(57)【要約】  成長ホルモン阻害剤を含む医薬組成物、および脳内成長ホルモンを検出する診断用医薬組成物を提供する。本発明により提供される医薬組成物は、難治てんかんにおいても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内の成長ホルモン量を定量するための試薬を含むてんかん診断用組成物。
【請求項２】
脳内の成長ホルモン量をウェスタンブロッティングまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
成長ホルモンが、成長ホルモン前駆体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質を定量するための試薬を含むてんかん診断用組成物。
【請求項５】
脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質が、リン酸化Stat5またはEgr1から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
脳内の成長ホルモンのイメージングのための試薬を含むてんかん診断用組成物。
【請求項７】
脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質をイメージングするための試薬を含むてんかん診断用組成物。
【請求項８】
脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質が、リン酸化Stat5またはEgr1から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
脳内の成長ホルモンのイメージングのための試薬または脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質をイメージングするための試薬が、抗体である、請求項６−８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
成長ホルモン阻害剤を含む、てんかんの処置または予防用組成物。
【請求項１１】
成長ホルモン阻害剤が、ソマトスタチンまたはソマトスタチン誘導体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ソマトスタチン誘導体が、オクトレオチド、SOM-230、RC-160、BIM23014からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
成長ホルモン阻害剤が、成長ホルモン受容体拮抗薬である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
成長ホルモン受容体拮抗薬が、ペグビソマントである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
てんかんが、難治てんかんである、請求項１０−１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１０−１５のいずれかに記載の組成物および請求項１−９のいずれかに記載の組成物を含む、てんかんの診断および予防または処置用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、てんかんの処置用または予防用組成物に関する。また、本発明は、てんかんの診断用組成物に関する。さらには、本発明は、てんかんの診断および処置または予防用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、種々の成因によって起こる慢性の脳障害で、大脳ニューロンの過剰発射の結果起こる反復性発作（てんかん発作）を主な特徴とし、これに種々の臨床症状および検査所見を伴うものと定義され（非特許文献１参照）、有病率０．５〜１％の頻度の高い神経疾患である（非特許文献２参照）。
てんかん治療の目的は、てんかん発作を抑制することであり、発作を繰り返すことによる二次的な脳損傷あるいは発作の難治化を防いで、てんかんの自然経過をよい方向に導くことである。てんかん治療では、抗てんかん薬の薬物療法が主体であり、発作型に適した抗てんかん薬の単独療法がまず推奨されるが、単剤療法を数剤で試みても発作を十分に抑制できない場合は多剤併用療法が行われ、異なる作用機序を有する薬剤の組み合わせが合理的とされている（非特許文献２参照）。【０００３】
しかし、２０〜３０％のてんかん患者では多剤併用療法を行っても発作を十分に抑制できないといわれ、いわゆる難治てんかんとされる（非特許文献３参照）。また、既存の抗てんかん薬には個体特異的（idiosyncratic）な副作用を含め重大な副作用が認められること、薬物代謝酵素を解する薬物相互作用等の問題が認められることから、抗てんかん薬の多剤併用療法では、安全性の面からも注意を要する。このような状況から、難治てんかんに対して有効かつ安全性の高い薬剤の必要性は特に高い。とりわけ、新規な作用機序を有する抗てんかん薬の創出が課題となっている。【０００４】
成長ホルモン（以下Ｇｈとも記載する）は、神経の発達を含む成長を制御する重要な役割を果たしており、脳神経系に関しては、認知機能改善作用が報告されている（非特許文献４参照）。しかしながら、てんかん発生とＧｈ発現の関連性についての報告はこれまでにされていない。また、てんかん発生の間、またはてんかん発生の後の遺伝子発現については報告があり、抗てんかん薬のターゲットとして有望な候補が見出されている（非特許文献５参照）が、従来の報告は、海馬を含む後部皮質を主に検討しており、てんかん発作の獲得に関連する神経回路網の遺伝子発現変動については、未だ十分に検討されていない。
【非特許文献１】Gastaut H. World Health Organization, Geneva. 1973:22.
【非特許文献２】井上有史  てんかん研究  2005;23:249-253
【非特許文献３】岩佐博人、他  脳の科学  2001;23:951-959
【非特許文献４】van Dam PS, et al., (2000) Growth Horm IGF Res Suppl B: S69-73
【非特許文献５】Nedivi E, et al., (1993) Nature 363:718-722
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、てんかん、とりわけ難治てんかんにつき、新規創薬ターゲットの創出が待望されている。本発明は、このような高い医療ニーズに鑑み、新規抗てんかん薬の創薬ターゲット、さらには、てんかんの診断に有用な因子を見出し、新たなてんかんの治療方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、従来の抗てんかん薬の創薬ターゲットの探索が海馬を含む後部皮質を中心になされており、てんかん発作の獲得に関連する神経回路網の遺伝子発現変動については未だ十分に検討されていないことを鑑み、この神経回路網を構成する前頭葉を含む大脳皮質、視床および海馬を含む後部皮質について、てんかん形成過程で変動する遺伝子を検討した結果、Ｇｈの転写がてんかん形成過程において増大することを見出した。また、Ｇｈの分泌を抑制するソマトスタチンの誘導体であるオクトレオチドを投与するとてんかんの発生が抑制され、Ｇｈを投与するとてんかんの発生が促進されることを見出した。これらの新規な知見に基づき、本発明者は、Ｇｈ阻害剤（ソマトスタチンまたはソマトスタチン誘導体を含む）を含む、てんかんの処置または予防用組成物に係る発明を完成させた。また、さらに、成長ホルモンを定量する、またはイメージングすることを利用する、てんかんの診断用組成物に係る発明も完成させた。【０００７】
本発明は、新規な作用機序を有する抗てんかん薬またはてんかん用診断薬を提供するものであり、てんかん患者、特に、多剤併用療法を行っても発作を十分に抑制できない難治てんかんに罹患している患者に対し、有用な治療手段を提供する。したがって、てんかん、とりわけ難治てんかんに対する、安全で、有効な薬剤の創出という従来の課題が解決される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るてんかんの処置または予防用組成物、および／またはてんかんの診断用組成物を用いることにより、てんかん、好ましくは難治てんかんが処置または予防、および／または診断される。また、本発明により、てんかん発生の新規メカニズムが解明されたので、新たな創薬ターゲットも提供される。よって、本願発明は、てんかんの臨床、医学に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ジーンチップアレイ（Ａ）およびリアルタイムＰＣＲ（Ｂ）を用いた、完全キンドリング、中間ステージ３および偽手術マウス間のＧｈ発現レベルの比較を示す。ｍＲＮＡレベルを比較する為に、全ＲＮＡを、キンドリングの、中間ステージ３の、そして偽手術のマウスの大脳皮質の前部（api、白丸）、視床（tha、褐色丸）および大脳皮質の後部（後部海馬、扁桃体、および側頭葉を含む）（cau、黒丸）から調製した。ジーンチップアレイは、てんかん発生の間、Ｇｈ転写の増加を示す（Ａ）。平均値およびS.E.M.は、生シグナル強度（MG430_Scal_Signal）に基づいて算出され、アフィメトリクスジーンチップのマウスゲノム430 2.0アレイで、Gapdhコントロールプローブセットを用いて決定されるシグナル強度で補正した。「存在または非存在」は、ウイルコクソンの符号付き検定を用いて決定した。Kyplot 4.0のKruskal-Wallis testを用いて、偽手術および完全キンドリングマウスの間の、前部皮質（X70.6、**p<0.01）、視床（X54.4、**p<0.01）および後部皮質（X23.2、**p<0.05）において、Ｇｈ発現の有意な差が存在した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、てんかん発生の間に、Ｇｈ転写の増加を確かにした（Ｂ）。ＰＣＲに用いたプライマーペアは、5'-GAC ATG GAA TTG CTT CGC TTC TC-3'（配列番号１）/5'-CGC TTT GTG CAG GTC CTT CTT GA-3'（配列番号２）(Gh中のGh1F1/Gh1R2、303bp、NM008117中の350-652bp)および5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'（配列番号３）/5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'（配列番号４）(Gapdh、NM008084中の452bp、Toyobo RT-PCR プライマーセット、大阪、日本）であった。分散図は、偽手術マウスの前部皮質より調製された全ＲＮＡの特定の一部Gapdh ｍＲＮＡに対する％として算出された、Ｇｈ転写レベルを示す。それぞれのステージの平均値をエラーバーと共に中抜き丸として示す（それぞれの領域でn=4）。KyPlot4.0のKruskal-Wallis test：*p<0.05。
【００１０】
【図２】ウエスタンブロッティング（ＣおよびＤ）を用いた、完全キンドリングおよび偽手術マウス間のＧｈ発現レベルの比較を示す。ウェスタンブロットは、てんかん発生の間のＧｈタンパク質の増加を示す（ＣおよびＤ）。１％ Triton X-100で可溶化した海馬および皮質タンパク質（20μｇ）を10％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜（アマシャム、東京、日本）を用いてウェスタンブロッティングし、膜を抗マウス成長ホルモン（Acris、BP526、Hiddenhausen、ドイツ）、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧと、そして、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム、東京、日本）と反応させた：完全キンドリング（Ｋ、レーン１−２）および偽手術（Ｓ、レーン３−４）（Ｃ）。下垂体タンパク質（20μｇ）を１％ Triton X-100で可溶化し、10％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティングした（Ｐ、レーン５）。Multi Gauge ver 3.0（富士フイルム）を用い、バンドの濃さの平均値およびS.E.M.を測定した（Ｄ）。差異の統計学的有意性は、p値（Mann-Whitney U-test）として示す。
【００１１】
【図３】冠状断面（14μm）におけるＧｈ ｃＲＮＡ標識パターンを表す、in situハイブリダイゼーションを示す。アルカリホスファターゼの基質を、ジゴキシゲニンで標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションの後、３０分（ＡおよびＤ）および７２時間（Ｂ）露出させ、そして、センスプローブ（Ｃ）でハイブリダイゼーションの後、７２時間露出させた。下垂体（Ａ−Ｃ、バー＝1mm）；海馬の前部および視床前核のレベルでの前頭面（Ｄ、バー＝1mm）。
【００１２】
【図４】冠状断面（14μm）におけるＧｈ ｃＲＮＡ標識パターンを表す、in situハイブリダイゼーションを示す。アルカリホスファターゼの基質を、ジゴキシゲニンで標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションの後、７２時間（Ｅ）露出させ、そして、センスプローブ（Ｆ）でハイブリダイゼーションの後、７２時間露出させた。海馬の前部および視床前核のレベルでの前頭面（Ｅ−Ｆ、バー＝1mm）；視床前背側核（Ｇ、バー＝1mm）。Ｇ中の矢印は、脈絡叢（ｃｐ）（Ｈ、バー＝100μm）および視床前背側核（ＡＤ）（Ｉ、バー＝50μm）を示す；Ｅ中の矢印は、梨状皮質の神経細胞（Ｍ、バー＝20μm）を示す。略語：ＡＤ、視床前背側核の前部；Ａｍｙ、扁桃体；ＡＲＨ、視床下部の弓状核；ｃｐ、脈絡叢；ｈｉｐ、海馬；ＰａＨ、視床下部の傍室核；Ｐｉｒ、梨状皮質；ＳＴｈ、視床下核；Ｔｕ、嗅結節。
【００１３】
【図５】冠状断面（14μm）におけるＧｈ ｃＲＮＡ標識パターンを表す、in situハイブリダイゼーションを示す。海馬（Ｊ、バー＝500μm）；Ｊ中の矢印は、海馬のＣＡ３領域の錐体細胞を示す（Ｋ、バー＝20μm）；視床下部および扁桃体（Ｌ、バー＝500μm）。略語：視床前背側核の前部；Ａｍｙ、扁桃体；ＡＲＨ、梨状皮質；ＳＴｈ。
【００１４】
【図６】冠状断面（14μm）におけるＧｈ ｃＲＮＡ標識パターンを表す、in situハイブリダイゼーションを示す。梨状皮質の神経細胞（Ｍ、バー＝20μm）を示す。
【００１５】
【図７】てんかん発生におけるジェノトロピンの効果を示す。ジェノトロピンの注入およびキンドリング刺激のスケジュールを示す（Ａ（図７））。矢印はジェノトロピンの注入を示す（542nmol/μlの１μl）。数字は注入およびキンドリング刺激の日数を示し；刺激は第１日より始め、第１６日まで継続した。脳波（EEG）における後発射の数（Ｂ（図７））。後発射の持続時間（秒）（Ｃ（図８））。刺激後のフリージング時間（秒）（Ｄ（図８））。ステージの変遷（Ｅ（図９））。左図は、刺激後の各日におけるマウスの４つのカテゴリーに関する平均値およびS.E.M.を示す。左図において、ジェノトロピンのプロット（n=9）をＧで、ジェノトロピンなしの緩衝液のプロット（n=11）をＢで示す。ジェノトロピンの注入は、Ｂ〜Ｅで示されるクライテリアにおいて、緩衝液に対し、統計的な差異を示す（２要因の分散分析：Ｂにおいて、F(1,276)=21.885, p<0.0001；Ｃにおいて、F(1,278)=19.230, p<0.0001；Ｄにおいて、F(1,306)=20.742, p<0.0001；Ｅにおいて、F(1,306)=16.873, p<0.0001）。星印は各日における注入間の有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.05および**p<0.01。真ん中のグラフは、第１から第１６の刺激後の生データより算出された平均値およびS.E.M.の比較を示す。星印は有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.001。右図は回帰曲線を示す：Y=0+5.011*X+0.122*X^2-0.005*X^3, R^2=0.673 （Ｂ（図７）中のジェノトロピン）Y=0+2.936*X+0.187*X^2-0.012*X^3, R^2=0.487 （Ｂ（図７）中の緩衝液）Y=0+3.088*X-0.22*X^2+0.007*X^3, R^2=0.666 （Ｃ（図８）中のジェノトロピン）Y=0+1.672*X-0.069*X^2+0.001*X^3, R^2=0.513 （Ｃ（図８）中の緩衝液）Y=0+13.727*X-0.873*X^2+0.03*X^3, R^2=0.581 （Ｄ（図８）中のジェノトロピン）Y=0+5.366*X-0.202*X^2+0.013*X^3, R^2=0.531 （Ｄ（図８）中の緩衝液）Y=0+1.066*X-0.101*X^2+0.003*X^3, R^2=0.939 （Ｅ（図９）中のジェノトロピン）Y=0+0.866*X-0.81*X^2+0.003*X^3, R^2=0.898 （Ｅ（図９）中の緩衝液）
【００１６】
【図８】てんかん発生におけるジェノトロピンの効果を示す。ジェノトロピンの注入およびキンドリング刺激のスケジュールを示す（Ａ（図７））。矢印はジェノトロピンの注入を示す（542nmol/μlの１μl）。数字は注入およびキンドリング刺激の日数を示し；刺激は第１日より始め、第１６日まで継続した。脳波（EEG）における後発射の数（Ｂ（図７））。後発射の持続時間（秒）（Ｃ（図８））。刺激後のフリージング時間（秒）（Ｄ（図８））。ステージの変遷（Ｅ（図９））。左図は、刺激後の各日におけるマウスの４つのカテゴリーに関する平均値およびS.E.M.を示す。左図において、ジェノトロピンのプロット（n=9）をＧで、ジェノトロピンなしの緩衝液のプロット（n=11）をＢで示す。ジェノトロピンの注入は、Ｂ〜Ｅで示されるクライテリアにおいて、緩衝液に対し、統計的な差異を示す（２要因の分散分析：Ｂにおいて、F(1,276)=21.885, p<0.0001；Ｃにおいて、F(1,278)=19.230, p<0.0001；Ｄにおいて、F(1,306)=20.742, p<0.0001；Ｅにおいて、F(1,306)=16.873, p<0.0001）。星印は各日における注入間の有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.05および**p<0.01。真ん中のグラフは、第１から第１６の刺激後の生データより算出された平均値およびS.E.M.の比較を示す。星印は有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.001。右図は回帰曲線を示す：Y=0+5.011*X+0.122*X^2-0.005*X^3, R^2=0.673 （Ｂ（図７）中のジェノトロピン）Y=0+2.936*X+0.187*X^2-0.012*X^3, R^2=0.487 （Ｂ（図７）中の緩衝液）Y=0+3.088*X-0.22*X^2+0.007*X^3, R^2=0.666 （Ｃ（図８）中のジェノトロピン）Y=0+1.672*X-0.069*X^2+0.001*X^3, R^2=0.513 （Ｃ（図８）中の緩衝液）Y=0+13.727*X-0.873*X^2+0.03*X^3, R^2=0.581 （Ｄ（図８）中のジェノトロピン）Y=0+5.366*X-0.202*X^2+0.013*X^3, R^2=0.531 （Ｄ（図８）中の緩衝液）Y=0+1.066*X-0.101*X^2+0.003*X^3, R^2=0.939 （Ｅ（図９）中のジェノトロピン）Y=0+0.866*X-0.81*X^2+0.003*X^3, R^2=0.898 （Ｅ（図９）中の緩衝液）
【００１７】
【図９】てんかん発生におけるジェノトロピンの効果を示す。ジェノトロピンの注入およびキンドリング刺激のスケジュールを示す（Ａ（図７））。矢印はジェノトロピンの注入を示す（542nmol/μlの１μl）。数字は注入およびキンドリング刺激の日数を示し；刺激は第１日より始め、第１６日まで継続した。脳波（EEG）における後発射の数（Ｂ（図７））。後発射の持続時間（秒）（Ｃ（図８））。刺激後のフリージング時間（秒）（Ｄ（図８））。ステージの変遷（Ｅ（図９））。左図は、刺激後の各日におけるマウスの４つのカテゴリーに関する平均値およびS.E.M.を示す。左図において、ジェノトロピンのプロット（n=9）をＧで、ジェノトロピンなしの緩衝液のプロット（n=11）をＢで示す。ジェノトロピンの注入は、Ｂ〜Ｅで示されるクライテリアにおいて、緩衝液に対し、統計的な差異を示す（２要因の分散分析：Ｂにおいて、F(1,276)=21.885, p<0.0001；Ｃにおいて、F(1,278)=19.230, p<0.0001；Ｄにおいて、F(1,306)=20.742, p<0.0001；Ｅにおいて、F(1,306)=16.873, p<0.0001）。星印は各日における注入間の有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.05および**p<0.01。真ん中のグラフは、第１から第１６の刺激後の生データより算出された平均値およびS.E.M.の比較を示す。星印は有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.001。右図は回帰曲線を示す：Y=0+5.011*X+0.122*X^2-0.005*X^3, R^2=0.673 （Ｂ（図７）中のジェノトロピン）Y=0+2.936*X+0.187*X^2-0.012*X^3, R^2=0.487 （Ｂ（図７）中の緩衝液）Y=0+3.088*X-0.22*X^2+0.007*X^3, R^2=0.666 （Ｃ（図８）中のジェノトロピン）Y=0+1.672*X-0.069*X^2+0.001*X^3, R^2=0.513 （Ｃ（図８）中の緩衝液）Y=0+13.727*X-0.873*X^2+0.03*X^3, R^2=0.581 （Ｄ（図８）中のジェノトロピン）Y=0+5.366*X-0.202*X^2+0.013*X^3, R^2=0.531 （Ｄ（図８）中の緩衝液）Y=0+1.066*X-0.101*X^2+0.003*X^3, R^2=0.939 （Ｅ（図９）中のジェノトロピン）Y=0+0.866*X-0.81*X^2+0.003*X^3, R^2=0.898 （Ｅ（図９）中の緩衝液）
【００１８】
【図１０】てんかん発生におけるオクトレオチドの効果を示す。酢酸オクトレオチドを1μl（87.8nmol/μl）注入した。  左図において、オクトレオチドのプロット（n=12）をＯで、オクトレオチドなしの緩衝液のプロット（n=13）をＢで示す。ＡおよびＢにおいて、オクトレオチド有り無しで、後発射の数および時間に有意な差は認められなかった２要因の分散分析：Ａ（図１０）において、F(1,380)=0.907, p<0.342；Ｂ（図１０）において、F(1,380)=0.635, p<0.426）。統計学的な有意差は、フリージングの時間およびステージの移行で見出された；Ｃ（図１１）において、F(1,380)=24.121, p<0.0001；Ｄ（図１１）において、F(1,380)=21.551, p<0.0001。星印は、注入間の有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.05および**p<0.01。真ん中のグラフは、第１から第１７の刺激後の生データより算出された平均値およびS.E.M.の比較を示す。星印は有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.001。右図は回帰曲線を示す：Y=0+2.341*X+0.192*X^2-0.008*X^3, R^2=0.395 （Ａ（図１０）中のオクトレオチド）Y=0+4.575*X-0.178*X^2+0.009*X^3, R^2=0.392 （Ａ（図１０）中の緩衝液）Y=0+1.546*X-0.002*X^2-0.003*X^3, R^2=0.501 （Ｂ（図１０）中のオクトレオチド）Y=0+3.181*X-0.335*X^2+0.013*X^3, R^2=0.486 （Ｂ（図１０）中の緩衝液）Y=0+2.914*X+0.035*X^2+0.004*X^3, R^2=0.556 （Ｃ（図１１）中のオクトレオチド）Y=0+13.276*X-0.946*X^2+0.026*X^3, R^2=0.617 （Ｃ（図１１）中の緩衝液）Y=0+0.634*X-0.052*X^2+0.002*X^3, R^2=0.910 （Ｄ（図１１）中のオクトレオチド）Y=0+1.008*X-0.108*X^2+0.004*X^3, R^2=0.907 （Ｄ（図１１）中の緩衝液）
【００１９】
【図１１】てんかん発生におけるオクトレオチドの効果を示す。酢酸オクトレオチドを1μl（87.8nmol/μl）注入した。  左図において、オクトレオチドのプロット（n=12）をＯで、オクトレオチドなしの緩衝液のプロット（n=13）をＢで示す。ＡおよびＢにおいて、オクトレオチド有り無しで、後発射の数および時間に有意な差は認められなかった２要因の分散分析：Ａ（図１０）において、F(1,380)=0.907, p<0.342；Ｂ（図１０）において、F(1,380)=0.635, p<0.426）。統計学的な有意差は、フリージングの時間およびステージの移行で見出された；Ｃ（図１１）において、F(1,380)=24.121, p<0.0001；Ｄ（図１１）において、F(1,380)=21.551, p<0.0001。星印は、注入間の有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.05および**p<0.01。真ん中のグラフは、第１から第１７の刺激後の生データより算出された平均値およびS.E.M.の比較を示す。星印は有意差を示す：Mann-Whitney U-testで*p<0.001。右図は回帰曲線を示す：Y=0+2.341*X+0.192*X^2-0.008*X^3, R^2=0.395 （Ａ（図１０）中のオクトレオチド）Y=0+4.575*X-0.178*X^2+0.009*X^3, R^2=0.392 （Ａ（図１０）中の緩衝液）Y=0+1.546*X-0.002*X^2-0.003*X^3, R^2=0.501 （Ｂ（図１０）中のオクトレオチド）Y=0+3.181*X-0.335*X^2+0.013*X^3, R^2=0.486 （Ｂ（図１０）中の緩衝液）Y=0+2.914*X+0.035*X^2+0.004*X^3, R^2=0.556 （Ｃ（図１１）中のオクトレオチド）Y=0+13.276*X-0.946*X^2+0.026*X^3, R^2=0.617 （Ｃ（図１１）中の緩衝液）Y=0+0.634*X-0.052*X^2+0.002*X^3, R^2=0.910 （Ｄ（図１１）中のオクトレオチド）Y=0+1.008*X-0.108*X^2+0.004*X^3, R^2=0.907 （Ｄ（図１１）中の緩衝液）
【００２０】
【図１２】ジーンチップアレイ（ＡおよびＢ）を用いた、完全キンドリング、中間ステージ３、そして偽手術のマウスの間の、FosおよびIgf1のＲＮＡレベルの比較を示す。てんかん発生の間のFos転写の増加をジーンチップアレイで試験した（Ａ）：Fosにおいて、X8.8 (api)、X5.3(tha)、X12.8(cau)、てんかん発生の間、Igf1の転写に相違はなかった。
【００２１】
【図１３】リアルタイムＰＣＲ（ＣおよびＤ）を用いた、完全キンドリング、中間ステージ３、そして偽手術のマウスの間の、FosおよびIgf1のＲＮＡレベルの比較を示す。ＰＣＲに用いたプライマーペアは、5'-TTC CTA GTG ACA CCT GAG AGC TG-3'（配列番号５）/5'-GAA CAT TGA CGC TGA AGG ACT AC-3'（配列番号６）（Fos、NM010234中の1536-1844bpにおける309bp）および5'-TAT ATC TCC TAG TCC CTG CCT CT-3'（配列番号７）/5'-CAC AGA TGG AGT CAG GTA CGT TA-3'（配列番号８）（Igf-1、326bp、NM01052中の750-1075bp）であった。  リアルタイムRT-PCR（Ｃ）：KyPlot 4.0.を用いたKruskal-Wallis testで、***p<0.005。てんかん発生の間、Igf1の転写に相違はなかった。
【００２２】
【図１４】FosおよびIgf1のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、1.4%アガロース−TAE中、CYBR greenフィルターで単一バンドを増幅した（Ｅ）。
【００２３】
【図１５】代表的なマウスにおけるキンドリングてんかん発生の間の脳波（ＥＥＧ）を示す。ジェノトロピン（Ａ）および緩衝液（Ｂ）の注入を受けたマウスにおける、第４回刺激（4th Stim）、第７回刺激（7th Stim）、第１２回刺激（12th Stim）、および第１５回刺激（15th Stim）後のＥＥＧを示す。矢印は、図７−１１で測定された代表的なスパイクを示す。
【００２４】
【図１６】冠状断面（ブレグマ4.2〜-4.8mmにおける厚さ14-μｍ）を、クライオスタットおよびスライド上でthaw mountすることにより切り出した。スライド上の切片を４％ホルムアミドで固定し、抗Ki67抗体および抗ウサギIgG蛍光抗体（赤色、矢印）で反応させた。核をHoechst33258（５μｇ／ｍｌ）でカウンター染色した（緑色）（スケールバー、100μｍ）。キンドリング（Kindling）および偽手術（Sham）のマウスの歯状回（Dentate Gyrus）および梨状皮質(priform cortex）について示す。挿入図は、共焦点顕微鏡により得られた、発火−発作後の梨状皮質のイメージである（矢じり）（抗ＧＦＡＰ抗体は緑色；抗Ki67抗体は赤色；Hoechst33258は青色）（スケールバー、20μｍ）。抗Ki67抗体で反応した赤色シグナルは、発火−発作後、歯状回顆粒細胞下層および梨状皮質で増加した。
【００２５】
【図１７】完全キンドリング（full-kindled）マウス（独立５個体）、中間ステージ３のマウス（独立４個体）および偽手術マウス（独立４個体）における、Ｇｈ発現レベルの比較。  成長ホルモン（Ｇｈ）のｍＲＮＡの定量的ＰＣＲを、TaqMan プローブ（アプライドバイオシステムズ、東京、日本）及びPremix Ex Taq（タカラバイオ、滋賀、日本）、7300リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）を用い、１サイクル及び５０サイクルの２段階増幅：９５℃、１０秒（１サイクル）、９５℃、５秒及び６０℃、３１秒（５０サイクル）で行った。ＰＣＲに用いたプラマーペアとＴａｑｍａｎプローブはPrimer Express Software Version 3.0（アプライドバイオシステムズ）を用いて以下のように設計した：５’−ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ−３’（配列番号１３）／５’−ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  Ｔ−３’（配列番号１４）／５’−ＦＡＭ−ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＣＧ−３’（配列番号１５）（Ｇｈ，  ８６bp，  ＮＭ００８１１７中の２０８−２９３ｂｐ）および５’−ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＡ−３’（配列番号１６）／５’−ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＴ−３’（配列番号１７）／５’−ＶＩＣ−ＣＣＡ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＣ−３’（配列番号１８）（Gapdh，１３６bp，  ＮＭ００８０８４中の２７８−４１３ｂｐ）。定量的ＲＴ−ＰＣＴの分散図（Ａ）は、偽手術マウス（Sham）、ステージ３（Stage 3）および完全キンドリングマウス（Kindling）における、大脳皮質前部（白丸）、視床（褐色丸）および大脳皮質の後部（caudal part of the cerebral cortex）（黒丸）での、Gapdh mRNAに比較したGh mRNAの比（Arbitrary unit: Gh mRNA/Gapdh mRNA）を示す。統計解析は、Kyplot 4.0のKruskal-Wallis試験を行った（*p<0.005）［各マウスにおける平均値を、エラーバー付の黒丸で示し、エラーバーはS.E.Mを示す。］Ｇｈの平均値は、偽手術マウスに比較し、発火−発作後では、前部皮質（apical cortex）、後部皮質（caudal cortex）および視床において、それぞれ、１２０、１１０および４０倍に増加した。
【００２６】
【図１８】完全キンドリング（full-kindled）マウス（独立５個体）、中間ステージ３のマウス（独立４個体）および偽手術マウス（独立４個体）における、Ｇｈ発現レベルの比較。  偽手術マウス（Sham）（黒塗り四角、独立４個体）および完全キンドリングマウス（Kindling）（白塗り四角、独立５個体）における、海馬および皮質（Hippocampus & Cortex）タンパク質（４０μｇ）より調製されたTriton可溶フラクションのウェスタンブロットの図、検出したバンドの強度を数値化した図を示す。同様に、下垂体（Pituitary）（２０μｇ）をウェスタンブロットした図、検出したバンドの強度を数値化した図を示す（独立３個体）。ウェスタンブロットは、抗マウス成長ホルモン（Acris、BP526）および抗マウス アクチン（pan、AB-5）を用いた。Ｇｈ蛋白質量は、発火−発作後の海馬および皮質タンパク質で増加した（Mann-Whitney U-test（23kDaにつき*p<0.03、19.5kDaにつき**p<0.02）。下垂体においては、偽手術マウスと完全キンドリングマウスでＧｈタンパク質量に差はなかった。ウェスタンブロットで検出したバンドの強度は偽手術マウス（Sham）を１とした相対値（Fold Change (Sham=1)）で示した。
【００２７】
【図１９】発火−発作のStat5およびJak2のチロシンリン酸化に対する影響を示す。偽手術マウス（Sham）（黒塗り四角、独立４個体）および完全キンドリングマウス（Kindling）（白塗り四角、独立４個体）の海馬および皮質タンパク質から調製したTriton可溶画分４０μｇを用い、Jak2、リン酸化Jak2（Tyr1007/1008; pJak2）、Stat5、リン酸化Stat5（Tyr694; pStat5）に対する抗体でプロービングすることにより、ウェスタンブロット解析を実施した。（Ａ）は、Jak2とリン酸化JaK2(120kDa）、（Ｂ）は、Stat5およびリン酸化Stat5（90kDa）についてのウェスタンブロットを示す。データを平均値±S.E.M（*Mann-Whitney U-test）で表す。シグナル強度は、偽手術マウスを１とした値（Fold Change）で表した。
【００２８】
【図２０】発火−発作のShcのチロシンリン酸化に対する影響を示す。偽手術マウス（Sham）（黒塗り四角、独立４個体）および完全キンドリングマウス（Kindling）（白塗り四角、独立４個体）の海馬および皮質タンパク質から調製したTriton可溶画分４０μｇを用い、Shcおよびリン酸化Shc（Tyr317;pShc）に対する抗体でプロービングすることにより、ウェスタンブロット解析を実施した。（Ｃ）は、Shcおよびリン酸化Shc（66kDaおよび52kDa）についてのウェスタンブロットを示す。データを平均値±S.E.M（*Mann-Whitney U-test）で表す。シグナル強度は、偽手術マウスを１とした値（Fold Change）で表した。
【００２９】
【図２１】完全キンドリングマウス（Kindling）（独立５個体）、中間ステージ３マウス（Stage 3）（独立４個体）および偽手術マウス（Sham）（独立４個体）のFos（Ａ）およびEgr1（Ｂ）の発現レベルの比較を定量的ＲＴ−ＰＣＴの分散図で示す。  定量的ＲＴ−ＰＣＴの分散図（Ａ）は、偽手術マウス（Sham）、ステージ３（Stage 3）および完全キンドリングマウス（Kindling）における、大脳皮質前部（白丸）、視床（褐色丸）および大脳皮質の後部（caudal part of the cerebral cortex）（黒丸）での、Gapdh mRNAに比較したFos mRNAの比（Arbitrary unit: Fos mRNA/Gapdh mRNA）を示す。統計解析は、Kyplot 4.0のKruskal-Wallis試験を行った（*p<0.001）［各マウスにおける平均値を、エラーバー付の黒丸で示し、エラーバーはS.E.Mを示す。］  同様に、定量的ＲＴ−ＰＣＴの分散図（Ｂ）は、偽手術マウス（Sham）、ステージ３（Stage 3）および完全キンドリングマウス（Kindling）における、大脳皮質前部（白丸）、視床（褐色丸）および大脳皮質の後部（caudal part of the cerebral cortex）（黒丸）での、Gapdh mRNAに比較したEgr1 mRNAの比（Arbitrary unit: Egr1 mRNA/Gapdh mRNA）を示す。統計解析は、Kyplot 4.0のKruskal-Wallis試験を行った（*p<0.01）［各マウスにおける平均値を、エラーバー付の黒丸で示し、エラーバーはS.E.Mを示す。］
【００３０】
【図２２】完全キンドリングマウス（Kindling）（独立５個体）、中間ステージ３マウス（Stage 3）（独立４個体）および偽手術マウス（Sham）（独立４個体）のJunb（Ｃ）の発現レベルの比較を定量的ＲＴ−ＰＣＴの分散図で示す。  定量的ＲＴ−ＰＣＴの分散図（Ｃ）は、偽手術マウス（Sham）、ステージ３（Stage 3）および完全キンドリングマウス（Kindling）における、大脳皮質前部（白丸）、視床（褐色丸）および大脳皮質の後部（caudal part of the cerebral cortex）（黒丸）での、Gapdh mRNAに比較したJunb mRNAの比（Arbitrary unit: Junb mRNA/Gapdh mRNA）を示す。統計解析は、Kyplot 4.0のKruskal-Wallis試験を行った（*p<0.005）［各マウスにおける平均値を、エラーバー付の黒丸で示し、エラーバーはS.E.Mを示す。］
【００３１】
【図２３】Egr1 mRNAの発現に対するジェノトロピン（genotropin）およびpegvisomantの影響を示す。（Ａ）は、全１または６回にわたる薬剤のインジェクション（Injection of drugs (total=1 or 6 times）を示し、ジェノトロピン（540pmol/μlを1μl）、pegvisomant（540pmol/μlを1μl）および緩衝液のマイクロインジェクションのスケジュールを示す。サンプルは、薬剤のインジェクションの回数（The number of injections of drugs）が１回の場合は、投与２４時間後に、薬剤のマイクロインジェクションの回数が６回の場合は、最終投与３時間後に調製した。（Ｂ）は定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。全ＲＮＡを、各個体（各薬剤毎４個体）につき、マイクロインジェクションを受けた海馬を含む後部皮質（caudal cortex）から抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。Egr1 mRNAは、ジェノトロピンのマイクロインジェクションが１回（Once）のとき、マイクロインジェクションの２４時間後に増加したが、マイクロインジェクションが６回（6 times）の後では差が認められなかった。グラフ中、Buffは緩衝液、ｒＧＨはジェノトロピン、Pegはpegvisomantの投与群を意味する。グラフの数値は、Gapdh mRNAに比較したEgr1 mRNAの比（Arbitrary unit: Egr1 mRNA/Gapdh mRNA）であり、平均値＋S.E.Mを表す。統計解析は、Kyplot 4.0のKruskal-Wallis試験を行った（*p<0.0085）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の第１の実施態様では、成長ホルモン阻害剤を含む、てんかんの処置または予防用組成物を提供する。
成長ホルモン阻害剤は、成長ホルモンの作用を阻害するものを含み、成長ホルモンとレセプターの結合を阻害するもの、レセプターからのシグナル伝達を阻害するもの、成長ホルモンの発現を阻害するもの、および成長ホルモンの分泌を阻害するものを含む。したがって、抗成長ホルモン抗体、成長ホルモン受容体拮抗薬、ソマトスタチンまたはソマトスタチン誘導体等が、成長ホルモン阻害剤に含まれる。好ましくは、成長ホルモン阻害剤は、ソマトスタチンまたはソマトスタチン誘導体である。また、成長ホルモン受容体拮抗薬には、ペグビソマント（Pegvisomant）が含まれる。【００３３】
ソマトスタチン誘導体とは、天然発生のテトラデカペプチドであるソマトスタチン由来の直鎖または環状のポリペプチドを意味し、天然のソマトスタチンが有する成長ホルモン分泌抑制作用を有するものである。例えば、天然ソマトスタチンより、１以上のアミノ酸単位が省略され、そして／または１以上の他のアミノ酸残基によって置換され、そして／または１以上の官能基が１以上の他の官能基によって置換され、そして／または１以上の官能基が１またはいくつかの他の同等の官能基によって置換されたものであり、好ましくは、オクトレオチド、SOM-230、RC-160、BIM23014、RC-15、RC-76、RC-88、RC-101、RC-102、RC-113、RC-114、RC-115、RC-121、RC-138、RC-150、RC-157、RC-161、RC-164、およびこれらの水素付加体が挙げられる（R-Z. Cai, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1896-1900参照）。より好ましくは、ソマトスタチン誘導体は、オクトレオチド、SOM-230、RC-160、BIM23014であり、さらに好ましくは、オクトレオチドである。
なお、ソマトスタチンの由来は特に限定されないが、好ましくはヒトである。【００３４】
てんかんは、「さまざまな原因によってもたらされる慢性の脳疾患であって、大脳神経細胞の過剰な放電に由来する反復性の発作（てんかん発作）を主徴とし、多種多様な臨床および検査所見を伴うもの」である（大原健士郎：脳器質性疾患・てんかん・その他、精神科ハンドブック（５）８７−１４２ページ、星和書店（１９９７）参照）。てんかんに見られる発作型については、国際てんかん連盟により、大分類として、部分発作、全般発作、分類不能発作と分類され、それぞれが、さらに小分類として、単純部分発作、複雑部分発作、二次性全般化強直・間代発作、欠神発作、非定型欠神発作、ミオクロニー発作、間代発作、強直発作、強直・間代、脱力発作に分類されている。
本発明に係る医薬組成物は、てんかんの処置、予防、および／または診断用に提供されるが、好ましくは、難治てんかんの処置、予防、および／または診断用に提供される。
本発明における、難治てんかんとは、抗てんかん薬でコントロールできない治療抵抗性の発作を伴うてんかんである。したがって、難治てんかんとは、薬物抵抗性のてんかんである。【００３５】
本発明に係る成長ホルモン阻害剤を含む、てんかんの処置または予防用組成物は、さらに１以上の抗てんかん薬を含むことができる。抗てんかん薬は、市販されている抗てんかん薬であれば限定されないが、例えば、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、フェノバルビタール、エトサクシミド、クロナゼパム、オキシカルバゼピン、ラモトリジン、ゾニサミド、フェルバメート、トピラメイト、ガバペンチン、ビガバトリン、タイギャビン、プレガバリンおよびレベチラセタム等が挙げられる。【００３６】
本発明に係る医薬組成物は、治療目的に応じて各種の薬学的投与形態とすることができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。これらの投与剤は、医薬的に許容される担体等を用い、本分野で通常知られた慣用的な製剤方法により製剤化してもよい。【００３７】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロール、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、コーンスターチ、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤などを使用できる。【００３８】
さらに、錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。【００３９】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤などを使用できる。【００４０】
カプセル剤は常法に従い、上記で例示した各種担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。【００４１】
経口用液体製剤とする場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を用い、常法により、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が、緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。【００４２】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を使用できる。【００４３】
注射剤とする場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば水、乳酸水溶液、エチルアルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖またはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。【００４４】
さらに、上記各製剤には必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や、他の医薬品を配合してもよい。【００４５】
好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、脳内に投与される形態で調製される。脳内投与に適した剤は、例えば、液剤であり、殺菌され、且つ脳脊髄液と等張であることが好ましい。例えば、脳内投与に適した液剤は、リン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを含む溶液であり、好ましくは、当業者に公知の人工脳脊髄液（120mM NaCl, 26mM NaHCO3, 3mM KCl, 1.5mMKH2PO4, 1.4mM MgSO4, 2mM CaCl2, 10mM Glc）を含む。所望により、マンニトールなどの添加剤を含ませてもよい。【００４６】
本発明に係る医薬組成物は、有効成分が２以上ある場合は、それぞれ単独で単位投与形態に製剤化されていてもよいし、２以上の有効成分が混合されて１つの投与形態に製剤化されていてもよい。例えば、ソマトスタチンまたはソマトスタチン誘導体を脳内投与用の液剤として製剤化し、クロナゼパム等の抗てんかん薬を別途経口投与用の錠剤として製剤化し、同一のてんかん患者に別々に適宜投与してもよい。また、ソマトスタチンまたはソマトスタチン誘導体、およびクロナゼパム等の抗てんかん薬を混合し脳内投与用の一つの液剤として製剤化し、患者に投与してもよい。また、例えば、ペグビソマントを脳内投与用の液剤として製剤化し、クロナゼパム等の抗てんかん薬を別途経口投与用の錠剤として製剤化し、同一のてんかん患者に別々に適宜投与してもよい。さらには、ペグビソマントおよびクロナゼパム等の抗てんかん薬を混合し脳内投与用の一つの液剤として製剤化し、患者に投与してもよい。【００４７】
本発明に係る医薬組成物の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、患者の症状の程度に応じて適宜決定される。例えば、皮下投与、静脈内投与、脳内投与で投与され得る。脳内に投与する場合は、例えば、持続注入であり得る。
また、本発明に係る医薬組成物に含まれるソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体の投与量も、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、患者の症状の程度に応じて適宜決定される。たとえば、マウスにおいて、酢酸オクトレオチド１ng〜100μg、好ましくは10ng〜1μg、さらに好ましくは、100ng〜500ngに相当する量が、ヒトに外挿されて投与され得る。また、本発明に係る医薬組成物に含まれるペグビソマントの投与量も、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、患者の症状の程度に応じて適宜決定される。たとえば、マウスにおいて、１ng〜100μg、好ましくは100ng〜10μgに相当する量が、ヒトに外挿されて投与され得る。【００４８】
本発明の第２の実施態様では、脳内の成長ホルモンのイメージングのための試薬を含むてんかん診断用組成物を提供する。イメージングのための試薬としては、脳内におけるＧｈの存在またはＧｈｍＲＮＡの発現を何らかの手段で外部より可視化できるものであれば何でも採用できるが、例えば、放射性同位元素やＭＲＩ造影剤などのＭＲＩシグナル源で標識した抗成長ホルモン抗体が例示される。抗成長ホルモン抗体は、好ましくは抗ヒト成長ホルモン抗体である。
また、本発明の第２の実施態様では、脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質をイメージングするための試薬を含むてんかん診断用組成物を提供する。成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質とは、成長ホルモンが受容体に結合してからその効果を発現するまでに関与する物質であり、例えば、成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質には、Egr1およびリン酸化Stat5が含まれる。イメージングのための試薬としては、脳内における成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質の存在またはそれらのｍＲＮＡの発現を何らかの手段で外部より可視化できるものであれば何でも採用できるが、例えば、放射性同位元素やＭＲＩ造影剤などのＭＲＩシグナル源で標識した成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体が例示される。好ましくはヒトの成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体である。【００４９】
ＭＲＩを使用する場合には、例えば、ガドリニウムで標識した抗成長ホルモン抗体または成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体を、脳内の成長ホルモンのイメージングのための試薬として採用できる。
ガドリニウムで標識した抗成長ホルモン抗体または成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体は、ＭＲＩの造影剤として通常使用されるガドリニウム錯体を公知の方法で抗体に結合させることにより調製できる。
また、ガンマカメラを使用する場合は、例えば、111Ｉｎで標識した抗成長ホルモン抗体または成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体を、脳内の成長ホルモンのイメージングのための試薬として採用できる。【００５０】
脳内成長ホルモンのイメージング用に標識した抗成長ホルモン抗体または成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体をてんかん患者またはてんかんに罹患していることが疑わしい患者に投与し、ＭＲＩまたはガンマカメラを用いることで、脳のイメージングが可能となる。このイメージングより、被検体がてんかんに罹患しているか否か、てんかんが成長ホルモンに起因するものであるか否か、てんかんの病巣がどこであるか、等の情報が得られ、てんかんの診断に利用できる。その診断結果に基づき、医師は、薬物治療、外科手術、電気刺激療法等の治療方針を決定することができる。【００５１】
本発明に係る脳内成長ホルモンのイメージング用に標識した抗成長ホルモン抗体および／または成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体を含むてんかん診断用組成物は、医薬組成物であり、上記で記載した、剤型で投与され得る。好ましくは、本発明に係る診断用組成物は脳内投与に適した液剤であり、脳内に投与される。【００５２】
また、本発明は、脳内の成長ホルモンのイメージングのための試薬または脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質をイメージングするための試薬を含むてんかん診断用組成物と成長ホルモン阻害剤および／または抗てんかん薬を含むてんかんの処置または予防用組成物を一緒にパッケージしたキットを提供する。当該キットは、患者のてんかんが成長ホルモンに起因するものであるか否かを判断し、そして、成長ホルモンに起因する場合は、脳のどの部位が病巣であるかを確認した後、処置または予防用組成物を投与できるので有用である。【００５３】
なお、抗成長ホルモン抗体は、てんかんの処置または予防にも有用であるので、脳内成長ホルモンのイメージング用に標識した抗成長ホルモン抗体または脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質のイメージング用に標識した抗体は、てんかんの診断だけでなく、処置または予防にも有用である。したがって、本発明は、また、脳内成長ホルモンのイメージング用に標識した抗成長ホルモン抗体または脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質のイメージング用に標識した抗体を含む、てんかんの診断および処置または予防用の組成物を提供する。当該組成物には、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、成長ホルモン受容体拮抗薬、抗てんかん薬等を含み得る。【００５４】
本発明の第３の実施態様では、脳内の成長ホルモン量を定量するための試薬を含むてんかん診断用組成物を提供する。脳内の成長ホルモン量を定量するための試薬は、限定されないが、脳脊髄液中または脳実質に存在する成長ホルモンを定量するＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタンブロティングに使用する試薬が例示される。また、本発明の第３の実施態様では、脳内の成長ホルモンの量として、成長ホルモンのｍＲＮＡを定量的なＲＴ−ＰＣＲにより定量するための試薬を含むてんかん診断用組成物を提供する。【００５５】
てんかん発生により脳内で発現が上昇した成長ホルモンは、脳脊髄液内に移行するので、脳実質のみならず脳脊髄液中の成長ホルモンの量も上昇する。これをＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等で定量することにより、被検体がてんかんに罹患しているか否か、てんかんが成長ホルモンに起因するものであるか否か、等の情報が得られる。その診断結果に基づき、医師は、薬物治療、外科手術、電気刺激療法等の治療方針を決定することができる。【００５６】
ＥＬＩＳＡは、好ましくはヒト成長ホルモンを定量できるものであればよく、限定はされないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス（株）から発売されているヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡキットを利用してもよい。また、好ましくは、成熟型の成長ホルモンではなく、前駆体の成長ホルモンをＥＬＩＳＡによって検出する。前駆体の成長ホルモンは、マウスにおいては、２３．０ｋＤａの分子量を有するものであり、ヒトにおいては、マウス２３ＫＤａの分子に対応するものである。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、好ましくはヒト成長ホルモンを定量できるものであればよく、限定はされない。成長ホルモンまたは抗体を放射性ヨウ素等の放射性元素で標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に用いることができる。例えば、抗成長ホルモン抗体を９６穴プレートに固定し、これに放射標識された成長ホルモンを結合させ、その後、非標識の成長ホルモンを含む脳脊髄液等のサンプルを添加し、遊離する放射標識成長ホルモンを検出することで、サンプル中の成長ホルモン量を定量できる。好ましくは、成熟型の成長ホルモンではなく、前駆体の成長ホルモンをラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって検出する。前駆体の成長ホルモンは、マウスにおいては、２３．０ｋＤａの分子量を有するものであり、ヒトにおいては、マウス２３ＫＤａの分子に対応するものである。【００５７】
また、ウェスタンブロッティングにより、成長ホルモン、好ましくは前駆体の成長ホルモンの量を定量することもできる。例えば、脳脊髄液またはTritonX-100等の界面活性剤で可溶化した脳実質のサンプルを、電気泳動し、抗成長ホルモン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、成長ホルモン（前駆体の成長ホルモンを含む）に対応するバンドの強度をMulti Gauge ver 3.0（富士フイルム）で解析することにより定量できる。
また、定量的なＲＴ−ＰＣＲにより、成長ホルモンの量を定量することもできる。例えば、脳実質のサンプルより全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成し、TaqMan プローブ（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行うことにより、成長ホルモンのｍＲＮＡ量を定量できる。
脳実質のサンプルは、てんかん発生により成長ホルモンの発現が亢進している脳内の部位から摘出され、このような脳内の部位には、例えば、海馬、大脳皮質、視床がある。【００５８】
また、本発明の第３の実施態様では、脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質の量を定量するための試薬を含むてんかん診断用組成物を提供する。脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質の量を定量するための試薬は、限定されないが、脳脊髄液中または脳実質に存在する脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質の量を定量するＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはウェスタンブロティングに使用する試薬が例示される。
成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質には、リン酸化Stat5およびEgr1が含まれる。
例えば、脳実質のサンプルを、成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質に特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロッティングすることにより、脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質の量を定量することができる。
また、例えば、脳実質のサンプルより全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成し、TaqMan プローブ（アプライドバイオシステムズ）を用いて定量的なＰＣＲを行うことにより、脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質のｍＲＮＡ量を定量できる。
脳実質のサンプルは、てんかん発生により成長ホルモンの発現が亢進している脳内の部位から摘出され、このような脳内の部位には、例えば、海馬、大脳皮質、視床がある。【００５９】
さらに、本発明は、脳内の成長ホルモン量を定量するための試薬または脳内の成長ホルモンシグナル伝達系に関わる物質の量を定量するための試薬を含むてんかん診断用組成物と成長ホルモン阻害剤、および、所望により抗てんかん薬を含むてんかんの処置または予防用組成物を一緒にパッケージしたキットを提供する。当該キットは、患者のてんかんが成長ホルモンに起因するものであるか否かを判断した後、処置または予防用組成物を投与できるので有用である。【００６０】
本発明は、また、上記本発明に係る処置または予防用組成物、および／または本発明に係る診断用組成物を使用した処置、予防、診断方法も提供する。
本発明は、哺乳動物に向けられたものであり、好ましくはヒトに向けられたものである。【００６１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものでない。
【実施例１】
【００６２】
実験の材料および方法を以下に記載する。【００６３】
使用した抗体
以下の抗体を使用した。
ウサギ抗マウス成長ホルモン抗体（Acris, BP526, Hiddenhausen, ドイツ）、抗アクチン抗体（pan AB-5, Thermo Fisher Scientific, イギリス）、抗Jak2ウサギmAb（D2E12, Cell Signaling Technology, Inc.）、抗リン酸化Jak2（Tyr1007/1008）抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、抗Stat5ウサギ抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、抗リン酸化Stat5（Tyr694）ウサギmAb（C11C5, Cell Signaling Technology, Inc.）、抗Shcウサギ抗体（Upstate, NY）、抗リン酸化Shc（Tyr317）マウスmAb（15E11, Upstate）、抗Ki67ウサギ抗体（Novocastra）、抗GFAPマウスmAb（Sigma）、抗ウサギIgG-HRP（Promega）、抗マウスIgG-HRP（Promega）、抗ウサギIgGローダミン結合抗体（Jackson）、およびマウスIgG蛍光抗体（Jackson）。【００６４】
キンドリングマウスの調製
マウス（８週齢、雄性、Slc:ddY、日本エスエルシー（静岡、日本）より購入）を１週間飼育し、馴化させた。手順は全て、大阪府立大学動物保護ガイドラインおよび是認されたプロトコルに従った。全ての手術手技は、イソフルラン（大日本住友製薬、大阪、日本）による麻酔下で実施した。PaxinosおよびFranklin（Paxinos G and Franklin KBJ (2001) The mouse brain in stereotaxic coordinates second edition. Academic Press Inc., San Diego.）によって示された位置決めに従い、脳領域の位置を決定した。
扁桃体外側基底核の右側（ブレグマより、A -2.0、L 3.0、V 4.5mm）および硬膜下腔の左側（ブレグマより、A 2.0、L 1.5mm）の、それぞれに、単極の陰極電極；タングステンスチールで製造され、幅0.1mm（Inter Medical co, Ltd.、名古屋、日本）、および陽極電極；スクリューででき、幅1.0mm、長さ3.0mm（Biotex、京都、日本）を埋め込んだ。術後１０日に、無作為に、電気刺激装置（SEN-3301、日本光電、東京、日本）およびアイソレーター（SS-202J）を用いて、１日１回、マウスに２相の方形波［480μA；60Hz、200μsの持続時間で２秒］を与えた。脳波（EEG）記録を、PreAmpおよびHead Amp（BEMCT-21およびBH-3、Biotex、京都、日本）およびデータ獲得プログラムSleepSign ver. 2.0（Kissei Comtec co.,ltd.、長野、日本）を用いて、刺激の前および後に、硬膜下腔の両側の電極で行った。
発作を、修正したRacineのクライテリア（Racine RJ, (1972) Electroencephalogr Clin Neurophysiol 32:281-294.参照）による分類によりモニターし、後発射（afterdischarge）とフリーズの持続時間を行動のクライテリアに加えることにより、キンドリング獲得過程を５段階に分類した：ステージ１：口や顔面の動き、ステージ２：ステージ１に加えて、前肢の間代性けいれん（clonus）および後発射の時間５秒以上、ステージ３：ステージ２に加えて、前肢の間代性けいれん（clonus）およびフリーズの持続時間１５秒以上、ステージ４：ステージ３に加えて、強直性・間代性けいれんおよび尾の巻き上げ、ステージ５：ステージ４に加えて、転倒（Kato K, et al.,(2001) Brain Res. 901:281-295参照）。ステージ５に至った後、続いて３日間のみ更なる刺激を行ったマウスを完全キンドリングマウスとして実験に用いた。最終キンドリング刺激の２時間以内に断頭し、マウスの脳を摘出した。偽手術マウスは、刺激なしで、しかし他の全ての点で同一に処理した。【００６５】
脳内への薬物のマイクロインジェクション
てんかん発生の間のＧｈの効果を観察する為に、キンドリングマウス調製のための手術時に、ガイドカニューレ（ID=0.4mm、OD=0.5mm、Eicom corp）を装着したマイクロインジェクションカニューレ（ID=0.2mm、Eicom corp.、京都、日本）を、海馬の左側（ブレグマからA -2.9、L 1.5、V 2.5mm）に埋め込んだ。ジェノトロピン（組換えヒト成長ホルモン、１９１アミノ酸、12mg/ml、ファイザー、東京、日本）およびその緩衝液（40mg/ml D-マンニトール、2mg/ml グリシン,0.02mM リン酸ナトリウム pH 6.85）の１μｌ；および／または、酢酸オクトレオチド（100μg/ml  ノバルティス、東京、日本）およびその緩衝液（NaHCO3中、45mg/ml D-マンニトール、3.4mg/ml 乳酸、pH 4.5）の１μｌ；および／またはpegvisomant（Ｇｈアンタゴニスト、組換タンパク質、12mg/ml、ファイザー）およびその緩衝液（40mg/ml D-マンニトール、2mg/ml グリシン、0.02mMリン酸ナトリウムpH 6.85）をスケジュールに従って、マイクロシリリンジポンプ（kdScientific KDS 200シリーズ）を用いて、0.5μｌ／分の流速で注入した。注入されたこれらの試薬の濃度は、臨床で適用されている濃度に従った。マイクロインジェクションに続き、マウスに二相の方形波パルスを与えた。後発射の数および持続時間を、データ獲得プログラムSleepSign ver.2.0を用いたＥＥＧ記録に基づき、手動で計算し、統計学的試験を主にExcelおよびStatview-J5.0の組み合わせを用いて行った。エラーバーは、４つの独立した測定間の標準誤差（S.E.M.）を示す。【００６６】
組織の回収
断頭後、偽手術の、中間ステージ３の、そして完全キンドリングの、各マウスから、大脳皮質の後部（海馬、扁桃体、および側頭葉を含む）（ブレグマ4.0〜-0.9mm）、視床、および大脳皮質の前部（ブレグマ-0.9〜-5.2mm）を回収した。ジーンチップアレイのために、全ＲＮＡを３匹のマウスから集めた各脳領域より、RNeasy lipid tissue mini（Qiagen、東京、日本）を用いて調製した。全ての実験材料はドライアイス上で凍結させ、使用時まで-80℃で保存した。リアルタイムＰＣＲの為に、全ＲＮＡを２匹のマウスから集めた各脳領域より調製した（２匹の動物毎に１反応；合計n=36、３つのステージにおける脳の３つの部位毎の各サブセットの数：それぞれn=4）。【００６７】
アフィメトリクスジーンチップについての手順
偽手術の、中間ステージ３の、そして完全キンドリングのマウスにつき、キンドリング−てんかん発生の間の脳の３部位において、９のマイクロアレイ解析を実施した。マイクロアレイを製造元の指示（アフィメトリクス、東京、日本）に従って用いた。簡単には、ビオチン標識ｃＲＮＡを、GeneChip IVT labeling kit（アフィメトリクス）を用い、全ＲＮＡにつき調製し、約39,000転写物に対するプローブセット（プローブセット当たり１１プライマー）を含むマウスゲノム430 2.0 アレイチップ（アフィメトリクス）に供した。チップ上のハイブリダイゼーションシグナルを、スキャナー（HP GeneArray scanner、Hewlett-Packard、Palo Alto、CA、USA）を用いスキャンし、GeneSuiteソフトウェア（アフィメトリクス）により処理した。【００６８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡ（１μｇ）を、100ユニットのM-MLV逆転写酵素（ReverTra Ace、東京、日本）、200ngのランダムヘキサデオキシリボヌクレオチド  プライマー（宝酒造株式会社、京都、日本）、製造元によって供給された緩衝液中の0.5mM dNTPs（アマシャム、東京、日本）を用い、および100μｌの反応体積で３７℃、１時間、逆転写させた。全ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、プライマー（0.1μＭ、最終濃度）を含む２５μｌの反応混合物中で、プライマー対当たりトリプリケートで増幅させ、定量的なＰＣＲをＳＹＢＲ Green（Platinum SYBR qPCR Super Mix-UDG、インビトロジェン、東京、日本）をＤＮＡ増幅のマーカーとして、iCycler iQリアルタイムＰＣＲシステム（Bio-Rad、東京、日本）で、２段階増幅の４０サイクル：９５℃、３分間（１サイクル）、９５℃、１５秒間および６０℃、１分間（４０サイクル）、６０℃、１分間（１サイクル）、および融解曲線で、実施した。使用前に、iCyclerのＣＣＤカメラをウェルファクタープレート（外部）方法により調節した。上記プライマーを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、1.4%アガロース−ＴＡＥ中、ＣＹＢＥＲグリーンフィルターを用いて、転写物由来の単一バンドを増幅した（図１４）。リアルタイムＰＣＲからのデータは、iCycler iQソフトウェアver.3.0Aを用いて解析した。遺伝子発現レベルを偽手術マウスの大脳皮質前部、後部、及び視床でそれぞれ発現するGapdhのｍＲＮＡに比較してｍＲＮＡ含量％を算出した。統計学的試験を、ExcelおよびKyplot4.0の組み合わせを用いて実施した。エラーバーは４つの独立した測定間の標準誤差（S.E.M.）を示す。【００６９】
５’−ＲＡＣＥ解析
５’−ＲＡＣＥ解析を、GENERACERキット（インビトロジェン、Carlsbad CA）を用い、発火−発作（kindled-seizure）後の大脳皮質前部の全ＲＮＡについて、製造元の指示書に従って、実施した。完全長のｍＲＮＡにGeneRacer ＲＮＡオリゴをライゲーションした後、ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写した。ｃＤＮＡをプライマー：5'-CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3'（配列番号９）/ 5'-CAA TTC CAT GTC GGT TCT CTG CT-3'（配列番号１０）（GeneRacer 5'/Gh1R4, 339-371 bp（NM008117））を用いた第１のＰＣＲ、そして、5'-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3'（配列番号１１）/ 5'-ACT CTT TGT AGG TGT CAG CAG CCA GC-3'（配列番号１２）（GeneRacer 5' Nested/Gh1R5、204-230 bp （NM008117））を用いたnested-PCRによって増幅した。その結果、４種のＰＣＲ断片を回収した。オリゴｄＴの代わりに、２ラウンドのＰＣＲにより、ｃＤＮＡを、ランダムプライマーを用いて増幅し、その結果、２つのｃＤＮＡ断片が回収された。５つのＰＣＲ断片をゲルで精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローニングした。それぞれのＰＣＲ断片をＥ．ｃｏｌｉ中にクローン化し、配列決定し（３０クローン）、全てのクローンの５’末端を、NM-008117のそれと完全に同一であるものとして同定した。てんかん発症後の大脳皮質前部はまた、下垂体と同じGh mRNAの転写開始部位を有することが示唆された。【００７０】
Ｉn situハイブリダイゼーション
リボプローブを調製する為に、成長ホルモン標的配列を、発火−発作（kindled-seizure）後の大脳皮質前部の全ＲＮＡから合成された単一ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ Advantage 2 ポリメラーゼ（Takara Bio、京都、日本）を添加した緩衝液中で、Gh1F1/Gh1R2プライマーを用いたＰＣＲの１ラウンド、９５℃、１分間、３５サイクル（９５℃、３０秒間、６８℃、１分間、７２℃、２分間）、そして７２℃、１０分間で増幅し、そして、ＰＣＲ断片をpGEM-T easy ベクターにサブクローニングした。鋳型をpGEM-Tのマルチクローニング配列中の適切な制限酵素により処理し、線状化した。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識した成長ホルモンのリボプローブを、製造元の指示書（Roche、東京、日本）に従って調製した：アンチセンス、Sal 1およびT7 RNA ポリメラーゼ（T7）およびセンス、Nco1およびSP6 RNA ポリメラーゼ（SP6）。
In situハイブリダイゼーション組織化学を、製造元の指示書（Roche、東京、日本）および修正RI-in situハイブリダイゼーション組織化学手順（Okabe, et al., (2001), J Neurochem 77:1185-1197）に従って行った。
詳しくは、延髄および小脳を切除した脳を用い、クリオスタット上で、冠状断面（ブレグマ4.2〜-4.8mm、14-μｍ厚さ）を切り出し、アセトン中の0.1% 3-アミノプロピルトリエトキシ  シラン（シグマ−アルドリッチ、東京、日本）でコートしたスライド上に解凍−マウント（thaw-mounted）した。スライド上のセクションを0.1Mリン酸ナトリウムｐＨ７．４中の４％ホルムアルデヒドで、室温、２０分固定した。洗浄し、５０ｍＭ  Tris-HCl、ｐＨ７．５、および５ｍＭ  ＥＤＴＡ中の１０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫで室温、３分間処置し、上記固定剤で固定し、再度洗浄し、２４ｍＭ無水酢酸および０．１Ｍトリエタノールアミンで１０分間アセチル化し、洗浄し、濃度が高くなる系列のアルコールを通して脱水した。ＤＩＧ標識リボプローブ（250ng/スライドグラス）をハイブリダイゼーション緩衝液；５０％脱イオンホルムアミド、０．３Ｍ NaCl、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％硫酸デキストラン、１Ｘdenhardt's 溶液、０．２％  Ｎ−ラウロイルサルコシン、500μg/ml酵母ｔＲＮＡ、２００μｇ/ｍｌ  サケ睾丸ＤＮＡおよび２０ｍＭ  Tris-HCl、ｐＨ８．０で混合し、切片上に置き、５５℃で１６時間インキュベーションした。切片を５７℃で３０分、それぞれ、４ＸNaCl/Citおよび５０％ホルムアミド、２ＸNaCl/Citで洗浄した。そして、０．５Ｍ  NaCl、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  Tris-HCl、ｐＨ７．５中の２μｇ/ｍｌ  RNaseAで３７℃、３０分間処置し、そして、５０％ホルムアミド、２ＸNaCl/Citで５７℃、３０分間、０．１Ｍ  Tris-HCl、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）およびＴＢＳ，０．２％  Tween２０（ＴＢＳＴ）でそれぞれ２回、室温で、５分間洗浄した。切片を、０．２％ヒツジ血清、１％ブロッキング試薬（1 096 176、Rosch）、２ｍＭ  Levamisol（シグマ、東京、日本）およびＴＢＳＴ（ブロッキング緩衝液）で、室温１時間、そして、ブロッキング緩衝液中にアルカリホスファターゼを結合した抗ＤＩＧ抗体で、４℃、１６時間インキュベーションした。ＴＢＳＴおよび２ｍＭ  Levamisol、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．１Ｍ  Tris-HCl、ｐＨ９．５（ＮＴＭ）で洗浄後、切片を、ＮＴＭ中の基質、１７５μｇ／ｍｌ  5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート（ＢＣＩＰ）、２２５μｇ／ｍｌ  ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）で展開した。ＴＥで洗浄後、切片をpermafluor（Beckman coulter、東京、日本）でマウントした。
イメージをAxioVision 4.2.を接続したAxioplan 2 顕微鏡（Carl Zeiss、東京、日本）で捉えた。顕微鏡下で撮影したイメージを、Panorama（Carl zeiss）を用いてつなぎ合わせた。【００７１】
ウェスタンブロット解析
海馬および扁桃体を含む全大脳皮質を、偽手術の、そしてキンドリングのマウス（ddY）から摘出し、粗抽出物を調製した（Kato K, et al.,(2001) J Biol Chem 276:14562-14571参照）。キンドリングの、そして偽手術のマウス、それぞれについて、４ロットのタンパク質を解析した（n=4）。
２０μｇのTritonＸ−１００可溶性画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いて、ニトロセルロース膜（アマシャム、東京、日本）を用いてウェスタンブロッティングを行った。一次抗体は、以下を用いた：ウサギ抗マウス成長ホルモン抗体（Acris, BP526, Hiddenhausen, ドイツ）、抗アクチン抗体（pan AB-5, Thermo Fisher Scientific, イギリス）、抗Jak2ウサギmAb（D2E12, Cell Signaling Technology, Inc.）、抗リン酸化Jak2（Tyr1007/1008）抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、抗Stat5ウサギ抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、抗リン酸化Stat5（Tyr694）ウサギmAb（C11C5, Cell Signaling Technology, Inc.）、抗Shcウサギ抗体（Upstate, NY）、抗リン酸化Shc（Tyr317）マウスmAb（15E11, Upstate）。２次抗体はHRP結合抗体を用いた。検出はECL western blotting detection system（アマシャム、東京、日本）を用いた。イメージをLAS-3000（富士フイルム、東京、日本）で捉え、バンドの強度をMulti Gauge ver 3.0（富士フイルム）で解析した。Ｇｈの分子量を、Precision protein standards（Bio-rad）を用いて決定した。統計学的試験をExcelとStatview-J 5.0.の組み合わせを用いて実施した。【００７２】
TaqMan プローブを用いた定量的RT-PCR（qRT-PCR）
偽手術（４個体）、ステージ３（４個体）及びキンドリング（５個体）より、それぞれ、大脳皮質の後部［海馬、扁桃体、および側頭葉を含む］（ブレグマ4.0〜-0.9mm）、視床、大脳皮質の前部（Apical part）（ブレグマ-0.9〜-5.2）を摘出した。qRT-PCR用に、それぞれの脳部位からRNeasy lipid tissue mini（キアゲン、東京、日本）を用いて、説明書通りに、全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡ（１μｇ）をＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ReverTra Ace、東洋紡、大阪、日本）を用いて逆転写した。成長ホルモン（Ｇｈ）のｍＲＮＡの定量的ＰＣＲを、TaqMan プローブ（アプライドバイオシステムズ、東京、日本）及びPremix Ex Taq（タカラバイオ、滋賀、日本）、7300リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）を用い、１サイクル及び５０サイクルの２段階増幅：９５℃、１０秒（１サイクル）、９５℃、５秒及び６０℃、３１秒（５０サイクル）で行った。ＰＣＲに用いたプラマーペアとＴａｑｍａｎプローブはPrimer Express Software Version 3.0（アプライドバイオシステムズ）を用いて以下のように設計した：５’−ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ−３’（配列番号１３）／５’−ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  Ｔ−３’（配列番号１４）／５’−ＦＡＭ−ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＣＧ−３’（配列番号１５）（Ｇｈ，  ８６bp，  ＮＭ００８１１７中の２０８−２９３ｂｐ）および５’−ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＡ−３’（配列番号１６）／５’−ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＴ−３’（配列番号１７）／５’−ＶＩＣ−ＣＣＡ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＣ−３’（配列番号１８）（Gapdh，１３６bp，  ＮＭ００８０８４中の２７８−４１３ｂｐ）。
また、Ｅｇｒ１、ＪｕｎｂおよびＦｏｓの定量的ＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Power SYBR Green PCR Master Mix、アプライドバイオシステムズ）で、７３００Real-Time PCR systemを用いて、１サイクル、５０サイクルおよび３段階増幅の１サイクル：９５℃、１０分（１サイクル）、９５℃、１５秒および６０℃、１分（５０サイクル）、および９５℃、１５秒、６０℃、１分、９５℃、１５秒及び６０℃、１分（１サイクル）で実施した。ＰＣＲに用いたＰＣＲプライマーは以下のようである：５’−ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号１９）／５’−ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＧ  ＴＧＴ  ＣＡ−３’（配列番号２０）（Ｅｇｒ１，６６ｂｐ，ＮＭ００７９１３中の２６０８−２６７３ｂｐ）、５’−ＣＣＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  Ｇ−３’ （配列番号２１）／５’−ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  Ａ−３’（配列番号２２）（Ｊｕｎｂ，１５０bp，ＮＭ００８４１６中の１５３１−１６８０ｂｐ）、５’−ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＴＧ−３’（配列番号５）／５’−ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＡＣ−３’（配列番号６）（Fos，３０９bp，ＮＭ０１０２３４中の１５３６−１８４４ｂｐ）、および５’−ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＡ−３’（配列番号１６）／５’−ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＴ−３’（配列番号１７）（Gapdh，１３６bp，ＮＭ００８０８４中の２７８−４１３ｂｐ）。
標的およびGapdhの相対的標準曲線を、偽手術マウスの大脳皮質の前部の固定ロット由来の固定量のｃDNAを用いて描いた。標的およびGapdhの量を、該曲線に基づき定量し、SDS software version 1.4（アプライドバイオシステムズ）を用いて、各領域で、Gapdh mRNAに比較した標的ｍRNAの比として記載した。統計学的試験はExcelおよびStatview-J 5.0を組み合わせて用いて実施した。【００７３】
抗Ki67抗体を用いた免疫染色
冠状断面（ブレグマ4.2〜-4.8mmにおける厚さ14-μｍ）を、クライオスタットおよびスライド上でthaw mountすることにより切り出した。スライド上の切片を４％ホルムアミドで固定し、抗Ki67抗体および抗ウサギIgG蛍光抗体（赤色、矢印）で反応させた。核をHoechst33258（５μｇ／ｍｌ）でカウンター染色した（緑色）。【００７４】
以下、上記実験手法を用い行った実験およびその結果を記載する。【００７５】
キンドリング−てんかん発生の間に成長ホルンモンが増加する
てんかんの進展に関わる調節タンパク質を同定する為に、キンドリング−てんかん発生の間の脳における異なる遺伝子の発現を、ジーンチップアレイを用いてスクリーニングした。てんかん発生の間に、外側基底核（BLA）からキンドリング刺激が伝搬する脳の部位において、Ｇｈが遺伝子発現の増加を示すことを見出した。キンドリング刺激が伝搬する扁桃体および海馬、視床、および大脳皮質前部を含む領域から全ＲＮＡを調製した（図１Ａ）。マウスゲノム430 2.0アレイチップは、表２に示すように４種のＧｈプローブセットを含み、全てのセットでキンドリング−てんかん発生の間のＧｈ転写物の増加を見出した。さらに、ｍRNAの定量的リアルタイムポリメラーゼチェインリアクションに基づく解析（qRT-PCR）により、てんかん発生の間のＧｈ増加を確認した（図１Ｂ）。両アッセイにより、とりわけ、大脳皮質前部がてんかん発生の間、高レベルのＧｈを有することが明らかとなった。さらに、以前の報告では、ＧｈがIgf−1の発現を主に肝臓で、そしていくつかの脳の領域で誘導すること（Frago LM, et al., (2002) Endocrinol 143:113-22およびHonda et. al. (2003) J Endocrinol 178:71-82）およびIgf1が神経生存機能を発揮すること（Subramanian, et al.,(2005) J Neurosci 16: 2838-2852）が示されているので、てんかん発生の間のIgf1の発現の相違についても検討した。しかしながら、少なくとも、てんかん発生の間にキンドリング刺激が伝搬する脳の領域においては、Igf1 ｍＲＮＡの発現の有意な相違は認められなかった（図１２Ｂおよび図１３Ｄ、表２の５行）。なお、てんかん発作後の神経活性化を評価するのに一般的に用いられている、c-fos ｍＲＮＡの発現の増加は、本モデルでも認められた（図１２Ａおよび図１３Ｃ）。また、成長ホルモンレセプター（Ｇｈｒ）、成長ホルモン放出ホルモン（Ｇｈｒｈ）およびグレリン（Ｇｈｒｌ）の各ｍＲＮＡの発現には、てんかんの発生の間、有意な変化は認められなかった。【００７６】
大脳皮質前部において過剰発現したＧｈのｍＲＮＡが、下垂体で発現するものと同一であるか否かを検討する為に、５’−ＲＡＣＥ解析を行った。５つのＰＣＲ断片を、発火−発作後の大脳皮質前部より調製した全ＲＮＡを用いた５’−ＲＡＣＥより得た。配列決定により、全ての断片の転写開始部位が、下垂体で発現するもの（GenBank NM008117）と完全に同一であることが分かり、全ての断片は、NM008117の配列におけるのと全く同じＭｅｔ部位を含むことが分かった。これにより、大脳皮質前部のＧｈの転写物のほとんどが、下垂体におけるそれと同じであることが示唆された。【００７７】
キンドリングの、そして偽手術のマウスの海馬および皮質抽出物をウェスタンブロット解析することにより、発火−発作後に、Ｇｈの最終産物が増加するか否かを検討した。２つのバンド（２３．０および１９．５ｋＤａ）が、海馬および皮質抽出物において検出され、両者ともに、発火−発作後、約１．４倍量増加した（図２ＣおよびＤ）。さらに、海馬および皮質抽出物におけるＧｈの小さいバンドの分子量が下垂体のものと一致した。【００７８】
下垂体では、Ｇｈ前駆体がＧｈの最も初期に検出される生合成形態であり、その後、該前駆体はプラスミン様プロテアーゼによりプロセッシングされて成熟型Ｇｈが生理的に分泌されると報告されている。したがって、海馬および皮質抽出物における大きい分子量のバンドのＧｈは、前駆体であり、海馬および皮質は、前駆体のＧｈを成熟型より明確に多く含むと理解できる。
海馬および大脳皮質の抽出物で、発火−発作後に前駆体および成熟体のＧｈが増加する一方で、下垂体では、偽手術群と完全キンドリング群とで差がなかった。ｍＲＮＡと同様に、Ｇｈタンパク質も、てんかん発生の間にキンドリング刺激が伝搬する領域で増加した。
これらのことから、下垂体から運ばれたＧｈではなく、キンドリング刺激を受けたマウスの海馬および大脳皮質で発現が上昇したＧｈが、これらの領域で機能していることを示す。【００７９】
Ｇｈは、Ｊａｋ２、Ｓｔａｔ５およびＭＡＰキナーゼおよびＰｉ３キナーゼ経路を含む細胞内分子およびシグナル伝達を刺激すること、内因性の血清応答エレメント（Serum Response Element：ＳＲＥ）−制御遺伝子、Ｆｏｓ、Ｅｇｒ１、ＪｕｎＢの発現を誘導することが報告されている。キンドリング−てんかん発生が、脳内のＧｈシグナリングに関わる分子を活性化するか否かを検討したところ、Ｓｔａｔ５のリン酸化は、発火−発作後の海馬および大脳皮質抽出物で２倍増加した一方、Ｊａｋ２およびＳｈｃのリン酸化は変わらなかった（図１９および２０）。さらに、定量的ＰＣＲの結果、Ｆｏｓ、Ｅｇｒ１およびＪｕｎＢの転写物が、キンドリング−てんかん発生の間に徐々に増加していること、偽手術マウスに比較して、発火−発作後では、海馬および大脳皮質において、それぞれ平均して３倍、２倍、２倍増加していることが示された（図２１および２２）。この結果より、キンドリング刺激は、Ｇｈシグナリングのうちの少なくとも一部のシグナル伝達経路を活性化し、転写を活性化することが示された。
また、キンドリング刺激せず、ヒトＧＨリコンビナントを海馬にマイクロインジェクションしてから２４時間後に、Ｅｇｒ１のｍＲＮＡが増加することを見出した。このことは、脳内において、Ｅｇｒ１の発現がＧｈシグナリング経路の下流で直接的に制御されていることを示し、上記のＧｈシグナル伝達経路の活性化が、キンドリング刺激の神経伝達に伴う内因性Ｇｈ発現の増加により惹起されることが示された。
さらに、プロスタグランジン合成関連遺伝子である、Ｐｔｇｓ２の転写物が、キンドリングにより増加することも見出した。
成長ホルモンが神経細胞の分化、増殖に影響を与えることから、発火−発作後に前駆細胞が増加するか否かを、Ki67抗体を用いた免疫組織染色により検討した。その結果、発火−発作後の歯状回顆粒細胞下層（subgranular cell layer of the dentate gyrus）および梨状皮質に、増殖マーカーであるKi67抗体に陽性な前駆細胞の増加が見出された（図１６）。【００８０】
脳におけるＧｈ ｍＲＮＡの分布
ＧｈのｍＲＮＡは、下垂体において非常に強く発現した（図３Ａ−Ｃ）。in situハイブリダイゼーション反応における基質の露出時間を３０分から７２時間に延ばすことにより、脳において、ｃＲＮＡプローブでラベルされたＧｈｍＲＮＡが検出された（図４Ｅ）。７２時間の過剰露出により、キンドリングの、そして偽手術のマウスの脳において、ＧｈｍＲＮＡ陽性シグナルが得られた。７２時間は、基質（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート、ＢＣＩＰおよびニトロブルーテトラゾリウム、ＮＢＴ）とアルカリホスファターゼの反応が飽和するに十分な時間なので、シグナルの強度にはほとんど相違がなかった。図４Ｉ、図５Ｋおよび図６Ｍに示すように、ＣＮＳにおいて、神経細胞は、表１で挙げられた脳領域で、ｃＲＮＡシグナルを有する典型的な楕円形から構成された。さらに、非神経発現に関し、脈絡叢がｍＲＮＡを発現した（図４Ｈ）。結論として、梨状皮質（図４Ｅ）、視床前核（図４ＧおよびＩ）、および海馬（図４Ｅ、図５ＪおよびＫ）を含む辺縁領域周辺の脳でとりわけ、ＧｈｍＲＮＡは中程度に発現した。【００８１】
難治性てんかんの患者に対し、病巣の外側の深部脳構造の電気刺激療法が、薬剤および病巣の外科的切除の代わりとして、開発されてきている。in situハイブリダイゼーションの結果は、これら電気刺激療法をうける領域のほとんどが、ＧｈｍＲＮＡを発現する領域と一致することを示した（図３−６）。たとえば、患者の発作の頻度を抑制する最も効果的な領域は、視床前核および海馬であり（Salanova and worth (2007) Curr Neurol Neurosci Rep 7:315-319参照）、それらは、下垂体を除いて、脳の部位の中でＧｈｃＲＮＡの標識を最も強く受ける部位であった（図４Ｇ、Ｉおよび図５Ｊ、表１）。さらに、扁桃体キンドリングラットにおける治療的電気刺激のターゲットとして、梨状皮質が提案されている（Zhu-Ge, et al., (2007) Neuroscience 146:901-906）が、ここも、ＧｈｍＲＮＡの強いシグナルを有する（図４Ｅ、表１）。これらの間接的な証拠は、Ｇｈを発現する脳領域が、ヒトおよびマウスでのてんかん発生の間の神経サーキットの刺激の伝搬に関わることを示唆している。【００８２】
てんかん発生における成長ホルモンの効果
てんかん発生におけるＧｈの顕著な役割を検討する為に、ジェノトロピン（ヒトＧＨリコンビナント、ｒｈＧＨ）およびオクトレオチド（Ｇｈの分泌を抑制するソマトスタチン（Ｓｓｔ）アナログを、図７Ａに記載したスケジュールに従って、てんかん発生の初期および中期の数日に海馬に注入し、そして、１日１回の扁桃体刺激に応じたキンドリングの進展に対するこれら薬剤の効果を検討した。ｒｈＧＨの投与は、全体として、コントロールに比較し、てんかん発生を有意に増強した（２要因の分散分析、図７−図９のＡ−Ｄ左および中央グラフ）。初期におけるｒｈＧＨの投与は、行動ステージの進展に影響した（図８Ｄおよび図９Ｅ、左）が、後発射の特性にはほとんど影響を与えなかった（図７Ｂおよび図８Ｃ、左）。一方、中期におけるｒｈＧｈの投与は、行動ステージに加えて、後発射の数および期間にも影響を与えた。特に、中期、そしてその後において、ｒｈＧｈの投与は、コントロールのラインと比較してほぼ平行して、後発射の増加を増強した（図７Ｂ、左）。さらに、ステージの回帰曲線（図９Ｅ、右、Ｒ２＝０．９）は、また、コントロール緩衝液に比較してｈＧＨが進展に起因することを示唆した（図９Ｅ、右）。ｈＧｈによる行動ステージの増強は、後発射の特性の移行に影響し、その結果、刺激を受けた動物の後期で獲得されるＥＥＧおいて、大変なてんかん誘発用の波が生じた。【００８３】
オクトレオチドの投与は、全体として、てんかん発生の間の行動ステージを阻害する（２要因の分散分析、図１１ＣおよびＤ左および中央グラフ）。初期におけるオクトレオチドの投与は、後発射の数と時間の増加がコントロールと同程度であるにもかかわらず、行動ステージを阻害した。中期における投与は、進展にほとんど影響しなかった。このことは、キンドリング−刺激が、内在性のＧｈ発現を増加させ、それにより、オクトレオチドの中期での投与にもかかわらず、ステージの進展を促進した可能性がある。つまり、外因性のオクトレオチドは、てんかん発生の間、内因性Ｇｈ分泌をするために十分なレベルでなかった可能性がある。【００８４】
キンドリング刺激の前およびその間における海馬への外因性ｒｈＧｈの投与は、行動ステージを早めた。一方、オクトレオチドは行動ステージの進展を遅くした。よって、成長ホルモンがてんかん発生を促進することが理解された。また、オクトレオチドの投与は、緩衝液を注入したコントロールマウスと同程度に後発射の数と時間を増加したにもかかわらず、てんかん発生の間、キンドリングの行動特性を阻害した。このことから、成長ホルモンが、てんかん発生の間、後発射の閾値を低下させること、言い換えれば、Ｇｈが低い数の後発射でさえ、キンドリングの行動特性を増強することが、理解できる。
【表１】
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【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明により新規な作用機序を有する抗てんかん薬及びてんかん用診断薬が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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