(57)【要約】  本発明は、IgG抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵中に生産されるIgG抗体を有効成分とする細胞障害性組成物に関する。当該IgG抗体は、タンパク質の一次構造を変えることなく、CHO細胞由来のIgG抗体よりも高いCDC活性を示し、副作用が少なく高い抗腫瘍効果が期待される。また、当該細胞障害性組成物を含有する癌の改善または治療剤、あるは抗自己免疫疾患治療剤が提供される。
2009142186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgG抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵から得られる抗体を有効成分とする細胞障害性組成物。
【請求項２】
卵白から得られる抗体を有効成分とする、請求項１記載の細胞障害性組成物。
【請求項３】
IgG抗体の定常領域がヒトIgGクラスである、請求項１または２に記載の細胞障害性組成物。
【請求項４】
トランスジェニック鳥類がトランスジェニック家禽鳥類である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項５】
抗体のＮ−グリコシド結合複合体糖鎖のフコース含量が、CHO細胞由来抗体の５分の１以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項６】
抗体のCDC活性が、CHO細胞で生産した抗体に比べて５倍以上である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項７】
IgG抗体が、癌細胞に特異的に発現する抗原を認識する抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞障害性組成物を含む癌疾患の改善または治療剤。
【請求項９】
IgG抗体が、自己抗原に反応するエフェクター細胞を中和・抑制する抗体である請求項１〜６記載のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６、または９のいずれかに記載の細胞障害性組成物を含む自己免疫疾患の改善または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はIgG抗体において、天然由来の抗体もしくはCHO培養細胞から製造された抗体よりも、高い補体依存性細胞障害（CDC)活性をもつ遺伝子組換えIgG抗体を有効成分とする細胞障害性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は免疫グロブリンと呼ばれる糖タンパク質で、リンパ球のうちＢ細胞で産生される。抗体の特性として特定の分子構造（抗原）を認識して結合する能力が高く、生物組織に侵入してきた細菌やウイルスなどの非自己タンパクを排除して感染防御に重要な役割を果たしている（非特許文献１）。【０００３】
単一の抗体産生細胞に由来するクローンから均一な性質をもつ抗体（モノクローナル抗体）を調製することが可能となり、癌細胞や免疫疾患の原因となる特定の抗原を標的とした抗体医薬品が実用化されてきた。モノクローナル抗体を調製するには、マウス細胞から抗原に対する抗体を得る方法が一般的だが、人に投与するためには拒絶反応を防ぐため、定常部等をヒト抗体のアミノ酸配列にする必要がある。【０００４】
抗体医薬品は特異性が高いため、癌や自己免疫疾患に対する効果的な医薬品となりうるが（非特許文献２）、製造コストが高く医療費の高騰を招く、との欠点がある。このため製造法の改善が望まれるが、トランスジェニック（遺伝子組換え）ニワトリなどによる動物工場は、安価な抗体生産検討への取り組みのひとつである（特許文献１）。【０００５】
また、実用化されている抗体医薬の臨床知見が広がるにつれ、その効果が必ずしも充分でないことがわかり、より効果の高い抗体を見出す必要性も出てきた。抗体の薬効を高めるためにその活性増強を検討することは、薬効面の利点だけでなく投与量が減ることによりコスト軽減にも有用である。【０００６】
より高い活性をもつ抗体を作製するため、抗体の糖鎖やアミノ酸を遺伝子組換え技術によって変換して、抗体依存性細胞障害（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity：ADCC）活性や補体依存性細胞障害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性を高める手法が研究されてきている（特許文献２）。ADCC活性は、抗体のFc領域に結合するＮ−グリコシド結合複合体糖鎖からフコースを除去することで効果が高くなることが知られている。また、導入遺伝子の発現によりトランスジェニックニワトリが卵白中に生産する抗体は、Ｎ−グリコシド結合複合体糖鎖のフコース含量が少ないため、ADCC活性が高いことが知られる（非特許文献３）。【０００７】
このように糖鎖の人工的変換によってADCC活性を高めることはできるが、CDC活性を高める実用的方法は知られていない。先に述べたように、抗体Fc領域のＮ−グリコシド複合体糖鎖にフコースがなければ、ADCC活性が高いことが予測されるが、この場合でもCDC活性が高いとは限らない。IgG抗体にはサブクラスがあり、抗体医薬品としては、薬効が高くProtein Aに選択的に結合することにより精製が容易なIgG1が用いられることが多い。しかしCDC活性はIgG3抗体のほうが高いため、IgG1抗体のＦｃ領域の一部をIgG3抗体のアミノ酸に置き換えることで、CDC活性を高めた抗体医薬品を人工的に作製できることが知られている。しかしこのようなIgGのサブクラス間で構造を変換したキメラ抗体は天然に存在しないため、予期されない副作用（抗原性）が現れる可能性があり、抗体のFc領域タンパク一次構造を変換しないでCDC活性を高める技術が望まれる。【０００８】
CDC活性は効率的な標的細胞の排除に大きな役割をはたすため、この活性が高いIgG抗体は、制癌もしくはアレルギーやアトピーなどの自己免疫疾患を改善させるための抗体医薬品に応用されれば強い効果が期待できる。非ホジキンリンパ腫治療用抗体であるリツキシマブ（rituximab）の抗癌作用機作には、CDC活性が大きく関与しており（非特許文献４）天然型アミノ酸構造を変換せず、高いCDC活性をもつIgG抗体をより安価に製造できる技術があれば、現代において高い罹患率をもつ癌患者や自己免疫疾患の患者にとって福音となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０１６０８１
【特許文献２】ＷＯ２００７／０１１０４１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Monoclonal Antibodies:Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. (1995)
【非特許文献２】Nature Reviews Cancer, 1, 119 (2001)
【非特許文献３】Nature Biotechnology, 28, 1038 (2005)
【非特許文献４】Biochemi. Soc. Trans, 25:705 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
天然型のタンパク質一次構造を変化させないで、CDC活性やADCC活性のように治療効果に結びつく機能を高めた抗体組成物、およびその安価な製造法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、IgG抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵中に蓄積されるIgG抗体が、CHO細胞由来のIgG抗体よりもCDC活性が高いことを見出して、本発明に至った。【００１３】
すなわち本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであり、以下の発明を包含する。【００１４】
（１）IgG抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵から得られる抗体を有効成分とする細胞障害性組成物。
（２）卵白から得られる抗体を有効成分とする、前記（１）の細胞障害性組成物。
（３）IgG抗体の定常領域がヒトIgGクラスである、前記（１）または（２）の細胞障害性組成物。
（４）トランスジェニック鳥類がトランスジェニック家禽鳥類である、前記（１）〜（３）のいずれかの細胞障害性組成物。
（５）抗体のＮ−グリコシド結合複合体鎖のフコース含量が、CHO細胞由来抗体の５分の１以下であることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれかの細胞障害性組成物。
（６）抗体のCDC活性が、CHO細胞で生産した抗体に比べて５倍以上である、前記（１）〜（５）のいずれかの細胞障害性組成物。
（７）IgG抗体が、癌細胞に特異的に発現する抗原を認識する抗体である、前記（１）〜（６）のいずれかの細胞障害性組成物。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかの細胞障害性組成物を含む癌疾患の改善または治療剤。
（９）IgG抗体が自己抗原の反応するエフェクター細胞を中和・抑制する抗体である、前記（１）〜（６）のいずれかの細胞障害性組成物。
（１０）前記（１）〜（６）または（９）のいずれかの細胞障害性組成物を含む自己免疫疾患の改善または治療剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の細胞障害性組成物は、IgG抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵から得られる抗体を有効成分とする。当該IgG抗体は、CHO細胞由来のIgG抗体よりCDC活性が高く、また、タンパク質の一次構造は天然型から変化しておらず、副作用が少なく効果の高い抗体医薬品が提供される。また、トランスジェニックニワトリが卵白中に生産する抗体は、Ｎ−グリコシド結合複合体糖鎖のフコース含量が少ないことが知られており、ADCC活性も高いことが期待できる。CDC活性とADCC活性の両方が高いことにより、標的細胞を効果的に破壊、死滅または不活化することができる。【００１６】
さらに、当該IgG抗体はトランスジェニック鳥類によって、その卵中に生産されるため、安価に製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施例９に係る、TNF抗原発現Ｔ細胞に対する、トランスジェニックニワトリ由来およびCHO細胞由来抗TNF完全ヒト型抗体の致死活性（CDC活性）を示した図である。TG卵白抗体は、トランスジェニックニワトリが産んだ卵白から精製した抗TNF完全ヒト型抗体を示す。CHO抗体は、CHO細胞で製造した抗TNF完全ヒト型抗体を示す。縦軸はFACS測定した標的細胞の死滅率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の細胞障害性組成物とは、IgG抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵から得られる抗体を有効成分とし、当該抗体のCDC活性、あるいは、CDC活性とADCC活性の両方により、ある種の疾病、疾患に関与する細胞を破壊、死滅または不活化し得る組成物を表す。
【００１９】
トランスジェニック鳥類を作製するための遺伝子導入法については、特に限定されることはないが、ウイルスベクター法や精子ベクター法、PGC（始原生殖細胞）を使う方法が挙げられる。
【００２０】
本発明で使用するレトロウイルスベクターは、安全性を考慮して、複製能を欠失していることが好ましい。複製能の欠失方法としては、ウイルス粒子の複製に必要な内部コアに含まれるタンパク質（group specific antigen, gag）、逆転写酵素（polymerase, pol）及びエンベロープ糖タンパク質（envelope, env）のうちいずれか又はその組み合わせが発現しないように、コード配列または発現に必要な配列の少なくとも一部または全部を欠失するか、それらが発現不能なように置換、挿入変異を含むことが好ましい。
【００２１】
レトロウイルスベクターは、ウイルス毎に挿入可能な遺伝子の長さが限定を受ける為、欠失変異が好ましく、安全性や挿入断片の長さを増やす観点から、gag、pol、envの複数を欠失させることが好ましい。レトロウイルスベクターはウイルス粒子にパッケージされる目印として機能するウイルスパッケージングシグナル（phi）を含んでいることが好ましい。gag領域の一部はウイルスパッケージングシグナルとして機能することもあるため、ウイルス力価向上の観点から、ウイルスベクターは発現不能としたｇａｇ領域の少なくとも一部を含んでいることが好ましい（J. Virol., 1987, 61(5), 1639-46）。
【００２２】
レトロウイルスとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルスやモロニーマウス肉腫ウイルスやトリ白血病ウイルス（ALV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）由来のウイルス等が挙げられる。鳥類の胚へ感染させるため、マウス肝細胞ウイルス（MSCV）やマウス胚性肝細胞ウイルス（MESV）等、胚細胞や肝細胞への感染性の高いウイルスを用いることが好ましい。鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパク質を人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のVSV-Gエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
【００２３】
マーカー遺伝子は正しく遺伝子導入された細胞の同定及び単離の目印となるタンパク質をコードする遺伝子である。レトロウイルスベクターにはマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては特に限定されないが、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（GFP）やシアン・フルオレッセント・プロテイン（CFP）、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質の遺伝子、ネオマイシン耐性（Neoｒ）、ハイグロマイシン耐性（Hygｒ）ピュ−ロマイシン耐性（Puroｒ）等の薬剤耐性遺伝子、他にチミジンキナーゼ、ジヒドロフォレート・レダクタ−ゼ、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β―ラクタマーゼ、β―ガラクトシダーゼ等の遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子はプロモーター遺伝子や発現に必要な要素を伴っていることが好ましい。
【００２４】
外来性遺伝子は抗体タンパク質のコード配列を含み、コード配列の境界は５’末端の開始コドン、及び開始コドンに対応する３’末端の終始コドンにより決定される。５’末端の開始コドン近傍はコザックのコンセンサス配列を含むことが好ましい。コード配列の上流にはリボソーム結合部位が存在していることが好ましい。外来性遺伝子は鳥類細胞内で発現するために適当なプロモーター遺伝子の少なくとも一部または全部を含んでいることが好ましい。プロモーター遺伝子とは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、DNAまたはRNA上の領域のことである。
【００２５】
抗体分子は抗原の構造に合わせて変化する結合領域と、比較的変化の少ない定常領域からなり、定常領域の構造の違いによっていくつかの種類（クラス）に分類される。哺乳類は、定常領域の構造の違いによりIgG、IgE、IgA、IgM、IgDの５種類のクラスがあり、それぞれに生理活性も異なっている。さらにIgA，IgGはサブクラスに分けられる。
【００２６】
抗体医薬品としては、血中寿命が長く効果の高いIgG1クラスの抗体が用いられるため、本発明でトランスジェニック鳥類に導入される抗体の遺伝子としてはIgG1クラスの抗体の構造遺伝子が好ましい。またトランスジェニック鳥類が産む卵中への蓄積効率の観点からも、IgG1クラスの抗体は優れている。ほかに卵中での蓄積がよいことから、ヒトIgGクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒトIgG1、ウズラIgG2、ニワトリIgG2やマウスIgG2のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。
【００２７】
他の好ましい抗体構造遺伝子としては、種間キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。ここでいう種間キメラ抗体とは、２種以上の異なる生物種の遺伝形質から構成される同一のIgGサブクラス間の雑種抗体のことをいう。従来マウスハイブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来であるためヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。この欠点を解消するため、例えばマウス（げっ歯類）抗体を組換え手法によってFc部等をヒト化することにより、拒絶反応のリスクを大幅に軽減することができる。
【００２８】
上記種間キメラ抗体としては、例えば抗ヒトCD2抗体、抗CD20受容体抗体、抗TNF抗体などが挙げられ、すでに医薬品として上市されているものもある。さらに近年では全てのアミノ酸配列がヒト抗体由来である完全ヒト型抗体が医薬品として実用化されており、本発明により製造する抗体として好ましいと言える。
【００２９】
本細胞障害性組成物の利用分野としては医薬品用途が考えられる。抗腫瘍剤や癌疾患の改善または治療剤としては、癌細胞に特異的に発現する抗原を認識し、癌細胞を破壊する制癌用途に用いられる抗体を有効成分として含むことが好ましい。癌細胞は正常細胞との構造の違いが少ないため特異的に除去するのが難しいが、その細胞表面に特異的に発現する抗原タンパクの存在が明らかになり、抗体によって認識する診断や治療が可能になってきている。
【００３０】
また、本発明の細胞障害性組成物の有効成分としては、自己抗原に反応するエフェクター細胞を中和・抑制する自己免疫疾患治療抗体も好ましい。この場合、本発明の細胞障害性組成物は抗リウマチ剤等の自己免疫疾患の改善または治療剤として用いることができる。
【００３１】
このような抗体は、単に標的細胞を認識するだけでなく、標的細胞の機能を不活化する必要があり、このときに重要な役割を果たすのが、先に述べた抗体依存性細胞障害（ADCC）活性や補体依存性細胞障害（CDC）活性である。補体依存性細胞障害活性とは、標的細胞に結合した抗体が補体系を活性化させ、補体のもつ酵素によって効果的に標的細胞を溶解する作用であり、近年抗体医薬品の研究により制癌作用の発現に重要な役割を果たしている事が知られてきた。
【００３２】
CHO細胞で作製されたIgG抗体などよりも補体依存性細胞障害活性を高められたモノクローナル抗体は、標的となる癌細胞を効果的に破壊することにより投与量を低く抑えられるため、副作用を小さくして患者のＱＯＬを高めることが可能であり、また製造コストを抑制することにより患者負担の軽減につながる。抗体組成物のCDC活性が、CHO細胞で生産した抗体組成物に比べて５倍以上であるとき、本願発明の細胞障害性組成物に好適に用いることができる。また、抗体組成物のCDC活性が、CHO細胞で生産した抗体組成物に比べて１０倍以上であるとき、本願発明の細胞障害性組成物にさらに好適に用いることができる。
【００３３】
抗体組成物のＮ−グリコシド結合複合体糖鎖のフコース含量が、CHO細胞由来抗体の５分の１以下であるとき、好適に用いることができるし、１０分の１以下であるとき、さらに好適に用いることができる。
【００３４】
導入される構造遺伝子の発現を制御するためには、組織特異的なプロモーター遺伝子等が用いられる。組織特異的なプロモーター遺伝子とは、鳥類の特定の組織・細胞で特別に活性の強いプロモーター遺伝子のことである。組織特異的なプロモーター遺伝子を用いることにより、目的タンパク質の発現が鳥類の発生や生存に悪影響を与える可能性を減少または排除できる利点がある。組織特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、卵管特異的なプロモーター遺伝子をあげることができる。卵管組織は性成熟後に活発に活動することから性成熟後に強く誘導されることが多い。
【００３５】
卵管特異的なプロモーター遺伝子として鳥類由来のオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、G2グロブリン、G3グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン、アビジンのプロモーター遺伝子等をあげることができる。これらの卵管特異的なプロモーター遺伝子を用いた場合、目的タンパク質を卵白中に高発現させることができることが特に好ましい。
【００３６】
このほかのプロモーターとしては、組織非特異的なプロモーターがある。組織非特異的なプロモーター遺伝子とは、組織特異的なプロモーター遺伝子でないプロモーター遺伝子のことである。組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、鳥類のほぼ全ての体細胞で活性のあるものをいう。その場合、目的タンパク質は血中にも発現するため雛の段階で発現の可否を検出できるという利点がある。組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、βアクチンプロモーター遺伝子、EF1αプロモーター遺伝子、チミジンキナーゼプロモーター遺伝子やシミアンウイルス４０（SV40）プロモーター遺伝子、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター遺伝子、ラウスザルコーマウイルス（RSV）プロモーター遺伝子等のウイルス由来プロモーター遺伝子が挙げられる。他に、テトラサイクリン誘導型プロモーター遺伝子のような、組織非特異的な誘導型プロモーター遺伝子をもちいても良い。
【００３７】
外来性遺伝子は転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含んでいてもよい。転写エンハンサーはプロモーター遺伝子からの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないDNAまたはRNA上の領域のことである。本来機能しているものとは異なるプロモーター遺伝子に連結した場合にも機能することが多いのでプロモーター遺伝子との組み合わせについては限定しない。転写エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。調節エレメントは転写調節や、転写後のRNAの安定化に寄与する単独では転写を起こせないDNAまたはRNA上の領域のことである。調節エレメントとしては特に限定されないが、WPRE（ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント、米国特許6136597号公報）等が挙げられる。
【００３８】
また外来性遺伝子は上記以外の非翻訳領域を含んでもよい。
【００３９】
パッケージング細胞又はヘルパーウイルス等を利用することにより調製されたシュードタイプのウイルスベクターは、通常のマイクロインジェクション法（Bosselman, R. Aら、Science 243, 533 (1989)）により、初期胚、血管内、心臓内へ導入される。遺伝子導入法としては、この他にもリポフェクションやエレクトロポレーション法等が考えられるがマイクロインジェクション法は操作性、導入効率の高さの点で好ましい。
【００４０】
外来性遺伝子としては特に限定されず、鳥類以外の遺伝子はもちろん、鳥類のものを含んでも良い。トランスジェニック作製に用いる個体が有する配列であっても、その個体が本来有する全遺伝子にあらたに遺伝子を導入するので外来性遺伝子と呼ぶ。
【００４１】
複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる胚は、孵卵開始から２４時間以上経過していることが望ましい。より望ましくは孵卵開始から３２時間以後７２時間以前の胚である。更に望ましくは、４８時間以後６４時間以前の胚である。感染させる、つまりウイルス液を導入する場所としては、心臓内あるいは血管内が好ましい。遺伝子導入効率の高いＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製する上で、心臓の拍動を観察することができる初期の段階（心臓が拍動を開始してから６時間以内）に、遺伝子を導入することが好ましい。そして、それは血流に乗せて全身に遺伝子を運ぶという観点と、細胞数が少ないという観点による。
【００４２】
マイクロインジェクションは顕微鏡下で先端を細くした微小ガラス管等を用い、特定の場所に直接ウイルス液を導入する方法である。本研究では、心臓や血管という特定の場所にウイルス液を導入するため、リポフェクション法やエレクトロポレーション法といった他の遺伝子導入法より好ましい。
【００４３】
本発明で使用する鳥類としては特に限定されないが、家畜として利用可能な家禽鳥類であることが好ましい。家禽鳥類としては、ニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラ、アヒル等を挙げることができる。なかでもニワトリは入手が容易で、産卵種としても多産であり、卵も大きく大量飼育方法が確立している点で特に好ましい。
【００４４】
生殖細胞に外来性遺伝子を保有するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を野生型鳥類、又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類又はその子孫と交配させ、孵化したヒナを選別することによりＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができる。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類は全ての細胞に外来性遺伝子が導入される確率は低く、ほとんどの場合外来性遺伝子が導入された細胞と野生型の細胞との異なる遺伝子型の細胞が共存しているキメラ状態である。一方で、Ｇ１トランスジェニック鳥類は、好ましくは、全ての体細胞に均一に導入遺伝子を保有している。体細胞や生殖細胞への遺伝子導入の確認は血や体細胞や精子や卵由来のDNAやRNAをPCR法等によって調べることによって確認できる。また、目的タンパク質の発現からも判断できる。目的タンパク質の発現はＥＬＩＳＡ法や電気泳動法、目的タンパク質の活性測定等によって調べる事ができる。
【００４５】
Ｇ２以降の世代のトランスジェニック鳥類は、Ｇ１トランスジェニック鳥類を交配させることにより作製される。交配型はＧ１トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ１トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ１トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ１オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ１オスに対し複数の野生型メスを交配させることができるため、効率の点から好ましい。
【００４６】
本発明の目的タンパク質生産法は、前述のトランスジェニック鳥類から目的タンパク質を回収することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジェニック鳥類の血中及び／又は卵中から因子を抽出、精製することを特徴とする。
【００４７】
精製は、トランスジェニック鳥類の卵とくに卵白成分を純水もしくは平衡塩類溶液で希釈した溶液からカラム法やろ過法で行うことを特徴とする。希釈は卵白の粘性を低減し、カラム法を円滑に行う目的で行われ、粘性低減のためには高倍に希釈することが望ましい反面、容積が増えると回収が困難になることから、２倍から１０倍が好ましく、５倍から６倍に希釈するのがより好ましい。
【００４８】
この卵白溶液から目的とする抗体組成物を回収するため、プロテインＡカラム法、塩析法、吸着カラムクロマトグラフ法、イオン交換カラムクロマトグラフ法、ゲルろ過カラムクロマトグラフ法、抗体カラム法を単独、もしくは組み合わせて精製するが、これらのみに限定されるものではない。吸着クロマトグラフ法としては、ブルーセファロースクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー等があり、イオン交換カラム法としては、陰イオン交換クロマトグラフィー法等がある。
【実施例】
【００４９】
以下、抗ＴＮＦ抗体を例に、トランスジェニック鳥類の卵から得たIgG抗体がCHO細胞由来のIgG抗体と比べ、非常に高いCDC活性を有することを示す。ただし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００５０】
遺伝子操作について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（J. Samnrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis; Molecular Cloning, A Laboratry Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory）。細胞培養について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った。商品名を記載している場合は特に記述のない限り添付の説明書の指示に従った。【００５１】
（実施例１）  抗ＴＮＦ完全ヒト型抗体発現プラスミドｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ））の構築
抗ヒトＣＤ２抗体ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＣＤ２）はJORNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, Vol.98 ,No.4 ,298-303, 2004に開示されている。【００５２】
抗ＴＮＦ完全ヒト型抗体の配列（Adalimumab；HUMIRA(R)）を公開配列情報に基づいて全塩基配列を化学合成した。これを、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＣＤ２）のＣＤ２配列に置き換えて、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ））とした。【００５３】
（実施例２）  ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ））とpVSV-Gを用いたレトロウイルスベクターの調製
以後、特に記述のない限り、培地は１０％の牛胎児血清（Fetal Bovine Serum, FBS）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM）を用いた（ギブコ社製）。培養は３７℃、ＣＯ２５％で行った。レトロウイルスベクターに用いるプラスミドDNAの精製にはEndo Free Plasmid Maxi Kit（QIAGEN社製）を用いた。【００５４】
実施例１で構築したプラスミドｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ））よりレトロウイルスベクターを調製するため、gag、pol遺伝子を持つパッケージング細胞GP293を、コラーゲンコートされた直径１００ｍｍの培養ディッシュに細胞数５×１０６個／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントとなるようにする）。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキン（シグマ社製）を加えて、さらに一時間培養した。５６μｌのLipofectamine 2000溶液（インビトロジェン社製）を１．４ｍｌのOpti-MEMI培地（ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分間置いた。１２μｇのｐＭＳＣＶ／ＧΔＡＬＩＨ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ））と１２μｇのpVSV-Gを１．４ｍｌのOpti-MEMI培地に懸濁した。Lipofectamine 2000溶液とプラスミドDNA溶液を混合し、室温で２０分置いた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ  HEPES Buffer Solution（ギブコ社製）を加えさらに２４時間培養した。【００５５】
培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集めた。超遠心機CS100GXL（日立工機社製）を用い、２８，０００ｒｐｍ（５０，０００ｇ）で１．５時間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ  Tris-HCl（pH7.8）、１３０ｍＭ  NaCl、１ｍＭ  EDTA）を加え、４℃で一晩静置し、よく懸濁して小型高速遠心機で１２，０００ｒｐｍで一分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルター（アドバンテック社製）に通して、そのろ液をウイルス液とした。【００５６】
（実施例３）  ウイルス力価の測定
ウイルス液の力価はNIH3T3細胞（ATCC CRL-1658）にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義した。６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約９．４ｃｍ２）に存在する５×１０４のNIH3T3細胞に１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるGFP（Green Fluorescent Proteins）遺伝子を発現している細胞の割合を調べることでウイルス液の力価を測定した。１０６倍希釈で４コロニー現れた場合、ウイルス力価は４×１０６ｃｆｕ／ｍｌとなる。【００５７】
具体的には力価測定開始の前日にNIH3T3細胞を６ウェル培養プレートに５×１０４個／ウェルとなるように播種し培養した。翌日、細胞の培地を９μｇ／ｍｌのポリブレン含有培地９００μｌ／ウェルで交換し、ウイルス液を培地で１０−１〜１０−５に希釈し、それぞれ１００μｌをウェルに添加して感染させた（ポリブレン終濃度８μｌ／ｍｌ）。４〜６時間培養後、１ｍｌの培地をさらに加えた。次の日、培地を交換し、以後３〜４日おきに培地交換した。感染から約１週間後GFPを発現しているコロニー数を測定し、力価を求めた。【００５８】
（実施例４）  抗TNF完全ヒト型抗体発現安定パッケージング細胞の選択
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレートにGP293細胞を１．５×１０４個／ウェルとなるように播種し培養した。ウイルス感染の当日１０μｇ／ｍｌのポリブレン含有培地１ｍｌ／ウェルで交換した。これに実施例２で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローン化する。具体的には、次の日、細胞を１０個／ｍｌになるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌづつ播種し（ウェルに１個の細胞が入るようにする）、細胞増殖速度が早く、GP293細胞と形態の近い細胞を選択し、抗TNF完全ヒト型抗体発現安定パッケージング細胞クローンを得た。【００５９】
（実施例５）  抗TNF完全ヒト型抗体発現安定パッケージング細胞とpVSV-Gを用いたレトロウイルスベクターの調製
直径１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養デュッシュに抗TNF完全ヒト型抗体発現安定パッケージング細胞を５×１０６個（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントとなるようにする）。翌日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキンを加えて、更に１時間培養した。５６μｌのLipofectamine 2000溶液を１．４ｍｌのOpti-MEMI培地に懸濁し、室温で５分間置いた。１２μｇのpVSV-Gを１．４ｍｌのOpti-MEMI培地に懸濁した。Lipofectamine 2000溶液とプラスミドDNA溶液を混合し、室温で２０分置いた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ  HEPES Buffer Solutionを加えさらに２４時間培養した。【００６０】
培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルターに通し、ろ液を遠心管に集めた。超遠心機を用い、２８，０００ｒｐｍ（５０，０００ｇ）で１．５時間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿に２０μｌのTNF緩衝液を加え、４℃で一晩静置し、よく懸濁して小型高速遠心機で１２，０００ｒｐｍで一分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルター（アドバンテック社製）に通して、ろ液をウイルス液とした。このようにすれば、１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上の力価を持つウイルス液が得られる。【００６１】
（実施例６）ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化による抗TNF完全ヒト型抗体産生トランスジェニックニワトリ作製
マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件化で行った。ニワトリ受精卵（城山種鶏場）の外側を消毒液（昭和フランキ社製）およびエタノールで除菌した。孵卵機P-008(B)型（昭和フランキ社製）を３８℃、湿度５０〜６０％環境になるようにセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０°転卵しながら孵卵を行った。【００６２】
孵卵開始から約５５時間経過後、孵卵機の転卵を３０分ごとに３０°転卵に変更した。孵卵機から卵を取り出し、その鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンド刃（刃先径２０ｍｍ、シャフト径２．３５ｍｍ）をつけたミニルーター（プロクソン社製）で切り取った。ニワトリ二黄卵（城山種鶏場）の鋭端部を直径４．５ｃｍに切り取り、中身を捨てた卵殻に受精卵の中身を移し、注射器の内筒で胚を上方へ移動させた。実体顕微鏡システムSZX12（オリンパス社製）下でフェムトチップII（エッペンドルフ社製）にウイルス液を注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ社製）を用い、ウイルス溶液約２μｌをマイクロインジェクションした。卵白を糊として約８×８ｃｍ２に切ったサランラップ（旭化成社製）でこの穴を塞ぎ、孵卵機に戻し孵卵を続けた。孵卵開始から２０日目にサランラップに２０Ｇの注射針で２０個程度穴を開け、孵卵機に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。雛がハシ打ちを始めたら、卵殻を割って孵卵させた。この人工孵化による孵化率は７〜３０％だった。【００６３】
（実施例７）  トランスジェニックニワトリ卵からのIgG抗体の取得
誕生した雛を飼育して成長させた。飼料として幼雛ＳＸセーフティーおよびネオセーフティー１７（豊橋飼料社製）を用いた。該トランスジェニックニワトリの卵からのIgG抗体の抽出は卵白から行った。卵白は、超音波や物理的手法により全体を一様になるように前処理した。IgG抗体は、プロテインＡカラムを使い、一般的なカラム精製法で調製した。調製したIgG抗体はアッセイ時まで−８０℃で凍結保存した。融解は３７℃で迅速に行い、凍結融解を繰り返すことは避けることが好ましい。【００６４】
（実施例８）  ＥＬＩＳＡによる免疫グロブリン分子濃度の定量
実施例７で調製した卵白中のIgG抗体発現量を測定するために、enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）法を行った。抗体生産量は測定で用いた標準品より算出した。【００６５】
測定方法は代表的な方法に従った（Immunochemistry, 8, 871-874 (1971)）。【００６６】
ウサギ抗ヒトIgG（Fc特異的）抗体（Organon Teknika, Durham, NC, USA）を一次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトIgG抗体（Organon Teknika, Durham, NC, USA）を二次抗体として用いた。検出基質としてO‐Phenylenediamineを用いて発色させ、吸光度をプレートリーダーで測定した。定量時のスタンダードとしてhuman IgG1（Athens Research and Technology, Athens, GA, USA）を用いた。【００６７】
（実施例９）
実施例１〜７によって調製したトランスジェニックニワトリ卵白由来抗TNF完全ヒト型抗体のCDC活性を、CHO細胞で作製した完全ヒト型抗体のCDC活性と比較した。【００６８】
２４ｗｅｌｌプレートにTNF抗原を発現したＴ細胞（Jurkat細胞（ATCC No. TIB-152）もしくはRaji細胞（ATCC No. CCL-86））を５×１０５／ｗｅｌｌで１ｍｌ添加し、１０％ヒト血清RPMI1640（ニッスイ社製）、抗体サンプルを０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ加えて３７℃３時間培養後、PI（propidium iodide）で染色してFACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）測定して生細胞数を出した。標的細胞の死滅率は次の方法で算出した。【００６９】
標的細胞の死滅率＝（全細胞数−生細胞数）／全細胞数（％）
図１に示したように、トランスジェニックニワトリ卵白由来の抗TNF完全ヒト型抗体は、CHO細胞由来の抗TNF完全ヒト型抗体に比べて、１／１０濃度で同程度の標的細胞致死効果を示し、１０倍のCDC活性があることがわかった。なお、CHO細胞由来完全ヒト型抗体としては、市販のアダリムマブ（adalimumab：商品名HUMIRA(R)）を用いた。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年12月2日(2010.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ抗体をコードする遺伝子を導入されたトランスジェニック鳥類が産む卵から得られる完全ヒト型抗体を有効成分とする細胞障害性組成物。
【請求項２】
卵白から得られる抗体を有効成分とする、請求項１記載の細胞障害性組成物。
【請求項３】
ＩｇＧ抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１クラス又はヒトＩｇＧ２クラスである、請求項１または２に記載の細胞障害性組成物。
【請求項４】
トランスジェニック鳥類がトランスジェニック家禽鳥類である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項５】
抗体のＮ−グリコシド結合複合体糖鎖のフコース含量が、ＣＨＯ細胞由来抗体の５分の１以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項６】
抗体のＣＤＣ活性が、ＣＨＯ細胞で生産した抗体に比べて５倍以上である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項７】
ＩｇＧ抗体が、癌細胞に特異的に発現する抗原を認識する抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞障害性組成物を含む癌疾患の改善または治療剤。
【請求項９】
ＩｇＧ抗体が、自己抗原に反応するエフェクター細胞を中和・抑制する抗体である請求項１〜６のいずれかに記載の細胞障害性組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６、または９のいずれかに記載の細胞障害性組成物を含む自己免疫疾患の改善または治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【国際調査報告】
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