(57)【要約】  本発明は、筋萎縮の治療法、並びに筋肥大を促進するための方法及び手段を提供する。具体的には、本発明は、筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法であって、（a）被験物質又は因子による処置を受けた動物から得られた筋細胞において、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を測定するステップ、（b）（a）の結果に基づいて被験物質又は因子を筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定するステップを含む方法を提供する。
2013038740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法であって、
（a）被験物質又は因子による処置を受けた動物から得られた筋細胞において、ペルオキシ亜硝酸及び／又はスーパーオキシド及び／又はカルシウムの濃度を測定するステップ、
（b）（a）の結果に基づいて被験物質又は因子を筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法であって、
（a）筋細胞を、被験物質又は因子により処置するステップ、
（b）該筋細胞において、ペルオキシ亜硝酸及び／又はスーパーオキシド及び／又はカルシウムの濃度を測定するステップ、
（c）（b）の結果に基づいて被験物質又は因子を筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定するステップ
を含む方法。
【請求項３】
被験物質又は因子による処置を行う前に、筋細胞において、ペルオキシ亜硝酸及び／又はスーパーオキシド及び／又はカルシウムの濃度を測定するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
筋細胞におけるペルオキシ亜硝酸及び／又はスーパーオキシド及び／又はカルシウムの濃度が、非処置の筋細胞における濃度よりも高い場合には、被験物質又は因子が筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
動物が、筋萎縮した動物、nNOS欠損型動物若しくは筋ジストロフィーを発症した動物である、又は筋細胞が、該動物に由来する筋細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ペルオキシ亜硝酸供与剤、スーパーオキシド供与剤及びTRPチャネルアゴニストからなる群より選択される少なくとも1種の薬物を含むことを特徴とする筋肥大促進剤。
【請求項７】
ペルオキシ亜硝酸供与剤が、SIN-1又はモルシドミンである、請求項６に記載の筋肥大促進剤。
【請求項８】
TRPチャネルアゴニストがHyp9又はオルバニルである、請求項６に記載の筋肥大促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法、及び筋肥大促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋重量はタンパク質合成と分解のバランスによって制御されている（非特許文献１）。ギプス固定やベッドレストなどの筋不活動状態においては、タンパク質合成の抑制及びタンパク質分解の促進により、筋タンパク質含有量が低下し、結果として筋量が減少し、筋が萎縮する(廃用性筋萎縮)。筋萎縮は、微小重力下の宇宙飛行（非特許文献２）や、尾部懸垂（非特許文献３）などによる不動化だけでなく、カヘキシア（非特許文献４）、老化（サルコペア）（非特許文献５）、ステロイド投与（非特許文献６）などによっても生ずる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Sandri, M., Physiology (Bethesda), 2008. 23:160-170
【非特許文献２】Nikawa, T., et al., FASEB J, 2004. 18(3):522-524
【非特許文献３】Suzuki, N., et al., J Clin Invest, 2007. 117(9):2468-2476
【非特許文献４】Zhou, X., et al., Cell, 2010. 142(4):531-543
【非特許文献５】Altun, M., et al., J Biol Chem, 2010. 285(51):39597-39608
【非特許文献６】Shimizu, N., et al., Cell Metab, 2011. 13(2):170-182
【非特許文献７】Suzuki, N., et al., J Neurol Sci, 2010. 294(1-2):95-101
【非特許文献８】Wehling, M., et al., J Cell Biol, 2001. 155(1):123-131
【非特許文献９】Rommel, C., et al., Nat Cell Biol, 2001. 3(11):1009-1013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
筋萎縮に対する治療法の開発は、高齢化社会を迎えた日本において非常に大きな課題の一つである。筋肥大を誘導、あるいは筋萎縮を軽減させる手段を得ることができれば、神経原性の筋萎縮を生じる筋萎縮性側索硬化症（非特許文献７）、また筋萎縮を伴う意味では分子病態が共通する可能性のある筋ジストロフィー（非特許文献８）に対する効果的な手段の開発にも結びつくことが期待される。【０００５】
タンパク質合成を活性化させることで筋肥大を誘導することは、筋萎縮に対する治療として期待が持たれる。重度の筋萎縮を伴う患者や寝たきりの高齢者に対し、一般的な運動療法を用いることは非常に難しく、薬物治療が望まれる。これまでPI3K/Akt経路を活性化させるIgf-1（非特許文献９）を投与することでタンパク質合成を活性化させる研究が行われてきたが、その効果は疑問視されている。【０００６】
本発明者の研究グループは、筋の不動化によってもたらされる筋萎縮では、神経性一酸化窒素シンターゼ（nNOS）が深く関与していることを明らかにしている（非特許文献３）。マウスの尾部懸垂時に筋細胞膜から遊離したnNOSは、細胞質に移って一酸化窒素（NO）を産生し、Forkhead box O（Foxo）のリン酸化を阻害してE3ユビキチンリガーゼの発現を活性化することにより筋萎縮を招いていた。またその後の研究により、nNOSは再負荷時における筋萎縮からの回復にも関与することがわかった。このことはnNOSが筋萎縮のみならず、筋肥大をも制御していることを示唆している。【０００７】
そこで本発明は、筋肥大時におけるnNOSの機能を明らかにするとともに、その分子基盤を元に新たな筋萎縮の治療法、すなわち筋肥大を促進するための方法及び手段を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、NOとスーパーオキシドにより生成されるペルオキシ亜硝酸（peroxynitrite）がTRPチャネルを介して細胞内カルシウム濃度を制御することによって筋肥大が促進されることを見出し、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又は筋細胞内のカルシウムの濃度を上昇させることによって筋肥大を促進することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［1］〜［9］である。
［1］筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法であって、
（a）被験物質又は因子による処置を受けた動物から得られた筋細胞において、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度を測定するステップ、
（b）（a）の結果に基づいて被験物質又は因子を筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定するステップ
を含む方法。
［2］筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法であって、
（a）筋細胞を、被験物質又は因子により処置するステップ、
（b）該筋細胞において、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度を測定するステップ、
（c）（b）の結果に基づいて被験物質又は因子を筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定するステップ
を含む方法。
［3］被験物質又は因子による処置を行う前に、筋細胞において、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を測定するステップをさらに含む、［1］又は［2］に記載の方法。
［4］筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度が、非処置の筋細胞における濃度よりも高い場合には、被験物質又は因子が筋肥大を促進する物質又は因子の候補として同定される、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［5］動物が、筋萎縮した動物、nNOS欠損型動物若しくは筋ジストロフィーを発症した動物である、又は筋細胞が、該動物に由来する筋細胞である、［1］〜［4］のいずれかに記載の方法。
［6］スーパーオキシド供与剤、ペルオキシ亜硝酸供与剤及びTRPチャネルアゴニストからなる群より選択される少なくとも1種の薬物を含むことを特徴とする筋肥大促進剤。
［7］ペルオキシ亜硝酸供与剤が、SIN-1又はmolsidomineである、［6］に記載の筋肥大促進剤。
［8］TRPチャネルアゴニストがHyp9又はオルバニルである、［6］に記載の筋肥大促進剤。
［9］スーパーオキシド供与剤、ペルオキシ亜硝酸供与剤及びTRPチャネルアゴニストからなる群より選択される少なくとも1種の薬物の有効量を被験体に投与することを含む筋肥大促進方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るスクリーニング方法により、筋肥大を促進する物質又は因子を同定することができ、筋委縮などの治療法の開発に有用である。また、本発明に係る筋肥大促進剤は、筋肥大を効果的に促進することができ、筋委縮などの予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】共働筋切除7日後のnNOS野生型及び欠損型マウスの筋重量を示すグラフ（A）と、筋肉HE染色像（B）である。
【図２】共働筋切除後のNOと筋肥大促進との関係を示すグラフである。
【図３】共働筋切除後のnNOSによるNOと筋肥大促進との関係を示すグラフである。
【図４】nNOS野生型及び欠損型マウスにおける過負荷後のnNOSの活性化を示すグラフである。
【図５】nNOS野生型及び欠損型マウスにおける過負荷後のnNOSによるmTORの活性化の制御を示す写真（A）及びグラフ（B）である。
【図６】NOX阻害剤の存在下における筋肥大を示すグラフである。
【図７】過負荷前後におけるスーパーオキシド産生を示すグラフである。
【図８】足底筋におけるNOX1、NOX2、NOX3及びNOX4の発現を示す写真である。
【図９】スーパーオキシド消去剤又はペルオキシ亜硝酸消去剤の投与による筋肥大の変化を示すグラフである。
【図１０】ペルオキシ亜硝酸供与剤によるnNOS欠損型マウスの表現型の回復を示すグラフである。
【図１１】ペルオキシ亜硝酸消去剤の投与による過負荷直後のmTORの活性化の抑制を示す写真（A）及びグラフ（B）である。
【図１２】Thapsigarginの投与による細胞内カルシウム濃度の上昇によるmTORの活性化を示す写真（A）及びグラフ（B）である。
【図１３】カルシウムキレート剤及びTRPチャネル阻害剤による筋肥大の抑制を示すグラフである。
【図１４】カルシウムキレート剤及びTRPチャネル阻害剤による過負荷によるmTORの活性化の抑制を示す写真である。
【図１５】NO供与剤及びペルオキシ亜硝酸供与剤によるnNOS欠損型マウスの表現型の回復と、カルシウムキレート剤及びTRPチャネル阻害剤による影響を示すグラフである。
【図１６】TRPチャネルアゴニストの投与によるnNOS欠損型マウスの表現型の回復を示すグラフである。
【図１７】ペルオキシ亜硝酸による細胞内カルシウム濃度の制御を介した筋肥大の促進機構を示す図である。
【図１８Ａ】NO/peroxynitrite供与剤（SIN-1）により筋芽細胞内のカルシウム濃度が上昇することを示す蛍光画像である。
【図１８Ｂ】図１８Ａの蛍光強度の経時的変化をグラフとして表す。
【図１８Ｃ】筋芽細胞内のカルシウム濃度が、SIN-1の濃度依存的に上昇することを示すグラフである。
【図１８Ｄ】SIN-1による筋芽細胞内のカルシウム濃度の上昇がperoxynitrite消去剤（FeTPPS）により阻害されることを示すグラフである。
【図１９Ａ】NO/peroxynitrite供与剤（SIN-1）が筋小胞体からのカルシウム放出を誘導することを示す蛍光画像である。
【図１９Ｂ】図１９Ａの蛍光強度のピークをグラフとして表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、2011年9月14日に出願された日本国特許出願第2011-200716号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【００１３】
本発明は、筋肥大におけるスーパーオキシド、ペルオキシ亜硝酸及び細胞内カルシウムの関与に基づいて、筋肥大を促進する物質及び因子をスクリーニングする方法と筋肥大促進剤を提供する。
【００１４】
本発明者は、筋肥大におけるnNOSの機能を明らかにするため、nNOS野生型及び欠損型マウスに後肢共働筋切除を行い、過負荷による代償性筋肥大を誘導した。同マウスの術後7日の筋重量を計測した結果、野生型は対照群と比べ40％程度筋重量が増加したが、欠損型は20％程度しか増加しなかった。nNOSが筋肥大過程のどの時期に機能するか明らかにするため、NOS活性測定を行った結果、nNOSは過負荷開始3分後に活性化し、1時間後には定常レベルにまで活性が低下した。nNOS活性を薬理学的に阻害した結果、この過負荷開始1時間の間に産生されたNOが筋肥大を促進することがわかった。nNOS野生型では過負荷3分後にmTORが活性化され、タンパク質合成経路が活性化していたが、欠損型ではその活性化が見られなかった（実施例１、及び伊藤ら, 第33回日本分子生物学会 演題2T9-11）。
【００１５】
しかし、血管拡張剤、8Br-cGMP等を投与しても欠損型の表現型を回復することはできず、nNOSによって産生されたNOは古典的なNO-cGMP経路によって制御される血管拡張を介さず、筋肥大を促進することが示唆された。そこでcGMP非依存的な経路であり、NOとスーパーオキシド（superoxide）との反応物であるペルオキシ亜硝酸（peroxynitrite）が筋肥大を促進する可能性があると考え、過負荷直後におけるsuperoxide、及びperoxynitriteの機能を明らかにする実験を行った（実施例２）。
【００１６】
骨格筋におけるsuperoxideの主な供給分子であるNOXの筋肥大における機能を明らかにするため、NOX活性を薬理学的に阻害した。その結果、nNOS欠損型と同様に筋肥大の進行が抑えられた。NOとsuperoxideとの反応物であるperoxynitriteの筋肥大における機能を明らかにするため、superoxide消去剤又はperoxynitrite消去剤を投与した結果、nNOS欠損型と同様に筋肥大の進行が抑えられた。またperoxynitrite消去剤投与群におけるタンパク質合成経路の活性化を調べた結果、nNOS欠損型と同様、過負荷直後においてmTORの活性化が見られなかった。これらの結果から、nNOS由来のNOとNOX由来のsuperoxideから成るperoxynitriteが過負荷直後に産生され、mTORによって制御されるタンパク質合成経路を活性化させることで筋肥大を促進することを見出した。
【００１７】
さらに、NOX由来のsuperoxide、またperoxynitriteは細胞内カルシウム濃度を制御し得ることから、peroxynitriteが細胞内カルシウム濃度の制御を介してmTORを制御し、筋肥大を促進すると考えた（Adachi T et al. Nat Med 2004; 10: 1200-1207； Martins AS et al. J Physiol 2008; 286: 197-210）。細胞内カルシウム濃度とmTORの活性化の関係を明らかにするため、筋小胞体によるカルシウムの取り込みを阻害し、細胞内カルシウム濃度を上昇させるthapsigarginを筋注した結果、mTORの活性化が見られた。細胞内カルシウム濃度と筋肥大の関係を明らかにするため、カルシウムキレート剤であるBAPTA-AM、EGTAを筋注した結果、術後7日の筋重量が有意に抑制された。また骨格筋において代表的なカルシウムチャネルであるリアノジン受容体、DHPR、TRPチャネルの阻害薬（dantrolene, nifedipine, BTP2）を筋注した結果、TRPチャネル阻害薬BTP2によって術後7日の筋重量が有意に抑制されたが、dantrolene、nifedipineによっては抑制されなかった。BTP2は過負荷直後におけるmTORの活性化も抑制した。また、nNOS欠損型の表現型はNO供与剤、peroxynitrite供与剤によって回復されるが、その効果はBAPTA-AM、BTP2との共投与により完全に抑制された。さらに、TRPチャネルアゴニスト（Hyp9, olvanil）の投与により、nNOS欠損型の表現型は回復し、筋重量が増大した。またさらに、peroxynitriteが筋芽細胞におけるカルシウム濃度の上昇に関与しており、具体的には、筋小胞体のカルシウム放出を誘導することがわかった。
【００１８】
これらの結果から、superoxide、peroxynitrite及びその下流の細胞内カルシウム濃度制御が、過負荷によるタンパク質合成経路の活性化に重要であることが明らかになった。またperoxynitriteはTRPチャネルによる細胞内カルシウム濃度（特に筋小胞体内カルシウム濃度）の制御を介して、筋肥大を促進することが見出された。そのため、TRPチャネルのアゴニストを用い、細胞内カルシウム濃度を上昇させることで人為的にタンパク質合成を活性化させることが可能であると考えられる。
【００１９】
本発明では、筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度に基づいて、筋肥大を促進又は阻害する物質又は因子を同定する。すなわち、動物又は筋細胞を、被験物質又は因子で処置し、該動物又は筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度を測定することによって、該被験物質又は因子がスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度、すなわち筋肥大に影響を及ぼすか否かを判定することができる。
【００２０】
本発明に関連して、「筋肥大」とは、内在タンパク質量の増加に伴う単一筋線維重量又は断面積の増加による筋重量の増加といい、「筋肥大を促進する」とは、内在タンパク質量の増加を促進することによって、単一筋線維重量又は断面積の増加による筋重量の増加を促進することをいう。
【００２１】
本発明に係るスクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」ともいう）においては、被験物質又は因子で処置された動物から得られた筋細胞を準備するか、あるいは筋細胞を被験物質又は因子で処置し、該筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を測定する。好ましくは、被験物質又は因子による処置を行う前に、動物から得られた筋細胞又は筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を測定する。
【００２２】
対象となる動物は、筋肉を有する動物であれば特に限定されるものではなく、哺乳動物、例えばヒト、霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタなど）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、サルなど）や、両生類、爬虫類及び鳥類も含まれる。また動物は、正常な動物であってもよいし、あるいは筋萎縮した動物、nNOS欠損型動物又は筋ジストロフィーを発症した動物などであってもよい。一般的には、細胞レベルにおいて被験物質又は因子の有効性が確認された後に、実験動物、さらにはヒトにおいて、例えば臨床試験などにより有効性の評価が行われる。
【００２３】
本スクリーニング方法の対象となる被験物質又は因子の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験物質又は因子は、任意の物質、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験物質又は因子は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。さらに、被験物質又は因子は、放射線、紫外線、炭素濃度、温度などの環境因子であってもよい。
【００２４】
また、被験物質又は因子としては単一の被験物質又は因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質又は因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質又は因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００２５】
動物を被験物質又は因子で処置する場合には、その処置量、処置期間、処置経路などの処置条件は、被験物質又は因子の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、動物に被験物質を投与する場合の投与経路は、被験物質の種類、使用する動物の種類などに応じて、筋肉内注射、経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。
【００２６】
筋細胞は、当技術分野で公知の方法により採取することができる。具体的には、例えば、骨格筋を細切し、50 ml円錐底チューブに移した後、筋重量1 gあたり4 mlのDispase2 (2.4 IU/ml) -Collagenase XI (0.2％) 溶液を加え、37℃、45〜60分間インキュベートし、途中15分ごとにピペットを用いてピペッティングする。その後、18 Gの注射針に数回通して組織片を粉砕し上清を回収する。上清を80μmのフィルターに通して細胞塊を除き、細胞懸濁液を50 ml円錐底チューブに移し、さらにDispase2 (2.4 IU/ml) -Collagenase XI (0.2％) 処理後のチューブに増殖培地を加え、その上清を同様にフィルターに通して回収する。増殖培地を加え、合計30 mlとし、数回ピペッティングを行い、1,000 rpmで5分間、4℃で遠心する。上清を捨て沈殿細胞に増殖培地20 mlを加え、再度懸濁した後、1,000 rpmで5分間、4℃で遠心する。沈殿細胞を増殖培地25 mlに懸濁し、コーティングなしの15 cm培養皿に移しbFGFを添加し、37℃、5％CO2濃度で90分間培養後、未付着細胞を含む上清を回収する。この上清を用いて培養皿の底面を洗い、180度向きを変えてもう一度37℃、5％CO2濃度で90分間培養し、上清を回収する。回収した上清を15 cmコラーゲンコート培養皿に移しbFGFを添加し、37℃、5％CO2濃度で一晩培養する。翌日筋芽細胞が30〜40％コンフルエント以上になっているようなら継代を行い、それ以下なら培地交換に留める。筋分化を防ぐために以後、毎日継代ないしは培地交換を行う。あるいは、市販の筋細胞又は公に入手可能な筋細胞を使用することも可能である。
【００２７】
筋細胞を被験物質又は因子と接触させる場合、その接触の条件は、その物質又は因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、そのような接触は、筋細胞を被験物質を添加した培地中で培養することにより、筋細胞を被験物質を含む溶液中に浸漬することにより、筋細胞上に被験物質を積層することにより、又は筋細胞を被験因子の存在下で培養することにより行うことができる。
【００２８】
また、被験物質又は因子の効果及び有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験物質又は因子で処置する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験物質又は因子の処置期間も適宜設定することができるが、例えば、1日から数週間、数ヶ月、数年の期間にわたって処置を行うことができる。
【００２９】
さらに、複数の物質及び／又は因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験物質及び／又は因子を組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
続いて、動物又は筋細胞を被験物質又は因子で処置した後、適当な時期に、該動物から得られた筋細胞又は該筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度を測定する。例えば、処置の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2〜10日後、10〜20日後、20〜30日後、1ヶ月〜6ヵ月後に測定を行う。
【００３１】
スーパーオキシドの測定は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えばスーパーオキシドと反応することにより発光するルシゲニンなどを使用して、その発光強度を測定することにより行うことができる。
【００３２】
ペルオキシ亜硝酸の測定は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えばペルオキシ亜硝酸が活性酸素種又は活性窒素種と反応することにより発せられる蛍光物質の蛍光強度を測定し、ペルオキシ亜硝酸消去剤処理した対照群との差を算出することにより行うことができる。
【００３３】
また筋細胞内のカルシウム濃度の測定も当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば、カルシウムと結合することにより蛍光を発するFluo-4などを使用して、その蛍光強度を測定することにより行うことができる。
【００３４】
筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を測定した後、対照と比較し、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を上昇又は低減させる被験物質又は因子を、筋肥大を促進又は阻害する物質又は因子として選択する。対照としては、被験物質又は因子による処置を受けていない動物又は筋細胞などを用いることができる。
【００３５】
また、本発明においては、一次スクリーニングとして、筋細胞を被験物質又は因子で処置し、該筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウムの濃度の上昇を示した被験物質又は因子を選択し、次に二次スクリーニングとして、選択した被験物質又は因子で動物を処置し、該動物の筋細胞におけるスーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を測定して濃度上昇を示した被験物質又は因子を選択してもよい。
【００３６】
さらに、筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニングにおいては、選択された被験物質又は因子を、実験動物に投与して、被験物質又は因子が実験動物における筋肥大を促進するか否かを判定してもよい。実験動物としては、後肢懸垂、除神経、デキサメタゾン投与等により筋萎縮が誘導されたモデル動物、好ましくはマウスを用いることができる。被験物質又は因子が実験動物における筋肥大を促進するか否かの判定は、実験動物の種類などにより異なるが、当業者であれば、当技術分野で公知の方法により適宜判定することができる。例えば、動物から筋組織を採取し、その筋重量を測定することができる。
【００３７】
以上のようにして、本スクリーニング方法により、筋肥大を促進する物質又は因子の候補を同定し、さらには筋肥大を促進する物質又は因子の有効性を確認することができる。
【００３８】
本発明に係る筋肥大促進剤は、スーパーオキシド及び／又はペルオキシ亜硝酸及び／又はカルシウム濃度を上昇させることができる物質又は因子を含むものである。具体的には、本発明に係る筋肥大促進剤は、スーパーオキシド供与剤、ペルオキシ亜硝酸供与剤及びTRPチャネルアゴニストからなる群より選択される少なくとも1種の薬物を含む。本発明に係る筋肥大促進剤は、筋萎縮などの疾患又は障害の予防又は治療、特に重度の筋萎縮を伴い、リハビリテーション等の運動療法が困難な患者の治療や寝たきりの患者の筋増量に有用である。
【００３９】
有効成分であるスーパーオキシド供与剤としては、当技術分野においてスーパーオキシドを供与することが知られている薬物であれば任意の薬物を用いることができる。
【００４０】
有効成分であるペルオキシ亜硝酸供与剤としては、当技術分野においてペルオキシ亜硝酸を供与することが知られている薬物であれば任意の薬物を用いることができる。例えば、SIN-1、モルシドミン（molsidomine）などが含まれ、いずれも市販されている。また有効成分であるTRPチャネルアゴニストも、当技術分野においてTRPチャネルに対してアゴニスト活性を有することが知られている薬物であれば任意の薬物を用いることができる。例えば、Hyp9、オルバニルなどが含まれ、市販品を用いることができる。
【００４１】
本筋肥大促進剤は、有効成分として、1種のスーパーオキシド供与剤及び／又はペルオキシ亜硝酸供与剤及び／又はTRPチャネルアゴニストを含有するものであってもよいし、又は2種以上のスーパーオキシド供与剤及び／又はペルオキシ亜硝酸供与剤及び／又はTRPチャネルアゴニストを組み合わせて含有するものであってもよい。本筋肥大促進剤は、スーパーオキシド供与剤、ペルオキシ亜硝酸供与剤及びTRPチャネルアゴニストからなる群より選択される少なくとも1種の薬物を有効成分として含有する限り、上述した筋肥大の促進作用を発揮する。
【００４２】
本筋肥大促進剤は、有効成分であるスーパーオキシド供与剤及び／又はペルオキシ亜硝酸供与剤及び／又はTRPチャネルアゴニストの他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００４３】
本筋肥大促進剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセルなど）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などのいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥製剤にしてもよい。また、本筋肥大促進剤を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤、クリーム剤、座剤、パップ剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤などの外用剤などの製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。
【００４４】
これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００４５】
本筋肥大促進剤に配合するスーパーオキシド供与剤及び／又はペルオキシ亜硝酸供与剤及び／又はTRPチャネルアゴニストは、その有効成分の種類、用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えば総重量を基準として0.01〜90重量％、好ましくは1〜50重量％である。
【００４６】
また、本筋肥大促進剤の有効量（投与量又は摂取量）は、該剤に含まれる有効成分の種類、被験体の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変更することができる。例えば、通常成人1日当たりのスーパーオキシド供与剤及び／又はペルオキシ亜硝酸供与剤及び／又はTRPチャネルアゴニストの有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間〜約1年間、好ましくは約1ヶ月〜約12ヶ月にわたり投与することができる。
【００４７】
本筋肥大促進剤は、使用する対象（被験体）を特に限定するものではない。例えば、ヒト、家畜（ウシなど）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（サルなど）などの被験体に投与する又は摂取させることができる。
【００４８】
本筋肥大促進剤は、当技術分野で公知の他の筋肥大促進剤又は筋肥大促進に有効な方法と組み合わせることができる。例えば、筋肥大に必要な栄養素であるタンパク質の投与、該栄養素を筋に同化させるホルモン（成長ホルモンなど）の投与、筋肉への負荷（例えば軽度な運動、筋力トレーニング、加圧トレーニング）などと組み合わせることができる。
【００４９】
本筋肥大促進剤は、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品又は飼料などに配合されてもよい。「食品」及び「飼料」とは、栄養素を1種以上含む天然物及びその加工品をいい、あらゆる飲食物を含む。本筋肥大促進剤が配合された食品又は飼料は、筋肥大を促進するための健康補助製品として有用である。
【００５０】
本筋肥大促進剤を食品に配合する場合、固体状食品、ゼリー状食品、液状食品、カプセル状食品など様々な形態の食品に添加することができる。ここで、固体状食品としては、パン生地；せんべい、ビスケット、クッキーなどの焼き菓子用生地；そば、うどんなどの麺類；かまぼこ、ちくわなどの魚肉製品；ハム、ソーセージなどの畜肉製品；粉ミルクなどが挙げられる。また、ゼリー状食品としては、フルーツゼリー；コーヒーゼリーなどが挙げられる。さらに、液状食品としては、清涼飲料・果実飲料などの飲料類（茶、コーヒー、紅茶、発酵乳、乳酸菌飲料など）、調味料など（マヨネーズ、ドレッシング、味付け調味液など）が挙げられる。カプセル状食品としては、ハードカプセル、ソフトカプセルなどがあげられる。
【００５１】
本筋肥大促進剤を食品に添加する場合、添加量としては、食品全体に対してスーパーオキシド供与剤及び／又はペルオキシ亜硝酸供与剤及び／又はTRPチャネルアゴニストの含有量が0.01〜90重量％となるように配合することができる。効果が期待できる摂取量は年齢、体重、性別、症状の程度などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定される。摂取回数は一日に何回かに分けて摂取できるが、その場合は、回数に応じて量を分割することも可能である。また、長期にわたり連続して摂取することが可能である。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。【００５３】
［実施例１］
本実施例では、筋肥大におけるnNOSの寄与を明らかにするため、nNOS野生型及び欠損型マウスに共働筋切除を行い、過負荷による代償性筋肥大を誘導した。
対象には、Jackson Laboratories（Wilmington, MA）より購入したnNOS欠損型マウス、及び日本クレア（日本）より購入したC57BL/6マウスを用いた。【００５４】
以下のように共働筋切除による代償性筋肥大誘導と薬物投与を行った。すなわち、12週齢マウスの腓腹筋及びヒラメ筋の腱を麻酔下で切除した（Adams, G.R. and F. Haddad, J Appl Physiol, 1996. 81(6):2509-16）。対照群には皮膚を切る偽手術（sham）を施した。術後は飲料水に1 mg/mlアンピシリンを加えた。NOS阻害剤L-NAME（1mg/ml, Sigma-Aldrich）は飲水投与し、飲水は毎日交換した。nNOS阻害剤7-NI（50 mg/kg, Calbiochem）及びNOX阻害剤DPI（2 mg/kg, Sigma-Aldrich）は過負荷開始30分前若しくは60分後に腹腔内投与した。また、apocynin（10 mg/kg, Sigma-Aldrich）、tadalafil（10 mg/kg, Toronto Research Chemicals）、sildenafil（10 mg/kg, Sigma-Aldrich）、8-Br-cGMP（10 mg/kg, Calbiochem）、rotenone（5 mg/kg, Sigma-Aldrich）、allopurinol（10 mg/kg, Cayman）、尿酸（200 mg/kg Sigma-Aldrich；実施例２）、FeTPPS（30 mg/kg, Calbiochem；実施例２）、ebselen（30 mg/kg, Sigma-Aldrich；実施例２）、molsidomine（50 mg/kg, Sigma-Aldrich；実施例２）、SIN-1（10 mg/kg, DOJINDO；実施例２及び３）、SNAP（20 mg/kg, Calbiochem；実施例３）は過負荷開始30分前に腹腔内投与した。BAPTA-AM（50μM, Calbiochem；実施例３）、EGTA（1 mM, Dojindo；実施例３）、dantrolene（10μM, Sigma-Aldrich；実施例３）、nifedipine（10μM, Sigma-Aldrich；実施例３）、BTP2（10μM, Calbiochem；実施例３）、Gd3+（50μm, Sigma-Aldrich；実施例３）、GsMTx-4（10μM, Wako；実施例３）、thapsigargin（20μM, Calbiochem；実施例３）、Hyp9（10μM, Sigma-Aldrich；実施例３）、olvanil（10μM, Sigma-Aldrich；実施例３）は過負荷開始30分前に筋注した。【００５５】
安楽死後、足底筋を凍結固定し、8μmに薄切した後にヘマトキシリン・エオジン染色を行った。【００５６】
ウエスタンブロットのため、凍結後、薄切した足底筋をサンプルバッファー（0.1％Triton X-100, 50 mM HEPES (pH7.4), 4 mM EGTA, 10 mM EDTA, 15 mM Na4P2O7, 100 mM glycerophosphate, 25 mM NaF, 5 mM Na2VO4, 及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche)）でホモジナイズし、遠心分離（15,000g，10分間）後に上澄を採取した。Coomassie Brilliant Blue G-250（BioRad, CA, USA）を用いてタンパク質濃度を測定した後、等量のサンプルローディングバッファー（30％glycerol, 5％2-mercaptoethanol, 2.3％SDS, 62.5 mM Tris-HCl (pH6.8), 0.05％bromophenol blue）と混ぜ、60℃で15分間の熱変性を行い、30μgをウエスタンブロットに供した。PVDF転写膜はトリス緩衝生理食塩水（TBS）＋5％スキムミルク（雪印）でブロッキングを行い、1次抗体を用いて4℃で16時間のインキュベーションを行った。1次抗体にはAkt（#9272, Cell Signaling Technology）、p-Akt（Ser473）（#9271, Cell Signaling Technology）、p70S6K（#9202, Cell Signaling Technology）、及びp-p70S6K（Thr389）（#9205, Cell Signaling Technology）を用いた。転写膜を0.1％Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBST）で洗浄後、2次抗体（ウサギ特異的HRP標識抗体, GE Healthcare）でインキュベートを行い、再度TBSTで洗浄し、ECL Western Blotting Detection System（GE HealthCare, Buckinghamshire, UK）で検出した。【００５７】
また、NO産生時の副産物であるシトルリン量を測ることで活性測定を行った。凍結後、薄切した足底筋を10倍量の測定バッファー（25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 及び0.1 mM NaCl）でホモジェナイズし、遠心分離（1,000g，10分間）後に上澄を採取した。30μlの上澄みを60μlのリアクションバッファー（[3H]arginine (53.0 Ci/mmol; GE Healthcare), 1 mM NADPH, 750μM CaCl2, 1μM calmodulin, 3μM tetrahydrobiopterin, 3μM flavin-adenine dinucleotide及び3μM flavin mononucleotide）と混ぜ、37℃で20分間インキュベートした。1 mlの反応停止バッファー（2 mM EDTAを含む20 mM HEPES (pH 5.5)）を加えた後、AG50WX-8 columns（Na+形態; Dowex）と混ぜ、未反応の[3H]arginineを回収した後、液体シンチレーションカウンターにて[3H]citrulline量を測定した。【００５８】
2群間のデータの比較にはstudent-t検定を用いた。また、多群間比較には、ANOVA検定を行った後、Tukey's法による多群間検定を行った。データは平均値±標準誤差を用いて示し、p < 0.05を有意差ありと判定した。【００５９】
同マウスの術後7日の筋重量を計測した結果、野生型は対照群と比べ、過負荷により40％程度筋重量が増加したが、欠損型は20％程度しか増加しなかった（図１のA及びB）。筋肥大におけるNOの寄与を明らかにするため、上記の通りNOS阻害剤であるL-NAMEを投与した。術後3日前から7日後まで、及び術後3日前から1日後までL-NAMEを投与した群は、術後7日の筋重量は有意に低下したが、術後1日以降投与した群では効果は見られなかった（図２）。NO産生がnNOSによるものか検討するため、nNOS特異的阻害剤である7-NIを過負荷30分前若しくは60分後に投与した。その結果、過負荷前に投与した群は有意に筋肥大が抑えられたが、過負荷後に投与した群に効果は見られなかった（図３）。これらの結果から、過負荷開始1時間の間に産生されたnNOSによるNO産生が筋肥大を促進することが示唆された。【００６０】
過負荷開始3分、1、6及び12時間後にNOS活性測定を行った結果、NOS活性は過負荷開始3分後に上昇し、1時間以降には定常レベル若しくはそれ以下にまで低下した（図４のA）。またこの上昇はnNOS欠損型マウスでは見られなかった（図４のB）。これらの結果から、過負荷直後に活性化されたnNOS及びその後に産生されたNOが筋肥大を促進することが分かった。【００６１】
nNOS野生型では過負荷3分後に、mTORによって制御されるp70S6Kスレオニン389のリン酸化（Zoncu, R., A. Efeyan, and D.M. Sabatini, Nat Rev Mol Cell Biol, 2011. 12(1):21-35）が上昇し、mTORが活性化され、タンパク質合成経路が活性化していたが、欠損型ではその活性化が見られなかった（図５のA及びB）。【００６２】
これらの結果から、過負荷直後に活性化したnNOSはmTORによって制御されるタンパク質合成経路の活性化を介して筋肥大を促進することがわかった。【００６３】
また、ミトコンドリア呼吸鎖、キサンチンオキシダーゼの阻害剤であるrotenone及びallopurinolを投与しても術後7日の筋重量は低下しなかったが、NOX阻害剤であるapocynin及びDPI投与群は欠損型と同様に筋肥大の進行が抑えられた（図６）。【００６４】
しかし、血管拡張剤であるtadalafil、sildenafil、及びcGMP経路を活性化させる8Br-cGMPを投与しても欠損型の表現型を回復することはできず（データは示さず）、nNOSによって産生されたNOは古典的なNO-cGMP経路（Kemp-Harper, B. and R. Feil, Meeting report: cGMP matters. Sci Signal, 2008. 1(9):pe12）によって制御される血管拡張を介さず、筋肥大を促進することが示唆された。【００６５】
そこでcGMP非依存的な経路であり、NOとsuperoxideとの反応物であるperoxynitrite（Heck, D.E., Antioxid Redox Signal, 2001. 3(2):249-60）が筋肥大を促進する可能性があると考え、過負荷直後におけるsuperoxide、及びperoxynitriteの機能を明らかにする実験を以下の実施例２及び３で行った。【００６６】
［実施例２］
本実施例では、骨格筋におけるスーパーオキシド（superoxide）の主な供給分子であるミトコンドリア呼吸鎖、キサンチンオキシダーゼ、及びNADPHオキシダーゼ（NOX）の筋肥大における寄与を検討した。【００６７】
過負荷によってNOX活性が上昇するか検討するため、superoxide産生測定を行った。superoxideとルシゲニンとの反応による発光を測定することでsuperoxide産生を測定した。凍結後、薄切した足底筋を測定バッファー（150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH7.4), 25 mM EGTA, 25 mM EDTA, 及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)）でホモジェナイズし、1,000g、10分間後に上澄を採取した。上澄みを測定バッファー（100 mM KH2PO4, (pH7.0) 及び10μM lucigenin (Sigma-Aldrich)）と混ぜた。200μM NADPHは測定直前に反応液に加え、液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、過負荷直後にsuperoxide産生は上昇しなかった（図７）。【００６８】
また、足底筋におけるNOX1、NOX2、NOX3及びNOX4の発現を、以下に示す配列を有するプライマーセットを用いてRT-PCRにより調べた。【００６９】
【表１】
2013038740.tif 000003
【００７０】
足底筋にはNOX2及びNOX4が発現しており（図８）、またNOX4は常時活性化型の酵素（Bedard, K. and K.H. Krause, Physiol Rev, 2007. 87(1):245-313）であることが報告されており、NOX4が筋肥大を促進することが示唆された。【００７１】
superoxideの筋肥大における機能、及びNOとsuperoxideとの反応物であるペルオキシ亜硝酸（peroxynitrite）の筋肥大における機能を明らかにするため、実施例１に記載のようにsuperoxide及びperoxynitrite消去剤であるebselenと、peroxynitrite消去剤である尿酸、FeTPPSを投与した結果、欠損型と同様に筋肥大の進行が抑えられた（図９）。またperoxynitrite供与剤であるmolsidomine、SIN-1を欠損型に投与した結果、術後7日の筋重量は野生型並みに回復し、この回復はFeTPPSとの共投与により阻害された（図１０）。またFeTPPS投与群におけるタンパク質合成経路の活性化を調べた結果、欠損型と同様、過負荷直後においてp70S6Kのリン酸化が見られず、mTORが活性化しなかった（図１１のA及びB）。これらの結果から、nNOS由来のNOとNOX由来のsuperoxideから成るperoxynitriteが過負荷直後に産生され、mTORによって制御されるタンパク質合成経路を活性化させることで筋肥大を促進することを見出した。【００７２】
［実施例３］
ペルオキシ亜硝酸（peroxynitrite）は細胞内カルシウム濃度を制御し得る（Trebak, M., et al., Antioxid Redox Signal, 2010. 12(5):657-74）ことから、peroxynitriteが細胞内カルシウム濃度の制御を介してmTORを制御し、筋肥大を促進すると考えた。細胞内カルシウム濃度とmTORの活性化の関係を明らかにするため、筋小胞体によるカルシウムの取り込みを阻害し、細胞内カルシウム濃度を上昇させるthapsigarginを筋注した結果、mTORの活性化が見られた（図１２のA及びB）。【００７３】
細胞内カルシウム濃度と筋肥大の関係を明らかにするため、カルシウムキレート剤であるBAPTA-AM、EGTAを筋注した結果、術後7日の筋重量が有意に抑制された（図１３）。また骨格筋において代表的なカルシウムチャネルであるryanodine receptor、L型カルシウムチャネル、TRPチャネルの阻害剤（dantrolene、nifedipine、BTP2）を筋注した。その結果、TRPチャネル阻害薬BTP2によって術後7日の筋重量が有意に抑制されたが、dantrolene、nifedipineによっては抑制されなかった（図１３）。また、stretch-activated channelの阻害剤であるGd3+、GsMTx-4を投与しても筋重量が有意に抑制された（図１３）。BAPTA-AM及びBTP2は過負荷直後におけるmTORの活性化も抑制したが、dantrolene、nifedipineは効果が見られなかった（図１４）。【００７４】
nNOS欠損型の表現型はNO供与剤（SNAP）、peroxynitrite供与剤（SIN-1）によって回復されるが、その効果はBAPTA-AM、BTP2との共投与により抑制された（図１５）。また、欠損型の表現型は、TRPチャネルアゴニスト、すなわちTRPC6チャネルアゴニストであるHyp9（Leuner, K., et al., Mol Pharmacol, 2010. 77(3):368-77）及びTRPV1チャネルアゴニストであるオルバニル（olvanil）の投与により回復された（図１６）。【００７５】
これらの結果から、過負荷直後に産生されたNO/peroxynitriteはTRPチャネルによる細胞内カルシウム濃度の制御を介して、筋肥大を促進することが明らかとなった（図１７）。【００７６】
［参考例１］
筋芽細胞における細胞内カルシウム濃度の変化をin vitroにおいて解析した。具体的には、筋芽細胞株であるC2C12（RCB0987、理研バイオリソースセンターセルバンク）を成長培地（DMEM, 10％ウシ胎児血清, 1％ペニシリン-ストレプトマイシン）で37℃、5％CO2濃度で培養した。その後、分化培地（DMEM, 2％ウマ血清, 1％ペニシリン-ストレプトマイシン）で2日間培養し、筋分化を誘導した。細胞内カルシウム濃度の変化はカルシウム指示薬であるFluo-4（DOJINDO）を用いて計測した。筋分化を誘導したC2C12をPSS溶液（140mM NaCl, 5mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM HEPES, 10mM glucose pH7.0）にて6時間以上培養した後、8μMのFluo-4を添加し、30分間室温で培養した。過剰なFluo-4を取り除き、37℃にて5分間培養した後、SIN-1（DOJINDO）による蛍光強度の変化を倒立蛍光顕微鏡（Olympus）を用いて3秒おきに計測した。細胞外カルシウムを取り除く場合、SIN-1を0 Ca2+溶液（140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 10mM HEPES, 10mM glucose, 2mM EGTA pH7.0）を用いて、細胞に添加した。また、SIN-1による処理の際に、peroxynitrite消去剤であるFeTPPS（calbiochem）を100μMの濃度でSIN-1と一緒に添加した。筋小胞体のカルシウムを枯渇させる場合、Fluo-4と共にthapsigargin（Calbiochem, 2μM）を加えた。【００７７】
その結果、NO/peroxynitrite供与剤であるSIN-1で細胞を処理した直後から細胞内カルシウム濃度が上昇した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。この細胞内カルシウム濃度の上昇は濃度依存的であり（図１８Ｃ）、peroxynitrite消去剤であるFeTPPSにより阻害された（図１８Ｄ）。これらの結果から、peroxynitriteは細胞内カルシウム濃度を上昇させることがわかった。【００７８】
細胞内カルシウム濃度の上昇は、細胞外のカルシウムの取り込み、又は細胞内筋小胞体に貯蔵されているカルシウムの放出によって起こる。細胞外のカルシウムを取り除く（0Ca2+）、又はthapsigarginにより筋小胞体内のカルシウムを枯渇させた。その結果、SIN-1による細胞内カルシウム濃度の上昇は筋小胞体内カルシウムの枯渇によって抑制された（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。これらの結果から、peroxynitriteは筋小胞体からのカルシウム放出を誘導することがわかった。【００７９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号1〜10：人工配列（合成オリゴヌクレオチド）
【図１】
2013038740.tif 000004
【図２】
2013038740.tif 000005
【図３】
2013038740.tif 000006
【図４】
2013038740.tif 000007
【図５】
2013038740.tif 000008
【図６】
2013038740.tif 000009
【図７】
2013038740.tif 000010
【図８】
2013038740.tif 000011
【図９】
2013038740.tif 000012
【図１０】
2013038740.tif 000013
【図１１】
2013038740.tif 000014
【図１２】
2013038740.tif 000015
【図１３】
2013038740.tif 000016
【図１４】
2013038740.tif 000017
【図１５】
2013038740.tif 000018
【図１６】
2013038740.tif 000019
【図１７】
2013038740.tif 000020
【図１８Ａ】
2013038740.tif 000021
【図１８Ｂ】
2013038740.tif 000022
【図１８Ｃ】
2013038740.tif 000023
【図１８Ｄ】
2013038740.tif 000024
【図１９Ａ】
2013038740.tif 000025
【図１９Ｂ】
2013038740.tif 000026
【配列表】
2013038740000001.app
【国際調査報告】
2013038740.tif 000027
2013038740.tif 000028
2013038740.tif 000029
2013038740.tif 000030
2013038740.tif 000031