(57)【要約】  ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ発現の抑制を促進する促進剤を提供する。  本発明の促進剤は、レスベラトロール（resveratrol）、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体および立体異性体、ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの有効成分を含み、前記有効成分が、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進することを特徴とする。前記核酸は、ｍｉＲＮＡが好ましい。本発明の促進剤は、例えば、ＲＮＡ干渉を利用した疾患の治療方法、医薬品、食品添加物、ノックダウンによる遺伝子解析等に適用できる。
2013051459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロール（resveratrol）、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体および立体異性体、ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの有効成分を含み、
前記有効成分が、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進することを特徴とする促進剤。
【請求項２】
前記レスベラトロールおよびレスベラトロール誘導体が、下記化学式（１）で表される化合物であることを特徴とする請求項１記載の促進剤。
【化１】
2013051459.tif 000006
前記化学式（１）中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、水素原子または疎水基であり、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項３】
前記化学式（１）中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３における前記疎水基が、それぞれ、飽和または不飽和炭化水素基であり、
前記飽和または不飽和炭化水素基は、分枝構造を含んでいても含んでいなくてもよく、環状構造を含んでいても含んでいなくてもよく、さらに、１または複数のアルコキシ基またはアリールオキシ基で置換されていても置換されていなくてもよい、
請求項２記載の促進剤。
【請求項４】
前記飽和炭化水素基が、直鎖もしくは分枝アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、またはアルキルシクロアルキルアルキル基である請求項３記載の促進剤。
【請求項５】
前記飽和炭化水素基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基である請求項４記載の促進剤。
【請求項６】
前記不飽和炭化水素基が、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはアラルキル基であり、前記アリール基およびアラルキル基の芳香環の各水素原子は、それぞれ、飽和もしくは不飽和炭化水素基、アルコキシ基、またはアリールオキシ基で置換されていてもよい、請求項３から５のいずれか一項に記載の促進剤。
【請求項７】
前記アリール基が、シクロペンタジエニル基、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、ｏ−メトキシフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ビフェニリル基、アントリル基、フェナントリル基、またはピレニル基である請求項６記載の促進剤。
【請求項８】
前記化学式（１）で表される化合物が、下記化学式（２）で表されるレスベラトロール（resveratrol）および下記化学式（３）で表されるプテロスチルベン（pterostilbene）の少なくとも一つであることを特徴とする請求項２記載の促進剤。
【化２】
2013051459.tif 000007
【化３】
2013051459.tif 000008
【請求項９】
前記核酸が、ｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の促進剤。
【請求項１０】
特定の遺伝子が関与する疾患を治療する方法であって、
前記遺伝子は、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現が抑制される遺伝子であり、
請求項１から９のいずれか一項に記載の促進剤により、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進させることを特徴とする治療方法。
【請求項１１】
さらに、前記遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡ干渉により抑制する外因性の核酸を投与することを特徴とする請求項１０記載の治療方法。
【請求項１２】
前記疾患が、がん、アルツハイマーおよび糖尿病からなる群から選択される少なくとも一つの疾患であることを特徴とする請求項１０または１１記載の治療方法。
【請求項１３】
特定の遺伝子が関与する疾患を治療する医薬品であって、
前記遺伝子は、ＲＮＡ干渉により発現が抑制される遺伝子であり、
請求項１から９のいずれか一項に記載の促進剤と、
前記遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡ干渉により抑制する外因性の核酸とを含み、
請求項１から９のいずれか一項に記載の促進剤が、前記外因性の核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進することを特徴とする医薬品。
【請求項１４】
前記疾患が、がん、アルツハイマーおよび糖尿病からなる群から選択される少なくとも一つの疾患であることを特徴とする請求項１３記載の医薬品。
【請求項１５】
ＲＮＡ干渉により標的遺伝子をノックダウンする方法であって、
前記標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制する外因性の核酸を細胞に導入する工程を含み、
請求項１から９のいずれか一項に記載の促進剤により、前記導入された外因性の核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進させることを特徴とするノックダウン方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ発現の抑制を促進する促進剤およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、またはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等の核酸が、前記核酸に相補的な標的ｍＲＮＡを特異的に分解することにより、標的タンパク質の発現を特異的に抑制する現象である。このような現象は、細胞の分化、増殖、アポトーシス等の生命現象に関わっていると考えられている。このため、前記核酸は、種々の疾患の診断法または治療薬としての応用が期待され、その実用化に向けて、様々な研究が進められている。【０００３】
ｍｉＲＮＡの医薬品への応用としては、例えば、線維症関連疾患の治療に、特定のｍｉＲＮＡを投与することが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−５１６４１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記特許文献１のように、ｍｉＲＮＡを医薬品として応用する研究は盛んに行われている。しかしながら、例えば、内在性のｍｉＲＮＡおよび投与された外因性のｍｉＲＮＡによるｍＲＮＡ発現の抑制を促進する促進剤の開発は行われておらず、このような促進剤はこれまで存在しなかった。また、ｍｉＲＮＡに限らず、他の核酸によるｍＲＮＡ発現の抑制を促進する促進剤は存在しなかった。【０００６】
そこで、本発明は、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ発現の抑制を促進する促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の促進剤は、レスベラトロール（resveratrol）、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体および立体異性体、ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの有効成分を含み、前記有効成分が、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者は、レスベラトロール（resveratrol）、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体および立体異性体、ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの有効成分が、ｍｉＲＮＡ等の核酸の転写を活性化すること、およびＲＮＡｉ経路において、前記核酸に結合し、標的ｍＲＮＡの認識・切断を行うＲＩＳＣ（RNA-induced  silencing  complex）の主要なコンポーネントの一つであるArgonaute2（Ago2）の発現を誘導することにより、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ発現の抑制が促進されることを突き止め、本発明に到達した。本発明の促進剤によれば、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ発現の抑制を促進できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（Ａ）は、レスベラトロールが濃度依存的に、悪性度の高いMDA-MB231D3H2LN細胞の浸潤を抑制したことを示す写真およびグラフである。図１（Ｂ）は、レスベラトロールがMDA-MB231D3H2LN細胞の抗がん剤であるドセタキセルに対する薬剤感受性を向上させたことを示すグラフである。図１（Ｃ）は、レスベラトロールがin vivoで、MDA-MB231D3H2LN細胞の腫瘍形成を阻害したことを示す写真およびグラフである。図１（Ｄ）は、レスベラトロールがin vivoで、MDA-MB231D3H2LN細胞の抗がん剤であるドセタキセルに対する薬剤感受性を向上させたことを示すグラフである。
【図２】図２（Ａ）は、レスベラトロールが濃度依存的に、MDA-MB231D3H2LN細胞のがん幹細胞（CD24-/CD44+）の割合を減少させたことを示すフローサイトメトリーおよびグラフである。図２（Ｂ）は、レスベラトロールが、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるがん幹細胞を抑制するｍｉＲＮＡの一種であるmiR-200cの発現を上昇させたことを示すグラフである。
【図３】図３（Ａ）は、レスベラトロールが、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるがん抑制的なｍｉＲＮＡであるmiR-16、miR-141、miR-143の発現を上昇させたことを示すグラフである。図３（Ｂ）は、浸潤を抑制するmiR-141の発現を減少させると、MDA-MB231D3H2LN細胞に対するレスベラトロールの浸潤抑制効果が低下したことを示す写真およびグラフである。図３（Ｃ）は、細胞増殖を抑制するmiR-143の発現を減少させると、MDA-MB231D3H2LN細胞に対するレスベラトロールの細胞増殖抑制効果が低下したことを示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）は、レスベラトロールが、多数のがん抑制的なｍｉＲＮＡの発現を上昇させることを、マイクロアレイを使用して確認した結果を示すグラフである。図４（Ｂ）は、レスベラトロールが、MCF7-ADR細胞におけるｍｉＲＮＡマシナリーの一種であるAgo2の発現を上昇させたことを示すグラフである。図４（Ｃ）は、Ago2を強制発現させたMDA-MB231D3H2LN細胞において、miR-16、miR-143の発現が上昇したことを示すグラフである。図４（Ｄ）は、Ago2を強制発現させたHEK293細胞において、RNA干渉の効果がより持続されたことを示すグラフである。
【図５】図５（Ａ）は、レスベラトロールおよびプテロスチルベンが、MCF7細胞の細胞増殖抑制効果を有することを示すグラフである。図５（Ｂ）は、レスベラトロールおよびプテロスチルベンが、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるAgo2の発現を上昇させることを示すグラフである。
【図６】図６は、レスベラトロールおよびプテロスチルベンが、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるがん抑制的なｍｉＲＮＡであるmiR-141、miR-143、miR-200cの発現を上昇させたことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（促進剤）
本発明の促進剤は、前述のように、レスベラトロール（resveratrol）、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体および立体異性体、ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの有効成分を含み、前記有効成分が、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進することを特徴とする。本発明の促進剤は、例えば、in vitroで細胞に添加してもよいし、in vivoで個体動物に投与してもよい。また、本発明の促進剤により転写が促進される核酸は、例えば、細胞における内因性の核酸でもよいし、細胞外から投与された外因性の核酸でもよい。例えば、本発明の促進剤により前記内因性の核酸の転写が促進されることで、前記内因性の核酸によるＲＮＡ干渉作用が促進され、例えば、疾患に関与する特定の遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制でき、その結果、前記疾患を治療できる。さらに、本発明の促進剤により前記外因性の核酸の転写が促進されることで、前記外因性の核酸によるＲＮＡ干渉作用が促進され、例えば、さらに、疾患に関与する特定の遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制でき、その結果、より効果的に前記疾患を治療することもできる。
【００１１】
本発明の促進剤において、前記レスベラトロールおよびレスベラトロール誘導体が、下記化学式（１）で表される化合物であることが好ましい。
【化１】
2013051459.tif 000003
【００１２】
前記化学式（１）中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、水素原子または疎水基であり、互いに同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２つまたは３つが疎水基である場合、それらは、互いに同一の疎水基でもよいし、異なる疎水基でもよい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも一つが疎水基であると、例えば、前記化学式（１）で表される化合物の親水性が抑制されることにより、前記有効成分が生体組織内に留まりやすい。前記有効成分が生体組織内に留まりやすければ、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進するという効果を、さらに発揮しやすい。
【００１３】
前記化学式（１）中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３における前記疎水基が、それぞれ、飽和または不飽和炭化水素基であることがより好ましい。前記飽和または不飽和炭化水素基は、分枝構造を含んでいても含んでいなくてもよく、環状構造を含んでいても含んでいなくてもよい。前記飽和炭化水素基の炭素数は、特に限定されないが、例えば１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０である。前記不飽和炭化水素基の炭素数は、特に限定されないが、例えば２〜３０、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜１０である。また、前記飽和または不飽和炭化水素基は、さらに、１または複数のアルコキシ基またはアリールオキシ基で置換されていても置換されていなくてもよい。前記アルコキシ基の炭素数は、特に限定されないが、例えば１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０である。前記アリールオキシ基の炭素数は、特に限定されないが、例えば５〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは６〜１０である。なお、本発明において、前記「アルコキシ基」は、オキシ基（酸素原子、−Ｏ−）に、アリール基（芳香族炭化水素基）以外の任意の炭化水素基が結合した基をいう。前記「アリール基（芳香族炭化水素基）以外の任意の炭化水素基」は、前記オキシ基にアリール基（芳香族炭化水素基）が直接結合していなければ、その構造中にアリール基を含む基（例えば、ベンジル基等）であってもよい。また、本発明において、前記「アリールオキシ基」は、オキシ基（酸素原子、−Ｏ−）に、アリール基（芳香族炭化水素基）が直接結合した基をいう。前記「アリール基（芳香族炭化水素基）」は、前記オキシ基に芳香環が直接結合していれば、その構造中に、脂肪族炭化水素により形成された置換基、連結基等を含んでいてもよい。前記脂肪族炭化水素により形成された置換基は、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等があげられる。前記脂肪族炭化水素により形成された連結基は、例えば、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基等があげられる。
【００１４】
なお、本発明において「アリール基」は、芳香族炭化水素基をいい、例えば、単環でも縮合環でもよく、ビフェニリル基（Ｃ６Ｈ５−Ｃ６Ｈ４−）等でもよい。本発明において、アリール基（芳香族炭化水素基）の炭素数は、特に限定されないが、例えば５〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは６〜１０である。アリール基をその構造中に含む置換基、またはアリール基から誘導される基（例えば、アリールオキシ基、アラルキル基等）においても同様である。また、本発明において「アルキル基」は、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基およびtert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等が挙げられる。アルキル基をその構造中に含む基またはアルキル基から誘導される基（例えば、アルキルオキシ基、アルキレン基、アラルキル基等）においても同様である。本発明において、「アルケニル基」は、例えば、前記アルキル基の炭素−炭素単結合の１または複数が二重結合に置き換わった基でもよい。「アルキニル基」は、例えば、前記アルキル基の炭素−炭素単結合の１または複数が三重結合に置き換わった基でもよい。アルケニル基もしくはアルキニル基をその構造中に含む基、または、アルケニル基もしくはアルキニル基から誘導される基においても同様である。また、本発明において、置換基等に異性体が存在する場合は、特に限定しない限り、どの異性体でもよい。例えば、単に「プロピル基」という場合は、n-プロピル基でもイソプロピル基でもよい。また、例えば、単に「ビフェニリル基」という場合は、２−ビフェニリル基でも、３−ビフェニリル基でも、４−ビフェニリル基でもよい。
【００１５】
前記化学式（１）中のＲ１、Ｒ２およびＲ３における前記疎水基の、前記飽和炭化水素基は、直鎖もしくは分枝アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、またはアルキルシクロアルキルアルキル基であることがさらに好ましく、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であることがさらに好ましい。また、前記化学式（１）中のＲ１、Ｒ２およびＲ３における前記疎水基の、前記不飽和炭化水素基は、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはアラルキル基であることがさらに好ましい。前記アリール基およびアラルキル基の芳香環の各水素原子は、それぞれ、飽和もしくは不飽和炭化水素基、アルコキシ基、またはアリールオキシ基で置換されていてもよい。前記アリール基は、シクロペンタジエニル基、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、ｏ−メトキシフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ビフェニリル基、アントリル基、フェナントリル基、またはピレニル基であることがさらに好ましい。なお、シクロペンタジエニル基は、アニオン状態では、π電子数が６となり、芳香族性を示す。
【００１６】
前記化学式（１）で表される化合物は、下記化学式（２）で表されるレスベラトロール（resveratrol）および下記化学式（３）で表されるプテロスチルベン（pterostilbene）の少なくとも一つであることが特に好ましい。なお、下記化学式（２）で表されるレスベラトロールは、前記化学式（１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が全て水素原子である化合物である。また、下記化学式（３）で表されるプテロスチルベンは、前記化学式（１）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ３がメチル基である化合物である。
【化２】
2013051459.tif 000004
【化３】
2013051459.tif 000005
【００１７】
前記レスベラトロールは、ブドウ（ブドウ科ブドウ、Vitis vinifera）の果実のファイトアレキシンとして見出された物質である。前記レスベラトロールは、例えば、天然物由来のものでもよいし、人工合成されたものでもよい。前記レスベラトロールが天然由来の場合、その由来は、特に限定されない。例えば、レスベラトロールは、ブドウの果実に加え、木の実（例えば、ラズベリー、ブルーベリー、メリンジョ等）、草の実（例えば、ピーナッツ等）、およびその他の植物（例えば、イタドリ等）等、多くの種類の植物に含まれている。前記レスベラトロールは、例えば、これらの植物の一種または二種以上から抽出したものでもよい。また、前記レスベラトロールが天然物由来のものである場合、前記レスベラトロールは、例えば、精製されていないクルードな状態のものでもよいし、精製された状態のもの（精製品）でもよい。また、前記レスベラトロールは、例えば、前述のように、その誘導体でもよい。前記レスベラトロールの誘導体としては、例えば、前記化学式（１）で表される化合物（前記化学式（２）で表されるレスベラトロール自体を除く）でもよい。また、例えば、前記化学式（３）で表されるプテロスチルベンは、前記レスベラトロールの類似体（アナログ）であり、前記レスベラトロールの誘導体に含まれる。前記レスベラトロールは、例えば、市販品を購入してもよいし、前記天然物から従来公知の方法で自家調製してよい。
【００１８】
前記プテロスチルベンは、前述のように、前記レスベラトロールの類似体（アナログ）である。前記プテロスチルベンは、例えば、天然物由来のものでもよいし、人工合成されたものでもよい。前記プテロスチルベンが天然由来の場合、その由来は、特に限定されない。例えば、プテロスチルベンは、ブルーベリーのうち、特定の品種（例えば、ディアベリー）に多く含まれる。前記プテロスチルベンは、例えば、前記ディアベリー等から抽出したものでもよい。また、前記プテロスチルベンが天然物由来のものである場合、前記プテロスチルベンは、例えば、精製されていないクルードな状態のものでもよいし、精製された状態のもの（精製品）でもよい。また、前記プテロスチルベンは、例えば、その誘導体でもよい。前記プテロスチルベンの誘導体としては、例えば、前記化学式（１）で表される化合物（前記化学式（３）で表されるプテロスチルベン自体を除く）でもよい。前記プテロスチルベンは、例えば、市販品を購入してもよいし、前記天然物から従来公知の方法で自家調製してよい。
【００１９】
なお、前述のように、前記化学式（１）で表される化合物に互変異性体、幾何異性体または立体異性体（例えば、配座異性体、光学異性体等）等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体も、本発明の促進剤における前記有効成分として用いることができる。例えば、前記化学式（１）は、炭素−炭素二重結合に対し、Ｅ型の幾何異性体を表しているが、その異性体であるＺ型の幾何異性体も、前記有効成分に含まれる。また、前記化学式（１）で表される化合物、その互変異性体、幾何異性体または立体異性体の塩も、同様に本発明に用いることができる。前記塩は、医学的または薬学的に許容可能な塩であることが好ましい。前記塩は、酸付加塩でも塩基付加塩でもよい。さらに、前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でも良く、前記塩基付加塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でもよい。前記無機酸としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、リン酸、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜フッ素酸、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜フッ素酸、亜塩素酸、亜臭素酸、亜ヨウ素酸、フッ素酸、塩素酸、臭素酸、ヨウ素酸、過フッ素酸、過塩素酸、過臭素酸、過ヨウ素酸等が挙げられる。前記有機酸も特に限定されないが、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、ヒドロキシカルボン酸、プロピオン酸、マロン酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸等が挙げられる。前記無機塩基としては、特に限定されないが、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩等があげられ、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム等が挙げられる。前記有機塩基も特に限定されないが、例えば、アルコールアミン、トリアルキルアミン、テトラアルキルアンモニウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が挙げられる。前記アルコールアミンとしては、例えば、エタノールアミン等が挙げられる。前記トリアルキルアミンとしては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン等が挙げられる。前記テトラアルキルアンモニウムとしては、例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム等が挙げられる。これらの塩の製造方法も特に限定されず、例えば、前記レスベラトロール、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体または立体異性体に、前記のような酸または塩基を公知の方法により適宜付加させる等の方法で製造することができる。
【００２０】
また、本発明の促進剤は、前記レスベラトロール、レスベラトロール誘導体、それらの互変異性体、幾何異性体および立体異性体、ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの有効成分以外の物質を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００２１】
本発明において、前記核酸は、前述のように、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸であり、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等があげられ、これらの中でも、ｍｉＲＮＡが特に好ましい。前記核酸は、例えば、疾患に関連する遺伝子のｍＲＮＡ発現を抑制する核酸であることが好ましい。
【００２２】
本発明の促進剤は、前述のように、前記核酸の転写促進、およびArgonaute2（Ago2）の発現促進の少なくとも一方により、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの発現抑制を促進する。このため、本発明の促進剤は、例えば、ＲＮＡ干渉を利用した疾患の治療方法、医薬品、食品添加物、ノックダウンによる遺伝子解析等に適用できる。
【００２３】
（治療方法）
本発明の治療方法は、特定の遺伝子が関与する疾患を治療する方法であって、前記遺伝子は、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現が抑制される遺伝子であり、前記本発明の促進剤により、ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの発現を抑制する核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進させることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の促進剤の記載を引用できる。
【００２４】
本発明の治療方法では、例えば、さらに、前記遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡ干渉により抑制する外因性の核酸を投与してよい。このように、外因性の核酸を投与することにより、例えば、より効果的に疾患を治療できる。前記外因性の核酸は、例えば、前述の核酸を使用できる。
【００２５】
前記疾患は、特定の遺伝子が関与する疾患であり、例えば、がん、アルツハイマー、糖尿病等があげられる。前記外因性の核酸は、前記疾患に関与する遺伝子に応じて、適宜設定できる。
【００２６】
（医薬品）
本発明の医薬品は、特定の遺伝子が関与する疾患を治療する医薬品であって、前記遺伝子は、ＲＮＡ干渉により発現が抑制される遺伝子であり、前記本発明の促進剤と、前記遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡ干渉により抑制する外因性の核酸とを含み、前記本発明の促進剤が、前記外因性の核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進することを特徴とする。本発明の医薬品は、前記本発明の促進剤および前記本発明の治療方法の記載を引用できる。
【００２７】
本発明の医薬品の投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。経口剤として投与する時の形態は、特に限定されず、通常のおよび腸溶性錠剤、カプセル、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶剤、懸濁剤、シロップ、固体または液体エアロゾル、ならびに乳濁液等、当業者が通常用いる形態を選択することができる。また、前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。本発明の医薬品の投与量は、特に制限されず、例えば、患者の体の大きさ、年齢、性別、病状の進行状況等により適宜決定される。
【００２８】
本発明の医薬品は、例えば、一種類以上の医学的または薬学的に許容可能な添加物をさらに含んでいてもよい。すなわち、例えば、前記本発明の促進剤を、投与に先立ち、一種類以上の薬学的または医学的に許容可能な添加物と共に製剤してもよい。前記添加物は、特に限定されないが、例えば、担体、希釈剤、香料、甘味料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、およびカプセル化材等の不活性物質である。また、これら以外にも、例えば、医薬の分野で一般に使用されている任意の添加物を適宜用いても良い。
【００２９】
（食品添加剤）
本発明の食品添加物は、特定の遺伝子が関与する疾患を予防または改善する食品添加剤であって、前記遺伝子は、ＲＮＡ干渉により発現が抑制される遺伝子であり、前記本発明の促進剤を含むことを特徴とする。本発明の食品添加物は、前記本発明の促進剤を含むことが特徴であって、これ以外の構成は特に制限されない。本発明の食品添加物は、前記本発明の促進剤および前記本発明の医薬品の記載を引用できる。
【００３０】
（ノックダウン方法）
本発明のノックダウン方法は、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子をノックダウンする方法であって、前記標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制する外因性の核酸を細胞に導入する工程を含み、レスベラトロール（resveratrol）およびプテロスチルベン（pterostilbene）の少なくとも一つにより、前記導入された外因性の核酸の転写、およびArgonaute2（Ago2）の発現の少なくとも一方を促進させることを特徴とする。本発明のノックダウン方法によれば、前記レスベラトロールおよび前記プテロスチルベンの少なくとも一方により、前記細胞内において、前記外因性の核酸によるＲＮＡ干渉作用が促進され、前記標的遺伝子の発現が抑制される。このため、本発明のノックダウン方法により、例えば、遺伝子の解析を良好に行える。本発明のノックダウン方法は、前記本発明の促進剤の記載を引用できる。前記核酸の導入工程は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により行え、前記外因性の核酸は、前記標的遺伝子の種類に応じて適宜設定できる。また、前記細胞の種類または形態等は、特に制限されない。
【実施例】
【００３１】
つぎに、本発明の実施例について、説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。【００３２】
（レスベラトロール、プテロスチルベン）
（１）レスベラトロール（cayman  chemical社製）
（２）プテロスチルベン（東京化成工業社製）【００３３】
（細胞）
細胞は、下記（１）〜（４）の細胞を使用した。
（１）MDA-MB231D3H2LN細胞（Xenogen社製）
（２）MCF7-ADR細胞（入手元：American  Type  Culture  Collection）
（３）Ago2強制発現MDA-MB231D3H2LN細胞（Xenogen社製）
（４）Ago2強制発現HEK293細胞（Xenogen社製）【００３４】
（個体動物）
（１）マウス（日本チャールズリバー社製）【００３５】
（浸潤率（%  invasion））
浸潤率は、下記の試薬器具を使用し、製造元の説明書の記載に従って測定した。
マトリゲル  インベージョン  チャンバー  24ウェル  8μm（BD社製）【００３６】
（細胞生存率（％））
細胞生存率は、下記の試薬を使用し、製造元の説明書の記載に従って測定した。
TetraColor  One（生化学バイオビジネス社製）【００３７】
図１（Ｃ）に示す発光量は、下記のようにして測定、解析した。すなわち、まず、マウスにD-ルシフェリン(150mg/kg,  Promega)  を腹腔投与し、10分後にIVIS  イメージングシステム(Xenogen)を用いて、発光量（Photon/sec）を測定した。前記発光量の測定結果を、LIVINGIMAGE  2.50  software(Xenogen)を用いて解析した。【００３８】
（腫瘍残存率（%  of  tumor））
腫瘍残存率は、下記のようにして測定した。すなわち、まず、前記機器であるIVISイメージングシステム(Xenogen)を用いて、発光量を測定した。前記発光量の測定結果を、LIVINGIMAGE  2.50  software(Xenogen)を用いて解析した。この解析結果から、腫瘍残存率を測定した。【００３９】
（フローサイトメトリー）
がん幹細胞の割合を測定するために、下記の試薬および機器を使用した。
・抗ヒトCD44-FIT抗体(Becton  Dickinson社製,  clone  L178)
・抗ヒトCD24-APC抗体(Biolegend社製,  clone  ML5)
・デスクトップセルソーターJSAN（ノベルサイエンス社製）【００４０】
（ｍｉＲＮＡおよびAgo2のｍＲＮＡ発現量の測定）
（１）トータルRNAの抽出
がん細胞（MDA-MB231D3H2LN細胞またはMCF7-ADR細胞）に、レスベラトロールまたはプテロスチルベンを所定濃度で添加した。前記添加から４８時間後に、RNA精製前の細胞の溶解液を、Qiazol（キアゲン社製)で処理した。前記処理した溶液から、miRNeasy  Mini  Kit(50)（キアゲン社製）を用いて、total  RNAを抽出した。【００４１】
（２）リアルタイムPCT
（２−１）ｍｉＲＮＡのリアルタイムPCR
ｍｉＲＮＡに関しては、逆転写反応は、Taqmn  miRNA  assays  Kitを用いて行った。すわなち、total  RNA  1μgに、100mM  dNTPs(with  dTTP)  0.05μL、MultiScribe（登録商標）Reverse  Transcriptase（50U/μL）  0.33μL、10×Reverse  Transcription  Buffer  0.50μL、RNase  Inhibitor(20U/μL)  0.063μL、Nuclease-free  water  1.387μL、そしてそれぞれのｍｉＲＮＡに対応する5×RT  primer(ID  number;  miR-16：000391、miR-141：000463、miR-143：002249、miR-200c：002300)を添加した。この混合物を、16℃・5分間、42℃・30分間、85℃・30分間反応させた。【００４２】
リアルタイムPCRは、TaqMan  2X  Universal  PCR  Master  Mix,  No  AmpErase  UNG  5μL、20×TaqMan（登録商標）Small  RNA  Assay  0.5μL、鋳型として４倍希釈したRT反応物を4.5μL添加した、10μLの反応系で行った。リアルタイムPCRのプログラムは、95℃で10分間反応させたのち、95℃・15秒、60℃・60秒の反応を１サイクルとし、このサイクルを40回繰り返すプログラムとした。蛍光強度を、60℃の反応終了時に測定した。【００４３】
（２−２）Ago2のリアルタイムPCR
Ago2に関しては、逆転写反応は、High  Capacity  cDNA  Reverse  Transcription  Kitを用いて行った。total  RNA  1μgに、100mM  dNTPs(with  dTTP)  0.8μL、MultiScribe（登録商標）Reverse  Transcriptase(50U/μL)  0.8μL、10×Reverse  Transcription  Buffer  2μL、RNase  Inhibitor（20U/μL）  0.5μL、10×RT  random  Primer  2μLを添加し、そして、Nuclease-free  waterを、混合物全体が20μLになるように添加した。この混合物を、25℃・10分間、37℃・120分間、85℃・1分間反応させた。【００４４】
リアルタイムPCRは、Platinum  qPCR  SuperMix-UDG  with  ROX  5μL、20×TaqMan（登録商標）probe(ID  number；  Ago2：Hs01085579_m1、TARBP2：Hs00366328_m1、DICER1：Hs00229023_m1、DROSHA6：Hs00203008_m1、DGCR8：Hs00377897_m1)  0.5μL、鋳型として10倍希釈したRT反応物を4.5μL添加した、10μLの反応系で行った。リアルタイムPCRのプログラムは、50℃・2分間および95℃・2分間反応させたのち、95℃・15秒、60℃・30秒の反応を１サイクルとし、このサイクルを45回繰り返すプログラムとした。蛍光強度を、60℃の反応終了時に測定した。【００４５】
図１〜６におけるグラフについて、「*」は、Ｐ＜０．０５を示し、「**」は、Ｐ＜０．０１を示し、「***」は、Ｐ＜０．００１を示す。【００４６】
［実施例１−１］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞の浸潤への影響を確認した。【００４７】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）〜５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、顕微鏡観察、浸潤率（%  invasion）の測定を行った。コントロール（vehicle）は、レスベラトロールに代えて、DMSOを添加し、同様にして顕微鏡観察、浸潤率の測定を行った。【００４８】
図１（Ａ）の写真およびグラフに示すように、レスベラトロールは、濃度依存的に、悪性度の高いMDA-MB231D3H2LN細胞の浸潤を抑制することが確認された。すなわち、図１（Ａ）の顕微鏡写真に示すとおり、がん細胞を示す黒点は、レスベラトロール濃度依存的に減少し、この結果は、同図のグラフにおいて、浸潤率（%  invasion）がレスベラトロール濃度依存的に減少したことと一致した。【００４９】
［実施例１−２］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞のドセタキセルに対する薬剤感受性への影響を確認した。【００５０】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）およびドセタキセル（Docetaxel）を２．５ｎＭ（ｎｍｏｌ／Ｌ）添加した。前記がん細胞について、細胞生存率（Cell  viability（％））の測定を行った。コントロール（vehicle）は、レスベラトロールおよびドセタキセルに代えて、DMSOを添加し、同様にして細胞生存率の測定を行った。【００５１】
図１（Ｂ）のグラフに示すように、レスベラトロールは、MDA-MB231D3H2LN細胞の抗がん剤であるドセタキセルに対する薬剤感受性を向上させることが確認された。【００５２】
［実施例１−３］
本実施例では、レスベラトロールの、in vivoでの腫瘍形成および薬剤感受性への影響を確認した。【００５３】
個体動物は、SCID  Hairless  Outbred(SHO)マウスを使用した。前記動物の腹部に、がん細胞であるMDA-MB231D3H2LN細胞を移植した。この状態で、前記動物に、レスベラトロールを、16.5mg/kg/dayで投与した。また、別個体の前記動物に、レスベラトロールおよびドセタキセルを、16.5mg/kg/dayおよび10mg/kg/weekで投与した。前記投与後の動物における腹部のがん細胞について、発光量（Photon/sec）の測定および解析、ならびに腫瘍残存率（%  of  tumor）の測定を行った。レスベラトロールを投与した実験のコントロール（vehicle）は、レスベラトロールに代えて、エタノールを投与し、同様にして発光量の測定および解析を行った。レスベラトロールおよびドセタキセルを投与した実験のコントロール（vehicle）は、ドセタキセルを投与し、同様にして腫瘍残存率を測定した。【００５４】
図１（Ｃ）の写真およびグラフ、ならびに図１（Ｄ）のグラフに示すように、レスベラトロールは、in vivoで、MDA-MB231D3H2LN細胞の腫瘍形成を抑制し、抗がん剤であるドセタキセルに対する薬剤感受性を向上させることが確認された。図１（Ｃ）左側の写真に示すように、コントロール（vehicle）マウスでは、同図中「ａ」および「ｂ」で示す円で囲った位置に、腹腔内の腫瘍に由来する発光が確認された。これに対し、図１（Ｃ）右側の写真に示すレスベラトロール投与マウスは、発光量が小さいために（図１（Ｃ）のグラフ参照）、この写真では発光が確認できなかった。また、図１（Ｄ）のグラフに示すように、レスベラトロール投与マウスは、投与後２２日（Day  22）および２９日（Day  29）のいずれでも、コントロール（vehicle）マウスより腫瘍残存率（%  of  tumor）が小さく、特に、投与後２９日では、腫瘍残存率がきわめて低くなっていた。【００５５】
［実施例２−１］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞のがん幹細胞の割合（CD24-/CD44+）への影響を確認した。【００５６】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）〜５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、フローサイトメトリー測定を行った。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールに代えて、DMSOを添加し、同様にしてフローサイトメトリー測定を行った。【００５７】
図２（Ａ）のフローサイトメトリーおよびグラフに示すように、レスベラトロールは、濃度依存的に、MDA-MB231D3H2LN細胞のがん幹細胞（CD24-/CD44+）の割合（Percentage  of  CD24-/CD44+）を減少させることが確認された。【００５８】
［実施例２−２］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞におけるがん幹細胞を抑制するｍｉＲＮＡであるmiR-200cの発現への影響を確認した。【００５９】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）または５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、相対的ｍｉＲＮＡ発現量を測定した。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールに代えて、DMSOを添加し、同様にして相対的ｍｉＲＮＡ発現量（Comparative  expression  of  miR-200c）を測定した。【００６０】
図２（Ｂ）のグラフに示すように、レスベラトロールは、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるがん幹細胞を抑制するｍｉＲＮＡであるmiR-200cの発現を上昇させることが確認された。【００６１】
上記実施例２−１および実施例２−２の結果から、レスベラトロールがｍｉＲＮＡの発現（転写）を促進することが確認され、この結果、がん幹細胞が抑制されることが確認された。【００６２】
［実施例３−１］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞におけるがん抑制的なｍｉＲＮＡであるmiR-16、miR-141、miR-143の発現への影響を確認した。【００６３】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）または５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、相対的ｍｉＲＮＡ発現量（Comparative  expression  of  miR-16、miR-141、miR-143）を測定した。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールに代えてDMSOを添加し、同様にして相対的ｍｉＲＮＡ発現量を測定した。【００６４】
図３（Ａ）のグラフに示すように、レスベラトロールは、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるがん抑制的なｍｉＲＮＡであるmiR-16、miR-141、miR-143の発現を上昇させることが確認された。【００６５】
［実施例３−２］
本実施例では、がんの浸潤を抑制するmiR-141の発現減少による、レスベラトロールの浸潤抑制効果への影響を確認した。【００６６】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、Anti-miR-141（Ambion社製）を、トランスフェクション試薬であるDharmaFECT  1（０．２μＬ）を用いて、１００ｎＭ（ｎｍｏｌ／Ｌ）で添加した。ついで、Anti-miR-141を添加したがん細胞（Anti-miR-141）および添加していないがん細胞（Anti-miR-NC）に、レスベラトロールを５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、顕微鏡観察および浸潤率（%  invasion）の測定を行った。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールに代えて、DMSOを添加し、同様にして浸潤率を測定した。【００６７】
図３（Ｂ）の写真およびグラフに示すように、浸潤を抑制するmiR-141の発現を減少させると、MDA-MB231D3H2LN細胞に対するレスベラトロールの浸潤抑制効果が低下することが確認された。すなわち、図３（Ｂ）の写真に示すように、Anti-miR-141を添加した場合（Anti-miR-141）の方が、添加しなかった場合（Anti-miR-NC）よりも、がん細胞を示す黒点が多く、この結果は、同図のグラフにおいて、Anti-miR-141の方がAnti-miR-NCよりも浸潤率（%  invasion）が高かったことと一致した。【００６８】
［実施例３−３］
本実施例では、がんの細胞増殖を抑制するmiR-143の発現減少による、レスベラトロールの細胞増殖抑制効果への影響を確認した。【００６９】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、Anti-miR-143（Ambion社製）を、トランスフェクション試薬であるDharmaFECT  1（０．２μＬ）を用いて、１００ｎＭ（ｎｍｏｌ／Ｌ）で添加した。ついで、前記がん細胞に、レスベラトロールを５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、細胞生存率（cell  viability  (%）)測定を行った。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールに代えて、DMSOを添加し、同様にして細胞生存率を測定した。【００７０】
図３（Ｃ）のグラフに示すように、細胞増殖を抑制するmiR-143の発現を減少させると、MDA-MB231D3H2LN細胞に対するレスベラトロールの細胞増殖抑制効果が低下することが確認された。すなわち、同図に示すように、Anti-miR-141を添加した場合（Anti-miR-141）の方が、添加しなかった場合（Anti-miR-NC）よりも、細胞生存率（cell  viability  (%）)が高かった。【００７１】
上記実施例３−１〜３−３の結果から、レスベラトロールがｍｉＲＮＡの発現（転写）を促進することにより、がん細胞の増殖を抑制することが確認された。【００７２】
［実施例４−１］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞におけるがん抑制的なｍｉＲＮＡの発現への影響を、マイクロアレイを使用して確認した。【００７３】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールに代えて、DMSOを添加した。前記添加から４８時間後に、RNA精製前の細胞の溶解液を、Qiazol（キアゲン社製）で処理した。前記処理した溶液から、miRNeasy  Mini  Kit(50)（キアゲン社製）を用いて、total  RNAを抽出した。前記total  RNAを、マイクロアレイ（Agilent社製）に供して、ｍｉＲＮＡの発現を測定した。【００７４】
図４（Ａ）のグラフに、前記マイクロアレイによるｍｉＲＮＡ発現の測定結果を示す。図４（Ａ）において、縦軸は、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した群の個々のｍｉＲＮＡの発現量を、横軸はレスベラトロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））を添加しなかった群の個々のｍｉＲＮＡの発現量を示している。あるｍｉＲＮＡの発現量がレスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した群とレスベラトロールを添加しなかった群とで等しい場合、直線（y=x）上にプロットが存在する。また、あるｍｉＲＮＡの発現量がレスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した群がレスベラトロールを添加しなかった群より高い場合、直線（y=x）より上にプロットが存在する。図４（Ａ）に示すように、レスベラトロールは、多数のがん抑制的なｍｉＲＮＡの発現を上昇させることが確認された。【００７５】
［実施例４−２］
本実施例では、レスベラトロールの、がん細胞におけるAgo2の発現への影響を確認した。【００７６】
がん細胞は、MCF7-ADR細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、Ago2の相対的ｍＲＮＡ発現量を測定した。【００７７】
図４（Ｂ）のグラフに、Ago2の相対的ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示す。図４（Ｂ）において、縦軸は、相対的ｍＲＮＡ発現量（Comparative  expression  of  mRNA（normalized  with  DMSO））を示し、横軸の１〜５は、それぞれ、１：Ago2、２：TARBP2、３：DICER1、４：DROSHA6、５：DGCR8を示す。Ago2、TARBP2、DICER1、DROSHA6、DGCR8は、全てｍｉＲＮＡの生合成に関与する遺伝子である。図４（Ｂ）に示すように、レスベラトロールは、MCF7-ADR細胞において、Ago2の発現を上昇させることが確認された。【００７８】
上記実施例４−１および４−２の結果から、レスベラトロールは、ｍｉＲＮＡの発現（転写）、およびAgo2の発現の両方を促進することが確認された。【００７９】
［実施例４−３］
本実施例では、Ago2を強制発現させたがん細胞における、miR-16およびmiR-143の発現を確認した。【００８０】
がん細胞は、Ago2を強制発現させたMDA-MB231D3H2LN細胞（Ago2  O/E）を使用した。前記がん細胞について、相対的ｍｉＲＮＡ発現量を測定した。コントロール（ＮＣ）は、Ago2を強制発現させていないMDA-MB231D3H2LN細胞について、同様にして相対的ｍｉＲＮＡ発現量（Comparative  expression  of  miR-16、miR-143）を測定した。【００８１】
図４（Ｃ）のグラフに示すように、MDA-MB231D3H2LN細胞においてAgo2を強制発現させた結果、miR-16、miR-143発現の上昇が確認された。【００８２】
［実施例４−４］
本実施例では、Ago2を強制発現させた細胞における、ＲＮＡ干渉効果の持続性を確認した。【００８３】
正常細胞として、Ago2強制発現HEK293細胞（HEK293  Ago2  O/E）を使用した。前記正常細胞について、相対的ｍｉＲＮＡ発現量を測定した。コントロール（HEK293）は、Ago2を強制発現させていないHEK293細胞について、同様にして相対的ｍｉＲＮＡ発現量を測定した。前記相対的ｍｉＲＮＡ発現量の測定は、図４（Ｄ）のグラフに示すように、前記各細胞におけるレニラルシファラーゼに対して規格化されたホタルルシファラーゼ活性に基づいて行った。前記各細胞におけるRNA干渉の効果を確認した。【００８４】
図４（Ｄ）のグラフに示すように、HEK293細胞においてAgo2を強制発現させた結果、ＲＮＡ干渉の効果がより持続されることが確認された。すなわち、同図に示すように、Ago2強制発現後５日（day  5）において、Ago2強制発現HEK293細胞（HEK293  Ago2  O/E）の方が、Ago2を強制発現させていないHEK293細胞（HEK293）よりも、ルシフェラーゼ活性（luciferase  activity）が低かったことから、ＲＮＡ干渉の効果がより持続されることが確認された。【００８５】
上記実施例４−１〜４−４の結果から、細胞種に関わりなく、Ago2の発現が促進されることで、ｍｉＲＮＡの発現（転写）が促進され、ＲＮＡ干渉の効果が持続されることが確認された。すなわち、レスベラトロールにより、Ago2の発現およびｍｉＲＮＡの転写が促進され、ｍｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉の効果が向上することが明らかである。【００８６】
［実施例５−１］
本実施例では、レスベラトロールおよびプテロスチルベンの、がん細胞の細胞増殖への影響を確認した。【００８７】
がん細胞は、MCF7細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）〜１００μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）、または、プテロスチルベンを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）〜１００μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、細胞生存率（cell  viability  (%）)測定を行った。コントロール（０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ））は、レスベラトロールおよびプテロスチルベンに代えて、DMSOを添加し、同様にして細胞生存率測定を行った。【００８８】
図５（Ａ）のグラフに示すように、レスベラトロールおよびプテロスチルベンは、MCF7細胞の細胞増殖抑制効果を有することが確認された。プテロスチルベンは、レスベラトロールよりさらに優れた、MCF7細胞の細胞増殖抑制効果を有することが確認された。【００８９】
［実施例５−２］
本実施例では、レスベラトロールおよびプテロスチルベンの、がん細胞におけるAgo2の発現への影響を確認した。【００９０】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）、またはプテロスチルベンを５０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記がん細胞について、Ago2の相対的ｍＲＮＡ発現量（Relative  expression  of  Ago2）を測定した。コントロール（vehicle）は、レスベラトロールおよびプテロスチルベンに代えて、DMSOを添加し、同様にしてAgo2の相対的ｍＲＮＡ発現量を測定した。【００９１】
図５（Ｂ）のグラフに示すように、レスベラトロールおよびプテロスチルベンは、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるAgo2の発現を上昇させることが確認され、プテロスチルベンは、レスベラトロールよりさらに優れて、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるAgo2の発現を上昇させることが確認された。【００９２】
［実施例５−３］
本実施例では、レスベラトロールおよびプテロスチルベンの、がん細胞におけるｍｉＲＮＡであるmiR-141、miR-143、miR-200cの発現への影響を確認した。【００９３】
がん細胞は、MDA-MB231D3H2LN細胞を使用した。前記がん細胞に、レスベラトロールを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）、またはプテロスチルベンを２５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）で添加した。前記添加から４８時間後に、RNA生成前の細胞の溶解液を、Qiazol（キアゲン社製）で処理し、total  RNAを抽出した。前記total  RNA  1μgに、100mM  dNTPs(with  dTTP)  0.05μL、MultiScribe（登録商標）Reverse  Transcriptase（50U/μL）  0.33μL、10×Reverse  Transcription  Buffer  0.50μL、RNase  Inhibitor(20U/μL)  0.063μL、Nuclease-free  water  1.387μL、そしてそれぞれのｍｉＲＮＡに対応する5×RT  primer(ID  number;  miR-16：000391、miR-141：000463、miR-143：002249、miR-200c：002300)を添加することにより、逆転写反応を行った。その後、リアルタイムPCRでmiR-141、miR-143、miR-200cを定量解析することにより、前記がん細胞について、miR-141、miR-143、miR-200cの相対的ｍｉＲＮＡ発現量（Relative  expression  of  mRNA）を測定した。コントロール（vehicle）は、レスベラトロールおよびプテロスチルベンに代えて、DMSOを添加し、同様にして相対的ｍｉＲＮＡ発現量を測定した。【００９４】
図６のグラフに示すように、レスベラトロールおよびプテロスチルベンは、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるmiR-141、miR-143、miR-200cの発現を上昇させることが確認され、プテロスチルベンは、レスベラトロールよりさらに優れて、MDA-MB231D3H2LN細胞におけるmiR-141、miR-143、miR-200cの発現を上昇させることが確認された。【００９５】
上記実施例５−１〜５−３の結果から、レスベラトロールに加えて、プテロスチルベンも、Ago2の発現とｍｉＲＮＡの発現（転写）を促進することが確認され、その結果、がん細胞の増殖を抑制することが確認された。【００９６】
以上の実施例の結果から、レスベラトロールおよびプテロスチルベンは、ｍｉＲＮＡの発現（転写）およびAgo2の発現を促進することが確認され、前記促進により、ｍｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果が促進されることが確認された。このため、本発明の促進剤は、例えば、特定の遺伝子が関連する疾患に対して、前記遺伝子に対するｍｉＲＮＡのＲＮＡ干渉作用を促進することで、前記疾患の治療等に有用といえる。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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