(57)【要約】【課題】非ヒト由来の捕獲抗体や検出抗体を用いた場合でも、偽陽性反応が生じにくく、高精度でウイルス抗原を検出可能なウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットを提供することにある。【解決手段】抗異種イムノグロブリン抗体を含んだヒト検体中に含まれるウイルス抗原の検出方法であって、非ヒト由来の捕獲抗体を担体に固定化し、非ヒト由来の検出抗体を標識物質で標識化する。次に、捕獲抗体と検出抗体に共通のエピトープであって抗異種イムノグロブリン抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを有する阻止抗体を、ヒト検体中に添加して抗異種イムノグロブリン抗体と結合させる工程と、ヒト検体を捕獲抗体及び検出抗体と反応させてウイルス抗原に捕獲抗体と検出抗体を結合させる工程と、を同時又はこの順序で行う。続いて、ウイルス抗原に結合した検出抗体の標識物質を検出する。捕獲抗体と検出抗体との間でブリッジが形成されず、偽陽性が生じにくい。
2009031351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗異種イムノグロブリン抗体を含んだヒト検体中に含まれるウイルス抗原の検出方法であって、
前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体を担体に固定化する工程と、
前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体に標識物質を標識化する工程とを任意の順序で行い、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体に共通のエピトープであって前記抗異種イムノグロブリン抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを有し、前記抗異種イグノグロブリン抗体が、前記捕獲抗体及び前記検出抗体のＦ（ａｂ´）２領域のエピトープと結合することを阻害する阻止抗体を、前記ヒト検体中に添加して前記抗異種イムノグロブリン抗体と結合させる工程と、
前記ヒト検体を前記捕獲抗体及び前記検出抗体と反応させて前記ウイルス抗原に前記捕獲抗体及び前記検出抗体を結合させる工程とを同時又はこの順序で行い、続いて、
前記ウイルス抗原に結合した前記検出抗体の前記標識物質を検出する工程を行うことを特徴とするウイルス抗原の検出方法。
【請求項２】
前記阻止抗体は、前記ヒト検体中に含まれる前記抗異種イムノグロブリン抗体の量に対して過剰量となるように添加されることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項３】
前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ及びウシから選択される同一の生物種由来の抗体であって、かつ同一のクラス及びサブクラスであることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項４】
前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウスＩｇＧ１抗体であることを特徴とする請求項３に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項５】
前記阻止抗体は、前記ウイルス抗原を含まない抗原を非ヒト生物に免疫し、得られたハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項６】
前記阻止抗体は、ヒト末梢血単核球をマウスに免疫して得られることを特徴とする請求項５に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項７】
前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項８】
抗異種イムノグロブリン抗体を含んだヒト検体中に含まれるウイルス抗原の検出キットであって、
担体に固定化され前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体と、
標識物質で標識化され前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体と、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体に共通のエピトープであって前記抗異種イムノグロブリン抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを有し、前記抗異種イグノグロブリン抗体が、前記捕獲抗体及び前記検出抗体のＦ（ａｂ´）２領域のエピトープと結合することを阻害する阻止抗体と、を含むことを特徴とするウイルス抗原の検出キット。
【請求項９】
前記阻止抗体は、前記ヒト検体中に含まれる前記抗異種イムノグロブリン抗体の量に対して過剰量となるように添加されることを特徴とする請求項８に記載のウイルス抗原の検出キット。
【請求項１０】
前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ及びウシから選択される同一の生物種由来の抗体であって、かつ同一のクラス及びサブクラスであることを特徴とする請求項８に記載のウイルス抗原の検出キット。
【請求項１１】
前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウスＩｇＧ１抗体であることを特徴とする請求項１０に記載のウイルス抗原の検出キット。
【請求項１２】
前記阻止抗体は、前記ウイルス抗原を含まない抗原を非ヒト生物に免疫し、得られたハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項８に記載のウイルス抗原の検出キット。
【請求項１３】
前記阻止抗体は、ヒト末梢血単核球をマウスに免疫して得られることを特徴とする請求項１２に記載のウイルス抗原の検出方法。
【請求項１４】
前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であることを特徴とする請求項８に記載のウイルス抗原の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットに関し、特に、ヒトの検体中に含まれるウイルス抗原を免疫測定法により検出するウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに感染するウイルスによって様々な感染症が引き起こされることが知られている。
例えば、後天性免疫不全症候群（エイズ；ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染によってヘルパーＴ細胞が破壊された結果、免疫能力が極端に低下することにより他の病原体に日和見感染することが原因で罹患する疾病である。なお、ＨＩＶには、ウイルスの起源によりＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の２つのタイプが存在する。【０００３】
従来、ヒト血清等の検体中に含まれるＨＩＶ−１を検出する方法やこれに用いられるキットが知られている（例えば、特許文献１参照）。
この方法やキットでは、ＨＩＶ−１ウイルスのキャプシドタンパクであるｐ２４を抗原として認識して結合するマウス抗体（捕獲抗体）と、同じくＨＩＶ−１  ｐ２４抗原を認識して結合する標識されたマウス抗体（検出抗体）とを用いて、ＨＩＶ−１ウイルスの検出や定量を行っている。【０００４】
この従来のＨＩＶ−１検出方法は以下のとおりである。
まず、ＨＩＶ−１検出用のマイクロプレートに捕獲抗体を含む溶液を塗布し、マイクロプレート表面を担体として捕獲抗体を固定化する。続いて、このマイクロプレート上でヒト検体に検出抗体を加えてサンドイッチ法による反応を行い、検体中に含まれるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と捕獲抗体及び検出抗体との結合反応を行う（図４（ａ））。次に、反応後のマイクロプレートを洗浄して未反応の血清タンパクや検出抗体を除去し、洗浄後のマイクロプレートに基質と発色液を加えて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により標識された検出抗体を定量する。これにより、検出抗体が結合したＨＩＶ−１  ｐ２４抗原（すなわち、ウイルス抗原）を間接的に検出・定量している。【０００５】
市販されているＨＩＶ−１検出キットには、ｐ２４の検出抗体や捕獲抗体の両方あるいは一方にヒト由来の抗ｐ２４抗体を用いているものがある。しかしながら、ヒト由来のｐ２４捕獲抗体や検出抗体は、ＨＩＶ−１感染者の血清から分離精製する必要があるため、一度に大量に抗体を取得することが困難であり、キット製造のコスト上昇を招くという不都合があった。【０００６】
また、同一の感染者から入手できる血清の量は少量で限られているため、複数の感染者から抗体を入手する必要がある。しかしながら、抗体の特性は感染者ごとにばらつきがあるため、検出キットのロットごとに検出精度のばらつきが生じ、正確な検出や定量が困難になるという不都合があった。【０００７】
そこで、特許文献１では、検出抗体や捕獲抗体として、非ヒト由来の生物から産生される抗体を用いている。具体的には、マウス由来のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いている。このように、非ヒト由来のハイブリドーマを樹立して抗体を産生させることで、ヒトの血清中から捕獲抗体や検出抗体を入手する場合と比較して、均一なロットの抗体を大量に入手することが可能となる。これにより、検出感度の安定性向上と検出キット製造のコスト低減を図ることができる。【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／１２６２８７号パンフレット
【特許文献２】特開昭６３−１２９６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、ヒト血清中には、ヒト以外の生物由来のイムノグロブリンに対する抗体（抗異種イムノグロブリン抗体；抗異種Ｉｇ抗体）が多少含まれる場合がある。このような抗異種Ｉｇ抗体が含まれる理由については明らかではないが、自然抗体による交差反応が理由の１つであると考えられる。そしてこのような抗異種Ｉｇ抗体の中には、上述した捕獲抗体や検出抗体と同一の生物種由来の抗体（上の例ではマウス抗体）を認識して結合するものもある。【００１０】
このような血清では、血清中に含まれる抗異種Ｉｇ抗体が捕獲抗体と検出抗体の両方に結合してブリッジを形成することで、見かけ上、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原陽性反応（すなわち、偽陽性反応）を示すことがある（図４（ｂ））。このように、抗異種Ｉｇ抗体を高く有する血清では、偽陽性反応によりＨＩＶ−１の検出精度が低下するという不都合が生じる。【００１１】
ところで、特許文献２には、測定に用いた特定のモノクローナル抗体と同一由来かつ同クラスのモノクローナル抗体（以下、阻止抗体という）を測定系に添加することで、非特異反応を抑制して検出感度を向上させる技術が記載されている。
この文献に記載の阻止抗体は、検出系に用いる抗体（例えば、捕獲抗体や検出抗体）と同クラスのモノクローナル抗体である。
ここで、一般的に、抗体のクラスは、Ｆｃ部に基づいて決定される。したがって、この技術の阻止抗体は、検出系の抗体と同じＦｃ部を有する抗体である（図５参照）。【００１２】
しかしながら、抗異種イムノグロブリン抗体には、大きく分けて抗体のＦｃ部に結合するタイプと、可変部以外のＦａｂ、Ｆ（ａｂ´）２に結合するタイプの２種類が存在する。これら２種類の抗異種イムノグロブリン抗体は、検出系に与える影響の仕方が異なっている。
具体的には、Ｆｃ部に結合するタイプの抗異種イムノグロブリンは、検出系の抗体において抗異種イムノグロブリン抗体に認識される部位（以下、エピトープという）が抗原認識部位である可変部と離れている。このため、抗異種イムノグロブリン抗体が検出系の抗体に結合しても、ブリッジが形成されなければ抗原（例えば、ｐ２４抗原）を介してサンドイッチが形成され、抗原を検出することができる。【００１３】
一方、可変部以外のＦａｂ部、Ｆ（ａｂ´）２に結合するタイプの抗異種イムノグロブリン抗体は、上述したブリッジ形成により偽陽性反応を示す。
さらに、このタイプの抗異種イムノグロブリン抗体が認識する検出系の抗体は、エピトープが可変部の近傍にあるため、抗異種イムノグロブリン抗体が検出系の抗体に結合すると、立体障害により抗原が可変部に結合できなくなる。したがって、抗異種イムノグロブリン抗体が検出系の抗体に単独で結合すると、ブリッジが形成されなくても抗原が検出系の抗体に結合できなくなり、抗原検出を阻害して検出感度を低下させる。【００１４】
本発明の目的は、上記課題に鑑み、非ヒト由来の捕獲抗体や検出抗体を用いた場合でも、偽陽性反応が生じにくく、高い精度でウイルス抗原を検出可能なウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットを提供することにある。【００１５】
また、本発明の他の目的は、特にＦ（ａｂ´）２結合タイプの抗異種イムノグロブリン抗体に対して偽陽性反応を生じにくくすることができるとともに、抗原検出感度の低下を防止することが可能なウイルス抗原の検出方法及びウイルス抗原の検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題は、本発明のウイルス抗原の検出方法によれば、抗異種イムノグロブリン抗体を含んだヒト検体中に含まれるウイルス抗原の検出方法であって、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体を担体に固定化する工程と、前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体に標識物質を標識化する工程とを任意の順序で行い、
前記捕獲抗体及び前記検出抗体に共通のエピトープであって前記抗異種イムノグロブリン抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを有し、前記抗異種イグノグロブリン抗体が、前記捕獲抗体及び前記検出抗体のＦ（ａｂ´）２領域のエピトープと結合することを阻害する阻止抗体を、前記ヒト検体中に添加して前記抗異種イムノグロブリン抗体と結合させる工程と、前記ヒト検体を前記捕獲抗体及び前記検出抗体と反応させて前記ウイルス抗原に前記捕獲抗体及び前記検出抗体を結合させる工程とを同時又はこの順序で行い、続いて、前記ウイルス抗原に結合した前記検出抗体の前記標識物質を検出する工程を行うことにより解決される。【００１７】
この場合、前記阻止抗体は、前記ヒト検体中に含まれる前記抗異種イムノグロブリン抗体の量に対して過剰量となるように添加されることが好ましい。【００１８】
また、前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ及びウシから選択される同一の生物種由来の抗体であって、かつ同一のクラス及びサブクラスであると好適である。【００１９】
さらにこの場合、前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウスＩｇＧ１抗体であることが好ましい。【００２０】
抗異種イムノグロブリン抗体は、捕獲抗体と検出抗体に共通のエピトープとしてこれらの抗体の可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域を認識して結合する。
一方で阻止抗体は、この共通エピトープを可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域に有している。
このため、ヒト検体中に阻止抗体を添加することで、捕獲抗体や検出抗体の可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域に結合するタイプの抗異種イムノグロブリン抗体を阻止抗体に結合させることができる。
したがって、抗異種イムノグロブリン抗体による偽陽性反応を抑制し、ヒト検体中のウイルス抗原を高い精度で検出することができる。
また、可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域に結合するタイプの抗異種イムノグロブリン抗体は、捕獲抗体や検出抗体に単独で結合することによるこれらの抗体と抗原との結合を阻害する。
しかしながら、上述したように可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域をエピトープとして有する阻止抗体をヒト検体中に添加することで、この抗異種イムノグロブリン抗体と阻止抗体とが結合して上述した阻害反応を抑制することができる。
したがって、抗異種イムノグロブリン抗体による抗原検出阻害反応を抑制し、ヒト検体中のウイルス抗原を高い精度で検出することができる。【００２１】
また、前記阻止抗体は、前記ウイルス抗原を含まない抗原を非ヒト生物に免疫し、得られたハイブリドーマから産生されると好適である。【００２２】
この場合、前記阻止抗体は、ヒト末梢血単核球をマウスに免疫して得られると好適である。【００２３】
また、前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であることが好ましい。【００２４】
上記課題は、本発明のウイルス抗原の検出キットによれば、抗異種イムノグロブリン抗体を含んだヒト検体中に含まれるウイルス抗原の検出キットであって、担体に固定化され前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の捕獲抗体と、標識物質で標識化され前記ウイルス抗原と特異的に結合する非ヒト由来の検出抗体と、前記捕獲抗体及び前記検出抗体に共通のエピトープであって前記抗異種イムノグロブリン抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを有し、前記抗異種イグノグロブリン抗体が、前記捕獲抗体及び前記検出抗体のＦ（ａｂ´）２領域のエピトープと結合することを阻害する阻止抗体と、を含むことにより解決される。【００２５】
この場合、前記阻止抗体は、前記ヒト検体中に含まれる前記抗異種イムノグロブリン抗体の量に対して過剰量となるように添加されることが好ましい。【００２６】
また、前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ及びウシから選択される同一の生物種由来の抗体であって、かつ同一のクラス及びサブクラスであると好適である。【００２７】
さらにこの場合、前記捕獲抗体、前記検出抗体及び前記阻止抗体は、いずれもマウスＩｇＧ１抗体であることが好ましい。【００２８】
抗異種イムノグロブリン抗体は、捕獲抗体と検出抗体に共通のエピトープとしてこれらの抗体の可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域を認識して結合する。
一方で阻止抗体は、この共通エピトープを可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域に有している。
このため、ヒト検体中に阻止抗体を添加することで、捕獲抗体や検出抗体の可変部以外のＦａｂ部に結合するタイプの抗異種イムノグロブリン抗体を阻止抗体に結合させることができる。したがって、抗異種イムノグロブリン抗体による偽陽性反応を抑制し、ヒト検体中のウイルス抗原を高い精度で検出することができる。
また、可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域に結合するタイプの抗異種イムノグロブリン抗体は、捕獲抗体や検出抗体に単独で結合することによるこれらの抗体と抗原との結合を阻害する。
しかしながら、上述したように可変部以外のＦ（ａｂ´）２領域をエピトープとして有する阻止抗体をヒト検体中に添加することで、この抗異種イムノグロブリン抗体と阻止抗体とが結合して上述した阻害反応を抑制することができる。
したがって、抗異種イムノグロブリン抗体による抗原検出阻害反応を抑制し、ヒト検体中のウイルス抗原を高い精度で検出することができる。【００２９】
また、前記阻止抗体は、前記ウイルス抗原を含まない抗原を非ヒト生物に免疫し、得られたハイブリドーマから産生されると好適である。【００３０】
この場合、前記阻止抗体は、ヒト末梢血単核球をマウスに免疫して得られると好適である。【００３１】
また、前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）であり、前記捕獲抗体及び前記検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする抗体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のウイルス抗原の検出方法やウイルス抗原の検出キットによれば、抗異種イムノグロブリン抗体は捕獲抗体と検出抗体に共通のエピトープ（Ｆ（ａｂ´）２領域のエピトープ）を認識して結合し、阻止抗体はこのエピトープと同一のエピトープ（Ｆ（ａｂ´）２領域のエピトープ）を有している。
このため、ヒト検体中に阻止抗体を添加することで、抗異種イムノグロブリン抗体を阻止抗体に結合させることができる。
これにより、抗異種イムノグロブリン抗体が捕獲抗体と検出抗体の両方と結合してブリッジを形成することを防止できる。したがって、抗異種イムノグロブリン抗体による偽陽性反応を抑制し、ヒト検体中のウイルス抗原を高い精度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】阻止抗体による抗マウスＩｇＧ抗体の吸収反応を示す模式図。
【図２】ＥＬＩＳＡ法によるＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の検出反応を示す模式図。
【図３】ＨＩＶ−１陰性健常者の血清中に対するｐ２４測定結果を示すグラフ。
【図４】従来のＥＬＩＳＡ法の問題点を示す模式図。
【図５】抗体の各部位を示す模式図。
【図６】実験結果を示すグラフ。
【図７】実験結果を示すグラフ。
【図８】実験結果を示すグラフ。
【図９】実験結果を示すグラフ。
【図１０】実験結果を示すグラフ。
【図１１】実験結果を示すグラフ。
【図１２】実験結果を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明の一実施形態について説明する。なお、以下に説明する部材、配置等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。【００３５】
以下に、ウイルス抗原の一例として、ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１（ＨＩＶ−１）のｐ２４を用いた場合のウイルス抗原の検出方法とウイルス抗原の検出キットについて説明する。なお、本発明におけるウイルスは、ヒトに感染し、検体中に含まれるものであればＨＩＶ−１に限定されない。例えば、同じヒト免疫不全ウイルスであれば、タイプ２（ＨＩＶ−２）でもよい。また、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、パルボウイルスといった他の感染性ウイルスでもよい。【００３６】
また、ヒト検体としては、血清を例にして説明をしている。しかしながら、ヒト検体としては、上記ウイルス抗原や抗異種イムノグロブリン抗体（以下、抗異種Ｉｇ抗体という）が含まれるものであればよく、例えば、リンパ液、組織液、骨髄液、関節液、尿、唾液、膣分泌液、精液などの他の体液や、これらの体液に所定の処理を施したものが挙げられる。【００３７】
本発明のウイルス抗原の検出キットは、担体に固定化された非ヒト由来の捕獲抗体と、標識物質で標識化された非ヒト由来の検出抗体と、ヒト検体中に含まれる抗異種Ｉｇ抗体の認識するエピトープを有する阻止抗体と、を少なくとも含んでいる。このエピトープは、抗異種Ｉｇ抗体が認識する捕獲抗体と検出抗体に共通のエピトープと同一である。【００３８】
そして、ヒト検体に含まれる抗異種Ｉｇ抗体を阻止抗体に結合させて吸収し、抗原であるＨＩＶ−１  ｐ２４を捕獲抗体と検出抗体の両方と反応させてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出する。これにより、抗異種Ｉｇ抗体が捕獲抗体・阻止抗体に結合することによる偽陽性反応を防止し、高い精度でウイルス抗原を検出する点を特徴としている。【００３９】
（捕獲抗体）
捕獲抗体は、非ヒト由来の抗体であり、ヒト検体中に含まれるウイルスを抗原として認識し、特異的に結合する。本実施形態の捕獲抗体は、種々の感染者のＨＩＶ−１に共通する抗原部位としてのコアタンパク質ｐ２４を抗原とし、その一部の領域をエピトープとして特異的に認識し、結合するＨＩＶ−１  ｐ２４抗体である。【００４０】
捕獲抗体は、プラスチックプレートなどの担体に固定化されており、ウイルス抗原と結合することでこれを担体に固定する。プラスチックプレートの材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどであって、捕獲抗体に対する結合性を示すものが挙げられる。本実施形態では、プラスチックプレートと捕獲抗体の抗体分子との間の吸着により捕獲抗体が固定化される。【００４１】
なお、捕獲抗体と担体との固定化は、上述した吸着に限定されず、例えば共有結合性や静電的相互作用により固定化してもよい。
また、捕獲抗体を固定化する担体としては、プラスチックプレートに限定されず、プラスチックチューブ、スライドガラス、樹脂ビーズなどであって捕獲抗体に対して結合性を示す材料でもよい。【００４２】
（検出抗体）
検出抗体は、捕獲抗体と同様に非ヒト由来の抗体であり、ヒト検体中に含まれるウイルスを抗原として認識し、結合する一次抗体である。本実施形態の検出抗体は、上述した捕獲抗体と同様に、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原と特異的に結合するＨＩＶ−１  ｐ２４抗体であるが、捕獲抗体の認識するエピトープとは異なるエピトープを認識して結合する。
すなわち、捕獲抗体と検出抗体は、同じ抗原（この場合はｐ２４）の互いに異なる領域を抗原として認識するものである。【００４３】
捕獲抗体と検出抗体は、ヒト以外の生物（非ヒト生物）由来の抗体であり、かつ同一のクラス／サブクラスを有している。本実施形態で使用される捕獲抗体と検出抗体は、いずれもマウス由来のモノクローナル抗体であり、いずれもクラス／サブクラスはＩｇＧ１である。なお、これらの抗体は、非ヒト由来の抗体であれば由来となる生物種はマウスに限定されず、例えばハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ、ウシなどであってもよい。また、そのサブクラスもＩｇＧ１に限定されず、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３などの他のサブクラスであってもよい。【００４４】
また、本実施形態における捕獲抗体と検出抗体は、いずれもＨＩＶ−１のｐ２４を抗原とする抗体であるが、ＨＩＶ−１の他の領域を抗原として認識する抗体であってもよい。例えば、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０やトランスメンブレムタンパク質ｇｐ４１を認識する抗体であってもよい。【００４５】
本発明における捕獲抗体と検出抗体は、例えば非ヒト由来のハイブリドーマから取得することができる。非ヒト由来のハイブリドーマとして、例えばマウス由来のハイブリドーマを用いる場合以下の手順で取得することができる。
まず精製したＨＩＶ−１  ｐ２４をＢＡＬＢ／ｃマウスに接種して免疫し、抗ＨＩＶ−１  ｐ２４抗体を産生する組織、例えば脾臓細胞を採取する。次に、得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（例えば、ＳＰ−２／０）を、ポリエチレングリコールを利用した公知の細胞融合法を用いて細胞融合し、複数種のハイブリドーマを樹立する。【００４６】
続いて、得られたハイブリドーマから産生される抗体のうち、ＨＩＶ−１  ｐ２４と反応する抗体を、精製ＨＩＶ−１  ｐ２４を抗原とする酵素免疫反応法（ＥＬＩＳＡ法）により選別する。
さらに、選別されたハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した後、得られた腹水を取得して硫安塩析法とゲルろ過法で処理する。これにより、ｐ２４抗原に特異的な抗体を得ることができる。
なお、脾臓細胞とミエローマ細胞の融合は、上述のようにポリエチレングリコールを用いた方法に限定されず、センダイウイルスを用いる方法や電気処理による方法であってもよい。【００４７】
本実施形態の検出抗体には、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が標識物質として標識化されている。標識化された検出抗体は、抗体分子（マウスＩｇＧ分子）にＨＲＰが共有結合している。検出抗体の標識化は、公知の方法、例えば過ヨウ素酸法、マレイミド法、グルタルアルデヒド法などにより行うことができる。【００４８】
なお、本実施形態では、標識分子としてペルオキシダーゼを用いているが、検出抗体に結合する標識分子は、上述したペルオキシダーゼに限定されず、検出系に応じて他の分子を用いてもよい。例えば、アルカリホスファターゼなどの他の酵素、ＦＩＴＣ、ビオチン、金コロイドなどを標識化してもよい。【００４９】
さらに、本実施形態のウイルス抗原の検出キットでは、ビオチン標識化チラミンによる信号増幅システムを用いて、標識化された検出抗体の検出感度を向上させている。
ビオチン標識化チラミンは、ビオチンにチラミンが共有結合した分子である。検出溶液中に過酸化水素を加えると、検出抗体に結合したペルオキシダーゼはこれを基質として酸素を発生する。チラミンは、発生した酸素により酸化され、タンパク質と結合する性質を有している。ＨＲＰ標識された検出抗体では、ペルオキシダーゼの近傍で過酸化水素が還元されて酸素が発生する。この発生した酸素によりチラミンが酸化され、ペルオキシダーゼ自身やその近傍の検出抗体、ｐ２４やブロッキング処理タンパクと結合する。
１分子のペルオキシダーゼに対して数倍量のチラミンがペルオキシダーゼ等に結合し、その結合量はペルオキシダーゼの量に比例する。すなわち、検出抗体１分子に対して数倍のビオチン標識化チラミンをプレート上に結合させることができる。【００５０】
検出抗体等に結合したビオチン標識化チラミンは、ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを用いて定量することができる。すなわち、ここではビオチンとストレプトアビジンとの特異的結合反応を利用している。【００５１】
ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンの定量は、過酸化水素を基質、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を発色剤とし、この発色剤の吸収波長（４５０ｎｍ）における吸光度を測定することで行うことができる。
以上の信号増幅システムを用いることで、検出抗体１分子あたりの検出感度を数倍に増幅することができる。したがって、この増幅システムを用いない従来の方法と比較して、ｐ２４の検出感度を約１０倍以上向上させることが可能となる。【００５２】
捕獲抗体は、上述した実施形態のようにｐ２４と直接結合して固定化するものであってもよく、他の分子（例えば担体に固定化された抗体）を介して間接的に結合して固定化するものでもよい。
同様に、検出抗体についても、ｐ２４と直接結合して標識化するものであってもよく、他の分子（例えば、標識化された二次抗体）を介して間接的に結合して標識化するものでもよい。【００５３】
（阻止抗体）
次に、本発明の阻止抗体とこれに結合する抗異種Ｉｇ抗体について説明する。阻止抗体は、ヒト検体中に含まれる抗異種Ｉｇ抗体と結合し、吸収するための抗体である。
抗異種Ｉｇ抗体は、上述した捕獲抗体と検出抗体の両方に共通のエピトープを認識し、結合する抗体である。この抗異種Ｉｇ抗体は、捕獲抗体と検出抗体の両方に結合してＨＩＶ−１偽陽性反応を示す。【００５４】
阻止抗体は、この共通のエピトープと同一のエピトープを分子内に有する抗体であり、抗異種Ｉｇ抗体により認識・結合される。このため、ヒト検体中に阻止抗体を加えることで、抗異種Ｉｇ抗体が阻止抗体に特異的に結合し、この結果、抗異種Ｉｇ抗体が吸収される。すなわち、抗異種Ｉｇ抗体は、阻止抗体と結合することで捕獲抗体や検出抗体と結合できなくなる。このため、抗異種Ｉｇ抗体による捕獲抗体と検出抗体との間のブリッジ形成を阻止することができる。【００５５】
阻止抗体は、捕獲抗体と検出抗体の由来となる生物種と同一の生物種から得ることができる。阻止抗体のクラス及びサブクラスは、捕獲抗体及び検出抗体と同一である。例えば、捕獲抗体と検出抗体がマウスＩｇＧ１であれば、阻止抗体もマウスＩｇＧ１となる。
なお、阻止抗体は、検出対象となるウイルス抗原と全く結合しないものが好ましい。阻止抗体がウイルス抗原を認識して結合すると、捕獲抗体や検出抗体のウイルス抗原への結合を阻害することがあり、この場合はウイルス抗原の正確な検出や定量が困難となるためである。【００５６】
阻止抗体は、ハイブリドーマ法により取得する方法や、マウス血漿中から直接取得する方法により得ることができる。
ハイブリドーマ法により取得する方法では、阻止抗体を産生するハイブリドーマを樹立して阻止抗体を産生させる。
例えば、阻止抗体としてマウスＩｇＧ１抗体を用いる場合、検出対象であるウイルス抗原と無関係な適当な抗原をマウスに免疫し、得られたマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合することで、マウスＩｇＧ１を産生するハイブリドーマを作製する。【００５７】
また、マウス血漿中から直接取得する方法では、検出対象であるウイルス抗原とは無関係な抗原を適宜選択してマウスを免疫し、この免疫マウスの腹水や血清からクロマトグラフィー法などを用いてマウスＩｇＧ１抗体を精製する。クロマトグラフィー法としては、イオン交換クロマトグラフィー、分子吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィーを１又は２以上組み合わせて行う方法が挙げられる。【００５８】
阻止抗体の量としては、抗異種Ｉｇ抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）の量に対して過剰量となるように添加されることが好ましい。阻止抗体の量が抗マウスＩｇＧ抗体に対して過剰量となることで、抗マウスＩｇＧ抗体のほとんどが阻止抗体と結合して吸収されるためである。
阻止抗体の量としては、具体的には、抗異種Ｉｇ抗体１分子に対して５倍量以上、好ましくは１０倍量以上、より好ましくは５０倍量以上となるように添加されることが好ましい。一方、阻止抗体の量の上限としては、特には限定されないが、あまりに多すぎるとコスト面で負担が大きくなる。したがって、好ましくは１００００倍量以下、より好ましくは１０００倍量以下、特に好ましくは１００倍量以下とするとよい。【００５９】
（ウイルス抗原の検出キット）
以下に、本発明のウイルス抗原の検出キットの１つの実施形態を示す。本実施形態のウイルス抗原の検出キットは、以下の材料から構成されている。
・マイクロプレート
・抗原・抗体希釈液
・洗浄液
・ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体（捕獲抗体）
・ＨＩＶ−１  ｐ２４標準液（界面活性剤処理可溶化ウイルス）
・ＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体（検出抗体）
・マウスＩｇＧ（阻止抗体）
・ビオチン標識化チラミン
・ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン
・過酸化水素水
・発色剤（例えばテトラメチルベンチジン）
・停止液（硫酸）【００６０】
（ウイルス抗原の検出方法）
次に、上記のウイルス抗原の検出キットを用いたウイルス抗原の検出方法について説明する。
まず、マイクロプレートのウエルに捕獲抗体溶液を載せ、マイクロプレート表面に捕獲抗体を吸着させて固定化する。マイクロプレート表面のうち捕獲抗体が吸着していない領域には、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の吸着を防止するため、スキムミルクなどのブロッキング液でブロッキングする。
また、ＨＲＰで標識化された検出抗体を準備する。ＨＲＰの標識化は、上述した過ヨウ素酸法などの公知の手法で行うことができる。なお、捕獲抗体の固定化とｐ２４検出抗体のＨＲＰ標識化は、任意の順序で行うことができる。【００６１】
一方、ヒト検体（例えば血清）中にはＨＩＶ−１  ｐ２４の他に抗マウスＩｇＧ抗体（抗異種Ｉｇ抗体）が含まれている（図１（ａ））。このヒト検体に過剰量の阻止抗体を混合し、反応させると（図１（ｂ））、抗マウスＩｇＧ抗体が阻止抗体に結合し、吸収される。阻止抗体を抗マウスＩｇＧ抗体に対して過剰量含まれるように添加すると、ヒト検体中に含まれる抗マウスＩｇＧ抗体のほとんどが阻止抗体と反応して吸収されるため好ましい。【００６２】
なお、吸収された抗マウスＩｇＧ抗体は、ヒト検体中に含まれていても捕獲抗体や検出抗体と反応しないため、反応後のヒト検体をウイルス抗原の検出反応にそのまま用いることができる。【００６３】
次に、阻止抗体反応後のヒト検体をマイクロプレートのウエルに載せ、抗原抗体反応によりマイクロプレートの表面に固定された捕獲抗体とｐ２４とを結合させる。これと同時にあるいはこれに続けて、ＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体をウエルに載せ、抗原抗体反応によりｐ２４と検出抗体とを反応させる（図２（ｃ））。反応後のマイクロプレートを洗浄し、血清タンパクや未反応のｐ２４と検出抗体を除去する。
また、濃度既知のｐ２４標準液を段階的に希釈して異なる濃度の標準液を複数準備し、マイクロプレートのウエルに載せる。【００６４】
次に、ビオチン標識化チラミンと基質としての過酸化水素を添加し、ペルオキシダーゼと過酸化水素を反応させる。反応により生じた酸素によりビオチン標識化チラミンのチラミンと検出抗体やその近傍のｐ２４あるいはブロッキング剤とが反応し、結合する（図２（ｄ））。この反応では、ペルオキシダーゼ１分子につき複数のビオチン標識化チラミンが結合する。【００６５】
洗浄後、続いて、ＨＲＰ標識化ストレプトアビジンを添加し、ビオチン標識化チラミンのビオチンとストレプトアビジンとを結合させる。
次に、発色剤（ＴＭＢ）を添加し、ＨＲＰ標識化ストレプトアビジンのペルオキシダーゼと反応させて青色に発色させる。発色量は、ＨＲＰ標識化ストレプトアビジンの量に比例する。最後に、停止剤（硫酸）を混合し、発色反応を停止させる。
発色剤による発色を波長４５０ｎｍの吸光度で測定する。この吸光度は、ＨＩＶ−１  ｐ２４の濃度に比例する。ｐ２４標準液の濃度と吸光度に基づいて検量線を作成し、この検量線とヒト検体の吸光度からヒト検体中に含まれるｐ２４の濃度を定量することができる。【００６６】
以上の一連の工程で、ウイルス抗原を検出することができる。なお、ヒト検体への阻止抗体の添加は、マイクロプレートにヒト検体を載せる前に行っても載せるのと同時に行ってもよい。阻止抗体をヒト検体に添加するタイミングを載置前とすることで、マイクロプレートに載せる前にヒト検体中の抗異種Ｉｇ抗体を予め阻止抗体で吸収することができる。一方、マイクロプレートにヒト検体を載せるのと同時に阻止抗体を添加することで、事前に阻止抗体を添加する作業が不要となり、操作が簡便になる。
なお、阻止抗体はヒト検体中に過剰に含まれても検出系にほとんど影響を及ぼさないため、本発明の検出キットは、抗異種Ｉｇ抗体を含むヒト検体のみならず、抗異種Ｉｇ抗体を含まないヒト検体であってもウイルス抗原を検出できることは言うまでもない。
【実施例】
【００６７】
以下に、本発明のウイルス抗原の検出方法とウイルス抗原の検出キットについて、具体的な実験例を示して詳細に説明する。【００６８】
１．捕獲抗体・検出抗体の作製
以下の手順で捕獲抗体と検出抗体を作製した。なお、作製方法は、国際公開第ＷＯ２００６／１２６２８７号パンフレットに記載されている方法とほぼ同様である。【００６９】
＜免疫＞
市販の精製リコンビナント  ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原  １ｍｇ／ｍｌ（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製：ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４  ５０μｌ／ｔｕｂｅ）とフロイント完全アジュバントと等量混合し、エマルジョン状態でマウス皮下に接種し、感作を行った。さらに２週間後、同量の濃縮ＨＩＶ−１をフロイント完全アジュバントと等量混合し、マウス皮下に免疫をした。この免疫操作を２週間おきに３回繰り返した。最終免疫の２週間後に、同量の濃縮ＨＩＶ−１をマウスの腹腔内に接種し、その３日後に脾臓を無菌的に摘出した。【００７０】
＜細胞融合＞
マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０を１０％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で対数的に増殖させ、洗浄した。
一方、上記で摘出されたマウス脾臓は、ステンレスメッシュで裏ごしして細胞浮遊液とし、この細胞浮遊液と増殖したマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０とを４：１の比率でポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）を用いて細胞融合した。
融合細胞の混合液を９６ウエルマイクロプレートに播き込み、ハイブリドーマの選択を行った。ハイブリドーマの選択には、市販のＨＡＴ選択培地を用いた。すなわち、３日ごとにマイクロプレートの培地交換を行い、融合後１４〜２１日に培養中に出現した融合細胞コロニーの培養上清を、以下に述べる蛍光抗体法でスクリーニングした。【００７１】
＜スクリーニング＞
ＨＩＶ−１感染細胞を１５穴スライドグラスに塗抹し、乾燥後にエタノールで固定して用いた。次いで、各穴で、抗体サンプルと反応させ、３０分後に洗浄した。さらに、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを室温にて３０分間反応させた。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いてｐ２４に結合する抗体をスクリーニングした。【００７２】
＜クローニングとＩｇクラスの決定＞
抗体産生ウエル中のハイブリドーマは、常法に従ってマウス胸腺細胞をフィーダー細胞とする限界希釈法で２回クローニングした。最終クローニング後の培養上清に含まれる抗体のＩｇクラスとサブクラスの決定は、市販のヤギ抗マウスＩｇキットを用いてＥＬＩＳＡ法で行った。クラス及びサブクラスは、捕獲抗体及び検出抗体ともにＩｇＧ１であった。【００７３】
＜抗体の大量調製と精製＞
市販のＢＡＬＢ／ｃマウスに０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内に投与し、１週間後に上記で得たハイブリドーマ約５００万個を腹腔移植し、１０日後に腹水を得た。この腹水をプールし、１５０００回転／１０分間の遠心により細胞を沈殿させ、得られた上清をさらに１０μｍのフィルターでろ過し、ろ液を５０％飽和硫酸により沈殿させた。得られた沈査をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２００を用いるゲルろ過法によりＩｇＧ分画を調製した。抗体の濃度は、ＯＤ２８０にて推定した。
以上の方法により数種類の抗ＨＩＶ−１  ｐ２４抗体を産生するハイブリドーマを得た。その中で、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により高感度にＨＩＶ−１  ｐ２４の測定を可能とする組合せを選択し、一方を捕獲抗体、他方を検出抗体とした。【００７４】
２．阻止抗体の作製
以下の手順で阻止抗体を作製した。なお、作製方法の大筋は上述した「捕獲抗体・検出抗体の作製」に記載されている方法と同様であるが、抗原としてＨＩＶ−１  ｐ２４を用いずに活性化ヒト末梢血単核球を用いる点で相違する。【００７５】
＜免疫＞
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＨＡ（インゲン豆レクチン）で３日間刺激したヒト末梢血液単核球（ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ）で免疫した。具体的には、１千万個のＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを０．５ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝液）に浮遊させ、５匹のマウスの腹腔内にそれぞれ注射した。２週間後、４週間後に同量のＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを同様な方法で注射し、再度免疫した。最終免疫から３日後にすべてのマウスの脾臓を無菌的に摘出した。【００７６】
＜細胞融合＞
常法に従って免疫脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０とをＰＥＧを用いて融合した。ＳＰ２／０は、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で対数的に増殖させた。
一方、上記で摘出されたマウス脾臓は、ステンレスメッシュで裏ごしして細胞浮遊液とし、３回洗浄した後、この細胞浮遊液とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０とを４：１の比率でＰＥＧ４０００を用いて細胞融合した。
融合細胞の混合液を９６ウエルマイクロプレートに１ウエルあたり約３０万個となるように播き込み、ハイブリドーマの選択のために、市販のＨＡＴ選択培地を翌日から加えた。３日ごとに半量の培地交換を行い、融合後１４日〜２１日に出現した融合細胞コロニーの培養上清を、以下の述べる蛍光抗体法でスクリーニングした。【００７７】
＜スクリーニング＞
ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣと非活性化ＰＢＭＣとを別々の１５ウエルスライドガラス（大日本製薬社製）に塗抹し、風乾後、１００％エタノールで２０℃、１０分間固定した。スライドガラスの各ウエルにサンプルを載せ、室温で３０分間反応させ、その後緩やかに洗浄した。次に、市販のＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体ＩｇＧ（１／１００希釈）を載せ、室温で３０分間さらに反応させた。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いてＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを染色し、非活性化ＰＢＭＣは染色しない抗体をスクリーニングした。ヒトＯＸ４０に対する反応性は、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ細胞の可溶化物を抗原として作製し、ウエスタンブロット法で確かめた。【００７８】
＜クローニングとＩｇクラス決定＞
抗体産生ウエルのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地を含まない一般培地で増殖させ、常法に従ってマウス胸腺細胞をフィーダーとする限界希釈法で２回クローニングした。最終クローニング後の培養上清に含まれる抗体のＩｇクラスとサブクラスの決定は、市販のヤギ抗マウスＩｇを用いるキットを用いて、ＥＬＩＳＡ法で判定した。クラス及びサブクラスはＩｇＧ１であった。【００７９】
＜抗体の大量調製と精製＞
市販のＢＡＬＢ／ｃマウスに０．５ｍｌのプリスタンを腹腔投与し、１週間後にハイブリドーマ約５００万個を腹腔移植し、１０日後に腹水を得た。この腹水をプールし、１５０００回転、１０分間の遠心で細胞を沈殿させた上清を、さらに１０μｍのフィルターでろ過したものに、等量の１００％飽和硫酸アンモニウムを加え（５０％飽和）、遠心により沈殿させた。沈査をＰＢＳに溶解させ、０．４５μｍのフィルターでろ過し、次にＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２００を用いたゲルろ過法により、ＩｇＧ分画を得た。抗体の濃度は、ＯＤ２８０にて推定した。【００８０】
３．ウイルス抗原の検出キットの調製
得られた各種抗体を用いてウイルス抗原の検出キットを作製した。ウイルス抗原の検出キットは以下の試薬からなる。
（１）９６ウエルマイクロプレート（カセット方式）
（２）ＨＩＶ−１  ｐ２４捕獲抗体（３００μｇ／ｍｌ、０．００２％チメロサールを含むＰＢＳ）
（３）抗原・抗体希釈液（０．１％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００２％チメロサールを含む１×ＰＢＳ）
（４）抗体塗布希釈液（２％トレハロース、０．００２％チメロサールを含む１×ＰＢＳ）
（５）抗原・抗体希釈液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＢＳＡ、０．００２％チメロサールを含むＰＢＳ）
（６）ＨＩＶ−１  ｐ２４標準液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した可溶化ウイルス）１０００ｐｇ／ｍｌ
（７）ＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体（１０μｇ／ｍｌ：  １％ＢＳＡ、０．００２％チメロサールを含むＰＢＳ）
（８）増感溶液（２０×ＰＢＳ）
（９）増感試薬（チラミンとして２．５ｍｇ／ｍｌを含むビオチン標識化チラミン）
（１０）０．０１％過酸化水素水
（１１）ＨＲＰ標識化ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ社製  Ｓ−２４３８  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  １ｍｇ／ｍｌ）
（１２）プレート洗浄剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）
（１３）基質液（１倍濃縮）
（１４）発色剤（１ｍｇ／ｍｌ  ＴＭＢを含むジメチルホルムアミド）
（１５）停止液（２Ｎ  硫酸）
（１６）プレートシール【００８１】
４．阻止抗体による偽陽性反応の抑制実験
上記のウイルス抗原の検出キットを用いて偽陽性反応の抑制実験を行った。ヒト検体としてＨＩＶ−１陰性の健常者から採取した血清を用い、阻止抗体を添加した場合（実施例１〜３）と添加しない場合（比較例１）とでウイルス抗原の検出実験を行い、得られた値を評価した。ウイルス抗原の検出方法は以下の手順で行った。【００８２】
まず、必要な量の捕獲抗体希釈液に１／１００量の捕獲抗体を加え、静かに混合し、９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに５０μｌずつ注入した。注入後のマイクロプレートの端を軽くタッピングし、捕獲抗体溶液をまんべんなくウエル上に広げた。【００８３】
プレートシールを用いてマイクロプレートをシールし、３７℃で１時間反応させた。次に、反応後のマイクロプレートの各ウエルにブロッキング液を添加し、プレートシールを用いて再度シールし、３７℃で３０分間反応させた。プレート洗浄緩衝液を作製し、ブロッキング反応後のマイクロプレートを５回洗浄した。【００８４】
次に、ＨＩＶ−１陰性健常者の血清５０μｌに、最終濃度が２．５μｇ／ｍｌ（実施例１）、５．０μｇ／ｍｌ（実施例２）、１０．０μｇ／ｍｌ（実施例３）となるように阻止抗体を添加し、マイクロプレートの各ウエルに直ちに注入した【００８５】
必要量の抗原抗体希釈液に１／１００量のＨＲＰ標識化ｐ２４検出抗体を加え、静かによく混和し、全ウエルに５０μｌずつ分注した。次に、分注後のマイクロプレートをプレートシールでシールし、室温で１時間反応させた。
反応後のマイクロプレートを洗浄し、必要量の増感溶液に１／１００量の増感試薬（ビオチン標識化チラミン）と１／１００量の過酸化水素水を順に添加後、静かによく混和し、全ウエルに１００μｌずつ分注した。【００８６】
分注後のマイクロプレートをプレートシールでシールし、室温で３０分間反応させた。次に、反応後のマイクロプレートを洗浄し、１／１００００量のＨＲＰ標識化ストレプトアビジン（終濃度０．１μｇ／ｍｌ）を添加後、静かによく混和し、全ウエルに１００μｌずつ分注した。
分注後のマイクロプレートをプレートシールで再度シールし、室温で３０分間反応させた。反応後のマイクロプレートを洗浄し、１／１００量の発色剤を添加後、静かによく混和し、全ウエルに１００μｌずつ分注した。【００８７】
室温で１０分間遮光静置し、１５分後、各ウエルに停止液を５０μｌずつ添加し、プレート吸光度計（大日本製薬社製プレートリーダ）で波長４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。【００８８】
表１と図３に、ＨＩＶ−１陰性健常者の血清中に対するｐ２４抗原をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す。４種類の阻止抗体濃度（０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ）につき、それぞれ３種類のサンプル（＃１〜＃３）について測定を行った。表中の数値はＯＤ４５０での吸光度である。
【表１】
2009031351.tif 000003
【００８９】
表１と図３を見ると、阻止抗体を加えなかった場合（比較例１）では、ＨＩＶ−１陰性健常者のサンプルであるにもかかわらずＯＤ４５０で０．２２０〜０．２５９程度の値が検出された。これは、ＨＩＶ−１の濃度で１０〜２０ｐｇ／ｍｌに対応する値であり、偽陽性によりＨＩＶ−１が検出されたことを示している。
一方、阻止抗体を加えた場合（実施例１〜３）では、ＯＤ４５０の値が０．００４〜０．０２９の範囲とかなり低いことがわかる。すなわち、阻止抗体を加えることで、偽陽性反応が抑制されたことがわかる。【００９０】
特に、阻止抗体の濃度が２．５μｇ／ｍｌ（実施例１）ではＯＤ４５０の値が０．０１６〜０．０２９であったのに対して、５．０μｇ／ｍｌ（実施例２）では０．００４〜０．０１１であり、１０．０μｇ／ｍｌ（実施例３）では０．００６〜０．０１８と、いずれの実施例も実施例１と比較して低い値となっている。このことから、阻止抗体の濃度は２．５μｇ／ｍｌ以上であることがより好ましいことがわかる。【００９１】
次に、ＨＩＶ−１陽性患者の血清をサンプルとし、ｐ２４抗体の濃度を変化させて阻止抗体なし（比較例２）と阻止抗体あり（実施例４）の場合でサンプルのｐ２４濃度を測定し、測定への阻止抗体の影響について評価した。
測定方法は、上記「阻止抗体による偽陽性反応の抑制実験」で述べた方法と同様である。【００９２】
表２に測定結果を示す。上記と同様に、実施例４と比較例２について、それぞれ３種類のサンプルで測定を行った。表中の数値はＯＤ４５０での吸光度である。なお、ＯＤ値が２．０以上は推定値である。
【表２】
2009031351.tif 000004
【００９３】
阻止抗体あり（実施例４）と阻止抗体なし（比較例２）とを比較すると、ｐ２４のそれぞれの濃度において阻止抗体あり（実施例４）の方が阻止抗体なし（比較例２）のサンプルよりも数値が若干低いものの、両者の違いがほとんど見られないことがわかる。また、特にｐ２４の濃度が０．７８〜１２．２５ｐｇ／ｍｌの範囲内では、実施例４、比較例２ともに濃度とＯＤ値との間に直線性が見られる。このことから、阻止抗体は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗体の検出や定量にほとんど影響を与えないことがわかった。【００９４】
５．抗異種イグノグロブリン抗体の阻止抗体認識部位に関する実験
抗異種イグノグロブリン抗体が阻止抗体を認識する過程において、この阻止抗体の立体構造が反応特異性に寄与するか否かの実験を行った。
阻止抗体は、熱処理した阻止抗体及び非処理の阻止抗体を準備した。
熱処理は、１００℃で３分行った。
実験方法等は、熱処理した阻止抗体と、非処理の阻止抗体を使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図６に示す【００９５】
図６に示すように、熱処理した阻止抗体では、非処理の阻止抗体が示すような、疑陽性反応を阻害する効果はない。
つまり、熱処理され、立体構造が変化した阻止抗体には、もはや疑陽性反応を阻止することはできない。
換言すれば、阻止抗体の反応には、立体構造が関与していることが示される。【００９６】
６．認識部位に関する実験
次いで、阻止抗体の認識部位を特定するために、プロテアーゼであるＦｉｃｉｎにより分解したＩｇＧ分画を使用して実験を行った。
阻止抗体をＦｉｃｉｎ分解すると、Ｆ（ａｂ´）２領域とＦｃ領域とに分解される。
このように分解した阻止抗体と、未分解阻止抗体を用いて実験を行った。
実験方法等は、Ｆｉｃｉｎ分解した阻止抗体と、未分解の阻止抗体を使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図７に示す。【００９７】
図７に示すように、Ｆｉｃｉｎ分解した阻止抗体と、未分解の阻止抗体とでは、同様の疑陽性反応阻害効果を示すことがわかる。
つまり、Ｆ（ａｂ´）２領域とＦｃ領域いずれかに、特異的結合部位が存在し、疑陽性阻止機能があることがわかる。【００９８】
７．疑陽性阻止機能部位の特定実験
次いで、１ｍＭ  ｃｙｓｔｅｉｎ存在下で、Ｆｉｃｉｎ分解した阻止抗体のＦ（ａｂ´）２領域とＦｃ領域のどちらに、疑陽性阻止機能があるかを検討する実験を行った。
Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域と、Ｆｉｃｉｎ未分解の阻止抗体と、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦｃ領域とＦｉｃｉｎ未分解の阻止抗体との混合物と、を使用して実験を行った。
実験方法等は、Ｆｉｃｉｎ分解した阻止抗体と、未分解の阻止抗体を使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図８に示す。【００９９】
図８に示すように、Ｆｉｃｉｎにより分解して得たＦ（ａｂ´）２領域は、未分解の阻止抗体と同様に疑陽性反応を阻害することがわかった。
同時に調整されるＦｃ領域とＦｉｃｉｎ未分解の阻止抗体との混合物も阻害活性を示したが、これは、未分解の阻止抗体の影響と考えられる。【０１００】
８．Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域の阻害活性確認実験１
次いで、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域が阻害活性を示すことを確認するための実験を行った。
阻止抗体として使用した抗体は、未分解の阻止抗体（上記抗体と同様にヒト抗原ＯＸ４０を認識する抗体であるが、区別のため、以下「ＩｇＧ１」と記す）、未分解の阻止抗体（ヒトＩＬ−２Ｒを認識する抗体であり、区別のため、以下「ＩｇＧ２ａ」と記す）、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域（ＩｇＧ１を分解したものであるが、区別のため、以下「ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２」と記す）、である。
実験方法等は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２を使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図９に示す。【０１０１】
図９に示すように、ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａと同様に、疑陽性反応を阻害することがわかった。【０１０２】
９．Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域の阻害活性確認実験２
次いで、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域が阻害活性を示すことを確認するための実験を、上記阻害活性確認実験１と別のドナーにより行った。
阻止抗体として使用した抗体は、未分解の阻止抗体（上記抗体と同様にヒト抗原ＯＸ４０を認識する抗体であるが、区別のため、以下「ＩｇＧ１」と記す）、未分解の阻止抗体（ヒトＩＬ−２Ｒを認識する抗体であり、区別のため、以下「ＩｇＧ２ａ」と記す）、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域（ＩｇＧ１を分解したものであるが、区別のため、以下「ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２」と記す）、である。
実験方法等は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２を使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図１０に示す。【０１０３】
図１０に示すように、ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａと同様に、疑陽性反応を阻害することがわかった。【０１０４】
１０．Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域の阻害活性確認実験２
次いで、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域が阻害活性を示すことを確認するための実験を、上記阻害活性確認実験１及び阻害活性確認実験２と別のドナーにより行った。
阻止抗体として使用した抗体は、未分解の阻止抗体（上記抗体と同様にヒト抗原ＯＸ４０を認識する抗体であるが、区別のため、以下「ＩｇＧ１」と記す）、未分解の阻止抗体（ヒトＩＬ−２Ｒを認識する抗体であり、区別のため、以下「ＩｇＧ２ａ」と記す）、Ｆｉｃｉｎ分解して得たＦ（ａｂ´）２領域（ＩｇＧ１を分解したものであるが、区別のため、以下「ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２」と記す）、である。
実験方法等は、阻止抗体として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２を使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図１１に示す。【０１０５】
図１１に示すように、ＩｇＧ２ａには、疑陽性反応の阻害効果はなく、逆に疑陽性反応を促進することがわかる。
しかし、ＩｇＧ１Ｆ（ａｂ´）２は、ＩｇＧ１と同様に、疑陽性反応を阻害することがわかった。【０１０６】
１１．精製Ｆ（ａｂ´）２領域の阻害活性確認実験
次いで、精製商品であるＦ（ａｂ´）２領域、Ｆａｂ領域、Ｆｃ領域、及び市販品であるマウスＩｇＧ、を使用して、阻害活性を確認する実験を行った。
実験方法等は、阻止抗体として、精製商品であるＦ（ａｂ´）２領域、Ｆａｂ領域、Ｆｃ領域、及び市販品であるマウスＩｇＧを使用する他は、上記と同様であるため、説明を省略する。
結果を図１２に示す。【０１０７】
図１２に示すように、Ｆ（ａｂ´）２領域は、ＩｇＧ同様に、疑陽性反応を阻害することがわかった。
また、この阻害効果は、Ｆａｂ領域よりも高いことがわかる。
更に、Ｆｃ領域には、疑陽性反応の抑制効果はないことが示された。【０１０８】
以上のように、阻止抗体を加えることで、偽陽性反応が抑制されることがわかるが、この抑制効果は、阻止抗体の立体構造が関与していることがわかる。
つまり、抗異種イムノグロブリン抗体は、阻止抗体の立体構造を認識して結合することがわかった。
この抗異種イムノグロブリン抗体が認識する部位は、阻止抗体のＦｃ領域ではなく、Ｆ（ａｂ´）２領域であることがわかった。
なお、阻止抗体としてＩｇＧ２ａを使用した実験においては、このＩｇＧ２ａが疑陽性を促進することが確認された。
つまり、マウス由来の別の抗体が混入することによって、抗異種イムノグロブリン抗体の選択性が撹乱される可能性が示唆された。
よって、疑陽性反応を阻止するためには、ＨＩＶ−１  ｐ２４に反応しないＩｇＧ１を選択するだけでは不十分であり、実際に試験をして疑陽性を抑制する抗体を適確に選別する必要性がある。
このように選択された抗体のＦ（ａｂ´）２領域を阻止抗体として使用することによって、有効に疑陽性を抑制することができると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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