(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成するＲＮＡ合成工程と、
ｍＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、を用いて、前記ＲＮＡ合成工程で合成されたＲＮＡにキャップ構造を付加するキャップ構造付加工程と、
を少なくとも含むことを特徴とするキャップ化ＲＮＡの製造方法。
【請求項２】
鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列及び該Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列を有し、前記Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列より下流であり、かつ該Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列から１１番目〜１３番目の塩基がチミジンである請求項１に記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法。
【請求項３】
ＲＮＡ合成工程の後、かつキャップ構造付加工程の前に、前記ＲＮＡ合成工程で得られたＲＮＡを固相に添加し固相抽出法により精製する精製工程を更に含む請求項１から２のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法。
【請求項４】
固相からＲＮＡを３容量％〜９容量％のアセトニトリル水溶液で溶出する工程を更に含む請求項３に記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法。
【請求項５】
キャップ構造が、キャップコア構造、キャップ０構造、及びキャップ１構造の少なくともいずれかであり、キャップ構造が付加されたＲＮＡの９０％以上がキャップ１構造である請求項１から４のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法。
【請求項６】
下記配列番号４で表される塩基配列を有するキャップ化ＲＮＡを製造する請求項１から５のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法。
ｍ７ＧｐｐｐＧｍＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ（配列番号４）
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法により製造されたキャップ化ＲＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とするＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼが、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼであり、該ＲＮＡポリメラーゼが有するキャップ化ＲＮＡの切り出し反応を阻害する物質をスクリーニングする請求項７に記載のＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
（ｉ）ｍＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｉｉ）ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素、及び
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素
を含むことを特徴とする酵素組成物。
【請求項１０】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを担持し得る固相と、請求項９に記載の酵素組成物と、を少なくとも含み、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質をスクリーニングすることに用いられることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規キャッピング酵素、並びに、前記新規キャッピング酵素を使用したキャップ化ＲＮＡの製造方法、前記キャップ化ＲＮＡの製造方法により製造されたキャップ化ＲＮＡを使用したＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法、及び前記新規キャッピング酵素を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗インフルエンザウイルス薬として、タミフルに代表されるノイラミニダーゼ標的薬が使用され、若年層における中枢神経系抑制作用等の副作用の報告があるものの、感染初期において新型インフルエンザウイルスについても効果を発揮するなど、広く治療薬として使用されている。
しかしながら、前記タミフルに耐性を示すＨ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスが報告されており、これまでの抗インフルエンザウイルス薬とは異なる作用機序で作用し、かつ優れた効果を発揮し得る抗インフルエンザウイルス薬の開発が望まれている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、該インフルエンザウイルスのｍＲＮＡを合成する際にユニークな遺伝子発現機構を有することが知られている。即ち、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、宿主細胞のｍＲＮＡのキャップ構造を認識し、該キャップ構造に結合する。そして、宿主細胞から、前記キャップ構造を含むＲＮＡ断片を切断する。特に、宿主細胞のｍＲＮＡの５’末端側から１１番目〜１３番目の塩基（キャップ構造の塩基を除く）を切断し、これをプライマーとして利用することで、インフルエンザウイルスのｍＲＮＡを合成する。
【０００４】
前記キャップ構造とは、真核生物や、該真核生物を宿主とするウイルスのｍＲＮＡの大部分に存在し、その構造としては、ｍＲＮＡの５’末端に７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）の５’水酸基が３個のリン酸基（ｐｐｐ−）を介してＲＮＡの５’末端に結合した構造である。前記キャップ構造は、一般に、メチル基を有さないキャップコア構造（Ｇ（５’）ｐｐｐＮｐＮｐ−で表される）、１つのメチル基を有するキャップ０構造（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＮｐＮｐ−で表される）、及び２つのメチル基を有するキャップ１構造（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＮｍｐＮｐ−で表される）がある。ここで、前記Ｎは、任意の塩基を表す。これらの中でも、前記インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、特にキャップ１構造を好適に認識することが知られている。
【０００５】
前記インフルエンザウイルスのｍＲＮＡにおける遺伝子発現機構を利用した抗インフルエンザウイルス薬は、未だ開発されておらず、該遺伝子発現機構を利用することで、これまでの抗インフルエンザウイルス薬にはない作用機序で作用する抗インフルエンザウイルス薬の開発が期待できる。
【０００６】
これに対し、ＲＮＡの５’末端にキャップ構造を付加し、キャップ化ＲＮＡを製造する方法が提案されている（特許文献１参照）。しかし、この提案方法では、ＲＮＡのキャップ化に、ワクシニアウイルスやポックスウイルス等のウイルスを用いており、安全性の点で問題がある。また、前記ウイルスを用いる場合、大量に高純度の酵素を得ることが困難であり、キャップ化ＲＮＡの製造効率が悪いという問題もある。
【０００７】
したがって、前記インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより好適に認識され、前記遺伝子発現機構を利用した抗インフルエンザウイルス薬のスクリーニングに使用可能であり、高精製度で、かつ効率よく大量にキャップ化ＲＮＡを製造することができるキャップ化ＲＮＡの製造方法は、未だ提供されておらず、その提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２０８６３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性が高く、簡便な方法で大量に、かつ高精製度で得ることができるキャッピング酵素、前記キャッピング酵素を使用し、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより好適に認識され、高精製度で、かつ効率よく大量にキャップ化ＲＮＡを製造することができるキャップ化ＲＮＡの製造方法、前記キャップ化ＲＮＡを使用したＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法、及び前記キャッピング酵素を含むキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  鋳型ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成するＲＮＡ合成工程と、ｍＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、を用いて、前記ＲＮＡ合成工程で合成されたＲＮＡにキャップ構造を付加するキャップ構造付加工程と、を少なくとも含むことを特徴とするキャップ化ＲＮＡの製造方法である。
＜２＞  鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列及び該Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列を有し、前記Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列より下流であり、かつ該Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列から１１番目〜１３番目の塩基がチミジンである前記＜１＞に記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法である。
＜３＞  ＲＮＡ合成工程の後、かつキャップ構造付加工程の前に、前記ＲＮＡ合成工程で得られたＲＮＡを固相に添加し固相抽出法により精製する精製工程を更に含む前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法。
＜４＞  固相からＲＮＡを３容量％〜９容量％のアセトニトリル水溶液で溶出する前記＜３＞に記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法である。
＜５＞  キャップ構造が、キャップコア構造、キャップ０構造、及びキャップ１構造の少なくともいずれかであり、キャップ構造が付加されたＲＮＡの９０％以上がキャップ１構造である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法である。
＜６＞  下記配列番号４で表される塩基配列を有するキャップ化ＲＮＡを製造する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法である。
ｍ７ＧｐｐｐＧｍＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ（配列番号４）
＜７＞  前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のキャップ化ＲＮＡの製造方法により製造されたキャップ化ＲＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とするＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法である。
＜８＞  ＲＮＡポリメラーゼが、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼであり、該ＲＮＡポリメラーゼが有するキャップ化ＲＮＡの切り出し反応を阻害する物質をスクリーニングする前記＜７＞に記載のＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法である。
＜９＞  （ｉ）ｍＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素、（ｉｉ）ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素、及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素、の少なくともいずれかを有することを特徴とする酵素である。
＜１０＞  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを担持し得る固相と、前記＜９＞に記載の酵素と、を少なくとも含み、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質をスクリーニングすることに用いられることを特徴とするキットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性が高く、簡便な方法で大量に、かつ高精製度で得ることができるキャッピング酵素、前記キャッピング酵素を使用し、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより好適に認識され、高精製度で、かつ効率よく大量にキャップ化ＲＮＡを製造することができるキャップ化ＲＮＡの製造方法、前記キャップ化ＲＮＡを使用したＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法、及び前記キャッピング酵素を含むキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、キャップ構造付加工程のフローチャートの一例を示す図である。
【図２】図２は、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法のフローチャートの一例を示す図である。
【図３】図３は、酵素Ｄ１Ｎの製造時の精製工程において各画分を電気泳動で確認した結果である。
【図４】図４は、酵素ＡＢＤ１の製造時の精製工程において各画分を電気泳動で確認した結果である。
【図５】図５は、酵素ＶＰ３９の製造時の精製工程において各画分を電気泳動で確認した結果である。
【図６】図６は、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法における精製工程において各画分中のＲＮＡの存在を確認した結果を示す図である。
【図７】図７は、ジヌクレオチドの含有量を確認した結果を示す図である。
【図８】図８は、キャップ構造付加工程における、酵素Ｄ１Ｎ、酵素ＡＢＤ１、及び酵素ＶＰ３９のそれぞれの機能を解析した結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例及び比較例のキャップ構造付加効率を確認した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法で得られたキャップ化ＲＮＡが、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼに認識され、キャップ構造を含むヌクレオチドが切断されることを確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（酵素）
本発明の酵素は、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の少なくともいずれかを有する酵素である。
（ｉ）ＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性（以下、「ＴＰａｓｅ活性」と称することがある）及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性（以下、「ＧＴａｓｅ活性」と称することがある）を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素である（以下、「酵素Ｄ１Ｎ」と称することがある）。
（ｉｉ）ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性（以下、「ＭＴａｓｅ活性」と称することがある）を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素である（以下、「酵素ＡＢＤ１」と称することがある）。
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性（以下、「キャップ１ＭＴａｓｅ活性」と称することがある）を有し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素である（以下、「酵素ＶＰ３９」と称することがある）。
前記酵素Ｄ１Ｎ、前記酵素ＡＢＤ１、及び前記酵素ＶＰ３９は、いずれもＲＮＡのキャップ化に寄与し得るキャッピング酵素である。
【００１４】
＜酵素Ｄ１Ｎ＞
前記酵素Ｄ１Ｎは、ＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有し、これによりＲＮＡの５’末端にキャップコア構造（ＧｐｐｐＧ）を付加することができる酵素である。
前記酵素Ｄ１Ｎは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素であるが、ＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するものであってもよく、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）のアミノ酸が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
これらの中でも、前記酵素Ｄ１Ｎは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１５】
また、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するものとしては、例えば、公知のタンパク質解析プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０）など）を用いて選択することができる。
【００１６】
また、前記酵素Ｄ１Ｎは、例えば、融合タンパク質等のより大きいタンパク質の一部としてもよい。前記融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基等の精製に有効な配列、組換え体を産生する際の安定性に有効な配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の遺伝子工学的手法により製造する方法、自然界（天然に存在するもの）から、破砕、抽出、精製等の標準的な手法により調製する方法などが挙げられる。
前記酵素Ｄ１Ｎを、前記自然界から調製する方法としては、例えば、ワクシニアウイルスから得る方法などが挙げられる。
【００１８】
前記遺伝子工学的手法の具体例としては、前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作製し、これを用いて適宜選択した宿主細胞（例えば、大腸菌）を形質転換して形質転換体を作製し、該形質転換体内で発現された組換えタンパク質を回収することにより、前記酵素Ｄ１Ｎを得ることができる。前記回収された組換えタンパク質は、必要に応じて、公知の方法で濃縮、精製等の処理が施されてもよい。
【００１９】
前記遺伝子工学的手法を用いることで、例えば、前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列と、所望のタンパク質をコードするその他のＤＮＡ配列とを、同じベクターにクローニングし、前記同様の方法で組換えタンパク質を産生させることで、前記酵素Ｄ１Ｎに任意のペプチド乃至タンパク質が連結された融合組換えタンパク質を得ることもできる。
前記その他のＤＮＡ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記酵素ＡＢＤ１、前記酵素ＶＰ３９などが挙げられる。
また、前記酵素Ｄ１Ｎの製造において、糖鎖及び／又は脂質の付加や、Ｎ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。
以上のような修飾により、組換えタンパク質である前記酵素Ｄ１Ｎの抽出及び／又は精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００２０】
なお、本発明には、このようにして作製した、前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列、前記ベクター、前記形質転換体なども、本発明の範囲内に含み得る。
【００２１】
−酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列−
前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列としては、該ＤＮＡ配列より得られる酵素がＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号５で表される塩基配列を有することが好ましい。
また、前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものであってもよく、配列番号５で表される塩基配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）の塩基が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号５で表される塩基配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
【００２２】
前記ＤＮＡ配列に前記変異を導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、制限酵素により処理する方法、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等により処理する方法、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法、紫外線を照射する方法などが挙げられる。
これらの中でも、前記酵素Ｄ１Ｎは、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ配列でコードされるタンパク質であることが好ましい。
【００２３】
また、前記配列番号５で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものとしては、例えば、配列番号５で表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型などが挙げられる。
【００２４】
本発明において、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、配列番号５で表される塩基配列が結合する塩基配列の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる（Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  １９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ参照）。
このようなストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）、０．１質量％  ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、３７℃」程度の条件を挙げることができ、前記条件で洗浄しても、配列番号５で表される塩基配列とハイブリダイズ状態を維持するものをいう。
【００２５】
配列番号５で表される塩基配列を有する前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の、遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法等を用いて調製する方法などが挙げられる。
具体例としては、ワクシニアウイルス（例えば、ＷＴＦ７−３株）から常法によりゲノムＤＮＡを調製し、前記ゲノムＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプライマーを適宜利用してＰＣＲ法などにより調製することができる。前記オリゴヌクレオチドプライマーは、市販の自動化ＤＮＡ合成装置等を用いて容易に合成することができる。また、配列情報を利用して、化学合成によって目的とする塩基配列を得てもよい。
【００２６】
−ベクター−
前記ベクターとしては、前記酵素Ｄ１ＮをコードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号５で表される塩基配列を有するベクターである。
前記ベクターとは、該ベクターに挿入された核酸分子を宿主細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類や形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。これらの中でも、前記ベクターは、前記宿主細胞内で前記酵素Ｄ１Ｎを発現させることができる発現ベクターであることが好ましい。
【００２７】
−形質転換体−
前記形質転換体としては、前記酵素Ｄ１ＮコードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号５で表される塩基配列が導入された形質転換体である。
前記形質転換体は、所望の宿主細胞等のターゲットに、前記組換えベクターを用いて、トランスフェクション又はトランスフォーメーション等を行うことにより調製することができる。
前記トランスフェクション又はトランスフォーメーションを行う方法としては、例えば、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法などが挙げられる。
前記宿主細胞としては、特に制限はなく、使用するベクターの種類などに応じて適宜選択することができる。
【００２８】
＜用途＞
本発明の前記酵素Ｄ１Ｎは、安全性が高く、簡便な方法で大量に、かつ高精製度で得ることができ、ＲＮＡの５’末端にキャップコア構造（ＧｐｐｐＧ）を付加することができるため、ＲＮＡのキャップ化に好適に利用でき、特に後述するキャップ化ＲＮＡの製造方法、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法、キットなどに好適に利用可能である。
【００２９】
＜酵素ＡＢＤ１＞
前記酵素ＡＢＤ１は、ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有し、これによりキャップコア構造（ＧｐｐｐＧ）をキャップ０構造（ｍＧｐｐｐＧ）に転換することができる酵素である。
前記酵素ＡＢＤ１は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素であるが、ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するものであってもよく、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）のアミノ酸が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
これらの中でも、前記酵素ＡＢＤ１は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００３０】
また、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するものとしては、例えば、公知のタンパク質解析プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴなど）を用いて選択することができる。
【００３１】
また、前記酵素ＡＢＤ１は、例えば、融合タンパク質等のより大きいタンパク質の一部としてもよい。前記融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基等の精製に有効な配列、組換え体を産生する際の安定性に有効な配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３２】
前記酵素ＡＢＤ１の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法と同様の方法などが挙げられる。
前記酵素ＡＢＤ１を、前記自然界から調製する方法としては、例えば、出芽酵母から得る方法などが挙げられる。
本発明には、前記酵素ＡＢＤ１をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有するベクター、該ベクターを導入した形質転換体なども、本発明の範囲内に含み得る。
【００３３】
−酵素ＡＢＤ１をコードするＤＮＡ配列−
前記酵素ＡＢＤ１をコードするＤＮＡ配列としては、該ＤＮＡ配列より得られる酵素がｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号６で表される塩基配列を有することが好ましい。
また、前記酵素ＡＢＤ１をコードするＤＮＡ配列は、配列番号６で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものであってもよく、配列番号６で表される塩基配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）の塩基が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号６で表される塩基配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
【００３４】
前記ＤＮＡ配列に前記変異を導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法と同様の方法などが挙げられる。
これらの中でも、前記酵素ＡＢＤ１は、配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ配列でコードされるタンパク質であることが好ましい。
【００３５】
また、前記配列番号６で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものとしては、例えば、配列番号６で表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型などが挙げられる。
【００３６】
配列番号６で表される塩基配列を有する前記酵素ＡＢＤ１をコードするＤＮＡ配列を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の、遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法等を用いて調製する方法などが挙げられるが、前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法と同様の方法が好ましい。
【００３７】
−ベクター−
前記ベクターとしては、前記酵素ＡＢＤ１をコードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号６で表される塩基配列を有するベクターである。
前記ベクターとの種類や形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。これらの中でも、前記ベクターは、前記宿主細胞内で前記酵素ＡＢＤ１を発現させることができる発現ベクターであることが好ましい。
【００３８】
−形質転換体−
前記形質転換体としては、前記酵素ＡＢＤ１コードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号６で表される塩基配列が導入された形質転換体である。
前記形質転換体の調製方法、使用し得る宿主細胞等は、前記酵素Ｄ１ＮコードするＤＮＡ配列が導入された形質転換体と同様である。
【００３９】
＜用途＞
本発明の前記酵素ＡＢＤ１は、安全性が高く、簡便な方法で大量に、かつ高精製度で得ることができ、キャップコア構造（ＧｐｐｐＧ）をキャップ０構造（ｍＧｐｐｐＧ）に転換することができるため、ＲＮＡのキャップ化に好適に利用でき、特に後述するキャップ化ＲＮＡの製造方法、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法、キットなどに好適に利用可能である。
【００４０】
＜酵素ＶＰ３９＞
前記酵素ＶＰ３９は、ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有し、これによりキャップ０構造（ｍＧｐｐｐＧ）をキャップ１構造（ｍＧｐｐｐＧｍ）に転換することができる酵素である。
前記酵素ＶＰ３９は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素であるが、ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有する限り、配列番号３で表されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するものであってもよく、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）のアミノ酸が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号３で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
これらの中でも、前記酵素ＶＰ３９は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００４１】
また、前記配列番号３で表されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するものとしては、例えば、公知のタンパク質解析プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴなど）を用いて選択することができる。
【００４２】
また、前記酵素ＶＰ３９は、例えば、融合タンパク質等のより大きいタンパク質の一部としてもよい。前記融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基等の精製に有効な配列、組換え体を産生する際の安定性に有効な配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４３】
前記酵素ＶＰ３９の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法と同様の方法などが挙げられる。
前記酵素ＶＰ３９を、前記自然界から調製する方法としては、例えば、ワクシニアウイルスから得る方法などが挙げられる。
本発明には、前記酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有するベクター、該ベクターを導入した形質転換体なども、本発明の範囲内に含み得る。
【００４４】
−酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列−
前記酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列としては、該ＤＮＡ配列より得られる酵素がｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号７で表される塩基配列を有することが好ましい。
また、前記酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列は、配列番号７で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものであってもよく、配列番号７で表される塩基配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）の塩基が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号７で表される塩基配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
【００４５】
前記ＤＮＡ配列に前記変異を導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法と同様の方法などが挙げられる。
これらの中でも、前記酵素ＶＰ３９は、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ配列でコードされるタンパク質であることが好ましい。
【００４６】
また、前記配列番号７で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものとしては、例えば、配列番号７で表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型などが挙げられる。
【００４７】
配列番号７で表される塩基配列を有する前記酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の、遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法等を用いて調製する方法などが挙げられるが、前記酵素Ｄ１Ｎの製造方法と同様の方法が好ましい。
【００４８】
−ベクター−
前記ベクターとしては、前記酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号７で表される塩基配列を有するベクターである。
前記ベクターとの種類や形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。これらの中でも、前記ベクターは、前記宿主細胞内で前記酵素ＶＰ３９を発現させることができる発現ベクターであることが好ましい。
【００４９】
−形質転換体−
前記形質転換体としては、前記酵素ＶＰ３９をコードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号７で表される塩基配列が導入された形質転換体である。
前記形質転換体の調製方法、使用し得る宿主細胞等は、前記酵素Ｄ１ＮコードするＤＮＡ配列が導入された形質転換体と同様である。
【００５０】
＜用途＞
本発明の前記酵素ＶＰ３９は、安全性が高く、簡便な方法で大量に、かつ高精製度で得ることができ、キャップ０構造（ｍＧｐｐｐＧ）をキャップ１構造（ｍＧｐｐｐＧｍ）に転換することができるため、ＲＮＡのキャップ化に好適に利用でき、特に後述するキャップ化ＲＮＡの製造方法、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法、キットなどに好適に利用可能である。
【００５１】
（キャップ化ＲＮＡ及びその製造方法）
本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法は、ＲＮＡ合成工程と、キャップ構造付加工程と、を少なくとも含み、精製工程とを含むことが好ましく、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
前記ＲＮＡ合成工程は、前記キャップ構造付加工程の前に行われることが好ましく、前記精製工程は、前記キャップ構造付加工の前、好ましくは、前記ＲＮＡ合成工程の後、かつ前記キャップ構造付加工程の前に行われる。
【００５２】
＜ＲＮＡ合成工程＞
前記ＲＮＡ合成工程は、鋳型ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ（キャップ構造を付加する前のｍＲＮＡ）を合成する工程である。
【００５３】
＜＜鋳型ＤＮＡ＞＞
前記鋳型ＤＮＡ配列としては、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識し得る塩基配列を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号８で表されるＴ７プロモーター配列に相補的な配列を有することが好ましい。
５’−ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号８）
【００５４】
前記鋳型ＤＮＡが有するＴ７プロモーター配列は、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識し得る限り、配列番号８で表される塩基配列又は配列番号８で表される塩基配列に相補的な配列と相同な塩基配列を有するものであってもよい。
これらの中でも、前記Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列は、配列番号８で表される塩基配列であることが好ましい。
【００５５】
また、前記鋳型ＤＮＡ配列は、前記Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列より下流（５’末端側）であり、かつ該Ｔ７プロモーター配列に相補的な配列から１１番目〜１３番目の塩基がチミジン（Ｔ）であることが好ましい。
このような鋳型ＤＮＡ配列は、市販の自動化ＤＮＡ合成装置等を用いて容易に合成することができる。
【００５６】
前記鋳型ＤＮＡの長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２８塩基〜４０塩基が好ましく、２８塩基〜３３塩基がより好ましい。前記鋳型ＤＮＡが、１５塩基未満であると、固相抽出による分離において不純物が混入する可能性があり、５０塩基を超えると、溶出効率が悪くなることがある。
【００５７】
これらの中でも、前記鋳型ＤＮＡ配列は、下記配列番号９で表される塩基配列を有することが好ましい。なお、前記鋳型ＤＮＡ配列は、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識し得る限り、配列番号９で表される塩基配列と相同な塩基配列を有するものであってもよく、配列番号９で表される塩基配列において、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）の塩基が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。
配列番号９で表される塩基配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、プロモーター配列又は該プロモーターに相補的な配列以外の位置であることが好ましい。また、配列番号９で表される塩基配列における複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
これらの中でも、前記鋳型ＤＮＡ配列は、配列番号９で表される塩基配列からなることが好ましい。なお、配列番号９で表される塩基配列において、下線は、Ｔ７プロモーターの相補鎖の配列を示す。
５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号９）
【００５８】
前記鋳型ＤＮＡは、市販の自動化ＤＮＡ合成装置等を用いて容易に合成することができる。
【００５９】
＜＜Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ＞＞
前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、前記Ｔ７プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ等を基質として、該Ｔ７プロモーター配列より下流（５’末端側）の鋳型ＤＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡを合成する酵素である。
前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、市販品を用いることができる。
【００６０】
前記ＲＮＡ合成工程に使用する前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２，０００Ｕ／ｍＬ〜４，０００Ｕ／ｍＬが好ましく、３，０００Ｕ／ｍＬ〜４，０００Ｕ／ｍＬがより好ましい。
【００６１】
前記ＲＮＡ合成工程を実施する温度、時間などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６２】
前記ＲＮＡ合成工程において、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを反応させる際の反応系に含まれる組成としては、前記鋳型ＤＮＡと、前記Ｔ７プライマーと、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、基質（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰなど）とを少なくとも含むことが好ましく、その他、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの効果を損なわない限り、特に制限はないが、ＧＴＰの濃度は他のヌクレオチドに対して１／５程度の濃度であることが望ましいが、目的に応じて適宜選択することができる。
前記基質のうち、キャップ構造を形成するＧＴＰは、標識を有することが好ましい。
【００６３】
＜＜ＲＮＡ＞＞
前記ＲＮＡ合成工程で得られたＲＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、製造されたキャップ化ＲＮＡがインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼの基質として用いられる場合は、５’末端のキャップ構造を有するグアニン（Ｇ）から数えて（５’末端のキャップ構造を有するグアニンを１番目としたとき）、１１番目〜１３番目の塩基がアデニン（Ａ）であることが好ましく、下記配列番号１０で表されるＲＮＡを有することがより好ましい。なお、配列番号１０で表される塩基配列は、１個又は数個（例えば、３個〜１０個）の塩基が、欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組み合わせにより変異したものであってもよい。配列番号１０で表される塩基配列において、欠失、置換、付加、挿入などが生じる位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、複数の位置で欠失、置換、付加、挿入などが生じてもよい。
これらの中でも、前記ＲＮＡ合成工程で得られたＲＮＡは、配列番号１０で表される塩基配列からなることが特に好ましい。
５’−ｐｐｐＧＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ−３’（配列番号１０）
【００６４】
また、前記ＲＮＡは、蛍光標識や、放射性標識を有することが、ＲＮＡ量を正確に把握することができる点で好ましい。
前記蛍光標識としては、前記ＲＮＡに結合可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン、オレゴングリーン、エオシン、エリスロシン等のフルオレセイン類；テトラメチルローダミン誘導体、テキサスレッド誘導体、ローダミンＢ  ｂａｓｅ、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ等のローダミン類；クマリン類；ダンシル型（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸型）蛍光色素；ＮＢＤ型色素；ピレン；Ｒ−フィコエリスリン、フロフィコシアニン、アロフィコシアニン等のフィコビリプロテイン；ＢＯＤＩＰＹ誘導体；Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等のＣｙ（登録商標）色素；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６８０、７００、７５０等のアレキサ（登録商標）フローラなど挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記放射性標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３２Ｐ、３３Ｐなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６５】
前記ＲＮＡに前記標識が結合する位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ＲＮＡに前記標識を結合させる方法としても、特に制限はなく、該標識の種類などに応じて公知の方法の中から適宜選択することができる。例えば、前記ＲＮＡ合成反応時に、反応系に該標識を付した基質（ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ等）を添加しておくことにより、これが取り込まれることにより得られるＲＮＡが標識される。
【００６６】
前記ＲＮＡ合成工程で得られるＲＮＡの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｐｍｏｌ／μＬ以上が好ましく、１０ｐｍｏｌ／μＬ〜２０ｐｍｏｌ／μＬがより好ましい。前記濃度が、１ｐｍｏｌ／μｍ未満であると、次に精製工程を行う場合、該精製工程を行う前にエタノール沈殿等で濃縮する必要があり、操作が煩雑になる。
前記ＲＮＡ濃度は、前記標識を利用して測定することができる。例えば、前記標識が放射性同位体である場合は、該放射活性を測定することにより、また、前記標識が蛍光である場合は、該蛍光の強度を測定することにより、該ＲＮＡの濃度を求めることができる。
【００６７】
＜精製工程＞
前記精製工程は、前記ＲＮＡ合成工程で得られたＲＮＡを精製する工程である。前記精製工程は、前記ＲＮＡ合成工程の後、かつ前記キャップ構造付加工程の前に行われることが好ましい。
前記ＲＮＡを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、固相に添加し固相抽出法により精製する方法が好ましく、前記ＲＮＡ合成工程で合成したＲＮＡを前記固相（固定相）に添加し、該固相に該ＲＮＡを結合させた後、洗浄を行い、その後該固相に結合したＲＮＡを溶出する方法がより好ましい。
前記精製工程を行うことにより、前記ＲＮＡ合成工程において十分に反応しなかったジヌクレオチド等の不要成分を除去することができ、後述するキャップ構造付加工程において、効率よくキャップ１構造を付加することができる点で有利である。
【００６８】
前記固相としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基材に官能基が結合した担体、ポーラスポリマー、セルロース、シリカなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記固相としては、基材に官能基が結合したシリカ担体が好ましい。
【００６９】
前記基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シリカなどが挙げられる。
前記官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルキル基、フェニル基、ハロゲン化アルキル基などが挙げられる。これらの中でも、アルキル基が好ましい。
前記アルキル基の炭素数（Ｃ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｃ１〜Ｃ１８が好ましく、Ｃ１６〜Ｃ１８がより好ましく、Ｃ１８が特に好ましい。
【００７０】
前記固相は、カラム等に充填されて用いられることが、取り扱いが簡便である点で好ましい。このような固相カラムとしては、市販品を用いることができ、例えば、ＩｎｔｅｒＳｅｐ（登録商標）Ｓｌｉｍ−ＪＣ１８（ＧＬ−サイエンス社製）、などが挙げられる。
【００７１】
前記固相カラムに対する前記ＲＮＡの添加量としては、特に制限はなく、固相の充填量（５００ｍｇ）などに応じて適宜選択することができるが、０．５ｎｍｏｌ〜２ｎｍｏｌが好ましく、１ｎｍｏｌ〜１．５ｎｍｏｌがより好ましい。前記添加量が、０．５ｎｍｏｌ未満であると、十分な量のＲＮＡを得ることができないことがあり、２ｎｍｏｌを超えると、固相の結合容量を超え、ＲＮＡをロスすることがある。
【００７２】
前記固相は、前記ＲＮＡを添加後、洗浄される。前記洗浄に使用する溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ギ酸アンモニウム、水、炭酸水素アンモニウム、トリフルオロ酢酸などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ギ酸アンモニウム水溶液が好ましい。
【００７３】
前記ギ酸アンモニウム水溶液におけるギ酸アンモニウムの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍＭ〜１００ｍＭが好ましく、５０ｍＭ〜１００ｍＭがより好ましい。
前記ギ酸アンモニウムのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ２．７が好ましい。ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５の中性付近でも問題はないが、前記固相に対する前記ＲＮＡの結合容量を上げ精製度を高めるためには、ｐＨ２．７が特に好ましい。前記ｐＨは、ギ酸によって調製することができる。
【００７４】
前記洗浄回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、カラム容量の２倍程度の容量の溶媒で３回以上が好ましく、３回〜５回がより好ましい。前記洗浄回数が３回未満であると、前記ジヌクレオチド等の前記ＲＮＡ合成工程における不要成分が残存し、後述のキャップ構造付加工程においてキャップ化の効率が悪くなることがあり、５回を超えると、それ以上洗浄による効果が得られず操作が煩雑である。
【００７５】
前記洗浄後、前記固相に結合されたＲＮＡは、溶出溶媒により溶出される。
前記溶出に使用される溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセトニトリル、水、ギ酸アンモニウム（好ましくは、ｐＨ２．７）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アセトニトリル水溶液が好ましい。
【００７６】
前記アセトニトリル水溶液中のアセトニトリル濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３容量％〜９容量％が好ましく、４容量％〜６容量％がより好ましい。前記アセトニトリル濃度が、３容量％未満又は９容量％を超えると、目的とするＲＮＡを含む画分を得ることができないことがある。
【００７７】
＜キャップ構造付加工程＞
前記キャップ構造付加工程は、ＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、ｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素と、を用いて、ＲＮＡにキャップ構造を付加する工程である。
本発明の前記キャップ化ＲＮＡの製造方法に使用し得る酵素としては、本発明の前記酵素Ｄ１Ｎ、前記酵素ＡＢＤ１、及び前記酵素ＶＰ３９が好適に使用されるため、詳細な説明は省略する。
【００７８】
従来から、ＲＮＡにキャップ構造を付加するためには、ワクシニアウイルスやポックスウイルス等のウイルスの酵素が用いられてきた。しかしながら、これらのウイルスの酵素をそのまま用いた場合、安全性の面で問題がある。また、これらのウイルスから大量のキャッピング酵素を精製することは、操作が煩雑であり、またその精製度も十分なものではないという問題もあった。
これに対し、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法は、前記酵素Ｄ１Ｎ、前記酵素ＡＢＤ１、及び前記酵素ＶＰ３９を使用するため、安全性が高く、高精製度で、かつ効率よく大量にキャップ化ＲＮＡを製造することができる点で有利である。
【００７９】
前記キャップ構造付加工程において、前記酵素Ｄ１Ｎ、前記酵素ＡＢＤ１、及び前記酵素ＶＰ３９は、１回の反応において、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、前記酵素Ｄ１Ｎ、前記酵素ＡＢＤ１、及び前記酵素ＶＰ３９を使用する順序としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＲＮＡ合成工程で合成されたＲＮＡと、前記酵素Ｄ１Ｎとを反応させた後、前記酵素ＡＢＤ１と反応させ、最後に酵素ＶＰ３９と反応させることが、効率よくキャップ１構造を有するキャップ化ＲＮＡを得ることができる点で好ましい。
【００８０】
前記キャップ構造付加工程において、前記各キャッピング酵素を反応させる際の反応系に含まれる組成としては、キャップ化対象であるＲＮＡと、前記各キャッピング酵素と、基質（ＧＴＰ、Ｓ−アデノシルメチオニン）と、を少なくとも含むことが好ましく、前記ＲＮＡの分解を防止する目的でＲＮａｓｅインヒビターを含むことがより好ましく、その他、前記各キャッピング酵素の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記基質のうち、キャップ構造を形成するＧＴＰは、標識を有することが、後述するＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング等に用いる際に解析が容易である点で好ましい。
前記標識としては、前記ＲＮＡ合成工程と同様のものなどが挙げられる。
【００８１】
前記キャップ構造付加工程において、前記各キャッピング酵素を反応させる際の反応温度としては、前記酵素が活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０℃〜３８℃が好ましく、３６℃〜３７℃がより好ましい。
【００８２】
前記キャップ構造付加工程において、前記各キャッピング酵素を反応させる際の反応時間としては、十分にキャップ構造が付加され得る時間であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６０分間〜１８０分間が好ましく、６０分間〜１２０分間がより好ましい。
【００８３】
前記キャップ構造付加工程におけるキャップ構造付加効率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＲＮＡの全量に対して、キャップコア構造（ＧｐｐｐＧ）、キャップ０構造（ｍＧｐｐｐＧ）、及びキャップ１構造（ｍＧｐｐｐｍＧ）を合わせた全キャップ構造を有するＲＮＡが、９５％以上であることが好ましく、１００％であることがより好ましい。
また、前記キャップ構造の中でも、特にインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼに好適に認識されるキャップ１構造が付加されたものが多いことが好ましい。そのため、キャップ構造が付加されたＲＮＡの９０％以上がキャップ１構造であることが好ましく、９５％以上がキャップ１構造であることがより好ましく、１００％がキャップ１構造であることが特に好ましい。
本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法によれば、このように高度にキャップ１構造が付加されたキャップ化ＲＮＡを効率よく得ることができる点で有利である。
【００８４】
前記各キャップ構造の含有量は、前記キャップ構造付加工程後のキャップ化ＲＮＡから、ヌクレアーゼＰ１等のホスホジエステラーゼを用いてキャップ構造を遊離させ、これを薄層クロマトグラフィーで展開し、前記キャップ構造に結合させた標識を利用して、各キャップ構造の量を分析することにより求めることができる。したがって、前記キャップ構造付加効率は、キャップ構造を付加する前のＲＮＡ全量を１００％とし、これに対するキャプ化されたＲＮＡの割合を調べることで算出することができる。
【００８５】
図１に、前記好ましい態様で各酵素を反応させた場合のフローチャートの一例を示すが、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法におけるキャップ構造付加工程は、これに限られるものではない。
図１の例において、「ｐ」はリン酸基、「Ｎ」は任意の塩基、「Ｇ」はグアニン、「ｍ」はメチル基を表す。
ＲＮＡ（ｐｐｐＮｐＮｐ−ＲＮＡ）に、前記酵素Ｄ１Ｎを作用させると、該酵素Ｄ１ＮのＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性により、ＲＮＡの５’末端における３リン酸のうち１つのリン酸が脱リン酸化される（ｐｐＮｐＮｐ−ＲＮＡ）。次いで、前記酵素Ｄ１ＮのｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性により該５’末端にグアニン（Ｇ）が付加され、キャップコア構造（Ｇ（５’）ｐｐｐＮｐＮｐ−ＲＮＡ）が形成される。次いで、前記酵素ＡＢＤ１のｍＲＮＡ（グアニン−７−）メチルトランスフェラーゼ活性により、前記キャップコア構造の５’末端のグアニンの７位にメチル基が導入され、キャップ０構造（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＮｐＮｐ−ＲＮＡ）が形成される。最後に前記酵素ＶＰ３９のｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼ活性により、前記キャップ０構造の前記グアニン（５’末端の塩基）の次の塩基（５’末端から２番目の塩基）にメチル基が導入され、キャップ１構造（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＮｍｐＮｐ−ＲＮＡ）が形成される。
【００８６】
＜＜キャップ化ＲＮＡ＞＞
前記キャップ化ＲＮＡの製造方法により製造されたキャップ化ＲＮＡの長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１３塩基〜４０塩基が好ましく、２８塩基〜４０塩基がより好ましく、３３塩基が特に好ましい。前記キャップ化ＲＮＡの長さが、１３塩基未満であると、インフルエンザウイルスの活性測定に使用できなくなることがある。
前記キャップ化ＲＮＡの長さは、前記鋳型ＤＮＡの長さにより調整することができる。
【００８７】
前記キャップ化ＲＮＡの塩基配列としては、特に制限はなく、前記鋳型ＤＮＡの配列などに応じて適宜選択することができるが、前記ＲＮＡの製造方法により製造されたキャップ化ＲＮＡが、後述するスクリーニング方法に用いられる場合、該キャップ化ＲＮＡにおけるキャップ構造が付加されたグアニンを除いて、５’末端から１１番目〜１３番目がアデニン（Ａ）であることが、前記インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼに認識されやすい点で好ましい。
【００８８】
図２に、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法について、鋳型ＤＮＡ配列として前記配列番号９で表される塩基配列を用いた場合のフローチャートの一例を示すが、本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法は、これに限られるものではない。
まず、前記ＲＮＡ合成工程において、前記配列番号９で表される鋳型ＤＮＡ配列と、下記配列番号１１で表されるＴ７プライマーと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとを反応させることにより、前記配列番号１０で表されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が合成される。合成されたＲＮＡは、前記精製工程で固相抽出法により精製され、前記ＲＮＡ合成工程における副反応により産生されたジヌクレオチドが除去される。次いで、前記キャップ構造付加工程において、まず、前記酵素Ｄ１Ｎと、放射性標識（ここでは、α−３２Ｐ）されたＧＴＰとを含む反応系で、前記配列番号１０で表されるＲＮＡの５’末端に、放射性標識を有するグアニン（Ｇｐ＊）が付加され、下記配列番号１２で表される塩基からなるキャップコア構造が形成される。なお、図２において「＊」は、放射性標識を示す。次に、前記酵素ＡＢＤ１により、キャップコア構造の５’末端のグアニンの７位にメチル基が導入され、下記配列番号１３で表される塩基からなるキャップ０構造が形成される。更に、前記酵素ＶＰ３９により、前記キャップ０構造の５’末端から２番目の塩基にメチル基が導入され、下記配列番号４で表される塩基からなるキャップ１構造が形成される。
５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ−３’（配列番号１１）
５’−ＧｐｐｐＧＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ−３’（配列番号１２）
５’−ｍ７ＧｐｐｐＧＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ−３’（配列番号１３）
５’−ｍ７ＧｐｐｐＧｍＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ−３’（配列番号４）
【００８９】
＜用途＞
前記キャップ化ＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼメラーゼ、特にインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼによって、そのキャップ構造部分を含む十数ヌクレオチドが好適に切断される。したがって、本発明の前記キャップ化ＲＮＡの製造方法によって製造されたキャップ化ＲＮＡは、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼの反応を阻害する物質のスクリーニングに好適に用いることができ、特に後述の本発明のスクリーニング方法に好適に利用できる。
【００９０】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、本発明の前記キャップ化ＲＮＡの製造方法で製造されたキャップ化ＲＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質（ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤）をスクリーニングする方法である。
前記ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（インフルエンザＲＮＡポリメラーゼとも称することがある）を阻害するＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であり、該ＲＮＡポリメラーゼが有するキャップ化ＲＮＡの切り出し反応（キャップ依存エンドヌクレアーゼ活性）を阻害する物質であることが好ましい。
【００９１】
前記インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼとしては、該インフルエンザウイルスは抗原性の違いにより、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型などに分類され、Ａ型ウイルスは更に、表面抗原の違いによりＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１５）、ＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）の亜型に分類されているが、ＲＮＡポリメラーゼは型間においても、活性ドメインのアミノ酸配列がかなりよく保存されていることが知られている。したがって、前記スクリーニング方法においては、全ての抗原性のインフルエンザウイルスを対象とすることができる。
【００９２】
前記インフルエンザＲＮＡポリメラーゼの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、発育鶏卵を用いてインフルエンザウイルスを培養し、ウイルス粒子を精製後、界面活性剤処理してウイルス粒子を破壊し、ＲＮＡポリメラーゼとウイルスＲＮＡ及びＮＰ（ヌクレオプロテイン）からなるＲＮＰ（リボヌクレオプロテイン）をグリセロール密度勾配遠心処理で精製する方法などが挙げられる。
【００９３】
前記スクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（１）被験物質の存在又は非存在下で、前記キャップ化ＲＮＡと、前記ＲＮＡポリメラーゼとを、該ＲＮＡポリメラーゼが反応し得る緩衝液中で反応させる反応工程と、（２）前記反応工程で得られた溶液中のＲＮＡポリメラーゼ活性を検出する検出工程と、（３）前記検出工程の結果に基づき、前記被験物質の存在下におけるＲＮＡポリメラーゼ活性が、該被験物質非存在におけるＲＮＡポリメラーゼ活性より低い場合に、該被験物質を、ＲＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する物質として選択する選択工程と、を含むことが好ましい。
【００９４】
＜反応工程＞
前記反応工程における反応温度としては、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性が生じ得る温度であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２８℃〜３３℃が好ましく、２８℃〜３０℃がより好ましい。
前記反応工程における反応時間としては、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性が生じ得る時間であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５時間〜２時間が好ましく、０．５時間〜１時間がより好ましい。
前記反応工程における前記緩衝液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＲＮＡポリメラーゼとしてインフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼを使用する場合、該インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、マグネシウム（Ｍｇ）要求性であるため、マグネシウムを含むことが好ましい。また、ＥＤＴＡ等のキレート剤の添加により、酵素反応の開始や停止を制御することができる。
【００９５】
＜検出工程＞
前記ＲＮＡポリメラーゼの活性を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記反応工程後の溶液を電気泳動等により分析し、キャップ化ＲＮＡの構造を分析する方法、即ち、キャップ化ＲＮＡのキャップ構造が、ＲＮＡポリメラーゼにより分解されたか否かを分析する方法などが挙げられる。
前記検出する方法としては、特に制限はなく、標識の種類等に応じて適宜選択することができる。
【００９６】
＜選択工程＞
前記選択工程において、前記被験物質の存在下におけるＲＮＡポリメラーゼ活性が、該被験物質非存在におけるＲＮＡポリメラーゼ活性より低いことは、前記被験物質の存在下におけるキャップ化ＲＮＡのキャップ構造が、該被験物質非存在におけるキャップ化ＲＮＡのキャップ構造と比べて分解されている場合に、該被験物質を、ＲＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する物質として選択することができる。
【００９７】
なお、前記例示した方法では、被験物質の存在又は非存在下で比較したが、本発明のスクリーニング方法は、被験物質の存在下同士の比較を行い、よりＲＮＡポリメラーゼ阻害活性が強いものを選択してもよい。
具体例としては、被験物質Ａと被験物質Ｂについてスクリーニングを行った場合、該被験物質Ａの存在下におけるＲＮＡポリメラーゼ活性が、該被験物質Ｂの存在下におけるＲＮＡポリメラーゼ活性より低い場合、該被験物質Ａを、より優れたＲＮＡポリメラーゼ阻害剤として選択することができる。
【００９８】
＜被験物質＞
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然物、合成物などが挙げられる。また、前記被験物質は、高分子化合物であってもよく、低分子化合物であってもよい。これらの中でも、医薬品として用いるためには、低分子化合物であることが好ましい。
【００９９】
これらの被験物質は、その物質の性質に応じて、適宜溶媒を選択して溶解後、前記反応工程に供することが好ましい。なお、前記被験物質非存在下の対照としては、前記被験物質の溶媒を同量添加することが好ましい。
なお、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤としては、下記構造式（１）で表されるファビピラビルや、その活性体である下記構造式（２）で表されるファビピラビル３リン酸（富山化学工業社製）などが知られており、該ファビピラビル乃至その誘導体などを対照として用いてもよい（Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２００５，  ４９（３），  ｐ．９８１−９８６参照）。
【化１】
0005923303.tif 000002
【化２】
0005923303.tif 000003
【０１００】
（キット）
本発明のキットは、ＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質をスクリーニングすることに用いられるキットであり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを担持し得る固相と、本発明の前記酵素（前記酵素Ｄ１Ｎ、前記酵素ＡＢＤ１、及び前記酵素ＶＰ３９の少なくともいずれか）とを少なくとも含み、必要に応じて、更に蛍光標識、放射性標識、標識を有していてもよい基質（ＮＴＰｓ）内部標準マーカー、プレート、緩衝溶液、容器、使用説明書等のその他の要素を含む。
【０１０１】
＜用途＞
前記キットは、簡便に前記ＲＮＡポリメラーゼの阻害活性を測定できるため、該ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニングなどに好適に利用可能である。
【実施例】
【０１０２】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【０１０３】
（製造例１：酵素Ｄ１Ｎの製造）
＜遺伝子増幅工程＞
ワクシニアウイルスであるＷＴＦ７−３株（学校法人北里研究所、中山哲夫博士より供与）から常法に従ってゲノムＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として用い、下記配列番号１４及び１５で表されるプライマーを含む下記組成のＰＣＲ反応液を用いてｍＲＮＡ５’−トリホスファターゼ活性及びｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するＤ１Ｎの遺伝子（以下、「Ｄ１Ｎ遺伝子」と略記する）をＰＣＲ反応〔９４℃・２分間を１サイクル、次いで、９４℃・１分間、５５℃・１分間、及び７２℃・２分間を２５サイクル〕により増幅した。
［ＰＣＲ反応液］
下記組成を混合し、合計１００μＬのＰＣＲ反応液とした。
・２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）
・２ｍＭ塩化マグネシウム
・０．０５質量％  Ｔｗｅｅｎ２０
・２００μＭ  ｄＮＴＰｓ
・５０ｐｍｏｌ  ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号１４）
・５０ｐｍｏｌ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号１５）
・５０ｎｇゲノムＤＮＡ
・５Ｕ  ｅｘ−Ｔａｇ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）
［プライマー配列］
ｆｏｒｗａｒｄプライマー：  ５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１４）
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：  ５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＡＴＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１５）
なお、配列番号１４において下線で示す箇所は、ＮｄｅＩ制限酵素部位であり、配列番号１５において下線で示す箇所は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位である。
【０１０４】
＜クローニング工程＞
得られたＤ１Ｎ遺伝子を、遺伝子精製キット（ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて精製した後、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＵＣ１９  ＤＮＡ（タカラバイオ株式会社製）にクローニングした。常法により塩基配列を確認した後、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、アガロース電気泳動法によって目的のＤＮＡ断片を分離し、精製した。
Ｈｉｓタグを有する大腸菌発現ベクターｐＴ７−７（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、Ｓａｍ  Ｃｈｏｗ博士より供与）をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ、並びに、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで二重消化し、前記精製したＤＮＡ断片を挿入し、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎ発現プラスミド（以下、「ｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−Ｄ１Ｎ」と称することがある）を作製した。
【０１０５】
＜組換えタンパク質発現工程＞
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン社）を、ｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−Ｄ１Ｎを用いて常法により形質転換した。形質転換した大腸菌は、０．０１質量％のアンピシリンを添加したＬＢ培地（ナカライテスク株式会社製）を用いて、２５℃にて、５５０ｎｍにおける吸光度が１．０となるまで振盪培養した。次いで０．５ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加後、更に５時間培養し、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎタンパク質を発現させた。
【０１０６】
＜精製工程＞
培養後、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎタンパク質を発現する大腸菌を遠心分離により集菌した。これを、ＬＢ培地１Ｌあたりに４０ｍＬの緩衝液１〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１００ｍＭ  Ｌ−（＋）−アルギニン塩酸塩、１０質量％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）〕を含む破砕液に懸濁した後、超音波処理により該大腸菌を破砕した。破砕した大腸菌を含む破砕液を、６，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間の条件で遠心分離し、得られた上清を、透析溶液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０質量％グリセロール〕に対して透析し、透析画分を得た。
【０１０７】
前記透析画分を含む前記培養液１Ｌに対して１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）を添加し、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎタンパク質を結合させた。次いで、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎタンパク質を結合させたＮｉ−ＮＴＡ  ｒｅｓｉｎを、２０ｍＭイミダゾールを含む１０ｍＬの緩衝液１で３回洗浄した後、カラムに詰めた。このカラムを、２０ｍＭから２５０ｍＭのイミダゾールの直線濃度勾配により展開し、目的とするＤ１Ｎタンパク質を含む画分を集めた（以下、「ＮＴＡ−Ｄ１Ｎタンパク質画分」と称することがある）。
ＮＴＡ−Ｄ１Ｎタンパク質画分を緩衝液２〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．１）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０質量％グリセロール、０．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）〕に対して透析し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した（以下、「ＳＰ−Ｄ１Ｎタンパク質画分」と称することがある）。なお、前記カラムクロマトグラフィーは、緩衝液２中で塩化ナトリウム濃度を０Ｍから１Ｍに直線的に増加させた。
目的とするＳＰ−Ｄ１Ｎタンパク質画分を集め、緩衝液３〔２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．９）、５０質量％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ〕に対して透析し、精製Ｄ１Ｎタンパク質として酵素Ｄ１Ｎを得た。なお、２Ｌの培養液から得られた精製Ｄ１Ｎタンパク質の収量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で測定した結果、０．１９ｍｇであった。
各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）染色して確認した結果を図３に示す。図３において、６１ｋＤａの位置に酵素Ｄ１Ｎが確認された。なお、図３において「Ｍ」は分子量マーカーを示し、レーン１は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅに結合しなかったＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ非吸着画分を示し、レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ精製後のＮＴＡ−Ｄ１Ｎタンパク質画分を示し、レーン３は、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＰＬＣ精製後の精製Ｄ１Ｎタンパク質を示す。
【０１０８】
（製造例２：組換えタンパク質ＡＢＤ１の製造）
＜遺伝子増幅工程＞
製造例１の遺伝子増幅工程において、鋳型としてのゲノムＤＮＡを、出芽酵母であるＡ３６４ａ株（国立大学法人東京大学、中福雅人博士より供与）から常法に従って調製したゲノムＤＮＡに変え、かつ、配列番号１４及び１５で表されるプライマーを、下記配列番号１６及び１７で表されるプライマーに変えたこと以外は、製造例１の遺伝子増幅工程と同様の方法で、出芽酵母ｍ７ＧメチルトランスフェラーゼＡＢＤ１遺伝子（以下、「ＡＢＤ１遺伝子」と略記する）を増幅した。
［プライマー配列］
ｆｏｒｗａｒｄプライマー：  ５’−ＣＣＡＧＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１６）
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：  ５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＧＣ−３’（配列番号１７）
なお、配列番号１６において下線で示す箇所は、ＮｄｅＩ制限酵素部位であり、配列番号１７において下線で示す箇所は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位である。
【０１０９】
＜クローニング工程＞
得られたＡＢＤ１遺伝子を、遺伝子精製キット（ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて精製した後、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＵＣ１９  ＤＮＡ（タカラバイオ株式会社製）にクローニングした。塩基配列を確認した後、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化し、アガロース電気泳動法によって目的のＤＮＡ断片を分離し、精製した。
Ｈｉｓタグを有する大腸菌発現ベクターｐＴ７−７（ＵＣＬＡ  Ｓａｍ  Ｃｈｏｗ博士より供与）をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ、並びに、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで二重消化し、前記精製したＤＮＡ断片を挿入し、Ｈｉｓタグ融合ＡＢＤ１遺伝子発現プラスミド（以下、「ｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−ＡＢＤ１遺伝子」と称することがある）を作製した。
【０１１０】
＜組換えタンパク質発現工程＞
製造例１の組換えタンパク質発現工程において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株をｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−Ｄ１Ｎで形質転換したことに変えて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株をｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−ＡＢＤ１で形質転換したこと以外は、製造例１の組換えタンパク質発現工程と同様の方法でＨｉｓタグ融合ＡＢＤ１タンパク質を発現させた。
【０１１１】
＜精製工程＞
製造例１の精製工程において、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎタンパク質を発現する大腸菌を、Ｈｉｓタグ融合ＡＢＤ１タンパク質を発現する大腸菌に変えたこと以外は、製造例１の精製工程と同様の方法で、精製ＡＢＤ１タンパク質として酵素ＡＢＤ１を得た。２Ｌの培養液から得られた精製ＡＢＤ１タンパク質の収量を、製造例１と同様の方法で測定した結果、１．６０ｍｇであった。
各画分について製造例１と同様の方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色して確認した結果を図４に示す。図４において、４８ｋＤａの位置に酵素ＡＢＤ１が確認された。なお、図４において「Ｍ」は分子量マーカーを示し、レーン１は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅに結合しなかったＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ非吸着画分を示し、レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ精製後のＮＴＡ−ＡＢＤ１タンパク質画分を示し、レーン３は、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＰＬＣ精製後の精製ＡＢＤ１タンパク質を示す。
【０１１２】
（製造例３：酵素ＶＰ３９の製造）
＜遺伝子増幅工程＞
製造例１の遺伝子増幅工程において、配列番号１４及び１５で表されるプライマーを、下記配列番号１８及び１９で表されるプライマーに変えたこと以外は、製造例１の遺伝子増幅工程と同様の方法で、ｍＲＮＡ２’−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼＶＰ３９活性を有するＶＰ３９の遺伝子（以下、「ＶＰ３９遺伝子」と略記する）を増幅した。
［プライマー配列］
ｆｏｒｗａｒｄプライマー：  ５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＴＴＡＧＡＴＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１８）
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：  ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号１９）
なお、配列番号１８において下線で示す箇所は、ＮｄｅＩ制限酵素部位であり、配列番号１９において下線で示す箇所は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位である。
【０１１３】
＜クローニング工程＞
製造例２のクローニング工程において、クローニング対象であるＡＢＤ１遺伝子を、ＶＰ３９遺伝子に変えたこと以外は、製造例２のクローニング工程と同様の方法でＨｉｓタグ融合ＶＰ３９発現プラスミド（以下、「ｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−ＶＰ３９」と称することがある）を作製した。
【０１１４】
＜組換えタンパク質発現工程＞
製造例１の組換えタンパク質発現工程において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株をｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−Ｄ１Ｎで形質転換したことに変えて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株をｐＴ７−７（Ｈｉｓ）−ＶＰ３９で形質転換したこと以外は、製造例１の組換えタンパク質発現工程と同様の方法でＨｉｓタグ融合ＶＰ３９タンパク質を発現させた。
【０１１５】
＜精製工程＞
製造例１の精製工程において、Ｈｉｓタグ融合Ｄ１Ｎタンパク質を発現する大腸菌を、Ｈｉｓタグ融合ＶＰ３９タンパク質を発現する大腸菌に変えたこと以外は、製造例１の精製工程と同様の方法で、精製ＶＰ３９タンパク質として、酵素ＶＰ３９を得た。２Ｌの培養液から得られた精製ＶＰ３９タンパク質の収量を、製造例１と同様の方法で測定した結果、０．５０ｍｇであった。
各画分について製造例１と同様の方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色して確認した結果を図５に示す。図５において、３７ｋＤａの位置に酵素ＶＰ３９が確認された。なお、図５において「Ｍ」は分子量マーカーを示し、レーン１は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅに結合しなかったＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ非吸着画分を示し、レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ精製後のＮＴＡ−ＶＰ３９タンパク質画分を示し、レーン３は、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＰＬＣ精製後の精製ＶＰ３９タンパク質を示す。
【０１１６】
（実施例１：キャップ化ＲＮＡ１の製造）
＜ＲＮＡ合成工程＞
下記配列番号９で表される塩基配列を鋳型ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）として含む、下記組成の反応液を用いて、３７℃で２時間転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。
［反応液］
下記組成を混合し、合計１００μＬの反応液とした。
・１０ｐｍｏｌ／μＬ  鋳型ＤＮＡ（配列番号９）                            ４μＬ
・１０ｐｍｏｌ／μＬ  Ｔ７プライマー（配列番号１１）                      ４μＬ
・１Ｍ  トリス塩酸（ｐＨ８．０）                                          ４μＬ
・１Ｍ  スペルミジン                                                  ０．１μＬ
・２０質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００                                ０．２５μＬ
・１Ｍ  塩化マグネシウム                                                  １μＬ
・１Ｍ  ＤＴＴ                                                        ０．５μＬ
・１０ｍＭ  ＧＴＰ                                                    ２．５μＬ
・１０μＣｉ／μＬ［α−３２Ｐ］ＧＴＰ（室町薬品株式会社製）          ０．５μＬ
・１００ｍＭ  ＡＴＰ                                                      １μＬ
・１００ｍＭ  ＵＴＰ                                                      １μＬ
・１００Ｕ／ｍＬ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン株式会社製）    ４μＬ
・ＲＮａｓｅを含まない水                                                    残部
［鋳型ＤＮＡ］
５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号９）
［Ｔ７プライマー］
５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ−３’（配列番号１１）
【０１１７】
前記ｍＲＮＡの合成反応終了後、フェノール／クロロホルム法によりタンパク質を除去し、常法によりエタノール沈殿を行い、ｍＲＮＡを回収した。回収後のｍＲＮＡは、滅菌水に溶解した（以下、「未精製ＲＮＡ１」と称することがある）。
未精製ＲＮＡ１の放射活性を液体シンチレーションカウンター（日立アロカメディカル株式会社製）で測定することにより、ｍＲＮＡの濃度を定量したところ、２５０μｇ／ｍＬであった。
なお、得られた未精製ＲＮＡ１は、下記配列番号１０で表されるｍＲＮＡであり、その長さは、７Ｍ尿素を含む１８質量％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で確認した。
５’−ｐｐｐＧＡＡＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＵＡＡＵＵＡＡＵＵＡＡ−３’（配列番号１０）
【０１１８】
＜精製工程＞
得られた未精製ＲＮＡ１を、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーにより以下に示す方法で精製した。
まず、Ｃ１８カートリッジ（ＩｎｔｅｒＳｅｐ（登録商標）Ｓｌｉｍ−ＪＣ１８、ＧＬ−サイエンス社製）を、５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ２．７）を用いて平衡化した。ここに前記未精製ＲＮＡ１を１ｎｍｏｌ添加した後、Ｃ１８カートリッジを１ｍＬの５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ２．７）で５回洗浄した（以下、１回の洗浄ごとの画分をそれぞれ「洗浄画分１」、「洗浄画分２」、「洗浄画分３」、「洗浄画分４」、及び「洗浄画分５」と称することがある）。次いで、１質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ２．７）１ｍＬで３回溶出し（以下、１回の溶出ごとの画分をそれぞれ「１質量％−１」、「１質量％−２」及び「１質量％−３」と称することがある）、次いで、２質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ２．７）１ｍＬで３回溶出し（以下、１回の溶出ごとの画分をそれぞれ「２質量％−１」、「２質量％−２」及び「２質量％−３」と称することがある）、次いで、３質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ２．７）１ｍＬで３回溶出し（以下、１回の溶出ごとの画分をそれぞれ「３質量％−１」、「３質量％−２」及び「３質量％−３」と称することがある）、次いで、４質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ２．７）１ｍＬで３回溶出し（以下、１回の溶出ごとの画分をそれぞれ「４質量％−１」、「４質量％−２」及び「４質量％−３」と称することがある）、次いで、５質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ２．７）１ｍＬで３回溶出（以下、１回の溶出ごとの画分をそれぞれ「５質量％−１」、「５質量％−２」及び「５質量％−３」と称することがある）することにより、段階的な溶出を行った。
【０１１９】
未精製ＲＮＡ１と、Ｃ１８カートリッジに吸着しなかった非吸着画分と、得られた各洗浄画分と、各溶出分画とを、７Ｍ尿素存在下の２０質量％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
図６の結果より、未精製ＲＮＡ１には、配列番号１０で表されるｍＲＮＡの他に、大量のジヌクレオチド（ｐｐｐＧｐＡ）が含まれていることがわかった。
一方、このジヌクレオチドは、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーによる精製でそのほとんどが除かれ、前記段階的な溶出において、４質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウム、及び５質量％アセトニトリル水溶液を添加した５０ｍＭギ酸アンモニウムによる溶出画分には、配列番号１０で表されるｍＲＮＡのみを含む画分（４質量％−１、４質量％−２、５質量％−１、及び５質量％−２）が得られることがわかった。
以下の実施例においては、前記画分（４質量％−１、４質量％−２、５質量％−１、及び５質量％−２）を集め、遠心濃縮により濃縮したものを用いた（以下、「精製ＲＮＡ１」と称することがある）。
【０１２０】
＜キャップ構造付加工程＞
前記精製ＲＮＡ１を含む、下記組成の反応液を用いて、３７℃で６０分間反応させた後、製造例３で製造したＶＰ３９タンパク質（０．１８ｍｇ／ｍＬ）を１５μＬ加え、更に３７℃で６０分間反応させた。ここに１００μＬの反応停止液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）〕を加えて反応を停止させ、フェノール／クロロホルム法によりタンパク質を除去し、常法によりエタノール沈殿を行い、キャップ構造を付加したＲＮＡ（以下、「キャップ化ＲＮＡ１」と称することがある）を回収した。
［反応液］
下記組成を混合し、合計１００μＬの反応液とした。
・１Ｍ  トリス塩酸（ｐＨ７．９）                                          ４μＬ
・１００ｍＭ  塩化マグネシウム                                        １．５μＬ
・１Ｍ  ＤＴＴ                                                        ０．５μＬ
・１０ｍＭ  ＧＴＰ                                                        ２μＬ
・１０μＣｉ／μＬ［α−３２Ｐ］ＧＴＰ（室町薬品株式会社製）              ５μＬ
・２ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン                                        ５μＬ
・精製ＲＮＡ１                                                      １．２５μｇ
・０．０５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ１Ｎタンパク質                                  １１μＬ
・０．４２ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＤ１タンパク質                                  ５μＬ
・２０Ｕ／ｍＬ  ＲＮａｓｅインヒビター（タカラバイオ株式会社製）          ２μＬ
・１０ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン                                      ２μＬ
・ＲＮａｓｅを含まない水                                                    残部
【０１２１】
（比較例１：キャップ化ＲＮＡ２の製造）
＜ＲＮＡ合成過程＞
市販のＲＮＡ合成キット（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、エピセンター社製）を用いて、前記ＲＮＡ合成キットの説明書に記載の方法に従い、ｍＲＮＡを合成した。具体的には、下記組成の反応液を用いて、３７℃で２時間転写反応を行い、ｍＲＮＡ（以下、「未精製ＲＮＡ２」と称することがある）を合成した。
［反応液］
下記組成を混合し、合計１００μＬの反応液とした。
・１０ｐｍｏｌ／μＬ  鋳型ＤＮＡ（配列番号９）                            ４μＬ
・１０ｐｍｏｌ／μＬ  Ｔ７プライマー（配列番号１１）                      ４μＬ
・１０×ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ    １０μＬ
・１００ｍＭ  ＡＴＰ                                                  ７．５μＬ
・１００ｍＭ  ＣＴＰ                                                  ７．５μＬ
・１００ｍＭ  ＧＴＰ                                                      １μＬ
・１０μＣｉ／μＬ［α−３２Ｐ］ＧＴＰ（室町薬品株式会社製）              ２μＬ
・１００ｍＭ  ＵＴＰ                                                  ７．５μＬ
・１００ｍＭ  ＤＴＴ                                                    １０μＬ
・ＲｉｂｏＧｕａｒｄ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                  ２．５μＬ
・ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ          １０μＬ
・ＲＮａｓｅを含まない水                                                    残部
【０１２２】
＜キャップ構造付加工程＞
前記ＲＮＡ合成工程で得られた未精製ＲＮＡ２は、精製工程を経ず、以下のキャップ構造付加工程を行った。
市販のキャップ構造付加キット（ＳｃｒｉｐｔＣａｐＴＭ  ｍ７Ｇ  ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、エピセンター社製）を用いて、前記キャップ構造付加キットの説明書に記載の方法に従い、未精製ＲＮＡ２にキャップ構造を付加した。なお、未精製ＲＮＡ２にキャップ１構造を付加するために、前記キャップ構造付加キットに、更にＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（エピセンター社製）を添加してキャップ付加工程を行った。前記キャップ構造付加キットを用いたキャップ化反応は、具体的には下記組成の反応液を用いて、３７℃で１時間反応させた。
［反応液］
下記組成を混合し、合計２０μＬの反応液とした。
・未精製ＲＮＡ２                                                    １．２５μｇ
・１０×ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ              ２．０μＬ
・１０ｍＭ  ＧＴＰ                                                    ２．０μＬ
・２ｍＭ  ＳＡＭ                                                      １．０μＬ
・ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ              ０．５μＬ
・ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ                    １．０μＬ
・ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ    １．０μＬ
・ＲＮａｓｅを含まない水                                                    残部
【０１２３】
次いで、実施例１のキャップ付加工程と同様に、フェノール／クロロホルム法によりタンパク質を除去し、常法によりエタノール沈殿を行い、キャップ構造を付加したＲＮＡ（以下、「キャップ化ＲＮＡ２」と称することがある）を回収した。
【０１２４】
（比較例２：キャップ化ＲＮＡ３の製造）
実施例１において、キャップ構造付加工程を、下記に記載の方法に変えたこと以外は、実施例１と同様の方法でキャップ構造を付加したＲＮＡ（以下、「キャップ化ＲＮＡ３」と称することがある）を合成した。
なお、比較例２において、ＲＮＡ合成工程で得られたｍＲＮＡを「未精製ＲＮＡ３」、精製工程で得られたｍＲＮＡを「精製ＲＮＡ３」と称することがある。
【０１２５】
＜キャップ構造付加工程＞
市販のキャップ構造付加キット（ＳｃｒｉｐｔＣａｐＴＭ  ｍ７Ｇ  ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、エピセンター社製）を用いて、前記キャップ構造付加キットの説明書に記載の方法に従い、精製ＲＮＡ３にキャップ構造を付加した。なお、精製ＲＮＡ３にキャップ１構造を付加するために、前記キャップ構造付加キットに、更にＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（エピセンター社製）を添加してキャップ付加工程を行った。前記キャップ構造付加キットを用いたキャップ化反応は、具体的には下記組成の反応液を用いて、３７℃で１時間反応させた。
［反応液］
下記組成を混合し、合計２０μＬの反応液とした。
・精製ＲＮＡ３                                                      １．２５μｇ
・１０×ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ              ２．０μＬ
・１０ｍＭ  ＧＴＰ                                                    ２．０μＬ
・２ｍＭ  ＳＡＭ                                                      １．０μＬ
・ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ              ０．５μＬ
・ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ                    １．０μＬ
・ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ    １．０μＬ
・ＲＮａｓｅを含まない水                                                    残部
【０１２６】
次いで、実施例１のキャップ付加工程と同様に、フェノール／クロロホルム法によりタンパク質を除去し、常法によりエタノール沈殿を行い、キャップ構造を付加したキャップ化ＲＮＡ３を回収した。
【０１２７】
（比較例３：キャップ化ＲＮＡ４の製造）
実施例１において、ＲＮＡ合成工程を以下に記載の方法に変え、精製工程を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の方法でキャップ構造を付加したＲＮＡ（以下、「キャップ化ＲＮＡ４」と称することがある）を合成した。
【０１２８】
＜ＲＮＡ合成工程＞
市販のＲＮＡ合成キット（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、エピセンター社製）を用いて、前記ＲＮＡ合成キットの説明書に記載の方法に従い、ｍＲＮＡを合成した。具体的には、下記組成の反応液を用いて、３７℃で２時間転写反応を行い、ｍＲＮＡ（以下、「未精製ＲＮＡ４」と称することがある）を合成した。
［反応液］
下記組成を混合し、合計１００μＬの反応液とした。
・１０ｐｍｏｌ／μＬ  鋳型ＤＮＡ（配列番号９）                            ４μＬ
・１０ｐｍｏｌ／μＬ  Ｔ７プライマー（配列番号１１）                      ４μＬ
・１０×ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ    １０μＬ
・１００ｍＭ  ＡＴＰ                                                  ７．５μＬ
・１００ｍＭ  ＣＴＰ                                                  ７．５μＬ
・１００ｍＭ  ＧＴＰ                                                      １μＬ
・１０μＣｉ／μＬ［α−３２Ｐ］ＧＴＰ（室町薬品株式会社製）              ２μＬ
・１００ｍＭ  ＵＴＰ                                                  ７．５μＬ
・１００  ｍＭ  ＤＴＴ                                                  １０μＬ
・ＲｉｂｏＧｕａｒｄ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                  ２．５μＬ
・ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ          １０μＬ
・ＲＮａｓｅを含まない水                                                    残部
【０１２９】
（比較例４：ＲＮＡ２の製造）
比較例１におけるＲＮＡ合成工程と同様の方法でｍＲＮＡの合成を行い、ｍＲＮＡ（以下、「未精製ＲＮＡ５」と称することがある）を合成した。比較例４では、未精製ＲＮＡ５について、精製工程及びキャップ構造付加工程を行わなかった。
【０１３０】
実施例１及び比較例１〜４について、下記表１にまとめて示す。なお、表１において、表中の各用語は、以下の意味を示す。
・「Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ」：実施例１に記載の方法でＲＮＡ合成工程を行ったことを示す。
・「Ｃ１８逆相クロマトグラフィー」：実施例１に記載の方法で精製工程を行ったことを示す。
・「Ｄ１Ｎ＋ＡＢＤ１＋ＶＰ３９」：実施例１に記載の方法でキャップ構造付加工程を行ったことを示す。
・「市販のＲＮＡ合成キット」：ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（エピセンター社製）を用いてＲＮＡ合成工程を行ったことを示す。
・「市販のキャップ構造付加キット」：ＳｃｒｉｐｔＣａｐＴＭ  ｍ７Ｇ  ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（エピセンター社製）に、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（エピセンター社製）を添加してャップ構造付加工程を行ったことを示す。
【０１３１】
【表１】
0005923303.tif 000004
【０１３２】
（試験例１）
＜ジヌクレオチド含有量の分析＞
実施例１における未精製ＲＮＡ１、比較例４で得られた未精製ＲＮＡ５、実施例１及び比較例１〜３で得られたキャップ化ＲＮＡ１〜４を、７Ｍ尿素存在下の２０質量％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。結果を図７に示す。
図７の結果、精製工程を行わなかった比較例１及び３では、大量のジヌクレオチド（ｐｐｐＧｐＡ）が混在していた。
【０１３３】
（試験例２）
＜キャッピング酵素の機能解析＞
製造例１で製造したＤ１Ｎタンパク質、製造例２で製造したＡＢＤ１タンパク質、及び製造例３で製造したＶＰ３９タンパク質の機能について分析した。
（１）実施例１のキャップ構造付加工程において、酵素Ｄ１Ｎ、酵素ＡＢＤ１、及び酵素ＶＰ３９のいずれも添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の方法でキャップ構造付加工程を行った。
（２）実施例１のキャップ構造付加工程において、ＡＢＤ１タンパク質及びＶＰ３９タンパク質を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の方法でキャップ構造付加工程を行った。
（３）実施例１のキャップ構造付加工程において、ＶＰ３９タンパク質を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の方法でキャップ構造付加工程を行った。
【０１３４】
実施例１で得られたキャップ化ＲＮＡ１及び上記（１）〜（３）で得られた各ＲＮＡに、等量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．８）及び１Ｕ／μＬのヌクレアーゼＰ１（生化学工業株式会社製）を含む溶液を加え、５０℃にて６０分間反応させ、キャップ構造を遊離させた。この溶液を、ポリエチレンイミン薄層クロマトグラフィーで展開後、オートラジオグラフィーを行った。結果を図８に示す。
【０１３５】
図８の結果より、Ｄ１Ｎタンパク質のみを用いた場合（上記（２）、図８のレーン２）、キャップコア構造（ＧｐｐｐＧ）が付加され、Ｄ１Ｎタンパク質及びＡＢＤ１タンパク質を用いた場合（上記（３）、図８のレーン３）、キャップ０構造（ｍＧｐｐｐＧ）が付加され、Ｄ１Ｎタンパク質、ＡＢＤ１タンパク質、及びＶＰ３９タンパク質を用いた場合（実施例１、図８のレーン４）、キャップ１構造（ｍＧｐｐｐｍＧ）が付加されることが確認できた。
（試験例３）
＜キャップ化ＲＮＡの構造解析＞
実施例１における未精製ＲＮＡ１、比較例４で得られた未精製ＲＮＡ５、実施例１及び比較例１〜３で得られたキャップ化ＲＮＡ１〜４に、等量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．８）及び１Ｕ／μＬのヌクレアーゼＰ１（生化学工業株式会社製）を含む溶液を加え、５０℃にて６０分間反応させ、キャップ構造を遊離させた。この溶液を、ポリエチレンイミン薄層クロマトグラフィーで展開後、オートラジオグラフィーを行った。結果を図９に示す。
【０１３６】
図９の結果、ＡｍｐｌｉＣａｐ−Ｍａｘ  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ  Ｋｉｔｓ（エピセンター社製）の方法でキャップ化ＲＮＡを合成した比較例１（キャップ化ＲＮＡ２）及び前記キットの方法でＲＮＡ合成工程を行った後、酵素Ｄ１Ｎ、酵素ＡＢＤ１、及び酵素ＶＰ３９でキャップ化を行った比較例３は、キャップコア構造、キャップ０構造、及びキャップ１構造が混在していた。また、精製工程を経て、キャップ構造付加工程におけるキャッピング酵素のみ前記キットに付属の酵素を用いて行った比較例２においては、キャップコア構造は認められなかったものの、キャップ化反応が不完全であり、キャップ０構造とキャップ１構造が混在していた。
一方、実施例１は、ほぼ全てがキャップ１構造であった。したがって、酵素Ｄ１Ｎ、酵素ＡＢＤ１、及び酵素ＶＰ３９を用いることにより、キャップ１構造を有するキャップ化ＲＮＡが、ほぼ１００％のキャップ付加効率で得られることがわかった。
この結果は、全てがキャップ１構造を有するキャップ化ＲＮＡを得るために、キャップ構造付加工程において、酵素Ｄ１Ｎ、酵素ＡＢＤ１、及び酵素ＶＰ３９を用いること、また前記精製工程を行うことが重要であることを示唆している。
【０１３７】
（試験例４）
＜インフルエンザウイルスによるキャップスナッチング反応＞
−インフルエンザウイルスの精製−
インフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｈ１Ｎ１、公益財団法人微生物化学研究会より入手）を用い、「ウイルス実験プロトコール」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｅｗ社、ｐ１５４−１５９、永田恭介著に記載の方法に従い、インフルエンザウイルスＡ（以下、「Ｆｌｕ−Ａ」と称することがある）を精製した。
【０１３８】
前記精製したＦｌｕ−Ａを含む、下記組成の反応液を用いて、３０℃にて１時間反応させた。次いで、下記組成の反応停止液１７５μＬと、１００μＬのフェノール／クロロホルム混合液（１：１（体積比））を加えて反応を停止させた。これを遠心分離し、上清を回収し、常法に従いエタノール沈殿を行った。この沈殿を減圧乾燥させて、７Ｍ尿素存在下で１８質量％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析スナッチング反応の分析を行った。結果を図１０に示す。
［反応液］
下記組成を混合し、合計２５μＬの反応液とした。
・５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ  酢酸アンモニウム
・０．１質量％  ＮＰ−４０
・２．５ｍＭ  ＤＴＴ
・５ｍＭ  塩化マグネシウム
・１０ｆｍｏｌ  ［３２Ｐ］キャップ化ＲＮＡ１（実施例１）
・１．２μｇ  インフルエンザウイルスＡ
［反応停止液］
下記組成を混合し、合計１７５μＬの反応停止液とした。
・２０ｍ  Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）
・１ｍＭ  ＥＤＴＡ
・０．２質量％  ＳＤＳ
・０．３ｍｇ／ｍＬ  大腸菌ｔＲＮＡ（シグマ社製）
【０１３９】
図１０の結果より、キャップ化ＲＮＡ１のキャップ構造は、インフルエンザウイルスＡによって分解されることが確認できた。この結果は、前記キャップ化ＲＮＡ１が、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼを阻害する物質のスクリーニングに好適に利用できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明のキャップ化ＲＮＡの製造方法は、安全性が高く、簡便な方法で大量に、かつ高精製度で得ることができるキャッピング酵素を使用することにより、高精製度で、かつ効率よく大量にキャップ化ＲＮＡを製造することができるため、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニング方法に好適に利用可能である。
【図１】
0005923303.tif 000005
【図２】
0005923303.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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