(57)【要約】  一般的なＭＡＬＤＩ法による質量分析法に適用可能で、試料に含まれている複数の測定対象分子の測定を従来法と比べて、定量的にかつ短時間で効率よく、また定量的に行うことができる質量分析法を提供することを課題とし、複数の測定対象分子を含む試料のＭＡＬＤＩ質量分析法であって、該複数の測定対象分子は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物であり、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の点から、該複数の測定対象分子についての定量的なマススペクトルを得ることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析法により課題を解決した。
2013031797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の測定対象分子を含む試料のＭＡＬＤＩ質量分析法であって、該複数の測定対象分子は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物であり、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の点から、該複数の測定対象分子についての定量的なマススペクトルを得ることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項２】
上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドの混合物であって、そのペプチド部分は同一であるか、又は、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一である請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項３】
上記複数の測定対象分子が糖の混合物であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項４】
上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項５】
上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドの混合物であって、その糖ペプチドは糖及び／又はペプチドがそれぞれ異なってもよいものであり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項６】
上記縮合多環化合物がピレン環化合物である請求項３ないし請求項５の何れかの請求項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項７】
上記ピレン環化合物が１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）である請求項６に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【請求項８】
測定試料に存在する上記複数の測定対象分子がそれぞれ１０ｐｍｏｌ以下である請求項１ないし請求項７の何れかの請求項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析法に関し、更に詳しくは、測定試料全体を測定し積算平均化することなくシグナルが出る任意の点から、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（以下、「ＭＳ」と略記することがある）法」とは、測定対象分子を含む試料をイオン化し、測定対象分子由来のイオンを質量電荷比（質量／電荷（ｍ／ｚ））によって分離し検出することによって、その測定対象分子の化学構造に関する情報を得る方法である。【０００３】
ＭＳにおいて、試料のイオン化は、分析の可否や得られるスペクトルの質を左右する重要な過程であり、試料を効率よくイオンにするためにこれまで多くのイオン化法が開発されてきた。現在のところ、生体高分子のイオン化には、ソフトイオン化であるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＭＡＬＤＩ」と略記することがある）法やエレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＥＳＩ」と略記することがある）法が主に用いられている。これらのイオン化法を用いた質量分析計は、ＮＭＲ等に比べて試料量が少なくても測定が可能であることから、バイオ分野でも広く用いられている。【０００４】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて、特に例えば糖類等の分析は、ペプチドやタンパク質等に比べて困難であると考えられている。その根本的な理由のひとつに、糖類のイオン化の効率がペプチド等に比べて著しく悪く、高感度分析が困難であることが挙げられる。【０００５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける試料のイオン化効率は、用いるマトリックスの種類、マトリックスへの添加剤、溶媒等の様々な要因により異なってくることが報告されており、感度良く測定するために特殊なマトリックスが開発されている（特許文献１〜３、非特許文献１〜２）。【０００６】
また、測定対象分子の性質そのものにも影響されるため、測定対象分子を誘導体化することでイオン化効率を向上させることも知られており、糖鎖の水酸基をメチル化する手法や、糖鎖の還元末端やシアル酸を誘導体化する手法が知られている（例えば、特許文献４〜５）。【０００７】
測定対象分子を予め誘導体化して別の分子に変換してから分析すると、測定対象分子の感度が上昇し、測定対象分子の正確な情報が得られるものは多い。また、測定試料に複数の測定対象分子が存在したり測定対象分子以外の分子も共存したりする場合に、その中の特定の分子のみが誘導体化されることによって他の分子と区別されることを利用して、より詳細な又は正確な情報を得る分析方法も考えられる。【０００８】
特に、測定対象分子の一部の物性を測定したり、測定対象分子のフラグメントを測定したり、誘導体化に用いた誘導体化剤の情報が測定対象分子の情報を阻害しなかったり、誘導体化剤の情報のみを除去できるような分析等に関しては、測定対象分子の誘導体化が好適に用いられ得る。【０００９】
例えば、非特許文献３には、４−アミノ安息香酸エチルエステル、２−アミノピリジン、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（１−ｐｙｒｅｎｅｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ；ＰＢＨ）等を用いて、予め糖鎖を誘導体化した後に試料支持部材に載せ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）する方法が提案されている。【００１０】
しかしながら、未だ、ＭＡＬＤＩのイオン化メカニズムは完全に解明されていないため、測定に用いる誘導体化試薬やマトリックスの選択、測定試料の調製方法等は、経験的な知見に基づく場合が多い。一般に、ＭＡＬＤＩで主として用いられる固体マトリックスにおいて、マトリックスと試料は良く混ざり、混合結晶となる必要があると考えられている。しかし、固体結晶となるため不均一となり、更に、結晶が生成した場所すべてから測定対象分子由来のイオンが得られるわけでもなく、生成した結晶のごく一部分にレーザーを照射した場合のみ測定対象分子由来のイオンが得られる。【００１１】
そこで、通常、測定は複数回（数十回〜数百回）のレーザー照射を繰り返し、個別に得られたスペクトルを積算平均化して代表スペクトルとする。定量的な測定には、１０００〜３０００レーザーショットの積算を行うことが多い。その際、測定試料表面の１点に固定しての測定では、表面のむらに影響されて代表的でないスペクトルとなるおそれがあるので、レーザー照射位置を移動しながら積算する手法が採られる。【００１２】
その際、自動測定により、一定間隔で多数の測定点を積算することも可能である（非特許文献４）。ところが、測定試料の状態によってはイオンの生成する部位が極めて限定的で、上記自動測定では結果的に貧弱で定量的でないスペクトルになってしまう場合がある。【００１３】
あるいは、測定対象分子由来のイオンが特に感度良く得られるスイートスポットを探し出して質の高いマススペクトルを得る手法もある。しかし、スイートスポットが結晶のどの部分であるかは測定対象分子によって異なり、それぞれのスイートスポットは経験によって探す他はない。
また、スイートスポットを探し出し、そこにレーザー照射を行ったとしても、スイートスポットの位置は測定対象分子によって異なるため、従来の調製方法で調製した測定試料では、複数の測定対象分子を定量的に測定することは難しかった。例えば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を正確に取得することは難しかった。【００１４】
ペプチドや糖ペプチドの混合物を単一の測定対象分子として分離することは一般に確立された方法はなく、特に、微量になると分離精製は極めて困難であった。
そこで、更に、糖タンパク質や糖ペプチドの糖鎖構造解析の際には、糖鎖を一旦ペプチドから切り離して、遊離糖鎖を精製して質量分析する方法が一般的であり、感度が低いため多量の試料が必要であること、作業に時間を要することや、試料が消費される等の問題点があった。【００１５】
このように、特に極めて微量の測定対象分子を含む試料に対しては、高感度で効率よく、短時間で測定対象分子を定量的に測定する質量分析法が強く望まれているが未だ十分な方法はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００８−２６１８２４号公報
【特許文献２】特開２００８−２６１８２５号公報
【特許文献３】特開２００１−０１３１１０号公報
【特許文献４】特開２００８−０５１７９０号公報
【特許文献５】ＷＯ２００６／１０９４８５号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Snovida,  S.I.  et  al.,  J.Am.Soc.  Mass  spectrom.  19  (2008)  1138-1146
【非特許文献２】Fukuyama,Y.  et  al.,  Anal.Chem.  80  (2008)  2172-2179
【非特許文献３】Sugahara,  D.  et  al.,  Anal.Sci.  19  (2003)  167-169
【非特許文献４】高橋他、ぶんせき  7  (2007)  328-335
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、一般的なＭＡＬＤＩ質量分析法に適用可能で、試料に含まれている複数の測定対象分子の測定を従来法と比べて定量的にかつ短時間で効率よく行うことができる質量分析法を提供することにある。【００１９】
更に、具体的には、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、測定試料の一部のシグナルが出る任意の点にレーザー照射することによって、短時間での定量測定をも可能にする質量分析法を提供することにある。
それによって、測定対象分子を含む試料が極めて微量であっても、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる質量分析法を提供することにある。【００２０】
また、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に適用して、その機能解明や病態の解明に有用な情報を好適に得ることができる質量分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、測定試料に含まれる複数の測定対象分子のうち、糖鎖構造が異なる糖ペプチドであったり、そこに糖を持たないペプチドが存在していたりしても、ペプチド部分の構造が同一であれば、試料支持部材上に調製したＭＡＬＤＩマトリックス結晶中で、シグナルが出る点やイオン化効率に優れたスイートスポットとなる位置は共通であることを見いだした。【００２２】
また、複数の測定対象分子の間で、ペプチド部分の構造が異なっている糖ペプチドであったり、ペプチドを持たない糖であったりしても、共通の誘導体化剤を用いて試料に誘導体化反応を施し、複数の測定対象分子に共通の誘導体化を行えば、測定対象分子のイオン化効率が極めて向上するだけでなく、複数の測定対象分子の「スイートスポットを含むシグナルが出る点」が、測定試料上の共通の位置に形成されることを見いだした。【００２３】
更に、試料の一部のシグナルが出る任意の点にレーザーを照射することにより、調製した測定試料の全体にレーザーを多点照射して長時間かけて測定しなくても、複数の測定対象分子の定量を、より短時間で効率よく行えることを見いだして本発明を完成するに至った。【００２４】
すなわち、本発明は、
［１］複数の測定対象分子を含む試料のＭＡＬＤＩ質量分析法であって、
該複数の測定対象分子は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物であり、
測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の点から、該複数の測定対象分子についての定量的なマススペクトルを得ることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００２５】
［２］上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドの混合物であって、そのペプチド部分は同一であるか、又は、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一である［１］に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００２６】
［３］上記複数の測定対象分子が糖の混合物であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する［１］に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００２７】
［４］上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する［１］に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００２８】
［５］上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドの混合物であって、その糖ペプチドは糖及び／又はペプチドがそれぞれ異なってもよいものであり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する［１］に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００２９】
［６］上記縮合多環化合物がピレン環化合物である［３］ないし［５］の何れかに記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００３０】
［７］上記ピレン環化合物が１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）である［６］に記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。【００３１】
［８］測定試料に存在する上記複数の測定対象分子がそれぞれ１０ｐｍｏｌ以下である［１］ないし［７］の何れかに記載のＭＡＬＤＩ質量分析法である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、前記問題点を解消し前記課題を解決し、複数の測定対象分子の測定を、従来法と比べて定量的に短時間で効率よく行うことができる。【００３３】
更に具体的には、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、試料の一部のシグナルが出る任意の点を測定することによって、複数の測定対象分子の定量測定をも可能にする質量分析法を提供することができる。そのため、測定対象分子を含む試料が極めて微量であっても、測定の再現性を向上させることができ、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる。【００３４】
また、複数の測定対象分子の混合物である場合、それぞれの測定対象分子のイオン化効率が異なったり、互いにイオン化を阻害したりする可能性があるので、測定試料全体を積算平均化するとかえって定量的な結果が得られないが、本発明によれば、複数の測定対象分子の混合物中の測定対象分子が同一のイオン化効率やシグナル分布を示すようになるので、測定試料全体を積算平均化しても、あるいは、シグナルが出る任意の１点を測定しても定量的な結果が得られる。【００３５】
また、本発明は微量な生体試料由来の分子や生体試料中の分子に適用できるので、例えば、糖、糖ペプチド、糖タンパク質等の分子の化学構造解析はもちろん、機能解明や病態の解明にも有用な情報をより好適に得ることができる。
バイオロジクスにも適用することができるので、各グリコフォームの存在比が明らかになり、薬理活性や有害作用の予測や品質管理にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例１において、測定対象分子としてピレン環化合物で標識された２種類の糖（Ａ２、Ａ２Ｆ）を含む試料のマススペクトルを示す図である。  Ｔｏｔａｌ：全体を自動測定した結果のマススペクトルである。  Ｐｏｉｎｔ  １〜３：測定試料の３箇所の測定点における個別マススペクトルである。
【図２】比較例１において、測定対象分子として２種類の糖（Ａ２、Ａ２Ｆ）を含む測定試料のマススペクトルを示す図である。  Ｔｏｔａｌ：全体を自動測定した結果のマススペクトルである。  Ｐｏｉｎｔ  １〜３：測定試料の３箇所の測定点における個別マススペクトルである。
【図３】比較例２において、測定対象分子として２−アミノベンザミドで標識した２種類の糖（２ＡＢ−ＮＡ２、２ＡＢ−ＮＡ２Ｆ）を含む試料のマススペクトルを示す図である。  Ｔｏｔａｌ：全体を自動測定した結果のマススペクトルである。  Ｐｏｉｎｔ  １〜２：測定試料の２箇所の測定点における個別マススペクトルである。
【図４】実施例２において、測定対象分子として５種類の糖ペプチドを含む試料の、マススペクトルと、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真と、測定対象分子のシグナルの出る点の分布を示す図である。  （ａ）〜（ｃ）：測定試料中の３箇所の測定点における個別マススペクトルである。
【図５】実施例３における、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真と、３種類の測定対象分子のシグナルの出る点の分布を示す図である。
【図６】実施例４における、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真と、３種類の測定対象分子のシグナルの出る点の分布を示す図である。
【図７】実施例５及び比較例３において、測定対象分子として６種類の糖ペプチドを含む試料の、マススペクトルと、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真と、測定対象分子のシグナルの出る点の分布を示す図である。  ａ：測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真である。  ｂ：全体を自動測定した結果のマススペクトルである。  ｃ：ペプチドとしてＥＥＱＦＮＳＴＦＲの構造を有する糖ペプチド３種類のシグナルの出る点の分布と、ペプチドとしてＥＥＱＹＮＳＴＹＲの構造を有する糖ペプチド３種類のシグナルの出る点の分布を示す図である。
【図８】実施例６における、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真と、測定対象分子のシグナルの出る点の分布を示す図である。
【図９】実施例で使用した化合物の構造を示す図である。
【図１０】実施例８における、Ｇｌｕ−Ｃ消化糖ペプチド混合物のマススペクトルを示す図である。
【図１１】実施例８における、測定対象分子のシグナルの出る点の分布を示す図である。
【図１２】実施例で使用した化合物の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
【００３８】
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、複数の測定対象分子を含む試料とマトリックスとから調製される質量分析法用測定試料（本発明においては、単に「測定試料」と略記することがある）を用いた質量分析法であって、複数の測定対象分子は共通のペプチド構造を有するか、又は、誘導体化試薬により共通の誘導体化構造を有することにより、シグナルが出る点が共通の位置に形成されるので、測定試料全体にわたって、例えば数百回以上の、レーザーショットを繰り返して得られたスペクトルを積算平均化することなく、測定試料の何れかの測定点にレーザーを照射して個別のスペクトルを測定するのみで定量的なマススペクトルを得ることを特徴とする。
【００３９】
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、複数の測定対象分子を含む試料のＭＡＬＤＩ質量分析法であって、該複数の測定対象分子は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物であり、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の点から、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることを特徴とする。
【００４０】
＜測定対象分子＞
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法が適用される測定対象分子は特に限定はないが、生体由来の分子又は生体試料中の分子であることが好ましく、具体的には、糖、糖ペプチド、ペプチド、糖タンパク質又はタンパク質であり、特に好ましくは、糖、糖ペプチド又は糖タンパク質である。
本発明において「糖」と記載するときは、主として糖鎖（オリゴ糖、多糖）をいうが、単糖も含めた糖類全般をいうものとする。また、糖タンパク質や糖脂質由来の「糖」も含む。
【００４１】
「測定対象分子」としては、天然物から調製されるもの、天然物を化学的又は酵素学的に一部改変して調製されるものの他、化学的又は酵素学的に調製されるものも好ましい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものや生体に含まれる分子を模倣して作製されたものも好ましい。
【００４２】
質量分析法に用いる試料支持部材（以下、「プレート」と略記することがある）上に載せる試料、すなわち、測定対象分子を含む試料としては、「測定対象分子」そのものだけでもよいし、「測定対象分子」を含むものであってもよい。
また、試料は、例えば、生体の組織、細胞、体液や分泌物（例えば、血液、血清、尿、精液、唾液、涙液、汗、糞便等）等から得られたものであってもよい。
試料をプレート上に載せ、酵素処理等を行なって、測定対象分子を調製してもよい。
【００４３】
「複数の測定対象分子を含む試料」中には、従って、測定対象分子以外の分子を含んでいてもよく、ここで「測定対象分子以外の分子」には、測定対象でない、糖、糖ぺプチド、ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、糖脂質、脂質等も含まれる。
【００４４】
上記した分子は、分析に供される試料が少量である場合が多く、また特に、糖、糖ぺプチド若しくは糖タンパク質のような複合糖質、又は、それらから化学的若しくは酵素学的に遊離させて得たものは、糖部分のイオン化の効率が著しく悪いために、又は、スイートスポットを含むシグナルの出る点が容易に見つからないために、測定を断念していた場合も多く、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、それら分子の化学構造解析に対して、特に前記顕著な効果を奏するので好ましい。
【００４５】
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法において、上記「複数の測定対象分子」は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物である。
【００４６】
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、
（ａ）上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドの混合物であって、そのペプチド部分は同一であるか、又は、
（ｂ）上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一である、ことが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該測定試料の任意のシグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある１点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
【００４７】
また、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、
（ｃ）上記複数の測定対象分子が糖の混合物であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製することが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある１点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
【００４８】
また、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、
（ｂｃ）上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する、ことが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある１点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
【００４９】
また、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法は、
（ｃ’）上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドの混合物であって、その糖ペプチドは糖及び／又はペプチドがそれぞれ異なってもよいものであり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する、ことが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある１点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
【００５０】
従来から、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の１点から、複数の測定対象分子についてのマススペクトルを得る方法は知られていた。
しかしながら、糖ペプチド（糖タンパク質）の糖鎖部分の化学構造を知りたい場合には、通常はペプチド部分（タンパク質部分）を外してから測定試料を調製するか、又は、外さずに測定試料全体を測定し積算平均化していた（多点測定の積算が行われていた）ため、有効な方法ではなかった。
【００５１】
本願発明は、ペプチド部分（タンパク質部分）を除かなくても、更に、上記した、（ａ）又は（ｂ）；（ｃ）；（ｂｃ）；（ｃ’）という「特定の測定対象分子の組み合わせ又は特定の測定試料の形態」にあっては、むしろ除かない方が、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、結果として前記した顕著な効果が得られることを見いだしてなされたものである。
【００５２】
また、従来から、誘導体化剤で測定対象分子を標識し、得られた測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の１点から、複数の測定対象分子についてのマススペクトルを得る方法は知られていた。
しかしながら、特定の誘導体化剤で測定対象分子を標識した場合には、ペプチド部分（タンパク質部分）は除いても除かなくても、複数の測定対象分子について、スイートスポットを含む「シグナルが出る点」が共通になり、その結果として前記した顕著な効果が得られることを見いだして、本願発明はなされたものである。
【００５３】
測定対象分子がペプチド又は糖ペプチドである場合、該ペプチド又は該糖ペプチドは、タンパク質や糖タンパク質を化学的に断片化したり、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ等の酵素を、単独又は組み合わせて用いて調製したりしたものであることが好ましい。どの方法が最適であるかはタンパク質のアミノ酸配列にもよるが、より小さいペプチドにするときはサーモリシン等が好ましく、Ｃ末端アミノ酸が同一になる点ではエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ等が好ましい。
【００５４】
誘導体化剤としてＰＤＡＭを用いるときは、以上のどの方法でもＣ末端アミノ酸のカルボキシル基が存在するので好適であるが、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを使用すると、Ｃ末端アミノ酸側鎖にもカルボキシル基が存在するので特に好ましい。
【００５５】
＜測定点＞
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、スイートスポットでなくても、測定試料のシグナルが出る任意の点から、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることを特徴とする。
本発明の極めて限定された「複数の測定対象分子」を含む測定試料においては、測定試料上のシグナルが出る点にレーザー照射すれば、その点が該「複数の測定対象分子」で共通するので、複数の測定対象分子を含有する試料中でのそれぞれの含有比率を正確に取得・把握できる。
【００５６】
「測定試料のシグナルが出る任意の点」とは、いわゆるスイートスポット（ｓｗｅｅｔ  ｓｐｏｔ）を含むが、シグナルが得られればよく、必ずしも高感度である点である必要はなく、「スイートスポット」には限られない。
「スイートスポット」とは、そこにレーザーを照射したとき、測定対象分子由来のイオンが特に感度良く得られる場所のことをいう。
【００５７】
「測定試料のシグナルが出る点」の大きさは、通常、１場所のレーザーの照射面積に等しく、市販のＭＡＬＤＩ質量分析法用の装置の１場所のレーザーの照射面積が好ましいが、具体的には、１００００μｍ２（１００μｍ×１００μｍ）以下が好ましく、１００μｍ２（１０μｍ×１０μｍ）〜２５００μｍ２（５０μｍ×５０μｍ）が特に好ましい。
【００５８】
本発明は、少なくとも測定対象分子のシグナルが出る任意の１点（スイートスポットも含まれる）から、「複数の測定対象分子について定量的なマススペクトル」を得ることが必須であるが、測定試料のシグナルが出る任意の２点以上の数点から、「複数の測定対象分子について定量的なマススペクトル」を得て、それらを平均化してもよい。ただし、測定試料全体を測定し積算平均化することは除かれる。
シグナルが出る任意の１点に対するレーザーショット数は限定されないが、５〜２０ショットが好ましい。
【００５９】
＜試料とマトリックスとの混合結晶の析出又は混合物の生成＞
本発明では、まず、ＭＡＬＤＩ質量分析法における測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させる。該混合結晶を析出させる方法は特に限定はないが、例えば、好ましい方法として、以下の（１）〜（３）が挙げられる。
（１）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥後又は乾燥する前にマトリックスの溶液を載置し、次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法。
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法。
（３）試料支持部材上に該マトリックスの溶液を載置し、次いで該溶液を乾燥させ該マトリックスの結晶を析出させた後、同一又は異なる化学構造を有するマトリックスと測定対象分子を含む溶液を重層し、次いで該溶液を乾燥させて混合物を生成させる方法。
【００６０】
液体マトリックスの場合は例えば以下のようになる。
（１）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥後又は乾燥する前にマトリックスの溶液を載置し、次いで、該混合溶液の溶媒を揮発させて、該混合物を生成させる方法。
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、次いで、該混合溶液の溶媒を揮発させて、該混合物を生成させる方法。
【００６１】
試料とマトリックスの混合結晶を析出させる方法として、特に好ましくは上記（１）又は（２）である。すなわち、
（１）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は、
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、
次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法
である。
【００６２】
＜＜（１）法＞＞
上記（１）法は、本発明において特に好適な方法であり、測定対象分子を含む試料を先に試料支持部材上に存在させ、次いで、マトリックスの溶液（好ましくは実質的にマトリックスのみの溶液）を、該試料に重層し、試料を溶解させながら、試料支持部材（以下、「プレート」と略記することがある）上で乾燥させて、結晶を析出させる測定試料の調製方法である。
【００６３】
上記（１）においては、マトリックス溶液をプレート上で乾燥する工程を、プレート上に物質を供給する工程の中では最終の工程とする。一般に、高いイオン生成量を得るためには試料とマトリックスがよく混合されなければならないとされているが、上記（１）の方法を用いれば、最終の工程でプレートに供給する溶液の中に測定対象分子が溶解（含有）されていなくてもマトリックスとよく混和する。
【００６４】
物質をプレート上に載置するための実質的な最終工程に、マトリックスのみの溶液を用いる場合、該溶液の溶媒は、測定対象分子と該マトリックスの何れをも溶解できる溶媒であることが好ましい。下層に既にある測定対象分子を溶解して、マトリックスと混合させることができるからである。
【００６５】
上記（１）法は、以下の、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を必須の工程として含むことが好ましい。
（Ａ）測定対象分子を含む試料の溶液をプレート上で乾燥する工程と、その後に、
（Ｂ）マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を、上記プレートに滴下する工程
【００６６】
工程（Ａ）では、測定対象分子を含む試料の溶液をプレート上で乾燥する。このときの溶液は、測定対象分子を含有してさえいればよく、マトリックスは含有されていてもいなくてもよい。ただし、測定対象分子を含む試料が極微量の場合、測定対象分子を含む試料の良溶媒がマトリックスの貧溶媒であり、そのマトリックスや溶媒を用いたい場合、マトリックスが溶解した溶媒に対して試料が不安定でありストック溶液として保管若しくは使用ができない又は取り扱いが難しくなる場合等には、測定試料の調製が容易である点、溶媒の選択幅が広がる点、試料の分解や容器への吸着を抑制できる点等のため、このときの溶液中にはマトリックスが溶解されておらず、測定対象分子を含む試料のみが溶解されている方が好ましい。
【００６７】
その際の溶媒としては、測定対象分子を含む試料を溶解しさえすれば特に限定はなく、マトリックスを溶解させる性質は有していなくてもよいし、常圧における沸点が高く、蒸発（乾燥）速度は遅くてもよい。測定対象分子又は測定対象分子を含む試料が水溶性であるならば、工程（Ａ）で用いる溶媒は水単独が特に好ましい。測定対象分子を含む試料が糖であるならば、工程（Ａ）で用いる溶媒は水単独が最も好ましい。マトリックスを溶解させないので、マトリックスに対する溶解度は低くてもよく、そのため測定対象分子又は測定対象分子を含む試料に最も好適な溶媒が選択できる。
【００６８】
工程（Ａ）における上記溶液中における測定対象分子の濃度は特に限定はないが、１ａｍｏｌ／μＬ〜１μｍｏｌ／μＬが好ましく、１００ａｍｏｌ／μＬ〜１ｎｍｏｌ／μＬが特に好ましい。工程（Ａ）終了後に（乾燥後に）、プレート上に存在する測定対象分子を含有する層の厚さは特に限定はないが、５μｍ以下が好ましく、１μｍ以下が特に好ましい。かかる層の厚さが厚すぎると、マトリックス溶液を滴下した場合にマトリックス分子とうまく混和しない可能性があり、ＭＳシグナル強度が低下する場合がある。
【００６９】
（１）法は、「測定対象分子を含む試料」の溶液をまずプレートに滴下するので、測定対象分子を含む試料が極めて微量である場合に、別の容器でマトリックス溶液と混合しその一部をプレートに滴下することなく、微量試料のほとんど全量を分析に供することができるため特に有用である。
【００７０】
（１）法においては、試料は複数の測定対象分子を含むが、それぞれの測定対象分子は、１０ｐｍｏｌ以下の場合が好ましく、１ｐｍｏｌ（１０００ｆｍｏｌ）以下の場合がより好ましく、３００ｆｍｏｌ以下の場合が特に好ましく、１００ｆｍｏｌ（例えば、それぞれの測定対象分子１００ｆｍｏｌ／μＬに溶解した水溶液を１μＬ滴下する等によりプレート上に１００ｆｍｏｌ載せる等）以下の場合に更に有用である。
【００７１】
（１）法においては、工程（Ａ）の後に、（Ｂ）マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下する工程を有する。「工程（Ａ）の後に」の意味は、「工程（Ａ）の直後に」には限定されず、工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に、他の工程が挿入されていてもよい。「他の工程」としては、例えば、後述する工程（Ｃ）が挙げられる。
【００７２】
工程（Ｂ）では、実質的にマトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下するが、測定対象分子と該マトリックスの何れをも溶解できる溶媒を用いることによって、下層の測定対象分子がマトリックス分子と混和し、乾燥後、混合結晶が現出し、スイートスポットが形成される。
【００７３】
＜＜＜誘導体化＞＞＞
（１）法において測定試料の誘導体化を行う場合は、上記工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に、
（Ｃ）測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を、上記プレートに滴下して乾燥する工程
を含むことが、イオン化効率を更に高めるために好ましい。
【００７４】
すなわち、（Ａ）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後であって、（Ｂ）マトリックスの溶液を載置する前に、（Ｃ）測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を該試料支持部材上に滴下して乾燥する工程を挿入するＭＡＬＤＩ質量分析法は、イオン化効率が更に高くなるために好ましい。
【００７５】
測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤（以下、単に「誘導体化剤」と略記する）を、予め測定対象分子と反応させてから、プレートに供給すると、測定試料のロスに繋がる場合がある。従って、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に質量分析法を適用する場合、工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に工程（Ｃ）を挿入することが特に好ましい。
【００７６】
誘導体化剤は、誘導体化された測定対象分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率を高めるものであれば特に限定はない。誘導体化剤は、ＭＡＬＤＩ質量分析法におけるマトリックスとしての効果を有する化合物、又はそれらに後記する反応性官能基やスペーサ部分を更に有する化合物も好ましい。
【００７７】
かかる誘導体化剤の化学構造は上記効果を奏するものであれば特に限定はないが、その分子内にナフタレン、アントラセン、ピレン等の縮合多環を有する縮合多環化合物が、上記効果（イオン化効率を高める効果）を好適に奏することに加えて、試料支持部材上において、測定対象分子のシグナルが出る測定試料上の点が共通になるためにより好ましい。「シグナルが出る測定試料の任意の点」にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について、試料中での混合比を反映した定量的なマススペクトルを得ることができる。
【００７８】
ここで「縮合多環化合物」とは、窒素、硫黄又は酸素分子を含む複素環を一部に含んでいてもよい縮合多環部分と、測定対象分子とを結合することが可能である反応性官能基と、要すれば、該縮合多環部分と該反応性官能基とを連結するスぺーサー部分とを有する化合物をいう。特に、芳香族環を有する縮合多環芳香族化合物であることが好ましい。
【００７９】
誘導体化剤は、測定対象分子に反応することによって、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子の、イオン化切断位置を制御できるようにするものであることが特に好ましい。
【００８０】
誘導体化剤は、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基、ヨード基（−Ｉ）等の反応性官能基を有することが好ましい。特に好ましい誘導体化剤としては、具体的には、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環等の縮合多環に、上記基が直接若しくは他の基（スペーサ部分）を介して結合した縮合多環誘導体化合物；ヨウ化メチル；ジアゾメタン；トリメチルシリルジアゾメタン等が挙げられる。
【００８１】
このうち、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率が高まる；イオン化切断位置を制御できる；試料支持部材上に調製した測定試料上で、複数の測定対象分子について、「シグナルが出る測定試料の点」が共通になる；等の点から、ピレン環化合物が特に好ましい。
ここで「ピレン環化合物」とは、ピレン環と、「測定対象分子」に結合することが可能である反応性官能基と、要すれば該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
【００８２】
具体的には、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）（以下、「ＰＢＨ」と略記する）、１−ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１−ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１−ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１−ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１−ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１−ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesμＬfonyl chloride）、１−ピレニルジアゾメタン（1-pyrenyldiazomethane）（以下、「ＰＤＡＭ」と略記する）、１−ピレンカルバルデヒド  ヒドラゾン（1-pyrenecarbaldehyde hydrazone）、１−ピレニルチオシアネート（1-pyrenylthiocyanate）、１−ピレニルイソチオシアネート（1-pyrenylisothiocyanate）等が好ましいものとして挙げられる。
【００８３】
誘導体化剤としては、上記具体的化合物において、ピレン環を、ナフタレン環又はアントラセン環に代えたものも好ましいものとして挙げられる。また、ヨウ化メチル、ジアゾメタン又はトリメチルシリルジアゾメタンも好ましい。
【００８４】
これらのうち、試料支持部材上に調製した測定試料中で、複数の測定対象分子について「シグナルが出る点」が共通になるために、更に好ましくはＰＢＨ又はＰＤＡＭであり、最も好ましくはＰＤＡＭである。「シグナルが出る測定試料の任意の点」にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について、効率よく、かつ定量的なマススペクトルを得ることができる。
【００８５】
好ましい「測定対象分子と誘導体化剤との組み合わせ」としては、測定対象分子がアルデヒド基を含有する糖鎖を有する分子であり、誘導体化剤がアミノ基又はヒドラジド基等を有するものである場合が挙げられる。
また、好ましい組み合わせとしては、測定対象分子が、カルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基を有する糖ペプチド若しくはペプチド、又は、かかる基を有する糖タンパク質若しくはタンパク質であり、誘導体化剤が、アミノ基、ヒドラジド基又はジアゾメチル基等を有するものである場合が挙げられ、更に、測定対象分子が、カルボキシル基を有する糖ペプチド若しくはペプチド、又は、かかる基を有する糖タンパク質若しくはタンパク質であり、誘導体化剤がヨウ化メチル又はトリメチルシリルジアゾメタンである場合が挙げられる。
これらの組み合わせは、測定対象分子及び誘導体化剤を、容易にプレート上で反応させることができる点、イオン化を阻害しない点、反応が選択的である点、一般に微量での分析の必要性が高いので、前記効果を奏し易い点等から好ましい。
【００８６】
測定対象分子と誘導体化剤の反応温度は特に限定はないが、４０〜１００℃で反応させることが好ましく、６０〜９０℃で反応させることが特に好ましい。室温より高い温度で反応させることによって、反応速度が増加する。
【００８７】
＜＜（２）法＞＞
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、試料支持部材上に該混合結晶を析出させる方法も好ましい。かかる（２）の測定試料の調製方法は、「Ｄｒｉｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ法」として知られているものである。（１）の調製方法で、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥する前にマトリックスの溶液を載置する方法も同様である。
【００８８】
（２）法においては、試料は複数の測定対象分子を含むが、それぞれの測定対象分子は、１０ｐｍｏｌ以下の場合が好ましく、１ｐｍｏｌ（１０００ｆｍｏｌ）以下の場合がより好ましく、３００ｆｍｏｌ以下の場合が特に好ましく、１００ｆｍｏｌ以下の場合が更に好ましい。
【００８９】
この（２）法においても測定対象分子の誘導体化を行ってもよい。「好ましい誘導体化剤」等は、（１）法と同様である。
【００９０】
＜マトリックス溶液＞
マトリックスはレーザーの光エネルギーを吸収して、共存する分析対象分子の脱離及びイオン化を達成する物質であれば液体及び固体を問わず種類は限定されないが、例えば、以下のものが挙げられる。
【００９１】
１，８−ジアミノナフタレン（1,8-Diaminonaphthalene）（１，８−ＤＡＮ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（2,5-Dihydroxybenzoic acid）（以下、「ＤＨＢＡ」と略記する場合がある）、１，８−アントラセンジカルボン酸ジメチルエステル（1,8-Anthracenedicarboxylic Acid Dimethyl ester）、ロイコキニザリン（Leucoquinizarin）、アントラロビン（Anthrarobin）、１，５−ジアミノナフタレン（1,5-Diaminonaphthalene）（１，５−ＤＡＮ）、６−アザ−２−チオチミン（6-Aza-2-thiothymine）、１，５−ジアミノアントラキノン（1,5-Diaminoanthraquinone）、１，６−ジアミノピレン（1,6-Diaminopyrene）、３，６−ジアミノカルバゾール（3,6-Diaminocarbazole）、１，８−アントラセンジカルボン酸（1,8-Anthracenedicarboxylic Acid）、ノルハルマン（Norharmane）、１−ピレンプロピルアミンハイドロクロライド（1-Pyrenepropylamine hydrochloride）、９−アミノフルオレンハイドロクロライド（9-Aminofluorene Hydrochloride）、フェルラ酸（Ferulic
acid）、ジトラノール（Dithranol）、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（2-(4-Hydroxyphenylazo) benzoic acid）（ＨＡＢＡ）、trans−２−［３−（４−tert−ブチルフェニル）−２−メチル−２−プロペニリデン］マロンニトリル（trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile）（ＤＣＴＢ）、trans−４−フェニル−３−ブテン−２−オン（trans-4-Phenyl-3-buten-2-one）（ＴＰＢＯ）、trans−３−インドールアクリル酸（trans-3-Indoleacrylic acid）（ＩＡＡ）、１，１０−フェナントロリン（1,10-Phenanthroline）、５−ニトロ−１，１０−フェナントロリン（5-Nitro-1,10-phenanthroline）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid）（ＣＨＣＡ）、シナピン酸（Sinapic acid）（ＳＡ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（2,4,6-Trihydroxyacetophenone）（ＴＨＡＰ）、３−ヒドロキシピコリン酸（3-Hydroxypicolinic acid）（ＨＰＡ）、アントラニル酸（Anthranilic
acid）、ニコチン酸（Nicotinic acid）、３−アミノキノリン（3-Aminoquinoline）、２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸（2-Hydroxy-5-methoxybenzoic
acid）、２，５−ジメトキシ安息香酸（2,5-Dimethoxybenzoic acid）、４，７−フェナントロリン（4,7-Phenanthroline）、ｐ−クマル酸（p-Coumaric acid）、１−イソキノリノール（1-Isoquinolinol）、２−ピコリン酸（2-Picolinic acid）、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（1-Pyrenebutanoic acid, hydrazide）（ＰＢＨ）、１−ピレンブタン酸（1-Pyrenebutyric acid）（ＰＢＡ）、１−ピレンメチルアミンハイドロクロライド（1-Pyrenemethylamine hydrochloride）（ＰＭＡ）、３−ＡＣ（アミノキノリン）−ＣＨＣＡ（3-AC(aminoquinoline)-CHCA）。
【００９２】
マトリックスを溶解させる溶媒としては特に限定はないが、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、それらの混合溶媒等が挙げられる。
マトリックス溶液の乾燥方法は特に限定されないが、加温する、冷却する、風を送る、減圧する等によって乾燥を促進することが効果的な場合がある。
【００９３】
＜質量分析装置＞
イオン化に用いられるレーザーとしては、窒素レーザー（３３７ｎｍ）、ＹＡＧレーザー３倍波（３５５ｎｍ）、ＮｄＹＡＧレーザー（２５６ｎｍ）、炭酸ガスレーザー（２９４０ｎｍ）等が挙げられるが、窒素レーザーが好ましい。イオンの分離検出方法は特に限定はなく、二重収束法、四重極集束法（四重極（Ｑ）フィルター法）、タンデム型四重極（ＱＱ）法、イオントラップ法、飛行時間（ＴＯＦ）法等を用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する。好ましくは、ＱＩＴ−ＴＯＦである。
【００９４】
糖、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質等の分子は、分子量や組成が同じ異性体を多く含むので、イオンの生成効率を向上させ、分子のフラグメント化をｎ回繰り返す方法（ＭＳｎ法）が好ましい。ＭＳｎ法により、例えば分子中の結合位置等を決定できる。
【実施例】
【００９５】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。【００９６】
実施例１
＜Ａ２／Ａ２Ｆ混合物、ＰＤＡＭ標識（誘導体化）、測定点によってスペクトルが一定＞
まず、質量分析用プレート（試料支持部材）に、測定対象分子である中性糖鎖Ａ２及びＡ２Ｆ（それぞれの化学構造を図９に示す）を水に溶解して、それぞれ１００ｆｍｏｌ／μＬにした水溶液を１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【００９７】
次に、誘導体化剤である標識試薬ＰＤＡＭ（１−ｐｙｒｅｎｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ；Ｐｒｏｂｅｓ社製）を、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＳＩＧＭＡ社製）に溶解させ、１０ｎｍｏｌ／μＬにした溶液を０．２５μＬ滴下し、ヒートブロック上で、７０℃、大気圧下に放置し乾燥させた。余剰の誘導体化剤を除くため、キシレン（ＳＩＧＭＡ社製）に浸し、余剰のＰＤＡＭを除去し十分に乾燥させた。【００９８】
次に、マトリックスとして、高純度ＤＨＢＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を６０％アセトニトリル水溶液に溶解して１０ｍｇ／ｍＬにした水溶液１．００μＬを試料支持部材上に滴下し、室温、大気圧下で溶媒を乾燥させ結晶化を行った。【００９９】
この測定試料について、ＭＡＬＤＩ質量分析法によってマススペクトルを取得した。測定は、質量分析計として、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ型質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、負イオンモードで行った。
また、測定試料の全域に対して、レーザーパワーを測定対象分子のイオンのシグナルが出始める閾値に最適化した後、５０μｍ間隔でレーザー照射を行い、自動測定した。
自動測定は、１点あたり１０ショットのレーザーを照射し、１つの測定試料につき２２０９点を測定し、積算平均化したスペクトルを取得した。【０１００】
得られたマススペクトルを図１に示した。図１の「Ｔｏｔａｌ」には、測定試料の全体を自動測定し積算平均化したスペクトルを、「Ｐｏｉｎｔ  １〜３」には、測定試料にレーザー照射し、糖鎖のシグナルが顕著に検出されたうちの異なる３点から得られたスペクトルを示した。【０１０１】
比較例１
＜Ａ２／Ａ２Ｆ混合物、標識（誘導体化）無し、測定点によってシグナルパターンが異なる＞
まず、質量分析用プレート（試料支持部材）に、測定対象分子である糖鎖Ａ２及びＡ２Ｆ（化学構造を図９に示す）を水に溶解して、それぞれ２ｐｍｏｌ／μＬ及び１ｐｍｏｌ／μＬにした水溶液を１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【０１０２】
この測定試料について、実施例１と同様の操作により結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によってマススペクトルを取得した。【０１０３】
得られたマススペクトルを図２に示した。図２の「Ｔｏｔａｌ」には、測定試料の全体を自動測定し積算平均化したスペクトルを、「Ｐｏｉｎｔ  １〜３」には、測定試料にレーザー照射した際に糖鎖のシグナルが顕著に検出されたうちの異なる３点で得られたスペクトルを示した。【０１０４】
比較例２
＜ＮＡ２／ＮＡ２Ｆ混合物、２ＡＢ標識（誘導体化）、測定点によってシグナルパターンが異なる＞
まず、質量分析用プレート（試料支持部材）に、測定対象分子である糖鎖ＮＡ２及びＮＡ２Ｆ（化学構造を図９に示す）の２−アミノベンズアミド（以下、「２ＡＢ」と略記する）の誘導体を水に溶解して、それぞれ１００ｆｍｏｌ／μＬにした水溶液を１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。
以下、２ＡＢで標識（誘導体化）したものを、「２ＡＢ−ＮＡ２」、「２ＡＢ−ＮＡ２Ｆ」等と表記する。【０１０５】
この測定試料について、実施例１と同様の操作により結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって正イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１０６】
得られたマススペクトルを図３に示した。図３の「Ｔｏｔａｌ」には、測定試料の全体を自動測定し積算平均化したスペクトルを、「Ｐｏｉｎｔ  １〜２」には、測定試料にレーザー照射した際に糖鎖のシグナルが顕著に検出されたうちの異なる２点で得られたスペクトルを示した。【０１０７】
＜実施例１、比較例１及び比較例２の結果＞
実施例１の「Ｐｏｉｎｔ  １〜３」のマススペクトルを比較すると、２つの測定対象分子のシグナルの相対強度は、レーザーを照射した場所によらず一定で、同一の測定試料内でばらつきがなく、各点それぞれのスペクトルは、測定試料の全体を自動測定し積算平均化したスペクトルと一致していた。【０１０８】
一方で、比較例１の図２の「Ｐｏｉｎｔ  １〜３」のマススペクトルを比較すると、２つの測定対象分子のシグナルの相対強度は、レーザーを照射した場所によって異なり、同一の測定試料内でもばらつきがあることが明らかである。具体的には、Ｐｏｉｎｔ  ２は、全体平均のスペクトルと類似のスペクトルを示していたが、Ｐｏｉｎｔ  １とＰｏｉｎｔ  ３は、２つのシグナルの強度比が平均のスペクトルとは逆転していた。【０１０９】
更に、比較例２においても、Ｐｏｉｎｔ  １と、Ｐｏｉｎｔ  ２のスペクトルを比較すると、２つのシグナルの強度比は測定場所によって異なっていた。【０１１０】
このことは、非標識の糖（比較例１）や、非標識の糖に比べて高感度にはなるが２−ＡＢにより誘導体化した糖（比較例２）では、測定場所により各シグナルの相対強度が異なったが、ＰＤＡＭを用いて誘導体化（標識）した糖（実施例１）では、各シグナルの相対強度が、測定試料中での位置に依存せず一定となった。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを１０分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。【０１１１】
実施例２
＜ＲＮａｓｅＢ糖ペプチド、標識（誘導体化）無し＞
＜ペプチドが付加することによって、糖鎖構造が不均一でもスペクトルのシグナルパターンが同一になることの実施例＞
まず、２０μｇのＲＮａｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ（ｗａｔｅｒｓ社製）を最終濃度が０．１％となるように加え、１００℃で５分間加熱した。冷却後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと１０ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトールを含む水溶液に溶解し、５５℃で４５分間インキュベートした。
反応後、１３５ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミドを５μＬ加え、暗所で４５分間静置した。次に、１μｇのＬｙｓ−Ｃを加え、３７℃で一晩反応させた。【０１１２】
反応後の溶液は、セルロースを用いて濃縮精製した後、得られた溶液を質量分析用プレート（試料支持部材）に１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【０１１３】
この測定試料について、実施例１と同様の操作により結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって正イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１１４】
図４に、測定試料において異なる３点で測定されたマススペクトルと、測定対象分子の糖ペプチド（Ｍａｎ５〜９−ＳＲＮＳＴＫ）の顕著にシグナルが検出された点の分布及び測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真を示した。
「ＳＲＮＳＴＫ」は、１文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。【０１１５】
＜実施例２の結果＞
実施例２の図４（ａ）〜（ｃ）のマススペクトルを比較すると、３つのスペクトルのシグナル強度比が場所によらず一定であることが分かる。更に、Ｍａｎ５〜７−ＳＲＮＳＴＫのシグナル分布は一致していた。【０１１６】
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が共通であれば、糖鎖部分の化学構造が異なっていても、シグナルが出る点の分布は共通であることを示している。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、より強いシグナルが出る点を時間をかけて探さなくても、シグナルが出る一部分だけを１０分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。【０１１７】
実施例３
＜ＩＲＮＫＳ／ＧｌｃＮＡｃ−ＩＲＮＫＳ／ＮＡ２−ＩＲＮＫＳ、標識（誘導体化）無し＞
まず、質量分析用プレート（試料支持部材）に、測定対象分子である、ペプチドＩＲＮＫＳを１ｐｍｏｌ／μＬ、糖ペプチドＧｌｃＮＡｃ−ＩＲＮＫＳを５００ｆｍｏｌ／μＬ、及び、ＮＡ２−ＩＲＮＫＳ（化学構造を図９に示す）５００ｆｍｏｌ／μＬを水に溶解した水溶液を１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。
「ＩＲＮＫＳ」は、１文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。【０１１８】
この測定試料について、実施例１と同様の操作によりマトリックスの結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって正イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１１９】
図５に、測定試料において測定対象分子であるペプチド及び糖ペプチドイオンのシグナルが顕著に検出されたそれぞれの位置及び測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真を示した。【０１２０】
＜実施例３の結果＞
実施例３の図５を比較すると、３つの測定対象分子のシグナル分布は一致していた。
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が共通であれば、糖鎖部分の有無や化学構造が異なっていても、それぞれのシグナル分布は共通であることを示している。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを１０分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。【０１２１】
実施例４
＜ＩＲＮＫＳ／ＧｌｃＮＡｃ−ＩＲＮＫＳ／ＮＡ２−ＩＲＮＫＳ、ＰＤＡＭ標識（誘導体化）有り＞
＜ペプチドが同一で、更にピレン標識されると、測定点によってシグナルパターンがより均一になる＞
まず、質量分析用プレート（試料支持部材）に、測定対象分子であるペプチドＩＲＮＫＳを１ｐｍｏｌ／μＬと、糖ペプチドＧｌｃＮＡｃ−ＩＲＮＫＳ及びＮＡ２−ＩＲＮＫＳ（化学構造を図９に示す）をそれぞれ５００ｆｍｏｌ／μＬを水に溶解した水溶液を１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。
「ＧｌｃＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルグルコサミンを示す。【０１２２】
次に、誘導体化剤である標識試薬ＰＤＡＭ（１−ｐｙｒｅｎｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＳＩＧＭＡ社製）に溶解させて１０ｎｍｏｌ／μＬにした溶液を０．２５μＬ滴下し、ヒートブロック上で、７０℃、大気圧下に放置し乾燥させた。
余剰の誘導体化剤を除くため、キシレン（ＳＩＧＭＡ社製）に浸し余剰のＰＤＡＭを除去し十分に乾燥させた。【０１２３】
この測定試料について、実施例１と同様の操作により結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって正イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１２４】
図６に、測定試料において測定対象分子であるペプチド及び糖ペプチドイオンのシグナルが顕著に検出されたそれぞれの位置及び測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真を示した。【０１２５】
＜実施例４の結果＞
実施例４の図６を比較すると、３つの測定対象分子のシグナルが出る点の分布は一致しており、実施例３の分布状態よりも更に均一になっていた。【０１２６】
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が共通で、更にＰＤＡＭによる誘導体化を行うと、糖鎖部分の有無や化学構造が異なっていても、それぞれのシグナルが出る点の分布は共通であることを示している。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを１０分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。【０１２７】
実施例５
＜ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２混合物、標識（誘導体化）無し＞
＜ＩｇＧ１又はＩｇＧ２のグリコフォームを調べることが可能＞
まず、２０μｇの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、主にサブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ２が含まれる）（和光純薬工業製）に、ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ（ｗａｔｅｒｓ社製）を最終濃度が０．１％となるように加え、１００℃で５分間加熱した。
冷却後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと１０ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトールを含む水溶液に溶解し、５５℃で４５分間インキュベートした。
反応後、１３５ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミドを５μＬ加え、暗所で４５分間静置した。反応後の溶液に１μｇのトリプシンを加え、３７℃で一晩反応させた。
「ＩｇＧ１」、「ＩｇＧ２」は、それぞれ、免疫グロブリンＧのサブクラスであり、上記の操作により、ＩｇＧ試薬から得られた測定対象分子の糖ペプチドを示す。【０１２８】
反応後、溶液はセルロースを用いて濃縮精製し、０．８％のトリフルオロ酢酸を加えて８０℃で４５分間加熱し、溶媒を乾燥させた。
得られた試料を水に溶解し、質量分析用プレート（試料支持部材）に１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【０１２９】
この測定試料について、実施例１と同様の操作により結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって負イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１３０】
図７（ａ）に、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真、図７（ｂ）には測定試料において得られたマススペクトル、図７（ｃ）には測定対象分子の糖ペプチドのシグナル（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２それぞれのＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）が顕著に検出されたそれぞれの位置を示した。【０１３１】
比較例３
＜実施例５と同じ「ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２混合物」、誘導体化無し＞
＜ペプチドの異なるＩｇＧ１とＩｇＧ２はＭＡＬＤＩイメージ偏在分離・不均一＞
実施例５において、ペプチド部分が異なり、糖鎖部分が共通の測定対象分子とする以外は、実施例５と同様の実験を行った。【０１３２】
＜実施例５と比較例３の結果＞
実施例５の図７（ｂ）のマススペクトルには、６種類の糖ペプチド（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２のそれぞれＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ））が検出されている。そのうちのＩｇＧ２の糖ペプチドＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆは、糖鎖の化学構造が異なるがペプチド部分はＥＥＱＦＮＳＴＦＲで共通である。また、ＩｇＧ１の糖ペプチドＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆは、糖鎖の化学構造が異なるがペプチド部分はＥＥＱＹＮＳＴＹＲで共通である。【０１３３】
これら６種類の糖ペプチドのシグナル分布を比較すると、ペプチド部分が共通の３つの測定対象分子のシグナルが出る点の分布は一致している。すなわち、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆの糖鎖が異なっても、ペプチド部分が同じの糖ペプチドであれば、それらのシグナルは、同一場所から再現性よく検出された。【０１３４】
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が共通であれば、糖鎖部分の化学構造が異なっていても、それぞれのシグナルが出る点の分布は共通であることを示している。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを１０分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。【０１３５】
一方、比較例３において、ペプチド部分が異なり、糖鎖部分が共通の測定対象分子同士のシグナル分布を比較すると、全く異なっていることが分かった。
従って、糖鎖が同一であっても、ペプチドが異なれば検出される位置も異なり、測定対象試料の一部分だけを測定して、ペプチド部分の異なる糖ペプチド同士のシグナル強度を比較することはできないことが分かった。【０１３６】
実施例６
＜ＩｇＧ１＋ＩｇＧ２混合物、誘導体化有り＞
＜感度向上、スペクトルパターン同一、ペプチドが異なってもＭＡＬＤＩイメージ類似、ペプチドの異なるＩｇＧ１とＩｇＧ２を比較することが可能＞
まず、２０μｇの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（和光純薬工業製）にＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ（ｗａｔｅｒｓ社製）を最終濃度が０．１％となるように加え、１００℃で５分間加熱した。冷却後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと１０ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトールを含む水溶液に溶解し、５５℃で４５分間インキュベートした。
反応後、１３５ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミドを５μＬ加え、暗所で４５分間静置した。次に、２μｇのキモトリプシンを加え、２５℃で一晩反応させた。
反応後、溶液はセルロースを用いて濃縮精製し、０．８％のトリフルオロ酢酸を加えて８０℃で４５分間加熱し、溶媒を乾燥させた。【０１３７】
得られた試料を水に溶解し、質量分析用プレート（試料支持部材）に１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【０１３８】
次に、誘導体化剤である標識試薬ＰＤＡＭ（１−ｐｙｒｅｎｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）をＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＳＩＧＭＡ社製）に溶解させ、１０ｎｍｏｌ／μＬにした溶液を０．２５μＬ滴下し、ヒートブロック上で、７０℃、大気圧下に放置し乾燥させた。
余剰の誘導体化剤を除くため、キシレン（ＳＩＧＭＡ社製）に浸し余剰のＰＤＡＭを除去し十分に乾燥させた。【０１３９】
この測定試料について、実施例１と同様の操作によりマトリックスの結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって負イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１４０】
図８には、測定試料の共焦点レーザー顕微鏡写真と、測定対象分子の糖ペプチドのシグナル（ＩｇＧ１（Ｇ１Ｆ）、ＩｇＧ２（Ｇ１Ｆ））が顕著に検出されたそれぞれの位置を示した。【０１４１】
実施例６のＩＧｇ１とＩｇＧ２の糖ペプチドのシグナル分布を比較すると、何れの糖ペプチドにおいても、測定試料の同一部分から強いシグナルが検出されていた。
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が異なっていても、ＰＤＡＭを用いて誘導体化することにより、それぞれの検出感度が増加するだけでなく、測定試料の一部分からでも、異なる糖ペプチドを同時に測定できることを示している。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。【０１４２】
実施例７
＜２種類の糖ペプチド混合物、誘導体化有り＞
＜感度向上、スペクトルパターン同一、ペプチドが異なってもＭＡＬＤＩイメージ類似、ペプチドの異なるＮＡ２−ＬＮＤＴＲとＮＡ２−ＡＱＮＮＧＳＮを比較することが可能＞
まず、２μｇのα２−ＨＳ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸アンモニウムに溶解し、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを最終濃度が２００Ｕ／ｍＬとなるように加え、５６℃で一晩インキュベートした。反応後、０．８％のトリフルオロ酢酸を加えて８０℃で４５分間加熱し、溶媒を乾燥させた。次に、試料に水を加えて再溶解し、カーボングラファイトカートリッジ（ＧＬサイエンス製）を用いて精製した。更に、セルロースを用いて濃縮精製した後、溶媒を乾燥させた。【０１４３】
得られた試料を水に溶解し、質量分析用プレート（試料支持部材）に１μＬ（１ｐｍｏｌ）滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【０１４４】
次に、実施例６と同様の操作により、糖ペプチドのＰＤＡＭ誘導体化を行った。【０１４５】
この測定試料について、実施例１と同様の操作によりマトリックスの結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって負イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１４６】
実施例７において得られた、ペプチドの異なる２種類の糖ペプチドＮＡ２−ＬＮＤＴＲとＮＡ２−ＡＱＮＮＧＳＮ（化学構造を図９に示す）のシグナル分布を比較すると、何れの糖ペプチドにおいても、強いシグナルが測定試料から一様に検出されており、その強いシグナルの分布は同一であった。更に、測定試料中で、異なる測定点から得られたマススペクトルを比較すると、２つの測定対象分子のシグナルの相対強度は、レーザーを照射した場所によらず一定で、同一の測定試料内でばらつきがなく、従って各点それぞれのスペクトルは、測定試料の全体を自動測定し積算平均化したスペクトルとも一致していた。【０１４７】
実施例８
＜多種類の糖ペプチド混合物、誘導体化有り＞
＜感度向上、スペクトルパターン同一、ペプチドが異なってもＭＡＬＤＩイメージ類似、ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃな糖鎖構造を比較することが可能＞
１０μｇのα１−ａｃｉｄ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を実施例６と同様に、ＲａｐｉＧｅｓｔで変性後、還元アルキル化を行い、５０ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸アンモニウムに溶解し、Ｇｌｕ−Ｃを５００ｎｇ（タンパク質量の１／２０）となるように加え、３７℃で一晩インキュベートした。
反応後、０．８％のトリフルオロ酢酸を加えて８０℃で４５分間加熱し、溶媒を乾燥させた。次に、試料に水を加えて再溶解し、セルロースを用いて濃縮精製した後、溶媒を乾燥させた。【０１４８】
得られた試料を水に溶解し、質量分析用プレート（試料支持部材）に１μＬ（２５０ｎｇ）滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。【０１４９】
次に、実施例６と同様の操作により、糖ペプチドのＰＤＡＭ誘導体化を行った。【０１５０】
この測定試料について、実施例１と同様の操作によりマトリックスの結晶化を行い、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって正イオン及び負イオンモードのマススペクトルを取得した。【０１５１】
図１０に、Ｇｌｕ−Ｃ消化糖ペプチド混合物のマトリックス結晶中の一部分にレーザーを照射して得られた負イオンスペクトルを示す。
Ｎ３８、Ｎ５４、Ｎ７５及びＮ８５の４カ所の糖鎖結合アスパラギンをそれぞれ含む糖ペプチドが検出された。Ｎ３８には、糖鎖ＮＡ２及びＮＡ３が結合し、Ｎ５４には、糖鎖ＮＡ２、ＮＡ３及びＮＡ４が結合し、Ｎ７５には、糖鎖ＮＡ３及びＮＡ４が結合し、Ｎ８５には、糖鎖ＮＡ２、ＮＡ３及びＮＡ４が結合することが分かった。【０１５２】
更に、図１１には、マトリックス全域を自動測定し、これらのうちの糖ペプチドのシグナルの分布を示したが、同一の分布であった。すなわち、ペプチドが同一で糖鎖が異なった糖ペプチド同士でも、ペプチドが異なる糖ペプチド同士でも分布は同じであり、各測定点のスペクトルは同一となることを示している。
正イオン測定でも同様の結果が得られた。【０１５３】
比較例４
＜多種類の糖ペプチド混合物、誘導体化無し＞
実施例８と同様に、α１−ａｃｉｄ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎをＧｌｕ−Ｃ消化を行った後、ＰＤＡＭ誘導体化を実施しなかった測定試料のＭＡＬＤＩ質量分析を行った。その結果、実施例８で検出された４カ所の糖鎖結合アスパラギンをそれぞれ含む糖ペプチドを検出することはできず、定量的なＭＳスペクトルを得ることはできなかった。
このことは、一種類のペプチドではなく、異なったペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドの混合物では、それぞれのペプチドをもつ糖ペプチドがマトリックス分子と異なった相互作用をしたり、互いにイオン化を阻害したりすることで、定量的な測定をすることが困難であることを示している。【０１５４】
実施例９
＜多種類の糖ペプチド混合物、誘導体化有り＞
α１−ａｃｉｄ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎを実施例６と同様な操作により得たサーモリシン消化糖ペプチド混合物でも同様の結果が得られた。すなわち、Ｎ１５を含むＩＴＮ、Ｎ５４を含むＦＴＰＮＫＴＥＤＴ、Ｎ７５を含むＩＹＮ、Ｎ８５を含むＶＱＲＥＮＧＴの４種類のペプチド（「ＩＴＮ」、「ＦＴＰＮＫＴＥＤＴ」、「ＩＹＮ」、「ＱＲＥＮＧＴ」はそれぞれ、１文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。）に複数の糖鎖が結合した糖ペプチドを検出し、それぞれのシグナル分布は同一であった。【０１５５】
以上のように、糖タンパク質から調製された糖ペプチド試料は、糖鎖部分及び／又はペプチド部分がそれぞれ異なった混合物であり、本発明により、縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製することが、試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。【０１５６】
特に、生体試料由来測定試料は、多種類の糖タンパク質が含まれていたり、一種類の糖タンパク質でも糖鎖が２カ所以上に結合していたりするので、糖鎖部分及び／又はペプチド部分がそれぞれ異なった混合物であり、本発明により、著しく効果を奏する。
更に、糖ペプチド調製にサーモリシンを用いると、比較的低分子量のペプチドを生じるので、縮合多環化合物で標識した測定対象分子中の共通の誘導体化構造の占有率が大きくなり好ましい。
あるいは、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ又はＡｒｇ−Ｃによる消化を実施すると、Ｃ末端アミノ酸が共通になるので、共通の誘導体化構造の効果を更に向上させるので好ましい。【０１５７】
以上のことは、糖ペプチドのペプチド部分が大きく異なっていても、ＰＤＡＭを用いて誘導体化することにより、それぞれのイオン化効率が一様に増加し、検出感度が増加するだけでなく、測定試料の一部分からでも、異なる糖ペプチドを同時に測定できることを示している。
従って、測定対象試料の全体を１時間以上かけて２００００回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、それぞれのより強いシグナルが出る点を探さなくても、最初に測定したシグナルが出る一部分だけを短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明の質量分析法は、試料に含まれている複数の分子を短時間で効率よく定量することができ、それによって信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができるので、微量な生体試料由来の分子や生体試料中の分子の化学構造解析はもちろん、機能解明や病態の解明の分野にも広く利用されるものである。【０１５９】
本願は、２０１１年８月３１日に出願した日本の特許出願である特願２０１１−１８８６１５に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図１０】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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