(57)【要約】  液体中の微生物を迅速かつ連続的に検出する装置。微生物を含む液体のミスト化、ミストの蒸発による微生物の空気中への取り出し、インパクションによる微生物の捕集面への捕集の工程の後、微生物に特異的に結合する蛍光標識を含んだミストをインパクションにより捕集した微生物に付着させ、捕集面上で微生物と蛍光標識の結合反応や蛍光検出を行うことにより、短時間に空気中の微生物の検出を行うことが可能になる。
2013132630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象となる検体を液とし、液の中に含まれる微生物を検出する検出装置において、
前記液をミスト状にするミスト生成部と、
前記ミストを蒸発させる蒸発部と、
前記蒸発により空気中に取り出される前記微生物を空気と共に噴出させる複数のノズルを備えた多孔板と、
前記多孔板と対向する位置で前記ノズルから出た前記微生物を捕捉する捕集面を有する捕集板と、
前記捕集面に捕捉された前記微生物に、蛍光或いは発色反応を生じさせる反応手段を与える反応部と、
前記捕集面上に生じる蛍光或いは発色を検出するための光学検出部と、
前記蒸発部から前記多孔板を通して前記捕集面に向けて空気の流れを発生するファンと、を備え、
前記ノズルの領域、前記反応部、及び前記光学検出部よりも、前記捕集板の捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくし、前記捕集板を、前記ノズルの領域、前記反応部、及び前記光学検出部に対して相対的に移動させる機構を有することを特徴とする液中微生物の検出装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記反応手段は、前記微生物に対して特異的に結合して蛍光を生じさせる試薬、或いは、微生物自体が励起光を受けて蛍光或いは発色する性質を有する場合には、その励起光である請求項１記載の液中微生物の検出装置。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記反応部は、前記微生物に対して特異的に結合して蛍光を生じさせる試薬供給部を含み、
前記捕集面と対向する位置に、前記微生物を前記蒸発部から空気と共に取り込んで前記多孔板に導く微生物取り込み空間部と、前記試薬供給部からの試薬が散布される試薬散布空間部と、光学検出に先立ち前記捕集板の非特異吸着の試薬を除去する洗浄液が散布される洗浄液散布空間部と、光学検出後に前記捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離するために解離液が散布される解離液散布空間部と、が配置され、
前記微生物取り込み空間部、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部よりも、前記捕集板の捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくし、前記捕集板を、前記微生物取り込み空間部、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部に対して相対的に移動させる機構を有することを特徴とする液中微生物の検出装置。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記捕集板が長方形の板もしくはロール状のシートである液中微生物の検出装置。
【請求項５】
請求項３において、
筒状の筐体を有し、この筐体は、前記ファンにより筐体内部に筐体軸方向の空気流を形成する空間を有し、この空気流を形成する前記筐体内部の空間を、複数の仕切り板により前記筐体の周方向に複数に仕切ることで、前記微生物取り込む空間、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部を形成し、
これらの空間部の底部が、それぞれ多孔板で形成されて、前記微生物を含む空気を噴出するノズルのほかに、前記試薬のノズル、前記洗浄液のノズル、及び前記解離液のノズルを構成し、
前記それぞれのノズルの下流に前記各ノズルと対向する円盤状の前記捕集板が、前記各ノズルに対して周方向に相対的に移動する構成をなして配置されている液中微生物の検出装置。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記ミスト生成部は、ベンチュリ効果、加圧気体、超音波、遠心力、又はオリフィスを利用してミストを発生させる構成を有する液中微生物の検出装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記ミスト生成部は、前記ミストの粒径および単位時間のミスト生成量を調整する機構を備え、粒径１μｍ〜１ｍｍ、数密度１０６〜１０１２個/ｍ３のミストを生成する構成を有する液中微生物の検出装置。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記蒸発部は、液蒸気透過性の膜で構成された内管と、前記内管の少なくとも一部の周りを覆う外管とを備えた二重管構造で、前記ミストが内管を通して流れ、前記内管と前記外管との間には、加熱機構により加熱された乾燥空気が通過する構成とし、加熱された前記乾燥空気の温度や風量を調整することで、前記ミストから蒸発する液の量を調整する機構を有する液中微生物の検出装置。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記蒸発部は、液蒸気を吸収する吸収体により形成された管で、その外周を発熱体に覆われた構成をなし、前記発熱体の発熱量を調整することで、前記ミストから蒸発するの分量を調整する機構を有する液中微生物の検出装置。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、
前記多孔板は、厚さ０．０１ｍｍ〜２ｍｍ、直径５ｍｍ〜２００ｍｍの金属板で、孔径５０μｍから２００μｍの円形の複数のノズルを備えている液中微生物の検出装置。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、
前記捕集板は、複数のピラーを備え、前記多孔板と前記捕集板とが相対移動を停止した状態での前記複数のピラーの位置は、前記多孔板の前記複数のノズルの位置と重なるように位置制御される構成を有し、微生物は前記ピラーの上面に捕捉される液中微生物の検出装置。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記ピラーは、前記ノズルの面積の１倍〜１０倍で、前記ピラーの高さは前記ピラーと前記ノズルの間隔の２倍以上である構成を有する液中微生物の検出装置。
【請求項１３】
請求項１１又は１２において、
前記ピラーの上面には、特定の微生物と特異的に結合する物質が修飾されている液中微生物の検出装置。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記捕集板は、ガラス、石英、樹脂類（ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチルエステル等アクリル、ポリジメチルシロキサン）、金属類（鉄、アルミニウム、銅、錫、金、銀などの純金属および合金鋼、銅合金、アルミニウム合金、ニッケル合金などの合金）のいずれか１種である液中微生物の検出装置。
【請求項１５】
請求項３ないし１４のいずれか１項において、
前記試薬供給部は、液体の試薬を、直径０．３μm〜１０μm、数密度１０６〜１０１２個/ｍ３のミストにして散布する構成を有している液中微生物の検出装置。
【請求項１６】
請求項１５において、
前記試薬散布空間部は、特定の微生物に特異的に結合する蛍光標識を含む液体をミスト状に散布し、
前記洗浄液散布空間部は、純水もしくは緩衝液をミスト状に散布し、
前記解離液散布空間部は、低ｐＨの液体をミスト状に散布する構成としている液中微生物の検出装置。
【請求項１７】
請求項２において、
試薬供給部から前記試薬を前記捕集面に噴射させる複数のノズルを構成する多孔板を備え、この試薬噴射ノズルの数と前記微生物を含む空気を噴射させる複数の前記ノズルの数との比率を変更可能な構成とした液中微生物の検出装置。
【請求項１８】
検査対象となる検体を液とし、液の中に含まれる微生物を検出する方法において、
前記液をミスト状にするミスト生成工程と、
前記ミストを蒸発させてミストに含まれる微生物を空気中に取り出す蒸発工程と、
前記微生物を含む空気を、複数のノズルを構成する多孔板を介して捕集板の捕集面に当てて、前記微生物を捕捉する噴射工程と、
捕捉された前記微生物に、蛍光或いは発色反応を生じさせる反応手段を与える反応工程と、
前記捕集面上に蛍光或いは発色が生じている場合にそれを光学的に検出する検出工程と、を有し、
前記ミスト生成工程、蒸発工程、噴射工程をファンにより生じる空気の流れの中で連続的に行い、
前記噴射工程と前記反応工程の行われる場よりも、前記捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくして、前記捕集板を、前記噴射工程及び前記反応工程を与える場に対して相対的に移動させながら、前記噴射工程と前記反応工程を行うことを特徴とする液中微生物の検出方法。
【請求項１９】
請求項１８において、
前記反応工程において微生物に与えられる反応手段は、微生物に対して特異的に結合して蛍光或いは発色を生じさせる試薬、或いは、微生物自体が励起光を受けて蛍光或いは発色する性質を有する場合には、その励起光である液中微生物の検出方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９において、
前記反応手段として、蛍光標識を用いた試薬を用いる場合には、前記検出工程に先立ち前記捕集面に非特異吸着した蛍光標識を洗浄して捕集面に捕捉された前記微生物と結合した蛍光標識のみを残す洗浄工程と、前記検出工程後に前記捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離液を用いて解離する解離工程とを有し、
これらの洗浄工程、解離工程も、前記ミスト生成工程、蒸発工程、噴射工程、及び反応工程と共に、前記ファンにより生じる空気の流れの中で行い、
前記噴射工程、反応工程、洗浄工程及び解離工程の行われる場よりも、前記捕集面の円周方向或いは直線方向に大きくして、前記捕集板を、前記噴射工程、反応工程、洗浄工程、及び解離工程の場に対して相対的に移動させながら、前記噴射工程、反応工程、洗浄工程、及び解離工程を行うことを特徴とする液中微生物の検出方法。
【請求項２１】
請求項２０において、
前記洗浄工程は、純水または緩衝液のミストと空気とを混合したものを、前記多孔板に形成された微生物用の前記ノズルと別のノズルから前記捕集面に向かって噴射して、前記捕集面に非特異吸着した蛍光標識を洗浄し、
前記解離工程は、低ｐＨの液体のミストと空気を混合したものを、前記多孔板に形成されたさらなる別のノズルから前記捕集面に向かって噴射して、前記捕集面に付着した微生物を除去する液中微生物の検出方法。
【請求項２２】
請求項２１において、
検出する前記微生物の種類や濃度、使用する前記蛍光標識の種類や濃度に応じて、前記微生物を含む空気を噴射させるための複数のノズルの数と、ミスト状の蛍光標識と空気の混合したものを噴射させるための複数のノズルの数の比率を変更し、前記微生物の検出に必要な各工程の所要時間を変更することを特徴とする微生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液中の微生物の検出方法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、水道水の安全・衛生に対する消費者の関心が高まっている。水道水の水質に関する法的な基準は水道法第４条で決められており、病原性微生物（一般生菌数、大腸菌数）、化学物質（亜硝酸性窒素など）、臭気、濁度など数十の項目について許容値が決められている。これらの項目については人手による水質検査が月一回行われており、項目に応じて１時間から数日かけて検査を実施している。【０００３】
水道水の検査項目の中で、病原性微生物の検査結果は、消費者の安全・衛生に係ることであるので、消費者の関心が高い。水道水の水質検査では、一般生菌数と大腸菌数が検査項目に含まれており、一般生菌数の許容値が１００個/１ｍｌ以下、大腸菌数の許容値は０個/１００ｍｌ以下であり、その許容数値は、非常に小さい。そのため病原性微生物の検査は高感度な方法で行うことが必要である。一般的には寒天培地上で菌を培養しコロニー状になった菌塊を計測する培養法が用いられている。培養法は正確に菌数を計測することのできる高感度の方法である。しかしながら、菌の培養に長時間を要するため、迅速性や連続性が要求される検査には適さない。そのため現状では病原性微生物の突発的な発生・混入などを緊急に検出する場合には、対処しきれない。【０００４】
菌を迅速に検査する方法としては、菌の内部に存在するATP（アデノシン三リン酸）を検出するATP法が知られている。【０００５】
例えば、特許文献１記載の試料作製装置及び試料作製用の噴霧装置は、メンブレンフィルタに検体をろ過することで菌をフィルタ上に捕捉し、その後、フィルタ上にATPを抽出するための試薬とATPにより発光する試薬を噴霧する。試薬が噴霧されたフィルタを生物発光画像解析装置などでフィルタ上の輝点を撮像することで菌数を測定する。【０００６】
また病原性微生物の検査で使用する検体量は、試料管等を用いる場合には、数ｍｌ程度であるが、水道水の検査おいては最低１００ｍｌの検体量を検査する必要がある。このような多量の検体量を検査する場合には、検査の迅速性のためには、検査する検体を濃縮し液量を減少することが必要になる。一般的に、菌などの微生物を含む検体を濃縮する場合には、特許文献１のようにメンブレンフィルタで検体をろ過する方法が用いられる。しかしフィルタを用いたろ過では目詰まりする可能性があり、また連続的に処理することが難しいため、フィルタを用いずに検体を濃縮する方法が望まれる。従来は、そのような液中微生物の検体濃縮方法として、ニーズに充分に応えるものがなかった。【０００７】
ちなみに、生体関連以外の分野では、例えば、特許文献２の超純水中の不揮発性不純物の分析および定量方法に記載されるように、超純水を高温の乾燥管に噴霧し、粒子を含む液滴から液体を揮発させたのち、粒子を分光分析的手法により分析および定量する方法が提案されている。同様に特許文献３のパーティクル捕集方法及びパーティクル捕集装置においては、パーティクルを含む洗浄液を噴霧器で液滴化した後、熱風を利用して乾燥させ、乾燥後のパーティクルをフィルタに捕集して元素分析を行なうにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−７８９６４号公報
【特許文献２】特開平０６−１３０００７号公報
【特許文献３】特開平２００３−３０７４７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
水道水、井戸水等の液中の検査に関しては、数少ない微生物を高感度、迅速、連続的な方法で常時モニタリングすることができれば、有効であり、安全・衛生に対する消費者のニーズにも応えることができる。さらに、水道水の検査では最低１００ｍｌの検体量を検査する必要があり、検査の迅速性のためには、検体を連続的に濃縮し液量を減少する機能が必要になる。【００１０】
現在、主に実施されている培養法は高感度の方法であるが、菌の培養に長時間を要するため、迅速性や連続性が必要な検査には適さない。特許文献１の装置は、ATP法を用いることで菌の迅速検知を実現しているが、検体のろ過とフィルタへの試薬の噴霧を行う装置と生物発光画像解析装置が別になっているため、検体を連続的に検査することが難しい。また、凹凸のあるフィルタ面を光学的に測定するため、検出感度も低下する。さらに、メンブレンフィルタを用いたろ過であるため、目詰まりを起こしやすく連続的にろ過することが難しい。【００１１】
特許文献２、３の方法または装置は、粒子を含む液体を微小液滴化し乾燥させることでフィルタを用いずに連続的に液体を濃縮することが可能である。しかしながら、微生物特有の物質を検出する方法及び装置ではないため、微生物を検出することはできない。【００１２】
本発明の目的は、水道水、井戸水等の液中の検査において、微生物を含む可能性のある液を連続的に濃縮し、かつ高感度、迅速、連続的に微生物の有無を常時モニタリングする機能を備えた液中微生物の検出装置およびその検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記目的を達成するために、基本的には、次のような液中微生物の検出方法及び装置を提案する。
（１）一つは、方法の発明であり、検査対象となる検体を液とし、液の中に含まれる微生物を検出する液中微生物の検出方法において、
前記液をミスト状にするミスト生成工程と、
前記ミストを蒸発させてミストに含まれる微生物を空気中に取り出す蒸発工程と、
前記微生物を含む空気を、複数のノズルを構成する多孔板を介して捕集板の捕集面に当てて、前記微生物を捕捉する噴射工程と、
捕捉された前記微生物に、蛍光或いは発色反応を生じさせる反応手段を与える反応工程と、
前記捕集面上に蛍光或いは発色が生じている場合にそれを光学的に検出する検出工程と、を有し、
前記ミスト生成工程、蒸発工程、噴射工程をファンにより生じる空気の流れの中で連続的に行い、
前記噴射工程と前記反応工程の行われる場よりも、前記捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくして、前記捕集板を、前記噴射工程及び前記反応工程を与える場に対して相対的に移動させながら、前記噴射工程と前記反応工程を行うことを特徴とする。【００１４】
ここで、反応工程において微生物に与えられる反応手段は、代表的には、微生物に対して特異的に結合して蛍光を生じさせる試薬がある。その他、微生物自体が励起光を受けて蛍光或いは発色する性質を有する場合には、その励起光が反応手段となる。【００１５】
また、前記反応手段として、試薬を用いる場合には、好ましくは、上記工程に加えて、前記検出工程に先立ち前記捕集面に非特異吸着した蛍光標識を洗浄して捕集面に捕捉された前記微生物と結合した蛍光標識のみを残す洗浄工程と、前記検出工程後に前記捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離液を用いて解離する解離工程とを有し、
これらの洗浄工程、解離工程も、前記ミスト生成工程、蒸発工程、噴射工程、及び反応工程と共に、前記ファンにより生じる空気の流れの中で連続的に行い、
前記噴射工程、反応工程、洗浄工程及び解離工程の行われる場に対して、前記捕集板の微生物捕集領域を円周方向或いは直線方向に大きくして、前記捕集板を、前記噴射工程、反応工程、洗浄工程、及び解離工程の場に対して相対的に移動させながら、前記噴射工程、反応工程、洗浄工程、及び解離工程を行う。【００１６】
好ましくは、前記洗浄工程は、純水または緩衝液のミストと空気とを混合したものを、前記多孔板に形成された微生物用の前記ノズルと別のノズルから前記捕集面に向かって噴射して、前記捕集面に非特異吸着した蛍光標識を洗浄し、
前記解離工程は、低ｐＨの液体のミストと空気を混合したものを、前記多孔板に形成されたさらなる別のノズルから前記捕集面に向かって噴射して、前記捕集面に付着した微生物を除去する。【００１７】
さらに、検出する前記微生物の種類や濃度、使用する前記蛍光標識の種類や濃度に応じて、前記微生物を含む空気を噴射させるための複数のノズルの数と、ミスト状の蛍光標識と空気の混合したものを噴射させるための複数のノズルの数の比率を変更し、前記微生物の検出に必要な各工程の所要時間を変更してもよい。
（２）もう一つは、装置の発明であり、検査対象となる検体を液とし、液の中に含まれる微生物を検出する液中微生物検出装置において、
前記液をミスト状にするミスト生成部と、
前記ミストを蒸発させる蒸発部と、
前記蒸発により空気中に取り出される前記微生物を空気と共に噴出させる複数のノズルを備えた多孔板と、
前記多孔板と対向する位置で前記ノズルから出た前記微生物を捕捉する捕集面を有する捕集板と、
前記捕集面に捕捉された前記微生物に、蛍光或いは発色反応を生じさせる反応手段を与える反応部と、
前記捕集面上に生じる蛍光或いは発色を検出するための光学検出部と、
前記蒸発部から前記多孔板を通して前記捕集面に向けて空気の流れを発生するファンと、を備え、
前記ノズルの領域、前記反応部、及び前記光学検出部よりも、前記捕集板の捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくし、前記捕集板を、前記ノズルの領域、前記反応部、及び前記光学検出部に対して相対的に移動させる機構を有することを特徴とする。【００１８】
上記捕集面への微生物の捕捉は、代表的には、微生物が捕集面にインパクションを介して特異的に結合する態様が例示される。【００１９】
前記反応部が、前記微生物に対して特異的に結合して蛍光を生じさせる試薬供給部を含む場合、次のような構成も提案される。【００２０】
前記捕集面と対向する位置に、前記微生物を前記蒸発部から空気と共に取り込んで前記多孔板に導く微生物取り込み空間部と、前記試薬供給部からの試薬が散布される試薬散布空間部と、光学検出に先立ち前記捕集板の非特異吸着の試薬を除去する洗浄液が散布される洗浄液散布空間部と、光学検出後に前記捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離するために解離液が散布される解離液散布空間部と、が配置され、
前記微生物取り込み空間部、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部よりも、前記捕集板の捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくし、前記捕集板を、前記微生物取り込み空間部、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部に対して相対的に移動させる機構を有する。【００２１】
前記ミスト生成部は、例えば、ベンチュリ効果、加圧気体、超音波、遠心力、又はオリフィス（インジェクションノズル）を利用してミストを発生させる。【００２２】
好ましくは、前記ミスト生成部は、ミストの粒径および単位時間あたりのミスト生成量を調整する機能を備え、前記ミストの粒径は１μｍ〜１ｍｍであり、数密度は１０６〜１０１２個/ｍ３であることが好ましい。【００２３】
前記蒸発部は、例えば、液蒸気透過性の膜で構成された内管と、少なくともその一部の周りを覆う外管とを備えた二重管構造で、前記ミストが内管を通して流れ、前記内管と前記外管との間には、加熱機構により加熱された乾燥空気が通過する構成とする。このような二重管構造で、加熱乾燥空気により、前記内管を流れるミストを蒸発させることができる。前記乾燥空気の温度や風量を調整することで、前記ミストから蒸発する液量を調整することが好ましい。【００２４】
また、前記蒸発部は、上記構成に代えて、液蒸気（例えば水分）を吸収する吸収体により形成された管で、その外周を発熱体に覆われた構成をなす。このような蒸発部では、前記ミストは管内を通過し、前記発熱体の発熱量を調整することで、前記ミストから蒸発する液量を調整する。【００２５】
前記多孔板は、好ましくは、例えば、厚さ０．０１ｍｍ〜２ｍｍ、直径５ｍｍ〜２００ｍｍの金属板で、孔径５０μｍから２００μｍの円形の複数のノズルを備えていることが好ましい。【００２６】
前記捕集板は、例えば、複数のピラーを備え、前記多孔板と前記捕集板とが相対移動を停止した状態での前記複数のピラーの位置は、前記多孔板の前記複数のノズルの位置と重なるように位置制御される構成を有し、微生物は前記ピラーの上面に捕集されるよう設定する。【００２７】
前記ピラーは、前記ノズルの面積の１倍〜１０倍で、前記ピラーの高さは前記ピラーと前記ノズルの間隔の２倍以上であることが好ましい。【００２８】
また、好ましくは、前記ピラーの上面には特定の微生物と特異的に結合する物質が修飾されている。【００２９】
たとえば、前記捕集板は円盤状もしくは長方形の板もしくは無端ベルト形状をなす。【００３０】
また、前記捕集板は、ガラス、石英、樹脂類（ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチルエステル等アクリル、ポリジメチルシロキサン）、金属類（鉄、アルミニウム、銅、錫、金、銀などの純金属および合金鋼、銅合金、アルミニウム合金、ニッケル合金などの合金）が好ましい。【００３１】
前記試薬供給部は、液体の試薬をミスト状にして散布する構成が好ましく、ミスト状の試薬の直径は０．３μm〜１０μm、数密度は１０６〜１０１２個/ｍ３であることが好ましい。【００３２】
また、前記試薬供給部は、特定の微生物に特異的に結合する蛍光標識を含む液体をミスト状に散布する試薬供給部と、純水もしくは緩衝液をミスト状に散布する試薬供給部と、低ｐＨの液体をミスト状に散布する試薬供給部によって構成してもよい。【００３３】
また、微生物を含む空気を噴射させるための複数のノズルの数とミスト状の試薬（蛍光標識を含む液体）を含む空気を噴射させるための複数のノズルの数の比率を変更することができることが好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、液中微生物の捕集及び検出を迅速に行い、かつ常時監視を可能とした液中微生物等の検出装置及びその検出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の実施例１に係る水中微生物検出装置の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の実施例１に係る水中微生物検出装置の概略構成を示す図である。
【図３】本発明の実施例１に係る微生物検出部の概略構成を示す図である。
【図４】本発明の実施例１に係る微生物検出部の一部分の拡大図である。
【図５】本発明の実施例１に係る微生物検出部における検出工程の詳細を示す図である。
【図６】本発明の実施例１に係る微生物検出部における検出工程の詳細を示す図である。
【図７】本発明の実施例２に係る微生物検出部の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の実施例３に係る微生物検出部の概略構成を示す図である。
【図９】水を例にした、常温でのミストの直径と蒸発時間の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、検査対象となる検体である液又は液体の一例として水を例に本発明の実施するための形態を説明するが、水以外の液を検体としても良い。
【００３７】
既述したように、従来は、水質検査の結果が得られるまで数日必要なことや水質検査が実施される回数が月1回と少ない。万一の病原性微生物の発生・混入などを考慮に入れた場合には、水道水の安全・衛生をさらに高める見地から、水道水中の病原性微生物などの微生物の有無を高感度、迅速、連続的な方法で常時モニタリングすることが求められる。そこで、本願発明の発明者らは水道水中の病原性微生物を短時間で検出し、かつ常時監視するための構造方法及び装置を種々検討した結果、本願発明に至った。以下その好ましい実施例について説明する。
【００３８】
なお、本明細書において、検出対象となる水中に含まれる微生物とは、通常の微生物の概念より広く、ウイルス、細菌、酵母、原生動物、菌類、胞子、花粉の検査方法及び検査装置を意味する。また、本明細書では、表記を簡単にするため、一般的に定義されている微生物（細菌、酵母、原生動物、菌類）の他、ウイルス、胞子、花粉を含め単に「微生物」と表記した。
【００３９】
以下、図面を参照して、本発明の実施例を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施例同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００４０】
図１は、本実施例に関わる水中微生物検出装置の概略構成を示す図である。【００４１】
水中微生物検出装置１００は、大別すると、検査対象（検体）である水をミスト状にするミスト生成部３と、ミストを蒸発させてミストに含まれる微生物を空気中に取り出すための蒸発部２と、蒸発により空気中に取り出される微生物を検出する微生物検出部１とからなる。【００４２】
水道管３１の分岐管３１ａから供給される水道水（検体）３２をミスト化すなわち微小液滴（以下検体ミスト１７１と表記）にするミスト生成部３の一例として、噴霧装置３０を備える。水道管３１の分岐管３１ａと、噴霧装置３０と、噴霧装置３０・蒸発部２（乾燥管２０１）間を連結する連結管３３とで、検体ミスト部３を構成している。噴霧装置３０でミスト化された検体ミスト１７１は、後述のファン１４によって形成される空気流の流れに乗せられて、連結管３３を介して蒸発部２に搬送される。【００４３】
蒸発部２は、供給される検体ミスト１７１の水分を蒸発させる乾燥管２０１を備える。乾燥管２０１は、検体ミスト１７の水分を蒸発させることで、検体ミスト１７１に取り込まれた水中微生物１７を、空気中に取り出す。微生物１７は、蒸発部２と微生物検出部１とを連結する連結管２２を介して、前記した空気流の流れに乗って蒸発部２に搬送される。【００４４】
微生物検出部１は、連結管２２を介して空気流を介して搬送される微生物１７を、連続的に捕集・検出する。ここで、検出対象となる微生物１７は、既述したように元々、水中に含まれる微生物であり、水中微生物或いは液中微生物と称することもある。【００４５】
ミスト生成部３の噴霧装置３０は、既述したように、供給された水道水３２を検体ミスト１７１にすることで、水道水３２中の水中微生物１７を検体ミスト１７１内に取り込ませる機能を持つ。【００４６】
水道水３２を検体ミスト１７１にするには、気体を利用して液滴を発生させる方法（ベンチュリ効果或いは加圧気体により液体表面で強く吹く方法、液中でバブリングする方法、加圧気体と液体を混合してノズルから噴き出す方法）、超音波などの振動エネルギーを液面に与え液滴を発生させる方法、遠心力を利用して液膜を振り切り液滴を発生させる方法、オリフィスから噴き出る液体に振動を与えることで液滴を発生させる方法などがあり、いずれか一つ或いは任意に組み合わせたものを用いる。【００４７】
例えば超音波を利用する場合は振動周波数を変えることで、検体ミスト１７１の粒径を変えることが可能であり、対象とする水中微生物１７の粒径に応じて最適な粒径の検体ミスト１７１を発生させることができる。検体ミスト１７１の最適な粒径としては、粒径の大きいカビ、胞子を対象とする場合は０．１〜１ｍｍの粒径、菌やウイルスを対象とする場合は１〜１００μｍの粒径が好ましい。また、ミストの数密度は１０６〜１０１２個/ｍ３が好ましい。また、供給される水道水３２に含まれる塩などのイオン濃度が高い場合には、脱塩装置３４を検体噴霧部３の上流に設けてもよい。【００４８】
蒸発部２の乾燥管２０１は、内管２０２と外管２０３とからなる二重管構造である。内管２０２が噴霧部−蒸発部間の連結管３３と連結している。内管２０２は、水蒸気透過性の膜で構成され、管内に検体ミスト１７１が通過する。内管２０２と外管２０３との間には、加熱機構（図示省略）により加熱された加熱乾燥空気２０４が通過する。検体ミスト１７１が内管２０２を通過する際に、加熱乾燥空気２０４により内管２０２に加熱される。【００４９】
この内管２０２からの放熱により、検体ミスト１７１の水分は水蒸気になる。この水蒸気は、内管２０２を構成する水蒸気透過性の膜を透過し加熱乾燥空気２０４とともに外部に排出される。一方、検体ミスト１７１中の微生物１７は、水蒸気透過性の膜を通過せずに、空気中に取り出された状態で、空気流に乗って微生物検出部１に供給される。【００５０】
加熱乾燥空気２０４の温度や流速を調整して蒸発性能を変えることで、検体ミスト１７１の粒径が変わっても最適な状態で水中微生物１７を空気中に取り出すことが可能であり、蒸発不足もしくは蒸発過多になることを防ぐことができる。さらに水道水３２の微小液滴化（ミスト化）と検体ミスト１７１の蒸発は連続的に行うことが可能であり、またフィルタを用いないため目詰まりも発生しない。【００５１】
図９に純水を例にした、常温でのミストの直径と蒸発時間の関係を示す。ミスト粒径を小さくするほど、蒸発時間が短くなるので、微生物に合わせたミスト粒径を蒸発時間との関係で最適値に定めることが好ましい。【００５２】
図２は、蒸発部２の他の例を示すものであり、その他の構成は、図１の実施例と同様である。【００５３】
図２の蒸発部２における乾燥管２０１は、（水分）を吸収する吸収体２１２により形成された管で、その外周を発熱体２１３に覆われた構成をなす。検体ミスト１７１が吸収体２１２の管を通過する際に、加熱された管内で検体ミスト１７１が蒸発し、その水分は吸収体２１２に吸収される。検体ミスト１７１中の水中微生物１７は、管内で空気中に取り出され、空気流に乗って微生物検出部１に供給される。吸収体２１２を覆っている発熱体２１３は、吸収体２１２に吸収された水分を加熱することで外部に放出し吸収体２１２の水分吸収性能を維持する。発熱体２１３による加熱量（発熱量）を調整して蒸発性能を変えることで、供給される検体ミスト１７１の粒径が変わっても、最適な状態で水中微生物１７を空気中に取り出すことが可能である。したがって、蒸発不足もしくは蒸発過多になることを防ぐことができる。さらに水道水３２の微小液滴化（ミスト化）と検体ミスト１７１の蒸発は連続的に行うことが可能であり、またフィルタを用いないため目詰まりも発生しない。【００５４】
図３は、微生物検出部１の概略構成を示す図であり、図４は微生物検出部１の一部（内部筐体１９２を中心に構成される要素）を半截した状態で拡大した図である。【００５５】
微生物検出部１は、概略的には、
i)円盤形を呈して捕集面が円周方向に連続的に形成される捕集板１１と、
ii)捕集面１１と対向する位置に配置され、多数のノズル１０１が形成された多孔板１０と、
iii)蒸発部２から連結管２２を介して搬送される微生物を含む空気流を受け入れる微生物取り込み空間部１９１０と、
iv)試薬供給部（試薬散布部）１５１からの試薬がミスト状に散布される試薬散布空間部１９１１と、
v) 光学検出に先立ち捕集板１１の非特異吸着の試薬を除去するために、洗浄液供給部（洗浄液散布部）１５２からの洗浄液がミスト状に散布される洗浄液散布空間部１９１２と、
vi)光学検出後に、捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離するために、解離液供給部（解離液散水部）１５３からの解離液がミスト状に散布される解離液散布空間部１９１３と、が前記円周方向に配置され、
vii)捕集板１１は、多孔板１０、微生物取り込み空間部１９１０，試薬散布空間部１９１１、洗浄液散布空間部１９１２、及び解離液散布空間部１９１３に対して、前記円周方向に相対的に移動する機構（捕集板制御部）１２を有する。【００５６】
以下、微生物検出部１の具体的一例について詳述する。【００５７】
まず、微生物検出部１は、円筒形の外部筐体１９２と、当該外部筐体の上部に配置された円筒形の内部筐体１９１とを備えている。【００５８】
内部筐体１９１の底部には、放射状に多数配列されたノズル１０１を備えた扇状の多孔板１０と、この多孔板下方に位置し、ノズル１０１を通過した微生物を捕集するための円盤状の捕集板１１とが対向して配置されている。捕集板１１の上面には、微生物を捕捉するためのピラー１１１が多数配置されている。また、内部筐体１９１には、捕集板１１の保持と動きの制御を行うための捕集板制御部１２と、捕集板のピラー１１１上に捕捉された微生物１７を光学的に検出するための光学検出部１３を備えている。【００５９】
外部筐体１９２の下部には、空気（微生物を含む）を取り込むためのファン１４と排気口フィルタ１６４が設けられている。内部筐体１９１と外部筐体１９２の間の空間上部には、試薬や洗浄のための液体をミスト状にして散布するための散布部（供給部）１５１、１５２，１５３とが設けられている。また、上記各散布部１５１、１５２、１５３に空気を取り込む大気吸引口１６１、１６２、１６３が形成されている。【００６０】
上記多孔板１０に形成されたノズル１０１と、捕集板１１に形成されたピラー１１１とは、上部から見て同じ位置に配置されており、それぞれ、中心から放射状に、円盤の直径方向に、等間隔で、かつ、回転方向にも等角度で配置されている。これら多孔板１０と捕集板１１とは、同心円の位置関係にある。そして、捕集板制御部１２は、捕集板１１の停止位置では、ノズル１０１とピラー１１１とが必ず対向するように、捕集板１１の回転方向の動きを制御する。【００６１】
また、この多孔板１０は、中心角θが優角（180゜<θ<360゜）となる扇形の形状を有し、内部筐体１９１の底面を構成するよう接合されている。【００６２】
内部筐体１９１と多孔板１０で構成される空間は、図４に示すように、その内部にある仕切り板１９１５、１９１６、１９１７、１９１８、１９１９によって区分され、もって、複数の空間１９１０、１９１１、１９１２、１９１３が構成される。それぞれの空間１９１０〜１９１３は、微生物もしくはミストの種類に応じて、既述した微生物取り込み空間部１９１０、試薬散布空間部（以下、蛍光標識散布空間部とする）１９１１、洗浄液散布空間部１９１２、解離液散布空間部１９１３として機能する。そのため、上記の仕切り板１９１５〜１９１９も、区分けする空間に応じ、微生物取り込み空間部-蛍光標識散布空間部間の仕切り板１９１５、蛍光標識散布空間部-洗浄液散布空間部間の仕切り板１９１６、洗浄液散布空間部-検出部間の仕切り板１９１７、検出部-解離液散布空間部間の仕切り板１９１８、解離液散布空間部-微生物取り込み空間部間の仕切り板１９１９となっている。【００６３】
捕集板１１のピラー１１１の上面には、元々、水に含まれる微生物１７と特異的に結合する物質（抗体など）が結合している（又は、修飾されている）。そのため、微生物１７がピラー１１１の上面に衝突すると、微生物１７はピラー１１１の上面に結合する。【００６４】
一方、散布部１５１〜１５３は、供給される試薬、洗浄液、解離液をそれぞれミスト状にする機能を備えている。しかしながら、それぞれ、散布する試薬に応じ、以下のように区別される。即ち、蛍光標識散布部１５１は、微生物１７と特異的に結合する蛍光標識を含んだ試薬をミスト状（蛍光標識ミスト１５１２）にする。洗浄液散布部１５２は、ピラー１１１上に非特異的に吸着した蛍光標識を洗浄するための洗浄液をミスト状（洗浄液ミスト１５２２）にする。解離液散布部１５３は、ピラー１１１から微生物を引き剥がす効果がある解離液をミスト状（解離液ミスト１５３２）にする。また、大気吸引口１６１〜１６３も、ミストの種類に応じ、蛍光標識用大気吸引口１６１、洗浄液用大気吸引口１６２、解離液用大気吸引口１６３となっている。また、蛍光標識用大気吸引口１６１、洗浄用大気液吸引口１６２、及び、解離液用大気吸引口１６３は、それぞれ、空気中のごみを取り除くためのフィルタ１５１１、１５２１、１５３１を備える。また、図１、２には示されていないが、捕集板制御部１２は、梁のような構造により外部筐体１９２に連結されている。【００６５】
なお、詳細については後述するが、微生物検出部１による微生物１７の検出は、次のように実行される。まず、ファン１４が回転することにより空気の流れが生じ、これに伴い、ミスト生成部３の連結管３３−乾燥管２０１の内管２０２−連結管２２に空気流が形成され、蛍光標識用大気吸引口１６１と、洗浄液用大気吸引口１６２と、解離液用大気吸引口１６３とに空気が流入する。【００６６】
連結管２２を介して流入した空気と空気に含まれる微生物１７は、微生物取り込み空間部１９１０を経由して、多孔板１０のノズル１０１を通過した後、捕集板１１のピラー１１１の上面にあたり、空気はピラー１１１の脇に流れる。このとき、空気の流れの力に対する微生物１７の慣性力が強いと、微生物１７は空気の流れに追従せずに、ピラー１１１の上面に衝突し、その結果、ピラー１１１の上面に結合している物質（微生物１７を特異的に結合する）により捕捉されることとなる。【００６７】
一方、蛍光標識用大気吸引口１６１を経由して流入した空気からは、フィルタ１５１１を通過した際、その内部に含まれる微生物１７が取り除かれる。このろ過された空気は、蛍光標識散布部１５１から発生する蛍光標識ミスト１５１２を巻き込み、蛍光標識散布空間部１９１１を経由して多孔板１０のノズル１０１を通過し、捕集板１１のピラー１１１の上面にあたり、その後、ピラー１１１の脇に流れる。このとき、空気の流れの力に対する蛍光標識ミスト１５１２の慣性力が強いと、蛍光標識ミスト１５１２は、空気の流れには追従せず、ピラー１１１の上面に衝突する。そして、このような衝突後、蛍光標識ミスト１５１２に含まれている蛍光標識は、ピラー１１１の上面に捕捉されている微生物１７と特異的に結合する。同様にして、洗浄液ミスト１５２２と解離液ミスト１５３２も、また、ピラー１１１の上面に捕捉される。このように、各ピラーの上面には、当該ピラーの位置に応じて、微生物１７か、蛍光標識ミスト１５１２か、洗浄液ミスト１５２２か、又は、解離液ミスト１５３２が供給されることとなる。【００６８】
一方、上述した捕集板制御部１２により捕集板１１を等角度（ピラーの回転方向のピッチ）にステップ状に回転させることによれば、ピラー１１１の上面では、（１）微生物１７の捕集、（２）蛍光標識ミスト１５１２の供給による微生物１７の蛍光標識、（３）洗浄液ミスト１５２２の供給による非特異吸着した蛍光標識の洗浄、（４）光学検出部１３によるピラー１１１上の微生物１７の検出、（５）解離液ミスト１５３２の供給による微生物１７の解離と言う複数の工程を、順に行うことが可能になる。さらに、捕集板１１が一周することにより、再び、上述した微生物１７の捕集の工程に戻る。即ち、上記複数の工程を繰り返して、再度9、検査を行うことが可能になる。【００６９】
続いて、上述した各構成要素の詳細について説明する。【００７０】
まず、多孔板１０は、厚さ０．０１ｍｍ〜２ｍｍ、直径５ｍｍ〜２００ｍｍの金属板である。多孔板１０に形成されたノズル１０１の孔径は捕集粒子径によって決まる。いま、仮に、捕集粒子径３００μｍの微粒子を９０%以上の割合で捕集しようとする場合には、孔径は２００μｍ以下であることが必要であり、ノズルの加工性、ノズル１０１を通過する空気の乱流条件などを考慮すると、孔径は、例えば、５０〜１００μｍが好ましい。また、ノズルの形成は、エッチング、レーザー加工、放電加工、電子線ビーム加工、機械加工などの加工により行うことができる。【００７１】
捕集板１１は複数のピラー１１１を備えた円盤形状の板である。ノズル１０１とピラー１１１上面との間隔の最適値は、ノズル１０１の径によっても変わるが、ノズル径の１／３〜１５倍とすることが好ましく、さらに好ましくは、１／２〜５倍（２５〜５００μｍ）の範囲とする。即ち、ピラー１１１の直径は小さすぎると、微生物１７をピラー１１１上面に衝突させることが困難になる。他方、大きすぎると、必要な検出範囲が広くなるため、検出に必要な時間が長くなる。また、ピラー１１１の高さが低いほど、その加工は容易になるが、しかし、ノズル１０１からの気流の一部が隣接するピラー１１１の上面に流れこむため、微生物１７をピラー上面に衝突させることが困難になる。なお、発明者等による詳細な検討の結果によれば、ノズル１０１を通過した微生物１７をピラー１１１の上面に確実に衝突させ、かつ、ピラー１１１上面の微生物１７を効率的に検出するためには、当該ピラー１１１の直径は、ノズル１０１の直径の１〜１０倍であることが好ましく、また、当該ピラー高さは、ノズル１０１とピラー１１１上面との間隔の２倍、又は、それ以上とすることが好ましいことがわかった。【００７２】
また、この捕集板１１の材質は、シリコン、ガラス、石英、樹脂類（ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチルエステル等アクリル、ポリジメチルシロキサンなど）、で形成されることが好ましい。ピラーの形成には、材料によって異なるが、例えば、シリコン、ガラス、石英に対しては、エッチングなどの手法、また、樹脂類ではホットエンボス、射出成型、転写などの手法を用いることができる。【００７３】
捕集板制御部１２は、上述したように、捕集板１１をステップ状に回転させる機能があるが、本実施例では、捕集板１１のピラー１１１と多孔板１０のノズル１０１の位置のずれを小さくする目的のため、捕集板１１の位置を検知するためのセンサを備える。【００７４】
捕集板１１をステップ状に回転させた後、当該センサからの情報に基づいて、捕集板１１のピラー１１１と多孔板１０のノズル１０１との位置調整を行う。また、このセンサは、ピラー１１１の上面の微生物１７を検出するための光学検出部１３により代用してもよい。【００７５】
光学検出部１３は、蛍光標識を励起するための励起光の光源、蛍光標識から発せられる蛍光を検出するための光検出器、光源からの励起光や蛍光標識からの蛍光を集光するためのレンズ系、励起光や蛍光の波長選別を行うための光学フィルタ、そして、迷光を排除するための空間フィルタ（ピンホール）で構成される蛍光検出用光学系と共に、更に、蛍光検出用光学系の焦点をピラー１１１上面に合わせるための位置合わせ制御機構と、光学検出部１３を捕集板１１の半径方向に移動させるための半径方向移動機構とで構成される。これらの移動機構により、光学検出部１３を捕集板１１の半径方向に移させながら、ピラー１１１上面に捕捉された微生物１７に結合した蛍光標識の蛍光を検出することにより、微生物１７の検出が行われる。【００７６】
蛍光標識散布部１５１、洗浄液散布部１５２、解離液散布部１５３は、上述したように、試薬をミスト状にするネブライザとしての機能を備える。これらの散布部によりミスト状になった試薬は、吸引された空気と混合し、即ち、気流の流れを利用して捕集板１１のピラー１１１の上面に供給される。【００７７】
なお、散布するミストの粒径の範囲は、例えば、０．３μm〜１０μmであり、また、ミストの数密度としては、１０６〜１０１２個/ｍ３が好ましい。【００７８】
フィルタ１５１１、１５２１、１５３１と排気口フィルタ１６４には、ＨＥＰＡフィルタ（High Efficiency Particulate Air Filter）が使用される。これらのフィルタ１５１１、１５２１、１５３１は、吸引した空気に微生物１７やその他の粒子が混入することを防ぎ、これにより、検査の結果が異常となることを防ぐ。また、排気口フィルタ１６４は、捕集板１１上に捕捉しきれなかったウイルス凝集体や、各試薬のミストを除去するためのものである。【００７９】
次に、図５（ａ）〜（ｅ）、図６（ａ），（ｂ）を用いて、検査工程の詳細について説明する。
（I）捕集（捕捉）工程（図５（ａ）参照）：
ファン１４（図１）により吸引された空気と共に、この空気に含まれる微生物１７は、多孔板１０のノズル１０１を通過する。吸引された空気は、捕集板１１のピラー１１１の上面にあたった後、ピラー１１１の脇に流れるが、しかし、上述したように、微生物１７はその慣性力により、ピラー１１１の上面に衝突する。ピラー１１１の上面には微生物１７の表面に存在する抗原と特異的に結合する抗体１８１が修飾されているため、ピラー１１１上面に衝突した微生物１７は、抗原抗体反応により、ピラー１１１上面に特異的に結合する。ピラー１１１の上面への抗体１８１の結合方法は一般的に知られる方法であり、例えば、非特異吸着を利用した結合方法、シランカップリングを利用した結合方法、特定のリンカーを利用した結合方法などである。
(II)標識工程（図５（ｂ）参照）：
蛍光標識散布部１５１（図１）により発生した蛍光標識ミスト１５１２は、ファン１４（図１）により吸引された空気と混合し、多孔板１０のノズル１０１を通過する。その際、吸引された空気は捕集板１１のピラー１１１の上面にあたった後、ピラー１１１の脇に流れるが、一方、蛍光標識ミスト１５１２は、その慣性力によりピラー１１１の上面に衝突する。蛍光標識ミスト１５１２は、その内部に微生物１７と特異的に結合する蛍光標識１５１３（蛍光色素が標識された抗体）を含んでいるため、上述した捕集工程においてピラー１１１の上面の抗体１８１と結合した微生物１７と、蛍光標識１５１３とは、抗原抗体反応により特異的に結合する。【００８０】
なお、上述のように、微小な蛍光標識ミスト１５１（φ０．３μｍ〜１０μｍ）により抗原抗体反応を行うことのメリットは、次の二点である。【００８１】
（メリット１）：拡散距離の微小化による拡散時間の短縮：微生物１７と蛍光標識１５１３が結合するには、二つの物質は十分な距離まで近づく必要がある。理論上は、物質が一定の距離を移動する時間は距離の二乗に比例する。一般的な反応容器内での抗原抗体反応（液半径１ｍｍ、液深さ１ｍｍと仮定）と、微小ミスト中での抗原抗体反応とを比較すると、一例として、マイクロタイタープレートでの反応では、微生物１７と蛍光標識１５１３は最大で約1ｍｍ離れているが、一方、微小ミスト中での反応では、微生物１７と蛍光標識１５１３は最大１０μｍ（ミスト直径相当）しか離れていない。そのため、衝突までの時間はマイクロタイタープレートでの反応に比べると1/10000倍になる。【００８２】
（メリット２）：ウイルスの濃度の高濃度化による反応時間の短縮：物質Ａと物質Ｂが結合してＡＢになる反応では、結合の反応時間は、二つの物質の濃度に比例する。先ほどと同様に、一般的な反応容器内での抗原抗体反応（液半径１ｍｍ、液深さ１ｍｍの液の中に微生物が1個あると仮定）と、微小ミスト内での抗原抗体反応（φ１０μｍの中に微生物が1個あると仮定）とを比較すると、微小ミスト内での微生物１７の濃度は、一般的な反応容器内での微生物１７の濃度に比べ、約１×１０６倍も濃くなる。そのため、反応速度も１×１０６倍速くなる。
(III)洗浄工程（図５（ｃ）参照）：
洗浄液散布部１５２（図３、図４）により発生した洗浄液ミスト１５２２は、ファン１４（図１）により吸引された空気と混合し、多孔板１０のノズル１０１を通過する。吸引された空気は、捕集板１１のピラー１１１の上面にあたった後、ピラー１１１の脇に流れるが、洗浄液ミスト１５２２は、その慣性力によりピラー１１１の上面に衝突する。衝突した洗浄液ミスト１５２２は、ピラー１１１の上面に非特異的に吸着した蛍光標識１５１４を取り込む。そして、この洗浄液ミスト１５２２の衝突が連続的に行われると、その一部はピラー１１１の上面から溢れ出ることから、取り込んだ蛍光標識１５１４をピラー１１１の上面から除去することができる。一方、抗原抗体反応により特異的にピラー１１１上面の抗体と結合している微生物１７と、そして、微生物１７に特異的に結合している蛍光標識１５１３とは、互いに強く結合しているため、ピラー１１１の上面に残る。なお、洗浄液としては、例えば、濃度の薄い緩衝液や純水が適している。
(IV)検出工程（図５（ｄ）参照）：
光学検出部１３を捕集板１１（図１）の半径方向に移動させながら、同時に、ピラー１１１上面の蛍光強度を計測する。即ち、蛍光標識１５１３が結合した微生物１７がピラー１１１の上面に存在すれば、光学検出部１３は、当該ピラー１１１が移動する際に、強い蛍光１５１５を計測する。もって、計測した蛍光強度によって、捕集した微生物１７の数を計測することができる。
(V)解離工程（図５（ｅ）参照）：
解離液散布部１５３（図１）により発生した解離液ミスト１５３２は、ファン１４（図１）により吸引された空気と混合し、多孔板１０のノズル１０１を通過する。吸引された空気は、捕集板１１のピラー１１１の上面にあたった後、ピラー１１１の脇に流れるが、解離液ミスト１５３２はその慣性力によりピラー１１１の上面に衝突し、そして、衝突した解離液ミスト１５３２は、ピラー１１１の上面の抗体１８１に結合した微生物１７を取り込む。なお、この解離液は、低ｐＨの液体で抗原抗体反応により結合している物質を解離させる働きがある。この解離液ミスト１５３２の衝突が連続的に行われると、その一部は、ピラー１１１の上面から溢れ出し、これにより14、取り込んだ微生物１７をピラー１１１の上面から除去することができる。【００８３】
なお、ピラー１１１上の抗体１８１に結合した微生物１７を除去すれば、上述したようにピラー１１１の上面は捕集工程前の状態に戻ることから、捕集工程から始めることで、再び、微生物１７の捕集・検出を繰り返すことが可能になる。なお、以上の工程における各部の動作は、上述した図示されないマイクロコンピュータのメモリ等に格納されたプログラムに従って実行される。【００８４】
次に、微生物検出部１での微生物検出の常時監視の方法の仕組みについて、上述した図８（ａ）及び（ｂ）を用いて説明する。図８（ａ）は、ある時点における捕集板１１の位置を示す。また、図中の丸数字は、捕集板１１の或る半径上に存在するピラーの集まりを示す。なお、以下の説明では、図中で使用した丸数字は使わず、これに代え、ピラーの集まり１、２…と表記する。【００８５】
なお、本発明の微生物検出部１では、仕切り板１９１５〜１９１９（図４）によって、実行する複数の工程を区分する。図６（ａ）時点においては、ピラーの集まり１、２３〜３２は、捕集工程にあり、ピラーの集まり２０〜２２は、標識工程にあり、ピラーの集まり１６〜１９は、洗浄工程にあり、ピラーの集まり１２〜１５は、検出工程にあり、そして、ピラーの集まり２〜１１は、解離工程にあり、上述したそれぞれの工程を行っている。そのうち、検出工程では、ピラーの集まり１３のみが、光学検出部１３により実施される蛍光測定の対象となっている。なお、この蛍光測定時に光学検出部１３が、捕集板１１の半径方向に移動する際、微生物検出部１のその他の構成部分に接触することを防止するため、ピラーの集まり１３の前後には、所定の間隔が設けられている。【００８６】
なお、この時点から一定時間経過後には、捕集板制御部１２の機能により、捕集板１１は１ステップ分だけ回転移動する。即ち、ピラーの集まり２は、ピラーの集まり１の位置に、ピラーの集まり３は、ピラーの集まり２の位置に、それぞれ、移動する。これによれば、図６（ｂ）に示す微生物の検出に必要な工程を、同時に、かつ、並列して、順次、連続的に実行することにより、常時、その監視が可能になっている。【００８７】
また、各工程の処理時間は、検出対象の微生物の種類や使用する試薬に応じて異なるが、微生物検出部１は、仕切り板１９１５〜１９１９の位置の設定によって各工程の処理時間が決まるため、仕切り板の位置を変えることで、各工程の時間を適宜、調整することが可能になる。
【実施例２】
【００８８】
次に、図７は本発明の他の形態（実施例２）に係る微生物検出部４の概略構成を示しており、この図に示す実施例は、特に、微生物の簡易検査を行うことをその主目的としたものである。即ち、上記実施例１の微生物検出部１との最大の違いは、捕集板１１の形状と捕集板制御部１２の捕集板の動きの制御方法にある。なお、図中において、上記の実施例の構成要素に対応するものには同様の符号を付しており、そのため、ここでは。その詳細な説明は省略する。【００８９】
より具体的に述べれば、捕集板１１は、複数のピラー１１１を備えた長方形の板からなり、そして、捕集板制御部１２は、捕集板１１を、図中の矢印Ａの方向に、直線的に、ステップ状に移動する。なお、微生物検出部２は、上記実施例１の微生物検出部１と同様に、捕集部、標識部、洗浄部を備える。【００９０】
また、その動作について説明すると、微生物１７は、ファン（図示せず）より吸引された空気と共に、大気吸引口１６０を経由し多孔板１０のノズルを通過する。ノズルを通過した微生物１７は、上記実施例１と同様に、捕集板１１のピラー１１１の上面に衝突する。捕集板１１は、捕集板制御部１２により、図の矢印Ａの方向に、ステップ状に、ピラー１１１の間隔だけ移動する。そして、微生物１７が衝突したピラー１１１には、蛍光標識散布部１５１により作られた蛍光標識ミスト１５１２と共に、洗浄液散布部１５２により作られた洗浄液ミスト１５２２が、やはり実施例１と同様に、衝突する。更に、光学検出部１３により、ピラー１１１上面の微生物１７に特異的に結合した蛍光標識１５１３の蛍光を検出することで、微生物１７の有無を簡便に判定することができる。但し、本実施例では、解離工程を行わないため、検査を継続するためには、１回の検出工程の終了後に、捕集板１１を、新たな捕集板１１に交換する必要がある。
【実施例３】
【００９１】
図８は、本発明の更に他の形態（実施例３）に係る微生物捕集装置の概略構成を示す図である。実施例２との違いは、捕集板１１がロールシート状になっていること、そして、捕集板制御部１２がロールシート状の捕集板１１を巻き取るように回転することであり、そのため、捕集板１１は図中の矢印Ａの方向に移動する。捕集板１１の巻き取りは、微生物の光学検出と同期してピラー１１１が１ピッチずつ移動し得るように行われる。【００９２】
本実施例によれば、捕集板１１がロールシート状になっていることから、上記実施例１と同様、微生物１７の捕集・検出を繰り返すことが可能であり、そのため、実施例２の捕集板１１よりも長い期間使用することが可能となる共に、ここでは図示しないが、解離液散布部（図１の１５３を参照）が設けられている。【００９３】
なお、ここでも、図中における上記の実施例の構成要素に対応するものには同様の符号を付しており、そのため、その詳細な説明は省略している。【００９４】
本実施例になる微生物検出部５によれば、上記実施例２の微生物検出部２よりも長い期間に亘り、微生物１７の監視を行うことが可能となる。【００９５】
なお、以上に述べた実施例１〜３では、蛍光標識を微生物と特異的に結合させることにより、当該微生物の検出を実施している。このように、蛍光標識を用いることによれば、微生物の特定を容易にし、また、検出感度を大きく向上することが可能となるが、しかしながら、蛍光標識を含む液をその残量に応じ、適宜、補完する必要がある、場合によっては、その検出動作を、一時的に停止せざるを得ない場合が考えられる。【００９６】
そこで、以下には、蛍光標識を用いずに微生物を検出するための方法とそのための構造について説明する（実施例４）。
【実施例４】
【００９７】
一般に、細胞を持つ微生物は、NADH（還元型ニコチンアミドヌクレオチド）、NADPH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）やフラビン蛋白質などの蛍光物質を細胞内に保有している。そのため、上述した光学検出部１３に、これら蛍光物質を励起する励起光（NADHやNADPHならば紫外光、フラビン蛋白質ならば青色）を照射する機能（手段）と共に、これら蛍光物質が発する蛍光（NADHやNADPHならば青色、フラビン蛋白質ならば緑色）を検出する機能（手段）を設けることによれば、蛍光標識の補完を行うことなく、即ち、上述したメンテナンスのための一時的に停止を必要とすることなく、連続的に、微生物の検出することが可能になる。
（その他の実施形態）
なお、上記実施例では、相対移動関係において、捕集板１１を移動させ、微生物取り込み空間部１９１０、試薬散布空間部１９１１、洗浄液散布空間部１９１２、光学検出部１３、解離液散布空間部１９１３及びこれに付随するミスト散布機器（１５１、１５２、１５３）を固定しているが、前者を固定、後者を移動する構成にしてもよい。【００９８】
また、微生物検出部３は、図示されていないが、次のように構成することも可能である。【００９９】
捕集板は、無端ベルト状をなしてベルト車により移動する構成をなす。この捕集板の上方に、前記多孔板と、前記試薬供給部からの試薬が散布される試薬散布空間部と、洗浄液が散布される洗浄液散布空間部と、解離液が散布される解離液散布空間部と、を捕集板の移動方向に配置されている微生物検出装置。
【符号の説明】
【０１００】
１…微生物検出部、２…乾燥部、３…検体噴霧部、１０…多孔板、１１…捕集板、１２…捕集板制御部、１３…光学検出部、１４…ファン、３０…噴霧装置、１００…水中微生物検出装置、１０１…ノズル、１１１…ピラー、１５１〜１５３…散布部、１０５…フィルタ、１０６…ホルダ、１０７…内周部排気口、１０８…外周部排気口、１１２…凹凸捕集基板、１２３…柱、２０１…乾燥管。
【図１】
2013132630.tif 000003
【図２】
2013132630.tif 000004
【図３】
2013132630.tif 000005
【図４】
2013132630.tif 000006
【図５（ａ）】
2013132630.tif 000007
【図５（ｂ）】
2013132630.tif 000008
【図５（ｃ）】
2013132630.tif 000009
【図５（ｄ）】
2013132630.tif 000010
【図５（ｅ）】
2013132630.tif 000011
【図６（ａ）】
2013132630.tif 000012
【図６（ｂ）】
2013132630.tif 000013
【図７】
2013132630.tif 000014
【図８】
2013132630.tif 000015
【図９】
2013132630.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月5日(2012.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象となる検体を液とし、液の中に含まれる微生物を検出する検出装置において、
前記液をミスト状にするミスト生成部と、
前記ミストを蒸発させる蒸発部と、
前記蒸発により空気中に取り出される前記微生物を空気と共に噴出させる複数のノズルを備えた多孔板と、
前記多孔板と対向する位置で前記ノズルから出た前記微生物を捕捉する捕集面を有する捕集板と、
前記捕集面に捕捉された前記微生物に、蛍光或いは発色反応を生じさせる反応手段を与える反応部と、
前記捕集面上に生じる蛍光或いは発色を検出するための光学検出部と、
前記蒸発部から前記多孔板を通して前記捕集面に向けて空気の流れを発生するファンと、を備え、
前記ノズルの領域、前記反応部、及び前記光学検出部よりも、前記捕集板の捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくし、前記捕集板を、前記ノズルの領域、前記反応部、及び前記光学検出部に対して相対的にステップ状に移動させる機構を有することを特徴とする液中微生物の検出装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記反応手段は、前記微生物に対して特異的に結合して蛍光を生じさせる試薬、或いは、微生物自体が励起光を受けて蛍光或いは発色する性質を有する場合には、その励起光である請求項１記載の液中微生物の検出装置。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記反応部は、前記微生物に対して特異的に結合して蛍光を生じさせる試薬供給部を含み、
前記捕集面と対向する位置に、前記微生物を前記蒸発部から空気と共に取り込んで前記多孔板に導く微生物取り込み空間部と、前記試薬供給部からの試薬が散布される試薬散布空間部と、光学検出に先立ち前記捕集板の非特異吸着の試薬を除去する洗浄液が散布される洗浄液散布空間部と、光学検出後に前記捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離するために解離液が散布される解離液散布空間部と、が配置され、
前記微生物取り込み空間部、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部よりも、前記捕集板の捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくし、前記捕集板を、前記微生物取り込み空間部、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部に対して相対的に移動させる機構を有することを特徴とする液中微生物の検出装置。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記捕集板が長方形の板もしくはロール状のシートである液中微生物の検出装置。
【請求項５】
請求項３において、
筒状の筐体を有し、この筐体は、前記ファンにより筐体内部に筐体軸方向の空気流を形成する空間を有し、この空気流を形成する前記筐体内部の空間を、複数の仕切り板により前記筐体の周方向に複数に仕切ることで、前記微生物取り込む空間、前記試薬散布空間部、前記洗浄液散布空間部、前記光学検出部、及び前記解離液散布空間部を形成し、
これらの空間部の底部が、それぞれ多孔板で形成されて、前記微生物を含む空気を噴出するノズルのほかに、前記試薬のノズル、前記洗浄液のノズル、及び前記解離液のノズルを構成し、
前記それぞれのノズルの下流に前記各ノズルと対向する円盤状の前記捕集板が、前記各ノズルに対して周方向に相対的に移動する構成をなして配置されている液中微生物の検出装置。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記ミスト生成部は、ベンチュリ効果、加圧気体、超音波、遠心力、又はオリフィスを利用してミストを発生させる構成を有する液中微生物の検出装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記ミスト生成部は、前記ミストの粒径および単位時間のミスト生成量を調整する機構を備え、粒径１μｍ〜１ｍｍ、数密度１０６〜１０１２個／ｍ３のミストを生成する構成を有する液中微生物の検出装置。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記蒸発部は、液蒸気透過性の膜で構成された内管と、前記内管の少なくとも一部の周りを覆う外管とを備えた二重管構造で、前記ミストが内管を通して流れ、前記内管と前記外管との間には、加熱機構により加熱された乾燥空気が通過する構成とし、加熱された前記乾燥空気の温度や風量を調整することで、前記ミストから蒸発する液の量を調整する機構を有する液中微生物の検出装置。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記蒸発部は、液蒸気を吸収する吸収体により形成された管で、その外周を発熱体に覆われた構成をなし、前記発熱体の発熱量を調整することで、前記ミストから蒸発するの分量を調整する機構を有する液中微生物の検出装置。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、
前記多孔板は、厚さ０．０１ｍｍ〜２ｍｍ、直径５ｍｍ〜２００ｍｍの金属板で、孔径５０μｍから２００μｍの円形の複数のノズルを備えている液中微生物の検出装置。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、
前記捕集板は、複数のピラーを備え、前記多孔板と前記捕集板とが相対移動を停止した状態での前記複数のピラーの位置は、前記多孔板の前記複数のノズルの位置と重なるように位置制御される構成を有し、微生物は前記ピラーの上面に捕捉される液中微生物の検出装置。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記ピラーは、前記ノズルの面積の１倍〜１０倍で、前記ピラーの高さは前記ピラーと前記ノズルの間隔の２倍以上である構成を有する液中微生物の検出装置。
【請求項１３】
請求項１１又は１２において、
前記ピラーの上面には、特定の微生物と特異的に結合する物質が修飾されている液中微生物の検出装置。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記捕集板は、ガラス、石英、樹脂類（ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチルエステル等アクリル、ポリジメチルシロキサン）、金属類（鉄、アルミニウム、銅、錫、金、銀などの純金属および合金鋼、銅合金、アルミニウム合金、ニッケル合金などの合金）のいずれか１種である液中微生物の検出装置。
【請求項１５】
請求項３ないし１４のいずれか１項において、
前記試薬供給部は、液体の試薬を、直径０．３μｍ〜１０μｍ、数密度１０６〜１０１２個／ｍ３のミストにして散布する構成を有している液中微生物の検出装置。
【請求項１６】
請求項１５において、
前記試薬散布空間部は、特定の微生物に特異的に結合する蛍光標識を含む液体をミスト状に散布し、
前記洗浄液散布空間部は、純水もしくは緩衝液をミスト状に散布し、
前記解離液散布空間部は、低ｐＨの液体をミスト状に散布する構成としている液中微生物の検出装置。
【請求項１７】
請求項２において、
試薬供給部から前記試薬を前記捕集面に噴射させる複数のノズルを構成する多孔板を備え、この試薬噴射ノズルの数と前記微生物を含む空気を噴射させる複数の前記ノズルの数との比率を変更可能な構成とした液中微生物の検出装置。
【請求項１８】
検査対象となる検体を液とし、液の中に含まれる微生物を検出する方法において、
前記液をミスト状にするミスト生成工程と、
前記ミストを蒸発させてミストに含まれる微生物を空気中に取り出す蒸発工程と、
前記微生物を含む空気を、複数のノズルを構成する多孔板を介して捕集板の捕集面に当てて、前記微生物を捕捉する噴射工程と、
捕捉された前記微生物に、蛍光或いは発色反応を生じさせる反応手段を与える反応工程と、
前記捕集面上に蛍光或いは発色が生じている場合にそれを光学的に検出する検出工程と、を有し、
前記ミスト生成工程、蒸発工程、噴射工程をファンにより生じる空気の流れの中で連続的に行い、
前記噴射工程と前記反応工程の行われる場よりも、前記捕集面を円周方向或いは直線方向に大きくして、前記捕集板を、前記噴射工程及び前記反応工程を与える場に対して相対的に移動させながら、前記噴射工程と前記反応工程を行うことを特徴とする液中微生物の検出方法。
【請求項１９】
請求項１８において、
前記反応工程において微生物に与えられる反応手段は、微生物に対して特異的に結合して蛍光或いは発色を生じさせる試薬、或いは、微生物自体が励起光を受けて蛍光或いは発色する性質を有する場合には、その励起光である液中微生物の検出方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９において、
前記反応手段として、蛍光標識を用いた試薬を用いる場合には、前記検出工程に先立ち前記捕集面に非特異吸着した蛍光標識を洗浄して捕集面に捕捉された前記微生物と結合した蛍光標識のみを残す洗浄工程と、前記検出工程後に前記捕集面に捕捉された微生物を捕集面から解離液を用いて解離する解離工程とを有し、
これらの洗浄工程、解離工程も、前記ミスト生成工程、蒸発工程、噴射工程、及び反応工程と共に、前記ファンにより生じる空気の流れの中で行い、
前記噴射工程、反応工程、洗浄工程及び解離工程の行われる場よりも、前記捕集面の円周方向或いは直線方向に大きくして、前記捕集板を、前記噴射工程、反応工程、洗浄工程、及び解離工程の場に対して相対的に移動させながら、前記噴射工程、反応工程、洗浄工程、及び解離工程を行うことを特徴とする液中微生物の検出方法。
【請求項２１】
請求項２０において、
前記洗浄工程は、純水または緩衝液のミストと空気とを混合したものを、前記多孔板に形成された微生物用の前記ノズルと別のノズルから前記捕集面に向かって噴射して、前記捕集面に非特異吸着した蛍光標識を洗浄し、
前記解離工程は、低ｐＨの液体のミストと空気を混合したものを、前記多孔板に形成されたさらなる別のノズルから前記捕集面に向かって噴射して、前記捕集面に付着した微生物を除去する液中微生物の検出方法。
【請求項２２】
請求項２１において、
検出する前記微生物の種類や濃度、使用する前記蛍光標識の種類や濃度に応じて、前記微生物を含む空気を噴射させるための複数のノズルの数と、ミスト状の蛍光標識と空気の混合したものを噴射させるための複数のノズルの数の比率を変更し、前記微生物の検出に必要な各工程の所要時間を変更することを特徴とする微生物の検出方法。
【国際調査報告】
2013132630.tif 000017
2013132630.tif 000018
2013132630.tif 000019
2013132630.tif 000020