(57)【要約】本発明は、Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明により、Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
（ｉ）試験化合物をＮｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞と接触させた場合の該細胞におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定し、（ｉｉ）試験化合物をＮｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞と接触させない場合の該細胞におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性の比較を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｉ）の場合におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性が、前記（ｉｉ）の場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性より高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物として選択する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）試験化合物をＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域の下流に標識遺伝子を連結した組換えベクターを導入した細胞と接触させた場合の該細胞における標識遺伝子の発現量または活性を測定し、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合の該細胞における標識遺伝子の発現量または活性を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合の標識遺伝子の発現量または活性の比較を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｉ）の場合における標識遺伝子の発現量または活性が、前記（ｉｉ）の場合の標識遺伝子の発現量または活性より高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物として選択する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の安定性を増強する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項７】
（ｉ）試験化合物をＮｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞と接触させた場合の該細胞におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定し、（ｉｉ）試験化合物をＮｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞に接触させない場合の該細胞におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量の比較を行うことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｉ）の場合におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量が、前記（ｉｉ）の場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量より高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物として選択する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試験化合物として、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞を用いてスクリーニングしたＮｒｆ１の安定性を増強する化合物を用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた化合物から、脂質分解を促進する化合物を選択することを含む、脂質分解を促進する化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、脂肪酸の代謝のための中心的な器官であり、脂肪酸は、トリグリセリド合成または酸化的代謝によって代謝される。これらの代謝プロセスは、部分的には転写レベルで調節され、異常調節は病的変化をもたらす。最も一般的な肝臓の変化は脂肪変性であり、これは、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、および最終的には肝細胞癌といった、脂質障害の進行性のカスケードに関連する。脂質代謝の転写ネットワークを理解することにより、これらの肝臓障害の発病についての新たな洞察が得られるであろう。
過去数十年間において、様々な転写因子が、肝臓の脂質代謝に関係があるとされてきた。例えば、ＰＰＡＲα（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ）は、脂肪酸の分解において重要な役割を有する。遊離脂肪酸などのリガンドに応答して、ＰＰＡＲαはそのコアクチベーターと複合体化し、その後、脂肪酸の酸化などの脂質代謝プロセスに関与する遺伝子の発現を誘発する。ＰＰＡＲαノックアウトマウスでは、ミトコンドリアのβ酸化の低下および飢餓誘導性の脂肪肝が観察される。さらに、ＳＲＥＢＰｓ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、脂質合成の主要な調節因子である。構成的に活性な形態のＳＲＥＢＰ１を発現するトランスジェニックマウスは、脂肪肝を発症する。さらに、新たな証拠は、肝臓の脂質代謝がまた、低酸素誘導性因子および小胞体ストレス誘導性転写因子などの様々なストレス誘導性の転写因子によっても調節されることを示唆している。したがって、エネルギー代謝は適応ストレス応答と強く連動していると考えられる。
Ｎｒｆ１（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １）およびＮｒｆ２は、Ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒ（ＣＮＣ）転写因子ファミリーのメンバーであり、これは、抗酸化酵素遺伝子および生体異物解毒酵素遺伝子の調節因子として特徴付けされている。定常状態では、Ｎｒｆ２は、Ｋｅａｐ１−Ｃｕｌ３  Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体によって迅速にユビキチン化され、ユビキチン−プロテアソーム経路によって分解される。親電子試薬または酸化ストレスに曝露されると、Ｎｒｆ２は核内に蓄積し、そこで小Ｍａｆタンパク質とヘテロ二量体を形成し、ＡＲＥ／ＥｐＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ／ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）への結合を介して遺伝子発現を活性化する。Ｎｒｆ２ノックアウトマウスは、ＡＲＥ依存性の細胞保護遺伝子の誘導の低下のため、ストレスに対する感受性の増大を示す（文献１）。最近の研究によって、Ｎｒｆ２もまた肝臓の脂質代謝に寄与することが明らかにされた。Ｎｒｆ２の欠失により、メチオニン−コリン欠損または高脂肪食により誘発される脂肪肝の迅速な発病および進行がもたらされ、このことは、肝臓の代謝におけるＮｒｆ２に仲介される防御系の重要性を示唆している。
Ｎｒｆ２とは対照的に、Ｎｒｆ１の分子機能はあまり定義されていない。Ｎｒｆ１は小胞体膜に固定されていることが報告されている（文献２）。しかし、いかにしてＮｒｆ１活性が調節されているかはあまり理解されていない。それでも、Ｎｒｆ１の機能的重要性は、遺伝子ターゲティングの研究によって実証されている。Ｎｒｆ１ノックアウトマウスは、貧血のため、１３．５日目に胚性致死となる（文献３）。Ｎｒｆ１中枢神経系特異的ノックアウトマウスは、進行性の運動失調、およびニューロンにおけるポリユビキチン化したタンパク質の蓄積を伴う神経変性を示す（文献４、文献５）。本発明者らのグループおよび他のグループは、Ｎｒｆ１肝細胞特異的ノックアウトマウスが脂肪肝を発症することを報告している（文献６、文献７）。最近の研究によって、Ｎｒｆ１がプロテアソームサブユニット遺伝子の誘導に関与することが示唆されている（文献８、文献２）。また、Ｎｒｆ１の分解がβ−ＴｒＣＰ（β−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＨｒｄ１により制御されているとの報告がある（文献９）。しかし、Ｎｒｆ１突然変異マウスにおける脂肪肝に関連する、下流の関連標的遺伝子は、依然としてほとんど分かっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ，Ｋ．ら、ＴＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３６：３１３−３２２．（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４０：１４７−１５８．（２０１０）
【非特許文献３】Ｃｈａｎ，Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：１７７９−１７８７．（１９９８）
【非特許文献４】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ａ．，ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １６：６９２−７０３．（２０１１）
【非特許文献５】Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０８：８４０８−８４１３．（２０１１）
【非特許文献６】Ｘｕ，Ｚ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２：４１２０−４１２５．（２００５）
【非特許文献７】Ｏｈｔｓｕｊｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３３５５４−３３５６２．（２００８）
【非特許文献８】Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３８：１７−２８．（２０１０）
【非特許文献９】Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：４５００−４５１２．（２０１１）
【発明の開示】
【０００４】
Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物は、脂肪肝などの疾患の予防・治療薬の候補化合物となり得る。このような状況下、Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法が求められていた。特に、Ｎｒｆ１特異的な化合物をスクリーニングできるような、生体内のＮｒｆ１の機能を反映したｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定系はこれまで知られていなかった。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。具体的には、肝臓の代謝に対するＮｒｆ１の寄与を明確にするために、本発明者らは、Ｎｒｆ１欠損肝臓の網羅的な遺伝子発現のパターンを調べた。本発明者らは、脂質およびアミノ酸の代謝ならびにミトコンドリアの呼吸機能に関連する遺伝子の発現が、Ｎｒｆ１欠損肝臓において異常調節されたことを見出し、このことは、Ｎｒｆ１機能の欠如によって、いくつかの代謝経路の異常調節がもたらされることを示唆していた。興味深いことに、これらの経路は、Ｎｒｆ２欠損マウスの肝臓でもＫｅａｐ１ノックダウン（ＫＤ）マウスの肝臓でも大きく変化せず、このことは、肝臓の代謝におけるＮｒｆ１およびＮｒｆ２の役割が異なることを示唆している。さらに、代謝の転写コアクチベーターであるＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルは、Ｎｒｆ１欠損肝臓において減少した。クロマチン免疫沈降分析によって、Ｎｒｆ１およびそのヘテロ二量体のパートナーであるＭａｆＧが、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥに動員されることが明らかになった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験によって、Ｎｒｆ１がＬｉｐｉｎ１遺伝子およびＰＧＣ−１β遺伝子のＡＲＥに結合し、転写を活性化することが確認された。これらのデータは、Ｎｒｆ１が、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現を直接的に制御する転写因子であることを示唆する。これらのことから、本発明者らは、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現量および／または活性を指標とすることで、Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングできることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物のスクリーニング方法、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物のスクリーニング方法、脂質分解を促進する化合物のスクリーニング方法などを提供する。
［１］Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
［２］（ｉ）試験化合物をＮｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞と接触させた場合の該細胞におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定し、（ｉｉ）試験化合物をＮｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞と接触させない場合の該細胞におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性の比較を行うことを含む、上記［１］に記載の方法。
［３］前記（ｉ）の場合におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性が、前記（ｉｉ）の場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性より高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物として選択する、上記［２］に記載の方法。
［４］（ｉ）試験化合物をＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域の下流に標識遺伝子を連結した組換えベクターを導入した細胞と接触させた場合の該細胞における標識遺伝子の発現量または活性を測定し、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合の該細胞における標識遺伝子の発現量または活性を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合の標識遺伝子の発現量または活性の比較を行うことを含む、上記［１］に記載の方法。
［５］前記（ｉ）の場合における標識遺伝子の発現量または活性が、前記（ｉｉ）の場合の標識遺伝子の発現量または活性より高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物として選択する、上記［４］に記載の方法。
［６］Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の安定性を増強する化合物をスクリーニングする方法。
［７］（ｉ）試験化合物をＮｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞と接触させた場合の該細胞におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定し、（ｉｉ）試験化合物をＮｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞に接触させない場合の該細胞におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量の比較を行うことを含む、上記［６］に記載の方法。
［８］前記（ｉ）の場合におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量が、前記（ｉｉ）の場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量より高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物として選択する、上記［７］に記載の方法。
［９］前記試験化合物として、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞を用いてスクリーニングしたＮｒｆ１の安定性を増強する化合物を用いる、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］さらに、上記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法により得られた化合物から、脂質分解を促進する化合物を選択することを含む、脂質分解を促進する化合物のスクリーニング方法。
本発明は、Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βは、Ｎｒｆ１により直接的に発現制御される遺伝子であることから、これらを用いることにより、Ｎｒｆ１特異的、かつ生体内でのＮｒｆ１の機能を反映したスクリーニング系とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、様々な代謝経路に関連する遺伝子のエンリッチメントを同定するためのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。（Ａ）Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓において下方調節（左側のパネル）または上方調節（右側のパネル）される遺伝子のＲｅａｃｔｏｍｅパスウェイ解析結果の表。（Ｂ）「脂肪酸代謝」、「酸化的リン酸化」、および「細胞周期の調節」に関与する遺伝子セットについてのＧＳＥＡヒストグラム。ｐ値は、全て０．００１より小さく、正規化されたエンリッチメントスコアは、それぞれ１．２８、１．５２、−１．７０である。各プロットの下部には、マイクロアレイにおいて観察された遺伝子発現のスペクトルが示されている。図の左側は、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおける発現の低減を示し、右側は発現の増大を示す。（Ｃ）脂肪酸の代謝経路における代表的な遺伝子（Ａｃｏｘ１、Ｈａｄｈ、Ａｋｒ１ｄ１、Ｈｍｇｃｓ２、およびＦａｄｓ１）の発現を、ｑＰＣＲによって調べた。（Ｄ）メチオニン代謝に関連する遺伝子（Ｍａｔ１ａ、Ａｈｃｙ、Ｇｎｍｔ、およびＮｎｍｔ）の発現を、ｑＰＣＲによって調べた。ＲＮＡ試料を６週齢のＮｒｆ１ｄＮ／＋（対照）マウスおよびＮｒｆ１ｄＮ／−：Ａｌｂ−Ｃｒｅ（ＣＫＯ）マウスの肝臓から調製した（Ｃ、Ｄ）。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表し、対応のないスチューデントｔ検定のｐ値は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１として示される。対照マウスにおける各遺伝子の発現を１に設定した。
図２は、マイクロアレイ分析によって、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウス、Ｎｒｆ２ノックアウトマウス、およびＫｅａｐ１  ＫＤマウスの肝臓における示差的な遺伝子発現プロファイルが明らかになったことを示す図である。（Ａ）マイクロアレイ分析に用いた遺伝子型が示される。（Ｂ）Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおける示差的に調節された遺伝子（ｐ≦０．０５（ｔ検定）で≧１．５倍の変化）のヒートマップ、ならびにＮｒｆ２ノックアウトマウスおよびＫｅａｐ１  ＫＤマウスについての発現データが示される。（Ｃ）Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて減少した遺伝子、Ｎｒｒ２ノックアウトマウスにおいて減少した遺伝子、およびＫｅａｐ１  ＫＤマウスにおいて増大した遺伝子の間でのオーバーラップの程度を示すベン図。（Ｄ〜Ｈ）脂質代謝（Ｄ）、アミノ酸代謝（Ｅ）、プロテアソームサブユニット（Ｆ）、ミトコンドリアの呼吸鎖（Ｇ）、および典型的なＮｒｆ２標的遺伝子（Ｈ）のカテゴリーに属する、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて示差的に発現した遺伝子のヒートマップが、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスおよびＫｅａｐ１  ＫＤマウスについての発現データと共に示される。ヒートマップの色は、対照マウスにおける各遺伝子の発現に対するｌｏｇ（２）倍変化の値を反映する。ここで用いられる遺伝子記号は、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＭＧＩ）データベースにおいて用いられるものと一致する。
図３は、Ｎｒｆ１欠損肝臓における肝臓の脂質代謝に関連する転写調節因子の発現の様子を示す図である。ｍＲＮＡの発現を、４週齢および６週齢のＮｒｆ１ｄＮ／＋（対照）マウスおよびＮｒｆ１ｄＮ／−：Ａｌｂ−Ｃｒｅ（ＣＫＯ）マウスの肝臓において、ｑＰＣＲによって調べた。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表し、対応のないスチューデントｔ検定のｐ値は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１として示される。対照マウスにおける各遺伝子の発現を１に設定した。
図４は、Ｎｒｆ１ノックダウンによって、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの発現が低減することを示す図である。Ｎｒｆ１を標的化するｓｈＲＮＡを安定して発現するＨｅｐａｌ細胞、または非サイレンシング対照遺伝子を用いた。ｍＲＮＡの発現を、５つの独立したクローンにおいて、ｑＰＣＲによって検出した。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１を表す。対照マウスにおける各遺伝子の発現を１に設定した。
図５は、Ｎｒｆ１およびＭａｆＧは、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥに動員されることを示す図である。（Ａ）ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの調節領域において見られるＭＡＲＥおよびＡＲＥのアラインメント。染色体の番号および染色体上の位置は、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）に従って示される。（Ｂ、Ｃ）正常なＩｇＧ（黒色のバー）および抗Ｎｒｆ１抗体または抗ＭａｆＧ抗体（白色のバー）を用いて、Ｈｅｐａｌ細胞のクロマチン抽出物でＣｈＩＰアッセイを行い、ＰＰＡＲαのプロモーター（Ｐ）および５’ＵＲＴ（Ｕ）、Ｌｉｐｉｎ１のプロモーターおよびイントロン（Ｉ）、ならびにＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥに隣接するプライマーを用いて、ｑＰＣＲによって分析した。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。挿入図は、ＰＰＡＲα遺伝子およびＬｉｐｉｎ１遺伝子についてのＣｈＩＰ分析の拡大されたグラフである。
図６は、Ｎｒｆ１はＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写を活性化することを示す図である。（Ａ〜Ｃ）Ｈｅｐａｌ細胞を、Ｎｒｆ１発現ベクターを伴って、または伴わずに、Ｌｉｐｉｎ１プロモーター（Ａ）、Ｌｉｐｉｎ１イントロン（Ｂ）、またはＰＧＣ−１βイントロン（Ｃ）のＡＲＥを含むルシフェラーゼレポーター構築物でコトランスフェクトした。平均値±Ｓ．Ｄが示され、ｎ＝３である。縦軸は、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を示す。エフェクタープラスミドの非存在下でのホタルルシフェラーゼ活性を１に設定する。（Ｄ）Ｎｑｏ１プロモーター領域、Ｌｉｐｉｎ１プロモーター領域、Ｌｉｐｉｎ１イントロン領域、およびＰＧＣ−１βイントロン領域のＡＲＥを含む、ビオチン標識したプローブを用いて、ＥＭＳＡ分析を行った。組換えＭａｆＧおよび／またはＮｒｆ１またはＮｒｆ２タンパク質をプローブと共にインキュベートし、タンパク質−ＤＮＡ複合体および遊離プローブを電気泳動によって分離した。（Ｅ）野生型（Ｗ）および突然変異型（Ｍ）オリゴヌクレオチドの配列が示される。突然変異型配列には下線が引かれている。（Ｆ）Ｎｒｆ２タンパク質およびＭａｆＧタンパク質を、２００倍モル濃度過剰な未標識の競合ＤＮＡの存在下または非存在下で、組み合わせてインキュベートした。白色の矢じり印は、Ｎｒｆ１／ＭａｆＧヘテロ二量体複合体を示し、黒色の矢じり印はＮｒｆ２−ＭａｆＧヘテロ二量体複合体を示し、矢印はＭａｆＧホモ二量体複合体を示す。
図７は、Ｎｒｆ２は、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの調節に関与しないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）１００μＭのＤＥＭもしくはＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）で６時間にわたり処理したＨｅｐａｌ細胞（Ａ）またはＫｅａｐ１  ＫＤマウスの肝臓（Ｂ）における、Ｎｑｏ１、Ｇｃｌｃ、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの発現。ｍＲＮＡの発現を、ｑＰＣＲによって分析した。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。（Ｃ〜Ｆ）抗Ｎｆｒ２抗体（Ｃ、Ｄ）または抗ＭａｆＧ抗体（Ｅ、Ｆ）を用いて、１００μＭのＤＥＭもしくはＤＭＳＯ（Ｖｅｈ）で４時間にわたり処理したＨｅｐａｌ細胞（Ｃ、Ｅ）のクロマチン抽出物またはＫｅａｐ１  ＫＤマウスの肝臓（Ｄ、Ｆ）のクロマチン抽出物で、ＣｈＩＰ分析を行った（白色のバー）。正常なＩｇＧを陰性対照として用いた（黒色のバー）。免疫沈降したＤＮＡの量を、Ｎｑｏ１プロモーター、Ｌｉｐｉｎ１プロモーター、ならびにＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域に隣接するプライマーを用いて、ｑＰＣＲによって分析した。トロンボキサンシンターゼ（Ｔｘ）遺伝子の３番目のイントロンを陰性対照として用いた。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。
図８は、Ｎｅｏ欠失（ｄＮ）対立遺伝子を用いる、Ｎｒｆ１  ＣＫＯの生成のようすを示す図である。（Ａ）Ｎｒｆ１の野生型（ＷＴ）対立遺伝子、Ｎｒｆ１のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子、ｄＮ対立遺伝子、およびＮｒｆ１を欠失させた（ＫＯ）対立遺伝子の構造を示す。Ｎｅｏ遺伝子を、Ｎｒｆ１のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子から取り除き、遍在性のＣｒｅレコンビナーゼを発現するＡｙｕ１−Ｃｒｅマウスと交配させることによって、ｄＮ対立遺伝子を生じさせた。（Ｂ）３、４、および６週齢のＮｒｆ１  ＣＫＯマウスおよび対照マウスの肝臓におけるＮｒｆ１のｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって調べた。（Ｃ）Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスおよび対照マウスにおける血清ＡＬＴ活性を調べた。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。Ｕ、単位。（Ｄ〜Ｇ）３週齢（Ｄ、Ｅ）および５週齢（Ｆ、Ｇ）のＮｒｆ１ｄＮ／＋（対照）マウスおよびＮｒｆ１ｄＮ／−：Ａｌｂ−Ｃｒｅ（ＣＫＯ）マウスの肝臓切片を、オイルレッドＯで染色した。スケールバーは、１００μｍに相当する。
図９は、Ｎｒｆ１−ルシフェラーゼ融合タンパク質発現細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す図である。（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ，Ｍｅａｎ±ＳＤ）
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．Ｎｒｆ１、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１β
１．１．Ｎｒｆ１
「Ｎｒｆ１」（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １）は、ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒ（ＣＮＣ）転写因子ファミリーのメンバーである。Ｎｒｆ１は、代謝を含む様々な生物学的プロセスにとって重要な調節因子と見なされている。Ｎｒｆ１は細胞質から核内に移行してＭａｆタンパク質とヘテロ二量体を形成することでＡＲＥ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列に結合し、標的遺伝子を活性化する。Ｎｒｆ１の標的遺伝子は、例えば、Ｌｉｐｉｎ１、ＰＧＣ−１β等の遺伝子である。
本発明において、Ｎｒｆ１は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトＮｒｆ１の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００３２０４（ｇｅｎｅ）（配列番号：１）およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００３１９５（ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号：２）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。マウスＮｒｆ１の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００８６８６（ｇｅｎｅ）（配列番号：３）およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３２７１２（ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号：４）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
本明細書中では、Ｎｒｆ１は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Ｎｒｆ１のアミノ酸配列中の１〜複数個（例えば、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
実質的に同質の活性としては、例えば、Ｎｒｆ１標的遺伝子の転写促進活性、ＡＲＥ結合活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同等であることを示す。したがって、ＡＲＥ結合活性、Ｎｒｆ１標的遺伝子の転写促進活性等が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
なお、本明細書中、「Ｎｒｆ１」は一般的にＮｒｆ１タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Ｎｒｆ１遺伝子のことを意味する場合もある。
１．２．Ｌｉｐｉｎ１
「Ｌｉｐｉｎ１」は、Ｌｉｐｉｎ２、Ｌｉｐｉｎ３等とともにＬｉｐｉｎファミリーに属するタンパク質である。Ｌｉｐｉｎ１は細胞内局在の違いによる２つの脂質代謝調節機能が知られている。１つ目として、Ｌｕｐｉｎ１は、小胞体膜上においてホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有する。２つ目として、Ｌｉｐｉｎ１は、核内においてＰＰＡＲα／ＰＧＣ−１α調節経路のコアクチベーターとしても作用し、脂肪酸の酸化的代謝を正方向に調節する。
本発明において、Ｌｉｐｉｎ１は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトＬｉｐｉｎ１の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１４５６９３（ｇｅｎｅ）（配列番号：５）およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿６６３７３１（ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号：６）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。マウスＬｉｐｉｎ１の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１７２９５０（ｇｅｎｅ）（配列番号：７）およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿７６６５３８（ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号：８）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
本明細書中では、Ｌｉｐｉｎ１は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Ｌｉｐｉｎ１のアミノ酸配列中の１〜複数個（例えば、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
実質的に同質の活性としては、例えば、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、ＰＰＡＲα／ＰＧＣ−１α調節経路のコアクチベーター活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同等であることを示す。したがって、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、ＰＰＡＲα／ＰＧＣ−１α調節経路のコアクチベーター活性等が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
なお、本明細書中、「Ｌｉｐｉｎ１」は一般的にＬｉｐｉｎ１タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子のことを意味する場合もある。
１．３．ＰＧＣ−１β
「ＰＧＣ−１β」（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １β）は、ＥＲＲα（ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α）およびｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １の共活性化に必要なタンパク質である。ＰＧＣ−１βノックアウトマウスは、ミトコンドリアの酸化的代謝遺伝子の発現の変化および高脂肪飼料誘発性の脂肪肝を示す。
本発明において、ＰＧＣ−１βは、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトＰＧＣ−１βの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１３３２６３（ｇｅｎｅ）（配列番号：９）およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿５７３５７０（ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号：１０）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。マウスＰＧＣ−１βの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１３３２４９（ｇｅｎｅ）（配列番号：１１）およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿５７３５１２（ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号：１２）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
本明細書中では、ＰＧＣ−１βは、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記ＰＧＣ−１βのアミノ酸配列中の１〜複数個（例えば、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
実質的に同質の活性としては、例えば、ＥＲＲαおよびｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １の共活性化活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同等であることを示す。したがって、ＥＲＲαおよびｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １の共活性化活性等が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
なお、本明細書中、「ＰＧＣ−１β」は一般的にＰＧＣ−１βタンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、ＰＧＣ−１β遺伝子のことを意味する場合もある。
２．スクリーニング方法
２．１．Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物のスクリーニング方法
本発明は、Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを用いて、試験化合物からＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物は、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物またはＮｒｆ１の活性を阻害する化合物をいう。好ましくは、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物である。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を指標として、Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の別の好ましい態様は、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域の下流に標識遺伝子を連結し、その標識遺伝子の発現量または活性を指標としてＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様では、例えば、（ｉ）試験化合物をＮｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞と接触させた場合の該細胞におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定し、（ｉｉ）試験化合物をＮｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞に接触させない場合の該細胞におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性の比較を行う。
本方法においては、まず、Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞に、試験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウスなど由来の細胞であり、好ましくは、ヒト由来の細胞である。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞」は、例えば、肝細胞、肝癌由来細胞株などである。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Ｎｒｆ１とＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βとを発現する細胞」は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することもできる。
次に、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、それぞれの場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を測定する。原則、発現量を測定することが好ましいが、発現量の代替指標として活性を測定してもよい。活性の強さは発現量に比例する。Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性の測定は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。例えば、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量は、マイクロアレイ、ＰＣＲ、抗体などを用いて検出することができる。
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を増強（または阻害）する化合物を選択する。例えば、上記（ｉ）の場合におけるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性が、上記（ｉｉ）の場合のＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性より高くなる試験化合物、特には、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上高くなる試験化合物を、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を増強する試験化合物として選択する。このようにして選択されたＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を増強する試験化合物は、Ｎｒｆ１の活性を増強する化合物であり得る。同様にＮｒｆ１の活性を阻害する化合物は、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βの発現量または活性を低下させることを指標に選択すればよい。
本発明のスクリーニング方法の別の好ましい態様では、Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域の下流に標識遺伝子を連結し、その標識遺伝子の活性を指標としてＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする。
本方法では、例えば、（ｉ）試験化合物をＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域の下流に標識遺伝子を連結した組換えベクターを導入した細胞と接触させた場合の該細胞における標識遺伝子の発現量または活性を測定し、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合の該細胞における標識遺伝子の発現量または活性を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合の標識遺伝子の発現量または活性の比較を行う。
本方法で用いるＬｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域は、図５Ａに示された塩基配列を含むものであり、好ましくは、配列番号：１３（ＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＣ）または配列番号：１４（ＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣ）の塩基配列を含むものである。標識遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子を用いることができる。Ｌｉｐｉｎ１および／またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥ領域の下流に標識遺伝子を連結した組換えベクター、および該組換えベクターを導入した細胞は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。用いる細胞は特に限定はされないが、哺乳動物由来細胞が好ましく、肝細胞、肝癌由来細胞株などが好適である。また、該細胞には、Ｎｒｆ１を発現する組換えベクターを導入してもよい。内在のＮｒｆ１と用いるか、Ｎｒｆ１を外来的に発現させるかは、用いる細胞種や測定系の感度に応じて、適宜選択し得る。
次に、標識遺伝子の発現量または活性を測定する。ここでいう標的遺伝子の活性とは、標識遺伝子の発現の結果産生される標識蛋白質（ルシフェラーゼ等）の活性を意味する。標的遺伝子の活性の強さは、標識遺伝子の発現量に比例するので、活性を測定することにより発現量を算出することができる。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、それぞれの場合の標識遺伝子の発現量または活性を測定する。標識遺伝子の発現量または活性の測定は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、標識遺伝子の発現量または活性を増強（または阻害）する化合物を選択する。例えば、上記（ｉ）の場合における標識遺伝子の発現量または活性が、上記（ｉｉ）の場合の標識遺伝子の発現量または活性より高くなる試験化合物、特には、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上高くなる試験化合物を、Ｎｒｆ１の活性を増強する試験化合物として選択する。同様にＮｒｆ１の活性を阻害する化合物は、標識遺伝子の発現量または活性を低下させることを指標に選択すればよい。
２．２．Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物のスクリーニング方法
本発明は、さらに、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞を用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の安定性を増強する化合物をスクリーニングする方法（以下では「一次スクリーニング方法」という場合がある）を提供する。本発明の一次スクリーニング方法により得られたＮｒｆ１の安定性を増強する化合物を、前記Ｎｒｆ１の活性を調節する化合物のスクリーニング方法（以下では、「二次スクリーニング方法」という場合がある）における試験化合物として用いることができる。本発明の一次スクリーニング方法を用いることで、続く二次スクリーニング方法によりＮｒｆ１特異的な化合物を得ることができる。
本発明の一次スクリーニング方法で用いる試験化合物は、前記と同様である。Ｎｒｆ１は、定常状態ではプロテアソームにより分解されており、活性化刺激によりその分解系から脱し、Ｎｒｆ１のタンパク質が安定化することで、標的遺伝子の転写活性化を行なうと考えられている。Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質を細胞に発現させても、定常状態では分解されてしまう。ここに、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物を接触させた場合、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質の分解が抑制され、検出できる標識タンパク質の量が増加する。
「Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質」は、Ｎｒｆ１と標識タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色タンパク質）との融合タンパク質のことを指す。
より具体的には、本発明の一次スクリーニング方法の好ましい態様では、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質量を指標として、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物をスクリーニングする。例えば、（ｉ）試験化合物をＮｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞と接触させた場合の該細胞におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定し、（ｉｉ）試験化合物をＮｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞に接触させない場合の該細胞におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定し、（ｉｉｉ）前記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量の比較を行う。
本方法においては、まず、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質発現細胞に、試験化合物を接触させる。用いる細胞は特に限定はされないが、哺乳動物由来細胞が好ましく、肝細胞、肝癌由来細胞株などが好適である。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質細胞」は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
次に、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、それぞれの場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量を測定する。Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質量の測定は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。具体的には、融合タンパク質の標識タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色タンパク質）の活性を測定する。
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Ｎｒｆ１−標識融合タンパク質量が増える化合物を選択する。例えば、上記（ｉ）の場合におけるＮｒｆ１−標識融合タンパク質量が、上記（ｉｉ）の場合のＮｒｆ１−標識融合タンパク質量より増える試験化合物、特には、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上増える試験化合物を、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物として選択することができる。
２．３．Ｎｒｆ１ＫＯ細胞および／またはＮｒｆ２ＫＯ細胞を組み合わせてスクリーニングする方法
本発明は、さらに、Ｎｒｆ１ＫＯ細胞および／またはＮｒｆ２ＫＯ細胞を用いることを含む、試験化合物からＮｒｆ１の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
Ｎｒｆ１ＫＯ（ノックアウト）細胞は、内在性のＮｒｆ１を保有しない。前述の一次スクリーニング方法および／または二次スクリーニング方法で得られた化合物について、Ｎｒｆ１ＫＯ細胞を用いて、一次スクリーニング方法および／または二次スクリーニング方法と同様の試験を行うことにより、化合物の作用がＮｒｆ１特異的か否かを判定することが可能となる。Ｎｒｆ１ＫＯ細胞としては、例えば、Ｎｒｆ１ＫＯマウス（文献３）由来のＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ｆｉｒｏｂｌａｓｔｓ）を用いることができる。また、Ｎｒｆ１肝細胞特異的ＫＯマウス（文献７）由来の肝細胞を用いてもよい。
Ｎｒｆ２ＫＯ（ノックアウト）細胞は、内在性のＮｒｆ２を保有しない。前述の一次スクリーニング方法および／または二次スクリーニング方法で得られた化合物について、Ｎｒｆ２ＫＯ細胞を用いて、一次スクリーニング方法および／または二次スクリーニング方法と同様の試験を行うことにより、化合物がＮｒｆ１のみではなくＮｒｆ２にも作用を示すものか否かを判定することが可能となる。Ｎｒｆ２ＫＯ細胞としては、例えば、Ｎｒｆ２ＫＯマウス（文献１）由来のＭＥＦや肝細胞を用いることができる。Ｎｒｆ１ＫＯ細胞およびＮｒｆ２ＫＯ細胞を組み合わせて用いることで、Ｎｒｆ２に作用せず、Ｎｒｆ１に特異的に作用する化合物を同定することが可能となる。
２．４．脂質分解を促進する化合物のスクリーニング方法
前記スクリーニング方法により得られたＮｒｆ１の活性を増強する化合物は、脂質分解を促進する化合物の候補化合物となる。
そこで、さらに、選択された候補化合物を実験動物（例、マウス、ラットなど）に投与して、選択された候補化合物の脂質分解促進効果を確認する。例えば、脂肪肝を発症する公知のモデル動物（例、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ−ＮＡＳＨマウス、ＦＬＳマウス、Ｚｕｃｋｅｒ−ｆａ／ｆａラットなど）に化合物を投与し、脂質分解促進効果を確認することができる。
脂質分解を促進する化合物は、例えば、肝臓障害（例、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌等）、高脂血症等の予防・治療薬として用いることができる。
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願２０１２−０１１８３３号（２０１２年１月２４日出願）の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を参照して組み込むものとする。
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例１】
【０００７】
１．１  材料および方法
１．１．１  ＤＮＡ構築物
レポーター分析のために、ＡＲＥを含む以下の配列：
Ｌｉｐｉｎ１プロモーター（５’−ＡＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＧ−３’；配列番号：１５）、Ｌｉｐｉｎ１イントロン（５’−ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＣＧＧ−３’；配列番号：１６）、およびＰＧＣ−１βイントロン（５’−ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＡＡ−３’；配列番号：１７）
に、ＭｌｕＩ部位およびＮｈｅＩ部位を隣接させ、ｐＲＢＧＰ３ベクター（Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ３６７：５６８−５７２．（１９９４））内にクローニングして、Ｌｉｐｉｎ１プロモーターＡＲＥ−Ｌｕｃ、Ｌｉｐｉｎ１イントロンＡＲＥ−Ｌｕｃ、およびＰＧＣ−１βイントロンＡＲＥ−Ｌｕｃをそれぞれ生じさせた。
Ｎｒｆ１を標的化する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現構築物は、ヒトＮｒｆ１遺伝子とマウスＮｒｆ１遺伝子の両方のコード領域内に存在する１９ｍｅｒの以下の配列：（５’−ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  Ｇ−３’；配列番号：１８）、その後に続く相補的な１９ヌクレオチドの配列に基づくものであり、これを、９ヌクレオチドの以下の配列：（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）によって隔て、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）のＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの部位内にクローニングした。
Ｎｒｆ１のカルボキシル末端側の半分を発現する構築物を生じさせるために、マウスＮｒｆ１のｃＤＮＡ（Ｇ３４１〜Ｋ７４１）を、鋳型である３×ＦＬＡＧ−Ｎｒｆ１と以下のプライマー：フォワードプライマー（５’−ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ−３’：配列番号：１９）およびリバースプライマー（５’−ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧＧ−３’：配列番号：２０）とを用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングして、６×Ｈｉｓ−Ｎｒｆ１ＣＴを生じさせた。
１．１．２  マウス
Ｎｒｆ１コンディショナル対立遺伝子およびＮｒｆ１ノックアウト対立遺伝子（文献７）、Ｎｒｆ２ノックアウト対立遺伝子（文献１）、ならびにＫｅａｐ１  ＫＤ対立遺伝子（Ｔａｇｕｃｈｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３０：３０１６−３０２６．（２０１０））は、公知のものを用いた。アルブミン（Ａｌｂ）−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。マウスには水および齧歯動物用飼料を自由に摂取させ、特定病原体不在の条件下で維持した。全てのマウスは、東北大学の実験動物の人道的な飼育および使用のための基準ならびに日本の文部科学省の動物実験の適正な実施に向けたガイドラインの規程に従って扱った。
１．１．３  組織学的分析および生化学的分析
肝臓の脂質含有量を可視化するために、肝臓をＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）中に包埋した。凍結した切片をオイルレッドＯ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。血漿中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を、公知の手法を用いて測定した（文献７）。
１．１．４  ＲＮＡ精製および定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ  ＲＮＡ抽出キット（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を用いて抽出し、Ｓｕｐｅｒ−ｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＴａｑＭａｎプローブまたはＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎおよびＡＢＩ７３００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＰＣＲマスターＭｉｘを用いてｑＰＣＲを実施した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（Ｎｑｏ１）、グルタミン−システインリガーゼ触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ）、およびチオレドキシンレダクターゼ  １（Ｔｘｎｒｄ１）検出のためのプライマーおよびプローブは、公知のものを用いた（Ｋａｔｓｕｏｋａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８０４４−８０５１．（２００５））。発現レベルは、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の発現レベルに対して正規化した。
１．１．５  マイクロアレイ分析およびデータマイニング
各遺伝子型の雌マウスから得た３つの独立したＲＮＡ試料を、マイクロアレイ分析に用いた。Ａｇｉｌｅｎｔの４×４４Ｋ  Ｗｈｏｌｅ−Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔのプロトコルに従って、ハイブリダイズし、洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンした。発現データを、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて統計分析した。パスウェイ分析は、Ｒｅａｃｔｏｍｅパスウェイエンリッチメントツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ）を用いて行った。遺伝子セット分析は、遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）法をデフォルトパラメータとして用いて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ）行った。Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０ソフトウェアをクラスタリングに用い、ＪＡＶＡ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗを用いて結果を可視化した（ｈｔｔｐ：／／ｊｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）。
１．１．６  ＣｈＩＰアッセイ
ＣｈＩＰアッセイは公知の手法に準じて行った（Ｓｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  １０３：８４３−８５２．（２０００））。簡潔に述べると、肝組織または肝細胞を１％ホルムアルデヒドで、室温で５分間にわたり固定し、その後、０．１２５Ｍのグリシンでクエンチングした。固定した試料を溶解し、超音波処理した。抗体のインキュベーションを４℃で一晩行った。６５℃で２時間にわたり架橋をほどいた。精製したＤＮＡをｑＰＣＲによって分析した。用いた抗体は、抗Ｎｒｆ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１３０３１）、抗Ｎｒｆ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１３０３２）、および抗ＭａｆＧ、および正常ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０２７）であった。免疫沈降した試料から得られた値は、インプットＤＮＡに対して正規化した。
１．１．７  細胞培養および安定な細胞系の生成
マウス肝癌細胞系Ｈｅｐａｌｃｌｃ７（Ｈｅｐａｌ）を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｗａｋｏ）内で培養した。Ｎｒｆ１ノックダウン細胞系を確立するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｎｒｆ１  ｓｈＲＮＡプラスミドをＨｅｐａｌ細胞内にトランスフェクトした。安定な形質転換体を２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択し、いくつかのクローン細胞系を確立した。Ｎｒｆ２の活性を誘発するために、Ｈｅｐａｌ細胞を１００μＭのジエチルマレイン酸（ＤＥＭ）またはＤＭＳＯで４時間または６時間にわたり処理した。
１．１．８  ルシフェラーゼアッセイ
Ｈｅｐａｌ細胞を、２４ウェルプレート内に、ウェル当たり２×１０５個細胞の密度で播種した。前記のｐＲＢＧＰ３ルシフェラーゼベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｎｒｆ１発現ベクターおよびｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ありまたはなしで、コトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。全ての試料は３組調製した。
１．１．９  電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは公知の手法に準じて行った。簡潔に述べると、発現ベクター６×Ｈｉｓ−Ｎｒｆ１ＣＴ、６×Ｈｉｓ−Ｎｒｆ２ＣＴ、および６×Ｈｉｓ−ＭａｆＧ１−１２３を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に形質転換し、誘導されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。１０μｌの結合緩衝液中の５’ビオチン標識されたＤＮＡプローブおよび精製されたタンパク質を用いて、結合反応を行った。競合アッセイにおいて、２００倍過剰な、未標識のアニーリングしたＤＮＡを添加した。反応物を室温で２０分間にわたりインキュベートし、反応混合物を５％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上にロードし、Ｚｅｔａ  Ｐｒｏｂｅナイロン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  ＥＭＳＡ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可視化した。
１．２  結果
１．２．１  Ｎｒｆ１の欠損により、様々な肝細胞機能が低下する。
肝臓の代謝に対するＮｒｆ１の寄与を明確にするために、本発明者らは、Ｎｒｆ１欠損肝臓における網羅的な遺伝子発現のパターンを調べた。この目的のために、Ｎｒｆ１のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を有するマウスを用いた（文献７）。本実施例のために、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子を、Ｎｒｆ１のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子から事前に取り除き、Ｎｒｆ１遺伝子の効率的な欠失を可能にした（詳細は図８Ａを参照されたい）。得られたＮｒｆ１  Ｎｅｏ欠失（ｄＮ）対立遺伝子を、Ａｌｂ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと組み合わせて用いて、肝細胞におけるＮｒｆ１の発現を特異的にノックアウトした。Ｎｒｆ１肝細胞特異的コンディショナルノックアウトマウス（Ｎｒｆ１  ＣＫＯ、Ｎｒｆ１ｄＮ／−：Ａｌｂ−Ｃｒｅ）は、Ｎｒｆ１の発現の進行性の喪失に従って、４週齢で血漿中ＡＬＴレベルの顕著な増大を示した（図８ＢおよびＣ）。３週齢のＮｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓では明らかな脂質の堆積は見られなかったが（図８ＤおよびＥ）、５週齢のＮｒｆ１欠損肝臓では脂質の蓄積の増大が観察された（図８ＦおよびＧ）。これらの結果は、Ｎｒｆ１のＡｌｂ−Ｃｒｅに仲介される除去によって、すぐに脂質の代謝が低下することを示した。
そこで、本発明者らは、マイクロアレイ分析を用いて、６週齢のＮｒｆ１  ＣＫＯマウスおよび対照マウス（Ｎｒｆ１ｄＮ／＋）において肝臓の転写プロファイリングを行った。代謝に影響し得る、屠殺の週齢および時期の差を最小化するために、全ての動物はツァイトゲーバータイム９（消灯の３時間前）に屠殺した。ｐが０．０５以下（ｔ検定）で１．５倍以上の変化という統計的基準を用いて、本発明者らは、対照マウスと比較して、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて、およそ１５００の上方調節された遺伝子および１７００の下方調節された遺伝子を同定した。Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを用いて、示差的に発現した遺伝子を既知のパスウェイにマッピングした。従来の知見（文献２、８）と一致して、プロテアソームサブユニット遺伝子の発現レベルは、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて減少し（図１Ａ）、このことは、Ｎｒｆ１が正常な条件下で肝臓において実際に機能的であることを示唆している。さらに、脂質およびアミノ酸の代謝ならびにミトコンドリアの呼吸鎖に関与する遺伝子は、下方調節された遺伝子セットの間で大きな比率を占めていた（図１Ａ）。しかし、細胞周期およびＤＮＡ複製に関与する遺伝子は、上方調節された遺伝子セットにおいて大きな比率を占めており（図１Ａ）、このことは、細胞周期の調節が、Ｎｒｆ１欠損マウスの肝臓において異常であることを示唆している。これらの観察をさらに確認するために、全ての細胞発現データをＧＳＥＡに供した。ここでも、脂質代謝およびミトコンドリアの呼吸鎖に関連する遺伝子セットならびに細胞周期に関連する遺伝子セットは、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいてそれぞれ、下方調節された遺伝子および上方調節された遺伝子の間でエンリッチされていた（図１Ｂ）。
脂肪酸の代謝に関与するＰＰＡＲα標的遺伝子の異常調節によって脂肪肝が生じ得ることから、本発明者らは次に、これらの遺伝子の発現に注目した（図１Ｃ）。ｑＰＣＲの結果によって、ａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｏｘｉｄａｓｅ  １，ｐａｌｍｉｔｏｙｌ（Ａｃｏｘ１）、ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｈａｄｈ）、ｌｄｏ−ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒＤ１（Ａｋｒ１ｄ１）、３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２（Ｈｍｇｃｓ２）、およびｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  １（Ｆａｄｓ１）などの、ＰＰＡＲα標的遺伝子の発現が、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスで減少したことが確認された（図１Ｃ）。本発明者らはまた、ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｄｅｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ（Ｍａｔ１  α）、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ａｈｃｙ）、ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｇｎｍｔ）、およびｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｎｎｍｔ）などの、メチオニン代謝に関連するいくつかの遺伝子もまた、Ｎｒｆ１欠損マウスの肝臓において下方調節されることにも気付いた（図１Ｄ）。これらの結果を組み合わせると、Ｎｒｆ１の欠損によって、脂質およびアミノ酸の代謝を含む様々な肝細胞機能が低下することが明らかに示された。
１．２．２  Ｎｒｆ１によって調節される遺伝子セットは、Ｎｒｆ２機能の喪失および獲得によって有意に影響されない。
Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２が機能的特徴を共有することが報告されており、したがって、これらの遺伝子も同様に同一の遺伝子セットを調節する可能性があり得る。この可能性を試験するために、本発明者らは、マイクロアレイ分析によって、Ｎｒｆ１欠損マウスの肝臓の遺伝子発現プロファイルと比較して、Ｎｒｔ２ノックアウトマウスおよびＮｒｆ２が構成的に活性化されたＫｅａｐ１  ＫＤ（Ｋｅａｐ１ＫＤ／−）マウスの肝臓における遺伝子発現プロファイルを調べた（図２Ａ）。Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて下方調節された遺伝子の間で、ほんの一部の発現が、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスまたはＫｅａｐ１  ＫＤマウスにおいて有意に変化した（図２ＢおよびＣ）。したがって、本発明者らは、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて低下した同一の代謝経路がＮｒｆ２ノックアウトマウスまたはＫｅａｐ１  ＫＤマウスにおいても変化するかどうかを調べた。結果は、脂質代謝（図２Ｄ）、アミノ酸代謝（図２Ｅ）、プロテアソーム分解（図２Ｆ）、およびミトコンドリアの呼吸鎖（図２Ｇ）に関連する経路が、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスまたはＫｅａｐ１  ＫＤマウスにおいて大きくは影響されないことを示した。しかし、第ＩＩ相解毒酵素遺伝子および抗酸化酵素遺伝子などの、典型的なＮｒｆ２標的遺伝子は、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスまたはＫｅａｐ１  ＫＤマウスにおいてそれぞれ有意に低減するかまたは誘導された（図２Ｈ）。したがって、これらの結果は、Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２が肝臓の代謝において異なる役割を有することを強く示唆する。
１．２．３  肝臓における代謝の転写調節因子のＮｒｆ１依存性の発現。
次に、本発明者らは、代謝経路の調節に対するＮｒｆ１の寄与を特徴付けした。マイクロアレイ分析を用いて、本発明者らは、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βなどの、いくつかの代謝転写因子遺伝子およびコアクチベーター遺伝子の発現が、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓において減少することを観察した。代謝経路のＮｒｆ１依存性の調節についての洞察を得るために、本発明者らは、これらの候補および肝臓の代謝に関与するいくつかの調節因子のｍＲＮＡ発現レベルを調べた。マイクロアレイ分析のデータと一致して、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの発現は、６週齢のＮｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓において減少した（図３）。対照的に、ＰＧＣ−１αおよびＳＲＥＢＰ１の発現は、対照およびＮｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて有意には変化しなかった（図３）。ＰＰＡＲα転写産物は、対照マウスと比較して、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて増加した（図３）。同様の結果が、重篤な脂肪肝を有さない４週齢のＮｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて得られた（図３）。これらによって、Ｎｒｆ１は、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの重要な調節因子として関連付けられた。
ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βのｍＲＮＡの低減が脂肪肝の二次的なものであった可能性もある。この可能性を排除するために、本発明者らは、細胞培養系におけるこれらの遺伝子の発現に対するＮｒｆ１の低減の影響を調べた。本発明者らは、ＲＮＡ干渉に仲介される遺伝子サイレンシングを用いて、マウス肝癌細胞系ＨｅｐａｌにおけるＮｒｆ１の発現をノックダウンした。本発明者らは、Ｎｒｆ１を特異的に標的化するｓｈＲＮＡを安定的に発現させることによって、５つの独立した細胞系を作製し、これらは、内因性Ｎｒｆ１のｍＲＮＡレベルを効果的に低減したが、Ｎｒｆ２のｍＲＮＡは低減しなかった（図４）。マウス個体でのデータと一致して、Ｎｒｆ１のノックダウンによって、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの遺伝子発現は有意に低減したが、一方、Ｎｑｏ１およびＴｘｎｒｄ１などのＮｒｆ２標的遺伝子は有意には変化しなかった（図４）。総合すると、これらのインビボおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験は、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βがＮｒｆ１の直接的または間接的な下流標的であることを示唆する。
１．２．４  Ｎｒｆ１および小Ｍａｆタンパク質はＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βに結合する。
上記の観察をきっかけとして、本発明者らは、Ｎｒｆ１がＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、およびＰＧＣ−１βの発現を直接的に調節するかどうかを決定した。本発明者らは、ＰＰＡＲα、Ｌｉｐｉｎ１、ＰＧＣ−１βのゲノム配列を探査し、それらの調節領域にいくつかの推定ＡＲＥモチーフを発見した（図５Ａ）。Ｎｒｆ１およびそのヘテロ二量体パートナーである小ＭａｆがこれらのＡＲＥモチーフに直接的に結合するかどうかを決定するために、本発明者らはＣｈＩＰ分析を行った。各タンパク質に特異的な抗体を用いて、Ｈｅｐａｌ細胞のクロマチンを免疫沈降させ、沈降したＤＮＡの量を、ｑＰＣＲを用いて調べた。結果は、Ｎｒｆ１が、Ｌｉｐｉｎ１プロモーターならびにＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥに動員されたが、ＰＰＡＲαプロモーターおよび５’ＵＴＲ領域中のＡＲＥには動員されなかったことを示した（図５Ｂ）。しかし、肝臓において最も豊富な小Ｍａｆタンパク質であるＭａｆＧは、この分析において試験した全てのＡＲＥに動員された（図５Ｃ）。特に、ＭａｆＧは、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥに強く結合した。この結合は、両端にＧＣボックスを有し、小Ｍａｆホモ二量体によって認識される、ＡＲＥ中のＭａｆ認識エレメント（ＭＡＲＥ）の存在により生じた可能性がある（図５Ａ）。全体として、ＣｈＩＰ分析は、Ｎｒｆ１がＡＲＥを介してＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現を直接的に調節することを強く示唆する。
１．２．５  Ｎｒｆ１はＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥを介して転写を活性化し得る。
本発明者らは、これらの推定ＡＲＥがＮｒｆ１依存性の転写活性を付与するかどうかをさらに分析した。この目的のために、ＡＲＥモチーフを含むＤＮＡ断片を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に挿入し、得られた構築物を、Ｎｒｆ１発現ベクターを伴って、または伴わずに、Ｈｅｐａｌ細胞内にトランスフェクトした。Ｌｉｐｉｎ１プロモーターのＡＲＥを含む構築物は、基底のレポーター活性の増大を示したが、Ｎｒｆ１発現ベクターを加えても、さらなる活性化は観察されなかった（図６Ａ）。しかし、Ｌｉｐｉｎ１またはＰＧＣ−１βのイントロンのいずれかのＡＲＥを含むレポーター構築物では、ルシフェラーゼ活性はＮｒｆ１の発現によって有意に増大した（図６ＢおよびＣ）。これらの結果は、Ｎｒｆ１が、Ｌｉｐｉｎ１またはＰＧＣ−１βのイントロン中のＡＲＥへの結合を介して転写を活性化し得ることを示唆する。
Ｎｒｆ１−ＭａｆＧヘテロ二量体がＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１β中のＡＲＥに結合することのさらなる証拠を得るために、本発明者らはＥＭＳＡを行った。Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２の結合特異性を試験するために、本発明者らは、これらのＡＲＥおよびＮｑｏ１遺伝子のＡＲＥに対するＮｒｆ１−ＭａｆＧヘテロ二量体およびＮｒｆ２−ＭａｆＧヘテロ二量体の結合を調べた。結果は、Ｎｒｆ１−ＭａｆＧヘテロ二量体とＮｒｆ２−ＭａｆＧヘテロ二量体との両方がＬｉｐｉｎ１プロモーターならびにＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのイントロンのＡＲＥに結合することを示した（図６Ｄ）。Ｌｉｐｉｎ１プロモーターのＡＲＥへのＮｒｆ１−ＭａｆＧヘテロ二量体の結合親和性は、Ｎｑｏ１のＡＲＥへの結合親和性よりもわずかに弱かった（図６Ｄ）。特に、ＭａｆＧホモ二量体もまた、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのイントロンのＡＲＥに結合し（図６Ｄ）、この結果は、ＭａｆＧがこれらの領域において強くエンリッチされたことを示すＣｈＩＰデータと一致した（図５Ｃ）。結合特異性を、野生型オリゴヌクレオチドまたは突然変異型オリゴヌクレオチドを用いる競合アッセイによって確認した（図６Ｅ）。過剰量の未標識の野生型オリゴヌクレオチドを加えると、Ｎｒｆ１−ＭａｆＧヘテロ二量体とＮｒｆ２−ＭａｆＧヘテロ二量体との両方の結合活性が消えたが、突然変異型オリゴヌクレオチドでは消えなかった（図６Ｆ）。したがって、これらの結果は、Ｎｒｆ１−ＭａｆＧヘテロ二量体とＮｒｆ２−ＭａｆＧヘテロ二量体との両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬｉｐｉｎ１プロモーターならびにＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのイントロンのＡＲＥに結合することを実証する。
１．２．６  Ｎｒｆ２はＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの調節に関与しない。
ＥＭＳＡは、Ｎｒｆ１だけではなくＮｒｆ２もｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥに結合し得ることを示したため、本発明者らは、Ｎｒｆ２がＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βを調節し得る可能性をさらに調べた。この目的のために、本発明者らは、Ｈｅｐａｌ細胞をＮｒｆ２誘導因子であるＤＥＭで処理し、ｑＰＣＲによって遺伝子発現を調べた。Ｎｑｏ１およびＧｃｌｃなどのＮｒｆ２標的遺伝子はＤＥＭによって誘導されたが、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βは有意に影響されなかった（図７Ａ）。同様に、Ｎｑｏ１およびＧｃｌｃの発現は、Ｋｅａｐ１  ＫＤの肝臓において有意に誘導されたが、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現は有意には変化しなかった（図７Ｂ）。これらの発現データと一致して、ＣｈＩＰ分析は、ＤＥＭ処理されたＨｅｐａｌ細胞とＫｅａｐ１  ＫＤの肝臓との両方において、Ｎｒｆ２はＮｑｏ１プロモーター領域のＡＲＥに強く動員されたが、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子およびＰＧＣ−１β遺伝子のＡＲＥには動員されなかったことを明らかに実証した（図７ＣおよびＤ）。ここでも、ＭａｆＧは、Ｎｑｏ１のＡＲＥにだけではなく、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子およびＰＧＣ−１β遺伝子の調節領域中のＡＲＥにも動員された（図７ＥおよびＦ）。総合すると、これらの発見は、Ｎｒｆ２はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥに結合する可能性があり得るが、内因性Ｎｒｆ２はインビボでＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの調節に関与しないことを示す。全体として、これらの結果は、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの調節におけるＮｒｆ１の直接的な関与を示し、このことは、肝臓の代謝の調節におけるＮｒｆ１およびＮｒｆ２の異なる役割を示唆する。
１．３  考察
Ｎｒｆ１肝臓特異的ノックアウトマウスは、脂肪肝を示す。しかし、いかにしてＮｒｆ１が肝臓の脂質の恒常性に寄与するかはほとんど知られていない。本実施例において、本発明者らは、Ｎｒｆ１欠損肝臓の幅広い転写プロファイリングを行い、Ｎｒｆ１欠損によって、脂質およびアミノ酸の代謝などの、いくつかの代謝経路の異常調節がもたらされることを見出した。本発明者らは、肝臓の代謝に関連する転写調節因子に注目し、Ｎｒｆ１は、転写コアクチベーターであるＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現を直接的に調節するが、Ｎｒｆ２はしないことを見出した。これらの結果は、Ｎｒｆ１が、代謝性転写調節因子の発現を制御することによって肝臓の代謝の調節に関与することを示唆する。
網羅的な遺伝子発現プロファイリングによって、Ｎｒｆ１の喪失が様々な細胞機能に対して有意な影響を有することが明らかになった。従来の知見（文献２、８）と一致して、プロテアソームサブユニット遺伝子の発現は、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓において下方調節され、このことは、Ｎｒｆ１が恒常的な条件下で肝臓において実際に機能的であることを示唆する。本実施例はまた、脂質およびアミノ酸の代謝ならびにミトコンドリアの呼吸鎖に関連する経路が、Ｎｒｆ１欠損の結果、低下することを明らかにした。特に、アミノ酸代謝遺伝子の観察された異常調節は、Ｎｒｆ１がアミノ酸代謝とプロテアソーム分解系との両方の調節を介してタンパク質の異化に寄与することを示唆する。したがって、Ｎｒｆ１の全体的な機能が、脂質、タンパク質、およびアミノ酸の異化に関与する遺伝子の発現を誘導することによってエネルギーの恒常性を調節することであることは、最もらしく思われる。しかし、マイクロアレイ分析はまた、細胞周期の制御およびＤＮＡ複製に関連する遺伝子がＮｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓において上方調節されることを明らかにした。これらの変化がＮｒｆ１機能の欠損の直接的な影響であるかどうかは明らかではないが、細胞周期の調節における機能障害がまた、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスの肝臓において観察された発病に寄与した可能性がある。
本実施例は、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βがＮｒｆ１の直接的な標的遺伝子であるという考えを支持するものである。Ｌｉｐｉｎ１は、脂肪肝ジストロフィー（ｆｌｄ）マウスの表現型の原因となる遺伝子突然変異を同定するためのポジショナルクローニングアプローチを用いて発見された（Ｐｅｔｅｒｆｙら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：１２１−１２４．（２００１））。Ｌｉｐｉｎ１は、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有する。しかし、Ｌｉｐｉｎ１はまた、ＰＰＡＲα／ＰＧＣ−１α調節経路のコアクチベーターとしても作用し、脂肪酸の酸化的代謝を正方向に調節する（Ｆｉｎｃｋら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．４：１９９−２１０．（２００６））。Ｆｌｄマウスは、脂質代謝に関与するタンパク質の発現の低減および肝臓における脂肪酸酸化速度の低下を伴う、新生児の脂肪肝を示す（Ｒｅｈｎｍａｒｋら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３９：２２０９−２２１７．（１９９８））。ＰＧＣ−１βは、ＥＲＲ  α（ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α）およびｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １の共活性化に必要であり（Ｖｉａｎｎａら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．４：４５３−４６４（２００６））、これらは、ミトコンドリアの生合成の制御を介する呼吸鎖反応の調節における主要な転写因子である。ＰＧＣ−１βノックアウトマウスは、ミトコンドリアの酸化的代謝遺伝子の発現の変化および高脂肪飼料誘発性の脂肪肝を示す（Ｖｉａｎｎａら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．４：４５３−４６４（２００６）、Ｓｏｎｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４：５２２３−５２２８．（２００７））。したがって、本実施例によって示唆される最も興味深い可能性は、Ｌｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現の低減が、ＰＰＡＲαに、ＥＲＲαに、およびｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １に仲介される転写に影響し、最終的に、それらの標的遺伝子の発現を減少させ、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて観察される脂肪肝をもたらすことである。しかし、Ｌｉｐｉｎ１の減少に起因するホスファチジン酸代謝の異常調節が、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおける表現型に寄与する可能性もある。
２つの代謝コアクチベーターの発現の欠陥に加え、他の異常もまた、Ｎｒｆ１欠損肝臓の病理に寄与すると考えられる。例えば、コリン−メチオニン欠乏食によって脂肪肝が誘発されるため、メチオニン代謝経路の異常調節（図１Ｄ）は、脂肪肝の進行に関連する可能性がある。興味深いことに、Ｎｒｆ１  ＣＫＯマウスにおいて下方調節された遺伝子はＭａｔｌａおよびＧｎｍｔを含み、Ｎｒｆ１がこれらの遺伝子を直接的に調節するかどうかは依然として明らかにされていないが、これらの遺伝子の欠損は、典型的に、脂肪肝をもたらす（Ｌｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：５５６０−５５６５．（２００１）、Ｌｉｕら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４６：１４１３−１４２５．（２００７））。本発明者らは、Ｎｒｆ１欠損肝臓における遺伝子発現プロファイルの変化は、Ｎｒｆ１の欠損に対するゲノムワイドの代償反応を反映すると想定する。したがって、本データとＮｒｆ１結合部位のゲノムワイドの研究（すなわち、ＣｈＩＰ配列分析）の結果とを組み合わせると、Ｎｒｆ１に仲介される遺伝子調節ネットワークのさらに良好な概観が得られるはずである。
Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２が機能的特徴を共有することが報告されているが（Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４８０２１−４８０２９．（２００３））、本実施例では、これらの２つの因子の役割が大きく異なることが示唆される。この考えと一致して、本発明者らは以前に、Ｎｒｆ１が肝臓におけるメタロチオネイン１およびメタロチオネイン２の遺伝子発現を選択的に調節することを報告した（文献７）。さらに、本実施例は、Ｎｒｆ１がＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの発現を直接的に調節するが、Ｎｒｆ２はしないことを強く示唆する。しかし、Ｎｒｆ１およびＮｒｆ２の示差的な結合特異性についての分子的機序は、現在のところ不明である。さらに、本発明者らのＥＭＳＡデータは、Ｎｒｆ１とＮｒｆ２との両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βの調節領域のＡＲＥに結合し得ることを示した（図６Ｄ）。それでも、ＣｈＩＰ分析は、Ｎｒｆ１がＬｉｐｉｎ１およびＰＧＣ−１βのＡＲＥに特異的に動員されることを明らかに実証した（図５および７）。したがって、全体として、これらの観察は、転写コファクターの示差的な動員、またはヒストンの修飾およびＤＮＡのメチル化を含むエピゲノムでの差などの、さらなる分子メカニズムが、ＣＮＣ因子の標的遺伝子特異性に関与し得ることを示唆する。
結論として、本発明者らは、Ｎｒｆ１を、Ｌｉｐｉｎ１遺伝子およびＰＧＣ−１β遺伝子の発現の新規な調節因子として同定した。包括的な遺伝子発現分析もまた、Ｎｒｆ１の喪失が、脂質およびアミノ酸の代謝などの様々な代謝経路に対する有意な影響を有することを示し、このことは、Ｎｒｆ１が細胞成分の異化を介してエネルギー恒常性に寄与し得ることを示唆する。いかにしてＮｒｆ１活性が肝臓において調節されるかは依然として不明であるが、栄養状態の変化がＮｒｆ１の活性に影響する可能性はあり得る。したがって、Ｎｒｆ１誘導因子の同定によって、肝臓におけるＮｒｆ１の機能についてのさらに包括的な洞察が得られるはずである。
【実施例２】
【０００８】
２．１  材料および方法
マウスＮｒｆ１  ｃＤＮＡのクローニングは、公知の手法を用いて行った（Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９９：３７３−３８５．（２００６））。このマウスＮｒｆ１  ｃＤＮＡ配列を鋳型に以下のプライマー：５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’（配列番号：２１）と５’−ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’（配列番号：２２）により増幅される配列と、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型に以下のプライマー：５’−ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＡＧ−３’（配列番号：２３）と５’−ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＣＧＧ  ＣＧ−３’（配列番号：２４）により増幅される配列をつなぎ合わせ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５Ｈｉｓ  Ｂ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングすることで、マウスＮｒｆ１全長とルシフェラーゼの融合タンパク質（ｍＮｒｆ１−Ｌｕｃ）発現ベクターを作製した。また、マウスＮｒｆ１  ｃＤＮＡ配列を鋳型に以下のプライマー：５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’（配列番号：２５）と５’−ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号：２６）により増幅される配列と、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型に以下のプライマー：５’−ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号：２７）と５’−ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＣＧＧ  ＣＧ−３’（配列番号：２８）により増幅される配列をつなぎ合わせ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５Ｈｉｓ  Ｂ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングすることで、ＣＮＣ−ｂＺｉｐドメインを欠失したマウスＮｒｆ１とルシフェラーゼ融合タンパク質（ｍＮｒｆ１ΔＣＮＣ−ｂＺｉｐ−Ｌｕｃ）発現ベクターを作製した。ＣＮＣ−ｂＺｉｐドメインを欠失したほうが、Ｎｒｆ１が発現しやすくなる可能性が考えられた。
マウス肝癌細胞系Ｈｅｐａｌｃｌｃ７（Ｈｅｐａｌ）を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｗａｋｏ）内で培養した。マウスＮｒｆ１−ルシフェラーゼ融合タンパク質またはＣＮＣ−ｂＺｉｐドメイン欠失マウスＮｒｆ１−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現細胞株を得るため、ｍＮｒｆ１−Ｌｕｃ発現ベクターまたはｍＮｒｆ１ΔＣＮＣ−ｂＺｉｐ−Ｌｕｃ発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩにより直線化した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いＨｅｐａｌ細胞内にトランスフェクトした。この細胞を、１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ−４１８を含む培地中で培養することで安定発現細胞を選別し、複数のクローン細胞系を確立した。
各細胞株を、２４ウェルプレート内に、ウェル当たり５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、一晩培養した後、溶媒コントロールのＤＭＳＯまたは１０μＭ  ＭＧ−１３２（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で４時間処理した。その後、ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ホタルルシフェラーゼ活性をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて測定した。
２．２  結果
ｍＮｒｆ１−Ｌｕｃ発現ベクターまたはｍＮｒｆ１ΔＣＮＣ−ｂＺｉｐ−Ｌｕｃ発現ベクターを導入した安定発現細胞株に対し、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２を添加した結果、溶媒を添加した場合と比べ、ルシフェラーゼ活性の大幅な上昇が認められた（図９）。
２．３  考察
Ｎｒｆ１はＮｒｆ２と同様、定常状態ではプロテアソームにより分解されており、活性化刺激によりその分解系から脱し、Ｎｒｆ１のタンパク質が安定化することで、標的遺伝子の転写活性化を行なうと考えられている。Ｎｒｆ１を活性化する内在性の刺激およびリガンドは明らかになっていないが、プロテアソーム阻害剤の添加によりＮｒｆ１のタンパク質が安定化し、転写活性化能を示すことが報告されている（文献２）。今回Ｎｒｆ１とルシフェラーゼの融合タンパク質を発現させることで、ルシフェラーゼ活性を指標にＮｒｆ１タンパク質の安定化を評価するアッセイ系の構築を行なった。図９に示す通り、プロテアソーム阻害剤の添加により、ルシフェラーゼ活性の大幅な上昇が認められた。このことから、Ｎｒｆ１−ルシフェラーゼ融合タンパク質は、プロテアソームの機能が阻害されることでその分解系から脱し、安定化により増加した融合タンパク質の量がルシフェラーゼ活性として反映されたと考えられる。以上のことから、Ｎｒｆ１−ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いた本アッセイ系は、内在的なＮｒｆ１の活性化メカニズムを反映した機能的なアッセイ系であり、本アッセイ系を用いることで、Ｎｒｆ１の安定性を増強する化合物のスクリーニングが可能になると考えられる。
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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