(57)【要約】【課題】  自然環境から得た微生物試料から強い増殖力を有する有用微生物株を一度に複数種効率的に取得する手段の提供。【解決手段】  複数の微生物細胞を含有する可能性のある試料を培地に接種し、細胞肥大剤の存在下で培養する第一工程、前記第一工程後、前記培地にエステラーゼ基質蛍光染色剤を入れる第二工程、前記第二工程で着色した肥大化微生物細胞をマイクロ・マニピュレーション法で単離し、一個の微生物細胞が接種された株化用培地を複数作製する第三工程、  前記複数の株化用培地で微生物細胞を培養する第四工程、及び、前記第四工程で培養した前記複数の株化用培地から、細胞増殖が確認された株化用培地を選択する第五工程を有する、目的とする微生物株を試料から効率的に取得するスクリーニング方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微生物細胞を含有する可能性のある試料を培地に接種し、細胞肥大剤の存在下で培養する第一工程、
前記第一工程後、前記培地にエステラーゼ基質蛍光染色剤を入れる第二工程、
前記第二工程で着色した肥大化微生物細胞をマイクロ・マニピュレーション法で単離し、一個の微生物細胞が接種された株化用培地を複数作製する第三工程、
前記複数の株化用培地で微生物細胞を培養する第四工程、及び
前記第四工程で培養した前記複数の株化用培地から、細胞増殖が確認された株化用培地を選択する第五工程
を有する、有用微生物株を試料から効率的に取得するスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞肥大剤が、ピリドンカルボン酸系の抗生物質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ピリドンカルボン酸系の抗生物質を有効成分として含有する薬剤であって、当該薬剤が適合培地に存在している状況下では細胞分裂が阻害されて微生物細胞が肥大化し得ると共に、当該肥大化した一個の微生物細胞を株化用培地に移植して培養すると細胞分裂が開始し得る、複数の微生物細胞を含有する可能性のある試料から有用微生物株を効率的に取得するスクリーニング用剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットであって、
前記第一工程で使用する前記培地、
前記第一工程で使用する前記細胞肥大剤、
前記第二工程で使用する前記エステラーゼ基質蛍光染色剤、及び
前記第三工程で使用する前記株化用培地
の少なくとも一つを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来よりも高効率で、自然環境から取得した微生物試料から目的とする有用微生物株を一度に纏めて取得可能な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然環境中には多種・多様な微生物が生息する。そして、その中には、人類にとって有用な物質を作ったり有害な物質を分解したりして大きな利益をもたらす有用微生物も多い。【０００３】
例えば、それらの一つが脱窒菌等の土壌微生物である。近年、窒素肥料の大量使用や輸入食料・飼料の増大等により、硝酸態窒素による水系汚染、温室効果ガスであるＮ２Ｏ（亜酸化窒素）の発生等の環境問題が深刻になっているが、この解決には脱窒菌が大きな役割を期待されている。即ち、水田土壌には窒素肥料や生活廃水に由来するアンモニア（ＮＨ４＋）が存在し、一部はイネにより吸収されるが、残りは硝化菌の働きでまず硝酸イオン（ＮＯ３−）になり、最終的には脱窒菌により窒素酸化物でなく無害な窒素ガス（Ｎ２）に変換されて大気中に戻される。したがって、硝化菌や脱窒菌の連携した作用のおかげで水田土壌は畑土壌や草地土壌に比べて硝酸の溶脱やＮ２Ｏ等窒素酸化物の発生の少ない優良農地になっている。しかし現在、人工の培養条件下で脱窒能を示す微生物（脱窒菌）は多種知られているが、水田土壌で実際に機能している脱窒菌の種類に関する信頼できる同定結果は非常に少ない。
【非特許文献１】Koch, R. (1882). Die Aetiologie derTuberculose. Berl Klin Wochenschr 19, 221-230.
【特許文献１】特開２０００−７９０００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、自然環境中の有用微生物を取得することは、環境上もまた産業上も有用である。ここで、当該有用微生物を取得する手法として、微生物叢（多数の微生物の集合からなる固まり）からマイクロ・マニピュレーション法で得た１個の微生物細胞を１本の試験管（希望する微生物グループの増殖に適合した培地が入った試験管）に移して増殖させるという作業を複数の試験管で同時に行う方法（マイクロ・マニピュレーション法）がある。しかしながら、自然環境中では大部分の微生物細胞は休眠状態（または仮死状態）にあり、増殖の準備が出来ているものはほんの一部である。また、増殖の準備が出来ているものであっても、適合した条件（即ち、適合した培地に入れられた）ときのみ活発に増殖し、不適合培地に入れられた場合には多くは死滅する。そのため、マイクロ・マニピュレーション法で取得できる、増殖能の高い活力ある有用微生物株は全試験管の１〜５％に過ぎず、取得効率が著しく悪い。【０００５】
そこで、増殖力の高い活力ある有用微生物株をより効率的に取得する別法として、希釈平板法が最も広く使われている（非特許文献１参照）。この方法は、自然環境中に生息する微生物を無菌水等に分散し、可能な限り一個の細胞ずつバラバラにし、次にこれを寒天平板上に均一に塗布して増殖させる手法である。そして、一個の細胞から多数の細胞を増殖させて、利用可能なコロニーを形成させることを目論んでいる。しかしながら、当該希釈平板法では、実際には一個の細胞には分散されず数個〜１００個の細胞が一つの塊を形成することが多く、その結果、一つのコロニー中には数十種類以上の細胞が混在することになる。この場合、コロニーが増殖するに伴い、その中で次第に競争に弱い微生物は死減して競争に強いもののみが生き残ることになる。その結果、たとえ多数のコロニーが出現したとしても、同じ種類のものが多くなり、得られる微生物の種類数は非常に限定されたものとなる。更に、有用であるが競争に弱い微生物は得難いという問題もある。【０００６】
このように、微生物叢から有用微生物株をスクリーニングするに際し、前者のマイクロ・マニピュレーション法では、増殖力のある微生物も無い微生物も区別すること無く一個ずつ試験管に入れるので、全試験管に入れられた微生物数に対する強い増殖力の微生物数の割合が低い故、その取得効率が著しく悪くなる。また、後者の希釈平板法では、競争に弱い微生物が死滅する確率が高い故、前者の手法同様、新規な有用微生物株の取得効率が悪くなる。【０００７】
以上のように、自然環境から得た微生物試料から有用微生物株を効率的にスクリーニングすることの困難さ故、これら有用微生物の大部分はまだ利用されていないのが実情である。そこで、本発明は、自然環境から得た微生物試料から強い増殖力を有する有用微生物株を一度に複数種効率的に取得する手段（スクリーニング法）を提供することを第一の目的とする。【０００８】
更には、自然環境中には非常に多くの微生物種が存在していることに加えて同一種類内でも細胞ごとに遺伝的な変異が極めて大きいため、自然環境中に生息する微生物は、遺伝的・生理的特性が極めて多様である。したがって、個々の微生物株が要求する培地の種類も極めて多様になるために、それらに適合する極めて多種類の培地を用意しない限り、これら株を長期間安定して培養することは難しかった。その結果、従来法により海洋や土壌等の自然環境中から有用物質を生産する微生物株を得ても、増殖速度が非常に遅くて大量培養できなかったり長期の培養後には微生物活性が低下して有用物質を生産しなくなったりした。そこで、本発明は、自然環境から得られた微生物株を長期間強い増殖力のままで安定して培養する手段を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、以下の発明（１）〜（４）に到達した。【００１０】
本発明（１）は、複数の微生物細胞を含有する可能性のある試料を培地に接種し、細胞肥大剤の存在下で培養する第一工程、
前記第一工程後、前記培地にエステラーゼ基質蛍光染色剤を入れる第二工程、
前記第二工程で着色した肥大化微生物細胞をマイクロ・マニピュレーション法で単離し、一個の微生物細胞が接種された株化用培地を複数作製する第三工程、
前記複数の株化用培地で微生物細胞を培養する第四工程、及び
前記第四工程で培養した前記複数の株化用培地から、細胞増殖が確認された株化用培地を選択する第五工程
を有する、有用微生物株を試料から効率的に取得するスクリーニング方法である。【００１１】
本発明（２）は、前記細胞肥大剤が、ピリドンカルボン酸系の抗生物質（例えば、ナリジクス酸、ピペミド酸及びピロミド酸から選択される一種以上）である、前記発明（１）の方法である。【００１２】
本発明（３）は、ピリドンカルボン酸系の抗生物質（例えば、ナリジクス酸、ピペミド酸及びピロミド酸から選択される一種以上）を有効成分として含有する薬剤であって、当該薬剤が適合培地に存在している状況下では細胞分裂が阻害されて微生物細胞が肥大化し得ると共に、当該肥大化した一個の微生物細胞を株化用培地に移植して培養すると細胞分裂が開始し得る、複数の微生物細胞を含有する可能性のある試料から有用微生物株を効率的に取得するスクリーニング用剤である。【００１３】
本発明（４）は、前記発明（１）又は（２）のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットであって、
前記第一工程で使用する前記培地、
前記第一工程で使用する前記細胞肥大剤
前記第二工程で使用する前記エステラーゼ基質蛍光染色剤、
前記第三工程で使用する前記株化用培地
の少なくとも一つを含むキットである。尚、第一工程で使用する前記培地内に予め前記細胞肥大剤が入っている場合も、「前記培地」及び「前記細胞肥大剤」を含むキットとする。また、「少なくとも一つ」であるので、培地のみ、細胞肥大剤のみ、エステラーゼ基質蛍光染色剤のみ、株化用培地のみ、培地＋細胞肥大剤、培地＋エステラーゼ基質蛍光染色剤、培地＋株化用培地、培地＋細胞肥大剤＋エステラーゼ基質蛍光染色剤、培地＋細胞肥大剤＋株化用培地、培地＋細胞肥大剤＋エステラーゼ基質蛍光染色剤＋株化用培地、細胞肥大剤＋エステラーゼ基質蛍光染色剤、細胞肥大剤＋株化用培地、細胞肥大剤＋エステラーゼ基質蛍光染色剤＋株化用培地、エステラーゼ基質蛍光染色剤＋株化用培地のいずれでも、或いはこれらと別の構成要素（例えば、マイクロマニピュレーション法で用いる切断具等）との組み合わせのいずれでもよい。【００１４】
ここで、本特許請求の範囲及び本明細書における各用語の定義を説明する。「エステラーゼ基質蛍光染色剤」とは、元来無蛍光であるが、酵素エステラーゼの作用により蛍光を発するようになる染色剤を指す。従って、この染色剤の添加により、全ての生きている微生物（または生物）はエステラーゼ活性を持っているので、染色されることになる。「細胞」とは、生物体を構成する形態上・機能上の構成単位であり、真核細胞、原核細胞及び古細菌（アルケア）のいずれをも含む。「試料」は、複数の微生物細胞を含有する可能性があるものである限り限定されず、例えば、土壌、砂、底泥、動物組織及び組織内物質、植物組織、浮遊粉塵、河川水、海水、食品、化粧品、飼料、等を挙げることができる。「細胞肥大剤」とは、当該薬剤が存在する状況下では、細胞の肥大化が促進され得る薬剤を指し、好適には、当該薬剤が適合培地に有効量存在している状況下では、微生物細胞を肥大化させ得る性質を有すると共に、当該肥大化した一個の微生物細胞を肥大剤が含まれない株化用培地に移植して培養すると細胞分裂が開始し得る性質（可逆性）を有する薬剤を指す。「肥大化微生物細胞」とは、顕微鏡で観察すると、通常の微生物細胞（大きさ：１〜２μｍ）よりもはるかに大きい細胞（例えば、通常の大きさの３〜４倍程度の長さ又は大きさになる）を指す。「株」とは、遺伝的に均一な微生物集団を指す。「マイクロ・マニピュレーション法」とは、顕微鏡下でマイクロツールを一又は複数個操作することにより微生物を操作する手法を指す。「マイクロ・マニピュレータ」とはマイクロ・マニピュレーション法に用いる機器を示す。
【発明の効果】
【００１５】
本発明（１）によれば、マイクロ・マニピュレーション法及び蛍光染色剤を使用することで、細胞肥大剤を含有する培地から肥大化細胞を一個ずつ複数取得する作業を短時間で済ますことが可能になるので、スクリーニングを実施するための複数の株化用培地への全移植時間を大幅に短縮できる。その結果、肥大化細胞が細胞肥大剤に適用（浸漬）されている時間を移植されるすべての肥大化細胞について略同一（例えば、平均時間±２ｈ）とすることができるので、（１）細胞肥大剤の浸漬時間が短すぎることに起因した、有用微生物が十分に肥大化しないという状況を防止できる結果、当該有用微生物がスクリーニングの対象から外れてしまう危険を回避できる一方、（２）細胞肥大剤の浸漬時間が長すぎることに起因した、有用微生物の増殖停止を防止できるという効果を奏する。このように、上記理由によって、本発明（１）は、有用微生物の効率的スクリーニングに特に向いている。また、本発明（１）によれば、前述のように短時間で効率的に有用微生物株を取得できるので、有用微生物株を取得するまでの費用、時間及び労力（一個の有用微生物当たり）を軽減できる。【００１６】
更に、本発明（１）は、微生物細胞を一個ずつ別々の株化用培地に入れて培養する前に、細胞肥大剤の存在下、希望する微生物種に適合した培地で微生物叢全体を予備的培養する工程を含む。その結果、当該培地及び当該細胞肥大剤に適合している微生物種であり、かつ、その種の中でより強い繁殖力を有するものや休眠中でない微生物を肥大化細胞として獲得できるので、この肥大化細胞を一個ずつ別々の株化用培地に入れて培養することにより、増殖力のある微生物も無い微生物も区別すること無く一個ずつ株化用培地に入れて培養する従来法と比較し、目的とする微生物株の取得効率が顕著に向上する（例えば、従来法では１〜５％、本法では２０〜６０％、なお、本実施例では８２／１３０＝６３％の場合を示す）という効果を奏する。また、予備的培養では希望する微生物種に適合した培地及び細胞肥大剤を使用するため、自然環境中から希望する性質（特に培養的性質）を有する微生物グループのみを効率よく入手できるという効果をも奏する。更には、まさに増殖を開始した一個の細胞を得ることが出来るので、得た一個の細胞が確実に多数に増殖するという効果をも奏する。また、株化の対象となる細胞が肥大化するため、当該細胞を顕微鏡下で発見することが容易であるという効果をも奏する。【００１７】
更には、有用微生物株を取得した後は、株化の際に用いたものと同じ培地をそのまま使用すればよいので、従来のように培地不適合のために、得られた有用微生物株の増殖速度が非常に遅くて大量培養できなかったり長期の培養後には有用物質を生産しなくなったりするといった事態を招くことが無い（適合した培地中で保存されていない微生物は長期間には次第に増殖力を失うからである）。即ち、本発明（１）に係る方法で得られた微生物株は、株化の際に用いた培地で容易にしかも速く増殖するので、大量培養が容易になり、有用物質を大量に生産できるという効果を奏する。更には、本発明（１）に係る方法で得られた微生物株は、非常に良く適合する培地が判明しているので、長期間良い状態で保存が可能である、即ち、長期の培養後でも有用物質の生産をする可能性が高いという効果を奏する。【００１８】
更には、蛍光染色剤として、核酸に結合せず代謝に対する毒性も無くかつ蛍光を発する為の励起光も無害な光（例えば青色）であるエステラーゼ基質蛍光染色剤を用いたので、肥大化細胞を単離した後も株化培養が可能な程度まで肥大化細胞の活力を維持できるという効果を奏する。【００１９】
本発明（２）及び（３）によれば、細胞分裂を阻害する機能を有する所定化合物を細胞肥大剤として使用するので、細胞分裂を許容しつつ細胞肥大させる場合と比較し、より短時間での細胞肥大効果を期待できる結果、単位時間当たりの有用微生物のスクリーニング効率を更に高めることが可能になるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の最良形態を説明する。尚、本発明の技術的範囲は本最良形態に限定されるものではない。例えば、細胞肥大剤として細胞分裂阻害機能を有するものを例示し、また、マイクロ・マニピュレーション法として以下の態様を例示するが、これらに限定されるものではない。ここで、本最良形態に係るスクリーニング方法は、上述した第一工程〜第五工程からなる。以下、各工程について詳述する。【００２１】
《第一工程》
第一工程は、複数の微生物細胞を含有する可能性のある試料を培地に接種し、細胞肥大剤の存在下で培養する工程である。ここで、細胞肥大剤の添加順序は、特に限定されず、培地内にもともと含ませてもよく、試料を接種する前に培地に適用してもよく、更には、試料を接種した後に培地に適用してもよい。以下、各要素を詳述する。【００２２】
（細胞肥大剤）
まず、本最良形態に係る好適な細胞肥大剤は、（１）所定濃度では細胞分裂を阻害又は抑制して微生物細胞を肥大化させる性質を有すると共に、（２）濃度が低下すると細胞分裂の阻害作用又は抑制作用を失いかつ正常な増殖その他機能に対して悪影響を与えない性質（可逆性）を有する限り特に限定されず、例えば、細胞分裂を止める細胞分裂阻害剤｛例えば、細胞分裂に関与する酵素の阻害作用を有する薬剤（例えば抗生物質、農薬）｝を挙げることができる。当該性質を有する具体的な薬剤としては、例えば、ピリドンカルボン酸系の抗生物質（例えば、ナリジクス酸、ピペミド酸及びピロミド酸）を挙げることができる。尚、当該細胞肥大剤を用いると、例えば、細胞は通常の大きさの３〜４倍程度の長さ又は大きさになる。ここで、細胞肥大剤は、微生物の種類により適用すべき薬剤が異なる。更には、細胞肥大剤は、濃度が高い場合には微生物の殺菌剤として機能し、濃度が低くなると微生物の分裂機能を損なわせる細胞肥大剤として機能する（後者が本最良形態にいう「細胞肥大剤」）。このように、肥大剤の種類と量を適宜選択することにより、培地による種類選択圧以外にも肥大剤による選択圧をかけることができる。例えば、上述した薬剤の内、ナリジクス酸はグラム陰性菌、ピペミド酸とピロミド酸はグラム陽性菌に有効である。また、複数の菌種に関して共通の性質を有することが判明している場合には、複数の細胞肥大剤を組み合わせて使用してもよい。例えば、実施例においては脱窒能を持つ菌（グラム陽性・陰性菌どちらにも存在）の取得を目的とし、これら両方をカバーするために３種の抗生物質を組み合わせて使用している。尚、第一工程における当該肥大剤の適用時間は、細胞肥大剤の種類や濃度、対象とする有用微生物の種類にもよるが、通常は２４時間以内である。また、第一工程の時間を、単離するすべての肥大化細胞について略同一（例えば、平均時間±２ｈ）にすることが重要である。ここで、「平均時間」とは、例えば、取得を希望する有用微生物が十分に肥大化するであろう予想時間（例えば、取得を希望する種類と同種についての過去データに基づき決定）を指す。この平均時間からのブレが少ない程、取得を希望する有用微生物の取得効率が向上する。その理由は、（１）細胞肥大剤の浸漬時間が短すぎることに起因した、有用微生物が十分に肥大化しないという状況を防止できる結果、当該有用微生物がスクリーニングの対象から外れてしまう事態を回避できる一方、（２）細胞肥大剤の浸漬時間が長すぎることに起因した、有用微生物の増殖停止を防止できる、からである。尚、後述するように、第二工程での蛍光染色剤を添加した後、発色するまでに所定時間を要するので、当該発色時間をも考慮の上、第一工程の時間を、前述の予想時間から当該発色時間分を減じた時間としてもよい。【００２３】
（培地）
次に、使用する培地は、特に限定されないが、ある特定の種類の微生物のみが生育する培地（即ち、取得を希望する微生物に適合した培地）を選択することが好適である。例えば、光合成を行う菌と行わない菌を取得する場合には、グルコース等のエネルギー源のない培地（即ち無機的な栄養素のみの培地）では光合成を行う菌のみが生育し、グルコースのようなエネルギー源を含む培地では光合成を行わない菌が生育する。尚、当業者であれば、どのような微生物の取得を希望するときにどのような培地を選択すればよいかは容易に判断可能である。参考までに、取得を希望する微生物と使用される培地との一例を表１に示す。【００２４】
【表１】
2009116127.tif 000002
【００２５】
（繰り返し処理）
更には、培地及び／又は細胞肥大剤を変えて、第一工程を複数回実行してもよい。例えば、第一工程（１回目）では、細胞肥大剤の存在下、天然試料をある培地で培養して肥大化微生物を得る。次に、第一工程（２回目）では、同じ細胞肥大剤の存在下、当該肥大化微生物を別の培地を用いて培養する。これにより、第一工程（２回目）で得られた肥大化微生物は、１回目と２回目のいずれの培地にも適合した性質を有する微生物ということになる。尚、この繰り返し処理を実行する場合には、後述する第二工程（エステラーゼ基質蛍光染色剤添加工程）を第一工程の各回とセットで実施することが好適である｛例えば、第一工程（１回目）→第二工程→第一工程（２回目）→第二工程・・・｝。ここで、図１を参照しながら、本工程における目的微生物の取得プロセスパターン例を挙げることとする。尚、ここでは、理解の容易上、試料中に存在する微生物が「菌Ａ」〜「菌Ｄ」の４種類であり、使用される培地が「培地イ」及び「培地ロ」の２種類であり、使用される細胞肥大剤が「細胞肥大剤α」及び「細胞肥大剤β」の２種類である、簡単なモデルを例にとり説明する。また、図中、培地に関する「○」は、対象となる菌の生育に適した培地であることを意味し、培地に関する「×」は、対象となる菌の生育に不適な培地であることを意味し、細胞肥大剤に関する「○」は、使用濃度においては対象となる菌に対して細胞肥大作用を示す薬剤であることを意味し、細胞肥大剤に関する「×」は、使用濃度においては対象となる菌に対して毒（殺菌剤）となる薬剤である（この場合は死滅又は弱体化）か、或いは対象となる菌に対して作用しない薬剤である（この場合は通常通り細胞分裂）ことを意味する。【００２６】
まず、図１中の例１は、使用する細胞肥大剤の種類を固定した状況で、複数種類の培地を連続的に適用することにより、最終的に菌Ｃを単離する例である。ここで、まず第一回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに対して細胞肥大作用を示す細胞肥大剤αの存在下、菌Ａ〜菌Ｃの選択培地イが使用されている。この場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で増殖・肥大する。他方、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のため、増殖することなく死滅又は弱体化する。特に、細胞肥大剤αが毒として作用する場合には、菌Ｄは死滅する。このように、第一回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃが選択される。次に、第二回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに対して細胞肥大作用を示す細胞肥大剤αの存在下、菌Ｃ〜菌Ｄの選択培地ロが使用されている。この場合、菌Ｃ〜菌Ｄは、当該培地の栄養で増殖し得るが、これらの内、菌Ｃは細胞肥大剤αに適合しているので肥大する一方、菌Ｄは細胞肥大剤αに適合していないので増殖するものの細胞は相対的に小さいままである（加えて、菌Ｄは、第一回培養において不適応培地に適用されていたので、休眠等して生存している菌が仮に存在していたとしても、当該菌数は減少しているか弱体化している）。このように、第二回培養においては、菌Ｃが選択される結果、菌Ｃのみを単離することが可能となる。【００２７】
ここで、例１においては、菌Ｃを確実に取得するため、各培養工程において細胞肥大剤を使用している。しかしながら、最終工程（例１では第二回培養）で細胞肥大剤を使用する限りは、理論上、その途中の培養工程の一部又はすべてにおいて細胞肥大剤を使用しなくともよい。例えば、例１の変更例として、例１の第一培養工程において、細胞肥大剤αを使用しない例を示す。このように、理論的には、第一培養工程で培地イにより菌Ａ〜菌Ｃが選択されるが、菌Ｄは休眠又は死滅する。またこれらの菌には肥大剤を適用しない。第二培養工程では、培地ロにより菌Ｃと菌Ｄが生育できるが、菌Ｄは既に死滅しているので菌Ｃのみが選択され、最終的に肥大剤αにより菌Ｃのみが肥大する。【００２８】
次に、例２は、使用する培地を固定した状況で、複数種類の細胞肥大剤を連続的に適用することにより、最終的に菌Ｃを単離する例である。ここで、まず第一回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに適合した培地イの存在下、菌Ａ〜菌Ｃに対して肥大作用を示す細胞肥大剤αが使用されている。この場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で肥大する。他方、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のため、肥大することなく死滅又は弱体化する。特に、細胞肥大剤αが毒として作用する場合には、菌Ｄは死滅する。次に、第二回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに適合した培地イの存在下、菌Ｃ〜菌Ｄに対して肥大作用を示す細胞肥大剤βが使用されている。この場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で増殖し得るが、これらの内、菌Ａと菌Ｂは、（１）当該細胞肥大剤βが毒として作用する菌については、死滅又は弱体化し、（２）当該細胞肥大剤βが毒として作用しない菌については、肥大することなく細胞分裂を行う（即ち、相対的に小さいまま）。そのため、残る菌Ｃのみが、当該培地で更に肥大する結果、菌Ｃのみを単離することが可能となる。【００２９】
次に、例３は、使用する培地と細胞肥大剤とを絞込み、より少ない回数（本例では一回）で菌Ｃを単離する例である。ここで、培地としては、菌Ａ〜菌Ｃの選択培地イを採用する。他方、細胞肥大剤としては、菌Ｃ〜菌Ｄに対して肥大作用を示す細胞肥大剤βを採用する。このように、まず、選択培地イを採用した場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で増殖し得る。他方、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のため、増殖することなく死滅又は弱体化する。更に、細胞肥大剤βを採用した場合、菌Ｃ〜菌Ｄは肥大可能であるが、前述のように、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のために増殖することなく死滅又は弱体化しているので、菌Ｃのみが、当該培地で肥大する。その結果、菌Ｃのみを単離することが可能となる。【００３０】
《第二工程》
第二工程は、前記第一工程後、前記培地にエステラーゼ基質蛍光染色剤を入れる工程である。ここで、当該工程では、肥大した微生物細胞を単離するに際し、生きている微生物のみが染まる染色剤を組み合わせて使用すると、更に発見することが容易となる。但し、肥大化細胞は通常の大きさの細胞と比べて弱いため、通常の染色剤を使用すると、以後の培養工程でも増殖速度が遅くなったり、増殖しなかったり、増殖したとしても有用物質の生産を行わない株となる恐れがある。そこで、本スクリーニング法においては、肥大化細胞をその後に培養する際にも当該肥大化細胞に悪影響を与えない、エステラーゼ基質蛍光染色剤である必要がある。当該染色剤としては、例えば、ＣＦＤＡ−ＡＭ（5-carboxyfluorescein
diacetate, acetoxymethyl ester）｝及びＣＦＤＡ（carboxyfluorescein diacetate）を挙げることができる。【００３１】
ここで、肥大化細胞の株化という観点から蛍光染色剤の種類を限定するという発想はそれ自体新規である。このことを詳述する。まず、菌に細胞分裂阻害剤を適用して肥大化させた上で蛍光染色剤を添加することは、本出願前から知られていた（ＤＶＣ法、特許文献１）。但し、当該蛍光染色剤として細胞のＤＮＡに障害を与えるエチジウムブロミド染色剤（ＥＢ染色剤）を必須的に使用する点で本発明と相違する。このような状況下、本発明者は、このＤＶＣ法と各種染色剤（ＥＢ染色剤をはじめとする多種の染色剤）とを組み合わせて細胞を肥大化させた後、染色された当該肥大化細胞を単離し培養することを試みたが、長らくの間全く成功しなかった。そして、本発明者は、鋭意研究の結果、その成功しない理由が、細胞肥大剤を適用すると細胞は肥大化するものの、従来の染色剤では当該細胞自体が弱体化し、その後の培養に適用できなくなる場合があることを突き止めた。例えば、上述のＥＢ染色剤は、核酸の二本鎖の間に入り込んだり（intercalation)、又はＤＮＡ鎖のある特定部分に吸着して核酸情報の読み取りを撹乱したりするため、肥大化細胞がダメージを受けるとの知見を得た。更に、本発明者は、ある種の蛍光染色剤に関しては、顕微鏡観察の為に紫外線又は近紫外線を照射する必要があり、そのために微生物の細胞または核酸がダメージを受けるとの知見を得た。これら知見を踏まえ、本発明者は、核酸に結合せず代謝に対する毒性も無くかつ蛍光を発する為の励起光も無害な光である青色という性質を有するエステラーゼ基質蛍光染色剤が、上記のような問題が無く、肥大化細胞を単離した後も培養可能な程度まで肥大化細胞の活力が維持されることを見出した。更に、エステラーゼ基質蛍光染色剤は生細胞のみを染めるので、培養に供する微生物細胞を探すのに適している。更に、エステラーゼ基質蛍光染色剤は、通常の細胞に適用した場合には一部の種類では発する蛍光が弱く観察しにくいという問題があるが、肥大化細胞に適用した場合には細胞が大きいため、蛍光が弱くても容易に識別できる。【００３２】
《第三工程》
第三工程は、前記第二工程で着色した肥大化微生物細胞をマイクロ・マニピュレーション法で単離し、単一の微生物細胞が接種された株化用培地を複数作製する工程である。以下、各要素を詳述する。【００３３】
（マイクロ・マニピュレーション法）
まず、有用微生物の候補となり得る、肥大した一個の微生物を迅速に分離取得するに際しては、顕微鏡下でのマイクロ・マニピュレーション法で実施する必要がある。マイクロ・マニピュレータの操作中に肉眼で細胞を識別することにより、希望する種類の微生物を効率的に選択できるからである（特に細胞の大きさや形状に特徴があるもの）。更には、自然環境中には叢状や糸状の微生物細胞が多く、従来法では株化が困難である状況下、マイクロ・マニピュレーション法によると集団状の細胞を一個一個の細胞に分離することが可能であるからである。【００３４】
そこで、当該マイクロ・マニピュレーション法の一態様は、肥大した一個の微生物を分離取得するに際し、把持や吸引といった物理力で一個の微生物を保持可能な保持器を使用する手法である。当該保持器の好適例としては、キャピラリーで一個の微生物を吸引可能なマイクロ・マニピュレータを挙げることができる。ここで、当該キャピラリーは、ガラス製、鋼鉄製等であることが好適であり、かつ、内径が５〜１００μｍであり、２０〜８０μｍであることが好適である。ここで、「内径」とは、先端内径を意味し、顕微鏡で確認可能である。ここで、図２は、マイクロ・マニピュレータ１を使用して肥大した一個の微生物を保持する様子を示した図である。図に示すように、マイクロ・マニピュレータ１のキャピラリーホルダー１ａは、本体部に固定されており（図示せず）、油圧でＸＹＺ方向にミクロン単位で移動可能に構成されている。また、当該キャピラリーホルダー１ａは、注射筒１ｂと連結している。そして、当該注射筒１ｂの操作により、キャピラリーホルダー１ａ内は減圧・加圧状態となり、これにより当該ホルダー内部に微生物が吸引・放出される。具体的な微生物取得法を説明すると、図に示すように、培養後の試料をスライドグラス２上に載せた後、顕微鏡３で覗きながら試料中の肥大した微生物を探す。この際、微生物自体が巨大であるので発見することが容易である。そして、このような肥大した微生物を発見した後は、顕微鏡を覗きながらキャピラリーホルダー１ａをＸＹＺ方向に適宜操作し、キャピラリーホルダー１ａの先端部分にあるキャピラリー１ｃを当該肥大した微生物に接触させ、注射筒１ｂを図中の矢印方向に操作すると、当該微生物がキャピラリー１ｃ内に吸引される。【００３５】
次に、当該マイクロ・マニピュレーション法の別態様は、微生物叢から一個の微生物を切断する手法である。ここで、採取した試料にもよるが、そのままの状態では微生物同士が相互に連結していたり凝集している場合がある（土壌試料では経験上９０％程度はこの状態）。ここで、当該切断の際に使用する微小工具例を詳述する。【００３６】
図３は、当該例に係る切断器具Ａ（１）の構造を示した図である。微小工具（切断器具）Ａ（１）は、マイクロ・マニピュレータにより力が直接加えられる長手部材である切断子１１０と、微生物を両手で押さえ付けることが可能な把持子１２０とを有する。ここで、切断子１１０は、マイクロ・マニピュレータに装着される装着部１１１を一端に有し、糸状・叢状になった多数の微生物群を切断するための切断部１１２を他端に有する。一方、把持子１２０は、切断子１１０の装着部１１１との接合部位となる接合部１２１と、当該切断子１１０を略中央に挟む形で左右に拡開した二本の可とう性脚部１２２と、を有する。ここで、まず、装着部１１１から説明すると、当該装着部１１１は、マイクロ・マニピュレータに切断器具Ａ（１）を装着した際に当該器具がぐらつかず、切断操作に耐えられる強度を有する限り特に限定されない。次に、切断部１１２は、その先端に刃状の切断箇所（カッター）１１２ａが形成されている。当該切断部１１２の素材（特に切断箇所１１２）は、鋼鉄、ガラス等の硬度の高い素材が好適である。例えば、当該切断部１１２は、高炭素鋼から成る動物皮用の縫い針や釣り針を目が非常に細かいサンドペーパで研ぐことにより製造可能である。次に、接合部１２１は、その裏面において切断子１１０の装着部１１１と何らかの手段により接合可能であれば特に限定されない。ここで、切断子１１０と把持子１２０との結合形態は、切断子１１０が切断動作可能に接合されている限り特に限定されず、一体成型であっても、部材同士を接着剤や溶接や半田等により接合した態様であっても、更には、枢軸部を設けて動作可能に接合した態様であってもよい。次に、二本の可とう性脚部１２２は、微生物群を任意の二点で確実に押圧できる程度の可とう性を有する限りどのような材料でもよく、例えば金属でもプラスチックでもよい（尚、当該二本の可とう性脚部１２２は、その両先端間距離が、微生物をはさみ込める程度の長さになるように開脚していることが好ましく、例えば０．４ｍｍ）。ここで、当該二本の可とう性脚部１２２間の距離は、処理対象である細胞又は細胞群の大きさにより好適距離が変動する。即ち、処理対象の細胞又は細胞群を両脚部で押え付けることが可能であるよう、両脚部間の距離を当該処理対象の大きさよりも小さくする必要がある。したがって、例えば、当該二本の可とう性脚部１２２間距離としては、例えば、処理対象の大きさが１００μｍであるときには、当該距離を１００μｍ未満とする必要がある。【００３７】
ここで、図３の切断器具Ａ（１）は、切断子１１０と把持子１２０とが直結しており、かつ、把持子１２０が可とう性を有している態様であるが、これには限定されない。例えば、図４の切断器具Ａ（２）は、例えば樹脂製のベース部材１３０（２）の端に、把持子１２０（２）が埋め込まれており、更に、切断子１１０（２）が弾性接着剤（例えばゴム状弾性接着剤）１４０（２）によりベース部材１３０（２）に接合されている態様である。尚、ベース部材１３０（２）は、切断子１１０（２）及び把持子１２０（２）の固定部材としての機能のみであるため、図示した大きさよりも小さくでも構わない。この態様においては、弾性接着剤１４０（２）が主として当該切断器具の可とう性を発揮している。図４（ｂ）及び図４（ｃ）は、マイクロ・マニピュレータにより切断子１１０（２）を操作した場合における、二本の脚部１２２（２）に対して切断部１１２（２）が上から下に相対移動する様子を示した図である。更に、図５の切断器具Ａ（３）は、二本の脚部１２２（３）が、その先端に突起部１２２ａ（３）を有している態様である。このような構成を採ることにより、処理対象物をより確実に止めておくことが可能となる。【００３８】
ここで、当該切断器具Ａ（１）の使用方法を説明すると、まず、二本の可とう性脚部１２２の両先端で、相互に連結した微生物群又は塊の任意の二点を押圧する。このようにすることで、切断などの操作の際に微生物群の滑りを防止することができると共に、微生物群のたるみを取りピンとさせることが可能になる。この状態で、切断部１１２を微生物群に作用させると、二本の可とう性脚部１１２で異なる二点が押圧されているために微生物群の滑りが防止できることに加え、微生物群がピンとしているために比較的弱い力でも綺麗に切断することが可能になる。尚、切断器具Ａ（２）及びＡ（３）も同じ使用方法である。【００３９】
（株化用培地）
次に、肥大した一個の微生物を分離取得する先は、株化用培地の入った試験管が典型的である。ここで、当該株化用培地は、第一工程とは異なり、細胞肥大剤が存在していない培地である。但し、肥大化微生物の細胞内には細胞肥大剤が残存しておりまた細胞外に細胞肥大剤が多少なりとも付着していることが想定されるので、肥大化微生物を当該培地に投入した場合、厳密には「細胞肥大剤が存在していない培地」の状態ではないことが想定される。しかしながら、その濃度は第一工程におけるそれと比較すると顕著に低いので、このような場合も、本特許請求の範囲及び本明細書にいう「細胞肥大剤が存在していない培地」に含まれるものとする。また、株化用培地の数（換言すれば試験管の数）は、特に限定されないが、例えば５０本〜１００本程度が一度の作業量としては好適である。更に、株化用培地の種類は、第一工程で使用した培地と同じである又は近いことが好適である。第一工程で使用した培地については、当該肥大化微生物が適合する培地であることが確定しているからである。【００４０】
（取得時間）
第三工程の所要時間は、以下の二点の理由から、短時間である程好適である。まず、第一の理由は、第一工程における、単離するすべての肥大化細胞の細胞肥大剤への適用時間を略同一にすべきであるからである。即ち、略同一とすることにより、（１）細胞肥大剤の浸漬時間が短すぎることに起因した、有用微生物が十分に肥大化しないという状況を防止できる結果、当該有用微生物がスクリーニングの対象から外れてしまう事態を回避できる一方、（２）細胞肥大剤の浸漬時間が長すぎることに起因した、有用微生物の増殖停止を防止できる、からである。この観点からは、第一工程終了後、単離するすべての肥大化細胞の取得時間の平均値を基準として、±２ｈ以内（即ち、単離作業を開始してから４時間以内）に第三工程を実施することが好適である。第二の理由は、第二工程における、蛍光染色剤の添加からの経過時間が余り長すぎると、細胞以外の部分（例えば土）も染色されてしまい肥大化細胞と背景との区別ができなくなってしまうことに加え、生きている細胞のみならず死んだ細胞まで染色されてしまい生死の判別も困難になるからである。この観点からは、第二工程における蛍光染色剤の添加後、４０分〜４時間以内であることが好適である。以上の二点を考慮すると、上記の時間例（尚、上記の時間は、使用する薬剤や染色剤の種類や濃度等により変わるものであり、あくまで一例と捉えるべきである）の場合だと、第二工程での蛍光染色剤を添加してから４０分後に第三工程の作業を開始し、４時間以内にすべての作業を終了することが好適である。したがって、一つの株化作業のために許容される時間は、スクリーニング対象とする株数にもよるが、例えば、１００株を対象とする場合には、１株当たり１〜２分である。この時間内で、顕微鏡を見ながらスクリーニング対象とする微生物を発見し、当該微生物を単離する（具体的には、肥大化している細胞の中から、取得を希望する種類の特徴を有しているものを見出し、当該特徴を有する肥大化細胞をマイクロ・マニピュレーション法で取得する）。このような短時間でのスクリーニング対象となる肥大化細胞の取得は、マイクロ・マニピュレーション法と蛍光染色剤とを組み合わせて初めて実現できる。【００４１】
（《第四工程》
第四工程は、複数の株化用培地で微生物細胞を培養する工程である。当該工程は、従来通りの周知手法であり、通常は所定期間（例えば１〜５週間）実施する。このように、１個の微生物細胞を顕微鏡下でマイクロ・マニピュレーション法で捕らえて株化用培地のみが入っている試験管中に移して増殖させると、肥大剤が存在しないために、１個の大きい細胞は分裂して数個の正常の大きさの細胞になる。即ち、増殖を開始し、数日後には同じ遺伝子を持つ多数の細胞が生まれる結果、１つの微生物株が形成される。この株の微生物細胞は、前述の肥大剤の不存在下では良く増殖する。【００４２】
（《第五工程》
第五工程は、前記第四工程で培養した前記複数の株化用培地から、細胞増殖が確認された株化用培地を選択する工程である。当該工程は、従来通りの周知手法である。【００４３】
《用途》
次に、本スクリーニング法を用いての応用例を説明する。まず、本法は、バイオレメディエーションに有用である。バイオレメディエーションとは、微生物等の働きを利用して汚染物質を分解・無害化することによって、土壌・地下水等の環境汚染の浄化・修復を図る技術である。この汚染物質の分解・無害化を行なう微生物の発見を効率的に行うことができる。例えば、ＰＣＢやプラスティクのような自然環境中の望ましくない物質を除去する微生物株を見つけられる可能性がある。目的とする被分解物質上に集合する肥大微生物を発見できるので、この肥大微生物群の中に有望な分解能を持つ微生物細胞が存在する可能性が高いからである。更に、これら方法は、新薬を生み出す素となる微生物の発見にも有用である。特に、放線菌は医薬品の素として重要な多くの有用物質を作ることが知られている。したがって、新種の放線菌を探すことは重要である。そこで、放線菌のみを生育させる培地に放線菌が含まれている土壌等を入れて、分裂阻害剤を入れて微生物を生育させると放線菌のみが肥大する。ここから一個の放線菌の細胞を本法で得て培養すると、未知のものも含めて高い効率で多種の放線菌を入手することができる。このように、本スクリーニング法は、土壌のバイオレメディエーション、石油のバイオ脱硫、医薬品製造など広い分野の産業に応用可能で、自然界に存在する有用微生物を短期間に確実に株化することができるので、大量取得が可能である。
【実施例】
【００４４】
水田土壌中の脱窒菌は、過剰施肥による地下水の硝酸態窒素汚染を抑えたり、温室効果が非常に高いＮ２Ｏ窒素酸化物の発生を抑えたりすると考えられている。今まで実験室レベルでは脱窒作用を示す菌の種類は多数存在することが知られているが、水田土壌中で実際に脱窒作用を示していることが判明した菌の種類は、非常に少なかった。これは、従来の方法では競争に強い菌しか培養できなかったためと、実際の水田土壌中で脱窒作用を示している菌を同定できなかったからである。【００４５】
そこで、活発に脱窒が起こる水田土壌の室内モデルとして、１０mLのバイアルびんに１０mL弱の土壌（東京大学田無農場水田土壌）、脱窒菌の選択的基質（コハク酸ナトリウム約５ｇ／L）と硝酸ナトリウム（約５ｇ／L）を入れ、気相をアルゴン−アセチレンで完全にガス置換し、３０度で嫌気的に培養した。２４時間培養後、再び基質(コハク酸ナトリウム)、硝酸ナトリウムをいずれも最終濃度が約５ｇ／Lとなるように添加すると同時に、３種の細胞肥大剤｛ナリジクス酸（８０μｇ／g土壌)、ピペミド酸(４０μｇ／g土壌)、ピロミド酸（４０μｇ／g土壌）｝を添加し、更に３０度で嫌気的に２４時間培養した。この培養物に蛍光染色剤｛ＣＦＤＡ−ＡＭ（最終濃度５０μＭ）｝を添加し、蛍光顕微鏡（青色励起。青色光をあてる）で確認した｛図６（ｂ）｝。併せて、比較例として、細胞肥大剤を添加せずに、蛍光染色剤を添加し、顕微鏡で確認した｛図６（ａ）｝。その結果、図６（ａ）では試料中に円形又は楕円形の微生物細胞のみが見られたが、図６(ｂ）では細長くて大きい細胞も見られるようになった｛矢印で表記｝。【００４６】
蛍光染色剤を添加して４５分後、蛍光顕微鏡を観察しながら、肥大化細胞をマイクロ・マニピュレータにより単離し、一個ずつ別々のＬＢ液体培地（１３０個）に入れた。尚、肥大化細胞の単離作業開始からＬＢ液体培地の移植作業がすべて完了するまでの所要時間は、１９０分であった。その後、これら１３０個のＬＢ液体培地を１週間培養したところ、８２株が生育・増殖した。増殖が見られたものを、Giltay液体培地で１週間培養し、ガス発生と培地の変色により脱窒作用の有無を検定し、５０株に脱窒作用があると判定した。脱窒作用が認められた５０株中の８株について増殖し、これについて、細菌の１６SrDNA塩基配列に基づいて系統解析を行った。なお、以上の実施例で必要な場合には無菌操作を行なった。【００４７】
系統解析の結果、次の５種類の細菌であることが判明した。Stenotrophomonas sp.（２株）、Ochrobactrum anthropi（１株）、 Burkholderia cepacia（２株）、 Pseudomonas putida（２株）、 Pseudomonas sp.（１株）。このうち前２種、即ちStenotrophomonas sp.、Ochrobactrum anthropiは従来脱窒作用を持たないと思われていたが、脱窒作用を持つことが新たに分かった。Burkholderia cepacia以下の３種については、従来、実験室で培養した株に脱窒作用は認められていたが、本発明の方法の適用により具体的な水田土壌の試料から容易にその脱窒作用が確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本法における目的微生物の取得プロセスパターン例である。ここでは菌Ｃを得る為に、培地の種類と細胞肥大剤の種類をそれぞれ変えて組み合わせた３つの例を提示している。
【図２】図２は、マイクロ・マニピュレータを使用して肥大した一個の微生物を保持する様子を示した図である。
【図３】図３は、本最良形態に係る切断器具Ａ（１）を示した図である。
【図４】図４は、本最良形態に係る切断器具Ａ（２）を示した図である。
【図５】図５は、本最良形態に係る切断器具Ａ（３）を示した図である。
【図６】図６は、実施例における、土壌中の微生物に対する細胞肥大剤の効果を示した図（写真）である｛図６（ａ）は添加前、図６（ｂ）は添加後｝。
【符号の説明】
【００４９】
１：マイクロ・マニピュレータ
１ａ：キャピラリーホルダー
１ｂ：注射筒
１ｃ：キャピラリー
２：スライドグラス
３：顕微鏡の対物レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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