(57)【要約】  ヒアルロン酸フラグメントを利用した、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤を提供する。  ２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤の有効成分として用いる。前記ヒアルロン酸フラグメントは、３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントであることが好ましく、３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントであることがより好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするサーチュイン誘導剤。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項１記載のサーチュイン誘導剤。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項１記載のサーチュイン誘導剤。
【請求項４】
心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために用いられる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
【請求項５】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
【請求項６】
２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織修復剤。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項６記載の組織修復剤。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項６記載の組織修復剤。
【請求項９】
角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に用いられる、請求項６〜８のいずれか１つに記載の組織修復剤。
【請求項１０】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項６〜８のいずれか１つに記載の組織修復剤。
【請求項１１】
２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１２】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項１１記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１３】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項１１記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１４】
肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために用いられる、請求項１１〜１３のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１５】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１１〜１３のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１６】
２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織恒常性維持剤。
【請求項１７】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項１６記載の組織恒常性維持剤。
【請求項１８】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項１６記載の組織恒常性維持剤。
【請求項１９】
組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導するために用いられる、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
【請求項２０】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
【請求項２１】
２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＴＬＲ４作用剤。
【請求項２２】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項２１記載のＴＬＲ４作用剤。
【請求項２３】
前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項２１記載のＴＬＲ４作用剤。
【請求項２４】
角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、又は血管における疾患の治療及び／又は予防のために用いられる、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
【請求項２５】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸フラグメントを有効成分とするサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、及びＴＬＲ４作用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、関節、皮膚、脳などの細胞外マトリックスを構成する天然高分子として知られ、従来から、医薬品や化粧料に保湿成分として用いられている。【０００３】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖単位が連結した多糖類であり、その分子量によって、高分子量ヒアルロン酸、低分子量ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸フラグメントに分類される。高分子量ヒアルロン酸の分子量は一般的に１０万から１００万程度である。低分子量ヒアルロン酸の分子量は１万から１０万程度である。ヒアルロン酸フラグメントの分子量は、４００から１万程度である（非特許文献１）。そして、ヒアルロン酸は、生体内でも様々な生理活性を有しており、その生理活性は分子量によって大きく異なる（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ、  第２２８巻第１３２４〜１３２６頁（１９８５年）
【非特許文献２】Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ａｋｉｒａ  Ａｓａｒｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｅｄ：Ｇａｒｇ、ＨＧ  ａｎｄ  Ｈａｌｅｓ  ＣＡ、４５７〜４７３頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特に、ヒアルロン酸フラグメントの生理活性は、高分子量のヒアルロン酸や低分子量のヒアルロン酸とは非常に異なると考えられている。しかしながら、その機能や効用などは未だ明らかではなかった。【０００６】
本発明の目的は、ヒアルロン酸フラグメントを利用した、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするサーチュイン誘導剤。
［２］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［１］記載のサーチュイン誘導剤。
［３］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［１］記載のサーチュイン誘導剤。
［４］心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために用いられる、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
［５］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
［６］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織修復剤。
［７］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［６］記載の組織修復剤。
［８］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［６］記載の組織修復剤。
［９］角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に用いられる、上記［６］〜［８］のいずれか１つに記載の組織修復剤。
［１０］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［６］〜［８］のいずれか１つに記載の組織修復剤。
［１１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子誘導剤。
［１２］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［１１］記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１３］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［１１］記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１４］肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために用いられる、上記［１１］〜［１３］のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１５］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［１１］〜［１３］のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１６］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織恒常性維持剤。
［１７］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［１６］記載の組織恒常性維持剤。
［１８］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［１６］記載の組織恒常性維持剤。
［１９］組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導するために用いられる、上記［１６］〜［１８］のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
［２０］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［１６］〜［１８］のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
［２１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＴＬＲ４作用剤。
［２２］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［２１］記載のＴＬＲ４作用剤。
［２３］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［２１］記載のＴＬＲ４作用剤。
［２４］角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、又は血管における疾患の治療及び／又は予防のために用いられる、上記［２１］〜［２３］のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
［２５］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［２１］〜［２３］のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のサーチュイン誘導剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これによりサーチュイン蛋白質の発現を促進することができる。よって、例えば、心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために有効に用いられる。【０００９】
本発明の組織修復剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これにより組織を修復することができる。よって、例えば、角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復のために有効に用いられる。【００１０】
本発明の肝細胞増殖因子誘導剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これにより肝細胞増殖因子の発現を促進することができる。よって、例えば、肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために有効に用いられる。【００１１】
本発明の組織恒常性維持剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これにより組織の恒常性を維持することができる。よって、例えば、組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導するために有効に用いられる。【００１２】
本発明のＴＬＲ４作用剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これによりＴＬＲ４を介する作用を発揮できる。よって、例えば、角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、又は血管における疾患の治療及び／又は予防のために有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例１においてヒト表皮角化細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した染色像を示す写真である。
【図２】試験例１におけるサーチュイン蛋白質の発現量の結果を示す図表である。
【図３】試験例２における細胞溶解液におけるサーチュイン酵素活性（ｓｉｒｔ１酵素活性）の結果を示す図表である。
【図４】試験例３においてヒト表皮角化細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した染色像を示す写真である。
【図５】試験例３におけるヒト表皮角化細胞の大きさの変化の結果を示す図表である。
【図６】試験例４においてヒト表皮角化細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した染色像を示す写真である。
【図７】試験例４において分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の単位視野面積当りの細胞数の結果を示す図表である。
【図８】試験例５において分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の単位視野面積当りの細胞数の結果を示す図表である。
【図９】試験例６において分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の単位視野面積当りの細胞数の結果を示す図表である。
【図１０】試験例７においてヒト神経幹細胞（Gibco human neural stem cells (H9-Derived)）を抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体及び抗ヒトチューブリン抗体で二重染色した染色像を示す写真である。
【図１１】試験例８におけるサーチュイン蛋白質の発現量の結果を示す図表である。
【図１２】試験例９においてヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を抗ＮＦ−ｋａｐｐａＢ抗体で染色した染色像を示す写真である。
【図１３】試験例９におけるＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量の結果を示す図表である。
【図１４】試験例１０におけるＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量の結果を示す図表である。
【図１５】試験例１１において角膜に損傷を与えてから２４時間経過時のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。
【図１６】試験例１１において角膜に損傷を与えてから２４時間経過時の創傷部位の面積をグラフで示したものである。
【図１７】試験例１１において角膜に損傷を与えてから４８時間経過時のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。
【図１８】試験例１１において角膜に損傷を与えてから４８時間経過時の創傷部位の面積をグラフで示したものである。
【図１９】試験例１２において角膜に損傷を与えてから３３時間経過時ウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色したものである。
【図２０】試験例１４において保存前の無処置の肝臓又は臓器保存液で保存した後の肝臓の織切片の顕微鏡写真である。
【図２１】試験例１４における単位視野面積当りのｂｌｅｂ（泡沫）数の結果を示す図表である。
【図２２】試験例１５における血中ＧＯＴ値の結果を示す図表である。
【図２３】試験例１６において老化誘導したヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。
【図２４】試験例１７において老化誘導したヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。
【図２５】試験例１８において老化誘導したヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。
【図２６】試験例１９において老化誘導したヒト口腔由来上皮細胞（Ｃａ９−２２細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。
【図２７】試験例２０において老化誘導したヒト神経幹細胞（Gibco human neural stem cells (H9-Derived)）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。
【図２８】試験例２１において老化誘導したラット骨髄由来間葉系幹細胞に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。
【図２９】試験例２２において角化細胞マーカーＫｅｒａｔｉｎ Ｋ１４をヒト表皮角化細胞において検出した結果を示す図表である。
【図３０】試験例２３において角化細胞マーカーＦｉｌａｇｇｒｉｎをヒト表皮角化細胞において検出した結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（ヒアルロン酸フラグメント）
本発明で使用するヒアルロン酸フラグメントは、ヒアルロン酸の構成単位である、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとがグリコシド結合してなる二糖単位を少なくとも含み、２糖以上２０糖以下のサイズのものを意味する。具体的には、下記式（１）、式（２）、式（３）又は式（４）で表わされる構造を有するヒアルロン酸フラグメントである。
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ−ＧｌｃＮＡｃ    （１）
（式（１）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）ｎ    （２）
（式（２）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ−ＧｌｃＡ    （３）
（式（３）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎ    （４）
（式（４）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−はグリコシド結合を、ｎは０〜９の整数を示す。）
なお、上記式中のＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃにおけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡにおけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
【００１５】
本発明で使用するヒアルロン酸フラグメントは、上記基本構造を有すればよく、その糖部分が修飾されていることに、特に制限はない。例えば、糖の水酸基の一部またはすべては、エステル化、エーテル化等を受けていてもよい。グルクロン酸のカルボキシル基の一部またはすべては、エステル化、アミド化等を受けていてもよい。非還元末端に位置する糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。
【００１６】
上記ヒアルロン酸フラグメントは、そのサイズが２糖以上２０糖以下であるので、組織・細胞内に浸透しやすい。また、低粘度のため効率よく塗布するのにも適している。そのサイズは、３糖以上１０糖以下であることがより好ましい。これによれば、組織・細胞内に更により浸透しやすい。また、低粘度のため効率よく塗布するのにも更により適している。そのサイズは３糖又は４糖であることが最も好ましい。これによれば、前記効果とともに、組織・細胞に対する効果が、他のサイズのものに比べ顕著に優れている。
【００１７】
本発明においては、ヒアルロン酸フラグメントの薬学的に許容される塩を用いることもできる。その塩としては、アルカリ金属塩であるナトリウム塩やカリウム塩などが挙げられる。また、無水塩のみならず含水塩が含まれてもよい。その塩は、原料に由来するものであったり、また、ヒアルロン酸フラグメントの調製時に持ち込まれたりする場合もある。これらの塩は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸フラグメントと同様に機能する。
【００１８】
本発明においては、ヒアルロン酸フラグメントの薬学的に許容される溶媒和物を用いることもできる。溶媒和物としては、水和物が挙げられる。例えば、大気中に放置したり、再結晶することにより、水分を吸収したり、吸着水が付いたりして、水和物となる場合がある。また、ヒアルロン酸フラグメントの調製時に持ち込まれる場合もある。これらの溶媒和物は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸フラグメントと同様に機能する。
【００１９】
上記ヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物は、その１種類のみを用いてもよく、その２種以上の複数を用いてもよい。すなわち、ヒアルロン酸フラグメントのサイズや分子構造が単一であってもよく、それらの異なるヒアルロン酸フラグメントを併用し、又はそれらの異なるヒアルロン酸フラグメントの複数を含有する複合物を用いてもよい。更に、塩や溶媒和物についても、単一種であってもよく、それらの異なる複数種を併用し、又はそれらの異なる複数種を含有する複合物を用いてもよい。
【００２０】
（ヒアルロン酸フラグメントの製造方法）
本発明で使用するヒアルロン酸フラグメントは、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたものであってよく、また、化学的もしくは酵素的に合成されたものを使用してもよい。好ましくは、例えば鶏冠、臍体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法によって得ることができるヒアルロン酸を酵素分解、酸分解、塩基分解、加熱処理、超音波処理などの分解処理した後、公知の精製法によってヒアルロン酸フラグメントを精製することにより製造することができる。また、乳酸菌やストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によって生成されるヒアルロン酸を出発原料として同様に製造することができる。更には、市販の高分子量のヒアルロン酸を出発原料としてもよい。
【００２１】
酵素分解の方法によりヒアルロン酸フラグメントを製造する場合、国際公開第２００２／４４７１号パンフレットや、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１２巻、第７号、第４２１−４２６頁に開示される方法に準じて製造することができる。高分子量ヒアルロン酸塩を、溶液のｐＨが５付近になるように緩衝液（例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液）に溶解し、ヒアルロニダーゼを添加して加水分解を行う。加水分解の温度は、３７℃付近が好ましく、１〜２４時間程度反応させる。反応後、１０、０００ｒｐｍ程度で遠心分離して上清を回収し、この上清をイオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸フラグメントを得ることができる。
【００２２】
酸加水分解によりヒアルロン酸フラグメントを製造する場合、高分子量ヒアルロン酸塩を、濃塩酸の５０％水溶液中において、４０℃〜還流温度で１〜５時間程度反応させる。反応後、イオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸フラグメントを得ることができる。また、ＤＭＳＯの溶媒中に０．０５〜１Ｍ程度の塩酸を用いて加熱することにより、より緩和な条件下で加水分解を行うこともできる。
【００２３】
一方、Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779には、固相合成法によって、下記のようなヒアルロン酸フラグメントを、その糖サイズごとに効率よく製造する方法が開示されているので、そのような方法によって製造することもできる。
【００２４】
【化１】
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【００２５】
なお、上記のうち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）の基本的糖構成を有するヒアルロン酸フラグメントは、ヒアルロン酸を出発原料にしてそれを分解処理することによっては、ほとんど得られないか、あるいは非常に収率の悪いヒアルロン酸フラグメントである。
【００２６】
（剤形等）
本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤は、上記に説明したヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物（以下、単に「ヒアルロン酸フラグメント」という。）を、その有効成分として含有するものである。
【００２７】
ヒアルロン酸フラグメントの含有量は、本発明の効果を発揮すれば特に限定されるものではないが、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤の総質量に対して、０．０００１質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、０．５質量％以上５質量％以下であることが最も好ましい。
【００２８】
本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤は、例えば、医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いることができる。
【００２９】
医薬品の形態としては、例えば、錠剤、液剤、乾燥粉末剤、注射剤、点滴剤、外用剤、貼付剤、気化投与用の液剤、挿入剤などが挙げられる。この場合、１種又は２種以上の薬学的に許容される成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、添加剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料などを加えることができる。また、外用の形態で用いる場合には、例えば、ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤、イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水、グリセリン、ＰＥＧといった角質層の保湿のための保湿剤、エステル油、植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分）、原料成分を可溶化するための可溶化剤、ｐＨを調整するための緩衝剤、微生物を抑制し、腐敗を防止するための防腐剤、着色するための着色剤、紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤、収れん剤、殺菌剤、賦活剤、消炎剤などを加えることができる。
【００３０】
機能性食品の形態としては、例えば、液状食品、錠剤食品、粉末状食品、顆粒状食品などが挙げられる。この場合、食用として許容される１種又は２種以上の成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ナイアシン、ビタミンＥといったビタミン類、油脂類、増粘剤、防腐剤、着色料、並びに酸化防止剤、調味料、酸味料、甘味料などを加えることができる。
【００３１】
化粧料の形態としては、例えば、点眼剤、ゲル、クリーム、スプレー液剤、噴霧液剤、泡状エアゾール製剤、ゲル状やシート状のフェイスマスクなどが挙げられる。この場合、１種又は２種以上の化粧料製剤的に許容される成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤、イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水、グリセリン、ＰＥＧといった角質層の保湿のための保湿剤、エステル油、植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分）、原料成分を可溶化するための可溶化剤、ｐＨを調整するための緩衝剤、微生物を抑制し、腐敗を防止するための防腐剤、着色するための着色剤、紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤、収れん剤、殺菌剤、賦活剤、消炎剤などを加えることができる。
【００３２】
本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤を、医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いる場合、ヒアルロン酸フラグメントの含有量は、その医薬品、機能性食品、又は化粧料の総質量に対して、０．０００１質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、０．５質量％以上５質量％以下であることが最も好ましい。
【００３３】
本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤の投与形態としては、経口的に摂取したり、注射剤や点滴剤の形態にて静脈注射や灌流することにより投与したりすることができる。あるいは皮膚に塗布したり、呼吸器系から吸引したりして吸収させてもよく、それらの局所に適用してもよい。点眼投与であってもよい。いずれにしてもこれらの投与形態に特に制限されるものではない。また、ヒトだけでなく動物にも適用できる。
【００３４】
ヒアルロン酸フラグメントの１回あたりの投与量、投与間隔等は、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、経口摂取する場合には、成人１人１回当り１ｍｇ〜７５００ｍｇが例示される。また、皮膚に塗布する場合には、単位面積あたり一回およそ０．０１μｇ〜１０００μｇ／ｃｍ２の量が例示される。また、点眼投与する場合には、１回当り０．０１μｇ〜１０００μｇの適用量が例示される。
【００３５】
なお、ヒアルロン酸フラグメントは毒性や抗原性がほとんどないことから、副作用のおそれの極めて少ない、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤として有効に作用する。
【００３６】
（サーチュイン誘導剤）
サーチュイン蛋白質は、ＳＩＲＴ１遺伝子の翻訳産物であり、ヒストンを脱アセチル化する酵素である。サーチュイン蛋白質が発現した細胞では、ヒストンからアセチル基が外れ、ＤＮＡがヒストンに巻き付く力が強くなる。ＤＮＡがヒストンに強く巻き付いた結果、その領域の遺伝子の発現は低下し、これにより特定の遺伝子や転写因子の発現が調節される。また、ＤＮＡの損傷も減少する。サーチュイン蛋白質は、また、ストレス抵抗性、脂肪・グルコース代謝、神経細胞の分化など、さまざまな細胞機能の調節作用を担うことで細胞、組織又は生物個体の寿命の決定に関与している。
【００３７】
よって、本発明に係るサーチュイン誘導剤は、サーチュイン蛋白質の発現を促進することによって、細胞、組織、生物個体等の老化を抑制することができる。そして、生物個体を健康にたもち、その寿命を長くすることができる。また、細胞、生体組織レベルにおいても、その老化を抑制して、例えば、その活性維持や生存期間の延長を図ることができる。
【００３８】
更に、例えば、遺伝子操作でサーチュイン発現を高めてやると癌形成が抑制され、逆にサーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１遺伝子）をノックダウンすると癌形成が促進されることが報告されている（Kabra N, Li Z, Chen L, Li B, Zhang X, Wang C, Yeatman T, Coppola D, Chen J「SirT1 is an inhibitor of proliferation and tumor formation in colon cancer.」J Biol. Chem. 2009 Jul 3;284(27):18210-7.）。
【００３９】
また、サーチュイン誘導により心筋梗塞を治療できるという報告もある（Samuel SM, Thirunavukkarasu M, Penumathsa SV, Paul D, Maulik N「Akt/FOXO3a/SIRT1-mediated cardioprotection by n-tyrosol against ischemic stress in rat in vivo model of myocardial infarction: switching gears toward survival and longevity.」J Agric Food Chem. 2008 Oct 22;56(20):9692-8.）。
【００４０】
また、サーチュイン誘導により、血管内皮細胞の老化を抑制して、動脈硬化を防ぐという報告もある（Ota H, Eto M, Ogawa S, Iijima K, Akishita M, Ouchi Y「SIRT1/eNOS axis as a potential target against vascular senescence, dysfunction and atherosclerosis.」Journal of Atherosclerosis and Thrombosis Vol. 17 (2010) No. 5 p431-435.)。
【００４１】
また、サーチュイン誘導により、動脈狭窄・動脈硬化をもたらす因子であるレジスチン（resistin）が抑制されるという報告もある（Carter S, Miard S, Roy-Bellavance C, Boivin L, Li Z, Pibarot P, Mathieu P, Picard F「Sirt1 inhibits resistin expression in aortic stenosis.」PLoS One. 2012;7(4):e35110.)。
【００４２】
また、サーチュイン誘導により、骨破壊をもたらす破骨細胞におけるNF-kappaB活性化を抑制して、骨粗鬆症を防ぐという報告もある（Shakibaei M, Buhrmann C, Mobasheri A「Resveratrol-mediated SIRT-1 interactions with p300 modulate receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) activation of NF-kappaB signaling and inhibit osteoclastogenesis in bone-derived cells.」J Biol Chem. 2011 Apr 1;286(13):11492-505.)。
【００４３】
また、サーチュイン誘導により、炎症を増悪させる因子NF-kappaBの抑止し、炎症性腸炎の症状を軽減できるという報告もある（Singh UP, Singh NP, Singh B, Hofseth LJ, Price RL, Nagarkatti M, Nagarkatti PS「Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) induces silent mating type information regulation-1 and down-regulates nuclear transcription factor-kappaB activation to abrogate dextran sulfate sodium-induced colitis.」J Pharmacol Exp Ther. 2010 Mar;332(3):829-39.)。
【００４４】
また、サーチュイン蛋白質は、認知症（アルツハイマー病）の原因となっているアミロイドβ産生を抑制するという報告もある（Donmez G, Wang D, Cohen DE, Guarente L「SIRT1 suppresses beta-amyloid production by activating the alpha-secretase gene ADAM10.」Cell 2010 Jul 23;142(2):320-32.)。
【００４５】
また、種々のアルツハイマー病動物モデルにおいて、サーチュイン誘導により、治療効果が認められたという報告もある（Donmez G「The Effects of SIRT1 on Alzheimer's Disease Models.」Int J Alzheimers Dis. 2012;2012:509529.)。
【００４６】
また、脳卒中（脳虚血）モデルにおいて、ニコチンアミドリボースリン酸転移酵素（Nicotinamide phosphoribosyltransferase）よる脳障害の抑制作用には、サーチュイン蛋白質が関与しているという報告もある（Wang P, Xu TY, Guan YF, Tian WW, Viollet B, Rui YC, Zhai QW, Su DF, Miao CY「Nicotinamide phosphoribosyltransferase protects against ischemic stroke through SIRT1-dependent adenosine monophosphate-activated kinase pathway.」Ann Neurol. 2011 Feb;69(2):360-74.）。
【００４７】
また、サーチュイン蛋白質高発現モデル（遺伝子操作による）において、通常の動物に比べて、メタボリックシンドロームによる障害とそれに関連するがん化が抑制されたという報告もある（Herranz D, Munoz-Martin M, Canamero M, Mulero F, Martinez-Pastor B, Fernandez-Capetillo O, Serrano M「Sirt1 improves healthy ageing and protects from metabolic syndrome-associated cancer.」Nat Commun. 2010 Apr 12;1:3.）。
【００４８】
また、遺伝子操作でサーチュイン蛋白質発現を高めると癌形成が抑制され、逆にサーチュイン蛋白質発現を弱めると癌形成が促進されたという報告もある（Kabra N, Li Z, Chen L, Li B, Zhang X, Wang C, Yeatman T, Coppola D, Chen J「SirT1 is an inhibitor of proliferation and tumor formation in colon cancer.」J Biol Chem. 2009 Jul 3;284(27):18210-7.）。
【００４９】
また、大気微粒子に起因する肺の炎症や血栓に関し、サーチュイン蛋白質がその作用の抑制性因子であるという報告もある（Wu Z, Liu MC, Liang M, Fu J「Sirt1 protects against thrombomodulin down-regulation and lung coagulation after particulate matter exposure.」Blood. 2012 Mar 8;119(10):2422-9.）。
【００５０】
また、喫煙は、サーチュイン蛋白質を介した作用により肺の細胞にオートファジーをもたらし、これがＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）の要因であり、サーチュイン誘導により、そのオートファジーが抑制されたという報告もある（Hwang JW, Chung S, Sundar IK, Yao H, Arunachalam G, McBurney MW, Rahman I「Cigarette smoke-induced autophagy is regulated by SIRT1-PARP-1-dependent mechanism: implication in pathogenesis of COPD.」Arch Biochem Biophys. 2010 Aug 15;500(2):203-9.)。
【００５１】
また、腎臓の虚血再還流障害モデルにサーチュイン活性化剤を投与すると、腎臓における細胞死が抑制されて、腎障害が低減化されたという報告もある（Fan H, Yang HC, You L, Wang YY, He WJ, Hao CM「The histone deacetylase, SIRT1, contributes to the resistance of young mice to ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury.」Kidney Int. 2013 Jan 9.)。
【００５２】
また、サーチュイン誘導により、シスプラチンが誘導する腎臓の尿細管に対する毒性およびNF-kappaB活性化が低減化されたという報告もある（Jung YJ, Lee JE, Lee AS, Kang KP, Lee S, Park SK, Lee SY, Han MK, Kim DH, Kim W「SIRT1 overexpression decreases cisplatin-induced acetylation of NF-κB p65 subunit and cytotoxicity in renal proximal tubule cells.」Biochem Biophys Res Commun. 2012 Mar 9;419(2):206-10.)。
【００５３】
また、インスリン抵抗性の発生機序には、サーチュイン蛋白質が関与するという報告もある（Chen YR, Lai YL, Lin SD, Li XT, Fu YC, Xu WC「SIRT1 interacts with metabolic transcriptional factors in the pancreas of insulin-resistant and calorie-restricted rats.」Mol Biol Rep. 2013 Jan 6.)。
【００５４】
また、降圧薬テルミサルタンによる、インスリン感受性の向上の作用機序には、サーチュイン蛋白質が関与するという報告もある（Shiota A, Shimabukuro M, Fukuda D, Soeki T, Sato H, Uematsu E, Hirata Y, Kurobe H, Maeda N, Sakaue H, Masuzaki H, Shimomura I, Sata M「Telmisartan ameliorates insulin sensitivity by activating the AMPK/SIRT1 pathway in skeletal muscle of obese db/db mice.」Cardiovasc Diabetol. 2012 Nov 8;11:139.）。
【００５５】
また、サーチュイン蛋白質は、ヒト軟骨細胞においてＴＮＦαが誘導する炎症を制御するという報告もある（Moon MH, Jeong JK, Lee YJ, Seol JW, Jackson CJ, Park SY「SIRT1, a class III histone deacetylase, regulates TNF-α-induced inflammation in human chondrocytes.」Osteoarthritis Cartilage. 2013 Mar;21(3):470-80.)。
【００５６】
また、ヒトの軟骨細胞では、サーチュイン蛋白質を過剰発現させると、ＩＬ−１ｂｅｔａ処理しても変形性関節因子の発現が抑制されるという報告もある（Matsushita T, Sasaki H, Takayama K, Ishida K, Matsumoto T, Kubo S, Matsuzaki T, Nishida K, Kurosaka M, Kuroda R「The overexpression of SIRT1 inhibited osteoarthritic gene expression changes induced by interleukin-1β in human chondrocytes.」J Orthop Res. 2012 Nov 9.）。
【００５７】
また、サーチュイン蛋白質は、リウマチの増悪因子の作用に関与しているという報告もある。（Kok SH, Lin LD, Hou KL, Hong CY, Chang CC, Hsiao M, Wang JH, Lai EH, Lin SK「Simvastatin inhibits Cyr61 expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through the regulation of SIRT1/FoxO3a signaling.」Arthritis Rheum. 2012 Dec 12.)。
【００５８】
また、サーチュイン活性化剤により、プロジェリア（Progeria）モデル動物の疾患改善効果が示されたという報告もある。（Liu B, Ghosh S, Yang X, Zheng H, Liu X, Wang Z, Jin G, Zheng B, Kennedy BK, Suh Y, Kaeberlein M, Tryggvason K, Zhou Z「Resveratrol rescues SIRT1-dependent adult stem cell decline and alleviates progeroid features in laminopathy-based progeria.」Cell Metab. 2012 Dec 5;16(6):738-50.)。
【００５９】
また、放射線障害は、GAPDHの細胞質から核への移行により細胞死が誘導されることによりもたらされ、サーチュイン蛋白質はそのGAPDHの核移行を抑制し、細胞死を抑制したという報告もある。（Joo HY, Woo SR, Shen YN, Yun MY, Shin HJ, Park ER, Kim SH, Park JE, Ju YJ, Hong SH, Hwang SG, Cho MH, Kim J, Lee KH「SIRT1 interacts with and protects glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from nuclear translocation: implications for cell survival after irradiation.」Biochem Biophys Res Commun. 2012 Aug 10;424(4):681-6.)。
【００６０】
また、サーチュイン蛋白質には、筋線維を強化するだけでなく、筋肉を種々の疾患から保護する作用があるという報告もある。（Tonkin J, Villarroya F, Puri PL, Vinciguerra M「SIRT1 signaling as potential modulator of skeletal muscle diseases.」Curr Opin Pharmacol. 2012 Jun;12(3):372-6.)。
【００６１】
また、サーチュイン蛋白質を高発現させると海馬神経細胞の樹状突起形成が促進され、逆にサーチュイン阻害剤を作用させると、樹状突起は萎縮し、更に、サーチュイン蛋白質を高発現させると、アミロイドβ処理による樹状突起萎縮も抑制するので、これは、サーチュイン蛋白質が海馬などの脳神経組織の発達および維持をもたらしていることを意味するという報告もある。（Codocedo JF, Allard C, Godoy JA, Varela-Nallar L, Inestrosa NC「SIRT1 regulates dendritic development in hippocampal neurons.」PLoS One. 2012;7(10):e47073.)。
【００６２】
また、サーチュイン蛋白質は、高血圧を誘導する因子であるアンジオテンシンＩＩ（angiotensinII）を抑制するという報告もある（Li L, Gao P, Zhang H, Chen H, Zheng W, Lv X, Xu T, Wei Y, Liu D, Liang C「SIRT1 inhibits angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy.」Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2011 Feb;43(2):103-9.)。
【００６３】
また、サーチュイン誘導により、インシュリン抵抗性や肥満が抑制されるという報告もある（Li H, Xu M, Lee J, He C, Xie Z「Leucine supplementation increases SIRT1 expression and prevents mitochondrial dysfunction and metabolic disorders in high-fat diet-induced obese mice.」Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012 Nov 15;303(10):E1234-44.)。
【００６４】
よって、本発明に係るサーチュイン誘導剤は、特に、心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために、好ましく用いられる。
【００６５】
（組織修復剤）
本発明に係る組織修復剤は、生体組織の創傷部位や、欠損部位の組織の修復を促進するものである。より具体的には、生体組織の創傷部位や欠損部位の細胞増殖を促進し、又は細胞の分化を誘導することで、生体組織の創傷部位や、欠損部位の組織の修復を促進することができる。
【００６６】
例えば、褥瘡傷（床ずれ）、栄養性潰瘍、火傷、無痛性潰瘍、外傷後潰瘍、静脈および静脈炎後の静脈血腫による潰腫、皮膚病巣、皮膚移植および単純ヘルペスに由来する皮膚病変を含む種々の傷の処置に有用である。また、例えば、角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に、好ましく用いられる。
【００６７】
（肝細胞増殖因子誘導剤）
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、分子量約６万の重鎖と約３．５万の軽鎖がジスルフィド結合したヘテロダイマーの構造を有するタンパク質である。肝細胞増殖因子は生体内において合成された後、Ｎ末端シグナルペプチドの除去、細胞外への分泌を経て、ＨＧＦアクチベーター又はウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）などにより２本鎖に切断され活性型となる。
【００６８】
肝細胞増殖因子は、肝細胞の増殖を促進するだけでなく、主臓器由来の上皮細胞を中心に、血管内皮細胞、造血系細胞及び神経系細胞に働き、様々な細胞を活性化し、増殖を促す。また、皮膚等の賦活化にも関与している。例えば、肝細胞増殖因子は、上皮細胞である角化細胞、毛母、毛包細胞及び直下の血管内皮細胞に作用し、細胞を活性化する。更に、肝細胞増殖因子は、細胞運動性亢進作用、管腔形成などの形態形成誘導作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用および免疫応答調節作用なども有する。このように、肝細胞増殖因子は、生体内のおいて重要な役割を担っている。
【００６９】
よって、本発明に係る肝細胞増殖因子誘導剤は、肝細胞増殖因子の発現を促進することにより、肝臓、心臓、胃腸、血管、皮膚を含む各種の臓器や組織の細胞を活性化し、又はその活性を維持し、それらを炎症、細菌、ウイルス等の疾病因子や、経時的あるいは外的な損傷から保護することができる。特に、肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために、好ましく用いられる。
【００７０】
本発明に係る肝細胞増殖因子誘導剤の他の側面は、ＨＧＦの形態形成誘導作用や血管新生作用である。例えば、血管，皮膚や胃腸などの創傷治癒の効果を期待できる。また、肝炎などの肝障害、腎炎などの腎障害、肺炎などの肺障害などの各種炎症に対して著しい防止作用の効果を期待できる。
【００７１】
本発明に係る肝細胞増殖因子誘導剤の更に他の側面は、化粧料の形態で用いることに関する。本発明に係る化粧料は、ヒアルロン酸フラグメントを有することで、肝細胞増殖因子の発現を促進する効果を有する。このため、例えば皮膚の炎症を抑えることができる。また、生体表面の細胞を活性化することで、生体表面の細胞増殖を促進し、抗老化作用発揮できる。例えば、特開平５−２１３７３３号公報には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効成分とする日焼けによる肌荒れを改善し、皮膚の小ジワを改善する美肌効果に優れた皮膚化粧料が開示されている。本発明に係る化粧料も、この公報に開示された化粧料と同様、日焼けによる肌荒れを改善し、皮膚の小ジワを改善する美肌効果に優れた皮膚化粧料としても機能する。
【００７２】
（組織恒常性維持剤）
組織老化は、組織幹細胞の枯渇によることが報告されている(Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE「Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche.」Science. 2005 Feb 4;307(5710):720-4)。すなわち、組織老化は、組織において細胞が新生増殖しないことと、構成細胞が機能不全になることにより起こる。したがって、組織老化を防ぐには、＜1＞組織幹細胞の維持・増殖と＜2＞機能する細胞である成熟・分化した細胞の誘導ならびに＜3＞成熟・分化した細胞をなるべく機能するように保つことが必要である。
【００７３】
後述する実施例のヒト角化細胞とヒトneurosphereの例により、ヒアルロン酸フラグメントは、組織幹細胞の維持と分化誘導の両方をもたらすことが判明した。
【００７４】
よって、本発明に係る組織恒常性維持剤によれば、特に、組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導することにより、生体組織レベルにおいて、その老化を抑制して、例えば、その活性維持や生存期間の延長を図ることができる。
【００７５】
（ＴＬＲ４作用剤）
後述する実施例により、ヒアルロン酸フラグメントは、サーチュイン蛋白質の発現を促進し、その発現誘導はＴＬＲ４（ｔｏｌｌ様レセプター４）を介する作用によりもたらされることが判明した。また、ヒアルロン酸フラグメントは、ＴＮＦ−α処理によって引き起こされるＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量の増加を抑制し、その抑制もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。更に、ヒアルロン酸フラグメントは、種々の原因に起因する細胞老化を抑制する作用効果を有し、その抑制もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。更にまた、ヒアルロン酸フラグメントは、組織保存液に保存した後の組織の障害を軽減する作用効果を有し、その軽減もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。更にまた、ヒアルロン酸フラグメントは、細胞分化を誘導し、その誘導もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。
【００７６】
ＴＬＲ４（ｔｏｌｌ様レセプター４）は、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）を認識する受容体として見出され、例えば、炎症をもたらすＮＦ−ｋａｐｐａＢを活性化させる受容体であることが知られている。また、ＮＦ−ｋａｐｐａＢの活性化以外にも、ＴＬＲ４は、以下の文献に示すように、角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、血管など各臓器・細胞に発現し、様々な生理機能に関与していることが知られている。よって、そのＴＬＲ４を利用して、下記記載の種々の疾患の治療・予防に応用できる。
【００７７】
・角膜（角膜上皮、ケラトサイト）
角膜疾患：ドライアイ、角膜上皮障害、角膜上皮剥離、炎症による角膜組織破壊など
Johnson AC, Heinzel FP, Diaconu E, Sun Y, Hise AG, Golenbock D, Lass JH, Pearlman E「Activation of toll-like receptor (TLR)2, TLR4, and TLR9 in the mammalian corneainduces MyD88-dependent corneal inflammation.」Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Feb;46(2):589-95.
【００７８】
・皮膚（keratinocytes、ラングハンス細胞、線維芽細胞）
皮膚疾患：褥瘡，皮膚潰瘍、感染・炎症による皮膚組織破壊など
1. Tuon FF, Fernandes ER, Duarte MI, Amato VS「The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 in the epidermisof patients with cutaneous leishmaniasis.」J Dermatol Sci. 2010 Jul;59(1):55-7.
2. Yuan ZQ, Bennett L, Campo MS, Nasir L「Bovine papillomavirus type 1 E2 and E7 proteins down-regulate Toll Like Receptor 4 (TLR4) expression in equine fibroblasts.」Virus Res. 2010 Apr;149(1):124-7.
3. Wang X, Bi Z, Wang Y, Wang Y「Increased MAPK and NF-κB expression of Langerhans cells is dependent on TLR2 and TLR4, and increased IRF-3 expression is partially dependent on TLR4following UV exposure.」Mol Med Report. 2011 May-Jun;4(3):541-6.
【００７９】
・肝臓（肝実質細胞、クッパー細胞）
急性肝炎、慢性肝炎、肝移植障害など
1. Sahin H, Borkham-Kamphorst E, do O NT, Berres ML, Kaldenbach M, Schmitz P, Weiskirchen R, Liedtke C, Streetz KL, Maedler K, Trautwein C, Wasmuth HE「Proapoptotic effects of the chemokine, CXCL 10 are mediated by the noncognate receptor TLR4 in hepatocytes.」Hepatology. 2012 Sep 19. doi: 10.1002/hep.26069.
2. Bai T, Lian LH, Wu YL, Wan Y, Nan JX「Thymoquinone attenuates liver fibrosis via PI3K and TLR4 signaling pathways in activated hepatic stellate cells.」Int Immunopharmacol. 2013 Jan 12;15(2):275-281.
【００８０】
・神経組織（神経細胞、マイクログリア細胞）
神経障害：認知症、神経発達障害、神経組織変性、神経分化阻害など
1. Capiralla H, Vingtdeux V, Zhao H, Sankowski R, Al-Abed Y, Davies P, Marambaud P「Resveratrol mitigates lipopolysaccharide- and Aβ-mediated microglial inflammation by inhibiting the TLR4/NF-κB/STAT signaling cascade.」J Neurochem. 2012 Feb;120(3):461-72.
2. Okun E, Barak B, Saada-Madar R, Rothman SM, Griffioen KJ, Roberts N, Castro K, Mughal MR, Pita MA, Stranahan AM, Arumugam TV, Mattson MP「Evidence for a developmental role for TLR4 in learning and memory.」PLoS One. 2012;7(10):e47522.
3. Hutchinson MR, Zhang Y, Brown K, Coats BD, Shridhar M, Sholar PW, Patel SJ, Crysdale NY, Harrison JA, Maier SF, Rice KC, Watkins LR「Non-stereoselective reversal of neuropathic pain by naloxone and naltrexone: involvement of toll-like receptor 4 (TLR4).」Eur J Neurosci. 2008 Jul;28(1):20-9.
【００８１】
・腎臓（メザンギウム細胞、腎上皮細胞）
腎炎、腎症など
1. Lee IT, Shih RH, Lin CC, Chen JT, Yang CM「Role of TLR4/NADPH oxidase/ROS-activated p38 MAPK in VCAM-1 expression induced by lipopolysaccharide in human renalmesangial cells.」Cell Commun Signal. 2012 Nov 15;10(1):33.
2. Good DW, George T, Watts BA 3rd「Lipopolysaccharide directly alters renal tubule transport through distinct TLR4-dependent pathways in basolateral and apical membranes.」Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Oct;297(4):F866-74.
【００８２】
・肺（上皮細胞、stromal cell、平滑筋）
肺炎、ＣＯＰＤ、虚血再環流障害など
1. Perros F, Lambrecht BN, Hammad H「TLR4signalling in pulmonary stromal cells is critical for inflammation and immunity in the airways.」Respir Res. 2011 Sep 24;12:125.
2. Su HY, Mo BW, Wei JH, Huang JW, Wang CM, Zeng JR, Xu Q, Lin Y「Effect of TLR4 on the migration of asthmatic airway smooth muscle cells induced by airway epithelial cells.」Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2012 Mar;28(2):103-6.
【００８３】
・心臓（心筋）
心筋梗塞、狭心症など
Frantz S, Kobzik L, Kim YD, Fukazawa R, Medzhitov R, Lee RT, Kelly RA「Toll4 (TLR4) expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium.」J Clin Invest. 1999 Aug;104(3):271-80.
【００８４】
・骨格筋（骨格筋細胞）
筋萎縮、多発筋炎、重症筋無力症、筋ジストロフィーなど
Zbinden-Foncea H, Raymackers JM, Deldicque L, Renard P, Francaux M「TLR2 and TLR4 activate p38 MAPK and JNK during endurance exercise in skeletal muscle.」Med Sci Sports Exerc. 2012 Aug;44(8):1463-72.
【００８５】
・膵臓
膵炎
1. Akbarshahi H, Axelsson JB, Said K, Malmstrom A, Fischer H, Andersson R「TLR4 dependent heparan sulphate-induced pancreatic inflammatory response is IRF3-mediated.」J Transl Med. 2011 Dec 21;9:219.
2. Awla D, Abdulla A, Regner S, Thorlacius H「TLR4 but not TLR2 regulates inflammation and tissue damage in acute pancreatitis induced by retrograde infusion of taurocholate.」Inflamm Res. 2011 Dec;60(12):1093-8.
【００８６】
・動脈（平滑筋）
動脈硬化など
Li H, Xu H, Sun B「Lipopolysaccharide regulates MMP-9 expression through TLR4/NF-κB signaling in human arterial smooth muscle cells.」Mol Med Report. 2012 Oct;6(4):774-8.
【００８７】
よって、本発明に係るＴＬＲ４作用剤によれば、そのＴＬＲ４を介する作用によって、各種の疾患を治療及び／又は予防することができる。例えば、ドライアイ、角膜上皮障害、角膜上皮剥離、炎症による角膜組織破壊などの角膜疾患；褥瘡，皮膚潰瘍、感染・炎症による皮膚組織破壊などの皮膚疾患；急性肝炎、慢性肝炎、肝移植障害などの肝臓疾患；認知症、神経発達障害、神経組織変性、神経分化阻害などの神経組織疾患；腎炎、腎症などの腎臓疾患；肺炎、ＣＯＰＤ、虚血再環流障害などの肺疾患；心筋梗塞、狭心症などの心臓疾患；筋萎縮、多発筋炎、重症筋無力症、筋ジストロフィーなどの骨格筋疾患；膵炎などの膵臓疾患；動脈硬化などの血管疾患などにおける疾患の治療及び／又は予防のために、好適に用いられる。
【実施例】
【００８８】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【００８９】
下記に試験例において用いたヒアルロン酸フラグメントをまとめて示す。【００９０】
（１）４ｍｅｒ
・「ＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ４ＥＦ−５」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
これは、ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）１−ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた４糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。【００９１】
（２）６ｍｅｒ
・「ＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ６ＥＦ−１」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
これは、ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）２−ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた６糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。【００９２】
（３）８ｍｅｒ
・「ＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ８ＥＦ−１」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
これは、ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）３−ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた８糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。【００９３】
（４）１０ｍｅｒ
・「ＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ１０ＥＦ−１」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
これは、ＧｌｃＡ（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ）４−ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた８糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。【００９４】
（５）Ｌ３ｍｅｒ
・下記（ａ）の構造を有するヒアルロン酸フラグメント【００９５】
【化２】
2013125634.tif 000004
これは、固相合成法（Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779）により化学合成して精製して得られた３糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。【００９６】
（６）Ｌ４ｍｅｒ
・下記（ｅ）の構造を有するヒアルロン酸フラグメント【００９７】
【化３】
2013125634.tif 000005
これは、固相合成法（Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779）により化学合成して精製して得られた４糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。【００９８】
＜試験例１＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導  その１）
ヒト表皮角化細胞（正常ヒト角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、アジア人女性（２７歳）由来））を培養し、準備した。ヒト表皮角化細胞は、長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。その後、細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌの培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培地（Ｇｉｂｃｏ社製「ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ＳＦＭ」）、又はこれにヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した各濃度の同培地に替え、２４時間培養した。【００９９】
２４時間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した。抗ヒトＳＩＲＴ１抗体は、ヒトのサーチュイン蛋白質を認識し、染色する抗体である。染色した細胞を、ニコン社製の顕微鏡を用いて観察し、細胞の形状及び細胞の染色像を撮影した。【０１００】
図１にはその染色像の写真を示す。図１（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｂ）は、０．０１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｃ）は、０．１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｄ）は、１．０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｅ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。【０１０１】
図１（ａ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞では、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の数は少なく、染色された細胞では、細胞全体が薄く染色された。【０１０２】
一方、図１（ｂ）〜（ｅ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞では、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の数が増加し、細胞の核が特に濃く染色された。これらの結果から、ヒト表皮角化細胞でのサーチュイン蛋白質の発現が、ヒアルロン酸フラグメントにより促進されていることがわかる。【０１０３】
上記の染色像を、画像解析ソフト（フリーソフト「Ｉｍａｇｅ Ｊ」）を用いて解析した結果を表１示す。また、図２には、表１の結果をグラフで示す。なお、この結果の染色強度は、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体による染色の程度を示しており、その値が高いほど、サーチュイン蛋白質の発現量が多いといえる。【０１０４】
【表１】
2013125634.tif 000006
【０１０５】
表１又は図２に示されるように、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度のヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞では、サーチュイン蛋白質の発現量が、ヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の発現量に比べて有意に増加していることがわかる。【０１０６】
＜試験例２＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導  その２）
ヒアルロン酸フラグメントの最終濃度を１０ｎｇ／ｍｌとし、そのサイズを４糖（４ｍｅｒ）、６糖（６ｍｅｒ）、１０糖（１０ｍｅｒ）と替えて行なった以外は、試験例１と同様にしてヒト表皮角化細胞を処理し、その細胞溶解液におけるサーチュイン酵素活性（ｓｉｒｔ１酵素活性）を測定した。比較のため、１０ｋＤａ又は９００ｋＤａのヒアルロン酸や、サーチュイン活性化剤であることが知られているレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）についても、同じく１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。また、遺伝子組み換え手法により作成されたヒトサーチュイン組み換え蛋白質（recombinant human sirt 1）を測定系を検証する物質として用いた。なお、サーチュイン酵素活性は、細胞の粗抽出液を「CycLex SIRT1/Sir2 Deacetylase Fluorometric Assay Kit」（商品名、サイクレックス社）に供し、キットのプロトコルに従い測定した。その結果を図３に示す。【０１０７】
図３に示されるように、４糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）では、その測定値が陰性対照に比べ約３倍となった。サーチュイン活性化剤として知られているレスベラトロールは同じ量を添加しても変化を示さなかったことから、４糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）によるサーチュイン酵素活性の誘導効果が顕著であることが分かる。【０１０８】
＜試験例３＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導  その３）
試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞のサーチュイン誘導試験を行なった。【０１０９】
図４には、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の染色像の写真を示す。図４（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図４（ｂ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。【０１１０】
図４に示されるように、図４（ａ）の陰性対照においては、主として丸く小さな細胞にサーチュイン蛋白質の発現が見られた（図中、矢印をもってその細胞を示す。）。また、細胞体が比較的小さな未熟細胞が多かった。一方、図４（ｂ）に示すように、ヒアルロン酸フラグメントの処理により、より大きなサイズの細胞すなわち成熟した細胞が多く出現し、その細胞にサーチュイン蛋白質の発現が見られた（図中、矢印をもってその細胞を示す。）。【０１１１】
細胞の大きさの変化について、画像解析ソフト（「Ｉｍａｇｅ Ｊ」）を用いて解析した。その結果を表２示す。また、図５には、表２の結果をグラフで示す。なお、この結果のピクセル数は、１つ細胞の画像上での面積を示しており、その値が高いほど、細胞が大きいといえる。【０１１２】
【表２】
2013125634.tif 000007
【０１１３】
表２又は図５に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントによる２４時間の処理で、より大きな細胞が出現したことがわかる。別途、Alcian blue染色により細胞外基質分泌が通常どおりであることが確認されたことから、細胞の活性（vaibility）は衰えておらす、このような形態変化は細胞の老化を示す肥大ではなく、分化によるものと考えられた。なお、ここには最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）で処理したときの結果を示したが、４糖サイズ（４ｍｅｒ）、６糖サイズ（６ｍｅｒ）、８糖サイズ（８ｍｅｒ）のいずれのヒアルロン酸フラグメントを使用した場合も、また最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌのいずれの処理においても、同様の形態変化が認められた。【０１１４】
＜試験例４＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導  その４）
試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞のサーチュイン誘導試験を行なった。【０１１５】
図６には、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の染色像の写真を示す。この図６は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で２４時間培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。【０１１６】
図６に矢印で示した分裂中の細胞は、他に比べて小さく、そのような細胞においてサーチュイン蛋白質が高発現していた。一般的に、組織幹細胞は成熟した細胞に比べ高い増殖能（分裂能）を有しており、その形態上も、成熟した細胞に比べて小さいことが知られている。また、サーチュイン蛋白質は幹細胞において高発現していることが報告されている。よって、図６に矢印で示した、サーチュイン蛋白質が高発現している分裂中の細胞は、ヒト表皮角化細胞の幹細胞であることがわかる。【０１１７】
図７には、図６に矢印で示した細胞と同様な、分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の細胞数についてまとめた結果を示す。結果は、観察した画像視野中での平均数で示す。【０１１８】
図７に示されるように、最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）、又は最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）で処理したときのいずれの場合も、陰性対照に比べて、ヒト表皮角化細胞の幹細胞におけるサーチュイン蛋白質の発現が顕著に促進されていた。【０１１９】
＜試験例５＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導  その５）
試験例４と同様にして、分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞を観察した。また、その際、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて１μｇ／ｍｌのＴＬＲ４／ＭＤ２（遺伝子組み換え手法により作成されたＴＬＲ４（ｔｏｌｌ様レセプター４）蛋白質、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）を加えた培養液で培養したヒト表皮角化細胞についても、同様に観察した。図８にその結果を示す。【０１２０】
図８に示されるように、ヒト表皮角化細胞の幹細胞でのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）によるサーチュイン誘導は、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によって完全に阻害された。このことは、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）は、細胞表面のＴＬＲ４受容体に結合することによって、サーチュイン誘導を引き起こしていることを意味していた。よって、ＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、ヒアルロン酸フラグメントは、ＴＬＲ４を介する作用により、ヒト表皮角化細胞の幹細胞のサーチュイン誘導が起こし、ひいては幹細胞の増殖を引き起こすことが明らかとなった。【０１２１】
＜試験例６＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導  その６）
ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に替えて、化学合成品である３糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を用いて、試験例５と同様の試験を行なった。その結果を図９に示す。【０１２２】
図９に示されるように、化学合成品である３糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）によっても、ヒト表皮角化細胞の幹細胞でのヒサーチュイン誘導がもたらされた。そして、それが、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によってほぼ完全に阻害された。このことは、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）は、細胞表面のＴＬＲ４受容体に結合することによって、サーチュイン誘導を引き起こしていることを意味している。よって、ヒト表皮角化細胞の幹細胞のＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、サーチュイン誘導が起こり、ひいては幹細胞の増殖が引き起こされることが、更に確認できた。【０１２３】
＜試験例７＞（ヒト神経幹細胞に対するＬ３ｍｅｒの作用）
ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （Ｈ９-Ｄｅｒｉｖｅｄ）」Ｇｉｂｃｏ社製）を、培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。その後、細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌの培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）、又はヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した同培地に替え、１２日間培養した。【０１２４】
１２日間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体及び抗ヒトチューブリン抗体で二重染色した。なお、Ｎｅｓｔｉｎは、神経幹細胞に特異的に発現している蛋白質であり、神経幹細胞マーカーである。染色した細胞を、ニコン社製の顕微鏡を用いて観察し、細胞の形状及び細胞の染色像を撮影した。【０１２５】
図１０にはその染色像の写真を示す。図１０（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体による染色像を示したものである。図１０（ｂ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトチューブリン抗体による染色像を示したものである。図１０（ｃ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体による染色像を示したものである。図１０（ｄ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトチューブリン抗体による染色像を示したものである。【０１２６】
図１０（ａ）、（ｂ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）では、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎの発現が確認できたが、細胞分化の指標であるチューブリンの発現が弱く、その形態上、突起形成も認められなかった。【０１２７】
一方、図１０（ｃ）、（ｄ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）では、Ｎｅｓｔｉｎとチューブリンの発現がともに確認でき、その形態上の突起形成も認められた。これらの結果から、ヒアルロン酸フラグメントは、ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の幹細胞性を維持（Ｎｅｓｔｉｎ発現）しながら、神経細胞分化（突起形成およびチューブリン発現）を誘導していることがわかる。【０１２８】
＜試験例８＞（ヒト大腸上皮細胞におけるサーチュイン誘導）
ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、２４時間培養した。【０１２９】
２４時間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。その結果を図１１に示す。【０１３０】
図１１に示されるように、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）においても、ヒアルロン酸フラグメントの処理によりサーチュイン誘導がもたらされた。そして、それが、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によってほぼ完全に阻害された。よって、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）においても、ＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、サーチュイン誘導が引き起こされることが明らかとなった。【０１３１】
＜試験例９＞（ヒト大腸上皮細胞におけるＮＦ−ｋａｐｐａＢ発現に対する作用  その１）
ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）をＴＮＦ−α処理したときのＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。なお、ＮＦ−ｋａｐｐａＢは、炎症、組織破壊などに関与する転写因子である。【０１３２】
ＴＮＦ−αにヒアルロン酸フラグメントを添加したＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）と添加しないＤＭＥＭ培地を用意し、この培地でヒト大腸上皮細胞を２４時間処理した。その後、活性化した（リン酸化した）ＮＦｋａｐｐａＢを認識する抗体で染色した。【０１３３】
図１２は、ＮＦ−ｋａｐｐａＢを蛍光染色したヒト大腸上皮細胞の様子を撮影したものである。図１２（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメント及びＴＮＦ−αを添加していない培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｂ）は、ＴＮＦ−α処理のみをし、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｃ）は、ＴＮＦ−αおよび１０ｎｇ／ｍｌの４糖ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｄ）は、ＴＮＦ−αおよび１０ｎｇ／ｍｌの４糖及び６糖のヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒと６ｍｅｒを各５ｎｇ／ｍｌ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｅ）は、ＴＮＦ−αおよび１０ｎｇ／ｍｌの６糖のヒアルロン酸フラグメント（６ｍｅｒ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｆ）は、ＴＮＦ−αおよび１０ｎｇ／ｍｌの８糖のヒアルロン酸フラグメント（８ｍｅｒ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｇ）は、ＴＮＦ−α処理をし、１０ｎｇ／ｍｌの９００ｋＤａのヒアルロン酸を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。【０１３４】
図１２（ａ）及び図１２（ｂ）を比較すると、ヒト大腸上皮細胞をＴＮＦ−α処理すると、ＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量が増加しているのがわかる。ＮＦ−ｋａｐｐａＢは老化により発現量が増えるタンパク質であるため、老化の指標タンパク質となるものであ（Salminen A、 Kaarniranta K. Genetics vs. entropy: longevity factors suppress the NF-kappaB-driven entropic aging process. Ageing Res Rev. 2010 Jul; 9(3): 298-314）。つまり、図１２（ｂ）では、ＴＮＦ−α処理によって、細胞の老化が進行していることがわかる。一方、図１２（ｃ）〜図１２（ｆ）では、ヒアルロン酸フラグメントを添加することにより、ＴＮＦ−α処理をしたにも関わらず、ＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現が抑えられていることがわかる。図１２（ｇ）では、９００ｋＤａの高分子量のヒアルロン酸を添加した。図１２（ｇ）においても、ＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量の減少は見られるが、ヒアルロン酸フラグメントを添加した場合ほどの減少は見られなかった。これらの結果から、ヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞では、ＴＮＦ−α処理によって引き起こされるＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量の増加を抑制することがわかった。【０１３５】
図１３は、蛍光染色したＮＦ−ｋａｐｐａＢの蛍光強度をグラフで示したものである。グラフの縦軸は、蛍光強度を示す。４〜８糖のヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞では、ＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量が有意に減少していることがわかる。さらに、ヒアルロン酸フラグメントは４糖のものが、最もＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現量の増加を抑制することができることがわかった。【０１３６】
以上の結果より、ヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞培養液で細胞を培養した場合、細胞の老化を抑制することがわかった。【０１３７】
＜試験例１０＞（ヒト大腸上皮細胞におけるＮＦ−ｋａｐｐａＢ発現に対する作用  その２）
ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ＴＮＦ−αを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、そのＴＮＦ−αに加えて更にヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのＴＮＦ−αとヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、２４時間培養した。【０１３８】
２４時間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗リン酸化ＮＦ−ｋａｐｐａＢ抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。その結果を図１４に示す。【０１３９】
図１４に示されるように、この試験例においても、ＴＮＦ−α処理によるヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）のＮＦ−ｋａｐｐａＢの発現が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により抑制された。そして、それが、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によって完全に阻害された。よって、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）のＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ発現の抑制が引き起こされることが明らかとなった。【０１４０】
＜試験例１１＞（角膜損傷に対する作用効果  その１）
角膜損傷に対するヒアルロン酸フラグメントの作用効果を調べた。被検点眼液としては以下のものを準備した。【０１４１】
（被検点眼液）
・ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒと４ｍｅｒを同濃度で混合したもの）を最終濃度が０．１ｗ/ｖ％となるように生理食塩水に溶解したもの
・平均分子量５０万〜１２０万のヒアルロン酸を有効成分として０．１ｗ/ｖ％含有する点眼液【０１４２】
・生理食塩水
試験には２２〜２４ヶ月齢のウサギ（体重３〜４ｋｇ）を６頭使用した。６頭のウサギの両眼にｎ−ヘプタノール０．０５ｍｌを浸したろ紙（直径１ｃｍの円）を置き、ウサギ眼に角膜に創傷を与えた。その後、２時間、６時間、２４時間、２７時間、３０時間後に、ウサギの１眼に被検点眼液を０．０５ｍｌ滴下した。これと同時に、ウサギの他の１眼には、生理食塩水を０．０５ｍｌ滴下し、これをコントロールとした。【０１４３】
角膜に損傷を与えてから２４時間後及び４８時間後に、ニコン社製のカメラを用いて、ウサギの眼の角膜を撮影した。蛍光剤（ＦＩＴＣ）は創傷部位に接着することを利用して、ウサギにこれを点眼し、角膜の創傷部位面積を、画像解析ソフト（「ＮＩＨイメージ」）にて測定した。【０１４４】
図１５は、角膜に損傷を与えてから２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。ウサギの眼の角膜の創傷部位は、破線で示している。図１５（ａ）には、生理食塩水を滴下した場合の、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位は、ウサギの黒目部分よりも大きく、全体に広がっていた。図１５（ｂ）には、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位は、ウサギの黒目部分よりも小さい範囲に収まっていた。よって、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の創傷部位は、生理食塩水を滴下した場合に比べ、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の方が小さくなっていることがわかる。一方、図１５（ｃ）には、平均分子量５０万〜１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位は、生理食塩水を滴下した場合に比べて若干小さくなったが、その縮小はあまり顕著ではなかった。【０１４５】
図１６は、角膜に損傷を与えてから２４時間経過後の創傷部位の面積をグラフで示したものである。生理食塩水を滴下した場合の創傷部位の面積の平均が、１４０００ピクセルであるのに対し、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の創傷部位の面積の平均は、１１０００ピクセルと値が小さくなっているのがわかる。一方、平均分子量５０万〜１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の面積の平均は１３５００ピクセルとなり、その値の減少は有意ではないことがわかる。【０１４６】
図１７は、角膜に損傷を与えてから４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。ウサギの眼の角膜の創傷部位は、破線で示している。図１７（ａ）には、生理食塩水を滴下した場合の、４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位の面積は、２４時間経過後と比較して小さくなっているが、創傷部位は、残ったままであった。図１７（ｂ）には、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の、４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合は、４８時間経過後には、創傷部位は完全に消失していた。よって、生理食塩水を滴下した場合は、４８時間経過後でも創傷部位が残ったままであるが、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合は、創傷部位が完全に治癒していることがわかる。一方、図１７（ｃ）には、平均分子量５０万〜１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の、４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。生理食塩水を滴下した場合に比べて面積は小さいが、創傷部位が残存していた。【０１４７】
図１８は、角膜に損傷を与えてから４８時間経過後の創傷部位の面積をグラフで示したものである。生理食塩水を滴下した場合の創傷部位の面積の平均が、９５０ピクセルであるのに対し、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の創傷部位の面積の平均は、０ピクセルと創傷部位が消失していることがわかる。一方、平均分子量５０万〜１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の面積の平均は５２０ピクセルとなり、その値の減少があまり顕著ではないことがわかる。【０１４８】
以上の結果より、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合、傷つけらえた眼の角膜に治癒時間が短縮されるとういことがわかった。つまり、ヒアルロン酸フラグメントは組織を修復させるということがわかった。【０１４９】
＜試験例１２＞（角膜損傷に対する作用効果  その２）
試験例１１と同様に、ウサギ角膜に損傷を与えて、損傷後に被検液を点眼し、その損傷を与えてから３３時間後に、ウサギの眼の角膜組織を採取した。角膜組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋した標本及び凍結包埋した標本を作製した。このパラフィン包埋した標本から薄切切片を作製し、薄切切片にヘマトキシリン・エオシン染色を施した。染色した、角膜組織を、オリンパス社製の顕微鏡によって観察し、角膜組織の角膜上皮の様子を記録した。【０１５０】
図１９は、ウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色したものである。図１９（ａ）には、生理食塩水を滴下した場合の、３３時間経過後のウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色した様子を示す。色が濃い部分が角膜上皮を示しており、角膜上皮が非常に薄い状態であることがわった。図１９（ｂ）には、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の、３３時間経過後のウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色した様子を示す。この場合、広範囲に渡り、角膜上皮が厚く形成されていることがわった。また、角膜上皮に複数の細胞の層が形成されていることがわかった。【０１５１】
一方、図１９（ｃ）には、平均分子量５０万〜１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の、３３時間経過後のウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色した様子を示す。この場合、角膜上皮において空胞（図中、矢印で示す。）、ならび角膜実質細胞（ｋｅｒａｔｏｃｙｔｅｓ）の活性化（通常は扁平であるが紡錘形を呈した）が認められた（図中、他の矢印で示す。）。この結果は、高分子量のヒアルロン酸が、組織に対するなんらかのダメージを与えていることを示していた。ヒアルロン酸フラグメントでは、このような組織のダメージは観察されず、角膜損傷を治療するための組織修復剤として、より優れていることが明らかとなった。【０１５２】
以上の結果より、ヒアルロン酸フラグメントは、創傷部位やその周辺部位の細胞増殖を促進させることがわかった。また、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合においては、角膜上皮の形成が進み、複数の細胞層が形成されることがわかった。これにより、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合には、創傷部位で、細胞の分化が誘導されていることがわかった。つまり、ヒアルロン酸フラグメントは、細胞増殖を促進することに加え、細胞分化の誘導及び組織修復も行うことができることがわかった。【０１５３】
＜試験例１３＞（ヒト表皮角化細胞における肝細胞増殖因子誘導）
ヒト表皮角化細胞（正常ヒト角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、アジア人女性（２７歳）由来））を、それぞれ、４糖のヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）１０ｎｇ／ｍｌを含んだ培地と含まない培地（無処置）で２４時間培養した。培地は、ＤＳファーマバイオメディカル社の正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地を用いた。培養後に細胞を回収し、これをＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）で解析した。【０１５４】
表３は、ヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞培養液又はヒアルロン酸フラグメントを添加していない細胞培養液で培養した正常ヒト角化細胞の蛍光（Ｃｙ５）の強度を示している。【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
表３の結果より、ヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞培養液で細胞を培養した場合、肝細胞増殖因子の発現量が２倍に増加することがわかった。【０１５７】
＜試験例１４＞（老齢ラット肝臓に対する作用効果  その１）
老齢ラット肝臓に対するヒアルロン酸フラグメントの作用効果を調べた。試験液としては以下のものを準備した。【０１５８】
（試験液）
・臓器保存液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液：臓器保存に使用されているスタンダードな液）
・ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解したもの
・ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解したもの
・ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解し、且つＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解したもの【０１５９】
ＳＤ系ラット２４ヶ月齢（老齢）の肝門脈から各試験液を注入し、７．５ｍｌを灌流させた後、同じ液で３７℃で６時間保存した。肝臓をＯＣＴコンパウンドに包埋し凍結して作製したブロックから切片を作製し、これを顕微鏡観察に供した。【０１６０】
図２０にはその顕微鏡像の写真を示す。図２０（ａ）は、保存前の無処置の肝臓の組織切片の様子を示したものである。保存前では類洞が明確に観察できた。図２０（ｂ）は、臓器保存液に何も添加しないで保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。臓器保存液で保存すると、類洞が不明確になり（類同狭窄）、ｂｌｅｂ（泡沫）が多数出現した（細胞障害）。なお、虚血肝臓組織に出現するｂｌｅｂ（泡沫）は、虚血によるＡＴＰレベルの低下→ミトコンドリアから細胞質へのＣａイオンの流出→Ｃａイオン依存性蛋白分解酵素の活性化と細胞骨格系の障害の結果惹起される。この変化を経て肝細胞は細胞死にいたる。また、このような変化は、薬物傷害や老化などの様々の病態、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ誘導肝障害においても認められる。【０１６１】
図２０（ｃ）は、臓器保存液にヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を添加して保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有する臓器保存液で保存すると、類同狭窄とｂｌｅｂ出現が抑制された。図２０（ｄ）は、臓器保存液にヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を添加して保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有する臓器保存液で保存すると、類同狭窄とＢｌｅｂ出現が抑制された。図２０（ｅ）は、臓器保存液にヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）とＴＬＲ４／ＭＤ２とを添加して保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。この場合には、類洞が不明確になり（類同狭窄）、ｂｌｅｂ（泡沫）が多数出現した。【０１６２】
図２１は、単に面積当りのｂｌｅｂ（泡沫）の数をまとめたものである。図２１に示されるように、４ｍｅｒ処理よりＬ３ｍｅｒ処理の方がｂｌｅｂ出現を抑制する効果が高かった。これは、分子量が小さいＬ３ｍｅｒの方が４ｍｅｒより組織浸透性に優れているため、より効果的にｂｌｅｂ出現を抑制できたことによると考えられた。また、Ｌ３ｍｅｒによるｂｌｅｂ出現抑制の効果はＴＬＲ４／ＭＤ２の添加により減じた。これにより、肝臓の保存時の障害の抑制作用においても、アルロン酸フラグメントはＴＬＲ４を介して作用していることが明らかとなった。【０１６３】
＜試験例１５＞（老齢ラット肝臓に対する作用効果  その２）
老齢ラット肝臓に対するヒアルロン酸フラグメントの作用効果を調べた。具体的には、２０ヶ月齢(老齢)の雌性Ｂａｌｂ/ｃマウスにＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ(２０ｍｇ/ｋｇ体重)を尾静脈より１回静注して、肝障害モデルとし、そのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａの投与直後にヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒあるいはＬ３ｍｅｒ）を経口投与し、その効果を調べた。肝機能障害は、２４時間後に血液を採取し、血中ＧＯＴおよびＧＰＴ値を測定することにより評価した。図２２には血中ＧＯＴ値の結果を示す。【０１６４】
図２２に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントの投与によりＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ投与による肝機能障害が改善された。その効果は、４ｍｅｒよりＬ３ｍｅｒの方が顕著に優れていた。これは、分子量が小さいＬ３ｍｅｒの方が４ｍｅｒより組織浸透性に優れているため、より効果的にＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ投与による肝機能障害を抑制できたことによると考えられた。なお、ＧＰＴ値についても同様の傾向の結果であった。【０１６５】
＜試験例１６＞（老化誘導したヒト大腸上皮細胞に対する作用  その１）
ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を過酸化水素処理したときの過酸化水素刺激による細胞老化（傷害によってミトコンドリア活性が下がる、あるいは細胞死がおきるとＭＴＳの値は下がる）が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。【０１６６】
ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１０μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、３時間培養した。【０１６７】
３時間経過後に、ＭＴＳアッセイに供した。なお、ＭＴＳは、細胞内のミトコンドリアにある脱水素によってホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に変化する作用に基づき、ＯＤ４９０ｎｍを測定することによりミトコンドリア機能を測定するものである。【０１６８】
図２３に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）は、過酸化水素刺激による細胞老化（傷害によってミトコンドリア活性が下がる、あるいは細胞死がおきるとＭＴＳの値は下がる）を抑制した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、ヒアルロン酸フラグメントが細胞表面のＴＬＲ４に結合することによってもたらされることが判明した。よって、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）のＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、細胞老化の抑制効果がもたらされることが明らかとなった。【０１６９】
＜試験例１７＞（老化誘導したヒト大腸上皮細胞に対する作用  その２）
被検物質をヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ４ｍｅｒ）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）とし、被検物質を含む培地に交換してからの培養時間を１時間にした以外は、試験例１６と同様の試験を行なった。その結果を図２４に示す。【０１７０】
図２４に示されるように、化学合成品であるＬ４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒでも、４ｍｅｒ同様に、細胞老化に対する抑制効果を示した。【０１７１】
＜試験例１８＞（老化誘導したヒト大腸上皮細胞に対する作用  その３）
被検物質をヒアルロン酸フラグメント（Ｌ４ｍｅｒ）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）とした以外は、試験例１６と同様の試験を行なった。その結果を図２５に示す。【０１７２】
図２５に示されるように、化学合成品であるＬ４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒでも、４ｍｅｒ同様に、細胞老化に対する抑制効果を示した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、Ｌ４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒによる老化抑制効果も、ＴＬＲ４を介してもたらされることが判明した。【０１７３】
＜試験例１９＞（老化誘導したヒト口腔由来上皮細胞に対する作用）
ヒト口腔由来上皮細胞（Ｃａ９−２２細胞）を過酸化水素処理したときのミトコンドリア機能が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。【０１７４】
ヒト口腔由来上皮細胞（Ｃａ９−２２細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又は９００ｋＤａヒアルロン酸を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、３時間培養した。【０１７５】
３時間経過後に、ＭＴＳアッセイに供した。なお、ＭＴＳは、細胞内のミトコンドリアにある脱水素によってホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に変化する作用に基づき、ＯＤ４９０ｎｍを測定することによりミトコンドリア機能を測定するものである。【０１７６】
図２６に示されるように、ヒト口腔由来上皮細胞でも、過酸化水素刺激による細胞老化がヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒあるいは４ｍｅｒ）により抑制されることが明らかとなった。一方、９００ｋＤａヒアルロン酸では、その老化抑制の効果は得られなかった。【０１７７】
＜試験例２０＞（老化誘導したヒト神経幹細胞に対する作用）
ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）を過酸化水素処理したときの細胞老化（空胞変性および肥大化）が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。【０１７８】
ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （Ｈ９-Ｄｅｒｉｖｅｄ）」Ｇｉｂｃｏ社製）を、培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１０μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した同培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した同培地に替え、２４時間培養した。【０１７９】
２４時間経過後に、倒立顕微鏡により細胞を観察した。図２７にその顕微鏡像の写真を示す。【０１８０】
図２７に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）は、過酸化水素による細胞老化（空胞変性および肥大化）を抑制した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、ヒアルロン酸フラグメントが細胞表面のＴＬＲ４に結合することによってもたらされることが判明した。よって、ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）でもＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、細胞老化の抑制効果がもたらされることが明らかとなった。【０１８１】
＜試験例２１＞（老化誘導したラット骨髄由来間葉系幹細胞に対する作用）
ラット骨髄由来間葉系幹細胞を過酸化水素処理したときの細胞老化（死細胞の増加）が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。【０１８２】
ラット骨髄由来間葉系幹細胞を常法に従い常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、２時間培養した。【０１８３】
２時間経過後に、死細胞に取り込まれて赤い蛍光を発するＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を終濃度５μg／ｍｌで培地に加えて１５分インキュベートし、死細胞の出現の様子を蛍光顕微鏡にて観察した。図２８には単位視野内の死細胞の平均数を示す。【０１８４】
図２８に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）は、過酸化水素による細胞老化（死細胞の増加）を抑制した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、ヒアルロン酸フラグメントが細胞表面のＴＬＲ４に結合することによってもたらされることが判明した。よって、ラット骨髄由来間葉系幹細胞でもＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、細胞老化の抑制効果がもたらされることが明らかとなった。【０１８５】
＜試験例２２＞（ヒト表皮角化細胞における角化細胞マーカーの検出  その１）
ヒアルロン酸フラグメントとして４ｍｅｒ又はＬ３ｍｅｒを用い、更にそれに最終濃度１μｇ／ｍｌのＴＬＲ４／ＭＤ２を添加した試験群を加えた以外は、試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞を刺激した。【０１８６】
各ｗｅｌｌの細胞を抗Ｋｅｒａｔｉｎ Ｋ１４抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。なお、Ｋｅｒａｔｉｎ Ｋ１４は基底層角化細胞のマーカーである。その結果を図２９に示す。【０１８７】
図２９に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒあるいはＬ３ｍｅｒ）の処理により、Ｋｅｒａｔｉｎ Ｋ１４の高発現細胞が増加した。これは、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒが細胞分化を誘導したことを示している。この作用も、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒによる角化細胞誘導効果も、ＴＬＲ４を介してもたらされることが判明した。【０１８８】
＜試験例２３＞（ヒト表皮角化細胞における角化細胞マーカーの検出  その２）
ヒアルロン酸フラグメントとして４ｍｅｒ又はＬ３ｍｅｒを用い、更にそれに最終濃度１μｇ／ｍｌのＴＬＲ４／ＭＤ２を添加した試験群を加えた以外は、試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞を刺激した。【０１８９】
各ｗｅｌｌの細胞を抗Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。なお、顆粒層角化細胞が産生するＦｉｌａｇｇｒｉｎは成熟した角化細胞のマーカーである。その結果を図３０に示す。【０１９０】
図３０に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒあるいはＬ３ｍｅｒ）の処理により、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ高発現細胞が増加した。これは、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒが細胞分化を誘導したことを示している。この作用も、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒによる角化細胞誘導効果も、ＴＬＲ４を介してもたらされることが、更に確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月6日(2013.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３糖及び／又は４糖のヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするサーチュイン誘導剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
動脈硬化、骨粗鬆症、メタボリックシンドローム、プロジェリア、放射線障害、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために用いられる、請求項１記載のサーチュイン誘導剤。
【請求項５】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１記載のサーチュイン誘導剤。
【請求項６】
３糖及び／又は４糖のヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織修復剤。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に用いられる、請求項６記載の組織修復剤。
【請求項１０】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項６記載の組織修復剤。
【請求項１１】
３糖のヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために用いられる、請求項１１記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１５】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１１記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
【請求項１６】
３糖及び／又は４糖のヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする幹細胞性維持剤。
【請求項１７】
皮膚組織の幹細胞性維持のために用いられる、請求項１６記載の幹細胞性維持剤。
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
組織中の幹細胞を増殖しかつ分化を誘導するために用いられる、請求項１６、１７記載の幹細胞性維持剤。
【請求項２０】
医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１６、１７、１９記載の幹細胞性維持剤。
【請求項２１】
３糖及び／又は４糖のヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物が有効成分として適用可能な疾患、臓器、組織、又は細胞を探索・開発するための標的分子としてのＴＬＲ４の使用。
【請求項２２】
請求項１、４、５記載のサーチュイン誘導剤、請求項６、９、１０記載の組織修復剤、請求項１１、１４、１５記載の肝細胞増殖因子誘導剤、又は請求項１６、１７、１９、２０記載の幹細胞性維持剤が適用される疾患、臓器、組織、又は細胞に適用可能な物質を探索・開発するための標的分子としてのＴＬＲ４の使用。
【国際調査報告】
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