(57)【要約】  癌原発巣からリンパ節特にセンチネルリンパ節へリンパ行性転移した癌細胞を簡便かつ短時間で正確に検出することができる簡易なキットと、癌原発巣の所為で微小癌細胞の付着し易い環境が構築され微小癌細胞が付着しているそのセンチネルリンパ節内へ検査、治療に用いる薬剤を選択的に到達させることができる薬物輸送剤とを、提供する。  センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、ヒトリンパ管由来内皮細胞株が基材に付されたものである。センチネルリンパ節内への薬物輸送剤は、センチネルリンパ節で癌原発巣からの転移癌細胞がリンパ管内皮細胞へ付着するのを介在する接着分子に対する抗体が、コロイド粒子の表面から露出されたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトリンパ管由来内皮細胞株が基材に付されていることを特徴とするセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項２】
前記ヒトリンパ管由来内皮細胞株が、摘出されたヒトリンパ管の内腔にプロテアーゼ液を灌流することにより剥離させて採取した内皮細胞であることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項３】
前記ヒトリンパ管由来内皮細胞株と癌原発巣から転移した癌細胞との付着を介在する接着分子を、抗原抗体反応により検出するイムノアッセイ検出剤が、添加されることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項４】
前記接着分子が、活性化されて発現していることを特徴とする請求項３に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項５】
前記接着分子が、ＩＣＡＭ−１、又はＥ−セレクチンであることを特徴とする請求項３に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項６】
前記接着分子が、それのリガンドを介して結合していることを特徴とする請求項３に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項７】
前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃであることを特徴とする請求項６に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット。
【請求項８】
センチネルリンパ節で癌原発巣からの転移癌細胞がリンパ管内皮細胞へ付着するのを介在する接着分子に対する抗体及び／又はリガンドが、コロイド粒子の表面から露出し、又は懸濁されていることを特徴とするセンチネルリンパ節内への薬物輸送剤。
【請求項９】
前記抗体が、抗ＩＣＡＭ−１抗体、及び／又は抗Ｅ−セレクチン抗体であることを特徴とする請求項８に記載の薬物輸送剤。
【請求項１０】
前記リガンドが、ＩＣＡＭ−１リガンドであることを特徴とする請求項８に記載の薬物輸送剤。
【請求項１１】
前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃであることを特徴とする請求項１０に記載の薬物輸送剤。
【請求項１２】
前記コロイド粒子に、蛍光剤、造影剤、治療剤、及び／又は転移癌細胞接着増強剤が、含有され及び／又は露出されていることを特徴とする請求項８に記載の薬物輸送剤。
【請求項１３】
前記コロイド粒子が、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、又はリポソームであることを特徴とする請求項８に記載の薬物輸送剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌原発巣からリンパ節特にセンチネルリンパ節へリンパ行性転移した癌細胞を検出するキット、及びそのセンチネルリンパ節内へ選択的に到達させる薬物輸送剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の転移は、主にリンパ行性によって生じる。癌患者を治療する際、癌原発巣や転移している恐れがあるリンパ節を郭清する外科手術が行われる。このようなリンパ節の郭清は、術式が複雑となり、患者の身体的負担が大きなものである。郭清したとしても、転移していたリンパ系を完全に郭清できたか、また癌細胞のリンパ系への再転移の可能性が無いかを、術後に検査するために、リンパ節転移を指標とする臨床検査を行なわなければならない。【０００３】
癌原発巣と郭清すべきリンパ節のみとを外科手術で摘出するために、最近、癌原発巣に放射性同位体や染料を注射し、癌原発巣からリンパ流を最初に受ける局所リンパ節であるセンチネルリンパ節（ＳＬＮ：Sentinel Lymph Node）を見つけ出し、生検するという検査方法が、提唱されている。【０００４】
このセンチネルリンパ節は、癌細胞のリンパ行性微小転移が最初に起こる部位である。このようなセンチネルリンパ節の検査が臨床的に重要であるということは多くの乳癌患者で実証されてきた。しかし、微小転移癌細胞に作用するセンチネルリンパ節内とそこに最も近接している輸入リンパ管のリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ：Lymphatic Endothelial Cells）との生物学的・組織学的特徴は、依然として明らかでない。【０００５】
癌原発巣が、前転移段階で癌組織の微小環境に影響していることは、最近いくつかの報告がみられる。例えば、癌原発巣によって肺マクロファージや内皮細胞で発現され、前転移段階で癌細胞を肺組織への侵入及び誘発を促進させるマトリックスメタロプロテアーゼ９は、癌原発巣から分泌されるＶＥＧＦ−Ａに、関与している。しかし、転移前のセンチネルリンパ節中の如何なる分子が、癌細胞とリンパ管内皮細胞との付着に関わる微小転移し易い環境を、誘発しているのかについても、明らかでない。そのため微小癌細胞転移を検出したり、それを阻害して癌原発巣の転移を抑制したりする方法が、望まれている。【０００６】
ところで、本発明者らは、特許文献１や非特許文献１のように、プロテアーゼを用い、乳癌患者のセンチネルリンパ節の輸入リンパ管由来のヒトリンパ管内皮細胞株を樹立している。【０００７】
本発明者らは、ヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＭＣＦ−７を用いて、このヒトリンパ管内皮細胞上の接着分子の発現に関して癌細胞培養上清の効果を調べ、発現した接着分子がリンパ管内皮細胞への癌細胞付着を助長するのかという点について、検討した。また、癌細胞特に悪性乳癌細胞が、センチネルリンパ節やそれに最も近接する輸入リンパ管中で、転移前に癌細胞の微小転移を起こし易い環境を作る化学物質を放出する可能性について、検討した。また、センチネルリンパ節に最も近い輸入リンパ管に存するヒトリンパ管内皮細胞を培養した細胞上で接着分子の発現に関して様々なケモカイン類の影響を調べ、発現した接着分子がリンパ管内皮細胞への癌細胞付着を助長するのかという点につき、検討した。さらに、乳癌患者から摘出した直後に凍結しておいたセンチネルリンパ節組織上での接着分子の免疫組織化学的発現についても、検討した。それらの検討結果に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２２２１５５号公報
【非特許文献１】Kawai  Yら、Lymphatic Research and Biology(リンパティック  リサーチ  アンド  バイオロジー)、２００７年、第５巻、ｐ.１１５−１２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、癌原発巣からリンパ節特にセンチネルリンパ節へリンパ行性転移した癌細胞を簡便かつ正確に短時間で検出することができる簡易なキットと、癌原発巣の所為で微小癌細胞の付着し易い環境が構築され微小癌細胞が付着しているそのセンチネルリンパ節内へ検査、治療に用いる薬剤を選択的に到達させることができる薬物輸送剤とを、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、ヒトリンパ管由来内皮細胞株が基材に付されていることを特徴とする。【００１１】
請求項２に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、請求項１に記載されたもので、前記ヒトリンパ管由来内皮細胞株が、摘出されたヒトリンパ管の内腔にプロテアーゼ液を灌流することにより剥離させて採取した内皮細胞であることを特徴とする。【００１２】
請求項３に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、請求項１に記載されたもので、前記ヒトリンパ管由来内皮細胞株と癌原発巣から転移した癌細胞との付着を介在する接着分子を、抗原抗体反応により検出するイムノアッセイ検出剤が、添加されることを特徴とする。【００１３】
請求項４に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、請求項１に記載されたもので、前記接着分子が、活性化されて発現していることを特徴とする。【００１４】
請求項５に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、請求項３に記載されたもので、前記接着分子が、ＩＣＡＭ−１、又はＥ−セレクチンであることを特徴とする。【００１５】
請求項６に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、請求項３に記載されたもので、前記接着分子が、それのリガンドを介して結合していることを特徴とする。【００１６】
請求項７に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、請求項６に記載されたもので、前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃであることを特徴とする。【００１７】
請求項８に記載のセンチネルリンパ節内への薬物輸送剤は、センチネルリンパ節で癌原発巣からの転移癌細胞がリンパ管内皮細胞へ付着するのを介在する接着分子に対する抗体及び／又はリガンドが、コロイド粒子の表面から露出し、又は懸濁されていることを特徴とする。【００１８】
請求項９に記載の薬物輸送剤は、請求項８に記載されたもので、前記抗体が、抗ＩＣＡＭ−１抗体、及び／又は抗Ｅ−セレクチン抗体であることを特徴とする。【００１９】
請求項１０に記載の薬物輸送剤は、請求項８に記載されたもので、前記リガンドが、ＩＣＡＭ−１リガンドであることを特徴とする。【００２０】
請求項１１に記載の薬物輸送剤は、請求項１０に記載されたもので、前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃであることを特徴とする。【００２１】
請求項１２に記載の薬物輸送剤は、請求項８に記載されたもので、前記コロイド粒子に、蛍光剤、造影剤、治療剤、及び／又は転移癌細胞接着増強剤が、含有され及び／又は露出されていることを特徴とする。【００２２】
請求項１３に記載の薬物輸送剤は、請求項８に記載されたもので、前記コロイド粒子が、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、又はリポソームであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、癌原発巣からリンパ節特にセンチネルリンパ節へリンパ行性転移した癌細胞を、簡便かつ正確に検出することができるものである。しかも短時間で検出できるので、癌原発巣の切除手術の際に、既に悪性癌細胞が転移したり微小癌細胞が付着したりしているリンパ節のみを確実に郭清して、癌の再発防止に資することができる。【００２４】
本発明の薬物輸送剤は、癌細胞が転移したり微小癌細胞が付着したりしているセンチネルリンパ節へ選択的に集まり、その癌細胞に結合し易いので、癌の検査、治療に用いる薬剤をセンチネルリンパ節内の癌細胞へ選択的に到達させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、癌培養上清による接着分子発現の変化を示す図である。
【図２】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、癌細胞上清毎の接着分子発現の変化を示す図である。
【図３】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、サイトカイン又は増殖因子刺激による各種接着分子発現の変化を示す図である。
【図４】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、癌培養上清の前処理をしたときの接着分子発現の影響を示す図である。
【図５】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、ＡＴＰ又はスラミンの作用による接着分子発現の影響を示す図である。
【図６】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、スラミン、ＤＰＣＰＸ又はＤＭＰＸの作用による接着分子発現の影響を示す図である。
【図７】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、スラミンの作用による接着分子の接着能の変化を示す図である。
【図８】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、抗ＩＣＡＭ−１抗体による接着分子の接着能の変化を示す図である。
【図９】培養細胞上におけるリンパ管マーカーでの染色を示す図である。
【図１０】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、接着分子の発現におけるケモカイン類の影響を示す図である。
【図１１】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、ＣＣＬ２介在による接着分子の発現における刺激時間が与える影響を示す図である。
【図１２】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、接着分子の発現におけるＣＣＬ２の濃度が与える影響を示す図である。
【図１３】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、ＣＣＬ２介在による接着分子の発現において、ＣＣＬ２の中和が与える影響を示す図である。
【図１４】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、ＣＣＬ２介在によるヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞付着促進に対するＩＣＡＭ−１抗血清の影響を示す図である。
【図１５】本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、癌細胞に対するＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂの発現を検討した図である。
【図１６】センチネルリンパ節組織の癌細胞転移の有無によるＥ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１の発現を検討した図である。
【発明を実施するための好ましい形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の好ましい形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施の形態に限定されるものではない。
【００２７】
本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、リンパ管、とりわけ摘出ヒトリンパ管の内腔に、トリプシン液やコラゲナーゼ液のようなプロテアーゼ液を灌流することにより、剥離させて採取したヒトリンパ管由来内皮細胞株が、播種等により基材に付されたものである。
【００２８】
ヒトリンパ管は、ヒト集合リンパ管、中でもヒト腋窩リンパ節輸入リンパ管であることが好ましい。ヒトリンパ管由来内皮細胞株は、内皮細胞採取後、低酸素環境下で培養したものであることが好ましい。この低酸素環境下は、酸素濃度が１〜１０％であることが好ましく、３〜７％であることが一層好ましく、５％であることが特に好ましい。ヒト生体内のリンパ液中の酸素濃度が血液中の酸素濃度に比べ格段に低いことから、このような低酸素環境下での培養条件は、ヒトリンパ管由来内皮細胞株の培養に最適なものであると考えられる。
【００２９】
ヒト集合リンパ管由来内皮細胞株を分離する際に用いるコラゲナーゼ液は、コラゲナーゼII液（米国Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製；品番Ｓ２Ｂ５４５６）が挙げられる。それの濃度は０．０１〜０．１％が好ましく、０．０５％が特に好ましい。ヒト集合リンパ管内腔を灌流する速度は、コラゲナーゼII液の場合、少なくともコラゲナーゼIIの酵素作用が発現できさえすれば如何なる速度でもよく、灌流を一旦停止させて内皮細胞を剥離させることも可能であるし、灌流をしたまま内皮細胞を剥離させていくことも可能である。コラゲナーゼII液の組成はコラゲナーゼIIが前述の濃度で含有されていれば特に限定されるものではない。
【００３０】
ヒトリンパ管由来内皮細胞株は、現在市販されているＨＵＶＥＣ(human umbilical vein endothelial cells:タカラバイオ株式会社製；製品番号＃ＣＣ−２５１７)やヒト皮下組織から採取したＨＭＶＥＣ（human microvascular endothelial cells：タカラバイオ株式会社製；製品番号＃ＣＣ−２５０５）と同様に、単一細胞由来ではなく、可能継代数も１０継代程度という性質を有する。
【００３１】
ヒトリンパ管由来内皮細胞株はマイコプラズマ除去されていることが好ましい。この内皮細胞に、マイコプラズマ除去剤を添加して、マイコプラズマ陰転化した後、精製したものであることが好ましい。マイコプラズマ除去剤は、特に限定されるものではなく、少なくともマイコプラズマの除去が可能であれば如何なる方法や物質を用いてもよく、マイコプラズマ除去剤の濃度も特に限定されるものではない。マイコプラズマ除去は、如何なる継代目に行なわれてもよいが、２〜５継代目、好ましくは２継代目に行われることが好ましい。マイコプラズマ除去は、例えば市販のＭｙｎｏｘ（Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｌａｂｓ社製；商品名）１５倍希釈液やＭＣ−２１０（大日本製薬株式会社製；商品名）のような適当な濃度の培養細胞用マイコプラズマ除去剤を用いたり、別な除去手法を併用したりして行われる。
【００３２】
マイコプラズマ除去の前に、マイコプラズマ感染の有無を計測してもよく、マイコプラズマ除去の前であればいかなる継代目に計測してもよいが、好ましくは２〜５継代目、特に好ましいのは２継代目である。マイコプラズマ感染の有無の計測は、マイコプラズマ感染測定キットＭｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製；商品名)を使用してもよいが、少なくともマイコプラズマ感染の有無が計測出来さえすれば如何なる方法や物質を用いても良く、複数の手法を併用してもよい。
【００３３】
このヒトリンパ管由来内皮細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に平成１８年１月１８日に受領され国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７６８が付されたものであり、同センターに平成２１年１月１６日に国際寄託へ移管申請され受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０８９が付されたものである。
【００３４】
例えばこのキットは、ヒトリンパ管由来細胞株である内皮細胞株が生育できる基材上に、播種されたものである。基材は、如何なる培養用プレート、培養用スライドガラス、半透膜を用いてもよく、その形状や、培養表面の修飾状態などは、如何なるものであってもかまわない。このキットの基材に用いる培養液は少なくとも細胞株が増殖できる培養液であれば如何なる成分組成であってもよいが、例えば血管内皮細胞用培地であるＥＧＭ−２（三光純薬株式会社製）が挙げられる。培地には、ｈＦＧＦやＶＥＧＦやＲ３−ＩＧＦ−１やｈＥＧＦやＶＦＧＦ−ＣやＶＥＧＦ−ＤやＰＤＧＦ−ＢＢといったサイトカイン、アスコルビン酸などの各種ビタミン、ヒドロコルチゾンといったステロイド、血清など適切な添加物が適宜添加されていてもよい。基材上のヒトリンパ管由来内皮細胞数は、播種基材の面積によるが、１×１０４〜１×１０５個／ｃｍ２であることが好ましい。
【００３５】
センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、このヒトリンパ管由来内皮細胞株が付された基材とそのヒトリンパ管由来内皮細胞へ転移癌細胞とが接着するのを介在する接着性の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）やＥ−セレクチンのような接着分子が活性化されて発現されていることが好ましい。特に、接着分子が、ＩＣＡＭ−１であると、一層好ましい。
【００３６】
センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、ヒトリンパ管由来内皮細胞へ転移癌細胞と接着するのを介在する接着分子が、そのリガンドを介して結合していてもよい。そのようなリガンドとして、例えばＩＣＡＭ−１のリガンドであるＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃが挙げられる。
【００３７】
センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、接着分子を免疫染色するイムノアッセイ検出剤を、有していると、なお好ましい。
【００３８】
このようなイムノアッセイ検出剤は、抗原抗体反応を利用する間接免疫組織化学的観察に用いられるもので、その沈降や凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法、ラジオイムノアッセイ・エンザイムイムノアッセイ・蛍光イムノアッセイのように標識抗体を用いる標識化免疫測定法に用いられるものであれば、特に限定されない。
【００３９】
センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、以下のようにして使用される。キットの基材に、リンパ液例えば乳癌患者から採取したセンチネルリンパ節内リンパ液を、添加する。そのリンパ液中に癌原発巣からの転移癌細胞例えば微小転移細胞があると、その転移癌細胞がヒトリンパ管由来内皮細胞上の接着分子を介してヒトリンパ管由来内皮細胞に付着する。その接着分子がその抗体でイムノアッセイにより検出されると、リンパ液に微小転移細胞があるから、センチネルリンパ節にも転移癌細胞があると確認することができる。
【００４０】
本発明のセンチネルリンパ節内への薬物輸送剤は、センチネルリンパ節で癌原発巣からの転移癌細胞がリンパ管内皮細胞へ付着するのを介在する接着分子に対する抗体、例えば抗ＩＣＡＭ−１抗体や抗Ｅ−セレクチン抗体が、コロイド粒子の表面から露出されているというものである。薬物輸送剤は、接着分子に対するリガンド例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃが、コロイド粒子の表面から露出されていてもよい。
【００４１】
このような抗ＩＣＡＭ−１抗体や抗Ｅ−セレクチン抗体、ＣＤ１１ａやＣＤ１１ｂやＣＤ１１ｃのようなＩＣＡＭ−１リガンドは、市販されているものを用いてもよい。
【００４２】
このようなＩＣＡＭ−１アゴニストは、癌細胞表面に多数発現しており、リンパ節内皮細胞に発現した接着分子に結合されることが見出されたので、この薬物輸送剤は、そのメカニズムを用いて、部位特異的に薬物輸送を行うことができるというものである。ＩＣＡＭ−１は、癌細胞が転移しているリンパ節内の内皮細胞に発現しているので、それに結合するのに、介在している。
【００４３】
コロイド粒子は、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、リポソーム粒子が挙げられ、その平均粒径が５〜５００ｎｍのいわゆるナノ粒子であることが好ましい。粒径が５ｎｍ未満であると、生体中で速やかに排泄されてしまい、一方５００ｎｍを超えると生体中の異物として排除されてしまう。約２００ｎｍであると、特に血管傷害部位の細胞間に生じた間隙や血管内で露出した平滑筋細胞に取り込まれ易い。薬物輸送剤は、このコロイド粒子を０．５〜２．０％含有していることが好ましい。生体分解性樹脂粒子は、例えば懸濁させたポリ乳酸粒子が挙げられる。合成樹脂粒子は、平均粒径約２００ｎｍのポリスチレンビーズが挙げられる。リポソームは、例えば脂肪やリン脂質でできた直径５０〜８００ｎｍ、好ましくは２００〜４００ｎｍのものが挙げられる。
【００４４】
薬物輸送剤は、蛍光剤、造影剤、治療剤、及び／又は転移癌細胞接着増強剤のような薬効物質が、このコロイド粒子に、含有されたり、又は含有乃至は結合されて露出されたりしていることが好ましい。
【００４５】
薬物輸送剤は、これら薬効物質と前記の抗体やリガンドとが結合したり相互作用したりしつつ、懸濁されていてもよい。薬物輸送剤は、例えば、ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｂ又はＣＤ１１ｃのようなＩＣＡＭ−１のリガンド類に蛍光剤である薬効物質を結合させたものを含むコロイド粒子を含有するものが挙げられ、インビトロで細胞に接着し蛍光顕微鏡で観察するのに用いられ、又はインビボで所望の生体部位へ輸送させるのに用いられる。蛍光剤は、例えばフロオロセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、生細胞染色用色素Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（株式会社同人化学研究所製；商品名）が挙げられる。また、薬物輸送剤は、例えば、ケモカイン類にインドシアニングリーンのような近赤外発色性色素を結合させたものを含むコロイド粒子を含有するものであってもよい。
【００４６】
造影剤は、例えば核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物、Ｘ線断層撮影用ヨード化合物が挙げられる。治療剤は、例えば血管内皮細胞増殖促進剤、血管平滑筋細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、抗癌剤が挙げられる。転移癌細胞接着増強剤であってもよい。
【００４７】
この薬物輸送剤は、以下のようにして使用される。この薬物輸送剤が、癌原発巣やその近傍のリンパ管に投与されると、リンパ液循環によりセンチネルリンパ節に到達する。もし癌原発巣の下流のリンパ管内皮細胞やセンチネルリンパ節内皮細胞に、癌細胞、例えば微小癌細胞が転移していると、癌細胞との接着を介在する接着分子例えばＩＣＡＭ−１等がその内皮細胞に発現している。薬物輸送剤の接着分子抗体が、抗原抗体反応を引き起して、この接着分子に結合する。又は薬物輸送剤の接着分子リガンドが、あたかも鍵と鍵穴とのように選択的に酵素反応を引き起して、この接着分子に結合する。その後、蛍光剤、造影剤、治療剤、又は転移癌細胞接着増強剤が、薬物輸送剤のコロイド粒子表面から滲出して放出されたり転移癌細胞に吸収されたりして、蛍光させたり造影させたり薬効を発現したりする。
【００４８】
例えば超音波診断や核磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）やＸ線断層撮影法（ＣＴ）により、薬物輸送剤が選択的に集中する癌転移したセンチネルリンパ管の所在を、その画像で確認することができる。センチネルリンパ節に付着する僅か１〜２個の微小転移癌細胞でもそれにより微小癌転移を起こり易くするリンパ節内部の微小環境を構築して接着分子を発現することから、その接着分子を確実に検出でき、郭清すべきリンパ節を正確かつ迅速に特定することができる。より具体的には、ガドリニウムのような金属を含むＭＲＩ用造影剤の表面に、接着分子抗体や接着分子リガンドが露出したものが挙げられる。
【００４９】
またこの薬物輸送剤は、センチネルリンパ節に捕捉された微小転移細胞を、それより下流のリンパ管へ転移させないようにその接着を増強することもできる。さらにこの薬物輸送剤は、徐放性を有するので、薬効を長期間持続させることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット、及び薬物輸送剤を実施した例について、詳細に説明する。【００５１】
用いた試薬及び方法は、以下の通りである。【００５２】
（１．細胞培養）
ヒトリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の単離及び培養は、乳癌患者のセンチネルリンパ節に最も近接している輸入リンパ管を用い、Kawai Yらの手法（非特許文献１、及びLymphatic Research and Biology(リンパティック  リサーチ  アンド  バイオロジー)、２００８年、第６巻、ｐ.１５〜２７）に準じて行った。その実験プロトコルは、信州大学医学部内の医倫理委員会で承認されたものである。その乳癌患者に研究の目的やリスクに関し全て告知したうえで、同意書を提出してもらってある。【００５３】
（1.1  ヒトリンパ管内皮細胞由来内皮細胞株（ヒトＬＥＣ）の調製）
信州大学医学部乳腺外科内での乳癌患者の乳腺内分泌外科手術によるセンチネルリンパ節生検症例のうち、その手術前に同意が得られた患者から摘出したセンチネルリンパ節輸入リンパ管の内腔に、無菌ポリエチレン管を挿入し、予め３７℃に温めたトリプシン・エチレンジアミン四酢酸溶液５００Ｕ／ｍｌで１０分間灌流した。その内腔を酵素分解した後、その内腔に存在している内皮細胞を含んだ液を得た。それに１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する内皮増殖培地（ＥＧＭ）−２（米国Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）入りの遠心分離管に、静かに流し込んだ。それを、４℃で５分間、２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で遠心分離した。上澄みを取り除き、得られた沈殿している細胞成分をＥＧＭ−２培地に再懸濁させ、それを、Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製）でコーティングした直径３５ｍｍの培養皿（米国Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に付した。このようにして得られたヒト乳癌センチネルリンパ節輸入リンパ管由来リンパ管内皮細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２に保存し、第５〜７継代培養して使用した。リンパ管内皮細胞を、酸素５％、二酸化炭素５％及び窒素ガス９０％の大気条件下、３７℃で培養した。【００５４】
別な方法として、以下のようにしてヒト集合リンパ管由来内皮細胞株を分離し培養した。同じく同意が得られた乳癌患者から、手術時に摘出された周囲組織が付着したままヒト腋窩リンパ節輸入リンパ管であるヒト集合リンパ管の提供を受けた。ヒト集合リンパ管由来の細胞以外の混入を避けるため、実体顕微鏡下で、このリンパ管外周の脂肪、毛細血管などの組織を剥離した。灌流、洗浄、細胞採取を行うために細いポリエチレンチューブを、ヒト集合リンパ管内腔に挿入して留置した。この内腔を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で灌流して洗浄した。この内腔に、０．０５％のコラゲナーゼII液（米国Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製；品番Ｓ２Ｂ５４５６）を充填した。それを３７℃の培養器内で内皮細胞の剥離が認められる時間、主に１０分間静置した。培地および培地添加物として、血管内皮細胞用増殖培地ブレットキットＥＧＭ−２（三光純薬株式会社；品番ＣＣ−３１６２）５００ｍｌ、および牛胎児血清（Fetal Bovine Serum：ＦＢＳ）（Ｊａｐａｎ Ｂｉｏｓｅｒｕｍ社製；品番Ｓ１５６０）４０ｍｌを用いた。ヒト集合リンパ管内腔を１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２の１ｍｌで灌流し、この内腔に剥離した内皮細胞を回収した。この内皮細胞の回収液をチューブに入れ、２０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心し、内皮細胞成分を採取した。これによりヒト集合リンパ管由来内皮細胞株が分離できた。細胞の接着を向上させるためＩ型コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製；品番Ｉ−Ｐ）を塗布した３５ｍｍ細胞培養用プレートに、採取したうちの１×１０５個の内皮細胞を播種し、培地として１．５ｍｌの１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２を入れて、３７℃で、５％酸素、５％二酸化炭素および９０％窒素の低酸素環境下で培養した。ダブリングタイムは、約４８時間であった。コンフルエントになったらそれを、ＰＢＳ溶液で洗浄し、０．２５％トリプシン液により３７℃で３分間処理した後、細胞を回収して２０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心し、Ｉ型コラーゲンを塗布した３〜４枚の新しい３５ｍｍ細胞培養用プレートに播種した。またコンフルエントになったら適宜継代培養を施行した。これらの細胞は、患者由来の細胞のためか初代継続代時すでにマイコプラズマ感染を認める症例もあるため、２継代目にまずマイコプラズマ感染測定キットＭｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製；商品名）を用いて感染の有無を計測した。計測の結果、マイコプラズマ陽性である場合には、培養細胞用マイコプラズマ除去剤であるＭｙｎｏｘ （独国Ｍｉｎｅｒｖａ ｂｉｏｌａｂｓ社製；商品名）１５倍希釈液およびＭＣ−２１０（大日本製薬株式会社製；商品名）０．５μｇ／ｍｌの単独もしくは併用方法にてマイコプラズマ除去を行った。マイコプラズマが陰転した後も、適時（２継代毎程度）マイコプラズマ感染状況を上記感染測定キットにて確認し、マイコプラズマ陰性の細胞株を樹立した。【００５５】
（1.2  ヒトリンパ管由来内皮細胞株の増殖能評価）
酸素５％という低酸素環境下と酸素２０％という通常の酸素環境下とでそれぞれ９６時間かけてこのヒトリンパ管由来内皮細胞株を培養した場合に、顕微鏡でそれぞれの１視野の細胞数を数えることにより、酸素濃度毎の内皮細胞株の増殖能の相違を検討した。その結果、通常の酸素環境下での内皮細胞株の培養よりも低酸素環境下での内皮細胞株の培養の方が、一層優れた増殖能を示していた。【００５６】
（1.3  ヒトリンパ管由来内皮細胞株の保存）
ヒトリンパ管由来内皮細胞株の保存条件は、０．２５％トリプシン液で内皮細胞株を回収し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および９０％ＦＢＳからなる凍結保存液を用いて細胞懸濁液を調製した後、凍結チューブに入れ、バイセルを用いて段階的に冷却し、最終的に液体窒素内で保存するというものである。その融解条件および融解時培養条件は、凍結チューブを３７℃の恒温槽で融解させ、２０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心して内皮細胞株を回収し、細胞培養液として１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２を用いて細胞懸濁液を調製し、前記の内皮細胞株の培養の条件と同様にして培養するというものである。【００５７】
（1.4  ヒトリンパ管由来内皮細胞株の生物学的特性）
(1.4  Ａ．  ＣＤ３１（platelet endothelial cell adhesion molecule：ＰＥＣＡＭ）による免疫染色観察)
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、これを１０％ホルマリンにて固定した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、一次抗体として内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−８３０６）を１：１００に０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で希釈して加え、４℃で一晩静置した。その一次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後に、この一次抗体に見合う二次抗体として色素で蛍光標識してあるヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−２０１２）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：１００に希釈して加え、室温で１時間静置した。その二次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後、Ｍｏｂｉ ＧＬＯＷ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（独国ＭｏＢｉＴｅｃ社；品番ＭＧＭ０１）に封入して蛍光顕微鏡で観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＣＤ３１に対して陽性であることが確認された。【００５８】
(1.4  Ｂ．  ＶＥＧＦ−Ｒ３（vascular endothelial growth factor receptor 3）による免疫染色観察)
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、これを１０％ホルマリンにて固定した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、一次抗体としてリンパ管内皮細胞の特異的なマーカーであるＶＥＧＦ−Ｒ３（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−６３７）を１：１００に０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で希釈して加え、４℃で一晩静置した。その一次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後に、この一次抗体に見合う二次抗体として蛍光標識してあるヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−２０１２）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：１００に希釈して加え、室温で１時間静置した。その二次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後、Ｍｏｂｉ ＧＬＯＷ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（独国ＭｏＢｉＴｅｃ社；品番ＭＧＭ０１）に封入し、蛍光顕微鏡で観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＶＥＧＦ−Ｒ３に対して陽性であることが確認された。【００５９】
(1.4  Ｃ．  ＬＹＶＥ−１（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1）による免疫染色観察)
一次抗体としてリンパ管内皮細胞の特異的な別のマーカーであるＬＹＶＥ−１（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−１９３１６）を用い、二次抗体として蛍光標識であるロバ抗ヤギ免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−２０２４）を用いたこと以外は、ＶＥＧＦ−Ｒ３による免疫染色と同様に観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＬＹＶＥ−１に対して陽性であることが確認された。これらのＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ３およびＬＹＶＥ−１の免疫染色の観察の結果から明らかなように、リンパ管由来内皮細胞株は培養系に移行させても、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ３およびＬＹＶＥ−１の発現が認められ、内皮細胞の生物学的特性が維持されていた。したがって、リンパ管由来内皮細胞株の分離・培養が樹立できたと確認された。【００６０】
(1.4  Ｄ．  細胞骨格蛋白Ｆ−アクチンによる染色観察)
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、刺激因子として腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（米国ＳＩＧＭＡ社製；品番Ｔ−０１５７）の１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（米国ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製；品番２００−０１Ｂ）の１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのそれぞれを３％ＦＢＳ添加ＥＢＭ−２（三光純薬株式会社；品番ＣＣ−３１５６）にて溶解して細胞上に付加し、２時間３７℃で培養した。これを、３．７％ホルマリンにて固定した。これをＰＢＳ溶液にて洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（米国ＳＩＧＭＡ社製；品番Ｘ−１００）添加ＰＢＳ溶液内で５分間静置した。ＰＢＳ溶液にて洗浄し、ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ抗体（米国ＳＩＧＭＡ社製；品番Ｐ−５２８２）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：５００に希釈して加え、室温で２時間静置した。ＰＢＳ溶液にて洗浄した後、Ｍｏｂｉ ＧＬＯＷ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍに封入した。また、刺激因子を用いないこと以外は同様にしてネガティブコントロールを調製した。これらを蛍光顕微鏡で観察し比較したところ、刺激因子がないネガティブコントロールは不明瞭な緑の蛍光色を示しＦ−アクチンの発現が少なかったのに対し、ＴＮＦ−αやＩＬ−１βで刺激されたものは明瞭な緑の蛍光色を示しＦ−アクチンの発現の増加が確認された。【００６１】
（1.5．  その他のヒトリンパ管由来内皮細胞株の形態的特徴・培養的性質・生理学的性質）
(1.5.1.  形態的性質)
(1)形、大きさ
培養内皮細胞の特徴である多角形を示し、単層で敷石状配列を呈する。大きさは直径50μm前後である。
(2)多形性
内皮細胞はほぼ同様の形態を示しており、多形性は認められない。
（1.5.2.  培養的性質）
(1)培地
血管内皮細胞用増殖培養液であるEGM-2に、最終濃度が10%になるよう牛胎児血清(Fetal Bovine Serum：FBS)を添加したものを用いている。
(2)培養条件
37℃の細胞培養器を用い、5%酸素、5%二酸化炭素、90%窒素環境下で培養を行う。
(3)生理学的性質
(3.1)リンパ管内皮細胞マーカーの発現
本細胞は、内皮細胞マーカーであるCD31、リンパ管内皮細胞マーカーであるProx-1・LYVE-1・podoplaninの発現が確認できた。
(3.2)生物学的特長
細胞の倍加時間は約48時間であり、リンパ管新生因子であるbasic-FGF、VEGF、VEGF-Cで増殖能の亢進が確認できた。【００６２】
（1.6  乳癌細胞株の調製）
ヒトの乳癌細胞株である高転移株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び低転移株のＭＣＦ−７は、米国Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社から購入したものを用いた。この癌細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／養分混合Ｆ１２ハム培地で保存した。リンパ管内皮細胞を、酸素５％、炭酸ガス５％、及び窒素ガス９０％の大気条件下、３７℃で培養した。癌細胞を、酸素２１％、炭酸ガス５％、及び窒素ガス７４％の標準酸素条件下、３７℃で培養した。【００６３】
（２．各種測定及び観察）
（2.1  サイトカイン及び増殖因子の測定）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ−７との夫々の培養上清中の特定のサイトカイン及び増殖因子の濃度を、酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked  Immuno  Sorbent  Assay：ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。先ずそれらの上清を回収し、癌細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に播種した。翌日その培地を、ＦＢＳ未含有のＤＭＥＭ／Ｆ１２に置換し、一晩培養した。その培養液を、４℃で５分間、２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で遠心分離した後、サイトカイン及び増殖因子を測定するために−２０℃で冷凍保存した。ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃの濃度を、民間検査機関（株式会社エスアールエル）に委託して測定した。検出限界は夫々、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が５ｐｇ／ｍＬ、腫瘍成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）が５ｎｇ／ｍＬ、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）が０．１Ｕ／ｍＬ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）が１０ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−６が０．２ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−１２が７．８ｐｇ／ｍＬ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が１０ｐｇ／ｍＬ、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）が３１．２ｐｇ／ｍＬ、血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）が２０ｐｇ／ｍＬ、及びＶＥＧＦ−Ｃが１０９ｐｇ／ｍＬである。【００６４】
（2.2  ＡＴＰの測定）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１培養液と、ＡＴＰ（１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、及び１０−６Ｍ）含有又はＡＴＰ非含有培養液（何れもＤＭＥＭ／Ｆ１２）との夫々の上清中のＡＴＰ濃度について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製；登録商標）による発光細胞生存試験(Luminescent  Cell  Viability  Assay)で、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応測定をした。具体的には、１００μＬのＭＤＡ−ＭＢ−２３１培養上清、又は１００μＬのＡＴＰ含有又は非含有の培養上清を、９６穴培養皿に添加し、１００μＬのルシフェリン・ルシフェラーゼ溶液を加え、その発光を照度計（大日本住友製薬株式会社製）により検出した。【００６５】
（2.3  Ａ  免疫組織化学的観察Ｉ）
間接免疫組織化学的方法を用いて、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１のようなヒトリンパ管内皮細胞の接着分子に対して、癌細胞株である２種類のＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ−７との培養上清の作用について検討した。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に癌細胞を播種した。翌日その培地を、３％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に置換し、一晩培養した後、回収した。回収した溶液を、４℃で５分間、２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で遠心分離した。ヒトリンパ管内皮細胞での接着分子発現に対するこれら上清の作用について解析するために、回収した各溶液１ｍＬを、ヒトリンパ管内皮細胞の３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２飢餓培地に加えた後、４８時間培養した。また、異なる濃度（１／１００に希釈、又は１／１０,０００に希釈）の上清溶液を、３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２の適量に加えたものについても、同様にして培養した。【００６６】
Ｉ型コラーゲンコーティングスライドガラス上に播種した培養リンパ管内皮細胞について、間接免疫組織化学的観察を行い、その細胞を、３．３％ホルマリン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により２０分間、常温で固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、Ｅ−セレクチン／ＣＤ６３Ｅ（希釈１０μｇ／ｍＬ、米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｐ−セレクチン／ＣＤ６３Ｐ（希釈１０μｇ／ｍＬ、米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＶＣＡＭ−１／ＣＤ１０６（希釈１０μｇ／ｍＬ、米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）又はＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４（希釈１０μｇ／ｍＬ、米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の一次ポリクローナルヒト抗血清と共に、４℃で一晩、培養した。【００６７】
一次染色前に、癌細胞を、０．１％のトリトンＸに浸透させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、１：１００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗マウス免疫グロブリンＧ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、常温で１時間培養した。培養細胞の細胞核を対比染色剤で染色し、４',６−ジアミジン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）添加のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ非退色試薬を加え、蛍光顕微鏡（スイス国Ｌｅｉｃａ社製）で観察し、撮影した。【００６８】
非特異的染色については、ネガティブコントロールとして、一次抗血清のかわりにＢｌｏｃｋ−Ａｃｅ（大日本住友製薬株式会社製）を用いた。【００６９】
（2.3  Ｂ  免疫組織化学的観察II）
乳癌患者から摘出された培養ヒトリンパ管内皮細胞や乳癌患者から摘出した直後に凍結しておいたセンチネルリンパ節について、免疫組織化学的観察を行った。具体的には、培養リンパ管内皮細胞を、１０％ホルマリン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により常温で固定した。一次ポリクローナルヒト抗血清血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）−１（１：１００に希釈、米国ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体（ＬＹＶＥ）−１（１：５０に希釈、独国ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ社製）、Ｐｒｏｘ−１（１：５０に希釈、米国ＡｎｇｉｏＢｉｏ社製）、ポドプラニン（１：５０に希釈、米国ＡｎｇｉｏＢｉｏ社製）、内皮増殖因子受容体３（ＶＥＧＦ  Ｒ３）（１：５０に希釈、米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）、Ｅ−セレクチン／ＣＤ６２Ｅ（１：５０に希釈、米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｐ−セレクチン／ＣＤ６２Ｐ（１：５０に希釈、米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１／ＣＤ１０６（１：５０に希釈、米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、又は細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１／ＣＤ５４（１：５０に希釈、米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の存在下、細胞を室温で４時間培養した。染色前に、０．１％トリトン−Ｘで、培養細胞に浸透化処理を施した。次に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ニワトリ抗ウサギ免疫グロブリンＧ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ロバ抗マウス免疫グロブリンＧ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、その細胞を染色した。培養細胞の細胞核を、対比染色し、４',６−ジアミジン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有退色防止薬ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）で標本にした。培養細胞を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社、独国）で観察し、撮影した。【００７０】
一方、新鮮なまま凍結したセンチネルリンパ節組織を、１００％アセトンにより、４℃で固定した。室温下、３０分間、０．３％Ｈ２Ｏ２で、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。その組織を、一次ポリクローナル抗血清Ｅ−セレクチン（米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＩＣＡＭ−１（米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）存在下、室温で１時間培養し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリンＧ及び抗マウス免疫グロブリンＧ（株式会社ニチレイ製）存在下、室温で、３０分間培養した。反応生成物を、ＤＡＢキット（株式会社ニチレイ製）で染色した。センチネルリンパ節組織の細胞核も、ヘマトキシリン染色により、対比染色した。センチネルリンパ節組織を、光学顕微鏡（独国Ｌｅｉｃａ社製）で観察し、撮影した。【００７１】
ヒトリンパ管内皮細胞上の接着分子の免疫組織化学的発現に関するケモカイン類の効果を調べるため、様々な濃度のケモカインを含む３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２の１ｍＬを飢餓培地に加え、次いでヒトリンパ管内皮細胞を４時間、１８時間、４８時間刺激した。各種ケモカイン濃度は、各ケモカインを適量の３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２で希釈して、調製した。【００７２】
また、幾つかの実験では、特異的ＣＣＬ２抗体（１．０μｇ／ｍＬ）含有飢餓培地中で、ＣＣＬ２を終夜、中和した後、前記と同様な方法によって、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的発現における１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２の効果を、評価した。【００７３】
Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１に対する一次抗血清のポジティブコントロールとして、ヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の免疫組織化学的発現について１０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α又は１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖体（ＬＰＳ）の１８時間刺激による効果を、調べた。【００７４】
非特異的染色として、Ｂｌｏｃｋ−ａｃｅ（大日本住友製薬株式会社製）を一次抗血清で置換し、ネガティブコントロールとした。【００７５】
ヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１発現について、高解像度デジタル顕微鏡撮影を行い、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ分析プログラムを用いて、定量的な免疫組織化学データを取得した。各ヒトリンパ管内皮細胞の一定領域を、グレースケール画像にして、濃淡計測を行った。その結果を相対単位（平均密度／ピクセル）で表記した。また、そのデータを平均±平均の標準誤差（ｎ＝５）で示した。【００７６】
（2.4  インビトロでのヒトリンパ管内皮細胞付着性試験）
I型コラーゲンでコーティングした３５ｍｍの培養皿上で、ヒトリンパ管内皮細胞を単層に形成し、３７℃で、酸素５％、二酸化炭素５％及び窒素９０％にて、コンフルエントになるまで培養した。３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２を有する血清飢餓培地で、リンパ管内皮細胞を保存した。所定の培養皿を、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間、処理した。幾つかの実験では、培養皿を、特異的ＣＣＬ２抗体１．０μｇ／ｍＬで１０ｎｇ／ｍのＣＣＬ２を予め中和した血清飢餓培地で刺激した。【００７７】
また幾つかの実験では、培養皿を、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間処理した後、抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体（米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で３０分間処理した。【００７８】
ＰＫＨ２６蛍光染料（米国ＳＩＧＭＡ社製）で染色した２種類の乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ−７とを、各培養皿当り、１×１０５個の細胞を播種し、３７℃で３０分間培養した。接着しなかった細胞を吸引して取り除き、培養皿をＥＢＭ−２で３回洗浄した。癌細胞の接着は、顕微鏡（独国Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、１００倍に拡大して、細胞数を計測することにより、定量した。【００７９】
ＩＣＡＭ−１に対する乳癌細胞上のリガンド／カウンター受容体の免疫組織化学的発現を解析するため、ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＣＦ−７の乳癌細胞株上でのＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）及びＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）の発現を調べた。殆んど免疫組織化学的方法は、リンパ管マーカー（図９）の実験に用いられる方法と同じである。実験では、ＣＤ１１ａ（１：５０に希釈、米国ＡｎａＳｐａｃｅ社製）及びＣＤ１１ｂ（１：５０に希釈、米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）に対するポリクローナル抗血清を用いた。【００８０】
（2.5  逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の定量）
ＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡに対する定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により、０時間、１時間、４時間、１８時間におけるＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの発現を評価した。Ｉｓｏｇｅｎ試薬（株式会社日本ジーン）を用いそのメーカーの使用説明書に従って、培養ヒトリンパ管内皮細胞から全ＲＮＡを抽出した。分光光度計による２６０ｎｍ吸収から、各ＲＮＡの濃度を計算した。抽出したＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（米国Ａｍｂｉｏｎ社製）で逆転写した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を行うｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）には、１．０μｇ／ｍＬの全ＲＮＡを用いた。ＩＣＡＭ−１のフォワードプライマー及びリバースプライマーとサイクロフィリンＡとを夫々特異的プローブとして用いた。夫々、ＩＣＡＭ−１（タカラバイオ株式会社製）、サイクロフィリンＡ；5'-TTCGTGCTCTGAGCACTGGAG-3'（forward：配列表の配列番号１）、5'-GGACCCGTATGCTTTAGGATGAAG-3'（reverse：配列表の配列番号２）である。ｃＤＮＡを５倍に希釈してから、ＰＣＲ増幅を行った。Light Cycler rapid thermal cycler system（英国Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。０．５μＭのプライマー、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、緩衝液が含有された２０μＬ容量を、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製；ＳＹＢＲは登録商標）に添加して、反応させた。ＰＣＲの操作には、１０秒間の変質、次いで９５℃で５秒間の変質と６０℃で２０秒間のアニール化とを４５回繰返す工程とが、含まれているものである。さらに７２℃で放置した後に、蛍光生成物を検出した。ネガティブコントロールは、ｃＤＮＡを用いずにＰＣＲ反応させたものである。増幅特異性を確認するため、各プライマー対から得られるＰＣＲ生成物を、融解温度曲線分析にかけ、Light Cycler分析ソフトウエアを用いて、定量データを解析した。その結果を、サイクロフィリンＡに対するＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの発現の標準化指数として示した。【００８１】
（2.6  ウェスタンブロット分析法）
培養ヒトリンパ管内皮細胞上でＣＣＬ２が介在したＩＣＡＭ−１発現を定量分析するために、ウェスタンブロット法を行った。細胞を、Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（米国Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中に、溶解させ、１４，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離した。全細胞溶解物の内の１５μｇの試料を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ＳＤＳ試料緩衝液で分析し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（アトー株式会社製）に転写して、４５分間インキュベートした。抗ＩＣＡＭ−１抗血清（１：１０００に希釈、米国Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）でその膜に反応させた後、抗ウサギ免疫グロブリンＧ ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗体とインキュベートした。モノクローナル抗アクチン抗体（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）でその膜に再反応させた後、ＥＣＬ−ウェスタンブロッド検出システム（英国Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で、可視化した。【００８２】
（３．センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット及び薬物輸送剤の調製及びその評価方法）
（3.1  調製）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から放出された刺激物質の化学的特性、ヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ-１の免疫組織化学発現のおける化学的処理又は物理的処理が施された上清の作用について評価するために、４８時間刺激した。上清を３０分間８０℃で加熱処理、又はプロテアーゼであるプロナーゼＥ（１μｇ／ｍＬ、米国ＳＩＧＭＡ社製）で、３７℃で一晩、処理した。また、分子量１,０００又は５００の物質透析用の２種類の管状透析膜（米国Ｓｐｅｃｔｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）により、それら上清を透析した。透析は、管状透析膜を緩衝剤（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地）に入れて、４℃で一晩かけて行った。管状透析膜内に得られた上清を、バイオアッセイに用いた。この上清は、分子量１,０００未満、又は５００未満の物質を含まないものである。【００８３】
次いで、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１から放出された刺激物質の薬理学的特性を評価するため、１０−７及び１０−６Ｍのスラミン（Ｐ２Ｘ及びＰ２Ｙ受容体拮抗剤）、１０−７及び１０−６Ｍの８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（ＤＰＣＰＸ；選択的アデノシンＡ１拮抗剤）、及び１０−７及び１０−６Ｍの３，７−ジメチル−１−プロパルグリキサンチン（ＤＭＰＸ；選択的アデノシン拮抗剤）の夫々の存在下、又は非存在下で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清と１０−８及び１０−７ＭのＡＴＰとの４８時間刺激によるヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１発現の作用について、検討した。【００８４】
定量的にヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１発現の免疫組織化学的結果を評価するのに、高解像度デジタル顕微鏡撮影を行い、画像解析ソフトであるＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅで解析した。リンパ管内皮細胞の夫々の一定範囲に、モノクロで線引きし、密度測定を行った。その結果を、平均密度／ピクセルで表わした。【００８５】
（3.2  インビトロでのヒトリンパ管内皮細胞付着性試験）
Ｉ型コラーゲンでコーティングした直径３５ｍｍの培養皿上で、ヒトリンパ管内皮細胞を単層に形成してコンフルエントになるまで、３７℃で、酸素５％、炭酸ガス５％、及び窒素ガス９０％の条件下、培養した。それらリンパ管内皮細胞を、３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２血清飢餓培地で保存した。培養皿を、１０−７ＭのＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４８時間刺激した。さらに、１０−６Ｍのスラミンを、１０−７ＭのＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４８時間刺激する際に、同時に添加した。【００８６】
また、培養皿を、１０−７ＭのＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４８時間刺激した後、抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体(米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製)で３０分間処理した。ＰＫＨ２６蛍光染料（米国ＳＩＧＭＡ社製）で染色した乳癌細胞を、各培養皿毎に５×１０４個の細胞ずつ付加し、３０分間３７℃で培養した。接着しなかった細胞を、吸引して取り除き、培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２で３回洗浄した。細胞付着は、顕微鏡（スイス国Ｌｅｉｃａ社製）を用いて１００倍に拡大して細胞数をカウントすることにより定量した。【００８７】
（4.1  試薬）
なお、用いた塩類は、全て和光純薬工業株式会社製のものである。ＡＴＰ及びスラミンは米国ＳＩＧＭＡ社製、ＤＰＣＰＸ及びＤＭＰＸはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのものである。ＤＰＣＰＸをエタノールで希釈し、ＤＭＰＸをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈して用いた。エタノール及びＤＭＳＯの濃度は、培養細胞の生存に影響を及ぼさない程度にしてある。細胞ケモカインは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国）から入手したものである。試薬濃度は、培養皿での最終濃度で、表記してある。【００８８】
（4.2  統計処理）
全ての結果を、平均±平均の標準誤差で示した。統計学的有意性に関し、不対スチューデントｔ検定により解析し、ｐ＜０．０５のとき有意差ありと、判断した。ｐ＜０．０１のとき極めて有意差がある。【００８９】
（５．センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット及び薬物輸送剤の評価結果）
（5.1  ヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の発現に関するＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清又はＭＣＦ−７上清の影響）
図１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で刺激したときのリンパ管内皮細胞上での接着分子であるＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の発現結果についての代表的な免疫組織化学的顕微鏡写真である。３％ＦＢＳ含有飢餓培地で一晩培養したところ、無刺激、即ち０時間では、図１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに示すように、培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の各接着分子につき、その免疫活性染色が全く又は殆んど観察されなかったことから、ヒトリンパ管内皮細胞上でそれら接着分子の発現は、全く又は殆んど惹起されていなかった。なお３％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で４８時間培養しても、同様に、ヒトリンパ管内皮細胞上で、接着分子は、全く発現していなかった。【００９０】
それとは対照的に、図１のＥ、Ｆに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４時間刺激したところ、殆んど全ての培養リンパ管内皮細胞は、Ｅ−セレクチン抗血清及びＰ−セレクチン抗血清によってはっきりと免疫活性染色が観察されたことから、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＥ−セレクチン及びＰ−セレクチンの発現が、顕著に惹起されていた。図１のＧ、Ｈに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４時間刺激しても、ＶＣＡＭ−１抗血清及びＩＣＡＭ−１抗血清による免疫活性染色は、ヒトリンパ管内皮細胞で微かにしか観察されなかったことから、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の発現は、殆んど惹起されていなかった。【００９１】
ところが、刺激時間をさらに１８時間、４８時間に延ばすと、図１のＩ、Ｊ、Ｍ、Ｎに示すように、抗Ｅ−セレクチン及び抗Ｐ−セレクチンの免疫反応が著しく減少し、一方、図１のＬ、Ｐに示すように、その免疫活性染色で、ＩＣＡＭ−１にのみ全ての培養細胞が濃く染色されており、免疫反応の強度が顕著に増加していたことから、ＩＣＡＭ−１の発現が惹起されていた。【００９２】
図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清又はＭＣＦ−７上清で４８時間刺激したときのヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子であるＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１の発現結果についての代表的な免疫組織化学的顕微鏡写真である。【００９３】
図２のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに示すように、ＭＣＦ−７上清で４８時間刺激した場合、培養ヒトリンパ管内皮細胞上に、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１につき、その免疫活性染色が全く又は殆んど観察されないことから、それらの接着分子の発現は、全く又は殆んど惹起されていなかった。【００９４】
一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で４８時間刺激した場合、図２のＥに示すように、ヒトリンパ管内皮細胞上のＥ−セレクチンにつき、その免疫活性染色が微かに観察されたことから、Ｅ−セレクチンの発現が僅かに惹起されていた。図２のＩ、Ｍに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清を１／１００倍、１／１０,０００倍に希釈すると、免疫活性染色が殆んど観察されなくなった。また、図２のＦ、Ｇに示すように、リンパ管内皮細胞上のＰ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１の発現は、全く又は殆んど認められなかった。【００９５】
ところが、それとは対照的に、図２のＨに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で４８時間刺激した場合、殆んど全ての培養リンパ管内皮細胞がＩＣＡＭ−１抗血清によってはっきりと免疫活性染色されていたことから、ヒトリンパ管内皮細胞上にＩＣＡＭ−１の顕著な発現が惹起されており、さらに図２のＰに示すように、１／１０,０００倍に希釈した上清により免疫反応が幾分減退したがそれでもなお強い免疫活性染色が観察されたことから、その希釈血清によって産生されるＩＣＡＭ−１の過剰発現が惹起されていた。【００９６】
（5.2  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清又はＭＣＦ−７上清中のサイトカイン及び成長因子の測定）
表１に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１培養上清又はＭＣＦ−７培養上清中、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２の各サイトカインの濃度と、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃの各成長因子の濃度との測定データを、纏めて示す。【００９７】
【表１】
2009116322.tif 000002
【００９８】
表１から明らかな通り、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清中のＩＬ−６、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃの濃度は、ＭＣＦ−７上清から得たものよりも著しく高かった。【００９９】
また、ヒトリンパ管内皮細胞の接着分子の発現における１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ａ、５００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｃで４８時間処理したことによる効果を、検討した。代表的な顕微鏡写真のデータを纏めて図３に示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で得られたデータとは対照的に、Ｐ−セレクチン抗血清によってほぼ全ての培養リンパ管内皮細胞がはっきりと染色された（図３  Ｂ、Ｆ、Ｊ）。ヒトリンパ管内皮細胞上のＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１でも微かに染色が認められた（図３  Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ）。しかしヒトリンパ管内皮細胞上のＥ−セレクチンの発現は、全く又は殆ど認められなかった（図３Ａ、Ｅ、Ｉ）。【０１００】
（5.3  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清中のＡＴＰ測定）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清中、又はＡＴＰ（１０−８、１０−７及び１０−６Ｍ）存在下若しくは非存在下での培地中の各ＡＴＰ濃度を、纏めて表２に示す。【０１０１】
【表２】
2009116322.tif 000003
【０１０２】
表２に基づく１０−８、１０−７及び１０−６ＭのＡＴＰを含む培地での一次回帰分析の結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清中のＡＴＰ濃度は約２．１×１０−８Ｍであることが分かった。【０１０３】
（5.4  ヒトリンパ管内皮細胞での接着分子の発現におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清の酵素分解、加熱、又は透析による影響）
図４のＡ−１〜Ａ−４に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清をプロテアーゼによる酵素分解処理や加熱処理を行っても、また分子量５００未満のものを除去する透析膜で前処理をおこなっても、ヒトリンパ管内皮細胞上での上清媒介ＩＣＡＭ−１発現の有意な効果は認められなかった。また、同図のＢ−１〜Ｂ−４に示すように、これらの場合とＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清のみの場合との間に有意差がなかった（何れもｎ＝５）。【０１０４】
それとは対照的に、同図のＡ−５に示すように、分子量１,０００未満のものを除去する透析膜で前処理すると、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１発現の顕著な減退が認められ、同図のＡ−６のネガティブコントロールである３％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地での４８時間処理によって産生されるＩＣＡＭ−１の発現と略同様にまで、減退していた。また、同図のＢ−５に示すように、分子量１,０００未満のものを除去した場合は、同図のＢ−１のＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清のみの場合との間にｐ＜０．０１で有意差があり、同図のＢ−６のネガティブコントロールとの間に有意差がなかった（何れもｎ＝５）。【０１０５】
（5.5  ヒトリンパ管内皮細胞上でのＡＴＰ媒介ＩＣＡＭ−１発現におけるスラミンの影響）
ＡＴＰの分子量が５５１．１であるという事実に基づき、ヒトリンパ管内皮細胞上で付着分子の発現におけるＡＴＰの影響を検討した。その結果を、図５のＡ−１及びＡ−２に示す。１０−８又は１０−７ＭのＡＴＰで４８時間処理したところ、ヒトリンパ管内皮細胞上のＩＣＡＭ−１の顕著な発現が惹き起こされ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で４８時間処理することによって産生されたリンパ管内皮細胞上のＩＣＡＭ−１の発現と極めて似ていた。【０１０６】
それとは対照的に、ＡＴＰ処理と同時に１０−７又は１０−６Ｍのスラミンで処理したところ、図５のＡ−３及びＡ−４に示すように、リンパ管内皮細胞上でのＡＴＰ媒介ＩＣＡＭ−１発現の顕著な減退が認められた。また、同図のＢ−３及びＢ−４に示すようにスラミンで処理した場合には、同図のＢ−２の１０−７ＭのＡＴＰの場合との間に、ｐ＜０．０１で有意差があった（何れもｎ＝５）。【０１０７】
（5.6  ヒトリンパ管内皮細胞上のＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現におけるスラミン、ＤＰＣＰＸ又はＤＭＰＸの影響）
図６のＡ−１〜Ａ−３に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で刺激するのと同時に１０−７又は１０−６Ｍのスラミンで４８時間処理したところ、ヒトリンパ管内皮細胞上でＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現の顕著な減退が惹き起こされた。また、同図Ｂ−１〜Ｂ−３に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清のみの場合と、同時にスラミンで処理した場合との間に、ｐ＜０．０１で有意差があった（何れもｎ＝５）。【０１０８】
それとは対照的に、図６のＡ−４〜Ａ−７に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で刺激するのと同時にＤＰＣＰＸ（１０−７及び１０−６Ｍ）又はＤＭＰＸ（１０−７及び１０−６Ｍ）で４８時間処理したところ、ヒトリンパ管内皮細胞上でＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現の顕著な効果が認められなかった。また、同図Ｂ−４〜Ｂ−７に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清のみの場合と、同時にＤＰＣＰＸ又はＤＭＰＸで処理した場合との間に、有意差がなかった（何れもｎ＝５）。【０１０９】
（5.7  スラミン存在下若しくは非存在下で４８時間刺激したＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清の付着性試験）
図７のＡ−１〜Ａ−３で示すように、インビトロで１０−７ＭのＡＴＰで４８時間刺激した場合、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着が、ネガティブコントロールであるＤＭＥＭ／ハムＦ１２培養液のみの場合に比べ顕著に増大した。一方、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着増加は、１０−６Ｍのスラミンで同時に刺激することによって減退した。同図のＢ−２に示すＡＴＰで刺激した場合には、同図のＢ−１に示すＤＭＥＭ／ハムＦ１２培養液のみの場合及び同図のＢ−３に示すＡＴＰの刺激と同時にスラミンで処理した場合との間に、ｐ＜０．０１で両者に有意差があった（何れもｎ＝５）。【０１１０】
また、ＡＴＰ刺激の場合と同様に、図７のＡ−４〜Ａ−５で示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清による４８時間処理の場合も、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞のインビトロでの付着を顕著に促進した。さらに、同時に１０−６Ｍのスラミンで４８時間刺激した場合、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清によるヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の接着が顕著に減退した。同図７のＢ−４で示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で刺激した場合には、同図Ｂ−１のネガティブコントロールであるＤＭＥＭ／ハムＦ１２培養液のみの場合やＢ−５で示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清の刺激と同時に１０−６Ｍのスラミンで刺激した場合との間に、ｐ＜０．０１で両者に有意差があった（何れもｎ＝５）。【０１１１】
（5.8  抗ＩＣＡＭ-１抗体存在下若しくは非存在下で４８時間刺激したＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清の付着性試験）
次いで、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清又はＡＴＰにより促進されるインビトロでの癌細胞とヒトリンパ管内皮細胞との付着を、ＩＣＡＭ−１抗体処理による抑制の可能性を調べた。図８のＡ−１〜Ａ−３に示すように、１０−７ＭのＡＴＰで４８時間刺激した場合、培養液ＤＭＥＭ／Ｆ１２のみの場合よりも、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着が顕著に増大した。付着性試験での１０−７ＭのＡＴＰによる増加は、抗ＩＣＡＭ−１抗体による処理で顕著に減少した。同図Ｂ−２で示すＡＴＰ刺激の場合には、Ｂ−１の培養液ＤＭＥＭ／Ｆ１２のみの場合やＢ−３の抗ＩＣＡＭ−１抗体処理の場合との間に、ｐ＜０．０１で両者に有意差があった（何れもｎ＝５）。【０１１２】
ＡＴＰ刺激の場合と同様に、図８のＡ−４〜Ａ−５に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で４８時間刺激した場合もまた、培養液ＤＭＥＭ／Ｆ１２のみの場合よりも、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着が顕著に増大した。さらに、抗ＩＣＡＭ−１抗体より処理した場合、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着が顕著に減退した。さらに、同時に１０−６Ｍのスラミンで４８時間刺激した場合、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清によるヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の接着が顕著に減退した。同図８のＢ−４で示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で刺激した場合には、同図Ｂ−１のネガティブコントロールであるＤＭＥＭ／ハムＦ１２培養液のみの場合やＢ−５で示す抗ＩＣＡＭ−１抗体で処理した場合との間に、ｐ＜０．０１で両者に有意差があった（何れもｎ＝５）。【０１１３】
（5.9  培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのリンパ管マーカーの免疫組織化学的発現）
図９は、培養細胞上における、ＶＥＧＦ−Ｒ３（同図Ｃ）、ＬＹＶＥ−１（同図Ｄ）、Ｐｒｏｘ−１（同図Ｅ）、及びポドプラニン（同図Ｆ）のようなリンパ管マーカーの代表的な顕微鏡写真である。ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｐｒｏｘ−１、ポドプラニン、及びＰＥＣＡＭ−１（同図Ｂ）の抗血清により、培養細胞が強く染色されたのに対し、ＬＹＶＥ−１に対する抗体では、極僅かに培養細胞を微かに染色しただけであった（同図Ｄ）。なお、図９Ａは、培養細胞の位相差画像についての代表的な顕微鏡写真である。これらの結果は、培養細胞が、乳癌患者のセンチネルリンパ節に最も近接している輸入リンパ管のヒトリンパ管内皮細胞であることを示している。【０１１４】
（5.10  ヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の発現におけるケモカイン類の影響）
図１０に、ヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の発現におけるケモカイン類の影響を、示す。同図Ａは夫々、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１（同図Ａの１〜４）、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２（同図Ａの５〜８）、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１２（同図Ａの９〜１２）、及び１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２１（同図Ａの１３〜１６）の各ケモカイン類で培養ヒトリンパ管内皮細胞を１８時間刺激した場合、その細胞上での接着分子の免疫組織化学的発現を示す代表的な顕微鏡写真である。同図Ａの８に示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間刺激した場合にのみ、ほぼ全ての培養リンパ管内皮細胞がＩＣＡＭ−１抗血清により、はっきりと染色されており、リンパ管内皮細胞上でＩＣＡＭ−１の顕著な発現が認められた。同図Ａの１、５、９、１３、及び３、７、１１、１５に示すように、培養リンパ管内皮細胞上にＥ−セレクチン又はＶＣＡＭ−１の発現は、全く又は殆ど認められなかった。それとは対照的に、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１２、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２１で夫々刺激したリンパ管内皮細胞上に、同図Ａの４、１２、１６に示すように、ＩＣＡＭ−１抗血清により、僅かに染色されているのが認められた。【０１１５】
一方、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、及びＶＣＡＭ−１に対するポジティブコントロールとして、培養ヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の免疫組織化学的発現におけるＴＮＦ−α又はＬＰＳの影響を、調べた。図１０Ｂに示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで１８時間刺激した場合、リンパ管内皮細胞上で、Ｅ−セレクチン（同図Ｂの１）、Ｐ−セレクチン（同図Ｂの２）、ＶＣＡＭ−１（同図Ｂの３）、及びＩＣＡＭ−１（同図Ｂの４）が、顕著に発現していた。それとは対照的に、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１８時間刺激した場合には、リンパ管内皮細胞上でのＥ−セレクチン（同図Ｂの５）及びＩＣＡＭ−１（同図Ｂの８）の顕著な発現はあったが、Ｐ−セレクチン（同図Ｂの６）及びＶＣＡＭ−１（同図Ｂの７）の発現は全く又は殆どなかった。【０１１６】
なお図１０のＡ，Ｂの全顕微鏡写真は、対応するヒトリンパ管内皮細胞のＤＡＰＩ対比染色画像を重ねて表示している。【０１１７】
（5.12  ヒトリンパ管内皮細胞上でＣＣＬ２が介在した接着分子又はＩＣＡＭ−１
ｍＲＮＡの発現における刺激時間の影響）
図１１Ａは、培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在による接着分子の免疫組織学的発現において、刺激時間が与える影響を示している。同図Ａの１〜１６は、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２を介在させて培養ヒトリンパ管内皮細胞を、０時間、４時間、１８時間、又は４８時間の各時間、刺激した場合、その細胞上でのＥ−セレクチン（同図１、５、９、１３）、Ｐ−セレクチン（同図２、６、１０、１４）、ＶＣＡＭ−１（同図３、７、１１、１５）、及びＩＣＡＭ−１（同図４、８、１２，１６）の各接着因子の免疫組織化学的発現について刺激時間による影響を示す代表的な顕微鏡写真である。【０１１８】
図１１Ａの１、２、３、４の顕微鏡写真が示すように、刺激時間が０時間の場合、培養リンパ管内皮細胞上でのＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の発現は全く又は殆どなかった。また３％ＦＢＳ含有飢餓培地でこれを終夜培養しても、リンパ管内皮細胞上での接着分子の発現は全く又は殆ど認められなかった。同様に３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２で１８時間培養したところ、同様にヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の顕著な発現は、全く認められなかった。【０１１９】
これとは対照的に、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で４時間刺激した場合、図１１Ａの８に示すように、培養リンパ管内皮細胞上でＩＣＡＭ−１の顕著な発現がみられ、ほぼ全ての培養リンパ管内皮細胞がＩＣＡＭ−１抗血清により著しく染色された。また、同図Ａの５に示すように、リンパ管内皮細胞上でＥ−セレクチン抗血清による僅かな染色も観察された。一方、同図Ａの７に示すように、リンパ管内皮細胞上にＶＣＡＭ−１の発現は全く又は殆どみられなかった。同図Ａの９及び１３に示すように、刺激時間を１８時間から４８時間へと増やすにつれ、抗Ｅ−セレクチンの免疫反応は顕著に減退した。しかし、同図Ａの１２に示すように、ＩＣＡＭ−１の免疫反応は、刺激時間が１８時間の場合にのみ顕著に強くなった。よって、全ての培養リンパ管内皮細胞上のＩＣＡＭ−１の免疫反応は、１８時間の刺激後に、最も強く認められることが分かった。【０１２０】
図１１Ｂは、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で刺激した場合の刺激時間が、培養ヒトリンパ管内皮細胞内でのＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡレベルに与える影響を纏めたグラフである。同図Ｂは、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２によりヒトリンパ管内皮細胞を０時間、１時間、４時間、１８時間の各時間、刺激した場合、その細胞のＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡレベルを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により評価することにより、刺激時間が与える影響を示している。＊＊はｐ＜０．０１の有意差あり、＊はｐ＜０．０５の有意差あり、ＮＳは有意差なしであることを示している。ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのＣＣＬ２介在による発現は、刺激してから１時間経過後に顕著に増加していた。そのＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡのＣＣＬ２介在による発現の増加は、刺激してから約４時間経過後にほぼ最大発現レベルに到達し、刺激後１８時間までは、僅かに増加し続けた。【０１２１】
（5.13  ヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的発現におけるＣＣＬ２濃度の影響）
図１２は、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的発現に関して、１０ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２の濃度が与える影響を示すものである。同図Ａは、１０ｐｇ／ｍＬ（同図Ａの１）、１００ｐｇ／ｍＬ（同図Ａの２）、１ｎｇ／ｍＬ（同図Ａの３）、及び１０ｎｇ／ｍＬ（同図Ａの４）の各濃度のＣＣＬ２で夫々ヒトリンパ管内皮細胞を１８時間刺激した場合、その細胞上でのＩＣＡＭ−１の発現について濃度による影響を示す代表的な顕微鏡写真である。同図Ａの１に示すように、１０ｐｇ／ｍＬのＣＣＬ２による刺激では、僅かにではあるが培養ヒトリンパ管内皮細胞上に明らかなＩＣＡＭ−１の発現を、惹き起こしていた。リンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１の発現は、濃度依存的に最大１ｎｇ／ｍＬまで増加し、１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２による刺激は、ほぼ全ての培養リンパ管内皮細胞上にＩＣＡＭ−１の顕著な発現を、惹き起こした。【０１２２】
図１２Ｂは、夫々５検体ずつヒトリンパ管内皮細胞の一定領域を、グレースケール画像にして濃淡計測し、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ分析による各顕微鏡写真の密度測定データを纏め、相対単位（平均密度／ピクセル）で表記してグラフで示したものである。縦軸は、平均密度／ピクセル（ｎ＝５）により示される濃度測定の正規化数を示す。＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり、ＮＳは有意差なしであることを示している。同図Ｂから明らかな通り、その１０ｐｇ／ｍＬ（同図Ｂの１）と１００ｐｇ／ｍＬ（同図Ｂの２）との間は有意差が無かったが、１０ｐｇ／ｍＬ（同図Ｂの１）と１ｎｇ／ｍＬ（同図Ｂの３）や１０ｎｇ／ｍＬ（同図Ｂの４）との間は夫々ｐ＜０．０１で有意差があった。【０１２３】
（5.14  ヒトリンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２が介在したＩＣＡＭ−１の発現におけるＣＣＬ２中和の影響）
図１３は、培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１の発現において、ＣＣＬ２の中和が与える影響を示すものである。同図Ａは、１．０μｇ／ｍＬの特異的なＣＣＬ２抗体が存在する場合（同図Ａの３）と存在しない場合（同図Ａの２）と夫々において、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２が及ぼす影響について示した代表的な顕微鏡写真である。同図Ａの１は、血清飢餓培養培地（３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２）により得られたネガティブコントロールを示す顕微鏡写真である。同図Ａの３に示すように、特異的ＣＣＬ２抗体によりＣＣＬ２を中和すると、培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的発現が、顕著に減退した。【０１２４】
図１３Ｂは、夫々５検体ずつヒトリンパ管内皮細胞の一定領域を、グレースケール画像にして濃淡計測し、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ分析による各顕微鏡写真の密度測定データを纏め、相対単位（平均密度／ピクセル）で表記してグラフで示したものである。縦軸は、図１２Ｂと同様である。＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり、＊はｐ＜０．０５で有意差ありであることを示している。図１３Ｂから明らかな通り、ネガティブコントロール（Ｂ１）よりもＣＣＬ２１０ｎｇ／ｍＬ処理の場合にｐ＜０．０１で有意に増加しており、ＣＣＬ２１０ｎｇ／ｍＬ処理の場合よりもＣＣＬ２１０ｎｇ／ｍＬ処理後に中和した場合にｐ＜０．０５で有意に減少していた。【０１２５】
次に、培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１タンパク質の発現におけるＣＣＬ２中和の影響を定量的に分析するため、ウェスタンブロット法分析を行った。図１３Ｃは、ウェスタンブロット分析した代表的な電気泳動の結果の一部を示す写真である。同図Ｃの２に示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２により１８時間刺激した場合、培養ヒトリンパ管内皮細胞上にＩＣＡＭ−１の顕著な発現が認められたが、同図Ｃの３に示すように、ＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１の発現は、ＣＣＬ２中和処置により、顕著に抑制された。なお、同図Ｃの１に、ネガティブコントロールを示す。【０１２６】
（5.15  １０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２にＣＣＬ２中和剤を加えた培地で１８時間刺激した後の付着性試験）
１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２含有培地をＣＣＬ２で中和するか否かで、夫々癌細胞の付着数を計測した。図１４は、乳癌細胞株であるＭＣＦ−７（Ｉ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（II）を用い、特異的ＣＣＬ２抗体が存在しない場合（Ｉ−２及びII−２）と存在する場合（ＣＣＬ２中和：Ｉ−３及びII−３）、及び抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｉ−４及びII−４）が存在する場合の夫々において、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２が及ぼす影響について付着性試験を行ったデータを纏めたグラフである。同図のＩに癌細胞ＭＣＦ−７について白抜き棒グラフで示し、同図のIIに癌細胞ＭＤＡ−ＭＤ−２３１について斜線付き棒グラフで示す。縦軸は、一視野（倍率は１００倍）の接着癌細胞の正規化数を示す。＊＊はｐ＜０．０１の有意差ありを示している。同図のＩ−２及びII−２に示すように、ヒトリンパ管内皮細胞に対し、インビトロで１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間刺激した場合、ＭＣＦ−７（Ｉ−２）、及びＭＤＡ−ＭＤ−２３１（II−２）の付着が、夫々のＤＭＥＭ／Ｆ１２であるネガティブコントロールに比べ、夫々ｐ＜０．０１で有意に増大した。また、同図のＩ−３及びII−３に示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で刺激後、ＣＣＬ２の中和した場合は、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間刺激した場合よりも、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着の増加が、ｐ＜０．０１で有意に減退した。このように、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２介在反応又は各乳癌細胞の場合と顕著に異なる。【０１２７】
（5.16  １０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２により１８時間刺激した場合の抗ＩＣＡＭ−１抗血清の有無における付着性試験）
次に、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２介在によるヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＤ−２３１の付着の促進を、ＩＣＡＭ−１抗血清で阻害するかについて検討した。その結果を示す図１４のＩ−４及びII−４のように、ヒトリンパ管内皮細胞に対し、インビトロで１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間刺激した後、抗ＩＣＡＭ−１抗体で処理した場合は、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２で１８時間刺激した場合よりも、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の付着の増加が、ｐ＜０．０１で有意に減退した。【０１２８】
（5.17  ヒト乳癌細胞株でのＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂの免疫組織化学的発現）
ＩＣＡＭ−１のカウンター受容体／リガンドを評価するため、ヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対するＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）及びＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）の免疫組織化学的発現について、検討した。図１５は、ヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１上でのＣＤ１１ａ（同図Ａ、Ｂ）及びＭＣＤ１１ｂ（同図Ｄ、Ｅ）の免疫組織化学的発現を示す代表的な顕微鏡写真である。同図Ｃ及びＦは、夫々、ＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂの一次抗体を含まないネガティブコントロールの場合の代表的な顕微鏡写真である。ＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂの両方の顕著な免疫組織化学的発現が、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上に認められた。【０１２９】
（5.18  癌細胞の転移の有無における、センチネルリンパ節組織上でのＥ−セレクチン及びＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的発現）
図１６は、乳癌患者から摘出した直後に凍結した癌細胞転移センチネルリンパ節組織、及び同患者から摘出した直後に凍結した癌細胞未移転センチネルリンパ節組織の夫々におけるＥ−セレクチン（同図Ｃ、Ｄ）及びＩＣＡＭ−１（同図Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の免疫組織化学的発現を示す代表的な顕微鏡写真である。同図Ａは癌細胞転移のあるセンチネルリンパ節組織、同図Ｂは癌細胞未転移のセンチネルリンパ節組織の代表的なヘマトキシリン−エオシン染色を示す顕微鏡写真である。同図Ｆ及びＨに示すように、癌細胞が転移したセンチネルリンパ節組織上では、ＩＣＡＭ−１の顕著な免疫組織化学的発現が、認められた。これとは対照的に、同図Ｅ及びＧに示すように、同じ乳癌患者から摘出した癌細胞未転移のセンチネルリンパ節組織上では、ＩＣＡＭ−１の発現が、殆ど認められなかった。一方、同図Ｃ及びＤに示すように、癌細胞の転移の有無に関わらず、センチネルリンパ節組織上でＥ−セレクチンの発現は、全く又は殆どみられなかった。なお、同図Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ中の「＊」はセンチネルリンパ節での癌細胞転移範囲を示す。【０１３０】
以上のことから、以下に示すように、本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット及び薬物輸送剤が、有用であることが明らかとなった。【０１３１】
（６．センチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット及び薬物輸送剤の有用性）
局所リンパ節は、悪性腫瘍が通常最初に転移する部位である。リンパ節は、そこでの癌細胞の通過を物理的に阻害するバリアとして働き、またそこでの癌の成長を生化学的に阻害するバリアとしても働く。センチネルリンパ節ナビゲーション手術が臨床現場で劇的な成功を収めているということは、移行している癌細胞に対する物理的なバリアとなる有効なフィルター機構を局所リンパ節が有していることを、示唆している。一方、癌原発巣が、転移前に癌組織の微小環境に影響を及ぼしていることが知られている。しかし、転移前の局所リンパ節中の分子がリンパ節への微小転移に適した環境を構築できるか否かについては、今まで明らかにされていなかった。しかし、局所リンパ節へ癌細胞の微小転移に適した前転移の環境を構築するのに重要な化学物質を悪性癌細胞が放出することが分かったので、そのことを利用した本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キット及び薬物輸送剤が、臨床的に有用であることが、明らかとなった。【０１３２】
本発明に関する重要な知見は、以下の通りである。【０１３３】
（6.1  ヒト乳癌細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１からのＡＴＰの放出）
極めて高い転移能を有するヒト悪性乳癌細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の上清をヒトリンパ管内皮細胞上で４８時間処理すると、選択的にＩＣＡＭ−１の発現が、惹き起こされる。上清を１／１０,０００倍に希釈してさえ、ＩＣＡＭ−１の免疫反応の強度は極めて強い。一方、低い転移能を有するヒト乳癌細胞系であるＭＣＦ−７の上清は、ヒトリンパ管内皮細胞上で、全く又は殆んどＩＣＡＭ−１の発現を惹き起こさない。【０１３４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清中のＩＬ−６、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃの濃度は、ＭＣＦ−７の上清から得られるそれらの濃度よりも、遥かに高い。しかし、サイトカインや成長因子は、ヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１の発現を僅かにしか惹き起こさず、リンパ管内皮細胞上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現と異なっている。【０１３５】
分子量１,０００未満の物質を透析する化学的処理を行うと、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現が完全に減退してしまっていた。それとは対照的に、加熱処理、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清のプロテアーゼによる酵素分解、又は分子量５００未満の物質を透析する前処理を行っても、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現には、殆んど影響がなかった。これらの知見は、ヒト乳癌細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、分子量５００以上で分子量１,０００未満の非ペプチド性物質を放出しているようである。【０１３６】
一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清中のＡＴＰ濃度は、培地のみから得られるそれの濃度よりも有意に高かった。ヒトリンパ管内皮細胞での発現分子におけるＡＴＰの影響を調べたところ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清が惹き起こすのと同様に、１０−８及び１０−７ＭのＡＴＰが、ヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１発現を惹き起こした。【０１３７】
１０−７及び１０−６Ｍのスラミン（Ｐ２Ｘ及びＰ２Ｙ受容体拮抗剤）の前処理を行うと、リンパ管内皮細胞でのＡＴＰとＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現とが顕著に減退した。スラミン濃度によっては、Ｐ２Ｘ及びＰ２Ｙ受容体を選択的に遮断することが知られている。【０１３８】
それとは対照的に、１０−７及び１０−６ＭのＤＰＣＰＸ（選択的アデノシンＡ１受容体拮抗剤）や、１０−７及び１０−６ＭのＤＭＰＸ（選択的アデノシンＡ２受容体拮抗剤）では、ヒトリンパ管内皮細胞でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清媒介ＩＣＡＭ−１発現に、全く影響しなかった。【０１３９】
従って、リンパ管内皮細胞上のプリン作動性Ｐ２Ｘ及びＰ２Ｙ受容体の活性化によりヒトリンパ管内皮細胞での選択的ＩＣＡＭ−１発現を誘発するＡＴＰを、悪性ヒト乳癌細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１が放出又は漏出させているようである。【０１４０】
このことは、サイトカインや、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃのような成長因子がヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１発現に全く又は殆んど影響を及ぼさないという知見とも整合している。さらにこのことは、分子量５００〜１,０００の範囲にあるＡＴＰ（分子量５５１．１）であるという事実とも合致している。さらにこのことは、悪性黒色腫細胞系であるＢ１６−ＢＬ６が分子量１,０００未満の非ペプチド性物質を放出させて、それによりリンパ管内皮細胞から内因性の酸化窒素を産生又は放出させたり平滑筋細胞でのミトコンドリアのＡＴＰ選択的Ｋ＋チャンネルを活性化したりしてリンパ管ポンプ活動をかなり停止させているようであるという生理学的知見からも、支持されるものである。【０１４１】
ＡＴＰは、リンパ管ポンプ活動の停止を制御している。単離したラットリンパ管のポンプ活動をＡＴＰで誘発して制御及び阻害するのは、内皮依存性反応、又は内皮非依存性反応である。このように、ＡＴＰ媒介阻害反応は、リンパ管内皮細胞で内因性酸化窒素を幾らか産生させて放出させたり、さらにリンパ平滑筋でのＡＴＰ選択的Ｋ＋チャンネルの活性化を伴ったりしているようである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１やＢ１６−ＢＬ６のような悪性癌細胞から放出されたり漏出されたりした高濃度のＡＴＰが、間質部位に拡散し、リンパ毛細管に侵入し、活性リンパ輸送機構を狂わせ、局所リンパ節への癌細胞の微小転移に適した前転移環境を構築するものと推察される。このようにＡＴＰは、リンパ管の制御とリンパポンプ活性の減退とを惹き起こして、リンパ流を減少させ、癌組織の浮腫を形成させているようである。癌組織での微小環境浮腫は、癌細胞の再拡散に悪影響を及ぼし、センチネルリンパ節での微小転移の発生の一因となっているようである。【０１４２】
（6.2  ＡＴＰにより、ヒトリンパ管内皮細胞へのＩＣＡＭ−１媒介癌細胞付着の促進の惹起）
本発明のもう一つの重要な点は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で４８時間処理すると、インビトロで癌細胞とヒトリンパ管内皮細胞との付着の促進が惹き起こされるということである。１０−７ＭのＡＴＰで刺激しても、リンパ管内皮細胞への癌細胞の付着が顕著に増加し、その反応はＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清で惹き起こされるのと略同様であった。【０１４３】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清の反応もＡＴＰ誘発の反応も、同時に１０−６Ｍのスラミンで処理すると、顕著に減退した。スラミン濃度によっては、プリン作動性Ｐ２Ｘ及びＰ２Ｙ受容体を選択的に遮断することが知られている。このような知見は、ＡＴＰが、リンパ管内皮細胞上のプリン作動性Ｐ２Ｘ及び／又はＰ２Ｙ受容体の活性化によるリンパ管内皮細胞上のＩＣＡＭ−１接着分子の過剰発現によって、センチネルリンパ節の内部乃至近傍のヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の接着を促進していることを、示唆している。【０１４４】
そのことから、ヒト悪性乳癌細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１が、多量のＡＴＰを放出又は漏出させて、局所リンパ節内及び／又は近傍のリンパ管内皮細胞上に選択的にＩＣＡＭ−１接着分子を形成させ、リンパ管内皮細胞への癌細胞の付着を促進させるものと、考えられる。このことは、ＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清を媒介するヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞の接着の促進が、さらに抗ＩＣＡＭ−１抗体で処理することによって顕著に減退するという知見からも、強く示唆されている。【０１４５】
このように、ヒトリンパ管内皮細胞でのＡＴＰ誘発ＩＣＡＭ−１過剰発現は、前転移環境を構築して局所リンパ節内の癌細胞の微小転移を惹き起こす一因となっているようである。【０１４６】
それとは対照的に、低転移能を有するヒト乳癌細胞系であるＭＣＦ−７の上清は、ヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１の発現を全く又は殆んど惹き起こさなかった。このように、局所リンパ節内の癌細胞の微小転移を起こし得るＡＴＰの産生及び放出に関してこれらの癌細胞は、夫々極めて異なる性質を有する。【０１４７】
（6.3  微小転移におけるＩＣＡＭ−１の重要性）
最近、癌細胞によるＩＣＡＭ−１発現は転移進行を促進する主要因子であると報告された。一方、白血球−癌毛細管内皮細胞接着の研究により、一次的サイトカイン刺激条件下、接着の影響が低減することが明らかになっている。癌毛細管内での内皮のＩＣＡＭ−１発現が減退するとされた免疫組織化学的な細胞蛍光の結果とも矛盾がない。【０１４８】
内皮細胞上のＩＣＡＭ−１を抑制すれば、癌の進行を抑制し、癌細胞をリンパ系に流れる所為で免疫学的な監視が必要となるのを忌避することが可能である。癌の脈管構造に関して、内皮のＩＣＡＭ−１発現を促進させたところ非小細胞肺腫瘍及び乳癌での炎症性表現型が似ているという別な幾つかの免疫組織学的研究も、報告されているが、ヒトリンパ管内皮細胞の接着分子の発現については、明らかにされていなかった。【０１４９】
しかし、ヒトリンパ管内皮細胞でのＩＣＡＭ−１の過剰発現を惹き起こすＡＴＰを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１が放出又は遺漏させ、乳癌患者のセンチネルリンパ節に最も近接しているリンパ管内皮細胞へ癌細胞がＩＣＡＭ−１媒介付着するのを促進するようであることが明らかとなった。【０１５０】
炎症反応においては、血管内皮細胞への白血球の接着が、重要な過程であって、組織損傷、感染又は病変形成の部位への白血球の漸増や浸潤を伴っている。【０１５１】
これらの過程には、接着分子の多様性が介在している。内皮細胞で発現したＩＣＡＭ−１は、細胞接着過程の主要な一因である細胞表面の糖タンパクのうちの一つである。ＩＣＡＭ−１は、本質的に内皮細胞で発現するものであるが、腫瘍壊疽死因子（ＴＮＦ）−αやインターロイキン（ＩＬ）−１βのような前炎症性伝達物質に対する反応をかなり誘発し得るものである。【０１５２】
本発明の転移癌細胞検出キットを利用して行った免疫組織化学的研究によれば、ＩＣＡＭ−１は、血管内皮細胞に比べると特徴的なことに、本質的にリンパ内皮細胞で発現しているのではないことが示唆された。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清中のＴＮＦ−αやＩＬ−１βのような前炎症性伝達物質の濃度を測定したところ、ヒトリンパ管内皮細胞でＩＣＡＭ−１が過剰発現することを裏付ける顕著な増加が認められなかった。【０１５３】
（6.4  癌に対するＡＴＰの極めて重要な役割）
アデニンヌクレオチドの抗腫瘍活性は、既に知られている。担腫瘍マウスへの腹腔内ＡＴＰ投与により、様々な急性悪性癌腫に対して顕著な抗腫瘍活性が認められた。ＡＴＰは、マウスでのネズミ結腸腺腫やヒトすい臓癌腫の成長を阻害する。インビトロでの前立腺癌細胞の成長は、Ｐ２受容体を介するＡＴＰにより９０％も阻害されるが、サブタイプがその効果に介在していることやそれが直接的な抗増殖性効果や前アポトーシス効果であることは、未だにはっきりしていない。細胞外のＡＴＰは、アデノシンやＡＴＰが一部介在しているヒトＨＬ−６０白血病細胞の分化の誘発及び増殖を、抑制する。慢性リンパ性白血病評価系でのＰ２Ｘ７受容体発現が、確認されており、ＡＴＰは、この白血病評価系での白血球の増殖を抑制する。Ｐ２Ｘ７受容体ｍＲＮＡの発現は殆んどの種類の白血病において頻発するが、Ｐ２Ｘ７受容体作用の低下が認められる。【０１５４】
最近の研究で、初期扁平上皮癌や前立腺膀胱癌での悪性黒色腫のＡＴＰ抑制の一因であるＰ２Ｘ受容体サブタイプについて、分析が行われている。一般的に、Ｐ２Ｙ１及びＰ２Ｙｚ受容体は増殖又は抗増殖に介在し、Ｐ２Ｘ５受容体は細胞分化に介在し、実際に抗増殖性のＰ２Ｘ７はアポトーシス細胞死に介在している。【０１５５】
それとは対照的に、接着分子の発現や、前転移微小環境又は癌細胞微小転移のような癌細胞との相互作用に関わっているセンチネルリンパ節の近傍又は内部のヒトリンパ管内皮細胞でのＡＴＰの効果に関する報告は、今までなされていなかった。【０１５６】
従って、本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットや薬物輸送剤は、高転移能を有する悪性癌細胞から放出又は漏出されたＡＴＰが、局所リンパ節内での前転移環境の構築と悪性癌細胞の高転移性の微小転移の進展とにおける重要な役割を果たしていることを利用して、臨床的に用いられる最初のものである。【０１５７】
（6.5  ＣＣＬ２によるヒトリンパ管内皮細胞へのＩＣＡＭ−１介在癌細胞付着促進の惹起）
ケモカイン類は、可溶性低分子量タンパク質であり、同族のＧ−タンパク共役受容体と結合して、通常、方向性移動又は走化性のような細胞反応を引き起こす。腫瘍細胞は、ケモカイン類を分泌したり、ケモカイン類に反応したりする。ケモカイン類は、内皮細胞漸増や免疫学的監視機能の破壊や腫瘍性白血球ケモカイン特性に影響によって腫瘍の増殖を促進して、免疫編集を歪めるものであり、遊離されたケモカイン類は、遠隔部位へ腫瘍を転移させたり増殖させたりする。【０１５８】
ＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４軸は、遠隔臓器への転移を促進し、ＣＣＬ２１−ＣＣＲ７対は、むしろリンパ節への転移を促進する。これら２種類のケモカインのリガンド−受容体系は、種々の悪性腫瘍の癌細胞の転移に重要な伝達物質であり、化学療法における重要な指標となるものである。【０１５９】
局所リンパ節は、悪性腫瘍が通常最初に転移する部位である。センチネルリンパ節ナビゲーション手術が、臨床現場で劇的な成功を収めているということは、転移性癌細胞に対する物理的なバリアとなる有効なフィルター機能を局所リンパ節が有していることを、示唆している。また、原発腫瘍が、転移前に腫瘍組織の微小環境に影響を及ぼしていることも知られている。しかし、局所リンパ節中の如何なる分子が、リンパ節への微小転移に適した環境を構築できるかについては、明らかでない。そこで、悪性腫瘍及び／又は転移癌細胞が、局所リンパ節への癌細胞微小転移に適した環境を構築する重要な化学物質を放出するという仮説を、立てた。【０１６０】
ケモカイン類であるＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１２及びＣＣＬ２１の内、ケモカインＣＣＬ２のみが、乳癌患者のセンチネルリンパ節に最も近接している輸入リンパ管から単離したヒトリンパ管内皮細胞の培養細胞上でＩＣＡＭ−１の特異的で顕著な免疫組織化学的発現を引き起こした。ＣＣＬ２による刺激時間を、４時間から１８時間へ、又４８時間に増した場合、刺激時間１８時間までは、ＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的な発現強度が経時的に、顕著に増強した。また、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡレベルも、１８時間までは顕著に増加した。ウェスタンブロット法分析を行ったところ、１８時間刺激した場合に、ＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１タンパクの発現が、認められた。リンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的発現は、濃度依存的に最大１ｎｇ／ｍＬまで増加し、その発現は、特異的ＣＣＬ２抗体によるＣＣＬ２の中和により、著しく減退した。インビトロでＣＣＬ２により１８時間処理したところ、癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７がヒトリンパ管内皮細胞へ付着することが、顕著に促進された。付着性試験でのＣＣＬ２介在による応答は、ＣＣＬ２の中和処理により、又は抗ＩＣＡＭ−１抗体による添加処理により、顕著に減退した。従って、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１２、及びＣＣＬ２１ではなく、ＣＣＬ２のみが、培養ヒトリンパ管内皮細胞のＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡ及びＩＣＡＭ−１タンパク質の選択的発現を誘起し、さらに、インビトロで癌細胞であるＭＤＡ−ＭＤ−２３１及びＭＣＦ−７が培養リンパ管内皮細胞へ付着することが、インビトロ微小転移実験モデルにおけるＩＣＡＭ−１の過剰発現により促進されていると、考えられる。よって、ヒトリンパ管内皮細胞上でのＣＣＬ２介在によるＩＣＡＭ−１の過剰発現は、局所リンパ節への癌細胞微小転移に適した環境を構築し、微小転移を引き起こす一因になっていると考えられる。【０１６１】
このことは、ＣＣＬ２を膵臓癌のマウスに腫瘍内投与したところ、その腫瘍組織にＩＣＡＭ−１の発現が認められ、さらに、その腫瘍周辺部で単球と内皮細胞との間に際立った相互作用が誘起されたという最近の報告と矛盾していない。ＣＣＬ２は、主に単球に認められる特定の受容体に結合し、炎症部位及び癌組織における単球の働きを調節していることが、知られている。しかし、単球／マクロファージ間の浸潤が、腫瘍増殖における宿主反応の主因であるということについては、見解が分かれている。活性マクロファージに関して、癌細胞対し細胞傷害性があることが知られているが、正常な細胞については殆んど無い。一方、腫瘍に結合したマクロファージは、インビトロで腫瘍細胞の増殖を促進させることが分かっており、腫瘍蔓延及び腫瘍進行に関与している。腫瘍細胞における単球／マクロファージの役割の見解が分かれているとしても、少なくとも宿主免疫反応における進行以前の段階で、微小循環及びリンパ循環により腫瘍部位へ単球が移行するはずである。そして、単球を漸増させるために、特定のケモカイン類を投与することは、抗癌宿主反応を誘発する。【０１６２】
ＣＣＬ２が、センチネルリンパ節及び／又は最も近接している輸入リンパ管のヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１の過剰発現を惹き起こし、リンパ管内皮細胞と悪性腫瘍細胞との相互作用を促進するということは、極めて注目すべきことである。【０１６３】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清及びＭＣＦ−７細胞培養上清中のＣＣＬ２濃度を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ分析）により測定したところ、６２．５ｐｇ／ｍＬ未満であった。皮膚の微小リンパ管から分離した培養ヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１及びＣＣＬ２の発現を、リポ多糖体が誘発することも、明らかとなっている。しかし、センチネルリンパ節内でのＩＣＡＭ−１の過剰発現を引き起こすＣＣＬ２の発生源は、必ずしも明らかでない。【０１６４】
（6.6  微小転移におけるＩＣＡＭ−１の重要性）
腫瘍細胞によるＩＣＡＭ−１発現は、転移進行を促進する主要因子である。一方、白血球と内皮細胞とが接着した腫瘍微小血管の研究から、基礎条件及びサイトカイン刺激条件下で接着相互作用が低減することが明らかになっている。このことは、腫瘍微小血管内での内皮のＩＣＡＭ−１発現が減退するという免疫組織化学的な知見や細胞蛍光の知見とも矛盾していない。内皮でのＩＣＡＭ−１を抑制することは、リンパ球の循環による免疫学的監視から腫瘍細胞が免れさせることになり、腫瘍の進行を促進させることになる。乳癌での炎症性所見に似た内皮でのＩＣＡＭ−１発現促進が腫瘍血管系で惹き起こされているという報告があるが、ヒトリンパ管内皮細胞上での接着分子の発現については、明らかではなかった。【０１６５】
本発明者らは、ＣＣＬ２が、乳癌患者のセンチネルリンパ節に最も近接している輸入リンパ管に存するヒトリンパ管内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１の過剰発現を惹き起した後、産生促進されたＩＣＡＭ−１が、ヒトリンパ管内皮細胞への癌細胞接着を介在することを見出し、本発明を完成させた。カウンター受容体と、ＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂのようなＩＣＡＭ−１のリガンドとが、インビトロでの付着性試験において用いた乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７上に、はっきり観察できた。さらに、Ｅ−セレクチンではなくＩＣＡＭ−１のみに顕著な免疫組織化学的発現が、乳癌患者から採取した直後に凍結しておいた悪性腫瘍細胞転移センチネルリンパ節組織上に、認められた。従って、ＣＣＬ２が、癌細胞の微小転移に適した微小環境を局所リンパ節内に構築するのに重要な役割を果たしていることを、最初に示したものである。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、癌原発巣の摘出手術前やその手術途中で、郭清すべきリンパ節を特定するのに有用である。【０１６７】
また、本発明の薬物輸送剤は、癌細胞転移したリンパ節に、選択的に薬物を到達させることができるので、マーカーや定量試薬として、治療や診断に有用である。しかも、微小癌転移細胞が付着したリンパ節にも到達させることができるので、悪性癌の進行や予防に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年7月8日(2009.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌原発巣からセンチネルリンパ節内への最初のリンパ行性癌細胞によりそのセンチネルリンパ節内部で癌細胞の付着し得る環境が構築されることによってそのセンチネルリンパ節内皮細胞に発現した接着分子ＩＣＡＭ−１を、診断マーカーとし、それに抗体及び／又はリガンドが結合することによって検出するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤であって、前記抗体及び／又は前記リガンドが、コロイド粒子の表面から露出し又は懸濁されて含有されており、前記センチネルリンパ節内へ輸送されて到達して前記結合するものであることを特徴とするセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項２】
前記抗体が、抗ＩＣＡＭ−１抗体であり、前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃとするＩＣＡＭ−１リガンドであることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項３】
前記抗体を含んでいる抗ＩＣＡＭ−１抗血清であることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項４】
前記コロイド粒子に、蛍光剤、及び／又は造影剤が、含有され及び／又は露出されていることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項５】
前記蛍光剤が結合している前記リガンド、又は近赤外発色性色素が結合しているケモカイン類を、前記コロイド粒子が含んでいることを特徴とする請求項４に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項６】
前記造影剤が、核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物、又はＸ線断層撮影用ヨード化合物であることを特徴とする請求項４に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項７】
前記コロイド粒子が、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、又はリポソームであることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項８】
１〜２個の前記癌細胞により活性化されて発現した前記接着分子を、前記検出することを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項９】
前記癌細胞が、乳癌細胞であることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
。
課題を解決するための手段
［００１０］
前記の目的を達成するためになされたセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、ヒトリンパ管由来内皮細胞株が基材に付されていることを特徴とする。
［００１１］
そのセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、前記ヒトリンパ管由来内皮細胞株が、摘出されたヒトリンパ管の内腔にプロテアーゼ液を灌流することにより剥離させて採取した内皮細胞であることを特徴とする。
［００１２］
そのセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、前記ヒトリンパ管由来内皮細胞株と癌原発巣から転移した癌細胞との付着を介在する接着分子を、抗原抗体反応により検出するイムノアッセイ検出剤が、添加されることを特徴とする。
［００１３］
そのセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、前記接着分子が、活性化されて発現していることを特徴とする。
［００１４］
そのセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、前記接着分子が、ＩＣＡＭ−１、又はＥ−セレクチンであることを特徴とする。
［００１５］
そのセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、前記接着分子が、それのリガンドを介して結合していることを特徴とする。
［００１６］
そのセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃであることを特徴とする。
［００１７］
請求項１に記載のセンチネルリンパ節内への薬物輸送剤、即ちセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、癌原発巣からセンチネルリンパ節内への最初のリンパ行性癌細胞によりそのセンチネルリンパ節内部で癌細胞の付着し得る環境が構築されることによってそのセンチネルリンパ節内皮細胞に発現した接着分子ＩＣＡＭ−１を、診断マーカーとし、それに抗体及び／又はリガンドが結合することによって検出するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤であって、前記抗体及び／又は前記リガンドが、コロイド粒子の表面から露出し又は懸濁されて含有されており、前記センチネルリンパ節内へ輸送されて到達して前記結合するものであることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
［００１８］
請求項２に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記抗体が、抗ＩＣＡＭ−１抗体であり、前記リガンドが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃとするＩＣＡＭ−１リガンドであることを特徴とする。
［００１９］
請求項３に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記抗体を含んでいる抗ＩＣＡＭ−１抗血清であることを特徴とする。
［００２０］
請求項４に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記コロイド粒子に、蛍光剤、及び／又は造影剤が、含有され及び／又は露出されていることを特徴とする。
［００２１］
請求項５に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項４に記載されたもので、前記蛍光剤が結合している前記リガンド、又は近赤外発色性色素が結合しているケモカイン類を、前記コロイド粒子が含んでいることを特徴とする。
［００２２］
請求項６に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項４に記載されたもので、前記造影剤が、核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物、又はＸ線断層撮影用ヨード化合物であることを特徴とする。
請求項７に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記コロイド粒子が、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、又はリポソームであることを特徴とする。
請求項８に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、１〜２個の前記癌細胞により活性化されて発現した前記接着分子を、前記検出することを特徴とする。
請求項９に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記癌細胞が、乳癌細胞であることを特徴とする。
発明の効果
［００２３］
本発明のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットは、癌原発巣からリンパ節特にセンチネルリンパ節へリンパ行性転移した癌細胞を、簡便かつ正確に検出することができるものである。しかも短時間で検出できるので、癌原発巣の切除手術の際に、既に悪性癌細胞が転移したり微小癌細胞が付着したりしているリンパ節のみを確実に郭清して、癌の再発防止に資することができる。
［００２４］
本発明の薬物輸送剤は、癌細胞が転移したり微小癌細胞が付着したりしているセンチネルリンパ節へ選択的に集まり、その癌細胞に結合し易いので、癌の検査、治療に用いる薬剤をセンチネルリンパ節内の癌細胞へ選択的に到達させることができる。
図面の簡単な説明
［００２５］
［図１］本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、癌培養上清による接着分子発現の変化を示す図である。
［図２］本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、癌細胞上清毎の接着分子発現の変化を示す図である。
［図３］本発明を適用するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出キットを用いて、サイト
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月11日(2011.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センチネルリンパ節内の内皮細胞に発現しておりそのセンチネルリンパ節で癌原発巣からの転移癌細胞が前記内皮細胞へ付着するのを介在する接着分子ＩＣＡＭ−１を、診断マーカーとし、それに抗ＩＣＡＭ−１抗体及び／又はＩＣＡＭ−１リガンドが結合することによって検出するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤であって、
前記抗ＩＣＡＭ−１抗体及び／又は前記ＩＣＡＭ−１リガンドが、コロイド粒子の表面から露出しているコロイドとして含有されて、
または、前記抗ＩＣＡＭ−１抗体及び／又は前記ＩＣＡＭ−１リガンドが、懸濁している懸濁液として含有されてなるものであって、
前記センチネルリンパ節内へ輸送されて到達して前記結合するものであることを特徴とするセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項２】
前記接着分子ＩＣＡＭ−１が、癌原発巣から前記センチネルリンパ節内への最初のリンパ行性癌細胞の転移によりそのセンチネルリンパ節内部で前記癌細胞の付着し得る環境が構築されることによってそのセンチネルリンパ節内の内皮細胞に発現したものであることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項３】
前記ＩＣＡＭ−１リガンドを、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃとすることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項４】
前記抗体を含んでいる抗ＩＣＡＭ−１抗血清であることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項５】
前記コロイド粒子に、蛍光剤、及び／又は造影剤が、含有され及び／又は露出されていることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項６】
前記蛍光剤が結合している前記リガンド、又は近赤外発色性色素が結合しているケモカイン類を、前記コロイド粒子が含んでいることを特徴とする請求項５に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項７】
前記造影剤が、核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物、又はX線断層撮影用ヨード化合物であることを特徴とする請求項５に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項８】
前記コロイド粒子が、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、又はリポソームであることを特徴とする請求項１に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項９】
１〜２個の前記癌細胞により活性化されて発現した前記接着分子ＩＣＡＭ−１を、前記検出することを特徴とする請求項２に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【請求項１０】
前記癌細胞が、乳癌細胞であることを特徴とする請求項２に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
請求項１に記載のセンチネルリンパ節内への薬物輸送剤、即ちセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、センチネルリンパ節内の内皮細胞に発現しておりそのセンチネルリンパ節で癌原発巣からの転移癌細胞が前記内皮細胞へ付着するのを介在する接着分子ＩＣＡＭ−１を、診断マーカーとし、それに抗ＩＣＡＭ−１抗体及び／又はＩＣＡＭ−１リガンドが結合することによって検出するセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤であって、
前記抗ＩＣＡＭ−１抗体及び／又は前記ＩＣＡＭ−１リガンドが、コロイド粒子の表面から露出しているコロイドとして含有されて、
または、前記抗ＩＣＡＭ−１抗体及び／又は前記ＩＣＡＭ−１リガンドが、懸濁している懸濁液として含有されてなるものであって、
前記センチネルリンパ節内へ輸送されて到達して前記結合するものであることを特徴とする。
請求項２に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記接着分子ＩＣＡＭ−１が、癌原発巣から前記センチネルリンパ節内への最初のリンパ行性癌細胞の転移によりそのセンチネルリンパ節内部で前記癌細胞の付着し得る環境が構築されることによってそのセンチネルリンパ節内の内皮細胞に発現したものであることを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
請求項３に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記ＩＣＡＭ−１リガンドを、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１１ｃとすることを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
請求項４に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記抗体を含んでいる抗ＩＣＡＭ−１抗血清であることを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
請求項５に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記コロイド粒子に、蛍光剤、及び／又は造影剤が、含有され及び／又は露出されていることを特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
請求項６に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項５に記載されたもので、前記蛍光剤が結合している前記リガンド、又は近赤外発色性色素が結合しているケモカイン類を、前記コロイド粒子が含んでいることを特徴とする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
請求項７に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項５に記載されたもので、前記造影剤が、核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物、又はX線断層撮影用ヨード化合物であることを特徴とする。
請求項８に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記コロイド粒子が、生体分解性樹脂ミセル粒子、合成樹脂ミセル粒子、又はリポソームであることを特徴とする。
請求項９に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項２に記載されたもので、１〜２個の前記癌細胞により活性化されて発現した前記接着分子ＩＣＡＭ−１を、前記検出することを特徴とする。
請求項１０に記載のセンチネルリンパ節内転移癌細胞検出用薬物輸送剤は、請求項２に記載されたもので、前記癌細胞が、乳癌細胞であることを特徴とする。
【国際調査報告】
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2009116322.tif 000024
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