(57)【要約】  脳虚血障害治療剤は、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。脳虚血障害治療剤は、経静脈投与用の注射剤の剤型を有することが好ましい。水性注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を、好ましくは０．３〜３．５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．６〜２．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする脳虚血障害治療剤。
【請求項２】
経静脈投与用注射剤の剤型を有する請求項１に記載の脳虚血障害治療剤。
【請求項３】
脳虚血障害治療剤は水性であり、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を０．３〜３．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する請求項２に記載の脳虚血障害治療剤。
【請求項４】
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を０．６〜２．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する請求項３に記載の脳虚血障害治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳虚血障害治療剤に係り、詳しくは、溶媒溶解性の高いＬ−ヒスチジン誘導体を有効成分として含有する脳虚血障害治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高カロリー食の摂取や飲酒、喫煙、運動不足、ストレス等の悪い生活習慣が原因で発症する肥満や高血圧、高血糖、高脂血症等の生活習慣病が知られている。生活習慣病は、脳梗塞や心筋梗塞等の成人病の原因と考えられている。成人病の中でも脳梗塞は、身体障害や言語障害、痴呆症状といった後遺症が病後に残ることが多いというのが現状である。【０００３】
脳梗塞とは、例えば、脳動脈が血栓で閉塞したりあるいは硬化して狭窄したりすることにより、脳虚血が生じ、脳組織への酸素及び栄養の供給が不足する結果、脳組織が壊死（ネクローシス）又はそれに近い状態に陥る疾患である。脳梗塞においては、脳虚血状態から脱したときにフリーラジカルが発生し、それが周辺の脳組織のさらなる壊死を引き起こすことにより、脳虚血障害がさらに進行することが知られている。【０００４】
脳虚血障害の治療は２つに大別される。１つは、例えば血栓の溶解及び血管の拡張により血流を再開させること、もう１つは、フリーラジカルや腫脹による脳組織の壊死の進行を阻止することである。いずれも薬物療法が主流であるが、前者では、例えば血栓溶解剤や血小板凝集抑制剤が使用され、後者では、例えばフリーラジカルスカベンジャーや抗浮腫剤が使用される。脳梗塞の予後を良好なものにするためには、血流の再開と壊死の進行阻止という２つの治療を組み合わせて行なうことが必要であるが、とりわけ壊死の進行を阻止することは重要である。【０００５】
しかしながら、壊死の進行を阻止して脳障害を抑える薬剤は限られており、副作用の問題もある。脳保護剤としてフリーラジカルスカベンジャーであるエダラボン（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）が知られているが、エダラボンは、肝機能障害や腎機能障害といった副作用を高率でもたらすという問題を有している。そこで、副作用の少ない脳虚血障害治療剤が幅広く探索されている。【０００６】
例えば、特許文献１には、アミノ酸の一つであるＬ−ヒスチジンが、脳虚血障害の抑制効果を示すことが記載されている。ただし、Ｌ−ヒスチジンには、遊離のＬ−ヒスチジンの水（２５℃）への溶解度が４．３ｇ／ｄＬ（０．２８ｍｏｌ／Ｌ）と低いという問題がある。血中のＬ−ヒスチジン濃度を速やかに上昇させるためには経静脈投与が望ましいが、Ｌ−ヒスチジンの水への溶解度が低いために、Ｌ−ヒスチジンを有効な濃度で含有する注射剤を調製することには困難を伴う。Ｌ−ヒスチジンの溶解度を高めるためには、Ｌ−ヒスチジンを塩酸塩等の塩の形態で用いたり、あるいは注射剤に酸を加えて酸性にしたりすることが考えられるが、その場合、アシドーシス等の副作用を招くおそれがある。
【特許文献１】国際公開第２００６／０２５５９８号
【発明の開示】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、副作用のおそれ少なく血中のＬ−ヒスチジン濃度を速やかに上昇させるのに有用な脳虚血障害治療剤を提供することにある。本発明者らは、Ｌ−ヒスチジンに着目し、副作用のおそれ少なく血中のＬ−ヒスチジン濃度を速やかに上昇させる方法を模索した。その結果、Ｌ−ヒスチジン誘導体である特定のヒスチジンジペプチドが水への溶解度が高く、良好な安定性を有し、しかも副作用がないことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する脳虚血障害治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】異なるＬ−ヒスチジン誘導体を投与した３つの投与群における血中Ｌ−ヒスチジン濃度の時間経過を示すグラフ。
【図２】脳虚血再灌流時の脳虚血障害に対するグリシル−Ｌ−ヒスチジン投与の影響を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施形態を説明する。
本実施形態の脳虚血障害治療剤は、ヒスチジン誘導体であるＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジンは、Ｌ−アラニンとＬ−ヒスチジンがペプチド結合したジペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＯＨ、分子量２２６．２４、ＣＡＳ  Ｎｏ．３２５３−１７−６）である。グリシル−Ｌ−ヒスチジンは、グリシンとＬ−ヒスチジンがペプチド結合したジペプチド（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−ＯＨ、分子量２１２．２１、ＣＡＳ  Ｎｏ．２４８９−１３−６）である。Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジンとグリシル−Ｌ−ヒスチジンのいずれも水（２５℃）に対する溶解度は、Ｌ−ヒスチジンのそれよりも高い３．５ｍｏｌ／Ｌ以上である。【００１０】
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンは、公知の方法により得ることができ、例えば、化学的又は生物学的手法により合成してもよく、あるいは市販品を使用してもよい。生物学的手法による合成は、例えば公知の酵素又は微生物を使用して行われる。より具体的には、これらのジペプチドは、ジペプチダーゼにより既知配列のポリペプチドを加水分解することにより製造してもよい。【００１１】
脳虚血障害治療剤は、好ましくは経静脈投与用注射剤の剤型を有する。注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を経静脈投与した場合、脳虚血障害治療剤中の有効成分の血中濃度が速やかに上昇する結果、脳虚血障害治療剤の効能が迅速且つ十分に発揮される。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、溶媒と、溶媒に溶解したＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種とを含有する。溶媒は、好ましくは、水、又は水を含有する溶媒である。すなわち、経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、好ましくは水性である。溶媒の水は、滅菌水が好ましく、発熱性物質を含有していない注射用水がより好ましい。水を含有する溶媒としては、例えば、生理食塩水やブドウ糖液、乳酸配合リンゲル液など、医薬製剤において用いられている公知のものを使用することができる。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を溶媒に溶解し、必要に応じてろ過、容器充填及び滅菌処理を行うことにより製造される。【００１２】
経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を、例えば凍結乾燥及び減圧乾燥等の公知の方法で乾燥することにより、粉末状又は顆粒状の剤型にしてもよい。得られる粉末状又は顆粒状の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、溶媒に溶解して注射剤の剤型としてから使用することができる。すなわち、脳虚血障害治療剤は、使用時に溶媒に溶解される粉末状又は顆粒状の剤型で提供されてもよい。粉末状又は顆粒状の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、例えば、注射用水、生理食塩水、ブドウ糖液等の溶媒と組み合わせてキット製品として提供されてもよい。【００１３】
経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、好ましくはｐＨ５〜８．５、より好ましくはｐＨ６〜８．０である。
経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、例えば、点滴容器やプレフィルドシリンジに収容される。点滴容器の例としては、例えば、合成樹脂製の柔軟な輸液バッグやガラス瓶が挙げられる。【００１４】
経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、使用目的に応じて異なるが、好ましくは０．３〜３．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６〜２．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは１〜１．７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１〜１．５ｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を含有する。【００１５】
脳虚血障害治療剤は、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種に加えて、緩衝剤や抗酸化剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤等の公知の添加剤をさらに含有してもよい。緩衝剤の例としては、例えば、リン酸緩衝剤やクエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤が挙げられる。抗酸化剤の例としては、例えば、亜硫酸ナトリウムや亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、例えば、グリセリン及びプロピレングリコールなどの多価アルコールのほか、リドカイン塩酸塩やベンジルアルコールが挙げられる。ｐＨ調整剤として使用される酸は、有機酸及び無機酸のいずれであってもよく、例えば、アスコルビン酸、塩酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、ホウ酸、リン酸、硫酸、酒石酸又はクエン酸であってもよい。ｐＨ調整剤として使用される塩基は、例えば、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム又は水酸化マグネシウムであってもよい。【００１６】
経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造するに際してはまず、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を、必要に応じて添加剤とともに、溶媒に溶解する。Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種は、添加剤と同時に溶媒に混合してもよいし、あるいは添加剤を溶媒に混合するよりも先に又は混合した後に溶媒に混合してもよい。こうして得られた溶液は次いで、例えば、メンブランフィルタによるろ過滅菌や、オートクレーブによる加圧熱滅菌、間欠滅菌法による熱滅菌等の滅菌処理に供される。好ましい滅菌処理は、熱変性のおそれがないことから、ろ過滅菌である。滅菌処理後の溶液のｐＨは５〜８．５の範囲であることが好ましい。【００１７】
脳虚血障害治療剤の投与方法は、特に制限されるものでなく、例えば、剤型、患者の年令、性別、及び疾患の程度に応じて適宜選択される。脳虚血障害治療剤は、静脈投与用にＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を輸液に混和したものであってもよい。使用される輸液は、特に限定されるものでなく、例えば、ブドウ糖注射液や、キシリトール注射液、Ｄ−マンニトール注射液、フルクトース注射液、生理食塩水、デキストラン４０注射液（血流改善剤）、デキストラン７０注射液（血漿増量剤）、アミノ酸注射液、リンゲル液、乳酸リンゲル液を使用することができる。【００１８】
脳虚血障害治療剤の投与量は、例えば、投与方法、剤型、患者の年令、性別、及び疾患の程度に応じて適宜選択されるが、好ましくはＬ−ヒスチジン換算で０．１〜３ｇ／ｋｇ／日程度である。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、単回又は１日数回の経静脈投与、及び持続点滴静注のいずれの方法で投与してもよい。【００１９】
脳虚血障害治療剤は、好ましくは脳虚血障害の治療に使用される。より具体的には、脳虚血障害治療剤は、脳虚血に伴う脳組織の損傷時、すなわち脳細胞が壊死（ネクローシス）又はそれに近い状態に陥りつつあるときに投与されることが好ましい。あるいは、脳虚血障害治療剤は、脳虚血状態を脱したことによる再灌流時に発生するフリーラジカルや炎症性反応が周辺の脳組織を破壊するのを防ぐべく、脳虚血状態から脱するときに投与されることが好ましい。あるいは、脳細胞の壊死のさらなる進行を防止するために脳虚血障害の回復期に脳虚血障害治療剤を投与してもよい。【００２０】
本実施形態によれば、以下の効果を得ることができる。
（１）本実施形態の脳虚血障害治療剤は、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種のＬ−ヒスチジン誘導体を有効成分として含有する。これらのＬ−ヒスチジン誘導体は、Ｌ−ヒスチジンに比べて水等の溶媒に対する溶解度が高いため、高濃度で生体内に投与することが容易である。【００２１】
（２）脳虚血障害治療剤は、副作用のおそれ少なく脳虚血障害を有効に改善する作用を有する。
（３）経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、経静脈投与により血中のＬ−ヒスチジン濃度を速やかに上げるのに有効である。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤はまた、Ｌ−ヒスチジンを継続的に投与するのにも有効である。【００２２】
（４）経静脈投与用の注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤がＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を０．３〜３．５ｍｏｌ／Ｌ、さらに言えば０．６〜２．１ｍｏｌ／Ｌ、もっと言えば１〜１．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する場合には、副作用のおそれをより少なくできるうえに、比較的少ない量の脳虚血障害治療剤の投与により血中のＬ−ヒスチジン濃度を有効レベルにまで速やかに上昇することが可能である。【００２３】
（５）Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンの溶解度が比較的高いことにより、経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤において使用される溶媒の量を減ずることが可能である。このことは、脳虚血障害治療剤の投与により、脳虚血障害治療剤中の溶媒が原因で生体内の水電解質バランスが崩れたり血圧が一過性に上昇したりするのを防ぐうえで有利である。【００２４】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・  脳虚血障害治療剤は、経静脈投与用注射剤の剤型を有する代わりに、例えば、動脈内注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、脊髄腔内注射剤、腹腔内注射剤、又は経口投与剤の剤型を有してもよい。この場合も、脳虚血障害治療剤は、血中のＬ−ヒスチジン濃度を上昇させるのに有用であると期待される。【００２５】
・  脳虚血障害治療剤は、ヒトに投与するに限らず、家畜（例えば、ウマやウシ、ブタ）や家禽（例えば、ニワトリ）などの飼養動物に投与してもよいし、犬、猫、ラット、マウスなどのペットに投与してもよい。【００２６】
次に、本発明の脳虚血障害治療剤の製造例、及びその製造例で得られる脳虚血障害治療剤を用いた試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
製造例１
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）２９．２ｇを注射用水に溶解して全量１００ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつガラスバイアル瓶に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン濃度は１．２９ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で２０％（Ｗ／Ｖ））である。【００２７】
製造例２
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン２９．２ｇの代わりにグリシル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）２７．４ｇを用いたことを除いてそれ以外は製造例１と同様にして注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル−Ｌ−ヒスチジン濃度は１．２９ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で２０％（Ｗ／Ｖ））である。【００２８】
製造例３
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン２９．２ｇの代わりにＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）１４．６ｇ及びグリシル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）１３．７ｇを用いたことを除いてそれ以外は製造例１と同様にして注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン及びグリシル−Ｌ−ヒスチジンの合計濃度は１．２９ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で２０％（Ｗ／Ｖ））である。【００２９】
製造例４
グリシル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）１６．４１ｇを注射用水に溶解して全量１２０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつガラスバイアル瓶に充填、密封し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル−Ｌ−ヒスチジン濃度は０．６４ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ））である。【００３０】
製造例５
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）３．３９ｇを注射用水に溶解して全量１０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１ｍＬずつガラス製注射筒に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン濃度は１．５ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で２３．３％（Ｗ／Ｖ））である。【００３１】
製造例６
グリシル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）３．６１ｇを注射用水に溶解して全量１０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１ｍＬずつガラス製注射筒に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル−Ｌ−ヒスチジン濃度は１．７ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で２６．４％（Ｗ／Ｖ））である。【００３２】
製造例７
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）４．７５ｇを注射用水に溶解して全量１０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１ｍＬずつガラス製注射筒に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン濃度は２．１ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で３２．６％（Ｗ／Ｖ））である。【００３３】
製造例８
プラスチック製の２室バッグの一方の室にグリシル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）３．１８ｇを封入し、他方の室に注射用蒸留水５０ｍＬを封入してなる用時溶解型の注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。両室を連通させることにより両室の中身を混合して得られる溶液中のグリシル−Ｌ−ヒスチジン濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で４．７％（Ｗ／Ｖ））である。【００３４】
試験例１：脳虚血再灌流時における脳虚血障害の抑制効果の確認
＜中大脳動脈閉塞再開通モデルの作製＞
約９週齢のWistar系雄性ラットを用い、ハロセン麻酔下、小泉らの方法（脳卒中、第８巻、第１−８頁、１９８６年）に準じて中大脳動脈閉塞再開通モデルを作製した。すなわち、ガス麻酔下（初期麻酔：ハロセンを３％含有したルームエア下で実施、持続麻酔：ハロセンを１％含有したルームエア下で実施）で自然呼吸のままラットを固定し、頸部を正中切開した。次に、左総頸および外頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。続いて、内頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。更に、ハサミで左外頸動脈と内頸動脈の分岐点近くに穴を開け、ナイロン栓子のシリコンコーティング部を内頸動脈に１５〜１６ｍｍ挿入した。これにより、挿入したナイロン栓子の先端は中大脳動脈部分を超えて前大脳動脈内に達することになり、中大脳動脈の入口が栓子のシリコンコーティング部で閉塞された。その後、ナイロン糸端を血管外に少し残して結紮し、頸部を縫合した。【００３５】
術後約１５分及び中大脳動脈の再開通前に神経症状の確認を行い、神経症状が認められた動物を選別し、更に術後９０分後の直腸温が高値を示した動物を選んで被験動物とした。【００３６】
＜薬剤の投与＞
中大脳動脈を閉塞してから９０分後に中大脳動脈の再開通を行い、再開通直後と再開通から６時間後に、上記製造例１で得られた注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を被験動物に投与した（実験群）。再開通は、中大脳動脈を閉塞しているナイロン栓子を引き抜くことにより行った。脳虚血障害治療剤の投与は、翼付静注針に５０ｍＬ容量のポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を取り付けたシリンジポンプを用いて、６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与で行った。被験動物は、自由摂餌とした（個体数ｎ＝１０）。製造例１の脳虚血障害治療剤の代わりに生理食塩水を同様に投与したコントロール群と、製造例１の脳虚血障害治療剤の代わりにエダラボン（商品名ラジカット；田辺三菱製薬社製）を３ｍｇ／ｋｇの用量で再開通直後と再開通から３０分後にボーラス投与した比較群もまた準備した。【００３７】
＜脳梗塞巣の体積測定＞
薬剤を投与した翌日に、被験動物をエーテルで麻酔して脳を摘出し、約２ｍｍ厚さの６枚の切片に左脳を分割した。塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解して調製される２％ＴＴＣ溶液で満たした１２穴プレートの各ウェルに、測定面を下にして脳切片を一枚ずつ入れ、暗所にて室温下で染色した。染色後の各脳切片の測定面をデジタルカメラで撮影し、撮影した画像を画像解析ソフトに取り込んで各脳切片の測定面における梗塞巣（脳組織の壊死が認められる部位）の面積を測定し、それに脳切片の厚さを乗ずることにより各脳切片における梗塞巣の体積を求めた。梗塞率として、左脳全体積に対する梗塞巣の合計体積の割合（百分率）を計算し、各群における平均を求めた結果を表１に示す。【００３８】
【表１】
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【００３９】
上記結果より、実験群では、コントロール群及び比較群に比べて、脳虚血再灌流時における脳虚血障害が顕著に抑制されていることが確認された。つまり、製造例１で得られる脳虚血障害治療剤は、脳梗塞の発症及び進行を抑制する作用を有することが示された。【００４０】
試験例２：血中Ｌ−ヒスチジン濃度の測定と副作用の検証
７〜９週齢のWistar系雄性ラットを以下の８つの投与群に分けた。各群の個体数は４とした。【００４１】
（第１投与群）
製造例１で得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４２】
（第２投与群）
製造例１で得られた脳虚血障害治療剤を２倍に希釈して６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４３】
（第３投与群）
製造例２で得られた脳虚血障害治療剤を２倍に希釈して６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４４】
（第４投与群）
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩を注射用水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整することにより得られるＬ−ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４５】
（第５投与群）
Ｌ−ヒスチジンを注射用水に添加し、酢酸をさらに添加することによりＬ−ヒスチジンを溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整することにより得られるＬ−ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４６】
（第６投与群）
Ｌ−ヒスチジンを注射用水に添加し、クエン酸をさらに添加することによりＬ−ヒスチジンを溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整することにより得られるＬ−ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４７】
（第７投与群）
β−アラニル−Ｌ−ヒスチジンを注射用水に添加し、塩酸でｐＨ７に調整することにより得られるＬ−ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４８】
（第８投与群）
Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒスチジンを注射用水に添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整することにより得られるＬ−ヒスチジン濃度で８％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００４９】
薬剤投与後の各ラットから一定時間毎に採血し、血中のＬ−ヒスチジン（単量体）濃度を、高速アミノ酸分析計Ｌ−８８００Ａ（日立ハイテクノロジーズ社製）を使って測定したところ、いずれも薬剤の投与から１５分経過後に血中のＬ−ヒスチジン濃度は最大値を示した。また、薬剤の投与前から投与後にかけて、被験動物の体温、血圧、心拍数を測定するとともに外観観察し、薬剤の投与による副作用の有無を調べた。薬剤の投与から１５分経過後に血中のＬ−ヒスチジン濃度を測定した結果、及び薬剤の投与による副作用の有無を調べた結果を表２に示す。【００５０】
【表２】
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【００５１】
表２に示されるように、第１〜第３投与群では、副作用なくＬ−ヒスチジンの血中濃度が有効に上昇することが確認された。したがって、製造例１又は製造例２で得られる脳虚血障害治療剤又はその希釈物は、脳梗塞の治療に好適に使用することができると期待される。第１投与群と第２投与群の結果の比較からは、投与するＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジンの濃度が２倍になると血中のＬ−ヒスチジンの濃度が３〜３．５倍に上昇することが分かった。一方、第４〜第７投与群では、薬剤の投与により副作用があることが確認された。また、第７及び第８投与群では、血中のＬ−ヒスチジンの濃度が有効に上昇しないことが確認された。【００５２】
試験例３：Ｌ−ヒスチジン誘導体（ジペプチド）の溶媒溶解性の検証
Ｌ−ヒスチジンを構成アミノ酸の一部として含有する以下の９種類のジペプチド、（１）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グルタミン酸、（２）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−チロシン、（３）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリン、（４）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フェニルアラニン、（５）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン、（６）Ｌ−ヒスチジルグリシン、（７）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−メチオニン、（８）Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−セリン、及び（９）Ｌ−グルタミル−Ｌ−ヒスチジンについて、ｐＨ６〜７の注射液の製造を試みた。しかしながら、いずれのジペプチドも０．３ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で４．６７％（Ｗ／Ｖ））以上の濃度で溶解させることは出来なかった。これら９種類のジペプチドは、注射投与により血中のＬ−ヒスチジン濃度を速やかに上昇させる用途には向かないことが予想される。【００５３】
試験例４：異なるＬ−ヒスチジン誘導体（ジペプチド）の投与による血中Ｌ−ヒスチジン濃度の比較
７〜８週齢のＷｉｓｔｅｒ系雄性ラットを以下の３つの投与群に分けた。各群の個体数は２又は３とした。【００５４】
（Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン投与群）
Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン（Bachem社製）１．００ｇを注射用水に溶解して全量１３．７０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつシリンジに充填し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン濃度は０．３２ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で５％（Ｗ／Ｖ））である。得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００５５】
（Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グリシン投与群）
Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グリシン（Bachem社製）１．００ｇを注射用水に溶解して全量１４．６０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつシリンジに充填し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−ヒスチジル−Ｌ−グリシン濃度は０．３２ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で５％（Ｗ／Ｖ））である。得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００５６】
（Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グルタミン酸投与群）
Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グルタミン酸（Bachem社製）１．００ｇを注射用水に溶解して全量１０．９０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつシリンジに充填し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ−ヒスチジル−Ｌ−グルタミン酸濃度は０．３２ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ−ヒスチジン濃度で５％（Ｗ／Ｖ））である。得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。【００５７】
薬剤投与前及び薬剤投与後の各ラットから一定時間毎に採血し、血中のＬ−ヒスチジン（単体量）濃度を、高速アミノ酸分析計Ｌ−８８００Ａ（日立ハイテクノロジー社製）を使って測定した結果を表３及び図１に示す。【００５８】
【表３】
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【００５９】
表３及び図１に示されるように、血中のＬ−ヒスチジン濃度はいずれの投与群でも薬剤投与の終了直後（０分）から１５分に最大値を示し、その後速やかに低下した。３つの投与群の中で最も血中Ｌ−ヒスチジン濃度が上昇したものは第１投与群であり、第１投与群における薬剤投与の終了直後の血中Ｌ−ヒスチジン濃度は、第２投与群のそれの約２倍、第３投与群のそれの約５倍であることが確認された。薬剤投与による副作用（死亡例）はいずれの投与群でもみられなかった。この結果から、副作用なく血中Ｌ−ヒスチジン濃度を速やかに上昇するのに、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジンが最も有効であることが確認された。【００６０】
試験例５：脳虚血再灌流時における脳虚血障害の抑制効果の確認
＜中大脳動脈閉塞再開通モデルの作製＞
約７週齢のWistar系雄性ラットを用い、ハロセン麻酔下、小泉らの方法（脳卒中、第８巻、第１−８頁、１９８６年）に準じて中大脳動脈閉塞再開通モデルを作製した。すなわち、ガス麻酔下（初期麻酔：ハロセンを３％含有したルームエア下で実施、持続麻酔：ハロセンを１％含有したルームエア下で実施）で自然呼吸のままラットを固定し、頸部を正中切開した。次に、右総頸および外頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。続いて、内頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。更に、ハサミで右外頸動脈と内頸動脈の分岐点近くに穴を開け、ナイロン栓子のシリコンコーティング部を内頸動脈に１７〜１８ｍｍ挿入した。これにより、挿入したナイロン栓子の先端は中大脳動脈部分を超えて前大脳動脈内に達することになり、中大脳動脈の入口が栓子のシリコンコーティング部で閉塞された。その後、ナイロン糸端を血管外に少し残して結紮し、頸部を縫合した。【００６１】
術後約１５分及び中大脳動脈再開通前に神経症状の確認を行い、神経症状が認められた動物を選別し、更に術後９０分後の直腸温が高値を示した動物を選んで被験動物とした。
＜薬剤の投与＞
中大脳動脈を閉塞してから１２０分後に中大脳動脈再開通を行い、再開通直後と再開通から６時間後に、上記製造例４で得られた注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を被験動物投与した（実験群）。再開通は、中大脳動脈を閉塞しているナイロン栓子を引き抜くことにより行った。脳虚血障害治療剤の投与は、翼付静注針に５０ｍＬ容量のポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を取り付けたシリンジポンプを用いて、６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与で行った。被験動物は、自由摂餌とした（個体数ｎ＝８〜１０）。脳虚血障害治療剤の代わりに生理食塩水を同様に投与したコントロール群もまた準備した。【００６２】
＜脳梗塞部位の体積測定＞
薬剤を投与した翌日（脳虚血再灌流から２４時間後）に、被験動物をエーテルで麻酔して脳を摘出し、約２ｍｍ厚さの６枚の切片に右脳を分割した。塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）をリン酸緩衝生理食塩水で溶解して調製される２％ＴＴＣ溶液で満たした１２穴プレートの各ウェルに、測定面を下にして脳切片を一枚ずつ入れ、暗所にて室温下で染色した。染色後の各脳切片の測定面をデジタルカメラで撮影し、撮影した画像を画像解析ソフトに取り込んで各脳切片の測定面における梗塞巣（脳組織の壊死が認められる部位）の面積を測定し、それに脳切片の厚さを乗ずることにより各脳切片における梗塞巣の体積を求めた。梗塞率として、右脳の全体積に対する梗塞巣の合計体積の割合（百分率）を計算し、各群における平均を求めた。また、脳浮腫率として、左脳全体積に対する右脳全体積の割合（百分率）を計算し、各群における平均を求めた。結果を図２に示す。【００６３】
図２に示される結果より、実験群では、コントロール群に比べて、脳虚血再灌流時における脳虚血障害（梗塞率及び脳浮腫率）が顕著に抑制されていることが確認された。つまり、製造例４で得られる脳虚血障害治療剤は、脳梗塞の発症及び進行を抑制する作用を有することが示された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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