(57)【要約】【課題】ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対する抗体と同時に、ＨＩＶ−１  ｐ２４を１段階で検出することが可能なウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット、並びにウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法を提供することにある。【解決手段】ヒト検体中に含まれるウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キットに関する。  担体に固定化され、ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体、及びウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗原と、標識物質で標識化されウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体、及び標識物質で標識化されウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗原と、を少なくとも備え、捕獲抗体及び捕獲抗原と、検出抗原及び検出抗体との結合が１段階の反応で行われる。
2009122591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト検体中に含まれるウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キットであって、
担体に固定化され、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体、及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗原と、
標識物質で標識化され前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体、及び前記標識物質で標識化され前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗原と、を少なくとも備え、
前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原と、前記検出抗原及び前記検出抗体との結合が１段階の反応で行われることを特徴とするウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット。
【請求項２】
前記捕獲抗体、前記捕獲抗原、前記検出抗体、前記検出抗原は、別個に提供されることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット。
【請求項３】
固定化された前記担体が保湿状態に維持されていることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット。
【請求項４】
前記保湿状態は、水分を含浸させた媒体を前記担体に接触させた状態で、外気と遮断することにより実現されることを特徴とする請求項３に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット。
【請求項５】
前記ウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キットは、
前記ウイルス抗原及び前記ウイルス抗体に結合した前記検出抗体及び前記検出抗原の前記標識物質を検出するための検査試薬を更に備えることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット。
【請求項６】
前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であるとともに、
前記ウイルス抗体は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）及びヒト免疫不全ウイルス  タイプ２（ＨＩＶ−２）の抗体であり、
前記捕獲抗原及び前記検出抗原は、いずれもＨＩＶ−１  ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗原であることを特徴とする請求項１乃至請求項５いずれか一項に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット。
【請求項７】
ヒト検体中に含まれるウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法であって、
前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗原を担体に固定化する工程と、
前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗原に標識物質を標識化する工程とを任意の順序で行い、
前記ヒト検体を前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原と反応させて、前記ウイルス抗原及び前記ウイルス抗体に前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原を結合させる反応を１段階で行う工程と、
前記ウイルス抗原及び前記ウイルス抗体に結合した前記検出抗体及び前記検出抗原の前記標識物質を検出する工程と、を行うことを特徴とするウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法。
【請求項８】
前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の前記捕獲抗体及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の前記捕獲抗原を前記担体に固定化する工程に次いで、
前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原が固定化された前記担体を、保湿状態に維持する工程を行うことを特徴とする請求項７に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法。
【請求項９】
前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原が固定化された前記担体を、保湿状態に維持する工程において、前記保湿状態は、水分を含浸させた媒体を前記担体に接触させた状態で、外気と遮断することにより実現されることを特徴とする請求項８に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法。
【請求項１０】
前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であるとともに、
前記ウイルス抗体は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）及びヒト免疫不全ウイルス  タイプ２（ＨＩＶ−２）の抗体であり、
前記捕獲抗原及び前記検出抗原は、いずれもＨＩＶ−１  ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗原であることを特徴とする請求項７乃至請求項９いずれか一項に記載のウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット、並びにウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法に関し、特に、ヒトの検体中に含まれるウイルス抗原及びウイルス抗体を免疫測定法により検出するウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット、並びにウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに感染するウイルスによって様々な感染症が引き起こされることが知られている。
例えば、後天性免疫不全症候群（エイズ；ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染によってヘルパーＴ細胞が破壊された結果、免疫能力が極端に低下することにより他の病原体に日和見感染することが原因で罹患する疾病である。なお、ＨＩＶには、ウイルスの起源によりＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の２つのタイプが存在する。【０００３】
従来、ヒト血清等の検体中に含まれるＨＩＶ−１を検出する方法やこれに用いられるキットが知られている（例えば、特許文献１参照）。
この方法やキットでは、ＨＩＶ−１ウイルスのキャプシドタンパクであるｐ２４を抗原として認識して結合するマウス抗体（捕獲抗体）と、同じくＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識して結合する標識されたマウス抗体（検出抗体）とを用いて、ＨＩＶ−１ウイルスの検出や定量を行っている。【０００４】
この従来のＨＩＶ−１検出方法は以下のとおりである。
まず、ＨＩＶ−１検出用のマイクロプレートに捕獲抗体を含む溶液を塗布し、マイクロプレート表面を担体として捕獲抗体を固定化する。続いて、このマイクロプレート上でヒト検体に検出抗体を加えてサンドイッチ法による反応を行い、検体中に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と捕獲抗体及び検出抗体との結合反応を行う。次に、反応後のマイクロプレートを洗浄して未反応の血清タンパクや検出抗体を除去し、洗浄後のマイクロプレートに基質と発色液を加えて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により標識された検出抗体を定量する。これにより、検出抗体が結合したＨＩＶ−１  ｐ２４抗原（すなわち、ウイルス抗原）を間接的に検出・定量している。【０００５】
市販されているＨＩＶ−１検出キットには、ｐ２４の検出抗体や捕獲抗体の両方あるいは一方にヒト由来の抗ｐ２４抗体を用いているものがある。しかしながら、ヒト由来のｐ２４捕獲抗体や検出抗体は、ＨＩＶ−１感染者の血清から分離精製する必要があるため、一度に大量に抗体を取得することが困難であり、キット製造のコスト上昇を招くという不都合があった。
また、ヤギ由来の検出抗体及び捕獲抗体を使用するものもあるが、これもヒト由来の検出抗体及び捕獲抗体と同様に、一度に大量に抗体を取得することが困難であり、キット製造のコスト上昇を招くという不都合があった。【０００６】
また、同一の感染者から入手できる血清の量は少量で限られているため、複数の感染者から抗体を入手する必要がある。しかしながら、抗体の特性は感染者ごとにばらつきがあるため、検出キットのロットごとに検出精度のばらつきが生じ、正確な検出や定量が困難になるという不都合があった。【０００７】
そこで、特許文献１では、検出抗体や捕獲抗体として、非ヒト由来の生物から産生される抗体を用いている。具体的には、マウス由来のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いている。このように、非ヒト由来のハイブリドーマを樹立して抗体を産生させることで、ヒトの血清中から捕獲抗体や検出抗体を入手する場合と比較して、均一なロットの抗体を大量に入手することが可能となる。これにより、検出感度の安定性向上と検出キット製造のコスト低減を図ることができる。【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／１２６２８７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、感染症の撲滅は世界平和を実現するための世界共通課題の一つである。
特に、発展途上国での感染症の勃発・蔓延は、交通手段と人的交流の国際化により、先進国での再興感染症の引きがねともなりかねない。
昨今報道されているように、特に発展途上国においては、ＨＩＶや肝炎ウイルスを代表とするウイルス感染の拡大が深刻な問題となっている。【００１０】
現在のＨＩＶ感染の血液診断キットで最新のものは、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対する抗体及びＨＩＶ−１  ｐ２４を同時に測定する方法であり、第４世代診断キットと呼ばれている。
抗体の検出には抗原捕獲法、つまりＨＩＶ−１とＨＩＶ−２抗原を塗布したプレートに血清を反応させ、抗体が陽性の場合は次に反応させる酵素（ＨＲＰ）標識されたＨＩＶ−１とＨＩＶ−２抗原の混合物がプレートに結合することを用いる方法が使用されている。この反応は１段階の反応で検査が終了する。
しかし、早期診断を可能とするＨＩＶ−１  ｐ２４の検出には、現在はビオチン標識抗体を用いるため、ＨＲＰ標識Streptavidinとの２段階の反応が必要であり手間と時間を費やしている。【００１１】
そこで、このような現在行われているような、方法でＨＩＶ−１  ｐ２４検出方法を１段階化することができれば、第４世代キットでも１段階で検査反応を終了させることが可能である。
これはより簡便で進歩した方法といえる。
さらに、このキットのプレート及び試薬の常温での保管を可能とする方法を新たに考案すれば、保冷施設のない発展途上国へのエイズ対策の支援となると期待される。【００１２】
本発明の目的は、上記課題に鑑み、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対する抗体と同時に、ＨＩＶ−１  ｐ２４を１段階で検出することが可能なウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キット、並びにウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、本発明に係るウイルス抗原及びウイルス抗体を一度に検出可能なウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キットによれば、ヒト検体中に含まれるウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キットであって、担体に固定化され、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体、及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗原と、標識物質で標識化され前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体、及び前記標識物質で標識化され前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗原と、を少なくとも備え、前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原と、前記検出抗原及び前記検出抗体との結合が１段階の反応で行われることにより解決される。【００１４】
また、上記課題は、本発明に係るウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法によれば、ヒト検体中に含まれるウイルス抗原及びウイルス抗体の検出方法であって、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗原を担体に固定化する工程と、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗原に標識物質を標識化する工程とを任意の順序で行い、前記ヒト検体を前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原と反応させて、前記ウイルス抗原及び前記ウイルス抗体に前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原を結合させる反応を１段階で行う工程と、前記ウイルス抗原及び前記ウイルス抗体に結合した前記検出抗体及び前記検出抗原の前記標識物質を検出する工程と、を行うことにより解決される。【００１５】
このように、本発明においては、ウイルス抗原及びウイルス抗体に捕獲抗体及び捕獲抗原を結合させる反応を１段階で行うことができる。
つまり、従来のように、２段階の反応を行う必要がなくなる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を例にとると、現在、その抗体の検出には、抗原捕獲法が使用されている。これは、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２抗原を塗布したプレートに血清を反応させ、抗体が陽性の場合は次に反応させる酵素（ＨＲＰ）標識されたＨＩＶ−１とＨＩＶ−２抗原の混合物がプレートに結合することを用いる方法である。この反応は一段階の反応で検査が終了する。
しかし、早期診断を可能とするＨＩＶ−１  ｐ２４の検出には、現在はビオチン標識抗体を用いるため、ＨＲＰ標識Streptavidinとの２段階の反応が必要であり手間と時間を費やしている。
そこで、本発明のキットであれば、ＨＩＶ−１  ｐ２４検出方法を１段階化することにより、短時間で検査反応を終了させることが可能である。
また、操作のステップも減少するため、より簡便に検査を行うことができる。【００１６】
このとき、前記捕獲抗体、前記捕獲抗原、前記検出抗体、前記検出抗原は、別個に提供されると、個々の検査を別個に行うことも可能となるため好適である。
例えば、１回目の検査で陽性と判定された検体について、個々の検査を別個に行うことにより、更に詳細な感染の診断が可能となる。【００１７】
また、このとき、固定化された前記担体が保湿状態に維持されていると好適である。
これは、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の前記捕獲抗体及び前記ウイルス抗体と特異的に結合する非ヒト由来の前記捕獲抗原を担体に固定化する工程に次いで、前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原が固定化された前記担体を、保湿状態に維持する工程を行うことにより実現される。
更に、このとき、前記保湿状態は、水分を含浸させた媒体を前記担体に接触させた状態で、外気と遮断することにより実現されるとより好適である。
これは、前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原が固定化された前記担体を、保湿状態に維持する工程において、前記保湿状態は、水分を含浸させた媒体を前記担体に接触させた状態で、外気と遮断することにより実現される。【００１８】
このように、捕獲抗体及び捕獲抗原が固定化された担体を保湿状態に維持することにより、ウイルス抗原検出能及びウイルス抗体検出能を維持した状態で、常温保存を行うことができる。
ウイルス感染症の血液検査方法として使用されるこのようなキット及び方法は、簡素な施設においても多検体を同時にスクリーニングでき、さらに経済性と簡便性に優れているため、非常に有益であるが、公知の抗原抗体検査キット及び方法のすべては、精度管理の理由から、搬送と保管においては冷蔵が必須条件とされている。
つまり、キットを長期間、常温にさらすことは禁忌とされているのである。
このため、電力供給や冷蔵施設のない世界の地域ではその保管や使用さえ困難であったが、本発明に示すように、捕獲抗体及び捕獲抗原が固定化された担体を保湿状態に維持することにより、長期間常温で保存することが可能となる。
よって、使用地域が限定されることがなく、全世界的において有効に使用可能となる。【００１９】
また、前記ウイルス抗原及びウイルス抗体の検出キットは、前記ウイルス抗原及び前記ウイルス抗体に結合した前記検出抗体及び前記検出抗原の前記標識物質を検出するための検査試薬を更に備えると、利便性が増すため好適である。【００２０】
更に、前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であるとともに、前記ウイルス抗体は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）及びヒト免疫不全ウイルス  タイプ２（ＨＩＶ−２）の抗体であり、前記捕獲抗原及び前記検出抗原は、いずれもＨＩＶ−１  ｇｐ４１抗原、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗原であると好適である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットは、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に対する抗体と同時に、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を１段階で検出することが可能である。
このため、検査時間を短縮することができるとともに、操作ステップが減少し、簡易に感染症の検査を実施することができる。
また、本発明に係るウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットは、常温状態（約１０℃乃至４０℃程度）においてもその性能を維持することができる。
従って、搬送と保管においては冷蔵が必須条件とされない。
このため、世界中の広い地域で有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出感度を示す検量線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
なお、以下に説明する部材、配置等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
また、本明細書中において「常温」とは、本発明に係るキットが通常の流通ルート及び保存環境において、自然にさらされる可能性の高い温度、つまり、約１０℃乃至約４０℃程度の温度を想定している。
ただし、この温度は厳密にこの範囲に限れられるものではなく、流通及び保存時において常識的及び良識的に想定される温度という意味であり、範囲とした数字は、この常識的及び良識的に想定される温度を例示したに過ぎない。
もちろん、これより極めて低い温度及びこれより極めて高い温度も地球上に自然に存在するが、これより極めて低い温度の場合は、冷蔵・冷凍状態と同じ条件となり、これより極めて高い温度の場合は、実際の使用・流通上可能性の低い条件である。【００２４】
以下に、ウイルス抗原及び抗体の一例として、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）のｐ２４を用いた場合のウイルス抗原の検出キット及び検出方法、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）、タイプ２（ＨＩＶ−２）を用いた場合のウイルス抗体の検出キットと検出方法について説明する。
なお、本発明におけるウイルスは、ヒトに感染し、検体中に含まれるものであればＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２に限定されない。
例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、パルボウイルスといった他の感染性ウイルスでもよい。【００２５】
また、ヒト検体としては、血清を例にして説明をしている。
しかしながら、ヒト検体としては、上記ウイルス抗原や抗異種イムノグロブリン抗体（以下、抗異種Ｉｇ抗体という）が含まれるものであればよく、例えば、リンパ液、組織液、骨髄液、関節液、尿、唾液、膣分泌液、精液などの他の体液や、これらの体液に所定の処理を施したものが挙げられる。【００２６】
本発明のウイルス抗原の検出キットは、担体に固定化された非ヒト由来の捕獲抗体及び捕獲抗原と、標識物質で標識化された非ヒト由来の検出抗体及び検出抗原と、ヒト検体中に含まれる抗異種Ｉｇ抗体の認識するエピトープを有する阻止抗体と、を少なくとも含んでいる。
このエピトープは、抗異種Ｉｇ抗体が認識する捕獲抗体と検出抗体に共通のエピトープと同一である。【００２７】
そして、抗原・抗体測定系としては、目的抗原及び目的抗体を、捕獲抗体及び捕獲抗原と、検出抗体及び検出抗原の両方と反応させてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出する。
なお、阻止抗体を使用することより、抗異種Ｉｇ抗体が捕獲抗体・阻止抗体に結合することによる偽陽性反応を防止し、高い精度でウイルス抗原を検出可能となる。【００２８】
（捕獲抗体）
捕獲抗体は、非ヒト由来のモノクローナル抗体（抗ＨＩＶ−１  ｐ２４）であり、ヒト検体中に含まれるウイルスを抗原として認識し、特異的に結合する。
本実施形態の捕獲抗体は、種々の感染者のＨＩＶ−１に共通する抗原部位としてのコアタンパク質ｐ２４を抗原とし、その一部の領域をエピトープとして特異的に認識し、結合するＨＩＶ−１  ｐ２４抗体である。【００２９】
（捕獲抗原）
捕獲抗原は、組み換えＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０抗原及び組み換えＨＩＶ−２
ｇｐ３６抗原であり、人検体中に含まれるウイルス抗体を認識し、特異的に結合する。
本実施形態の捕獲抗原は、種々の感染者のＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０抗体及びＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗体と結合する。【００３０】
捕獲抗体及び捕獲抗原は、プラスチックプレートなどの担体に固定化されて使用され、ウイルス抗原及びウイルス抗体と結合することでこれを担体に固定する。
プラスチックプレートの材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどであって、捕獲抗体に対する結合性を示すものが挙げられる。
本実施形態では、プラスチックプレートと捕獲抗体の抗体分子との間の吸着、及びプラスチックプレートと捕獲抗原の抗原分子との間の吸着により捕獲抗体及び捕獲抗原が固定化される。【００３１】
なお、捕獲抗体及び捕獲抗原と担体との固定化は、上述した吸着に限定されず、例えば共有結合性や静電的相互作用により固定化してもよい。
また、捕獲抗体及び捕獲抗原を固定化する担体としては、プラスチックプレートに限定されず、プラスチックチューブ、スライドガラス、樹脂ビーズなどであって捕獲抗体及び捕獲抗原に対して結合性を示す材料でもよい。【００３２】
（検出抗体）
検出抗体は、捕獲抗体と同様に非ヒト由来の抗体であり、ヒト検体中に含まれるウイルスを抗原として認識し、結合する一次抗体である。
本実施形態の検出抗体は、上述した捕獲抗体と同様に、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と特異的に結合するＨＩＶ−１  ｐ２４抗体であるが、捕獲抗体の認識するエピトープとは異なるエピトープを認識して結合する。
すなわち、捕獲抗体と検出抗体は、同じ抗原（この場合はｐ２４）の互いに異なる領域を抗原として認識するものである。【００３３】
捕獲抗体と検出抗体は、ヒト以外の生物（非ヒト生物）由来の抗体であり、かつ同一のクラス／サブクラスを有している。
本実施形態で使用される捕獲抗体と検出抗体は、いずれもマウス由来のモノクローナル抗体であり、いずれもクラス／サブクラスはＩｇＧ１である。
なお、これらの抗体は、非ヒト由来の抗体であれば由来となる生物種はマウスに限定されず、例えばハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ、ウシなどであってもよい。また、そのサブクラスもＩｇＧ１に限定されず、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３などの他のサブクラスであってもよい。【００３４】
また、本実施形態における捕獲抗体と検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１のｐ２４を抗原とする抗体であるが、ＨＩＶ−１の他の領域を抗原として認識する抗体であってもよい。
例えば、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０やトランスメンブレムタンパク質ｇｐ４１を認識する抗体であってもよい。【００３５】
本発明における捕獲抗体と検出抗体は、例えば非ヒト由来のハイブリドーマから取得することができる。非ヒト由来のハイブリドーマとして、例えばマウス由来のハイブリドーマを用いる場合以下の手順で取得することができる。
まず精製したＨＩＶ−１  ｐ２４をＢＡＬＢ／ｃマウスに接種して免疫し、抗ＨＩＶ−１  ｐ２４抗体を産生する組織、例えば脾臓細胞を採取する。次に、得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（例えば、ＳＰ−２／０）を、ポリエチレングリコールを利用した公知の細胞融合法を用いて細胞融合し、複数種のハイブリドーマを樹立する。【００３６】
続いて、得られたハイブリドーマから産生される抗体のうち、ＨＩＶ−１  ｐ２４と反応する抗体を、精製ＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする酵素免疫反応法（ＥＬＩＳＡ法）により選別する。
さらに、選別されたハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した後、得られた腹水を取得して硫安塩析法とゲルろ過法で処理する。これにより、ｐ２４抗原に特異的な抗体を得ることができる。
なお、脾臓細胞とミエローマ細胞の融合は、上述のようにポリエチレングリコールを用いた方法に限定されず、センダイウイルスを用いる方法や電気処理による方法であってもよい。【００３７】
本実施形態の検出抗体には、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が標識物質として標識化されている。標識化された検出抗体は、抗体分子（マウスＩｇＧ分子）にＨＲＰが共有結合している。検出抗体の標識化は、公知の方法、例えば過ヨウ素酸法、マレイミド法、グルタルアルデヒド法などにより行うことができる。【００３８】
なお、本実施形態では、標識分子としてペルオキシダーゼを用いているが、検出抗体に結合する標識分子は、上述したペルオキシダーゼに限定されず、検出系に応じて他の分子を用いてもよい。例えば、アルカリホスファターゼなどの他の酵素、ＦＩＴＣ、ビオチン、金コロイドなどを標識化してもよい。【００３９】
捕獲抗体は、上述した実施形態のようにｐ２４と直接結合して固定化するものであってもよく、他の分子（例えば担体に固定化された抗体）を介して間接的に結合して固定化するものでもよい。
同様に、検出抗体についても、ｐ２４と直接結合して標識化するものであってもよく、他の分子（例えば、標識化された二次抗体）を介して間接的に結合して標識化するものでもよい。【００４０】
（検出抗原）
また、検出抗原としては、組み換えＨＩＶ−１抗原及び組み換えＨＩＶ−２抗原が使用されており、これらの抗原には、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が標識物質として標識化されている。
標識化された検出抗原は、抗原分子にＨＲＰが共有結合している。
検出抗原の標識化は、公知の方法、例えば過ヨウ素酸法、マレイミド法、グルタルアルデヒド法などにより行うことができる。【００４１】
なお、本実施形態では、標識分子としてペルオキシダーゼを用いているが、検出抗原に結合する標識分子は、上述したペルオキシダーゼに限定されず、検出系に応じて他の分子を用いてもよいことは、上記検出抗体の場合と同様である。【００４２】
（阻止抗体）
次に、本発明の阻止抗体とこれに結合する抗異種Ｉｇ抗体について説明する。阻止抗体は、ヒト検体中に含まれる抗異種Ｉｇ抗体と結合し、吸収するための抗体である。
抗異種Ｉｇ抗体は、上述した捕獲抗体と検出抗体の両方に共通のエピトープを認識し、結合する抗体である。この抗異種Ｉｇ抗体は、捕獲抗体と検出抗体の両方に結合してＨＩＶ−１偽陽性反応を示す。【００４３】
阻止抗体は、この共通のエピトープと同一のエピトープを分子内に有する抗体であり、抗異種Ｉｇ抗体により認識・結合される。このため、ヒト検体中に阻止抗体を加えることで、抗異種Ｉｇ抗体が阻止抗体に特異的に結合し、この結果、抗異種Ｉｇ抗体が吸収される。すなわち、抗異種Ｉｇ抗体は、阻止抗体と結合することで捕獲抗体や検出抗体と結合できなくなる。このため、抗異種Ｉｇ抗体による捕獲抗体と検出抗体との間のブリッジ形成を阻止することができる。【００４４】
阻止抗体は、捕獲抗体と検出抗体の由来となる生物種と同一の生物種から得ることができる。阻止抗体のクラス及びサブクラスは、捕獲抗体及び検出抗体と同一である。例えば、捕獲抗体と検出抗体がマウスＩｇＧ１であれば、阻止抗体もマウスＩｇＧ１となる。
なお、阻止抗体は、検出対象となるウイルス抗原と全く結合しないものが好ましい。阻止抗体がウイルス抗原を認識して結合すると、捕獲抗体や検出抗体のウイルス抗原への結合を阻害することがあり、この場合はウイルス抗原の正確な検出や定量が困難となるためである。【００４５】
阻止抗体は、ハイブリドーマ法により取得する方法や、マウス血漿中から直接取得する方法により得ることができる。
ハイブリドーマ法により取得する方法では、阻止抗体を産生するハイブリドーマを樹立して阻止抗体を産生させる。
例えば、阻止抗体としてマウスＩｇＧ１抗体を用いる場合、検出対象であるウイルス抗原と無関係な適当な抗原をマウスに免疫し、得られたマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合することで、マウスＩｇＧ１を産生するハイブリドーマを作製する。【００４６】
また、マウス血漿中から直接取得する方法では、検出対象であるウイルス抗原とは無関係な抗原を適宜選択してマウスを免疫し、この免疫マウスの腹水や血清からクロマトグラフィー法などを用いてマウスＩｇＧ１抗体を精製する。クロマトグラフィー法としては、イオン交換クロマトグラフィー、分子吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィーを１又は２以上組み合わせて行う方法が挙げられる。【００４７】
阻止抗体の量としては、抗異種Ｉｇ抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）の量に対して過剰量となるように添加されることが好ましい。阻止抗体の量が抗マウスＩｇＧ抗体に対して過剰量となることで、抗マウスＩｇＧ抗体のほとんどが阻止抗体と結合して吸収されるためである。
阻止抗体の量としては、具体的には、抗異種Ｉｇ抗体１分子に対して５倍量以上、好ましくは１０倍量以上、より好ましくは５０倍量以上となるように添加されることが好ましい。一方、阻止抗体の量の上限としては、特には限定されないが、あまりに多すぎるとコスト面で負担が大きくなる。したがって、好ましくは１００００倍量以下、より好ましくは１０００倍量以下、特に好ましくは１００倍量以下とするとよい。【００４８】
（ウイルス抗原及び抗体の検出キット）
以下に、本発明のウイルス抗原及び抗体の検出キットの１つの実施形態を示す。
本実施形態のウイルス抗原及び抗体の検出キットは、以下の材料から構成されている。
・マイクロプレート
・抗原・抗体希釈液
・洗浄液
・ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体（捕獲抗体）
・ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０抗原（捕獲抗原）
・ＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗原（捕獲抗原）
・ＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体（検出抗体）
・ＨＲＰ標識化ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０抗原（検出抗原）
・ＨＲＰ標準化ＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗原（検出抗原）
・マウスＩｇＧ（阻止抗体）
・過酸化水素水
・発色剤（例えばテトラメチルベンチジン）
・停止液（硫酸）【００４９】
（ウイルス抗原の検出方法）
次に、上記のウイルス抗原の検出キットを用いたウイルス抗原及び抗体の検出方法について説明する。
まず、マイクロプレートのウエルに捕獲抗体及び捕獲抗原混合溶液を載せ、マイクロプレート表面に捕獲抗体及び捕獲抗原を吸着させて固定化する。
マイクロプレート表面のうち捕獲抗体が吸着していない領域には、スキムミルクなどのブロッキング液でブロッキングしてもよい。
また、ＨＲＰで標識化された検出抗体及び検出抗原を準備する。
ＨＲＰの標識化は、上述した過ヨウ素酸法などの公知の手法で行うことができる。
なお、捕獲抗体及び捕獲抗原の固定化と検出抗体及び検出抗原のＨＲＰ標識化は、任意の順序で行うことができる。【００５０】
一方、ヒト検体（例えば血清）中にはＨＩＶ−１  ｐ２４の他に抗マウスＩｇＧ抗体（抗異種Ｉｇ抗体）が含まれている。
このヒト検体に過剰量の阻止抗体を混合し、反応させると、抗マウスＩｇＧ抗体が阻止抗体に結合し、吸収される。
阻止抗体を抗マウスＩｇＧ抗体に対して過剰量含まれるように添加すると、ヒト検体中に含まれる抗マウスＩｇＧ抗体のほとんどが阻止抗体と反応して吸収されるため好ましい。【００５１】
なお、吸収された抗マウスＩｇＧ抗体は、ヒト検体中に含まれていても捕獲抗体や検出抗体と反応しないため、反応後のヒト検体をウイルス抗原の検出反応にそのまま用いることができる。【００５２】
次に、阻止抗体反応後のヒト検体をマイクロプレートのウエルに載せ、抗原抗体反応によりマイクロプレートの表面に固定された捕獲抗体とｐ２４とを結合させるとともに、捕獲抗原とＨＩＶ−１抗体及びＨＩＶ−２抗体とを結合させる。
これと同時にあるいはこれに続けて、ＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体及びＨＲＰ標識化ＨＩＶ−１抗原、ＨＲＰ標識化ＨＩＶ−２抗原をウエルに載せ、抗原抗体反応によりｐ２４と検出抗体とを反応させるとともに、ＨＩＶ−１抗体及びＨＩＶ−２抗体と検出抗原とを反応させる。
反応後のマイクロプレートを洗浄し、血清タンパクや未反応の物質と検出抗体を除去する。【００５３】
洗浄後、発色剤（ＴＭＢ）を添加し、ペルオキシダーゼと反応させて青色に発色させる。
最後に、停止剤（硫酸）を混合し、発色反応を停止させる。
発色剤による発色を波長４５０ｎｍの吸光度で測定する。この吸光度は、ＨＩＶ−１  ｐ２４、ＨＩＶ−１抗体、ＨＩＶ−２抗体の濃度に比例する。
同時に各標準液の濃度と吸光度に基づいて検量線を作成しておき、この検量線とヒト検体の吸光度からヒト検体中に含まれる抗体及び抗原の濃度を定量することができる。【００５４】
以上の一連の工程で、ウイルス抗原及びウイルス抗体を検出することができる。なお、ヒト検体への阻止抗体の添加は、マイクロプレートにヒト検体を載せる前に行っても載せるのと同時に行ってもよい。阻止抗体をヒト検体に添加するタイミングを載置前とすることで、マイクロプレートに載せる前にヒト検体中の抗異種Ｉｇ抗体を予め阻止抗体で吸収することができる。一方、マイクロプレートにヒト検体を載せるのと同時に阻止抗体を添加することで、事前に阻止抗体を添加する作業が不要となり、操作が簡便になる。
なお、阻止抗体はヒト検体中に過剰に含まれても検出系にほとんど影響を及ぼさないため、本発明の検出キットは、抗異種Ｉｇ抗体を含むヒト検体のみならず、抗異種Ｉｇ抗体を含まないヒト検体であってもウイルス抗原を検出できることは言うまでもない。
【実施例】
【００５５】
以下に、本発明のウイルス抗原の検出方法とウイルス抗原の検出キットについて、具体的な実験例を示して詳細に説明する。【００５６】
１．捕獲抗体及び抗原・検出抗体及び抗原の作製
捕獲抗体及び捕獲抗原（ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６抗原）、検出抗体及び検出抗原（ＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体、ＨＲＰ標識化ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０検出抗原、ＨＲＰ標準化ＨＩＶ−２  ｇｐ２４検出抗原）は、公知の方法で作成される。【００５７】
２．ウイルス抗原及び抗体の検出キットの調製
上記捕獲抗体及び捕獲抗原（ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０捕獲抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６捕獲抗原）、検出抗体及び検出抗原（ＨＲＰ標識化  ｐ２４検出抗体、ＨＲＰ標識化ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０検出抗原、ＨＲＰ標準化ＨＩＶ−２  ｇｐ３６検出抗原）を使用してウイルス抗原の検出キットを作製した。
ウイルス抗原及び抗体の検出キットは以下の試薬等からなる。
（１）９６ウエルマイクロプレート（カセット方式）
（２）ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体
（３）ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０捕獲抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６捕獲抗原混合物。
（４）ＨＲＰ標識ＨＩＶ−１  ｐ２４検出抗体
（５）ＨＲＰ標識ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０検出抗原、ＨＲＰ標識ＨＩＶ−２  ｇｐ３６検出抗原混合物。
（６）抗原・抗体希釈液
０．５％Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と記す）、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む。
また、ＨＩＶ−１  ｐ２４検出の際に防止すべき非特異反応を阻止する阻止抗体（マウスＩｇＧ１を適量(最終濃度２．５〜５．０  ｕｇ／ｍｌ)含む。
（７）０．０１％過酸化水素水
（８）プレート洗浄剤
０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳであり、２０倍濃度で提供し、使用時に希釈して使用する。
（９）発色剤（１ｍｇ／ｍｌ  ＴＭＢを含むジメチルホルムアミド）
（１０）停止液（２Ｎ  硫酸）
（１１）プレートシール（ポリエチレン製粘着シール）
（１２）次亜塩素酸ナトリウム溶液
使用後の血液内のＨＩＶ不活性化に使用する。
なお、必ずしも添付される必要はない。【００５８】
３．ウイルス抗原及び抗体の検出キットの比較実験
Ａ．プレートの作製
（１）プレートに塗抹するのは、ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体、及びＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０捕獲抗原、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６捕獲抗原混合物である。
これらの混合溶液を適当な濃度に希釈する。このとき、塗抹用緩衝液としては２％トレハロースを含むＰＢＳを使用する。
次いで、この溶液を９６ウエルプレートに１ウエルあたり５０ｕｌ添加する。
また、プレートは蒸発を防ぐために専用のプレートシールで覆う。
室温で１時間あるいは４℃で一晩インキュベートして反応させる。
トレハロースは、本溶液をウエル内に均等に拡散させるために必要である。
（２）インキュベートした後、プレート洗浄液で洗浄し、直ちに使用するか、保湿バッグ（専用のポリエチレンバック）に入れてプレートシールで封印した状態で冷蔵庫において保存する。
なお、保湿のために、０．００１％チメロサールを加えた精製水を含浸させたろ紙を同封する。【００５９】
Ｂ．性能比較試験
（１）各ウエルに検体となる血清、及び陰性コントロール、陽性コントロール、ｐ２４陽性コントロール溶液を５０ｕｌ入れる。
ブランクウエルには何もしない。
（２）さらに各ウエルに適当な濃度に希釈した検出試薬（ＨＲＰ標識化ＨＩＶ−１  ｇｐ４１，ｇｐ１２０検出抗原、ＨＲＰ標識化ＨＩＶ−２  ｇｐ３６検出抗原及びＨＲＰ標識化ＨＩＶ−１  ｐ２４検出抗体）を５０ｕｌを入れる。
この混合検出液の希釈は、抗原抗体希釈液で行う。
（３）室温で１時間インキュベーとして反応させた後、プレート洗浄液で３〜５回洗浄する。
（４）過酸化水素水を基質、ＴＭＢを発色色素とする発色液を各ウエルに１００ｕｌ加え、１５分〜２０分反応させた後、２Ｎ硫酸を５０ｕｌ／ｗｅｌｌに加え反応を停止させる。
（５）プレート吸光度計（大日本製薬社製プレートリーダ）でＯＤ４５０を測定する。
場合によっては、（４）の反応後に青色の濃さを肉眼で判定する。【００６０】
Ｃ．サンプル
米国ＢＢＩ社がＨＩＶ感染診断キットの性能評価用に販売している陽転血清パネル、及びＨＩＶ−２感染血清パネルで評価した。【００６１】
Ｄ．結果
ａ．特異性及び感度試験結果
なお、本実施形態に係るキットと、アボット社製のキットとを同時に使用して比較試験を行った。
この試験においては、米国ＢＢＩ社がＨＩＶ感染診断キットの性能評価用に販売している陽転血清パネルのキットを用いて、ＨＩＶ検査陽転前後の血清との反応を見る方法が用いられている。
表１及び表２にキットの特異性及び感度試験の結果を示す。【００６２】
（表１）
2009122591.tif 000003
【００６３】
（表２）
2009122591.tif 000004
【００６４】
この結果より、アボット社から市販されているキットと同様な特異性と感度をもって、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２感染の血清診断が可能であることがわかった。
つまり、表１に示すように、「Ｐａｎｅｌ  ＢＧ」では、抗体が陽転する５日前にすでに抗原が陽性となっていた血清を本実施形態に係るキットで検出できたことが示されている。
また、同様に、「Ｐａｎｅｌ  ＢＨ」では、抗体が陽転する６日前にすでに抗原が陽性となっていた血清を本実施形態に係るキットで検出できたことが示されている。
両者とも、陰性の時期には、抗原及び抗体共に全く反応を示しておらず、このことより、特異性も示された。
更に、表２に示すように、ＨＩＶ−２感染者を確実に検出することができることも示された。
なお、ＢＬＤは、検出限界以下を示し、今回のカットオフ値は正常人血清が示す吸光度の５倍とした。
Ｓ／Ｃ値は、１．０以上で陽性と判定する。【００６５】
ｂ．検出感度試験
本実施形態に係るキットのＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出感度を表３及び図１に示す。
ＨＩＶ−１  ｐ２４標準液で検量線を作成した。
検量線は、両対数グラフである。【００６６】
（表３）
2009122591.tif 000005
【００６７】
検量線の相関式は下記の式で示される。
Ｌｏｇ（ｙ）＝−２．９５＋０．９２６＊Ｌｏｇ（ｘ）
検出限界は、４ｐｇ／ｍｌであった。【００６８】
ｃ．各種クレードＨＩＶ−１  ｐ２４抗原に対する反応性試験
本実施形態に係るキットで、様々なＨＩＶ−１株の反応性を調べた。
結果を表４に示す。
なお、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の吸光度のカットオフ値は０．０２とし、Ｓ／Ｃ値１．０以上を陽性とした。【００６９】
（表４）
2009122591.tif 000006
【００７０】
表４に示すように、試験を行った全てのＨＩＶ−１株を検出することができた。
この結果から、本実施形態に係るキットは、様々なＨＩＶ−１株に対応することができることが示された。【００７１】
以上より、本実施形態におけるキットでは、１段階で検査を終了することがでいるため、従来の方法に比して、短時間で感染症の検査を行うことができる。
【図１】
2009122591.tif 000007
【国際調査報告】
2009122591.tif 000008
2009122591.tif 000009
2009122591.tif 000010
2009122591.tif 000011