(57)【要約】  本発明は、以下の工程（１）を含む、ペプチドの製造方法を提供する。（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で求核性のない有機塩基により除去してＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得た後、酸で中和し、中和後の反応液に、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド、縮合剤および縮合促進剤を添加し、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドを縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを得る工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）を含む、ペプチドの製造方法；
（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で求核性のない有機塩基により除去してＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得た後、酸で中和し、中和後の反応液に、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド、縮合剤および縮合促進剤を添加し、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドを縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを得る工程。
【請求項２】
工程（１）の後に、極性溶媒でＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程（２）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（２）の後に、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基および／またはＣ末端のアンカー基を除去する工程（３）をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンカーが、下記式（Ｉ）：
【化１】
2012165546.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【化２】
2012165546.tif 000009
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミン、および
２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−ブロモフルオレンからなる群より選択される化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
求核性のない有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタンおよび１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネンからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
求核性のない有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
酸が、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸無水物、硫酸および塩化水素／エーテル溶液からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酸が、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩化水素／ジエチルエーテル、および塩化水素／シクロペンチルメチルエーテルからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
縮合促進剤が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルボン酸エチルエステル、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、またはＯ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェートである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アミジン構造を有する複素環式化合物による脱保護工程を有することを特徴とする、連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
【請求項１２】
保護基がＦｍｏｃ基であることを特徴とする、請求項１１に記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中間体の単離、精製操作を極力省略し、簡便な操作により高純度かつ高収率で目的とするペプチドを得ることが可能な工業的製造に適した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの製造方法には、固相法と液相法の他に、近年、反応を均一な液相で行い、反応後に溶媒組成を変化させ単離・精製を濾過および洗浄だけで行える保護基（以下、アンカー基ともいう。）を用いた製造方法（以下、アンカー法ともいう。）が提案されてきた。アンカー法は、ペプチド合成等においてアミノ酸またはペプチドのＣ末端および／または側鎖の官能基を保護するためのアンカー基を形成する化合物（アンカー）として、溶媒組成の変化に応じて溶解状態と不溶化（沈殿）状態とが可逆的に変化する特定の化合物を用いるペプチドの製造方法である。ここで、アンカー基とは、該基が反応基質に結合することにより非極性溶媒に可溶化し、液相中の反応が可能であると共に、極性溶媒の添加により沈殿し、固液分離が可能となる保護基を意味し、反応性と後処理の簡便性を兼ね備えたものである。アンカーとは、アンカー基を形成するための化合物を意味する。【０００３】
例えば、特許文献１および非特許文献１には、それぞれ３，４，５−トリ（ｎ−オクタデシルオキシ）ベンジルアルコールをカルボキシ基等の保護化試薬とする手法が開示されている。また、特許文献２〜４には、それぞれ３，５−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、トリチル型化合物等のアンカーが開示されている。【０００４】
本発明者もアンカー法に使用可能なアンカーとして既に特定のジフェニルメタン化合物（特許文献５）およびフルオレン化合物（特許文献６）を開発してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−４４４９３号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０４１６６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００７／０３４８１２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００７／１２２８４７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１０／１１３９３９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１０／１０４１６９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ  ７４，７３３−７３８（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記アンカー法は、ペプチド合成等の有機合成方法において、後処理が簡便でスケールアップが可能である等、固相反応と液相反応の利点を兼備した有用な手法であり、工業的な観点からも注目されているが、ペプチド合成等の逐次的に多段階の合成反応を必要とする場合においては、次工程で望ましくない副反応を起こさないために、各工程で濃縮、貧溶媒による沈殿、濾過、洗浄および乾燥という単離・精製操作を繰り返す必要があり、操作工程数が多いため、多大な時間とコストを要することが工業化への障壁となっている。【０００８】
また、上記トリチル型化合物（特許文献４）およびフルオレン化合物（特許文献６）以外のアンカーを使用する場合には、液相反応と同様、ペプチド合成においては、Ｎ末端の一時保護基の除去後に、濃縮、沈殿、濾過、洗浄および乾燥という単離・精製操作を行うとジケトピペラジンが副生するという問題点も有しており、特にＣ末端または２残基目にプロリンを有する配列を含む場合やＣ末端２残基がＤ体とＬ体アミノ酸など異なる光学活性アミノ酸の場合には、ジケトピペラジンの副生が顕著である。さらに、本発明者は、アンカー法においては、液相反応と異なり、ジケトピペラジン副生に伴い脱離したアンカー自体も、アンカー基で保護されたペプチドの単離工程で、目的物と共に沈殿するためペプチドの精製が困難であり、また脱離したアンカー由来のアミノ酸配列や鎖長の異なるペプチドも副生してくるため、目的物の収率低下や純度低下の原因となるという知見を得ている。【０００９】
本発明は、以上のような従来のアンカー法によるペプチド合成特有の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来の課題であったジケトピペラジンの副生を抑制すると共に、中間体の単離・精製操作を極力省略し、ワンポットで連続して行うことができる工程を組み込んだ、工業的にも有用なペプチドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、アミノ酸またはペプチドのＮ末端アミノ基の一時保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（以下、Ｆｍｏｃ基ともいう。）を有し、かつＣ末端カルボキシ基の保護基としてアンカーに由来するアンカー基を用いたペプチド鎖伸長工程において、Ｆｍｏｃ基を求核性のない有機塩基で除去後、酸で中和するだけで、一時保護基の脱保護工程から濃縮、沈殿、濾過、洗浄および乾燥という一連の単離・精製操作を省略して、続くＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドとの縮合反応まで連続してワンポットで行うことができることを見出した。また、当該製造方法により、従来のアンカー法によるペプチド合成反応において問題であったジケトピペラジンの副生を抑制することによりアンカー基の脱離を抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下の通りである。【００１１】
［１］  以下の工程（１）を含む、ペプチドの製造方法；
（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で求核性のない有機塩基により除去してＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得た後、酸で中和し、中和後の反応液に、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド、縮合剤および縮合促進剤を添加し、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドを縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを得る工程。
［２］  工程（１）の後に、極性溶媒でＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程（２）をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］  工程（２）の後に、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基および／またはＣ末端のアンカー基を除去する工程（３）をさらに含む、上記［２］に記載の方法。
［４］  アンカーが、下記式（Ｉ）：【００１２】
【化１】
2012165546.tif 000002
【００１３】
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：【００１４】
【化２】
2012165546.tif 000003
【００１５】
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、上記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］  式（Ｉ）で表される化合物が、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミン、および
２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−ブロモフルオレンからなる群より選択される化合物である、上記［４］に記載の方法。
［６］  求核性のない有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタンおよび１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネンからなる群より選択される、上記［１］〜［５］のいずれか一つに記載の方法。
［７］  求核性のない有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセンである、上記［１］〜［５］のいずれか一つに記載の方法。
［８］  酸が、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸無水物、硫酸および塩化水素／エーテル溶液からなる群より選択される、上記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］  酸が、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩化水素／ジエチルエーテル、および塩化水素／シクロペンチルメチルエーテルからなる群より選択される、上記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］  縮合促進剤が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルボン酸エチルエステル、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、またはＯ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェートである、上記［１］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］  アミジン構造を有する複素環式化合物による脱保護工程を有することを特徴とする、連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
［１２］  保護基がＦｍｏｃ基であることを特徴とする、上記［１１］に記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のペプチドの製造方法によれば、アミノ酸またはペプチドのＮ末端アミノ基の一時保護基であるＦｍｏｃ基の除去工程、中和工程、および続くＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドとの縮合工程を、中間体の単離・精製操作を行うことなく、連続してワンポットで行うことができるので、工業的製造に適した簡便かつ効率的なペプチドの製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、従来ジケトピペラジンが副生するため、収率良く合成するのが困難であった特定の配列を含むペプチド鎖伸長工程において、不純物ペプチド化合物の副生は抑制され、高純度および高収率で目的とするペプチド化合物を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
本発明の方法により製造されるペプチドの構成単位となるアミノ酸は、同一分子内にアミノ基とカルボキシ基を有する化合物であって、天然アミノ酸でも、非天然アミノ酸でもよく、またＬ体でも、Ｄ体でも、あるいはラセミ体でもよい。また、ペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、アミノ酸成分のアミノ基と、別のアミノ酸成分のカルボキシ基との脱水縮合工程（縮合工程）を繰り返すことにより合成される。以下、このペプチド結合の形成に関与する２つのアミノ酸成分の内、アミノ基を提供するものをアミン成分、カルボキシ基を提供するものを酸成分と称することがある。
【００１９】
本発明における縮合工程に使用される酸成分のＮ末端アミノ基の保護基は、Ｆｍｏｃ基である。
【００２０】
本明細書において、「Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸」または「Ｎ−Ｆｍｏｃペプチド」とは、そのＮ末端アミノ基がＦｍｏｃ基で保護されており、カルボキシ基が保護されていないアミノ酸またはペプチドを意味する。
【００２１】
本明細書において、「Ｃ−保護アミノ酸」または「Ｃ−保護ペプチド」とは、そのＣ末端カルボキシ基が、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカー（例えば、ベンジル化合物、ジフェニルメタン化合物、またはフルオレン化合物）と縮合して、アンカー基を形成することにより保護されており、Ｎ末端アミノ基が保護されていないアミノ酸またはペプチドを意味する。
【００２２】
本明細書において、「Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸」または「Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチド」とは、上記「Ｃ−保護アミノ酸」または「Ｃ−保護ペプチド」のＮ末端アミノ基が一時保護基であるＦｍｏｃ基で保護されたものを意味する。
【００２３】
本発明におけるハロゲン系溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素が挙げられる。ハロゲン系溶媒は、２種以上の混合溶媒でもよい。ハロゲン系溶媒の中では、クロロホルムおよびジクロロメタンが特に好ましい。
【００２４】
本発明におけるエーテル系溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル（以下、ＣＰＭＥと称することもある。）、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと称することもある。）等が挙げられる。エーテル系溶媒は、２種以上の混合溶媒でもよい。エーテル系溶媒の中でもＣＰＭＥおよびＴＨＦが特に好ましい。
【００２５】
本発明における極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等、ならびにこれら２種以上の混合溶媒が挙げられる。中でも、メタノールまたはアセトニトリルが好適に使用される。本発明における極性溶媒としては、特に実用的観点からメタノールが好ましい。
【００２６】
本発明におけるハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーの一実施態様は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。これらの中でも、分子量４００以上のものが好ましい。
【００２７】
式（Ｉ）：
【００２８】
【化３】
2012165546.tif 000004
【００２９】
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【００３０】
【化４】
2012165546.tif 000005
【００３１】
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、またはハロゲン原子を示す。］
【００３２】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーは、保護化を意図する化合物と結合する。すなわち、Ｙが、ヒドロキシ基、−ＮＨＲ基、またはハロゲン原子であるアンカーは、アミノ酸またはペプチドのＣ末端等のカルボキシ基と縮合することにより、化合物を保護化する。
【００３３】
本明細書中、Ｒで示される「アルキル基」としては、直鎖または分岐鎖のＣ１−３０アルキル基が挙げられ、好ましくはＣ１−１０アルキル基、より好ましくはＣ１−６アルキル基である。好適な具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられ、特にメチル、エチルが好ましい。
【００３４】
本明細書中、Ｒで示される「アラルキル基」としては、Ｃ７−３０アラルキル基が挙げられ、好ましくはＣ７−２０アラルキル基、より好ましくはＣ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）である。好適な具体例としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられ、特にベンジルが好ましい。
【００３５】
Ｒとしては、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基が好ましく、水素原子、メチル、エチルまたはベンジルがより好ましく、水素原子が特に好ましい。
【００３６】
本明細書中、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。本明細書中、Ｙで示される「ハロゲン原子」としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が好ましく、臭素原子がより好ましい。
【００３７】
本明細書中、Ｒ２またはＲ４として示される「脂肪族炭化水素基を有する有機基」とは、その分子構造中に脂肪族炭化水素基を有する１価の有機基である。
【００３８】
「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖または分岐状の飽和または不飽和の脂肪族炭化水素基であり、炭素数５以上の脂肪族炭化水素基が好ましく、炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基がより好ましく、炭素数５〜３０の脂肪族炭化水素基がさらに好ましく、炭素数１０〜３０の脂肪族炭化水素基が特に好ましい。
「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における「脂肪族炭化水素基」の部位は、特に限定されず、末端に存在しても（１価基）、それ以外の部位に存在してもよい（例えば２価基）。
【００３９】
「脂肪族炭化水素基」としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ラウリル基、トリデシル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基、オレイル基、イソステアリル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が挙げられる。
【００４０】
「脂肪族炭化水素基を有する有機基」中の「脂肪族炭化水素基」以外の部位は任意に設定することができる。例えば、リンカーとして−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、および−ＣＯＮＨ−、並びに、炭化水素基（１価基または２価基）等の部位を有していてもよい。「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が用いられる。「アルキル基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基等が好ましく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。「アルケニル基」としては、例えば、Ｃ２−６アルケニル基等が好ましく、例えば、ビニル、１−プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。「アルキニル基」としては、例えば、Ｃ２−６アルキニル基等が好ましく、例えば、エチニル、プロパルギル、１−プロピニル等が挙げられる。「シクロアルキル基」としては、例えば、Ｃ３−６シクロアルキル基等が好ましく、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。「アリール基」は、例えば、Ｃ６−１４アリール基等が好ましく、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。中でもＣ６−１０アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。「アラルキル基」としては、例えば、Ｃ７−２０アラルキル基が好ましく、例えば、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられる。中でも、Ｃ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）がより好ましく、ベンジルが特に好ましい。当該「炭化水素基」は、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子）、１個以上のハロゲン原子により置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、オキソ基等から選択される置換基で置換されていてもよい。
【００４１】
上記式（Ｉ）中のＯＲ２基またはＯＲ４基を構成する「脂肪族炭化水素基を有する有機基」は、分岐等によって複数の「脂肪族炭化水素基」が存在してもよい。「脂肪族炭化水素基を有する有機基」中に「脂肪族炭化水素基」が複数存在する場合には、その各々は同一のものであっても異なるものであってもよい。
【００４２】
上記式（Ｉ）中のＲ２またはＲ４として示される「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における、炭素数合計の下限は５が好ましく、１０がより好ましく、１２が更に好ましく、１４が更に一層好ましく、１６が殊更好ましく、２０が特に好ましい。一方、Ｒ２またはＲ４として示される「脂肪族炭化水素基を有する有機基」における、炭素数合計の上限は、２００が好ましく、１５０がより好ましく、１２０が更に好ましく、１００が更に一層好ましく、８０が殊更好ましく、６０が特に好ましく、４０が特に一層好ましく、３０が最も好ましい。当該炭素数が大きいほど、ペプチド鎖が長鎖となった場合でも、式（Ｉ）で表される化合物の極性溶媒における結晶性が良好となる。
【００４３】
「ＯＲ２」基または「ＯＲ４」基の好適な具体例として、ドデシルオキシ、セチルオキシ、オクタデシルオキシ、ドコシルオキシ、ドコシルオキシ−ドデシルオキシ、トリアコンチルオキシ等が挙げられる。「ＯＲ２」基または「ＯＲ４」基は合計でｐまたはｒ個存在し（ｐは１〜４の整数であり、ｒは０〜４の整数である。）、ｐは好ましくは２または３であり、ｒは好ましくは０〜２の整数である。
【００４４】
上記式（Ｉ）中の環Ａまたは環Ｂ中に有していてもよい置換基の好適な具体例としては、Ｃ１−６アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等のＣ１−４アルコキシ基）、１個以上のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等のＣ１−６アルキル基、トリフルオロメチル、トリクロロメチル等のハロゲン置換されたＣ１−６アルキル基）、またはハロゲン原子が挙げられ、中でもＣ１−６アルコキシ基が好ましい。
【００４５】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの好ましい態様としては、式（Ｉ）中、Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒ１が水素原子であり；
Ｒ２および／またはＲ４が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり；
ｐが１〜３の整数であり；
ｒが０〜２の整数である化合物である。
【００４６】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数５〜６０の脂肪族炭化水素基であり；
ｐが１〜３の整数である化合物である。
【００４７】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１０〜４０のアルキル基であり；
ｐが２または３である化合物である。
【００４８】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルキル基であり；
ｐが２または３である化合物である。
【００４９】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するベンジル基であり；
ｐが１〜３の整数である化合物である。
【００５０】
上記式（Ｉ）で表されるアンカーの別の好ましい態様としては、式（Ｉ）中、
Ｙがヒドロキシ基であり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ１が共に水素原子であり；
Ｒ２が炭素数１２〜３０のアルコキシ基を１〜３個有するシクロヘキシルメチル基であり；
ｐが１〜３の整数である化合物である。
【００５１】
本発明におけるハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーの好ましい例としては、以下のアンカーが挙げられる。
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミン、および
２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−ブロモフルオレン。
【００５２】
前記アンカーの製造方法としては、特に限定されないが、自体公知の方法（特許文献１〜６、非特許文献１参照）またはこれらに準ずる方法に従って原料化合物から製造することができる。なお、原料化合物として使用する化合物、例えば、式（Ｉ）の基Ｒ２またはＲ４に対応するハロゲン化物等は、市販品として入手可能であるか、あるいは、自体公知の方法またはこれらに準ずる方法に従って製造することができる。
【００５３】
本発明に使用する酸成分およびアミン成分であるアミノ酸またはペプチドは、ペプチド結合の形成に関与するアミノ基またはカルボキシ基に加えて、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基等の脱水縮合反応に供される官能基を有する場合が多い。これらの官能基を、主鎖のペプチド結合を形成するアミノ基およびカルボキシ基と区別して、側鎖官能基と称する。側鎖官能基は、本発明の本質を損なわない限り、必ずしも保護する必要はないが、脱水縮合反応によるペプチド結合の形成、ならびにＮ末端アミノ基の脱保護反応時に、望ましくない副反応を防ぐために、適切な保護基により保護するのが好ましい。
【００５４】
側鎖官能基の保護基は、前述のアミン成分におけるＣ末端カルボキシ基の保護基と同様に、Ｎ末端アミノ基の保護基との組み合わせにおいて、一定の制約を受ける。すなわち、側鎖官能基の保護基は、Ｎ末端アミノ基の保護基であるＦｍｏｃ基の除去条件においても除去されることなく、所望のアミノ酸配列が完成するまで保持される必要がある。尚、当該保護基は、脱水縮合反応によるペプチド結合の形成、並びに、Ｎ末端アミノ基の脱保護反応時に、側鎖官能基が望ましくない副反応を引き起こさなければ特に限定されない。
【００５５】
側鎖官能基の保護基としては、Ｎ末端アミノ基の保護基（一時保護基）であるＦｍｏｃ基の脱保護条件において安定であれば、特に限定されず、例えば、ペプチド合成の基礎と実験、丸善株式会社出版（１９８５年）や、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている保護基を挙げることができる。
【００５６】
側鎖官能基がカルボキシ基である場合は、エステル型保護基、アミド型保護基、ヒドラジド型保護基等を挙げることができる。
【００５７】
エステル型保護基としては、置換若しくは無置換のアルキルエステル、置換若しくは無置換のアラルキルエステルが好ましく用いられる。置換若しくは無置換のアルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、シクロヘキシルエステル、トリクロロエチルエステル、フェナシルエステル等が好ましく用いられる。置換若しくは無置換のアラルキルエステルとしては、ベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ジフェニルメチルエステル、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）エステル、４−ピコリル（Ｐｉｃ）エステル等が好ましく用いられる。
【００５８】
アミド型保護基としては、無置換のアミド、Ｎ−メチルアミド、Ｎ−エチルアミド、Ｎ−ベンジルアミド等の１級アミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド、ピロリジニルアミド、ピペリジニルアミド等の２級アミド等が好ましく用いられる。
【００５９】
ヒドラジド型保護基としては、無置換のヒドラジド、Ｎ−フェニルヒドラジド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルヒドラジド等が好ましく用いられる。
【００６０】
中でも、Ｆｍｏｃ基の脱保護条件下で安定なｔ−ブチルエステル、置換若しくは無置換のベンジルエステル等のエステル型保護基が好ましく用いられ、置換若しくは無置換のベンジルエステルが、比較的合成が容易であることから、特に好ましく用いられる。
【００６１】
側鎖官能基がアミノ基である場合は、ウレタン型保護基、アシル型保護基、スルホニル型保護基等を挙げることができる。
【００６２】
ウレタン型保護基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基等が用いられ、好ましくは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、Ｂｏｃ基等である。中でもＢｏｃ基は、穏和な酸性条件下で選択的に脱保護ができることから、特に好ましく用いられる。
【００６３】
アシル型保護基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等が好ましく用いられる。
【００６４】
スルホニル型保護基としては、例えば、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）基、ｐ−トリルメタンスルホニル基、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基等が好ましく用いられる。
【００６５】
上記以外の側鎖官能基についても、同様にＮ末端アミノ基の保護基（一時保護基）であるＦｍｏｃ基の脱保護条件において安定なものを選んで用いることができる。
【００６６】
側鎖官能基は目的のペプチド結合を形成した後に、必要に応じて脱保護すればよい。
【００６７】
次に、本発明の製造方法について説明する。本発明の製造方法は、ペプチドの製造方法であって、以下の工程（１）を含むことを特徴とする。
（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で求核性のない有機塩基により除去してＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得た後、酸で中和し、中和後の反応液に、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド、縮合剤および縮合促進剤を添加し、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドを縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを得る工程（Ｎ末端の脱保護工程およびそれに続く縮合工程）。
【００６８】
本発明の製造方法における工程（１）にて使用するＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドは、以下の工程（ａ）によって製造することができる。以下では、工程（１）の説明の前に、まず工程（ａ）から説明する。
【００６９】
工程（ａ）（Ｃ末端の保護工程）
本工程は、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーをＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−ＦｍｏｃペプチドのＣ末端と縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを得る工程である。
【００７０】
本工程で使用するＮ−Ｆｍｏｃペプチドが、本工程で使用する溶媒に可溶である限り、Ｎ−Ｆｍｏｃペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、Ｎ−Ｆｍｏｃペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下である。
【００７１】
縮合反応は、アンカー、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドおよび触媒量のジメチルアミノピリジンを溶媒に溶解させ、縮合剤（および必要に応じて縮合促進剤）を加えた後、攪拌して行うことが好ましい。
【００７２】
本工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。当該溶媒における溶解度が高い程、優れた反応性が期待できるため、前記Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドの溶解度の高い溶媒を選択することが好ましい。具体的にはクロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；１，４−ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、上記ハロゲン系溶媒やエーテル系溶媒に、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；アセトン、２−ブタノン等のケトン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類を、本発明の製造方法で用いられる化合物が溶解し得る限り、適宜の割合で混合して用いてもよい。中でも、クロロホルム、ジクロロメタン、シクロペンチルメチルエーテルまたはテトラヒドロフランが好ましく、クロロホルムが特に好ましい。
【００７３】
本工程におけるＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドの溶液中の濃度は、溶解していれば特に限定されないが、好ましくは１〜３０ｗｔ％である。
【００７４】
本工程におけるＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドの使用量は、前記アンカー１モルに対し、１〜１０モル使用することができ、好ましくは１〜５モルである。
【００７５】
Ｙが、ヒドロキシ基の場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、ジメチルアミノピリジン触媒下、縮合剤、および必要に応じて縮合促進剤を添加することにより、エステル結合が形成される。
【００７６】
Ｙが、−ＮＨＲ基の場合、縮合促進剤存在下、縮合剤を添加してアミド結合が形成される。
【００７７】
Ｙが、ハロゲン原子の場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を添加することにより、エステル結合が形成される。
【００７８】
縮合促進剤としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルボン酸エチルエステル（ＨＯＣｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）等が挙げられ、好ましくは、ＨＯＢｔである。
【００７９】
縮合促進剤の使用量は、前記アンカー１モルに対して、好ましくは０．０５〜１．５モルである。
【００８０】
縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
【００８１】
縮合剤の使用量は、前記アンカー１モルに対して、例えば１〜１０モルであり、好ましくは１〜５モルである。
【００８２】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、好ましくは−１０℃以上、より好ましくは０℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。反応時間は、例えば、１〜７０時間である。
【００８３】
このようにして得られた反応混合物に含まれるＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドの単離は、反応溶媒を減圧濃縮後、前記した極性溶媒の添加により沈殿させ、沈殿物を固液分離（濾過）し、アセトニトリルで洗浄することにより行うことができる。本工程で使用する極性溶媒としては、例えば、メタノール、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはメタノールである。
【００８４】
工程（１）（Ｎ末端の脱保護工程およびそれに続く縮合工程）
本工程は、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を求核性のない有機塩基で処理することにより除去してＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得、次いで中和した後、単離・精製操作を行うことなく、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドとＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドとを脱水縮合させる工程である。
【００８５】
本工程で使用するＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドが、本工程で使用する溶媒に可溶である限り、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下である。また、本工程で使用するＣ−保護ペプチドが、本工程で使用する溶媒に可溶である限り、Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下ある。
【００８６】
以下では、工程（１）を、工程（１−１）（Ｎ末端の脱保護工程）および工程（１−２）（縮合工程）に分けて説明する。
【００８７】
工程（１−１）（Ｎ末端の脱保護工程）
Ｆｍｏｃ基の除去（脱保護）は、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で、求核性のない有機塩基で処理することにより行われる。脱保護は、その反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
【００８８】
求核性のない塩基としては、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタン（ＤＡＢＣＯ）、および１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネン（ＤＢＮ）等が挙げられ、ＤＢＵおよびＤＢＮが好ましく、ＤＢＵがより好ましい。
【００８９】
ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒は、いずれも、２種以上の混合溶媒であってもよい。ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒は、好ましくはクロロホルム、ジクロロメタン、ＴＨＦまたはＣＰＭＥである。
【００９０】
当該脱保護工程において、Ｆｍｏｃ基の除去の際に汎用されるジメチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジン、モルホリン等の求核性を有する有機塩基（２級アミン類）をクロロホルム等の非極性有機溶媒中で使用した場合には、反応を完結させるために大過剰量の有機塩基を要する。また、求核性塩基を使用すると、次の縮合工程において、酸成分がアミド化されるという副反応も起こる。これに対し、前記求核性のない塩基を本工程に使用すれば、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中でも、脱保護反応が完結する。求核性のない塩基の使用量は、反応基質（Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチド）に対して、好ましくは０．８当量以上、より好ましくは１当量以上であり、好ましくは５当量以下、より好ましくは３当量以下である。
【００９１】
本工程において、ワンポット化を実現するためには、次のＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドとＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドとの縮合反応において、悪影響（新たに加える酸成分であるＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド自体のＮ末端の脱保護等の副反応）を及ぼす有機塩基を除去する必要がある。そこで、本工程においては、脱保護工程後の反応液に酸の添加を行う中和工程を組み込むことが必須である。
【００９２】
中和工程に使用する酸としては、例えば、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸無水物、硫酸、塩化水素／エーテル溶液等が挙げられる。中でも、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩化水素／ジエチルエーテルおよび塩化水素／シクロペンチルメチルエーテルが好ましい。
【００９３】
酸の使用量は、求核性のない有機塩基１モルに対して、好ましくは０．５モル以上、より好ましくは０．９モル以上であり、好ましくは１．１モル以下、より好ましくは１．０モル以下である。
【００９４】
工程（１−１）の反応の温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、好ましくは−１０℃以上、より好ましくは０℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。工程（１−１）の反応の時間は、例えば、１〜７０時間である。
【００９５】
工程（１−２）（縮合工程）
本工程は、工程（１−１）における中和工程後の反応液に、直接Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド、縮合剤および縮合促進剤を添加することにより、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドを縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを得る工程である。
【００９６】
本工程は、前記工程（ａ）に記載の縮合剤、縮合促進剤等を使用し、ペプチド化学の分野において一般的に用いられるペプチド合成条件下で行われる。本工程において、特に好ましい縮合剤、および縮合促進剤の組合せは、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）である。
【００９７】
縮合促進剤の使用量は、前記Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチド１モルに対して、好ましくは０．０５モル以上、より好ましくは０．９モル以上であり、好ましくは１．５モル以下、より好ましくは１．１モル以下である。
【００９８】
本発明の製造方法は、工程（１）の後に、極性溶媒でＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程（２）（沈殿工程）をさらに含んでいてもよい。以下、工程（２）について説明する。
【００９９】
工程（２）（沈殿工程）
本工程は、上記工程（１）で得られた縮合物（Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチド）を単離するために、該縮合物が溶解している溶媒を変化させ（例、溶媒組成の変更、溶媒の種類の変更）、沈殿させる工程である。すなわち、縮合物が溶解するような条件下にて反応を行った後、溶媒置換することによって縮合物を沈殿化および固液分離、続くスラリー洗浄により不純物を淘汰する。溶媒置換の前に、溶媒留去などを行ってもよい。置換溶媒としては、メタノールやアセトニトリル等の極性溶媒を用いる。すなわち化合物が溶解するような条件下にて反応を行い、反応後、溶媒置換としては、例えば溶解にはハロゲン系溶媒等を用いて、沈殿化にはメタノールやアセトニトリル等の極性溶媒を用いる。
【０１００】
上記工程（１）および（２）を２回以上繰り返して、ペプチド鎖を伸長させたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドを取得してもよい。ペプチド鎖を伸長させたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドが、工程（１）で使用する溶媒に可溶である限り、ペプチド鎖を伸長させたＮ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのアミノ酸残基数の上限に特に限定は無いが、このアミノ酸残基数は、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下、さらに好ましくは５０以下である。
【０１０１】
本発明のペプチドの製造方法は、工程（２）の沈殿工程の後に、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基および／またはＣ末端のアンカー基を除去する工程（３）をさらに含むことができる。Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去は、例えば、上記した工程（１）に準じて行われる。
【０１０２】
Ｃ末端のアンカー基の除去は、上記工程（２）の沈殿工程の後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去に続き、またはＦｍｏｃ基の除去に先立って行われる。これによりペプチドのＣ末端が−ＣＯＯＨ（例えば、前記式（Ｉ）のＹが、ヒドロキシ基またはハロゲン原子の場合）、または−ＣＯＮＨＲ（例えば、前記式（Ｉ）のＹがＮＨＲ基の場合）である最終目的物であるペプチドが得られる。
【０１０３】
前記式（Ｉ）のＹが、ヒドロキシ基またはハロゲン原子であるアンカー由来のアンカー基を選択的に除去する場合には、脱保護は好適には酸処理により行われる。脱保護に使用する酸としては、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡという。）、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも、ＴＦＡが好ましい。脱保護に使用する溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンまたはこれらの混合溶媒等が挙げられる。脱保護に使用する酸の濃度は、例えば、０．１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％である。
【０１０４】
前記式（Ｉ）のＹが、ヒドロキシ基、−ＮＨＲ基、またはハロゲン原子である芳香族化合物（アンカー）由来のアンカー基を、ペプチド中の他の側鎖の保護基と同時に除去することも可能である。その場合には、当該分野、特にペプチド合成、において行われている慣用の方法が用いられるが、酸などを加える方法が好適に採用される。酸としてＴＦＡ、塩酸、硫酸、メシル酸、トシル酸、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール等が使用される。中でもＴＦＡが特に好ましい。酸の使用量は、用いる酸の種類によって適宜設定され、アンカー基を除去するのに適当な量が用いられる。酸の使用量は、Ｎ−Ｆｍｏｃ Ｃ−保護ペプチド１モルに対して、好ましくは３モル以上、より好ましくは５モル以上であり、好ましくは１００モル以下、より好ましくは５０モル以下である。これらの使用とともに、更なる強酸源として、トリフルオロメタンスルホン酸や、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、ＢＦ３・エーテラートなどを加えることもできる。
【０１０５】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、０℃〜５０℃が好ましく、０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、例えば０．５〜２４時間である。
【０１０６】
上記工程（ａ）、工程（１）および工程（３）における反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。すなわち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。また、本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。【０１０８】
実施例で使用したアンカーは、自体公知の方法（前記特許文献１〜６、非特許文献１参照）またはこれに準ずる方法、あるいは下記参考例１またはこれに準ずる方法に従って、公知（または市販品）の原料化合物から製造することができる。【０１０９】
参考例１：４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコールの合成
（ｉ）３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール(８３．０ｇ，９０．８ｍｍｏｌ)をクロロホルム(８３０ｍｌ)に溶解し、０℃で塩化チオニル(２１．６ｇ，０．１８２ｍｏｌ)を加えて１．５時間室温で攪拌した。溶媒を留去し、残渣をアセトニトリル(８００ｍｌ)で晶析して３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルクロリドを湿晶として９３．６ｇを得た。【０１１０】
（ｉｉ）３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルクロリド(９３．６ｇ，ｗｅｔ，<９０．８ｍｍｏｌ)、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒド(１５．２ｇ，０．１０ｍｏｌ)、炭酸カリウム(３１．４ｇ，０．２３ｍｏｌ)をＤＭＦ(８３０ｍｌ)に懸濁し、８０℃で一晩攪拌した。反応液をクロロホルム(１６００ｍｌ)に溶解し、１Ｎ塩酸(８００ｍｌ)で３回、５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液(８００ｍｌ)で1回、２０ｗｔ％食塩水(８００ｍｌ)で１回洗浄した。溶媒を留去し、残渣をメタノール(８００ｍｌ)で晶析し、アセトニトリル(８００ｍｌ)で洗浄して、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンズアルデヒド（９３．５ｇ，８９．２ｍｍｏｌ，収率９８％）を得た。【０１１１】
（ｉｉｉ）４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンズアルデヒド（９３．５ｇ，８９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ−メタノール（１８７０ｍｌ＋９４ｍｌ）に溶解し、０℃で水素化ホウ素ナトリウム（４．０５ｇ，１０７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１．５時間攪拌した後、０℃で０．２Ｎ塩酸（１００ｍｌ）を加えて反応を停止した。溶媒を半分程度留去し、クロロホルム（２４００ｍｌ）に溶解して０．１Ｎ塩酸（１２００ｍｌ）で２回、５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液（１２００ｍｌ）で１回、２０ｗｔ％食塩水（１２００ｍｌ）で１回洗浄した。溶媒を留去し、残渣をメタノール（９００ｍｌ）で晶析し、アセトニトリルで洗浄して４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール（９２．４ｇ，８８．０ｍｍｏｌ，収率９７％（vs ３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール）)を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ０．８８（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｃ１７Ｈ３４−Ｍｅ），１．１５−１．４０（８４Ｈ，ｂｒ，Ｃ３’，４’，５’−ＯＣ３Ｈ６−Ｃ１４Ｈ２８−ＣＨ３），１．４０−１．５５（６Ｈ，ｂｒ，Ｃ３’，４’，５’−ＯＣ２Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ１５Ｈ３１），１．７０−１．８５（６Ｈ，ｍ，Ｃ３’，４’，５’−ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ１６Ｈ３３），２．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＯＨ），３．７９（３Ｈ，ｓ，Ｃ４−ＯＭｅ），３．９０−４．０３（６Ｈ，ｍ，Ｃ３’，４’，５’−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ１７Ｈ３５），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ａｒ−ＣＨ２−ＯＨ），４．９７（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｏ−ＣＨ２−Ａｒ），６．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．１Ｈｚ，Ｃ５−Ｈ），６．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ３−Ｈ），６．６０（２Ｈ，ｓ，Ｃ２’，６’−Ｈ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｃ６−Ｈ）【０１１２】
実施例１：脱保護工程（Ｆｍｏｃ基の除去工程）、中和工程およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨとの脱水縮合工程を連続してワンポットで行うＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）からのジペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７））の合成
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール（以下、Ｂｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）−ＯＨと表記することもある。）（３．０ｇ, ３．２８ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１．３当量）をクロロホルム中に溶解させ、氷冷下でＥＤＣ・ＨＣｌ（１．４当量）、ジメチルアミノピリジン（０．１当量）を加えて攪拌した。反応完結後、溶媒を留去してＭｅＯＨ（４５ｍｌ）を加えて攪拌後、沈殿物をろ過し、アセトニトリルで洗浄し乾燥させた。
得られたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）をクロロホルムに溶解させ、氷冷下でＤＢＵ（１．０当量）を加えて攪拌した。脱保護反応完結後、ＨＣｌ／ＣＰＭＥ溶液をＤＢＵに対して０．９５当量加えた後、ＨＯＢｔ（１．０当量）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１．１当量）を加え、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）を添加して攪拌した。縮合反応完結後、溶媒を留去してＭｅＯＨ（４５ｍｌ）を加えて攪拌し、沈殿物をろ過してアセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥させることにより、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）（４．０４ｇ，３．１９ｍｍｏｌ，収率９７％）を得た。
ＴＯＦ−ＭＳ（＋）＝１４６８．１【０１１３】
なお、実施例１で使用した測定機器およびその条件は以下の通りである。
測定機器：Ｗａｔｅｒｓ社製  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
サンプルコーン電圧：８６Ｖ
ディソルレーション温度：３５０℃
ソース部温度：１２０℃
ＬＣ部
溶媒：トリフルオロ酢酸水溶液（トリフルオロ酢酸濃度：０．０５ｖ／ｖ％）−ＭｅＣＮとＴＨＦとの混合溶媒（ＭｅＣＮ濃度：０．０５ｖ／ｖ％）
カラム：ＡＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１×５０ｍｍ
温度：４０℃
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
波長：２２０ｎｍ
注入量：２μｌ【０１１４】
実施例２：脱保護工程（Ｆｍｏｃ基の除去工程）、中和工程およびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨとの脱水縮合工程を連続してワンポットで行うＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）からのトリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７））の合成
実施例１と同様の方法により得られたＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）（４００ｍｇ）を、クロロホルム（５ｍｌ）に溶解させ、氷冷下でＤＢＵ（１．０当量）を加えて攪拌した。脱保護反応完結後、ＨＣｌ／ＣＰＭＥ溶液をＤＢＵに対して０．９７当量加え、ＨＯＢｔ（１．０当量）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１．１当量）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）添加して攪拌した。縮合反応が完結後、溶媒を留去してＭｅＯＨ（５ｍｌ）を加えて攪拌し、沈殿物をろ過してアセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥させることによりＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）（４１５ｍｇ）を得た。得られた固形物中のＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）−ＯＨの量は、実施例１と同じ条件で測定したところ、目的物の０．９ｍｏｌ％であった。
ＴＯＦ−ＭＳ（＋）＝１３６１．５【０１１５】
実施例３：脱保護工程（Ｆｍｏｃ基の除去工程）、中和工程およびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨとの脱水縮合工程を連続してワンポットで行うＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｏ−アンカー基からのトリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｏ−アンカー基）の合成
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール（以下、ＨＯ−Ｂｚｌ（２−ＴＯＢ−４−ＯＭｅ）と表記することもある。）を出発原料とした以外は、実施例１と同様の方法により得られたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＢｚｌ（２−ＴＯＢ−４−ＯＭｅ）（９．０ｇ（４．９０ｍｍｏｌ））を、クロロホルム（９０ｍｌ）に溶解させ、氷冷下でＤＢＵ（８７０ｍｇ，１．２当量）を加えて攪拌した。脱保護反応完結後、メタンスルホン酸（５２２ｍｇ，ＤＢＵに対して０．９５当量）を加え、ＨＯＢｔ（６４０ｍｇ，１．０当量）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．５６ｇ，１．１当量）、およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１．１１ｇ，１．２当量）を添加して攪拌した。縮合反応が完結後、溶媒を留去してＭｅＯＨ（９０ｍｌ）を加えて攪拌し、沈殿物をろ過してアセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥させることによりＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＢｚｌ（２−ＴＯＢ−４−ＯＭｅ）（９．０４ｇ，４．７７ｍｍｏｌ，収率９９％）を得た。得られた固形物中の分解したＢｚｌ（２−ＴＯＢ−４−ＯＭｅ）−ＯＨの量は、実施例１と同じ条件で測定したところ、目的物の１ｍｏｌ％であった。
ＴＯＦ−ＭＳ（＋）＝１８９３．２【０１１６】
実施例４：脱保護工程（Ｆｍｏｃ基の除去工程）、中和工程、およびＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨとの脱水縮合工程を連続してワンポットで行い、さらに、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨによるペプチド鎖伸長工程もワンポットで行うことによるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ−アンカー基からのトリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｏ−アンカー基）の合成
２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−ブロモフルオレン１．０ｇとＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（２当量）をクロロホルムに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２当量）を加えて６０℃で攪拌した。反応完結後、溶媒を留去してメタノール５ｍｌ加えて攪拌し、沈殿物をろ過してアセトニトリルで洗浄し減圧乾燥させた。その固体をクロロホルムに溶解させて氷冷下でＤＢＵ（１．５当量）を加えて脱Ｆｍｏｃ化させた。反応完結後にＨＣｌ／ＣＰＭＥ溶液をＤＢＵに対して０．９５当量加え、ＨＯＢｔ（１．０当量）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１．１当量）を添加して、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）添加して攪拌した。縮合反応が完結後、溶媒を留去してメタノール５ｍｌ加えて攪拌し、沈殿物をろ過してアセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥させてＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｏ−アンカー基を１．２８ｇ得た。この固形物１ｇを更に上記と同様の操作により脱Ｆｍｏｃ化、続く縮合反応に付すことによりＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＧｌｙＯ−アンカー基を１．０４ｇ得た。得られた固形物中の分解した２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−フルオレノールの量は、実施例１と同じ条件で測定したところ、目的物の０．２面積％であった。
ＴＯＦ−ＭＳ（＋）＝１２３２．５【０１１７】
実験例１：Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）の脱保護反応（Ｆｍｏｃ基の除去）におけるジケトピペラジン副生に及ぼす各種有機塩基および溶媒の影響【０１１８】
実験方法
実施例１で得られたジペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７））をクロロホルムまたはＣＰＭＥに溶解させて、各種塩基を用いて２．５時間、脱保護反応に付した後、ジケトピペラジン副生に伴い分解して生成する３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコールの量を、目的物の収量に対する相対的な比率としてＨＰＬＣにより測定した。【０１１９】
実験結果
有機塩基として求核性のないＤＢＵを使用した場合、エーテル系溶媒であるＴＨＦ、ハロゲン系溶媒であるクロロホルムのいずれの溶媒中でも、アンカー基の脱離はほとんどみられず、ジケトピペラジン副生を抑えることができた。一方、求核性を有するジエチルアミンまたはピペリジンを使用した場合には、アンカー基の脱離量が顕著に増加したことから、ジケトピペラジンが大量に副生することが分かった。【０１２０】
【表１】
2012165546.tif 000006
【０１２１】
実験例２：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７）合成反応におけるジケトピペラジンの副生についての本発明のワンポット合成法（Ａ法：実施例２）と従来の逐次合成法（Ｂ法、Ｃ法）との比較【０１２２】
実験方法
下記のＢ、Ｃ各方法によりトリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（３，４，５−ＯＣ１８Ｈ３７））を製造した場合のジケトピペラジンの副生率を、脱離したアンカー量の測定から算出し、比較した。
Ｂ法：Ａ法と同様の条件下、ＤＢＵ（１当量）／ジエチルアミン（１５当量）によりＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｏ−アンカー基のＮ末端のＦｍｏｃ基を除去し、反応終了後、ＤＢＵに対して０．９５当量の塩化水素／ＣＰＭＥにて中和し、濃縮および沈殿化操作を行った。その後、沈殿物を溶解させてＦｍｏｃ−Ａｌａとの縮合工程に付すことにより、トリペプチドを単離した。
Ｃ法：Ａ法と同様の条件下、ジエチルアミン（５０当量）によりＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｏ−アンカー基のＮ末端のＦｍｏｃ基を除去し、反応終了後、濃縮および沈殿化操作を行った。その後、沈殿物を溶解させてＦｍｏｃ−Ａｌａとの縮合工程に付すことにより、トリペプチドを単離した。【０１２３】
実験結果
Ｆｍｏｃ基の除去の際、ＤＢＵを使用するＡ法に比べ、ジエチルアミンを用いた場合（Ｃ法）においては、ハロゲン系溶媒中で反応を完結させるために、過剰量の塩基を要した。そして、上記Ｃ法のみならず、ジベンゾフルベンを捕捉するためにジエチルアミンを用いた場合（Ｂ法）においても、Ｆｍｏｃ基の除去後に濃縮および沈殿工程を行ったにも拘らず、表２に示されるようにジケトピペラジンの副生に起因するアンカー基の脱離を抑制することはできなかった。【０１２４】
【表２】
2012165546.tif 000007
【０１２５】
以上のように、Ｆｍｏｃ基の脱保護剤として汎用されている求核性を有する有機塩基であるジエチルアミンまたはピペリジンを用いた場合には、求核性のない有機塩基であるＤＢＵと比較して、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中では、過剰量の有機塩基を使用しても脱保護速度が遅く、また続く縮合工程で酸成分と反応してアミドを形成するという副反応も起こるため、目的物の収率が低下することが分かった。さらに、ジエチルアミンまたはピペリジンを用いた場合には、脱保護反応中のジケトピペラジンの副生を抑えられないことが分かった。これらの結果から、Ｆｍｏｃ基の除去には求核性がなく塩基性が高いＤＢＵ等の有機塩基を０．８〜５当量程度使用するのが最適であり、さらに中和工程を組み込むことにより、続く縮合工程まで連続してワンポットで行うことができ、かつジケトピペラジンの副生を抑制できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明のペプチドの製造方法によれば、アミノ酸またはペプチドのＮ末端アミノ基の一時保護基であるＦｍｏｃ基の除去工程、中和工程、および続くＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドとの縮合工程を、途中に単離・精製操作を行うことなく、連続してワンポットで行うことができるので、工業的製造に適した簡便かつ効率的なペプチドの製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、ジケトピペラジンの副生を抑制できるので、配列を問わず、純度良く目的とするペプチド化合物を製造することができる。【０１２７】
本発明のペプチドの製造方法の特徴を表す、別の表現方法について以下に示す。
「固定化保護基」を「（脱保護工程）および（縮合工程）で影響を受けず、（最終脱保護工程）で脱保護される保護基」とし、通常の「保護基」を「（縮合工程）で影響を受けず、（脱保護工程）では脱保護される保護基」と定義する。
また、「Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法によるペプチドの製造方法」を「Ｃ末端固定化保護されたＮ末端保護アミノ酸またはペプチドのＮ末端脱保護工程（脱保護工程）と、新規Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドと縮合させる工程（縮合工程）とを繰り返して、Ｎ末端方向にペプチド鎖を伸長させるペプチドの製造方法」と定義すると、Ｆ−ｍｏｃ法やＢｏｃ法がこれに含まれ、Ｆ−ｍｏｃ法が好ましい。【０１２８】
ここに、「連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法」を「（脱保護工程）と（縮合工程）の間は、途中で抽出・沈殿化等により精製させることなく溶液中で連続的に行い、（縮合工程）終了後に、（沈殿化工程）により精製させることを特徴とする、Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長法」と定義すれば、本発明のペプチドの製造方法を以下のように表現することもできる。
〔１〕アミジン構造を有する複素環式化合物による脱保護工程を有することを特徴とする、連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
〔２〕アミジン構造を有する複素環式化合物が１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタン、１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネンからなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする、〔１〕記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
〔３〕脱保護工程後に、酸による中和工程を更に有することを特徴とする、〔１〕または〔２〕記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
〔４〕縮合工程後に、沈殿化工程を有することを特徴とする、〔３〕記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
〔５〕保護基がＦｍｏｃ基であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれか一項記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。
〔６〕最終脱保護工程を有することを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項記載の連続的改良Ｃ末端固定化保護Ｎ末端伸長によるペプチドの製造方法。【０１２９】
本発明のペプチドの製造方法は、更に以下のように詳細に表現することもできる。
（第一工程：Ｃ末端固定化保護工程）
Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドのＣ末端に、固定化保護基を反応させ、Ｃ末端固定化保護されたＮ末端保護アミノ酸またはペプチドを製造する工程。
（第二工程：脱保護工程）
Ｃ末端固定化保護されたＮ末端保護アミノ酸またはペプチドのＮ末端保護基を脱保護して、Ｃ末端固定化保護されたアミノ酸またはペプチドを製造する工程。
（第三工程：縮合工程）
Ｃ末端固定化保護されたアミノ酸またはペプチドに対して、新規Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドと縮合させ、Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドを製造する工程。
（第四工程：沈殿化工程）
Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドを、極性溶媒中で沈殿化させ、Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチドを精製させる工程。
（第五工程：最終脱保護工程）
Ｃ末端固定化保護された伸長されたＮ末端保護ペプチド、または、Ｃ末端固定化保護された伸長されたペプチドの、Ｃ末端固定化保護を脱保護して、伸長されたペプチドを製造する工程。【０１３０】
上記、第二工程、第三工程、第四工程を1つのセットとして繰り返し行われるので、本発明のペプチドの製造方法は、具体的には以下のような２ケースが含まれる。ただし、ｍは、自然数を表し、（・・・）×ｍ回によりカッコ内の工程をｍ回繰り返すことを意味する。
（ケース１）第一工程⇒（第二工程⇒第三工程⇒第四工程）×ｍ回⇒第五工程
（ケース２）第一工程⇒（第二工程⇒第三工程⇒第四工程）×ｍ回⇒第二工程⇒第五工程【０１３１】
本願は、日本に出願された特願２０１１−１２２７９８号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月18日(2012.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）を含む、ペプチドの製造方法；
（１）ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒に可溶で、かつ極性溶媒に不溶な分子量が３００以上のアンカーに由来するアンカー基によりＣ末端のカルボキシ基が保護されたＮ−Ｆｍｏｃ  Ｃ−保護アミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃ  Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基を、ハロゲン系溶媒またはエーテル系溶媒中で求核性のない有機塩基により除去してＣ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドを得た後、酸で中和し、中和後の反応液に、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチド、縮合剤および縮合促進剤を添加し、Ｃ−保護アミノ酸またはＣ−保護ペプチドのＮ末端にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸またはＮ−Ｆｍｏｃペプチドを縮合させて、Ｎ−Ｆｍｏｃ  Ｃ−保護ペプチドを得る工程。
【請求項２】
工程（１）の後に、極性溶媒でＮ−Ｆｍｏｃ  Ｃ−保護ペプチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程（２）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（２）の後に、Ｎ−Ｆｍｏｃ  Ｃ−保護ペプチドのＮ末端のＦｍｏｃ基および／またはＣ末端のアンカー基を除去する工程（３）をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンカーが、下記式（Ｉ）：
【化１】
2012165546.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、水素原子であるか、あるいはＲｂが下記式（ａ）で表される基である場合には、Ｒ３と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；
ｐ個のＲ２は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｐは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｐ個のＯＲ２に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；かつ
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ）：
【化２】
2012165546.tif 000011
（式中、＊は結合位置を示し；
ｒは、０〜４の整数を示し；
ｒ個のＲ４は、独立してそれぞれ脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ３は、水素原子を示すか、またはＲ１と一緒になって単結合を示して、環Ａおよび環Ｂと共にフルオレン環を形成していてもよく；かつ環Ｂは、ｒ個のＯＲ４に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示し；かつ
Ｙは、ヒドロキシ基、ＮＨＲ（Ｒは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドコシルオキシ）ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアルコール、
４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２−メトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
３，５−ジメトキシ−４−［３’，４’，５’−トリ（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアルコール、
２，４−ジ（ドデシルオキシ）ベンジルアルコール、
３，４，５−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルアミン、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メタノール、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミン、および
２−（１２−ドコシルオキシ−ドデシルオキシ）−９−（３−フルオロフェニル）−９−ブロモフルオレンからなる群より選択される化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
求核性のない有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンおよび１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネンからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
求核性のない有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
酸が、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸無水物、硫酸および塩化水素／エーテル溶液からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酸が、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩化水素／ジエチルエーテル、および塩化水素／シクロペンチルメチルエーテルからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
縮合促進剤が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルボン酸エチルエステル、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート、またはＯ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェートである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アミジン構造を有する複素環式化合物による、Ｎ末端およびＣ末端が保護されたアミノ酸またはペプチドのＮ末端の脱保護工程、酸による中和工程、およびＮ−保護アミノ酸またはＮ−保護ペプチドと脱保護工程でＮ末端が脱保護されたアミノ酸またはペプチドとの縮合工程を有することを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
脱保護工程で脱保護される保護基がＦｍｏｃ基であることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチドの製造方法。
【国際調査報告】
2012165546.tif 000012
2012165546.tif 000013
2012165546.tif 000014
2012165546.tif 000015