(57)【要約】  所要の寿命を有する一方、所定の生体反応を招来することができるモデル動物の作出方法及びモデル動物を提供する。  本発明は、非ヒト哺乳動物の第１ＥＳ細胞を用いて、目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を産生させる。一方、目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製し、前記動物のＸ染色体の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域をフラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する。そして、置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させ、第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を得る。
2013094240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、
前記目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体を得ておき、
前記目的遺伝子の相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、
前記動物のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、
該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を前記フラグメントに
て置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と、
得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程と
を実施し、
前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させる
ことを特徴とするモデル動物の作出方法。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、
前記動物の第１ＥＳ細胞を用いて前記目的遺伝子を欠損させる工程と、
得られた第１ＥＳ細胞を用いて前記目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を産生させる工程と
を実施する一方、
前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、
前記動物のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を前記フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と、
得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程と
を実施し、
前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させる
ことを特徴とするモデル動物の作出方法。
【請求項３】
前記第２ＥＳ細胞として、対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなるＥＳ細胞を用いる請求項１又は２記載のモデル動物の作出方法。
【請求項４】
前記動物としてマウスを用い、
前記第２ＥＳ細胞として、前記所定領域がＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に設けてあるＥＳ細胞を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のモデル動物の作出方法。
【請求項５】
前記第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いる請求項４記載のモデル動物の作出方法。
【請求項６】
前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とする請求項４又は５記載のモデル動物の作出方法。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物であって、
目的遺伝子はホモ欠損させてあり、
Ｘ染色体内に前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントが導入してあり、身体を構成する細胞内の一部の細胞において、当該相同遺伝子を発現させたメスである
ことを特徴とするモデル動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物であって、
目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体と、前記動物のＸ染色体内に、前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを導入した第２個体とを交配させてなり、
前記目的遺伝子はホモ欠損しており、身体を構成する細胞の内の一部の細胞において前記相同遺伝子が発現しているメスであることを特徴とするモデル動物。
【請求項９】
前記フラグメントはＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に導入してある請求項７又は８記載のモデル動物。
【請求項１０】
前記動物はマウスであり、前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３であり、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１である請求項７〜９のいずれかに記載のモデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子を改変した非ヒト哺乳類のモデル動物を作出する方法、及び当該方法によって作出されたモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性膵炎の疾患に対するより効果的な治療法の開発が望まれており、かかる治療法の開発過程においては、慢性膵炎を発症するモデル動物を利用することが効率的である。【０００３】
膵炎の発症は、膵臓が産生するトリプシンの活性と当該トリプシンの活性を阻害する阻害因子（インヒビター）の活性とのバランスに起因するものと考えられている。つまり、阻害因子の活性に比べてトリプシンの活性が相対的に高い場合、又はトリプシンの活性に比べて阻害因子の活性が相対的に低い場合に膵炎が発症する。【０００４】
そのため、膵炎を発症するモデル動物として、エステラーゼプロモータ並びに野生マウスの膵臓トリプシノーゲン、β−グロビン及びＳＶ４０のポリアデニレーション部位をそれぞれコードした各フラグメント等を用いて構築された転写遺伝子をＣ５７Ｂ１／６マウスの受精卵の前核に注入することによって、トリプシノーゲンを過剰に発現するようになしたモデル動物が作出されていた（非特許文献１参照）。【０００５】
しかし、このような従来の方法にて作出されたモデルマウスにあっては、ヒト慢性膵炎に特徴な所見である膵腺細胞の脱落、又は膵臓の線維化等が観察されないという問題があった。すなわち、前述した従来の方法では慢性膵炎のモデルマウスを作出することはできないのである。【０００６】
そこで、本発明者らはヒトのＳＰＩＮＫ１（Ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｋａｚａｌ  ｔｙｐｅ  １）遺伝子に対するマウスのホモログであるＳｐｉｎｋ３（Ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｋａｚａｌ  ｔｙｐｅ  ３）遺伝子をノックアウトしたノックアウトマウスを作出した（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ハーバート・アーチャー（HERBERT ARCHER）、他４名、「Ｒ１２２Ｈトリプシノーゲンの遺伝子導入により遺伝的に膵炎を招来されたマウスモデル（A Mouse Model of Hereditary PancreatitisGenerated by Transgenic Expression of R122H Trypsinogen）」、胃腸病学（GASTRORNTEROLOGY）、２００６年、１３１巻、ｐ１８４４−１８５５
【非特許文献２】大村谷  昌樹、他１１名、「セリンプロテアーゼ阻害因子カーザルタイプ３欠損マウスにおける膵臓の腺房細胞の自食細胞死（Autophagic Cell Death of Pancreatic AcinarCell in Serine Protease Inhibitor Kazal type 3-Deficient Mice）」、胃腸病学（GASTRORNTEROLOGY）、２００５年、１２９巻、ｐ６９６−７０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、作出したノックアウトマウスは、出生直後に全ての腺房細胞が細胞死を来し、これによって外分泌機能不全を発症して生後２週間以内に死亡してしまった。【０００９】
本発明は斯かる事情に鑑みてなされたものであって、所要の寿命を有する一方、例えばヒト慢性膵炎に特徴的な所見というように、所定の生体反応を招来することができるモデル動物の作出方法、及び該方法によって作出されたモデル動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るモデル動物の作出方法は、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、前記目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体を得ておき、前記目的遺伝子の相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、前記動物のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を前記フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と、得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程とを実施し、前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させることを特徴とする。【００１１】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、常法によって目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を得ておく。【００１２】
一方、前述した目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製する。かかる工程は、相同遺伝子をクローニングしてもよいし、相同遺伝子を構成する各エクソンを含むように設計した遺伝子配列を合成してもよい。次いで、前記動物のＸ染色体の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞内に前記フラグメントを、例えばＣｒｅ発現ベクターといった発現ベクターと共に導入することによって、前記所定領域を相同遺伝を含むフラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する。次に、得られた置換ＥＳ細胞を適宜処理した後、疑似妊娠させた動物内に移入させて個体を産生させ、得られた個体からＸ染色体の所定領域を相同遺伝子で置換させた第２個体を選択する。【００１３】
これら第１個体と第２個体とを交配させて、前記目的遺伝子がホモ欠損しており、対をなすＸ染色体の一方で前記相同遺伝子が発現し得るメスのモデル動物を産生させる。【００１４】
ここで、哺乳動物における遺伝子量補償は、メスの２本のＸ染色体のうちの一方が不活性にすることで達成されており、かかる現象をＸ染色体不活性化と呼ばれている。そして、２本のＸ染色体のうちのどちらが不活化されるかはランダムである。そのため、前述した如く産生されたモデル動物にあっては、対象部分を構成する各細胞が、目的遺伝子が欠損しているがＸ染色体の相同遺伝子によって救済されているものと、目的遺伝子が欠損しておりそのような救済がなされていないものとがランダムに混在している。かかるモデル動物にあっては、所要の寿命を有する一方、所定の生体反応を招来する。【００１５】
また、本発明に係るモデル動物の作出方法は、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、前記動物の第１ＥＳ細胞を用いて前記目的遺伝子を欠損させる工程と、得られた第１ＥＳ細胞を用いて前記目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を産生させる工程とを実施する一方、前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、前記動物のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を前記フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と、得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程とを実施し、前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させることを特徴とする。【００１６】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、目的遺伝子に対応するターゲッティングベクターを作製し、該ターゲッティングベクターを非ヒト哺乳動物の第１ＥＳ細胞内に導入させることによって、目的遺伝子を欠損させた第１ＥＳ細胞を得る。次いで、得られた第１ＥＳ細胞を適宜処理した後、疑似妊娠させた前記動物内に移入させて個体を産生させ、得られた個体から目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を選択する。これによって、所要の目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を確実に得ることができる。【００１７】
一方、前同様、目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製し、前記動物のＸ染色体の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞内に前記フラグメントを導入することによって、前記所定領域を前記フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成し、得られた置換ＥＳ細胞を適宜処理した後、疑似妊娠させた動物内に移入させて個体を産生させ、得られた個体からＸ染色体の所定領域を相同遺伝子で置換させた第２個体を選択する。【００１８】
そして、前記第１個体と第２個体とを交配させて、前記目的遺伝子がホモ欠損しており、対をなすＸ染色体の一方で前記相同遺伝子が発現し得るメスのモデル動物を産生させる。これによって、前同様、所要の寿命を有する一方、所定の生体反応を招来するモデル動物を得ることができる。【００１９】
また、本発明に係るモデル動物の作出方法は、前記第２ＥＳ細胞として、対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなるＥＳ細胞を用いることを特徴とする。【００２０】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体内に例えば適宜のベクターを導入することによって、当該Ｘ染色体の所定領域を置換可能に構成した第２ＥＳ細胞を用いる。このとき、他の遺伝子を導入するＸ染色体の位置は、当該第２ＥＳ細胞から派生したモデル動物の生態に影響が生じない遺伝子がよい。これによって、前述したＸ染色体の不活性化を適用させて目的とするモデル動物を効率良く、確実に得ることができる。【００２１】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、前記動物としてマウスを用い、前記第２ＥＳ細胞として、前記所定領域がＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に設けてあるＥＳ細胞を用いることを特徴とする。【００２２】
Ｄｉａｐ２遺伝子はＸ染色体にあり、Ｄｉａｐ２遺伝子を欠損させたマウスは正常であることが確認されている。従って、第２ＥＳ細胞として、前記所定領域がＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に設けてあるＥＳ細胞を用いた場合、得られたモデルマウスに悪影響を及ぼすことなく、所定の生体反応を招来させることができる。【００２３】
本発明に係るモデル動物の作出方法は、前記第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いることを特徴とする。【００２４】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いる。かかる第２ＥＳ細胞は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１１年１２月１日（原寄託日）に国内寄託されており、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７２の受託番号が付与されている。更に、本ＥＳ細胞は、２０１２年５月３０日（移管日）に前記特許微生物センターに対して国際寄託への移管請求がなされ、２０１２年６月１１日にＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２の受託番号が付与されている。【００２５】
この第２ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）は、前述したＤｉａｐ２遺伝子内にトラップベクターであるｐＵ−２１Ｂを導入することによって構成されており、トラップベクターｐＵ−２１Ｂの所定領域は外来フラグメントと置換可能になっている。従って、この置換可能領域と相同遺伝子を含むフラグメントとを置換させてＤｉａｐ２遺伝子内に相同遺伝子を導入することができる。一方、前述したように、Ｄｉａｐ２遺伝子を欠損させてもそのマウスは正常であるので、第２ＥＳ細胞としてＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いた場合、得られたモデルマウスに悪影響を及ぼすことなく、所定の生体反応を招来させることができる。【００２６】
本発明に係るモデル動物の作出方法は、前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とすることを特徴とする。【００２７】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１としたので、得られたモデルマウスには、ヒト慢性膵炎に特徴な所見を観察することができる。【００２８】
本発明に係るモデル動物は、非ヒト哺乳動物であって、目的遺伝子はホモ欠損させてあり、Ｘ染色体内に前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントが導入してあり、身体を構成する細胞内の一部の細胞において、当該相同遺伝子を発現させたメスであることを特徴とする。【００２９】
本発明のモデル動物にあっては、目的遺伝子はホモ欠損させてあるので、例えば目的遺伝子が生命維持に必要である場合、このままではモデル動物の生命を維持することができない。そこで、モデル動物の染色体に前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子をノックインさせるのであるが、単にノックインさせただけでは目的遺伝子の欠損が救済されるだけであるので、例えば、目的遺伝子が疾病に関与する場合にあっては、そのような疾病をモデル動物が発症せず、正常なモデル動物が得られるだけである。【００３０】
そこで、本発明にあっては、モデル動物のＸ染色体内に、前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを導入して、該相同遺伝子を発現させ得るようにしてある。【００３１】
前述したＸ染色体不活性化によって、モデル動物の身体を構成する各細胞にあっては、一部の細胞では前述した相同遺伝子が発現しており、他の細部では相同遺伝子が発現していない。すなわち、目的遺伝子がホモ欠損しているがＸ染色体の相同遺伝子によって救済されているものと、目的遺伝子がホモ欠損しておりそのような救済がなされていないものとがランダムに混在する。これによって、当該モデル動物は、所要の寿命を有する一方、所定の疾病といった生体反応を招来する。【００３２】
本発明に係るモデル動物は、非ヒト哺乳動物であって、目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体と、前記動物のＸ染色体内に、前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを導入した第２個体とを交配させてなり、前記目的遺伝子はホモ欠損しており、身体を構成する細胞の内の一部の細胞において前記相同遺伝子が発現しているメスであることを特徴とする。【００３３】
本発明のモデル動物にあっては、非ヒト哺乳動物であって、目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体と、前記動物のＸ染色体内に、前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを導入した第２個体とを交配させてなる。第１個体及び第２個体は安定して形質を保存することができ、従って本発明のモデル動物の形質も安定している。【００３４】
また、モデル動物は、目的遺伝子はホモ欠損しており、身体を構成する細胞の内の一部において、前述したようにＸ染色体に導入された相同遺伝子が発現しているメスであるので、前同様、所要の寿命を有する一方、所定の疾病といった生体反応を招来する。【００３５】
本発明に係るモデル動物は、前記フラグメントはＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に導入してあることを特徴とする。【００３６】
本発明のモデル動物にあっては、前記フラグメントはＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に導入してあるので、前同様、当該モデル動物に悪影響を及ぼすことなく、所定の生体反応を招来させることができる。【００３７】
本発明に係るモデル動物は、前記動物はマウスであり、前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３であり、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１であることを特徴とする。【００３８】
本発明のモデル動物にあっては、前記動物はマウスであり、目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３であり、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１であるので、前同様、得られたモデルマウスには、ヒト慢性膵炎に特徴な所見を観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明に係るモデル動物の作出手順を示すフローチャートである。
【図２】本発明に係るモデル動物の作出手順を示すフローチャートである。
【図３】本発明に係るモデル動物の作出手順を示すフローチャートである。
【図４】Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子の作製手順の一例を説明するフローチャートである。
【図５】Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子をクローニングしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターの構造図である。
【図６】置換ベクターの構造図である。
【図７】本発明方法によって作出したモデルマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。
【図８】本発明方法によって作出したＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄの８週齢のモデルマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。
【図９】本発明方法によって作出したＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄの８週齢のモデルマウスの膵臓の切片をアザン染色した結果を示す顕微鏡画像図である。
【図１０】種々のマーカに対する発現の有無をウェスタンブロッティング法によって調べた結果を示す画像図である。
【図１１】種々のマーカに対する発現の有無をウェスタンブロッティング法によって調べた結果を示す画像図である。
【図１２】従来のモデルマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。
【図１３】Ｓｐｉｎｋ３をヘテロ欠損（Ｓｐｉｎｋ３＋／−）させた８週齢のマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。
【図１４】Ｓｐｉｎｋ３をヘテロ欠損（Ｓｐｉｎｋ３＋／−）させた８週齢のマウスの膵臓の切片をアザン染色した結果を示す顕微鏡画像図である。
【図１５】ｐＵ−２１Ｂの構造を模式的に説明する説明図である。
【図１６】Ｄｉａｐ２遺伝子領域内に導入された後のｐＵ−２１Ｂの構造を模式的に説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明について図面を用いて詳述する。なお、本発明は後述する実施の形態に何ら限定されるものではない。請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形様態もこの発明に含まれる。
図１〜図３は本発明に係るモデル動物の作出手順を示すフローチャートであり、慢性膵炎を発症するモデルマウスの作出に適用した場合を示している。
【００４１】
［Ｓｐｉｎｋ３をヘテロ欠損させたマウスの樹立］（ステップＳ１）
図２に示したように、近交系であるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア株式会社製）から適宜の部位、好ましくは腎臓を採取し、当該部位の細胞に含まれるＤＮＡを抽出・精製する。（ステップＳ１１）
【００４２】
ＤＮＡの抽出・精製は、例えば次のようにして行うことができる。なお、以後にあっても同様であるが、本発明にあってはかかる例示に限定されないことはいうまでもなく、所要の目的を達成し得る方法であれば適宜適用することができる。
【００４３】
すなわち、採取した部位を細かく切断し、適量をマイクロチューブに投入する。このマイクロチューブに溶解用緩衝液（１×ＳＳＣ、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））を６００μｌと１０質量／容量％のＳＤＳ溶液を８０μｌとを注入して、５５℃で適宜の間隔で撹拌しつつ２〜３時間程度反応させた後、２０ｍｇ／ｍｌプロテインキナーゼＫを０．５μｌ〜１μｌ添加して撹拌し、更に１時間程度反応させることによってマイクロチューブ内の細胞を溶解させる。
【００４４】
次に、フェノール・クロロホルム混液をマイクロチューブ内の液体と等量になるように添加し、撹拌機によって十分に撹拌した後、１２０００〜１５０００ｒｐｍの回転速度で遠心分離し、有機溶媒層である上層を取り除く。同様の操作を繰り返した後、イソプロピルアルコールをマイクロチューブ内の液体と等量になるように添加し、ＤＮＡの糸屑が生成するまで十分に撹拌する。
【００４５】
ＤＮＡの糸屑が沈降する適宜の回転数で遠心分離して上清を廃棄した後、７０％容量／容量％エタノール、次いで１００％エタノールで順次、ＤＮＡの洗浄・遠心分離・上清の廃棄を繰り返してＤＮＡを洗浄し、残留するエタノールを蒸発・除去する。このようして得られたＤＮＡにトリス−ＥＤＴＡ緩衝液といった適宜の緩衝液を５０μｌ程度添加して当該ＤＮＡを溶解させ、鋳型として用いるＤＮＡ溶液とする。
【００４６】
このようにしてマウスのＤＮＡが調製されると、Ｓｐｉｎｋ３遺伝子を欠損させたノックアウトマウスを作出するためのターゲッティングベクターを次のようにして作製する（ステップＳ１２）。
【００４７】
ここで、Ｓｐｉｎｋ３遺伝子はＳｐｉｎｋ１遺伝子と同様、エクソン１〜エクソン４までの４つのエクソンにて構成されている。そこで、エクソン１の相同領域である５´側の適宜領域及び３´側の適宜領域をクローニングした。なお、エクソン１の５´側の適宜領域及び３´側の適宜領域は両者合わせて１０ｋｂ程度になるように設計するとよい。
【００４８】
かかるクローニングは例えば次のようにして行うことができる。
すなわち、予め所要の設計をした以下のプライマーを用いて、ＰＣＲ法にてＳｐｉｎｋ３のエクソン１の５´側の２．２ｋｂの領域と、３´側の８ｋｂの領域をそれぞれ増幅した。なお、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムス社製）のＰＣＲ装置、及びＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用い、９４℃で５分間保持した後、（９０℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で３分間）保持する操作を４０回繰り返し、その後、６８℃で７分間保持するＰＣＲ反応を実施した。
ｍＰＳＴＩ-１３：５´-tacgtctccggtcttcttct-３´（配列番号１）
ｌｏｘＰ-Ｂ：５´-gatccggaacccttaatataa-３´（配列番号２）
【００４９】
得られた増幅断片は例えば精製キットであるＭａｘｉｐｒｅｐ（キアゲン社製）を用いて精製した後、例えば、（Ｓｐｉｎｋ３のエクソン１の５´側の２．２ｋｂ）−（変異ｌｏｘ）−（ＰＧＫプロモータ）−（ｎｅｏカセット）−（変異ｌｏｘ）−（Ｓｐｉｎｋ３のエクソン１の３´側の８ｋｂ）となるように互いに連結することによってターゲッティングベクターを得た。なお、（変異ｌｏｘ）−（ＰＧＫプロモータ）−（ｎｅｏカセット）−（変異ｌｏｘ）は、Ｓｐｉｎｋ３のエクソン１の開始コドンであるＡＴＧの直前のＢｇｌＩＩの制限酵素サイトに挿入されるようにデザインした。
【００５０】
なお、真核細胞プロモータであるＰＧＫプロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子を包含するｎｅｏカセットは、例えば国立大学法人熊本大学生命資源研究・支援センターから入手することができる。
【００５１】
また、変異ｌｏｘは、変異を含む部分に５ｂ程度加えたプライマーと、ｌｏｘＰの外側のＴ３又はＴ７のプライマーを用いてＰＣＲし、得られたフラグメントをサブクローニングすることによって作製することができる。
【００５２】
一方、変異ｌｏｘとして次の配列を合成によって作製することもできる。
Ｌｏｘ７１：５´-taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat-３´（配列番号３）
Ｌｏｘ６６：５´-ataacttcgtatagcatacattatacgaacggta-３´（配列番号４）
ｌｏｘＫＭＲ：５´-ataacttcgtatagcatacattataccttgttat-３´（配列番号５）
【００５３】
次に、このようにして得られたターゲッティングベクターを複数のＥＳ細胞（ＴＴ２株）内に例えばエレクトロポレーション法によって導入して、Ｓｐｉｎｋ３（目的遺伝子）を欠損させる（ステップＳ１３）。なお、ＴＴ２株は、Ｃ５７ＢＬ／６の雌マウスとＣＢＡの雄マウスとを交配させたＦ１を用いて樹立されたＥＳ細胞であり、例えば国立大学法人熊本大学生命資源研究・支援センターから入手することができる。ここで、エレクトロポレーションを実施する装置としてはＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲＩＩ（バイオラッド社製）を用いることができ、エレクトロポレーションの条件としては８００Ｖ、３０μＦを設定することができる。なお、ターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入法及びその条件は本例示に限られないことはいうまでもない。
【００５４】
エレクトロポレーションが終了すると、全てのＥＳ細胞をネオマイシンであるＧ４１８を２００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した培地に移し、ＣＯ２濃度が５％であり、温度が３７℃になした培養器内で数日間培養した。なお、培地としては例えば次表に示す組成のものを用いることができる。また、常法に従ってネオマイシン耐性のＴＴ２株を予めフィーダーしておくとよい。
【００５５】
【表１】
2013094240.tif 000003
【００５６】
適宜日数培養した後に生育してきたＥＳ細胞の塊をそれぞれ採取し、各塊を個々のＥＳ細胞に分離して、それぞれを各別に保存する。そして、これら各ＥＳ細胞について目的とする相同組み換えが生じているか否かを遺伝子解析し、相同組み換えが生じているものをＳｐｉｎｋ３欠損ＥＳ細胞とする（ステップＳ１４）。
【００５７】
このようにして得られたＳｐｉｎｋ３欠損ＥＳ細胞を用い、凝集法（アグリゲーション法）によってブラストシストを生成させ、得られたブラストシストを疑似妊娠させたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの子宮内に移植して個体になすことによってキメラマウス（Ｆ０）を産生させる（ステップＳ１５）。そして、得られたキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配させて、Ｓｐｉｎｋ３ヘテロ欠損マウス（Ｆ１）を産生させる（ステップＳ１６）。
【００５８】
［Ｘ染色体の所定領域とＳｐｉｎｋ１とを置換させたマウスの樹立］（ステップＳ３）
図３に示したように、当該マウスを樹立するためにＳｐｉｎｋ１ミニ遺伝子（置換遺伝子）を例えば次のようにして作製する（ステップＳ３０）。
【００５９】
図４はＳｐｉｎｋ１ミニ遺伝子の作製手順の一例を説明するフローチャートである。同意を得た提供者から血液を採取し、当該血液からリンパ球を分離し、得られたリンパ球から前述したステップＳ１１の操作と同様の操作を行ってヒトＤＮＡを得る（ステップＳ３０１）。
【００６０】
Ｓｐｉｎｋ１はエクソン１〜エクソン４まで４つのエクソンで構成されているが、各エクソンについて５´側のイントロンと３´側のイントロンとをそれぞれ２００ｂｐ〜３００ｂｐ程度ずつ包含するようにクローニングを行う（ステップＳ３０２）。なお、エクソン１の５´側のイントロンと、エクソン４の３´側のイントロンの部分はクローニングしないように設計する。また、Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子の大きさは、後述するＸ染色体の置換対象領域（本実施の形態にあってはＤｉａｐ２遺伝子）の大きさに応じて定める。
【００６１】
かかるクローニングは、例えば次のようなプライマーを用いて実施することができる。
【００６２】
エクソン１に対するプライマーは次の通りである。
ＳＰＩＮＫ１−ｅｘ１ｓ１：５´−ttc cag tcc cag gct tct gaa−３´（配列番号６）
ＳＰＩＮＫ１−ｉｎ１ａ１：５´−ggt cag cca cat caa tag agg−３´（配列番号７）
【００６３】
エクソン２に対するプライマーは次の通りである。
ＳＰＩＮＫ１−ｉｎ１ｓ１Ｓｐｅ：５´−gct cag tgc ctg att cat ttc cac tag t−３´（配列番号８）
ＳＰＩＮＫ１−ｉｎ２ａ２：５´−tcc acc cca aat act tgt cta c−３´（配列番号９）
【００６４】
エクソン３に対するプライマーは次の通りである。
ＳＰＩＮＫ１−ｉｎ２ｓ１Ｂａｍ：５´−acg gat cca tgt aaa tct aaa tct cac aac−３´（配列番号１０）
ＳＰＩＮＫ１−ｉｎ３ａ１Ｂａｍ：５´−tag gct tgg atc cta caa gtg act tct a−３´（配列番号１１）
【００６５】
エクソン４に対するプライマーは次の通りである。
ＳＰＩＮＫ１−ｉｎ３ｓ２：５´−gag gca tca gga gca aaa gct tca−３´（配列番号１２）
ＳＰＩＮＫ１−ｐＡａ２Ｈｉｎｄ：５´−ggt ata atc aaa caa agc ttt gag g−３´（配列番号１３）
【００６６】
このようにして得られた各フラグメントはそれぞれ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）にクローニングした。
【００６７】
次に各フラグメントを順に結合させるため、エクソン１を含むフラグメントを対応するクローニングベクターからＳａｃＩＩ及びＳｐｅＩの制限酵素を用いて切り出し、それをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターのクローニングサイトに結合させる。次いで、エクソン２を含むフラグメントを対応するクローニングベクターからＳｐｅＩの制限酵素を用いて切り出し、それを前記ベクターのエクソン１を含むフラグメントの下流に結合させる。同様の操作をエクソン３を含むフラグメント、及びエクソン４を含むフラグメントについて順次実施することによって、図５に示した如く、エクソン１を含むフラグメント〜エクソン４を含むフラグメントを順に結合させてなるＳｐｉｎｋ１ミニ遺伝子を得る（ステップＳ３０３）。なお、前者の切り出しにはＢａｍＨＩの制限酵素を用い、後者の切り出しにはＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素を用いることができる。
【００６８】
なお、このようなＳｐｉｎｋ１ミニ遺伝子はその全てを合成によって作製することもできる。Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子を合成する場合の遺伝子配列を配列番号１４に例示する。Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子を合成によって作製する場合、ヒトの血液を採取することなくＳｐｉｎｋ１ミニ遺伝子を作製できるため好適である。
【００６９】
次に、このようにしてＳｐｉｎｋ１ミニ遺伝子が得られると、図３に示したように、当該Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子をＣＡＧプロモータ（国立大学法人熊本大学生命資源研究・支援センターより入手可能）の下流に連結した後、Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子の３´側にポリＡ配列を結合させて（ＣＡＧ）−（Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子）−（ポリＡ配列）のフラグメントを得る。
【００７０】
変異ｌｏｘ、ＰＧＫプロモータ、ＰＡＣ（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ）、ポリＡ、及び変異ｌｏｘをこの順に包含する置換ベクターを予め作製しておき、該置換ベクターの前記変異ｌｏｘとＰＧＫプロモータとの間に前述した如く得たフラグメントを挿入させることによって（変異ｌｏｘ）−（ＣＡＧ）−（Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子）−（ポリＡ配列）−（ＰＧＫプロモータ）−（ＰＡＣ）−（ポリＡ）−（変異ｌｏｘ）を包含する置換ベクターを作製する（ステップＳ３２）。この置換ベクターの構造を図６に示す。
【００７１】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＤｉａｐ２遺伝子をヘテロ欠損させたＥＳ細胞（第２ＥＳ細胞）、及びＣｒｅ発現ベクター（国立大学法人熊本大学生命資源研究・支援センターより入手可能）を予め準備しておく。なお、本ＥＳ細胞は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１１年１２月１日（原寄託日）に国内寄託されており、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７２の受託番号が付与されている。更に、本ＥＳ細胞は、２０１２年５月３０日（移管日）に前記特許微生物センターに対して国際寄託への移管請求がなされ、２０１２年６月１１日にＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２の受託番号が付与されている。
【００７２】
なお、本ＥＳ細胞の科学的性質は次の通りである。
すなわち、本ＥＳ細胞（第２ＥＳ細胞）は、Ｂ６マウスとＣＢＡマウスのＦ１である胚盤胞（ブラストシスト）から作製されたＴＴ２  ＥＳ細胞を、フィーダーフリー化した後、トラップベクターであるｐＵ−２１Ｂを導入し、さらに抗生物質（Ｇ４１8）耐性にしたものである。トラップベクターはｄｉａｐｈａｎｏｕｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｄｉａｐ２）遺伝子に挿入されており、Ｄｉａｐ２遺伝子プロモータの活性により、レポータ遺伝子β−ｇｅｏが発現するようになっている。
【００７３】
このＤｉａｐ２遺伝子はＸ染色体にあり、前述したように本ＥＳ細胞にあっては、一対のＸ染色体の一方のＤｉａｐ２遺伝子領域内にトラップベクターｐＵ−２１Ｂ（国立大学法人熊本大学生命資源研究・支援センターより入手可能）を導入して、当該Ｄｉａｐ２遺伝子を欠損させてある。なお、Ｄｉａｐ２遺伝子を欠損させたマウスは正常であることが確認されている。
【００７４】
図１５はｐＵ−２１Ｂの構造を模式的に説明する説明図であり、図１６はＤｉａｐ２遺伝子領域内に導入された後のｐＵ−２１Ｂの構造を模式的に説明する説明図である。かかるｐＵ−２１Ｂは、前記ＥＳ細胞にあっては、Ｄｉａｐ２遺伝子の第２９エクソンの下流側に隣接するイントロン内の第２９エクソンから５．３ｋｂ下流の位置に導入されている。
【００７５】
図１５に示したようにｐＵ−２１Ｂは５´側より順に、（ＥＮ２イントロン）−（ｌｏｘ７１）−（ＥＮ２−ＳＡ）−（β−ｇｅｏ）−（ｐＡ１）−（ＦＲＴ）−（ｌｏｘＰ）−（ｐＡ２）−（ＦＲＴ）−（ｌｏｘ２２７２）−（ｐＳＰ７３）−（ｌｏｘ５１１）にて構成されており、ｌｏｘ７１とｌｏｘＰとの間の領域が他の遺伝子と置換し得るようになっている。なお、置換対象の他の遺伝子の５´側及び３´側にはそれぞれ、ｌｏｘ７１及びｌｏｘＰを付加しておく。
【００７６】
一方、Ｄｉａｐ２遺伝子領域内に導入されたｐＵ−２１Ｂの構造を解析したところ、図１６に示したように、５´側の１３２１ｂｐの領域及び３´側の１ｋｂ以上の領域が欠失していた。すなわち、５´側ではＥＮ２イントロンの一部領域が欠失しており、３´側ではｌｏｘ５１１の全領域及びｐＳＰ７３の一部領域が欠失していた。
【００７７】
なお、本実施の形態では第２ＥＳ細胞として、一方のＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子にｐＵ−２１Ｂを導入して当該遺伝子を他の遺伝子と置換可能に欠損させた場合について説明したが、本発明はこれに限らず、他のトラップベクターを用いてもよいことはいうまでもない。その場合、Ｄｉａｐ２遺伝子に導入されるトラップベクターの位置は、使用するトラップベクターの構造に応じて、前述したｐＵ−２１Ｂとは異なってもよい。また、トラップベクター内の置換可能な遺伝子構成も種々構築することができる。
【００７８】
複数のＤｉａｐ２ヘテロ欠損ＥＳ細胞（第２ＥＳ細胞）に、前記置換ベクター及びＣｒｅ発現ベクターをエレクトロポレーション法により導入する（ステップＳ３３）。なお、導入条件としては４００Ｖ、１２５μＦを設定することができる。これによって、Ｘ染色体のＤｉａｐ２遺伝子欠損内の前述した特定領域と、（ＣＡＧ）−（Ｓｐｉｎｋ１ミニ遺伝子）−（ポリＡ配列）−（ＰＧＫプロモータ）−（ＰＡＣ）とを置換させた置換体を生成させることができる。
【００７９】
エレクトロポレーションが終了すると、全てのＥＳ細胞をピューロマイシンを２μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した培地に移し、ＣＯ２濃度が６．５％であり、温度が３７℃になした培養器内で数日間培養した。なお、常法に従ってピューロマイシン耐性のＥＳ細胞を予めフィーダーしておくとよい。
【００８０】
適宜日数培養した後に生育してきたＥＳ細胞の塊をそれぞれ採取し、各塊を個々のＥＳ細胞に分離して、それぞれを各別に保存する。そして、これら各ＥＳ細胞について目的とする置換が生じているか否かを遺伝子解析し、当該置換が生じているものを置換ＥＳ細胞とする（ステップＳ３４）。
【００８１】
このようにして得られた置換ＥＳ細胞を用い、凝集法によってブラストシストを生成させ、得られたブラストシストを疑似妊娠させたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの子宮内に移植して個体になすことによって、Ｘ染色体の所定領域とＳｐｉｎｋ１とを置換させた、すなわちＸ染色体にＳｐｉｎｋ１をノックインさせたマウス（第２個体）が産生される（ステップＳ３５）。
【００８２】
［モデル動物の樹立］
このようにしてＳｐｉｎｋ３ヘテロ欠損マウス、及びＸ染色体にＳｐｉｎｋ１をノックインさせたＳｐｉｎｋ１ノックインマウスが得られると、図１に示したように、両者を交配させて、Ｓｐｉｎｋ３＋／−ＹＸＣＡＧ−ＳＰ１（オス）と、Ｓｐｉｎｋ３＋／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄ（メス）とが樹立される。
【００８３】
そして、両マウスを交配することによって、Ｓｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄのモデルマウスを樹立する（ステップＳ５）。
【００８４】
ここで、哺乳動物における遺伝子量補償は、雌の２本のＸ染色体のうちの一方が不活性にすることで達成されており、かかる現象はＸ染色体不活性化と呼ばれている。そして、２本のＸ染色体のうちのどちらが不活化されるかはランダムである。そのため、前述した如く樹立されたモデルマウスの膵臓を構成する各細胞にあっては、Ｓｐｉｎｋ３が欠損しているがＸ染色体のＳｐｉｎｋ１によって救済されているＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１のものと、Ｓｐｉｎｋ３が欠損しており前記救済がなされていないＳｐｉｎｋ３−／−Ｘｗｉｌｄのものとがランダムに混在しており、これによって当該モデルマウスは、後述するように慢性膵炎を発症する。
【００８５】
次に、このようにして得られたＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄのモデルマウスについて病理解析を実施した結果について説明する。
【００８６】
図７は本発明方法によって作出したＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄのモデルマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。また、図１２（ａ）はＳｐｉｎｋ３をヘテロ欠損（Ｓｐｉｎｋ３＋／−）させたマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図であり、図１２（ｂ）はＳｐｉｎｋ３をホモ欠損（Ｓｐｉｎｋ３−／−）させたマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。なお、いずれの結果も生後０．５日のマウスのものであり、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色してある。
【００８７】
図１２（ａ）に示されたように、Ｓｐｉｎｋ３のヘテロ欠損マウスの膵臓では、膵実質（腺房細胞）は正常であるが、図１２（ｂ）に示されたように、Ｓｐｉｎｋ３をホモ欠損（Ｓｐｉｎｋ３−／−）させたマウスの膵臓では、腺房細胞が殆ど脱落している。
【００８８】
これらに対して図７から明らかな如く、本発明に係るモデルマウスの膵臓にあっては、腺房細胞も観察される一方、図中（ｄ）で示したように脱落した腺房細胞も観察された。つまり、Ｓｐｉｎｋ３が欠損しているがＸ染色体のＳｐｉｎｋ１によって救済されているＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１の腺房細胞は残存しており、Ｓｐｉｎｋ３が欠損しており前記救済がなされていないＳｐｉｎｋ３−／−Ｘｗｉｌｄの腺房細胞は脱落しているのである。
【００８９】
一方、図８は本発明方法によって作出したＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄの８週齢のモデルマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図であり、図１３はＳｐｉｎｋ３をヘテロ欠損（Ｓｐｉｎｋ３＋／−）させた８週齢のマウスの膵臓の切片の顕微鏡画像図である。なお、両切片ともＨＥ染色してある。
【００９０】
図１３から明らかな如く、Ｓｐｉｎｋ３をヘテロ欠損させたマウスの膵臓では膵管の拡張は観察されなかった。これに対して図８から明らかな如く、本発明に係るモデルマウスの膵臓にあっては、膵管に明らかな拡張が観察された。
【００９１】
更に、両図８及び図１３に示した膵臓の切片を、膠原線維と筋線維とを染め分けるアザン染色した結果を図９及び図１４に示す。
【００９２】
両図９及び図１４を比較すると、Ｓｐｉｎｋ３をヘテロ欠損させたマウスの膵管の周囲組織はさほど線維化されていないが、本発明に係るモデルマウスの膵管の周囲組織には過剰な線維化が生じていた。
【００９３】
このように、本発明に係るモデルマウスは８週齢以上生存する一方、その膵臓には膵実質（腺房細胞）の脱落と膵管の拡張、またその周囲の過剰な線維化が確認され、ヒト慢性膵炎の病理像と酷似していた。
【００９４】
次に、本発明に係るモデルマウスの膵臓を構成する細胞の遺伝子発現について検討した結果について説明する。
【００９５】
図１０及び図１１は、種々のマーカに対する発現の有無をウェスタンブロッティング法によって調べた結果を示す画像図であり、図中、Ａは本発明に係るモデルマウスの膵臓を用いた場合を、一方Ｓ１はＳｐｉｎｋ３をヘテロ欠損（Ｓｐｉｎｋ３＋／−）させたマウスの膵臓を用いた場合を、またＳ２はＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ＣＡＧ−ＳＰ１のマウスの膵臓を用いた場合をそれぞれ示している。なお、いずれのマウスの膵臓も８週齢のものを用いている。また、Ｓｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ＣＡＧ−ＳＰ１のマウスは、前述した如くＳｐｉｎｋ３＋／−ＹＸＣＡＧ−ＳＰ１とＳｐｉｎｋ３＋／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ｗｉｌｄとを交配させた場合に派生するものであり、それを用いた。
【００９６】
両図１０、１１から明らかな如く、組織の繊維化を促す物質のマーカであるＴＧＦβ、膵星細胞のマーカであるＤｅｓｍｉｎ及びαＳＭＡ、発癌、癌の増殖促進のマーカであるＨｅｒ２、発癌、癌の増殖促進のマーカであるＲａｓについて、本発明に係るモデルマウスでは大きな反応が示されていたが、Ｓｐｉｎｋ３ヘテロ欠損マウス及びＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ＣＡＧ−ＳＰ１のマウスは正常であるので、それらのマーカとの反応は示されなかった。
【００９７】
一方、消化酵素であるアミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）については、正常マウスであるＳｐｉｎｋ３ヘテロ欠損マウス及びＳｐｉｎｋ３−／−ＸＣＡＧ−ＳＰ１／ＣＡＧ−ＳＰ１のマウスは、いずれも大きな反応が示されていたが、本発明に係るモデルマウスでは殆ど反応が示されなかった。
【００９８】
なお、本実施の形態では慢性膵炎を発症するモデルマウスを作出する方法について説明したが、本発明はこれに限らず、糖尿病、膵臓癌等を発症するモデルマウスの作出に適用し得る。また、膵星細胞の大量精製、臓器の線維化、等、疾患以外にも適用し得る。一方、対象動物はマウスに限らず、ラット、ラビット等、哺乳類であって非ヒトの他のモデル動物にも適用できる。
【００９９】
また、本実施の形態では対をなすＸ染色体の一方に相同遺伝を含むフラグメントを導入した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、対をなすＸ染色体の両方に相同遺伝子を導入してもよい。この場合、例えば、相同遺伝子とプロモータとを含むフラグメントと、相同遺伝子は含むがプロモータは含まない他のフラグメントとを準備しておき、対をなす両Ｘ染色体の所定領域を置換可能に構成してなるＥＳ細胞に両フラグメントを導入することによって、対をなすＸ染色体の一方には前記フラグメントが導入される一方、対をなすＸ染色体の他方には前記他のフラグメントが導入されたＥＳ細胞を得るようにする。つまり、対をなす両Ｘ染色体に相同遺伝子を導入するが、一方のＸ染色体に導入された相同遺伝子は発現し得るが、他方のＸ染色体に導入された相同遺伝子は発現し得ないようになすのである。
【０１００】
これによって、前同様にＸ染色体不活性化が適用されるので、対象部分を構成する各細胞が、目的遺伝子が欠損しているがＸ染色体の相同遺伝子によって救済されているものと、目的遺伝子が欠損しておりそのような救済がなされていないものとがランダムに混在しているモデル動物が得られる。かかるモデル動物にあっては、前同様、所要の寿命を有する一方、所定の生体反応を招来する。ただし、このような方法に比べて、前述したように対をなすＸ染色体の一方に相同遺伝を含むフラグメントを導入する方法の方が、モデル動物の作出効率は高い。
【０１０１】
追記
ところで、以上の説明から明らかなように、本実施の形態からは更に以下の発明が導かれる。
【０１０２】
（１）  非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、
前記目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体を得る一方、
前記目的遺伝子の相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、
前記動物の対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子内の所定領域を置換可能に構成した第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を当該フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と
得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程と
を実施し、
前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させる
ことを特徴とするモデル動物の作出方法。
【０１０３】
（２）  前記動物としてマウスを用い、
前記第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いる（１）記載のモデル動物の作出方法。
【０１０４】
（３）  前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とする（２）記載のモデル動物の作出方法。
【０１０５】
（１）記載のモデル動物の作出方法は、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、前記目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体を得る一方、前記目的遺伝子の相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、前記動物の対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子内の所定領域を置換可能に構成した第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を当該フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程とを実施し、前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させることを特徴とする。
【０１０６】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、常法によって目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を得ておく。
【０１０７】
一方、前述した目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製する。かかる工程は、相同遺伝子をクローニングしてもよいし、各エクソンを含むように設計した遺伝子配列を合成してもよい。
【０１０８】
次いで、対象動物の対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子内の所定領域を置換可能に構成した第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を当該フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する。Ｄｉａｐ２遺伝子はＸ染色体にあり、Ｄｉａｐ２遺伝子を欠損させたマウスは正常であることが確認されている。このＤｉａｐ２遺伝子内に、例えば適宜のベクターを導入することによって、当該Ｘ染色体の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、この第２ＥＳ細胞内に、前記フラグメントを、例えばＣｒｅ発現ベクターといった発現ベクターと共に導入することによって、前記所定領域を前記フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する。
【０１０９】
次に、得られた置換ＥＳ細胞を適宜処理した後、疑似妊娠させた動物内に移入させて個体を産生させ、得られた個体からＸ染色体の所定領域を相同遺伝子で置換させた第２個体を選択する。
【０１１０】
そして、これら第１個体と第２個体とを交配させて、前記目的遺伝子がホモ欠損しており、前記相同遺伝子が対をなすＸ染色体の一方に導入されたメスのモデル動物を産生させる。
【０１１１】
ここで、哺乳動物における遺伝子量補償は、メスの２本のＸ染色体のうちの一方が不活性にすることで達成されており、かかる現象をＸ染色体不活性化と呼ばれている。そして、２本のＸ染色体のうちのどちらが不活化されるかはランダムである。そのため、前述した如く産生されたモデル動物にあっては、対象部分を構成する各細胞が、目的遺伝子が欠損しているがＸ染色体の相同遺伝子によって救済されているものと、目的遺伝子が欠損しておりそのような救済がなされていないものとがランダムに混在しているものが得られる。かかるモデル動物にあっては、所要の寿命を有する一方、所定の生体反応を招来する。
【０１１２】
また、前述したようにＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子を欠損させた対象動物は正常であるので、第２ＥＳ細胞として、Ｘ染色体のＤｉａｐ２遺伝子を欠損させてなるＥＳ細胞を用いた場合、得られたモデル動物に悪影響を及ぼすことなく、所定の生体反応を招来させることができる。
【０１１３】
（２）記載のモデル動物の作出方法は、前記動物としてマウスを用い、前記第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いることを特徴とする。
【０１１４】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、前記動物としてマウスを用い、第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いる。かかる第２ＥＳ細胞は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１１年１２月１日（原寄託日）に国内寄託されており、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７２の受託番号が付与されている。更に、本ＥＳ細胞は、２０１２年５月３０日（移管日）に前記特許微生物センターに対して国際寄託への移管請求がなされ、２０１２年６月１１日にＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２の受託番号が付与されている。
【０１１５】
この第２ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）は、前述したＤｉａｐ２遺伝子内にトラップベクターであるｐＵ−２１Ｂを導入することによって構成されており、トラップベクターｐＵ−２１Ｂの所定領域は他のフラグメントと置換可能になっている。従って、この置換可能領域と相同遺伝子とを置換させてＤｉａｐ２遺伝子内に相同遺伝子を導入することができる。一方、前述したように、Ｄｉａｐ２遺伝子を欠損させてもそのマウスは正常であるので、第２ＥＳ細胞としてＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いた場合、得られたモデルマウスに悪影響を及ぼすことなく、所定の生体反応を招来させることができる。
【０１１６】
（３）記載のモデル動物の作出方法は、前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とすることを特徴とする。
【０１１７】
本発明のモデル動物の作出方法にあっては、目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とするので、得られたモデルマウスには、ヒト慢性膵炎に特徴な所見を観察することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
以上のように本発明は、慢性膵炎、糖尿病、膵臓癌等を発症するモデル動物作出に適用し得る。また、膵星細胞の大量精製、臓器の線維化、等、疾患以外にも適用し得る。
【符号の説明】
【０１１９】
ｄ    脱落した腺房細胞
【図１】
2013094240.tif 000004
【図２】
2013094240.tif 000005
【図３】
2013094240.tif 000006
【図４】
2013094240.tif 000007
【図５】
2013094240.tif 000008
【図６】
2013094240.tif 000009
【図７】
2013094240.tif 000010
【図８】
2013094240.tif 000011
【図９】
2013094240.tif 000012
【図１０】
2013094240.tif 000013
【図１１】
2013094240.tif 000014
【図１２】
2013094240.tif 000015
【図１３】
2013094240.tif 000016
【図１４】
2013094240.tif 000017
【図１５】
2013094240.tif 000018
【図１６】
2013094240.tif 000019
【配列表】
2013094240000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月20日(2013.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、
前記目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体を得ておき、
前記目的遺伝子の相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、
前記動物のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、
該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を前記フラグメントに
て置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と、
得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程と
を実施し、
前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させる
ことを特徴とするモデル動物の作出方法。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、
前記動物の第１ＥＳ細胞を用いて前記目的遺伝子を欠損させる工程と、
得られた第１ＥＳ細胞を用いて前記目的遺伝子がヘテロ欠損した第１個体を産生させる工程と
を実施する一方、
前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、
前記動物のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなる第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を前記フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と、
得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程と
を実施し、
前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させる
ことを特徴とするモデル動物の作出方法。
【請求項３】
前記第２ＥＳ細胞として、対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体内の所定領域を置換可能に構成してなるＥＳ細胞を用いる請求項１又は２記載のモデル動物の作出方法。
【請求項４】
前記動物としてマウスを用い、
前記第２ＥＳ細胞として、前記所定領域がＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に設けてあるＥＳ細胞を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のモデル動物の作出方法。
【請求項５】
前記第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いる請求項４記載のモデル動物の作出方法。
【請求項６】
前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とする請求項４又は５記載のモデル動物の作出方法。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物であって、
目的遺伝子はホモ欠損させてあり、
Ｘ染色体内に前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントが導入してあり、身体を構成する細胞内の一部の細胞において、当該相同遺伝子を発現させたメスである
ことを特徴とするモデル動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物であって、
目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体と、前記動物のＸ染色体内に、前記目的遺伝子と相同性を有する相同遺伝子を含むフラグメントを導入した第２個体とを交配させてなり、
前記目的遺伝子はホモ欠損しており、身体を構成する細胞の内の一部の細胞において前記相同遺伝子が発現しているメスであることを特徴とするモデル動物。
【請求項９】
前記フラグメントはＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子領域内に導入してある請求項７又は８記載のモデル動物。
【請求項１０】
前記動物はマウスであり、前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３であり、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１である請求項７〜９のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項１１】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を用いて目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出する場合、
前記目的遺伝子をヘテロ欠損させた第１個体を得る一方、
前記目的遺伝子の相同遺伝子を含むフラグメントを作製する工程と、
前記動物の対をなすＸ染色体の一方のＸ染色体のＤｉａｐ２遺伝子内の所定領域を置換可能に構成した第２ＥＳ細胞を用い、該第２ＥＳ細胞に前記フラグメントを導入して前記所定領域を当該フラグメントにて置換した置換ＥＳ細胞を生成する工程と
得られた置換ＥＳ細胞を用いて第２個体を産生させる工程と
を実施し、
前記第１個体と第２個体とを交配させてモデル動物を産生させる
ことを特徴とするモデル動物の作出方法。
【請求項１２】
前記動物としてマウスを用い、
前記第２ＥＳ細胞として、ＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）を用いる請求項１１記載のモデル動物の作出方法。
【請求項１３】
前記目的遺伝子はＳｐｉｎｋ３とし、前記相同遺伝子はＳｐｉｎｋ１とする請求項１２記載のモデル動物の作出方法。
【請求項１４】
目的遺伝子を欠損させたモデル動物を作出するために用いられる非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞であって、
該ＥＳ細胞はＥＳ細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１７２）であることを特徴とする非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞。
【国際調査報告】
2013094240.tif 000020
2013094240.tif 000021
2013094240.tif 000022
2013094240.tif 000023