(57)【要約】  患者の脳で形成された不溶性凝集体と同質の不溶性凝集体を大量に製造する方法を開発すること。  本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法は、（１）神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に、神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分を導入するステップと、（２）前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養するステップと、（３）前記培養細胞から不溶性画分を抽出するステップとを含む。神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を培養細胞において増幅するステップを含む場合がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に、神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分を導入するステップと、（２）前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養するステップと、（３）前記培養細胞から不溶性画分を抽出するステップとを含むことを特徴とする、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法。
【請求項２】
（４）培養細胞から抽出された不溶性画分を、神経変性疾患関連タンパク質を構成的に発現する培養細胞に導入し、前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養し、前記培養細胞から不溶性画分を抽出することを含む、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を培養細胞において増幅するステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（５）前記ステップ（４）をさらに少なくとも１回連続して繰り返すステップを含むことを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記神経変性疾患関連タンパク質は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質、αシヌクレイン、タウタンパク質、βアミロイドタンパク質、ポリグルタミン、ＳＯＤ１及びプリオンタンパク質からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の製造方法によって得られることを特徴とする、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体。
【請求項６】
（１）生物学的試料から抽出された不溶性画分を神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に導入するステップと、（２）前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養するステップと、（３）前記培養細胞から不溶性画分を抽出するステップとを含むことを特徴とする、生物学的試料から神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法。
【請求項７】
（４）培養細胞から抽出された不溶性画分を、神経変性疾患関連タンパク質を構成的に発現する培養細胞に導入し、前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養し、前記培養細胞から不溶性画分を抽出することを含む、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を培養細胞において増幅するステップを含むことを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
（５）前記ステップ（４）をさらに少なくとも１回連続して繰り返すステップを含むことを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１つに記載の製造方法によって得られることを特徴とする、生物学的試料由来の前記神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体。
【請求項１０】
請求項９に記載の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体か、前記神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分かを、前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に導入するステップと、前記培養細胞の細胞死の程度を定量化するステップとを含むことを特徴とする、生物学的試料の細胞毒性の検査方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体か、前記神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分かを、前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に導入するステップと、前記培養細胞に神経変性疾患の治療薬の候補化合物を接触させるステップと、前記培養細胞の細胞死を抑制する効果を有する前記候補化合物を前記神経変性疾患の治療薬候補としてスクリーニングするステップとを含むことを特徴とする、神経変性疾患の治療薬候補のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法と、該方法により製造される不溶性凝集体とに関し、具体的には、神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞内で、前記神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分をシードとして不溶性凝集体を形成させるステップを繰り返すことによる、不溶性凝集体の製造方法と、該方法により製造される不溶性凝集体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの神経変性疾患の患者脳には、それぞれの疾患に特徴的な細胞内封入体（凝集体）が出現する。アルツハイマー病（ＡＤ）では神経原線維変化、パーキンソン病（ＰＤ）ではレビー小体と呼ばれる病理構造物は、いずれも種々のタンパク質からなる不溶性凝集体である。神経原線維変化の主要構成成分としてタウ、レビー小体の主要構成成分としてαシヌクレイン、そして筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）に認められるユビキチン陽性の細胞内封入体の主要構成成分として４３ｋＤａのＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）がそれぞれ同定されている。これらは正常な場合には可溶性のタンパク質として存在しているが、患者脳においては不溶性の異常な凝集体として沈着しており、そのメカニズムは今のところ不明である。また、これらの凝集体の出現部位と神経細胞の脱落（細胞死）部位に相関が見られることから、細胞内に出現するこれらの凝集体が細胞毒性を有し、最終的に神経細胞が死に至り発症につながるというメカニズムが考えられている。したがって、細胞内凝集体の形成機構や凝集体による細胞死誘導機構などを解明することは、種々の神経変性疾患の治療薬の開発などに貢献できると考えられる。【０００３】
このためには、各疾患に特徴的な細胞内凝集体を培養細胞に再現させる系の構築が必要となる。しかし、これらの凝集体を形成するタンパク質をただ単に細胞に発現させても患者脳に見られる凝集体は一切出現しない。近年本願の発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製されたそれらのタンパク質の凝集体を培養細胞に効率よく導入する方法を確立した（特許文献１、非特許文献１）。そして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製された前記凝集体を予めこれらのタンパク質を一過性に発現した細胞に導入すると、患者脳に見られる細胞内凝集体と性質や形状が類似した凝集体が出現することを見いだした。これらの凝集体は、単に細胞に一過性にそのタンパク質を発現した場合には全く認められないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製された前記タンパク質の凝集体が前記細胞に導入されると、該凝集体が凝集の核、すなわち、シードとなって、前記細胞の中で新たな凝集体が形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際出願第ＷＯ２００７／０６６８０９号公開公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｏｎａｋａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：３４８８５（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製された前記タンパク質の凝集体から細胞内で形成された凝集体は、前記神経変性疾患の進行に伴って出現する不溶性凝集体とは所詮異なる。そこで、前記神経変性疾患の発症過程を再現するためには、前記神経変性疾患の患者の脳で形成された不溶性凝集体をシードとして細胞内で凝集体を形成する過程を再現する実験系を開発する必要がある。また、細胞内で凝集体を形成する過程を詳細に解析するためには、患者の脳で形成された不溶性凝集体を大量に得る必要がある。しかし、患者の脳で形成された不溶性凝集体は量が限られるので、同質の不溶性凝集体を製造する方法を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法を提供する。本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法は、（１）神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に、神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分を導入するステップと、（２）前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養するステップと、（３）前記培養細胞から不溶性画分を抽出するステップとを含む。【０００８】
本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法は、（４）培養細胞から抽出された不溶性画分を、神経変性疾患関連タンパク質を構成的に発現する培養細胞に導入し、前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養し、前記培養細胞から不溶性画分を抽出することを含む、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を培養細胞において増幅するステップを含む場合がある。【０００９】
本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法は、（５）前記ステップ（４）をさらに少なくとも１回連続して繰り返すステップを含む場合がある。【００１０】
本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法において、前記神経変性疾患関連タンパク質は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質、αシヌクレイン、タウタンパク質、βアミロイドタンパク質、ポリグルタミン、ＳＯＤ１及びプリオンタンパク質からなるグループから選択される場合がある。【００１１】
本発明は、本発明の製造方法によって得られる前記神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を提供する。【００１２】
本発明は、生物学的試料から神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を製造する方法を提供する。本発明の生物学的試料から神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を製造する方法は、（１）生物学的試料から抽出された不溶性画分を神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に導入するステップと、（２）前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養するステップと、（３）前記培養細胞から不溶性画分を抽出するステップとを含む。【００１３】
本発明の生物学的試料から神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を製造する方法は、（４）培養細胞から抽出された不溶性画分を、神経変性疾患関連タンパク質を構成的に発現する培養細胞に導入し、前記不溶性画分が導入された前記培養細胞を培養し、前記培養細胞から不溶性画分を抽出することを含む、神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を培養細胞において増幅するステップを含む場合がある。【００１４】
本発明の生物学的試料から神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を製造する方法は、（５）前記ステップ（４）をさらに少なくとも１回連続して繰り返すステップを含む場合がある。【００１５】
本発明は、本発明の生物学的試料から神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を製造する方法によって得られる、生物学的試料由来の前記神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体を提供する。【００１６】
本発明は、生物学的試料の細胞毒性の検査方法を提供する。本発明の生物学的試料の細胞毒性の検査方法は、本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体か、前記神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分かを、前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に導入するステップと、前記培養細胞の細胞死の程度を定量化するステップとを含む。【００１７】
本発明は、神経変性疾患の治療薬候補のスクリーニング方法を提供する。本発明の神経変性疾患の治療薬候補のスクリーニング方法は、本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体か、前記神経変性疾患の患者脳に由来する不溶性画分かを、前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に導入するステップと、前記培養細胞に神経変性疾患の治療薬の候補化合物を接触させるステップと、前記培養細胞の細胞死を抑制する効果を有する前記候補化合物を前記神経変性疾患の治療薬候補としてスクリーニングするステップとを含む。【００１８】
本明細書における神経変性疾患とは、患者脳の神経細胞内に特徴的な病理構造物、すなわち、種々のタンパク質からなる線維性の不溶性凝集体の出現を伴う疾患であり、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＦＴＬＤ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ：ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＣＢＤ）、ピック病（Ｐｉｃｋ）等が知られている。前記不溶性凝集体は、細胞毒性の原因となり、最終的に神経細胞が死に至り発症につながると考えられている。【００１９】
本明細書における神経変性疾患関連タンパク質とは、神経変性疾患で出現する不溶性凝集体の主要構成成分となるタンパク質であって、アルツハイマー病では微小管結合タンパク質の１つであるタウが、パーキンソン病ではαシヌクレインが、そして、筋萎縮性側索硬化症及び前頭側頭葉変性症では４３ｋＤａのＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）がそれぞれ同定されている。タウは分子量５５〜６２ｋＤａのタンパク質であり、選択的スプライシングにより６種のアイソフォームが存在している。微小管結合部位を４つ有する４リピートタウと３つ有する３リピートタウとに分けられる。タウの蓄積を伴う神経変性疾患はタウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）と総称されており、疾患により蓄積するタウのアイソフォームが異なることが知られている。ＡＤにおける凝集体（ＰＨＦ）には６種類全てのアイソフォームが蓄積しているが、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）などでは、４リピートタウが主に蓄積する凝集体が認められる。またピック病では、３リピートタウが主に蓄積する特徴的な凝集体が出現する。そのほか、βアミロイドタンパク質、ポリグルタミン、ＳＯＤ１及びプリオンタンパク質も、本明細書における神経変性疾患関連タンパク質に含まれる。【００２０】
本発明において、「神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞」は、それぞれの疾患において不溶性凝集体を形成することができることを条件として、いずれの細胞タイプの細胞であってもかまわない。前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞は、神経細胞に類似した性質を有する細胞が好ましい。その由来は、当該疾患の患者に由来する細胞であってもかまわないし、疾患と無関係に得られた細胞であってもかまわない。前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞の由来は、神経細胞の細胞系譜に属する細胞や、神経細胞の細胞系譜由来の腫瘍細胞であってもかまわない。ＫＥＬＬＹ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＢＥ（２）−Ｃ、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、及び、ＳＫ−Ｎ−ＳＨを含むが、これらに限定されない、神経芽種細胞株が前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞として用いられる場合がある。前記神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞その他の多分化能を有する幹細胞から神経細胞に分化させられた細胞に由来してもかまわない。あるいは、神経細胞以外の細胞タイプの細胞から直接分化転換により神経細胞に分化させられた細胞に由来してもかまわない。【００２１】
本発明において、「神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される」とは、いずれかの神経変性疾患関連タンパク質を一過的又は恒久的に発現することをいい、不溶性画分を導入する際に多くの細胞で前記神経変性疾患関連タンパク質が発現されていることを条件として、いかなる手法で前記神経変性疾患関連タンパク質が発現されてもかまわない。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ウイルスベクター法等の手法を含むが、これらに限定されない。細胞に外来ＤＮＡを取り込ませる際に細胞を傷つけないリポフェクション法が好ましい。これらの手法に用いる試薬は当業者に知られたいかなる試薬を用いてもかまわない。本明細書の実施例で用いられたＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９の他、ＦｕＧＥＮＥ６、リポフェクチン、リポフェクタミン、マルチフェクタム等の市販の試薬を用いる場合がある。【００２２】
本明細書における「不溶性画分」とは、界面活性剤を含む水溶液に溶解しない画分をいう。本明細書では、サルコシルでも溶解せず、遠心により沈殿として分離できる画分をいう。不溶性画分は、前記神経変性疾患の患者の脳組織か、前記培養細胞かに由来する場合がある。本発明の不溶性画分は、前記脳由来の不溶性画分の場合と、前記脳由来の不溶性画分を前記培養細胞に導入して数日間培養後に抽出される不溶性画分の場合と、該不溶性画分を前記培養細胞に導入して数日間培養後に抽出される不溶性画分の場合と、不溶性画分の導入及び抽出を１回又は２回以上繰り返して得られる不溶性画分の場合とがある。【００２３】
本発明において、神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞に不溶性画分を導入するステップは、いかなる手法を用いて実行されてもかまわない。細胞に前記不溶性画分を導入する際に細胞を傷つけないリポフェクション法が好ましい。これらの手法に用いる試薬は当業者に知られたいかなる試薬を用いてもかまわない。本明細書の実施例で用いられたマルチフェクタムの他、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９、ＦｕＧＥＮＥ６、リポフェクチン、リポフェクタミン等の市販の試薬を用いる場合がある。本発明において、不溶性画分が由来した神経変性疾患と、細胞に発現されるタンパク質が関連する神経変性疾患とは、同一の場合のあれば、異なる場合もある。【００２４】
本発明において、神経変性疾患関連タンパク質が構成的に発現される培養細胞を得ること、及び、前記培養細胞に不溶性画分を導入することは、実施例と同様に作用効果を奏することを条件として、培養容器、培養細胞数、導入される不溶性画分の量等をスケールアップしてもかまわない。【００２５】
本発明の細胞毒性の検査方法において、細胞毒性とは、細胞膜が破れて細胞質が培地に放出されることを指し、色素排除能力の喪失や、通常は細胞質に局在するＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）等の酵素活性の培地中での検出によって定量される場合がある。【００２６】
本発明のスクリーニング方法において、不溶性凝集体の形成を促進又は抑制する候補化合物は、微生物、菌類、植物及び動物から調製される化合物と、化学的に合成される化合物とを含むが、これらに限定されない。不溶性凝集体の形成を促進する化合物は、神経変性疾患を増大させるリスク管理と、疾患の病理的機序の解明とのために必要である。不溶性凝集体の形成を抑制する化合物は、神経変性疾患の予防、治療、改善、病状の進行抑制等のために有用な医薬の開発に利用することができる。【００２７】
本発明の神経変性疾患関連タンパク質、培養細胞、不溶性画分及び生物学的試料の動物種は、導入された不溶性画分を凝集の核（シード）として、培養細胞内で発現した神経変性疾患関連タンパク質から新たな不溶性凝集体が形成されることを条件として、どのような動物種の組み合わせであってもかまわない。ヒトの他、トランスジェニック動物の作出が可能なモデル動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の哺乳類と、ＥＳ細胞が利用可能なアカゲザル等の霊長類とを含むグループから選択される場合がある。患者の脳由来の不溶性画分を利用する場合には、ヒト神経変性疾患関連タンパク質を発現するヒト培養細胞を用いることがあるが、ヒト神経変性疾患関連タンパク質を発現する培養細胞であれば、ヒト以外の動物種由来の細胞であってもかまわない。例えば、タンパク質リン酸化酵素、タンパク質分解酵素等のノックアウト動物由来の培養細胞が用いられる場合がある。【００２８】
本発明において生物学的試料とは、ヒト神経変性疾患関連タンパク質の凝集体を形成するための核となる不溶性画分を含む可能性がある全ての生物学的試料をいい、髄液、血液、血漿、リンパ液、精液を含むが、これらに限定されない体液と、脳、脊髄、骨髄、胸腺を含むが、これらに限定されない臓器又は組織を含む。好ましい生物学的試料は、脳又は髄液である。【００２９】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図１−２】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図１−３】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図２−１】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図２−２】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図３−１】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分によって蓄積された不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色された培養細胞の共焦点顕微鏡写真。
【図３−２】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分によって蓄積された不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色された培養細胞の共焦点顕微鏡写真。
【図３−３】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分によって蓄積された不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色された培養細胞の共焦点顕微鏡写真。
【図３−４】ＡＬＳ患者由来の不溶性画分によって蓄積された不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色された培養細胞の共焦点顕微鏡写真。
【図４−１】ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図４−２】ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図４−３】ＤＬＢ患者由来の不溶性画分によって蓄積した不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色された培養細胞の共焦点顕微鏡写真。
【図５−１】ＰＳＰ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図５−２】ＰＳＰ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図５−３】ＣＢＤ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図５−４】ピック病患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図６】さまざまな疾患の患者由来の不溶性画分が導入された培養細胞の細胞毒性試験の結果を示すグラフ。
【図７−１】ＨＡタグに対する抗体を用いて検出された、増幅用不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図７−２】リン酸化ＴＤＰに対する抗体を用いて検出された、増幅用不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図。
【図８】ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体を用いて検出された、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分の導入から１回目、２回目及び３回目の増幅後のＴＤＰ発現細胞の不溶性画分のウェスタンブロット図。
【図９】ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体を用いて検出された、神経変性疾患の治療薬の候補化合物存在下で増幅された不溶性画分のウェスタンブロット図。
【図１０】図９の各レーンの不溶性凝集体のデンシトメーターによる定量結果を対照溶媒のＤＭＳＯ存在下での増幅結果を１００％とする百分率で表した凝集体形成率の棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００３２】
１．材料及び方法
１．１  検体の入手
本実施例の実験は公益財団法人東京都医学総合研究所（旧東京都精神医学総合研究所）の研究倫理委員会の承認（承認番号：１７−３６、承認日：２００５年９月３日）を得て実施された。【００３３】
１．２  脳検体からの不溶性画分の調製
前記患者から採取された脳の凍結検体（０．５ｇ）が５倍容量のＡ６８緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でホモジナイズされ、懸濁液が作製された。該懸濁液にＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムが終濃度１％添加され、３７°Ｃで３０分間インキュベーションされた。前記懸濁液は遠心分離（１２，０００ｇ、１０分間、２５°Ｃ）され、上清が回収された。前記上清はさらに遠心分離（１００，０００ｇ、２０分間、２５°Ｃ）され、沈殿が得られた。前記沈殿はＰＢＳ中でＢｉｏｍｉｃ  ７０４０  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ装置（セイコー株式会社）を使用して超音波処理され、５００μＬ程度の沈殿試料がエッペンドルフ型試験管に分注された。上清が遠心分離（１００，０００ｇ、２０分間、２５°Ｃ）後に除去され、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が調製された。【００３４】
１．３  細胞導入用試料の調製
ＰＢＳ  １５０μＬが前記不溶性画分に添加され、ＶＰ−５Ｓ装置（タイテック株式会社）を使用して超音波処理が行われた。上清が遠心分離（２，３００ｇ、５分間、２５°Ｃ）後に回収された。前記上清５μＬずつが６ウェルプレートのウェル１個分の培養細胞に導入されるために１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに分注され、該チューブ１本につき、マルチフェクタム（プロメガ株式会社）６２．５μＬと、ＯｐｔｉＭＥＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）１２０μＬとが添加され、室温で３０分間インキュベーションされた。前記ＯｐｔｉＭＥＭ６２．５μＬがさらに添加され、室温で５分間インキュベーションされた。得られた細胞導入用試料の全量が、６ウェルプレートの単一ウェルに播種された培養細胞に導入された。【００３５】
１．４  細胞培養
培養細胞として、神経芽腫細胞株のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と、これに所望のタンパク質を一過的に発現させたトランスフェクタントとが用いられた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は１０％ウシ胎仔血清を含む細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて培養された。以下、特記されない場合には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びそのトランスフェクタントは３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は播種翌日にウェル中で３０％ないし５０％コンフルエントになるように市販の６ウェルプレートに播種された。【００３６】
１．５  トランスフェクタントの作製
（１）ヒトαシヌクレイン（以下、「αＳ」という。）を発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（以下、「αＳ発現細胞」という。）と、（２）ＨＡでタグ化したＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（以下、「ＨＡ−ＴＤＰ」という。）を発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（以下、「ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞」という。）という２種類のトランスフェクタントが作製された。簡潔には、αＳ又はＨＡ−ＴＤＰをエンコードするポリヌクレオチドがｐｃＤＮＡ３ベクターに挿入されたコンストラクトが用意された（Ｕｅｄａ．  Ｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９０：１１２８２（１９９３）、Ｏｕ．  ＳＨら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ３５８４：  ３９４（１９９５））。前記コンストラクト１μｇと、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）３μＬと、前記ＯｐｔｉＭＥＭ  １００μＬとの混合液が、前記ＤＮＡトランスフェクション試薬の３０ないし５０％コンフルエントの前記ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加され、終夜培養後、以下の不溶性画分の導入に供された。【００３７】
１．６  培養細胞への不溶性画分の導入
前記６ウェルプレートのウェル１個用の導入試料がウェル１個の前記細胞培養用培地に添加された後、前記培養細胞は６時間培養された。前記インキュベーション後、培地が新鮮な細胞培養用培地（２ｍＬ）に交換され、３日間培養された。その後、前記培養細胞は、ウェスタンブロット法又は免疫細胞化学法による解析に供された。直ちに使用されない場合には−２０°Ｃで保存された。【００３８】
１．７  ウェスタンブロット法による解析
１．７．１  さまざまな細胞抽出画分の調製
培養細胞への不溶性画分の導入後、前記細胞培養用培地は除去され、ＰＢＳ  １ｍＬが添加された。前記培養細胞は剥離され、遠心分離（１，８００ｇ、５分間、４°Ｃ）された。上清の除去後、ＰＢＳ  １ｍＬが添加された。前記培養細胞は再度遠心分離（１，８００ｇ、５分間、４°Ｃ）され、洗浄された。【００３９】
１．７．２  トリス緩衝液可溶性画分の調製
前記培養細胞は細胞破砕溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び、プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（カタログ番号５３９１３４、メルク株式会社））１００μＬに懸濁され、３７°Ｃで３０分間インキュベーションされた。ＶＰ−５Ｓ装置（タイテック株式会社）を使用して超音波処理した後、上清と沈殿とが超遠心分離（２９０，０００ｇ、２０分間、４°Ｃ）によって分離され、前記上清がトリス緩衝液可溶性画分（以下、「ＴＳ画分」という。）として用いられた。【００４０】
１．７．３  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有トリス緩衝液可溶性画分の調製
前記ＴＳ画分の調製で得られた沈殿は１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む前記細胞破砕溶液  １００μＬに懸濁され、３７°Ｃで３０分間インキュベーションされた。ＶＰ−５Ｓ装置（タイテック株式会社）を使用して超音波処理した後、上清と沈殿とが超遠心分離（２９０，０００ｇ、２０分間、４°Ｃ）によって分離され、前記上清はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有トリス緩衝液可溶性画分（以下、「ＴＸ画分」という。）として用いられた。【００４１】
１．７．４  Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム含有トリス緩衝液可溶性画分及び不溶性画分の調製
前記ＴＸ画分の調製で得られた沈殿は１％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを含む前記細胞破砕溶液に懸濁され、３７°Ｃで３０分間インキュベーションされた。ＶＰ−５Ｓ装置（タイテック株式会社）を使用して超音波処理した後、上清と沈殿とが超遠心分離（２９０，０００ｇ、２０分間、４°Ｃ）によって分離され、前記上清はＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム含有トリス緩衝液可溶性画分（以下、「Ｓａｒ画分」という。）として用いられた。また、前記沈殿は不溶性画分（以下、「ｐｐｔ画分」という。）として用いられた。【００４２】
１．７．５  ウェスタンブロッティング法による解析
ＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分は、当業者に周知な標準的な方法でウェスタンブロット法による解析に供された。簡潔には、前記画分のそれぞれが１３．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分離された。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜に転写され、以下の１次抗体及び２次抗体と反応され、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）と、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ＬＡＳ  ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）とを用いて検出された。【００４３】
用いられた１次抗体と、その希釈倍率とは以下のとおりである。
（１）ＴＤＰ単量体を認識する抗ＴＤＰ抗体（カタログ番号６００１９?２?Ｉｇ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、株式会社トランスジェニック、以下、「抗ＴＤＰ単量体抗体」という。）、１：１０００希釈
（２）ＨＡタグを認識する抗ＨＡ抗体（カタログ番号Ｈ９６５８、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）（以下、「ａｎｔｉ−ＨＡ」という。）、１：２０００希釈
（３）４０９番目／４１０番目のリン酸化セリンを認識する抗ＴＤＰ抗体（ＴＤＰ４３−ｐＳ４０９／４１０、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４、ＷＯ２００９／００８５２９）（以下、「ａｎｔｉ−４０９／４１０」という。）、１：１，０００希釈
（４）αシヌクレイン及びβシヌクレインを認識する抗体（抗Ｓｙｎ１０２抗体、Ｎｏｎａｋａ  Ｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４４：  ３６１（２００５））（以下、「ａｎｔｉ−Ｓｙｎ１０２抗体」という。）、１：２，０００希釈
（５）１２９番目のリン酸化セリンを認識する抗αシヌクレイン抗体（Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈら，Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４：  １６０（２００２））（以下、「ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９抗体」という。）、１：２，０００希釈
（６）シヌクレインの１３１番目−１４０番目のペプチドを抗原とする抗シヌクレイン抗体（Ｍａｓｕｄａ  Ｍら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５８３：  ７８７（２００９））（以下、「１３１−１４０抗体」という。）、１：１，０００希釈【００４４】
用いられた２次抗体と、その希釈倍率とは以下のとおりである。
（１）抗ウサギーＨＲＰ標識ＩｇＧ（カタログ番号１７０?６５１５、バイオラッド株式会社）１：２０，０００希釈
（２）抗マウスーＨＲＰ標識ＩｇＧ（カタログ番号１７０?６５１６、バイオラッド株式会社）１：２０，０００希釈
（３）ビオチン化抗ウサギーＩｇＧ（カタログ番号ＢＡ１０００、フナコシ株式会社）１：５００希釈
（４）ビオチン化抗マウスーＩｇＧ（カタログ番号ＢＡ２０００、フナコシ株式会社）１：５００希釈【００４５】
１．８  共焦点顕微鏡観察
免疫細胞化学染色は当業者に周知な標準的な方法で行われた。簡潔には、前記培養細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定された。その後、透過処理が０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で行われ、ブロッキングが５％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ溶液で行われた。前記ａｎｔｉ−ＨＡと、前記ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体とが適切に希釈され、１次抗体として用いられた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（カタログ番号Ａ１１００８、インビトロジェン株式会社）と、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（カタログ番号Ａ１１００４、インビトロジェン株式会社）とが適切に希釈され、２次抗体として用いられた。細胞核はＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で染色された。前記培養細胞はＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号Ｐ３６９３４、インビトロジェン株式会社）で封入され、共焦点顕微鏡（カールツァイスマイクロスコピー株式会社）で観察された。【００４６】
２．結果
２．１  ウェスタンブロット解析
図１−１、１−２及び１−３は、それぞれ、抗ＴＤＰ単量体抗体、ａｎｔｉ−ＨＡ及びａｎｔｉ−４０９／４１０抗体を用いて検出された、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞画分のウェスタンブロット図である。「ＨＡ−ＷＴ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないＨＡ−ＴＤＰ発現細胞であることを表す。「ＡＬＳｐｐｔ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＡＬＳ患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「ＨＡ−ＷＴ＋ＡＬＳｐｐｔ」はＡＬＳ患者脳由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「ＨＡ−ＷＴ」、「ＡＬＳｐｐｔ」又は「ＨＡ−ＷＴ＋ＡＬＳｐｐｔ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図１−１、１−２及び１−３から明かなとおり、抗ＴＤＰ単量体抗体、ａｎｔｉ−ＨＡ及びａｎｔｉ−４０９／４１０抗体は、ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分とに対しては反応しなかった。しかし、前記抗ＴＤＰ単量体抗体、ａｎｔｉ−ＨＡ及びａｎｔｉ−４０９／４１０抗体は、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分に対して反応した。特に、前記ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体は、約５０ｋＤａのインタクトなＴＤＰと、約２５ｋＤａのＴＤＰのＣ末端断片とを検出した。この交叉反応性は、神経変性疾患患者、特にＡＬＳ患者由来の試料のウェスタンブロット解析で検出される交叉反応性と非常に類似していた。【００４７】
図２−１及び２−２は、それぞれ、ａｎｔｉ−Ｓｙｎ１０２抗体及びａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９抗体を用いて検出された、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分を導入したαＳ発現細胞のウェスタンブロット図である。「αＳ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないαＳ発現細胞であることを表す。「ＡＬＳｐｐｔ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＡＬＳ患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「αＳ＋ＡＬＳｐｐｔ」はＡＬＳ患者脳由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「αＳ」、「ＡＬＳｐｐｔ」又は「αＳ＋ＡＬＳｐｐｔ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図１−１、１−２及び１−３から明かなとおり、ａｎｔｉ−Ｓｙｎ１０２抗体及びａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９抗体は、αＳ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分を導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分と、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分を導入したαＳ発現細胞のｐｐｔ画分とに対して反応しなかった。【００４８】
以上の結果から、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分は、ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞では不溶性凝集体の蓄積を顕著に促進する一方、αＳ発現細胞では不溶性凝集体の蓄積を促進しないことが示された。したがって、不溶性凝集体の蓄積には、凝集の核（シード）となる不溶性画分と、前記不溶性凝集体を形成するタンパク質単量体との特異的な組み合わせが必要であることが示された。【００４９】
２．２  共焦点顕微鏡観察
図３−１、３−２、３−３及び３−４は、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分によって蓄積した不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色された培養細胞の共焦点顕微鏡写真である。図の写真のそれぞれの左上に用いた１次抗体が示されている。「ｍｅｒｇｅ」は、残りの３枚の写真の画像を合成したことを意味する。図３−１、３−３及び３−４ではＨＡ−ＴＤＰ発現細胞が用いられ、図３−２ではＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が用いられた。図３−１では不溶性画分は導入されなかったが、図３−２、３−３及び３−４ではＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入された。図３−１から、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されなかったＨＡ−ＴＤＰ発現細胞ではリン酸化ＴＤＰは検出されなかった。図３−２から、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞ではリン酸化ＴＤＰはわずかに検出された。図３−３及び３−４から、ＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞では、リン酸化ＴＤＰとＨＡ−ＴＤＰは局在パターンが重なった。図３−４ではリン酸化ＴＤＰ及びＨＡ−ＴＤＰを発現する細胞はダイヤ状のユニークな形態をとっていた。
【実施例２】
【００５０】
１．材料及び方法
１．１  不溶性凝集体と、神経変性疾患関連タンパク質との組み合わせ
検体の入手、脳検体からの不溶性画分の調製、不溶性画分を含む導入試料の調製、細胞培養、トランスフェクタントの作製、培養細胞への不溶性画分の導入、ウェスタンブロット解析、及び、共焦点顕微鏡観察は実施例１と同様に行われた。脳検体は、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ：ＤＬＢ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ：ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＣＢＤ）、ピック病（Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び、前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＦＴＬＤ）の患者から入手され、不溶性画分が調製された。２種類のトランスフェクタント、（１）ＨＡでタグ化され、３つの繰り返し配列を有する微小管結合タンパク質タウのアイソフォーム（以下、「ＨＡ−３Ｒ１Ｎ」という。）を発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（以下、「ＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞」という。）と、（２）ＨＡでタグ化され、４つの繰り返し配列を有する微小管結合タンパク質タウのアイソフォームのアイソフォーム（以下、「ＨＡ−４Ｒ１Ｎ」という。）を発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（以下、「ＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞」という。）という２種類のトランスフェクタントがさらに作製された。簡潔には、ＨＡ−３Ｒ１Ｎ又はＨＡ−４Ｒ１ＮをエンコードするヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３ベクターに挿入したコンストラクトが用意された。（Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３：  ５１９（１９８９）前記コンストラクト１μｇと、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）３μＬと、ＯｐｔｉＭＥＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）１００μＬとの混合液が、前記ＤＮＡトランスフェクション試薬の３０ないし５０％コンフルエントの前記ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加され、終夜培養後、以下の不溶性画分の導入に供された。ウェスタンブロット解析では、１次抗体として３９６番目のリン酸化セリンを認識する抗タウ抗体（カタログ番号５７７８１５、メルク株式会社）（以下、「ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体」という。）と、２次抗体として抗ウサギーＨＲＰ標識ＩｇＧ（カタログ番号１７０?６５１５、バイオラッド株式会社）１：２０，０００希釈あるいはビオチン化抗ウサギーＩｇＧ（カタログ番号ＢＡ１０００、フナコシ株式会社）１：５００希釈とがさらに用いられた。【００５１】
１．２  細胞毒性試験
細胞毒性試験は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と、ＡＬＳ、ＦＴＬＤ又はピック病患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞とについて、市販の細胞毒性試験キット（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｇ１７８０、プロメガ株式会社）を用いて製造者の指示書に従って行われた。細胞毒性率（％）が、細胞培養液中の乳酸脱水素酵素の測定値を細胞培養液中および生細胞中の乳酸脱水素酵素の測定値で除算した商の百分率として算出された。【００５２】
２．結果
図４−１及び４−２は、それぞれ、ａｎｔｉ−Ｓｙｎ１０２抗体及びａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９抗体を用いて検出された、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のウェスタンブロット図である。「αＳ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないαＳ発現細胞であることを表す。「ＤＬＢｐｐｔ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＤＬＢ患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「αＳ＋ＤＬＢｐｐｔ」はＤＬＢ患者脳由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「αＳ」、「ＤＬＢｐｐｔ」又は「αＳ＋ＤＬＢｐｐｔ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図４−１及び４−２から明かなとおり、ａｎｔｉ−Ｓｙｎ１０２抗体は、αＳ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分と、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のｐｐｔ画分とに対して反応しなかった。ａｎｔｉ−ＰＳｅｒ１２９抗体は、αＳ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分とに対して反応しなかった一方、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞のｐｐｔ画分に対して反応した。これらの結果から、αＳ発現細胞では、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されても、されなくても、ほとんどのαＳは可溶性画分に存在し、不溶性凝集体は非常に微量であった。しかし、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞では、リン酸化αＳのかなりの量が不溶性画分に移る。トランスフェクションが行われずにＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にはリン酸化αＳがほぼまったく検出されなかったことから、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分が導入されたαＳ発現細胞では、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分がシードとなって新たに不溶性凝集体が形成されることが示唆された。【００５３】
図４−３は、ＤＬＢ患者由来の不溶性画分によって蓄積した不溶性凝集体を検出するために免疫細胞化学染色した培養細胞の共焦点顕微鏡写真である。図の写真のそれぞれの左上に用いた１次抗体が示されている。「ｍｅｒｇｅ」は、残りの３枚の写真の画像を合成したことを意味する。ＤＬＢ患者由来の不溶性画分を導入したαＳ発現細胞では、αＳそのものは細胞質全体に局在して検出されたが、リン酸化αＳは封入体に局在して検出された。【００５４】
図５−１は、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体を用いて検出された、ＰＳＰ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図である。「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＰＳＰ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＳＰ患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ＋ＰＳＰ」はＰＳＰ患者脳由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ」、「ＰＳＰ」又は「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ＋ＰＳＰ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図５−１から明かなとおり、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体は、ＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＰＳＰ患者由来の不溶性画分を導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分と、ＰＳＰ患者由来の不溶性画分を導入したＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分とに対して反応しなかった。【００５５】
図５−２は、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体を用いて検出された、ＰＳＰ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図である。「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＰＳＰ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＰＳＰ患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ＋ＰＳＰ」はＰＳＰ患者脳由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ」、「ＰＳＰ」又は「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ＋ＰＳＰ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図５−２から明かなとおり、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体は、ＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＰＳＰ患者由来の不溶性画分を導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分とに対して反応しなかった一方、ＰＳＰ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分に対して反応した。【００５６】
図５−３は、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体を用いて検出された、ＣＢＤ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図である。「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＣＢＤ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＣＢＤ患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ＋ＣＢＤ」はＣＢＤ患者脳由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ」、「ＣＢＤ」又は「ＨＡ−ｔａｕ４Ｒ１Ｎ＋ＣＢＤ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図５−３から明かなとおり、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体は、ＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分と、ＣＢＤ患者由来の不溶性画分が導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分とに対して反応を示さなかった一方、ＣＢＤ患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分に対して反応した。【００５７】
図５−４は、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体を用いて検出された、ピック病患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のウェスタンブロット図である。「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ」は、患者脳由来の不溶性画分が導入されないＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「Ｐｉｃｋ」はトランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にピック病患者脳由来の不溶性画分が導入されたことを表す。「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ＋Ｐｉｃｋ」はピック病患者脳由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−４Ｒ１Ｎ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ」、「Ｐｉｃｋ」又は「ＨＡ−ｔａｕ３Ｒ１Ｎ＋Ｐｉｃｋ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図５−４から明かなとおり、ａｎｔｉ−ＰＳ３９６抗体は、ＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分と、ピック病患者由来の不溶性画分を導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分とに対して反応しなかった一方、ピック病患者由来の不溶性画分が導入されたＨＡ−３Ｒ１Ｎ発現細胞のｐｐｔ画分に対して反応した。【００５８】
図６は、異なる疾患の患者由来の不溶性画分が導入された培養細胞の細胞毒性試験の結果を示すグラフである。細胞毒性率（％）は、トランスフェクションが行われずにＡＬＳ患者由来の不溶性画分が導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞実験群では約５％であり、患者由来の不溶性画分が導入されなかったＨＡ−ＴＤＰ発現細胞実験群では約６％であり、ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞へのＡＬＳ、ＦＴＬＤ及びピック病患者由来の不溶性画分の導入実験群では、それぞれ、約１１％、約１５％及び約４．５％であった。【００５９】
以上の結果から、さまざまな神経変性疾患の不溶性凝集体の蓄積には、凝集の核（シード）となる不溶性凝集体と、該神経変性疾患の関連タンパク質との特異的な組み合わせが必要であることが示された。また、細胞死が不溶性凝集体の蓄積にともなって増大することが示された。さらに、さまざまな神経変性疾患患者から調製した不溶性画分と、該神経変性疾患の関連タンパク質とを利用して、不溶性凝集体の蓄積モデル細胞培養系を構築することができることが示唆された。
【実施例３】
【００６０】
１．材料及び方法
検体の入手、脳検体からの不溶性画分の調製、不溶性画分を含む導入試料の調製、細胞培養、トランスフェクタントの作製、培養細胞への不溶性画分の導入、及び、ウェスタンブロット解析は実施例１と同様に行われた。ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞へのＡＬＳ患者由来の不溶性画分の導入後、前記ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞から調製されたｐｐｔ画分（以下、「増幅用不溶性画分」という。）は新たなＨＡ−ＴＤＰ発現細胞に導入された。【００６１】
２．結果
図７−１は、ａｎｔｉ−ＨＡ抗体を用いて検出された、増幅用不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図である。図７−２は、ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体を用いて検出された、増幅用不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のウェスタンブロット図である。「ｎｏｎｅ」は、トランスフェクションを行われなかったＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に患者脳由来の不溶性画分が導入されない条件であることを表す。「ＨＡ−ＷＴ」はＨＡ−ＴＤＰ発現細胞に患者脳由来の不溶性画分が導入されない条件であることを表す。「ＨＡ−ＷＴ＋Ｃｅｌｌ  ｐｐｔ」は増幅用不溶性画分が導入されたＨＡ−ＴＤＰ発現細胞であることを表す。「ＴＳ」、「ＴＸ」、「Ｓａｒ」及び「ｐｐｔ」は、それぞれのレーンには、「ｎｏｎｅ」、「ＨＡ−ＷＴ」又は「ＨＡ−ＷＴ＋Ｃｅｌｌ  ｐｐｔ」の条件で処理された細胞のＴＳ画分、ＴＸ画分、Ｓａｒ画分及びｐｐｔ画分が適用されたことを示す。図７−１及び７−２から明かなとおり、ａｎｔｉ−ＨＡは、増幅用不溶性画分を導入したＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分に対して強く反応した。また、ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体は、約５０ｋＤａのインタクトなＴＤＰと、約２５ｋＤａのＴＤＰのＣ末端断片とに対して反応した。以上の結果から、神経変性疾患患者由来の不溶性画分と同様に、培養細胞由来の不溶性画分も不溶性凝集体を形成できることが示された。つまり、神経変性疾患関連タンパク質の単量体を強制発現させた培養細胞に、当該神経変性疾患患者の脳由来の不溶性画分を導入させると、該不溶性画分がシードとなって新たに不溶性凝集体が形成される。換言すると、前記培養細胞内で不溶性凝集体が増幅される。そして、培養細胞内で形成された不溶性凝集体は、それ自身がシードとして新たな培養細胞に導入されると不溶性凝集体を形成することができる。すると、不溶性凝集体の形成を繰りかえすことにより、神経変性疾患患者の脳由来の不溶性画分を大量に増幅することができる。【００６２】
図１−３及び図７−２のブロット図のバンドの濃度をデンシトメーターで定量化し、その測定値をもとに、本実施例における不溶性凝集体の増幅倍率を推定した。図１−３の「ＨＡ−ＷＴ＋ＡＬＳ  ｐｐｔ」のｐｐｔレーン（ＡＬＳ患者脳由来のサルコシル不溶性画分をＨＡ−ＷＴ発現細胞に導入後３日間培養した細胞の破砕液から得られたサルコシル不溶性画分が適用されたレーン）の２０ないし５５ｋＤａの範囲のバンドをデンシトメーターで測定したところ、その読み取り値は１８７，４１９，４６１であった。このｐｐｔ画分は、１００μＬのＰＢＳに懸濁されたもので、図１−３のウェスタンブロット法による解析には１５μＬが前記レーンに適用され、５μＬが新たなＨＡ−ＷＴ発現細胞への導入に用いられた。したがって、増幅前の不溶性凝集体の量はデンシトメーターの読み取り値の単位で、６２，４７３，１５３．６５となる。図７−２の「ＨＡ−ＷＴ＋Ｃｅｌｌ  ｐｐｔ」のｓaｒ及びｐｐｔレーン（本実施例で増幅されたサルコシル可溶性及び不溶性画分が適用されたレーン）の２０ないし１５０ｋＤａの範囲のバンドをデンシトメーターで測定したところ、その読み取り値は２７８，２２６，６６９であった。このｓaｒ及びｐｐｔ画分は、ともに１００μＬのＰＢＳに懸濁されたもので、図７−２のウェスタンブロット法による解析には１０μＬが前記レーンに適用された。したがって、増幅後の不溶性凝集体の量はデンシトメーターの読み取り値の単位で、２，７８２，２６６，６９０となる。すると、２，７８２，２６６，６９０を６２，４７３，１５３．６５で除算した商の約４４．５が本実施例における不溶性凝集体の増幅倍率の推定値である。この結果から、本発明の神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法は少なくとも数十倍の増幅効率を有することが示された。
【実施例４】
【００６３】
１．材料及び方法
検体の入手、脳検体からの不溶性画分の調製、不溶性画分を含む導入試料の調製、細胞培養、トランスフェクタントの作製、培養細胞への不溶性画分の導入、及び、ウェスタンブロット解析は実施例３と同様に行われた。本実施例では、ＨＡタグ化されないインタクトのＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（以下、「ＴＤＰ」という。）を発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（以下、「ＴＤＰ発現細胞」という。）も用いられた。ＴＤＰ発現細胞へのＡＬＳ患者由来の不溶性画分の導入から３日後、前記ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分（以下、「１回目の増幅後の不溶性画分」という。）が回収され、ウェスタンブロット解析に供されるとともに、第１のＨＡ−ＴＤＰ発現細胞に導入された。前記１回目の増幅後の不溶性画分の導入から３日後、第１のＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分（以下、「２回目の増幅後の不溶性画分」という。）が回収され、ウェスタンブロット解析に供されるとともに、第２のＨＡ−ＴＤＰ発現細胞に導入された。前記２回目の増幅後の不溶性画分の導入から３日後、第２のＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分（以下、「３回目の増幅後の不溶性画分」という。）が回収され、ウェスタンブロット解析に供された。【００６４】
２．結果
図８は、ａｎｔｉ−４０９／４１０抗体で検出された、１回目、２回目及び３回目の増幅後の不溶性画分のウェスタンブロット図である。それぞれのウェスタンブロット図のレーン１は、トランスフェクションされないＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｐｐｔ画分であった。それぞれのウェスタンブロット図のレーン２は、不溶性画分が導入されなかったＨＡ−ＴＤＰ発現細胞（１回目）又はＴＤＰ発現細胞（２回目及び３回目）であった。それぞれのウェスタンブロット図のレーン３は、１回目、２回目又は３回目の増幅後の不溶性画分であった。１回目、２回目及び３回目の増幅後の不溶性画分のウェスタンブロット図のレーン３のバンドを比較すると、１回目の増幅後の不溶性画分は患者脳の不溶性画分をシードとしてタグ化されないＴＤＰが不溶化したため、タグ化されたＴＤＰが不溶化された２回目及び３回目の増幅後の不溶性画分に比べて分子量が小さい。実施例３と同様にデンシトメーターで１回目の増幅後の不溶性凝集体と、３回目の増幅後の不溶性凝集体とを定量したところ、それぞれデンシトメーターの読み取り値の単位で、１，５３４，５７３．８２と、５２，３４５，８１３．５とであった。したがって、本実施例の２段階の増幅での増幅倍率は、後者を前者で割った商の３４．１倍である。
【実施例５】
【００６５】
１．材料及び方法
検体の入手、脳検体からの不溶性画分の調製、不溶性画分を含む導入試料の調製、細胞培養、トランスフェクタントの作製、培養細胞への不溶性画分の導入、及び、ウェスタンブロット解析は実施例３と同様に行われた。本実施例では、患者脳由来の不溶性画分のＨＡ−ＴＤＰ発現細胞への導入から６時間後に、神経変性疾患の治療薬の候補化合物がそれぞれ終濃度２０μＭとなるように添加された。前記候補化合物として、エキシフォン（ｅｘｉｆｏｎｅ、東京化成工業株式会社、Ｈ１０６５）、ゴッシペチン（ｇｏｓｓｙｐｅｔｉｎ、ＣｈｒｏｍａＤｅｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州アーバイン）、ＡＳＢ−００００７３９０−０１０、和光純薬工業株式会社）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、Ｍ６７６０−１０ＭＧ）及び没食子酸エピカテキン（（?）−Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、Ｅ３８９３−１０ＭＧ）と、対照実験として溶媒のＤＭＳＯとが用いられた。前記候補化合物は１００％ＤＭＳＯを溶媒として２０ｍＭ溶液として調製され、ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞の培養液中に１０００倍希釈で添加された。したがって、対照実験のＤＭＳＯも終濃度が０．１％となるように添加された。患者脳由来の不溶性画分の導入から３日後にＨＡ−ＴＤＰ発現細胞のｐｐｔ画分が回収され、ウェスタンブロット解析に供され、不溶性凝集体の量がデンシトメーターを用いて定量された。【００６６】
２．結果
図９はａｎｔｉ−４０９／４１０抗体で検出された、神経変性疾患の治療薬の候補化合物存在下で増幅された不溶性画分のウェスタンブロット図である。矢印は、不溶性凝集体を構成するタグ化ＴＤＰのバンドを表す。レーンはそれぞれ、ＨＡ−ＷＴ（ＨＡ−ＴＤＰ発現細胞に患者脳由来の不溶性画分が導入されない条件）、ＤＭＳＯ（神経変性疾患の治療薬の候補化合物の対照溶媒）、エキシフォン、ゴッシペチン、ミリセチン及び没食子酸エピカテキンを表す。図１０は、図９の各レーンの不溶性凝集体のデンシトメーターによる定量結果を対照溶媒のＤＭＳＯ存在下での結果を１００％とする百分率で表した棒グラフである。図１０から明かなとおり、神経変性疾患の治療薬の候補化合物のうち、エキシフォンはほとんど凝集体形成を阻害する効果を示さなかったが、没食子酸エピカテキン、ミリセチン及びゴッシペチンは凝集体形成を阻害する効果が認められた。最も有効なゴッシペチンでは、凝集体形成が４０％近く阻害された。この結果から、本発明の不溶性凝集体の蓄積モデル細胞培養系は、神経変性疾患の治療薬の候補のスクリーニングに使用可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本明細書において説明したとおり、本発明の不溶性凝集体の製造方法によれば、均質な不溶性凝集体を大量に調製できる。したがって、本発明の不溶性凝集体の製造方法は、不溶性凝集体を含む生検試料を入手できない研究機関にも不溶性凝集体を提供することを可能とし、神経変性疾患研究を発展することが可能となる。また、本発明の不溶性凝集体の製造方法は、神経変性疾患の治療薬候補の簡便かつ安価なスクリーニング方法を提供することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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