(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含んでなり、
前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質は胆管癌細胞の成長、浸潤及び移動を抑制するＬ１ＣＡＭ特異的な抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体であり、
前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質はＬ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、胆管癌の成長または転移を抑制するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質が、細胞膜結合形態または細胞膜から遊離された形態を認識することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドが、Ｌ１ＣＡＭをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が、受託番号ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰのハイブリドーマによって分泌される４−６３、またはＵＪ１２７であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３’または５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’の配列を有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆管癌の細胞表面に存在するタンパク質Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、胆管癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物、およびこれを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胆管癌は、肝の胆管に生じる癌であって、肝癌などの幹細胞から発生するものと思われる(Sell and Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363, 1989)。世界的に見て胆管癌の発生頻度は肝癌に比べて一層低いが、東南アジアにおける発生頻度はヨーロッパまたは北アメリカより一層高い。胆管癌は、高い再発率のため外科的切除術が非効果的であり、通常の化学療法または放射線療法がよく効かないという特徴を持つ(Pederson et al Cancer Res. 4325-4332, 1997)。しかも、胆管癌の診断が容易でなく、胆管のバクテリアまたは寄生虫の感染による慢性炎症に起因する胆管の慢性炎症が胆管癌を形成する傾向があるという所見がある(Roberts et al., Gastroenterology 112:269-279, 1997)。
【０００３】
それにも拘らず、胆管癌の発生原因に対するメカニズムは未だよく知られておらず、胆管癌の治療のためのターゲット分子も知られていない。また、幾つかの胆管癌の細胞遺伝的研究が発表され、極めて少数の細胞株のみが確立されており(Yamaguchi et al., J. Natl Cancer Inst 75: 29-35, 1985; Ding et al., Br J Cancer 67: 1007-1010, 1993)、この細胞株を用いて胆管癌に特異的な抗体を製造する方法も知られていない。
【０００４】
最近、韓国人の胆管癌患者から胆管癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫが確立された(Kim et al., Genes, chromosome & Cancer 30: 48-56, 2001)。これらの癌細胞をマウスに注射して癌細胞の表面抗原を認識するモノクローナル抗体を製造し、これらの抗体が胆管癌細胞の成長を抑制する効果があることさえ確認すれば、これらの抗体を用いて胆管癌の治療方法を開発することができるであろう。
【０００５】
公知の癌予後因子(prognostic factor)としてよく知られている上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の遺伝子は、ガン原遺伝子(proto-oncogene)であって、腫瘍形成(tumorigenesis)とａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｂｅｈａｖｉｏｕｒに関与することが明らかになっており、ＥＧＦＲは、乳癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、胆嚢癌、頭頸部癌、卵素癌、前立腺癌、子宮頸癌および胃癌などの様々な癌で過剰発現する(Modjtahedi, H. and Dean, C. The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer. Int. J. Oncol. 4 : 277-296, 1994)。また、ＥＧＦＲの発現と癌予後との関係は癌の種類によって異なる(Nicholson, R. I. et al. EGFR and cancer prognosis. Eur. J. Cancer 37, S9-S15, 2001)。例えば、ＥＧＦＲは、膀胱癌、子宮頸癌、食道癌、頭頸部癌および卵素癌では強力な予後因子(strong prognosis factor)であるが、非小細胞肺癌(non small cell lung carcinoma、ＮＳＣＬＣ)では弱い予後因子(weak prognostic indicator)であることが明らかになっている。ところが、胆管癌については全く知られていない。
【０００６】
また、ＥＧＦＲに対する治療用抗体の各癌細胞の成長に対する抑制効率も１５〜５０％の範囲内で異なる。また、同種の癌でも生体外および生体内成長阻害(in vitro and in vivo growth inhibition)効果が異なる(Dassonville, O. et al., EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine inhibitors similarities and differences. Critical Reviews in Oncology/Hematology 62, 53-61. 2007)。現在、ＥＧＦＲに対する抗体は、大腸癌および頭頸部癌の治療剤として臨床的に用いられているばかりであり、前記に列挙したＥＧＦＲが過発現した全ての癌組織に対する治療剤として用いられてはいない。
【０００７】
上述したように、タンパク質が癌細胞で発現するだけでは、前記タンパク質が癌の予後因子であることは容易に類推することが可能ではないうえ、このような発現および癌の予後との関連性は癌の種類によって異なることが従来からよく知られていた。癌において、強力で悪い(strong and poor)予後因子は、癌に対する治療効果および予後を容易に予測することを可能にするうえ、これらの因子をターゲットとする治療剤を開発して選択的且つ効果的な癌治療方法の開発を可能にする。よって、このような各癌の種類による予後因子の発掘は癌の診断および治療において非常に重要である。
【０００８】
一方、Ｌ１ＣＡＭ(L1 cell adhesion molecule)は、細胞表面で細胞間接着(cell-to-cell adhesion)を仲介する免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules、ＣＡＭｓ)に属する内在性膜糖タンパク質(integral membrane glycoprotein)の一つであって、その分子量が２２０ｋＤａにも達する。Ｌ１ＣＡＭは、元々ニューロンから発見され(Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059; 1996)、ニューロンの移動、神経突起の成長および細胞移動などの機能を有するものとして知られている。ヒトのＬ１ＣＡＭ遺伝子は、マウスとラットのＬ１ＣＡＭ相同体(homolog)で縮退性オリゴヌクレオチド(degenerate oligonucleotide)をプローブとして用いてヒト胎児の脳ｃＤＮＡライブラリーから分離した（Hlavin, M. L. & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991；米国特許第５８７２２２５号、１９９９年２月１６日に登録）。このＬ１ＣＡＭは、元々主に脳で発現するものと知られているが、幾つかの正常組織で発見されており、最近では様々な癌細胞でも発見され始めている。
【０００９】
Ｌ１ＣＡＭと癌との連関性は、Ｌ１ＣＡＭが黒色腫(melanoma)、神経芽細胞腫(neuroblastoma)、卵素癌および大腸癌などの様々な癌で発現することが報告されている(Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Caner, 38: 1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005)。Ｌ１ＣＡＭは、膜結合型(membrane bound form)の他にも、切断された産物(cleavage product)が細胞外に分泌されることが発見される(Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003)。そして、最近、Ｌ１ＣＡＭは、癌細胞の成長に重要な役割を果たす分子の一つとして探索されることにより(Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1);41-53, 2003)、癌治療の新しいターゲットとして浮き上がった（ＵＳ２００４／０１１５２０６ Ａｌ出願２００４年６月１７日）。最近、Ｌ１ＣＡＭが大腸癌のインベイシブフロント(invasive front)で発現し(Gavert, et al., J Cell boil. 14;168(4):633-42, 2005)、この分子に対する抗体が卵素癌細胞の成長および転移を抑制することが明らかになった(Arlt, et al., Cancer Res. 66:936-943. 2006)。
【００１０】
ところが、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌に発現するという事実は未だ知られておらず、胆管癌の成長および転移に重要に作用するか否かも知られていない。また、Ｌ１ＣＡＭが高発現している胆管癌患者の死亡率が、低発現している胆管癌患者の死亡率よりさらに高いか、すなわちＬ１ＣＡＭが胆管癌の悪い予後因子(poor prognostic factor)であることが未だ知られていない。しかも、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体は胆管癌の増殖および転移を抑制することにより治療剤としての可能性があるという事実も未だ知られていない。
【００１１】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ１，１７２，６５４Ａ１および米国特許出願ＵＳ２００４／０２５９０８４号は、Ｌ１ＣＡＭが卵素癌、子宮内膜癌またはそれらの癌の素因の存在に対する標識になるという前提の下に、卵素癌または子宮内膜癌の診断および予後のために患者のサンプルにおいてＬ１ＣＡＭの抗体によってＬ１ＣＡＭの水準を決定することを特徴とする手段、および細胞毒性薬とＬ１ＣＡＭまたはその断片とを結合させて十分な量で患者に投与して癌を治療する方法について開示している。ところが、これらの文献は、Ｌ１ＣＡＭタンパク質が体液または組織で卵素癌または子宮内膜癌の非常に特異的なマーカーであることを開示しているだけである。
【００１２】
米国特許出願ＵＳ２００４／０１１５２０６号は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体を用いて癌細胞死滅を誘導する製剤、細胞死滅のために前記抗体を使用する手段、およびＬ１ＣＡＭ抗体の含まれた薬学的組成物について開示しているとともに、癌細胞で細胞成長を阻害し細胞死を誘導することが可能な有効量の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を細胞に接触させることにより、細胞の成長を抑制し且つ細胞死滅を誘導することについて開示している。ところが、この文献も、Ｌ１ＣＡＭが発現する癌の例として乳癌、大腸癌および子宮頸癌についてのみ言及しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のみを行ったばかりで、ｉｎ ｖｉｖｏ結果は裏付けられておらず、胆管癌との関連性については言及していない。また、この文献は、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を癌細胞に接触させることにより細胞成長を抑制し且つ細胞死滅を誘導することについてのみ開示しているばかりで、癌細胞の移動、浸潤および転移を抑制することができることについては開示していない。
【００１３】
また、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８１４８は、卵素癌および子宮内膜癌で過剰発現するＬ１ＣＡＭタンパク質、それらの発現を阻害する組成物、並びにこれを用いて卵素癌および子宮内膜癌を予防および治療する方法について開示している。この文献は、Ｌ１ＣＡＭタンパク質の機能を阻害するＬ１ＣＡＭ抗体およびその誘導体を含む組成物が卵素癌および子宮内膜癌の機能を抑制して癌細胞の移動および進展を阻止することにより癌を治療し得ることを開示している。ところが、この文献も、卵素癌および子宮内膜癌で細胞表面または水溶性形態のＬ１ＣＡＭが癌細胞の移動を促進することについてのみ開示している。
【００１４】
要するに、従来の公知の文献らには、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌に高発現率で発現し、胆管癌に特異的な悪い予後因子(poor prognostic factor)として作用する。よって、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体のようにＬ１ＣＡＭの活性を抑制する物質は、特に胆管癌に対する著しい診断または治療効果を持つことができることについては全く開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明らは、胆管癌の診断または治療に使用可能な抗体を開発しようと努力したところで、最近確立された胆管癌細胞株(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001)をマウスに免疫注射して胆管癌の細胞表面に結合するモノクローナル抗体を得て、これをＡ１０−Ａ３抗体と命名し、Ａ１０−Ａ３抗体がＬ１ＣＡＭを特異的に認識することを確認した。
【００１６】
また、前記Ａ１０−Ａ３抗体および公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体を用いて、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌の細胞株の表面に発現することを確認し、抹消血管リンパ球、肝細胞、血液内皮細胞などの正常細胞には発現しないことを確認した。これまで、Ｌ１ＣＡＭが乳癌、卵素癌、大腸癌、皮膚癌などで発現することは明らかになっているが、胆管癌で発現するという事実は明らかになっていない。本発明者らは、Ａ１０−Ａ３抗体を用いて肝内胆管癌患者と肝外胆管癌患者の癌組織でＬ１ＣＡＭがどれほど発現するかを分析した結果、肝内胆管癌患者の４５．２％および肝外胆管癌患者の３９．８％がＬ１ＣＡＭを高発現することを確認し、特に胆管癌の転移の開始を知らせるインベイシブフロントでＬ１ＣＡＭが高発現することを確認した。そして、Ｌ１ＣＡＭの発現率と生存率との関係に対する統計学的分析結果より、高いＬ１ＣＡＭ発現率を有するグループの胆管癌患者の死亡率が低いＬ１ＣＡＭ発現率を有するグループの胆管癌患者の死亡率より確実に高いことを確認した。この結果は、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌の悪い予後因子であることを証明することであり、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌治療の重要ターゲットになれることを示唆する。これに対し、現在臨床的に使用中の癌治療剤（例えば、セテュキマブ(cetuximab)、ＥＧＦＲに対するキメラ抗体）のターゲットであるＥＧＦＲが胆管癌で高発現するが、胆管癌における発現率と胆管癌患者の生存率との関係を分析したところ、統計的な有意性がないという結果が出て、ＥＧＦＲが胆管癌の悪い予後因子ではないことを確認した。これは、癌細胞で過剰発現する分子が必ずしも悪い予後因子になるのではなく、重要な治療ターゲットになるのではないことを証明する。
【００１７】
Ｌ１ＣＡＭが胆管癌の成長および転移に実際関与するかを確認するために、Ｌ１ＣＡＭを発現する胆管癌細胞株（Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫ）にＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを導入させてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させた後、胆管癌細胞の成長、移動、浸潤に影響を及ぼすかを分析したところ、Ｌ１ＣＡＭの発現が抑制された胆管癌細胞の成長、移動、浸潤が阻害されることを確認した。この結果はＬ１ＣＡＭが胆管癌細胞の成長および転移に重要に作用していることを証明する。
【００１８】
Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が胆管癌を治療することができるかを分析するために、胆管癌細胞株（Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫ）の培地にＡ１０−Ａ３抗体または公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体（ＵＪ１２７）を処理した結果、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が胆管癌細胞の成長、移動または浸潤を抑制する効果があることを確認した。また、動物実験で胆管癌細胞株をヌードマウスに注射して胆管癌を形成するとき、Ａ１０−Ａ３抗体を注射すると、胆管癌の成長が阻害されることを確認した。また、ヒト胚芽幹細胞をマウスに免疫注射して得たハイブリドーマ（ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰ）が生産するモノクローナル抗体４−６３も、癌細胞表面のＬ１ＣＡＭを認識し、胆管癌の成長を抑制した。よって、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体を胆管癌の診断および治療に利用可能であることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、胆管癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を用いて胆管癌を治療する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭに対する抗体を提供することにある。
本発明の別の目的は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記薬学的組成物を用いて胆管癌細胞の成長または転移を抑制する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１はマウスモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３（Ａ）と４−６３（Ｂ）、および公知の抗体５Ｇ３（Ｃ）とＵＪ１２７（Ｄ）が胆管癌などの様々な癌細胞および正常細胞の表面に結合するか否かを、蛍光細胞染色およびフローサイトメトリーを用いて分析した結果を示す図である。
【図２】図２はＡ１０−Ａ３抗体に結合する抗原がＬ１ＣＡＭタンパク質であることを免疫沈降とウエスタンブロット方法によって証明した結果を示す図である。Ａは胆管癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫの細胞表面をビオチン化させた後、抗体Ａ１０−Ａ３または公知の抗−Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体（ＵＪ１２７）で免疫沈降させた後、沈降したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとストレプトアビジン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロットを行った結果である。Ｂは抗体Ａ１０−Ａ３で免疫沈降させたタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで公知の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体（ＵＪ１２７）を用いたウエスタンブロットを行った結果、Ｌ１ＣＡＭが検出されることを確認したものであり、ここで、ｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇは抗体を入れずに免疫沈降させた陰性対照群、ＩＰ ｗｉｔｈ Ａ１０−Ａ３は抗体Ａ１０−Ａ３で免疫沈降させたもの、ＩＰ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−Ｌ１ＣＡＭはＬ１ＣＡＭに対する公知のモノクローナル抗体で免疫沈降させたもの、Ａ１０−Ａ３ ｏｎｌｙは抗体自体のみをＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものをそれぞれ示す。Ｃは水溶性Ｌ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養液を公知の抗体であるＵＪ１２７、５Ｇ３、Ａ１０−Ａ３抗体、または４−６３抗体を用いてウエスタンブロットした結果を示したものであり、ここで、「−」はＬ１発現ベクターを入れていない細胞培養液、「＋」は水溶性Ｌ１発現ベクターを入れて培養した細胞培養液をそれぞれ示す。
【図３】図３はＱ−ＴＯＦ分析した結果を示したものである。Ａ１０−Ａ３抗体を用いて免疫沈降させたＣｈｏｉ−ＣＫ細胞からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してトリプシンによって切断した後、Ｑ−ＴＯＦ分析によって、得られたペプチドがＬ１ＣＡＭであることを確認した図であって、下側のアミノ酸配列は全長Ｌ１ＣＡＭを示し、上側のアミノ酸配列は全長Ｌ１ＣＡＭ配列の下線部分にそれぞれ相当する、分析されたペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は癌患者組織をＡ１０−Ａ３（Ａ）、４−６３（Ｂ）抗体を用いて免疫組織化学染色した結果であって、正常肝組織には結合せず、人体胆管癌組織には結合することを示す写真である。
【図５】図５は肝内胆管癌（Ａ）および肝外胆管癌（Ｂ）のＬ１ＣＡＭ発現と臨床病理学的特徴との関連性を示す図である。
【図６】図６はＬ１ＣＡＭの発現率と胆管癌患者の生存率との関連性を肝外胆管癌患者（６０ケース）を対象として分析した結果を、ＯＳ(overall survival)およびＤＦＳ(disease free survival)で示した資料である。
【図７】図７はＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを形質感染させた胆管癌細胞および非特異的なｓｉＲＮＡを形質感染させた胆管癌細胞のＬ１ＣＡＭ発現水準（Ａ）と、細胞増殖(proliferation)、浸潤(invasion)および移動(migration)の度合い（Ｂ）とを比較した資料である。
【図８】図８は抗体Ａ１０−Ａ３（Ａ）、抗体４−６３（Ｂ）、または公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体ＵＪ１２７および５Ｇ３（Ｃ）によって胆管癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫの成長が抑制される効果を分析した図であって、細胞の陽性対照群として卵素癌細胞ＳＫ−ＯＶ３を使用し、陰性対照群としてはＡ１０−Ａ３抗体が結合していない腎臓癌細胞ＡＣＨＮを使用し、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ｃｏｎｔｒｏｌ）、抗体を沸かして不活性化させた抗体（Ａ１０−Ａ３ｂまたは４−６３ｂ）または正常マウスＩｇＧを使用したものであり、培養中の細胞に抗体１０μｇ／ｍＬを入れて７２時間培養した後、細胞の成長度合いを、抗体を入れていないｃｏｎｔｒｏｌに比べて百分率で表現したものである。
【図９】図９は抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３および公知の抗体５Ｇ３によって胆管癌細胞（Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫ）の浸潤と移動が抑制される効果を分析したものであって、細胞の陰性対照群としてはＡ１０−Ａ３抗体が結合していない腎臓癌細胞ＡＣＨＮを使用し、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ｃｏｎｔｒｏｌ）、または正常マウスＩｇＧを使用し、培養中の細胞に抗体１０μｇ／ｍＬを入れて７２時間培養した後、細胞の浸潤（Ａ）と移動（Ｂ）の度合いを、抗体を入れていない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する百分率で表現したものである。
【図１０】図１０は抗体Ａ１０−Ａ３によって癌細胞の成長、浸潤および移動が抑制される細胞信号伝達メカニズムを分析した結果を示すもので、胆管癌細胞株Ｃｈｏｉ−ＣＫまたはＳＣＫの培地に抗体を入れないか、Ａ１０−Ａ３抗体またはマウス免疫グロブリンＩｇＧを添加して培養した後、収去した細胞抽出物の量を取ってβ−ａｃｔｉｎに対する抗体を用いて確認し、ＰＣＮＡ（Ａ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ（Ａ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｂ）およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫ（Ｃ）に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った写真である。
【図１１】図１１はＡ１０−Ａ３抗体による癌成長抑制効果を人体胆管癌異種移植(xenograft)モデルマウスで証明する実験結果を示すものである。Ａは抗体を投与したマウス５匹（Ａ１０−Ａ３群）と、抗体を投与していないマウス５匹（対照群）の癌の大きさを時間別に示す結果、Ｂは癌細胞移植３週後に測定した癌組織の重量を示す結果、Ｃは癌組織の写真、Ｄは体重を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一様態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、胆管癌細胞の成長または転移を抑制する薬学的組成物に関する。
【００２２】
具体的な一様態において、本発明の薬学的組成物は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質を含むことができる。好ましくは、前記活性抑制物質は胆管癌細胞の表面抗原または分泌された表面抗原（Ｌ１ＣＡＭ）を特異的に認識する抗体である。このような抗体は、モノクローナル抗体、これらのキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を全て含み、新規の抗体以外にも、当該技術分野における公知の抗体も含んでもよい。さらに好ましくは、前記抗体は、新規のＬ１ＣＡＭに対するモノクローナル抗体であるＡ１０−Ａ３または４−６３、公知の抗体ＵＪ１２７およびこれらのキメラ抗体、ヒト化抗体並びにヒト抗体である。これらのＡ１０−Ａ３および４−６３抗体はそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰおよびＫＣＴＣ１０９６６ＢＰによって分泌されて生産される。
【００２３】
前記抗体は、Ｌ１ＣＡＭを特異的に認識する結合の特性を持つ限りは、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的断片も含む。抗体の分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００２４】
別の具体的な一様態において、前記薬学的組成物は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を含むことができる。Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞でＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、癌細胞の成長と転移の役割を果たすＬ１ＣＡＭの作用が減少して癌治療が可能である。前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、さらに好ましくは５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３’または５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’の配列を含むｓｉＲＮＡである。
【００２５】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイレンシング(silencing)を媒介することが可能な約２０ヌクレオチドサイズの小さい核酸分子を意味し、「ｓｈＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡターゲット配列のセンスおよびアンチセンス配列が５〜９個の塩基からなるループ(loop)を挟んで位置した短いヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA)を意味する。最近、遺伝子水準でタンパク質の発現を調節するための方法として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象を用いた方法が研究されている。ｓｉＲＮＡは、一般に、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合してタンパク質発現を抑制することが明らかになっている。
【００２６】
本発明の組成物に含まれるｓｉＲＮＡを製造する方法には、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法(Sui G et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520)や、ｉｎｖｉｔｒｏ転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法(Brummelkamp TR et al., (2002) Science296:550-553)などがあるが、これに限定されない。また、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの高価の生合成費用や、低い細胞形質感染効率によるＲＮＡ干渉効果の短時間維持などの欠点を克服するためのもので、ＲＮＡ合酵素IIIのプロモータからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムを用いてこれを細胞内に導入して発現させることができる。このようなｓｈＲＮＡは、細胞内に存在するｓｉＲＮＡプロセシング酵素(Dicer or Rnase III)によって、正確な構造を持つｓｉＲＮＡに転換され、目的遺伝子のサイレンシングを誘導することが広く知られている。
【００２７】
用語「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内における、典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーへテロ二本鎖の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間のバックボーンを有するオリゴマーを指す。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を持つことができる。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害し、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセシング過程を変化させることができる。よって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴマーである。
【００２８】
好ましくは、本発明の組成物には、公知の治療剤を直接的または間接的に結合させるか、あるいは一緒に含ませることができる。抗体と結合可能な治療剤には放射性核種、薬剤、リンフォカイン、毒素または二重特異的抗体などが含まれる。ところが、本発明の組成物に含まれる治療剤は、これに限定されず、抗体と結合させることができるか、あるいは抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に投与して癌治療効果を得ることが可能な公知の治療剤であれば可能である。
【００２９】
前述した放射線核種には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅなどがあり、これに限定されない。
【００３０】
前述した薬剤および毒素には、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シス−白金およびシス−白金同族体、ブレオマイシン類、エスペラマイシン類、５−フルオロウラシル、メルファラン、およびその他の窒素マスタードなどがあり、これに限定されない。
また、本発明に係る組成物は、投与方式によって許容可能な担体を含むことができる。  
【００３１】
投与方式に適した製剤は、当該分野に公知になっている。また、本発明の薬学的組成物は癌治療のために薬学的有効量で投与できる。典型的な投与量の水準は標準臨床的技術を用いて最適化することができる。
【００３２】
別の様態において、本発明は、前記薬学的組成物を用いて胆管癌を治療する方法に関する。
具体的に、本発明の治療方法は、前記薬学的組成物を薬学的有効量で人体内に投与することを含む。前記薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内に投与でき、局部的免疫抑制治療のために、必要であれば病変内投与を含む適切な方法によって投与される。非経口注入には筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましい投与方式は静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射および点滴注射である。
【００３３】
本発明の薬学的組成物を人体内に投与し、これに含まれたＬ１ＣＡＭに特異的な抗体を癌細胞の表面抗原Ｌ１ＣＡＭに結合させて癌細胞の増殖または転移を抑制させることにより、胆管癌を治療することができる。
【００３４】
また、本発明の薬学的組成物を人体内に投与し、抗体を分泌されたＬ１ＣＡＭと結合させて癌細胞の成長および転移を遮断させることにより、胆管癌を治療することができるうえ、これを人体内に投与して癌細胞の表面抗原Ｌ１ＣＡＭに結合させて、これを認知する免疫細胞が癌細胞を捕食、自殺および殺害させることにより、胆管癌を治療することができる。
【００３５】
また、本発明の薬学的組成物に含まれたＬ１ＣＡＭの発現抑制物質を用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、癌細胞の成長および転移の役割を果たすＬ１ＣＡＭの作用が減少して癌治療が可能である。
【００３６】
別の様態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭに対する抗体、またはＬ１ＣＡＭの発現を抑制するＬ１ＣＡＭに対するオリゴヌクレオチドに関する。
【００３７】
具体的な一様態において、前記抗体は、本発明に係る組成物で言及したように、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する特性を持つ限りは、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的断片も含む。抗体の分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００３８】
好ましくは、前記抗体は、胆管癌細胞の表面抗原または分泌された表面抗原（Ｌ１ＣＡＭ）を認識する抗体である。前記抗体は、胆管癌細胞の表面タンパク質Ｌ１ＣＡＭと結合してその作用を抑制または中和(neutralization)させ、癌細胞と結合して癌細胞の成長および転移抑制を図り、癌細胞を捕食、自殺または殺害させることができることを特徴とする。
【００３９】
前述したＵＳ２００４／０１１５２０６に開示されているように、Ｌ１ＣＡＭの抗体はＬ１ＣＡＭの作用を必ずしも抑制するのではない。本発明の抗体は、Ｌ１ＣＡＭの作用を促進する抗体ではなく、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する抗体であることを特徴とする。
【００４０】
さらに好ましくは、前記モノクローナル抗体は新規の抗体Ａ１０−Ａ３または４−６３である。
【００４１】
具体的な別の一様態において、本発明のＬ１ＣＡＭの発現を抑制するＬ１ＣＡＭに対するオリゴヌクレオチドは、本発明の組成物で言及されたＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。
【００４２】
具体的な一実施例として、本発明者らは、胆管癌細胞を大量培養した後、マウスの足底に前記細胞を注入し、前記マウスのリンパ節(lymph node)からリンパ球を分離して骨髄腫(myeloma)癌細胞と細胞融合させることにより、胆管癌細胞に結合する抗体を生産するマウスハイブリドーマを製造した。
【００４３】
より具体的に、本発明者らは、胆管癌細胞ＳＣＫとＣｈｏｉ−ＣＫをマウスの足底に注射し、前記マウスのリンパ節からリンパ球を分離した。その後、前記リンパ球とＦＯ骨髄腫細胞株とを細胞融合させた後、抗体が発現するクローンを選抜した。前記製造したクローンの中で、比較的安定的にモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ上澄み液の胆管癌細胞に対する結合能を調査し、これらのモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをハイブリドーマＡ１０−Ａ３と命名し、これを２００６年２月２０日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託した（住宅番号：ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰ）。具体的に、前記モノクローナル抗体が認識する癌細胞は、胆管癌細胞株には結合するが（図１参照）、肝細胞、ＨＵＶＥＣ（ヒト由来の臍帯静脈内皮細胞）および抹消血液リンパ球(peripheral blood lymphocyte)などの正常細胞には結合せず（図１参照）、これらの抗体を使用したときに胆管癌細胞の成長、移動または浸潤が抑制された。また、公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体５Ｇ３は、胆管癌細胞に結合するが、癌の成長抑制効果が低かったが（図８参照）、他の公知の抗体ＵＪ１２７は胆管癌細胞に結合してそれらの成長を抑制した。これにより、Ｌ１ＣＡＭの抗体が必ずしもＬ１ＣＡＭの作用を抑制するのではないことが分かった。
【００４４】
具体的な別の一実施例において、本発明者らは、５−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３および５−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３の配列を有するｓｉＲＮＡをそれぞれＣｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫに形質感染させて非特異的なオリゴヌクレオチド配列を形質感染させたものと比較した結果、非特異的なオリゴヌクレオチドを処理した対照群とは異なり、Ｌ１ＣＡＭの量が減少しただけでなく、ｓｉＲＮＡによってＬ１ＣＡＭがノックダウン(knock-down)された細胞群は正常的にＬ１ＣＡＭを発現する細胞群に比べて癌細胞の増殖、浸潤および移動の度合いが減少することを確認した。
【００４５】
本発明の実施例（実施例５、６および７参照）から分かるように、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌細胞で発現すること、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌患者の約４０％で過発現すること、Ｌ１ＣＡＭは胆管癌の進行に重要に作用して死亡危険率を高くする、胆管癌の悪い予後因子であること、これに反し、他の癌で悪い予後因子として知られているＥＧＦＲは胆管癌の悪い予後因子でないことは、本発明者らによって最初に明らかになった。よって、本発明に係るＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質、これを含む癌の中でも胆管癌に特異的に著しい、癌の診断および治療が可能であるという効果を持つ。
【００４６】
それだけでなく、本発明者らは、免疫組織化学染色方法によって非小細胞肺癌患者におけるＬ１ＣＡＭ発現率が１０％未満であることを確認し、Ａ１０−Ａ３抗体を、Ｌ１ＣＡＭを発現する非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９とＮＣＩ−Ｈ５２２に処理したときに癌細胞の成長阻害率はそれぞれ１４％および２４％であることを確認した。ところが、これはＡ１０−Ａ３の胆管癌細胞成長阻害率である約４０％に大きく及ばない。これにより、本発明の組成物が胆管癌に特異的な効果を持つことはさらに証明されるといえる。これに関連した事項は、本発明者らが本出願と同日付で出願する韓国特許出願の明細書（発明の名称：「肺癌の治療用薬学的組成物、並びにこれを用いた肺癌の成長、転移抑制および治療方法」）に具体的に記載されている。前記文献は本発明に対する参考文献として含まれる。
【００４７】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。ところが、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：癌細胞の培養
癌細胞株は、全て１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）を含有する次の培地を用いて、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の高温培養器で培養した。ＳＨ−Ｊ１(hepatocellular carcinoma)、ＳＣＫ(cholangiocarcinoma)、Ｃｈｏｉ−ＣＫ(cholangiocarcinoma)およびＡＣＨＮ(Renal cell adenocarcinoma)細胞はＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地を利用し、ＳＫ−ＯＶ３(ovary adenocarcinoma)細胞はＭｃＣｏｙ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）培地を利用した。Ａ５４９(non small cell lung carcinoma)は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋ培地で、ＮＣＩ−Ｈ５２２(non small cell lung carcinoma)、ＤＭＳ１１４(small cell lung carcinoma)、ＤＭＳ５３(small cell lung carcinoma)、ＮＣＩ−Ｈ６９(small cell lung carcinoma)はＷａｙｍｏｕｔｈ’ｓ（Ｇｉｂｃｏ社）培地で培養した。ＳＨ−Ｊ１、ＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞株は、キムデゴン博士（韓国の全北大学校医科大学）から得、その他の癌細胞株はＡＴＣＣから購入した。
正常細胞である肝細胞(hepatocyte)はＣａｍｂｒａｘ社から購入し、ＨＵＶＥＣ細胞もＣａｍｂｒａｘ社から購入した後、１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）を含有するＥＧＭ−２（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）培地を用いて、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）は、ヒトの血液からフィコール密度勾配で遠心分離により分離した後で収得した。
【００４９】
実施例２：癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫに結合するモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３の製造
培養した癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫを細胞分離緩衝液(Cell dissociation buffer)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて取り外し、約５×１０５の細胞を３０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右足底にＣｈｏｉ−ＣＫを注射し、３日後に左足底にはＳＣＫを注射した。これを３〜４日間隔で６回反復投与し、細胞融合１日の前にさらに注射した。リンパ節細胞と融合させるＦＯ骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）は、１０％の牛胎児血清を含有したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地で２週前から培養して準備した。
【００５０】
癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫで免疫させたマウスの膝窩リンパ節をそれぞれ取り出してＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地でよく洗浄し、培養皿でよく粉砕して細胞浮遊物を１５ｍＬのチューブに移しておいた。ＦＯ骨髄腫細胞を遠心分離して収去し、１０ｍＬのＤＭＥＭ培地に懸濁して前記リンパ節細胞と共に細胞数を計数した。その後、１０６個の骨髄腫細胞ＦＯと１０７個のリンパ節細胞を５０ｍＬのチューブに移して混ぜた後、２００×ｇで５分間遠心分離して上澄み液を除去し、しかる後に、３７℃の水が充填されたビーカーに２分間放置した。チューブを軽く叩いて細胞を柔らかくし、３７℃の水に浸漬した状態でゆっくり振とうしながら、１ｍＬのＰＥＧ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）を１分間徐々に添加した。１００×ｇで２分間遠心分離し、５ｍＬのＤＭＥＭ培地を３分にわたって徐々に添加し、さらに５ｍＬのＤＭＥＭ培地を２分間ゆっくり添加した後、２００×ｇで遠心分離して細胞を回収した。そして、細胞融合効率および生存率を高めるために、ハイブリドーマクローニング因子(Hybridoma Cloning Factor)（ＢｉｏＶｅｒｉｓ社、ＵＳＡ）を予め１０％で正常培地（ＤＭＥＭ＋２０％の牛胎児血清）に混ぜておいた。回収した細胞を、ハイブリドーマクローニング因子を混ぜた３０ｍＬの正常培地（ＤＭＥＭ＋２０％の牛胎児血清）に丁寧に懸濁した。３７℃のＣＯ２培養器で３０分間放置した後、９６ウェルプレートにウェル当り７０μＬずつ１０５個の細胞となるように分注して３７℃のＣＯ２培養器で培養した。翌日７０μＬのＨＡＴを加え、３日間隔でＨＡＴ培地で２週以上成長させながら、成長するコロニーを観察した。このようにＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を免疫注射したリンパ節、およびＳＣＫ細胞を免疫注射したリンパ節から分離したリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて得たハイブリドーマコロニーの上澄み液を用いて、次の実験を行った。
【００５１】
抗体が発現するクローンを選抜するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)法を使用した。抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を２μｇ／ｍＬでコートしたプレートに１００μＬのハイブリドーマ培養液を添加して３７℃で１時間反応させ、さらに抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭのＨＲＰ(horseradish peroxidase、Ｓｉｇｍａ社）の１／５０００希釈液と１時間さらに反応させた。０．０５％のツイン２０を添加したリン酸緩衝液で培養容器を洗浄し、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ社）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の含有される基質溶液を添加し、波長４９２ｎｍの吸光分析器で吸光度を測定することにより、抗体を生産するクローンを選別した。
【００５２】
これらの製造したクローンの中で、比較的安定的に抗体を分泌するハイブリドーマ上澄み液のＳＣＫとＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する結合能を調査した。具体的に、培養されたＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を細胞分離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２０分間３７℃で処理して単一細胞に分離した後、４０μｍのストレイナー(strainer)を通過させて５×１０５細胞をフローサイトメトリー(Flow cytometry)に使用した。まず、単一細胞化されたＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞をＰＢＡ（１％のＢＳＡをＰＢＳに溶解）に浮遊させ、抗体上澄み液を４℃で３０分間反応させた。４℃で１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離して１００μＬの上澄み液を除去し、ここに抗マウスＩｇ−ＦＴＣ（ＢＤ）を２００倍希釈して４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＡで２回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide、ＰＩ）陰性である細胞のみを選んでフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ）でＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する結合能を分析した。
【００５３】
その結果、ＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫに結合する抗体を分泌する様々なハイブリドーマを選別し、持続的な継代培養によって安定化を維持させた後、サブクローニングした。前記サブクローニングによって確実に安定性を維持させたＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する特異性を維持した抗体Ａ１０−Ａ３を分泌するハイブリドーマを選別した。
【００５４】
前記モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３を分泌するハイブリドーマをハイブリドーマＡ１０−Ａ３（受託番号：ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰ）と命名し、これらを２００６年２月２０日付でＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城区魚隠洞５２番地韓国生命工学研究院）に寄託した。
【００５５】
実施例３：モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３の癌細胞結合特異性の分析
Ａ１０−Ａ３ハイブリドーマ細胞株を無血清培地（ＰＦＨＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した後、培養液からタンパク質Ｇ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて精製した(Fike et al., Focus 12:79, 1990)。精製されたＡ１０−Ａ３抗体の胆管癌細胞に対する結合能を蛍光細胞染色によって実施例３と同様の方法によって調査した（図１）。図１において、実線部分はモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３、およびＬ１ＣＡＭに対する公知の抗体５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）とＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であり、陰影部分は２次抗体のみを含んだものである。様々な癌細胞に対するＡ１０−Ａ３、４−６３、５Ｇ３およびＵＪ１２７の結合能力を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。その結果、前記モノクローナル抗体が癌細胞の中でもＳＣＫ、Ｃｈｏｉ−ＣＫおよびＳＫ−ＯＶ３などの癌細胞に結合することを観察することができた（図１のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）。ところが、ＡＣＨＮ癌細胞、肝細胞、ＨＵＶＥＣ、抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）とは結合しない結果を示した。
【００５６】
実施例４：モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３が認識する抗原の分離および同定
実施例４−１：抗原の分離
モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３が認識する細胞表面認識因子を分離するために、まず、培養したＣｈｏｉ−ＣＫ細胞をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でビオチン化させた後、細胞を溶解溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１００μｇ／ｍＬのフェニルメチルフルホニルフッ化物、５μｇ／ｍＬのロイペプチン）を用いて４℃で２０分間反応させた後、細胞残骸(debris)を除去するために遠心分離を行った。上澄み液のみを回収してＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した。
【００５７】
タンパク質Ｇプラス−セファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースと４℃で２時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し、回収した上澄み液はさらに約１μｇの抗体と４℃で１２時間反応させた。ここに２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースを添加して４℃で２時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。
【００５８】
回収した沈殿物を細胞溶解液で１０回以上洗浄し、残っているタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝溶液で１時間反応させてから、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜をストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲート（１：１５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して１時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ビオチン化タンパク質をＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。
【００５９】
その結果、約２００ｋＤａサイズのタンパク質にＡ１０−Ａ３抗体が結合することを確認した（ 図２のパネルＡ）。抗体Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降するタンパク質を集めるために、１×１０８Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞から得た細胞溶解液を前述の方法で免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。このゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ２５０（Ｂｉｏｒａｄ）で染色した。
【００６０】
実施例４−２：質量分析器(Mass Spectrometry)による抗原の同定
Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降したタンパク質を含むＳＤＳゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で供給者のプロトコール通りに染色した。タンパク質含有部分を切り出し、３０％のメタノールで５分間洗浄し、細かく粉砕した。ゲル切片を３０％メタノールによって染色が完全に脱色するまで反応させてから、１００％のアセトニトリルによって１０分間水分を除去し、３０分間真空遠心分離器によって乾燥させた。乾燥したゲル切片は５０ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液で３００ｎｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１６時間３７℃で反応させた。切断されたペプチドは３回１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで抽出し、真空遠心分離器で乾燥させた。ペプチド混合物はＱ−ＴＯＦ ｍｉｃｒｏ（ＭｉｃｒｏＭａｓｓ）でＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ(electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry)によって分析した。その結果、このタンパク質がＬ１ＣＡＭ(L1 Cell Adhesion molecule)であることを確認した（図３）。図３における下線部分は、実際アミノ酸配列がＱ−ＴＯＦで解明されたことを表示する。よって、実際Ｌ１ＣＡＭに対する抗モノクローナル抗体ＵＪ２７．１１をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ＵＳＡ）社から購入してビオチン標識付きＣｈｏｉ−ＣＫ細胞溶解液を用いて実施例４−１のように免疫沈降させ、ＥＣＬで確認した。図２のパネルＡに示すように、Ａ１０−Ａ３と抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体が約２００ｋＤＡの同一位置にタンパク質を免疫沈降させることが分かる。
【００６１】
実施例４−３：ウエスタンブロット(Western blotting)によるＬ１ＣＡＭ抗原の確認
Ａ１０−Ａ３抗体が本当にＬ１ＣＡＭを認識するかを再確認するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫの細胞溶解液を用いてこの抗体でまず免疫沈降を行った。タンパク質Ｇプラス−セファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースと４℃で２時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し（図２のｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ）、回収した上澄み液はさらに約１μｇの抗体と４℃で１２時間反応させた。ここに２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースを添加して４℃で２時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞溶解液で１０回以上洗浄し、残っているタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２−メルカプトエタノールなしに分離した。このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝溶液で１時間反応させてから、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜を公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を１次抗体として添加して１時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、抗−マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間反応させた。さらにＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。その結果、Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降した約２００ｋＤａサイズのタンパク質にＬ１ＣＡＭ抗体が結合することを確認した（図２のパネルＢ）。これはさらにＡ１０−Ａ３抗体がＬ１ＣＡＭを認識することを示す。
【００６２】
実施例４−４：水溶性Ｌ１ＣＡＭの発現
水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させるための発現ベクターを製作するために、培養された癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫからＲＮＡ抽出キット（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離した。分離されたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いて、２つの両末端プライマーＩｇ−ｄｏｍ−Ｆ（５’−ｇＡｇ ｇＡｇ ｇＡＡ ＴＴＣ Ｃｇｇ ＣｇＣ Ｃｇｇ ｇＡＡ ＡｇＡ Ｔｇｇ ＴＣｇ Ｔｇｇ Ｃｇ−３’、３８ｍｅｒ）とＬ１−Ｆｎ−Ｓｔｏｐ−Ｒ（５’−ＣＴＣ ＴＡｇ ＡｇＴ ＴＣＴ ＣｇＡ ｇＴＣ ＡｇＡ ｇＣＣ ＴＣＡ ＣｇＣ ｇｇＣ Ｃ−３’、３４ｍｅｒ）とｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ ｃｏ．）を用いて９５℃で５分間前処理反応させた後、９５℃、３０秒／５８℃、３０秒／７２℃、２分間２５回連鎖重合反応を行い、７２℃で１０分間重合反応を行って増幅した。増幅された水溶性Ｌ１ ＤＮＡ断片をｐＪＫ−ｄｈｆｒ２発現ベクター（Ａｐｒｏｇｅｎ）に挿入するために、ベクターと増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ酵素でそれぞれ切断して１％アガロースゲルに電気泳動して当該断片を切り取ってＧｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ ｃｏ．）を用いて回収した。回収された２つのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いて１６℃で３０分間反応させて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）にヒートショック(heat shock)法によって形質転換させた。形質転換された細胞からプラスミドＤＮＡを分離して塩基配列を分析することにより、水溶性Ｌ１ＣＡＭのｃＤＮＡがクローニングされていることを確認した。製造された発現ベクターはｐＪＫ−ｄｈｆｒ２−Ｌ１−ｍｏｎｏｍｅｒと命名した。
【００６３】
水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させるために、ｐＪＫ−ｄｈｆｒ２−Ｌ１−ｍｏｎｏｍｅｒ ＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１２６８、以下「２９３Ｔ」という）に形質転換してＬ１−ｍｏｎｏｍｅｒを発現させた。５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）と前記発現ベクター１０μｇをそれぞれ混入して５分間常温で反応させる。２つの反応液を合わせた後、１５分間常温でさらに反応させた。２つの反応液を常温で反応させる間、２９３Ｔ細胞をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）で丁寧に洗浄して除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を入れた後、さらに除去する。リポフェクタミン２０００とＤＮＡとを反応させた溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地４ｍＬを入れて攪拌した後、これを２９３Ｔ細胞のある培養容器に注意深く仕込み、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。６時間の培養後、５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地をさらに添加し、３日間培養した。
【００６４】
実施例４−５：抗体の水溶性Ｌ１ＣＡＭに対する結合特異性の確認
２９３Ｔ細胞で水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させた細胞培養液と、水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させていない細胞培養液に対して１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝溶液を用いて４℃で１２時間反応させてから、前記ＴＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と前記Ａ１０−Ａ３および４−６３抗体を、５％脱脂乳含有のＴＢＳＴ緩衝溶液に１：１００００で希釈された１次抗体と１時間反応させた。前記ＴＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間反応させた。さらにＴＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。その結果、前記各抗体は約２００ｋＤａサイズの水溶性Ｌ１ＣＡＭに結合することを確認した（図２のパネルＣ）。また、前記Ｌ１発現細胞培養液に対して前記抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った結果、各抗体は発現した水溶性Ｌ１ＣＡＭに対する結合特異性があることを確認した。
【００６５】
実施例５：胆管癌組織に対する免疫組織化学的染色
胆管癌の免疫組織化学染色のために、癌から厚さ３μｍの切片を準備した。この切片を、それぞれポリ−Ｌ−リジンを塗布したスライドに接着させた。まず、６０℃のオーブンで３時間乾燥させた後、キシレンによって室温で５分間３回脱パラフィン化させた。１００％、９０％、８０％および７０％のアルコールでそれぞれ１分間処理し、抗原性回復のためにｔａｒｇｅｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）にスライドを浸漬した後、圧力釜を用いて４分間沸かしたＴＢＳＴ(Tris-buffered saline-Tween 20)緩衝溶液で水洗した。高感度の免疫組織化学染色のために、Ｂｉｏｔｉｎ−ｆｒｅｅ Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍであるＣＳＡIIｋｉｔ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いた。非特異抗原を除去するために、３％の過酸化水素に５分間反応させた後、緩衝溶液で５分間２回洗浄し、非特異タンパクの結合を除去するために十分な無血清蛋白質ブロック(serum-free protein block)で５分間反応させた。１次抗体（Ａ１０−Ａ３、４−６３、１：５０希釈）を塗布して１５分間反応させ、抗−マウス免疫グロブリン−ＨＲＰに１５分間処理した。その後、増幅剤(Amplification reagent)に１５分間放置した後、抗−フルオレセイン−ＨＲＰに１５分間反応させた。ＤＡＢを用いて５分間発色させた後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ で対照染色を行った。それぞれの段階が終わると、ＴＢＳＴ緩衝溶液で５分間２回洗浄した。陰性対照群は染色の際に１次抗体を除外して正常羊血清を添加するか、あるいは１次抗体の代わりに正常マウスＩｇＧ１血清を添加し、残りの全ての過程は同様にした。その結果、正常組織には結合せず、胆管癌組織にはＡ１０−Ａ３および４−６３抗体がよく結合することが分かった（図４）。
前記結果は胆管癌組織でＬ１ＣＡＭが発現することを意味する。
【００６６】
前記Ｌ１ＣＡＭが発現した癌のうち、胆管癌におけるＬ１ＣＡＭの発現率を調べるために、Ａ１０−Ａ３抗体を用いた免疫組織化学染色法を用いて肝内胆管癌患者（４２ケース）と肝外胆管癌患者（１０３ケース）の癌組織でＬ１ＣＡＭがどれほど発現するかを分析した結果、肝内胆管癌患者の４５．２％および肝外胆管癌患者の３９．８％でＬ１ＣＡＭが高発現することを確認した（図５）。特に胆管癌の転移の開始を知らせるインベイシブフロントでＬ１ＣＡＭが高発現することを確認した（図４）。
【００６７】
実施例６：胆管癌におけるＬ１ＣＡＭの発現率と患者生存率との関係に対する統計学的分析
Ｌ１ＣＡＭの発現率と胆管癌患者の生存率との関連性を肝外胆管癌患者（６０ケース）を対象として分析した結果、高いＬ１ＣＡＭ発現率を有するグループが、低いＬ１ＣＡＭ発現率を有するグループよりＯＳ(overall survival)およびＤＦＳ(disease free survival)が統計学的に有意的に低い、すなわち死亡危険性が高いことを確認した（図６）。生存グラフにおいて、Ｌ１ＣＡＭの過発現と低発現は胆管癌患者の２年間の総生存率（ＯＳ）に多くの差異を示し、統計学的に最も有効性があるものと確認された。また、生存グラフにおいて、Ｌ１ＣＡＭの過発現および低発現は胆管癌患者の２年間再発せずに生存することが可能な確率（ＤＦＳ）が統計学的に有意性を持つものと確認された。
【００６８】
これに対し、胆管癌または他の腫瘍で過発現するものと知られているＥＧＦＲ(epidermal growth factor receptor)の発現率と生存率との相関関係は、統計学的に有意性があるものとは確認されなかった（図６）。これはＬ１ＣＡＭに対する抗体を胆管癌の診断および治療に利用可能であることを示唆し、特に死亡率が高い胆管癌の転移を早期に診断および治療して治療効果を高めることができることを示唆する。Ｌ１ＣＡＭの発現率と生存率との関係に対する統計学的分析結果より、高いＬ１ＣＡＭ発現率を有するグループの胆管癌患者の死亡率が、低いＬ１ＣＡＭ発現率を有するグループの胆管癌患者の死亡率より確実に高いことを確認した。
【００６９】
この結果は、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌の悪い予後因子であることを証明するもので、Ｌ１ＣＡＭが胆管癌治療の重要ターゲットになれることを示唆する。これに対し、現在臨床的に使用中の癌治療剤（例えば、セテュキマブ(cetuximab)、ＥＧＦＲに対するキメラ抗体のターゲットであるＥＧＦＲが胆管癌で高発現するが、胆管癌における発現率と胆管癌患者の生存率との関係を分析した結果、統計的な有意性がないものと確認した。また、ＥＧＦＲは胆管癌の悪い予後因子でないことを確認した。これは癌細胞で過剰発現する分子が必ずしも悪い予後因子になるのではなく、重要な治療ターゲットになるものではないことを証明する。
【００７０】
実施例７：Ｌ１ＣＡＭ発現抑制の胆管癌細胞機能に対する効果
実施例７−１：胆管癌細胞におけるｓｉＲＮＡを用いたＬ１ＣＡＭの発現抑制
Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫでＬ１ＣＡＭの発現をノックダウンさせるために、Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３’および５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’）と非特異的なオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧｄｔｄｔ−３’）をそれぞれ形質感染させた後、７２時間培養した。Ｌ１ＣＡＭのノックダウン(knock down)はＡ１０−Ａ３を用いたフローサイトメトリー(flow cytometry)、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットによって確認した。その結果、Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡをＣｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫに処理したところ、非特異的なｓｉＲＮＡを処理した対照群と比較したとき、Ｌ１ＣＡＭの全体発現量と細胞表面に存在するＬ１ＣＡＭの量が減少することを確認した（図７のパネルＡ）。
【００７１】
実施例７−２：Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを処理した胆管癌細胞の活性分析
Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを形質感染させた胆管癌細胞と非特異的なｓｉＲＮＡを形質感染させた胆管癌細胞の増殖(proliferation)、浸潤(invasion)および移動(migration)の度合いを比較した。増殖の度合いは、それぞれ同数の細胞を計数して７２時間後の細胞をトリファンブルー(Tryphan Blue)溶液を用いて測定した。また、浸潤および移動の度合いはＱＣＭ２４−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて分析した。Ｌ１ＣＡＭがノックダウンされた細胞群は、Ｌ１ＣＡＭが正常的に発現する細胞群に比べて増殖、浸潤および移動の度合いが減少することを確認した。これはＬ１ＣＡＭが胆管癌細胞の成長、移動および浸潤に作用していることを示唆する（図７のパネルＢ）。
【００７２】
実施例８：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体による胆管癌細胞の成長抑制
Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が胆管癌細胞の成長を阻害するかを実験するために、Ａ１０−Ａ３抗体が結合するＣｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫと、陽性対照群としての卵素癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３と、陰性対照群としてのＡＣＨＮ細胞を３ｍＬの培地内に２×１０５ｃｅｌｌｓずつ計数して６ウェルプレートで培養し、前記モノクローナル抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した後、細胞を３７℃のＣＯ２反応器で７２時間反応させた。そして、細胞を回収して０．２％トリファンブルー溶液で死細胞と生細胞を数え、全体細胞中の生細胞の百分率を求めた。その結果、Ａ１０−Ａ３抗体によってＣｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫ細胞の成長はＳＫ−ＯＶ３細胞のように著しく減少し、ＡＣＨＮは何の影響も受けなかった（図８のパネルＡ）。一方、４−６３抗体も胆管癌の成長を抑制した（図８のパネルＢ）。
Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合するものと知られている公知の抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を前記胆管癌細胞に処理したとき、ＵＪ１２７抗体は前記癌細胞の成長を阻害したが、５Ｇ３抗体の場合には胆管癌細胞（Ｃｈｏｉ−ＣＫ）の成長を若干阻害した（図８のパネルＣ）。５Ｇ３抗体はＣｈｏｉ−ＣＫ細胞には結合した（図１のパネルＣ）。この結果は、モノクローナル抗体が癌細胞に結合するとしても、必ずしも癌細胞の成長を阻害するのではないことを示唆する。
【００７３】
実施例９：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体による胆管癌細胞の浸潤および移動抑制
インベイションアッセイ(Invasion assay)を行うために、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社のＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用した。インサート(insert)のＥＣＭ層を再水和するために、予め温め直した３００μＬの無血清培地（ＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）をインサートに入れ、常温で３０分間放置しておいた。Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫ、ＳＫ−ＯＶ３およびＡＣＨＮをＰＢＳによって２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、３７℃の培養器に入れた。インベイジョン培地（ＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ）から取り外した細胞を収去し、細胞数を１×１０５／２００μＬのインベイジョン培地に合わせた後、それぞれのインサートに細胞を仕込み、抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３または公知の抗体５Ｇ３（１０μｇ／ｍＬ）と正常マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を処理した。Ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに１０％ＦＢＳを入れたインベイジョン培地を仕込み、７２時間３７℃の培養器で培養した。培養が終わった後、インサートに残った細胞と培地を除去し、インサートを新規のウェルに移した。予め温め直した細胞分離溶液２２５μＬにインサートを乗せ、３７℃の培養器で３０分間培養した。残った細胞を完全に取り外すためにインサートを振とうし、細胞分離溶液と細胞入り溶液に７５μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ／Ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを仕込み、常温で１５分間放置した。２００μＬの溶液を９６ウェルに移して４８０ｎｍ／５２０ｎｍのｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅで読み取った。その結果、Ａ１０−Ａ３はＡＣＨＡでは抑制作用がないが、Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫおよびＳＫ−ＯＶ３では癌細胞の浸潤を抑制することが分かった（図９のパネルＡ）。４−６３抗体もＣｈｏｉ−ＣＫ細胞の浸潤を抑制した（図９のパネルＡ）。ところが、５Ｇ３抗体はＣｈｏｉ−ＣＫ細胞の浸潤抑制作用がＡ１０−Ａ３および４−６３抗体より良くなかった（図９のパネルＡ）。
【００７４】
マイグレーションアッセイ(Migration assay)の際には、インサートの底部に別途にコラーゲンタイプＩを１０μｇ／ｍＬでコートした以外は前記方法と同様にして実験した。その結果、抗体Ａ１０−Ａ３はＡＣＨＮでは抑制作用がないが、Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫおよびＳＫ−ＯＶ−３では癌細胞の移動を抑制することが分かる（図９）。
【００７５】
実施例１０：Ａ１０−Ａ３抗体による癌細胞信号伝達抑制
実施例１０−１：Ａ１０−Ａ３抗体による癌細胞のＰＣＮＡ発現抑制
細胞の増殖を表現するＰＣＮＡ(Proliferating cell nuclear antigen)の発現がＡ１０−Ａ３抗体によって低下するかをウエスタンブロットによって検証するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞に抗体Ａ１０−Ａ３、マウスＩｇＧ１０をそれぞれ７２時間処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファー(Western transfer)した。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、マウスモノクローナル抗−ＰＣＮＡ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５００）抗体および抗−βアクチン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１：４０００）抗体と１時間反応させた。そして、抗−マウスホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）と反応させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ(Enhanced Chemiluminescence Reagent)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でＰＣＮＡとβ−ａｃｔｉｎを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３で処理したＣｈｏｉ−ＣＫでのみＰＣＮＡの発現が著しく減少することを観察することができた（図１０のパネルＡ）。
【００７６】
実施例１０−２：ＭＡＰＫリン酸化(phosphorylation)の抑制
癌細胞の成長、浸潤および生存に関与するＭＡＰＫ(mitogen-activated protein kinase)リン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって検証するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞に抗体Ａ１０−Ａ３およびマウスＩｇＧを１０μｇ／ｍＬでそれぞれ７２時間処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂牛で一晩４℃でブロッキングし、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ ＭＡＰＫ（Ａｂ Ｃａｍ、１：１０００）抗体と１％脱脂乳で一晩反応させた。リン酸化していないＭＡＰＫの発現を調査するためには、同量のタンパク質を前述のように同様に処理し、ブロッキングしたニトロセルロース膜とａｎｔｉ−ＭＡＰＫ（Ａｂ Ｃａｍ、１：１０００）抗体を１時間反応させた。そして、抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｇｎａｌｉｎｇ、１：１００００）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ ＭＡＰＫとＭＡＰＫを検出した。同一のＭＡＰＫが発現するＣｈｏｉ−ＣＫ癌細胞で抗体Ａ１０−Ａ３を処理したＣｈｏｉ−ＣＫでのみｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫの量が著しく減少することを観察することができた（図１０のＡ）。
【００７７】
実施例１０−３：Ａ１０−Ａ３抗体によるＡＫＴリン酸化抑制
癌細胞の生存に関与するＡｋｔリン酸化(phosphorylation)がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって検証するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞に抗体Ａ１０−Ａ３とマウスＩｇＧ１０をそれぞれ３０分、１時間、１時間３０分および２時間ずつ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂牛で一晩４℃でブロッキングし、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）抗体およびｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−Ａｋｔ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）と１％脱脂乳で一晩反応させ、抗−ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１００００）抗体と１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ(enhanced chemiluminescence reagent)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔと全体Ａｋｔを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３を処理したＣｈｏｉ−ＣＫ細胞でｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔの量が減少することを観察することができた（図１０のＢ）。
【００７８】
実施例１０−４：Ａ１０−Ａ３抗体によるＦＡＫリン酸化抑制
癌細胞の成長および移動に重要に作用するＦＡＫ(focal adhesion kinase)のリン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって分析するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫ細胞に抗体Ａ１０−Ａ３を３０分、１時間、１時間３０分、２時間ずつ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）抗体と１％脱脂乳で一晩反応させ、ａｎｔｉ−β ａｃｔｉｎ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１：４０００）抗体と１時間反応させた。そして、抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００００）と１時間反応させ、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ(enhanced chemiluminescence reagent)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫとβ−ａｃｔｉｎを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３で処理したＣｈｏｉ−ＣＫおよびＳＣＫでｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫの量が著しく減少することを観察することができた（図１０のＣ）。
【００７９】
実施例１１：マウスモデルにおける抗体Ａ１０−Ａ３の癌細胞成長抑制実験
ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕを中央実験動物社を介してＳＬＣ（日本）から購入した。週齢および体重は６〜８週齢および１８〜２２ｇであって、韓国生命工学研究院で１週間馴化させた。その後、皮下に３×１０６ｃｅｌｌｓのＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を利殖し、２０日目に３９０ｍｍ３の大きさに成長した（図１０のＡ）。腫瘍容積(Tumor volume)は横（ｍｍ）×縦（ｍｍ）×高さ（ｍｍ）／２で測定した。実験最終日にヌードマウスをＣＯ２を用いて犠牲にした後、腫瘍を分離し、その重量を測定した。動物に対する毒性を検証するために、動物の体重を測定した。標準偏差（ＳＤｓ）およびｐ−ｖａｌｕｅはＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｉｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）およびＳｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔを用いて算出した。
Ａ１０−Ａ３を１日目(day 1)から毎週３回ずつ１０ｍｇ／ｋｇの濃度で尾静脈に注射したとき、２０日目(day 20)まで強い抗癌効果が観察された（図１０のＡ）。対照群(control)としてはマウスＩｇＧ抗体を同量で尾静脈に注射した。２０日目の腫瘍のサイズは２３２ｍｍ３であって、対照群と比較して約４０％の抗癌効果が観察された（図１１のＡ）。実験最終日（２０日目）に腫瘍を分離した後、その重量を測定した（図１１のＢ、Ｃ）。対照群の平均腫瘍重量は８７２ｍｇであり、Ａ１０−Ａ３投与群の平均腫瘍重量は５１６ｍｇであって、約４０％の抗癌効果が観察された。
【００８０】
Ａ１０−Ａ３の毒性を予測するために、ヌードマウスの体重変化を２０日間測定し、肉眼で行動の変化を検証した（図１１のＤ）。２０日目に対照群と比較したとき、体重減少および異常行動も観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
上述したように、本発明者らは、胆管癌の細胞表面にＬ１ＣＡＭが発現して胆管癌の増殖および浸潤に関与し、このようなＬ１ＣＡＭが胆管癌に特異的な悪い予後因子(poor prognostic factor)であることを解明したところ、本発明に係る胆管癌細胞表面のＬ１ＣＡＭタンパク質を認識し、胆管癌組織に特異的に結合する抗体またはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびこれを含む薬学的組成物は、胆管癌の成長、浸潤および移動を抑制し且つ細胞死滅を誘導することにより、胆管癌の治療に有用に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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