(57)【要約】この発明は、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト７番染色体断片が、染色体マーカーＡＣ００４９２２とＡＣ０７３８４２との間に存在する少なくともヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む約１Ｍｂ±５００Ｋｂサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター、並びに、該ベクターを含む非ヒト哺乳動物に関する。
2009063722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト７番染色体断片が、染色体マーカーＡＣ００４９２２とＡＣ０７３８４２との間に存在する少なくともヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む約１Ｍｂ±５００Ｋｂサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター。
【請求項２】
ヒト人工染色体ベクターである、請求項１に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
【請求項３】
前記ヒト人工染色体ベクターが、前記ヒト７番染色体断片を、ヒト１４番染色体由来のＳＣ２０ベクター（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３）に転座して得られたベクターである、請求項２に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
【請求項４】
前記ヒト人工染色体ベクターが、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２８のニワトリＤＴ４０細胞株ＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）２１４に保持されたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔである、請求項２に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
【請求項６】
マウスＥＳ細胞である、請求項５に記載の分化多能性細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
キメラ動物又はその子孫動物である、請求項７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
前記子孫動物が、前記キメラ動物と、それと同種の野生型動物との交配により得られる動物である、請求項８に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
前記非ヒト哺乳動物において、前記ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのホモログである前記非ヒト哺乳動物固有のチトクロームＰ４５０遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している、請求項７〜９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
マウスである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
マウスが子孫マウスである、請求項１１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のマウス又はその子孫マウスを、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを欠損したマウスと交配させることにより作製されたマウス又はその子孫であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持すること、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを欠損していること、及びヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、上記マウス又はその子孫。
【請求項１４】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物或いは請求項１３に記載のマウス又はその子孫に由来する、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現が可能であることを特徴とする、細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織。
【請求項１５】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、請求項１３に記載のマウス又はその子孫、或いは請求項１４に記載の細胞、器官又は組織において、これらが保持するヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を発現させて生物学的活性を有するヒトチトクロームＰ４５０を産生させ、該ヒトチトクロームＰ４５０を回収することを含む、生物学的活性を有するヒトチトクロームＰ４５０の製造方法。
【請求項１６】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、請求項１３に記載のマウス又はその子孫、或いは請求項１４に記載の細胞、器官又は組織に薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝の試験方法。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持する非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームＰ４５０遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
【請求項１８】
ｎｔＥＳ細胞である、請求項１７に記載の分化多能性細胞。
【請求項１９】
マウス由来ｎｔＥＳ細胞である、請求項１７又は１８に記載の分化多能性細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体断片を保持しかつ子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターに関する。
本発明はまた、上記ベクターを保持する非ヒト哺乳動物、例えばマウス、その細胞、器官又は組織に関する。
本発明はさらに、上記非ヒト哺乳動物、その細胞、器官又は組織を用いて、ヒトチトクロームＰ４５０を製造する方法、或いは薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝を試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物の体内での代謝は、主に肝臓に存在するチトクロームＰ４５０（以下、「Ｐ４５０」ともいう。）によって行われる。Ｐ４５０は、多くの遺伝子からなるスーパーファミリーを形成しており、アミノ酸配列に関して相同性が４０％を超えるＰ４５０を同じファミリーとし、同じファミリー内でも５５％以上のアミノ酸相同性を示すものについてはサブファミリーに分類する（非特許文献１）。同じサブファミリーに属していても、ヒトとラットのＰ４５０を比較した場合では性質の違いが認められ、基質となる物質や代謝産物に違いが認められることがある。ゆえに、ある薬物の代謝についてラットでの情報をそのままヒトに適用することはできず、ヒトでの薬物代謝を正確に予測する試験系の開発が望まれている（非特許文献２）。
又、ヒトでの薬物代謝を検討するのであれば、ヒト肝ミクロソームを用いるのが一つの手段であるが、ヒトの肝ミクロソームは入手が困難である。一方、遺伝子工学的な手法でヒトの酵素を比較的容易に作ることが可能になってきており、これによると安定して同一の規格のものを供給できることから、その利用が考えられる（非特許文献３）。他方、Ｐ４５０により代謝されて活性化された薬物の生体への影響を調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系が構築されている。これは、肝ミクロソームと薬物を細胞の培養液中に添加することにより、細胞外で代謝された代謝産物の前記細胞への影響をみるものである。この場合、活性化された物質は細胞膜と吸着し、一部分しか細胞内に到達しない。したがって、細胞に対する代謝産物の影響を正確に把握することができないと考えられる。細胞そのものがＰ４５０を発現する場合、細胞膜に吸着することなく侵入した薬物が細胞内で活性化すると考えられ、毒性をはじめとする代謝産物による影響を適切に再現できると考えられる。このような観点から、ヒトＰ４５０遺伝子を導入した細胞を代謝産物の毒性評価に用いることが望ましいとされている（非特許文献４）。
しかし、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現系を用いた方法は、いずれも何らかの問題点を抱えているのが現状である。ヒトＰ４５０を導入した酵母を用いた発現系（例えば、非特許文献５）では、Ｐ４５０の発現量はある程度得られ、Ｐ４５０ｃＤＮＡを改変せずに発現できることなどの利点はあるものの、系に酵母自身のＰ４５０が含まれる問題がある。大腸菌を用いる発現系（例えば、非特許文献６）は取扱いが容易で大量に酵素を得ることができるものの、安定して発現させるためには発現させるＰ４５０のＮ−末端アミノ酸を改変する必要がある。また、この改変が酵素活性に影響を与える可能性が示唆されたり、大腸菌がＰ４５０活性を発揮するのに必要な還元酵素を持っていないため還元酵素を別に添加したりする必要があるなどの問題もある。また、昆虫細胞とバキュロウイルスを用いる系（例えば、非特許文献７）では発現量も多くＮ−末端アミノ酸の改変も必要ないが、発現のための操作に若干の熟練を要する。ヒト肝癌由来のＨｅｐＧ２細胞とワクシニアウイルスを用いる系（例えば、非特許文献８）やヒトＢリンパ球を用いる系はヒトの細胞を用いることもあり、Ｐ４５０がよりｉｎ  ｖｉｖｏの環境に近い状態で発現していると考えられるが、ワクシニアウイルスの使用を伴なう場合やＨｅｐＧ２細胞ミクロソームを用いる場合は、安全性に対する配慮が必要である（非特許文献２）。
薬物代謝酵素の生物学的役割と制御については、未だに完全には解明されていない。これらの動物細胞、酵母、昆虫、細菌を用いる実験系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物代謝と化学発癌におけるＰ４５０の役割を検討するモデルとなりうるが、薬物動態のパラメーターなど他の要素のために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける状態を充分には反映していないことを踏まえて使用しなくてはならない（非特許文献９）。しかし、ヒトのＰ４５０遺伝子が導入され、体内でヒトと同じ代謝産物を生成する実験動物ができれば、ヒトで特異的に生成する代謝産物であっても、その薬理作用はもとより毒性に関して動物を用いて検証できるなどの大きな利点があげられる（非特許文献１０）。そのため、Ｐ４５０遺伝子を導入したトランスジェニックマウスについての研究も行われている。例えばＲａｍｓｄｅｎら（非特許文献１１）は、ラットＣｙｐ２Ｂ２遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製した。ラットＣｙｐ２Ｂ２遺伝子の発現は、組織特異的、発生特異的に制御されると共に、フェノバルビタールによって発現が誘導されることが知られている。トランスジェニックマウスにおける、フェノバルビタールによるトランスジーンの発現誘導には８００ｂｐのプロモーター配列だけでは不充分であり、さらに上流の遺伝子配列が必要であることが示された。また、トランスジーンの発現のコントロールには、転写開始点の数十キロベース上流の配列が必要であり、これによって発現量や組織特異性も再現できる可能性が示された（非特許文献１１）。
また、ＬｏｅｆｇｒｅｎらはＣＹＰ２Ｃ１８およびＣＹＰ２Ｃ１９を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）をもつトランスジェニックマウスを作製し、発現に性差があることが報告された。この系では導入された遺伝子の導入部位はマウス２番染色体Ｃ１であり、コピー数は１１−１３であった。通常ヒトの遺伝子コピー数は２であることからヒトのＣＹＰ２Ｃを生理的に発現させるモデルとしては不十分であることが示唆された（非特許文献１２）。
また、Ｙｕら（非特許文献１３）はヒト成体に特異的に発現するＣＹＰ３Ａ４を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）をもつトランスジェニックマウスを作製した。この例では導入したＣＹＰ３Ａ４の遺伝子の発現は２週齢および４週齢でのみであったが、発現誘導剤を投与すると、８週齢においても発現が観察された。このトランスジェニックマウスでは乳腺の発達が悪く、子孫の生存が悪かった。この系では導入された遺伝子の導入部位やコピー数は検定されていない。従って、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子によるものかどうかは、いくつかのコピー数、挿入部位の異なる系統での再現性を取る必要があると考えられた。
さらにまた、Ｌｉら（非特許文献１４）は、ヒト胎児に特異的に発現するＣＹＰ３Ａ７をもつトランスジェニックマウスを作製した。この例ではメタロチオネインプロモーターが使用され、Ｐ４５０遺伝子の組織特異的な誘導発現は観察されなかった。すなわち、作製された６系統のトランスジェニックマウスのうち１系統のみで、導入したＣＹＰ３Ａ７遺伝子の肝臓での発現が認められたが、他の系統ではさまざまな臓器において発現が認められ、本来の組織特異性が認められなかった。したがって、肝臓特異的にＰ４５０遺伝子を発現させるためにはメタロチオネインプロモーターでは不充分であると考えられる。
ＣＹＰ３Ａに関しては、胎児期の毒性研究のためのツールとしての応用についての研究も行われている（非特許文献４）。また、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（非特許文献１５）は、ラットＣｙｐ１Ａ１遺伝子のプロモーターとその上流配列をｌａｃＺ遺伝子と結合した遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製し、それによりＣｙｐ１Ａ１プロモーターによる遺伝子発現の制御について解析を進めた。
トランスジェニックマウスに限らず、Ｐ４５０遺伝子のノックアウトマウスも開発されてきており、発生や細胞レベルのホメオスタシスへの影響やｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物あるいは化学物質を介した毒性に関するＰ４５０の役割について解明する重要なツールとして期待されている（非特許文献１６）。例えば、内因性Ｃｙｐ１ａ２のノックアウトマウスは２つの研究グループによって作製された。Ｐｉｎｅａｕら（非特許文献１７）によって作製されたＣｙｐ１ａ２ノックアウトマウスは、ヘテロでは正常であるが、ホモであると生後すぐに死亡した。一方、Ｌｉａｎｇら（非特許文献１８）によって作製されたＣｙｐ１ａ２ノックアウトマウスは、ホモ個体の表現型に異常はなかった。この違いは、欠損させる遺伝子の配列が異なることに起因しているものと考えられる。また、Ｃｙｐ１ａ２ノックアウトマウスを用いたＰ４５０遺伝子の欠損の影響や代謝の異常についても報告（例えば、非特許文献１９）されており、このようなノックアウトマウスを用いたＣｙｐ１ａ２の代謝系での役割が解明されてきている。エタノールを代謝する主要な酵素として知られるＣｙｐ２ｅ１についてもノックアウトマウスが作製された（非特許文献２０）。Ｃｙｐ２ｅ１はエタノール以外にも、アセトアミノフェンやアセトン、アラキドン酸の代謝に関与していることが知られているが、Ｃｙｐ２ｅ１が完全に欠損したホモ個体であっても外見上はワイルドタイプのマウスと変わらなかったが、アセトアミノフェンに対する耐性が上がり、また、病理所見の結果などからアセトアミノフェンによる肝毒性にＣｙｐ２ｅ１による代謝が大きく関与していることが示唆された。これらのＰ４５０遺伝子ノックアウトマウスのいずれも、遺伝子ノックアウトによる当該遺伝子の機能解明を目的として作製されたものであり、導入される外来のＰ４５０遺伝子の発現レベルの上昇を目的としたものではない。
他方、ＨｅｒｗａａｒｄｅｎらはＣｙｐ３ａ遺伝子ノックアウトマウスを作製し、さらにヒトのＣＹＰ３Ａ４遺伝子を肝臓または小腸に発現させたマウスを作製し、ドセタキセルの代謝に関する研究が報告されている。しかしながら、これらのマウスでは肝臓または小腸特異的なプロモーター下流にヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子を繋いで強制的に発現させており、ヒトの発現量を生理的に再現するものではない（非特許文献２１）。
このような事情に鑑み、例えば、特許文献１では、ヒト正常線維芽細胞由来７番染色体の部分断片をミクロセル法によりマウスＥＳ細胞（胚性幹細胞）に導入し、このＥＳ細胞を用いて正常組織においてヒト染色体断片を保持し、薬剤の誘導によって肝臓、小腸においてヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子を発現するキメラマウスが得られたことが記載されている。これに関連して、特許文献１は、ＣＹＰ３Ａ遺伝子群（以下、「ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター」ともいう。）を含むヒト７番染色体断片（約５Ｍｂ）をＳＣ２０−ＨＡＣベクター（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３；特許文献２）に転座して得られた＃７−ＨＡＣベクターを開示しているが、このベクターは子孫伝達能を欠くものであった。さらに、特許文献１には、ヒトＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ３Ａファミリー）を有し、さらにマウス内在性のＰ４５０遺伝子（Ｃｙｐ３ａファミリー）が破壊されたマウスの作製が記載されている。
特許文献１に記載のごとく、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子群を含む７番染色体の部分断片を保持するマウスまたは、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子群を含む７番染色体の約５Ｍｂの領域をマウス個体内で安定であることがわかっているヒト人工染色体ベクター（ＳＣ２０）に搭載し、そのヒト人工染色体ベクターを保持するマウスが作製されたが、キメラマウスからの安定的な子孫伝達が不可能であった。子孫伝達個体が得られない場合、キメラマウスによるマウスの生産となり、その都度胚操作を必要とすることや均一な遺伝的背景を持つマウスが得られないこと、さらには、目的とする複数のヒトＰ４５０遺伝子群が導入され、かつ内在性の薬物代謝酵素が破壊された子孫マウスが得られないことを意味する。特許文献１記載のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子群を保持するキメラマウスから子孫伝達しない原因の１つとしてこれまでにゲノムインプリンティングに関与する遺伝子や発生・生殖細胞分化に重要とされる遺伝子の過剰発現は胎生致死になることが報告されている（非特許文献２２−２４）。
しかし一方で、ヒト人工染色体ベクター（以下、「ＨＡＣベクター」ともいう。）の利点は、１）宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、宿主遺伝子を破壊しない、２）一定のコピー数で安定に保持され、宿主細胞の生理的発現制御を受けることから、挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、３）導入可能なＤＮＡサイズに制約がないことから、発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子／アイソフォームの導入が可能となることが挙げられる。このように、ヒト人工染色体ベクターは、従来のベクター系（ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、プラスミド）にはない利点を有していることから、新たな遺伝子の機能解析のためのベクターやヒト型モデル動物の作製系として期待されている（例えば、非特許文献２５−２６）。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／０１１９５１号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２３００２０号公報
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｏｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：１，１９９６
【非特許文献２】舩江ら，バイオサイエンスとインダストリー，５５：８１，１９９７
【非特許文献３】鎌滝，（財）安評センター研究所報，７：２７，１９９７
【非特許文献４】Ｋａｍａｔａｋｉら，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，８２−８３：８７９，１９９５
【非特許文献５】Ｋｏｖａｌｅｖａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２１：１２９，１９９６
【非特許文献６】Ｇｉｌｌａｍら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０５：１２３，１９９３
【非特許文献７】Ａｓｓｅｆｆａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７４：４８１，１９８９
【非特許文献８】Ｓｈｏｕら，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，１０：１５９，１９９４
【非特許文献９】Ｗｏｌｆら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５０：５６７，１９９８
【非特許文献１０】鎌滝ら，薬物動態，１３：２８０，１９９８
【非特許文献１１】Ｒａｍｓｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１７２２，１９９３
【非特許文献１２】Ｌｏｅｆｇｒｅｎら，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３６：９５５−９６２，２００８
【非特許文献１３】Ｙｕら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４６：２９１１，２００５
【非特許文献１４】Ｌｉら，Ａｒｃｈｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２９：２３５，１９９６
【非特許文献１５】Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０９：２６１９，１９９６
【非特許文献１６】ＭｃＫｉｎｎｏｎら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５：７８３，１９９８
【非特許文献１７】Ｐｉｎｅａｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２：５１３４，１９９５
【非特許文献１８】Ｌｉａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３：１６７１，１９９６
【非特許文献１９】Ｇｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５：１８１９，１９９８
【非特許文献２０】Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２０６３，１９９６
【非特許文献２１】Ｈｅｒｗａａｒｄｅｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１７：３５８３−３５９２，２００７
【非特許文献２２】Ｏｋｉｔａら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，８１（６）：５５６，２００３
【非特許文献２３】Ｓｕｎ  ＦＬ，Ｄｅａｎ  ＷＬ，Ｋｅｌｓｅｙ  Ｇ，Ａｌｌｅｎ  ＮＤ，Ｒｅｉｋ  Ｗ．：Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｇｆ２  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７  Ｏｃｔ  ２３；３８９（６６５３）：７８５，７８７．
【非特許文献２４】Ｐｕｅｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１００９０，２０００
【非特許文献２５】Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：１０８６，２０００
【非特許文献２６】Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２，２０００
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、ヒト７番染色体上の発生段階・生殖細胞分化に重要であると思われる遺伝子を除き、かつヒトＰ４５０（ＣＹＰ３Ａ）遺伝子群を含む特定の遺伝子領域を、ヒト人工染色体ベクター上にクローニングし、非ヒト哺乳動物へ導入することで子孫伝達可能なトランスクロモソミック動物を作製することにある。これによって、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体断片を保持する子孫伝達可能なヒト人工染色体ベクター、及び該ベクターを含む非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類、有蹄類など）を得ることができる。
本発明の別の目的は、上記の非ヒト哺乳動物、或いはその組織、器官又は細胞を用いて、薬物や食品の薬理作用又は代謝を試験する方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト７番染色体において、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのテロメア側ＡＣ０７３８４２において削除し、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのセントロメア側ＡＣ００４９２２においてｌｏｘＰ配列を挿入することにより、発生段階・生殖細胞分化に重要であると思われる遺伝子を除いたヒトＰ４５０（ＣＹＰ３Ａ）遺伝子群を含む特定のヒト７番染色体の遺伝子領域（約１Ｍｂ±０．５Ｋｂ）をヒト人工染色体ベクター上にクローニングし、そのヒト人工染色体ベクターを、非ヒト哺乳動物であるマウスに導入することによって、子孫伝達可能なトランスクロモソミックマウスが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
発明の概要
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
（１）ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト７番染色体断片が、染色体マーカーＡＣ００４９２２とＡＣ０７３８４２との間に存在する少なくともヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む約１Ｍｂ±５００Ｋｂサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター。
（２）ヒト人工染色体ベクターである、上記（１）に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
（３）前記ヒト人工染色体ベクターが、前記ヒト７番染色体断片を、ヒト１４番染色体由来のＳＣ２０ベクター（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３）に転座して得られたベクターである、上記（２）に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
（４）前記ヒト人工染色体ベクターが、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２８のニワトリＤＴ４０細胞株ＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）２１４に保持されたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔである、上記（２）に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
（６）マウスＥＳ細胞である、上記（５）に記載の分化多能性細胞。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
（８）キメラ動物又はその子孫動物である、上記（７）に記載の非ヒト哺乳動物。
（９）前記子孫動物が、前記キメラ動物と、それと同種の野生型動物との交配により得られる動物である、上記（８）に記載の非ヒト哺乳動物。
（１０）前記非ヒト哺乳動物において、前記ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのホモログである前記非ヒト哺乳動物固有のチトクロームＰ４５０遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
（１１）マウスである、上記（７）〜（１０）のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
（１２）マウスが子孫マウスである、上記（１１）に記載の非ヒト哺乳動物。
（１３）上記（１１）又は（１２）に記載のマウス又はその子孫マウスを、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを欠損したマウスと交配させることにより作製されたマウス又はその子孫であって、上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持すること、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを欠損していること、及びヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、上記マウス又はその子孫。
（１４）上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物或いは上記（１３）に記載のマウス又はその子孫に由来する、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現が可能であることを特徴とする、細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織。
（１５）上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物、上記（１３）に記載のマウス又はその子孫、或いは上記（１４）に記載の細胞、器官又は組織において、これらが保持するヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を発現させて生物学的活性を有するヒトチトクロームＰ４５０を産生させ、該ヒトチトクロームＰ４５０を回収することを含む、生物学的活性を有するヒトチトクロームＰ４５０の製造方法。
（１６）上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物、上記（１３）に記載のマウス又はその子孫、或いは上記（１４）に記載の細胞、器官又は組織に薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝の試験方法。
（１７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持する非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームＰ４５０遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
（１８）ｎｔＥＳ細胞である、上記（１７）に記載の分化多能性細胞。
（１９）マウス由来ｎｔＥＳ細胞である、上記（１７）又は（１８）に記載の分化多能性細胞。
定義
本明細書中で使用する用語の定義は以下の意味を含む。
本明細書中の「哺乳動物人工染色体ベクター」という用語は、哺乳動物染色体に基づいて作製された人工染色体を意味する。例えば、ヒト染色体に基づいて作製された人工染色体は、ヒト人工染色体と称される。
本明細書中の「ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター」という用語は、ヒト７番染色体上に位置するＣＹＰ３Ａ遺伝子群を意味する。ＣＹＰ３Ａ遺伝子群は、例えば、ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ７，ＣＹＰ３Ａ５，ＣＹＰ３Ａ４３を含む。
本明細書中の「ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子」という用語は、ヒトＣＹＰ遺伝子群の総称を意味し、例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｄ６を含む。
本明細書中の「マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター」という用語は、マウス５番染色体上に位置するＣｙｐ３ａ遺伝子群を意味する。Ｃｙｐ３ａ遺伝子群は、例えば、Ｃｙｐ３ａ１１，Ｃｙｐ３ａ２５，Ｃｙｐ３ａ１３を含む。
本明細書中の「ホモログ」という用語は、任意の遺伝子に対応する他の動物種の相同遺伝子を意味する。例えばヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のマウスホモログはＣｙｐ３ａ１１である。なお、ＣＹＰ遺伝子群においては、アルファベットのあとの数字は各動物種によって一致しないことが多い。
本明細書中の「ｎｔＥＳ細胞」という用語は、ドナー細胞核からあらかじめ除核したレシピエント卵へ核移植を行うことにより作製されたＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＥＳ）細胞を意味する。
本明細書中の「非ヒト哺乳動物」という用語は、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などを含むが、これらに限定されない。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−２９５９９３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、＃７−ＨＡＣおよびＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣおよびＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの作製方法の概略を示した図である。
図２は、＃７−ＨＡＣおよびＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣおよびＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持領域とキメラ率、保持率および子孫伝達率のまとめを示した図である。
図３は、各ステップでの組換えや細胞融合や染色体導入が行われたことを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。図３ａはＤＴ４０（＃７）クローン、図３ｂはＤＴ４０（ＤＦ１４１）クローン、図３ｃはＤＴ４０（ＮＰ２５）クローン、図３ｄはＲクローン、図３ｅはＲＰ１３クローン、図３ｆはＲＰＣ１３Ｆ２クローン、図３ｇはＣＨＯクローン、及び図３ｈはＴＴ２Ｆクローンである。
図４は、ヒト７番染色体上のＡＣ００４９２２へｌｏｘＰを導入する概略図（ａ）と、導入の結果を示すサザン解析の結果を示した図（ｂ）である。
図５は、ヒト７番染色体上のＡＣ０７３８４２において部位特異的切断を行う概略図である。ｃｅｎはセントロメア側、ｔｅｌはテロメア側を表す。
図６は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスにおけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのゲノム解析の結果を示した図である。
図７は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスにおけるＦＩＳＨ解析を示す図である。左のグラフはＦＩＳＨ解析による各組織（横軸）におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持率（縦軸）を示す。右のグラフはＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスの尻尾繊維芽細胞のＦＩＳＨの結果を示す写真である。
図８は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスにおけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの発現解析の結果を示した図である。ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を表す。
図９は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウス肝臓におけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの時期特異的遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図１０は、薬物誘導によるＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウス肝臓における遺伝子発現解析の結果を示した図である。Ｒｉｆはリファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）を表す。
図１１は、ｐＢｌｕｅＬＡＢ（２９７５ｂｐ）マルチクローニング部位の構造を示した図である。
図１２は、ｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）の構造を示した図である。
図１３は、ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）マルチクローニング部位の構造を示した図である。
図１４は、ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）マルチクローニング部位の構造を示した図である。
図１５は、ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ（Ｒ）の構造（７６０２塩基対）を示した図である。
図１６は、ｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯの構造（約１５．８ｋｂ）を示した図である。
図１７は、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯベクターによる相同組換え体（ＨＲ体）ＥＳ細胞株のゲノムサザン解析の概略を示した図である。
図１８は、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯマウス個体の遺伝子型解析の概略を示した図である。
図１９は、ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯマウス個体の遺伝子型解析の概略を示した図である。
図２０は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス肝臓における遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図２１は、発現誘導後のＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／ΔｃｙｐマウスにおけるウェスタンブロッティングによるＣＹＰ３Ａ遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図２２は、発現誘導後のＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスにおける代謝解析の結果を示した図である。
図２３は、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスにおけるヒト特異的代謝物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて測定した結果を示した図である。図２３Ａはヒト、図２３Ｂはマウス（野生型）、図２３ＣはΔｃｙｐマウス、図２３ＤはＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスにおける測定結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、その一の態様において、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト７番染色体断片が、染色体マーカーＡＣ００４９２２とＡＣ０７３８４２との間に存在する少なくともヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む約１Ｍｂ±５００Ｋｂサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクターを提供する。
本明細書中において「チトクロームＰ４５０」は、水酸化酵素ファミリーの総称であり、種々の基質を水酸化する作用（生物学的活性）をもつ酵素である。動物では、主に肝臓に存在し、物質の解毒、脂肪酸の代謝、ステロイドホルモンの生合成などに関与している。本明細書中では、チトクロームＰ４５０を単に「Ｐ４５０」ということがある。
ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子のＣＹＰ３Ａ分子種の遺伝子群は、ヒト７番染色体長腕７ｑ２１〜ｑ２２のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターに存在する（例えばＢ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４３：２８０，１９８８）。本発明の子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターの作製において、上記ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む特に有用な領域は、ヒト７番染色体長腕の染色体マーカーＡＣ００４９２２とＡＣ０７３８４２との間に存在する少なくともヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む、約１Ｍｂ±５００Ｋｂ、好ましくは約１Ｍｂ±３００Ｋｂ、より好ましくは約１Ｍｂ±２００Ｋｂサイズの領域からなるヒト７番染色体断片である。特に、ＡＣ００４９２２からＡＣ０７３８４２までの領域（例えば、Ｊ．Ｅ．Ｓｕｌｓｔｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，８：１０９７，１９９８）は、約１Ｍｂのサイズであり、この領域を含む近傍の領域は、胎生致死、発生異常、奇形などをもたらすと考えられるゲノムインプリンティング遺伝子クラスターを含まないし、また、不妊の原因となる生殖細胞分化に重要とされる遺伝子も含まない。
本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、これを非ヒト哺乳動物に導入したとき、該動物本来の染色体とは独立して存在し得る。このとき得られたトランスクロモソミック動物は、ヒトＰ４５０遺伝子を保有するため、この異種遺伝子を発現することを可能にするし、また、交配によって子孫への上記ベクターの伝達を可能にする。この点で、本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、国際公開第ＷＯ０１／０１１９５１号に記載されたヒト人工染色体ベクター（＃７−ＨＡＣ）と比べて、キメラ率及び染色体保持率のいずれも優れているし、さらに優れた特徴として子孫伝達可能であることが挙げられる。一方、公知の＃７−ＨＡＣベクターは子孫伝達不能であった。
本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む特定の領域の他に、哺乳動物の任意の染色体由来のセントロメアおよびテロメア・サブテロメア領域を含むことができる。ここで、哺乳動物の例は、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などを含むが、これらに限定されない。該セントロメアは哺乳動物染色体由来、好ましくはヒトの任意の染色体由来、より好ましくはヒト１４番染色体由来のセントロメアである。該テロメア・サブテロメア領域は哺乳動物染色体由来、好ましくはヒト染色体由来、より好ましくはヒト７番又は１４番染色体由来、より好ましくは人工的に合成されたＴＴＡＧＧＧ配列の繰り返し配列由来である。本発明のベクターはさらに、哺乳動物染色体由来、好ましくはヒト染色体由来、より好ましくはヒト７番染色体由来のＭＤＲ１遺伝子クラスターを含むことも可能である。本発明の哺乳動物人工染色体ベクターの好ましい例は、ヒト人工染色体ベクターである。
本発明の一実施形態によれば、ヒト人工染色体ベクターは、上記ヒト７番染色体断片を、ヒト１４番染色体由来のＳＣ２０ベクター（国際寄託の受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３；特開２００５−２３００２０号公報）に転座して得られたベクターである。転座とは、ある染色体の一部が別の染色体に移動することをいう。
本発明の別の実施形態によれば、ヒト人工染色体ベクターは、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２８のニワトリＤＴ４０細胞株ＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）２１４内に保持されたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔである。この細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１９年（２００７年）１０月３０日付で国際寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２８が付与された。
以下では、本発明の哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物の作製例、並びにそれらの使用例を説明する。
具体的には、ヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子群をマウスなどの非ヒト哺乳動物中で安定かつ効率良く発現させるために、ヒト７番染色体断片を保持するヒト人工染色体（以下、「ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ」と呼ぶ）の構築を開示する。このＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの構築及び構造は、後述の実施例、図１及び図２に記載されている。
（ｉ）ヒト７番染色体の改変
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターは、７番染色体上の７ｑ２１．３−ｑ２２．１に存在する（Ｂ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓら、上記）。ヒトＣＹＰ３Ａファミリーには、少なくともＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３が含まれ、ＣＹＰ３Ａのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＧ＿０００００４として登録されている。本発明のヒトＰ４５０は、ＣＹＰ３Ａファミリーに属するＰ４５０酵素、例えばＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５及びＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３の酵素の全てを対象とする。
ヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む断片は、ヒト１４番染色体に由来する染色体断片（ＳＣ２０−ＨＡＣベクター）に転座、クローニングした新規ヒト人工染色体の構築、該ヒト人工染色体のマウスでの子孫伝達、並びに、該ヒト人工染色体を保持するトランスクロモソミック非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、有蹄類などの哺乳動物）の作製に使用することができる。
本明細書中において、哺乳動物人工染色体とは、哺乳動物染色体上の所望の領域を、同種又は異種の哺乳動物由来の安定な染色体断片（染色体ベクター）に転座させて作製された、人工染色体をいう。また、トランスクロモソミック非ヒト哺乳動物とは、異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、ヒト以外の哺乳動物をいう。
本発明者らは、哺乳動物人工染色体の作製において、マウスなどの被染色体導入動物の発生に悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を染色体インサート上から可能な限り除去することが望ましいと考えてきた。しかし、従来は、ヒト染色体の詳細な配列等の構造に関する情報がないか、または不足していたため、目的遺伝子の近傍に、例えば、ｌｏｘＰ配列およびヒトテロメア配列を挿入することが困難な場合があった。この場合、両配列に挟まれた領域には目的遺伝子以外にも、その他多くの遺伝子が含まれるので、これら余剰遺伝子がマウスなどの非ヒト哺乳動物に導入された場合に、個体発生または生殖細胞分化に悪影響を及ぼすことが危惧された。さらにまた、目的遺伝子を含む染色体インサートのサイズと、被染色体導入動物のキメラ率および導入染色体保持率および子孫伝達効率との関係が不明であった。
本発明者らは、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターが存在するヒト７番染色体の構造に関する情報に基づき、ある特定サイズ範囲の、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター含有染色体インサートについて、被染色体導入動物のキメラ率および導入染色体保持率および子孫伝達効率がいずれも有意に上昇することを今回見出した。このように余剰遺伝子をヒト人工染色体から取り除くことによって、特定されたＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺をインサートとして保持する新規ヒト人工染色体を作製することが可能となった。本明細書中、余剰遺伝子とは、被染色体導入動物の発生や生殖細胞分化に悪影響を与える有害遺伝子を指し、例えば、インプリンティング遺伝子や遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域、生殖細胞で発現する遺伝子群などである。
ゲノムインプリンティングに関与する遺伝子の過剰発現は胎生致死、発生異常、奇形などに導くことが知られているが、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの存在するヒト７番染色体上の７ｑ２２（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターよりセントロメア側）にはゲノムインプリンティング遺伝子クラスターが存在するため、これを削除することが望ましいと考えられる。また、精巣や卵巣の生殖細胞で発現する遺伝子群の過剰発現は生殖細胞分化に悪影響を及ぼすことが知られているが、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの存在するヒト７番染色体上の７ｑ２２（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターよりテロメア側）には生殖細胞で発現する遺伝子が複数存在するため、これを削除することが望ましいと考えられる。その結果、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域全体の大きさを縮小し、これによって高い子孫伝達効率を達成しうる。
下記の（ｉｉ）で、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含むヒト７番染色体断片をＳＣ２０−ＨＡＣベクター上へ転座させる場合、転座させる染色体インサート（ヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域を含む）の大きさは、＃７−ＨＡＣ（国際公開第ＷＯ０１／０１１９５１号）の場合の５Ｍｂよりも小さいサイズ、通常約４Ｍｂ〜約０．５Ｍｂ、好ましくは約３Ｍｂ〜約０．５Ｍｂ、さらに好ましくは約２Ｍｂ〜約０．５Ｍｂ、最も好ましくは約１Ｍｂ〜約０．５Ｍｂとしうる。また、余剰遺伝子を削除する実験の結果、転座させる染色体インサートのセントロメア側の端は、好ましくはＡＣ００４９２２座であり、一方テロメア側の端は、好ましくはＡＣ０７３８４２座であるのが好ましいことが判明した。すなわち、７ｑ２２ゲノムインプリンティング遺伝子クラスターを除き、かつＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのセントロメア側に位置する染色体部位（例えば、ＡＣ００４９２２；ＮＣＢＩデータベース）に組換え酵素Ｃｒｅの認識配列であるｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入し、さらに７ｑ２２に存在する生殖細胞で発現する遺伝子を除き、かつＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの極テロメア側に位置する染色体部位（例えば、ＡＣ０７３８４２；ＮＣＢＩデータベース）にヒトテロメア配列を相同組換えにより挿入し、その位置により部位特異的に切断（テロメアトランケーション）（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：３４４７，１９９８）することで、ＡＣ００４９２２−ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２断片を作製し、これを本発明の人工染色体ベクターの作製に用いることができる。
（ｉｉ）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムによるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含むヒト７番染色体断片のＳＣ２０−ＨＡＣベクター上への転座
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、例えば、ｌｏｘＰ配列及びヒトテロメア配列をヒト染色体上の目的遺伝子領域の近傍に相同組換えにより挿入し、両配列に挟まれた目的遺伝子領域周辺のみを別の染色体断片（安定でかつ子孫伝達可能な染色体断片であることが望ましい；例えばヒト１４番染色体由来ＳＣ２０染色体ベクター：ＳＣ２０−ＨＡＣベクター）上の対応ｌｏｘＰ配列挿入部位に特異的に転座させることによって、目的遺伝子領域周辺のみをインサート（染色体インサート）として保持するヒト人工染色体として作製されうる（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：１０８６，２０００）。
この場合、転座させる染色体インサート（ヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域を含む）の大きさは、上記のとおり、＃７−ＨＡＣの場合の５Ｍｂよりも小さいサイズ、通常約４Ｍｂ〜約０．５Ｍｂ、好ましくは約３Ｍｂ〜約０．５Ｍｂ、さらに好ましくは約２Ｍｂ〜約０．５Ｍｂ、最も好ましくは約１Ｍｂ〜約０．５Ｍｂとしうる。前記転座させる染色体インサートのセントロメア側の端は、好ましくはＡＣ００４９２２座であり、一方テロメア側の端は、好ましくはＡＣ０７３８４２座である（Ｊ．Ｅ．Ｓｕｌｓｔｏｎら、上記）。
本発明のヒト人工染色体の作製をさらに具体的に説明する。
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含むヒト７番染色体あるいはその断片は、周知の方法で取得しうる。すなわち、ミクロセル法によりヒト染色体あるいはその断片をマウスＡ９細胞にライブラリ化することができる（Ｋｏｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８０：４１３−４１８，１９８９）。得られたライブラリから、ＰＣＲ等によりヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター特異的な配列を検出することにより、ヒト７番染色体あるいはその断片を保持するクローンを選抜することができる。ヒト７番染色体あるいはその断片は、その後の改変の便宜のため、さらにミクロセル法により好ましくはニワトリＤＴ−４０細胞（理研セルバンク（日本国）：ＲＣＢ１４６４；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１１１）に移入することができる。
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターは７番染色体上の７ｑ２２に存在する（Ｂ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓら，上記）。前述の＃７−ＨＡＣにおいては、ＡＣ００４０８２座からＡＦ００６７５２座までの５Ｍｂ領域が染色体インサートとして転座クローニングされていた。この５Ｍｂインサートにおいて、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域よりもテロメア側には２Ｍｂの、セントロメア側には２Ｍｂの余分な染色体領域が含まれている。さらにはセントロメア側の２Ｍｂにはインプリンティング遺伝子クラスターが含まれている。さらには、テロメア側の２Ｍｂには生殖細胞で発現する遺伝子が複数存在する。そこで、まずセントロメア側２Ｍｂ領域を取り除くために、７番染色体断片（ＡＦ００６７５２座でテロメアトランケーションされている断片）をＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域の極く近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に存在するＡＣ００４９２２座（Ｊ．Ｅ．Ｓｕｌｓｔｏｎら、上記）でｌｏｘＰ配列を相同組換えにより挿入する。これらの改変により、ＡＣ００４９２２−ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＦ００６７５２断片（約３Ｍｂ）のみを染色体インサートとしてＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングできる。その結果得られた人工染色体ベクターは、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣである（図１及び図２）。
次に、この染色体ベクターをＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域の極く近傍かつテロメア側（約２００Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ０７３８４２領域（Ｊ．Ｅ．Ｓｕｌｓｔｏｎら、上記）においてテロメアトランケーション（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら、上記（１９９８））することで切断すれば、ＡＣ００４９２２−ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２断片（約１Ｍｂ）のみを染色体インサートとしてＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングできる。その結果得られたヒト染色体ベクターがＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔである（図１及び図２）。もっと具体的に言えば、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔでは、ＡＣ０７３８４２中の位置１２４４５５で切断されるため、存在するゲノム領域はＡＣ０７３８４２の位置１２４４５６〜１３２７６４であり、位置１〜１２４４５５は存在していないし、また、ＡＣ００４９２２の中の位置３２３４０で転座されるため、存在するゲノム領域はＡＣ００４９２２の位置１〜３２３４０であり、位置３２３４１〜８２３５９は存在していない。
本発明では、しかしながら、ゲノムインプリンティング遺伝子クラスター、生殖細胞分化に重要とされる遺伝子などの有害な領域を含まないで、かつ、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含む限り、上記の特定の領域からなるヒト７番染色体断片に限定される必要はない。
これらＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ及びＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの作製において、ニワトリＤＴ４０細胞中でのテロメアトランケーションとＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムによる染色体間転座を利用することができる。
先ず、上記のようにして得られた改変ヒト７番染色体断片と改変ＳＣ２０−ＨＡＣベクター（Ｋｕｒｏｉｗａら，上記（２０００））のそれぞれを保持するＤＴ４０細胞を作製する。次に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含むヒト７番染色体断片をＳＣ２０−ＨＡＣベクター上へ転座させるために、それぞれの改変ヒト染色体断片を保持するＤＴ４０細胞を融合させることによって、２本の改変ヒト染色体断片を保持するＤＴ４０細胞ハイブリッドを作製する。次に、Ｃｒｅ組換え酵素をこのＤＴ４０細胞ハイブリッド中で発現させて転座させるが、２本の非相同染色体間での組換え（転座）頻度は非常に低いことが報告されており（例えば、Ａ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，９：３７６，１９９５）、さらに本発明の場合は、内在性染色体間ではなく、外来性のヒト染色体間での転座であるため、さらに組換え効率が低くなる可能性も考えられる。そこで、期待通りｌｏｘＰ間で組換えが起こった細胞を選択できるポジティブセレクション系を考えることが好ましい。そこで、ｌｏｘＰ間で染色体の転座が起こった細胞において、ＧＦＰ遺伝子が発現し、ＦＡＣＳでソーティングすることによって目的の細胞をクローニングするシステムを用いる。さらに、組換え頻度を上げるために、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性ではなく、安定発現させる。２本の染色体間での転座は相互的に起こるので、Ｃｒｅ組換え酵素を安定発現させると、せっかく転座を起こした染色体が、頻度こそは低いが、再び組換え（転座）を起こして元に戻ってしまう可能性があるので、通常このような実験においては、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させたり、Ｃｒｅ組換え酵素の発現を厳密にコントロールしたりする。しかし、本発明においては、ＤＴ４０ハイブリッド中で転座させた直後に目的の転座したヒト人工染色体をミクロセル融合法によりチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞へ移入させるため、ＣＨＯ細胞においては、Ｃｒｅ組換え酵素の影響は受けずに済む。そのため、単純にＣｒｅ組換え酵素を安定発現させることが可能となる。
上記の手法を用いることによって、如何なるサイズのヒト染色体断片（ＹＡＣベクターのクローニングサイズを超える）をも安定なＳＣ２０−ＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ部位にクローニングすることができる。
上記のヒト人工染色体構築システムにより作製されたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ又はＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔは、マウスＥＳ細胞に導入される前に、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞に導入されるべきである。Ｄｉｅｋｅｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１２：１７４，１９９６）は、改変ヒト染色体をニワトリＤＴ４０細胞からマウスＭＥＬ細胞（癌細胞の一種）へ移入したが、大部分が断片化された状態で移入された。これを回避するために、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞へ移入することによって、無傷の状態でヒト染色体を移入することができる。ＣＨＯ細胞はマウスＡ９細胞と同様に効率良くミクロセルを形成することが知られており（Ｋｕｒｏｉｗａら、上記（２０００））、これにより改変ヒト染色体をＣＨＯ細胞から非ヒト哺乳動物の分化多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞）へ移入し、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ保持キメラ動物を作製することができる。
（ｉｉｉ）分化多能性細胞へのヒトＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター）を含む人工染色体の移入
本発明はさらに、上記の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞を提供する。
本明細書において、分化多能性細胞には、例えば胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞、Ｈａｎａｏｋａら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８：８３，１９９１）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４，１９８１）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞、Ｍａｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ，７０：８４１，１９９２）、核移植由来胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞、Ｗａｋａｙａｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０，２００１）、精巣由来多能性幹細胞（ｍＧＳ細胞、Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，Ｃｅｌｌ，１１９：１００１，２００４）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３，２００６）などの、非ヒト哺乳動物の初期胚に注入するか或いは該初期胚と共培養することにより、未分化な状態の細胞が分化して様々な形態あるいは機能を有する体細胞に変化（分化）する上記細胞が含まれる。とりわけ、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などはその能力が特に高く、多くの場合生殖細胞にも寄与し、その細胞由来の子孫を作ることができる。ＥＣ細胞は主に生殖細胞癌から、ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、ＥＧ細胞は発生初期に出現する原始生殖細胞から、ｎｔＥＳ細胞は除核した未受精卵にドナー核を核移植して、その胚盤胞の内部細胞塊から、ｍＧＳ細胞は精巣由来幹細胞から、ｉＰＳ細胞はマウスなどの哺乳動物由来の、繊維芽細胞などの体細胞に特定の２、３又は４因子（ｋｌｆ４，ｏｃｔ４；ｋｌｆ−４，ｏｃｔ４，ｓｏｘ２；ｋｌｆ−４，ｏｃｔ４，ｃ−ｍｙｃ，ｓｏｘ２など）をコードするＤＮＡを導入することで、得られる。
分化多能性細胞の中でも特にＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞がよく知られているため、本発明では、マウスＥＳ細胞を好ましく使用することができる。また、マウス以外の動物種におけるＥＳ細胞又は分化多能性細胞の樹立は、ラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６３：２８８，１９９４）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒら，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６：５６３，１９９４）において報告されている。あるいは、ＥＳ様細胞として知られるｉＰＳ細胞の使用も好ましい。したがって、これらのＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞あるいは他の分化多能性細胞を受容細胞として、ヒト人工染色体を移入すれば、マウスの場合と同様に、ヒト人工染色体あるいはその断片を保持し、該ヒト人工染色体上の遺伝子を発現する非ヒト動物が作製可能である。さらに、これらの非ヒト哺乳動物を利用して、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを発現することも可能である。上記非ヒト動物において該ヒト人工染色体が子孫伝達不可能な場合でも、非ヒト動物由来の分化多能性細胞においてヒトＰ４５０遺伝子の相同遺伝子に対応する遺伝子を破壊し、該ヒト人工染色体を導入すれば、非ヒト動物由来の内在のＰ４５０遺伝子が欠損し、かつヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを発現することができる分化多能性細胞が得られる。
本発明におけるヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体断片を移入するための受容細胞としては、上記のような分化多能性細胞株を用いることができる。
また、標識されたヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体断片を保持する染色体供与細胞としては、１）受容細胞で選択可能なマーカーで標識されたヒト染色体を保持し、２）それ以外のヒト染色体を含まない、３）ミクロセル形成能が高い細胞が望ましい。ヒト染色体提供の材料としては、ヒト由来のあらゆる細胞株、癌細胞、初代培養細胞を用いることができるが、染色体の欠失、増幅等の異常の可能性が低く、また培養が容易な点を考慮すると正常線維芽細胞が適している。まず、１）については、ヒト細胞は、薬剤（例えばＧ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジンなど）耐性等のマーカー遺伝子を発現するベクターにより形質転換することができる。ここで用いるマーカー発現制御のためのプロモーターとしては、ヒト細胞においてのみならず、マウスＥＳ細胞のような受容細胞で効率よく働くものが望ましい。この目的には、ＳＶ４０エンハンサーと単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターを連結したもの（Ｋａｔｏｈら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１２：５７５，１９８７）、マウスＰＧＫ−１プロモーター（Ｓｏｒｉａｎｏら，Ｃｅｌｌ，６４：６９３，１９９１）等を用いることができる。上記マーカー遺伝子、必要に応じてプロモーターを連結したマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片で、エレクトロポーレーション（石田ら，細胞工学実験操作入門、講談社、１９９２）等によりヒト細胞を形質転換し、マーカー遺伝子が発現する細胞を選択することにより、導入されたマーカー遺伝子が、２３種４６本あるヒト染色体上にランダムに挿入されたようなヒト細胞形質転換体のライブラリを得ることができる。３）については、多くのヒト正常細胞はミクロセル形成能が非常に低いので、上記の形質転換体をミクロセル形成能の高い細胞、例えば、マウスＡ９細胞（Ｋｏｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８０：４１３−４１８，１９８９）と全細胞融合することにより、ミクロセル形成能を付与することができる。
受容細胞へのヒト染色体断片移入の材料としては、ヒトＰ４５０遺伝子を含むヒト７番染色体供与細胞から調製されるミクロセル、或いは、ガンマ線照射したミクロセルを用いることができる。受容細胞への移入は、（清水素行，細胞工学ハンドブック，羊土社，１９９２）等に記載された方法で受容細胞とミクロセルを融合することにより行う。ミクロセル供与細胞においては、ヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体またはその断片が受容細胞において選別可能なマーカーを保持している。この中から、特異的な遺伝子マーカーや多型マーカーに基づくプライマー又は蛍光標識プローブを使用した、ＰＣＲ、サザンブロット解析、ＦＩＳＨ解析等により、ヒトＰ４５０遺伝子あるいはヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体断片を保持する株を選択すれば、ヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体断片を導入することが可能である。また、異なる選択マーカーを保持する複数のヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体断片を逐次導入することにより、これらを同時に保持する受容細胞を得ることもできる。ヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体上のマーカー（Ｇ４１８耐性等）により選抜された受容細胞が、供与細胞の保持していたヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体断片を保持していることは、例えば、選抜された受容細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用い、プローブとしてヒト特異的繰り返し配列（Ｌ１、Ａｌｕ等、Ｋｏｒｅｎｂｅｒｇら，Ｃｅｌｌ，５３：３９１，１９８８）、ヒト染色体特異的プローブ（Ｌｉｃｈｔｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８０：２２４，１９８８）を用いたフルオレッセンス・インサイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の染色体解析、ヒトＰ４５０遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲ法、ヒトＰ４５０遺伝子特異的配列プローブを用いたサザン解析により検出される。
また、これに関連して、動物細胞への遺伝子導入におけるレポーター遺伝子としてオワンクラゲ由来のＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子が知られている（例えば、Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃら，Ｇｅｎｅ，１１１：２２９，１９９２）。ＧＦＰの発光には基質は必要でなく、蛍光で検出することが可能であるので、生細胞のまま、しかも短時間でモニターすることができる。ｌｏｘＰ組換え体のポジティブセレクションマーカーとして、ＧＦＰ遺伝子を用いることができる。具体的には、プロモーターを含まないＧＦＰ遺伝子をＳＣ２０−ＨＡＣベクターの一端に挿入し、７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのセントロメア側の一端にはＧＦＰの発現に必要なプロモーターを挿入する。ＣｒｅによるｌｏｘＰ配列間での組換えが起こると、プロモーターとＧＦＰ遺伝子とが連結され、ＧＦＰが発現するようになる。この組換えＤＴ４０細胞は蛍光を発光するので、ＳＣ２０−ＨＡＣベクターにＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターをクローニングするためのセレクションおよび該ＨＡＣベクターの受容細胞でのセレクションが可能になる。
（ｉｖ）ヒトＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター）を含む人工染色体を導入した非ヒト哺乳動物由来ＥＳ細胞又は分化多能性細胞からのキメラ動物の作製
本発明はさらに、上記のヒト人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒト哺乳動物を提供する。
非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞株又は分化多能性細胞、例えばマウス細胞ＥＳ株やｎｔＥＳ細胞株からのキメラ動物の作製は、相澤慎一，バイオマニュアルシリーズ８ジ−ンターゲティング，羊土社，１９９５、等に記載された方法で行うことができる。効率的なキメラ動物の作製を行うための宿主胚の発生時期、系統等の選択については、それぞれのＥＳ細胞株についてすでに検討された条件を用いることが望ましい。例えば、マウスＥＳ細胞株であるＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６  Ｆ１由来のＴＴ２細胞（野生色、Ｙａｇｉら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４：７０，１９９３）については、Ｂａｌｂ／ｃ（白色、日本クレア社）又はＩＣＲ（日本クレア社）由来の８細胞期胚を宿主胚として用いることが望ましい。
具体的には、上記の方法で作製した本発明の人工染色体ベクターを保持するＣＨＯ細胞からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ培地中、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ１０００）の存在下で、ミクロセルとＥＳ細胞またはｎｔＥＳ細胞との融合を行う。得られたＥＳ細胞またはｎｔＥＳ細胞クローンを、雌雄交配により得られた８細胞期胚（上記）に注入し、注入胚を仮親に移植し、キメラ動物を誕生させる。好ましい分化多能性細胞は非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞またはｎｔＥＳ細胞である。さらに好ましいＥＳ細胞またはｎｔＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞またはマウスｎｔＥＳ細胞である。
好ましい実施形態においては、ヒトＰ４５０遺伝子を効率良く発現させるために、かつヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子群による薬物代謝をよりヒト型にするために、非ヒト哺乳動物内在性のＣＹＰ３Ａ遺伝子群を破壊することができる。すなわち、ヒト遺伝子の導入を行った動物に対して、内在性ＣＹＰ３Ａ遺伝子の破壊を行うか、或いはこの逆に、内在性のＣＹＰ３Ａ遺伝子群を破壊した動物にヒト遺伝子の導入を行うことも可能である。
本発明においては、このようにして得られる非ヒト哺乳動物は、本発明の人工染色体ベクターを保持し、ヒトＰ４５０遺伝子の発現を可能にする、キメラ動物或いはその子孫動物である。また、子孫動物は、上記キメラ動物と、それと同種の野生型動物との交配により得られる動物であってもよいし、或いは上記キメラ動物と、それと同種の動物の対応遺伝子の破壊された動物との交配により得られる動物であってもよい。
好ましい実施形態によれば、本発明の非ヒト哺乳動物においては、上記ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームＰ４５０遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している。
さらに、好ましい実施形態によれば、本発明の非ヒト哺乳動物は、マウスであり、キメラマウス及びその子孫マウスの両方を含む。このようなマウス又はその子孫は、本発明の人工染色体ベクターを保持すること、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを欠損していること、及びヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする。
本発明によれば、ＥＳ細胞（Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失）からキメラ非ヒト哺乳動物を作製し、野生型動物と交配させ、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失したＦ１動物を得る。このＦ１動物どうしを交配させ、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがホモに欠失したＦ２動物を得る。一方、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含むヒト人工染色体を保持するキメラ非ヒト動物と野生型動物を交配させ、該ヒト人工染色体を保持するＦ１動物を得る。このＦ１動物とＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターがホモに欠失した上記Ｆ２動物とを交配させ、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持するＦ２動物を得る。このＦ２動物とＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失したＦ２動物とを交配させることによって、最終的に目的の非ヒト哺乳動物（マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターがホモに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持）が得られる。
（ｖ）キメラ非ヒト哺乳動物又はその子孫におけるヒトＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター）を含む人工染色体の保持およびヒト遺伝子発現の確認
ＥＳ細胞を注入した胚から誕生した非ヒト哺乳動物におけるＥＳ細胞の貢献率は、その毛色によりおおまかな判定ができる。しかし、毛色に貢献がみられないからといって他の組織で貢献がないと判断はできない。より詳細なキメラ動物各組織におけるヒト染色体の保持は、各組織より抽出されたゲノムＤＮＡを用いたサザン解析、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ等によって確認することができる。導入された染色体上のヒトＰ４５０遺伝子の発現は以下のようにして確認される。ヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体由来のｍＲＮＡの発現は、各組織由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５６９８，１９８８）、ノーザンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｅｎ  Ｗｉｌｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９４）により検出される。タンパク質レベルの発現はウェスタンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，前記）あるいは、キメラ動物肝ミクロソームを用いたテストステロン６β水酸化活性測定等により検出される。さらに、キメラ動物細胞中でのヒトＰ４５０遺伝子群を含む染色体の保持および該染色体上の遺伝子の発現が、キメラ動物由来初代培養細胞での薬剤耐性マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子発現による耐性細胞の出現により確認できる。
本発明の非ヒト哺乳動物において、ヒトＰ４５０遺伝子群を含む人工染色体を保持するＥＳ細胞が、そのキメラ動物の生殖細胞に分化した場合、その子孫にも導入したヒトＰ４５０遺伝子群を含む染色体断片が認められ、その染色体断片上の遺伝子を発現する。
さらにまた、上記キメラ動物と正常動物の交配により、ヒトＰ４５０遺伝子群を含むヒト染色体が子孫伝達したかどうかは、子孫動物の組織、器官又は細胞より抽出されたゲノムＤＮＡを用いたサザン解析、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ等によって同様に確認することができる。また、子孫伝達動物における個体発生段階などの時期特異的、組織特異的遺伝子発現の確認もまた上記と同様に行うことができる。
（ｖｉ）子孫伝達非ヒト哺乳動物における遺伝子発現誘導の確認
遺伝子発現の確認については、上記（ｖ）の方法と同様である。例えば遺伝子発現の誘導はＲｉｆａｍｐｉｃｉｎやＰＣＮで誘導される（後述の実施例６参照）。
（ｖｉｉ）非ヒト哺乳動物内在性Ｐ４５０遺伝子群のノックアウト動物の作製
ノックアウトベクターおよびノックアウトＥＳ細胞は、後述の実施例７、或いはＰ．Ｈａｓｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５０：２４３−２４６、Ｍ．Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：４３５−４３８などに記載の方法により作製可能であり、また、ノックアウト動物の作製については上記（ｉｖ）の方法と同様である。
簡単に説明すると、内在性の目的遺伝子の機能を不活性化するために通常使用される方法の１つが、ジーンターゲッティング法である。該遺伝子の複数のエクソンを含む約数ｋｂのゲノムＤＮＡの１つのエクソンの内部に例えばｎｅｏｒ遺伝子などの外来遺伝子を挿入した組換えＤＮＡを作製し、これを適当なベクターに挿入することによってノックアウトベクターを作ることができる。ベクターＤＮＡをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８耐性細胞を選別し、相同組換えを起こした細胞を例えばサザンブロット解析によって選抜したのち、胚盤胞に注入し、得られた胚を、同種の仮親非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、キメラ動物を誕生させる。キメラ動物同士、又はキメラ動物と野生型動物間、の交配によってホモ接合体であるノックアウト動物を得ることができる。
なお、マウスの場合、内在性（又は「固有の」）Ｐ４５０遺伝子を含むＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターは、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ１３、Ｃｙｐ３ａ２５、Ｃｙｐ３ａ４１などのＰ４５０遺伝子を含み、該クラスターはマウス５番染色体上に存在する（例えば、Ｃｙｐ３ａ１１は、マウスＣｈｒ５．  ７８．０ｃＭ、Ｃｙｐ３ａ１３は、マウスＣｈｒ５．  ７３．７ｃＭにそれぞれ存在する）。
（ｖｉｉｉ）ノックアウト非ヒト哺乳動物における内在性Ｐ４５０遺伝子群の欠損の確認
作製されたノックアウト動物におけるＥＳ細胞の貢献率は、ヒト染色体導入キメラ動物と同様にその毛色によっておおよその判断ができる。さらに、ノックアウト動物より抽出したゲノムＤＮＡを用いたサザン解析、ＰＣＲ等により内在性遺伝子の欠損を確認することが望ましい。また、ターゲティング部分にＧＦＰを挿入した場合は、動物個体においても発現が認められるため、ＥＳ細胞におけるセレクションと同様に、蛍光によって、容易にノックアウト動物の選別が可能となる。
（ｉｘ）内在性Ｐ４５０遺伝子群が欠損されたかつヒトＰ４５０遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物の作製
ヒトＰ４５０遺伝子群を含むヒト染色体を保持し、非ヒト哺乳動物内在性Ｐ４５０遺伝子群を欠くヒトＰ４５０保持動物は、上記の方法によって作製された、ヒトＰ４５０遺伝子群を含むヒト染色体を保持するキメラ動物あるいはその子孫と、内在性Ｐ４５０遺伝子をクラスターごと欠損させたキメラ動物あるいはその子孫を交配することにより得られる。「ヒト染色体の保持」、「内在性Ｐ４５０遺伝子の欠損」は共に、基本的にメンデルの法則に従って両者の遺伝的要素が伝達すると考えられる。
動物の交配方法には種々のパターンが考えられるが、具体的には以下のように実施可能である。まず、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失したキメラ動物を野生型動物と交配させ、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失したＦ１動物を得る（Ｆ１動物Ａ）。このＦ１動物Ａどうしを交配させ、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがホモに欠失したＦ２動物を得る（Ｆ２動物Ｂ）。一方、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを含むヒト人工染色体を保持するキメラ動物と野生型動物を交配させ、該ヒト人工染色体を保持するＦ１動物を得る（Ｆ１動物Ｃ）。Ｆ２動物ＢとＦ１動物Ｃを交配させ、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがヘテロに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持するＦ２動物を得る（Ｆ２動物Ｄ）。このＦ２動物ＤとＦ２動物Ｂとを交配させることによって、最終的な動物（動物Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターがホモに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持）が得られる。
さらに、本発明によって、内在性Ｐ４５０遺伝子群が欠損されたかつヒトＰ４５０遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物から、上記のヒト人工染色体ベクターを保持する非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームＰ４５０遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞を作製することも可能である。分化多能性細胞の例は、上記のように、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞、Ｈａｎａｏｋａら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８：８３，１９９１）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４，１９８１）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞、Ｍａｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ，７０：８４１，１９９２）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３，２００６）など、とりわけ核移植由来胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞、Ｗａｋａｙａｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０，２００１）、例えばマウス由来ｎｔＥＳ細胞である。具体的には、後述の実施例１３〜１６に説明されている。
（ｘ）ヒトＰ４５０タンパク質の製造方法
本発明はさらに、上記の非ヒト哺乳動物或いは上記のマウス又はその子孫に由来する、かつ、ヒトチトクロームＰ４５０遺伝子の発現が可能であることを特徴とする、細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織を提供する。
本発明はまた、上記の非ヒト哺乳動物、上記のマウス又はその子孫、或いは上記の細胞、器官又は組織において、これらが保持するヒトチトクロームＰ４５０遺伝子を発現させて生物学的に活性を有するヒトチトクロームＰ４５０を産生させ、該ヒトチトクロームＰ４５０を回収することを含む、生物学的活性を有するヒトチトクロームＰ４５０の製造方法を提供する。
なお、ヒトＰ４５０のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０１７４６０（ＣＹＰ３Ａ４遺伝子）、ＮＭ＿０００７７７（ＣＹＰ３Ａ５遺伝子）、ＮＭ＿０００７６５（ＣＹＰ３Ａ７遺伝子）、ＮＭ＿００２２８２０（ＣＹＰ３Ａ４３遺伝子）として登録されている。
上記のようにして得られるキメラ動物を利用して生物学的に活性のあるヒトＰ４５０タンパクをその器官、組織、細胞から得ることができる。例えば、キメラ動物あるいはその子孫の肝ミクロソームからヒトＰ４５０を含む分画を抽出し、精製することでヒトのＰ４５０タンパクを抽出できる。あるいは、ヒトＰ４５０遺伝子を含む染色体を保持するキメラ動物あるいはその子孫の組織から細胞株を樹立し、培養することでその培養物からヒトＰ４５０タンパクを回収することが可能である。
タンパク質の精製は、公知の技術を組み合わせて行うことができる。そのような精製法には、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどのクロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動、限外ろ過、硫安分画、透析などが含まれる。
ヒトＰ４５０の同定は、市販のアッセイキットを用いて行うことができる。そのようなアッセイキットの例は、Ｐ４５０−ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４  Ａｓｓａｙ、Ｐ４５０−ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ７  Ａｓｓａｙ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ）である。このアッセイ法は、Ｐ４５０の基質であるルシフェリン誘導体をＰ４５０酵素によりルシフェリンに変換したのち、ルシフェラーゼ反応により生じた発光量に基づいてＰ４５０酵素活性を測定する方法からなる。
（ｘｉ）薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝の試験方法
本発明は更に、上記の非ヒト哺乳動物、上記のマウス又はその子孫、或いは上記の細胞、器官又は組織に薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝の試験方法を提供する。
本発明のキメラ動物あるいはその子孫、或いは、それらと動物内在性Ｐ４５０遺伝子群を欠損させたノックアウト動物とを交配させてできたヒトＰ４５０導入動物は、その体内で本来ヒトの生体内で発現しているのと同じパターンでヒトＰ４５０を発現していると考えられるため、特定の薬物を投与することで個体レベルでの薬理効果、毒性、がん原性、催奇形性、薬物動態を研究するための実験動物としての利用価値が高い。さらに、ヒトにおける薬物の代謝メカニズムや組織ごとの毒性について、薬物をヒトに投与することなく知ることができる。動物における代謝解析では、肝ミクロソームを用いたトリアゾラム（ｔｒｉａｚｏｌａｍ）水酸化活性測定やテストステロン６β水酸化活性測定等によりヒトＣＹＰ３Ａで代謝される薬物の代謝活性が検出されうる。この試験方法の具体例は、後述の実施例１２、図２２及び図２３に記載されている。
（ｘｉｉ）キメラ率及び保持率
上述したように、本発明により、ヒト７番染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域を含む約３Ｍｂ及び約１Ｍｂ領域をＳＣ２０−ＨＡＣベクターに転座、クローニングして得られたヒト人工染色体（それぞれＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ及びＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）を作製し、次いでＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣおよびＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの各々をマウス個体へ導入し、キメラマウスにおけるキメラ率について＃７−ＨＡＣ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９：７０８，２００２）と比較し、キメラ率および染色体保持率の向上とヒト人工染色体の効率的な子孫伝達の達成を確認した。
キメラ率はキメラ動物におけるＥＳ細胞の組織（体毛）への寄与率を示し、通常キメラ動物の体表面におけるＥＳ細胞に由来する体毛色の占める割合を視覚的に評価することにより決定されうる。一方で保持率は導入染色体の組織への寄与率を示す。ヒト染色体としての安定性があり、かつ発生に悪影響を及ぼす因子がその染色体上に存在する場合、高いキメラ率のマウスは発生障害を引き起こし致死につながることから、生まれてこない。しかし、ヒト染色体上に発生に悪影響を及ぼす因子があっても安定性がなければ、高キメラマウスが生まれてくる可能性があり、その場合ヒト染色体は高頻度で維持されない。
ここで言う安定性は、個々の染色体のセントロメア機能や個々の染色体上に存在する遺伝子（例えば細胞増殖を抑制する因子）に影響されうる。
したがって、安定的な子孫伝達個体を得るためには高キメラマウス（体細胞におけるＥＳ細胞の寄与率の高いキメラマウス個体）に高い保持率で外来染色体が維持されている必要がある。
ヒト７番染色体断片又は＃７−ＨＡＣを保持する高いキメラ率のキメラマウスはこれまでに作製されているが、安定的にヒト７番染色体断片もしくは＃７−ＨＡＣが子孫に伝達することはなかった（国際公開第ＷＯ０１／０１１９５１号；Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９：７０８，２００２）。ヒト７番染色体断片もしくは＃７−ＨＡＣを保持する高いキメラ率のキメラマウスにおいて、外来染色体の子孫伝達が観察されなかったことは導入染色体の組織への寄与率が低かった可能性が示唆される。
本発明により、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣあるいはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔによるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを保持するトランスクロモソミック非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）の効率のよい作出が可能になる。これは、医薬品の候補となった薬剤の毒性スクリーニングや食品の機能性や安全性のための非ヒト動物として有用であると考えられる。ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣあるいはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔトランスクロモソミックマウスは異種染色体断片の子孫伝達が可能であるので、交配により均一な形質を持ったトランスクロモソミックマウスの大量生産が可能になるだろう。Ｙｕらの報告（Ｅｎｄｏｃｏｌｏｇｙ  １４６：２９１１−２９１９）では、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの一部（ＣＹＰ３Ａ４）を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を導入したトランスジェニックマウスが構築された。しかし、当該マウス系統にて発現するＣＹＰ３Ａ４遺伝子は成体期に発現する遺伝子であり、胎児期に発現するＣＹＰ３Ａ７や他のＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターであるＣＹＰ３Ａ５やＣＹＰ３Ａ４３などを含まない。従って、該マウス系統で発現するＣＹＰ３ＡはＣＹＰ３Ａ４に限定的であると想像される。さらに導入されているＢＡＣコピー数や導入部位は同定されておらず、ヒトと同じ生理的発現制御を受けているとは言い難い。また、Ｈｅｒｗａａｒｄｅｎらの報告（Ｈｅｒｗａａｒｄｅｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１７：３５８３−３５９２，２００７）ではＣｙｐ３ａ遺伝子ノックアウトマウスを作製し、さらにヒトのＣＹＰ３Ａ４遺伝子を肝臓または小腸に発現させたマウスを作製した。しかし、これらのマウスでは肝臓または小腸特異的なプロモーター下流にヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子を繋いで強制的に発現させており、ヒトと同じ生理的発現制御を受けているとは言い難い。
本明細書で開示されるヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを発現するマウス系統においては、ヒトと同様にＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの時期特異性発現や組織特異性発現、発現誘導能等がより忠実に再現される。例えば、ＣＹＰ３Ａ４やＣＹＰ３Ａ７が含まれるため成体期および胎児期のＣＹＰ３Ａ発現をヒトと同様に検出することができる。誘導剤の例は、ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎやＰＣＮ（Ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  １６α−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）である。
これらのヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター発現トランスクロモソミックマウスを適当な誘導剤により発現誘導することにより、その肝臓より活性の高いミクロゾーム・Ｓ９が得られる。これらのＳ９は薬品や化学品や食品の代謝研究に利用できる。
さらにまた、上記のようにして得られるトランスクロモソミック非ヒト動物細胞や動物を利用して、外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することにより、生物学的に活性な物質を製造することができる。具体的には、トランスクロモソミック非ヒト動物個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後、発現産物を動物の肝臓、小腸などから回収することができる。
また、トランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの（例えば、肝臓由来幹細胞）などを、外来染色体またはその断片上の遺伝子が発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物を培養物から回収することができる。
あるいはまた、これらトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものから抽出した外来染色体もしくはその断片、この外来染色体もしくはその断片を構成するＤＮＡ、またはトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものに保持された外来染色体もしくはその断片に由来するｃＤＮＡを、動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、パン酵母細胞、ＳＦ９細胞、ＨＥＰＧ２細胞等）に導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物を培養物から回収することができる。生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、Ｐ４５０、特にヒトＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３などを挙げることができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
以下の実施例１〜実施例１６において、ヒト７番染色体上のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター周辺領域３Ｍｂ又は１ＭｂをＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ又はＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの作製について説明する（図１）。さらには、作製された各ＨＡＣのマウス個体への導入及びＨＡＣのキメラマウス子孫への伝達について説明する。
実施例１
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ００４９２２−ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＦ００６７５２）３ＭｂをＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの構築
（Ａ）ヒト７番染色体のＡＣ００４９２２へのｌｏｘＰ配列の部位特異的挿入
（Ａ．１）ターゲティングベクターｐＮＰｌｏｘＰＨｙｇの作製
ヒト７染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約３００Ｋｂセントロメア側）に位置するＡＣ００４９２２領域にＣｒｅ組換え酵素の認識配列ｌｏｘＰを挿入するためのターゲティングベクターｐＮＰｌｏｘＰＨｙｇを以下のようにして作製した。まず、ＡＣ００４９２２ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
2009063722.tif 000003
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１（Ｌｅｘｉｃｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃７分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ベーリンガー）およびＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断しＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ１０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片（３．７ｋｂおよび３．０ｋｂ）をＶ９０１プラスミドのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩサイトにクローニングした（Ｖ９０１−ＮＰ２１）。次に、Ｖ９０１−ＮＰ２１を制限酵素ＡｓｃＩ（ＮＥＢ）で切断し脱リン酸化後、カセットベクターｐｌｏｘＰｈｙｇ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）から制限酵素ＡｓｃＩでｌｏｘＰを含むＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーションした。ｌｏｘＰ配列の方向がクローニングしたＡＣ００４９２２ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターｐＮＰｌｏｘＰＨｙｇとした。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１４．１ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図４ａに示す。
（Ａ．２）トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
ＷＯ０１／０１１９５１に記載された方法で作製されたヒト７番染色体断片（ＡＦ００６７５２座で部位特異的に切断されている）を保持するニワトリＤＴ−４０細胞（クローンＤＦ１４１）に上記（Ａ．１）で作製したターゲティングベクターｐＮＰｌｏｘＰＨｙｇをトランスフェクションし、ＡＣ００４９２２ゲノム領域へのｌｏｘＰ配列の挿入を試みた。
ニワトリＤＴ−４０細胞の培養は１０％ウシ胎児血清（ギブコ、以下ＦＢＳで記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＮｏｔＩＩ（宝酒造）で線状化したターゲティングベクターｐＮＰｌｏｘＰＨｙｇを２５〜３０μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。２４時間後、ハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート３枚に分注して約２週間の選択培養を行った。５回のトランスフェクションで得た合計９６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＮＰ））。
（Ａ．３）相同組換え体の選別
（Ａ．３．１）ＰＣＲ解析
ハイグロマイシンＢ耐性クローンからＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出して、以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
以下の２組のプライマーを用いたＰＣＲにより相同組換え体の同定を行った。
2009063722.tif 000004
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃  １分の熱変性後、９８℃  １０秒、６８℃  ４分を３５サイクル行った。９６クローンをスクリーニングした結果、３６クローンが相同組換え体として同定された（組換え頻度３７．５％）。
（Ａ．３．２）サザンブロット解析
上記ＰＣＲ解析にて組換えを確認した６クローンについて以下のようにサザンブロット解析を行った。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で処理し、０．８％アガロースゲル中で電気泳動し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  ＰｌｕｓＴＭハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン（ＮＥＮＴＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）へアルカリブロッティングした。このフィルターに対してＡＣ００４９２２中の遺伝子配列をＰＣＲにより増幅したＮＰｐプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の同定を行った（図４）。ＮＰｐプローブの作製は以下のプライマーを用いＤＦ１４１のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を鋳型としてランダムプライミングによる３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを作製した（アマシャム、添付のプロトコールに従った）。
ＮＰｐプローブ作製用プライマー：
2009063722.tif 000005
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５４℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。サザンハイブリダイゼーションにより、非相同組換え体では約１０．９ｋｂ、相同組換え体では約８．１ｋｂのバンドが検出されると予測された（図４ｂ）。サザンハイブリダイゼーションの結果、６クローン中すべてのクローンが目的の相同組換え体であった（ＮＰクローンと呼ぶ）。
（Ａ．３．３）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記Ａ．３．２で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびハイグロマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト７番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、７ｑ２２付近にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。結果を図３ａ−ｃ示す。図３ａはＤＴ４０（＃７）、図３ｂはＤＴ４０（ＤＦ１４１）、図３ｃはＤＴ４０（ＮＰ２５）クローンを示す。
（Ｂ）ヒト７番染色体断片とＳＣ２０−ＨＡＣベクターの両者を保持するＤＴ−４０ハイブリッドの作製
まず、最初に上記Ａ．３．２で得られたクローンＮＰ２５をＳＣ２０−ＨＡＣベクターを保持するＤＴ−４０細胞Ｒクローン（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）と細胞融合することによって、ヒト７番染色体断片と１４番染色体断片ＳＣ２０断片の両者を保持するＤＴ−４０ハイブリッドを作製した。
（Ｂ．１）細胞融合およびダブル薬剤耐性クローンの単離
ＲクローンはブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、ＮＰ２５クローンはハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。１〜２×１０７個の両クローンを混合し遠心後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め３７℃で保温しておいた５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー）０．５ｍｌを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍｌを約３分間かけて加え、３７℃で１０分間静置した。その後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２４〜４８時間培養した。その後、ブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ）・ハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２４穴培養プレート５枚に分注し、３〜４週間培養した。５回の細胞融合で得た合計８個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＲＰ））。
（Ｂ．２）相同組換え体の選別
（Ｂ．２．１）ＰＣＲ解析
ダブル薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０−ＨＡＣベクター）、７番染色体断片の２本が保持されていることを確認した。
ヒト１４番染色体（ＳＣ２０染色体ベクター）検出用プライマー：
2009063722.tif 000006
2009063722.tif 000007
ヒト７番染色体（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター）検出用プライマー：
2009063722.tif 000008
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、８クローン中６クローンが全てのプライマーで陽性であった。
（Ｂ．２．２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析方法はＫｕｒｏｉｗａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）に従った。上記Ｂ．２．１で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒト１４番染色体特異的プローブ（ローダミン標識）とヒト７番染色体特異的プローブ（ＦＩＴＣ標識）を用いたＦＩＳＨ解析を行ったところ、ＳＣ２０−ＨＡＣベクターとヒト７番染色体断片は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、独立に１本ずつシグナルが検出されたことから細胞融合が起こったことが確かめられた。結果を図３ｄ−ｅに示す。図３ｄはＲクローン、図３ｅはＲＰ１３クローンを示す。
以上の結果から、これらの６ハイブリッドクローンはヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０−ＨＡＣベクター）、７番染色体断片の２本を保持していると判断できた。
（Ｃ）ＤＴ−４０ハイブリッドクローン（ＲＰ１３）におけるヒト７番染色体領域（ＡＣ００４９２２−ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＦ００６７５２）３ＭｂのＳＣ２０−ＨＡＣベクターへの部位特異的転座
Ｋｕｒｏｉｗａら（上記，２０００）の方法に従って、ヒト染色体間の部位特異的転座はＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いることによって行った。
上記と同様にして、制限酵素ＫｐｎＩ（ベーリンガー）で線状化したＣｒｅ組換え酵素安定発現ベクターｐＢＳ１８５ｈｉｓＤ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１０８６，２０００）をＲＰ１３ハイブリッドクローンにトランスフェクションし、２４穴プレートへ分注し、ヒスチヂノール（１ｍｇ／ｍｌ）存在下で約２週間選択培養した。それぞれのウェルからゲノムを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行い、ＳＣ２０−ＨＡＣベクターとヒト７番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。
2009063722.tif 000009
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。まず、第一のＰＣＲは、９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６１℃３０秒、７２℃１分をＰＧＫ−１とＧＦＰ−１をプライマーとして３５サイクル行った。この反応液の一部を鋳型として、９８℃  １０秒、５９℃  ３０秒、７２℃  ０秒をＰＧＫ−２とＧＦＰ−２をプライマーとして３５サイクル行った。ＰＣＲ陽性で転座が確認できたウェル中の細胞プールを１０７細胞数になるまで増やし、プールを５％  ＦＢＳと１μ／ｍｌのプロピディアムアイオダイド（ＰＩ）を添加したＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）４ｍｌに懸濁し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン）により解析した。Ｋｕｒｏｉｗａら（前出）の報告にあるように、ｌｏｘＰ間での組換え転座が起こるとＧＦＰ遺伝子が再構築され発現するので転座を起こした細胞をＦＡＣＳで検出できる。ＧＦＰ陽性と思われる細胞画分のソーティングを２回繰り返した。毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で行った。その結果、ＧＦＰ陽性細胞を９８〜９９％の純度で濃縮することができた。
次に、ＦＡＣＳでクローニングされたＧＦＰ陽性クローン（ＲＰＣ１３Ｆ２）において、期待通りｌｏｘＰ間で組換えが起こっていることを前記ＰＧＫ−２とＧＦＰ−２をプライマーとして用いたＰＣＲによって確認した。さらに、クローンＲＰＣ１３Ｆ２に対して、ヒト１４番染色体特異的プローブ（ローダミン標識）とヒト７番染色体特異的プローブ（ＦＩＴＣ標識）を用いたＦＩＳＨ解析（黒岩ら、上記）を行った結果、確かにヒト７番染色体領域がＳＣ２０−ＨＡＣベクター（ヒト１４番染色体断片）に転座した人工染色体の存在が確認された（図３ｆ）。
以上の結果から、クローンＲＰＣ１３Ｆ２において、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ００４９２２−ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＦ００６７５２）３ＭｂがＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣが構築できたと結論付けた。
（Ｄ）ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ含有ＤＴ−４０ハイブリッド細胞のＣＨＯ細胞へのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの導入
Ｋｕｒｏｉｗａら（上記）の報告にあるように、構築されたＨＡＣをマウスＥＳ細胞へ導入するために、まずＣＨＯ細胞への導入を試みた。
ＤＴ−４０ハイブリッドクローンＲＰＣ１３Ｆ２をＴ２２５フラスコ（スミロン）８本で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、１％  ニワトリ血清、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、さらに２４時間培養してミクロセルを形成させた。細胞を２４ｍｌの血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、予め１００μｇ／ｍｌのポリ  Ｌ−リジンでコートした遠心用２５ｃｍ２フラスコ１２本（コーニング）に２ｍｌずつ分注し、３７℃で１時間培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、１７００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。一方、約１０７個のＣＨＯ細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。再度、ミクロセルを１７００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を除かずに先のＣＨＯ懸濁液５ｍｌを静かに重層した。遠心後、培養液を除去し、ＰＥＧ１５００溶液（ベーリンガー）０．５ｍｌを加え、約２分間ピペットで激しく攪拌した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを約３分間かけてゆっくり加え、３７℃で１０分間静置した。遠心後、１０％ＦＢＳ添加Ｆ１２培地（ギブコ）に細胞を懸濁し、２４穴培養プレート５〜６枚に分注し、３７℃で２４時間培養した。その後、Ｇ４１８  ８００μｇ／ｍｌ含有Ｆ１２培地に交換し、３〜４週間選択培養した。
Ｇ４１８耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出してＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーおよびＰＧＫ−２、ＧＦＰ−２プライマーを用いて、前述と同様の条件でＰＣＲを行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＣＨＯクローンを同定した（例えば、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ４，２５）。さらに、上記ＰＣＲで陽性だったクローンに対して、ヒトＣＯＴ１ＤＮＡをプローブに用いてＦＩＳＨ解析を行った結果、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの存在を確認した。これらの結果から、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞クローンが得られたと結論付けた（図３ｇ）。
（Ｅ）ＣＨＯ細胞からのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣのマウスＥＳ細胞への移入
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するキメラマウスを作製するために、上記（Ｄ）で得られたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へミクロセル法により導入した。
Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ４，２５，３２，３３など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ４からは２５クローン、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ２５からは１３クローン、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ３２からは２８クローンがＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、ヒトＣＯＴ１ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、ＣＯＴ１プローブにより特異的に検出されるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの存在が６６クローン中、５２クローンで確認された。このうちマウスの核型が正常なクローンは２８クローンであった。以上のことから、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ保持ＴＴ２Ｆ細胞が２８クローン得られたと結論付けた（図３ｈ）。
（Ｆ）ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するキメラマウスの作製
上記（Ｅ）で得られたＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野性型ＴＴ２Ｆ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣクローン（例えばＦ８／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ−１および１８、上記（Ｅ）で取得）を注入した９４１０個の胚を仮親に移植した結果、４８４匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち２９匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。すなわち、ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
（Ｇ）ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＥＳ細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
上記（Ｆ）でＴＴ２Ｆ／ＣＹＰ３Ａクローン（Ｆ８／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ−１および１８）より作製されたキメラマウス（キメラ率約８０％）の尻尾からＴｏｍｉｚｕｋａらの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）に記された方法でゲノムＤＮＡを調製し、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの保持を検討した。その結果、２種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの保持が確認された。また、キメラ率約８０％のキメラマウス２匹の肝臓組織を用いてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，：１０，１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でヒトＣＯＴ１ＤＮＡをプローブに用いてＦＩＳＨ解析を行った結果、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの存在を確認し、そのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの保持率は両個体とも７０％であり、キメラ率とほぼ一致した。キメラ率はＥＳ細胞の組織（体毛）への寄与率を示し、保持率は導入染色体の組織への寄与率を示す。キメラ率が高く、保持率も高いキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持ＥＳ細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。すなわちＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの使用により、ＣＹＰ３Ａ遺伝子を含むヒト染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
上記（Ｆ）で作製された雌キメラマウス（キメラ率約１００％）４匹をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した４０匹の仔マウスのうち、２９匹がＥＳ細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＥＳ細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス２９匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡについてＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの保持を検討した結果、全てにおいて２種のプライマー共に陰性であり、キメラマウス子孫におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの保持は確認されなかった。すなわち、キメラ率、保持率が高いキメラ個体において子孫伝達が観察されなかったことはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ上に発生あるいは生殖細胞分化に悪影響を及ぼすヒト遺伝子が存在することが示唆された。
実施例２
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺（ＡＣ００４９２２−ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２）１ＭｂをＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの構築
上記ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣにおいては、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＦ００６７５２間に約２Ｍｂの余分な領域がまだ残存している。そこで、厳密に余分な染色体領域を取り除き、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺のみを転座クローニングする目的で、ＡＣ００４９２−ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２領域約１ＭｂをＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを構築することを試みた。
（Ａ）ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣのＤＴ４０細胞への移入
染色体改変を効率的に行うために、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣをＣＨＯ細胞から相同組換え頻度の高いＤＴ４０細胞へ移入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３−１４３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ３２、実施例１記載）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。１〜２×１０７個のニワトリＤＴ４０細胞をＤＭＥＭで２回洗浄後、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、ＰＥＧ１５００溶液（ベーリンガー）０．５ｍｌを加え、約２分間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、１０％ウシ胎児血清（ギブコ、以下Ｆ  ＢＳで記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で培養した。２４時間後、培地を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約３週間選択培養した。薬剤耐性コロニーからゲノムＤＮＡを抽出してＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして３５サイクル行った。その結果、約５クローン中、２クローンがＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマー陽性であった。さらに、ヒトＣＯＴ１ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨを行った結果、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣが独立して存在していることが分かった。以上の結果から、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するニワトリＤＴ４０細胞（以下、ＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ）と略記）がクローニングできた。
（Ｂ）ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ上のヒト７番染色体領域ＡＣ０７３８４２での部位特異的切断
（Ｂ．１）ターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴの作製
ヒト７染色体上のＣＹＰ３Ａ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約１５０Ｋｂテロメア側）に位置するＡＣ０７３８４２領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴを以下のようにして作製した。まず、ＡＣ０７３８４２ゲノム領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
2009063722.tif 000010
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をプロテネースＫ（ギブコ）処理した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ４００（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ベーリンガー）およびＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）で切断し、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−ＴＥ  １０００（クローンテック）でゲル濾過した。このＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＥＬｈｉｓＤ（Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：８８，２００２）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＡＣ０７３８４２ゲノムシークエンスの方向はテロメア→セントロメアなので、クローニングされたＡＣ０７３８４２ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴとした（図５）。
最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１４．４ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図５に示した。
（Ｂ．２）トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
上記と同様に、上記で作製したターゲティングベクターｐＴＥＬｈｉｓＤ−ＰＴを制限酵素ＳｒｆＩ（東洋紡）で線状化後、上記で作製したクローンＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ）−４にトランスフェクションし、ヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。５回のトランスフェクションで得た合計４３３個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ））。
（Ｂ．３）相同組換え体の選別
（Ｂ．３．１）ＰＣＲ解析
ヒスチジノール耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
2009063722.tif 000011
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。次に上記プライマーで検出されなかった４３３クローンのうちの１１クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをＰＣＲにて確認した。そのプライマーの位置を図５に示す。配列は以下のとおりである。
2009063722.tif 000012
上記プライマー及び上記Ｂ．１のプライマーの組み合わせ（ＰＴ２Ｒ−ｈｉｓＤ２、ＰＴ２Ｒ−ｈｉｓＤ３）によりＰＣＲはＬＡＴａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰＳ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃２０秒、６８℃８分を３５サイクル行った。１１クローンのうち部位特異的に組換えが起こった９クローンでのみ約８ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ）ではバンドは検出されなかった。
（Ｂ．３．２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。上記Ｂ．３．１で組換えを確認したクローンのうち７クローンをヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびヒスチジノールをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔは全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ末端にヒスチジノール由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の結果から、クローンＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）２１４において、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター領域周辺ＡＣ００４９２２−ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター−ＡＣ０７３８４２）１ＭｂがＳＣ２０−ＨＡＣベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが構築できたと結論付けた。
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するニワトリＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）２１４は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１９年（２００７年）１０月３０日付けで国際寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２８が与えられた。
（Ｃ）ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ含有ＤＴ−４０ハイブリッド細胞のＣＨＯ細胞へのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの導入
Ｋｕｒｏｉｗａら（前出）の報告にあるように、構築されたＨＡＣをマウスＥＳ細胞へ導入するために、まずＣＨＯ細胞への導入を試みた。
ＤＴ−４０ハイブリッドクローンＤＴ４０（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）２１４をＴ２２５フラスコ（スミロン）８本で培養し、コンフルエントになった時点で２０％  ＦＢＳ、１％  ニワトリ血清、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、さらに２４時間培養してミクロセルを形成させた。細胞を２４ｍｌの血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、予め１００μ／ｍｌのポリ  Ｌ−リジンでコートした遠心用２５ｃｍ２フラスコ１２本（コーニング）に２ｍｌずつ分注し、３７℃で１時間培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、１７００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。一方、約１０７個のＣＨＯ細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。再度、ミクロセルを１７００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を除かずに先のＣＨＯ懸濁液５ｍｌを静かに重層した。遠心後、培養液を除去し、ＰＥＧ１５００溶液（ベーリンガー）０．５ｍｌを加え、約２分間ピペットで激しく攪拌した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを約３分間かけてゆっくり加え、３７℃で１０分間静置した。遠心後、１０％  ＦＢＳ添加Ｆ１２培地（ギブコ）に細胞を懸濁し、２４穴培養プレート５〜６枚に分注し、３７℃で２４時間培養した。その後、Ｇ４１８  ８００μｇ／ｍｌ含有Ｆ１２培地に交換し、３〜４週間選択培養した。
Ｇ４１８耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出してＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーおよびＰＧＫ−２、ＧＦＰ−２プライマーを用いて、前述と同様の条件でＰＣＲを行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＣＨＯクローンを同定した（例えば、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ４，６）。さらに、上記ＰＣＲで陽性だったクローンに対して、ヒトＣＯＴ１ＤＮＡをプローブに用いてＦＩＳＨ解析を行った結果、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの存在を確認した。これらの結果から、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＣＨＯ細胞クローンが得られたと結論できた。
（Ｄ）ＣＨＯ細胞からのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔのマウスＥＳ細胞への移入
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するキメラマウスを作製するために、上記（Ｃ）で得られたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞（野性型ＴＴ２Ｆ）へミクロセル法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ４，６，７，１０など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆをトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ４からは４クローン、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ６からは４クローン、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ７からは３クローン、ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ１０からは４クローンがＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、ヒトＣＯＴ１ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、ＣＯＴ１プローブにより特異的に検出されるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの存在が１５クローン中、１５クローンで確認された。このうちマウスの核型が正常なクローンは３クローンであった。以上のことから、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ保持ＴＴ２Ｆ細胞が３クローン得られたと結論付けた。
（Ｅ）ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するキメラマウスの作製
上記（Ｄ）で得られたＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野性型ＴＴ２Ｆ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔクローン（例えばＦ８／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ−７および１１、上記（Ｄ）で取得）を注入した８００個の胚を仮親に移植した結果、９２匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。うち１０匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約１００％の個体であった。すなわち、ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
（Ｆ）ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＥＳ細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
（Ｆ．１）ゲノムＰＣＲ解析
上記（Ｅ）でＴＴ２Ｆ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔクローン（Ｆ８／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ−７および１１）より作製されたキメラマウス（キメラ率約８０％）の尻尾からＴｏｍｉｚｕｋａらの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３，１９９７）に記された方法でゲノムＤＮＡを調製し、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持を検討した。その結果、２種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持が確認された。
（Ｆ．２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
また、キメラ率約８０％のキメラマウス２匹の肝臓組織を用いてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でヒトＣＯＴ１ＤＮＡをプローブに用いてＦＩＳＨ解析を行った結果、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの存在を確認し、そのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持率は両個体とも７０％であり、キメラ率とほぼ一致した。キメラ率はＥＳ細胞の組織（体毛）への寄与率を示し、保持率は導入染色体の組織への寄与率を示す。キメラ率が高く、保持率も高いのキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持ＥＳ細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。すなわちＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの使用により、ＣＹＰ３Ａ遺伝子を含むヒト染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
（Ｇ）ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するキメラマウスからの人工染色体子孫伝達
上記（Ｅ）で作製された雌キメラマウス（キメラ率約１００％）４匹をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した８０匹の仔マウスのうち、７５匹がＥＳ細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＥＳ細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス７５匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡについてＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持を検討した結果、２４匹において２種のプライマーで共に陽性であり、キメラマウス子孫におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持が確認された。ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが子孫伝達されたマウス系統をＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）と呼ぶ。
実施例３
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウス系統の体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持
（３．１）ゲノムＰＣＲ解析
上記で得られたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスのうち雄（１６５）および雌（１５５）１匹ずつについて脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣（または子宮）からのゲノムを鋳型として、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いて、前述と同様の条件でＰＣＲを行い、全ての臓器でＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを検出した。その雌（１５５）の代表的な結果を図６に示す。
（３．２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
また上記と同様の個体や組織において、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、５５〜９５％でＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持することが確かめられた（図７）。特にＣＹＰ３Ａが主に発現する肝臓および小腸では８５％以上の高い染色体保持率であることが確かめられた。ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて同様にＦＩＳＨ解析を行った結果、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの存在を確認し、マウス染色体とは独立にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが存在していることが確かめられた（図７）。
実施例４
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウス系統における組織特異的ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現
上記でＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスのうち雄（１６５）および雌（１５５）１匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣（または子宮）において、トータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターおよびマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターの発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター発現検出用プライマー：
2009063722.tif 000013
2009063722.tif 000014
マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター発現検出用プライマー：
2009063722.tif 000015
コントロール遺伝子発現検出用プライマー：
2009063722.tif 000016
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。
その結果ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）を保持するマウスにおいて、ＣＹＰ３Ａ４は肝臓と小腸でのみ、ＣＹＰ３Ａ５は肝臓と小腸と肺でのみ、ＣＹＰ３Ａ７は肝臓と小腸と腎臓と肺でのみ、ＣＹＰ３Ａ４３は肝臓と小腸と腎臓でのみ、Ｃｙｐ３ａ１１は肝臓と小腸でのみ、Ｃｙｐ３ａ１３は肝臓と小腸でのみ、Ｃｙｐ３ａ２５は肝臓と小腸でのみ、Ｃｙｐ３ａ４４は肝臓と小腸でのみ発現を検出できた。また、コントロールのＧＡＰＤＨは全ての組織で検出された。その雌（１５５）の代表的な結果を図８に示す。このようにヒトでみられるよう組織特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。
実施例５
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウス系統における時期特異的ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現
（５．１）ゲノムＰＣＲ解析
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスの雄および雌の胎齢１４．５日、胎齢１６．５日、胎齢１８．５日、生後０日、２週齢、４週齢、６週齢、８週齢、２４週齢における肝臓からのゲノムを鋳型として、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いて、前述と同様の条件でＰＣＲを行い、全ての胎齢、週齡でＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを検出した。
（５．２）ＲＴ−ＰＣＲ解析
また上記と同じ個体の肝臓のトータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、上述のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター発現およびマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。
その結果、成体型発現のヒトＣＹＰ３Ａ４、ヒトＣＹＰ３Ａ５、マウスｃｙｐ３ａ１１、マウスＣｙｐ３ａ１３は成体期において、胎児型のＣＹＰ３Ａ７は胎児において強く発現していることが確かめられた。また、コントロールのＧＡＰＤＨは全ての胎齢、週齡で同程度の発現量が検出された。その代表的な結果を図９に示す。このようにヒトでみられるような時期特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。
実施例６
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウス系統におけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現誘導
ヒトＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導する物質として知られるＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ（シグマ）がＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）マウスにおけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現に及ぼす影響について検討するため、一回の投与量は１００ｍｇ／ｋｇとし、４日間腹腔内投与した。なお、投与液はＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ（「Ｒｉｆ」）をコーンオイル（シグマ）に懸濁して調製した。５日目に各マウス肝臓を摘出し、トータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、上述のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子の発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。その結果、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）において溶媒（ｃｏｒｎ  ｏｉｌ）投与群に比べてＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ投与群においてヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現が強く発現していることが確かめられた。また、コントロールのＧＡＰＤＨは両群ともに同程度の発現量が検出された。その雄３匹ずつ（Ｒｉｆ投与およびｏｉｌ投与）の代表的な結果を図１０に示す。
以上のことからＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）におけるヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子の発現誘導がヒト型化されていることが確かめられた。
実施例７
内因性Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
（７．１）Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子エクソン１領域を含むＤＮＡ断片のクローニング
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）に新たな制限酵素サイトを付加するため以下のＤＮＡを合成した。
2009063722.tif 000017
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。一方プラスミドに新たな制限酵素サイトＮｒｕＩ、ＳｇｒＡＩおよびＡｓｃＩを付加するため、２０μｌ反応液中に２種のオリゴＤＮＡ（ＬｉｎｋＡ１およびＬｉｎｋＡ２）各１００μｍｏｌを添加し、７０℃１５分→３７℃１５分→室温１５分の順序で計４５分インキュベーションして得られたＤＮＡ断片を、前記制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）プラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡを取得した。
続いて、ｐＢｌｕｅＬＡを制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。プラスミドに新たな制限酵素サイトＰａｃＩ、ＦｓｅＩおよびＳａｌＩを付加するため、２０μｌ反応液中に２種のオリゴＤＮＡ（ＬｉｎｋＢ１およびＬｉｎｋＢ２）各１００μｍｏｌを添加し、７０℃１５分→３７℃１５分→室温１５分の順序で計４５分インキュベーションして得られたＤＮＡ断片を、前記制限酵素処理したｐＢｌｕｅＬＡプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（図１１）を取得した。
ＢＡＣクローン、ＲＰ２３−４２５Ｎ１７（ジェノテックス社より購入）をＨｉｎｄＩＩＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、マウスＣｙｐ３ａ１３遺伝子周辺領域を含むＤＮＡ断片（１０３１９ｂｐ）を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって同ＤＮＡ断片を精製した。この断片をｐＢｌｕｅＬＡＢのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入しｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）（図１２）を取得した。
（７．２）ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）の構築
上記７．１で作製されたｐＢｌｕｅＬＡＢの制限酵素サイトを改変するために以下のオリゴＤＮＡを合成した。
2009063722.tif 000018
ｐＢｌｕｅＬＡＢを制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。一方２０μｌ反応液中に上記２種のオリゴＤＮＡ各１００μｍｏｌを添加し、７０℃１５分→３７℃１５分→室温１５分の順序で計４５分インキュベーションして得られたＤＮＡ断片を、上記ＳａｃＩ／ＸｈｏＩ処理したベクターに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）（図１３）を取得した。
（７．３）ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）の構築
上記７．１で作製されたｐＢｌｕｅＬＡＢの制限酵素サイトを改変するために以下のオリゴＤＮＡを合成した。
５’ＮｏｔＩＡｓｃＩ  ｌｉｎｋｅｒ３６  Ｓ（５’リン酸付加）：
2009063722.tif 000019
５’ＮｏｔＩＡｓｃＩ  ｌｉｎｋｅｒ３６  Ａ（５’リン酸付加）：
2009063722.tif 000020
ｐＢｌｕｅＬＡＢを制限酵素ＰｖｕＩＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。精製されたベクターＤＮＡをアリカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ由来、タカラ）処理後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。一方２０μｌ反応液中に上記２種のオリゴＤＮＡ各１００μｍｏｌを添加し、７０℃１５分→３７℃１５分→室温１５分の順序で計４５分インキュベーションして得られたＤＮＡ断片を、上記ＰｖｕＩＩ制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）（図１４）を取得した。
（７．４）Ｃｙｐ３ａ１３（エクソン１〜イントロン１）領域ＤＮＡ断片の調製及びｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）への挿入
Ｃｙｐ３ａ１３（エクソン１〜イントロン１）領域の一部を含むＤＮＡ調製するために以下のオリゴＤＮＡを合成した。
2009063722.tif 000021
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー（１０μｍｏｌ）を各１．５μｌ、鋳型として上記７．１で作製されたｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）を添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒→６０℃１分→６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた２０９ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＡｓｃＩおよびＡｃｃＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＮＡ断片を回収した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）を制限酵素ＡｓｃＩおよびＡｃｃＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。精製されたベクターに上記で調製したＤＮＡ断片（Ｃｙｐ３ａ１３エクソン１〜イントロン１領域の一部を含む）を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）ｃｙｐ３ａ１３（２０９ｂｐ）を取得した。
（７．５）Ｃｙｐ３ａ１３−５’ゲノム領域を含むＤＮＡ断片（１１０ｂｐ）のｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）への挿入
Ｃｙｐ３ａ１３−５’ゲノム領域を含むＤＮＡ断片（１１０ｂｐ）を得るために下記のオリゴＤＮＡを作製した。
３ａ１３  ＰｖｕＩＩ−ｅｘ１  Ｓ：
2009063722.tif 000022
３ａ１３  ＰｖｕＩＩ−ｅｘ１  Ａ：
2009063722.tif 000023
ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）を制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＦｓｅＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。一方２０μｌ反応液中に上記２種のオリゴＤＮＡ各１００μｍｏｌを添加し、７０℃１５分→３７℃１５分→室温１５分の順序で計４５分インキュベーションして得られた１１０ｂｐＤＮＡ断片を、上記ＰｖｕＩＩ／ＦｓｅＩ処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）ｃｙｐ３ａ１３（１１０ｂｐ）を取得した。
（７．６）ｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）由来３’ゲノム断片（約２．８ｋｂ）のｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）Ｃｙｐ３ａ１３（２０９ｂｐ）への挿入
上記７．４にて作製したｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）ｃｙｐ３ａ１３（２０９ｂｐ）を制限酵素ＡｃｃＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。精製されたベクターＤＮＡをアリカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ由来、タカラ）処理後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。一方ｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）を制限酵素ＡｃｃＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子エクソン１の一部及び、エクソン２を含む約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＮＡ断片（２．８ｋｂ）を精製した。得られたＤＮＡ断片（２．８ｋｂ）を、上記ＡｃｃＩ処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）ｃｙｐ３ａ１３（２．８ｋｂ）を取得した。
（７．７）ｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）由来５’ゲノム断片（約５．１ｋｂ）のｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）ｃｙｐ３ａ１３（１１０ｂｐ）への挿入
上記７．５にて作製したｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）ｃｙｐ３ａ１３（１１０ｂｐ）を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＰｖｕＩＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。一方ｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＰｖｕＩＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子５’領域及びエクソン１の一部を含む約５．１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＮＡ断片（約５．１ｋｂ）を精製した。得られたＤＮＡ断片（約５．１ｋｂ）を、上記ＡａｔＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）Ｃｙｐ３ａ１３（５．１ｋｂ）を取得した。
（７．８）ＫＯ基本ベクターの構築
ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されたｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏプラスミドをＸｈｏＩ消化し、両端にＬｏｘＰ配列を持つＮｅｏ耐性遺伝子（ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ）を取得した。ＬｏｘＰ−Ｎｅｏの両末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂ断片を取得した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＥｃｏＲＶ消化後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂ断片を挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体のうち、ベクター上ＣｌａＩ部位側にＮｅｏ耐性遺伝子をドライブするプロモーターが配置されているようクローンについてＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ（Ｒ）を取得した。
ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（ライフテックオリエンタル株式会社）をＸｈｏＩおよびＳａｌＩ消化後、０．８％アガロースゲルにアプライし、約１ｋｂのバンドを分離回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＴ−Ａフラグメントを回収した。ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ（Ｒ）をＸｈｏＩ消化後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、ＤＴ−Ａフラグメントを挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、ＫＯ基本ベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ（Ｒ）（図１５）を取得した。
（７．９）ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ（Ｒ）へのＣｙｐ３ａ１３−３’ゲノム断片（約３．０ｋｂ：ＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ）及びＣｙｐ３ａ１３−３’ゲノム断片（約５．２ｋｂ：ＮｏｔＩ−ＦｓｅＩ）の挿入
ｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＳＡＡＸ）ｃｙｐ３ａ１３（２．８ｋｂ）を制限酵素ＡｓｃＩ、ＸｈｏＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子エクソン１の一部及び「エクソン２を含む約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片（３．０ｋｂ）を精製した。さらにｐＢｌｕｅＬＡＢ（ＮＡＰＦ）ｃｙｐ３ａ１３（５．１ｋｂ）を制限酵素ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子５’領域及びエクソン１の一部を含む約５．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＮｏｔＩ−ＦｓｅＩ  ＤＮＡ断片（５．２ｋｂ）を精製した。
ＫＯ基本ベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ（Ｒ）プラスミドを制限酵素ＡｓｃＩ及びＸｈｏＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。上記で得られたＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片（３．０ｋｂ）を、上記ＡｓｃＩ／ＸｈｏＩ処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ（Ｒ）＋３’ｇｅｎｏｍｅを取得した。
上記ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ（Ｒ）＋３’ｇｅｎｏｍｅプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及びＦｓｅＩで処理した反応液を０．８％ゲルで分離し、ベクターＤＮＡ断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＴＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってベクターＤＮＡ断片を精製した。上記で得られたＮｏｔＩ−ＦｓｅＩ  ＤＮＡ断片（５．２ｋｂ）を、上記ＮｏｔＩ／ＦｓｅＩ処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ（図１６）を取得した。
（７．１０）ゲノムサザン解析用プローブの調製
ＢＡＣクローン、ＲＰ２３−４２５Ｎ１７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＣ１２５０６３）の塩基配列情報を基に、Ｃｙｐ３ａ１３−５’ゲノム領域を含むＤＮＡ断片（約１．２ｋｂ）を取得するため以下のＤＮＡを合成した。
2009063722.tif 000024
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー（１０μｍｏｌ）を各１．５μｌ、鋳型として上記７．１で作製されたｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）を添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒→６０℃３０秒→６８℃２分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた約１．２ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片（５’側ゲノムサザン用プローブ、５’ＫＯ−ｐｒｏｂ、図１７）を回収した。
ＢＡＣクローン、ＲＰ２３−４２５Ｎ１７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＣ１２５０６３）の塩基配列情報を基に、Ｃｙｐ３ａ１３−３’ゲノム領域を含むＤＮＡ断片（約１．２ｋｂ）を取得するため以下のＤＮＡを合成した。
2009063722.tif 000025
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー（１０μｍｏｌ）を各１．５μｌ、鋳型として上記７．１で作製されたｐＢＡＣｃｙｐ３ａ１３（＃３９）を添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒→６０℃３０秒→６８℃２分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた約１．２ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片（３’側ゲノムサザン用プローブ、３’ＫＯ−ｐｒｏｂ、図１７）を回収した。
（７．１１）Ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯベクターを用いたジーンターゲティング
マウスＥＳ細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウスを交配することにより得られる受精後２．５日の胚を採取し、ＥＳ細胞用培地中でインビトロ培養し、該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そして該胚を、フィーダー細胞培地中に播種して培養し、該培養胚からＥＳ様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有するＥＳ細胞用培地を用いて分散処理、及び、フィーダー細胞培地を用いて培養し、更にはＥＳ細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。
相同組換えによるｐｃｙｐ３ａ１３遺伝子ノックアウト・マウスＥＳ細胞の取得のため、ｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯを制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従ってマウスＥＳ細胞ＴＴ２（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。ＴＴ２細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２細胞をトリプシン処理し、３ｘ１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁した。その後、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。２４時間後に２００μｇ／ｍｌのネオマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。
得られたネオマイシン耐性ＴＴ２細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造）で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター３’相同領域の下流に位置するＤＮＡ断片（３’ＫＯ−ｐｒｏｂ、図１７）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＳａｃＩ消化により、１本のバンド（約８．３ｋｂ）が検出された。相同組換え体においては、２本のバンド（約８．３ｋｂと約１１．９ｋｂ）が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約１１．９ｋｂの新たなバンドが確認された（図１７）。更に、５’ＫＯ−ｐｒｏｂによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造）で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター５’相同領域の上流に位置するＤＮＡ断片（５’ＫＯ−ｐｒｏｂ）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＴＴ２細胞ではＳｐｈＩ消化により、１本のバンド（約１１．６ｋｂ）が検出された。相同組換え体においては、２本のバンド（約１１．６ｋｂと約１３．３ｋｂ）が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約１３．３ｋｂの新たなバンドが確認された（図１７）。すなわち、これらのクローンはマウスＣｙｐ３ａ１３遺伝子エクソン１の開始コドン周辺領域を領域を欠失し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子（両端にはターゲティングベクター由来の制限酵素サイト部位を含む）が挿入されたものである。３’および５’ＫＯ−ｐｒｏｂによるサザン解析の結果、ｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯを制限酵素ＮｏｔＩで線状化したベクターを用いた場合には６０株中５株が相同組換え体であるという結果を得た。
（７．１２）ｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ  ＥＳ細胞株を用いたキメラマウスの作製
上記７．１１で得られたＧ４１８耐性マウスＥＳ細胞株（＃４、＃１６、＃２５、＃３６、＃４２）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本クレア社）の雌雄交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。移植実験の結果、５種のＥＳ細胞株から計３７匹のキメラマウスが誕生した。
（７．１３）ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ  ＥＳ細胞株由来キメラマウスからのｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯアレルの子孫伝達
上記７．１２で作製されたｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ  ＥＳ細胞株（＃４、＃４２）由来キメラマウスのうち、１００％のキメラ率を示しかつ雄である個体（＃４：９匹、＃４２：１匹）について、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統雌マウス（日本クレア社）と交配し、ＥＳ細胞由来のｐｃｙｐ３ａ１３−ＫＯアレルを有する子孫が誕生するかを検討した。この交配によって得られた仔マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡについて、以下のプライマーを用いてＰＣＲ解析を実施した。
2009063722.tif 000026
ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ）を用い添付文書にしたがって反応液（３０μｌ）を調製し、プライマーとして上記３’ｇｅｎｏｍｅ２と５’ｄｏｗｎ（図１８、（１）×（２））、あるいは３’ｇｅｎｏｍｅ２とｎｅｏ３−１（図１８、（１）×（３））の組み合わせ、鋳型として前記仔マウスゲノムＤＮＡを添加し、９４℃５分保温した後、９４℃３０秒→６０℃３０秒→７２℃３分を１サイクルとして３５サイクル増幅した。反応液を０．８％ゲルにて電気泳動し増幅産物の検出を行った。野生型Ｃｙｐ３ａ１３アレルについては（１）×（２）のプライマーの組み合わせによって３．５ｋｂの特異的産物が、ＫＯ型Ｃｙｐ３ａ１３アレルについては（１）×（３）のプライマーの組み合わせによって３．２ｋｂの特異的産物が検出される（図１８）。＃４、＃４２、それぞれのＥＳ細胞株に由来するキメラマウスより誕生した仔マウスの尻尾ＤＮＡについて解析を行った結果、（１）×（２）、および（１）×（３）のプライマーの組み合わせの両方で陽性となるｃｙｐ３ａ１３−ＫＯヘテロ接合体（図１８）が存在することが確認された。
（７．１４）ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯマウスとｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯマウスの交配によるｃｙｐ３ａ１３／４４／１１／２５−ＫＯマウスの作製
マウスＣｙｐ３ａファミリー遺伝子のうち、Ｃｙｐ３ａ４４とＣｙｐ３ａ１１とＣｙｐ３ａ２５を同時に欠失するｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯマウスの作製法はＷＯ０１／０１１９５１に開示されている。Ｃｙｐ３ａ４４とＣｙｐ３ａ１１とＣｙｐ３ａ２５遺伝子は他の２種のＣｙｐ３ａファミリー遺伝子（３ａ１６、３ａ４１）と共にマウス５番染色体上でクラスターを形成しているが、このＣｙｐ３ａファミリー遺伝子クラスターとＣｙｐ３ａ１３遺伝子の距離は約１０Ｍｂである。
上記７．１２にて作製されたｃｙｐ３ａ１３−ＫＯヘテロ接合体マウス個体と上記ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯマウスヘテロ接合体マウス個体の交配によって得られた仔マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡについて、まずＣｙｐ３ａ１３遺伝子座の遺伝子型を決定するため上記７．１３（図１８）に記載されたＰＣＲ解析を実施した。その結果より（１）×（２）、および（１）×（３）のプライマーの組み合わせの両方で陽性となるｃｙｐ３ａ１３−ＫＯヘテロ接合体（図１８）を選抜し、さらにＣｙｐ３ａ４４／１１／２５遺伝子座の遺伝子型を決定するため以下のＰＣＲ解析を実施した。
2009063722.tif 000027
Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ）を用い添付文書にしたがって反応液（３０μｌ）を調製し、プライマーとして上記３ａ２５Ｆｗと３ａ２５Ｒｖ（図１９、（４）×（５））、あるいは前記ＰＧＫ２とＧＦＰ２（図１９、（６）×（７））の組み合わせ、鋳型として前記仔マウスゲノムＤＮＡを添加し、８５℃３分、９４℃１分保温した後、９４℃１０秒→５９℃３０秒→７２℃３０秒を１サイクルとして３５サイクル増幅した。反応液を２％ゲルにて電気泳動し増幅産物の検出を行った。野生型Ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５アレルについては（４）×（５）のプライマーの組み合わせによって０．３ｋｂの特異的産物が、ＫＯ型Ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５アレルについては（６）×（７）のプライマーの組み合わせによって０．４ｋｂの特異的産物が検出される（図１９）。以上の解析を実施した結果、Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子ノックアウトについてヘテロ接合体かつ、（４）×（５）、および（６）×（７）のプライマーの組み合わせの両方で陽性となるｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯヘテロ接合体（図１９）を得た。
ここで得られたｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯ、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯの両者についてヘテロ接合体であるダブルヘテロ個体の体細胞においては、２種のＫＯアレルは同一染色体上には存在しない。しかし精子あるいは卵子を形成する減数分裂過程においては相同染色体間の組換えが起こり、２種のＫＯアレルを同一染色体上に有する配偶子がある確率で生じる。この現象を利用して、ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯアレルとｃｙｐ３ａ１３−ＫＯアレルを同一の染色体上に有するマウス個体の取得を試みた。上記で得られたｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ／ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯついてヘテロ接合体であるダブルヘテロ個体のうち雄について、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統雌マウス（日本クレア社）と交配を実施し、得られた仔マウスの尻尾よりゲノムＤＮＡを調製し、上記７．１２及び上記に示したｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯ、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ遺伝子型解析を実施した。両ＫＯアレルについてヘテロ接合体である個体の体細胞においては２種の遺伝子ＫＯアレルが同一染色体上にあると考えられるが、本解析の結果、両ＫＯアレルについてヘテロ接合体である個体を得た。
さらに上記で取得された両ＫＯアレルについてヘテロ接合体であるダブルヘテロ（同一染色体）個体の雌雄交配により、ｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯ、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯの両ＫＯアレルについてホモ接合体であり、これら３種のＣｙｐ３ａファミリー遺伝子を欠損するダブルホモ個体の取得を試みた。上記で得られたダブルヘテロ（同一染色体）個体のうち雄について、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統雌マウス（日本クレア社）と交配を実施し、得られた仔マウスの尻尾よりゲノムＤＮＡを調製し、上記７．１２及び上記に示したｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯ、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯ遺伝子型解析を実施した（図１８、１９）。その結果、ｃｙｐ３ａ１３−ＫＯについて（１）×（２）のプライマーセットで陰性、（１）×（３）のプライマーセットで陽性、かつｃｙｐ３ａ４４／１１／２５−ＫＯについて（４）×（５）のプライマーセットで陰性、（６）×（７）のプライマーセットで陽性となる両ＫＯアレルについてホモ接合体である個体を得た（図１８、１９）（以下、Δｃｙｐと記す）。Ｃｙｐ３ａクラスターの遺伝子型は上記プライマーに対応して以下の表１のようになる。
【表１】
2009063722.tif 000028
表中、Ｐｒｉｍｅｒ１は配列番号１０３、Ｐｒｉｍｅｒ２は配列番号１０５、Ｐｒｉｍｅｒ３は配列番号１０４、３ａ２５Ｆｗは配列番号１０６、３ａ２５Ｒｖは配列番号１０７、ＰＧＫ２は配列番号４３、ＧＦＰ２は配列番号４４の配列を表す。
得られたダブルホモマウス雌雄個体の生殖機能は正常であり、以後、ダブルホモマウス雌雄個体同士の交配により本系統を維持した。
実施例８
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持し、かつ内因性Ｃｙｐ３ａ遺伝子群の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
実施例２で作製されたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）を、実施例７で作製されたΔｃｙｐ系統に戻し交配し、得られたマウス個体について、ＰＣＲ法を用いて遺伝子型の解析を行った（実施例４および７参照）。交配して得られた仔マウス１０９匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡについてＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーおよび上記表１記載のプライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持およびＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターのＫＯを検討した結果、２４匹においてＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持し、かつ内因性Ｃｙｐ３ａ遺伝子群の片方のアレルが破壊された（ヘテロＫＯ）マウス系統であることが確認された。さらにこのヘテロにＣｙｐ３ａ遺伝子群が破壊され、かつＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するマウスと実施例７で作製されたΔｃｙｐ系統に戻し交配し、得られた仔マウス１７８匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムＤＮＡを調製し、上記と同様のＰＣＲ法を用いて遺伝子型の解析を行った。その結果２８匹においてＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持し、かつ内因性Ｃｙｐ３ａ遺伝子群の両方のアレルが破壊された（ホモＫＯ）マウス系統であることが確認された。（以下、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐと記す）。
実施例９
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統の体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持
（９．１）ゲノムＰＣＲ解析
上記で得られたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスのうち雄（３０１）および雌（２９８）１匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣（または子宮）からのゲノムを鋳型として、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いて、前述と同様の条件でＰＣＲを行い、全ての臓器でＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを検出した。
（９．２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
得られたＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスのうち雄（３０１）および雌（２９８）１匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣（または子宮）において、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、４９〜９５％でＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持することが確かめられた。特にＣＹＰ３Ａが主に発現する肝臓および小腸では８４％以上の高い染色体保持率であることが確かめられた。
実施例１０
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統におけるＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現
Ｂ６雄マウスの３週齢（Ｂ６−６）および１０週齢（Ｂ６−１）の肝臓、Ｂ６雌マウスの３週齢（Ｂ６−８）および１０週齢（Ｂ６−４）の肝臓、Δｃｙｐ雄マウスの３週齢（ＰＴ４８２）および１０週齢（ＰＴ４４９）の肝臓、Δｃｙｐ雌マウスの３週齢（ＰＴ４８５）および１０週齢（ＰＴ３００）の肝臓、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスの１０週齢における雄（３０１）および雌（２９８）の肝臓、のトータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、上述のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター発現およびマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。
その結果、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／ΔｃｙｐマウスではマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターは発現せず、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターは発現し、ΔｃｙｐマウスではマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスター、ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターともに発現せず、Ｂ６正常マウスではヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターは発現せず、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターは発現していることが確かめられた（図２０）。
実施例１１
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統におけるＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターの遺伝子発現誘導
ＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａの発現を誘導する物質として知られるＰＣＮ（Ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  １６α−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）（シグマ）がＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス、Δｃｙｐマウス、Ｂ６正常マウスにおけるＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａ遺伝子の発現に及ぼす影響について検討するため、一回の投与量は１００ｍｇ／ｋｇとし、４日間腹腔内投与した。なお、投与液はＰＣＮをコーンオイル（シグマ）に懸濁して調製した。５日目に各マウス肝臓を摘出し、肝臓ミクロソーム画分よりタンパク質を抽出し、岡田雅人・宮崎香（タンパク質実験ノート、羊土社、１９９６）に従い、ａｎｔｉ−ＣＹＰ３Ａ抗体（第一化学薬品；カタログ番号２４２４９６）およびａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ５４４１）によるウェスタンブロッティング解析を行った。
その結果、ＰＣＮを投与したＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／ΔｃｙｐマウスおよびＢ６正常マウスでの発現はコーンオイルのみ投与した同系統のマウスよりもＣＹＰ３Ａ発現は上昇しており、その発現量はヒトミクロソーム画分より抽出したタンパク質の発現と同程度であった。また、ΔｃｙｐマウスにおいてはＰＣＮを投与した個体においても発現は観察されなかった。一方で、コントロールとして用いたβ−ａｃｔｉｎの発現は全ての個体で同程度であった。以上のことから、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統においてＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ上のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子がＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａ誘導剤によって発現誘導されることが確かめられた（図２１）。
実施例１２
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統における代謝解析
上記でＰＣＮまたはコーンオイルを投与したＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス、Δｃｙｐマウス個体の肝臓ミクロソームをＯｍｕｒａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９，２３７０，１９６４）に従い、ＣＹＰ３Ａ４で代謝されることがわかっているトリアゾラム（Ｔｒｉａｚｏｌａｍ）（２００μＭ）と混合し、その代謝物であるα−ＯＨ−ｔｒｉａｚｏｌａｍおよび４−ＯＨ−ｔｒｉａｚｏｌａｍを測定した。その結果、ＰＣＮを投与したＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスにおいて、コーンオイルのみ投与した同系統のマウスの１０倍の代謝活性が得られ、それはヒト（ＨＬＭ：ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ）の約半分の活性であることが確かめられた。一方で、ＰＣＮ投与したΔｃｙｐマウスでは活性がほとんど認められなかった。ヒトでは相同遺伝子が２本あり、このＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／ΔｃｙｐマウスではＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターが染色体１本分であると考えられる。ヒトの約半分の活性をＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスで示したことは、ヒトと同様の代謝能を示していることが示された。一方で、ＰＣＮ投与したΔｃｙｐマウスでは活性がほとんど認められなかった。以上のことから、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統においてＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ上のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられた（図２２）。
実施例１３
ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統におけるヒト特異的代謝物の測定
ＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａで代謝されることが知られているｍｉｄａｚｏｌａｍのヒト特異的代謝物がＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスにおいて、ヒトと同様にヒト特異的な代謝物が観察されるかを検討するため、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス、Δｃｙｐマウス、Ｂ６正常マウス、ヒトの各肝臓由来ミクロソームとｍｉｄａｚｏｌａｍを反応させて、以下のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて質量分析した。反応混液（１０μＭ  ｍｉｄａｚｏｌａｍ，８７．５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４），０．５ｍｇ／ｍＬ  肝ミクロソーム）を３７℃で５分間プレインキュベーション後、ＮＡＤＰＨ生成システム（３．３ｍＭ  β−ＮＡＤＰ＋，８０ｍＭ  グルコース−６−リン酸、１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  グルコース−６−リン酸脱水素酵素）を添加し３７℃で３０分間インキュベーションした。アセトニトリルの添加により反応を停止後、混液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ，５分間）し上清を分取した。これを窒素気流下４０℃で溶媒留去し、乾固した抽出物をアセトニトリルに再溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて質量分析した。
その結果、ヒトとＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウスのミクロソームにおいて１０．２２に特異的な代謝物を検出することができた。一方で、主代謝物である１０．６２には全てのミクロソーム群で代謝物を検出することができた。以上のことから、ＴＣ（ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）／Δｃｙｐマウス系統においてＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ上のヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられた（図２３）。
実施例１４
（１４．１）Δｃｙｐマウス由来ｎｔＥＳ細胞の作製
実施例７で得られたΔｃｙｐマウスの尻尾繊維芽細胞をＷａｋａｙａｍａらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０，２００１）従い培養し、あらかじめ除核した未受精卵に上記Δｃｙｐマウス由来の尻尾繊維芽細胞由来の核を注入した。雄のΔｃｙｐマウス１匹（個体Ｎｏ．５９６）および雌Δｃｙｐマウス１匹（個体Ｎｏ．４８０）からそれぞれ、３ラインずつｎｔＥＳを樹立した（５９６−１，２，３および４８０−１，２，４）。
（１４．２）Δｃｙｐマウス由来ｎｔＥＳ細胞のｎｅｏ耐性遺伝子除去
Δｃｙｐ−ｎｔＥＳへＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣおよびＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを導入するためにΔｃｙｐ−ｎｔＥＳに存在するｎｅｏ耐性遺伝子を除去する必要があるため、以下のようにＣｙｐ３ａ１３遺伝子のＫＯに用いたｎｅｏ耐性遺伝子（２つのｌｏｘＰで挟まれている、図１７参照）の除去を行った。上記で得られたΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ細胞株６クローンに対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ギブコ）をトランスフェクションした。これによって、マウス内在性Ｃｙｐ３ａ１３遺伝子領域に存在するｌｏｘＰ配列間で部位特異的組換えが起こり、結果的にｎｅｏ遺伝子が欠失すると期待できた。Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ細胞をトリプシン処理し、１．０ｘ１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、３０μｇのｐＢＳ１８５（インビトロジェン）ベクターを加え、ジーンパルサーを用いて２５０Ｖ、９６０μＦの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを行った。その後、１００ｍｍシャーレ１枚に播種した。期待通りのｌｏｘＰ間組換えが起こっている場合にはベクター中のｎｅｏ遺伝子が発現しなくなり、Ｇ４１８の耐性の有無によって検出可能と考えられた。Ｃｒｅ発現ベクターｐＢＳ１８５導入から７２時間培養後、トリプシン処理により細胞をディッシュから剥離し、ＥＳ用ＤＭＥＭで懸濁後、１５ｍｌチューブに移して１０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を吸引した。チューブをタッピングした後、ＥＳ用ＤＭＥＭ  １０ｍｌで細胞を再懸濁し、ゼラチンコートした１００ｍｍディッシュに播種し約一時間培養した。その後培地を静かに回収し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心後、上清を吸引し、細胞塊をタッピングしてほぐし、フィーダー細胞があらかじめ播種された６０ｍｍディッシュに十分分離した数十のコロニーが出現するように播種した。一週間後、フィーダー細胞があらかじめ播種された２４ｗｅｌｌにコロニーを各クローンにつき１２個ずつピックアップし、さらに数日後、フィーダー細胞があらかじめ播種された２４ｗｅｌｌ２枚に播種し、片方にＧ４１８を含む培地、片方にＧ４１８を含まない培地を加えた（マスタープレート）。Ｇ４１８を加えた培地で死滅したクローンがｎｅｏ耐性遺伝子が除去されたクローンであると考えられたので、Ｇ４１８で死滅したクローンのマスタープレートを増殖させ、２４穴プレート１穴分の細胞を４穴プレート２穴に播種した。４穴プレート１穴分を−８０℃にて凍結保存した。残りの１穴分はゲノムＤＮＡ取得用として３．５ｃｍゼラチンコートしたディッシュに播種し培養した。上記細胞からゲノムＤＮＡを調製し、ｎｅｏ遺伝子が欠失した細胞株であることを、実施例７記載のＰｒｉｍｅｒ１／２およびＰｒｉｍｅｒ１／３のプライマーを用いてＰＣＲにて確認した。Ｎｅｏ耐性遺伝子が除去されたクローンは表１の正常マウスと同じパターンになることが予測された。４８０−１では１２クローン中５クローン、４８０−２では１２クローン中７クローン、４８０−４では１２クローン中８クローン、５９６−１では１２クローン中９クローン、５９６−２では１２クローン中８クローン、５９６−３では１２クローン中１０クローン、でｎｅｏ遺伝子が欠損しているＰＣＲパターンであ��、それらのクローンではすべてＧ４１８は非耐性であったことから、上記クローンはすべてｎｅｏ遺伝子が除去されたΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞であることが確認された。
実施例１５
Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞へのＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの導入
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞を保持するキメラマウスを作製するために、実施例２で得られたＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＣＨＯ細胞から実施例１４で得られたΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞へミクロセル法により導入した。Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）の方法に従い、約１０８個のＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ４，２５，３２，３３など、またはＣＨＯ／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ４，６，７，１０など）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁した。約１０７個のΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞（５９６−１−２、５９６−２−９など）をトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ  ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４  ＰＥＧ溶液［５ｇ  ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ  ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ  １０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣを保持するΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞（Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ）は２１クローン、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞（Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ）は５７クローンがＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記で得られたΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ細胞およびΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ細胞の１２クローンずつについて、ヒトＣＯＴ１ＤＮＡプローブを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）を行った結果、ＣＯＴ１プローブにより特異的に検出されるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣの存在が１２クローン中、１１クローンで、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの存在が１２クローン中、１２クローンで確認された。このうちマウスの核型が正常なクローンはΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣでは５クローンで、Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔでは９クローンあった。以上のことから、少なくともΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ細胞が５クローン、Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが９クローン、得られたと結論付けた。
実施例１６
Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔからのキメラマウス作製
実施例１５で得られたｎｔＥＳ細胞クローンを用いてＷａｋａｙａｍａらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０，２００１）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ（例えばΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ５，６，７および１１、Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ２５，６３，６７、実施例１５で取得）を注入した約５００個の胚を仮親に移植した結果、Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣからは２６匹のキメラマウス、Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔからは２９匹のキメラマウス（毛色に黒色の部分の認められる）が誕生した。すなわち、ヒト人工染色体ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するｎｔＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
実施例１７
ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔを保持するΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
（１７．１）ゲノムＰＣＲ解析
実施例１６でΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣクローン（Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣ５，６，７および１１）またはΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ（Δｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ２５，６３，６７）より作製されたキメラマウス（キメラ率約５０％）の尻尾から富塚らの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）に記された方法でゲノムＤＮＡを調製し、ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト１４番染色体検出用プライマーを用いたＰＣＲを前記と同様に行い、ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持を検討した。その結果、調べた１０匹すべてで２種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの保持が確認された。
（１７．２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
またΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔ由来のキメラマウス（キメラ率約５０％）から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、視覚的にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔの存在を確認し、マウス染色体とは独立にＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが存在していることが確かめられた。約５０％の割合でＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが保持されていたことから、キメラ率と一致してＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔが効率に保持されていることが確かめられた。
以上のことから、内在のマウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを欠損し、かつヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを保持しているΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣまたはΔｃｙｐ−ｎｔＥＳ（Ｇ−）／ＣＹＰ３Ａ−ＨＡＣΔは各種細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで分化誘導をさせることで、マウスＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターを発現しない、かつヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスターを発現する細胞を提供できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、ヒト７番染色体上のヒトＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ３Ａ遺伝子クラスター）を含む特定領域を保持する哺乳動物人工染色体ベクターは、それを非ヒト哺乳動物、例えばマウス、に導入するとき、良好なキメラ率及び染色体保持率に加えて、従来不可能であった安定的な子孫伝達が可能でかつ該動物組織中で安定に保持される、非ヒト哺乳動物を提供することが可能となる。このことは、ヒトＰ４５０遺伝子の発現を可能にする子孫動物の提供を可能にすることを意味する。
本発明は、以下の有用性を有する。
（１）ヒトＰ４５０遺伝子領域を保持し、かつ次世代へ高効率で子孫伝達可能で個体内で安定に維持されるヒト人工染色体が提供される。
（２）また、該ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物由来ＥＳ細胞が提供される。
（３）また、本発明により、該ヒト人工染色体を個体内で安定に維持し、高効率で次世代に子孫伝達する非ヒト動物およびその子孫が提供される。
（３）これと相同遺伝子となる非ヒト哺乳動物内在性Ｐ４５０遺伝子が破壊されたノックアウト非ヒト哺乳動物あるいはその子孫と交配させてできた産仔では、特定のＰ４５０分子種に関して完全にヒト型化していると考えられる。よって、発現の組織特異性や薬物誘導また発現の割合だけでなく、代謝産物の機能についても特定のＰ４５０分子種に関して完全にヒト型化したヒトＰ４５０導入非ヒト哺乳動物を提供できると考えられる。
（４）この特定のＰ４５０分子種に関して完全にヒト型化したヒトＰ４５０導入非ヒト哺乳動物を用いれば、薬理効果や薬物代謝あるいは毒性といった薬物のヒトへの影響を実際にヒトに投与することなく研究あるいは予測することが可能である。
（５）さらに、この特定のＰ４５０分子種に関して完全にヒト型化したヒトＰ４５０導入非ヒト哺乳動物の全胎児培養によって、その代謝と薬物毒性や奇形などの評価も可能である。
（６）完全にヒト型化したヒトＰ４５０導入非ヒト哺乳動物の個体や、その組織、細胞から生物学的活性のあるヒトＰ４５０タンパクを得ることが可能である。このようなタンパクは、従来入手の困難なヒトＰ４５０タンパクを容易に提供できるばかりか、大腸菌に代表される細菌を用いた発現系では解決し得なかったリン酸化や糖鎖による修飾などに代表されるタンパクの修飾の面でもよりヒトの体内で生産されるＰ４５０に近いものを提供できる。
（７）また、上記非ヒト哺乳動物由来の組織や細胞を不死化して培養系で用いる場合、安定してヒトＰ４５０タンパクを供給できる。さらに、ヒトにおける薬物代謝の培養系における研究材料として利用が可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１〜８６、９９〜１０７：プライマー
配列番号８７〜９８：オリゴＤＮＡ
［配列表］
2009063722.tif 000029
2009063722.tif 000030
2009063722.tif 000031
2009063722.tif 000032
2009063722.tif 000033
2009063722.tif 000034
2009063722.tif 000035
2009063722.tif 000036
2009063722.tif 000037
2009063722.tif 000038
2009063722.tif 000039
2009063722.tif 000040
2009063722.tif 000041
2009063722.tif 000042
2009063722.tif 000043
2009063722.tif 000044
2009063722.tif 000045
2009063722.tif 000046
2009063722.tif 000047
2009063722.tif 000048
2009063722.tif 000049
2009063722.tif 000050
2009063722.tif 000051
2009063722.tif 000052
2009063722.tif 000053
2009063722.tif 000054
2009063722.tif 000055
2009063722.tif 000056
2009063722.tif 000057
2009063722.tif 000058
2009063722.tif 000059
2009063722.tif 000060
【図１】
2009063722.tif 000061
【図２】
2009063722.tif 000062
【図５】
2009063722.tif 000063
【図１１】
2009063722.tif 000064
【図１２】
2009063722.tif 000065
【図１３】
2009063722.tif 000066
【図１４】
2009063722.tif 000067
【図１５】
2009063722.tif 000068
【図１６】
2009063722.tif 000069
【図１７】
2009063722.tif 000070
【図１８】
2009063722.tif 000071
【図１９】
2009063722.tif 000072
【図２２】
2009063722.tif 000073
【図２３Ａ】
2009063722.tif 000074
【図２３Ｂ】
2009063722.tif 000075
【図２３Ｃ】
2009063722.tif 000076
【図２３Ｄ】
2009063722.tif 000077
【図３】
2009063722.tif 000078
【図４】
2009063722.tif 000079
【図６】
2009063722.tif 000080
【図７】
2009063722.tif 000081
【図８】
2009063722.tif 000082
【図９】
2009063722.tif 000083
【図１０】
2009063722.tif 000084
【図２０】
2009063722.tif 000085
【図２１】
2009063722.tif 000086
【国際調査報告】
2009063722.tif 000087
2009063722.tif 000088
2009063722.tif 000089
2009063722.tif 000090