(57)【要約】  プローブ存在下での核酸増幅において、増幅反応の阻害を抑制して標的配列を増幅する方法を提供する。標的配列の増幅の際、共存させるプローブとして、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖との二本鎖核酸を形成させた際に、前記二本鎖核酸の融解温度が前記伸長反応の反応温度以下を示す塩基配列であるプローブを使用する。このようなプローブの存在下であれば、例えば、プライマーのアニーリングや伸長反応が、プローブの存在によって阻害され難く、標的配列の増幅を十分に行うことができる。このため、Ｔｍ解析等により標的配列における検出目的部位の多型を解析する際、高い信頼性を実現できる。
2009081967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法であって、
前記標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下、プライマーからの伸長反応により前記標的核酸配列を増幅する工程を含み、
前記プローブとして、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用することを特徴とする増幅方法。
【請求項２】
前記プローブとして、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用する、請求の範囲１記載の増幅方法。
【請求項３】
前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記伸長反応の反応温度との差が、約０℃以上である、請求の範囲２記載の増幅方法。
【請求項４】
前記プローブが、
前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記プローブと前記プローブに対して１塩基を除いて完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度との差が、約１℃以上を示すプローブである、請求の範囲２記載の増幅方法。
【請求項５】
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１記載の増幅方法。
【請求項６】
前記標識物質が、蛍光物質である、請求の範囲４記載の増幅方法。
【請求項７】
プローブ存在下での鋳型核酸における標的核酸配列の増幅において、前記標的核酸配列の増幅の阻害を抑制する増幅阻害の抑制方法であって、
前記標的核酸配列の増幅方法が、請求の範囲１記載の増幅方法であることを特徴とする抑制方法。
【請求項８】
標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを用いた前記標的核酸配列の解析方法であって、
下記（Ａ）および（Ｂ）工程を有することを特徴とする標的核酸配列の解析方法。
（Ａ）請求の範囲１記載の増幅方法により、前記プローブの存在下、鋳型核酸における前記標的核酸配列の増幅を行う工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程の後、前記（Ａ）工程の反応液の温度を変化させ、得られた増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
【請求項９】
さらに、下記（Ｃ）工程を有する、請求の範囲８記載の解析方法。
（Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記標的配列の解析を行う工程
【請求項１０】
前記（Ｃ）工程が、温度変化に伴うシグナル値の変動を表す融解曲線を用いた融解曲線解析である、請求の範囲９記載の解析方法。
【請求項１１】
前記標的核酸配列が、多型を生じる検出対象部位を有する配列であり、
前記（Ｃ）工程において、前記シグナル値の変動から、前記標的核酸配列の検出対象部位における多型を解析する、請求の範囲９記載の解析方法。
【請求項１２】
前記（Ｃ）工程において、前記シグナル値の変動から、前記標的核酸配列の増幅の有無を解析する、請求の範囲９記載の解析方法。
【請求項１３】
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲８記載の解析方法。
【請求項１４】
前記標識物質が蛍光物質であり、前記（Ｂ）工程におけるシグナル値が、蛍光強度である、請求の範囲１３記載の解析方法。
【請求項１５】
請求の範囲１記載の増幅方法に使用するためのプローブであって、
前記プローブが、
前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることを特徴とするプローブ。
【請求項１６】
前記プローブが、
前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブである、請求の範囲１５記載のプローブ。
【請求項１７】
前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記伸長反応の反応温度との差が、約０℃以上である、請求の範囲１６記載のプローブ。
【請求項１８】
前記プローブと前記プローブに対して完全に相補的な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度と、前記プローブと前記プローブに対して１塩基を除いて完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度との差が、約１℃以上を示すプローブである、請求の範囲１６記載のプローブ。
【請求項１９】
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１５記載のプローブ。
【請求項２０】
前記標識物質が、蛍光物質である、請求の範囲１９記載のプローブ。
【請求項２１】
プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法に使用するための前記プローブの設計方法であって、
前記プローブを、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計することを特徴とするプローブ設計方法。
【請求項２２】
前記プローブを、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計する、請求の範囲２１記載のプローブ設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ存在下で標的核酸配列を増幅する方法およびそれに用いるプローブに関する。また、本発明は、プローブ存在下での標的核酸配列の増幅阻害の抑制方法、ならびに、標的核酸配列の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の多型や変異を検出する方法として、標的核酸配列と検出用プローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：melting  temperature）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから融解曲線解析、または、Ｔｍ解析と呼ばれている。Ｔｍは、一般的に、以下のように定義されている。二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖核酸における両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖核酸に解離（核酸の融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖核酸が解離して一本鎖核酸になると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖核酸のみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍ（℃）とは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。【０００３】
一塩基多型は、検出対象部位における一塩基の置換（点突然変異）によって生じている。このため、前記検出対象部位がどのような多型であるかを解析するには、一塩基の違いを判別することが必要となる。そこで、前述のＴｍ解析においては、この一塩基の違いをＴｍ値の違いによって分析している。以下に、具体的に説明する。なお、検出対象部位における多型を、便宜上、変異型および野生型と呼ぶ。【０００４】
Ｔｍ値は、二本鎖核酸の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、例えば、変異型の検出対象部位を含む標的核酸配列に完全に相補的な検出用プローブ（以下、「変異型プローブ」という）を設計した場合、前記変異型プローブと検出対象部位が変異型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｍｕｔ値は、前記変異型プローブと検出対象部位が野生型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｗｉｌｄ値よりも高い値を示すこととなる。この性質を利用したＴｍ解析によれば、以下のようにして、多型を解析できる。まず、予め、評価基準として、前記変異型プローブを使用した場合の前記Ｔｍｍｕｔ値とＴｍｗｉｌｄ値とを決定しておく。続いて、検出対象部位の塩基が不明である分析対象の標的核酸配列と前記変異型プローブとの二本鎖核酸を形成させ、形成された二本鎖核酸に加熱処理を施し、温度上昇に伴う二本鎖核酸の解離を示す吸光度等のシグナル値を測定する。そして、温度変化に伴うシグナル値の変動を示す融解曲線を作成し、予め決定したＴｍｍｕｔ値およびＴｍｗｉｌｄ値のいずれにピークが存在するかを確認する。その結果、Ｔｍｍｕｔ値付近にピークが存在する場合、前記変異型プローブと１００％マッチしているため、標的核酸配列における検出対象部位は、変異型の多型であると判断できる。他方、Ｔｍｗｉｌｄ値付近にピークが存在する場合、前記変異型プローブと１塩基ミスマッチしているため、標的核酸配列における検出対象部位は、野生型の多型であると判断できる。また、多型が、ホモ接合性であるか、ヘテロ接合性であるかについても判断することができる。すなわち、一対の対立遺伝子における多型の分析の場合、Ｔｍｍｕｔ値付近とＴｍｗｉｌｄ値付近の両方にピークが存在する場合、ヘテロ接合性と判断でき、他方、Ｔｍｍｕｔ値付近にのみピークが存在する場合は、変異型のホモ接合性であり、Ｔｍｗｉｌｄ値付近にのみピークが存在する場合は、野生型のホモ接合性であると判断することができる。また、野生型の検出対象部位を含む標的核酸配列に完全に相補的な検出用プローブ（以下、「野生型プローブ」という）を使用する場合も、評価基準として、前記野生型プローブと検出対象部位が野生型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｗｉｌｄ値ならびに前記野生型プローブと検出対象部位が変異型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｍｕｔ値とを設定しておけば、同様に判断することができる。なお、野生型プローブの場合、前記野生型プローブと検出対象部位が野生型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｗｉｌｄ値は、前記野生型プローブと検出対象部位が変異型である標的配列との二本鎖核酸のＴｍｍｕｔ値よりも高い値を示すこととなる。【０００５】
そして、このようなＴｍ解析を利用した多型の解析方法においては、さらなる簡略化を図るべく、前記検出用プローブの存在下で前記標的核酸配列の増幅反応を行い、前記増幅反応後の反応液をそのまま用いて、シグナル値の測定が行われている。このような方法によれば、増幅反応の後に、前記反応液に前記検出用プローブを別途添加する工程を省略できるため、簡略化が可能となる。また、前記反応液に予め検出用プローブを添加しておけば、例えば、前記反応液の密閉状態を維持できるため、コンタミネーションの防止が可能である。
【特許文献１】特開２００５−５８１０７号公報
【発明の開示】
【０００６】
しかしながら、プローブの非存在下で増幅反応を行った後に、その反応液にプローブを添加してＴｍ解析を行う方法と、プローブの存在下で増幅反応を行い、その反応液を用いてＴｍ解析を行う方法とでは、例えば、鋳型核酸やプローブが同じであっても、後者の方法には、以下のような問題が生じるケースが見られることがわかった。すなわち、多型が既知の標的核酸配列、つまり、Ｔｍｗｉｌｄ値およびＴｍｍｕｔ値のいずれにピークが見られるかが既知である標的核酸配列を使用した場合でも、ピークが小さいために判別し難い、または、ピークが見られないという問題である。特に、ヘテロ接合性であることが既知のサンプルの場合、理論的には、Ｔｍｗｉｌｄ値およびＴｍｍｕｔ値のいずれにも同程度のピークが見られると考えられるが、実際には、前記プローブに完全に相補的な標的配列についてのピーク（例えば、変異型プローブを使用した場合、Ｔｍｍｕｔ値のピーク）が判断し難いというケースが見られる。
【０００７】
そこで、本発明は、プローブの存在下であっても標的核酸配列を増幅できる増幅方法、前記プローブによる増幅阻害を抑制する方法ならびに標的核酸配列の解析方法、および、それに用いるプローブの提供を目的とする。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の増幅方法は、プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法であって、
前記標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下、プライマーからの伸長反応により前記標的核酸配列を増幅する工程を含み、
前記プローブとして、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用することを特徴とする。本発明において、以下、標的核酸配列を標的配列ともいう。
【０００９】
本発明の増幅阻害の抑制方法は、プローブ存在下での鋳型核酸における標的核酸配列の増幅において、前記標的核酸配列の増幅の阻害を抑制する増幅阻害の抑制方法であって、前記標的核酸配列の増幅方法が、本発明の増幅方法であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の解析方法は、標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを用いた前記標的核酸配列の解析方法であって、下記（Ａ）および（Ｂ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）本発明の増幅方法により、前記プローブの存在下、鋳型核酸における前記標的核酸配列の増幅を行う工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程の後、前記（Ａ）工程の反応液の温度を変化させ、得られた増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
【００１１】
また、本発明のプローブは、前記本発明の増幅方法に使用するためのプローブであって、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖との二本鎖核酸を形成させた際に、前記二本鎖核酸の融解温度が前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることを特徴とする。
【００１２】
本発明者らは、プローブの存在下で増幅反応を行い、その反応液を用いてＴｍ解析を行う場合に、前述のような問題が生じる原因を解明すべく、鋭意研究を行った。その結果、前記増幅反応前に予め反応液に添加しておいたプローブが、増幅反応時において、鋳型核酸にハイブリダイズしてしまい、例えば、プライマーのアニーリングやアニーリングしたプライマーからの伸長を阻害しているという可能性を見出すに到った。このように鋳型核酸へのプライマーのアニーリングやプライマーからの伸長が阻害されると、標的配列が存在するにもかかわらず、その増幅が十分に起こらないため、結果的に、ピークが検出し難いという問題が起こっていると考えられる。そこで、本発明者らは、そのＴｍ値と伸長反応温度とが前述の関係を満たすプローブを設計することで、前述の問題を回避できることを見出した。これは、以下のような理由による。
【００１３】
プローブを用いた多型解析においては、解析精度を向上させるため、通常、標的配列に特異的にハイブリダイズするようにプローブが設計される。このようにプローブを特異的にハイブリダイズさせるためには、一般に、プローブの長さを相対的に長くするという手法がとられる。しかしながら、前記プローブが相対的に長いほど、そのＴｍ値（すなわち、例えば、前記プローブと完全に相補的な配列とからなる二本鎖核酸のＴｍ値）は相対的に高くなるため、二本鎖が形成されると、より高い温度でなければ鋳型からプローブが解離し難いこととなる。そこで、本発明者らは、ピークが検出し難いという従来の問題は、核酸増幅後の多型のＴｍ解析のために、標的核酸に特異的にハイブリダイズさせるべく設計したプローブが、核酸増幅の際に、鋳型核酸にハイブリダイズしてしまい、プライマーのアニーリングやアニーリングしたプライマーからの伸長反応を阻害していることを見出した。そこで、少なくとも核酸増幅における伸長反応の際に、プローブが鋳型核酸にハイブリダイズし難くなるように、プローブの塩基配列を、そのＴｍ値、すなわち、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖（例えば、完全な相補鎖）との二本鎖核酸のＴｍ値が前記伸長反応温度以下を示す塩基配列とすることで、本発明に想到した。本発明によれば、プローブの存在下で標的配列の増幅を行っても、前記伸長反応の反応温度において、前記プローブが鋳型核酸にハイブリダイズし難い。このため、プローブによって、標的配列の核酸増幅が阻害され難く、具体的には、例えば、プライマーの鋳型核酸へのアニーリングや前記プライマーからの伸長反応が阻害され難く、結果として、前記標的配列の増幅を十分に行うことが可能となる。特に、前記プローブに完全に相補的な相補鎖とのＴｍ値と、前記プローブと一塩基のみが異なる相補鎖とのＴｍ値では、前者の方が高い値であるため、従来では、一塩基のみが異なる標的配列よりも完全に相補的な標的配列の方が、プローブによる影響を受け易いと考えられる。しかしながら、本発明のプローブによれば、そのような問題も回避されるため、例えば、前述のように、ヘテロ接合性の鋳型核酸であっても、同様の増幅効率を実現することが可能になり、Ｔｍ解析でのピークも同様に検出可能となる。したがって、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析において、従来よりもピークの有無を高い信頼性で判別することができる。このため、本発明は、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。
【００１４】
なお、プローブ存在下で核酸増幅を行った場合のＴｍ解析に与える問題やその原因は、本発明者らが初めて得た知見である。また、前述のように、プローブを標的配列に特異的にハイブリダイズさせるために、プローブのＴｍ値を相対的に高く設定することはあっても、本発明のように、プローブが核酸増幅に与える影響を回避するために、そのＴｍ値と伸長反応との温度関係からプローブを設計したのは、本発明が初めてである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、比較例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜増幅方法＞
本発明の増幅方法は、前述のように、プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法であって、前記プローブの存在下、プライマーからの伸長反応により前記標的核酸配列を増幅する工程を含み、
前記プローブとして、本発明のプローブ、すなわち、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブを使用することを特徴とする。本発明において使用する前記プローブを、以下、本発明のプローブという。本発明の増幅方法において、前記プローブは、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることが好ましい。【００１７】
このように、本発明のプローブの存在下で核酸増幅反応を行うことによって、前述のように、例えば、鋳型核酸に対するプライマーのアニーリングや、アニーリングしたプライマーからの伸長の阻害を抑制して、標的配列の増幅を行うことができる。なお、本発明の増幅方法においては、前述の条件を満たすプローブを使用することが特徴であって、核酸増幅方法の種類や条件等は何ら制限されない。【００１８】
なお、本発明においては、使用するプローブを特定するために、前記プローブの性質として、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖との二本鎖核酸を形成させた場合に、「前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が前記伸長反応の反応温度以下を示す」と規定している。つまり、前記「完全な相補鎖」とは、あくまでも、使用するプローブの性質を特定するための条件であって、使用時において、前記プローブが、完全な相補鎖と二本鎖核酸を形成することを条件とするものではない。このように、本発明は、例えば、前記プローブと前記プライマーに対する完全相補鎖とから二本鎖核酸を形成させる工程を必須とするものではない。また、例えば、後述する標的核酸配列の解析方法等において、増幅反応後の増幅産物と前記プローブとの二本鎖を形成させる際、前記プローブがハイブリダイズする対象は、前記プローブに対する完全な相補鎖には制限されず、前記プローブは、１塩基または数塩基のミスマッチを有する相補鎖にハイブリダイズしてもよい。【００１９】
本発明においては、以下、前記プローブに対して完全に相補的であることを「パーフェクトマッチ」、前記プローブにパーフェクトマッチする相補鎖を「パーフェクトマッチ相補鎖」、前記プローブと前記パーフェクトマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸を「パーフェクトマッチの二本鎖核酸」、前記パーフェクトマッチの二本鎖核酸のＴｍ値を「ＴｍＰｅｒ値」という。また、前記プローブに対して一塩基（または複数の塩基）を除き完全に相補的であることを「ミスマッチ」、前記プローブにミスマッチする相補鎖を「ミスマッチ相補鎖」、前記プローブと前記ミスマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸を「ミスマッチの二本鎖核酸」、前記ミスマッチの二本鎖核酸のＴｍ値を「ＴｍＭｉｓ値」という。また、本発明において、核酸増幅方法により増幅させる配列は、標的配列およびそれに相補的な配列であってもよいし、前記標的配列を含む領域からなる配列およびそれに相補的な配列であってもよい。【００２０】
本発明のプローブは、例えば、前記パーフェクトマッチのＴｍＰｅｒ値と前記伸長反応温度との関係が、「ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度（℃）」を満たすプローブであればよく、その塩基配列や塩基数は何ら制限されない。核酸増幅には、通常、二本鎖核酸の融解（一本鎖核酸への解離）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、および、アニーリングしたプライマーからの相補鎖の伸長反応という３ステップが含まれる。前記伸長反応は、アニーリングが前提であり、核酸増幅においては、例えば、アニーリング温度と伸長反応とは、同じ温度に設定されることが一般的である。この場合、本発明における「伸長反応温度」は、例えば、アニーリング温度に置き換えることも可能である。【００２１】
本発明のプローブは、例えば、伸長反応の反応温度が設定されている場合、Ｔｍ値が前記伸長反応温度以下となるように、その塩基配列を設計することができる。Ｔｍ値を考慮したプローブの設計方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。プローブの配列やＴｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）や最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）等で決定することができる。このようなソフトウエア等を用いて設計したプローブについては、例えば、実際に行う核酸増幅の条件下で、ＴｍＰｅｒ値を確認することが好ましい。また、本発明のプローブは、例えば、前述のように伸長反応温度に応じて塩基配列を決定する他に、前記プローブのＴｍＰｅｒ値に応じて前記伸長反応温度を設定することで、本発明の条件を具備させてもよい。つまり、本発明のプローブは、最終的に、プローブのＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度とが式「ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度」を満たしていればよく、前記式を満たすための手法は、例えば、前記プローブの塩基配列の調整でも、伸長反応温度の調整のいずれであってもよい。【００２２】
前記プローブと前記パーフェクトマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸のＴｍＰｅｒ値は、「ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度（℃）」を満たしていればよい。ＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度との差は、例えば、０℃以上（約０℃以上）であり、上限は特に制限されないが、例えば、好ましくは０〜３０℃であり、より好ましくは０〜２０℃であり、さらに好ましくは０〜１０℃、特に好ましくは０〜２℃である。【００２３】
前記プローブに対する前記ミスマッチ相補鎖の相同性は、前記パーフェクトマッチ相補鎖の相同性よりも低くなることから、ＴｍＭｉｓ値は、ＴｍＰｅｒ値よりも低くなる（ＴｍＭｉｓ値＜ＴｍＰｅｒ値≦伸長反応温度（℃））。本発明のプローブは、前記プローブと前記パーフェクトマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸のＴｍＰｅｒ値と、前記プローブと前記ミスマッチ相補鎖とから形成される二本鎖核酸のＴｍＭｉｓ値との差は、例えば、１℃以上（約１℃以上）であることが好ましく、より好ましくは３℃以上（約３℃以上）であり、特に好ましくは５℃以上（約５℃以上）である。このように、ＴｍＰｅｒ値とＴｍＭｉｓ値との差を十分に設けることで、例えば、後述するような融解曲線を作成した際に、ＴｍＰｅｒ値のピークとＴｍＭｉｓ値のピークの判断が容易となり、解析精度もさらに向上する。【００２４】
前記プローブのＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度とが前述の関係を満たしている限りにおいて、前記プローブの長さは、特に制限されない。前記プローブは、例えば、標的配列により特異的にハイブリダイズできることから、相対的に長い配列であることが好ましい。前記長さとしては、例えば、５〜５０塩基であり、好ましくは１０〜３０塩基である。【００２５】
本発明のプローブは、例えば、未標識のプローブでもよいし、標識物質で標識化された標識化プローブでもよく、特に、前記標識化プローブが好ましい。このような標識化プローブによれば、例えば、後述する標的配列の解析方法において、前記増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値として、標識物質のシグナルを測定することができる。【００２６】
前記標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光団等の蛍光物質があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、前記蛍光物質で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとしては、ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、Ｃであることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする塩基配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１塩基〜３塩基離れた塩基がＧとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが塩基配列にハイブリダイズすると、蛍光物質で標識化された末端のＣが、前記塩基配列におけるＧに近づくことによって、前記蛍光物質の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。【００２７】
前記蛍光物質としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等の蛍光色素があげられ、市販の蛍光物質としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等の蛍光色素があげられる。【００２８】
本発明のプローブを１つの反応系において２種類以上使用する際には、例えば、各プローブを、異なる蛍光物質（異なる波長で検出される蛍光物質）で標識化することが好ましい。前記蛍光物質の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等があげられる。【００２９】
また、５’末端に蛍光色素を標識化した標識化プローブは、例えば、増幅反応において、プローブ自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。【００３０】
本発明において、前記核酸増幅方法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  acid  sequence  based  amplification）法、ＴＭＡ（Transcription−mediated  amplification）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。【００３１】
本発明を適用する試料としては、例えば、鋳型となる核酸を含んでいればよく、特に制限されない。具体例としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液（例えば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。【００３２】
核酸増幅の反応液における試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されないが、例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。【００３３】
また、後述するように、核酸増幅の反応液について光学的検出を行う場合、特に、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応液における全血試料等の生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。ＰＣＲ反応においては、通常、核酸変性（一本鎖核酸への解離）のために熱処理が施されるが、この熱処理によって、試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶性の沈殿物や濁り等が発生するおそれがある。このため、増幅産物の有無や多型を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上することができる。【００３４】
また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１〜０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５〜１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２．８２５〜５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは５．６５〜２８．２５ｇ／Ｌの範囲である。なお、前記反応液中における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。【００３５】
全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。【００３６】
本発明において、試料に含まれる鋳型核酸は、例えば、ＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、核酸増幅により増幅させた増幅産物ＤＮＡであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応により生成させたｃＤＮＡがあげられる。【００３７】
本発明の増幅産物の製造方法において、例えば、核酸増幅の開始に先立ち、前記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減することができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。【００３８】
前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％であり、より好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。【００３９】
つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、ＤＮＡを鋳型核酸とし、本発明のプローブの存在下、標的核酸を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲにより、標的核酸を増幅する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプローブを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。【００４０】
まず、ＰＣＲ反応液を調製する。前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記反応液に１０〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜２００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、プローブの標識として蛍光物質を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよく、この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識化プローブと未標識プローブのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。【００４１】
前記反応液におけるプライマーの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、プライマーとしては、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一対のプライマーセットを使用することができ、この場合、両プライマーを前述の範囲で添加することが好ましい。フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは１：０．５〜１：２である。なお、プライマーやプライマーセットは、例えば、１種類でもよいし２種類以上でもよい。本発明において、使用するプライマーは、例えば、１つの反応液において増幅させたい標的配列の数に応じて、適宜使用できる。【００４２】
前記反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるように設定できるが、例えば、１００〜２０００倍であり、好ましくは２００〜１０００倍である。【００４３】
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ））および溶媒があげられる。また、前述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。【００４４】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（商品名ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。【００４５】
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。【００４６】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／またはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。【００４７】
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。【００４８】
また、前記ＰＣＲ反応液は、さらに、グリセロ−ル、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＤＭＳＯ等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。【００４９】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（サーマルサイクラー）や、チューブまたはチップ等の容器等に応じて適宜決定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。【００５０】
つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常、（１）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、（２）一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、（３）アニーリングしたプライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）の３ステップが１サイクルとなる。各ステップにおける温度条件は、特に制限されず、前述のように、前記（３）の伸長反応温度が、前記プローブのＴｍＰｅｒ値以上であればよい。前記（１）の解離ステップは、例えば、９０〜９９℃で１〜１２０秒、好ましくは９２〜９５℃で１〜６０秒、前記（２）のアニーリングステップは、例えば、４０〜７０℃で１〜３００秒、好ましくは５０〜７０℃で５〜６０秒、前記（３）の伸長ステップは、例えば、５０〜８０℃で１〜３００秒、好ましくは５０〜７５℃で５〜６０秒の条件が例示できるが、これには制限されない。【００５１】
ＰＣＲのサイクル数は、特に制限されないが、例えば、３０サイクル以上が好ましく、上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。【００５２】
以上のようにして、本発明のプローブの存在下で、標的配列を増幅できる。この方法によれば、前述のように、プライマーの鋳型核酸に対するアニーリングやアニーリングしたプライマーからの伸長が、プローブによって阻害され難いため、前記標的配列が、前記プローブに対するパーフェクトマッチの相補鎖およびミスマッチの相補鎖のいずれを含む場合であっても、従来より優れた効率で増幅させることが可能である。なお、本発明の増幅方法は、標的配列の増幅物の製造方法ともいえる。【００５３】
本発明の増幅方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた標的配列の増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、増幅産物の有無や、標的配列における多型を検出することもできる。この実施形態については、本発明の標的配列の解析方法として、その一形態を以下に説明する。【００５４】
＜標的配列の解析方法＞
本発明の標的配列の解析方法は、前述のように、標的核酸配列にハイブリダイズ可能なプローブを用いた前記標的核酸配列の解析方法であって、下記（Ａ）および（Ｂ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）本発明の増幅方法により、前記プローブの存在下、前記標的核酸配列の増幅を行う工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程の後、前記（Ａ）工程の反応液の温度を変化させ、得られた増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値を測定する工程【００５５】
本発明の標的配列の解析方法によれば、例えば、前記標的配列の増幅の有無や、前記標的配列における多型の判別等を行うことができる。なお、本発明の解析方法においては、本発明の増幅方法で標的配列を増幅すること、すなわち、本発明のプローブ存在下で標的配列を増幅することが特徴であり、例えば、その他の構成や条件等は何ら制限されない。【００５６】
本発明の標的配列解析方法は、例えば、さらに、下記（Ｃ）工程を有することが好ましい。このように、前記反応液の温度変化に伴うシグナル値の変動を確認することで、前述のような前記標的配列の増幅の有無や多型の判別が可能である。
（Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記標的配列の解析を行う工程【００５７】
本発明において、前記（Ｃ）工程は、温度変化に伴うシグナル値の変動を表す融解曲線を用いた融解曲線解析であることが好ましい。融解曲線は、一般に、各温度と、サンプルの融解状態を示すシグナル値またはシグナル値の微分値（以下、「シグナル微分値」という）との関係を示すグラフである。このような融解曲線を用いれば、例えば、ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値におけるピークの有無を、例えば、目視により容易に判断できる。【００５８】
前記融解曲線は、シグナルの変化量が判断し易いことから、前記温度とシグナル微分値との関係を示すグラフであることが好ましい。前記シグナル微分値は、例えば、「ｄＦ／ｄＴ」で表してもよいし、「−ｄＦ／ｄＴ」で表してもよい。ｄＦは、シグナル値の変化量、ｄＴは、温度の変化量を示す。シグナルの発生が、サンプルの融解によって抑制される場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となり、シグナル微分値を「−ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となる。また、シグナルが、サンプルの融解によって発生する場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となり、シグナル微分値を「−ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となる。前記シグナルは、例えば、サンプルの非融解によって発生し、サンプルの融解によって発生が抑制されるものでもよいし、反対に、サンプルの非融解によって発生が抑制され、前記サンプルの融解によって発生するものであってもよい。シグナルがサンプルの融解・非融解のいずれで発生しても、また、シグナル微分値を前述のいずれの式で表した場合も、ピークの大きさは、シグナル微分値の絶対値の大きさで評価可能である。【００５９】
本発明の解析方法により、前記標的配列の多型を解析する場合、例えば、前記標的配列とは、多型を生じる検出対象部位を有する配列であり、本発明のプローブは、これに相補的な配列となる。そして、前記（Ｃ）工程において、前記シグナル値の変動から、前記標的配列の検出対象部位における多型を解析することができる。前述のように、プローブが変異型プローブの場合、ＴｍＰｅｒ値（すなわちＴｍｍｕｔ値）付近にピークが検出されれば、多型は変異型、ＴｍＭｉｓ値（すなわちＴｍｗｉｌｄ値）付近にピークが検出されれば、多型は野生型と判断できる。また、一方のＴｍ値のみにピークが検出されれば、ホモ接合性の多型、両方のＴｍ値にピークが検出されれば、ヘテロ接合性の多型と判断することができる。なお、本発明において、検出対象部位における多型を、変異型および野生型と呼んでいるが、これは便宜上であって、本発明を制限するものではない。【００６０】
前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物と前記プローブとの二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値の測定は、前述のように、２６０ｎｍの吸光度の測定でもよいし、標識物質のシグナル測定であってもよい。前者は、例えば、本発明のプローブが未標識プローブの場合に採用することが好ましい。後者は、例えば、本発明のプローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである場合に採用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、標的配列とのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、標的配列とのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識物質によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。【００６１】
本発明においては、前述のように、同一反応液で、２つ以上の標的配列の解析を行ったり、１つの標的配列における２つ以上の検出対象部位の多型の解析を行うこと等ができる。このような場合、前記（Ａ）工程の核酸増幅の反応液には、予め、解析する標的配列や検出対象部位に応じて、例えば、２種類以上の本発明のプローブを添加しておけばよい。このように２種類以上のプローブを使用する際には、それぞれが、異なる条件で検出可能な異なる標識物質によって標識化されていることが好ましい。このように異なる標識物質を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって、各標的配列や各検出対象部位を別個に解析することが可能である。【００６２】
つぎに、本発明の解析方法について、本発明のプローブとして標識化プローブを使用した例をあげて説明するが、本発明は、これには制限されない。また、特に示さない限り、本発明の増幅方法と同様に行うことができる。【００６３】
まず、前述と同様に、標識化プローブおよび標的配列を増幅するためのプライマーを含むＰＣＲ反応液を準備して、ＰＣＲを行い、前記標的配列の増幅を行う。前記反応液は、例えば、本発明のプローブ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび鋳型核酸を含有する試料等を含む。この他に、前記反応液は、核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。【００６４】
次に、前記ＰＣＲ反応液をそのまま用いて、得られた増幅産物の解離（例えば、二本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸への解離）、および、解離した一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。【００６５】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。【００６６】
解離した一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、特に制限されないが、前記標的配列が前記プローブに対してパーフェクトマッチであるか否かを確認する場合は、前記標識化プローブのＴｍＰｅｒ値よりも低いことが好ましい。また、標的配列が前記プローブに対してミスマッチであるか否かを確認する場合、さらに、パーフェクトマッチであるかミスマッチであるかを確認する場合は、ＴｍＭｉｓ値よりも低いことが好ましい。前記ハイブリダイズの温度は、特に制限されないが、一般的に、例えば、４０〜５０℃である。【００６７】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。【００６８】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。【００６９】
次に、前記シグナルの変動から、標的配列の解析を行う。この際、本発明のプローブについては、予め、ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値を決定しておく。そして、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出し、前記ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値のいずれかにおいて、最も大きい絶対値を示しているか否かを確認する。具体的には、例えば、温度と「−ｄ蛍光強度増加量／ｄＴ」とをプロットした融解曲線を作成し、前記ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値のいずれかに、最も低い値を示す谷型のピークが存在するか否かを確認する。また、例えば、温度と「ｄ蛍光強度増加量／ｄＴ」とをプロットした融解曲線を作成した場合は、前記ＴｍＰｅｒ値およびＴｍＭｉｓ値のいずれかに、最も高い値を示す山型のピークが存在するか否かを確認する。その結果、前記ＴｍＰｅｒ値付近にピークが確認されれば、前記標的配列は、前記プローブとパーフェクトマッチであると判断でき、前記ＴｍＭｉｓ値付近にピークが確認されれば、前記標的配列は、前記プローブとミスマッチであると判断できる。さらに、前記プローブが変異型検出用であれば、パーフェクトマッチは、多型が変異型、ミスマッチは、多型が野生型、反対に、前記プローブが野生型検出用であれば、パーフェクトマッチは、多型が野生型、ミスマッチは、多型が変異型と判断することができる。【００７０】
また、グアニン消光プローブとは反対に、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光を発し、解離した状態では、蛍光が減少（または消光）するプローブを使用する場合は、蛍光を発しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。【００７１】
また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。【００７２】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。【００７３】
＜増幅阻害の抑制方法＞
本発明の増幅阻害の抑制方法は、前述のように、プローブ存在下での標的配列の増幅において、前記標的配列の増幅の阻害を抑制する増幅阻害の抑制方法であって、前記標的配列の増幅方法が、本発明の増幅方法であることを特徴とする。本発明は、プローブ存在下での標的配列の増幅において、本発明の増幅方法を行うこと、すなわち、本発明のプローブ存在下で標的配列を増幅することが特徴であり、その他の構成や条件は何ら制限されない。なお、本発明は、前記本発明の増幅方法と同様にして行うことができる。【００７４】
＜プローブ＞
本発明のプローブは、前述のように、本発明の増幅方法または本発明の増幅阻害の抑制方法に使用するためのプローブであって、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すプローブであることを特徴とする。前記プローブは、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すことが好ましい。具体的には、本発明の増幅方法で記載した通りである。本発明のプローブは、本発明の抑制方法、増幅方法および解析方法に使用できる。【００７５】
＜増幅用試薬＞
本発明の増幅用試薬は、本発明の増幅方法、抑制方法または解析方法に使用するための試薬であって、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明の増幅用試薬は、本発明のプローブを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の増幅試薬は、例えば、さらに、標的配列を増幅するためのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を含んでもよい。【００７６】
本発明の増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、本発明のプローブや、前記プライマー等のその他の成分の含有量も、特に制限されない。本発明の増幅用試薬は、例えば、増幅用キットでもよく、例えば、各試薬は、同じ容器または別個の容器に収容されてもよい。また、前記増幅用キットは、さらに使用説明書を備えることが好ましい。【００７７】
＜プローブの設計方法＞
本発明のプローブの設計方法は、プローブ存在下で鋳型核酸における標的核酸配列を増幅する方法に使用するための前記プローブの設計方法であって、前記プローブを、前記プローブと前記プローブに対する相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計することを特徴とする。本発明において、前記プローブは、前記プローブと前記プローブに対する完全な相補鎖とから形成される二本鎖核酸の融解温度が、前記伸長反応の反応温度以下を示すように設計することが好ましい。本発明の設計方法は、具体的には、前記本発明の増幅方法において説明した方法と同様に行うことができる。また、本発明は、プローブの製造法ともいうことができ、前述のようにプローブを設計する工程を含む。【００７８】
つぎに、本発明について、実施例をあげて説明するが、本発明は、これらには制限されない。
【実施例１】
【００７９】
ヘテロ接合性の多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３を示す被検者の血液から、キット（商品名ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ゲノムを精製した。精製ゲノムをＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）で１／１０希釈（体積）した。この希釈した精製ゲノム１μＬを、下記組成のＰＣＲ試薬４９μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、二本鎖の解離処理１秒および伸長反応処理１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。前記解離処理の温度は、９５℃、伸長反応処理（アニーリング処理を含む）の温度は、所定温度（５２℃、５８℃または６０℃）とした。そして、ＰＣＲ反応後、さらに、前記反応液を９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）とした。【００８０】
【表１】
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【００８１】
（プライマーセット）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３  Ｆプライマー  （配列番号１）
5'-gagcccctgcatgcaa-3'  
ＣＹＰ２Ｃ９＊３  Ｒプライマー  （配列番号２）
5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3'
（変異型検出用プローブ）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３  プローブ  （配列番号３）
5'-gggagaagGtcaAGgTatc-(BODIPY  FL)-3'【００８２】
変異型検出用のＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブと前記プローブに対して完全に相補的な相補鎖とのハイブリッド（パーフェクトマッチ二本鎖）のＴｍＰｅｒ値は、５８℃である。また、前記ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブと前記プローブに対して検出対象部位の１塩基を除いて完全に相補的な相補鎖とのハイブリッド（ミスマッチ二本鎖）のＴｍＭｉｓ値は、５３℃である。【００８３】
これらの結果を図１〜図３に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示す融解曲線のグラフであり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄＴ」（−ｄＦ／ｄＴ）を示し、横軸は温度を示す。図１は、ＰＣＲの伸長反応温度を５２℃に設定した際の融解曲線を示すグラフであり、図２は、前記伸長反応温度を５８℃に設定した際の融解曲線を示すグラフ、図３は、前記伸長反応温度を６０℃に設定した際の融解曲線を示すグラフである。【００８４】
前記伸長反応温度が５２℃の場合、前記パーフェクトマッチ二本鎖のＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度との関係は、「ＴｍＰｅｒ値＞伸長反応温度」となり、本発明における条件を満たしていない。このため、図１に示すように、５３℃におけるミスマッチ二本鎖のピークは十分に確認できるものの、５８℃におけるパーフェクトマッチ二本鎖のピークは極めて小さく、判断し難いという結果であった。これに対して、前記伸長反応温度が５８℃の場合、前記パーフェクトマッチ二本鎖のＴｍＰｅｒ値と伸長反応温度との関係は、「ＴｍＰｅｒ値＝伸長反応温度」となり、前記伸長反応温度が６０℃の場合、前記パーフェクトマッチ二本鎖のＴｍ値と伸長反応温度との関係は、「ＴｍＰｅｒ値＜伸長反応温度」となり、本発明の条件を満たしている。その結果、図２および図３に示すように、５３℃におけるミスマッチのピークはもちろんのこと、５８℃におけるパーフェクトマッチのピークも同様に検出することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
以上のように、本発明によれば、プローブの存在下で標的配列の増幅を行っても、前記伸長反応の反応温度において、前記プローブが鋳型核酸にハイブリダイズし難い。このため、プライマーの鋳型核酸へのアニーリングや前記プライマーからの伸長反応がプローブによって阻害され難く、結果として、前記標的配列の増幅を十分に行うことが可能となる。したがって、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析において、従来よりもピークの有無を高い信頼性で判別することができる。このため、本発明は、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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