(57)【要約】【課題】シランカップリング剤に使用できる新規な有機ケイ素化合物を提供する。【解決手段】下記式（１）：【化１】2013038901.tif 000016（式中、Ａ-は下記式（２）又は式（３）：【化２】2013038901.tif 000017を表し、Ｅは下記式（４）又は式（５）：【化３】2013038901.tif 000018を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に炭素原子数１乃至５のアルキル基を表し、Ｒ3は水素原子又はメチル基を表し、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立に炭素原子数１乃至５のアルキル基を表し、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立に１乃至５の整数を表し、ｑは１乃至３の整数を表す。）で表される有機ケイ素化合物。【選択図】なし
2013038901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2013038901.tif 000013
（式中、Ａ-は下記式（２）又は式（３）：
【化２】
2013038901.tif 000014
を表し、Ｅは下記式（４）又は式（５）：
【化３】
2013038901.tif 000015
を表し、前記式（４）及び式（５）中のカルボニル基はＲ3が結合している炭素原子と結合し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に炭素原子数１乃至５のアルキル基を表し、Ｒ3は水素原子又はメチル基を表し、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立に炭素原子数１乃至５のアルキル基を表し、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立に１乃至５の整数を表し、ｑは１乃至３の整数を表す。）
で表される有機ケイ素化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の有機ケイ素化合物、極性有機溶媒及び水を含むシランカップリング剤。
【請求項３】
さらに有機酸を含む請求項２に記載のシランカップリング剤。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のシランカップリング剤からなる生体物質又は細胞の付着抑制剤。
【請求項５】
前記細胞が生体を構成する体細胞、生体から分離された癌細胞、又は生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞である、請求項４に記載の付着抑制剤。
【請求項６】
前記細胞が血小板である請求項４に記載の付着抑制剤。
【請求項７】
請求項２又は請求項３に記載のシランカップリング剤を基材上に塗布しベークする工程、その後極性溶媒で前記基材を洗浄する工程、及び前記基材を乾燥させる工程を含むシランカップリング剤固定化方法。
【請求項８】
基材を請求項２又は請求項３に記載のシランカップリング剤中に浸漬する工程、その後極性溶媒で前記基材を洗浄する工程、及び前記基材を乾燥させる工程を含むシランカップリング剤固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリコン、ガラス等の無機物質、又はポリエチレン等の樹脂に対して表面処理を行うことにより、タンパク質等の生体物質、血小板等の細胞の付着を抑制可能な、一分子内に安定な正負両電荷を持つベタイン型又はスルホベタイン型有機ケイ素化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体系は、人工材料など外的なものと接触した場合、当該人工材料を異物として認識するため、時間の経過に伴い血栓形成、免疫反応、炎症反応など様々な異物反応が引き起こされる。そのため、人工臓器などの医療用器具を用いる場合、ヘパリンなどの抗血液凝固剤、免疫抑制剤のような薬剤を併用しなければならない。【０００３】
ところが、上記抗血液凝固剤等を使用した場合には、肝臓障害、アレルギー反応などの様々な副反応を生じるおそれがある。【０００４】
そこで、これらの課題を解決するために、生体膜と同じ両性型のリン脂質であるホスホリルコリンを高分子鎖の側鎖に有するポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（以下、本明細書ではＭＰＣポリマーという。）を用いた医療用材料が提案されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。【０００５】
また、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインの高分子量体（以下、本明細書ではＣＭＢポリマーという。）を用いた医療用材料が提案されている（例えば、特許文献３、特許文献４及び特許文献５参照）。【０００６】
ＭＰＣポリマー又はＣＭＢポリマーを材料表面に被覆することで、抗血液凝固剤を使用しない場合でも血液凝固を抑えることが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５４−６３０２５号公報
【特許文献２】特開２０００−２７９５１２号公報
【特許文献３】特開２００７−１３０１９４号公報
【特許文献４】特開２００８−２７４１５１号公報
【特許文献５】特開２０１０−５７７４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＭＰＣポリマー及びＣＭＢポリマーの合成、さらに当該ポリマーを含む溶液を作製するまでの工程に手間がかかるという問題がある。本発明の課題は、溶液を作製することにより、直接、基材の表面に被覆することが可能であり、しかも、従来のＭＰＣポリマー及びＣＭＢポリマーと同等の効果を示す非ポリマーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、タンパク質等の生体物質、血小板等の細胞を付着させない、一分子内に安定な正負両電荷を持つベタイン型又はスルホベタイン型有機ケイ素化合物を見出した。
すなわち、本発明の態様の一つは、下記式（１）：
【化１】
2013038901.tif 000003
（式中、Ａ-は下記式（２）又は式（３）：
【化２】
2013038901.tif 000004
を表し、Ｅは下記式（４）又は式（５）：
【化３】
2013038901.tif 000005
を表し、前記式（４）及び式（５）中のカルボニル基はＲ3が結合している炭素原子と結合し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に炭素原子数１乃至５のアルキル基を表し、Ｒ3は水素原子又はメチル基を表し、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立に炭素原子数１乃至５のアルキル基を表し、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立に１乃至５の整数を表し、ｑは１乃至３の整数を表す。）
で表される有機ケイ素化合物である。【００１０】
本発明の他の態様は、前記有機ケイ素化合物、極性有機溶媒及び水を含むシランカップリング剤（表面処理剤）である。【００１１】
さらに本発明の他の態様は、前記シランカップリング剤からなる生体物質又は細胞の付着抑制剤である。
また、本発明の他の態様は、前記シランカップリング剤を基材に塗布又は該シランカップリング剤中に基材を浸漬させる工程を含む、シランカップリング剤固定化方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の有機ケイ素化合物を含むシランカップリング剤（表面処理剤）を用いることにより、シリコン、ガラス等の無機物質又はポリエチレン等の樹脂（以下、本明細書では基材という。）の表面処理が可能で、その表面は、一分子内に安定な正負両電荷を持つベタイン又はスルホベタインで被覆される。そのため、ＭＰＣポリマー、ＣＭＢポリマーのようなポリマーを用いることなく、上記無機物質又は樹脂表面にタンパク質等の生体物質、血小板等の細胞を付着させないことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前記式（１）で表される有機珪素化合物は、例えばベタイン及びメルカプトシランを反応させることによって合成することができる。
前記式（１）で表される有機ケイ素化合物の原料であるベタインとしては、例えば、N−メタクリロイルオキシエチル−N，N−ジメチルアンモニウム−α−N−メチルカルボキシベタイン、N−メタクリロイルオキシエチル−N，N−ジメチルアンモニウム−α−N−プロピルスルホキシベタイン、N−メタクリロイルアミノプロピル−N，N−ジメチルアンモニウム−α−N−プロピルスルホキシベタインが好ましい。
【００１４】
また、前記式（１）で表される有機ケイ素化合物のもう一つの原料であるメルカプトシランとしては、例えば、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシラン及びメルカプトメチルトリメトキシシランが好ましい。
【００１５】
上記有機ケイ素化合物を基材である無機物質の表面処理に用いる場合、その無機物質には特に制限がない。例えば、シリコン、銅、鉄、アルミニウム、亜鉛またはそれらの合金、ガラス、シリカ、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、酸化マグネシウムが挙げられる。
【００１６】
上記有機ケイ素化合物を基材である樹脂の表面処理に用いる場合、その樹脂には特に制限がない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、ポリカーボネート、セルロース、セルロース誘導体が挙げられる。
【００１７】
上記有機ケイ素化合物は、医薬品、医薬部外品、医療用器具等の表面処理に用いることが可能である。前記医療用器具の例として、ドラッグデリバリーシステム材、成形補助材、包装材、人工血管、血液透析膜、カテーテル、ガードワイヤー、コンタクトレンズ、血液フィルター、血液保存パック、内視鏡、人工臓器、バイオチップ、細胞培養シート、糖鎖合成機器が挙げられるが、その医療用器具には特に制限がない。
【００１８】
本明細書における生体物質とは、生体を構成する基本材料であり、例えば、タンパク質、核酸、各種糖類、アミノ酸、ヌクレオシド、脂質、ビタミンが挙げられる。これらの生体物質の内、本発明の有機ケイ素化合物を含むシランカップリング剤（表面処理剤）を用いることにより付着が抑制される生体物質としては、タンパク質、核酸、各種糖類、アミノ酸、ヌクレオシド、脂質、ビタミンが挙げられ、好ましくはタンパク質、核酸、各種糖類が挙げられ、更に好ましくはタンパク質が挙げられる。
【００１９】
本明細書における細胞とは、生体を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子、卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、及び単核細胞が含まれる。上記体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。上記幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。上記前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。上記癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。上記細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏが含まれる。
【００２０】
これらの細胞の内、本発明の有機ケイ素化合物を含むシランカップリング剤（表面処理剤）を用いることにより付着が抑制される細胞としては、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞が挙げられ、好ましくは生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）が挙げられ、より好ましくは生体を構成する体細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）が挙げられ、さらに好ましくは生体を構成する体細胞が挙げられ、最も好ましくは血小板が挙げられる。
【００２１】
本発明の有機ケイ素化合物を含むシランカップリング剤（表面処理剤）は、生体物質、細胞の付着が効率よく抑制されるため、生体物質、細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞又は組織の分化、増殖を調節する因子を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞と当該細胞から得られる生体物質の数又は種類、細胞表面分化マーカー、発現遺伝子の変化を解析する。この際に本発明のシランカップリング剤を用いることにより生体物質、細胞の付着が抑えられるため、目的の生体物質、細胞を効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、シランカップリング剤の種類、その含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、当業者により適宜選択される。培養により増殖又は出現した細胞は、本発明に係る技術分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からＤＮＡ（デオキシリボ核酸）又はＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し、サザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。
【００２２】
本発明の有機ケイ素化合物を含むシランカップリング剤（表面処理剤）は、例えば、当該有機ケイ素化合物に水及びメタノール、エタノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル等の極性有機溶媒を加え０．００１質量％乃至２０質量％になるように希釈して、調製される。前記シランカップリング剤のｐＨを調整するために、さらに有機酸を添加してもよい。前記有機酸としては、例えば、酢酸、蟻酸、乳酸が挙げられる。
【００２３】
前記基材を、本発明のシランカップリング剤で表面処理する方法は特に限定されず、例えば、浸漬、塗布（スピンコート、スプレーコートなど）又は蒸着によって処理できる。
【００２４】
具体的には、本発明のシランカップリング剤を基材上に塗布しベークする工程、その後極性溶媒で前記基材を洗浄する工程、及び前記基材を乾燥させる工程を経てシランカップリング剤を固定化させる。あるいは、基材を前記シランカップリング剤中に浸漬する工程、その後極性溶媒で前記基材を洗浄する工程、及び前記基材を乾燥させる工程を経てシランカップリング剤を固定化させる。洗浄工程に使用する極性溶媒としては、例えば、前記シランカップリング剤に含まれる水又は極性有機溶媒を使用することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明に係る具体例を説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。なお、ＣＯ2インキュベーターにおけるＣＯ2の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ2の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチ社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（バイオロジカルインダストリーズ社製）を意味する。【００２６】
（合成例１）
【化４】
2013038901.tif 000006
マグネチックスターラーを備えた５００ｍｌ四ッ口フラスコに、化合物１  ２０．０３ｇ、（３−メルカプトプロピル）トリエトキシラン２２．１５ｇ、トリエチルアミン０．４８ｇ及びエタノール８０ｇを仕込み、室温下、２４時間攪拌した。反応液を濃縮乾燥し、化合物２を４０．５６ｇ得た（収率：９６％）。
【化５】
2013038901.tif 000007
【００２７】
（合成例２）
【化６】
2013038901.tif 000008
マグネチックスターラーを備えた３００ｍｌ四ッ口フラスコに、化合物３  １５．００ｇ、（３−メルカプトプロピル）トリエトキシラン１２．８１ｇ、トリエチルアミン１．０９ｇ、エタノール６０ｇ及びメタノール２０ｇを仕込み、室温下、２時間攪拌した。反応液を濃縮後、ヘキサン６０ｇを加え、析出した結晶をろ過乾燥し、化合物４を１３．８１ｇ得た（収率：５０％）。
【化７】
2013038901.tif 000009
【００２８】
（シランカップリング剤の調製１）
ＰＧＭＥ（プロピレングリコールモノメチルエーテル）／水＝９／１体積％濃度の溶媒に酢酸を加えて、ｐＨ４．０に調製した。その後、合成例１及び合成例２で得られた有機ケイ素化合物それぞれを、１質量％濃度となるように前記溶媒に溶解させ、シランカップリング剤を調製した。【００２９】
（実施例１）
合成例１で得られた化合物２を含むシランカップリング剤１０ｍｌ中にガラス基板（ＴＥＭＰＡＸ  Ｆｌｏａｔ〔登録商標〕、５０×５０ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を浸漬させ、４０℃で２４時間静置した。そのガラス基板を前記シランカップリング剤から取り出した後、ＰＧＭＥで洗浄し、風乾した。【００３０】
（実施例２）
合成例２で得られた化合物４を含むシランカップリング剤１０ｍｌ中に、実施例１で使用したガラス基板と同種のガラス基板を浸漬させ、４０℃で２４時間静置した。そのガラス基板を前記シランカップリング剤から取り出した後、ＰＧＭＥで洗浄し、風乾した。【００３１】
（実施例３）
合成例１で得られた化合物２を含むシランカップリング剤０．５ｍｌを、実施例１で使用したガラス基板と同種のガラス基板上にスピンコーターを用いて塗布し、ホットプレート上にて１００℃で１５分間ベークした。その後、ＰＧＭＥで洗浄し、風乾した。【００３２】
（実施例４）
合成例２で得られた化合物４を含むシランカップリング剤０．５ｍｌを、実施例１で使用したガラス基板と同種のガラス基板上にスピンコーターを用いて塗布し、ホットプレート上にて１００℃で１５分間ベークした。その後、ＰＧＭＥで洗浄し、風乾した。【００３３】
（比較例１）
実施例１で使用したガラス基板と同種のガラス基板をＰＧＭＥにて洗浄し、風乾した。【００３４】
（接触角測定）
実施例１乃至実施例４及び比較例１で処理した各ガラス基板の表面に対する接触角測定を、水及びジヨードメタンを用いて行った。接触角計（協和界面科学（株）製）を用いて液滴法にて測定し、θ／２法にて接触角を算出した。その結果を下記表１に示す。【００３５】
（蛍光タンパク質吸着実験）
蛍光標識されたウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社製）をリン酸生理食塩水（ＰＢＳ、ｐH７．４）に溶解させ、１００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液を調製した。このＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液０．５ｍｌを、実施例１乃至実施例４及び比較例１で処理した各ガラス基板の表面に添加し、３７℃で３０分間静置した。その後、前記各ガラス基板の表面からＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液を除き、溶媒として用いたＰＢＳにて洗浄し、風乾した。【００３６】
蛍光顕微鏡（オリンパス（株）製）を用いて４９０ｎｍの波長で１０秒励起し、５２０ｎｍの波長で蛍光測定を行い、蛍光強度にてＦＩＴＣ−ＢＳＡの吸着を確認した。その結果を下記表１に示す。
【表１】
2013038901.tif 000010
【００３７】
接触角測定の結果、実施例１乃至実施例４で処理した各ガラス基板は比較例１で処理したガラス基板（蛍光たんぱく質処理なし）に対して、水及びジヨードメタンに対する接触角の減少が見られた。このことから、化合物２を含むシランカップリング剤及び化合物４を含むシランカップリング剤は、ガラス基板上にコーティングされていることが考えられる。【００３８】
蛍光タンパク質の吸着実験の結果、比較例１で処理したガラス基板（蛍光タンパク質処理あり）の蛍光強度に対して、実施例１及び実施例２で処理した各ガラス基板の蛍光強度は低下し、比較例１で処理したガラス基板（蛍光タンパク質処理なし）と同等となった。この結果は、化合物２及び化合物４の正負両イオン性部位がガラス基板の表層に配置され、蛍光タンパク質の吸着を阻止したためと考えられる。実施例３及び実施例４で処理した各ガラス基板の蛍光強度もまた、比較例１で処理したガラス基板（蛍光タンパク質処理あり）の蛍光強度より低下し、蛍光タンパク質の吸着が抑えられた。【００３９】
（シランカップリング剤の調製２）
合成例１及び合成例２で得られた有機ケイ素化合物それぞれを、１０ｍＭ溶液となるように９９．５体積％エタノール（０．５体積％の水含有）に溶解させ、シランカップリング剤を調製した。【００４０】
（実施例５）
合成例１で得られた化合物２を含む１０ｍＭエタノール溶液１００ｍｌ中に、Ｏ2エッチングにて表面洗浄したガラス基板（ＴＥＭＰＡＸ  Ｆｌｏａｔ〔登録商標〕、Φ１２ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を浸漬させ、室温で４８時間静置した。そのガラス基板を前記の溶液から取り出した後、エタノールで洗浄し、風乾した。【００４１】
（実施例６）
合成例２で得られた化合物４を含む１０ｍＭエタノール溶液１００ｍｌ中に、実施例５で使用したガラス基板と同種のガラス基板を浸漬させ、室温で４８時間静置した。そのガラス基板を前記の溶液から取り出した後、エタノールで洗浄し、風乾した。【００４２】
（比較例２）
実施例５で使用したガラス基板と同種のガラス基板をプラスチックケース内に１週間保管した。【００４３】
（血小板溶液の調製）
３．８質量％クエン酸ナトリウム溶液０．５ｍｌに対して、健康なボランティアより採血した血液４．５ｍＬを混和した後、遠心分離にて［冷却遠心機５９００（（株）久保田製作所製）、１０００ｒｐｍ／１０分、室温］上層の多血小板血漿（ＰＲＰ）を回収した。引き続き、下層について遠心分離を行い（上記遠心機、３５００ｒｐｍ／１０分、室温）、上層の乏血小板血漿（ＰＰＰ）を回収した。多項目自動赤血球分析装置（ＸＴ−２０００ｉ、シスメックス（株）製）にてＰＲＰの血小板数を計測後、ＰＰＰを用いてＰＲＰの血小板濃度が３０×１０4ｃｅｌｌｓ／μＬになるように調製した。【００４４】
（血小板付着実験）
２４穴平底マイクロプレート（コーニング社製）に実施例５、実施例６及び比較例２で処理した各ガラス基板を配置し、上記血小板濃度に調製したＰＲＰ溶液３００μＬを添加した。５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で９０分間ＣＯ2インキュベーター内にて静置した。プレート内のＰＲＰを除いた後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３ｍＬにて５回洗浄した。その後、２．５体積％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液２ｍＬを添加し、４℃で一昼夜静置後、グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液を除き、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）３ｍＬで５回洗浄した。さらに、７０％エタノール水（ｖ／ｖ）１ｍＬで３回洗浄し、風乾した。この実験を２回行った（Ｒｕｎ−１、Ｒｕｎ−２）。【００４５】
（電子顕微鏡観察）
上記血小板付着実験を行った実施例５、実施例６及び比較例２で処理した各ガラス基板に、イオンスパッター（Ｅ−１０３０、（株）日立ハイテクノロジーズ製）にてＰｔ−Ｐｄを１分間蒸着した。その後、電子顕微鏡（Ｓ−４８００、（株）日立ハイテクノロジーズ製）にて血小板の付着を１，０００倍で観察した。【００４６】
電子顕微鏡にてガラス基板内５箇所の血小板付着数を計測した。各箇所の計測値を平均することで、Ｒｕｎ−１又はＲｕｎ−２の血小板付着数とした。さらに、Ｒｕｎ−１とＲｕｎ−２の血小板付着数を平均することで、実施例５、実施例６及び比較例２で処理した各ガラス基板の血小板の付着性を比較した。その結果を下記表２に示す。
【表２】
2013038901.tif 000011
【００４７】
血小板付着実験の結果、比較例２で処理したガラス基板では付着物が多く、血小板付着数の計測が困難であった。一方、実施例５及び実施例６で処理した各ガラス基板では、血小板付着数が計測可能で、比較例２で処理したガラス基板より明らかに付着物が少なかった。【００４８】
（細胞の調製）
細胞は、ヒト胎児腎細胞株Ｈｅｋ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ヒト胎児肺細胞株ＭＲＣ５（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。それらの細胞の培養に用いた培地は、ＨｅＬａ、Ｈｅｋ２９３及びＭＲＣ５：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）、ＨｅｐＧ２：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）、ＣＨＯ：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマアルドリッチ社製）を用いた。細胞は、３７℃ＣＯ2インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍｌで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液 (インビトロジェン社製)１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにて懸濁した。本懸濁液を遠心分離（上記血小板溶液の調製で用いた遠心機、１５００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。【００４９】
（細胞付着実験）
２４穴平底マイクロプレート（コーニング社製）に実施例５、実施例６及び比較例２で処理した各ガラス基板を配置し、調製した上記細胞懸濁液を２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各１ｍＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で２４時間ＣＯ2インキュベーター内にて静置した。【００５０】
（細胞付着数計測）
２４時間後、上記細胞付着実験を行った実施例５、実施例６及び比較例２で処理した各ガラス基板を別の２４穴平底マイクロプレートに移し、ＰＢＳ１ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを除いた後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液 (インビトロジェン社製)５００μＬを添加した。５分〜１０分後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）を５００μＬ添加し、剥がれた細胞を１．５ｍＬマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移した。遠心分離（（株）トミー精工製、型番：ＭＸ−３０７、１５００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）１００μＬを添加して細胞懸濁液を調製した。本懸濁液にトリパンブルー染色液を等量添加後、血球計測板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞数（細胞付着数）を計測した。【００５１】
培養２４時間後、実施例５、実施例６及び比較例２で処理した各ガラス基板に対する細胞の付着数を比較した。その結果を下記表３に示す。表３中、“−”は細胞付着数の計測困難を表す。
【表３】
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【００５２】
細胞付着実験の結果、培養２４時間後、比較例２で処理したガラス基板に対して、実施例５及び実施例６で処理した各ガラス基板では、いずれの細胞の場合も細胞の付着数が低下した。
【国際調査報告】
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