(57)【要約】α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α−アクチニン−４に対する抗体であって、当該領域における置換アミノ酸残基の全部又は一部を認識する、前記抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α−アクチニン−４に対する抗体であって、当該領域における置換アミノ酸残基の全部又は一部を認識する、前記抗体。
【請求項２】
変異型α−アクチニン−４が、α−アクチニン−４をコードするＤＮＡのエキソン８’に由来するスプライスバリアントである請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
置換アミノ酸残基が、α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４８番目のグリシン、第２５０番目のロイシン及び第２６３番目のシステインからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
置換アミノ酸残基を含むアミノ酸配列がＤＩＶＧＴＬＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＣ（配列番号４）で示される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０であるハイブリドーマにより産生される、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
【請求項８】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項５又は６に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体の断片。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０であるハイブリドーマ。
【請求項１２】
変異型α−アクチニン−４に対する抗体の製造方法であって、
（ａ）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであって当該領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、及び
（ｂ）当該非ヒト哺乳動物から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
変異型α−アクチニン−４に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、
（ａ）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであって当該領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
（ｂ）前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物が、ＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物である請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と生体試料とを反応させて、変異型α−アクチニン−４を検出することを特徴とする、変異型α−アクチニン−４の検出方法。
【請求項１６】
α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む変異型α−アクチニン−４をコードする遺伝子を検出する方法であって、当該置換アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーと生体試料とを反応させて前記遺伝子を検出する、前記方法。
【請求項１７】
変異型α−アクチニン−４をコードする遺伝子が、α−アクチニン−４をコードするＤＮＡのエキソン８’に由来するスプライスバリアントのｍＲＮＡである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法により得られた検出結果を用いて腫瘍を検出する方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法により検出された結果を指標として腫瘍の状態又は予後の状態を評価する方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含む、腫瘍の検出又は診断用試薬。
【請求項２１】
α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーを含む、腫瘍の検出又は診断用試薬。
【請求項２２】
腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である請求項２０又は２１に記載の試薬。
【請求項２４】
α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α−アクチニン−４の機能を阻害する物質を含む、抗腫瘍用医薬組成物。
【請求項２５】
変異型α−アクチニン−４の機能を阻害する物質が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体若しくはその断片、又は変異型α−アクチニン−４をコードする遺伝子の阻害性核酸である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である請求項２４又は２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型α−アクチニン−４に対する抗体であり、特に、α−アクチニン−４タンパク質の新規スプライスバリアントに対するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−アクチニン−４（以下ＡＣＴＮ４ともいう）は、α−アクチニンのひとつであり、Ｎ末端には球状のアクチン結合ドメイン、Ｃ末端にはカルシウムが結合するモチーフ（ＥＦハンドドメインという）を有している。また、ＡＣＴＮ４は、その中央部にあるロッドドメインを使って二量体を形成してダンベル状になり、また両端のアクチン結合ドメインを使ってアクチンを架橋し束状にする（非特許文献１）。哺乳類のα−アクチニンはアクチニン−１〜４の４種類が同定されており、アクチニン−１、−４が非筋肉型、そしてアクチニン−２と−３が筋肉型である（非特許文献１、２、３、４）。
ＡＣＴＮ４は、アクチン束状化に関与し、細胞運動性を促すアクチン結合タンパク質であり、細胞運動が亢進していると考えられる細胞突起に濃縮していることが確認されている。さらに、がん浸潤に対して何らかの積極的な貢献をしている可能性が示唆されている（非特許文献２）。
また、家族性糸球体巣状硬化症の家系に遺伝子変異がみられるエキソン８をスキップし，いままでに知られていない新規エキソン８’を挿入するタイプの選択的スプライスバリアントは、小細胞肺癌に特異的に発現しており、正常組織からは精巣にしか発現が確認できないことからがん精巣抗原である可能性が示唆されている（非特許文献５）。
一方、肺がんは、その組織所見により小細胞肺癌（ＳＣＬＣという）と、非小細胞肺癌（非ＳＣＬＣという）の２つに分類される。ＳＣＬＣは、原発性肺癌の２０％を占め、発育スピードが速いために多臓器転移を伴う進展型で発見されるケースが多く、”高い悪性度”と”予後不良”で知られている（非特許文献５）。
治療においては、腺癌と扁平上皮癌がその大半を占める非ＳＣＬＣとＳＣＬＣでは、その治療法が異なる。少しでも病期の進んだＳＣＬＣでは外科療法が適用できない点、非ＳＣＬＣでは化学療法の効果が低い点など特徴がある。そのため、早い病期で両者を鑑別することが、的確な治療を行うために重要であると考えられてきた。
また、非ＳＣＬＣに含まれる大細胞癌の亜型、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣという）は、原発性肺がんの３％を占め、ＳＣＬＣと同様に”予後不良”である。共にその他の肺がんと異なり、高い神経内分泌性格を持つ（非特許文献６）。
従来、ＳＣＬＣとＬＣＮＥＣは肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｎｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ，ＨＧＮＴ）と呼ばれ、診断法の一つとして、切除標本に対する神経内分泌マーカー（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ，Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ，ｎｅｕｒａｌ−ｃｅｌｌ−ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ））の免疫染色が行われてきた（非特許文献７）。
しかし、それら３マーカーの陽性率は決して高いものではなく、偽陽性率の高さが問題視されてきた。よって、小細胞肺癌と大細胞神経内分泌癌に高い特異性を持ち、早期検出が可能な新たな腫瘍マーカーの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．５８，１０４−１１１，２００４
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４０，１３８３−１３９３，１９９８
【非特許文献３】Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４７，６２−７１，１９９０
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９２８１−９２８８，１９９２
【非特許文献５】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２３，５２５７−５２６２，２００４
【非特許文献６】Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１９，１３５８−６８，２００６
【非特許文献７】Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．３１，２６−３２，２００７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＡＣＴＮ４の新規スプライスバリアントタンパク質などの変異型ＡＣＴＮ４（以下ＡＣＴＮ４−Ｖａという）に反応し、恒常的に発現するＡＣＴＮ４（以下ＡＣＴＮ４−Ｕｂという）に反応しない、ＡＣＴＮ４−Ｖａ特異的モノクローナル抗体、および当該抗体を産生する細胞株を提供することを目的とする。また本発明は、前記ＡＣＴＮ４−Ｖａの検出方法、および検出用試薬などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そしてＡＣＴＮ４−Ｖａまたはポリペプチドを抗原として用い、さらに、ＡＣＴＮ４−Ｕｂまたはポリペプチドをスクリーニングに用い、そして、抗原を抗親和性抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより、ＡＣＴＮ４−Ｖａと反応し、ＡＣＴＮ４−Ｕｂとは反応しない抗体、すなわち、ＡＣＴＮ４−ＶａとＡＣＴＮ４−Ｕｂとの識別が可能なモノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α−アクチニン−４に対する抗体であって、当該領域における置換アミノ酸残基の全部又は一部を認識する、前記抗体。
（２）変異型α−アクチニン−４が、α−アクチニン−４をコードするＤＮＡのエキソン８’に由来するスプライスバリアントである（１）に記載の抗体。
（３）置換アミノ酸残基が、α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４８番目のグリシン、第２５０番目のロイシン及び第２６３番目のシステインからなる群から選ばれる少なくとも１つである（１）に記載の抗体。
（４）置換アミノ酸残基を含むアミノ酸配列がＤＩＶＧＴＬＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＣ（配列番号４）で示される、（１）に記載の抗体。
（５）抗体がモノクローナル抗体である（１）に記載の抗体。
（６）受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０であるハイブリドーマにより産生される、（５）に記載の抗体。
（７）上記（５）又は（６）に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
（８）抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、（５）又は（６）に記載の抗体。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体の断片。
（１０）上記（５）又は（６）に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（１１）受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０であるハイブリドーマ。
（１２）変異型α−アクチニン−４に対する抗体の製造方法であって、
（ａ）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであって当該領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、及び
（ｂ）当該非ヒト哺乳動物から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
（１３）変異型α−アクチニン−４に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、
（ａ）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであって当該領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
（ｂ）前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
（１４）非ヒト哺乳動物が、ＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物である（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と生体試料とを反応させて、変異型α−アクチニン−４を検出することを特徴とする、変異型α−アクチニン−４の検出方法。
（１６）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む変異型α−アクチニン−４をコードする遺伝子を検出する方法であって、当該置換アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーと生体試料とを反応させて前記遺伝子を検出する、前記方法。
（１７）変異型α−アクチニン−４をコードする遺伝子が、α−アクチニン−４をコードするＤＮＡのエキソン８’に由来するスプライスバリアントのｍＲＮＡである（１６）に記載の方法。
（１８）上記（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法により得られた検出結果を用いて腫瘍を検出する方法。
（１９）上記（１５）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法により検出された結果を指標として腫瘍の状態又は予後の状態を評価する方法。
（２０）上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含む、腫瘍の検出又は診断用試薬。
（２１）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーを含む、腫瘍の検出又は診断用試薬。
（２２）腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である（１８）又は（１９）に記載の方法。
（２３）腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である（２０）又は（２１）に記載の試薬。
（２４）α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α−アクチニン−４の機能を阻害する物質を含む、抗腫瘍用医薬組成物。
（２５）変異型α−アクチニン−４の機能を阻害する物質が、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体若しくはその断片、又は変異型α−アクチニン−４をコードする遺伝子の阻害性核酸である、（２４）に記載の医薬組成物。
（２６）腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である請求項２４又は２５に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、変異型ＡＣＴＮ４に対する抗体、より具体的には、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する特異的な抗体、および当該抗体を産生する細胞株が提供される。また、本発明により、上記抗体と生体試料とを反応させることを特徴とするＡＣＴＮ４−Ｖａを検出する方法およびＡＣＴＮ４−Ｖａを検出するための試薬が提供される。
本発明のＡＣＴＮ４−Ｖａと反応するモノクローナル抗体は、組織、細胞、および血液等の検体中のＡＣＴＮ４−Ｖａを高感度かつ特異的に検出でき、腫瘍、好ましくは癌の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は免疫方法の概要を示す図である。
図２Ａは、クローン「１３Ｇ９」及び「１１Ｈ２」由来の精製抗体における特異性確認試験結果を示す図である。
図２Ｂは、クローン「９Ｂ３」、「１５Ｈ２」及び「１０Ｅ１０」由来の精製抗体における特異性確認試験結果を示す図である。
図３は、クローン「１３Ｇ９」、「１１Ｈ２」、「９Ｂ３」、「１５Ｈ２」、「１０Ｅ１０」由来のモノクローナル抗体におけるＡＣＴＮ４−Ｖａに対するウェスタンブロッティングによる特異性確認試験結果を示す図である。
なお、図中の記号は以下の通りである。
▲１▼（丸付き数字の１）：ＭＣＦ７由来抽出液
▲２▼（丸付き数字の２）：Ｈ６９由来抽出液
▲３▼（丸付き数字の３）：ＢｘＰＣ−３由来抽出液
Ｉ：ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体（１１Ｈ２）
ＩＩ：ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体（１５Ｈ２）
ＩＩＩ：ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体（１０Ｅ１０）
ＩＶ：ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体（１３Ｇ９）
Ｖ：ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体（９Ｂ３）
Ｍ：サイズマーカー
Ｐ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＡＣＴＮ４−Ｎ抗体（１３Ｇ９）
図４は、クローン「１５Ｈ２」由来のモノクローナル抗体を用いたＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子導入細胞を用いたウェスタンブロッティングによる特異性確認試験結果を示す図である。
図５は、クローン「１５Ｈ２」由来のモノクローナル抗体を用いたＨＧＮＴにおけるＡＣＴＮ４−Ｖａに対する免疫組織染色による診断適応試験結果を示す図である。
図６は、ＡＣＴＮ４−Ｖａのタンパク質発現とＨＧＮＴ，ＳＣＬＣ，ＬＣＮＥＣ患者の予後解析結果を示す図である。
図７は、ｓｉＲＮＡによりＡＣＴＮ４−Ｖａの発現を抑制した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、α−アクチニン−４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α−アクチニン−４に対する抗体であり、本発明の抗体は、上記第２４５番目から第２６３番目の領域において置換されたアミノ酸残基（置換アミノ酸残基）の全部又は一部を認識するものである。本発明の一態様において、本発明の抗体が認識する変異型α−アクチニン−４は、α−アクチニン−４をコードするＤＮＡのエキソン８’に由来するスプライスバリアントである。
さらに、本発明は、ＡＣＴＮ４−Ｖａに反応し、ＡＣＴＮ４−Ｕｂに反応しない、ＡＣＴＮ４−Ｖａを識別して結合する抗体に関するものである。
１．本発明の抗体
本発明の抗体は、ＡＣＴＮ４分子中のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む変異型ＡＣＴＮ４（タンパク質またはポリペプチド）に対する抗体である。
ここで、本明細書において、「α−アクチニン−４」、「ＡＣＴＮ４」、「変異型アクチニン−４」、「ＡＣＴＮ４−Ｖａ」、「スプライスバリアント」、「ＡＣＴＮ４−Ｕｂ」などの用語は、特に言及しない限り全長タンパク質、部分ポリペプチド及び部分ペプチドのいずれをも包含するものである。従って、例えば「本発明の抗体がＡＣＴＮ４−Ｖａを認識する」と表現した場合は、本発明の抗体はＡＣＴＮ４−Ｖａ（例えばＡＣＴＮ４のスプライスバリアント）の全長タンパク質を認識すること、あるいはＡＣＴＮ４−Ｖａの部分ポリペプチド（例えばＡＣＴＮ４のエキソン８’に由来するスプライスバリアントのアミノ酸置換が生じた領域を含む部分ポリペプチド）を認識することのいずれも意味するものである。
本発明の好ましい態様においては、本発明の抗体は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される少なくとも１つの性質を有するものである。
（ｉ）ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体であって、新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換の全部あるいは何れかを認識する条件を満たす。
（ｉｉ）上記アミノ酸置換がアミノ酸配列の２４８番目のグリシン（Ｇ：ｇｌｙｃｉｎｅ）、２５０番目のロイシン（Ｌ：ｌｅｕｃｉｎｅ）、あるいは２６３番目のシステイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）である。
（ｉｉｉ）抗原のアミノ酸配列がＤＩＶＧＴＬＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＣ（配列番号１）で示される。
アミノ酸残基の置換部位及び置換後のアミノ酸残基は、第２４５番目のアスパラギン酸から第２６３番目のセリンまでのアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸残基である。好ましくは、ＡＣＴＮ４のアミノ酸配列の第２４８番目のグリシン、第２５０番目のロイシン及び第２６３番目のシステインであり、これらの１つ又は２つ以上の組み合わせの置換アミノ酸残基を有する。
ここで、ＡＣＴＮ４のアミノ酸配列は配列番号２に示される。配列番号２において、エキソン８に由来するアミノ酸配列は第２４５番目のアスパラギン酸から第２６３番目のセリンまでのアミノ酸配列（ＤＩＶＮＴＡＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＳ（配列番号３））である。
従って、本発明において、変異型ＡＣＴＮ４は、第２４５番目のアスパラギン酸から第２６３番目のセリンまでのアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したものである。好ましくは、野生型ＡＣＴＮ４のアミノ酸配列の第２４８番目のバリンがグリシンに、第２５０番目のアラニンがロイシンに、及び第２６３番目のセリンがシステインに変異しているか、あるいはこれらのいずれか１つ又は２つが変異したものをいう。この変異はエキソン８の代わりにエキソン８’が挿入することにより生じた変異、すなわちスプライスバリアント（非特許文献５）が含まれる。このような変異となるアミノ酸の置換を、本明細書では「ＡＣＴＮ４−Ｖａ特異的なアミノ酸配列置換」ともいう。
従って、本発明のより好ましい態様において、本発明の抗体は、ＡＣＴＮ４−Ｖａのアミノ酸配列のうち、新たに挿入されたエキソン８’由来の新規スプライスバリアント部分のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を含む部分断片または全長に対し特異的に結合する高特異性抗体である。以下、本明細書においては、変異型ＡＣＴＮ４に対する抗体（スプライスバリアントに対する抗体を含む）を、「抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体」ともいう。
本発明において、「特異的に結合する」又は「認識する」とは、変異型ＡＣＴＮ４（ＡＣＴＮ４−Ｖａ）、例えば置換されたアミノ酸残基の全部又は１つ（少なくとも１つ）には結合する（反応する）が、変異がないＡＣＴＮ４−Ｕｂには結合しない（反応しない）ことを意味する。本発明の抗体が結合又は認識する領域は、置換されたアミノ酸残基のみというわけではなく、置換されたアミノ酸残基を含む限り他の領域も含まれる。すなわち、本発明の抗体が結合又は認識する領域は、置換されていないアミノ酸配列の領域が排除されるものではない。
結合が特異的か否かであることの確認は、免疫学的手法、例えばＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、又は免疫組織学的染色等によって確認することができる。
２．抗体の製造
次に、本発明の抗体の製造方法について説明する。
２−１．抗原の調製
ＡＣＴＮ４−Ｖａは小細胞肺癌患者組織、小細胞肺癌由来の細胞株、あるいは正常組織の精巣にしか発現しない。また、目的の抗原部位は新規スプライスバリアントに存在するアミノ酸配列置換に由来する上記３種類のアミノ酸のいずれかである。このため、目的の抗体を得るための免疫抗原を調製する場合、全長配列を含む組織又は細胞由来の抗原たんぱく質は免疫抗原として適当でない。そこで、アミノ酸置換がされた配列を含む免疫抗原を合成する必要がある。
本発明においては、ＡＣＴＮ４−Ｖａの部分ペプチドを合成し免疫抗原として用いるが、合成ペプチドは低分子であり、そのままの状態でマウスに免疫しても抗体を得ることは困難である。そこで、合成ペプチドとキャリア蛋白質とをＭＢＳ法によりジスルフィド結合させ、免疫抗原を作製する。
本発明において免疫抗原は、公知の方法に準じて作製することができる（Ｆｍｏｃ法、Ｋｕｎｉｏ  Ｆｕｊｉｗａｒａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６１，２１７−２２６（１９８３））。
ペプチドの化学合成は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の、当業者に公知の方法によって行うことができる。
キャリア蛋白質は、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）の他、例えば、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）等を使用することができる。当業者であれば、免疫抗原を公知の方法によって作製することができる。
抗原ペプチドを合成する基本となるアミノ酸配列はＡＣＴＮ４−Ｖａ中の部分配列であり、そのアミノ酸配列の中から任意に連続する１０〜５０個、好ましくは１０〜３０個、さらに好ましくは１５〜２０個の長さのアミノ酸配列を選択する。選択基準は、アミノ酸配列中に少なくとも１個のＡＣＴＮ４−Ｖａ特異的なアミノ酸配列置換が含まれていることが必要である。これらのアミノ酸残基を用いてペプチドを合成する。
抗原として使用できるペプチドは、好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４５番目〜２６３番の領域のペプチドであり、ＡＣＴＮ４−Ｖａ特異的なアミノ酸配列置換を含むペプチドとして、上記領域のペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたペプチドを用いることができる。好ましくは、上記領域の第２４８番目のバリン、第２５０番目のアラニン、及び第２６３番目のセリンのうち少なくとも１つが他のアミノ酸に置換されたペプチドを用いる。さらに、エキソン８’の挿入に基づく置換変異、すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８番目のアスパラギンがグリシンに（Ｎ２４８Ｇ）、第２５０番目のアラニンがロイシンに（Ａ２５０Ｌ）、そして第２６３番目のセリンがシステインに（Ｓ２６３Ｃ）変異したアミノ酸残基を含む、ＡＣＴＮ４−Ｖａの部分ペプチド（例えばＤＩＶＧＴＬＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＣ（配列番号４））を用いることが好ましい。
但し、ＡＣＴＮ４−Ｖａ特異的なアミノ酸配列置換は、上記Ｎ２４８Ｇ、Ａ２５０Ｌ及びＳ２６３Ｃに限定されるものではなく、置換後のアミノ酸残基が、第２４８番目ではＮ及びＧを除く他の１８種類のアミノ酸残基（Ａ、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ又はＶ）、第２５０番目ではＡ及びＬを除く他の１８種類のアミノ酸残基（Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ又はＶ）、そして第２６３番目ではＳ及びＣを除く他の１８種類のアミノ酸残基（Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｗ、Ｙ又はＶ）であってもよい。
２−２．ポリクローナル抗体の製造
前記のようにして作製した部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫し、抗体価を測定する。
免疫する非ヒト哺乳動物の種類は特に限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等などが挙げられ、マウスが好ましい。本発明の好ましい態様において、本発明の抗体を作製するために、免疫する動物として、高特異性抗体産生能を有する「ＧＡＮＰ（登録商標）」と呼ばれるトランスジェニック非ヒト哺乳動物（ＷＯ２００４／０４０９７１）を用いることもできる。
ＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニック非ヒト哺乳動物とは、胚中心結合核タンパク質（Ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物であり、当該動物を所定の抗原で免疫することにより、当該抗原に対して高親和性あるいは高特異性抗体を産生することができる動物である（ＷＯ００／５０６１１号公報、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ａｐｒ  １５；１７４（８）：４４８５−９４．）。
例えばＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えばマウス）は、上記公報又はＳａｋａｇｕｃｈｉらの文献に記載の方法により作製することが可能であり、あるいは、市販品のＧＡＮＰ（登録商標）マウス（株式会社トランスジェニック）として得ることができる。
抗原の動物１匹あたりの投与量は、全体で１０〜２０００μｇである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。
免疫により抗体価が吸光度レベルで２以上上昇したのち、抗体価が吸光度レベルで０．０５〜１、好ましくは０．０５〜０．５、より好ましくは０．０５まで低下するまで、２〜６ヶ月間、好ましくは４〜６ヶ月間、より好ましくは６ヶ月間動物を放置する。なお、上記吸光度レベルを示す血清の希釈率は、例えば２７，０００倍である。
ＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する場合は、吸光度レベルが低下するまで放置する必要がなく、一般的なモノクローナル抗体作製法の免疫間隔に従って、最終免疫まで行えばよい。
抗体価は、免疫した動物から採取した血液を用いて調べることができる。採取した血液は、採血後低温下で保管せずに、速やかに遠心し血清を分離することが好ましい。得られた血清を段階希釈し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ））等で抗体価を測定することができる。ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡで抗体価を測定する場合、吸光度は、分光光度計で測定することができる。
測定の結果、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体価の高い動物に最終免疫を施す。但し、抗原の免疫と抗体価の測定に関しては上記測定法に限定するものではない。
その後、最終免疫日から数日後に、好ましくは３〜５日後に免疫担当細胞（脾臓細胞等）を摘出する。また、動物の足蹠皮下に抗原を注入した場合には、最終免疫の回数は１回で、免疫から７〜１３日後に、好ましくは８〜１０日後に脾臓細胞などの免疫担当細胞又は所属リンパ節を摘出する。採血の間隔は、免疫して１〜４週間後、好ましくは１〜２週間後に行う。
本発明において、ポリクローナル抗体を取得する場合は、上記所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得る。抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
２−３．ＡＣＴＮ４−Ｖａに対するモノクローナル抗体の作製
以下に、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対するモノクローナル抗体の作製方法について説明するが、これに限定するものではない。
本発明のモノクローナル抗体（「抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体」）を得る方法としては、まず、新規スプライスバリアントのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列ペプチドをＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物などの動物に免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（例えばＢ細胞）を採取し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。
抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体は、いわゆるハプテン抗体と呼ばれるものであるが、そのようなハプテン抗体を作製する場合、ハプテン−キャリア複合体の分子構造デザインは、特異抗体の性能に対して非常に大きな影響を与える。
（１）抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、免疫した非ヒト哺乳動物等の動物の脾臓細胞等又は所属リンパ節等から調製する。ＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた場合でも、上記と同様に脾臓細胞やリンパ節から抗体産生細胞を採取することができる。リンパ節は、例えば鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節などがあげられる。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離することが望ましい。また、抗体産生細胞を調製する際には、組織の残骸や赤血球をできる限り除いておくことが好ましい。赤血球除去の方法は、一般的に市販されている赤血球除去液を使用するか、塩化アンモニウムとトリスで調製した中性の緩衝液を作製して使用する方法が好ましく採用される。調製した抗体産生細胞は、調製後直ちに次の作業に取りかからないと細胞の状態が悪化する場合があるので、調製後次の作業までに時間がかかる場合は、氷上に静置させておくことが好ましい。
（２）細胞融合
細胞融合は、上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させ、抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製するために行う作業である。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）やＰ３／ＮＳ  Ｉ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ  Ｉ）等が挙げられる。
細胞融合は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等を含まないＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０培地などの一般に市販されている培地で、１×１０６〜１×１０７個／ｍＬの脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞と１×１０５〜１×１０６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合し（脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞とミエローマ細胞との細胞比は５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在下で融合を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量２００〜２００００ダルトンのポリエチレングリコールを使用することができる。
また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、融合させることもできる。さらに、センダイウイルスを用いて細胞を融合させることもできる。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることができる。
融合後、例えば１０〜２０％（好ましくは２０％）ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで作製したＨＡＴ培地で細胞を希釈後、９６穴培養プレートの各ウェルに０．５〜３×１０５個ずつ細胞を播き込み、ＣＯ２インキュベーターで培養する。
（３）ハイブリドーマの樹立
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から１０〜１４日後に、前記したようにＨＡＴ培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性９６穴培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体価を確認する。確認方法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で行う。このとき、細胞から産生される抗体にはキャリア蛋白質であるＫＬＨやＢＳＡに対する抗体も含まれるので、ＫＬＨ等に対する抗体価を測定することで、ＫＬＨ等に対する抗体価の高いＫＬＨ抗体陽性ウェルを除くことができる。ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体産生陽性ウェルを確認できた後は、２４穴や１２穴培養プレートに細胞を移す。
ここで、培地はアミノプテリンを除いたＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン含有培地）に置き換えることが好ましい。ＨＴ培地は、細胞内に残留したアミノプテリンの影響がある間、サルベージ経路にプリンおよびピリミジンの前駆体を供給し続けるハイブリドーマの回復用培地として用いる。ＨＴ培地中でしばらく培養後、再度培養上清中の抗体価を確認する。ハイブリドーマは融合細胞であるために不安定であり、すぐに抗体産生能が消失する可能性が高いため、２度目の抗体価の確認を行っておくことが好ましい。前記したように、本発明においてはＡＣＴＮ４−Ｕｂとは交差反応せず、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対して高い特異性を有するハイブリドーマを取得することが必要であるため、ここで重要なことは、培養上清レベルで他のＡＣＴＮ４−Ｕｂとの交差反応性をＥＬＩＳＡやＲＩＡ等で確認することである。
最終的に選択されたウェルの細胞は、単一の細胞にするためにクローニングを行う。クローニングは、例えば細胞懸濁液を１０〜２０％のＦＣＳ含有（好ましくは２０％）ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希釈後、９６穴培養プレートの各ウェルに０．３〜２個入るように細胞を播き込む。９６穴培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、１つのウェルに入る細胞が１個である確率が高くなるようにするため、好ましくは各ウェルに１個入るように細胞を播く。細胞播き込み後、７〜１０日後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収する。このとき、３〜５日後にシングルコロニーであることを確認することが好ましい。回収した培養上清は、抗体価を確認する。ここでもＡＣＴＮ４−Ｖａに対して高い特異性を有し、かつＡＣＴＮ４−Ｕｂに対する交差反応性が低いクローンを選択する。さらに選択されたウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立する。クローニングは必要に応じて数回行っても良い。
（４）モノクローナル抗体の調製
樹立したハイブリドーマ株から以下の方法でＡＣＴＮ４−Ｖａ特異的なモノクローナル抗体を精製及び採取する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を０．１〜４×１０５個／ｍＬで調製し、１〜２週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを０．１〜１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。
培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等がある。抗体の精製方法は、プロテインＧアフィニティカラム又はプロテインＡアフィニティカラムで精製する方法、ＡＣＴＮ４−Ｖａアフィニティカラムで精製する方法、硫安塩析分画からゲルろ過クロマトグラフィーで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法等があり、これら公知の方法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。なお、プロテインＡアフィニティカラムを用いてマウスのＩｇＧ１を精製する場合は、結合条件を至適化したバッファーなどを用いることが有効であり、当業者であれば至適条件を適宜選択して、精製することができる。
（５）微生物の寄託
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「Ａｎｔｉ  ＡＣＴＮ４−Ｖａ  ＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．１５Ｈ２）」と称し、２０１１年８月３１日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足  ２−５−８  ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に国際寄託した。その受付番号を示す受領番号（受領書に記載）は、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０である。ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０は、実施例１で「１５Ｈ２」として樹立したクローンである。
（６）モノクローナル抗体の性質
本発明のモノクローナル抗体は、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対して特異的に結合し、高特異性を示すものである。その特異性は、ウェスタンブロッティングにおけるＡＣＴＮ４−Ｖａと抗体との反応系において、ＡＣＴＮ４−Ｖａが特異的に発現したヒト小細胞肺癌由来癌細胞株Ｈ６９の細胞抽出液を用いた際の抗原抗体反応系が、非発現株のヒト膵臓腺癌由来細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト乳癌由来細胞株ＭＣＦ７の細胞抽出液を用いた際の抗原抗体反応系と比較して、目的の分子量の位置にＡＣＴＮ４−Ｖａのバンドを検出することによって、特異性を示すことができる条件を満たすものである。
例えば、
（ｉ）まず、新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換が存在するＡＣＴＮ４−Ｖａを含む、ヒト小細胞肺癌由来癌細胞株Ｈ６９の抽出液（これを「抗原１」という）をウェスタンブロッティングに供する。同様に、新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換が存在しないＡＣＴＮ４−Ｕｂを含むヒト膵臓腺癌由来細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト乳癌由来細胞株ＭＣＦ７の細胞抽出液（これらをそれぞれ「抗原２」および「抗原３」という）をウェスタンブロッティングに供する。
（ｉｉ）次に、当該抗原に対する抗体をそれぞれの抗原に対して同一濃度で反応させる。
上記（ｉ）の抗原抗体反応における抗原分子（抗原１）は、そのアミノ酸配列において新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換が存在し、本発明のモノクローナル抗体は新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換を含む固相化抗原１と特異的に結合する。そのため、ウェスタンブロットでは分子量約１００ＫＤａのたんぱく質バンドとして検出が出来る。
また、上記反応系において、固相化抗原が抗原２および抗原３の場合は新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換を有しないため、この同相化抗原２および３と、本発明のモノクローナル抗体とは特異的に結合できない。そのため、ウェスタンブロットでは分子量約１００ＫＤａのたんぱく質バンドとして検出が出来ない。
本発明の抗体は、上記抗原抗体反応試験を行なったときに、抗原１、２および３の泳動量が１０μｇ／ｌａｎｅの場合、抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体の検出濃度が少なくとも１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２．５μｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１μｇ／ｍｌ以下となる検出条件を満たすものであり、抗原１に対して極めて高い特異性を有する。
あるいは、ＡＣＴＮ４−Ｖａを遺伝子導入した発現細胞由来抗原を用いたウェスタンブロッティングにより、本モノクローナル抗体の特異性を示してもよい。
その特異性は、以下のようにして検出することができる。
ウェスタンブロッティングにおけるＡＣＴＮ４−Ｖａと抗体との反応系において、ＡＣＴＮ４−ＶａのＮ末端にＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を付加したプラスミドベクターを作製し、ヒト腎上皮細胞株ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３という）に遺伝子導入した発現細胞由来の抽出液を用いた際の抗原抗体反応系を実施する（反応系１という）。一方、ＡＣＴＮ４−ＵｂのＮ末端にＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を付加したプラスミドベクターを作製し、ＨＥＫ２９３に遺伝子導入した発現細胞由来の抽出液を用いた際の抗原抗体反応系を実施する（反応系２という）。
次に、反応系１と反応系２とを比較して、反応系１において目的の分子量の位置にＡＣＴＮ４−Ｖａのバンドが現れるかを検出する。
（７）抗体断片
上記抗体の断片も、本発明の抗体に含まれる。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗体と同様に、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体であって、新たに挿入されたエキソン８’由来のアミノ酸配列置換の全部あるいは何れかを認識する上記性質を有するものである。
抗体の断片としては、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、線状抗体、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
ｓｃＦｖの場合は、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。ｄｓＦｖの場合は、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドの場合は、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法及びｔＢｏｃ法等の化学合成法によって製造することもできる。
抗体のアミノ酸配列が改変されたとしても、上記変異型ＡＣＴＮ４と特異的に結合することができる限り、そのような抗体は本発明の範囲内に含まれる。
（８）遺伝子組換え抗体
本発明のＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって構築できる。
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えばＮａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）等を参照）。
ヒト化抗体（完全ヒト抗体）は、一般にＶ領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
また、本発明においては、本発明のハイブリドーマ（例えば受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０のハイブリドーマ）又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
（９）本発明の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体
さらに、本発明の抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体としては、例えば、受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１４０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合（認識）する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体も好ましく挙げられる。エピトープとしては、以下に例示するものが挙げられる。
本発明の抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるＡＣＴＮ４−Ｖａの少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、ＡＣＴＮ４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目のアミノ酸配列を含む領域であり、第２４８番目、第２５０番目及び第２６３番目が他のアミノ酸残基、好ましくはそれぞれグリシン、ロイシン、システインに置換されたアミノ酸配列を含むものである。このようなエピトープのアミノ酸配列は、ＤＩＶＧＴＬＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＣ（配列番号４）で示されるものである。
３．検出方法
ＡＣＴＮ４−Ｖａは、癌の臨床マーカー（腫瘍マーカー）として利用することができるため、本発明の抗体を生体試料と反応させ、生体試料中のＡＣＴＮ４−Ｖａを測定することにより、その測定結果を指標として腫瘍を検出または診断することができる。
従って、本発明は、本発明の抗体又はその断片と生体試料とを反応させて、変異型α−アクチニン−４を検出することを特徴とする、変異型α−アクチニン−４の検出方法を提供する。
また、本発明は、本発明の抗体と生体試料とを反応させて、ＡＣＴＮ４−Ｖａに反応し、ＡＣＴＮ４−Ｕｂに反応しない、ＡＣＴＮ４−Ｖａを検出することを特徴とする、癌の検出または診断方法を提供する。検出の対象となるタンパク質としては、例えばＡＣＴＮ４−Ｖａが挙げられ、検出の対象は、ＡＣＴＮ４−Ｖａの全長タンパク質、あるいはＡＣＴＮ４−Ｖａの部分ポリペプチド（例えば下記のアミノ酸配列を含むポリペプチド）が挙げられる。
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ＡＣＴＮ４−Ｖａの測定は、一般に行われる免疫組織染色（ＩＨＣ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇという）、あるいはハプテン免疫測定法として知られている方法のいずれの方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）等によっても行うことができ、特に限定されない。
癌としては、特に限定されるものではなく、例えば脳腫瘍、唾液腺がん、食道癌、咽頭癌、口腔がん、肺癌、胃癌、小腸又は十二指腸癌、大腸癌、尿路悪性腫瘍（例えば前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍）、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆道癌、膵がん、神経内分泌腫瘍、肉腫（例えば骨肉種、筋肉種など）及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられるが、好ましくは、肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍（ＨＧＮＴ）である。ＨＧＮＴには、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）が含まれ、これらの中から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。検出対象となる癌の種類は、１種類でもよく２種類以上が併発したものでもよい。癌の状態は、癌の有無、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無からなる群から選ばれる少なくとも１つである。
特に、ＨＧＮＴ患者由来のＡＣＴＮ４−Ｖａには、上記配列番号４に示すペプチド（アミノ酸が置換されているペプチド）のアミノ酸配列が含まれているため、このアミノ酸配列に特異的に結合する本発明の抗体は、前述の癌を検出するのに特に好ましい。
癌患者、癌が疑われる患者、あるいは健康診断受診者等の被験者から生体試料を採取し、ＡＣＴＮ４−Ｖａ測定試料を調製する。生体試料としては、組織、細胞等が挙げられる。組織は、採取した後に組織切片として調製したものを用いることが好ましい。
次いで、前記測定試料と本発明の抗体とを反応させる。ＡＣＴＮ４−Ｖａの検出は、一般に行われるＩＨＣにより行うことができる。ここでは、説明の便宜上、本発明の抗体にはマウス由来の抗体を用いる。
ＩＨＣでの測定には、切片上のパラフィンを除去したのち、内因性のペルオキシダーゼ活性の阻止を行い、熱処理にて抗原を賦活させる。２％の豚血清で非特異的なタンパク質結合のブロッキングを行い、１次抗体（抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体）を４度、１６時間以上でハイブリダイゼーションを行う。１次抗体を洗浄し、２次抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧで室温１時間でハイブリダイゼーションをおこない、さらに洗浄後アビジンペルオキダーゼ標識３次抗体で反応させ、ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅという）を基質として発色を行う。
また、本発明の別の態様においては、ＡＣＴＮ４−ＶａのｍＲＮＡ量を検出し、その検出結果から腫瘍を検出することができる。
従って、本発明は、ＡＣＴＮ４のアミノ酸配列の第２４５番目から第２６３番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む変異型ＡＣＴＮ４をコードする遺伝子を検出する方法を提供する。その方法は、上記置換アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーと生体試料とを反応させて前記遺伝子を検出するというものである。検出の遺伝子としては、ＡＣＴＮ４をコードするＤＮＡのエキソン８’に由来するスプライスバリアントのｍＲＮＡであることが好ましい。
ｍＲＮＡの測定は、例えばノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、マイクロアレイ等により行なうことができる。
ＡＣＴＮ４−Ｖａをコードする遺伝子は、前記Ｎ２４８Ｇ、Ａ２５０Ｌ若しくはＳ２６３Ｃ、又はこれらの組み合わせの置換変異を有するように配列番号１に示される塩基配列が置換されている。すなわち、Ｖ２４８Ｇでは配列番号１に示す塩基配列の第８６１〜８６３番の「ａａｃ」（Ａｓｎのコドン）が「ｇｇｃ」（Ｇｌｙのコドン）に、Ａ２５０Ｌでは配列番号１に示す塩基配列の第８６７〜８６９番の「ｇｃｃ」（Ａｌａのコドン）が「ｃｕｇ」（Ｌｅｕのコドン）に、そしてＳ２６３Ｃでは配列番号１に示す塩基配列の第９０６〜９０８番の「ａｇｃ」（Ｓｅｒのコドン）が「ｕｇｃ」（Ｃｙｓのコドン）に置換されている。
従って、ノーザンブロッティングを行う場合は、ＡＣＴＮ４−Ｖａをコードする遺伝子のうち、上記変異部位を含むヌクレオチド（エキソン８’に由来するヌクレオチド）にハイブリダイズするプローブを設計し、合成する。
また、ＲＴ−ＰＣＲやＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行う場合は、上記変異部位を含むヌクレオチド（エキソン８’に由来するヌクレオチド）が増幅されるようにプライマーを設計する。
ｍＲＮＡの解析では、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００００４９２４．４に示すＡＣＴＮ４遺伝子（配列番号１）に対応したスプライスバリアント、すなわちエキソン８’の挿入に基づく塩基の置換を網羅的に検出することができる。
そしてＡＣＴＮ４が変異型であることの判断、あるいは腫瘍であるかどうかの判断は、プローブによるハイブリダイゼーション、ＰＣＲによる増幅反応又はシークエンシングの結果、目的のバンドが検出された場合、あるいは変異型の塩基配列が得られた場合は、ＡＣＴＮ４が変異型であると判断することができる。
その際、健常者由来のｍＲＮＡ発現量と比較することが好ましい。例えば、被験者由来の試料中のｍＲＮＡ発現量（試験値）と、健常人由来の被検試料中におけるｍＲＮＡの発現鼠（対照値）との比を比較し、基準値以上であれば癌であると判定する。
ところで、本発明の方法では、複数の被験者由来の生体試料を用いてＡＣＴＮ４−Ｖａ又はそのｍＲＮＡのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験者（１次母集団）において上記ＡＣＴＮ４−Ｖａ又はそのｍＲＮＡ量を測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる個々の被験者由来の生体試料由来のＡＣＴＮ４−Ｖａ又はそのｍＲＮＡ量とを比較することができる。
さらに、上記測定された被験者のデータが所定値以上のときは前記母集団の値に組み込んでＡＣＴＮ４−Ｖａ又はそのｍＲＮＡ量のレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験者（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ＡＣＴＮ４−Ｖａ又はそのｍＲＮＡ量の臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、癌の検出又は診断精度を高めることができる。
さらに、患者又は健康診断受診者等の被験者から個別に採取した生体試料に対し、本発明の方法を用いて、実際に治療を開始する前などに当該被験者の癌の検出を行うことができる。即ち、当該生体試料からｍＲＮＡを採取してそのレベル又は塩基配列を検査し、その検査結果が陽性である場合又は目的の塩基配列が解析された場合には、当該被験者が癌である確率（リスク）が高いものと判断することができる。
上記検出結果は、例えば癌の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。より詳細には癌の検査又は確定診断を行う場合には、上記検出結果に加えて、その他の検査結果、例えば生検、他の癌マーカーのレベルから選択される少なくとも１つと組み合わせて、総合的に判断すればよい。
４．癌の評価方法
本発明においては、前記３に示す検出方法により得られた検出結果を指標として癌の状態を評価することができる。検出結果が所定の基準値を超えるものをＡＣＴＮ４−Ｖａ陽性、所定の基準値以下のものをＡＣＴＮ４−Ｖａ陰性とし、陽性の場合には、癌を発症している可能性があると判断し、癌の状態を評価することができる。所定の基準値は、癌の種類によって適宜設定される。
癌の状態とは、癌または腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、癌発症の有無、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無等が挙げられる。上記評価に際し、これらの癌の状態は１つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。癌の有無を評価するには、癌に罹患しているか否かを判断する。癌の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価を行ったり、いわゆる早期癌、進行癌を分類して評価することも可能である。癌の転移は、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。再発は、間欠期又は寛解の後に再び癌が現れたか否かにより評価する。
５．本発明の抗体を含むキット、試薬
本発明においては、ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体をＡＣＴＮ４−Ｖａの検出用試薬又はキットとして使用することができる。本発明の試薬又はキットは、上記腫瘍の検出等に使用することができる。
本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）を癌の検出又は診断薬として用いる場合には、このモノクローナル抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。また、モノクローナル抗体を酵素標識し、使用することができる。標識酵素として、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、金コロイドなどを用いることができる。
本発明をキットに用いる場合には、本発明の抗体の他に、上記の溶媒、溶質、酵素標識試薬、抗原固相化マイクロプレート、抗体希釈溶液、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液、使用説明書などを含めることができる。また、反応の至適条件を与える緩衝液、反応生成物質の安定化に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などの反応媒体も本発明のキットに含まれ得る。
本発明において、ＡＣＴＮ４−ＶａのｍＲＮＡを検出するためのプローブ及びプライマーは、本発明の試薬又はキットに含めることができる。プローブ又はプライマーの設計の基礎とする領域はエキソン８’を検出し得る限り、特に限定されるものではない。
シーケンスプライマーの長さは、１８〜２４塩基、好ましくは２０〜２２塩基である。シーケンスプライマーの塩基配列としては以下のものを例示することができる。
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また、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲを行ってＡＣＴＮ４−ＶａのｍＲＮＡを増幅するためのプライマーとしては、エキソン８’を増幅する限り特に限定されるものではなく、エキソン８’の上流領域及び下流領域から１５〜２４塩基、好ましくは１６〜２２塩基の長さのヌクレオチドを設計及び合成し、これをプライマーとして使用することができる。
例えば、プライマーの塩基配列としては以下のものを例示することができる。
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また、ハイブリダイゼーションを行うプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）としては、以下のものを例示することができる。
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ハイブリダイゼーションやＰＣＲに使用される試薬や反応条件は、当業者に周知である。
６．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、変異型α−アクチニン−４（ＡＣＴＮ４−Ｖａ）の機能を阻害する物質、好ましくは本発明の抗体を有効成分として含有するものであり、腫瘍の予防、治療に有効である。
従って、本発明は、変異型α−アクチニン−４の機能を阻害する物質を患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法を提供する。
「変異型α−アクチニン−４の機能を阻害する物質」とは、低分子化合物若しくは機能阻害性抗体であることを意味し、好ましくは本発明のＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体、及びＡＣＴＮ４−Ｖａをコードする遺伝子の阻害性核酸である。
ＡＣＴＮ４−Ｖａをコードする遺伝子（ＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子ともいう）の阻害性核酸は、その遺伝子機能又は遺伝子発現を抑制する核酸を意味し、例えば、アンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡなどが挙げられる。これらの阻害性核酸は、上記遺伝子の発現を抑制することが可能であり、腫瘍の遺伝子治療用医薬組成物として使用することができる。
＜アンチセンス核酸＞
アンチセンス核酸は、ＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子（標的遺伝子）のｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも１４ヌクレオチドであり、好ましくは１４〜１００ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、転写又は翻訳を抑制する。
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。アンチセンス核酸は、例えば、各種ＤＮＡトランスフェクション又はエレクトロポレーション等の遺伝子導入方法により、あるいはウイルスベクターを用いることにより、細胞に導入される。
＜デコイ核酸＞
本発明において、デコイ核酸は、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味し、ＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子の転写因子に結合し、プロモーター活性を抑制することができる。この核酸を細胞内に導入し、転写因子がこの核酸に結合することにより、転写因子の本来のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、その転写因子の発現が抑制される。具体的には、デコイ核酸は、標的結合配列に結合しうる核酸又はその類似体である。本発明のデコイ核酸は、上記遺伝子のプロモーター配列をもとに、１本鎖、又はその相補鎖を含む２本鎖として設計することができる。長さは特に限定されるものではなく、１５〜６０塩基、好ましくは２０〜３０塩基である。
核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、あるいは、その核酸内に修飾された核酸及び／又は擬核酸を含んでいてもよい。またこれらの核酸は１本鎖又は２本鎖であってもよく、また環状でも線状でもよい。
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、ＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、ＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより所望の核酸を製造してもよい。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。
デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロッティング法、ＦＡＣＳ解析法、ＲＴ−ＰＣＲ等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばｐｒｏｍｅｇａ  ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。
＜ＲＮＡ干渉＞
本発明においては、細胞においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を調節しうる合成小核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ分子を使用することができる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子を用いる場合は、ＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とすることができる。そのようなＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ等が挙げられる。本発明において標的とする遺伝子は、選択的スプライシングによって生じたスプライスバリアントであるため、ｓｉＲＮＡ分子を用いてエキソン部分（エキソン８’）の発現を阻害することができる。
ｓｉＲＮＡ分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくはＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ又はＣＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基のセグメントを選択することができる。ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、３０〜７０％、好ましくは３５〜５５％である。
ｓｉＲＮＡは、二本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンＲＮＡ分子として生成することができる。ｓｉＲＮＡ分子は、通常の化学合成により得ることができる。
本発明において使用される好ましいｓｉＲＮＡの塩基配列は、例えば以下の通りである。
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本発明においては、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順でこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するように連結し、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となる遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
さらに、本発明は、マイクロＲＮＡを用いて上記遺伝子の発現を抑制することができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、細胞内に存在する長さ２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）の一種である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
ｍｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに基づく阻害性核酸であるため、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに準じて設計し合成することができる。
本発明において治療の対象となる疾患は癌患者であり、癌の種類は前記した通りであるが、中でも神経内分泌腫瘍、好ましくは肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍（小細胞肺癌又は大細胞神経内分泌）である。
本発明の抗体又はＡＣＴＮ４−Ｖａ遺伝子の阻害性核酸は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体または希釈剤等と共に医薬組成物として投与することができ、またその投与は１回または数回に分けて行うことができる。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口又は非経口的に投与することができる。
経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができる。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。
注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に５ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの抗体濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において体表面積あたり、２５０ｍｇ／ｍ２〜３７５ｍｇ／ｍ２の割合で、好ましくは２５０ｍｇ／ｍ２〜４００ｍｇ／ｍ２の割合で、１週間あたり１回として、数回投与することができる。
但し、投与量はこの範囲に限定されるものではなく、患者の体重および症状や個々の投与経路によって変動し得る。治療する患者の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともある。
投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体又は粉末組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを投与する場合は、その有効眼は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、患者に投与すべき有効量を、身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの処方を考慮して決定することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、非経口投与（例えば静注）の場合約１ｐＭ〜約２０ｐＭ、好ましくは５ｐＭ〜１０ｐＭの細胞内濃度である。
以下、実施例および実験例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例および実験例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００９】
ＡＣＴＮ４−Ｖａに特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の作製
ＡＣＴＮ４−Ｖａは小細胞肺癌患者組織又は小細胞肺癌由来の細胞株、あるいは正常組織の精巣にしか発現しない。また、それらより免疫抗原を調製しようとしても、目的の抗原部位は新規スプライスバリアントに存在するアミノ酸配列置換に由来するアミノ酸３種類のいずれかである。よって、目的の抗体を得るための抗原として、全長配列を含む組織あるいは細胞由来の抗原たんぱく質は免疫抗原として適当でない。そこで、アミノ酸置換された配列を含む免疫抗原（配列番号４）を部分ペプチドとして化学合成した。
次に、合成されたＡＣＴＮ４−Ｖａ部分ペプチドを免疫抗原として用いた。
合成ペプチドとキャリア蛋白質であるＫＬＨとをＭＢＳ法によりジスルフィド結合させ、免疫抗原を作製した。
（２）マウスへの免疫
免疫方法の概略を図１に示す。免疫は以下の方法で行った。１．２５ｍｇ／ｍＬに調製した免疫抗原をＦＣＡと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを１６０μＬずつマウスの背部皮下に投与し、その後２週間間隔で１．２５ｍｇ／ｍＬの免疫抗原とＦＩＡと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを８０μＬずつマウスの背部皮下に投与した。最終的に合計５回抗原を投与し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を確認し、抗体価の高かったものに対して、１．２５ｍｇ／ｍＬの免疫抗原４０μＬと生理食塩水４６０μＬを混合したものをマウスの腹腔内に最終投与し、その３日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
摘出した脾臓をすりつぶし、ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体産生細胞を含む脾臓細胞を調製したところ、１匹あたり約１×１０８個の脾臓細胞を調製できた。一方で、ミエローマ細胞であるＰ３Ｕ１を培養し、細胞融合当日に生細胞率が９５％以上のＰ３Ｕ１を調製した。これら脾臓細胞とＰ３Ｕ１を５：１で混ぜ、５０％濃度の分子量１，４５０のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、培地で洗浄し、ＨＡＴ培地に懸濁したものを、９６穴培養プレートの各ウェルに１×１０５個／ウェルとなるように細胞を播きこんだ。
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、１０日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを後述の実験例１の方法で行った。１２６４ウェル中３１ウェルでＡＣＴＮ４−Ｖａ陽性、ＡＣＴＮ４−Ｕｂ陰性であった。これらの選択したウェルの培養上清で、再度実験例２の方法でスクリーニングを行ったところ、最終的に、１７ウェル分がＡＣＴＮ４−Ｖａ陽性であった。
（５）クローニング
ＡＣＴＮ４−Ｖａに対する特異性の高かった１７ウェル分を限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で５個／ｍＬに調製し、９６穴培養プレート２枚分の各ウェルに２００μＬずつ添加した。１０日後、後述の実験例１および２の方法で培養上清中のＡＣＴＮ４−Ｖａに対する抗体価および特異性を測定し、陽性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを５クローン得た。それぞれの樹立クローンを「１３Ｇ９」、「１１Ｈ２」、「９Ｂ３」、「１５Ｈ２」、「１０Ｅ１０」とした。
＜実験例１＞
抗体のスクリーニング法
９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、固相化抗原としてＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１μｇ／ｍＬに調製したＡＣＴＮ４−Ｖａペプチドを５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。また、同時に特異性確認のためＡＣＴＮ４−ＵｂペプチドＤＩＶＮＴＡＲＰＤＥＫＡＩＭＴＹＶＳＳ（配列番号３）を同様に５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．０）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄後、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳＴ（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。洗浄後、培養上清を原液のまま各ウェルに５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。次に、ＰＢＳＴで３回洗浄後、各ウェルに２５００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。次に、ＰＢＳＴで３回洗浄後、各ウェルに０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液１００μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーによって測定した。
＜実験例２＞
ウェスタンブロッティングによるスクリーニング法および特異性確認法
以下の方法で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）を行った後、セミドライブロッティングによる、ウェスタンブロッティング（ＷＢという）を行い、特異性確認試験を行った。
特異性評価用のサンプルは癌細胞株由来の抽出液を用いる場合は、ＡＣＴＮ４−Ｖａが特異的に発現しているヒト小細胞肺癌由来癌細胞株Ｈ６９および非発現株のヒト膵臓腺癌由来細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト乳癌由来細胞株ＭＣＦ７の計３種類の細胞抽出液を用いた。発現細胞由来の抽出液を用いる場合はＡＣＴＮ４−Ｖａを遺伝子導入したＨＥＫ２９３  ＧＦＰ−ＡＣＴＮ４−ＶａおよびＡＣＴＮ４−Ｕｂを遺伝子導入したＨＥＫ２９３  ＧＦＰ−ＡＣＴＮ４−Ｕｂの２種類と、ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３  ＧＦＰの計４種類を用いた。
また、培養上清でのスクリーニングの際は、Ｈ６９抽出液のみを用いて評価を行い、精製抗体での確認試験には癌細胞由来あるいは発現細胞由来の抽出液を用いて評価した。
調製にはそれぞれ、１×１０７ｃｅｌｌ以上の細胞を用意し、Ｔ−ＰＥＲ抽出液（Ｔｈｅｒｍｏ社）に１００倍希釈でプロテインインヒビター（ナカライテスク社）を加えた抽出液５００ｕｌ以下で混和し、取扱説明書に従って抽出を行いサンプルとした。また、各サンプルはＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ社）により濃度を測定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％単一濃度のポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社）を使用し、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて電気泳動を行った。また、サンプルは９．３％  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含む６×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈し、９５℃、５分の熱反応処理を行った後、１０ｕｇ／ｌａｎｅで電気泳動に供した。その際の泳動条件は２０ｍＡ、定電流であり、泳動はゲルの下端まで可視化用に添加された、サンプル中のブロモフェノールブルーのラインが移動した時点で終了した。
次にＷＢを行った。前処理として、泳動が終了するまでに９×８．５ｃｍのＰＶＤＦメンブレン（メンブレンという）（ミリポア社）をメタノールで１分処理した後、２０％メタノールを含むＢｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒへ再度浸透させた。同様にメンブレンと同サイズにカットしたろ紙６枚をＢｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒへ浸透させた。
次にメンブレンへのブロッティングを行った。セミドライブロッティングシステム（ＧＥ社：旧Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にろ紙３枚、ＰＶＤＦメンブレン、サンプルの泳動が終了したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ろ紙３枚の順に重ね、１ｃｍ２／２ｍＡでメンブレンに終圧１５Ｖ〜３０Ｖがかかるように定電流で５０分泳動した。
次にＢｌｏｋｉｎｇを行った。サンプルがＨ６９の場合は１ｌａｎｅごとに、ＢｘＰＣ−３、ＭＣＦ７を含む３種類の場合は３種類を１組としてメンブレンを切断した後、ミリＱ水で３倍希釈したＮ１０１Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（日油社）を用いて２５℃で１時間の振とう反応を行った。
次に、１次反応を行った。培養上清を用いるスクリーニングの場合は、培養上清をＰＢＳＴで１０倍希釈したブロッキング液（抗体希釈液という）を用いて３倍に希釈してメンブレンと反応させた。精製抗体を用いて特異性を確認する場合は、同様に抗体希釈液を用いて１μｇ／ｍｌに調製し、メンブレンと反応させた。それぞれ２５℃で１時間の振とう反応を行った。
次に２次反応を行った。ＰＢＳＴでメンブレンを３回洗浄後、抗体希釈液を用いて２００００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を調製し、２５℃で１時間の振とうによりメンブレンと反応させた。
次に発色反応を行った。ＰＢＳＴでメンブレンを３回洗浄後、ケミルミワン（ナカライ社）を用いて発色反応を行った。方法は取扱説明書に従った。発色反応の後、ＬＡＳ−３０００を（ＧＥ社）を用いて、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（化学発光）を検出した。
（６）抗体の精製
上記（５）で樹立した５つのクローンから目的のモノクローナル抗体を以下の方法で精製した。まず、樹立クローンを市販の無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、４×１０５個／ｍＬになるように調製した。Ｔ２２５フラスコにその細胞懸濁液を５０ｍＬ入れ、３７℃、５．０％  ＣＯ２環境下で約１週間培養した。培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清をプロテインＧカラムにアプライし、グリシンバッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、モノクローナル抗体を精製した。
その後、精製抗体を用いて、再度実験例１および２の方法でＡＣＴＮ４−Ｖａに対する特異性確認試験を行った。
その結果、５クローンで培養上清の場合と同様な結果が得られた（図２、図３および図４）。
（７）樹立クローンの免疫組織染色による診断適応試験
上記の５クローンに関して、生体組織中のＡＣＴＮ４−Ｖａを認識する抗体の免疫組織染色による診断適応試験を下記実験例３の方法で行った。診断には肺原発ＨＧＮＴおよびＡｄ、Ｓｑの切除病理検体（ｎ＝５５７）を用いた。その結果、癌組織における免疫染色がＡＣＴＮ４−Ｖａに対する特異的モノクローナル抗体「１５Ｈ２」を用いて可能であった（図５）。
また、ＡＣＴＮ４−Ｖａ陽性率は実験例３の評価法を基に診断を行った。その結果、ＬＣＮＥＣで４７．５％（５８／１２２）、ＳＣＬＣで６０．０％（４２／７０）となり擬陽性率はＡｄ（０／１５８），Ｓｑ（０／１５８）ともに０％であった。肺原発低悪性度神経内分泌腫瘍であるカルチノイド（ｃａｒｃｉｎｏｉｄ）の陽性率は９．８％（５／５１）となり高悪性度神経内分泌腫瘍に比べて陽性率が低かった（表１）。
【表１】
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表１は、クローン「１５Ｈ２」由来のモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による各癌の陽性率診断結果を示す表である。
＜実験例３＞
免疫組織染色による診断適応試験
以下の方法で免疫染色を行い、診断適応を確認した。
サンプルには、国立がん研究センター中央病院で切除されホルマリン固定パラフィンブロックとして保存されていた症例から作製された組織マイクロアレイ（ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＴＭＡという）を使用した。
ＴＭＡの切片厚は４μｍで作製した。ベンタナディスカバリー（ロッシュ社）を用いて自動免疫染色をした。ＴＭＡはベンタナディスカバリー内のプログラムに従い脱パラフィンを行った後、熱処理にて抗原賦活をし、その後に内因性のペルオキシダーゼ活性阻害を行った。
次いて２％の豚血清（ベクター社）でブロッキングを行った。
１次反応は抗ＡＣＴＮ４−Ｖａ抗体を５μｇ／ｍｌに調製し３７℃、６０分でハイブリダイゼーションを行った。
２次抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧ（ベクター社）を１００倍に調製し３７度３０分でハイブリダイゼーションをおこなった。
発色はＴＭＡをベンタナディスカバリーＤＡＢキットプロトコールに従い染色した。
その後免疫組織化学染色の評価は、二人の観察者が別々に評価し、細胞膜全周性に強発現する症例を（３＋）、細胞質内に顆粒状に強発現する症例を（２＋）、細胞質に弱く染色性を有する症例を（１＋）、全く染色されないものを（０）と定義し、このうち（３＋）と（２＋）の症例を陽性、（１＋）と（０）の症例を陰性とそれぞれ定義した。
（８）免疫組織診断結果を用いた全生存率解析
（７）の結果を用いてＨＧＮＴとそのサブクラス解析としてＳＣＬＣとＬＣＮＥＣのそれぞれ腫瘍で、ＡＣＴＮ４−Ｖａの発現と予後の関連について、カプランマイヤー法とＣｏｘ比例ハザード法を用いて検討した。全生存期間をカプランマイヤー法で解析したところＨＧＮＴ、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣともにＡＣＴＮ４−Ｖａ陽性患者が陰性患者に比べて、陽性患者の生存期間が有意に短かった（図６）。Ｃｏｘ比例ハザード法を用いて死亡に関する危険率を評価したところ、ＨＧＮＴ、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣのそれぞれでＡＣＴＮ４−Ｖａの発現は予後を予測する独立因子になり得ることが示された（表２）
【表２】
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表２は、Ｃｏｘ比例ハザード法を用いてＡＣＴＮ４−Ｖａの発現におけるＨＧＮＴ、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣ患者の死亡に関する危険率を評価した結果を示す表である。表２において、ＡＣＴＮ４−Ｖａのタンパク質発現が多変量解析で有意性を持つことから、ＨＧＮＴ、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣに対する独立した予後因子であると言える。
【実施例２】
【００１０】
ｓｉＲＮＡによるＡＣＴＮ４−Ｖａの発現阻害
（１）ｓｉＲＮＡの作製
本発明において使用される好ましいｓｉＲＮＡ（配列番号１０、１１、１２）を化学合成により生成した。陰性対照には、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１ｓｉＲＮＡおよびＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃２  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いた。
（２）細胞への導入
ＡＣＴＮ４−Ｖａを発現するヒト肺小細胞癌細胞株ＳＢＣ−３に対して、遺伝子導入用カチオン性脂質を用いたｓｉＲＮＡの導入を行った。
ＳＢＣ−３は、６穴培養プレートの１ウェルに対して３ｘ１０５個／２ｍｌで播き、２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
ｓｉＲＮＡの導入に用いる複合体は、２種類の混合液を反応させることで調製した。第１の混合液は、１０μＭの各ｓｉＲＮＡ  １μｌ（１０ｐｍｏｌ）とＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５０μｌを混合して作製した。第２の混合液は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  ２５０μｌを混合して作製した。これら２種類の混合液を室温で２０分間静置した。また、陰性対照の混合液作製では、１０μＭの陰性対照ｓｉＲＮＡ  ０．５μｌ（２０ｐｍｏｌ）を用いた。
次に、複合体５００μｌをＳＢＣ−３培養ウェルへ添加し、３７℃で７２時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（３）ウェスタンブロッティング
導入反応後のＳＢＣ−３の抽出液を用いてウェスタンブロッティングを行い、精製抗体１５Ｈ２によるＡＣＴＮ４−Ｖａの検出を行った。
（４）結果
結果を図７に示す。図７において、各レーンは以下のｓｉＲＮＡ又は対照を使用したときのバンドを表す。
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レーン１〜３ではＡＣＴＮ４−Ｖａのバンドが消失していることから、本発明のｓｉＲＮＡを用いることによりＡＣＴＮ４−Ｖａの発現を抑制できることが示された。従って、本発明のｓｉＲＮＡは腫瘍、特に神経内分泌腫瘍の治療に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の抗体は、組織、細胞、および血液等の検体中のＡＣＴＮ４−Ｖａを高感度かつ特異的に検出でき、腫瘍、好ましくは癌の検出及び診断に、また抗腫瘍用医薬組成物として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＲＮＡ
配列番号１１：合成ＲＮＡ
配列番号１２：合成ＲＮＡ
［配列表］
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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