(57)【要約】  本発明は、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤、またはＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いた、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法などを提供する。
2013162021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤。
【請求項２】
ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤。
【請求項３】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項１または２に記載の予防・治療剤。
【請求項４】
ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項４記載のスクリーニング方法
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応
（３）被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程。
【請求項６】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項４または５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法。
【請求項８】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項７記載の評価方法
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
（２）肝疾患予防・治療剤を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程。
【請求項９】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項７または８に記載の評価方法。
【請求項１０】
以下の工程を含むことを特徴とする、肝疾患の診断方法
（１）被検者の試料中のＡＩＭ濃度を測定する工程、
（２）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度と健常者の試料中のＡＩＭ濃度とを比較する工程、
（３）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度が健常者の試料中のＡＩＭ濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程。
【請求項１１】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法。
【請求項１３】
ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法。
【請求項１４】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、請求項１２または１３に記載の予防・治療方法。
【請求項１５】
肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１６】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、請求項１５に記載のＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１７】
肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤。
【請求項１８】
肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、請求項１７に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患の予防または治療剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームは、近年の生活環境の変化に伴い急速に表面化した現代病であり、２型糖尿病や動脈硬化性疾患など様々な制御困難な疾患群がドミノ倒し的に発症する。一連の疾患の中で、肥満とともに初期から著明になってくるものとして脂肪肝があげられる。最近、脂肪肝を持つ患者の数十％が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）と呼ばれる疾患へと進行することが明らかになった。ＮＡＳＨではアルコール非依存性に肝実質が広範に線維化し、更に肝硬変や肝細胞癌を発症する場合も多い。ＮＡＳＨの治療には、インスリン抵抗性改善薬、抗酸化剤、肝庇護剤、抗高脂血症薬、降圧薬などが使用されているが、確立した治療法はなく、有効な治療薬の開発が望まれている。【０００３】
ＮＡＳＨの正確な発症機序は依然として不明である。脂肪肝の存在下に、炎症とインスリン抵抗性が加わるとＮＡＳＨに進行するという、２ヒット・セオリーが提唱されているが、実験的な確証はない。また、ＮＡＳＨの動物モデルとして、ＭＣＤ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｅｔ）や四塩化炭素を負荷したマウスがあげられるが、いずれも肝不全による肝壊死後の線維化が主体であり、体重は減少しており、ヒトのメタボリックシンドロームの患者に見られる過剰栄養による肥満・脂肪肝から生ずる肝線維化を正確に反映していない。ヒトの病態を再現できるＮＡＳＨの動物モデルを作製できれば、ＮＡＳＨの治療薬のスクリーニングや評価を行うことが可能になる。【０００４】
メタボリックシンドロームは肥満に伴うインスリン抵抗性獲得がその基盤となるが、近年、脂肪組織における慢性炎症が重要であることが明らかとなった。肥満に伴う脂肪組織の持続的な炎症が全身に波及する結果、全身性のインスリン抵抗性が惹起される。【０００５】
本発明者は、この病態の鍵となるのが、ＡＩＭ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であることを、近年、以下に述べるように明らかにした（非特許文献１−４）。ＡＩＭはマクロファージが特異的に産生し血中に存在するが、肥満に伴い血中濃度が上昇し、ＣＤ３６を介したエンドサイトーシスにより脂肪細胞に取り込まれ、蓄積している中性脂肪の分解（ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）を誘導し、脂肪細胞から遊離脂肪酸を放出させる（非特許文献５）。放出された脂肪酸が、ｔｏｌｌ様受容体の刺激を介して脂肪組織に慢性炎症を惹起・維持する（非特許文献６）。実際に、ＡＩＭノックアウト（ＫＯ）マウスでは、肥満しても、脂肪組織や肝臓を含め全身で慢性炎症が生じず、インスリン抵抗性に陥らないため、糖尿病・動脈硬化発症も著しく抑制される（非特許文献４、６）。しかし、ＡＩＭが肝疾患、特にＮＡＳＨの発症、進行に関与することはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：４１３−４２２，１９９９
【非特許文献２】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２２９１０−２２９１４，２００１
【非特許文献３】Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６２：８３７−８４７，２００３
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １：２０１−２１３，２００５
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １１：４７９−４９２，２０１０
【非特許文献６】ＰＮＡＳ  １０８：１２０７２−１２０７７，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、肝疾患の予防又は治療薬を提供することである。また、新たな肝疾患のモデルマウスを用いた肝疾患の予防又は治療薬の評価方法及びスクリーニング方法などを提供することである。さらに本発明の別の目的は、肝疾患の診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、高脂肪食を負荷し、肥満させたＡＩＭノックアウトマウスについて病態の検討を行ったところ、（１）肥満、（２）先行する脂肪肝、（３）肝実質の線維化、及び（４）高頻度の発癌、というヒトＮＡＳＨの病態に近似している病態が、肝臓を含む全身での慢性炎症もインスリン抵抗性も抑制されている状態で生じるという、非常に興味深い知見を得た。このことから、ＡＩＭを補充することは、脂肪肝、ＮＡＳＨ、肝癌といった一連の肝疾患の予防又は治療になると考えられた。
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤；
［２］ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤；
［３］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［１］または［２］に記載の予防・治療剤；
［４］ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［５］以下の工程を含むことを特徴とする、［４］に記載のスクリーニング方法
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程；
［６］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［４］または［５］に記載のスクリーニング方法；
［７］ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法；
［８］以下の工程を含むことを特徴とする、［７］に記載の評価方法
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
（２）肝疾患予防・治療剤を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程；
［９］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［７］または［８］に記載の評価方法；
［１０］以下の工程を含むことを特徴とする、肝疾患の診断方法
（１）被検者の試料中のＡＩＭ濃度を測定する工程、
（２）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度と健常者の試料中のＡＩＭ濃度とを比較する工程、
（３）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度が健常者の試料中のＡＩＭ濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程；
［１１］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［１０］に記載の診断方法；
［１２］ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法；
［１３］ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法；
［１４］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、［１２］または［１３］に記載の予防・治療方法；
［１５］肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸；
［１６］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、［１５］に記載のＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸；
［１７］肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤；
［１８］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、［１７］に記載の薬剤；
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、有効成分としてＡＩＭ等を含む、肝疾患の予防・治療剤を提供することができる。また、本発明の肝疾患モデルマウスを用いたスクリーニング方法によれば、肝疾患に対する予防・治療に有効な物質を探索することができる。また本発明の肝疾患モデルマウスを用いて、肝疾患の公知の予防・治療剤の効果を評価することができる。さらに、本発明は、被験者の試料中のＡＩＭ濃度を測定することで、肝疾患の診断方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ａ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝臓重量、体重に対する肝臓重量の割合、および肝臓中の中性脂肪重量を示すグラフである。ｍｅａｎ±ＳＥＭ，＊＊＊；Ｐ＜０．００１。Ｂ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像である。
【図２】Ａ：高脂肪食を負荷後２０週目におけるＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片のシリウスレッド染色像である。Ｂ：高脂肪食を０、６、１２、２０、４５、５５週間負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片における線維化の割合を示すグラフである。Ｃ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝臓におけるＴＧＦβ１およびαＳＭＡの相対的ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図３】Ａ：高脂肪食を５２週間負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスから摘出した肝臓の写真像である。Ｂ：高脂肪食を５２週間負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスの肝組織片のヘマトキシリン・エオジン染色像である。Ｃ：高脂肪食を０、６、１２、２０、４５、５２週間負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびにＷＴマウスの肝組織片における、高分化型肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症頻度を示すグラフである。
【図４】高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片の抗ＡＦＰ抗体染色像および肝臓におけるＡＦＰの相対的発現量を示すグラフである。
【図５】高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝臓におけるＦ４／８０（マクロファージ）、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの相対的発現量を示すグラフである。ｍｅａｎ±ＳＥＭ，＊；Ｐ＜０．０５，＊＊；Ｐ＜０．０１，＊＊＊；Ｐ＜０．００１。
【図６】Ａ：ＡＩＭ  ＫＯマウス、ＷＴマウスおよびＲＡＧ  ＫＯマウスの血清中に存在するＡＩＭのウエスタンブロット像、およびモノクローナルＩｇＭまたはポリクローナルＩｇＭとｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合させたＡＩＭのウエスタンブロット像である。Ｂ：ＩｇＭを静脈注射されたＲＡＧ  ＫＯマウスの血清中に存在するＡＩＭのウエスタンブロット像である。
【図７】マウスおよびヒト血清中のＡＩＭ濃度とＩｇＭ濃度の相関関係を示すグラフである。
【図８】ＡＩＭ存在下で培養したマウス初代培養肝細胞の抗ＡＩＭ抗体染色像及びウエスタンブロット像である。
【図９】オレイン酸で前培養後、ＡＩＭ存在下またはＡＩＭ非存在下で培養したマウス初代培養肝細胞のオイルレッドＯ染色像及び該細胞におけるＦＳＰ２７の相対的発現量を示すグラフである。
【図１０】３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞に対するＡＩＭまたはＳＲＣＲドメイン蛋白質の脂肪細胞分化抑制効果を示すグラフである。
【図１１】ＮＡＳＨ患者および非ＮＡＳＨ患者における、血清中のＡＩＭ濃度を示すグラフである。
【図１２】Ａ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスのｒＡＩＭ投与群とＰＢＳ投与群の体重変化を示すグラフである。Ｂ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ  ＫＯマウスのｒＡＩＭ投与群とＰＢＳ投与群の肝臓の巨視的像、肝組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像（癌部、非癌部）、癌発症率を示すグラフ、肝内中性脂肪量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明におけるＡＩＭは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
ＡＩＭは、例えば、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）の免疫細胞であるマクロファージから単離・精製される蛋白質であってよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
【００１３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。ここで「活性」とは、例えば、動脈硬化巣マクロファージのアポトーシス抑制活性、動脈硬化の維持・促進活性、脂肪細胞分化抑制活性、脂肪細胞の脂肪滴融解活性、脂肪細胞縮小活性、ＣＤ３６結合活性、脂肪細胞へのエンドサイトーシス活性、ＦＡＳ結合活性、ＦＡＳ機能抑制活性、抗肥満活性などをいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、前記活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例えば、約０．１〜約１０倍、好ましくは約０．５〜約２倍）や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
前記活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
【００１５】
また、本発明のＡＩＭには、例えば、（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１〜５０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
【００１６】
本発明のＡＩＭは、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＡＩＭ蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＤ０１４４６）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれアクセッション番号：ＡＡＤ０１４４５として登録されているマウスホモログ等］である。
【００１７】
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のＡＩＭは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のＡＩＭがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のＡＩＭには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００１８】
ＡＩＭの部分ペプチド（以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称する場合もある）は、上記したＡＩＭの部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つＡＩＭと実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はＡＩＭの場合と同様に行なうことができる。
ＡＩＭは、システインを多く含む３つのＳＲＣＲ（Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ）ドメインを含んでいることから、それぞれのＳＲＣＲドメインを本発明の部分ペプチドとして使用できる。具体的には、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、ＳＲＣＲ１ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４〜１２５）、ＳＲＣＲ２ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３８〜２３９）、ＳＲＣＲ３ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４４〜３４６）をそれぞれ含む部分アミノ酸配列やＳＲＣＲドメインの任意の組合せを含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記の機能ドメインを含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ましくは５０個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは１００個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、さらに好ましくは２００個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。
【００１９】
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、ＡＩＭについて前記したものと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＡＩＭと同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２０】
本発明で用いられるＡＩＭまたはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２１】
ＡＩＭは、前述した哺乳動物のマクロファージから自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物のマクロファージをホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ、該上清を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりＡＩＭまたはその塩を調製することができる。
【００２２】
ＡＩＭまたはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる（以下、これらの化学合成の説明においては、特にことわらない限り、全長ＡＩＭおよびその部分ペプチドを包括して、単にＡＩＭという）。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＡＩＭを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６年）
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
【００２３】
このようにして得られたＡＩＭは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるＡＩＭが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にＡＩＭが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２４】
さらに、ＡＩＭは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＩＭを分離精製することによって製造することもできる。ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、トリなど）のマクロファージ由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡであれば、前記動物のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］より調製したゲノムＤＮＡ画分を鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することができ、ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするｃＤＮＡであれば、マクロファージより調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ＰＣＲ法およびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００２５】
ＡＩＭをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記したＡＩＭと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００２６】
ＡＩＭをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列で示されるヒトＡＩＭ蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１１４２９）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれアクセッション番号：ＡＦ０１１４２８として登録されているマウスホモログ等］である。
【００２７】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列の部分塩基配列を含むＤＮＡ、または（２）配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列の部分塩基配列を含むＤＮＡと約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、前記したＡＩＭと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
【００２８】
ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、ＡＩＭの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２９】
ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、ＡＩＭをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；動物細胞発現プラスミド（例：ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
【００３０】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０  ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
【００３１】
上記したＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、ＡＩＭまたはその部分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，エシェリヒア・コリＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，エシェリヒア・コリＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，エシェリヒア・コリＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，エシェリヒア・コリＣ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
【００３２】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３３】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
【００３４】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜約４３℃で、約３〜約２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８である。培養は、通常約３０℃〜約４０℃で、約１５〜約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にＡＩＭを製造せしめることができる。
【００３５】
前記形質転換体を培養して得られる培養物からＡＩＭまたはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、ＡＩＭまたはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。また、ＡＩＭまたはその部分ペプチドが菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、培養上清中に含まれるＡＩＭまたはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００３６】
かくして得られるＡＩＭまたはその部分ペプチドの存在は、ＡＩＭに対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００３７】
以上の通りにして得られるＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはその塩あるいはＡＩＭもしくはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸（ここでは、ＡＩＭ類と表現することもある）は、肝疾患の発症の予防・治療剤として提供することができる。
【００３８】
本発明はまた、ＡＩＭ類に替えて、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤やＡＩＭを安定化させる薬剤も使用することができる。
【００３９】
ＡＩＭの発現を誘導する薬剤としては、例えば、ＡＩＭ転写活性作用を持つ化合物などが挙げられ、該化合物としては、ＡＩＭ遺伝子のプロモーター領域に結合できる転写因子等が挙げられる。また、本発明者は、ＡＩＭがマクロファージにおいて発現することを見出している。従って、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤として、マクロファージ分化誘導剤が挙げられる。マクロファージ分化誘導剤としては、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）やマクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｍ）などの前駆細胞からマクロファージを分化誘導できるものであれば特に制限されないが、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）などを用いることができる。転写因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦは、前記の公知手段によって、哺乳動物の組織・細胞から単離・精製される蛋白質であってよいし、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよい。あるいは、上記蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
【００４０】
ＡＩＭを安定化させる薬剤としては、ＡＩＭ分解を阻害する化合物、または尿中への排泄を阻害する化合物などが挙げられる。分解を阻害する化合物としては、プロテアーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤（フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＧＦ）、アプロチニン、トリプシンインヒビターなど）、システインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ−６４、ロイペプチンなど）などが挙げられる。プロテアソーム阻害剤としては、ラクタシスチン、ＭＧ−１１５、ＭＧ−１３２、プロテアソームインヒビターＩなどが挙げられる。尿中への排泄を阻害する化合物としては、例えば、糸球体の基底膜を通過できない分子量をＡＩＭに付与する化合物が挙げられる。後述する実施例の通り、ＩｇＭはＡＩＭと結合することが確認できたことから、尿中への排泄を阻害する化合物として、ＩｇＭが挙げられる。しかし、ＩｇＭ自体を投与すると免疫系の副作用が懸念されることから、ＡＩＭとの結合部位であるＩｇＭのＦｃ部分と尿細管でろ過され尿中に排出されない程度の分子量の蛋白質とを融合させた融合蛋白質が好ましく用いられる。融合させる蛋白質は限定されないが、副作用の懸念が少ない蛋白質が好ましく、例えばアルブミンが使用できる。結合は直接つなげても構わないし、ヒンジ部分を用いてつなげても構わない。ヒンジ部分としてはＦＬＡＧ  ｔａｇを並列したものが例示される。このような分子は、それぞれをコードする遺伝子をつなぎ、ひとつの組換えタンパクとして常法により製造することができる。
【００４１】
本発明の後述する実施例においては、ＡＩＭのノックアウトマウスは野生型（ＷＴ）マウスと比較して、高脂肪食負荷条件下、肝疾患の発症が促された。特に該肝疾患は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病態に近似し、該疾患の特徴である肝硬変、肝細胞癌への進行も再現することが確認できた。以上のことから、ＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤、或いは、後述するスクリーニング方法で探索することができるＡＩＭの機能を代替できる化合物は、肝疾患の発症、進行を予防・治療できることが示唆される。
【００４２】
本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する医薬組成物の適用対象となる肝疾患は、例えば、脂肪肝、ＮＡＳＨ、肝硬変、肝臓癌があげられる。また、別の側面では、本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する医薬組成物の適用対象となる肝疾患は、肝星細胞の活性化を伴う肝疾患であってよい。肝星細胞の活性化の指標として、αＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）ｍＲＮＡの発現が挙げられる。従って、該肝疾患としては、正常な肝組織と比較してαＳＭＡｍＲＮＡが有意に高発現する肝疾患であってもよい。さらに、別の側面では、該肝疾患は、正常な肝組織と比較してＴＧＦβ１またはＣｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１が有意に高発現する肝疾患であってもよい。
【００４３】
本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する医薬組成物は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００４４】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００４５】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００４６】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤は、例えば、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。
【００４７】
本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する上記予防・治療剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の肝疾患の治療・予防のために使用する場合には、本発明のＡＩＭ類を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００４８】
なお、前記した各組成物は、本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００４９】
さらに、本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤は、肝疾患の治療に有用な他の薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬（例、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等のチアゾリジン誘導体等、メトホルミン、ブホルミン等のビグアナイド剤）；抗酸化剤（例、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ベタイン、ＥＰＬ（Ｐｏｌｙｅｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等）；肝庇護剤（例、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）等）；抗高脂血症薬（例、フィブラート系薬剤、プロブコール、スタチン系薬剤等）；降圧薬（例、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等）；グリチルリチン製剤；漢方薬（例、小紫胡湯等）；抗がん剤などと併用してもよい。本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤および上記薬剤は、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。
【００５０】
また、前記の通り、ＡＩＭのノックアウトマウスは野生型マウスと比較して、高脂肪食負荷条件下、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病態に近似した肝疾患を高頻度に発症し、更に肝硬変、肝細胞癌へ進行することを確認した。このことは、高脂肪食負荷条件下に置かれたＡＩＭのノックアウトマウスは、肝疾患の新たなモデルマウスとして提供できることを示唆する。従って、本発明は、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いた、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５１】
ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物とは、内在性ＡＩＭの発現が不活性化された非ヒト哺乳動物を意味し、ＡＩＭがノックアウト（ＫＯ）されたＥＳ細胞から、作製されるＡＩＭ  ＫＯ動物の他、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ技術によりＡＩＭの発現が不活性化されたノックダウン（ＫＤ）動物なども含まれる。ここで「ノックアウト（ＫＯ）」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なｍＲＮＡを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン（ＫＤ）」とは、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を阻害することにより、結果的に内在性遺伝子の発現を不活性化することを意味する。以下、本発明のＡＩＭ  ＫＯ／ＫＤ動物を、単に「本発明のＫＯ／ＫＤ動物」という場合がある。本発明のＡＩＭ  ＫＯ動物としては、例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，４１３−４２２，１９９９）に開示されている。
【００５２】
本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてＣ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系としてＢ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＩＣＲ系統など）およびラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）が好ましい。
また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類を本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
【００５３】
ＡＩＭをノックアウトする具体的な手段としては、前記のＭｉｙａｚａｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，４１３−４２２，１９９９）にも開示されているが、その他の公知の一般的な手法としては、対象非ヒト哺乳動物由来のＡＩＭ（ゲノムＤＮＡ）を常法に従って単離し、例えば、（１）そのエキソン部分やプロモーター領域に他のＤＮＡ断片（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンもしくはプロモーターの機能を破壊するか、（２）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いてＡＩＭの全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、（３）蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは（４）転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入して、完全なｍＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のＡＩＭ遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
【００５４】
該相同組換え体は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）への上記ターゲッティングベクターの導入により取得することができる。
ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のターゲッティングベクターを導入されたＥＳ細胞を分化させて得られるＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおけるＡＩＭの細胞生物学的検討において有用である。
【００５５】
例えば、ターゲッティングベクターが、ＡＩＭのエキソン部分やプロモーター領域に他のＤＮＡ断片を挿入することにより、該エキソンもしくはプロモーターの機能を破壊すべく設計されたものである場合、当該ベクターは、例えば、以下のような構成をとることができる。
【００５６】
まず、相同組換えにより、ＡＩＭのエキソンもしくはプロモーター部分に他のＤＮＡ断片が挿入されるために、ターゲッティングベクターは、当該他のＤＮＡ断片の５’上流および３’下流に、それぞれ標的部位と相同な配列（５’アームおよび３’アーム）を含む必要がある。
【００５７】
挿入される他のＤＮＡ断片は特に制限はないが、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を用いると、ターゲッティングベクターが染色体へ組み込まれたＥＳ細胞を、薬剤耐性もしくはレポーター活性を指標として選択することができる。ここで薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子などが、レポーター遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子などがそれぞれ挙げられるが、それらに限定されない。
【００５８】
薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞内で機能し得る任意のプロモーターの制御下にあることが好ましい。例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）ＬＴＲ、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。しかしながら、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子がＡＩＭの内在性プロモーターの制御下におかれるようにＡＩＭ内に挿入される場合は、ターゲッティングベクター中に該遺伝子の転写を制御するプロモーターは必要でない。
【００５９】
また、ターゲッティングベクターは、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子の下流に、該遺伝子からのｍＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いることができる。好ましくは、ＳＶ４０由来のターミネーターなどが用いられる。
【００６０】
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択（ポジティブ選択）によっては相同組換えにより標的となる内在性ＡＩＭにターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内在性ＡＩＭ遺伝子座にターゲッティングされた細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される（ネガティブ選択）。あるいは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００６１】
ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、上述のように、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、相同組換え体が得られる頻度は低いので、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択される。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０６〜１０８細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、ターゲッティングベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
【００６２】
ターゲッティングベクターが組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、他のＤＮＡ断片として薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を使用した場合は、それらの発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択することができる。例えば、ポジティブ選択用マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをトランスフォーマントの候補として選択する。また、ネガティブ選択用マーカー遺伝子として、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むベクターを用いた場合、ガンシクロビルを含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーを相同組換え体の候補として選択する。得られたコロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入ＤＮＡの存在を確認する。
【００６３】
導入ＤＮＡの組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラＫＯ動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することによりＡＩＭ発現不全が遺伝的に固定されたＫＯ動物を作製することができる。
【００６４】
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
【００６５】
いずれの場合も、宿主胚は、後述する受精卵への遺伝子導入において、採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ１マウス（毛色：ブラック）由来やＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡとのＦ１（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
【００６６】
また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
【００６７】
採卵用雌マウスは約４〜約６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００６８】
胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
【００６９】
共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００７０】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
【００７１】
生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ１動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ１の毛色はアグーチとなる。
【００７２】
上記のようにして得られるターゲッティングベクターが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方のＡＩＭのみがＫＯされたヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方のＡＩＭがＫＯされたホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ１動物のうちヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ１動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
【００７３】
ターゲッティングベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が５’および３’アームの間に挿入され、該アームの外側にネガティブ選択用マーカー遺伝子を含むＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９９巻，第４号，第２１４０−２１４５頁，２００２年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞を播き、培養液にウイルスベクターを加えて（所望によりポリブレンを共存させてもよい）、１〜２日間培養後、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００７４】
ＡＩＭをノックダウンする具体的な手段としては、ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）をコードするＤＮＡを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物細胞内で発現させる方法などが挙げられる。
【００７５】
目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるＤＮＡは、該目的のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡとしては、ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
【００７６】
ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ポリヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
特に、ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、（ａ）翻訳阻害を指向したアンチセンスＤＮＡの場合は、ＡＩＭのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが、（ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合は、イントロンを含むＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡがそれぞれ好適である。
【００７７】
具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０１１４２８として登録されている塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡ、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。
【００７８】
ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、「本発明のアンチセンスＤＮＡ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたＡＩＭをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスＤＮＡは、ＡＩＭの複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＡＩＭから転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００７９】
本発明のアンチセンスＤＮＡの標的領域は、アンチセンスＤＮＡがハイブリダイズすることにより、結果としてＡＩＭへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。具体的には、ＡＩＭの５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンスＤＮＡの好ましい標的領域として選択しうるが、ＡＩＭ内の如何なる領域も対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＡＩＭのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＡＩＭと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成してＲＮａｓｅＨによる分解を誘導するものであってもよい。
【００８０】
ＡＩＭをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムをコードするＤＮＡもまた、本発明のアンチセンスＤＮＡに包含され得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。ＡＩＭｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
【００８１】
本明細書においては、ＡＩＭのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆる単鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明のＫＤ動物作製のために用いることができる。ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相同なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
【００８２】
本発明のアンチセンスオリゴＤＮＡ及びリボザイムは、ＡＩＭのｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。合成されたアンチセンスオリゴＤＮＡまたはリボザイムは、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、アンチセンスオリゴＲＮＡまたはリボザイムをコードするＤＮＡ発現ベクターを調製することができる。ここで用いられ得る発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましく例示される。また、プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）ＬＴＲ、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００８３】
より長いアンチセンスＲＮＡ（例えば、ＡＩＭｍＲＮＡの相補鎖全長など）をコードするＤＮＡ発現ベクターは、常法によりクローニングしたＡＩＭｃＤＮＡを、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に挿入することにより調製することができる。
【００８４】
一方、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードするＤＮＡとして別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。ｓｉＲＮＡの発現ベクターとしては、Ｕ６やＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、ｓｉＲＮＡが形成される。ｓｈＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば１５から２５塩基程度）を間に挿入したユニットを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。ｓｈＲＮＡの発現ベクターとしてはＵ６やＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたｓｈＲＮＡは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされることにより成熟ｓｉＲＮＡが形成される。あるいは、Ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターで、ターゲットのｓｉＲＮＡ配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させてＲＮＡｉによりノックダウンを達成することも可能である。この場合には組織特異的発現を示すプロモーターにより、組織特異的ノックダウンも可能となる。
【００８５】
ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入する方法としては、標的細胞に応じて自体公知の方法が適宜用いられる。例えば、受精卵などの初期胚への導入については、マイクロインジェクション法が用いられる。また、ＥＳ細胞への導入については、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが用いられ得る。あるいは、ベクターとしてレトロウイルスやレンチウイルスなどを用いる場合には、初期胚やＥＳ細胞にウイルスを添加して１〜２日培養し、該細胞を該ウイルスに感染させることにより、簡便に遺伝子導入を達成し得る場合がある。ＥＳ細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は、本発明のＫＯ動物において上記したと同様の方法により行うことができる。
【００８６】
好ましい一実施態様においては、ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚（受精卵）に導入される。
【００８７】
受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入ＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配超遠心または陰イオン交換樹脂カラム等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入ＤＮＡは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００８８】
ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２ヶ月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
【００８９】
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、［３，５−ＤｉＩ−Ｔｙｒ５］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨ−ＲＨ、［ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨ−ＲＨおよびそれらのＥｔｈｙｌａｍｉｄｅなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００９０】
通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはＡｖｅｒｔｉｎ、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
【００９１】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００９２】
受精卵細胞段階におけるＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡの導入は、導入ＤＮＡが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入ＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ０）の生殖系列細胞において発現ベクターが存在することは、その後代（Ｆ１）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに発現ベクターが存在することを意味する。
通常、Ｆ０動物は相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ０個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に発現ベクターを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ０動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ１動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
【００９３】
ベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、上記ＫＯ動物の場合と同様に、ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる。細胞として受精卵を用いる場合は、感染に先立って透明帯を除いておくことが好ましい。ウイルスベクターを感染させて１〜２日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ＥＳ細胞であれば、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００９４】
さらに、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９８巻，第１３０９０−１３０９５頁，２００１年に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をＳＴＯフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よくＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡのへテロＴｇ（＋／−）産仔を得ることができる。
【００９５】
Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，４１３−４２２，１９９９）に記載された、あるいは上記の手法によって取得されうる本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物は、高脂肪食負荷条件下において、対応する野生型動物と比較して、以下の特性： 
（１）肝臓重量が増大する、
（２）脂肪肝が亢進する、
（３）肝臓癌を発症する、および／または
（４）肝臓において炎症反応が抑制される、
を有する。また、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物は、野生型動物と同様に、高脂肪食負荷条件下において肝線維化が亢進する特徴を有する。これらの表現型は、従来公知のＡＩＭ  ＫＯマウスにおいては、少なくとも報告されていない。特に、脂肪肝、肝線維化、肝臓癌への変遷が、ＮＡＳＨの病態と近似したものであることは新たな発見である。
【００９６】
（１）肝臓重量が増大するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と比較して、肝臓重量および／または肝臓重量／体重（％）の有意な差が認められることをいう。後述する実施例においては、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷６週目から野生型マウスと比べて有意な差が認められた。
（２）脂肪肝が亢進するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と比較して、早期に肝臓に脂肪の蓄積が認められることをいう。肝臓における脂肪の蓄積は、例えば、肝組織片をオイルレッドＯ染色することによって確認することができる。あるいは、肝臓組織中の中性脂肪量を測定することによっても確認できる。後述する実施例においては、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷６週目から野生型マウスと比べて有意な差が認められた。
（３）肝臓癌を発症するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、肝臓癌の発症が認められることをいう。肝臓癌は、例えば、肝組織片を抗ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）染色すること、肝組織中のＡＦＰ発現量を測定すること、または血中ＡＦＰ濃度を測定することによって確認することができる。後述する実施例においては、野生型マウスでは高脂肪食負荷１年後も肝臓癌はほぼ確認できないが、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷１年後には全てのマウスに肝臓癌が認められた。
（４）肝臓において炎症反応が抑制されるとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷しても、野生型動物と比較して、肝臓において炎症反応が抑制されることをいう。炎症反応は、例えば、Ｆ４／８０（マクロファージのマーカー）、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの発現によって確認することができる。後述する実施例においては、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷１２週目から野生型マウスに比較して肝臓における炎症が有意に抑制されていた。
また、肝線維化が亢進するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と同様に、肝線維化が認められることをいう。肝線維化は、例えば、肝組織片をシリウスレッド染色することによって確認することができる。あるいは、肝線維化には、肝星細胞によるコラーゲン合成が関与していることが知られているが、肝星細胞のマーカーであるαＳＭＡの発現によっても確認することができる。また、肝臓におけるＴＧＦβ１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１の発現によっても確認することができる。後述する実施例においては、野生型マウスおよびＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷２０週目から肝線維化が認められた。また、野生型マウスおよびＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷２０週目からαＳＭＡの高発現が認められた。ＴＧＦβ１は、高脂肪食負荷期間の長さに比例して、発現量が増加する傾向があった。しかしながら、野生型マウスとＡＩＭノックアウトマウスの間に、線維化の程度、αＳＭＡやＴＧＦβ１の発現量について有意な差は認められなかった。
【００９７】
これらの知見は、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物を高脂肪食負荷条件下に置くことで、肝疾患のモデル動物として有用であることを示し、さらに肝疾患の予防・治療薬のスクリーニングに用いることができることを示す。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含む。
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程。
【００９８】
本発明のスクリーニング方法で、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に負荷される高脂肪食としては、脂質含量が高いものであれば特に制限されないが、通常、脂質含量が２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上のものが挙げられる。また、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に対して、高脂肪食を負荷する期間は、少なくとも前記の特性が確認できるまで実施する。負荷期間としては、６週間以上、より好ましくは１２週間以上、より好ましくは２０週間以上である。
【００９９】
ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に投与される被験物質としては、蛋白質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられてよい。被検物質を投与する時期は、高脂肪食負荷の開始前であっても、開始と同時であってもよいし、あるいはＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物が高脂肪食負荷されて、前記した特性が観察されるようになってからでもよい。投与の方法としては、経口的であっても非経口的であってもよい。経口的投与としては飼料や飲料水に混ぜて投与することができる。非経口的投与としては、腹腔内投与、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射、点滴注射等による投与、坐剤による直腸投与などが挙げられる。また、投与は単回投与であっても複数回投与であってもよい。
【０１００】
被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の特性は、被検物質の投与後、通常４週間以降、好ましくは６週間以降に観察する。肝臓重量については、前記哺乳動物から摘出した肝臓重量および／または肝臓重量／体重（％）を計測することで観察することができる。肝脂肪については、前記摘出した肝臓の肝組織片をオイルレッドＯ染色し、その染色程度を数値化すること、あるいは肝組織中の中性脂肪量を測定することで観察することができる。肝線維については、前記摘出した肝臓の肝組織片をシリウスレッド染色し、その染色程度を数値化することで観察することができる。あるいは、肝線維については、前記摘出した肝臓におけるαＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）、ＴＧＦβ１またはＣｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１の発現程度を数値化することによっても確認することができる。肝臓癌については、前記摘出した肝臓の肝組織片を抗ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）染色し、その染色程度を数値化すること、前記摘出した肝臓におけるＡＦＰの発現程度を数値化すること、または血中ＡＦＰ濃度を測定することによって観察することができる。肝臓における炎症反応については、前記摘出した肝臓におけるＦ４／８０、ＴＮＦα、ＩＬ−６またはＩＬ−１βの発現程度を数値化することで確認することができる。
【０１０１】
上記のようにして得られた前記特性の観察結果について、被検物質非投与の場合と比較する。あるいは、前記特性について肝疾患の有無との相関図をあらかじめ作成しておき、得られた前記特性の観察結果をその相関図と比較してもよい。比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【０１０２】
そして、得られた前記特性の観察結果が、被検物質非投与の場合に比べて改善される場合には、該被検物質を肝疾患の予防・治療剤として選択することができる。ここで改善されるとは、（ｉ）肝臓重量が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｉｉ）肝脂肪量（オイルレッドＯ染色の程度、又は中性脂肪量）が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｉｉｉ）肝線維化の程度（シリウスレッド染色の程度、αＳＭＡ、ＴＧＦβ１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１の発現）が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｉｖ）ＡＦＰ発現が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｖ）Ｆ４／８０、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの発現が被検物質非投与の場合に比べて高いことをいう。
【０１０３】
前記選択された被検物質を肝疾患の予防・治療剤として用いる場合、本発明のＡＩＭ類と同様に製剤化され、同様の投与経路・用量で投与することができる。該予防・治療剤の対象となる肝疾患についても、前記と同様でありうる。
【０１０４】
また、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物は高脂肪食負荷条件下、肝疾患のモデル動物として有用であることから、該哺乳動物は、肝疾患の予防・治療薬の評価方法に用いることができる。従って、本発明はまた、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法を提供する。具体的には、本発明の評価方法は、以下の工程を含む。
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
（２）肝疾患予防・治療剤を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程。
【０１０５】
本発明の評価方法で、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に投与される肝疾患予防・治療剤としては、公知の肝疾患予防・治療剤であってよく、たとえば、インスリン抵抗性改善薬（例、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等のチアゾリジン誘導体等、メトホルミン、ブホルミン等のビグアナイド剤）；抗酸化剤（例、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ベタイン、ＥＰＬ（Ｐｏｌｙｅｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等）；肝庇護剤（例、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）等）；抗高脂血症薬（例、フィブラート系薬剤、プロブコール、スタチン系薬剤等）；降圧薬（例、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等）、グリチルリチン製剤、漢方薬（例、小紫胡湯等）、抗がん剤等が挙げられるが、それらに制限されない。肝疾患予防・治療剤の投与時期、投与方法、投与回数などは前記のスクリーニング方法と同様であってよい。
【０１０６】
本発明の評価方法で観察される特性の観察方法は、前記スクリーニング方法の記載に従って実施してよい。また、その評価方法について、得られた前記特性の観察結果が、肝疾患予防・治療剤非投与の場合に比べて改善される程度が大きい程、該被検物質を肝疾患の予防・治療剤として予防・治療効果が高いと評価することができる。ここで改善されるとは前記と同様であってよい。
【０１０７】
また、本発明の後述する実施例において、ＮＡＳＨ患者の血清中ＡＩＭ濃度は非ＮＡＳＨ患者と比較して低いことが確認された。特に、肝臓癌に進行したＮＡＳＨ患者における血清中ＡＩＭ濃度は、肝臓癌まで進行していないＮＡＳＨ患者に比べてもさらに低いことが確認できた。以上のことから、被験者の血中ＡＩＭ濃度を測定することによって、肝疾患を診断できることが示唆される。具体的には、本発明の診断方法は、以下の工程を含む。
（１）被検者の試料中のＡＩＭ濃度を測定する工程、
（２）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度と健常者の試料中のＡＩＭ濃度とを比較する工程、
（３）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度が健常者の試料中のＡＩＭ濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程。
【０１０８】
本発明の診断方法が適用できる被験者は特に制限されないが、例えば、肝疾患を発症するおそれがあるか、もしくは発症していることが疑われる被験者が挙げられる。そのような被験者としては、限定されるものではないが、例えば、肥満、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、高脂血症などの症状を有する被験者が挙げられる。また、健常者とは、臨床的に肝疾患であるとは診断されていない者、例えば、前記の症状を有しない者が挙げられる。
【０１０９】
本発明の診断方法に用いられる試料としては、上記被験者から採取されるものであって、測定対象であるＡＩＭ遺伝子産物（例、ＲＮＡ、蛋白質、その分解産物など）を含有するものであれば特に制限されない。例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、汗、唾液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、あるいはそれらに含まれる細胞、特にマクロファージなどが挙げられる。
【０１１０】
被験者から採取した試料におけるＡＩＭ濃度の測定は、マクロファージからＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれるＡＩＭ遺伝子の転写産物を測定することにより調べることができる。ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン−ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いて、微量のマクロファージから迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中のＡＩＭ遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量のマクロファージから迅速且つ簡便に定量性よくＡＩＭ遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が好ましい。
【０１１１】
ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、ＡＩＭ遺伝子の転写産物の測定は、該遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸（プローブ）を用いて行うことができる。そのような核酸としては、ＡＩＭ遺伝子の転写産物に示される塩基配列（例えば、配列番号：１に示される塩基配列）を含む核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ハイストリンジェントな条件とは、前記した条件などが挙げられる。
【０１１２】
プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約１５塩基以上、好ましくは約３０塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
【０１１３】
ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したＲＮＡ画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、上記ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、ＡＩＭ遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、ＲＮＡ画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し、スポットの標識量を測定することにより、ＡＩＭ遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１１４】
別の好ましい実施態様によれば、ＡＩＭ濃度を測定する方法として定量的ＰＣＲ法が用いられる。定量的ＰＣＲとしては、例えば、競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどがある。
ＰＣＲにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、ＡＩＭ遺伝子転写産物のセンス鎖（コード鎖）およびアンチセンス鎖（非コード鎖）とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるＤＮＡ断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約１５〜約１００塩基、好ましくは各々約１５〜約５０塩基の長さを有し、約１００ｂｐ〜１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅するようにデザインされたオリゴＤＮＡのセットが挙げられる。より具体的には、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、配列番号：１に示される塩基配列を含む核酸（センス鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、及び前記の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸（アンチセンス鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ここでハイストリンジェントな条件とは前記と同義である。
【０１１５】
競合ＲＴ−ＰＣＲとは、目的のＤＮＡを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的ＤＮＡの量を算出する方法をいう。したがって、競合ＲＴ−ＰＣＲによる場合、上記したプライマーセットに加えて、該プライマーセットで増幅でき、増幅後に標的核酸（すなわち、ＡＩＭ遺伝子の転写産物）の増幅産物と区別することができる（例えば、増幅サイズが異なる、制限酵素処理断片の泳動パターンが異なるなど）既知量のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸が用いられる。標的核酸とｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸とはプライマーを奪い合って増幅が競合的に起こるので、増幅産物の量比が元の鋳型の量比を反映することになる。ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡの場合、上記のようにして調製されるＲＮＡ画分から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後に、上記プライマーセットおよびｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの共存下でＰＣＲを行えばよく、ＲＮＡの場合は、ＲＮＡ画分にｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒを添加して逆転写反応を行い、さらに上記プライマーセットを添加してＰＣＲを実施すればよい。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のｍＲＮＡの絶対量を推定することができる。
【０１１６】
一方、リアルタイムＰＣＲは、蛍光試薬を用いて増幅量をリアルタイムでモニタリングする方法であり、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、例えば、インターカレンター法、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法等が挙げられる。いずれも、上記のようにして調製されるＲＮＡ画分から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後に、上記プライマーセットとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、エチジウムブロマイド等の二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣ等）および消光物質（例：ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ等）で修飾したもの（ＴａｑＭａｎＴＭプローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブ）などの蛍光試薬（プローブ）とを、それぞれＰＣＲ反応系に添加するというものである。インターカレーターは合成された二本鎖ＤＮＡに結合して励起光の照射により蛍光を発するので、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るとともにヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドであり、ヘアピン構造をとっている時は消光物質の存在により蛍光を発せず、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズして蛍光物質と消光物質との距離が広がることにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速にＡＩＭ遺伝子の発現を解析可能である。
【０１１７】
別の態様では、被験者から採取した試料におけるＡＩＭ濃度の測定は、該試料から蛋白質画分を調製し、該画分中に含まれるＡＩＭを検出することにより調べることができる。ＡＩＭの検出は、ＡＩＭに対する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット等）によって行うことができる。あるいはまた、ＡＩＭの検出は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ等の質量分析法を用いても行うことができる。
尚、ＡＩＭに対する抗体は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含む蛋白質を感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。
【０１１８】
個々の免疫学的測定法を本発明の診断方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＡＩＭの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【０１１９】
前述のとおり、本発明のＡＩＭは、肝疾患患者において血中濃度が低下する。したがって、上記のようにして、ＡＩＭ濃度を測定した結果、健常者と比べて低下していた場合、被験者は肝疾患を発症しているか、発症する可能性が高いと判定することができる。あるいは、肝疾患の有無とＡＩＭ濃度との相関図をあらかじめ作成しておき、得られた測定結果をその相関図と比較してもよい。比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【０１２０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＡＩＭの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトＡＩＭのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
Ｆ４／８０に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
Ｆ４／８０に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＴＮＦαに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ＴＮＦαに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＩＬ−６に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ＩＬ−６に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ＩＬ−１βに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ＩＬ−１βに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
αＳＭＡに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
αＳＭＡに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ＴＧＦβ１に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ＴＧＦβ１に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ＡＦＰに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ＡＦＰに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ＧＡＰＤＨに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ＧＡＰＤＨに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
【実施例】
【０１２１】
以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。【０１２２】
実施例１：ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することによる脂肪肝の亢進
ＡＩＭノックアウトマウスおよびにＷＴマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することにより、肝臓重量、体重に対する肝臓の重量、肝臓中の中性脂肪重量、およびヘマトキシリン・エオジン組織染色による肝脂肪の蓄積について検討した。その結果、ＷＴマウスにＨＦＤを付加しても、２０週目まで肝臓重量／体重は明確な変化は示さなかったが、ＡＩＭノックアウトマウスにＨＦＤを付加することにより、６週目からＷＴに比較し有意な肝臓重量／体重の増加が認められた（図１Ａ）。また、肝臓中の中性脂肪重量の結果から、ＡＩＭノックアウトマウスにＨＦＤを付加することにより、６週目から肝臓での脂肪の蓄積が認められ、ＷＴと比較して脂肪肝が亢進していることが明らかとなった（図１Ｂ）。【０１２３】
実施例２：ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することによる肝線維化（肝硬変）の進行
野生型マウス（オス、１０匹、１２週齢）とＡＩＭノックアウトマウス（オス、１０匹、１２週齢）に高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷し、０、６、１２、２０、４５、５５週間後に肝臓をフォルマリン固定し、切片をシリウスレッドで染色し、染色された線維化部分（図２Ａ）をＮＩＨ−Ｊ  ｉｍａｇｅにて定量化した。各マウスにつき３枚の非連続切片で解析し、その平均値（切片全体における線維化の割合）を示している（図２Ｂ）。その結果、線維化領域はＨＦＤ負荷期間が長いほど増加するが、野生型マウスとＡＩＭノックアウトマウスで有意な差は認められなかった。また、固定前に一部の肝組織からＲＮＡを抽出し、量的ＲＴ−ＰＣＲによって、肝線維化に関与する代表的な遺伝子であるαＳＭＡとＴＧＦβについてｍＲＮＡ発現量を解析した（図２Ｃ）。高脂肪食（ＨＦＤ）負荷後４５、５５週のＡＩＭノックアウトマウスでは、癌が多発し、正常肝部での正確な発現量が解析できにくいため、ＲＮＡ解析は、０、６、１２、２０週間負荷したマウスのみで行った。その結果、αＳＭＡとＴＧＦβのｍＲＮＡ発現量は、ＨＦＤ負荷と共に上昇したが、両者に有意な差はなかった。【０１２４】
実施例３：ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することによる肝細胞癌の発症
ＷＴマウスにＨＦＤを５２週間負荷しても、脂肪肝は見られるものの、肝細胞癌はほぼ発症しなかったのに対し、ＡＩＭノックアウトマウスでは全例に肝細胞癌が観察され、観察された腫瘍のほとんどが、高分化型肝細胞癌（ＨＣＣ）であった（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。肝細胞癌はＨｏｅｃｈｓｔ／ＡＦＰ染色でＡＩＭノックアウトマウスの肝臓に確認され（図４）、肝臓でのＡＦＰの発現亢進も確認できた。【０１２５】
実施例４：高脂肪食（ＨＦＤ）の負荷に対するＡＩＭノックアウトマウスの炎症反応
ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することにより肝臓での炎症反応は抑制されていた（図５）。ＷＴマウスにＨＦＤを付加すると、１２−２０週目で肝臓でのマクロファージの集積、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの発現亢進といった炎症反応の亢進が見られた。一方、ＡＩＭノックアウトマウスではＷＴと比較してこれらの炎症反応は抑制されていた（図５）。【０１２６】
実施例５：血中ＡＩＭのＩｇＭによる安定化
Ｂリンパ球が欠損しているため血中にＩｇＭが存在しないＲＡＧ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ）ＫＯマウスの血清中ＡＩＭをウエスタンブロットにより解析した。ＷＴに比べ、ＲＡＧ  ＫＯマウスでは血清中ＡＩＭ量が極めて少なく、またＡＩＭ−ＩｇＭ複合体は検出されなかった（図６Ａ）。そこでｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＩＭとＩｇＭの結合を調べたところ、ＡＩＭとＩｇＭの結合が確認された（図６Ａ）。さらにＲＡＧ  ＫＯマウスに２００μｇのＩｇＭを静脈内投与したところ、血中のＡＩＭが増加した（図６Ｂ）。さらに、マウスおよびヒト血清中のＡＩＭ濃度とＩｇＭ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定したところ、ヒトにおいても血中のＡＩＭ濃度とＩｇＭ濃度は、マウスと同様に相関していることが判明した（図７）。以上より、ＡＩＭは血中でＩｇＭと複合体を形成し、安定化していることが示唆された。【０１２７】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＩＭの脂肪肝抑制効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＩＭの肝細胞に対する作用を検討した。マウス初代培養肝細胞にＡＩＭを５時間作用した後、細胞を抗ＡＩＭ抗体で染色及びウエスタンブロットしたところ、細胞がＡＩＭを取り込んでいることが確認された（図８）。さらにマウス初代培養肝細胞に８００μＭオレイン酸（ＯＡ）を添加し、２４時間培養することにより脂肪肝化させた後、ＡＩＭ添加またはＡＩＭ非添加で２４時間培養した。オイルレッドＯ染色およびＦＳＰ２７（Ｆａｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７）のｍＲＮＡ発現量から脂肪肝化を測定した。ＡＩＭ非添加（ＯＡ→ＤＭＥＭ）では、ＯＡ非添加に比べオイルレッドＯ染色の程度およびｆｓｐ２７発現量が増加し、脂肪肝化が確認された（図９）。一方、ＡＩＭ添加（ＯＡ→ＡＩＭ）では、オイルレッドＯ染色の程度およびｆｓｐ２７発現量の増加は見られず（図９）、ＡＩＭの脂肪肝改善効果が確認された。【０１２８】
実施例７：ＳＲＣＲドメインによる脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制
組換えヒトＳＲＣＲドメイン（ＳＲＣＲ１、ＳＲＣＲ２、ＳＲＣＲ３）タンパクは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、それぞれＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグを付加したヒトＳＲＣＲドメインを発現させ、抗ＨＡ抗体カラムにより精製することにより得た。３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞を、１μｇ／ｍＬインスリン、１μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）存在下で４８時間培養することにより脂肪細胞への分化を誘導し、それに対するＳＲＣＲドメインおよびＡＩＭの分化抑制作用を検討した。添加したＡＩＭとしては、ヒト全長ＡＩＭ（ｈＡＩＭ）、前記の３種のＳＲＣＲドメイン蛋白質を２０μｇ／ｍｌで用いた。脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色の程度を無添加の場合を１００％として定量化した。すべてのＳＲＣＲドメインにＡＩＭと同じ脂肪細胞分化抑制作用が見られた（図１０）。【０１２９】
実施例８：ＮＡＳＨ患者における血清中ＡＩＭ濃度の測定
ＮＡＳＨ患者３例（うち２例は肝細胞癌に進行）および非ＮＡＳＨ患者3例の血清中ＡＩＭ濃度を測定した。測定は、抗ＡＩＭ抗体を用いたウエスタンブロットで行い、シグナルの強さを定量化した。非ＮＡＳＨ患者に比べ、ＮＡＳＨ患者では血清中のＡＩＭ濃度が低下していた（図１１）。また、肝細胞癌に進行しているＮＡＳＨ患者では、血清中ＡＩＭ濃度がより低下していた（図１１）。【０１３０】
参考例：高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷されたＡＩＭノックアウトマウスに対するＡＩＭ投与の効果
８週齢のＡＩＭ  ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷して飼育する。肝臓への脂肪の蓄積が見られる前のＨＦＤ負荷２〜３週目よりＡＩＭまたはｖｅｈｉｃｌｅを連日投与する。投与４〜６週後に肝臓をオイルレッドＯ染色すると、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では脂肪の蓄積が見られるのに対し、ＡＩＭ投与群では脂肪の蓄積が見られない。従って、ＡＩＭが脂肪肝の予防に有用であることがわかる。また、８週齢のＡＩＭ  ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷して飼育する。肝臓への脂肪の蓄積が見られるＨＦＤ負荷６〜８週目よりＡＩＭまたはｖｅｈｉｃｌｅを連日投与する。投与４〜８週後に肝臓をオイルレッドＯ染色すると、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では投与前に比べ脂肪の蓄積が増加するのに対し、ＡＩＭ投与群では投与前に比べ脂肪の蓄積が減少する。従って、ＡＩＭが脂肪肝の改善又は治療に有用であることがわかる。また、ＡＩＭの代わりに、ＡＩＭの機能をアゴニスティックに調節できる薬剤（ＡＩＭ活性を有するＡＩＭの部分ペプチドを含む）やＡＩＭの発現を誘導する薬剤を使用しても同様の結果が得られる。同様にして、肝線維化および肝癌の発症時期に合わせてＡＩＭを投与することにより、肝硬変および肝癌に対するＡＩＭの予防、改善又は治療効果も確認できる。【０１３１】
実施例９：高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷されたＡＩＭノックアウトマウスに対するＡＩＭ投与の効果
ＡＩＭノックアウトマウス（オス１０匹、１２週齢）に高脂肪食（ＨＦＤ）を４３週間負荷し、３０週目から４３週目まで組換えＡＩＭ（ｒＡＩＭ）（２０ｍｇ／Ｋｇ（体重）；５匹）またはＰＢＳ（５匹）を週一回腹腔内注射にて投与した。ＨＦＤ４３週目にマウスを屠殺し、摘出した肝臓をフォルマリン固定した後、肝組織切片を作製した。得られた肝組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、癌の状況と脂肪肝の状況について解析した。肝組織切片は各マウスにつき１０枚非連続切片で作製し、癌の有無、大きさ、個数について解析した。また、肝臓（非癌部）の一部は固定前に切除し中性脂肪の含有量を測定した。その結果、ｒＡＩＭ投与群の体重は有意に減少した。一方ＰＢＳ投与群の体重は増加した（図１２Ａ）。また、ｒＡＩＭ投与群には明らかな癌部は認められなかった。一方、ＰＢＳ投与群では、全てのマウスに複数個の癌結節が見られた。組織学的にも多発性の肝癌が認められた。巨視的な写真とヘマトキシリン・エオジン染色像を示す（図１２Ｂ）。さらに、脂肪肝についてはｒＡＩＭ投与群では組織学的に明らかな改善が認められた。また肝（非癌部）の中性脂肪含有量も、ＰＢＳ投与群に比して有意に減少した（図１２Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、有効成分としてＡＩＭを含む、肝疾患の予防・治療剤を提供することができる。また、本発明の肝疾患モデルマウスは、肝疾患の発症メカニズムを解明に寄与し、さらに該モデルマウスを用いたスクリーニング方法によれば、肝疾患に対する予防・治療に有効な物質を探索することができる。また本発明の肝疾患モデルマウスを用いて、肝疾患の公知の予防・治療剤の効果を評価することができる。さらに本発明は、肝疾患の診断方法を提供することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１２−１０３９５８（出願日：平成２４年４月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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