(57)【要約】本発明は、哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ４５抗体と結合せず、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細胞を単離する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体および抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ抗体と結合せず、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項２】
哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項３】
哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ４５抗体と結合せず、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、請求項２記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項４】
フローサイトメトリーを用いて、細胞をソーティングする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項５】
哺乳動物平滑筋細胞をフローサイトメトリーによりＬｉｎ（ＣＤ３１，ＣＤ４５，Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ）陽性細胞（Ｌｉｎ＋）とＬｉｎ陰性細胞（Ｌｉｎ−）に選別しＬｉｎ陰性細胞を採取し、さらにＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性細胞を採取することを含む、請求項１記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項６】
哺乳動物平滑筋細胞からフローサイトメトリーによりＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性細胞を採取することを含む、請求項２記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項７】
哺乳動物平滑筋細胞からフローサイトメトリーによりＣＤ４５陰性細胞を採取し、さらにＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性細胞を採取することを含む、請求項３記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項８】
平滑筋が子宮筋である請求項１〜７のいずれか１項に記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである請求項１〜８のいずれか１項に記載の平滑筋幹細胞を単離する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により単離されたＣＤ３１、ＣＤ４５およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａが陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性である平滑筋幹細胞。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により単離された、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性である平滑筋幹細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により単離されたＣＤ４５が陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性である平滑筋幹細胞。
【請求項１３】
さらに、ＡＢＣＧ２が陽性である請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の平滑筋幹細胞。
【請求項１４】
平滑筋に移植することにより平滑筋に分化する能力を有する請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の平滑筋幹細胞。
【請求項１５】
子宮筋に移植することにより子宮筋に分化する能力を有する子宮筋由来の請求項１４記載の平滑筋幹細胞。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の平滑筋幹細胞を含む平滑筋組織再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の表面マーカーを有する平滑筋由来の組織幹細胞、その新しい単離方法および培養方法ならびにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な器官・組織に存在する固有の生体（組織）幹細胞が、それぞれの器官・組織の維持と再生を担っていることが、近年明らかになってきた。現在までに種々の組織由来の幹細胞について報告され、また幹細胞が単離されている。
現在までに単離された幹細胞として、例えば、骨格筋幹細胞、心筋幹細胞、肝臓幹細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、表皮幹細胞、脂肪組織幹細胞等が挙げられる。その単離方法として、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）法が用いられることが多く、本発明者は以前にＳＰ法を用いてヒト子宮の平滑筋幹細胞を単離した（特許文献１を参照）。
再生医療は、疾患や外傷などで損傷し、または喪失した人体の細胞や組織を修復し、その機能を回復させる医療として現在大きな注目を受けている。上記の組織幹細胞を単離同定し、複製増殖させることが可能になれば、再生医療が可能になると考えられている。
【特許文献１】特開２００７−２０２４３５号公報
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、平滑筋幹細胞、特に子宮筋幹細胞の提供を目的とし、さらにそれらの幹細胞の利用の提供を目的とする。
平滑筋の１種である子宮筋は年の単位で、妊娠による著明な細胞サイズの増大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）と細胞数の増加（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）を起こすことが可能であり、その劇的な変化を女性の一生において２０回以上も反復し得る。妊娠・分娩時には著明な増大と細胞数の増加を示し、産褥期には急激にアポトーシスを起こすことが知られている非常にユニークな組織である。
本発明者は、妊娠から産褥期における細胞数の増加およびアポトーシスという一連のイベントに着目し、子宮筋の主な構成組織である子宮平滑筋において、組織幹細胞が存在している可能性を考えた。本発明者は以前にＳＰ法でヒト子宮の平滑筋幹細胞を単離する方法を発明した（特開２００７−２０２４３５号公報）。しかし、ＳＰ法では、ＤＮＡ色素との反応後にＵＶレーザーを照射し選別する過程を経るため、細胞のダメージも含め、単離した幹細胞の安全性・無菌性が担保されない。
そこで、本発明者は、細胞のダメージが少なく、且つ単離細胞の安全性や無菌性が担保できる方法として、表面マーカーを用いた単離を試みた。すなわち、正常子宮筋層を採取し、酵素処理により分散細胞を得て、フローサイトメトリーによりＬｉｎ（ＣＤ３１，ＣＤ４５，Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ）陰性細胞を選別した後，ＣＤ３４陽性／ＣＤ４９ｆ陽性細胞（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−）とそれ以外の細胞（ｎｏｎＤＰ）に分別した。最終的に該分散細胞からＣＤ３１、ＣＤ４５およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａが陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性であることを特徴とするＤｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−を子宮筋ＤＰ／Ｌｉｎ−（ＤＰ／Ｌｉｎ−）として、ＦＡＣＳにより単離した。
一方、本発明者は、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆのみの発現を指標として、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性であることを特徴とするＤｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰを子宮筋ＤＰとして単離できることを見出した。この際あらかじめ、ＣＤ４５が陰性の細胞を選択し、その中からＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性であることを特徴とするＤｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰを子宮筋ＤＰとして単離できることも見出した。
次いで、ＤＰ／Ｌｉｎ−、ＤＰおよびＤＰ／Ｌｉｎ−以外の子宮筋細胞の発現遺伝子を解析し、幹細胞の特徴を有していることを確認した。さらに、ＤＰ／Ｌｉｎ−およびＤＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨・脂肪・軟骨細胞へ分化誘導され得ること、ＤＰ／Ｌｉｎ−およびＤＰを免疫不全マウスに移植した場合に、子宮筋様組織を再構築し得ることを見出し、単離した細胞が子宮平滑筋幹細胞であることを確認した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体および抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ抗体と結合せず、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細胞を単離する方法。
［２］  哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、平滑筋幹細胞を単離する方法。
［３］  哺乳動物平滑筋由来の平滑筋幹細胞を単離する方法であって、哺乳動物平滑筋細胞を蛍光色素で標識した抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させ、抗ＣＤ４５抗体と結合せず、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４９ｆ抗体と結合する細胞を単離することを含む、［２］の平滑筋幹細胞を単離する方法。
［４］  フローサイトメトリーを用いて、細胞をソーティングする、［１］〜［３］のいずれかの平滑筋幹細胞を単離する方法。
［５］  哺乳動物平滑筋細胞をフローサイトメトリーによりＬｉｎ（ＣＤ３１，ＣＤ４５，Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ）陽性細胞（Ｌｉｎ＋）とＬｉｎ陰性細胞（Ｌｉｎ−）に選別しＬｉｎ陰性細胞を採取し、さらにＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性細胞を採取することを含む、［１］の平滑筋幹細胞を単離する方法。
［６］  哺乳動物平滑筋細胞からフローサイトメトリーによりＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性細胞を採取することを含む、［２］の平滑筋幹細胞を単離する方法。
［７］  哺乳動物平滑筋細胞からフローサイトメトリーによりＣＤ４５陰性細胞を採取し、さらにＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性細胞を採取することを含む、［３］の平滑筋幹細胞を単離する方法。
［８］  平滑筋が子宮筋である［１］〜［７］のいずれかの平滑筋幹細胞を単離する方法。
［９］  哺乳動物がヒトである［１］〜［８］のいずれかの平滑筋幹細胞を単離する方法。
［１０］  ［１］〜［９］のいずれかの方法により単離されたＣＤ３１、ＣＤ４５およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａが陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性である平滑筋幹細胞。
［１１］  ［１］〜［９］のいずれかの方法により単離された、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性である平滑筋幹細胞。
［１２］  ［１］〜［９］のいずれかの方法により単離されたＣＤ４５が陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性である平滑筋幹細胞。
［１３］  さらに、ＡＢＣＧ２が陽性である［１０］〜［１２］のいずれかの平滑筋幹細胞。
［１４］  平滑筋に移植することにより平滑筋に分化する能力を有する［１０］〜［１３］の平滑筋幹細胞。
［１５］  子宮筋に移植することにより子宮筋に分化する能力を有する子宮筋由来の［１４］の平滑筋幹細胞。
［１６］  ［１０］〜［１５］のいずれかの平滑筋幹細胞を含む平滑筋組織再生用組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−１０３８６７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１−１は、蛍光標識された抗体による染色を施した子宮筋分散細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示した図である。
図１−２は、ＤＰ／Ｌｉｎ−、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋におけるＡＢＣＧ２のＲＴ−ＰＣＲによる発現解析の結果を示す図である。図中、Ｔｉｓｓｕｅとは、機械的・酵素的処理により分散した時点での子宮筋細胞のことをいい（ＤＰ／Ｌｉｎ−、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋）、ＮＣは蒸留水をテンプレートにしたもので陰性コントロールを示す。
図２は、通常酸素濃度２０％または低酸素濃度２％下で培養したＤＰ／Ｌｉｎ−およびそれ以外の分画の増殖に関して細胞増殖活性を指標に表したグラフである。
図３は、骨細胞誘導培地下で培養したＤＰ／Ｌｉｎ−（図３Ａ）およびｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−（図３Ｂ）のアルカリホスファターゼ染色顕微鏡像を示す写真である。
図４は、脂肪細胞誘導培地下で培養したＤＰ／Ｌｉｎ−（図４Ａ）およびｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−（図４Ｂ）のオイルレッド０染色顕微鏡像を示す写真である。
図５は、軟骨細胞誘導培地下で培養したＤＰ／Ｌｉｎ−のトルイジンブルー染色顕微鏡像を示す写真である。
図６は、ＤＰ／Ｌｉｎ−を移植したＮＯＧ妊娠マウス子宮の蛍光免疫染色像を示す写真である。
図７は、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−を移植したエストロゲン（Ｅ２）徐放ペレット移植ＮＯＧマウス子宮の蛍光免疫染色像を示す写真である。
図８は、ＤＰ／Ｌｉｎ−、ＤＰ／Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋を移植したＮＯＧマウス子宮のエストロゲン（Ｅ２）徐放ペレット移植、妊娠によるヒト細胞の割合を表現したグラフである。
図９は、蛍光標識された抗体による染色を施した、Ｌｉｎマーカーを用いた前選別をしない子宮筋分散細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示した図である。
図１０は、ＤＰ（Ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ；ＣＤ４９ｆ（＋）ＣＤ３４（＋））分画中のＣＤ３１の発現を指標にした細胞亜分画の細胞分布を示す図である。
図１１は、ＤＰ分画、ＣＤ４９ｆ（−）ＣＤ３４（＋）分画およびＣＤ３４（−）分画における分化マーカー遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
図１２は、ＤＰ分画の細胞のコロニー形成の状態を示す写真である。
図１３は、ＤＰ分画、ＣＤ４９ｆ（−）ＣＤ３４（＋）分画、ＣＤ３４（−）分画、ＤＰ分画中のＣＤ３１（＋）亜分画（ＤＰ３１＋）およびＤＰ分画中のＣＤ３１（−）亜分画（ＤＰ３１−）のコロニー形成能を示す図である。
図１４は、ＤＰ分画を重度免疫不全マウス子宮内へ移植した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の幹細胞は、平滑筋から単離される平滑筋由来組織幹細胞である。本発明の幹細胞が由来する平滑筋として、子宮平滑筋、内臓平滑筋、血管平滑筋が挙げられ、好ましくは子宮平滑筋である。これらの組織片を採取し、細胞を分散させ、分散させた細胞から幹細胞を単離することができ、例えば、子宮筋腫片を用いることができる。平滑筋を採取する動物種は限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳動物を用いることができる。
本発明において、「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多能性を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本発明において、幹細胞というときは、幹細胞を少なくとも一定量含む細胞集団をいい、例えば、幹細胞を９０％以上、好ましくは９５％以上含む細胞集団が含まれる。
本発明の平滑筋幹細胞は、Ｌｉｎ−であり、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性の細胞である。Ｌｉｎ−細胞とは、分化抗原が陰性であり幹細胞から特定系統の細胞への分化に対応して出現する表面抗原を有していない細胞、すなわちこれらの表面抗原を細胞表面に発現していない細胞をいう。本発明においては、ＣＤ３１、ＣＤ４５およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ（ＧＰＡ）が陰性である細胞をいう。ＣＤ３１はほとんど全ての単球、血小板および顆粒球に発現している抗原であり、ＣＤ４５は末梢血のリンパ球、単球、顆粒球、好酸球、好塩基球を含むすべての白血球に発現している抗原であり、ＧＰＡは赤血球と関連を有する抗原である。ＣＤ３４は未分化の幹細胞に発現する細胞であり、ＣＤ４９ｆは血小板や巨核球に発現する細胞である。本発明において、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性の細胞をダブルポジティブ（ＤＰ）細胞と呼び、Ｌｉｎ−であり、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性の細胞をＤＰ／Ｌｉｎ−細胞と呼ぶ。本発明の平滑筋幹細胞は、さらに幹細胞マーカーであるＡＢＣＧ２（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｇ２）を発現している。
さらに、本発明の平滑筋幹細胞は、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性の細胞である。該細胞においては、ＣＤ４５、ＣＤ３１およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａは陰性であっても、陽性であってもよい。本発明においては、該細胞をもダブルポジティブ（ＤＰ）細胞と呼ぶ。
本発明の幹細胞は、平滑筋細胞の細胞表面の抗原特性に基づいて単離することができる。すなわち、平滑筋細胞からＬｉｎ−であり、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性である細胞を単離すればよい。
一方、本発明の幹細胞は、平滑筋細胞から、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆのみの発現を指標として、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性である細胞を単離してもよい。さらに、この際、あらかじめＣＤ４５陰性細胞を選択し、その中からＣＤ３４陽性かつＣＤ４９ｆ陽性である細胞を単離してもよい。
最初に平滑筋から細胞を分散させる。細胞の分散は、組織片を細切し、コラゲナーゼ等の酵素で処理することにより行うことができる。分散した細胞は、単一細胞の状態まで分散させることが望ましく、例えば、セルストレーナ等を通し、さらにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）等の比重液を用いて密度勾配遠心分離し、さらにトリプシン処理等を行うことにより単一細胞として分散させることができる。
次いで、それぞれ異なる蛍光色素で標識したＣＤ３１、ＣＤ４５、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆあるいはさらにＡＢＣＧ２に対する抗体を、分散した平滑筋細胞と接触させ表面抗原を有する平滑筋細胞を染色し、フローサイトメトリーやＦＡＣＳを用いて、ＤＰ／Ｌｉｎ−細胞をソーティングすることにより本発明の平滑筋幹細胞を単離することができる。この際、平滑筋細胞から直接フローサイトメトリーで単離してもよいし、フローサイトメトリーでソーティングする前にＣＤ３１、ＣＤ４５およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａからなる分化抗原のうちの１種類以上の抗原に対する抗体を結合させた磁気ビーズを用いて、分化抗原を有する細胞を除去し、残った細胞からＦＡＣＳを用いて本発明の細胞を単離してもよい。
また、それぞれ異なる蛍光色素で標識したＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ、あるいはＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆに対する抗体を、分散した平滑筋細胞と接触させ表面抗原を有する平滑筋細胞を染色し、フローサイトメトリーやＦＡＣＳを用いて、ＤＰ細胞をソーティングすることにより本発明の平滑筋幹細胞を単離することができる。この際、平滑筋細胞から直接フローサイトメトリーでＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ陽性細胞を単離してもよいし、フローサイトメトリーでソーティングする前にＣＤ４５に対する抗体を結合させた磁気ビーズを用いて、ＣＤ４５を有する細胞を除去し、残った細胞からＦＡＣＳを用いて本発明の細胞を単離してもよい。
標識に用いる蛍光色素としては、Ｃｙ（商標）３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、ＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＰＥ−Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰｅｒＣＰ等が挙げられる。フローサイトメトリー、ＦＡＣＳとしては例えばＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
単離した本発明の幹細胞は、培養により増殖させることができる。この際、用いる培地は限定されず、公知の培地（例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地）を用いることができる。特に、公知の幹細胞培養用培地を用いることが望ましい。例えば、間葉系幹細胞培養用培地ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＢＭ））（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、現Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社）、ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、現Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社）、等を用いることができる。培地には、適宜ウシ胎児血清等の血清やペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質および種々の生理活性物質を添加してもよい。また、本発明の幹細胞を培養する場合、培養酸素濃度が通常の培養時の２０％より低い条件下で行う。好ましくは５％以下、さらに好ましくは、２．５％以下、特に好ましくは２％で行う。この方法で培養することにより、幹細胞を増殖させることができる。組織培養用培養皿に細胞を播種して培養すればよい。
さらに、単離した本発明の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の組織細胞へ分化誘導することができる。本発明の幹細胞は多能性を有するため、基本的には任意の組織細胞に分化誘導することができる。種々の組織への分化誘導培地が市販されており、これらの市販培地を用いて分化誘導することができる。例えば、骨細胞へ分化誘導する場合、ブレットキット骨芽細胞分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、現Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社）を用いればよく、脂肪細胞へ分化誘導する場合、ブレットキット脂肪細胞分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、現Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社）を用いればよく、軟骨細胞へ分化誘導する場合、ブレットキット軟骨細胞分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて培養を行えばよい。また、本発明の平滑筋幹細胞を子宮筋組織細胞等の平滑筋組織細胞に分化誘導することもできる。この際、酸素濃度は通常の細胞培養条件、すなわち約２０％で行う。これらの組織細胞へと分化した細胞をさらに培養し、組織を構築させることができる。
幹細胞が組織細胞へ分化誘導したか否かは、各組織細胞に特有なマーカーの発現を調べることにより決定することができる。例えば、骨細胞への分化はアルカリフォスファターゼ染色陽性細胞の有無で調べることができ、脂肪細胞への分化はオイルレッド０染色陽性細胞の有無で調べればよい。さらに軟骨細胞への分化はトルイジンブルー染色陽性軟骨ペレットの有無で調べることができる。
さらに、本発明は本発明の平滑筋幹細胞の不死化させた株細胞を包含する。該株細胞は増殖能および多能性を併せ持ち、必要な数だけ増殖させて、利用することができる。樹立した株細胞は、平滑筋の分化、発生等の研究用ツールとして利用することが可能である。ヒトの細胞では放射線や突然変異誘発物質やウイルスで不死化細胞（ある場合はがん細胞）になるが、特に最近は、腫瘍化や染色体異常を引き起こすことなく、オリジナルの細胞特性を比較的保持させたまま不死化させる方法として、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）やＳＶ４０Ｔ遺伝子などを細胞に導入することが行われている。
本発明の平滑筋幹細胞は再生医療等に用いることができる。例えば、本発明の平滑筋幹細胞を損傷した平滑筋部位にシリンジを用いた注入により移植投与することにより、幹細胞が平滑筋細胞に分化し、損傷した平滑筋を再生することができる。また、上記のように本発明の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化誘導し、組織を構築させ、該組織を移植してもよい。これらの再生医療において、移植した細胞または組織のレシピエントによる拒絶を避けるためには、再生医療を受けようとする患者から組織片を採取し、該組織片から本発明の平滑筋幹細胞を単離し、利用することが望ましい。例えば、子宮肉腫等の疾患により、子宮の一部を切除した患者の残存している部分の子宮筋から組織片を採取し、該組織片から子宮筋幹細胞を単離し、前記患者の子宮の再生に利用することが可能である。また、上述のように、本発明の平滑筋幹細胞は他の組織へと分化させることもできる。例えば、平滑筋以外の特定の組織を損傷した患者から、子宮筋等の平滑筋から組織片を取り出し、平滑筋幹細胞を単離し、該平滑筋幹細胞を損傷した組織に分化誘導することにより、平滑筋以外の組織の再生医療に用いることが可能である。本発明は本発明の幹細胞を含む再生医療用組成物、すなわち再生医療用製剤をも包含する。
さらに、ヒト由来の本発明の幹細胞をヒト以外の動物であって免疫不全動物に移植することにより、ヒトの平滑筋組織を部分的に有するモデル動物を得ることができる。例えば、免疫不全動物の平滑筋に本発明の平滑筋幹細胞を移植することにより、本発明の幹細胞が平滑筋に分化し、動物体内に部分的にヒト平滑筋組織が構築される。動物体内にヒト平滑筋組織が構築されたことは、細胞が発現するヒト平滑筋に特有なタンパク質を測定し、形態的に平滑筋の特徴を有していることを確認すればよい。例えば、平滑筋が子宮筋の場合、ｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性すなわちヒト由来であり（赤色）、かつαＳＭＡ陽性細胞（緑色）で形態的にも子宮平滑筋であることを確認すればよい。このようにして得られた部分的にヒト平滑筋組織を有する動物は、ヒト平滑筋組織を有するモデル動物として利用することができる。例えば、平滑筋が子宮筋の場合、子宮を収縮させ、または子宮を弛緩させる薬剤のスクリーニングに用いることができる。また、本発明の平滑筋幹細胞を癌化させて移植した場合、ヒト子宮癌等を有するモデル動物を作出することができ、治療剤のスクリーニングに用いることができる。免疫不全動物として、ｓｃｉｄマウス、ＮＯＧマウス等の免疫不全マウスが挙げられる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
子宮筋Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−細胞の調製
（１）  単一分散子宮筋細胞の調製
ヒト子宮から単離された子宮筋腫片を、ハサミで約２ｍｍ３の小片にまで細切し、０．２％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼ（和光純薬、大阪）、０．０５％（ｗ／ｖ）のＤＮａｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ、米国カリフォルニア州）を含有するＤＭＥＭ培地（１％の抗生物質−抗真菌剤［ＧＩＢＣＯ］、１０％のウシ胎児血清［ＢｉｏＷｅｓｔ、米国フロリダ州］を含有するダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州］）中に、組織片１ｇに対して１０ｍｌの割合で移し、３７℃にて１６時間振盪して酵素的に細胞分散処理を行った。続いて、４００μｍ孔径のポリエチレンメッシュで濾過後、さらに４０μｍ孔径セルストレーナ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州）に細胞を通すことにより、単一細胞の状態にまで分散させた。続いて、これら分散した細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州）上に重層して７８０×ｇにて１５分間の密度勾配遠心を実施し、界面層から単一細胞の分散液を回収した。これを、０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）・０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ溶液による酵素処理とピペッティングにより完全に分散した細胞集団にした。
（２）  蛍光標識抗体による細胞染色
上記の分散した単一子宮筋細胞集団を、２％胎児ウシ血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１％ペニシリン並びにストレプトマイシン含有のハンクス平衡化緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム無含有、ＨＢＳＳ＋）に２×１０６の濃度で浮遊させ、蛍光標識抗体を加えて、４℃で３０分間反応させた。続いて４℃で遠心した後、２ｍｌの上記のハンクス液に浮遊させ、死細胞の選別のためＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色した。
用いた蛍光標識抗体は、ＰＥ結合抗ＣＤ３１抗体（ＩｇＧ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合抗ＣＤ４５抗体（ＩｇＧ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合抗Ｇｌｙｃｏｈｐｏｒｉｎ  Ａ抗体（ＩｇＧ２ｂ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３４抗体（ＩｇＧ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４９ｆ抗体（ＩｇＧ２ａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。
（３）  子宮筋Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−の分離
蛍光強度に基づいてフローサイトメトリーにより細胞集団を２次元に展開した。上記の染色した分散細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）および解析ソフトウエア（Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析した。
図１にその細胞分布図を示す。このように２次元展開をしながら１×１０５の細胞を収集して、Ｌｉｎ（ＣＤ３１，ＣＤ４５，Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ）陽性細胞（Ｌｉｎ＋）と陰性細胞（Ｌｉｎ−）を選別した後（図１−１ＡおよびＢ）、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４９ｆ陽性細胞（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−）とそれ以外の細胞（ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−）に分別した（図１−１Ｃ）。最終的にＤｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−分画を分取し、子宮筋ＤＰ／Ｌｉｎ−細胞とした。
（４）  分化マーカー遺伝子の発現解析
上記の分離したＤＰ／Ｌｉｎ−、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋からトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＡＢＣＧ２のメッセンジャーＲＮＡの発現をｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって解析した。図１−２がその結果である。なお、内部標準であるＧＡＰＤＨの発現レベルは両者で差が無かった。これは、ＤＰ／Ｌｉｎ−が他の分画に比べて幹細胞マーカーであるＡＢＣＧ２を高発現しており分化度がより低い未熟な段階にあることを示しており、ＤＰ／Ｌｉｎ−は組織幹細胞の特性に合致した性質を有している。
【実施例２】
【０００７】
子宮筋Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−細胞の培養
通常の培養の酸素濃度である２０％ではなく、２％という低酸素濃度下においてマルチガスインキュベーター（アステック社、福岡）で培養した。
その結果、２０％酸素濃度下で培養した場合は、３週間しても細胞は他の分画に比較して増殖しなかったのに対して、２％の低酸素濃度下では培養１週間の時点で、細胞コロニーが形成され、２週間の時点で、ほぼコンフルエントになるまで細胞が増殖した（図２）。
【実施例３】
【０００８】
子宮筋Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−細胞の分化誘導アッセイ
上記の培養ＤＰ／Ｌｉｎ−が、幹細胞特性のひとつである多分化能を有しているかについて検討するため、ＤＰ／Ｌｉｎ−を脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞にそれぞれ分化誘導可能な培地下で培養し、異なる細胞系譜へ分化しうるかを調べた。
骨細胞への分化誘導培地としてプレキット骨芽細胞分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、三光純薬販売、製品番号ＰＴ−３００２）を用い、脂肪細胞への分化誘導培地として、プレキット脂肪細胞分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、三光純薬販売、製品番号ＰＴ−３００４）を使用した。軟骨細胞への分化誘導培地として、プレキット軟骨細胞分化培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、三光純薬販売、製品番号ＰＴ−４１２１）を使用した。上記培養したＤＰ／Ｌｉｎ−とＤＰ／Ｌｉｎ  ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−を９６ｗｅｌｌプレートに約５×１０３／ｗｅｌｌの濃度で蒔き、ＭＳＣＧＭ培地下でコンフルエントになるまで２％（低酸素濃度）の酸素濃度下で約２〜３週間培養した。以下の分化誘導のための培養開始に際しては、酸素濃度を通常の２０％に戻して分化誘導を行った。
骨への分化
上記の培養ＤＰ／Ｌｉｎ−の骨細胞への分化誘導を行った。上記の骨細胞誘導培地を３〜４日毎に交換して、２〜３週間培養した。骨細胞への分化はアルカリフォスファターゼ染色陽性細胞の出現で評価した。その結果、ＤＰ／Ｌｉｎ−ではアルカリフォスファターゼ染色陽性細胞（紫色）が多数出現したのに対して（図３Ａ）、ｎｏｎ  ＤＰ／Ｌｉｎ−ではほとんど認められなかった（図３Ｂ）。
脂肪への分化
上記の培養ＤＰ／Ｌｉｎ−の脂肪細胞への分化誘導を行った。まず、上記の脂肪細胞基礎培地で３日間培養してから、脂肪細胞分化誘導培地で１〜３日間培養した。これを１サイクルとして３サイクル行い、最後は、基礎培地で最大１週間培養してから、洗浄・固定して、脂肪滴を染色するためにオイルレッドＯ染色を行った。その結果、ＤＰ／Ｌｉｎ−ではオイルレッドＯ染色陽性細胞（赤色）が出現したのに対して（図４Ａ）、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−では、ほとんど全く認められなかった（図４Ｂ）。
軟骨への分化
上記の培養ＤＰ／Ｌｉｎ−の軟骨細胞への分化誘導を行った。上記の軟骨細胞誘導培地を３〜４日毎に交換して、２〜３週間１５ｍｌ遠心管内において３次元培養した。軟骨細胞への分化はトルイジンブルー染色陽性軟骨ペレットの出現で評価した。その結果、ＤＰ／Ｌｉｎ−ではトルイジンブルー染色陽性軟骨ペレット（紫色）が出現したのに対して（図５）、ｎｏｎ  ＤＰ／Ｌｉｎ−では軟骨ペレットが認められなかった。
【実施例４】
【０００９】
重度免疫不全マウスへの子宮筋Ｄｏｕｂｌｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞；ＤＰ／Ｌｉｎ−細胞の移植実験
ＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γＣｎｕｌｌ）マウス（財団法人  実験動物中央研究所、川崎市）に１０％ペントバルビタール（大日本薬品製）含有リン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を３５０μｌ腹腔内注射して麻酔した。上記の分離した約５×１０４個のＤＰ／Ｌｉｎ−およびＤＰ／Ｌｉｎ−を、ＮＯＧマウスのそれぞれの子宮角に２９ゲージの注射針を用いて注入し、その後約４〜５週間飼育した。上記の移植をしてから４〜５週間後より移植後ＮＯＧマウスを３つのグループに分けて幹細胞の生体内での動態解析を行った。まず、１つ目のグループは高エストロゲン環境にするために、エストロゲン（Ｅ２）徐放ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、米国フロリダ州）を２錠皮下移植した。次に、２つ目のグループには何もしなかった。最後に、３つ目のグループは雄マウスと交配させ妊娠１８．５日目に解析に供した。
蛍光組織染色
子宮を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州）に包埋して凍結し、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ・ウェツラー市）を用いて６μｍ厚にて連続薄切した。得られた凍結切片については、４％パラホルムアルデヒドにて室温で２０分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄した。０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝液で１０分間細胞膜透過処理を行った後、１０％ウシ血清アルブミン溶液中に３０分間浸漬してブロッキング処理を施行した。続いて、これらの処理をした切片を、子宮平滑筋マーカーであるα−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）に対する抗体（ｃｌｏｎｅ  １Ａ４，２００倍希釈、ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏ、デンマーク）と４℃オーバーナイトで反応させてから、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（緑色蛍光用）標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）（１０００倍希釈，３７℃，１時間）を用いて一次抗体を検出した。続いて、赤色蛍光色素であるＣｙ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって直接標識された、ヒトの細胞にのみ反応するｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｖ９）と反応させて、蛍光二重染色を行った。さらに切片は核染色剤ＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で対比染色した。各染色後の切片を、ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検鏡した。
その結果、図６に示すように、ＤＰ／Ｌｉｎ−を移植した子宮では、ｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性すなわちヒト由来であり（赤色）、かつαＳＭＡ陽性細胞（緑色）で形態的にも子宮平滑筋である組織（黄色）が出現した。一方、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋を移植した子宮では、上記のＤＰ／Ｌｉｎ−でみられたヒト由来の組織は認められず、図７に示すように、ヒト由来の細胞は存在するが（赤色）、それらはマウス平滑筋組織（緑色）の間隙に分布した。
また、ＤＰ／Ｌｉｎ−の増殖はエストロゲンペレットや妊娠により刺激され、定量的にヒト由来細胞の割合が高くなっていることがわかる（図８）。
以上は、ＤＰ／Ｌｉｎ−が子宮平滑筋を構築する能力を有している一方、ｎｏｎＤＰ／Ｌｉｎ−およびＬｉｎ＋はその能力を持っていないことを示しており、ＤＰ／Ｌｉｎ−は子宮筋の組織幹細胞特性を特異的に有している。また、ＤＰ／Ｌｉｎ−の増殖はエストロゲン（Ｅ２）徐放ペレットや妊娠により刺激されることが判明した。
【実施例５】
【００１０】
子宮筋ＣＤ３４陽性／ＣＤ４９ｆ陽性細胞の調製（Ｌｉｎマーカーによる前選別がない場合）
さらに単離した各々の細胞分画について２００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２という低細胞密度で培養皿で培養し、コロニー形成能について解析した。解析するにあたり、培養皿に２９Ｇ針にて擦過し、一つ一つの培養細胞の挙動を把握できるようにした。
（１）  単一分散子宮筋細胞の調整
ヒト子宮から単離された子宮筋腫片を、ハサミで約２ｍｍ３の小片にまで細切し、０．２％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼ（和光純薬、大阪）、０．０５％（ｗ／ｖ）のＤＮａｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ、米国カリフォルニア州）を含有するＤＭＥＭ培地（１％の抗生物質−抗真菌剤［ＧＩＢＣＯ］、１０％のウシ胎児血清［ＢｉｏＷｅｓｔ、米国フロリダ州］を含有するダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州］）中に、組織片１ｇに対して１０ｍｌの割合で移し、３７℃にて１６時間振盪して酵素的に細胞分散処理を行った。続いて、４００μｍ孔径のポリエチレンメッシュで濾過後、さらに４０μｍ孔径セルストレーナ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州）に細胞を通すことにより、単一細胞の状態にまで分散させた。続いて、これら分散した細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州）上に重層して７８０×ｇにて１５分間の密度勾配遠心を実施し、界面層から単一細胞の分散液を回収した。これを、０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）・０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ溶液による酵素処理とピペッティングにより完全に分散した細胞集団にさせた。
（２）  蛍光標識抗体による細胞染色
上記の分散した単一子宮筋細胞集団を、２％胎児ウシ血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ならびに１％ペニシリンおよびストレプトマイシン含有のハンクス平衡化緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム無含有、ＨＢＳＳ＋）に２×１０６の濃度で浮遊させ、蛍光標識抗体を加えて、４℃で３０分間反応させた。続いて４℃で遠心した後、２ｍｌの上記のハンクス液に浮遊させ、死細胞の選別のためＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色した。蛍光標識抗体は、実施例１で用いたものを用いた。
（３）  子宮筋ＣＤ３４陽性／ＣＤ４９ｆ陽性細胞の分離
ＰＩ（−）（生細胞）、ＣＤ４５陰性およびＦＳＣ（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（前方散乱光）；細胞の大きさを示す）１５０〜５００の細胞について、蛍光強度に基づいてフローサイトメトリーにより細胞集団を２次元に展開した。上記の染色した分散細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）および解析ソフトウエア（Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析した。分画した細胞の分化マーカー遺伝子の発現解析は実施例１と同様の方法で行った。さらに、実施例２と同様の方法でコロニー形成能を調べた。さらに、実施例４と同様の方法で重度免疫不全マウスに移植した。
図９に細胞分布を示す。図９Ａに細胞集団全体の細胞分布を示し、図９Ｂ、ＣおよびＤにそれぞれＤＰ（Ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ；ＣＤ４９ｆ（＋）ＣＤ３４（＋））分画、ＣＤ４９ｆ（−）ＣＤ３４（＋）分画およびＣＤ３４（−）分画の各画分の細胞分布を示す。横軸がＣＤ４９ｆの強度を、縦軸がＣＤ３４の強度を示す。ＰＩ（−）の生細胞のうちのＤＰ（Ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）分画は９．８％、４９ｆ（−）３４（＋）分画は１３．７％、３４（−）分画は４３．８％であった。この中から、ＤＰ（ＣＤ４９ｆ（＋）ＣＤ３４（＋））分画を分取した。
図１０にＤＰ分画中のＣＤ３１の発現を指標にした細胞亜分画の細胞分布を示す。図に示すように、ＤＰ分画はＣＤ３１の発現の有無でさらに２つの亜分画（ＤＰ３１＋およびＤＰ３１−）に分けることができた。図１０Ａは細胞集団全体の細胞分布を、図１０ＢはＤＰ分画の細胞分画を示す。図１０ＣはＤＰ分画のＣＤ３１の発現パターンを示し、図１０ＤはＣＤ３１（＋）分画の細胞分布を、図１０ＥはＣＤ３１（−）分画の細胞分布を示す。単一子宮筋細胞集団のＰＩ（−）の細胞の中にＣＤ３１陽性細胞は３．６％存在し、ＣＤ３１陰性細胞は３．７％存在した。
図１１にＤＰ分画、ＣＤ４９ｆ（−）ＣＤ３４（＋）分画およびＣＤ３４（−）分画における分化マーカー遺伝子の発現解析の結果を示す。図１１に示すように、ＤＰ分画は他の分画に比べて、ＥＲα、ＥＲβおよび平滑筋分化マーカーの発現レベルが低かった。その一方で、ＡＢＣＧ２は強発現していた。
図１２にＤＰ分画の細胞の１日目（Ａ）、７日目（Ｂ）、１４日目（Ｃ）および２１日目（Ｄ）のコロニー形成の状態を示す。図１２ＥおよびＦは増殖中のコロニーの状態を示す。また、図１３にＤＰ分画、ＣＤ４９ｆ（−）ＣＤ３４（＋）分画、ＣＤ３４（−）分画、ＤＰ分画中のＣＤ３１（＋）亜分画（ＤＰ３１＋）およびＤＰ分画中のＣＤ３１（−）亜分画（ＤＰ３１−）のコロニー形成能を示す。図に示すように、ＤＰ分画は他の分画（ＣＤ４９ｆ（−）ＣＤ３４（＋）分画、ＣＤ３４（−）分画）と比較したコロニー形成能が高かった。また、ＤＰ分画中のＣＤ３１（＋）亜分画とＣＤ３１（−）亜分画の間ではコロニー形成能に差は認められなかった。
図１４にＤＰ分画を重度免疫不全マウス子宮内へ移植した結果を示す。図に示すように、ＤＰ分画を移植した子宮では、ｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性すなわちヒト由来であり（赤色）、かつαＳＭＡ陽性細胞（緑色）で形態的にも子宮平滑筋である組織（黄色）が出現した。このことは、ＤＰ分画の細胞が子宮筋様組織を構築する能力を有していることを示す。
以上より、ｌｉｎｅａｇｅマーカーによる選別をせずに、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆの発現を指標にして子宮平滑筋幹細胞を単離し得ることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
実施例に示すように、本発明のＣＤ３１、ＣＤ４５およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａが陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性であることを特徴とするＤＰ／Ｌｉｎ−およびＣＤ４５が陰性であり、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆが陽性であることを特徴とするＤＰが、１）未分化状態、２）多分化能、３）自己組織構築能、といった組織幹細胞特性を有することから、ＤＰ／Ｌｉｎ−およびＤＰは子宮筋の組織幹細胞であり、本法により世界で初めて子宮筋の組織幹細胞の単離に成功した。単離したＤＰ／Ｌｉｎ−およびＤＰは、子宮筋の発生機構、妊娠・分娩における子宮筋の増殖・退縮・機能発現を担う細胞メカニズム、更に子宮筋腫などの子宮筋由来疾患の病因解析やそれに対する薬剤開発をするうえで、有用な生物資源となる。またＤＰ／Ｌｉｎ−細胞およびＤＰ細胞は他臓器治療における細胞マテリアルとしても臨床応用が期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図２】
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【図８】
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【図１３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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