(57)【要約】本発明は、液体クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供することを目的とする。本発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項３】
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタ、及び、
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法。
【請求項５】
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法。
【請求項６】
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタ、及び、
１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。また、本発明は、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で高精度に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。この用途では、再現性試験におけるヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）が１％以下程度の精度が要求される。【０００３】
液体クロマトグラフィーにより安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定するための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくして均一にすることである。しかしながら、カラム充填剤粒子の粒径を小さくすると、測定系に生じる圧力値が高くなる。例えば、特許文献１には、平均粒径値が３〜４μｍのカラム充填剤粒子を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法が開示されているが、特許文献１の技術を用いた測定系の圧力値は５ＭＰａ以上と高くなるため、耐圧性の高い液体クロマトグラフが必要となる。また、このような高圧状態で長期間使用した場合、配管の接続部分の劣化による液漏れやカラム寿命の短縮等を引き起こしやすい。【０００４】
更に、測定系の圧力値は、液体クロマトグラフに用いられるフィルタの詰まりによっても変動する。フィルタは、通常、液体クロマトグラフの流路に設置され、測定試料や試薬類等から流路に混入する夾雑物を取り除く。例えば、特許文献２には、カラムのエンドフィッティング内に、ステンレス鋼繊維を積層して焼結した繊維焼結フィルタをフリットとして設置した液体クロマトグラフィー用カラムが開示されている。ステンレス焼結フィルタは最も一般的な液体クロマトグラフ用のフィルタであるが、血液等の生体試料を測定する場合には、血液中のタンパク質等がフィルタの表面に吸着するため測定系の圧力値が上昇しやすい。フィルタの詰まりによる測定系の圧力上昇は、上記に示した小さな粒径の充填剤を用いた高圧での測定と同様の問題を引き起こしやすい。また、フィルタへの非特異吸着により測定系の圧力値が変動して、クロマトグラムの変形を引き起こすため測定再現性が低下しやすい。【０００５】
このようなフィルタへの非特異吸着を抑制する方法として、例えば、特許文献３には、シリコーン類によるフィルタのコーティング処理技術が開示されている。特許文献３では、この処理技術によれば、広いｐＨ範囲でヘモグロビンの回収率が高く、非特異吸着が少なく、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値に悪影響を与えないとされている。しかしながら、シリコーン類によるコーティング処理は、コーティング条件によってはコーティング層の厚みが増して目詰まりが起こりやすくなること、長期間の連続使用により圧力が上昇する場合があること、測定時間を短くした場合には分離性能が悪くなること等の欠点がある。これらの欠点は、特に特許文献１のような高圧測定系に用いた場合に顕著に現れる。
また、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時に測定する場合は、分離するピーク数が増えるため、分離性能の低下により測定値が大きく変動する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０５−００５７３０号公報
【特許文献２】特開平０７−２６０７６３号公報
【特許文献３】特開２０００−１３１３０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、液体クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供する。また、本発明は、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時に測定できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定において、液体クロマトグラフの流路上に設置するフィルタ及びカラム本体の少なくともいずれかを、一定の濃度範囲のシリコーンオイルを含む溶液又は一定の濃度範囲のシリコーン樹脂を含む溶液で処理し、一定の圧力範囲で測定を行うことにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定、並びに、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定ができることを見出した。【０００９】
本発明の第１の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明の第２の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明の第３の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタ、及び、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明の第４の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
本発明の第５の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液又は１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
本発明の第６の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタ、及び、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
以下、第１の発明及び第４の発明から詳述する。【００１０】
第１の発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及び第４の発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置する。
本明細書において、シリコーンオイル及びシリコーン樹脂を合わせて、単に「シリコーン」ともいう。また、シリコーンオイルを含む溶液又はシリコーン樹脂を含む溶液の両者を合わせて「シリコーン溶液」ともいう。更に、シリコーン溶液で処理する前のフィルタを単に「フィルタ」、シリコーン溶液で処理した後のフィルタを「シリコーン処理フィルタ」といい、両者を指す場合は「フィルタ類」という。【００１１】
第１の発明及び第４の発明に用いるフィルタは、金属製、樹脂製、ガラス製等の液体クロマトグラフィーに用いる公知のフィルタの素材が使用できる。
フィルタの素材は、具体的には例えば、アルミニウム、銅、チタン、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属類や、ステンレス等の合金類や、ナイロン樹脂、フッ素樹脂、セルロース樹脂、ポリスルホン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂、ポリエステル樹脂、ビニロン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等の樹脂類や、ジルコニア等のセラミック類や、ホウ珪酸ガラス、石英ガラス等のガラス類等が好ましい。【００１２】
フィルタの形状は、溶離液等の液状試薬が流入する方向に面するろ過面が円形の円盤体、円柱体、円錐体等が好ましい。
フィルタの表面には凸部や凹部が設けられていてもよい。【００１３】
フィルタのろ過面が円形の場合、直径の好ましい下限は０．５ｍｍ、好ましい上限は２０ｍｍである。フィルタの直径が０．５ｍｍ未満であると、フィルタが目詰まりを起こしやすくなる。フィルタの直径が２０ｍｍを超えると、フィルタ内で測定試料や移動相が拡散して分離性能が低下することがある。フィルタの直径のより好ましい下限は１ｍｍ、より好ましい上限は１０ｍｍである。【００１４】
フィルタの厚さの好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は１０ｍｍである。フィルタの厚さが０．１ｍｍ未満であると、目詰まりを起こしやすくなる。フィルタの厚さが１０ｍｍを超えると、フィルタ内で測定試料や移動相が拡散して分離性能が低下することがある。フィルタの厚さのより好ましい下限は０．２ｍｍ、より好ましい上限は５ｍｍである。【００１５】
フィルタの孔径の好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。フィルタの孔径が０．１μｍ未満であると、フィルタが目詰まりを起こしやすくなる。フィルタの孔径が２０μｍを超えると、ろ過精度が低下することがある。フィルタの孔径のより好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は１５μｍである。
また、特開平２−２６２０５４号公報に開示されているように、孔径の異なる部分を内部に有するフィルタを用いてもよい。【００１６】
第１の発明及び第４の発明に用いるフィルタは、公知の方法により加工したフィルタを用いることができる。具体的には例えば、上述した素材を繊維状、膜状、シート状、ろ紙状等の薄膜状に加工したフィルタ、上述した素材からなる繊維を不織布、織布、編み物状に加工したフィルタ、上述した素材からなる繊維又は粉体を積層し、圧縮等の方法により加工したフィルタ、上述した素材からなる繊維又は粉体を積層して焼結したフィルタ等が挙げられる。【００１７】
第１の発明及び第４の発明に用いるシリコーン処理フィルタは、上記フィルタの表面をシリコーン溶液で処理したフィルタである。
上記「フィルタの表面」とは、測定試料が接触するフィルタの外表面及び内表面を含む。【００１８】
シリコーン溶液は、シリコーン、及び、シリコーンを溶解する溶媒により構成される。
シリコーン溶液に含まれるシリコーンは、硬化反応により被膜を形成するシリコーンが好ましく、縮合反応又は付加反応により架橋構造を形成することにより硬化するシリコーンがより好ましい。
シリコーンとしては、例えば、ジメチルシリコーン、メチルフェニルシリコーン、メチルハイドロジェンシリコーン等のアルキルシリコーン化合物や、アルキルシリコーンのアルキル基の一部がアミノ基、エーテル基、エポキシ基、ジオール基、カルボキシル基、メタクリル基、フッ素等に置換された変性シリコーン化合物等のシリコーン化合物を含むシリコーンオイル又はシリコーン樹脂が好ましい。【００１９】
市販されているシリコーンとしては、例えば、東レダウコーニングシリコーン社製のＡＹシリーズ、ＢＹシリーズ、ＤＹシリーズ、ＳＥシリーズ、ＳＦシリーズ、ＳＨシリーズ、ＳＲシリーズ、ＦＺシリーズ、及び、８００ＲＥＳＩＮシリーズや、信越化学工業社製のＫＣシリーズ、ＫＥシリーズ、ＫＦシリーズ、ＫＭシリーズ、ＫＲシリーズ、ＫＳシリーズ、Ｘシリーズ、及び、ＥＳシリーズや、チッソ社製のＤＭＳシリーズ及びＰＤＳシリーズや、三菱化学社製のＭＳシリーズや、昭和電工社製のＧＲシリーズや、モメンティブパフォーマンスマテリアルズジャパン合同会社製のＴＳＦシリーズ及びＴＳＲシリーズや、ビックケミー・ジャパン社製のＢＹＫシリーズ等が挙げられる。これらのシリコーンは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。【００２０】
シリコーンを溶解する溶媒は、使用するシリコーンを溶解する液体であれば特に制限はないが、有機溶媒類が好ましい。
有機溶媒類としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール等のアルコール類や、ペンタン、ヘキサン、オクタン等の直鎖状又は分岐状の炭化水素類や、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類等が挙げられる。【００２１】
シリコーン溶液中のシリコーンの濃度の下限は１重量％、上限は５０重量％である。シリコーンの濃度が１重量％未満であると、シリコーンによる処理が充分に行えなくなる。シリコーンの濃度が５０重量％を超えると、高濃度のシリコーンによりフィルタが目詰まりする。シリコーン濃度の好ましい下限は２重量％、好ましい上限は４５重量％である。【００２２】
シリコーン溶液によるフィルタの処理は、シリコーン溶液中のシリコーンでフィルタ表面を被覆する処理が好ましく、フィルタをシリコーン溶液に接触させる工程、及び、フィルタに接触させたシリコーン溶液中のシリコーンによりフィルタ表面を被覆する工程を含む処理がより好ましい。【００２３】
フィルタをシリコーン溶液に接触させる方法は、例えば、フィルタをシリコーン溶液に浸漬する方法、フィルタにシリコーン溶液を通液する方法、フィルタにシリコーン溶液を塗布する方法等が挙げられる。【００２４】
シリコーン溶液中のシリコーンによりフィルタ表面を被覆する方法は、フィルタをシリコーン溶液に接触させた後、室温下、加温下、紫外線等のエネルギー線照射、有機溶媒の添加等の方法により、フィルタ表面で縮合反応や付加反応等の架橋反応を起こさせてシリコーンを硬化させる方法が好ましい。
フィルタをシリコーン溶液に接触させる際、又は、フィルタ表面でシリコーンを硬化させる際に架橋剤等の公知の添加剤を加えてもよい。【００２５】
また、第１の発明及び第４の発明に用いるシリコーン処理フィルタを、ブロッキング試薬でブロッキング処理してもよい。
ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビン、グロブリン、ラクトフェリン等のタンパク質や、リン脂質等の極性脂質や、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）等の界面活性剤等が挙げられる。【００２６】
ブロッキング処理は、例えば、シリコーン処理フィルタをブロッキング試薬の溶液に浸漬する方法、シリコーン処理フィルタにブロッキング試薬の溶液を通液する方法、シリコーン処理フィルタにブロッキング試薬の溶液を塗布する方法等により行うことができる。【００２７】
第１の発明は、上述したシリコーン処理フィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置した液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。また、第４の発明は、上述したシリコーン処理フィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置した液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
シリコーン処理フィルタは、液体クロマトグラフの流路上に設置する。特に、測定試料が通過する流路上に設置することが好ましい。シリコーン処理フィルタは、例えば、流路配管の途中に設置するラインフィルタ、分離用カラムの直前に設置するプレフィルタ、カラムのエンドフィッティング内で充填剤に接して設置されるフリット等、公知の使用方法に使用されるフィルタとして用いることが好ましい。なかでも、プレフィルタ又はフリットとしての使用が好適である。【００２８】
なお、シリコーン処理フィルタをフリットとして用いる場合は、シリコーン処理フィルタをエンドフィッティング内に設置してもよいし、フィルタをエンドフィッティングに設置した後、フィルタを含むエンドフィッティングに対してシリコーン処理を行ってもよい。【００２９】
第１の発明及び第４の発明では、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する。
本明細書において、「測定系に生じる圧力値（以下、単に圧力値ともいう）」とは、液体クロマトグラフの流路において、カラムを含む送液ポンプ以降の流路全体により発生する圧力値を意味する。例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計により測定できる値である。また、上述した「９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下」の圧力範囲を本発明の「圧力規定値」という。【００３０】
圧力値を９．８×１０３Ｐａ未満に設定した場合は、ヘモグロビン類の測定値の再現性が低下し測定時間が長くなる。また、設定圧力値が非常に小さいため圧力値を安定させることが困難となる。圧力値を１９．６×１０５Ｐａを超える値に設定した場合は測定値の再現性が低下する。【００３１】
第１の発明及び第４の発明の液体クロマトグラフィーは、送液用ポンプ、分離用カラム、検出器、試料導入機構等を備えた公知の液体クロマトグラフに、上述したシリコーン処理フィルタを設置して行う。液体クロマトグラフの構成例を図１に示す。【００３２】
液体クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましい。例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸は、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸は、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物、カオトロピック化合物等を適宜添加してもよい。【００３３】
ヘモグロビン類の測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、充分なイオン交換反応が行なわれずヘモグロビン類を分離することが困難となることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、緩衝液中の塩が析出して液体クロマトグラフに悪影響を及ぼすことがある。【００３４】
第１の発明により、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる。第１の発明では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定と同時に、健常人血に含まれる他のヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等を短時間で再現性良く測定できる。
また、第４の発明により、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類、例えばヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等の中の１種類又は２種類以上を、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定と同時に測定できる。
なお、ここでいう「同時に」とは、１回の測定で安定型ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン類のピークをクロマトグラム上に表示して測定対象の各ヘモグロビン類の含有率を示すことを意味する。
第４の発明では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃに加えて、健常人血に含まれる他のヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等を異常ヘモグロビンと同時に短時間で再現性良く測定できる。【００３５】
本発明の第２の発明は、内表面をシリコーン溶液で処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
また、本発明の第５の発明は、内表面をシリコーン溶液で処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
本明細書において、「カラム本体」とは、一般に用いられる液体クロマトグラフィー用カラムにおけるエンドフィッティング部分を除く筒状部分であり、カラム充填剤を収容する部分を指す。また、本明細書において、シリコーン処理前のカラム本体を含むカラムを単に「カラム」、シリコーン溶液による処理後のカラム本体を含むカラムを「シリコーン処理カラム」といい、両者を指す場合は「カラム類」という。【００３６】
第２の発明及び第５の発明に用いるカラム本体は、金属製、樹脂製、ガラス製等の液体クロマトグラフに用いる公知のカラム本体の素材を使用することができる。
カラム本体の素材は、具体的には例えば、アルミニウム、チタン等の金属類や、ステンレス等の合金類や、ナイロン樹脂、フッ素樹脂、セルロース樹脂、ポリスルホン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂、ポリエステル樹脂、ビニロン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等の樹脂類や、ジルコニア等のセラミック類や、ホウ珪酸ガラス、石英ガラス等のガラス類等が好ましい。また、エンドフィッティングの素材はカラム本体と同じでもよいし、異なっていてもよい。【００３７】
カラム本体の形状は、公知の液体クロマトグラフィー用カラムに用いられるものであり、円筒状が好ましい。
カラム本体の内径の好ましい下限値は０．５ｍｍ、好ましい上限値は１０ｍｍである。カラム本体の内径が０．５ｍｍ未満であると、圧力値を第２発明又は第５の発明の圧力規定値内に維持するのが困難となり再現性が低下することがある。カラム本体の内径が１０ｍｍを超えると、カラム内での測定試料や移動相の拡散が大きくなり分離性能が低下することがある。カラム本体の内径のより好ましい下限値は１．０ｍｍ、より好ましい上限値は６．０ｍｍである。【００３８】
カラム本体の長さの好ましい下限値は５ｍｍ、好ましい上限値は１００ｍｍである。カラム本体の長さが５ｍｍ未満であると、測定試料と相互作用する充填剤量が少ないため分離性能が低下することがある。カラム本体の長さが１００ｍｍを超えると、ヘモグロビン類の溶出に時間がかかるために測定時間が延長することがある。カラム本体の長さのより好ましい下限値は１０ｍｍ、より好ましい上限値は５０ｍｍである。【００３９】
第２の発明及び第５の発明に用いられるシリコーン処理カラムは、上記カラム本体の内表面がシリコーン溶液により処理されている。第２の発明及び第５の発明に用いるシリコーン溶液は、上記第１の発明及び第４の発明と同様のシリコーン溶液が好ましい。【００４０】
シリコーン溶液によるカラム本体の処理は、第１の発明及び第４の発明におけるフィルタの処理と同様である。即ち、カラム本体をシリコーン溶液に接触させる工程、及び、カラム本体に接触させたシリコーン溶液中のシリコーンにより、カラム本体の内表面を被覆させる工程を有する処理が好ましい。【００４１】
カラム本体をシリコーン溶液に接触させる方法は、例えば、カラム本体をシリコーン溶液に浸漬させる方法、カラム本体にシリコーン溶液を通液する方法、カラム本体にシリコーン溶液を塗布する方法が挙げられる。
カラム本体に接触したシリコーン溶液中のシリコーンを硬化させる方法は、第１の発明及び第４の発明と同様の方法が使用できる。
また、カラム本体に加えて、カラムのエンドフィッティングに、同様のシリコーン溶液による処理を行ってもよい。【００４２】
また、第２の発明及び第５の発明に用いるシリコーン処理カラムを、ブロッキング試薬でブロッキング処理してもよい。使用するブロッキング試薬及びブロッキング処理の方法は、第１の発明及び第４の発明と同様である。【００４３】
第２の発明は、上述したシリコーン処理カラムを液体クロマトグラフの流路上に設置した液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。また、第５の発明は、上述したシリコーン処理カラムを液体クロマトグラフの流路上に設置した液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
液体クロマトグラフィーは、充填剤を充填したシリコーン処理カラムを、図１の液体クロマトグラフの流路（図１の７）に接続して行う。【００４４】
シリコーン処理カラムに充填する充填剤は、イオン交換基を有する充填剤が好ましく、カチオン交換基を有する充填剤がより好ましい。
カチオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が好ましく、なかでも、スルホン酸基が好ましい。【００４５】
充填剤粒子の平均粒径値の下限は１μｍ、上限は５０μｍが好ましい。充填剤粒子の平均粒径値が１μｍ未満の場合、圧力値を圧力規定値内に維持するのが困難となることがあり、再現性が低下することがある。充填剤粒子の平均粒径値が５０μｍを超えると、充填剤粒子間で測定試料が拡散して分離性能が低下することがある。充填剤粒子の平均粒径値のより好ましい下限値は２μｍ、より好ましい上限値は３０μｍである。
なお、充填剤粒子の平均粒径値は、粒度分布測定装置を用いて測定することができる。【００４６】
第２の発明及び第５の発明では、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する。圧力値を９．８×１０３Ｐａ未満に設定した場合は、設定圧力値が非常に小さいために圧力値を安定させることが困難となる。また、測定時間が長くなる場合がある。圧力値を１９．６×１０５Ｐａを超える値に設定した場合は再現性が低下する。【００４７】
第２の発明及び第５の発明に用いられる液体クロマトグラフは、第１の発明及び第４の発明と同様である。また、第２発明及び第５の発明に用いられる溶離液は、第１の発明及び第４の発明と同様である。
第２の発明により、第１の発明と同様に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと、健常人血に含まれる他のヘモグロビン類とを測定できる。また、第５の発明により、第４の発明と同様に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと、健常人血に含まれる他のヘモグロビン類、及び、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類を同時に測定できる。【００４８】
本発明の第３の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタ、及び、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明の第３の発明では、第１の発明におけるシリコーン処理フィルタと第２の発明におけるシリコーン処理カラムの両者を液体クロマトグラフの流路上に設置し、測定系に生じる圧力値を本発明の圧力規定値に設定するため、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを、更に短時間で再現性良く測定できる。
また、本発明の第６の発明は、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で表面を処理したフィルタ、及び、１〜５０重量％のシリコーンオイルを含む溶液、又は、１〜５０重量％のシリコーン樹脂を含む溶液で内表面を処理したカラム本体を液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法である。
本発明の第６の発明では、第４の発明におけるシリコーン処理フィルタと第５の発明におけるシリコーン処理カラムの両者を用い、測定系に生じる圧力値を本発明の圧力規定値に設定するため、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを、更に短時間で再現性良く同時に測定できる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて、規定濃度のシリコーンを含むシリコーン溶液で処理したフィルタ及びシリコーン溶液で処理したカラム本体の少なくともいずれかを用い、圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、１９．６×１０５Ｐａ以下に設定することにより、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定、並びに、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定を短時間で再現性良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に用いる液体クロマトグラフの例を示す構成図である。
【図２】評価（３）において、測定例１により得られたクロマトグラムである。
【図３】評価（３）において、測定例８により得られたクロマトグラムである。
【図４】評価（５）において、測定例１により得られたクロマトグラムである。
【図５】評価（５）において、測定例８により得られたクロマトグラムである。
【図６】評価（６）において、測定例１により得られたクロマトグラムである。
【図７】評価（６）において、測定例８により得られたクロマトグラムである。
【図８】評価（７）において、測定例１３、１４、１５の平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図９】評価（７）において、測定例１６、１７、１８の平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１０】評価（８）において、測定例１３、１４、１５の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１１】評価（８）において、測定例１６、１７、１８の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１２】評価（９）において、測定例１３、１４、１５の平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１３】評価（９）において、測定例１６、１７、１８の平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１４】評価（１０）において、測定例１３、１４、１５の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１５】評価（１０）において、測定例１６、１７、１８の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１６】評価（１０）において、測定例１３、１４、１５の平均圧力値とヘモグロビンＳ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１７】評価（１０）において、測定例１６、１７、１８の平均圧力値とヘモグロビンＳ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１８】評価（１０）において、測定例１３、１４、１５の平均圧力値とヘモグロビンＣ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図１９】評価（１０）において、測定例１６、１７、１８の平均圧力値とヘモグロビンＣ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。
【図２０】評価（１１）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時の平均圧力値の推移を示すグラフである。
【図２１】評価（１１）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時の圧力値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【図２２】評価（１１）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【図２３】評価（１２）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時の平均圧力値の推移を示すグラフである。
【図２４】評価（１２）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時の圧力値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【図２５】評価（１２）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【図２６】評価（１２）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時のヘモグロビンＳ値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【図２７】評価（１２）において、測定例１６、１９、２０の繰り返し測定時のヘモグロビンＣ値のＣＶ値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
【００５２】
（製造例１）
製造例１〜３では、平均粒径値の異なるヘモグロビン類測定用のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１４０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１、３−ジメタクリロキシプロパン（架橋性単量体、新中村化学工業社製）６０ｇの単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を３５０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行った。次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（親水性単量体、東亞合成社製）１８０ｇ、及び、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（親水性単量体、日油社製）６０ｇ、メタノール１００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
粒度分布測定装置（ナイコンプ社製、「アキュサイザー７８０」）により、平均粒径を測定した結果、４．７μｍであった。
【００５３】
（製造例２）
製造例１における反応系の撹拌条件を３００ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。製造例１と同様に平均粒径を測定した結果、６．４μｍであった。
【００５４】
（製造例３）
製造例１における反応系の撹拌条件を２５０ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。製造例１と同様に平均粒径を測定した結果、９．５μｍであった。
以上の製造例１〜３で得られたカラム充填剤の平均粒径値を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2013047563.tif 000002
【００５６】
（実施例１）
実施例１〜３では、シリコーン処理フィルタを調製した。
直径４ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱状のフィルタを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した（以下、このフィルタを「未処理フィルタ」ともいう）。シリコーン溶液は、３重量％のシリコーン（信越化学工業社製、「ＫＦ−９６」）を含むエチルアルコール溶液を用いた。上記フィルタを室温下で３０分間シリコーン溶液に浸漬した後、フィルタをシリコーン溶液から取り出し、１００℃で６０分間加熱してシリコーンを硬化させてシリコーン処理フィルタを得た。
【００５７】
（実施例２）
シリコーン溶液を、実施例１の３重量％のシリコーンを含むエチルアルコール溶液から、２０重量％のシリコーン（東レダウコーニング社製、「ＳＲ２４１０」）を含むエチルアルコール溶液に変更してシリコーン処理を行った。
実施例１で用いた未処理フィルタを上記シリコーン溶液に室温下で３０分間浸漬した後、フィルタをシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させてシリコーン処理フィルタを得た。
【００５８】
（実施例３）
シリコーン溶液を、実施例１の３重量％のシリコーンを含むエチルアルコール溶液から、４５重量％のシリコーン（東レダウコーニング社製、「ＳＲ２３０９」）を含むブチルアルコール溶液に変更してシリコーン処理を行った。
実施例１で用いた未処理フィルタを上記シリコーン溶液に室温下で３０分間浸漬した後、フィルタをシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させて、シリコーン処理フィルタを得た。
【００５９】
（比較例１）
比較例１では、シリコーンで処理していないフィルタを調製した。
シリコーンで処理していないフィルタは、実施例１で用いた未処理フィルタを、シリコーン溶液による処理を行わずにそのまま用いた。
【００６０】
（比較例２）
比較例２では、本発明の第１の発明及び第４の発明に規定する濃度未満のシリコーンを含むシリコーン溶液で処理したフィルタを調製した。
シリコーン溶液を、実施例１の３重量％のシリコーンを含むエチルアルコール溶液から、０．５重量％のシリコーン（信越化学工業社製、「ＫＦ−９６」）を含むエチルアルコール溶液に変更してシリコーン処理を行った。
実施例１で用いた未処理フィルタを上記シリコーン溶液に室温下で３０分間浸漬した後、フィルタをシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させてシリコーン処理フィルタを得た。
【００６１】
（比較例３）
比較例３では、本発明の第１の発明及び第４の発明に規定する濃度を超えるシリコーンを含むシリコーン溶液で処理したフィルタを調製した。
シリコーン溶液を、実施例２の２０重量％のシリコーンを含むエチルアルコール溶液から、７０重量％のシリコーン（東レダウコーニング社製、「ＳＲ２４１０」）を含むエチルアルコール溶液に変更してシリコーン処理を行った。
実施例１で用いた未処理フィルタを上記シリコーン溶液に室温下で３０分間浸漬した後、フィルタをシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させてシリコーン処理フィルタを得た。
【００６２】
（実施例４）
実施例４及び実施例５では、シリコーン処理カラムを調製した。
ステンレスＳＵＳ３１４製のカラム本体（巴製作所社製、長さ３５ｍｍ、内径４．６ｍｍ、以下、「未処理カラム本体」ともいう）を、シリコーン溶液として３重量％のシリコーン（信越化学工業社製、「ＫＦ−９６」）を含むエチルアルコール溶液に室温下で３０分間浸漬した。その後、カラム本体をシリコーン溶液から取り出し、１００℃で６０分間加熱してシリコーンを硬化させてシリコーン処理カラム本体を得た。実施例１で用いた未処理フィルタをフリットとして装着したステンレスＳＵＳ３１４製エンドフィッティング（シリコーン未処理）を上記のシリコーン処理したカラム本体の両端に取り付け、シリコーン処理カラムを得た。
【００６３】
（実施例５）
実施例４で用いた未処理カラム本体及びエンドフィッティングを、シリコーン溶液として４５重量％のシリコーン（東レダウコーニング社製、「ＳＲ２３０９」）を含むブチルアルコール溶液に室温下で３０分間浸漬した。その後カラム本体及びエンドフィッティングをシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させてシリコーン処理カラムを得た。
【００６４】
（比較例４）
比較例４では、シリコーン溶液で処理していないカラムを調製した。
シリコーン溶液で処理していないカラムは、実施例４で用いた未処理カラム及びエンドフィッティングをシリコーン溶液による処理を行わずにそのまま用いた。
【００６５】
（比較例５）
比較例５では、本発明の第２の発明及び第５の発明に規定する濃度未満のシリコーンを含むシリコーン溶液で処理したカラムを調製した。
シリコーン溶液を、実施例４の３重量％のシリコーンを含むエチルアルコール溶液から、０．５重量％のシリコーン（信越化学工業社製、「ＫＦ−９６」）を含むエチルアルコール溶液に変更してシリコーン処理を行った。
実施例４で用いた未処理カラム本体を上記シリコーン溶液に室温下で３０分間浸漬した後、カラム本体をシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させて、シリコーン処理したカラム本体を得た。実施例１で用いた未処理フィルタをフリットとして装着したステンレスＳＵＳ３１４製エンドフィッティング（シリコーン未処理）を上記のシリコーン処理したカラム本体の両端に取り付け、シリコーン処理カラムを得た。
【００６６】
（比較例６）
比較例６では、本発明の第２の発明及び第５の発明に規定する濃度を超えるシリコーンを含むシリコーン溶液で処理したカラムを調製した。
シリコーン溶液を、実施例４の３重量％のシリコーンを含むエチルアルコール溶液から、７０重量％のシリコーン（信越化学工業社製「ＫＦ−９６」）を含むエチルアルコール溶液に変更してシリコーン処理を行った。
実施例４で用いた未処理カラム本体を上記シリコーン溶液に室温下で３０分間浸漬した後、カラム本体をシリコーン溶液から取り出し、１２０℃で１００分間加熱してシリコーンを硬化させて、シリコーン処理したカラム本体を得た。実施例１で用いた未処理フィルタをフリットとして装着したステンレスＳＵＳ３１４製エンドフィッティング（シリコーン未処理）を上記のシリコーン処理したカラム本体の両端に取り付け、シリコーン処理カラムを得た。
以上の実施例１〜５及び比較例１〜６の処理内容を表２に示す。
【００６７】
【表２】
2013047563.tif 000003
【００６８】
（評価）
実施例１〜５及び比較例１〜６で得られたフィルタ類及びカラム類を組み合わせて、表３に示す測定例１〜１２の測定系を調製した。
なお、表３の「プレフィルタ」、「フリット」、「カラム本体」において、本発明の規定範囲内の濃度のシリコーン溶液を用いて処理を行ったものを「○」、本発明の規定範囲外の濃度のシリコーン溶液を用いて処理を行ったものを「△」、シリコーン処理を行わなかったものを「×」とした。
【００６９】
【表３】
2013047563.tif 000004
【００７０】
（１）ヘモグロビン類測定用カラムの調製
製造例１〜３で得られたカラム充填剤を、実施例及び比較例で得られたカラム類に充填して、ヘモグロビン類測定用カラムを調製した。
製造例１〜３で得られた各カラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに添加して撹拌した後、５分間超音波処理して充填剤スラリーを調製した。実施例４、５、比較例４、５又は６で調製した各カラム類を接続したカラム充填用パッカー（容量３０ｍＬ、アズワン社製）にスラリー全量を注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、２０ＭＰａの圧力で充填してヘモグロビン類測定用カラムを得た。
【００７１】
（２）測定条件
図１の液体クロマトグラフ１に、上記「（１）ヘモグロビン類測定用カラムの調製」で得られたヘモグロビン類測定用カラムを接続した（図１の７）。また、実施例１〜３又は比較例１〜３のフィルタを、インジェクションバルブ５と分離用カラム７の間に接続した（図１の６）。圧力値は、送液ポンプ３とインジェクションバルブ５の間に圧力計４（長野計器社製、「デジタル圧力計ＧＣ６１」）を接続して測定した。
測定条件を表４に示す。
【００７２】
【表４】
2013047563.tif 000005
【００７３】
評価（３）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定
測定例１〜１２の測定系を用いて、健常人血液中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃを表４記載の測定条件で測定した。
測定試料は、フッ化ナトリウム入り採血管で採血した健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチジャパン社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１２０倍に溶血希釈したものを用いた。
測定例１により得られたクロマトグラムを図２に示す。また、測定時の圧力値を表３に示す。測定例１の測定系を用いて測定した場合、１分以内で安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ピーク１）を他のヘモグロビン類から良好に分離できた。測定例２〜７の測定系を用いた場合も、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを良好に分離でき、図２と同様のクロマトグラムが得られた。
シリコーン処理フィルタ及びシリコーン処理カラムを使用しない測定例８により得られたクロマトグラムを図３に示す。測定例８の測定系を用いて測定した場合、測定例１の測定系を用いて測定した場合と比較して分離性能が悪く、安定型ヘモグロビンＡ１ｃは分離できなかった。
また、測定例９及び測定例１１の、本発明の規定量未満の濃度のシリコーン溶液により処理したフィルタ又はカラムを用いた場合は、図３と同様のクロマトグラムを示した。これはシリコーン濃度が低いため、シリコーン処理の効果が現れなかったことによる。
測定例１０及び測定例１２の、本発明の規定量を超えるシリコーン濃度を用いたシリコーン溶液によりフィルタ又はカラム本体を処理した場合も図３と同様のクロマトグラムを示した。これは高濃度のシリコーン溶液処理による圧力値が規定量を超えたために、分離性能が向上しなかったと考えられる。
【００７４】
評価（４）修飾ヘモグロビン類の測定
測定例１〜１２の測定系を用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類を含む試料を表４記載の測定条件で測定した。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を公知の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血にシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血（非修飾品）の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表３に示す。
測定例１〜７のシリコーン処理フィルタ又はシリコーン処理カラムを用いた場合のΔ値は０．２％未満であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できた。特にシリコーン処理フィルタ及びシリコーン処理カラムの両者を用いた測定例７はΔ値が小さく、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能に優れていることがわかった。
測定例８のシリコーン未処理のフィルタ及びカラムを用いた場合はΔ値が０．３％以上であり、修飾ヘモグロビン類の影響を受けて正確な安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定ができなかった。
測定例９及び測定例１１の、本発明の規定量未満の濃度のシリコーン溶液により処理したフィルタ又はカラムを用いた場合、また、測定例１０及び測定例１２の、本発明の規定量を超えるシリコーン濃度を用いたシリコーン溶液によりフィルタ又はカラム本体を処理した場合もΔ値が０．３％以上であり、修飾ヘモグロビン類の影響を受けて正確な安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定ができなかった。
【００７５】
評価（５）安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定
測定例１〜１２の測定系を用いて、異常ヘモグロビンのヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）を表５記載の測定条件で測定した。
測定例１のシリコーン処理フィルタを用いた場合（図４）はヘモグロビンＳ（ピーク２４）及びヘモグロビンＣ（ピーク２５）を良好に分離できた。
測定例２〜７の測定系を用いた場合も、図４と同様のクロマトグラムが得られた。
測定例８の測定系を用いた場合（図５）はヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離できなかった。
測定例９〜１２の測定系を用いた場合も、測定例８の測定系を用いた場合と同様に、良好な分離は得られず、図５と同様のクロマトグラムが得られた。
上記試料を２０回繰り返して測定し、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣの同時再現性を確認した（表３）。
測定例１〜７では各ヘモグロビンともＣＶ値が１％以下であり良好な再現性を示した。
測定例８〜１２ではＣＶ値が大きく再現性は不良だった。
【００７６】
【表５】
2013047563.tif 000006
【００７７】
評価（６）ヘモグロビンＡ２の測定
測定例１〜７の測定系を用いて、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）を含む試料（バイオラッド社製「Ａ２コントロールレベル２」）を表５記載の測定条件で測定した。
測定例１のシリコーン処理フィルタを用いた場合（図６）はヘモグロビンＡ２（ピーク２６）を良好に分離できた。
測定例２〜７の場合も、図６と同様のクロマトグラムが得られた。
測定例８の測定系を用いた場合（図７）はヘモグロビンＡ２を分離できなかった。
測定例９〜１２の測定系を用いた場合も、測定例８の測定系を用いた場合と同様に、良好な分離は得られず、図７と同様のクロマトグラムが得られた。
上記試料を２０回繰り返して測定し、ヘモグロビンＡ２の同時再現性を確認した（表３）。
測定例１〜７ではＣＶ値が１％以下であり良好な再現性を示した。
測定例８〜１２ではＣＶ値が大きく再現性は不良だった。
上記の評価（３）〜（６）により、本発明に規定する濃度のシリコーンを含むシリコーン溶液で処理したフィルタ及びカラム本体の少なくともいずれかを用いることにより、ヘモグロビン類の分離性能が向上することが確認できた。
【００７８】
評価（７）圧力値の評価１
評価（７）〜（１０）では、測定時の流速を故意に変えて、測定系の圧力値を変化させて測定を行った。これらの評価に用いた測定例１３〜２０の条件を表６、表７に示す。
なお、表６の「プレフィルタ」、「フリット」、「カラム本体」において、本発明の規定範囲内の濃度のシリコーン溶液を用いて処理を行ったものを「○」、シリコーン処理を行わなかったものを「×」とした。
【００７９】
【表６】
2013047563.tif 000007
【００８０】
【表７】
2013047563.tif 000008
【００８１】
まず、測定例１３〜１５により、製造例１〜３の充填剤及び実施例２のシリコーン処理フィルタを用いて健常人血液中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃを、流速以外は表４記載の測定条件で測定した。流速を０．１〜３．３ｍＬ／分の間で変更して各２０回の測定を行った場合の、平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を図８に示す。本発明の圧力規定値内において圧力値のＣＶ値は良好であり安定していた。
測定例１６〜１８の、製造例１〜３の充填剤及び比較例１のフィルタ（シリコーン未処理フィルタ）を用いて、同様に流速を変更して測定した場合の平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を図９に示す。図８と比較した場合、圧力値のＣＶ値が大きく、本発明の圧力規定値内での圧力値のＣＶ値も向上しなかった。
以上により、本発明にかかるシリコーン処理フィルタを用いると、本発明の圧力規定値内において良好な圧力値のＣＶ値が安定して得られることが確認できた。
【００８２】
評価（８）安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性試験
上記「（７）圧力値の評価１」時に安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の同時再現性を確認した。各流速での測定時において、健常人血液試料を２０回連続測定した場合の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。シリコーン処理フィルタを用いた場合の測定例１３〜１５の測定時の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を図１０に示す。本発明の圧力規定値内においてＣＶ値が１．０％以下となり良好な再現性が得られた。シリコーン処理フィルタを用いた場合でも圧力規定値外ではＣＶ値が大きくなった。
測定例１６〜１８のシリコーン未処理フィルタを用いた場合の、測定時の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を図１１に示す。ＣＶ値が１．０％以下にならず再現性は不良であった。
以上から、シリコーン処理フィルタを用い、かつ、圧力値を本発明の圧力規定値内とした場合に、圧力値は安定して安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が向上することが確認できた。なお、シリコーン処理カラムとシリコーン処理していないカラムとを比較した場合も同様の挙動差を示した。
【００８３】
評価（９）圧力値の評価２
まず、測定例１３〜１５により、製造例１〜３のカラム充填剤及び実施例２のシリコーン処理フィルタを用いて異常ヘモグロビンを含む試料（ＡＦＳＣヘモコントロール）を、流速以外は表５記載の測定条件で測定した。
流速を０．１〜３．３ｍＬ／分の間で変更して各２０回の測定を行った場合の、平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を図１２に示す。
本発明の圧力規定値内において圧力値のＣＶ値は良好であり安定していた。
測定例１６〜１８の、製造例１〜３の充填剤及び比較例１のフィルタ（シリコーン未処理フィルタ）を用いて、同様に流速を変更して測定した場合の平均圧力値と圧力値のＣＶ値の関係を図１３に示す。
図１２と比較した場合、圧力値のＣＶ値が大きく、本発明の圧力規定値内での圧力値のＣＶ値も向上しなかった。
以上により、本発明にかかるシリコーン処理フィルタを用いると、本発明の圧力規定値内において良好な圧力値のＣＶ値が安定して得られることが確認できた。
また、シリコーン処理フィルタを用いても、本発明の圧力規定値外の場合にはＣＶ値が悪くなることが確認できた。
【００８４】
評価（１０）安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値及び異常ヘモグロビン値の再現性試験
上記「（９）圧力値の評価２」時に安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値及び異常ヘモグロビンの同時再現性を確認した。
各流速での測定時において、異常ヘモグロビンを含む試料（ＡＦＳＣヘモコントロール）を２０回連続測定した場合の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値、ヘモグロビンＳ値、ヘモグロビンＣ値のＣＶ値を算出した。
測定例１３〜１５のシリコーン処理フィルタを用いた場合の、測定時の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を図１４に示す。
本発明の圧力規定値内においてＣＶ値が１．０％以下となり良好な再現性が得られた。
シリコーン処理フィルタを用いた場合でも圧力規定値外ではＣＶ値が大きくなった。
測定例１６〜１８のシリコーン未処理フィルタを用いた場合の、測定時の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を図１５に示す。
ＣＶ値が１．０％以下にならず再現性は不良であった。
同様に測定例１３〜１５のシリコーン処理フィルタを用いた場合のヘモグロビンＳ値のＣＶ値の推移を図１６に、測定例１６〜１８のシリコーン未処理フィルタを用いた場合のヘモグロビンＳ値のＣＶ値の推移を図１７に示す。
また、測定例１３〜１５のシリコーン処理フィルタを用いた場合のヘモグロビンＣ値のＣＶ値の推移を図１８に、測定例１６〜１８のシリコーン未処理フィルタを用いた場合のヘモグロビンＣ値のＣＶ値の推移を図１９に示す。
測定例１３〜１５のシリコーン処理フィルタを用い、かつ、本発明の圧力規定値内における測定では良好なＣＶ値が得られ、シリコーン処理フィルタを用いた場合でも圧力規定値外ではＣＶ値が大きくなった。
また、測定例１６〜１８のシリコーン未処理フィルタを用いた場合は再現性が不良であった。
以上から、シリコーン処理フィルタを用い、かつ、圧力値を本発明の圧力規定値内とした場合に、圧力値は安定して安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値及び異常ヘモグロビン値の測定再現性が向上することが確認できた。
なお、シリコーン処理カラムとシリコーン処理していないカラムとを比較した場合も同様の挙動差を示した。
【００８５】
評価（１１）繰り返し測定の影響評価１
表６の測定例１６、１９、２０により、健常人血液試料を表４記載の測定条件で合計３０００回測定した際の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性の推移を確認した。２００回の測定毎に上記「（８）安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性試験」（ｎ＝２０）を実施した時の平均圧力値の推移を図２０に、圧力値のＣＶ値の推移を図２１に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を図２２に示す。
測定例１６のシリコーン処理していないフィルタを用いた場合は、約５００回の測定で平均圧力値が上昇し始めたのに対し、シリコーン処理したフィルタを用いた測定例１９は約２０００回測定まで、シリコーン処理したフィルタ及びシリコーン処理したカラムを用いた測定例２０は３０００回測定まで平均圧力値は安定していた。
また、圧力値のＣＶ値及び安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値は、測定例１９及び２０で小さく、安定していた。特に、測定例２０は３０００回測定においても良好なＣＶ値を示した。
以上から、シリコーン処理フィルタ及びシリコーン処理カラムにより圧力値の上昇とバラツキ増大が抑制され、その結果、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の良好な再現性を維持できることが確認できた。
【００８６】
評価（１２）繰り返し測定の影響評価２
表７の測定例１６、１９、２０により、異常ヘモグロビンを含む試料（ＡＦＳＣヘモコントロール）を表５記載の測定条件で合計３０００回測定した際の同時再現性の推移を確認した。
２００回の測定毎に上記「（１０）安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値及び異常ヘモグロビン値の再現性試験」（ｎ＝２０）を実施した時の平均圧力値の推移を図２３に、圧力値のＣＶ値の推移を図２４に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を図２５に示す。
測定例１６のシリコーン処理していないフィルタを用いた場合は、約５００回の測定で平均圧力値が上昇し始めたのに対し、シリコーン処理したフィルタを用いた測定例１９は約２０００回測定まで、シリコーン処理したフィルタ及びシリコーン処理したカラムを用いた測定例２０は３０００回測定まで平均圧力値は安定していた。
また、圧力値のＣＶ値及び安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値は、測定例１９及び２０で小さく、安定していた。
特に、測定例２０は３０００回測定においても良好なＣＶ値を示した。
また、ヘモグロビンＳ値のＣＶ値の推移を図２６に、ヘモグロビンＣ値のＣＶ値の推移を図２７に示す。
これらの異常ヘモグロビン値のＣＶ値の推移も安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値と同様の推移を示した。
以上から、シリコーン処理フィルタ及びシリコーン処理カラムにより、圧力値の上昇とバラツキ増大とが抑制され、その結果、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値及び異常ヘモグロビン値の良好な再現性を維持できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、液体クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供できる。また、本発明によれば、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとの同時測定法を提供できる。
【符号の説明】
【００８８】
１  液体クロマトグラフ
２  溶離液切替バルブ
３  送液ポンプ
４  圧力計
５  インジェクションバルブ
６  プレフィルタ
７  分離用カラム
８  検出器
９  溶離液
１０  オートサンプラ
１１  廃液容器
２１  ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）
２２  安定型ヘモグロビンＡ１ｃ
２３  ヘモグロビンＡ０
２４  ヘモグロビンＳ
２５  ヘモグロビンＣ
２６  ヘモグロビンＡ２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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