(57)【要約】  抗原を粘膜組織に投与したとき、効果的に粘膜免疫を増強することにより、抗原特異的な分泌型イムノグロブリンＡ抗体（ＩｇＡ抗体）をはじめとする抗体産生を増強することができ、しかも、生体に適用しても安定で、且つ、安全な新規粘膜投与アジュバント、及び、斯かるアジュバントと抗原とを有効成分とする抗体産生増強用組成物を提供する事を課題とする。  ツモア・ネクローシス・ファクター−α（ＴＮＦ−α）−コレステロールプルラン複合体を有効成分とする粘膜投与アジュバント、及び、斯かるアジュバントと抗原とを有効成分とする抗体産生増強用組成物を提供することにより上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と、ツモア・ネクローシス・ファクター−α（ＴＮＦ−α）とコレステロールプルランとからなる複合体とを含有する抗体産生増強用組成物。
【請求項２】
抗体が分泌型イムノグロブリンＡ抗体である請求項１記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項３】
コレステロールプルランが、プルラン分子中のグルコース１００分子当たり、コレステリル基を１個以上２個以下導入したものである請求項１又は２記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項４】
さらに、製剤学的に許容される１又は２種以上の成分を配合してなる請求項１乃至３の何れかに記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項５】
抗原が病原性微生物由来である請求項１乃至４何れかに記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項６】
病原性微生物由来の抗原が、その病原性微生物及び／又はその亜型の病原性微生物に対する感染防御に有効な抗体産生の誘導能を有している請求項５に記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項７】
病原性微生物及び／又はその亜型の病原性微生物に対する感染防御に有効な抗体産生の誘導能を有している抗原が、それらの微生物の感染防御用ワクチンとして用いられる抗原又はそれらの微生物の産生する毒素の中和抗体産生増強用のトキソイドから選ばれる何れか１種又は２種以上である請求項６に記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項８】
粘膜投与用である請求項１乃至７の何れかに記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項９】
経鼻投与又は経口投与形態である請求項８に記載の抗体産生増強用組成物。
【請求項１０】
ツモア・ネクローシス・ファクター−α（ＴＮＦ−α）とコレステロールプルランとからなる複合体を含有するアジュバント。
【請求項１１】
コレステロールプルランが、プルラン分子中のグルコース１００分子当たり、コレステリル基を１個以上２個以下導入したものである請求項１０記載のアジュバント。
【請求項１２】
さらに、製剤学的に許容される１又は２種以上の成分を配合してなる請求項１０又は１１に記載のアジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアジュバント、及び、斯かるアジュバントと抗原とを含有する抗体産生増強用組成物に関し、より詳細には、ツモア・ネクローシス・ファクター−α−コレステロールプルラン複合体を有効成分として含有する、安全かつ効率的な免疫活性増強のための粘膜投与アジュバント、及び、斯かるアジュバントと抗原とを含有する抗体産生増強のための粘膜投与用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、粘膜面における免疫機構が解明されてきたのに伴い、有効性の高い粘膜免疫ワクチンの開発が進められている。病原性微生物の感染予防にもっとも効果を発揮するのはワクチンであるが、従来から用いられている皮下接種型のワクチンでは主に血清イムノグロブリンＧ抗体（以下、イムノグロブリンを「Ｉｇ」と略記する場合がある。）の産生が増強されるので、感染の予防というよりも、発症の予防や重症化の予防が中心となる。これに対し、粘膜免疫ワクチンの場合には、抗原を口腔、鼻腔などの粘膜組織経路で投与（以下、「粘膜投与」という）することにより、鼻腔や気道などの全身の粘膜系組織において、分泌型イムノグロブリンＡ抗体（以下、単に「分泌型ＩｇＡ抗体」という場合がある）が産生される。しかも、ＩｇＡ抗体はＩｇＧ抗体に比べ交叉防御能が高いといわれており、病原性微生物の主たる感染部位は粘膜であることから、分泌型ＩｇＡ抗体産生増強に優れる粘膜免疫ワクチンは、感染防御にも優れた効果を発揮する。例えば、気道感染症などの原因菌であるヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌（非特許文献１）や、歯のう蝕の原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）菌の外膜タンパク質（非特許文献２）は、経鼻投与により、粘膜系及び全身系の両方で免疫応答が誘導されることが知られており、これらのタンパク質は、病原性微生物に対して粘膜系で免疫応答を誘導できるため、感染防御用の新たなワクチンとして臨床への応用が期待されている。また、ワクチンとして用いられる抗原は、安全性の点で、従来の弱毒化した生ワクチンや全細胞ワクチンから、成分ワクチンやコンポーネントワクチンへとシフトしている。【０００３】
しかしながら、粘膜投与ワクチン、とりわけ、成分ワクチンやコンポーネントワクチンは免疫原性が弱く、皮下投与ワクチンに比較し多量の抗原の投与が必要となる。また、粘膜組織への抗原の大量投与は免疫応答の寛容（不応答化）を引き起こす場合もある。これらの点から、粘膜投与により効果的な免疫応答を誘導するためには、安全で、且つ、免疫反応を効果的に増強するためのアジュバントとの併用が必要不可欠となる。【０００４】
粘膜投与アジュバントとしては、コレラ毒素や微生物の菌体成分をはじめとする種々のものが提案されている（例えば、特許文献１参照）。また、毒性を低減した大腸菌の易熱性毒素やベロ毒素１のＢサブユニットの利用なども提案されている（例えば、特許文献２参照）。【０００５】
しかしながら、これらの既知の粘膜投与アジュバントは、免疫増強の点では優れているものの、その毒性や、神経麻痺などの副作用との因果関係が完全には否定されていないなどの問題がある。また、生体内で代謝分解される菌体成分では、サイトカイン類に代表される多種多様な生理活性物質を放出させる一方で、逆に免疫反応を特定の方向に誘導するために一定の種類の生理活性物質のみを放出させるという特異性に乏しい。【０００６】
斯かる欠点を解消するため、インターフェロンやツモア・ネクローシス・ファクター−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、以下、「ＴＮＦ−α」と略記する。）などのサイトカイン類をアジュバントとして用いる方法も提案されている（例えば、特許文献３及び特許文献４参照）。しかしながら、サイトカイン類はタンパク質／ペプチドであるため、数分から数時間のオーダーで、生体内で速やかに失活乃至消失し、持続的作用に欠けている。この問題を解決するため、サイトカインを生体に頻回投与する方法、さらには、抗原とサイトカインとを、高分子やリポソーム等のコロイド分散システムを用いてＤＤＳ化して投与する方法が提案されており、ゼラチンを架橋して調製したミクロスフェアに顆粒球／単球−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）やインターフェロン−γなどのサイトカインを封入しＤＤＳ化して用いるシステマテックな免疫増強方法が具体的に開示されている（特許文献４）ものの、これらの方法や製剤は安全性、安定性に問題がある場合がある。【０００７】
また、ＴＮＦ−αではその分子中のリジン残基を別のアミノ酸に置き換えることにより、生体に投与したとき分解を受けにくく、コレラトキシンＢサブユニットと同様に強い粘膜投与アジュバント活性を有する変異体も知られている（非特許文献４）。しかし、斯かる変異体ＴＮＦ−αは野生型に比べヒトに対する抗原性が高いので、アジュバントとしてヒトに投与すると、変異体ＴＮＦ−αに対する抗体が産生され、その結果、変異体ＴＮＦ−αによるアジュバント効果が低下乃至消滅したり、変異体ＴＮＦ−αをアジュバントとして再度投与した場合には、野生型を用いた場合に比べ、炎症やアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性が高いなどのリスクがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特許文献１：特表２００８−５４６６５８号公報
特許文献２：特開２００３−３２１３９２号公報
特許文献３：特開２０１０−５０２６７９号公報
特許文献４：米国特許第５，８６１，１５９号明細書
特許文献５：国際公開ＷＯ９８／０９６５０号パンフレット
特許文献６：国際公開ＷＯ２００６／０７７７２４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
非特許文献１：Ｋｕｒｏｎｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  『Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．』、第１６１巻、４１１５−４１２１頁（１９９８年）
非特許文献２：Ｓａｉｔｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  『Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．』、第１８３巻、８２３−８２６頁（２００１年）
非特許文献３：Ａｄｌｅｒｅｔ  ａｌ．，『Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．』，  １０：２９３−３０６頁（１９９５年）
非特許文献４：萱室裕之等、『ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ』、第１３０巻、第１号、５５−６１（２０１０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記のような事情に鑑み、抗原を粘膜組織に投与（以下、「粘膜投与」という。）したとき、効率よく粘膜免疫を増強することにより、その抗原に特異的な抗体産生を増強することができ、しかも、生体に適用しても安定で、且つ、安全な新規粘膜投与アジュバントを提供することを課題とする。また、本発明は、斯かるアジュバントと抗原とを有効成分とする抗体産生増強用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するためにＴＮＦ−αに着目し、鋭意研究を重ね、種々試行錯誤を繰り返す中で、ＴＮＦ−αは溶液状態での安定性に欠けるだけでなく、これを粘膜投与した場合には速やかに失活し、弱いアジュバント効果しか発揮できないという問題があることを見いだした。【００１２】
本発明者は、斯かる問題点を解決するため、さらに研究を重ねたところ、ＴＮＦ−αとコレステロールプルランとの複合体（以下、「ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体」或いは「ＴＮＦ／ＣＨＰ」という場合がある。）が、抗原と同時、或いは、抗原投与の前後に粘膜投与することにより、複合体化されていないＴＮＦ−α（以下、複合体化されていないＴＮＦ−αを、単に「ＴＮＦ−α」という。）を用いた場合と比べ、生体の抗原に対する特異的な抗体産生を増強する強いアジュバント効果を発揮することを見出した。さらに、その増強効果は、粘膜投与アジュバントとしてその作用効果の強さが公知で、粘膜投与ワクチン開発の際に、陽性対照として汎用されているコレラトキシンＢサブユニットと同等以上であることを見出した。さらに、本発明者は、ワクチンなどに用いる抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを含有する組成物が、生体に投与したとき、とりわけ、経鼻投与したとき、斯かる抗原特異的なＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の産生、とりわけ分泌型ＩｇＡ抗体産生を効果的に増強すること、及び、抗原として病原性微生物由来の成分を用いた場合、これを投与した生体に、斯かる病原性微生物に対する感染防御能（交叉防御能を含む）及び／又は感染症の重篤化の予防能を効果的に賦与できることを見出した。【００１３】
さらに、本発明者は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の状態のＴＮＦ−αは、水溶液の状態でも安定で、かつ、それ単独、或いは、抗原や、製剤学的に許容される１種又は２種以上の成分を含有する製剤中でも極めて安定であることを見出した。【００１４】
さらに、本発明者は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体及びこれを含む製剤が、生体に適用しても、重篤な副作用を誘発することがない安全な組成物であることを確認し本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を有効成分とする粘膜投与アジュバント、及び、斯かるアジュバントと抗原とを含有する粘膜投与用の抗体産生増強用の組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。【００１６】
また、粘膜組織への投与とは別の一態様において、本発明のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、抗原と同時に、或いは、抗原投与の前後に、皮下、皮内、筋肉内などの経皮経路により粘膜組織以外の部位へ投与することにより、抗原に対する抗体、とりわけＩｇＧ抗体の産生を効果的に増強するアジュバントとして用いることができる。血管内投与も可能であるが、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を過剰に血管内投与した場合、複合体から血液中に放出されたＴＮＦ−α量が多いと、副作用が生じる懸念があるので、適宜、投与回数や投与量を調整し、ＴＮＦ−αの血中濃度の急激な上昇を抑制する必要がある。なお、腹腔、胸腔、中耳腔などの体腔内にある粘膜組織ヘの抗原の投与は、注射、カテーテル、内視鏡などを用いる経皮経路となるものの、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の投与部位が粘膜組織で、かつ、投与した抗原に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体の産生が、投与部位及び投与部位以外の粘膜組織において増強されるので、投与部位が粘膜組織の場合、投与経路のいかんに関わらず、本明細書では、全て粘膜投与（粘膜組織への投与）に含めることとする。【００１７】
本発明のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を有効成分とする粘膜投与アジュバントと共に用いる抗原としては、通常、ヒトに対し経皮投与用のワクチンとして用いられる、例えば、インフルエンザ、日本脳炎、麻しん、風しん、黄熱、ラッサ、デング等のウイルス、結核菌等の細菌、マラリアなどの原虫等の病原性微生物に由来する抗原や、破傷風菌、ジフテリア菌、百日咳菌、出血性大腸炎、髄膜炎等の原因菌に由来する毒素やアミロイドβペプチドのような細胞毒性を有する物質由来の抗原等を挙げることができる。また、ヒト以外の動物に対し、感染防御等の目的で用いる口蹄疫やニューカッスル病などの病原性微生物に由来する抗原を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の粘膜投与アジュバントは、ヒト或いはヒト以外の脊椎動物において、抗原を粘膜投与すると同時、或いは、その前後に、鼻腔、眼、喉、気管、気管支、肺、膣、口腔、消化管や体腔内などにある粘膜組織に投与することにより、斯かる抗原を有する病原性微生物の感染防御や毒性を有する物質の中和に有効なＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の産生を効果的に増強することができる。【００１９】
さらに、本発明の粘膜投与アジュバントと抗原を含む組成物は、ヒト或いはヒト以外の脊椎動物において、鼻腔、眼、喉、気管、気管支、肺、膣、口腔、消化管や体腔内などにある粘膜組織に投与することにより、斯かる抗原を有する病原性微生物の感染防御や毒性を有する物質の中和に有効なＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の産生を効果的に増強することができる。【００２０】
さらに、本発明の粘膜投与アジュバントは、粘膜組織に投与することにより、同時或いはその前後に投与した抗原を有する病原性微生物に対してのみでなく、その近縁（亜型）の病原性微生物に対する交叉防御能を誘導することができる。【００２１】
さらに、本発明の粘膜投与アジュバントの有効成分であるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体、或いは、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と抗原とを含む組成物は、ヒトやヒト以外の脊椎動物に適用した場合、比較的低用量の抗原投与により、投与した抗原に対する免疫応答を増強できるので、抗原を大量に投与したとき誘導される場合がある免疫応答の寛容の問題を回避することができる。また、プレパンデミックワクチンのように短期間に大量のワクチンを調製することが要求される場合、従来の経皮投与ワクチンよりも少量の抗原量で対応できるので、大規模接種に必要な十分量のワクチンを製造する期間を短縮することができる。【００２２】
さらに、本発明の粘膜投与アジュバントであるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体、或いは、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と抗原とを含む組成物は、ヒトやヒト以外の動物に適用しても、ＴＮＦ−αを投与したときのようにＴＮＦ−αが短時間で失活乃至消失することがなく、安定で、且つ、重篤な副作用を誘発することのない安全な組成物である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．用語の定義：
本明細書において以下の用語は以下の意味を有している。
【００２４】
＜アジュバント＞
本明細書でいう「アジュバント」とは、免疫機構を非特異的に刺激することによって、抗原に対する特異的免疫反応を増強する機能をもつ物質をいう。
【００２５】
＜粘膜投与アジュバント＞
本明細書でいう「粘膜投与アジュバント」とは、抗原と同時、或いは、抗原の投与前後に、粘膜組織に投与した場合、斯かる抗原に対する免疫反応を特異的に増強する作用を有するものをいい、抗原特異的な血液中の抗体の産生を増強する作用を有するものを含む。
【００２６】
＜粘膜組織＞
本明細書でいう「粘膜組織」とは、外界と直接接している体表に存在する粘膜組織をいう。具体的には、鼻腔、眼、喉、気管、気管支、肺、膣、口腔や食道から大腸までの消化管の粘膜組織などを挙げることができ、さらに、胸腔、腹腔や内耳腔などの体腔内にある粘膜組織を含む。
【００２７】
＜ＴＮＦ−α＞
本明細書でいう「ＴＮＦ−α」は、特にことわりのない限り、１５７個のアミノ酸からなる、分子量約１７．３キロダルトン（ｋＤ）のヒト由来のポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ１６４４１や特開２００４−２２５１号公報に記載の配列表における配列番号１で表される野生型ＴＮＦ−αのアミノ酸配列参照）をいい、天然型及び組換型の両方を含む。通常、ＴＮＦ−α分子は、生理的条件下では３量体の形態にある。
【００２８】
＜変異体ＴＮＦ−α＞
本明細書でいう「変異体ＴＮＦ−α」とは、前記ＴＮＦ−αを構成するアミノ酸の１乃至６個が、欠失又は他のアミノ酸で置換されたポリペプチドであって、ＴＮＦ−αの生理活性が野生型のＴＮＦ−αと同様のアジュバント活性を有するものをいう。具体的には、特開２００４−２２５１号公報に開示された野生型ＴＮＦ−αペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１１番目、６５番目、９０番目、９８番目、１１２番目及び１２８番目のリジンが全てアスパラギン、アラニン、アルギニン、セリン、トレオニン、プリン、メチオニン又はロイシンの何れかで置換されたペプチドを例示することができる。斯かるペプチドはいずれも野生型と同等以上のアジュバント活性を有している。
【００２９】
＜ＴＮＦ−αの活性（ＪＲＵ）＞
本明細書でいう「ＴＮＦ−αの活性（ＪＲＵ）」は、国立感染症研究所（旧国立予防衛生研究所）が供給する日本標準品（ＬｏｔＮｏ．Ｊ−ＰＳ５Ｋ０１）に基づき、マウス由来の線維芽細胞株（マウスＬＭ細胞）に対する細胞障害活性を指標とするバイオアッセイにより測定される。純粋なヒトＴＮＦ−αの比活性は、約２×１０６ＪＲＵ／ｍｇタンパク質である。
【００３０】
＜コレステロールプルラン＞
本明細書でいう「コレステロールプルラン」とは、水溶性多糖類のプルランのもつＯＨ基の一部に、コレステリル基を導入した化合物をいう。斯かるコレステロールプルランは、水溶液中では、コレステリル基を非共有結合の架橋点として数分子間で自己会合することにより、粒径が２０乃至１００ｎｍ程度の単分散的なナノ微粒子を形成し、球状のタンパク質と複合体を形成することができる（例えば、特許文献５及び６参照）。また、同様に、ナノ微粒子を形成し、球状のタンパク質と複合体を形成することが可能な、コレステリル基にさらにアルキル基などを導入したコレステリル基の類縁体を導入したプルランを含む。ＴＮＦ−α複合体としてのアジュバント活性の強さの点では、コレステリル基を導入したプルランが最も望ましい。
【００３１】
＜ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体＞
本明細書でいう「ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体」とは、水溶液中で自己会合し形成されたコレステロールプルランのナノ微粒子中に、ＴＮＦ−αタンパク質が取り込まれ、疎水結合などの共有結合以外の結合様式により複合体を形成したものをいう。斯かる複合体位の結合様式が共有結合以外のものであることは、後述のように、ＴＮＦ−α−コレステロールプルランを含む溶液に、コレステリル基に対する親和性の高いメチルβ−シクロデキストリンを添加することにより、ＴＮＦ−αが放出され、メチル−β−シクロデキストリン添加前には認められなかったＴＮＦ−αの活性が出現することで容易に確認することができる。
【００３２】
＜ＤＤＳ化＞
本明細書でいう「ＤＤＳ化」とは、生体内での薬剤の動態を精密に制御することを目的とするＤＤＳ技術を用い、薬剤の放出を制御することのできる投与形態とすることをいう。
【００３３】
＜抗原＞
本明細書でいう「抗原」とは、ヒト或いはヒト以外の脊椎動物に投与したとき、それに特異的な抗体産生を誘発するものをいい、単独投与では抗体産生の誘導能が無いものであっても、アジュバントと共に投与したとき抗体産生を誘発するものを含む。また、多糖類などのような物質に結合させることにより抗体産生能の誘導が可能なものを含む。
【００３４】
２．本発明について：
上記のとおり、本発明は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を有効成分として含有する粘膜投与アジュバント、及び、斯かる粘膜投与アジュバントと抗原とを含有する当該抗原に対する抗体産生増強用組成物に関するものである。
【００３５】
本発明で用いるＴＮＦ−α自体は公知のサイトカインであり、アジュバントとしての利用も提案されている（特許文献３）。しかしながら、後述の実施例で示すように、ＴＮＦ−αを抗原と共に粘膜投与してもアジュバントとしての効果はさほど発揮されないことが判明した。
【００３６】
本発明で用いるＴＮＦ−αは、その起源や由来を問わず、天然型であっても、遺伝子組換ＤＮＡ技術により製造された組換型ＴＮＦ−α（以下、「ｒｅｃ−ＴＮＦ−α」と略記する場合がある。）であってもよく、アミノ酸を原料に化学的に合成したものであってもよいし、例えば、非特許文献４に開示されているようなＴＮＦ−αを構成するアミノ酸の一部を他のアミノ酸で置換した変異体ＴＮＦ−αを用いてもよいが、とりわけ、ヒトに投与する場合は、ヒトに対する抗原性が低く、アジュバント効果の低下乃至消失や、副作用誘発のリスクの低さの点においてヒトの野生型のＴＮＦ−αが望ましい。ＴＮＦ−αは生理的条件下では、通常、３量体の形態で存在している。また、ヒト以外の動物に用いる場合には、対象とする投与動物由来のＴＮＦ−αを用いることもできる。
【００３７】
本発明でコレステロールプルランの調製に用いるプルランは、その質量平均分子量が、１万乃至１００万ダルトンのものが用いられ、５万乃至５０万ダルトンのものが望ましく、７．５万乃至２５万ダルトンのものがより望ましい。以下に示す本発明のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体が医薬用途であることを勘案すると、その分子量はそろったものが望ましく、質量平均分子量を数平均分子量で除した値が２．５よりも小さいものが望ましく、２．０以下のものがより望ましく、１．５以下のものが特に望ましい。
【００３８】
本発明でコレステロールプルランの調製に用いるプルランは、その起源や由来を問わず、発酵法、合成法などの方法により調製することができる。経済性の点からは、発酵法が望ましい。又、市販のプルラン（株式会社林原製造）を用いてもよく、斯かるプルランを原料に、例えば、特開昭５７−１４１４０１号公報に記載のゲル濾過クロマトグラフィーや分別沈殿法などの方法を適用し、分子量分布の幅を狭めて用いればよい。
【００３９】
本発明で用いるコレステロールプルランは、プルラン分子を構成するグリコシル基の水酸基の一部が、次式：−Ｏ−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ（式中Ｒはコレステリル基又はその類縁体；ｍは０又は１；ｎは２乃至６の整数）で表される基を有するものいう。斯かるコレステリル基は、プルラン分子を構成するグリコシル基１００個あたり０．５個以上１０個以下導入したものが用いられ、１個以上３個以下導入したものが望ましく、１個以上２個以下導入したものが特に望ましい。ちなみに、プルラン分子のグルコシル基１００個あたりのコレステリル基の導入量は、１Ｈ−ＮＭＲ測定によるプルランとコレステリル基とのプロトン積分比から求めることができる。
【００４０】
本発明で用いるコレステロールプルランの製法に特に制限はなく、常法により、プルランにコレステリル基乃至その類縁体を導入すればよい。また、例えば、市販のコレステロールプルラン（商品名『ＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ  ＣＰ−１００Ｔ』、日油株式会社販売）を用いることもできる。ちなみに、この市販のコレステロールプルランは、分子量約１００，０００ダルトンのプルラン分子を構成するグリコシル基の６位の水酸基１００個あたり、次式：−Ｏ−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ（式中Ｒはコレステロール）で表される基を１個以上２個以下有する構造を有している。
【００４１】
前記のように、コレステロールプルラン自体は公知の疎水化多糖類であり、コレステロールプルランと抗原との複合体は、抗体産生能をもつ動物に投与すると斯かる抗原に対する免疫応答が増強されるので、コレステロールプルランについてはワクチン用のアジュバントとしての利用も提案されている（特許文献５及び特許文献６）。しかしながら、後述の実施例で示すように、コレステロールプルランと抗原とを混合し、同時に粘膜投与しても、短時間では、通常、抗原との複合体が形成されることはないので、そのような投与形態では、コレステロールプルラン自体のアジュバントとしての効果はさほど発揮されないことが判明した。
【００４２】
さらに、コレステロールプルランと抗原との複合体は、通常、その抗原に対する免疫応答の増強に用いられるので（例えば特許文献５及び特許文献６参照）、例えば、ＴＮＦ−αとコレステロールプルランとの複合体を投与すると、ＴＮＦ−αに対する抗体の産生が増強され、ＴＮＦ−αのアジュバント活性が中和されるリスクの増大が懸念される。しかし、本発明者等が見出したところによれば、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の場合、これを粘膜組織に複数回投与しても、ＴＮＦ−αに対する抗体産生が誘導されることはなく、アジュバント活性の抑制は起こらないことが判明した。
【００４３】
本発明に係るＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の調製方法に特に制限はないが、例えば、コレステロールプルランとして、前記分子量１００，０００ダルトンのプルランの分子を構成するグルコシル基の６位の水酸基１００個あたり、次式：−Ｏ−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ（式中Ｒはコレステロール）で表される基を１個以上２個以下有する構造を有しているものを用いる場合、予め、５０乃至６０℃としたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの水性溶媒に斯かるコレステロールプルランを加えて撹拌混合した後、１日程度振盪することにより、コレステロールプルランを水性溶媒に完全に溶解させる。このコレステロールプルラン溶液に、ＰＢＳなどの水性溶媒に溶解したＴＮＦ−αを加え、均一になるよう撹拌混合した後、室温乃至４０℃、望ましくは２５℃乃至３７℃を維持しつつ、２日乃至７日間、望ましくは４日乃至６日間静置することにより、コレステロールプルランが形成するナノ粒子内に、通常、ＴＮＦ−αの３量体が１個取り込まれ、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体が形成される。このようにして調製したＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、そのままアジュバントとして用いることができる。本発明で用いるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の調製は、通常、ＴＮＦ−αとコレステロールプルランとを、モル比で１：１乃至３０の比率で混合すればよく、より効率よくＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を調製するには１：２乃至２０の比率が望ましく、１：３乃至１５の比率が特に望ましい。斯かる混合比率の場合、ほぼ全量のＴＮＦ−αを複合体化することができる。この比率よりもコレステロールプルランに対するＴＮＦ−αの混合比率が高くなると、ＴＮＦ−α量が増加するため、アジュバントとして用いる際にその投与量によっては、ＴＮＦ−αによる副作用が生じる可能性が高くなるので、ゲル濾過法などを用いる精製工程が必要となる場合がある。逆に、この比率よりもコレステロールプルランの混合比率が高くなると、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の全ナノ粒子に占める割合が低下し、アジュバントとして不要なＴＮＦ−αを含まないナノ粒子の割合が増加するので好ましくない。
【００４４】
斯かる方法により調製されたＴＮＦ−αと複合体化したコレステロールプルランが形成するナノ粒子の粒径は、市販の粒度分布測定装置（商品名『島津レーザ回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−７１００）』、島津製作所製造）で測定したとき、約２０乃１００ｎｍである。ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体が形成されたことは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、原料として用いたＴＮＦ−αタンパク質のピークが減少乃至消失し、コレステロールプルランよりも高分子側に、新たな単一ピークが出現することで確認できる。また、ＴＮＦ−αとコレステロールプルランを上記適正な比率で混合し複合体とした場合、ＴＮＦ−αの大部分が複合体を形成するので、斯かる溶液のＴＮＦ−α活性を測定した場合、活性は検出されないか、僅かに検出される程度となる。また、この溶液に、後述の実施例で示すように、メチル−β−シクロデキストリンを含有するＰＢＳを加えることにより、複合体からＴＮＦ−αが放出され、その活性が検出されることでも確認できる。
【００４５】
本発明の粘膜投与アジュバントと共に用いる抗原に特に制限はないが、とりわけ、投与の対象となるヒト或いはヒト以外の脊椎動物において、経皮投与や粘膜投与により、目的とする病原性微生物及び／又はその亜型の病原性微生物に対し、感染防御に有効な抗体産生の誘導能を有することが確認でき、且つ、投与しても安全であることが確認できる抗原が望ましい。斯かる抗原としては、例えば、従来から経皮投与用のワクチンとして用いられる病原性微生物由来の抗原や、アレルギーの減感作療法で用いられるアレルギーの原因物質であるアレルゲンに由来する抗原などを挙げることができる。より具体的には、不活化ワクチン、生ワクチン、成分（コンポーネント）ワクチン、多価ワクチン、混合ワクチン、ＤＮＡ組換ワクチンなどのワクチン類や、病原性微生物が産生する細胞毒を中和する抗体産生の誘導を目的として用いられるトキソイド類などの抗原が望ましく、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ抗体の産生増強作用に優れる本発明のアジュバントの特性からすると粘膜組織経路で感染する病原性微生物の感染防御用ワクチンとして用いられる抗原が特に望ましい。より具体的には、例えば、ヒトに適用する場合、インフルエンザ、風邪、肺炎などの呼吸器疾患、風しん、麻しん、オタフクカゼ、黄熱病、デング熱、ラッサ熱、日本脳炎、ポリオ、水痘、エイズ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などの肝炎、ヘルペス、子宮頸ガン、肺炎、狂犬病、下痢などの消化器疾患などの各種疾患の原因ウイルス由来の抗原、結核菌、赤痢菌、コレラ菌、チフス菌、ペスト菌、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）菌、ポリフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）菌、肺炎球菌等の病原性細菌やマラリアなどの病原性原虫、マイコプラズマなどの外膜タンパク質などを挙げることができる。とりわけ、インフルエンザウイルスのように、毎年、感染に関与する表面タンパク質が変異し、既存の経皮投与ワクチンでは、その感染防御に有効な血中ＩｇＧ抗体の産生誘導が不可能乃至不十分で、時として、世界的な大流行をもたらすような病原性微生物に対し迅速に交叉防御反応に基づく感染防御能を誘導するためのプレパンデミックワクチンとして有用である。また、抗原性を有するのであれば糖タンパク質等複合タンパク質はもとより、核酸、多糖類、脂質などや、感染防御に有効な抗体産生の誘導能を有するエピトープを含むそれらの部分分解物などを用いることもできる。より具体的には、不活化ワクチンとしては、例えば、コレラワクチン、百日咳ジフテリア混合ワクチン、百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン、ワイル病秋やみ病混合ワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、乾燥日本脳炎ワクチン、不活化狂犬病ワクチン、乾燥組織培養不活化狂犬病ワクチンなどを例示することができる。また、生ワクチンとしては、例えば、痘瘡ワクチン、乾燥痘瘡ワクチン、乾燥細胞培養痘瘡ワクチン、経口生ポリオワクチン、乾燥弱毒生風しんワクチン、乾燥弱毒オタフクカゼワクチンを例示することができる。日本脳炎ワクチン、麻しんワクチン、風しんワクチン、マイコプラズマワクチン、パピローマウイルスワクチン、ロタウイルスワクチンまた、トキソイド類としては、例えば、ジフテリアトキソイド、成人用沈降ジフテリアトキソイド、沈降破傷風トキソイド、ジフテリア破傷風混合トキソイド、沈降ジフテリア破傷風混合トキソイド、沈降ハブトキソイドなどを例示することができる。これらは、いずれも通常、感染防御及び／又は感染した病原性微生物による臨床症状の発症や重篤化の防止用のワクチンとして用いられる抗原やトキソイドである。さらに、ベロ毒素などの出血性大腸炎の原因毒素やアミロイドβペプチドなどの細胞毒性を有するタンパク質やペプチドであってもよい。また、アレルゲンとしては、スギやブタクサなどの花粉由来やダニ由来のアレルギーの原因物質などを挙げることができる。
【００４６】
また、ヒト以外の動物に適用する場合に対象となる抗原として、例えば、口蹄疫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、各種動物に感染するインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、炭疽病菌などの病原性微生物由来の抗原を例示することができる。前記以外の抗原としては、試薬や臨床診断薬として用いられる、酵素、細胞表面マーカー、腫瘍マーカー、抗体等を例示することができる。
【００４７】
また、抗原中の抗原決定基（エピトープ）部分やそれを含むものを用いてもよく、さらには、抗原がタンパク質或いはペプチドの場合、例えば、国際公開第２００４／８７７６７号パンフレットなどに開示されているような免疫反応誘導能を有するＴ細胞エピトープと、抗体産生を目的とする抗原のＢ細胞エピトープとを人為的に連結した、Ｂ細胞エピトープに対する抗体産生を誘導可能な合成ペプチドや、特表平１１−５１５００６号公報などに開示されているようなキャリアー分子にＢ細胞エピトープを連結した合成ペプチドなどを用いてもよい。また、それ自体は、単独で投与しても抗体産生の誘導能を有さない物質であっても、本発明のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と併用することにより抗体産生を誘導できるものは言うに及ばず、キャリアー分子などに結合して抗原性を賦与したものや、他のアジュバントとの併用により抗体産生を誘導できるものも用いることもできる。
【００４８】
本発明の粘膜投与アジュバントと共に用いる抗原は、その製造方法や由来に制限はなく、抗原を発現している微生物や、その微生物が産生する抗原を含む産生物を用いることができ、ＤＮＡ組換技術により製造したものや化学合成したものを用いることもできる。破傷風、ジフテリアの毒素、アミロイド−βペプチドなどのように、対象とする抗原自体に生体に対する毒性がある場合や、ポリオのように感染性のある微生物を用いる必要がある場合には、通常、これらを無毒化乃至弱毒化したものやその部分配列を有するペプチドを用いることもできる。これらの抗原は、生体に投与した際に、重篤な障害を引き起こさない限り、粗抽出物や、それを部分的に精製したもの或いは高度に精製したものを用いてもよい。特定の抗原のみに対する抗体産生を目的とする場合や、副作用発生の低減の点からは、目的とする抗原をできるだけ高度に精製したものを用いるのが望ましい。また、それ単独投与では抗体産生の誘導能が低い乃至ない成分の場合には、前述のように、Ｔ細胞エピトープを連結したり、キャリアー分子などに結合して、抗原性を増強したものを用いることもできるし、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体以外のアジュバントをさらに併用することもできる。また、市販のワクチン製剤の製造に用いられている抗原をそのまま用いてもよく、とりわけ、不活化ワクチンや弱毒生ワクチンを抗原とする場合は、そのまま用いるのが望ましい。
【００４９】
本発明に係わる粘膜投与アジュバントと抗原とを別々に投与する場合の投与経路は、粘膜組織経路或いは経皮経路の何れであってもよいが、感染経路が粘膜組織である病原性微生物に対し、その感染防御に特に有効な分泌型ＩｇＡ抗体の産生を惹起するためには、粘膜組織経由で投与するのが望ましく、投与の容易さや確実さからは、鼻腔内又は口腔内への粘膜投与が望ましく、鼻腔内への投与がより望ましい。血中ＩｇＧ抗体やＩｇＡ抗体の産生を増強するためには粘膜組織か、或いは、状況に応じ、皮下、皮内、筋肉内などの経皮経路での投与も選択することができる。その際の、抗原の投与量は、本発明のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を併用することにより、生体に対し抗体産生を増強できる用量であれば、特に制限はなく、用いる抗原の抗原性の強さに応じ、適宜調整すればよい。粘膜投与の場合、通常は、抗原質量として、体重５０ｋｇの成人１回当たり、０．０１μｇ〜１００μｇ、好ましくは０．１μｇ〜１０μｇ投与すればよい。抗原の投与量が０．０１μｇ未満では抗体産生を誘導できない場合があり、１００μｇ回を越える量を投与しても投与量に見合う効果が認められない場合がある。また、投与の対象が、ヒト以外の脊椎動物の場合、ヒトへの投与量に基づき、投与部位の容積を勘案して、適宜、その投与量を調整すればよい。
【００５０】
本発明に係わる粘膜投与アジュバントと混合して投与する場合の抗原の用法は、抗原に対する特異的抗体の産生を増強できる用法であれば制限はなく、その抗原の抗体産生誘導能、疾患の種類、投与経路、投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、既存のワクチンに用いられている抗原を用いる場合は、１日１回乃至複数回、１週間に１回乃至略１ヶ月に１回の間隔で、１乃至５回程度投与すればよい。通常、１回の投与で感染防御に必要な感作は成立するものの、インフルエンザウイルスなどのように伝染性の強い病原性微生物の流行期に用いる場合や、抗原性がパンデミックを引き起こすように変異した亜型の病原性微生物の場合のように短期間で効率良く交叉防御能を増強する必要がある場合は、１日１回乃至複数回、１週間に１回乃至１ヶ月に１回の間隔で、２乃至５回程度、望ましくは、２乃至４回、さらに望ましくは３又は４回投与すればよい。他の抗原を用いる場合の用法用量は、上記に準じるか、適宜の方法で、抗原特異的な抗体の産生の有無やその産生量を確認しながら、適宜調整すればよい。また、粘膜組織以外の部位へ経皮経路で投与する場合、投与量によっては投与部位に炎症反応を誘発する場合があるので、炎症反応の重篤度を勘案し、粘膜投与の場合よりも投与量を適宜減じる必要がある。
【００５１】
本発明の粘膜投与アジュバントは、ヒトや動物に対し、粘膜投与或いはそれ以外の部位へ経皮経路で抗原を投与した際に、抗原を投与する前後或いは同時に、より好ましくは抗原の投与と同時に、抗原の投与部位、或いは、投与部位以外の粘膜組織へ投与した場合やそれ以外の部位へ経皮投与した場合でも、優れたアジュバント効果を発揮することができるが、抗体産生の増強効果の強さの点からは、抗原投与部位に投与するのが望ましい。分泌型ＩｇＡ抗体の産生増強、投与の容易さ及び副作用の誘発のリスクの低減の点からは、粘膜投与が望ましく、経鼻又は口腔内投与が望ましく、経鼻投与が特に望ましい。抗原と別々に投与する場合は、抗原の投与前０乃至４時間以内に投与するのが望ましく、０乃至２時間以内に投与するのがより望ましく、可能な限り同時に投与するのが特に望ましい。抗原投与後に投与することも可能であるが、その場合も、抗原投与後できるだけ速やかに、望ましくは、０乃至３時間以内に投与する必要がある。抗原投与後、余り時間をおいて投与すると、アジュバント効果が十分発揮されない場合がある。
【００５２】
本発明の粘膜投与アジュバントは、有効成分であるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を含有する組成物の形態、又は、抗体産生の増強を目的とする抗原と混合した組成物の形態で提供される。また、用時に適量を抗原と混合した組成物の形態としてもよい。
【００５３】
本発明の効果を妨げない限り、本発明に係る粘膜投与アジュバント、或いは、粘膜投与アジュバントと抗原を含む組成物は、これらの成分以外の製剤学的に許容できる１種又は２種以上の製剤用添加剤を組み合わせて医薬組成物を調製することもできる。製剤用添加剤としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アルコールなどの溶媒、グルコース、マルトースなどの還元性糖質、α，α−トレハロース、ショ糖、サイクロデキストリンなどの非還元性糖質、或いは、α−グルコシルα，α−トレハロース、α−マルトシルα，α−トレハロースなどのα，α−トレハロースの糖質誘導体、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、マルトトリイトールなどの糖アルコール、寒天、プルラン、グアガム、アラビアガム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子、脂質、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸やその塩類、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤、吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤、溶解剤、ｐＨ調整剤、香料、栄養機能食品、医薬部外品或いは医薬品の有効成分や上記以外の食品、食品添加物、医薬部外品添加物、医薬品添加物などを挙げることができ、これらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。また、必要に応じ、本発明に斯かるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン以外のアジュバントを配合することもできる。なかでも、ＴＮＦ−αや他の添加剤に対する安定化効果の高い、α，α−トレハロース及びα，α−トレハロースの糖質誘導体が好ましい。なお、抗原以外のタンパク質やメチルβ−シクロデキストリンなどの糖質のように、コレステリル基に対する親和性の高い成分の添加は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体からＴＮＦ−αが放出されるので、添加剤として好ましくない。
【００５４】
ちなみに、本発明に係る粘膜投与アジュバントと抗原とを含む組成物の場合、抗原はタンパク質やペプチドの場合が多いので、その調製時に、抗原量が多いことに起因するＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体からのＴＮＦ−αの放出がおこらないよう、ＴＮＦ−α−コレテロールプルラン複合体と混合する抗原の濃度はできるだけ低くする必要があり、通常は、組成物中の抗原濃度が１０ｍｇ／ｍｌ以下となるように混合すればよく、５ｍｇ／ｍｌ以下が望ましく、１ｍｇ／ｍｌ以下とすることがより望ましい。
【００５５】
また、本発明の粘膜投与アジュバント、或いは、斯かる粘膜投与アジュバントと抗原とを含有する組成物の形態としては、溶液、シラップ、凍結乾燥品、粉末、顆粒、錠剤、トローチ、舌下錠、クリーム、軟膏、ジェルなどの剤形から、投与対象、投与方法、製剤の保存方法や輸送方法を考慮して適宜選択すればよい。また、本発明に係わる粘膜投与アジュバント又はそれを含有する組成物は、必要に応じ、皮膚、組織への浸透促進剤やイオン導入法などを併用することにより、抗原提示細胞の存在部位への浸透を促進させることもできる。また、本発明に係る製剤は、必要に応じ、錠菓、飴、清涼飲料などの各種飲食品の形態とし、これを経口的に摂取することにより、経粘膜的に投与することもできる。
【００５６】
本発明に係る粘膜投与アジュバントを有効成分として含有する医薬組成物、又は、斯かる粘膜投与アジュバントと抗原とを有効成分として含有する医薬組成物のヒトへの投与方法には、特に制限はなく、本発明に係る粘膜投与アジュバント、又は、アジュバントと抗原とを有効成分として含有する組成物が、投与部位へ確実に到達できる方法であれば何れであってもよい。粘膜投与する場合、例えば、スポイトや注射器を用いて適量を粘膜上に滴下してもよく、経口摂取や、クリーム或いはジェル状にして粘膜に塗布したり、カテーテルなどで投与部位に誘導してもよく、さらには、鼻や喉にスプレーやネブライザーなどにより霧状にして吹き付けたり、気管、気管支、或いは、肺へ吸引させてもよいし、座剤の形態で大腸内に投与することもできる。また、皮下、皮内、筋肉内、血管内、腹腔内や胸腔内などの体腔内への投与には、注射器、カテーテル、点滴など、投与部位や投与経路に応じて適宜の投与方法を用いることができる。
【００５７】
本発明の粘膜投与アジュバントを有効成分として含有する組成物、又は、斯かる粘膜投与アジュバントと抗原とを有効成分として含有する抗体産生増強用組成物は、１つ又は２つ以上の他の医薬組成物と同時にあるいは順番に用いることもできる。他の医薬組成物を投与した後に本発明に係る粘膜投与アジュバントを有効成分として含む医薬組成物を投与してもよいし、当該医薬組成物を投与した後に、他の医薬組成物を投与してもよく、更に、当該医薬組成物と化学療法剤を同時に投与してもよい。他の医薬組成物としては、対象とする疾患によって異なるが、一例としては他のワクチン、化学療法剤、抗体医薬、アンチセンス核酸医薬、ｓｉＲＮＡ医薬等を挙げることができる。
【００５８】
本発明に係わる粘膜投与アジュバントの用法は、抗原の抗体産生誘導能、疾患の種類、投与経路、投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、抗原の投与スケジュールにあわせて投与される。具体的には、例えば、既存のワクチン類に用いられている抗原を用いる場合、そのワクチンの用法に従えばよく、通常は、１日１回乃至複数回、１乃至３０日間隔で、望ましくは１乃至１４日間隔で、特に望ましくは１乃至１４日間隔で、１乃至５回、好ましくは２乃至４回程度投与すればよい。ワクチン類以外の抗原と用いる場合、上記に準ずるか、用いる抗原の抗原性の強さに応じ、適宜の方法で、抗原特異的な抗体産生の増強の有無や抗体の産生量を確認しながら、適宜調整すればよい。粘膜投与の場合、その用量は、体重５０ｋｇの成人に対し、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体をＴＮＦ−αタンパク質として０．１〜５，０００μｇ／回、好ましくは０．１〜２，５００μｇ／回投与、より好ましくは０．１〜１００μｇ／回投与すればよい。用いる抗原の免疫原性の強さや投与量によっては、０．１μｇ／回未満の投与量ではアジュバント効果が発揮されない場合があり、５，０００μｇ／回を越える量を投与しても投与量に見合うアジュバント効果が得られない場合がある。また、投与の対象が、ヒト以外の脊椎動物の場合、ヒトへの投与量に基づき、鼻腔内の容積を勘案して、適宜、その投与量を調整すればよい。
【００５９】
本発明のアジュバントは、汎用性が高く、ワクチンとして用いられている抗原をはじめとする種々の抗原と共に経鼻投与などの粘膜投与することにより、唾液、鼻腔液等の全身の粘膜組織および血液中に、投与した抗原に特異的な抗体、とりわけ、分泌型ＩｇＡ抗体の産生が著しく増強される。分泌型ＩｇＡ抗体は交叉防御能が高いので、粘膜投与用抗原に対する抗体産生増強用のアジュバントとして極めて有効であり、交叉防御能を誘導することができるので、その結果、病原性微生物由来の抗原と併用した場合には、生体に対し、斯かる微生物やその近縁（亜型）の微生物に対する感染防御能及び／又は微生物感染による病気（微生物由来の毒性物質に起因する病気を含む）の発症や重篤化の予防能を効率よく賦与することができる。しかも、粘膜投与の場合、ＴＮＦ−α自体に対する抗体の産生誘導のリスクは極めて低い。なお、本発明のアジュバントは、抗原と共に粘膜組織以外の部位へ経皮経路で投与した場合には、血液中に、投与した抗原に特異的なＩｇＧ抗体及び又はＩｇＭ抗体、並びに、ＩｇＡ抗体の産生が増強されるので、本発明のアジュバントは、粘膜組織以外の部位へ経皮経路で投与する種々の抗原に対する抗体産生増強用のアジュバントとしても極めて有効である。
【００６０】
本発明のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、アジュバントとして有用であるだけで無く、粘膜組織以外の部位へ経皮経路で投与しても、徐放性を維持することができるので、ＴＮＦ−αを投与する場合に比べ、低用量で同様の効果を発揮することができ、副作用の発生を低減できることから、単独で、或いは、他の治療剤と併用して、乳ガン、肝ガン、腎ガン、メラノーマ、菌状息肉症などの悪性腫瘍やウイルス性疾患をはじめとするＴＮＦ−α感受性疾患の治療用として、さらには、血管透過性改善用などの生物学的製剤としても有利に利用することができる。
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
＜ＤＤＳ化した各種ＴＮＦ−α標品の調製＞
本発明者が、予備実験により、生理食塩水に溶解したＴＮＦ−αを、鼻腔内の粘膜組織に投与しても弱いアジュバント作用しか示さないことが判明した。その原因を究明するため、生理食塩水に溶解したＴＮＦ−αをアジュバントとして用いたところ、生理食塩水に溶解した状態ではＴＮＦ−αは、比較的短時間で活性が失活することが判明した。さらに、本発明者が、別の実験において、蛍光色素で標識したＴＮＦ−αを生理食塩水に溶解し、マウスの皮下に投与したところ、投与部位からの蛍光色素の急速な消失が認められたことから、ＴＮＦ−αは投与部位から速やかに組織中に拡散する可能性があることも判明した。これらの予備実験から、ＴＮＦ−αを経鼻投与した場合も、その投与部位において、ＴＮＦ−αが短時間で失活乃至消失することにより、充分なアジュバント活性を発揮できない可能性が示唆された。そこで、粘膜投与時に、ＴＮＦ−αを長期間粘膜組織上で安定に保持するために、そのＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化乃至安定化方法の検討を行った。すなわち、ＴＮＦ−αのＤＤＳ化乃至安定化のために、下記に示す方法により、コレステロールプルランとの複合体化を調製した。また、対照として、ＤＤＳ化乃至安定化剤として汎用されている生体吸収性ハイドロゲルへの吸着、皮下吸収性リオトロピック液晶（Ｎａｎｏｃｕｂｅ）への封入、及び、リポソームへの封入を行った。さらに、水溶性高分子ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という。）を用い、ＴＮＦ−α分子のアミノ基へのランダムな修飾によるＴＮＦ−αのＤＤＳ化を試みた。なお、以下の実施例では、センダイウイルスを誘導剤として用いヒトリンパ芽球様細胞株ＢＡＬＬ−１細胞に産生させ、常法により精製した天然型ヒトＴＮＦ−α（株式会社林原生物化学研究所製造、比活性約２×１０６ＪＲＵ／ｍｇタンパク質）を用いた。【００６３】
＜ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体標品の調製＞
コレステロールプルラン（商品名『ＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ  ＣＰ−１００Ｔ』、日油株式会社販売）適量を秤量後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにダルベッコのＰＢＳ（商品名『ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」』、日水製薬株式会社販売）（以下、「Ｄ−ＰＢＳ」という。）に懸濁し、５５℃の温水浴中で１６時間振盪し溶解した後、ポアサイズが０．２２μｍの膜フィルターを用い濾過滅菌した。このコレステロールプルラン溶液７ｍｌとＤ−ＰＢＳ（−）に溶解したＴＮＦ−α（ＴＮＦ−αタンパク質量１．４５４ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌとを混合し、ポアサイズが０．２２μｍの膜フィルターを用い濾過滅菌した後、３７℃で５日間反応することにより、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体標品を調製した。この溶液のＴＮＦ−α活性をマウスＬＭ細胞を用いた細胞障害活性に基づくバイオアッセイにより測定したところ活性は検出されなかった。また、この溶液に２００ｍｇ／ｍｌのメチル−β−シクロデキストリンを含有するＤ−ＰＢＳを等量混合し、３７℃で２時間反応させＴＮＦ−αをコレステロールプルランのナノゲル外に放出させた後、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１容積％含有するＭＥＭ培地（以下、「１容積％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地」という。）で希釈し、同様に活性を測定したところ、複合体調製に用いたＴＮＦ−αとほぼ同量の活性が確認された。【００６４】
＜ＴＮＦ−αの生体吸収性ハイドロゲル封入体標品の調製＞
生理活性物質のＤＤＳ化に用いられている市販のゼラチンベースの生体吸収性ハイドロジェル２種（商品名『ＭｅｄＧｅｌ』ＰＩ５及びＰＩ９、株式会社メドジェル販売）のシートを、各々、約４ｍｍ×約１２ｍｍ（約２ｍｇに相当）にカットし、微量天秤で質量を測定後、ポリプロピレン製のチューブ（商品名『ファルコン２０５９チューブ』、ベクトンディッキンソン社販売）に入れた。ＴＮＦ−α（１．４５４ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ／ゲル（ＴＮＦ−αタンパク質として３０μｇ／ゲル）でシート上に滴下し、４℃で一晩静置し、ＴＮＦ−αのハイドロゲル封入体標品を調製した。【００６５】
＜ＴＮＦ−αの皮下吸収性リオトロピック液晶封入体標品の調製＞
ＰＢＳに溶解したＴＮＦ−α（株式会社林原生物化学研究所製造、ＴＮＦ−αタンパク質７．５４ｍｇ／ｍｌ）３０μｌとグリセリン３９．５７μｌとを、１．５ｍｌ容のポリプロピレンチューブ（商品名『エッペンドルフチューブ』、エッペンドルフ社販売）に入れ、ボルテックスミキサーを用い強く撹拌、混合した。さらに、ポリオキシエチレン（２０）オクチルドデシルエーテル（商品名『エマルゲン２０２０Ｇ−ＨＡ』、ＨＬＢ１３、花王株式会社販売）４９．２６ｍｇを加え、ボルテックスミキサーを用いて強く撹拌、混合した後、スクワラン４９．０２μｌを加え、ボルテックスミキサーを用いて強く撹拌、混合することにより、ＴＮＦ−αのリオトロピック液晶封入体を調製した。ちなみに、皮下吸収性リオトロピック液晶封入体は、経皮吸収促進作用のある化粧品用ジェル基材として用いられている（例えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ．等、『Ｐｈａｒｍａｚｉｅ』、第６１巻、１１２−１１６頁（２００６年）参照）。【００６６】
＜リポソーム内封ＴＮＦ−α標品の調製＞
ＴＮＦ−α（株式会社林原生物化学研究所製造、ＴＮＦ−αタンパク質１．４５４ｍｇ／ｍｌ）をカリウムを含まないＰＢＳ（ＰＢＳ（Ｋ−））で希釈し、ＴＮＦ−αタンパク質の濃度が３６３．５μｇ／ｍｌ及び６３２μｇ／ｍｌである水溶液を、各々、２ｍｌ調製した。これらの溶液を、注射器に充填し、それぞれ、市販の凍結乾燥型中空リポソーム粉末入りバイアル（商品名『ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＥＬ−０１−Ｎ』、脂質として、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）５４μｍｏｌ、コレステロール４０μｍｏｌ、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）６μｍｏｌ入り、日油株式会社販売）に注入した。バイアルを、３乃至５回振盪し、リポソーム内封ＴＮＦ−α含有溶液を調製した。この溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（商品名『セファクリル−Ｓ３００ＨＲ』、カラムサイズ：φ１５ｍｍ×５００ｍｍ、リージェントコンセントレイト株式会社販売）に供し、ＰＢＳ（Ｋ−）で溶出し、溶出画分中のタンパク質量とコレステロール量とを、各々、市販のブラッドフォード試薬（商品名『プロテインアッセイダイ』、バイオラッド株式会社販売）及びコレステロール検出試薬（商品名『コレステロールテストワコー』、和光純薬工業株式会社販売）を用いて測定し、遊離ＴＮＦ−α画分（タンパク質含有画分）、リポソーム画分（コレステロール含有画分）をそれぞれ回収した。上記ゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供したリポソーム内封ＴＮＦ−α含有溶液及びカラムから溶出されたリポソーム画分０．１ｍｌに、各々、１．０５質量％トリトン−Ｘ１００溶液０．０４ｍｌを加え、ローテーターで３０分間振盪することによりリポソームを破壊し内封されたＴＮＦ−αを放出させた後、１容積％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＭＥＭ培地（商品名『イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ』、コード番号０５９０２、カナマイシン及びフェノールレッド不含有、日水製薬株式会社販売）で希釈し、マウスＬＭ細胞に対する細胞障害活性に基づくバイオアッセイにより、各溶液中のＴＮＦ−αの力価を測定した。【００６７】
＜ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−α標品の調製＞
ＴＮＦ−α（１．１１ｍｇ／ｍｌ、１．９８×１０６ＪＲＵ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液１．６７ｍｇと、ＰＥＧ試薬（ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＥＧ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；商品名『ＭＰＥＧ−ＳＰＡ−２０ｋ』、ネクター社販売）６．６８ｍｇとを混合し、３７℃の水浴で１５分間ゆっくり攪拌した。さらに、ＰＥＧ試薬６．６８ｍｇを添加し、３７℃の水浴で１５分間ゆっくり攪拌、混合した。反応を停止するために、ε−アミノカプロン酸０．８７６ｍｇ（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ−２０ｋの１０倍モル）を添加し、３７℃の水浴で、１０分間ゆっくり攪拌した。この反応液停止後の溶液を、ゲル濾過クロマトグラフィー（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００』、カラムサイズφ１６ｍｍ×６００ｍｍ、ゲル容積１２０ｍｌ、ＧＥヘルスケア株式会社販売）に供し、ＴＮＦ−α１分子当たり分子量が２０キロダルトンのＰＥＧが１〜３個付加したと考えられる分子量の分子が溶出される画分を回収し、ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−αを調製した。ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンから、本方法により調製し、回収した大部分のＰＥＧ修飾ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−α１分子に対しＰＥＧ１分子が結合していると判断した。【００６８】
上記調製した５種類のＴＮＦ−αをＤＤＳ化した標品におけるＴＮＦ−αのＤＤＳ化率（質量％）、ＤＤＳ化されたＴＮＦ−αタンパク質の２分の１量が生理食塩水中で放出されるまでの時間（リポソームへの内封ＴＮＦ−α、ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−αを除く）、及び、ＤＤＳ化されたＴＮＦ−αを、蓋付きのポリプロピレンチューブに入れて４℃又は２５℃の恒温条件で保存したときの保存安定性につき、表１に纏めた。なお、ＤＤＳ化率は、ブラッドフォード法によりＤＤＳ化された標品中のＴＮＦ−αタンパク質量をＤＤＳ化に用いたＴＮＦ−αタンパク質量で除し１００倍して求めた。ＤＤＳ化時の失活率（％）は、ＤＤＳ化したＴＮＦ−αを、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の場合は、メチル−β−シクロデキストリンを加えて、リオトロピック液晶の場合は生理食塩水を加え、リポソームへの内封の場合は乳化剤を加え、ＴＮＦ−αを放出させた後、その生理活性とブラッドフォード法によりタンパク質量を測定し、生理活性をタンパク質量で除し放出されたＴＮＦ−αの比活性（ＪＲＵ／ｍｇタンパク質）を求めた。この比活性を、失活が無い場合のＴＮＦ−αの比活性（２×１０６ＪＲＵ／ｍｇタンパク質）で除し、１００倍し、１００から減じて算出した。ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−α標品は、直接その生理活性とタンパク質量を測定した結果に基づき、同様に算出した。この場合、ＤＤＳ化時にＴＮＦ−αの失活がない場合には、失活率は０％となる。保存安定性は、ＤＤＳ化した試料を表１に示す温度条件に保存し、７日毎にサンプリングして、ＴＮＦ−αの活性を測定し、ＤＤＳ化直後の各々の標品について測定した活性を１００％として、その活性が９０％以上維持されている期間とした。なお、ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−αはＰＥＧとＴＮＦ−αとが共有結合しているのでＴＮＦ−αが放出されることはないので放出時間の測定試験は実施しなかった。また、リポソームへの内封ではＴＮＦ−αの大部分が失活したため放出時間の測定試験は実施しなかった。さらに、ハイドロゲルへの吸着では、添加したＴＮＦ−α溶液全量がゲルに吸収されたので、そのＤＤＳ化率は見かけ上１００％となったものの、ＤＤＳ化されたＴＮＦ−αタンパク質の２分の１量が生理食塩水中で放出されるまでの時間は０．５時間以下であり、実際には、ＴＮＦ−αはＤＤＳ化されていなかった、また、リポソームへの内封及びＰＥＧ修飾ではＴＮＦ−αの大部分が失活していた。それゆえ、これらの方法は何れもＴＮＦ−αのＤＤＳ化には不適と判断し、保存安定性の試験は実施しなかった。【００６９】
【表１】
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【００７０】
表１から明らかなように、ＴＮＦ−αとコレステロールプルランとの複合体を形成させる方法では、ＴＮＦ−αタンパク質のほぼ全量が複合体となり、複合体形成時のＴＮＦ−αの失活も、生理食塩水中でのＴＮＦ−αタンパク質の放出もなく、その保存安定性に優れていた（試験群１）。これに対し、ハイドロゲルへ吸着させた場合は、用いたＴＮＦ−αタンパク質のほぼ全量を吸着したものの、生理食塩水中でＴＮＦ−αが、短時間でゲルから放出された（試験群２）。リオトロピック液晶へ封入にしたものは、ＴＮＦ−αのほぼ全量がＤＤＳ化され、ＤＤＳ化の際の失活もなく、その保存安定性に優れていた（試験群３）。また、リオトロピック液晶へ封入した場合は、液晶が生理食塩水中で容易に溶解するので、ＴＮＦ−αが短時間で放出された。リポソームへの内封法では、内封されるＴＮＦ−α量が、用いたＴＮＦ−αタンパク質の２％以下と極めて低く、内封時に約６０質量％のＴＮＦ−αが失活した（試験群４）。ＰＥＧによる修飾の場合は、用いたＴＮＦ−αタンパク質の１分子に１個以上の割合でＰＥＧ修飾されたものの、ＴＮＦ−αの失活率が９０％以上となり、ＴＮＦ−αタンパク質量当たりの細胞障害活性（比活性）がＰＥＧ修飾前のＴＮＦ−αに比し１０分の１以下に低下した（試験群５）。この結果から、ハイドロゲルへの吸着ではＴＮＦ−αがゲルに吸着されなかったためＴＮＦ−αのＤＤＳ化方法としては不適と判断した。また、リポソームへの内封は効率が極めて低く、内封時にＴＮＦ−αの失活も認められたため、ＴＮＦ−αのＤＤＳ化方法としては不適と判断した。【００７１】
ちなみに、本発明者が別の実験により確認しところ、コレステロールプルラン複合体に封入されたＴＮＦ−αを複合体から放出させるためには２００ｍｇ／ｍｌの濃度のメチル−β−シクロデキストリンを含有するＰＢＳと等量混合する必要があるのに対し、例えば、インターフェロン−α−コレステロールプルラン複合体の場合は１２ｍｇ／ｍｌと、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の場合の約２０分の１の濃度のメチル−β−シクロデキストリンを含有するＰＢＳと等量混合することにより、容易にインターフェロン−αを放出させることができる。また、上記調製のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は血清のような高濃度タンパク質溶液中では、そのＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体から５０％のＴＮＦ−αが放出されるためには約５時間を要したのに対し、インターフェロン−α−コレステロールプルラン複合体やインターフェロン−γ−コレステロールプルラン複合体の場合には、３０分以内と、極めて短時間で完全にインターフェロンが放出され、ＴＮＦ−αとの複合体の場合のようなＤＤＳ化効果は認められなかったことから、コレステロールプルランとの複合体化によるサイトカインのＤＤＳ化には、用いるサイトカインに対する選択性があり、ＴＮＦ−αはコレステロールプルラン複合体によるＤＤＳ化に好適なサイトカインであることが判明した。
【実施例２】
【００７２】
ワクチンなどの抗原をヒトに投与した場合の抗体産生増強効果を確認するモデルとして汎用されているマウスを用い、実施例１で調製のＤＤＳ化したＴＮＦ−αが、抗原と同時に粘膜投与した場合における抗原特異的な抗体産生に及ぼす影響を調べた。斯かるヒトへの病原性微生物の感染モデル系として、病原性微生物の自然感染経路として代表的な鼻腔粘膜及び上気道粘膜での感染防御を想定し、斯かる感染経路の代表的な病原性微生物としてインフルエンザウイルスを選択した。【００７３】
＜抗原＞
抗原として、市販のインフルエンザＨＡワクチン（商品名『インフルエンザＨＡワクチン』、製造株として、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（Ａソ連型）、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）株（Ａ香港型）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８株を用いた製剤、デンカ生研株式会社販売）を生理食塩水で希釈し用いた。【００７４】
＜試験方法＞
＜経鼻投与＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、雌、８週齢）７７匹を、無作為に７匹ずつ１１群に分け、１週間の予備飼育後、５群各７匹には、抗原として用いたインフルエンザＨＡワクチン（以下、「インフルエンザワクチン」という場合がある。）と、アジュバントとして用いた実施例１で調製したＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体標品、ＴＮＦ−αのリオトロピック液晶封入体標品、及び、ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−α標品の何れかとを投与した（試験群５、７、８）。対照１として、生理食塩水のみを投与した（試験群１）。対照２として、インフルエンザワクチンを含む生理食塩水を投与した（試験群２）。対照３として、インフルエンザワクチンと、ＤＤＳ化処理をしていないＴＮＦ−αをアジュバントとして投与した（試験群３）。陽性対照として、インフルエンザワクチンと粘膜アジュバント活性が確認されているコレラトキシンＢサブユニット（和光純薬工業株式会社販売、ロット番号ＣＤＨ６４６２（以下、コレラトキシンＢサブユニットを「ＣＴＢ」と略記する場合がある。）とを投与した（試験群９）。投与は、ＴＮＦ−αタンパク質、コレラトキシンＢサブユニット及びインフルエンザワクチンタンパク質が表２に示す投与量となるように、アジュバントとインフルエンザワクチンとを混合し、１週間に１回の投与スケジュールで、４週間（投与回数４回）連続して、マウスの左右の鼻腔内に１５μｌずつ投与した（合計３０μｌ／匹／回）。アジュバント又は抗原の投与量が０の対照は生理食塩水を混合し、投与した。併せて、ｒｅｃ−ＴＮＦ−α、及び、このｒｅｃ−ＴＮＦ−αを用い、実施例１におけるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合の調製と同じ反応条件によりｒｅｃ−ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を調製し、これらの標品を用いて経鼻投与によるアジュバント活性の確認試験を実施した（試験群４及び試験群６）。【００７５】
なお、ｒｅｃ−ＴＮＦ−αは野生型ＴＮＦ−αをコードするＤＮＡ（例えば、特開２００４−２２５１号公報に記載の配列表における配列番号１で表される野生型ＴＮＦ−αのＤＮＡ配列参照）を、市販のプラスミドベクターへ導入した後、常法に従い、このプラスミドを大腸菌（ＢＬ２１ＤＥ３株）に導入し、得られた形質転換体を培養し、培養物をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを用いて精製したもの（株式会社林原生物化学研究所製造、比活性約２×１０６ＪＲＵ／ｍｇタンパク質）を用いた。【００７６】
＜皮下投与＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、雌、８週齢）１４匹を、無作為に７匹ずつ２群に分け、１週間の予備飼育後、１群７匹のマウスには、抗原としてインフルエンザワクチンを投与した（試験群１０）。残りの１群７匹には、アジュバントであるＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とインフルエンザワクチンとを投与した（試験群１１）。投与は、ＴＮＦ−αタンパク質及びインフルエンザワクチンタンパク質が表２に示す投与量となるように、アジュバントとインフルエンザワクチンとを混合し、飼育開始２週目及び４週目（経鼻投与の場合の１回目及び３回目の投与と同じ投与スケジュール、投与回数２回）に、１００μｌ／匹／回、マウスの背部皮下に投与した（試験群１１）。対照として表２に示す投与量となるように、生理食塩水とインフルエンザワクチンとを混合し、飼育開始２週目及び４週目（経鼻投与の場合の１回目及び３回目の投与と同じ投与スケジュール、投与回数２回）に、１００μｌ／匹／回、マウスの背部皮下に投与した（試験群１０）。なお、実施例１の結果から、ＤＤＳ化したＴＮＦ−αのうち、ハイドロゲルへの吸着ではＤＤＳ化されず、又、リポソームへの封入は、ＤＤＳ化率（リポソーム内への封入率）が極めて低く、ＴＮＦ−αの失活が起こることが判明したので、これらの方法によるＴＮＦ−αのＤＤＳ化は困難と見なし、アジュバント作用の試験は行わなかった。また、リオトロピック液晶へ封入した場合、ハイドロゲルへの吸着とは異なりＴＮＦ−αは、リオトロピック液晶に封入されており、水性溶媒と混合しない状態で投与することができる粘膜投与では、液晶が粘膜組織上で体液（粘液）に接触する割合が低いので、ＴＮＦ−αを比較的長期間投与部位に保持できる可能性があると考え、アジュバント作用の試験に供した。【００７７】
経鼻投与の４回目或いは皮下投与の２回目終了の１週間後に、マウスをエーテル麻酔下で、常法により、血液と鼻腔洗浄液とを採取し、含まれるインフルエンザワクチンに特異的なＩｇＡ抗体量及びＩｇＧ抗体量を、インフルエンザワクチンタンパク質を固相とし、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識抗マウスＩｇＧ抗体或いはＩｇＡ抗体を用い、発色試薬としてオルトフェニレンジアミンを用いるＨＲＰＯによる発色反応に基づく酵素抗体法（ＥＩＡ）により測定した。試験群１乃至９のマウスの血清中のインフルエンザワクチンタンパク質特異的ＩｇＧ抗体（以下、「血中ＩｇＧ抗体」という場合がある）量及び鼻腔内洗浄液中のインフルエンザワクチンタンパク質特異的ＩｇＡ抗体量（抗体価：Ｕ／ｍｌ）を、下記方法により調製した標準品の抗原特異的抗体量に基づき算出した。結果を表２に示す。なお、採取した血液は、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、８分）し、血清を採取し測定に用いた。鼻腔内洗浄液は、生理食塩水を２５０μｌずつマウスの左右の鼻腔内に注入し（合計５００μｌ／匹）これを回収した後、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、８分）し、その上清を測定に用いた。【００７８】
＜ＥＩＡによるＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体定量用の標準品の調製＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、雌、８週齢）２匹を１週間の予備飼育後、インフルエンザワクチンタンパク質が０．３μｇ／３０μｌとコレラトキシンＢサブユニットが０．８μｇ／３０μｌとなるように混合した溶液を、右左の鼻腔に各々１５μｌ／匹／回（計３０μｌ／匹／回）、週１回の投与スケジュールで４週間（合計４回）連続投与した１週間後、フロイントのコンプリートアジュバントに懸濁したインフルエンザワクチンを、インフルエンザワクチンタンパク質として０．３μｇ／３００μｌ／匹、腹腔内投与した。さらに、その１週間後に、フロイントのインコンプリートアジュバントに懸濁したインフルエンザワクチンを、インフルエンザワクチンタンパク質として０．３μｇ／３００μｌ／匹、腹腔内投与した。その１週間後に、両マウスを、エーテル麻酔下で、血液を採取し、血清を分離し混合して、これをインフルエンザワクチンタンパク質特異的ＩｇＧ抗体の標準品とした。また、両マウスより鼻腔内洗浄液を採取し、これを混合して、インフルエンザワクチンタンパク質特異的ＩｇＡ抗体の標準品とした。これらの標準品を適宜稀釈し、上記インフルエンザワクチンタンパク質を固相とする、インフルエンザワクチンタンパク質に対する特異的ＩｇＧ抗体又はＩｇＡ抗体定量用のＥＩＡに供したとき、ＨＲＰＯによる発色値（吸光度）が０．１となる稀釈率の標準品に含まれるインフルエンザワクチンタンパク質特異的ＩｇＧ抗体量又はＩｇＡ抗体量を、各々１単位／ｍｌ（抗体価：Ｕ／ｍｌ）と定義した。ちなみに、これらの標準品は、血清は２００万倍稀釈したとき特異的なＩｇＧ抗体量が１Ｕ／ｍｌとなり、鼻腔内洗浄液は１９２倍稀釈したとき特異的ＩｇＡ抗体量が１Ｕ／ｍｌとなった。なお、本測定系における抗体の検出限界は、ＩｇＡ抗体が６Ｕ／ｍｌ、ＩｇＧ抗体が２１Ｕ／ｍｌであり、以下の実施例における各種抗原に対する抗体価測定系においても、ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の検出感度は、本実施例の場合とほぼ同程度の検出限界値であった。以下の実施例における試験結果を示す表では、抗体量が検出限界以下であった場合、抗体価は「０Ｕ／ｍｌ」と表記した。【００７９】
【表２】
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【００８０】
表２に示すように、インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを同時に経鼻投与した場合、インフルエンザワクチンタンパク質に対する特異的ＩｇＡ抗体の産生が鼻腔内に認められ、特異的ＩｇＧ抗体の産生が血中に認められた（試験群５）。インフルエンザワクチンと、ＴＮＦ−α（試験群３）、ＴＮＦ−α−リオトロピック液晶封入体（試験群７）、ＰＥＧ修飾ＴＮＦ−α（試験群８）或いはコレラトキシンＢサブユニット（試験群９）の何れかとを、同時に経鼻投与した場合、インフルエンザワクチンタンパク質に対する特異的ＩｇＡ抗体の産生が鼻腔内に認められ、特異的ＩｇＧ抗体の産生が血中に認められた。ＩｇＡ抗体の産生量でみると、インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を同時に経鼻投与した場合が最も高く、ＴＮＦ−α、その他のアジュバント同時投与群及びアジュバントなしでインフルエンザワクチンを投与した場合の何れに対しても有意に増強された。血中ＩｇＧ抗体についてみると、インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を投与した場合が最も高く（試験群５）、次いでＴＮＦ−α−リオトロピック液晶封入体を同時に経鼻投与した場合が高かった（試験群７）。アジュバントなしでインフルエンザワクチンを投与した場合（試験群２）にも弱いながら分泌型ＩｇＡ抗体の産生が認められた。皮下投与群では、分泌型ＩｇＡ抗体の産生は、アジュバントなしでインフルエンザワクチンを投与した場合（試験群１０）、或いは、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と同時に投与した場合（試験群１１）の何れでも認められなかったのに対し、血中ＩｇＧ抗体の産生は、何れの場合にも増強され、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体との同時投与で、顕著に増強された（試験群１１）。また、インフルエンザワクチンと、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン（試験群５）又はｒｅｃ−ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン（試験群６）とを同時に経鼻投与した場合、鼻腔内の特異的ＩｇＡ抗体及び血中の特異的ＩｇＧ抗体産生量に差は認められなかった。インフルエンザワクチンと、ＴＮＦ−α（試験群３）又はｒｅｃ−ＴＮＦ−α（試験群４）とを同時に経鼻投与した場合、鼻腔内の特異的ＩｇＡ抗体及び血中の特異的ＩｇＧ抗体産生量に差は認められなかった。試験期間中、ＴＮＦ−α−リオトロピック液晶封入体投与群マウスは（試験群７）、立毛し衰弱気味で、生理食塩水投与群（試験群１）に比して、体重減少が認められたのに対し、他のインフルエンザワクチン及び／又はアジュバント投与群では、生理食塩水投与群と同様の体重の推移を示し、外観的な異常も認められなかった。【００８１】
この結果は、ＴＮＦ−αを粘膜投与アジュバントとして用いる場合、既知のサイトカイン類の安定化方法を適用しても、用いた方法によりＴＮＦ−αの安定化乃至ＤＤＳ化効果は大きく異なり、コレステロールプルランとの複合体を形成するＤＤＳ化、安定化法により、最も好ましいアジュバント作用が得られることを示している。また、そのアジュバント作用は、粘膜アジュバントとして顕著な作用を発揮することが公知のコレラトキシンＢサブユニットよりも強いことから、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は粘膜アジュバントとして極めて有用であることを示している。さらに、斯かる粘膜アジュバント活性は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルランとｒｅｃ−ＴＮＦ−α−コレステロールプルランとでは差異が無いことが判明した。また、ＴＮＦ−α−リオトロピック液晶封入体の投与では、マウスの体重減少、体調不良が発生したことから、この方法でＤＤＳ化したＴＮＦ−αを粘膜投与アジュバントとして用いる場合の安全性には問題があることを示している。
【実施例３】
【００８２】
＜ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の投与回数の抗体産生に及ぼす影響＞
実施例２において、試験に用いたＤＤＳ化したＴＮＦ−αのなかで、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体（以下、「ＴＮＦ／ＣＨＰ」という場合がある。）が最も強いアジュバント作用を示し、且つ、安全性の点でも優れていたので、その投与の回数が、抗原特異的な抗体産生に及ぼす影響を調べた。すなわち、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と抗原（インフルエンザワクチン）とを混合した標品の投与回数を１乃至４回とし、表３に示す組み合わせを用い経鼻投与した以外は、実施例２と同じ条件で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与したときの、インフルエンザワクチン特異的な鼻腔内洗浄液中の分泌型ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＧ抗体量を、実施例２と同じ方法で測定した。結果を表３に示す。【００８３】
【表３】
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【００８４】
表３に示すように、抗原（インフルエンザワクチン）とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを１乃至４回投与すると、投与回数に依存して、抗原特異的な鼻腔内洗浄液中のＩｇＡ抗体量が上昇し、２乃至４回投与すると、投与回数に依存して、抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体量が上昇し、何れの抗体量も４回投与で最も高くなった（試験群１４乃至１６）。これに対し、抗原とＴＮＦ−α溶液（試験群１０乃至１２）、或いは、抗原のみ（試験群６乃至８）を投与した場合にも、投与回数に依存して、抗原特異的な鼻腔内洗浄液中のＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＧ抗体量が上昇したものの、その抗体産生量は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体をアジュバントとして用いた場合に比べ、２乃至４回の何れの投与回数においても、有意に低かった。生理食塩水を投与した場合には、抗原特異的な鼻腔内洗浄液中のＩｇＡ抗体及び血中ＩｇＧ抗体の産生は、何れの投与回数においても認められなかった。この結果は、新規抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを生体に投与する場合、抗原特異的なＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の産生を増強するためには、２回以上、望ましくは３回以上の投与が必要であることを示している。又、既に免疫記憶が成立している抗原乃至それと交叉反応性のある抗原を投与する場合は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を同時に経鼻投与することにより、１回の投与でも抗体産生の増強が可能であり、２回以上の投与でより効率よく投与した抗原に特異的な抗体の産生を増強できると推測される。さらに、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体をアジュバントとして用いた場合（試験群１４）、２回目の投与において、抗原単独投与（試験群６）或いはＴＮＦ−αをアジュバントとして用いた場合（試験群１０）では認められなかった、鼻腔内洗浄液中の分泌型ＩｇＡ抗体の産生が既に認められた。斯かる感染防御に有効な分泌型ＩｇＡ抗体の産生誘導に必要な期間の短縮は、投与した個体に短期間で感染防御能を賦与できることから、感染症の拡大を抑制するための手段として用いられるワクチン類のアジュバントとして極めて有用であることを示している。また、投与期間を通じて、マウスに外観的な異常や死亡個体は見出せなかったので、この実施例で用いた用量、用法では、抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを同時に経鼻投与しても、何ら重篤な副作用は発生しないことが明らかとなった。
【実施例４】
【００８５】
＜ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体及び抗原の投与量＞
ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体及び抗原の投与量が、抗原特異的ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体産生に及ぼす影響を調べた。すなわち、実施例１で調製したＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と抗原（インフルエンザワクチン）とを混合した標品の投与量を表４に示す組み合わせを用い、週１回の投与スケジュールで、３週間経鼻投与した（合計３回）以外は、実施例２と同じ条件で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与したときの、インフルエンザワクチン特異的な鼻腔内洗浄液中のＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＧ抗体量を、実施例２と同じ方法で測定した。結果を表４に示す。【００８６】
【表４】
2013085021.tif 000005
【００８７】
表４に示すように、抗原（インフルエンザワクチンタンパク質）０．００１乃至１０μｇ／匹／回と、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体０．０１乃至５０μｇ（ＴＮＦ−αタンパク質として）／匹／回を同時に、経鼻投与することにより、抗原特異的なＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の産生が誘導され、分泌型ＩｇＡの産生量でみると、抗原０．０１乃至１０μｇ／匹／回の投与量において、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体０．１乃至５０μｇ（ＴＮＦ−αタンパク質として）／匹／回の同時投与が、より抗体産生の増強効率がよいことが判明した。また、血中ＩｇＧ量の産生量も併せてみると、抗原０．１乃至１０μｇ／匹／回の投与量において、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体１乃至５０μｇ（ＴＮＦ−αタンパク質として）／匹／回の同時投与が、より抗体産生の増強効率がよいことが判明した。抗原量が０．１μｇ以上／匹／回では投与量に見合う抗体産生の増強は認められなかった。また、ＴＮＦ−αと抗原とを投与したマウス（試験群３３）及び、ＴＮＦ−α、コレステロールプルランと抗原とを投与したマウス（試験群３５）では、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と抗原とを投与した場合と比べ弱い抗体産生しか認められなかった。ちなみに、通常、マウスの鼻腔の容積は３０μｌ程度、ヒトの鼻腔の容積は２ｍｌ（小人）乃至４ｍｌ（成人）といわれているので、鼻腔容積の比率を考慮すると、抗原及びＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体をワクチンとしてヒトに適用する場合、１回当たりの投与量は、マウスにおける有効投与量の約１００倍となる。また、ＴＮＦ−αと抗原とを投与したマウス（試験群３３）及び、ＴＮＦ−α、コレステロールプルランと抗原とを投与したマウス（試験群３５）では、立毛し衰弱気味で、外見的な異常が観察されたのに対し、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と抗原とを投与したマウスに外観的な異常や死亡個体は、投与期間を通じて見出せなかったので、この実施例で用いた用量、用法では、抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを同時に経鼻投与しても、何ら重篤な副作用は発生しないことが明らかとなった。また、コレステロールプルラン自体にはアジュバント活性はないとの報告もあるが（例えば、『ｎａｔｕｒｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ』、第９巻、第７号、５７２−５７８頁（２０１０年）参照）、この試験系では弱いながらアジュバント活性があることが明らかとなった。
【実施例５】
【００８８】
実施例２乃至４において、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体が、抗原を経鼻投与する際のアジュバントとして極めて有用であり、優れた抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及び／又は分泌型ＩｇＡ抗体の産生増強作用を有することが確認されたので、斯かるアジュバント作用により産生が誘導される抗体が、インフルエンザウイルス感染防御能の直接の指標となる赤血球凝集阻害に及ぼす影響について調べた。すなわち、実施例２において、抗原（インフルエンザワクチン）の投与と同時に、生理食塩水を投与した群（試験群２）、ＴＮＦ−α投与群（試験群３）、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体投与群（試験群５）及びコレラトキシンＢサブユニット投与群（試験群９）から採血して得た血清を用い、その赤血球凝集阻害活性の測定を、市販の体外診断用医薬品（商品名『インフルエンザウイルスＨＩ試薬「生研」』、デンカ生研株式会社販売）を用いて行った。判定は、添付された添付文書の記載に従い、血清の稀釈倍率が１０倍以上で赤血球凝集阻害活性が認められた場合を阻害活性有り（「有」）、認められなかった場合を阻害活性無し（「無」）と判定した。結果を表５に示す。表５の赤血球凝集阻害活性の項以外は表２の値をそのまま転記した。【００８９】
【表５】
2013085021.tif 000006
【００９０】
表５に示すように、抗原（インフルエンザワクチン）の投与と同時にＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を投与した場合には、抗原として用いたワクチンに含まれるＡ型（Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）及びＢ型インフルエンザウイルス全てに対し、赤血球凝集反応の阻害活性有りと判定された（試験群５）。これに対し、抗原（インフルエンザワクチン）の投与と同時にコレラトキシンＢサブユニットを投与した場合には、Ａ型インフルエンザウイルスに対する赤血球凝集反応に対してのみ阻害活性有りと判定された（試験群９）。生理食塩水、または、ＴＮＦ−αを同時に投与した場合には、何れの型のインフルエンザウイルスに対する赤血球凝集反応の阻害活性も無しと判定された（試験群２及び３）。この結果は、抗原と同時にＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を経鼻投与することにより、抗原として投与した３種の型のインフルエンザウイルス全てに対する感染防御能を効率よく賦与できることを示している。アジュバントとしてコレラトキシンＢサブユニットを用いた場合、血中抗体価は上昇しているものの、３種の型全てのインフルエンザウイルスに対する赤血球凝集反応の阻害には不十分であった。ちなみに、実施例４で得た血清につき同様に赤血球凝集反応の阻害活性の有無を確認したところ、ＩｇＧ抗体量が２０，０００Ｕ／ｍｌを越える場合に、いずれも３種の型全てのインフルエンザウイルスに対する赤血球凝集反応の阻害活性が認められた。
【実施例６】
【００９１】
＜インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体との経鼻投与によるインフルエンザウイルス感染に及ぼす影響１＞
実施例２乃至５において、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体が、抗原を経鼻投与する際のアジュバントとして極めて有用であり、感染防御乃至感染後の発病やその重篤化を阻止するために有用な、抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及び／又は分泌型ＩｇＡ抗体の産生増強作用に優れていることが確認されたので、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体のアジュバント作用が、実際に、生体における感染防御能の誘導に有用であることを、ヒトインフルエンザウイルス感染症のモデル動物として汎用されているマウス感染モデルを用いて確認した。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、雌、８週齢）４５匹を、無作為に５匹ずつ９群に分け、インフルエンザワクチン溶液及びＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、同時に、１週間に１回の投与スケジュールで、２乃至４回投与した（試験群７乃至９）。対照１として、インフルエンザワクチン溶液及びＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体に換えて生理食塩水を、同時に、１週間に１回、２乃至４回投与した（試験群１乃至３）。対照２として、インフルエンザワクチン溶液と、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体に換えて生理食塩水とを、同時に、１週間に１回、２乃至４回投与した（試験群４乃至６）。ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体、インフルエンザワクチン及び生理食塩水の投与量は、何れも、３０μｌ／匹／回で、経鼻投与した。【００９２】
抗原として用いたインフルエンザワクチン溶液は、市販のインフルエンザワクチン（商品名『インフルエンザＨＡワクチン』、デンカ生研株式会社販売、製造株として、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１型）（Ａソ連型）、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２型）株（Ａ香港型）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８株を用いた製剤）を、各々の株のウイルス由来のタンパク質として０．３μｇ／３０μｌとなるよう生理食塩水で希釈し投与した。【００９３】
アジュバントとして用いたＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、実施例１の方法で調製したものを、ＴＮＦ−αタンパク質として５μｇ／３０μｌとなるよう生理食塩水で希釈し投与した。１週間の予備飼育後、４回投与に設定したマウスから投与を開始し、投与開始時期を１週間ずつ遅らせて、３回及び２回投与に設定したマウスにも投与を開始し、投与終了時点を全ての試験群で同じとした。【００９４】
所定の投与回数終了の１週間後に、インフルエンザウイルス（ＰＲ８株（Ｈ１Ｎ１型）、１６０ｐｆｕ／５０μｌ（６乃至７週齢マウスに対するＬＤ５０量の１０倍量に相当）を５０μｌ経鼻投与し、その後の生存の確認と体重測定を毎日行った。ウイルス投与時のマウス個体数を１００％とする相対値を求め、各群の平均値を生存率として表６に示す。また、ウイルス投与時の体重を１００％としたときの体重の相対値を求め、１００％から減じ、各群の平均値を体重の変化率として表７に示す。本実施例では、表７において体重変化率がマイナスの値は体重の減少を意味している。変化率がプラス乃至０に近いほど、体重に対する影響が少なく、ウイルス感染が阻止された乃至感染しても症状が軽度であったことを意味する。なお、体重が、ウイルス感染前と比較して２５％（変化率：−２５％）より減少した場合、マウスは死亡したとみなし、安楽死させた。【００９５】
【表６】
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【００９６】
【表７】
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【００９７】
表６及び７に示すように、１週間に１回の投与スケジュールで、３又は４回、インフルエンザワクチンを経鼻投与すると同時に、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体をアジュバントとして経鼻投与した場合、マウスに死亡個体は発生せず、体重の変化率も−５％程度と極めて低かった（試験群８及び９）。１週間に１回の投与スケジュールで２回、インフルエンザワクチンを経鼻投与すると同時にＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を経鼻投与した場合、マウスに死亡個体は発生せず、ウイルス投与後６及び７日目に、最大１２％（変化率：−１２％）の体重の減少が認められたものの、８日目以降は増加に転じた（試験群７）。これに対し、インフルエンザワクチンと生理食塩水を同時に、２回（試験群４）又は３回（試験群５）経鼻投与した場合、ウイルスを投与後８乃至９日目に死亡個体が発生し、それぞれ６０％、８０％の個体が死亡した。この場合、ウイルス投与１０日目以降も生存した個体の体重は、ウイルス投与後７及び８日目に２０％（変化率：−２０％）以上減少し、その後増加に転じた。インフルエンザワクチンのみを４回投与した場合（試験群６）、及び、生理食塩水のみを投与した場合（試験群１乃至３）は、ウイルスを投与後７乃至９日目までに全個体が死亡した。この結果は、インフルエンザワクチンと同時にＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を経鼻投与することにより、ワクチンの単独投与よりもインフルエンザウイルスに対する感染防御能が飛躍的に増強されることを示している。体重の変化率の程度も勘案すると、本実施例で用いた投与量では、インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを、２回投与するよりは３回又は４回投与する方がより効果的に、生体に対し感染防御能を誘導できることを示している。
【実施例７】
【００９８】
＜インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体との経鼻投与によるインフルエンザウイルス感染に及ぼす影響２＞
実施例６において、インフルエンザワクチンとＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを、同時に経鼻投与することにより、インフルエンザウイルスに対する感染防御能を効果的に増強できることが明らかとなったので、本実施例では、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の粘膜投与アジュバントとしての有用性を、粘膜投与アジュバントとしての作用効果に優れていることが確認されているコレラトキシンＢサブユニットと比較する試験を行った。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、雌、８週齢）５０匹を、無作為に１０匹ずつ５群に分け、表８及び９に示す抗原とアジュバントの組み合わせで経鼻投与し、インフルエンザウイルス感染に及ぼす影響を評価した。試験は、マウスを１週間予備飼育後、アジュバントと抗原を、週１回の投与スケジュールで、３回投与し、３回目の投与１週間後にインフルエンザウイルスを投与し、ウイルス投与後の観察期間を１５日間とした以外は実施例６と同じ方法により行った。生存率を表８に、体重変化率を表９に示す。なお、陽性対照として用いたコレラトキシンＢサブユニット（和光純薬工業株式会社販売、ロット番号ＣＤＨ６４６２）は、タンパク質として０．８μｇ／３０μｌとなるよう生理食塩水で希釈し、０．８μｇ／３０μｌ／匹／回経鼻投与した。【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
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【０１０１】
表８及び９で示すように、１週間に１回の投与スケジュールで３回、インフルエンザワクチンを経鼻投与すると同時に、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体をアジュバントとして経鼻投与した場合、マウスの生存率は９０％と極めて高く、体重の変化率も−７％程度と極めて低かった（試験群４）。インフルエンザワクチンを経鼻投与すると同時に、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体に代えてコレラトキシンＢサブユニットを経鼻投与した場合も、マウスの生存率は９０％と極めて高く、体重の変化率も−５％程度と極めて低く（試験群５）、両群間では、生存率や体重の変化率に有意な差は認められず、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体はコレラトキシンＢサブユニットを投与した場合と同様の強いアジュバント活性が確認された。生理食塩水のみを３回投与した場合（試験群１）、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体と生理食塩水とを同時に３回経鼻投与した場合（試験群２）、及び、インフルエンザワクチンと生理食塩水とを同時に３回経鼻投与した場合（試験群３）は、何れも、インフルエンザウイルス投与後１０日までに全ての個体が死滅した。この結果は、インフルエンザワクチンと同時にＴＮＦ−αコレステロールプルラン複合体を経鼻投与することにより、ワクチンの単独投与よりも、インフルエンザウイルスに対する感染防御能が効果的に誘導されることを示している。さらに、感染に用いたインフルエンザウイルスＰＲ８株（Ｈ１Ｎ１型）と抗原として投与したインフルエンザワクチンに含まれているＡ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１型）（Ａソ連型）ウイルスとは抗原性が異なるにもかかわらず（例えば、『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ』、Ｍａｒ．、２９１０−２９１９頁（２００５年）参照）、インフルエンザウイルスＰＲ８株由来のタンパク質を含まないインフルエンザワクチンで免疫したマウスの血清において、ＰＲ８株による赤血球凝集を阻害するＩｇＧ抗体の誘導が確認されたことから、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、交叉防御能を誘導する粘膜投与アジュバントとして有用であり、パンデミックを引き起こすような抗原性の変異を起こした亜型のインフルエンザウイルスに対する感染防御能の誘導にも有用であることが明らかとなった。また、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体のアジュバント作用は、コレラトキシンＢサブユニットと同等であり、経鼻投与アジュバントとして極めて有用であることを示している。さらに、これらの結果は、実施例２における抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及び／又は分泌型ＩｇＡ抗体産生の増強に係る結果及び実施例５における赤血球凝集阻害活性の結果とよく一致していることから、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体のアジュバント作用により増強される病原性微生物に対する感染防御能の増強は、斯かる微生物由来の抗原に対する抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及び／又は分泌型ＩｇＡ抗体の産生の増強によると判断した。
【実施例８】
【０１０２】
＜ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体投与の各種病原性微生物由来の抗原に対する抗体産生に及ぼす影響１＞
実施例２乃至７の結果から、生体にＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の経鼻投与により、経鼻投与した抗原に対する抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体及び血清中のＩｇＧ抗体産生が増強され、その結果、投与した抗原を有する病原性微生物に対し、強い感染防御能を効率よく誘導できることが明らかになったので、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体投与の、インフルエンザ以外の病原性微生物由来の抗原投与時の抗体産生に及ぼす影響を調べた。下記に示す、Ａ型肝炎ワクチン及びジフテリアトキソイドを用い、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の経鼻投与によるアジュバント効果を、コレラトキシンＢサブユニットを用いた場合のアジュバント効果と比較を行った。試験に用いた抗原及びその調製方法を以下に示す。【０１０３】
＜Ａ型肝炎ワクチン＞
市販の乾燥組織培養不活化Ａ型肝炎ワクチン（商品名「エイムゲン」、化学及血清療法研究所製、以下「ＨＡＶ」と略記する場合がある。）添付の説明書に従い、滅菌水を１バイアルあたり０．７ｍｌ加えて希釈した。調製後ＨＡＶは４℃に保存した。投与直前にＨＡＶ（ＨＡＶ由来タンパク質として１μｇ／ｍｌ）４０μｌに対して、ＴＮＦ／ＣＨＰ（ＴＮＦ−αタンパク質として２５０μｇ／ｍｌ）、もしくはＣＴＢ（４０μｇ／ｍｌ）を８０μｌ混和し、３０μｌ／匹投与した（ＨＡＶとして０．０１μｇ／匹／回）。週１回の投与スケジュールで４週間（合計４回）連続して点鼻投与した。以下、投与回数、投与方法、投与スケジュールはいずれの抗原の場合も同様とした。【０１０４】
＜ジフテリアトキソイド＞
市販のジフテリアトキソイド（ＬＩＳＴ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ社販売、以下「ＤＴ」と略記する場合がある。）の凍結乾燥品０．５ｍｇを滅菌水で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、４℃に保存した。投与直前にＤＴ溶液（ジフテリアトキソイドタンパク質として０．１ｍｇ／ｍｌ）４０μｌに対し、ＴＮＦ／ＣＨＰ（ＴＮＦ−αタンパク質として２５０μｇ／ｍｌ）８０μｌ、もしくはＣＴＢ（４０μｇ／ｍｌ）８０μｌを混和し、３０μｌ／匹投与した（ジフテリアトキソイドタンパク質として１μｇ／匹／回）。【０１０５】
＜試験方法＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、８週齢、雌）７２匹を無作為に、８匹ずつ９群に分けた。１週間の予備飼育後、上記調製の２種の抗原の何れか１種と、アジュバントとしてＴＮＦ／ＣＨＰの何れかと含む被験試料を、鼻の右穴と左穴に各１５μｌ／匹／回（計３０μｌ／匹／回）、週１回の投与スケジュールで４週間（合計４回）投与した。また、アジュバントのコントロールとして、生理食塩水を用いた。被験試料の４回目の投与の１週後、マウスをエーテル麻酔下で切開し、血液、鼻腔内洗浄液を採取し、抗原特異的なＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体量を、マウスに投与した抗原を固相とする酵素抗体法により測定した。抗体量は、別途、各抗原につき、ＢＡＬＢ／ｃマウスに試験に用いた抗原とコレラトキシンＢサブユニットとを混合して、左右の鼻腔に各１５μｌ匹／回（計３０μｌ／匹／回）、週１回の投与スケジュールで４週間（合計４回）投与し、同様に、血液、鼻腔内洗浄液を採取し、抗原特異的なＩｇＡ抗体及び、抗原としてＡ型肝炎ワクチンを用いた場合は血中ＩｇＭ抗体量を、ジフテリアトキソイドを用いた場合は血中ＩｇＧ抗体量を、マウスに投与した抗原を固相とする酵素抗体法により測定した。結果を表１０に併せて示す。なお、Ａ型肝炎では、通常血中ＩｇＭ抗体の産生がその感染の指標として用いられるので（例えば、『日本臨床検査自動化学会誌』、第１６巻、第３号、１９４−２００頁（１９９１年）参照）、本実施例においても、抗原特異的な血中ＩｇＭ抗体の産生量を測定して、アジュバント効果を判定した。本実施例におけるＡ型肝炎ワクチン特異的ＩｇＭ抗体の検出限界は２１Ｕ／ｍｌであり、他の実施例で用いた抗原特異的ＩｇＧ抗体検出法の感度と同程度であった。【０１０６】
【表１０】
2013085021.tif 000011
【０１０７】
表１０に示すように、抗原であるＡ型肝炎ワクチン或いはジフテリアトキソイドの何れかと、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを、経鼻投与した場合、投与した各々の抗原に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＭ抗体量又はＩｇＧ抗体量が上昇した。これに対し、これら抗原と共に、アジュバントとしてコレラトキシンＢサブユニット或いはＴＮＦ−αを経鼻投与した場合、投与した各々の抗原に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＭ抗体量又はＩｇＧ抗体量が上昇したものの、その上昇は、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を投与した場合と比較すると有意に低かった。抗原と共に、アジュバントに替えて生理食塩水を投与した場合には、投与した各々の抗原に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＭ抗体量又はＩｇＧ抗体量の上昇は認められなかった。また、投与期間を通じて、マウスに外観的な異常や死亡個体は見出せなかったので、この実施例で用いた用量、用法では、試験に用いたこれらの抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを同時に経鼻投与しても、何ら重篤な副作用は発生しないことが明らかとなった。
【実施例９】
【０１０８】
＜ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体投与の各種病原性微生物由来の抗原に対する抗体産生に及ぼす影響２＞
表１１に示す市販の各種ワクチンを抗原として用い、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体又はＴＮＦ−αを用いた以外は、実施例８と同じ方法により、これらの抗原を経鼻投与すると同時に、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体の経鼻投与した場合の、投与した抗原に対する抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体及び血中ＩｇＧ抗体産生に及ぼす影響を調べた。試験には以下に示す抗原を用いた。【０１０９】
＜抗原＞
肺炎球菌ワクチン（商品名『ニューモバックスＮＰ』、ＭＳＤ株式会社製）、乾燥ＢＣＧワクチン（商品名『乾燥ＢＣＧワクチン』、日本ビーシージー製造株式会社製）、乾燥狂犬病ワクチン（商品名『乾燥組織培養不活化狂犬病ワクチン』、アステラス製薬株式会社製）、乾燥弱毒性水痘ワクチン（商品名『乾燥弱毒性水痘ワクチン「ビケン」』、財団法人阪大微生物病研究会製）及び日本脳炎ワクチン（商品名『ジェービックＶ』、財団法人阪大微生物病研究会製）を、表１１に示す濃度となるように各々生理食塩水で稀釈し用いた。結果を表１１に併せて示す。【０１１０】
【表１１】
2013085021.tif 000012
【０１１１】
表１１に示すように、肺炎球菌ワクチン（試験群３）、乾燥ＢＣＧワクチン（試験群６）、乾燥狂犬病ワクチン（試験群９）、乾燥弱毒性水痘ワクチン（試験群１２）及び日本脳炎ワクチン（試験群１５）の何れかと共に、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を投与した場合、何れも、投与した各々の抗原に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＧ抗体量が上昇した。これに対し、ＴＮＦ−αをアジュバントとして用いた場合は、何れの抗原を用いた場合も、抗原に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＧ抗体量の上昇はごく僅かしか認められなかった。アジュバントに替えて、生理食塩水を投与した場合の抗原特異的な抗体価の上昇は認められなかった。また、投与期間を通じて、マウスに外観的な異常や死亡個体は見出せなかったので、この実施例で用いた用量、用法では、試験に用いたこれらの抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを同時に経鼻投与しても、何ら重篤な副作用は発生しないことが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１１２】
＜抗原（アレルゲン）の経鼻投与による抗体産生に及ぼすＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体投与の影響＞
実施例８及び９において、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体投与が、種々のワクチン類を経鼻投与による分泌型ＩｇＡ抗体や、血中ＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体の産生を効果的に増強できること、その増強効果はＴＮＦ−αに比べて優れていることが明らかとなったので、本実施例では、抗原としてアレルゲンを投与した場合の抗体産生に及ぼす影響を、コレラトキシンＢサブユニットをアジュバントとして用いた場合と比較した。アレルゲンとして、代表的なスギ花粉由来のアレルゲン（以下、「ＳＢＰ」という。）を用いた。
＜試験方法＞
病原性微生物由来の抗原にかえて、表１２に示す投与量のスギ花粉由来のアレルゲンを抗原として用い、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体又はコレラトキシンＢサブユニットを経鼻投与した４時間後に、抗原としてスギ花粉由来アレルゲンを経鼻投与した以外は、実施例９と同一の方法により感作試験を実施し、投与した抗原特異的な鼻腔内洗浄液中の分泌型ＩｇＡ抗体量及び分泌型ＩｇＧ抗体量、血中ＩｇＡ抗体量及び血中ＩｇＧ抗体量を測定した。なお、抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体及び血中ＩｇＧ抗体に対する標準品は、前記ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体の標準品の調製方法と同様の方法で調製した。結果を表１２に示す。【０１１３】
【表１２】
2013085021.tif 000013
【０１１４】
表１２に示すように、抗原（スギ花粉由来アレルゲン：ＳＢＰ）の投与と同時に、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、経鼻投与した場合（試験群２）には、抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体、並びに、鼻腔内洗浄液中のＩｇＡ抗体の産生が増強された。コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）を経鼻投与した場合（試験群４）にも、血中のＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体、並びに、鼻腔内洗浄液中のＩｇＡ抗体の産生が増強された。分泌型ＩｇＡ抗体及び血中ＩｇＡ抗体の産生量は、アジュバントとしてＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を投与した場合とＣＴＢを投与した場合とで有意差は認められなかったものの、抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体量は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を投与した場合の方が遥かに高かった。斯かる抗体価の推移は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、抗原としてアレルゲンを用いる場合のアジュバントとしても有用であることを示している。さらに、これらの実施例１乃至１０の試験結果は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体が、ワクチン類や毒性を有する成分、アレルゲンなどに対する抗体産生を増強するための汎用性の粘膜投与用アジュバントとして有用であることを示している。また、投与期間を通じて、マウスに外観的な異常や死亡個体は見出せなかったので、この実施例で用いた用量、用法では、抗原とＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体とを同時に経鼻投与しても、何ら重篤な副作用は発生しないことが明らかとなった。
【実施例１１】
【０１１５】
＜急性毒性試験＞
ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を有効成分とする本発明による粘膜投与アジュバントの安全性を確認する試験を実施した。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー株式会社販売、８週齢、雄及び雌、平均体重２０ｇ）各３５匹を無作為に、５匹ずつ７群に分け、雌雄各２群各５匹には、実施例１で用いたと同じＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、生理食塩水で希釈して、２００μｌ／匹で経口又は皮下投与した（試験群５及び６）。雌雄各２群各５匹にはアジュバントを含まない生理食塩水２００μｌ／匹で経口又は皮下投与した（試験群２及び３）。また、雌雄各１群５匹には、実施例１で用いたのと同じＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、生理食塩水で希釈して、１５μｌずつ両方の鼻腔内に投与した（合計３０μｌ／匹）で投与した（試験群７）。雌雄各１群５匹にはアジュバントを含まない生理食塩水を１５μｌずつ両方の鼻腔内に投与した（合計３０μｌ／匹）で投与した（試験群４）。残りの雌雄各１群５匹には、対照として、無処置のまま放置した（試験群１）。ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体含有又は含有しない生理食塩水投与４８時間、これらのマウスの外観を観察した後、常法により、剖検し、抗原及びアジュバントの投与部位、並びに、主要臓器の病理組織学的観察により異常の有無の確認をすると共に、血液及び尿を採取し、骨髄機能、腎機能及び肝機能の指標となる臨床検査を行った。無処置マウスも、同様に外観及び病理組織学的観察を行うと共に、骨髄機能、腎機能及び肝機能の指標となる臨床検査を行った。無処置マウスと比較した場合の異常の有無を表１３に併せて示す。試験結果に雌雄による差異は認められなかったので、結果は雌雄に投与した場合をまとめ、表１３に示す。【０１１６】
【表１３】
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【０１１７】
表１３から明らかなように、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、経口及び経鼻投与しても、投与直後から観察終了まで、外観的な変化は認められず、その投与部位や主要臓器の病理組織学的な異常は認められず、骨髄機能、腎機能及び肝機能の指標となる臨床検査値についても、対照のマウス（試験群１）と差は認められず、何れの検討項目においても、毒性学的に問題となる所見は認められなかった。この結果は、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体は、ヒトに経口及び経鼻投与しても、その安全性は極めて高いことを示している。また、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を皮下投与した場合（試験群６）、毒性学的に全身性の異常とは判定されなかったものの、病理組織学的な観察により好中球の軽度の浸潤が観察されたことから、この投与量では、投与部位に軽微な炎症が誘発されているのではないかと推測される。なお、ｒｅｃ−ＴＮＦ−αを用いた以外は、実施例１１と同じ条件で急性毒性試験を実施したところ、その結果は、野生型を用いた実施例１１の場合と有意な差は認められなかった。
【実施例１２】
【０１１８】
＜アジュバント製剤：溶液形態＞
コレステロールプルラン（商品名『ＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ  ＣＰ−１００Ｔ』、日油株式会社販売）の適量を秤量後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））に懸濁し、５５℃の温水浴中で１６時間振盪し溶解した後、ポアサイズが０．２２μｍの膜フィルターを用い濾過滅菌した。このコレステロールプルラン溶液７ｍｌとＤ−ＰＢＳに溶解した実施例１で用いたＴＮＦ−α又は実施例２で用いたｒｅｃ−ＴＮＦ−α（何れもＴＮＦ−αタンパク質量１．４５４ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌのいずれかとを混合し、ポアサイズが０．２２μｍの膜フィルターを用い濾過滅菌した後、３７℃で５日間反応することにより、２種のＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体含有溶液を調製した。この溶液を、各々注射用生理食塩水（商品名『大塚生食注』、大塚製薬株式会社販売）で稀釈し、ＴＮＦ−αタンパク質として２．５、２５及び２５０μｇ／ｍｌの溶液とし、その各々を０．５ｍｌ／バイアルで充填し、粘膜投与用のアジュバント剤を調製した。【０１１９】
本品は、脊椎動物、とりわけ、ヒトにおける病原性微生物の感染防止に用いられるワクチン類、毒性を有する成分、アレルゲンなどの抗原に対する抗体産生の増強を目的として、これらの抗原を粘膜投与する際、通常、成人１回当たり、その０．０１ｍｌ乃至０．２ｍｌを、抗原と同時に、或いは、その前後に粘膜投与することにより、投与した抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及び／又はＩｇＭ抗体、並びに、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ抗体の産生を効果的に増強することができるので、脊椎動物、とりわけ、ヒトにおける病原性微生物に対する感染防御能（交叉防御能を含む）の獲得や、アレルギー疾患などに極めて有用である。また、本品は、種々の抗原と共に生体に投与しても、重篤な副作用の発生のない安全性の高いアジュバント製剤である。
【実施例１３】
【０１２０】
＜アジュバント製剤：凍結乾燥形態＞
実施例１２と同様の方法で、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体及びｒｅｃ−ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、各々ＴＮＦ−αタンパク質として１、１０及び１００μｇ／ｍｌの溶液とし、その各々を０．５ｍｌ／バイアルで充填し、これを常法により、凍結乾燥して、粘膜投与用のアジュバント剤を調製した。【０１２１】
本品は、用時に、注射用精製水に溶解し、脊椎動物、とりわけ、ヒトにおける病原性微生物の感染防止に用いられるワクチン類、毒性を有する成分、アレルゲンなどの抗原に対する抗体産生の増強を目的として、これらの抗原を粘膜投与する際、その０．０１ｍｌ乃至０．２ｍｌを、抗原と同時に、或いは、その前後に粘膜投与することにより、投与した抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及び／又はＩｇＭ抗体、並びに、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ抗体の産生を効果的に増強することができるので、脊椎動物、とりわけ、ヒトにおける病原性微生物に対する感染防御能（交叉防御能を含む）の獲得や、アレルギー疾患などに極めて有用である。また、本品は、種々の抗原と共に生体に投与しても、重篤な副作用の発生のない安全性の高いアジュバント製剤である。
【実施例１４】
【０１２２】
＜粘膜投与用ワクチン製剤：溶液形態＞
実施例１２と同様の方法で、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体及びｒｅｃ−ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、各々ＴＮＦ−αタンパク質として２、２０及び２００μｇ／ｍｌの溶液とした何れかと、抗原として下記表１４に示す成分を、各々生理食塩水で稀釈し、表１４に示すタンパク質濃度に稀釈したワクチン類、トキソイド、アミロイドβペプチド或いはアレルゲンの何れか１種とを等量混合した溶液を、それぞれ、０．５ｍｌ／バイアルで充填して、粘膜投与用の抗体産生増強用組成物を調製した。【０１２３】
本品を、それぞれ、実施例２の方法に準じ、マウスの左右の鼻腔内に、１５μｌ／回／匹ずつ、２乃至４回、経鼻投与したところ、何れの組成物も、それに含まれる抗原特異的な、分泌型ＩｇＡ抗体、血中ＩｇＧ抗体及び／又は血中ＩｇＭ抗体の産生が増強され、それら抗体の産生量は、投与回数に依存して増強された。本品は、通常、成人或いは成獣１回あたり、その０．０１ｍｌ乃至０．２ｍｌを、１乃至４回程度、望ましくは、３乃至４回、粘膜投与することにより、配合した抗原に対する抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体、並びに、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ抗体の産生を効果的に増強することができるので、投与した抗原がワクチン類の場合、その抗原が由来する病原性微生物に対する感染防御能（交叉防御能を含む）の獲得、さらには、感染症の発症予防乃至重篤化の抑制に極めて有用である。また、投与した抗原がトキソイドの場合、その抗原が由来するトキシンによる感染症の発症を効果的に予防することができる。投与した抗原がアミロイドβペプチドの場合、アルツハイマー病等のアミロイドβペプチドの毒性により引き起こされる各種疾患の発症予防乃至重篤化の抑制に有用である。投与した抗原がアレルゲンの場合、斯かるアレルゲンに起因するアレルギーの発症を抑制乃至その症状の軽減に有用である。また、本品は、生体に投与しても、重篤な副作用の発生のない安全性の高い粘膜投与用の組成物である。【０１２４】
【表１４】
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【実施例１５】
【０１２５】
＜粘膜投与用ワクチン製剤：凍結乾燥品形態＞
実施例１２と同様の方法で、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体及びｒｅｃ−ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を、各々ＴＮＦ−αタンパク質として２．５、２５及び２５０μｇ／ｍｌの溶液とした何れかと、抗原として上記表１４に示す、経口生ポリオワクチン以外の成分を、各々生理食塩水で稀釈し、表１４に示すタンパク質濃度に稀釈したワクチン類、トキソイド、アミロイドβペプチド或いはアレルゲンの何れか１種とを等量混合した溶液を、それぞれ、０．５ｍｌ／バイアルで充填し、これを常法により、凍結乾燥して、粘膜投与用のワクチン製剤を調製した。【０１２６】
本品を、各々０．５ｍｌの注射用精製水に溶解し、実施例２の方法に準じ、マウスの左右の鼻腔内に、１５μｌ／回／匹ずつ、２乃至４回、経鼻投与したところ、何れの組成物も、それに含まれる抗原特異的な、分泌型ＩｇＡ抗体、血中ＩｇＧ抗体及び／又は血中ＩｇＭ抗体の産生が増強され、それら抗体の産生量は、投与回数に依存して増強された。本品は、用時に、注射用精製水に溶解し、通常、成人或いは成獣１回あたり、その０．０１ｍｌ乃至０．２ｍｌを、１乃至４回程度、望ましくは、３乃至４回、粘膜投与することにより、配合した抗原に対する抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体、並びに、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ抗体の産生を効果的に増強することができる。また、本品は、粘膜組織以外の部位へ経皮経路で投与することにより、投与した抗原特異的な血中ＩｇＧ抗体の産生を効果的に増強することができるので、投与した抗原が病原性微生物に対する感染防御用のワクチン類の場合、その抗原が由来する病原性微生物に対する感染防御能（交叉防御能を含む）の獲得、さらには、感染症の発症予防乃至重篤化の抑制に極めて有用である。また、投与した抗原がトキソイドの場合、その抗原が由来するトキシンによる疾患の発症を効果的に予防することができる。投与した抗原がアミロイドβペプチドの場合、アルツハイマー病等のアミロイドβペプチドの細胞毒性により引き起こされる各種疾患の発症予防乃至重篤化の抑制に有用である。投与した抗原がアレルゲンの場合、斯かるアレルゲンに起因するアレルギーの発症を抑制乃至その症状の軽減に有用である。また、本品は、生体に投与しても、重篤な副作用の発生のない安全性の高い粘膜投与用の組成物である。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
以上のように、ＴＮＦ−α−コレステロールプルラン複合体を有効成分として含有する本発明の経粘膜アジュバントは、粘膜投与或いはそれ以外の部位へ経皮経路で投与した抗原に対する抗体産生を効果的に増強できるアジュバントとして、及び、斯かるアジュバントと抗原とを有効成分として含有する抗体産生増強用組成物は、粘膜或いはそれ以外の部位へ経皮経路で投与した抗原に対する抗体産生を効果的に増強できる組成物として、ワクチンなどの医薬品を製造する業界や、試薬、臨床診断薬用の抗体を製造する業界において利用することができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【国際調査報告】
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