(57)【要約】【課題】  本発明は、免疫バランス調節作用を有する新たな天然素材を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤を提供する。生体防御に重要な免疫細胞を、特に抗原提示細胞を活性化することによって免疫機能を賦活化させることができる。また同時に、行き過ぎたＴｈ２系免疫能を抑制して、Ｔｈ１系免疫能とＴｈ２系免疫能とのバランスを保ち、免疫による生体防御機能の強化と望ましくないアレルギー反応の抑制を達成することができる。
2009154051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤。
【請求項２】
黒千石が、水で膨潤した黒千石である、請求項１に記載の免疫バランス調節剤。
【請求項３】
水で膨潤した黒千石が水で煮た黒千石又は水蒸気で蒸した黒千石である、請求項２に記載の免疫バランス調節剤。
【請求項４】
黒千石の破砕物が、水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものである、請求項１に記載の免疫バランス調節剤。
【請求項５】
水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものが水で煮た黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で煮たもの、若しくは水蒸気で蒸した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水蒸気で蒸したものである、請求項４に記載の免疫バランス調節剤。
【請求項６】
黒千石の破砕物が、水を移動相とした遠心分離において４００×ｇで上澄み画分に回収され、１８０００×ｇで沈殿画分に回収される破砕物である、請求項４又は請求項５に記載の免疫バランス調節剤。
【請求項７】
さらに水分が除去された黒千石又はその破砕物である、請求項２〜請求項６の何れかに記載の免疫バランス調節剤。
【請求項８】
エタノール水溶液が、３０体積％エタノール水溶液及び／又は６０体積％エタノール水溶液である、請求項１〜請求項７の何れかに記載の免疫バランス調節剤。
【請求項９】
エタノール水溶液抽出物が、エタノール水溶液を移動相とした遠心分離において４８５×ｇで上澄み画分に回収される抽出物である、請求項１〜請求項７の何れかに記載の免疫バランス調節剤。
【請求項１０】
抗原提示細胞を活性化させるための、請求項１〜請求項９の何れかに記載の免疫バランス調節剤。
【請求項１１】
脾臓免疫細胞を活性化させるための、請求項１〜請求項９の何れかに記載の免疫バランス調節剤。
【請求項１２】
黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物の免疫バランス調節用食品としての使用。
【請求項１３】
黒千石が、水で膨潤した黒千石である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
水で膨潤した黒千石が水で煮た黒千石又は水蒸気で蒸した黒千石である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
黒千石の破砕物が、水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものが水で煮た黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で煮たもの、若しくは水蒸気で蒸した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水蒸気で蒸したものである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
黒千石の破砕物が、水を移動相とした遠心分離において４００×ｇで上澄み画分に回収され、１８０００×ｇで沈殿画分に回収される破砕物である、請求項１５又は請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
さらに水分が除去された黒千石又は黒千石の破砕物である、請求項１３〜請求項１７の何れかに記載の使用。
【請求項１９】
抗原提示細胞を賦活化させるための食品としての、請求項１２〜請求項１８の何れかに記載の使用。
【請求項２０】
脾臓免疫細胞を活性化させるための食品としての、請求項１２〜請求項１８の何れかに記載の使用。
【請求項２１】
水で膨潤した黒千石を磨り潰したものを、水を移動相として４００×ｇの遠心分離を行い、回収される上澄み画分をさらに１８０００×ｇで遠心分離を行って、沈殿画分として回収される破砕物からなる黒千石の破砕物を有効成分とする免疫バランス調節剤。
【請求項２２】
水で膨潤した黒千石を磨り潰したものを、水を移動相として８００×ｇの遠心分離を行って回収される沈殿画分に３０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、回収される濾液を４８５×ｇの遠心分離を行って上澄み画分に回収される抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤。
【請求項２３】
水で膨潤した黒千石を磨り潰したものを、水を移動相として８００×ｇの遠心分離を行って回収される沈殿画分に３０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、さらに回収される固形分に６０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、回収される濾液を４８５×ｇの遠心分離を行って上澄み画分に回収される抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物、特に水で膨潤した黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物を有効成分とする免疫賦活剤に関する。なお、本願は、平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、生体の防御機構を構成する多くの要素の中で特に重要であり、細菌、酵母、カビ、ウイルス等の微生物による感染あるいは腫瘍等に対する防御並びに生体の恒常性維持において、重要な役割を果している。その主要な機構は、微生物や腫瘍を異物として認識する樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞や抗原提示細胞からの刺激を受けたＴリンパ球及びＢリンパ球等のいわゆる獲得免疫細胞が、抗原特異的に活性化され、あるいは菌体成分やレクチン等を認識する受容体を介して抗原非特異的に活性化され、異物を排除する能力を高めることである。【０００３】
特に抗原提示細胞は、生体に侵入した異物を貧食して細胞内に取り込み、消化して排除するとともに、消化した異物のペプチドを細胞表面に発現させてリンパ球に提示する機能を有する他、癌細胞に対する傷害性の獲得や、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２)等の各種サイトカイン類の放出によってＴ細胞やＢ細胞等の他の免疫細胞の活性化に関与する等、深く免疫系の賦活化に関与していることが知られている。そのため、抗原提示細胞を活性化することは、免疫能の賦活化において重要な課題である。【０００４】
一方、免疫系は、加齢、ストレス、疲労、環境因子等、何らかの要因により、その機能が低下することが知られている。こうした要因は日常生活において頻繁に発生する性質のものであることから、機能が低下する度に免疫能を賦活化させるよりも、むしろ食事やサプリメントの摂取等によって免疫能を恒常的にあるいは日常的に賦活化させておくことが望ましいと考えられている。【０００５】
そうした恒常的なあるいは日常的な免疫能の賦活化を目的として、様々な食品やサプリメント、あるいは漢方処方や生薬等の天然抽出物を含む免疫賦活剤が数多く研究され、また開発されている。例えば、ケフィア粒（特許文献１）、イソマルトオリゴ糖（特許文献２）、アマノリ属抽出物（特許文献３）、大豆タンパク質（特許文献４）には水溶性リグニン（特許文献５）等を、例として挙げることができる。【０００６】
黒千石は、栽培に手間がかかることから１９７０年代頃にはいったん栽培が途絶えてしまった、黒大豆の一種である。最近になって、黒大豆が大豆イソフラボン、アントシアニンを多く含むという栄養的な価値と味の良さが再評価され、再び栽培が始められたが、その利用は納豆、黒豆茶、雑穀商品、巻き寿司等の、一般的な食品素材としての範囲に留まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−６５７９０号公報
【特許文献２】特開平２−１７４７１８号公報
【特許文献３】特開平３−２８４６２６号公報
【特許文献４】特開平４−２２９１８９号公報
【特許文献５】特開平２−２３７９３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、免疫バランス調節作用、特に免疫賦活能を有する新たな天然素材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物、特に水で膨潤した黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物が、その他の黒大豆には認められない免疫賦活能を示すこと、及び行き過ぎたＴｈ２系免疫能の亢進を抑制し得ることを見いだし、下記の各発明を完成した。【００１０】
（１）黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤。【００１１】
（２）黒千石が、水で膨潤した黒千石である、（１）に記載の免疫バランス調節剤。【００１２】
（３）水で膨潤した黒千石が水で煮た黒千石又は水蒸気で蒸した黒千石である、（２）に記載の免疫バランス調節剤。【００１３】
（４）黒千石の破砕物が、水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものである、（１）に記載の免疫バランス調節剤。【００１４】
（５）水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものが水で煮た黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で煮たもの、若しくは水蒸気で蒸した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水蒸気で蒸したものである、（４）に記載の免疫バランス調節剤。【００１５】
（６）黒千石の破砕物が、水を移動相とした遠心分離において４００×ｇで上澄み画分に回収され、１８０００×ｇで沈殿画分に回収される破砕物である、（４）又は（５）に記載の免疫バランス調節剤。【００１６】
（７）さらに水分が除去された黒千石又は黒千石の破砕物である、（２）〜（６）の何れかに記載の免疫バランス調節剤。【００１７】
（８）エタノール水溶液が、３０体積％エタノール水溶液及び／又は６０体積％エタノール水溶液である、（１）〜（７）の何れかに記載の免疫バランス調節剤。【００１８】
（９）エタノール水溶液抽出物が、エタノール水溶液を移動相とした遠心分離において４８５×ｇで上澄み画分に回収される抽出物である、（１）〜（７）の何れかに記載の免疫バランス調節剤。【００１９】
（１０）抗原提示細胞を活性化させるための、（１）〜（９）の何れかに記載の免疫バランス調節剤。【００２０】
（１１）脾臓免疫細胞を活性化させるための、（１）〜（９）の何れかに記載の免疫バランス調節剤。【００２１】
（１２）黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物の免疫バランス調節用食品としての使用。【００２２】
（１３）黒千石が、水で膨潤した黒千石である、（１２）に記載の使用。【００２３】
（１４）水で膨潤した黒千石が水で煮た黒千石又は水蒸気で蒸した黒千石である、（１３）に記載の使用。【００２４】
（１５）黒千石の破砕物が、水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものである、（１２）に記載の使用。【００２５】
（１６）水で膨潤した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で膨潤したものが水で煮た黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水で煮たもの若しくは水蒸気で蒸した黒千石の破砕物又は黒千石の破砕物であって水蒸気で蒸したものである、（１５）に記載の使用。【００２６】
（１７）黒千石の破砕物が、水を移動相とした遠心分離において４００×ｇで上澄み画分に回収され、１８０００×ｇで沈殿画分に回収される破砕物である、（１５）又は（１６）に記載の使用。【００２７】
（１８）さらに水分が除去された黒千石又は黒千石の破砕物である、（１３）〜（１７）の何れかに記載の使用。【００２８】
（１９）抗原提示細胞を賦活化させるための食品としての、（１２）〜（１８）の何れかに記載の使用。【００２９】
（２０）脾臓免疫細胞を活性化させるための食品としての、（１２）〜（１８）の何れかに記載の使用。【００３０】
（２１）水で膨潤した黒千石を磨り潰したものを、水を移動相として４００×ｇの遠心分離を行い、回収される上澄み画分をさらに１８０００×ｇで遠心分離を行って、沈殿画分として回収される破砕物からなる黒千石の破砕物を有効成分とする免疫バランス調節剤。【００３１】
（２２）水で膨潤した黒千石を磨り潰したものを、水を移動相として８００×ｇの遠心分離を行って回収される沈殿画分に３０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、回収される濾液を４８５×ｇの遠心分離を行って上澄み画分に回収される抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤。【００３２】
（２３）水で膨潤した黒千石を磨り潰したものを、水を移動相として８００×ｇの遠心分離を行って回収される沈殿画分に３０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、さらに回収される固形分に６０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、回収される濾液を４８５×ｇの遠心分離を行って上澄み画分に回収される抽出物を有効成分とする免疫バランス調節剤。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の免疫バランス調節剤は、黒千石という天然素材を利用した安全な免疫バランス調節剤であり、生体防御に重要な免疫細胞を、特に抗原提示細胞を活性化することによって免疫機能を賦活化させることができる。また同時に、行き過ぎたＴｈ２系免疫能を抑制して、Ｔｈ１系免疫能とＴｈ２系免疫能とのバランスを保ち、免疫による生体防御機能の強化と望ましくないアレルギー反応の抑制を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１に示した黒千石又は黒千石の破砕物のＩＦＮγ産生誘導能を示すグラフである。
【図２】収穫年の異なる黒千石から調製した破砕物のＩＦＮγ産生誘導能を示すグラフである。
【図３】黒千石とその他の豆から調製した可溶画分と沈殿画分（破砕物）におけるＩＦＮγ産生誘導能の比較試験結果を示すグラフである。
【図４】収穫年の異なる黒千石から調製した破砕物の、脾臓免疫細胞に対する増殖促進作用をグラフである。
【図５】黒千石の破砕物との共培養による、ＮＫ１．１陽性ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞、ＴＣＲβ陽性Ｔ細胞の活性化している細胞の割合の増加を示す、フローサイトメトリーによる解析結果である。
【図６】黒千石の破砕物との共培養により、ＤＣ表面のＭＨＣクラスＩＩ分子及びＣＤ８６分子の発現が有意に促進されることを示す、フローサイトメトリーによる解析結果である。
【図７】黒千石の破砕物との共培養により、ＤＣ表面のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現が有意に促進されることを示す、フローサイトメトリーによる解析結果である。
【図８】黒千石とその他の豆から調製した沈殿画分（破砕物）におけるＤＣに対するＩＬ−１２ｐ７０産生促進能の比較試験結果を示すグラフである。
【図９】エタノールを用いて乾燥させた黒千石の破砕物のＩＦＮγ産生誘導能を示すグラフである。
【図１０】黒千石きな粉からの破砕物のＩＦＮγ産生誘導能を示すグラフである。
【図１１】黒千石の破砕物がＴＬＲ２又はＴＬＲ４に認識され、ＩＦＮγの産生を誘導することを示すグラフである。
【図１２】黒千石の水溶画分、３０体積％エタノール抽出画分、６０体積％エタノール抽出画分及び１００％エタノール抽出画分の脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導作用を示したグラフである。
【図１３】６０体積％エタノール抽出画分が、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４に認識され、脾臓免疫細胞からのＩＦＮγ産生を誘導することを示す図である。
【図１４】６０体積％エタノール抽出画分が、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４に認識され、骨髄由来樹状細胞からのＩＬ−１２ｐ７０産生を誘導することを示す図である。
【図１５】６０体積％エタノール抽出画分が、ヒト末梢血単核球からのＩＦＮγ産生をより誘導することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物を有効成分とする免疫賦活剤である。黒千石は黒大豆（学名Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）の一種であるが、実は球形であること、他の黒大豆よりも極小粒（１００粒重量は約１０−１１ｇ）であること、他の黒大豆よりも大豆イソフラボン及びアントシアニンの含有量が高いこと、普通の大豆の歯数が９−１０枚であるのに対して黒千石は１３−１４枚であること等、多くの点でその他の黒大豆とは性質が異なる、固有の品種である。
【００３６】
黒千石は、北海道では北海道黒千石生産組合（北海道雨竜郡北竜町字碧水３１番地の１）が推進役となって同北竜町や北海道爾志郡乙部町等において生産され、供給されている。また、黒千石は岩手県岩手郡雫石町においても生産され、供給されている。本発明では、これら黒千石をその産地を問わずにいずれも利用することができ、黒千石又は納豆等の黒千石の加工品に新たな機能的付加価値を与えるものである。
【００３７】
本発明の免疫バランス調節剤の一態様は、黒千石、特に水で膨潤した黒千石をそのまま使用するものである。水で膨潤した黒千石は、乳鉢と乳棒を用いて磨り潰せるあるいは砕ける程度にまで、適当な量、好ましくは過剰量の水に一昼夜浸すか、過剰量の水に浸して煮るか、あるいは水蒸気を用いて蒸すかして、調製すればよい。また、本発明では、上記の様な水で膨潤した黒千石を凍結乾燥等によって乾燥させたものも使用することができる。本発明において「水で膨潤した黒千石」と表すときは、特に断らない限り、水で膨潤した黒千石及びそれを乾燥させたものを含めて意味するものとする。本発明の免疫バランス調節剤の好適な態様は、黒千石に対してその重量比で約１０倍程度の量の水を加えて煮ることで得られる、「水で膨潤した黒千石」である。
【００３８】
本発明の免疫バランス調節剤の他の好ましい形態は、黒千石由来の破砕物である。黒千石由来の破砕物には、生の黒千石又は黒千石を加熱焙煎したものを磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物であって一度も水で膨潤していない破砕物、生の黒千石又は黒千石を加熱焙煎したものを磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物を水で膨潤させて得られる破砕物、水で膨潤した黒千石を磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物、水で膨潤した黒千石を乾燥させたものを磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物等を挙げることができる。すなわち、本発明の免疫バランス調節剤は、黒千石の破砕物である限り、破砕する前の黒千石が生であるか、加熱焙煎されたものであるか、水で膨潤したものであるか、水で膨潤したものを乾燥させたものかは問わず、また破砕の操作と水による膨潤の操作の前後も問わない。また、破砕物には粉末も含まれる。
【００３９】
さらに、生の黒千石又は黒千石を加熱焙煎したものを磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物を水で膨潤させて得られる破砕物及び水で膨潤した黒千石を磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物は、加熱乾燥、風乾、あるいは凍結乾燥等の乾燥処理によって水を除去してから使用してもよい。すなわち本発明では、水を含んだままの破砕物及びそこから水を除去したものも、利用することができる。
【００４０】
本発明では、「水で膨潤した黒千石の破砕物」と表すときは、前記水を含んだままの破砕物及びそこから水を除去したものの何れも含むことを意味する。また、「黒千石の破砕物」と表すときは、一度も水で膨潤していない破砕物及び「水で膨潤した黒千石の破砕物」を含め、本発明における黒千石由来の破砕物の全ての態様を含むことを意味する。
【００４１】
黒千石又は「水で膨潤した黒千石」を磨り潰す又は砕く操作は、乳鉢と乳棒、ミキサーやブレンダーその他の豆類を破砕することのできる一般的な器具、装置あるいは方法によって行うことができ、特別な器具、装置、方法等は特に必要とされない。
【００４２】
本発明で利用可能な「黒千石の破砕物」の好ましい第一の例は、生の黒千石又は黒千石を加熱焙煎したものを磨り潰すあるいは砕いて得られる破砕物である。この黒千石の破砕物はそのまま免疫バランス調節剤として使用してもよく、また破砕物を過剰量の水に浸して水で膨潤させて「水で膨潤した黒千石の破砕物」としてから、免疫バランス調節剤として使用してもよい。なお、前記の通り、この破砕物から水を除去したものを「水で膨潤した黒千石の破砕物」として使用してもよい。
【００４３】
本発明で利用可能な「黒千石の破砕物」の好ましい第二の例は、過剰量の水を用いて煮た黒千石を煮汁と共に乳鉢と乳棒を用いて磨り潰した後、濾過処理でフィルター上に回収される「水で膨潤した黒千石の破砕物」である。この破砕物はほぼ白色を呈しており、黒千石の黒褐色の元となっているアントシアニンやポリフェノール等の植物色素の殆どは、濾過処理における濾液画分に移行しているものと推察される。なお、前記の通り、この破砕物から水を除去したものを「水で膨潤した黒千石の破砕物」として使用してもよい。
【００４４】
また、本発明で利用可能な「黒千石の破砕物」の好ましい第三の例は、過剰量の水を用いて煮た黒千石を煮汁と共に乳鉢と乳棒を用いて磨り潰した後、４００×ｇで遠心分離を行って上澄み画分を回収し、さらにこの上澄み画分を１８０００×ｇで遠心分離したときに沈殿画分として回収される、前記第一の例よりも細かい「水で膨潤した黒千石の破砕物」である。この破砕物も、第一の例と同様にほぼ白色を呈する。また、前記の通り、この破砕物から水を除去したものを「水で膨潤した黒千石の破砕物」として使用してもよい。
【００４５】
本発明の免疫バランス調節剤のもう一つの好ましい形態は、前記黒千石、特に水で膨潤した黒千石のエタノール水溶液抽出物、又は前記黒千石の破砕物、特に水で膨潤した黒千石の破砕物のエタノール水溶液抽出物を使用するものである。抽出に用いるエタノール水溶液のエタノール濃度は特に限定されず、適宜濃度を選択することができるが、エタノール濃度を３０体積％とするのが好ましく、６０体積％とするのがより好ましい。
【００４６】
本発明で利用可能な「エタノール水溶液抽出物」の好ましい第一の例は、過剰量の水を用いて煮た黒千石を煮汁と共に乳鉢と乳棒を用いて磨り潰した後、遠心分離処理して回収される沈殿画分に過剰量エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、その濾液として回収し、これを遠心分離処理して上澄みとして回収される抽出物である。加えるエタノール水溶液の量は、過剰量であれば特に限定されず、例えば１０倍量とすることができる。また、それぞれの上澄み画分を、そのまま「エタノール水溶液抽出物」として用いてもよく、あるいは回収後に適宜凍結乾燥等して用いることができる。
【００４７】
本発明で利用可能な「エタノール水溶液抽出物」の好ましい第二の例は、過剰量の水を用いて煮た黒千石を煮汁と共に乳鉢と乳棒を用いて磨り潰した後、遠心分離処理して回収される沈殿画分に過剰量エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、フィルター上に回収される固形分にさらに過剰量エタノール水溶液を加えて濾過処理を行うことにより濾液として回収し、これを遠心分離処理して上澄みとして回収される抽出物である。この場合、得られた固形分にさらに過剰量エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、その濾液を回収する工程を１又は２以上加えてもよく、また、加える過剰量エタノール水溶液の濃度を適宜選択することができる。例えば、過剰量の水を用いて煮た黒千石を煮汁と共に乳鉢と乳棒を用いて磨り潰した後、遠心分離処理して回収される沈殿画分に過剰量の３０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、フィルター上に回収される固形分に過剰量の６０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行うことにより回収される濾液を、さらに遠心分離処理して上澄みとして抽出物を回収することができる。なお、加えるエタノール水溶液の量は、過剰であれば特に限定されず、例えば１０倍量とすることができる。また、上澄み画分を、そのまま「エタノール水溶液抽出物」として用いてもよく、あるいは回収後に適宜凍結乾燥等して用いることができる。
【００４８】
また、本発明で利用可能な「エタノール水溶液抽出物」の好ましい第三の例は、過剰量の水を用いて煮た黒千石を煮汁と共に乳鉢と乳棒を用いて磨り潰した後、８００×ｇで遠心分離を行って回収される沈殿画分に過剰量の３０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行い、フィルター上に回収される固形分に過剰量の６０体積％エタノール水溶液を加えて濾過処理を行うことにより回収される濾液を、さらに４８５×ｇで遠心分離処理を行って上澄みとして抽出物を回収することができる。なお、加えるエタノール水溶液の量は、過剰であれば特に限定されず、例えば１０倍量とすることができる。また、上澄み画分を、そのまま「エタノール水溶液抽出物」として用いてもよく、あるいは回収後に適宜凍結乾燥等して用いることができる。
【００４９】
本発明では、上記の黒千石、「水で膨潤した黒千石」、「黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」が、特に「水で膨潤した黒千石」、「水で膨潤した黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」が、免疫バランス調節剤として、免疫賦活剤として、免疫バランス調節用飲食物として、又は免疫賦活用飲食物として使用される。すなわち本発明は、上記の黒千石、「水で膨潤した黒千石」、「黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」、特に「水で膨潤した黒千石」、「水で膨潤した黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」を免疫バランス調節剤又は免疫バランス調節用飲食物として、特に免疫賦活剤又は免疫賦活用飲食物として使用すること、換言すれば動物の免疫バランスを調節すること、あるいはその免疫能を強化、増強ないし活性化することを目的としたあるいは意図した、上記の黒千石、「水で膨潤した黒千石」、「黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」の、特に「水で膨潤した黒千石」、「水で膨潤した黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」の使用に関するものである。本発明では、上記の黒千石、「水で膨潤した黒千石」、「黒千石の破砕物」又はそれらの「エタノール水溶液抽出物」をまとめて、「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」と表すこととする。
【００５０】
本発明にいう免疫バランス調節、すなわち免疫バランスを調節する作用とは、Ｔｈ１系免疫能とＴｈ２系免疫能の一方、特にＴｈ１系免疫能を賦活化し、Ｔｈ２系免疫能の行き過ぎた亢進を減弱することで、両免疫能が調節された状態に導く作用を意味する。なお、本発明にいう免疫バランスの調節は免疫バランスの調整と交換可能に使用される。また「免疫賦活」とは、動物、特にヒトを含む哺乳動物に備わる異物又は悪性新生腫瘍等に対する生体防御機構である免疫能、特にＴｈ１系免疫能を強化、増強ないし活性化することを意味する。
【００５１】
一般に、Ｔｈ１系免疫は、抗原提示細胞である樹状細胞やマクロファージからの抗原ペプチドの提示とＩＬ−１２の作用によって誘導されるＴｈ１細胞（Ｔヘルパー１細胞）が関与する細胞性免疫として理解されている。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγ等Ｔｈ２細胞の分化阻害やＢ細胞の成熟阻害を介したＩｇＥ抗体の産生を抑制するサイトカインの他に、ＩＬ−２やＴＮＦ−α等を産生し、キラーＴ細胞の活性化や樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞の活性を高める働きを有する。一方のＴｈ２免疫系は、抗原提示細胞であるマクロファージからの抗原ペプチドの提示とＩＬ−４の作用によって誘導されるＴｈ２細胞（Ｔヘルパー２細胞）が関与する液性免疫として理解されている。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４やＩＬ−１３等のＢ細胞の成熟を介したＩｇＥ抗体の産生を増加させるサイトカインの他に、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０を産生する。
【００５２】
Ｔｈ２細胞から産生されるＩＬ−４、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮγの産生を抑制するように、互いにその作用を調節し合うことが知られており、またＴｈ２系免疫能が優性であると細胞性免疫が抑制され、感染症が重症化し易く、またＢ細胞の成熟を介したＩｇＥ抗体産生が増加し、アレルギー体質に陥りやすいと考えられている。従って、Ｔｈ１系免疫能とＴｈ２系免疫能のバランスの崩壊、特に行き過ぎたＴｈ２免疫系機能の亢進ないし優性は、必ずしも生体にとって好ましいものとは言えない。
【００５３】
本発明で使用する「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、後の実施例に示すように、抗原提示細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫細胞に対する活性化、すなわちＴｈ１系免疫能を賦活化し、免疫能を強化、増強、ないし活性化するという免疫賦活作用を有する。また、本発明で使用する「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、Ｔｈ２細胞の分化阻害やＢ細胞の成熟阻害に重要なＩＦＮγの産生を誘導する作用、ＮＫ細胞やＴ細胞のＩＦＮγ産生誘導に重要なサイトカインであるＩＬ−１２の産生を誘導する作用を示す。さらにこうした免疫賦活作用、ＩＦＮγの産生誘導、あるいはＩＬ−１２の産生を誘導する作用を通じて、行き過ぎたＴｈ２系免疫能を減弱させることにより、Ｔｈ２免疫系機能が優位にある状態、例えばアレルギーを緩和することができる。
【００５４】
この様に、「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、免疫賦活能を介した免疫バランス調節剤として利用することができる。具体的には、本発明の免疫バランス調節剤には、アトピー性皮膚炎、肌荒れ、敏感肌、花粉症、喘息、気管支喘息、鼻炎、蕁麻疹等のアレルギー性疾患等の予防、治療あるいは症状の改善効果を期待することができる。
【００５５】
また、上記のように、本発明で使用する「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」はＴｈ１系免疫能を強化、増強、ないし活性化する、すなわち免疫賦活作用を有しており、免疫賦活剤として利用することができる。さらに、本発明で使用する「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、ＩＦＮγ産生誘導剤として、又はＩＬ−１２産生誘導剤としても利用することができる。従って、「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」を有効成分とする免疫バランス調節剤及び免疫賦活剤には、ウイルスや細菌等による感染症や悪性新生腫瘍等の予防、治療あるいは症状の改善効果を期待することができる。特に、本発明で使用される「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」を継続的に摂取することにより、ウイルスや細菌等に感染しにくい体質へと、あるいは悪性新生腫瘍に罹患しにくい体質へと、体質改善を図ることもできるものと期待される。
【００５６】
さらに、本発明で使用される「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、抗原提示細胞に直接作用することで、Ｔ細胞に対する抗原提示において重要な役割を果たす主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の発現、さらにＴ細胞等を補助的に活性化する働きのあるＣＤ８６及びＣＤ４０分子の発現を上昇させる作用を有する。従って、本発明における「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、抗原提示細胞活性化剤としても有用である。
【００５７】
本発明で使用される「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、そのまま免疫バランス調節剤、特に免疫賦活剤として利用できる他、適当な賦形剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤等と組み合わせて組成物とし、乳剤、油剤、水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等その他の一般的な剤型に製剤化して使用することも可能である。特に、経口的に摂取が可能な剤型とすることが好ましい。
【００５８】
組成物あるいは剤型における「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」の配合量は特に規定されるものではないが、組成物あるいは製剤全量中、乾燥固形分として１〜９９重量％、好ましくは１０〜９９重量％、更に好ましくは５０〜９９重量％配合させるのがよい。
【００５９】
上記組成物あるいは各種の剤型は、「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」の他に、ビタミンや生薬等の薬物を有効成分として必要に応じて配合し、医薬品、医薬部外品の形態としても差し支えない。あるいは、デンプン、タンパク質、ミネラル成分その他の栄養素を含む食品原材料や食品添加物と組み合わせることで、免疫バランス調節作用あるいは免疫賦活作用を有する飲食物やサプリメントの形態に加工して使用することもできる。
【００６０】
飲食物の形態の例としては、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、ビスケット又はスナック等の菓子、アイスクリーム、シャーベット又は氷菓等の冷菓、羊羹、最中、甘納豆等の和菓子、プリン、ジャム等が挙げられるが、これらには限定されない。これらの飲食物に対する「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」の添加量としては、飲食物の形態によっても異なるが、０．００１重量％以上の添加が望ましく、嗜好性の面からは５重量％以下の添加が好ましい。この様な飲食物の形態にある「黒千石、黒千石の破砕物又はそれらのエタノール水溶液抽出物」は、免疫バランスを調節することを、あるいは免疫力を強化、増強、ないし活性化することを目的としてあるいは意図して使用される限り、本発明の実施の一態様として理解される。
【００６１】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定的に解釈されるものではない。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞水で膨潤した黒千石のＩＦＮγ産生誘導能
（１）水で膨潤した黒千石の調製
黒千石を約２０ｇ量りとったあと、ｍｉｌｌｉＱ水で繰り返し表面を洗い、表面に付いた汚れを十分に除去した。さらにｍｉｌｌｉＱ水２００ｍＬを加え、オートクレーブで１２１℃、２０分間、加圧しながら黒千石を水で膨潤させ、ペーパーフィルターを用いて回収した。さらにこの水で膨潤した黒千石を−３０℃で凍結した後、凍結乾燥機を用いて乾燥させた。【００６３】
（２）水で膨潤した黒千石の破砕物の調製
黒千石を約１０ｇ量りとり、ｍｉｌｌｉＱ水で繰り返し表面を洗い、表面に付いた汚れを十分に除去した。さらにｍｉｌｌｉＱ水６０ｍＬを加え、オートクレーブで１２１℃、２０分間、加圧しながら黒千石を水で膨潤させた。【００６４】
ペーパーフィルターを用いて煮汁と黒千石を分け、黒千石を乳鉢に移し、煮汁を加えながら乳棒で磨り潰した。磨り潰した黒千石を煮汁と共に５０ｍＬ容チューブに移して、１５００ｒｐｍ（４８５×ｇ）で１０分間分遠心分離処理を行い、上澄み画分を回収した。この上澄み画分の１０ｍＬを１５ｍＬ容チューブに移し、１５００ｒｐｍ（４８５×ｇ）で１０分間遠心分離処理を行って、再度、上澄み画分を回収した。【００６５】
この２回目の遠心分離処理後の上澄み画分１ｍＬを１．５ｍＬ容エッペンチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ（１７３６０×ｇ）で１０分間遠心分離処理して、可溶画分と沈殿画分である水で膨潤した黒千石の破砕物とをそれぞれ得た。【００６６】
（３）脾臓免疫細胞の分離
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスより脾臓を採取した。１０％ＦＣＳ、２．３８ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐｅｓ、０．１１ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、２００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬社）中でピンセットを用いて脾臓をほぐした。細胞を培養液と共にナイロンメッシュ (和光純薬社) を通して組織部分を除去しながら回収した。小型冷却遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２、ＨＩＴＡＣＨＩ社）を用いて１５００ｒｐｍ、５分間遠心処理したあと、上清を捨て２ｍＬの０．１５５Ｍ塩化アンモニウムで３７℃、１分３０秒インキュベートすることで赤血球を排除し、脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製した。【００６７】
（４）ＩＦＮγ産生誘導作用の確認
前記（１）で凍結乾燥サンプルをＰＢＳで懸濁後、最終的に０．０６ｍｇ／ｍＬ〜４ｍｇ／ｍＬとなるように、（３）の脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地に添加して共培養を行った。また前記（２）より得た可溶画分は最終的に５〜３２０倍稀釈となるように、また沈殿画分である破砕物は最終的に２５０〜１６０００倍稀釈となるように、それぞれ（３）の脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地に添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で共培養を行った。共培養は、９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ社）を用い、脾臓免疫細胞の濃度は５×１０５ｃｅｌｌ／ウェルとした。４８時間後、培養上清中のＩＦＮγ量をＥＬＩＳＡ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。【００６８】
その結果、（１）の凍結乾燥サンプルと（２）の破砕物に、脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導能が確認された。一方、（２）の可溶画分には脾臓免疫細胞に対する有意なＩＦＮγ産生誘導能は確認されなかった（図１）。【００６９】
＜実施例２＞黒千石のＩＦＮγ産生誘導作用に対する収穫年度の影響
平成１７、１８、１９年各年に収穫され、室温保存されていた黒千石から実施例１の（２）と同じ操作によって破砕物（沈殿画分）を調製し、実施例１の（４）と同じ操作（稀釈倍率を除く）によって脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導能を調べた。【００７０】
その結果、収穫年度によらず、何れの破砕物についても脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導能を有することが確認された（図２）。【００７１】
＜実施例３＞黒千石と他の豆類とのＩＦＮγ産生誘導作用の比較
中国産のオレンジささげ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、北海道のあずき（あずき−１、商品名「十勝産大粒手撰豆」、Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）のあずき、北海道産の小豆（あずき−２、Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、宮城産の大豆（商品名「鶴の子大豆」、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、北海道産の大納言（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、北海道産の黒豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）それぞれから、実施例１の（２）と同じ操作によって可溶画分と沈殿画分を調製し、実施例１の（４）と同じ操作（稀釈倍率を除く）によって、脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導能を調べた。【００７２】
その結果、黒千石以外の豆から調製された可溶画分と沈殿画分のいずれにも、脾臓免疫細胞に対する有意なＩＦＮγ産生誘導能は確認されなかった（図３）。【００７３】
＜実施例４＞黒千石の脾臓免疫細胞に対する増殖促進作用の確認
実施例２における収穫年度の異なる黒千石から調製した破砕物と脾臓免疫細胞との４８時間の共培養の終了後、各ウェルから培養上清を一部除去し、代わりに適量のＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥ試薬（生化学工業社）を加え、さらに２時間インキュベートした。インキュベーション後の各ウェルの４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＥＺＡ−ＡＢＳ、ＩＷＡＫＩ社）を用いて測定した。これらの吸光度の差（４５０ｎｍの吸光度−６３０ｎｍの吸光度）の値から、細胞増殖の程度を定量化することができる。【００７４】
その結果、破砕物を加えないコントロールと比べて、破砕物を培地に添加することで脾臓免疫細胞の増殖が促進されることが確認された（図４）。【００７５】
＜実施例５＞
実施例１の（４）における破砕物（実施例１の（２）の沈殿画分、１０００倍稀釈）と共培養した脾臓免疫細胞について、培養３６時間後の培養液中のＮＫ１．１陽性ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞、ＴＣＲβ陽性Ｔ細胞を、それぞれ抗ＮＫ１．１＋（ＰＫ１３６）、抗ＣＤ１１ｃ＋（ＨＬ３）、抗ＣＤ１９＋（１Ｄ３）、抗ＴＣＲβ＋（Ｈ５７−５９７）各モノクローナル抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて検出した。上記各分子は、脾臓免疫細胞における代表的な表面抗原である。また併せて、前記各細胞の細胞表面抗原の陽性細胞における初期活性化抗原であるＣＤ６９分子について、抗ＣＤ６９モノクローナル抗体（Ｈ１．２Ｆ３）を用いて染色した。なお、培地に何も添加してない群を無添加コントロールとして用意した。【００７６】
その結果、無添加コントロールと比較して、黒千石の破砕物との共培養により、前記細胞表面抗原を有する細胞数が有意に増加していることが確認された（図５）。【００７７】
＜実施例６＞
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し、６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ社）に１×１０６ｃｅｌｌ／ウェルとなるよう播種し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ (Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）の存在下で６日間培養し、抗原提示細胞である樹状細胞（ＤＣ）を誘導した。この細胞と実施例１の（２）の黒千石破砕物（沈殿画分、１０００倍稀釈）とを１０％ＦＣＳ、２．３８ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐｅｓ、０．１１ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、２００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で共培養し、３６時間後における細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子及びＣＤ８６分子の発現レベルを、抗ＭＨＣクラスＩＩ分子モノクローナル抗体（ＡＦ６−８８．５）及び抗ＣＤ８６モノクローナル抗体（ＧＬ１）を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により検出した。【００７８】
その結果、黒千石の破砕物を添加しないコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、黒千石の破砕物を添加することにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子及びＣＤ８６分子の発現が有意に促進されていることが確認された（図６）【００７９】
＜実施例７＞
実施例６で調製したＤＣを実施例１の（２）の黒千石破砕物（沈殿画分、１０００倍稀釈）と１０％ＦＣＳ、２．３８ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐｅｓ、０．１１ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、２００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で共培養し、０、４及び８時間後におけるＤＣ表面のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現レベルを、抗ＭＨＣクラスＩ分子モノクローナル抗体（ＡＦ６−１２０．１）、抗ＭＨＣクラスＩＩ分子モノクローナル抗体（ＡＦ６−８８．５）、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（３／２３）及び抗ＣＤ８６モノクローナル抗体（ＧＬ１）を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により検出した。【００８０】
その結果、黒千石の破砕物を添加しないコントロールと比較して、黒千石の破砕物を添加することにより、ＤＣ表面のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現が有意に促進されていることが確認された（図７）。【００８１】
＜実施例８＞黒千石と他の豆類との抗原提示細胞の活性化作用の比較
実施例６で調製したＤＣを実施例３で調製した各種の豆由来の破砕物（沈殿画分）と１６時間、前記ＲＰＭＩ−１６４０培地中で共培養した後の培養上清を用意し、培地中のＩＬ−１２ｐ７０をマウスＩＬ−１２ＢＤ ＯｐｔＥＩＡセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。【００８２】
その結果、黒千石由来の破砕物がＤＣに対する有意なＩＬ−１２ｐ７０産生促進能を有する一方、その他の豆由来の破砕物にはＤＣに対するＩＬ−１２ｐ７０産生促進能は確認されなかった（図８）。【００８３】
＜実施例９＞
実施例１の（２）で調製した沈殿画分（破砕物）を１００％エタノールで懸濁した後、プラスチックシャーレに広げ、遮光したデシケーターにて一晩乾燥させた。残った固形物を回収し、サンプルとした。これらのサンプルを最終濃度０〜１００μｇ／ｍＬになるように調節して、実施例１の（４）と同様にして、マウス脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導能の評価を行った。【００８４】
その結果、１００％エタノールを用いて乾燥させた黒千石の破砕物についても、ＩＦＮγ産生誘導能が確認された（図９）。【００８５】
＜実施例１０＞
（１）黒千石きな粉の調製
含水量１５％以下の乾燥黒千石を、遠赤外線処理した炒り鍋で１００℃乃至１５０℃で１５分乃至２０分間、一様に攪拌しながら加熱焙煎した後、さらに温度を１８０℃乃至２００℃に上げて３０秒〜１分間加熱焙煎して炒り上げた。この加熱焙煎した黒千石から得られる黒千石きな粉５００ｍｇを、ｍｉｌｌｉＱ水２ｍＬに懸濁して十分に撹拌した後、１５００ｒｐｍ（４８５×ｇ）で遠心分離を行った。その上澄み画分を回収し、１５０００ｒｐｍ（１７３６０×ｇ）で再び遠心分離して回収される沈殿画分を１００μＬのＰＢＳで懸濁して、黒千石の破砕物を得た。この破砕物を用いて、実施例１の（４）と同様にして、マウス脾臓免疫細胞に対するＩＦＮγ産生誘導能の評価を行った。【００８６】
その結果、黒千石きな粉からの破砕物についても、ＩＦＮγ産生誘導能が確認された（図１０）。【００８７】
＜実施例１１＞黒千石によるＩＦＮγ産生誘導作用におけるＴＬＲ依存性の検討
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス、ＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）欠損マウス、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）欠損マウス及びＴＬＲ９（Ｔｏｌｌ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９）欠損マウスからそれぞれ脾臓を採取し、実施例１の（３）と同じ操作によって脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製した。実施例１の（２）と同じ操作により、沈殿画分である水で膨潤した黒千石の破砕物を得、２００倍稀釈となるようそれぞれの脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地に添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で共培養を行った。共培養は、９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ社）を用い、脾臓免疫細胞の濃度は５×１０５ｃｅｌｌ／ウェルとした。４８時間後、培養上清中のＩＦＮγ量をＥＬＩＳＡ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。また、沈殿画分である水で膨潤した黒千石の破砕物を加えずに、同様に培養したそれぞれの脾臓免疫細胞の培養上清中のＩＦＮγ量を定量し、これをコントロールとした。【００８８】
その結果、黒千石の破砕物を添加して共培養したＣ５７ＢＬ／６雌マウス及びＴＬＲ９欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中では、コントロールと比較して高いＩＦＮγ産生が確認された。一方、黒千石の破砕物を添加して共培養したＴＬＲ２欠損マウス及びＴＬＲ４欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中においては、コントロールと比較してＩＦＮγ産生がされているものの、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス及びＴＬＲ９欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中に比べると、著しいＩＦＮγ産生の減弱が確認された。このことから、沈殿画分である水で膨潤した黒千石の破砕物は、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４によって認識され、ＩＦＮγの産生を誘導することが示された（図１１）。【００８９】
＜実施例１２＞黒千石のエタノール抽出画分によるＩＦＮγ産生誘導作用の確認
黒千石を約１０ｇ量りとったあと、ｍｉｌｌｉＱ水で繰り返し表面を洗い、表面に付いた汚れを十分に除去した。さらにｍｉｌｌｉＱ水６０ｍＬを加え、オートクレーブで１２１℃、２０分間、加圧しながら黒千石を水で膨潤させた。【００９０】
ペーパーフィルターを用いて煮汁と黒千石を分け、黒千石を乳鉢に移し、煮汁を加えながら乳棒で磨り潰すことにより黒千石破砕物懸濁液を調製した。この懸濁液を３０００ｒｐｍ（８００×ｇ）で２０分間遠心分離処理を行うことにより沈殿画分と上澄み画分とを得、凍結乾燥機を用いてこの上澄み画分を乾燥させることにより水溶画分を調製した。【００９１】
前記沈殿画分を１０倍量の３０体積％エタノール水溶液に懸濁して３０分間攪拌した後、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて３０体積％エタノール固形分と３０体積％エタノール濾液とに分離した。３０体積％エタノール濾液を１５００ｒｐｍ（４８５×ｇ）で１５分間遠心分離処理し、得られた上澄み画分を濃縮遠心機（ＥＹＥＬＡ社）で処理してエタノールを蒸発させた後、液体窒素で冷却し、凍結乾燥機で完全に溶媒を除去することにより、３０体積％エタノール抽出画分を調製した。【００９２】
次いで、前記３０体積％エタノール固形分を１０倍量の６０体積％エタノール水溶液に懸濁して３０分間攪拌した後、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて６０体積％エタノール固形分と６０体積％エタノール濾液とに分離した。６０体積％エタノール濾液を３０体積％エタノール濾液と同様に処理することにより、６０体積％エタノール抽出画分を調製した。【００９３】
さらに、前記６０体積％エタノール固形分を１０倍量の１００％エタノール水溶液に懸濁して３０分間攪拌した後、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて１００％エタノール固形分と１００％エタノール濾液とに分離した。１００％エタノール濾液を３０体積％エタノール濾液及び６０体積％エタノール濾液と同様に処理することにより、１００％エタノール抽出画分を調製した。【００９４】
それぞれ調製した、水溶画分、３０体積％エタノール抽出画分、６０体積％エタノール抽出画分及び１００％エタノール抽出画分をＰＢＳで懸濁後、最終的に６．２５μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬとなるように、実施例１の（３）と同じ操作によって得た脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地に添加して、実施例１の（４）と同様にしてＩＦＮγ量を定量した。【００９５】
その結果、水溶画分及び１００％エタノール抽出画分を添加した場合は、いずれもＩＦＮγ産生はほとんど確認されなかった。一方、３０体積％エタノール抽出画分又は６０体積％エタノール抽出画分を添加した場合は、いずれも１２．５μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬとなるように添加した場合において、ＩＦＮγ産生が顕著であることが確認された。特に、３０体積％エタノール抽出画分を５０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ及び６０体積％エタノール抽出画分を５０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬとなるように添加した場合において、ＩＦＮγ産生が非常に顕著であることが確認された（図１２）。【００９６】
＜実施例１３＞６０体積％エタノール抽出画分によるＩＦＮγ産生誘導作用におけるＴＬＲ依存性の検討
実施例１２と同じ操作によって調製した６０体積％エタノール抽出画分をＰＢＳで懸濁後、最終的に５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬとなるように、それぞれ、実施例１の（３）と同じ操作によって得た脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地に添加し、実施例１の（４）と同様にしてＩＦＮγ量を定量した。【００９７】
その結果、６０体積％エタノール抽出画分を添加して共培養したＣ５７ＢＬ／６雌マウス及びＴＬＲ９欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中では、いずれの濃度となるように添加した場合も、コントロールと比較して高いＩＦＮγ産生が確認された。また、ＴＬＲ２欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中では、６０体積％エタノール抽出画分を添加して共培養した場合、コントロールと比較してＩＦＮγ産生がされているものの、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬとなるように添加した場合、同濃度で添加した場合のＣ５７ＢＬ／６雌マウス及びＴＬＲ９欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中に比べると、著しいＩＦＮγ産生の減弱が確認された。さらに、６０体積％エタノール抽出画分を添加して共培養したＴＬＲ４欠損マウスの脾臓免疫細胞の培養上清中では、いずれの濃度となるように添加した場合も、ＩＦＮγ産生はほとんど確認されなかった。以上のことから、６０体積％エタノール抽出画分は、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４、特にＴＬＲ４によって認識され、ＩＦＮγの産生を誘導することが示された（図１３）。【００９８】
＜実施例１４＞６０体積％エタノール抽出画分によるＩＬ−１２ｐ７０産生誘導作用におけるＴＬＲ依存性の検討
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス、ＴＬＲ２欠損マウス、ＴＬＲ４欠損マウス及びＴＬＲ９欠損マウスそれぞれの大腿骨から骨髄細胞を採取し、実施例６と同じ操作によってＤＣを誘導した。実施例１２と同じ操作によって６０体積％エタノール抽出画分を得、ＰＢＳで懸濁後、最終的に２００μｇ／ｍＬとなるようにして、実施例８と同じ操作により、それぞれのＤＣと共培養を行った。１２時間後、実施例８と同じ操作により培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０を定量した。また、６０体積％エタノール抽出画分を添加せずに同様に培養したＤＣの培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０量をそれぞれ定量し、これをコントロールとした。【００９９】
その結果、６０体積％エタノール抽出画分を添加して共培養したＣ５７ＢＬ／６雌マウス及びＴＬＲ９欠損マウスのＤＣの培養上清中では、コントロールと比較して高いＩＬ−１２ｐ７０産生が確認された。また、ＴＬＲ２欠損マウスのＤＣの培養上清中では、６０体積％エタノール抽出画分を添加して共培養した場合、コントロールと比較してＩＬ−１２ｐ７０産生がされているものの、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス及びＴＬＲ９欠損マウスのＤＣの培養上清中に比べると、著しいＩＦＮγ産生の減弱が確認された。さらに、ＴＬＲ４欠損マウスのＤＣの培養上清中では、コントロールと同様にＩＬ−１２ｐ７０産生が全く確認されなかった。以上のことから、６０体積％エタノール抽出画分は、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４、特にＴＬＲ４によって認識され、ＩＬ−１２ｐ７０産生を誘導することが示された（図１４）。【０１００】
＜実施例１５＞６０体積％エタノール抽出画分によるヒト末梢血単核球におけるＩＦＮγ産生誘導作用の検討
健康な被験者２名（図１５中に示す被験者−１及び被験者−２）より末梢血を採取し、リンパ球比重分離液（ＳＩＧＭＡ社）を用いて末梢血単核球を単離し、それぞれの被験者について末梢血単核球／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製した。これを９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ社）に末梢血単核球の濃度が２×１０５ｃｅｌｌ／ウェルとなるよう播種し、そこに０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬとなるよう抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク社）を加えてＴ細胞を刺激した。その後、実施例１２と同じ操作によって調製した６０体積％エタノール抽出画分をＰＢＳで懸濁後、最終的に５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように、それぞれの末梢血単核球／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で共培養を行った。４８時間後、培養上清中のＩＦＮγ量をｈｕｍａｎ  ＩＦＮγ  ＢＤ ＯｐｔＥＩＡセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。また、抗ＣＤ３抗体及び／又は６０体積％エタノール抽出画分を添加せずに同様に培養した末梢血単核球の培養上清中のＩＦＮγ量をそれぞれ定量し、これをコントロールとした。【０１０１】
その結果、いずれの被験者の末梢血単核球の培養上清中においても、抗ＣＤ３抗体を加えなかった場合はＩＦＮγ産生がほとんど確認されなかった。一方、０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体を加えた場合、コントロールと比較してＩＦＮγ産生が確認された。また、そのＩＦＮγ産生量は６０体積％エタノール抽出画分を添加することよって増加し、６０体積％エタノール抽出画分を５０μｇ／ｍＬとなるように添加した場合よりも、６０体積％エタノール抽出画分を１００μｇ／ｍＬとなるように添加した場合の方が、より増加することが確認された（図１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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