(57)【要約】（１）配列番号２０、配列番号１２、または配列番号２１に示す塩基配列から成る核酸、（２）配列番号２０、配列番号１２、または配列番号２１に示す塩基配列と同様のプロモーターの活性を維持している核酸であって、元の塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、元の塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、または元の塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸から成る群から選ばれる、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
（１）配列番号２０に示す塩基配列から成る核酸、
（２）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、
（３）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３】
配列番号２０に示す塩基配列を含む、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項６】
切り花である、請求項５に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項７】
請求項６に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。
【請求項８】
以下の：
（１）配列番号１２に示す塩基配列から成る核酸、
（２）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１２に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、
（３）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１２に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号１２に示す塩基配列を含む、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。
【請求項１２】
請求項８に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項１３】
切り花である、請求項１２に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項１４】
請求項１３に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。
【請求項１５】
以下の：
（１）配列番号２１に示す塩基配列から成る核酸、
（２）トレニアFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２１に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、
（３）トレニアFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）トレニアFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２１に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
配列番号２１に示す塩基配列を含む、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。
【請求項１９】
請求項１５に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項２０】
切り花である、請求項１９に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項２１】
請求項１９に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸と請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２０に示す塩基配列と配列番号２１に示す塩基配列を含む、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。
【請求項２５】
請求項１に記載の核酸と請求項１５に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項２６】
切り花である、請求項２５に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項２７】
請求項８に記載の核酸と請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２８】
配列番号１２に示す塩基配列と配列番号２１に示す塩基配列を含む、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。
【請求項３０】
請求項８に記載の核酸と請求項１５に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項３１】
切り花である、請求項３０に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。
【請求項３２】
請求項３１に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規プロモーターに関する。より詳しくは、本発明は、トレニア由来のフラボノイド３’，５’-水酸化酵素（以下、F3’5’Hと略す。）遺伝子又はフラボン合成酵素（以下、FNSと略す。）遺伝子の転写調節領域及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を利用すると、有用な遺伝子を目的の植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を付与することができる。このようにして作製された遺伝子組換え植物は既に広範囲で商業栽培されている。遺伝子の発現の調節は、主に転写の段階で制御されているので、転写調節は遺伝子の発現を調節する上で最も重要である。すなわち、適切な時期に、適切な組織で、適切な強さで目的の遺伝子を転写をさせることが、産業上有用な遺伝子組換え植物を作製するために重要である。転写の開始は多くの場合、翻訳領域の5’側にあるＤＮＡ配列により制御されている。遺伝子の転写の開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域はプロモーターと呼ばれる。プロモーターは、開始コドンの5’側数十ｂｐに存在することがあり、ＴＡＴＡボックスなどの配列を含むことが多い。そのさらに５’側には様々な転写調節因子が結合するシスエレメントがあり、これらの存在は、転写の時期、転写が行われる組織、転写の強さなどを制御している。転写調節因子はそのアミノ酸配列により多くのファミリーに分類される。例えば、Ｍｙｂ型転写調節因子、ｂＨＬＨ（basic helix loop helix）型転写調節因子などは有名なファミリーである。実際には、転写制御領域とプロモーターは同じような意味で用いられることが多く、厳密な区別はされていない。【０００３】
花の色の主成分であるアントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物の一員である。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのB環の水酸基の数が増加すると青くなる。代表的なアントシアニジンには、デルフィニジン、シアニジン、ペラルゴニジンがあり、それぞれB環の水酸基の数は3個、2個、1個である。これらの中ではデルフィニジンがもっとも青い（図１参照）。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基（クマロイル基、カフェオイル基など）の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり（すなわち吸収極大値が長波長にシフトする）、アントシアニンの安定性が増すことが知られている。あるいは、フラボンなどのフラボノイドがアントシアニンと共存する場合には、色が青くかつ濃く変化することも知られている。このような効果をコピグメント効果とよび、フラボンはコピグメントの1種である（以下、非特許文献１参照）。【０００４】
アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている（同非特許文献１参照）。例えば、B環の水酸基の数を増やす反応を触媒する酵素はフラボノイド３’-水酸化酵素（以下、F3’Hと略す。）とF3’5’Hである。F3’Hはシアニジンの、F3’5’Hはデルフィニジンの合成に必要である。バラ、カーネーション、キクなどはデルフィニジンを合成しないため、これらの植物には青い品種がない。これらの植物でF3’5’H遺伝子を発現させることによって花の色を青く変化させた例がある（国際公開第ＷＯ１９９６／０３６７１６号、以下特許文献４同第ＷＯ２００９／０６２２５３号参照）。フラボンは、フラバノンからFNSの触媒により合成される。フラボン合成酵素遺伝子をペチュニアで発現させることにより花の色を変化させた例がある（Plant Biotechnol 21 377-386 (2004)参照）。【０００５】
さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写調節についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5’側に位置する転写制御領域の中には、Ｍｙｂ型転写調節因子、ｂＨＬＨ型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Ｍｙｂ型転写調節因子とｂＨＬＨ型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている（同非特許文献１参照）。【０００６】
植物において遺伝子の転写を担っているプロモーター（以下、転写調節領域ともいう。）には、どの組織でも又は発育段階のどの時期にでも機能するいわゆる構成的プロモーターと、特定の器官・組織でのみ機能する器官・組織特異的プロモーターや、発育段階の特定時期にのみ発現する時期特異的プロモーターがある。遺伝子組換植物で有用遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、構成的なプロモーターがよく用いられる。代表的な構成的プロモーターとしては、カリフラワー３５Ｓプロモーターやそれを元に構築されたプロモーター（以下、非特許文献３参照）、Mac1プロモーター（以下、非特許文献４参照）などがある。しかしながら、植物において、多くの遺伝子は、組織・器官特異的又は時期特異的に発現している。これは遺伝子を組織・器官特異的又は時期特異的に発現することが植物にとっては必要であることを示唆している。このような組織・器官特異的又は時期特異的な転写調節領域を利用して植物の遺伝子組換えを行った例がある。例えば、種子特異的な転写調節領域を用いて蛋白質を種子で蓄積させた例がある。【０００７】
花弁で特異的に機能する又は花弁で主に機能するプロモーターとその利用についてはいくつかの報告がある。たとえば、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターを用いてF3’5’H遺伝子をペチュニアとカーネーションで発現させ、花弁の色を変えた例がある。バラのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターはバラやキクで機能したことが示されている。サイネリアのF3’5’H遺伝子のプロモーターをペチュニアで発現させることにより花の色を変えた例もある。また、キク花弁においてF3’5’H遺伝子を発現させるためにキクのフラバノン3-水酸化酵素遺伝子プロモーターが用いられた例もある。【０００８】
しかしながら、このようなプロモーターが目的の組換え植物において、どの程度強く機能して目的の表現型をもたらすことができるかどうかは、予測することは困難である。また、宿主植物と同じ又は類似の塩基配列を導入したり、導入遺伝子が染色体に多コピー又は繰り返して挿入されたりすると、遺伝子のサイレンシングが起こることがある（以下、非特許文献５参照）。したがって、複数の外来遺伝子を発現させるために同じプロモーターを繰り返して使うことは遺伝子のサイレンシングを引き起こすことがあるので、避けるべきである。また、フラボノイドの合成にかかわる酵素遺伝子は、花弁で機能するとは言っても、発現のタイミングは異なる。一般にフラボンやフラボノールはアントシアニンよりも、花がより若いときに発現することが知られている。たとえば、花の色を変えるためには、発現のタイミングが異なる複数のプロモーターを取得することは、産業上重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９６／２５５００号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０１／７２９８４号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９４／２８１４０号
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０５／１７１４７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Plant J. 54, 737-749, 2008
【非特許文献２】Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800, 1989
【非特許文献３】Plant Cell Physiology 1996, 37, 49-59
【非特許文献４】Plant Molecular Biology 1990, 15, 373-381
【非特許文献５】Annals of Botany 1997, 79, 3-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーターとして、トレニア由来のF3’5’H遺伝子とFNS遺伝子の転写調節領域を発見し、その有用性を確認して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。【００１３】
［１］以下の：
（１）配列番号２０に示す塩基配列から成る核酸、
（２）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、
（３）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。【００１４】
［２］前記［１］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００１５】
［３］配列番号２０に示す塩基配列を含む、前記［２］に記載の発現ベクター。【００１６】
［４］前記［２］又は［３］に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。【００１７】
［５］前記［１］に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００１８】
［６］切り花である、前記［５］に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００１９】
［７］前記［６］に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。【００２０】
［８］以下の：
（１）配列番号１２に示す塩基配列から成る核酸、
（２）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１２に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、
（３）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）トレニアF3’5’H遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号１２に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。【００２１】
［９］前記［８］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００２２】
［１０］配列番号１２に示す塩基配列を含む、前記［９］に記載の発現ベクター。【００２３】
［１１］前記［９］又は［１０］に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。【００２４】
［１２］前記［８］に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００２５】
［１３］切り花である、前記［１２］に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００２６】
［１４］前記［１３］に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。【００２７】
［１５］以下の：
（１）配列番号２１に示す塩基配列から成る核酸、
（２）トレニアFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２１に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸、
（３）トレニアFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）トレニアFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２１に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。【００２８】
［１６］前記［１５］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００２９】
［１７］配列番号２１に示す塩基配列を含む、前記［１６］に記載の発現ベクター。【００３０】
［１８］前記［１６］又は［１７］に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。【００３１】
［１９］前記［１５］に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００３２】
［２０］切り花である、前記［１９］に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００３３】
［２１］前記［２０］に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。【００３４】
［２２］前記［１］に記載の核酸と前記［１５］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００３５】
［２３］配列番号２０に示す塩基配列と配列番号２１に示す塩基配列を含む、前記［２２］に記載の発現ベクター。【００３６】
［２４］前記［２２］又は［２３］に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。【００３７】
［２５］前記［１］に記載の核酸と前記［１５］に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００３８】
［２６］切り花である、前記［２５］に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００３９】
［２７］前記［８］に記載の核酸と前記［１５］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００４０】
［２８］配列番号１２に示す塩基配列と配列番号２１に示す塩基配列を含む、前記［２７］に記載の発現ベクター。【００４１】
［２９］前記［２７］又は［２８］に記載の発現ベクターにより形質転換された非ヒト宿主。【００４２】
［３０］前記［８］に記載の核酸と前記［１５］に記載の核酸が導入された、植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００４３】
［３１］切り花である、前記［３０］に記載の植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織。【００４４】
［３２］前記［３１］に記載の切り花を原料として用いて得た切花加工品。
【発明の効果】
【００４５】
トレニア花弁で酵素遺伝子の転写を司っていると考えられるプロモーター領域、すなわち、トレニアF3’5’H遺伝子とFNS遺伝子の転写を制御している境域を用いることにより、花などのフラボノイドやアントシアニンが蓄積する組織内で特異的に外来遺伝子の転写を起こさせることが可能となる。転写させる外来遺伝子としては、花色、香りに関連した遺伝子があるが、これらに限られるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】フラボノイド生合成経路の概略図。
【図２】遺伝子導入用バイナリーベクターpSPB3797の概略図。
【図３】遺伝子導入用バイナリーベクターpSPB3798の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明の転写調節領域としては、例えば、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列から成る核酸が挙げられる。しかしながら、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列から成る核酸において数個（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の塩基の付加、欠失及び／又は置換によって修飾された塩基配列から成るプロモーターも、元のプロモーターと同様の活性を維持していると考えられる。従って、本発明は、花弁で転写調節領域として機能する限り、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸にも関する。
【００４８】
本発明は、さらに、トレニアF3’5’H遺伝子又はFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、あるいはトレニアF3’5’H遺伝子又はFNS遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸にも関する。
【００４９】
これらの核酸として、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列に相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号２０、１２又は２１に示す塩基配列と、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の配列同一性を有する塩基配列から成る核酸が挙げられる。
【００５０】
ここで、ストリンジェンシー条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。 具体的には、例えば、低ストリンジェンシー条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。また、高ストリンジェンシー条件としては、例えば、洗浄段階において、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェンシー条件をより高くすることにより、配列相同性又は同一性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
【００５１】
本発明は、トレニアF3’5’H遺伝子、及び／又はFNS遺伝子の転写調節領域を含むベクター、並びに該ベクターにより形質転換された非ヒト宿主にも関する。
さらに、本発明は、トレニアF3’5’H遺伝子、及び／又はFNS遺伝子の転写調節領域を、有用な外来遺伝子に連結し、該外来遺伝子を導入して得られる色変わりなどの有用な形質をもつ植物若しくはその子孫又はその部分若しくは組織に関し、該部分は切り花であってもよい。形質転換可能である植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、ダリア、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、アサガオ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明は、上記切り花を用いた加工品（切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、プリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cloning（Sambrook and Russell, 2001）に依った。アグロバクテリウム、ペチュニア、バラの形質転換は、国際公開第ＷＯ２００４／０２０６３７号又は特許文献４に記載されているが、これらの方法に限定されるものではない。【００５４】
［実施例１：トレニアF3’5’H遺伝子TBG10の転写制御領域のクローニング］
トレニアF3’5’HｃDNAの塩基配列は公知である（Molecular Breeding 6, 239-246 (2000)、Gene Bank DNA 受託番号AB012925）。トレニアの染色体DNAライブラリーを、λDASHII（アジレントテクノロジー株式会社）をベクターとして用いて、製造者の推奨する方法により、作製した。トレニア染色体DNAは、トレニア品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社）の葉から調製した。得られたトレニア染色体DNAライブラリーを、標識したトレニアF3’5’H cDNAを用いてスクリーニングし、トレニアF3’5’H cDNAとハイブリダイズしたファージのプラークを回収した。このファージを鋳型として、2種のオリゴヌクレオチド（T3pro：5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’（配列番号１）、T7pro:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’（配列番号２））をプライマーとしてPCRを行い、トレニアの染色体DNA由来の配列を含むDNA断片を増幅した。このDNAを鋳型とし、一組のオリゴヌクレオチド（T3pro、THF2RV:5’-CTATGGAAGATAACAATG-3’（配列番号３））又は一組のオリゴヌクレオチド（T７pro、THF2RV）をプライマーとしPCRを行った。T3proとTHF2RVを用いたPCRで増幅することができた約5.6kbのDNA断片（配列番号４）をpCR2.1 TOPO (in vitrogen社)にクローニングした。得られたプラスミドをpSPB3745とした。【００５５】
上記ファージを鋳型にし、一組のオリゴヌクレオチド（TBG10proFW：5’-TGAAATATAAATATGAATGGG-3’（配列番号５）、TBG10proRV：5’-ACTGAATGGTGACTAGCTGC-3’（配列番号６））をプライマーとしPCRを行った。得られたDNA断片をBluntII-TOPO (in vitrogen社)にクローニングし、プラスミドpSPB3764とした（配列番号７を含む）。このDNA配列を配列番号７に示す。さらに、pSPB3764を鋳型にし、一組のオリゴヌクレオチド（TBG10proFW、TBG10proXbaIRV：5’-TCTAGACTGAATGGTGACTAGC-3’（配列番号８））をプライマーとしPCRを行った。このDNA断片をBluntII-TOPOにクローニングすることによりpSPB3770を得た。このプラスミドには、約4kbのトレニアF3’5’Hの５’非翻訳配列が含まれ、3’端に制限酵素XbaIの認識配列がある。【００５６】
［実施例２：トレニアF3’5’H遺伝子TBG16の転写制御領域クローニング］
実施例１で得たトレニアF3’5’H cDNAとハイブリダイズしたファージのプラークを増殖し、ファージDNAを調製した。これを鋳型とし、一組のオリゴヌクレオチド（T3pro、THF2RV）又は一組のオリゴヌクレオチド（T７pro、THF2RV）をプライマーとしPCRを行った。（T3pro、THF2RV）由来のPCRから得られた約2.3kbのDNA断片をpCR2.1 TOPOにクローニングして、pSPB3746とした。この配列を配列番号９に示す。このプラスミドを鋳型に、一組のオリゴヌクレオチド（TBG16proFW：5’-TCCTATTGCACTCGTTTTTTC-3’（配列番号１０）、TBG16proRV：5’-ACTGAATGGTGACTAGCCGC-3’（配列番号１１））をプライマーとしPCRを行った。得られたDNA断片をBluntII-TOPO (in vitrogen社)にクローニングし、プラスミドpSPB3758とした。このプラスミドに含まれるDNA配列を配列番号１２に示す。さらに、pSPB3758を鋳型にし、一組のオリゴヌクレオチド（TBG16proFW、TBG16proBamHI：5’-GGATCCACTGAATGGTGACTAGCC-3’（配列番号１３））をプライマーとしPCRを行った。このDNA断片をBluntII-TOPOにクローニングすることによりpSPB3768を得た。このプラスミドには、約0.7kbのトレニアF3’5’Hの５’非翻訳配列が含まれ、3’端に制限酵素BamHIの認識配列がある。【００５７】
［実施例３：トレニアFNS遺伝子の転写制御領域のクローニング］
実施例１で得たトレニア染色体DNAライブラリーを、標識したトレニアFNS cDNAを用いてスクリーニングし、トレニアFNS cDNAとハイブリダイズしたファージのプラークを回収した。ファージのプラークを増殖し、ファージDNAを調製した。このDNAを鋳型にし、一組のオリゴヌクレオチド（T3pro、TFNSR3:5’-ATTCCTAATGGGCTGAAAGTG-3’（配列番号１４））又は一組のオリゴヌクレオチド（T7pro、TFNSR3）をプライマーとして、PCRを行った。T7proとTFNSR3を用いたPCRで増幅できた約4.2kbのDNA断片（配列番号１５）をpCR2.1 TOPOにクローニングした。得られたプラスミドをpSPB3747とした。【００５８】
上記ファージDNAを鋳型とし、一組のオリゴヌクレオチド（TFNS1proFW:5’-CAAATGAAACCCCATCAGTGTC-3’（配列番号１６）、TFNS1proRV:5’-GCTTTATATATATTTTTTTAGCGC-3’（配列番号１７））をプライマーとして、PCRを行った。増幅されたDNA断片をBluntII-TOPOにクローニングして、プラスミドpSPB3759とした。このプラスミドに挿入されている配列を配列番号１８に示す。pSPB3759を鋳型にし、一組のオリゴヌクレオチド（TFNS1proFW、TFNS1pBamHIRV：5’-GGATCCGCTTTATATATATTTTTTTAGC-3’（配列番号１９））をプライマーとして、PCRを行った。このDNA断片をBluntTOPOにクローニングすることによりpSPB3769を得た。このプラスミドには、約3.6kbのトレニアFNSの5’非翻訳配列が含まれ、3’端に制限酵素BamHIの認識配列がある。【００５９】
［実施例4 ：トレニアF3’5’H及びFNSの転写制御領域を含むバイナリーベクターの作製］
実施例１で得たプラスミドpSPB3770をSspIで消化して平滑末端化し、さらにXbaIで消化した。得られた1.6kbのDNA断片（配列番号２０）と、ｐBinPLUSをHindIIIで消化して平滑末端化し、さらにXbaIで消化したDNA断片とを連結して、プラスミドｐSPB3791とした。
プラスミドpSPB580（特許文献４に記載される）を、BamHIとPacIで消化して得られるDNA断片（パンジー由来F3’5’H BP40 cDNAとペチュニアD8ターミネーター配列を含む）を、BamHIとPacIで消化して得られたｐBinPLUSに連結し、プラスミドpSPB3795を得た。プラスミドpSPB3791をXbaIとPacIで消化して得られたDNA断片と、ｐSPB3795をXbaIとPacIで消化して得られたDNA断片とを連結することにより、バイナリーベクターpSPB3793を得た。このバイナリーベクター上では、TBG10由来の転写制御領域、パンジー由来F3’5’H cDNA、ペチュニアD8ターミネーターが順に連結されている。【００６０】
実施例２で得たプラスミドpSPB3768をEcoRIで消化して平滑末端化し、さらにBamHIで消化した。得られた0.7kbのDNA断片と、ｐBinPLUSをHindIIIで消化して平滑末端化し、さらにBamHIで消化したDNA断片とを連結して、プラスミドｐSPB3790とした。これをBamHIとPacIで消化して得られるDNA断片と、ｐSPB580をBamHIとPacIで消化して得られるDNA断片とを連結して、バイナリーベクターpSPB3792を得た。このバイナリーベクター上では、TBG16由来の転写制御領域、パンジー由来F3’5’H cDNA、ペチュニアD8ターミネーターが順に連結されている。【００６１】
実施例３で得たプラスミドpSPB3769をSpeIで消化し平滑末端化し、さらにBamHIで消化した。得られた1.4kbのDNA断片(配列番号２１)と、ｐSPB3383をHindIIIで消化して平滑末端化し、さらにBamHIで消化したDNA断片とを連結して、プラスミドpSPB3789を得た。このプラスミド上には、トレニアFNS転写制御領域、トレニアFNScDNA、ペチュニアD8ターミネーターが順に連結されていて、これらを含むDNA断片はAscIで切断することにより回収することができる。このDNA断片を、pSPB3793のAscIに導入したバイナリーベクターをpSPB3798とし（図３参照）、そしてｐSPB3792のAscIに導入したバイナリーベクターをpSPB3797とした（図２参照）。【００６２】
［実施例５：ペチュニアでの発現（PT315の結果）］
実施例４に記載のバイナリーブラスミドpSPB3797又はpSPB3798をAgrobacterium tumefaciens系統Agl0に導入した。この形質転換アグロバクテリウムを用いて、薄いピン色の花を咲かせるペチュニア系統Skr4xSw63（国際公開第ＷＯ９３／０１２９０号に記載される）を形質転換した。pSPB3797由来の実験区をPT314とし、pSPB3798由来の実験区をPT315 とした。PT314では独立した２系統の形質転換体を得た。両系統の花色は赤紫色に変化していた。以下の表１と表２に、ぞれぞれ、PT314とPT315の花弁、及びSkr4xSw63のアントシアニジンを公知の方法で分析した結果を示す。【００６３】
【表１】
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【００６４】
PT315では独立した26系統の形質転換体を得た。このうち15系統の花色は赤紫色に変化していた。これらの一部の系統の花弁、及びSkr4xSw63のアントシアニジンとフラボンを公知の方法で分析した。【００６５】
【表２】
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【００６６】
以上の結果は、pSPB3770が含むTBG10由来の転写制御領域、pSPB3768が含むTBG16由来の転写制御領域、pSPB3759が含むFNS由来の転写制御領域が異種のペチュニアでも機能したことを示す。【００６７】
［実施例６：バラ品種 「オーシャンソング」へのpSPB3798の導入］
実施例４に記載のバイナリーブラスミドpSPB3798をAgrobacterium tumefaciens系統Agl0に導入した。この形質転換アグロバクテリウムを用いて、バラ品種「オーシャンソング」を形質転換し、15個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った15個体のうち5個体でデルフィニジンの蓄積を確認できた。デルフィニジン含有率は最高7.3％（平均5.0％）であった。また、フラボノール・フラボン分析の結果、9個体中8個体でミリセチンが検出され、7個体でトリセチンが検出された。デルフィニジン、ミリセチン、トリセチンは、いずれもパンジー由来のF3’5’Hの働きにより生成されるものであり、バラにおいてトレニアTBG10由来遺伝子の転写制御領域が機能したことを示している。【００６８】
一方、分析を実施した個体の全てで新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積が確認できたことから、トレニア由来のFNS遺伝子の転写制御領域がバラで機能することが示された。尚、フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり0.6588mgであった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表３に示す。【００６９】
【表３】
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【００７０】
［実施例７：バラ品種 「オーシャンソング」へのpSPB3797の導入］
藤色系のバラ品種「オーシャンソング」に、実施例４に記載のpSPB3797を導入し、７個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った７個体の全てにおいてデルフィニジンの蓄積は確認できなかった。また、フラボノール・フラボン分析の結果、ミリセチンやトリセチンが検出された個体は存在しなかった。これらの結果は、バラにおいてトレニア由来のTBG16 遺伝子のプロモーターが機能しないことを示している。
一方、トレニア由来のFNSの働きにより、分析を実施したすべての個体で新たにフラボン（ルテオリン、アピゲニン）の蓄積が確認できたことから、トレニア由来のFNS遺伝子のプロモーターがバラで機能することが示された。なお、フラボン総量は最高で新鮮花弁重量1gあたり0.1704mgであった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表４に示す。【００７１】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００７２】
トレニアの花で酵素遺伝子の転写を司っていると考えられるプロモーター領域、すなわち、トレニアのフラボノイド3’,5’-水酸化酵素遺伝子及びフラボン合成酵素遺伝子の転写調節領域が異種であるペチュニアとバラの花弁で転写調節領域として機能しうることが分かった。したがって、こられの転写調節領域を利用して、花などのアントシアニンが蓄積する組織内で特異的に外来遺伝子の転写を起こさせることが可能となる。転写させる外来遺伝子としては、花色、香りに関連した遺伝子があるが、これらに限られるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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