(57)【要約】  被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法である。本発明の腎疾患の検査方法は、前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含むことが好ましい。本発明の腎疾患の検査方法は、検出感度及び特異性が良好で、簡便かつ安全に腎疾患（好ましくは、ＩｇＡ腎症）と判定することができる。
2009147999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
【請求項２】
前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含む請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記複合体検出工程で検出された複合体の検出量の、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する比率を得る工程をさらに含む請求項１または請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含む請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法。
【請求項６】
前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含む請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する判定工程をさらに含む請求項５または請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、
前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは前記試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、
前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
【請求項９】
前記複合体検出工程は、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いる免疫化学的方法である請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記免疫化学的方法は、サンドイッチ法である請求項９に記載の検査方法。
【請求項１１】
被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出方法。
【請求項１２】
前記複合体は、前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて免疫化学的方法で検出される請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記免疫化学的方法は、サンドイッチ法である請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトである請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症である請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
少なくとも、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを含む腎疾患の検査キット。
【請求項１７】
前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症である請求項１６に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＡ腎症は１９６８年Bergerらによって記載された疾患であり、糖尿病性腎症を除く慢性糸球体腎炎の中で最も頻度の高い腎疾患である（例えば、非特許文献１参照）。ＩｇＡ腎症は長期予後不良の疾患であり、透析治療を必要とする末期腎不全患者の約２５％がＩｇＡ腎症を起因疾患とするものと推定されている。従来、ＩｇＡ腎症の進行を遅延させる治療法はあっても治癒させる治療法はなかった。しかし、近年堀田らにより早期に治療を開始すれば完全寛解が得られる治療法が確立されてきた。【０００３】
一方、ＩｇＡ腎症の診断方法は「厚生省特定疾患進行性腎障害調査研究班と日本腎臓学会の共同委員会」によると、尿検査（持続的顕微鏡的血尿、持続的または間欠的蛋白尿、肉眼的血尿）、血液検査（血清ＩｇＡ値が３５０ｍｇ/ｄｌ以上）を補助的診断基準とし、確定診断は腎生検によって腎糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡの沈着を証明することを唯一の方法としている。しかし、腎生検は１週間程度の入院を必要とし、出血の多い危険な検査方法であるため、受診率は必ずしも高いとは言えない。早期のＩｇＡ腎症を簡便かつ安全な方法で診断できる検査方法が求められているのが現状である。
また、ＩｇＡ腎症の診断方法としてＩｇＡ−フィブロネクチン複合体を用いる方法等が知られているが（例えば、特開２０００−２４１４３１号公報、特許２５９２１２１号公報、Cederholm et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 85:4865-8, 1988参照）、これまで実用化された方法は無かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、検出感度と特異性とが良好で、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症と判定することができるＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に特異的な抗体を作製し、その抗体を用いてヒト尿中のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とＩｇＡとの複合体の検出量を測定したところ、健康人やＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者に比べＩｇＡ腎症患者において、前記複合体がより高い濃度で存在することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
本発明の第１の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むＩｇＡ腎症の検査方法である。前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含むことが好ましい。また前記複合体検出工程で検出された複合体の検出量の、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する比率を得る工程をさらに含むことが好ましく、前記比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含むことがより好ましい。【０００７】
本発明の第２の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法である。前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含むことが好ましく、前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する工程をさらに含むことがより好ましい。【０００８】
本発明の第３の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは前記試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法である。
本発明の検査方法における前記複合体検出工程は、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いる免疫化学的方法であることが好ましく、サンドイッチ法であることがより好ましい。【０００９】
本発明の第４の態様は、被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出方法である。前記複合体は、前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて免疫化学的方法で検出されることが好ましく、サンドイッチ法で検出されることがより好ましい。
また前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトであることが好ましく、前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症であることがより好ましい。【００１０】
本発明の第５の態様は、少なくとも、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを含む腎疾患の検査キットである。前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、検出感度と特異性とが良好で、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症と判定することができるＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】尿中のＩｇＡ−６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。
【図２】尿中のＩｇＡ−６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図３】尿中のＩｇＡ−６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。
【図４】尿中のＩｇＡ−６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析をした結果を示す図である。
【図５】尿中のＩｇＡ−４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。
【図６】尿中のＩｇＡ−４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図７】尿中のＩｇＡ−４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。
【図８】尿中のＩｇＡ−４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の腎疾患の検査方法は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むものである。前記複合体を尿に由来する試料から検出することによって、被験者における腎疾患を良好な検出感度と良好な特異性で検出することができる。尚、前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症とＩｇＡ腎症以外の腎疾患とを含むものである。【００１４】
本発明において、前記試料とは、被験者から採取した尿自体であっても、採取した尿に通常行われる稀釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。本発明においては、ヒトから採取した尿を常法により稀釈した尿試料であることが好ましい。
さらに前記被験者の尿に由来する試料は、前記尿試料をヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体、またはヒトＩｇＡに対する抗体と接触させて得られるものであってもよい。【００１５】
また、本発明におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とは、ヒト腎メサンギウム培養細胞、ヒト腎から分離したメサンギウム細胞及びこれらから抽出された細胞抽出物に存在する抗原であって、ＩｇＡと複合体を形成可能であり、腎疾患を有する被験者の尿中に存在する抗原であれば特に制限はない。中でも、腎疾患及びＩｇＡ腎症の検出特異性の観点から、ヒト腎メサンギウム細胞以外の糸球体を構成する細胞に由来する抗原と識別可能な抗原であることが好ましく、ヒト近位尿細管上皮細胞に由来する抗原と識別可能な抗原であることがより好ましい。【００１６】
また前記細胞抽出物は、ヒト腎メサンギウム培養細胞、又はヒト腎から分離したメサンギウム細胞から抽出されたものであれば特に制限はないが、腎疾患及びＩｇＡ腎症の検出特異性の観点から、細胞の骨格成分抽出物であることが好ましい。
前記細胞抽出物は、通常の方法で調製することができる。例えば、ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiochem社製)を用いる方法等を挙げることができる。【００１７】
前記複合体の検出方法については特に制限はなく、通常用いられる蛋白質の検出方法を適用することができるが、検出される複合体を定量又は半定量可能な方法であることが好ましい。【００１８】
本発明において複合体の検出に用いる装置には特に制限はなく、複合体の検出方法に応じて適宜選択することができる。具体的には例えば、ＨＰＬＣ機器、質量分析機器（マススペクトロメトリー）、電気泳動機器（キャピラリー電気泳動装置等）、全自動あるいは半自動酵素免疫測定機器、セルウォッシャー、全自動あるいは半自動化学発光免疫測定機器、発光測定装置、全自動あるいは半自動電気化学発光免疫測定機器、光学測定装置、プレートリーダー、ＣＣＤカメラ、全自動あるいは半自動蛍光免疫測定機器、蛍光測定装置、全自動あるいは半自動放射免疫測定機器、液体シンチレーションカウンター、クールターカウンター、表面プラズモン測定装置、ブロッティング装置、デンシトメーター等を挙げることができる。【００１９】
本発明においては、検出感度、特異性及び簡便性の観点から、前記複合体に対する結合する抗体を用いる免疫化学的方法であることが好ましい。本明細書において「複合体に対する抗体」とは、「複合体を認識する抗体」、「複合体に結合する抗体」等の抗体において通常用いられる意味で用いられるものである。すなわち、前記「複合体に対する抗体」は、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原及びヒトＩｇＡからなる複合体の少なくとも一部と結合し、新たな複合体を形成する。以下、「ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体」、「ヒトＩｇＡに対する抗体」等についても同様である。
本発明における免疫化学的方法としては、通常行われる方法を特に制限なく用いることができる。具体的には例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、吸光度測定、蛍光抗体法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴、ウェスタンブロット法、ドットブロット法等を挙げることができる。本発明においては、検出感度、特異性及び簡便性の観点から、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることが好ましい。【００２０】
本発明における免疫化学的方法としては、特異性と簡便性の観点から、前記複合体中のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原を認識して結合する抗体と前記複合体中のＩｇＡを認識して結合する抗体とを用いるサンドイッチ法であることが好ましい。【００２１】
前記サンドイッチ法は、例えば、以下のようにして行うことができる。前記複合体と結合する抗体（一次抗体）を、プレート等の担体に固相化する。通常プレート等の非特異的な結合部位をふさぐため、カゼイン等蛋白質あるいは界面活性剤でブロッキング操作を行なう。次いで尿に由来する試料または被検試料を添加してインキュベーションする。プレート等を洗浄した後、前記複合体と結合する抗体であって標識された二次抗体を添加し、インキュベーション後、プレート等を洗浄し、標識を検出する方法で行うことができる。【００２２】
本発明においては、検出感度と特異性の観点から、前記一次抗体及び前記二次抗体として、前記複合体に結合する抗体から選ばれる２種の抗体を用いることが好ましく、前記一次抗体及び前記二次抗体のうち一方の抗体としてヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体を用い、他方の抗体としてヒトＩｇＡに対する抗体を用いることが、より好ましく、前記一次抗体として、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体を用い、前記二次抗体としてヒトＩｇＡに対する抗体を用いることがさらに好ましい。【００２３】
本発明において、前記複合体に結合する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、腎疾患の検出特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
前記複合体に結合する抗体は、通常行われる方法によって調製することができる。【００２４】
ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対するポリクローナル抗体は、通常の作製方法に得ることができ、例えば、次のようにして得ることができる。ヒト腎メサンギウム培養細胞、ヒト腎から分離したメサンギウム細胞、又はその抽出物をウサギ、ヤギ等の動物に免疫して血清を得る。これを例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ヒト腎メサンギウム細胞の抽出物をカップリングしたアフィニティカラム等により精製することで調製できる。
本発明においては、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原以外の抗原に結合する抗体を通常行われる方法、例えば吸収操作等によって除いたヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する特異性がより高い抗体であることが好ましい。【００２５】
また例えば、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対するモノクローナル抗体であれば、ヒト腎メサンギウム培養細胞、ヒト腎から分離したメサンギウム細胞、又はその抽出物を、マウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これにより形成された融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原と結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで選択したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ヒト腎メサンギウム細胞の抽出物をカップリングしたアフィニティカラム等により精製することで調製できる。【００２６】
前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に結合するモノクローナル抗体を産生するクローンの選択においては、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に反応性の高いクローンを選択することが好ましい。またこれに加えて、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原以外の抗原にも結合する抗体を産生するクローンを除外することが好ましい。前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原以外の抗原としては、例えば、尿中に混入する可能性の高い細胞であって、ヒト腎メサンギウム細胞以外の細胞に由来する抗原を挙げることができ、ヒト近位尿細管上皮細胞に由来する抗原であることが好ましい。【００２７】
本発明におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体としては、腎疾患及びＩｇＡ腎症の検出特異性の観点から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に結合し、かつ、尿中に混入する可能性の高い細胞であってヒト腎メサンギウム細胞以外の細胞に由来する抗原には結合しない抗体であることが好ましく、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に結合し、かつ、ヒト近位尿細管上皮細胞に由来する抗原には結合しない抗体であることがより好ましい。
尚、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体は、上記のようにして得られるマウス等の小動物に由来する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体等のいずれであってもよい。【００２８】
ヒトＩｇＡに対する抗体としては、前記複合体中のＩｇＡと結合可能な抗体であれば特に制限はなく、ヒトＩｇＡのＨ鎖、Ｊ鎖、分泌片（secretory component）等のいずれを認識するものであってもよい。
また、ヒトＩｇＡに対する抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、複合体の検出特異性の観点から、ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。
前記ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体は、抗原としてヒトＩｇＡを用いて、上記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と同様にして調製することができる。またヒトＩｇＡに対する抗体としては、市販の抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることもできる。
尚、ヒトＩｇＡに対する抗体は、上記のようにして得られるマウス等の小動物に由来する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体等のいずれであってもよい。【００２９】
前記標識としては特に制限なく公知の標識を用いることができる。例えば、酵素、化学発光物質、電気化学発光物質、放射性物質等を挙げることができる。
本発明においては、検出感度と簡便性の観点から、前記標識として酵素を用いることが好ましい。
前記酵素としては、物理的、化学的方法で定量可能な酵素であれば特に制限はない。例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ等の酵素を挙げることができる。【００３０】
また標識の検出方法は、標識を定量又は半定量可能な検出方法であれば特に制限はなく、標識に応じて適宜選択することができる。例えば、吸光度、発光強度、蛍光強度、放射線計数等を挙げることができる。
標識を定量又は半定量することで、前記複合体を定量又は半定量することができる。【００３１】
本発明における複合体検出工程を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用い、標識の検出を吸光度にて行なう場合、本発明に好ましく用いられる前記複合体を検出する測定装置としては、複合体に結合した標識によって生じた色素の吸光度を測定可能な吸光度測定装置であって、標識によって生じた色素を含む試料を載置する試料載置部と、前記試料に光を照射する光照射部と、前記試料からの反射光及び透過光の少なくともいずれかを受光し、受光した光量を測定する光量測定部と、を備える吸光度測定装置を挙げることができる。
本発明においては、検体（被験者の尿に由来する試料）に含まれるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体と結合した標識によって生じた色素に、前記光照射部により光を照射し、前記色素の吸光度を光量測定部により定量化することにより、検体中におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の存在量を測定することができる。【００３２】
また、前記標識の検出を吸光度に代えて、検体からの発光を検出することによって行うこともできる。その場合は、前記吸光度測定装置に代えて、複合体に結合した標識そのものまたは反応液中の標識の基質から発せられる光を測定可能な測定装置であって、標識を含む試料を載置する試料載置部と、前記試料からの発光を受光し、受光した光量を測定する光量測定部と、を備える測定装置を挙げることができる。
本発明においては、検体（被験者の尿に由来する試料）に含まれるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体と結合した標識を含む試料から発せられた光を前記光量測定部により定量化することにより、検体中におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の存在量を測定することができる。【００３３】
本発明の腎疾患の検査方法は、前記尿に由来する試料中に含まれる前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する判定工程を含むことが好ましい。本発明における前記複合体の検出量としては、前記尿に由来する試料中に含まれる前記複合体の濃度又はそれに対応する定量値又は半定量値であれば特に制限なく用いることができる。例えば、前記複合体の検出量を直接的に測定した測定値、前記複合体の検出量を標識の検出を介して間接的に測定した測定値等を挙げることができる。【００３４】
また本発明の腎疾患の検査方法においてＩｇＡ腎症を検査する場合、ＩｇＡ腎症と判定することに用いる複合体の検出量は、被験者の尿に由来する試料中の総尿蛋白質量に対する複合体の検出量の比率であることが好ましい。前記比率は複合体の検出量の測定値を被験者の尿に由来する試料中の総尿蛋白質量の測定値で除して得られるものであっても、総尿蛋白質量に対する相対値として得られる複合体の検出量であってもよい。かかる比率に基づいて判定することで、より高い感度と特異性でＩｇＡ腎症と判定することができる。
尚、総尿蛋白質量を測定する被験者の尿に由来する試料は、同一の被験者から得られるものであれば、前記複合体の検出に用いる尿に由来する試料とは異なる試料であってもよい。【００３５】
本発明の腎疾患の検査方法における判定工程は、被験者の尿に由来する試料からのヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出量と、対照となる健常人の尿に由来する試料からの前記複合体の検出量とを比較する工程と、前記被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量が対照となる健常人の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量よりも大きい場合と腎疾患とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。【００３６】
ここで対照となる健常人とは、腎疾患を発症していないことが予め判明している個体を意味する。また、検出量が大きいとは、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された正常検出量（カットオフ値）よりも、被験者に由来する前記複合体の検出量のほうが大きいことである。【００３７】
前記カットオフ値は、例えば、腎疾患患者の尿に由来する試料群における前記複合体の検出量と、対照となる健常体群の尿に由来する試料群における前記複合体の検出量とをＲＯＣ解析等に付することよって設定することができる。ＲＯＣ解析は、例えば、疾病の検査方法の検出能、診断能を評価可能な解析方法であって、例えば、日本臨床検査自動化学会会誌「臨床検査の診断的有用性評価マニュアル」Ver.1.3(2004.9.1)、Vol.29 Suppl.1(通巻第154号)(2004年9月1日発行)に記載された解析方法である。
また、カットオフ値は、例えば、健常人の検出レベルの平均値に、標準偏差を２倍あるいは３倍した値を加算した値として定めることもでき、更に、感度（検出率）・特異性（偽陽性率の低さ）をバランスよく満たす値に適宜定めることができる。【００３８】
本発明における腎疾患としては、例えば、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）、膜性腎症（ＭＮ）、ループス腎炎（ＳＬＥ）、巣状糸球体硬化症（ＦＧＳ）、微少変化群ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）、糖尿病性腎症（ＤＭＮ）、アミロイドーシス、遺伝性腎症（Ａｌｐｏｒｔ）、燃え尽きＩｇＡ腎症（ＩｇＡ腎症の自然寛解状態）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連腎炎、菲薄基底膜症候群（ＴＢＭＤ）、腎硬化症等を挙げることができる。
本発明の腎疾患の検査方法は、尿中の前記複合体を検出することで、ＩｇＡ腎症をはじめとする種々の腎疾患を検出することができる。【００３９】
本発明のＩｇＡ腎症の検査方法は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むことを特徴とする。
尿に由来する試料中の総蛋白質量に対する前記複合体の検出量の比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定することで、高感度かつ高特異的であって、治療介入によって完全寛解が得られる初期段階においても、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症を判定することができる。【００４０】
本発明における複合体検出工程は、前記腎疾患の検査方法における複合体検出工程と同様である。
また、尿蛋白質量の検出方法としては、尿に由来する試料中の総蛋白質量を測定可能であれば特に制限なく、通常行われる尿に由来する試料中の蛋白質検出方法を適用することができる。例えば、金井光正ら著の「臨床検査法概要改訂版第３２版」、１７３〜１７４頁、２００５年に記載の方法を適用することができる。【００４１】
本発明における第１の判定工程において、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量に基づいて腎疾患と判定する工程は、前記腎疾患の検査方法における判定工程と同様である。
また、前記尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する工程は、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された正常検出量（カットオフ値）よりも、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量のほうが大きい場合と腎疾患とを関連づける工程、を含むことが好ましい。
ここで尿蛋白質量の正常検出量は、通常の方法で設定することができる。【００４２】
本発明における第２の判定工程は、被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率（複合体／総蛋白質）と、対照となるＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率とを比較する工程と、前記被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率が対照となるＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率よりも大きい場合とＩｇＡ腎症とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。【００４３】
ここで、比率が大きいとは、ＩｇＡ腎症とＩｇＡ腎症以外の腎疾患を区別するために設定されたカットオフ値よりも、被験者に由来する前記複合体の検出量比率のほうが大きいことである。
前記カットオフ値は上述した腎疾患の検査方法におけるカットオフ値と同様にして設定することができるが、検出特異性の観点から、ＲＯＣ解析の結果に基づいてカットオフ値を設定することが好ましい。【００４４】
本発明のＩｇＡ腎症の検査方法は、尿中の前記複合体の検出量と総蛋白質量とを測定し、前記総蛋白質量に対する前記複合体の検出量の比率に基づいて、ＩｇＡ腎症を検出することが可能であることから、簡便で安全なＩｇＡ腎症の検査方法である。【００４５】
本発明のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出方法は、被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む。これによりヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を、高感度かつ高い特異性で検出することができる。
本発明の複合体の検出方法には、前記腎疾患の検査方法における複合体検出工程において説明した事項を同様に適用することができる。【００４６】
また前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトであることが好ましい。ここで言う腎疾患を発症する可能性を有しているヒトとは、腎疾患を発症しているヒトまたは腎疾患を発症していると疑われるヒトのいずれでもないあらゆるヒトをいう。また前記腎疾患はＩｇＡ腎症であることがより好ましい。【００４７】
本発明の腎疾患の検査キットは、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体の少なくとも１種と、ヒトＩｇＡに対する抗体の少なくとも１種とを含むことを特徴とする。前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて、尿に由来する試料中のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出することで、良好な検出感度と特異性で腎疾患と判定することが可能になる。
本発明の腎疾患の検査キットは、前記抗体に加えて、被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させて、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出し、その検出量と腎疾患と関連付けることが記載された取扱い説明書をさらに含むことが好ましい。
また、本発明の腎疾患の検査キットは、ＩｇＡ腎症の検査用として好ましく用いることができる。【００４８】
日本国出願番号第２００８−１４４８８３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００５０】
[実施例１]
＜ヒト腎メサンギウム細胞抗原認識モノクローナル抗体の取得＞
正常ヒト腎メサンギウム細胞（Cryo NHMC:Cambrex社）を培養し、その細胞またはその細胞骨格成分抽出フラクションを免疫源としてＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）に免疫した。免疫源に対する抗体価が上昇したことを確認し、その脾臓細胞をＰ３Ｕ−１細胞と細胞融合してハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの１ｓｔスクリーニングは、２種類の免疫抗原（正常ヒト腎メサンギウム細胞またはその細胞骨格成分抽出フラクション）をマイロプレートのカップに固相化したＥＩＡ法により行い、両方あるいはいずれか一方の抗原に対して高い発色値を示したハイブリドーマを選択した。尚、細胞骨格成分抽出フラクションは、ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiochem社製)を用いて調製した。
選択したハイブリドーマは、限界希釈法でモノクローンにした後、これらを用いてヒト腎メサンギウム細胞に特異的なハイブリドーマを選択するために２ｎｄスクリーニングを行った。ハイブリドーマの２ｎｄスクリーニングは、後述するＥＬＩＳＡ法を用い、固相に正常ヒト腎メサンギウム細胞またはその細胞骨格成分抽出フラクションを用いたもので反応し、対照用に培養した正常ヒト近位尿細管上皮細胞（Cryo RPTEC:Cambrex社）またはその細胞骨格成分抽出フラクションを固相にしたものでは反応しないクローンを選択した。【００５１】
ＥＬＩＳＡ法は次の通り行った。正常ヒト腎メサンギウム細胞と正常ヒト近位尿細管上皮細胞の、それぞれ４０００ｃｅｌｌｓ／２００μｌをポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に注入し３７℃、一夜培養した。カップをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５回洗浄した後、０．０５％グルタルアルデヒド溶液１００μｌ／ｗｅｌｌを注入し室温、３０分間反応させた。カップを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、ブロッキング液（１０％正常ウサギ血清(Pel-Freeze)、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ３）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で１日以上ブロッキングした（以下、「抗体スクリーニング用カップ」という）。
一方、正常ヒト腎メサンギウム細胞と正常ヒト近位尿細管上皮細胞の骨格成分抽出フラクションは、それぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃で一夜コートした。コート後以降の操作は、前述の抗体スクリーニング用カップと同様に行った。【００５２】
４種類の抗体スクリーニング用カップを、それぞれ洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄後、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．１Ｍクエン酸で緩衝化(ｐＨ５．４)した２５％正常ウサギ血清（Pel-Freeze）で希釈した２種類の標識抗体（HRP-Rabbit Anti-Mouse ＩｇＧ(Zymed社製：１０００倍希釈)、HRP-Rabbit Anti-Mouse ＩｇＧ１(Zymed社製:４０００倍希釈）を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ（４５０−６５０ｎｍ）を測定した。本測定結果において、特にHRP-Anti-Mouse ＩｇＧ１で正常ヒト腎メサンギウム細胞及びその細胞骨格成分抽出フラクションの両方あるいはそのいずれか一方で高い発色値を示し、かつ、正常ヒト近位尿細管上皮細胞及びその細胞骨格成分抽出フラクションのいずれでも低い発色値を示したクローンを選択した。【００５３】
＜モノクローナル抗体の反応特性の確認＞
上記で取得したハイブリドーマを培養し、その細胞をマウス腹腔に移植して得られた腹水からＰＲＯＳＥＰ−Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）によってＩｇＧを精製した。精製モノクローナル抗体の特異性は、上記スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡ法と同様の方法で特異性を確認した。【００５４】
精製モノクローナル抗体５種（４Ｈ３−１Ｄ１２−１Ｄ２、４Ｈ３−２Ｅ７−１Ｄ２、６Ｃ４−６Ａ８−１Ｂ４、１４Ｅ１１−２Ｇ７−１Ｂ２、１１Ａ１１−２Ｆ９−１Ｇ３）はすべて、固相に正常ヒトメサンギウム細胞または細胞骨格成分抽出フラクションに対しては高い発色値を示し、対照用の正常ヒト近位尿細管上皮細胞（Cryo RPTEC:Cambrex社）またはその細胞骨格成分抽出フラクションを固相にしたものでは低い発色値しか示さなかった。【００５５】
次に、正常ヒト腎メサンギウム細胞の骨格成分抽出フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースフィルター（Schleicher&Schuell社製、ＢＡ８５）にブロッティングした。フィルターをブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％スキムミルク、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ３）に浸し、４℃で一夜振とうした後、ブロッキング液を交換し、取得したモノクローナル抗体各クローンの培養上清を加え、室温で２時間振とうし、洗浄液で３回洗浄した。洗浄液に二次抗体のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Zymed Laboratories,Inc.社製）を１／１０００濃度で加え、室温で1時間振とうし、洗浄液で3回洗浄した後、発色液（８．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ６．５)、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  4-Chloro-1-Naphtol、０．０１％  Ｈ２Ｏ２）を加えて発色させた。【００５６】
上記ウエスタンブロッティング解析実験の結果、クローン４Ｈ３と６Ｃ４はヒト腎メサンギウム細胞の骨格成分抽出フラクションの異なる分子量の成分と反応した。クローン４Ｈ３と６Ｃ４はヒト腎メサンギウム細胞の異なる抗原を認識していると考えられる。【００５７】
＜腎疾患の検出＞
〜ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＡ−６Ｃ４認識抗原複合体の検出〜
６Ｃ４−６Ａ８−１Ｂ４抗体（以下、「６Ｃ４」という）をＰＲＯＳＥＰ−Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で精製後、更に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで透析して精製した精製抗体を５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ濃度に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃で一夜コートした。コート後、洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、ブロッキング液（５０％Ｎ１０２(日本油脂社製)、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で１日以上ブロッキングした（以下、「６Ｃ４コートカップ」という）。【００５８】
６Ｃ４コートカップを洗浄液(５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、検体希釈液（５０％Ｎ１０２(日本油脂社製)、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）で５０倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で1時間反応した。洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で３０００倍希釈したHRP-GOAT Anti-Human ＩｇＡ(Zymed社製)を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ(４５０−６５０ｎｍ)を測定した。ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４６例と健康人（健常人）２８例について測定した結果を図１に示す。【００５９】
図１においてブランクを差し引いた値を比較することで、ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４６例と健康人（健常人）２８例を有意に区別できる結果が得られた。
また、腎疾患患者１４６例と健康人２８例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図２に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は０．１５５であった。そのカットオフ値から腎疾患患者１４６例と健康人２８例の陽性率を求めた結果を表１に示す。表１に示す通り、腎疾患患者１４６例中陽性１３２例（９０．４％）、健康人２８例中陽性２例（７．１％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は９０．４％、特異度（特異性）は９２．９％、診断効率は９０．８%であった。【００６０】
【表１】
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【００６１】
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
次に、複合体検出量が上記カットオフ値以上の発色値を示した検体についてピロガロールレッド法により尿中の蛋白濃度を定量した。上記で検出したＩｇＡ−６Ｃ４認識抗原複合体の検出量（図１に示した値）を尿中の蛋白濃度で除して、尿中の蛋白量あたりの複合体検出量を算出した結果を図３に示した。図３から、ＩｇＡ腎症患者８３例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例とを有意に区別できることが分かる。
また、ＩｇＡ腎症患者８３例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図４に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は４５０９であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者８３例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例の陽性率を求めた結果を表２に示した。表２から、ＩｇＡ腎症患者８３例中陽性６１例（７３．５％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例中陽性１０例（２０．８％）であり、両者を有意に区別できることが分かる。その時の感度は７３．５％、特異度は７９．２％、診断効率は７５．６%であった。【００６２】
【表２】
2009147999.tif 000004
【００６３】
[実施例２]
＜腎疾患の検出＞
〜ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＡ−４Ｈ３認識抗原複合体の検出〜
４Ｈ３−１Ｄ１２−１Ｄ２抗体（以下、「４Ｈ３」という）をＰＲＯＳＥＰ−Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で精製後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで透析した精製抗体を５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ濃度に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃一夜コートした。コート後、洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、ブロッキング液（５０％ Ｎ１０２(日本油脂社製)、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で1日以上ブロッキングした（以下、「４Ｈ３コートカップ」という）。【００６４】
４Ｈ３コートカップを洗浄液(５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、検体希釈液（５０％Ｎ１０２(日本油脂社製)、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）で５０倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液(５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で３０００倍希釈したHRP-GOAT Anti-Human ＩｇＡ(Zymed社製)を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ(４５０−６５０ｎｍ)を測定した。ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４９例と健康人２８例について測定した結果を図５に示す。【００６５】
図５においてブランクを差し引いた値を比較することで、ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４９例と健康人２８例を有意に区別できる結果が得られた。
また、腎疾患患者１４９例と健康人２８例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図６に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は０．１９２であった。そのカットオフ値から腎疾患患者１４９例と健康人２８例の陽性率を求めた結果を表３に示す。表３から、腎疾患患者１４９例中陽性１４７例（９８．７％）、健康人２８例中陽性１例（３．６％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は９８．７％、特異度は９６．４％、診断効率は９８．３%であった。【００６６】
【表３】
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【００６７】
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
次に、カットオフ値以上の発色値を示した検体についてピロガロールレッド法により尿中のタンパク濃度を定量した。上記で検出したＩｇＡ−４Ｈ３認識抗原複合体の検出量（図５に示した値）を尿中タンパク濃度で除して、尿中の蛋白量あたりの複合体検出量を算出した結果を図７に示した。図７から、ＩｇＡ腎症患者９２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者５４例を有意に区別できることが分かる。
また、ＩｇＡ腎症患者９２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者５４例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図８に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は１５．０７であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者９２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者５４例の陽性率を求めた結果を表４に示す。表４から、ＩｇＡ腎症患者９２例中陽性７１例（７７．２％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例中陽性１４例（２５．９％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は７７．２％、特異度は７４．１％、診断効率は７６．０％であった。【００６８】
【表４】
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【００６９】
上記から、尿中に存在するヒトＩｇＡとヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原の複合体を検出することで、健康人と腎症患者を識別できることが分かる。
また、尿中に存在するヒトＩｇＡとヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原の複合体の尿蛋白濃度当りの検出量を測定することでＩｇＡ腎症とそれ以外の腎疾患を識別できることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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