(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性ゲノム及び該内在性ゲノムに組み込まれた外来性非コード核酸を含む単離した細胞又は細胞株であって、該外来性非コード核酸が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの３つ以上の対に対する複数の対形成した標的部位を含み、（i）各対形成した標的部位中の２つの標的部位が０〜１８個のヌクレオチドによって互いに分離され；（ii）各対形成した標的部位が非コードＰＣＲプライマー部位によって互いに分離され；（iii）各対形成した標的部位が該内在性ゲノムに存在しない、細胞又は細胞株。
【請求項２】
複数の対形成した標的部位の各々からの１つの標的部位が、同じ配列を含む、請求項１に記載の細胞又は細胞株。
【請求項３】
１つ以上の外来性コード配列を更に含む、請求項１または２に記載の細胞又は細胞株。
【請求項４】
前記細胞又は細胞株は、植物細胞、哺乳類細胞又は哺乳類細胞株である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞又は細胞株。
【請求項５】
１つ以上の外来性配列を細胞又は細胞株のゲノムに組み込むための方法であって、
（ａ）亜鉛フィンガーヌクレアーゼの１つ以上の対を用いて、請求項１又は２に記載の細胞又は細胞株のゲノムを開裂させること、ここで、前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、前記組み込まれた外来性非コード核酸中の標的部位に結合し、その結果、前記ヌクレアーゼのそれらの標的部位への結合が、前記細胞又は細胞株のゲノムを開裂させる、
（ｂ）前記細胞又は細胞株を、外来性配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、ここで、前記外来性配列は、前記組み込まれた外来性非コード核酸内の細胞又は細胞株のゲノムに組み込まれる、を含む、方法。
【請求項６】
追加的な外来性配列の存在下で、前記組み込まれた外来性非コード核酸中の追加的な標的部位を開裂させる追加的な亜鉛フィンガーヌクレアーゼを用いて、ステップ（ａ）および（ｂ）を反復し、それによって前記追加的な外来性配列を、前記細胞又は細胞株のゲノムに挿入することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記外来性配列のうちの１つ以上は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼに対する１つ以上の標的部位を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的部位は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの片側標的部位であり、前記片側標的部位の組み込み時に標的部位が形成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記外来性配列のうちの１つ以上は、コード配列を含み、前記細胞又は細胞株は、前記コード配列の産物を発現する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞又は細胞株のゲノムに挿入される１つ以上の配列を欠失させる方法であって、
（ａ）請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法に従って、１つ以上の外来性配列を組み込むこと、
（ｂ）前記外来性配列のうちの１つ以上がゲノムから欠失させられるように、前記細胞又は細胞株中に適切なヌクレアーゼを発現させること、
を含む、方法。
【請求項１１】
ゲノムが変更された細胞又は細胞株を提供する方法であって、
（ａ）請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法に従って、少なくとも第１の非ヒト細胞又は細胞株に１つ以上の外来性配列を組み込むか、または欠失させること、
（ｂ）前記第１の細胞又は細胞株を性的に成熟した生物に発達させること、
（ｃ）前記生物を、ゲノム変更を含む第２の生物と交配させて、前記第１および第２の生物の前記ゲノム変更のうちの少なくとも１つを有する、第２の細胞を生成すること、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記第２の細胞のゲノム変更は、前記第２の細胞中の単一のゲノム位置における複数の異種遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞又は細胞株は更に、前記組み込まれた外来性非コード核酸を含む領域の外側で、そのゲノムの修飾を含む、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞又は細胞株は、植物細胞である、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、ゲノム工学の分野、特に、細胞のゲノムへの、１つ以上の外来性配列の標的化組み込みおよび／または標的化切除に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月２２日に出願された米国仮出願第６１／３３６，４５７号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
連邦支援による研究下でなされた発明に対する権利の記載
該当なし。
【０００４】
背景
生物工学は、食物生産に対する増加し続ける世界的需要の課題に対応する努力における必須のツールとして出現した。農業生産性の改善、例えば、収率の向上または病虫害抵抗性の改変のための従来のアプローチは、突然変異育種、または形質転換による作物種のゲノムへの新規遺伝子の導入のいずれかに依存する。両プロセスは、本質的に非特異的であり相対的に非効率的である。例えば、従来の植物の形質転換方法は、無作為位置におけるゲノムに組み込む、外来性ＤＮＡを送達する。故に、望ましい属性を有する遺伝子導入系を特定および単離するために、数千の固有の無作為組み込み事象を生成し、その後、所望の個体のためにスクリーニングすることが必要である。結果として、従来の植物形質改変は手間がかかり、時間を浪費し、かつ予測不可能な事業である。更に、これらの組み込みの無作為的性質は、意図されないゲノム破壊に起因する多面効果が生じているかどうかを予測することを困難にする。結果として、改変された遺伝子または形質を有する植物株の生成、単離、および特性評価は、成功確立の低い、非常に労働集約的およびコスト集約的プロセスとなっている。
【０００５】
標的化遺伝子修飾は、植物系における従来の実務の事業計画上の課題を克服するものであり、したがって、基本的な植物生物学研究および農業生物工学の両方における長年の目標でありながら、定義し難い目標であった。しかしながら、イネにおける陽性−陰性薬物選択を介した「遺伝子標的法」、または事前に改変された制限部位の使用を除いて、全ての植物種のモデルおよび作物の両方における標的化ゲノム修飾は、最近まで非常に困難であることが確認されていた。Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（１０）：１０３０、Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４４（２）：８４６、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．６（１）：９３。
【０００６】
哺乳類細胞において、安定な遺伝子組み換えおよび標的化遺伝子挿入は、遺伝子療法および細胞改変の両方において、多くの潜在的な用途を有する。しかしながら、現在の戦略は、しばしば非効率的であり、導入遺伝子をゲノムＤＮＡに非特異的に挿入する。ゲノム挿入の位置を制御する能力の欠如は、ゲノム内の位置効果に起因して、集団全体にわたる導入遺伝子発現レベルの高い変動性をもたらす可能性がある。更に、安定な遺伝子組み換えおよび導入遺伝子の増幅の現在の方法は、しばしば導入遺伝子の物理的損失、経時的な導入遺伝子サイレンシング、内在性遺伝子の内側もしくはそれに隣接した遺伝子および自律的プロモーターの組み込みによる挿入変異、染色体異常の作成および再配列遺伝子産物の発現（内在性遺伝子、挿入された導入遺伝子、または両方からなる）、ならびに／または安定な導入遺伝子発現を提供するためのベクターの長期持続性の必要性に起因して永続的に発現される、ベクター由来遺伝子からのインビボのベクター関連毒性もしくは免疫原性の作成をもたらす。
【０００７】
最近、ゲノムＤＮＡの標的化開裂のための方法および組成物が記載されている。かかる標的化開裂事象を使用して、例えば、標的突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導し、かつ所定の染色体座における標的組み換えを促進することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、および同第２００６０１８８９８７号、ならびに国際公開第ＷＯ２００７／０１４２７５号を参照されたく、それらの開示は、参照によりそれらの全体が全目的で組み込まれる。米国特許公開第２００８０１８２３３２号は、植物ゲノムの標的化修飾のための非標準的な亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を記載し、米国特許公開第２００９０２０５０８３号は、植物ＥＰＳＰＳ遺伝子座のＺＦＮ媒介型標的修飾を記載する。加えて、Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（９）：３０５５−３０６０）は、特異的遺伝子座における標的化遺伝子付加のために設計されたＺＦＮを使用することを記載する。
【０００８】
しかしながら、植物およびその子孫における安定な遺伝性の遺伝子修飾を確立するための植物への標的化組み込みのため、ならびに遺伝子療法および細胞株育成目的の哺乳類細胞への標的組み込みのためを含む、標的化組み込みのための組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００９】
概要
本開示は、細胞ゲノムに組み込まれる、多重挿入部位に組み込まれた外来性核酸配列（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ分子）の１つ以上の産物を発現させるための方法および組成物を提供する。細胞は、真核細胞、例えば、植物、酵母、または哺乳類細胞であり得る。
【００１０】
外来性核酸配列の組み込みは、１つ以上のヌクレアーゼ、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に対する多重標的部位を含むポリヌクレオチド配列の、細胞のゲノムへのゲノム組み込みによって促進される。ポリヌクレオチド（本明細書で多重挿入部位とも称される）は、細胞のゲノム内での特異的な標的化二本鎖開裂を可能にし、その二本鎖開裂は次に、相同性依存性および相同性非依存性機構の両方を通じた外来性配列の組み込みをもたらす。
【００１１】
故に、一態様では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）等のヌクレアーゼに対する１つ以上の標的部位を含む、多重挿入部位としても知られる核酸分子が本明細書に開示される。ある実施形態では、標的部位は、多重挿入部位が組み込まれる内在性ゲノム中に存在しない。多重挿入部位は、ヌクレアーゼに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれを超える標的部位を含んでもよい。ある実施形態では、隣接した標的部位（対形成した標的部位）に結合する２つの結合ＤＮＡ結合タンパク質の開裂片側ドメインの二量体化が、開裂に必要とされる（例えば、各部位に対のそれぞれが結合する、一対のヌクレアーゼが開裂に必要とされる）。本明細書に記載される多重挿入部位のいずれかにおいて、各対の標的部位のうち一方の標的部位は、同じ配列を含んでもよい。例えば、図１を参照されたい。ある実施形態では、少なくとも一つの対は標的部位が同じである。他の実施形態では、少なくとも１対の標的部位は、異なる標的からの個々の標的配列（例えば、異なる遺伝子および／または異なる生物からの遺伝子）を含む。ある実施形態では、対形成した標的部位のうちの少なくとも１つは、配列番号１〜２０からなる群から選択される配列を含む。ある実施形態では、多重挿入部位は、更に１つのコード配列、例えば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）コード配列を含む植物転写単位（ＰＴＵ）、または哺乳類細胞と共に使用するためのスクリーニングマーカーを含んでもよい。
【００１２】
多重挿入部位は、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）に対するゲノム標的を提供するために細胞（例えば、植物または哺乳類細胞）のゲノムに組み込まれる。ある実施形態では、標的部位は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの１つ以上の対がホモ二量体として結合し、開裂するように位置する。他の実施形態では、標的部位は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの１つ以上の対がヘテロ二量体として結合し、開裂するように位置する。
【００１３】
別の態様では、本明細書に記載される１つ以上の多重挿入部位および／または多重挿入部位に組み込まれる１つ以上の外来性配列を含む、植物または種子が本明細書に開示される。ある実施形態では、多重挿入部位および／または外来性配列は、トウモロコシ植物の配偶体に組み込まれる。
【００１４】
ある態様では、本明細書に記載される１つ以上の多重挿入部位および／または多重挿入部位に組み込まれる１つ以上の外来性配列を含む、修飾された哺乳類細胞株、修飾された初代細胞、修飾された幹細胞、および／または遺伝子導入動物が本明細書に提供される。
【００１５】
別の態様では、外来性配列を、細胞（例えば、植物または哺乳類細胞）のゲノムに組み込まれた多重挿入部位に組み込むための方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）ヌクレアーゼに対する１つ以上の標的部位を含む多重挿入部位ポリヌクレオチドを、細胞のゲノムに組み込むことと、（ｂ）ヌクレアーゼのそれらの標的部位への結合が細胞のゲノムを開裂させるように、多重挿入部位ポリヌクレオチドにおける第１の標的部位に結合する１つ以上のヌクレアーゼを提供および／または発現させることと、（ｃ）細胞を、外来性核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させ、それによって外来性配列の、多重挿入部位ポリヌクレオチド内の細胞のゲノムへの相同性依存性組み込みをもたらすことと、を含む。
【００１６】
別の態様では、多重外来性配列を細胞（例えば、植物または哺乳類細胞）のゲノムに組み込むための方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）第１の多重挿入部位ポリヌクレオチドが、第１および第２のヌクレアーゼに対する標的部位が側面に位置する少なくとも１つの第１の遺伝子を含む、ヌクレアーゼに対する１つ以上の標的部位を含む第１の多重挿入部位ポリヌクレオチドを、細胞のゲノムに組み込むことと、（ｂ）第３および第４のヌクレアーゼに対する標的部位が側面に位置する少なくとも１つの第２の遺伝子を含む第２の多重挿入部位ポリヌクレオチドの存在下で、細胞中の第１または第２のヌクレアーゼを発現させ、それによって第１および第２の遺伝子の細胞のゲノムへの組み込みをもたらすことと、を含む。ある実施形態では、本方法は更に、コード配列および／またはヌクレアーゼ部位を含む、追加的な外来性配列を組み込むために、挿入された多重挿入部位上に存在する適切なヌクレアーゼを発現させるステップを一回以上反復することを含む。ヌクレアーゼは、ヘテロ二量体ＺＦＮであってもよく、ヌクレアーゼのうちの１つ以上の間にあるものと共通の１つの単量体が存在してもよい。幾つかの実施形態では、挿入のための外来性ＤＮＡ配列は、外来性配列の組み込み時に、ドナーＤＮＡに関連する片側標的部位、およびゲノムＤＮＡに関連する片側標的部位を含む新規ＺＦＮ標的部位が作り出されるように、ＺＦＮ片側標的部位を含んでもよい。この新規ＺＦＮ標的部位は、類似の新規ヘテロ二量体ＺＦＮに対する標的部位としての役割を果たすことができる。
【００１７】
別の態様では、細胞（例えば、植物または哺乳類細胞）中で１つ以上の外来性核酸配列の産物を発現させるための方法が本明細書に開示され、本方法は、外来性配列が、組み込まれた核酸分子中の細胞のゲノムに組み込まれ、外来性配列の産物が発現されるように、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って１つ以上の外来性核酸配列を組み込むことを含む。
【００１８】
細胞のゲノムに挿入された１つ以上の遺伝子を欠失させる方法もまた提供され、本方法は、複数の外来性配列を、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって組み込むことと、外来性配列のうちの１つ以上がゲノムから欠失させられるように、細胞中で適切なヌクレアーゼを発現させることと、を含む。ある実施形態では、欠失させられる外来性配列は、マーカー遺伝子である。ある実施形態では、外来性配列の欠失およびその後のゲノム内の末端部の再結合は、ゲノム位置における機能性遺伝子または配列を作り出し、例えば、発現可能なスクリーニングマーカーを作り出す。
【００１９】
なおも別の態様では、ゲノムが変更された細胞を提供する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って、第１の細胞中の１つ以上の外来性核酸配列を組み込むおよび／または切除することと、第１の細胞を第１の性的に成熟した生物に発達させることと、生物を、対立位置におけるゲノム変更を含む第２の生物と交配させて、第１および第２の生物のゲノム変更を有する第２の細胞を生成することと、を含む。ある実施形態では、生物は、植物である。他の実施形態では、生物は、遺伝子導入動物である。
【００２０】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、本方法は、１つ以上の内在性遺伝子座における標的化組み込みおよび／または標的化不活性化を含む、ゲノム変更の他の方法と組み合わせて使用されてもよい。更に、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、ヌクレアーゼは、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび開裂片側ドメインを含む１つ以上の融合タンパク質を含んでもよく、ここで亜鉛フィンガー結合ドメインは、多重挿入部位において標的部位に結合するように改変されている。更に、これらの方法のうちのいずれにおいても、外来性核酸配列は、多重挿入部位における配列、および／または多重挿入部位が組み込まれる領域における、内在性配列と相同である１つ以上の配列を含む。
【００２１】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、１つ以上の多重挿入部位は、任意の好適な方法によって、例えば、挿入が所望される内在性遺伝子を標的とするＺＦＮを使用する、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を介した標的化組み込みによって、ゲノムに組み込まれてもよい。代替的に、１つ以上の多重挿入部位は、標準技術を使用して細胞のゲノムに無作為に組み込まれてもよい。
【００２２】
外来性核酸配列は、１つ以上のプロモーターを含むもしくは含まない、１つ以上の機能性ポリペプチド（例えば、ｃＤＮＡ）をコードする配列を含んでもよく、かつ／または望ましい形質を生物に付与する、１つ以上のＲＮＡ配列（例えば、１つ以上のｓｈＲＮＡ発現カセットを介して）を産生してもよい。植物におけるかかる形質には、除草剤抵抗性または耐性；虫害抵抗性または耐性；病害抵抗性または耐性（ウイルス、細菌、真菌、線虫）；干ばつ、暑気、冷気、凍結、過度の湿気、塩ストレスに対する抵抗性または耐性によって例示されるようなストレス耐性および／または抵抗性；酸化ストレス；増加した収率；食物含量および組成（ｆｏｏｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｋｅｕｐ）；外見；雄性不稔性；ドライダウン；標準性（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）；多産性；デンプンの量および質；油の量および質；タンパク質の量および質；アミノ酸組成等が含まれるが、これらに限定されない。当然のことながら、除草剤、虫害、病害（ウイルス、細菌、真菌、線虫）、もしくは干ばつ抵抗性、雄性不稔性、ドライダウン、標準性、多産性、デンプン特性、油の量および質を付与するもの、または収率もしくは栄養の質を増加させるもの等の、任意の説明の任意の２つ以上の外来性核酸が、所望に応じて用いられてもよい。ある実施形態では、外来性核酸配列は、除草剤抵抗性タンパク質（例えば、ＡＡＤ（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ）遺伝子）および／またはその機能的断片をコードする配列を含む。組み込まれる配列の発現は、組み込まれる配列に操作可能に連結されたプロモーターによって駆動することができる。代替的には、組み込まれる配列は、プロモーターを含まず、転写は、多重挿入部位ポリヌクレオチドの挿入の領域における内在性プロモーターによって駆動される。他の実施形態では、結合部位の開裂および不正確な修復は、目的の遺伝子を不活性化または活性化する可能性がある。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、線状ＤＮＡ分子である。
【００２３】
哺乳類細胞中で、本発明の方法および組成物は、細胞株構築のため、例えば、抗体等の多量体ポリペプチドを発現する細胞株の構築のために使用されてもよい。幾つかの実施形態では、細胞株は、研究目的のため、例えば、目的の経路のメンバーを発現する細胞株の構築のために使用されてもよい。幾つかの実施形態では、初代細胞または幹細胞を使用して、細胞治療目的のために目的の多量体タンパク質を発現させてもよい。
【００２４】
別の態様では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ活性を測定する方法が本明細書に提供される。ある実施形態では、本方法は、（ａ）対形成した標的部位の各々が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが結合する２つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼ片側標的部位を含む、本明細書に記載される少なくとも１つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび核酸分子、ならびに片側標的部位の間に挿まれる切断部位である、結合した亜鉛フィンガーヌクレアーゼによって切断される切断部位を提供することと、（ｂ）亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、少なくとも切断部位内で対形成した標的部位を開裂させるように、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを核酸と組み合わせることと、（ｃ）少なくとも切断部位の配列を決定して、配列データを生成することと、（ｄ）配列データにおいて、切断部位内の塩基対欠失の数および長さを、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの不在下での切断部位内の塩基対欠失の数および長さと比較して、それによって対形成した標的部位における亜鉛フィンガーヌクレアーゼ活性を測定することと、を含む。ある実施形態では、１つを超える塩基対の欠失は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの増加した活性を示す。
【００２５】
なおも他の実施形態では、対形成した標的部位における亜鉛フィンガーヌクレアーゼ活性を最適化するための方法が本明細書に提供される。ある実施形態では、本方法は、（ａ）対形成した標的部位の各々が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが結合する２つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼ片側標的部位を含む、本明細書に記載される少なくとも１つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび核酸分子、ならびに片側標的部位の間に挿まれる切断部位である、結合した亜鉛フィンガーヌクレアーゼによって切断される切断部位を提供することと、（ｂ）亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、少なくとも切断部位内で対形成した標的部位を開裂させるように、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを核酸と組み合わせることと、（ｃ）切断部位における亜鉛フィンガーヌクレアーゼ活性レベルを決定することと、（ｄ）切断部位における塩基対の数に変化を与えることと、（ｅ）ステップ（ｂ）〜（ｄ）を数回反復することと、（ｆ）最高レベルの亜鉛フィンガーヌクレアーゼ活性を提供する塩基対の数を含む、核酸に組み込むための切断部位を選択し、それによって対形成した標的部位における亜鉛フィンガーヌクレアーゼ活性を最適化することと、を含む。
【００２６】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼを伴う本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、第１および第２の開裂片側ドメインは、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩまたはＳｔｓＩからのものである。更に、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、融合タンパク質のうちの少なくとも１つは、例えば、開裂片側ドメインの偏性ヘテロ二量体が形成されるように、開裂片側ドメインの二量体化成面のアミノ酸配列における変更を含んでもよい。
【００２７】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、植物細胞は、単子葉または双子葉植物細胞を含む可能性がある。ある実施形態では、植物細胞は、作物植物、例えば、トウモロコシである。ある実施形態では、細胞は、初代細胞、細胞株、または幹細胞等の哺乳類細胞を含む可能性がある。幾つかの実施形態では、哺乳類細胞株は、目的のポリペプチドの産生のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本明細書に記載される例示的な多重挿入部位を示す概略図。図１は、７つのＺＦＮ標的部位から成り立つ多重挿入部位を示す。標的部位に結合するＺＦＮ対は、幾何学的図として示される。「ブロック１」は、ＺＦＮ標的部位（影付きおよび格子模様の三角）を維持しながら、適切なＺＦＮ対の存在下で多重挿入部位に組み込まれる外来性配列である。図１は、ＺＦＮ標的部位の代わりの、適切なＺＦＮ対の存在下での「ブロック１」の多重挿入部位への組み込みを示す。
【図２】「ブロック２」が、適切なＺＦＮ対の存在下で多重挿入部位に組み込まれる外来性配列である、図１に示される例示的な多重挿入部位を示す概略図。
【図３】ＺＦＮによって強化された対立遺伝子間組み換えの概略図。同一のゲノム位置にあるが、互いから移動させられる２つの挿入物は、ＺＦＮによる二本鎖開裂後に、相同組み換えまたは鎖交換を経る可能性がある。ＺＦＮ対（このうち両方のＺＦＮ単量体が一緒に発現される）は、ＺＦＮ対を発現する植物を、両方の対立遺伝子を含む植物と一緒に交配させることによって、または単一の対立遺伝子を含有する植物との交配の両側からの２つのＺＦＮ単量体を導入することによって、提供することができる。
【図４】ヘテロ二量体ＺＦＮ「左」および「右」標的ドメインの使用を示す概略図。上部の線は、左および右標的ＺＦＮドメインを有するゲノムを示す（影付き三角および碁盤格子三角）。異なるヘテロ二量体対が側面に位置する遺伝子を含む外来性分子の存在下で、適切なＺＦＮ対が付加されるとき、遺伝子および隣接するヌクレアーゼ部位は、示されるようにゲノムに挿入される。
【図５】ゲノムが組み込まれた配列のいずれかの側上での、外来性配列（「遺伝子」として示される）の組み込みおよび切除を示す概略図。付加された遺伝子の側面には、遺伝子カセットを適切な部位内に導くための相同性領域が位置する。挿入のために使用されるＺＦＮ標的部位の２つの片側は、挿入されるＤＮＡにおいて２つの新たな組み合わせを作り出すことによって組み換えられる。遺伝子カセットの切除は、隣接するＺＦＮ標的部位において開裂するための適切なＺＦＮ対を結合させることによって遂行される。切除は、所望のＤＮＡ配列の欠失を防止するために、相同性アームを含有するテンプレートを必要とする可能性がある。各「遺伝子」は、１つ以上の配列、例えば、１つ以上のコード配列を含む可能性がある。
【図６】ＺＦＮヘテロ二量体（異なる陰影を有する三角として示される）を使用する、挿入されたマーカー遺伝子の切除および「再利用」を示す概略図。
【図７】ｐＤＡＢ１０５９００のプラスミドマップ。
【図８】ｐＤＡＢ１０５９０８のプラスミドマップ。
【図９】亜鉛フィンガーヌクレアーゼホモ二量体発現カセットの線図。
【図１０】亜鉛フィンガーヌクレアーゼヘテロ二量体発現カセットの線図。
【図１１】開裂後の非相同末端結合からもたらされる欠失の頻度によって決定される、トウモロコシにおけるｅＺＦＮ開裂活性を示す。
【図１２】開裂後の非相同末端結合からもたらされる欠失の頻度によって決定される、タバコにおけるｅＺＦＮ開裂活性を示す。
【図１３】同じ遺伝子座への２つの遺伝子導入挿入物の概略図。上部の線は、遺伝子座における相同組み換えに必要とされるｅＺＦＮ結合部位を含有する、多重挿入部位（本明細書でランディングパッドとも称される）を表すＭＩＳと標識された無作為配列、ならびにカナマイシン選択可能マーカー遺伝子およびＧＵＳスクリーニング可能マーカー遺伝子を含むブロック１を示す。中間の線は、上部のＤＮＡにあるものと同じ多重挿入部位（ＭＩＳ）と共に、ハイグロマイシン抵抗性選択可能マーカー遺伝子および黄色蛍光タンパク質スクリーン可能マーカー遺伝子（ＨＰＴ／ＹＦＰ）を含むブロック２を示す。下部の線は、組み換えに続く遺伝子座を示す。
【図１４】ＺＦＮによる対立位置における相同組み換え、および図１３に説明されるものと同じ遺伝子座における２つの異なるＤＮＡ挿入物の生成を示す。ブロック１（カナマイシンおよびＧＵＣマーカーを含む、ＧＵＳ／ＮＰＴ）、多重挿入部位（ＭＩＳまたはランディングパッド）、およびブロック２（ハイグロマイシン（ｈｙｇｏｍｙｃｉｎ）および黄色蛍光マーカーを含む、ＨＰＴ／ＹＦＰ）を含む構築物が、アラビドプシスに形質転換される。各ブロックのみを別個の植物における多重挿入部位と一緒に生成するために、ブロック２は、ブロック１のみの構成を生成するために組み込まれる部位から切除されるか、またはブロック１は、ブロック２のみの構成を生成するために組み込まれる部位から切除される。遺伝子ブロックの除去は、元の遺伝子導入事象を含有する植物を、遺伝子ブロックの各々に隣接するｅＺＦＮ結合部位において開裂するＺＦＮを発現する植物と交配させることによって遂行される。回収された単一のブロック植物は交配されて、２つの構成物を単一の植物中に一緒にまとめ、その植物が減数分裂特異的プロモーターを発現する植物と交配されて、２つのブロック１とブロック２対立遺伝子との間のＤＮＡの交換に影響を及ぼす。
【図１５】２つの配列の間の中間部位におけるＺＦＮ開裂によって、同じ遺伝子座に位置する２つのＤＮＡ配列の間の組み換えを得るためのステップを示す概略フローチャート。図１６に説明される構築物は、アラビドプシスに形質転換される。２つの遺伝子ブロック（図１４に説明される）の１つは、結合部位がブロックに隣接するｅＺＦＮを発現する植物と交配させることによって除去され、ブロック１またはブロック２のいずれかを含有する植物をもたらす。
【図１６】交換遺伝子座をアラビドプシスに導入するために使用されるプラスミドの概略図。それは、図１４に説明されるブロック１および２、ならびに多重挿入部位配列を含有する。ｅＺＦＮ結合部位が示され、ブロック１および２（ブロック１：ｅＺＦＮ１および８、ブロック２：ｅＺＦＮ３および６）に隣接するか、または相同組み換えを促進するために多重挿入部位（ｅＺＦＮ４および７）における中心に位置する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本開示は、ゲノム、例えば、トウモロコシ等の作物植物または哺乳類細胞への標的化組み込み（ＴＩ）のための方法および組成物に関する。１つ以上のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）に対する多重標的部位を含有する多重挿入部位が、ゲノムに組み込まれる。多重挿入部位のゲノムへの組み込みに続いて、適切なヌクレアーゼが、挿入対象の外来性配列と共に細胞に導入される。
【００３０】
ある実施形態では、ヌクレアーゼは、１つ以上のＺＦＮを含む。ＺＦＮは典型的には、開裂ドメイン（または開裂片側ドメイン）および亜鉛フィンガー結合ドメインを含み、タンパク質として、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、またはポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組み合わせとして導入されてもよい。亜鉛フィンガーヌクレアーゼは典型的には、開裂片側ドメインの二量体化に続いて、二量体タンパク質として機能する。「左」および「右」認識ドメインに結合するＺＦＮ単量体が会合して活性ヌクレアーゼを形成することができる、偏性ヘテロ二量体ＺＦＮが記載されている。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。故に、適切な標的部位が与えられると、「左」単量体は、任意の「右」単量体を有する活性ＺＦヌクレアーゼを形成し得る。これは、様々な組み合わせで使用することができる、立証された左および右ドメインに基づいて有用なヌクレアーゼ部位の数を有意に増加させる。例えば、４個のホモ二量体ＺＦヌクレアーゼの結合部位を組み換えることは、追加的な１２個のヘテロ二量体ＺＦヌクレアーゼを生み出す。より重要なことに、あらゆる新たな導入された配列の側面に、遺伝子を再び切除するため、またはそれの隣の追加的な遺伝子を標的とするために使用することができる固有のＺＦＮ部位が位置することになるような、遺伝子導入設計に対する系統的な手法を可能にする。更に、この方法は、ＺＦＮ依存性二本鎖切断によって駆動される、単一の遺伝子座へのスタッキングの戦略を単純化することができる。
【００３１】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、標準（Ｃ２Ｈ２）亜鉛フィンガーまたは非標準（例えば、Ｃ３Ｈ）亜鉛フィンガーであり得る。更に、亜鉛フィンガー結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれを超える亜鉛フィンガー）を含む可能性があり、多重挿入部位内の任意の配列に結合するように改変することができる。細胞中のかかる融合タンパク質（複数可）の存在は、融合タンパク質（複数可）のその（それらの）結合部位への結合および多重挿入部位内の開裂をもたらし、それは外来性配列の組み込みをもたらす。
【００３２】
概論
本明細書で開示される方法の実践、ならびに組成物の調製と使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および関連分野における従来の技術を採用しており、当技術分野の技術範囲内である。これらの技術は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３３】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状コンフォメーションで、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸（ホスホロチオエート主鎖）部分内で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成する。
【００３４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３５】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。結合相互作用の全ての構成要素は、相互作用が全体として配列特異的である限り（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触）、配列特異的である必要はない。かかる相互作用は、一般に、１０-6Ｍ-1以下の解離定数（Ｋd）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指す。高い結合親和性は、低いＫdと関連している。
【００３６】
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合においては、それは、それ自体に結合する（その結果、ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができる、および／または異なるタンパク質または複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００３７】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、または構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上の亜鉛フィンガーによって配列特異的な様式でＤＮＡを結合するより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰとして略記される。
【００３８】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように、「改変」することができる。亜鉛フィンガータンパク質を改変するための方法の非制限的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成は、主として合理的基準によってもたらされる。設計のための合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、また、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６号も参照されたい。
【００３９】
「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、天然には見出されないタンパク質であり、その産生は、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスによって主にもたらされる。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、および国際公開第０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００４０】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数）ヌクレオチド長、好ましくは約１００〜１，０００（またはそれらの間の任意の整数）ヌクレオチド長、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。
【００４１】
「相同非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は、第２の配列と同一ではない、第１の配列を指す。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列に対して相同的かつ非同一である。ある実施形態では、２つの配列の間の相同性の度合いは、通常の細胞機構を利用して、それらの間で相同組み換えを可能にするために十分である。２つの相同非同一配列は、任意の長さである可能性があり、非相同性の度合いは、１ヌクレオチドほど小さいか（例えば、標的化相同組み換えによるゲノム点突然変異の補正のため）、または１０キロベース以上ほど大きい（例えば、染色体内の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため）可能性がある。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一の長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
【００４２】
核酸およびアミノ酸配列同一性を判定するための技術は、当該技術分野において既知である。典型的には、かかる技術は、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を判定すること、および／またはそれによってコードされたアミノ酸配列を判定すること、ならびにそれらの配列を、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、この方法で決定し、比較することができる。一般に、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸の対応が完全であることを指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性百分率を判定することによって比較することができる。核酸配列であれアミノ酸配列であれ、２つの配列の同一性百分率は、短い方の配列の長さで割り、１００を乗じた、２つの整合配列の間の厳密な合致数である。核酸配列の近似配列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所性相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性百分率を判定するためのこのアルゴリズムの例示的実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用用途において、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。配列の間の同一性百分率または類似性を計算するための好適なプログラムは、当該技術分野において一般に既知であり、例えば、別の整合プログラムは、デフォルトパラメータと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して、使用することができる：遺伝コード＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、期待数＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、表示＝５０配列、分類＝高スコア、データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｌｓａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネット上で見出すことができる。本明細書に説明する配列に関して、望ましい配列同一性の度合いの範囲は、約８０％〜１００％、およびそれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列の間の同一性百分率は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは、８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、更に好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００４３】
代替的には、ポリヌクレオチド間の配列類似性の度合いは、相同領域間で安定した二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化された断片の寸法決定によって決定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して判定されるように、分子の定義された長さにわたって、少なくとも７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、更に好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％の配列同一性を示すとき、互いに実質的に相同的である。本明細書に使用するとき、実質的に相同的はまた、指定されるＤＮＡまたはポリペプチド配列に完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同的であるＤＮＡ配列は、例えば、サザンハイブリダイゼーション実験において、その特定の体系のために定義されるストリンジェントな条件下で特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００４４】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次のように決定することができる。２つの核酸分子の間の配列同一性の度合いは、かかる分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野において周知である、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション、または同等物、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を使用して評価することができる。かかるアッセイは、異なる度合いの選択性を使用して、例えば、低ストリンジェンシーから高いストリンジェンシーまで異なる条件を使用して、実施することができる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合では、非特異的結合の不在は、非特異的結合事象の不在下で二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な配列同一性の度合いさえ持たない二次プローブ（例えば、標的分子との配列同一性が約３０％未満であるプローブ）を使用し、評価することができる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する時、参照核酸配列に相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、プローブおよび参照配列が二重鎖分子を形成するように、互いに選択的にハイブリダイズするか、または結合する。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズする能力を有する核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にするような条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約９０〜９５％を上回る配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が、特異的な度合いの配列同一性を有する、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において既知のとおり決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００４６】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う度合いを指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対する許容度の低さに相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、ならびに例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度を含むが、これらに限定されない。当業者には既知であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増加する。
【００４７】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、数々の等価条件は、例えば、次の因子：配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬（例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存否、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに洗浄条件を変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために使用することができることは、当該技術分野において周知である。特定の一連のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準方法に従い選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００４８】
「組み換え」は、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝子情報の交換のプロセスを指す。この開示に関して、「相同組み換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞中の二本鎖切断の修復中に行われるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験するもの）のテンプレート修復に「ドナー」分子を使用し、かつ、それがドナーから標的への遺伝子情報の移動をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として多様に知られる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる移動は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される、「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴う可能性がある。かかる特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが、標的ポリヌクレオチド内に組み込まれるような、標的分子の配列の変化をもたらす。
【００４９】
「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有主鎖の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない多様な方法によって開始することができる。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの別々の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらす可能性がある。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ開裂のために使用される。
【００５０】
「開裂ドメイン」は、ＤＮＡ開裂に対する触媒活性を有する１つ以上のポリペプチド配列を含む。開裂ドメインは、単一のポリペプチド鎖内に含有され得るか、または開裂活性は、２つ（またはそれを超える数）のポリペプチドの会合からもたらされ得る。
【００５１】
「開裂片側ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一のまたは異なるいずれかの）と併せて、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。
【００５２】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアが、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて変化する長さ）がヌクレオソームコアの間に延在する。１分子のヒストンＨ１は、一般にリンカーＤＮＡと会合する。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、原核性および真核性の両方の全ての種類の細胞核タンパク質を包含するように意図されている。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５３】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含む全染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。
【００５４】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムが挙げられる。
【００５５】
「到達可能領域」は、核酸内に存在する標的部位が標的部位を認識する外来性分子によって結合され得る、細胞クロマチン内の部位である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造内にパッケージングされない領域であると考えられる。到達可能領域の別々の構造は、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対する、その感受性によって検出することができる。
【００５６】
「標的部位」または「標的配列」は、結合にとって十分な条件が存在すれば、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。
【００５７】
「外来性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞中に導入することができる分子である。「通常は細胞中に存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋の胚発達中にのみ存在する分子は、成体筋細胞に対しては外来性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対しては外来性分子である。外来性分子は、例えば、任意のポリペプチドもしくはその断片に対するコード配列、機能不全型内在性分子の機能型、または正常機能型内在性分子の機能不全型を含む可能性がある。更に、外来性分子は、宿主細胞中の内在性遺伝子のオルソログである別の種からのコード配列を含む可能性がある。
【００５８】
外来性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの等の小分子、または、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子の１つ以上を含む任意の複合体等の高分子であってもよい。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、それは一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成する能力のあるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号明細書を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
外来性分子は、内在性分子と同一の種類の分子、例えば、外来性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外来性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞中に外来性分子を導入するための方法は当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。更なる内在性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれてもよい。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、「外来性核酸の産物」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡ等のポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【００６２】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に、連結された分子である。サブユニット分子は、同一の化学種類の分子であってもよいか、または異なる化学種類の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送達すること、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することによってもたらされてもよく、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂、およびポリペプチド連結はまた、細胞中のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法が本開示の他所で提示される。
【００６４】
本開示に関して、「遺伝子」は、かかる調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネータ、リポソーム結合部位および内部リポソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質である可能性がある。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００６６】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００６７】
「植物」細胞には、単子葉（単子葉類）または双子葉（双子葉類）植物の細胞が含まれるが、これらに限定されない。単子葉類の非限定的例としては、トウモロコシ、イネ、オオムギ、オートムギ、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナ、およびココナッツ等の穀物植物が挙げられる。双子葉類の非限定的例としては、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿花、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノーラ（ナタネ）、およびアルファルファが挙げられる。植物細胞は、植物の任意の部分からの、および／または植物発達の任意の段階からのものであってもよい。
【００６８】
「目的の領域」は、例えば、領域内で外因性分子を結合させることが望まれる、遺伝子、または遺伝子内のもしくはそれに隣接する非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域である。結合の目的は、標的化ＤＮＡ開裂および／または標的化組み換えであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノム内に存在することができる。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等の転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内である可能性がある。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長、またはヌクレオチド対の任意の整数値である可能性がある。
【００６９】
「作動的連結」および「作動的に連結」（または「作動可能に連結」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関連して交換可能に使用され、その中で両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許容するように各構成要素が配置される。例証として、プロモーター等の転写調節配列は、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合に、コード配列に作動的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していなくても、コード配列に作動的に連結される転写調節配列である。
【００７０】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結」という用語は、構成要素の各々が連動して機能し、そのように連結されていない場合にそれが果たす機能と同じ機能を実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関しては、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することが可能であり、開裂ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを開裂することが可能である場合に、作動的連結状態にある。
【００７１】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一でないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同一の残基数を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリッド形成する能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的相補性および生化学的相補性の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照されたい。
【００７２】
多重挿入部位
多重挿入部位、つまり、適切なＺＦＮ対の結合時に、多重挿入部位がＺＦＮ対の標的部位の間で開裂されるように複数の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）結合部位を含むポリヌクレオチドが、本明細書に開示される。
【００７３】
多重挿入部位上に含まれる標的部位は、好ましくは、それが組み込まれる細胞のゲノム内には見出されない。したがって、ゲノム内の望まれない開裂の発生は、低減または排除される。任意の数、例えば、１〜５０（またはその間の任意の数）、好ましくは２〜３０（またはその間の任意の数）、および更により好ましくは５〜２０（またはその間の任意の数）の標的部位が、多重挿入部位ポリヌクレオチドに含まれてもよい。亜鉛フィンガーヌクレアーゼについて、標的部位は、典型的には、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成して、適切な部位で開裂するような対になっている。
【００７４】
更に、図１に示されるように、標的部位（図１の影付き三角）の各対の１つの標的部位は、多重挿入部位全体にわたって同じであってもよい。代替的には、ヘテロ二量体対は、部位の間で異なってもよい。
【００７５】
多重挿入部位は、ホモ二量体のみが結合する標的部位、ヘテロ二量体のみが結合する標的部位、またはホモ二量体またはヘテロ二量体が結合する標的部位の組み合わせを含んでもよい。場合によっては、次の１つ以上の理由で、ホモ二量体が結合する標的部位が好ましい可能性がある：１つのＺＦＮの送達が２つのそれよりも効率的であり得ること、ホモ二量体化が、ＺＦＮの不均等な発現に起因する不均等な化学量論の問題を低減すること；オフターゲット部位における開裂からの毒性が低減され得ること；ＣＣＨＣ（非標準）亜鉛フィンガードメインを使用するとき、それによってホモ二量体が破壊される可能性が半減すること；および／または固有の標的可能部位の総数が拡大され得ること。代替的に、他の場合には、ヘテロ二量体は、異なる標的部位の混合およびマッチング、故にＺＦＮ対に対する標的可能部位の増加の可能性を許容するため、好ましい可能性がある。また、ヘテロ二量体は、実行者の必要に応じて、ドナーの逐次的付加も許容する。ヘテロ二量体組み合わせはまた、新規ＺＦＮ対の使用を通じて、ドナーの任意の所望の部分の特異的欠失も許容し得る。
【００７６】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼに対する標的部位が３ヌクレオチドの倍数である必要がないことは明白であろう。例えば、交差鎖相互作用が生じる場合（例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および国際公開第０２／０７７２２７号を参照されたい）、マルチフィンガー結合ドメインの個々の亜鉛フィンガーのうちの１つ以上は、重複する四重亜部位に結合することができる。結果として、３フィンガータンパク質は、１０ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで１０番目のヌクレオチドは、末端フィンガーが結合する四重の一部であり、４フィンガータンパク質は、１３ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで１３番目のヌクレオチドは、末端フィンガーが結合する四重の一部である、等である。
【００７７】
マルチフィンガー結合ドメインにおける個々の亜鉛フィンガーの間のアミノ酸リンカー配列の長さおよび性質もまた、標的配列への結合に影響を及ぼす。例えば、マルチフィンガー結合ドメインにおける隣接した亜鉛フィンガーの間の、いわゆる「非標準的なリンカー」、「長いリンカー」、または「構造化リンカー」の存在は、それらのフィンガーが直接隣接していない亜部位に結合することを可能にし得る。かかるリンカーの非限定的例は、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号および国際公開第０１／５３４８０号に記載される。したがって、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する標的部位における１つ以上の亜部位は、互いから１、２、３、４、５、またはそれを超えるヌクレオチド分だけ隔てられてもよい。一例を提供するにすぎないが、４フィンガー結合ドメインは、順番に、２つの隣接する３ヌクレオチド亜部位、介入するヌクレオチド、および２つの隣接する三重亜部位を含む、１３ヌクレオチド標的部位に結合することができる。
【００７８】
配列（例えば、標的部位）の間の距離は、互いに最も近接した配列の端から測定した、２つの配列の間に介入するヌクレオチドまたはヌクレオチド対の数を指す。
【００７９】
開裂が２つの亜鉛フィンガードメイン／開裂片側ドメイン融合分子の、別個の標的部位への結合に依存するある実施形態では、２つの標的部位は、反対側のＤＮＡ鎖上にあり得る。他の実施形態では、両方の標的部位は、同じＤＮＡ鎖上にある。
【００８０】
多重挿入部位は、植物ゲノム内のいずれの場所にも組み込むことができる。ある実施形態では、多重挿入部位は、トウモロコシゲノムにおけるＺｐ１５に組み込まれ、それは米国出願第１２／６５３，７３５号に記載されるように、外来性配列の標的の組み込みのために望ましい部位である。
【００８１】
ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に開示される方法で使用することができる。ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。亜鉛フィンガー結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１６０９−１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｂ．：５６−６５、米国特許第６，４５３，２４２号。本明細書に記載される亜鉛フィンガー結合ドメインは、一般に、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または更にそれを超える亜鉛フィンガーを含む。
【００８２】
典型的には、単一の亜鉛フィンガードメインは、約３０アミノ酸長である。構造的研究は、各亜鉛フィンガードメイン（モチーフ）が、２つのベータシート（２つの不変のシステイン残基を含有するベータターンにおいて保有される）およびアルファヘリックス（２つの不変のヒスチジン残基を含有する）を含有し、それらが２つのシステインおよび２つのヒスチジンによる亜鉛原子の配位を通じて、特定のコンフォメーションにおいて保有されることを実証している。
【００８３】
亜鉛フィンガーは、標準的なＣ2Ｈ2亜鉛フィンガー（すなわち、亜鉛イオンが２つのシステインおよび２つのヒスチジン残基によって配位されるもの）、ならびに例えば、Ｃ3Ｈ亜鉛フィンガー（亜鉛イオンが３つのシステイン残基および１つのヒスチジン残基によって配位されるもの）、およびＣ4亜鉛フィンガー（亜鉛イオンが４つのシステイン残基によって配位されるもの）等の非標準的な亜鉛フィンガーの両方を含む。植物における使用のための非標準的なＺＦＰに関してはまた、国際公開第０２／０５７２９３号、およびまた米国特許公開第２００８０１８２３３２号も参照されたい。
【００８４】
改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。改変方法には、合理的設計および様々な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列に結合する亜鉛フィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する。
【００８５】
ファージディスプレイおよび２ハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示される。
【００８６】
亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００８７】
個々の亜鉛フィンガーは、３ヌクレオチド（すなわち、三重）配列（または隣接した亜鉛フィンガーの４ヌクレオチド結合部位により、１ヌクレオチド分だけ重複し得る４ヌクレオチド配列）に結合するため、亜鉛フィンガー結合ドメインが改変されて結合する配列（例えば、標的配列）の長さは、改変亜鉛フィンガー結合ドメインにおける亜鉛フィンガーの数を決定するであろう。例えば、フィンガーモチーフが重複する亜部位に結合しないＺＦＰについて、６ヌクレオチド標的配列には、２フィンガー結合ドメインが結合し、９ヌクレオチド標的配列には、３フィンガー結合ドメインが結合する、等である。本明細書に記載されるように、標的部位における個々の亜鉛フィンガーに対する結合部位（すなわち、亜部位）は、隣接している必要はないが、マルチフィンガー結合ドメインにおける亜鉛フィンガーの間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さおよび性質に依存して、１つ以上のヌクレオチド分だけ隔てられる可能性がある。
【００８８】
マルチフィンガー亜鉛フィンガー結合ドメインにおいて、隣接した亜鉛フィンガーは、およそ５アミノ酸（いわゆる「標準」フィンガー間リンカー）のアミノ酸リンカー配列分、または代替的に、１つ以上の非標準的なリンカー分だけ隔てられる可能性がある。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。３つを超えるフィンガーを含む改変された亜鉛フィンガー結合ドメインについて、場合によっては、ある種の亜鉛フィンガー間のより長い（「非標準」）フィンガー間リンカーの挿入は、それが結合ドメインによる結合の親和性および／または特異性を増加させ得るため、望ましい可能性がある。例えば、米国特許第６，４７９，６２６号および国際公開第０１／５３４８０号を参照されたい。したがって、マルチフィンガー亜鉛フィンガー結合ドメインはまた、非標準的なフィンガー間リンカーの存在および位置に関して特徴付けることができる。例えば、３フィンガー（２つの標準的なフィンガー間リンカーによって結合される）、長いリンカー、および３つの追加的なフィンガー（２つの標準的なフィンガー間リンカーによって結合される）を含む６フィンガー亜鉛フィンガー結合ドメインは、２×３構成と表示される。同様に、２つのフィンガー（その間に標準的なリンカーを有する）、長いリンカー、および２つの追加的なフィンガー（標準的なリンカーによって結合される）を含む結合ドメインは、２×２構成と表示される。３つの２フィンガー単位（その各々において２つのフィンガーは、標準的なリンカーによって結合される）を含み、その中で各２つのフィンガー単位が長いリンカーによって隣接した２つのフィンガー単位に結合されるタンパク質は、３×２構成と称される。
【００８９】
マルチフィンガー結合ドメインにおける２つの隣接した亜鉛フィンガーの間の、長いまたは非標準的なフィンガー間リンカーの存在は、しばしば、２つのフィンガーが、標的配列内で直接隣接していない亜部位に結合することを可能にする。したがって、標的部位における亜部位の間に１つ以上のヌクレオチドのギャップが存在し得、すなわち、標的部位は、亜鉛フィンガーが接触していない１つ以上のヌクレオチドを含有し得る。例えば、２×２亜鉛フィンガー結合ドメインは、１ヌクレオチド分だけ隔てられた２つの６ヌクレオチド配列に結合することができ、すなわち、それは１３ヌクレオチド標的部位に結合する。また、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３２−１４３６、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３７−１４４１、および国際公開第０１／５３４８０号も参照されたい。
【００９０】
前述のように、標的亜部位は、単一の亜鉛フィンガーが結合する、３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド配列である。ある目的に関して、２フィンガー単位は、「結合モジュール」と表示される。結合モジュールは、例えば、特定の６ヌクレオチド標的配列に結合するマルチフィンガータンパク質（一般に、３フィンガー）の文脈において、２つの隣接したフィンガーについて選択することによって得ることができる。代替的に、モジュールは、個々の亜鉛フィンガーの組立によって構築することができる。また、国際公開第９８／５３０５７号および国際公開第０１／５３４８０号も参照されたい。
【００９１】
代替的に、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ，ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然の標的部位に結合するよう改変することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００９２】
別の代替として、ＤＮＡ結合ドメインは、ロイシンジッパータンパク質に由来し得る。ロイシンジッパーは、遺伝子発現に関連する重要な転写因子である多くの真核性調節タンパク質におけるタンパク質−タンパク質相互作用に関与する、タンパク質のクラスである。ロイシンジッパーは、動物、植物、酵母等を含む複数の界にわたって、これらの転写因子において共有される共通の構造モチーフを指す。ロイシンジッパーは、２つのポリペプチドのロイシン残基がヘリックスの同じ面上で終了するように、ロイシン残基がα−ヘリックスを通じて均等に間隔をあけられる様態で、特異的ＤＮＡ配列に結合する２つのポリペプチド（ホモ二量体またはヘテロ二量体）によって形成される。ロイシンジッパーのＤＮＡ結合特異性は、本明細書に開示されるＤＮＡ結合ドメインにおいて利用することができる。
【００９３】
幾つかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナスに由来するＴＡＬエフェクターからの改変ドメインである（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ  ２２  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］、Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９  Ｏｃｔ  ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）、およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９  Ｏｃｔ  ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７）を参照されたい。
【００９４】
開裂ドメイン
上記のように、ＤＮＡ結合ドメインは、開裂（ヌクレアーゼ）ドメインに関連し得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能を保持しながら、それらのＤＮＡ結合特異性において修飾されてもよい。加えて、亜鉛フィンガータンパク質を、開裂ドメインに融合して、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成してもよい。本明細書に開示される融合タンパク質の開裂ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインの由来であり得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ａｎｄ  Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを開裂する追加的な酵素は既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、また、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの非限定的例としては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが既知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上を、開裂ドメインおよび開裂片側ドメインの源として使用することができる。
【００９５】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡ（認識部位における）に配列特異的に結合すること、また結合の部位におけるまたはそれに近接するＤＮＡを開裂することができる。ある種の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位におけるＤＮＡを開裂し、分離可能な結合および開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、１つの鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、およびもう１つの鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。故に、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの開裂ドメイン（または開裂片側ドメイン）および１つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメインを含み、それは改変されてもよく、されなくてもよい。
【００９６】
開裂ドメインが結合ドメインから分離可能な、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示に関して、開示される融合タンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、開裂片側ドメインとみなされる。故に、亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合を使用する細胞配列の標的化二本鎖開裂および／または標的化置換のために、各々がＦｏｋＩ開裂片側ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成することができる。代替的に、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂片側ドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合を使用する標的化開裂および標的化配列変更についてのパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。
【００９７】
開裂ドメインまたは開裂片側ドメインは、開裂活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能性開裂ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
【００９８】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、譲受人共通の国際公開第ＷＯ２００７／０１４２７５号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
開裂特異性を強化するために、開裂ドメインがまた修飾されてもよい。ある実施形態では、開裂片側ドメインの変異体が用いられ、これらの変異体は、開裂片側ドメインのホモ二量体化を最小化または防止する。かかる修飾された開裂片側ドメインの非限定的例は、国際公開第２００７／０１４２７５号に詳細に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、実施例も参照されたい。ある実施形態では、ホモ二量体化を最小化または防止する改変開裂片側ドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも称される）を含む開裂ドメインは、当業者に既知であり、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に記載され、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位におけるアミノ酸残基は全てＦｏｋＩ開裂片側ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号、国際特許公開第ＷＯ０７／１３９８９８号、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（７）：７７８−７８５、およびＤｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８（１）：７４−７９を参照されたい。
【０１００】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの追加的な改変された開裂片側ドメインを、本明細書に記載されるＺＦＮにおいて使用することもできる。一実施形態では、第１の開裂片側ドメインは、ＦｏｋＩの４９０および５３８位におけるアミノ酸残基における突然変異を含み、第２の開裂片側ドメインは、アミノ酸残基４８６および４９９における突然変異を含む。
【０１０１】
ある実施形態では、開裂ドメインは、２つの開裂片側ドメインを含み、それらの両方が、結合ドメイン、第１の開裂片側ドメイン、および第２の開裂片側ドメインを含む単一のポリペプチドの一部である。開裂片側ドメインは、それらがＤＮＡを開裂させるように機能する限り、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができる。
【０１０２】
一般に、融合タンパク質が、開裂片側ドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。代替的に、２つの開裂片側ドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの開裂片側ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各開裂片側ドメインが、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、互いに対して、２つの融合タンパク質のそれらの対応する標的部位への結合が、例えば、二量体化によって、開裂片側ドメインが機能性開裂ドメインを形成することを可能にする相互に対する空間的配向で開裂片側ドメインを配置するように、配置される。故に、ある実施形態では、標的部位の近端は、５〜８ヌクレオチド分または１５〜１８ヌクレオチド分、隔てられる。しかしながら、任意の整数の数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位（例えば、２〜５０ヌクレオチド以上）の間に介入してもよい。一般に、開裂の点は、標的部位の間にある。
【０１０３】
融合タンパク質
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知である。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガードメイン）および調節または開裂ドメイン（または開裂片側ドメイン）を含む融合タンパク質、ならびにかかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの設計および構築のための方法は、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号、ならびに米国特許出願公開第２００７／０１３４７９６号および同第２００５／００６４４７４号に記載され、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが構築される。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに挿入することができ、ベクターは、細胞に導入することができる（ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのベクターおよび方法に関する追加的な開示については下記を参照されたい）。
【０１０４】
本明細書に記載される方法のある実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ制限酵素からの亜鉛フィンガー結合ドメインおよび開裂片側ドメインを含む融合タンパク質を含み、２つのかかる融合タンパク質は、細胞中で発現される。２つの融合タンパク質の細胞中の発現は、２つのタンパク質の細胞中への送達、１つのタンパク質およびタンパク質の１つをコードする１つの核酸の、細胞中への送達、各々がタンパク質の１つをコードする２つの核酸の、細胞中への送達から、または両方のタンパク質をコードする単一の核酸の、細胞中への送達によって、もたらされ得る。追加的な実施形態では、融合タンパク質は、２つの開裂片側ドメインおよび亜鉛フィンガー結合ドメインを含む、単一のポリペプチド鎖を含む。この場合、単一の融合タンパク質が細胞中で発現され、理論に拘束されることを望むものではないが、開裂片側ドメインの分子内二量体の形成の結果としてＤＮＡを開裂させると考えられる。
【０１０５】
ある実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合）の構成要素は、亜鉛フィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最近接し、開裂片側ドメインがカルボキシ末端に最近接するように配列される。これは、ＦｏｋＩ酵素に由来するもの等の天然に存在する二量体化開裂ドメインにおける開裂ドメインの相対的配向を反映し、ここでＤＮＡ結合ドメインは、アミノ末端に最近接し、開裂片側ドメインは、カルボキシ末端に最近接する。これらの実施形態では、機能性ヌクレアーゼを形成するための開裂片側ドメインの二量体化は、融合タンパク質の、反対側のＤＮＡ鎖上の部位への結合によって引き起こされ、このうち結合部位の５’末端は、互いに近位にある。
【０１０６】
追加的な実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合）の構成要素は、開裂片側ドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最近接し、亜鉛フィンガードメインがカルボキシ末端に最近接するように配列される。これらの実施形態では、機能性ヌクレアーゼを形成するための開裂片側ドメインの二量体化は、融合タンパク質の、反対側のＤＮＡ鎖上の部位への結合によって引き起こされ、このうち結合部位の３’末端は、互いに近位にある。
【０１０７】
なおも追加的な実施形態では、第１の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に最近接した開裂片側ドメイン、およびカルボキシ末端に最近接した亜鉛フィンガードメインを含有し、第２の融合タンパク質は、亜鉛フィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最近接し、開裂片側ドメインがカルボキシ末端に最近接するように配列される。これらの実施形態では、両方の融合タンパク質が同じＤＮＡ鎖に結合し、このうち第１の融合タンパク質の結合部位は、アミノ末端に最近接した亜鉛フィンガードメインを含有する第２の融合タンパク質の結合部位の５’側に対して位置する、カルボキシ末端に最近接した亜鉛フィンガードメインを含有する。
【０１０８】
開示される融合タンパク質のある実施形態では、亜鉛フィンガードメインと開裂ドメイン（または開裂片側ドメイン）との間のアミノ酸配列は、「ＺＣリンカー」と表示される。ＺＣリンカーは、上述のフィンガー間リンカーと区別されるべきである。開裂を最適化するＺＣリンカーを得ることに関する詳細については、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４Ａ１号および同第２００３０２３２４１０号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０５／０８４１９０号を参照されたい。
【０１０９】
一実施形態では、本開示は、表１に示される認識ヘリックスアミノ酸配列のうちの１つ以上を有する亜鉛フィンガータンパク質を含むＺＦＮを提供する。別の実施形態では、表１に示される１つ以上の認識ヘリックスを有するＺＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む、ＺＦＰ発現ベクターが本明細書に提供される。
【０１１０】
標的化組込み
開示される方法および組成物を使用して、多重挿入部位が組み込まれている任意の細胞ゲノム中のＤＮＡを開裂することができ、それは適切なＺＦＮ対の存在下での、外来性配列の多重挿入部位への安定な標的化組み込みおよび／または外来性配列の切除を促進する。図１および２を参照されたい。
【０１１１】
ＺＦＮ挿入部位が外来性配列の一部として細胞のゲノムに連続して導入される方法もまた、本明細書に記載される。図４および５を参照されたい。例えば、ヘテロ二量体ヌクレアーゼ部位の異なる組み合わせが側面に位置する外来性配列が、ゲノムに挿入される。その後、適切な隣接するＺＦＮ部位の１つにおいて開裂するＺＦＮ対が、再びヘテロ二量体ヌクレアーゼ部位の異なる組み合わせを含む別の外来性配列の存在下で、細胞に導入される。このプロセスは、外来性配列を挿入するために所望に応じて反復することができる。加えて、適切なＺＦＮ対の存在下で、１つ以上の外来性配列がゲノムから切除されてもよい。
【０１１２】
図６は、外来性配列がマーカー遺伝子および目的の遺伝子を含む、別の実施形態を示す。マーカー遺伝子および目的の遺伝子の両方の側面には、適切な場合、例えば、追加的な遺伝子を挿入するときに、マーカー遺伝子が欠失させられ得るように、異なるＺＦＮ結合部位（異なる陰影を有する三角として示される）が位置する。選択可能マーカーの数が限定される植物等の生物において、これはわずか１つにすぎない選択可能マーカー遺伝子の使用を可能にし、目的の遺伝子をスタッキングする可能性を大幅に促進する。ある実施形態では、例えば、相同性指向性ＤＮＡ修復の効率に依存して、「分裂した」選択可能マーカーが使用されてもよい。分裂した選択可能マーカーを使用するドナーＤＮＡ配列の正しい組み込みにより、発現可能な選択可能マーカー遺伝子が作り出される。選択可能マーカーは、組み込まれたＤＮＡ配列から切除することができ、したがって再利用することができる。別の実施形態では、除去のための外来性配列には、ゲノムにおいて分裂したマーカー遺伝子の部分配列が隣接する。切除されると、マーカー遺伝子は再構築され、機能性マーカー遺伝子の作成をもたらす。選択可能マーカー切除の使用は、必要とされる選択可能マーカーの数を２つまたは場合によっては１つのみに限定する。
【０１１３】
本明細書に記載されるように組み込まれた多重挿入部位への標的化組み込みについて、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）は、所定の開裂部位における、またはそれに近接した標的部位に結合するように改変され、改変ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインを含む融合タンパク質が細胞中で発現される。融合タンパク質のＤＮＡ結合（例えば、亜鉛フィンガー）部分が標的部位に結合すると、ＤＮＡは、好ましくは二本鎖切断を介して、開裂ドメインによって標的部位に近隣して開裂される。
【０１１４】
多重挿入部位における二本鎖切断の存在は、相同組み換えを介した外来性配列の組み込みを促進する。ある実施形態では、多重挿入部位への挿入対象の外来性配列を含むポリヌクレオチドは、相同組み換えを促進するために、多重挿入部位ポリヌクレオチドおよび／または周辺のゲノムと相同性の１つ以上の領域を含むであろう。ドナー配列とゲノム配列との間の、およそ２５、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチドまたはそれを超える配列相同性（または１０〜２，０００ヌクレオチドもしくはそれを超える任意の整数値）がその間の相同組み換えを支持するであろう。ある実施形態では、相同性アームは、１，０００塩基対長未満である。他の実施形態では、相同性アームは、７５０塩基対長未満である。また、米国仮特許出願第６１／１２４，０４７号も参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる。ドナー分子（外来性配列）は、細胞クロマチンに対して相同性の、複数の不連続の領域を含有し得る。例えば、目的の領域に通常存在しない配列の標的化挿入のために、該配列は、ドナー核酸分子に存在し、目的の領域における遺伝子配列に対して相同性の領域が側面に位置する可能性がある。
【０１１５】
目的の任意の配列（外来性配列）は、本明細書に記載されるように多重挿入部位に導入、またはそこから切除することができる。例示的な外来性配列には、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター、エンハンサー、および他の調節配列（例えば、干渉ＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ発現カセット、エピトープタグ、マーカー遺伝子、開裂酵素認識部位および様々な種類の発現構築物が含まれるが、これらに限定されない。かかる配列は、標準的な分子生物学技術（クローニング、合成等）を使用して容易に得ることができ、かつ／または市販されている。外来性配列は、融合タンパク質の発現の前に、それと同時に、またはその後に細胞に導入することができる。
【０１１６】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであっても、一本鎖または二本鎖のいずれか一方であってもよく、線状または環状形態で細胞に導入されてもよい。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端部は、当業者に既知の方法によって保護（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補性オリゴヌクレオチドは、１つまたは両方の末端部に結合される。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加的な方法には、末端アミノ基の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修飾されたヌクレオチド間結合の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗体抵抗性をコードする遺伝子等の追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。更に、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、ナノ粒子、リポソーム、もしくはポロキサマー等の薬剤と複合体化した核酸として、導入することができるか、または細菌もしくはウイルスによって植物細胞に送達することができる（例えば、アグロバクテリウム、リゾビウム属ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、メソリゾビウム・ロティ、タバコモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、およびカッサバ葉脈モザイクウイルス。例えば、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１（１）：１−４を参照されたい。
【０１１８】
上に詳述されるように、各々が亜鉛フィンガー結合ドメインおよび開裂片側ドメインを含む、２つの融合タンパク質（ホモ二量体またはヘテロ二量体）に対する多重挿入部位上の結合部位は、他の結合部位に最近接した各結合部位の端から測定して５〜８または１５〜１８ヌクレオチド離れて位置し得、開裂は、結合部位の間で生じる。開裂が単一の部位においてまたは結合部位の間の多重部位において生じるかは、開裂されたゲノム配列がドナー配列によって置換されるため、重要でない。故に、標的化組み換えによる単一のヌクレオチド対の配列の効率的変更のために、結合部位の間の領域の中点は、そのヌクレオチド対の１０，０００ヌクレオチド内、好ましくは１，０００ヌクレオチド、または５００ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド、または５０ヌクレオチド、または２０ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド、または５ヌクレオチド、または２ヌクレオチド、または１ヌクレオチド内であるか、または目的のヌクレオチド対における。
【０１１９】
例えば、ＲＡＤ５４エピスタシスグループ（例えば、ＡｔＲａｄ５４、ＡｔＲａｄ５１）の植物遺伝子、遺伝子の産物が前述の遺伝子産物と相互作用する遺伝子等の相同組み換えに関与する遺伝子の発現を活性化するための、追加的なＺＦＰ機能性ドメイン融合の使用を含むが、これらに限定されない、標的化組み換えのレベルを強化し得る方法および組成物もまた、提供される。例えば、Ｋｌｕｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００８  Ａｐｒ；１７８（４）：２３８９−９７を参照されたい。
【０１２０】
同様に、ＺＦＰ機能性ドメイン融合は、非相同末端結合（例えば、Ｋｕ７０／８０、ＸＲＣＣ４、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ４）に関与する遺伝子の発現を抑制するために、本明細書に開示される方法および組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、Ｒｉｈａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ  ２１：２８１９−２８２６、Ｆｒｅｉｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３４：４２７−４４０、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２４：１３５−１４２を参照されたい。亜鉛フィンガー結合ドメインと機能性ドメインとの間の融合を使用した、遺伝子発現の活性化および抑制のための方法は、例えば、譲受人共通の米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，８２４，９７８号、および同第６，９３３，１１３号に開示される。追加的な抑制方法には、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または抑制対象の遺伝子の配列を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）もしくはｓｈＲＮＡの使用が含まれる。
【０１２１】
亜鉛フィンガー／ヌクレアーゼ融合分子およびドナーＤＮＡ分子を含む細胞中の標的化組み換えの効率における更なる増加は、相同性駆動型修復プロセスが最大限に活性である細胞周期のＧ2期において細胞を遮断することによって達成される。かかる停止は、幾つかの方法で達成することができる。例えば、細胞は、Ｇ2期の細胞を停止させるために、例えば、細胞周期進行に影響を及ぼす薬物、化合物および／または小分子で処置することができる。この種類の例示的な分子には、微小管重合に影響を及ぼす化合物（例えば、ビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール）、ＤＮＡと相互作用する化合物（例えば、シス−プラチナム（ＩＩ）ジアミンジクロリド、シスプラチン、ドキソルビシン）、および／またはＤＮＡ合成に影響を及ぼす化合物（例えば、チミジン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−ミモシン、エトポシド、５−フルオロウラシル）が含まれるが、これらに限定されない。組み換え効率における追加的な増加は、クロマチン構造を変化させて、ゲノムＤＮＡを細胞組み換え機構へとより到達可能にする、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ）の使用によって達成される。
【０１２２】
細胞周期停止のための追加的な方法には、例えば、タンパク質をコードするｃＤＮＡを細胞中に導入することによって、または細胞中にタンパク質をコードする遺伝子の発現を活性化する改変されたＺＦＰを導入することによって、ＣＤＫ細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質を過剰発現させることが含まれる。細胞周期停止はまた、例えば、ＲＮＡｉ法を使用して（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号）サイクリンおよびＣＤＫの活性を阻害することによって、または細胞中に、例えば、サイクリンおよび／またはＣＤＫ遺伝子等の、細胞周期進行に関与する１つ以上の遺伝子の発現を抑制する改変されたＺＦＰを導入することによっても達成される。遺伝子発現の調節のために改変された亜鉛フィンガータンパク質の合成のための方法については、例えば、譲受人共通の米国特許第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１２３】
代替的に、ある場合には、ドナーポリヌクレオチドの不在下で（好ましくはＳまたはＧ2期において）標的化開裂が実施され、組み換えが相同染色体の間で生じる。
【０１２４】
発現ベクター
本明細書に記載される１つ以上の融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）をコードする核酸は、複製および／または発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換のために、ベクターにクローン化することができる。ベクターは、原核性ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター、または真核性ベクターであり得る。融合タンパク質をコードする核酸もまた、細胞への投与のために発現ベクターにクローン化することができる。
【０１２５】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）を発現させるために、融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を導くためのプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローン化される。好適な細菌および真核性プロモーターは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９；３rd  ｅｄ．，２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載される（上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。ＺＦＰを発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス属、およびサルモネラで入手可能である（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３））。かかる発現系のためのキットが市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核性発現系は、当業者に周知であり、また市販されている。
【０１２６】
融合タンパク質コード核酸の発現を導くために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、宿主細胞に適合させられた強力な構成的プロモーターは、典型的には融合タンパク質の発現および精製のために使用される。
【０１２７】
対照的に、植物遺伝子の調節のために融合タンパク質がインビボ投与されるとき（下記の「植物細胞への核酸送達」節を参照されたい）、融合タンパク質の特定の使用に依存して、構成的プロモーター、調節されたプロモーター（例えば、発達中に、組織または細胞型によって、または環境によって）、または誘導性プロモーターのいずれかが、使用される。植物プロモーターの非限定的例としては、シロイヌナズナ・ユビキチン−３（ｕｂｉ−３）（Ｃａｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５−１２４８６−１２４９３）、アグロバクター・ツメファシエンス（Δｍａｓ）（Ｐｅｔｏｌｉｎｏら、米国特許第６，７３０，８２４号）、および／またはカッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１：１１２９−１１３９）に由来するプロモーター配列が挙げられる。また、実施例も参照されたい。
【０１２８】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核性または真核性のいずれかの宿主細胞中での核酸の発現に必要とされる全ての追加的な要素を含有する、転写単位または発現カセットを含有する。典型的な発現カセットは故に、例えば、融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結のために必要とされるシグナルを含有する。カセットの追加的な要素には、例えば、エンハンサー、異種スプライシングシグナル、および／または核局在化シグナル（ＮＬＳ）が含まれてもよい。
【０１２９】
遺伝子情報を細胞中に移入するために使用される特定の発現ベクターは、融合タンパク質の意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原虫等における発現に関連して選択される（後述の発現ベクターを参照されたい）。標準的な細菌および動物発現ベクターは、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４Ａ１号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０５／０８４１９０号、同第ＷＯ０５／０１４７９１号、および同第ＷＯ０３／０８０８０９号に詳述される。
【０１３０】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞株を産生することができ、それは次いで標準技術を使用して精製することができる（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，１９９０）を参照されたい）。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準技術に従って実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）、Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８３）を参照されたい。
【０１３１】
外来ヌクレオチド配列をかかる宿主細胞に導入するための周知の手順のうちのいずれが使用されてもよい。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソーム型および組み込み型の両方のウイルスベクターの使用、ならびにクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝材料を、宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれの使用も含まれる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。使用される特定の遺伝子改変手順が、少なくとも１つの遺伝子を、選択のタンパク質を発現することができる宿主細胞に首尾よく導入できれば十分である。
【０１３２】
植物細胞への核酸送達
上記のように、ＤＮＡ構築物は、多様な従来の技術によって所望の植物宿主に（例えば、そのゲノムに）導入されてもよい。かかる技術の概説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３、およびＧｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８，２ｄ  Ｅｄ．），Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９を参照されたい。
【０１３３】
例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション等の技術を使用して植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入されてもよく、またはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡマイクロプロジェクタイルボンバードメント等のバイオリスティック法を使用して植物組織に直接導入することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３を参照されたい）。代替的に、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞に導入することができる（例えば、米国特許出願第１２／２４５，６８５号を参照されたく、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替的に、ＤＮＡ構築物は、好適なＴ−ＤＮＡ境界／隣接領域と組み合わされ、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクターに導入されてもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介型形質転換技術は、無害化（ｄｉｓａｒｍｉｎｇ）およびバイナリーベクターの使用を含めて、科学文献に詳細に記載される。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６−４９８、およびＦｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４８０３を参照されたい。
【０１３４】
加えて、遺伝子移入は、リゾビウム属ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、メソリゾビウム・ロティ、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、およびカッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルス等の、非アグロバクテリウム細菌またはウイルスを使用して達成してもよく、例えば、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１（１）：１−４を参照されたい。
【０１３５】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主のビルレンス機能は、バイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）または共培養手順（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１）を使用して、細胞をこの細菌に感染させるとき、構築物および隣接マーカーを含有するＴ鎖の、植物細胞ＤＮＡへの挿入を導く。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を改変するために使用される（Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ  １６：３５７−３８４、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１８：６２７−６４１）。アグロバクテリウム形質転換系は、単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを形質転換ならびに移入するためにも使用することができる。米国特許第５、５９１，６１６号、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：３０３９−３０４１、Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−７６４、Ｇｒｉｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：１６７７−１７９、Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３１−４０、およびＧｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５：４２６−４３４を参照されたい。
【０１３６】
代替的な遺伝子移入および形質転換方法には、カルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはエレクトロポレーション媒介型ネイキッドＤＮＡの取り込みを通じたプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７１７−２７２２、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９−１７７、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４−５８２８、およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４−２７６を参照されたい）、および植物組織のエレクトロポレーション（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５）が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞形質転換のための追加的な方法には、マイクロインジェクション、炭化ケイ素媒介型ＤＮＡ取り込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ９：４１５−４１８）、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９、およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８を参照されたい）が含まれる。
【０１３７】
開示される方法および組成物を使用して、外来配列を、植物細胞のゲノムに挿入されている多重挿入部位に挿入することができる。植物ゲノムに導入された導入遺伝子の発現は、その組み込み部位に決定的に依存するため、これは有用である。例えば、除草剤耐性、虫害抵抗性、栄養素、抗体または治療用分子をコードする遺伝子は、標的化組み換えによって、それらの発現に好ましい植物ゲノムの領域に挿入することができる。
【０１３８】
上記の形質転換技術のいずれかによって産生される形質転換された植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型を有し、故に所望の表現型を有する、全植物体を再生することができる。かかる再生技術は、組織培養成長培地中のある種の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存する。培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１２４−１７６、Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３、およびＢｉｎｄｉｎｇ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｐｐ．２１−７３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８５に記載される。再生はまた、植物のカルス、外植片、器官、花粉、胚、またはそれらの一部から得ることもできる。かかる再生技法は、一般に、Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６に記載される。
【０１３９】
植物細胞に導入された核酸を使用して、本質的にいずれの植物にも、所望の形質を付与することができる。本開示の核酸構築物および上述の様々な形質転換方法を使用して、本明細書に記載される所望の生理学的および作物栽培学的特徴のために、多種多様な植物および植物細胞系が改変されてもよい。好ましい実施形態では、改変用の標的植物および植物細胞には、穀物作物（例えばコムギ、トウモロコシ、イネ、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）、オオムギ）、果実作物（例えばトマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えばアルファルファ）、根菜作物（例えばニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えばレタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えばペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えばマツ、モミ、トウヒ）、ファイトレメディエーションに使用される植物（例えば重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）および実験目的のために使用される植物（例えば、アラビドプシス）を含む作物等の単子葉植物および双子葉植物が含まれるが、これらに限定されない。故に、開示される方法および組成物は、例えば、限定するわけではないが、アスパラガス属、カラスムギ属、アブラナ属、ミカン属、スイカ属、トウガラシ属、カボチャ属、ニンジン属、ダイズ属、ワタ属、オオムギ属、アキノノゲシ属、トマト属、リンゴ属、マニホット属、タバコ属、イネ属、ワニナシ属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、コムギ属、ブドウ属、ササゲ属、およびトウモロコシ属に属する種を含むが、これらに限定されない、広範囲にわたる植物に使用することができる。
【０１４０】
当業者であれば、現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、作動可能であることが確認された後、それを有性交配によって他の植物体に導入できることを認識するであろう。幾つかの標準的育種技術のうちのいずれも、交配させる種に依存して使用することができる。
【０１４１】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物体は、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質に関して、改変された植物材料を選択またはスクリーニングすることによって特定し、単離することができる。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物によって耐性を付与される、阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地上で、改変された植物材料を成長させることよって行うことができる。更に、形質転換された植物および植物細胞はまた、組み換え核酸構築物上に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって特定することもできる。かかる選択およびスクリーニング手法は、当業者に周知である。
【０１４２】
また、物理的および生化学的方法を使用して、挿入された遺伝子構築物を含有する植物形質転換体または植物細胞形質転換体を特定してもよい。これらの方法には、１）組み換えＤＮＡ挿入を検出し、その構造を決定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅、２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出し、検査するためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅、３）かかる遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされる場合、酵素活性またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、４）遺伝子構築物産物がタンパク質である場合、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技術、免疫沈降、または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。また、インサイツハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色等の追加的な技術を使用して、特定の植物器官または植物組織における組み換え構築物の存在または発現を検出することもできる。全てのこれらのアッセイを行うための方法は、当業者に周知である。
【０１４３】
本明細書に開示される方法を使用する遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織から単離されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットよって観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するか、またはｍＲＮＡの量が増加している場合、対応する導入遺伝子が発現されていると想定することができる。遺伝子および／またはコードされたポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用される基質および反応産物または副産物の増減を検出する方法に依存して、異なる種類の酵素アッセイを使用することができる。加えて、発現されるポリペプチドのレベルは、免疫化学的に、すなわち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングのいずれかによる）等による当業者に周知の他の抗体に基づくアッセイで測定することができる。１つの非限定的例として、ＥＬＩＳＡアッセイを使用するＡＡＤ−１およびＰＡＴタンパク質の検出は、米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載され、この参考文献は、本明細書での参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。導入遺伝子は、植物体の一部の組織において、または一部の発達段階で、選択的に発現させてもよく、または導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織において、実質的にそのライフサイクル全体にわたって発現させてもよい。しかしながら、任意の組み合わせ発現（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）様式もまた適用可能である。
【０１４４】
本開示はまた、上述の遺伝子導入植物の種子も包含し、ここで種子は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。本開示は更に、上述の遺伝子導入植物の子孫、クローン、細胞株もしくは細胞を包含し、該子孫、クローン、細胞株もしくは細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。
【０１４５】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）および融合タンパク質をコードする発現ベクターは、遺伝子調節、標的化開裂、および／または組み換えのために、植物に直接投与することができる。ある実施形態では、植物は、多重パラロガス標的遺伝子を含有する。故に、１つ以上の異なる融合タンパク質または融合タンパク質をコードする発現ベクターは、植物におけるこれらのパラロガス遺伝子（例えば、Ｚｐ１５、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１００７７３１９号を参照されたい）遺伝子のうちの１つ以上を標的とするために、植物に投与されてもよい。
【０１４６】
有効量の投与は、融合タンパク質を導入して、処置対象の植物細胞と最終接触させるために通常使用される経路のうちのいずれによっても行われる。ＺＦＰは、好ましくは許容される担体と共に、任意の好適な様態で投与される。かかるモジュレータを投与する好適な方法が利用可能であり、かつ当業者に周知であり、１つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供することができる。
【０１４７】
また、担体が使用されてもよく、それは一部には、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、多種多様の好適な担体の製剤が利用可能である。
【０１４８】
哺乳類細胞への送達  
本明細書に記載されるＺＦＮは、任意の好適な手段によって、例えば、ＺＦＮ  ｍＲＮＡの注入によって、標的哺乳類細胞に送達されてもよい。Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５９：８７−１１５を参照されたい。
【０１４９】
亜鉛フィンガーを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載され、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
本明細書に記載されるＺＦＮはまた、ＺＦＮのうちの１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達されてもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない、任意のベクター系が使用されてもよい。また、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。更に、これらのベクターのうちのいずれも、ＺＦＮをコードする１つ以上の配列を含み得ることは明白であろう。故に、ＺＦＮの１つ以上の対が細胞に導入される時、ＺＦＮは、同じベクター上または異なるベクター上で担持され得る。複数のベクターが使用されるとき、各ベクターは、１つまたは複数のＺＦＮをコードする配列を含み得る。
【０１５１】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、改変されたＺＦＰをコードする核酸を、哺乳類細胞に導入することができる。また、かかる方法を使用して、ＺＦＰをコードする核酸を、哺乳類細胞にインビトロ投与することもできる。ある実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ用途のために投与される。
【０１５２】
非ウイルスベクター送達系には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸共役体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により強化されたＤＮＡの取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。追加的な例示的核酸送達系には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照されたい）によって提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号、および米国特許第４，８９７，３５５号に記載され、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂肪および中性脂肪には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号のものが含まれる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に行うことができる。免疫脂質複合体等の標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１５３】
上記のように、開示される方法および組成物は、任意の種類の哺乳類細胞において使用することができる。タンパク質（例えば、ＺＦＰ）、それをコードするヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって標的細胞に送達され得る。好適な細胞には、真核細胞および／または細胞株ならびに原核細胞および／または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。かかる細胞、またはかかる細胞から生成された細胞株の非制限的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な初代細胞には、抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞等であるが、これらに限定されない他の血液細胞サブセットが含まれる。好適な細胞にはまた、例として、胚性幹細胞、人口多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞等の幹細胞も含まれる。
【実施例】
【０１５４】
実施例１：プラスミド設計
実施例１．１：ｅＺＦＮ結合部位
【０１５５】
８つの改変亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ｅＺＦＮ）結合部位（ＣＬ：ＡＲ−配列番号１、ＲＬ：ＰＲ−配列番号２、ＡＬ：ＰＲ−配列番号３、ＰＬ：ＡＲ−配列番号４、ＣＬ：ＲＲ−配列番号５、ＲＬ：ＣＲ−配列番号６、ＣＬ：ＰＲ−配列番号７、ＲＬ：ＡＲ−配列番号８）を、ｅＺＦＮ結合部位の各々に対して固有の、隣接するＰＣＲプライマー部位を有する単一のＤＮＡ断片（多重ｅＺＦＮ結合部位）中に組み合わせた。加えて、他のｅＺＦＮ結合部位を設計し、酵母において高レベルで開裂することを示したが（例えば、米国特許公開第２００９／０１１１１１９号を参照されたい）、それは次のものを含む：ＰＬ：ＲＲ−配列番号９、ＡＬ：ＲＲ−配列番号１０、ＡＬ：ＣＲ−配列番号１１、ＰＬ：ＣＲ−配列番号１２、ならびにホモ二量体ｅＺＦＮのＲＲ：ＲＲ−配列番号１３、ＲＬ：ＲＬ−配列番号１４、ＰＲ：ＰＲ−配列番号１５、ＰＬ：ＰＬ−配列番号１６、ＣＬ：ＣＬ−配列番号１７、ＣＲ：ＣＲ−配列番号１８、ＡＲ：ＡＲ−配列番号１９、およびＡＬ：ＡＬ−配列番号２０。「ＣＬ」および「ＣＲ」は、それぞれ、８２６６および８１９６と指定される、ＣＣＲ５受容体に対する「左」および「右」手亜鉛フィンガー設計を指し、それは米国特許出願第２００８／０１５９９９６号に示される配列を有し、そこで示される標的部位に結合する。「ＡＬ」および「ＡＲ」は、それぞれ、１５５５６および１５５９０と指定される、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対する「左」および「右」手亜鉛フィンガー設計を指し、米国特許出願第２００８／０２９９５８０号に示される認識ヘリックス配列を有し、そこで示される標的部位に結合する。「ＰＬ」および「ＰＲ」設計ならびに「ＲＬ」および「ＲＲ」設計に対する認識ヘリックス配列および標的部位は、下記の表１および２に列挙される。ＰＬおよびＰＲの両方は、ヒトＰＲＭＴ１遺伝子に特異的なＺＦＮに対する「左」および「右」手亜鉛フィンガー設計を指す一方で、「ＲＬ」および「ＲＲ」は、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座に特異的なＺＦＮに対する「左」および「右」手亜鉛フィンガー設計を指す。
【０１５６】
これらの標的部位のうちのいずれも、バイオインフォマティクス分析によって計測するとき、トウモロコシゲノム中に存在しない。ＰＣＲプライマー部位を、ｅＺＦＮによる染色体局在性ＤＮＡ断片の二本鎖開裂からもたらされるＮＨＥＪの評価のために含めた。
【０１５７】
【表１】
0005902631.tif 000002
【０１５８】
【表２】
0005902631.tif 000003
【０１５９】
Ａｔｔ部位を、合成したＤＮＡ断片中に含めて、断片を、ＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、プラスミド中にクローン化した。Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応を使用して、この断片をｐＤＡＢ１０１８３４およびｐＤＡＢ１０１８４９に移入した。これらのベクターは、それぞれタバコおよびトウモロコシに好適な選択可能マーカーを含有する。ｐＤＡＢ１０１８３４は、カッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ、カッサバ葉脈モザイクウイルスに由来するプロモーターおよび５’非翻訳領域、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３１（６）１１２９−１１３９）、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＰＡＴ、Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７０（１），２５−３７）、およびＡｔｕＯＲＦ１  ３’  ＵＴＲ（アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２（６），３３５−５０）からなる。トウモロコシｐＤＡＢ１０１８４９ベクターは、イネ（ｒｉｃｅ）アクチン１遺伝子プロモーター（ＯｓＡｃｔ１、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）アクチン１（Ａｃｔ１）遺伝子に由来するプロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、およびイントロン、ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２（２）：１６３−７１）およびＺｍＬｉｐ  ３’  ＵＴＲ（トウモロコシＬＩＰ遺伝子の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＧｅｎＢａｎｋ受入Ｌ３５９１３）を含む選択可能マーカーカセットを含有する。
【０１６０】
結果として得られたタバコベクター、ｐＤＡＢ１０５９００（図７）を、エレクトロポレーションを使用してアグロバクテリウム・ツメファシエンスに移入した。制限酵素検証後、アグロバクテリウムを、使用するまでグリセロールストックとして保管した。トウモロコシベクター、ｐＤＡＢ１０５９０８（図８）を一括にして、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。
【０１６１】
実施例１．２：ｅＺＦＮを発現させるためのベクター
標準（Ｃ２Ｈ２）主鎖または非標準（Ｃ３Ｈ）主鎖のいずれかにおいて適切な認識ヘリックスを発現するＺＦＮベクターを、本質的に、米国特許出願第２００８／０１８２３３２号および同第２００８／０１５９９９６号に記載されるように調製した。
【０１６２】
ＺＦＮの機能を、酵母ＺＦＮスクリーニング系に挿入した、実施例１．１に記載されるｅＺＦＮ多重挿入部位に対して試験した（米国特許公開第２００９／０１１１１１９号を参照されたい）。試験した全てのＺＦＮ対は、酵母系において活性であった。
【０１６３】
８つのｅＺＦＮを、植物細胞中の発現に必要な調節配列を含有するベクター中にクローン化した。構築用に配備したクローニング戦略は、米国特許出願第２００９／０１１１１８８Ａ１号および同第２０１００１９９３８９号に本質的に記載される通りである。図９および１０は、一般化したｅＺＦＮ発現カセットの概略図を示す。
【０１６４】
実施例２：トウモロコシにおけるｅＺＦＮの評価
実施例２．１：ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介型ＤＮＡ送達
トウモロコシの胚形成Ｈｉ−ＩＩ細胞培養物を産生し、内部への組み込みが実証された生存植物細胞の源として使用した。当業者は、多様な植物種に由来する細胞培養物、または多様な植物種に由来する分化した植物組織を、内部への組み込みが実証された生存植物細胞の源として利用することを想定し得る。
【０１６５】
この実施例において、ＰＡＴ植物選択可能マーカーカセットおよび多重ｅＺＦＮ結合部位挿入配列を含有するプラスミド（ｐＤＡＢ１０５９０８）を使用して、遺伝子導入事象を得た。遺伝子導入単離株を、ｅＺＦＮにより形質転換して、二本鎖開裂を評価した。
【０１６６】
特に、事前に凍結保存した細胞株からの１２ｍＬ血中血球容積（ＰＣＶ）、加えて２８ｍＬの条件培地を、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中、８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｓｉｎ  １８：６５９−６６８）、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５．８）中に継代培養し、１２５ｒｐｍで、２８℃でシェーカー上に配置した。このステップを、同じ細胞株を使用して２回反復して、総計３６ｍＬ  ＰＣＶが３つのフラスコにわたって分配されるようにした。２４時間後、ＧＮ６液体培地を除去し、７２ｍＬ  ＧＮ６  Ｓ／Ｍ浸透培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、４５．５ｇ／Ｌソルビトール、４５．５ｇ／Ｌマンニトール、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、ｐＨ６．０）と交換した。フラスコを暗所で３０〜３５分間、２８℃で適度に撹拌しながらインキュベートした（１２５ｒｐｍ）。インキュベーション時間中、炭化ケイ素ウィスカ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＬＬＣ，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣ）の５０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を、８．１ｍＬのＧＮ６  Ｓ／Ｍ液体培地を４０５ｍｇの滅菌炭化ケイ素ウィスカに添加することによって調製した。
【０１６７】
ＧＮ６  Ｓ／Ｍ浸透培地中でのインキュベーションに続いて、各フラスコの内容物を２５０ｍＬ遠心瓶中にプールした。フラスコ中の全ての細胞が底に沈殿した後、およそ１４ｍＬを超える内容積のＧＮ６  Ｓ／Ｍ液体を引き出し、後の使用のために滅菌１−Ｌフラスコ中に収集した。事前に湿潤させたウィスカの懸濁液を、ボルテックス上で、最大速度で６０秒間混合し、次いで遠心瓶に添加した。
【０１６８】
この実施例において、ｐＤＡＢ１０５９０８プラスミドＤＮＡからの１７０μｇの精製した断片を各瓶に添加した。一旦、ＤＮＡを添加すると、瓶を、改変したＲｅｄ  Ｄｅｖｉｌ  ５４００商業用塗料ミキサ（Ｒｅｄ  Ｄｅｖｉｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）中に即座に配置し、１０秒間撹拌した。撹拌に続いて、細胞、培地、ウィスカ、およびＤＮＡのカクテルを、１２５ｍＬの新鮮なＧＮ６液体培地と共に１−Ｌフラスコの内容物に添加して、浸透圧溶質を減少させた。細胞を、１２５ｒｐｍに設定したシェーカー上で２時間回収させた。６ｍＬの分散した懸濁液を、ハウス真空管路（ｈｏｕｓｅ  ｖａｃｕｕｍ  ｌｉｎｅ）に接続したガラス細胞収集ユニットを使用して、Ｗｈａｔｍａｎ第４濾紙（５．５ｃｍ）上で濾過して、１瓶当たり６０のフィルターを得るようにした。フィルターをＧＮ６固体培地（２．５ｇ／Ｌゲルライトゲル化剤を用いたことを除いてＧＮ６液体培地と同じ）の６０×２０ｍｍプレート上に配置し、暗所条件下で、２８℃で１週間培養した。
【０１６９】
実施例２．２：推定遺伝子導入事象の特定および単離
ＤＮＡ送達の１週間後、濾紙を、選択剤を含有するＧＮ６（１Ｈ）選択培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、２．５ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）の６０×２０ｍｍプレートに移した。これらの選択プレートを、暗所で、２８℃で１週間インキュベートした。暗所での１週間の選択後、細胞の半分を各プレートから、３７〜３８℃で保持された３．０ｍＬのＧＮ６アガロース培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、７ｇ／Ｌ  ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース、ｐＨ５．８、１２１度でわずか１０分間オートクレーブ処理）を含有する管にこすり落とすことによって、組織を新鮮な培地上に埋め込んだ。
【０１７０】
アガロース／組織混合物をへらで粉砕し、その後、３ｍＬのアガロース／組織混合物を、ＧＮ６（１Ｈ）培地を含有する１００×１５ｍｍペトリ皿の表面上に均等に注いだ。このプロセスを、各プレートの両方の片について反復した。一旦、全ての組織を埋め込むと、プレートをＮＥＳＣＯＦＩＬＭ（登録商標）またはＰＡＲＡＦＩＬＭ  Ｍ（登録商標）で個々に密閉し、暗所条件下で、２８℃で最長１０週間培養した。
【０１７１】
これらの選択条件下で増殖する推定的に形質転換した単離株を、埋め込まれたプレートから除去し、６０×２０ｍｍプレート中の新鮮な選択培地に移した。およそ２週間後に持続的な増殖が明白であった場合、事象を、適用された除草剤（選択剤）に対して抵抗性であるとみなし、細胞のアリコートをその後、遺伝子型分析のために採取した。
【０１７２】
実施例２．３：ゲノムＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、実施例２．２に記載される単離したトウモロコシ細胞から抽出し、ＰＣＲ遺伝子型同定実験のためのテンプレートとして利用した。ｇＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に詳述される製造業者のプロトコルに従って上述のように単離した、およそ１００〜３００μＬ血中血球容積（ＰＣＶ）のＨｉ−ＩＩカルスから抽出した。ゲノムＤＮＡを、１００μＬのキット提供の溶出緩衝剤中に溶出して２０〜２００ｎｇ／μＬの最終濃度を得、その後、下に概説されるＰＣＲに基づく遺伝子型同定法を介して分析した。
【０１７３】
実施例２．４：コピー数の分子分析
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを行って、除草剤抵抗性カルスの試料をスクリーニングして、ｐＤＡＢ１０５９０８導入遺伝子の単一コピー組み込みを含有したものを特定した。遺伝子発現カセットに特異的なプライマーおよびプローブを使用して、詳細な分析を行った。単一コピー事象を追加的な分析のために特定した。
【０１７４】
カスタムＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＨｉ−ＩＩカルスにおけるＰＡＴ遺伝子分析のために開発した。ゲノムＤＮＡ試料を、９６ウェルプレートフォーマットで９５℃でのインキュベーションによって最初に変性させ、次いで周囲温度まで冷却した。次に、マスターミックス（緩衝剤に加えてＰＡＴのためのプローブミックスおよび内部参照遺伝子を含有する）を各ウェルに添加し、試料を鉱物油で上塗りした。プレートを密閉し、ＢｉｏＲａｄ  ＴＥＴＲＡＤ（登録商標）サーモサイクラー中でインキュベートした。プレートを周囲温度まで冷却した後、蛍光プレートリーダー上で読み取った。全てのプレートは、１コピー、２コピー、および４コピー標準物、ならびに野生型対照試料および試料を含有しないブランクウェルを含有した。読み取りを収集し、各チャネルについてのフォールドオーバーゼロ（ｆｏｌｄ  ｏｖｅｒ  ｚｅｒｏ）（すなわち、バックグラウンド）との比較は、試料の原シグナルを、テンプレートを含有しない原シグナルで割ることによって、各試料について決定した。
【０１７５】
このデータから標準的な曲線を構築し、最良適合を線形回帰分析によって決定した。この適合から特定したパラメータを使用して、次いで見かけのＰＡＴコピー数を各試料について推定した。
【０１７６】
実施例２．５：ＰＣＲ遺伝子型同定のためのプライマー設計  
この実施例において、ＰＣＲ遺伝子型同定は、ゲノムに埋め込まれたドナーＤＮＡを含有することが予測される単離したトウモロコシカルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続いてＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列分析を含むが、これらに限定されないものとして理解した。ＰＣＲ遺伝子型同定の方法は、詳細に記載されており（例えば、Ｒｉｏｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３２：２４３−２５３）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用されてもよい。
【０１７７】
当業者は、植物ゲノムにおける特異的配列の増幅、植物ゲノムにおける多重特異的配列の増幅、植物ゲノムにおける非特異的配列の増幅、またはそれらの組み合わせを含む（しかしこれらに限定されない）、ＰＣＲ遺伝子型同定のための戦略を考案し得る。増幅には、この実施例に記載されるように、クローニングおよび配列決定が続いてもよく、または増幅産物の直接配列分析が続いてもよい。当業者は、本明細書で生成される増幅産物の分析のための代替的な方法を想定することもあり得る。本明細書に記載される一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲ増幅において用いられる。
【０１７８】
本明細書に提示される実施例において、オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって、標準的な脱塩の条件下で、水で１００μＭの濃度まで希釈して合成される。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡ挿入の隣接する領域とアニーリングするように設計した。プライマーを、プラスミドＤＮＡの希釈を使用して、非遺伝子導入植物から単離したＤＮＡの存在下で試験した。ｐＤＡＢ１０５９０８導入遺伝子を、プライマーを使用して推定事象のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。結果として得られた断片をプラスミドベクター中にクローン化し、配列決定して、多重ｅＺＦＮ結合部位配列が形質転換中に植物ゲノムに完全に組み込まれたことを確認した。
【０１７９】
実施例２．６：標的ＤＮＡを有する遺伝子導入事象の選択
低コピー（１〜２）事象をＰＣＲによって、無傷の多重ｅＺＦＮ結合部位配列について、およびＰＡＴ遺伝子について、スクリーニングした。コピー数を、サザン分析によって、ＰＡＴ遺伝子プローブによる標準的な方法を使用して確認した。単一コピーの無傷の挿入物を有する選択された遺伝子導入事象からのカルスを、一過性発現ｅＺＦＮによるその後の評価のために維持した。
【０１８０】
実施例３：植物細胞中へのｅＺＦＮ  ＤＮＡ送達
ｅＺＦＮ媒介型二本鎖開裂を可能にするために、ＤＮＡをコードするｅＺＦＮの送達、続いて植物細胞中の機能性ｅＺＦＮタンパク質の発現が必要であることを理解する。当業者は、機能性ＺＦＮタンパク質の発現が、ＺＦＮをコードする構築物の遺伝子組み換え、またはＺＦＮをコードする構築物の一過性発現を含むが、これらに限定されない複数の方法によって達成され得ることを想定し得る。
【０１８１】
本明細書に引用される実施例において、ｅＺＦＮをコードするＤＮＡの植物細胞中への送達のための方法が記載される。当業者は、アグロバクテリウム媒介型形質転換、バイオリスティックに基づくＤＮＡ送達、またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介型ＤＮＡ送達を含むが、これらに限定されない、植物細胞に適切な多様なＤＮＡ送達方法のうちのいずれを使用することもできる。本明細書に記載される一実施形態では、バイオリスティック媒介型ＤＮＡ送達実験を、様々なｅＺＦＮをコードするＤＮＡ構築物を使用して行った。
【０１８２】
実施例３．１：バイオリスティック媒介型ＤＮＡ送達
上述のように、トウモロコシの胚形成Ｈｉ−ＩＩ細胞培養物を産生し、ｅＺＦＮ機能を評価するための生存植物の源として使用した。当業者は、多様な植物種に由来する細胞培養物、または多様な植物種に由来する分化した植物組織を、内部への標的化組み込みが実証される生存植物細胞の源として利用することを想定し得る。
【０１８３】
多重ｅＺＦＮ結合部位上の特異的標的配列において結合する８つのｅＺＦＮのうちの１つを発現するプラスミドを、内部対照（ＩＰＫ−１）と一緒に、５〜１０個の遺伝子導入単離株からのカルスのプール中に衝撃した。
【０１８４】
遺伝子導入Ｈｉ−ＩＩトウモロコシカルス事象を、ＧＮ６（１Ｈ）培地上で毎週継代培養した。培養の７日後、およそ４００ｍｇの細胞を、２．５ｇ／Ｌゲルライトで凝固させたＧＮ６  Ｓ／Ｍ培地を含有する１００×１５ｍｍペトリ皿の中心上で、直径２．５ｃｍの円形に薄く広げた。細胞を暗所条件下で４時間培養した。バイオリスティック粒子をＤＮＡでコーティングするために、３ｍｇの０．６ミクロン直径の金粒子を１００％エタノールで１回、滅菌蒸留水で２回洗浄し、シリコン処理したエッペンドルフ管中の５０μＬ水中に再懸濁させた。総計５μｇのプラスミドＤＮＡ、２０μＬスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬ塩化カルシウム（２．５Ｍ）を金懸濁液に別個に添加し、ボルテックス上で穏やかに混合した。混合物を室温で１０分間インキュベートし、ベンチトップ微量遠心機において１０，０００ｒｐｍで１０秒間ペレット化し、６０μＬ冷１００％エタノール中に再懸濁させ、８〜９μＬを各マクロ担体上に分配した。
【０１８５】
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／ＨＥ（商標）系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して衝撃を行った。細胞を含有するプレートを、１１００ｐｓｉおよび２７インチのＨｇ真空の条件下で棚中段に配置し、作動マニュアルに従って衝撃した。衝撃の２４時間後、組織を小さい塊でＧＮ６固体培地に移した。
【０１８６】
実施例４：Ｓｏｌｅｘａ配列決定および分析
実施例４．１：試料調製
ｅＺＦＮおよび対照ＩＰＫ１−ＺＦＮ（Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，４３７−４４１）による衝撃の７２時間後、組織を２ｍＬ微量遠心管中に収集し、少なくとも４８時間凍結乾燥させた。ゲノムＤＮＡを、製造業者の仕様書に従ってＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ｇＤＮＡ抽出キットを使用して、凍結乾燥させた組織から抽出した。最後に、ＤＮＡを２００μＬの水中に再懸濁させ、濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して決定した。ＤＮＡの無傷を、全ての試料を０．８％アガロースＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で泳動させることによって推定した。全ての試料をＰＣＲ増幅に対して正規化して（２５ｎｇ／μＬ）、Ｓｏｌｅｘａ配列決定に対するアンプリコンを生成した。
【０１８７】
ｅＺＦＮ開裂部位の各々を包含する領域の増幅のためのＰＣＲプライマー、ならびに標的（ＺＦＮ処置された）試料および対照試料からのＩＰＫ１−ＺＦＮ標的部位を、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。これらのプライマーのために最適な増幅条件を、勾配ＰＣＲによって、２３．５μＬ反応中、０．２μＭの適切なプライマー、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（１．１Ｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および１００ｎｇのテンプレートゲノムＤＮＡを使用して特定した。循環パラメータには、９５℃（５分間）での最初の変性、続いて３５周期の変性（９５℃、１５秒間）、アニーリング［５５−７２℃、３０秒間］、伸張（６８℃、１分間）、および最終伸張（７２℃、７分間）が含まれる。増幅産物を３．５％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。最適なアニーリング温度を特定した後、分取ＰＣＲ反応を行って、各々一連のＰＣＲプライマーを検証し、またＳｏｌｅｘａアンプリコンを生成した。トウモロコシおよびタバコにおけるｅＺＦＮ標的領域の増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドを、下記の表３に示す。ＩＰＫ１標的領域は、プライマー（配列番号２７  ＧＣＡＧＴＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣ（順方向プライマー）および配列番号２８  ＣＡＧＧＡＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＴＣ（逆方向プライマー））を使用して増幅した。
【０１８８】
【表３】
0005902631.tif 000004
【０１８９】
分取ＰＣＲのために、上述の条件を使用して各テンプレートについて８つの個々の小規模ＰＣＲ反応を完了し、産物を一緒にプールし、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ゲル精製キットを使用して３．５％アガロースゲル上でゲル精製した。ゲル精製したアンプリコンの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して決定し、ｅＺＦＮ標的化および対応する野生型対照ならびに正規化ＩＰＫ−１標的化および野生型対照からのおよそ１００ｎｇのアンプリコンをプールすることによって、Ｓｏｌｅｘａ試料を調製した。ｅＺＦＮ＋ＩＰＫ−１標的化試料、ＩＰＫ−１標的化試料、および野生型対照から、アンプリコンを含む４つの最終Ｓｏｌｅｘａ試料を生成し、配列決定した。アンプリコンをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、配列決定に供してプライマーを検証した後、Ｓｏｌｅｘａ配列決定を行った。
【０１９０】
実施例４．２：Ｓｏｌｅｘａ配列決定および分析
Ｓｏｌｅｘａ配列決定は、数千の配列の産生をもたらした。ＤＡＳ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＮＧＳ）分析スクリプトを使用して配列を分析した。低質の配列（品質スコアカットオフ＜５を有する配列）を取り除いた。次いで配列を参照配列と整列させ、しばしばＺＦＮ活性の指標であるインデルを引き起こす、ＺＦＮ媒介型開裂およびＮＨＥＪ媒介型修復によって引き起こされた、ＺＦＮ開裂部位における挿入／欠失（インデル）についてスコア化した。バックグラウンド活性を差し引いた後の、ＺＦＮタンパク質に対する結合部位の間の「ギャップ」配列内での１ｂｐを超える欠失の数によって、編集活性を決定した。本研究における各ｅＺＦＮに対する活性を、野生型対照と比較して算出し、ＩＰＫ−１  ＺＦＮ活性に対して正規化した。次いで各ｅＺＦＮについて正規化した活性を比較して、研究に使用したｅＺＦＮをランク付けした。また、活性を、ｅＺＦＮ開裂部位におけるインデルの存在によって、配列整列レベル（Ｓｏｌｅｘａ出力と比較した参照）において査定した。
【０１９１】
図１１に示すように、８つのうち７つのｅＺＦＮは、トウモロコシにおける編集活性を示す。
【０１９２】
実施例５：タバコにおけるｅＺＦＮの評価
実施例５．１：多重ｅＺＦＮ結合部位配列の安定な組み込み
本明細書に上述される多重ｅＺＦＮ結合部位配列の組み込まれたコピーを有する遺伝子導入植物事象を作製するために、ＰｈｙｔａＴｒａｙｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中のＭＳ培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｓ，Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫＳ）および３０ｇ／Ｌスクロース上に無菌で増殖させた、Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａタバコ植物から切り取った葉ディスク（１ｃｍ2）（例えば、事前に組み込まれたＺＦＮ−ＩＬ１結合部位を含有する事象１５８５−１０）を、ＯＤ600約１．２まで増殖させたアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４含有プラスミドｐＤＡＢ１０５９００の一晩の培養物上に浮遊させ、滅菌濾紙上でブロッティング乾燥させ、次いで６０×２０ｍｍ皿（１皿当たり５ディスク）中、１ｍｇ／Ｌインドール酢酸および１ｍｇ／Ｌベンジアミノ（ｂｅｎｚｙａｍｉｎｏ）プリンを添加した同じ培地上に配置した。７２時間の共培養後、葉ディスクを、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび５ｍｇ／Ｌ  ＢＡＳＴＡ（登録商標）を有する同じ培地に移した。３〜４週間後、小植物を、ＰｈｙｔａＴｒａｙｓ中、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび１０ｍｇ／Ｌ  ＢＡＳＴＡ（登録商標）を有するＭＳ培地に更に２〜３週間移した後、葉の採取および分子分析を行った。
【０１９３】
実施例５．２：多重ｅＺＦＮ結合部位配列遺伝子導入事象のコピー数およびＰＴＵ分析
ＤＮＡ単離。遺伝子導入タバコ植物組織をＢＡＳＴＡ（登録商標）抵抗性小植物から採取し、９６ウェル収集プレート中で少なくとも２日間凍結乾燥させた。次いでＤＮＡを、製造業者の指示に従って、ＤＮＥＡＳＹ（商標）９６ウェル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して単離した。Ｍｏｄｅｌ  ２−９６Ａ  Ｋｌｅｃｏ組織粉砕機（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｖｉｓａｌｉａ  ＣＡ）を使用して組織破壊を行った。
【０１９４】
ＤＮＡ定量化。結果として得られたゲノムＤＮＡを、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（登録商標）Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して定量化した。２０ｎｇ／μＬ〜１．２５ｎｇ／μＬ（段階希釈した）の範囲の、５つの事前に定量化したＤＮＡ標準物を使用して標準曲線生成を行った。未知の試料を、アッセイの線形範囲内に入るように、最初に１：１０または１：２０希釈に希釈した。５μＬの希釈した試料および標準物を、１００μＬの希釈したＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ基質（１：２００）と混合し、暗所で１０分間インキュベートした。次いで蛍光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ２  プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して記録した。ゲノムＤＮＡ濃度を、バックグラウンド蛍光補正後に算定された標準曲線から推定した。ＴＥまたは水を使用して、ＤＮＡを次いで、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ３０００自動液体処理機を使用して（Ｑｉａｇｅｎ）１０ｎｇ／μＬの一般的な濃度まで希釈した。
【０１９５】
コピー数推定。推定遺伝子導入事象を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した多重化ＤＮＡ加水分解プローブアッセイを使用して、組み込み複雑性について分析した。多重部位構築物のコピー数を、ＰＡＴ導入遺伝子および内在性タバコ参照遺伝子、ＰＡＬの両方に対する、配列特異的プライマーおよびプローブを使用して推定した。両方の遺伝子についてのアッセイを、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブ設計ソフトウェア２．０リアルタイムＰＣＲを使用して設計し、両方の遺伝子について、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０系（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して評価した。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックスを、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ容量の多重化反応物中、１倍の最終濃度で調製した（下記の表４）。２ステップ増幅反応を、蛍光取得により５８℃で３８秒間の伸張により行った。全ての試料を３系列で実験し、平均Ｃｔ値を各試料の分析のために使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析を、相対定量モジュール（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔ  ｍｏｄｕｌｅ）を使用するＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアを使用して行い、それはΔΔＣｔ法に基づいた。このために、単一コピーキャリブレーターからのＤＮＡの試料を含めて、結果を正規化した。単一コピーキャリブレーター事象をサザン分析によって特定し、それがＰＡＴ遺伝子の単一の挿入物を有することを確認した。
【０１９６】
【表４】
0005902631.tif 000005
【０１９７】
ＰＣＲ。低コピー（１〜２）事象をその後、ＰＡＴ遺伝子に対する無傷の植物転写単位（ＰＴＵ）、および無傷の多重ｅＺＦＮ結合部位についてＰＣＲによってスクリーニングした。
【０１９８】
実施例６：多重ｅＺＦＮ結合部位配列におけるｅＺＦＮ開裂の試験
組み込まれた多重ｅＺＦＮ結合部位配列における標的開裂を促進する、ｅＺＦＮの能力を試験するために、遺伝子導入タバコ葉ディスクのアグロバクテリウム共培養を介したｅＺＦＮ構築物の一過性発現に基づいて、一過性アッセイを使用した。多重ｅＺＦＮ結合部位配列含有構築物の単一の完全長コピー（ならびにＺＦＮ−ＩＬ１構築物の単一の完全長コピー）を含有する、遺伝子導入事象から切り取った葉ディスク（１ｃｍ2）を、ＯＤ600約１．２まで増殖させたアグロバクテリウムの一晩の培養物上に浮遊させ、滅菌濾紙上でブロッティング乾燥させ、次いで１ｍｇ／Ｌインドール酢酸および１ｍｇ／Ｌベンジアミノ（ｂｅｎｚｙａｍｉｎｏ）プリンを添加した同じ培地上に配置した。試験した各ｅＺＦＮに対して、次の３つの処置を使用した：１処置当たり２０個の葉ディスクを用いて、ｐＤＡＢ１６０１（陰性対照ＰＡＴのみ）、ｐＤＡＢ４３４６のみ（陽性対照ＺＦＮ−ＩＬ１のみ）、およびｐＤＡＢ４３４６＋ｐＤＡＢｅＺＦＮ−Ｘ（試験対象のＺＦＮ−ＩＬ１＋ｅＺＦＮ）。
【０１９９】
実施例６．１：配列分析
ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ抽出キットを使用して、アグロバクテリウム処置した遺伝子導入タバコ葉ディスク物から単離した。全ての処置を２系列で行い、全ての試料からのゲノムＤＮＡを１００μＬの水中に再懸濁させ、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐによって決定した。個々の処置に対する各複製物からの等量のゲノムＤＮＡを一緒にプールし、Ｓｏｌｅｘａアンプリコン生成のための出発テンプレートとして使用した。
【０２００】
標的（ｅＺＦＮ処置された）試料および対照試料からの、多重ｅＺＦＮ結合部位配列および開裂部位を包含する領域の増幅のためのＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）からのものであり、それをＨＰＬＣ精製した。最適な増幅条件を、勾配ＰＣＲによって、２３．５μＬ反応中、０．２μＭの適切なプライマー、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（１．１Ｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および１００ｎｇのテンプレートゲノムＤＮＡを使用して特定した。循環パラメータは、９５℃（５分間）での最初の変性、続いて３５周期の変性（９５℃、１５秒間）、アニーリング［５５〜７２℃、３０秒間］、伸張（６８℃、１分間）、および最終伸張（７２℃、７分間）であった。増幅産物を３．５％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。最適なアニーリング温度（５６．１℃）を特定した後、分取ＰＣＲ反応を行って、各々一連のＰＣＲプライマーを検証し、またＳｏｌｅｘａアンプリコンを生成した。
【０２０１】
分取ＰＣＲのために、上述の条件を使用して各テンプレートについて８つの個々の小規模ＰＣＲ反応を行い、産物を一緒にプールし、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル精製キットを使用して３．５％アガロースゲル上でゲル精製した。ゲル精製したアンプリコンの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用することによって決定し、およそ２００ｎｇの各アンプリコンを一緒にプールして、最終Ｓｏｌｅｘａ配列決定試料（８００ｎｇ総試料）を調製した。また、アンプリコンをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ中にクローン化し、通常の配列決定に供してプライマーを検証した後、Ｓｏｌｅｘａ配列決定を行った。Ｓｏｌｅｘａ分析（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６：１１３５−１１４５）を行い、配列を分析した。
【０２０２】
実施例６．２：Ｓｏｌｅｘａ配列決定および分析
Ｓｏｌｅｘａ配列決定を行って、数千の配列の産生がもたらされた。ＤＡＳ  ＮＧＳ分析スクリプトを使用して配列を分析した。低質の配列（品質スコアカットオフ＜５を有する配列）を取り除いた。次いで配列を参照配列（多重ｅＺＦＮ結合部位を含有するｐＤＡＢ１０５９００）と整列させ、開裂部位における挿入／欠失（インデル）についてスコア化した。各ｅＺＦＮおよび無処置対照に対する編集活性（ＮＨＥＪ％）を算出し（インデルを有する高質配列の数／高質配列の総数×１００）、下記の図１２に示す。２つの遺伝子導入タバコ事象（１０５９００／第３３および１０５９００／第４５）における８−ｅＺＦＮの活性を実証した（図１２）。８つのうちの３つのｅＺＦＮが、試験した２つの遺伝子導入タバコ事象において活性であった。活性をまた、ｅＺＦＮ処置試料中のｅＺＦＮ開裂部位におけるインデルの存在によって、配列整列レベル（参照対ｓｏｌｅｘａ出力）において査定した。
【０２０３】
ＺＦＮ単量体（「右」および「左」）片側の全ての組み合わせが、酵母アッセイにおいて活性であった。トウモロコシおよびタバコ実験について記載されるデータは、組み合わせのうちの幾つかまたはほとんどが植物において活性であることを実証し、研究のために選択された４つの元のＺＦＮからの２つのＺＦＮ単量体の、有意な数の順列を使用する可能性を支持している。
【０２０４】
実施例７：対立遺伝子内組み換え
対立遺伝子内組み換えは、導入遺伝子の２つの独立したブロックの発達および最適化を可能にし、次いでそれを組み換えによって１つの遺伝子座において一緒にスタッキングすることができる。２つのブロックの間の組み換えのレベルを強化するために、二本鎖開裂は、遺伝子変換または染色分体交換によってＤＮＡ交換を開始する。
【０２０５】
植物におけるこの概念を実証するために、図１３に例証する遺伝子導入挿入物を、アラビドプシス・タリアナ中で作製する。構築物には、選択可能マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、およびにスコア化可能なマーカー（β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））を含有する遺伝子ブロックが含まれる。これらの遺伝子ブロックは、同一のゲノム位置にあるが、互いからおよそ２ｋｂが置換される。２つのブロックの間の組み換えは、子孫を、２つのブロックの間の中心の位置において開裂するＺＦＮを発現する植物と交配させ、次いでそれらを再交配させることによって、２つのブロックの各々を担持する染色体を、単一の植物中に組み合わせることによって遂行する（図１３ＭＩＳ上部の黒色バー）。ＺＦＮは、減数分裂特異的／選好的プロモーターを使用して発現させる。使用されるランディングパッド配列には、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／２９７，６４１号に記載されるものが含まれる。
【０２０６】
同一のゲノム位置における独立したブロックを生成するために、隣接する配列において両方のブロックを含む構築物を作製した（図１４）。独立したブロックのみを担持する植物を作り出すために、対応するＺＦＮ結合部位におけるそれぞれのブロックのいずれかの側上で、ＤＮＡを切断するように設計したＺＦＮを使用して、別個の交配において各ブロックを切除する（赤色および青色バー）。図１５は、適切な株（ＺＦＮを発現するアラビドプシス）と交配させた後、ブロックが切断されて、単一のブロック挿入物を生成することを例証する。これらの株は、選択可能マーカーとしてＰＡＴ遺伝子を担持する。予想される表現型（ＨｙｇＲ＋、ＫａｎＲ−、ＰＡＴ＋、ＹＦＰ＋ｏｒ  Ｋａ  ｎＲ＋、ＨｙｇＲ−、ＰＡＴ＋、ＧＵＳ＋）を有する植物の回収を、表現型スクリーニング（ＨｙｇＲ、ＫａｎＲ、およびＰＡＴ遺伝子に対する除草剤抵抗性、またはＧＵＳおよびＹＦＰのスコア化可能なマーカー遺伝子発現）を介して、またはＰＣＲおよびサザン分析等の分子分析によって確認する。２つの異なるブロックの１つを担持する植物を交配させて、ＨｙｇＲ＋、ＫａｎＲ＋、ＰＡＴ−、ＧＵＳ＋、ＹＦＰ＋子孫を生成する。
【０２０７】
結果として得られた植物の分子特性評価後、確認された挿入物を有する植物を、減数分裂特異的プロモーターを使用して、結合部位が２つのブロックの間に位置するＺＦＮを発現する株と交配させて、ＤＮＡの交換を達成する。これは、１つのＤＮＡ位置における２つのブロックのスタッキングをもたらす。最終のスタッキングされた遺伝子植物は、単一の分離遺伝子座として、ＨｙｇＲ＋、ＫａｎＲ＋、ＧＵＳ＋、ＹＦＰ＋構成を担持する。代替的には、ブロックのうちの１つを含有する植物を、減数分裂プロモーター／ＺＦＮ構築物を含む２つの単量体のうちの１つと交配させ、２つの挿入物に対してホモ接合型である植物を得、次いで一緒に交配させる。
【０２０８】
実施例７．１：ＤＮＡ構築
ＺＦＮ構築物の構築用に配備したクローニング戦略は、米国特許出願第２００９／０１１１１８８Ａ１号および同第２０１０／０１９９３８９号に本質的に記載される通りである。図９は、例示的なｅＺＦＮ発現カセットを示す。ＺｍＵｂｉ１プロモーター（トウモロコシユビキチン１（Ｕｂｉ−１）遺伝子に由来するプロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、およびイントロン、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８（４），６７５−８９）を使用して、ＺＦＮコード配列を発現させる。これらをその後、ＰＡＴ遺伝子の発現を駆動するイネアクチン１プロモーターを含有する、バイナリーＧＡＴＥＷＡＹ（商標）デスティネーションベクター中にクローン化した。それぞれブロック１  Ｅｘｃｉｓｏｒ（ｅＺＦＮ１，８）またはブロック２  Ｅｘｃｉｓｏｒ（ｅＺＦＮ３，６）構築物として指定する、結果として得られたプラスミドｐＤＡＢ１０５９５１（ＺＦＮ１、ＣＬ：ＡＲ）、１０５９５４（ＺＦＮ８、ＲＬ：ＡＲ）、１０５９５２（ＺＦＮ３、ＡＬ：ＰＲ）、１０５９５３（ＺＦＮ６、ＣＬ：ＲＲ）を、アグロバクテリウム株ＤＡ２５５２ｒｅｃＡに移した。
【０２０９】
アグロバクテリウムＤＡ２５５２株を、ＤＡ２５５２株をグリセロールストックから、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）（１００μｇ／ｍＬ）およびエリスロマイシン（ｅｒｙ）（１５０μｇ／ｍＬ）を含有する１０ｍＬのＹＥＰ中に植菌することによって種培養を調製することによって、エレクトロポレーションのためにコンピテントにした。１０ｍＬ培養物を、２００ｒｐｍで、２８℃で一晩インキュベートした。５ミリリットルの種培養を使用して、適切に標識化した１．５Ｌエルレンマイヤーフラスコ中、適切な抗生物質を有する５００ｍＬのＹＥＰを植菌した。培養を、２００ｒｐｍで、２８℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、培養を、湿潤の氷水浴中に配置し、穏やかに旋回させることによって冷却した。細胞を、全ての更なるステップのために４℃で維持した。細胞を、事前冷却したローター内で標識化した滅菌遠心瓶中、４０００ｘｇで、４℃で１０分間、遠心分離機にかけることによってペレット化した。上清を注ぎ出して破棄し、次いで５〜１０ｍＬの氷冷滅菌再蒸留水を添加し、塊が残らなくなるまで、細胞を上下に穏やかにピペット操作した。懸濁液容量を、氷冷滅菌再蒸留水でおよそ５００ｍＬまで調整した。細胞を、事前冷却したローター内で、４０００ｘｇで、４℃で１０分間、遠心分離機にかけることによってペレット化した。上清を破棄し、５〜１０ｍＬの氷冷滅菌再蒸留水を添加し、次いで塊が残らなくなるまで、滅菌ワイドボアピペットを使用して細胞を上下に穏やかにピペット操作した。懸濁液容量を、氷冷滅菌再蒸留水でおよそ２５０ｍＬまで調整し、細胞を、事前冷却したローター内で、４０００ｘｇで、４℃で１０分間、遠心分離機にかけることによってペレット化した。上清を破棄し、５〜１０ｍＬの氷冷滅菌再蒸留水を添加し、ペレットを穏やかに再懸濁させ、最終容量を氷冷滅菌再蒸留水で５０ｍＬまで調整した。細胞を、事前冷却したローター内で、４０００ｘｇで、４℃で１０分間、遠心分離機にかけることによってペレット化した。細胞を、５ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）氷冷の滅菌グリセロールの最終容量中に再懸濁させた。細胞を滅菌０．５ｍＬ微量遠心管中の５０μＬアリコートに分与し、液体窒素中で凍結させた。
【０２１０】
２０マイクロリットルのコンピテントＤＡ２５５２細胞を、製造業者のプリセット設定およびアグロバクテリウムエレクトロポレーションのためのプロトコルに従って、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＸＣＥＬＬ（登録商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ．）を使用して、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡで電気穿孔処理した。細胞をＳＯＣ中、２８℃で２時間回収し、次いでＹＥＰ  ｓｐｅｃ／ｅｒｙ寒天プレート上にプレートし、２８℃で４８時間増殖させた。
【０２１１】
実施例７．２：交換遺伝子座構築物
交換遺伝子座ＤＮＡ構築物を、ベクター１：ＡｔＡｃｔ２プロモーター（ＡｔＡｃｔ２プロモーターｖ２（アラビドプシス・タリアナアクチン遺伝子（ＡＣＴ２）からのプロモーター、５’非翻訳領域、およびイントロン、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１０，１０７−１２１））／ＧＵＳ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６，３９０１−３９０７）／ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’  ＵＴＲ（アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含む、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２（６）：３３５−５０）：：ＡｔＡｃｔ２プロモーター／ＮＰＴＩＩ（Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０４，１８４−１８７）／  ｅＺＦＮ  １および８が側面に位置するＡｔｕＯＲＦ２３  ３’  ＵＴＲ、ベクター２：配列の中心にｅＺＦＮ  ４および７を有する合成２ｋｂ領域、およびベクター３：ＣｓＶＭＶプロモーター／ＨＰＴ（Ｋａｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１（１９），６８９５−６９１１（１９８３））／ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’  ＵＴＲ：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーター（アラビドプシス・タリアナポリユビキチン１０（ＵＢＱ１０）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域、およびイントロン、Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（５）：８９５−９０６）／ＰｈｉＹＦＰ（Ｓｈａｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２１：８４１−８５０）／  ｅＺＦＮ  ３および６が側面に位置するＡｔｕＯＲＦ２３  ３’  ＵＴＲ、を含むＧＡＴＥＷＡＹ（商標）エントリーベクターから調製した。デスティネーションベクターを、２つの１ｋｂ無作為化合成ＤＮＡ配列を、アグロバクテリウムバイナリーベクター主鎖に挿入することによって調製し、このうち制限部位をそれらの間に含めて、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）ｃｃｄＢ陰性選択可能マーカーカセットをクローン化した。エントリーベクターを、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ反応によってデスティネーションベクター中にクローン化した。結果として得られたベクター、ｐＤＡＢ１００６４６（図１６）を、上述のアグロバクテリウムに移した。
【０２１２】
実施例７．３：アラビドプシス形質転換
Ｃｌｏｕｇｈ＆Ｂｅｎｔ（１９９８  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１６，７３５−７４３）によって記載される方法に従って、アラビドプシスへの全ての形質転換を行った。
【０２１３】
切除因子株
「切除因子」株構築物は、グルフォシネートに対する抵抗性を伝達するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をプロセスする。植付けの７、１０、および１３日後、Ｔ1植物に、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（グルフォシネート１リットル当たり２００グラムの活性成分（ｇ  ａｉ／Ｌ）、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）の２８４ｍｇ／Ｌ溶液を、１０ｍＬ／トレー（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧容量で、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気ノズルチップを使用して噴霧して、１回の塗布当たり２００ｇ  ａｉ／ｈａグルフォシネートの有効率を送達した。最終噴霧の４〜７日後、生存物（活発に成長している植物）を特定し、培養土（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０）で調製した３インチポットに個々に移植した。
【０２１４】
切除因子事象におけるｅＺＦＮの発現を逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ  ＰＣＲ）によって決定し、コピー数を、ＰＡＴ遺伝子について本明細書に記載されるようにｑＰＣＲによって決定し、サザン分析によって確認する。ＺＦＮを高レベルで発現する３つの低コピー事象を、交換遺伝子座（Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｌｏｃｕｓ）事象と交配させる。
【０２１５】
交換遺伝子座株
交換遺伝子座株を、ハイグロマイシンまたはカナマイシンを含有する培地についての選択を含む、Ｃｌｏｕｇｈ＆Ｂｅｎｔ（１９９８  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１６，７３５−７４３）によって記載される方法に従って、アラビドプシスにおいて生成する。
【０２１６】
実施例７．４：アラビドプシス交配および子孫回収
交換遺伝子座事象の、２つの一連のブロック１およびブロック２切除因子株との交配を、標準的な方法を使用して行う。
【０２１７】
交配からの種子をハイグロマイシン（ブロック１欠失）またはカナマイシン（ブロック２欠失）上で増殖させ、抵抗性植物をＧＵＳ発現（ブロック１欠失）またはＹＦＰ発現（ブロック２欠失）について分析する。ＧＵＳ活性を、組織化学的アッセイ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ  ５，３８７−４０５）を用いて、またＹＦＰを、蛍光顕微鏡検査法を使用して、決定する。所望の表現型（ブロック１陽性：ＧＵＳ＋、ＮＰＴ＋、ＨＰＴ−、ＹＦＰ−、ブロック２陽性：ＧＵＳ−、ＮＰＴ−、ＨＰＴ＋、ＹＦＰ＋）を有する植物を、ＰＣＲおよびサザン法によって分析して、所望の遺伝子構成を確認する。選択された植物からの葉を、ビアラホス溶液で塗布して、どれがＰＡＴ＋であるかを査定する。
【０２１８】
ブロック１およびブロック２遺伝子カセットを含有する植物を交配させ、子孫をハイグロマイシン／カナマイシンプレート上で選択する。ＨｙｇＲ／ＫａｎＲ植物を、ＰＣＲおよび表現型スクリーニングによって、全ての遺伝子の存在について分析する。所望の表現型を有するＦ１植物を増殖させ、減数分裂プロモーター／ＺＦＮ植物と交配させて、ブロック１およびブロック２の間の組み換えを達成する。結果として得られた子孫を、ハイグロマイシン／カナマイシンプレート上で増殖させる。選択後に生存した植物を、ＧＵＳおよびＹＦＰについてスクリーニングする。ＰＣＲ、サザン、配列決定、および分離比分析を使用して、組み換えの確認および特性評価を行う。
【０２１９】
実施例８：ｅＺＦＮ部位における遺伝子スタッキング
図１、２、４、５、および６に示す戦略は、次の方法を使用して遂行することができる。
【０２２０】
構築物設計
ヘテロ二量体ｅＺＦＮ部位の様々な組み合わせは、植物形質転換に好適なプラスミドベクター中のコンカテマーとして組み立てることができる。図１、図２、および図４は、ベクターに組み入れて、植物の染色体に形質転換することができるヘテロ二量体ｅＺＦＮ部位の様々なバージョンを例証する。
【０２２１】
ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）形質転換
トウモロコシの胚形成Ｈｉ−ＩＩ細胞培養物を、米国特許第７，１７９，９０２号に記載されるように産生し、標的組み込みが例示される生存植物細胞の源として使用する。植物選択可能マーカーカセットに結合されたヘテロ二量体ｅＺＦＮ部位を含有するＤＮＡ断片を使用して、遺伝子導入事象を生成する。遺伝子導入事象を、単離し、特徴付ける。
【０２２２】
事前に凍結保存した細胞株からの１２ｍＬの血中血球容積（ＰＣＶ）、加えて２８ｍＬの条件培地を、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中、８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｓｃｉ  Ｓｉｎ．１８：６５９−６６８）、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５．８）中に継代培養し、シェーカー上に１２５ｒｐｍで、２８℃で配置する。同じ細胞株を使用してこのステップを２回反復して、総計３６ｍＬＰＣＶが３フラスコにわたって分配されるようにする。
【０２２３】
２４時間後、ＧＮ６液体培地を除去し、７２ｍＬ  ＧＮ６  Ｓ／Ｍ浸透培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、４５．５ｇ／Ｌソルビトール、４５．５ｇ／Ｌマンニトール、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、ｐＨ６．０）と交換する。フラスコを暗所で３０〜３５分間、２８℃で適度に撹拌しながらインキュベートする（１２５ｒｐｍ）。インキュベーション時間中、炭化ケイ素ウィスカ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＬＬＣ，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣ）の５０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）懸濁液を、８．１ｍＬのＧＮ６  Ｓ／Ｍ液体培地を４０５ｍｇの滅菌炭化ケイ素ウィスカに添加することによって調製する。ＧＮ６  Ｓ／Ｍ浸透培地中でのインキュベーションに続いて、各フラスコの内容物を２５０ｍＬ遠心瓶中にプールする。フラスコ中の全ての細胞が底に沈殿した後、およそ１４ｍＬを超える内容積のＧＮ６  Ｓ／Ｍ液体を引き出し、後の使用のために滅菌１−Ｌフラスコ中に収集する。事前に湿潤させたウィスカの懸濁液を、ボルテックス上で、最大速度で６０秒間混合し、次いで遠心瓶に添加する。
【０２２４】
８５μｇの精製したＤＮＡ断片のアリコートを各瓶に添加する。一旦、ＤＮＡを添加すると、瓶を、改変したＲｅｄ  Ｄｅｖｉｌ  ５４００商業用塗料ミキサ（Ｒｅｄ  Ｄｅｖｉｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）中に即座に配置し、１０秒間撹拌する。撹拌に続いて、細胞、培地、ウィスカ、およびＤＮＡのカクテルを、１２５ｍＬの新鮮なＧＮ６液体培地と共に１−Ｌフラスコの内容物に添加して、浸透圧溶質を減少させる。細胞を、１２５ｒｐｍに設定したシェーカー上に２時間回収させる。６ｍＬの分散懸濁液を、ハウス真空管路（ｈｏｕｓｅ  ｖａｃｕｕｍ  ｌｉｎｅ）に接続したガラス細胞収集ユニットを使用して、Ｗｈａｔｍａｎ第４濾紙（５．５ｃｍ）上で濾過して、１瓶当たり６０のフィルターを得るようにする。フィルターをＧＮ６固体培地（２．５ｇ／Ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅゲル化剤を用いることを除いてＧＮ６液体培地と同じ）の６０×２０ｍｍプレート上に配置し、暗所条件下で、２８℃で１週間培養する。
【０２２５】
推定標的組み込み遺伝子導入事象の特定および単離
ＤＮＡ送達の１週間後、濾紙を、選択剤を含有するＧＮ６（１Ｈ）選択培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、２．５ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）の６０×２０ｍｍプレートに移す。これらの選択プレートを、暗所で、２８℃で１週間インキュベートする。暗所での１週間の選択後、細胞の１／２を各プレートから、３７〜３８℃で保持される３．０ｍＬのＧＮ６アガロース培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、７ｇ／Ｌ  ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）アガロース、ｐＨ５．８、１２１度で１０分間オートクレーブ処理）を含有する管にこすり落とすことによって、組織を新鮮な培地上に埋め込む。
【０２２６】
アガロース／組織混合物をへらで粉砕し、その後、３ｍＬのアガロース／組織混合物を、ＧＮ６（１Ｈ）培地を含有する１００×２５ｍｍ皿の表面上に均等に注ぐ。このプロセスを、各プレートの両方の片について反復する。一旦、全ての組織を埋め込むと、プレートを暗所条件下で、２８℃で最長１０週間培養する。これらの選択条件下で増殖した推定的に形質転換した単離株を、埋め込まれたプレートから除去し、６０×２０ｍｍプレート中の新鮮な選択培地に移す。およそ２週間後に持続的な増殖が明白である場合、事象を、適用された除草剤（選択剤）に対して抵抗性であるとみなし、細胞のアリコートをその後、遺伝子型分析のために採取する。安定な植物形質転換は、スタッキング実験のために使用される単一コピー組み込み体を産生する。
【０２２７】
事象の分子特性評価
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、記載される単離されたトウモロコシ細胞から抽出し、ＰＣＲ遺伝子型同定実験のためのテンプレートとして利用する。ｇＤＮＡを、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に詳述される製造業者のプロトコルに従って単離する、およそ１００〜３００μＬ血中血球容積（ＰＣＶ）のＨｉ−ＩＩカルスから抽出する。ゲノムＤＮＡを、１００μＬのキット提供緩衝剤中に溶出して２０〜２００ｎｇ／μＬの最終濃度を得、その後、ＰＣＲに基づく遺伝子型同定法を介して分析する。
【０２２８】
コピー数の分子分析
ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）または加水分解プローブアッセイを行って、除草剤抵抗性カルスの試料をスクリーニングして、Ｔ鎖ＤＮＡの単一コピー組み込みを含有するものを特定する。遺伝子発現カセットに特異的なプライマーおよびプローブを使用して、詳細な分析を行う。単一コピー事象を追加的な分析のために特定する。
【０２２９】
カスタムＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイを、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＨｉ−ＩＩカルスにおける選択可能マーカー遺伝子分析のために開発する。ゲノム試料を、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイキットを使用して増幅し、読み取りを収集する。これらの読み取りから、各チャネルについてのフォールドオーバーゼロ（ｆｏｌｄ−ｏｖｅｒ  ｚｅｒｏ）（すなわち、バックグラウンド）を、試料の原シグナルを、テンプレートを含有しない原シグナルで割ることによって、各試料について決定する。このデータから標準的な曲線を構築し、最良適合を線形回帰分析によって決定する。この適合から特定したパラメータを使用して、次いで見かけの選択可能マーカーコピー数を各試料について推定する。
【０２３０】
標的ＤＮＡを有する遺伝子導入事象の選択
低コピー（１〜２コピーの導入遺伝子）事象を、上述のように、選択可能マーカー遺伝子カセットおよび無傷のｅＺＦＮ部位を含有する無傷の植物転写単位（ＰＴＵ）について、ＰＣＲによってスクリーニングする。コピー数を、サザン分析によって、選択可能マーカー遺伝子による標準的な方法を使用して更に確認する。単一コピーの無傷の挿入を有する選択された遺伝子導入事象からのカルスを維持する。
【０２３１】
ｅＺＦＮを含有する植物細胞中へのバイオリスティック媒介型ＤＮＡ送達
上述のように、トウモロコシの胚形成Ｈｉ−ＩＩ細胞培養物を産生し、内部への標的組み込みが実証される生存植物細胞の源として使用する。トウモロコシの胚形成懸濁液を、ＧＮ６液体培地中におよそ２４時間継代培養し、その後、上述される実験を行う。およそ０．４ｍＬ  ＰＣＶの細胞を、２．５ｇ／Ｌゲルライトで凝固させたＧＮ６  Ｓ／Ｍ培地を含有する１００×１５ｍｍペトリ皿の中心上で、直径２．５ｃｍの円形に薄く広げる。
【０２３２】
細胞を暗所条件下で４時間培養する。バイオリスティック粒子を、ドナーＤＮＡ（図１のブロック１、図２のブロック２、または図４の遺伝子１）を含有するＤＮＡでコーティングするために、３ｍｇの１．０ミクロン直径の金粒子を１００％エタノールで１回、滅菌蒸留水で２回洗浄し、シリコン処理したエッペンドルフ管中の５０μＬ水中に再懸濁させる。総計５μｇのプラスミドＤＮＡ（単一のベクター中または別個のベクター中に、ｅＺＦＮをコードする核酸分子およびドナーＤＮＡ断片を含有する）、２０μＬスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬ塩化カルシウム（２．５Ｍ）を金懸濁液に別個に添加し、ボルテックス上で混合する。混合物を室温で１０分間インキュベートし、ベンチトップ微量遠心機において１０，０００ｒｐｍで１０秒間ペレット化し、６０μＬ冷１００％エタノール中に再懸濁させ、８〜９μＬを各マクロ担体上に分配する。
【０２３３】
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／ＨＥ（商標）系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して衝撃を行う。細胞を含有するプレートを、１，１００ｐｓｉおよび２７インチのＨｇ真空の条件下で棚中段に配置し、作動マニュアルに従って衝撃する。衝撃の１６時間後、組織を小さい塊でＧＮ６（１Ｈ）培地に移し、暗所条件下で、２８℃で２〜３週間培養する。ドナーＤＮＡの組み込みからもたらされる推定遺伝子導入単離株が現れ始めるまで、移入を２〜４週間毎に継続する。ビアラホス抵抗性コロニーを、一般に、ＰＣＲおよびサザンブロッティングによって、標的配列を含有する単離株を生成するために上に詳述される方法を使用して分析する。
【０２３４】
ＰＣＲ遺伝子型同定を介する標的組み込み事象についてのスクリーニング
ＰＣＲ反応を行って、ドナーＤＮＡの無傷のコピーの存在を調査する。追加的な反応は、標的とドナーとの間の５’境界およびドナーと標的との間の３’境界に焦点を当てる。増幅した断片をゲル切除し、標準的なプロトコルに従って精製する。精製した断片をその後、製造業者のプロトコルに従って、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ（登録商標）Ｋｉｔ（ｐＣＲ２．１ベクターを有する）およびＯＮＥ  ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙコンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してｐＣＲ２．１プラスミド中にクローン化する。
【０２３５】
個々のコロニーを選択し、増幅したＰＣＲ断片を含有することを確認する。プラスミドクローンの二本鎖配列決定反応を行って、ＰＣＲ増幅したゲノム配列が組み込まれたドナーを含有することを確認する。ドナー断片を含有することが特定された事象は、ＺＦＮ媒介型二本鎖切断の相同性駆動型修復、およびドナーＤＮＡの特異的遺伝子標的における標的組み込みが存在する標的を表す。
【０２３６】
ｅＺＦＮ部位を使用する遺伝子スタッキングの特異的用途
図１は、植物の染色体に安定に形質転換される７つの（７）ｅＺＦＮ標的部位から成り立つ多重挿入部位の変形を示す。標的部位に結合するｅＺＦＮ対を幾何学的図として示す。「ブロック１」は、特異的ｅＺＦＮ部位を開裂するように設計されたｅＺＦＮにより形質転換されるとき、適切なｅＺＦＮ対の多重挿入部位に組み込まれ得る外来性ポリヌクレオチド配列である。ｅＺＦＮおよび「ブロック１」ドナーＤＮＡ配列の共形質転換は、前述のバイオリスティック形質転換方法を使用して達成することができる。様々な他のｅＺＦＮ部位の忠実度は、植物細胞中に形質転換されるｅＺＦＮがこれらの他の部位を開裂しないため、維持される。「ブロック１」は、相同組み換えを介して植物染色体に組み込み、「ブロック１」の配列を含有する植物細胞をもたらす。結果として得られた植物細胞は、成熟植物に成長させられ、サザンブロッティング、Ｔａｑｍａｎアッセイ、またはＩｎｖａｄｅｒアッセイ等の当該技術分野において既知である分析分子生物学的方法を使用して「ブロック１」の存在についてスクリーニングされ得る。
【０２３７】
図２は、図１の別の変形を例証し、ここで異なるｅＺＦＮ結合部位は、ポリヌクレオチドドナー配列「ブロック２」により標的化される。ＤＮＡ断片の結果として得られた組み込みは、染色体内に「ブロック２」を含有する安定な植物を産生する。
【０２３８】
図４は、ｅＺＦＮ「左」および「右」ドメインの使用を例証する。上部の線は、左および右ｅＺＦＮドメインにより形質転換された植物のゲノムを示す（影付き三角および碁盤格子三角）。新たなおよび異なるヘテロ二量体ｅＺＦＮ部位が側面に位置する「遺伝子１」を含む外来分子の存在下で、適切なｅＺＦＮが付加されるとき、「遺伝子１」および隣接するｅＺＦＮ部位がゲノムに挿入される。「遺伝子１」および隣接するｅＺＦＮ部位を含有する、結果として得られた子孫が特定され、これらの植物を、その後、親植物内には存在しなかった新たなヘテロ二量体ｅＺＦＮ部位を使用して、再標的化することができる（すなわち、影付き三角および碁盤格子三角を含有するｅＺＦＮ部位）。
【０２３９】
図５および図６は、ｅＺＦＮ部位を使用して、新たな導入遺伝子を染色体位置中にスタッキングすることができる様態を例証する。更に、この戦略は、他の遺伝子発現カセットの切除を可能にする。場合によっては、遺伝子発現カセットを完全に除去することができ（図５）、他のシナリオでは、遺伝子発現カセットを植物の特異的生成において除去し、最終的にそれらの植物の子孫に再導入することができ、それによって遺伝子発現カセットの再利用が可能となる。欠失したマーカー（図６）配列は、上述のプロトコルを使用して相同組み換え媒介型遺伝子標的法を介して再導入することができる。ヘテロ二量体ｅＺＦＮ部位への遺伝子標的法は、上述のプロトコルを使用して完了する。この実施例において、ｅＺＦＮ結合部位は、形質転換植物からの、選択可能マーカー遺伝子を含む、植物体での任意の導入遺伝子の欠失を可能にするために使用される。２０１０年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２９７６２８号を参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４０】
本明細書で言及した全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が全目的で本明細書に組み込まれる。
【０２４１】
理解の明瞭化を目的とした図示および例を用いて、本開示を多少詳しく提供したが、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を実施することができることは当業者には明らかであろう。したがって、前述の説明および例を限定的であると解釈すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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