(57)【要約】  培養細胞の加齢に伴う生理状態の変化を伴うことなく、均一な環境条件で連続的に細胞を培養・観察することができ、特定の細胞のヒストリー（系譜）を追跡することも可能な細胞培養装置、細胞培養長期観察装置、細胞長期培養方法、細胞培養長期観察方法を提供すること。  細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有する細胞培養装置であって、細胞培養基板は、表面に、細胞を保持培養するための細い培養用溝と、この培養用溝内に保持培養された細胞を排出するための太い排出用溝を有するとともに、前記培養用溝の両端は、排出用溝に接続し、排出用溝は、培養用溝より太く、深いものであり、半透膜は、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用されるものであり、培養液の供給手段は、半透膜によって覆われた細胞培養基板に、培養液を連続的に供給できるものとする。
2013011962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有する細胞培養装置であって、
細胞培養基板は、表面に、細胞を保持培養するための細い培養用溝と、この培養用溝内に保持培養された細胞を排出するための太い排出用溝を有するとともに、前記培養用溝の両端は、排出用溝に接続し、排出用溝は、培養用溝より太く、深いものであり、
半透膜は、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用されるものであり、
培養液の供給手段は、半透膜によって覆われた細胞培養基板に、培養液を連続的に供給できるものであることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
前記半透膜は、ビオチン−アビジン結合を介して細胞培養基板を被覆可能とされていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記培養液の供給手段は、送液パッドを有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞培養装置と、細胞培養基板上の細胞を観察可能な顕微観察手段とを備えることを特徴とする細胞培養長期観察装置。
【請求項５】
顕微観察手段は、倒立型顕微鏡であることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養長期観察装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養装置によることを特徴とする細胞長期培養方法。
【請求項７】
所望の細胞を細胞培養基板の培養用溝内に保持する工程と、
半透膜で、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆う工程と、
供給手段によって培養液を連続的に細胞培養基板へ送り、細胞培養基板の培養用溝内に保持された細胞へ半透膜を介して培養液の供給を行うとともに、培養用溝の両端と接続する排出用溝を流れる培養液によって、培養用溝内の細胞の一部を排出用溝へ排出する工程と、
を含む請求項６に記載の細胞長期培養方法。
【請求項８】
請求項４に記載の細胞培養長期観察装置によることを特徴とする細胞培養長期観察方法。
【請求項９】
所望の細胞を細胞培養基板の培養用溝内に保持する工程と、
半透膜で、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆う工程と、
供給手段によって培養液を連続的に細胞培養基板へ送り、細胞培養基板の培養用溝内に保持された細胞へ半透膜を介して培養液の供給を行うとともに、培養用溝の両端と接続する排出用溝を流れる培養液によって、培養用溝内の細胞の一部を排出用溝へ排出する工程と、
顕微観察手段によって細胞培養基板上の細胞を観察する工程と、
を含む請求項８に記載の細胞培養長期観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置、細胞培養長期観察装置、細胞長期培養方法、および細胞培養長期観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ディッシュなどに細胞を入れ、顕微鏡下で細胞を観察する場合、時間経過とともに、細胞が栄養を消費し、老廃物が蓄積し、細胞周囲の環境が変化するため、何世代にも渡る細胞の連続的な培養・観察が困難であった。また、この場合、細胞が幾何級数的に増殖するため、特定の細胞を追跡して観察することが難しいという問題もあった。【０００３】
そこで、本発明者は、細胞を長期培養するための方法として、例えば、マイクロメーターサイズの容器に細胞を入れ、一部の細胞を光ピンセットなどの細胞ハンドリング技術を用いて計測系外に除去する方法を提案している（非特許文献１）。しかしながら、この方法は、一度に動かせる細胞の数が少なく、また実験者がひとつひとつの細胞を選別して除去する必要があるため、作業の負担が大きく、実際上、長くても１０世代程度の連続培養が限界であった。【０００４】
一方、最近では、細胞を長期培養・観察するための方法として、「Mother machine」と呼ばれる方法が注目されている（非特許文献２）。この方法では、基板上に、幅大の溝（１００μｍ幅）と、ひげ状に幅小の溝（１μｍ幅、２５μｍ長）を形成している。そして、この幅小の溝に細胞を入れ、幅大の溝から培養液を流し、細胞増殖に伴って幅小の溝から幅大の溝に押し出されてきた細胞を培養液で洗い流すことで連続的に不要な細胞を除去して、幅小の溝内の細胞を２００世代以上に渡って培養できるとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wakamoto, Y. et al. (2001) Fres' J Anal Chem; Wakamoto, Y. et al. (2005) Analyst
【非特許文献２】Current Biology, 22 June 2010, Pages1099-1103 「Robust Growth of Escheruchia coli.」Ping Wang et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、「Mother machine」では、ひげ状の幅小の溝の一方の端部が閉鎖されており、連続培養に不要な細胞が除去されても、この幅小の溝に残る細胞が必ず古い細胞（母細胞）になるように設計されている。すなわち、「Mother machine」においては、培養細胞の加齢に伴う生理状態の変化を抑制するという着想が存在せず、観察する細胞の加齢に伴う生理状態の変化が付随することが不可避となる問題がある。【０００７】
さらに、「Mother Machine」では、細胞周囲の培養環境は、幅大の溝からの拡散によって起こる幅小の溝内の培養液の交換によって行われている。この方法では幅小の溝の長さを長く形成した場合、幅小の溝内において、幅大の溝に近い領域と遠い領域では、環境条件が大きく変化するという問題がある。したがって、例えば、細胞の薬物等への応答を観察する場合には、環境条件の違いに起因して培養細胞の応答の結果にゆらぎが生じ、正確な検証が困難になることも考えられる。【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、培養細胞の加齢に伴う生理状態の変化を伴うことなく、均一な環境条件で連続的に細胞を長期培養・観察することができ、特定の細胞のヒストリー（系譜）を追跡することが、可能な細胞培養装置、細胞培養長期観察装置、細胞長期培養方法および細胞培養長期観察方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の細胞培養装置は、上記の課題を解決するため、細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有する細胞培養装置であって、細胞培養基板は、表面に、細胞を保持培養するための細い培養用溝と、この培養用溝内に保持培養された細胞を排出するための太い排出用溝を有するとともに、前記培養用溝の両端は、排出用溝に接続し、排出用溝は、培養用溝より太く、深いものであり、半透膜は、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用されるものであり、培養液の供給手段は、半透膜によって覆われた細胞培養基板に、培養液を連続的に供給できるものであることを特徴としている。【００１０】
この細胞培養装置では、半透膜は、ビオチン−アビジン結合を介して細胞培養基板を被覆可能とされていることが好ましい。【００１１】
この細胞培養装置では、前記培養液の供給手段が送液パッドを有することがより好ましい。【００１２】
本発明の細胞培養長期観察装置は、前記の細胞培養装置と、細胞培養基板上の細胞を観察可能な顕微観察手段とを備えることを特徴としている。【００１３】
この細胞培養長期観察装置では、顕微観察手段は、倒立型顕微鏡であることが好ましい。【００１４】
本発明の細胞長期培養方法は、前記細胞培養装置によって細胞を長期培養する方法である。さらに、所望の細胞を細胞培養基板の培養用溝内に保持する工程と、半透膜で、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆う工程と、供給手段によって培養液を連続的に細胞培養基板へ送り、細胞培養基板の培養用溝内に保持された細胞へ半透膜を介して培養液の供給を行うとともに、培養用溝の両端と接続する排出用溝を流れる培養液によって、培養用溝内の細胞の一部を排出用溝へ排出する工程と、を含むことを特徴としている。【００１５】
本発明の細胞培養長期観察方法は、前記細胞培養長期観察装置によって細胞を長期培養し、観察する方法である。さらに、所望の細胞を細胞培養基板の培養用溝内に保持する工程と、半透膜で、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆う工程と、供給手段によって培養液を連続的に細胞培養基板へ送り、細胞培養基板の培養用溝内に保持された細胞へ半透膜を介して培養液の供給を行うとともに、培養用溝の両端と接続する排出用溝を流れる培養液によって、培養用溝内の細胞の一部を排出用溝へ排出する工程と、顕微観察手段によって細胞培養基板上の細胞を観察する工程と、を含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、長期連続培養を可能とし、培養細胞の加齢に伴う生理状態の変化を伴うことなく、均一な環境条件、もしくは制御された環境変化条件下で連続的に細胞を培養しながら、生育状態を長期観察することができ、特定の細胞の生育を長期にわたり追跡して観察することができるので、細胞サイズ頻度分布、成長率の頻度分布、世代時間の頻度分布、タンパク質発現量の自己相関関数の測定、細胞系譜の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）は、本発明の細胞培養装置を構成する細胞培養基板の一実施形態を例示した部分拡大図である。（Ｂ）は、図１（Ａ）のＡ-Ａ’断面図であり、（Ｃ）は、図１（Ａ）のＢ-Ｂ’断面図である。
【図２】本発明の細胞培養装置を構成する細胞培養基板の別の実施形態を例示した部分拡大図である。
【図３】（Ａ）は、本発明の細胞培養装置の一実施形態を例示した全体図であり、一部を断面で示している。（Ｂ）は、半透膜の使用方法を例示した概要図である。
【図４】半透膜で覆った細胞培養基板へ培養液を供給した際の細胞の状態を例示した模式図である。（Ａ）は平面図で、（Ｂ）は断面図である。
【図５】本発明の細胞培養装置の別の実施形態を例示した全体図であり、一部を断面で示している。
【図６】本発明の細胞培養長期観察装置の一実施形態を例示した全体図であり、一部を断面で示している。
【図７】細胞培養基板上の培養用溝内に存在する細胞の様子を記録した連続画像の一部である。
【図８】画像解析により得られた、１細胞系列における５５世代分の細胞サイズの変化、および細胞内部でのGFP発現量（細胞内濃度）の変化をプロットした図である。
【図９】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、観察された全ての時点の全ての細胞の細胞内GFP平均蛍光輝度を測定し、それをもとに推定したGFP発現量の頻度分布を測定した結果を示すグラフである（実施例４）。
【図１０】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、細胞サイズの頻度分布を測定した結果を示すグラフである（実施例５）。
【図１１】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、成長率の頻度分布を測定した結果を示すグラフである（実施例６）。
【図１２】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、世代時間の頻度分布を測定した結果を示すグラフである（実施例７）。
【図１３】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、タンパク質発現量の自己相関関数を測定した結果を示すグラフである（実施例８）。
【図１４】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、細胞分裂齢の頻度分布を測定した結果を示すグラフである（実施例９）。
【図１５】GFPを発現する大腸菌のタイムラプス観察を行い、ひとつの観察用溝内で観察された細胞系譜を測定した結果を示すグラフである（実施例１０）。
【図１６】（Ａ）は、ガラス基板の表面に、溝深さが、細胞のサイズよりも小さい培養用溝を形成した場合の細胞の状態を示したガラス基板上方からの写真である。（Ｂ）は、ガラス基板の表面に、溝深さが細胞のサイズよりも２倍以上大きい培養用溝を形成した場合の細胞の状態を示したガラス基板上方からの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の細胞培養装置は、細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有している。
【００１９】
図１（Ａ）は、本発明の細胞培養装置を構成する細胞培養基板の一実施形態を例示した部分拡大図である。図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＡ-Ａ’断面図であり、図１（Ｃ）は、図１（Ａ）のＢ-Ｂ’断面図である。
【００２０】
細胞培養基板は、表面に、細い培養用溝Ｌの両端が太い排出用溝Ｍに接続した格子状の溝パターンが形成されている。培養用溝Ｌと排出用溝Ｍは、略直角に交差している。
【００２１】
培養用溝Ｌは、細胞を溝内に保持して連続的な培養を可能とする領域として機能し、排出用溝Ｍは、培養用溝Ｌ内に保持培養された細胞を適度に洗い出して排出することで、培養用溝Ｌ内の環境を調整する領域として機能する。
【００２２】
本発明において、連続的な培養とは、複数世代に渡る細胞培養をいい、本発明では、細胞周囲の環境を制御することで２００世代以上に渡る長期細胞培養を実現することができる。
【００２３】
本発明の対象となる細胞は所望の細胞であってよく、細胞の種類は限定されない。具体的には、例えば、ヒトまたは非ヒト動物の組織から単離した幹細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、肝細胞、膵島細胞、神経細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨細胞、筋細胞などや、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの細菌細胞などの細胞が含まれ、これらのうちの１種または２種以上を培養することができる。
【００２４】
培養用溝Ｌは、溝内に細胞を保持するためのものであることから、溝深さＬ１および溝幅Ｌ２が培養する細胞のサイズより大きいことが前提となる。具体的には、培養用溝Ｌの溝深さＬ１は、細胞のサイズより１倍〜２倍、好ましくは１倍〜１．５倍大きく設計することができる。また、培養用溝Ｌの溝幅Ｌ２は、細胞のサイズより１倍〜３倍、好ましくは１倍〜２倍大きく設計することができる。
【００２５】
ここで、「細胞のサイズ」とは、略球形の細胞であれば細胞の直径（最大長さ）が基準とされる。また、例えば、細長の棒状などの球形以外の細胞であれば、細胞を基板上に載せた状態での細胞の厚さ（幅）に基づいて決定することができ、この場合、培養用溝Ｌの溝深さＬ１は、細胞の厚さ（幅）より１倍〜２倍、溝幅Ｌ２は、細胞の厚さ（幅）より１倍〜３倍大きく設計することができる。
【００２６】
また、細胞のサイズは、文献などに記載の公知のサイズを参考にすることもできるし、実際に顕微鏡などで細胞のサイズを測定した結果に基づいて決定することもできる。
【００２７】
培養用溝Ｌの溝深さＬ１および溝深さＬ２が前記の範囲であると、培養用溝Ｌ内に細胞を安定に保持することができ、細胞の連続的な培養・観察が可能となる。また、培養用溝Ｌの溝深さＬ１が細胞のサイズより２倍を超えて大きい場合は、細胞が培養用溝Ｌ内に留まらずに排出用溝Ｍへ流出するおそれがあり、培養用溝Ｌ内に細胞を保持して連続的に培養することが難しい。また、培養用溝Ｌの溝幅Ｌ２が細胞のサイズより３倍を超えて大きい場合には、半透膜が培養用溝内にも接着し、細胞を押しつぶす、または細胞が排出用溝に流れ出ていかないおそれがあり、連続的に培養することが難しい。
【００２８】
また、培養用溝Ｌの長さは、細胞のサイズや培養用溝Ｌ内に保持培養すべき細胞の数などに応じて適宜設計することができる。具体的には、例えば、１０μｍ〜１００μｍ程度の範囲、好ましくは３０μｍ〜１００μｍ程度の範囲を例示することができる。
【００２９】
一方、排出用溝Ｍは、培養用溝Ｌより太く、深く形成されている。すなわち、排出用溝Ｍの溝深さＭ１および溝幅Ｍ２は、培養用溝Ｌの溝深さＬ１および溝幅Ｌ２よりも大きく形成されている。ここで、「排出用溝Ｍの溝深さＭ１」とは、図１に示したように、培養用溝Ｌの溝底の高さ位置から排出用溝Ｍの溝底までの距離をいう。
【００３０】
排出用溝Ｍの溝深さＭ１および溝幅Ｍ２は、培養用溝Ｌに保持培養する細胞のサイズや数、細胞培養基板上を流れる細胞培養液の速度に応じて、培養用溝Ｌ内の細胞を洗い出すことが可能な範囲で適宜設計することができる。一応の目安としては、排出用溝Ｍの溝深さＭ１は、細胞のサイズの３倍〜５０倍の大きさが好ましい。また、培養用溝Ｌとの関係では、培養用溝Ｌの溝深さＬ１の１.５倍〜５０倍の深さを例示することができる。具体的には、排出用溝Ｍの溝深さＭ１は、５μｍ〜５０μｍ程度の範囲を好ましく例示することができる。
【００３１】
また、排出用溝Ｍの溝幅Ｍ２は、溝深さＭ１と同程度またはそれ以上の大きさを有していることが好ましい。培養用溝Ｌとの関係では、培養用溝Ｌの溝幅Ｌ２の１０倍〜１００倍の長さを例示することができ、具体的には、１０μｍ以上、好ましくは３０μｍ以上の範囲を例示することができる。
【００３２】
このように、培養用溝Ｌおよび排出用溝Ｍの溝深さ（Ｌ１、Ｍ１）および溝幅（Ｌ２、Ｍ２）は、培養する所望の細胞のサイズに応じて適宜設計することができる。具体例を示すと、例えば、大腸菌は、サイズがおよそ０．５μｍ〜１．０μｍ（幅）×１．５μｍ〜７．０μｍ（長さ）であることが知られている。本発明の細胞培養装置によって大腸菌を連続培養する場合には、例えば、細胞培養基板の培養用溝Ｌは、溝深さＬ１：１．０μｍ〜１．５μｍ、溝幅Ｌ２：１．０μｍ〜３．０μｍ、排出用溝Ｍは、溝深さＭ１：５μｍ〜２０μｍ、溝幅Ｍ２：２０μｍ〜１００μｍの範囲を好ましく例示することができる。
【００３３】
細胞培養基板の材料は、例えば、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラスや、ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、あるいはシリコン基板などを例示することができる。なかでも、ガラス基板は、加工性、取り扱い性に優れているため好ましい。
【００３４】
細胞培養基板をガラスで製作する場合には、ガラス板の一方の面に対して、例えば、フォトリソグラフィー法により、培養用溝Ｌと排出用溝Ｍの形状をフォトレジストにパターニングし、公知の方法でエッチングすることにより培養用溝Ｌと排出用溝Ｍを形成して細胞培養基板を作成することができる。また、適宜、ガラス板にレーザ加工等を施すこともできる。また、パターニングとしては、フォトリソグラフィー法の他に、電子ビーム直接描画法等を用いることもできる。細胞培養基板は、その表面を表面処理剤によって処理しても良いし、物理的な表面加工処理をしても良い。例えば、細胞培養基板表面或いは表面の一部を、親水性、親油性、撥水性等機能を付与する処理が出来る。例えば、シリコンコート、官能基コート、例えばアミノ基、イソシアネート基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基、ＳＨ基、シラノール基、等官能基を表面付与することができる。また、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等のいずれかで表面を修飾したものが好ましい。或いは、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン等の細胞接着基質で細胞培養基板の表面をコートすることもできる。
【００３５】
培養用溝Ｌと排出用溝Ｍとの溝パターンは、図１で例示した形状に限定されるものではない。細胞培養基板は、培養用溝Ｌと排出用溝Ｍとは、略直角な角度で接続していればよく、例えば、図２に例示したような、２本の排出用溝Ｍの間に１本の培養用溝Ｌが形成されている溝パターンを有する形態であってもよい。また、培養用溝Ｌ内の細胞を適当に洗い流すことができれば、培養用溝Ｌに対して排出用溝Ｍが厳密に直角に接続していなくてもよく、具体的には、培養用溝Ｌに対する排出用溝Ｍの角度は、９０°±１５°の範囲程度は許容し得る。さらに、培養用溝Ｌおよび排出用溝Ｍは直線状であることが好ましいが、部分的に屈曲した領域を有していてもよい。また、図１では、培養用溝Ｌと排出用溝Ｍの断面形状が方形に形成されているが、この形状に限定されるものではなく、例えば、溝の底部が湾曲した形状であってもよい。
【００３６】
本発明の細胞培養装置の有する半透膜とは、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用される。半透膜としては、例えば、セルロース膜などの公知のものを採用することができる。半透膜は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンのうちのいずれかで修飾されていることが好ましく、この場合、細胞培養基板も、基板の表面が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンのうちのいずれかで修飾されていることが好ましい。細胞培養基板がビオチンで修飾されている場合には、アビジンまたはストレプトアビジンで修飾された半透膜を利用し、細胞培養基板がアビジン、ストレプトアビジンで修飾されている場合には、ビオチンで修飾された半透膜を利用することで、ビオチン−アビジン結合によって、細胞培養基板の培養用溝Ｌおよび排出用溝Ｍを上方からシールすることができる。この半透膜により新鮮な培養液が上面から常に細胞に供給することが出来る。
【００３７】
半透膜で細胞培養基板の上面を覆う場合、例えば、以下の方法を例示することができる。まず、細胞培養基板の上面に、シリコン、あるいは酸化シリコン、あるいはクロム、あるいはアルミニウム、あるいは鉄、あるいはチタン等の、シラノール基とシランカップリングする素材の薄膜を蒸着あるいはスパッタリングする。そして、この薄膜の表面に、例えば、片端にシラノール基を持ち、他端にアミノ基あるいはカルボキシル基あるいはＳＨ基を持つ二価性試薬等によってアミノ基あるいはカルボキシル基あるいはＳＨ基を導入し、ビオチンを共有結合させる。そして、セルロース等膜などの半透膜をアビジンまたはストレプトアビジンで修飾し、この半透膜と薄膜を接触させ、ビオチン−アビジン結合させることで細胞培養基板の上面をシールすることができる。なお、細胞培養基板の薄膜の表面にアビジンまたはストレプトアビジンを、半透膜にビオチンを結合させることもできる。なお、半透膜は、細胞培養基板の排出用溝および培養用溝を上方から、良好な密着性をもって被覆可能であればよく、必ずしもビオチン−アビジン結合を利用する形態に限定されない。
【００３８】
次に、本発明の細胞培養装置の一実施形態について説明する。図３（Ａ）は、本発明の細胞培養装置の一実施形態を例示した全体図であり、一部を断面で示している。図３（Ｂ）は、半透膜の使用方法を例示した概要図である。さらに、図４は、半透膜で覆った細胞培養基板へ培養液を供給した際の細胞の状態を例示した模式図で（Ａ）が平面図、（Ｂ）が断面図である。
【００３９】
細胞培養装置１は、細胞培養基板２と、半透膜３と、培養液の供給手段４とを有している。
【００４０】
上述したように、細胞培養基板２には、培養用溝Ｌおよび排出用溝Ｍが形成され、この上面が半透膜３で覆われている。図３（Ｂ）に例示したように、半透膜３は、少なくとも培養用溝Ｌの上方域で覆われていればよい。排出用溝Ｍの両端部側は、半透膜３で覆わずに開放された状態とすることで、排出用溝Ｍの一端から培養液を供給し、他端から培養液を排出することができる。そして、半透膜３で覆われた培養用溝Ｌ内には細胞が保持されている。
【００４１】
培養用溝Ｌおよび排出用溝Ｍの周囲には、細胞培養基板２の表面にフレームシールＳが配設されている。フレームシールは、適度な厚さがあり、表裏面に接着性を有するものであるものを好ましく例示することができるが、特に限定されるものではない。
【００４２】
培養液の供給手段４は、送液ポンプ４１（シリンジ）と、送液パッド４２と、廃液タンク４３とを有している。
【００４３】
送液ポンプ４１は送液パッド４２の一端の貫通孔と送液管で接続しており、細胞のための培養液を送り出し、細胞培養基板２へ培養液を供給することができる。
【００４４】
送液パッド４２は、細胞培養基板２の上に配置されて、培養用溝Ｌ、排出用溝Ｍ、および半透膜３を覆い、かつ培養用溝Ｌ、排出用溝Ｍ、および半透膜３を含む範囲の周囲でフレームシールＳを介して密着し封止されるように配置される。また、送液パッド４２は、その一方の端部に培養液の流入する貫通孔と、他方の端部に廃培養液を外部に排出する貫通孔とを少なくとも１ヶ所ずつパッド面を貫通するように設けられている。これらの各貫通孔は、送液パッド４２と細胞培養基板２との間に形成され培養液が満たされる空間において、培養液流入用貫通孔から排出用貫通孔に培養液が流れるようにそれぞれ配置されれば良い。
【００４５】
すなわち送液パッド４２は、細胞培養基板２上に新鮮な培養液を常に保持する機能を有する。
【００４６】
送液パッド４２は、ガラス、アクリル等の硬質材料や、ゴム、エラストマー等の柔軟材料を特に制限なく用いて得ることができる。また送液パッド４２の透明性については、細胞培養装置１の上面からの透過光を顕微鏡観察に必要とする場合は透明な材料が適しているが、蛍光観察など、透過光を必要としない場合には、必ずしも透明である必要はない。
【００４７】
この実施形態では、図３（Ａ）に示すように、送液パッド４２は、フレームシールＳを介して細胞培養基板２の上方に接着されている。細胞培養基板２と送液パッド４２との間には空間が形成されており、培養時には、送液ポンプから供給された培養液でこの空間が満たされる。そして、細胞培養基板２上を通過した培養液は、送液パッド４２の前記の貫通孔でこの送液パッド４２と接続する廃液タンク４３へと送り出される。送液パッド４２は、例えば、PDMS（ポリジメチルシロキサン）によって形成された透明なものを好ましく例示することができる。PDMSによる送液パッド４２は、例えば、シリコンウェハ上にフォトレジストを塗布して、リソグラフィー法により溝を反転した凸型の鋳型を製作し、その鋳型にPDMS樹脂を流し込んで加熱して成型することにより箱蓋形に作成することができる。また、送液パッド４２には、例えば、培養液中の泡を除去する泡トラップ溝などを箱蓋内面底に設けることもできる。
【００４８】
そして、図３（Ａ）においては、培養液の供給手段４は、送液ポンプ４１から細胞培養基板２へと供給される培養液の供給方向が、細胞培養基板２の排出用溝Ｍの長さ方向と一致するように配置されている。
【００４９】
さらに図６のように、本発明の細胞培養装置１は、細胞培養基板２上の細胞を観察可能な顕微観察手段５と共に、細胞培養長期観察装置を構成することができる。顕微観察手段５としては、例えば、観察対象の細胞の像を拡大するレンズ等の光学系を備えた装置を挙げることができ、具体的には、倒立型顕微鏡、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、ビデオ録画装置、カメラなどを例示することができる。また、これらの顕微観察手段をパソコンなどと接続して画像処理を行うこともできる。また、細胞の観察を容易にするための光照射装置とともに用いてもよい。
【００５０】
次に、本発明の細胞培養装置を利用した細胞長期培養方法、細胞培養長期観察方法の一実施形態について説明する。
【００５１】
図３，図５の供給手段４の送液ポンプ４１を駆動させ、細胞培養基板２上に培養液を送る。送液ポンプ４１から細胞培養基板２への培養液の送液方向が、細胞培養基板２の排出用溝Ｍの方向と一致しているため、送液ポンプ４１から供給された培養液は、排出用溝Ｍの一端からスムーズに流入し、送液パッド４２と細胞培養基板２との間の内部空間を満たしながら細胞培養基板２上を通過する。例えば、培養液の送液は、送液速度０．５ｍｌ/ｈｒ〜２００ｍｌ/ｈｒ程度の範囲で行うことができる。
【００５２】
このとき、細胞培養基板２の上面が半透膜３で覆われていることによって、細胞培養基板２に培養液を流した際に、培養用溝Ｌ内で保持培養された細胞が流出するのを抑制すると共に培養液を供給することができる。細胞培養基板２は、細い培養用溝Ｌの両側に太い排出用溝Ｍが接続しているため、例えば、対向する２本の排出用溝Ｍを流れる培養液の流速がわずかに異なる場合などがある。このため、半透膜３を使用しない場合には、培養用溝Ｌ内に培養液が速い流速で流れ込んで培養用溝Ｌ内から排出用溝Ｍへ細胞が流れ出てしまう恐れがある。細胞培養基板２の培養用溝Ｌを半透膜３で覆うことによって、排出用溝Ｍから培養用溝Ｌへの培養液の流入を抑制し、培養用溝Ｌ内の細胞を安定に保持することができる。
【００５３】
さらに、培養用溝Ｌ内に保持された細胞に対しては、半透膜３の上側を流れる培養液が半透膜３を介して透過、拡散することによって供給される。このため、例えば、培養用溝Ｌを３０μｍ以上に長く形成した場合にも、培養用溝Ｌ内は、安定かつ均一な環境条件が維持される。また、培養環境が均一であることで、細胞の薬物などへの応答をより正確に検証することが可能となる。
【００５４】
図４は、半透膜で覆った細胞培養基板へ培養液を供給した際の細胞の状態を例示した模式図である。なお、図４においては、培養用溝Ｌと排出用溝Ｍの接続部の境界線の図示は省略している。図４（Ａ）は平面図で、図４（Ｂ）は断面図である。
【００５５】
半透膜３を介した培養液の供給によって、培養用溝Ｌ内の細胞は安定に培養され、幾何級数的に増殖する。そして、細胞が培養用溝Ｌ内を満たす状態となると、培養用溝Ｌの両側で略直角な角度で接続する排出用溝Ｍを流れる培養液によって、培養用溝Ｌの両端（排出用溝Ｍと培養用溝Ｌの接続部）付近に位置する細胞の一部は、排出用溝Ｍ内へ洗い出され、培養液とともに排出されて廃液タンク４３へ回収される。このため、培養用溝Ｌ内の細胞の数を所定の数に維持することができ、従来、時間経過とともに生じていた細胞の栄養消費、老廃物の蓄積、細胞周囲の環境の変化などの問題を解消することができ、顕微観察手段５を用いた細胞培養長期観察装置により、２００世代以上にも渡る細胞の連続的な培養・観察を行うことができる。これによって、一細胞系列による成長速度や遺伝子発現量のゆらぎの大きさ、自己相関関数といった情報を、これまでにない長期間の時系列データをもとに計測することが可能となる。そして、１００世代以上にも渡る時間は、遺伝子型の変化を伴う進化状態が起こる時間スケールに相当することから、本発明の細胞培養装置、細胞培養長期観察装置は、これまで実験的な実証、検証が難しかった進化研究への応用が可能となる。
【００５６】
そして、本発明の細胞培養装置を構成する細胞培養基板は、培養用溝Ｌの両端で排出用溝Ｍが接続しているため、培養用溝Ｌ内の細胞には流動性があり、従来の「Mother machine」のように、母細胞が培養用溝Ｌに残ることが避けられる。したがって、培養用溝Ｌ内の細胞に加齢に伴う生理状態の変化を伴うことが抑制される。
【００５７】
また、培養用溝Ｌ内に残っている細胞は、培養用溝Ｌ内に存在した細胞（母細胞）から分裂したものであることから、顕微観察手段５やコンピュータによる画像解析などを行うことで、特定の細胞のヒストリー（系譜）を追跡して細胞培養長期観察装置による観察、解析をすることができる。
【００５８】
さらに、本発明の細胞培養装置、細胞培養長期観察装置は、遺伝子変異の検出にも用いることができる。具体的には、フレームシフト変異、点変異などの遺伝子変異が、ある特定の部位に生じたときに、その部位に配置された蛍光タンパク質が、正しい配列で発現するように設計された細胞株を用いることで、培養用溝内に存在する細胞において、当該変異が生じた場合、蛍光タンパク質の発現により細胞が蛍光を発し始めるという形で、細胞を殺さずに変異が生じたことを検出できる。この細胞を、細胞培養装置内で長期間連続観察することにより、当該遺伝子変異の発生頻度、分裂周期の中での発生タイミング等の情報を取得することができる。
【００５９】
図５は、本発明の細胞培養装置の別の実施形態を例示した全体図であり、一部を断面で示している。図３、図４で示した形態と共通する部分についての説明は省略する。
【００６０】
図５に例示した細胞培養装置１では、複数の送液ポンプ４１が送液パッド４２に接続され、半透膜３で覆われた細胞培養基板２に、それぞれの送液ポンプから培養液の供給が可能とされている。この実施形態では、例えば、それぞれの送液ポンプ４１に異なる成分の培養液を入れ、連続培養における適宜なタイミングで、使用する送液ポンプを切り替えることで、細胞培養基板２の培養用溝Ｌに保持された細胞に様々な環境条件の変化を与えることができ、環境条件の変化が与える細胞への影響を長期に渡って検証することができる。
【００６１】
図６は、本発明の細胞培養長期観察装置の一実施形態を例示した全体図であり、一部を断面で示している。図３、図５で示した実施形態と共通する部分についての説明は省略する。
【００６２】
図６に例示した細胞培養長期観察装置１ａは、細胞培養装置１と、顕微観察手段５とを備えている。
【００６３】
この実施形態では、上述したような細胞の成長速度や蛍光タンパク質の発現などの経時観察に適した顕微観察手段５として、蛍光顕微鏡の機能を備えた倒立型電動顕微鏡を用いている。
【００６４】
倒立型電動顕微鏡（顕微観察手段５）は、明視野観察光源５１ａ、蛍光観察用光源５１ｂ、自動シャッター５２ａ、自動シャッター５２ｂ、コンデンサーレンズ５３、ダイクロイックミラー５４、対物レンズ５５、およびＸＹステージ５６を備えている。ＸＹステージ５６は開口部Ａを有し、細胞培養装置１の細胞培養基板２は、細胞が保持される培養用溝Ｌが開口部Ａに位置するようにＸＹステージ５６上に載置される。
【００６５】
培養用溝Ｌに保持された細胞は、電動モータで駆動されるＸＹステージ５６によって、自動で観察したい位置に移動できるようになっている。ＸＹステージ５６の開口部Ａの下方には対物レンズ５５が隣接して配置されている。ＸＹステージ５６の光軸を横切るＸ、Ｙ軸方向に個別に移動させ、また対物レンズ５５をＺ軸方向に上下方向に移動させることによって、ＸＹステージ５６と対物レンズ５５との相対的な位置の調整が可能である。また、ＸＹステージ５６を、Ｘ、Ｙ軸方向に加えて、Ｚ軸方向に独立して移動させて、これにより対物レンズ５５との相対的な距離を調整することもできる。
【００６６】
倒立型電動顕微鏡は、不図示の本体ケースの内部に、明視野透過照明系、落射照明系、撮像系を備えている。明視野透過照明系は、ＸＹステージ５６の高さ位置よりも上に配置され、落射照明系および撮像系は、ＸＹステージ５６の高さ位置よりも下に配置されている。
【００６７】
明視野透過照明系は、透過光による観察を行うために用いられる。明視野透過照明系は、明視野観察光源５１ａ、自動シャッター５２ａ、コンデンサーレンズ５３を含む。明視野観察光源５１ａには、ハロゲンランプなどを用いることができる。この明視野観察光源５１ａから出射された光は、自動シャッター５２ａが開いた状態で、コンデンサーレンズ５３を通過し、垂直方向下方に向かってＸＹステージ５６上に載置された細胞培養基板２の培養用溝Ｌに保持された細胞を照射する。
【００６８】
落射照明系は、蛍光による観察を行うために用いられる。落射照明系は、蛍光観察用光源５１ｂ、自動シャッター５２ｂ、ダイクロイックミラー５４を含む。蛍光観察用光源５１ｂには、水銀ランプなどを用いることができる。落射照明系は、その他に、熱吸収フィルタ、コレクターレンズや、蛍光観察用光源５１ｂからの光を特定の短い波長帯域の励起光にするための励起フィルタなどの光学系を備えることができる。この蛍光観察用光源５１ｂから出射された光は、自動シャッター５２ｂが開いた状態で、ダイクロイックミラー５４および対物レンズ５５を通過し、垂直方向上方に向かって、ＸＹステージ５６上に載置された細胞培養基板２の培養用溝Ｌに保持された細胞を開口部Ａから照射する。
【００６９】
撮像系は、ダイクロイックミラー５４に臨んで取り付けられたカメラ５７を含む。カメラ５７は、例えば、ＣＣＤカメラを用いることができる。
【００７０】
さらに倒立型電動顕微鏡は、電源ユニット、モータ駆動回路基板などが搭載されている。電源ユニットは、明視野観察光源５１ａの電源、倒立型電動顕微鏡に組み込まれたモータなどのシステムを制御するための電源、蛍光観察用光源５１ｂの電源などを含む。モータ駆動回路基板は、例えば、ＸＹステージ５６をＸ、Ｙ軸方向に駆動するためのモータ、撮像系の電動ズーム機構を駆動するためのモータ、水銀ランプなどの蛍光観察用光源５１ｂの絞りを駆動するためのモータなどを制御する。
【００７１】
倒立型電動顕微鏡は、パーソナルコンピュータなどのコンピュータ５８によって、キーボードやマウスを用いてユーザが各種の操作や設定を行うことができる。
【００７２】
透過照明系と落射照明系とは選択的に用いられる。透過照明系が選択されたときには、明視野観察光源５１ａからの透過照明光によって得られた培養用溝Ｌに保持された細胞の像は、開口部Ａから対物レンズ５５を通過しダイクロイックミラー５４で反射され、水平方向に向けて配置されたカメラ５７に取り込まれる。
【００７３】
一方、落射照明系が選択されたときには、蛍光観察用光源５１ｂからの励起光の照射によって得られた培養用溝Ｌに保持された細胞の蛍光による像は、開口部Ａから対物レンズ５５を通過しダイクロイックミラー５４で反射され、水平方向に向けて配置されたカメラ５７に取り込まれる。
【００７４】
さらに、図示はしないが、倒立型電動顕微鏡は、細胞を眼で観察するための接眼レンズと、接眼レンズと対物レンズ５５とを光学的に結合する光学系を備えている。この光学系は、ミラー、リレーレンズ、光路切り換えプリズムを含む。例えば、カメラ５７で観察する場合は、光路切り換えプリズムが観察光軸上に挿入され、対物レンズ一次像は光路切り換えプリズムで反射され、カメラ５７で観察できるようになっている。一方、眼で観察する場合は、光路切り換えプリズムが観察光軸から外され、対物レンズ一次像はミラーにより接眼レンズへ向けて反射される。さらに対物レンズ一次像はリレーレンズによりリレーされ、接眼レンズにより眼で観察できるようになっている。
【００７５】
以上のような構成の細胞培養装置１を用いて、次のような細胞観察を行うことができる。
【００７６】
図３、図５の実施形態と同様に、培養液の供給手段４によって、フレームシールＳを介して細胞培養基板２の上方に接着された送液パッド４２と、細胞培養基板２との間に培養液を供給する。なお、この実施形態では、送液パッド４２には、上述した、培養液中の泡を除去する溝である泡トラップ用溝４４を設けている。
【００７７】
この実施形態では、顕微観察手段５として倒立型電動顕微鏡を使用することで、顕微観察手段５の観察位置が細胞培養装置１の下に位置していることが重要である。
【００７８】
これによって、送液パッド４２と細胞培養基板２との間に供給された培養液中の泡は、細胞培養基板２の上方の泡トラップ用溝４４により上方に除去され、これとは反対側の細胞培養基板２の下方から、ＸＹステージ５６の開口部Ａを通じて対物レンズ５５より、培養用溝Ｌ内に保持された細胞の拡大像を得ることができる。
【００７９】
そのため、細胞培養装置１内に生じた泡が顕微観察手段５による観察を邪魔することが防止され、長期連続細胞観察、例えば、２００世代の長期連続細胞観察も可能となる。
【００８０】
半透膜３を介した培養液の供給によって、培養用溝Ｌ内の細胞は安定に培養され、幾何級数的に増殖する。そして、細胞が培養用溝Ｌ内を満たす状態となると、培養用溝Ｌの両側で略直角な角度で接続する排出用溝Ｍを流れる培養液によって、培養用溝Ｌの両端付近に位置する細胞の一部は、排出用溝Ｍ内へ洗い出され、培養液とともに排出される。
【００８１】
このようにして培養用溝Ｌ内で培養された細胞は、透過照明系と落射照明系のいずれかを照射し、対物レンズ５５を用いて拡大した像として、カメラ５７または接眼レンズによって観察することができる。
【００８２】
透過照明系による観察では、具体的には、上述したような細胞のサイズ、特に一つの細胞系列における細胞サイズの変化や成長速度などを観察することができる。
【００８３】
落射照明系による蛍光観察では、具体的には、上述したような細胞内部での蛍光タンパク質の発現量とその変化や、染色した細胞の蛍光画像とその変化などを観察することができる。
【００８４】
すなわち、培養用溝Ｌ内に残っている細胞は、培養用溝Ｌ内に存在した細胞（母細胞）から分裂したものであることから、顕微観察手段５やコンピュータ５８による解析などを行うことで、特定の細胞のヒストリーを追跡して観察、解析をすることができる。
【００８５】
例えば、蛍光タンパク質の蛍光画像などを経時でカメラ５７により取得し、これをコンピュータ５８に記録することで、タイムラプス計測を行うことができる。このタイムラプス画像を専用の画像解析ソフトを用いてコンピュータ５８で解析することにより、取得画像に含まれる細胞のサイズ、内部の蛍光輝度の平均などについての時系列情報を取得することができる。これによって、一細胞系列による成長速度や遺伝子発現量のゆらぎの大きさ、自己相関関数といった情報を、これまでにない長期間の時系列データをもとに計測することが可能となる。
【００８６】
本発明は以上の実施形態に限定されることはない。その細部について様々な形態が可能であることは言うまでもない。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜実施例１＞細胞培養基板の作成
大腸菌を連続的に培養するための細胞培養基板として、ガラス基板（６０ｍｍ（長さ）×２４ｍｍ（幅）×０．１７ｍｍ（厚さ））に、培養用溝Ｌ（溝深さＬ１：１.０μｍ、溝幅Ｌ２：３.０μｍ、長さ３０μｍ、５０本）、排出用溝Ｍ（Ｍ１：溝深さ１７μｍ、Ｍ２：溝幅６０μｍ、長さ５０００μｍ、２０本）を格子状に設けた（図１参照）。
＜実施例２＞半透膜による被覆
実施例１で作成した細胞培養基板の表面をビオチンで修飾した。一方、半透膜として幅１ｍｍ×長さ１ｍｍのセルロース製半透膜を使用し、表面をストレプトアビジンで修飾した。そして、細胞培養基板の表面の培養用溝Ｌ、排出用溝Ｍの上方から大腸菌を含む培養液を１μｌ滴下した後、細胞培養基板の培養用溝Ｌおよび排出用溝Ｍの上方の中央部分の一部の領域を半透膜でシールした。
＜実施例３＞細胞の培養・観察
本発明の細胞培養装置によって、細胞を連続的に培養・観察した。具体的には、両面テープである四角枠形状をしたフレームシール（バイオラッド社製：SLF-0201）を培養用溝および排出用溝を取り囲む形で細胞培養基板上にシールし、さらにフレームシール上面にPDMS製の送液パッドを貼付けた。PDMS製の送液パッドに取付けてある２本のシリコン製チューブのうち１本をシリンジ（送液ポンプ）に連結し、もう１本を廃液タンク内に導入した（図３参照）。シリンジにより、２ｍｌ/ｈの流速で、０．２％重量比のグルコースを栄養源として含む、大腸菌培養用M9最小培地を連続的に流し続けた。この細胞培養装置を、倒立型電動顕微鏡のステージ上に配置することによって図６に示すような細胞培養長期観察装置を構成し、培養用溝内の細胞を倍率１００倍位相差対物レンズを用いて、２分間隔でタイムラプス観察した。【００８８】
観察に用いた大腸菌は、具体的にはW3110株であり、rpsL遺伝子のプロモーターに制御される形で蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドを有するものである。【００８９】
タイムラプス計測では、細胞のGFPの蛍光画像を取得し、これをPC上に記録した。画像解析ソフトImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）を用いて、このタイムラプス画像を解析することにより、取得画像に含まれる細胞のサイズ、内部の蛍光輝度の平均（GFPの細胞内濃度に相当）についての時系列情報を取得した。【００９０】
図７は、細胞培養基板上の培養用溝内に存在する細胞の様子を記録した連続画像の一部である。【００９１】
図７に示したように、細胞培養基板に培養液を供給して連続培養すると、培養用溝内に存在する細胞のうち、培養用溝の両端に存在する細胞の一部が適度に排出用溝へ洗い流され、画面から消えている様子が確認される。また、細胞培養基板の溝形状および半透膜によって、培養用溝Ｌ内に細胞が安定に保持され培養されていることも確認される。さらに、半透膜を介した細胞への培養液の供給によって、培養用溝Ｌ内は、安定かつ均一な環境下が維持されている。【００９２】
培養用溝の両端に存在する細胞が適度に排出用溝へ洗い流されることで、培養用溝Ｌ内の細胞の数を所定の数に維持することができ、従来、時間経過とともに生じていた細胞の栄養消費、老廃物の蓄積、細胞周囲の環境の変化などの問題を解消することができ、細胞の連続的な培養・観察を行うことができることが確認された。また、母細胞が培養用溝Ｌに残ることが避けられ、加齢に伴う生理状態の変化を伴わずに、培養用溝Ｌ内の細胞を長期培養することができることも確認された。【００９３】
図８は、画像解析により得られた、一つの細胞系列における５５世代分の細胞サイズの変化、および細胞内部でのGFP発現量（細胞内濃度）の変化をプロットした図である。【００９４】
図８に示したように、本発明の細胞培養装置によって、長期に渡る細胞の連続的な培養が可能であることが確認された。これによって、一細胞系列による成長速度（細胞サイズの変化）や遺伝子発現量のゆらぎの大きさなどの情報を、これまでにない長期間の時系列データをもとに計測することが可能となることが確認された。
＜実施例４＞タンパク質発現量の頻度分布
実施例３と同様の細胞培養基板、ＰＤＭＳ製の送液パッド、シリンジ（送液ポンプ）、および廃液タンクを有する細胞培養装置を倒立型電動顕微鏡のステージ上に配置し、培養用溝内の蛍光タンパク質GFPを発現する大腸菌をタイムラプス観察した。シリンジにより、２ｍｌ/ｈの流速で、０．２％重量比のグルコースを栄養源として含む、大腸菌培養用M9最小培地を連続的に流し続けた。観察時の培養温度は３７℃に維持し、培養用溝内の細胞を１分間隔で５０００分にわたってタイムラプス観察した。【００９５】
観察された全ての時点の全ての細胞の細胞内GFP平均蛍光輝度を測定し、それをもとに推定したGFP発現量の頻度分布を測定した。その結果を図９に示す。
＜実施例５＞細胞サイズの頻度分布
実施例４のタイムラプス観察において、細胞サイズの頻度分布を測定した。その結果を図１０に示す。
＜実施例６＞成長率の頻度分布
実施例４のタイムラプス観察において、成長率の頻度分布を測定した。１細胞の成長率は分裂から分裂までの細胞サイズの変化を指数関数C×２ktでフィッティングし、その指数kを各細胞の成長率とした。ただし、Cは定数、tは時間を表す。その結果を図１１に示す。
＜実施例７＞世代時間分布
実施例４のタイムラプス観察において、世代時間の頻度分布を測定した。世代時間とは、各細胞が分裂から次の分裂にまで要する時間である。その結果を図１２に示す。
＜実施例８＞タンパク質発現量の自己相関関数
実施例４のタイムラプス観察において、タンパク質発現量の自己相関関数を測定した。ある時点tでのタンパク質発現量をx(t)とすると、時間t離れた時点との自己相関A(t)は次式を計算することで求めた。【００９６】
【化１】
2013011962.tif 000003
【００９７】
ただし、E[ ]、V[ ]はそれぞれ期待値と分散を表す。その結果を図１３に示す。この図はA(τ)をτに対してプロットしたものである。
＜実施例９＞細胞分裂齢の分布
実施例４のタイムラプス観察において、細胞分裂齢の頻度分布を測定した。細胞分裂齢とは、直前の分裂から現在までの時間を表す。その結果を図１４に示す。
＜実施例１０＞ひとつの観察用溝内で観察される細胞系譜
実施例４のタイムラプス観察において、ひとつの観察用溝内で観察された細胞系譜を測定した。その結果を図１５に示す。系列の枝分かれは細胞分裂を表し、系列の途切れているところは細胞が洗い流されたことを示している。
＜実施例１１＞
実施例３と同様の細胞培養基板、ＰＤＭＳ製の送液パッド、シリンジ（送液ポンプ）、および廃液タンクを有する細胞培養装置を倒立型電動顕微鏡のステージ上に配置し、培養用溝内の細胞をタイムラプス観察した。実施例３の大腸菌をマウスES細胞に代えて、シリンジポンプにより２ｍｌ/ｈの流速で、大腸菌培養用M9最小培地に代えて未分化維持用無血清培地ESF7を連続的に流し続けた。前記ガラス基板表面は、マウスES細胞のへの接着を促進するため、コラーゲンもしくは、Eカドヘリン-Fcをコートした。培養用溝内のマウスES細胞は、倒立型電動顕微鏡で倍率２０倍位相差対物レンズを用い、タイムラプス観察を１５分間隔で行った。【００９８】
その結果、細胞培養基板に培養液を供給して連続培養すると、培養用溝内に存在するマウスES細胞のうち、培養用溝の両端に存在するマウスES細胞の一部が適度に排出用溝へ洗い流されていく様子が確認された。【００９９】
また、細胞培養基板の溝形状および半透膜によって、培養用溝Ｌ内にマウスES細胞が安定に保持され培養されていることも確認された。【０１００】
半透膜を介したマウスES細胞への培養液の供給によって、培養用溝Ｌ内は、安定かつ均一な環境下が維持され、培養用溝の両端に存在するマウスES細胞が適度に排出用溝へ洗い流されることで、培養用溝Ｌ内のマウスES細胞の数を所定の数に維持することができ、細胞の連続的な培養・観察を行うことができることが確認された。また、母細胞が培養用溝Ｌに残ることが避けられ、加齢に伴う生理状態の変化を伴わずに、培養用溝Ｌ内のマウスES細胞を長期培養することができることも確認された。
＜比較例１＞
ガラス基板の表面に、溝深さＬ１が細胞のサイズよりも小さい培養用溝Ｌを形成し、大腸菌の培養が可能であるか検討した。具体的には、培養用溝Ｌ（Ｌ１：溝深さ０.５μｍ、Ｌ２：溝幅２.０μｍ、長さ３０μｍ、５０本）、排出用溝Ｍ（Ｍ１：溝深さ１７μｍ、Ｍ２：溝幅６０μｍ、長さ５０００μｍ、２０本）を格子状に設けた。【０１０１】
そして、実施例２と同様に細胞培養用基板を半透膜で覆い、実施例３と同様の装置構成で細胞培養基板に培養液を供給し、細胞を観察した。【０１０２】
結果は、図１６（Ａ）に示したように、培養用溝Ｌ内の細胞Ｃは、半透膜により押しつぶされて変形し、正常状態での観察はできなかった。
＜比較例２＞
ガラス基板の表面に、溝深さＬ１が細胞サイズ（厚さ）の２倍を超えて大きい培養用溝Ｌを形成し、大腸菌の培養が可能であるか検討した。具体的には、培養用溝Ｌ（Ｌ１：溝深さ２．０μｍ、Ｌ２：溝幅２.０μｍ、長さ３０μｍ、５０本）、排出用溝Ｍ（Ｍ１：溝深さ１７μｍ、Ｍ２：溝幅６０μｍ、長さ５０００μｍ、２０本）を格子状に設けた。【０１０３】
そして、実施例２と同様に細胞培養用基板を半透膜で覆い、実施例３と同様の装置構成で細胞培養基板に培養液を供給し、細胞を観察した。【０１０４】
結果は、図１６（Ｂ）に示したように、培養用溝Ｌ内の細胞Ｃは安定に保持されず、培養用溝Ｌから排出用溝Ｍへ流出してしまい、連続培養が困難であることが確認された。
【符号の説明】
【０１０５】
１  細胞培養装置
１ａ  細胞培養長期観察装置
２  細胞培養基板
３  半透膜
４  供給手段
５  顕微観察手段
４１  送液ポンプ
４２  送液パッド
４３  廃液タンク
４４  泡トラップ用溝
５１ａ  明視野観察光源
５１ｂ  蛍光観察用光源
５２ａ  自動シャッター
５２ｂ  自動シャッター
５３  コンデンサーレンズ
５４  ダイクロイックミラー
５５  対物レンズ
５６  ＸＹステージ
５７  カメラ
５８  コンピュータ
Ｌ  培養用溝
Ｍ  排出用溝
Ａ  開口部
Ｓ  フレームシール
【図１】
2013011962.tif 000004
【図２】
2013011962.tif 000005
【図３】
2013011962.tif 000006
【図４】
2013011962.tif 000007
【図５】
2013011962.tif 000008
【図６】
2013011962.tif 000009
【図７】
2013011962.tif 000010
【図８】
2013011962.tif 000011
【図９】
2013011962.tif 000012
【図１０】
2013011962.tif 000013
【図１１】
2013011962.tif 000014
【図１２】
2013011962.tif 000015
【図１３】
2013011962.tif 000016
【図１４】
2013011962.tif 000017
【図１５】
2013011962.tif 000018
【図１６】
2013011962.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月21日(2012.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有する細胞培養装置であって、
細胞培養基板は、表面に、細胞を保持培養するための細い培養用溝と、この培養用溝内に保持培養された細胞を排出するための太い排出用溝を有するとともに、前記培養用溝の両端は、排出用溝の側面に接続し、排出用溝は、培養用溝より太く、深いものであり、
半透膜は、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用されるものであり、
培養液の供給手段は、半透膜によって覆われた細胞培養基板に、培養液を連続的に供給できるものであることを特徴とする細胞培養装置。
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月15日(2013.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有する細胞培養装置であって、
細胞培養基板は、表面に、細胞を保持培養するための細い培養用溝と、この培養用溝内に保持培養された細胞を排出するための太い排出用溝を有するとともに、２本の排出用溝の間に培養用溝が形成されている溝パターンであり、前記培養用溝の両端は、培養用溝に対する排出用溝の角度９０°±１５°の範囲で排出用溝の側面に接続し、排出用溝は、培養用溝より太く、深いものであり、
半透膜は、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用されるものであり、
培養液の供給手段は、半透膜によって覆われた細胞培養基板に、培養液を連続的に供給できるものであることを特徴とする細胞培養装置。
【国際調査報告】
2013011962.tif 000020
2013011962.tif 000021
2013011962.tif 000022
2013011962.tif 000023