００個／μＬのアレルＡ検出用捕捉プローブ固相済みｘＭＡＰ微粒子：０．２μＬ、１μＭアシストプローブ−１：０．２５μＬ、２０μＭ  ＨＣＰ−１：０．６２５μＬ、２０μＭ  ＨＣＰ−１：０．７５μＬ、ＰＣＲ増幅産物：１μＬ、５Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）バッファ：７．５μＬ、10×Supplement[1M N-lauroylsarcosine, 500mM Tris-HCl(pH8.0), 40mM EDTA]：２．５μＬ、及び滅菌蒸留水：１１．９７５μＬを含む容量２５μＬの反応溶液をＰＣＲ反応用チューブ（０．２ｍＬ容量）に調製した。【０１０１】
該ＰＣＲ反応用チューブをサーマルサイクラー（Eppendorf社製epGradient S）に載せ、９５℃／５分（ＰＣＲ産物の変性反応）、５８℃／６０分［工程（ｂ）］のプログラムを実行した。反応終了後、各反応液をMultiScreen HTSプレート（Millipore社）のウェルに移し、吸引濾過によって液を除いた。各ウェルに２００μＬのＴＰ／ＰＢＳを加えて、再度、液を吸引除去して固相を洗浄した。さらに１００μＬのＴＰ／ＰＢＳを加え、約３０秒間プレートミキサーで振とうし、固相を十分に分散させた後、MultiScreen HTSプレートをＬｕｍｉｎｅｘ  １００に載せ、各ウェル中の固相の蛍光強度を測定した。結果を図１９に示した。【０１０２】
（実施例２）
第２の核酸プローブとして、アシストプローブ−１の代わりに下記塩基配列を有するアシストプローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。アシストプローブ−２は、ＰＣＲ増幅産物に相補的な領域とＨＣＰ−１の一部と同じ塩基配列（配列ＺＹＺ）を有する核酸プローブであり、且つ捕捉プローブとアシストプローブ−２が１塩基離れた状態でＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズように構成されている。結果を図１９に示した。
アシストプローブ−２の塩基配列(5’-T2(1)’-Z-Y-Z-3’)
5’-ATTTAGAATAAGGAAC-GTTCGCCATAGACG CCACATTCAGACCC GTTCGCCATAGACG-3’（配列番号８）【０１０３】
（実施例３）
第２の核酸プローブとして、アシストプローブ−１の代わりに下記塩基配列を有するアシストプローブ−３を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。アシストプローブ−３は、ＰＣＲ増幅産物に相補的な領域とＨＣＰ−１の一部と同じ塩基配列（配列ＺＹＺ）を有する核酸プローブであり、且つ捕捉プローブとアシストプローブ−３が２塩基離れた状態でＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズように構成されている。結果を図１９に示した。
アシストプローブ−３の塩基配列(5’-T2(2)’-Z-Y-Z-3’)
5’-TTTAGAATAAGGAACA-GTTCGCCATAGACG CCACATTCAGACCC GTTCGCCATAGACG-3’（配列番号９）【０１０４】
図１９に示した如く、本発明方法によりＳＮＰを高感度に検出できた。また、第１の核酸プローブと第２の核酸プローブが隣接した状態で増幅ＤＮＡ産物とハイブリダイズする実施例１、及び第１の核酸プローブと第２の核酸プローブが隣接していない状態で増幅ＤＮＡ産物とハイブリダイズする実施例２，３のいずれにおいても高いアレル特異的シグナルが得られた。【０１０５】
（実施例４）
５種類の市販のヒト組織由来ゲノムＤＮＡ検体を用いて実施例１と同様に実験を行った。結果を図２０に示した。図２０は、横軸がＧアレル検出用固相の蛍光強度、縦軸がＡアレル検出用の固相の蛍光強度を示したスキャッタープロットデータである。この結果より、これら５種類の検体が３つのクラスターに分類された。まず、Ｇアレル検出用固相の蛍光強度のみ高いクラスター（クラスター１）、次いで、ＧアレルおよびＡアレル検出用固相のいずれもがともに高いクラスター（クラスター２）、最後に、アレル検出用固相の蛍光強度のみ高いクラスター（クラスター３）である。これら５つの検体のＮＡＴ２遺伝子８５７位の塩基をダイレクトシークエンス法で決定したところ、クラスター１の検体がＧホモ、クラスター２の検体がＧ／Ａヘテロ、そして、クラスター３の検体がＡホモであり、塩基配列決定法と本発明方法によるＳＮＰタイピングの結果とが完全に一致した。このことより、本発明によりＳＮＰの判定が適正に行われることが示された。
【符号の説明】
【０１０６】
１０：ＤＮＡ増幅産物、１２：第１の核酸プローブ、捕捉プローブ、１３：担体、１４：第２の核酸プローブ、アシストプローブ、１６：シグナル増幅用プローブ、１６ａ：第１のシグナル増幅用プローブ、１６ｂ：第２のシグナル増幅用プローブ、１８、２２、３４：プローブポリマー、２０ａ：第１ダイマープローブ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ：第２ダイマープローブ、２０ｅ：第３ダイマープローブ、２１ａ〜２１ｈ、２１ｊ、２１ｋ：ダイマー形成用プローブ、３０ａ，３０ｂ：ダイマープローブ、３１ａ〜３１ｄ：ダイマー形成用プローブ、３２ａ〜３２ｄ：架橋プローブ、４０ａ，４０ｂ：ダイマープローブ、４１ａ〜４１ｄ：ダイマー形成用プローブ、４２ａ〜４２ｄ：架橋プローブ、Ｔｘ：塩基変異部位。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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