(57)【要約】【課題】  本発明は、血管新生を抑制することのできる、新たなポリペプチドとその利用を提供することを目的とする。【解決手段】  配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が１２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチド。本発明のポリペプチドは、血管新生抑制作用を有しており、ＰＥＤＦと比較してより低分子のポリペプチドであり、生体、特に患部への浸透性乃至吸収性に優れる。
2009116529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が１２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸残基数が２０以下である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１〜３に示されるいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり血管新生抑制作用を有するポリペプチドを有効成分とする乾癬治療剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする乾癬治療剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする腫瘍細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、血管新生抑制用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、乾癬治療用医薬組成物。
【請求項１２】
外用剤である、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生が関与する疾患の治療もしくは予防に有効なポリペプチド、当該ポリペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤、または当該ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの体内において、血管の新生は、血管新生を促進する因子と血管新生を抑制する因子との機能的バランスによる厳密な制御の下で、例えば創傷の治癒や月経周期の特定段階等の適切な時期あるいは部位でのみ、誘導される。【０００３】
しかしながら、いくつかの疾患では、何らかの理由によってかかる制御が不能となり、望ましくない血管新生が誘導され、症状をより深刻なものとしていることが知られている。例えば、糖尿病性網膜症や加齢黄斑変性症では、虹彩、網膜または視神経における新血管形成が観察されており、重篤な視覚喪失をもたらすことが知られている。また、多くの固形腫瘍においても血管新生が誘導されており、新たに形成された血管は、腫瘍細胞へ血液を供給して腫瘍を成長させて周辺の正常組織の損傷を招くと共に、血流を介した他の部位や組織への腫瘍細胞の転移も促すことが知られている。【０００４】
血管新生の制御に関与する因子のいくつかは既に同定されている。血管新生を促進する因子の代表例としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）のアルファサブユニット、免疫グロブリンスーパーファミリーの１１０ｋＤａメンバー、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）およびアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）等がある。また、内皮細胞表面で発現された膜貫通タンパク質チロシンキナーゼの一種であるＦｌｔ−１やＦＬｋ−１／ＫＤＲ受容体も、ＶＥＧＦと結合して周辺組織での最終的な血管新生を起こす細胞シグナルのカスケードを惹起することから、これらも血管新生促進因子として理解することができる。【０００５】
一方の血管新生を抑制する因子の代表例としては、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、エンドスタチン、ＴＩＭＰ−３等を挙げることができる。これらの血管新生抑制因子は、血管新生が誘導されている部位に投与されることによって、血管新生を抑制し、一定の治療効果を奏することが報告されている。例えば、ＰＥＤＦを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを投与したモデル動物において、網膜上皮細胞における毛血管新生の抑制が確認されている（特許文献１）。また、アンジオスタチンを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを投与したモデル動物においても血管新生が抑制されることが、さらに未熟児網膜症のマウスモデルへのエンドスタチンの網膜下注射も網膜の血管新生を抑制することが、それぞれ知られている（特許文献２）。【０００６】
これら血管新生抑制因子の中でも、ＰＥＤＦ（非特許文献１）は強力な血管新生抑制作用を有していることから、ＰＥＤＦの血管新生抑制剤としての応用が、注目を集めている（例えば特許文献１、特許文献３等）。【０００７】
また、特許文献４は、血管透過性または血管新生の亢進が関与する疾患の治療に、ＰＥＤＦまたはＰＥＤＦの７８〜１２１番目のアミノ酸配列からなる４４アミノ酸残基を有するポリペプチド（ＰＥＤＦ４４ＡＡペプチド）を用いることを提唱している。特許文献１では、ＰＥＤＦに認められている生理的機能の全てが、前記４４アミノ酸の領域に存在し、特にそのなかの特定のアミノ酸残基が、ＰＥＤＦおよびＰＥＤＦ４４ＡＡペプチドの機能発現に必須であると結論している。【０００８】
【非特許文献１】Ｓｔｅｅｌｅら、１９９３年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ、第９０巻、第４号、第１５２６−１５３０頁
【特許文献１】特表２００７−５２８９０３号公報
【特許文献２】特表２００４−５１７１１７号公報
【特許文献３】特表２００４−５１６００１号公報
【特許文献４】特表２００７−５０９９８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、血管新生を抑制することのできる、新たなポリペプチドとその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＰＥＤＦに代わる、血管新生抑制活性を有する新たなポリペプチドを探索した結果、意外なことに、ＰＥＤＦの７８〜１２１番目のアミノ酸の領域とは全く異なる、ＰＥＤＦのＣ末端近辺に位置する特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、血管新生抑制効果を示すことを見いだし、下記の各発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。【００１１】
（１）配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が１２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチド。【００１２】
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、（１）に記載のポリペプチド（Ｆ３）。【００１３】
（３）アミノ酸残基数が２０以下である、（１）に記載のポリペプチド。【００１４】
（４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる、（３）に記載のポリペプチド（Ｐ５）。【００１５】
（５）配列番号１〜３に示されるいずれかのアミノ酸配列からなる、（１）に記載のポリペプチド（Ｐ５−１〜３）。【００１６】
（６）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり血管新生抑制作用を有するポリペプチド（ＰＥＤＦ）を有効成分とする乾癬治療剤。【００１７】
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする血管新生抑制剤。【００１８】
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする乾癬治療剤。【００１９】
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする腫瘍細胞増殖抑制剤。【００２０】
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、血管新生抑制用医薬組成物。【００２１】
（１１）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、乾癬治療用医薬組成物。【００２２】
（１２）外用剤である、（１０）または（１１）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のポリペプチドは、血管新生抑制作用を保持した、ＰＥＤＦと比較してより低分子のポリペプチドであり、皮膚バリア等の生体が有する異物侵入に対する防御機構を乗り越えることができ、生体、特に患部への浸透性乃至吸収性に優れるという特徴を有する。また、より低分子のポリペプチドは化学合成によって製造することが可能であり、組み換え的に製造することが要求されるＰＥＤＦの製造よりも、安価かつ大量に製造することができることから、医薬製造コストを大幅に減ずることができる。さらに、低分子ポリペプチドは、巨大分子であるタンパク質等と比べて一般に安定性に優れており、当該ポリペプチドを様々な形態を有する医薬として利用するにおいて有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＰＥＤＦに対する各ポリペプチドの配置を示した模式図である。
【図２】ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３に対するＰＥＤＦおよびポリペプチドＦ１〜Ｆ３の増殖抑制効果を示すグラフ図である。図中、ＣｏｎはＰＢＳを添加したコントロールを示す。
【図３】ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３に対するポリペプチドＰ１〜Ｐ６の増殖抑制効果を示すグラフ図である。図中、ＣｏｎはＰＢＳを添加したコントロールを示す。
【図４】ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３に対するポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３の増殖抑制効果を示すグラフ図である。ＣｏｎはＰＢＳを添加したコントロールを示す。
【図５】ＨＵＶＥＣｓに対するポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３の増殖抑制効果を示すグラフ図である。図中、ＣｏｎはＰＢＳを添加したコントロールを示す。
【図６】マウス背部に移植された乾癬患者由来の皮膚の厚みの変化を示すグラフ図である。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅはランダムな配列のペプチドを添加したコントロールを示す。
【図７】マウス背部に移植された乾癬患者由来の皮膚の毛細血管内皮細胞数の変化を示すグラフ図である。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅはランダムな配列のペプチドを添加したコントロールを示す。
【図８】ＰＥＤＦタンパク質とＰＢＳとを各々皮下注射した場合の、マウス背部に移植された乾癬患者由来の皮膚の厚みを示した写真図である。
【図９】ＰＥＤＦタンパク質とＰＢＳとを各々皮下注射した場合の、マウス背部に移植された乾癬患者由来の皮膚の厚みを示したグラフ図である。
【図１０】ＰＥＤＦタンパク質とＰＢＳとを各々皮下注射した場合の、マウス背部に移植された健常者由来の皮膚の厚みを示した写真図である。
【図１１】ＰＥＤＦタンパク質とＰＢＳとを各々皮下注射した場合の、マウス背部に移植された健常者由来の皮膚の厚みを示したグラフ図である。
【図１２】ＰＥＤＦタンパク質とＰＢＳとを各々皮下注射した場合の、マウス背部に移植された乾癬患者由来の皮膚のＣＤ３１陽性毛細血管内皮細胞数を示したグラフ図である。
【図１３】ＰＥＤＦタンパク質とＰＢＳとを各々皮下注射した場合の、マウス背部に移植された健常者由来の皮膚のＣＤ３１陽性毛細血管内皮細胞数を示したグラフ図である。
【図１４】マウス背部に移植された乾癬患者由来の皮膚の基底細胞層中のＫｉ６７陽性細胞の頻度を示す。
【図１５】マウス背部に移植された健常者由来の皮膚の基底細胞層中のＫｉ６７陽性細胞の頻度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が１２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチドを提供する。【００２６】
上記ポリペプチドの好ましい態様は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。以下、このポリペプチドをＦ３と表す。Ｆ３のアミノ酸配列は、ＰＥＤＦ（配列番号６にその全アミノ酸配列を示す）の３０１〜４１８番目のアミノ酸配列と同一である。【００２７】
また、上記ポリペプチドの好ましい別の態様は、配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチドであり、より好ましくは、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。以下、このポリペプチドをＰ５と表す。Ｐ５のアミノ酸配列は、ＰＥＤＦの３８１〜４００番目のアミノ酸配列と同一である。【００２８】
上記ポリペプチドの最も好ましい態様は、配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列からなる、血管新生抑制作用を有するポリペプチドである。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＰＥＤＦのアミノ酸配列の３８１番目〜３８７番目までのアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ＰＥＤＦのアミノ酸配列の３８８番目〜３９４番目までのアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列はＰＥＤＦのアミノ酸配列の３９５番目〜４００番目までのアミノ酸配列と、それぞれ同一である。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰ５−１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰ５−２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰ５−３と、それぞれ表す。【００２９】
本発明のポリペプチドは、後の実施例に示すように、ＰＥＤＦと同様に、ヒト骨肉腫細胞であるＭＧ６３細胞またはＨＵＶＥＣｓ（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）の生育を抑制する活性を有している。このことは、本発明のポリペプチドが、ＰＥＤＦと同様に、血管新生抑制作用を有することを意味するものである。従って、本発明のポリペプチドは、血管新生抑制剤として利用することができる。なお、本発明において、「血管新生を抑制する」および「血管新生抑制剤」は、「血管新生を阻害する」および「血管新生阻害剤」と交換可能に用いられる。したがって、「血管新生を抑制する作用」は「血管新生を阻害する作用」と、また「血管新生抑制剤」は「血管新生阻害剤」としても表すことができる。【００３０】
既に述べたように、前記特許文献４は、ＰＥＤＦの機能を司る部位を、ＰＥＤＦのＮ末端側に位置する７８〜１２１番目のアミノ酸配列部分であるとしている。この７８〜１２１番目のアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは全く異なるアミノ酸配列であり、両アミノ酸配列はＰＥＤＦ上でも全くオーバーラップしていない。ＰＥＤＦのような機能性タンパク質のいわゆる「活性中心」が、単一タンパク質の異なる位置に別個独立に複数存在することは希であり、本発明は、ＰＥＤＦの構造機能相関について、これまでは知られていなかった全く新しい知見を与えるものである。【００３１】
なお、Ｆ３は、「配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が１２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチド」の一例であり、Ｆ３のアミノ酸配列において、配列番号１〜３のいずれかに相当するアミノ酸配列以外のアミノ酸の１個または数個が置換または欠失したアミノ酸配列、またはＦ３のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基数として１２０を超えない範囲でアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、血管新生抑制効果が保持される限りにおいて、いずれも本発明に含まれる。【００３２】
またＰ５は、「配列番号１〜３に示されるいずれか１種または２種以上のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸残基数が２０以下である、血管新生抑制作用を有するポリペプチド」の一例であり、Ｐ５のアミノ酸配列において、配列番号１〜３のいずれかに相当するアミノ酸配列以外のアミノ酸の１個または数個が置換または欠失したアミノ酸配列、またはＰ５のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基数として１２０を超えない範囲でアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、血管新生抑制効果が保持される限りにおいて、いずれも本発明に含まれる。【００３３】
Ｆ３におけるアミノ酸配列の置換および欠失に関する「１もしくは数個」とは、１〜数十アミノ酸以内、好ましくは１〜３０個以内、より好ましくは１〜２０個以内、更に好ましくは１〜１０個以内、最も好ましくは１〜５個以内を意味する。またＦ３のアミノ酸配列を基にしたアミノ酸配列の同一性（％）で表せば、それぞれのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。また、Ｐ５におけるアミノ酸配列の置換および欠失に関する「１もしくは数個」とは、１〜１０アミノ酸以内、好ましくは１〜５個以内、より好ましくは１〜３個以内を意味する。またＦ３のアミノ酸配列を基にしたアミノ酸配列の同一性（％）で表せば、それぞれのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。【００３４】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。従って、本発明のポリペプチドにおいても、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、血管新生抑制作用を有する場合もあり、その様なポリペプチドは、依然として本発明の一態様として理解される。【００３５】
また、本発明のポリペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端に、本発明のポリペプチドの機能とは別の機能を有するポリペプチドを付加させた、いわゆる融合ポリペプチドとして製造し、または使用してもよい。この様な融合ポリペプチドも、本発明の一態様である。かかる融合ポリペプチドは、付加されたポリペプチドが示す機能がさらに加わる点で、本発明のポリペプチドを単独で製造し、あるいは使用する場合に比べて、高められた有用性を有する場合があり得る。そのような機能性ポリペプチドの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、蛍光タンパク質、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグまたはキチン結合配列等を挙げることができる。【００３６】
さらに、本発明のポリペプチドには、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付加したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子を結合させたりすることが可能であり、あるいは本発明のポリペプチドを不溶性担体へ結合させたりすることも可能である。こうしたポリペプチドを対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られており、本発明で使用されるポリペプチドの機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい。なお、本発明のポリペプチドは、糖鎖修飾を受けていない形態で血管新生抑制作用を示していることから、本発明のポリペプチドに対して糖鎖修飾を行うことは必ずしも必要ではない。【００３７】
本発明のポリペプチドの血管新生抑制作用は、例えば後に説明する実施例で行ったＨＵＶＥＣｓに対する増殖抑制作用の確認の他に、マウス角膜法による血管新生阻害活性検定法（Ｕｓｈｉｒｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９７年、第４１８巻、第３４１−３４５頁）、市販の血管新生キット（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、クラボウ社）、鶏受精卵漿尿膜を用いたアッセイ（Ａｕｓｐｒｕｎｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９７５年、第９７巻、第５９７頁）等、当業者に知られた方法を用いて確認することができる。【００３８】
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードする核酸を用いて組み換え的に作ることができる。組み換え生産に使用される核酸は、好ましくはＤＮＡであり、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を基に塩基配列を決定し、ホスホアミダイト法等の化学合成的により、あるいは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて、調製することができる。また、ＰＥＤＦをコードするＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって調製してもよい。この様にして調製された核酸、好ましくはＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、さらに当該ベクターで大腸菌等の適当な宿主細胞を形質転換することで、本発明のポリペプチドを組み換え的に生産することができる。【００３９】
こうしたポリペプチドを遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法は、核酸の調製、プロモーター等の選択、組み換えベクターの作製、宿主−ベクター系の組合せ、宿主細胞の形質転換並びにその培養方法乃至培養条件に到るまで、様々な方法が多数開発され、使用されている。またその様な方法を簡便に行うためのキットも多数市販されている。本発明のポリペプチドを組み換え的に生産する場合には、その様な組み換え的手法の何れも利用することができ、具体的な操作は、数多くの実験操作マニュアルやキットや試薬に添付されているプロトコルにしたがって行えばよい。【００４０】
また、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、組織特異的あるいは臓器特異的な遺伝子の発現を可能にする発現ベクターに組み込んで使用することにより、生体の特定の部位でのみ本発明のポリペプチドを発現、生産させ、本発明のポリペプチドの機能を発揮させることも可能である。その様な組織特異的あるいは臓器特異的な遺伝子発現技術も、当業者に広く知られているところであり、本発明のポリペプチドの使用に関して、それらのいずれの技術も利用可能である。【００４１】
本発明のポリペプチドは、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）その他の有機化学的合成方法により、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いることにより、作製することもできる。特に、Ｐ５−１〜３等のような比較的低分子のポリペプチドの作製においては、大量合成が可能である等の点から、有機化学的合成によって製造することが好ましい。【００４２】
ポリペプチドの有機化学的合成法は、Ｓｔｅｗａｒｔら（固相ペプチド合成、第２版、１９８４年、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ１１）、ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（ペプチド合成の実際、１９８４年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）その他の多くの実験操作マニュアルに記載されており、その様な方法に従って本発明のポリペプチドを合成してもよい。【００４３】
また、合成されたポリペプチドが設計通りのものであるかどうかは、アミノ酸分析器、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等の高解像ＭＳ法、アミノ酸シーケンサー等を用いて、確認することができる。さらに、合成されたポリペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）等を用いて、必要に応じて精製して使用することが好ましい。【００４４】
本発明は、前記ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む血管新生抑制用医薬組成物を提供する。また本発明は、前記ポリペプチドを有効成分とする乾癬治療剤、前記ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む乾癬治療用医薬組成物を提供する。【００４５】
医薬組成物は、前記本発明のポリペプチドと、一種もしくは二種以上の薬学的に許容される担体、または一種もしくは二種以上の賦形剤を含み、さらに医薬組成物に汎用される添加成分、さらには本発明のポリペプチド以外の薬効成分を含んでいてもよい。この様な医薬組成物は、経口用製剤、外用剤、経皮吸収型製剤、経粘膜剤、点眼剤、注射剤その他の種々の投与経路に適した製剤として調製することができる。また本発明の医薬組成物は、固形剤、液剤、懸濁剤、乳化型製剤、軟膏剤、リポソーム製剤、徐放性製剤その他の態様に調製することもできる。この様な医薬組成物の製剤化は、当業者に公知あるいは周知の製剤化技術によって行うことができる。【００４６】
本発明の医薬組成物は、外用剤の形態に製剤化されることが好ましい。外用剤は、軟膏剤、液剤、ローション、クリーム、貼付剤、スプレー、乳化型製剤その他の形態として調製することができる。本発明のポリペプチドは、１２０アミノ酸残基以下の大きさを有しており、一般的なタンパク質と比べて、皮膚バリアを越えた吸収性が高く、外用剤としての使用に適している。【００４７】
本発明の医薬組成物の投与量は、当該医薬の投与が必要とされる疾患の状態、年齢その他の医学的要因に基づく医師の判断により適宜定められるものであるが、医薬組成物に配合される本発明のポリペプチドの量としては、概ね組成物重量当たり０．１〜９９％（ｗ／ｗ）の範囲で調整し、必要に応じて医薬組成物の投与量を調節すればよい。【００４８】
本発明のポリペプチドは、後に説明する実施例において記載されるように、ＰＥＤＦと同等の生理活性を有しており、ＰＥＤＦについて認められている様々な疾患に対して利用することができる。特に本発明のポリペプチドは、血管新生を抑制する作用を有しており、望ましくない血管新生を伴う疾患の治療に対して有効である。本発明のポリペプチドを用いて治療することのできる、望ましくない血管新生を伴う疾患には、悪性新生物（腫瘍）、悪性黒色腫、動脈硬化症、慢性関節リューマチ、糖尿病性網膜症、血管新生型加齢黄斑変性症、尋常性乾癬等が含まれるが、これらに限定されるものではない。【００４９】
特に本発明のポリペプチドは、尋常性乾癬の治療に有効である。乾癬は、主に皮膚に灰白色または銀白色の鱗屑で覆われた紅斑性の乾燥斑の出現を臨床的特徴とし、真皮における毛細管の新生を伴う皮膚疾患である。特に露出部の皮疹は患者のＱＯＬを著しく低下させ、さらに関節症状や膿疱を伴って発熱を呈することもある疾患である。【００５０】
乾癬の薬学的治療法としては、皮膚軟化薬、サリチル酸、ステロイド外用剤、ビタミンＤ３外用剤（カルシポトリオール（ｃａｌｃｉｐｏｔｒｉｏｌ））、エトレチネート（ｅｔｒｅｔｉｎａｔｅ）、またはシクロスポリン等の局部投与があり、またソラレンの投与と長波長紫外線照射を用いる光化学療法も時折使用されている。しかしこれらの治療は、治療効果の面で必ずしも満足のいくものではなく、また皮膚刺激等の副作用を伴うものも少なくない。特にステロイド外用剤は皮膚萎縮等、またビタミンＤ３外用剤は高Ｃａ血症等、シクロスポリンは腎障害等の副作用がある。【００５１】
本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドを含む医薬組成物は、ヒトのタンパク質に由来するポリペプチドを有効成分とするものであり、効果に優れ、また副作用が殆ど認められない等の利点を有する医薬として、尋常性乾癬の新たな薬学的治療法を提供するものである。【００５２】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は説明の目的にのみ提供されるもので、何ら本発明を限定するものではない。また、特に断らない限り、実施例における実験操作は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）その他の実験操作マニュアル書の記載、また市販されている試薬乃至キットに添付された指示書の記載に従って行った。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞
１）ＰＥＤＦをコードするｃＤＮＡの調製
Ｙａｍａｇｉｓｈｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００２年、第２９６巻、第８７７−８８２頁）に記載された方法に従い、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に対して下記の一組プライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
プライマー１Ｆ：５’−ＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＡＧ−３’(配列番号７)
プライマー１Ｒ：５’−ＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣ−３’(配列番号８)【００５４】
約１３００ｂｐの増幅産物をアガロースゲルから回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳのＳｍａＩ部位に連結した。得られた構築物を、制限酵素による消化および配列決定によって確認した。このベクターからＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断、回収した断片を、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＮｈｅＩ（平滑末端化）およびＸｂａＩ部位間にクローニングし、ＰＥＤＦをコードするｃＤＮＡを有する発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ−ＰＥＤＦプラスミドを作製した。【００５５】
２）ポリペプチドＦ１〜Ｆ３の作製
１）で作製したベクターを鋳型とし、下記の３組のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
プライマー２Ｆ：５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号９）
プライマー２Ｒ：５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１０）
プライマー３Ｆ：５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡ−３’（配列番号１１）
プライマー３Ｒ：５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＧＡ−３’（配列番号１２）
プライマー４Ｆ：５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡ−３’（配列番号１３）
プライマー４Ｒ：５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＴ−３’（配列番号１４）【００５６】
プライマー２Ｆと２Ｒによって増幅されるＤＮＡ断片は、ＰＥＤＦの１〜１６０番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｆ１）を、プライマー３Ｆと３Ｒによって増幅されるＤＮＡ断片は、ＰＥＤＦの１６１〜３００番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｆ２）を、プライマー４Ｆと４Ｒによって増幅されるＤＮＡ断片は、ＰＥＤＦの３０１〜４１８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｆ３）を、それぞれコードする。【００５７】
上記のＰＣＲ反応による増幅産物をそれぞれ精製し、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断後、同じくＮｄｅＩおよびＳａｌＩを用いて開環させたｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のマルチクローニングサイトに連結し、Ｆ１〜Ｆ３のそれぞれを発現するベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−Ｆ１〜−Ｆ３を得た。更に、各ベクターを用いて形質転換した大腸菌（ＪＭ１０９）から、Ｗａｌｋｅｒら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１２巻、第６０１−６０５頁）に記載された方法に従って、ポリペプチドＦ１〜Ｆ３を作製した。【００５８】
また、ＰＥＤＦのアミノ酸配列の３０１番目から４１８番目までを２０アミノ酸残基毎に区切って細分化したアミノ酸配列からなるポリペプチドＰ１〜Ｐ６（Ｐ６のみ１６アミノ酸残基となる）を、ペプチドシンセサイザー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いてＦｍｏｃ固相合成法により化学合成した。さらに、ＰＥＤＦのアミノ酸配列の３８１番目〜３８７番目、３８８番目〜３９４番目、３９５番目〜４００番目の各アミノ酸配列からなるポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３を、ペプチドシンセサイザーを用いて化学合成した。図１に、ＰＥＤＦに対する各ポリペプチドの配置を模式的に示す。【００５９】
３）活性測定
Ｔａｋｅｎａｋａら（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第７７巻、第３２３１−３２４１頁）に記載された方法に従い、ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に対する、各ポリペプチドの腫瘍細胞増殖抑制効果を測定した。【００６０】
１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、以下、単に培地を表す）にＭＧ６３を懸濁し、市販のＰＥＤＦタンパク質（Ｓｉｇｍａ社）１００ｎＭ、および本実施例１「２）ポリペプチドＦ１〜Ｆ３の作製」で調製したポリペプチドＦ１〜Ｆ３各１００ｎＭ／培地をそれぞれ加えて、３７℃で２４時間インキュベートした。続いて、ＭＧ６３による［３Ｈ］チミジン（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加して４時間培養した後、取込量を測定し、腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を検討した。その結果を図２に示す。【００６１】
図２に示すように、ＰＥＤＦタンパク質を添加したコントロールと比べて、ポリペプチドＦ３に強い腫瘍細胞増殖抑制効果が確認された（図２、ｐ＜０．０１）。【００６２】
また、上記と同様の操作を行って、ポリペプチドＰ１〜Ｐ６各１００ｎＭを添加したときの、５−ブロモ−２’デオキシウリジン（Ｒｏｃｈｅ社）取込量測定によるＭＧ６３腫瘍細胞増殖抑制効果を検討した。その結果を図３に示す。【００６３】
図３に示すように、ポリペプチドＰ５に腫瘍細胞増殖抑制効果が確認された（図３、Ｐ＜０．０１）。【００６４】
さらに、上記と同様の操作を行って、ポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３各１００ｎＭを添加したときの、５−ブロモ−２’デオキシウリジン取込量測定によるＭＧ６３腫瘍細胞増殖抑制効果を検討した。その結果を図４に示す。【００６５】
図４に示すように、ポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３のいずれについても、ポリペプチドＰ５と同様の腫瘍細胞増殖抑制効果が確認された（図４、Ｐ＜０．０１）。【００６６】
４）ＨＵＶＥＣｓ（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）に対する増殖抑制効果
１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＨＵＶＥＣｓを９６ウェルプレートの各ウェルに播き、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる市販のＰＥＤＦタンパク質（Ｓｉｇｍａ社）１００ｎＭ、ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）１００ｎｇ／ｍＬおよびポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３各１００ｎＭをそれぞれウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２〜４日間インキュベートし、ＨＵＶＥＣｓによる５−ブロモ−２’デオキシウリジン取込量を測定した。その結果を図５に示す。【００６７】
図５に示すように、ポリペプチドＰ５−１〜Ｐ５−３はＰＥＤＦタンパク質を添加したコントロールと比較して、いずれもＨＵＶＥＣｓの増殖を有意に抑制した（図５、ｐ＜０．０１）。【００６８】
５）皮膚に対する外用治療効果
７〜８週齢のＳＣＩＤマウス（Ｃｌｅａ社）の背毛を１ｃｍ２ほど刈り取り、さらに背筋肉を覆う筋膜上のｖｅｓｓｅｌ ｐｌｅｘｕｓを保持した皮膚全厚を剥離した。倫理規定に基づいてサンプリングした乾癬患者の患部皮膚を１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、１％アンホテリシンＢを含むＰＢＳで洗浄し、前記マウスの皮膚剥離部に別々に移植した。【００６９】
移植７日後のマウスの移植部に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解したポリペプチドＰ５−１、Ｐ５−２、Ｐ５−３（各１ｍＭ）溶液を各々７０μＬ、３匹ずつに１４日間毎日塗布した。その結果、塗布部位周辺に副作用等は確認されなかった。さらに、コントロールとしてランダムな配列を有するポリペプチドＰＢＳ溶液およびポリペプチドを溶解しないＰＢＳを同量塗布した。１４日後、移植皮膚の一部を回収し、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）試薬（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社）に浸した後、液体窒素で凍結し、５μｍの切片を作製した。この塗布実験を３回繰り返し行い、その結果を図６に示す。【００７０】
図６に示すように、ＨＥ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）染色を行った切片の観察から、ポリペプチドＰ５−１，Ｐ５−２，Ｐ５−３が投与された移植皮膚の厚みは、いずれについても有意に減少していた（図６、ｐ＜０．０５）。【００７１】
また、Ａｂｅら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００４年、第１６４巻、第４号、第１２２５−１２３２頁）の方法に従い、毛細血管内皮細胞（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）のマーカータンパク質であるＣＤ３１を指標とした、ラット抗マウスＣＤ３１抗体を用いたイムノアッセイによって、移植された皮膚の最上皮（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｄｅｒｍｉｓ）における毛細血管内皮細胞の数を測定した。その結果を図７に示す。【００７２】
図７に示すように、毛細血管内皮細胞の数は有意に減少していた（図７）。【００７３】
さらに、上記と同様に、７〜８週齢のＳＣＩＤマウス（Ｃｌｅａ社）の背毛を１ｃｍ２ほど刈り取り、さらに背筋肉を覆う筋膜上のｖｅｓｓｅｌ ｐｌｅｘｕｓを保持した皮膚全厚を剥離し、倫理規定に基づいてサンプリングした乾癬患者の患部皮膚および健常者の皮膚それぞれを１％ペニシリン、１％アンホテリシンＢを含むＰＢＳで洗浄した後、前記マウスの皮膚剥離部に別々に移植した。【００７４】
移植７日後のマウスの移植部に、市販のＰＥＤＦタンパク質（３０μｇ）を皮下注射した。注射は３回／週を３週行った。コントロールとしてＰＢＳのみを皮下注射したものを用いた。最後の皮下注射を行った翌日、移植皮膚の一部を回収し、上記と同様にＨＥ染色を行い、移植皮膚の厚みを計測した。乾癬患者の患部皮膚の結果を図８（写真図）および図９に示し、健常者の皮膚の結果を図１０（写真図）および図１１に示す。【００７５】
図８、図９、図１０および図１１に示すように、健常者の皮膚および感染患者の患部皮膚の厚みはいずれも有意に減少していた（図９および図１１、いずれもｐ＜０．０５）。【００７６】
また、上記と同様の操作を行って、ＣＤ３１を指標とした毛細血管内皮細胞数を計測した。乾癬患者の患部皮膚の結果を図１２に示に示し、健常者の皮膚の結果を図１３に示す。【００７７】
図１２および図１３に示すように、ＰＥＤＦタンパク質投与群では健常者の皮膚および感染患者の患部皮膚のいずれも毛細血管内皮細胞数が有意に減少していた（図１２および図１３、いずれもｐ＜０．０５）。【００７８】
さらに、Ｇｉｌｈａｒら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００６年、第１６８巻、第１号、第１７０−１７５頁）の方法に従い、基底細胞層の増殖マーカーであるＫｉ６７を発現する陽性細胞の頻度を測定した。乾癬患者の患部皮膚の結果を図１４に示し、健常者の皮膚の結果を図１５に示す。【００７９】
図１４および図１５に示すように、ＰＥＤＦタンパク質投与群では、健常者の皮膚および乾癬患者の患部皮膚のいずれについても有意に低下しており、基底細胞の増殖を抑制したことが示唆された（図１４および図１５、いずれもｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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