(57)【要約】  ＥＬＩＳＡ法によるＡβオリゴマーの測定法、特に比較的高分子のＡβオリゴマーを選択的に測定する方法を提供する。  ［解決手段］  下記の工程：（ａ）不溶性担体に結合している、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第１抗体）に、Ａβオリゴマーを含有している可能性がある試料を接触させて、第１抗体にＡβオリゴマーを結合させる工程；および（ｂ）工程（ａ）で第１抗体に結合したＡβオリゴマーに、標識化された、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程を含む、Ａβオリゴマーの測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
（ａ）不溶性担体に結合している、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第１抗体）に、Ａβオリゴマーを含有している可能性がある試料を接触させて、第１抗体にＡβオリゴマーを結合させる工程；および
（ｂ）工程（ａ）で第１抗体に結合したＡβオリゴマーに、標識化された、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程
を含む、Ａβオリゴマーの測定方法。
【請求項２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体がＢＡＮ５０ａである請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ａβオリゴマーが９量体以上である請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ａβオリゴマーが１２量体以上である請求項１記載の方法。
【請求項５】
標識化されたモノクローナル抗体（第２抗体）がＦａｂフラグメント化されている請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ａβオリゴマーが、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）、もしくはＡβ（１−４３）、もしくはそれらのＮ末短縮体、またはそれらの修飾体あるいはそれらの混合物のオリゴマーである請求項１記載の方法。
【請求項７】
（ａ）不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）；および
（ｂ）標識化されたモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第２抗体）
を含有する、Ａβオリゴマーの測定キット。
【請求項８】
Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断薬である、請求項７記載の測定キット。
【請求項９】
請求項７記載の測定キットを用いてＡβオリゴマーを測定することを特徴とする、Ａβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索方法。
【請求項１０】
請求項７記載の測定キットを用いてＡβオリゴマーを測定することを特徴とする、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断方法。
【請求項１１】
請求項７記載の測定キットを用いてＡβオリゴマーを測定することを特徴とする、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＡβオリゴマー測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知能力の進行性の損失、ならびに脳におけるアミロイド沈着、神経原線維変化、および神経細胞の欠損等の神経病理学的特徴によって特徴付けられる神経変性疾患である。
近年、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドのオリゴマーの、神経性疾患（例、アルツハイマー病、MCI（mild cognitive impairment）、ダウン症候群）における役割が議論されており、Ａβ（１−４２）のオリゴマーが病原性の構造原理であり、その形成がアルツハイマー病の初期の病理的イベントであることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，９５，８３４−８４７）。
また、比較的高分子量のオリゴマー、特に１２量体が記憶の損傷に、より大きな影響を与えることが報告されている（Ｖｏｌ４４０，Ｎｕｍｂｅｒ  ７０８２，２００６，ｐ．３５２−３５７，ｎａｔｕｒｅ）。
したがって、Ａβオリゴマーの測定方法の開発は、アルツハイマー病の初期の診断、およびＡβオリゴマーの治療薬の開発等に有効であることが期待される。
Ａβオリゴマーは、ウエスタンブロット法により測定することができるが、ウエスタンブロット法では多くの検体を分析することが困難なので、ＥＬＩＳＡ法によるＡβオリゴマーの測定法の開発が望まれている。【０００３】
ＡβオリゴマーをＥＬＩＳＡ法で測定した例として、非特許文献１には、４Ｇ８抗体を用いたサンドイッチＥＩＡによってＡβオリゴマー（２〜３量体）を測定した例が記載されている。
また、非特許文献２には、抗体６Ｅ１０を用いたサンドイッチＥＩＡで、Ａβオリゴマーを検出した例が記載されている。
また、非特許文献３には、抗体２Ｆ１２または抗体６Ｅ１０を用いたサンドイッチＥＩＡで、Ａβオリゴマーを検出した例が記載されている。
また、非特許文献４には、抗体２Ｆ１２を用いたサンドイッチＥＩＡで、オリゴマーを検出した例が記載されている。
また、非特許文献５には、抗体２Ｆ１２を用いたサンドイッチＥＩＡで、オリゴマーを検出した例が記載されている。【０００４】
【特許文献１】国際公開第９４／１７１９７号パンフレット
【非特許文献１】ＬｅＶｉｎｅら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３５  （２００４）  ｐ．８１−９０
【非特許文献２】Ｙａｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、Ｖｏｌ．２８０、Ｎｏ．７、ｐ．５８９２−５９０１
【非特許文献３】ＨＯＷＬＥＴＴら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９９年、３４０、ｐ．２８３−２８９
【非特許文献４】ＷＡＲＤら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２０００年、３４８、ｐ．１３７−１４４
【非特許文献５】Ｈｏｗｌｅｔｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９７年、４１７、ｐ．２４９−２５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、Ａβオリゴマーの中でも、高分子量オリゴマーが、強い毒性を示すことが報告されており、なおＥＬＩＳＡ法によるＡβオリゴマーの測定法、特に比較的高分子のＡβオリゴマーを選択的に測定する方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討の結果、第１抗体として配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体を用い、第２抗体として当該第１抗体を標識化したものを用いることで、Ａβオリゴマーを検出でき、特に比較的高分子量のＡβオリゴマーを選択的に測定できることを見出し、更なる研究の結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
［１］
下記の工程：
（ａ）不溶性担体に結合している、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第１抗体）に、Ａβオリゴマーを含有している可能性がある試料を接触させて、第１抗体にＡβオリゴマーを結合させる工程；および
（ｂ）工程（ａ）で第１抗体に結合したＡβオリゴマーに、標識化された、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程
を含む、Ａβオリゴマーの測定方法；
［２］
配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体がＢＡＮ５０ａである上記［１］記載の方法；
［３］
Ａβオリゴマーが９量体以上である上記［１］記載の方法；
［４］
Ａβオリゴマーが１２量体以上である上記［１］記載の方法；
［５］標識化されたモノクローナル抗体（第２抗体）がＦａｂフラグメント化されている上記［１］記載の方法；
［６］
Ａβオリゴマーが、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）、もしくはＡβ（１−４３）、もしくはそれらのＮ末短縮体、またはそれらの修飾体あるいはそれらの混合物のオリゴマーである上記［１］記載の方法；
［７］
（ａ）不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）；および
（ｂ）標識化されたモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第２抗体）
を含有する、Ａβオリゴマーの測定キット；
［８］
Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断薬である、上記［７］記載の測定キット；
［９］
上記［７］記載の測定キットを用いてＡβオリゴマーを測定することを特徴とする、Ａβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索方法；
［１０］
上記［７］記載の測定キットを用いてＡβオリゴマーを測定することを特徴とする、Ａ
βオリゴマーが関与する神経性疾患の診断方法；
［１１］
上記［７］記載の測定キットを用いてＡβオリゴマーを測定することを特徴とする、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の治療方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＡβオリゴマーの測定方法によれば、比較的高分子量のＡβオリゴマーを選択的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ゲル濾過したＡβ４２溶液のタンパク質濃度を示す図である。
【図２】ゲル濾過したＡβ４２溶液の各フラクションの分析結果を示す図である。
【図３】クルクミンによるオリゴマーＡβ形成阻害の分析結果を示す図である。
【図４】Ａβ４２モノマー換算にしたＡβオリゴマーの検量線を示す図である。
【図５】アルツハイマー病患者および健常者の各オリゴマーＡβの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書中、「測定」なる用語は、量を測定することのみならず、単に存在を検出することを包含する意味で用いられる。
本発明のＡβオリゴマーの測定方法では、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体を用いる。
配列番号：１は、Ａβ（１−１６）のアミノ酸配列である。
［配列番号：１］
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
【００１０】
当該モノクローナル抗体として、特に好ましくは、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａである。
モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａは、国際公開ＷＯ９４−１７１９７号パンフレットに記載された公知の抗体であり、当該特許文献に記載の方法で製造することができる。また、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａは、特許生物寄託センター（旧通商産業省工業技術院生命工学技術研究所）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ４１６３で寄託されているハイブリドーマを用いて、公知の方法により製造することができる。
【００１１】
本発明のＡβオリゴマーの測定方法は、下記の工程（ａ）および工程（ｂ）を含む。その操作は、汎用のＥＬＩＳＡ法に従って行えばよい。
工程（ａ）：不溶性担体に結合している、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第１抗体）に、Ａβオリゴマーを含有する試料を接触させて、第１抗体にＡβオリゴマーを結合させる工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）で第１抗体に結合したＡβオリゴマーに、標識化された、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
【００１２】
工程（ａ）で用いられる、「不溶性担体に結合している、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第１抗体）」の製造は、汎用の、タンパク質の不溶化（固定化）方法に従って行えばよい。
当該不溶化（固定化）においては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えば、ビオチン−（ストレプト）アビジン系が好ましく用いられる。本発明に用いられる担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、およびセルロースなどの不溶性多糖類；ポリスチレン、ポリアクリルアミド、およびシリコンなどの合成樹脂；およびガラスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
不溶性担体に、前記「配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体」を結合させたのち、所望により、市販のブロッキング剤を用いて、ブロッキング処理を行ってもよい。
【００１３】
工程（ｂ）で用いられる、「標識化された、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体（第２抗体）」の製造は、汎用の、タンパク質の標識化方法に従って行えばよい。
当該標識化に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素（例：西洋ワサビ  ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ））、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなどが挙げられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、およびフルオレッセンイソチオシアネートが挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンが挙げられる。標識化されるモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体のＩｇＧ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント（好ましくは、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’ フラグメント）を用いることができる。例えば、西洋ワサビ  ペルオキシダーゼで標識する場合、モノクローナル抗体のＩｇＧまたはＦａｂフラグメントに西洋ワサビ  ペルオキシダーゼを常法により結合させればよい。
【００１４】
Ａβオリゴマーを含有する（または、その可能性がある）試料は、例えば、次の方法等により調製することができる。
［方法１］
Ａβ１−４２（例えば、ペプチド研究所から入手可能である）を１ｍＭの濃度になるようにＨＦＩＰにて溶解し、エッペンドルフチューブに１０μＬとなるように分注し、エバポレータにて乾燥させる。その後、−３０℃以下に冷凍保存する。凍結保存合成Ａβペプチドを、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）で、１０μＬとなるように溶解後、更に生理的なバッファー（リン酸緩衝液；ＰＢＳ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変培地）、Ｆ１２培地など）を用いて最終濃度が１０μＭの濃度になるように溶解し、氷冷室等で一定時間（例、一昼夜）、インキュベーションする。
［方法２］
Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患（例、アルツハイマー病、ＭＣＩ、ダウン症候群）に罹患している（または、その可能性がある）対象、老齢者、またはアルツハイマー病原因遺伝子過剰発現トランスジェニックマウス等に由来する生体試料（例、脳の一部、生物の血液、脳脊髄液）を、氷冷下で、例えばプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴｒｉｓバッファーで抽出することにより、測定用サンプルとする。
本発明の方法は、好ましくは、９量体以上の高分子（例、約40kd〜200kd）オリゴマー（特に好ましくは１２量体以上（例、１２量体〜３２量体）のオリゴマー）を含有する（または、その可能性がある）試料の分析に、好適に用いられる。
【００１５】
工程（ａ）と工程（ｂ）は、逐次的に行ってもよく、同時に行ってもよいが、好ましくは、工程（ａ）の後に、工程（ｂ）を実施する。
【００１６】
工程（ｂ）の後、Ａβオリゴマーに未結合の第２抗体を洗い流す。
ついで、標識剤の種類に応じて、標識剤のシグナルを測定することにより、試料中のＡβオリゴマーを測定する。
【００１７】
より具体的には、本発明の方法は、例えば、下記の実施例１の方法に準じて行うことができる。
【００１８】
本発明のＡβオリゴマーの測定方法によれば、Ａβ（１−１６）またはその一部（例、Ａβ（３−１６））を含有するＡβ、またはその修飾体あるいはそれらの混合物のオリゴマーを測定することができる。このようなＡβの例としては、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）、Ａβ（１−４３）、およびそれらのＮ末短縮体（例、Ａβ（３−４２）、Ａβ（３−４２）、およびＡβ（３−４３））が挙げられる。
【００１９】
Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）、およびＡβ（１−４３）、Ａβ（３−４０）、Ａβ（３−４２）、およびＡβ（３−４３）のアミノ酸配列の例を以下に示す。
〔Ａβ（１−４０）〕配列番号：２
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
〔Ａβ（１−４２）〕配列番号：３
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
〔Ａβ（１−４３）〕配列番号：４
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr
〔Ａβ（３−４０）〕配列番号：５
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
〔Ａβ（３−４２）〕配列番号：６
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
〔Ａβ（３−４３）〕配列番号：７
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr
【００２０】
前記修飾体としては、パイログルタメート化物等のＮ末修飾体およびアミノ酸置換体等が挙げられる。このような修飾は、当業者に慣用の方法を用いて行うことができる。また、このような修飾体は、天然サンプルからも得られる。
【００２１】
本発明のＡβオリゴマーの測定方法によれば、２〜６量体は、実質的に測定せず、９量体以上の高分子（約40kd〜200kd）オリゴマー（特に好ましくは、１２量体以上（例、１２量体〜３２量体）のオリゴマー）を選択的に測定することができる。
【００２２】
本発明は、
（ａ）不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）；および
（ｂ）標識化されたモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第２抗体）
を含有する、Ａβオリゴマーの測定キット
もまた提供する。
【００２３】
このようなキットは、
（ａ）不溶性担体に結合している、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）；および
（ｂ）標識化されたモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第２抗体）
に加えて、ＥＬＩＳＡ法に必要な各種試薬や器具を備えていてもよい。
当該キットは、本発明の測定方法の実施のために使用することができ、９量体以上の高分子（約40kd〜200kd）オリゴマー（特に好ましくは、１２量体以上（例、１２量体〜３２量体）のオリゴマー）を選択的に測定することができる。
【００２４】
本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、Ａβオリゴマーを測定することにより、Ａβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索（スクリーニング）することができる。
例えば、
（１）初代神経細胞の培養液に被検化合物を添加した後、その培養上清中のＡβオリゴマーの量を、本発明の測定方法または本発明の測定キットを用いて測定し、その量を低下させる活性のある化合物を選択すること、または
（２）被検化合物を投与した動物の脳内のＡβオリゴマーの量を、本発明の測定方法または本発明の測定キットを用いて測定し、その量を低下させる活性のある化合物を選択することによって、Ａβオリゴマー形成を阻害する化合物の探索（スクリーニング）をすることができる。
【００２５】
より具体的には、当該方法は、例えば、下記の実施例２の方法に準じて行うことができる。
【００２６】
また、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、Ａβオリゴマーを測定することにより、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患（例、アルツハイマー病、ＭＣＩ、ダウン症候群）の解析が可能になる。本発明は、特に、アルツハイマー病に、好適に用いられる。
例えば、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、Ａβオリゴマーを測定することにより、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断を行なう事ができる。すなわち、本発明の測定キットは、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の診断薬として用いる事ができる。
具体的には、例えば、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、対象の脳脊髄液中のＡβオリゴマー量を測定することにより、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の罹患の有無、および病態進行度を診断することができる。
【００２７】
また、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の予防または治療のための医薬を投与した、かかる疾患に罹患した患者の脳脊髄液中等のＡβオリゴマー量を測定することにより、当該医薬の薬効を評価することができる。このような医薬としては、例えば、Ａβ凝集阻害薬（例、Ａｌｚｈｅｍｅｄ）、Ａβ産生低下薬（例、Flurizan、LY-450139）、および抗Ａβ（オリゴマー型を含む）抗体が挙げられる。
すなわち、本発明の測定方法、および本発明の測定キットは、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の予防または治療のための医薬の治療効果のモニター、または治験薬の評価に使用することができる。
【００２８】
アルツハイマー病患者においても、脳内のＡβオリゴマーの量には、大きな差がある。ここで、脳脊髄液中のＡβオリゴマーの量が多い患者は脳内のＡβオリゴマーの量が多いことが推察されるが、本発明の測定方法、または本発明の測定キットを用いて、対象の脳脊髄液等の中のＡβオリゴマー量を測定することにより、Ａβオリゴマーが関与する神経性疾患の予防または治療のための医薬（例、Ａβオリゴマー形成阻害薬）の治験に、より適した患者を選択することが可能となる。
さらに、本発明の方法、または本発明の測定キットを用いてＡβオリゴマーが関与する神経性疾患に罹患した患者の脳脊髄液等の中のＡβオリゴマーを測定することにより、その患者にとってより適当な治療方法を選択するオーダーメード治療も可能となる。
【００２９】
本願発明の方法、および測定キットを、タウ、リン酸化タウ、ｓＡＰＰα、もしくはＡＰＰβ等の測定方法、または他のＡβ（Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはそれらのＮ末短縮体）の測定方法と組み合わせることにより、神経性疾患（例、アルツハイマー病、ＭＣＩ、ダウン症候群）の罹患の有無、および病態進行度を診断することもできる。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例および試験例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３１】
下記の実施例中の略号は、以下の通りである。
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
）
下記の実施例において、各ＥＬＩＳＡは、以下のバッファーを用いて実施した。
［バッファー］
コーティングバッファーＡ
（０．１Ｍ  炭酸バッファー、ｐＨ９．６）
ブロッキングバッファーＢ
（２５％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ  ｉｎ  ＰＢＳ）
バッファー  Ｃ
（ｐＨ７．０、２０ｍＭ  リン酸バッファー、１０％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、０．２％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（商標）  Ｎａ（チメロサール）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０７６％  ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、５６℃  ３０分加熱処理後、冷室保存）【００３２】
実施例１
ＢＡＮ５０ａおよびＨＲＰ標識化ＢＡＮ５０ａを用いたＥＬＩＳＡ（オリゴマーＡβの定量）を、以下のステップで実施した。
（１）ＢＡＮ５０ａ抗体を１０μｇ／ｍｌ（７５μｌ／ｗｅｌｌ）の濃度でコーティングバッファーＡに溶かし、ＥＩＡ９６ウェルプレート（ｈｉｇｈ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｅ、Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に添加後、一昼夜、冷蔵室（約４℃）でインキュベーションした。
（２）ＰＢＳ（カルシウム，マグネシウム・フリー；以下、ＰＢＳ（−）と略記載する場合がある）で３回洗浄し、ブロッキングバッファーＢを１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、保存した。
（３）実験日に、ブロッキングバッファーＢを捨て、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、２５μｌのバッファーＣを添加した。
（４）スタンダードモノマーＡβ１−４２［Ａβ１−４２  ＴＦＡ塩（ペプチド研究所）をＤＭＳＯに１ｍＭとなるように溶解し、さらにＦ１２培地（GIBCO）で１０μＭに希釈して１ｍｌずつ分注して冷室（約−４℃）に一昼夜静置した溶液（当該溶液中には、オリゴマーが形成されている）を、バッファーＣにてスタンダードのモノマー濃度換算値として、１μＭ溶液になるように希釈し分注後、−８０℃で保存した。使用時に、分注した１μM溶液を、サンプルバッファーで２倍希釈系列（Ａβ１−４２濃度換算で１０〜０．００９７ｎＭ）を作成しスタンダードとして用いた。］を含む溶液は、バッファーＣにてＡβのモノマー相当濃度として１００ｎＭ濃度から２倍希釈系列で０．３９０６２５ｎＭまで準備した。サンプルを適当な濃度で希釈して、検量線の中に入ることを確認し、プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加した。
（５）一昼夜、サンプルを冷蔵室（約４℃）にてインキュベーションした。
（６）プレートをＰＢＳ（−）で４回洗浄した。
（７）二次抗体として、ＨＲＰ標識化ＢＡＮ５０ａ（生体内試料を測定する場合（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏの場合）はＦａｂ'−ＨＲＰ）を５０００倍希釈にバッファーＤにて希釈溶解し７５μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加した。これらの２次抗体は、専門業者（和光純薬）に依頼して、製造を行った。
（８）室温にて３時間以上インキュベーションした。
（９）プレートをＰＢＳ（−）で６回洗浄した。
（１０）各プレートにＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社）が７５μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加し、室温でインキュベーションした。
（１１）その後、反応した基質溶液に１Ｍリン酸溶液（７５μｌ／ｗｅｌｌ）を添加し、反応を停止させ、マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）によって、ＯＤ４５０を測定した。【００３３】
実施例２
以下の方法で、被試験化合物のオリゴマー形成への影響を調べた。
（１）Ａβ１−４２をＤＭＳＯで溶解し、３００μＭとした。
（２）適当な組成の反応液を調製して、チューブに入れた。
［反応液の組成の例（Ａβ１−４２の最終反応溶液中のＡβ１−４２濃度が３μＭ、化合物が３μＭ）］
Ａβ１−４２  （３００μＭ）              １μＬ
クルクミン溶液（３００μＭ）              １μＬ
Ｆ１２培地                              ９８μＬ
計                                    １００μＬ
（３）チューブを４℃で一昼夜インキュベーションした。
（４）反応液をバッファーＣ（前述）にて１００倍希釈し、前述のＥＬＩＳＡにて測定した。
（５）Ｖｅｈｉｃｌｅ群を１００％として、阻害率を算定した。【００３４】
試験例１
実施例１のＥＬＩＳＡ系によって認識されるオリゴマーＡβの分子種を同定した。Ａβ１−４２  ＴＦＡ塩（ペプチド研究所）をＤＭＳＯに１ｍＭとなるように溶解し、更に、１０μＭの濃度になるようにＦ−１２培地に溶解し、４℃で一昼夜、インキュベーション処理した。その後、本サンプルをろ過膜（０．４５μｍ）で前処理した後、ゲルろ過カラムに３００μＬ注入した。ゲルろ過は、Ｗａｔｅｒｓ社のＡｌｌｉａｎｃｅシステムで、Ｂｉｏｓｕｉｔｅ  ４５０，１２５の２本を組み合わせ、ＰＢＳ（−）を溶出バッファーとして１ｍＬ／ｍｉｎの速度で、氷冷室にて溶出させた。また、分子量のキャリブレーションに、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の低分子量、高分子量の２つのマーカーセットを用いた。キャリブレーションは、エクセル（マイクロソフト社）で、Ｌｏｇ（分子量）をＹ軸に、溶出時間をＸ軸にしてプロットすることで実施した。タンパク質の量は、ＯＤ＝２８０ｎｍでモニターした（図１）。また、溶出で分画したサンプル液を、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃで１０倍以上希釈し、実施例１のＥＬＩＳＡ系を用いて、分析した。その結果、実施例１のＥＬＩＳＡ系では、モノマーおよび比較的低分子のオリゴマー（２ｍｅｒ〜６ｍｅｒ）は検出されず、１７分から１９分に溶出した高分子オリゴマー（１２ｍｅｒ〜３２ｍｅｒ）が高い感度で検出された（図２）。【００３５】
試験例２
実施例２に従って、オリゴマーＡβの形成を阻害することが知られているクルクミン（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ）による高分子オリゴマーＡβ形成阻害を分析した。クルクミンの濃度を変えてＡβ４２溶液に添加後、実施例１のＥＬＩＳＡを用いて、クルクミンのオリゴマーＡβ形成への影響を検討した。その結果、オリゴマーＡβのシグナルが特異的に低下した。結果を図２に示す。対照のため、モノマーを認識する、ＢＡＮ５０ａ−ＨＲＰ標識化ＢＣ０５ａやＢＮＴ７７ａ−ＨＲＰ標識化ＢＣ０５ａのＥＬＩＳＡでの同様の分析（Asami-Odaka A, Ishibashi Y, Kikuchi T, Kitada C, Suzuki N., Long amyloid beta-protein secreted from wild-type human neuroblastoma IMR-32 cells. Biochemistry. 1995 Aug 15;34(32):10272-8. ）に記載の方法に準じて行った。）の結果も、あわせて、図３に示す。【００３６】
試験例３
ＢＡＮ５０ａ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に溶解し、９６−ｗｅｌｌ  ポリスチレンプレート（ＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）  ６００、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社）に添加（７５μｌ／ｗｅｌｌ）後に４℃で２４時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（−）（Ｃａ，Ｍｇ−ｆｒｅｅ  ＰＢＳ、ＤＵＬＢＥＣＣＯ'Ｓ  ＰＢＳ、大日本住友製薬ラボラトリープロダクツ部）で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ（−）／０．８％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本住友製薬ラボラトリープロダクツ部）／０．０１％  Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ  Ｎａ）を１００μｌ／ｗｅｌｌになるように添加して４℃で保存した。実験日にブロッキングバッファーを捨てて、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、２５μｌのサンプルバッファー（０．０２Ｍ  リン酸バッファー／０．４％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ／０．２％  ＢＳＡ／０．０５％  Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ  Ｎａ／０．４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０７６％  ＣＨＡＰＳ／２ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）を各ｗｅｌｌに添加した。アルツハイマー病患者髄液（コントロールとしては健常者髄液）をプロテアーゼインヒビター（ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を加えた（１タブレット／５ｍｌ）２倍濃度のサンプルバッファーで２倍に希釈し、各ｗｅｌｌに１００μｌずつ添加した。また、Ａβ１−４２  ＴＦＡ塩（ペプチド研究所）をＤＭＳＯに１ｍＭとなるように溶解し、さらにＦ１２培地（GIBCO）で10μＭに希釈して１ｍｌずつ分注して冷室（約−４℃）に一昼夜静置したものバッファーCにて１μM溶液に希釈し分注後、−80℃で保存。使用時に、分注した１μＭ溶液を、サンプルバッファーで２倍希釈系列（Ａβ１−４２モノマー濃度換算で２．５〜０．００９７ｎＭ）を作成しスタンダードとして用いた。すなわち、毎回の実験で全く同様の手順で作成したＡβ１−４２溶液（２倍希釈系列，１００μｌ／ｗｅｌｌ）中に存在するＡβ４２オリゴマーをスタンダードとして用いた。バッファーCで希釈したサンプル及びスタンダード溶液を添加したプレートを４℃で２４時間保存した後に、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、ＨＲＰ標識ＢＡＮ５０ａ抗体（1000〜5000倍希釈液）を１００μｌ／ｗｅｌｌになるように添加して室温で３時間インキュベートした。インキュベーション後にプレートをＰＢＳ（−）で６回洗浄した後に、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ、ＰＩＥＲＣＥ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加して、ルミノメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ（商品名）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で発光強度を定量した。検量線の結果を図４に、脳脊髄液サンプル測定の結果を図５に示す。図５に示されるように、当該方法により、アルツハイマー病患者および健常者の髄液中のＡβオリゴマー濃度を、有意に区別できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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