(57)【要約】  本発明は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有することを特徴とする核酸分子、該核酸分子を用いる２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法、２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する化合物を検出するための該核酸分子の使用、及び２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有することを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
実質的に同一な推定構造及び／又は構造モチーフを有することを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
当該核酸分子の配列が、配列番号６に記載の配列と実質的に相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項３】
当該核酸分子の配列が、配列番号６に記載の配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号６に記載の配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記構造モチーフとして、ＧＣＧＡＧＡＡからなる配列を含むことを特徴とする請求項２乃至４に記載の核酸分子。
【請求項６】
当該核酸分子の配列が、配列番号６に記載の配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号６に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
当該核酸分子の配列が、配列番号７に記載の配列と実質的に相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項９】
当該核酸分子の配列が、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号７に記載の配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項１１】
当該核酸分子の配列が、配列番号７に記載の配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号７に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する化合物を検出するための、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１４】
前記化合物は、２，４，６−トリニトロトルエンであることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の核酸分子を用いることを特徴とする２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法。
【請求項１６】
２，４，６−トリニトロトルエンを検出することを特徴とする請求項１５に記載の２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子、この核酸分子を用いた２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法、及びこの核酸分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリニトロトルエン（２，４，６−トリニトロトルエン）は、下記の構造式（Ｉ）を有する化合物であって、いわゆるＴＮＴ火薬として使用されるものである。【０００３】
【化１】
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【０００４】
ＴＮＴを検出する方法は、生命に関わる重要な事項であって、関心のもたれている技術である。例えば、特許文献１は、所定のシロキサン繰り返し単位を有する複合体を用いたニトロ化合物の検出方法について、開示する。また、特許文献２は、帯電したコレクタ表面を介して抽出されたＴＮＴなどの低分子量化合物を質量分光法等の検出手段を用いる機構を開示する。さらに、特許文献３は、圧電結晶電極などの固体担体上に被覆された金属表面に、脂肪族炭化水素のリンカー分子を介してＴＮＴに対して特異的な抗体に可逆的に結合するＴＮＴを結合した部材を用いたＴＮＴの検出方法について、開示する。【０００５】
しかしながら、いずれの文献も、現在の要求されている要件の点で、一長一短がある。つまり、特許文献１では、検出に必要な所定のシロキサン繰り返し単位のモノマーを重合体化して、これをさらに薄膜化する必要があり、検出系の構築が非常に困難である。特許文献２では、検出対象物をイオン化する必要があり、検出対象物の形態に制約がある。特許文献３では、検出対象物に対して特異的な結合性を有する抗体を調製する必要があり、抗体の生産性に大きな制約があるとともに、抗体の調製に動物を使用する必要があるなど、倫理面から問題もある。【０００６】
また、検出対象物であるＴＮＴがどのような形態で存在するかは、対象物が含まれる試料の物性等に左右され、また微量のＴＮＴであっても検出し得る系が好ましいところ、いずれの文献も、その要件を満たしたものとはいえない。【０００７】
さらに、いずれの文献に開示の方法も、検出の対象物であるＴＮＴを検出系で直接取り扱う必要があるため、方法の使用者に対する危険がある。【０００８】
従って、いずれの方法も、ＴＮＴの検出に現在要求されている要件を満たしたものであるとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５１３３４７号公報
【特許文献２】特表２００７−５１５６１９号公報
【特許文献３】特表２００５−５３０１７５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍ．Ｚｕｋｅｒ著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２４４巻、ｐ．４８〜５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の従来の問題に鑑みなされたものであって、検出対象物を含む試料の形態に制約がなく、再現性よく製造することができ、ＴＮＴのような２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物に対して高い結合能を有する核酸分子、この核酸分子を用いた２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法、及び、当該検出へのこの核酸分子の使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一の態様は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有することを特徴とする核酸分子に関する。【００１３】
本発明の第二の態様は、前記２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子を用いることを特徴とする２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法に関する。【００１４】
本発明の第三の態様は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する化合物を検出するための、該２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子の使用に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、火薬の原料であるＴＮＴをはじめとした２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物を、高感度で、簡便に、且つ安全に検出し得る核酸分子の提供が可能となる。
また、本発明による核酸分子を用いた検出方法、及びその核酸分子の使用によれば、ＴＮＴをはじめとした２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物を、高感度で、簡便に、且つ安全に検出し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ドットブロットのイメージ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（本発明による核酸分子）
本発明による核酸分子は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有することを特徴とするものである。
【００１８】
本発明において、核酸分子とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）など種々の核酸を有するヌクレオチドであれば、特に制約はなく、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど、鎖の本数や、核酸が修飾されているか否か等に制約はない。また、核酸分子は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格への結合の程度に影響を与えない範囲で、フッ素、塩素、臭素及び要素などのハロゲンや、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基など、適当に置換された核酸分子の置換体も包含する。
【００１９】
本発明による核酸分子は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子であって、この核酸分子の塩基配列は、配列番号６又は７の塩基配列と実質的に相同性を有する塩基配列を含むものが好ましい。本発明において、「実質的に相同性を有する塩基配列」とは、（１）比較の対象とする塩基配列（例えば、配列番号６又は７の塩基配列）において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列；又は（２）比較の対象とする塩基配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列を意味する。さらに、本発明による核酸分子は、その一部又は全部が、配列番号６又は７の塩基配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなることがより好ましく、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％である。
【００２０】
また、本発明による核酸分子は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸であって、実質的に同一な推定構造及び／又は構造モチーフを有することが好ましい。本発明において、「実質的に同一な推定構造及び／又は構造モチーフを有する」とは、核酸の配列の二次構造及びこの構造のモチーフを予測するプログラムを用い、複数の配列からなる配列群に見出される一定の同一性を有することを意味する。この一定の同一性を見出す場合、比較対照とする配列間の相同性が、７０％以上であることが好ましい。実質的に同一性を有することにより、２，４，６−トリニトロフェニル骨格への結合性が向上する。このようなプログラムの例としては、非特許文献１に記載のＺｕｋｅｒｆｏｌｄプログラムが挙げられる。
【００２１】
本発明において、実質的に同一な推定構造及び／又は構造モチーフを有する例を挙げると、本発明の配列番号６には「ＧＣＧＡＧＡＡ」の構造モチーフが含まれている。この構造モチーフは、実施例に示す通り後述のＳＬＥＸ法により配列番号６のアプタマーを取得した際に、最終的に得られたＲＮＡプール中の４５個の配列を解析した結果、このうち９個の配列に含まれていたものである。また、これら９個の配列のうち、配列番号６を含む７個の配列について、核酸分子の二次構造を解析した結果、各配列のいずれにおいてもステム・ループ構造が予測され、「ＧＣＧＡＧＡＡ」モチーフは、これら二次構造においてステム部を挟む形でステム部とループ部とにオーバーラップして存在していた。このように、実質的に同一な推定構造及び／又は構造モチーフを有することにより、本発明の核酸分子の２，４，６−トリニトロフェニル骨格に対する結合能を保証することが可能となる。したがって、例えば、本発明の核酸分子は、配列番号６の塩基配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列をその全部又は一部に含み、かつ、「ＧＣＧＡＧＡＡ」の構造モチーフを有することが好ましい。また、この場合において、「ＧＣＧＡＧＡＡ」の構造モチーフは、予測されるステム・ループ構造において、ステム部を挟む形でステム部とループ部とにオーバーラップしていることがより好ましい。
【００２２】
本発明において、「２，４，６−トリニトロフェニル骨格」とは、下記式（ＩＩ）に示す構造式のものをいう。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
本発明による核酸分子は、いわゆるＲＮＡプールなどの核酸分子と、標的物質として２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する適当な基体とを用いて、核酸分子と標的物質とが特異的に結合して形成される核酸分子／標的物質複合体から、この複合体の形成に関与した核酸分子のみを選択する方法で製造することが可能である。このような方法としては、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と称される方法や、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどの担体を用いて核酸分子／標的物質複合体を得た後にこの複合体の形成に関与した核酸分子のみを回収する方法などが挙げられる。
【００２５】
（ＳＥＬＥＸ法に準じた本発明による核酸分子の製造方法）
本発明による核酸分子は、ＳＥＬＥＸ法に従って、またこの方法に準じた方法で、ＲＮＡプールと、標的物質を有する適当な基体とを反応させて得られるＲＮＡプール−標的物質複合体を回収した後、この複合体から、この複合体の形成に関与したＲＮＡプールのみを回収して、製造することが可能である。
【００２６】
ＲＮＡプールとは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵからなる群から選択された塩基、及びこの塩基の置換体を２０〜１２０個程度連結した領域（この領域を、以下、「ランダム領域」と称する。）を有する遺伝子配列を総称する遺伝子の混合物をいう。従って、ＲＮＡプールは、４２０〜４１２０（１０１２〜１０７２）種類の複数の遺伝子が含まれ、４３０〜４６０（１０１８〜１０３６）種類の遺伝子が含まれることが好ましい。塩基の置換体としては、フッ素、塩素、臭素及び要素などのハロゲンや、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基など、適当に置換された塩基が挙げられる。
【００２７】
ＲＮＡプールは、ランダム領域を有する限り、その他の構造に制約はないが、本発明による核酸分子をＳＥＬＥＸ法に準じて製造する場合、ランダム領域の５’末端及び／又は３’末端には、後述のＰＣＲ等で利用するプライマー領域や、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域を有することが好ましい。例えば、ランダム領域は、５’末端側からＴ７プロモーターなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、この領域を「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」と称する。）と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を「５’末端側プライマー領域」と称する。）とを連結し、この５’末端側プライマー領域の３’末端にランダム領域を連結し、さらにこのランダム領域の３’末端側にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を、「３’末端側プライマー領域」と称する。）を連結した構造を有してもよい。また、ＲＮＡプールは、これらの領域の他に、標的物質への結合を補助する公知の領域を有してもよい。さらに、ＲＮＡプールは、ランダム領域の一部が各ＲＮＡプールにおいて同じ配列を有するものであってもよい。
【００２８】
ランダム領域は、ＲＮＡプールのランダム領域のＵをＴに置き換えた初期プールを鋳型として、ＰＣＲ法に基づいて、遺伝子増幅した後、得た遺伝子産物と、Ｔ７ポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを反応させて、調製されてもよい。また、初期プールに相補的な遺伝子を合成し、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、５’末端側プライマー領域に相補的な配列とからなるプライマーを、初期プールにおいてこのプライマーと相補的な遺伝子にアニーリングさせて、ＰＣＲ法に基づいて、調製されてもよい。
【００２９】
標的物質である２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する基体としては、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子を下記の通り得るのに支障のない範囲で選択すればよく、例えば、ビーズやファイバーなどが挙げられる。基体の材料としては、セルロース、セファロース、アガロースなどが挙げられる。また、タンパク質に標的物質を固定化することで、ニトロセルロースのようなフィルターを用いてセレクションすることも可能である。
【００３０】
標的物質である２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する基体の調製に用いる２，４，６−トリニトロフェニル骨格を与える材料としては、基体との反応性を有する各種の材料であれば、特に制約はなく、例えば、ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）等の２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物が挙げられる。
【００３１】
２，４，６−トリニトロフェニル骨格と基体との結合の形態としては、安定性の点から、共有結合であることが好ましい。また、２，４，６−トリニトロフェニル骨格と基体との結合に当たり、適当なリンカー分子を用いてもよい。このようなリンカー分子としては、グリシンのようにアミノ基とカルボキシル基の両方を含む化合物が挙げられる。リンカー分子を用いて２，４，６−トリニトロフェニル骨格と基体とを結合した場合、得られる標的物質としては、例えば、２，４，６−トリニトロフェニル骨格−リンカー分子−基体が挙げられ、リンカー分子としてグリシンを用いた場合、グリシンのカルボキシル末端を基体との結合に用い、グリシンのアミノ末端を２，４，６−トリニトロフェニル骨格との結合に用いてもよい。
【００３２】
次に、このようにして合成したＲＮＡプールと、標的物質である２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する適当な基体とを水素結合などの分子間力を介して結合させる。この結合方法としては、ＲＮＡプールと標的物質とを、標的物質の結合などの機能が保たれる緩衝液中で一定時間インキュベートする方法が挙げられる。このようにして、緩衝液中でＲＮＡプール−標的物質複合体が形成される。
【００３３】
次に、このように形成されたＲＮＡプール−標的物質複合体を回収する。緩衝液中には、この複合体の他、複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールや標的物質が含まれるが、この複合体の回収方法としては、標的物質に結合性を有する核酸分子を回収することを目的として、緩衝液中に存在する複合体の形成に関与しなかったランダム領域を除去する方法により行えばよい。この方法としては、ＲＮＡプール−標的物質複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合性を利用した方法、複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用する方法、標的物質及びＲＮＡプールの吸着性の違いを利用した方法が挙げられる。
【００３４】
ＲＮＡプール−標的物質複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合性を利用した方法としては、ＲＮＡプールと標的物質との間で形成された水素結合などの種々の結合を利用した方法が挙げられる。例えば、標的物質として、上記式（ＩＩ）に示す２，４，６−トリニトロフェニル骨格を共有結合したセファロースビーズを用いた場合、ビーズに、ＲＮＡプールを含む溶媒を適用した後、２，４，６−トリニトロフェニル骨格を介してＲＮＡプールが結合して得られるＲＮＡプール−標的物質複合体から、ＲＮＡプールと標的物質との間の結合を切断する条件で、ＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。ＲＮＡプール−標的物質複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との間の結合を切断する条件としては、ＲＮＡプールと標的物質との結合の形態を考慮して、適宜選択すればよく、例えば、水素結合を切断する尿素やグアニジン塩酸塩などのカオトロピック効果をもつ溶液や、ＲＮＡプールと標的物質との結合に必要なＭｇ２＋などの二価金属をキレートするＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸塩）、ＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸塩）などを用いてもよい。また、ＲＮＡプール−標的物質複合体においてＲＮＡプールと標的物質との結合に競合する２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する化合物を用いてもよく、このような化合物として、ＴＮＴ、ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）、ピクリン酸（２，４，６-トリニトロフェノール（ＴＮＦ））などのトリニトロ化合物が挙げられる。また、ジニトロトルエン（２，４−ＤＮＴ又は２，６-ＤＮＴ）などのジニトロ化合物が挙げられる。なお、これらの条件は、単一の条件で用いてもよく、また適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
また、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用した方法としては、アガロースゲルなど、ＲＮＡプールを通過させ得るがＲＮＡプール−標的物質複合体を通過させ得ない程度のポアを有する担体を利用して、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとを電気的に分離し、この複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００３６】
さらに、標的物質とＲＮＡプールとの吸着性の違いを利用した方法としては、例えば、ＴＮＢＳをタンパク質に標識した標的物質を固定化させることで、ニトロセルロース膜を利用してセレクションすることも可能である。この標的物質に吸着性を有する膜を用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を有する緩衝液を濾過し、この膜上にＲＮＡプール−標的物質複合体を吸着させ、その後、この膜上に残存したＲＮＡプール−標的物質複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを、例えばこの複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合を解除した後にＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００３７】
次に、このようにして得たＲＮＡプール−標的物質複合体から回収した複合体の形成に関与したＲＮＡプールを用いて、遺伝子増幅を行う。この遺伝子増幅の方法としては、ＲＮＡプールに含まれる５’末端側プライマー領域、３’末端側プライマー領域、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用する方法が挙げられる。例えば、複合体の形成に関与したＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な遺伝子断片をプライマーとして用いて、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応に従ってｃＤＮＡを調製した後、このｃＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域及び３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行い、得た遺伝子産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行って、ＲＮＡプールの遺伝子増幅を行ってもよい。
【００３８】
このように遺伝子増幅された複合体の形成に関与したＲＮＡプールと、標的物質とを用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を形成する方法以下の各方法を繰り返し行い、最終的に、標的物質としての２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する適当な基体に特異的に結合する核酸分子、つまり、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子を得ることができる。
【００３９】
また、上記の例では、ＳＥＬＥＸ法に準じた方法により、本発明の核酸分子を製造しているが、その他の例として、以下の実施例において２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有することが確認されている配列番号６又は７に示す塩基配列について、塩基の削除、置換及び／または付加等の塩基配列の改変に基づき、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子を化学合成等することにより、本発明の核酸分子を製造してもよい。なお、ここで得られた核酸分子についての２，４，６−トリニトロフェニル骨格結合能の評価は、以下の実施例に準じた方法その他公知の方法により可能である。
【００４０】
（本発明による２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法、及び、本発明による核酸分子の使用）
本発明による２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物の検出方法ないし核酸分子の使用は、２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有する化合物（２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物）を検出するための、２，４，６−トリニトロフェニル骨格に結合能を有する核酸分子を用いることを特徴とする。すなわち、本発明による検出方法及び核酸分子の使用において用いる核酸分子としては、上記の本発明による核酸分子が挙げられる。
【００４１】
本発明の核酸分子が２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物に結合した場合に、その結合を検出する方法としては、発色、蛍光、化学発光等を利用した方法、あるいは電気センサーを含む方法等を挙げることができ、公知慣用の技術を適宜応用することができる。例えば、本発明の核酸分子を適当な固相に固定化して用い、ＴＮＴが結合することでもたらされるＲＮＡの構造変化を、電位や蛍光変化で検出することができる。より具体的には、本発明による検出の例として、ＲＮＡにメチレンブルーなどの電子供与性物質を標識したものを金膜上に固定化し、ＴＮＴが結合し構造変化する際に惹起される電位変化を測定することによるものであってもよい。また、蛍光物質及びその消光物質の両方を用いてＲＮＡを修飾し、この修飾ＲＮＡについて、ＴＮＴ結合による構造変化を蛍光変化で測定するものであってもよい。
【００４２】
本発明による検出方法ないし核酸分子の使用において、検出対象物である２，４，６−トリニトロフェニル骨格含有化合物としては、特に制約はなく、例えば、ＴＮＴ、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、２，４，６−トリニトロアニソール、トリアミノトリニトロベンゼン、ピクリン酸等が挙げられる。
【００４３】
本発明による核酸分子は、種々の適用例において、２，４，６−トリニトロフェニル骨格を有するＴＮＴなどの検出に用いることが可能である。このような適用例としては、検査試薬、センサーをはじめ、ろ過フィルターなどに核酸分子を結合させて目的分子を捕捉することなどが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
（製造例１）
［ＲＮＡプールの調製］
配列番号４に示す初期プールを、ＤＮＡ合成装置（３３４ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））で合成した。この初期プール（５００ｎＭ）と、プライマー１（配列番号２）と、プライマー２（配列番号３）と、２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ社製）とを用いて、初期プールと、初期プールに相補的な遺伝子鎖とからなるｃＤＮＡを得た。次に、このようにして得たｃＤＮＡと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製））とを用いて、転写反応を行い、ＲＮＡプール（配列番号１）を得た。【００４５】
［ＴＮＢＳ固定化ビーズの調製］
０．１Ｍ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸；２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ｐＨ４．７）に溶解した０．２Ｍ グリシン（Ｗａｋｏ社製）０．５ｍＬと１００％ＤＭＳＯに溶解した０．２Ｍ  ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、ＴＮＢＳと略す。）（Ｗａｋｏ）０．５ｍＬとを、４℃で２４時間反応させ、反応溶液を得た。次に、反応溶液とＥＡＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ社製）１０ｍＬを混合し４℃で２４時間反応させ、ＴＮＢＳ固定化ビーズを得た。【００４６】
［ＲＮＡプールとＴＮＢＳ固定化ビーズとの結合］
上記の通り得たＴＮＢＳ固定化ビーズを、結合バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に懸濁し、これを、Ｕｌｔｒａ−ｆｒｅｅ  ＭＣ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に充填し、適当量の結合バッファーで平衡化した。これに、上記の通りに調製したＲＮＡプールを結合バッファーに溶解し、平衡化したカラムにアプライし、ＲＮＡプールとＴＮＢＳ固定化ビーズとを結合させた。【００４７】
ＲＮＡプールとＴＮＢＳ固定化ビーズとを結合させた後、７Ｍの尿素を有する結合バッファー（以下、溶出バッファー１と称する。）を、カラムに流し、溶出物を得た。【００４８】
その後、この溶出物（ＲＮＡ２０μＭに相当）と、プライマー３（配列番号５）と、ＡＭＶ由来逆転写酵素トランスクリプター（ロシュ社製）とを用いて、５５℃で、３０分間、逆転写反応を行った。【００４９】
この反応産物全量と、２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ社製）と、３０ｎＭのプライマー１（配列番号２）と、プライマー２（配列番号３）とを用いて、９０℃×５０秒、５３℃×７０秒及び７４℃×５０秒の順で行うサイクルを１サイクルとして、１２サイクルでＰＣＲ反応を行った。得た液にエタノール沈殿を施し、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。【００５０】
この二本鎖ＤＮＡ産物を８μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解し、そのうち４μＬと、１６μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製））とを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。なお、ここまでの工程を１サイクルと定義する。【００５１】
以下、表１に示すように、何サイクル目にどのような溶出条件を用いたかを示した表１に従って、上記の一連の操作を繰り返し、最終的に、配列番号６に示す核酸分子を得た。なお、表１中、「溶出バッファー１」は、上記の溶出バッファー１に対応し、「溶出バッファー２」は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを有する結合バッファーに対応し、「−」は、対応するサイクル目においては、溶出を行わず、その直前のサイクル目で終了したことを示す。【００５２】
なお、本製造例１において、配列番号６を含む、１０サイクル後に取得されたＲＮＡプール中の４５個の配列について解析した結果、このうち９個の配列に「ＧＣＧＡＧＡＡ」なる構造モチーフが含まれていた。また、これら９個の配列のうち、配列番号６を含む７個の配列について、核酸分子の二次構造を解析した結果、各配列のいずれにおいてもステム・ループ構造が予測され、「ＧＣＧＡＧＡＡ」の構造モチーフは、これら二次構造においてステム部を挟む形でステム部とループ部とにオーバーラップして存在していた。  【００５３】
（製造例２）
製造例１において、溶出条件を表１に従って行った以外は、製造例１と同様に行い、配列番号７の核酸分子を得た。【００５４】
【表１】
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【００５５】
（実施例１）
製造例１で得たＴＮＢＳ固定化ビーズを、製造例１と同様にカラムに充填した。一方、上記の二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、α−３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）存在下で、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の方法に準じて転写反応を行い、配列番号６に示す配列を放射標識したＲＩ放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。このＲＩ標識核酸分子を、ビーズを充填したカラムに添加し、ビーズに結合させた。十分量の結合バッファーを用いてビーズを洗浄し、ＲＩ標識核酸分子−ＴＮＢＳ固定化ビーズ複合体を得た。この複合体に、１０ｍＭのＴＮＢＳ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む結合バッファーを添加して、カラムから溶出した。なお、この溶出物にはＴＮＢＳを特異的に結合するＲＩ標識核酸分子が含まれると考えられる。【００５６】
なお、参照群として、ＴＮＢＳを用いずに上記の［固定化ビーズの調製］を行って得たビーズ（以下、グリシンビーズと称する。）を調製し、上記と同様に、複合体及び溶出濃縮物を得た。【００５７】
これらの複合体及び溶出物を、ドットブロット法に準じて、ワットマン３Ｍろ紙に結合させ、ろ紙上に検出されたＲＩを観察した。結果を、図１に示す。なお、図１において、「０プール」は、配列番号１のＲＮＡプールを用いて同様に行って得た産物に対応する。【００５８】
また、表２は、複合体の形成に用いたＲＩ標識核酸分子に対応するドットの濃さをデンシトメーターで数値化して得た値を１００％とした時の、それぞれのドットの濃さのデンシトメーターによる数値化で得た値の割合を示したものである。なお、表２において、「ドット番号」は、図１に記載の各ドットの下部に記載の番号に対応する。【００５９】
（実施例２）
実施例１において、配列番号６の配列に代えて、配列番号７の配列を用いた以外は、実施例１と同様に行い、複合体及び溶出物を得た。結果を図１及び表２に示す。【００６０】
【表２】
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【００６１】
（比較例１）
実施例１において、配列番号６の配列に代えて、製造例１の６サイクル目で得た二本鎖ＤＮＡ産物を用いて実施例１と同様に行って得たＲＩ標識産物を用いた以外は、実施例１と同様に行い、複合体及び溶出物を得た。結果を図１及び表２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、トリニトロトルエン等の火薬類ないし爆発物を、簡便かつ安全に検出し得ることから、化学工業の分野、セキュリティー対策の分野等において高い産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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