(57)【要約】  結晶を簡便に製造することが可能で、かつ、製造された結晶が取り扱いやすい結晶製造方法を提供する。  本発明の結晶製造方法は、生体物質を結晶化させる結晶化工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、前記結晶化工程において、前記生体物質をゲル中で結晶化させることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を結晶化させる結晶化工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、
前記結晶化工程において、前記生体物質をゲル中で結晶化させることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記生体物質が、生体高分子化合物、タンパク質、天然タンパク質、人工タンパク質、ペプチド、天然ペプチド、人工ペプチド、核酸、天然核酸、人工核酸、糖鎖、天然糖鎖、または人工糖鎖である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記結晶化工程に先立ち、
前記生体物質の溶液を準備する溶液準備工程と、
前記溶液をゲル化させて前記ゲルを調製するゲル化工程とをさらに含む、
請求項１の製造方法。
【請求項４】
前記生体物質溶液がゲル化剤をさらに含む請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
ゲル化剤が、多糖類、増粘多糖類、タンパク質、および昇温時ゲル化型ゲルからなる群から選択される少なくとも一つである請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
ゲル化剤が、アガロース、寒天、カラギーナン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアクリルアミド、昇温時ゲル化型ポリアクリルアミドゲルからなる群から選択される少なくとも一つである請求項４記載の製造方法。
【請求項７】
前記ゲルのゲル強度が１００Ｐａ以上である請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
製造される前記結晶が、前記ゲルで被覆された被覆結晶である請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
生体物質の結晶を凍結する凍結工程を含む凍結結晶の製造方法であって、
請求項８記載の方法により前記被覆結晶を製造する被覆結晶製造工程をさらに含み、
前記凍結工程において、前記被覆結晶を凍結することを特徴とする製造方法。
【請求項１０】
前記凍結工程に先立ち、前記被覆結晶を抗凍結剤に浸漬させる浸漬工程をさらに含む請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
種結晶である生体物質結晶を前記生体物質の溶液中でさらに成長させる結晶成長工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、
前記結晶成長工程において、前記種結晶が、請求項８記載の方法により製造される被覆結晶であることを特徴とする製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法により製造される結晶。
【請求項１３】
生体物質の結晶を構造解析する方法であって、
請求項８記載の製造方法により製造された被覆結晶または請求項９もしくは１０記載の製造方法により製造された凍結結晶を構造解析する構造解析工程を含むことを特徴とする構造解析方法。
【請求項１４】
前記構造解析工程において、Ｘ線結晶構造解析または中性子線結晶構造解析により前記結晶を構造解析する請求項１３記載の構造解析方法。
【請求項１５】
生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング方法であって、
前記生体物質の結晶を製造する結晶製造工程と、
前記結晶製造工程における結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含み、
前記結晶製造工程において、請求項１記載の結晶製造方法または請求項９記載の凍結結晶製造方法により前記結晶を製造することを特徴とする結晶化スクリーニング方法。
【請求項１６】
生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング装置であって、
前記生体物質の結晶を製造する結晶製造手段と、
前記生体物質の結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング手段とを含み、
前記結晶製造手段が、ゲル中で前記生体物質の結晶を析出させる結晶化手段を含むことを特徴とする結晶化スクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶製造方法、凍結結晶製造方法、結晶、結晶構造解析方法、結晶化スクリーニング方法、結晶化スクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸等の生体物質の立体構造を明らかにすることは、産業上極めて有用である。具体的には、例えば、前記生体物質の生体中における機能が明らかになるため、能率的な医薬品の開発が可能となる。【０００３】
タンパク質、核酸等の立体構造を解析するための方法としては、例えば結晶構造解析、特にＸ線回折像撮影による結晶構造解析が優れており、広く用いられている。この方法により解析するためには、検体（被解析物質）である前記タンパク質、核酸等の結晶を製造する必要がある。そのために、前記検体を含む溶液から前記検体の結晶を析出（結晶化）させる方法が行われている（特許文献１等）。
【特許文献１】国際公開パンフレットＷＯ２００４／１０６５９８号公報
【発明の開示】
【０００４】
前述のようにタンパク質、核酸等の溶液から結晶を析出（結晶化）させる結晶の製造方法には、非常に高度な技術が必要であり、困難を伴う。さらに、タンパク質、核酸等の結晶は、非常に脆く、結晶内部にひずみを生じやすいので、慎重に取り扱わなければ簡単に破壊されてしまうという問題がある。
【０００５】
そこで、本発明は、結晶を簡便に製造することが可能で、かつ、製造された結晶が取り扱いやすい結晶製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者等は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、タンパク質、核酸等の生体物質の結晶製造方法において、前記生体物質の溶液に代えてゲル中から結晶を析出させることを見出した。前述の通り、タンパク質、核酸等の生体物質の結晶製造方法においては、従来、溶液から結晶を析出させることが一般に行われていた。これらの生体物質について、ゲル中から直接結晶を析出させる試みは、本発明者等がはじめて行った。
【０００７】
すなわち、本発明の結晶製造方法は、
生体物質の結晶を製造する方法であって、
前記生体物質をゲル中で結晶化させる結晶化工程を含むことを特徴とする。
【０００８】
さらに、本発明は、
生体物質の結晶を凍結する凍結工程を含む凍結結晶の製造方法であって、
前記本発明の結晶製造方法により、前記ゲルで被覆された前記被覆結晶を製造する被覆結晶製造工程をさらに含み、
前記凍結工程において、前記被覆結晶を凍結することを特徴とする凍結結晶製造方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、
種結晶である生体物質結晶を前記生体物質の溶液中でさらに成長させる結晶成長工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、
前記結晶成長工程において、前記種結晶が、前記本発明の結晶製造方法により製造される、前記ゲルで被覆された被覆結晶であることを特徴とする結晶製造方法を提供する。なお、この結晶製造方法を、以下、「本発明の成長結晶製造方法」または単に「成長結晶製造方法」ということがある。
【００１０】
さらに、本発明は、前記本発明の結晶製造方法、前記本発明の凍結結晶製造方法、または前記本発明の成長結晶製造方法により製造される結晶を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、
生体物質の結晶を構造解析する方法であって、
前記本発明の結晶製造方法により製造された被覆結晶または前記本発明の凍結結晶製造方法により製造された凍結結晶を構造解析する構造解析工程を含むことを特徴とする構造解析方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、
生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング方法であって、
前記生体物質の結晶を製造する結晶製造工程と、
前記結晶製造工程における結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含み、
前記結晶製造工程において、本発明の結晶製造方法または本発明の凍結結晶製造方法により前記結晶を製造することを特徴とする結晶化スクリーニング方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、
生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング装置であって、
前記生体物質の結晶を製造する結晶製造手段と、
前記生体物質の結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング手段とを含み、
前記結晶製造手段が、ゲル中で前記生体物質の結晶を析出させる結晶化手段を含むことを特徴とする結晶化スクリーニング装置を提供する。
【００１４】
本発明の結晶製造方法によれば、溶液中から結晶を析出させるよりも、前記生体物質の結晶を簡便に製造することが可能である。この理由は必ずしも明らかではないが、例えば、溶液中と異なり、生成した結晶がゲルにより固定されていることが原因と考えられる。より具体的には、例えば、生成した結晶がゲルに固定されているため、容器の壁等への衝突による破損、生成した結晶同士の衝突による多結晶化等が防止可能であり、格子欠陥の少ない単結晶に成長しやすいと考えられる。ただし、これらの考察は、可能な機構の一例を示すに過ぎず、本発明を何ら限定しない。
【００１５】
また、本発明の凍結結晶製造方法によれば、前記結晶が凍結による損傷を受けにくい。さらに、本発明の構造解析方法によれば、前記ゲルで被覆された被覆結晶またはそれを凍結した前記凍結結晶を構造解析するため、結晶の取り扱いがしやすいという利点がある。
【００１６】
さらに、本発明の成長結晶製造方法によれば、前記ゲルで被覆された被覆結晶を種結晶として結晶を成長させるため、より大きな結晶を得ることができる。また、本発明の結晶は、前記本発明の結晶製造方法、前記本発明の凍結結晶製造方法、または前記本発明の成長結晶製造方法により製造されることで、例えば結晶構造解析等に向いた良好な特性を有する。ただし、本発明の結晶の製造方法は特に制限されず、同様の特性を有するのであれば他の任意の製造方法で製造された結晶でもよい。
【００１７】
さらに、本発明の結晶化スクリーニング方法は、本発明の結晶製造方法により簡便に結晶を製造できることで、結晶製造条件をさほど厳密に設定しなくても良いため、スクリーニングをも簡便に行うことができる。さらに、本発明の結晶化スクリーニング装置は、同様の理由により、装置の構成を簡略化することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の一実施例により得られた結晶の写真である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの結晶を角度を変えて撮影した写真である。
【図２Ａ】図２Ａは、図１の結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの一部の拡大図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の他の一実施例により得られた結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの一部の拡大図である。
【図４】図４は、図３の結晶を別の条件により測定したときのＸ線回折像を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、図４の結晶をさらに別の条件により測定したときのＸ線回折像を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの一部の拡大図である。
【図６Ａ】図６Ａは、図３〜５の結晶を抗凍結剤に浸漬する直前の状態を示す写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａの結晶を抗凍結剤に浸漬してから５秒後の状態を示す写真である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６Ａの結晶を抗凍結剤に浸漬してから１分後の状態を示す写真である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図６Ａの結晶を抗凍結剤に浸漬してから５分後の状態を示す写真である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明のさらに別の一実施例により得られた結晶の写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７Ｂの一部の拡大図である。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明のさらに別の一実施例により得られた結晶の写真である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａの結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ｂの一部の拡大図である。
【図９Ａ】図９Ａは、比較例の結晶を抗凍結剤に浸漬する直前の状態を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの結晶を抗凍結剤に浸漬した直後の状態を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、他の比較例の結晶を抗凍結剤に浸漬する直前の状態を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａの結晶を抗凍結剤に浸漬した直後の状態を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明のさらに別の実施例および比較例の結晶の写真およびデータを示す図である。
【図１２】図１２は、本発明のさらに別の実施例の結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図１３】図１３は、生体分子の結晶構造解析結果の一例を示す模式図である。
【図１４】図１４は、生体分子の結晶構造解析結果のさらに別の一例を示す模式図である。
【図１５】図１５は、本発明の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明のさらに別の実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示す写真およびグラフである。
【図２３】図２３は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示す写真およびグラフである。
【図２４】図２４は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明のさらに別の一実施例における結晶化スクリーニング結果を示す写真である。
【図２６】図２６は、本発明のさらに別の実施例における大腸菌由来タンパク質結晶を示す写真である。
【図２７】図２７は、本発明のさらに別の実施例におけるＤＮＡ結晶を示す写真である。
【図２８】図２８は、本発明のさらに別の実施例における、結晶化スクリーニング結果を示すグラフおよび結晶の写真である。
【図２９】図２９は、温度を低下させて被覆ゲルを除去した例を示す写真である。
【図３０】図３０は、実施例の結晶および比較例の結晶の乾燥耐性評価を示す写真である。
【図３１Ａ】図３１Ａは、さらに別の実施例および比較例の結晶の乾燥耐性評価を示す写真である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、図３１Ａの評価時間の経過後における、同じ実施例の結晶および比較例の結晶の乾燥耐性評価を示す写真である。
【図３２】図３２は、さらに別の実施例で製造した結晶において、周囲の溶液のゲル化前およびゲル化後の結晶状態を示す写真である。
【図３３】図３３は、実施例の結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図３４】図３４は、さらに別の実施例の結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図３５】図３５は、ゲル被覆結晶のフェムト秒レーザーによる加工を示す写真である。
【図３６】図３６は、フェムト秒レーザー加工したゲル被覆結晶の取り出しを示す写真である。
【図３７】図３７は、図３６の結晶の写真およびＸ線結晶構造解析データを示す図である。
【図３８】図３８は、成長結晶製造方法の一実施例を示す写真である。
【図３９】図３９は、成長結晶製造方法の別の一実施例を示す写真である。
【図４０】図４０は、遠心分離による濃度勾配を用いた結晶化スクリーニング方法の一例を模式的に示す図である。
【図４１】図４１は、図４０の方法による結晶化スクリーニング結果を示す写真である。
【図４２】図４２は、結晶構造解析における結晶のマウント操作を例示する模式図である。
【図４３】図４３は、結晶構造解析における結晶のマウント操作に用いる機器を例示する模式図である。
【図４４】図４４は、本発明の結晶化スクリーニング装置の一例を示す模式図である。
【図４５】図４５は、本発明の結晶化スクリーニング装置（結晶化キット）のさらに別の一例を示す模式図である。
【図４６】図４６は、本発明の結晶化スクリーニングの一例を示す模式図である。
【図４７】図４７は、アガロースゲルのゲル強度測定結果の一例を示すグラフである。
【図４８】図４８は、図４７のグラフのデータの一部を抜粋したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されない。なお、本発明において、数値限定により発明を特定する場合、特に示さない限り、厳密にその数値でも良いし、約その数値でもよい。例えば、「０〜９０℃」と記載した場合、特に示さない限り、厳密に０〜９０℃でも良いし、約０℃〜約９０℃でも良い。【００２０】
［結晶製造方法］
前述の通り、本発明の結晶製造方法は、生体物質を結晶化させる結晶化工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、前記結晶化工程において、前記生体物質をゲル中で結晶化させることを特徴とする。【００２１】
本発明において、「生体物質」とは、生体由来の物質でも良いが、それと同一の構造を有する合成物質でも良く、または、生体由来物質と類似の構造を有する誘導体や人工物質であっても良いものとする。例えば、前記生体物質が生体高分子化合物の場合は、生体由来の高分子化合物でも、それと同一の構造を有する合成高分子化合物でも、または、生体由来高分子化合物と類似の構造を有する誘導体や人工高分子化合物であっても良い。前記生体物質がタンパク質の場合は、生体由来（天然由来）のタンパク質でも、合成タンパク質でも良いし、天然に存在する構造の天然タンパク質でも、天然に存在しない構造の人工タンパク質でもよい。前記生体物質がペプチドの場合は、生体由来（天然由来）のペプチドでも、合成ペプチドでも良いし、天然に存在する構造の天然ペプチドでも、天然に存在しない構造の人工ペプチドでもよい。前記生体物質が核酸の場合は、生体由来（天然由来）の核酸でも、合成核酸でも良いし、天然に存在する構造の天然核酸でも、天然に存在しない構造の人工核酸でもよい。前記生体物質が糖鎖の場合は、生体由来（天然由来）の糖鎖でも、合成糖鎖でも良いし、天然に存在する構造の天然糖鎖でも、天然に存在しない構造の人工糖鎖でもよい。前記生体物質は、特に制限されないが、例えば、生体高分子化合物、タンパク質、天然タンパク質、人工タンパク質、ペプチド、天然ペプチド、人工ペプチド、核酸、天然核酸、人工核酸、糖鎖、天然糖鎖、または人工糖鎖であることが好ましい。なお、天然核酸としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等があげられる。また、人工核酸としては、特に制限されないが、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ等があげられる。また、本発明において、前記生体物質の分子量は特に制限されない。例えば、前記「生体高分子化合物」の分子量は、例えば、５０００以上であるが、これには限定されず、５０００未満であっても良い。また、前記生体物質がペプチドの場合、分子量は、例えば１０００以上であるが、これには限定されず、１０００未満であっても良い。【００２２】
本発明の結晶製造方法は、前記結晶化工程に先立ち、前記生体物質の溶液を準備する溶液準備工程と、前記溶液をゲル化させて前記ゲルを調製するゲル化工程とをさらに含むことが好ましく、前記生体物質溶液がゲル化剤をさらに含むことがより好ましい。前記ゲル化剤は特に制限されないが、例えば、多糖類、増粘多糖類、タンパク質、および昇温時ゲル化型ゲルからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましく、アガロース、寒天、カラギーナン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアクリルアミド、昇温時ゲル化型ポリアクリルアミドゲルからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。ゲル化温度は特に制限されないが、結晶製造の行いやすさの観点から、例えば０〜９０℃、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは０〜３５℃である。【００２３】
前記ゲル化剤は、例えば、低温でゲル化し高温でゾル化するゲルでも良いし、逆に低温でゾル化し高温でゲル化するゲルでも良い。低温でゾル化し高温でゲル化するゲルは、「昇温時ゲル化型ゲル」という。また、例えば、冷却により得られたゲルを再び昇温した時、あるいは昇温により得られたゲルを再び冷却した時、再びゾルに戻るゲルであることが好ましい。このようなゲル化剤は「熱可逆性ゲル」という。また、前記ゲル化剤は、例えば、ハイドロゲルでもオルガノゲルでも良いが、ハイドロゲルが好ましい。ハイドロゲルとしては、例えば、昇温時ゲル化型ハイドロゲルを用いることがより好ましい。昇温時ゲル化型ハイドロゲルは、低温でゲル化し高温でゾル化する一般的なゲルとは逆に、前述のように低温でゾル化し高温でゲル化する性質を持っている。このため、昇温時ゲル化型ハイドロゲルで被覆された被覆結晶は、例えば、乾燥に特に強い、冷却によりゲルを簡便に除去できる、などの利点を有する。昇温時ゲル化型ハイドロゲルとしては、特に制限されないが、例えば、メビオールジェルが挙げられる。メビオールジェルは、メビオール株式会社の昇温時ゲル化型ハイドロゲルの商品名であり、例えば下記の化学構造を有する。メビオールジェルは、昇温時ゲル化型ハイドロゲルとしての性質および熱可逆性ハイドロゲルとしての性質を有するポリアクリルアミドゲルである。
【化１】
2009091053.tif 000002
【００２４】
本発明の結晶製造方法は、より具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。【００２５】
（１）溶液準備工程
まず、前記生体物質を溶媒に溶かし、溶液とする。前記溶媒は特に制限されないが、例えば、公知の結晶製造方法に用いる溶媒と同じ物を用いてもよい。前記溶媒は、具体的には、例えば、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトン、アニソール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、シクロヘキサン、ジエチルアミン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ブタノール、ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ベンゼン、メチルエチルケトンからなる群から選択される少なくとも一つであり、好ましくは水である。前記生体物質の濃度は、特に制限されないが、例えば０．２〜３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍＬである。また、必要に応じ、ｐＨ調整剤等を適宜加えてもよい。【００２６】
（２）ゲル化工程
次に、前記生体物質溶液にゲル化剤を加え、ゲル化させ、前記生体物質を含むゲルを調製する。ゲル化剤は、前記生体物質溶液中に直接加えても良いが、別途ゲル化剤溶液を調製した後、前記生体物質溶液に混合すると、均一に混合しやすいため好ましい。前記ゲル化剤溶液の溶媒は特に制限されないが、例えば、前記生体物質溶液と同じである。また、前記ゲル化剤溶液中におけるゲル化剤濃度は特に制限されないが、後述のゲル強度等の観点から、前記ゲル化剤溶液の全質量に対し、例えば０．６〜５０質量％、好ましくは０．８〜４０質量％、より好ましくは１．０〜３０質量％、さらに好ましくは１．０〜２５質量％、特に好ましくは１．０〜２０質量％である。なお、ゲル化剤濃度と前記生体物質の結晶化のしやすさとの相関関係のメカニズムは不明であるが、例えば、後述する本発明の結晶化スクリーニング方法等を利用して、前記ゲル化剤濃度を適宜設定できる。前記生体物質溶液にゲル化剤を加えた後、ゲル化させる方法は特に制限されない。例えば、ゲル化温度よりも高い温度（例えば２０〜４５℃）で前記ゲル化剤溶液を調製し、前記生体物質溶液と混合した後、ゲル化温度以下の温度で静置すれば良い。より具体的には、例えば、前記ゲル化剤溶液と前記生体物質溶液を混合した後、キャピラリーに封入し、キャピラリー中でゲル化させてもよい。これにより、ゲルがキャピラリーに封入された状態となる。また、熱可逆性ハイドロゲルの場合は、例えば前記とは逆に、低温で前記ゲル化剤溶液を調製し、前記生体物質溶液と混合した後、温度を上昇させてゲル化させてもよい。【００２７】
前記ゲル化後のゲル強度は、後述する結晶化工程で析出した前記生体物質結晶を物理的衝撃から保護しやすい等の観点から、例えば１００Ｐａ以上、好ましくは２００Ｐａ以上、より好ましくは３００Ｐａ以上、さらに好ましくは５００Ｐａ以上、特に好ましくは１０００Ｐａ以上である。前記ゲル化剤のゲル強度は高いほど好ましく、上限は特に制限されないが、例えば、２０００００Ｐａ以下である。前記ゲル化後のゲル強度は、前記ゲル化剤濃度を調節することによって、適宜設定することができる。同じゲル化剤濃度における前記ゲル強度は、前記ゲル化剤の種類によって異なる。例えば、図４７のグラフに示すとおり、アガロースＩＩＩ、アガロースＳＰ（アガロースＳｅａ  Ｐｌａｑｕｅ）、アガロース９Ａ（いずれもタカラバイオ株式会社の商品名）は、同じ濃度であれば、ゲル化後は、通常、アガロースＩＩＩ＞アガロースＳＰ＞アガロース９Ａの順にゲル強度が高くなる。なお、図４８のグラフに、図４７におけるアガロース９Ａのみの測定結果を示す。図４７および４８において、横軸は前記各アガロースの濃度（質量％）であり、縦軸はゲル強度（ｇ／ｃｍ２）である。なお、１ｇ／ｃｍ２は、９８．０６６５Ｐａに相当する。また、ゲル化剤濃度が一定の臨界的濃度未満である場合、前記ゲル化剤を含む溶液が明確にゲル化しないため、ゲル強度は測定不能（グラフ上の記載としては０）である。しかしながら、ゲル化剤濃度が前記臨界的濃度以上になると、前記溶液が明確にゲル化することが可能であるため、ゲル強度が測定可能となる。本発明においては、前記ゲル化剤濃度を前記臨界的濃度以上にすることが好ましい。前記臨界的濃度は、アガロースＩＩＩ、アガロースＳＰ、アガロース９Ａの場合、図４７および図４８に示すとおり、いずれも、約０．６質量％である。【００２８】
なお、前記ゲル強度は、レオストレス  ＲＳ１  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（英弘精機株式会社のレオメーターの商品名）を動的粘弾性測定モードで用い、周波数１Ｈｚ、測定温度２０℃で測定した数値とする。図４７および図４８に示す測定値も、この方法で測定した。なお、ゲル溶解温度が２０℃よりも低いために２０℃でゲル状態にならない（ゾル状である）ゲルの場合は、前記ゲル強度は、前記ゲル溶解温度よりも低く５で割り切れる摂氏温度（例：１５℃、１０℃、５℃、０℃、−５℃）のうち最も高い測定可能温度での測定値とする。熱可逆性でありゲル溶解温度が２０℃よりも高いために２０℃でゲル状態にならない（ゾル状である）ゲルの場合は、前記ゲル強度は、前記ゲル溶解温度よりも高く５で割り切れる摂氏温度（例：２５℃、３０℃、３５℃）のうち最も低い測定可能温度での測定値とする。ただし、この測定方法は、前記ゲル強度の測定方法の一例であって、本発明は、この測定方法における工程および条件によって何ら限定されない。また、他のレオメーターを用いても、同じ測定モード、測定温度および周波数で測定すれば、誤差を除いて同じゲル強度測定値を得ることができる。【００２９】
（３）結晶化工程
さらに、前記ゲル中から前記生体物質の結晶を析出させる。この方法は特に制限されない。例えば、前記ゲルを単に静置し、前記生体物質の結晶が析出するのを待ってもよい。また、例えば、前記ゲルを、沈殿化剤溶液に接触もしくは近接させた状態で静置してもよい。より具体的には、例えば、前記ゲルをキャピラリーに封入した後、前記沈殿化剤溶液に浸漬させてもよい。前記沈殿化剤は特に制限されないが、例えば、公知の結晶製造方法に用いる沈殿化剤と同じ物を用いてもよい。前記沈殿化剤は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酒石酸カリウムナトリウム、クエン酸ナトリウム、PEG（ポリエチレングリコール）、塩化マグネシウム、カコジル酸ナトリウム、HEPES(2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸)、MPD(2-メチル-2,4-ペンタンジオール)、Tris-HCl（塩酸トリスヒドロキシメチルアミノメタン）からなる群から選択される少なくとも一つである。前記沈殿化剤溶液の溶媒は特に制限されないが、例えば、前記生体物質溶液と同じでもよい。前記沈殿化剤の濃度も特に制限されないが、例えば０．０００１〜１０Ｍ、好ましくは０．０００５〜８Ｍ、より好ましくは０．０００５〜６Ｍである。また、前記沈殿化剤は、必要に応じ、ｐＨ調整剤等を適宜含んでいてもよい。なお、沈殿化剤は、「沈殿剤」とも言うことがある。また、上記においては、前記生体物質溶液を含むゲルを沈殿化剤溶液に接触もしくは近接させる方法を示したが、沈殿化剤を用いる結晶化方法は、これに限定されない。例えば、前記結晶化方法は、前記生体物質溶液にゲル化剤とともに沈殿化剤を混合しておき、ゲル化させて沈殿化剤を含むゲルとし、ゲル化後そのまま静置して結晶を析出させる方法でもよい。このような結晶化方法を「バッチ法」という。前記生体物質溶液の溶媒、前記生体物質の濃度、前記ゲル化剤の濃度、前記沈殿化剤の濃度等は、特に制限されないが、例えば、前記と同様である。【００３０】
タンパク質等の生体物質の結晶化は、例えば、前記生体物質と沈殿化剤との混合比により制御することができる。この混合比をより詳細に制御することで、例えば、さらに高品質かつ大型の単結晶を得ることも可能である。本発明では、例えば、網目の分子構造を持ったゲル（例えばアガロースゲル）に前記のようにして沈殿化剤を拡散させることによって、濃度勾配を形成できる。これにより、前記生体物質溶液と沈殿化剤溶液を直接混合するよりも、前記混合比を容易に制御することが可能である。この場合、沈殿化剤の拡散速度が結晶成長速度に比べ十分遅いことがより好ましい。これにより、最適な混合比の条件で前記タンパク質等の生体物質の結晶化が実現できるため、結晶の製造がさらに簡便になる。また、これにより、本発明の製造方法は、様々な組み合わせの混合比を一気に検索することが可能な“コンビナトリアル結晶化技術”として、結晶化スクリーニング方法に応用することもできる。前記濃度勾配形成を利用したスクリーニングの具体的な方法およびそれに用いる装置は、例えば、後述の通りである。【００３１】
以上のようにして本発明の結晶製造方法を実施することができるが、本発明はこれに限定されない。本発明の結晶製造方法は、例えば、下記(i)または(ii)の方法により行っても良いし、それ以外の方法により行ってもよい。なお、本発明において、下記(i)を「カウンターディフュージョン法」と呼び、下記(ii)を「液体−固体法」と呼ぶものとする。
(i)前述のように、ゲル化温度よりも高い温度（例えば２０〜４５℃）で前記ゲル化剤溶液を調製し、前記生体物質（タンパク質等）の溶液と混合し、キャピラリー中に封入してゲル化させる。その後、必要に応じ、沈殿化剤溶液と接触させる。
(ii)まず、ゲル（例えば、固形アガロース）を準備し、これに、別途準備した前記生体物質（タンパク質等）の溶液を浸透させ、ゲル中で前記生体物質を結晶化させる。必要に応じ、沈殿化剤を前記ゲルにさらに浸透させることにより、前記生体物質を結晶化させる。沈殿化剤は、溶液の状態でも、固形のまま用いてもよい。【００３２】
さらに、本発明の結晶製造方法では、前述の通り、前記生体物質をゲル中で結晶化させる。この「ゲル中で結晶化させる」とは、例えば前述のように、ゲル化工程後にそのゲル中で前記生体物質を結晶化させてもよい。その他、前記「ゲル中で結晶化させる」とは、例えば、ゲル化剤を含む前記生体物質溶液が、ゲル化せずゾル状態の場合に、そのゾル状態のゲル化剤溶液中で前記生体物質を結晶化させることも含むものとする。メカニズムは明らかではないが、ゾル状態の溶液でも、ゲル化剤を含むことにより、結晶が析出しやすくなり、結晶の破損等が起こりにくくなるという本発明の効果が得られる場合があるためである。前記ゾル状態のゲル化剤溶液中で前記生体物質を結晶化させる方法は、例えば、前記ゲル化剤が熱可逆性ハイドロゲルである場合に特に有用である。また、例えば、前記生体物質および前記熱可逆性ハイドロゲルを含むゾル状態溶液を攪拌しながら前記生体物質を結晶化させ、その後前記溶液をゲル化させ、そのゲル中で前記生体物質結晶をさらに成長させることが特に好ましい。前記ゾル状態溶液の攪拌を行うことで、例えば、さらに前記生体物質結晶が成長しやすくなり、大きな結晶が得やすい等の利点がある。前記攪拌の速度は特に制限されないが、例えば１０〜１０００ｒｐｍ、好ましくは３０〜２００ｒｐｍ、より好ましくは５０〜１００ｒｐｍである。前記攪拌の時間も特に制限されないが、例えば５分〜６０日、好ましくは３０分〜３０日、より好ましくは１時間〜２０日である。前記攪拌時の前記ゾル状態溶液の温度も特に制限されないが、例えば０〜４０℃、好ましくは２〜３０℃、特に好ましくは４〜２５℃である。【００３３】
本発明の結晶製造方法により製造される結晶は、例えば、前記ゲルで被覆された被覆結晶であることが好ましい。この被覆結晶の製造条件は特に制限されないが、例えば、本発明の結晶製造方法において、前記ゲル中から前記生体物質の結晶を析出させることで、必然的に、前記ゲルで被覆された被覆結晶としてもよい。一般に、タンパク質等の生体物質の結晶は、脆く、かつ、乾燥等により変質しやすい。このため、生体物質結晶は、例えば、結晶構造解析の試料として供する操作（マウント）および種結晶として供する操作（Seeding）時など、慎重にかつ手早く操作を行わないと、物理的衝撃や乾燥により破損、変質等を起こしてしまうことが多い。これに対し、本発明における前記被覆結晶は、結晶がゲルで被覆されていることにより、乾燥や物理的衝撃に対する耐性が向上しており、結晶の変質、破損等が起こりにくい。このため、例えば、前記マウント操作やSeeding操作が極めて行いやすくなる。さらに、結晶の保存性も向上する。【００３４】
なお、前記被覆結晶において、結晶を被覆している前記ゲルは、例えば、後述の結晶構造解析において測定ノイズの原因となるなどの支障がある場合は、あらかじめ除去することが好ましい。除去方法は特に制限されない。例えば、前記ゲルが熱可逆性ハイドロゲルであれば、前述の通り、冷却により前記ゲルがゾル化するため、簡便に除去できる。ゾル化させるための冷却温度は特に制限されないが、メビオールジェルの場合、例えば、１５℃以下である。また、前記被覆結晶を適宜な方法で加工し、前記ゲルを含まない結晶だけを取り出すこともできる。前記加工の方法は特に制限されないが、例えば、レーザー光を用いた加工がある。前記レーザー光も特に制限されないが、フェムト秒レーザーを用いることが特に好ましい。フェムト秒レーザーは、集光点付近のみで加工を行うことが可能であるため、例えば、結晶製造（育成）用容器を密封したままで簡便に加工できる等の利点があるためである。また、レーザー光を用いた加工によれば、例えば、結晶を、構造解析等の用途に適した大きさや形状に切り出すこともできる。このような加工工程により、結晶を適切な大きさや形状に切り出すことで、前記適切な大きさや形状の結晶を製造することもできる。また、例えば、前記加工工程により、前記被覆結晶からゲルのみを適切に除去し、結晶部分のみを残した加工結晶を製造することもできる。すなわち、前記加工結晶は、ゲルで被覆された被覆結晶でも良いし、ゲルで被覆されていなくても良い。【００３５】
なお、レーザー光によるこのような加工は、ゲルで被覆されていない結晶に対しても行うことができる。しかしながら、前記被覆結晶であれば、結晶がゲルにより固定および保護されているため、結晶が加工しやすく損傷を受けにくい、加工の際のデブリ（切りくずや結晶の破片など）が拡散せず結晶表面に再付着しにくい、などの利点がある。【００３６】
本発明の結晶製造方法によれば、例えば、従来よりも高い確率で高品質かつ大型の結晶が得られ、かつ、前述の濃度勾配形成を利用したスクリーニング法（濃度勾配法）によれば、結晶化条件の広範な探索（コンビナトリアル探索）が可能である。これらに関しては、例えば、従来、タンパク質等の結晶化で最も良く用いられてきた蒸気拡散法よりも優れた結果を得ることもできる。【００３７】
また、本発明の結晶製造方法によれば、例えば、前記ゲル中から前記生体物質の結晶を析出させることで、以下のような利点が得られる。【００３８】
構造ゲノム科学の分野におけるタンパク質結晶の構造解析等では、結晶のマウントに高度な技能を有する。例えば、低温における結晶構造解析を行うに際しては、抗凍結条件下に置いた結晶をナイロン糸を用いたループ状のマウント器具を用いて溶液ごとすくい取り、表面張力でループ内に結晶を保持した状態で凍結および測定を行う方法が従来から行われている。この方法では結晶の周りを抗凍結剤溶液が取り囲むので、測定中に結晶を非接触で保持が可能である。その反面、結晶の取り出し時にループの接触等による物理的な損傷を与える可能性がある。すなわち、溶液中で得られた結晶は、結晶マウントの際、溶液中を自由に移動するため、前記ループ等への間接・直接的な接触により、Ｘ線測定前に損傷を受けるおそれがある。このため、精度良い測定を行うにはループの取り扱いについての熟練した技能が要求される。【００３９】
一方、本発明の結晶製造方法では、ゲル中から前記生体物質（タンパク質等）の結晶を析出させる。このため、前記生体物質結晶がゲルで固定された状態となる。したがって、前記生体物質結晶がゲルで固定され移動が阻害されること、ゲルで保護され損傷を受けにくいこと等により、マウント操作が容易であり、再現性の高いマウント操作が可能となる。これによれば、例えば、結晶マウント工程を自動化することにより、従来達成不可能であったタンパク質結晶等のＸ線構造解析のフルオートメーション化も達成可能となる。また、固相（ゲル中）に前記生体物質（タンパク質等）の結晶を析出させることで、得られた結晶はゲルに被覆されるため、結晶の凍結と簡便なマウント操作が可能となり、結晶の質を低下させずに凍結できるため高精度データが得られる。【００４０】
［凍結結晶製造方法］
次に、本発明の凍結結晶製造方法は、前述の通り、生体物質の結晶を凍結する凍結工程を含む凍結結晶の製造方法であって、前記本発明の結晶製造方法により、前記ゲルで被覆された前記被覆結晶を製造する被覆結晶製造工程をさらに含み、前記凍結工程において、前記被覆結晶を凍結することを特徴とする。これ以外には、本発明の凍結結晶製造方法は特に制限されないが、前記凍結工程に先立ち、前記被覆結晶を抗凍結剤に浸漬させる浸漬工程をさらに含むことが好ましい。【００４１】
例えば、タンパク質のＸ線構造解析を行う場合には、結晶を凍結した状態（例えば100K以下）でＸ線回折データを収集することが、従来から行われている。その理由としては、例えば、タンパク質結晶を凍結した状態で測定することで、放射線（例えば、高分解能データを得るためのシンクロトロン放射光）による前記結晶の損傷を劇的に抑制するという理由が挙げられる。また、例えば、サイズが極めて小さい結晶は、キャピラリーに封入して測定することが難しいため、キャピラリーへの封入に代えて前記凍結により、放射線による前記結晶の損傷を抑制する。しかし、この場合、タンパク質結晶の周りの水分子が氷へと変化し、結晶自体を損傷させてしまうため、良好なＸ線回折像を得ることができず、回折データの質や分解能を大きく低下させる場合がある。この機構は必ずしも明らかではないが、例えば、食品を冷凍した際に風味や品質が劣化する場合があるのと同様、凍結により結晶が変質してしまうためと考えられる。そのため、抗凍結剤と呼ばれる試薬を適量、結晶化母液に加え、その中にタンパク質結晶を浸す操作を行う事により、水をアモルファス状で凍結させる事が行われている。しかし、タンパク質、核酸等の結晶は環境の変化に弱いため、前記抗凍結剤の添加で結晶化母液に変化が生じることによって、致命的な損傷を受ける場合がある。そのため、前記抗凍結剤の添加により、かえって良好なＸ線回折点が得られず、構造解析に至らない場合がある。【００４２】
本発明の凍結結晶製造方法により得られた凍結結晶は、例えば、凍結で生じた氷による損傷が抑制される。この理由は必ずしも明らかでないが、前記被覆結晶および凍結結晶がゲルで保護されているためと考えられる。また、例えば、前記ゲルにより、Ｘ線等による損傷も抑制されると考えられる。また、前記被覆結晶を抗凍結剤に浸漬させる浸漬工程をさらに含むことで、凍結による結晶損傷がさらに抑制される。さらに、前記被覆結晶がゲルで被覆されていることにより、抗凍結剤による結晶の損傷を大幅に抑制することができる。【００４３】
本発明の凍結結晶製造方法において、抗凍結剤は、特に制限されないが、有機化合物が好ましく、例えば、グリセロール（グリセリン）、MPD(2-Methyl-2,4-PentaneDiol)、DMSO（ジメチルスルホキシド）、PEG（ポリエチレングリコール）、および酢酸リチウムからなる群から選択される少なくとも一つである。これらは、そのまま用いても良いし、水溶液としてもよい。従来の凍結結晶製造方法では、前述の通り、抗凍結剤による結晶の損傷が著しいため、例えば、結晶化母液中に加える抗凍結剤の量（濃度）を微調整し、最適な条件をスクリーニングすることが必要であった。また、結晶化の対象となる生体物質（タンパク質等）の種類に応じて、最適な抗凍結剤の探索も必要であった。本発明において、前記抗凍結剤の濃度は特に制限されない。前述の通り、本発明によれば抗凍結剤による結晶の損傷を大幅に抑制することができるので、例えば、１００％のDMSO、PEG、あるいはそれらの高濃度水溶液（例えば５０〜６０質量％）に前記生体物質の結晶を直接浸漬することもできる。本発明において、抗凍結剤の種類自体は、例えば、従来と同じものを用いてもよい。【００４４】
なお、従来の生体物質結晶の構造解析において、例えば、図１３の模式図に示すように、抗凍結剤分子が前記生体物質の活性部位に結合し、結晶中に残留してしまう場合があった。同図は、グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）のX線結晶構造解析において、抗凍結剤としてグリセロールを用い、分解能０．９４Åで測定した場合の構造解析結果の一例を示す模式図である。図中の「２ＧＬＫ」はＰＤＢ  ＩＤ（プロテインデータバンクの登録番号）であり、グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）を意味する。このように、結晶中に抗凍結剤分子が残留すると、活性部位を塞ぎ、例えば、薬物設計等の際に不利となる。一方、本発明の被覆結晶を用いれば、例えば、図１４の模式図に示すように、活性部位に抗凍結剤が結合せずフリーな状態の構造情報が得られ、薬物設計等に有利である。前述の通り、従来の凍結結晶製造方法では、抗凍結剤による結晶の損傷が著しいため、結晶の損傷を起こしにくい抗凍結剤の種類は、ごく限られていた。このため、結晶の損傷を起こしにくい抗凍結剤の中から、結晶中に残留しにくい抗凍結剤を選択することも困難であった。しかしながら、本発明の凍結結晶製造方法によれば、抗凍結剤による結晶の損傷が抑制されているため、選択できる抗凍結剤の幅が広く、結晶中に残留しにくい抗凍結剤を適切に選択することもできるのである。例えば、グルコースイソメラーゼに対しては、必ずしも明らかではないが、グリセロールよりも酢酸リチウムの方が結晶中に残留しにくいと考えられる。ただし、この説明はあくまでも例示であって、本発明を何ら限定せず、例えば、本発明に用いる抗凍結剤としてグリセロールが不適切であるということを意味しない。【００４５】
［成長結晶製造方法］
本発明の成長結晶製造方法は、前述の通り、種結晶である生体物質結晶を前記生体物質の溶液中でさらに成長させる結晶成長工程を含み、前記種結晶が、前記ゲルで被覆された被覆結晶である。これ以外には、本発明の成長結晶製造方法は特に制限されない。例えば、前記結晶成長工程における前記生体物質溶液の濃度、温度等の各種条件は、従来技術において種結晶を用いて結晶を成長させる方法等を参考にして適宜設定してもよい。前記生体物質溶液の好ましい濃度は、前記生体物質の種類等により異なるが、成長の結晶しやすさの観点からは、なるべく高濃度であることが好ましい。温度も特に制限されず、例えば、室温（約５〜３５℃程度）で静置しても良いし、冷蔵庫等で５℃以下、あるいは０℃以下の低温に冷却しても良い。前記結晶成長工程の時間も特に制限されず、望ましい結晶が析出するまで適宜静置しておけば良い。【００４６】
種結晶を溶液中でさらに成長させる結晶製造方法は広く行われているが、タンパク質等の生体物質の場合、結晶が脆いために、種結晶を前記生体物質溶液中に移動させる際、物理的衝撃による損傷等が起こるおそれがあった。また、前記種結晶を前記生体物質溶液中に移動させた後、前記種結晶の周りの溶液の濃度や浸透圧の変化により、前記種結晶が溶解してしまい、結晶成長が起こらないおそれがあった。しかし、本発明の成長結晶製造方法によれば、前記種結晶が、前記ゲルで被覆された被覆結晶であるため、物理的衝撃による損傷のおそれが激減する。また、前記種結晶が、前記ゲルで被覆された被覆結晶であるために、前記種結晶の溶解も抑制され、結晶が成長しやすい。これにより、本発明の成長結晶製造方法によれば、例えば中性子線結晶構造解析等の各種用途に向いた大型の結晶を、簡便な操作により、高い確実性で得ることができる。【００４７】
［構造解析方法］
次に、本発明の構造解析方法は、前述の通り、生体物質の結晶を構造解析する方法であって、本発明の結晶製造方法により製造された被覆結晶または本発明の凍結結晶製造方法により製造された凍結結晶を構造解析する構造解析工程を含むことを特徴とする。前記構造解析工程において、前記結晶を構造解析する方法は特に制限されないが、Ｘ線結晶構造解析または中性子線結晶構造解析によることが好ましい。本発明の結晶製造方法によれば、前述の通り、結晶の破損、多結晶化等が防止できるため、中性子線結晶構造解析に適した大きい結晶を得ることができる。【００４８】
上記以外には、本発明の構造解析方法は特に制限されず、従来の結晶構造解析方法、Ｘ線結晶構造解析方法または中性子線結晶構造解析方法と同様に行ってもよい。本発明の構造解析方法において構造解析する生体物質（タンパク質等）の結晶は、本発明の結晶製造方法により製造された被覆結晶または本発明の凍結結晶製造方法により製造された凍結結晶であることにより、高品質かつ大型の結晶とすることができる。これにより、本発明の構造解析方法においては、高精度のデータ（例えば、Ｘ線回折データ）を再現性良く得ることができる。その他に、本発明の結晶製造方法および凍結結晶製造方法の項で述べたような利点もある。【００４９】
本発明の構造解析方法は、前述の通り特に制限されず、どのような方法でもよいが、例えば以下のようにして行うことができる。図４２の上部に第一のスキームを、下部に第二のスキームを、それぞれ別個に示す。第一のスキームは本発明の構造解析方法の第一の例を示し、第二のスキームは本発明の構造解析方法の第二の例を示す。同図中の文言は、説明の便宜のための例示であって、本発明を何ら限定しない。【００５０】
本発明の構造解析方法の第一の例は、例えば、前記第一のスキームに示すとおり、まず、プレート１０１上に載せた被覆結晶１０２を準備する。被覆結晶１０２は、ゲルで被覆されており、本発明の結晶製造方法により製造された被覆結晶である。次に、この被覆結晶を、抗凍結剤に浸し、さらに、前述したようなループ状のマウント器具ですくい取る。すくい取った前記被覆結晶を、低温ガス吹きつけ装置等により凍結し（凍結工程）、その凍結結晶を、Ｘ線結晶構造解析または中性子線結晶構造解析等により構造解析する。このようにして、本発明の構造解析方法の第一の例を実施することができる。この第一の例は、例えば、前記ループ状のマウント器具を手作業で用いて前記被覆結晶をすくい取り、凍結させることができる。なお、前記ループ状のマウント器具は、例えば「クライオループ」などということがある。【００５１】
本発明の構造解析方法の第二の例は、例えば、前記第二のスキームに示すとおり、まず、被覆結晶１０２とチューブ１０３とを準備する。被覆結晶１０２は、ゲルで被覆されており、本発明の結晶製造方法により製造された被覆結晶である。チューブ１０３は、例えば、図示のように、その根元に、チューブ１０３自体を別の器具または装置により保持するための保持部が設けられていてもよい。次に、チューブ１０３の先端を被覆結晶１０２に突き刺し、結晶が含まれた部分を、被覆しているゲルごとチューブ１０３の先端に取り込む。さらに、チューブ１０３の先端に取り込まれた結晶およびゲルだけを、例えばレーザー加工等により、被覆結晶１０２の他の部分から切り離す。そして、結晶およびゲルが取り込まれたチューブ１０３の先端を、別途の容器中に準備した抗凍結剤の中に浸す。そして、チューブ１０３の先端を上に向けて置き（マウント）、そこに取り込まれた前記被覆結晶を、低温ガス吹きつけ装置等により凍結し（凍結工程）、その凍結結晶を、Ｘ線結晶構造解析または中性子線結晶構造解析等により構造解析する。このようにして、本発明の構造解析方法の第二の例を実施することができる。この第二の例は、例えば、前記各工程を必要に応じて自動化した「オートマウント」法として行うことができる。被覆結晶１０２は、例えば図４３に示すように、別のチューブの内部に準備されていてもよい。この場合、図４３に示すとおり、前記別のチューブの中にチューブ１０３の先端を突き刺し、結晶が含まれた部分を、被覆しているゲルごとチューブ１０３の先端に取り込んでもよい。これ以降の工程は、図４２の前記第二のスキームと同様に行うことができる。【００５２】
なお、前記被覆結晶において、結晶を被覆している前記ゲルが測定ノイズの原因となるなどの支障がある場合は、あらかじめ除去することが好ましい。除去方法は特に制限されないが、例えば、前述の通り、熱可逆性ハイドロゲルを冷却する方法、フェムト秒レーザー等のレーザー光で加工する方法等がある。【００５３】
［結晶化スクリーニング方法および結晶化スクリーニング装置］
次に、本発明の結晶化スクリーニング方法は、前述の通り、生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング方法であって、前記生体物質の結晶を製造する結晶製造工程と、前記結晶製造工程における結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含み、前記結晶製造工程において、本発明の結晶製造方法または本発明の凍結結晶製造方法により前記結晶を製造することを特徴とする。【００５４】
本発明の結晶化スクリーニング方法によれば、前述の通り、本発明の結晶製造方法により簡便に結晶を製造できることで、結晶製造条件をさほど厳密に設定しなくても良いため、スクリーニングをも簡便に行うことができる。具体的には、例えば、前記生体物質濃度、前記生体物質と前記沈殿化剤の濃度比（混合比）等の最適条件を簡便にスクリーニングすることができる。また、本発明の凍結結晶製造方法により簡便に凍結結晶を製造できることで、凍結結晶製造条件のスクリーニングを簡便に行うことができる。より具体的には、例えば、前述の通り抗凍結剤による結晶の損傷を大幅に抑制できることにより、抗凍結剤濃度等の条件のスクリーニングを簡便にすることができる。【００５５】
さらに、本発明の結晶化スクリーニング装置は、前述の通り、生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング装置であって、前記生体物質の結晶を製造する結晶製造手段と、前記生体物質の結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング手段とを含み、前記結晶製造手段が、ゲル中で前記生体物質を結晶化させる結晶化手段を含むことを特徴とする。これら以外には、本発明の結晶化スクリーニング装置は特に制限されないが、例えば、従来の結晶化スクリーニング装置よりも構成を簡略化することも可能である。例えば、前述のような前記生体物質濃度、前記生体物質と前記沈殿化剤の濃度比（混合比）、抗凍結剤濃度等の条件のスクリーニングを簡便にできることで、それらに必要な手段を省略または簡略化することも可能である。本発明の結晶化スクリーニング方法は、どのような装置や器具を用いて行っても良いが、本発明の結晶化スクリーニング装置により行うことが好ましい。【００５６】
図４４に、本発明の結晶化スクリーニング装置およびそれを用いた本発明の結晶化スクリーニング方法の例を三つ示す。前記結晶化スクリーニング方法の三つの例を、それぞれ、ハンギングドロップ（Ｈａｎｇｉｎｇ  Ｄｒｏｐ）法、シッティングドロップ（Ｓｉｔｔｉｎｇ  Ｄｒｏｐ）法、および濃度勾配法という。図４４左上は、ハンギングドロップ法に用いる装置の例であり、左下は、シッティングドロップ法に用いる装置の例であり、右上は、濃度勾配法に用いる装置の例である。【００５７】
まず、図４４左上の装置について説明する。図示の通り、この装置は、蓋体２０１と、プレート２０３とを主要構成要素とする。これらは、本発明の結晶化スクリーニング装置における前記結晶化手段および結晶製造手段を構成するとともに、前記スクリーニング手段をも兼ねる。蓋体２０１は板状であり、その片面には突起部２０２が設けられており、他方の面は平らな形状をしている。突起部２０２の上面は、ゲルを載せることができるように、例えば平らな形状をしている。プレート２０３の上面には、反対側まで貫通しないウェル（穴）が形成されている。前記ウェル中には、蓋体２０１に形成された突起部２０２をはめ込むことが可能である。なお、蓋体２０１に設けられた突起部２０２およびプレート２０３に形成されたウェルの数は任意であり、それぞれ１つでも複数でも良いが、スクリーニングを効率的に行うために十分な数を設けることが好ましい。また、突起部２０２は、例えば、蓋体２０１本体から取り外し可能であると、結晶の採取等の操作が行いやすいため好ましい。なお、この装置において、各構成要素の形成材料は特に制限されない。例えば、ガラス、プラスチック等、理化学機器に一般に用いられる材質であって、結晶の製造およびスクリーニングの妨げにならない材質を用いれば良い。また、各構成要素の大きさも特に制限されないが、例えば、装置全体として、実験台の上での取り扱いに便利な程度の大きさであることが好ましい。【００５８】
この装置を用いた本発明の結晶化スクリーニング方法（ハンギングドロップ法）は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず、蓋体２０１を、突起部２０２を上に向けて準備する。次に、突起部２０２上面に、生体物質を含むゲルを載せるか、または、生体物質を含む溶液として突起部２０２上面に載せ、そこで固化（ゲル化）させる。このゲルの製造方法は、例えば前述の通りである。なお、図中では「タンパク質とゲルの混合物」と記載しているが、タンパク質に限定されず、どのような生体物質でもよい。一方、プレート２０３のウェル中には、沈殿化剤（沈殿剤）溶液を入れておく。沈殿化剤溶液の製造方法も、例えば前述の通りである。そして、蓋体２０１を上下反転させて突起部２０２を下に向け、突起部２０２をプレートウェル中にはめ込む。これにより、生体物質を含む前記ゲルを前記沈殿化剤（沈殿剤）溶液中に浸漬させ、生体物質をゲル中で結晶化させる。これにより、本発明の結晶化スクリーニング方法における結晶製造工程を行うことができる。そして、この結晶製造工程において、前記生体物質濃度および前記沈殿化剤濃度等の条件を種々変更しておき、前記結晶製造工程終了後、各条件における結晶の形成状態を観察する。これにより、結晶化条件をスクリーニングする前記スクリーニング工程を行う。ここで、突起部２０２およびウェルが複数設けられている場合は、各突起部２０２およびウェルにおいて、前記生体物質濃度および前記沈殿化剤濃度を種々変更することにより、一度の結晶製造工程で前記スクリーニング工程を行うことも可能である。以上のようにして、この装置を用いた本発明の結晶化スクリーニング方法（ハンギングドロップ法）を実施することができる。【００５９】
次に、図４４左下の装置について説明する。図示の通り、この装置は、プレート２０７を主要構成要素とする。このプレート２０７は、本発明の結晶化スクリーニング装置における前記結晶化手段および結晶製造手段を構成するとともに、前記スクリーニング手段をも兼ねる。プレート２０７の上面には、反対側まで貫通しないウェル（穴）が形成されている。前記ウェルの数は任意であり、１つでも複数でも良いが、スクリーニングを効率的に行うために十分な数を設けることが好ましい。なお、この装置の形成材料および大きさについては、前述の図４４左上の装置と同様である。【００６０】
この装置を用いた本発明の結晶化スクリーニング方法（シッティングドロップ法）は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず、プレート２０７のウェル中に、生体物質を含むゲルを入れるか、または、生体物質溶液の状態で前記ウェル中にいれ、そこで固化（ゲル化）させる。このゲルの製造方法は、例えば前述の通りである。図中では「タンパク質とゲルの混合物」と記載しているが、タンパク質に限定されず、どのような生体物質でもよい。次に、前記ウェル中に、沈殿化剤（沈殿剤）溶液を注入する。沈殿化剤溶液の製造方法も、例えば前述の通りである。これにより、生体物質を含む前記ゲルを前記沈殿化剤（沈殿剤）溶液中に浸漬させ、生体物質をゲル中で結晶化させる。なお、このとき、前記ウェル中への異物の混入、沈殿化剤溶液の揮発等を防ぐため、例えば、プレート２０７の上面にシール等を設置することが好ましい。これにより、本発明の結晶化スクリーニング方法における結晶製造工程を行うことができる。そして、この結晶製造工程において、前記生体物質濃度および前記沈殿化剤濃度等の条件を種々変更しておき、前記結晶製造工程終了後、各条件における結晶の形成状態を観察する。これにより、結晶化条件をスクリーニングする前記スクリーニング工程を行う。ここで、前記ウェルが複数設けられている場合は、各ウェルにおいて、前記生体物質濃度および前記沈殿化剤濃度を種々変更することにより、一度の結晶製造工程で前記スクリーニング工程を行うことも可能である。以上のようにして、この装置を用いた本発明の結晶化スクリーニング方法（シッティングドロップ法）を実施することができる。【００６１】
さらに、図４４右上の装置について説明する。図示の通り、この装置は、蓋体２０９と、プレート２０６とを主要構成要素とする。これらは、本発明の結晶化スクリーニング装置における前記結晶化手段および結晶製造手段を構成するとともに、前記スクリーニング手段をも兼ねる。蓋体２０９は板状であり、その片面の一部が突出してチューブ２０５を形成している。チューブ２０５の内部は空洞であり、蓋体２０９本体に接した側の端は開口している。チューブ２０５の他端（以下「突端」という）は閉じており、例えば半透膜（透析膜）等が張られていることにより、固形物は透過せず、一定の大きさ以下の粒子のみが透過可能である。プレート２０６の上面には、反対側まで貫通しないウェル（穴）が形成されている。前記ウェル中には、蓋体２０９に形成されたチューブ２０５をはめ込むことが可能である。蓋体２０９に形成されたチューブ２０５およびプレート２０６に形成されたウェルの数は任意であり、それぞれ１つでも複数でも良いが、スクリーニングを効率的に行うために十分な数を設けることが好ましい。なお、この装置の形成材料および大きさについては、チューブ２０５端部の前記半透膜（透析膜）等以外は、前述の図４４左上の装置と同様である。【００６２】
この装置を用いた本発明の結晶化スクリーニング方法（濃度勾配法）は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず、蓋体２０９に形成されたチューブ２０５内部に、生体物質を含むゲルを入れる。このゲルの製造方法は、例えば前述の通りである。前記ゲルは、ゲルの状態にしてからチューブ２０５内部に注入してもよいが、溶液（ゾル）の状態でチューブ２０５内部に注入し、チューブ２０５内部でゲル化させることが簡便で好ましい。なお、図中では「タンパク質とゲルの混合物」と記載しているが、タンパク質に限定されず、どのような生体物質でもよい。一方、プレート２０６のウェル中には、沈殿化剤（沈殿剤）溶液を入れておく。沈殿化剤溶液の製造方法も、例えば前述の通りである。そして、チューブ２０５をプレート２０６のウェル中にはめ込む。これにより、沈殿化剤が、チューブ２０５突端を通じて、前記ゲル中に浸透する。前述の通り、チューブ２０５突端には、半透膜（透析膜）等が張られていることにより、前記ゲルは透過しない。これにより、生体物質をゲル中で結晶化させる。このとき、前記ウェル中への異物の混入、ゲルの乾燥等を防ぐため、例えば、蓋体２０９の上面にシール等を設置することが好ましい。これにより、本発明の結晶化スクリーニング方法における結晶製造工程を行うことができる。このとき、前述のように、沈殿化剤は、チューブ２０５突端を通じて前記ゲル中に浸透するため、前記ゲル中において、沈殿化剤（沈殿剤）濃度に勾配が形成される。すなわち、チューブ２０５突端に近い側では沈殿化剤濃度が高くなり、前記突端から遠ざかるほど沈殿化剤濃度が低くなる。この濃度勾配が形成されることによって、チューブ２０５内部の各部で前記生体物質濃度と前記沈殿化剤濃度との比が種々変化する。このため、前記結晶製造工程終了後、チューブ２０５内部における結晶の形成状態を観察することで、結晶化条件をスクリーニングする前記スクリーニング工程を行うことができるのである。さらに、チューブ２０５およびウェルが複数設けられている場合は、各チューブ２０５およびウェルにおいて、前記生体物質濃度および前記沈殿化剤濃度を種々変更することにより、さらに詳細に前記スクリーニング工程を行うことも可能である。このようにして、この装置を用いた本発明の結晶化スクリーニング方法（濃度勾配法）を実施することができる。【００６３】
なお、濃度勾配法による結晶化スクリーニング方法は、例えば、後述の実施例のように、遠心分離装置を用いて行うこともできる。生体物質およびゲル化剤の種類および濃度、等の各種条件は、後述の実施例に限定されず、任意に設定できる。具体的には、例えば、他の実施形態と同様である。遠心分離速度等も特に制限されず、適宜設定可能である。また、濃度勾配法による結晶化スクリーニング方法は、沈殿化剤濃度の勾配を形成して行うのみならず、例えば、生体物質の濃度勾配を形成して行うこともできる。具体的には、例えば、前記生体物質を含まないゲルをあらかじめ準備しておき、そのゲルの片面から前記生体物質溶液を徐々に浸透させることで、前記ゲル中に前記生体物質濃度の勾配を形成しても良い。前記ゲルは、例えば、あらかじめ沈殿化剤を含んでいても良いし、含んでいなくても良い。【００６４】
さらに、本発明の結晶化スクリーニング装置および結晶化スクリーニング方法は、これらに限定されず、どのような装置および方法でもよい。例えば、結晶化スクリーニング方法の各種条件は、前述の説明に限定されず、適宜変更が可能である。例えば、結晶化の方法として、図４４を用いた前述の説明では、前記生体物質溶液を含むゲルを沈殿化剤溶液に接触もしくは近接させる方法を示した。しかし、前述の通り、沈殿化剤を用いた結晶化方法は、例えば、前記生体物質溶液にゲル化剤とともに沈殿化剤を混合しておき、ゲル化させて沈殿化剤を含むゲルとし、ゲル化後そのまま静置して結晶を析出させる方法でもよい。また、結晶化スクリーニング装置としては、例えば、図４５に示すように、前記「濃度勾配法」の装置（図４４右上に示す装置）のチューブ２０５を、浅いウェル３０５に変えた装置でもよい。図４５において、蓋体３０４およびプレート３０６は、ウェルの深さがウェル３０５に合わせて浅い以外は、前記「濃度勾配法」の装置（図４４右上に示す装置）と同様である。この装置を用いた結晶化スクリーニング方法は、ゲル中における濃度勾配形成がない以外は、前記「濃度勾配法」の装置と同様であり、あるいは図４４に示した他の装置と同様である。図４５の装置は、蓋体３０４およびプレート３０６に形成されたウェルが浅いことにより、前記「濃度勾配法」の装置と比較して操作全般が簡便であるという利点がある。また、図４５の装置は、ゲルと沈殿化剤溶液とがそれぞれ別のウェル中に存在するため、前記「ハンギングドロップ法」および前記「シッティングドロップ法」の装置と比較すると、前記ゲルと前記沈殿化剤溶液との分離操作が簡便である利点がある。【００６５】
なお、本発明の結晶化スクリーニング方法は、例えば、自動化して行うことが、効率的で好ましい。例えば図４６に示すように、前記生体物質の溶液（ゾル）を分注装置により自動的に各ウェルあるいはチューブ内部などに分注するなどの方法により、前記結晶製造工程を自動化してもよい。なお、同図においては「温度コントローラー付きタンパク質分注装置」と記載しているが、これは単なる一例であり、生体物質は、タンパク質に限定されずどのような物質でもよいし、分注装置も、どのような分注装置でもよい。また、例えば、前記結晶製造工程終了後、結晶の形成状態を、図示のように顕微鏡で自動的に観察および写真撮影することで、前記スクリーニング工程を自動化してもよい。【００６６】
なお、本発明の結晶化スクリーニング装置は、生体物質の結晶を製造する結晶製造手段を含んでいるため、生体物質の結晶を製造する結晶製造装置としても使用可能である。
【実施例】
【００６７】
次に、本発明の実施例および比較例について説明する。【００６８】
以下の実施例１〜７および比較例１〜７では、検体（被解析物質）として、下記（１）〜（３）のタンパク質結晶を用いた。実施例８以下では、検体（被解析物質）として、下記（１）〜（２）および（４）〜（７）のタンパク質結晶、または（８）の核酸（ＤＮＡ）結晶を用いた。
（１）リゾチーム
（２）グルコースイソメラーゼ
（３）ソーマチン
（４）エラスターゼ
（５）Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ由来ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）
（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ（ＰＲＫ）／Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）
（６）セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）
（７）大腸菌異物排出トランスポーター（ＡｃｒＢ）
（８）ＤＮＡ【００６９】
Ｘ線源は、株式会社リガク製の商品名Ｕｌｔｒａｘ−１８（Ｃｕ対陰極）を用いた。検出器は、株式会社リガク製のＲ−ＡＸＩＳ  ＩＶ＋＋を用いた。測定電圧は５０ｋＶ、測定電流は１００ｍＡ、ビーム径は０．３ｍｍとした。【００７０】
［実施例１］
アガロース−III（（株）同仁化学研究所製、ゲル化温度は約３７〜３９℃）２質量％と水９８質量％を加熱溶解させたもの（Ａ）０．１ｍＬとニワトリ卵白リゾチーム溶液（Ｂ）０．１ｍＬの両者を３５℃の一定温度下で混合し結晶化溶液（Ｃ）とした。この結晶化溶液（Ｃ）が固化したゲルとなる前に、キャピラリー（ヒルゲンベルグ社製）へ充填した。前記キャピラリーは、ガラス製（８０ｍｍ、内径０．７ｍｍ）であり、内部の管状空間に固化する前の結晶化溶液（Ｃ）を充填した。この結晶化溶液（Ｃ）は室温にて数十秒後に固化し、キャピラリー内部空間は結晶化溶液（Ｃ）が固化したゲルで充満された。次に、充填されたキャピラリーを、沈殿化剤溶液の約２ｍｌが注入された試験管容器に挿入した。この試験管容器は、直径約１６ｍｍ、長さ約１３３ｍｍ、のガラス製を用いた。このとき、キャピラリーの挿入端において、固化（ゲル化）した結晶化溶液（Ｃ）と沈殿化剤溶液との接触界面が形成された。このとき、固化した結晶化溶液（Ｃ）と沈殿化剤溶液との間に気泡が入らないように注意した。さらに、試験管の開口端を栓によって密栓した。なお、以下に、前記タンパク質溶液および沈殿化剤溶液の組成を示す。【００７１】
タンパク質溶液（Ｂ）：
３０mg/mLニワトリ卵白リゾチーム
０.１M  酢酸バッファーｐH４．５
沈殿化剤溶液：
１.０M塩化ナトリウム
０.１M酢酸バッファーｐH４．５
結晶化温度：
２０℃【００７２】
前記キャピラリーを挿入し、栓によって密封した試験管を、結晶化温度２０℃でセットアップ後、数日内に、固化したゲル中にリゾチーム結晶を確認した。試験管からキャピラリーを取り出し、キャピラリー内の固化したゲル中に晶出したリゾチーム結晶を以下の方法で取り出した。すなわち、まず、ガラスプレートを準備し、その上に沈殿化剤溶液と抗凍結剤溶液（本実施例では１００％ジメチルスルホキシド溶液）をそれぞれ約３０μＬ、別々の位置に分注してのせておいた。ピンセットやキャピラリーカッター等を用いて取り出したい結晶の前後５〜１０ｍｍの範囲でキャピラリーを切断または破砕し、次に固化したゲルをカッター等で切断した。さらに、取り出したゲル中にある結晶を、先に準備しておいた沈殿化剤溶液中に移動させた。マイクロツール（ハンプトンリサーチ社製）などを用いて顕微鏡下にて、リゾチーム結晶の周りにあるゲルを厚さ約０．１ｍｍになるまで慎重に剥ぎ取った。厚さ約０．１ｍｍのゲルに覆われたリゾチーム結晶をループ状のマウント器具を用いて沈殿化剤溶液からすくい上げ、先に準備しておいた抗凍結剤溶液に数秒間浸漬した後、素早く取り出し凍結した。さらにＸ線結晶構造解析を行った。Ｘ線回折像撮影は、レンズと結晶との距離１００ｍｍ、露光時間１ｍｉｎ、振動角Δ１°、撮影枚数２０枚で行った。その結果、リゾチームの結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００７３】
（リゾチーム結晶：実施例１）
Ｐ４３２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝ｂ＝７７．２Å，  ｃ＝３７．３Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０４３（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．６７°【００７４】
図１Ａおよび図１Ｂに、ゲルで保護された実施例１のリゾチーム結晶を、それぞれ撮影角度を変えて撮影した写真を示す。図示の通り、実施例１では、大きく高品質なリゾチーム単結晶が得られた。また、図２Ａおよび図２Ｂに、実施例１のリゾチーム結晶のＸ線回折像を示す。図２Ａは全体図であり、図２Ｂは、一部（図２Ａ右下の枠線部分）の拡大図である。図示の通り、良好なＸ線回折像が得られたことが分かる。【００７５】
［実施例２］
ニワトリ卵白リゾチーム溶液に代えてグルコースイソメラーゼ溶液を用い、タンパク質溶液及び沈殿化剤溶液の組成、抗凍結剤の種類以外は実施例１と同様にして結晶を製造した。結晶化温度４℃でセットアップ後、約１週間で、固化したゲル中にグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。以下に、タンパク質溶液および沈殿化剤溶液の組成を示す。【００７６】
タンパク質溶液：
２５mg/mLグルコースイソメラーゼ
０.１M  ヘペスバッファー  pH  ７．５
１ｍM  塩化マグネシウム
沈殿化剤溶液：
２.５M  硫酸アンモニウム
０.１M  ヘペスバッファー  pH７．５
結晶化温度：
４℃【００７７】
抗凍結剤溶液は、本実施例では２．５M酢酸リチウム溶液を用いてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、グルコースイソメラーゼ結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００７８】
（グルコースイソメラーゼ結晶：実施例２）
Ｐ２１２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝８５．９Å，ｂ＝９４．１Å，  ｃ＝９８．３Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  
Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ  
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０３８（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．６４°【００７９】
図３Ａ、図３Ｂ、図４、図５Ａおよび図５Ｂに、実施例２のグルコースイソメラーゼ結晶のＸ線回折像を示す。図３Ａは全体図であり、図３Ｂは、一部（図３Ａ右上の枠線部分）の拡大図である。図４は、条件を変えて撮影したＸ線回折像である。図５Ａは、さらに条件を変えて測定したＸ線回折像の全体図であり、図５Ｂは、一部（図５Ａ右下の枠線部分）の拡大図である。図示の通り、良好なＸ線回折像が得られたことが分かる。また、図６Ａ〜Ｄに、実施例２のリゾチーム結晶を示す。図６Ａは、抗凍結剤溶液に浸漬する直前の状態を示す図であり、単結晶が得られている。図６Ｂは、抗凍結剤溶液に浸漬してから５秒後、図６Ｃは、浸漬してから１分後、図６Ｄは、浸漬してから５分後の状態をそれぞれ示す。図Ａ〜Ｄ右側の結晶は、抗凍結剤溶液浸漬前から若干の欠陥があったため、浸漬後次第に崩壊したが、左側の結晶は、良好な単結晶であり、５分間浸漬しても全く崩壊しなかった。【００８０】
［実施例３］
グルコースイソメラーゼ溶液を用い、抗凍結剤の種類以外は実施例２と同様にして結晶化を行った。セットアップ後、約１週間で固化したゲル中にグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。抗凍結剤溶液は、本実施例では１００％グリセロールを用いてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、グルコースイソメラーゼ結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００８１】
（グルコースイソメラーゼ結晶：実施例３）
Ｐ２１２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝８５．９Å，ｂ＝９２．２Å，  ｃ＝９９．０Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  
Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ  
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０７７（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．７１°【００８２】
［実施例４］
グルコースイソメラーゼ溶液を用い、抗凍結剤の種類以外は実施例２と同様にして結晶化を行った。セットアップ後、約１週間で固化したゲル中にグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。抗凍結剤溶液は、本実施例では５０％グリセロール溶液を用いてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、グルコースイソメラーゼ結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００８３】
（グルコースイソメラーゼ結晶：実施例４）
Ｐ２１２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝８６．０Å，ｂ＝９２．４Å，  ｃ＝９９．０Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｖｏｌｕｍｅ  ２２２３０２．０
Ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  
Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ  
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０５１（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．５１°【００８４】
［実施例５］
ニワトリ卵白リゾチーム溶液に代えてソーマチン溶液を用い、タンパク質溶液及び沈殿化剤溶液の組成、抗凍結剤の種類以外は実施例１と同様にして結晶化を行った。結晶化温度２０℃でセットアップ後、約１週間で固化したゲル中にグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。以下に、タンパク質溶液及び沈殿化剤溶液の組成を示す。【００８５】
タンパク質溶液：
２０mg/mLソーマチン
０.１M  N−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸バッファー  pH６．５
沈殿化剤溶液：
２.０M  酒石酸ナトリウムカリウム
０.１M  N−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸バッファー  pH６．５
結晶化温度：
２０℃【００８６】
抗凍結剤溶液は、本実施例では１００％グリセロールを用いてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、ソーマチン結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００８７】
（ソーマチン結晶：実施例５）
Ｐ４１２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝ｂ＝５７．５Å，  ｃ＝１４９．８Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  
Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０３２（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．４９°【００８８】
図７Ａに、ゲルで保護された実施例５のソーマチン結晶の写真を示す。図示の通り、実施例５では、大きく高品質なソーマチン単結晶が得られた。また、図７Ｂおよび図７Ｃに、実施例５のソーマチン結晶のＸ線回折像を示す。図７Ｂは全体図であり、図７Ｃは、一部（図７Ｂ下部の枠線部分）の拡大図である。図示の通り、良好なＸ線回折像が得られたことが分かる。【００８９】
［実施例６］
ソーマチン溶液を用い、抗凍結剤の種類以外は実施例５と同様にして結晶化を行った。セットアップ後、約１週間で固化したゲル中にソーマチン結晶を確認した。抗凍結剤溶液は、本実施例では１００％ポリエチレングリコール（平均分子量４００）を用いてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、ソーマチン結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００９０】
（ソーマチン結晶：実施例６）
Ｐ４１２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝ｂ＝５７．９Å，  ｃ＝１５０．１Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  
Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ  
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０５５（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．７４°【００９１】
［実施例７］
ソーマチン溶液を用い、抗凍結剤の種類以外は実施例５と同様にして結晶化を行った。セットアップ後、約１週間で固化したゲル中にソーマチン結晶を確認した。抗凍結剤溶液は、本実施例では６０％ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）溶液を用いてＸ線結晶構造解析を行った。その結果、ソーマチン結晶を損傷なく容易に捕捉することができ、また抗凍結剤溶液による損傷も無く液体窒素処理にも耐え、良好なＸ線回折像が得られた。以下に、結晶構造解析結果を示す。なお、１Å＝１０−１０ｍである。【００９２】
（ソーマチン結晶：実施例７）
Ｐ４１２１２
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０．００−１．６４（）
ａ＝ｂ＝５７．７Å，  ｃ＝１５０．１Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  
Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ  
Ｉ／σ（Ｉ）（）
Ｒｍｅｒｇｅ  ０．０４９（）
Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ  ０．５２°【００９３】
図８Ａに、ゲルで保護された実施例７のソーマチン結晶の写真を示す。図示の通り、実施例７では、大きく高品質なソーマチン単結晶が得られた。また、図８Ｂおよび図８Ｃに、実施例７のソーマチン結晶のＸ線回折像を示す。図８Ｂは全体図であり、図８Ｃは、一部（図８Ｂ下部の枠線部分）の拡大図である。図示の通り、良好なＸ線回折像が得られたことが分かる。【００９４】
なお、前記アガロース−III（（株）同仁化学研究所製、ゲル化温度は約３７〜３９℃）に代えてアガロースＩＸ−Ａ（シグマ社製、ゲル化温度は約８〜１７℃）を用いることと、温度条件を変更すること以外は実施例１〜７と同様にして結晶および凍結結晶を製造し、同様に良好な結果が得られた。【００９５】
［比較例１］
アガロースを添加しないリゾチーム溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、数日内にリゾチーム結晶を確認した。キャピラリーから取り出したリゾチーム結晶は、抗凍結剤溶液（１００％ジメチルスルホキシド溶液）に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。図９Ａおよび図９Ｂに、比較例１のリゾチーム結晶の写真を示す。図９Ａは、抗凍結剤溶液に浸漬する直前の状態を示す写真であり、単結晶が得られている。図９Ｂは、抗凍結剤溶液に浸漬した直後の状態を示す写真であり、結晶は粉々になっている。【００９６】
［比較例２］
アガロースを添加しないグルコースイソメラーゼ溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、約１週間でグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。キャピラリーから取り出したグルコースイソメラーゼ結晶は、抗凍結剤溶液（２．５M酢酸リチウム溶液）に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。【００９７】
［比較例３］
アガロースを添加しないグルコースイソメラーゼ溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、約１週間でグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。キャピラリーから取り出したグルコースイソメラーゼ結晶は、抗凍結剤溶液（１００％グリセロール）に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。【００９８】
［比較例４］
アガロースを添加しないグルコースイソメラーゼ溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、約１週間でグルコースイソメラーゼ結晶を確認した。キャピラリーから取り出したグルコースイソメラーゼ結晶は、抗凍結剤溶液（５０％グリセロール溶液）に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。【００９９】
［比較例５］
アガロースを添加しないソーマチン溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、約１週間でソーマチン結晶を確認した。キャピラリーから取り出したソーマチン結晶は、抗凍結剤溶液（１００％グリセロール）に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。【０１００】
［比較例６］
アガロースを添加しないソーマチン溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、約１週間でソーマチン結晶を確認した。キャピラリーから取り出したソーマチン結晶は、抗凍結剤溶液（１００％ポリエチレングリコール（平均分子量４００））に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。図１０Ａおよび図１０Ｂに、比較例６のリゾチーム結晶の写真を示す。図１０Ａは、抗凍結剤溶液に浸漬する直前の状態を示す写真であり、単結晶が得られている。図１０Ｂは、抗凍結剤溶液に浸漬した直後の状態を示す写真であり、結晶は粉々になっている。【０１０１】
［比較例７］
アガロースを添加しないソーマチン溶液を用いる以外は実施例１と全く同様に結晶化を行った。セットアップ後、約１週間でソーマチン結晶を確認した。キャピラリーから取り出したソーマチン結晶は、抗凍結剤溶液（６０％ポリエチレングリコール（平均分子量４０００）溶液）に浸漬した瞬間に粉々に割れ、溶けてしまった。そのため、Ｘ線結晶構造解析を行うことができなかった。【０１０２】
以上の通り、実施例１〜７によれば、ゲル中で得られた３種類のタンパク質結晶（リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、ソーマチン）は、全て、抗凍結剤による結晶への損傷がほぼ完全に防止された。すなわち、ゲルでコートされた実施例のタンパク質結晶と、比較例のフリーな結晶を比べると、３種のタンパク質結晶ともに抗凍結剤に対する崩壊速度にきわめて大きな差があった。また、ゲルでコートされた実施例のタンパク質結晶を用いたＸ線回折実験で、ice-ringが生じても、タンパク質結晶自体の損傷は、ほとんど観察されなかった。さらに、シンクロトロン放射光による回折実験でも問題なく十分なデータが得られ、かつ構造解析可能なデータであった。本実施例によれば、リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、ソーマチンの３種のタンパク質結晶について、従来のＸ線結晶構造解析結果を上回る最高分解能の反射が得られた。【０１０３】
［実施例８〜１０、比較例８〜９］
ゲルで被覆された被覆結晶を製造し、２．５Ｍ酢酸リチウム水溶液を抗凍結剤として用いてＸ線結晶構造解析を行った。抗凍結剤として２．５Ｍ酢酸リチウム水溶液を用いることと、抗凍結剤への前記被覆結晶の浸漬時間を１５分間とすることと、被解析結晶を構成する生体物質と、ゲル（アガロースＩＩＩ）の濃度以外は、実施例１と同様に行った。前記生体物質として、タンパク質の一種であるエラスターゼを用い、ゲル（アガロースＩＩＩ）の濃度を２．０質量％としたものを実施例８とする。前記生体物質として、タンパク質の一種であるリゾチームを用い、ゲル（アガロースＩＩＩ）の濃度を１．６質量％としたものを実施例９とする。前記生体物質として、タンパク質の一種であるグルコースイソメラーゼを用い、ゲル（アガロースＩＩＩ）の濃度を１．６質量％としたものを実施例１０とする。【０１０４】
さらに、ゲルを添加しないことと、抗凍結剤（２．５Ｍ酢酸リチウム水溶液）への浸漬時間を変える以外は実施例８および９と同様にして生体物質結晶を製造し、Ｘ線結晶構造解析を行った。前記生体物質として、タンパク質の一種であるエラスターゼを用い、抗凍結剤への浸漬時間を２秒としたものを実施例８とする。前記生体物質として、タンパク質の一種であるリゾチームを用い、抗凍結剤への浸漬時間を１５秒としたものを実施例９とする。【０１０５】
図１１に、実施例８〜１０および比較例８〜９の結晶の写真およびデータを示す。左から右に向かって、それぞれ、比較例８、実施例８、比較例９、実施例９、および実施例１０の写真である。図下方の数値は、アガロースの添加量（質量％）、抗凍結剤（Ｃｒｙｏ）溶液への浸漬時間、およびＸ線結晶構造解析におけるモザイク性（Ｍｏｓａｉｃｉｔｙ）を示す。図示の通り、実施例８〜１０の被覆結晶は、抗凍結剤（２．５Ｍ酢酸リチウム水溶液）に１５分間という長時間浸漬させても結晶が損傷しなかった。これらの結晶のモザイク性は、いずれも約０．３と十分に小さい数値であり、質の高い結晶であることが示された。一方、比較例８の結晶はモザイク性が１．１７と大きく、比較例１０の結晶は、抗凍結剤に１５秒間浸漬させると破損してしまい、Ｘ線結晶構造解析ができなかった。【０１０６】
［実施例１１］
抗凍結剤（２．５Ｍ酢酸リチウム水溶液）への浸漬時間を１０分間に変える以外は実施例１０と同条件で被覆結晶製造およびＸ線結晶構造解析を行った。その結果、モザイク性の数値は、ビーム分散を含めて０．０８°と、極めて小さい数値であり、従来技術を上回る非常に高品質の結晶であることが示された。図１２に、本実施例の結晶のＸ線回折像を示す。なお、このときの分解能は０．９３Åであり、被解析結晶は、径が０．５ｍｍ以上の大きな結晶であった。【０１０７】
［実施例１２：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
アガロース−ＩＩＩ溶液（Ａ）におけるアガロース−ＩＩＩ濃度を０〜２．０質量％まで、０．２質量％刻みで種々変化させたことと、タンパク質溶液（Ｂ）においてリゾチームの濃度を３０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬに変えたことと、沈殿化剤溶液における塩化ナトリウム濃度を１．０Ｍから３．０質量％に変えたことと、図４４左下に示したようなバッチ法に適した結晶化プレート（ハンプトンリサーチ社製Ｉｍｐ＠ｃｔ  ｐｌａｔｅ（商品名））を用いてバッチ法にて実施したこと以外は実施例１と同様にして、アガロース−ＩＩＩのゲルで被覆された被覆結晶を製造し、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。なお、以下、図４４左下の図（シッティングドロップ法）の符号を用いて説明するが、この図は模式図であるため、ウェル数、各部の寸法比等は、実際の機器であるＩｍｐ＠ｃｔ  ｐｌａｔｅとは異なる。すなわち、まず、アガロース−ＩＩＩ溶液（Ａ）におけるアガロース−ＩＩＩ濃度を、前述のとおり０〜２．０質量％まで０．２質量％刻みで変化させた種々のアガロース−ＩＩＩ濃度で調製した。これと、タンパク質溶液（Ｂ）とを混合させ、アガロース−ＩＩＩ濃度が種々異なる結晶化溶液（Ｃ）を調製した。次に、異なるアガロース−ＩＩＩ濃度を有する前記結晶化溶液（Ｃ）を沈殿化剤溶液と混合した後、６μＬずつ、結晶化プレート２０７のそれぞれのウェルに注入した。さらに、各アガロース−ＩＩＩ濃度について、同じアガロース−ＩＩＩ濃度の結晶化サンプルを合計８つ作製し、それぞれ別個のウェルに注入した。この結晶化溶液（Ｃ）は、ウェル内で液滴を形成し、すぐにゲル化した。その直後、プレート（結晶化プレート）２０７上面にシールを貼って各ウェル中のゲルの大気に対する曝露を防止し、そのまま２０℃で３日間静置したところ、結晶の生成を確認した。その後、各サンプル中に生成した結晶数を顕微鏡で観察した。各濃度における８つのサンプルの生成結晶数を平均し、平均結晶数（個）とした。【０１０８】
図１５のグラフに、前記平均結晶数を示す。図中、横軸はアガロース−ＩＩＩ濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロース−ＩＩＩ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース−ＩＩＩ存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１０９】
［実施例１３：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
アガロースの種類を、アガロース−ＩＩＩ（ＡｇａｒｏｓｅＩＩＩ）、アガロース９Ａ、またはアガロースＳｅａ  Ｐｌａｑｕｅ（アガロースＳＰ）、およびアガロースＳｅａＫｅｍ（いずれも、タカラバイオ株式会社の商品名）としたことと、アガロース濃度を０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５または６．０質量％と種々変化させること（ＳｅａＫｅｍについては２．０質量％以下まで）以外は実施例１２と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。図１６のグラフに、アガロース濃度０〜２．０質量％の結果を示す。図左上のグラフは、アガロース９Ａの結果を示すグラフである。図右上のグラフは、アガロースＳＰの結果を示すグラフである。図左下のグラフは、アガロース−ＩＩＩの結果を示すグラフである。図右下のグラフは、アガロースＳｅａＫｅｍの結果を示すグラフである。図中、横軸はアガロース濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。また、図１７のグラフに、アガロース濃度０および２．０〜６．０質量％の結果を示す。図右上のグラフは、アガロース−ＩＩＩの結果を示すグラフである。図左下のグラフは、アガロース９Ａの結果を示すグラフである。図右下のグラフは、アガロースＳＰの結果を示すグラフである。図中、横軸はアガロース濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロース濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１０】
［実施例１４：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
アガロースの種類を、ＮｕＳｉｅｖｅ３：１（タカラバイオ株式会社の商品名）とすることと、アガロース濃度を０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５または６．０質量％と種々変化させること以外は実施例１２およびと同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。図１８のグラフに、その結果を示す。図中、横軸はＮｕＳｉｅｖｅ３：１濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロースであるＮｕＳｉｅｖｅ３：１濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。また、ＮｕＳｉｅｖｅ３：１の場合、濃度が５．０質量％付近で最も良好な結晶製造条件が得られたことも示された。【０１１１】
［実施例１５：ゲル濃度および沈殿化剤濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
沈殿化剤溶液中における塩化ナトリウム濃度を、２．０質量％、３．０質量％、４．０質量％、５．０質量％および６．０質量％と種々変化させることと、沈殿化剤への浸漬時間を６日または７日とすること以外は実施例１２と同様にして、ゲル濃度および沈殿化剤変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。なお、ゲル濃度は、各塩化ナトリウム濃度について、実施例１２と同様、０から２．０質量％まで０．２質量％刻みで変化させた。図１９のグラフに、その結果を示す。図中、横軸はアガロース−ＩＩＩ濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロース−ＩＩＩ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース−ＩＩＩ存在下（濃度が０以外）では、いずれの塩化ナトリウム濃度でも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１２】
［実施例１６：ゲル濃度および沈殿化剤濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
前記各実施例で用いた通常のアガロース−ＩＩＩに代えて高融点アガロース−ＩＩＩを用いること以外は実施例１５と同様にして、ゲル濃度および沈殿化剤変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。なお、ゲル濃度は、各塩化ナトリウム濃度について、実施例１５と同様、０から２．０質量％まで０．２質量％刻みで変化させた。図２０のグラフに、その結果を示す。図中、横軸はアガロース−ＩＩＩ濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロース−ＩＩＩ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース−ＩＩＩ存在下（濃度が０以外）では、いずれの塩化ナトリウム濃度でも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１３】
［実施例１７：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
アガロース−ＩＩＩ濃度を０、０．４、１．０、１．６または２．０に種々変化させたことと、タンパク質としてリゾチームに代えてエラスターゼを用い、タンパク質溶液（Ｂ）においてエラスターゼの濃度を１２．５ｍｇ／ｍＬとしたことと、アガロースの種類をアガロースＳｅａｐｌａｑｕｅ（ＳＰ）としたことと、平均結晶数の算出に用いるサンプル数を８個に代えて１２個としたこと以外は実施例１２と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。図２１のグラフに、その結果を示す。図中、横軸はアガロースＳＰ濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロースＳＰ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１４】
［実施例１８：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
タンパク質としてリゾチームに代えてグルコースイソメラーゼを用い、タンパク質溶液（Ｂ）においてグルコースイソメラーゼの濃度を１０ｍｇ／ｍＬとしたことと、アガロースの種類を超低分子量アガロース９Ａとしたことと、沈殿化剤を、塩化ナトリウム水溶液に代えて、１０質量％の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）を含む０．１Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液としたことと、緩衝液を、０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ４．５に代えて０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０としたこと以外は、実施例１２と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。図２２の写真およびグラフに、その結果を示す。各写真の下方の数値は、アガロース９Ａ濃度（質量％）を示す。グラフ中、横軸はアガロース９Ａ濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロース９Ａ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１５】
［実施例１９：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
アガロースの種類をアガロースＳＰとしたことと、沈殿化剤を、８．０質量％の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）を含む０．１Ｍ酢酸カルシウム（ＣａＡｃ）水溶液としたこと以外は実施例１８と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。図２３の写真およびグラフに、その結果を示す。各写真の下方の数値は、アガロースＳＰ濃度（質量％）を示す。グラフ中、横軸はアガロースＳＰ濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロースＳＰ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１６】
［実施例２０：タンパク質濃度およびゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
タンパク質としてリゾチームに代えてソーマチンを用いたことと、アガロースの種類をＳｅａｐｌａｑｕｅ（タカラバイオ株式会社の商品名）としたことと、沈殿化剤（沈殿剤）を０．３Ｍ  Ｎａ／Ｋ酒石酸塩としたことと、平均結晶数の算出に用いるサンプル数を８個に代えて１２個としたこと以外は実施例１２と同様にして、タンパク質濃度およびゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。図２４のグラフに、その結果を示す。図中、横軸はアガロースＳＰ（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）濃度、縦軸は、前記平均結晶数（個）である。図示の通り、アガロースＳＰ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。また、ソーマチン濃度は、５０ｍｇ／ｍＬでも２５ｍｇ／ｍＬでも、いずれでも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１７】
［実施例２１：ゲル濃度変化条件下での結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
下記（１）〜（３）以外は実施例１２と同様にして結晶製造および結晶化条件スクリーニングを行った。
（１）ＶＤＸ  ｐｌａｔｅ（ハンプトンリサーチ社の商品名）を用いたハンギングドロップ法により結晶製造を行った。
（２）タンパク質としてリゾチームに代えてＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ由来ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ（ＰＲＫ）／Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）を用い、これとゲル化剤（アガロース−ＩＩＩに代えてアガロース９Ａを用いた）および４ｍＭのＣＨ２ＨｇＣｌとの混合溶液を結晶化溶液（Ｃ）とした。なお、この結晶化溶液（Ｃ）は、すぐにゲル化するため、調製後、速やかに結晶製造工程に供した。
（３）塩化ナトリウム水溶液および０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ４．５に代えて、１２質量％のイソプロパノール、０．１Ｍまたは０．２２Ｍ酢酸カリウム、および０．１Ｍ  Ｍｅｓ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  ｐＨ６．５水溶液を沈殿化剤溶液とした。【０１１８】
ハンギングドロップ法による結晶製造工程は、以下のように行った。すなわち、まず、プレート２０３の各ウェル（プレートウェル）中に、あらかじめ前記沈殿化剤溶液を５００μＬ／ウェル入れて準備した。一方、前記の通り調整した結晶化溶液（Ｃ）を、突起部２０２（カバーガラス）上に２μＬずつ分注してゲル化させた。各濃度の前記結晶化溶液（Ｃ）について、８つの同じサンプルを、８つの突起部２０２の上面に載せた。その後、蓋体２０１を上下反転させて突起部２０２を下に向け、突起部２０２を、前記沈殿化剤溶液を含むプレートウェル中にはめ込み、前記ゲルと前記沈殿化剤溶液とを近接させた。このようにセットした後、２０℃で３日間静置し、ゲル中でＤＮＡ結晶を析出させて結晶を製造した。図２５の写真に、その結果を示す。図中、各写真の下方の数値は、アガロース濃度（質量％）および沈殿化剤（沈殿剤）濃度を示す。図示の通り、アガロース９Ａ濃度（ゲル濃度）と平均結晶数の相関関係のメカニズムは不明であるが、アガロース存在下（濃度が０以外）では、いずれも良好な結晶製造条件が得られたことが示された。【０１１９】
［実施例２２：大腸菌由来タンパク質の結晶製造（結晶化）］
タンパク質として、前記のタンパク質に代えて大腸菌由来セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）７．５ｍｇ／ｍＬを用いたことと、沈殿化剤（沈殿剤）溶液を４．５質量％のＰＥＧ８０００（Ｐｒｏｍｅｇａ社のポリエチレングリコールの商品名）および０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウムを含むｐＨ６．５水溶液としたこと以外は実施例２１と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。【０１２０】
［実施例２３：大腸菌由来タンパク質の結晶製造（結晶化）］
沈殿化剤（沈殿剤）溶液を、７．５質量％のＰＥＧ８０００（Ｐｒｏｍｅｇａ社のポリエチレングリコールの商品名）および０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウムを含むｐＨ６．５水溶液としたこと以外は実施例２２と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。【０１２１】
［実施例２４：大腸菌由来タンパク質の結晶製造（結晶化）］
タンパク質として、ＳＡＴに代えて大腸菌異物排出トランスポーター（ＡｃｒＢ）２８ｍｇ／ｍＬを用いたことと、沈殿化剤（沈殿剤）溶液を、１０質量％のＰＥＧ２０００（Ｐｒｏｍｅｇａ社のポリエチレングリコールの商品名）、８０ｍＭリン酸二水素ナトリウムおよび２０ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ５．６水溶液としたこと以外は実施例１２と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。【０１２２】
［実施例２５：大腸菌由来タンパク質の結晶製造（結晶化）］
沈殿化剤（沈殿剤）溶液のＰＥＧ２０００濃度を１０質量％に代えて１４質量％としたこと以外は実施例２４と同様にして、ゲル濃度変化条件下での結晶化条件（結晶製造条件）をスクリーニングした。【０１２３】
実施例２２〜２５の結果、大腸菌由来セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）および大腸菌異物排出トランスポーター（ＡｃｒＢ）のいずれについても、良好な結晶製造（結晶化）条件が得られた。図２６の写真に、実施例２２および２３（ＳＡＴ）についてはアガロース濃度１．０質量％における結果を、実施例２４および２５（ＡｃｒＢ）についてはアガロース濃度２．０質量％における結果を、併せて示す。図左上および中上は、実施例２２の結果を示す写真である。図左下および中下は、実施例２３の結果を示す写真である。図右上は、図２４の結果を示す写真である。図右下は、実施例２５の結果を示す写真である。図示の通り、大腸菌由来のＳＡＴおよびＡｃｒＢのいずれについても、良好な結晶を得ることができた。【０１２４】
［実施例２６：核酸（ＤＮＡ）の結晶製造および結晶化条件スクリーニング］
以下のようにして、核酸（ＤＮＡ）の結晶を製造した。【０１２５】
まず、ＤＮＡをアニーリングした。すなわち、まず、一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡ１（５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’：配列番号１）の１ｍＭ水溶液と、ＤＮＡ１の相補鎖であるＤＮＡ２（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’：配列番号２）の１ｍＭ水溶液とを等量混合し、まず６０℃で１０分間、続いて２０℃で１５分間静置した。ここに、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、株式会社ジーンデザイン社製）の１ｍＭ水溶液を、前記ＤＮＡ１水溶液と同量加え、２０℃で終夜静置した。このようにして、ＤＮＡのアニーリングを行い、アニール化ＤＮＡ水溶液を得た。このアニール化ＤＮＡ水溶液を、結晶製造に供した。【０１２６】
ＶＤＸ  ｐｌａｔｅ（ハンプトンリサーチ社の商品名）を用いたハンギングドロップ法により結晶製造を行うことと、結晶化溶液（Ｃ）として、下記のゲルとＤＮＡとの混合水溶液を用い、沈殿化剤（リザーバー）溶液として下記の溶液を用いること以外は、実施例１２と同様にして結晶製造および結晶化条件スクリーニングを行った。
ゲルとＤＮＡとの混合水溶液（濃度は最終濃度）
アガロース９Ａ  １．０または１．６質量％
１．５質量％  ＭＰＤ  
０．５ｍＭ  ＤＮＡ（前記アニール化ＤＮＡ水溶液を左記濃度相当分使用）
２０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液（ｐＨ６．８）
沈殿化剤（リザーバー）溶液
１８質量％  ＭＰＤ水溶液（５００μＬ／ウェル）
【０１２７】
なお、本実施例では、以下のようにして結晶化溶液（Ｃ）（前記ゲルとＤＮＡとの混合水溶液）を調整した。すなわち、まず、アガロース９Ａを８５℃の水に溶かし、３７℃で保温したゲル化剤水溶液（最終濃度の４倍濃度）を調製した。このゲル化剤水溶液と、ＭＰＤ、カコジル酸ナトリウムおよびＭｇＣｌ２を最終濃度の４倍濃度で含む緩衝液と、前記アニール化ＤＮＡ水溶液とを、この順に１：１：２の体積比で混合し、結晶化溶液（Ｃ）を得た。この結晶化溶液（Ｃ）は、すぐにゲル化するため、調製後速やかに以下の結晶製造工程に供した。【０１２８】
結晶製造工程は、以下のように行った。すなわち、まず、プレート２０３の各ウェル（プレートウェル）中に、あらかじめ前記沈殿化剤溶液を５００μＬ／ウェル入れて準備した。一方、前記の通り調整した結晶化溶液（Ｃ）を、突起部２０２（カバーガラス）上に２μＬずつ分注してゲル化させた。各濃度の前記結晶化溶液（Ｃ）について、８つの同じサンプルを、８つの突起部２０２の上面に載せた。その後、蓋体２０１を上下反転させて突起部２０２を下に向け、突起部２０２を、前記沈殿化剤溶液を含むプレートウェル中にはめ込み、前記ゲルと前記沈殿化剤溶液とを近接させた。このようにセットした後、２０℃で１〜５日間静置し、ゲル中でＤＮＡ結晶を析出させて結晶を製造した。【０１２９】
図２７の写真に、本実施例におけるＤＮＡ結晶製造（結晶成長）の過程を示す。図２７左欄は、アガロースを加えなかった例（比較例に相当）である。中欄は、アガロース９Ａの最終濃度１．０質量％の例である。右欄は、アガロース９Ａの最終濃度１．６質量％の例である。また、それぞれにおいて、上段は、２０℃で１日静置直後の写真であり、下段は、２０℃で５日静置直後の写真である。図示の通り、アガロースを加えなくてもＤＮＡ結晶は成長するが、アガロースを加えた本発明の実施例によれば、さらに結晶が成長しやすいことが示された。また、図示の通り、２０℃で静置後５日経つと、静置後１日の時よりも、細かい結晶が減ってゲルの透明度が上昇し、結晶が大きく成長した。【０１３０】
［実施例２７：メビオールジェルを用いた結晶製造および結晶化スクリーニング］
アガロース−ＩＩＩ溶液（Ａ）に代えて、メビオールジェル濃度を０、１、３および５質量％に種々変化させたメビオールジェル溶液を用いたことと、タンパク質溶液（Ｂ）においてリゾチームの濃度を４０ｍｇ／ｍＬに変えたこと以外は実施例１２と同様にしてリゾチームの結晶を製造し、結晶化スクリーニングを行った。図２８に、その結果を示す。図左側のグラフにおいて、横軸は、メビオールジェル添加量（質量％）であり、縦軸は、平均結晶数（結晶析出数）である。また、右側の写真は、メビオールジェルを１質量％添加した場合およびメビオールジェルを添加しなかった場合において、それぞれ析出した結晶を示す。図示の通り、メビオールジェルを添加しなかった場合は、リゾチーム結晶はほとんど析出せず、析出した結晶も、クラックが発生してしまい、良質な結晶ではなかった。これに対し、メビオールジェルを添加した場合、クラック等のない良質な結晶が多数得られた。特に、メビオールジェル添加量を５質量％に増加させると、結晶析出数が急激に上昇した。さらに、メビオールジェルを７質量％に増加させても、同様に良好な結果が得られた。【０１３１】
また、上記結晶は、メビオールジェルで被覆された被覆結晶であるが、１５℃以下に冷却することにより、メビオールジェルが液化（ゾル化）し、極めて簡便にゲル被覆を除去することができた。図２９の写真に、その様子を示す。左側の写真は、冷却前の、メビオールジェルで被覆された結晶を示す。右側の写真は、冷却後の、ゲル被覆が除去された結晶を示す。【０１３２】
［ゲル被覆結晶の耐乾燥性］
実施例１３および２７における結晶化スクリーニングで製造した被覆結晶の対乾燥性を評価した。実施例１３は、２．０質量％アガロース９Ａ、２．０質量％アガロースＳＰ、または２．０質量％アガロース−ＩＩＩを用いて製造した被覆結晶をそれぞれ評価に用いた。実施例２７は、メビオールジェル１質量％を用いて製造した被覆結晶を評価に用いた。評価は、結晶の入った前記ハンギングドロップ法用の装置（ハンプトンリサーチ社製ＶＤＸ  ｐｌａｔｅ（商品名））ウェル上面からシールを取り除いて結晶を常温の大気に曝露し、経時変化を顕微鏡観察することで行った。【０１３３】
図３０の写真に、実施例１３の結晶の対乾燥性評価結果を示す。１番左の「Ｎｏｎｅ」のラインは、ゲルを添加しないで製造した結晶（比較例）の経時変化を示す。左から２番目の「２．０％  ９Ａ」のラインは、２．０質量％アガロース９Ａを用いて製造した結晶の経時変化を示す。左から３番目の「２．０％  ＳＰ」のラインは、２．０質量％アガロースＳＰを用いて製造した結晶の経時変化を示す。一番右の「２．０％  ＩＩＩ」のラインは、２．０質量％アガロース−ＩＩＩを用いて製造した結晶の経時変化を示す。写真の左側における「ｍｉｎ」で表した数字は、結晶の、大気に対する曝露時間（分）を表す。図示の通り、ゲルを添加しないで製造した結晶（比較例）は、曝露時間１０分ですでに乾燥が始まり、曝露時間１６分では顕著なクラックが起こり、すでに実用に耐えず、曝露時間２９分では完全に崩壊していた。これに対し、実施例の各被覆結晶は、曝露時間２０〜２９分という長時間、乾燥に耐えた。【０１３４】
さらに、図３１Ａおよび３１Ｂの写真に、実施例２７の結晶の対乾燥性評価結果を示す。図３１Ａ上段の「ゲル添加なし」のラインは、ゲルを添加しないで製造した結晶（比較例）の経時変化を示す。図３１Ａ下段の「メビオール１％添加」のラインは、１．０質量％メビオールジェルを用いて製造した結晶の経時変化を示す。図３１Ｂ上段は、図３１Ａ上段に引き続き、ゲルを添加しないで製造した結晶（比較例）の経時変化を示す。図３１Ｂ下段は、図３１Ａ下段に引き続き、１．０質量％メビオールジェルを用いて製造した結晶の経時変化を示す。「ｍｉｎ」で表した数字は、結晶の、大気に対する曝露時間（分）を表す。図示の通り、ゲルを添加しないで製造した結晶（比較例）は、曝露時間４分ですでに表面の乾燥がはじまり、曝露時間２２分でクラックが入り始め、曝露時間２８分では顕著な沈殿やひび割れが生じ、曝露時間３６分でほぼ完全に崩壊した。これに対し、メビオールジェルで被覆された実施例の被覆結晶は、曝露時間３６分でもクラックや乾燥等の劣化を何ら起こさず、曝露時間４１分でも、ごく一部の結晶に微細なクラックが入ったのみであった。【０１３５】
このように、本発明の製造方法により製造される被覆結晶は、ゲルで被覆されていることにより、乾燥に極めて強く、保存に向くことが確認された。【０１３６】
［実施例２８：メビオールジェルを用いた結晶製造］
リゾチーム濃度  ３５ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム濃度  ３質量％、酢酸ナトリウム濃度を０．２Ｍ、メビオールジェル濃度  ２質量％の混合溶液を１２℃に保ち、そのまま１２℃で約１週間静置して結晶を析出させ、本発明の結晶製造方法を実施した。さらにその後、前記混合溶液の温度を２０℃に上昇し、ゲル状態に変換（移動）させた。この状態変化（移動）の前後で結晶に損傷等の変化があるか観察した。図３２の写真に、その観察結果を示す。左はゾル状態（移動前）の写真であり、右はゲル状態（移動後）の写真である。図示の通り、移動前後で結晶の状態に変化は見られなかった。さらに、メビオールジェル濃度を３質量％に代えても同様の結果が得られた。【０１３７】
図３３の表および写真に、実施例２７および２８の結晶のＸ線結晶構造解析の結果を示す。Ｘ線結晶構造解析は、前述の各実施例と同様に行った。抗凍結剤は２．５Ｍ酢酸リチウムを用い、浸漬時間は１５分間とした。表中の番号１は、メビオールジェルを添加せずに製造した結晶（比較例）を示す。番号２および３は、実施例２８の結晶（メビオールジェル２質量％および３質量％）を示す。番号４および５は、実施例２７の結晶（メビオールジェル２質量％および５質量％）を示す。写真は、Ｘ線回折像を示し、写真に付された１、２、３および５の番号は、それぞれ表中の番号に対応する。図示のとおり、いずれの結晶においても良好な解析結果が得られ、メビオールジェルの添加および結晶析出後のゲル化は、結晶に対し何ら悪影響を及ぼさないことが確認された。なお、番号２の結晶のみ、若干モザイク性の数値が大きくなっているが、これは、結晶を前記ＶＤＸ  ｐｌａｔｅから剥がす際の操作エラーにより、若干損傷が起こってしまったためであり、結晶構造の本質的な欠陥によるものではない。【０１３８】
さらに、実施例２７のリゾチーム結晶のうち、メビオールジェルを７質量％添加して製造したものについて、同様にＸ線結晶構造解析を行った。図３４に、その結果を示す。図３４左側に示すように、良好な結晶が得られ、右側に示すように、良好なＸ線回折像と低いモザイク性（０．３１７８）が得られた。【０１３９】
［フェムト秒レーザーによる被覆結晶の加工による加工結晶の製造］
実施例１８で製造したグルコースイソメラーゼのアガロースＳＰゲル被覆結晶（アガロースＳＰ濃度１．６質量％）をフェムト秒レーザーで加工し、一部を切り出し、加工結晶を製造した。レーザ光源としては、サイバーレーザー社製イフリート（商品名）を用い、出力は０．７〜２．０ｍＷとした。図３５の写真に、その様子を示す。図左は加工前であり、図右は加工後である。図示のように、フェムト秒レーザーで加工した加工部において、結晶およびゲルの一部を切り出し、加工結晶を製造することができた。【０１４０】
加工により切り出した加工部（加工結晶）は、ピンセットやクライオループなどを用いて取り出し、Ｘ線結晶構造解析に供することができた。図３６左は、前記加工部（加工結晶）を取り出している最中の状態を示す写真であり、図３６右は、取り出し後の前記加工部（加工結晶）の写真である。また、図３７に、前記加工部のＸ線結晶構造解析結果を示す。図３７左は、前記加工部の結晶とゲルを示す写真であり、図右は、図左に示した各部分の分解能およびモザイク性である。図示のように、加工部に含まれる結晶は、良好な構造を有することが確認された。【０１４１】
このように、フェムト秒レーザー等のレーザー光を用いた加工によれば、例えば、ゲル被覆結晶から、ゲルおよび結晶のうち使用目的に供する部分のみを適切に切り出すことができる。また、例えば、結晶からゲルのみを適切に除去し、前記ゲルを含まない結晶だけを取り出すこともできる。【０１４２】
このようなレーザー光加工は、ゲルで被覆されていない結晶に対しても行うことができる。このレーザー光加工によれば、密封環境下で非接触加工を行うことができる。さらに、光エネルギーで分子結合を切断するため、周辺部分に熱拡散せずに加工を行うことができる。特に、フェムト秒レーザーは、集光点付近の例えば数μｍの部分でのみ光エネルギー吸収が起こるため、精密な三次元加工等が可能である。しかしながら、液中に存在しゲルで被覆されていない結晶をレーザー光で加工した場合、結晶がゲルで固定されておらず動いてしまうために、正確な加工がしにくい場合がある。また、結晶がゲルで保護されていないために損傷してしまうおそれがある。さらに、加工の際のデブリ（切りくずや結晶の破片など）が拡散して結晶表面に再付着し、多結晶化等を引き起こしてしまうおそれもある。しかし、レーザー光加工に用いる結晶が、ゲルで被覆された被覆結晶（ゲル被覆結晶）であれば、これらの問題を解決することができる。一方、ゲル被覆結晶にレーザー光を用いて加工すれば、物理的手段による加工よりも、結晶の加工や取出しを簡便に行うことができ、ゲル被覆が加工の妨げになりにくいという利点がある。このように、ゲル被覆結晶のレーザー光加工であれば、ゲル被覆結晶とレーザー光加工との双方の課題を補うことができるのである。【０１４３】
［実施例２９：被覆結晶を種結晶として用いた成長結晶製造］
実施例１２の結晶化スクリーニングにおいて製造した、アガロースゲルで被覆されたリゾチーム結晶（アガロース−ＩＩＩ濃度１．０質量％）の一部を、前述のフェムト秒レーザーにより切り出して種結晶とした。この種結晶を、塩化ナトリウム３質量％およびリゾチーム２０ｍｇ／ｍＬを含む水溶液中に入れ、室温で６０日間静置して結晶を成長させ、本発明の成長結晶製造方法を実施した。図３８の写真に、その様子を示す。左図は、実施例１２のゲル被覆結晶であり、中図は、その一部をフェムト秒レーザー加工で切り出した種結晶（加工結晶）であり、右図は、室温で６０日間成長させた後の成長結晶である。図示の通り、溶液中での成長により、種結晶よりもはるかに大きな、径が約１ｍｍにも達する大きな結晶が得られた。このような大きな結晶は、種々の用途に用いることができ、例えば、中性子線結晶構造解析等に向く。【０１４４】
［実施例３０：被覆結晶を種結晶として用いた成長結晶製造］
実施例２７の結晶化スクリーニングにおいて製造した、メビオールジェルで被覆されたリゾチーム結晶（メビオールジェル濃度５．０質量％）の一部を、前述のフェムト秒レーザーにより切り出して種結晶とした。この種結晶を、塩化ナトリウム３質量％およびリゾチーム２０ｍｇ／ｍＬを含む水溶液中に入れ、室温で４日間静置して結晶を成長させ、本発明の成長結晶製造方法を実施した。図３９の写真に、その様子を示す。左図は、実施例２７のゲル被覆結晶であり、中図は、その一部をフェムト秒レーザー加工で切り出した種結晶（加工結晶）であり、右図は、室温で４日間成長させた後の成長結晶である。図示の通り、溶液中での成長により、種結晶よりもはるかに大きな、径が約０．５ｍｍにも達する大きな結晶が得られた。このような大きな結晶は、実施例２９でも述べた通り、種々の用途に用いることができ、例えば、中性子線結晶構造解析等に向く。【０１４５】
［実施例３１：遠心分離による濃度勾配を用いた結晶化スクリーニング］
遠心分離機を用い、遠心分離チューブ内部の上部と下部とで沈殿剤（沈殿化剤）濃度に勾配を形成することで、結晶化スクリーニングを行った。以下、図４０を用いて具体的に説明する。【０１４６】
すなわち、まず、遠心分離チューブ４０５（ＢＤ社製、商品名  ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ）を準備した。この遠心分離チューブは、底部にＰＥＴ製の半透膜（透析膜）が貼られており、前記半透膜は、固形物は通さずに、一定の大きさ以下の粒子のみを通す。次に、この遠心分離チューブ４０５内部に、２．０質量％アガロース水溶液（アガロースの種類は、Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）を６５０μＬ入れ、ゲル化させた。さらにそのゲルの上面に、リゾチーム５０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム４．０質量％、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．５を含む水溶液６５０μＬを注いだ。これを、遠心分離機器（久保田商事株式会社社製、商品名  Ｐｌａｔｅ  Ｓｐｉｎ）を用いて、２０℃において２０，０００ｒｐｍで１５時間遠心分離し、前記ゲル中にリゾチーム溶液を均一に拡散させた。【０１４７】
一方、遠心分離チューブ４０５よりも太く底部が閉じられた円筒容器４０６中に、沈殿化剤（４．０質量％塩化ナトリウム水溶液）１０００μＬを入れた。さらにその中に、前記ゲルを含んだ遠心分離チューブ４０５を入れた。そのまま２０℃で２日間静置すると、遠心分離チューブ４０５内部には、底部のＰＥＴ膜を通じて徐々に沈殿化剤が浸透し、下部では沈殿化剤濃度が高く、上部では沈殿化剤濃度が低くなり、前記ゲル中にリゾチーム結晶が析出した。このようにして、前記ゲル中で結晶を析出させてリゾチーム結晶を製造した。【０１４８】
結晶製造（析出）後の遠心分離チューブ４０５内におけるゲル内部を、実体顕微鏡で観察した。撮影は、遠心分離チューブ４０５（カップ）内部の下部（ＰＥＴ膜（メンブレン）側）から上部にかけて、複数の異なる角度から行った。図４１に、その写真を示す。図示の通り、図４１上部は、遠心分離チューブ４０５（カップ）内部の上部を示し、図４１下部は、遠心分離チューブ４０５（カップ）内部の下部（ＰＥＴ膜（メンブレン）側）を示す。同図から分かる通り、沈殿化剤濃度が高いカップ下部（メンブレン側）では析出した結晶の個数が多かった。逆に、沈殿化剤濃度が低いカップ上部では、析出した結晶の個数が少なかった。すなわち、遠心分離を用いて、遠心分離容器内部の上部と下部とで沈殿化剤の濃度勾配を形成し、結晶化条件のスクリーニングを行うことができた。なお、この実施例は、沈殿化剤の濃度勾配を利用した結晶化条件のスクリーニングであるが、同様にタンパク質濃度勾配を形成することによる結晶化条件のスクリーニングも簡便に行うことができる。タンパク質以外の生体物質に対しても同様である。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
以上の通り、本発明の結晶製造方法によれば、溶液中から結晶を析出させるよりも、前記生体物質の結晶を簡便に製造することが可能である。また、本発明の凍結結晶製造方法によれば、前記結晶が凍結による損傷を受けにくい。さらに、本発明の成長結晶製造方法によれば、前記ゲルで被覆された被覆結晶を種結晶として結晶を成長させるため、より大きな結晶を得ることができる。また、本発明の結晶は、前記本発明の結晶製造方法、前記本発明の凍結結晶製造方法、または前記本発明の成長結晶製造方法により製造されることで、例えば結晶構造解析等に向いた良好な特性を有する。さらに、本発明の構造解析方法によれば、前記ゲルで被覆された被覆結晶またはそれを凍結した前記凍結結晶を構造解析するため、結晶の取り扱いがしやすいという利点がある。【０１５０】
さらに、本発明の結晶化スクリーニング方法は、本発明の結晶製造方法により簡便に結晶を製造できることで、結晶製造条件をさほど厳密に設定しなくても良いため、スクリーニングをも簡便に行うことができる。さらに、本発明の結晶化スクリーニング装置は、同様の理由により、装置の構成を簡略化することが可能である。【０１５１】
本発明の結晶製造方法および凍結結晶製造方法は、結晶構造解析、特にＸ線結晶構造解析に有用であり、さらに、結晶化スクリーニング方法にも応用可能である。さらに、本発明の結晶製造方法および凍結結晶製造方法と、それらにより製造された結晶および凍結結晶の用途は、前記の用途に限定されず、あらゆる用途に使用可能である。
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２４】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月12日(2009.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を結晶化させる結晶化工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、
前記結晶化工程において、前記生体物質をゲル中で結晶化させ、前記ゲルのゲル強度が１００Ｐａ以上であることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記生体物質が、生体高分子化合物、タンパク質、天然タンパク質、人工タンパク質、ペプチド、天然ペプチド、人工ペプチド、核酸、天然核酸、人工核酸、糖鎖、天然糖鎖、または人工糖鎖である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記結晶化工程に先立ち、
前記生体物質の溶液を準備する溶液準備工程と、
前記溶液をゲル化させて前記ゲルを調製するゲル化工程とをさらに含む、
請求項１の製造方法。
【請求項４】
前記生体物質溶液がゲル化剤をさらに含む請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
ゲル化剤が、多糖類、増粘多糖類、タンパク質、および昇温時ゲル化型ゲルからなる群から選択される少なくとも一つである請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
ゲル化剤が、アガロース、寒天、カラギーナン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアクリルアミド、昇温時ゲル化型ポリアクリルアミドゲルからなる群から選択される少なくとも一つである請求項４記載の製造方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
製造される前記結晶が、前記ゲルで被覆された被覆結晶である請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
生体物質の結晶を凍結する凍結工程を含む凍結結晶の製造方法であって、
請求項８記載の方法により前記被覆結晶を製造する被覆結晶製造工程をさらに含み、
前記凍結工程において、前記被覆結晶を凍結することを特徴とする製造方法。
【請求項１０】
前記凍結工程に先立ち、前記被覆結晶を抗凍結剤に浸漬させる浸漬工程をさらに含む請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
種結晶である生体物質結晶を前記生体物質の溶液中でさらに成長させる結晶成長工程を含む、前記生体物質の結晶の製造方法であって、
前記結晶成長工程において、前記種結晶が、請求項８記載の方法により製造される被覆結晶であることを特徴とする製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法により製造される結晶。
【請求項１３】
生体物質の結晶を構造解析する方法であって、
請求項８記載の製造方法により製造された被覆結晶または請求項９もしくは１０記載の製造方法により製造された凍結結晶を構造解析する構造解析工程を含むことを特徴とする構造解析方法。
【請求項１４】
前記構造解析工程において、Ｘ線結晶構造解析または中性子線結晶構造解析により前記結晶を構造解析する請求項１３記載の構造解析方法。
【請求項１５】
生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング方法であって、
前記生体物質の結晶を製造する結晶製造工程と、
前記結晶製造工程における結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含み、
前記結晶製造工程において、請求項１記載の結晶製造方法または請求項９記載の凍結結晶製造方法により前記結晶を製造することを特徴とする結晶化スクリーニング方法。
【請求項１６】
生体物質の結晶化条件をスクリーニングする結晶化スクリーニング装置であって、
前記生体物質の結晶を製造する結晶製造手段と、
前記生体物質の結晶化条件をスクリーニングするスクリーニング手段とを含み、
前記結晶製造手段が、ゲル中で前記生体物質の結晶を析出させる結晶化手段を含むことを特徴とする結晶化スクリーニング装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
い。これにより、ゲルがキャピラリーに封入された状態となる。また、熱可逆性ハイドロゲルの場合は、例えば前記とは逆に、低温で前記ゲル化剤溶液を調製し、前記生体物質溶液と混合した後、温度を上昇させてゲル化させてもよい。
［００２７］
前記ゲル化後のゲル強度は、後述する結晶化工程で析出した前記生体物質結晶を物理的衝撃から保護しやすい等の観点から、例えば１００Ｐａ以上、好ましくは２００Ｐａ以上、より好ましくは３００Ｐａ以上、さらに好ましくは５００Ｐａ以上、特に好ましくは１０００Ｐａ以上である。前記ゲル化後のゲル強度は高いほど好ましく、上限は特に制限されないが、例えば、２０００００Ｐａ以下である。前記ゲル化後のゲル強度は、前記ゲル化剤濃度を調節することによって、適宜設定することができる。同じゲル化剤濃度における前記ゲル強度は、前記ゲル化剤の種類によって異なる。例えば、図４７のグラフに示すとおり、アガロースＩＩＩ、アガロースＳＰ（アガロースＳｅａ  Ｐｌａｑｕｅ）、アガロース９Ａ（いずれもタカラバイオ株式会社の商品名）は、同じ濃度であれば、ゲル化後は、通常、アガロースＩＩＩ＞アガロースＳＰ＞アガロース９Ａの順にゲル強度が高くなる。なお、図４８のグラフに、図４７におけるアガロース９Ａのみの測定結果を示す。図４７および４８において、横軸は前記各アガロースの濃度（質量％）であり、縦軸はゲル強度（ｇ／ｃｍ２）である。なお、１ｇ／ｃｍ２は、９８．０６６５Ｐａに相当する。また、ゲル化剤濃度が一定の臨界的濃度未満である場合、前記ゲル化剤を含む溶液が明確にゲル化しないため、ゲル強度は測定不能（グラフ上の記載としては０）である。しかしながら、ゲル化剤濃度が前記臨界的濃度以上になると、前記溶液が明確にゲル化することが可能であるため、ゲル強度が測定可能となる。本発明においては、前記ゲル化剤濃度を前記臨界的濃度以上にすることが好ましい。前記臨界的濃度は、アガロースＩＩＩ、アガロースＳＰ、アガロース９Ａの場合、図４７および図４８に示すとおり、いずれも、約０．６質量％である。
［００２８］
なお、前記ゲル強度は、レオストレス  ＲＳ１  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（英弘精機株式会社のレオメーターの商品名）を動的粘弾性測定モードで用い、周波数１Ｈｚ、測定温度２０℃で測定した数値とする。図４７および図４８に示す測定値も、この方法で測定した。なお、ゲル溶解温度が２０℃よりも低いために２０℃でゲル状態にならない（ゾル状である）ゲルの場合は、前記ゲル強度は、前記ゲル溶解温度よりも低く５で割り切れる摂
【国際調査報告】
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