(57)【要約】要約  特定のペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤が開示されている。該ペプチドは、ヒト悪性脳腫瘍に過剰に発現しているGPNMB中の特定の領域に存在する部分ペプチドであり、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有する。さらに、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞は、GPNMBを発現する癌細胞を障害する能力を有する。このため、該ペプチドは、癌の治療及び／又は予防剤並びに抗原提示細胞の処理剤として利用可能な免疫誘導剤の調製に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有する免疫誘導剤。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。
【請求項２】
前記(b)のペプチドが前記(a)のペプチドと８５％以上の相同性を有する請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
前記免疫誘導活性を有するペプチドが、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416若しくはaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド又は前記ペプチドを部分配列として含みアミノ酸残基数が８〜３０であるペプチドである請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
前記免疫誘導活性を有するペプチドが、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチドである請求項３記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
前記免疫誘導活性を有するペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
ペプチドを有効成分として含有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
癌の治療及び／又は予防剤である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項８】
抗原提示細胞の処理剤である請求項６記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。
【請求項１０】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。
【請求項１１】
請求項９記載の単離抗原提示細胞又は請求項１０記載の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬。
【請求項１２】
請求項９記載の単離抗原提示細胞又は請求項１０記載の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤。
【請求項１３】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターの有効量を個体に投与することを含む、免疫誘導方法。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。
【請求項１４】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチドと抗原提示細胞とを接触させることを含む、抗原提示細胞の処理方法。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。
【請求項１５】
請求項９記載の単離抗原提示細胞又は請求項１０記載の単離Ｔ細胞の有効量を個体に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
【請求項１６】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターの、免疫誘導剤の製造のための使用。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。
【請求項１７】
請求項９記載の単離抗原提示細胞又は請求項１０記載の単離Ｔ細胞の、医薬の製造のための使用。
【請求項１８】
請求項９記載の単離抗原提示細胞又は請求項１０記載の単離Ｔ細胞の、癌の治療及び／又は予防剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの癌に特異的なタンパク質又はその部分ペプチドを含む免疫誘導剤に関する。さらに本発明は、上記ペプチドによって刺激され誘導された活性化Ｔ細胞、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む抗原提示細胞、及び上記活性化Ｔ細胞又は上記抗原提示細胞を有効成分として含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。【０００３】
近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１を参照）。１９９１年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原MAGE1を単離した（非特許文献２を参照）。Boonの報告後ＣＤ８陽性Ｔ細胞の認識する抗原としてtyrosinase（非特許文献３を参照）、MART1/MelanA（非特許文献４を参照）、gp100（非特許文献５を参照）などの単離が行われた。【０００４】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるタンパク質は、正常細胞には少なく、癌細胞に過剰に存在していることが望ましい。また抗原タンパク中に、抗原を発現した腫瘍を直接障害する抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチド部分に加えて、細胞障害性Ｔ細胞の活性を補助する抗原特異的ヘルパーＴ細胞を誘導できるペプチド部分も含まれていることが望ましい。【０００５】
最近、Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B（以下GPNMBと略記する）が、大部分のヒト悪性脳腫瘍に過剰に発現していることが報告された。一方、本タンパク質は正常脳組織にはほとんど発現していない（非特許文献６を参照）。【０００６】
【非特許文献１】秋吉毅，「癌と化学療法」、1997年、第24巻、p551-519
【非特許文献２】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献３】Robbins P.F. et al., Cancer Res., 54:3124-3126(1994)
【非特許文献４】Kawakami Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9):3515-3519(1994)
【非特許文献５】Kawakami Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6458-6462(1994)
【非特許文献６】Kuan C.T. et al.,Clin.Cancer Res., 12(7):1970-1982(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤として有用なペプチドを見出し、該ペプチドの免疫誘導剤としての用途を提供することである。また、本発明の目的は、該ペプチドの癌の治療及び／又は予防剤としての用途並びに抗原提示細胞を処理する処理剤としての用途を提供することである。さらに本発明の目的は、該ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞、及びペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する単離Ｔ細胞並びにそれらの癌の治療及び／又は予防剤の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する上記GPNMB中の特定の領域に存在する部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、さらに、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞がGPNMBを発現する癌細胞を障害する能力を有することを見出し、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であること、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、(a) 配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド、(b) (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド、並びに(c) (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチドのいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有する免疫誘導剤を提供する。また、本発明は、上記(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を提供する。さらに、本発明は、上記(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞を有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、上記(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターの有効量を個体に投与することを含む、免疫誘導方法を提供する。さらに、本発明は、上記(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチドと抗原提示細胞とを接触させることを含む、抗原提示細胞の処理方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞の有効量を個体に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法を提供する。さらに、本発明は、上記(a)ないし(c)のいずれかのペプチドであって免疫誘導活性を有するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターの、免疫誘導剤製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞の、医薬の製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の単離抗原提示細胞又は上記本発明の単離Ｔ細胞の、癌の治療及び／又は予防剤製造のための使用を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、癌の治療及び／又は予防や、そのための抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用なペプチドが新規に同定され、医学分野における該ペプチドの各種用途が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、上記ペプチドにより活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、GPNMBを発現する癌細胞に対して優れた細胞障害活性を示す。従って、本発明で用いられる上記ペプチドは、これをヒトに投与することにより、又はこれを用いてインビトロで活性化Ｔ細胞をヒトに投与することにより、癌の治療及び／又は予防に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が、該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。
【図２】配列番号４ないし７に示すアミノ酸配列を有する各ペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が、該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。
【図３】配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示した図である。
【図４】配列番号４ないし７に示すアミノ酸配列を有する各ペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示した図である。
【図５】配列番号３ないし７に示すアミノ酸配列を有する各ペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるペプチドは、以下に挙げるペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。
(a)  配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中のaa265-274、aa303-311、aa408-416又はaa495-504の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(b)  (a)のペプチドと８０％以上の相同性を有し、７個以上のアミノ酸から成るペプチド。
(c)  (a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であるペプチド。【００１３】
なお、「aa」は、アミノ酸配列のＮ末端（すなわち配列表に示すアミノ酸配列の第1番アミノ酸）から数えて何番目のアミノ酸残基かを示す。例えば「aa408」は、Ｎ末端から数えて４０８番目のアミノ酸残基であることを示し、「aa408-416の領域」は、Ｎ末端から数えて408番目のアミノ酸残基から416番目のアミノ酸残基までの９個のアミノ酸残基から成る領域を示す。【００１４】
ここで、「免疫誘導活性」とは、GPNMBを発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させる能力を意味し、具体的には、下記実施例に詳述する方法により測定される、ペプチドで刺激されたＴ細胞のIFN-γ産生能力及び／又はGPNMB発現癌細胞に対する細胞障害活性が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりも高く、かつ、ペプチドで刺激されたＴ細胞が、ペプチドで刺激していない対照のＴ細胞よりもよく増殖することを意味する。増殖は、目視観察、フローサイトメトリー、培地中のトリチウムチミジンの細胞内への取り込み量等により確認することができる。なお、下記実施例で採用したIFN-γ産生能力の測定は、例えばJ.Immunol.,154,p2257,1995に記載されており、また、細胞障害活性の測定は、Int.J.Cancer,58:p317,1994に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法に準拠している。【００１５】
上記(a)のペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列（GPNMBのアミノ酸配列）中の、aa265-274、aa303-311、aa408-416及びaa495-504の領域のうちのいずれかの領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成り、かつ、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性部分ペプチド」と言うことがある）である。このようなペプチドの好ましい例としては、配列番号３から配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらのペプチドの配列表中の配列番号、そのアミノ酸配列、及び配列番号２中の位置を下記表１に示す。なお、この分野において、抗原提示細胞上に提示される抗原ペプチドのサイズは、通常、７〜３０アミノ酸残基程度であり、最低でも７個のアミノ酸残基から成るペプチドであれば抗原性を発揮することが知られている。なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」とは、Ser Leu Ile Asp Phe Val Val Thr Cysのアミノ酸配列を持つ９アミノ酸残基のサイズのペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド」を「配列番号３のペプチド」と略記することがある。【００１６】
【表１】
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【００１７】
上記(b)のペプチドは、(a)のペプチドのうちの少数のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入され、元の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上の相同性を有し、かつ、免疫誘導活性を有する、７個以上のアミノ酸から成るペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性修飾ペプチド」と言うことがある）である。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤等の調製に用いることができる。また、上記(b)のペプチドは、(a)のペプチドのうち、１個のアミノ酸残基が置換し、欠失し又は挿入されたペプチドであることも好ましく、もとの(a)のペプチドが１０個のアミノ酸残基から成る場合には、そのうちの２個のアミノ酸残基がそれぞれ置換し、欠失し又は挿入されたペプチドも好ましい。具体的には、(b)のペプチドの好ましい例としては、例えば、配列番号３ないし７に示すアミノ酸配列のうち１個のアミノ酸が置換し、欠失し又は挿入されたアミノ酸配列を有するペプチドや、配列番号６に示すアミノ酸配列のうち２個のアミノ酸がそれぞれ置換し、欠失し又は挿入されたアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。【００１８】
ここで、アミノ酸配列の「相同性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、相同性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、上記(a)のペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。【００１９】
上記(c)のペプチドは、(a)又は(b)のペプチドを部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜３０であって、免疫誘導活性を有するペプチドである。すなわち、(a)又は(b)のペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はペプチドが付加されたものであって、アミノ酸残基数が８〜３０であり、免疫誘導活性を有するペプチド（以下、便宜的に「免疫誘導性付加ペプチド」と言うことがある）である。これらのペプチドも、本発明の免疫誘導剤等の調製に用いることができる。このような免疫誘導性付加ペプチドの具体例としては、例えば、Hisタグ等を付加した形態にあるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。【００２０】
本発明で用いられる上記ペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でペプチドを生産させることにより、目的とするペプチドを得ることができる。上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、GPNMB遺伝子を発現する組織から抽出したＲＮＡから、GPNMB遺伝子のcDNAをＲＴ−ＰＣＲにより調製して得ることができる。また、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に調製することができる。GPNMBのアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、また、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示す通りであるから、該塩基配列を参照すれば、配列番号２の一部から成る上記した免疫誘導性部分ペプチドを容易に調製することができる。配列番号１中の部分配列と同一の塩基配列の他、その保存的置換塩基配列（コードするアミノ酸配列が同じで塩基配列が異なるもの）を用いることもできる。なお、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した免疫誘導性修飾ペプチド及び免疫誘導性付加ペプチドをコードするポリヌクレオチドも、塩基配列を容易に特定することができ、調製は容易である。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。【００２１】
下記実施例に具体的に記載されるように、上記ペプチドは、免疫誘導活性を示す。すなわち、該ペプチドで刺激したＴ細胞は、GPNMBを発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示し、増殖する。従って、該ペプチドを有効成分として含む免疫誘導剤を癌患者に投与すれば、患者の癌を治療することができる。また、該免疫誘導剤を癌の発症前に生体に投与すれば、該生体にあらかじめ該ペプチドに対する免疫を誘導することができるので、癌を予防することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療にも予防にも有用である。【００２２】
本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防剤として用いる場合、対象となる癌としては、GPNMBを発現している癌を挙げることができ、脳腫瘍、メラノーマ、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、肺または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができる。また、投与対象は、哺乳動物であり、特にヒトが好ましい。【００２３】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。また、投与量は、免疫誘導するのに有効な量、すなわち、GPNMBを発現する癌細胞に反応するＴ細胞を活性化および増殖させるのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。投与量は、症状、使用目的等に応じて適宜選択されるが、通常、有効成分量で0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜100mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。【００２４】
本発明の免疫誘導剤は、ペプチドのみから成っていてもよいし、また、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体及び／又は希釈剤を用いて製剤することもできる。製剤方法及びそのための各種担体は、医薬製剤の分野において周知である。薬理学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、生理緩衝液のような緩衝液や、賦形剤（砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）であってよく、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等）等が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などによる非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。【００２５】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができるアジュバントや各種サイトカイン等の因子と組み合わせて用いることができる。これにより、免疫誘導剤の免疫誘導活性を高めることができるので、例えば癌の治療及び／又は予防剤として用いる場合には、癌の治療及び／又は予防効果を高めることができる。【００２６】
アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願WO96/33739（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ；ポリＩＣＬＣならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。好ましくは、ペプチドは、フロイントの不完全アジュバントもしくはモンタニドと混合されて投与される。上記アジュバントとペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントはこれらに限定されず、当業界で既知のその他のアジュバントも本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。【００２７】
対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγおよびＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も、本発明の免疫誘導剤に含ませて、又は別個の組成物として、本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。【００２８】
下記実施例において具体的に記載されるように、本発明で用いられる上記ペプチドと、抗原提示細胞をインビトロで接触させることにより、該ペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞の処理剤として用いることができる。ここで、抗原提示細胞としては、ＨＬＡクラスI又はＨＬＡクラスII分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＨＬＡクラスI及びＨＬＡクラスII分子が同定されており、周知である。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。ＨＬＡクラスII分子としては、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPを挙げることができる。【００２９】
ＨＬＡクラスI又はＨＬＡクラスII分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜8週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。【００３０】
本発明で用いられる上記ペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は周知の方法により行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。すなわち、抗原提示細胞を、上記ペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、103細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。【００３１】
上記したペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のHLA分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞をも提供する。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ペプチドを提示し、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させる。【００３２】
上記のようにして調製される、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、抗原提示細胞をＴ細胞をインビトロで接触させることにより、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。なお、本明細書において、上記のように、ペプチドを抗原提示細胞の表面に提示させるためにペプチドを抗原提示細胞の培養液に加えることを、「ペプチドで細胞をパルスする」と呼ぶことがある。また、上記ペプチドを提示する抗原提示細胞とＴ細胞を接触させることを、「ペプチドでＴ細胞を刺激する」と呼ぶことがある。【００３３】
上記の共存培養により、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。本発明は、このような、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞をも提供する。【００３４】
上記ペプチドを提示する上記抗原提示細胞は、生体内においても該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、これを生体に投与することにより癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。また、上記ペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、Ｔ細胞は、GPNMBを発現する癌細胞に対して細胞障害活性を示すので、該Ｔ細胞を生体に投与することによっても癌の治療及び／又は予防を行なうことができる。従って、本発明は、上記本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤、並びに上記本発明のＴ細胞を有効成分として含有する医薬、並びに癌の治療及び／又は予防剤をも提供する。治療対象となる癌の例としては、当然ながら、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌の治療及び／又は予防剤の対象として上記した癌を挙げることができる。【００３５】
生体に投与する抗原提示細胞又はＴ細胞は、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように本発明で用いられる上記(a)ないし(c)のペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。【００３６】
抗原提示細胞又はＴ細胞を有効成分として含む医薬、特に癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。【００３７】
また、上記(a)ないし(c)のペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記した(a)ないし(c)のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。このような、生体内で抗原ペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。【００３８】
遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。そのようなベクターは種々のものが市販されており、市販品を好ましく用いることができる。例えば、市販のベクターのマルチクローニング部位に、上記(a)ないし(c)のペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、上記組換えベクターを得ることができる。なお、上記ペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。【００３９】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。【００４０】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。【００４１】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。【００４２】
本発明で用いられる上記ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。【００４３】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。【００４４】
一方、大腸菌や酵母菌などの微生物用のベクターも周知であり、種々のものが市販されている。微生物用のベクターに上記ポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、本発明で用いられる上記ペプチドを遺伝子工学的に大量生産するために用いることができる。微生物への組換えベクターの組み込みは周知の方法により行なうことができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。【００４６】
実施例１：GPNMB由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）ヒトGPNMBタンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201結合モチーフ予測のため、公知のBIMASソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトGPNMBタンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスI分子に結合可能と予想されるペプチドを選択した。これらのペプチドは、市販のペプチド合成機を用いて常法により調製した。【００４７】
（２）HLA-A0201陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して1,500rpmで室温で２０分間遠心分離した。末梢血単核球（PBMC）を含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、PBMCを得た。得られたPBMCをAIM-V培地（Life Technololgies, Inc., Grand Island, NY）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。【００４８】
一方、付着細胞をAIM-V培地中でIL-4（1000U/ml）およびGM-CSF（1000U/ml）の存在下で培養した。６日後にIL-4（1000U/ml）、GM-CSF（1000U/ml）、IL-6（1000U/ml、Genzyme, Cambridge, MA）、IL-1β（10ng/ml、Genzyme, Cambridge, MA）およびTNF-α（10ng/ml、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したAIM-V培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。【００４９】
（３）調製した樹状細胞をAIM-V培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（3000rad）し、AIM-V培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、IL-6（1000U/ml）およびIL-12（10ng/ml、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するAIM-V培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、IL-7（10U/ml、Genzyme, Cambridge, MA）およびIL-2（10U/ml、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するAIM-V培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。【００５０】
実施例２：HLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するGPNMB由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、本発明の範囲内のペプチドである配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。本Ｔ細胞の配列番号３のペプチドに対する特異性を調べるために、ペプチドでパルスされた、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（文献及び入手先：Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をELISA法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号３のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において顕著なＩＦＮ−γ産生が確認された（図１）。従って、配列番号３のペプチドは特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。同様にして、特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有する配列番号４から配列番号７に記載の４種のペプチドを同定した（図２）。【００５１】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。参照番号２はGPNMB由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドＡＹＭＲＥＨＮＱＬ（配列番号８）についての結果を示す（比較例１）。参照番号３はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例２）。また、図２中、横軸の参照番号４から７は、それぞれ、配列番号４から配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号８はGPNMB由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号８のペプチドについての結果（比較例３）、横軸の参照番号９はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例４）。【００５２】
（２）次に、本発明の範囲内のペプチドの１つである配列番号３のペプチドが、HLA-A0201陽性でGPNMBを発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A0201陽性でGPNMBを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。GPNMBの発現が確認されている悪性脳腫瘍細胞株、Ｕ２５１（ピッツバーグ大学岡田博士からの供与）を１０５個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個づつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された５ｘ１０４、２．５ｘ１０４、１．２５ｘ１０４および６．２５ｘ１０３個の配列番号３のペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。また同時に、上記と同じ条件で調製した各細胞に、配列番号３のペプチドでパルスされた、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中、配列番号３のペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）１０４個を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、配列番号３のペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＵ２５１に対する細胞障害活性を有することが判明した（図３中●で示す）。従って、本発明のペプチドの１つである配列番号３のペプチドは、HLA-A0201陽性でGPNMBを発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。なお、本ペプチドでパルスされたＴ２細胞を加えた穴の培養上清は、放出されるクロミウム５１の量が少なく、Ｕ２５１に対する細胞障害活性は検出されなかった（図３中○で示す）。これは、クロミウム５１を細胞内に取り込んでいない本ペプチドでパルスされたＴ２細胞（Ｕ２５１の１０倍量の細胞を添加）によって、本ペプチド特異的にＵ２５１に対する細胞障害活性の競合阻害が起こったためである。この結果により、Ｕ２５１に対する細胞障害活性が、本ペプチド特異的に起こっていることが証明された。同様にして、配列番号４から配列番号７に記載の４種のペプチド各々で刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞はＵ２５１に対して細胞障害活性を示した（図４）。さらに、配列番号３から配列番号７に記載の５種のペプチド各々で刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、GPNMBの発現が確認されている別の悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（Stein GH et al.,J. Cell Physiol., 99:43-54(1979)、ＡＴＣＣより購入）に対して細胞障害活性を示した（図５）。【００５３】
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明の範囲内の各ペプチドで刺激誘導されたCD8陽性T細胞５ｘ１０４個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８ＧおよびＵ２５１とを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したCD8陽性T細胞のＵ２５１およびＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を示した結果である。＊式：細胞障害活性（％）＝CD8陽性T細胞を加えた際のＵ２５１およびＴ９８Ｇからのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００【００５４】
なお、図４中、横軸の参照番号１０〜１３は、それぞれ、配列番号４から配列番号７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号１４はGPNMB由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号８のペプチドについての結果（比較例５）、横軸の参照番号１５はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例６）。また、図５中、横軸の参照番号１６〜２０は、それぞれ、配列番号３から配列番号７のペプチドについての結果を示す。さらに、横軸の参照番号２１はGPNMB由来ペプチドの１つであるが本発明の範囲外のペプチドである配列番号８のペプチドについての結果（比較例７）、横軸の参照番号２２はペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果を示す（比較例８）。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明で用いられるペプチドは、癌の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用であり、また、癌の治療及び／又は予防剤として利用できる抗原提示細胞やＴ細胞の誘導に有用である。
【図１】
2009054470.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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