(57)【要約】本発明は、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができる耳介軟骨組織の製造方法、及び、該耳介軟骨組織の製造方法により製造された耳介軟骨組織を提供することを目的とする。本発明は、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布上に耳介軟骨細胞を播種する細胞播種工程と、前記耳介軟骨細胞が播種された不織布を、生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠と複合化して形状を整える成形工程とを有する耳介軟骨組織の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布上に耳介軟骨細胞を播種する細胞播種工程と、
前記耳介軟骨細胞が播種された不織布を、生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠と複合化して形状を整える成形工程とを有する
ことを特徴とする耳介軟骨組織の製造方法。
【請求項２】
生体吸収性材料からなる不織布の平均繊維径が０．９０μｍであることを特徴とする請求項１記載の耳介軟骨組織の製造方法。
【請求項３】
生体吸収性材料がポリグリコリド又はラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体であることを特徴とする請求項１又は２記載の耳介軟骨組織の製造方法。
【請求項４】
耳介軟骨細胞が播種された、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布と、生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠とからなる耳介軟骨組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができる耳介軟骨組織の製造方法、及び、該耳介軟骨組織の製造方法により製造された耳介軟骨組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、細胞、成長因子を用いる方法、組織又は器官の再生の足場になる支持体を患者に移植する方法等がある。このような支持体としては、例えば、特許文献１に、コラーゲン単糸からなる移植用基材が開示されている。
また、特許文献２及び特許文献３には、生体吸収性素材の発泡体と、同様素材により補強した心血管系組織培養基材、並びにチューブ状の神経再生基材が開示されている。
更に、特許文献４には、スポンジ状または、不織布状の高分子材料成形物からなる骨格の内部に細胞を分散したゲルを有する医用材料が開示されている。【０００３】
再生医療の対象の一つとして、耳介軟骨組織の再生が挙げられている。耳介軟骨組織は、大型で厚みのある組織であることに加え、比較的高い力学的強度が求められる。しかしながら、従来の支持体を用いた生体組織の製造方法では、このような大型で厚みのある耳介軟骨組織の製造は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１９３３２８号公報
【特許文献２】特開２００１−７８７５０号公報
【特許文献３】特開２００３−１９１９６号公報
【特許文献４】特開２００３−２０４８０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができる耳介軟骨組織の製造方法、及び、該耳介軟骨組織の製造方法により製造された耳介軟骨組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布上に耳介軟骨細胞を播種する細胞播種工程と、前記耳介軟骨細胞が播種された不織布を、生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠と複合化して形状を整える成形工程とを有する耳介軟骨組織の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。【０００７】
本発明者らは、種々の材質及び形状を有する支持体に耳介軟骨細胞を播種して、耳介軟骨組織の再生を試みた。その結果、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布を用いた場合には、他の材質や形状を有する支持体を用いた場合に比べて、著しく耳介軟骨組織の再生が促進されることを見出した。そして更に検討の結果、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布に耳介軟骨細胞を播種した後、これを生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠と複合化して成形することにより、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布を用いた場合、特に耳介軟骨組織の再生が促進される理由については明らかではない。本発明者らは、試みに平均繊維径の異なる複数のポリグリコリドからなる不織布に耳介軟骨細胞を播種した後、細胞の付着数を測定してみた。しかしながら、特に平均繊維径が０．９０〜７．００μｍである場合に有意に細胞が付着したということはなかった。【０００９】
本発明の耳介軟骨組織の製造方法は、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布（以下、単に「不織布」ともいう。）上に耳介軟骨細胞を播種する細胞播種工程を有する。このような特定の平均繊維径、特定の材質からなる不織布を用いることにより、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができる。【００１０】
上記生体吸収性材料は特に限定されず、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体、ポリ（ｐ−ジオキサノン）等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、ポリグリコリド又はラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体が好ましく、ポリグリコリドがより好ましい。【００１１】
上記不織布の平均繊維径は０．９０〜７．００μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合に、耳介軟骨組織の再生が促進される。なかでも、上記不織布の平均繊維径が０．９０μｍである場合には、特に耳介軟骨組織の再生が促進される。
なお、本明細書において不織布の平均繊維径は、不織布の生地の中央の一部を切り取り、電子顕微鏡を用いて観察し、焦点が合っている繊維を無作為に抽出して、測定の合計が１００本以上となるまで場所を変えながら繊維の直径を測定したときに、得られた１００本以上の繊維の直径を平均した値を意味する。【００１２】
上記不織布は、目付の好ましい下限が１ｇ／ｍ２、好ましい上限が１００ｇ／ｍ２である。この範囲外であると、充分な耳介軟骨組織の再生ができないことがある。上記不織布の目付のより好ましい下限は５ｇ／ｍ２、より好ましい上限は５０ｇ／ｍ２である。【００１３】
上記平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布を製造する方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。なかでも、メルトブロー法が好適である。【００１４】
上記細胞播種工程では、上記不織布上に耳介軟骨細胞を播種する。
上記耳介軟骨細胞は、従来公知の方法により採取することができる。例えば、人や動物等から得た耳介から、皮膚、結合織、軟骨膜を除去したうえで、５ｍｍ×５ｍｍ程度の小片に細切した後、コラゲナーゼ処理することにより、耳介軟骨細胞を単離することができる。単離した耳介軟骨細胞は、そのまま本発明の耳介軟骨組織の製造方法に供してもよく、培養により増殖させた後に本発明の耳介軟骨組織の製造方法に供してもよい。【００１５】
上記播種の方法は特に限定されず、従来公知の播種方法を用いることができる。
上記播種の際の播種の密度は特に限定されないが、好ましい下限は２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好ましい上限は１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。細胞播種密度が２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満であると、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織が形成されるまでに時間がかかることがあり、１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２を超えて細胞を播種しても、それ以上の効果は認められない。細胞播種密度のより好ましい下限は５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。【００１６】
上記耳介軟骨細胞を播種した不織布は、耳介軟骨細胞が充分に付着するまで、１０分間程度静置することが好ましい。また、必要に応じて、数時間から数日間程度の間、培養を行ってもよい。培養を行う場合の培養液としては、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等の一般的な培養液に、１〜１０重量％程度のウシ胎児血清を添加した血清添加培地を用いることができる。【００１７】
本発明の耳介軟骨組織の製造方法は、上記耳介軟骨細胞が播種された不織布を、生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠と複合化して形状を整える成形工程を有する。
耳介軟骨組織の再生には、大型で厚みのある組織が形成されることが必要である。また、移植部位に合わせた形状を整えることも重要である。上記生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠は、得られる耳介軟骨組織を任意の形状、任意の厚みに調整する役割を果たすものである。【００１８】
上記メッシュ状の型枠を形成する生体非吸収性材料は、生体に対する毒性がなく、適度な硬さと弾力性とを有するものであれば特に限定されないが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＥＦ）、ナイロン等が好適である。【００１９】
上記メッシュ状の型枠は、再生したい耳介軟骨組織に対応する形状を備えることが好ましい。例えば、耳介の全体を再生すべき場合には、耳介全体に対応する形状を備えることが好ましい。または、耳介の全体を複数のパーツに分割して、その各々のパーツに対応した形状として、その後に組み合わせて耳介の全体を構成してもよい。【００２０】
上記耳介軟骨細胞が播種された不織布とメッシュ状の型枠との複合化の方法としては特に限定されず、２枚のメッシュ状の型枠間に耳介軟骨細胞が播種された不織布を挟み込んで任意の形状に成形してもよいし、任意の形状のメッシュ状の型枠を包み込むように耳介軟骨細胞が播種された不織布を巻きつけてもよい。【００２１】
本発明の耳介軟骨組織の製造方法により製造された耳介軟骨組織を、生体内に移植することにより、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織が再生される。
耳介軟骨細胞が播種された、平均繊維径が０．９０〜７．００μｍの生体吸収性材料からなる不織布と、生体非吸収性材料からなるメッシュ状の型枠とからなる耳介軟骨組織もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができる耳介軟骨組織の製造方法、及び、該耳介軟骨組織の製造方法により製造された耳介軟骨組織を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実験例で作製したサンプルＩＩＩの不織布の生地の中央部の電子顕微鏡写真である。
【図２】移植５週間後の組織再生確認用サンプルの組織切片の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００２５】
（実験例）
（１）不織布の調製
メルトブロー法で得られた不織布を延伸、又は、紡糸された筒編み布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が０．６７μｍ（サンプルＩ）、０．９０μｍ（サンプルＩＩ）、３．１０μｍ（サンプルＩＩＩ）、７．００μｍ（サンプルＩＶ）、及び、２０．６０μｍ（サンプルＶ）のポリグリコリドからなる、厚さ０．１３〜０．３０ｍｍの不織布を得た。
【００２６】
なお、サンプルＩＩＩの不織布の生地の中央の一部を切り取り、電子顕微鏡を用いて観察した像を図１に示した（写真下のバーは３０μｍを示す）。
図１に示したように、電子顕微鏡写真中の焦点が合っている繊維を無作為に抽出し、各々の繊維の直径を測定した。測定の合計が１００本となるまで場所を変えながら繊維の直径を測定し、得られた１００本の繊維の直径を平均して、３．１０μｍという平均繊維径を得た。他のサンプルＩ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖについても同様の方法により平均繊維径を得た。
【００２７】
（２）耳介軟骨細胞の単離と播種
ビーグル犬（メス、６〜８週齢）の両耳介を、麻酔下で切断した。得られた耳介から、皮膚、結合織、軟骨膜を除去したうえで、５ｍｍ×５ｍｍ程度の小片に細切した。得られた小片を、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中で１晩処理した後、耳介軟骨細胞を単離した。単離した耳介軟骨細胞をリン酸バッファー中に懸濁させて、１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を得た。
【００２８】
（３）メッシュ状の型枠との複合化
ポリプロピレンからなる大きさが２ｃｍ×２ｃｍ、厚さが０．３４±０．００７ｍｍのシート状のメッシュを準備した。
曲げ強度測定用サンプルとして、耳介軟骨細胞が播種された不織布を２枚のシート状メッシュに挟んで複合化し、平板型のスカフォールドを作製した。
一方、３次元形状維持確認用サンプルとして、耳介軟骨細胞が播種された不織布を、シード状メッシュにて挟んだパーツを耳介形状に成形し、ヒト耳介形状のスカフォールドを得た。
【００２９】
（４）移植
得られた平板型のスカフォールド及びヒト耳介形状のスカフォールドを同一の個体（ビーグル犬、メス、６〜８週齢）に自家移植した。全身麻酔後、後頸部に切開し、頭部筋膜間にスカフォールドを移植、固定した。移植後５週間後に犠牲死させて、各々のサンプルを取り出した。
【００３０】
（評価）
（１）曲げ強度の測定
取り出した曲げ強度測定用サンプルについて、ＲＯＹらの方法に従い、オートグラフを用いて曲げ強度を測定した。即ち、グリップ間を１ｃｍに調整した後、２０ｍｍ×５ｍｍの大きさにしたサンプルを台座に固定し、垂直板を０．０２ｍｍ／ｓｅｃの速度で下降させる条件により曲げ強度を測定した。
結果を表１に示した。
【００３１】
【表１】
2013081103.tif 000002
【００３２】
表１より、平均繊維径が０．９０μｍ以上の不織布（サンプルＩＩ〜Ｖ）を用いた場合には、比較的高い曲げ強度が得られたのに対して、平均繊維径が０．６７μｍの不織布（サンプルＩ）を用いた場合には、著しく低い曲げ強度となったことが判る。
【００３３】
（２）耳介軟骨組織再生の評価
取り出した３次元形状維持確認用サンプルの外見の写真と、断面部の染色写真を図１に示した。サンプルの断面は、図１上図の線部分で切断した後、サフラニンＯ染色法により染色を行ったものである。
図１より、平均繊維径が０．９０μｍ以上の不織布（サンプルＩＩ〜Ｖ）を用いた場合には、再生軟骨の誘導が充分であるのに対して、平均繊維径が０．６７μｍ（サンプルＩ）の不織布を用いた場合には、再生軟骨の誘導が不充分であったことが判る。
【００３４】
（参考実験）
実験例と同様の方法により、平均繊維径が０．６７μｍ（サンプルＩ）、０．９０μｍ（サンプルＩＩ）、３．１０μｍ（サンプルＩＩＩ）、７．００μｍ（サンプルＩＶ）、及び、２０．６０μｍ（サンプルＶ）のポリグリコリドからなる、厚さ０．１３〜０．３０ｍｍの不織布の不織布を得た。
【００３５】
ビーグル犬（メス、６〜８週齢）の両耳介を、麻酔下で切断した。得られた耳介から、皮膚、結合織、軟骨膜を除去したうえで、５ｍｍ×５ｍｍ程度の小片に細切した。得られた小片を、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中の１番処理した後、耳介軟骨細胞を単離した。単離した耳介軟骨細胞をリン酸バッファー中に懸濁させて、１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を得た。
得られた細胞懸濁液２００μＬを、２ｃｍ×２ｃｍの大きさに切断した不織布上に播種した。
【００３６】
播種後の不織布を２つの群に分け、一方の群にフィブリン糊（ブィブリノーゲンとトロンビンとの混合液）を散布した。
フィブリン糊散布後、５分間静置した後、両群を２．５％グルタルアルデヒド溶液中に浸漬してサンプルを得た。
不織布１００μｍ毎に切り出しを行い、トルイジンブルーにて染色を行った後、不織布内部に浸潤している軟骨細胞の計測を行い、細胞数を計数した。
結果を表２に示した。
【００３７】
【表２】
2013081103.tif 000003
【００３８】
図１に示したように、平均繊維径が０．６７μｍ（サンプルＩ）のときは細胞密度が低く、中間に空間があり充分に細胞が入っていない。また、平均繊維径が２０．６０μｍ（サンプルＶ）のときは細胞密度が低く、繊維束周辺のみに細胞が分布しており一様ではなかった。平均繊維径が０．９０μｍ（サンプルＩＩ）〜７．００μｍ（サンプルＩＶ）のときに、細胞密度の高いものが得られた。
【００３９】
表１に示した曲げ強度の測定の結果から、平均繊維径が０．９０μｍ以上（サンプルＩＩ〜Ｖ）の不織布において比較的、高い強度が得られた。
【００４０】
表２に示した細胞密度の結果から、平均繊維径が０．９０μｍ（サンプルＩＩ）〜７．００μｍ（サンプルＩＶ）で良好な結果が得られた。
よって、軟骨再生組織に利用する不織布の平均繊維径が０．９０μｍ（サンプルＩＩ）〜７．００μｍ（サンプルＩＶ）のものが、耳介軟骨の再生には最適である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、充分な厚みと力学的強度とを有する耳介軟骨組織を製造することができる耳介軟骨組織の製造方法、及び、該耳介軟骨組織の製造方法により製造された耳介軟骨組織を提供することができる。
【図１】
2013081103.tif 000004
【図２】
2013081103.tif 000005
【国際調査報告】
2013081103.tif 000006
2013081103.tif 000007
2013081103.tif 000008
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