(57)【要約】    アミノペプチダーゼの効率的な製造方法が開示されている。当該方法は，宿主細菌をアミノペプチダーゼ遺伝子及び中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換するか，又は該宿主細菌の一部を該アミノペプチダーゼ遺伝子で形質転換すると共に該宿主細菌の他の一部を該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換するステップと，該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換された該宿主細菌を，又は該アミノペプチダーゼ遺伝子で形質転換された該宿主細菌及び該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換された宿主細菌の混合物を，培地中で培養して該アミノペプチダーゼ及び該中性プロテアーゼ遺伝子の双方を発現させるステップと，産生されたアミノペプチダーゼを培養液から回収するステップとを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細菌をアミノペプチダーゼ遺伝子及び中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換するか，又は該宿主細菌の一部を該アミノペプチダーゼ遺伝子で形質転換すると共に該宿主細菌の他の一部を該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換するステップと，
該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換された該宿主細菌を，又は該アミノペプチダーゼ遺伝子で形質転換された該宿主細菌及び該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換された宿主細菌の混合物を，培地中で培養して該アミノペプチダーゼ及び該中性プロテアーゼ遺伝子の双方を発現させるステップと，
産生されたアミノペプチダーゼを培養液から回収するステップと
を含んでなる，アミノペプチダーゼの製造方法。
【請求項２】
アミノペプチダーゼの回収が，培養上清中に遊離されたアミノペプチダーゼを回収することを含むものである，請求項１の製造方法。
【請求項３】
該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子の各々が，宿主細菌とは別の種に属する細菌由来のものである，請求項１又は２の製造方法。
【請求項４】
該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子が，互いに同一の種に属する細菌由来のものである，請求項１ないし３の何れかの製造方法。
【請求項５】
該アミノペプチダーゼ遺伝子が，タンパク質中のプロリン残基の１残基手前でペプチド結合切断反応を停止する特性を有するアミノペプチダーゼの遺伝子である，請求項１ないし４の何れかの製造方法。
【請求項６】
該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子が，共にV. proteolyticus由来のものである，請求項１ないし５の何れかの製造方法。
【請求項７】
該宿主細菌が大腸菌である，請求項１ないし６の何れかの製造方法。
【請求項８】
該アミノペプチダーゼが，そのプレプロタンパク質において配列番号４のアミノ酸配列を有するものである，請求項１ないし７の何れかの製造方法。
【請求項９】
該中性プロテアーゼがビブリオリシンである，請求項１ないし８の何れかの製造方法。
【請求項１０】
該ビブリオリシンがその成熟タンパク質において配列番号１８のアミノ酸配列を有するものである，請求項１ないし９の何れかの製造方法。
【請求項１１】
該ビブリオリシン遺伝子が，Ｎ末端プロペプチド領域内に変異を有するものである，請求項１ないし９の何れかの製造方法。
【請求項１２】
該変異が，Ｎ末端プロペプチド領域における第158番目のアミノ酸残基AlaのValへの変異である，請求項１ないし１１の何れかの製造方法。
【請求項１３】
配列番号１５の塩基配列をビブリオリシンプロペプチドをコードする塩基配列として含んでなる，ビブリオリシン遺伝子。
【請求項１４】
配列番号１５の塩基配列とこれに続く配列番号１７の塩基配列とを含んでなる請求項１３のビブリオリシン遺伝子。
【請求項１５】
シグナル配列をコードする塩基配列に続いて，配列番号１５の塩基配列とこれに続く配列番号１７の塩基配列とを含んでなる請求項１４のビブリオリシン遺伝子。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５の何れかのＤＮＡを含んでなるビブリオリシン発現用の大腸菌用発現ベクターであるプラスミド。
【請求項１７】
ビブリオリシン遺伝子とV. proteolyticus由来アミノペプチダーゼ遺伝子の導入によりこれらの遺伝子を発現するよう形質転換された大腸菌。
【請求項１８】
ビブリオリシン遺伝子が，そのプロペプチド領域内に，アミノ酸残基に変異を生じさせる塩基の変異を有するものである，請求項１７の大腸菌。
【請求項１９】
請求項１６のプラスミドと，V. proteolyticus由来アミノペプチダーゼ遺伝子を含んでなる発現ベクターであるプラスミドとを導入することにより形質転換された，大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミノペプチダーゼの製造方法に関し，特に大腸菌を用いたアミノペプチダーゼの改良された製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術が１９８０年代に確立されて以来，真核生物の単純タンパク質を，製造コストの低い大腸菌を用いて製造することが広く行われている。多くのタンパク質は，それら本来の生物体内において，不活性型の前駆体タンパク質として合成された後に，タンパク質分解酵素による切断〔例えば，アミノ末端（Ｎ末端）側のメチオニンの除去〕その他の処理を受けて成熟型のタンパク質となる。しかしながら，原核生物である大腸菌に産生させた真核生物のタンパク質は，そのＮ末端側に開始コドンに由来するメチオン残基等の不要なアミノ酸残基が残った形であることが多い。そのような不要なアミノ酸残基を有するタンパク質は，医薬品としてヒトに投与した場合，アナフィラキシー等の抗原抗体反応を引き起こす可能性がある。そのため，不要なアミノ酸残基を取り除く必要がある。【０００３】
タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）側からアミノ酸残基を１つずつ切断除去する活性を有するアミノペプチダーゼには，特異性を異にするものなど種々のものが知られており，それらを用いて前駆体タンパク質を成熟タンパク質へと変換する方法についても種々報告されている（例えば，特許文献１，特許文献２，特許文献３）。【０００４】
例えば，ヒト成長ホルモンは，これを組換え大腸菌で産生させるとＮ末端にメチオニン残基を残した前駆体ヒト成長ホルモンとして得られ，そのアミノ酸配列は，Ｎ末端から，「Met-Phe-Pro-・・」と続く。アミノペプチダーゼのうち，タンパク質中のプロリン残基の１残基手前でペプチド結合切断反応を停止する特性を有するものは，前駆体ヒト成長ホルモンのＮ末端メチオニン残基のみを選択的に除去することができる。そのようなアミノペプチダーゼを使用することにより，前駆体ヒト成長ホルモンから成熟型ヒト成長ホルモンが得られることは周知であり，現在，その方法で製造された成熟型ヒト成長ホルモンを含んだ製剤が，医薬品市場に供給されている。【０００５】
これまでに，前駆体ヒト成長ホルモンが有するようなＮ末端メチオニンの除去に適したアミノペプチダーゼは，種々知られている（特許文献４，；特許文献５）。そのようなアミノペプチダーゼの一つに，Vibrio proteolyticusのアミノペプチダーゼがある。この酵素は，４個のドメイン（シグナルペプチド，Ｎ末端プロペプチド，成熟領域，及びＣ末端プロペプチド）からなるプレプロタンパク質として翻訳される。V. proteolyticusのアミノペプチダーゼは， V. proteolyticusを一定時間培養した後の培養液中に見出され，遠心分離等により菌体と簡単に分離できるという利点を有する。しかしながら，上記培養液中に見出されるアミノペプチダーゼの量は少なく，工業的に必要とされるアミノペプチダーゼを生産するには，大規模な設備が必要となり，そのためコストがかかるという大きな欠点がある。このためV. proteolyticusのアミノペプチダーゼ遺伝子を，分泌シグナルをPelBに変換するなど大腸菌での発現用に適するように改変して，大腸菌に産生，分泌させるようにすることも研究されているが，産生効率はV. proteolyticusそのものを用いた場合の３倍程度に留まっている。【０００６】
一般にアミノペプチダーゼ（ＡＰ）は不活性型として翻訳された後に活性型へと変換されるが，その機序は十分に解明されていない。V. proteolyticusの近縁種においてＡＰがある種のプロテアーゼにより切断され，活性型となることが知られている（非特許文献１，非特許文献２）。また，V. proteolyticus培養液中に中性プロテアーゼ〔ビブリオリシン（vibriolysin : nprV）〕が見出されている（非特許文献３，非特許文献４，非特許文献５）。ビブリオリシンは，アミノ酸１〜24よりなるシグナルペプチド，アミノ酸25〜196よりなるＮ末端プロペプチド，及び残りの，成熟タンパク質を構成するアミノ酸197〜609よりなるペプチド鎖として翻訳される細胞外亜鉛メタロプロテアーゼであるが，V. proteoliticusにおけるアミノペプチダーゼ産生に対するビブリオリシンの役割については，これまで明らかにされていない。【０００７】
【特許文献１】特開昭６２−２４４３８１号公報
【特許文献２】特表昭６２−５００００３号公報
【特許文献３】特表２００４−５３３２６３号公報
【特許文献４】ＷＯ ８６／０１２２９
【特許文献５】米国特許５５６９５９８
【非特許文献１】S. Nirasawa et al. (1999) Biochim Biophys Acta. Aug 17;1433(1-2):335-42
【非特許文献２】ZZ. Zhang et al. (2000) Biochem J. Sep 15;350 Pt 3:671-6
【非特許文献３】J. Prescott et al. (1976) Methods Enzymol.45 404-415
【非特許文献４】D. Durham (1990) Appl Environ Microbiol. Aug;56(8):2277-81
【非特許文献５】S. Shinoda et al. (2004) Handbook of Proteolytic Enzymes 2nd ed.,399-40
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記背景のもと，本発明は，アミノペプチダーゼの製造効率を改善することのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは， V. proteolyticusのアミノペプチダーゼ遺伝子と同細菌の中性プロテアーゼであるビブリオリシン（vibriolysin：nprV) 遺伝子とを大腸菌内で共発現させることにより，これまで形質転換大腸菌を用いて可能であったよりも高い効率で，培養上清中にアミノペプチダーゼを得ることに成功した。更にまた，nprV遺伝子の塩基配列に改変を加えることによって，形質転換大腸菌にアミノペプチダーゼを更に飛躍的に高い効率で安定に産生させ且つ細胞外に分泌させることに成功した。本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。【００１０】
すなわち本発明は，以下を提供するものである。
１．宿主細菌をアミノペプチダーゼ遺伝子及び中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換するか，又は該宿主細菌の一部を該アミノペプチダーゼ遺伝子で形質転換すると共に該宿主細菌の他の一部を該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換するステップと，
該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換された該宿主細菌を，又は該アミノペプチダーゼ遺伝子で形質転換された該宿主細菌及び該中性プロテアーゼ遺伝子で形質転換された宿主細菌の混合物を，培地中で培養して該アミノペプチダーゼ及び該中性プロテアーゼ遺伝子の双方を発現させるステップと，
産生されたアミノペプチダーゼを培養液から回収するステップと
を含んでなる，アミノペプチダーゼの製造方法。
２．アミノペプチダーゼの回収が，培養上清中に遊離されたアミノペプチダーゼを回収することを含むものである，上記１の製造方法。
３．該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子の各々が，宿主細菌とは別の種に属する細菌由来のものである，上記１又は２の製造方法。
４．該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子が，互いに同一の種に属する細菌由来のものである，上記１ないし３の何れかの製造方法。
５．該アミノペプチダーゼ遺伝子が，タンパク質中のプロリン残基の１残基手前でペプチド結合切断反応を停止する特性を有するアミノペプチダーゼの遺伝子である，上記１ないし４の何れかの製造方法。
６．該アミノペプチダーゼ遺伝子及び該中性プロテアーゼ遺伝子が，共にV. proteolyticus由来のものである，上記１ないし５の何れかの製造方法。
７．該宿主細菌が大腸菌である，上記１ないし６の何れかの製造方法。
８．該アミノペプチダーゼが，そのプレプロタンパク質において配列番号４のアミノ酸配列を有するものである，上記１ないし７の何れかの製造方法。
９．該中性プロテアーゼがビブリオリシンである，上記１ないし８の何れかの製造方法。
１０．該ビブリオリシンがその成熟タンパク質において配列番号１８のアミノ酸配列を有するものである，上記１ないし９の何れかの製造方法。
１１．該ビブリオリシン遺伝子が，Ｎ末端プロペプチド領域内に変異を有するものである，上記１ないし９の何れかの製造方法。
１２．該変異が，Ｎ末端プロペプチド領域における第158番目のアミノ酸残基AlaのValへの変異である，上記１ないし１１の何れかの製造方法。
１３．配列番号１５の塩基配列をビブリオリシンプロペプチドをコードする塩基配列として含んでなる，ビブリオリシン遺伝子。
１４．配列番号１５の塩基配列とこれに続く配列番号１７の塩基配列とを含んでなる上記１３のビブリオリシン遺伝子。
１５．シグナル配列をコードする塩基配列に続いて，配列番号１５の塩基配列とこれに続く配列番号１７の塩基配列とを含んでなる上記１４のビブリオリシン遺伝子。
１６．上記１３ないし１５の何れかのＤＮＡを含んでなるビブリオリシン発現用の大腸菌用発現ベクターであるプラスミド。
１７．ビブリオリシン遺伝子とV. proteolyticus由来アミノペプチダーゼ遺伝子の導入によりこれらの遺伝子を発現するよう形質転換された大腸菌。
１８．ビブリオリシン遺伝子が，そのプロペプチド領域内に，アミノ酸残基に変異を生じさせる塩基の変異を有するものである，上記１７の大腸菌。
１９．上記１６のプラスミドと，V. proteolyticus由来アミノペプチダーゼ遺伝子を含んでなる発現ベクターであるプラスミドとを導入することにより形質転換された，大腸菌。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば，アミノペプチダーゼ，特にV. proteolyticus由来アミノペプチダーゼを，従来よりも高い効率で宿主細菌，特に宿主大腸菌に産生させ培地中に遊離させることができる。特に，アミノペプチダーゼと共発現させる中性プロテアーゼとしてV. proteolyticus由来のものを用いるときは，培地中へのアミノペプチダーゼの産生効率を大きく高めることができ，更にまた，中性プロテアーゼのアミノ酸配列に変異を導入することにより，産生効率を格段に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】(A) ベクターpRL-AP，（B）ベクターpET-AP，及び（C）ベクターpCDF-nprVの組換え部分を示す。
【図２】ベクターpRL-PelB-APの遺伝子マップ
【図３】BL21/pRL-APを40℃及び42℃で発現誘導した後の培養上清中及び細胞溶解液中のアミノペプチダーゼ活性（ＡＰ酵素活性）をそれぞれ示すグラフ。
【図４】pET-43.1b(+)ベクターの遺伝子マップ
【図５】BL21(DE3)/pET-APを25℃，１ｍＭ IPTGで発現誘導した後の，培養上清中及び細胞溶解液中のアミノペプチダーゼ活性（ＡＰ酵素活性）を示すグラフ。
【図６】ベクターpCDF-1bの遺伝子マップ。
【図７】BL21(DE3)/pET-AP及びBL21(DE3)/pET-AP&pCDF-nprVを，25℃，１ｍＭ IPTGで発現誘導した後の培養上清中及び細胞溶解液中のアミノペプチダーゼ活性をそれぞれ示すグラフ。
【図８】BL21(DE3)/pET-AP及びBL21(DE3)/pET-AP&pCDF-nprV-Rを，25℃，１ｍＭ IPTGで発現誘導した後の培養上清中のアミノペプチダーゼ活性を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において，アミノペプチダーゼと中性プロテアーゼで宿主細菌を形質転換するに際し，アミノペプチダーゼ遺伝子を含んだ発現ベクターと中性プロテアーゼ遺伝子を含んだ別の発現ベクターとを同一の宿主細菌に導入してこれを形質転換することができる。代わりとして，アミノペプチダーゼ遺伝子及び中性プロテアーゼ遺伝子を共に含んだ発現ベクターにより宿主細菌を形質転換してもよい。更には，アミノペプチダーゼ遺伝子を含んだ発現ベクターを宿主細菌の一部に導入してこれを形質転換すると共に，中性プロテアーゼ遺伝子を含んだ発現ベクターを宿主細菌の他の一部に導入してこれを形質転換してもよい。この最後の場合には，一方の遺伝子のみで形質転換された２とおりの宿主細菌は，各遺伝子の発現のための培養に際して混合される。【００１４】
アミノペプチダーゼとしては，当業者に知られている種々のものを用いることができるが，特に好ましいアミノペプチダーゼは，V. proteolyticus由来のアミノペプチダーゼである。【００１５】
中性プロテアーゼとしては，当業者に知られている種々のものを用いることができるが，特に好ましい中性プロテアーゼは，V. proteolyticus由来のビブリオリシン（nprV）である。【００１６】
宿主細菌としては，種々のものを用いることが可能であるが，安価で取り扱いやすいことから大腸菌が好ましい。【００１７】
本発明において，「ビブリオリシン遺伝子」というときは，野生型遺伝子（配列番号１２）のみならず，ビブリオリシンの酵素活性発現に悪影響を及ぼさない限り部分的にアミノ酸の変異を有するものも包含する。アミノ酸の変異は，挿入，置換，欠失及び付加を含み，通常，変異させるアミノ酸の個数は１〜数個（例えば１〜５個）である。特にビブリオリシンのＮ末端プロペプチド領域にアミノ酸の変異を起こさせることは，ビブリオリシンを大腸菌で安定に活性型として発現させる上で好ましい影響を与え得る。ビブリオリシンのアミノ酸配列の変異は，対応する遺伝子の塩基配列を変異させることで導入することができる。遺伝子は，所望の位置に，又はランダムに，周知の技術を用いて変異させることができる。変異を起こさせたビブリオリシン遺伝子をアミノペプチダーゼ遺伝子と共に宿主細菌に導入して形質転換させ，培養して両遺伝子を共発現させることにより産生される活性なアミノペプチダーゼ量を測定することにより，より高いアミノペプチダーゼ産生量をもたらすビブリオリシン変異体を容易に選択することができる。
【実施例１】
【００１８】
以下，実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００１９】
〔参考例１〕  形質転換大腸菌によるアミノペプチダーゼの製造
次のようにして，V. proteolyticusよりゲノムＤＮＡを調製し，アミノペプチダーゼ（ＡＰ）遺伝子をクローニングした。【００２０】
（１）アミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
0.8％Nutrient Broth（Difco，No. 234000）及び3.0％ＮａＣｌを含む培地で26℃一晩（14時間）培養したV. proteolyticusの菌体培養液を3.0ｍＬから，「GenElute Bacterial Genomic DNAキット」（Sigma，No. NA2100）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した（具体的な方法はキットに記載の方法に基づき実施）。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし，アミノペプチダーゼ（ＡＰ）遺伝子を，２種のプライマー（下記）を用いて，ＰＣＲ法（反応条件：94℃２分→94℃15秒，55℃30秒，68℃90秒を30サイクル→68℃７分）により増幅し，得られた増幅産物をクローニングベクターpGEM-T easy（プロメガ製）中にライゲーションした。
・BaRBFL41プライマー：CGGGATCCTAAGGAGGTTATCATATGAAATATACCAAAACG（配列番号１）
（塩基３〜８のGGATCCは，BamHI部位）
・No-FL33Rプライマー：CGGCGGCCGCTTATCAGAAAGTGCTGGCTTTCA（配列番号２）
（塩基３〜１０のGCGGCCGCは，NotI部位）
この反応液を用い大腸菌のコンピテントセルを形質転換し，形成されたコロニーからプラスミドを抽出した。このプラスミドのＤＮＡ配列を解析し，配列に誤りがないことを確認した。ＡＰ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を，配列番号３及び配列番号４に，それぞれ示す。【００２１】
（２）分泌シグナル配列の置換
次いで，ＡＰ遺伝子の分泌シグナル配列をErwinia carotovora のPelB分泌シグナル配列に変換した。まず，PelB分泌シグナル配列を，４本のオリゴヌクレオチド（下記）を張り合わせることで作成した。具体的には，下記の一本鎖ＤＮＡ(i) PelB-1Fと(ii) PelB-2R，及び(iii) PelB-3Fと(iv) PelB-4RをそれぞれＰＣＲに付し，次に両方のＰＣＲ増幅産物をさらに張り合わせてＰＣＲに付すことで，PelB分泌シグナル配列を得た（ＰＣＲ条件：94℃2分→  98℃10秒，55℃30秒，68℃30秒で実施，１回目は5サイクル，２回目は35サイクル）。ＡＰ遺伝子の5’末端部分をこのPelB分泌シグナル配列で置換（BamHI/MunI部位を使用）し，PelB-AP配列を得た。
(i) PelB-1F：ACGGGATCCTAAGGAGGTTATCATATGAAATACCTGCTGCCCAC（配列番号５）
(ii) PelB-2R：CAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTGGGCAGCAGGTATTTCAT（配列番号６）
(iii) PelB-3F：GCTGGTCTGCTGCTCCTGGCTGCCCAACCCGCGATGGCCGAAG（配列番号７）
(iv) PelB-4R：CGCACCAATTGAGATCCACACTTTGTCTTCGGCCATCGCGGGTT（配列番号８）
元の分泌シグナルの塩基配列（63塩基）を配列番号９に，これに置換わったPelB分泌シグナルの塩基配列（66塩基）を配列番号１０に，それぞれ示す。【００２２】
（３）PelB-APのpRＬベクターへの組み込み
上記により得られた，分泌シグナルをPelB分泌シグナルに変換したＡＰ遺伝子（PelB-AP）を，温度依存的λpRLプロモーターをもつpRLベクターにクローニングし，ＡＰ発現ベクター“pRL-AP”を作製した（図１）。すなわち，ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）より，プラスミドpCE30（ATCC37830）（Elvin CMら，1990，Gene 87，123-126）を購入した。このプラスミドは，クローニング部位の上流に，順次，λファージのｐＬプロモーター，これとタンデムに並んだｐＲプロモーター，更にはその上流の温度感受性リプレッサー遺伝子λcI857の塩基配列を有し，30℃ではプロモーターの転写が抑制され，４２℃で培養することで導入遺伝子が発現するように構築されている。このプラスミドに改良を加え，ラムダプロモーターの直後にNotI部位を加えたものを発現ベクターpRLとした。pRLベクターをあらかじめBamHIとNotIで消化し，ベクター領域を精製した。PelB-AP配列についても同様に消化し，この配列を精製した。これらのＤＮＡ断片をライゲーション，コンピテント化した大腸菌を形質転換することでコロニーを得た。このコロニーからプラスミドを抽出し，制限酵素切断並びにシークエンシングにより配列を確認した。得られたプラスミドをpRL-PelB-APとした（図２）。【００２３】
18μＬのコンピテント細胞（大腸菌BL21株）に２μLのpRL-PelB-APプラスミド溶液を加え，30分氷上で静置後，42℃，18秒の熱処理を行い，これをＬＢ＋アンピシリン（Amp）プレートに播種し，30℃で一晩静置した。任意のコロニーを選択し，100μｇ／ｍＬ Ampを含むＬＢ培地で30℃一晩振盪培養（200ｒｐｍ）した。誘導発現には，この一晩培養した培養液をＬＢ＋Amp培地で10倍に希釈し，30℃で３時間振盪培養（200ｒｐｍ）し，その後温度を40℃又は42℃に上げ，4.5時間更に培養し，培養液を12000ｒｐｍで５分間遠心分離して上清と沈澱に分けた。上清は，下記の酵素活性測定等へ供し，沈殿は次の操作に付し，酵素を抽出した。【００２４】
（４）酵素の抽出
上記沈殿に，１／５体積量のBugBuster（タカラバイオ）を加え，室温で10分間穏やかに撹拌した後，15000ｒｐｍで10分間遠心分離して上清と沈殿に分けた。この上清を細胞溶解液として酵素活性測定等へ供した。【００２５】
（５）ＡＰ酵素活性の測定
得られたＡＰの酵素活性を，合成基質（L-pNA）を用いて測定した。「J. Prescott et al.(1971)J.Biol.Chem.246(6)1756-1764」および「J. Prescott et al.(1976)Methods Enzymol.45 530-543」の方法を参考にして，以下の手順で測定を行った。まず100μLの基質溶液（１ｍＭロイシン−ｐ−ニトロアニリド（Sigma, L-2158），0.5ｍＭトリシン〔Tricine；Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〕，５μＭ硫酸亜鉛を含む50ｍＭトリス塩酸，ｐＨ8.0）に10μＬのサンプルを加え，室温で30分反応させた。停止液（0.1Ｍ塩酸）を300μＬ加えて混合した後，100μＬを96ウェルプレートに移し，プレートリーダーでＯＤ（405ｎｍ）を測定した（表１）。またアミノペプチダーゼ（Sigma, A-8200）を標準品として検量線を作成し，各サンプル中のＡＰ活性を求めた。その結果，図３に示すように，細胞抽出液中にはＡＰ活性が見出されたが，培養液中にはほとんど見出されなかった。【００２６】
【表１】
2009057533.tif 000002
【００２７】
（６）pETへのPelB変換体ＡＰ遺伝子のクローニング
一般的に分泌発現には低温での培養が有利とされている。そこでより低温での誘導を検討するため，Ｔ７プロモーターをもつｐＥＴベクターにPelB変換ＡＰ遺伝子をクローニングし，ＡＰ発現ベクター“pET-AP”を作製した（図１）。すなわち，pET-43.1b(+) (Novagen, 70940-3)（図４）をメルク社より購入し，NdeIとNotIで消化し，Nus-tag部分を除去し，ベクター領域を精製した。先に作製済みのpRL-PelB-APも同様にNdeIとNotIで消化し，PelB-AP領域を精製した。これら両断片をライゲーション後，JM109へ形質転換し，コロニーを得た。任意のコロニーよりプラスミドを調製し，NdeIとNotIによる制限酵素処理で正しいクローンを選択した。得られたプラスミドをpET-APとした。【００２８】
（７）ＡＰの発現
こうして得られたpET-APを大腸菌BL21(DE3)株に導入し，25℃の条件下，１ｍＭのIPTGで誘導することによりＡＰを発現させた。すなわち，50μＬのBL21-star(DE3)コンピテントセル（Invitrogen,C6010-03）に１μＬのpET-AP溶液を加え，30分氷上で静置後，42℃，30秒の熱処理を行った。LB+アンピシリン(Amp)プレートに播種し，30℃で一晩静置した。任意のコロニーを選択し，100μｇ／ｍＬのAmpを含むＬＢ培地で30℃，16時間振盪培養（220ｒｐｍ）した。ＬＢ培地で20倍希釈し，さらに30℃，３時間振盪培養（220ｒｐｍ）後に，終濃度１ｍＭとなるようにIPTGを加え，更に16〜20時間，25℃で振盪培養（220ｒｐｍ）した。培養液を3000ｒｐｍにて30分遠心処理し，上清をＡＰ酵素活性測定へ供した。【００２９】
（８）ＡＰ酵素活性の測定
上記（５）と同様の方法でＡＰ酵素活性を測定し次の結果を得た。【００３０】
【表２】
2009057533.tif 000003
【００３１】
表２に見られるように，培養液中に高いＡＰ活性が認められ，これはV. proteolyticusを用いた場合の３倍程度であった。しかしこの系で培養液中に分泌されたのは全ＡＰ活性の１０％未満であり，９０％以上は分泌されず細胞抽出液中に見出された（図５）。この結果は従来科学論文等に報告されているものと同様で，効率よく培養液中にＡＰ活性を得ることはできなかった。【００３２】
〔実施例１〕  中性プロテアーゼとアミノペプチダーゼとの共発現
本発明者らは，以下のようにして，nprVをAPと大腸菌で共発現させることを試みた。【００３３】
（１）ビブリオリシン（nprV）遺伝子のクローニング
中性プロテアーゼnprV（プレプロタンパク質）をコードする塩基配列を配列番号１１で，そのアミノ酸配列を配列番号１２で，それぞれ示す。配列番号１１中，塩基１〜72がシグナル配列，塩基73〜588がプロペプチド配列，塩基589〜1830が成熟タンパク質を，それぞれコードする。配列番号１２中，アミノ酸１〜24がシグナル配列，アミノ酸25〜196がプロペプチド配列，アミノ酸197〜609が請求項タンパク質に，それぞれ相当する。【００３４】
上記「（１）アミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング」の部において調製したゲノムＤＮＡを鋳型に，次の手順でＰＣＲによりnprV遺伝子をクローニングした。Blend Taq-plus(TOYOBO,BTQ-201)を用いてＰＣＲ反応を行った。以下に示す配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
(i) nprV_NcoI_FWプライマー(5’-GCATAATCCATGGCAAAATAAAACACAACGTCACATCAACTGGC-3’：配列番号１３，塩基８〜１３のCCATGGは，NcoI部位)
(ii) nprV_NotI_BamHI_RVプライマー
(5’-GCATAATGCGGCCGCGGATCCATTAGTCAGCACGCAAAGTTACACC-3’：配列番号１４，塩基８〜２２は，NotI及びBamHI部位)
反応条件は「94℃／２分，（94℃／30秒，60→54℃（−１℃／サイクル）／30秒，72℃／2.5分）×７サイクル，（94℃／30秒，53℃／30秒，72℃／2.5分）×30サイクル，４℃／∞」とした。【００３５】
（２）発現ベクターpCDF-nprVの作成
次いで，クローニングされたnprV遺伝子（NcoI部位を付与するため，開始コドンATGの直後に（Alaをコードする）GCAが挿入されたもの）を，T7プロモーター下にクローニングし，nprV発現ベクター“pCDF-nprV”を作製した（図1）。すなわち，pCDF-1b(Novagen, 71330-3)（図６）をメルク社より購入し，このプラスミドと，上記で調製したnprV遺伝子のPCR産物とを，NcoIとNotIで消化した。それぞれを精製した後，両断片をライゲーションし，これによりJM109を形質転換してコロニーを得た。任意のコロニーよりプラスミドを調製し，NcoIとNotIによる制限酵素処理により正しいクローンを選択した。塩基配列の解析を行い，配列に変異がないことを確認した。得られたプラスミドをpCDF-nprVとした。【００３６】
（３）大腸菌におけるビブリオリシンとアミノペプチダーゼとの共発現
この発現ベクターと前記pET-APベクターを大腸菌BL21(DE3)株に導入し，25℃の条件下，１ｍＭ IPTGで誘導することによりＡＰおよびnprVを発現させた。上記「（６）pETへのPelB変換体ＡＰ遺伝子のクローニング」の部で作製したBL21star(DE3)/pET-APを塩化カルシウム法でコンピテントセルとして調製し，上記（２）で作製したpCDF-nprVプラスミドで形質転換した。Ampとストレプトマイシン（Sm）の両薬剤で選択し，成育してきたコロニーを発現実験に用いた。任意のコロニーを選択し，100μｇ／ｍＬ Amp + 40μｇ／ｍＬ Smを含むLB培地で30℃，16時間振盪培養（220ｒｐｍ）した。LB培地で20倍希釈し，さらに30℃，３時間振盪培養（220ｒｐｍ）後に，終濃度１ｍＭとなるようにIPTGを加え，さらに16〜20時間，25℃で振盪培養（220ｒｐｍ）した。培養液を3000ｒｐｍ，30分遠心処理し，上清をＡＰ酵素活性測定およびプロテアーゼ活性測定へ供した。【００３７】
（４）プロテアーゼ活性の測定
150μＬの基質溶液（0.1％ アゾカゼインを含む50mM Tris-HCl pH7.4）に10μＬのサンプルを加えて37℃で10分間反応させた。これに150μＬの停止液（10％ TCA）を加えて氷上で10分静置した。12000ｒｐｍ，4℃，4分遠心し，上清250μLを96ウェルプレート移し，プレートリーダーでＯＤ420を測定した。【００３８】
【表３】
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【００３９】
【表４】
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【００４０】
表３に見られるように，大腸菌にＡＰとnprVの双方を導入した場合には，ＡＰのみを導入した場合の５〜６倍の高いＡＰ活性を培養上清中に得ることができた。これはV. proteolyticusが産生するＡＰ活性に比べて約15〜20倍に相当する。また，表４に見られるように，ＡＰとnprVを共発現させた大腸菌では，培養上清中に高いプロテアーゼ活性が認められた。興味深いことに，nprVをＡＰと共発現させた大腸菌では，細胞抽出液中には殆どＡＰ活性が見出せなかった（図７）。このことは，ＡＰとnprVとの共発現によって，培養上清中のＡＰの活性型への変換のみでなく，ＡＰの培地中への分泌効率も上昇することを示唆している。【００４１】
〔実施例２〕  変異型中性プロテアーゼとアミノペプチダーゼとの共発現
（１）変異型中性プロテアーゼの作成
nprVにランダムに突然変異を導入し，大腸菌で安定に活性型として発現できる変異型nprVを取得した（nprV-Rと命名）。すなわち，ランダム変異導入には，in vivoで突然変異を誘発できるXL1-Red変異株(Stratagene社, Cat#200129)を用いた。上記で作製済みのnprV発現ベクターpCDF-nprVを用いてXL1-Red変異株を形質転換し，ＬＢ寒天＋40μｇ／ｍＬ Sm プレートに播種した。37℃で24時間培養後，300個のコロニーを掻き取り10ｍＬのＬＢ＋ 40μｇ／ｍＬ Smに植菌し，37℃で18時間培養後にアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを精製した。このプラスミドでBL21(DE3)を形質転換し，ＬＢ寒天＋1.5％スキムミルク＋40μｇ／ｍＬ Sm＋１ｍＭ IPTG プレートへ播種した（15ｍｍ プレート×２）。37℃で16時間培養後，約4000個のコロニー／プレートが得られた。２枚のプレート(8000個のコロニー)のうち，１個のコロニーだけがスキムミルクを分解し，その回りにハローが確認できた。このコロニーを1.5ｍＬのＬＢ＋40μｇ／ｍＬ Ｓｍに懸濁し，37℃で一晩培養後に，GenElute Plasmid Miniprep Kit(Sigma, #PLN350)で精製した。こうして得られたnprV-Rの塩基配列を確認した。nprV-Rは，２箇所の変異を有することが判明した。それらは，（１）シグナル領域の塩基配列において（開始コドン直後に挿入されたGCAを含めた場合）33番目の塩基がGからAへと変異したことによる，アミノ酸配列における（先頭のMetの直後に挿入されたAlaを含めた場合）11番目のTrpのSTOPコドン（Opal：TGA）への変異，及び（２）Ｎ末端プロペプチド領域の塩基配列における（開始コドン直後に挿入されたGCAを含めた場合）548番目の塩基がCからTへと変異したことによる，プレプロ体のアミノ酸配列における（先頭のMetの直後に挿入されたAlaを含めた場合）183番目のAlaのValへの変異である。【００４２】
（２）変異型中性プロテアーゼとアミノペプチダーゼとの共発現
次いで，ＡＰとnprV-Rの共発現を行うため，BL21(DE3)/pCDF-nprV-RをpET-APで形質転換し，BL21(DE3)/pCDF-nprV-R & pET-APを作成した。任意のクローンを１ｍＬのＬＢ＋100μｇ／ｍＬ Amp＋40μｇ／ｍＬ Smに懸濁して30℃で５時間培養した後，終濃度１ｍＭのIPTGを加えて更に30℃で17時間培養した。3000rpmで30分遠心して上清を得た。上清中のＡＰ活性を測定した。その結果，変異型中性プロテアーゼ遺伝子とＡＰ遺伝子とを共発現させた大腸菌によれば，ＡＰ遺伝子のみを導入したコントロール（BL21(DE3)/pET-AP）に比べて20倍以上のＡＰ活性が見られた（図８）。このことは，変異型中性プロテアーゼとアミノペプチダーゼとの共発現により，培地中に極めて高い効率で活性なアミノペプチダーゼが得られることを示している。【００４３】
上記中性プロテアーゼに生じさせた変異（１）はシグナル配列中に，後者はＮ末プロペプチド配列中に，それぞれ見出されたものである。前者の変異の結果生じたコドンは，終止コドンとして認識されればそこで翻訳が終了してしまう筈である。しかしながら，実際には上記の結果からnprVの活性が見られることから，この変異コドンはリードスルーされているものと推察され，セレノシステインとして翻訳されている可能性が高い。シグナル中の変異のみ元に戻した変異型遺伝子を用いても同様の結果が得られることを確認している（データ示さず）。従ってシグナル配列中の変異は必須ではない。【００４４】
また変異（２）は，Ｎ末端プロペプチド（Ｎ末端メチオニンの直後にアミノ酸１個が挿入されているこの変異型nprV-Rでは，アミノ酸26〜197：変異型のＮ末端プロペプチドの塩基配列を配列番号１５で，そのアミノ酸配列を配列番号１６で，それぞれ示す。）中の変異である（配列番号１５の473番目の塩基のCからTへの変異，及びこれによる，配列番号１６の158番目のアミノ酸のAlaからValへの変異）。このため当該変異は，成熟nprVの塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号１２におけるアミノ酸197〜609：その塩基配列を配列番号１７で，そのアミノ酸配列を配列番号１８で，それぞれ示す。）には影響しない。天然型のＮ末端プロペプチドがビブリオリシンの活性に対し阻害的に作用するのが，アミノ酸変異（２）の導入により防止されて，活性発現の安定性に寄与したものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は，アミノペプチダーゼの製造を顕著に効率化させることができる。従って，本発明は，医薬品及び食品の製造において，特にヒト成長ホルモン，Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−２等，Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンであるタンパク質の製造において，微生物に産生させたそれらタンパク質のＮ末端に余分なアミノ酸残基が付加されているときこれを選択的に除去するために用いるアミノペプチダーゼの製造方法として，有用性が高い。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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