(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程：（１）多能性幹細胞を１以上のＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；（２）工程（１）で得られた細胞を１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程。を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法：
（１）多能性幹細胞を１以上のＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）で得られた細胞を１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程。
【請求項２】
１以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む、請求項１に記載の方法：
式（Ｉ）：
【化１】
2013111875.tif 000025
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【請求項３】
１以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、以下からなる群から選択される化合物またはその塩を含む、請求項２に記載の方法：
ＫＹ０２１１１
【化２】
2013111875.tif 000026
ＫＹ０１０４１
【化３】
2013111875.tif 000027
Ｔ６１１６４
【化４】
2013111875.tif 000028
ＫＹ０２１１４
【化５】
2013111875.tif 000029
ＫＹ０１０４５
【化６】
2013111875.tif 000030
ＫＹ０１０４０
【化７】
2013111875.tif 000031
ＫＹ０２１０９
【化８】
2013111875.tif 000032
ＫＹ０１０４２
【化９】
2013111875.tif 000033
ＫＹ０１０４３
【化１０】
2013111875.tif 000034
ＫＹ０１０４６
【化１１】
2013111875.tif 000035
ＰＢ２８５２
【化１２】
2013111875.tif 000036
Ｎ１１４７４
【化１３】
2013111875.tif 000037
ＰＢ２５７２
【化１４】
2013111875.tif 000038
ＰＢ２５７０
【化１５】
2013111875.tif 000039
ＫＹ０２１０４
【化１６】
2013111875.tif 000040
ＳＯ０８７
【化１７】
2013111875.tif 000041
ＳＯ１０２
【化１８】
2013111875.tif 000042
ＳＯ０９６
【化１９】
2013111875.tif 000043
ＳＯ０９４
【化２０】
2013111875.tif 000044
。
【請求項４】
１以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、以下の化合物またはその塩を含む、請求項３に記載の方法：
ＫＹ０２１１１
【化２１】
2013111875.tif 000045
。
【請求項５】
１以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、ＸＡＶ９３９およびＩＷＰ−２からなる群から選択されるＷＮＴシグナル阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
１以上のＷＮＴシグナル活性化剤が、ＧＳＫ３β阻害剤を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１以上のＷＮＴシグナル活性化剤が、ＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択されるＷＮＴシグナル活性化剤を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（１）および（２）における培地が血清を含まない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程（１）および（２）における培地がサイトカインを含まない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（１）および（２）における培地がアルブミンを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）および（２）における培地がアルブミン以外のタンパク質を含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（１）および（２）が異種成分非存在下で行われる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞がサルまたはヒト多能性幹細胞である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
心筋細胞の製造方法である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
１以上のＷＮＴシグナル活性化剤および／または１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む心筋分化促進用キットであって、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞 (hPSC)（ヒト胚性幹細胞 (hESC)およびヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC)を含む）は、未分化状態では無限に増殖し、心臓を含むヒト組織の多くのタイプの細胞へ分化することができる（非特許文献１−７）。それゆえ、hPSCは、心疾患に対する細胞基盤治療において有用となりうる。細胞基盤治療には、hPSCからの機能的心筋細胞の効率的産生が必要とされる。現在使用されている最も一般的な方法は、胚様体のサイトカイン（例えば、DKK1、bFGF、アクチビンA（Activin A）、およびBMP4）との懸濁培養、またはマウスEND2 (近位内胚葉 (visceral endoderm)様細胞)との接着共培養である（非特許文献１３、１５−１７）。しかしながら、これら方法は効率が低く(心筋細胞の産生は10-50%)（非特許文献１５）、動物細胞またはウシ胎児血清 (FBS)を使用するため異種成分のコンタミネーションが避けられず（非特許文献１８）、また、組換サイトカインの使用は大規模な産生にとっては費用効率が良くない。さらに、これまでの研究により、心筋細胞の誘導に最適なサイトカイン濃度は個々のhPSC株間で異なることが示されており（非特許文献１９）、これは方法の最適化操作が必要であることを示している。最近、hPSC株に依存しない普遍的な心筋分化方法が報告されたが、この方法は効率的な分化のためにはFBSとbFGFやBMP4のような成長因子を必要とする（非特許文献２０）。【０００３】
低分子化合物は、組換サイトカインやFBS中の未知の因子の代替物の有力な候補であり（非特許文献２１）、大規模培養のための既知組成培地の作成に適している。これまでに、WNTシグナルやTGF-βシグナルのようなシグナル伝達経路を活性化または阻害するために（非特許文献２２、２３）、あるいは転写因子に代えて遺伝子の発現を調節するために（非特許文献２４、２５）、低分子化合物が用いられている。多数の低分子化合物が、分化の促進について試験またはスクリーニングされている。BMPシグナル阻害剤 (Dorsomorphin)、p38MAPKシグナル阻害剤 (SB203580)、WNTシグナル活性化剤 (BIO)、およびWNTシグナル阻害剤 (XAV939、IWR-1、IWP-1、およびIWP-3)は、心筋分化を促進することが報告されている（非特許文献２６−３２）。しかしながら、これらの処理では、血清含有条件下であっても10-60%の心筋分化しか得られない（非特許文献２６−３２）。大規模な臨床応用のため、より効率的な分化をもたらす低分子化合物が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、効率的な多能性幹細胞の心筋分化誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程：
（１）多能性幹細胞を１以上のＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）で得られた細胞を１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程。
を含む方法を提供する。【０００６】
本発明は、１以上のＷＮＴシグナル活性化剤および／または１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む心筋分化促進用キットであって、前記方法に使用されるキットを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、既知の方法と比較して高効率かつ低コストに多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】心筋分化を促進する低分子化合物の同定および特性決定。(a) 低分子化合物のスクリーニングの説明図。ヒトαMHCプロモーター誘導EGFP（enhanced green fluorescent protein）トランスジェニックサルESCとハイコンテント解析（HCA）システムを用いて、9600化合物から1のヒット化合物が同定された（非特許文献４７）。(b) ヒット化合物N11474の有効時間窓。ヒトαMHCプロモーターにより誘導されるGFP発現の比率に基づくと、4-8日目における処理が心筋分化に最も効果的であった。DMSO対照の発現レベルが100%である。0-4日目の処理ではGFP発現は完全に抑制された。実験は2回行った。(c,d) N11474および関連化合物の構造活性相関、並びにこれら化合物による心筋分化促進。(c) N11474およびKY02111の化学式。(d) N11474および関連化合物により誘導されるGFP発現レベル。上のグラフはGFP誘導率を示す。ウェル全体の画像（下の写真）における白い点はGFPシグナルを有するコロニーを示す (スケールバーは10 mmである)。ベンゾチアゾール環とジメトキシフェニル環を繋ぐ炭素鎖の長さがGFP発現の誘導に重要であった。炭素数2または3の化合物 (KY02111またはKY02114)が最も高いレベルの誘導を示した。実験は3回実施した。(e) PSC株に対するKY02111の効果の一般性。hESC株 (KhES-1およびKhES-3)、サルESC株 (CMK6.4)、マウスESC株 (R1)、およびhiPSC株 (IMR90-1、IMR90-4、253G1、およびRCHIPC0003) は、KY02111の処理により心筋細胞へ分化した。培養ディッシュ上の全コロニーに対する拍動コロニーの比率は、全てのPSC株について70-90%増加した (平均±SEM, n=2)。
【図２】KY02111処理hPSCより誘導された心筋細胞の特性決定。(a,b) KY02111は、心筋マーカーの発現を促進した。 (a) IMR90-1 hiPSCをKY02111またはDMSOで処理した後、心筋マーカー (cTnT、αアクチニン（αActinin）、およびNKX2.5)、ペースメーカーマーカーであるHCN4、および線維芽細胞マーカーであるビメンチン（Vimentin）を検出した。上の写真がKY02111処理細胞、下の写真がDMSO処理細胞である (スケールバーは100μmである)。 (b) KY02111処理細胞の約80%または16%、および対照細胞の2%または0.8% が、それぞれ心筋マーカーまたはHCN4陽性であった。ビメンチン陽性比率は、KY02111およびDMSOにおいてそれぞれ20%および70%であった (平均±SEM, n=3)。(c) KY02111誘導心筋細胞のqPCR 遺伝子発現解析。全RNAを、心筋分化15日目（左棒）および30日目（右棒）の分化細胞から抽出した。心筋マーカー遺伝子 (αMHC、βMHC、cTnT、αアクチニン、およびNKX2.5)、およびチャネル遺伝子 (HCN4、Nav1.5、Cav1.2、Cav3.2、HERG1b、およびKCNQ1)が、KY02111誘導心筋細胞において高度に発現していた。ほぼ全ての遺伝子が30日目にアップレギュレーションされ、それらの遺伝子発現レベルは成人心臓組織の遺伝子発現レベル（100％とした）とほぼ同等であった (平均±SEM, n=3)。qPCRに使用したプライマーは表１に示す。(d,e) KY02111誘導心筋細胞 (KY-CM)の機能性。(d) パッチクランプ法におけるKY02111誘導心筋細胞からの自発的な心室様またはペースメーカー様活動電位 (AP)。(e) 100 nM E4031 (HERGチャネルブロッカー)および4μM クロマノール293B (Chromanol 293B) (KCNQ1チャネルブロッカー)により誘導される活動電位持続時間の延長。これらの結果は、KY-CMが電気的および薬理学的に機能的であることを示す。
【図３】KY02111および他のWNT阻害剤によるWNTシグナル経路の阻害を介する心筋分化の相乗的促進。(a) ダウンレギュレーションされる遺伝子のヒートマップ。IMR90-1 hiPSCをKY02111またはDMSOで12または24時間処理し(KY12h、KY24h、DMSO12h、またはDMSO24h)、26遺伝子が同定された。22のダウンレギュレーションされた遺伝子を用いてヒートマップを作成した。4つのアップレギュレーションされた遺伝子は表２に示す。WNTシグナル経路の標的遺伝子を表２に示す。(b) 化学性およびタンパク性WNT阻害剤の心筋分化促進活性の比較 (平均±SEM, n=4; **スチューデントt検定（student’s t−test）, P=0.009)。活性は、ヒトαMHCプロモーターにより誘導されるEFGP遺伝子を有するサルESCを用いて測定した。DMSO対照処理の活性レベルを100%とした。低分子化合物のWNT阻害剤は、KY02111(10μM)、IWP-2 (10μM)、XAV939 (10μM)、およびIWR-1 (10μM)であった。タンパク性因子は、IGFBP4 (1μg ml-1)、Dkk1 (300 ng ml-1)、およびbFGF、BMP4、VEGF、DKK1、およびアクチビンAの混合物 (Cytokines)（非特許文献１６）であった。いずれの阻害剤の濃度も心筋分化のため最適化した（データ非提示）。(c,d) GSK3β阻害剤は心筋分化に対するKY02111の効果を消失させなかった。ヒトαMHCプロモーターにより誘導されるGFPシグナルを有するコロニーは、KY02111(KY)、XAV939 (XAV)、IWP-2 (IWP)の処理により、5μM BIO (GSK3β阻害剤)の存在下または非存在下において、誘導された。(c) ウェル全体におけるGFPシグナル (白点)の写真。各写真の左下の数字はGFPシグナル比の増加を示す (DMSO=100%)。(d) 拍動コロニーの割合 (平均±SEM, n=3)。この結果は、BIOはKY02111による心筋分化の促進は消失させないが、XAV939およびIWP-2の活性は完全に阻害することを示す。(e) KY02111とXAV939、IWP-2、またはXAV939およびIWP-2との相乗効果。分化0日目、1ウェルあたり6 x 106個のIMR90-1 hiPSC細胞を6ウェルプレートに添加した。左の棒は、KY02111 (KY)、XAV939 (XAV)、IWP-2 (IWP)、KY+XAV、KY+IWP、およびKY+XAV+IWPにより誘導された拍動心筋コロニーの数を示す。右の棒は、全コロニーの合計細胞数とcTnT陽性細胞の比率との積により算出した全心筋細胞数を示す（図１０ａ、ｂ参照）。平均±SEM, n=4, *P <0.05, **P <0.001 (スチューデントt検定、KY02111単独処理と各処理とを比較)。
【図４】WNTシグナル経路を制御する低分子化合物を用いた血清不含既知組成培地における心筋分化。(a) WNTシグナル調節剤を用いた心筋分化の説明図。分化初期 (0-3日目)においては、前培養したPSC凝集体を、血清不含IMDM基盤培地（0.4-2% アルブミンおよびGSK3β阻害剤(2μM BIOおよび5μM CHIR99021)含有）中、ゼラチンまたはラミニン211をコートしたディッシュ上で培養した。中期 (3-9日目) においては、10μM KY02111、または10μM KY02111と2μM XAV939とを含む既知組成培地中で培養した。拍動心筋コロニーは、通常9日目に出現した。後期 (9-30日目) においては、既報のとおり、心筋コロニーをWNTシグナル調節剤を含まない既知組成培地中で浮遊培養により維持した（非特許文献３３）。(b) 血清含有および血清不含条件下における分化効率。心筋分化は、血清 (FBS) または1-2% BSA (Alb)を含む培地を用いて、図４ａに記載のとおり実施した。cTnT陽性細胞の割合は、Metamorphソフトウェアにより測定した。(c) 血清含有 (FBS)および血清不含 (Alb)条件下における分化細胞のcTnT免疫染色。スケールバーは100μmである。(d) アルブミン含有培地においてDMSO対照、KY02111 (KY)、またはKY02111+XAV939 (KY+XAV)により誘導されるcTnT陽性細胞の代表的フローサイトメトリーデータ。FACSCantoII (BD Biosciences)により各サンプルにつき30,000細胞を測定した。(e) 血清不含既知組成培養条件における拍動コロニー数 (左棒)および全心筋細胞数 (右棒)。分化0日目、1ウェルあたり6 x 106個のIMR90-1 hiPSC細胞を6ウェルプレートに添加した。右の棒は、全コロニーの合計細胞数とcTnT陽性細胞の比率との積により算出した各ウェルにおける心筋細胞数を示す。KY02111またはKY+XAVにより誘導される拍動コロニー数と全心筋細胞数は、いずれも血清含有培地 (FBS)中よりも既知組成培地 (Alb)中においてより増加した。平均±SEM, n=4; *P <0.05, **P <0.001 （スチューデントt検定）。
【図５】KY02111および関連化合物。(a) KY02111の合成スキーム。他の関連化合物も同様の合成方法を用いて合成した。(b) 心筋分化促進活性を有するKY02111関連化合物の化学式。(c) (b)に示すKY02111関連化合物の心筋分化活性 (サルESCのαMHCプロモーター誘導GFP増加率, DMSO=100%)。炭素鎖数2または3の化合物は、炭素鎖数0、1、または4の化合物よりも強い活性を示した。ベンゾチアゾール環のR1基として、塩素またはニトロ基は、メチル基、ヒドロキシメチル基、およびフッ素よりも適していた。
【図６】KY02111により誘導される心筋分化の経時変化。hiPSC (IMR90-1) の拍動コロニー比率は、心筋分化の間、10日目から38日目まで増加した。拍動はおよそ10日目から開始した。30日目、ディッシュ上の心筋コロニーを、実施例の「１．方法」に説明の通り浮遊培養へ移行した。
【図７】KY02111により誘導される心筋細胞のパッチクランプ法。(a) KY02111誘導心筋細胞 (KY-CM)の電位依存性Ca2+チャネル電流の電流電圧 (I-V)曲線 (n=8, 平均±SEM)。(b) KY-CMの電位依存性Na+チャネル電流の電流電圧 (I-V)曲線 (n=8, 平均±SEM)。(c) KY-CMの電位依存性HCNチャネル電流の電流電圧 (I-V)曲線 (n=5, 平均±SEM)。(d) KY-CMのHERGチャネル電流 (IKr)およびKCNQ1電流 (IKs)。保持電位：−40 mV；脱分極テストパルス：−40 mVから+40 mVまで、500 m秒。3つのトレース（処理前 (上)、HERGチャネルブロッカーであるE4031処理後 (中)、KCNQ1チャネルブロッカーであるクロマノール293B処理後 (下)）をあわせて表示した。KY-CMにおいて、E4031およびクロマノール293BによるIKr電流およびIKs電流の阻害が明確に検出された。(e) KY-CMの活動電位およびイオンチャネル電流の平均的性質。RP: 静止電位。APA: 活動電位振幅。APD90: 90%再分極時の活動電位持続。Vmax: 最大立ち上がり速度。INa: -90 mVから40 mVまでの脱分極時の電位依存性Na+チャネル電流。ICa: -40 mVから10 mVまでの脱分極時の電位依存性Ca2+チャネル電流。IKs: クロマノール293Bにより抑制された-40 mVから40 mVまでの500m秒脱分極パルス後の電位依存性K+チャネル電流。IKr: E4031により抑制された-40 mVから40 mVまでの500m秒脱分極パルス後の電位依存性K+チャネル電流。If: ザテブラジンにより抑制された-50 mVから−140 mVまでの500m秒過分極パルス後のHCNチャネル電流。E4031-APDinc: E4031により誘導されるAPD90増加率。C293B-APDinc: クロマノール293Bにより誘導されるAPD90。
【図８】KY-CMを用いたQT間隔延長試験。(a) 微小電極アレイ (MEA) ディッシュ上の単一KY-CMコロニー。(b) KY-CMコロニーより放出されるECG様波。上：処理前の波形。下：10μMアステミゾール（Astemizole）処理後の波形。Na+-K+波ピーク間隔は、アステミゾールにより延長された。アステミゾールは抗ヒスタミン薬だが、HERGチャネルを阻害することが報告されている（非特許文献３４）。(c) Na+-K+ 間隔延長のグラフ。アステミゾールは4分毎に用量依存的に添加した。Na+-K+ 間隔は、対照条件としての0.1 % DMSO処理では変化しなかった。
【図９−１】KY02111およびWNTシグナル調節剤による遺伝子発現プロファイルおよびTCF受容体アッセイ（１）。(a) KY02111を処理したIMR90-1 hiPSCのマイクロアレイ実験により同定されたWNT標的遺伝子のバリデーション。試験した全ての遺伝子において、qPCR解析による遺伝子発現パターンはマイクロアレイデータと同様であった。
【図９−２】KY02111およびWNTシグナル調節剤による遺伝子発現プロファイルおよびTCF受容体アッセイ（２）。(b,c) KY02111処理によりダウンレギュレーションされた遺伝子のDiRE (Distant Regulating Elements of co-regulated genes) 解析（非特許文献３５）。22遺伝子全て (b)またはKY02111処理後12時間の時点で最もダウンレギュレーションされた10遺伝子 (c)を解析した。出力データから、最も妥当な転写因子は古典的WNTシグナル経路のエフェクターであるLEF1およびTCF4であることが示された。
【図９−３】KY02111およびWNTシグナル調節剤による遺伝子発現プロファイルおよびTCF受容体アッセイ（３）。(d) KY02111、XAV939、IWP-2、またはBIOを処理したIMR90-1 hiPSCのqPCRによる遺伝子発現解析。全RNAを処理の12、24、および72時間後に抽出した。試験した全ての遺伝子の発現レベルがWNTシグナル阻害剤 (XAV939およびIWP-2)およびKY02111により抑制された。WNTシグナル活性化剤であるBIOは、これらの遺伝子発現レベルを増大させる傾向ににあった。
【図９−４】KY02111およびWNTシグナル調節剤による遺伝子発現プロファイルおよびTCF受容体アッセイ（４）。(e) TOPflashプラスミドをトランスフェクトしたhiPSC (IMR90-1)を用いたKY02111 (K)、XAV939 (X)、IWP-2 (I)、およびDMSO 対照 (D)のTCFレポーター・ルシフェラーゼアッセイ。Wnt3a (W)またはBIO (B) を添加して、WNTシグナル経路およびTCFプロモーター活性を上昇させた。KY02111およびXAV939は、Wnt3aおよびBIOによるTCFプロモーター活性を阻害した。IWP-2はTCFプロモーター活性を阻害しなかったが、これはIWP-2がWNTリガンド分泌の阻害剤であるためと考えられる。n=14, 平均±SEM, *P < 0.05, **P < 0.01 (独立両側スチューデントt検定（unpaired two-tailed Student’s t-test）)。(f) HEK293細胞におけるKY02111のTCFレポーターアッセイ。HEK293細胞において、KY02111はBIOによるTCFプロモーター活性を阻害したが、KY02111はWnt3aによるTCFプロモーター活性をさらに増強した。n=4,平均±SEM, *P < 0.05, **P < 0.01 (独立両側スチューデントt検定)。
【図１０】KY02111とXAV939、IWP-2、およびXAV939+IWP-2の全細胞数および心筋細胞率に対する相乗効果。(a) 6ウェルプレートの単一ウェルにおける分化細胞の数。(b) cTnT陽性心筋細胞率。IMR90-1 hiPSCは、実施例の「１．方法」に記載のとおり、KY02111(KY)、XAV939 (XAV)、IWP-2 (IWP)、KY+XAV、KY+IWP、またはKY+XAV+IWPにより処理した。全細胞数をNucleoCounter (Chemometec)を用いて心筋分化14日目に測定した。cTnT陽性心筋細胞は、実施例の「１．方法」に記載のとおり検討した。分化1日目に、6ウェルプレートの1ウェルにつき、600万個のIMR90-1 hiPSC細胞を使用した。n=4, 平均±SEM, *P <0.001 (KY02111単独と比較)。
【図１１】WNTシグナル経路を調節する低分子化合物による、サイトカイン、血清、および異種成分を含まない既知組成条件における強力な心筋分化。(a) hESC 株 (H1、H9、およびKhES-3) およびhiPSC 株 (IMR90-1および253G1) は、初期におけるBIO+CHIR99021の処理、および後期におけるKY02111+XAV939の処理により高効率に心筋細胞へ分化した。図４ａに示すように、0.4% ヒト血清アルブミンおよびヒトラミニン211を使用した。心筋拍動コロニ率 (培養ディッシュ上の全コロニーに対する拍動コロニー) は、全てのhPSC株で85-95%であった。n=3, 平均±SEM。(b) 各hPSC株から得られたcTnT陽性細胞の代表的フローサイトメトリーのデータ。FACSCantoII (BD Biosciences)により各サンプルにつき30,000細胞を測定した。(c) 異種成分およびサイトカイン不含条件下でのIMR90-1 hiPSC由来心筋細胞におけるcTnTおよびαアクチニン（αActinin）の免疫染色。スケールバー：100μm。サルコメア構造がはっきりと検出された。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明において「多能性幹細胞」（ＰＳＣと記載することもある）とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、ＥＳＣと記載することもある）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ｉＰＳＣと記載することもある）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
【００１０】
ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００−５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） などのＥＳ細胞が挙げられる（これら文献は引用により本明細書に含まれる）。
【００１１】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995)) （引用により本明細書に含まれる）が挙げられる。
【００１２】
本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007)（これら文献は引用により本明細書に含まれる）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
【００１３】
本発明における「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えばＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。本発明の方法においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル活性化剤を併用してもよい。
【００１４】
本発明における「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル阻害剤には、例えば、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物、並びにＩＧＦＢＰ４、およびＤｋｋ１などのタンパク質が含まれる。好ましくは、本発明におけるＷｎｔシグナル阻害剤は化合物である。本発明の方法においては、２以上、例えば２、３、または４種類のＷｎｔシグナル阻害剤を併用してもよい。
【００１５】
本発明に好適なＷｎｔシグナル阻害剤は、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である：
式（Ｉ）：
【化１】
2013111875.tif 000002
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【００１６】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
【００１７】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
【００１８】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
【００１９】
ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
【００２０】
好ましい態様において、Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００２１】
Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、最も好ましくはメトキシ基又はエトキシ基である。
【００２２】
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
【００２３】
ある態様において、Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００２４】
Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
【００２５】
好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。
【００２６】
ある態様において、Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖アルコキシ基であり、基−Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
【００２７】
好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン−１−イル基、ピペラジン−１−イル基、又はモルホリン−４−イル基である。
【００２８】
Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
【００２９】
好ましい態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
【００３０】
好ましい態様において、ｎは、０から４の整数である。さらに好ましい態様において、ｎは、２又は３である。
【００３１】
本発明における特に好適なＷｎｔシグナル阻害剤は、以下から選択される化合物またはその塩である：
ＫＹ０２１１１
【化２】
2013111875.tif 000003
ＫＹ０１０４１
【化３】
2013111875.tif 000004
Ｔ６１１６４
【化４】
2013111875.tif 000005
ＫＹ０２１１４
【化５】
2013111875.tif 000006
ＫＹ０１０４５
【化６】
2013111875.tif 000007
ＫＹ０１０４０
【化７】
2013111875.tif 000008
ＫＹ０２１０９
【化８】
2013111875.tif 000009
ＫＹ０１０４２
【化９】
2013111875.tif 000010
ＫＹ０１０４３
【化１０】
2013111875.tif 000011
ＫＹ０１０４６
【化１１】
2013111875.tif 000012
ＰＢ２８５２
【化１２】
2013111875.tif 000013
Ｎ１１４７４
【化１３】
2013111875.tif 000014
ＰＢ２５７２
【化１４】
2013111875.tif 000015
ＰＢ２５７０
【化１５】
2013111875.tif 000016
ＫＹ０２１０４
【化１６】
2013111875.tif 000017
ＳＯ０８７
【化１７】
2013111875.tif 000018
ＳＯ１０２
【化１８】
2013111875.tif 000019
ＳＯ０９６
【化１９】
2013111875.tif 000020
ＳＯ０９４
【化２０】
2013111875.tif 000021
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）（引用により本明細書に含まれる）により、あるいは実施例に記載の方法に準じて、合成することができる。
【００３３】
上記化合物は、例えば、J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735（引用により本明細書に含まれる）に記載されている（Ｎ１１４７４、Ｔ６１１６４)。また、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
【００３４】
本発明の方法において、工程（１）「多能性幹細胞を１以上のＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程」、および工程（２）「工程（１）で得られた細胞を１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程」における培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される培地であればよく、その組成は特に限定はされない。本発明の方法に用いる培地としては、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、実施例で使用している培地)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。
【００３５】
本発明の方法においては、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に適した培養方法を用いることができる。培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法等が挙げられる。本発明の方法では、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞を使用する必要がない。
【００３６】
本発明の方法によれば、血清を含まない培地（血清不含培地）であっても効率的に多能性幹細胞の心筋分化を誘導することができる。血清不含培地を用いる場合、培地はアルブミンを含むことが好ましく、培養方法としては接着培養法を用いることが好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが挙げられる。接着培養法においては、ゼラチンまたはラミニン（例えば、ヒトラミニン211）をコートした培養ディッシュを用いることができる。本発明の方法においてアルブミンを含む血清不含培地を用いた場合、血清、サイトカイン、支持細胞等、アルブミン以外のタンパク質や、使用する多能性幹細胞とは異なる生物種に由来する成分（すなわち、異種成分）の非存在下で多能性幹細胞心筋分化を誘導することができる。
【００３７】
本発明の方法において、心筋分化培地における培養（心筋分化培養）の開始から工程（１）および（２）の開始までの期間、および工程（１）および（２）の培養期間は適宜変更されうる。工程（２）は、工程（１）の終了直後から開始してもよいし、工程（１）の終了から一定期間後に開始してもよい。ＷＮＴシグナル活性化剤およびＷＮＴシグナル阻害剤は、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階および中期段階にそれぞれ添加すればよい。ここで、多能性幹細胞の心筋分化の初期段階とは、中胚葉マーカー遺伝子の発現上昇が起こる、多能性幹細胞から中胚葉への分化誘導期を意味し、中期段階とは、中胚葉から心筋への分化誘導期を意味する。中胚葉マーカー遺伝子としては、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。例えば、サルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合、心筋分化培養の０〜２日目または０〜３日目に、すなわち心筋分化培養開始から２または３日間、工程（１）を実施し、次いで、心筋分化培養の１４日目までのうち２日間以上（具体的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日間）、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、さらにより好ましくは４〜６日間、工程（２）を実施すればよい。ここで、工程（２）は、心筋分化培養の１０日目までのうち４〜６日間、例えば心筋分化培養の３〜９日目、３〜８日目、３〜７日目、４〜１０日目、４〜９日目、または４〜８日目に実施することが好ましい。
【００３８】
ＷＮＴシグナル活性化剤およびＷＮＴシグナル阻害剤の濃度は、特に限定はされない。ＷＮＴシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、最終濃度１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜１０μＭで使用すればよい。ＷＮＴシグナル阻害剤として式（Ｉ）の化合物またはＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、もしくはＩＷＲ１を用いる場合、例えば最終濃度０.５〜２０μＭ、好ましくは１〜１０μＭで使用すればよい。
【００３９】
本発明の方法は、心筋細胞の製造に用いることができる。心筋細胞への分化は、例えば、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。心筋マーカーとしては、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、およびＮＫＸ２．５が挙げられる。また、イオンチャネルとしては、ＨＣＮ４、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ３．２、ＨＥＲＧ１ｂ、およびＫＣＮＱ１が挙げられる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
【００４０】
本発明はまた、１以上のＷＮＴシグナル活性化剤および／または１以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含む心筋分化促進用キットであって、本発明の心筋分化誘導方法に使用されるキットを提供する。
【００４１】
以下、実施例によりさらに本発明を説明する。
【実施例】
【００４２】
１．方法
（１）hESC, hiPSC、およびサルESCの培養
PSC株はいずれも、マイトマイシンC処理マウス胎児線維芽細胞 (MEF)上、Primate ES Cell Culture Medium (ReproCELL Inc., Japan)中で、hPSCについては 5 ng ml-1 bFGFとともに、サルESCについてはbFGFなしで、維持した。ヒトESC株は、KhES-1、KhES-3、H1、およびH9（非特許文献１，４１）を用いた。ヒトiPSC株は、253G1、IMR90-1、IMR90-4（非特許文献４２，４３）、およびRCHIPC0003を用いた。RCHIPC0003は、ReproCELLによりヒト線維芽細胞から樹立された。サルESC株は、CMK6.4（非特許文献１，４４，４５）を用いた。hESC株は、ヒトES細胞の樹立及び使用に関する指針（文部科学省）にしたがい使用した。【００４３】
（２）トランスジェニックサルESC株
ヒトαMHCプロモーターの制御下でEGFPを発現するサルESCを作成するため、転写開始部位の上流からオープンリーディングフレーム直前の第３エキソンまでの918 bpを、KhES-1 hESCのゲノムDNAからPCRにより、プライマーセット（フォワードプライマー, 5’- CCAGGCACCTGCACCCTCTGG-3’; リバースプライマー, 5’- ( SalI リンカーを含む) 22 TAGTCGACCTTGGTGCTTCCCCTGGGTCAGAG-3’）を用いて増幅し、pGEM-T Easy Vector (Promega)にライゲートした。クローニングベクター由来のHindIII/SalI フラグメントをpEGFP-1 (Clontech)に結合した。直鎖化したαMHC-EFGP ベクターを CMK6.4 サルESCにエレクトロポレーションにより導入した。トランスジェニックESCクローンは、G418 (Sigma-Aldrich)により選択的に増殖させた。EGEPの発現は拍動コロニーにおいて確認した。【００４４】
（３）心筋分化促進のための低分子化合物のハイコンテント解析 (HCA)スクリーニング
コンフルエント (継代4-5日後) のαMHC-GFPトランスジェニックサルESCをCTK溶液（非特許文献１）により酵素的に解離させ、ESC塊 (直径40-100 μm) を40μmおよび100 μmのCell Strainer (BD Biosciences)を用いて得た。このESC塊 (約5.0×103 細胞/ウェル) を96ウェルプレート (Greiner Bio-One, 96-well black plate, Cat. No. 655090) に移し、下記（４）の心筋分化培地中でインキュベートした。心筋分化6-14日目に、化合物ライブラリー由来の9600化合物 (DMSOに溶解) を、96ウェルプレートを用いてスクリーニングした。16ウェルを対照 (0.1% DMSO)に、80ウェルを化合物（１ウェルにつき１化合物）に使用した。各化合物の最終濃度は約1-5μMであった。低分子化合物を含む培地は、4日毎に交換した。14日目に、Metamorphイメージングシステム (Molecular Device)を用いたプレート全体のスキャニングにより、ESCのGFP蛍光を測定した。Metamorphソフトウェアを使用してGFP蛍光データを解析し、各ウェルについて、蛍光領域、全蛍光強度、平均蛍光強度、およびGFP陽性コロニーの数を計算した。ヒット化合物は以下の基準により決定した：その化合物のウェルの平均蛍光強度が対照の平均蛍光強度（16ウェルの平均）＋6 SDよりも大きく、その化合物の全蛍光強度が対照の全蛍光強度＋0 SD よりも大きい；または、その化合物の全蛍光強度が対照の全蛍光強度＋4 SD よりも大きく、その化合物の平均蛍光強度が対照の平均蛍光強度＋0 SD よりも大きい。120化合物がこの基準を満たし、各化合物につき8ウェルを用いて再試験した。N11474という分子が、DMSOと比較して有意にESCのGFP蛍光を増加させた (スチューデントt検定t, P=0.015)。【００４５】
（４）血清含有培地における心筋分化
コンフルエントのhESCおよびhiPSCをCTK溶液を用いて穏やかに解離させ、Primate ES Cell Culture Medium (ReproCELL, Japan)を用いてペトリ皿 (BD BioSciences) に移した。細胞を懸濁培養にて8-24時間維持し、凝集させた。hPSC凝集体の大きさ (直径0.3-1 mm) は、効率的な分化に重要である。懸濁培養に続き、細胞凝集体を培養ディッシュに以下の心筋分化培地中で付着させた (3-10×105 細胞/cm2)：IMDM (Sigma) （20% FBS (Gibco)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.005N NaOH、並びに10 ng ml-1 BMP4 (R&D Systems)含有）。3日目（hiPSC株）または4日目（ヒトまたはサルESC株）に、培地を10μM KY02111および/または他のWNT阻害剤を添加した心筋分化培地に交換した：XAV939 (Wako, Japan)、IWP-2 (Santa Cruz Biotechnology)、IWR-1 (Merck4Bioscience)、IGFBP4 (R&D Systems)、Dkk1 (R&D Systems)、並びに、bFGF (R&D Systems)、BMP4 (R&D Systems)、VEGF (R&D Systems)、DKK1 (R&D Systems)、およびActivin A (R&D Systems)の混合物（非特許文献１６）。培地は2-3日毎に交換した。KY02111および他のWNT阻害剤は、hiPSC株およびサルESC株については9日目まで、hESC株については14日目まで添加した。15日目に、培養ディッシュ上の心筋細胞コロニーを、プロテアーゼ溶液 (0.1% コラゲナーゼタイプI、0.25% トリプシン、1 U ml-1 DNase I、116 mM NaCl、20 mM HEPES、12.5 mM NaH2PO4、5.6 mM グルコース、5.4 mM KCl、および0.8 mM MgSO4、pH 7.35)とともに0.5-2時間インキュベートし、ウェルの底から全ての心筋コロニーを解離させた。解離した心筋コロニーを新しい心筋分化培地を含む15 mlチューブに移し、重力により沈澱させ、上清を吸引により除去した。次いで、心筋コロニーを、超低接着培養ディッシュ (Corning, 3261) または6ウェルプレート (Corning, YO-01835-24) に、血清およびNaOHをいずれも含まない心筋分化培地中にて移した。この浮遊心筋コロニーを1ヵ月以上維持し、培地を5日毎に交換した。マウスESC (R1株)の分化方法は既報のとおり実施し（非特許文献４６）、KY02111は3-6日目に添加した。拍動コロニーは9日目に計測した。【００４６】
（５）血清不含既知組成培地における心筋分化
上記のペトリ皿での前培養後、細胞凝集体を、ゼラチン (Sigma G2625) またはヒトラミニン211 (BioLamina, Sweden) をコートした培養ディッシュに、以下の血清不含心筋分化培地中、3-10 x 105 細胞/cm2で付着させた：IMDM (Sigma)（1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および1-2% ウシ血清アルブミン (Wako, Japan)、または0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)、並びに5μM CHIR99021 (Axon)および2μM BIO (Calbiochem)を含有））。3-9日目に、10μM KY02111および／または他のWNT阻害剤 (XAV939および／またはIWP-2)を細胞培養に添加し、培地を2日毎に交換した。15日目に、心筋コロニーをプロテアーゼ溶液と5-10分間インキュベートし、全てのコロニーをウェルの底から解離させた。この心筋コロニーを、0.1% アルブミンを含む心筋分化培地ともに15 mlチューブに移し、重力により沈澱させ、上清を回収し、心筋コロニーを超低接着培養6ウェルプレート(Corning, YO-01835-24) に0.1% アルブミンを含む心筋分化培地ともに移した。この浮遊心筋コロニーを1ヵ月以上維持し、培地を5日毎に交換した。【００４７】
（６）免疫染色およびフローサイトメトリー
心筋コロニーを、前述のプロテアーゼ溶液とともに1-2時間37℃で撹拌することにより解離させ、ゼラチン (Sigma)でコートしたカバーガラス上で1日培養し、4% パラホルムアルデヒドで固定した。Triton Xで透過処理後、細胞を2% スキムミルクで1-2時間処理し、以下の一次抗体と2時間インキュベートした: NKX2.5 (ウサギポリクローナル, 1:250; Abcam)、αアクチニン (マウスモノクローナル, 1:800;Sigma)、心筋TnT (マウスモノクローナル, 1:100; Santa Cruz Biotechnology)、ビメンチン (マウスモノクローナル, 1:800; Sigma V6630)、およびHCN4 (マウスモノクローナル, 1:400; Abcam)。使用した二次抗体は、Alexa546結合抗マウスIgG、Alexa488結合抗マウスIgG、およびAlexa488結合抗ウサギIgG (1:1000; いずれもMolecular Probes, Invitrogenより入手)。核はDAPIにより可視化した。画像は蛍光顕微鏡 (Olympus)下に取得した。cTnT、αアクチニン、NKX2.5、HCN4、およびビメンチン陽性細胞の数を3つのランダムな領域から、Metamorphイメージングシステム (Molecular Devices)を用いて計測した。約1000個のDAPI染色細胞を用いて免疫陽性細胞の割合を計算した (免疫陽性細胞数／DAPI染色細胞数)。フローサイトメトリーのため、hPSC由来心筋コロニーからの単一細胞を抗cTnT抗体により染色し、Alexa488結合抗マウスIgG二次抗体により染色した。細胞は、FACS CantoII フローサイトメーター (BD Biosciences)を用いて解析した。データは、FACADiva ソフトウェア (BD Biosciences)を使用して解析した。【００４８】
（７）マイクロアレイ実験
IMR90-1 iPSCを血清含有心筋分化培地中で培養した。3日目に、細胞を10μM KY02111または0.1% DMSOにて0、12、または24時間処理した。非処理細胞(0 h)、KY02111で12時間または24時間処理した細胞 (KY12hrまたはKY24hr)、0.1% DMSOで12時間または24時間処理した細胞 (DMSO12hrまたはDMSO24hr)をマイクロアレイ解析に使用した。全RNAをRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて製造元の説明にしたがい調製した。cDNAの合成、インビトロ転写、およびビオチンラベル化cRNA、およびHuman Gene 1.0 ST アレイ (Affymetrix)へのハイブリダイゼーションは、Affymetrixのプロトコールにしたがい実施した。ハイブリダイズ後のアレイは、Affymetrix GeneChip Scannerを用いてスキャンした。データの正規化および更なる解析は、GeneSpring GX (Agilent Technologies)を用いて行った。遺伝子を発現する処理細胞の対照に対する割合 (KY02111/DMSO)を、各時点で計算した。KY02111の処理後12時間および24時間の両方の時点でKY/DMSO比において25%を超える変化を示す遺伝子を、KY02111に応答してダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされる遺伝子として同定した(ダウンレギュレーションされる遺伝子＝KY12h/DMSO12h <0.75 およびKY24h/DMSO24h <0.75; アップレギュレーションされる遺伝子＝KY12h/DMSO12h >1.25およびKY24h/DMSO24h >1.25)。マイクロアレイデータは、NCBIのGene Expression Omnibus (GEO) パブリックデータベースへ提出した (GEO accession number, GSE33622)。DiRE（Distant Regulating Elements of co-regulated genes）解析のため、全ての遺伝子またはダウンレギュレーションされた上位10遺伝子 (KY12h/DMSO12h比に基づく)を、ウェブのプログラム (http://dire.dcode.org/)（非特許文献３５）用いて解析した。【００４９】
（８）qRT-PCR
全RNAをRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。ゲノムDNAは、DNase I (Invitrogen)を用いて完全に消化した。全RNA (0.5μg)を、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いたcDNA合成に使用した。qRT-PCRは、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)にてSYBER GREEN PCR Master Mixを用いてトリプリケートで実施した。サイクル条件は以下のとおりである：95℃10分; 95℃15秒40サイクル; 60℃1分。ヒト成人心臓組織由来の全RNA (BioChain) を用いて、hPSC由来の心筋細胞の心筋マーカー遺伝子の発現レベルを評価した。全ての値をGAPDH発現レベルに対してノーマライズし、ヒト成人心臓における対応する値 (100%)と比較して表した。プライマーセットは表１に示す。【００５０】
（９）TOPFlashアッセイ
TCFレポーターアッセイのため、IMR90-1 hiPSCを前述のとおり血清含有分化培養にて培養し、2日目に、TOPflashプラスミド(Millipore 21-170)およびpRL-SV40プラスミド (ウミシイタケルシフェラーゼトランスフェクションコントロール, Promega E1980) をFuGENE HD transfection Reagenet (Promega E2311)を用いてトランスフェクトした。24時間後、10μM KY02111、10μM XAV939、または10μM IWP-2を、60 ng ml-1 マウスWnt3a (Wako 232-02421)または3μM BIOのいずれかとともに、培地に添加した。トランスフェクションの48時間後 (4日目）、ルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase Reporter 1000 Assay System キット (Promega E1980)および2030 ARVO X3 プレートリーダー (PerkinElmer)を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性は、キットのプロトコールにしたがい、トランスフェクションコントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光に対してノーマライズした。HEK293細胞を用いた実験では、細胞を10% FBS DMEM培地中で培養し、FuGENE HDを用いてTOPflashおよびpRL-SV40プラスミドをトランスフェクトした。24時間後、トランスフェクトした細胞を、10μM KY02111、10μM XAV939、または10μM IWP-2を、3μM BIOまたは60 ng ml-1 マウスWnt3aとともに含む培地中、96ウェルプレートに播種した (10,000 細胞/ウェル)。ルシフェラーゼ活性は、前述の方法によりトランスフェクションの48時間後に測定した。【００５１】
（１０）パッチクランプ法
拍動hPSC由来心筋細胞より、プロテアーゼ溶液を用いて細胞を単離した。解離した細胞を、ゼラチンをコートしたカバーガラス上で3-7日間培養した。パッチクランプ法は、約25℃の恒温室にて実施した。自発的拍動コロニーから、ホールセルパッチクランプの構成から得られるデータをHEKA EPC10 増幅器 (HEKA Instruments Inc.)を用いて記録した。外部溶液（140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、および10 mMグルコースを含有）は、NaOHによりpH 7.2 に調節した。ピペット溶液（80mM アスパラギン酸カリウム、50 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM EGTA、3 mM ATP-Mg、および10 mM HEPES）は、KOHによりpH 7.2 に調節した。一部の実験では、細胞を、0.1μM E4031、4μM クロマノール 293B、4μM ザテブラジン、1μM テトロドトキシン (TTX)、または4μM ニフェジピンで5分間処理した。これら阻害剤は、Sigma-Aldrichから入手した。E4031およびTTXの1 mM ストック溶液は、H2Oにより調製した。クロマノール 293B、ザテブラジン塩酸塩、およびニフェジピンの20 mM ストック溶液は、DMSOにより調製した。ストック溶液は全て、使用まで-20℃で保存した。電流電圧曲線は、膜電位を-40 mVから-60 mVに維持し、脱分極パルスを500ミリ秒間、INaについては-60 mVから60 mVまで、ICaL については-40 mVから40 mVまで、IKsおよびIKrについては-40 mVから40 mVまで、およびIhについては-50 mVから-140 mV まで、段階的に送達することで取得した。【００５２】
（１１）QT間隔延長アッセイ
微小電極アレイ (MEA)ディッシュ (Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany)を、ReproCoat (RCESD006, ReproCELL, Japan)により、5% CO2下にて37℃で1時間コーティングした。コーティング後、30日目のKY02111誘導心筋細胞を、前記MAEディッシュ上の1 mlのCardiomyocyte Culture Medium (RCESD006, ReproCELL, Japan)に移した。ピペットチップまたはガラス棒を用いて、心筋細胞を穏やかに電極上へ移動させ、一晩培養してMEAディッシュに付着させた。翌日、培地をCardiomyocyte Test Medium (RCESD003, ReproCELL, Japan)に交換した。拍動コロニーの存在を確認した後、MEAディッシュをMEA 増幅器 (Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany)に接続し、心電図(ECG)様波を記録した。記録の2分後、300 pM アステミゾール (Sigma) または0.1% DMSO を添加し、アステミゾールの濃度(300 pM-30μM)を4分毎に増加させた。各アステミゾール処理の2分後にECG様波を記録した。拍動率、Na+振幅、K+振幅、およびNa+-K+間隔は、LabChart TM ソフトウェア v7 (ADInstruments, Adelaide, Australia)により解析した。【００５３】
（１２）統計学的解析
結果はいずれも平均±SEMで表した。独立両側スチューデントt検定（Unpaired two-tailed student t-test）を用いて、異なる処理からの測定値の平均値を比較した。P <0.05のときに有意差ありと判断した。【００５４】
（１３）化学合成
KY02111、KY01041、KY02114、KY01045、KY01040、KY02109、KY01042、KY01043、KY01046、およびKY02104は、「３．製造例」に記載のとおり合成した。PB2852、PB2572、およびPB2570: PB285238764、PB257239592、およびPB257074412はUkrOrgSynthesisから購入した。T61164: T6116478はENAMINEから購入した。【００５５】
２．結果
（１）KY02111の発見および特性決定
hPSCからの心筋分化を効率的に促進する低分子化合物を同定するため、ヒトαMHCプロモーターの制御下でEGFPを発現するサルES細胞（ESC）を用いるハイコンテント解析（HCA）システムを構築した（図１ａ）。増強されたGFPシグナルの化学スクリーニングは「（１）方法」に説明のとおりである。このシステムにより、GFP強度および蛍光領域を含むHCAパラメータの値を対照と比較して有意に増強する分子として、N11474が同定された (スチューデントt検定, P=0.015)。【００５６】
上記化学スクリーニングでは、サルESCに低分子化合物を8日間（6-14日目に）処理した。N11474が効率的に分化を促進する期間を決定するため、複数のパターンの処理を行い、14日目にαMHCプロモーターの制御下で発現するEGFPの全シグナル強度を観察した（図１ｂ）。6-10日目におけるN11474処理は、前述のスクリーニングプロトコールと同様に有効であり、8日目以降（8-12日目または10-14日目）の処理は効果が低かった。4-8日目の処理によりGFP発現の増加が最大となり、0-4日目の処理ではGFP発現は完全に抑制された。これらの結果は、N11474がサルESCにおける心筋分化の初期段階（0-4日目）においては阻害剤として作用し、中期段階（4-8日目）においては促進剤として作用することを示唆する。【００５７】
次に、N11474のアナログを化学合成し、それらのサルESCの心筋分化促進能を評価した。構造活性相関研究により、ベンゾチアゾール環のメトキシ基の電子求引基との置換、およびメチレンリンカーの長さの調節により生物活性が大幅に改善することが明らかとなり、その結果、新規分子であるKY02111が得られた（図１ｃ、ｄ；図５ａ−ｃ）。この低分子化合物は、対照（DMSO）よりも約73倍、N11474よりも7.4倍、効率的に心筋分化を促進した（図１ｄ）。【００５８】
KY02111の活性の一般性を、様々な霊長類および齧歯類のPSCを用いて検討した。KY02111は、心筋拍動コロニーの比率を、２種類のヒトESC株（KhES-1およびKhES-3）、４種類のヒトiPSC株（253G1、IMR90-1、IMR90-4、およびRCHIPC0003）、および１種類のマウスESC株（R1）の細胞凝集塊において60-94％増加させた（図１ｅ）。hiPSCs（IMR90-1）を用いた経時的実験により、拍動コロニーは10日目に出現し、25日目まで数が増加した（図６）。拍動コロニーを継代培養すると、その後の拍動コロニーの割合は90%まで増加したが（図６）、これは機械的阻害が減少したことによると考えられる（非特許文献３３）。心筋コロニーは少なくとも50日目まで拍動し続けた（図６）。【００５９】
（２）KY02111により産生される心筋細胞の特性
免疫細胞化学により、KY02111により処理したhiPSC（IMR90-1）では約73-85%が心筋マーカーである心筋トロポニンT（cTnT）、α-アクチン、またはNKX2.5を発現するが、これらマーカーが陽性であるDMSO処理細胞は少数であることが示された（図２ａ、ｂ）。心臓ペースメーカーマーカーであるHCN4は16%のKY02111処理細胞において発現しており、ビメンチン陽性細胞（線維芽細胞）の比率は3.3倍減少した（図２ｂ）。平滑筋マーカーであるSMA（Smooth Muscle Actin）はKY02111処理細胞ではほとんど検出されなかった（データ非提示）。これらの結果から、hPSC由来心筋細胞は、細胞ソーティングの操作を行うことなく、単にKY02111誘導細胞コロニーを回収することによって濃縮できることが示唆される。15日目および30日目のリアルタイムPCR解析により、KY02111誘導心筋細胞（KY-CM）は、心筋マーカーであるαMHC、NKH2.5、およびHCN4を発現すること、検討したイオンチャネル遺伝子はいずれも成人心臓組織と同様のレベルで発現していることが示された（図２ｃ）。【００６０】
ホールセルパッチクランプ法による電気生理学的解析を用いて、KY-CMが機能的細胞であるかを検討した。活動電位特性から、KY-CM集団は心室細胞およびペースメーカー細胞を含むことが示唆された（図２ｄ）。電位依存性Ca2+チャネル、Na+チャネル、およびHCNチャネル電流の特性を、イオンチャネルブロッカーであるニフェジピン、リドカイン、およびザテブラジンをそれぞれ用いて検討した（図７ａ−ｃ）。電流密度と電圧の関係から、KY-CMは電気生理学的に機能的な細胞であることが示された。KY-CMをHERGチャネルブロッカーであるE4031およびKCNQ1チャネルブロッカーであるクロマノール293Bで処理すると、心電図 (ECG)により検出されるQT延長に相当する活動電位持続時間 (APD)が増加した（図２ｅ）。APD90 (90％再分極時のAPD)の持続時間の増加は、E4031処理について37.0% ± 11.2、クロマノール293B処理について42.1% ± 8.8であった（図２ｅ、図７ｅ）。さらに、電位依存性K+電流は、E4031およびクロマノール293Bの処理により抑制された （図７ｄ、ｅ）。これらの結果は、KY-CMが機能的HERGチャネルおよびKCNQ1チャネルを発現していることを示す。微小電極アレイを用いて実施した薬剤誘発QT延長試験により、ECG様波がKY-CMコロニーから放出されることが示された （図８ａ、ｂ）。臨床でQT延長をもたらすアステミゾール（非特許文献３４）による処理により、ECG様波のNa+-K+間隔は用量依存的に延長された（図８ｃ）。全体として、これらの結果は、KY-CMが電気的および薬理学的に機能的であることを示す。【００６１】
（３）KY02111による古典的（canonical）WNTシグナル経路の阻害
KY02111が如何にしてhPSCの心筋分化を促進するのかを調べるため、KY02111処理したhiPSC (IMR90-1)の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ技術を用いて解析した。KY02111またはDMSOを心筋分化培養3日目（IMR90-1細胞にとって最適な開始点）に添加し、12および24時間後に細胞集団を回収した。KY02111処理後、12時間および24時間の両方で、22種類のダウンレギュレーションされる遺伝子および4種類のアップレギュレーションされる遺伝子が同定された（図３ａ、表２）。マイクロアレイ解析では少数の遺伝子しか抽出されなかった（細胞集団が高度に不均質のためと考えられる）が、マイクロアレイデータをqPCRにより確認した（図９ａ）。ダウンレギュレーションされた22遺伝子について、遠位の調節要素を予測可能なDiRE（非特許文献３５）を用いて共通の転写因子結合部位を調べると、TCF4が共通の転写因子として予測された（図９ｂ）。処理細胞において最もダウンレギュレーションされた上位10遺伝子を調べると、LEF1およびTCF4 が共通の転写因子として予測された（図９ｃ）。ダウンレギュレーションされた22遺伝子のうち16遺伝子 (70%) は、古典的WNTシグナル経路の標的遺伝子として知られていた（表２）。さらに、WNT標的遺伝子に対するKY02111の効果は、XAV939およびIWP-2などの他のWNT阻害剤の効果と非常に類似していたが、WNT活性化剤であるBIOの効果とは類似していなかった（図９ｄ）。これらの結果は、KY02111がhPSCにおける古典的WNTシグナル経路を阻害することを示唆する。【００６２】
古典的WNTシグナル経路の活性測定に一般的に用いられるレポーターシステムであるTOPflashアッセイを用いて、KY02111が新規なWNTシグナル阻害剤であるかを確認した。IMR90-1細胞にTOPflashおよびpRL-SV40をトランスフェクトし、次いでKY02111または他のWNT阻害剤とともにWnt3aまたはBIOで処理した。KY02111または既知のWNT阻害剤であるXAV939の処理により、明らかにルシフェラーゼ活性が減少した（図９ｅ）。Wnt3aまたはBIOを用いたTOPflashの結果から、KY02111は古典的WNTシグナル経路の阻害剤であることが示唆された。興味深いことに、HEK293細胞を用いたWnt3aの存在下におけるTOPflashアッセイではKY02111がルシフェラーゼ活性を増強することが示されたが、Wnt3aに代えてBIOを使用したアッセイではKY02111がBIOによるWNT活性化を相殺することが示された（図９ｆ）。この活性は細胞株に依存する可能性はあるものの、KY02111は確かにhPSCにおけるWNTシグナル経路に対する阻害効果を有する。【００６３】
（４）WNT阻害剤とKY02111の相乗効果
次に、KY02111、数種の化学性またはタンパク性WNT阻害剤（IWP-2、IWR-1、XAV939、DKK1、およびIGFBP4（非特許文献３６））、および数種のサイトカインの組合せによるトランスジェニックサルESCにおける心筋分化の促進を比較した。予想どおり、これらはいずれもαMHCプロモーターにより誘導されるGFPシグナル強度を増強したが、KY02111が最も効果的であり、また、他の化学性WNT阻害剤はタンパク性阻害剤やサイトカインよりも効果が高かった（図３ｃ、ｄ）。KY02111の処理により、対照と比較して約80倍分化が増加した。KY02111の処理は、hiPSCの心筋分化の促進においても最も効果的であった（図３ｄ）。得られた分化細胞の全細胞数はWNT阻害剤の間で類似していたが（図１０ａ）、拍動コロニーの割合は相違しており、KY02111、IWP-2、およびXAV939のそれぞれについて87、37、および7.5%であった（図３ｄ）。
cTnT陽性細胞の割合は拍動コロニーの割合と同様の傾向を示した（図１０ｂ）。【００６４】
BIOをIWP-2またはXAV939とともに添加すると、サルESCおよびhiPSCの心筋分化は完全に阻害されたが、KY02111により促進される心筋分化はBIOによる影響を受けなかった（図３ｃ、ｄ）。これらの結果は、KY02111によるWNT阻害のメカニズムが、O-アシルトランスフェラーゼであるPORCNやポリADP-リボースポリメラーゼであるTNKSを阻害するIWP-2やXAV939（非特許文献２２、３１）とは異なることを示唆する。KY02111は、古典的WNTシグナル経路においてGSK3βの下流で作用する可能性がある。【００６５】
WNT阻害剤の間で標的が異なることから、WNT阻害剤を組み合わせて使用することで多能性幹細胞の心筋細胞への分化が増加するかについて調べた。KY02111単独で、IMR90-1 iPSCから約80％のcTnT陽性細胞が産生された。KY02111を他のWNT阻害剤と併用しても、分化効率は有意に増加しなかった（図１０ｂ）。しかしながら、WNT阻害剤の組合せの処理により、KY02111単独の処理と比較して、全細胞数および拍動コロニー数が有意に増強された（図３ｅ、図１０ａ）。産生された心筋細胞数は、対照と比較して、KY02111処理において80倍、組合せ処理（KY+XAV、KY+IWP、およびKY+XAV+IWP）において130-220倍、高かった（図３ｅ）。【００６６】
（５）既知組成のサイトカインおよび異種成分不含心筋分化
血清不含培地における分化効率を調べると、ゼラチンまたはヒトラミニン211によるコーティングと、0.4% ヒト血清アルブミンまたは1-2% ウシ血清アルブミンの添加という、2つの要件が明らかとなった。非接着細胞はほとんど心筋細胞へ分化せず、アルブミンを含まない血清不含培地では細胞死が起こった（データ非提示）。【００６７】
WNTシグナル経路の活性化は、hPSCにおける心筋分化の初期段階で必要とされる。それゆえ、WNT活性化剤であるBIOおよびCHIR99021の効果を分化の初期段階において、サイトカインであるBMP4の非存在下、検討した（図４ａ）。BIOおよびCHIR99021による0-3日目の処理、およびそれに続くKY02111単独またはKY02111およびXAV939 (KY+XAV)の処理は、血清含有培地および血清不含アルブミン含有培地のいずれにおいても、IMR90-1 hiPSCの84-98％の分化をもたらした（図４ｂ、ｃ）。これらの結果は、心筋分化の誘導に外因性BMP4と血清は必須ではなく、低分子化合物によるWNTシグナル経路の活性化と内因性シグナル伝達因子で十分であることを示唆する。【００６８】
KY+XAVの処理では、KY02111の処理による分化効率と有意に異なる分化効率は得られなかった（図４ｂ）。しかしながら、FACS解析によれば、サイトカイン不含および血清不含条件下においては、KY+XAVの処理による効率（98.1％）はKY02111単独の処理による効率（90.2%）よりも幾分か高かった（図４ｄ）。さらに、免疫染色解析により、KY+XAVの処理によるcTnT陽性細胞の割合（97.7% ± 0.8）はKY02111単独の処理による割合（93.3% ± 4.4）よりも高いことが示された（図４ｂ、ｃ）。それゆえ、KYとXAVの併用は、hPSCの高効率な心筋分化をもたらすと考えられる。【００６９】
KY02111と血清の処理による分化効率（83.7% ± 8.0）は、KY02111とアルブミンの処理による分化効率（93.3% ± 4.4）よりも低かった（図４ｂ）。拍動コロニー数および心筋細胞数は、血清存在下のKY02111処理よりも、血清非存在下のKY02111処理の方が約3倍高かった（図４ｅ）。同様に、血清存在下のKY+XAVの処理により、拍動コロニー数および心筋細胞数は血清非存在下の処理の約1.5倍増強された（図４ｅ）。これらの結果は、FBSが心筋誘導および／または心筋前駆細胞の増殖を阻害する因子を含む可能性があることを示唆する。【００７０】
さらなる実験により、他のhPSC (KhES-3、H1、H9、および253G1)が、既知組成のサイトカインおよび異種成分不含培地において、KY02111、BIO、CHIR99021、およびXAV939により効率的に心筋細胞へ分化することが確認された。IMR90-1 hiPSCにおいて観察されたように、試験した全ての細胞株において、これらの処理により拍動コロニーおよびcTnT陽性細胞の割合が増加した（図１１ａ、ｂ）。さらに、cTnTおよびα-アクチニンの免疫染色により、IMR90-1 hiPSC由来の心筋細胞においてサルコメア構造がはっきりと示された（図１１ｃ）。全体として、これらの結果は、WNTシグナル経路を調節する低分子化合物と既知組成培地とを用いるKY02111による分化方法により、hPSC由来の機能的な心筋細胞が高い割合で効率的に産生されることを示す。【００７１】
【表１】
2013111875.tif 000022
【表２−１】
2013111875.tif 000023
【表２−２】
2013111875.tif 000024
【００７２】
３．製造例
ＫＹ０１０４１
３，４−ジメトキシベンゾイルイルクロリド（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（８３，０μｌ．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５００μｌ）に溶かし、２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を加え一時間、室温にて撹拌した。反応終了後、塩化メチレンに希釈し、飽和食塩水にて洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加え、７０度に加熱し、溶解させた後に室温に戻すことで再結晶を行い、２−（３，４−ジメトキシベンズアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１３０ｍｇ、収率６８％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 7.83 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.63-7.45 (m, 3H), 7.36 (dd, J= 1.8, 8.7 Hz, 1H), 6.91 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 349 [M+H]+【００７３】
ＫＹ０２１１１
３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパノイルクロリド（１００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（７８ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１１３ｍｇ、収率７２％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.41(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.37 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.67 (m, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.03 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.77 (t, J= 9.9 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 399 [M+H]+【００７４】
ＫＹ０２１１４
４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイルクロリド（１００ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（７６ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１２１ｍｇ、収率７５％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.15(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J= 11.3 Hz, 1H), 7.39 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.68 (m, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.67 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.48 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.09 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 413 [M+H]+【００７５】
ＫＹ０１０４５
５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタノイルクロリド（３０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（２３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタンアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを３９ｍｇ、収率７５％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.91 (s, 1H), 7.79 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.49 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 6.79 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.71 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.70 (s, 1H), 3.87(s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.62 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.52 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.72 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 405 [M+H]+【００７６】
ＫＹ０１０４０
３，４−ジメトキシベンゾイルイルクロリド（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（３，４−ジメトキシベンズアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを１００ｍｇ、収率５６％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 8.80 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.63-7.47 (m, 2H), 6.95 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 360 [M+H]+【００７７】
ＫＹ０２１０９
２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセチルクロリド（１００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（９４ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセトアミド）−６−クロロベンゾチアゾールを１５３ｍｇ、収率８３％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.91(s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.31 (dd, J= 12.1 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.00-6.70 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 396 [M+H]+【００７８】
ＫＹ０１０４２
３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパノイルクロリド（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（１０５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを１３８ｍｇ、収率７１％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.29(s, 1H), 8.75 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.06 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.83 (t, J= 7.3 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 388 [M+H]+【００７９】
ＫＹ０１０４３
４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイルクロリド（５５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（５０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを６５ｍｇ、収率６６％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.29 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.66 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.54 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.11 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 402 [M+H]+【００８０】
ＫＹ０１０４６
５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタノイルクロリド（３０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール（２５ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（５−（３，４−ジメトキシフェニル）ペンタンアミド）−６−ニトロベンゾチアゾールを３８ｍｇ、収率７０％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.94 (s, 1H), 8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.32 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.72 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.71 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.63 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.56 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.73 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 416 [M+H]+【００８１】
ＫＹ０２１０４
２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセチルクロリド（１００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）と２−アミノ−６−フルオロベンゾチアゾール（８６ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を基質に用いて上記と同様に反応を行い、２−（２−（３，４−ジメトキシフェニル）アセトアミド）−６−フルオロベンゾチアゾールを１５７ｍｇ、収率８９％で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.14(s, 1H), 7.64 (dd, J= 6.2, 12.1 Hz, 1H), 7.50 (dd, J= 3.6, 11.0 Hz, 1H), 7.14 (ddt, J= 3.7, 12.1 Hz, 1H), 6.90-6.78 (m, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.80 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 369 [M+H]+【００８２】
ＳＯ０８７
２−アミノ−６−ブロモベンゾチアゾール（５００ｍｇ，２．１８ｍｍｏｌ）、３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（５０５ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１．０９ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（４１９μｌ，２．４１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）−６−ブロモベンゾチアゾールを３２０ｍｇ、収率３５％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.45 (s, 1H), 8.25 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 1.8, 8.4 Hz, 1H), 6.87-6.83 (m, 2H), 6.77-6.73 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.88 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.0 Hz, 2H)【００８３】
ＳＯ１０２
２−アミノ−６−クロロベンゾチアゾール（５５ｍｇ，０．２９８ｍｍｏｌ）および３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（８０ｍｇ，０．３５７ｍｍｏｌ）を基質に用いてＳＯ０８７と同様に反応を行い，Ｎ−（６−クロロベンゾチアゾール−２−イル）−３−（４−エトキシ−３−メトキシフェニル）プロパンアミドを４０ｍｇ、収率３４％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.44 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 2.2, 8.8 Hz, 1H), 6.90-6.82 (m, 2H), 6.72 (dd, J = 1.8, 7.0 Hz), 3.94 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.82-2.75 (m, 2H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H)【００８４】
ＳＯ０９４
２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４００ｍｇ，２．４１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（７ｍｌ）溶液をアルゴン雰囲気下、氷冷攪拌中、水素化ナトリウム（６０％）（１０６ｍｇ，２．６５ｍｍｏｌ）を加えて３０分攪拌後、４−ブロモ酪酸エチル（５２１μｌ，３．６２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去し、エチル  ４−（（２−アミノベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエートを３７２ｍｇ、収率５５％で得た。【００８５】
エチル  ４−（（２−アミノベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエート（３７２ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）、３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸（３３５ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（６５９ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（２７８μｌ，１．５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、エチル  ４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエートを４４７ｍｇ、収率７６％で得た。【００８６】
エチル  ４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタノエート（４４７ｍｇ，０．９４６ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液に、５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（３７８μｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を濃縮し、氷冷下、６Ｎ  塩酸にて中和した。析出物を吸引ろ取し、水洗し，４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタン酸を２７１ｍｇ，収率６４％で得た。【００８７】
４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタン酸（１００ｍｇ，０．２２５ｍｍｏｌ）およびモルホリン（２２μｌ，０．２４８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３８ｍｇ，０．２４８ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５２ｍｇ，０．２７０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて２日間攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（６−（４−モルホリノ−４−オキソブトキシ）ベンゾチアゾール−２−イル）プロパンアミドを５０ｍｇ、収率４３％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.83 (m, 2H), 6.75 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.56-3.53 (m, 4H), 3.46-3.42 (m, 4H), 2.87 (t, J = 7.0 Hz), 2H), 2.75 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.51-2.46 (m, 2H), 1.96 (t, J = 7.0 Hz, 2H)【００８８】
ＳＯ０９６
４−（（２−（３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパンアミド）ベンゾチアゾール−６−イル）オキシ）ブタン酸（８０ｍｇ，０．１８０ｍｍｏｌ）および１−メチルピペラジン（２１．８μｌ，０．１９８ｍｍｏｌ）を基質に用いてＳＯ０９４と同様に反応を行い、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（６−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−４−オキソブトキシ）ベンゾチアゾール−２−イル）プロパンアミドを３９ｍｇ、収率４１％で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (br s, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.6Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.82 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 1H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.45-3.41 (m, 4H), 2.86 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.50-2.45 (m, 2H), 2.29-2.20 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 1,94 (t, J = 7.0 Hz, 2H)【００８９】
先行技術文献
非特許文献
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（上記文献はいずれも引用により本明細書に含まれる。）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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