(57)【要約】  ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液に、クエン酸を好ましくは終濃度が０．１２５Ｍ以上となるよう添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ反応の停止方法。本発明により、ペルオキシダーゼ活性の測定の感度あるいは精度を向上することができ、加えて反応停止作業、反応停止剤の安全性の改善という効果も得ることができることから、本発明は、免疫生化学分野、遺伝子工学分野、応用生命科学分野、及び医学分野において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする、ペルオキシダーゼ反応の停止方法。
【請求項２】
テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はその塩である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ペルオキシダーゼ反応液に終濃度が０．１２５Ｍ以上となるようクエン酸を添加する請求項１記載の方法。
【請求項４】
ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ標識物を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ペルオキシダーゼ標識物がペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原である請求項４記載の方法。
【請求項６】
クエン酸を有効成分として含有する、請求項１〜５いずれかに記載のペルオキシダーゼ反応の停止方法に使用される反応停止剤。
【請求項７】
（１−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、及び
（１−ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有するペルオキシダーゼ活性を測定するためのキット。
【請求項８】
クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼを含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である請求項７記載のキット。
【請求項９】
（２−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（２−ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原、及び
（２−ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有する酵素免疫測定法のためのキット。
【請求項１０】
クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である請求項９記載のキット。
【請求項１１】
テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はその塩である請求項７〜１０いずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼによる呈色反応の停止方法、及び当該停止方法に使用する停止剤に関する。更に詳しくは、テトラアルキルベンジジン又はその塩を発色物質としたペルオキシダーゼによる呈色反応の停止方法、及び当該停止方法に使用する停止剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中の成分、例えば血液中あるいは尿中の抗原又は抗体などを測定する方法として、抗原又は抗体を酵素で標識して使用する酵素免疫測定方法が普及している。代表的な方法としてサンドイッチ法があるが、この方法では（１）まず測定しようとする物質（抗原）に対する第１の抗体をプレートやビーズなどの担体に固相化しておき、これに抗原を添加して抗原を固相化抗体に結合させる。（２）次いで酵素で標識した第２の抗体を添加し、固相化抗体−抗原−標識抗体複合体を形成する。（３）そして抗原に結合しなかった酵素標識抗体を洗浄して除去し、その後固相に結合した酵素活性を測定することにより抗原量を求める。すなわち、酵素活性は固相に結合した酵素標識抗体の量によって決まり、その酵素標識抗体量は固相化抗体に結合した抗原量によって決まるので、酵素活性は抗原量に相関することになる。ここで酵素としては、分子量が比較的小さく、反応が早く、短時間で感度の高い測定が期待できるためペルオキシダーゼが広く用いられている。【０００３】
従来からペルオキシダーゼ活性は種々の反応方法で測定されているが、過酸化物の存在下、発色物質を酸化させることにより色素を形成させ、これを比色定量する方法が最も一般的に行なわれている。かかる発色物質としては種々のものが使用されてきた。代表的な発色物質としてオルトフェニレンジアミンなどが用いられていたが、人体に有害であり使用時に注意が必要であった。新たな発色物質としてテトラアルキルベンジジン、なかでも非常に鋭敏な感度が得られかつ非発癌性である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（以下、ＴＭＢＺという）が開発され（非特許文献１）、その有用性のためサンドイッチ法（特許文献１）やテストストリップ（特許文献２）に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−２８６６６号公報
【特許文献２】特開昭５２−２１８９２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第３０巻、３２９９−３３０２頁、１９７４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ペルオキシダーゼによる呈色反応の停止には、一般的に０．５〜２Ｍの硫酸のような強酸を用いる。ところがテトラアルキルベンジジンを発色物質に用いたペルオキシダーゼ反応の停止に硫酸を用いた場合、発色強度が高くなるにつれ退色の速さが速く、かつ沈殿物の生成リスクが高くなり、データの信頼性に影響を及ぼす可能性があることが分かった。また退色は１時間を超えると顕著になるため、測定の時間的条件が著しく制限される点においても問題があることが分かった。【０００７】
上記の現状に鑑み、本発明の目的は、ペルオキシダーゼによる呈色反応において反応停止後の退色を抑制するペルオキシダーゼによる呈色反応の停止方法、及び当該停止方法に使用する停止剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上述した反応停止後の呈色安定性の改善という問題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、発色物質としてテトラアルキルベンジジンを含有するペルオキシダーゼ反応において、クエン酸を含有する反応停止剤を添加した反応液の呈色安定性が高いことを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち本発明を概説すれば、下記[１]〜[１１]に関する。
[１]  ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする、ペルオキシダーゼ反応の停止方法。
[２]  テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はその塩である[１]記載の方法。
[３]  ペルオキシダーゼ反応液に終濃度が０．１２５Ｍ以上となるようクエン酸を添加する[１]記載の方法。
[４]  ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ標識物を含む[１]記載の方法。
[５]  ペルオキシダーゼ標識物がペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原である[４]記載の方法。
[６]  クエン酸を有効成分として含有する、[１]〜[５]いずれかに記載のペルオキシダーゼ反応の停止方法に使用される反応停止剤。
[７]  （１−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、及び
（１−ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有するペルオキシダーゼ活性を測定するためのキット。
[８]  クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼを含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である[７]記載のキット。
[９]  （２−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（２−ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原、及び
（２−ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有する酵素免疫測定法のためのキット。
[１０]  クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である[９]記載のキット。
[１１]  テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はその塩である[７]〜[１０]いずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ペルオキシダーゼ活性の比色定量において、反応後の呈色が安定化されるため、ペルオキシダーゼ活性の測定の感度あるいは精度の向上が実現される。また、硫酸による反応停止の際に見られる沈殿の発生がないために、ペルオキシダーゼ活性が高い領域での測定も可能となった。加えてクエン酸は、食品添加物として使用されているとおり人体への毒性がないため、反応停止作業、反応停止剤の安全性の改善という効果も得ることができ、強酸で懸念される流通上の問題が生じにくい。更にクエン酸溶液は金属腐食性が低いことにより、分析機器を腐蝕する恐れもすくないことも本発明の効果として挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、硫酸又は各濃度のクエン酸水溶液の添加によるペルオキシダーゼによる呈色反応停止後の反応液の吸光度と経過時間との関係を示す図である。
【図２】図２は、硫酸添加による反応停止後のペルオキシダーゼによる呈色反応液の吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。
【図３】図３は、クエン酸添水溶液加による反応停止後のペルオキシダーゼによる呈色反応液の吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ペルオキシダーゼは過酸化物、例えば過酸化水素のペルオキシドを還元する酵素である。ペルオキシダーゼは西洋わさび、牛乳、酵母、白血球、赤血球などから抽出されるものが知られているが、本発明には研究用試薬、標識用酵素として汎用されている西洋わさび由来のペルオキシダーゼが好ましい。
【００１３】
本発明でいうペルオキシダーゼによる呈色反応とは、ペルオキシダーゼが触媒する反応、例えば過酸化水素の分解反応に共役した色素の呈色反応を言う。本明細書では、かかる色素のことを発色物質といい、ペルオキシダーゼによる呈色反応のことを単にペルオキシダーゼ反応と記載することもある。当該反応を利用するものとして、例えば石川榮治ら編集「酵素免疫測定法」、３０−４９頁（医学書院１９８２年発行）には、ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を用い、ペルオキシダーゼ活性量を過酸化物及び発色物質を含有する基質溶液を用いて測定する酵素免疫測定法が記載されている。本発明では発色物質としてテトラアルキルベンジジン又はその塩を用いることから、ペルオキシダーゼ活性量を過酸化物及びテトラアルキルベンジジン又はその塩から選択される発色物質を含有する基質溶液を用いて測定する方法ならいずれの方法にも適用される。
【００１４】
具体的には、本発明の方法は過酸化物、例えば過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出する方法や試料中のペルオキシダーゼを検出・測定する方法に利用することが可能である。また、前記のとおり、ペルオキシダーゼは抗体を用いた物質の検出に広く利用されており、本発明の方法はペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を利用した酵素免疫測定法に好適に使用することができる。本発明では、かかる方法においてペルオキシダーゼ反応が行われる液のことをペルオキシダーゼ反応液といい、該反応液には、過酸化物、ペルオキシダーゼ、発色物質としてテトラアルキルベンジジン又はその塩が含有される。なお、これらの成分は、予め反応液に存在したものであっても、別途添加したものであってもよい。
【００１５】
本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法では、前記ペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする。本発明において、該反応液におけるクエン酸終濃度が０．１２５Ｍ以上であると安定にペルオキシダーゼによる呈色反応が停止される。また３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを発色物質としたペルオキシダーゼによる呈色反応のエンドポイントアッセイで用いられる４５０ｎｍにおける吸光度測定を行う場合、更にクエン酸終濃度が高いほど吸光度が高くなり、測定感度の面で好ましい。よって、クエン酸濃度としては、ペルオキシダーゼ反応液へ添加された後の終濃度が好ましくは０．１２５Ｍ以上、より好ましくは０．２４Ｍ以上、更に好ましくは０．５Ｍ以上、更により好ましくは１Ｍ以上である。また、クエン酸の濃度に特に上限はないが、例えばペルオキシダーゼ反応液への添加後のクエン酸の終濃度が好ましくは３Ｍ以下、より好ましくは１．５Ｍ以下である。また、本発明におけるクエン酸終濃度の好適な範囲は、０．９８０Ｍ〜１．４７１Ｍである（後述の実施例２参照）。本発明では、かかるクエン酸終濃度となるように調製されたクエン酸溶液を、反応停止剤として用いることができる。
【００１６】
本発明におけるペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼ単体であっても、ペルオキシダーゼ標識物に含まれるものであってもよい。ペルオキシダーゼ標識物としては、ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原が挙げられるが、標識物の調製は公知の方法に従って行なうことができる。また、本発明に使用されるペルオキシダーゼ標識された抗体としては、測定対象物質に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらでも良いが、測定の再現性の観点からはペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体が好ましい。抗体のペルオキシダーゼによる標識は公知の方法、例えばグルタルアルデヒドを用いる方法、過ヨウ素酸を用いる方法、マレイミド基の導入を利用する方法により実施することができる。
【００１７】
また、本発明で用いられるテトラアルキルベンジジン又はその塩はベンジジンの誘導体であり、溶液中でペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解と共役して酸化し強い青色の化合物に変わり、酸性下で黄色となる。テトラアルキルベンジジンとしては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンが挙げられる。また、その塩としては、例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩二水和物が挙げられる。
【００１８】
なかでも本発明に好ましく用いられる３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）又はその塩は非常に鋭敏な感度でペルオキシダーゼ活性を測定することができ、且つ非発癌性であるとされる。本発明に用いられるＴＭＢＺを含む組成物の態様としてはペルオキシダーゼ反応に共役した色素の呈色反応に使用できるものであれば限定はなく、ＴＭＢＺの塩酸塩など、又はＤＭＳＯ溶液などの市販品を使用することができる。
【００１９】
ＴＭＢＺは、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解と共役して酸化し鋭敏に青緑色（λｍａｘ＝６５５ｎｍ）に発色する。この発色は酸性下では直ちに黄色（λｍａｘ＝４５０ｎｍ)の色素に変化する。したがって、ペルオキシダーゼによる呈色反応をクエン酸で停止させる本発明の方法では、硫酸を用いる従来の方法と同様に酸性下で反応を停止させることができ、同じ測定波長でペルオキシダーゼ活性の比色定量ができる。
【００２０】
ペルオキシダーゼ反応が停止される温度としては、クエン酸が反応液に十分混合されれば特に限定はないが、４〜３７℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。
【００２１】
なお、本発明の方法を免疫測定法にて使用する場合、測定対象となる物質に特に限定はない。研究、診断、環境測定などの分野で測定することが望まれ、かつそれに結合する抗体を取得可能である物質を測定対象とすることができる。例えばヒトもしくは非ヒト動物の生体由来物質、植物、微生物、ウイルスに由来する抗原やアレルゲン等が挙げられる。
【００２２】
かくして、ペルオキシダーゼの反応をクエン酸によって停止することが出来、その結果、テトラアルキルベンジジンの酸性下での呈色によりペルオキシダーゼ活性を測定することが可能となる。従って、本発明の別の態様として、ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする、ペルオキシダーゼ活性の測定方法が挙げられる。
【００２３】
また、本発明の一態様として、クエン酸を反応液に添加することでペルオキシダーゼ反応を停止させることができることから、クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤を提供する。該反応停止剤は、前記本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法に好適に用いられる。
【００２４】
本発明における反応停止剤は、有効成分としてクエン酸を含有し、テトラアルキルベンジジンとペルオキシダーゼを含有する反応液に添加された際にペルオキシダーゼの触媒する反応を停止し、かつ反応停止後に生じた黄色色素の吸光度が安定に保持されるものであれば限定はない。具体的には、例えば、クエン酸水溶液が挙げられる。
【００２５】
反応停止剤におけるクエン酸含有量は一概には決定されず、ペルオキシダーゼ反応液へ添加された後のクエン酸終濃度が好ましくは０．１２５Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上、更に好ましくは１Ｍ以上となるよう調製されたクエン酸溶液が反応停止剤として適している。また、特に上限はないが、例えば反応液への添加後のクエン酸の終濃度が好ましくは３Ｍ以下、より好ましくは１．５Ｍ以下となるよう調製された反応停止剤が本発明に適している。かかるクエン酸濃度となるのであれば、反応停止剤の調製方法は特に制限されず、例えば、クエン酸一水和物を水に溶解して調製することができる。
【００２６】
なお、本明細書において「クエン酸を有効成分として含有する」とは、ペルオキシダーゼ反応を実質的に停止する成分としてクエン酸を含有することを意味し、本発明の反応停止剤には、クエン酸以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で、ペルオキシダーゼ反応を停止可能な公知の成分が含まれていてもよく、また、ペルオキシダーゼ反応に関与しない成分が含まれていてもよい。
【００２７】
上記の、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法に使用される反応停止剤を含有するキットも本発明の一態様である。
【００２８】
具体的には、
（１−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、及び
（１−ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有するペルオキシダーゼ活性を測定するためのキット（ペルオキシダーゼ活性測定用キット）が挙げられる。
【００２９】
該キットにおける（１−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩としては、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法にて用いられるものと同様のものを用いることができ、なかでも、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はその塩が好ましい。また、（１−ｂ）反応停止剤は、本発明の反応停止剤であれば特に限定はない。
【００３０】
キットの形態や使用方法は特に制限されず、例えば、（１−ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤を、（１−ａ）テトラアルキルベンジジンとペルオキシダーゼを含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加することで、ペルオキシダーゼ反応を停止させてペルオキシダーゼ活性を測定することができる。該反応液には、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法における反応液に含有される成分と同様の成分を添加してもよい。また、反応停止剤の添加は、反応を停止させたいポイントで添加すればよい。
【００３１】
また、
（２−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（２−ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原、及び
（２−ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有する酵素免疫測定法のためのキットが挙げられる。
【００３２】
該キットにおける（２−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩としては、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法にて用いられるものと同様のものを用いることができ、なかでも、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はその塩が好ましい。
【００３３】
（２−ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原としては、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法にて記載したものが例示され、その調製方法も同様である。
【００３４】
（２−ｃ）反応停止剤は、本発明の反応停止剤であれば特に限定はない。
【００３５】
キットの形態や使用方法は特に制限されず、例えば、（２−ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤を、（２−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩と（２−ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加してペルオキシダーゼ活性を測定することで、酵素免疫測定を行なうことができる。該反応液には、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法における反応液に含有される成分と同様の成分を添加してもよい。また、反応停止剤の添加は、反応を停止させたいポイントで添加すればよい。
【００３６】
より詳しくは、本発明を利用した酵素免疫測定法の一例としては、例えば下記のような工程１）〜５）の手順での測定が例示される。
１）固相化一次抗体による測定対象物質の捕捉と固相の洗浄。
２）測定対象物質へのペルオキシダーゼ標識二次抗体の結合、並びに固相の洗浄。
３）基質溶液（過酸化水素並びにＴＭＢＺ）を添加してインキュベーション（ペルオキシダーゼによる呈色反応）。
４）本発明の反応停止剤を添加してペルオキシダーゼによる呈色反応を停止。
５）吸光度を測定。
【００３７】
上記１）〜３）の工程は、従来のペルオキシダーゼ標識された抗体を用いた酵素免疫測定法とまったく同一の操作で実施することができる。本発明では、反応停止後に生じる呈色の退色が抑制されていることから、工程４）と５）の間に時間がかかった場合であっても、再現性のあるデータを取得することができる。
【００３８】
なお、本発明が上記のようなサンドイッチ法の以外の酵素免疫測定法（例えば競合法、ウェスタンブロット法）にも適用できることは言うまでもない。
【００３９】
測定対象物質の検出・定量に使用される、
（３−ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（３−ｂ）測定対象物質に結合するペルオキシダーゼ標識抗体、又はペルオキシダーゼ標識された測定対象物質、及び
（３−ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤、
を含有するキットも本発明に包含される。
【００４０】
以上詳細に説明したように、本発明の態様として、
［１２］発色物質としてテトラアルキルベンジジンを含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼによる呈色反応の安定化方法、
［１３］テトラアルキルベンジジンが３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである［１２］記載の方法、
［１４］ペルオキシダーゼ反応液に終濃度が０．１２５Ｍ以上となるようクエン酸を添加する［１２］記載の方法、
［１５］ペルオキシダーゼ反応液がペルオキシダーゼ標識物を含有する反応液である［１２］記載の方法、
［１６］ペルオキシダーゼ標識物がペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原である［１５］記載の方法、
［１７］クエン酸を有効成分として含有する、［１２］〜［１６］いずれかに記載のペルオキシダーゼによる呈色反応の安定化方法に使用される反応停止剤及び／又は安定化剤、
も提供される。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例により、更に詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。なお、本明細書において、室温とは特に断りのない限り４〜３７℃のことである。【００４２】
実施例１  クエン酸を含有する反応停止剤によるペルオキシダーゼによる呈色反応の停止
１．５ｍＬ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅ（Ｔｒｅｆｆ社製）にＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社製）５００μＬと本発明者らが取得した過ヨウ素酸をもちいた抗Ｒａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ２抗体−ペルオキシダーゼ標識物液２０μＬを添加して攪拌後、８分間室温で静置してペルオキシダーゼによる呈色反応を行った。次に各種反応停止剤を５００μＬ添加して反応を停止した。反応停止後の各反応液を９６  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）各１ウェルに１００μＬずつ分注し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｘ  Ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて停止直後から５分毎に４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。反応は４連で行い測定値の平均値を採用した。ここで反応停止剤は、硫酸（和光純薬工業社製）を精製水で希釈して調製した０．５Ｍ硫酸、又はクエン酸一水和物（ナカライテスク社製）０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ水溶液を使用し、各反応停止剤に用いられた硫酸又はクエン酸の反応液における終濃度は、硫酸が０．２４５Ｍ、クエン酸が０．１２３Ｍ、０．２４５Ｍ、０．４９０Ｍ、０．７３５Ｍ、０．９８０Ｍであった。【００４３】
その結果を図１に示す。すなわち図１は、０．５Ｍ硫酸（図１中●）又は各濃度のクエン酸水溶液（図１中、０．２５Ｍ（×）、０．５Ｍ（◇）、１Ｍ（△）、１．５Ｍ（□）、２Ｍ（○））の添加による反応停止後の反応液の吸光度と経過時間との関係を示す図である。図１に示すとおり、反応停止を目的として０．５Ｍ硫酸、又は各濃度のクエン酸水溶液を添加したところ、添加直後から反応液の吸光度上昇がみられなくなった。このことから、クエン酸は硫酸と同様、ペルオキシダーゼによる呈色反応を停止できることが示された。今回用いた最も希薄なクエン酸水溶液（濃度０．２５Ｍ）であっても添加後のペルオキシダーゼによる呈色反応は進まず当該反応を停止できることが確認された。一方、硫酸による反応停止後の反応液と比較した各クエン酸水溶液による反応停止後の反応液の４５０ｎｍにおける吸光度は、クエン酸終濃度が低い場合には低く、クエン酸の終濃度が高くなるにつれて高くなり、０．５Ｍ硫酸による反応停止後の反応液と同等の吸光度を得るには２Ｍ以上のクエン酸水溶液の添加、すなわち終濃度１Ｍ以上のクエン酸の添加が必要であることが判明した。【００４４】
更に驚くべきことに、吸光度４付近を示す本測定条件において、図１に示すとおり硫酸による反応停止条件では反応停止後の反応液が退色し吸光度の低下が観測されたことと比較し、クエン酸による反応停止条件ではいずれのクエン酸濃度条件においても退色が抑制され、吸光度の安定性が顕著に改善されたことが判明した。また、硫酸による反応停止条件で反応停止後に見られた沈殿物はクエン酸による反応停止条件では見られなかった。【００４５】
実施例２  ０．５Ｍ硫酸による反応停止後の反応液と同等の吸光度が得られるクエン酸水溶液濃度の同定
実施例１と同様の試験を行い、反応停止直後の反応液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。反応は４連で行い、測定値の平均値を表１に示した。ここで反応停止剤は０．５Ｍ硫酸、又は２Ｍ、２．２５Ｍ、２．４Ｍ、３Ｍとなるクエン酸一水和物水溶液を使用した。また、各反応液における硫酸又はクエン酸の終濃度は、硫酸が０．２４５Ｍ、クエン酸が０．９８０Ｍ、１．１０３Ｍ、１．１７６Ｍ、１．４７１Ｍであった。表１に示されるように、終濃度０．９８０〜１．４７１Ｍの範囲で実質的に０．５Ｍ硫酸添加による反応を停止条件と同様の測定値を得た。【００４６】
【表１】
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【００４７】
表１に示すとおり２Ｍ以上のクエン酸水溶液添加条件において、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止後の反応液と同等の吸光度が安定して得られることが判明した。したがって以降の実施例ではクエン酸を含む反応停止剤として５０ｗ／ｖ％クエン酸一水和物水溶液を用いることとした。５０ｗ／ｖ％クエン酸一水和物水溶液は同２．３８Ｍに相当する。【００４８】
実施例３  ペルオキシダーゼによる呈色反応の安定性の評価
ＴａＫａＲａ  Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ）  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（Ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）（タカラバイオ社製）を用いて以下の試験を行った。キット添付のペルオキシダーゼ標識抗ＰＩＰモノクローナル抗体液を１００μＬずつキット添付の抗ＰＩＰモノクローナル抗体プレートの各ウェルに添加した後、あらかじめ調製した各濃度のＰＩＰ液をマイクロピペットで２０μＬずつ各ウェルに添加し、３７℃で３時間反応した。ＰＩＰ液の投入はすみやかに（５分以内）行った。次に反応液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄後、キット添付のＴＭＢＺ溶液を８連ピペットで１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温（２０〜３０℃）で１５分間反応させた。次に反応停止剤を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ウェルに添加し反応を停止させた後よく混和し、反応停止直後、１時間後、３時間後に４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各測定の間、反応停止後の反応液は室温に静置した。反応は２連で行い、測定値の平均値を採用した。ここで反応停止剤には０．５Ｍ硫酸、又は５０ｗ／ｖ％クエン酸一水和物水溶液を使用した。また、各反応液における硫酸又はクエン酸の終濃度は、硫酸が０．２５Ｍ、クエン酸が１．１９Ｍであった。【００４９】
その結果を図２及び図３に示す。すなわち図２は、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止直後（図２中〇）、１時間後（図２中□）、３時間後（図２中◇）のペルオキシダーゼによる呈色反応液の４５０ｎｍにおける吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。図３は、５０ｗ／ｖ％クエン酸添水溶液加による反応停止直後（図３中●）、１時間後（図３中■）、３時間後（図３中◆）のペルオキシダーゼによる呈色反応液の４５０ｎｍにおける吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。図２から明らかなように、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止後の反応液は、特にＰＩＰ濃度６４０ｎｇ／ｍＬ以上の条件において退色が著しく、経時的な吸光度低下の度合いが高く、データの信頼性が損なわれた。一方でクエン酸添加による反応停止後の反応液は、図３から明らかなように、反応停止３時間後であっても反応停止直後の吸光度カーブを維持していた。このことから本発明によるクエン酸を有効成分として含む反応停止剤を用いたことによって、ペルオキシダーゼによる呈色反応停止後の反応液の呈色安定性が飛躍的に向上することが明らかとなった。このことは測定の精度が向上し、かつ測定の時間的条件の制限が改善される効果を生んだことを示す。【００５０】
また、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止後の反応液は、ＰＩＰ濃度が６４０ｎｇ／ｍＬ以上の条件において、沈殿の発生が観察された。一方５０ｗ／ｖ％クエン酸水溶液添加による反応停止後の反応液ではＰＩＰ濃度２５６０ｎｇ／ｍＬであっても沈殿が発生せず正常に吸光度測定が可能であった。このことは本発明によるクエン酸を有効成分として含む反応停止剤を用いることによって、従来ＰＩＰ濃度６４０ｎｇ／ｍＬ以下と制限されていた当該キットの測定可能範囲が広がるという利点が得られたことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、ペルオキシダーゼ活性の測定の感度あるいは精度を向上することができる。したがって本発明は、免疫生化学分野、遺伝子工学分野、応用生命科学分野、及び医学分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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