(57)【要約】安全性が高く、質の良い受精卵を得ることができ、妊娠率を高めることができるヒト胚の体外受精及び培養用培養液。この培養用培養液は、ヒトの精子と卵子の受精を行うのに用いられる第１培養液と、受精後から１６細胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第２培養液と、桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第３培養液とを備える。第１〜第３培養液は、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩を含有し、かつ無血清である。グルコース濃度は第１培養液が最も高く、第２培養液が最も低い。乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度は第３培養液が最も低い。
2009122541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの精子と卵子の受精を行うのに用いられる第１培養液と、受精後から１６細胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第２培養液と、桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第３培養液とを備え、第１〜第３培養液は、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩を含有し、かつ無血清であると共に、グルコース濃度は第１培養液が最も高く、第２培養液が最も低く、乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度は第３培養液が最も低いことを特徴とするヒト胚の体外受精及び培養用培養液。
【請求項２】
第１培養液は、グルコース濃度が２．２±１．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であり、第２培養液は、グルコース濃度が０．２±０．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であり、第３培養液は、グルコース濃度が２．１±１．０５ｍＭ、乳酸塩濃度が１０±５ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．１５±０．０７５ｍＭ、かつ無血清であることを特徴とする請求項１に記載のヒト胚の体外受精及び培養用培養液。
【請求項３】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかに上皮細胞成長因子及びインスリンが添加されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒト胚の体外受精及び培養用培養液。
【請求項４】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかに完全無血清化のために血清及びアルブミン代替物質としてヒアルロナンが添加されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のヒト胚の体外受精及び培養用培養液。
【請求項５】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかにはリコンビナントヒトアルブミンが添加されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のヒト胚の体外受精及び培養用培養液。
【請求項６】
グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩を含有し、かつ無血清である第１〜第３培養液を用いてヒト胚を体外で培養する方法であって、グルコース濃度が最も高い第１培養液でヒトの精子と卵子の受精を行い、グルコース濃度が最も低い第２培養液で受精後から１６細胞期までのヒト胚を培養し、乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度が最も低い第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養することを特徴とするヒト胚の体外受精及び培養方法。
【請求項７】
第１培養液として、グルコース濃度が２．２±１．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であるものを用い、第２培養液として、グルコース濃度が０．２±０．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であるものを用い、第３培養液として、グルコース濃度が２．１±１．０５ｍＭ、乳酸塩濃度が１０±５ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．１５±０．０７５ｍＭ、かつ無血清であるものを用いることを特徴とする請求項６に記載のヒト胚の体外受精及び培養方法。
【請求項８】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかに上皮細胞成長因子及びインスリンが添加されていることを特徴とする請求項６又は７に記載のヒト胚の体外受精及び培養方法。
【請求項９】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかに完全無血清化のために血清及びアルブミン代替物質としてヒアルロナンが添加されていることを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載のヒト胚の体外受精及び培養方法。
【請求項１０】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかにはリコンビナントヒトアルブミンが添加されていることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載のヒト胚の体外受精及び培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）においてヒトの不妊治療、特に体外受精治療の際にヒト胚を体外で受精及び培養するのに用いられるヒト胚の体外受精及び培養用培養液及びこれを用いてヒト胚を体外で受精及び培養するヒト胚の体外受精及び培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
不妊は、子を持つことを望む夫婦にとって深刻な問題であると共に、少子高齢化の問題にも関わるものであるため、早急に解決することが望まれている。従来、不妊治療としては、薬物療法や外科的手段による生殖細胞の通過性の回復、人工授精や体外受精（ＩＶＦ）などが行われている。このうち体外受精は、採卵から１〜３時間後にシャーレの中で調整済みの精子を振りかけて受精を行い、この受精した卵を培養した後、分裂した卵（胚）を子宮内に移植することによって行われている。ここで、受精卵の培養には様々な培養液が開発されて用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００３−２４０５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の培養液は、ヒト胚の代謝（metabolism）に適したものではないので、質の良い受精卵を得るのが難しく、妊娠率を高めることができないという問題がある。【０００４】
また、近年においては安心・安全な医療が求められているが、従来の培養液には例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のようなヒト由来の血清成分が含まれているため、感染症の危険性が否定できないという問題もある。そして現在のところ血清成分を含まない完全無血清培養液は存在しない。【０００５】
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、安全性が高く、質の良い受精卵を得ることができ、妊娠率を高めることができるヒト胚の体外受精及び培養用培養液及びヒト胚の体外受精及び培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の請求項１に係るヒト胚の体外受精及び培養用培養液は、ヒトの精子と卵子の受精を行うのに用いられる第１培養液と、受精後から１６細胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第２培養液と、桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第３培養液とを備え、第１〜第３培養液は、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩を含有し、かつ無血清であると共に、グルコース濃度は第１培養液が最も高く、第２培養液が最も低く、乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度は第３培養液が最も低いことを特徴とするものである。【０００７】
請求項２に係る発明は、請求項１において、第１培養液は、グルコース濃度が２．２±１．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であり、第２培養液は、グルコース濃度が０．２±０．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であり、第３培養液は、グルコース濃度が２．１±１．０５ｍＭ、乳酸塩濃度が１０±５ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．１５±０．０７５ｍＭ、かつ無血清であることを特徴とするものである。【０００８】
請求項３に係る発明は、請求項１又は２において、第１〜第３培養液の少なくともいずれかに上皮細胞成長因子及びインスリンが添加されていることを特徴とするものである。【０００９】
請求項４に係る発明は、請求項１乃至３のいずれか１項において、第１〜第３培養液の少なくともいずれかに完全無血清化のために血清及びアルブミン代替物質としてヒアルロナンが添加されていることを特徴とするものである。【００１０】
請求項５に係る発明は、請求項１乃至４のいずれか１項において、第１〜第３培養液の少なくともいずれかにはリコンビナントヒトアルブミンが添加されていることを特徴とするものである。【００１１】
本発明の請求項６に係るヒト胚の体外受精及び培養方法は、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩を含有し、かつ無血清である第１〜第３培養液を用いてヒト胚を体外で培養する方法であって、グルコース濃度が最も高い第１培養液でヒトの精子と卵子の受精を行い、グルコース濃度が最も低い第２培養液で受精後から１６細胞期までのヒト胚を培養し、乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度が最も低い第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養することを特徴とするものである。【００１２】
請求項７に係る発明は、請求項６において、第１培養液として、グルコース濃度が２．２±１．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であるものを用い、第２培養液として、グルコース濃度が０．２±０．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であるものを用い、第３培養液として、グルコース濃度が２．１±１．０５ｍＭ、乳酸塩濃度が１０±５ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．１５±０．０７５ｍＭ、かつ無血清であるものを用いることを特徴とするものである。【００１３】
請求項８に係る発明は、請求項６又は７において、第１〜第３培養液の少なくともいずれかに上皮細胞成長因子及びインスリンが添加されていることを特徴とするものである。【００１４】
請求項９に係る発明は、請求項６乃至８のいずれか１項において、第１〜第３培養液の少なくともいずれかに完全無血清化のために血清及びアルブミン代替物質としてヒアルロナンが添加されていることを特徴とするものである。【００１５】
請求項１０に係る発明は、請求項６乃至９のいずれか１項において、第１〜第３培養液の少なくともいずれかにはリコンビナントヒトアルブミンが添加されていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の請求項１に係るヒト胚の体外受精及び培養用培養液によれば、安全性が高く、質の良い受精卵を得ることができ、妊娠率を高めることができるものである。【００１７】
請求項２に係る発明によれば、安全性が高く、質の良い受精卵を得ることができ、妊娠率を高めることができるものである。【００１８】
請求項３に係る発明によれば、生産効率と生産胚の品質を高めることができるものである。【００１９】
請求項４に係る発明によれば、卵子・精子細胞を保護したり、受精・発育を促進したりすることができるものである。【００２０】
請求項５に係る発明によれば、感染の心配がなく安全であるので、第１〜第３培養液を受精・培養に適したものにすることができるものである。【００２１】
本発明の請求項６に係るヒト胚の体外受精及び培養方法によれば、安全性が高く、質の良い受精卵を得ることができ、妊娠率を高めることができるものである。【００２２】
請求項７に係る発明によれば、安全性が高く、質の良い受精卵を得ることができ、妊娠率を高めることができるものである。【００２３】
請求項８に係る発明によれば、生産効率と生産胚の品質を高めることができるものである。【００２４】
請求項９に係る発明によれば、卵子・精子細胞を保護したり、受精・発育を促進したりすることができるものである。【００２５】
請求項１０に係る発明によれば、感染の心配がなく安全であるので、第１〜第３培養液を受精・培養に適したものにすることができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態を説明する。【００２７】
本発明においてヒト胚の体外受精及び培養用培養液は、第１培養液と、第２培養液と、第３培養液とを備えている。【００２８】
第１培養液は、ヒトの精子と卵子の受精を行うのに用いられるものであり、また第２倍溶液は、受精後（前核期）から１６細胞期までのヒト胚を培養するのに用いられるものであり、また第３培養液は、桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養するのに用いられるものである。いずれの培養液も、無機塩、エネルギー源（糖、アミノ酸など）、細胞保護物質（ポリビニールアルコール、ヒアルロナンを代表とするグリコスアミノグリカンなど）、抗生物質、生理活性物質（成長因子、サイトカインなど）を超純粋又は再蒸留水に溶解させることによって調製することができる。ただし、いずれの培養液も無血清である。また第１〜第３培養液においてエネルギー源の濃度は異ならせ、エネルギー源以外の成分の濃度は同じにしてある。【００２９】
ここで、エネルギー源以外の成分としては、次のようなものを用いることができる。すなわち、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を９５±４７．５ｍＭ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を０．７±０．３５ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣｌ）を２．５０±１．２５ｍＭ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を１．７０±０．８５ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を０．２０±０．１０ｍＭ、Ｌ−アラニン（L-Alanine）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−アルギニン一塩酸塩（L-Arginine HCl）を０．３０±０．１５ｍＭ、Ｌ−アスパラギン一水和物（L-Asparagine H2O）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−アスパラギン酸（L-Aspartic acid）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−シスチン二塩酸塩（L-Cystine 2HCl）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−グルタミン酸（L-Glutamic acid）を０．０５±０．０２５ｍＭ、グリシン（Glycine）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物（L-Histidine HClH2O）を０．１０±０．０５ｍＭ、Ｌ−イソロイシン（L-Isoleucine）を０．２０±０．１０ｍＭ、Ｌ−ロイシン（L-Leucine）を０．２０±０．１０ｍＭ、Ｌ−リシン一塩酸塩（L-LysineHCl）を０．２０±０．１０ｍＭ、Ｌ−メチオニン（L-Methionine）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−フェニルアラニン（L-Phenylalanine）を０．１０±０．０５ｍＭ、Ｌ−プロリン（L-Proline）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−セリン（L-Serine）を０．０５±０．０２５ｍＭ、Ｌ−トレオニン（L-Threonine）を０．２０±０．１０ｍＭ、Ｌ−トリプトファン（L-Tryptophan）を０．０２５±０．０１２５ｍＭ、Ｌ−チロシン（L-Tyrosine）を０．１０±０．０５ｍＭ、Ｌ−バリン（L-Valine）を０．２０±０．１０ｍＭ、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を２１．４３±１０．７ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物（EDTA 2Na 2H2O）を０．０１±０．００５ｍＭ、ゲンタマイシン硫酸塩（Gentamicin Sulfate）を５．０±２．５ｍｇ／Ｌ用いることができ、また培養時の操作性を向上させるために血清の代替成分としてポリビニルアルコール（Polyvinylalcohol）を１００．０±５０．０ｍｇ／Ｌ用いることができる。またＬ−グルタミン（L-Glutamine）を１．００±０．５０ｍＭ用いることができるが、アンモニア／アンモニウムが発生するおそれがあるので、Ｌ−グルタミン（L-Glutamine）の代わりにアラニル−Ｌ−グルタミン（Alanyl-L-Glutamine）を１．００±０．５０ｍＭ用いるのが好ましい。またｐＨ調整用として塩酸（ＨＣｌ）を０．００３±０．００１５ｍＭ用いることができる。【００３０】
また、エネルギー源としては、Ｄ−グルコース（D-Glucose）等のグルコース、ＤＬ−乳酸ナトリウム（DL-Lactate Na）等の乳酸塩（Lactate）、ピルビン酸ナトリウム（Na-pyruvate）等のピルビン酸塩（Pyruvate）を用いることができるものであるが、これらの濃度は第１〜第３培養液において異ならせている。すなわち、グルコース濃度は第１培養液が最も高く、第２培養液が最も低い。また、乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度は第３培養液が最も低い。【００３１】
具体的には、第１培養液は、グルコース濃度が２．２±１．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭである。このように第１培養液は精子のエネルギー代謝に必要なグルコースを豊富に含んでいるものである。なお、第１培養液の浸透圧は２６０〜２７５ｍＯｓｍであることが好ましく、ｐＨは７．２〜７．４であることが好ましい。【００３２】
また第２培養液は、グルコース濃度が０．２±０．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭである。第２培養液では初期胚の発育にグルコースを余り必要としないので、上記のようにグルコース濃度が低く設定されている。なお、第２培養液の浸透圧は２６０〜２７５ｍＯｓｍであることが好ましく、ｐＨは７．２〜７．４であることが好ましい。【００３３】
また第３培養液は、グルコース濃度が２．１±１．０５ｍＭ、乳酸塩濃度が１０±５ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．１５±０．０７５ｍＭである。第３培養液では後期胚の卵割に多くのエネルギーを必要とするので、上記のようにグルコース濃度が高く設定されている。また第３培養液では卵子の栄養要求性に合わせて乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度が低く設定されている。なお、第３培養液の浸透圧は２６０〜２７５ｍＯｓｍであることが好ましく、ｐＨは７．２〜７．４であることが好ましい。【００３４】
ここで、生産効率と生産胚の品質の観点から、特に第１〜第３培養液の少なくともいずれかには上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０±１０ｎｇ／ｍｌ及びインスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）を１０±５μｇ／ｍｌ添加しておくのが好ましい。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は細胞の成長と発育を促進するものであり、またインスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）は糖代謝を円滑に進めるものであり、これらのものは細胞の分割促進と受精卵の子宮内への着床を行わせるのに重要な役割を演ずる。なお、同様に第１培養液にも上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及びインスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）を添加しておいてもよい。【００３５】
また第１〜第３培養液の少なくともいずれかには完全無血清化のために血清及びアルブミン代替物質としてヒアルロナンを０．０５〜７．０ｍｇ／ｍｌ添加しておくのが好ましい。これにより、卵子・精子細胞を保護したり、受精・発育を促進したりすることができるものである。なお、ヒアルロナンとはヒアルロン酸やヒアルロン酸ナトリウム等のヒアルロン酸塩のことをいう。【００３６】
また第１〜第３培養液の少なくともいずれかにはリコンビナントヒトアルブミン（ｒ−ＨＡ）を０．１〜２質量％添加しておくのが好ましい。リコンビナントヒトアルブミンは、感染の心配がなく安全であるので、第１〜第３培養液を受精・培養に適したものにすることができるものである。【００３７】
また各培養液の浸透圧及びｐＨは、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）等を適宜に増量又は減量することによって調整することができる。【００３８】
そしてヒトの卵子の採取は、ヒト卵子採取用培養液を用いて行うことができる。このヒト卵子採取用培養液は、第１培養液に１１±５．５ｍＭのＨｅｐｅｓ（4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；Ｃ６Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ）及び９±４．５ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ（Sodium 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ylethanesulphonate；Ｃ８Ｈ１７Ｎ２ＮａＯ４Ｓ）を添加して調製することができる。このようにＨｅｐｅｓ及びＮａ−Ｈｅｐｅｓが添加されていることによって、インキュベータ外の空気中でヒトの卵子を採取する場合に、ヒト卵子採取用培養液のｐＨを安定させることができるものである。なお、ヒトの卵子の採取は、卵子採取用ツールの注射筒にあらかじめヒト卵子採取用培養液を吸引した後、超音波ガイド下で卵子採取用ツールの注射針を卵胞に穿刺し、卵胞内の卵胞液と共に卵子を注射筒内に吸引することによって行うことができる。【００３９】
また、不妊患者から採取した卵子は、ガラス化保存法によって、すなわち卵子凍結保存液に入れて液体窒素で凍結することによって半永久的に保存することができる。ここで、卵子凍結保存液は、ヒト卵子採取用培養液にメチルセルロースを０．１〜１．０質量％添加して調製することができる。必要に応じてさらに、糖類（ラフィノース、シュークロース、トレハロース及びラクトースなど）、高分子化合物（Dextrin, PVA；Poly Vinyl Alcohol，PVP；Poly Vinyl Pyrrolidoneなど）等の毒性の低いあるいは毒性の無い凍結保護剤（エチレングリコール、DMSO:Dimethyl Sulphoxide）を１０〜４０質量％添加してもよい。この凍結保護剤は、卵子の凍結保存前に卵子細胞内外の自由水及び結合水と置き換わって、卵子に耐凍能を付与することができる。【００４０】
また、上記のヒト卵子採取用培養液は、ヒト卵子マイクロタクタイルセンサ（ＭＴＳ）測定用培養液として用いることができる（例えば、文献日本受精着床学会雑誌 25,116-119,2008及び文献Human Cell2006,19,119-125）。このヒト卵子ＭＴＳ測定用培養液は、ヒト卵子の品質を評価するためにＭＴＳを用いて卵子透明帯の弾性率を測定するために用いられるものである。そして弾性率の測定は、インキュベータ外の空気中で行われるが、ヒト卵子ＭＴＳ測定用培養液にはＨｅｐｅｓ及びＮａ−Ｈｅｐｅｓが添加されているので、ｐＨが安定しているものである。【００４１】
他方、ヒトの精子の採取は、ヒト精子採取用培養液を用いて、ヒトから採取した精液を洗浄すると共に遠心分離することによって行うことができる。ここで、ヒト精子採取用培養液は、ヒト卵子採取用培養液と同様に、第１培養液に１１±５．５ｍＭのＨｅｐｅｓ（4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；Ｃ６Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ）及び９±４．５ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ（Sodium 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ylethanesulphonate；Ｃ８Ｈ１７Ｎ２ＮａＯ４Ｓ）を添加して調製することができる。このようにＨｅｐｅｓ及びＮａ−Ｈｅｐｅｓが添加されていることによって、インキュベータ外の空気中でヒトの精液を洗浄したり遠心分離したりする場合に、ヒト精子採取用培養液のｐＨを安定させることができるものである。なお、精液の洗浄・遠心分離によって、細菌や白血球などの不純物を除去し、運動性の高い精子のみを得ることができるものである。【００４２】
また、一旦採取した精子は、精子凍結保存液に入れて液体窒素で凍結することによって半永久的に保存することができる。ここで、精子凍結保存液は、ヒト精子採取用培養液にメチルセルロースを０．１〜１．０質量％、ヒアルロナンを０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ添加して調製することができる。必要に応じてさらに、糖類（ラフィノース、シュークロース、トレハロース及びラクトースなど）、高分子化合物（Dextrin, PVA；Poly Vinyl Alcohol，PVP；Poly Vinyl Pyrrolidoneなど）等の毒性の低いあるいは毒性の無い凍結保護剤を１０〜３０質量％添加してもよい。この凍結保護剤は、精子の凍結保存前に精子細胞内外の自由水及び結合水と置き換わって、精子に耐凍能を付与することができる。【００４３】
次に、上記のように採卵・採精した後、第１〜第３培養液を備える体外受精及び培養用培養液を用いてヒト胚を体外で培養するにあたっては、インキュベータ内において、まず第１培養液でヒトの精子と卵子の受精を行う。このとき特に精子の活力が芳しくなく自力受精が不可能な場合には、顕微授精法（卵細胞質内精子注入法；ＩＣＳＩ）によって受精を行うこともできる。【００４４】
受精確認後、第１培養液を第２培養液に交換し、この第２培養液で受精確認後から１６細胞期までのヒト胚（初期胚）を培養する。このヒト胚は、胚細胞緊密化（compaction）を起こす前のものである。【００４５】
なお、２〜８細胞期に至ったヒト胚は、医師の判断により、第２培養液と共に移植用カテーテルによって、非外科的（経膣的）に子宮内に移植することができる。ここで、着床率をより向上させるためには、第２培養液をヒト胚移植用培養液に交換した後に移植するのが好ましい。このヒト胚移植用培養液は、第２培養液にヒアルロナンを０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を１０〜５０ｎｇ／ｍｌ添加して調製することができる。そしてこのヒト胚移植用培養液中のヒアルロナンが、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）との相乗効果により血管新生を促進させ、着床率をより向上させるものである。【００４６】
ここで、受精後から１６細胞期に至るまでの間、ヒト胚の品質を評価するためにマイクロタクタイルセンサ（ＭＴＳ）を用いて透明帯の弾性率を測定することができる。この測定には初期胚ＭＴＳ測定用培養液を用いることができ、この初期胚ＭＴＳ測定用培養液は、第２培養液に１１±５．５ｍＭのＨｅｐｅｓ（4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；Ｃ６Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ）及び９±４．５ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ（Sodium 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ylethanesulphonate；Ｃ８Ｈ１７Ｎ２ＮａＯ４Ｓ）を添加して調製することができる。このようにＨｅｐｅｓ及びＮａ−Ｈｅｐｅｓが添加されていることによって、インキュベータ外の空気中でヒト胚の透明帯の弾性率を測定する場合に、初期胚ＭＴＳ測定用培養液のｐＨを安定させることができるものである。【００４７】
また、初期胚は、ガラス化保存法によって、すなわち初期胚凍結用培養液に入れて液体窒素で凍結することによって半永久的に保存することができる。ここで、初期胚凍結用培養液は、初期胚ＭＴＳ測定用培養液にメチルセルロースを０．１〜１．０質量％、ヒアルロナンを０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ添加して調製することができる。必要に応じてさらに、糖類（ラフィノース、シュークロース、トレハロース及びラクトースなど）、高分子化合物（Dextrin, PVA；Poly Vinyl Alcohol，PVP；Poly Vinyl Pyrrolidoneなど）等の毒性の低いあるいは毒性の無い凍結保護剤（エチレングリコール、DMSO:Dimethyl Sulphoxide）を１０〜４０質量％添加してもよい。この凍結保護剤は、卵子の凍結保存前に精子細胞内外の自由水及び結合水と置き換わって、初期胚に耐凍能を付与することができる。【００４８】
そして１６細胞期又は桑実期に至ると、第２培養液を第３培養液に交換し、この第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのヒト胚（後期胚）を培養する。このように発育ステージに応じて第１培養液を第２培養液に交換し、さらに第２培養液を第３培養液に交換するものである。なお、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％ＣＯ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行うのが好ましい。【００４９】
ここで、１６細胞期又は桑実期に至るまでの間、ヒト胚の品質を評価するためにマイクロタクタイルセンサ（ＭＴＳ）を用いて透明帯の弾性率を測定することができる（例えば、文献日本受精着床学会雑誌 25,116-119,2008及び文献Human Cell2006,19,119-125）。この測定には後期胚ＭＴＳ測定用培養液を用いることができ、この後期胚ＭＴＳ測定用培養液は、第３培養液に１１±５．５ｍＭのＨｅｐｅｓ（4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；Ｃ６Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ）及び９±４．５ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ（Sodium 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ylethanesulphonate；Ｃ８Ｈ１７Ｎ２ＮａＯ４Ｓ）を添加して調製することができる。このようにＨｅｐｅｓ及びＮａ−Ｈｅｐｅｓが添加されていることによって、インキュベータ外の空気中でヒト胚の透明帯の弾性率を測定する場合に、後期胚ＭＴＳ測定用培養液のｐＨを安定させることができるものである。【００５０】
また、後期胚は、ガラス化保存法によって、すなわち後期胚凍結用培養液に入れて液体窒素で凍結することによって半永久的に保存することができる。ここで、後期胚凍結用培養液は、後期胚ＭＴＳ測定用培養液にメチルセルロースを０．１〜１．０質量％、ヒアルロナンを０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ添加して調製することができる。必要に応じてさらに、糖類（ラフィノース、シュークロース、トレハロース及びラクトースなど）、高分子化合物（Dextrin, PVA；Poly Vinyl Alcohol，PVP；Poly Vinyl Pyrrolidoneなど）等の毒性の低いあるいは毒性の無い凍結保護剤を１０〜３０質量％添加してもよい。この凍結保護剤は、卵子の凍結保存前に精子細胞内外の自由水及び結合水と置き換わって、後期胚に耐凍能を付与することができる。【００５１】
そして、胚盤胞期に至ったヒト胚は、医師の判断により、第３培養液と共に移植用カテーテルによって、非外科的（経膣的）に子宮内に移植することができる。ここで、着床率をより向上させるためには、第３培養液をヒト胚移植用培養液に交換した後に移植するのが好ましい。このヒト胚移植用培養液は、第３培養液にヒアルロナンを０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を１０〜５０ｎｇ／ｍｌ添加して調製することができる。そしてこのヒト胚移植用培養液中のヒアルロナンが、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）との相乗効果により血管新生を促進させ、着床率をより向上させるものである。【００５２】
従来は受精から胚盤胞期までのヒト胚を単一の培養液で培養するのが一般的であったが、このような培養方法では質の良い受精卵を得ることが難しい。しかし、本発明では第１〜第３培養液において、ヒト胚の発育ステージの栄養要求性に合わせて、グルコース濃度、乳酸塩濃度、ピルビン酸塩濃度をそれぞれ増減させているので、質の良い受精卵を得ることができるものであり、その結果、着床率が向上し、妊娠率を高めることができるものである。そして第１〜第３培養液においてグルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩以外の成分と濃度はほぼ同一であるので、患者の卵巣から卵子を採取し、精巣から精子を採取してから、受精卵の培養を経て子宮内へ受精卵を移植するまでの間、卵子、精子、受精卵に対するストレスを最小限に抑えることができるものである。従って、第１〜第３培養液は、看者子宮への受精卵移植液あるいはガラス化保存液としての使用も可能である。本発明ではヒト由来の血清成分を除外しているので、病原体の侵入・感染を防止することができ、安全性を高めることができるものである。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。【００５４】
下記［表１］に示す組成で実施例１、２及び比較例１の培養液を調製した。実施例１、２はそれぞれ第１〜第３培養液を備えている。比較例１はＫＳＯＭ（Potassium Simplex Optimized Medium）をベースとする従来の市販の培養液（Life Global社製「Global」）である。【００５５】
【表１】
2009122541.tif 000003
【００５６】
次に、実施例１及び比較例１の培養液を用いてそれぞれマウス胚を体外で培養した。【００５７】
実施例１については、まず第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行い、次に第２培養液で受精後から１６細胞期までのマウス胚を培養した後、第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。なお、受精・培養は、ＣＯ２濃度を５〜６％に保ったインキュベータ内において行った。【００５８】
比較例１については、上記［表１］に示す培養液のみで受精を行うと共に、受精後から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。【００５９】
また、実施例１及び比較例１の第２、第３培養液のそれぞれに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌ添加して上記と同様にマウス胚を培養した。また、実施例１及び比較例１の第２、第３培養液のそれぞれにインスリン（Ｉｎｓ）を１０μｇ／ｍｌ添加して上記と同様にマウス胚を培養した。また、実施例１及び比較例１の第２、第３培養液のそれぞれに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌ及びインスリン（Ｉｎｓ）を１０μｇ／ｍｌ添加して上記と同様にマウス胚を培養した。【００６０】
なお、上記の培養実験では、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％ＣＯ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。また上記の培養実験は各２回行った。【００６１】
そして、ＥＧＦもＩｎｓも添加していない場合、ＥＧＦのみ添加した場合、Ｉｎｓのみ添加した場合、ＥＧＦとＩｎｓを両方添加した場合のそれぞれの場合について、胚盤胞到達率、総細胞数、総細胞数５０未満の胚盤胞の個数と割合、総細胞数１００以上の胚盤胞の個数と割合を求めた。その結果を下記［表２］に示す。なお、下記［表２］中、「Ｎ」は総細胞数を数えた胚盤胞の個数（総細胞数５０未満の胚のデータは含まない）を示し、「ＳＴＤ」は標準偏差を示す。【００６２】
【表２】
2009122541.tif 000004
【００６３】
一方、実施例２及び比較例１の培養液を用いてそれぞれマウス胚を体外で培養した。【００６４】
実施例２については、まず第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行い、次に第２培養液で受精後から１６細胞期までのマウス胚を培養した後、第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。【００６５】
比較例１については、上記［表１］に示す培養液のみで受精を行うと共に、受精後から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。【００６６】
また、実施例２及び比較例１の第２、第３培養液のそれぞれに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌ添加して上記と同様にマウス胚を培養した。また、実施例２及び比較例１の第２、第３培養液のそれぞれにインスリン（Ｉｎｓ）を１０μｇ／ｍｌ添加して上記と同様にマウス胚を培養した。また、実施例２及び比較例１の第２、第３培養液のそれぞれに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌ及びインスリン（Ｉｎｓ）を１０μｇ／ｍｌ添加して上記と同様にマウス胚を培養した。【００６７】
なお、上記の培養実験では、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％ＣＯ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。また上記の培養実験は各２回行った。【００６８】
そして、ＥＧＦもＩｎｓも添加していない場合、ＥＧＦのみ添加した場合、Ｉｎｓのみ添加した場合、ＥＧＦとＩｎｓを両方添加した場合のそれぞれの場合について、胚盤胞到達率、総細胞数、総細胞数５０未満の胚盤胞の個数と割合、総細胞数１００以上の胚盤胞の個数と割合を求めた。その結果を下記［表３］に示す。なお、下記［表３］中、「Ｎ」は総細胞数を数えた胚盤胞の個数（総細胞数５０未満の胚のデータは含まない）を示し、「ＳＴＤ」は標準偏差を示す。【００６９】
【表３】
2009122541.tif 000005
【００７０】
また、実施例２の培養液を用いて次のようにマウス胚を体外で培養した。【００７１】
まず第１培養液にコスモ・バイオ株式会社製のヒアルロナンを０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、ナカライテスク株式会社製のヒアルロナンを０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１質量％添加し、各第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行った。また比較のため、ヒアルロナンもＨＳＡも添加しない無添加の第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行った。このときの受精数及び受精率を下記［表４］に示す。【００７２】
次に第２、第３培養液のそれぞれに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌ及びインスリン（Ｉｎｓ）を１０μｇ／ｍｌ添加した。さらにこの第２、第３培養液にコスモ・バイオ株式会社製のヒアルロナンを０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、ナカライテスク株式会社製のヒアルロナンを０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ添加し、各第２培養液で受精後から１６細胞期までのマウス胚を培養した後、各第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。また比較のため、ヒアルロナンもＨＳＡも添加しない無添加の第２培養液で受精後から１６細胞期までのマウス胚を培養した後、同様に無添加の第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。【００７３】
なお、上記の培養実験では、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％ＣＯ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。【００７４】
そして、上記の各場合について、２ｃｅｌｌ分割数（受精後２細胞に発育した胚数）、２ｃｅｌｌ分割率（受精後２細胞に発育した胚の占める占有率）、胚盤胞到達数、胚盤胞到達率、Ｈ．ｉｎｇ数（Hatching blastocystのことであり、胚盤胞（blastocyst）に発育したものの中で透明帯から脱出を開始した胚数）、Ｈ．ｉｎｇ率（透明帯から脱出を開始した胚の占める占有率）を求めた。その結果を下記［表４］に示す。なお、下記［表４］中、「ＳＴＤ」は標準偏差を示し、「ｎ」は総細胞数を数えた胚盤胞の個数（総細胞数５０未満の胚のデータは含まない）を示す。【００７５】
【表４】
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【００７６】
また、実施例２の培養液を用いて次のようにマウス胚を体外で培養した。【００７７】
まず第１培養液にリコンビナントヒトアルブミン（ｒ−ＨＡ）を０．５質量％、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１質量％添加し、各第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行った。また比較のため、ｒ−ＨＡもＨＳＡも添加しない無添加の第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行った。さらに比較のため、株式会社ナカメディカル製「ＱＡファティリゼイション（ＨＴＦ）メディウム」にｒ−ＨＡを０．５質量％、ＨＳＡを１質量％添加し、各ＨＴＦでマウスの精子と卵子の受精を行った。このときの受精数及び受精率を下記［表５］に示す。【００７８】
次に第２、第３培養液のそれぞれに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌ及びインスリン（Ｉｎｓ）を１０μｇ／ｍｌ添加したが、ｒ−ＨＡもＨＳＡも添加しなかった。そして第２培養液で受精後から１６細胞期までのマウス胚を培養した後、第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。【００７９】
なお、上記の培養実験では、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％ＣＯ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。【００８０】
そして、上記の各場合について、２ｃｅｌｌ分割数（受精後２細胞に発育した胚数）、２ｃｅｌｌ分割率（受精後２細胞に発育した胚の占める占有率）、胚盤胞到達数、胚盤胞到達率、Ｈ．ｉｎｇ数（Hatching blastocystのことであり、胚盤胞（blastocyst）に発育したものの中で透明帯から脱出を開始した胚数）、Ｈ．ｉｎｇ率（透明帯から脱出を開始した胚の占める占有率）を求めた。その結果を下記［表５］に示す。なお、下記［表５］中、「ＳＴＤ」は標準偏差を示し、「ｎ」は総細胞数を数えた胚盤胞の個数（総細胞数５０未満の胚のデータは含まない）を示す。【００８１】
【表５】
2009122541.tif 000007
【００８２】
次に、実施例２の第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行い、受精後から第２培養液で培養を行い、受精確認後２４時間目に２細胞期の胚のみを選定し、４８時間目まで第２培養液、４８時間目以降は第３培養液で継続して培養を行い、受精確認後９６時間目に２細胞期胚のうちの胚盤胞数から総胚盤胞率を求めた。【００８３】
一方、比較例１の培養液でマウスの精子と卵子の受精を行い、受精後も同様の培養液で培養を行い、受精確認後２４時間目に２細胞期の胚のみを選定し、さらに同様の培養液で継続して培養を行い、受精確認後９６時間目に２細胞期胚のうちの胚盤胞数から総胚盤胞率を求めた。【００８４】
なお、上記のいずれの場合においても、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％Ｏ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。【００８５】
上記のようにして求めた実施例２及び比較例１の総胚盤胞率を棒グラフにして図１に示す。【００８６】
また、胚盤胞まで到達した胚に対して低張液にて低張処理を施し、これを固定液でスライドガラス上に固定した。引き続きＤＡＰＩ染色を施した後、蛍光顕微鏡にて観察及び撮影を行った。そして撮影した画像から全ての胚の総細胞数を数えて平均総細胞数を求めた。また、２種の蛍光色素で染色し、平均総細胞数と同様に細胞数を数えて平均ＩＣＭ（内部細胞塊）数を求めた。【００８７】
上記のようにして求めた実施例２及び比較例１の平均総細胞数を棒グラフにして図２に示す。【００８８】
また実施例２及び比較例１について胚盤胞の総細胞数を数えて総細胞数が１００個以上の優良胚盤胞率を求めた。この優良胚盤胞率を棒グラフにして図３に示す。【００８９】
また、実施例２及び比較例１について受胚雌妊娠率及び産仔生産率を求めた。【００９０】
具体的には実施例２については、まず第１培養液でマウスの精子と卵子の受精を行い、次に第２培養液で受精後から１６細胞期までのマウス胚を培養した後、第３培養液で桑実期から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。なお、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％Ｏ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。次にこの胚盤胞期のマウス胚をあらかじめ精管結刹を施したＩＣＲオスマウスと自然交尾させ偽妊娠の状態にしたＩＣＲメスマウスの卵管あるいは子宮に移植した。【００９１】
また比較例１については、上記［表１］に示す培養液のみで受精を行うと共に、受精後から胚盤胞期までのマウス胚を培養した。なお、受精から胚盤胞期までの培養は、インキュベータを用い、５〜６％Ｏ２を含む空気の湿度飽和気相の環境下において温度を３７．０℃に設定して行った。次にこの胚盤胞期のマウス胚をあらかじめ精管結刹を施したＩＣＲオスマウスと自然交尾させ偽妊娠の状態にしたＩＣＲメスマウスの卵管あるいは子宮に移植した。【００９２】
そして、胚盤胞期のマウス胚を移植した雌のうち、妊娠成立に至った雌の頭数の割合として受胚雌妊娠率（レシピエントの妊娠率）を求めた。また、移植した胚盤胞期のマウス胚の総数のうち、産まれた匹数の割合として産仔生産率を求めた。【００９３】
上記のようにして求めた実施例２及び比較例１の受胚雌妊娠率及び産仔生産率を棒グラフにして図４に示す。【００９４】
このように、図１〜図４にみられるように比較例１に比べて実施例２の培養液の方が質の良い受精卵を得ることができることが確認される。その結果、着床率が向上し、妊娠率を高めることができるものである。また本発明ではヒト由来の血清成分を除外しているので、病原体の侵入・感染を防止することができ、安全性を高めることができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施例２及び比較例１について総胚盤胞率を示す棒グラフである。
【図２】実施例２及び比較例１について平均総細胞数を示す棒グラフである。
【図３】実施例２及び比較例１について優良胚盤胞率を示す棒グラフである。
【図４】実施例２及び比較例１について受胚雌妊娠率（レシピエントの妊娠率）及び産仔生産率を示す棒グラフである。
【図１】
2009122541.tif 000008
【図２】
2009122541.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月18日(2011.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの精子と卵子の受精を行うのに用いられる第１培養液と、受精後から１６細胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第２培養液と、桑実期から胚盤胞期までのヒト胚を培養するのに用いられる第３培養液とを備え、第１〜第３培養液は、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩を含有し、かつ完全無血清であると共に、グルコース濃度は第１培養液が最も高く、第２培養液が最も低く、乳酸塩濃度及びピルビン酸塩濃度は第３培養液が最も低いことを特徴とするヒト胚の体外受精及び培養用キット。
【請求項２】
第１培養液は、グルコース濃度が２．２±１．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であり、第２培養液は、グルコース濃度が０．２±０．１ｍＭ、乳酸塩濃度が２０±１０ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．３±０．１５ｍＭ、かつ無血清であり、第３培養液は、グルコース濃度が２．１±１．０５ｍＭ、乳酸塩濃度が１０±５ｍＭ、ピルビン酸塩濃度が０．１５±０．０７５ｍＭ、かつ無血清であることを特徴とする請求項１に記載のヒト胚の体外受精及び培養用キット。
【請求項３】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかに上皮細胞成長因子及びインスリンが添加されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒト胚の体外受精及び培養用キット。
【請求項４】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかに完全無血清化のために血清及びアルブミン代替物質としてヒアルロナンが添加されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のヒト胚の体外受精及び培養用キット。
【請求項５】
第１〜第３培養液の少なくともいずれかにはリコンビナントヒトアルブミンが添加されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のヒト胚の体外受精及び培養用キット。
【国際調査報告】
2009122541.tif 000012
2009122541.tif 000013
2009122541.tif 000014
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