(57)【要約】  紫外線照射の弊害、残存モノマーや未反応官能基による毒性等の問題のない生体適合性に優れたコラーゲン架橋剤を提供することを目的とする。  末端に２個以上のＯＨ基を有する多価アルコールからなるスペーサーおよび、該ＯＨ基を介して、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、（繊維状タンパク質コラーゲンの）非共有結合型コラーゲン架橋剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端に２個以上のＯＨ基を有する多価アルコールからなるスペーサーおよび、該ＯＨ基を介して、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項２】
金粒子からなるスペーサーおよび、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドまたはコラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項３】
多価アルコールが、ＯＨ基を３〜１６個有する、請求項１に記載の非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項４】
多価アルコールが、ＯＨ基を４個有する、請求項１に記載の非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項５】
多価アルコールが、ペンタエリトリトールテトラポリエチレングリコールエーテルの４価アルコール、またはヘキサグリセロールオクタポリエチレングリコールエーテルの８価アルコールである、請求項１に記載の非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項６】
アームが、下記一般式（Ｉ）：
（Ｙ−Ｘ−Ｇ）ｎ    （Ｉ）
（式中，Ｇはグリシン（Ｇｌｙ）残基を表す：ＸおよびＹは、それぞれ独立してアラニン（Ａｌａ）残基（Ａ）、プロリン（Ｐｒｏ）残基（Ｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基（Ｏ）等のアミノ酸残基を表す；ｎは１〜５０の整数である）
で表される、請求項１に記載の非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項７】
アームが(Ｐ−Ｏ−Ｇ)である、請求項６に記載の非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【請求項８】
請求項５に記載の多価アルコールからなるスペーサーに請求項７記載のアームが結合した、請求項１に記載の非共有結合型コラーゲン架橋剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
コラーゲン架橋剤、非共有結合型コラーゲン架橋剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
円錐角膜は、角膜実質層が薄くなり中央部分が突出する疾患である。原因は解明されておらず、現状ではコンタクトレンズにより突出を抑えるか、角膜移植しか治療法がない。【０００３】
円錐角膜の治療に関する研究例として、リボフラビン（ビタミンＢ２）を点眼し、紫外線を照射することで角膜実質のコラーゲンを架橋させる手法が報告されている（非特許文献１など）。しかし、円錐角膜の進行を完全に止めることは難しく、また紫外線照射の弊害が問題である。【０００４】
コラーゲンを化学結合することに架橋させる架橋剤が知られている。例えば、国内では、Matsudaらの光反応性ゼラチンーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジアクリレート架橋剤（非特許文献２）やTaguchiらのスクシイミド化クエン酸架橋剤（非特許文献３）、Murakamiらのアルデヒド基を有する高分子ミセル（非特許文献４）、国外ではWallanceらのスクシイミド化ＰＥＧ（非特許文献５）などが知られている。しかしながら、残存モノマーや未反応官能基による毒性が懸念され、安全性に問題がある。【０００５】
【非特許文献１】T. Seiler et al., Am.J.Ophthalmol., 135, 620(2003)
【非特許文献２】J. Biomed. Mater. Res. 1999
【非特許文献３】Mater. Sci. Eng. C2004
【非特許文献４】J. Biomed. Mater. Res. 2007
【非特許文献５】J. Biomed. Mater. Res. 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、紫外線照射の弊害、残存モノマーや未反応官能基による毒性等の問題のない生体適合性に優れたコラーゲン架橋剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、末端に２個以上のＯＨ基を有する多価アルコールからなるスペーサーおよび、該ＯＨ基を介して、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の架橋剤は生体適合性に優れており、架橋の駆動力が三重らせん形成にある。そのため紫外線照射が必要なく、本発明の架橋剤を生体に適合しても紫外線照射による副作用の心配がない。また、従来の化学架橋型の架橋剤で問題となっているモノマー、反応性官能基の残存による毒性発現の心配が無い。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の架橋剤とコラーゲンとのＣＤスペクトルにおける［θ］２２５ｎｍの時間経過による変化を示すグラフ。
【図２】本発明の架橋剤とコラーゲンで形成されたゲルの動的粘弾性を示すグラフ。
【図３Ａ】コラーゲンディスクゲル（モデル角膜）に本発明の架橋剤水溶液を添加して架橋した時の破断強度を示すグラフ。
【図３Ｂ】コラーゲンディスクゲル（モデル角膜）に比較として当量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のみを添加した時の破断強度を示すグラフ。
【図３Ｃ】本発明の架橋剤を添加した時としない時のコラーゲンディスクゲルの破断強度（３回の平均）を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のコラーゲン架橋剤は、スペーサーおよび該スペーサーから伸びるアームから構成されている。【００１１】
スペーサーは、アーム間の距離を制御し、かつ親水性の付与の役割を担うもので、後述するアームを結合するための土台のようなものである。具体的には末端に２個以上のＯＨ基を有する多分岐型多価アルコールである。【００１２】
ＯＨ基は末端に２個以上有すればよい。「末端」としたのは、分岐鎖末端以外の箇所にＯＨ基を有していてもよいが、そのようなＯＨ基は本発明に規定するＯＨ基の数に含めないという意味である。末端ＯＨに限定した趣旨はアーム間の距離を制御する観点からである。【００１３】
ＯＨ基の数の上限は特に限定されないが、溶解性やアームの立体反発の観点から、ＯＨ基を２〜５１２、好ましくは３〜１６、より好ましくは４〜１６、さらにより好ましくは４〜８、特に４有する多価アルコールである。【００１４】
末端に２個以上のＯＨ基を有する多価アルコールの具体例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジエチレングリコール、エリトリトール、トレイトール、リビトール、キシリトール、マンニトール、カテコール、カテキン、ビスフェノールＡ等の２価アルコール、グリセロール、トリヒドロキシベンゼン等の３価アルコール、ペンタエリトリトール、ジグリセリン、ペンタエリトリトールポリエチレングリコールエーテル、例えばペンタエリトリトールテトラポリエチレングリコールエーテル等の４価アルコール、ジペンタエリトリトール、イノシトール等の６価アルコール、ヘキサグリセロールポリエチレングリコールエーテル、例えばヘキサグリセロールオクタポリエチレングリコールエーテル等の８価アルコール、ヒドロキシル化ポリアミドアミンデンドリマー（世代数＝２）等の１６価アルコール、ヒドロキシル化ポリアミドアミンデンドリマー（世代数＝３）等の３２価アルコール、ヒドロキシル化ポリアミドアミンデンドリマー（世代数＝４）等の６４価アルコール、ヒドロキシル化ポリアミドアミンデンドリマー（世代数＝５）等の１２８価アルコール、ヒドロキシル化ポリアミドアミンデンドリマー（世代数＝６）等の２５６価アルコール、ヒドロキシル化ポリアミドアミンデンドリマー（世代数＝７）等の５１２価アルコール、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖、二糖、それらのオリゴ糖および多糖類を挙げることができる。【００１５】
上記多価アルコールのＯＨはさらに生体安全性の観点からポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド等のアルキレングリコールまたはポリアルキレンオキシド等で鎖延長し、その延長鎖の末端にＯＨを存在させるようにすればよい（以下、鎖延長されたアルコールを「鎖延長多価アルコール」ということがあるが、本発明ではこのような鎖延長多価アルコールを含め「多価アルコール」というものとする）。【００１６】
上記多価アルコールは架橋の観点から、１ｍｌの溶液に多価アルコールが０．１〜５００ｍｇ（０．０１〜５０ｗｔ％）程度溶解可能な程度であればよい。高分子量の多価アルコールであっても上記条件を満たす限りその分子量は限定されない。【００１７】
多価アルコールの中で、生体安全性を高める観点から、生体成分や生体適合性に優れている化合物あるいは成分を多く含む多価アルコールを使用することが好ましい。【００１８】
該多価アルコールはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、エリトリトール、トレイトール、リビトール、キシリトール、マンニトール、カテコール、カテキン等の２価アルコール、グリセロール等の３価アルコール、ペンタエリトリトール、ジグリセリン、ペンタエリトリトールポリエチレングリコールエーテル等の４価アルコール、ジペンタエリトリトール、イノシトール等の６価アルコール、ヘキサグリセロールポリエチレングリコールエーテル等の８価アルコール、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖、二糖、それらのオリゴ糖および多糖類である。【００１９】
本発明に用いる多価アルコールの中で好ましいものは、末端ＯＨの数、親水性、生体安全性の観点から選ぶようにすればよいが、アームの立体反発、アーム間の距離等を考慮して適宜選定されるべきものである。ただ、十分な力学強度を有するコラーゲンゲルを得るためには３アーム以上有することが好ましいので、多価アルコールは３価以上のアルコールを使用することが好ましい。【００２０】
上記多価アルコールは、市場で入手可能なものばかりであり、また当業者であれば合成も可能なものである。【００２１】
アームは、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドまたはコラーゲンモデルペプチドからなるものである。コラーゲンモデルペプチドとは、コラーゲンペプチドに類似したアミノ酸の繰り返しで構成されるペプチドをいう。アームが、コラーゲン分子と３重らせんを形成し、コラーゲン分子同士を架橋する。アームはアミノ酸で構成されているので、生体適合性に優れているといえる。【００２２】
アームはペプチド結合で結合した下記一般式（Ｉ）で表される。
（Ｙ−Ｘ−Ｇ）ｎ    （Ｉ）
式中，Ｇはグリシン（Ｇｌｙ）残基を表す。ＸおよびＹは、それぞれ独立してアラニン（Ａｌａ）残基（Ａ）、プロリン（Ｐｒｏ）残基（Ｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基（Ｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）残基（Ｇ）等のアミノ酸残基を表す。好ましくは、アラニン（Ａｌａ）残基（Ａ）、プロリン（Ｐｒｏ）残基（Ｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基（Ｏ）、特に好ましくはプロリン（Ｐｒｏ）残基（Ｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基（Ｏ）である。ＸおよびＹは、メチル基、イソブチル基、フッ素原子で化学修飾されていてもよく、そのような基としてＮ-イソブチルグリシン、Ｎ−メチルアラニン、４−フルオロプロリン等が例示できる。ｎは１〜５０、好ましくは５〜２０の整数である。【００２３】
好ましい（Ｙ−Ｘ−Ｇ）は、（Ｐ−Ｏ−Ｇ）、（Ｐ−Ｐ−Ｇ）、（Ｐ−Ａ−Ｇ）、（Ｐ−Ｎ-イソブチルグリシン（Ｎｌｅｕ）−Ｇ）、（Ｐ−Ｎ-メチルアラニン（ｍｅＡ）−Ｇ）、（Ｐ−フルオロプロリン（Ｆｌｐ）−Ｇ）であり、より好ましくは、（Ｐ−Ｏ−Ｇ）、（Ｐ−Ｐ−Ｇ）、（Ｐ−Ａ−Ｇ）であり、３重らせんの安定性の観点から（Ｐ−Ｏ−Ｇ）である。【００２４】
上記式で表されるアームは、ペプチド液相合成法、ペプチド固相合成法、遺伝子工学法等の方法により当業者であれば合成することができる。例えば、（Ｐ−Ｏ−Ｇ）１０は、ペプチド固相合成法により合成することができる。また、（Ｐ−Ｏ−Ｇ）１０は商品名(Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ)１０・２０Ｈ２Ｏとして（株式会社ペプチド研究所）から入手可能である。【００２５】
アームはスペーサーに結合される。結合の態様はアームのカルボキシル基（ＣＯＯＨ）末端を利用するか、アミノ基（＞ＮＨ又はＮＨ２）末端を利用するかで異なる。【００２６】
アームのカルボキシル基末端を利用する場合は、アームとスペーサーは、該カルボキシル基（ＣＯＯＨ）とスペーサーのＯＨ基とのエステル結合を介して結合させることが可能である。このようなエステル結合合成反応は、通常使用されている方法、例えばカルボキシル基の活性エステル化法や縮合剤等の方法を適用すればよい。【００２７】
アームのアミノ基末端を利用する場合は、アームのアミノ基とスペーサーのヒドロキシル基とを直接反応させて結合を形成することが困難なため、スペーサーの末端を化学修飾することでＮーヒドロキシスクシンイミドエステル化し、これを利用したカップリング法によるアミド結合合成反応を利用してアームとスペーサーを結合させるとよい。その他にもスペーサーの末端ＯＨ基をメシル化、トシル化、パラニトロフェニルエステル化することで、アームとスペーサーを結合させることが可能である。【００２８】
スペーサーの有する全てのＯＨをアームで結合する必要はなく、少なくとも２つのスペーサーの末端ＯＨをアームと結合させればよい。スペーサーとアームの結合の数が多いほどコラーゲン分子同士を架橋結合させる架橋点が多くなる。用途、必要とされる架橋の強さ等によりスペーサーに結合させるアームの数は適宜調整すればよい。【００２９】
スペーサーとしては市販品も使用可能である。例えば２価アルコールからなるスペーサーとしては日油株式会社よりSUNBRIGHT DEシリーズとして入手可能な２−アーム型（２−arm type）のポリエチレングリコール（２−ａｒｍ−ＰＥＧ）（分子量（ＭＷ）３０００〜２００００）、日油株式会社よりSUNBRIGHT PTEシリーズとして入手可能な４−アーム型（４−arm type）のポリエチレングリコール（４−ａｒｍ−ＰＥＧ）（分子量（ＭＷ）１００００〜２００００）、日油株式会社よりSUNBRIGHT HGEOシリーズとして入手可能な８−アーム型（８−arm type）のポリエチレングリコール（８−ａｒｍ−ＰＥＧ）（分子量（ＭＷ）２００００）を使用することができる。上記シリーズは多価アルコールがすでにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化されているものである。その他にも市場で入手可能な末端スクシイミドエステル化分岐ポリエチレングリコール等も本発明架橋剤のスペーサーとして使用可能である。【００３０】
スペーサーとして金粒子等の粒子を使用することが可能である。金粒子を使用する場合、一般式（Ｉ）におけるＹ末端は、−ＳＨ結合を有するアミノ酸、例えばシステイン残基を結合させるようにする。金（Ａｕ）との間でＡｕ−Ｓ−結合を形成し、スペーサーとアームを結合させることができるからである。他の粒子(例えば、表面にカルボキシル基を有するポリスチレン粒子）の場合、粒子との間で結合を形成する官能基を有するアミノ酸(該ポリスチレン粒子の場合、リシン）をＹ末端に用いればよい。粒子の大きさは１〜１００ｎｍ程度の小さな粒子が好ましい。粒径は小さいほど好ましいが、粒径が１００ｎｍより大きくなると、コラーゲン線維の線維径よりも大きくなる場合があり、コラーゲン線維同士の接近を阻害する問題が生じる。【００３１】
金粒子にアームを結合させるには、室温でのインキュベーション等の方法により可能である。【００３２】
本発明のコラーゲン架橋剤は、コラーゲン水溶液に添加することにより、コラーゲン架橋剤とコラーゲン分子との三重らせん形成を駆動力として、架橋を形成する。その架橋は非共有結合型の結合によりコラーゲン分子が架橋されている。【００３３】
コラーゲン架橋剤とコラーゲン分子とが三重らせんを形成したことは、円偏光二色性スペクトル（ＣＤスペクトル）、混合によるコラーゲンゲルの形成により確認することができる。【００３４】
本発明のコラーゲン架橋剤が適用可能なコラーゲンは、特に限定されず、皮膚、靱帯、腱、骨、軟骨、角膜、血管、基底層、内部器官などを構成するタンパク質のひとつで、多細胞動物の細胞外基質（細胞外マトリクス）の主成分として知られているもの、また、酸、アルカリ、酵素等で化学処理したコラーゲン、または化学修飾したコラーゲン、合成コラーゲンであってもよい。それらのコラーゲンの中でも、本発明のコラーゲン架橋剤は、繊維状タンパク質コラーゲンに有用に使用できるものである。【００３５】
本発明のコラーゲン架橋剤とコラーゲンとの使用方法は、両者の水溶液を混合すればよく、両者の混合割合は、使用目的等により適宜選定すればよいが、ゲルの強度の観点からは、１／１００〜１／１、好ましくは１／１０〜１／２(重量比）で使用すればよい。【００３６】
本発明のコラーゲン架橋剤は生体適合性成分で構成できるので、例えば、角膜を構成するコラーゲンの架橋が弱くなり、角膜が薄くなって前にでてくる病気である円錐角膜という病気の治療への適用可能性がある。
【実施例】
【００３７】
実施例１
４−アーム(ａｒｍ)−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０の合成
スクシイミドエステル化４−ａｒｍ−ＰＥＧ(ＮＨＳ)と(ＰＯＧ)１０(ＣＭＰ)を、下記表に示した量、モル比で、炭酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ：８．２）６ｍｌ中で縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）と助剤である１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の共存下で２４時間縮合反応させることで４−ａｒｍ−ＰＥＧの末端に（ＰＯＧ）１０を導入した（下記反応式参照）。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定より(ＰＯＧ)１０の導入率を算出した結果、およそ８０％のＰＯＧ鎖の導入が確認された。収率は８０％以上であり、定量的に反応が進行したことが明らかとなった。【００３８】
なお、使用したスクシイミドエステル化４−ａｒｍ−ＰＥＧは、製品名SUNBRIGHT PTE-100GS（ＭＷ：１００００、日油株式会社製）を使用した。
（ＰＯＧ）１０は（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１０を意味し、製品名(Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ)１０・２０Ｈ２Ｏ（渡辺化学工業株式会社製）を使用した。【００３９】
【化１】
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【００４０】
【表１】
2009136599.tif 000004
【００４１】
実施例２
２−アーム(ａｒｍ)−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０の合成
８．２μｍｏｌのスクシイミドエステル化２−ａｒｍ−ＰＥＧ(ＮＨＳ)と１６．４μｍｏｌの(ＰＯＧ)１０(ＣＭＰ)を炭酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ：８．２）６ｍｌ中、３２．８μｍｏｌのＷＳＣとＨＯＢｔの共存下で２４時間縮合反応させることで２−ａｒｍ−ＰＥＧの末端に（ＰＯＧ）１０を導入した。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定より（ＰＯＧ）１０の導入率を算出した結果、およそ８０％のＰＯＧ鎖の導入が確認された。収率は９０％以上であり、定量的に反応が進行したことが明らかとなった。【００４２】
実施例３
８−アーム(ａｒｍ)−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０の合成
２．１μｍｏｌのスクシイミドエステル化８−ａｒｍ−ＰＥＧ(ＮＨＳ)と１６．４μｍｏｌの(ＰＯＧ)１０(ＣＭＰ)を炭酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ：８．２）６ｍｌ中、３２．８μｍｏｌのＷＳＣとＨＯＢｔの共存下で２４時間縮合反応させることで８−ａｒｍ−ＰＥＧの末端に（ＰＯＧ)１０を導入した。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定より（ＰＯＧ)１０の導入率を算出した結果、およそ８０％のＰＯＧ鎖の導入が確認された。収率は９０％であり、定量的に反応が進行したことが明らかとなった。【００４３】
４−ａｒｍ−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０の三重らせん形成の確認
得られた４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０（表１のランＮｏ．２）の２．２ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ：８．２）溶液に溶解し、炭酸ナトリウムバッファーを用いて１００倍希釈することで２２μｇ／ｍｌの溶液を調整した。この濃度は、溶液中の(ＰＯＧ)１０の濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように設定したものである。温度２５℃でＣＤスペクトルを測定したところ、２２５ｎｍに正のピークが確認された。これは三重らせんに起因するもので、４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０の三重らせん形成が確認された。【００４４】
４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０とコラーゲンとの三重らせん形成の確認
１０ｍｇのブタ皮膚由来I型アテロコラーゲン（日本ハム株式会社製）を１ｍｌの５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ：８．２）溶液に溶解し、炭酸ナトリウムバッファーを用いて１０００倍希釈することで１０μｇ／ｍｌの溶液を調整した。上記手法で調整した２２μｇ／ｍｌの４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０（表１中のランＮｏ．２）溶液とコラーゲン溶液を等量混合し、ＣＤスペクトル（［θ］２２５ｎｍ）およびその変化（［θ］２２５ｎｍ）を観測した。結果を図１に示す。【００４５】
図１は、架橋剤とコラーゲンとの混合後の［θ］２２５ｎｍ（温度２５℃）の経時変化を示している。図１には参照データとして、上記で使用した４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０のみ、コラーゲンのみで測定したデータを併せて記載した。【００４６】
図１から、コラーゲンへ４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０を添加することでθ２２５の増加が観察されたため、コラーゲンと架橋剤との三重らせん形成がなされていることがわかる。【００４７】
コラーゲンゲル化能
４−ａｒｍ−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０（表１中のランＮｏ．２）を２０ｗｔ％の濃度で酢酸緩衝液に溶解させた溶液１ｍｌを、ブタＩ型コラーゲン１０ｗｔ％水溶液０．１ｍｌと混合してコラーゲン／酢酸緩衝液にしたところ、１分以内にゲルが形成された。【００４８】
実施例２，実施例３で調製した２−アーム(ａｒｍ)−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０、８−アーム(ａｒｍ)−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０を用いて、上記と同様にコラーゲンと混合したところ、ゲルが形成された。【００４９】
このようにゲルが形成されたことは、２，４または８−ａｒｍ−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０がコラーゲン分子と３重らせんを形成し、コラーゲン分子同士を架橋することを示しているものである。【００５０】
得られたゲルは安定であり、透明であったことから、円錐角膜治療として眼科領域へ応用可能であると期待される。【００５１】
動的粘弾性
上記コラーゲンゲル化能で得られた２，４または８−ａｒｍ−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０とのコラーゲンゲルの動的粘弾性を測定した。測定は、試料面を完全に覆うようにゲルをのせ、加圧面をゲル表面から０．５ｍｍの高さに設置した後に測定を開始することにより、貯蔵弾性率および損失弾性率を測定した。結果を、図２に示す。【００５２】
貯蔵弾性率が損失弾性率より高い値であったことから、２，４または８−ａｒｍ−ＰＥＧ(ＰＯＧ)１０すべてにおいてゲルの形成が確認された。この結果からも、２，４または８−ａｒｍ−ＰＥＧ−(ＰＯＧ)１０がコラーゲン分子と３重らせんを形成し、コラーゲン分子同士を架橋していることが示唆された。【００５３】
実施例４
本発明の架橋剤によるコラーゲンゲルの架橋効果の確認
１００ｍｇのブタ皮膚由来Ｉ型アテロコラーゲン（日本ハム株式会社製）を１ｍｌの酢酸緩衝液に溶解させた。４ｍｇのＷＳＣと２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシイミド（ＮＨＳ）を溶解した１００μｌの酢酸緩衝液と混合した後、ガラス板表面に滴下し、厚さ３００μｍのシリコンラバーをスペーサーとして四方を囲み、別のガラス板で挟み、２５℃で２４時間反応することでコラーゲンゲルを得た。【００５４】
得られたゲルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に一晩浸漬することで洗浄した。その後、直径１．６ｃｍのポンチで打ち抜くことで、直径１．６ｃｍ、厚さ３００μｍのコラーゲンディスクゲルを作製した。４−ａｒｍ−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０（表１のランＮｏ．２）の２０ｍｇを１００μｌのＰＢＳに溶解し、ディスクゲルの表面に滴下し、４℃で１２時間インキュベートした。インキュベート後にＰＢＳに浸漬することで洗浄し、ＥＺtest小型卓上試験機（島津株式会社製）を用いて突き刺し試験による破断強度を測定した。結果を図３Ａに示す。【００５５】
図３Ｂは、架橋剤の代わりにＰＢＳのみを１００μｌ滴下して同条件でインキュベートした後の破断強度の結果を示している。図３Ｃは３回平均の破断強度を棒グラフで示したものである。【００５６】
架橋剤を滴下することで破断強度が増加することが確認された。生体角膜の実質層はＩ型コラーゲンで構成されており、実質層が薄くなって弱くなることで円錐角膜などの疾患が生じることが知られている。本発明の架橋剤を点眼することで角膜実質層が補強されると考えられるため、角膜実質疾患への治療効果が期待される。【００５７】
実施例５
家兎強角膜片への架橋剤の吸着
４−arm−ＰＥＧ−（ＰＯＧ）１０（表１のランＮｏ．２）に蛍光ラベル化剤であるAlexa488（インビトロジェン株式会社製）をＷＳＣとＮＨＳを用いた縮合反応により結合することで、蛍光ラベル化架橋剤を合成した。１ｍｇの架橋剤を１ｍｌのＰＢＳに溶解し、家兎強角膜片に滴下後、常温で２４時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後にヘキストで細胞核を染色し、蛍光顕微鏡にて観察したところ、角膜実質層の一面に強い蛍光が観察されたため、蛍光ラベル化架橋剤が角膜片に吸着していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の架橋剤は生体架橋剤、特にコラーゲン架橋剤として有用であり、本発明の架橋剤は、上記特性を利用して、コラーゲン溶液のゲル化、コラーゲンゲルのゲル強度補強に使用可能である。本発明の架橋剤は、さらには、例えば円錐角膜の治療への適用可能性がある。眼科領域だけでなく、組織接着剤としての応用も可能であるため、外科手術全般で用いられる可能性を秘めており、大きな経済効果、波及効果が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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