(57)【要約】本発明は、角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、低密度で、無血清培地を用いて接着培養することにより、角膜内皮前駆細胞を調製する方法に関する。本発明はまた、前記方法で得られた角膜内皮前駆細胞をさらに分化誘導することにより、角膜内皮細胞を調製する方法に関する。本発明によれば、角膜組織由来の細胞群から、角膜内皮前駆細胞を選択的に増殖させ、これを誘導して得た角膜内皮細胞を角膜内皮疾患の治療に応用することができる。これにより、角膜移植におけるドナー不足や拒絶反応の問題を解決することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を得ることを特徴とする、角膜内皮前駆細胞の調製方法。
【請求項２】
細胞群を５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度で播種して培養することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞群を２０〜２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種して培養することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも７日以上培養することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
得られる角膜内皮前駆細胞がＫｉ−６７陽性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
増殖される角膜内皮前駆細胞がｐ７５陽性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
増殖される角膜内皮前駆細胞が、ＦＯＸＣ２、ＳＯＸ９、及びＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
培地がｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、及びＷｎｔ３ａから選ばれる少なくとも１以上のサイトカインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
培地が血清代替物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
培地が、さらにレチノイン酸、βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、及びアスコルビン酸から選ばれる１又は２以上を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン、又はポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）でコーティングした培養容器を用いて接着培養することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法によって調製された角膜内皮前駆細胞を、角膜内皮細胞に分化誘導することを特徴とする、角膜内皮細胞の調製方法。
【請求項１３】
分化誘導がＴＧＦ−β２を含む無血清培地、又は血清を含む培地を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法で調製した角膜内皮前駆細胞、あるいは請求項１２又は１３に記載の方法で調製した角膜内皮細胞を高分子膜上で培養することを特徴とする、角膜内皮細胞シートの作製方法。
【請求項１５】
高分子膜が、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸を含むグリコサミノグリカン；アテロコラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、及びゼラチン；ケラチン；プロテオグリカン；アルギン酸、キトサン、及びヒアルロン酸；ポリアミノ酸（ポリ乳酸）；セルロース；（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体、及びこれらの共重合体を含む温度応答性ポリマー；からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含むものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜内皮組織から単離した細胞群から角膜内皮前駆細胞を選択的に増殖させる方法、及び前記方法で増殖させた角膜内皮前駆細胞から角膜内皮細胞を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は、外側から、角膜上皮層、ボーマン膜、実質角膜層、デスメ膜、角膜内皮層の５層からなる。このうち一番内側に存在する角膜内皮層は単一の細胞層で、角膜に必要な物質を前房水から取り込むとともに、角膜の水分を前房水へ排出して角膜厚を一定に保ち、角膜の透明性を維持する。角膜内皮細胞数が低下すると、水分排出が不十分になり、角膜混濁や、水疱性角膜症等の角膜内皮疾患の原因となる。【０００３】
通常ヒトの角膜内皮細胞密度は３０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２程度であるが、角膜内皮疾患では５００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２程度にまで低下してしまう。しかし、ヒト角膜内皮細胞は生体内においては増殖しないため、一度損傷を受けたり、著しく低下してしまうと、その根本的な治療は移植以外に方法がない。【０００４】
従来、水疱性角膜症等の難治性角膜内皮疾患に関しては、全層角膜移植術が行われているが、絶対的なドナー不足と移植後の拒絶反応という問題がある。拒絶反応を軽減するために、ヒト輸入アイバンク角膜の角膜内皮（一部実質を含む）を採取し、疾患眼に移植する方法（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ  ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ；ＤＳＥＫ）も行われているが、ＤＳＥＫでもドナー不足の問題を解決することはできない。【０００５】
角膜内皮細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、これを治療に利用する方法も試みられている（非特許文献１及び特許文献１及び２等）。しかし、従来の血清を用いた培養法では、角膜内皮細胞を長期培養するとその細胞形態が変化して角膜内皮機能が失われ、最終的に増殖は完全に停止してしまい、通常継代数５〜７まで増殖させることしかできない（非特許文献２）。これは、既存の手法では、角膜内皮前駆細胞を選択的に増殖させることができず、分化した細胞のみが一時的に増殖しているに過ぎないことが、理由として考えられる。【０００６】
これまでに角膜内皮細胞を浮遊培養することで得られる凝集体（ｓｐｈｅｒｅ）が角膜内皮前駆細胞の性質を有していることが報告されている（非特許文献３及び特許文献３）。しかし、この方法で得られる凝集体は角膜内皮の起源である神経堤幹細胞のマーカーｐ７５を発現しておらず、その未分化性については不明である。ｐ７５は神経堤幹細胞を含めた、成体内に少数存在する幹細胞にのみ発現しており、未分化性の指標としては最も信頼できるマーカーの一つである。【０００７】
以上のとおり、成熟した培養角膜内皮細胞を増幅させる技術はあっても、培養角膜内皮細胞の移植は行われていないのが現状である。そこで、安定的に増殖し良質な角膜内皮細胞へと誘導可能な、角膜内皮幹細胞や角膜内皮前駆細胞を取得し、増殖させる技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０７３７６１
【特許文献２】特開２００３−０３８１７０号
【特許文献３】特開２００６−１８７２８１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｄｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６  Ｆｅｂ．，２７（４）：６０７−６１４
【非特許文献２】Ｚｈｕ  Ｃ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ  ＮＣ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，２００４  Ｊｕｎ．，４５（６）：１７４３−１７５１
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，２００５  Ｍａｙ，４６（５）：１６２６−１６３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、角膜組織由来の細胞群から、未分化な角膜内皮前駆細胞を選択的に増殖させ、これを誘導して得た角膜内皮細胞を角膜内皮疾患の治療に応用することにより、角膜移植におけるドナー不足や拒絶反応の問題を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、角膜内皮組織から酵素処理で単離した細胞群を、特定の無血清培養液を用いて、低密度で、長期間培養することによって角膜内皮前駆細胞の選択的な増殖が可能なことを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は、角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、低密度で、無血清培地を用いて接着培養することを特徴とする、角膜内皮前駆細胞の調製方法に関する。【００１３】
細胞は、少なくとも１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満、好ましくは５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、より好ましくは２０〜２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、さらに好ましくは５０〜１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、もっとも好ましくは１００〜５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の密度で播種して培養する。【００１４】
本発明の方法では、増殖能の高い、未分化な角膜内皮前駆細胞群が選択的に増殖される。増殖される角膜内皮前駆細胞群は、未分化性の指標である神経堤マーカーｐ７５陽性によって特徴づけられ、さらに神経堤マーカーであるＦＯＸＣ２、ＳＯＸ９、及び角膜内皮マーカーであるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現も認められる。これらのマーカーは、培養開始時点において高い発現が認められるが、増殖が進むにつれて少しずつ消失する。一方、増殖された細胞群は、培養初期には発現していない増殖マーカーＫｉ−６７を高発現するようになり、非常に増殖能が高く、最終的に１細胞から少なくとも１×１０５ｃｅｌｌｓ以上に増殖可能である。【００１５】
本発明で用いられる培地は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、及びＷｎｔ３ａから選ばれる少なくとも１以上のサイトカインを含むことが望ましい。【００１６】
培地は、ＫＳＲなどの血清代替物を含んでいてもよい。また、レチノイン酸、βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、及びアスコルビン酸から選ばれる１又は２以上を含んでいてもよい。【００１７】
接着培養は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン、又はポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）でコーティングした培養容器を用いて行う。【００１８】
本発明の方法によれば、増殖能の高い、未分化な状態で角膜内皮前駆細胞を長期に培養することができる。好ましくは、培養は７日以上継続して行う。【００１９】
用いられる角膜内皮細胞組織の由来は限定されないが、ヒト由来であることが好ましい。【００２０】
角膜内皮前駆細胞は、上記方法で培養した細胞群からｐ７５陽性の細胞群を単離することにより取得することができる。【００２１】
本発明はまた、上記方法によって調製された角膜内皮前駆細胞群を、角膜内皮細胞群に分化誘導することを特徴とする、角膜内皮細胞の調製方法も提供する。【００２２】
角膜内皮細胞群への分化誘導は、たとえば、ＴＧＦ−β２を含む無血清培地、又は血清を含む培地を用いて行うことができる。【００２３】
角膜内皮細胞群への分化誘導は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）又はポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）等でコーティングした培養皿（器）を用いた接着培養により行うことができるが、後述する角膜内皮細胞シートを作製する場合には、角膜内皮前駆細胞を高分子膜上で培養し、角膜内皮細胞に分化誘導してもよい。【００２４】
本発明はさらに、本発明の方法によって調製された角膜内皮前駆細胞群、又は角膜内皮細胞群を、高分子膜を支持体として培養することにより、角膜内皮細胞シートを作製する方法も提供する。【００２５】
用いられる高分子膜は、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸を含むグリコサミノグリカン；アテロコラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、及びゼラチン；ケラチン；プロテオグリカン；アルギン酸、キトサン、及びヒアルロン酸；ポリアミノ酸（ポリ乳酸）；セルロース；（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体、及びこれらの共重合体を含む温度応答性ポリマー；からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含むものを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、角膜内皮組織由来の細胞を、より未分化な状態（ｐ７５陽性の状態を維持したまま）で増殖させることができる。換言すれば、本発明によれば、角膜内皮組織由来の細胞から、より未分化な細胞群（角膜内皮前駆細胞）を選択的に増殖させ、単離することが可能である。本発明で得られる角膜内皮前駆細胞群は高い増殖能を有し、それゆえ、長期にわたって継代培養することが可能であり、これにより大量の角膜内皮前駆細胞群を調製することができる。【００２７】
本発明で得られる角膜内皮前駆細胞群は、適当な条件下で培養することにより、成熟した角膜内皮細胞へ分化誘導させることが可能である。それゆえ、本発明によれば、長期的に安定した角膜内皮細胞源を供給することが可能となり、角膜再生医療における深刻なドナー不足（待機患者１０００万人）の問題を解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の方法によって角膜内皮組織より得られた細胞（Ａ：初代培養  １４日、Ｂ：初代培養  ２１日）を示す。
【図２】図２は、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞における神経堤マーカーｐ７５、ＳＯＸ９、ＦＯＸＣ２と、角膜内皮マーカーＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現を示す。各グラフ左から、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞、公知の方法で得られた細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏの角膜内皮細胞を示す。
【図３】図３は、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞におけるｐ７５の発現量を他の細胞と比較したグラフである。グラフ左から、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞、本発明の方法を浮遊培養に代えて行って得られた細胞、公知の方法で得られた細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏの角膜内皮細胞を示す。
【図４】図４は、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞の増殖能を示す。Ａ：初代培養細胞（左）と継代１代目の細胞（右）の培養２日後の写真。Ｂ：増殖マーカーＫｉ−６７の発現（左：Ｋｉ−６７の染色像、右：Ｋｉ−６７と核染色の染色像）。Ｃ：各継代細胞の増殖能（増殖曲線）。
【図５】図５Ａは、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞から分化した角膜内皮細胞の画像を示す（左：本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞、右：通常の培養角膜内皮細砲）。図５Ｂは、角膜内皮マーカータイプＶＩＩＩコラーゲン（ＣＯＬ８Ａ２）の発現を示す（グラフ左から、角膜内皮前駆細胞、角膜内皮前駆細胞から分化した角膜内皮細胞、公知の方法で得られた細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏの角膜内皮細胞）。
【図６】図６は、アテロコラーゲンシート上に作製した角膜内皮細胞シートの解析結果を示す（Ａ：アテロコラーゲンシート上に作製された角膜内皮細胞シート、Ｂ：位走査像、Ｃ：アリザリン染色像、Ｄ：Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの発現、Ｅ：ＺＯ−１の発現、Ｆ：Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現）。
【図７】図７は、角膜内皮細胞シートのポンプ機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系（ｕｓｓｉｎｇ−ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）で解析した結果を示す（Ａ：短絡電流の経時変化、Ｂ：角膜内皮前駆細胞から分化した角膜内皮細胞（左）と培養角膜内皮（右）の比較）。
【図８】図８は、ウサギの水疱性角膜症モデルに角膜内皮細胞シートを移植し、角膜の透明性（Ａ：上段は移植群、下段はコントロール群。いずれも左は移植前、中・右は移植２８日後）及び角膜厚の改善（Ｂ：−◆−移植群、−■−コントロール群）を検証した結果を示す。
【００２９】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１１−１５６６４１号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
１．定義
以下、本発明にかかる用語について説明する。
（１）角膜内皮細胞
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の３層構造をしている。「角膜内皮細胞」は、この角膜の一番内側の層を構成する細胞群で、障害を受けるとｉｎ  ｖｉｖｏでは再生しない。「角膜内皮細胞」は神経堤に由来する細胞で、敷石状の形態を有し、角膜内皮細胞の分化マーカーであるタイプＶＩＩＩコラーゲン、ＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅ等の発現によって特徴づけられる。
【００３１】
（２）角膜内皮前駆細胞
本発明にかかる「角膜内皮前駆細胞」とは、角膜内皮に分化可能な未分化細胞を意味する。「角膜内皮前駆細胞」は、樹状形態を有する細胞で、高い増殖能を有する。また、培養（増殖）初期段階では、分化マーカーを発現しておらず、神経堤幹細胞等の未分化細胞特異的なマーカーであるｐ７５の発現によって特徴づけられる。本発明で得られる「角膜内皮前駆細胞」は、幹細胞としての性質（多分化能と自己複製能）も有する可能性がある。その意味では、「角膜内皮前駆細胞」は「「角膜内皮幹細胞・前駆細胞」と記載することもできる。
【００３２】
（３）無血清培地
本発明で用いられる「無血清培地」とは、他種血清成分を含まない培地を意味する。無血清培地は、動物血清に由来する病原体による感染の恐れがなく、得られた細胞や培養物は安全に、臨床応用に適用することができる。それゆえ、本発明で得られる角膜内皮細胞の再生医療等への利用を考慮した場合、培地としては無血清培地を用いることが好ましい。なお、無血清培地は、後述する工血清代替物を含んでいてもよい。
【００３３】
（４）血清代替物
本発明で用いられる「血清代替物」とは、血清に代替して使用可能な人工血清代替物を意味し、例えば、前述したＫＳＲ（ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ＧＩＢＣＯ）製）、脂質リッチアルブミン等のアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノールや３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物を挙げられる。
【００３４】
（５）サイトカイン
「サイトカイン」とは、細胞から放出され、種々の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子の総称である。本発明においては、細胞の増殖と分化誘導を促進させる目的で、培地にサイトカインを添加する。
【００３５】
本発明で用いられる「サイトカイン」としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３ｅｔｃ．））、インターフェロン類（ＩＦＮα、β、γ）、インターロイキン類、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）等を挙げることができるが、本発明の目的と効果に適合する限り、これらに限定されない。
【００３６】
（６）細胞マーカー
本発明では、角膜内皮前駆細胞、及び、分化誘導された角膜内皮細胞を同定するために、各細胞種に特異的に発現しているタンパク質（細胞マーカー）を利用する。具体的には、本発明にかかる角膜内皮前駆細胞群は、培養初期段階においては、ｐ７５、ＦＯＸＣ２、ＳＯＸ９、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性によって特定される。これらのマーカーは、本発明の培養系において一定期間維持することが可能であるが、増殖が進むにつれて少しずつ消失する。一方で、角膜内皮前駆細胞は培養初期にはｋｉ−６７を発現していないが、増殖時にはｋｉ−６７を高発現するようになる。一方分化誘導された角膜内皮細胞を含む細胞群はタイプＶＩＩＩコラーゲン陽性によって特定される。
【００３７】
神経成長因子受容体はニュートロフィン類に対する受容体であるｐ７５はＬｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとして知られており、遊走している神経堤細胞のマーカーである。ｐ７５は神経堤幹細胞を含めた、成体内に少数存在する幹細胞にのみ発現しており、未分化性の指標としては最も信頼できるマーカーの一つである。その他、神経堤細胞のマーカーとしては、ＦＯＸＣ２（Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ２）、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１０、ＡＰ２β、ＡＰ２α、ｓｎａｉｌ、ｓｌｕｇ、ＰＩＴＸ２、ＦＯＸＣ１等も、知られている。
【００３８】
Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎはカルシウム依存性細胞接着分子に属するタンパクで、同種のカドヘリンの相互作用及びカテニンを介したアクチン細胞骨格との結合により細胞接着において重要な役割を担い、発生分化段階に関与することが知られている。Ｎ−カドヘリンは神経、心筋、骨格筋、血管内皮、角膜内皮など様々な組織に発現している間葉系マーカーである。
【００３９】
タイプＶＩＩＩコラーゲンは、非線維性コラーゲンで、形態形成が活発な組織で多く発現し、分化した角膜内皮細胞のマーカーとして知られている。このほか、分化した角膜内皮細胞のマーカーとしては、ＺＯ−１等を挙げることができる。
【００４０】
２．細胞の培養方法−角膜内皮前駆細胞群の選択的増殖方法
２．１  細胞の単離
まず、常法にしたがい、単離された角膜内皮組織をトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素で処理して、細胞を単離させる。単離させた細胞は、ＤＭＥＭ等の基本培地に懸濁させ、遠心して組織断片を除去する。こうして調製した角膜内皮組織由来の細胞群を以下の手順で培養を行う。
【００４１】
２．２  細胞の培養
本発明の方法は、（１）無血清培地、（２）低密度培養、（３）接着培養の３つを主たる特徴とする。
【００４２】
（１）培地組成（無血清培地）
本発明の方法では、血清を含まない無血清培地を用いて細胞を培養する。基本培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、α  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
【００４３】
本発明の培養方法で用いられる培地は、上記した基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成される。培地には、細胞の増殖を促すサイトカインや血清代替物を含むことが好ましい。培地に添加されるサイトカインとしては、たとえば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＧＦ−β）、インターフェロン類（ＩＦＮα、β、γ）、インターロイキン類、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）等を挙げることができる。
【００４４】
血清代替物としては、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、βメルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、市販のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）などを挙げることができる。
【００４５】
また、培地には、必要に応じて、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、アミノ酸等を添加することができる。
【００４６】
上記のほかに、栄養源として、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類等を含むことができる。
【００４７】
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
【００４８】
（２）低密度培養
一般に角膜内皮細胞の培養は、１０，０００〜１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の高密度で細胞を播種、またはデスメ膜ごと外植片培養を行う。しかし、本発明の方法では少なくとも１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満、好ましくは５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、より好ましくは２０〜２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、さらに好ましくは５０−１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、もっとも好ましくは１００〜５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の低密度で細胞を播種して培養を行う。
【００４９】
（３）接着培養
本発明の方法では、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）又はポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）等でコーティングした培養皿（器）を用いて、接着培養を行う。
【００５０】
上記した条件にしたがい、培養は、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１％〜２５％  Ｏ２、１％〜１５％  ＣＯ２の条件下で行われる。培養は、２〜３日に１回培地を交換しながら、少なくとも７日、好ましくは７日〜１４日間培養する。
【００５１】
２．３  角膜内皮前駆細胞群の選択的増殖
血清を含む培地を用いた従来の方法では、継代するにつれて細胞形態が変化し、角膜内皮機能や増殖能を維持することが困難になる。しかしながら、本発明の方法では、継代しても細胞形態は変化せず、高い増殖能を維持したまま、長期間の培養が可能となる。これは、本発明の方法では、角膜内皮組織由来の細胞を、未分化な状態を維持したまま増殖させることができるからである。換言すれば、本発明の方法では、増殖能の高い、より未分化な細胞群が選択的に増殖させることができる。
【００５２】
本発明で選択的に増殖される角膜内皮前駆細胞群は、未分化マーカーであるｐ７５陽性という点で、従来公知の方法で培養した角膜内皮由来の細胞群とは区別される。ｐ７５の発現は増殖が進むにつれて少しずつ消失していくが、これらの細胞群は高い増殖能を有し、最終的に１０００００倍まで増殖可能である。
【００５３】
この細胞群は、培養開始時点において、神経堤マーカーであるＳＯＸ９やＦＯＸＣ２を発現し、角膜内皮マーカーであるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎを発現しているという点においても、従来公知の方法で培養して得られる角膜内皮由来の細胞群とは区別される。ＳＯＸ９、ＦＯＸＣ２、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現も、増殖が進むにつれて少しずつ消失していく。
【００５４】
本発明の方法で増殖された角膜内皮前駆細胞群は、増殖マーカーＫｉ−６７を発現し、高い増殖能を有し、最終的に１細胞から少なくとも１×１０５ｃｅｌｌｓ以上に増殖可能な、非常に増殖能の高い細胞群である。この細胞群は、適当な条件下で角膜内皮細胞に分化可能である。本発明においては、この角膜内皮細胞に分化可能な細胞群を、「角膜内皮細胞前駆細胞（群）」と呼ぶ。
【００５５】
３．角膜内皮前駆細胞の角膜内皮細胞への分化誘導
上記のとおり、本発明の方法によって得られた角膜内皮前駆細胞群は、適当な条件下で培養することにより、成熟した角膜内皮細胞に分化させることができる。
【００５６】
（１）培地組成
基本培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、α  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
【００５７】
角膜内皮細胞への分化誘導で用いられる培地は、上記した基本培地に、角膜内皮細胞への分化誘導を促す因子や、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成される。
【００５８】
角膜内皮細胞への分化誘導を促す因子としては、ＴＧＦ−β２、コレラトキシン、トランスフェリン、インスリン、ＥＧＭ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、血清あるいは血清代替物、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）等を挙げることができる。
【００５９】
好ましくは、角膜内皮細胞への分化誘導にはＴＧＦ−β２を含む無血清培地（特開２００９−２６８４３３号参照）、あるいはＢＳＡ等の血清を含む培地を用いる。
【００６０】
また培地には、必要に応じて、ペニリシリン、ストレプトマイシン等の抗生剤、サイトカイン、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、アスコルビン酸等の抗酸化剤、アミノ酸等を添加することができる。
【００６１】
上記のほかに、栄養源として、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類等を含むことができる。
【００６２】
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
【００６３】
（２）培養条件
培養は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）又はポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）等でコーティングした培養皿（器）を用いて、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１％〜２５％  Ｏ２、１％〜１５％  ＣＯ２の条件下で行われる。培養期間は、２〜３日に１回培地を交換し、少なくとも７日、好ましくは１週間〜８週間程度である。
【００６４】
角膜内皮前駆細胞群から成熟角膜内皮細胞への分化誘導は、形態の変化（敷石状の形態の細胞への変化）、成熟角膜内皮細胞マーカーであるタイプＶＩＩＩコラーゲン等の発現によって確認することができる。
【００６５】
４．細胞の純化
本発明の方法によって増殖された角膜内皮前駆細胞群は、表面マーカーであるｐ７５等を利用して、簡便に単離（純化）することができる。例えば、ｐ７５に特異的な抗体で標識された免疫磁気ビーズ、ｐ７５抗体を固相化したカラム、蛍光標識されたｐ７５抗体を用いたセルソーター（ＦＡＣＳ）による分離を用いて単離することができる。
【００６６】
また、本発明の方法によって分化誘導された角膜内皮細胞群についても、表面マーカーではないものの、その特異的マーカーであるタイプＶＩＩＩコラーゲン等の発現を指標として単離することができる。
【００６７】
５．再生医療への利用
５．１  培養物
本発明の方法によって得られた角膜内皮前駆細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された角膜内皮細胞群を含む培養物は、研究、再生医療あるいは後述する細胞製剤の原料として利用することができる。
【００６８】
５．２  角膜内皮疾患治療用細胞製剤
本発明の方法によって、分化誘導され、単離された角膜内皮前駆細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された角膜内皮細胞群は、角膜内皮疾患用細胞製剤として利用できる。
【００６９】
本発明の細胞製剤の投与方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、局所注入投与を行うことができる。
【００７０】
本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。
【００７１】
細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
【００７２】
本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。
【００７３】
細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
【００７４】
患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよいが挙げられる。
【００７５】
その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００７６】
実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。
【００７７】
５．３  細胞シート
（１）キャリア上での培養
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞群を適当な高分子膜（キャリア）上で培養し、角膜内皮細胞に分化誘導させることにより、あるいは、上記３に記載した方法で得られた角膜内皮細胞群を適当な高分子膜（キャリア）上で培養することにより角膜内皮細胞シートを作製することができる。
【００７８】
用いる高分子膜としては、コラーゲン、アテロコラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸）、プロテオグリカン、アルギン酸、キトサン、ポリアミノ酸（ポリ乳酸）、セルロース等のバイオポリマー、あるいは、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体、又はこれらの共重合体等の温度応答性ポリマー等を挙げることができる。
【００７９】
これらの方法を用いた本発明の細胞製剤や細胞シート移植の対象となりうる疾患としては、水疱性角膜症を含む角膜内皮機能不全、角膜ジストロフィー、発達緑内障、Ｒｉｅｇｅｒ奇形、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、輪部デルモイド、強膜化角膜、円錐角膜やペルーシド角膜変性などの角膜形状異常、角膜瘢痕、角膜浸潤、角膜沈着、角膜浮腫、角膜潰瘍、化学物質や熱によるものを含む眼外傷、角膜炎、角膜変性、角膜感染症などの眼疾患や神経芽細胞腫、Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ病、Ｗａａｄｅｎｂｕｒｇ症候群、限局性白皮症Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ病が挙げられる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８１】
［材料・方法］
１．角膜内皮前駆細胞の培養・維持
角膜内皮前駆細胞の樹立・維持培地
・ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、基礎培地）
・２０％  ＫｎｏｃｋＯＵＴ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、血清代替物）
・２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・１００μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・４ｎｇ／ｍｌ  ｂａｓｉｃ−ＦＧＦ（Ｗａｋｏ社）【００８２】
角膜内皮前駆細胞の培養に用いるコーティング剤
・マトリゲルＴＭ  ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ社）
氷上又は４℃で融解したマトリゲルＴＭを冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３０倍希釈し、培養皿に添加し、３７℃、１時間インキュベートして培養皿をコーティングした。
・ラミニン５１１（ベリタス社）
ラミニン５１１をＰＢＳで２０μｇ／ｍｌに希釈し、培養皿に添加し、３７℃、２時間インキュベートして培養皿をコーティングした。ＰＢＳで２回、使用する培地で２回洗浄した後、培地を加えた。【００８３】
ヒト角膜内皮組織からの角膜内皮前駆細胞の調製
ヒト角膜内皮組織をデスメ膜ごと剥離し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ社，ＲＯＣＫ阻害剤；アポトーシス阻害剤）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の入った３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃で３０分維持した。【００８４】
次いで、１ｍｌのＳｔｅｍ  Ｐｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，細胞乖離液）を加え、３７℃で３０分処理したのち、４ｍｌのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、１５ｍｌチューブに移した。１，５００ｒｐｍ、５分遠心して、上清を吸引除去し、前述の培地を２００μｌ加え、マトリゲルＴＭ又はラミニン５１１でコーティングした培養皿に播種して（播種密度：５０−１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、２〜３日に１回培地を交換しながら培養を行った。約７〜１４日でコロニーが出現した。【００８５】
角膜内皮前駆細胞の継代
サブコンフルエントまで培養した細胞に、Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ社、アポトーシス阻害剤）を終濃度１０μＭになるように添加し、３７℃で６０分放置し、ＰＢＳで１回洗浄したのち、０．２５ｍｌのＳｔｅｍ  Ｐｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，細胞乖離液）を加え、室温で２〜５分放置した。【００８６】
５倍容の培地を加え、１５ｍｌチューブに移し、１，０００ｒｐｍ、５分遠心して、上清を吸引除去し、培地を加え、マトリゲルＴＭ又はラミニン５１１でコーティングした培養皿に播種して（播種密度：５，０００−２００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、２〜３日に１回培地を交換しながら培養を行った。【００８７】
２．角膜内皮前駆細胞の角膜内皮幹細胞への分化誘導
角膜内皮前駆細胞から成熟角膜内皮細胞への分化誘導培地
・ＤＭＥＭ  ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ（日研生物医学研究所）
・１０％  ＦＢＳ（日本バイオシーラム社）
・２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）【００８８】
角膜内皮細胞への分化誘導に用いるコーティング剤
・ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ（ＡｔｈｅｎａＥＳ社）
ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ（フィブロネクチンとタイプＩコラーゲンを含むコーティング剤）を培養皿に加え、室温、３０秒放置した。【００８９】
角膜内皮前駆細胞から成熟角膜内皮細胞への分化
上記方法で培養した角膜内皮前駆細胞にＹ−２７６３２（Ｗａｋｏ社）を終濃度１０μＭになるように添加し、３７℃で６０分処理し、ＰＢＳで１回洗浄したのち、０．２５ｍｌのＳｔｅｍ  Ｐｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，細胞乖離液）を加え、室温で２〜５分間インキュベーションした。【００９０】
５倍容の培地を加え、１５ｍｌチューブに移し、１，０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を吸引除去し、培地を加え、ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘでコーティングした培養皿またはアテロコラーゲンシート（ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ，ＫＯＫＥＮ社）上に播種し（播種密度：３，０００−５，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２）、２〜３日に１回培地を交換しながら培養を行った。１週間から４週間で角膜内皮様（敷石状）の形態を呈する細胞が出現した。【００９１】
成熟角膜内皮細胞の維持培地
・ＤＭＥＭ  ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ（日研生物医学研究所，基礎培地）
・１０％  ＦＢＳ（日本バイオシーラム社）
・２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・２ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）【００９２】
４．公知の方法による角膜内皮細胞
１と同様にして、角膜組織から細胞を単離し、公知の方法にしたがい培養を行った（前掲、Ｙｏｋｏｏら，ＩＶＯＳ，２００５）。すなわち、単離した角膜内皮細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２，Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，４０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含む培地を使用し、非接着性培養皿上に播種した。２日に１回４０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを追加し、計１０日間培養した。【００９３】
５．リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ抽出
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、細胞からＲＮＡを抽出した。【００９４】
ｃＤＮＡ合成
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、前項で得たＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。【００９５】
リアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と、表１記載のＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によりリアルタイムＰＣＲを行った。データ解析は、ＧＡＰＤＨを内因性コントロールとして、ΔΔＣｔ法により行った。【００９６】
【表１】
2013012087.tif 000002
【００９７】
６．免疫染色
上記した方法で調製した角膜内皮前駆細胞又は角膜内皮細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）で室温３０分又は冷メタノール（Ｗａｋｏ社）で−３０℃、３０分で固定した。トリス緩衝溶液（ＴＢＳ，ＴａＫａＲａ社）で２回洗浄し、５％  ＮＳＴ（組成は表２参照）で室温１時間処理した。【００９８】
【表２】
2013012087.tif 000003
【００９９】
１次抗体を１％ＮＳＴで各至適濃度に調整し、４℃で一晩インキュベート（表３参照）し、ＴＢＳで３回洗浄した。次いで、２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ｏｒ  ５６８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１％ＮＳＴで２００倍希釈して加え、室温で２時間インキュベートした。【０１００】
０．２ｍｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で核染色を行い、ＴＢＳで３回洗浄してから、水溶性封入剤（Ｐｅｒｍａ  Ｆｌｕｏｒ，サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で封入した。蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａ１，Ｚｅｉｓｓ社）で観察し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｚｅｉｓｓ社）で画像を取得した。【０１０１】
【表３】
2013012087.tif 000004
【０１０２】
７．アリザリン染色
アリザリンレッドＳ（Ｗａｋｏ社）を０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ４．２）に調整した。細胞を染色液で５分間染色したのち、４％パラホルムアルデヒドにより固定し、顕微鏡下で観察した。【０１０３】
８．ポンプ機能測定
ポンプ機能はＵｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒを用いて測定した。アテロコラーゲン上で培養した誘導角膜内皮細胞シートをＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液（１２０．７ｍＭ  ＮａＣｌ，２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ２，４．６ｍＭ  ＫＣｌ，０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐＨ７．４）でインキュベートした。Ｕｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒシステムはＷＰＩ社製のものを用いた。Ｎａ＋／Ｋ＋  −ＡＴＰａｓｅ阻害剤である１ｍＭウワバイン（Ｓｉｇｍａ社）を加え、短絡電流を算出した。【０１０４】
９．家兎角膜内皮障害モデルへの移植
家兎角膜内皮障害モデルは家兎の片眼をクライオ法によって角膜内皮を脱落させた。その１週間後、誘導角膜内皮シートの角膜内皮移植術（ＤＡＥＳＫ）によって角膜内皮面に接着させ、空気を注入して密着させた。角膜厚は経時的にパキメーター（ＳＰ−１００，Ｔｏｍｅｙ社）によって測定し、前眼部像はスリットランプによって観察した（ＡＩＰ−２０、トプコン社）。【０１０５】
［結果］
（１）本発明の方法で得られた細胞
ヒト角膜内皮組織（内皮細胞数：約１〜４×１０４細胞）から単離した細胞を５０−１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２／無血清下で培養することにより、約７〜１４日間培養で、コロニーの出現が認められた（出現率：約０．１％：１眼あたりに約１０〜４０細胞存在）。【０１０６】
本発明の方法によって角膜内皮組織より増殖された細胞の形態は、ｉＰＳ細胞から誘導した神経堤細胞と形態が酷似しており、角膜内皮前駆細胞である可能性が示唆された（図１）。【０１０７】
（２）角膜内皮前駆細胞のマーカー遺伝子の解析
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞は公知の方法で培養した内皮細胞や、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞と比較して、角膜内皮の発生に由来する神経堤マーカーｐ７５、ＳＯＸ９、ＦＯＸＣ２と、角膜内皮マーカーの一つであるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が亢進していた（図２）。【０１０８】
（３）角膜内皮前駆細胞と公知の方法で得られた細胞との比較
角膜内皮組織から公知の方法で得られた細胞や生体から単離しただけの細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ではｐ７５の発現が認められなかったが、本発明の方法で得られた角膜内皮幹細胞・前駆細胞では、ｐ７５の発現が認められた（図３）。ｐ７５（ＣＤ２７１／ＮＧＦＲ）は、神経堤幹細胞を含めた、生体内に少数存在する幹細胞にのみ発現するマーカーで、未分化性の指標である。上記の結果は、本発明の方法では、角膜内皮前駆細胞をより未分化な状態で増殖させることが可能であることを示す。【０１０９】
また、公知の角膜内皮前駆細胞の培養法である浮遊培養法（前掲、Ｙｏｋｏｏら，ＩＶＯＳ，２００５）を行った場合、得られた細胞ではｐ７５の発現が認められなかった（図３）。このことから、本発明は公知の方法に比較して、より未分化な角膜前駆細胞を単離、増幅可能であることを示す。【０１１０】
（４）角膜内皮前駆細胞の増殖能
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞では、増殖マーカーの発現が認められた（図４Ｂ）。また、継代を繰り返すことによって単一細胞から最大約１０８個に増幅可能であった（図４Ｃ）。このことは、１ドナーから理論上最大、細胞シート８×１０４枚が作製可能であることを示す。これに対し、公知の方法で得た細胞では、細胞形態が変化し、増殖能が低下するため、継代は困難である（前掲、Ｙｏｋｏｏら，ＩＶＯＳ，２００５）。【０１１１】
（５）角膜内皮前駆細胞から角膜内皮細胞の分化誘導
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞から分化した角膜内皮細胞は敷石状の細胞形態を呈し（図５Ａ）、角膜内皮マーカーであるタイプＶＩＩＩコラーゲン（ＣＯＬ８Ａ２）の発現の亢進が認められた（図５Ｂ）。このことから、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞は角膜内皮細胞に分化可能であることが確認された。【０１１２】
（６）誘導角膜内皮細胞シートの作製
アテロコラーゲンシートは安全性の高い医療用のコラーゲンシートで、角膜内皮の移植用キャリア候補の一つである。角膜内皮前駆細胞から誘導された角膜内皮細胞はアテロコラーゲンシート上に播種すると透明な角膜内皮細胞シートが作製でき（図６Ａ）、敷石状の細胞形態を呈した（図６Ｂ、Ｃ）。【０１１３】
（７）誘導角膜内皮細胞シートの発現解析
アテロコラーゲンシート上に再播種した角膜内皮細胞では、角膜内皮前駆細胞から分化誘導した角膜内皮細胞と同様に、角膜内皮マーカーであるＮａ＋／Ｋ＋  −ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１及びＮ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が認められた（図６Ｄ、Ｅ、Ｆ）。このことから、誘導角膜内皮細胞シートは成熟角膜内皮細胞を含み、再生医療用材料として使用可能であることが示された。【０１１４】
（８）誘導角膜内皮細胞シートのポンプ機能解析
本発明で得られた誘導角膜内皮細胞シートをＵｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒを用いてポンプ機能を解析した（図７Ａ）。その結果、培養角膜内皮細胞と比較して同程度であった（図７Ｂ）。【０１１５】
（９）誘導角膜内皮細胞シートの家兎内皮障害モデルへの移植実験
本発明で得られた誘導角膜内皮細胞シートを家兎角膜内皮障害モデルへ移植するとアテロコラーゲンのみを移植したコントロール群と比較して、移植後２週間目より顕著な角膜厚の減少が認められた（図８Ａ、Ｂ）。このことから、誘導角膜内皮細胞シートは成熟角膜内皮細胞を含み、再生医療用材料として使用可能であることが示された。【０１１６】
［結論］
本発明の方法により、角膜内皮組織由来の細胞をより未分化な状態（ｐ７５及びＦＯＸＣ２、ＳＯＸ９  陽性）で増殖させることが可能なことが確認された。得られる角膜内皮前駆細胞は、高い増殖能を有し、１ドナーから理論上、約３３０枚の角膜内皮細胞シート作製可能であった。当該細胞は成熟角膜内皮細胞への分化能を有する角膜内皮前駆細胞であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明によれば、角膜内皮組織由来の細胞を、未分化な状態を維持したまま増殖させることができる。換言すれば、角膜内皮組織由来の細胞から、増殖能の高い、より未分化な角膜内皮前駆細胞を選択的に増殖させることができる。本発明で得られた角膜内皮前駆細胞群は、適当な条件下で培養することにより、成熟した角膜内皮細胞へ分化誘導させることが可能である。それゆえ、本発明は、水疱性角膜症等に対する再生医療の基盤技術として利用可能である。【０１１８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月29日(2013.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を得ることを特徴とする、角膜内皮前駆細胞の調製方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
細胞群を２０〜２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種して培養することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも７日以上培養することを特徴とする、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
得られる角膜内皮前駆細胞がＫｉ−６７陽性である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項６】
増殖される角膜内皮前駆細胞がｐ７５陽性である、請求項１及び３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
増殖される角膜内皮前駆細胞が、ＦＯＸＣ２、ＳＯＸ９、及びＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の細胞である、請求項１及び３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
培地がｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、及びＷｎｔ３ａから選ばれる少なくとも１以上のサイトカインを含む、請求項１及び３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
培地が血清代替物を含む、請求項１及び３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
培地が、さらにレチノイン酸、βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、及びアスコルビン酸から選ばれる１又は２以上を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン、又はポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）でコーティングした培養容器を用いて接着培養することを特徴とする、請求項１及び３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を取得し、前記角膜内皮前駆細胞を、角膜内皮細胞に分化誘導することを特徴とする、角膜内皮細胞の調製方法。
【請求項１３】
分化誘導がＴＧＦ−β２を含む無血清培地、又は血清を含む培地を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を取得し、前記角膜内皮前駆細胞をそのまま、あるいは前記角膜内皮前駆細胞を角膜内皮細胞に分化誘導したのち、前記細胞を高分子膜上で培養することを特徴とする、角膜内皮細胞シートの作製方法。
【請求項１５】
高分子膜が、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸を含むグリコサミノグリカン；アテロコラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、及びゼラチン；ケラチン；プロテオグリカン；アルギン酸、キトサン、及びヒアルロン酸；ポリアミノ酸（ポリ乳酸）；セルロース；（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体、及びこれらの共重合体を含む温度応答性ポリマー；からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含むものである、請求項１４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月14日(2014.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、5000 cells/cm2以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を得ることを特徴とする、角膜内皮前駆細胞の調製方法。
【請求項２】
細胞群を20〜2000 cells/cm2の密度で播種して培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも７日以上培養することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
得られる角膜内皮前駆細胞がKi-67陽性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
増殖される角膜内皮前駆細胞がp75陽性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
増殖される角膜内皮前駆細胞が、FOXC2、SOX9、及びN-cadherin陽性の細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
培地がbFGF、EGF、TGF、NGF、及びWnt3aから選ばれる少なくとも１以上のサイトカインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
培地が血清代替物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
培地が、さらにレチノイン酸、βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、及びアスコルビン酸から選ばれる１又は２以上を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルTM、ポリ−L−オルニチン／ラミニン、又はポリ−D−リジン（PDL）でコーティングした培養容器を用いて接着培養することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、5000 cells/cm2以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を取得し、前記角膜内皮前駆細胞を、角膜内皮細胞に分化誘導することを特徴とする、角膜内皮細胞の調製方法。
【請求項１２】
分化誘導がTGF−β2を含む無血清培地、又は血清を含む培地を用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、5000 cells/cm2以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を取得し、前記角膜内皮前駆細胞をそのまま、あるいは前記角膜内皮前駆細胞を角膜内皮細胞に分化誘導したのち、前記細胞を高分子膜上で培養することを特徴とする、角膜内皮細胞シートの作製方法。
【請求項１４】
高分子膜が、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸を含むグリコサミノグリカン；アテロコラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、及びゼラチン；ケラチン；プロテオグリカン；アルギン酸、キトサン、及びヒアルロン酸；ポリアミノ酸（ポリ乳酸）；セルロース；（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体、及びこれらの共重合体を含む温度応答性ポリマー；からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含むものである、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
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