(57)【要約】  本発明は、鶏の卵殻強度に関連する遺伝子の存在を明らかにし、どのような遺伝子変異が卵殻強度の改善につながるのか特定し、かつ、遺伝子変異の検出によって、卵殻強度の強い鶏を識別する技術を提供することを目的とする。  本発明者らは、弱卵殻系統および強卵殻系統を親とする、Ｆ２交雑家系を作出し、卵殻強度関連遺伝子を解明するため、QTL（Quantitative trait loci、量的形質遺伝子座）解析を実施した。その結果、第９染色体上に卵殻強度に関連するQTLを見出した。さらに、オボカリキシン32（Ovocalyxin-32）遺伝子が卵殻強度に関係する形質に関連すること、該遺伝子の第６エキソンにおいて、アミノ酸残基置換を伴う一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検鶏について、オボカリキシン32遺伝子上の変異を検出することを特徴とする、野生型個体よりも卵殻強度関連形質が改善された卵を産むか否かを判定する方法であって、以下の工程（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）被検対象となる鶏から、DNAを抽出する工程
（ｂ）抽出したDNAにおいて、多型部位を含むDNA断片を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNA断片を解析し、多型を検出する工程
（ｄ）（ｃ）の工程において、検出された変異に基づき、卵殻強度の強い卵を産む鶏かどうかを判定する工程
【請求項２】
多型が一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多型部位において、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCである場合と比較してG、7056位の塩基種がAである場合と比較してC、7057位の塩基種がGである場合と比較してA、7063位の塩基種がCである場合と比較してT、7068位の塩基種がTである場合と比較してG、または7086位の塩基種がTである場合と比較してCである場合に、被検鶏が卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏であると決定する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
卵殻強度関連形質を決定するための対象形質が、卵重、卵殻重、卵殻強度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において、塩基配列の増幅がPCR法によって行なわれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）において、制限断片長多型（RFLP）を検出することにより、一塩基多型の存在を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
制限酵素Hinf I、CviBI、FnuAI、HhaIIまたはTfiIを用いて、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位の一塩基多型を検出することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において、増幅されたDNA断片の塩基配列を決定することにより、一塩基多型を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）において、一塩基多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするプローブにより、一塩基多型を検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オボカリキシン32タンパク質の変異体であって、野生型個体と比較して卵殻強度関連形質を改善する機能を有する、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載タンパク質。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、および7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAによってコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位における多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するプローブ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプローブを固定したDNAチップ。
【請求項１４】
配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位における多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載のプローブ、請求項１３に記載のDNAチップ、請求項１４に記載のプライマー、または制限断片長多型（RFLP）を検出するための制限酵素を含む、卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏か否かを判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵殻強度に関連する遺伝子と、その遺伝子変異に関するものであって、オボカリキシン32遺伝子上の変異を検出することを特徴とする、より卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏か否かを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏の遺伝的改良は、統計遺伝学的手法を用いて行われてきた。すなわち、表現型を測定した後、親から子に伝えられる能力（遺伝的能力）の度合いを推定し、それによって優良個体の選抜が行われてきた。【０００３】
卵殻強度に代表される卵質の測定は、成熟した雌でしか行うことができない。また雄の情報は、その雄を産んだ母親の遺伝的能力の半分を引き継いでいる、ということから推定するしかない。したがって、卵質の改良・個体選抜には、世代間隔を広く取り、成熟した個体を多数維持する必要があり、容易ではない。従って、卵殻強度等の卵質の優れた個体を容易に短期間で選抜できる技術の提供が強く要求される。【０００４】
ところで、鶏の産卵率、卵殻強度のように、連続した実数あるいは整数で示される形質を「量的形質」と呼ぶ。近年、鶏ゲノムの解析により、多くの量的形質と遺伝的に連鎖する遺伝子座、すなわち量的形質遺伝子座（QTL）が報告されている（非特許文献１：Poultry Science 85:2079-2096, 2006）。卵殻強度に関連するQTLは、第１、４、７およびZ染色体上にあると報告している。【０００５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Poultry Science 85:2079-2096, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した非特許文献１は貴重な報告であるが、非特許文献で提案されたQTLの中に、卵殻強度に関連する遺伝子が含まれる可能性があると仮定しても、いずれの遺伝子が卵殻強度に関連するのか、又、どのような遺伝子変異が卵殻強度に関連するのかの知見や示唆を与えない。【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、鶏の卵殻強度に関連する遺伝子の存在を明らかにし、どのような遺伝子変異が卵殻強度の改善につながるのか特定し、かつ、遺伝子変異の検出によって、卵殻強度の強い鶏を識別する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
農業・食品産業技術総合研究機構 畜産草地研究所は、卵用鶏の主流品種である白色レグホーン種の１つの系統を、卵殻強度によって１４世代以上選抜した弱卵殻系統および強卵殻系統を作出し、維持している。卵殻強度関連遺伝子を解明するため、両系統を親とする、Ｆ２交雑家系を作出した。弱卵殻系統と強卵殻系統は同じ系統を祖先とするので、この家系を丹念に解析すれば、卵殻強度の選抜によって変動した遺伝子情報が得られ、選抜によって動いた遺伝子群・座位に「卵殻強度決定遺伝子」が含まれると考え、QTL（Quantitative trait loci、量的形質遺伝子座）解析を実施した。【０００９】
そして、第９染色体上に卵殻強度に関連するQTLを見出した。これは、非特許文献１に記載されているQTLの位置（第１、４、７およびZ染色体）とは全く重複しない。【００１０】
該QTL情報と、鶏ゲノムの概要解読塩基配列（Ensembl Chicken Genome Browser http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/およびUCSC Chicken Genome Browser Gateway (2004) http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?org=Chicken&db=0&hgsid=30948908）と対比したところ、オボカリキシン32（Ovocalyxin-32）遺伝子に着目するに至った。【００１１】
該遺伝子と卵殻強度に関係する形質（卵殻重、卵重等）との関連について鋭意研究した結果、（１）該遺伝子の第６エキソンにおいて、アミノ酸残基置換を伴う一塩基多型（ＳＮＰ）が存在すること、（２）これら一塩基多型における塩基の種類にしたがって分類すると、国立バイオテクノロジー情報センターのタンパク質データベースEntrez （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein）に登録されているアミノ酸配列を持つタンパク質（野生型）を転写・翻訳産物とするものと、第６エキソンの一塩基多型に由来する野生型とはアミノ酸が５つ変異したタンパク質（変異型）を転写・翻訳産物とするものの２つのタイプの遺伝子型に大別されること、（３）さらに、２つの遺伝子タイプを持つ鶏が産する卵を比較したところ、卵重、卵殻重、短径、長径等の卵殻強度関連形質が有意に異なることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。
〔１〕  被検鶏について、オボカリキシン32遺伝子上の変異を検出することを特徴とする、野生型個体よりも卵殻強度関連形質が改善された卵を産むか否かを判定する方法であって、以下の工程（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）被検対象となる鶏から、DNAを抽出する工程
（ｂ）抽出したDNAにおいて、多型部位を含むDNA断片を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNA断片を解析し、多型を検出する工程
（ｄ）（ｃ）の工程において、検出された変異に基づき、卵殻強度の強い卵を産む鶏かどうかを判定する工程
〔２〕  多型が一塩基多型である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  多型部位において、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCである場合と比較してG、7056位の塩基種がAである場合と比較してC、7057位の塩基種がGである場合と比較してA、7063位の塩基種がCである場合と比較してT、7068位の塩基種がTである場合と比較してG、または7086位の塩基種がTである場合と比較してCである場合に、被検鶏が卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏であると決定する〔２〕に記載の方法。
〔４〕  卵殻強度関連形質を決定するための対象形質が、卵重、卵殻重、卵殻強度であることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  工程（ｂ）において、塩基配列の増幅がPCR法によって行なわれることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔６〕  工程（ｃ）において、制限断片長多型（RFLP）を検出することにより、一塩基多型の存在を検出することを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔７〕  制限酵素Hinf I、CviBI、FnuAI、HhaIIまたはTfiIを用いて、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位の一塩基多型を検出することを特徴とする、〔６〕に記載の方法。
〔８〕  工程（ｃ）において、増幅されたDNA断片の塩基配列を決定することにより、一塩基多型を検出することを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔９〕  工程（ｃ）において、一塩基多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするプローブにより、一塩基多型を検出することを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔１０〕  オボカリキシン32タンパク質の変異体であって、野生型個体と比較して卵殻強度関連形質を改善する機能を有する、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載タンパク質。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、および7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAによってコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質
〔１１〕  〔１０〕に記載のタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体。
〔１２〕  配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位における多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するプローブ。
〔１３〕  〔１２〕に記載のプローブを固定したDNAチップ。
〔１４〕  配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位における多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド。
〔１５〕  〔１２〕に記載のプローブ、〔１３〕に記載のDNAチップ、〔１４〕に記載のプライマー、または制限断片長多型（RFLP）を検出するための制限酵素を含む、卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏か否かを判定するためのキット。【００１３】
〔発明の実施の形態〕
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。【００１４】
本発明は、被検鶏について、オボカリキシン32遺伝子上の変異を検出することを特徴とする、野生型個体よりも卵殻強度関連形質が改善された卵を産むか否かを判定する方法であって、以下の工程（ａ）被検対象となる鶏から、DNAを抽出する工程、（ｂ）抽出したDNAにおいて、多型部位を含むDNA断片を増幅する工程、（ｃ）増幅したDNA断片を解析し、多型を検出する工程、および（ｄ）検出された変異に基づき、卵殻強度の強い卵を産む鶏かどうかを判定する工程を含む方法に関する。【００１５】
本発明において、「鶏」とは、学名Gallus gallus domesticusに属する動物を意味する。鶏の品種としては、白色レグホーン、褐色レグホーン、ミノルカ、アンダルシアン、オーストラロープなどの卵用種、横斑プリマスロック、白色プリマスロック、ロードアイランドレッド、ニューハンプシャー、ワイアンレッド、オーピントンなどの兼用種、白色コーニッシュなどの肉用種および尾長鶏、チャボなどの愛玩鶏に大別される（畜産大辞典、養賢堂、東京）が、判定対象（被検体）となる「鶏」は、上記いずれであってもよく、またこれらの交雑種であってもよい。好ましくは、卵用種、兼用種、あるいはこれらの交雑種その子孫が挙げられ、さらに好ましくは、白色レグホーンおよび白色レグホーンの交雑種とその子孫を挙げることができる。【００１６】
本明細書において、「オボカリキシン32（Ovocalyxin-32。以下、略して「OCX-32」ともいう。）」は、卵殻を構成する基盤タンパク質である。OCX-32のゲノム塩基配列を配列番号：１に示す。当該配列は、Ensembl Chicken Genome Browser http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/およびUCSC Chicken Genome Browser Gateway (2004) http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?org=Chicken&db=0&hgsid=30948908）の第９染色体23,996,312 - 24,003,804に示されており、当業者であれば容易に取得することができる。また、OCX-32のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。当該配列は、国立バイオテクノロジー情報センターのタンパク質データベースEntrez （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein）のアクセッション番号Q90YI1 に記載されており、当業者であれば容易に取得することができる。【００１７】
図３は、上記OCX-32遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）領域を模式的に示すものである。該ORFにエキソンは６つ存在する。以下、位置情報は、ORF領域の第１番目のヌクレオチドを「１」とし、同位置を基点として各位置が同位置から何番目のヌクレオチドに相当するかその番号を示している。【００１８】
本発明における「多型」の態様として、一塩基多型を挙げることができる。本発明の「一塩基多型部位」は、OCX-32遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域に存在する多型であれば、特に限定されない。【００１９】
本発明者らが詳細に調査検討した結果、OCX-32遺伝子の第６エキソンに見出した６つの一塩基多型（SNP）と、それによって生ずるOCX-32タンパク質のアミノ酸配列の変化が示される。【００２０】
具体的には、本発明の方法に用いる多型部位として、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位の多型部位に相当する多型部位を挙げることができる。【００２１】
本発明の好ましい態様においては、上述した多型部位における塩基種の変異が、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCである場合と比較してG、7056位の塩基種がAである場合と比較してC、7057位の塩基種がGである場合と比較してA、7063位の塩基種がCである場合と比較してT、7068位の塩基種がTである場合と比較してG、または7086位の塩基種がTである場合と比較してCである場合に、被検鶏が、卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏であると決定することができる。【００２２】
尚、配列番号１に示されるゲノムＤＮＡ配列は、突然変異などによりOCX-32遺伝子上（特に非翻訳領域（ＵＴＲ））において１〜数個の塩基の欠失または挿入等が生じている可能性がある。この場合、上記多型部位については、このような塩基の欠失または挿入等を考慮して読み替えて解釈するものとする。【００２３】
また、上記に示した一塩基多型部位の塩基種は配列表に示した配列に対して相補鎖側にある塩基種を示している場合があるが、本明細書において記載された前後配列を用いれば異同を確認することは当業者にとって容易であり、検出を行うにあたってはプラス鎖とマイナス鎖のどちらを調べても必然的にもう一方の結果を決定することができる。【００２４】
第６エキソンにある６つの一塩基多型（ＳＮＰ）のうち、５つの塩基置換は、アミノ酸置換を生じさせる。本発明者らが詳細に調査検討した結果、６つのＳＮＰは互いに独立した関係にはなく、原則として連鎖していることが判明した。例えば、第7052番目の塩基がシトシン（Ｃ）の時、7056番目の塩基はアデニン（Ａ）、7057番目の塩基はグアニン（Ｇ）、7063番目の塩基はＣ、7068番目の塩基はチミン（Ｔ）、7086番目の塩基はＴであった。この塩基配列から導かれるアミノ酸配列は、配列番号：２と同じであり、以下「野生型」と呼ぶ。反対に、本発明において新たに発見された変異体においては、第7052番目の塩基がグアニン（Ｇ）の時、7056番目の塩基はＣ、7057番目の塩基はＡ、7063番目の塩基はＴ、7068番目の塩基はＧ、7086番目の塩基はＣであった。この塩基配列から導かれるアミノ酸配列を配列番号：３に示し、以下「変異型」と呼ぶ。このことは、例えば、ある鶏が「野生型」の遺伝子型なのか「変異型」の遺伝子型なのかを調べる場合、7052、7056、7057、7063、7068、7086番目のいずれか一つの一塩基多型（SNP）を調べることによって、判定できることを意味する。【００２５】
本発明において、「卵殻強度関連形質が改善された」とは、好ましくは卵殻強度が向上することをいう。本発明において、卵殻強度は一般的な市場鶏卵の平均値よりも高ければよい。好ましくは、2.5 kg/cm2以上、好ましくは3.0 kg/cm2以上、さらに好ましくは3.5 kg/cm2以上、4.5 kg/cm2以上、5.0 kg/cm2以上である。【００２６】
本発明において、卵殻強度関連形質を決定するための対象形質は特に限定されないが、卵重、卵殻重、卵殻強度などが挙げられる。【００２７】
本発明における強卵殻系統を調査したところ、「変異型」遺伝子を持つ雌鶏の卵は、「野生型」遺伝子をホモで持つ雌鶏の卵より、卵重、卵殻重、短径、長径が有意に高い値を示した。すなわち、本発明で発見された「変異型」遺伝子を持つ雌鶏の卵は、「野生型」遺伝子をホモで持つ雌鶏の卵よりも、有意に大きいことが判明し、「変異型」遺伝子を持つ雌鶏は、卵の容積を小さくすることなく卵殻の強い卵である。この傾向は、本願で発見された「変異型」遺伝子をヘテロで持つ鶏に比べて、ホモで持つ鶏においてさらに大きい。【００２８】
本発明の判定方法において、OCX-32遺伝子の遺伝子型を調べる方法は特に限定されるものではなく、OCX-32遺伝子の7052、7056、7057、7063、7068、7086番目のいずれか一つの一塩基多型（ＳＮＰ）を直接的または間接的に調べることが可能な従来公知の方法を適用することができる。【００２９】
本発明の一塩基多型部位における塩基種の決定は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。【００３０】
本発明の方法は、（ａ）被検対象となる鶏から、核酸を抽出する工程、を含む。核酸の抽出は、当業者においては公知の方法によって行なうことができる。【００３１】
判定に供する遺伝子試料は、ゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであっても何れでもよい。ゲノムＤＮＡの場合は、被検体の鶏（屠殺前後を問わない）の任意の器官・組織・細胞・血液などの体液、羊水や漿尿液から採取した鶏胚由来細胞、採取した組織等を培養した細胞等から常法に従ってＤＮＡを精製・抽出すればよい。ｃＤＮＡの場合は、被検体の鶏の任意の器官・組織・細胞等から常法に従ってｍＲＮＡを精製・抽出した後、逆転写酵素によって合成すればよい。DNAまたはRNAの抽出は、当業者においては一般的に公知の方法、例えば、フェノール・クロロホルム法または市販のゲノムDNA抽出キットを用いて行うことができる。【００３２】
なお、有精卵においては、殻由来の核酸においては親となる鶏について、羊水または漿尿液から採取した鶏胚由来細胞由来の核酸では、子となる鶏について、卵殻強度関連形質を判定することができる。【００３３】
本発明の方法においては次いで、（ｂ）抽出した核酸において、多型部位を含む核酸断片を増幅する工程、を行なう。該核酸の増幅は、例えば、本発明の多型部位を含む核酸断片にハイブリダイズするプライマーを用いて、核酸試料を鋳型としたPCRを実施することにより行うことが可能である。PCRは、当業者においては、その反応条件等について実験または経験によって最適な条件を適宜選択して実施することが可能である。通常、PCRは、反応液および耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット、および市販のPCR装置等を利用して、簡便に実施することができる。PCRにより増幅するDNA領域としては、本発明の多型部位を含むDNA領域であれば特に制限はないが、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位のいずれかに相当する部分を含むDNA領域であることが好ましい。【００３４】
本発明のPCRに用いるプライマーとしては、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位のいずれかに相当する部分を含む塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。【００３５】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００３６】
本発明において使用されるSNPを含むDNA領域を増幅し得るプライマーオリゴヌクレオチドの配列は、当業者においては、鋳型となるDNAの配列情報に基づいて、適宜、設計することが可能である。好ましくは、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位のいずれかに相当する部分を含むDNAまたはその相補鎖であるDNAに相補的な連続する15塩基を含むオリゴヌクレオチドである。PCRにおいて、上記SNPを含むDNA領域を増幅する場合には、通常、上記SNPを含むDNA領域を挟み込むように設定されたオリゴヌクレオチドのペアが用いられる。配列番号：４および５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、最も好ましい本発明のオリゴヌクレオチドの例である。【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記SNPを含むDNA領域を増幅しうる限り、該DNA領域に完全に相補的である必要はない。例えば、5'末端側に数ベース程度の他の塩基への置換変異を有する、もしくは5'末端側に任意の塩基が付加されたオリゴヌクレオチドであっても、本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することが可能であるものと考えられる。【００３８】
本発明の上記オリゴヌクレオチドは、当業者においては、通常、市販されたオリゴヌクレオチド合成機もしくは合成オリゴヌクレオチド受託サービスを利用して容易に取得することが可能である。【００３９】
本発明のプライマーは、さらに修飾することができる。たとえば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーも本発明の方法に使用することができる。【００４０】
本発明においては次いで、（ｃ）増幅したDNA断片を解析し、多型を検出する工程を行なう。一例を示せば制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法を利用した方法を挙げることができる。【００４１】
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。【００４２】
本発明においては、例えば、制限酵素Hinf Iを用いて、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位一塩基多型を検出することができる。また、7052番目の塩基置換を検出するためにCviBI、FnuAI、HhaII、TfiIなどを使用してもよい。さらに、7056、7057、7063、7068、7086番目の塩基置換を検出する制限酵素であれば、種類は問わない。【００４３】
本発明の一塩基多型部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うこともできる。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。【００４４】
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、その塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、AcycloPrime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における多型部位の塩基種の決定に応用できる。【００４５】
また、PCR-SSP法を用いて塩基種を決定することもできる。PCR-SSP法とは、PCR産物にアレル特異的プライマーを用いて伸張反応を行い、SNP型を判定する方法である。判定は、シークエンサーでPCR産物のピークパターンを判別することで簡単に遺伝子型を決定できる。【００４６】
更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。【００４７】
より具体的には、前記OCX-32遺伝子の7052、7056、7057、7063、7068、7086番目のいずれか一つの塩基を検定するためのプローブを基板上に配置したＤＮＡチップ（または同種の器具）を作製し、このＤＮＡチップ等を用いて被検体からの遺伝子試料とプローブとのハイブリダイゼーションシグナルの有無により、一塩基多型（ＳＮＰ）のタイピングを行う方法である。プローブには、前記（１）〜（８）の多型部位の何れかの塩基を含む塩基配列またはその相補配列を用いることができる。尚、ここで、「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。このような本発明の判定方法に利用可能なＤＮＡチップ等の遺伝子多型検出器具も本発明に含まれる。【００４８】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アリル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。本発明においては、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位のいずれかに相当する多型部位のいずれかに記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション法に用いるプローブとして使用することができる。【００４９】
該オリゴヌクレオチドは、本発明の上記多型部位のいずれかの多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域における、上記OCX-32遺伝子のDNA塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。【００５０】
また、CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)マーカーあるいはプライマーに変異を導入し、制限酵素サイトを作り出すdCAPS (derived CAPS)マーカーを使用することもできる。dCAPSマーカーは、PCRのプライマーにテンプレートのDNAとミスマッチを起こして、PCR産物上に制限酵素サイトを作り出すという手法である（特開2003-259898）。【００５１】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を１本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。【００５２】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。【００５３】
本発明は、次いで（ｄ）（ｃ）の工程において、検出された変異に基づき、卵殻強度の強い卵を産む鶏かどうかを判定する工程を含む。本発明においては、上述のとおり、多型部位における塩基種の変異が、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCである場合と比較してG、7056位の塩基種がAである場合と比較してC、7057位の塩基種がGである場合と比較してA、7063位の塩基種がCである場合と比較してT、7068位の塩基種がTである場合と比較してG、または7086位の塩基種がTである場合と比較してCである場合に、被検鶏が卵殻強度の強い卵を産む鶏であると決定することができる。【００５４】
本発明の判定方法は、遺伝子組換え法などを用いて鶏の品種改良を行ったり、畜産等の分野に有用な遺伝子実験を行ったりする場合にも、対象となる鶏や精子などの選別に利用できる。その他、有精卵について孵化前の判定も可能であり、例えば羊水や漿尿液から鶏胚由来の細胞を採取し、その細胞から遺伝子試料を調製して、孵化前のひよこの段階で、卵殻強度が改善された卵を産む鶏であるかどうか等を判定することもできる。【００５５】
さらに、本発明は、卵殻強度関連形質を改善する機能を有する、OCX-32変異タンパク質を含む。本発明のOCX-32変異体として具体的には、卵殻強度が関連形質を改善する機能を有するOCX-32変異体であって、鶏由来である、下記（ａ）から（ｄ）のタンパク質を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、および7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAによってコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質【００５６】
本発明におけるOCX-32タンパク質の変異体とは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた含む。また、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位の塩基種がCからG、7056位の塩基種がAからC、7057位の塩基種がGからA、7063位の塩基種がCからT、7068位の塩基種がTからG、7086位の塩基種がTからCに変異した塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、OCX-32タンパク質の変異体として挙げることができる。【００５７】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸、塩基含有側鎖を有するアミノ酸、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸を挙げることができ、当業者であればこれらを適宜選択しうる。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。【００５８】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、OCX-32タンパク質の変異体と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、OCX-32タンパク質変異体の生物学的機能や生化学的機能としては、、卵殻強度関連形質を改善する機能を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。【００５９】
本発明は、また、本発明のOCX-32変異タンパク質に特異的に結合する抗体もまた提供する。【００６０】
本発明の検査薬の他の一つの態様は、OCX-32変異タンパク質を特異的に認識する抗体を含む、識別用試薬である。該抗体は、本発明の方法に用いることが可能な抗体であれば、特に制限されないが、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識されていてもよい。【００６１】
OCX-32変異タンパク質を認識する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。OCX-32変異タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントOCX-32変異タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、OCX-32変異タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、OCX-32変異タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどの試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、OCX-32変異タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、OCX-32変異タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【００６２】
本発明は、本発明の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、および多型部位を含むDNA領域にハイブリダイズするプローブを提供する。【００６３】
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、多型部位を含むDNAにおける、多型部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜２００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。【００６４】
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。【００６５】
本発明のプライマーの具体的な例としては、配列番号：１に記載の塩基配列における7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、または7086位に相当する多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドが挙げられるが、本発明のプライマーはこれに限定されるものではない。このようなプライマーの一例として、配列番号：４または５に記載のプライマーが挙げられる。【００６６】
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。【００６７】
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。【００６８】
本発明のプライマーまたはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、好ましくは１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。【００６９】
本発明のプローブの具体的な例としては、上述のように、配列番号：１に記載の塩基配列における、7052位、7056位、7057位、7063位、7068位、および7086位の多型部位に相当する多型部位のいずれかに記載の多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブであって、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するプローブが挙げられる。【００７０】
本発明はまた、本発明の卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏か否かを判定するための方法に使用するための試薬（検査薬）を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマー、プローブおよび／または抗体を含む。卵殻強度関連形質の判定においては上記、本発明の多型部位のいずれかに記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマー、プローブおよび／または抗体を用いる。【００７１】
本発明の試薬には、塩基種の決定方法に応じて、有効成分であるプライマー、プローブおよび／または抗体以外に、例えば、各種の酵素、酵素基質、緩衝液、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）および保存剤などを組み合わせることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基種決定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。【００７２】
さらに、本発明における試薬の別の態様は、本発明の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏か否かを判定するための試薬である。【００７３】
これらは本発明の多型部位を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、当業者に公知の方法で行なうことができる。【００７４】
また、本発明の試薬を少なくとも１つ含有する卵殻強度関連形質が改善された卵を産む鶏か否かを判定するためのキットもまた、本発明に含まれる。該キットには、上記プライマー、プローブまたは抗体のいずれかに記載の物質の他に、例えば、本発明の方法に用いるための各種試薬類、制限酵素、反応液、対照標品、反応容器、操作器具等を含めることができる。【００７５】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００７７】
被検体の鶏（白色レグホーン種）から調製したゲノムＤＮＡを遺伝子試料に用い、PCR-RFLP 法により判定を行った。OCX-32遺伝子の６つのＳＮＰ（7052、7056、7057、7063、7068、7086番目）は原則として連鎖しているので、６つのＳＮＰを含む部位を認識する制限酵素であればよいが、Hinf Iを使用して、7052番目の塩基を検出する場合を示す。【００７８】
PCR 反応液の組成は、ゲノムDNA30ng に、KOD plus ポリメラーゼ 0.125 Unit 、10×PCR バッファー 0.6μl、25mM dNTP mix 0.6μl、フォワードプライマー（200μM）及びリバースプライマー（200μM）各0.0125μlを加えたものを超純水で6μlにメスアップした。
この場合、設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列はそれぞれ下記
(a),(b) に示すとおりである。
(a)ATGACAGATAAGGAAGGACAAT（配列番号：４）
(b)AAGTAACAGAAAGTGAATGACG（配列番号：５）【００７９】
上記プライマー配列は、第６エキソンを挟むイントロンの塩基配列をもとに設計したものである。PCR の反応条件は、まず、（１）94 ℃  75秒間の熱変性後、熱変性（94 ℃、15秒）、アニーリング（60 ℃、30秒）、伸長反応（68 ℃、60秒）を10サイクル、アニーリング温度が55 ℃である点以外は同じ条件のサイクルを１０サイクル、更にアニーリング温度が50 ℃である点以外は同じ条件のサイクルを３０サイクル行い、最後に68 ℃、９分間の伸長反応を行った。【００８０】
上記PCR 法によって569bp のPCR 増幅産物を得た。このPCR 産物を制限酵素Hinf Iで処理すると、野生型遺伝子をホモで持つ個体は、278bpと297bpの断片が生じる。変異型遺伝子をホモで持つ個体は、7052番目の塩基が、チトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）に置換しているため、新たにHinf I認識部位（ＧＡＮＴＣ）が生じ、87bp、196bpおよび296bpの断片が生じる。そのため、３つの断片が検出される時、変異型と判断される。さらに、87bp、196bp、278bpおよび296bpの４つの断片が検出される場合、野生型と変異型遺伝子をヘテロで持つ個体と判断できる。【００８１】
尚、上記PCR-RFLP 法の何れの場合も、制限酵素の反応は、PCR 産物10μlに各制限酵素に対応する緩衝液2.0μlと制限酵素2Unit とを添加した後、超純水で20μlにメスアップし、この反応液を37 ℃ 下で一時間反応させた。電気泳動の条件は、２.5% アガロースゲルを用いて、100 Ｖ 、30 分間電気泳動を行った。【００８２】
図１には、電気泳動の結果が示される。このように、PCR-RFLP 法によれば簡便かつ精度良くOCX-32遺伝子の遺伝子型を調べることができる。【００８３】
畜産草地研究所では、共通の白色レグホーン系統から、非破壊変形を選抜形質として、１４世代以上選抜した、強卵殻系統（強系）と弱卵殻系統（弱系）が維持されている (非特許文献Nirazawaら、1998)。親世代（Ｐ）は、系統造成から２０世代目に該当する。Ｆ１は、強系雄６羽と弱系雌１６羽、弱系雄５羽×強系雌１７羽を交配して作出した。Ｆ２は、Ｆ１雄１７羽とＦ１雌６０羽を全兄弟交配し、262羽の雌鶏を得た。Ｆ２雌個体は、同じ日に同じ孵卵器で孵化し、同じ鶏舎で同じ餌を与えて、維持した。雌鶏の形質測定項目は、体重（240日齢時）のほか、卵重、卵殻重、卵殻厚、破壊強度、短径、長径などであり、卵の形質は、237-242日齢に産んだ卵のうち、最初の3個の測定値の平均を解析に用いた。DNA抽出キットを用いて、PーF1ーF2各個体の血液から、ゲノムDNAを抽出した。1014個の鶏のマイクロサテライトマーカーを試したが、わずか３１マーカーが、QTL解析に使用できた。その結果、体重、卵重、短径、長径、卵殻強度、卵殻厚、卵殻重のQTLを検出した（表１）。【００８４】
卵殻厚、卵殻重などの卵殻強度に関連するQTLが、第９番染色体の同一領域に検出された。【００８５】
【表１】
2009144809.tif 000002
＊：５％、＊＊：１％【００８６】
そこで、第９染色体（Chr9: 8556550-24004576、全長76.37 センチモルガン）の間に２９個のマイクロサテライトマーカーを新たに設定し、再び詳細なＱＴＬ解析を行った。その結果を図２および表２に示す。鶏では、検出されたＱＴＬ領域、特に７４〜７５センチモルガンに存在する遺伝子をドラフトゲノム配列と比較したところ、ただ一つの遺伝子OCX-32遺伝子を見出すに至った。【００８７】
【表２】
2009144809.tif 000003
＊：５％、＊＊：１％【００８８】
図３には、ニワトリゲノムの概要解読結果（ドラフトシーケンス）に基づくOCX-32遺伝子を模式的に表した。【００８９】
OCX-32遺伝子は、６つのエキソンを持っている。QTL解析用家系の親世代の強卵殻系統と弱卵殻系統（弱系）各個体のDNA塩基配列を、PCRダイレクトシーケンスによって、プラス鎖（センスストランド）とマイナス鎖（アンチセンスストランド）の両鎖を解読した後、SNP（一塩基多型）の存在を確認した。その結果、OCX-32遺伝子の第６エキソンに、アミノ酸配列の非同義置換を伴う、互いに連鎖したSNPを見出した（図３）。第６エキソンにある６つのＳＮＰのうち、５つの塩基置換は、アミノ酸置換を生じさせる。本発明者らが詳細に調査検討した結果、６つのＳＮＰは互いに独立した関係にはなく、原則として連鎖していることが判明した。例えば、第7052番目の塩基がシトシン（Ｃ）の時、7056番目の塩基はアデニン（Ａ）、7057番目の塩基はグアニン（Ｇ）7063番目の塩基はＣ、7068番目の塩基はチミン（Ｔ）、7086番目の塩基はＴであった。この塩基配列から導かれるアミノ酸配列は、配列番号２と同じであり、以下「野生型」と呼ぶ。反対に、第7052番目の塩基がグアニン（Ｇ）の時、7056番目の塩基はＣ、7057番目の塩基はＡ、7063番目の塩基はＴ、7068番目の塩基はＧ、7086番目の塩基はＣであった。この塩基配列から導かれるアミノ酸配列を配列番号３に示し、以下「変異型」と呼ぶ。このことは、例えば、ある鶏が「野生型」の遺伝子型なのか「変異型」の遺伝子型なのかを調べる場合、7052、7056、7057、7063、7068、7086番目のいずれか一つの一塩基多型（ＳＮＰ）を調べることによって、判定できることを意味する。【００９０】
【表３】
2009144809.tif 000004
【００９１】
OCX-32遺伝子において、野生型はEntrezに登録されているアミノ酸配列をもつOCX-32タンパク質を生成すると推測される。一方、変異型では図４に示すような、５つのアミノ酸残基が連続的に変異したOCX-32タンパク質を生成すると推測される。【００９２】
１８年度飼養された強卵殻系統を調査したところ、野生型および変異型対立遺伝子の頻度はそれぞれ、25.34%、74.66%であった。また、野生型のホモ個体（Ｗ／Ｗ）、野生型と変異型のヘテロ個体（Ｗ／Ｍ）、変異型のホモ個体（Ｍ／Ｍ）の頻度はそれぞれ、6.47%、37.74%、55.80%であった。【００９３】
強卵殻系統を調査したところ、「変異型」遺伝子をホモで持つ雌鶏（Ｍ／Ｍ）の卵は、「野生型」遺伝子をホモで持つ雌鶏（Ｗ／Ｗ）の卵より、卵重、短径、長径、卵殻重が有意に高い値を示した。すなわち、「変異型」遺伝子をホモで持つ雌鶏（Ｍ／Ｍ）の卵は、「野生型」遺伝子をホモで持つ雌鶏（Ｗ／Ｗ）の卵よりも、有意に大きいことが判明し、「変異型」遺伝子をホモで持つ雌鶏（Ｍ／Ｍ）は、卵の容積を小さくすることなく卵殻の強い卵を産むことが明らかになった。【００９４】
【表４】
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＊：５％、＊＊：１％
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、OCX-32遺伝子の遺伝子型に基づき、検査対象の鶏が卵殻強度の改善された卵を産むかどうかを判定する方法に関するものであり、畜産（鶏の飼育・繁殖・育種・改良等）、卵の生産加工等の分野に利用可能である。検査対象は、雌鶏だけにとどまらず、雄鶏であっても、その子孫が、卵殻強度の改善された卵を産むタイプの遺伝子型を保有するか、判定でき、鶏の育種や品種改良などに利用できる。【００９６】
また、この評価結果をもとに、例えば交配の際、遺伝子型に基づき分類された、卵殻強度の改善される遺伝子型を持つ鶏同士を交配して、鶏の育種や品種改良などにも利用できる。【００９７】
さらに、遺伝子組換え法などを用いて鶏の品種改良を行ったり、畜産等の分野に有用な遺伝子実験を行ったりする場合にも、対象となる鶏や精子などの選別に本発明の判定方法を利用できる。その他、有精卵について孵化前の判定も可能であり、例えば羊水や漿尿液から鶏胚由来の細胞を採取し、その細胞から遺伝子試料を調製して、孵化前のひよこの段階で、卵殻強度が改善された卵を産む鶏であるかどうか等を判定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】PCR-RFLP法によるOCX-32遺伝子7052番目のSNP検出結果を示す写真である。
【図２】第９染色体のＱＴＬ解析の結果を示す図である。
【図３】ニワトリゲノムの概要解読結果に基づくOCX-32遺伝子の模式図である。
【図４】野生型OCX-32遺伝子と変異体とのアミノ酸配列の比較図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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