(57)【要約】  測定対象物質との接触により赤色蛍光を発する蛍光プローブとして有用な式(I)〔R1は水素原子又は置換基を示し；R2、R3、R6、及びR7は水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、又は親水性置換基を示し；R4及びR5はアルキル基又はアリール基を示し；R8及びR9は測定対象物質との接触により切断される基を示し；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）で表される化合物又はその塩。2013122189.tif 000020
2013122189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
2013122189.tif 000019
〔式中、R1は水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し；R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は一価の親水性置換基を示し；R4及びR5はそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R6及びR7はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は一価の親水性置換基を示し；R8及びR9は水素原子又はそれぞれ独立に測定対象物質との接触により切断される同一又は異なる一価の基を示すが、R8及びR9が同時に水素原子であることはなく；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
R1が水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の一価の置換基(該置換基は炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R2及びR3がそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は1個若しくは2個のカルボキシアルキル基(該カルボキシル基はエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を部分構造として有する一価の親水性置換基を示し、R4及びR5がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基を示し、R6及びR7がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し、R8及びR9が水素原子又は同一の測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し（ただし、R8及びR9が同時に水素原子であることはない）、Xが珪素原子を示す請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
R1が水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の一価の置換基(該置換基は炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R2及びR3がそれぞれ独立に水素原子であるか、又は2個のカルボキシメチル基(該カルボキシル基はエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を部分構造として1若しくは2個有する一価の親水性置換基を示し、R4及びR5がそれぞれ独立に炭素数1〜3個のアルキル基を示し、R6及びR7が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又はフッ素原子であり、R8及びR9が水素原子又は同一の還元酵素、酸化酵素、又は加水分解酵素により切断される一価の基を示し（ただし、R8及びR9が同時に水素原子であることはない）、Xが珪素原子を示す請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
R1が水素原子を示し、R2及びR3がそれぞれ独立に水素原子であるか、又は2個のカルボキシメチル基(該カルボキシル基はアセトキシメチルエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を部分構造として1若しくは2個有するアルキル基(該アルキル基はオキソ基を有していてもよく、アミド結合を含んでいてもよい)を示し、R4及びR5がそれぞれ独立に炭素数1〜3個のアルキル基を示し、R6及びR7が共に水素原子であるか、又は共に塩素原子であり、R8及びR9がβ-ラクタマーゼ、チトクロームP450酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる酵素により切断される一価の基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項６】
測定対象物質の測定方法であって、請求項１に記載の一般式(I)(式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、及びXは上記と同義である)で表される化合物又はその塩を測定対象物質と接触させた後に蛍光を測定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な赤色蛍光団を有する蛍光プローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フルオレセインは1871年に報告された分子であり、高い水溶性、高い蛍光量子収率を有することからpH指示薬やラベル化色素として広く用いられてきた。また、フルオレセインを母核としたカルシウムプローブが開発されて以来、分子内光誘起電子移動(photoinduced electron transfer: PET)、スピロ環の開環や閉環などを利用した高感度な蛍光off/on型プローブが数多く提供されてきた。しかしながら、分子イメージングにおいてフルオレセインを母核とした色素同士は波長が重なるために同時に使用することができず、さらに分子内光誘起電子移動を利用したプローブではベンゼン環の酸化電位を精密に設計することが求められることから化学構造修飾に大きな制約を受けるという問題がある。【０００３】
一方、ローダミンの基本骨格であるパイロニンY(PY)の酸素原子を珪素原子に置換した化合物(TMDHS)及びこの化合物の蛍光プローブへの応用についての報告がある(Best, Qら、Pacifichem 2010, 演題番号2335、2010年12月19日；小出裕一郎ら、第4回日本分子イメージング学会, 演題番号P8-9, 2009年5月14日)。また、最近になってフルオレセインのキサンテン環の10位の酸素原子の構造修飾を行うことにより赤色蛍光プローブの母核として利用可能な化合物が報告されている(Chemical Communications, 47, pp.4162-4164, 2011)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Best, Qら、Pacifichem 2010, 演題番号2335、2010年12月19日
【非特許文献２】小出裕一郎ら、第4回日本分子イメージング学会, 演題番号P8-9, 2009年5月14日
【非特許文献３】Chemical Communications, 47, pp.4162-4164, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は新規な赤色蛍光団を有する蛍光プローブを提供することにある。
より具体的には、フルオレセイン骨格を化学修飾することにより、測定対象物質との接触により赤色蛍光を発する蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
フルオレセインのキサンテン環の9位は高い求電子性を持つためベンゼン環2'位のカルボキシ基によって求核攻撃を受けて互変異性体であるスピロラクトン環を有する化合物となることが知られており、開環状態では強い緑色蛍光を発するフルオレセインはスピロラクトン環を有する互変異性体となると実質的に無吸収かつ無蛍光に変化する。本発明者らはフルオレセインのキサンテン環の10位の酸素原子を珪素原子やゲルマニウム原子に変換した化合物において上記の性質を利用することにより、測定対象物質との接触により赤色蛍光を発する蛍光プローブを提供すべく鋭意研究を行った。その結果、下記の一般式(I)で表される化合物が赤色蛍光プローブとして極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
【化１】
2013122189.tif 000003
〔式中、R1は水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し；R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は一価の親水性置換基を示し；R4及びR5はそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R6及びR7はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は一価の親水性置換基を示し；R8及びR9は水素原子又はそれぞれ独立に測定対象物質との接触により切断される同一又は異なる一価の基を示すが、R8及びR9が同時に水素原子であることはなく；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）で表される化合物又はその塩が提供される。【０００８】
上記発明の好ましい態様によれば、R1が水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の一価の置換基(該置換基は炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R2及びR3がそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は1個若しくは2個のカルボキシアルキル基(該カルボキシル基はエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を部分構造として有する一価の親水性置換基を示し、R4及びR5がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基を示し、R6及びR7がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し、R8及びR9が水素原子又は同一の測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し（ただし、R8及びR9が同時に水素原子であることはない）、Xが珪素原子を示す化合物又はその塩が提供される。【０００９】
さらに好ましい態様によれば、R1が水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし3個の一価の置換基(該置換基は炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R2及びR3がそれぞれ独立に水素原子であるか、又は2個のカルボキシメチル基(該カルボキシル基はエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を部分構造として1若しくは2個有する一価の親水性置換基を示し、R4及びR5がそれぞれ独立に炭素数1〜3個のアルキル基を示し、R6及びR7が共に水素原子、塩素原子であるか、又はフッ素原子であり、R8及びR9が水素原子又は同一の還元酵素、酸化酵素、又は加水分解酵素により切断される一価の基を示し（ただし、R8及びR9が同時に水素原子であることはない）、Xが珪素原子を示す化合物又はその塩が提供される。【００１０】
特に好ましい態様によれば、R1が水素原子を示し、R2及びR3がそれぞれ独立に水素原子であるか、又は2個のカルボキシメチル基(該カルボキシル基はアセトキシメチルエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を部分構造として1若しくは2個有するアルキル基(該アルキル基はオキソ基を有していてもよく、アミド結合を含んでいてもよい)を示し、R4及びR5がそれぞれ独立に炭素数1〜3個のアルキル基を示し、R6及びR7が共に水素原子であるか、又は共に塩素原子であり、R8及びR9がβ-ラクタマーゼ、チトクロームP450酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる酵素により切断される一価の基である上記の化合物又はその塩が提供される。【００１１】
また、上記の一般式(I)(式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、及びXは上記と同義である)で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブ、蛍光プローブの製造のための上記の一般式(I)(式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、及びXは上記と同義である)で表される化合物又はその塩の使用、及び測定対象物質の測定方法であって、上記の一般式(I)(式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、及びXは上記と同義である)で表される化合物又はその塩を測定対象物質と接触させた後に蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により提供される一般式(I)で表される化合物又はその塩は、各種酵素などの測定対象物質との接触によりR8及びR9が水素原子である化合物を生成した後、分子内スピロラクトン環が開環して強い赤色蛍光を発する化合物に変化する性質を有している。従って、一般式(I)で表される化合物又はその塩は各種酵素などを高感度に測定可能な蛍光プローブとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】上図は2-COOH TM(1% DMSOを含む0.1 M リン酸バッファー中で濃度1 μM)のpH依存的な吸収スペクトル変化を示した図であり、下図は580 nmにおける2-COOH TMのpH依存的な吸収度変化を示した図である。下図において、単相性(赤)又は二相性(青)標準化で曲線をフィットさせ、χ2値はそれぞれ0.041及び4.4*10-4であった。
【図２】2-COOH DCTM及び2-COOH DFTMの光学特性を示した図である。1% DMSOを含む0.1 M リン酸バッファー中で濃度1 μM)のpH依存的な吸収スペクトル変化(左)及び蛍光スペクトル変化(右)を示した。
【図３】diCl-2-COOH-TM-diβGalとβ-ガラクトシダーゼとを反応させ、吸収スペクトル(左)及び蛍光スペクトル(右)を経時的に観測した結果を示した図である。
【図４】diCl-2-COOH-TM-diβGal、FDG、又はTG-βGalとβ-ガラクトシダーゼを3分の時点で加えて経時的な蛍光強度変化を測定した結果を示した図である。左側は経時的な蛍光強度、右側は標準化した蛍光強度を示す(青：TG-βGal、赤：diCl-2-COOH-TM-DiβGal、FDG:緑)。
【図５】diCl-2-COOH-TM-diβGal、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-ガラクトシダーゼ阻害剤としてβ-ガラクトシルアミジンを37℃で反応させ蛍光強度を経時的に観測した結果を示した図である。左側は経時的な蛍光強度、右側は観測初期の蛍光増加量を示す。
【図６】diCl-2-COOH TM-monoβGalの開環率を見積もるため常に開環構造として存在するTM-βGal との比較を行った結果を示した図である。
【図７】diCl-2-COOH-TM-monoβGalとβ-ガラクトシダーゼとを反応させ、吸収スペクトル(左)及び蛍光スペクトル(右)を経時的に観測した結果を示した図である。
【図８】diCl-2-COOH-TM-diβGal(1μM)、diCl-2-COOH-TM-monoβGal(1μM)、又はTG-βGal(1μM)とβ-ガラクトシダーゼ(1.5ユニット)とを加えて経時的な蛍光強度変化を測定した結果を示した図である。
【図９】diCl-2-COOH-TM-monoβGalとβ-ガラクトシダーゼとの酵素基質反応における酵素濃度依存性を検討した結果を示した図である。左側は各酵素濃度における経時的な蛍光強度、右図はβ-ガラクトシダーゼ添加量と蛍光増加量との相間を示す。
【図１０】diCl-2-COOH-TM-monoβGal(1μM)、β-ガラクトシダーゼ(0.09ユニット)、及びβ-ガラクトシダーゼ阻害剤としてβ-ガラクトシルアミジン(10μM又は100μM)を37℃で反応させ蛍光強度を経時的に観測した結果を示した図である。左側は経時的な蛍光強度、右側は観測初期の蛍光増加量を示す。
【図１１】diCl-2-COOH TM-ジアセチルとPLE(豚肝臓エステラーゼ)との反応を行った結果を示した図である。左側は経時的な吸収スペクトル変化、右側は経時的な蛍光スペクトル変化を示す。
【図１２】diCl-2-COOH TM-ジアセチルとPLEとのインビトロでの反応の経時的な蛍光強度変化を測定した結果を示した図である。
【図１３】diCl-2-COOH TM-ジアセチルとPLEとの酵素基質反応における酵素濃度依存性を調べた結果を示した図である。左側は各酵素濃度における経時的な蛍光強度、右図はPLE添加量と蛍光増加量との相間を示す。
【図１４】diCl-2-COOH TM-ジアセチル、PLE、及びエステラーゼ阻害剤としてAEBSFを37℃で反応させ経時的な蛍光変化を測定した結果を示した図である。左側は経時的な蛍光強度、右側は観測初期の蛍光増加量を示す。
【図１５】diCl-Si-half-calcein AMとPLEとの反応を蛍光時間変化として測定した結果を示した図である。左側は経時的な吸収スペクトル変化、右側は経時的な蛍光スペクトル変化を示す。
【図１６】diCl-Si-half-calcein AMとPLEとの酵素基質反応における酵素濃度依存性を調べた結果を示した図である。左側は各酵素濃度における経時的な蛍光強度、右図はPLE添加量と蛍光増加量との相間を示す。
【図１７】diCl-Si-half-calcein AM、PLE、及びエステラーゼ阻害剤としてAEBSFを37℃で反応させ経時的な蛍光変化を測定した結果を示した図である。左側は経時的な蛍光強度、右側は観測初期の蛍光増加量を示す。
【図１８】diCl-Si-half-calcein AMを用いて生細胞内エステラーゼ活性のイメージングを行った結果を示した図である。
【図１９】diCl-2-COOH TM-monoβGalを用いて生細胞内のβ-ガラクトシダーゼ活性のイメージングを行った結果を示した図である。
【図２０】diCl-2-COOH TM-diβGalを用いて生細胞内のβ-ガラクトシダーゼ活性のイメージングを行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基(例えばアルコキシ基など)のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数1〜6個、好ましくは炭素数1〜4個、さらに好ましくは炭素数1〜3個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基などを挙げることができる。本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子であり、より好ましくはフッ素原子又は塩素原子であり、特に好ましいのは塩素原子である。
【００１５】
一般式(I)で表される化合物において、R1は水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示す。R1がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が1ないし3個程度存在していることが好ましい。R1が1個又は2個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくはR1は水素原子を示すか、1個の一価の置換基を示し、より好ましくはR1は水素原子を示す。
【００１６】
R1が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基はさらに任意の置換基を1個又は2個以上有していてもよい。例えば、R1が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、又はオキソ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR1が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。アルキル鎖中にアミド結合を含んでいてもよい。また、例えばR1が示すアミノ基には1個又は2個のアルキル基が存在していてもよく、R1が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。さらに、R1が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には4-カルボキシブトキシ基又は4-アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。また、R1が1個又は2個以上の一価の置換基を示す場合、それらのうちの1個又は2個以上は下記のR2及びR3において説明する一価の親水性置換基であってもよく、複数の親水性置換基を有する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。
【００１７】
R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は一価の親水性置換基を示す。R2又はR3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR2又はR3が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子又は一価の親水性置換基であることが好ましく、R2及びR3のうちのいずれかが水素原子であり、他方が一価の親水性置換基であることがさらに好ましい。
【００１８】
R2及びR3が示す一価の親水性置換基の種類は特に限定されないが、該親水性置換基はその部分構造として1個若しくは2個のカルボキシアルキル基で置換されたアミノ基を有することが好ましい。カルボキシアルキル基のカルボキシル基のうちの1個又は2個以上がエステルを形成していてもよい。また、該部分構造は2個のカルボキシメチル基(該カルボキシル基はエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基であることがより好ましい。上記エステルとしてはエチルエステルなどのアルキルエステル、メトキシメチルエステルなどのアルコキシアルキルエステル、又はアセトキシメチルエステルなどのアルカノイルオキシアルキルエステルなどが好ましい。本明細書において「親水性置換基」の用語は、カルボキシル基の存在によりそれ自体が親水性の置換基となっている場合のほか、エステルの加水分解後に生成するカルボキシル基により親水性となる置換基を包含するが、後者の場合においてエステルを形成した置換基自体が親水性を有する必要はない。
【００１９】
該親水性置換基としては、例えば、1個若しくは2個のカルボキシアルキル基(カルボキシアルキル基のカルボキシル基のうちの1個又は2個以上がエステルを形成していてもよい)で置換されたアミノ基を1個又は2個有するアルキル基などが好ましい。該アルキル基はオキソ基で置換されていてもよく、アルキル鎖の構成要素としてアミド結合、アミノ基、又はエーテル結合などを含んでいてもよい。特に好ましい親水性置換基としてビス(カルボキシメチル)アミノメチル基又はそのエステル、あるいはビス(カルボキシメチル)アミノメチル基又はそのエステルを部分構造として2個含む親水性置換基などが好ましい。エステルとしてはアセトキシメチルエステルが特に好ましい。エステルを形成した親水性置換基として例えばビス(アセトキシメチルオキシカルボニルメチル)アミノ基を1個又は2個有する親水性置換基を挙げることができ、特に好ましくはビス(アセトキシメチルオキシカルボニルメチル)アミノメチル基を挙げることができる。
【００２０】
R4及びR5はそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示すが、R4及びR5はそれぞれ独立に炭素数1〜3個のアルキル基であることが好ましく、R4及びR5がともにメチル基であることがより好ましい。R4及びR5が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR4又はR5が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。R4又はR5がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は1個又は2個以上の環構成ヘテロ原子(例えば窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子など)を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には1個又は2個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよい。
【００２１】
R6及びR7はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子、又は一価の親水性置換基を示す。R6及びR7が共に水素原子であるか、又は共にハロゲン原子であることが好ましく、R6及びR7が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることがさらに好ましく、R6及びR7が共に水素原子であるか、又は共に塩素原子であることが特に好ましい。
【００２２】
R8及びR9は水素原子又はそれぞれ独立に測定対象物質との接触により切断される同一又は異なる一価の基を示すが、R8及びR9が同時に水素原子であることはない。
測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、酵素、金属イオン(例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど)、非金属イオン(炭酸イオンなど)、活性酸素種（例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など）などのいずれであってもよいが、好ましくは酵素である。
【００２３】
酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができる。例えば、β-ラクタマーゼ、チトクロームP450酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなど、感染症やがんなどの診断対象として有用な酵素を挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素のうち、特にエステラーゼなどの加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ−カラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。
【００２４】
測定対象物質として加水分解酵素を用いる場合には、該酵素の特異的基質となる化合物や官能基を選択して、該酵素による加水分解を受けてR8及びR9が共に水素原子である化合物を与えるように一般式(I)の化合物を設計することができる。例えば、糖加水分解酵素を測定対象物質として用いる場合にはR8及びR9の一方又は両方をその酵素の基質となる糖化合物の残基とすることができる。糖化合物が有する水酸基やアミノ基などの官能基は必要に応じて適宜の保護基で保護されていてもよい。このような保護基を有する化合物もすべて本発明の範囲に包含される。
【００２５】
また、R8及びR9の一方又は両方がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基である場合には活性酸素種との接触により分解を受けてR8及びR9が水素原子である化合物が生成することから、活性酸素種を測定対象物質として用いることができる。p-アミノフェニル基、又はp-ヒドロキシフェニル基を有する活性酸素蛍光プローブは、例えば、国際公開 (WO2001/064664)、国際公開（WO2004/040296）、US7378282などに記載されている。
【００２６】
Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示すが、珪素原子又はゲルマニウム原子であることが好ましく、珪素原子であることが特に好ましい。
【００２７】
上記一般式(I)で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
【００２８】
一般式(I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式(I)又は(II)で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００２９】
一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、各種酵素などの測定対象物質との接触によりR8及びR9が水素原子である化合物を生成した後、分子内スピロラクトン環を形成して強い赤色蛍光を発する化合物に変化する性質を有している。従って、一般式(I)で表される化合物又はその塩は各種酵素などを高感度に測定可能な蛍光プローブとして有用である。また、R1、R2、R3、R6、及びR7のうちのいずれか又は2つ以上に、好ましくはR2又はR3のいずれかにビス(アセトキシメチルオキシカルボニルメチル)アミノ基を有する親水性置換基、好ましくはビス(アセトキシメチルオキシカルボニルメチル)アミノメチル基を有する場合には、この置換基の脂溶性により細胞内に効率良く取り込まれ、かつ、細胞内に取り込まれると細胞内に存在するエステラーゼにより4-アセトキシメチルオキシカルボニルメチルエステルが加水分解を受けてカルボキシル基を生成し、水溶性の高い化合物となって細胞内に長時間滞留するので、細胞内の測定対象物質をイメージングするために極めて適している。
【００３０】
また、R6及びR7が共に塩素原子である場合には、生理的な中性条件において各種酵素などの測定対象物質との接触によりR8及びR9が水素原子である化合物を生成した後、速やかに分子内スピロラクトン環が開環し、中性条件においては大部分が強蛍光性の開環化合物として存在するようになる。従って、R6及びR7が共に塩素原子である化合物は生理的な中性条件下において使用するためのプローブとして特に有用である。
【００３１】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の蛍光プローブを用いた測定対象物の測定方法は、一般的には、(a)上記式(I)で表される化合物と測定対象物質とを接触させることによりR8及びR9を切断して対応の水素原子の化合物を生成させる工程、及び(b)上記工程(a)で生成した化合物(R8及びR9が共に水素原子であり、分子内スピロラクトン環が開環した化合物)の蛍光を測定する工程を含んでいる。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の蛍光プローブ又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、測定対象物との接触の前後における蛍光スペクトルを測定すればよい。
【００３２】
測定対象物質によりR8及びR9が切断された後の化合物の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。
【００３３】
本発明の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【００３４】
一般式(I)で表される化合物は、例えばChemical Communications, 47, pp.4162-4164, 2011に記載された製造方法に準じて製造することができる。本明細書の実施例には母核構造の合成方法を参考例として示した。また、一般式(I)で表される化合物の代表的化合物について実施例に具体的な合成方法を記載したので、当業者はこれらの製造方法に準じて、必要に応じて原料化合物、反応条件、又は反応試薬などを適宜変更することにより、一般式(I)に包含される本発明の化合物を容易に製造することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1
以下のスキームに従って本発明の化合物の製造用中間体を合成した。【００３６】
【化２】
2013122189.tif 000004
【００３７】
(a)3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン
炭酸カリウム (22.0 g, 159 mmol)をアセトニトリルに懸濁し、3-ブロモアニリン (8.71 mL, 80.0 mmol)、アリルブロミド (23.7 mL, 280 mmol) を加えて80℃で14時間攪拌した。室温まで冷却した後にセライトろ過を行い、酢酸エチルでよく洗った。溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/40 酢酸エチル/ヘキサン) で精製し、3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン (17.1 g, 67.9 mmol, 収率85%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 3.87-3.90 (m, 4H), 5.11-5.15 (m, 2H), 5.17-5.18 (m, 2H), 5.75-5.88 (m, 2H), 6.58 (dd, 1H, J = 2.2, 8.1 Hz), 6.77-6.81 (m. 2H), 7.01 (t, 1H, J = 8.1Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ 52.7, 110.8, 115.0, 116.3, 119.0, 123.3, 130.2, 133.2, 150.0
HRMS (ESI+): Found: 252.0429, calculated 252.0388 for [M+H]+ (+4.1 mmu)【００３８】
(b)ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン
3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン (17.1 g, 67.9 mmol) を酢酸 (200 mL) に溶解し、37% ホルムアルデヒド液 (10.2 g, 340 mmol)を加えて80℃で75分間加熱した。室温まで冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と水酸化ナトリウムで中和した。この混合物をジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン (15.2 g, 29.5 mmol, 収率87%)を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 3.85-3.87 (m, 8H), 3.96 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 8H), 5.76-5.88 (m, 4H), 6.54 (dd, 2H, J = 2.9, 8.8 Hz), 6.81 (d, 2H, J =8.1 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 2.9 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ 39.7, 52.7, 111.7, 116.0, 116.2, 125.5, 126.9, 130.8, 133.5, 148.1
HRMS (ESI+): Found: 517.0654, calculated 517.0677 for [M+H]+ (-2.3 mmu)【００３９】
(c)N,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコにビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン (8.16 g, 15.8 mmol) と脱水テトラヒドロフラン(THF, 50 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (45 mL, 45mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルシラン (2.9 mL, 30 mmol) を脱水THF 10 mLに溶解してゆっくりと加え、室温に戻して1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を停止して炭酸水素ナトリウムで中和した。この混合物をジクロルメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。残渣をアセトン (150 mL)に溶解し、0℃に冷却して過マンガン酸カリウム (6.88 g, 43.5 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。ジクロルメタン (200 mL)を加えてろ紙を用いて吸引ろ過した。溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン) で精製してN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントン (2.23 g, 5.20 mmol, 収率33%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 0.41 (s, 6H), 4.02 (d, 8H, J = 5.1 Hz), 5.17-5.23 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.80-6.83 (m, 4H), 8.34 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ -1.1, 52.8, 113.5, 114.8, 116.7, 130.0, 131.7, 133.1, 140.5, 150.2, 185.1
HRMS (ESI+): Found:429.2347, calculated 429.2362 for [M+H]+ (-1.5 mmu)【００４０】
(d)ジアミノ-Si-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコにテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(Pd(PPh3)4 , 35.0 mg, 0.0303 mmol) と1,3-ジメチルバルビツール酸 (196 mg, 1.08 mmol) を加えた。この混合物にN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントン(99.2 mg, 0.231 mmol) をジクロルメタン 10 mL に溶解して加え、64℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/3 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、ジアミノ-Si-キサントン(48.8 mg, 0.182 mmol, 収率79%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CD3OD): δ 0.40 (s, 6H), 6.76 (dd, 2H, J = 2.6, 8.4 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 8.13 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CD3OD): δ -1.3, 116.6, 118.4, 131.0, 132.8, 142.6, 153.0, 187.5
HRMS (ESI+Tof): m/z Found: 269.1108, calculated 269.1110 for [M+H]+ (-0.2 mmu)【００４１】
(e)ジヒドロキシ-Si-キサントン
ジアミノ-Si-キサントン (48.8 mg, 0.182 mmol) を混合溶媒 (メタノール、6 N H2SO4, 4/5) 45 mLに溶解した。0℃に冷却後、亜硝酸ナトリウム (84.6 mg, 1.22 mmol) を水 2mLに溶解してゆっくりと加え、そのままの温度で1時間攪拌した。この混合物を沸騰した1 N H2SO4(50 mL) にゆっくりと加え、さらに10分間還流した後に氷冷した。反応液をジクロルメタンで抽出し、食塩水でよく洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/20 メタノール/ジクロルメタン)で精製し、ジヒドロキシ-Si-キサントン (32.9mg, 0.122 mmol, 収率67%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CD3OD): δ 0.45 (s, 6H), 6.95 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.07 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 8.26 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CD3OD): δ -1.5, 118.4, 120.0, 133.3, 133.8, 143.1, 162.2, 187.6
HRMS (ESI-Tof): Found 269.0674, calculated 269.0634 for [M-H]- (+4.0 mmu)【００４２】
(f)3,6-ジ-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-Si-キサントン
ジヒドロキシ-Si-キサントン (32.9 mg, 0.122 mmol), イミダゾール (85.5 mg, 1.26 mmol) をジクロルメタン 20 mLに溶解し、tert-ブチルジメチルシリルクロリド(TBDMSCl, 185mg, 1.23 mmol)をジクロルメタン 5 mLに溶解してゆっくりと加え、室温で14時間攪拌した。この混合物に水を加えてジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/20 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジ-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-Si-キサントン(52.8 mg, 0.106 mmol, 収率84%)を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 0.26 (s, 12H), 0.46 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 6.98 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.04 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 8.37 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ -4.3, -1.6, 18.3, 25.6, 121.8, 123.7, 132.3, 134.5, 141.1, 158.7, 186.0
HRMS (ESI+): Found: 499.2480, calculated 499.2520 for [M+H]+ (-4.0 mmu)【００４３】
例2
以下の方法により本発明の化合物の製造用中間体であるゲルマニウム含有化合物を合成した。
【化３】
2013122189.tif 000005
【００４４】
(a) N,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-Ge-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン(6.16 g, 11.9 mmol) と脱水THF (40 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム(BuLi) (34 mL, 34 mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルゲルマン(2.62 mL, 22.7 mmol) を脱水THF 15 mLに溶解したものをゆっくりと加え、室温に戻し1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を止め、炭酸水素ナトリウムで中和した。これをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。これをアセトン (120 mL)に溶解し、0℃に冷却した。この混合物に過マンガン酸カリウム (5.20 g, 32.9 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。この混合物にジクロルメタン (200 mL)を加えて、その溶液をろ紙を用いて吸引ろ過した。そして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル、ジクロルメタン) で精製することにより目的物(1.29 g, 2.72 mmol, 収率23% )を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.54 (s, 6H), 4.00-4.02 (m, 8H), 5.17-5.23 (m, 8H), 5.81-5.94 (m, 4H), 6.72 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 6.78 (dd, 2H, J = 2.6, 9.2 Hz), 8.36 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -1.8, 52.3, 112.6, 114.4, 116.2, 129.6, 131.7, 132.7, 142.8, 149.8, 184.5
LRMS (ESI+): m/z Found 475, calculated 475 for [M+H]+【００４５】
(b) 3,6-ジアミノ-Ge-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、Pd(PPh3)4(330 mg, 0.285 mmol) と  1,3-ジメチルバルビツール酸(1.41 g, 9.04 mmol) を加えた。この混合物に、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-Ge-キサントン (1.00 g, 2.11 mmol) をジクロルメタン 50 mL に溶解して加え、35℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/3 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジアミノ-Ge-キサントン混合物(760 mg, 収率  定量的) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.55 (s, 6H), 6.73-6.76 (m, 4H), 8.33 (d, 2H, J = 9.5 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -1.9, 116.1, 118.3, 130.9, 133.2, 145.2, 152.9, 187.3
LRMS (ESI+): m/z Found: 315, calculated 315 for [M+H]+【００４６】
(c)3,6-ジヒドロキシ-Ge-キサントン
3,6-ジアミノ-Ge-キサントン混合物 (760 mg) を3/4, メタノール / 6 N H2SO4 (45 mL)に溶解した。0℃に冷却後、亜硝酸ナトリウム (838 mg, 12.1 mmol) をH2O 5mLに溶解してゆっくりと加え、そのままの温度で1時間攪拌した。それを沸騰した1 N H2SO4(70 mL) にゆっくりと加え、さらに10分間還流した後氷冷した。反応液をジクロルメタンで抽出し食塩水でよく洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジヒドロキシ-Ge-キサントン(478 mg, 1.52 mmol, 収率56% (2工程)) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.58 (s, 6H), 6.90 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.0 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 8.25 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -2.0, 117.7, 120.0, 133.7, 133.8, 145.6, 162.0, 187.7
LRMS (ESI+): Found 317, calculated 317 for [M+H]+【００４７】
(d)3,6-diTBDMSO-Ge-キサントン
ジヒドロキシ-Ge-キサントン(478 mg, 1.52 mmol)、イミダゾール(1.77 g, 26.0 mmol) をジクロルメタン 150 mLに溶解し、t-ブチルジメチルシリルクロリド(TBDMSCl, 3.70 g, 24.5 mmol)をジクロルメタン 50mLに溶解してゆっくりと加えて室温で14時間攪拌した。この混合物に水を加えてジクロルメタンで抽出し食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-diTBDMSO-Ge-キサントン (702 mg, 1.29 mmol, 収率85%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.25 (s, 12H), 0.59 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 6.92-6.98 (d, 4H, m), 8.36 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -4.4, -1.6, 18.2, 25.8, 121.1, 123.7, 132.5, 134.6, 143.6, 158.6, 185.9
LRMS (ESI+): m/z Found 545, calculated 545 for [M+H]+【００４８】
例3
以下のスキームに従ってR4及びR5がエチル基である本発明の化合物の製造用中間体を合成した。
【化４】
2013122189.tif 000006
【００４９】
(a)N,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコにビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン(1.65 g, 3.20 mmol) と脱水THF (20 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-BuLi (10 mL, 10 mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジエチルジクロロシラン（SiEt2Cl2, 1.04 mL, 7.02 mmol、Etはエチル基を示す) を脱水THF 5 mLに溶解してゆっくり加え、室温に戻し1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を止め、炭酸水素ナトリウムで中和した。これをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。これをアセトン(50 mL)に溶解し、0℃に冷却した。この混合物に過マンガン酸カリウム (1.49 g, 9.43 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。この混合物にジクロルメタン(50 mL)を加えて、その溶液をセライトろ過した。そして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 10/1 ヘキサン/酢酸エチル) で精製することによりN,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン (419 mg, 0.917 mmol, 収率29%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.91 (s, 10H), 4.01-4.02 (m, 8H), 5.17-5.22 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.79-6.84 (m, 4H), 8.35 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 5.56, 7.48, 52.7, 113.3, 115.0, 116.5, 130.9, 131.6, 133.1, 138.3, 149.9, 185.3
HRMS (ESI+): m/z Found 457.2661, calculated 457.2675 for [M+H]+ (-1.5 mmu)【００５０】
(b)3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン 
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、Pd(PPh3)4(204 mg, 0.176 mmol) と1,3-ジメチルバルビツール酸(1.04 g, 6.67 mmol) を加えた。この混合物に、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン (419 mg, 0.917 mmol) をジクロルメタン 30 mL に溶解して加え、35℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/5 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン (236 mg, 0.796 mmol, 収率87%) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.83-0.95 (m, 10H), 4.10 (s, 4H), 6.76-6.81 (m, 4H), 8.33 (d, 2H, J = 7.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 5.37, 7.38, 116.2, 117.5, 132.0, 132.9, 138.8, 148.9, 185.5
HRMS (ESI+): m/z Found 297.1462, calculated 297.1423 for [M+H]+ (3.9 mmu)【００５１】
(c)3,6-ジヒドロキシ-ジエチルSi-キサントン
3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン混合物(236 mg, 0.796 mmol) を3/4 メタノール/6N硫酸 (35 mL)に溶解した。0℃に冷却後、亜硝酸ナトリウム (315 mg, 4.56 mmol) を水3 mLに溶解したてゆっくりと加え、そのままの温度で1時間攪拌した。それを沸騰した1 N 硫酸 (50 mL) にゆっくりと加え、さらに10分間還流した後に氷冷した。反応液をジクロルメタンで抽出し、食塩水でよく洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、1/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジヒドロキシ-ジエチルSi-キサントン (74.3 mg, 0.249 mmol, 収率31%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.83-1.04 (m, 10H), 6.99 (dd, 2H, J = 2.2, 8.8 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 8.31 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 6.07, 7.56, 118.4, 120.0, 133.4, 135.0, 140.9, 162.0, 187.9
HRMS (ESI+): m/z Found 321.0964, calculated 321.0923 for [M+Na]+ (4.1 mmu)【００５２】
(d)3,6-diTBDMSO-ジエチルSi-キサントン 
ジヒドロキシ-ジエチルSi-キサントン(74.3 mg, 0.249 mmol)、イミダゾール(326 mg, 4.79 mmol)をジクロルメタン 20 mLに溶解し、TBDMSCl (715 mg, 4.74 mmol)をジクロルメタン 5 mLに溶解してゆっくり加えて室温で14時間攪拌した。この混合物にH2Oを加えてジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル、1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-diTBDMSO-ジエチルSi-キサントン (93.2 mg, 0.177 mmol, 収率71%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.26 (s, 12H), 0.85-1.02 (m, 28H), 6.98-7.05 (m, 4H), 8.39 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ -4.14, 5.46, 7.45, 18.5, 25.8, 122.1, 123.9, 132.5, 135.8, 139.2, 158.7, 186.3
HRMS (ESI+): m/z Found 527.2869, calculated 527.2833 for [M+H]+ (3.6 mmu)【００５３】
例4
(e)一般式(I)で表される化合物の合成(一般的手法)
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに2-ブロモ安息香酸エステルと脱水THFを加え、-78℃に冷却後、1M sec-BuLi (0.5 mmol)を加えて20分間攪拌し、そのままの温度で3,6-diOTBDMS-X-キサントンを脱水THFに溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌し、ジクロルメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を除去した後、HPLC で精製して一般式(I)で表される化合物を得る。
(b)2-COOH TMの合成
【化５】
2013122189.tif 000007
【００５４】
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、2-ブロモ安息香酸tert-ブチル(800 mg, 3.11 mmol) と脱水 THF (5 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1 M sec-BuLi (2.0 mmol) を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で3,6-diOTBDMS-Si-キサントン (40.0 mg, 0.0802 mmol) を脱水THF 5 mL に溶解してゆっくり加え、室温に戻した。室温で30分間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にトリフルオロ酢酸(TFA、3 mL)を加えて室温で1時間攪拌した。溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-COOH TM (13.6 mg, 0.0358 mmol, 収率45%)を得た。【００５５】
1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3): δ 0.56 (s, 3H), 0.64 (s, 3H), 6.76 (dd, 2H J = 2.9, 8.8 Hz), 6.83 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.23 (d, 2H J = 2.9 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.67 (td, 1H, J = 1.5, 7.3 Hz), 7.80 (td, 1H, J = 1.5, 7.3 Hz), 7.94 (dd, 1H, J = 1.5, 7.3 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): δ -1.4, 0.2, 91.1, 117.6, 121.1, 125.5, 126.3, 127.0, 129.3, 130.1, 135.1, 136.7, 138.2, 155.3, 157.7, 170.4
HRMS (ESI+): m/z Found 375.1018, calculated 375.1053 for [M+H]+ (-3.5 mmu)【００５６】
例5
【化６】
2013122189.tif 000008
【００５７】
(a)4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン
3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(81.1 mg, 0.300 mmol)をメタノール(5 mL) に溶解し、この混合物に次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl) を100 mMになるように溶かした 0.1 N 水酸化ナトリウム水溶液 4 mLをゆっくりと加え室温で1時間攪拌した。反応液に2 N 塩酸 を加えてpH 2とした後に 酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、1/1 酢酸エチル/ヘキサン)で精製することにより、4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(83.8 mg, 0.247 mmol, 収率82 %)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.80 (s, 6H), 7.11 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.27 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.6, 119.0, 127.0, 132.0, 133.8, 141.4, 158.4, 186.0
HRMS (ESI+): m/z Found 339.0053, calculated 339.0011 for [M+H]+ (4.2 mmu)【００５８】
(b)4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン
4,5-ジクロロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(69.0 mg, 0.203 mmol)、イミダゾール(54.5 mg, 0.801 mmol)をジクロルメタン(10 mL)に溶解し、TBDMSCl(121 mg, 0.803 mmol)をゆっくりと加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン)で精製することにより、4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(109 mg, 0.193 mmol, 収率95%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.30 (s, 12H), 0.81 (s, 6H), 1.06 (s, 18H), 7.06 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.35 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ -4.3, -2.0, 18.4, 25.6, 121.5, 130.6, 131.0, 134.2, 140.5, 155.1, 184.9
HRMS (ESI+): m/z Found 567.1731, calculated 567.1740 for [M+H]+ (-0.9mmu)【００５９】
(c)4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta (2-COOH DCTM)
乾燥させアルゴン置換したフラスコに2-ブロモ安息香酸tert-ブチル(129 mg, 0.502 mmol)と脱水 THF (5 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1 M sec-BuLi (0.30 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で4,5-ジクロロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(11.3 mg, 0.0200 mmol) を脱水THF 5 mL に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタン で抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にTFA (5 mL)を加えて室温で2時間攪拌した。溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-COOH DCTM (5.7 mg, 0.013 mmol, 収率64%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.83 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 6.85 (d, 2H J = 8.8 Hz), 6.89 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.98 (d, 1H J = 7.8 Hz), 7.51 (td, 1H, J = 1.0, 7.6 Hz), 7.60 (td, 1H, J = 1.0, 7.6 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 7.8 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): δ -0.2, 0.5, 90.0, 119.8, 123.6, 124.3, 126.4, 127.1, 127.8, 129.9, 135.1, 136.2, 136.7, 153.6, 158.3, 171.2
HRMS (ESI+): m/z Found 443.0241, calculated 443.0273 for [M+H]+ (-3.2 mmu)【００６０】
(d)4,5-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン
3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン (13.5 mg, 0.050 mmol)をアセトニトリル(3 mL)に溶解し、この混合物に Selectfluor (登録商標, 35.4 mg, 0.1 mmol)を加え、80℃で一晩加熱還流を行った後、HPLC で精製して4,5-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(4.1 mg, 0.013 mmol, 収率27 %)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.62-0.63 (m, 6H), 7.12 (m, 2H), 8.13 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
HRMS (ESI+): m/z, Found 329.0393, calculated 329.0422 for [M + Na]+ (-2.9 mmu)【００６１】
(e)4,5-ジフルオロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン
4,5-ジフルオロ-3,6-ジヒドロキシ-Si-キサントン(3.1 mg, 0.010 mmol)、イミダゾール(6.8 mg, 0.10 mmol)をジクロルメタン(2 mL)に溶解し、TBDMSCl(15.1 mg, 0.10 mmol)をゆっくりと加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン)で精製することにより、4,5-ジフルオロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(4.7 mg, 0.088 mmol, 収率88%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.25 (s, 12H), 0.64 (s, 6H), 1.02 (s, 18H), 7.09 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
HRMS (ESI+): m/z Found 535.2380, calculated 535.2332 for [M + H]+ (4.8 mmu)【００６２】
(f)2-COOH DFTM
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、2-ブロモ安息香酸tert-ブチル(51 mg, 0.20 mmol)と脱水 THF (3 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1 M sec-BuLi(0.30 mmol) を加えて20分間攪拌した。そのままの温度で4,5-ジフルオロ-3,6-diOTBDMS-Si-キサントン(5.4 mg, 0.010 mmol) を脱水THF 3 mL に溶解してゆっくり加え、室温に戻した。室温で1時間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて20分間攪拌した。それをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した後、残渣にTFA (3 mL)を加えて室温で2時間攪拌した。溶媒を除去した後、HPLC で精製して2-COOH DFTM (2.2 mg, 0.054 mmol, 収率54%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.68 (s, 3H), 0.79 (s, 3H), 6.66 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.87 (t, 2H, J = 9.2 Hz), 7.13 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.57-7.68 (m, 2H), 7.92 (d, 1H, J = 8.1 Hz)
HRMS (ESI+): m/z Found 411.0902, calculated 411.0864 for [M+H]+ (3.8 mmu)【００６３】
得られた2-COOH TM、2-COOH DCTM、及び2-COOH DFTMの光学特性を下記の表1に示す。参照のため2-COOH DCTM及び2-COOH DFTMのカルボキシル基をそれぞれメチル基に変更した2-Me DCTM及び2-Me DFTMの光学特性も示した。測定は1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む0.1M リン酸バッファー(pH 9)中で行った。pKaはリン酸バッファー(pH 9)中での吸収から単相性又は二相性の曲線フィッチングにより求めた。量子収率は0.1M リン酸バッファー(pH 9)においける2-Me TokyoMagenta（2-Me TM、国際公開 (WO2012/099218)に記載の化合物)の量子収率(0.42)を標準として求めた。【００６４】
【表１】
2013122189.tif 000009
【００６５】
例6：β-ガラクトシダーゼ測定用蛍光プローブ
【化７】
2013122189.tif 000010
【００６６】
(a)2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシル ブロミド
β-D-ガラクトースペンタアセテート (5.00 g, 12.8 mmol)、ビスマス (III) ブロミド (287 mg, 640 μmol) を ジクロロメタン (25 mL)に溶解し、そこにブロモトリエチルシラン (6.76 mL, 51.2 mmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下3時間攪拌した。反応液を氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注いだ後、ジクロロメタンで抽出し、食塩水にて洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去し、2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシル ブロミド (5.30 g, 定量的)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.01 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 4.08-4.22 (m, 2H), 4.47-4.51 (m, 1H), 5.05 (dd, 1H, J = 3.8, 10.6 Hz), 5.41 (dd, 1H, J = 3.3, 10.6 Hz), 5.51-5.52 (m, 1H), 6.70 (d, 1H, J = 3.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.5, 20.5, 20.6, 20.7, 60.8, 66.9, 67.7, 68.0, 71.0, 88.1, 169.7, 169.8, 170.0, 170.3【００６７】
(b)4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta ジ-(2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド)
4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta (15.0 mg, 33.8 μmol)、炭酸セシウム（Cs2CO3 , 300 mg, 921 μmol) をジメチルホルムアミド(DMF, 1 mL)に溶解し、そこに2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシル ブロミド (300 mg, 730 μmol) をDMF (1 mL) に溶解したものを加え、室温でアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。不溶物をろ過し、ろ液の溶媒を除去した後、HPLCにて精製し、4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta ジ-(2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド) (16.2 mg, 収率43% )を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.82 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.96 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 4.12-4.18 (m, 4H), 4.23-4.30 (m, 2H), 5.19-5.32 (m, 4H), 5.40-5.46 (m, 4H), 6.99 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.08-7.13 (m, 2H), 7.23-7.30 (m, 2H), 7.52 (dd, 1H, J = 6.6 Hz, 7.3 Hz), 7.61 (dd, 1H, J = 6.6 Hz, 7.3 Hz), 7.95 (d, 1H, J = 7.3 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -0.3, 0.5, 20.5, 20.5, 20.8, 62.4, 62.5, 68.6, 69.8, 72.0, 72.4, 90.3, 100.4, 100.8, 120.3, 120.8, 123.7, 123.7, 127.0, 127.6, 130.6, 130.8, 131.0, 136.0, 136.2, 136.7, 140.1, 140.4, 153.4, 153.6, 158.3, 171.2, 171.4, 171.4, 171.9, 171.9, 171.9, 172.5
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 1103.21748; Found, 1103.21412 (-3.36 mmu).【００６８】
(c)4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta ジ-β-D-ガラクトピラノシド
4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta  ジ-(2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシド) (10.0 mg, 9.06 μmol)をメタノール (2 mL)に溶解し、0℃ にてそこに28 % NaOMe メタノール溶液6 μLを加えた。0℃にて2 時間攪拌した後、アンバーライトIR-120 plus (H+)を加えて中和した。アンバーライトをろ過し、ろ液の溶媒を除去した後、HPLCにて精製し、4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta ジ-β-D-ガラクトピラノシド (diCl-2-COOH-TM-diβGal, 6.65 mg, 収率96%)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): 0.83 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 3.52-3.59 (m, 2H), 3.65-3.75 (m, 6H), 3.85-3.89 (m, 4H), 4.90 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.98 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.04-7.07 (m, 2H), 7.26-7.30 (m, 2H), 7.51 (dd, 1H, J = 6.8 Hz, 7.7 Hz),  7.59 (dd, 1H, J = 6.8 Hz, 7.7 Hz), 7.91 (d, 1H, J = 7.7 Hz)
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -0.1, 0.6, 62.4, 70.2, 72.0, 72.0, 74.9, 77.2, 90.8, 102.2, 102.6, 119.4, 119.6, 123.7, 124.1, 126.9, 127.5, 127.6, 130.4, 130.4, 130.5, 136.0, 136.5, 138.8, 139.0, 154.0, 154.2, 158.5, 172.7
HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 789.11491; Found, 789.11160 (-3.31 mmu)【００６９】
(d)β-ガラクトシダーゼ測定用蛍光プローブとしての機能評価
【化８】
2013122189.tif 000011
【００７０】
上記(c)で得られた化合物についてβ-ガラクトシダーゼ活性測定用蛍光プローブとしての機能を検討した。この化合物がβ-ガラクトシダーゼ活性測定用蛍光プローブとして機能する際の反応スキームは上記のとおりであり、R8及びR9として導入されたβ-ガラクトース残基が共に加水分解されて、開環状態の化合物となって強い赤色蛍光を発する。【００７１】
diCl-2-COOH-TM-diβGal(1μM)とβ-ガラクトシダーゼ(0.15ユニット)とを反応させ、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを経時的に観測した結果を図3に示す。反応は1 mM 塩化マグネシウム(MgCl2)、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、0.1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中で37℃で行った。蛍光の励起波長は591 nmとした。また、1 mM MgCl2、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中にdiCl-2-COOH-TM-diβGal(1μM)、FDG(1μM)、又はTG-βGal(1μM)とβ-ガラクトシダーゼ(1.5ユニット)とを3分の時点で加えて経時的な蛍光強度変化を測定した結果を図4に示した。左側は経時的な蛍光強度、右側は標準化した蛍光強度を示す(青：TG-βGal、赤：diCl-2-COOH-TM-DiβGal、FDG:緑)。FDG及びTG-βGalについては励起波長を491 nm、蛍光波長を509 nmとし、diCl-2-COOH-TM-diβGalについて励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした。【００７２】
(e)β-ガラクトシダーゼ阻害剤による阻害効果
diCl-2-COOH-TM-diβGal(1μM)、β-ガラクトシダーゼ(0.5ユニット)、及びβ-ガラクトシダーゼ阻害剤としてβ-ガラクトシルアミジン(10μM又は100μM)を1 mM MgCl2、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、1.1% DMSOを含む500 μLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中に3分の時点で加えて37℃で反応させ蛍光スペクトルを経時的に観測した。結果を図5に示す。励起波長は591 nmとし、蛍光波長は607 nmとした。【００７３】
例7：β-ガラクトシダーゼ測定用蛍光プローブ
【化９】
2013122189.tif 000012
【００７４】
(a)4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta モノ-β-D-ガラクトピラノシド(diCl-2-COOH TM-monoβGal)
4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta (15.0 mg, 33.8 μmol)、Cs2CO3 (17.0 mg, 52.1 μmol) をDMF (1 mL)に溶解し、そこに2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシル ブロミド (20 mg, 48.6 μmol) をDMF 1 mL に溶解したものを加え、室温でアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。不溶物をろ過し、ろ液の溶媒を除去した後、HPLCにて精製した。精製物をメタノール (3 mL)に溶解し、0℃にてそこに28% ナトリウムメトキシドのメタノール溶液6 μLを加えた。0℃にて2 時間攪拌した後、 アンバーライト IR-120 plus (H+)を加えて中和した。アンバーライトをろ過し、ろ液の溶媒を除去した後、HPLCにて精製し、4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta モノ-β-D-ガラクトピラノシド (4.09 mg, 収率20 %)を得た。250 nmの検出波長でHPLCによる分析を行ったところ12.0分に単一ピークを認めた(eluent A (水, 0.1M TEAA(酢酸テトラエチルアンモニウム) and eluent B (80 % アセトニトリル/H2O, 0.1M TEAA), gradient A:B = 80: 20 to 0: 100 (15 min))。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 0.83 (s, 3H), 0.99 (s, 3H), 3.52-3.58 (m, 1H), 3.67-3.75 (m, 3H), 3.85-3.89 (m, 2H), 4.89-4.98 (m, 1H), 6.89 (m, 2H), 6.97-7.03 (m, 2H), 7.25-7.29 (m, 1H), 7.51 (dd, 1H, J = 7.2 Hz, 8.0 Hz), 7.59 (dd, 1H, J = 7.2, 8.0 Hz), 7.91 (d, 1H, J =7.2 Hz)
HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 627.0621; Found, 627.0669 (+4.8 mmu)【００７５】
得られたdiCl-2-COOH TM-monoβGalの光学特性を下記の表2に示す。測定は0.1 Mリン酸バッファー中で行った。量子収率は0.1M 水酸化ナトリウム水溶液でのフルオレセインの量子収率(0.85)を標準として算出した。【００７６】
【表２】
2013122189.tif 000013
【００７７】
diCl-2-COOH TM-monoβGalの開環率を見積もるため、TM-βGal の吸光スペクトルとの比較を行った。TM-βGal はpHの影響を受けずに常に開環構造として存在するためpH変化によって吸光スペクトルは変わらない。このTM-βGalに比べてdiCl-2-COOH TM-monoβGalの吸光度の値は生理的条件のpH下において小さく、ほとんど（95 %以上）が無吸収の閉環構造を示した(図6)。測定は1.0% DMSOを含む種々のpHの0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中で10 μMのdiCl-2-COOH TM-monoβGalを用いて行った。励起波長はTM-βGal（国際公開 (WO2012/099218)に記載の化合物)について450 nmとし、diCl-2-COOH TM-monoβGalについては460 nmとした。【００７８】
【化１０】
2013122189.tif 000014
【００７９】
(b)β-ガラクトシダーゼ活性測定用蛍光プローブとしての機能評価
diCl-2-COOH TM-monoβGalのβ-ガラクトシダーゼ活性測定用蛍光プローブとしての機能を検討した。この化合物がβ-ガラクトシダーゼ活性測定用蛍光プローブとして機能する際の反応スキームは下記のとおりであり、R8として導入されたβ-ガラクトース残基が加水分解されてR8及びR9が水素原子の化合物となり、それが開環状態の化合物となって強い赤色蛍光を発する。【００８０】
【化１１】
2013122189.tif 000015
【００８１】
diCl-2-COOH-TM-monoβGal(1μM)とβ-ガラクトシダーゼ(0.3ユニット)とを反応させ、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを経時的に観測した結果を図7に示す。反応は1 mM MgCl2、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中で37℃で行った。励起波長を591 nmとし蛍光スペクトルを測定した。【００８２】
また、1 mM MgCl2、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中にdiCl-2-COOH-TM-diβGal(1μM)、diCl-2-COOH-TM-monoβGal(1μM)、又はTG-βGal(1μM)とβ-ガラクトシダーゼ(1.5ユニット)とを3分の時点で加えて経時的な蛍光強度変化を測定した結果を図8に示した。上側は経時的な蛍光強度、下側は標準化した蛍光強度を示す。TG-βGalについては励起波長を491 nm、蛍光波長を509 nmとし、diCl-2-COOH-TM-diβGal及びdiCl-2-COOH-TM-monoβGalについて励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした。【００８３】
diCl-2-COOH-TM-monoβGalとβ-ガラクトシダーゼとの酵素基質反応における酵素濃度依存性を検討した。1 mM MgCl2、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中にdiCl-2-COOH-TM-monoβGal(1μM)を加え、3分後に種々の濃度のβ-ガラクトシダーゼを添加した。励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとして測定を行った結果を図9に示す。右図はβ-ガラクトシダーゼ添加量と蛍光増加量との相関を示した図である。【００８４】
(c)β-ガラクトシダーゼ阻害剤による阻害効果
diCl-2-COOH-TM-monoβGal(1μM)、β-ガラクトシダーゼ(0.09ユニット)、及びβ-ガラクトシダーゼ阻害剤としてβ-ガラクトシルアミジン(10μM又は100μM)を1 mM MgCl2、14.3 mM 2-メルカプトエタノール、2.0% DMSOを含む500 μlの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中に3分の時点で加えて37℃で反応させ蛍光スペクトルを経時的に観測した。結果を図10に示す。励起波長は591 nmとし、蛍光波長は607 nmとした。【００８５】
例8：エステラーゼ測定用蛍光プローブ
(a)3',6'-ビス(アセチルオキシ)-4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta (diCl-2-COOH TM-ジアセチル)
【化１２】
2013122189.tif 000016
【００８６】
4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta (15.0 mg, 33.8 μmol)をピリジン (1.5 mL)に溶解し、そこに無水酢酸 (100 μL)を加え、室温でアルゴン雰囲気下1時間攪拌した。溶媒を除去した後、HPLCにて精製し、4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta ジアセチル (10.4 mg, 収率58%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.85 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 2.33 (s, 6H), 7.05 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.67 (dd, 1H, J = 1.2, 7.6, 7.8Hz), 7.80 (ddd, 1H, J = 1.5, 7.6, 8.1 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -0.6, 0.2, 20.7, 88.8, 122.4, 122.7, 125.6, 126.1, 126.2, 129.2, 133.2, 134.8, 135.3, 142.4, 146.8, 156.4, 168.2, 170.9
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 527.04844 Found, 527.04928 (+0.83 mmu)【００８７】
(b)エステラーゼ測定用蛍光プローブ
上記で得られた化合物についてエステラーゼ測定用蛍光プローブとしての機能を検討した。この化合物がエステラーゼ基質として機能する際の反応スキームは上記のとおりであり、R8及びR9として導入されたアセチル基が共に加水分解されて、開環状態の化合物となって強い赤色蛍光を発する。【００８８】
【化１３】
2013122189.tif 000017
【００８９】
diCl-2-COOH TM-ジアセチルとPLE(豚肝臓エステラーゼ)の酵素基質反応を検討した。0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-2-COOH TM-ジアセチル(1μM)及び0.1ユニットのPLEを加えて37℃で反応を行った。励起波長は591 nmとした。経時的な吸収及び蛍光の変化を図11に示す。また、diCl-2-COOH TM-ジアセチル及びFDA(フルオレセインジアセテート,  CAS[596-09-8]とPLEとのインビトロでの反応の経時的な蛍光強度変化を測定した結果を図12に示す(FDA：緑、diCl-2-COOH TM-ジアセチル：赤)。反応は0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-2-COOH TM-ジアセチル(1μM)又はFDA(1μM)と0.1ユニットのPLEを3分の時点で加えて37℃で反応を行った。FDAについては励起波長を491 nm、蛍光波長を509 nmとし、diCl-2-COOH TM-ジアセチルについては励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした。【００９０】
diCl-2-COOH TM-ジアセチルとPLEとの酵素基質反応における酵素濃度依存性を調べた。0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-2-COOH TM-ジアセチル(1μM)又はFDA(1μM)と種々の濃度のPLEを3分の時点で加えて37℃で反応を行った。励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした経時的な蛍光変化を測定した結果を図13に示す。【００９１】
(c)エステラーゼ阻害剤による阻害効果
1.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-2-COOH TM-ジアセチル(1μM)、0.1ユニットのPLE、及びエステラーゼ阻害剤として1 mM又は10 mMのAEBSFを3分の時点で加えて37℃で反応を行った。励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした経時的な蛍光変化を測定した結果を図14に示す。【００９２】
例9：生細胞染色用蛍光プローブ
(a)diCl-Si-half-calcein AM
例8で得たエステラーゼ測定用プローブに親水性置換基としてN,N'-ビス(アセトキシメチルオキシカルボニルメチル)アミノメチル基を導入した化合物を下記のスキームに従って製造した。
【化１４】
2013122189.tif 000018
【００９３】
(a)4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta ジエチルエステル
4',5'-ジクロロ-2-COOH TokyoMagenta (40.0 mg, 90.2 μmol)、イミノ二酢酸ジエチル (200 μL)、パラホルムアルデヒド(400 mg)をアセトニトリル (5.25 mL)と水(2.25 mL)の混合溶媒に懸濁し、アルゴン雰囲気下2日間加熱還流した。HPLCにて精製し、4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta ジエチルエステル (20.2 mg, 収率35%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.83 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 1.22 (t, 6H, J = 7.2 Hz), 3.41 (s, 4H), 3.80 (s, 2H), 4.10-4.14 (m, 4H), 6.69 (s, 1H), 6.85-6.87 (m, 2H), 6.98 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.49 (dd, 1H, J = 7.5, 8.1 Hz), 7.58 (dd, 1H, J = 7.5, 8.1 Hz), 7.89 (d, 1H, J = 7.5 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ -0.1, 0.5, 14.5, 55.0, 56.5, 62.1, 91.2, 119.6, 123.8, 124.3, 126.7, 127.1, 127.8, 127.9, 128.1, 130.2, 135.5, 135.7, 135.9, 136.3, 136.5, 153.9, 154.3, 158.7, 172.4, 172.9
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 644.12742 Found, 644.12867 (+1.24 mmu)【００９４】
(b)4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta (diCl-Si-half-calcein)
4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta ジエチルエステル (15.0 mg,  23.3 μmol)をメタノール(1.0 mL)に溶解し、そこに2N NaOH (1.0 mL, 2.0 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。メタノールを除去した後、HPLCにて精製し、4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta (11.0 mg, 収率80%)を得た。
1H NMR (300 MHz, DMF-d7): δ 0.82 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 3.20 (s, 4H), 3.74 (s, 2H), 6.74 (s, 1H), 6.92 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.10-7.13 (m, 2H), 7.56 (dd, 1H, J = 7.2, 8.1 Hz), 7.68 (dd, 1H, J = 7.2, 7.6 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 8.1 Hz)
13C NMR (100 MHz, D2O + NaOD): δ -3.3, -3.0, 56.5, 57.4, 122.3, 125.4, 126.8, 129.0, 129.2, 129.9, 130.4, 136.7, 137.3, 139.1, 139.7, 142.3, 143.5, 143.8, 144.2, 171.1, 173.7, 173.8, 175.3
HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 610.04677 Found, 610.04367 (-3.10 mmu)【００９５】
(c)3',6'-ビス(アセチルオキシ)-4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta ジアセトキシメチルエステル (diCl-Si-half-calcein AM)
4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta (8.0 mg, 13.6 μmol)を ピリジン (1.0 mL)に溶解し、そこに無水酢酸 (30.0 μL, 317 μmol)を加え、室温で3時間攪拌した。溶媒を除去した後、残渣をアセトニトリル (1.0 mL)に溶解した。そこにアルゴン雰囲気下、3時間ごとにN-エチルジイソプロピルアミン (9.0 μL, 51.7 μmol)とブロモメチル アセテート (5.1 μL, 46.1 μmol) ずつ4回加え、室温で攪拌した。HPLCにて精製し、3',6'-ビス(アセチルオキシ)-4',5'-ジクロロ-7'-[N,N'-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]-2-COOH TokyoMagenta ジアセトキシメチルエステル (1.8 mg, 収率16 %)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3 CN): δ 0.72 (s, 3H), 0.94 (s, 3H), 1.95 (s, 6H), 2.21 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 3.27 (s, 4H), 3.57-3.71 (m, 2H), 5.55 (s, 4H), 6.94 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.28 (s, 1H), 7.43-7.48 (m, 1H), 7.51-7.55 (m, 1H), 7.64 (d, 1H, J = 7.3 Hz)
HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 838.1102; Found, 838.1079 (-2.3 mmu)
HPLCによる分析(250 nmでの検出)で13.2分に単一ピークを与えた(eluent A (水, 0.1% 酢酸) and eluent B (80% アセトニトリル/水, 0.1% 酢酸), gradient A:B = 20: 80 to 0: 100 (10 min))。【００９６】
(d)diCl-Si-half-calcein AMとPLEの酵素基質反応を検討した。0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-Si-half-calcein AM(1μM)及び1.0ユニットのPLEを加えて37℃で反応を行った。励起波長は591 nmとした。経時的な吸収及び蛍光の変化を図15に示す。また、diCl-Si-half-calcein AMとPLEとの酵素基質反応における酵素濃度依存性を調べた。0.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-Si-half-calcein AM(1μM)と種々の濃度のPLEを3分の時点で加えて37℃で反応を行った。励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした経時的な蛍光変化を測定した結果を図16に示す。【００９７】
(e)エステラーゼ阻害剤による阻害効果
1.1% DMSOを含む3 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)にdiCl-Si-half-calcein AM(1μM)、1.0ユニットのPLE、及びエステラーゼ阻害剤として1 mM又は10 mMのAEBSFを3分の時点で加えて37℃で反応を行った。励起波長を591 nm、蛍光波長を607 nmとした経時的な蛍光変化を測定した結果を図17に示す。【００９８】
(f)diCl-Si-half-calcein AMを用いて生細胞内エステラーゼ活性のイメージングを行った。0.3%のジメチルスルホキシドを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中でHeLa細胞を3μMのdiCl-Si-half-calcein AMとともに37℃で30分間インキュベートした。PBSで2回洗った後にHBSS(ハンクス平衡塩)に置換し、落射蛍光顕微鏡IX-71(オリンパス)を用いて励起波長565-585 nm、検出波長600-690 nmにて観察した。結果を図18に示す。【００９９】
例10
β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子をstableに発現させたHEK293細胞(lacZ+)とコントロールとしてlacZ遺伝子を導入していないHEK293細胞(lacZ-)を用いてdiCl-2-COOH TM-monoβGal又はdiCl-2-COOH TM-diβGalにより細胞内のβ-ガラクトシダーゼを測定した。0.1%のDMSOを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHEK293細胞(lacZ+ or lacZ-)を10 μM のdiCl-2-COOH TM-monoβGal又はdiCl-2-COOH TM-diβGalとともに37℃で30分間インキュベーションした。共焦点顕微鏡SP5（Leica）で励起波長580 nm、蛍光波長630-650 nmにて観察した。結果を図19(diCl-2-COOH TM-monoβGal)及び図20(diCl-2-COOH TM-diβGal)に示す。水溶性の高いdiCl-2-COOH TM-diβGalに比べて１置換体のdiCl-2-COOH TM-monoβGalは細胞内の取り込み量が多いことから、細胞への応用に適していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2013122189.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
2013122189.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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2013122189.tif 000042
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