(57)【要約】  １または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入して、細胞内で官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する。
2013129663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、
化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、
上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。
【請求項２】
上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、
上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記機能性核酸分子は第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖からなり、かつ異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなる上記ハイブリダイズ領域を有し、
上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として細胞内に導入されるものであり、
上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記機能性核酸分子は、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とからなり、
上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として細胞内に導入されるものであり、
上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として細胞内に導入されるものであり、
上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記機能性核酸分子は、細胞内でＲＮＡ干渉作用を有する、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記求核基は、ホスホロチオエート基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、請求項６〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記求核基がホスホロチオエート基である場合、上記保護基が下記（ａ）〜（ｋ）の何れかである、請求項６、８または９に記載の方法。
【化１】
2013129663.tif 000024
（なお、上記式中で、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ１およびＲ２は互いに独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜３の整数を表す。なお、ｎが２または３のとき、ｎ個あるＲ１同士は互いに異なっていてもよく、ｎ個あるＲ２同士は互いに異なっていてもよい。また、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、(ｊ)、および（ｋ）中のベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。）
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、
機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物。
【請求項１２】
上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、
上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、請求項１１に記載の核酸組合せ物。
【請求項１３】
上記機能性核酸分子を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖を備えてなり、
上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として含まれており、
上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、上記断片が設計されている、請求項１２に記載の核酸組合せ物。
【請求項１４】
上記機能性核酸分子を構成する、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とを備えてなり、
上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として含まれており、
上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として含まれており、
上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、請求項１３に記載の核酸組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性核酸分子を細胞内で構築する新規な方法、および当該方法に用いる核酸組合せ物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子の中には、タンパク質をコードしないが、各種の生命現象に重要な機能を果たすものが知られている。このような核酸分子として、例えば、機能性のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ分子（非特許文献１）、およびＲＮＡ干渉作用を引き起こすＲＮＡの小分子（非特許文献２）等が挙げられる。【０００３】
例えば、ＲＮＡ干渉作用は、細胞内で、標的ＲＮＡの作用を特異的に抑制する重要な手法（非特許文献３）として、試薬としては元より、医薬としての応用（非特許文献４）も盛んに研究されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ryan J Taft, Ken C Pang, Timothy R Mercer, Marcel Dinger1 and John S Mattick, J Pathol., 2010, 220, 126-139.
【非特許文献２】Fire A, XuS, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C; Nature, 1998, 391, 806-11.
【非特許文献３】Sayda M. Elbashir, Javier Martinez, Agnieszka Patkaniowska, Winfried Lendeckel and Thomas Tuschl; EMBO J. 2001, 20, 6877-6888.
【非特許文献４】John C. Burnett, John J. Rossi and Katrin Tiemann; Biotechnol. J. 2011, 6, 1130-1146.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＲＮＡ干渉作用を引き起こすＲＮＡは小分子であるにもかかわらず、その効果を最大限に引き出すために、細胞膜の透過性をさらに向上させる要求、および免疫系を賦活化することによる毒性発現を抑制するためのさらなる要求が存在する。【０００６】
しかし、このような要求に対して、ＲＮＡ分子をさらに小分子とするため、その機能発揮に必要最小限な配列に絞りこむ努力がなされているに過ぎないのが現状である。【０００７】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、機能性核酸分子を細胞に取り込み容易な形態にして細胞内に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法を提供する。【０００９】
本発明はまた、上記方法に用いる核酸組合せ物であって、機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
機能性核酸分子を細胞に取り込み容易な複数の断片として細胞内に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る方法の一実施形態の概略を示す図である。
【図２】実施例において、用いた各種ＲＮＡの配列を示す図である。
【図３】実施例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるライゲーションの結果を示す図である。
【図４】実施例において、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を示す図である。
【図５】実施例において、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を示す図である。
【図６】実施例において、免疫応答測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔１．機能性核酸分子の構築法〕
（構築法の概要）
本発明に係る機能性核酸分子の構築法は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程１）および２）を含む。
１）化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程、
２）上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程。
【００１３】
つまり、本発明に係る機能性核酸分子の構築法は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程１）および２）を含む。
１）上記核酸鎖のうちの少なくとも１本を、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片とし、その上で、上記１または２本の核酸鎖（すなわち、少なくとも１本は２以上の断片とされている）を細胞内に導入する導入工程、
２）上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程。
【００１４】
上記の構築法は、機能性核酸分子を構成する核酸鎖の少なくとも一部を複数の断片として細胞に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築させる。したがって、機能性核酸分子の細胞への取り込みが向上する。また、核酸鎖の少なくとも一部をより短い断片として用いるために、機能性核酸分子に起因する免疫毒性が抑制されうる。
【００１５】
（機能性核酸分子）
本発明において、機能性核酸分子とは、複数個の核酸が鎖状に連結してなり（すなわち、オリゴまたはポリヌクレオチド）、タンパク質をコードせず、かつ発生・分化等の生命現象に対して所定の機能を発揮する核酸分子を指す。したがって、生命現象において特段の機能を発揮しない、単に標的特異的にハイブリダイズするだけのプライマーおよびプローブは、本発明における機能性核酸分子の範疇から除かれる。
【００１６】
機能性核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド分子である。機能性核酸分子は、１本の核酸鎖から構成されるものであっても、２本の核酸鎖から構成されるものであってもよい。また、機能性核酸分子は、その一部に非天然の核酸を含んでいてもよい。なお、本明細書において、用語「核酸鎖」とは、機能性核酸分子を構成している状態での全長核酸鎖を指し、当該「核酸鎖」をより短くしたものに相当する用語「断片」（後述する）とは区別されている。
【００１７】
上記ＤＮＡ分子としては、例えば、ＤＮＡアプタマー；ＣｐＧモチーフ；ＤＮＡザイム；等が挙げられる。なお、本明細書において、ベースがＤＮＡ鎖であり、一部にＲＮＡおよび／または非天然の核酸等が導入されているものは、ＤＮＡ分子に分類する。
【００１８】
上記ＲＮＡ分子としては、例えば、ＲＮＡアプタマー；ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏＲＮＡ等のＲＮＡ干渉作用を示すＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ用核酸分子）；アンチセンスＲＮＡ分子；ＲＮＡリボザイム；等が挙げられる。なお、本明細書において、ベースがＲＮＡ鎖であり、一部にＤＮＡおよび／または非天然の核酸等が導入されているものは、ＲＮＡ分子に分類する。
【００１９】
ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド分子としては、例えば、ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドアプタマー；等が挙げられる。
【００２０】
機能性核酸分子は、好ましくは、その機能を発揮するために、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成するものである。その理由は、後述の（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）欄の記載も参照される。
【００２１】
機能性核酸分子は、より好ましくは、核酸鎖内または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を持つＲＮＡｉ用核酸分子であり、さらに好ましくは２本の核酸鎖からなるＲＮＡｉ用核酸分子である。２本の核酸鎖からなるＲＮＡｉ用核酸分子の核酸鎖の長さ（ｍｅｒ）は、例えば、１５〜４０ｍｅｒであり、好ましくは１５〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは２０〜３５ｍｅｒである。
【００２２】
（核酸鎖の断片）
機能性核酸分子を構成する核酸鎖の「断片」とは、上記「核酸鎖」を２以上に分割した核酸分子に相当する。そして、一つの核酸鎖に由来する全ての「断片」を適切な順序で連結すると当該核酸鎖と同じ核酸配列を有する核酸分子が構築される。ただし、用語「断片」とは、核酸鎖を一度構築した後にこれを分断して当該断片を生成することを意図するものではない。
【００２３】
断片を結合して、機能性核酸分子を構成する核酸鎖を構築する場合、異なる断片間の３’側末端と、５’側末端とを相互結合させる。このとき、相互結合させるべき３’側末端と５’側末端との組合せを「対応する末端」と称する。すなわち、「対応する末端」とは、断片のデザインの元となる核酸鎖を構成するように断片を整列化したときに隣り合う末端である。
【００２４】
なお、一つの核酸鎖に由来する「断片」の長さは特に限定されないが、異なる断片間の長さ（ｍｅｒ）の差が著しく大きくなり過ぎないようにすることが好ましい場合がある。この観点では、一つの核酸鎖に由来する最長の「断片」に対して、残る全ての断片が〔２５％×最長の断片の長さ（ｍｅｒ）〕以上の長さであることが好ましく、〔３０％×最長の断片の長さ（ｍｅｒ）〕以上の長さであることがより好ましい。
【００２５】
上記「対応する末端」には、化学反応により相互結合する官能基対（官能基の組合せ）が結合されていて、これら官能基同士を反応させて断片同士を結合することにより核酸鎖が構成される。
【００２６】
上記の官能基対は特に限定されないが、例えば、求電子基と、求核基との組合せが好ましい。すなわち、上記「対応する末端」の一方に求電子基を結合させ、「対応する末端」の他方に求核基を結合させることにより、異なる断片同士を化学反応により相互結合する。なお、求電子基および求核基は、３’末端および５’末端の何れに結合させてもよい。すなわち、求電子基を３’末端に結合し、求核基を５’末端に結合してもよいし、あるいは、求電子基を５’末端に結合し、求核基を３’末端に結合してもよい。
【００２７】
上記の求電子基としては、特に限定されないが、ヨードアセチル基（参考文献：Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 327）、およびブロモアセチル基（参考文献：Nucleic Acids Res., 22, 5076）等のハロゲン化アルキル基；ヨード基（参考文献：Tetrahedron Lett., 1995, 38, 55959）、およびブロモ基等のハロゲン基；ホルミル基；等が挙げられる。一実施形態において、求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、またはヨード基であることが好ましい場合がある。
【００２８】
上記の求核基としては、特に限定されないが、ホスホロチオエート基；チオール基；ヒドロキシ基；アミノ基；チオメチル基等のアルキルチオ基；メトキシ基等のアルコキシ基；等が挙げられる。一実施形態において、求核基は、ホスホロチオエート基であることが好ましい場合がある。
【００２９】
また、官能基対を構成する上記求電子基と上記求核基との組合せも特に限定されないが、ハロゲン化アルキル基またはハロゲン基とホスホロチオエート基との組合せ、またはハロゲン化アルキル基またはハロゲン基とチオール基との組合せ、等が好ましい場合がある。また、一実施形態において、官能基対を構成する上記求電子基と上記求核基との組合せは、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、またはヨード基と、ホスホロチオエート基との組合せであることがより好ましい場合がある。
【００３０】
以下に、対応する末端に付される上記求電子基と上記求核基との好ましい組合せの一例、およびこれらの基が化学反応により相互連結する形態を示す。なお、化学式中で、糖は骨格部分のみを示しており、リボースであってもデオキシリボースであってもよい。また、化学式中のＢは核酸を構成する各種の塩基を示す。すなわち、以下の例では、機能性核酸分子がＲＮＡ分子の場合を示しているが、ＤＮＡ分子でも同様に構成することができる。
【００３１】
【化１】
2013129663.tif 000003
特に、相互結合させるべき複数の断片を同時に系内に存在させる場合、細胞外で相互結合する断片の割合をより低減する（実質的になくす）ために、上記求核基は、所望のタイミングで脱保護が可能な保護基によって保護されていることが好ましい。すなわち、一実施形態において、官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せであることが好ましい。
【００３２】
求核基を保護する保護基の種類は、求核基の種類に応じて適宜採用をすればよい。好ましい保護基としては、例えば、細胞中の内因性物質の作用によって求核基から脱離するものが挙げられる。「細胞中の内因性物質」とは、後述の「細胞外から導入される物質」と対をなすものであり、その細胞が元々保持している物質を意図している。細胞中の内因性物質としては、例えば、酵素およびペプチド等が挙げられる。遺伝子導入により細胞内で発現させた酵素およびペプチド等は、それ自体が「細胞外から導入される」ものではないため、細胞中の内因性物質の範疇である。
【００３３】
細胞中の内因性物質の作用によって求核基から脱離する保護基のうち、ホスホロチオエート基の保護に使用可能なものとしては、以下に構造を示す、フェニルチオ基（ａ）その他のアリールチオ基のような、ホスホロチオエート基をジスルフィド保護できるもの；ニトロベンジル基（ｂ）、エステル（ｃ、ｄ）、チオカルボニル（ｅ）、およびアミド（ｆ）；ならびにこれらの誘導体等が挙げられる。なお、上記ニトロベンジル基は、ｏ−ニトロベンジル基、ｍ−ニトロベンジル基およびｐ−ニトロベンジル基の何れでもよいが、反応性の観点からｍ−ニトロベンジル基およびｐ−ニトロベンジル基が好ましい。
【００３４】
【化２】
2013129663.tif 000004
なお、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）におけるＲ、Ｒ’およびＲ”は、本発明の目的を損なわない範囲であれば特に限定されないが、例えば、置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す。アルキル基またはアリール基は、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは炭素数１〜１０であり得る。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基等の鎖状アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基およびアダマンチル基等の環状アルキル基が挙げられる。また、アリール基としては、例えば、フェニル基、トリル基およびナフチル基等が挙げられる。
【００３５】
アルキル基またはアリール基が有する置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素）、ヒドロキシル基、炭素数１〜１０（好ましくは炭素数１〜４）のアルキル基（鎖状および環状アルキル基）、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜５個のアシルオキシ基、カルボキシル基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数６〜１０のアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。なお、置換基として複数の鎖状の上記アルキル基がアリール基上に存在する場合、これら鎖状のアルキル基同士は互いに結合して環を構成してもよく、該環における炭素原子の１〜数個（好ましくは１〜３個）が酸素原子に置換されていてもよい。一例として、アリール基上の隣接する炭素原子上に位置するアルキル置換基同士が環を形成し、かつ２つの炭素原子が酸素原子で置換された１，３−ジオキソラン様の環構造を形成することが挙げられる。
【００３６】
置換基として環状アルキル基を有するアルキル基としては、例えば、シクロペンチルメチル基、シクロペンチルエチル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基およびシクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。また、置換基としてアリール基を有するアルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフタレニルメチル基、ナフタレニルエチル基およびナフタレニルプロピル基等が挙げられる。
【００３７】
また、アリール基は骨格の一部が窒素原子、酸素原子または硫黄原子等に置換されて複素環を形成してもよい。また、（ａ）、（ｂ）、および(ｅ)におけるベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。したがって、（ａ）、（ｂ）、および(ｅ)の誘導体として、例えば、（ａ）、（ｂ）、または(ｅ)におけるベンゼン環上の水素原子（例えば１〜３個）が上記で置換基として列挙したものに置換されたものが挙げられる。
【００３８】
フェニルチオ基は、細胞内に存在するＧＳＨ（グルタチオン）等の生体内チオール源によって還元され脱離する。ニトロベンジル基は、細胞内に存在するニトロレダクターゼによって還元され脱離する（参考文献：Bioorg. Med. Chem., 11, 2453）。エステルおよびチオカルボニルは、細胞内に存在するエステラーゼによって脱離する。アミドは、細胞内に存在するペプチダーゼによって脱離する。
【００３９】
上記（ａ）〜（ｆ）のような保護基によってホスホロチオエート基を保護すれば、当該ホスホロチオエート基は細胞外で実質的に脱保護されない。それゆえ、核酸鎖の断片を細胞外で混合しただけでは結合反応が起こらない。したがって、短い断片のまま１回の操作で細胞内に導入できる可能性が高まる。さらに、細胞内の存在する酵素またはペプチドによって脱保護反応が自然に起こるため、１回の操作で導入工程および生成工程の両方を行うことができる。
【００４０】
ホスホロチオエート基を保護する保護基としては、上記の他に、光照射によって求核基から脱離するものが挙げられる。そのような保護基としては、例えば、下記の（ｇ）〜（ｊ）およびこれらの誘導体等が挙げられる（参考文献：Molecular Pharmaceutics, 2009, 6, 669）。
【００４１】
【化３】
2013129663.tif 000005
（ｇ）〜（ｊ）におけるＲ１、Ｒ２およびｎは、本発明の目的を損なわない範囲であれば特に限定されないが、例えば、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜３の整数、好ましくは（ｇ）では１または２を表し、好ましくは（ｈ）および（ｊ）では１を表す。なお、ｎが２または３のとき、ｎ個あるＲ１同士は互いに異なっていてもよく、ｎ個あるＲ２同士は互いに異なっていてもよい。また、（ｇ）〜（ｊ）におけるベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。したがって、（ｇ）〜（ｊ）の誘導体として、例えば、（ｇ）〜（ｊ）におけるベンゼン環上の水素原子（例えば１〜３個）が上記で置換基として列挙したものに置換されたものが挙げられる。
【００４２】
上記（ｇ）〜（ｊ）のような保護基によってホスホロチオエート基を保護すれば、当該保護基の脱離に必要な波長の光を照射しない条件下において、当該ホスホロチオエート基は細胞外で実質的に脱保護されない。それゆえ、核酸鎖の断片を細胞外で混合しただけでは結合反応が起こらない。したがって、短い断片のまま１回の操作で細胞内に導入できる可能性が高まる。さらに、光照射のタイミングを制御することによって、所望のタイミングで脱保護反応を起こさせることができる。
【００４３】
上記（ｇ）またはその誘導体の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
【００４４】
【化４】
2013129663.tif 000006
上記（ｈ）の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
【００４５】
【化５】
2013129663.tif 000007
上記（ｉ）の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
【００４６】
【化６】
2013129663.tif 000008
上記（ｊ）の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
【００４７】
【化７】
2013129663.tif 000009
ここで、上記保護基中のＲ３およびＲ４は、互いに独立して、上記で示したアリール基上で置換されてもよい置換基を表す。
【００４８】
ホスホロチオエート基を保護する保護基としては、上記の他に、細胞外から導入される物質によって脱離するものが挙げられる。そのような保護基としては、例えば、アジドベンジル基（ｋ）およびこれの誘導体等が挙げられる。なお、アジドベンジル基は、ｏ−アジドベンジル基、ｍ−アジドベンジル基およびｐ−アジドベンジル基の何れでもよいが、反応性の観点からｐ−アジドベンジル基が好ましい。また、（ｋ)におけるベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。したがって、（ｋ）の誘導体として、例えば、（ｋ）におけるベンゼン環上の水素原子（例えば１〜３個）が上記で置換基として列挙したものに置換されたものが挙げられる。
【００４９】
【化８】
2013129663.tif 000010
アジドベンジル基は、ホスフィンを細胞内に導入することによって脱離する（参考文献：Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 714）。ホスフィンは、膜透過性の観点から、水溶性ホスフィンであることが好ましい。
【００５０】
上記（ｋ）のような保護基によってホスホロチオエート基を保護すれば、当該ホスホロチオエート基は細胞外で実質的に脱保護されない。それゆえ、核酸鎖の断片を細胞外で混合しただけでは結合反応が起こらない。したがって、短い断片のまま１回の操作で細胞内に導入できる可能性が高まる。さらに、脱保護の作用物質（ホスフィン等）を細胞内に取り込ませるタイミングを制御することによって、所望のタイミングで脱保護反応を起こさせることができる。
【００５１】
また、所定の条件下のみで互いに反応して結合する官能基対としては、上記した脱保護反応を利用するものの他に、ホスホロジエステル基とヨード基との組合せ（参考文献：J. Mol. Evol., 2003, 56, 607）が挙げられる。この組合せを用いる場合、臭化シアン（ＢｒＣＮ）を細胞内に導入することによって結合反応を起こすことができる。
【００５２】
【化９】
2013129663.tif 000011
さらに、上記官能基対としてアミノ基とアルデヒド基との組合せ（参考文献：J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 10144；J. Am. Chem. Soc., 1997, 1119, 12420）も挙げられる。この組合せを用いる場合、シアノホウ素化水素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）またはシアノホウ素化水素カリウム（ＫＢＨ３ＣＮ）を細胞内に導入することによって結合反応を起こすことができる。
【００５３】
【化１０】
2013129663.tif 000012
さらに、上記官能基対としてアジド基とアルキニル基との組合せ（参考文献：PNAS, 2010, vol. 107, 15329-15334、ChemBioChem, 2011, 12, 125-131）が挙げられる。この組合せを用いる場合、銅を細胞内に導入することによって結合反応を起こすことができる。
【００５４】
【化１１】
2013129663.tif 000013
なお、上記の化学式中で、糖は骨格部分のみを示しており、リボースであってもデオキシリボースであってもよい。また、化学式中のＢは核酸を構成する各種の塩基を示す。すなわち、以上の例では、機能性核酸分子がＲＮＡ分子の場合を示しているが、ＤＮＡ分子でも同様に構成することができる。
【００５５】
なお、機能性核酸分子が２本の核酸鎖からなる場合、その少なくとも１本が２以上の断片となっていればよいが、２本ともが２以上の断片となっていることが好ましい。
【００５６】
（核酸鎖の断片の作成方法）
上記官能基が末端に付された核酸鎖の「断片」の作製方法は特に限定されない。例えば、当該断片のオリゴヌクレオチドの部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ合成方法、プラスミドもしくはウイルスベクターを用いる方法、またはＰＣＲカセットによる方法等によって合成することができる。純度の高さ、大量合成可能、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用安全性の高さ、および化学修飾可能等の観点から、化学合成方法が好ましい。化学合成方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法、およびＨ−ホスホネート法等が挙げられ、市販の核酸合成機を使用することができる。
【００５７】
また、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端（対応する末端）に、所定の官能基および保護基を付する方法は、官能基の種類に応じた公知の方法に従い行えばよい。なお、官能基等の導入がより容易であるという観点では、「対応する末端」を構成する核酸は、「核酸鎖」の種類に係らず、デオキシリボ体の核酸が好ましく、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴから選択されることがより好ましい。
【００５８】
このように作製した断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用安全性等の観点から、用途によっては、導入工程前に精製されることが好ましい。また、断片の細胞膜透過性を高めるために、当該断片に細胞膜透過性分子を結合させてもよい。このような分子としては、例えば、ＴＡＴペプチド、オリゴアルギニン、PENETRATIN、およびTP-10等の膜透過性ペプチド；コレステロール；ビタミンＡ等が挙げられる。
【００５９】
（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）
上記機能性核酸分子が、その機能を発揮するために、核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成するものである場合、当該核酸鎖の断片は、当該断片同士の結合がハイブリダイズ領域で生じるように設計されることが好ましい。以下、図１に基づき、より具体的に説明する。
【００６０】
図１は、機能性核酸分子としてのｓｉＲＮＡの好ましい設計の一例を示す（実施例も参照）。この例において、ｓｉＲＮＡは、第一のＲＮＡ鎖と第二のＲＮＡ鎖とがハイブリダイズするように構成されている。
【００６１】
第一のＲＮＡ鎖は、３’末端にホスホロチオエート基（官能基対の一方）を付与された第一の断片（図中Ａ）と、５’末端にヨードアセチル基（官能基対の他方）を付与された第二の断片（図中Ｂ）として与えられている。また、第二のＲＮＡ鎖は、３’末端にホスホロチオエート基（官能基対の一方）を付与された第三の断片（図中Ｃ）と、５’末端にヨードアセチル基（官能基対の他方）を付与された第四の断片（図中Ｄ）として与えられている。なお、ホスホロチオエート基は何れもフェニルチオ基（保護基）によって保護されている。
【００６２】
第一のＲＮＡ鎖および第二のＲＮＡ鎖は、互いにずれた位置でそれぞれ２つの断片になるよう設計されている。すなわち、第一のＲＮＡ鎖を構成する第一の断片と第二の断片とは、何れも、隣り合うように第三の断片に対してハイブリダイズする。同様に、第二のＲＮＡ鎖を構成する第三の断片と第四の断片とは、何れも、隣り合うように第一の断片に対してハイブリダイズする。これにより、第一のＲＮＡ鎖および第二のＲＮＡ鎖の何れにおいても、官能基が付された対応する末端同士が近接して、生成工程における官能基同士の結合反応を効率的に起こすことができる。
【００６３】
なお、図１では、第一のＲＮＡ鎖を構成する断片同士の結合と、第二のＲＮＡ鎖を構成する断片同士の結合とが、ハイブリダイズ領域の異なる箇所（互いにずれた位置）で生じるものを例示したが、例えば、図１において、第一のＲＮＡ鎖または第二のＲＮＡ鎖の一方のみが断片化されているものも、対応する末端同士を効率的に近接させることができる観点で好ましい断片化の一例である。
【００６４】
また、図１では機能性核酸分子としてｓｉＲＮＡを例示したが、この図で示した断片の設計は、核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成する機能性核酸分子に広く適用可能である。
【００６５】
（導入工程）
導入工程は、機能性核酸分子を構成する上記「核酸鎖」のうちの少なくとも１本を、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した２以上の「断片」の形態とした上で、当該機能性核酸分子を構成する全ての核酸鎖を細胞内に導入する工程である。なお、「核酸鎖」、「官能基対」、「対応する末端」、および「断片」の定義は上述の通りである。
【００６６】
より具体的には、導入工程では、例えば、以下の１）〜３）の何れかの「核酸組合せ物」が細胞内に導入される。なお、「核酸組合せ物」とは、２以上の核酸分子を組み合わせたものを指し、これらは混合された組成物の形態をとっていてもよく、あるいは、別々の保存容器に保管されるなどして互いに隔離された（混合されていない）形態をとっていてもよい。
１）機能性核酸分子が１本の核酸鎖からなる場合、当該核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」。全ての核酸分子が略等量（個数）で含まれていることが好ましい。
２）機能性核酸分子が２本の核酸鎖からなる場合、うち１本の核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」と、他の１本の核酸鎖。全ての核酸分子が略等量（個数）で含まれていることが好ましい。
３）機能性核酸分子が２本の核酸鎖からなる場合、うち１本の核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」と、他の１本の核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」。全ての核酸分子が略等量（個数）で含まれていることが好ましい。
【００６７】
核酸組合せ物の導入対象となる細胞は、特に限定されない。対象となる細胞は、原核細胞および真核細胞の何れでもよい。真核細胞としては、菌類、植物および動物等に由来する細胞が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞等の非哺乳類細胞および哺乳類細胞が挙げられる。哺乳類細胞としては、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、およびネコ等の非ヒト動物の細胞またはヒトの細胞が挙げられる。また、細胞は、培養細胞でもよいし、生体細胞（生体内にある単離されていない細胞）でもよい。細胞の好ましい一例は、ヒトの培養細胞、ヒトの生体細胞、非ヒト病態モデル動物の培養細胞、非ヒト病態モデル動物の生体細胞である。
【００６８】
核酸組合せ物の導入方法は特に限定されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、およびリン酸カルシウム法等が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入方法としては、例えば、局所投与、静脈内投与、および遺伝子銃を用いる方法等が挙げられる。ヒトまたは非ヒト動物の生体に適用する場合、安全性の観点から微生物等を用いない方法が好ましい。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入前に核酸組合せ物を含む試料を、透析またはｐＨ調節等を行うことによって生体に適合するように調製することが好ましい。また、ｉｎ  ｖｉｖｏに適用する場合、必要に応じて、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて薬学的組成物（例えば、リポソーム製剤等）を製造してもよい。
【００６９】
また、核酸組合せ物を構成する核酸分子は、全てを混合して核酸組成物として一度の操作で細胞内に導入してもよいし、核酸分子毎に別々に細胞内に導入してもよい。また、核酸鎖を構築するための２以上の断片を、一度の操作で細胞内に導入してもよいし、それぞれを別々に細胞内に導入してもよい。
【００７０】
（生成工程）
生成工程では、上記導入工程で核酸組合せ物を導入した細胞内で、上記「官能基対」を「対応する末端」に付した２以上の「断片」同士を結合させる。すなわち、官能基対の間で化学反応が進行して、「対応する末端」同士が結合（化学ライゲーション＝非酵素的なライゲーション）されることで、「断片」として与えられていた核酸鎖が１本の連続した核酸鎖として構築される。あわせて、必要に応じて核酸鎖内または異なる核酸鎖間でハイブリダイゼーションのような相互作用を生じて、機能性核酸分子を生成する。
【００７１】
上記の（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）欄で説明したケースでは、図１に示すように、導入工程後に、ハイブリダイゼーションによる断片の適切な整列化、「官能基」の脱保護、および「官能基対」の間での化学反応の進行（化学ライゲーション）、が同時進行的に生じて、２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子が生成する。
【００７２】
〔２．核酸組合せ物〕
（核酸組合せ物の概要）
本発明に係る機能性核酸分子の構築法に用いる核酸組合せ物（構築用核酸組合せ物）は、機能性核酸分子を構成する全ての上記「核酸鎖」を備えてなり、当該「核酸鎖」のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した２以上の「断片」として含まれているものである。なお、「核酸組合せ物」の例示は、上記（導入工程）欄で説明した通りのものである。
【００７３】
（核酸組合せ物の好ましい形態）
核酸組合せ物の好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」は、上記「核酸鎖」内でハイブリダイズするか、または異なる「核酸鎖」間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記「断片」同士の結合が、当該ハイブリダイズ領域で生じるように、上記「断片」が設計されている。
【００７４】
核酸組合せ物のより好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の「核酸鎖」および第二の「核酸鎖」を備えてなり、これら２本の「核酸鎖」は何れも、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した２つの「断片」として含まれている。そして、「第一の核酸鎖」を構成する「断片」同士の結合と、「第二の核酸鎖」を構成する「断片」同士の上記結合とが、ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、それぞれの断片が設計されている（図１および実施例も参照）。
【００７５】
核酸組合せ物のさらに好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」を構成する、ハイブリダイズが可能な「第一のＲＮＡ鎖」と「第二のＲＮＡ鎖」とを備えてなり、「第一のＲＮＡ鎖」は、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した「第一の断片」と「第二の断片」として含まれている。また、「第二のＲＮＡ鎖」は、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した「第三の断片」と「第四の断片」として含まれている。そして、「第一の断片」または「第二の断片」は、「第三の断片」および「第四の断片」の双方とハイブリダイズ可能であり、「第三の断片」または「第四の断片」は、「第一の断片」および「第二の断片」の双方とハイブリダイズ可能である（（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）欄、図１および実施例も参照）。
【００７６】
（核酸組合せ物の応用）
本発明に係る核酸組合せ物は、その使用手順が記載された使用説明書（ただし、紙媒体はもとより、電子媒体に格納されたものも含み記録媒体は特に限定されない）とともにパッケージ化されていてもよい。当該使用説明書には、例えば、上記（導入工程）欄、（生成工程）欄で説明したような核酸組合せ物の使用説明が記載される。核酸組合せ物はその用途に応じて、医薬、または試薬キットでありうる。
【００７７】
〔３．その他〕
（機能性核酸分子の構築法の応用）
核酸組合せ物は、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、およびネコ等の非ヒト動物の個体またはヒトの個体を治療するために用いてもよい。すなわち、非ヒト動物の個体またはヒトの個体に、核酸組合せ物を投与してもよい。投与方法は、上述のｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入方法として挙げたとおりである。
【００７８】
また、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ等の非ヒト動物の個体またはヒトの個体に対する核酸組合せ物の使用が提供される。また、核酸組合せ物が導入されている細胞が提供される。核酸組合せ物が導入されている細胞は、上述の核酸組合せ物を内部に保持している。核酸組合せ物が導入されている細胞は、その使用手順が記載された使用説明書（ただし、紙媒体はもとより、電子媒体に格納されたものも含み記録媒体は特に限定されない）とともにパッケージ化されていてもよい。当該使用説明書には、例えば、（生成工程）欄で説明したような細胞の使用説明が記載される。細胞はその用途に応じて、医薬、試薬キットであり得る。
【００７９】
〔４．まとめ〕
以上のように、本発明は、以下のものを含んでいる。
１）１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。
２）上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、１）に記載の方法。３）上記機能性核酸分子は第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖からなり、かつ異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなる上記ハイブリダイズ領域を有し、上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として細胞内に導入されるものであり、上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、２）に記載の方法。
４）上記機能性核酸分子は、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とからなり、上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として細胞内に導入されるものであり、上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として細胞内に導入されるものであり、上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、３）に記載の方法。
５）上記機能性核酸分子は、細胞内でＲＮＡ干渉作用を有する、１）〜４）の何れかに記載の方法。
６）上記化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、１）〜５）の何れかに記載の方法。
７）上記求核基は、ホスホロチオエート基である、６）に記載の方法。
８）上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、６）または７）に記載の方法。
９）上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、６）〜８）の何れかに記載の方法。
１０）上記求核基がホスホロチオエート基である場合、上記保護基が下記（ａ）〜（ｋ）の何れかである、６）、８）または９）に記載の方法。
【００８０】
【化１２】
2013129663.tif 000014
（なお、上記式中で、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ１およびＲ２は互いに独立して水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜３の整数を表す。なお、ｎが２または３のとき、ｎ個あるＲ１同士は互いに異なっていてもよく、ｎ個あるＲ２同士は互いに異なっていてもよい。また、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、(ｊ)、および（ｋ）中のベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。）
１１）上記１）〜１０）の何れかに記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物。
１２）上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、１１）に記載の核酸組合せ物。
１３）上記機能性核酸分子を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖を備えてなり、上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として含まれており、上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、上記断片が設計されている、１２）に記載の核酸組合せ物。
１４）上記機能性核酸分子を構成する、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とを備えてなり、上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として含まれており、上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として含まれており、上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、１３）に記載の核酸組合せ物。
【００８１】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００８２】
〔１．ＲＮＡの調製〕
（ＲＮＡの設計および合成）
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ１（図２の（ａ）；配列番号１および２）をもとに、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ３’−ＰＳ（ホスホロチオエート）  ＲＮＡおよび５’−アミノ  ＲＮＡに分割してＲＮＡの合成を行った（図２の（ｂ）；配列番号３および４）。【００８３】
３’−ＰＳ  ＲＮＡおよび５’−アミノ  ＲＮＡは、全てホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（GeneWorld H8-SE）を用いて合成した。アミダイト試薬としては、ＲＮＡには２’−Ｏ−ＴＯＭ保護体（Glen Research）を用い、３’末端のリン酸化には３’−Phosphate ＣＰＧ（Glen Research）およびSulfurizing Reagent（Glen Research）を用いた。また、５’−末端のアミノｄＴの導入には、５’−Amino dT Phosphoroamidite（Glen Research）を用いた。ＲＮＡの脱保護は定法に従い、３’−ＰＳ  ＲＮＡおよび５’−アミノ  ＲＮＡは粗精製のまま次の反応に用いた。【００８４】
（合成したＲＮＡの化学修飾）
上記で合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖における３’−ＰＳ  ＲＮＡをジフェニルジスルフィドと反応させることによってＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡを合成した（図２の（ｃ））。なお、３’末端のジスルフィド結合は細胞内に導入後、ＧＳＨなどの生体内チオール源によって脱離が進行する。３’−ＰＳ  ＲＮＡのジスルフィド化は、表１の組成で調製した混合液を室温で６時間インキュベートすることによって行った。【００８５】
【表１】
2013129663.tif 000015
また、センス鎖およびアンチセンス鎖における５’−アミノ  ＲＮＡをヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジルと反応させることによってヨードアセチルＲＮＡを合成した（図２の（ｄ））。５’−アミノＲＮＡのヨードアセチル化は、表２の組成で調製した混合液を室温で２時間インキュベートすることによって行った。【００８６】
【表２】
2013129663.tif 000016
（比較のために用いるＲＮＡの調製）
非修飾ｓｉＲＮＡ（２５ｍｅｒ：図２の（ａ）に示す配列）を３’−ＰＳ  ＲＮＡおよび５’−アミノ  ＲＮＡの合成と同様に、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（GeneWorld H8-SE）を用いて合成し、変性ポリアクリルアミドゲルによって完全鎖長の生成物を精製した。【００８７】
また、センス鎖およびアンチセンス鎖における５’−アミノ  ＲＮＡを酢酸ナトリウムと反応させることによって、３’−ＰＳ  ＲＮＡとの反応性を有さないアセチルＲＮＡを合成した（図２の（ｅ））。５’−アミノＲＮＡのアセチル化は、表３の組成で調製した混合液を室温で２時間インキュベートすることによって行った。【００８８】
【表３】
2013129663.tif 000017
さらに、３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとがライゲーションした場合に生成するｌｉｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡについても、３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとをｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞系）においてライゲーションすることによって合成した（図２の（ｆ）；配列番号５および６）。【００８９】
上記で合成したＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡ、ヨードアセチルＲＮＡ、アセチルＲＮＡ、およびｌｉｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡを、ＨＰＬＣ（Ｂ．ｃｏｎｃ．０〜４０％、Ａ液：５０ｍＭ  ＴＥＡＡ、５％  アセトニトリル  ｉｎ  Ｈ２Ｏ、Ｂ液：１００％  アセトニトリル）によって解析し精製した。その後、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを用いて脱塩（５０％アセトニトリル水  ６ｍＬによって溶出）し、遠心エバポレーターを用いて濃縮した。得られたＲＮＡを超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、溶液濃度を定量した。【００９０】
〔２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞系）におけるライゲーションの確認〕
（方法）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとのライゲーションが行われることを確認するために、表４の組成で反応を行った。表４中のレーン５はＧＳＨを添加していないコントロールである。【００９１】
【表４】
2013129663.tif 000018
なお、ＨＢＳＳの組成は、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．４１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．４である。【００９２】
上記混合液を３７℃で３０分間インキュベートした後、ローディングバッファー（１００％  ホルムアミド、０．５％  ＸＣ）を加え、９０℃で５分間インキュベーションした。反応液を２０％変性アクリルアミドゲルで泳動し、CYBR Green IIで３０分間染色することによって分析した。マーカーとして、レーン１には２５ｍｅｒのＲＮＡ鎖、レーン２には１９ｍｅｒのＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡ（センス鎖）、レーン３には１８ｍｅｒのＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡ（アンチセンス鎖）を同様にロードした。【００９３】
（結果）
泳動の結果を図３に示す。３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとのライゲーションが進行し、２５ｍｅｒのＲＮＡ鎖が生成したことが確認できた（レーン４）。【００９４】
また、センス鎖のみのＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡ４μＬおよびヨードアセチルＲＮＡ４μＬにＧＳＨ２μＬを加えて同様にライゲーション反応させた場合でも、２５ｍｅｒの一本鎖のＲＮＡ鎖が生成した。【００９５】
〔３．哺乳動物培養細胞系を用いたＲＮＡ干渉効果の測定１〕
（方法）
ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞（Caliper（PerkinElmer company）から購入）を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Wako製）培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、９６穴プレートに、１００μＬずつ、４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう分注した。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、約６０％コンフルエントの状態で各種ＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の３’−ＰＳ  ＲＮＡおよびヨードアセチルＲＮＡ）をトランスフェクション試薬Gene Silencer（Genlantis製）を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従いコトランスフェクションした。ＲＮＡの濃度は、２５、５０または１００ｎＭとした。【００９６】
具体的には、細胞に５０μＬのＨＢＳＳ（＋）を加えた状態で、下記のトランスフェクション用混合溶液を添加することで行った。トランスフェクション用混合溶液の組成は表５の通りである。【００９７】
【表５】
2013129663.tif 000019
トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートし、メディウムを１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へと交換した。３７℃でさらに１８時間インキュベート後、Luciferase Assay System（プロメガ製）を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した（条件：試薬量５０μＬ、delay time ２秒、read time１０秒、機器：Muthras LB 940（BERTHOLD製））。【００９８】
比較として、スクランブル（２５ｎＭ）、非修飾ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）、ｌｉｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）、Ｃａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡ＋アセチルＲＮＡ（２５ｎＭ、５０ｎＭまたは１００ｎＭ）、Ｃａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡのみ（１００ｎＭ）、ヨードアセチルＲＮＡのみ（１００ｎＭ）、およびアセチルＲＮＡのみ（１００ｎＭ）を上記と同様にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現量を定量した。【００９９】
（結果）
ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を図４に示す。ｎｏｎ−ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡ（ＩＡ）とを細胞内に導入した場合には、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が低く、十分な阻害活性が観察された。一方、ｎｏｎ−ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡとアセチルＲＮＡ（Ａｃ）とを導入した場合には阻害活性が観察されなかった。この結果は、細胞内で３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとのライゲーション反応によって、ｌｉｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡが生成し、遺伝子発現を抑制したことを示唆している。【０１００】
このように、機能性ＲＮＡを断片として細胞内に導入し、細胞内で機能性ＲＮＡを構築することが可能であることが明らかとなった。【０１０１】
〔４．哺乳動物培養細胞系を用いたＲＮＡ干渉効果の測定２（浸透圧ショックによるトランスフェクション）〕
（方法）
ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Wako製）培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、約６０％コンフルエントの状態で回収し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、hypertonic bufferと各種ＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の３’−ＰＳ  ＲＮＡおよびヨードアセチルＲＮＡ）との混合液（１０μＬ）で細胞を懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。そこへ滅菌水（５２．９μＬ）を加え、さらに３７℃で１０分間インキュベーションした。その後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、回収した細胞を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（４００μＬ）で懸濁し、９６穴プレートに１００μＬずつ分注した。hypertonic bufferの組成は、２．１Ｍ  スクロース、７．５％ＰＥＧ（２０００）、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）ｉｎ  ＨＢＳＳ  ｂｕｆｆｅｒである。hypertonic bufferと各種ＲＮＡとの混合液（１０μＬ）の組成は表６の通りである。【０１０２】
【表６】
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トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートし、Luciferase Assay System（プロメガ製）を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した（条件：試薬量３０μＬ、delay time ２秒、read time １０秒、機器：Muthras LB 940（BERTHOLD製））。また、BCA protein assay kit（Thermo Scientific製）を用い、添付のプロトコールに従いタンパク量を定量し、ルシフェラーゼ発現量を補正した。【０１０３】
比較として、スクランブル、および非修飾ｓｉＲＮＡを上記と同様にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現量を定量および補正した。【０１０４】
（結果）
ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を図５に示す。ｎｏｎ−ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡ（ＩＡ）とを細胞内に導入した場合には、非修飾ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した場合と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が低く、より阻害されていることがわかった。この結果は、ｓｉＲＮＡをＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡとＩＡとに断片化して導入することによって、細胞膜透過性が向上したことを示唆している。【０１０５】
このように、機能性ＲＮＡを断片として細胞内に導入することで、細胞膜透過性を向上させ、より多量の機能性ＲＮＡを細胞内に効率的に導入することが可能であることが明らかとなった。【０１０６】
〔５．哺乳動物培養細胞系を用いた免疫応答測定〕
（方法）
Ｔ９８Ｇ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターから入手）を１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Wako製）培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、２４穴プレートに、３００μＬずつ、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう分注した。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、約７０％コンフルエントの状態で各種ＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の３’−ＰＳ  ＲＮＡおよびヨードアセチルＲＮＡ）をトランスフェクション試薬lipofectamine 2000（invitrogen製）を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従いコトランスフェクションした。比較として、ＲＮＡなし、ポリＩ：Ｃ、非修飾ｓｉＲＮＡを同様にトランスフェクションした。ＲＮＡの濃度は１００ｎＭ（final volume ３００μＬ）とした。トランスフェクション用混合溶液の組成は表７の通りである。【０１０７】
【表７】
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トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートし、２０％ Serumを含むＲＰＭＩ−１６４０培地 ３００μＬを各ウェルに加えた。３７℃でさらに１８時間インキュベート後、ISOGEN（ニッポン・ジーン製）を用い、添付のプロトコールに従って、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡおよびOne Step PrimeScript（登録商標） RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Takara製）を用いて、ＩＦＮ−βおよびβ−Ａｃｔｉｎの発現量を測定した。得られた結果からΔΔCt法を用いて、ＩＦＮ−β発現量をβ−Ａｃｔｉｎ発現量で補正し、相対的なＩＦＮ−β発現量を算出した。リアルタイムＰＣＲに使用した反応液の組成は表８の通りである。また、リアルタイムＰＣＲの反応条件は表９の通りである。【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
【表９】
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（結果）
結果を図６に示す。ＲＮＡをトランスフェクションしなかったNegative Control（ＮＣ）と比較して、ｓｉＲＮＡまたはポリＩ：Ｃを細胞内に導入した場合にはＩＦＮ−βの発現量の増加が確認された。一方、ｎｏｎ−ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ  ３’−ＰＳ  ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡ（ＩＡ）とを細胞内に導入した場合には、ＩＦＮ−βの発現量の変化は観察されなかった。この結果は、ｓｉＲＮＡを断片として細胞内に導入することで、断片化されていないｓｉＲＮＡによって誘導される免疫応答を回避可能であることを示している。【０１１０】
このように、機能性ＲＮＡを断片として細胞内に導入することで、断片化されていない機能性ＲＮＡによって誘導される免疫応答を回避可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明は、機能性核酸分子を用いた医薬および試薬等の分野に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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