(57)【要約】  牛海綿状脳症（ＢＳＥ）由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の効率的な増幅方法を提供し、究極的には、ＢＳＥに感染した牛の早期発見によるプリオン病の伝播を根絶すること、また、プリオン不活性化方法の開発及びその早期評価を可能にすることであり、正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を攪拌混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによりＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃを増幅させるＰＭＣＡ（protein misfolding cyclic amplification）法において、攪拌混合・培養−超音波処理を、硫酸多糖化合物の存在下に行うことを特徴とするＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。
2009145195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによる牛海綿状脳症（ＢＳＥ）由来ＰｒＰＳｃを増幅させる蛋白質ミスホールディング循環増幅（ＰＭＣＡ：protein misfolding cyclic amplification）法において、
混合・培養−超音波処理を、硫酸多糖化合物の存在下に行うことを特徴とするＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項２】
ソースとして用いるＰｒＰＣが、ＰｒＰＣを含む脳乳剤であり、シードとして用いるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃが、ＢＳＥ感染動物由来のＰｒＰＳｃ、或いはＢＳＥの感染に基づく変異型クロイツフェルト・ヤコブ病由来のＰｒＰＳｃを含む体組織である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項３】
硫酸多糖化合物が、溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項４】
溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物が、デキストラン硫酸化合物、又はペントサンポリ硫酸化合物である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項５】
硫酸多糖化合物が、分子量５〜６ＫＤの硫酸多糖化合物である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項６】
硫酸多糖化合物が、分子量１．５〜１．９ＫＤの硫酸多糖化合物である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項７】
添加する硫酸多糖化合物の濃度が、０．００５〜１％である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項８】
硫酸多糖化合物がデキストラン硫酸化合物又はペントサンポリ硫酸である請求項１に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【請求項９】
デキストラン硫酸化合物が、デキストラン硫酸ナトリウム又はデキストラン硫酸カリウムである請求項８に記載のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、牛海綿状脳症（ＢＳＥ：Bovine Spongiform Encephalopathy）由来の異常プリオン蛋白質の効率的な試験管内の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常プリオン蛋白質の増殖による疾患として最初に発見されたのが、スクレイピー（Scrapie）という羊にみられる運動機能失調にかかわる疾患であり、脳にスポンジ状の空胞形成が認められるという特徴をもつ。その後、この異常プリオン蛋白質の増殖による疾患として、狂牛病とも称されている牛海綿状脳症（ＢＳＥ：Bovine Spongiform Encephalopathy）、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ：Creutzfeldt Jakob Disease）や、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ：Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome）などが知られている。【０００３】
これらの疾患はウイルス感染によるものではなく、また既知の病原体は発見されておらず、特異的な蛋白質が共通に存在するところから、これが伝達〜感染を引き起こす病原物質と思われ、「蛋白質性感染粒子“プリオン”： proteinaceous infectious particle：prion」が提唱されて、上記した各種の特異的疾患は、プリオン病と称されるようになった。【０００４】
ところで、ヒトのプリオン蛋白質遺伝子は、第２０番染色体上に存在し、プリオン蛋白質は、２３５個のアミノ酸により構成されていることが判明している。感染因子プリオンの主な構成成分はこのプリオン蛋白質と考えられており、感染因子を構成するプリオン蛋白質をスクレイピー型または異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）と称し、正常型のプリオン蛋白質を正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）と称している。
ヒトを含む多くの動物種でプリオン病が認知され、一般的にプロテアーゼ抵抗性の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の蓄積が感染個体に認められることから、このＰｒＰＳｃが主病原体として関与していると考えられている。【０００５】
プリオン病の伝播は、異種の動物間でも起こりえる。例えば、スクレイピーに感染した羊材料の動物飼料への混入により牛に感染してＢＳＥを発症した可能性があり、さらにＢＳＥに感染した牛材料を含む飼料を食した猫に、猫海綿状脳症（ＦＳＥ）が発症したと考えられる。したがって、最近の研究では、特にＢＳＥがヒトへ感染する可能性が濃厚となっていると報告されている（非特許文献１）。【０００６】
牛海綿状脳症（ＢＳＥ）は、１９８６年に英国ではじめて報告され、我が国でも２００１年以降３５症例が確認されている。
ところで、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）に感染した動物には、他の感染症や代謝病の診断に用いられているような簡便な診断法が応用できず、したがって、ＢＳＥの実用的な生前診断法は確立されていない。血液などの生体材料に含まれるＰｒＰＳｃ量は極微量であると考えられ、生前診断には、従来法の検出限界をはるかに凌ぐ超高感度な検出技法の開発が必要である。【０００７】
また、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）は、通常の滅菌処理では不活性化されないという特徴を有している。ＰｒＰＳｃの不活化の確認には、通常、不活性化されたであろうＰｒＰＳｃをマウスなどの実験動物に接種し、発症の有無を確認することで感染性を検出するバイオアッセイ法が用いられる。しかしながら、この方法は実験動物を長期間飼育・観察する必要があり、その結果は数十〜数百日後でないと得られず、膨大な経過観察の手間と費用がかかるという問題がある。
したがって、不活化処理後、残存するＰｒＰＳｃを短期間に検出することができる高感度な方法が開発できれば、プリオン不活性化方法の開発、及びその評価において著しい改善をもたらすことになる。【０００８】
これまで行われている異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の検出方法としては、プリオンに感染した脳乳剤と正常脳乳剤を試験管内で混合し、超音波処理・攪拌培養を繰り返すことによってＰｒＰＳｃを増幅させる方法としてのＰＭＣＡ（蛋白質ミスホールディング循環増幅：protein misfolding cyclic amplification）法が開発され、極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能となった（非特許文献２、特許文献１）。【０００９】
このＰＭＣＡ法で用いられたＰｒＰＳｃは、スクレイピー（ハムスターに順化させた２６３Ｋ株）を感染させたハムスターの脳乳剤であり、これを希釈し、それに正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）として正常なハムスターの脳乳剤を加えて、混合し、試験管内で培養させ、過剰に加えられたＰｒＰＣがＰｒＰＳｃに構造変換されることによりＰｒＰＳｃを増幅させ、これを超音波処理にかけて、凝集しているＰｒＰＳｃを微細化し、再び過剰のＰｒＰＣと培養するという、一連の混合・培養−超音波処理のサイクルを繰り返すことによりＰｒＰＳｃの量を増幅させる方法である。【００１０】
このＰＭＣＡ法は、ハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの増幅には極めて有効なものであり、５サイクルでＰｒＰＳｃの増幅率は平均５８であり、１０サイクルでは、ＰｒＰＳｃサンプルを１万倍以上に希釈しても検出でき、感染ハムスターの血液（非特許文献３）や尿（非特許文献４）といった体液中の極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能であり、潜伏期にある動物の血液細胞からもＰｒＰＳｃを検出することができ（非特許文献５および４）、プリオン病の早期診断法、或いはプリオン不活性化の評価法としての有用性が示されている。【００１１】
しかしながら、提案されたＰＭＣＡ法は、ハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの増幅には極めて有効なものであるが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の増幅に適用すると、十分な増幅が得られないといった問題があり、ＢＳＥの生前診断法若しくは早期診断法としてはその応用は十分なものではない。
【特許文献１】特公表２００４−５０３７４８号公報
【非特許文献１】Nature, 383: p685-690 (1996)
【非特許文献２】Nature, 411: p810-813 (2001)
【非特許文献３】Nat. Med., 11: p982-985 (2005)
【非特許文献４】J. Gen. Virol., 88: p2890-2898 (2007)
【非特許文献５】Science, 313: p92-94 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって本発明は、かかる現状に鑑み、異常プリオン蛋白質に感染した牛海綿状脳症（ＢＳＥ）由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の効率的な増幅方法を提供することを一義的な課題とし、究極的には、ＢＳＥに感染した牛の早期発見によるプリオン病の伝播を根絶すること、また、プリオン不活性化方法の開発及びその早期評価を可能にすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる課題を解決するために、本発明者はこれまで行われているＰＭＣＡ法を改良することにより、ＢＳＥ由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）を効率に増幅させることが可能となり、本発明を完成させるに至った。【００１４】
すなわち、これまで提案されているハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの増幅を可能にするＰＭＣＡ法においては、通常界面活性剤存在下で、ＰｒＰＳｃを増幅させている。本発明者はこの点を改良するべく検討を加え、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの増幅を行うに当たって、硫酸多糖化合物を添加してＰＭＣＡ増幅を行った結果、添加したこの硫酸多糖化合物の作用により、ＰｒＰＳｃの増幅効率が大幅に改善され、従来のＰＭＣＡ法では検出できなかった極微量のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃをも検出することが可能となることを確認し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
而して本発明は、正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を攪拌混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによる牛海綿状脳症（ＢＳＥ）由来ＰｒＰＳｃを増幅させる蛋白質ミスホールディング循環増幅（ＰＭＣＡ：protein misfolding cyclic amplification）法において、
攪拌混合・培養−超音波処理を、硫酸多糖化合物の存在下に行うことを特徴とするＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。【００１６】
具体的には、本発明は、ソースとして用いるＰｒＰＣが、ＰｒＰＣを含む脳乳剤であり、シードとして用いるＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃが、ＢＳＥ感染動物の体組織であるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法、更には、ＢＳＥがヒトに感染したと思われる変異型クロイツフェルト・ヤコブ病由来のＰｒＰＳｃ等の効率的増幅方法である。
したがって、本発明は、単にＢＳＥ感染動物における異常プリオン蛋白質の効率的増幅のみならず、ＢＳＥの感染によるプリオン病に罹患したヒトを含む生体組織であるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。【００１７】
より具体的には、本発明は以下の態様からなる。
（１）硫酸多糖化合物が、溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物である上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
（２）溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物が、デキストラン硫酸化合物、又はペントサンポリ硫酸化合物である上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
（３）硫酸多糖化合物が、分子量５〜６ＫＤの硫酸多糖化合物である上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
（４）硫酸多糖化合物が、分子量１．５〜１．９ＫＤの硫酸多糖化合物である上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
（５）添加する硫酸多糖化合物の濃度が、０．００５〜１％である上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
（６）硫酸多糖化合物がデキストラン硫酸化合物又はペントサンポリ硫酸である上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
（７）デキストラン硫酸化合物が、デキストラン硫酸ナトリウム又はデキストラン硫酸カリウムである上記のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法；
である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明方法により、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃについて、極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能となり、本発明方法によるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの検出感度は、ＥＬＩＳＡ法などの既存の検出方法と比較して著しく効率的なものであり、増幅１回でバイオアッセイ法を上回る感度が得られる利点を有している。
さらに、従来のバイオアッセイ法によるＰｒＰＳｃの検出には膨大な時間と経費がかかっていたが、これを回避することが可能となり、その実用性、迅速性の面においても優れたものである。【００１９】
したがって、ＢＳＥの生前診断並びに早期診断を可能にし、その上、ＢＳＥ異常プリオン蛋白質の不活性化の迅速な評価が可能となることから、異常プリオン蛋白質の不活性化方法を確立する一助となる。また、肉骨粉などの飼肥料原材料の安全性評価法、土壌ＰｒＰＳｃ等の環境モニタリング等に応用できる利点を有している。
特に、ＢＳＥの発生は、日本のみならず、ＥＵ圏を中心とした世界中で確認されており、また、未発生国においても今後のＢＳＥ発生のリスクは考慮されるべきであるが、本発明方法は生体（動物）輸入に対するＢＳＥ防疫対策、更には輸入牛肉に対するＢＳＥ予防対策としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の試験例１に従う、各種添加剤を添加した結果を示した図である。
【図２】本発明の試験例２に従う、フコイダン（Fucoidan）の添加検討の結果を示す図である。
【図３】本発明の試験例２に従う、コンドロイチン硫酸ナトリウム（CSS）並びにλ−カラギーナン（Cag）の添加検討の結果を示した図である。
【図４】本発明の試験例２に従う、ヘパラン硫酸ナトリウム（HSS）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、及びポリビニル硫酸ナトリウム（PVSP）の添加検討の結果を示した図である。
【図５】本発明の試験例２に従う、ペントサンポリ硫酸（PPS）の添加検討の結果を示した図である。
【００２１】
【図６】本発明の試験例３に従う、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を添加した結果を示した図である。
【図７】本発明の試験例４に従う、デキストラン硫酸カリウム（DSP）の添加量の検討結果を示した図である。
【図８】本発明の試験例４に従う、低濃度のデキストラン硫酸カリウム（DSP）の添加量の検討結果を示した図である。
【図９】本発明の試験例５に従う、培養−超音波処理のサイクルの検討結果を示した図である。
【図１０】本発明の試験例６に従う、ＢＳＥ実験感染牛を用いて、末梢神経組織におけるＰｒＰＳｃ分布を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、上記したように、その基本的な態様は、正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）をソースとし、異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）をシードとして用い、両者を攪拌混合・培養−超音波処理を繰り返えすことによるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃを増幅させるＰＭＣＡ法において、
攪拌混合・培養−超音波処理を、硫酸多糖化合物の存在下に行うことを特徴とするＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの効率的増幅方法である。【００２３】
ここで使用するソースとしての正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）としては、正常牛の体組織を用いることができ、好ましくは正常牛の脳乳剤が使用される。
この脳乳剤は、正常牛の脳を乳鉢等によりすりつぶしたもの（ホモジネートしたもの）であるが、より具体的には、正常牛の脳を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）−４ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（プロテアーゼインヒビターを含む）でホモジナイズし、１０％（ｗ／ｖ）溶液としたものを用いるのがよい。【００２４】
また、牛ＰｒＰ遺伝子を導入した異種動物、例えば、牛ＰｒＰトランスジェニックマウスの脳乳剤、或いは、この脳乳剤と牛ＰｒＰノックアウトマウスの脳乳剤を混合希釈したものを使用することができる。【００２５】
一方、シードとして用いるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃとしては、ＢＳＥ感染牛の体組織が好ましく使用される。そのような体組織としては、ＢＳＥ感染牛の脳組織、血液組織、尿等、あらゆる体組織を使用することができる。
すなわち、本発明が提供する増幅方法よれば、極微量のＰｒＰＳｃであっても効率的にＰｒＰＳｃを増幅することが可能となる。したがって、この新たなＰＭＣＡ法を活用することにより、極微量のＢＳＥ由来の異常プリオン蛋白質が存在する試料の検出が可能となり、ＢＳＥ感染牛検出感度が高まるものであることから、シードとして用いるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃとしては特に限定されず、ＢＳＥ感染牛のあらゆる体組織を使用することが可能である。【００２６】
なお、シードして用いるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃは上記のものに限定されず、ＢＳＥがヒトに感染したと思われる変異型クロイツフェルト・ヤコブ病由来のＰｒＰＳｃ等を挙げることができる。すなわち、単にＢＳＥ感染牛の体組織のみならず、ＢＳＥの感染によるプリオン病に罹患したヒトを含む生体組織を使用することができる。【００２７】
ところで従来のハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃを増幅させるＰＭＣＡ法にあっては、増幅を行う場合にあたって、通常、界面活性剤を添加し異常プリオン蛋白質を可溶化した後にＰｒＰＣとＰｒＰＳｃを混合し、ソースとして用いたＰｒＰＣをＰｒＰＳｃに構造変換させ、増幅を図っている。
本発明のＰＭＣＡ法においても界面活性剤の存在下に行われ、そのような界面活性剤としては、非イオン性の界面活性剤であり、好ましくは、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Triton X-100）、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（NP-40）等が使用されるが、これに限定されるものではない。
しかしながら、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃに関しては、この段階で界面活性剤のみの添加では、ＰｒＰＳｃの効率的な増幅反応は得られないものであった。【００２８】
本発明が提供する方法にあっては、界面活性剤に加えて、更に硫酸多糖化合物を添加することにより、ＰｒＰＳｃの効率的な増幅反応が得られることとなった。
その理論的根拠は定かではないが、硫酸多糖化合物が有する蛋白質の表面を覆っている水和水を強力に奪う作用により、プリオン蛋白質同士（正常プリオン蛋白質−異常プリオン蛋白質）の分子結合が強化されるのが一因であると考えられる。また、硫酸多糖化合物がプリオン蛋白質と結合し、増幅に適した蛋白質構造が誘導されるとも考えられる。
したがって、本発明による改良ＰＭＣＡ法は、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃを、ＰｒＰＣと混合し、攪拌培養することによりＰｒＣをＰｒＰＳｃに構造変換させるのであるが、この構造変換過程において硫酸多糖化合物が効果的に作用するものと考えられる。【００２９】
このような添加される硫酸多糖化合物の例としては、溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物である。
本発明者の検討によれば、陽性電荷をもつＤＥＡＥ（ジメチルアミノエチル）−デキストラン化合物、或いは電荷のないデキストラン自体には、その効果はほとんど認められないものであった（後記する試験例を参照）。
そのような溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物としては、デキストラン硫酸化合物或いはペントサンポリ硫酸化合物を挙げることができ、なかでもデキストラン硫酸ナトリウム、デキストラン硫酸カリウム等のデキストラン硫酸化合物を挙げることができる。【００３０】
本発明が提供する方法において、ＰｒＰＳｃの増幅効果は、添加する硫酸多糖化合物の分子量とも関係していることが判明した。
例えば、硫酸多糖化合物としてデキストラン硫酸化合物を用いた場合には、分子量９００〜２，０００ＫＤの高分子量のデキストラン硫酸ナトリウムよりも、分子量５〜６ＫＤのデキストラン硫酸ナトリウム、または分子量１．５〜１．９ＫＤのデキストラン硫酸カリウムといった低分子量のデキストラン硫酸化合物の方が増幅率は高いものであった（後記する試験例を参照）。【００３１】
また、界面活性剤と共に添加する硫酸多糖化合物の添加濃度も増幅効率に影響を与え、例えば、デキストラン硫酸化合物を用いる場合には、その添加濃度は、０．００５〜１％程度が適量であり、それ以下であっても、それ以上であっても増幅効率は低下することが判明した（後記する試験例を参照）。【００３２】
なお、デキストラン硫酸化合物と類する、グルコースが重合したデキストラン硫酸以外の硫酸多糖体、例えば、フコイダン、λ−カラギーナン、或いは生体内硫酸化グリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸ナトリウム、ヘパラン硫酸ナトリウム、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等は、その増幅効果はデキストラン硫酸化合物に比べて低いものであった。
一方、アニオン性高分子であるポリビニル硫酸ナトリウムにも効果は認められないものであった（後記する試験例を参照）。
その点で、本発明方法で使用する硫酸多糖化合物の添加は、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの増幅に対して極めて効果的なものであるといえる。【００３３】
本発明方法の一般的な操作方法を、以下に説明する。
すなわち、本発明方法にあっては、上記したＰｒＰＣをソースとし、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃをシードとして用い、両者を攪拌混合・培養するが、その培養（インキュベーション）条件は一概に限定されるものではなく、適宜最適な培養条件を選択することができる。具体的には、例えば、３７℃で攪拌しながら１時間程度インキュベートする方法で行うことができる。【００３４】
この攪拌混合・培養によりソースとして加えられたＰｒＣの一部がＰｒＰＳｃに構造変換されるが、その構造変換されたＰｒＰＳｃの凝集体を超音波処理により分散させ、再度過剰に存在するＰｒＣと攪混合拌・培養させるサイクルを繰り返す。
この超音波処理は、通常のＰＭＣＡ法で用いられている超音波処理をそのまま適用することができ特に限定されず、例えば、Ｂｒａｎｓｏｎ社のＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０Ｄ、或いはエレコン社０７０−ＧＯＴを用いて行うことができる。
なお、超音波処理条件としては、用いる装置により一概に限定できないが、例えば、出力を１００％に設定し、０．２秒発振−０．１秒停止、或いは３秒発振−１秒休止のサイクルを５回程度行うのがよい。【００３５】
この攪拌混合・培養−超音波処理のサイクルを繰り返すことにより、ソースとして添加したＰｒＰＣがＰｒＰＳｃに順次構造変換され、その結果、ＰｒＰＳｃの増幅が行われることとなる。
本発明方法にあっては、通常１回の増幅のために、上記のサイクルを、２０〜４０サイクルを１回の増幅処理として実施するのがよい。
なお、このサイクル回数は、使用するソースとして用いるＰｒＰＣ、並びにシードとして用いるＰｒＰＳｃの濃度によって異なり、限定されるものではない。【００３６】
ＰｒＰＳｃの増幅（攪拌培養−超音波処理のサイクルの繰り返し）が完了した後、得られた反応物を、蛋白分解酵素を用いて分解処理する、分解処理工程に付す。
一般に、異常プリオン蛋白質はプロテアーゼに抵抗性を示すので、特異的にこの蛋白質を取り出すためには、正常プリオン蛋白質を分解することが要求される。したがって、この分解処理工程は、プリオン蛋白質以外の蛋白質を分解すると共に、正常プリオン蛋白質を分解する工程である。
蛋白質分解酵素としては、プロティナーゼＫ（Proteinase K）を挙げることができ、これを用いて分解することが望ましい。【００３７】
なお、増幅されたＰｒＰＳｃの検出は、ウエスタンブロッティング法で検出することができる。具体的には、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離・泳動後メンブランに転写し、ブロッキング後、ＨＲＰ標識抗Ｔ２抗体で反応させる。次いで、メンブランを洗浄後、Immobilon Westernで発光反応を検出し、増幅されたＰｒＰＳｃを検出・確認することができる。【００３８】
本発明者の検討によれば、１回の増幅（攪拌培養−超音波処理の４０サイクル）で、バイオアッセイ法を上回る感度が得られることが判明した。
したがって、本発明方法は、実用性、迅速性において極めて優れたものであり、ＢＳＥの診断法、安全性評価法、防疫法として使用される可能性が高く、その応用性は多大なものである。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明を、実施例に代わる試験例により、より詳細に説明していくが、本発明はこれらの試験例により何ら限定されるものではない。【００４０】
試験例１：ＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃの増幅（添加剤の検討：その１）
１．方法
ＰＭＣＡ（protein misfolding cyclic amplification）法を用いて、ＢＳＥ由来の異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）を増幅した。
正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）ソースは、牛プリオン遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ＴｇＢｏマウス）の脳乳剤を、プリオン遺伝子ノックアウトマウスの脳乳剤で８倍に希釈し、最終濃度０．５％の各種添加剤を加えて調整した。
一方、ＰｒＰＳｃシードは、英国由来のＢＳＥ感染脳乳剤（感染価：１０６．７ ＬＤ５０／ｇ；Jpn. J. Infect. Dis., 60: p317-320 (2007)）を１０−２から１０−１０に希釈して用いた。
ＰＭＣＡ増幅後、サンプルをプロティナーゼＫで消化し、ウエスタンブロッティング法でプロテアーゼ抵抗性ＰｒＰ（ＰｒＰＲＥＳ）のシグナルを検出した。【００４１】
添加剤としては、分子量９００〜２，０００ＫＤのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS 900-2,000KD）、分子量５〜６ＫＤのデキストラン硫酸ナトリウム（DSSII 5-6KD）、分子量１．５〜１．９ＫＤのデキストラン硫酸カリウム（DSP 1.6-1.9KD）、分子量５０ＫＤのＤＥＡＥ−デキストラン（DEAE-Dextran 50KD）、及び各種の分子量（１５〜２３０ＫＤ）を有するデキストラン（Dextran）を使用した。
なお、対照として添加剤を添加しない比較増幅例を置いた。【００４２】
２．結果
その結果を図１に示した。図１に示した結果から判明するように、添加剤として溶液中で陰性電荷を持つ硫酸基を含む硫酸多糖化合物であるデキストラン硫酸ナトリウム、或いはデキストラン硫酸カリウムを添加した場合には、良好にＰｒＰＳｃの増幅が認められるのが判明する。
これに対して、添加剤を全く添加しない対照、或いは陽性荷電を持ったＤＥＡＥ−デキストラン、あるいは荷電のない各種分子量を有するデキストランを添加剤として用いた場合には、ＰｒＰＳｃの増幅がほとんど認められず、本発明の有効性がよく理解される。
また、増幅効果が認められるデキストラン硫酸化合物にあっても、分子量９００〜２，０００ＫＤの高分子量のデキストラン硫酸ナトリウムよりも、分子量５〜６ＫＤのデキストラン硫酸ナトリウム、または分子量１．５〜１．９ＫＤのデキストラン硫酸カリウム（DSP 1.6-1.9KD）である低分子量のデキストラン硫酸化合物の方が増幅率は高いことが判明した。【００４３】
試験例２：ＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃの増幅（添加剤の検討：その２）
試験例１の結果から、デキストラン硫酸化合物の添加がＰｒＰＳｃの増幅に極めて効果的なものであることが判明したが、硫酸基を有する他の化合物について、その添加がＰｒＰＳｃの増幅に効果的なものであるかを検討した。【００４４】
１．方法
試験例１と同様に、ＰＭＣＡ法を用いて、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃを増幅した。
添加剤としては、硫酸多糖化合物としてデキストラン硫酸カリウム（DSP）及びペントサンポリ硫酸（PPS）の他に、硫酸多糖体であるフコイダン（Fucoidan）、コンドロイチン硫酸ナトリウム（CSS）、λ−カラギーナン（Cag）、ヘパラン硫酸ナトリウム（HSS）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、及びアニオン性高分子であるポリビニル硫酸ナトリウム（PVSP）を使用した。【００４５】
［Ａ］フコイダン（Fucoidan）の添加検討：
フコイダン（Fucoidan）の添加の場合には、ＰｒＰＳｃシードとして、ＢＳＥ感染脳乳剤の１０−４希釈を使用し、最終濃度０．５％のデキストラン硫酸カリウム（DSP）並びに最終濃度０．１％、０．５％及び１．０％のフコイダン（Fucoidan）を加えて調製し、シード無添加、並びに添加剤無添加の比較対照例を置いた。【００４６】
［Ｂ］コンドロイチン硫酸ナトリウム（CSS）、並びにλ−カラギーナン（Cag）の添加検討：
ＰｒＰＳｃシードとして、ＢＳＥ感染脳乳剤の１０−４希釈を使用し、最終濃度０．０５％及び０．５％のデキストラン硫酸カリウム（DSP）、並びに最終濃度０．０５％及び０．５％のコンドロイチン硫酸ナトリウム（CSS）並びにλ−カラギーナン（Cag）を加えて調製し、添加剤無添加の比較対照を置いた。【００４７】
［Ｃ］ヘパラン硫酸ナトリウム（HSS）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、及びポリビニル硫酸ナトリウム（PVSP）の添加検討：
ＰｒＰＳｃシードとして、ＢＳＥ感染脳乳剤の１０−４希釈を使用し、それぞれ最終濃度０．５％のデキストラン硫酸カリウム（DSP）、ヘパラン硫酸ナトリウム（HSS）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、並びにポリビニル硫酸ナトリウム（PVSP）を加えて調製した。
なお、シード無添加、並びに添加剤無添加の比較対照を置いた。【００４８】
［Ｄ］ペントサンポリ硫酸（PPS）の添加検討：
ＰｒＰＳｃシードとして、ＢＳＥ感染脳乳剤の２×１０−４希釈を使用し、デキストラン硫酸カリウム（DSP）の５０μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬ、並びにペントサンポリ硫酸（PPS）の０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬを加えて調製した。
なお、シード無添加、並びに添加剤無添加の比較対照を置いた。【００４９】
２．結果
図２にフコイダン（Fucoidan）の添加検討の結果を、図３にコンドロイチン硫酸ナトリウム（CSS）並びにλ−カラギーナン（Cag）の添加検討の結果を、図４にヘパラン硫酸ナトリウム（HSS）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、及びポリビニル硫酸ナトリウム（PVSP）の添加検討の結果を、また図５にペントサンポリ硫酸（PPS）の添加検討結果を示した。
図２〜図５に示した結果からも判明するように、硫酸多糖化合物であるデキストラン硫酸カリウム並びにペントサンポリ硫酸の添加では、有意なＰｒＰＳｃの増幅が認められていた。
なお、硫酸基を有する化合物であっても、フコイダン（Fucoidan）、コンドロイチン硫酸ナトリウム（CSS）、λ−カラギーナン（Cag）、ヘパラン硫酸ナトリウム（HSS）並びにヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）にあっては、増幅効果はデキストラン硫酸化合物、ペントサンポリ硫酸と比べて低かった。【００５０】
試験例３：ＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃの増幅（添加剤濃度の検討：その１）
試験例１及び２の結果から、硫酸多糖化合物としてのデキストラン硫酸化合物の添加がＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの増幅に極めて効果的なものであることが判明した。そこで、次にその添加剤の添加濃度がＰｒＰＳｃの増幅にどの様な影響を与えるか検討した。
１．方法
上記した試験例と同様に、ＰＭＣＡ法を用いて、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃを増幅した。
正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）ソースとして、牛プリオン遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ＴｇＢｏマウス）の脳乳剤を、プリオン遺伝子ノックアウトマウスの脳乳剤で８倍に希釈し、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を最終濃度０％、０．２５％、０．５％、０．７５％及び１．０％となるよう加えて調製した。
ＰｒＰＳＣシードは、試験例１と同様の、英国由来のＢＳＥ感染脳乳剤（感染価：１０６．７ ＬＤ５０／ｇ）を１０−２及び１０−３に希釈して用いた。
なお、ＰｒＰＳｃシード無添加の例を比較対照として置いた。
ＰＭＣＡ増幅後、サンプルをプロティナーゼＫで消化し、ウエスタンブロッティング法でプロテアーゼ抵抗性ＰｒＰ（ＰｒＰＲＥＳ）のシグナルを検出した。【００５１】
２．結果
その結果を図６に示した。図中の結果からも判明するように、デキストラン硫酸ナトリウムを添加しない場合には、ＰｒＰＳｃの増幅は低いものであるが、デキストラン硫酸ナトリウムの添加により、劇的にＰｒＰＳｃの増幅効率が改善されることが理解される。
その添加濃度として、０．２５％〜１％程度で十分に増幅効果が得られるものであることが判明した。【００５２】
試験例４：ＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃの増幅（添加剤濃度の検討：その２）
試験例３の結果から、添加剤としての硫酸多糖化合物であるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）は、その添加濃度として０．２５％〜１％程度の添加でＰｒＰＳｃの増幅効率を改善するものであった。
次いで、硫酸多糖化合物として、デキストラン硫酸カリウム（DSP）を添加剤として使用し、その至適濃度を検討した。【００５３】
１．方法
試験例３と同様に行った。
デキストラン硫酸カリウム（DSP）の添加量としては、最初に０．５％、１．０％及び２．０％の添加量で検討し、その結果０．５％以下でも十分に増幅効果が得られる点を踏まえて、０．０５％、０．００５％、０．０００５％及び０．００００５％の添加量で検討を行った。
なお、比較対照としてＰｒＰＳｃシード無添加、並びに添加剤無添加の例を置いた。【００５４】
２．結果
図７及び図８にその結果を示した。
図７は、デキストラン硫酸カリウム（DSP）の添加量として０．５％、１．０％及び２．０％の添加量で検討した結果を示すが、２％以上の添加量ではかえってＰｒＰＳｃの増幅が低下することが判明した。
図８は、デキストラン硫酸カリウム（DSP）の添加量として、０．５％以下の濃度の添加に基づく検討結果であるが、０．００５％の低濃度であっても十分にＰｒＰＳｃの増幅が認められたが、それ以下の濃度では増幅効果は認められなかった。
以上の結果から、本発明にあっては、添加する硫酸多糖化合物の添加濃度は、０．００５〜１％程度が至適適量であり、それ以下であっても、また、それ以上であっても増幅効率は低下することが理解される。【００５５】
試験例５：ＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃの増幅（培養−超音波処理サイクルの検討）
本発明のＰＭＣＡ法における培養−超音波処理のサイクルを繰り返すが、４０サイクルにより１回のＰｒＰＳＣの増幅が完了する。
そこで、このサイクル数によるＰｒＰＳｃの増幅効果の相違を検討した。【００５６】
１．方法
上記試験例１と同様に、ＰＭＣＡ法を用いて、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃを増幅した。
正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）ソースは、牛プリオン遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ＴｇＢｏマウス）の脳乳剤を、プリオン遺伝子ノックアウトマウスの脳乳剤で８倍に希釈し、最終濃度０．５％のデキストラン硫酸カリウムを加えて調製した。
一方、ＰｒＰＳｃシードは、英国由来のＢＳＥ感染脳乳剤（感染価：１０６．７ ＬＤ５０／ｇ；Jpn. J. Infect. Dis., 60: p317-320 (2007)）を１０−２から１０−１０に希釈して用いた。
ＰＭＣＡ増幅後、サンプルをプロティナーゼＫで消化し、ウエスタンブロッティング法でプロテアーゼ抵抗性ＰｒＰ（ＰｒＰＲＥＳ）のシグナルを検出した。【００５７】
２．結果
その結果を図９に示した。
図中に示し結果からも判明するように、１回の増幅（４０サイクル）後、１０−６に希釈したduplicateのサンプルからＰｒＰＲＥＳのシグナルを認めた。
ＰＭＣＡ増幅に用いた感染脳乳剤の感染性は１０−４まで認められているが、１回の増幅によりバイオアッセイ法よりも１００倍近い感度が得られたことになる。
さらに、ＰＭＣＡ産物をＰｒＰＣソースで１／５に希釈し２回目の増幅（８０サイクル）を行うと、１０−９ではduplicateの両サンプルとも、１０−１０では片方のサンプルからＰｒＰＲＥＳシグナルを認めた。
従来のＰＭＣＡ法によるハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの検出限界は１０−１２程度であるが、６〜７回の増幅を繰り返す必要がある。この試験例で用いたＢＥＳ感染脳乳剤の感染価は、実験モデル感染ハムスター脳乳剤の１／１００程度であり、この点を考慮すると、わずか２回の増幅により、ハムスタースクレイピー感染モデルのＰｒＰＳｃの検出限界と同程度の検出感度が得られていることになる。【００５８】
試験例６：ＢＳＥ実験感染牛末梢組織におけるＰｒＰＳｃ検出
本発明により、極微量のＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃでも検出でき、感染牛におけるＰｒＰＳｃの体内動態を従来よりも詳細に解析することが可能になった。そこで、ＢＳＥ実験感染牛を用いて、末梢神経組織におけるＰｒＰＳｃ分布を解析した。【００５９】
１．方法
上記の試験例１と同様に、ＰＭＣＡ法を用いて、ＢＳＥ実験感染牛由来のＰｒＰＳｃを増幅した。正常プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）ソースは、牛プリオン遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ＴｇＢｏマウス）の１０％脳乳剤を、プリオン遺伝子ノックアウトマウスの１０％脳乳剤で５倍に希釈し、最終濃度０．５％のデキストラン硫酸カリウムを加えて調整した。一方、ＰｒＰＳｃシードは末梢神経組織から２０％乳剤を作製し、ＰｒＰＣソースで１／２０に希釈して用いた。ＰＭＣＡ増幅後、サンプルをプロティナーゼＫで消化し、ウエスタンブロッティング法でプロテアーゼ抵抗性ＰｒＰ（ＰｒＰＲＥＳ）のシグナルを検出した。組織毎に４つのサンプルを用いて増幅を行った。【００６０】
２．結果
その結果を図１０に示した。
本実験に用いたＢＳＥ感染牛は、経口接種後３６ヶ月目に解剖し、各組織を採取した。解剖時にはＢＳＥを発症しておらず、通常のウエスタンブロティング法では末梢組織からＰｒＰＳｃを検出しなかった。
図中に示した結果から判明するように、２回の増幅を行うと、迷走神経、交感神経および星状神経節からシグナルが検出されるようになった。さらに、３回目の増幅ですべてのサンプルにおいてＰｒＰＳｃシグナルが増強され、ＰｒＰＳｃの存在が明確となった。
なお、結果は、各末梢神経組織（４つ組）における増幅結果を示したものであり、図中のＮｓはシードを含まない無添加コントロールを示した。【００６１】
本実験例の結果から、本発明によるＢＳＥ由来ＰｒＰＳｃ増幅法は、末梢組織由来サンプルにおいても有効であり、未発症牛からもＰｒＰＳｃを検出できたことから、ＢＳＥ感染牛の早期摘発に応用できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上説明してきたように、本発明が提供する方法により、ＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃについて、効果的にその増幅を行うことができ、極微量のＰｒＰＳｃを検出することが可能となった。
本発明方法によるＢＳＥ由来のＰｒＰＳｃの検出感度は、ＥＬＩＳＡ法などの既存の検出方法と比較して著しく効率的なものであり、増幅１回でバイオアッセイ法を上回る感度が得られる利点を有しており、その実用性、迅速性の面においても優れたものである。【００６３】
したがって、ＢＳＥの生前診断、早期診断を可能にし、その上、ＢＳＥ異常プリオン蛋白質の不活性化の迅速な評価が可能となることから、異常プリオン蛋白質の不活性化方法を確立する一助となる。
また、肉骨粉などの飼肥料原材料の安全性評価法、土壌ＰｒＰＳｃ等の環境モニタリング等、更には、生体（動物）輸入に対するＢＳＥ防疫対策、更には輸入牛肉に対するＢＳＥ予防対策に応用でき、その有用性は極めて多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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