(57)【要約】  膵疾患マーカーを検出するための方法であって、偶発症のリスクを抑え、かつ信頼性の高い結果を得るための検出方法の提供する。抗原抗体反応を利用して固相に固定された抗原又は抗体を検出する測定方法により、被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定することを特徴とする膵疾患マーカーの検出方法、前記膵疾患マーカーの濃度が、所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が膵疾患に罹患している可能性が高いと判断することを特徴とする前記記載の膵疾患マーカーの検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出することを特徴とする膵疾患マーカーの検出方法。
【請求項２】
前記膵疾患マーカーの検出が、前記マーカー濃度を測定し、前記濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定することを特徴とする請求項１に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
【請求項３】
前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
【請求項４】
前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡであり、
前記膵疾患が膵癌であり、
前記閾値が、５０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度であることを特徴とする請求項２に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
【請求項５】
前記十二指腸液が、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された状態で保存された十二指腸液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
【請求項６】
前記測定方法がイムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
【請求項７】
自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの測定キットであって、
前記膵疾患マーカーに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする膵疾患マーカー測定キット。
【請求項８】
さらに、前記膵疾患マーカーを標識する第２の抗体を有することを特徴とする請求項７に記載の膵疾患マーカー測定キット。
【請求項９】
前記膜が、イムノクロマトグラフィー用テストストリップであることを特徴とする請求項７又は８に記載の膵疾患マーカー測定キット。
【請求項１０】
さらに、予めタンパク質分解酵素阻害剤が収容されている十二指腸液の保存容器を備えることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項に記載の膵疾患マーカー測定キット。
【請求項１１】
前記膵疾患マーカーがＣＥＡであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載の膵疾患マーカー測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓から排出された膵疾患マーカーを、安全かつ高性能に検出する方法に関する。
本願は、２０１１年９月１３日に、日本に出願された特願２０１１−１９９６８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌は５年生存率が５％以下であり、癌の中でも最も予後の悪い癌である。その理由は、第一に、膵癌検診で有効な検査法がないことが挙げられる。第二には、膵癌では早期では症状がでにくく、多くの場合で膵癌が進行してから発見されることが挙げられる。そのため、通常の検診でも実施できる低侵襲かつ簡便な方法により、治療可能な早期膵癌が検出できるようになれば、膵癌の予後は大きく改善されると期待される。【０００３】
体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。膵液も膵臓の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診、重炭酸塩測定、細菌検査等に用いられている。また、研究においても、膵癌等の膵臓関連疾患についての新たなマーカーの探索が広く行われている。【０００４】
血清腫瘍マーカーとして知られているＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）は、癌細胞の表面に存在する糖タンパク質であり、膵癌細胞でも高発現していることが知られている。臨床検査においては、血清中のＣＥＡ濃度を測定することにより、癌の悪性度の把握や治療の効果の確認ができることが報告されている。しかしながら、血清中のＣＥＡの測定からは、癌の発生部位である臓器を特定できない。また、腫瘍マーカー分子の濃度が全身性の血液で薄まるためかもしれないが、膵癌での検出感度は５０％程度と低いものであった。【０００５】
一方で、膵癌細胞を含んだ状態で、膵臓から排出される膵液中のＣＥＡを測定する研究が報告されている。例えばローニィらによって、以下に説明する方法で、健常者と慢性膵炎患者と膵癌患者を見分けようという研究がなされている（非特許文献１参照）。この方法では、まず膵液と胆汁の分泌刺激剤（セクレチン及びＣＣＫ）を検査対象へ静注する。次に、この静注の後、３０分間、及び４５分間経過後に排出された膵液を、透視下で十二指腸に挿入したゾンデから採取する（セクレチンテスト）。最後に、こうして得られた膵液中のＣＥＡを測定する。この方法では、ＣＥＡ濃度は、健常者で２．３〜２５ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で５０ｎｇ／ｍＬ付近と報告されている。しかしながら、この報告における膵癌の症例数がわずか数例と少なく、正確な値と判断することは難しかった。また、膵疾患以外に罹患した患者でもＣＥＡ濃度が高い場合があり、分泌刺激剤投与後に採取された十二指腸液中のＣＥＡ濃度が高いことが、かならずしも膵癌の存在を示すとはいえなかった。また、ファリーニらによっても、同様にセクレチンテストの方法で得た膵液中のＣＥＡが測定されており、健常者で５９〜４５０ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で３２０〜８００ｎｇ／ｍＬであった（非特許文献２参照）。つまり、同じセクレチンテストを行ったにもかかわらず、ローニィらによる結果とファリーニらによる結果では、ＣＥＡ濃度が１０倍近く相違しており、このセクレチンテストで得られた膵液の検査性能は、実施の形態によって大きくばらつくことが課題であった。【０００６】
これをうけて、非特許文献３及び４では、内視鏡的な膵管造影（ＥＲＣＰ）時に、膵管にカテーテルを挿入した後、膵液排出刺激剤（セクレチン）を投与して膵臓から排出される純粋な膵液を、１０分間又は１５分間採取し、得られた膵液中のＣＥＡの濃度を測定した結果が報告されている。測定されたＣＥＡ濃度は、非特許文献３では健常者（コントロール）が０．１〜１０ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で１〜５００ｎｇ／ｍＬであり、非特許文献４では健常者（コントロール）が５６±２７ｎｇ／ｍＬ、膵癌患者で１３８±５１ｎｇ／ｍＬであり、いずれもほぼ同程度であった。また、膵癌の検出性能も感度７１．４％、特異度９３．３％と高い値が報告されている。つまり、直接膵管にカテーテルを挿入して採取された純粋膵液を測定試料とすることにより、別施設であっても同様のＣＥＡの検査性能が出せることが示されている。これは、前述のセクレチンテストと比較して、直接膵管にカテーテルを挿入して膵液を採取していることから、胆汁等の影響を受けず、また採取手技のばらつきもうけることが少ないためと考えられた。しかしながら、この方法では、内視鏡的に膵管にカテーテルを挿入するという方法が必要であり、医師に高い技術が必要とされる。また、検査の偶発症として急性膵炎という重篤な症状を発症するリスクがあるため、膵疾患を強く疑われた患者にのみしか実施することができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ロルニィ（Rolny）、他２名、スカンディナヴィアン・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（Scandinavian Journal of Gastroenterology）、１９７７年、第１２巻、第７５９〜７６３ページ。
【非特許文献２】ファリーニ（Farini）、他１０名、ヘパトーガストロエンテロロジー（Hepato-Gastroenterology）、１９８０年、第２７巻、第２１３〜２１６ページ。
【非特許文献３】パンクリース（Pancreas）、１９９４年、第９巻、第６号、第７４１〜７４７ページ。
【非特許文献４】ヘパトーガストロエンテロロジー（Hepato-Gastroenterology）、１９９９年、第４６巻、第４６号、第３１〜３７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の態様は、膵疾患マーカーを検出するための方法であって、偶発症のリスクを抑え、かつ信頼性の高い結果を得るための検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、以下の知見を見出し、本発明を完成させた。膵液排出刺激剤を投与することなく、十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定した場合、すなわち自然に十二指腸に排出された膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合でも、膵液排出刺激を行った後に膵管に挿入されたカテーテルから直接採取した純粋膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同等のＣＥＡの検査性能を得ることができる。【００１０】
本発明の態様を以下に示す。
（１）被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出することを特徴とする膵疾患マーカーの検出方法。
（２）前記膵疾患マーカーの検出が、前記マーカー濃度を測定し、前記濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する前記（１）に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（３）前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡである前記（１）又は（２）に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（４）前記膵疾患マーカーが、ＣＥＡであり、
前記膵疾患が膵癌であり、
前記閾値が、５０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度である前記（２）に記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（５）前記十二指腸液が、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された状態で保存された十二指腸液である前記（１）から（４）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（６）前記測定方法がイムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法である前記（１）から（５）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカーの検出方法。
（７）自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの測定キットであって、
前記膵疾患マーカーに対する第１の抗体が固相された膜を有することを特徴とする膵疾患マーカー測定キット。
（８）さらに、前記膵疾患マーカーを標識する第２の抗体を有する前記（７）に記載の膵疾患マーカー測定キット。
（９）前記膜がイムノクロマトグラフィー用テストストリップである前記（７）又は（８）に記載の膵疾患マーカー測定キット。
（１０）さらに、予めタンパク質分解酵素阻害剤が収容されている十二指腸液の保存容器を備える前記（７）から（９）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカー測定キット。
（１１）前記膵疾患マーカーがＣＥＡである前記（７）から（１０）のいずれか一つに記載の膵疾患マーカー測定キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の一態様の膵疾患マーカーの検出方法は、膵液排出刺激剤を投与した後に直接膵管から採取された純粋膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同様に高い精度で、膵液排出刺激剤を使用せず、かつ膵管へのカテーテル挿入を要することなく、ＣＥＡ等の膵疾患マーカーを検出することができる。つまり、膵管へのカテーテル挿入処理に伴う偶発症のリスクがない上に、従来法と比較して簡便かつ低コストであるため、本発明の膵疾患マーカーの検出方法によって、膵疾患の疑いのない患者に対しても、より安全に膵液検査を実施することができる。したがって、本発明の膵疾患マーカーの検出方法により、膵癌の検査を広く一般的に普及させられることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、自然排出された十二指腸液（セクレチン前）とセクレチン刺激後に排出された十二指腸液（セクレチン後）の各十二指腸液中のｐ−アミラーゼ濃度の測定結果を示した図である。
【図２】実施例１において、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、疾患別に示した図である。
【図３】実施例１において、セクレチン刺激後に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、疾患別に示した図である。
【図４】実施例１において、自然排出された（セクレチン投与なし）十二指腸液中ＣＥＡ濃度を、疾患別に示した図である。
【図５】実施例１において、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、膵癌と良性腫瘍（ＳＣＮ）とを識別するマーカーとして用いた場合のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明及び本願明細書において、膵疾患マーカーは、膵液中に含まれているタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子であって、膵疾患の非罹患者と比較して、膵疾患に罹患している患者において、膵液中の濃度が有意に高くなる生体分子である。なお、膵疾患の非罹患者は、健常者に限らず、膵疾患以外の疾患の罹患者をも含む。また、膵疾患としては、例えば、膵癌、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）、ＭＣＮ（粘液性嚢胞腫瘍）、ＳＣＮ（漿液性嚢胞腫瘍）、ＮＥＴ（膵内分泌腫瘍）、慢性膵炎（ＣＰ）、急性膵炎等が挙げられる。
【００１４】
膵液とは、膵管から十二指腸の腸管内に排出される体液である。十二指腸液（十二指腸の腸管内に存在する腸管液）には、膵液に加えて、同じく乳頭部より排出された胆汁や、十二指腸壁から排出される十二指腸分泌液、血液等も含まれている。また、本発明及び本願明細書において、自然に排出された膵液とは、セクレチン等の膵液排出刺激剤が投与されていない状態で、膵管から十二指腸の腸管内に排出された膵液を意味する。
【００１５】
膵液は消化液であるため、様々な消化酵素を含む。これらの消化酵素は、膵臓内においては不活性の状態で存在しているが、十二指腸に排出された後に活性化することが知られている。これら種々の消化酵素の活性化により、膵液中に含まれるタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子は、十二指腸に排出後に分解、変性されてしまう。そのため、膵液中の目的とする生体分子を検査する際に、十二指腸へ排出された膵液を測定試料とした場合には、正確な測定はできないと考えられていた。
【００１６】
このため、従来は、膵液中の膵疾患マーカーを、臨床検査に要求される精度で検査するためには、十二指腸の腸管内に排出される前の純粋膵液を、膵臓の乳頭部へカテーテルを挿入し膵管から直接採取することが必要であると考えられていた（例えば、非特許文献３及び４参照）。また、測定試料として十二指腸液を用いる場合には、セクレチン等の膵液排出刺激剤を投与し、この刺激によって十分量の膵液を十二指腸へ排出させる必要があると考えられていた（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【００１７】
これらの従来の知見にもかかわらず、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度が、膵液排出刺激剤による刺激後に膵管から直接採取された純粋膵液中の膵疾患マーカーの濃度と同様に、膵疾患への罹患の有無・発症リスクの大小を反映していることが、本発明者らによって明らかにされた。つまり、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度は、膵疾患の非罹患者に比べて、膵疾患の罹患者において高い。このため、被験者から採取された十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出し、その濃度を測定することによって、この被験者が膵疾患に罹患しているか否かや、膵疾患の発症リスクを、従来法のなかで最も精度・信頼性の高い方法（膵液排出刺激剤による刺激後に膵管から直接採取された純粋膵液を測定試料とする方法）と同程度に高い精度で調べることができる。
【００１８】
すなわち、本発明の態様の膵疾患マーカーの検出方法（以下、本発明の膵疾患マーカーの検出法と称する）は、被検者から採取された、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定することを特徴とする。本発明の膵疾患マーカーの検出方法では、膵液排出刺激剤による刺激が不要であるため、より低コストに実施することができる。また、膵液排出刺激剤による刺激後の膵液を採取する場合、一般的には刺激後３０〜４５分経過後に膵液は採取されるが、本発明においては、十二指腸の腸管内に溜まっている十二指腸液が採取されるため、より短時間（例えば、数分〜十数分間程度）で採取することができる。さらに、乳頭部の膵管へのカテーテル挿入を行わないため、より非侵襲的かつ簡便に、膵疾患マーカー検出のための測定試料とする体液を採取することができる。すなわち、本発明の膵疾患マーカーの検出方法は急性膵炎等の検査の偶発症発症のリスクがないため、そのリスクからこれまで明らかに膵疾患がある患者にのみしか実施できなかった膵疾患マーカー検査を、膵疾患の発症の有無が不明である被験者に対しても、より安全に実施することができる。
【００１９】
本発明の膵疾患マーカーの検出方法において用いられる十二指腸液は、膵液排出刺激剤を投与されていない被験者の十二指腸の腸管内から採取された液である。十二指腸の腸管内のどこから採取された十二指腸液であってもよいが、十二指腸の第二ポーション又は第三ポーションに存在する十二指腸液であることが好ましい。十二指腸の第一ポーションは胃の幽門部から直接つながる部位であり、胃液の混入の可能性があること、また、採取のための内視鏡の固定が比較的難しく、採取が難しい場合があること等のためである。
【００２０】
十二指腸液の採取方法は、十二指腸の腸管内の貯留液を採取可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えば、十二指腸液を内視鏡カテーテルに接続したシリンジや真空ポンプなどの吸引手段にて採取することができる。具体的には、内視鏡を口腔から十二指腸まで挿入し、かんしチャネルを挿通して挿入したカテーテルを用いて、十二指腸の第二・第三ポーションに存在する十二指腸液を吸引し採取する。例えば、いわゆる胃カメラとしての胃・十二指腸の内視鏡検査（上部内視鏡検査）のついでに、十二指腸の腸管内に貯留している十二指腸液を採取し、得られた十二指腸液中の膵疾患マーカーを検査してもよい。
【００２１】
採取された十二指腸液に対して、採取後ただちに又は数時間以内に、膵疾患マーカーの測定試験が実施されることが好ましいが、採取後から所定期間保存した後の十二指腸液を、疾患マーカーの濃度測定試験に供してもよい。採取された十二指腸液は、冷蔵又は冷凍で保存してもよく、室温で保存してもよく、凍結乾燥処理を行い、凍結粉末として保存してもよい。また、十二指腸液中の消化酵素の分解を抑制するような物質を十二指腸液に混合した状態で保存することもできる。具体的には、膵疾患マーカータンパク質を分解するタンパク質分解酵素に対するタンパク質分解酵素阻害剤を混合することが好ましく、特に膵液中に豊富なセリンプロテアーゼ阻害剤を混合することが好ましい。タンパク質分解酵素阻害剤等は、生体から十二指腸液を採取した後に混合してもよく、タンパク質分解酵素阻害剤等を予め入れた容器に十二指腸液を採取することもできる。
【００２２】
採取された十二指腸液は、そのまま膵疾患マーカーの測定試験に用いてもよく、遠心分離処理等により、細胞等の固形分を分離除去した後に用いてもよい。その他、採取された十二指腸液を適当なバッファー等で希釈した希釈液や、十二指腸液又はその希釈液に各種添加剤を添加したものを、膵疾患マーカーの測定試験に用いてもよい。添加剤としては、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等が挙げられる。
【００２３】
本発明の膵疾患マーカーの検出方法において検出される膵疾患マーカーは、膵疾患の非罹患者と比較して、膵疾患に罹患している患者において、膵液中の濃度が有意に高くなる生体分子であればよく、特に限定されるものではない。本発明においては、膵疾患マーカーは、糖タンパク質や酵素等の、十二指腸液中に含まれている消化酵素の影響を受け難い生体分子であることが好ましい。本発明の膵疾患マーカーの検出方法において検出される膵疾患マーカーとしては、糖タンパク質であるＣＥＡ、ＣＡ１９−９（例えば、非特許文献３等参照）、ＭＵＣ−１（ＫＬ−６）（例えば、特開２００６−３０８５７６号公報等参照）、酵素であるＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）（例えば、Pancreas, 2002, vol.24, No.54, p344-347参照。）、ＭＭＰ７（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−７）等が挙げられる。その他にもS100Pなど膵疾患に罹患している患者において膵液中で有意に高くなる物質が上げられる。
【００２４】
本発明の膵疾患マーカーの検出方法において検出される膵疾患マーカーは、ＣＥＡであることが特に好ましい。自然排出された膵液を含む十二指腸液中のＣＥＡ濃度を指標とすることによって、膵癌、ＩＰＭＮ、ＭＣＮ、慢性膵炎、及び急性膵炎等の発症の有無や発症リスク等を調べることができる。
【００２５】
本発明の膵疾患マーカーの検出方法においては、十二指腸液中の膵疾患マーカーを、抗原抗体反応を利用して検出する。抗原抗体反応を利用して検出する場合には、固相に固定されたすなわち、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を十二指腸液に接触させ、形成された抗原抗体複合体を、固相上で検出する。例えば、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を予め固相に固定させておき、この固相に十二指腸液を接触させて、固定化された抗体（若しくは抗原）と膵疾患マーカーを結合させ、形成された複合体を検出する。逆に、十二指腸液中の生体分子を予め固相に固定させておき、この固相に膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を接触させて固定化された膵疾患マーカーと結合させ、形成された複合体を検出する。
【００２６】
抗原又は抗体を固定する固相としては、例えば、ニトロセルロース膜等の高分子膜、アガロースゲル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル等のゲル、プラスチックチューブやマイクロプレート等の容器の内表面、ラテックスビーズ、磁気ビーズ等が挙げられる。固相に固定された抗原又は抗体に対して形成された抗原抗体複合体を検出する方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法、ドットプロット法、スロットブロット法、免疫電気泳動法、免疫拡散法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックスビーズ等を用いた免疫凝集法や、磁気ビーズを用いた免疫測定法、SPR等が挙げられる。抗原又は抗体の固定化方法、及びこれらの方法は、測定対象として十二指腸液を用い、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を用いる以外は、常法により行うことができる。
抗原抗体反応を用いて液相で検出することもできる。液相で検出する場合には、標識した抗体と抗原との結合を、FCS、FRET等で測定することもできる。
また、抗原の存在をTOF-MS等の分子量測定で測定することもできる。
【００２７】
本発明の実施形態においては、迅速かつ簡便であり、また、定量的な検出も容易であることから、イムノクロマトグラフィー法又はＥＬＩＳＡ法により膵疾患マーカーを検出することが好ましく、イムノクロマトグラフィー法により検出することがより好ましい。例えば、予め膜表面上に膵疾患マーカーに対する抗体が固定化されたニトロセルロース膜に、十二指腸液を滴下し、この十二指腸液中の膵疾患マーカーを固定化された抗体と結合させ、形成された複合体を検出する。この複合体と結合する抗体として、蛍光物質、金コロイド、酵素等により予め標識した標識済抗体を用いることにより、この複合体をバンドとして検出することができる。
【００２８】
十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度は、十二指腸液を用いて検出されたバンドの濃さを既知濃度の膵疾患マーカーを用いて作成された検量用の色見本と目視で比較することにより、定性的に測定することができる。また、バンドの濃さを光学的に測定し、既知濃度の膵疾患マーカーを用いて同様に検出されたバンドの濃さと比較することによっても、簡便に求めることができる。さらに、バンドの濃さと膵疾患マーカーの濃度との関係を表す検量線を予め作成しておき、十二指腸液を用いて検出されたバンドの濃さを光学的に測定し、検量線から換算することにより、十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を求めることもできる。
【００２９】
自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度は、膵疾患を発症している罹患者のほうが、膵疾患の非罹患者よりも高い傾向にある。このため、被検者の十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を利用して、この被検者の膵疾患への罹患可能性を判断することができる。予め膵疾患の罹患者と非罹患者とを分ける閾値を設定し、被検者の十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定し、この濃度が所定の閾値以上であるか否かを判定する。この濃度が所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が膵疾患に罹患している可能性が高いと判断することができる。このように、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定し、所定の閾値と比較することにより、膵疾患を検出することができる。
【００３０】
膵疾患の罹患者と非罹患者とを分ける閾値は、膵疾患マーカーの種類、膵疾患マーカーの検出方法等を考慮して、実験的に設定することができる。例えば、膵疾患に罹患していないことが分かっている集団から採取された十二指腸液と、この疾患に罹患していることが分かっている集団から採取された十二指腸液とに対して、本発明の検出方法を行って自然に排出された十二指腸液中の膵疾患マーカーの濃度を測定し、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。
【００３１】
例えば、ＣＥＡを膵疾患マーカーとする場合、膵癌の罹患者と非罹患者（良性腫瘍であるＳＣＮの罹患者）とを分ける閾値は、５０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度とすることが好ましく、１００〜１５０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度とすることがより好ましい。閾値をこの範囲内に設定することにより、本発明の膵疾患マーカーの検出方法によって、被験者が膵癌に罹患しているか否かを、臨床上十分な感度及び特異度で識別することができる。特に、膵癌を確実に検出できるのみならず、膵癌のハイリスクとなるＩＰＭＮや、治療の対象となるＭＣＮ等も拾い上げることができ、自覚症状のない膵疾患を広く拾い上げることができる。また、ＣＥＡ濃度が高濃度であれば、進行した膵癌である可能性が高いため、迅速な精密検査と治療の開始が必要と判断することもできる。
【００３２】
具体的には、膵疾患マーカーがＣＥＡの場合、予め膜表面上に抗ＣＥＡ抗体が固定化されたニトロセルロース膜（イムノクロマト）に、十二指腸液を、膜上に固定化された抗体とはエピトープ部位が異なる標識済抗ＣＥＡ抗体とともに滴下し、このニトロセルロース膜の膜表面上に、固定化された抗ＣＥＡ抗体とＣＥＡと標識済抗ＣＥＡ抗体とからなる複合体を形成させる。形成されたバンドは、この標識済抗ＣＥＡ抗体中の標識により、バンドとして検出される。イムノクロマト上のＣＥＡ濃度は、所定濃度のＣＥＡを添加した場合に得られるバンドが記載された色見本のバンド濃度と目視で比較し、バンドの濃さから定量することもできる。また、バンドの濃さを光学的に測定して、所定の検量線等から換算してＣＥＡ濃度を換算することもできる。例えば、イムノクロマト上のバンドの濃さを、５０ｎｇ／ｍＬと２００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ濃度のバンドが記載された色見本と比較し、これらの２本のバンドの間の濃さであった場合、又は２００ｎｇ／ｍＬのバンドより濃かった場合に、陽性（測定に用いられた十二指腸液が採取された被験者が、膵癌、ＩＰＭＮ、ＭＣＮ、慢性膵炎、及び急性膵炎等の膵疾患、特に膵癌に罹患している可能性が高い）と判断することができる。
【００３３】
また、ＩＰＭＮやＭＣＮ等の良性が多い場合の疾患ではＣＥＡ濃度は比較的低く、進行した膵癌や進行した慢性膵炎ではＣＥＡ濃度が高いことが想定される。このため、適当な閾値を設定することにより、膵癌以外の特定の膵疾患への罹患可能性の大小を判断することも期待できる。
【００３４】
このように、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、イムノクロマトグラフィー法のような迅速キットによって測定することにより、十二指腸液の採取が行われる内視鏡室で迅速かつ簡便に陽性陰性の判断（被験者に膵疾患があるかどうかの判定）を行うことができる。したがって、本発明の膵疾患マーカーの検出方法を用いることにより、安全かつ高性能で迅速な膵癌のスクリーニング検査を行うことができるため、進行が早く、数ヶ月で死に至る膵癌の可能性を、十二指腸液の採取後速やかに判断でき、精密検査への動機づけや予約を迅速に行うことにより、迅速に膵癌の治療を開始することができる。
【００３５】
十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出するための方法に使用する試薬・装置等をキット化することにより、本発明の膵疾患マーカーの検出方法をより簡便に実施することができる。本発明の他態様である、自然に排出された膵液を含む十二指腸液中の膵疾患マーカーの測定キット（以下、本発明の膵疾患マーカー測定キットと称する）としては、膵疾患マーカーに対する抗体（膵疾患マーカーが抗体の場合には抗原）を予め固定させた固相、例えば、膵疾患マーカーに対する第１の抗体が固相された膜を含むことが好ましい。この膜としては、例えば、イムノクロマトグラフィー用テストストリップが挙げられる。この測定キットは、膵疾患マーカーを標識する第２の抗体を有することも好ましい。また、この測定キットは、さらに予めタンパク質分解酵素阻害剤が収容されている十二指腸液の保存容器を備えていてもよい。
【実施例】
【００３６】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３７】
［実施例１］
膵疾患を疑われる患者７３例から、十二指腸液を採取しＣＥＡ濃度を測定した。
一晩絶食した患者に、内視鏡を十二指腸の第二ポーションまで挿入し、膵管造影用のカテーテル（オリンパス社製、製品名：ＰＲ−１３０Ｑ）を用いて、第二、第三ポーション全体の十二指腸壁に浅く溜まっている十二指腸液を採取した。採取は、カテーテルの内視鏡外の手元側に接続したシリンジを吸引することによって行った。２から３分間程度で平均１ｍＬ程度の十二指腸液が採取できた。十二指腸の第一ポーションでは、胃側に内視鏡が抜けてしまい、安定な採取をすることができなかった。
自然に排出された十二指腸液を採取後に、７３例のうち４７例に対してさらにセクレチン（カイロクリン社製）を静注し、２から３分間後、第二、第三ポーション全体の十二指腸壁に浅く溜まっている十二指腸液を同様にして採取した。セクレチン刺激後には、２から３分間程度で約１．５ｍＬから約２ｍＬの十二指腸液が採取できた。
その後、各患者に対してさらに画像診断又は病理検査を行い、最終診断を行った。最終診断の結果、７３例中膵癌４１例、ＩＰＭＮ１７例、ＭＣＮ２例、ＳＣＮ６例、ＮＥＴ３例、慢性膵炎（ＣＰ）４例であった。７３例のうち、自然に排出された十二指腸液とセクレチン刺激後の十二指腸液の両方の採取が可能であった患者４７例の内訳は、膵癌２９例、ＩＰＭＮ７例、ＭＣＮ２例、ＳＣＮ３例、ＮＥＴ１例、慢性膵炎（ＣＰ）1例であった。【００３８】
自然に排出された十二指腸液とセクレチン刺激後の十二指腸液の両方の採取が可能であった４７例の患者から採取された２種類の十二指腸液（自然排出された十二指腸液と、セクレチン刺激後に排出された十二指腸液）中のｐ−アミラーゼ濃度及びＣＥＡ濃度を、それぞれ測定した。ｐ−アミラーゼ濃度は、酵素法（Ｇａｌ−Ｇ２−ＣＮＰ基質法）によって測定した。また、ＣＥＡ濃度は、市販のキット（ＩＢＬ社製）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。【００３９】
図１に、自然に排出された十二指腸液（セクレチン刺激前）とセクレチン刺激後に排出された十二指腸液（セクレチン後）の両方の採取が可能であった４７例の患者について各十二指腸液中のｐ−アミラーゼ濃度の測定結果を示す。セクレチン投与前の十二指腸液であっても、セクレチン投与後の十二指腸液とほぼ同程度のｐ−アミラーゼが含有されていることがわかった。ｐ−アミラーゼは膵液に由来するものであり、十二指腸液中には膵臓由来の膵液が自然に排出され含まれており、自然に排出された十二指腸液中からも、膵液由来の成分が検出できることが確認された。【００４０】
図２、図３、及び表１に、自然に排出された十二指腸液とセクレチン刺激後の十二指腸液の両方の採取が可能であった４７例患者の十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、疾患別に示した。図２は、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を示し、図３は、セクレチン刺激後に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を示した。この結果、疾患別の十二指腸液中のＣＥＡ濃度は、自然排出（セクレチン投与無し）された十二指腸液と、セクレチン投与後に排出された十二指腸液とで、ほぼ同等であった。また、非特許文献４等の過去の報告と比較しても、本実施例における自然排出（セクレチン投与無し）された十二指腸液中のＣＥＡ濃度は、乳頭部にカニュレーションして採取した純粋膵液のＣＥＡ濃度とも同様の濃度域であった。これらの結果から、自然に排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度を測定した場合であっても、純粋膵液のＣＥＡ濃度を測定した場合と同様の膵疾患識別効果が得られることがわかった。【００４１】
【表１】
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【００４２】
７３例の自然排出された（セクレチン投与なし）十二指腸液中ＣＥＡ濃度を十二指腸液中のＣＥＡ濃度を、図4および表２に疾患別に示した。
また、ほぼ図２と同様に十二指腸液のＣＥＡ濃度は膵癌で高く、膵疾患として治療対象となるＩＰＭＮや慢性膵炎（ＣＰ）も高値を示していた。ＮＥＴについては悪性のＮＥＴは良性のＮＥＴのデータよりもＣＥＡ濃度が高い結果となった。経過観察対象である良性腫瘍のＳＣＮは低値で図２と一致した結果であった。そこで、自然排出された十二指腸液中のＣＥＡ濃度が、膵癌を良性腫瘍（本発明ではＳＣＮ）と識別するためのマーカーとして使用可能かどうかを調べるため、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を行った。ＲＯＣ解析は、ＰＡＳＷ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖｅｒ．１８（ＩＢＭ製）を用いて作図した。解析結果を図５に示す。この結果、膵癌を良性腫瘍と区別するためのカットオフ値（閾値）は、純粋膵液中のＣＥＡ濃度やセクレチン投与後に採取された十二指腸液中のＣＥＡ濃度とほぼ同等であった。本実施例における膵癌の検出感度は感度７１％、特異度１００％であり、過去の報告にある純粋膵液中のＣＥＡ濃度を指標とした場合よりも勝るものであった。
【表２】
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【００４３】
次いで、膵癌と良性腫瘍（本発明ではＳＣＮ）を区別するためのカットオフ値を、３０から２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内で設定し、カットオフ値ごとの感度及び特異度を算出した。算出結果を表３に示す。この結果、カットオフ値を１００から１５０ｎｇ／ｍＬに設定した場合には、特異度が８０％以上であっても、感度が７０％以上であり、検査として利用価値のある感度が得られた。また、当該カットオフ値に設定した場合には、ＭＣＮ等の疾患から膵癌の検出を行うことも可能となり、より膵癌の特異度の高い検査が期待できる。また、膵癌だけでなくNETについても良悪性の判断ができることが期待できる。一方でカットオフ値を５０ｎｇ／ｍＬに設定すると、特異度は５０％であり、１００から１５０ｎｇ／ｍＬに設定した場合よりも半減するものの、感度が９３％であり、非常に高感度な膵癌の検査を実施することができる。【００４４】
【表３】
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【００４５】
［実施例２］
市販のＣＥＡイムノクロマトキット（製品名：ラナマンモカードＣＥＡ、日本化薬社製）を用いて、実施例１で用いた自然排出された十二指腸液検体中のＣＥＡを検出した。ＣＥＡ濃度は、当該キット添付のバンドの色見本と、各十二指腸液検体から検出されたイムノクロマトのバンドの濃さを比較して、目視で判定した。
この結果、色見本の１００ｎｇ／ｍＬ及び４００ｎｇ／ｍＬと比較した場合の十二指腸液検体のバンドの濃さと、ＥＬＩＳＡによるＣＥＡ濃度の測定値には相関が認められ、十二指腸液中のＣＥＡ濃度がイムノクロマトグラフィー法によっても測定可能であることが確認された。【００４６】
［実施例３］
カテーテルの内視鏡外の手元側に接続したシリンジ内に予めプロテアーゼ阻害剤（製品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ社製）を入れておき、実施例１の患者のうち４７例から、このカテーテルを介して十二指腸液を吸引した。吸引された十二指腸液は、シリンジ内でプロテアーゼ阻害剤と混合された後に、チューブに移し変えて凍結保存された。対照として、シリンジ内にプロテアーゼ阻害剤が予め含まれていないカテーテルを介して採取された十二指腸液も同様に、チューブに移し変えて凍結保存された。
保存後の各十二指腸液のＣＥＡ濃度及びＳ１００Ｐ濃度を測定した。ＣＥＡ濃度は、実施例１と同様にして測定した。また、Ｓ１００Ｐ濃度は、市販のキット（サイクレックス社製）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
表４及び５に、十二指腸液中のＣＥＡ濃度及びＳ１００Ｐ濃度の測定結果を、疾患別に示した。この結果、ＣＥＡ濃度については、プロテアーゼ阻害剤を添加して保存した十二指腸液（表４中、「阻害剤有り」）とプロテアーゼ阻害剤を添加せずに保存した十二指腸液（表４中、「阻害剤無し」）とでは、あまり濃度に違いがないことがわかった。一方でＳ１００Ｐ濃度は、プロテアーゼ阻害剤を添加して保存した十二指腸液（表５中、「阻害剤有り」）のほうが、プロテアーゼ阻害剤を添加せずに保存した十二指腸液（表５中、「阻害剤無し」）よりも有意に濃度が高かった。個々の症例を確認すると、阻害剤無しで測定不能だった検体が、測定可能となった例が複数あった。これらの結果から、Ｓ１００Ｐを膵疾患マーカーとした場合には、生体から採取された十二指腸液に予めプロテアーゼ阻害剤を混合することにより、Ｓ１００Ｐ濃度を測定する前に、この十二指腸液中のＳ１００Ｐの消化が抑制されるため、Ｓ１００Ｐの検出精度が向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の膵疾患マーカーの検出方法は、急性膵炎発症のリスク等がなく安全である上に、膵液排出刺激を行った後に膵管に挿入されたカテーテルから直接採取した純粋膵液中のＣＥＡ濃度を測定した場合と同等の精度で膵疾患マーカーを検出することができるため、膵液を解析する分野、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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