(57)【要約】  本発明の課題は、細胞内のアスパラギン合成酵素の定量分析に適したモノクローナル抗体を提供することである。本発明によれば、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
アスパラギン合成酵素のＮ末端のアミノ酸配列を認識する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項４】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１から３の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定するための試薬。
【請求項６】
請求項１から３の何れかに記載のモノクローナル抗体と、アスパラギン合成酵素を含む細胞とを接触させる工程を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定する方法。
【請求項７】
白血病細胞又は卵巣癌細胞に存在するアスパラギン合成酵素を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法によりアスパラギン合成酵素を測定し、上記の測定の結果に基づいて、白血病又は卵巣癌のＬ−アスパラキナーゼの感受性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスパラギン合成酵素を特異的に認識するモノクローナル抗体、並びに上記抗体を用いたアスパラギン合成酵素測定試薬及びアスパラギン合成酵素の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスパラギン合成酵素(ASNS)は生体内でL-グルタミンを窒素原としたATP依存性の反応によりL-アスパラギン酸からL-アスパラギンの生合成を触媒する[非特許文献１]。そのため、L-アスパラギンは体外から取り入れなければならない必須アミノ酸ではない。正常細胞ではL-アスパラギンの供給量が減少するとL-アスパラギンの合成により補うことができる。しかしながらリンパ芽球はASNSの活性が十分でないために外部からL-アスパラギンを取り入れなければならない[非特許文献２]。L-アスパラギナーゼ(ASNase)はL-アスパラギンをL-アスパラギン酸とアンモニアへと加水分解する酵素であるが[非特許文献３]、多くの急性リンパ性白血病(ALL)治療において重要な薬物である。ASNaseの投与は血液、髄液、骨髄のL-アスパラギンを枯渇させ、細胞内のL-アスパラギンまで枯渇させる。ASNSレベルが非常に低いリンパ芽球細胞は細胞死を起こしやすい。In vitro の系ではリンパ芽球細胞のASNaseへの暴露でG1期を停止しアポトーシスを引き起こした[非特許文献４]。ヒトASNSの過剰発現でASNase耐性を誘導するのに十分であることが示されれいる[非特許文献５]。ASNS発現量とASNase感受性の関係は白血病細胞だけでなく卵巣癌細胞でも認められている[非特許文献６及び７]。これらの所見はASNase治療を決定する診断マーカーとしてのASNS活性モニタリングの重要性を示唆している。ASNase抵抗性とASNS mRNA発現量の関係は広く報告されてきているが[非特許文献８]、ヒト白血病でのASNSタンパク質量を決定した研究は少ない[非特許文献９−１３]。その中にはASNase感受性予測についてASNSタンパク質測定の重要性を示した報告もある[非特許文献１３]。【０００３】
昆虫細胞株Sf9をホストとしたバキュロウイルス発現系はタンパク質の大量調製に用いられてきた。特に私達を含む多くの研究者は、膜タンパク質またはウイルスgp64タンパク質への融合タンパク質をSf9細胞だけでなく、発芽バキュロウイルス(BV)粒子にもディスプレイできることを示してきた。それ故にBVにディスプレイされた外因性のタンパク質は抗原タンパク質を精製することなく免疫に使用可能である[非特許文献１４、１５、１６]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】N.G. Richards, M.S. Kilberg, Asparagine synthetase chemotherapy. Annu Rev. Biochem. 75 (2006) 629-54.
【非特許文献２】Y. Kiriyama, M. Kubota, T. Takimoto, T. Kitoh, A. Tanizawa, Y. Akiyama, H. Mikawa, Biochemical characterization of U937 cells resistant to L-asparaginase: the role of asparagine synthetase. Leukemia 3 (1989) 294-7.
【非特許文献３】K. Aghaiypour, A. Wlodawer, J. Lubkowski, Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase. Biochemistry 40 (2001) 5655-64.
【非特許文献４】T. Ueno, K. Ohtawa, K. Mitsui, Y. Kodera, M. Hiroto, A. Matsushima, Y. Inada, H. Nishimura, Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. Leukemia 11 (1997) 1858-61.
【非特許文献５】A.M. Aslanian, B.S. Fletcher, M.S. Kilberg, Asparagine synthetase expression alone is sufficient to induce l-asparaginase resistance in MOLT-4 human leukaemia cells. Biochem. J. 357 (2001) 321-8.
【非特許文献６】U. Scherf, D.T. Ross, M. Waltham, L.H. Smith, J.K. Lee, L. Tanabe, K.W. Kohn, W.C. Reinhold, T.G. Myers, D.T. Andrews, D.A. Scudiero, M.B. Eisen, E.A. Sausville, Y. Pommier, D. Botstein, P.O. Brown, J.N. Weinstein, A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat. Genet. 24 (2000) 236-44.
【非特許文献７】P.L. Lorenzi, J. Llamas, M. Gunsior, L. Ozbun, W.C. Reinhold, S. Varma, H. Ji, H. Kim, A.A. Hutchinson, E.C. Kohn, P.K. Goldsmith, M.J. Birrer, J.N. Weinstein, Asparagine synthetase is a predictive biomarker of L-asparaginase activity in ovarian cancer cell lines. Mol. Cancer. Ther. 7 (2008) 3123-8.
【非特許文献８】R.G. Hutson, T. Kitoh, D.A. Moraga Amador, S. Cosic, S.M. Schuster, M.S. Kilberg, Amino acid control of asparagine synthetase: relation to asparaginase resistance in human leukemia cells. Am. J. Physiol. 272 (1997) C1691-9
【非特許文献９】M. Leslie, M.C. Case, A.G. Hall, S.A. Coulthard, Expression levels of asparagine synthetase in blasts from children and adults with acute lymphoblastic leukemia. Br. J. Haematol. 132 (2006) 740-2.
【非特許文献１０】W.A. Stams, M.L. den Boer, H.B. Beverloo, E.R. van Wering, R. Pieters, Upregulation of asparagine synthetase and cell cycle arrest in t(12;21)-positive ALL. Leukemia 19 (2005) 318-9.
【非特許文献１１】A. Dubbers, G. Wurthwein, H.J. Muller, P. Schulze-Westhoff, M. Winkelhorst, E. Kurzknabe, C. Lanvers, R. Pieters, G.J. Kaspers, U. Creutzig, J. Ritter, J. Boos, Asparagine synthetase activity in paediatric acute leukaemias: AML-M5 subtype shows lowest activity. Br. J. Haematol. 109 (2000) 427-9.
【非特許文献１２】S.E. Abbatiello, Y.X. Pan, M. Zhou, A.S. Wayne, T.D. Veenstra, S.P. Hunger, M.S. Kilberg, J.R. Eyler, N.G. Richards, T.P. Conrads, Mass spectrometric quantification of asparagine synthetase in circulating leukemia cells from acute lymphoblastic leukemia patients. J. Proteomics 71 (2008) 61-70.
【非特許文献１３】N. Su, Y.X. Pan, M. Zhou, R.C. Harvey, S.P. Hunger, M.S. Kilberg, Correlation between asparaginase sensitivity and asparagine synthetase protein content, but not mRNA, in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Pediatr. Blood Cancer 50 (2008) 274-9.
【非特許文献１４】K.M. Lindley, J.L. Su, P.K. Hodges, G.B. Wisely, R.K. Bledsoe, J.P. Condreay, D.A. Winegar, J.T. Hutchins, T.A. Kost, Production of monoclonal antibodies using recombinant baculovirus displaying gp64-fusion proteins. J. Immunol. Methods 234 (2000) 123-35.
【非特許文献１５】T. Tanaka, T. Takeno, Y. Watanabe, Y. Uchiyama, T. Murakami, H. Yamashita, A. Suzuki, R. Aoi, H. Iwanari, S.Y. Jiang, M. Naito, K. Tachibana, T. Doi, A.I. Shulman, D.J. Mangelsdorf, R. Reiter, J. Auwerx, T. Hamakubo, T. Kodama, The generation of monoclonal antibodies against human peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs). J. Atheroscler. Thromb. 9 (2002) 233-42.
【非特許文献１６】R. Saitoh, T. Ohtomo, Y. Yamada, N. Kamada, J. Nezu, N. Kimura, S. Funahashi, K. Furugaki, T. Yoshino, Y. Kawase, A. Kato, O. Ueda, K. Jishage, M. Suzuki, R. Fukuda, M. Arai, H. Iwanari, K. Takahashi, T. Sakihama, I. Ohizumi, T. Kodama, M. Tsuchiya, T. Hamakubo, Viral envelope protein gp64 transgenic mouse facilitates the generation of monoclonal antibodies against exogenous membrane proteins displayed on baculovirus. J. Immunol. Methods 322 (2007) 104-17.
【非特許文献１７】S. Mizushima, S. Nagata,  pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322.
【非特許文献１８】T. Irino, T. Kitoh, K. Koami, T. Kashima, K. Mukai, E. Takeuchi, T. Hongo, T. Nakahata, S.M. Schuster, M. Osaka, Establishment of real-time polymerase chain reaction method for quantitative analysis of asparagine synthetase expression. J. Mol. Diagn. 6 (2004) 217-24.
【非特許文献１９】W.A. Stams, M.L. den Boer, A. Holleman, I.M. Appel, H.B. Beverloo, van E.R. Wering, G.E. Janka-Schaub, W.E. Evans, R. Pieters, Asparagine synthetase expression is linked with L-asparaginase resistance in TEL-AML1-negative but not TEL-AML1-positive pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood 105 (2005) 4223-5.
【非特許文献２０】W.A. Stams, den M.L. Boer, H.B. Beverloo, J.P. Meijerink, R.L. Stigter, E.R. van Wering, G.E. Janka-Schaub, R. Slater, R. Pieters, Sensitivity to L-asparaginase is not associated with expression levels of asparagine synthetase in t(12;21)+ pediatric ALL. Blood 101 (2003) 2743-7.
【非特許文献２１】S. Iwamoto, K. Mihara, J.R. Downing, C.H. Pui, D. Campana, Mesenchymal cells regulate the response of acute lymphoblastic leukemia cells to asparaginase. J. Clin. Invest. 117 (2007) 1049-57.
【非特許文献２２】D.A. Williams, A new mechanism of leukemia drug resistance? N. Engl. J. Med. 357 (2007) 77-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の通り、L-アスパラギナーゼ(ASNase)は小児性の急性リンパ球性白血病(ALL)の治療に重要である。ASNase感受性はALL細胞株に含まれるアスパラギン合成酵素 (ASNS)のタンパク質量と関係していることが報告されている。しかしながら、定量分析に適したモノクローナル抗体がないために、ASNSタンパク質量を報告した例は少ない。本発明は、細胞内のアスパラギン合成酵素の定量分析に適したモノクローナル抗体を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、フローサイトメトリーや酵素結合免疫吸着法(ELISA)に適応できる、アスパラギン合成酵素に特異的に認識するモノクローナル抗体の作製に成功した。このモノクローナル抗体により白血病細胞のASNSタンパク量を定量し、ASNase抵抗性を予測することが可能となる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を特異的に認識するモノクローナル抗体。
（２）  アスパラギン合成酵素のＮ末端のアミノ酸配列を認識する、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
（４）  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマ。
（５）  （１）から（３）の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定するための試薬。
（６）  （１）から（３）の何れかに記載のモノクローナル抗体と、アスパラギン合成酵素を含む細胞とを接触させる工程を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定する方法。
（７）  白血病細胞又は卵巣癌細胞に存在するアスパラギン合成酵素を測定する、（６）に記載の方法。
（８）  （６）又は（７）に記載の方法によりアスパラギン合成酵素を測定し、上記の測定の結果に基づいて、白血病又は卵巣癌のＬ−アスパラキナーゼの感受性を評価する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明においては、バキュロウイルス提示系を用いて、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素に特異的に認識するモノクローナル抗体を作製することに成功した。本発明のモノクローナル抗体はウェスタンブロッティング、免疫蛍光染色、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着法(ELISA)においてヒトアスパラギン合成酵素を認識することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、白血病細胞内のアスパラギン合成酵素タンパク質を定量測定し、白血病のASNase感受性を臨床評価することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、作製したモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット を示す。(A) N-AS融合タンパク質の発現確認。抗gp64モノクローナル抗体K7124 は1, 0.3, 0.1 μg/ml で使用した。矢印はN-AS融合gp64のバンドを指している。上パネルがN-AS-BV、下パネルが野生型BV。 (B)N-AS融合タンパク質に対する反応性。コントロールマウスIgGと抗ASNSモノクローナル抗体Z5801、Z5808は 1, 0.3, 0.1 μg/ml で使用した。上パネルがN-AS-BV、下パネルが野生型BV。(C) HA-ASNS過剰発現COS7細胞可溶化物に対する反応性。1レーンあたり104個の細胞を可溶化したタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。 (+): HA-ASNS トランスフェクト、 (-): 非トランスフェクト 細胞可溶化物のロードレーン。一次抗体としてコントロールマウスIgG、 抗HAモノクローナル抗体(Sigma)、抗ASNSモノクローナル抗体Z5801、Z5808 を1 μg/mlで使用した。 (D)内在性ASNSに対する反応性。1レーンあたり105 個の細胞を可溶化したタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。一次抗体として Z5808 を1 μg/mlで使用した。矢印は内在性ASNSのバンドを示す。
【図２】図２は、HA-ASNS過剰発現COS7細胞の免疫蛍光染色を示す。一次抗体としてウサギ抗HAポリクローナル抗体(Sigma)とマウス抗ASNSモノクローナル抗体(Z5801またはZ5808)をそれぞれ10μg/mlとなるように混合して反応させた。緑はAlexa fluor 488 の蛍光でHA-ASNSの発現を示す。赤はAlexa fluor 647の蛍光で抗ASNS抗体のHA-ASNSに対する反応性を示す。青はDAPI染色された細胞核を示す。
【図３】図３は、抗ASNSモノクローナル抗体のフローサイトメトリーへの適応を示す。 (A) HA-ASNSトランスフェクトCOS7細胞のフローサイトメトリー分析。塗り潰しのヒストグラムがHA-ASNSトランスフェクトCOS7細胞、白抜きのヒストグラムが非トランスフェクトCOS7細胞を示す。一次抗体としてコントロールマウスIgG、抗HAモノクローナル抗体(Sigma)、抗ASNSモノクローナル抗体Z5801、Z5808を3μg/mlで使用した。矢印はシフトしたヒストグラムでHA-ASNS発現COS7細胞を示す。(B) 内在性ASNSのフローサイトメトリー分析。塗り潰しのヒストグラムは一次抗体を反応させた細胞、白抜きのヒストグラムは二次抗体のみを反応させた細胞を示す。一次抗体は3 μg/mlで使用した。
【図４】図４は、K562細胞内ASNSタンパク質の定量を示す。(A) QIFIKIT（登録商標）キャリブレーションビーズのヒストグラム。6種類のビーズの抗体結合能Antibody Binding Capacity (ABC)はそれぞれA; 0、B; 1800、C; 12,000、D; 53,000、E; 185,000、 F; 530,000である。(B) 4種類のキャリブレーションビーズ(B-E) のMFI (Mean Fluorescence Intensity)対ABCをlog-logスケールで示した検量線。(C)ASNS測定サンドイッチELISAの構築。塗り潰しの丸がK562細胞抽出液、白抜きの丸がMOLT-4細胞の希釈系列に対する反応性である。データは二重測定の平均値を示した。 (D)任意ASNS濃度と450nmの吸光度で示した検量線。ASNS濃度の検出限界はA450が0.23の時11.3fmol/mlである。
【図５】図５は、MOLT-4とK562のフローサイトメトリーの結果とΔMFI差異を示す。
【図６】図６は、芽球比率34.5%のcase1のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図７】図７は、芽球比率34.5%及び24.5%のcase1及びcase2のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図８】図８は、Case 3（骨髄液と末梢血）のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図９】図９は、Case 4 (AML症例) のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１０】図１０は、Case6及びCase7(ALL症例) のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１１】図１１は、3症例（Case 5、Case 6、Case 7）の細胞株のMTT assayの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の抗体は、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素に特異的に認識するモノクローナル抗体であり、好ましくはアスパラギン合成酵素のＮ末端のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である。本発明の実施例においては、抗体の取得方法として、定法である一般的な免疫方法を使用せず、発芽型バキュロウイルスにASNSのＮ末端断片を提示させた抗原（BV抗原）をgp64発現トランスジェニックマウスに免疫する方法を採用した。即ち、本発明のモノクローナル抗体の取得方法の好ましい例としては、ASNS のＮ末端断片のcDNAを含む組み換えバキュロウイルスを感染させた宿主細胞の培養上清から回収されるＮ末端ASNS 提示発芽バキュロウイルスを抗原として用いて免疫動物を免疫することにより得る方法を挙げることができる。好ましくは、免疫動物は、gp64を過剰発現するトランスジェニックマウスである。
【００１１】
上記の通り、本発明では、ASNS 又はその断片（Ｎ末端断片など）のcDNAを含む組み換えバキュロウイルスを感染させた宿主細胞の培養上清から回収されるASNS 又はその断片を提示する発芽バキュロウイルスを抗原として用いる。抗原として用いる発芽バキュロウイルスの調製方法は公知であり、例えば、特開２００１−３３３７７３号公報、特開２００３−５２３７０号公報、Loisel TP, Ansanay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strosberg AD,Marullo S, Bouvier M., Nat Biotechnol. 1997 Nov;15(12):1300-4., Recovery of homogeneous and functional beta 2-adrenergic receptors from extracellular baculovirus particles：並びに国際公開ＷＯ９８／４６７７７などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００１２】
具体的には、ASNS 又はその断片（Ｎ末端断片など）のcDNAを含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを使用する。昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。本発明で用いられるバキュロウイルスとしては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）やカイコのボンビックス・モリ（Bombyx mori ）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスがベクターとして用いることができる。ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、ＢｍＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することから、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。宿主としては、Spodoptera Frugiperda細胞系統Sf9およびSf21などがS．frugiperda幼虫の卵巣組織から確立しており、Invitrogen社あるいはPharmingen社（San Diego，CA）、又はATCCなどから入手可能である。さらに、生きている昆虫幼虫を宿主細胞系として使用することもできる。
【００１３】
本発明で用いる組換えウイルスを構築する方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５'領域と３'領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるようなトランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こる。また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプラモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。トランスファーベクターの種類は特に限定されない。トランスファーベクターの具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズ（以上、フナコシ株式会社等から入手可能）などが挙げられる。
【００１４】
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築する。ここで宿主として用いる培養細胞とは、上記した宿主が挙げられ、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞など）である。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培養することが好ましい。このようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
【００１５】
本発明の方法では、前記の組換えバキュロウイルスを、上記した適当な宿主（Spodoptera Frugiperda細胞系統Sf9およびSf21などの培養細胞、又は昆虫幼虫など）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養上清から細胞外発芽ウイルス（budded virus, BV）を遠心などの分離操作によって回収することができる。細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行うことができる。先ず感染細胞の培養液を５００〜３，０００ｇで遠心分離して、細胞外発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができる。
【００１６】
本発明の抗体の種類は特に限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。免疫される動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、などの哺乳動物を用いることができる。
【００１７】
ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。
【００１８】
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ASNSを発現している細胞を用いたＦＡＣＳ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、ASNSを認識する抗体 を産生するハイブリドーマ細胞を選択することができる。所望の抗体 を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。
【００１９】
モノクローナル抗体 をコードするDNAは、慣用な方法(例えば、モノクローナル抗体 の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)により容易に単離、配列決定できる。
【００２０】
抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００２１】
上記のように、抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO, COS，ミエローマ、BHK （baby hamster kidney），HeLa，Vero，(2) 両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana）属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。
【００２２】
また、これらの抗体は、ASNS蛋白質を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体 や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Diabodyなどを挙げることができる。このような抗体 断片を得るには、これら抗体 断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。
【００２３】
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる。
【００２４】
本発明の抗体は、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定するために使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明の抗体と、アスパラギン合成酵素を含む細胞とを接触させる工程を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定する方法が提供される。特に本発明の抗体を用いることによって、１細胞あたりのアスパラギン合成酵素（ASNS）の分子数を評価することができる。本発明においては、特に、リンパ芽球などの白血病細胞や卵巣癌細胞に存在するアスパラギン合成酵素の量を測定し、得られた測定結果に基づいて、白血病や卵巣癌におけるＬ−アスパラキナーゼの感受性を評価することが可能である。
【００２５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１：
（１）材料と方法
（１−１）抗原(N末端ASNSディスプレイBV )の調製と免疫方法
ASNSのN末端領域  (2から51アミノ酸残基、以降N-ASとする)のcDNA はHuman Fetal Brain Marathon-Ready cDNA (Clontech)をテンプレートとし、プライマーとして5'-AACTGCAGTGTGGCATTTGGGCGCTGTTT-3'(配列番号１)と5'-CCGCCAACCGGTGAAATCCA-3' (配列番号２)を用いてPCR法により増幅し、gp64遺伝子と連結した。N-AS遺伝子が導入された組み換えウイルスの調製は、上記の非特許文献１５及び１６の記述に従った。感染から72時間後、その発芽ウイルス(N-AS-BV)を40,000g 、40minの遠心分離によりSf9培養液から回収し、免疫原として使用した。 gp64への免疫反応を避けるためにgp64トランスジェニックマウスを 非特許文献１６の記述に従い免疫に用いた。70 μg N-AS-BVにアジュバントとして0.1 μgの百日咳毒素を混合しgp64トランスジェニックマウスの腹腔内に投与、免疫した。追加免疫はアジュバントを含まない70 μgの N-AS-BVを2週間間隔で2回投与した。最終免疫から3日後に脾細胞を分離し、標準的な方法に従い1:10の混合比でマウスミエローマ細胞NS-1と細胞融合を行った。融合細胞はHAT選択培地(0.1 mM hypoxanthine, 0.1 mM aminopterine, and 0.16 mM thymidine)で7日間培養した。細胞融合から8日後、ハイブリドーマの培養上清を回収し、N-AS-BVに対するELISAとウェスタンブロッティングにより抗体産生細胞を選別した。 抗原発現BVを用いたELISAは非特許文献１６の記述に従った。【００２７】
（１−２）細胞株と遺伝子導入株
K562細胞と MOLT-4細胞は理研セルバンクより購入した。K562細胞はF-12 Nutrient Mixture (Ham's F-12)培地  (Invitrogen) 、MOLT-4 細胞はRPMI 1640培地でそれぞれ10％  ウシ胎児血清とペニシリンストレプトマイシンを含む、7% CO2、37℃の条件で浮遊培養した。 HAタグ付きヒトASNS調製のためにHuman Fetal Brain Marathon-Ready cDNA (Clontech)をテンプレートとし、プライマーとして5'-GAAGATCTATGTGTGGCATTTGGGCGCTG-3'(配列番号３)と 5'-GAAGATCTCTAAGCTTTGACAGCTGACTTG-3'(配列番号４)を用いてPCR法によりヒトASNS cDNA を増幅、pEF-BOS-HAベクター [非特許文献１７] へ連結した。発現コンストラクトはLipofectamine（登録商標）2000 reagent (Invitrogen)を用い、メーカーの説明書に従ってCOS7 細胞(ATCC)へトランスフェクト（遺伝子導入）した。【００２８】
（１−３）ウエスタンブロッティング
細胞を回収し、RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.5% sodium deoxycholate)で溶解した。溶解液中のタンパク質は12％  ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離しニトロセルロース膜(GE healthcare)へ転写した。転写膜への非特異結合をブロックエース(大日本ファーマ)でブロッキングし一次抗体を反応させた。TBS-T (0.05% Tween20/10 mM トリス緩衝液生理食塩水) で洗浄後、転写膜を１万倍希釈したhorseradish peroxidase (HRP)-conjugatedヤギ抗マウス抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) で反応させ、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo) を用いて検出した。gp64融合タンパク質の検出には、野生型バキュロウイルスを免疫し我々が作製したgp64タンパク質特異的抗体K7124 [非特許文献１６] を用いた。コントロールIgG (3423, 2AHB12) は特殊免疫研究所より購入した (Tokyo, Japan)。【００２９】
（１−４）免疫蛍光染色
HA-ASNS トランスフェクトCOS7細胞をカバーグラス上で培養後、4%パラフォルムアルデヒド/リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS) で固定し0.1 % Triton X-100/PBSで膜透過処理した。ブロックエースでブロッキング後、細胞と一次抗体として抗HAポリクローナル抗体と抗ASNSモノクローナル抗体であるZ5801またはZ5808の混合液をそれぞれ10μg/mlで反応させたPBSで洗浄後、二次抗体としてAlexa(登録商標) fluor 488標識抗ウサギIgG (Invitrogen)とAlexa（登録商標）fluor 647標識抗マウスIgG (Invitrogen) の混合液をそれぞれ２百倍希釈で反応させた。そのカバーグラスをProLong（登録商標）Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen)を用いてスライドグラスにマウントした。画像は蛍光顕微鏡を用いて撮影した(LEICA DB LB, Leica Microsystems)。【００３０】
（１−５）フローサイトメトリー
細胞の固定処理と膜透過処理はIntraStain, Fixation and Permeabilization Kit for Flow Cytometry (Dako)を用いてメーカーの取り扱い説明書に従って行った。膜透過処理試薬とともに一次抗体を3 μg/mlとなるように添加した。その細胞をdilution buffer(1% BSA/0.1 mM EDTA/PBS)で洗浄した後、 R-Phycoerythrin (R-PE)標識抗マウスIgG (Jackson ImmunoResearch Labolatries)をdilution bufferで百倍希釈したものを反応させた。最後に、細胞をdilution buffer で２回洗浄し、フローサイトーメーター(GUAVA （登録商標）EasyCyteTM Plus System , Millipore)で分析した。【００３１】
（１−６）酵素結合免疫吸着法
1x107 の細胞を0.2% Saponin/ protease inhibitor cocktail (Complete（登録商標）, Roche)/生理食塩水0.1 ml、15 min、室温で膜透過処理し、細胞破砕物を20,000xg、10 minの遠心分離により取り除いた。 この上清を細胞抽出液として用いた。【００３２】
モノクローナル抗体Z5801を生理食塩水で4 μg/mlに希釈しポリスチレン96ウェルプレート(Greiner)に固相化した。ブロックエース/生理食塩水でブロッキングした後、20倍から160倍の間で反応液(0.1% Saponin/50% ブロックエース/saline)を用いて適当に希釈した細胞抽出液を各ウェルに添加し、室温で2時間反応させた。次に、反応に用いたプレートを洗浄液(0.05% Tween 20/生理食塩水)で5回洗浄し、ビオチン化モノクローナル抗体Z5808を反応液で1μg/mlとなるように希釈し検出抗体として反応させた。ビオチン化はEZ-Link（登録商標）Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo)を用いてメーカーの取り扱い説明書に従って行った。最後に、反応プレートを洗浄し、Streptavidin-PolyHRP40 (Stereospecific Detection Technologies)を2千倍希釈となるように反応液で希釈し各ウェルに添加した。酵素反応はTMB Soluble Reagent (ScyTek Laboratories)を検出に用いた。酵素反応をTMB Stop Buffer (ScyTek Laboratories)で停止した後、マイクロプレートリーダー(Biotrak II, GE Healthcare)により450nmの吸光度を測定した。【００３３】
（２）結果
（２−１）抗ASNSモノクローナル抗体の作製
N-ASとウイルスgp64の融合タンパク質の発現確認は抗gp64モノクローナル抗体K7124を用いたウェスタンブロットにより行った。この抗体はN-AS-BVと野生型 BV両者の 64 kDaバンドを認識し(図１A) 、N-AS融合gp64タンパク質である約70 kDaも認識した (図１A 上パネル, 矢印) 。抗ASNSモノクローナル抗体を作製するために、この発芽ウイルス(N-AS-BV)をgp64トランスジェニックマウスに免疫し、その脾細胞をマウスミエローマ細胞NS-1と細胞融合した。細胞融合から8日後、ハイブリドーマ培養上清をBV-ELISAとN-AS-BV に対するWestern blottingにより選別した。最終的にELISAとウエスタンブロッティング両方でN-AS−BV特異的に反応する二つの陽性クローンZ5801 とZ5808が得られた(図１B) 。これら抗体のサブクラスはMouse Typer（登録商標） Sub-Isotyping kit (BIO-RAD)を用いてIgG2a, kappaと同定した。【００３４】
モノクローナル抗体Ｚ５８０１を産生するハイブリドーマ細胞（識別のための表示：Ｚ５８０１）は、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１４１として、２０１１年９月７日に、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、２０１２年８月２３日に、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１として、ブタペスト条約の下での国際寄託に移管された。
モノクローナル抗体Ｚ５８０８を産生するハイブリドーマ細胞（識別のための表示：Ｚ５８０８）は、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１４２として、２０１１年９月７日に、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、２０１２年８月２３日に、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２として、ブタペスト条約の下での国際寄託に移管された。【００３５】
（２−２）抗ASNS抗体の特異性
ASNS全長に対する反応特異性はHA-ASNS過剰発現COS7細胞を用いて確認した。この細胞の可溶化物を用いたウエスタンブロットではこれらのモノクローナル抗体は抗HA抗体が示したのと同様にHA-ASNS cDNAをトランスフェクトした細胞の分子量64kDaのバンドを認識した (図１C) 。さらに、Z5808に関してはK562細胞に内在性のASNSも認識した(図１D) 。免疫蛍光染色ではこれらのモノクローナル抗体は抗HA抗体と同様にHA-ASNS発現細胞を認識した(図２) 。【００３６】
（２−３）抗ASNS抗体のフローサイトメトリーへの適応
これら抗ASNS抗体がフローサイトメトリーに使用できるかどうかを確認するためにHA-ASNS過剰発現COS7細胞を Dako Intrastain kitを用いて固定処理、膜透過処理した後、抗HAモノクローナル抗体、Z5801またはZ5808モノクローナル抗体で染色した。抗ASNSモノクローナル抗体Z5801とZ5808は抗HA抗体と同様に特異的なヒストグラムシフトを示した(図３A) 。次に、これらの抗体がフローサイトメトリーで内在性ASNSを認識するかどうかを白血病細胞株K562とMOLT-4を用いて確認した。ASNSの発現レベルはK562細胞株は高く、MOLT4細胞株では非常に低いことが [非特許文献１７] で報告されている。どちらのモノクローナル抗体もK562細胞を特異的に認識し、ヒストグラムシフトを示した(図３B) 。フローサイトメトリーにおいてZ5808の反応性はZ5801よりも高かった。【００３７】
（２−４）フローサイトメトリーによるASNSタンパク質の定量
フローサイトメトリー定量法はQIFIKIT（登録商標） (Dako)を使用しメーカーの説明書に従って行った。始めに一次抗体であるZ5808のK562細胞における力価測定を行い、飽和濃度を3 μg/mlと決定した(データ掲載なし)。QIFIKIT（登録商標）のキャリブレーションビーズを用いて、この濃度における平均蛍光強度Mean Fluorescence Intensity (MFI) から１細胞当たりのモノクローナル抗体結合能を求めた。6種類のキャリブレーションビーズは細胞と同様にR-PE標識抗マウスIgG抗体により染色した(図４A)。この実験で、キャリブレーションビーズFは測定限界を超えていたため、キャリブレーションビーズB、C、D、Eをlog-log スケールでプロットした(図４B)。最小二乗法により検量線を作成し、これを用いてサンプルのMFI値から抗体結合能を示すAntibody Binding Capacity (ABC)を求めた。 K562細胞とMOLT-4細胞内のASNSタンパク質を定量するために、Z5808またはコントロールIgG  3μg/mlでのMFI値を見積り、コントロールIgGで補正した。フローサイトメーターで細胞を分析しABCを検量線の式に従って算出した(図4B)。１細胞内のASNS分子量がABCに等しいと仮定すると、次の等式が成立する：
ASNS molecules per cell = ABC (Z5808) - ABC (control IgG)
見積もられた１細胞あたりのASNS分子数はK562細胞で5800、MOLT-4で80であった(表１)。【００３８】
【表１】
2013051606.tif 000002
【００３９】
（２−５）ASNS測定ELISAの構築
ASNS定量ELISAを構築するにあたって、抗ASNSモノクローナル抗体Z5801を捕捉抗体として用い、検出抗体としてビオチン化Z5808を使用した。測定感度を増幅するためにStreptavidin-PolyHRP40を検出酵素として使用した。この測定系はK562細胞抽出液でASNSを検出できたがMOLT-4抽出液では検出しなかった(図４C)。フローサイトメトリーで見積もったK562細胞中のASNS分子を5800分子/細胞とすると、107個の細胞を1mlの抽出バッファーで抽出したとき、任意のASNS濃度は960fmol/mlとなる。任意のASNS濃度、38fmol/ml から 6fmol/ml の間で抽出液を希釈し検量線を作成した(図４D)。この測定系の検出限界はASNS陰性であるMOLT-4細胞抽出液の希釈系列からabsorbance 450 nm (A450) = 0.23 (mean + 3SD)に設定した。検量線は最小二乗法により指数関数で作成した(図４D)。ASNSの検出限界濃度は11.3fmol/ml と算出した。【００４０】
（３）考察
ASNase治療の効果予測において白血病細胞内のASNSタンパク質量を決定することの重要性が報告されている[非特許文献１２、１３]。ASNase抵抗性のメカニズムはまだ明らかにはされておらず、これらの現象はいくつかのASNS発現上昇患者と関係しているが、すべてには当てはまらず患者ごとに異なっている[非特許文献１９、２０]。本実施例では、フローサイトメトリーやELISAだけでなく、ウエスタンブロット、免疫蛍光染色に適応できる抗ASNSモノクローナル抗体を作製した。抗ASNS抗体を用いた報告はいくつかあるが[非特許文献７、８、１２]、フローサイトメトリーに使用できるモノクローナル抗体の報告はまだない。ASNaseの効果を予測する臨床診断においてASNS定量フローサイトメトリーは有用性がある。さらに、これら二つの抗体を用いてサンドイッチELISAが構築できることも確認した。比色ELISAは簡易かつ簡便な測定系の一つでありASNS定量比色ELISAの構築も臨床診断で有用性がある。モノクローナル抗体作製にバキュロウイルス タンパク質提示系を用いることの有利点は二つある。一つは、免疫に十分な量を得ることが難しいタンパク質の精製過程を省略でき、抗原提示バキュロウイルスと呼ばれる抗原の調製が非常に容易ということである。二つ目はバキュロウイルスそれ自身に強いアジュバント効果があるため、天然のタンパク質を認識する高い親和性の抗体を得られることである。この技術の大きな欠点はウィルス自身の強い免疫原性であるが、この欠点を逃れるためにウィルスの外被タンパク質であるgp64遺伝子導入マウスを作製した。このgp64遺伝子導入マウスはgp64に対して免疫寛容があり、ウィルスに対する反応は非常に低い[非特許文献１６]。本発明のモノクローナル抗体によれば、フローサイトメトリーやELISAでASNSタンパク質を定量する新規測定系を構築できる、ASNSタンパク質量とASNase抵抗性との関係を解明することができる。ASNase抵抗性白血病については新しい見解もある。骨髄中の間葉細胞が大量のアスパラギンを放出し白血病細胞のために防御ニッチをつくる。この別の細胞から供給されたアスパラギンが白血病細胞をASNase治療から守り生き残らせる。この薬物治療を受けた子供の数例で白血病が再発したのは骨髄の防御ニッチでASNaseに抵抗し生き残った白血病細胞が原因かもしれない。間葉細胞のASNS発現レベルは骨髄白血病細胞のASNase抵抗性を示唆している [非特許文献２１、２２] 。 このことから、間葉細胞のASNSを組織学的に定量することはASNase感受性を予測する上で重要である。本発明の抗ASNSモノクローナル抗体は間葉細胞の白血病細胞防御機構を解明するのに有用である。【００４１】
実施例２：
（１）材料と方法
白血病患者の骨髄液又は末梢血を用いた。ASNS活性既知の細胞株MOLT-4、K562をそれぞれ陰性対照、陽性対照として用いMTT assayを実施した。細胞株では10%fetal bovine serum加RPMI1640培地にて培養し、対数増殖期の細胞を3~10×106/mlに調整して使用した。一部の症例で、MTT assayを実施し、L-ASNase耐性、感受性の有無を判定した。【００４２】
（１−１）フローサイトメトリー（ＦＣＭ）
細胞の固定処理と膜透過処理はIntraStain, Fixation and Permeabilization Kit for Flow Cytometry (Dako)を用いてメーカーの取り扱い説明書に従って行った。使用したモノクローナル抗体Z5808は、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマの培養上清で、kappa鎖をもち、IgG2a classに属する。膜透過処理試薬とともに一次抗体を10μg/mlとなるように添加した。その細胞をdilution buffer(1% BSA/0.1 mM EDTA/PBS)で洗浄した後、PE標識Goat抗mouse IgG抗体（DAKO社）（二次抗体）を10μg/mlとなるように加え、反応させた。最後に細胞をdilution buffer で２回洗浄し、フローサイトーメーター(MoFlo（登録商標） XDP IntelliSort IISystem, BECKMAN COULTER)で分析した。【００４３】
（１−２）ASNase感受性のチェック；MTT assay
臨床検体では白血病、悪性腫細胞を含む骨髄または末梢血、細胞浮遊液から、Ficoll-Paque(Sigma)を用いて比重遠心法により単核球を分離する。分離後、細胞は単核球の80％以上を占め、生細胞率は95％以上であることを確認する。MOLT-4、K562では、対数増殖期にある細胞を3〜10×106/ml濃度に調整後、使用した。96穴プレート(Falcon)を用いて、薬剤を含まないあるいは段階希釈したASNaseを含む培養液（10％胎児ウシ血清入りRPMI1640）中に5 ％CO2、37℃で単核球を4日間培養する。ASNaseの最終濃度は0.008〜5.00U/ml とした［Yamada, S., et al., Clinical relevance of in vitro chemoresistance in childhood acute myeloid leukemia. Leukemia, 2001. 15(12): p. 1892-7］。1ウェル（培養液100μl）あたりの単核球数は、ALLでは3×105個、AMLでは1×105個とした。4 日間培養methyl-thiazol-tetrazolium（MTT）アッセイにより、薬剤無添加ウェルをコントロールとしてASNase添加ウェルの殺細胞率を算定した。用量反応曲線から50％の殺細胞率を示すASNaseの濃度（LD50asp）を求めた[Okada, S., et al., In vitro efficacy of l-asparaginase in childhood acute myeloid leukaemia. Br J Haematol, 2003. 123(5): p. 802-9]。【００４４】
（１−３）免疫細胞化学（ICC；Immunocytochemistry）
既報の別の抗体10μg/ml、抗ヒトASNS抗体 (モノクローナル抗体3Gハイブリドーマ培養上清; mouse IgG2a kappa 30ug/ml) [Sheng, S., et al., High-level expression of human asparagine synthetase and production of monoclonal antibodies for enzyme purification. Protein Expr Purif, 1992. 3(4): p. 337-46 ]を用いた免疫染色法[Kitoh, T., et al., Asparagine Synthetase Protein Expression in Leukemia Cells：Application of L−Asparaginase Treatment for Leukemia. Blood, 1998. 92(Suppl．1): p. 400a]で半定量し、FCMの結果との一致を確認した。方法は、未染色塗抹標本をエタノール固定し、内因性パーオキシダーゼをブロックしたのち、一次抗体として3G6ハイブリドーマの培養上清と 37℃で16分インキュベートし、二次抗体としてアビジン・ビオチンペルオキシダーゼ標識抗IgG抗体を使用し、染色は DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems)を使用して自動化イムノヒストケミストリーシステム(EX-IHC, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)を使用し、 3,3-ジアミノベンジジンにて発色、可視化した[Irino, T., et al., Establishment of real-time polymerase chain reaction method for quantitative analysis of asparagine synthetase expression. J Mol Diagn, 2004. 6(3): p. 217-24]。【００４５】
（２）結果
（２−１）
細胞株では既報のように、Erythroleukemia由来のASNS高発現のK562と、T-ALL由来のASNS低発現のMOLT-4においては、ASNSの酵素活性の測定、並びにELISA法による細胞あたりのASNS分子数の推定がされている。表１に示すようにその比率はおおむね、90〜75：1程度と考えられている。モノクローナル抗体Z5808を用いたフローサイトメトリー法（図１）では、平均蛍光強度（Mean  Fluorescence  Intensity）について全体（ALL MFI）から陰性コントロールのmean値（M1 MFI）を差し引いたものをΔMFIとして評価すると、ΔMFI値はK562では441.33、MOLT-4では0.02となり、それぞれのASNS酵素活性との間によい相関があった。L-ASNaseの感受性も、K562では、高度耐性(>1 U/ml)、MOLT-4では高感受性(<0.1 U/ml)であった。【００４６】
【表２】
2013051606.tif 000003
【００４７】
検討症例の概略を表３に示す。
【表３】
2013051606.tif 000004
【００４８】
（２−２）末梢血での結果
芽球比率34.5%のcase1のフローサイトメトリーの結果を図６に示す。scatter分布よりgatingを行い芽球を特定し、細胞質内のASNS蛋白を定量することができた。
Case2及びCase 3でも同様で（図７及び図８）、case3では、骨髄血、末梢血の結果を比較しても20%以上の芽球が含まれれば、細胞株や90%以上の芽球を含む骨髄血でのFCM検討と同等の結果が得られた。
AML症例  ; FAB分類M1のcase 4ではASNS低発現、FAB分類M2のcase 5ではASNS高発現であった（図９）。この例ではMTT assayも実施した。
同じく、MTT assayが実施できたALL２症例を図１０に示す。ともにASNS低発現であった。【００４９】
3症例の細胞株のMTT assayの結果を図１１に示す。Case5（AML M2）(図１１ではAML-5と表示)では、ASNS高発現、L-ASNase耐性のK562と同等の耐性度を示した。ALLの2症例（Case6及びCase7；図１１では、ALL-6、ALL-7と表示）は、T-ALL細胞株であるMOLT-4と同程度の感受性を示した。ASNS発現とL-ASNaseへの感受性の関係のまとめを表４に示す。発現量が増えるほど、L-ASNaseへの感受性が減弱する関係が明らかである。逆に発現量が低い症例ほどL-ASNase感受性であることが予想される。【００５０】
【表４】
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【００５１】
（３）考察
モノクローナル抗体Ｚ５８０８を用いたフローサイトメトリー（FCM）を実施し、腫瘍細胞内アスパラギン合成酵素ASNSの発現を蛍光的に検出した。FCMにおけるΔMFI(= Z5808のMFI−アイソタイプ対照のMFI)は、ASNS蛋白量を反映し、ALL症例、AML症例の多くが低ASNS蛋白量の白血病であった。AML症例の一部では、高ASNS蛋白量であった。MTT assayによるL-asparaginaseの感受性の検討では、高ASNS蛋白量のAML症例のID50は>5 U/mlでL-asparaginase抵抗性、低ASNS蛋白量のALL2例とも、<0.01 U/mlでの感受性であった。FCMによるASNS蛋白量の測定は、Ｌ−アスパラキナーゼの感受性について予測するための有力な情報をあたえるものと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2013051606000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月9日(2013.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を特異的に認識するモノクローナル抗体であって、アスパラギン合成酵素のＮ末端のアミノ酸配列を認識する上記抗体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項４】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４１又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４２を有するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１又は３に記載のモノクローナル抗体を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定するための試薬。
【請求項６】
請求項１又は３に記載のモノクローナル抗体と、アスパラギン合成酵素を含む細胞とを接触させる工程を含む、細胞内に存在するアスパラギン合成酵素を測定する方法。
【請求項７】
白血病細胞又は卵巣癌細胞に存在するアスパラギン合成酵素を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法によりアスパラギン合成酵素を測定し、上記の測定の結果に基づいて、白血病又は卵巣癌のＬ−アスパラキナーゼの感受性を評価する方法。
【国際調査報告】
2013051606.tif 000017
2013051606.tif 000018
2013051606.tif 000019
2013051606.tif 000020