(57)【要約】  本発明は、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である光学活性トロパ酸を製造するための手段を提供することを課題とする。  本発明は、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有する新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、ならびにそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（ａ）配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするDNA。
【請求項３】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのDNA。
（ｄ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列からなるDNA
（ｅ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
（ｆ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
（ｇ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項４】
請求項２又は３に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項６】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から発現させたポリペプチドを採取することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチド、または、請求項５若しくは６に記載の形質転換体を下記式（I）:
【化１】
2013047767.tif 000009
（式中、Ｘは水酸基またはアミド基を示し、Ｒは置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよいアラルキル基を示す。）で表されるカルボン酸アミドのエナンチオマー混合物に作用させ、下記式（II）：
【化２】
2013047767.tif 000010
（式中、Ｘ、Ｒは前記と同義である。）で表される（Ｒ）体または（Ｓ）体のカルボン酸及び／又は下記式（III）：
【化３】
2013047767.tif 000011
（式中、Ｘ、Ｒは前記と同義である。）で表される（Ｓ）体または（Ｒ）体のカルボン酸アミドを生成することを含む、光学活性カルボン酸及び／又は光学活性カルボン酸アミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有する新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、ならびにそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性トロパ酸は、生理活性のあるアルカロイドや医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。従来、光学活性トロパ酸を取得する方法については、ラセミ体トロパ酸にルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡを反応させて光学分割する方法（特許文献１）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ｌｉｐａｓｅ  Ｂ（ＣＡＬ−Ｂ）を用いてラセミ体トロパ酸ブチルエステルを光学分割する方法（非特許文献１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ由来エステラーゼを用いてラセミ体トロパ酸エステルを光学分割する方法（非特許文献２）が知られているが、ラセミ体トロパ酸アミドを不斉加水分解することよって光学活性トロパ酸を取得する方法については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開第２００７−２９０１７
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １６：２００５，３８９２−３８９６
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ５７，１５８−１６３（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である光学活性トロパ酸を製造するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らによって土壌から分離されたＫＮＫ ＡＭ ３８株からラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解できるアミダーゼ酵素を単離精製し、それをコードするDNAを取得した。また、取得したDNAを用いて製造されるアミダーゼに富んだ形質転換体により、高い立体選択的なトロパ酸アミドの加水分解反応が進行することを確認した。さらに、上記のＫＮＫ ＡＭ ３８株由来のDNAの塩基配列および当該塩基配列と相同性の高い既知の塩基配列を基に設計したプライマーを用いて別の土壌分離菌３株（ＫＮＫ ＡＭ ４０株、ＫＮＫ ＡＭ １０１１株、ＫＮＫ ＡＭ ２５０株）の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行ったところ、ＫＮＫ ＡＭ ３８株の有する加水分解活性と同等の活性を有するアミダーゼ酵素をコードするDNAを取得できた。取得した４つのDNAの塩基配列は、DDBJをはじめとするDNAデータベースには登録されておらず、新規配列であることが確認された。本発明はかかる知見により完成されたものである。【０００７】
本発明は以下の発明を包含する。
[１]  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（ａ）配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
[２]  [１]に記載のポリペプチドをコードするDNA。【０００８】
[３]  以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのDNA。
（ｄ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列からなるDNA
（ｅ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
（ｆ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
（ｇ）配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
[４]  [２]又は[３]に記載のDNAを含むベクター。
[５]  [４]に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
[６]  前記宿主細胞が大腸菌である[５]に記載の形質転換体。
[７]  [５]又は[６]に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から発現させたポリペプチドを採取することを特徴とする、[１]に記載のポリペプチドの製造方法。【０００９】
[８]  [１]に記載のポリペプチド、又は、[５]若しくは[６]に記載の形質転換体を下記式（I）:
【化１】
2013047767.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｘは水酸基またはアミド基を示し、Ｒは置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよいアラルキル基を示す。）で表されるカルボン酸アミドのエナンチオマー混合物に作用させ、下記式（II）：【００１１】
【化２】
2013047767.tif 000003
（式中、Ｘ、Ｒは前記と同義である。）で表される（Ｒ）体または（Ｓ）体のカルボン酸及び／又は下記式（III）：【００１２】
【化３】
2013047767.tif 000004
（式中、Ｘ、Ｒは前記と同義である。）で表される（Ｓ）体または（Ｒ）体のカルボン酸アミドを生成することを含む、光学活性カルボン酸及び／又は光学活性カルボン酸アミドの製造方法。
本願は、２０１１年９月２９日に出願された日本国特許出願２０１１−２１４３８１号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有する新規なポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドを利用すれば、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な光学活性トロパ酸などの光学活性カルボン酸や光学活性カルボン酸アミドを高光学純度でかつ高収率で製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．新規アミダーゼ及びポリペプチド
本発明のアミダーゼは、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列からなる。配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＫＮＫ ＡＭ ３８株より単離されたポリペプチドであり、配列番号３、５、７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれＫＮＫ ＡＭ ４０株、ＫＮＫ ＡＭ １０１１株、ＫＮＫ ＡＭ ２５０株より単離された上記活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチドである。「実質的に同等」とは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドの上記活性に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の活性をいう。
【００１５】
また、本発明のアミダーゼには、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有する限り、配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの相同ポリペプチドも含まれる。相同ポリペプチドとしては、例えば、配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、「複数個のアミノ酸」の数としては、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により欠失、挿入、置換及び／又は付加できる程度の数をいい、前記した活性を保持する限り、その数は制限されないが、例えば、３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは７個以下、特に好ましくは５個以下をいう。
【００１６】
上記のアミノ酸の欠失、挿入、置換及び／又は付加は、配列番号１、３、５、７に示すアミノ酸配列に対して、部位特異的変異導入法（Nucleic Acids Res (1982) 10: 6487； Methods in Enzymol (1983) 100:448; Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); PCR A Practical Approach, IRLP ress (1991) pp.200）等の公知手法またはこれに準ずる方法により導入することができる。
【００１７】
また、相同ポリペプチドとしては、配列番号１、３、５、又は７に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドもまた挙げられる。ここで、「８０％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性をいう。配列同一性は、例えば、相同性検索プログラムBLAST(W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するIdentityの値で表される。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列に基づいて化学合成する方法や、発現ベクターからのインビトロ転写や、発現ベクターによる形質転換細胞の発現産物として単離精製する方法等によって取得することができる。
【００１９】
ポリペプチドを化学合成する場合は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の公知の化学合成法により行うことができる。
【００２０】
ポリペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、ポリペプチドをインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが挙げられる。また、これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが挙げられる。
【００２１】
また、発現ベクターによる形質転換細胞の発現産物として単離精製する場合は、後述の形質転換体の項でも述べるが、概要は以下のとおりである。まず、上記各アミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードする塩基配列を決定し、該塩基配列からなるDNA断片を得る。次に、ポリペプチドを例えば、大腸菌で発現させる場合には、大腸菌中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに上記DNA断片を組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ポリペプチドを発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養することにより、その培養物中に生産された目的のポリペプチドを得ることができる。
【００２２】
２．DNA
本発明のDNAは、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で１．のポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。具体的には、本発明のDNAとして、配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００２３】
本発明のラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNAは、例えば、以下のような方法によって取得することができる。まず、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有する微生物、例えば前記ＫＮＫ ＡＭ３８株より精製されたポリペプチドのＮ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーなどで決定する。また、精製されたポリペプチドにリジルエンドペプチダーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、HPLC等を用いて得られたポリペプチドを精製し、上記と同様の方法に従って内部アミノ酸配列を決定する。このようにして得られたＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列に基づいて設計したDNAプライマーを合成する。次に、ポリペプチドの起源となる微生物より染色体DNAを単離する。染色体DNAは、培養された細胞を界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、クロロホルム、フェノール等で溶解、処理後、抽出されたDNAをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿をエタノールで洗浄することで得られる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)を参照）。この染色体DNAを鋳型に、上記のDNAプライマーを用いてPCRを行うことで、目的のDNAの一部を取得できる。次に、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするDNA断片をインバースPCR法により取得することができる（例えば、Nucleic Acids Res.16,8186(1988)を参照）。このDNA断片の塩基配列を決定後、ポリペプチドのＮ末端よりも上流と推定される部分、及び、Ｃ末端より下流と推定される部分のそれぞれの塩基配列にもとづきDNAプライマーを作成する。このDNAプライマーを用いて、先に得た染色体DNAを鋳型としたPCRをさらに行うことで目的のポリペプチドをコードするDNAを取得できる。
【００２４】
本発明のDNAには、ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有する限り、配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列からなるDNAの相同DNAも含まれる。
【００２５】
例えば、相同DNAとしては、配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA；配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA；配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。
【００２６】
上記の「８０％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性をいう。
【００２７】
また、配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとは、配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味する。
【００２８】
上記の「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号２、４、６、又は８に示す塩基配列に対して、上記のような高い配列同一性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。上記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed,, Cold Spring Harbor Laboratory(2001)を参照し、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、よりストリンジェントな条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度であり、よりストリンジェントな条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度であり、さらにストリンジェントな条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度である。ここで、１倍濃度のSSC溶液(1xSSC)の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる。温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より同一性の高い遺伝子を単離できる。
【００２９】
但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３０】
また、上記の「１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／又は付加された塩基配列」について、欠失、挿入、置換及び／又は付加されてもよい塩基の数としては、当該DNAによってコードされるポリペプチドが上記活性を失わない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２００塩基以下であり、より好ましくは１５０塩基以下、さらに好ましくは１００塩基以下、最も好ましくは、５０塩基以下である。
【００３１】
上記の相同DNAは、配列番号２、４、６、８に示す塩基配列に対して、部位特異的変異導入法（Nucleic Acids Res (1982) 10: 6487； Methods in Enzymol (1983) 100:448; Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); PCR A Practical Approach, IRLP ress (1991) pp.200）等の公知手法またはこれに準ずる方法により変異を導入することによって得ることができ、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを利用することができる。
【００３２】
本明細書において記述されている、上記DNAの単離、および後述するベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Grene Publishing Asscociates and Wiley-Interscience)等の成書に記載されている方法により実施できる。
【００３３】
３．ベクター
本発明のベクターは、適当な宿主細胞内で前記DNAによりコードされるポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００３４】
このようなベクターは、通常、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、lppプロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、pLプロモーター等の制御因子を含み、本発明のDNAと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、pUCN18が好適に使用できる。プラスミドpUCN18は、PCR法によりpUC18（タカラバイオ社製、GenBank Accession No. L09136）の185番目のTをAに改変してNdeIサイトを破壊し、更に471-472番目のGCをTGに改変することにより新たにNdeIサイトを導入したプラスミドである。
【００３５】
前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位など）を有する塩基配列をいう。上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００３６】
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
DNAを含むベクターは、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のEscherichia coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００３７】
４．形質転換体
本発明の「形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードするDNAを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形質転換体」には、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここでいう処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。ラセミ体トロパ酸アミドを（Ｒ）体選択的に加水分解する活性が残存する限りにおいては、これら処理物を本発明の反応に使用できる。
【００３８】
本発明の形質転換体の培養は、形質転換に用いた宿主細胞が増殖し、かつ本発明のポリペプチドが生産される限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
【００３９】
形質転換体で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００４０】
５．光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法
本発明によれば、上記ポリペプチドまたは形質転換体を下記式（I）:
【化４】
2013047767.tif 000005
（式中、Ｘは水酸基またはアミド基を示し、Ｒは置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよいアラルキル基を示す。）で表されるカルボン酸アミドのエナンチオマー混合物に作用させ、下記式（II）：
【００４１】
【化５】
2013047767.tif 000006
（式中、Ｘ、Ｒは前記と同義である。）で表される（Ｒ）体または（Ｓ）体のカルボン酸及び／又は下記式（III）：
【００４２】
【化６】
2013047767.tif 000007
（式中、Ｘ、Ｒは前記と同義である。）で表される（Ｓ）体または（Ｒ）体のカルボン酸アミドを生成することを含む、光学活性カルボン酸及び／又は光学活性カルボン酸アミドの製造方法が提供される。
【００４３】
前記式(I)のＲで表されるアルキル基とは、通常炭素数１〜８のアルキル基をいい、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基等が挙げられる。
【００４４】
前記式(I)のＲで表されるアルケニル基とは、通常炭素数２〜８のアルケニル基をいい、例えば、エテニル基、プロペニル基、ｎ−ブテニル基、ｉ−ブテニル基、ｓｅｃ-ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
【００４５】
前記式(I)のＲで表されるアルキニル基とは、通常炭素数２〜８のアルキニル基をいい、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基等が挙げられる。
【００４６】
前記式(I)のＲで表されるアリール基とは、通常炭素数６〜１４のアリール基をいい、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基等が挙げられる。
【００４７】
前記Ｒ基のアラルキル基としては、通常炭素数６〜８のアラルキル基をいい、具体的には、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。
【００４８】
上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びアラルキル基は置換基を有していてもよく、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
【００４９】
前記式(I)で表される基質となるカルボン酸アミドとしては、具体的には、トロパ酸アミド、３−ヒドロキシイソ酪酸アミド、２−ヒドロキシメチル吉草酸アミド、２−ヒドロキシメチルヘキサン酸アミド、２−ベンジル−３−ヒドロキシプロピオン酸アミド、２−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸アミド、３−ベンジル−２−ヒドロキシプロピオン酸アミド等が挙げられ、ラセミ体に限らずエナンチオマー混合物を用いることができる。
【００５０】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は例えば１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは例えば４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は例えば０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
【００５１】
上述の反応条件において、ラセミ体トロパ酸アミドを基質とした場合、（Ｒ）−トロパ酸と（Ｓ）−トロパ酸アミドが得られる。
【００５２】
反応で生じた光学活性カルボン酸及び／又は光学活性カルボン酸アミド、例えば、光学活性トロパ酸と光学活性トロパ酸アミドは、常法により、それぞれを単離、精製できる。例えば、加水分解反応で生じた光学活性トロパ酸を含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、又は、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、単離、精製できる。また、反応液から微生物菌体を除去したろ液を、硫酸等を用いて中和晶析し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。【００５４】
（参考例１）ラセミ体トロパ酸アミドの合成
ラセミ体トロパ酸（４９．８５ｇ、３００ｍｍｏｌ）をメタノール（２５０ｍｌ）と濃硫酸（０．５ｇ）中で８０℃、２０時間攪拌した後、減圧下にて溶媒を留去することにより、トロパ酸メチルの油状物（９．３ｇ、４５．９ｍｍｏｌ）を得た。【００５５】
上記のトロパ酸ジメチルの油状物（９．０ｇ、４４．５ｍｍｏｌ）を耐圧容器に入れ、アンモニア水溶液（２００ｍｌ、９００ｍｍｏｌ）を加えた後、密閉系にて室温下、２０時間攪拌した後、析出した固体を濾別した。濾別した固体を減圧下にて乾燥することにより、トロパ酸アミドの固体（２９ｇ、１７６ｍｍｏｌ）を得た。【００５６】
（実施例１）
（1）ＫＮＫ ＡＭ３８株由来のアミダーゼの単離・精製
土壌分離菌ＫＮＫ ＡＭ３８株を、試験管内で滅菌した６０ｍｌの培地Ａ（グリセロール２０ｇ、肉エキス１０ｇ、イーストエキス５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、脱イオン水にて１Ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して３０℃で１２時間、好気的に振とう培養した。この培養液１５ｍｌをフラスコ内で滅菌した３Ｌの培地Ａに植菌して３０℃で２４時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に０．５％終濃度となるよう硫酸プロタミンを添加し、生じた沈殿を遠心分離で除去した。この上清液に１０％終濃度となるようグリセリンを添加し、これをＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１０％濃度のグリセリンを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．３Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分に終濃度０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１０％濃度のグリセリンを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で０．５Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を、１０％濃度のグリセリンを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ(アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１０％濃度グリセリンを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．３Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライしてゲルろ過を行い、１０％濃度のグリセリン及び０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。得られた活性画分をＢＩＯ−Ｇｅｌ  ＨＴ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（バイオ・ラッドラボラトリー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１０％濃度のグリセリンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０ｍＭから２５ｍＭの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、アミダーゼは単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。【００５７】
（2) アミダーゼ遺伝子のクローニング
まず、(1)と同様の方法でＫＮＫ ３８株を培養して得た菌体を、ＣＴＡＢ、クロロホルム、フェノールを用いて溶解、処理後、抽出されたＤＮＡをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿をエタノールで洗浄することにより染色体ＤＮＡを調製した。次いで、(1)で精製したアミダーゼのアミノ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーを用いて決定した。さらに、(1)で精製したアミダーゼにＶ８プロテアーゼを４Ｍの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を、逆相ＨＰＬＣを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミダーゼの内部アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列番号９と、内部アミノ酸配列に基づいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列番号１０）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。この結果、目的のアミダーゼ遺伝子の一部（部分遺伝子と称す）を取得した。【００５８】
次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、アミダーゼ酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列番号１１、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列番号１２）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉで分解した断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端よりも上流と推定される部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５：配列番号１３）と、Ｃ末端より下流と推定される部分の塩基配列に制限酵素ＳａｃＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−６：配列番号１４）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでアミダーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片の一部の塩基配列を解析し、アミダーゼ遺伝子の全長（配列番号２）が含まれていることを確認した。【００５９】
(3) ＫＮＫ ＡＭ４０株、ＫＮＫ ＡＭ１０１１株、ＫＮＫ ＡＭ２５０株からのアミダーゼ遺伝子クローニング
(1)の配列番号２に示す塩基配列及び配列番号２と相同性の高い既知塩基配列を基に設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−７：配列番号１５、Ｐｒｉｍｅｒ−８：配列番号１６）を用いて、(1)に記載した方法にて得たＫＮＫ ＡＭ４０株、ＫＮＫ ＡＭ１０１１株、ＫＮＫ ＡＭ２５０株それぞれの染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。この結果、目的のアミダーゼ遺伝子の一部を取得した。(2)に記載した方法と同様の目的遺伝子の全長を取得する操作を行うことで、配列番号４、６、８に示す塩基配列からなるＤＮＡを得た。【００６０】
（実施例２）アミダーゼの調製
実施例１で得られたＫＮＫ ＡＭ３８株、ＫＮＫ ＡＭ１０１１株、ＫＮＫ ＡＭ２５０株由来のＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＡＭ３８、ｐＮＡＭ１０１１、ｐＮＡＭ２５０を構築した。また、実施例１で得られたＫＮＫ ＡＭ４０株由来のＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＡＭ４０を構築した。これらの組換えベクターｐＮＡＭ３８、ｐＮＡＭ４０、ｐＮＡＭ１０１１、ｐＮＡＭ２５０を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＡＭ３８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＡＭ４０）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＡＭ１０１１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＡＭ２５０）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。【００６１】
（実施例３）ラセミ体トロパ酸アミドのＲ体選択的加水分解
実施例２で調製した菌体懸濁液１ｍｌと、参考例１に記載した方法で合成した基質トロパ酸アミド２０ｍｇを混合し、３０℃にて２４時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、下記式により変換率（％）を求めた。さらに、反応液を１Ｎ塩酸でｐＨ２に調整し、酢酸エチル抽出で取得したトロパ酸を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、下記式により光学純度（％ｅｅ）を求めた。
・変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００
・光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００ （Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表し、Ａ＞Ｂである）【００６２】
上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
［変換率の分析］
カラム：５Ｃ１８−ＡＲII（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／分、カラム温度：３０℃、測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−Ｈ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ダイセル化学社製）、溶離液：ヘキサン／イソプロピルアルコール／トリフルオロ酢酸＝９５／５／０．１、流速：０．７ｍｌ／分、カラム温度：３５℃、測定波長：２５４ｎｍ
得られた結果を表１に示す。【００６３】
【表１】
2013047767.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、医薬品等の合成原料及び中間体となる光学活性カルボン酸及び／又は光学活性アミドの製造分野に利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【配列表】
2013047767000001.app
【国際調査報告】
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