(57)【要約】  次の(1)〜(4)の特性を有する、乳タンパク質画分からなる、骨吸収抑制作用に優れており、骨疾患の予防又は治療に有用である破骨細胞形成抑制剤。  (1) 乳由来であること。  (2)分子量80,000〜85,000ダルトンの範囲のタンパク質を含有する画分であること。  (3) 構成アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を16〜18重量％含有し、かつ、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比が0.65〜0.85の範囲であること。  (4) 破骨細胞形成抑制作用を有すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の(1)〜(4)の特性を有する乳タンパク質画分。
(1) 乳由来であること。
(2) ソディウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)電気泳動で、分子量80,000〜85,000ダルトンの範囲のタンパク質成分を含有する画分であること。
(3) 構成アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を16〜18重量％含有し、かつ、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比が0.65〜0.85の範囲であること。
(4) 破骨細胞形成抑制作用を有すること。
【請求項２】
請求項１に記載の乳タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解して得られる乳タンパク質画分分解物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する破骨細胞形成抑制剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用医薬品。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用飲食品。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用飼料。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物に関する。
本発明の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物は、破骨細胞形成抑制作用を有するので、骨疾患の予防又は治療、骨強化等を目的とした破骨細胞形成抑制剤として、また、骨疾患の予防又は治療用もしくは破骨細胞形成抑制用医薬品、飲食品及び飼料の有効成分として有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く（アンカップリング）。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防止することができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を予防することができると考えられている。【０００３】
従来、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、（１） 食餌によるカルシウム補給、（２）軽い運動、（３）日光浴、（４）薬物治療等が行われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されている。しかし、これらは必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆んど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ３の補給という点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、１α‐ヒドロキシビタミンＤ３ やカルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であるということが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可能なものではない。【０００４】
本発明者らは、食品素材として使用可能な骨強化作用を有する物質を得るために、乳中に存在する骨強化因子を探索し続けてきた。その結果、乳清タンパク質の水溶性画分から乳清由来の塩を除去したタンパク質及びペプチド混合物に骨強化作用があることを見出した（例えば、特許文献１参照）。そして、このタンパク質及びペプチド混合物の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、限外濾過膜処理をして得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及び骨強化作用があることを見出した（例えば、特許文献２、３参照）。また、乳中に存在する塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収防止作用があることを見出した（例えば、特許文献４参照）。
【特許文献１】特許3160862号公報
【特許文献２】特許3092874号公報
【特許文献３】特開平5-320066号公報
【特許文献４】特許3112637号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、食品素材としても使用可能な、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を見出し、この破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する破骨細胞形成抑制剤、及び、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用医薬品、飲食品及び飼料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、新たな破骨細胞形成抑制素材の探索を試みた結果、従来の食品素材よりも強い破骨細胞形成抑制作用を示す画分が得られることを見出した。そして、これらの知見に基づいてこの破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する破骨細胞形成抑制剤、及び、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した医薬品、飲食品及び飼料を得るに至ったものである。【０００７】
本発明は、下記の構成からなる発明である。（Ａ）次の特性を有する破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分に関する。
(1) 乳由来であること。
(2) ソディウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)電気泳動で，分子量80,000〜85,000ダルトンの範囲のタンパク質を含有する画分であること。
(3) 構成アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を16〜18重量％含有し、かつ、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比が0.65〜0.85の範囲であること。 
(4) 破骨細胞形成抑制作用を有すること。
（Ｂ）前記乳タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解して得られる乳タンパク質画分分解物。
（Ｃ） (Ａ）又は（Ｂ）に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を含有する破骨細胞形成抑制剤。
（Ｄ） (Ａ）又は（Ｂ）に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用医薬品。
（Ｅ） (Ａ）又は（Ｂ）に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用飲食品。
（Ｆ） (Ａ）又は（Ｂ）に記載の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用飼料。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする破骨細胞形成抑制剤、及び、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した医薬品、飲食品及び飼料は、経口的に摂取することにより、体内において破骨細胞の形成を抑制する。従って、本発明の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする破骨細胞形成抑制剤、及び、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した医薬品、飲食品及び飼料は、ヒトや動物の生体内で破骨細胞の形成を抑制することから、骨強化作用を有し、また骨粗鬆症等の骨量減少の抑制に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする破骨細胞形成抑制剤、及び、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を配合した医薬品、飲食品及び飼料に係るものである。【００１０】
本発明のこのような乳タンパク質画分は、例えば、脱脂乳や乳清等の乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させて、0.6Ｍの食塩溶液で洗浄後、この樹脂に吸着した乳タンパク質を1.0〜1.5Ｍの食塩溶出液で溶出することができる。なお、塩類としては、食塩の他、カリウム塩、アンモニア塩、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩等も使用することができ、洗浄液のイオン強度を0.55〜0.65、溶出溶液のイオン強度を1.0以上、好ましくは1.0〜2.0に適宜調整して、本発明の乳タンパク質画分を得ることができる。また、この溶出画分を回収し、逆浸透(ＲＯ)膜や電気透析(ＥＤ)法等により脱塩または濃縮し、必要に応じて乾燥することにより得ることができる。逆浸透(ＲＯ)膜としては、Desal-3(Desalination社製)、HR-95（Dow Danmark社製）、NTR-729HF（日東電工社製）等を例示することができる。また、電気透析(ＥＤ)装置は、ユアサアイオニクス社や日本錬水社製の電気透析装置を例示できる。【００１１】
また、乳由来の微量タンパク質画分を得る方法としては、乳又は乳由来の原料を陽イオン交換体に接触させた後、この陽イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質画分を、pＨ５を越え、イオン強度 0.5を越える溶出液で溶出して得る方法（特開平5-202098号公報）、アルギン酸ゲルを用いて得る方法（特開昭 61-246198号公報）、無機の多孔性粒子を用いて乳清から得る方法（特開平 1-86839号公報）、硫酸化エステル化合物を用いて乳から得る方法（特開昭63-255300号公報）等が知られており、本発明では、このような方法で乳由来のタンパク質画分を得ることができる。【００１２】
このようにして回収された乳タンパク質画分は、通常、凍結乾燥等により粉末化して使用することができる。【００１３】
本発明で用いる破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分は、その構成アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を16〜18重量％含有し、かつ、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比が0.65〜0.75の範囲であることが好ましい。この範囲を外れると本願発明の効果を発揮することができない。また、本発明品は、分子量80,000〜85,000ダルトン、等電点が7.0〜8.0を示すタンパク質が主成分のタンパク質の混合物である。【００１４】
乳タンパク質画分分解物は、乳タンパク質画分と同様のアミノ酸組成を有しており、例えば、上記の方法で得られた乳タンパク質画分にペプシン、トリプシン、キモトリプシン等のタンパク質分解酵素を作用させ、さらに必要に応じ、パンクレアチン等のタンパク質分解酵素を作用させることにより、平均分子量4,000以下の分解物として得ることができる。なお、乳タンパク質画分分解物は、通常、凍結乾燥等により粉末化して使用することができる。【００１５】
破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分の給原となる乳又は乳由来原料としては、牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等の乳を用いることができ、これらの乳をそのまま、あるいは、これらの乳の還元乳、脱脂乳、ホエー等を用いることができる。【００１６】
本発明の破骨細胞形成抑制剤を投与するに際しては、有効成分である破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。さらには、これらの乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合して、破骨細胞形成抑制を図ることも可能である。なお、本発明の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物は、比較的熱に対して安定なので、通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。【００１７】
本発明において、破骨細胞形成抑制作用を発揮させるためには、体重、性別や年齢等を考慮して適宜決定すればよいが、通常成人の場合、本発明品である乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を一日当たり、10‐100mg摂取できるよう配合量等を調整すればよい。このように本発明品は低用量で効果がある。本発明の破骨細胞形成抑制作用を有する成分は、破骨細胞形成抑制剤として、あるいはそれらを配合した医薬品、飲食品及び飼料を経口摂取することによって、破骨細胞形成抑制作用を発揮する。【００１８】
以下に、参考例、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するものであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。【００１９】
［参考例１］
下記の方法（特許第3112637号参照）により、骨強化が認められる市販品の乳タンパク質画分を調製した。
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100 ml /minで通液した後、このカラムを脱イオン水で充分洗浄し、0.95M塩化ナトリウムを含む 0.05Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透（ＲＯ）膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を２回繰り返して104gのタンパク質画分を得た。このタンパク質画分の等電点は 7.0〜8.5 であって、このタンパク質画分に含まれる塩基性アミノ酸は17.8％であった。
【実施例１】
【００２０】
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100ml/minで通液した後、このカラムを0.55Ｍ塩化ナトリウムを含む 0.05Ｍリン酸緩衝液(pＨ 7.0) で充分洗浄し、次いで、1.45Ｍ塩化ナトリウムを含む 0.05Ｍリン酸緩衝液(pＨ 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透（ＲＯ）膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を２回行い、乳タンパク質画分48gを得た。この画分の主な成分の分子量は、80,000〜85,000ダルトン、等電点は 7.0〜8.0であって、この乳タンパク質画分に含まれる構成アミノ酸のうち、塩基性アミノ酸は16〜18％であった。また、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比は0.65〜0.85であった。
【実施例２】
【００２１】
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100ml/minで通液した後、このカラムを0.55Ｍ塩化ナトリウムを含む0．05Ｍリン酸緩衝液(pＨ7．0)で充分洗浄し、1.0Ｍ塩化ナトリウムを含む 0.05Ｍリン酸緩衝液(pＨ 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透（ＲＯ）膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を1回行い、乳タンパク質画分22.1gを得た。この画分の主な成分の分子量は、80,000〜85,000ダルトン、等電点は 7.0〜8.0であって、この乳タンパク質画分に含まれる構成アミノ酸のうち，塩基性アミノ酸は16〜18％であった。また、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比は0.65〜0.85であった。
【実施例３】
【００２２】
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール(富士紡績製) 0.5リットルを充填した直径10cmのカラムを脱イオン水で充分洗浄した。このカラムに未殺菌脱脂乳 50リットルを流速100ml/minで通液した後、このカラムを0.65Ｍ塩化ナトリウムを含む 0.05Ｍリン酸緩衝液(pＨ 7.0) で充分洗浄し、次いで、2.0Ｍ塩化ナトリウムを含む 0.05Ｍリン酸緩衝液(pＨ 7.0) 2.5リットルを通液して樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透（ＲＯ）膜処理により、脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳タンパク質画分を得た。この操作を２回行い、乳タンパク質画分48.8gを得た。この画分の主な成分の分子量は、80,000〜85,000ダルトン、等電点は 7.0〜8.0であって、この乳タンパク質画分に含まれる構成アミノ酸のうち、塩基性アミノ酸は16〜18％であった。また、塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸比は0.65〜0.85であった。
【実施例４】
【００２３】
実施例２で得られた乳タンパク質画分22.1gを蒸留水８リットルに溶解した後、トリプシン（関東化学製）を２％濃度となるよう添加し、37℃で１時間撹拌しながら加水分解した、次いで、水酸化ナトリウム溶液でpＨ6.6に中和後、１％パンクレアチン（シグマ社製）を添加し、37℃で２時間反応させた。反応後、80℃で10分間加熱処理して酵素を失活させた後、乳タンパク質画分分解物20.8gを得た。
【実施例５】
【００２４】
実施例３で得られた乳タンパク質画分48.8gを蒸留水10リットルに溶解した後、ペプシン（関東化学製）を２％濃度となるよう添加し、37℃で１時間撹拌しながら加水分解した、次いで、水酸化ナトリウム溶液でpＨ6.8に中和後、１％パンクレアチン（シグマ社製）を添加し、37℃で２時間反応させた。反応後、80℃で10分間加熱処理して酵素を失活させた後、乳タンパク質画分分解物46.7gを得た。【００２５】
［試験例１］
骨芽細胞が産生する破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）は、生理的な破骨細胞の分化抑制因子として知られている。そこで、参考例１及び実施例１で得られた各乳タンパク質画分について、破骨細胞形成抑制作用として、骨芽細胞におけるＯＰＧの産生促進作用を調べた。ヒト骨芽細胞ＭＧ６３を2×10４ cells/mlになるようにＭＥＭ‐Ｅ培地〔GIBCO社製、ウシ胎児血清10％含有、非必須アミノ酸溶液（GIBCO社製）1％含有、ペニシリン‐ストレプトマイシン溶液（GIBCO社製）1％含有〕に懸濁した後、200μl/wellずつ96wellプレートに播種した。これを5％炭酸ガスインキュベーター中で4日間培養し、培地を吸引除去後、上記ＭＥＭ‐Ｅ培地を160μl/well、ＭＥＭ‐Ｅ培地で1.0mg/ml又は0.1mg/mlの濃度に溶解した参考例１及び実施例１で得られたタンパク質画分を40μl/well添加して、さらに4日間培養した。この培養上清を回収し、培養上清中のＯＰＧ濃度をヒトＯＰＧ‐ＥＬＩＳＡ測定キット（BIOMEDICA社製）を用いて測定した。また、試料溶液の代わりにＭＥＭ‐Ｅ培地のみで培養したものを対照とした。
表１に結果を示す。【００２６】
【表１】
2009057287.tif 000002
【００２７】
参考例１及び実施例１で得られた乳タンパク質画分はともに、ヒト骨芽細胞ＭＧ６３のＯＰＧ産生を促進した。さらに、実施例１で得られた乳タンパク質画分の作用は、参考例１で得られた乳タンパク質画分よりも有意にＯＰＧ産生を促進し、優れた破骨細胞形成抑制作用を有することが示された。【００２８】
［試験例２］
参考例１及び実施例２で得られた各タンパク質画分について、動物実験により骨強化作用を調べた。動物実験には４週齢のWistar系雌ラットを用いた。１週間の予備飼育後、卵巣摘出手術を施し、その後、カルシウム欠乏食で５週間飼育して動物実験に供した。なお、卵巣を摘出し、カルシウム欠乏食で５週間飼育したラットは、明らかに骨粗鬆症状態にあった。この骨粗鬆症状態を惹起したラットを１群７匹ずつ、乳タンパク質画分無添加の対照群（Ａ群）、参考例１で得られた乳タンパク質画分0.1重量％投与群（Ｂ群）、実施例２で得られた乳タンパク質画分0.1重量％投与群（Ｃ群）の３試験群に分け、それぞれ表１に示す試験飼料で４ヶ月飼育した。なお、各試験飼料の窒素含量(17.06％)が同様となるようカゼインで調整した。また、各試験飼料については、100g当たり、カルシウム 300mg、リン 230mg及びマグネシウム 50mgを配合した。【００２９】
【表２】
2009057287.tif 000003
【００３０】
４ヶ月間飼育したラットについて、大腿骨を摘出し、骨塩量測定装置(DCS-600、Alola社製)を用いて二重エネルギーＸ線吸収測定法（DEXA法）により骨塩量を測定した。対照群も同様に大腿骨の骨塩量を測定した。その結果を表３に示す。これによると、４ヶ月間試験食を摂食させた結果、ラット大腿骨の骨塩量は、対照群と比較して参考例１で得られた乳タンパク質画分投与群（Ｂ群）及び実施例２で得られた乳タンパク質画分投与群（Ｃ群）は有意に高かった。各乳タンパク質画分に骨塩量増加作用、即ち破骨細胞形成抑制が認められたが、その作用は参考例１で得られた乳タンパク質画分に比べて本発明品の方が強いことが明らかとなった。なお、実験結果は示さなかったが、実施例４及び実施例５で得られた乳タンパク質画分分解物を用いた場合も同様の効果が認められた。【００３１】
【表３】
2009057287.tif 000004
【実施例６】
【００３２】
実施例１で得られた乳タンパク質画分100mg に、含水結晶ぶどう糖93.4g、炭酸カルシウム5g、シュガーエステル1g、香料0.5gを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の破骨細胞形成抑制剤を製造した。
【実施例７】
【００３３】
表４に示した組成で各成分を混合してドウを作成し、成型した後、ばい焼して、破骨細胞形成抑制用のビスケットを製造した。【００３４】
【表４】
2009057287.tif 000005
【実施例８】
【００３５】
表５に示す組成の破骨細胞形成抑制用果汁飲料を製造した。【００３６】
【表５】
2009057287.tif 000006
【実施例９】
【００３７】
表６に示した配合により原料を混合し、破骨細胞形成抑制用イヌ飼育飼料を製造した。【００３８】
【表６】
2009057287.tif 000007
【実施例１０】
【００３９】
表７に示した組成で各成分を混合し、加圧成型して、実施例４で得られた乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用錠剤を調製した。【００４０】
【表７】
2009057287.tif 000008
【実施例１１】
【００４１】
表８に示した組成で各成分を混合し、乳化温度85℃で乳化して、実施例５で得られた乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用プロセスチーズを調製した。【００４２】
【表８】
2009057287.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物は、破骨細胞形成抑制作用を有し、また骨粗鬆症等の骨量減少の抑制に有効であるので、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画分又は乳タンパク質画分分解物を有効成分とする破骨細胞形成抑制剤、及び、破骨細胞形成抑制作用を有する乳タンパク質画又は乳タンパク質画分分解物を配合した破骨細胞形成抑制用医薬品、飲食品及び飼料として利用することが出来る。
【国際調査報告】
2009057287.tif 000010
2009057287.tif 000011
2009057287.tif 000012
2009057287.tif 000013