(57)【要約】対物レンズ１６と、レーザ光源３２，４２からのレーザ光束を前記対物レンズ１６を介して標本１２に照射する照明光学系５１と、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブ６１と、前記蛍光キューブの前記光源側に挿脱可能な光学手段７０とを有し、前記光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行にする第１光学部材７２と、前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の位置に集光する第２光学部材７３とを有し、前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系内で移動可能である顕微鏡装置１。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと、
レーザ光源からのレーザ光束を前記対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブと、
前記蛍光キューブの前記レーザ光源側に挿脱可能な光学手段とを有し、
前記光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行にする第１光学部材と、前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の位置に集光する第２光学部材とを有し、
前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系内で移動可能であることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系の光軸に略直交する方向に移動可能であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系の光軸に沿って移動可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記第２光学部材のみが前記照明光学系の光軸に沿って移動可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第１光学部材は、楔プリズムを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記第２光学部材は、結像レンズを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記所定の位置に集光された前記レーザ光束は、前記対物レンズから前記標本に対する入射角が全反射角以上で射出することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記照明光学系は、落射照明光学系を更に有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡は、生体細胞等の観察方法として広く使用されており、共にレーザ光源を使用する点で共通しており、共焦点顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡に使用できる顕微鏡が提案されている（例えば、特開２００５−１２１７９６号公報参照）。
【発明の開示】
【０００３】
従来の顕微鏡では、共焦点顕微鏡から全反射顕微鏡への切り替え、或いは全反射顕微鏡において対物レンズを切替えた際に、対物レンズの瞳位置の全反射条件領域にレーザ光を集光させるための光学部材をその都度交換する必要があり、切替え交換作業が煩雑であるという問題がある。
上記課題を解決するため、本発明は、対物レンズと、レーザ光源からのレーザ光束を前記対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記レーザ光束を前記標本へ導く蛍光キューブと、前記蛍光キューブの前記レーザ光源側に挿脱可能な光学手段とを有し、前記光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行にする第１光学部材と、前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の位置に集光する第２光学部材とを有し、前記第１光学部材と前記第２光学部材は、前記照明光学系内で移動可能であることを特徴とする顕微鏡装置を提供する。
本発明によれば、共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換え可能であると共に、全反射照明時の対物レンズの切替えにも対応が容易な顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。
図２は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。
図３は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。
図４Ａは、実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作用における、共焦点走査照明状態または落射照明状態を説明する図。
図４Ｂは、実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作用における、全反射照明状態を説明する図。
図４Ｃは、実施の形態にかかる顕微鏡装置における結像位置変換光学手段の作用における、楔プリズムの作用を説明する図。
図５Ａは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、移動量が「ｄ＋Δα」の場合の説明図。
図５Ｂは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、移動量が「ｄ」の場合の説明図。
図５Ｃは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作において、図５Ｂに対して結像位置変換手段を光軸方向に「Ｄ」移動した場合の説明図。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明の一実施の形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。
図１は、実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。図２は実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。図３は全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。図４Ａ〜４Ｃは結像位置変換光学手段の作用を説明する図であり、図４Ａは共焦点走査照明状態または落射照明状態を、図４Ｂは全反射照明状態を、図４Ｃは楔プリズムの作用をそれぞれ説明する図である。図５Ａ〜５Ｃは、実施の形態にかかる結像位置変換光学手段の動作を説明する図である。なお、図２、図３では、後述する透過照明光学系を省略している。
図１から図４Ａ〜４Ｃにおいて、顕微鏡装置１は、倒立型蛍光顕微鏡本体２（以後、単に顕微鏡と記す）と顕微鏡２に搭載されている各種装置を制御するパーソナルコンピュータ等からなる制御装置３（以後、ＰＣと記す）とから構成されている。
顕微鏡２は、ステージ１１に載置された標本１２を、透過照明光源１３からの光で透過照明光学系１４を介して照明し、標本１２を透過した光をリボルバ１５に搭載された対物レンズ１６で集光する。
対物レンズ１６で集光された光は、図２に示すように、結像光学系１７の結像レンズ１８とミラーＭ１を介して一次像面１７ａに結像される。一次像面１７ａに結像された標本１２の像は、リレーレンズ１７ｂ、ミラーＭ２、リレーレンズ１７ｃ、および接眼鏡筒１９のレンズ１９ａを介して二次像面１８ｂに結像され、不図示の接眼レンズを介して観察者に観察される。この際、図１に示す蛍光キューブホルダ２０中の蛍光キューブ２１は結像光学系１７の光路から外されている。また、プリズム２２は結像光学系１７の光路に交換可能に配置されており、標本１２の透過像を観察するときには光路から外されている。このように、顕微鏡装置１は透過型顕微鏡として使用することができる。
また、図２に示すように顕微鏡２には、共焦点走査観察系３１と落射照明系４１とが共通の照明光学系５１を介して配置されている。
以下、顕微鏡装置１を走査型顕微鏡（走査型蛍光顕微鏡、共焦点走査型顕微鏡）として使用する場合について図２を参照しつつ説明する。
走査型顕微鏡として使用する場合、共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源からのレーザ光を光ファイバ３２で導き、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光を光軸にほぼ平行なレーザ光にし、標本１２上で二次元に走査する二次元スキャナ３４に入射する。二次元スキャナ３４から射出されたレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像される。像面ＩＰ１を出射したレーザ光は、照明光学系５１の結像レンズ５２で光軸に略平行なレーザ光にされ光路に交換可能に配置された不図示のミラーに入射する。不図示のミラーは、蛍光キューブ２１、６１と切換え可能に構成されている。なお、共焦点走査観察系３１を使用する場合、後述する落射照明系４１で使用する照明光学系５１の光路に挿脱可能に配置されているダイクロイックミラー４４は、照明光学系５１の光路から外されている。
不図示のミラーに入射したレーザ光は、対物レンズ１６方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。
一方、レーザ光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され、不図示のミラーで反射され照明光学系５１を逆行し二次元スキャナ３４に入射してデスキャンされ、ダイクロイックミラー３６で反射されて結像レンズ３７とピンホール３８を介してＰＭＴ等の受光素子３９に入射する。ＰＣ３は受光素子３９で受光された各点の強度を基に二次元画像に生成しモニター３ａ等で表示する。このように、顕微鏡装置１は共焦点走査型顕微鏡として使用することができる。
次に、顕微鏡装置１を落射蛍光顕微鏡として使用する場合について図２を参照しつつ説明する。
図２において、落射照明系４１の不図示の光源からの光は、光ファイバ４２で導かれ、コレクタレンズ４３で光ファイバ４２の端面から射出された光が、視野絞り４５位置に集光される。視野絞り４５を射出した光は、照明光学系５１に挿脱可能に配置されたダイクロイックミラー４４に入射して反射され、照明光学系５１の結像レンズ５２で集光され、光軸に略平行な光として光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ２１に入射する。なお、不図示の光源は、レーザ光源、高圧水銀ランプ、あるいはキセノンランプ等が使用可能である。蛍光キューブ２１は、波長選択フィルタ２１ａ、ダイクロイックミラー２１ｂ及びエミッションフィルタ２１ｃが内蔵されている。
蛍光キューブ２１に入射した光は、波長選択フィルタ２１ａとダイクロイックミラー２１ｂで所定の励起波長の光が選択され、対物レンズ１６方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。
この光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ２１に入射し、蛍光キューブ２１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このようにして、顕微鏡装置１は落射蛍光顕微鏡として使用することができる。また、顕微鏡装置１では、撮像素子２３で撮像された蛍光画像と、受光素子３９で受光された信号から形成された共焦点画像をモニター３ａに重ねて表示させるなどして観察することが可能である。
次に、顕微鏡装置１を全反射顕微鏡として使用する場合について図３を参照しつつ説明する。
全反射顕微鏡として使用する際の照明は、上述の共焦点走査観察系３１のレーザ光を使用する。また、全反射照明を達成するための後述する結像位置変換光学手段７０を結像レンズ５２と蛍光キューブ６１との間の光路に挿入し全反射顕微鏡を達成している。
図３に示すように、共焦点走査観察系３１の不図示のレーザ光源からのレーザ光は、光ファイバ３２で導かれ、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光を光軸にほぼ平行なレーザ光にして二次元スキャナ３４に入射される。また、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの光軸から離れた全反射条件領域にレーザ光を集光するために二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾斜が図１に示すＰＣ３の制御部により制御される。二次元スキャナ３４から射出された光軸シフト後のレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像され、照明光学系５１の結像レンズ５２を介して結像位置変換光学手段７０に入射する。結像位置変換光学手段７０は、光軸シフト後のレーザ光の光軸を照明光学系５１の光軸から距離ｄずらしたのち、対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光する光束に変換する。変換されたレーザ光はその後蛍光キューブ６１に入射する。
結像位置変換光学手段７０は、楔プリズム７２と凸レンズなどの集光レンズ７３から構成されている。そして図１に示す照明光学系５１の光路に挿脱可能に構成されている。なお、楔プリズム７２と集光レンズ７３は、光軸Ｉ１が図３及び図４Ｂに示すように、光軸シフト後レーザ光の光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけずらすことを可能にしている。この距離「ｄ」は、対物レンズ１６を介して被検物体を照明する場合の全反射条件となる瞳面上の位置に対応している。
このように結像位置変換光学手段７０に入射したレーザ光は、楔プリズム７２で光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸に対して主光線が距離「ｄ」だけずらされたレーザ光となり、集光レンズ７３で対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域に集光される。この、全反射条件領域に集光されたレーザ光は、対物レンズ１６から標本１２と標本１２を支持するガラス基板との境界面で全反射される角度で標本１２に入射する。
全反射角で標本１２を支持する基板との境界面に入射したレーザ光は、境界面にエバネッセント波を発生し、標本１２の境界面近傍でこのエバネッセント波により励起された蛍光が発生する。なお、レーザ光の波長は、不図示のレーザ光源で選択されているため、このとき図２に示す波長選択フィルタ２１ａは不要である。
エバネッセント波で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ６１に入射し、蛍光キューブ６１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７の光軸に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。
このように、顕微鏡装置１は、照明光学系５１の光路中に結像位置変換光学手段７０を挿入し、レーザ光の光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけ二次元スキャナ３４と楔プリズム７２を介して略平行に移動させ、かつ結像レンズ７３で対物レンズ１６の瞳面Ｐの所定位置に結像させることによって全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。
図４Ａ〜４Ｃ、図５Ａ〜５Ｃを参照して、全反射照明への移行について詳説する。
図４Ａは、走査型顕微鏡あるいは落射蛍光顕微鏡として使用する場合の照明光の状態を示している。上記顕微鏡の場合、結像レンズ５２に入射した破線で示す（＋）最大画角光束）、実線で示す像中心光束、及び粗い破線で示す（−）最大画角光束のいずれの場合も、対物レンズ１６の瞳位置Ｐでは、集光されていない略平行光束である。
一方、図４Ｂに示す、全反射顕微鏡としての照明状態では、レーザ光の光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸から図４Ａ〜４Ｃの紙面では上方に距離「ｄ」シフトされている。また、結像レンズ５２から射出するレーザ光は、レーザ光の光軸Ｉ１が、図４Ｃに示すように照明光学系５１の光軸に対して角α傾斜して入射する。楔プリズム７２はこの傾斜角αをほぼゼロにして照明光学系５１の光軸とレーザ光の光軸Ｉ１とが距離「ｄ」だけ離れてほぼ平行になるように変換する。その後、レーザ光は集光レンズ７３で対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域に集光される。この結果、全反射照明が可能となる。
図４Ｃに示すように、傾斜角αと楔プリズム７２の頂角δの関係は、α＝（ｎ−１）×δで示される。ここでｎは、楔プリズム７２を構成する媒質の屈折率である。
このように、対物レンズ１６の開口数（ＮＡ）に応じたレーザ光の光軸Ｉ１の傾斜角αに対応する頂角δを有する楔プリズム７２と、焦点距離ｆの集光レンズ７３を組み合わせた結像位置変換光学手段７０を照明光学系５１の結像レンズ５２と蛍光キューブ６１との間に挿入することで容易に全反射照明を達成することが可能になる。
また、実施の形態にかかる顕微鏡１では、照明光学系５１の光路に挿入される結像位置変換光学手段７０の楔プリズム７２と結像レンズ７３は、図５Ａ〜５Ｃに示すように照明光学系５１の光路中で移動可能に構成されている。なお、図５Ａ〜５Ｃでは、楔プリズム７２と結像レンズ７３とが一体的に、照明光学系５１の光軸に対して直交する方向、或いは照明光学系５１の光軸に沿った方向に移動する場合を示しているが、楔プリズム７２と結像レンズ７３を個別に移動するように構成することもできる。例えば、結像位置変換手段７０を照明光学系５１の光軸に対して直交する方向に移動後、結像レンズ７３のみを照明光学系５１の光軸に沿って移動するように構成することも可能である。このように構成することで、レーザ光の光軸をｄずらしたのちに対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射領域に集光することが容易になる。
これにより、対物レンズ１６が交換されて、ＮＡと瞳位置Ｐが変わった場合でも、照明光学系５１内での楔プリズム７２と結像レンズ７３の位置を調整することで、対物レンズ１６に応じた全反射照明領域にレーザ光を集光することができる。
図５Ａ〜５Ｃを参照して、移動量「ｄ」と瞳位置が変化した場合の結像位置変換光学手段７０の作用について説明する。
図５Ａに示すように、移動量が「ｄ＋Δα」、瞳位置「Ｐ１」の対物レンズ１６から、図５Ｂ、図５Ｃに示す移動量が「ｄ」、瞳位置が「Ｐ」の対物レンズ１６に交換された場合について説明する。
まず、レーザ光の光軸Ｉ１の移動量を「ｄ＋Δα」から「ｄ」に、図１に示すＰＣ３の制御部を介して二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾きを制御すると共に、結像位置変換光学手段７０を照明光学系５１の光軸に直交する方向に移動して、楔プリズム７２から射出する光束の光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸に略平行になるようにする（図５Ｂ参照）。これで、光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸から「ｄ」の距離に設定される。
次に、結像位置変換光学部材７０を照明光学系５１の光軸に沿って移動量「Ｄ」（図５Ｂ参照）移動し対物レンズ１６の瞳位置「Ｐ」にレーザ光が集光するように結像レンズ７３を位置付けする（図５Ｃ参照）。以上の操作で、対物レンズ１６が変更された場合の、移動量「ｄ」と瞳位置「Ｐ」への集光調整が完了する。なお、結像位置変換光学手段７０の移動制御、或いは楔プリズム７２、結像レンズ７３それぞれの移動制御は、ＰＣ３の制御部を介して、不図示のそれぞれの駆動部を駆動するように構成することもできる。
以上述べたように、実施の形態にかかる顕微鏡装置１によれば、共焦点走査観察系３１の二次元スキャナ３４を所定の傾きに制御することでレーザ光を照明光学系５１の光軸からシフトさせた後、結像位置変換光学手段７０を照明光学系５１の光路中に挿入し、楔プリズム７２、結像レンズ７３の位置を調整することによって全反射蛍光観察を可能にすることができる。
また、対物レンズ１６が交換された場合でも、共焦点走査観察系３１の二次元スキャナ３４を所定の傾きに制御してレーザ光を照明光学系５１の光軸からシフトさせた後、結像位置変換光学手段７０の、楔プリズム７２、結像レンズ７３の位置を調整することによって全反射蛍光観察を可能にすることができる。
また、共焦点走査型観察、走査型蛍光観察、落射蛍光観察、透過観察等の顕微鏡としても使用可能な顕微鏡装置１を提供することができる。
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図１】
2009142312.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2009142312.tif 000008
【図５Ａ】
2009142312.tif 000009
【図５Ｂ】
2009142312.tif 000010
【図５Ｃ】
2009142312.tif 000011
【国際調査報告】
2009142312.tif 000012
2009142312.tif 000013