(57)【要約】本発明の目的は、造影剤を使用せず、簡便かつ高確率で肝癌を特定することができる検査方法、検査薬及びそれらのキットを提供すること。肝癌を治療及び予防するための物質を評価及び選抜し、得られた該物質を有効成分として含んだ肝癌の治療剤及び予防剤を提供することにある。上記目的は、肝癌細胞において特異的に発現するＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、及びＴＰＸ２遺伝子並びにそれらの発現産物からなる群から選ばれる少なくとも１種の発現量を指標とした肝癌の検査方法、肝癌の検査薬及び肝癌検査用キット、並びに上記発現量を低下させる物質を評価・選抜する方法及び上記物質を有効成分とする肝癌を治療及び予防するための組成物を提供することにより解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から得た被検体における
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、及び／又は
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量を測定する工程
を含む、肝癌の検査方法。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項２】
前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量が、前記被検体から調製されたタンパク質試料に含まれる前記標的タンパク質の量で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量が、前記被検体から調製されたＲＮＡ試料に含まれる前記標的タンパク質をコードするＲＮＡの量で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量が、前記被検体から調製されたｃＤＮＡ試料に含まれる前記標的タンパク質をコードするｃＤＮＡの量で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程をさらに含む、請求項１に記載の検査方法。
（Ａ）前記被検体から調製された核酸試料、並びに前記標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブが固定された基板を提供する工程
（Ｂ）前記核酸試料と前記基板に固定された核酸プローブとを接触させる工程
（Ｃ）前記核酸試料と前記基板に固定された前記核酸プローブとのハイブリダイズの有無を検出することにより、前記核酸試料に含まれる前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量を測定する工程
【請求項６】
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、並びに、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗体
を含む、肝癌の検査薬。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項７】
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、並びに、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗体
を含む、肝癌検査用キット。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項８】
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、及び／又は
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量
を低下させる物質を含む、肝癌を治療及び／又は予防するための組成物。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項９】
前記物質がｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験物質を作用させる工程、
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、
及び／又は
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量を測定する工程、並びに
該標的遺伝子の発現量及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を評価する工程
を含む、該標的遺伝子の発現量及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を評価する方法。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項１１】
請求項１０に記載の評価方法により評価した複数の被験物質から、前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量を低下させる物質を選抜する工程
を含む、該標的遺伝子の発現量及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を選抜する方法。
【請求項１２】
前記物質が、肝癌を治療及び／又は予防するために使用される物質である、請求項１１に記載の選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００８年３月１２日出願の日本特願２００８−６３００１号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、肝癌細胞において特異的に発現するＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、及びＴＰＸ２遺伝子並びにその発現産物の発現量を指標とした肝癌の検査方法、肝癌の検査薬及び肝癌検査用キットに関する。さらに本発明は、上記遺伝子又はその発現産物の発現量を低下させる物質を評価及び選抜する方法、並びに該物質を有効成分とする肝癌を治療及び予防するための組成物に関する。【０００３】
背景技術
ＷＨＯが公表した「WHO histological classification of tumours of the Digestive Tumours」の「WHO histological classification of tumours of the liver and intrahepatic bile ducts」項によれば、肝臓における腫瘍は、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血細胞性腫瘍、リンパ性腫瘍などに分類され、これらのうち悪性の上皮性腫瘍が肝臓を発生元とする原発性肝癌である。原発性肝癌のうち肝細胞癌が90％を占めており、肝細胞癌は日本や東アジアでの罹患率が高く、世界全体でみても非常にありふれた悪性腫瘍の一つとされている（国立がんセンター、“肝細胞がん”、［online］、2007年1月15日、［平成20年3月1日検索］、インターネット〈URL：http://ganjoho.ncc.go.jp/public/cancer/data/liver.html#prg6〉を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。【０００４】
肝癌に罹患すると、肝機能の悪化に伴い、全身倦怠感、食欲不振、腹痛、発熱などの症状が現れるが、罹患初期に自覚できる症状はほとんど現れない。さらに、症状が現れた肝癌罹患者は慢性肝炎や肝硬変を患っている場合がほとんどであり、このような肝癌罹患者を外科的手術や局所的な治療によって根治するのは非常に困難である。これらに加えて、肝癌に対する有効な抗がん剤もこれまでに開発されていないことから、肝癌罹患者の生存率は他の癌と比べても非常に低い。【０００５】
肝癌の検査としては、エコーやＣＴＩなどを用いた画像検査や、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＥＡなどを用いた腫瘍マーカー検査などが主として行われている（特開２００６−８４２２４を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。肝癌の治療としては、一部では肝動脈にカテーテルを留置して定期的に抗癌剤（シスプラチン、５−ＦＵ等）を注入する肝動注化学治療がなされているが、その大半は、肝癌の切除治療、ＰＥＩＴやＭＣＴなどの肝臓に針を刺すことによる腫瘍部の壊死治療、放射線治療などの物理的な治療である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
エコー画像検査は初期の肝癌を発見することが困難であり、ＣＴＩなどの画像検査は造影剤を使用するなど、肝癌の画像検査は、肝癌の特定や被検査者の負担の面で多くの問題を抱える検査法である。一方、腫瘍マーカーを用いた肝癌検査は、陽性率が低い、肝硬変や慢性肝炎などに対して擬陽性になる、進行した肝癌のみを発見できるなど、肝癌を特定する検査としては確実性が乏しい。【０００７】
肝癌の物理的治療は、肝癌罹患者の体力や自然治癒力に負うところが多く、治療を受けた罹患者は治療後の経過観察を強いられることとなる。その上、肝癌の物理的治療による根治は非常に困難である。肝癌の予防にいたっては、これまでに有効な手段は知られていない。【０００８】
したがって、本発明は、上記した従来の肝癌の検査並びに治療及び予防に関する問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、造影剤を使用せず、簡便かつ高確率で肝癌を特定することができる検査方法、検査薬及びそれらのキットを提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、肝癌を治療及び予防するための物質を評価及び選抜し、得られた該物質を有効成分として含んだ肝癌の治療剤及び予防剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、肝癌細胞がＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子を特異的に高発現していることを見出した。それぞれの遺伝子の発現産物について、ＡＫＲ１Ｂ１０はアルドース還元酵素の一種であるタンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇは染色体のクロマチン構造に関連するタンパク質、及びＴＰＸ２は細胞分裂に関連しＡｕｒｏｒａ  Ａと結合し活性化するタンパク質であることが知られている。しかし、これらが様々な正常組織や背景組織と比較し、肝癌に特異的に発現することは、本発明者らによってはじめて見出されたことである。【００１０】
さらに、本発明者らは、これらの遺伝子の発現を抑え得る物質を創製することに成功し、このような物質を用いれば肝癌細胞の増殖を抑制することができることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。【００１１】
すなわち、本発明によれば、以下のものが提供される。
［１］被検者から得た被検体における
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、及び／又は
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量を測定する工程
を含む、肝癌の検査方法。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
［２］前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量が、前記被検体から調製されたタンパク質試料に含まれる前記標的タンパク質の量で表される、上記［１］に記載の方法。
［３］前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量が、前記被検体から調製されたＲＮＡ試料に含まれる前記標的タンパク質をコードするＲＮＡの量で表される、上記［１］に記載の方法。
［４］前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量が、前記被検体から調製されたｃＤＮＡ試料に含まれる前記標的タンパク質をコードするｃＤＮＡの量で表される、上記［１］に記載の方法。
［５］以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程をさらに含む、上記［１］に記載の検査方法。
（Ａ）前記被検体から調製された核酸試料、並びに前記標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブが固定された基板を提供する工程
（Ｂ）前記核酸試料と前記基板に固定された核酸プローブとを接触させる工程
（Ｃ）前記核酸試料と前記基板に固定された前記核酸プローブとのハイブリダイズの有無を検出することにより、前記核酸試料に含まれる前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量を測定する工程
［６］以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、並びに、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗体
を含む、肝癌の検査薬。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
［７］以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、並びに、
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる標的タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗体
を含む、肝癌検査用キット。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
［８］以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、及び／又は
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量
を低下させる物質を含む、肝癌を治療及び／又は予防するための組成物。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
［９］前記物質がｓｉＲＮＡである、上記［８］に記載の組成物。
［１０］肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験物質を作用させる工程、
以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、
及び／又は
以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量を測定する工程、並びに
該標的遺伝子の発現量及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を評価する工程
を含む、該標的遺伝子の発現量及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を評価する方法。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
［１１］上記［１０］に記載の評価方法により評価した複数の被験物質から、前記標的遺伝子の発現量及び／又は前記標的タンパク質の発現量を低下させる物質を選抜する工程
を含む、該標的遺伝子の発現量及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を選抜する方法。
［１２］前記物質が、肝癌を治療及び／又は予防するために使用される物質である、上記［１１］に記載の選抜方法。【００１２】
発明の効果
本発明によれば、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量を検査（遺伝子検査、免疫検査等）することによって、造影剤などを使用せず、簡便かつ高確率で肝癌を特定することができる。すなわち、本発明によれば、肝癌の定期検査、治療後検査、早期検査などが可能になる。さらに本発明によれば、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現活性や生理活性などを抑制することによって肝癌を化学的に治療でき、肝癌の予防や原因治療も可能となる。これらの遺伝子やタンパク質の他の正常組織の発現量は肝癌細胞の発現量と比較して低いため、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質を標的とする製剤は、肝癌特異的な副作用の少ない製剤になる可能性が高い。【００１３】
以上の肝癌の検査、治療及び予防は、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の組み合わせられた発現量を用いることで、検査精度や予防・治療の効果が増すことになる。【００１４】
さらに本発明によれば、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を低下させる物質を評価・選抜することができ、これにより肝癌の予防剤及び治療剤の開発が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、リアルタイムＰＣＲ  法とエクソンアレイによる、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子の発現解析結果を示す。
【図２】図２は、肝細胞癌の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＨＣＡＰ−Ｇ、及びＴＰＸ２の免疫染色結果を示す。
【図３】図３は、ヒト肝細胞癌細胞株においてＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子の発現をｓｉＲＮＡを用いて阻害したときの細胞増殖の低下結果を示す。
【図４】図４は、ヌードマウス生体内における肝細胞癌の増殖をＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子の発現産物に対するｓｉＲＮＡが抑制した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、被検者から得た被検体における以下の（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的遺伝子の発現量、及び／又は以下の（４）〜（６）からなる群から選ばれる少なくとも１種の標的タンパク質の発現量を測定する工程を含む、肝癌の検査方法である。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【００１７】
本明細書における「肝癌」としては、通常知られている肝臓細胞及び肝臓組織の癌（悪性腫瘍）を挙げることができ、例えば、原発性の肝細胞癌を挙げることができる。
【００１８】
本明細書における「被検者」とは検査を受ける者として特に制限なく用いられ、肝癌罹患者及び肝癌非罹患者のいずれをも指す。本明細書における「被検体」とは、被検者から通常知られる方法によって採取された検査に供されるものを制限なく挙げることができ、例えば、被検者の血液、尿、唾液、生検や手術により得られた肝臓組織または細胞を挙げることができる。被検者から被検体を得る手段は特に制限されず、例えば、注射筒などの器具を用いる手段や外科的な手段を挙げることができる。
【００１９】
本明細書にいう「ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子」とは、アルドース還元酵素の一種であるＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質（Ａｃｃ：Ｏ６０２１８）をコードする遺伝子を意味し、通常第７染色体の１３３８６２８８４ｂｐ〜１３３８７６６９３ｂｐ近辺に位置する。ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子の塩基配列の具体例として、配列表の配列番号１に示した塩基配列を挙げることができる。ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子の塩基配列のコード領域は、例えば、配列番号２に示した塩基配列を挙げることができる。さらに、ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、配列番号７に示したアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２０】
本明細書にいう「ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子」とは、染色体のクロマチン構造に関連するタンパク質の一種であるＨＣＡＰ−Ｇタンパク質（Ａｃｃ：Ｑ９ＢＰＸ３）をコードする遺伝子を意味し、通常第４染色体の１７４２１６２３ｂｐ〜１７４５５５８３ｂｐ近辺に位置する。ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子の塩基配列の具体例として、配列表の配列番号３に示した塩基配列を挙げることができる。ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子の塩基配列のコード領域は、例えば、配列番号４に示した塩基配列を挙げることができる。さらに、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、配列番号８に示したアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２１】
本明細書にいう「ＴＰＸ２遺伝子」とは、細胞分裂に関連しＡｕｒｏｒａ  Ａと結合し活性化するＴＰＸ２タンパク質（Ａｃｃ：Ｑ９ＵＬＷ０）をコードする遺伝子を意味し、通常第２０染色体の２９７９０５６５ｂｐ〜２９８５３２６４ｂｐ近辺に位置する。ＴＰＸ２遺伝子の塩基配列の具体例としては、配列表の配列番号５に示した塩基配列を挙げることができる。ＴＰＸ２遺伝子の塩基配列のコード領域は、例えば、配列番号６に示した塩基配列を挙げることができる。さらに、ＴＰＸ２タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、配列番号９に示したアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２２】
本発明の方法において、肝癌に特異的に発現する標的遺伝子としては、下記（１）〜（３）の遺伝子が挙げられる。
（１）ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、又は配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（２）ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子、又は配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
（３）ＴＰＸ２遺伝子、又は配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子
【００２３】
本明細書にいう「機能的に同等」とは、生物学的機能及び／又は生化学的機能が同等であることを意味する。したがって、ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質とはＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と同じ生物学的機能及び／又は生化学的機能、例えば、アルドース還元酵素としての機能を有するタンパク質を、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質とはＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と同じ生物学的機能及び／又は生化学的機能、例えば、染色体のクロマチン構造に関連する機能を有するタンパク質を、並びにＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質とはＴＰＸ２タンパク質と同じ生物学的機能及び／又は生化学的機能、例えば、細胞分裂に関連しＡｕｒｏｒａ  Ａと結合し活性化する機能を有するタンパク質を意味する。
【００２４】
ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質のいずれかと機能的に同等なタンパク質とは、例えば、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子タンパク質及びＴＰＸ２遺伝子のいずれかに基づくスプライシングバリアント、ファミリー遺伝子、トランスジーンによりコードされるタンパク質やＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質のいずれかのホモログを挙げることができる。ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質を確認する方法としては、クローサスらの文献（Bernat Crosas et.al., Biochem. J., (2003), 373, 973-979を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の方法を挙げることができる。ＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質を確認する方法としては、グラスらの文献（Oliver J. Gruss et al., Nat. Cell Biol., (2002), 4, 871-879を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の方法を挙げることができる。ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質を確認する方法としては、キムラらの文献（Keiji Kimura et.al., J. Biol. Chem., (2001), 276, 5417-5420を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）に記載の方法を挙げることができる。
【００２５】
ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質のいずれかと機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を含む核酸を調製する方法としては、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997) （これらの記載は、ここに特に開示として援用される）等に記載されているハイブリダイゼーション技術を利用する方法が挙げられる。すなわち、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子のいずれかの塩基配列（例えば、配列番号１、３及び５）もしくはその一部（例えば、配列番号２、４及び６）を利用して、これと相同性の高い塩基配列を含む核酸を単離することは、当業者により容易になされ得ることである。
【００２６】
本発明において、ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質のいずれかと機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を含む核酸としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなど由来の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２７】
ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質のいずれかと機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を含む核酸を単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、ストリンジェントな条件が挙げられる。
【００２８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とは、例えば、配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む核酸をプローブとして使用し、サザンブロット又はノーザンブロットハイブリダイゼーション法等のハイブリダイゼーション技術を用いることにより得られる核酸の塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては低ストリンジェントや高ストリンジェントなどの条件がある。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば、４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは、５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有する核酸が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、被検者から調製された核酸または該核酸の断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる核酸の塩基配列等を挙げることができる。
【００３０】
当業者であれば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしなくとも、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子のいずれかの塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーなどの核酸合成装置を利用するなどして、ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質のいずれかと機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得することは可能である。
【００３１】
本発明の肝癌の検査方法において、肝癌に特異的に発現する標的タンパク質としては、下記（４）〜（６）のタンパク質が挙げられる。
（４）ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、又は配列番号７に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質と機能的に同等なタンパク質
（５）ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＨＣＡＰ−Ｇタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（６）ＴＰＸ２タンパク質、又は配列番号９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＴＰＸ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質
【００３２】
本明細書でいう「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８及び９個のいずれかを意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸の欠落もしくは消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸が別のアミノ酸に置き換えられていること、「アミノ酸の付加」とは配列の内部又は末端部に別のアミノ酸が付け加えられていること、「アミノ酸の挿入」とは配列中のアミノ酸の間に別のアミノ酸が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００３３】
配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む遺伝子がコードするタンパク質や配列番号７〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質は、通常、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子のいずれかがコードするタンパク質と、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有し、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。
【００３４】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）を用いることによって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，  １９９０を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、ｓｃｏｒｅ  ＝  １００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  １２とする。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、ｓｃｏｒｅ  ＝  ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  ３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者によりよく知られている手法を用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。
【００３５】
上記した標的遺伝子の発現量を指標とすることで肝癌を検査することが可能である。実施例で示す通り、肝癌細胞は、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＴＰＸ２遺伝子を特異的に高発現しているので、例えば、標的遺伝子のいずれか１種又は２種以上、好ましくは３種の発現量の上昇を指標とすれば、肝癌の判定を行うことができる。このような判定に際しては、例えば、肝癌非罹患者のものと比較して、被検者の肝臓細胞又は肝臓組織における標的遺伝子の発現量が有意に高い場合に肝癌であると判定することができる。ここで、「有意に高い」とは、統計分析上有意であることの他に、簡易的に非肝癌組織における発現量の平均に対して１５０％以上、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上、さらに好ましくは４００％以上、特に好ましくは５００％以上、最も好ましくは１０００％以上あることを意味する。さらに、肝癌の進行に相関して上記標的遺伝子の発現量は高まる。したがって、上記標的遺伝子の発現量の絶対評価によっても、肝癌の判定は可能である。例えば、被検者の肝臓細胞又は肝臓組織における標的遺伝子の発現量を、以下の実施例と同様の方法で測定した場合、エクソンアレイのシグナル値がＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子は２００以上、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子は２５以上、ＴＰＸ２遺伝子は７０以上ある場合に、肝癌であると判定できる。同様にして、上記した標的タンパク質の発現量を指標とすることで肝癌を検査することが可能であり、例えば、肝癌非罹患者のものと比較して、被検者の肝臓細胞又は肝臓組織における標的タンパク質の発現量が有意に高い場合に肝癌であると判定することができる。
【００３６】
肝癌であると判断された肝臓細胞又は肝臓組織をもつ被検者としては、現に癌に罹患している者もいれば、肝癌を今後発症する疑いがある（危険性が高い）者も包含される。
【００３７】
本発明の肝癌の検査方法は、上記した標的遺伝子又は標的タンパク質の発現量を測定する工程を含み、標的遺伝子には１又は２以上の遺伝子を含み、標的タンパク質には１又は２以上のタンパク質を含む。本発明の方法は、肝癌の進行判定や癌治療効果のモニタリングにおいてもまた使用することができる。
【００３８】
標的遺伝子の発現量とは、通常、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を意味するが、該ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの量や該ｍＲＮＡによって翻訳されたタンパク質もまた上記「標的遺伝子の発現量」に包含される。標的タンパク質の発現量とは、通常、標的タンパク質の量として表されるが、標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量や該ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの量も上記「標的タンパク質の発現量」に含まれる。
【００３９】
本発明の肝癌の検査方法の一つの態様としては、例えば、標的遺伝子の発現量又は標的タンパク質の発現量を、上記した被検体から調製されたタンパク質試料に含まれる標的タンパク質の量で表す方法を挙げることができる。被検体から調製されたタンパク質試料としては、例えば、被検体から当業者によく知られる方法で調製されたタンパク質試料が挙げられる。必要であれば、被検体から調製されたタンパク質試料に含まれる標的タンパク質の量を健常者である肝癌非罹患者のものと比較することもできる。
【００４０】
タンパク質試料に含まれる標的タンパク質の量を確認する方法としては、当業者によく知られる方法、例えば、免疫染色法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａｍ及びＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０）を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（タンパク質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４７  Ｎｏ．５（２００２）、タンパク質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４７  Ｎｏ．８（２００２）を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）、２次元電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
上記方法のうち、実施例に免疫染色法の具体的な態様を、以下にＥＬＩＳＡ法の具体的な態様を以下に述べるが、本発明の肝癌の検査方法は、これらの方法に限定されるものではない。ＥＬＩＳＡ法においては、対象となるタンパク質が、マイクロタイターウェルの表面に吸着される。その後表面上の残余のタンパク質−結合部位が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱失活した正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（保存剤、塩及び消泡剤を含む脂肪非含有乾燥ミルクの緩衝液）などの適当な物質でブロッキングされる。その後ウェルを、特異的抗体を含むことが疑わしい試料と共にインキュベーションする。試料は、希釈せずに適用するか、もしくはより頻繁には通常ＢＳＡ、ＮＧＳ、又はＢＬＯＴＴＯのようなタンパク質を少量（０．１〜５．０質量％）含有する緩衝液中に希釈することができる。特異的結合が生じるのに十分な時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄し、非結合のタンパク質を除去し、かつ次にレポーター基で標識した抗−種（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）特異的免疫グロブリン抗体と共にインキュベーションする。このレポーター基は様々な酵素から選択することができ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼがある。特異的結合が生じるのに十分な時間経過後、次にウェルを再度洗浄し、非結合の複合体を除去し、かつ該酵素の基質を添加する。色を発色させ、ウェルの内容物の光学密度を、肉眼で又は装置により決定する。
【００４２】
本発明の肝癌の検査方法においては、上記方法により、例えば、肝癌で高発現しているＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質及びＴＰＸ２タンパク質並びにこれらと機能的に同等なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種を検出することで、肝癌の早期検査等を行うことができる。
【００４３】
本発明の肝癌の検査方法の別の態様としては、次の方法が挙げられる。まず、上記被検体からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれる上記標的タンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する。必要に応じて、測定されたＲＮＡの量を肝癌非罹患者のものと比較する。その他の態様としては、次の方法が挙げられる。まず、上記被検体からｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれる上記標的タンパク質をコードするｃＤＮＡの量を測定する。必要に応じて、測定されたｃＤＮＡの量を肝癌非罹患者のものと比較する。このような方法としては、当業者によく知られる方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、エクソンアレイ法、リアルタイムＰＣＲ定量法等を挙げることができる。エクソンアレイ法やリアルタイムＰＣＲ定量法の具体的な態様は実施例に示されるが、本発明の肝癌の検査方法はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の肝癌の検査方法の別の態様としては、次の方法を挙げることができる。まず、上記被検体から調製されたｍＲＮＡ及びｃＤＮＡなどの核酸試料、並びに、上記した標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブが固定された基板を提供する。次いで、該核酸試料と該基板に固定された核酸プローブとを接触させる。次いで、該核酸試料と該基板に固定された核酸プローブとのハイブリダイズの有無を検出することにより、該核酸試料に含まれる標的遺伝子の発現量及び／又は標的タンパク質の発現量を測定する。必要に応じて、測定された標発現量を肝癌非罹患者のものと比較する。このような方法としては、例えば、マイクロアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）を挙げることができる。
【００４５】
被検体からのｃＤＮＡ試料の調製は、例えば、被検体から抽出したｍＲＮＡを鋳型にして、当業者によく知られる方法で行うことができる。例えば、被検者の肝癌罹患部などから、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、当業者によりよく知られる方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９７９）  １８，  ５２９４−５２９９を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）  、ＡＧＰＣ法  （Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９８７）  １６２，  １５６−１５９を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）  等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）  等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）  を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。
【００４６】
本明細書において「基板」とは、核酸を固定することが可能な材料であれば制限されず、例えば、板状のものを挙げることができる。本発明の方法で用いられる基板は、核酸を固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板が好ましい。
【００４７】
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千もの核酸プローブで構成されている。通常これらの核酸は非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００４８】
本発明において、核酸プローブの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常ｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、このような技術を本発明の肝癌の検査方法で用いられる基板の作製に利用することもできる。
【００４９】
上記核酸プローブは、上記標的遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列と特異的にハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブであれば特に制限されない。例えば、上記核酸プローブとしては、標的遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブ、標的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列と特異的にハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブ、標的遺伝子により転写されたｍＲＮＡの塩基配列と特異的にハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブ、標的遺伝子により転写されたｍＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブなどの１種又は２種以上を挙げることができる。上記核酸プローブのそれぞれの長さは１５ヌクレオチド以上が好ましい。上記核酸プローブは、例えば、市販の核酸合成機により作製することができ、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００５０】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載の条件を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）において、上記標的遺伝子の塩基配列若しくは標的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列以外の塩基配列とクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、検出する上記標的遺伝子の塩基配列若しくは標的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。また、本発明の方法に用いられる核酸プローブには、オリゴヌクレオチドやｃＤＮＡなどが含まれる。
【００５１】
上記核酸プローブは、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５'端を32Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５２】
本発明において、該核酸試料と該基板に固定された核酸プローブとのハイブリダイズの有無を検出する方法としては、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。
【００５３】
本発明の別の側面によれば、本発明の肝癌の検査方法に用いるための検査薬及び検査用キットを提供する。このような検査薬及び検査用キットとしては、例えば、上記核酸プローブ、標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブ、及び／又は標的タンパク質と特異的に結合する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗体を含む、肝癌の検査薬及び検査用キットを挙げることができる。
【００５４】
標的タンパク質に特異的に結合する抗体は、ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、ＴＰＸ２タンパク質及びそれらと機能的に同等なタンパク質に基づいて、通常知られる方法により作製することができる。さらに上記抗体は、実施例に示すメーカーなどによって市場から入手することもできる。肝癌の検査薬及び検査用キットに含められる抗体は、ＡＫＲ１Ｂ１０タンパク質、ＨＣＡＰ−Ｇタンパク質、ＴＰＸ２タンパク質及びそれらと機能的に同等なタンパク質のいずれかと特異的に結合する抗体の１種又は２種以上である。
【００５５】
標的タンパク質に特異的に結合する抗体は、上記の検査方法を行うための肝癌の検査薬及び肝癌の検査用キットとして使用することができるだけでなく、上記標的タンパク質を標的としたイメージングを行うことを特徴とする、肝癌の検査方法にも利用することができる。該方法の１つの態様としては、上記標的タンパク質に結合する抗体を作成する。次いで、該抗体をポジトロン放出同位元素で標識する。次いで、標識が付された抗体を被検者に投与する。次いで、ポジトロン放出断層撮影法で放射能を検出する。必要であれば、検出された放射能を肝癌非罹患者のものと比較する。
【００５６】
標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列及び該塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列とハイブリダイズする塩基配列の少なくとも一部を含む１以上の核酸プローブとは、例えば、標的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、該塩基配列と相補的な塩基配列、該遺伝子により転写されたｍＲＮＡの塩基配列、該ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列などのいずれかに特異的にハイブリダイズする塩基配列を少なくとも一部を含む、１種又は２種以上の核酸プローブを挙げることができ、長さは１５ヌクレオチド以上が好ましい。上記核酸プローブの作製方法や標識方法は、上記と同様の方法を挙げることができる。
【００５７】
本発明の検査薬及び検査用キットは、上記核酸プローブを１種又は２種以上含むものであり、該核酸プローブは基板に固定されている場合もあり得る。
【００５８】
本発明の検査薬やキットには、有効成分である抗体や核酸プローブ以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００５９】
本発明の別の側面によれば、肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験物質を作用させて、抗癌活性を有する物質を評価する方法を提供する。その具体例としては、肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験物質を作用させる工程、上記標的遺伝子の発現量又は上記標的タンパク質の発現量を測定する工程、および該標的遺伝子及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質を評価する工程を含む、該標的遺伝子及び／又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質の評価方法を挙げることができる。
【００６０】
さらに本発明の別の側面によれば、上記評価方法により評価した複数の被験物質から、上記標的遺伝子の発現量及び／又は標的タンパク質の発現量を低下させる物質を選択する工程を含む、該標的遺伝子又は該標的タンパク質の発現量を低下させる物質の選抜方法を提供する。
【００６１】
被験物質としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００６２】
肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験物質を作用させる方法としては、肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験物質を直接的に作用（例えば、添加や投与など）させる場合だけでなく、肝癌細胞及び／又は肝癌組織に被験試料を接種した生物由来の細胞を用いるなどして間接的に作用させる場合の双方を含む。このような方法としては、例えば、実施例に記載の方法を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
上記標的遺伝子又は上記標的タンパク質の発現量を低下させる物質における、発現量を低下させる度合いとしては、例えば、被験物質を作用させない場合と比べて、上記標的遺伝子又は上記標的タンパク質の発現量を５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは４０％以下、最も好ましくは５０％以下にまで低下させることを挙げることができる。
【００６４】
本発明の選抜方法により得られる、上記標的遺伝子又は上記標的タンパク質の発現量を低下させる物質は、有効成分として、肝癌を治療及び／又は予防するための組成物に含まれる。上記物質としては、例えば、ｓｉＲＮＡを挙げることができる。ｓｉＲＮＡの具体例としては、ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（配列表の配列番号１０及び１１、並びに１２及び１３）、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（配列番号１４及び１５、１６及び１７、並びに１８及び１９）、並びにＴＰＸ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列番号２０及び２１、２２及び２３、並びに２４及び２５）を挙げることができる。このようなｓｉＲＮＡは、常法に従って合成することができるが、例えば、実施例に記載の方法により合成することもできる。
【００６５】
例えば、上記ｓｉＲＮＡを用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの肝癌細胞におけるＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子、ＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子及びＨＣＡＰ−Ｇ遺伝子の発現レベルは２０〜６０％程度にまで低下させることができ、さらに肝癌細胞の増殖を２０〜６０％程度にまで抑制することができる（図３、図４）。
【００６６】
本発明の別の側面によれば、上記標的遺伝子又は上記標的タンパク質の発現量を低下させる物質と医薬上許容される担体とを含む、肝癌の治療及び／又は予防のための組成物を提供する。すなわち、本発明の組成物は、肝癌治療剤及び肝癌予防剤として、上記標的遺伝子又は上記標的タンパク質の発現量を低下させる物質と医薬上許容される担体とを混合して用いられる。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、アテロコラーゲン、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。具体的には、上記標的遺伝子又は上記標的タンパク質の発現量を低下させる物質がｓｉＲＮＡである場合、上記担体としてはアテロコラーゲンを好ましく用いることができる。
【００６７】
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００６８】
１．実験材料及び方法
細胞株
ヒト肝癌細胞株KIM-1 はDr. Masamichi Kojiro (久留米大学）より、Hep3B はCellResource Center for Biomedical Research (Tohoku University) より、 HLE はHealthScience Research Resources Bank (Osaka, Japan) より分譲を受けた。【００６９】
エクソンアレイ
GeneChip system (Affymetrix Inc., Santa Clara, USA) により発現解析を行った。1 μg のトータルＲＮＡをWhole Transcript Sense Target Labeling kit を用いて末端ラベルを施したcDNAプローブに変換した。プローブはHuman Exon 1.0 ST Array と45 度で16 時間ハイブリダイゼーションを行った。アレイはFluidics Station 450 により洗浄し、GeneChip Scanner によりそのシグナルを読み取った。得られた発現データはアレイアシスト（MediBic）により解析した。【００７０】
リアルタイムPCR
1 μg のトータルＲＮＡよりSuperScript reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてcDNA を合成した。ABI PRISM 7000 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて定量解析を行った。【００７１】
RNA干渉及び増殖測定
AKR1B10, HCAP-G, TPX2 に対する干渉オリゴRNA small interfering ribonucleic acid (siRNA) は、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＨＣＡＰ−Ｇ及びＴＰＸ２遺伝子のいずれかのＲＮＡに対するセンス鎖及びアンチセンス鎖を配列表の配列番号１０〜２５とした。これらのsiRNA およびコントロールsiRNAはAmbion から購入した。これらのsiRNA はLipofectamine 2000 試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて細胞株に導入した。siRNA を導入後、2 日目でPremix WST-1 Cell Proliferation Assay System (TaKaRa)を用いて細胞活性を測定した。【００７２】
抗体
抗AKR1B10 (clone 1A6) モノクローナル抗体と抗HCAP-G (clone 4B1)モノクローナル抗体はAbnova (Taipei, Taiwan)より、また、抗TPX2 抗体はNovusBiologicals, Inc. より購入した。【００７３】
免疫細胞染色
ホルマリン固定、パラフィン包埋した肝細胞癌を含む肝臓組織標本はアビジン、ビオチン法を用いて染色した。標本を一次抗体で4℃において一晩インキュベートした。二次抗体として、ビオチン化抗マウスIgG 抗体とビオチン化抗ラビットIgG 抗体(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA. USA)を使用した。ヌードマウスにおける肝癌細胞移植実験5 週齢のメスBALB/c nu/nu ヌードマウスをSLC （東京、日本）より購入し使用した。8×106 個のKIM−1 細胞は0.1 ml のPBS に懸濁しマウスの腹側部に注入した。7 日後にsiRNA をアテロコラーゲン（Koken Co., Ltd, Tokyo, Japan)と混合し、それぞれ最終濃度30 μM と0.5%で注入した。腫瘍の大きさは3 日ごとに計測した。腫瘍の大きさはV = 1/2 (A x B2)(A = 長径、B = 短径)の計算式で算出した。【００７４】
２．結果
AKR1B10、HCAP-G及びTPX2の発現量
肝細胞癌および正常組織におけるAKR1B10, HCAP-G, TPX2 の発現解析10 ペアの肝細胞癌とその背景組織、および正常組織（腎臓、肝臓、肺、脳、大腸、食道、心臓、卵巣、前立腺、骨格筋、小腸、脂肪細胞、膀胱、子宮頸部、脾臓、胸腺、甲状腺、気管）をエクソンアレイにより発現解析を行った。さらに、20 ペアの肝細胞癌とその背景組織についてリアルタイムPCR を行いAKR1B10, HCAP-G, TPX2 の発現を定量した。その結果、AKR1B10 は正常組織では高発現が見られず、肝細胞癌において特異的な高発現が見られた。HCAP-GとTPX2 は正常組織中では胸腺でのみ高発現がみられ、肝細胞癌において高発現がみられた（図１）。図１が示す通り、AKR1B10 は正常組織では高発現が見られず、肝細胞癌において特異的な高発現が見られた。HCAP-G とTPX2 は正常組織中では胸腺でのみ高発現がみられ、肝細胞癌において高発現がみられた。これらの結果と胸腺が成人で退縮するということから、AKR1B10、HCAP-G及びTPX2の発現量は治療標的になり得ることが明らかになった。【００７５】
免疫染色
肝細胞癌の組織切片を用い免疫染色を行いAKR1B10, HCAP-G, TPX2 のタンパクレベルでの発現を解析した。その結果、AKR1B10 は19 検体中84%にあたる16 検体において背景組織ではほとんど染色が見られず、肝細胞癌に非常に強い染色が見られた。HCAP-G は19 検体中58%にあたる11 検体において背景組織に比して肝細胞癌に強い染色が見られた。TPX2 は19 検体中42%にあたる8 検体において背景組織に比して肝細胞癌に強い染色が見られた (図２)。図２が示す通り、AKR1B10 は19 検体中84%にあたる16 検体において背景組織ではほとんど染色が見られず、肝細胞癌に非常に強い染色が見られた。HCAP-G は19 検体中58%にあたる11 検体において背景組織に比して肝細胞癌に強い染色が見られた。TPX2 は19 検体中42%にあたる8 検体において背景組織に比して肝細胞癌に強い染色が見られた。【００７６】
siRNAによる機能阻害
肝細胞癌において過剰発現が確認されたAKR1B10, HCAP-G, TPX2 についてsiRNA による機能阻害実験を行った。各遺伝子に対してsiRNA は３つずつ設計した。肝細胞株であるKIM-1, Hep3B, HLE にAKR1B10, HCAP-G, TPX2 に対するsiRNA をトランスフェクションし、その後細胞増殖を測定した。その結果、AKR1B10 に対するsiRNA の１と３（AKR1B10-1, 3）, HCAP-G に対するsiRNAの１〜３（HCAPG-1, 2, 3）,TPX2 に対するsiRNA の１〜３（TPX2-1, 2, 3）は３つの細胞株すべてにおいて増殖抑制効果を示した（図３上段）。増殖抑制効果のみられたsiRNA については、それぞれターゲット遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。KIM-1 細胞にsiRNA をトランスフェクション後RNA 抽出を行い、リアルタイムPCR にて各遺伝子の発現を定量した。その結果コントロールsiRNA をトランスフェクトした時と比較し、ターゲット遺伝子の発現が減少していることが確認できた（図３下段）。AKR1B10 に対するsiRNA の１と３（AKR1B10-1, 3）, HCAP-G に対するsiRNAの１〜３（HCAPG-1, 2, 3）,TPX2 に対するsiRNA の１〜３（TPX2-1, 2, 3）はKIM-1, Hep3B, HLE 細胞すべてにおいて増殖抑制効果を示した（上段）。増殖抑制効果のみられたsiRNA については、それぞれターゲット遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。KIM-1 細胞にsiRNA をトランスフェクション後RNA 抽出を行い、リアルタイムPCR にて各遺伝子の発現を定量した。その結果コントロールsiRNA をトランスフェクトした時と比較し、ターゲット遺伝子の発現が減少していることが確認できた（下段）。【００７７】
生体内における増殖抑制効果
生体内においてもAKR1B10, HCAP-G, TPX2 を抑制することで肝細胞癌の増殖が抑制されるかを検証するため、次のような実験を行った。ヌードマウスの腹側部にKIM-1 細胞を注入し生着させた後、この移植細胞をAKR1B10, HCAP-G,TPX2 に対するsiRNA とアテロコラーゲンの複合体で処理した。アテロコラーゲンはコラーゲンＩの分解物でプラスに帯電しておりsiRNA と複合体を形成できる。アテロコラーゲンと複合体を形成することでsiRNA が分解から保護されること、持続的な作用がみられることなどがすでに知られている。まず、siRNAとアテロコラーゲンによる処理により標的遺伝子の発現が低下していることをリアルタイムPCR により確認した（図４Ａ）。つぎにsiRNA とアテロコラーゲンによる処理を2 回行い、3 日ごとに移植細胞の大きさを計測した。その結果、図４ＢでみられるようにAKR1B10, HCAP-G, TPX2 に対するsiRNA を投与したときに顕著に増殖の抑制がみられた。KIM-1 細胞を注入後28 日目に生着した移植細胞を摘出し、重量を測定した結果、同様に増殖抑制効果が確認できた（図４Ｃ）。 siRNA とアテロコラーゲンによる処理により標的遺伝子の発現が低下していることをリアルタイムPCR により確認した。siRNA とアテロコラーゲンによる処理を2 回行い、3 日ごとに移植細胞の大きさを計測した結果、AKR1B10, HCAP-G, TPX2に対するsiRNAを投与したときに顕著に増殖の抑制がみられた。KIM-1細胞を注入後28 日目に生着した移植細胞を摘出し、重量を測定した結果、AKR1B10, HCAP-G, TPX2 に対するsiRNA を投与したときに顕著に重量の低下がおきた。
【図１】
2009113495.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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