(57)【要約】【課題】表面増強ラマン散乱を利用した生化学物質のＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析用基板及びそれを用いる分析方法を提供する。【解決手段】希薄プラズモン金属錯体溶液から金属基板上に析出させた金属錯体量子結晶からなる基板またはその基板上に抗体等の受容体を固定した受容体固相化基板であって、ＳＰＲ又はＳＥＲＳ分析方法に適用される。それを用い、表面増強ラマン散乱を利用して、分析対象が含む生化学物質の存在または含量を検出すると、金属錯体量子結晶に固相化された抗体等の受容体に、分析対象物が結合され、形成された多数個のホットスポットより、表面増強ラマン散乱スペクトルを利用して生化学物質が検出される。
2013065747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属基板又は金属粒子上に、金属錯体として析出する錯体安定度定数を有する金属錯体をその水溶液から還元して量子結晶を析出させてなり、析出した量子結晶が生化学物質（リガンド）又は受容体（レセプター）を吸着可能であることを特徴とする金属錯体量子結晶担持体。
【請求項２】
金属錯体が担持金属の電極電位Ｅと相関する式（I）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）を有するように選択される請求項１記載の金属錯体量子結晶担持体。
式（I）：Ｅ゜ ＝ （ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（β）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆは、ファラデー定数を表す。）
【請求項３】
金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体であって、ラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する請求項１記載の金属錯体量子結晶担持体。
【請求項４】
金属錯体が銀錯体であって、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇ β）が８以上の銀錯化剤とハロゲン化銀との反応により形成される請求項３記載の金属錯体量子結晶担持体。、
【請求項５】
ハロゲン化銀が塩化銀で、錯化剤がチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種である請求項４記載の金属錯体量子結晶担持体。
【請求項６】
ナノクラスタからなる量子ドットの平均直径が５〜２０ｎｍであって、量子結晶のサイズが１００〜２００ｎｍである請求項３記載の金属錯体量子結晶担体。
【請求項７】
金属基板又は金属粒子上に、金属錯体として析出する錯体安定度定数を有する金属錯体と受容体（レセプター）を含む水溶液から金属錯体の平衡電位近傍で還元して金属錯体結晶を受容体とともに析出させてなり、析出した量子結晶が受容体（レセプター）を吸着して受容体を固相化して担持し、生化学物質（リガンド）を吸着可能であることを特徴とする受容体固相化金属錯体量子結晶基板。
【請求項８】
金属錯体がプラズモン金属錯体であって、ラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有するＳＰＲ又はＳＥＲＳ分析用の請求項８記載の受容体固相化金属錯体量子結晶基板。
【請求項９】
金属錯体を量子結晶として析出させる錯体安定度定数を有するプラズモン金属錯体５００〜２０００ｐｐｍを含有する水溶液を、金属錯体の平衡電位近傍の卑なる電位を有する金属又は金属合金基板又は粒子上に滴下し、金属錯体を電位差で前記基板又は粒子上で凝集を開始させ、気体噴射により金属錯体溶液を基板又は粒子上から除去して凝集を停止し、ナノ金属クラスタを内包する金属錯体量子結晶を前記基板又は粒子上に形成するを特徴とするプラズモン金属錯体量子結晶の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のプラズモン金属錯体の量子結晶を形成したＳＥＲＳ基板上に被検体である生化学物質（リガンド）を含む液を滴下して吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することを特徴とするＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法。
【請求項１１】
請求項９に記載のプラズモン金属錯体の量子結晶を形成したＳＥＲＳ基板上に受容体（レセプター）を含む液を滴下して吸着させ、その後被検体である生化学物質（リガンド）を含む液を滴下して受容体（レセプター）に吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することを特徴とするＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法。
【請求項１２】
請求項９に記載のプラズモン金属錯体の量子結晶を形成するに際し、プラズモン金属錯体水溶液に受容体（レセプター）を含む液を予め混合して量子結晶を形成したＳＥＲＳ基板上に被検体である生化学物質（リガンド）を含む液を滴下して受容体（レセプター）に吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することを特徴とするＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法。
【請求項１３】
請求項９に記載のプラズモン金属錯体の量子結晶を形成するに際し、プラズモン金属錯体水溶液に生化学物質（リガンド）を含む液を予め混合して量子結晶を形成したＳＥＲＳ基板上に受容体（レセプター）を含む液を滴下して吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することを特徴とするＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は被検体である生化学物質に対し吸着性を有し、且つプラズモン増強効果を有する金属錯体量子結晶担持体およびそれを用いる生化学物質分析、特に表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属原子をナノレベルで形、大きさを制御し、ナノクラスタを形成した表面修飾ナノ粒子がナノテクノロジーにおける次世代の代表的な物質として注目を浴びている。ナノメートル領域で発現するであろう量子サイズ効果により新たな電子物性が設計されるためである。ここで、「ナノクラスター」とは、数個から数百個の原子・分子が集まってできる集合体で、その大きさは数ナノメータサイズである。これらは、分子より大きく、ナノ結晶よりは小さいといわれている。ナノクラスターは、原子・分子・バルク固体とは異なるユニークな機能を発揮する物質である。構成原子のサイズや数を制御することによって、様々な機能を発揮することから、相転移、結晶成長、化学反応、触媒作用などに対する新しい知見や発見が期待される。その一つが金属表面での表面プラズモン共鳴である。一般に金属中の電子は光との相互作用をしないが、金属ナノ粒子中の電子は特別な条件のもとで光と相互作用し、局在表面プラズモン共鳴を起こす。特に銀ナノ粒子について２連球の理論的考察では所定の粒子間距離において、波長４００ｎｍ付近の電場増強度が大変高く、それ以下では、波長３００ｎｍ付近にピークが存在すると言われている。また、粒子径との関係は粒子径が大きくなるにつれてピークの位置が高くなり、また、ピークが長波長側にシフトし、粒子が大きくなるにつれてピーク幅が大きくなるので、広域の波長に対応する電場増強効果が期待できると考えられている。【０００３】
従来、ナノ粒子の研究は非水溶媒を中心としたものが圧倒的多数を占め、水溶液系のナノ粒子の結晶化を定常的に研究しているのは極少数である。その原因は、水溶液は水素結合が力を媒介する特殊な溶液系で、強い水素結合が粒子間力を複雑にしていたこと、および金属と配位子の相互作用が水分子の水素結合によって壊されていたことによるとされ、唯一ジカルボン酸という二座配位性の修飾子を用いることで水溶液中で量子結晶の作成が得られたとの報告がある（非特許文献１）。しかしながら、量子結晶を用いて各種デバイスの作成を実現するためには、一定の担体上でナノ粒子を構成要素とする２次元、３次元の人工的な粒子結晶の作成が求められる。本発明者らは基板上に金属量子ドットを結晶化させることを目的として鋭意研究の結果、水溶液中で金属錯体を形成する場合、錯体安定度定数が高い、例えば二座配位以上の多座配位子で形成される高い錯体安定度定数を有する金属錯体はその平衡電位近傍の還元反応で析出させると、金属基板上に金属錯体のまま量子結晶として析出させることができることを見出した。また、金属錯体はそれを形成する配位子の選択により各種受容体（レセプター）である抗体（例えば、ヒトIgEモノクロール抗体）、各種マーカー又は被検体である生化学物質のターゲット分子（例えば、ＣＲＰタンパク）を吸着する物性を示し、各種検出に用いるのに適する固相化表面を容易に形成することを見出した（通常、５℃で一晩静置して固相化）。更に、金属錯体の金属がプラズモン金属である場合はナノクラスタサイズ（５〜２０ｎｍ）の量子ドットを規則的に分配して内包する金属錯体の量子結晶（１００〜２００ｎｍ）形成するためか、適正に分配されたナノ金属クラスタが金属としてラマン光に対し局在表面プラズモン共鳴増強効果を発揮すとともに、量子結晶が被検体を吸着して電荷移動錯体を形成してＳＰＲ又はＳＥＲＳ分析に適する基板を形成することを見出した。【０００４】
他方、遺伝子及び蛋白質に対する研究は、病の診断を予測できる新しい生物学的マーカー(biomarker)類推に機会を提供した。特に、癌のような疾病は、発病初期に正確な診断を通じて、病の完治が可能であり、再発を防ぐことも可能になる。したがって、このような抗原抗体反応による生物学的標識物の早期検出のための診断用センサー開発に対する研究が活発に進行されている。このようなセンサーは、医療診断の他にも、保健、環境、軍事、食品などの多様な分野に適用が可能であって、非常に多様な形態の研究が進行中であり、この微量抗原の検出のためには、光学的な装置を使用して抗原の有無を調べる方法があるが、時間と費用及び努力がかかるといった短所にもかかわらず、現在まで最も広く使用される方法である。最近は、抗原の有無によって吸収される光の波長が変わることを利用した方法（非特許文献２）、測定しようとする抗原の有無によって、抗原と相補結合できる表面を有したナノ粒子の変化を通じて吸収される光の波長が変わる方法（非特許文献３，４及び特許文献１）などが報告されている。【０００５】
その内、ＳＥＲＳ(Surface-Enhanced Raman Scattering, 以下SERS)分光法は、金、銀などの金属ナノ構造表面に分子が吸着される時、ラマン散乱の強度が急激に１０６〜１０８倍以上増加される現象を利用した分光法であって、現在、非常に速い速度で発展しているナノ技術と結合し、たった一つの分子を直接測定可能な高感度の技術に発展可能であり、特にメディカルセンサーとして緊要に使用されると期待を浴びている。【０００６】
このようなＳＥＲＳセンサーは、分子が吸着した時抵抗が変わる電気的ナノセンサーに比べて大きく技術的優位に立っているが、その理由は、抵抗センサーは、測定値がスカラーであるのに対し、ＳＥＲＳセンサーは、ベクター量のデータである全体のスペクトルを得るため、一回の測定で獲得する情報量が著しく大きいからである。【０００７】
そのため、ＫｎｅｉｐｐとＮｉｅらは、凝集されたナノ粒子を利用し、ナノ粒子に付いている分子を単分子水準でＳＥＲＳ測定が可能であるということを最初に報告し、それ以後、多様なナノ構造(ナノ粒子、ナノシェル、ナノ線)を利用したＳＥＲＳ増強現象に対する研究が報告された。このような高感度のＳＥＲＳ現象をバイオセンサー開発に利用するために、Ｍｉｒｋｉｎ研究チームは、最近ＤＮＡと結合されたナノ粒子を利用した高感度ＤＮＡ分析に成功した。【０００８】
高感度ＤＮＡ分析と共に現在ＳＥＲＳセンサーを利用して、アルツハイマー病あるいは糖尿病を始めた多様な疾病の初期診断を行おうとする研究が活発に進行されている。即ち、ＳＥＲＳ現象は、ラマン分光法が提供した分子の振動状態、あるいは分子構造に対する情報を直接提供するという面で、レーザー蛍光分析法のような既存の測定技術に比べて高選択性及び高情報性を有する測定技術と言えて、超高感度の化学的/生物学的/生化学的分析のための強力な分析方法として認められている。【０００９】
しかしながら、このような長所にもかかわらず、ＳＥＲＳ現象は、１）メカニズムが完璧に理解されていないばかりか、２）正確に構造的に定義されているナノ物質合成及び制御の困難性と、３）スペクトルを測定する時使用される光の波長、偏光方向による増強効率の変化などにより、再現性及び信頼性側面で解決すべき問題が多く、これは、ナノ−バイオセンサーの開発及び商用化を始めとしたＳＥＲＳ現象の応用に大きい課題として残っている。【００１０】
そこで、表面及び結晶状態が正確に定義されている気相合成されたナノワイヤとナノパーティクルのハイブリッド構造を利用して、生体抽出物及び蛋白質、ＤＮＡのようなバイオ分子のＳＥＲＳ信号の増強と測定の再現性、敏感度及び信頼度向上を図る技術が提案されている(特許文献２)。この種従来の金属−金属ナノ構造は、それらがナノ構造の隙間で局所表面プラズモン共鳴(LSPR；Localized Surface Plasmon Resonance)カップリングにより集中された電磁場領域である‘ホットスポット’を提供するので、表面増強ラマン散乱(SERS)は、単分子検出の高感度を有する魅力的な技術であり、さらに、ＳＥＲＳは、他の検出方法に比べ、高選択性を提供し、ラマンスペクトルが分析物の検出に使用できる特定化学作用基に対する信号を提供するので、この現象の発見以後から多様な化学物質の検出とＤＮＡと蛋白質のような生分子の確認のための分析道具として広く研究されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第6,974,669
【特許文献２】特開2011-81001号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/12_kiban/.../jigo.../summary_07_kimura.pdf
【非特許文献２】Chou et al., (2004) Biosens. Bioelectron. 19, 999-1005
【非特許文献３】Alivisatos et al., (2004) Nat. Biotechnol. 22, 47-52,
【非特許文献４】Namet al., (2003) Science. 301, 1884-1886
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、今なお最大の欠点は金属ナノ粒子と被検出物質とがSERS測定に必要な電荷移動錯体を形成するに長時間を要するという点であった。そこで、本発明は基板と被検出物質とがSERS測定に必要な電荷移動錯体を短時間で容易に形成できるプラズモン金属基板を提供し、それを用いて生化学物質の迅速なＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）又はＳＥＲＳ（表面増強ラマン散乱）分析法を実現することを課題とし、鋭意研究を重ねていたが、本発明者らは、上記金属錯体の量子結晶の特異な物性を発見し、鋭意研究の結果、金属錯体の量子結晶を担持する基板を用いると、従来固相化が困難であった抗体を固定する固相化表面を迅速かつ容易に形成でき、各種分析、特に金属錯体がプラズモン金属錯体である場合は、ラマン光に対し局在プラズモン増強効果が著しいことを利用するＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法を実施した結果、優れた分析能を有することを発見し、かかる知見に基づき、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の発明は金属基板又は金属粒子上に、金属錯体として析出する錯体安定度定数を有する金属錯体をその水溶液から還元して量子結晶を析出させてなり、析出した量子結晶が生化学物質（リガンド）又は受容体（レセプター）を吸着可能であることを特徴とする金属錯体量子結晶担持体にある。【００１５】
金属錯体は担持金属の電極電位Ｅと相関する式（I）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）以上を有するように選択される。
式（I）：Ｅ゜ ＝ （ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（βi）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆは、ファラデー定数を表す。）【００１６】
金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体である場合は、ラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する。【００１７】
金属錯体が銀錯体であるときは、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇ βi）が８以上の銀錯化剤とハロゲン化銀との反応により形成されるのがよい。、【００１８】
ハロゲン化銀としては塩化銀が好ましく、錯化剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種であるのが好ましい。【００１９】
銀錯体は平均直径が５〜２０ｎｍであるナノクラスタからなる量子ドットを有し、量子結晶のサイズが１００〜２００ｎｍとなる。【００２０】
金属基板又は金属粒子上に、金属錯体として析出する錯体安定度定数を有する金属錯体と受容体（レセプター）を含む水溶液から金属錯体の平衡電位近傍で還元して金属錯体結晶を受容体とともに析出させてなり、析出した量子結晶が受容体（レセプター）を吸着して受容体を固相化して担持させると、受容体固相化金属錯体量子結晶基板をし、生化学物質（リガンド）を吸着可能である受容体固相化基板を提供できる。【００２１】
金属錯体がプラズモン金属錯体であって、ラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有するＳＰＲ又はＳＥＲＳ分析用受容体固相化基板が提供される。【００２２】
本発明の基板は、金属錯体を量子結晶として析出させる錯体安定度定数を有するプラズモン金属錯体５００〜２０００ｐｐｍを含有する水溶液を、金属錯体の平衡電位近傍の卑なる電位を有する金属又は金属合金基板又は粒子上に滴下し、金属錯体を電位差で前記基板又は粒子上で凝集を開始させ、気体噴射により金属錯体溶液を基板又は粒子上から除去して凝集を停止し、ナノ金属クラスタを内包する金属錯体量子結晶を前記基板又は粒子上に形成することにより製造できる。【００２３】
したがって、この基板上に被検体である生化学物質（リガンド）を含む液を滴下して吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することよりＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法を実施できる。【００２４】
上記ＳＥＲＳ基板上に受容体（レセプター）を含む液を滴下して吸着させ、その後被検体である生化学物質（リガンド）を含む液を滴下して受容体（レセプター）に吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することによってもＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法を実施できる。【００２５】
また、プラズモン金属錯体の量子結晶を形成するに際し、プラズモン金属錯体水溶液に生化学物質（リガンド）を含む液を予め混合して量子結晶を形成したＳＥＲＳ基板上に受容体（レセプター）を含む液を滴下して吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することによってもＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法を実施することができる。【００２６】
さらに、プラズモン金属錯体の量子結晶を形成するに際し、プラズモン金属錯体水溶液に受容体（レセプター）を含む液を予め混合して量子結晶を形成したＳＥＲＳ基板上に被検体である生化学物質（リガンド）を含む液を滴下して受容体（レセプター）に吸着させ、次いでレーザ光を照射して表面増強ラマン散乱を測定することによってもＳＰＲ及びＳＥＲＳ分析法を実施することができる。【００２７】
本発明のプラズモン金属錯体量子結晶はナノプラズモン金属クラスタからなる量子ドットを内包し、ナノクラスタからなる量子ドットの平均直径が５〜２０ｎｍがラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する一方、量子結晶のサイズが１００〜２００ｎｍである錯体結晶が生化学物質（リガンド）又は受容体（レセプター）を吸着し、電荷移動錯体を形成するものと思われる。【００２８】
また、本発明において、プラズモン金属錯体の安定度定数が８以上であると、金属錯体の量子結晶を作成するのに適している。金属錯体の形態で量子結晶を形成するためである。【００２９】
特に、本発明によるＳＥＲＳ分析法は、表面増強ラマン散乱を利用して、分析対象が含む生化学物質の存在または含量を検出するための方法を提供するもので、希薄貴金属錯体溶液から銅又は銅合金上に析出させた金属錯体量子結晶に受容体を固定し、これに分析対象物を結合させ、形成された多数個のホットスポットより、表面増強ラマン散乱スペクトルを利用して生化学物質を検出することに適する。特に、ａ）受容体をプラズモン金属錯体水溶液中に添加し、プラズモン金属錯体に受容体を結合させるステップと、
b）受容体が結合したプラズモン金属錯体溶液を金属基板上に滴下して受容体が形成されたプラズモン金属錯体ナノ結晶（量子結晶）を作成した基板を用意するステップと、
c）該基板上で分析対象物質と接触させて、前記分析対象物質と前記受容体の結合させるステップと、
d）前記分析対象物質と受容体を結合させた量子結晶にレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得るステップ、とを含んで行われるのが好ましい。【００３０】
前記検出対象である前記生化学物質は、細胞構成物質、遺伝物質、炭素化合物、生物体の代謝、物質合成、物質輸送または信号伝達過程に影響を及ぼす有機物を含む。【００３１】
詳細には前記生化学物質は、高分子有機物、有機金属化合物、ペプチド、炭水化物、蛋白質、蛋白質複合体、脂質、代謝体、抗原、抗体、酵素、基質、アミノ酸、アプタマー(Aptamer)、糖、核酸、核酸断片、ＰＮＡ(Peptide Nucleic Acid)、細胞抽出物、またはこれらの組み合わせを含む。【００３２】
前記量子結晶の受容体と前記分析対象物質間の結合は、酵素−基質、抗原−抗体、蛋白質−蛋白質、ＤＮＡ間の相補的結合、またはビオチン(biotin)−アビジン(avidin)結合として特徴付けられる。その具体的な適用法としては受容体（レセプター）と生化学物質（リガンド）の組合せは炎症マーカーとＣＲＰタンパク、未分化マーカーと未分化細胞、ヒトＩｇＥモノクロール抗体と抗原、
腫瘍マーカーと酵素タンパク、ＬＡＬ試薬とエンドトキシン等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、金属錯体の凝集時間（金属基板上に滴下から停止までの時間）を調整して量子結晶に内包される量子ドッドの量子サイズが制御することができるので、良好な量子サイズ効果を発揮するデバイスを提供できる。特に光電変換のための表面プラズモン共鳴励起素子として有用な素子材料を提供することができる。本発明の生化学物質検出方法は、検出そのもののための生化学物質の前処理が必要なく、生化学物質そのものを直接的に検出可能な特徴があり、本発明に係る量子結晶から構成される基板はプラズモン増強に適するホットスポットを形成する金属ナノ粒子の配列を提供するだけでなく、抗体等の受容体を容易に固定して電荷移動錯体を形成する電荷を持ち、タンパク質のSERS検出に適するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１で示す新規SERS基板作成法の手順を示す説明図で、左上の有限会社マイテック製基板は右横のSEM像を示す写真である。
【図２】実施例１で製造したナノ粒子凝集体（量子結晶）の各種SEM像を示す写真である。
【図３】ナノ粒子の拡大SEM像を示す。
【図４】りん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真である。
【図５】量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフである。
【図６】実施例２でおこなわれたローダミン６G（１０ー５M）のSERSスペクトルを示すグラフである。
【図７】ローダミン（１０ー５M）の励起波長依存性を示すグラフである。
【図８】本発明の量子結晶の抗原抗体反応検出への適用手順を示す説明図である。
【図９】本発明の量子結晶による抗原抗体反応の検出結果を示すグラフである。
【図１０】金属板表面に作製されたエンドトキシン測定用器具の電子顕微鏡画像である。
【図１１】ＬＡＬ試薬と組み合わせて作製した測定器具に標準エンドトキシン水溶液を滴下したときのラマン散乱スペクトルの経時変化を示す。
【図１２】ＬＡＬ試薬を減じて作製した測定器具に標準エンドトキシンの水溶液を滴下して測定したラマン散乱スペクトルの９００ｃｍ-1付近のピークの高さを示す。
【図１３】ＬＡＬ試薬を１／１０００に減じて作製した測定器具に標準エンドトキシンの濃度の異なる水溶液を滴下して測定したラマン散乱スペクトルの９００ｃｍ-1付近のピークの高さを示す。
【図１４】実施例３でおこなわれたチオ尿素銀の基板のSERSスペクトルを示すグラフである。
【図１５】コンゴーレッド（３×１０ー６M）の励起波長依存性を示すSERSスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（実施例１）
図１に示すように、チオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その1滴をりん青銅板上滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばすと、右横のSEM像を示す量子結晶が作成されていた。
図２は実施例１で製造したナノ粒子凝集体（量子結晶）の各種SEM像を示す写真であり、図３はナノ粒子の拡大SEM像を示す。１００nm前後の薄い六角柱状結晶であって、表面に数nmオーダの凹凸が発現している。金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できなかった。
図４はりん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真である。まず、六角形の量子結晶が生成し、形状を維持しつつ成長するのが認められる。
図５は量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフである。りん青銅板上に形成された結晶は銀及び錯体配位子由来の元素を検出したが、銅板上にチオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その1滴を滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばした場合は、銀のみを検出したに過ぎなかった。
【００３６】
量子結晶の作成の考察
量子結晶は１０００ppmチオ硫酸銀錯体水溶液の場合、りん青銅板上に滴下して3分間放置すると100nm前後の六角柱状に形成され、各六角柱状の量子結晶は数nmオーダの凹凸を持つことがSEM像から確認された（図１、図２及び図３）が、
金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できず、EDS元素分析で銀及び錯体配位子由来の元素を検出されたため、全体は銀錯体のナノ結晶であって、その表面に現れる凹凸は錯体中の銀がクラスタとして量子ドットを形成して広がっていると推測される。本発明の銀錯体量子結晶がりん青銅板上に形成される一方、銅基板上には銀のみのナノ粒子が析出する現象を見ると、チオ硫酸銀錯体の平衡電位が０．３３で銅の電極電位（０．３４）と同等であるため、銅基板上には銀（０．８０）のみが析出し、りん青銅の場合は０．２２と電極電位がわずかに卑であるため、銀錯体の結晶が析出したものと思われる。したがって、量子結晶を作成するためには１）錯体水溶液が５００〜２０００ppmという希薄な領域であること、２）金属錯体水溶液の平衡電位に対し担持金属の電極電位がわずかに卑であること、３）電極電位差で金属錯体が凝集させることが重要であると思われる。また、１０００ｐｐｍチオ尿素銀錯体水溶液を使用した場合も同様であった。
【００３７】
（実施例２）
図６はローダミン６G（１０ー５M）を上記実施例１で製造した基板上に滴下し、そのSERSスペクトルを７８５nmと６３３nmの励起波長で検出した結果を示す。本発明の量子結晶によるラマンシグナル増強効果を観測した。図７はローダミン（１０ー５M）の励起波長依存性を示すグラフである。６３３nm励起では通常の共鳴ラマンスペクトルと同じであるが、７８５nm励起では強い未確認ピークが現れた。CT共鳴効果である可能性がある。しかしながら、上記実施例１で製造した基板にコンゴーレッド（１０ー５M）を上記実施例１で製造した基板上に滴下し、そのSERSスペクトルを７８５nmと６３３nmの励起波長で検出したがコンゴーレッド（３×１０ー６M）の励起波長依存性を示すピークは認められなかった。
【００３８】
（実施例３）
チオ尿素銀錯体を銀換算で１０００ppm水溶液を調製し、その1滴をりん青銅板上滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばし、量子結晶基板を作成した。
図１４は量子結晶のSERSスペクトルの結果を示すグラフである。次にコンゴーレッド（３×１０ー６M）と上記チオ尿素銀錯体の銀換算で１０００ppm水溶液を１対１で混合し、上記基板上に滴下し、そのSERSスペクトルを７８５nmの励起波長で検出した。図１５にその結果を示す。コンゴーレッドのラマンシグナル増強効果を観測した。ローダミン６G（１０ー５M）を添加して混合した試料についてはラマンシグナル増強効果を観測できなかった。
【００３９】
以上の結果よりチオ硫酸銀錯体量子基板とチオ尿素銀量子結晶基板とは基板表面の極性が異なるものと思われ、チオ硫酸銀錯体量子基板においてローダミン６Gが観測され、コンゴーレッド（３×１０ー６M）が観測されず、他方チオ尿素銀量子結晶基板においてローダミン６Gが観測されず、コンゴーレッド（３×１０ー６M）が観測される結果、前者はマイナス極性、後者はプラス極性を有していると推測される。これから金属錯体の配位子を変更することによりターゲット分子の吸着性に優れる金属錯体量子結晶基板を作成することができることになる。
【００４０】
（実施例４）
図８に示す手順で本発明の量子結晶の抗原抗体反応検出を行なった。１０００ppmのチオ硫酸銀水溶液から形成した基板上の量子結晶に抗体（抗ヒトIgEモノクロール抗体）を固定する。これにヒトIgE抗原を捕捉させ、SERSスペクトルを観測した。図９は本発明の量子結晶による抗原抗体反応の検出結果を示すグラフである。抗原抗体反応に特有のピークが観測された。
【００４１】
（実施例５）エンドトキシンの検出
１．測定用器具の作製
硝酸銀試薬の濃度が９．７ｍＭ、チオ硫酸ナトリウム試薬の濃度が２７ｍＭとなる割合で蒸留水に投入し、完全に溶解するまで攪拌混合した。該水溶液は孔径０．２μｍのセルロースアセテートメンブランフィルターでろ過し、細菌や微少な不溶解物質を除去した。該硝酸銀-チオ硫酸水溶液０．２ｍＬをオートクレーブ滅菌したマイクロピペット（以下、マイクロピペット）で和光純薬工業製ＬＡＬ試薬リムルス−Ｊ−シングルテストワコーが入っているガラス容器に投入し、ボルテックスミキサーで攪拌した。該溶液０．０６ｍＬを直径が７ｍｍで円盤状の銅合金板の表面にマイクロピペットで滴下し、室温下で静置した。３分後に防塵スプレーの気化ガスを用いて溶液を除去し、エンドトキシン測定用器具を作製した。図１０に銅合金基板に貼付した測定用器具の電子顕微鏡画像を示す。合金板には認められない六角形の結晶状微粒子が、該溶液の滴下と除去により形成されている。
２．経時変化
和光純薬工業製の標準エンドトキシン１７００ＥＵのバイアルビンに注射用蒸留水（大塚製薬製）３．４ｍＬをマイクロピペットで加えて溶解した後に、注射用蒸留水で希釈して０．５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン水溶液を調製した。室温で該水溶液０．０６ｍＬをマイクロピペットで測定器具に滴下し、ラマン分光計に取り付けて７８５ｎｍのレーザ光を照射しラマン散乱スペクトルを測定した。続いて、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後にラマン散乱スペクトルを測定した。図１１に示したラマン散乱スペクトルから明らかなように、測定器具のスペクトルピーク７８０ｃｍ-1と１０４５ｃｍ-1の主要ピークに加えて９００ｃｍ-1付近に新しいピークが出現した。ピークの強度は時間の経過と共に高くなっていることから、該ピークがＬＡＬ試薬のエンドトキシンによることは明らかである。
３．ＬＡＬ試薬の使用量
使用するＬＡＬ試薬を１／１０，１／１００，１／１０００と減じて作製した測定器具に、標準エンドトキシン５ＥＵ／ｍＬの水溶液を滴下して数分後に実施例２と同様にラマン散乱スペクトルを測定した。スペクトルピークの中で９００ｃｍ-1付近のピークの高さを図１２に示した。ＬＡＬ試薬が１／１０と１／１００のどちらとも減じる前の測定器具により測定される結果と同等である。１／１０００に減じた測定器具では該ピークの高さは低くなるが減じる前の５割くらいであり、エンドトキシンは１／１０００の試薬量で作製される該測定器具により測定される。
４．ＬＡＬ試薬の使用量を１／１０００に減じた測定器具
ＬＡＬ試薬を１／１０００に減じて作製した測定器具を用いて標準エンドトキシンの濃度が０．１，０．５，５ＥＵ／ｍＬと異なる水溶液を個別に測定器具に滴下して、実施例２と同様にラマン散乱スペクトルを測定したときの、９００ｃｍ-1付近のピークの高さを図１３に示した。標準エンドトキシン濃度が０．１ＥＵ／ｍＬ水溶液の場合、５ＥＵ／ｍＬと比較して高さは約８割であり、該測定器具により０．１ＥＵ／ｍＬが測定される。
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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