(57)【要約】  本発明は、がん幹細胞などの低酸素状態で複製能力をもつ細胞で特異的に遺伝子を発現し傷害することのできるウイルスまたはウイルスベクター、およびそれらを含む医薬組成物を提供する。詳細には、本発明は、ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスまたはウイルスベクター、およびそれらを含む医薬組成物を提供する。
2009090933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Oxygen-dependent Degradation Domain（ＯＤＤ）とウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、ウイルスまたはウイルスベクター。
【請求項２】
増殖に必須のタンパク質がヘルペスウイルスのＩＣＰ４、γ３４．５、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、レトロウイルス  ＬＴＲのＲおよびＵ５からなる群より選択されるものである、請求項１記載のウイルスまたはウイルスベクター。
【請求項３】
増殖に必須のタンパク質がＩＣＰ４である、請求項２記載のウイルスまたはウイルスベクター。
【請求項４】
リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）が欠損している、請求項１から３のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター。
【請求項５】
（ａ）請求項１から４のいずれか記載のウイルスを細胞に感染させ、
（ｂ）該細胞を低酸素状態で培養し、次に、
（ｃ）増殖したウイルスを回収する、
を含む、ウイルスまたはウイルスベクターの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により得ることのできるウイルスまたはウイルスベクター。
【請求項７】
ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ株である、請求項６記載のウイルスまたはウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、または請求項６または７記載のウイルスまたはウイルスベクターを含む、細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項９】
疾患ががん、肺線維症、肺高血圧症、虚血性心または脳疾患における血管狭窄症からなる群より選択されるものである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
疾患ががんである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
がんに存在するがん幹細胞を標的とするものである、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
低酸素状態が酸素分圧：１０ｍｍＨｇ以下の状態である、請求項８から１１のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１３】
対象における細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための方法であって、請求項１から４のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、または請求項６または７記載のウイルスまたはウイルスベクターを対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項１４】
対象における細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための医薬の製造のための、請求項１から４のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、または請求項６または７記載のウイルスまたはウイルスベクターの使用。
【請求項１５】
ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１５記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス、かかるウイルスを用いたウイルスの製造方法およびそれにより得ることのできるウイルスまたはウイルスベクター、ならびに該ウイルスまたはウイルスベクターを含む、細胞が低酸素状態にあることを特徴とする疾患を治療または予防するための医薬組成物などに関するものである。なお、本願は、２００８年１月６日出願の特願２００８−７１７９に対して優先権の利益を主張するものであり、参照により特願２００８−７１７９の全内容を本明細書に一体化させる。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、これまでの研究で、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）の遺伝子を改変し、ウイルスがカルポニン遺伝子を発現し増殖する細胞、すなわち平滑筋肉腫や中皮腫、血管狭窄部位で増殖する平滑筋細胞に感染した場合にのみ細胞内で増殖することを可能にし、これにより感染細胞内で遺伝子を発現させたり感染細胞を破壊する方法を開発した（特許文献１）。【０００３】
腫瘍内の低酸素環境にあるがん細胞は、放射線治療や化学療法が無効で、遠隔臓器への転移能を有する。また、急性骨髄性白血病において、骨髄の低酸素領域で自己複製能をもつ細胞集団におけるがん幹細胞の存在が報告された（非特許文献１）。さらに、最近、乳がんや脳腫瘍、大腸がんなどの固形がんにおいても、がん幹細胞の存在が報告されている（非特許文献２）。一般に、がん幹細胞は治療に抵抗性で高い転移能をもち、低酸素環境下でも自己複製が可能ながん細胞であると考えられている（非特許文献３）。従って、がん幹細胞のような低酸素領域にあるがん細胞を選択的に破壊する治療法の開発が望まれている。【０００４】
低酸素下にある細胞においてのみ安定化する転写因子ＨＩＦ１αのアミノ酸配列のうち正常酸素分圧における蛋白分解の目印となるＯＤＤ（酸素依存性分解ドメイン）配列を用いて、任意のタンパク質を低酸素下で安定に発現させる方法が研究されてきた。例えば、ＯＤＤ配列をアポトーシス促進因子であるカスパーゼ３タンパク質のアミノ末端に付加した融合タンパク質を作成し、低酸素下にある細胞でのみカスパーゼ３蛋白を活性化し、がん細胞でアポトーシスを誘導する方法やジフテリア毒素蛋白を発現させる方法が開発されている（非特許文献４および５）。しかしながら、かかる方法は、がん細胞などの異常細胞のみならず、正常細胞をも標的とする。また、ＯＤＤ配列で発現を抑制したタンパク質を直接投与するため、分解などのため発現が持続せず治療効果が弱いという欠点がある。標的細胞に特異的で強い治療効果の得られる方法の開発が必要である。また、これまでにＨＩＦ１αに応答するプロモーター配列Hypoxia-Responsive Element（ＨＲＥ）の下流にＥ１Ａ遺伝子を連結して低酸素条件下にある細胞でのみ複製可能なアデノウイルスが作成されているが、酸素分圧に依存したプロモーター活性のオン・オフ制御が不十分で、正常細胞への傷害活性が懸念されている（非特許文献６）。
【特許文献１】特願２００６−２０５００６
【非特許文献１】Sipkins D.A. et al. Nature 435, 969-973, 2005
【非特許文献２】Ailles L.E. and Weissman I.L. Curr. Opin. Biotech. 18, 460-466, 2007
【非特許文献３】De Toni F. et al. Oncogene 25, 3113-3122, 2006
【非特許文献４】Harada H. et al. Cancer Res. 62, 2013-2018, 2002
【非特許文献５】Koshikawa N. and Takenaga K. Cancer Res. 65, 11622-11630, 2005
【非特許文献６】Cuevas Y. et al. Cancer Res. 61, 6877-6884, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決課題は、がん幹細胞などの低酸素状態にある細胞を特異的に傷害するためのウイルス、低酸素状態にある細胞、好ましくは低酸素状態で複製能力をもつ細胞でより多く遺伝子を発現するウイルスベクター、およびそれらを含む医薬組成物などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）をウイルスの増殖に必須のタンパク質と融合させ、かかる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスを作製した。かかるウイルスは、正常酸素分圧にある細胞に感染した場合、該融合タンパク質がＯＤＤ配列内にあるプロリン残基がプロリン水酸化酵素によって水酸化修飾を受ける結果ユビキチン・プロテアソーム系によって認識され分解されるが、低酸素条件、例えば１０ｍｍＨｇ以下の酸素分圧では分解されない。したがって、正常酸素分圧にある細胞ではウイルスは増殖できず、低酸素状態にある増殖細胞に感染した場合にのみ特異的に増殖し、搭載遺伝子を発現すること、および特異的な溶解作用を生じさせ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、下記の（１）〜（１６）を提供するものである。
（１）Oxygen-dependent Degradation Domain（ＯＤＤ）とウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、ウイルスまたはウイルスベクター、
（２）増殖に必須のタンパク質がヘルペスウイルスのＩＣＰ４、γ３４．５、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、レトロウイルス  ＬＴＲのＲおよびＵ５からなる群より選択されるものである、（１）のウイルスまたはウイルスベクター、
（３）増殖に必須のタンパク質がＩＣＰ４である、（２）記載のウイルスまたはウイルスベクター、
（４）リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）が欠損している、（１）から（３）のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、
（５）（ａ）（１）から（４）のいずれか記載のウイルスを細胞に感染させ、
（ｂ）該細胞を低酸素状態で培養し、次に、
（ｃ）増殖したウイルスを回収する、
を含む、ウイルスまたはウイルスベクターの製造方法、
（６）（５）記載の方法により得ることのできるウイルスまたはウイルスベクター、
（７）ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ株である、（６）記載のウイルスまたはウイルスベクター、
（８）（１）から（４）のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、または（６）または（７）記載のウイルスまたはウイルスベクターを含む、細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための医薬組成物、
（９）疾患ががん、肺線維症、肺高血圧症、虚血性心または脳疾患における血管狭窄症からなる群より選択されるものである、（８）記載の医薬組成物、
（１０）疾患ががんである、（９）記載の医薬組成物、
（１１）がんに存在するがん幹細胞を標的とするものである、（１０）記載の医薬組成物、
（１２）低酸素状態が酸素分圧：１０ｍｍＨｇ以下の状態である、（８）から（１１）のいずれか記載の医薬組成物、
（１３）対象における細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための方法であって、（１）から（４）のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、または（６）または（７）記載のウイルスまたはウイルスベクターを対象に投与することを特徴とする方法、
（１４）対象における細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための医薬の製造のための、（１）から（４）のいずれか記載のウイルスまたはウイルスベクター、または（６）または（７）記載のウイルスまたはウイルスベクターの使用、
（１５）ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質、
（１６）（１５）記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００８】
従って、本発明により、がん幹細胞などの低酸素状態にある細胞、とりわけ低酸素状態で複製能力をもつ細胞を特異的に傷害することができるので、がん、肺線維症、肺高血圧症、虚血性心または脳疾患における血管狭窄症などを効果的に治療または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ  ＤＮＡ断片をトランスフェクションしたＡＺＰ７ａヒト胃がん細胞を１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）または低酸素分圧（Ｏ２  １％）で培養した後、ＥＧＦＰとＨＩＦ１αおよびＩＣＰ４の発現を蛍光顕微鏡で観察したものである。
【図２】図２は、ＩＣＰ４欠失ＨＳＶ−１変異体ｄ１２０のＤＮＡとＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ  ＤＮＡ断片をコトランスフェクションしたＡＺＰ７ａヒト胃がん細胞における正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）または低酸素分圧（Ｏ２  １％）でのＨＳＶ−１ウイルスのプラーク形成を示す。
【図３】図３は、ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲの構築を示す。
【図４】図４は、精製したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲをＶｅｒｏ細胞に感染させ、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）または低酸素分圧（Ｏ２  １％）で２４時間培養した時のＨＳＶ−１ウイルスの増殖能をプラークの総面積で表したものである。ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲは低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件でよく増殖した。
【図５】図５は、精製したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲをＡＺＰ７ａヒト胃がん細胞株に多重感染度（ＭＯＩ）０．１で感染させ、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）または低酸素分圧（Ｏ２  １％）で４８時間培養した時のＩＣＰ４タンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。ＩＣＰ４は低酸素分圧（Ｏ２  １％）でのみ発現していた。
【図６】図６は、精製したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲをＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ０．０１で感染させ、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）または低酸素分圧（Ｏ２  １％）で２６時間培養した時のガンシクロビル感受性を示すウイルス複製分析の結果である。
【図７】図７は、ＡＺＰ７ａヒト胃がん培養細胞をＳＣＩＤマウス腹腔内に移植した腫瘍において、ピモニダゾールで標識される腫瘍内低酸素領域でのｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ（ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲを１ｘ１０７ｐｆｕ注入）の増殖を示すＩＣＰ４タンパク質の発現とＨＳＶ−１エンベロープ抗原の存在を示す免疫組織化学である。
【図８】図８は、ＭＳＴＯヒト悪性中皮腫培養細胞をＳＣＩＤマウス背部皮下に移植した腫瘍に対するｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ（ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲを１−２ｘ１０３ｐｆｕ／回腫瘍内に注入）の抗腫瘍効果を示す。腫瘍の体積は、腫瘍内にトランスフェクションしたルシフェラーゼの活性をリアルタイムインビボイメージング法によりフォトンカウントとして定量した。
【図９】図９は、手術標本から樹立したヒト平滑筋肉腫初代培養細胞をＳＣＩＤマウス背部皮下に移植した腫瘍（ｎ＝８）に対するｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ（ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲを１−２ｘ１０３ｐｆｕ／回腫瘍内に注入；初回注入、以後３−４日おきに１７回注入）の抗腫瘍効果をｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ（ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲを１−２ｘ１０４ｐｆｕ／回腫瘍内に注入；初回注入、以後３−４日おきに１７回注入）と比較して示した。左は腫瘍体積の変化を示したもので、右は治療開始後８２日目の腫瘍塊における残存腫瘍細胞をカルポニンの免疫染色で示したものである。
【図１０】図１０は、ＧＩＳＴ培養細胞を、ＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ（Miltenyi社製）を用いてがん幹細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ１３３の陽性と陰性の分画に分けたのち、シャーレに培養し、精製したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲをＭＯＩ  ０．０１−０．０００１で感染させたウイルス複製分析の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、１の態様において、ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、ウイルスまたはウイルスベクターに関するものである。ＯＤＤ（酸素依存性分解ドメイン）とは、上述の通り、低酸素下においてのみ安定化する転写因子ＨＩＦ１αのうち正常酸素分圧におけるユビキチン・プロテアソーム系による蛋白分解の目印となるドメインをいう。ＯＤＤのアミノ酸配列を配列番号：１に、その核酸配列を配列番号：２に示す。本発明において用いられるＯＤＤは、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ末端に２３個のアミノ酸からなる核内移行シグナル（ＮＬＳ）および蛋白分解の目印としての機能を有するアミノ酸プロリンを含む。そのアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、本発明において用いられるＮＬＳ−ＯＤＤ配列をコードする核酸配列は５’端にＫｏｚａｋのコンセンサス配列を含む。その核酸配列を配列番号４に示す。【００１１】
ウイルスの増殖に必須のタンパク質は、ウイルスの増殖ばかりでなく、ウイルスベクターおよび／または核酸の複製に必須のタンパク質を含む。かかるタンパク質として、種々のものが知られており、例えば、ＨＳＶ−１のＩＣＰ４、γ３４．５、アデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂ、レトロウイルス  ＬＴＲのＲおよびＵ５、および単純ヘルペスウイルスのリボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのタンパク質のアミノ酸配列は既知である。本発明において用いられるウイルスの増殖に必須のタンパク質は、天然のアミノ酸配列において１個ないし数個、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該タンパク質の機能を保持しているタンパク質を含む。本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、感染細胞内で複製されることによって感染細胞を傷害するために用いられるので、好ましくは、ウイルスは増殖型ウイルスである。また、ウイルスはＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。感染細胞を傷害するメカニズムは、例えば、ウイルスの増殖による直接的な細胞溶解、ウイルス感染細胞のアポトーシス誘導、免疫系の活性化などによるものである。【００１２】
ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質は、これら２つのタンパク質が１本のポリペプチド鎖として存在するタンパク質であって、かつそれぞれのタンパク質の機能を保持するように結合したタンパク質をいう。当業者は、ＯＤＤおよびウイルスの増殖に必須のタンパク質の配列に基づき、かかる融合タンパク質を製造することができる。かかる融合タンパク質は、ＯＤＤのユビキチン・プロテアソーム系による分解に付随して分解され得るので、本発明のウイルスまたはウイルスベクターを用いて、かかる融合タンパク質の存在および／または量を感染細胞の酸素分圧に依存して制御することが可能になる。好ましくは、本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、増殖に必須のタンパク質の配列をコードする遺伝子の下流にInternal Ribosomal Entry Site（ＩＲＥＳ）（米国特許第４９３７１９０号）を介して、任意の外来遺伝子を連結し発現させることが可能で、低酸素状態にある細胞、好ましくは低酸素状態で複製能力をもつ細胞、例えばがん幹細胞等においてより多く搭載遺伝子を発現させることが可能なベクターとして用いることができる。【００１３】
好ましくは、本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）を欠損しているものである。欠損とは、ＲＲの機能が失われた状態をいい、例えば、ＲＲをコードする遺伝子におけるヌクレオチドの欠失、挿入、変異などにより引き起こされる。ＲＲは、ＤＮＡの合成過程において働く酵素であり、がん細胞などの活発に増殖している細胞において大量に産生されている。従って、ＲＲを欠損させることにより、本発明のウイルスの複製は、正常細胞よりがん細胞などの活発に増殖している細胞においてより頻繁に行われる。また、上述の通り、がん幹細胞などの既存の治療法に抵抗性の細胞は低酸素状態に存在し、自己複製能力を有することから、本発明のウイルスまたはウイルスベクターはＯＤＤを有し、かつＲＲを欠損していることにより、がん幹細胞を含む低酸素状態にある増殖細胞および／または自己複製細胞を特異的に傷害することができる。【００１４】
好ましくは、本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、融合タンパク質に含まれるウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子以外、ウイルス増殖に必須のタンパク質、たとえばＲＲをコードする遺伝子を含まない。かかる遺伝子を含まないことで、酸素分圧に応じたウイルスの複製制御がより良好に行われ得る。【００１５】
本発明は、もう１つの態様において、
（１）上記本発明のウイルスを細胞に感染させ、
（２）該細胞を低酸素状態で培養し、次に、
（３）増殖したウイルスを回収する、
を含む、ウイルスまたはウイルスベクターの製造方法に関するものである。本発明のウイルス遺伝子の細胞への導入は、ウイルスの通常の感染により行われる。ウイルスを感染させる細胞は、細胞内でウイルスが複製され得るものであればいずれのものでもよい。【００１６】
低酸素状態とは、酸素分圧がウイルスの通常の増殖環境の酸素分圧または生体内の正常酸素分圧より低い状態をいい、例えば、酸素分圧が約２０ｍｍＨｇ以下の状態（もしくは酸素分圧として約２％以下の状態）であり、好ましくは酸素分圧が約１０ｍｍＨｇ以下の状態（もしくは酸素分圧として約１％以下の状態）である。かかる低酸素状態でウイルス感染細胞を培養することにより、ＯＤＤとウイルス増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質が安定化され、それにより、ウイルス増殖が開始されるか、あるいは増大または促進される。低酸素状態以外の培養条件は、ウイルスを感染させた細胞などに依存して適宜選択される。【００１７】
増殖したウイルスは、培養上清から当業者に既知の手段・方法により回収される。得られたウイルスを、低酸素状態にある標的細胞、好ましくは低酸素状態で複製能力をもつ標的細胞に感染、一定時間増殖させ、特異的に傷害することもできるし、培養上清あるいはウイルス感染細胞を溶解し遠心した上澄み液に、本発明のウイルスまたはウイルスベクターを得ることもできる。【００１８】
本発明は、別の態様において、上記本発明のウイルスまたはウイルスベクターの製造方法により得ることのできるウイルスまたはウイルスベクターに関するものである。本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、低酸素状態にある細胞内、好ましくは低酸素状態で複製能力をもつ細胞内で効率的に増殖する。また、本発明のウイルスまたはウイルスベクターの製造方法において用いられたウイルスがＨＳＶ−１でＲＲを欠損している場合、本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、がん細胞などの活発に増殖する細胞においてより良好に増殖することができる。好ましくは、本発明のウイルスまたはウイルスベクターは、ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ株である。かかるｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ株を後で詳述する。また、本発明のウイルスまたはウイルスベクターを細胞に感染させ、細胞内でウイルス核酸を複製させることにより、本発明のウイルスまたはウイルスベクターを得ることもできる。【００１９】
本発明は、なお別の態様において、上記本発明のウイルスまたはウイルスベクターを感染または導入させた細胞に関するものである。本発明のウイルスまたはウイルスベクターの細胞への感染または導入は、公知の方法を用いて行うことができる。本発明のウイルスまたはウイルスベクターを感染または導入させた細胞を、生体内に注入し、該細胞に対する免疫応答の誘導などに用いることができる。【００２０】
本発明は、別の態様において、上記本発明のウイルスまたはウイルスベクターを含む、細胞が低酸素状態にあること、好ましくは細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。低酸素状態とは、上述の通りであるが、好ましくは、酸素分圧が約１０ｍｍＨｇ以下の状態（酸素分圧として約１％以下の状態）である。細胞が低酸素状態で複製能力をもつことを特徴とする疾患は、例えば、全てのがん、肺線維症、肺高血圧症、虚血性心または脳疾患における血管狭窄症などを含むが、これらに限定されない。例えば、がんの場合、がん幹細胞などの細胞が低酸素状態で複製能力をもつ。これらの細胞のみが、がんの再燃能力や転移能をもち、放射線治療や化学療法に抵抗性とみられることから、本発明の医薬組成物を用いて、既存の治療法に抵抗性の疾患、たとえばがんを治療およびその転移を予防することが可能となる。【００２１】
本発明の医薬組成物に含まれるウイルスまたはウイルスベクターは、低酸素状態にある細胞中、好ましくは低酸素状態で複製能力をもつ細胞中で複製または増殖することを特徴とするものである。従って、本発明のウイルスまたはウイルスベクターを含む医薬組成物は、低酸素状態にある細胞のみを標的とすることができる。詳細には、本発明の医薬組成物においてウイルスが含まれる場合、低酸素状態にある細胞においてのみウイルスが増殖することにより、該細胞を傷害することができる。ウイルスベクターが含まれる場合、低酸素状態にある細胞においてのみ特定の遺伝子を発現させることが可能である。好ましくはウイルスベクターが複製されるため、低酸素状態にある細胞において遺伝子の発現量は多く持続的である。【００２２】
さらに、本発明の医薬組成物において含まれるウイルスまたはウイルスベクターが、ＲＲを欠損している場合、本発明の医薬組成物は、活発に増殖しているがん細胞、好ましくは、自己複製能をもつがん幹細胞などをより特異的に傷害することができる。【００２３】
本発明の医薬組成物は、本発明のウイルスまたはウイルスベクターを含む以外、例えば、担体、賦形剤、添加剤など種々の成分を含んでいてもよい。かかる成分は、好ましくはウイルスまたはウイルスベクターの感染効率を増加させるものであり、疾患、治療対象となる標的細胞状態、投与方法などの種々の因子に応じて適宜選択される。本発明の医薬組成物に含まれるウイルスまたはウイルスベクターの量、および投与回数は、疾患、標的細胞、対象の状態、投与方法などの種々の因子に応じて適宜選択される。また、本発明の医薬組成物において、あるいは本発明の医薬組成物と併用して、治療または予防されるべき疾患の既知の治療剤を用いてもよい。【００２４】
本発明は、さらなる態様において、上記本発明の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、対象における細胞が低酸素状態にあることを特徴とする疾患を治療および／または予防する方法に関するものである。本発明の治療および／または予防方法において、治療または予防されるべき疾患の既存の治療法を併用してもよい。【００２５】
本発明は、さらなる態様において、細胞が低酸素状態にあることを特徴とする疾患を治療および／または予防する医薬の製造のための、本発明のウイルスまたはウイルスベクターの使用に関するものである。【００２６】
本発明は、別の態様において、ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質に関するものである。ウイルスの増殖に必須のタンパク質がＨＳＶ−１のＩＣＰ４である融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。かかる融合タンパク質は、配列番号：５に示すアミノ酸配列において１個ないし数個、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ融合タンパク質の機能、すなわち、ＯＤＤおよびウイルスの増殖に必須のタンパク質の機能を有するタンパク質を含む。本発明の融合タンパク質は、公知の方法、例えば遺伝子組み換え法により製造することができる。本発明の融合タンパク質は、細胞内にあらかじめ導入することにより生体内において低酸素の領域を標識することなどに用いることができる。【００２７】
本発明は、なお別の態様において、上記ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。ウイルスの増殖に必須のタンパク質がＨＳＶ−１のＩＣＰ４である融合タンパク質をコードする核酸配列を配列番号：６に示す。【００２８】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２９】
ウイルスの製造
ＨＳＶ−１の複製開始に必須の転写因子であるＩＣＰ４のアミノ末端に、正常酸素分圧において蛋白分解の目印となるアミノ酸配列であるＨＩＦ１αのＯＤＤ（oxygen-dependent degradation domain）内のユビキチン・プロテアソーム認識部位である５６４番目のプロリン残基を含む５７個のポリペプチドを付加した。さらにそのアミノ末端に２３個のアミノ酸からなる核内移行シグナルを付加した。【００３０】
ＩＣＰ４遺伝子はそのコード領域を含むｐＧＨ１０８（J. Virol. 56, 558-570, 1985）由来の４０８５ｂｐの平滑末端ＳａｌＩ−ＭｓｅＩ断片（Johns Hopkins School of MedicineのHayward博士より提供）からＰＣＲ法で開始コドンからＰｖｕＩＩサイトまでを増幅し、その５’端にＫｏｚａｋ配列（ａａｔｔｃｃｃａｇｃｔｔｇａｃ）と核内移行シグナルである２３個のアミノ酸配列と５７個のＯＤＤ配列をコードする２６１ｂｐのＤＮＡを連結した。この３’側にＩＣＰ４のＰｖｕＩＩ−ＭｓｅＩ断片を連結しＯＤＤ融合ＩＣＰ４遺伝子（４２２１ｂｐ）を構築した。さらに、その上流にＣＭＶプロモーター（５８８ｂｐ）を、その下流にＩＲＥＳ（５８５ｂｐ）を介してＥ．Ｃｏｌｉ由来のＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡ配列（３．３ｋｂ）を連結した約９ｋｂのＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡ断片を構築した。さらに、ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡをＥＧＦＰ−ｐｏｌｙＡに置換したＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片も構築した。【００３１】
最初に、ＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片を製造者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）を使用し、６ウエル組織培養プレート中のＡＺＰ７ａヒト胃がん細胞株（札幌医科大学西森氏より提供）（２．５ｘ１０５／ウエル）のサブコンフルエント単層培養に薬剤耐性遺伝子の発現ベクターであるｐＳＶ２ｎｅｏとともにコトランスフェクションした。当業者によく知られた方法を用いて、ＥＧＦＰを恒常的に発現する上記胃がん細胞のＧ４１８耐性クローンを選別した。この胃がん細胞クローンを用いて、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）と低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件で、ＩＣＰ４蛋白の発現が酸素分圧によって変化するかどうかを蛍光抗顕微鏡を用いて検討した。低酸素条件においてのみ、ＥＧＦＰとＩＣＰ４がともに同一細胞内に発現することを確認した（図１）。ＥＧＦＰは正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）または低酸素分圧（Ｏ２  １％）いずれの条件でも発現していたが、ＨＩＦ１αとＩＣＰ４は低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件で培養した細胞にのみ発現していた。ＯＤＤ−ＩＣＰ４融合タンパク質の発現が細胞の酸素分圧により制御されることが確認された（図１）。さらに、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）と低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件で、ＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ断片とＩＣＰ４を欠失するＨＳＶ−１変異体ｄ１２０ウイルスのＤＮＡを、製造者のプロトコルに従ってＡＺＰ７ａ細胞にコトランスフェクションし、４８時間後にプラーク数を数えた。低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件でのみプラークが形成されることを確認した（図２）。ウイルスの増殖を示すプラーク形成は、低酸素分圧（Ｏ２  １％）で培養した場合にはるかに多く認められた。ＯＤＤ−ＩＣＰ４融合タンパク質は、発現（図１およびウェスタンブロット）のみならず、その機能においても、細胞の酸素分圧により制御されることが確認された。【００３２】
ウイルスＤＮＡの複製に必須の酵素であるＲＲをコードする遺伝子（ＵＬ３９）の５’側２．３ｋｂの配列を含むｐＫｐＸ２（J. Virol. 62, 196-205, 1988）  （Coneticut大学のWeller氏より提供）のＳｔｕＩサイトにＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡ断片を挿入し、ＸｈｏＩ（ｐＫｐＸ２の５’側ＲＲ配列のさらに５’側にあるＸｂａＩサイトと３’側ＲＲ配列のさらに３’側にあるＨｉｎｄＩＩＩサイトをともにＸｈｏＩで置換したもの）消化によりで線状化し、ｐＵＣ１９配列を除去した１１．３ｋｂのＵＬ３９−ＣＭＶ−ＮＬＳ−ＯＤＤ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡ−ＵＬ３９相同組換えベクターを構築した。これをＩＣＰ４を欠失するＨＳＶ−１変異体ｄ１２０ウイルスのＤＮＡとともに、製造者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）を使用し、６ウエル組織培養プレート中のＩＣＰ４を恒常的に発現するＶｅｒｏＥ５細胞（２．５ｘ１０５／ウエル）のサブコンフルエント単層培養にコトランスフェクションした。トランスフェクション３時間後に２０％  ＤＭＥＭ培養液１ｍｌを添加し、９６時間後まで、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）０．５ｍｇ／ｍｌを含む前記培養液（１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）で培養した。プラーク形成を確認した後、ＨＭＢＡを含まない１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭで２４時間培養した。５００μｌ／ウエルのコールドウイルスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に細胞を懸濁し凍結保存した。【００３３】
超音波処理（３０秒間を３回）を組み合わせた凍結処理と解凍処理を三回行い、上記懸濁液を溶解した。懸濁液を段階的に希釈し、９６ウエル組織培養プレートのサブコンフルエント単層培養ＶｅｒｏＥ５細胞に感染させた。感染後９６時間１ウエルあたり１００μｌの１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab.社製）を含む１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで培養した。プラーク形成を確認し得たウエルからＶｅｒｏＥ５単層培養細胞を前記培養液１００μｌに懸濁し、そのうちの６μｌを用いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を基質にしたβガラクトシダーゼ酵素活性を、βガラクトシダーゼ酵素分析システム（Promega社製）を用いて測定した。βガラクトシダーゼ酵素活性陽性のウエルのＶｅｒｏＥ５細胞懸濁液を５０００回転で５分間遠心し、ペレットを１００μｌ／ウエルのコールドウイルスバッファーに懸濁した。９６ウエル組織培養プレートを用いた同様の限界希釈感染・βガラクトシダーゼ酵素活性の測定をＶｅｒｏＥ５細胞を用いてさらに２回繰り返し、組換えウイルスｄ１２．ＯＤＤΔＲＲを単一のプラークとして精製した（図３）。組換えウイルスｄ１２．ＯＤＤΔＲＲは本発明者において維持、管理されている。【００３４】
１０〜２０個の１５０ｃｍ２／組織培養フラスコ（Ｔ−１５０；IWAKI CLASS社製）中のＶｅｒｏ細胞に感染させ、無血清培地ＶＰ−ＳＭＦ（Invitrogen社製）で４８時間培養後に、剥離した細胞を４２０００ｇで４５分間遠心し、沈殿分画に回収することにより、ウイルスを調製した。１０ｍｌのコールドウイルスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に懸濁した。超音波処理（３０秒間を３回）を組み合わせた凍結処理と解凍処理を三回行い、上記細胞を溶解した後、４℃で５分間、５００×ｇで遠心分離を行ったあと、その上清に対してさらに４℃で４５分間、２６１００×ｇで遠心分離を行った。その結果得られたペレットをコールドウイルスバッファーに懸濁し、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）と低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件で、Ｖｅｒｏ細胞を用いたプラークアッセイを行い、精製したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲの増殖活性、細胞障害作用の酸素分圧感受性とその力価を決定した。ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲは、低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件で、より強く増殖し、細胞障害活性を示した（図４）。【００３５】
ＩＣＰ４発現のイムノブロット分析
ＡＺＰ７ａ細胞に、正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）と低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件で、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１となるようにｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ又はウイルスバッファーのみをそれぞれ感染させ、４８時間培養したのち回収した。同量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Bio-Rad社製）に移した。５％のスキムミルク（DIFCO Laboratories社製）を用いて、膜を室温で２時間ブロッキングし、その後、抗ＩＣＰ４抗体（Goodwin Institute for Cancer Research社製；希釈率１：５００）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。ＩＣＰ４蛋白は低酸素分圧（Ｏ２  １％）の条件でより多く発現していた（図５）。ウイルスバッファーのみをＡＺＰ７ａに添加してもＩＣＰ４の発現は認められなかった。【００３６】
ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲのガンシクロビル感受性を示すウイルス複製分析
２４ウエルの培養プレートに５×１０４個／ウエルのＶｅｒｏ細胞株を培養し、ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲウイルスをＭＯＩ  ０．０１で感染させた後、１％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭにガンシクロビル（和光純薬社製）を種々の濃度（０−１μｇ／ｍｌ）に添加して２６時間培養した。１０％ホルマリンＰＢＳで細胞を固定した後、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク数を計測した。ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲは正常酸素分圧（Ｏ２  ２０％）と低酸素分圧（Ｏ２  １％）いずれの条件でも、ガンシクロビルの添加により濃度依存性に増殖が抑制された。結果を図６に示す。【００３７】
（インビボでの処理及び組織学的分析）
ＡＺＰ７ａ細胞を、６週齢の雌の重症複合型免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）（日本クレア社製）の腹腔内に注射し、ＭＳＴＯヒト悪性中皮腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２０８１）ヒト平滑筋肉腫初代培養細胞、ＭＣＦ７ヒト乳がん細胞（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−２２）を、体側部に皮下注射して、腫瘍を定着させた。ＭＳＴＯには、ルシフェラーゼ遺伝子ｐＧＬ４．１３（Promega社）をトランスフェクションし、最も化学発光強度と増殖速度が高いクローンを選別した。クローン化した細胞中、ＳＣＩＤマウス背部皮下に定着したものから、中皮腫の４−５ｍｍ角の腫瘍塊を、６週齢の雌のＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植した。これらの腫瘍は、ＳＣＩＤマウスに移植後３０日で直径６から７ｍｍ程度（５０−７０ｍｍ３）に成長した。１×１０７ｐｆｕのｄ１２．ＯＤＤΔＲＲを含む５０μｌ（腫瘍容積１００ｍｍ３あたり）のウイルス懸濁液、あるいは同量のウイルス緩衝液を、３０ゲージの針を用いて腹腔内または腫瘍内に注入した。以後全く同じ処理を繰り返した。注入後所定の時間に腫瘍径を測定し、以下の式
（腫瘍容積）＝０．５３×（長さ）×（幅）２
を用いて腫瘍容積を計算した。ＭＳＴＯの場合は、腹腔内にルシフェリン（Sigma Chemicals社製）を注入し、リアルタイムインビボイメージングシステム（Berthold社製）を用いて、背部皮下の腫瘍細胞からの化学発光の強度を高感度ＣＣＤカメラで計測した。背部皮下に移植したヒト悪性中皮種、平滑筋肉腫、乳がん細胞への直接注入により、いずれの腫瘍に対してもｄ１２．ＯＤＤΔＲＲは顕著な抗腫瘍効果を示した。ヒト胃がん細胞の免疫組織化学の結果を図７に、ヒト悪性中皮種と平滑筋肉腫の治療結果を図８と９に示す。ウイルスバッファーのみを注入した対照群に比してｄ１２．ＯＤＤΔＲＲを矢印で示した所定の日に計７回注入した治療群の抗腫瘍効果は明らかであった（図８）。また、ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲで治療した腫瘍では残存腫瘍細胞が認められなかったのに対して、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲで治療した腫瘍では残存腫瘍細胞が認められた（図９）。
【００３８】
組織学的研究のため、１×１０７ｐｆｕ／腫瘍容積１００ｍｍ３のｄ１２．ＯＤＤΔＲＲ投与終了後、所定の日数で、腫瘍があるマウスを絶命させた。皮下腫瘍を取り出し、２％のパラホルムアルデヒド、０．５％のグルタルアルデヒドを用いて、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳで、４℃で一晩固定した。続いて、Ｘ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）、５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ６）、５ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ６）及び１ｍＭのＭｇＣｌ２をＰＢＳ中に含む基質溶液に、該腫瘍を３７℃で３時間浸し、その後、３％のＤＭＳＯを含むＰＢＳで洗浄した。免疫組織化学は、標本をブアン溶液［１５％（ｖ／ｖ）の飽和ピクリン酸溶液、１．６５％（ｖ／ｖ）のホルマリン、及び１％（ｖ／ｖ）の酢酸／ＰＢＳ］で固定し、パラフィンに包埋した。ポリ−Ｌ−リジンでコートしたマイクロスライドに、厚さ４μｍの切片をのせ、キシレン中で処理し、段階的アルコールで脱水し、内在のペルオキシダーゼを遮断するため、７０％のメタノールとＨ２Ｏ２の溶液中に浸した。その後、オートクレーブを１２１℃で１０分間使用して、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で抗原を回収した。切片を１％（ｖ／ｖ）のヤギ血清／ＰＢＳを用いて、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、前述の抗ＩＣＰ４抗体または抗エンベロープ抗体（Quartett社製）を用いて、２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ／ＰＢＳ中で、４℃で一晩インキュベートした。上記切片を０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄し、続いて、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（TAGO Immunologicals社製）を用いて、２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ／ＰＢＳで、室温で１時間インキュベートし、アビジン−ビオチン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（Vector Laboratories社製）を用いて室温で３０分間インキュベートした。０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、最終反応産物をジアミノベンチジン（WAKO Chemicals）で視覚化し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。コントロールとして非特異的染色をみるため、ヤギ血清で処理した組織標本を使用した。組織低酸素領域の検出は、製造者のプロトコルに従ってＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１  ｋｉｔ（Natural Pharmacia International社製）を使って行った。ＡＺＰ７ａヒト胃がん細胞株のＳＣＩＤマウス腹腔内移植モデルで、腹腔内に注入したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲがピモニダゾールで標識される腫瘍内低酸素領域に一致して増殖し、ＩＣＰ４蛋白を発現していることが確認された（図７）。【００３９】
ＧＩＳＴ培養細胞を、ＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ（Miltenyi社製）を用いてがん幹細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ１３３の陽性と陰性の分画に分けたのち、シャーレに培養し、精製したｄ１２．ＯＤＤΔＲＲをＭＯＩ  ０．０１−０．０００１で感染させたウイルス複製分析の結果を図１０に示す。ｄ１２．ＯＤＤΔＲＲは、ＣＤ１３３陽性腫瘍で、よりよく増殖し、より強い細胞障害作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、ＯＤＤとウイルスの増殖に必須のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスまたはウイルスベクターおよびそれらを含む医薬組成物などが提供されるので、医薬品等の分野、例えば、低酸素条件下にあって放射線治療や化学療法に抵抗性のがん、好ましくはがん幹細胞に対する治療薬の開発、製造において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
SEQ ID NO:1: ODD
SEQ ID NO:2: ODD
SEQ ID NO:3: NLS-ODD
SEQ ID NO:4: Kozak-NLS-ODD
SEQ ID NO:5: ODD-ICP4 fusion protein
SEQ ID NO:6: Kozak-NLS-ODD-ICP4
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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