(57)【要約】  破骨細胞で強く発現する遺伝子にコードされる蛋白質を標的とした骨代謝異常治療及び／又は予防用医薬組成物を提供すること。  ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５を特異的に認識し、破骨細胞の形成を抑制する活性を有する抗体を含む医薬組成物の提供等。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１乃至３個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の１乃至１０９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項４】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至３に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項５】
ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１乃至３に記載の抗体。
【請求項６】
キメラ抗体であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項６に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項８】
ヒト化されていることを特徴とする、請求項１、２又は４記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項９】
重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、請求項６又は８に記載の抗体。
【請求項１０】
破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）  配列番号１２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）  配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）  配列番号１６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）  配列番号１８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）  配列番号２０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）  配列番号２２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）  配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ８）  配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ９）  配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１０）  配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）  配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）  配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）  配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）  配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５）  配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ６）  配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１７】
配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１８】
配列番号１４のアミノ酸配列に示される２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１９】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２０】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２１】
配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２２】
配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２３】
配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項２４】
配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２５】
請求項１１乃至２４のいずれか一つに記載の抗体において、カルボキシル基末端側の１乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体。
【請求項２６】
請求項１乃至２５に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２７】
骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１乃至２５に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項２９】
骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１乃至２５に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は請求項２７若しくは２８に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
【請求項３４】
請求項１乃至２５に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は請求項２７に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後してして投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
【請求項３５】
骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項３３又は３４に記載の治療及び／又は予防方法。
【請求項３６】
骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項３５に記載の治療及び／又は予防方法。
【請求項３７】
骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項３６に記載の治療及び／又は予防方法。
【請求項３８】
請求項１乃至２５のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３８に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１乃至３６３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１乃至３２７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３８に記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）  配列番号１１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）  配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）  配列番号１５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）  配列番号１７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５）  配列番号１９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６）  配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７）  配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８）  配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ９）  配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１０）  配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ１４）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）  配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）  配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）  配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）  配列番号２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）  配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６）  配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ１０）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５４】
配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項３８乃至５５に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５７】
請求項３８乃至５５に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
【請求項５８】
請求項５６に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
【請求項５９】
請求項５７又は５８に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項１乃至２５のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝異常の治療及び／又は予防薬として有用な物質、並びに骨代謝異常の治療及び／又は予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、自らの形態変化や血中カルシウム濃度の維持のために、常に形成と吸収を繰り返して再構築を行う動的な器官として知られている。正常な骨では骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とは平衡関係にあり、骨量は一定に保たれている。一方、骨形成と骨吸収との平衡関係が崩れると、骨粗鬆症などの骨代謝異常になる（例えば、非特許文献１及び２を参照）。【０００３】
骨代謝を調節する因子としては、全身性のホルモンや局所性のサイトカインが数多く報告されており、それらの因子の共同作用により骨の形成と維持が営まれている（例えば、非特許文献１及び３を参照）。加齢による骨組織の変化としては、骨粗鬆症の発症が広く知られているが、その発症機構は性ホルモンの分泌低下やそのレセプター異常、骨局所におけるサイトカイン発現の変動、老化遺伝子の発現、破骨細胞や骨芽細胞の分化あるいは機能不全など多岐にわたっており、加齢による単純な生理現象として理解するのは困難である。原発性骨粗鬆症はエストロゲンの分泌低下による閉経後骨粗鬆症と加齢による老人性骨粗鬆症に大別されているが、その発症機構の解明と治療薬開発の為には、骨吸収と骨形成の調節機構についての基礎的研究の進展が必須である。【０００４】
破骨細胞は、造血幹細胞に由来する多核の細胞であり、骨との接着面に塩素イオンと水素イオンを放出することによって、細胞と骨の接着面の間隙を酸性化すると共に酸性プロテアーゼであるカテプシンＫなどを分泌する（例えば、非特許文献４を参照）。この結果、リン酸カルシウムの分解、酸性プロテアーゼの活性化と骨基質蛋白質の分解が引き起こされ、骨吸収が進行する。【０００５】
破骨細胞の前駆細胞は骨表面の骨芽細胞／ストローマ細胞の細胞膜上に発現するＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）の刺激を受けて、破骨細胞へ分化することが明らかにされた（例えば、非特許文献５及び６を参照）。ＲＡＮＫＬは骨芽細胞／ストローマ細胞が産生する膜蛋白質であり、その発現は骨吸収因子により調節されること、及びＲＡＮＫＬは破骨細胞前駆細胞から成熟多核破骨細胞への分化を誘導することなどが明らかにされた（例えば、非特許文献５及び７を参照）。さらに、ＲＡＮＫＬをノックアウトしたマウスが、大理石骨病様の病態を発症することが見出され、ＲＡＮＫＬが生理的な破骨細胞分化誘導因子であることが証明された（例えば、非特許文献８を参照）。【０００６】
骨代謝疾患の治療や治療期間の短縮を図る医薬品として、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、ＰＴＨ及びカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらの薬剤は、治療結果において必ずしも満足できるものではなく、より治療効果の高い薬剤の開発が望まれていた。【０００７】
免疫系細胞の細胞膜上はシアル酸含有糖鎖などの多様な糖鎖によって高度に覆われており、様々な糖鎖結合蛋白質によって認識されている。シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉａｌｉｃ−ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｌｅｃｔｉｎｓ、以下、「Ｓｉｇｌｅｃｓ」という。）は、シアル酸含有糖鎖を認識して結合するＩ型膜蛋白質ファミリーである。Ｓｉｇｌｅｃｓは免疫系細胞の細胞膜上で多く発現しており、同じく免疫系細胞の細胞膜上に存在するシアル酸を認識して細胞間相互作用や細胞機能を調節し、免疫応答に関与していると考えられている（例えば、非特許文献９を参照）が、生理的機能が明らかとなっていないＳｉｇｌｅｃｓ分子も多い。Ｓｉｇｌｅｃ−１５（Ｓｉａｌｉｃ−ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｌｅｃｔｉｎ  １５）は、Ｓｉｇｌｅｃｓに属することが新たに報告された分子で（例えば、非特許文献１０を参照）、ＣＤ３３Ｌ３（ＣＤ３３  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ  ３）と呼ばれる分子と同一である。この分子は魚類からヒトまで進化的な保存度が高く、ヒト脾臓及びリンパ節において、樹状細胞／マクロファージ系の細胞に強く発現することが明らかにされた。またシアル酸プローブを用いた結合試験の結果、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５はＮｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃと、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５はさらにＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃと結合することなども明らかにされた（例えば、非特許文献１０を参照）。最近まで、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生理的役割は明らかではなかったが、破骨細胞の分化、成熟に伴ってＳｉｇｌｅｃ−１５の発現が亢進し、ＲＮＡ干渉によってＳｉｇｌｅｃ−１５の発現を低下させると破骨細胞の分化が抑制されることが報告された（例えば、特許文献１を参照）。さらに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が破骨細胞分化におよぼす作用について、特許文献２（２００９年４月１６日公開）及び特許文献３（２０１０年１０月１４日公開）において初めて明らかにされた。さらに特許文献４においても破骨細胞の分化を抑制する抗体が開示されたが、より強力な作用を示す抗体の探索が続けられている。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０７／０９３０４２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０９／０４８０７２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ１１／０４１８９４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，（１９９２）１３，ｐ６６−８０
【非特許文献２】Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９６）ｐ８７−１０２
【非特許文献３】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，（１９９６）１７，ｐ３０８−３３２
【非特許文献４】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，（１９９１）２６０，Ｃ１３１５−Ｃ１３２４
【非特許文献５】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，（１９９８）９５，ｐ３５９７−３６０２、
【非特許文献６】Ｃｅｌｌ，（１９９８）９３，ｐ１６５−１７６
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９８）２３，Ｓ２２２
【非特許文献８】Ｎａｔｕｒｅ，（１９９９）３９７，ｐ３１５−３２３
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２００７）７，ｐ２５５−２６６
【非特許文献１０】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００７）１７，ｐ８３８−８４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、骨粗鬆症、関節リウマチ、癌の骨転移等に見られる種々の骨代謝異常の際に特異的に発現する遺伝子、破骨細胞の分化成熟と活性を阻害する物質、及び骨代謝異常の治療及び／又は予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、骨代謝異常の治療及び／又は予防効果を有する物質を探索する目的で、破骨細胞の分化、成熟及び活性化の機構（メカニズム）の解明を目指した研究を行った結果、破骨細胞の分化、成熟に伴いＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子の発現が上昇することを見出した。また、本発明者らは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合する抗体により、破骨細胞の分化が抑制されることを見出した。さらに発明者らは、得られたラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒト化して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。【００１２】
（１）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１乃至３個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の１乃至１０９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、（１）乃至（３）に記載の抗体の抗原結合断片。
（５）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）乃至（３）に記載の抗体。
（６）キメラ抗体であることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（７）配列番号８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（６）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（８）ヒト化されていることを特徴とする、（１）、（２）又は（４）記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（９）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、（６）又は（８）に記載の抗体。
（１０）破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）  配列番号１２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）  配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）  配列番号１６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）  配列番号１８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）  配列番号２０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）  配列番号２２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）  配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ８）  配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ９）  配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１０）  配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）  配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）  配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）  配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）  配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５）  配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ６）  配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１３）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１４）配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１５）配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１６）配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１７）配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１８）配列番号１４のアミノ酸配列に示される２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１９）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２０）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２１）配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２２）配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２３）配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２４）配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２５）（１１）乃至（２４）のいずれか一つに記載の抗体において、カルボキシル基末端側の１乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体。
（２６）（１）乃至（２５）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
（２７）骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（２６）に記載の医薬組成物。
（２８）（１）乃至（２５）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
（２９）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、（２７）又は（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（２９）に記載の医薬組成物。
（３１）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（３０）に記載の医薬組成物。
（３２）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（３１）に記載の医薬組成物。
（３３）（１）乃至（２５）に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（２７）若しくは（２８）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（３４）（１）乃至（２５）に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（２８）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後してして投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（３５）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（３３）又は（３４）に記載の治療及び／又は予防方法。
（３６）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（３５）に記載の治療及び／又は予防方法。
（３７）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（３６）に記載の治療及び／又は予防方法。
（３８）（１）乃至（２５）のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
（３９）（３８）に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１乃至３６３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１乃至３２７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
（４０）配列番号７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする（３９）に記載のポリヌクレオチド。
（４１）（３８）に記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）  配列番号１１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）  配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）  配列番号１５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）  配列番号１７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５）  配列番号１９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６）  配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７）  配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８）  配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ９）  配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１０）  配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ１４）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）  配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）  配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）  配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）  配列番号２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）  配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６）  配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ１０）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
（４２）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４３）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４４）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４５）配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４６）配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４７）配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４８）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４９）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５０）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５１）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５２）配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５３）配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５４）配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５５）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５６）（３８）乃至（５５）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
（５７）（３８）乃至（５５）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
（５８）（５６）に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
（５９）（５７）又は（５８）に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む（１）乃至（２５）のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、破骨細胞の分化成熟、及び骨吸収活性の阻害を作用機序とする、骨代謝異常の治療剤及び／又は予防剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】クローニングしたラット＃２４Ａ３重鎖可変領域のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図２】クローニングしたラット＃２４Ａ３軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図３】ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体重鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図４】ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体軽鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図５】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図６】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図７】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図８】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図９】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１０】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１１】ｈ＃２４Ａ３−Ｌ１のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１２】ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１３】ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１４】ｈ＃２４Ａ３−Ｌ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１５】ラット＃２４Ａ３抗体の各ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示した図である。
【図１６】ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトキメラ抗体によるヒト正常破骨細胞の分化の抑制を示したグラフである（Ｎ＝６）。
【図１７】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１８】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図１９】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図２０】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図２１】ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図２２】ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
【図２３】ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体によるヒト正常破骨細胞の分化の抑制を示したグラフである（Ｎ＝６）。
【図２４】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。
【図２５】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。
【図２６】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂ抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。
【図２７】ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂ抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
【００１６】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
【００１７】
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
【００１８】
本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
【００１９】
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
【００２０】
本明細書中において、「Ｓｉｇｌｅｃ−１５」は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５蛋白質と同じ意味で用いている。
【００２１】
本明細書中において、「破骨細胞の形成」は、「破骨細胞の分化」又は「破骨細胞の成熟」と同じ意味で用いている。
【００２２】
本明細書中における「抗体の抗原結合断片」とは、「抗体の機能性断片」とも呼ばれ、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
【００２３】
本明細書における、「エピトープ」とは、特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合するＳｉｇｌｅｃ−１５の部分ペプチドまたは部分立体構造を意味する。前記のＳｉｇｌｅｃ−１５の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ法等当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことが出来る。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のＣ末端あるいはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。又、特定のＳｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合するＳｉｇｌｅｃ−１５の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線結晶構造解析によって前記の抗体と隣接するＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。第一の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。また、第一の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する結合に対して第二の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が競合する（すなわち、第二の抗体が第一の抗体とＳｉｇｌｅｃ−１５の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープに結合し、かつ第一の抗体が抗原の中和活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。
【００２４】
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
【００２５】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１５  ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２６】
本明細書において、「１乃至数個」及び「１若しくは数個」なる記載がある場合の「数個」とは、２乃至１０個を示している。好ましくは、１０個以下、５もしくは６個以下、又は２もしくは３個である。
１．Ｓｉｇｌｅｃ−１５
本発明者らによって、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は巨細胞腫において特異的に発現していることが見出された。また、本発明者らによってＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
【００２７】
本発明で用いるＳｉｇｌｅｃ−１５は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）あるいはニワトリの単球細胞あるいは骨髄細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５  ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ−１５を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
【００２８】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿２１３６０２で登録されている。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＸＭ＿８８４６３６で登録されている。なお、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ＣＤ３３  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ３、ＣＤ３３  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ  ３、ＣＤ３３−ｌｉｋｅ  ３又はＣＤ３３Ｌ３と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
【００２９】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡは例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７−４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【００３０】
なお、ヒト又はマウスのＳｉｇｌｅｃ−１５をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡに含まれる。
【００３１】
また、ヒト又はマウスのＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質もＳｉｇｌｅｃ−１５に含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質もＳｉｇｌｅｃ−１５に含まれる。
【００３２】
２．骨代謝異常の検出
Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は、ヒト各種骨組織検体群における遺伝子の発現量の解析をすると、破骨細胞様の多核巨細胞が多数出現する骨腫瘍であり、臨床的所見として骨溶解性の骨破壊を特徴とする（Ｂｕｌｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ１７．６−１７．８，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９２））巨細胞腫（Ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ；  ＧＣＴ）において有意に発現量が増加していることが見出された。
【００３３】
また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
【００３４】
したがって、Ｓｉｇｌｅｃ−１５はＧＣＴのような骨吸収が亢進するヒトの病態に関与していると考えられる。すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子及び／又はＳｉｇｌｅｃ−１５の各細胞、及び／又は各組織における発現量を測定することでＳｉｇｌｅｃ−１５の過剰発現を伴う骨代謝異常の状態を判定することができる。なお、本明細書における骨代謝異常とは、正味の骨喪失によって特徴付けられる障害であり、具体的には骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明においてＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子及び／又はＳｉｇｌｅｃ−１５の発現量を調べる対象となる「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、骨髄、骨、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織、血液、体液又は排泄物等の試料を意味するが、本発明においては血液又は骨髄がより好ましい。
【００３６】
破骨細胞の分化に関連することが知られているＲＡＮＫＬについては、ノックアウトマウスが作製されており、ＲＡＮＫＬの機能が失われた場合の表現型について解析がなされている（Ｙｏｕｎｇ−Ｙｕｎ  Ｋｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９７，ｐ．３１５−３２３）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５についても同様にノックアウトマウスを作製することによって，Ｓｉｇｌｅｃ−１５の機能が失われた場合の表現型の解析を行うことができる。
【００３７】
３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の製造
本発明のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体は、常法を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＳｉｇｌｅｃ−１５を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
【００３８】
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。このような方法の具体的な例は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）及び第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレット（２０１０年１０月１４日公開）に記載されている。しかし、モノクローナル抗体を取得する方法は、既に古典的に確立された分野に該当し、前記の具体例に限定されるものではない。
【００３９】
なお、抗原となるＳｉｇｌｅｃ−１５はＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＳｉｇｌｅｃ−１５を精製すればよい。
【００４０】
このようにして樹立されたされたハイブリドーマ株の例としては、本明細書記載のハイブリドーマ＃２４Ａ３を挙げることができる。なお、本明細書中においては、ハイブリドーマ＃２４Ａ３が産生する抗体を、「＃２４Ａ３抗体」又は単に「＃２４Ａ３」と記載する。また、本明細書においては＃２４Ａ３抗体以外の抗体についても、同様な方法で抗体名を記載する。＃２４Ａ３抗体の重鎖可変領域を含む部分断片は、配列表の配列番号２の１乃至１２１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。また、＃２４Ａ３抗体の軽鎖可変領域配列を含む部分断片は、配列表の配列番号４の１乃至１０９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。
【００４１】
本発明の抗体には、上記Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００４２】
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５，  （１９８４）参照）。ラット抗マウス抗体＃２４Ａ３由来のキメラ抗体の一例として、配列表の配列番号８の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１０の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
【００４３】
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げることができる。
【００４４】
＃２４Ａ３抗体由来のヒト化抗体としては、＃２４Ａ３の６種全てのＣＤＲ配列を保持し、破骨細胞の形成を抑制する活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。なお、＃２４Ａ３抗体の重鎖可変領域は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＲＹＤＶＳ）、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＶＩＨＰＧＳＧＧＴＧＹＮＥＫＦＫＡ）、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＲＧＬＮＳＧＹＷＦＦＤＦ）を保有している。また、＃２４Ａ３抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＮＶＧＳＮＶＤ）、配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＥＳＴＮＲＹＴ）、及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＭＱＳＮＦＦＰＦＴ）を保有している。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は、図１５にも記載されている。
【００４５】
また、さらに各ＣＤＲ中の１乃至３個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＣＤＲ改変ヒト化抗体も、破骨細胞の形成を抑制する活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。ＣＤＲＨ３におけるアミノ酸置換例としては、配列番号３３に示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸を置換したＣＤＲＨ３を挙げることができる。好ましくは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＲＧＬＮＫＧＹＷＦＦＤＦ）である。このＣＤＲのアミノ酸配列は、図１５にも記載されている。
【００４６】
ラット抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の実例としては、配列表の配列番号１２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号１６の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号１８の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号２０の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号２２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号３８の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号４０の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号４２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号４４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号３０の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号４６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基、又は配列番号４８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
【００４７】
好適な組合せとしては、配列番号１２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１６の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１６の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１６の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１８の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１８の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１８の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号２０の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号２０の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号２０の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号２２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号３０の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
【００４８】
より好適な組合せとしては、配列番号１２の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１２の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１２の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１６の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１６の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１６の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１８の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１８の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１８の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号２０の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号２０の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号２０の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、又は配列番号２２の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３０の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、を挙げることができる。
【００４９】
さらに好適な組合せとしては、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３８の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４８の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４０の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４６の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号４４の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号２４の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
【００５０】
最も好適な組合せとしては、配列番号１４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号３８の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４８の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号４０の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号４２の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号４４の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２４の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
【００５１】
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３，；  Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，  Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
【００５２】
このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
【００５３】
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
【００５４】
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）も知られている。
【００５５】
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
【００５６】
上記の抗体は、実施例３又は実施例１０に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ  Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５−２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
【００５７】
また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ−Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１−７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１−４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９−３５，Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６−８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合断片の一種と解釈することも可能である。
【００５８】
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。  抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
【００６０】
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。
【００６１】
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合断片が保持する機能は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する結合活性であり、好ましくは破骨細胞の形成を抑制する活性であり、より好ましくは破骨細胞の細胞融合の過程を抑制する活性である。
【００６２】
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
【００６３】
さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
【００６４】
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７−５３９）。
【００６５】
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６−１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
【００６６】
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００６７】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
【００６８】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
【００６９】
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
【００７０】
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
【００７１】
本発明の抗体は、上記の抗体の重鎖及び／又は軽鎖と比較して８０％乃至９９％との同一性を有する抗体であってもよい。上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の抗原結合能、破骨再形成抑制作用及び／又は破骨細胞による骨吸収の抑制作用を有する抗体を選択することが可能である。このような相同性は、一般的には８０％以上の相同性であり、好ましくは９０％以上の相同性であり、より好ましくは９５％以上の相同性であり、最も好ましくは９９％以上の相同性である。また、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の各種作用を有する抗体を選択することが可能である。置換、欠失及び／又は付加されるアミノ酸残基数は、一般的には１０アミノ酸残基以下であり、好ましくは５乃至６アミノ酸残基以下であり、より好ましくは２乃至３アミノ酸残基以下であり、最も好ましくは１アミノ酸残基である。
【００７２】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【００７３】
二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ，  Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔにアクセスすることによっても使用することができる。なお、上記のＢｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍによってＩｄｅｎｔｉｔｙ（又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）及びＰｏｓｉｔｉｖｉｔｙ（又はＰｏｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ）の２種類のパーセンテージの値が計算される。前者は相同性を求めるべき二種類のアミノ酸配列の間でアミノ酸残基が一致した場合の値であり、後者は化学構造の類似したアミノ酸残基も考慮した数値である。本明細書においては、アミノ酸残基が一致している場合のＩｄｅｎｔｉｔｙ（同一性）の値を持って相同性の値とする。
【００７４】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
【００７５】
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７−１１４６）。
【００７６】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
【００７７】
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
【００７８】
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００７９】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。
【００８０】
例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
【００８１】
４．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含有する医薬
上述の「３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の中から、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する抗体は、生体内でのＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性、即ち、破骨細胞の分化及び／又は成熟を阻害することから、医薬として、破骨細胞の分化及び／又は成熟異常に起因する骨代謝異常に対する治療及び／又は予防剤として用いることができる。骨代謝異常は正味の骨喪失（骨減少症又は骨溶解症）によって特徴付けられるいずれの障害であってもよい。一般に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体による治療及び／又は予防は、骨吸収を抑制する必要がある場合に適用される。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で治療及び／又は予防可能な骨代謝異常としては、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症などを挙げることができるが、破骨細胞による正味の骨喪失を伴う疾患であれば、これらに限定されない。上記の医薬としての抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の例として、＃２４Ａ３抗体から「３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の製造」に記載の方法によって作製されたキメラ抗体又はヒト化抗体を挙げることができる。また、＃２４Ａ３抗体と同じエピトープを有するキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体も医薬として使用可能である。ある抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、＃２４Ａ３抗体と同じエピトープを持つことは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の特定の部分ペプチドに対してこれらの抗体が共通に結合するか否かを観察することによって確認できる。また、ある抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５との結合において＃２４Ａ３抗体と競合するのであれば、これらの抗体が共通のエピトープを持つと判定することができる。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性の中和活性は例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を過剰発現している細胞の破骨細胞への分化の抑制活性で測定することができる。例えば、マウス単球由来細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞又はＲＡＷ２６４細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬあるいはＴＮＦ−α刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。また、骨髄由来の初代培養細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−αあるいは活性型ビタミンＤ３刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。さらに、正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入可能、カタログ番号２Ｔ−１１０）に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦ刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。このような破骨細胞の分化抑制効果は、破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の抑制を指標として測定できる。また、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成の抑制、すなわち破骨細胞の細胞融合の抑制を指標としても、破骨細胞の分化抑制効果を測定することができる。さらに、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞を用いたピットアッセイ（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ，（１９９２）１７，３４７−３５９）実験において、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加して象牙切片上のピットの形成を観察することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性を測定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性の測定系としては、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングしたプレートを使用することも可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の骨代謝異常に対する治療又は予防効果は、例えば、骨粗鬆症モデル動物又はＳｉｇｌｅｃ−１５を過剰に発現しているトランスジェニック動物に抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を投与し、破骨細胞の変化を測定することで確認することができる。前記の骨粗鬆症モデル動物として、卵巣摘出ラット又は卵巣摘出サルを挙げることができる。これらの実験動物に抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を投与した後に骨密度又は骨代謝マーカーを測定することによって、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体による骨吸収活性の抑制効果を測定することができる。骨代謝マーカーとしては、骨吸収マーカーである尿中デオキシピリジノリン、尿中Ｎ−ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＮＴＸ）、尿中Ｃ−ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＣＴＸ）、血中ＮＴＸ、血中ＣＴＸ、血中Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ５ｂ）等や、骨形成マーカーである血中骨型アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、血中オステオカルシン（ＢＧＰ）、Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃ-ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｐ１ＮＰ）等を挙げることができるが、これらの骨代謝マーカーに限定されるものではない。
【００８３】
このようにして得られたＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の骨転移に伴う骨破壊等の骨代謝異常の治療又は予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
【００８４】
関節リウマチ（ＲＡ）の治療において、疾患の発症に伴って発生する骨喪失が大きな課題になっている。ＲＡに伴うこの骨喪失においては、破骨細胞が中心的な役割を果たしていることが報告されている。ＲＡにおける破骨細胞の誘導（分化、成熟）、活性化、及び骨破壊の原因として最も重要と考えられているサイトカインはＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αである（Ｒｏｍａｓ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  ３０，  ｐ３４０−３４６，  ２００２）。ＲＡＮＫＬのデコイレセプターであるＯＣＩＦ／ＯＰＧではＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成は抑制できるが、ＴＮＦ−αで誘導される破骨細胞形成は抑制されない。その一方で、本発明における抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、ＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成とＴＮＦ−αで誘導される破骨細胞形成の両方が効果的に抑制された。したがって、本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、ＲＡなどにおけるＴＮＦ−αで誘導される骨喪失と骨破壊が、ＲＡＮＫＬブロッカー（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、抗ＲＡＮＫＬ抗体など）以上に強力に抑制できることが期待される。
【００８５】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、一つの例としては、骨代謝異常の治療又は予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の骨疾患治療剤と併用して投与することができる。また一つの例として、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は治療上有効な量の抗骨代謝異常治療薬剤と併用して投与することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と併用して投与できる他の治療剤としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、又はｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ又はｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。骨代謝異常の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３あるいはそれ以上の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の薬剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、あるいは抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の骨疾患治療剤の遺伝子と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の遺伝子は、別々のあるいは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々のあるいは、同じベクターに導入することができる。
【００８６】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体、あるいはそのフラグメントに対し骨疾患治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１−２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、破骨細胞の認識性を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等のフラグメントを例として挙げることができ、本発明においても同様に、抗体及び該フラグメントを使用することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又は該抗体のフラグメントと骨疾患治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  （２００１）５３，１７１−２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５−１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と骨疾患治療剤が化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性高分子を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、抗体と骨疾患治療剤とがリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、骨疾患治療剤が水溶性高分子（分子量１０００乃至１０万程度の化合物）に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と骨疾患治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９５）１２２，  ５５−１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ  ａｎｄ  Ｊ  Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５−１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又は該フラグメント）と蛋白質性の骨疾患治療剤（又は該フラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
【００８７】
本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
【００８８】
本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも一つの骨疾患治療剤と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。骨疾患治療剤としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、又はｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ又はｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８９】
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
【００９１】
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓバッファー、ｐＨ４．０−５．５の酢酸バッファー、ｐＨ３．０−６．２のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及び少なくとも一つの骨疾患治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及び少なくとも一つの骨代謝異常治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
【００９２】
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する親和性、即ち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜１８０日間に１回投与すればよい。
【００９３】
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
【００９４】
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【実施例１】
【００９５】
可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質含有培養液の調製と精製
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ｐＤＮＯＲ２２１ベクター（インビトロジェン社製）に組み込むことによりエントリークローンを作製した。このエントリークローンから、インサートのＣ末側にＶ５エピトープと６×Ｈｉｓタグが付加される様に設計されたディストネーションベクターであるｐＤＯＮＭに組み換えを行うことにより発現プラスミド（可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭ）を得た。可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭを２９３−Ｆ細胞にトランスフェクションし、６〜１２％  ＣＯ２濃度、３７℃で９６時間（４日間）攪拌培養した。培養液を回収し、遠心分離することにより可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質含有培養上清を調製した。得られた培養上清をＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて粗精製し、続いてＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて分画した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（還元条件下）と銀染色により可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の検出と純度検定を行った結果、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分に分子量約３５ｋＤａの蛋白質（可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質）が効率的に精製濃縮されたことが確認された。
【実施例２】
【００９６】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３産生ハイブリドーマの樹立および精製抗体の調製
実施例１で作製した精製可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質をラットに免疫した。試験採血により抗体価の上昇を確認した後安楽死させ、脾臓を摘出した。細胞融合は、一般的なマウス（ラット）脾臓細胞とミエローマ細胞との融合法に従って実施した。スクリーニングにより抗体価の高い３５クローンを選抜し、さらに１次、２次クローニング操作を行った。その結果、抗体価の高いハイブリドーマとして＃２４Ａ３の樹立に成功した。樹立したハイブリドーマを１×１０７細胞／マウスとなるようにヌードマウスの腹腔内に移植した。移植後、腹水の蓄積が十分に見られた時点で腹水を採取しＩｇＧ画分を精製した。以上の操作により、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３を調製した。
【実施例３】
【００９７】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
３−１）ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインの発現精製
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５  Ｖ−ｓｅｔドメイン（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿９９８７６７のアミノ酸配列の３９乃至１６５番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド）のＮ末端側にＨｉｓタグ、および、ＦａｃｔｏｒＸａ認識配列を連結させた蛋白をコードするＤＮＡをベクターｐＤＥＳＴ１４（インビトロジェン社、カタログ番号：１１８０１−０１６）に組み込んだ。このプラスミドを用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（ノバジェン社、カタログ番号：７１１３６−４）を形質転換し、ＴＢ培地（インビトロジェン社、カタログ番号：２２７１１−０２２）で培養した。培養後、超音波破砕した菌体を遠心分離し、上清をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７−５２４７−０１）で精製した。その後、ＦａｃｔｏｒＸａ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号Ｐ８０１０Ｌ）でＨｉｓタグを切断後、Ｍｏｎｏ  Ｓ５／５０  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７−５１６８−０１）、さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０/３００カラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７−５１７４−０１）を用いて、電気泳動で分子量１４ｋＤａの単一バンドになるまでヒトＳｉｇｌｅｃ−１５  Ｖ−ｓｅｔドメインを精製した。【００９８】
３−２）ラット＃３２Ａ３とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインとの解離定数の測定
ラット＃２４Ａ３抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５Ｖ−ｓｅｔドメインの解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、抗体をリガンドとして固定化し、抗原をアナライトとして測定した。なお、対照となる抗体としてラット＃３２Ａ１抗体を使用した。ラット＃３２Ａ１抗体は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット及び第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレットに、その調製方法、並びに重鎖及び軽鎖の配列情報が記載されている。なお、ラット＃３２Ａ１抗体を産生するハイブリドーマ＃３２Ａ１は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（所在地：郵便番号３０５−８５６６  日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００８年８月２８日付けで寄託され、ａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃３２Ａ１の名称で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９９が付与されている。
＃３２Ａ１又は＃２４Ａ３抗体は、アミンカップリング法にてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へ固定化した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を介し、約５０ＲＵを結合させた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を用いた。抗体を結合したチップ上に、抗原の希釈系列溶液（０．００３-２ｎＭ）を流速９０μｌ／分で２３３秒間添加し、引き続き３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋｏｎ、解離速度定数ｋｏｆｆ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。その結果、ＫＤ値は＃３２Ａ１が１．５Ｅ−１０［Ｍ］、＃２４Ａ３が７．０Ｅ−１１［Ｍ］であり、＃２４Ａ３は＃３２Ａ１より約２倍強い親和性を有していた。
【実施例４】
【００９９】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３の可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅と塩基配列の解析
４−１）＃２４Ａ３の重鎖と軽鎖のＮ末端アミノ酸配列の同定
＃２４Ａ３の重鎖と軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を同定するために、実施例２で調製した＃２４Ａ３をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離後のゲルからＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にゲル中のタンパク質を転写し、洗浄バッファー（２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ホウ酸ナトリウムバッファー  ｐＨ８．０）で洗浄した後、染色液（５０％  メタノール、２０％  酢酸、０．０５％  クマシーブリリアントブルー）に５分間浸して染色してから、９０％  メタノールで脱色した。ＰＶＤＦ膜上で可視化された重鎖（移動度が小さい方のバンド）および軽鎖（移動度が大きい方のバンド）に相当するバンド部分を切り取った。重鎖に相当するバンドについては、少量の０．５％ポリビニルピロリドン／１００ｍＭ酢酸溶液中で、３７℃で３０分間保温した後、水でよく洗浄し、次に、Ｐｆｕ ピログルタミン酸アミノペプチダーゼキット（タカラバイオ株式会社）を用いて修飾Ｎ末端残基を除去し、水で洗浄した後風乾した。Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ  プロテインシーケンサー  Ｍｏｄｅｌ  ４９２ｃＬＣ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、自動エドマン法（Ｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６７）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１，８０参照）によりそれぞれのＮ末端アミノ酸配列の同定を試みた。その結果、＃２４Ａ３の重鎖に相当するバンドのＮ末端のアミノ酸配列は、
ＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＴＫＰであり、軽鎖に相当するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、
ＤＩＶＭＴＱＳＰＴＳＭＳＩＳだった。【０１００】
４−２）＃２４Ａ３産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
＃２４Ａ３の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、＃２４Ａ３産生ハイブリドーマよりｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてｍＲＮＡを調製した。【０１０１】
４−３）ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成
ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成は上記４−２）で調製したｍＲＮＡの１００ｎｇを用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。【０１０２】
４−４）５’-ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる＃２４Ａ３の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
＃２４Ａ３の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ (Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)、及び
５’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ−３’（ＲＧ２ＡＲ３）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ３はデータベースのラット重鎖（ＩｇＧ２ａ）の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、上記４−３）で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより＃２４Ａ３の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
シークエンスプライマーとして、データベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した
５’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ−３’（ＲＧ２ＡＲ３）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ (Ｎｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
決定された＃２４Ａ３の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示した。配列番号１のヌクレオチド配列及び配列番号２のアミノ酸配列は、図１にも記載されている。
ヌクレオチド配列より決定された＃２４Ａ３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は上記４−１）で決定したＮ末端アミノ酸配列と一致した。【０１０３】
４−５）５’-ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる＃２４Ａ３の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
＃２４Ａ３の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ (Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)
及び
５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ３はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、上記４−３）で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｌｏｎｔｅｃｈＨ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
シークエンスプライマーとして、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した
５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ (Ｎｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
決定された＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示した。配列番号３のヌクレオチド配列及び配列番号４のアミノ酸配列は、図２にも記載されている。ヌクレオチド配列より決定された＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は上記４−１）で決定したＮ末端アミノ酸配列と一致した。
【実施例５】
【０１０４】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトキメラ抗体遺伝子発現コンストラクトの作製
５−１）キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３-ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号５に示すヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’−ｔａｔａｃｃｇｔｃｇａｃｃｔｃｔａｇｃｔａｇａｇｃｔｔｇｇｃ−３’（３．３−Ｆ１）
５’−ｇｃｔａｔｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃｃｇｃｃｃｃｇａｃｇｔｔｇ−３’（３．３−Ｒ１）
５−２）キメラ及びヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ２の構築
ｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ２定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号６）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ２を構築した。【０１０５】
５−３）ヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖発現ベクターの構築
実施例４）で得られた＃２４Ａ３軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−ＬＫ／＃２４Ａ３」と命名した。作製されたヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖遺伝子は、配列表の配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有しており、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号９のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル、配列番号２１乃至１２９に示されるアミノ酸配列が軽鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１３０乃至２３４で示されるアミノ酸配列が軽鎖定常領域に相当する。配列番号９のヌクレオチド配列及び配列番号１０のアミノ酸配列は、図４にも記載されている。
ヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖用プライマーセット
５’−ＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣ−３’（２４Ａ３Ｌ−Ｆ）
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（２４Ａ３Ｌ−Ｒ）
５−４）ヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖発現ベクターの構築
実施例４）で得られた＃２４Ａ３重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ２を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−Ｇ２／＃２４Ａ３」と命名した。作製されたヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖遺伝子は、配列表の配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有しており、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号８のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル、２０乃至１４０番目に示されるアミノ酸配列が重鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１４１乃至４６６で示されるアミノ酸配列が重鎖定常領域に相当する。配列番号７のヌクレオチド配列及び配列番号８のアミノ酸配列は、図３にも記載されている。
ヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖用プライマーセット
５’−ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’（２４Ａ３Ｈ−Ｆ）
５’−ＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（２４Ａ３ＲＲ） 
【実施例６】
【０１０６】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトキメラ抗体の調製
６−１）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトキメラ抗体の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して１．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）３．６ｍｇをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製したＨ鎖発現ベクター（０．４ｍｇ）及びＬ鎖発現ベクター（０．８ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  （Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。
ｐＣＭＡ−Ｇ２／＃２４Ａ３とｐＣＭＡ−ＬＫ／＃２４Ａ３との組合せによって取得されたラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトキメラ抗体をｃ＃２４Ａ３と命名した。【０１０７】
６−２）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒトキメラ抗体の精製
上記６−１）で得られた培養上清から抗体を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（４−６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の２段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は４−６℃下で実施した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム）にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭ  りん酸ナトリウム／５０ｍＭ  ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した抗体溶液を、５ｍＭ  ＮａＰｉ／５０ｍＭ  ＭＥＳ／３０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ Ｔｙｐｅ‐Ｉ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調製し精製サンプルとした。
【実施例７】
【０１０８】
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の設計
ａ）＃２４Ａ３のヒト化バージョンの設計
ａ）−ｉ）＃２４Ａ３の可変領域の分子モデリング
＃２４Ａ３の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，D３０１−D３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定された＃２４Ａ３の可変領域と比較した。結果として、１２Ｅ８が、＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域に対して同様にフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、２ＯＳＬが、＃２４Ａ３の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、＃２４Ａ３の軽鎖及び重鎖に対応する１２Ｅ８及び２ＯＳＬの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。【０１０９】
最後に、エネルギーの点で＃２４Ａ３の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。【０１１０】
ａ）−ｉｉ）ヒト化＃２４Ａ３に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化＃２４Ａ３抗体の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて２通り選択された。＃２４Ａ３のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、ＨｕＭｃ３抗体がフレームワーク領域についての７４％の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。ＨｕＭｃ３についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、＃２４Ａ３についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された＃２４Ａ３の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化＃３２Ａ１配列を以下の実施例に記載されるように構築した。また、＃２４Ａ３の各ＣＤＲ中の１乃至３個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＣＤＲ改変ヒト化＃２４Ａ３配列についても以下の実施例に記載されるように構築した。【０１１１】
ｂ）＃２４Ａ３重鎖のヒト化
ｂ）−ｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１タイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号４９（プロリン）をスレオニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８７（アラニン）をバリンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９１（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１タイプ重鎖」と命名した。【０１１２】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に記載されている。配列番号１２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１に記載されている。配列番号１１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１のヌクレオチド配列及び配列番号１２のアミノ酸配列は、図５にも記載されている。【０１１３】
ｂ）−ｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２タイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８７（アラニン）をバリンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９１（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２タイプ重鎖」と命名した。【０１１４】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に記載されている。配列番号１４のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３に記載されている。配列番号１３のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１３のヌクレオチド配列及び配列番号１４のアミノ酸配列は、図６にも記載されている。【０１１５】
ｂ）−ｉｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３タイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３タイプ重鎖」と命名した。【０１１６】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に記載されている。配列番号１６のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５に記載されている。配列番号１５のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１５のヌクレオチド配列及び配列番号１６のアミノ酸配列は、図７にも記載されている。【０１１７】
ｂ）−ｉｖ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４タイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４タイプ重鎖」と命名した。【０１１８】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に記載されている。配列番号１８のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７に記載されている。配列番号１７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１７のヌクレオチド配列及び配列番号１８のアミノ酸配列は、図８にも記載されている。【０１１９】
ｂ）−ｖ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５タイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５タイプ重鎖」と命名した。【０１２０】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０に記載されている。配列番号２０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９に記載されている。配列番号１９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１９のヌクレオチド配列及び配列番号２０のアミノ酸配列は、図９にも記載されている。【０１２１】
ｂ）−ｖｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６タイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６タイプ重鎖」と命名した。【０１２２】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に記載されている。配列番号２２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１に記載されている。配列番号２１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２１のヌクレオチド配列及び配列番号２２のアミノ酸配列は、図１０にも記載されている。【０１２３】
ｃ）＃２４Ａ３軽鎖のヒト化
ｃ）−ｉ）  ｈ＃２４Ａ３−Ｌ１タイプ軽鎖：
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号６０（スレオニン）をプロリンに、アミノ酸番号６３（セリン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ１タイプ軽鎖」と命名した。【０１２４】
ｈ＃２４Ａ３−Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４に記載されている。配列番号２４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３に記載されている。配列番号２３のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２３のヌクレオチド配列及び配列番号２４のアミノ酸配列は、図１１にも記載されている。【０１２５】
ｃ）−ｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２タイプ軽鎖：
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号６０（スレオニン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２タイプ軽鎖」と命名した。【０１２６】
ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６に記載されている。配列番号２６のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５に記載されている。配列番号２５のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２５のヌクレオチド配列及び配列番号２６のアミノ酸配列は、図１２にも記載されている。【０１２７】
ｃ）−ｉｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３タイプ軽鎖：
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号６０（スレオニン）をプロリンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３タイプ軽鎖」と命名した。【０１２８】
ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に記載されている。配列番号２８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７に記載されている。配列番号２７のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２７のヌクレオチド配列及び配列番号２８のアミノ酸配列は、図１３にも記載されている。【０１２９】
ｃ）−ｉｖ）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ４タイプ軽鎖：
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ４タイプ軽鎖」と命名した。【０１３０】
ｈ＃２４Ａ３−Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に記載されている。配列番号３０のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９に記載されている。配列番号２９のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２９のヌクレオチド配列及び配列番号３０のアミノ酸配列は、図１４にも記載されている。【０１３１】
ｄ）ｈ＃２４Ａ３重鎖のヒト化（その２）
ｄ）−ｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８７（アラニン）をバリンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９１（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１２２（セリン）をリジンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖」と命名した。【０１３２】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に記載されている。配列番号３８のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号３８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７に記載されている。配列番号３７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３７のヌクレオチド配列及び配列番号３８のアミノ酸配列は、図１７にも記載されている。【０１３３】
ｄ）−ｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８７（アラニン）をバリンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９１（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１２２（セリン）をリジンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖」と命名した。【０１３４】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に記載されている。配列番号４０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９に記載されている。配列番号３９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３９のヌクレオチド配列及び配列番号４０のアミノ酸配列は、図１８にも記載されている。【０１３５】
ｄ）−ｉｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９１（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１２２（セリン）をリジンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖」と命名した。【０１３６】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に記載されている。配列番号４２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１に記載されている。配列番号４１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４１のヌクレオチド配列及び配列番号４２のアミノ酸配列は、図１９にも記載されている。【０１３７】
ｄ）−ｉｉｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅタイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８７（アラニン）をバリンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１２２（セリン）をリジンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅタイプ重鎖」と命名した。【０１３８】
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４に記載されている。配列番号４４のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３に記載されている。配列番号４３のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４３のヌクレオチド配列及び配列番号４４のアミノ酸配列は、図２０にも記載されている。【０１３９】
ｅ）ｈ＃２４Ａ３軽鎖のヒト化（その２）
ｅ）−ｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号６０（スレオニン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖」と命名した。【０１４０】
ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６に記載されている。配列番号４６のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号４６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５に記載されている。配列番号４５のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４５のヌクレオチド配列及び配列番号４６のアミノ酸配列は、図２１にも記載されている。【０１４１】
ｅ）−ｉｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号６０（スレオニン）をプロリンに、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖」と命名した。【０１４２】
ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４８に記載されている。配列番号４８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号４８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４７に記載されている。配列番号４７のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４７のヌクレオチド配列及び配列番号４８のアミノ酸配列は、図２２にも記載されている。
【実施例８】
【０１４３】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の発現ベクターの作製
８−１）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の重鎖発現ベクターの構築
実施例７−ｂ）に記載された、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社、人工遺伝子合成サービス）、キメラ及びヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現汎用ベクター（ｐＣＭＡ−Ｇ２）を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入することにより、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の重鎖発現ベクターを構築した。【０１４４】
８−２）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の軽鎖発現ベクターの構築
実施例７−ｃ）に記載された、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ社、人工遺伝子合成サービス）、キメラ及びヒト化軽鎖発現汎用ベクター（ｐＣＭＡ−ＬＫ）を制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に挿入することにより、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の軽鎖発現ベクターを構築した。【０１４５】
８−３）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の重鎖発現ベクターの構築（その２）
８−３−１）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２タイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧ−３’（Ｈ２ｂ−Ｆ）
５’−ＧＴＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣ−３’（Ｈ２ｂ−Ｒ）
８−３−２）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−３−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣ−３’（Ｈ２ｃ−Ｆ）
５’−ＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧ−３’（Ｈ２ｃ−Ｒ）
８−３−３）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−３−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣ−３’（Ｈ２ｄ−Ｆ）
５’−ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧ−３’（Ｈ２ｄ−Ｒ）
８−３−４）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−３−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣ−３’（Ｈ２ｅ−Ｆ）
５’−ＣＡＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣ−３’（Ｈ２ｅ−Ｒ）
８−４）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の軽鎖発現ベクターの構築（その２）
８−４−１）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖発現ベクターの構築
８−２）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧ−３’（Ｌ２ｂ−Ｆ）
５’−ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧ−３’（Ｌ２ｂ−Ｒ）
８−４−２）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖発現ベクターの構築
８−２）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧ−３’（Ｌ２ｂ−Ｆ）
５’−ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＴ−３’（Ｌ３ｂ−Ｒ）
【実施例９】
【０１４６】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の調製
９−１）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養を行うことが可能である。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して１．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）３．６ｍｇをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製した重鎖発現ベクター（０．４ｍｇ）及び軽鎖発現ベクター（０．８ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  （Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。
実施例８−１）、及び８−３）で作製したラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の重鎖発現ベクターと、実施例８−２）、及び８−４）で作製したラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の軽鎖発現ベクターとの組合せによって、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体を取得した。【０１４７】
９−２）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の精製
上記９−１）で得られた培養上清から抗体を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（４−６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の２段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は４−６℃下で実施した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム）にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭ  りん酸ナトリウム／５０ｍＭ  ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した抗体溶液を、５ｍＭ  ＮａＰｉ／５０ｍＭ  ＭＥＳ／３０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ Ｔｙｐｅ‐Ｉ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を２０ｍｇ／ｍｌに調製し精製サンプルとした。【０１４８】
なお、本明細書では、例えばｈ＃２４Ａ３−Ｈ１重鎖及びｈ＃２４Ａ３−Ｌ１軽鎖を有する抗体を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１／Ｌ１」又は「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１／Ｌ１抗体」と呼称する。上記９−１）及び９−２）の方法によって調製された抗体の具体例として、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１／Ｌ２、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１／Ｌ３、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２／Ｌ２、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２／Ｌ３、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３／Ｌ２、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３／Ｌ３、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４／Ｌ２、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４／Ｌ３、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５／Ｌ２、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５／Ｌ３、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６／Ｌ４、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ２ｂ、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂ、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂ、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ３ｂ、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ２ｂ、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ３ｂ、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ２ｂ、及びｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ３ｂを挙げることができる。
【実施例１０】
【０１４９】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のキメラ抗体及びヒト化抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
１０−１）キメラ抗体の結合性評価
ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインの解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、抗体をリガンドとして固定化し、抗原をアナライトとして測定した。なお、対照となる抗体としてヒトキメラ＃３２Ａ１抗体を使用した。ヒトキメラ＃３２Ａ１抗体は、国際公開第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレットに、その調製方法、並びに重鎖及び軽鎖の配列情報が記載されている。ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体又はヒトキメラ＃３２Ａ１抗体は、アミンカップリング法にてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へ固定化した抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を介し、約５０ＲＵを結合させた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を用いた。抗体を結合したチップ上に、抗原の希釈系列溶液（０．００３-２ｎＭ）を流速９０μｌ／分で２３３秒間添加し、引き続き３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋｏｎ、解離速度定数ｋｏｆｆ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。その結果、ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体のＫＤ値は１．７Ｅ−１１［Ｍ］であり、ヒトキメラ＃３２Ａ１抗体のＫＤ値は１．４Ｅ−１０［Ｍ］であった。ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体はラット＃２４Ａ３抗体と同等以上の親和性を有していた。また、ヒトキメラ＃３２Ａ１抗体はラット＃３２Ａ１抗体と同等の親和性を有していた。【０１５０】
１０−２）ヒト化抗体の結合性評価
上記１０−１）と同様の方法によって、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性を評価した。その結果を表１に示す。【０１５１】
（表１）
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
抗体                        ＫＤ［Ｍ］
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２／Ｌ１          ３．１Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２／Ｌ２          ２．８Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２／Ｌ３          ２．７Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ１        ９．８Ｅ−１２
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ２ｂ      ８．５Ｅ−１２
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂ      ７．７Ｅ−１２
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ１        １．０Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂ      １．３Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ３ｂ      １．５Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１        ４．５Ｅ−１２
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ２ｂ      １．０Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ３ｂ      ７．５Ｅ−１２
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１        ６．９Ｅ−１２
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ２ｂ      １．８Ｅ−１１
ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ３ｂ      １．６Ｅ−１１
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
ヒト化＃２４Ａ３抗体はヒトキメラ＃２４Ａ３抗体と同等以上の親和性を有していた。
【実施例１１】
【０１５２】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のキメラ抗体及びヒト化抗体によるヒト正常破骨細胞の分化に対する影響
１１−１）キメラ抗体によるヒト正常破骨細胞の分化に対する影響
酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は破骨細胞の分化に伴い発現が上昇するマーカーであり、成熟した破骨細胞から分泌されると考えられている。従って、破骨細胞の培養上清中におけるＴＲＡＰの活性を測定することにより、被験物質の破骨細胞分化に対する影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することが可能である。【０１５３】
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６穴プレートに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６８．４ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例２で取得したラット＃２４Ａ３抗体および実施例６で調製したヒトキメラ＃２４Ａ３抗体を、それぞれ終濃度４、２０、１００、５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した。培養上清７５μｌを採取し、基質溶液（１１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸及び１００ｍＭ酒石酸ナトリウムを含有する０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））７５μｌを加えて室温で３０分間インキュベートした。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌを加えて酵素反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした（図１６）。その結果、ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体によって４ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲でＴＲＡＰ活性が濃度依存的に抑制され、ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体がヒト破骨細胞の分化を抑制することが確認された。またこのヒトキメラ抗体の抑制作用は、もとのラット＃２４Ａ３抗体の抑制作用と同等以上であったことから、ヒトキメラ化による活性の低下はないと考えられた。【０１５４】
１１−２）ヒト化抗体によるヒト正常破骨細胞の分化に対する影響
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のキメラ抗体及びヒト化抗体によるヒト正常破骨細胞の分化に対する影響は、上記１１−１）に記載の方法によって試験することが可能である。【０１５５】
正常ヒト破骨前駆細胞を、９６穴プレートに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地中のヒトＲＡＮＫＬは、終濃度６６ｎｇ／ｍｌとなるように調製した。この培養上清中に、実施例９で取得したヒト化＃２４Ａ３抗体（ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂおよびｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂ）および実施例６で調製したヒトキメラ＃２４Ａ３抗体を、それぞれ終濃度４、２０、１００、５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で６日間培養した。培養上清７５μｌを採取し、基質溶液（１１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸及び１００ｍＭ酒石酸ナトリウムを含有する０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））７５μｌを加えて室温で２０分間インキュベートした。２Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌを加えて酵素反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした（図２３）。その結果、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１およびｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂによって２０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲で、またｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂによって４ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲で、ＴＲＡＰ活性が濃度依存的に抑制された。なおこれらの抑制作用はヒトキメラ＃２４Ａ３抗体の抑制作用とほぼ同等であったことから、ヒト化による活性の低下はほとんどないと考えられた。以上より、ヒト化＃２４Ａ３抗体がヒト破骨細胞の分化を抑制することが示された。
【実施例１２】
【０１５６】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体によるヒト正常破骨細胞の骨吸収活性に対する影響（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性評価）
破骨細胞はカテプシンＫなどのプロテアーゼを放出することにより、骨組織の構成成分であるＩ型コラーゲンを分解することが知られている。ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製、カタログ番号  ＰＡ−１５００）は、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングした９６穴プレート（９６−ｗｅｌｌ  ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）を提供しており、同プレート上で破骨細胞を培養した際に上清に遊離される蛍光コラーゲン断片量を測定することにより、破骨細胞の骨吸収活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することが可能である。ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体によるヒト正常破骨細胞の骨吸収活性の抑制効果は、以下に示す方法により評価が可能である。【０１５７】
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６−ｗｅｌｌ  ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに１×１０４細胞／穴となるように播種する。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６３．８ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いる。この培養上清中に、実施例１０で調製したラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体を終濃度０．８〜５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で３〜７日間培養する。培養上清１０μｌを採取し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを２００μｌ添加して、蛍光プレートリーダー（ＡＲＶＯ  ＭＸ、パーキンエルマー社製）を用いて蛍光強度を測定（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１５ｎｍ）することにより、培養上清中に放出された遊離蛍光コラーゲン断片量を定量する。
【実施例１３】
【０１５８】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の卵巣摘出ラットを用いた生物学的評価
実施例９において取得されたヒト化抗体の示す、卵巣摘出ラットにおける骨密度減少および骨吸収活性に対する抑制効果は、以下に記載の方法で評価することが可能である。
ａ）動物実験のプロトコール
１２週齢雌性Ｆ３４４ラット（日本チャールス・リバー社より入手）に両側卵巣摘除を施術し、溶媒投与群、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体投与群に分ける。また偽手術群についても１群設定する。抗体を投与する群については、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で、手術翌日から皮下に単回投与もしくは反復投与する。投与開始４週後に絶食下で２４時間採尿を行い、尿検体は測定まで−８０℃で保存する。採尿終了後にラットを安楽死させ、腰椎を摘出する。【０１５９】
ｂ）腰椎骨密度の測定
摘出した腰椎に付着している軟組織を除去し、第４〜６腰椎を切り出す。骨密度測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ社製）を用いて骨密度を測定し、溶媒投与群、偽手術群と比較することにより、ヒト化抗体の効果を判定する。【０１６０】
ｃ）尿中デオキシピリジノリン排泄量の測定
Ｉ型コラーゲン架橋の各種代謝産物は骨の代謝回転、特に骨吸収を鋭敏に反映し、なかでもデオキシピリジノリンは主として骨のコラーゲンに局在することから骨吸収の指標として信頼性が高いとされている。【０１６１】
凍結保存していた尿検体を融解し、遠心操作により不溶物質を沈殿させて上清を得る。この上清中に含まれるデオキシピリジノリン量を、オステオリンクス「ＤＰＤ」（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて測定する。また、上清中のクレアチニン含量も測定し、クレアチニン補正を行ったデオキシピリジノリン量を算出する。算出したデオキシピリジノリン量について、溶媒投与群、偽手術群と比較することにより、ヒト化抗体の効果を判定する。
【実施例１４】
【０１６２】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の熱安定性測定
示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）を用いて熱安定性の測定を行なった。サンプルは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＨＢＳｏｒ緩衝液（２５ｍＭヒスチジン（ｐH６．０）５％ソルビトールに調製）に溶解させ、４００μＬずつ試料溶液としてＤＳＣ測定に使用した。ＤＳＣ測定条件は、以下のように設定した。即ち、初期温度は２０℃、最終温度を１００℃とし、昇温速度を２００℃／１時間、フィルター時間２秒、フィードバックモードをＬｏｗとした。参照液はＨＢＳｏｒを使用した。全てのＤＳＣ測定装置としては、米国ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）製ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用した。試料溶液から得られたスキャン曲線からベースライン（試料セルにも参照溶液を充填して得られたスキャン曲線）を差し引いてベースライン補正を行なった。次に、各サンプルの分子量から算出されたモル濃度を用いて濃度のキャリブレーションを行った。図２４がｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１抗体のサーモグラム、図２５がｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１抗体のサーモグラム、図２６がｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂ抗体のサーモグラム、図２７がｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂ抗体のサーモグラムを示す。それぞれのサーモグラム中の最大のピークについてピークトップを示した温度を熱変性中点Ｔｍとすると、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄ／Ｌ１抗体のＴｍ値が８７．９℃、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅ／Ｌ１抗体のＴｍ値が８９．３℃、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂ／Ｌ３ｂ抗体のＴｍ値が８８．９℃、ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃ／Ｌ２ｂ抗体のＴｍ値が９１．０℃であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明のキメラ又はヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は破骨細胞の分化又は骨吸収活性の抑制能を有し、該抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物は骨代謝異常疾患の治療又は予防剤となり得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１６４】
配列番号１：＃２４Ａ３の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：＃２４Ａ３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４：＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号６：ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ２定常領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号７：ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号８：ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号９：ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号１０：ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１１：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１のヌクレオチド配列
配列番号１２：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２のヌクレオチド配列
配列番号１４：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３のヌクレオチド配列
配列番号１６：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１７：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４のヌクレオチド配列
配列番号１８：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ４のアミノ酸配列
配列番号１９：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５のヌクレオチド配列
配列番号２０：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ５のアミノ酸配列
配列番号２１：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６のヌクレオチド配列
配列番号２２：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ６のアミノ酸配列
配列番号２３：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ１のヌクレオチド配列
配列番号２４：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号２５：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２のヌクレオチド配列
配列番号２６：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号２７：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３のヌクレオチド配列
配列番号２８：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号２９：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ４のヌクレオチド配列
配列番号３０：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ４のアミノ酸配列
配列番号３１：＃２４Ａ３抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号３２：＃２４Ａ３抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号３３：＃２４Ａ３抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号３４：＃２４Ａ３抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号３５：＃２４Ａ３抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号３６：＃２４Ａ３抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号３７：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂのヌクレオチド配列
配列番号３８：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂのアミノ酸配列
配列番号３９：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃのヌクレオチド配列
配列番号４０：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃのアミノ酸配列
配列番号４１：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄのヌクレオチド配列
配列番号４２：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄのアミノ酸配列
配列番号４３：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅのヌクレオチド配列
配列番号４４：ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅのアミノ酸配列
配列番号４５：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂのヌクレオチド配列
配列番号４６：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂのアミノ酸配列
配列番号４７：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂのヌクレオチド配列
配列番号４８：ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂのアミノ酸配列
配列番号４９：＃２４Ａ３抗体の変異ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月17日(2014.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１乃至３個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の１乃至１０９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項４】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項５】
ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項６】
キメラ抗体であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項６に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項８】
ヒト化されていることを特徴とする、請求項１、２又は４記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項９】
重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、請求項６又は８に記載の抗体。
【請求項１０】
破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）  配列番号１２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）  配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）  配列番号１６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）  配列番号１８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）  配列番号２０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）  配列番号２２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）  配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ８）  配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ９）  配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１０）  配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）  配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）  配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）  配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）  配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５）  配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ６）  配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１７】
配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１８】
配列番号１４のアミノ酸配列に示される２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項１９】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２０】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２１】
配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２２】
配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２３】
配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２４】
配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
【請求項２５】
請求項１１乃至２４のいずれか一つに記載の抗体において、カルボキシル基末端側の１乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体。
【請求項２６】
請求項１乃至２５に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２７】
骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１乃至２５に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項２９】
骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１乃至２５のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１乃至３６３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１乃至３２７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
配列番号７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）  配列番号１１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）  配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）  配列番号１５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）  配列番号１７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５）  配列番号１９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６）  配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７）  配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８）  配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ９）  配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１０）  配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ１４）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）  配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）  配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）  配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）  配列番号２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）  配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６）  配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つヌクレオチド酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ１０）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項３３乃至５０に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５２】
請求項３３乃至５０に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
【請求項５３】
請求項５１に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
【請求項５４】
請求項５２又は５３に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項１乃至２５のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明者らは、骨代謝異常の治療及び／又は予防効果を有する物質を探索する目的で、破骨細胞の分化、成熟及び活性化の機構（メカニズム）の解明を目指した研究を行った結果、破骨細胞の分化、成熟に伴いＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子の発現が上昇することを見出した。また、本発明者らは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合する抗体により、破骨細胞の分化が抑制されることを見出した。さらに発明者らは、得られたラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒト化して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（１）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１乃至３個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列又は配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の１乃至１０９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の抗体の抗原結合断片。
（５）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の抗体。
（６）キメラ抗体であることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（７）配列番号８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（６）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（８）ヒト化されていることを特徴とする、（１）、（２）又は（４）記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（９）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、（６）又は（８）に記載の抗体。
（１０）破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）  配列番号１２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）  配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）  配列番号１６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）  配列番号１８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）  配列番号２０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）  配列番号２２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）  配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ８）  配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ９）  配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１０）  配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）  配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）  配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）  配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）  配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５）  配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ６）  配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１３）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１４）配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１５）配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１６）配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１７）配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１８）配列番号１４のアミノ酸配列に示される２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１９）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２０）配列番号１４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２１）配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２２）配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２３）配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２４）配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２５）（１１）乃至（２４）のいずれか一つに記載の抗体において、カルボキシル基末端側の１乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体。
（２６）（１）乃至（２５）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
（２７）骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（２６）に記載の医薬組成物。
（２８）（１）乃至（２５）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
（２９）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、（２７）又は（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（２９）に記載の医薬組成物。
（３１）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（３０）に記載の医薬組成物。
（３２）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（３１）に記載の医薬組成物。
（３３）（１）乃至（２５）に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（２７）若しくは（２８）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（３４）（１）乃至（２５）に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（２７）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後してして投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（３５）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（３３）又は（３４）に記載の治療及び／又は予防方法。
（３６）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（３５）に記載の治療及び／又は予防方法。
（３７）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（３６）に記載の治療及び／又は予防方法。
（３８）（１）乃至（２５）のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
（３９）（３８）に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１乃至３６３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１乃至３２７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
（４０）配列番号７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする（３９）に記載のポリヌクレオチド。
（４１）（３８）に記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）  配列番号１１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）  配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）  配列番号１５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）  配列番号１７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５）  配列番号１９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６）  配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７）  配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８）  配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ９）  配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１０）  配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ１１）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ａ１２）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ａ１３）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ１４）  ａ１）乃至ａ１０）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）  配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）  配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）  配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）  配列番号２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）  配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６）  配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ７）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ｂ８）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ｂ９）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ１０）  ｂ１）乃至ｂ６）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
（４２）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４３）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４４）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４５）配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４６）配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４７）配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４８）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（４９）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５０）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５１）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５２）配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５３）配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５４）配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５５）配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号２３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４１）に記載のポリヌクレオチド。
（５６）（３８）乃至（５５）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
（５７）（３８）乃至（５５）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
（５８）（５６）に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
（５９）（５７）又は（５８）に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む（１）乃至（２５）のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本明細書において、「１乃至数個」及び「１若しくは数個」なる記載がある場合の「数個」とは、２乃至１０個を示している。好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５もしくは６個以下、さらにより好ましくは、２もしくは３個である。
１．Ｓｉｇｌｅｃ−１５
本発明者らによって、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は巨細胞腫において特異的に発現していることが見出された。また、本発明者らによってＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５，  （１９８４）参照）。ラット抗ヒト抗体＃２４Ａ３由来のキメラ抗体の一例として、配列表の配列番号８の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１０の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質含有培養液の調製と精製
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（インビトロジェン社製）に組み込むことによりエントリークローンを作製した。このエントリークローンから、インサートのＣ末側にＶ５エピトープと６×Ｈｉｓタグが付加される様に設計されたディストネーションベクターであるｐＤＯＮＭに組み換えを行うことにより発現プラスミド（可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭ）を得た。可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭを２９３−Ｆ細胞にトランスフェクションし、６〜１２％  ＣＯ２濃度、３７℃で９６時間（４日間）攪拌培養した。培養液を回収し、遠心分離することにより可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質含有培養上清を調製した。得られた培養上清をＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて粗精製し、続いてＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて分画した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（還元条件下）と銀染色により可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の検出と純度検定を行った結果、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分に分子量約３５ｋＤａの蛋白質（可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質）が効率的に精製濃縮されたことが確認された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
３−２）ラット＃２４Ａ３とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインとの解離定数の測定
ラット＃２４Ａ３抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５Ｖ−ｓｅｔドメインの解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、抗体をリガンドとして固定化し、抗原をアナライトとして測定した。なお、対照となる抗体としてラット＃３２Ａ１抗体を使用した。ラット＃３２Ａ１抗体は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット及び第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレットに、その調製方法、並びに重鎖及び軽鎖の配列情報が記載されている。なお、ラット＃３２Ａ１抗体を産生するハイブリドーマ＃３２Ａ１は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（所在地：郵便番号３０５−８５６６  日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００８年８月２８日付けで寄託され、ａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃３２Ａ１の名称で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９９が付与されている。
＃３２Ａ１又は＃２４Ａ３抗体は、アミンカップリング法にてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へ固定化した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を介し、約５０ＲＵを結合させた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を用いた。抗体を結合したチップ上に、抗原の希釈系列溶液（０．００３-２ｎＭ）を流速９０μｌ／分で２３３秒間添加し、引き続き３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋｏｎ、解離速度定数ｋｏｆｆ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。その結果、ＫＤ値は＃３２Ａ１が１．５Ｅ−１０［Ｍ］、＃２４Ａ３が７．０Ｅ−１１［Ｍ］であり、＃２４Ａ３は＃３２Ａ１より約２倍強い親和性を有していた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
４−５）５’-ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる＃２４Ａ３の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
＃２４Ａ３の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ (Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)
及び
５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、上記４−３）で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
シークエンスプライマーとして、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した
５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ (Ｎｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
決定された＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示した。配列番号３のヌクレオチド配列及び配列番号４のアミノ酸配列は、図２にも記載されている。ヌクレオチド配列より決定された＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は上記４−１）で決定したＮ末端アミノ酸配列と一致した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
５−３）ヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖発現ベクターの構築
実施例４）で得られた＃２４Ａ３軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−ＬＫ／＃２４Ａ３」と命名した。作製されたヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖遺伝子は、配列表の配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有しており、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号９のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列がシグナル配列、アミノ酸番号２１乃至１２９に示されるアミノ酸配列が軽鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１３０乃至２３４で示されるアミノ酸配列が軽鎖定常領域に相当する。配列番号９のヌクレオチド配列及び配列番号１０のアミノ酸配列は、図４にも記載されている。
ヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖用プライマーセット
５’−ＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣ−３’（２４Ａ３Ｌ−Ｆ）
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（２４Ａ３Ｌ−Ｒ）
５−４）ヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖発現ベクターの構築
実施例４）で得られた＃２４Ａ３重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ２を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−Ｇ２／＃２４Ａ３」と命名した。作製されたヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖遺伝子は、配列表の配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有しており、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号８のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列がシグナル配列、２０乃至１４０番目に示されるアミノ酸配列が重鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１４１乃至４６６で示されるアミノ酸配列が重鎖定常領域に相当する。配列番号７のヌクレオチド配列及び配列番号８のアミノ酸配列は、図３にも記載されている。
ヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖用プライマーセット
５’−ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’（２４Ａ３Ｈ−Ｆ）
５’−ＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（２４Ａ３ＲＲ）
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の設計
ａ）＃２４Ａ３のヒト化バージョンの設計
ａ）−ｉ）＃２４Ａ３の可変領域の分子モデリング
＃２４Ａ３の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，D３０１−D３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定された＃２４Ａ３の可変領域と比較した。結果として、１２Ｅ８が、＃２４Ａ３の軽鎖の可変領域に対して同様にフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、２ＯＳＬが、＃２４Ａ３の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、＃２４Ａ３の軽鎖及び重鎖に対応する１２Ｅ８及び２ＯＳＬの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
ａ）−ｉｉ）ヒト化＃２４Ａ３に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化＃２４Ａ３抗体の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。＃２４Ａ３のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、ＨｕＭｃ３抗体がフレームワーク領域についての７４％の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。ＨｕＭｃ３についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、＃２４Ａ３についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された＃２４Ａ３の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化＃２４Ａ３配列を以下の実施例に記載されるように構築した。また、＃２４Ａ３の各ＣＤＲ中の１乃至３個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＣＤＲ改変ヒト化＃２４Ａ３配列についても以下の実施例に記載されるように構築した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
ｄ）＃２４Ａ３重鎖のヒト化（その２）
ｄ）−ｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖：
配列表の配列番号８に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３重鎖のアミノ酸番号２４（グルタミン）をバリンに、アミノ酸番号３０（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３１（スレオニン）をリジンに、アミノ酸番号３５（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３９（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号４３（スレオニン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号５７（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号５９（アルギニン）をアラニンに、アミノ酸番号６３（アラニン）をグリシンに、アミノ酸番号６７（イソロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号８６（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号８７（アラニン）をバリンに、アミノ酸番号８９（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号９０（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９１（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９９（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号１０１（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（スレオニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１０７（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１２２（セリン）をリジンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３重鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖」と命名した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
ｅ）＃２４Ａ３軽鎖のヒト化（その２）
ｅ）−ｉ）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖
配列表の配列番号１０に示されるヒトキメラ＃２４Ａ３軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号３３（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号３５（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号３７（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４１（メチオニン）をイソロイシンに、アミノ酸番号６０（スレオニン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号９３（フェニルアラニン）をロイシンに、アミノ酸番号９７（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号９８（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２２（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（アラニン）をスレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃２４Ａ３軽鎖を「ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖」と命名した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
８−３）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の重鎖発現ベクターの構築（その２）
８−３−１）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２タイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧ−３’（Ｈ２ｂ−Ｆ）
５’−ＧＴＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣ−３’（Ｈ２ｂ−Ｒ）
８−３−２）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−３−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｃタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣ−３’（Ｈ２ｃ−Ｆ）
５’−ＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧ−３’（Ｈ２ｃ−Ｒ）
８−３−３）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−３−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｄタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣ−３’（Ｈ２ｄ−Ｆ）
５’−ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧ−３’（Ｈ２ｄ−Ｒ）
８−３−４）ｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅタイプ重鎖発現ベクターの構築
８−３−１）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｂタイプ重鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｈ２ｅタイプ重鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣ−３’（Ｈ２ｅ−Ｆ）
５’−ＣＡＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣ−３’（Ｈ２ｅ−Ｒ）
８−４）ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体の軽鎖発現ベクターの構築（その２）
８−４−１）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖発現ベクターの構築
８−２）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｌ２ｂタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧ−３’（Ｌ２ｂ−Ｆ）
５’−ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧ−３’（Ｌ２ｂ−Ｒ）
８−４−２）ｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖発現ベクターの構築
８−２）で作製したｈ＃２４Ａ３−Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターをテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈ＃２４Ａ３−Ｌ３ｂタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。
プライマーセット：
５’−ＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧ−３’（Ｌ２ｂ−Ｆ）
５’−ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＴ−３’（Ｌ３ｂ−Ｒ）
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のキメラ抗体及びヒト化抗体のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
１０−１）キメラ抗体の結合性評価
ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインの解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、抗体をリガンドとして固定化し、抗原をアナライトとして測定した。なお、対照となる抗体としてヒトキメラ＃３２Ａ１抗体を使用した。ヒトキメラ＃３２Ａ１抗体は、国際公開第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレットに、その調製方法、並びに重鎖及び軽鎖の配列情報が記載されている。ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体又はヒトキメラ＃３２Ａ１抗体は、アミンカップリング法にてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へ固定化した抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を介し、約５０ＲＵを結合させた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を用いた。抗体を結合したチップ上に、抗原の希釈系列溶液（０．００３-２ｎＭ）を流速９０μｌ／分で２３３秒間添加し、引き続き３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋｏｎ、解離速度定数ｋｏｆｆ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。その結果、ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体のＫＤ値は１．７Ｅ−１１［Ｍ］であり、ヒトキメラ＃３２Ａ１抗体のＫＤ値は１．４Ｅ−１０［Ｍ］であった。ヒトキメラ＃２４Ａ３抗体はラット＃２４Ａ３抗体と同等以上の親和性を有していた。また、ヒトキメラ＃３２Ａ１抗体はラット＃３２Ａ１抗体と同等の親和性を有していた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
１０−２）ヒト化抗体の結合性評価
上記１０−１）と同様の方法によって、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃２４Ａ３のヒト化抗体のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性を評価した。その結果を表１に示す。
【国際調査報告】
2013147212.tif 000029
2013147212.tif 000030
2013147212.tif 000031
2013147212.tif 000032
2013147212.tif 000033
2013147212.tif 000034