(57)【要約】  非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドをDNA鎖に導入することにより、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを提供する。  本発明は、求核剤と式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを接触させることによって、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの3’位とCの5’末端との間のホスホジエステル結合が、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断されて、5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドCを得る、5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程を含む、オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法に関する。
2013150902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
求核剤と、式I：
(A)n-B-C
［式中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合が、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断されて、前記Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドと、式II：
(A)n-B’
［式中、
A及びnは、式Iにおいて定義したのと同様の意味であり、
B’は、求核剤の攻撃によるEの脱離に伴って形成されるBの残基部分である］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを得る、5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程を含む、オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
式II：
(A)n-B’
［式中、
A及びB’は、請求項1と同様の意味であり、
nは1である］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを反応させることによって、B’とAとの間のホスホジエステル結合が、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がB’から脱離することによって切断されて、式IIa：
A-PO3H2
で表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得る、3’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程をさらに含む、請求項1の方法。
【請求項３】
前記非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが、以下：
【化１】
2013150902.tif 000064
［式中、
Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル又はカルボニルであり；
R’は、水素、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；
rは、0〜4の整数であり；
R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；
R’’’は、-COZ、-C≡C-Z又は-CNであり；
Zは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキルである］
で表されるデオキシヌクレオシドから選択される、請求項1又は2の方法。
【請求項４】
前記5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程の前に、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB又はその誘導体と、天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシド又はその誘導体とを含む基質を用いて、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する、オリゴデオキシヌクレオチド合成工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項の方法。
【請求項５】
式I：
(A)n-B-C
［式中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして用いて、直鎖状二本鎖DNA断片を増幅するDNA断片増幅工程；
求核剤と、増幅された直鎖状二本鎖DNA断片とを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合が、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断されて、直鎖状二本鎖DNA断片に含まれる前記Cの5’末端がリン酸化されており、且つ式Iで表されるプライマー部分の少なくとも一部と相補的な配列を含む3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片を形成させる、3’突出末端形成工程；並びに
前記3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片と、別の二本鎖DNA断片とを連結する連結工程；
を含む、二本鎖DNAの連結方法。
【請求項６】
請求項1〜4のいずれか1項のオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法又は請求項5の二本鎖DNAの連結方法に使用するためのキットであって、式I：
(A)n-B-C
［式中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチド、又は求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB若しくはその誘導体を少なくとも含む、前記キット。
【請求項７】
以下の式：
【化２】
2013150902.tif 000065
［式中、
Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル又はカルボニルであり；
R'は、メチルであり；
rは、0〜4の整数であり；
R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；
R’’’は、-COZ、-C≡C-Z又は-CNであり；
Zは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキルである］
で表される非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非天然型塩基を含むオリゴデオキシヌクレオチドの切断による5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学分野の研究においては、デオキシリボ核酸（以下「DNA」とも記載する）を複製又は増幅、切断、及び連結する技術が使用される。このうち、DNAを切断する技術としては、制限酵素を用いる方法が、DNAを連結する技術としては、DNA連結酵素(DNAリガーゼ)を用いる方法が、それぞれ一般的である。例えば、タイプIIの制限酵素を用いて突出末端を有するDNA断片を調製し（非特許文献1及び2）、当該突出末端を有するDNA断片と、当該突出末端と相補的な突出末端を有する別のDNA断片とをDNA連結酵素を用いて連結することができる。【０００３】
しかしながら、上記の方法には、いくつかの問題点がある。第一に、タイプIIの制限酵素を用いて作製された突出末端は突出部分が短い。第二に、突出末端の突出部分の塩基配列が回文配列となる。第三に、制限酵素の認識配列でしか突出末端を作製することができない。これらの問題点のうち、第一及び第二の問題点は、DNA連結酵素によるDNA断片同士の連結効率の低下の原因となり、第三の問題点は、DNA断片を連結した結果形成される新たなDNAにおける塩基配列の大きな制約となる。【０００４】
このような問題点を解決するため、非天然型塩基を含むデオキシ又はリボヌクレオチドを予めDNA鎖に導入しておき、非天然型塩基を含むデオキシ又はリボヌクレオチドの部位でDNA鎖を切断する技術が開発された。特許文献1及び2、並びに非特許文献3〜5は、非天然型塩基としてウリジン（リボヌクレオチド）を導入したDNAプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等でDNAを増幅した後、増幅されたDNAをウリジン（リボヌクレオチド）の位置で切断する方法を記載する。また、非特許文献6〜12は、非天然型塩基として2’-デオキシウリジンを導入したDNAプライマーを用いてPCR等でDNAを増幅した後、増幅されたDNAを2’-デオキシウリジンの位置で切断する方法を記載する。上記文献に記載の方法は、DNAの切断にRNA分解酵素又はウラシル除去酵素のような酵素を用いる。それ故、コスト面で不利である。また、一般に酵素による切断反応は、pH及び／又は金属イオン濃度などに関する特別な反応条件を満たす必要がある。【０００５】
非特許文献13は、デプリネーションとして知られるDNA塩基の脱離反応とそれによって生じるアベーシック部位を経由する、DNAの切断方法を記載する。デプリネーションは、酸性条件下で容易に引き起こされるが、塩基性条件下では非常に起きにくいことが知られている（非特許文献14）。非特許文献15は、天然型塩基ではデプリネーションが起こりにくい塩基性条件下で、デプリネーションと類似の反応を引き起こす非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドを記載する。しかしながら、当該文献記載のデオキシヌクレオシドを用いる場合、DNA切断のために酸素バブリングという煩雑な操作を必要とする。また、DNA自動合成機によるDNAの合成条件下及び／又はPCRのようなDNAの複製条件下で安定であり、且つ天然型塩基と同様にDNAの複製反応で鋳型として機能する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドは報告されていない。【０００６】
オリゴデオキシヌクレオチド（以下「DNAオリゴマー」又は「オリゴDNA」とも記載する）を人工的に合成する場合、DNA自動合成機が使用される。DNA自動合成機を用いて合成されたDNAオリゴマーは、通常、5’末端がリン酸化されていない。このため、DNA連結酵素を用いて当該合成DNAオリゴマーを他のDNA（DNA誘導体）と連結する場合、予め5’末端をリン酸化する必要がある。【０００７】
DNAの5’及び／又は3’末端をリン酸化する方法としては、DNA断片をポリヌクレオチドキナーゼ処理する方法（5’末端リン酸化の場合）、並びにリン酸化アミダイトを用いる合成DNAの末端リン酸化法を挙げることができる（特許文献3並びに非特許文献16及び17）。このうち、リン酸化アミダイトを用いる方法の場合、リン酸化アミダイトのカップリング効率が100%ではないため、リン酸化されたDNA及びリン酸化されなかったDNAが生成する。ここで、5’末端のリン酸化の場合、リン酸化されたDNAとリン酸化されなかったDNAとは、逆相HPLCでは分離が困難という問題点が存在する。逆相HPLCにおいてリン酸化されたDNAとリン酸化されなかったDNAとの分離を改善する方法として、DNAの末端リン酸部分をDMTr基のような保護基で保護した形態でDNAオリゴマーを精製し、その後、酸処理によってDMTr基を脱保護するという方法がある。しかしながら、この方法の場合、脱保護に酸を使用するため、デプリネーション反応が起こってDNAが破壊されるという問題が存在する（非特許文献18）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平10-66576号公報
【特許文献２】米国特許第7393635号明細書
【特許文献３】米国特許第5959090号明細書
【特許文献４】米国特許第7794936号明細書
【特許文献５】米国特許第5432272号明細書
【特許文献６】米国特許第5645985号明細書
【特許文献７】国際公開第2007/058326号パンフレット
【特許文献８】国際公開第2009/101810号パンフレット
【特許文献９】米国特許第6864049号明細書
【非特許文献】
【０００９】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
DNAを切断する方法として公知の特許文献1及び2、並びに非特許文献3〜12に記載の方法は、上記のようにDNAの切断にRNA分解酵素又はウラシル除去酵素のような酵素を用いる。それ故、コスト面で不利である。また、一般に酵素による切断反応は、pH及び／又は金属イオン濃度などに関する特別な反応条件を満たす必要がある。非特許文献15に記載の方法は、酵素を使用せず化学反応によってDNAの切断を行うため、コスト及び反応効率の点で有利である。しかしながら、当該文献に記載の非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドは、対応する天然型塩基（A、T、G又はC）を含むデオキシヌクレオチドと比較して、DNA自動合成機によるDNAの合成条件下及び／又はPCRのようなDNAの複製条件下における安定性が低く、且つDNA複製反応のようなin vivo及びin vitroの反応において使用した場合にフィデリティが低くなる。また、当該文献記載のデオキシヌクレオシドを用いる場合、DNA切断のために酸素バブリングという煩雑な操作を必要とする。【００１１】
DNAの5’及び／又は3’末端をリン酸化する方法として公知の特許文献3並びに非特許文献16及び17に記載の方法は、上記のようにリン酸化アミダイトのカップリング効率が100%ではなく、且つリン酸化されたDNAとリン酸化されなかったDNAとの分離が困難という問題点が存在する。【００１２】
所望の部位でのDNA鎖の切断、及び切断された末端のリン酸化を行うためには、化学反応によってDNAを二つの断片に切断し、それによって生じるDNA断片の5’末端をリン酸末端とすることが可能である、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドを切断部位としてDNA鎖に導入する方法が、低コストで、反応条件の制約が少なく、且つ実験操作が簡便である点で有利である。それ故、本発明は、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドをDNA鎖に導入することにより、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、求核剤によって脱離可能な部分を有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチド又はデオキシヌクレオシドを用いることにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。【００１５】
（1）  求核剤と、式I：
(A)n-B-C
［式中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合が、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断されて、前記Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドと、式II：
(A)n-B’
［式中、
A及びnは、式Iにおいて定義したのと同様の意味であり、
B’は、求核剤の攻撃によるEの脱離に伴って形成されるBの残基部分である］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを得る、5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程を含む、オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。【００１６】
（2）  式II：
(A)n-B’
［式中、
A及びB’は、前記（1）と同様の意味であり、
nは1である］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを反応させることによって、B’とAとの間のホスホジエステル結合が、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がB’から脱離することによって切断されて、式IIa：
A-PO3H2
で表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得る、3’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程をさらに含む、前記（1）の方法。【００１７】
（3）  前記非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが、以下：
【化１】
2013150902.tif 000003
【００１８】
［式中、
Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル又はカルボニルであり；
R’は、水素、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；
rは、0〜4の整数であり；
R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；
R’’’は、-COZ、-C≡C-Z又は-CNであり；
Zは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキルである］
で表されるデオキシヌクレオシドから選択される、前記（1）又は（2）の方法。【００１９】
（4）  前記5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程の前に、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB又はその誘導体と、天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシド又はその誘導体とを含む基質を用いて、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する、オリゴデオキシヌクレオチド合成工程をさらに含む、前記（1）〜（3）のいずれかの方法。【００２０】
（5）  式I：
(A)n-B-C
［式中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして用いて、直鎖状二本鎖DNA断片を増幅するDNA断片増幅工程；
求核剤と、増幅された直鎖状二本鎖DNA断片とを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合が、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断されて、直鎖状二本鎖DNA断片に含まれる前記Cの5’末端がリン酸化されており、且つ式Iで表されるプライマー部分の少なくとも一部と相補的な配列を含む3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片を形成させる、3’突出末端形成工程；並びに
前記3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片と、別の二本鎖DNA断片とを連結する連結工程；
を含む、二本鎖DNAの連結方法。【００２１】
（6）  前記（1）〜（4）のいずれかのオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法又は前記（5）の二本鎖DNAの連結方法に使用するためのキットであって、式I：
(A)n-B-C
［式中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチド、又は求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB若しくはその誘導体を少なくとも含む、前記キット。【００２２】
（7）  以下の式：
【化２】
2013150902.tif 000004
【００２３】
［式中、
Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル又はカルボニルであり；
R'は、メチルであり；
rは、0〜4の整数であり；
R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；
R’’’は、-COZ、-C≡C-Z又は-CNであり；
Zは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキルである］
で表される非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシド。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを提供することが可能となる。【００２５】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第2012-084249号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法の一実施形態を示す工程図である。
【図２】合成例1-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：合成したDNAオリゴマー；B：合成したDNAオリゴマーを酵素分解した分解物。
【図３】合成例1-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTTPTTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図４】合成例1-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTAPATTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図５】合成例1-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTCPCTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６】合成例1-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTGPGTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図７】合成例1-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-CGCAATPTAACGC-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図８】使用例1-3において、合成したDNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：メチルアミンによる反応後の反応混合物；C：生成物1を酵素分解した分解物；D：生成物2を酵素分解した分解物。
【図９】使用例1-4において、各反応混合物のHPLCクロマトグラムを示す図である。A：メチルアミンによる反応後の反応混合物；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物；C：2-アミノエタノールによる反応後の反応混合物。
【図１０】使用例1-5において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図１１】使用例1-5において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTTPTTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図１２】使用例1-5において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTAPATTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図１３】使用例1-5において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTCPCTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図１４】使用例1-5において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTGPGTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図１５】使用例1-5において、合成した各DNAオリゴマー（5’-CGCAATPTAACGC-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図１６】使用例1-6において、合成したDNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：2-アミノエタノールによる反応後の反応混合物；C：反応後の反応混合物のHPLCクロマトグラムの拡大図。
【図１７】使用例1-7において、切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図１８】使用例1-8において、切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図１９】使用例1-8において、エチレンジアミンによる反応後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２０】使用例1-9において、切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２１】使用例1-9において、100 mMリン酸バッファー中で120℃処理後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２２】使用例1-10において、切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２３】使用例1-10において、エチレンジアミンによる反応後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２４】使用例1-10において、100 mMリン酸バッファー中で120℃処理後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２５】使用例1-11において、切り出し及び脱保護後の5’-末端がDMTr保護されたDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２６】使用例1-11において、エチレンジアミンによる反応後の5’-末端がリン酸化されたDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図２７】使用例1-12において、切り出し及び脱保護後のTT1及びTT2の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：TT1の逆相HPLCクロマトグラム；B： TT2の逆相HPLCクロマトグラム。
【図２８】使用例1-12において、各DNAオリゴマーの塩基配列及びポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す図である。A：各DNAオリゴマーの塩基配列；B：ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果。
【図２９】合成例2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(Pr)TCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図３０】合成例2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(Pr)TTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図３１】使用例2-1において、合成した合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(Pr)TCCTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、3時間反応後の反応混合物；C：70℃、16時間反応後の反応混合物。
【図３２】使用例2-1において、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを示す図である。A：生成物1；B：保持時間9.9分の小さなピーク；C：保持時間10.2分のピーク。
【図３３】使用例2-1において、合成した合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(Pr)TTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、3時間反応後の反応混合物；C：70℃、16時間反応後の反応混合物。
【図３４】使用例2-1において、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを示す図である。A：生成物1；B：保持時間10.3分のピーク。
【図３５】合成例3において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(Pa)TCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図３６】合成例3において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図３７】使用例3-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(Pa)TCCTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、10分間反応後の反応混合物；C：70℃、30分間反応後の反応混合物。
【図３８】使用例3-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、10分間反応後の反応混合物；C：70℃、30分間反応後の反応混合物。
【図３９】使用例3-2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：メチルアミンによる反応後の反応混合物；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図４０】使用例3-3において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’）の切断反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：切断反応後の反応混合物。
【図４１】合成例4-3において、合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：5’-TTTTCTT(CvU)TCCTTTT-3’；B：5’-TTTTTT(CvU)TTTTTT-3’。
【図４２】使用例4-1において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(CvU)TCCTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、3時間反応後の反応混合物；C：70℃、8時間反応後の反応混合物。
【図４３】使用例4-1において、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを示す図である。A：生成物1；B：保持時間10.3分のピーク。
【図４４】使用例4-1において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTT(CvU)TTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、3時間反応後の反応混合物；C：70℃、8時間反応後の反応混合物。
【図４５】使用例4-1において、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを示す図である。A：生成物1；B：保持時間10.5分のピーク。
【図４６】合成例5-4において、合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：5’-TTTTCTT(PC)TCCTTTT-3’；B：5’-TTTTTT(PC)TTTTTT-3’。
【図４７】使用例5-1において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(PC)TCCTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、3時間反応後の反応混合物；C：70℃、16時間反応後の反応混合物。
【図４８】使用例5-1において、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを示す図である。A：生成物1；B：保持時間10.2分のピーク；C：保持時間10.6分のピーク。
【図４９】使用例5-1において、合成した各DNAオリゴマー（5’-TTTTTT(PC)TTTTTT-3’）の反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：反応前のDNAオリゴマー；B：70℃、3時間反応後の反応混合物；C：70℃、16時間反応後の反応混合物。
【図５０】使用例5-1において、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを示す図である。A：生成物1；B：保持時間10.4分のピーク；C：保持時間10.9分のピーク。
【図５１】使用例6-1において、非天然塩基を含むDNAオリゴマーをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって標的DNAを増幅し、増幅産物を10%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を示す図である。レーン1：100塩基対遺伝子マーカー；レーン2：遺伝子1の増幅産物（X = P）；レーン3：遺伝子2の増幅産物（X = Pa）；レーン4：遺伝子2の増幅産物（X = P）レーン5：遺伝子2の増幅産物（X = Pa）。
【図５２】使用例6-2において、非天然塩基を含むDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断して得られた5’末端リン酸化DNA断片の連結反応産物を10%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を示す図である。レーン1：100塩基対遺伝子マーカー；レーン2：遺伝子1（X = P）の増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた5’末端リン酸化DNA断片；レーン3：遺伝子2（X = P）の増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた5’末端リン酸化DNA断片；レーン4：遺伝子1及び2（X = P）のDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた遺伝子1及び2の5’末端リン酸化DNA断片をリガーゼと反応させた連結反応産物；レーン5：遺伝子1及び2（X = Pa）のDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた遺伝子1及び2の5’末端リン酸化DNA断片をリガーゼと反応させた連結反応産物；レーン6：遺伝子3（遺伝子1及び2が連結した連結反応産物と同一の塩基配列を有する遺伝子；299塩基対)の増幅産物。
【図５３】合成例7-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTTQTTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図５４】合成例7-4において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図５５】使用例7-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTTQTTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図５６】使用例7-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図５７】使用例7-2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTTQTTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：メチルアミンによる反応後の反応混合物；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図５８】使用例7-2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：メチルアミンによる反応後の反応混合物；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図５９】合成例8-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(HP)TTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６０】合成例8-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６１】使用例8-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(HP)TTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６２】使用例8-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６３】使用例8-2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(HP)TTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：メチルアミンによる反応後の反応混合物；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図６４】使用例8-2において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。A：メチルアミンによる反応後の反応混合物；B：エチレンジアミンによる反応後の反応混合物。
【図６５】合成例9-5において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(fPG)TTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６６】合成例9-5において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(fPG)TCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６７】使用例9-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(fPG)TTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６８】使用例9-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(fPG)TCCTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図６９】合成例10-5において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(fPA)TTTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図７０】合成例10-5において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(fPA)TCCTTTT-3’）の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図７１】使用例10-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTTT(fPA)TTTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図７２】使用例10-1において、合成したDNAオリゴマー（5’-TTTTCTT(fPA)TCCTTTT-3’）の反応後の逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図７３】使用例11-1において、5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって標的DNAを増幅し、増幅産物を1％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す図である。レーン1：DNAマーカー；レーン2：LL1及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物；レーン3：LL2及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物；レーン4：LL5及びLL8をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物；レーン5：LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物。
【図７４】使用例11-2において、5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断して得られた5’末端リン酸化DNA断片の連結反応産物を、1％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す図である。レーン1：DNAマーカー；レーン2及び3：10回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物；レーン4及び5：20回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物；レーン6及び7：30回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物。レーン2、4及び6：LL1及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物；レーン3、5及び7：LL2及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物。
【図７５】使用例11-2において、5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断して得られた5’末端リン酸化DNA断片の、連結反応前のDNAと連結反応後のDNAとを1％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す図である。レーン1：DNAマーカー；レーン2及び3：メチルアミン処理を9時間行ってDNAの切断反応を行った場合の切断反応産物；レーン4及び5：メチルアミン処理を24時間行ってDNAの切断反応を行った場合の切断反応産物；レーン6及び7：メチルアミン処理を48時間行ってDNAの切断反応を行った場合の切断反応産物；レーン8及び9：メチルアミン処理を48時間行ってDNAの切断反応を行った後、30回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物。レーン2、4、6及び8：LL1及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを切断反応させた場合の切断反応産物又は切断反応及び連結反応させた場合の連結反応産物；レーン3、5、7及び9：LL2及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを切断反応させた場合の切断反応産物又は切断反応及び連結反応させた場合の連結反応産物。
【図７６】使用例11-3において、5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断して得られた5’末端リン酸化DNA断片の連結反応産物を、1％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す図である。レーン1：DNAマーカー；レーン2、3、6及び7：LL1及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL5及びLL8をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物；レーン4、5、8及び9：LL2及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物。レーン2〜5：T4 DNAリガーゼを用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物；レーン6〜9：Taq DNAリガーゼを用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物。レーン2、4、6及び8：2μLの前記増幅産物のDNAの混合溶液を用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物；レーン3、5、7及び9：4μLの前記増幅産物のDNAの混合溶液を用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
＜1. 定義＞
本明細書において、「オリゴデオキシヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（DNA）、一本鎖若しくは二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド若しくはポリデオキシヌクレオチド、又はそれらの誘導体を意味する。オリゴデオキシヌクレオチド（DNAオリゴマー又はオリゴDNA）は、天然のものでも合成のものでもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物であってもよい。好適なオリゴデオキシヌクレオチド誘導体としては、限定するものではないが、例えば、オリゴデオキシヌクレオチド中のホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合、N3’-P5’ホスホロアミダイト結合又はペプチド結合に変換されたオリゴデオキシヌクレオチド誘導体、オリゴデオキシヌクレオチド中のデオキシリボースが、モルホリン、2’-O-プロピルリボース、2’-O-メチルリボース、2’-フルオロ-2’-デオキシリボース、トレオフラノース(TNA)又は2’位のOと4’位のCとをメチレンで架橋したリボース（ロックされた核酸（LNA）若しくは架橋された核酸（BNA））に変換されたオリゴデオキシヌクレオチド誘導体、並びにペプチド核酸（PNA）を挙げることができる。
【００２９】
オリゴデオキシヌクレオチドの5’末端及び／又は3’末端は、特に記載する場合を除き、リン酸化されていてもよく、リン酸化されていなくてもよい。或いは、DNA自動合成機を用いるDNAオリゴマー合成において、最後のデオキシヌクレオチドの5’位ヒドロキシル基の保護基を脱保護しない条件で合成を行う場合のように、5’位のヒドロキシル基が保護基で保護された形態であってもよい。いずれの場合も、オリゴデオキシヌクレオチドに包含されるものとする。
【００３０】
本明細書において、「保護基」は、末端ヒドロキシル基と結合して望ましくない副反応を実質的に抑制又は防止する基を意味し、限定するものではないが、例えば、トリチル基、モノ置換若しくはジ置換トリチル基、o-ニトロベンジル基及びレブリニル基を挙げることができる。ジメトキシトリチル（DMTr）であることが好ましい。上記の保護基は、所定の脱保護処理をすることによって除去される。保護基がトリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基の場合、脱保護処理を行うために用いる脱保護剤としては、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸のような酸を挙げることができる。保護基がレブリニル基の場合、脱保護処理を行うために用いる脱保護剤としては、ヒドラジンを挙げることができる。保護基がo-ニトロベンジル基の場合、脱保護処理としては、UV光照射処理を挙げることができる。
【００３１】
オリゴデオキシヌクレオチドは、5’末端及び／若しくは3’末端のヒドロキシル基、並びに／又は塩基がプローブ分子で標識された形態であってもよい。いずれの場合も、オリゴデオキシヌクレオチドに包含されるものとする。本明細書において、「プローブ（標識）分子」は、オリゴデオキシヌクレオチドの標識のために当該技術分野で慣用される分子を意味し、ビオチン、ポリエチレングリコール（PEG）、蛍光色素、ジコキシゲニン、タンパク質（例えば、細胞透過性ペプチド又は細胞内局在シグナルペプチドを含む）、及び標識分子を付与するためのリンカー分子を挙げることができる。フルオレセイン誘導体及びシアニン色素からなる群より選択される蛍光色素が好ましい。当該プローブ分子は、そのままの形態であってもよく、活性エステル（例えばスクシンイミジルエステル）、アジド基、アミノ基、チオ―ル基、マレインイミド基又はアルキニル基のような、他の官能基との間で共有結合を形成し得る基が導入された形態でもよい。いずれの形態も、プローブ分子に包含されるものとする。
【００３２】
本明細書において、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖の脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、「員数1〜20のアルキル」及び「C1〜C20アルキル」は、少なくとも１個且つ多くても20個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖の炭化水素鎖を意味する。好適なアルキルは、限定するものではないが、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル及びn-オクチル等を挙げることができる。
【００３３】
本明細書において、「アルケニル」は、前記アルキルの１個以上のC-C単結合が二重結合に置換された基を意味する。好適なアルケニルは、限定するものではないが、例えばビニル、1-プロペニル、アリル、1-メチルエテニル（イソプロペニル）、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、1-メチル-1-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、1-ペンテニル、1-ヘキセニル、n-ヘプテニル及び1-オクテニル等を挙げることができる。
【００３４】
本明細書において、「アルキニル」は、前記アルキルの１個以上のC-C単結合が三重結合に置換された基を意味する。好適なアルキニルは、限定するものではないが、例えばエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-メチル-2-プロピニル、1-ペンチニル、1-ヘキシニル、1-ヘプチニル及び1-オクチニル等を挙げることができる。
【００３５】
本明細書において、「シクロアルキル」は、特定の数の炭素原子を含む、脂環式アルキルを意味する。例えば、「（環の）員数3〜20のシクロアルキル」及び「C3〜C20シクロアルキル」は、少なくとも3個且つ多くても20個の炭素原子を含む、環式の炭化水素基を意味する。好適なシクロアルキルは、限定するものではないが、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル等を挙げることができる。
【００３６】
本明細書において、「シクロアルケニル」は、前記シクロアルキルの１個以上のC-C単結合が二重結合に置換された基を意味する。好適なシクロアルケニルは、限定するものではないが、例えばシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル及びシクロヘキセニル等を挙げることができる。
【００３７】
本明細書において、「シクロアルキニル」は、前記シクロアルキルの１個以上のC-C単結合が三重結合に置換された基を意味する。好適なシクロアルキニルは、限定するものではないが、例えばシクロブチニル、シクロペンチニル及びシクロヘキシニル等を挙げることができる。
【００３８】
本明細書において、「ヘテロシクリル」は、前記シクロアルキル、シクロアルケニル又はシクロアルキニルの1個以上の炭素原子が、それぞれ独立して窒素原子（N）、硫黄原子（S）及び酸素原子（O）から選択される複素原子に置換された基を意味する。例えば、「（環の）員数3〜20のヘテロシクリル」及び「C3〜C20ヘテロシクリル」は、少なくとも3個且つ多くても20個の炭素原子を含む環式の炭化水素基の1個以上の炭素原子が、それぞれ独立して上記の複素原子に置換された基を意味する。この場合において、N又はSによる置換は、それぞれN-オキシド又はSのオキシド若しくはジオキシドによる置換を包含する。好適なヘテロシクリルは、限定するものではないが、例えばピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル及びピペラジニル等を挙げることができる。
【００３９】
本明細書において、「アリール」は、5〜20の炭素原子数を有する芳香族基を意味する。例えば、「（環の）員数5〜20のアリール」及び「C5〜C20アリール」は、少なくとも5個且つ多くても20個の炭素原子を含む芳香族基を意味する。好適なアリールは、限定するものではないが、例えばフェニル、ナフチル及びアントリル（アントラセニル）等を挙げることができる。
【００４０】
本明細書において、「アリールアルキル」は、前記アルキルの水素原子の1個が前記アリールに置換された基を意味する。好適なアリールアルキルは、限定するものではないが、例えばベンジル、1-フェネチル及び2-フェネチル等を挙げることができる。
【００４１】
本明細書において、「アリールアルケニル」は、前記アルケニルの水素原子の1個が前記アリールに置換された基を意味する。好適なアリールアルケニルは、限定するものではないが、例えばスチリル等を挙げることができる。
【００４２】
本明細書において、「ヘテロアリール」は、前記アリールの1個以上の炭素原子が、それぞれ独立して窒素原子（N）、硫黄原子（S）及び酸素原子（O）から選択される複素原子に置換された基を意味する。例えば、「（環の）員数5〜20のヘテロアリール」及び「C5〜C20ヘテロアリール」は、少なくとも5個且つ多くても20個の炭素原子を含む芳香族基の1個以上の炭素原子が、それぞれ独立して上記の複素原子に置換された基を意味する。この場合において、N又はSによる置換は、それぞれN-オキシド又はSのオキシド若しくはジオキシドによる置換を包含する。好適なヘテロアリールは、限定するものではないが、例えばフラニル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル及びインドリル等を挙げることができる。
【００４３】
本明細書において、「ヘテロアリールアルキル」は、前記アルキルの水素原子の1個が前記ヘテロアリールに置換された基を意味する。
【００４４】
本明細書において、「カルボニル」は、カルボニル基を有する一価の基を意味する。好適なカルボニルは、限定するものではないが、例えばホルミル、アセチル、ベンゾイル、カルボキシ、メトキシカルボニル、ハロカルボニル及びカルバモイル（アミノカルボニル）等を挙げることができる。
【００４５】
上記で説明した基は、それぞれ独立して、酸素原子（O）、窒素原子（N）、硫黄原子（S）、ケイ素原子（Si）及びリン原子（P）からなる群より選択される1個以上の複素原子を含んでいてもよい。酸素原子、窒素原子又は硫黄原子であることが好ましい。この場合、上記の基を構成する1個以上の炭素原子が、それぞれ独立してこれらの複素原子に置換される。それ故、上記で説明した基は、それ自体の形態だけでなく、該基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられた形態も含むものとする。
【００４６】
上記で説明した基は、それぞれ独立して、非置換であるか、又は1個以上のハロゲン、ヒドロキシル基、置換若しくは非置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、カルボニル基、アミド基又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の一価の炭化水素基（例えば置換若しくは非置換のC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C20アルキニル、C1〜C20アルコキシル、C3〜C20シクロアルキル、C3〜C20シクロアルキルオキシ、C3〜C20シクロアルケニル、C3〜C20シクロアルケニルオキシ、C4〜C20シクロアルキニル、C4〜C20シクロアルキニルオキシ、C3〜C20ヘテロシクリル、C3〜C20ヘテロシクリルオキシ、C5〜C20アリール、C5〜C20アリールオキシ、C6〜C20アリールアルキル、C6〜C20アリールアルケニル、C5〜C20ヘテロアリール、C5〜C20ヘテロアリールオキシ又はC6〜C20ヘテロアリールアルキルであって、これらの基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられていてもよい）によって置換することもできる。この場合、上記の基は、それぞれ独立して、1個以上の上記の基で更に置換されていてもよい。
【００４７】
なお、本明細書において、「ハロゲン」又は「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【００４８】
＜2. オリゴデオキシヌクレオチド＞
［2-1. オリゴデオキシヌクレオチド］
本発明者らは、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断及び切断された末端のリン酸化を行う手段を検討したところ、以下において説明する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドを導入したDNAオリゴマーと一級アミンのような求核剤とを反応させると、DNAオリゴマーが非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドの部位で切断されて、5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドが形成されることを見出した。当該反応は、前記DNAオリゴマーを求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって進行するため、デプリネーション反応のような酸性条件下で進行するDNAの分解反応を実質的に抑制又は防止することが可能となる。また、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドは、DNA自動合成機によるDNA合成条件下で安定であるため、当該非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドをモノマーユニットとして、DNA自動合成機を用いてDNAを高収率で化学合成することが可能となる。加えて、当該非天然型塩基は、PCRのようなDNA複製条件下で天然型塩基と実質的に同一又は略同一の相補性を示すため、非天然型塩基を含むDNAは、in vivo及びin vitroにおける反応において、天然型塩基からなるDNAと実質的に同一又は略同一の鋳型としての機能を発揮することが可能となる。
【００４９】
本発明の方法において、式I：
(A)n-B-C
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを使用する。
【００５０】
ここで、式I中、
Aは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、
Bは、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであり、
Cはオリゴデオキシヌクレオチドであり、
nは0又は1であり、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される。
【００５１】
式Iにおいて、オリゴデオキシヌクレオチドA及びCは、上記で説明した特徴を有するオリゴデオキシヌクレオチドであることが好ましい。オリゴデオキシヌクレオチドA及びCの塩基数は特に限定されないが、オリゴデオキシヌクレオチドAの場合、通常、0〜100,000の範囲であり、0〜20,000の範囲であることが好ましく、0〜10,000の範囲であることがより好ましい。オリゴデオキシヌクレオチドCの場合、通常、1〜100,000の範囲であり、1〜20,000の範囲であることが好ましく、1〜10,000の範囲であることがより好ましい。
【００５２】
求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、以下で説明する特徴を有する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドであることが好ましい。
【００５３】
式Iにおいて、nが0の場合、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの5’末端のヒドロキシル基は、無保護の形態であってもよく、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基、好ましくはDMTr基のような上記で説明した保護基で保護された形態であってもよい。いずれの形態も式Iで表されるオリゴヌクレオチドに包含されるものとする。
【００５４】
上記の特徴を有する式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを用いることにより、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。
【００５５】
［2-2. 非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシド］
本発明の方法で使用される非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、求核剤によって脱離可能な部分を有する。具体的には、以下の特徴を有する。
【００５６】
（i）DNA合成条件下において安定に存在する。
【００５７】
（ii）in vivo及び／又はin vitroにおける反応（例えばPCR反応）のようなDNA複製条件下において安定に存在する。
【００５８】
（iii）  求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって脱離可能な部分Eを有する。
【００５９】
（iv）  in vivo及び／又はin vitroにおける反応（例えばPCR反応）のようなDNA複製条件下において、フィデリティが高く、天然型塩基と実質的に同一又は略同一の相補性を示す。
【００６０】
（v）  3’位のヒドロキシル基において、別のオリゴデオキシヌクレオチドCの5’末端のリン酸基とホスホジエステル結合を形成している場合、Bの3’位とCの5’末端との間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される。これにより、5’末端がリン酸化された別のオリゴヌクレオチドCが形成される。
【００６１】
本明細書において、「DNA合成条件」は、当該技術分野において通常使用されるDNA自動合成機によってDNA合成を行う際に適用される、ホスホロアミダイト法のような一般的な合成条件を意味する。前記DNA自動合成機としては、限定するものではないが、例えば、ABI 392 DNA/RNAシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）、及びNTS H-6 DNA/RNAシンセサイザー（日本テクノサービス社）を挙げることができる。DNA合成条件は、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する際の基質として使用される、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB及び天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシドの組み合わせに基づいて、例えばDNA自動合成機に添付される取扱説明書を参照することによって適宜設定することができる。
【００６２】
特徴（i）「DNA合成条件下において安定に存在する」とは、具体的には以下の特徴を満足することを意味する。
【００６３】
（i-1）カップリング反応生成物の亜リン酸エステル部分の酸化に用いられるヨウ素存在下において、ヨウ素と実質的に反応しないこと。
【００６４】
（i-2）DMTr基の脱保護に用いられるトリクロロ酢酸のような酸存在下（酸性条件下）において、酸と実質的に反応しないこと。
【００６５】
（i-3）合成されたDNAの切り出し及び脱保護に用いられるアンモニア水のようなアルカリ存在下（アルカリ性条件下）において、アルカリと実質的に反応しないこと。
【００６６】
また、本明細書において、「DNA複製条件」は、当該技術分野において通常使用されるPCR反応によってDNAを複製する際に適用される、一般的な反応条件を意味する。DNA複製条件は、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを複製する際の鋳型として使用される当該オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列に基づいて、例えばKramer M. F.及びCoen D. M., “Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.”, Curr Protoc Cytom. 2006 Aug;Appendix 3:Appendix 3Kを参照することによって適宜設定することができる。
【００６７】
特徴（ii）「in vivo及び／又はin vitroにおける反応（例えばPCR反応）のようなDNA複製条件下において安定に存在する」とは、具体的には以下の特徴を満足することを意味する。
【００６８】
（ii-1）PCRで通常使用される緩衝溶液（例えば塩化マグネシウム又は塩化カリウムのような塩を含む、常温でpH8付近のトリスバッファー（場合により界面活性剤又はBSAを含んでもよい））中、PCRサイクルにおいて95℃で加熱しても実質的に分解されない。
【００６９】
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、より具体的には、以下の特徴（vi）及び（vii）を有することが好ましい。
【００７０】
（vi）  非天然型塩基が、置換若しくは非置換のアルケニル又はアルキニルで置換されたプリン型若しくはピリミジン型塩基の構造を有する。
【００７１】
（vii）  求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって、デオキシリボースの1’位の炭素原子が求核剤の攻撃を受け、グリコシド結合が切断されるとともに、グリコシド結合を形成していた電子対の流れがアルケニル又はアルキニルの炭素原子をさらに攻撃することにより、非天然型塩基部分で分子内環化反応を生じながら非天然型塩基に由来する部分Eが脱離する。
【００７２】
或いは、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、以下の特徴（vi’）及び（vii’）を有することが好ましい。
【００７３】
（vi’）  非天然型塩基が、置換若しくは非置換のアルケニル又はアルキニルで置換されたプリン型若しくはピリミジン型塩基の水付加体若しくは求核剤付加体、又はそれらの互変異性体の構造を有する。
【００７４】
（vii’）  求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって、置換若しくは非置換のアルケニル又はアルキニルで置換されたプリン型若しくはピリミジン型塩基に水若しくは求核剤が付加して該デオキシヌクレオシドの水付加体若しくは求核剤付加体を形成するか、又はそれらの互変異性体を形成する。そして、前記デオキシヌクレオシドの水付加体若しくは求核剤付加体、又はそれらの互変異性体のデオキシリボースの1’位の炭素原子が求核剤の攻撃を受け、グリコシド結合が切断されるとともに、非天然型塩基に由来する部分Eが脱離する。
【００７５】
或いは、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、以下の特徴（vi’’）及び（vii’’）を有することが好ましい。
【００７６】
（vi’’）  非天然型塩基が、カルボニル、置換若しくは非置換のアルキニル若しくはシアノを有する置換若しくは非置換のアリールで置換されたプリン型塩基の構造を有する。
【００７７】
（vii’’）  求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって、デオキシリボースの1’位の炭素原子が求核剤の攻撃を受け、グリコシド結合が切断されるとともに、グリコシド結合を形成していた電子対の流れがカルボニル、置換若しくは非置換のアルキニル又はシアノの炭素原子をさらに攻撃することにより、非天然型塩基に由来する部分Eが脱離する。
【００７８】
本明細書において、「非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB」は、化合物B自体だけでなく、該化合物の水付加体若しくは求核剤付加体又はそれらの互変異性体も意味するものとする。
【００７９】
例えば、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが上記の特徴（vi）及び（vii）を有する下記の式：
【化３】
2013150902.tif 000005
【００８０】
［式中、R及びR’は、下記で定義するものと同様の基を意味する。］
で表される化合物である場合、Bを含むオリゴデオキシヌクレオチドを、求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることにより、以下の反応が進行すると考えられる。なお、本発明の作用効果は、下記の反応機構に限定されるものではない。
【化４】
2013150902.tif 000006
【００８１】
上記の反応式において、R及びR’は下記で定義するものと同様の基を意味し、DNAはオリゴデオキシヌクレオチドを、Nuは求核剤を意味する。
【００８２】
例えば、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが上記の特徴（vi’）及び（vii’）を有する下記の式：
【化５】
2013150902.tif 000007
【００８３】
［式中、Rは、下記で定義するものと同様の基を意味する。］
で表される化合物である場合、Bを含むオリゴデオキシヌクレオチドを、求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることにより、該化合物の互変異性化を伴う以下の反応が進行すると考えられる。なお、本発明の作用効果は、下記の反応機構に限定されるものではない。
【化６】
2013150902.tif 000008
【００８４】
上記の反応式において、Rは下記で定義するものと同様の基を意味し、DNAはオリゴデオキシヌクレオチドを、Nuは求核剤を意味する。
【００８５】
例えば、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが上記の特徴（vi’）及び（vii’）を有する下記の式：
【化７】
2013150902.tif 000009
【００８６】
［式中、Rは、下記で定義するものと同様の基を意味する。］
で表される化合物である場合、Bを含むオリゴデオキシヌクレオチドを、求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることにより、該化合物の水付加反応又は求核剤付加反応が進行する可能性がある。
【化８】
2013150902.tif 000010
【００８７】
前記反応によって生じたBの水付加体又は求核剤付加体を含むオリゴデオキシヌクレオチドを、求核剤存在下（塩基性条件下）でさらに反応させることにより、以下の反応が進行すると考えられる。なお、本発明の作用効果は、下記の反応機構に限定されるものではない。
【化９】
2013150902.tif 000011
【００８８】
上記の反応式において、Rは下記で定義するものと同様の基を意味し、DNAはオリゴデオキシヌクレオチドを、Nuは求核剤を、RNuは求核剤付加に伴って生じる基を意味する。
【００８９】
例えば、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが上記の特徴（vi’’）及び（vii’’）を有する下記の式：
【化１０】
2013150902.tif 000012
【００９０】
［式中、r、R’’、R’’’及びZは、下記で定義するものと同様の基を意味する。］
で表される化合物である場合、Bを含むオリゴデオキシヌクレオチドを、求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることにより、以下の反応が進行すると考えられる。以下の反応式では、R’’’がホルミル基（-COZ, Z=H）の場合を例示したが、R’’’が他の基の場合であっても同様の反応が進行すると考えられる。なお、本発明の作用効果は、下記の反応機構に限定されるものではない。
【化１１】
2013150902.tif 000013
【００９１】
上記の反応式において、r及びR’’は下記で定義するものと同様の基を意味し、DNAはオリゴデオキシヌクレオチドを、Nuは求核剤を意味する。
【００９２】
上記の特徴を有する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBを本発明の方法に用いることにより、求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。また、本発明の方法によるDNAの切断は、求核剤の攻撃によって誘発される、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドからのEの脱離に伴って生じることから、当該一塩基のデオキシヌクレオシドBの挿入又は置換によってDNA鎖の任意の位置に切断部位を導入することが可能となる。
【００９３】
DNA自動合成機を用いて式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを調製する場合、モノマーユニットとして準備される非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの5’末端のヒドロキシル基は、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基、好ましくはDMTr基のような上記で説明した保護基で保護された形態であることが好ましい。また、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、nが0である場合、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの5’末端のヒドロキシル基は、無保護、或いはトリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基、好ましくはDMTr基のような上記で説明した保護基で保護された形態であることが好ましい。
【００９４】
本明細書において、「非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドB」は、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの5’末端のヒドロキシル基がリン酸化された形態を意味する。
【００９５】
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、以下：
【化１２】
2013150902.tif 000014
【００９６】
で表されるデオキシヌクレオシドであることが好ましく、式B-1、B-2、B-3、B-5、B-6、B-7、B-21又はB-22で表されるデオキシヌクレオシドであることがより好ましい。前記の化合物のうち、式B-3、B-7、B-21及び22（式中、Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル又はカルボニルであり；R'は、メチルであり；rは、0〜4の整数であり；R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり；R’’’は、-COZ、-C≡C-Z又は-CNであり；Zは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキルである）で表される化合物は、本発明者らが見出した新規化合物である。
【００９７】
式B-1〜B-7、B-11〜B-14、B-21及びB-22において、Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル又はカルボニルである。具体的には、Rは、水素、置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル、置換若しくは非置換のC3〜C20シクロアルキル、置換若しくは非置換のC3〜C20ヘテロシクリル、置換若しくは非置換のC5〜C20アリール、置換若しくは非置換のC6〜C20アリールアルキル、置換若しくは非置換のC5〜C20ヘテロアリール、置換若しくは非置換のC5〜C20ヘテロアリールアルキル又はカルボニルであることが好ましい。特に好適なRは、水素、メチル、エチル、フェニル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、メルカプトメチル、ハロメチル、ホルミル、カルボキシル、カルバモイル及びアセチルを挙げることができる。水素、メチル、フェニル又はカルバモイルであることが特に好ましい。
【００９８】
式B-1〜B-7、B-11〜B-14、B-21及びB-22において、R’が存在する場合、R'は、水素、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルである。具体的には、R'は、水素原子、又は置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル若しくはC2〜C10アルキニルであることが好ましく、メチルであることが特に好ましい。
【００９９】
式B-21及びB-22において、rは、0〜4の整数であり、R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル若しくはアルキニルである。具体的には、rは、0〜4の整数であり、R’’は、ハロゲン、又は置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル若しくはC2〜C10アルキニルであることが好ましく、rは、0であることが特に好ましい。
【０１００】
式B-21及びB-22において、R’’’は、-COZ、-C≡C-Z又は-CNである。具体的には、R’’’は、-COZであることが好ましい。
【０１０１】
式B-21及びB-22において、Zは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクリル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキルである。具体的には、Zは、水素、置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル、置換若しくは非置換のC3〜C20シクロアルキル、置換若しくは非置換のC3〜C20ヘテロシクリル、置換若しくは非置換のC5〜C20アリール、置換若しくは非置換のC6〜C20アリールアルキル、置換若しくは非置換のC5〜C20ヘテロアリール、又は置換若しくは非置換のC5〜C20ヘテロアリールアルキルであることが好ましい。特に好適なRは、水素、メチル、エチル、フェニル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、メルカプトメチル又はハロメチルを挙げることができる。水素、メチル又はフェニルであることが好ましく、水素であることがより好ましい。
【０１０２】
上記の基は、一部の炭素原子が、1又は複数、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個の複素原子と置き換えられていてもよい。前記複素原子は、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ケイ素原子及びリン原子からなる群より選択される複素原子であることが好ましい。
【０１０３】
また、上記の基が置換されている場合、当該基は、1個以上のハロゲン、ヒドロキシル基、置換若しくは非置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、カルボニル基、アミド基又は複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の一価の炭化水素基（例えば置換若しくは非置換のC1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシル、C3〜C20シクロアルキル、C3〜C20シクロアルキルオキシ、C3〜C20ヘテロシクリル、C3〜C20ヘテロシクリルオキシ、C5〜C20アリール、C5〜C20アリールオキシ、C6〜C20アリールアルキル、C5〜C20ヘテロアリール、C5〜C20ヘテロアリールオキシ又はC6〜C20ヘテロアリールアルキルであって、これらの基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられていてもよい）によって置換されていることが好ましい。
【０１０４】
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、該化合物自体だけでなく、その塩も包含する。非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの塩の対イオンとしては、限定するものではないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン若しくはマグネシウムイオンのようなカチオン、又は塩化物イオン、臭化物イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、安息香酸イオン、アスコルビン酸イオン、パモ酸イオン、コハク酸イオン、ビスメチレンサリチル酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンジスルホン酸イオン、プロピオン酸イオン、酒石酸イオン、サリチル酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、アスパラギン酸イオン、ステアリン酸イオン、パルミチン酸イオン、イタコン酸イオン、グリコール酸イオン、p-アミノ安息香酸イオン、グルタミン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、シクロヘキシルスルファミン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、イセチオン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン又は過塩素酸イオンのようなアニオンが好ましい。
【０１０５】
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、該化合物自体だけでなく、その溶媒和物も包含する。非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBと溶媒和物を形成し得る溶媒としては、限定するものではないが、例えば、メタノール、エタノール、2-プロパノール（イソプロピルアルコール）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸、エタノールアミン若しくは酢酸エチルのような有機溶媒、又は水が好ましい。
【０１０６】
また、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、該化合物自体だけでなく、その保護形態も包含する。本明細書において、「保護形態」は、1個又は複数の官能基に保護基が導入された形態を意味する。
【０１０７】
上記の特徴を有する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBを本発明の方法に用いることにより、求核剤存在下（塩基性条件下）で反応させることによって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。
【０１０８】
＜3. オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法＞
図1は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法の一実施形態を示す工程図である。以下、図1に基づき、本発明の方法の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【０１０９】
［3-1. 5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド形成工程］
本発明の方法は、求核剤と、式I：
(A)n-B-C
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを接触させることによって、前記Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドと、式II：
(A)n-B’
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを得る、5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド形成工程を含む（工程S2）。本工程は、BとCとの間のホスホジエステル結合を、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をBの3’位から脱離させることによって切断して、前記Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることを目的とする。
【０１１０】
式I及びIIにおいて、A、B、C及びnは、上記で定義したのと同様の意味を表す。
【０１１１】
式IIにおいて、B’は、求核剤の攻撃によるEの脱離に伴って形成されるBの残基部分である。
【０１１２】
式IIにおいて、AとB’とは、ホスホジエステル結合で連結されている。より具体的には、B’は、Bの5’位に由来する位置において、Aの3’末端とホスホジエステル結合で連結されている。本明細書において、「B’の5’位」は、B’において、Bの5’位に由来する位置を意味する。
【０１１３】
式Iにおいて、nが0である場合、求核剤と、式I’：
B-C
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合を、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をBの3’位から脱離させることによって切断して、前記Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを生じる。また、式Iにおいて、nが1である場合、求核剤と式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合を、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をBの3’位から脱離させることによって切断して、前記Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドと、式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを生じる。それ故、DNA自動合成機を用いて式I’で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを合成した後、本工程を実施することにより、5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドCを製造することが可能となる。
【０１１４】
本工程は、酵素処理を必要とせず、化学反応（求核剤による求核反応）によって式I又は式I’で表されるオリゴデオキシヌクレオチドの切断と、5’末端のリン酸化が行われる。それ故、ポリヌクレオチドキナーゼのような酵素を用いる従来技術の方法と比較して、低コスト且つ簡単な実験操作で5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを製造することが可能となる。
【０１１５】
例えば、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが式B-1で表される化合物である場合、本工程における反応は以下のように進行すると考えられる。なお、本発明の作用効果は、以下の原理に限定されるものではない。
【化１３】
2013150902.tif 000015
【０１１６】
前記の反応式において、A、C及びEは、上記で定義された式Iと同様の意味であり、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤（Nu）が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものを意味する。
【０１１７】
本工程において、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB-1を含む式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを求核剤存在下で反応させることにより、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB-1から部分Eが脱離すると考えられる（特徴（iii））。より具体的には、デオキシリボースの1’位の炭素原子が求核剤Nuの攻撃を受け、グリコシド結合が切断されるとともに、グリコシド結合を形成していた電子対の流れがアルキニルの炭素原子をさらに攻撃することにより、非天然型塩基部分で分子内環化反応を生じながら非天然型塩基に由来する部分Eが脱離すると考えられる（特徴（vii））。上記式では、1’位の炭素原子が求核剤の攻撃を受けた場合の反応機構を示したが、4’位の炭素原子が求核剤の攻撃を受けた場合にも同様の反応が進行すると考えられる。なお、ここでは、特徴（vi）及び（vii）を有するチミンに対応する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB-1を例示して説明した。前記の反応機構は、チミン及びシトシンのようなピリミジン型塩基に対応する非天然型塩基だけでなく、アデニン及びグアニンのようなプリン型塩基に対応する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBについても適用される。また、前記の反応機構は、特徴（vi）及び（vii）を有する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBだけでなく、特徴（vi’）及び（vii’）又は特徴（vi’’）及び（vii’’）を有する非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBについても、これらの非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBに関する前記の説明を考慮することにより、同様に適用することができる。
【０１１８】
この反応過程は、以下に示すデプリネーション反応で生じるアベーシック部位の分解反応と類似していると考えられる（非特許文献13）。
【化１４】
2013150902.tif 000016
【０１１９】
デプリネーション反応は、DNAに含まれるプリン塩基であるアデニン及び／又はグアニンがヌクレオシドより脱離する反応である。ここで、アデニン及びグアニンは、プロトン化することによって脱離しやすくなるので、デプリネーション反応は塩基性条件下では起こりにくく酸性条件下で起こりやすい。また、ピリミジン塩基であるシトシン及びチミンは、プリン塩基よりも脱離しにくく、塩基性条件及び中性条件だけでなく、酸性条件でもDNAからのピリミジン塩基の脱離は起きにくい。
【０１２０】
また、以下に示すように、塩基部分の3位の水素が脱離する環化反応は公知である（非特許文献26〜29）。しかしながら、上記のようにデオキシヌクレオシドBに含まれる非天然型塩基が環化すると同時にヌクレオシドから脱離すると考えられるメカニズムによりDNAが切断される反応はこれまでに報告されておらず、本発明者らが見出した新規な反応である。
【化１５】
2013150902.tif 000017
【０１２１】
DNAポリメラーゼを用いるDNAの複製反応において、チミジンとして働くチミジン誘導体の非天然型塩基を含むDNAは公知である（特許文献4及び5並びに非特許文献30〜34）。しかしながら、本工程の如く、塩基性条件下（求核剤存在下）で反応させた場合、DNAに含まれる天然型塩基は損傷を受けず、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドの部位でのみ特異的にDNAが切断され、且つ切断で生じる5’末端がリン酸化される反応はこれまでに報告されておらず、本発明者らが見出した新規な反応である。
【０１２２】
本工程において使用される式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドは、予め合成されたものを購入等することによって準備してもよく、以下で説明するオリゴデオキシヌクレオチド合成工程を実施することによって準備してもよい。いずれの場合も、本工程の実施形態に包含されるものとする。
【０１２３】
本工程において使用される求核剤は、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの部位を攻撃して、Bから脱離可能な部分Eを脱離させ、且つEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をBの3’位から脱離させることによって切断することができる化合物である。求核剤は、限定するものではないが、例えば、一級アミンを挙げることができる。メチルアミン、エチレンジアミン、2-アミノエタノール、エチルアミン、プロピルアミン、2-アミノエタンチオール、1,3-ジアミノプロパン及びトリス（2-アミノエチル）アミンからなる群より選択される一級アミンであることが好ましい。上記の求核剤を用いることにより、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるBとCとの間のホスホジエステル結合を、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をBの3’位から脱離させることによって切断して、5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドCを得ることが可能となる。
【０１２４】
本工程は、通常、求核剤と式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを所定の反応条件下で接触させることにより実施される。前記反応条件は、本工程で使用される求核剤及び非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの組み合わせに基づき適宜設定すればよい。具体的には、反応温度は、0〜90℃の範囲の温度であることが好ましく、4〜70℃の範囲の温度であることがより好ましい。また、前記反応条件が加熱条件の場合、反応温度は、60〜90℃の範囲の温度であることが好ましく、70〜80℃の範囲の温度であることがより好ましい。反応温度が90℃以下、特に4〜70℃の範囲の場合、低温であればあるほど長鎖のオリゴヌクレオチドのアルカリ変性を抑制することができる。反応時間は、0.1〜168時間の範囲の時間であることが好ましく、0.1〜48時間の範囲の時間であることがより好ましく、0.1〜24時間の範囲の時間であることがさらに好ましく、0.1〜12時間の範囲の時間であることが特に好ましい。上記の反応条件で本工程を実施することにより、求核剤と式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとの反応を促進することが可能となる。
【０１２５】
本工程は、通常、求核剤と式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとを媒体中で接触させることにより実施される。媒体は、本工程で使用される求核剤及び非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの組み合わせに基づき適宜設定すればよい。具体的には、水であることが好ましい。上記の媒体中で本工程を実施することにより、望ましくない副反応を抑制し、且つ求核剤と式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドとの反応を促進することが可能となる。
【０１２６】
本工程は、脱保護された形態の式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを用いて実施してもよく、例えば5’末端がトリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基、好ましくはDMTr基のような上記で説明した保護基で保護された形態の式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを用いて実施してもよい。後者の場合、本工程で得られる式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドは、5’末端が保護された形態となる。この場合、所望により、以下で説明する3’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程において、上記で説明した脱保護処理を行うことによって脱保護すればよい。
【０１２７】
本工程において得られた5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドC、及び場合により式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドは、当該技術分野で通常使用される精製手段により、互いに並びに原料及び副生成物から分離されることによって、精製及び単離することができる。それ故、本工程は、精製単離工程をさらに含んでもよい。精製手段としては、限定するものではないが、例えば、中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、減圧濃縮（留去）、凍結乾燥、再結晶、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相若しくはイオン交換担体を充填した簡易カートリッジによる処理及びエタノール沈殿、並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。或いは、本工程では精製単離工程を実施せず、以下において説明する3’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程において、5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドC及び3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドの精製及び単離を一緒に実施してもよい。上記の精製単離工程を実施することにより、高純度の5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドCを製造することが可能となる。
【０１２８】
［3-2. 3’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程］
本発明の方法は、場合により式II：
(A)n-B’
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを反応させて、式IIa：
A-PO3H2
で表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得る、3’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程をさらに含んでもよい（工程S3）。本工程は、B’とAとの間のホスホジエステル結合を、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をBから脱離させることによって切断して、式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることを目的とする。
【０１２９】
式II及びIIaにおいて、A及びB’は、上記と同様の意味であり、
nは1である。
【０１３０】
本工程は、化学反応（脱離反応）によって式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるB’とAとの間のホスホジエステル結合を切断することにより、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを生じる。それ故、リン酸化アミダイトを用いる合成DNAの末端リン酸化法と比較して、低コスト且つ簡単な実験操作で3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを製造することが可能となる。
【０１３１】
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBが式B-1で表される化合物である場合、本工程における反応は以下のように進行すると考えられる。なお、本発明の作用効果は、以下の原理に限定されるものではない。
【化１６】
2013150902.tif 000018
【０１３２】
前記の反応式において、A、C及びEは、上記で定義された式Iと同様の意味であり、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤（Nu）が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものを意味する。
【０１３３】
前工程における求核剤の攻撃によるEの脱離に伴って形成された式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドA-(B-1’)は、本工程において加熱処理することにより、B-1’とAとの間のホスホジエステル結合が、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がB-1’から脱離することによって切断されて、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを生じる。
【０１３４】
本工程は、通常、式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを所定の反応条件下で反応させることにより実施される。前記反応条件は、使用される非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB及びBの切断により形成されたB’に基づき適宜設定すればよい。具体的には、反応温度は、0〜120℃の範囲の温度であることが好ましく、4〜70℃の範囲の温度であることがより好ましい。また、前記反応条件が加熱条件の場合、反応温度は、90〜120℃の範囲の温度であることが好ましく、110〜120℃の範囲の温度であることがより好ましい。反応時間は、0.1〜168時間の範囲の時間であることが好ましく、0.1〜48時間の範囲の時間であることがより好ましく、0.1〜24時間の範囲の時間であることがさらに好ましく、0.1〜1時間の範囲の時間であることが特に好ましい。また、反応系のpHは、通常は中性条件であり、具体的には、6〜8の範囲の値であることが好ましく、6.8〜7.2の範囲の値であることがより好ましい。上記の条件で本工程を実施することにより、Aの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をB’から脱離させて、B’とAとの間のホスホジエステル結合を切断することが可能となる。
【０１３５】
本工程は、通常、式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを媒体中で反応させることにより実施される。媒体は、本工程で使用される式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドに基づき適宜設定すればよい。具体的には、水であることが好ましい。また、媒体は、反応系のpHを上記で説明した好ましいpH範囲に保持するために、1以上の緩衝成分を含んでもよい。前記緩衝成分は、限定するものではないが、例えば、リン酸塩及びカコジル酸塩、並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。リン酸塩であることが好ましい。緩衝成分の濃度は、10〜1000 mMの範囲であることが好ましく、10〜100 mMの範囲であることがより好ましい。上記の媒体中で本工程を実施することにより、望ましくない副反応を抑制し、且つAの3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分をB’から脱離させて、B’とAとの間のホスホジエステル結合を切断することが可能となる。
【０１３６】
本工程において得られた式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドは、当該技術分野で通常使用される精製手段により、原料及び副生成物から分離されることによって、精製及び単離することができる。それ故、本工程は、精製単離工程をさらに含んでもよい。精製手段としては、限定するものではないが、例えば、中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、減圧濃縮（留去）、凍結乾燥及び再結晶、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相若しくはイオン交換担体を充填した簡易カートリッジによる処理及びエタノール沈殿、並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。上記の精製単離工程を実施することにより、高純度の式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを製造することが可能となる。
【０１３７】
本工程は、脱保護された形態の式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを用いて実施してもよく、例えば5’末端がトリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基、好ましくはDMTr基のような上記で説明した保護基で保護された形態の式IIで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを用いて実施してもよい。後者の場合、本工程で得られる式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドは、5’末端が保護された形態となる。この場合、所望により、上記で説明した脱保護処理を行うことによって脱保護することにより、脱保護された形態の式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。
【０１３８】
［3-3. オリゴデオキシヌクレオチド合成工程］
本発明の方法は、予め合成された式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを購入等することによって実施してもよい。しかしながら、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを合成した後に、その場で又は逐次的に5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程を実施してもよい。それ故、本発明の方法は、場合により前記5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程の前に、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB又はその誘導体と、天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシド又はその誘導体とを含む基質を用いて、式I：
(A)n-B-C
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを合成する、オリゴデオキシヌクレオチド合成工程をさらに含んでもよい（工程S1）。本工程は、前記5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程の原料となる、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを得ることを目的とする。
【０１３９】
式Iにおいて、A、B及びCは、上記と同様の意味であり、
nは0又は1である。
【０１４０】
本工程において、求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBは、上記で説明した非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBを使用することができる。また、天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシドは、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるデオキシヌクレオチドのうち、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドB以外の、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選択される天然型塩基を含むデオキシヌクレオチドに対応するものを意味し、当該技術分野で通常使用される純度の天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドを使用することができる。
【０１４１】
求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドBの誘導体、及び天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドの誘導体は、限定するものではないが、例えば、3’位にホスホロアミダイト基を有する当該デオキシヌクレオシドの誘導体を挙げることができる。上記の誘導体を用いることにより、当該技術分野において通常使用されるDNA自動合成機によって式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。
【０１４２】
本工程において使用される基質は、上記で説明した求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB又はその誘導体と、天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシド又はその誘導体とを含む。前記基質は、所望により、他の非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシド若しくはその誘導体、又は蛍光色素、ビオチン若しくはジコギシゲニンなどの標識分子のような他の成分を含んでもよい。
【０１４３】
本工程は、前記基質と、所望により、アセトニトリル又はN,N-ジメチルホルムアミドのような媒体と、テトラゾール、テトラゾール誘導体又は4,5-ジシアノイミダゾールのような活性化剤とを接触させることにより、実施することができる。この場合、本工程は、上記で説明したDNA合成条件下で実施すればよい。
【０１４４】
上記の条件で本工程を実施することにより、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドを高収率で得ることが可能となる。
【０１４５】
＜4. 二本鎖DNAの連結方法＞
本発明の方法により、低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、結果として生じた末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることができる。それ故、本発明はまた、式I：
(A)n-B-C
［式中、A、B、C及びnは、上記で定義したのと同様の意味を表し、
nが1のとき、Aの3’末端とBの5’位とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
Bの3’位とCの5’末端とは、ホスホジエステル結合で連結されており、
BとCとの間のホスホジエステル結合は、求核剤の攻撃によって誘発されるEの脱離に伴って、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断される］
で表されるオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして用いて、直鎖状二本鎖DNA断片を増幅するDNA断片増幅工程；
求核剤と、増幅された直鎖状二本鎖DNA断片とを接触させることによって、BとCとの間のホスホジエステル結合が、Cの5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド部分がBの3’位から脱離することによって切断されて、直鎖状二本鎖DNA断片に含まれる前記Cの5’末端がリン酸化されており、且つ式Iで表されるプライマー部分の少なくとも一部と相補的な配列を含む3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片を形成させる、3’突出末端形成工程；並びに
前記3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片と、別の二本鎖DNA断片とを連結する連結工程；
を含む、二本鎖DNAの連結方法に関する。
【０１４６】
DNA断片増幅工程において、直鎖状二本鎖DNA断片を増幅する手段としては、限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を挙げることができる。この場合、本工程は、上記で説明したDNA複製条件下で実施すればよい。また、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、オリゴデオキシヌクレオチドCは、ポリメラーゼ連鎖反応の標的となる鋳型DNAの少なくとも一部と相補的な塩基配列を有すればよい。
【０１４７】
3’突出末端形成工程において使用される求核剤、及び本工程の具体的な反応条件としては、5’末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド形成工程に関して上記で説明した条件を適用することが好ましい。
【０１４８】
本発明の方法は、タイプIIの制限酵素を用いる方法と比較して、切断するDNA断片中の制限酵素認識配列の有無を考慮せずにDNAを切断でき、且つ突出末端の突出部分の長さ及び配列を任意に設定できるという利点を有する。それ故、本発明の方法で製造された3’突出末端を有する直鎖状二本鎖DNA断片は、DNA連結酵素を用いる連結の際に、タイプIIの制限酵素を用いて製造されたDNA断片と比較して高い連結効率を発揮することが可能となる。
【０１４９】
＜5. オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法に使用するためのキット＞
本発明の方法により、5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドC及び／又は式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることができる。それ故、本発明はまた、上記で説明した本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法又は二本鎖DNAの連結方法に使用するためのキットに関する。
【０１５０】
前記キットは、式I：
(A)n-B-C
で表されるオリゴデオキシヌクレオチド、又は求核剤によって脱離可能な部分Eを有する、非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB若しくはその誘導体を少なくとも含む。
【０１５１】
式Iにおいて、A、B及びCは、上記と同様の意味であり、
nは0又は1である。
【０１５２】
また、前記キットは、式Iで表されるオリゴデオキシヌクレオチド又は非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドB若しくはその誘導体に加えて、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選択される天然型塩基を含む1個以上のデオキシヌクレオシド又はその誘導体、求核剤、媒体、触媒、DNA連結酵素（リガーゼ）及び使用説明書からなる群より選択される1個以上のさらなる要素を含んでもよい。ここで、前記求核剤、媒体、触媒及びDNA連結酵素は、上記で説明した本発明の方法に使用し得るものの中から適宜選択することができる。上記の要素を含むことにより、前記キットを用いて本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法を実施することが可能となる。
【０１５３】
本発明のキットは、必ずしも上記の要素が一体化された形態で提供される必要はなく、該要素が別々に包装された形態で提供されてもよい。いずれの形態も前記キットに包含されるものとする。
【０１５４】
上記の特徴を有するキットを用いることにより、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法を実施して、低コスト且つ簡単な実験操作で5’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドC及び／又は式IIaで表される3’末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。
【０１５５】
以上詳細に説明したように、本発明により、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、さらにポリヌクレオチドキナーゼのような酵素法又はリン酸化アミダイトを用いる合成DNAの末端リン酸化法と比較してより高収率で末端のリン酸化を行うことが可能となる。
【実施例】
【０１５６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【０１５７】
＜1. 有機合成及びDNA合成の試薬並びに機器＞
有機合成及び／又はDNA合成のための試薬は、Sigma-Aldrich、和光純薬、東京化成、ナカライテスク又はグレンリサーチより購入した。合成反応に用いた溶媒は無水のものを使用した。合成反応は窒素雰囲気下で行った。合成した化合物の精製で使用したシリカゲルはワコーゲルC-200（和光純薬）を使用した。DNAの精製にはギルソン社製のHPLCシステムを使用した。逆相カラムはケムコ社のケムコボンド5-ODS-H (10×150 mm)を使用した。NMRスペクトルは日本電子社製のJNM-ECS400を使用して測定した。1H-NMRのケミカルシフトは、DMSO-d6の残留プロトンのケミカルシフト（2.49 ppm）を基準としてppm単位で記載した。HRMSスペクトルは、ウォータース社製のSYNAPT G2 MSを使用して測定した。MALDI TOF-MSスペクトルは、島津製作所社製のAXIMA Assuranceを使用して測定した。【０１５８】
＜2. 合成例1：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［合成例1-1：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンの合成］
3.54 g(10.0 mmol)の5-ヨード-2’-デオキシウリジン(分子量354.10)と1.16 g(2.00 mmol)のPd(PPh3)4(分子量1155.56)と190 mg(1.00 mmol)のCuI(分子量190.45)とを撹拌子とともにナスフラスコに入れ、そこへ20 mLのDMFと2.78 mL(20.0 mmol)のEt3N(分子量101.19, 比重0.73 g/mL)と2.52 mL(23.0 mmol)のエチニルベンゼン(分子量102.13, 比重0.93 g/mL)とを加え、窒素雰囲気下、80℃で加熱しながら1時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的物質を精製した（展開溶媒は2〜10% MeOH/AcOEt）。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量のメタノールに溶かし、約200 mLの酢酸エチルを加え、減圧下で溶液を濃縮し、生じた白色沈殿をろ過、真空ポンプで乾燥することにより2.02 g(6.15 mmol, 収率61.5%)の目的物質(分子量328.32)を白色粉末として得た。【０１５９】
得られた物質の1H NMRスペクトルを測定したところ、非特許文献19（Cho, J. H.ら, Eur. J. Org. Chem. 2010年, p. 3678-3683）に記載の1H NMRスペクトルデータとほぼ一致した。【０１６０】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ11.67 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.47-7.38 (m, 5H), 6.12 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.15 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.26-4.24 (m, 1H), 3.81-3.79 (m, 1H), 3.64-3.58 (m, 2H), 2.18-2.14 (m, 2H).
［合成例1-2：5-フェニルエチニル-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジンの合成］
656 mg(2.00 mmol)の5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン(分子量328.32)と813 mg(4.00 mmol)のDMTrCl(分子量338.83)とをナスフラスコに入れ、そこへ10 mLのピリジンを加え、室温で1時間撹拌した。約2 mLのメタノールを加え、反応を停止させ、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムで目的物質を精製した（展開溶媒は2〜5% MeOH, 2% Et3N/CH2Cl2）。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、真空ポンプで乾燥した。少量の塩化メチレンに溶かし、約400 mLのヘキサンを加え、生じた白色沈殿をろ過、真空ポンプで乾燥することにより1.20 g（1.64 mmol, 収率82.0%）の目的物質(分子量731.88(トリエチルアミン一分子を含む))を白色粉末として得た。【０１６１】
得られた物質の1H NMRスペクトルを測定したところ、一分子のトリエチルアミンが残った点を除いて、非特許文献24（Rospigliosi, A.ら, Langmuir 2007年, 23, 15, p. 8264-8271）に記載の1H NMRスペクトルデータとほぼ一致した。【０１６２】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ11.75 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.41-7.39 (m, 2H), 7.33-7.26 (m, 9H), 7.16-7.10 (m, 3H), 6.84-6.80 (m, 4H), 6.14 (t, J= 6.9 Hz, 1H), 5.40 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.34-4.28 (m, 1H), 3.98-3.95 (m, 1H), 3.644 (s, 3H), 3.640 (s, 3H), 3.24-3.14 (m, 2H), 3.04-3.03 (m, 6H), 2.32-2.21 (m, 2H), 1.19 (t, J = 7.3 Hz, 9H).
［合成例1-3：5-フェニルエチニル-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-N,N-ジイソプロピル(シアノエチル)ホスホロアミダイトの合成］
366 mg(0.500 mmol)の5-フェニルエチニル-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン(分子量731.88(トリエチルアミン一分子を含む))をナスフラスコに入れ、5 mLのCH3CNと261μL(1.50 mmol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(分子量129.25, 比重0.742 g/mL)を加え、撹拌し、さらに223μL(1.00 mmol)の2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロアミダイト(分子量236.68, 比重1.061 g/mL)を加え、室温で30分間撹拌した。25 mLのAcOEtと25 mLの飽和食塩水とを加え、分液し、有機層をさらに2回飽和食塩水で洗った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、フィルターでろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去した。アセトニトリルで3回共沸した後、10 mLのアセトニトリルを加えた。溶液を0.45μmのフィルターに通し、少量のモレキュラーシーブを加えた。DNA自動合成機に取り付けてDNA合成に使用した。【０１６３】
［合成例1-4：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの合成］
チミジン誘導体のカップリング時間を30分に伸ばした以外は通常のDNA自動合成機のDNA合成のプロトコールで、1μmolスケールでホスホロアミダイト法により合成した（Synthetic strategies and parameters involved in the synthesis of oligodeoxyribonucleotides according to the phosphoramidite method. Beaucage, S. L.及びCaruthers, M. H. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry UNIT 3.3）。担体からの切り出しは28%アンモニア水で行った。脱保護はDNAオリゴマーを切り出した後、室温で16時間静置することにより行った。脱保護後、アンモニアを遠心濃縮装置により減圧留去し、DNAを含む溶液を0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCにより10分付近の保持時間に溶出されたメインピークを精製し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒とを留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。合成したDNAオリゴマーは、約500μLの蒸留水を加えて水溶液とした。【０１６４】
以下において、5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン：
【化１７】
2013150902.tif 000019
【０１６５】
を「P」で示す。【０１６６】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図2〜7に示す。【０１６７】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０１６８】
5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’について10.9分（配列番号1）
5’-TTTTTTPTTTTTT-3’について11.0分（配列番号2）
5’-TTTTTAPATTTTT-3’について10.9分（配列番号3）
5’-TTTTTCPCTTTTT-3’について10.8分（配列番号4）
5’-TTTTTGPGTTTTT-3’について10.6分（配列番号5）
5’-CGCAATPTAACGC-3’について10.0分（配列番号6）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０１６９】
5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’について分子式C154H195N33O100P14、[M-H]-の計算値 4541.0、実測値 4541.9（配列番号1）
5’-TTTTTTPTTTTTT-3’ について分子式C137H172N26O89P12、[M-H]-の計算値 3977.6、実測値 3978.0（配列番号2）
5’-TTTTTAPATTTTT-3’ について分子式C137H170N32O85P12、[M-H]-の計算値 3995.7、実測値 3996.3（配列番号3）
5’-TTTTTCPCTTTTT-3’ について分子式C135H170N28O87P12、[M-H]-の計算値 3947.6、実測値 3948.4（配列番号4）
5’-TTTTTGPGTTTTT-3’ について分子式C137H170N32O87P12、[M-H]-の計算値 4027.7、実測値 4028.2（配列番号5）
5’-CGCAATPTAACGC-3’ について分子式C133H162N48O75P12、[M-H]-の計算値 4003.7、実測値 4004.7（配列番号6）
＜3. 使用例1: 5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例1-1：DNAオリゴマーの濃度決定］
DNAの濃度決定は、5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’について、DNAの水溶液10μLを10μLの酵素分解溶液（子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ (100 U/mL)とP1ヌクレアーゼ (100 U/mL)とを含む水溶液）と混合して、室温で12時間放置してデオキシヌクレオシドに分解したものを、逆相HPLC(3-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)により定量することによって行った。この結果より、5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’の260 nmのモル吸光定数は119,000と計算された。この値は、5’-TTTTCTTTTCCTTTT-3’の260 nmにおけるモル吸光定数の計算値である119,400と非常に近い値であったので（Predicting ultraviolet spectrum of single and double stranded deoxyribonucleic acids. Tataurov, A. V., You, Y.及びOwczarzy, R. Biophys. Chem. 2008, 133, 66-70）、Pを一つ含むDNAオリゴマーの260 nmにおけるモル吸光係数は、PをTに置換して計算したDNAのモル吸光係数に近い値であることが示唆された。よって、本実施例では、DNAオリゴマーを希釈して260 nmの吸光度を測定し、PをTに置換して計算した260 nmにおけるモル吸光係数を用いて（Predicting ultraviolet spectrum of single and double stranded deoxyribonucleic acids. Tataurov, A. V., You, Y.及びOwczarzy, R. Biophys. Chem. 2008, 133, 66-70）、元のDNAオリゴマーの濃度を決定した。【０１７０】
PをTに置換した場合の260 nmにおける各DNAオリゴマーのモル吸光定数εは以下の通りである。【０１７１】
5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’についてε= 119,400
5’-TTTTTTPTTTTTT-3’についてε= 105,900
5’-TTTTTAPATTTTT-3’についてε= 117,700
5’-TTTTTCPCTTTTT-3’についてε= 104,100
5’-TTTTTGPGTTTTT-3’についてε= 111,000
5’-CGCAATPTAACGC-3’についてε= 122,700
［使用例1-2：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応］
一般的な方法では、DNA水溶液に等体積の一級アミンを加え、密閉状態で70℃に加熱すると、DNAオリゴマーは切断される。ここで、使用される一級アミンが異なると、切断反応の速度及び切断で生じる一方のDNA断片が異なる。切断で生じる2つのDNA断片のうち、3’-末端を新たに生じるDNA断片には使用されるアミンが付加するので、使用される一級アミンにより生成するDNA断片は異なる。このDNA断片がさらに分解されて3’-リン酸末端になる場合があるが、その場合、使用される一級アミンに依らず、同一のDNA断片が生じる。切断で生じる2つのDNA断片のうち、5’-リン酸末端を新たに生じるDNA断片については、原料DNAオリゴマーが同じ場合、使用される一級アミンに依らず同じDNA断片が生じる。具体的な一級アミンの反応については以下に示した。【０１７２】
［使用例1-3：メチルアミンによる5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応及び生成物の同定］
スクリューチューブに30μLの5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLのメチルアミン（40% 水溶液）とを加え、水浴中で70℃、12時間加熱した。反応後は、メチルアミンを遠心濃縮装置で減圧留去し、逆相HPLCにより分析して生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。さらに生成物の一部について、酵素分解して得られたデオキシヌクレオシドの比を求めた。pTCCTTTTに関しては、アルカリホスファターゼ処理した生成物の逆相HPLCにおける保持時間が、別途合成したTCCTTTTと一致し、MALDI TOF-MS測定による分子量も一致することを確認した。DNAオリゴマーの脱塩が不十分でギ酸アンモニウムがDNAオリゴマーに含まれている場合は、生成物2の一部がさらに分解して3’-リン酸末端となる場合がある。【０１７３】
合成したDNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図8に示す。【０１７４】
生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するP由来の部分を意味する。【０１７５】
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.4
生成物2：TTTTCTTpRNu  分子式C75H103N16O51P7 FW 2261.5 [M-H]- 2260.5 実測値 2262.2
DNAオリゴマーを分解して生じるデオキシヌクレオシドの比は以下の通りである。【０１７６】
生成物1：dC:dT = 2:5
生成物2：dC:dT = 1:6
メチルアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、左側の生成物が生成物2に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。
【化１８】
2013150902.tif 000020
【０１７７】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０１７８】
［使用例1-4：メチルアミン、エチレンジアミン又は2-アミノエタノールによる5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応速度の比較］
スクリューチューブに30μLの5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLの一級アミン（メチルアミン、エチレンジアミン又は2-アミノエタノール）を加え、水浴中で70℃、1時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。各反応混合物のHPLCクロマトグラムを図9に示す。【０１７９】
5’-TCCTTTT-3’の260 nmにおけるモル吸光係数ε=55,500、5’-TTTTCTTTTCCTTTT-3’の260 nmにおけるモル吸光係数ε=119,400を利用して、HPLCクロマトグラム上のピーク面積に基づき定量したところ、メチルアミンを用いて得られた反応混合物における原料消失は24%、エチレンジアミンを用いて得られた反応混合物における原料消失は76%、そして2-アミノエタノールを用いて得られた反応混合物における原料消失は31%と計算された。この結果より、メチルアミン、エチレンジアミン又は2-アミノエタノールの一級アミンを用いるDNAオリゴマーの切断反応において、最も反応速度の速いものはエチレンジアミンを用いる切断反応であることが示唆された。【０１８０】
［使用例1-5：エチレンジアミンによる5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むさまざまな配列を有するDNAオリゴマーの切断反応及び生成物の同定］
スクリューチューブに30μLのDNAオリゴマー水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLのエチレンジアミン（無水）とを加え、水浴中で70℃、3時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。【０１８１】
合成した各DNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図10〜15に示す。【０１８２】
各DNAオリゴマーにおける生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するP由来の部分を意味する。【０１８３】
5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.4
生成物2：TTTTCTTpRNu  分子式C76H106N17O51P7 FW 2290.6 [M-H]- 2289.5 実測値 2290.4
5’-TTTTTTPTTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1842.3
生成物2：TTTTTTpRNu  分子式C67H94N14O45P6 FW 2001.4 [M-H]- 2000.4 実測値 2000.3
5’-TTTTTAPATTTTT-3’について
生成物1：pATTTTT  分子式C60H79N15O41P6 FW 1852.2 [M-H]- 1851.2 実測値 1851.0
生成物2：TTTTTApRNu  分子式C67H93N17O43P6 FW 2010.4 [M-H]- 2009.4 実測値 2009.2
5’-TTTTTCPCTTTTT-3’について
生成物1：pCTTTTT  分子式C59H79N13O42P6 FW 1828.2 [M-H]- 1827.2 実測値 1826.9
生成物2：TTTTTCpRNu  分子式C66H93N15O44P6 FW 1986.4 [M-H]- 1985.4 実測値 1985.5
5’-TTTTTGPGTTTTT-3’について
生成物1：pGTTTTT  分子式C60H79N15O42P6 FW 1868.2 [M-H]- 1867.2 実測値 1867.2
生成物2：TTTTTGpRNu  分子式C67H93N17O44P6 FW 2026.4 [M-H]- 2025.4 実測値 2025.2
5’-CGCAATPTAACGC-3’について
生成物1：pTAACGC  分子式C58H75N23O36P6 FW 1856.2 [M-H]- 1855.2 実測値 1855.2
生成物2：CGCAATpRNu  分子式C65H89N25O38P6 FW 2014.4 [M-H]- 2013.4 実測値 2013.2
エチレンジアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、左側の生成物が生成物2に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。
【化１９】
2013150902.tif 000021
【０１８４】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０１８５】
［使用例1-6：2-アミノエタノールによる5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応及び生成物の同定］
スクリューチューブに30μLの5’-TTTTCTTPTCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLの2-アミノエタノール（無水）とを加え、水浴中で70℃、12時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。【０１８６】
合成したDNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図16に示す。【０１８７】
生成物1、2及び3のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するP由来の部分を意味する。【０１８８】
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.2
生成物2：TTTTCTTp  分子式C69H92N15O49P7 FW2132.4 [M-H]- 2131.3 実測値 2131.1
生成物3：TTTTCTTpRNu  分子式C76H105N16O52P7 FW 2291.5 [M-H]- 2290.5 実測値 2290.5
2-アミノエタノールによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。2-アミノエタノールの場合、反応混合物にギ酸アンモニウムが含まれていなくても、切断で生じる5'-末端側の生成物の一部がさらに分解して、3’-リン酸末端を形成する。下記反応式において、左側の生成物が生成物3に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。生成物2は、生成物3から糖由来の残基部分が脱離して3’-リン酸末端を形成した化合物に対応する。
【化２０】
2013150902.tif 000022
【０１８９】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０１９０】
［使用例1-7：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを用いる5’-リン酸化（1）］
DNAオリゴマーの脱保護とチミジン誘導体の位置でのDNA切断反応とを同時に行った。【０１９１】
DNA自動合成機を用いて、5’-PTTATTGTT-3’の配列を有するDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。担体からの切り出しを28%アンモニア水と40%メチルアミン水溶液との1:1混合溶液で行った。切り出したDNAオリゴマー溶液をスクリューチューブに入れ、水浴中で70℃、16時間加熱することによって脱保護を行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニア及びメチルアミンを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。MALDI TOF-MS測定により、得られたDNAオリゴマーは5’-末端がリン酸化された5’-TTATTGTT-3’の分子量と一致することを確認した。得られたDNAオリゴマーの水溶液10μLを、10μLのアルカリホスファターゼ（子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ (100 U/mL)）と混合し、40℃で2時間加熱することにより、末端リン酸部分を除去した。生成物と5’-TTATTGTT-3’とを混合して逆相HPLCで分析したところ、両化合物は同一の保持時間を示すことが確認された。また、この生成物は、5’-TTATTGTT-3’と同一の分子量であることをMALDI TOF-MSによって確認した。【０１９２】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図17に示す。【０１９３】
メインピーク：5’-pTTATTGTT-3’  分子式C80H104N22O54P8 FW 2485.6 [M-H]- 2484.6 実測値 2484.7
反応スキームを下記に示す。
【化２１】
2013150902.tif 000023
【０１９４】
［使用例1-8：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを用いる5’-リン酸化（2）］
DNAオリゴマーの切り出し及び脱保護とチミジン誘導体の位置でのDNA切断反応とを別々に行った。【０１９５】
DNA自動合成機を用いて、5’-PTTATTGTT-3’の配列を有するDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。担体からの切り出しを28%アンモニア水で行い、脱保護は室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニアを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られた凍結乾燥物に30μLの蒸留水及び30μLのエチレンジアミンを加え、水浴中で70℃、3時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和した後、上記使用例1-7と同様の方法によりDNAオリゴマーを精製した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MSにより同定した。得られたDNAオリゴマーの水溶液10μLを、10μLのアルカリホスファターゼ（子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ (100 U/mL)）と混合し、40℃で2時間加熱することにより、末端リン酸部分を除去した。生成物と5’-TTATTGTT-3’とを混合して逆相HPLCで分析したところ、両化合物は同一の保持時間を示すことが確認された。また、この生成物は、5’-TTATTGTT-3’と同一の分子量であることをMALDI TOF-MSによって確認した。【０１９６】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図18に、エチレンジアミンによる反応後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図19に、それぞれ示す。【０１９７】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-PTTATTGTT-3’  分子式C97H118N24O58P8 FW 2795.9 [M-H]- 2794.9 実測値 2795.1
エチレンジアミンによる反応後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-PTTATTGTT-3’  分子式C97H118N24O58P8 FW 2795.9 [M-H]- 2794.9 実測値 2795.1
反応スキームを下記に示す。
【化２２】
2013150902.tif 000024
【０１９８】
［使用例1-9：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを用いる3’-リン酸化（1）］
DNAオリゴマーの脱保護とチミジン誘導体の位置でのDNA切断反応とを同時に行った。【０１９９】
DNA自動合成機を用いて、5’-TTATTGTTPT-3’の配列を有するDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。担体からの切り出しを28%アンモニア水と40%メチルアミン水溶液との1:1混合溶液で行った。切り出したDNAオリゴマー溶液をスクリューチューブに入れ、水浴中で70℃、16時間加熱することによって脱保護を行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニア及びメチルアミンを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCにより保持時間10分付近のピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。分取HPLCクロマトグラム上において、メインピークに近い小さなピークは、メインピークの生成物から糖に由来する部分が脱離して3’-リン酸末端になったものであった。得られたDNAオリゴマーに100 mMリン酸バッファー500μL（pH 7）を加え、スクリューチューブに移し、120℃に設定した乾燥器中で一時間静置した。逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。分取HPLCクロマトグラム上において、メインピークより少し後に溶出されたピークは、3’-末端のリン酸が脱離したものであった。MALDI TOF-MS測定により、得られたDNAオリゴマーは3’-末端がリン酸化された5’-TTATTGTT-3’の分子量と一致することを確認した。得られたDNAオリゴマーの水溶液10μLを、10μLのアルカリホスファターゼ（子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ (100 U/mL)）と混合し、40℃で2時間加熱することにより、末端リン酸部分を除去した。生成物と5’-TTATTGTT-3’とを混合して逆相HPLCで分析したところ、両化合物は同一の保持時間を示すことが確認された。また、この生成物は、5’-TTATTGTT-3’と同一の分子量であることをMALDI TOF-MSによって確認した。【０２００】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図20に、100 mMリン酸バッファー中で120℃処理後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図21に、それぞれ示す。【０２０１】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-TTATTGTTpRNu-3’  分子式C86H115N23O56P8 FW 2614.7 [M-H]- 2613.7 実測値 2613.4
リン酸バッファー中で120℃処理後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-TTATTGTTp-3’  分子式C80H104N22O54P8 FW 2485.6 [M-H]- 2484.6 実測値 2484.6
反応スキームを下記に示す。
【化２３】
2013150902.tif 000025
【０２０２】
生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２０３】
［使用例1-10：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを用いる3’-リン酸化（2）］
DNAオリゴマーの切り出し及び脱保護とチミジン誘導体の位置でのDNA切断反応とを別々に行った。【０２０４】
DNA自動合成機を用いて、5’-TTATTGTTPT-3’の配列を有するDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。担体からの切り出しを28 %アンモニア水で行い、脱保護は室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニアを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られた凍結乾燥物に30μLの蒸留水及び30μLのエチレンジアミンを加え、水浴中で70℃、3時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和した後、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCにより保持時間10分付近のピークを精製し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られた凍結乾燥物に500μLの100 mMリン酸バッファー（pH 7）を加えた後、スクリューチューブに移し、120℃に設定した乾燥器中で一時間静置した。逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MSにより同定した。得られたDNAオリゴマーの水溶液10μLを、10μLのアルカリホスファターゼ（子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ (100 U/mL)）と混合し、40℃で2時間加熱することにより、末端リン酸部分を除去した。生成物と5’-TTATTGTT-3’とを混合して逆相HPLCで分析したところ、両化合物は同一の保持時間を示すことが確認された。また、この生成物は、5’-TTATTGTT-3’と同一の分子量であることをMALDI TOF-MSによって確認した。【０２０５】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図22に、エチレンジアミンによる反応後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図23に、100 mMリン酸バッファー中で120℃処理後のDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図24に、それぞれ示す。【０２０６】
切り出し及び脱保護後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-TTATTGTTPT-3’  分子式C107H131N26O65P9 FW 3100.1 [M-H]- 3099.1 実測値 3099.4
エチレンジアミンによる反応後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-TTATTGTTpRNu-3’  分子式C87H118N24O56P8 FW 2643.8 [M-H]- 2642.8 実測値 2642.9
リン酸バッファー中で120℃処理後のDNAオリゴマー
メインピーク：5’-TTATTGTTp-3’  分子式C80H104N22O54P8 FW 2485.6 [M-H]- 2484.6 実測値 2484.7
反応スキームを下記に示す。
【化２４】
2013150902.tif 000026
【０２０７】
生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２０８】
［使用例1-11：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを用いるDMTr ON合成］
DNA自動合成機を用いるDNAオリゴマー合成において、最後のデオキシヌクレオシドの5’-末端のDMTr基を脱保護しない条件（以下「DMTr ON」とも記載する）で合成を行った。【０２０９】
DNA自動合成機を用いて、5’-PTTATTGTT-3’の配列を有するDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。但し、最後のデオキシヌクレオシドの5’-末端のDMTr基は脱保護せず、「DMTr ON」の条件で合成を行った。担体からの切り出しを28%アンモニア水で行い、脱保護は室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニアを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られた凍結乾燥物に100μLの蒸留水及び100μLのエチレンジアミンを加え、水浴中で70℃、8時間加熱した。反応混合物を水で1 mLに希釈し、酢酸で中和した後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られたDNAオリゴマーは、5’-末端がリン酸化された5’-TTATTGTT-3’と同一の分子量であることをMALDI TOF-MSによって確認した。【０２１０】
切り出し及び脱保護後の5’-末端がDMTr保護されたDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図25に、エチレンジアミンによる反応後の5’-末端がリン酸化されたDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図26に、それぞれ示す。【０２１１】
切り出し及び脱保護後の5’-末端がDMTr保護されたDNAオリゴマー
メインピーク：5’-DMTr-PTTATTGTT-3’  分子式C118H137N24O60P8 FW 3099.3 [M-H]- 3098.3 実測値 3097.7
エチレンジアミンによる反応後の5’-末端がリン酸化されたDNAオリゴマー
メインピーク：5’-pTTATTGTT-3’  分子式C80H104N22O54P8 FW 2485.6 [M-H]- 2484.6 実測値 2484.6
反応スキームを下記に示す。
【化２５】
2013150902.tif 000027
【０２１２】
［使用例1-12：5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーより調製された5’末端がリン酸化されたDNAオリゴマーと別のDNAオリゴマーとの連結反応］
DNA自動合成機を用いて、下記の配列を有するDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。但し、TS3は、最後のデオキシヌクレオシドの5’末端のDMTr基は脱保護せず、「DMTr ON」の条件で合成を行った。5’末端及び3’末端のFAM修飾には、それぞれグレンリサーチ社の5’-フルオレセインホスホロアミダイト (カタログ番号10-5901)及び3’-(6-FAM)-CPG (カタログ番号20-2961)を使用した。TF3の5'末端へのアミノ基の導入は、非特許文献35に記載の方法に従って行った。【０２１３】
TS1：5’-FAM-ATAGTGAGTCGTATTAGGCCCGATCCAGGCCATCGCGCATGCTCAG-3’（配列番号7）
TS3：5’-ATAGTGAGTCGTATTAGGCCCGATCCAGGCCATCGCGCATGCTCAG-3’（配列番号8）
TF3：5’-NH2-TTAACTGAGCATGCGCGATGGCCTG-3’（配列番号9）
TT1：5’-pGATCGGGCCTAATACGACTCACTAT-FAM-3’（配列番号10）
TT2：5’-pATCGGGCCTAATACGACTCACTAT-FAM-3’（配列番号11）
5’末端がリン酸化されたDNAオリゴマーであるTT1及びTT2は、以下の方法で調製した。5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを用いて、5’-PGATCGGGCCTAATACGACTCACTAT-FAM-3’（配列番号12）及び5’-PATCGGGCCTAATACGACTCACTAT-FAM-3’（配列番号13）の配列を有するDNAオリゴマーを上記使用例1-7と同じ方法で合成した。担体からの切り出しを28%アンモニア水と40%メチルアミン水溶液との1:1混合溶液で行った。切り出したDNAオリゴマー溶液をスクリューチューブに入れ、水浴中で70℃、16時間加熱することによって脱保護を行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニア及びメチルアミンを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。MALDI TOF-MS測定により、得られたDNAオリゴマーは5’末端がリン酸化されたDNAオリゴマーであるTT1及びTT2の分子量とそれぞれ一致することを確認した。【０２１４】
切り出し及び脱保護後のTT1及びTT2の逆相HPLCクロマトグラムを図27A及びBにそれぞれ示す。【０２１５】
TT1：
メインピーク：5’-pGATCGGGCCTAATACGACTCACTAT-FAM-3’  分子式C270H332N94O161P26 FW 8275.4 [M-H]-8274.4 実測値 8273.7
TT2：
メインピーク：5’-pATCGGGCCTAATACGACTCACTAT-FAM-3’  分子式C260H320N89O155P25 FW 7946.2 [M-H]-7945.2 実測値 7946.1
5’末端がFAM修飾されたDNAオリゴマー（以下「5’-FAM」とも称する）の構造を下記に示す。
【化２６】
2013150902.tif 000028
【０２１６】
5’末端がアミノ基で修飾されたDNAオリゴマー（以下「5’-NH2」とも称する）の構造を下記に示す。
【化２７】
2013150902.tif 000029
【０２１７】
3’末端がFAM修飾されたDNAオリゴマー（以下「FAM-3’」とも称する）の構造を下記に示す。
【化２８】
2013150902.tif 000030
【０２１８】
DNAオリゴマーの連結反応は、40μMのTF3及びTS3と、33μMのTT1（比較のためTT2）との混合溶液15μLに対して、15μLのLigation high（TOYOBO社製  カタログ番号LGK-101）を混合し、16℃において1時間から3時間振盪することによって行った。対照区として、TT1をTT2に変更した試料を上記と同様に反応させた。得られた反応混合物を、7 M 尿素を含む15% ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析して、連結反応の確認を行った。各DNAオリゴマーの塩基配列及びポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を図28に示す。【０２１９】
図28Bに示すように、ポリアクリルアミドゲルに紫外線を照射すると、蛍光色素FAMが蛍光を発するため、FAM修飾されたDNAオリゴマーはゲル上で白いバンドとして検出される。左から一番目のレーンのバンドは、46塩基からなるDNAオリゴマーであるTS1に、左から二番目及び六番目のレーンのバンドは、それぞれ25塩基及び24塩基からなるDNAオリゴマーであるTT1及びTT2に、それぞれ対応する。左から三番目〜五番目のレーンは、TS3を鋳型としてTT1及びTF3を1、2又は3時間連結反応させて得られたDNAオリゴマーのうち、FAM修飾されたTT1由来のDNAオリゴマーのゲル上の位置を示す。これらのレーンで検出されたメインバンドの位置は、46塩基からなるTS1の位置と近いことから、連結反応混合物中ではTT1及びTF3が連結されて、50塩基からなるDNAオリゴマーが形成されたことが示唆される。【０２２０】
右から一番目のレーンは、TS3を鋳型としてTT2及びTF3を3時間連結反応させて得られた対照区のDNAオリゴマーのゲル上の位置を示す。このレーンで検出されたメインバンドの位置は、24塩基からなる連結前のDNAオリゴマーであるTT2の位置と近いことから、TT2は、鋳型であるTS3とアニールするもののTF3とは連結されなかったことが示唆される。TT2は、TT1の5’末端が1塩基欠失した塩基配列からなるDNAオリゴマーであるため、TS3を鋳型としてTT2及びTF3をアニールさせると、TT2とTF3との間には1塩基のギャップが生じる（図28A）。このため、対照区の試料では連結反応が進行しなかったと考えられる。【０２２１】
＜4. 合成例2：5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシド（5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジン）のモノマーユニットであるホスホロアミダイト（非特許文献36〜41）は、グレンリサーチ社より購入した（非特許文献49）。DNA自動合成機を用いて、5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した（非特許文献42〜49）。担体からの切り出しを28%アンモニア水で行い、脱保護は室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニアを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。【０２２２】
以下において、5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジン：
【化２９】
2013150902.tif 000031
【０２２３】
を「Pr」で示す。【０２２４】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図29〜30に示す。【０２２５】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０２２６】
5’-TTTTCTT(Pr)TCCTTTT-3’について10.5分（配列番号14）
5’-TTTTTT(Pr)TTTTTT-3’について10.7分（配列番号15）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２２７】
5’-TTTTCTT(Pr)TCCTTTT-3’について分子式C149H193N33O100P14、[M-H]-の計算値 4478.8、実測値 4479.4（配列番号14）
5’-TTTTTT(Pr)TTTTTT-3’について分子式C132H170N26O89P12、[M-H]-の計算値 3915.6、実測値 3915.8（配列番号15）
＜5. 使用例2：5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例2-1：5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応］
スクリューチューブに30μLのDNAオリゴマー水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLのエチレンジアミン（無水）とを加え、水浴中で70℃、3時間又は16時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した(16時間反応後の試料の生成物)。【０２２８】
合成した各DNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図31及び33に、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを図32及び34に、それぞれ示す。【０２２９】
各DNAオリゴマーにおける生成物1のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２３０】
5’-TTTTCTT(Pr)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.4
5’-TTTTTT(Pr)TTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1841.9
エチレンジアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、右側の生成物が生成物1に対応する。左側の生成物は、反応時間が長くなったことに起因して、糖残基の脱離又は分子量が64増す反応が生じてさらに別の副生成物を形成したことがMALDI TOF-MSスペクトルより予想される。
【化３０】
2013150902.tif 000032
【０２３１】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２３２】
＜6. 合成例3：5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
非天然型塩基を含むデオキシヌクレオシドである5-エチニル-2’-デオキシウリジンは、抗ウイルス活性及び抗癌活性を有する公知の化合物である（非特許文献50〜53）。また、当該デオキシヌクレオシドは、細胞中のDNA標識法にも用いられている（非特許文献54〜63）。細胞培地に前記デオキシヌクレオシドを加えると、該デオキシヌクレオシドは、細胞のDNA中にチミジンと間違われて取り込まれる。このデオキシヌクレオシドは、エチニル基を有するため、クリックケミストリーによってアジド基を有する別の標識分子（例えば蛍光色素など）と容易にカップリングさせることができる。上記の機構により、細胞のDNA中に取り込まれた前記デオキシヌクレオシドを、蛍光色素などの標識により検出することが可能となる。或いは、ラマン分光を利用することにより、上記のような標識反応を行うことなく前記デオキシヌクレオシドを検出することもできる。それ故、生細胞中でも当該デオキシヌクレオシドをモニターすることが可能となる（非特許文献64）。【０２３３】
5-エチニル-2’-デオキシウリジンの合成は、これまでに多くの方法が報告されている（例えば、非特許文献65〜67）。また、DNA自動合成機を用いて、5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを合成する方法も、すでに報告されている（非特許文献68及び69）。しかしながら、前記デオキシヌクレオシドを、DNA鎖の切断及び切断された末端のリン酸化に適用した例は存在しない。【０２３４】
5-エチニル-2’-デオキシウリジンのモノマーユニットであるホスホロアミダイトは、非特許文献66及び68に記載の方法に従い合成した。DNA自動合成機を用いて、5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを合成例1-4と同じ方法で合成した（非特許文献69）。担体からの切り出し及び脱保護を、50 mM K2CO3/MeOH中、室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。DNAオリゴマーがアデニン及び／又はグアニンを含む場合、DNAオリゴマーに水を500μL加えた後、遠心濃縮装置を用いてメタノールを減圧留去し、さらに一体積分の28%アンモニア水を加えて撹拌して密閉し、24時間静置することによって、塩基部分を完全に脱保護することが可能である。遠心濃縮装置を用いてメタノールを減圧留去し、1 mLの蒸留水を加えた後に0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。【０２３５】
以下において、5-エチニル-2’-デオキシウリジン：
【化３１】
2013150902.tif 000033
【０２３６】
を「Pa」で示す。【０２３７】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図35及び36に示す。【０２３８】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０２３９】
5’-TTTTCTT(Pa)TCCTTTT-3’について10.4分（配列番号16）
5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’について10.7分（配列番号17）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２４０】
5’-TTTTCTT(Pa)TCCTTTT-3’について分子式C148H191N33O100P14、[M-H]-の計算値 4464.9、実測値 4465.3（配列番号16）
5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’について分子式C131H168N26O89P12、[M-H]-の計算値 3901.5、実測値 3901.8（配列番号17）
＜7. 使用例3：5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例3-1：5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応］
スクリューチューブに30μLのDNAオリゴマー水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLのメチルアミン（40% 水溶液）とを加え、水浴中で70℃、10分間又は30分間加熱した。遠心濃縮装置を用いて反応混合物からメチルアミンを減圧留去し、該反応混合物を逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した(30分間反応後の試料の生成物)。【０２４１】
合成した各DNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図37及び38に、それぞれ示す。【０２４２】
各DNAオリゴマーにおける生成物1のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２４３】
5’-TTTTCTT(Pa)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.2
生成物2：TTTTCTTRNu  分子式C75H103N16O51P7 FW 2261.5 [M-H]- 2260.5 実測値 2260.6
5’-TTTTTT(Pa)TTTTTT-3’ について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1841.8
生成物2：TTTTTTRNu  分子式C66H91N13O45P6 FW 1972.3 [M-H]- 1971.3 実測値 1971.3
メチルアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、右側の生成物が生成物1に、左側の生成物が生成物2にそれぞれ対応することがMALDI TOF-MSスペクトルより示された。
【化３２】
2013150902.tif 000034
【０２４４】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２４５】
上記のように、5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーは、70℃で30分間加熱することにより切断反応が略完結した。この結果から、5-エチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーは、5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー（使用例1）及び5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー（使用例2）と比較して極めて迅速に切断反応が進行することが明らかとなった。【０２４６】
［使用例3-2：メチルアミン又はエチレンジアミンによる5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーの25℃における切断反応速度の比較］
スクリューチューブに、200μLの5’-T6(Pa)T6-3’の水溶液(ストランド濃度 100μM)と200μLのメチルアミン又はエチレンジアミン（40％水溶液）とを加え、よく撹拌し、25℃で40時間静置した。メチルアミンによる反応の場合、反応後、反応溶液を加熱せずに遠心濃縮機で濃縮し、該反応溶液からメチルアミンを減圧留去した。エチレンジアミンによる反応の場合、酢酸で反応溶液を中和した。得られたそれぞれの反応混合物を、逆相HPLCにより分析した(8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。反応溶液のHPLCチャートを図39に示す。【０２４７】
図39に示すように、メチルアミンによる反応の場合、保持時間8.2分及び10.3分付近に（図39A）、エチレンジアミンによる反応の場合、保持時間8.1分及び10.3分付近に（図39B）、それぞれピークが検出された。前記使用例3-1と同様のMALDI TOF-MSスペクトル測定により、これらのピークが5’-T6(Pa)T6-3’の切断に由来する生成物に対応することが確認された。以上の結果から、25℃においてもDNAオリゴマーの切断が進行することが確認された。【０２４８】
［使用例3-3：炭酸カリウム水溶液中におけるPaを含むDNAオリゴマーの切断反応と生成物の同定］
スクリューチューブに、100μLの5’-T6PaT6-3’の水溶液(ストランド濃度 400μM)と100μLの炭酸カリウム水溶液（1 M）とを加え、乾燥機で120℃、4時間加熱した。反応溶液を酢酸で中和した。得られた反応混合物を、逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(5-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。DNAオリゴマーの切断反応前後のHPLCチャートを図40に示す。【０２４９】
図40に示すように、前記の切断反応により、生成物1及び2が生成した。分取した生成物1及び2は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２５０】
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1842.2
HPLCの保持時間  12.1分
生成物2：TTTTTTp  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1842.0
HPLCの保持時間 12.8分
炭酸カリウムによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、右側の生成物が生成物1に、左側の生成物が生成物2にそれぞれ対応することがMALDI TOF-MSスペクトルより示された。
【化３３】
2013150902.tif 000035
【０２５１】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２５２】
生成物1は、メチルアミンによる分解生成物との重ね打ちによるHPLC分析により、同一の保持時間を有することが確認された。本反応の求核種は、水酸化物イオンと考えられる。本反応では、非特許文献13に示されたアベーシックサイトを有するDNAの水中における分解反応と、同様の反応が起きたものと予想される。シトシンを含むDNAオリゴマーの反応では、生成物のピークが2つよりも多くなった。この結果から、アルカリ条件下で加熱することにより、シトシンのデアミネーションが起きることが示唆される。【０２５３】
＜8. 合成例4：5-[(E)-2-カルバモイルビニル]-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［合成例4-1：5’-O-ジメトキシトリチル-5-[(E)-2-カルボメトキシビニル]-2’-デオキシウリジンの合成］
非特許文献73に従って合成した767 mg(2.46 mmol)の5-[(E)-2-カルボメトキシビニル]-2’-デオキシウリジン(分子量312.28)と1.05 g(3.10 mmol)のDMTrCl(分子量338.83)とをナスフラスコに入れ、そこへ20 mLのピリジンを加え、室温で1時間撹拌した。約2 mLのメタノールを加え、反応を停止させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムで目的物質を精製した（展開溶媒は2〜5% MeOH, 2% Et3N/CH2Cl2）。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、真空ポンプで乾燥した。少量の塩化メチレンに溶かし、ヘキサンを加え、溶媒を減圧留去した後、真空ポンプで乾燥することにより、1.49 g（1.94 mmol, 収率79%）の目的物質(分子量766.43トリエチルアミン1.5分子を含む)を白色粉末として得た。【０２５４】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ11.70 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.39-7.36 (m, 2H),7.29-7.15 (m, 8H), 6.86-6.81 (m, 5H), 6.15 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 5.34 (d, J= 5.0Hz, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.93-3.88 (m, 1H),3.70 (s, 1H), 3.69 (s, 1H), 3.63 (s, 1H), 3.26-3.12 (m, 2H),3.07-2.98 (m, 9H), 2.36-2.28 (m, 1H), 2.24-2.16 (m, 1H), 1.20-1.15 (m, 13.5 H); HRMS (ESI): C34H34N2O9Naに対する計算値: 637.2157 [M+Na]+; 実測値: 637.2162.
［合成例4-2：5’-O-ジメトキシトリチル-5-[(E)-2-カルボメトキシビニル]-2’-デオキシウリジン-3’-N,N-ジイソプロピル(シアノエチル) ホスホロアミダイトの合成］
300 mg(0.391 mmol)の5’-O-ジメトキシトリチル-5-[(E)-2-カルボメトキシビニル]-2’-デオキシウリジン(分子量766.43；トリエチルアミン1.5分子を含む)をナスフラスコに入れ、5 mLのCH3CNと261μL(1.50 mmol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(分子量129.25, 比重0.742 g/mL)とを加え、撹拌し、さらに223μL(1.00 mmol)の2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロアミダイト(分子量236.68, 比重1.061 g/mL)を加え、室温で30分間撹拌した。25 mLのAcOEtと25 mLの飽和食塩水とを加え、分液し、有機層をさらに2回飽和食塩水で洗った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、フィルターでろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去した。アセトニトリルで3回共沸した後、10 mLのアセトニトリルを加えた。溶液を0.45μmのフィルターに通し、少量のモレキュラーシーブを加えた。DNA自動合成機に取り付けてDNA合成に使用した。【０２５５】
［合成例4-3：5-[(E)-2-カルバモイルビニル]-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの合成］
DNA自動合成機を用いて、5-[(E)-2-カルバモイルビニル]-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した（非特許文献70〜72）。担体からの切り出しを28%アンモニア水で行い、脱保護は室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。塩基部分のカルボメトキシビニル基は脱保護条件でカルバモイルビニル基に変換される。遠心濃縮装置を用いてアンモニアを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。【０２５６】
以下において、5-[(E)-2-カルバモイルビニル]-2’-デオキシウリジン：
【化３４】
2013150902.tif 000036
【０２５７】
を「CvU」で示す。【０２５８】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図41に示す。【０２５９】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０２６０】
5’-TTTTCTT(CvU)TCCTTTT-3’について10.5分（配列番号18）
5’-TTTTTT(CvU)TTTTTT-3’について10.6分（配列番号19）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２６１】
5’-TTTTCTT(CvU)TCCTTTT-3’について分子式C149H194N34O101P14、[M-H]-の計算値 4509.9、実測値 4510.0（配列番号18）
5’-TTTTTT(CvU)TTTTTT-3’について分子式C132H171N27O90P12、[M-H]-の計算値 3946.6、実測値 3946.6（配列番号19）
＜9. 使用例4：5-[(E)-2-カルバモイルビニル]-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例4-1：5-[(E)-2-カルバモイルビニル]-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応］
スクリューチューブに30μLのDNAオリゴマー水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLのエチレンジアミン（無水）とを加え、水浴中で70℃、3時間又は16時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した(8時間反応後の試料の生成物)。【０２６２】
合成した各DNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図42及び44に、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを図43及び45に、それぞれ示す。【０２６３】
各DNAオリゴマーにおける生成物1のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２６４】
5’-TTTTCTT(CvU)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.2
5’-TTTTTT(CvU)TTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1841.9
エチレンジアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、右側の生成物がHPLCクロマトグラム上の小さなピークである生成物1に対応する。反応後の分取HPLCにおいて原料のDNAオリゴマーと同じリテンションタイムに溶出されるピークを含むフラクションをMALDI TOF-MS測定すると、MALDI TOF-MSスペクトル上に原料+60に相当するピークが検出された。この結果から、反応後の前記フラクションには、原料のDNAオリゴマーにエチレンジアミンが一分子付加した化合物が多く含まれていることが示唆された。それ故、DNAオリゴマーの分解反応とは別の反応が同時に起きたことが予想される。
【化３５】
2013150902.tif 000037
【０２６５】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２６６】
＜10. 合成例5：N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマー＞
［合成例5-1：N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンの合成］
1.21 g(5.00 mmol)のチミジン(分子量242.23)を20 mLのアセトニトリルに懸濁し、そこへ5.58 mL(40.0 mmol)のトリエチルアミン(分子量101.19, 比重0.73 g/mL)と1.89 mL(20.0 mmol)の無水酢酸(分子量102.09, 比重1.08 g/mL)とを加え、25℃で21時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、100 mLの酢酸エチルと100 mLの飽和食塩水とを加えて分液した。有機層を100 mLの飽和食塩水で2回洗浄した後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥後の有機層をろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去して、真空ポンプにより乾燥した。3.45 g(50.0 mmol)の1,2,4-トリアゾール(分子量69.07)を加え、30 mLのアセトニトリルを加え、7.67 mL(55.0 mmol)のトリエチルアミン(分子量101.19, 比重0.73 g/mL)を加えた。混合物をよく撹拌しながら932μL(10.0 mmol)の塩化ホスホリル(分子量153.33, 比重1.645 g/mL)を加えた。25℃で1時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、100 mLの酢酸エチルと100 mLの飽和食塩水とを加えて分液した。有機層を100 mLの飽和食塩水で2回洗浄した後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥後の有機層をろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去して、真空ポンプにより乾燥した。約30 mLの1,4-ジオキサンを加え、溶解させた後、961μL(15.0 mmol)のプロパルギルアミン(分子量55.08, 比重0.86)を加え、25℃で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、30 mLのメタノールと30 mLの28%アンモニア水とを加えて25℃で24時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的生成物を精製した(10-15% MeOH/CH2Cl2)。873 mg(3.13 mmol, 収率63%)の目的物質(分子量279.29)を白色粉末として得た。【０２６７】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ7.65 (d, J= 0.9Hz, 1H), 7.57 (t, J= 5.7Hz, 1H), 5.19 (d, J= 4.6Hz, 1H), 5.01 (t, J= 5.3Hz, 1H), 4.23-4.18 (m, 1H), 4.14-4.01 (m, 2H),3.76-3.74 (m, 1H),3.62-3.50 (m, 2H), 3.04 (t, J = 2.5 Hz, 1H),2.12-2.05 (m, 1H),1.99-1.92 (m, 1H),1.84 (s, 3H); HRMS (ESI): C13H17N3O4Naに対する計算値: 302.1116 [M+Na]+; 実測値: 302.1117.
［合成例5-2：5’-O-ジメトキシトリチル- N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンの合成］
312 mg(1.12 mmol)のN6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジン(分子量279.29)と454 mg(1.34 mmol)のDMTrCl(分子量338.83)とをナスフラスコに入れ、そこへ10 mLのピリジンを加え、室温で1時間撹拌した。約2 mLのメタノールを加え、反応を停止させ、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムで目的物質を精製した（展開溶媒は2〜5% MeOH, 2% Et3N/CH2Cl2）。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、真空ポンプで乾燥した。少量の塩化メチレンに溶かし、ヘキサンを加え、溶媒を減圧留去し、真空ポンプで乾燥することにより、631 mg（0.924 mmol, 収率83%）の目的物質(分子量682.85；トリエチルアミン一分子を含む)を白色粉末として得た。【０２６８】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ7.63 (t, J= 5.7Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.39-7.35 (m, 2H),7.32-7.19 (m, 7H),6.90-6.86 (m, 4H),6.21 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 5.34 (d, J= 4.1Hz, 1H), 4.31-4.25 (m, 1H), 4.14-4.02 (m, 2H),3.90-3.86 (m, 1H),3.72 (s, 6H), 3.22-3.16 (m, 2H),3.09-3.00 (m, 6H),2.21-2.06 (m, 2H),1.50 (s, 3H), 1.23-1.15 (m, 9H); HRMS (ESI): C34H35N3O6Naに対する計算値: 604.2525 [M+Na]+;実測値: 604.2424.
［合成例5-3：5’-O-ジメトキシトリチル-N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジン-3’-N,N-ジイソプロピル(シアノエチル)ホスホロアミダイトの合成］
291 mg(0.426 mmol)の5’-O-ジメトキシトリチル-N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジン (分子量682.85；トリエチルアミン一分子を含む)をナスフラスコに入れ、5 mLのCH3CNと261μL(1.50 mmol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(分子量129.25, 比重0.742 g/mL)とを加え、撹拌し、さらに223μL(1.00 mmol)の2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロアミダイト(分子量236.68, 比重1.061 g/mL)を加え、室温で30分間撹拌した。25 mLのAcOEtと25 mLの飽和食塩水とを加え、分液し、有機層をさらに2回飽和食塩水で洗った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、フィルターでろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去した。アセトニトリルで3回共沸した後、10 mLのアセトニトリルを加えた。溶液を0.45μmのフィルターに通し、少量のモレキュラーシーブを加えた。DNA自動合成機に取り付けてDNA合成に使用した。【０２６９】
［合成例5-4：N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマーの合成］
DNA自動合成機を用いて、N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマーを上記と同じ方法で合成した。担体からの切り出しを28 %アンモニア水で行い、脱保護は室温（約25℃）で16時間静置することにより行った。遠心濃縮装置を用いてアンモニアを減圧留去し、0.45μmのフィルターに通した。その後、逆相HPLCによりメインピークを含むフラクションを分取し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置及び凍結乾燥機を用いてギ酸アンモニウム及び溶媒を留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。【０２７０】
以下において、N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジン：
【化３６】
2013150902.tif 000038
【０２７１】
を「PC」で示す。【０２７２】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図46に示す。【０２７３】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０２７４】
5’-TTTTCTT(PC)TCCTTTT-3’について10.6分（配列番号20）
5’-TTTTTT(PC)TTTTTT-3’について10.9分（配列番号21）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２７５】
5’-TTTTCTT(PC)TCCTTTT-3’について分子式C150H196N34O99P14、[M-H]-の計算値 4492.0、実測値 4491.9（配列番号20）
5’-TTTTTT(PC)TTTTTT-3’について分子式C133H173N27O88P12、[M-H]-の計算値 3928.6、実測値 3928.8（配列番号21）
＜11. 使用例5：N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例5-1：N6-(3-プロピニル)-5-メチル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマーの切断反応］
スクリューチューブに30μLのDNAオリゴマー水溶液(ストランド濃度 500μM)と30μLのエチレンジアミン（無水）とを加え、水浴中で70℃、3時間又は16時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析し、生成物を分取した(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した(16時間反応後の試料の生成物)。【０２７６】
合成した各DNAオリゴマーの反応前後の逆相HPLCクロマトグラムを図47及び49に、生成物1及び他の副生成物のMALDI TOF-MSスペクトルを図48及び50に、それぞれ示す。【０２７７】
各DNAオリゴマーにおける生成物1のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２７８】
5’-TTTTCTT(PC)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.5
5’-TTTTTT(PC)TTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1841.8
エチレンジアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、右側の生成物がHPLCクロマトグラム上の小さなピークである生成物1に対応する。反応後の分取HPLCにおいて原料のDNAオリゴマーと同じリテンションタイムに溶出されるピークを含むフラクションをMALDI TOF-MS測定したところ、原料のDNAオリゴマーが多く含まれていることが示唆された。それ故、当該DNAオリゴマーの分解反応は、使用例1の5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの場合と比較してかなり遅いことが示唆された。
【化３７】
2013150902.tif 000039
【０２７９】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０２８０】
＜12. 使用例6：非天然塩基を含むDNAオリゴマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅と増幅産物の連結反応＞
［使用例6-1：非天然塩基を含むDNAオリゴマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅］
鋳型DNAとして、λDNA(New England BioLabs社製  カタログ番号 N3011)を、酵素としてKOD FX Neo(TOYOBO 社製  カタログ番号 KFX-201)を用い、5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）又は5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ポリメラーゼ連鎖反応後の増幅産物に対して本発明のDNA鎖の切断反応を実施することにより、リガーゼによる連結が可能な突出末端が生成するように非天然塩基を含むDNAオリゴマーの配列設計を行い、2つの標的DNAを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を実施した。【０２８１】
標的DNAの塩基配列は、λDNA中において5’末端から28634-28770番目に相当する遺伝子1（136塩基対）と、28743-28932番目に相当する遺伝子2（179塩基対）とからなる。遺伝子1のフォワードプライマー鎖として5’-GTAGCGATCAAGCCATGAATGTAACG-3’（配列番号22）、及びリバースプライマー鎖として5’-ACAGGCGAATCGCAAXCACTG-3’(X = 5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）又は5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）)（配列番号23）を、遺伝子2のフォワードプライマー鎖として5’-ATTGCGATTCGCCTGXCTCTGC-3’(5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）又は5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）)（配列番号24）、及びリバースプライマー鎖として5’-GGTTGACTTAAATCGACCAGTAACAGG-3’（配列番号25）を設計した。【０２８２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、終濃度0.3μM プライマー、1 ng λDNA、0.4 mM dNTPs、1 U KOD Fx neo、及び製品添付のバッファーを用いて、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradient(Takara社製サーマルサイクラ―、カタログ番号 TP600)により、アニーリング：94℃, 2分、変性：98℃, 10秒、伸長：68℃, 10秒（変性→伸長を35回繰り返し）の条件下において実施した。増幅産物を、10%非変性ポリアクリルアミドゲルに供することによって、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物の確認を行った。結果を図51に示す。【０２８３】
図51では、電気泳動後のゲルを、30分間室温にてエチジウムブロマイド溶液に浸潤させることで、二本鎖DNA選択的な染色操作を行い、紫外線照射して発する蛍光を検出することにより、DNA鎖を白いバンドとして検出している。レーン1のバンドは、遺伝子マーカーとして100塩基対毎にバンドが検出されるTrackIt（商標） 100 bp DNAラダー(Invitrogen社製  カタログ番号 10488-058)を用いた。レーン2及び3のバンドは、それぞれX = 5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）又は5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーをプライマー鎖として用いた場合の遺伝子1の増幅産物を示しており、レーン4及び5のバンドは、それぞれX = 5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）又は5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーをプライマー鎖として用いた場合の遺伝子2の増幅産物を示している。マーカー由来の100塩基対と200塩基対の泳動度から、目的産物の増幅が確認された。【０２８４】
［使用例6-2：非天然塩基を含むDNA増幅産物の切断反応及び得られた5’末端リン酸化DNA断片の連結反応］
PCRチューブに、50μLの使用例5-1で調製されたDNA増幅産物及び50μLのエチレンジアミンを加え、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradientにより、70℃、3時間加熱した。反応後、50μLの蒸留水を加え、さらに150μLのPCI(フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール＝25:24:1)混合溶液を加えた後、ボルテックスミキサーを用いて前記溶液を激しく混ぜ、2層に均一に層分離するまで遠心分離した。上清を回収し、再び150μLのPCI混合溶液を加えた後、ボルテックスミキサーを用いて前記溶液を激しく混ぜ、2層に均一に層分離するまで遠心分離した。この操作を合計5回繰り返した。上記の操作によって得られた上清を、Bio-Spin 6カラム(BIO-RAD社製  カタログ番号 732-6227)に供した後、エタノール沈殿により精製を行った。遠心濃縮装置を用いて5’末端リン酸化DNA断片を乾燥させ、5μLのTEバッファーに再溶解させた。【０２８５】
それぞれ5μLの遺伝子1及び遺伝子2の5’末端リン酸化DNA断片を含む溶液を混合し、1.5μLの1 M NaCl及び3.5μLの蒸留水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradientにより、98℃、15分間加熱した後に室温まで徐冷した。15μLのLigation High (TOYOBO社製  カタログ番号 LGK-101)を加え、16℃、40時間振盪させた。リガーゼ反応後のサンプルを、PCI抽出操作及びエタノール沈殿により精製し、10%非変性ポリアクリルアミドゲルに供し、連結反応の解析を行った。結果を図52に示す。【０２８６】
レーン1のバンドは、遺伝子マーカーとして100塩基対毎にバンドが検出されるTrackIt（商標）100 bp DNAラダーを用いた。レーン2及び3のバンドは、それぞれX = 5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）を含む遺伝子1又は遺伝子2の増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた5’末端リン酸化DNA断片を示しており、レーン4及び5のバンドは、それぞれX = 5-フェニルエチニル-2’-デオキシウリジン（P）又は5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含む遺伝子1及び2のDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた遺伝子1及び2の5’末端リン酸化DNA断片をリガーゼと反応させた連結反応産物を示している。レーン6のバンドは、λDNA中において5’末端から28634-28932番目に相当する塩基配列を有するDNA断片、すなわち遺伝子1及び2が連結した連結反応産物と同一の塩基配列を有する遺伝子3(299塩基対)の増幅産物を示している。X = P又はPaを含む遺伝子1及び2のDNA増幅産物を本発明の切断反応で切断し、得られた5’末端リン酸化DNA断片をリガーゼと反応させた連結反応産物（レーン4及び5）は、遺伝子3（レーン6）の泳動度と一致することから、連結反応が高効率に進行していることが示された。【０２８７】
＜13. 合成例7：2’-デオキシ-4-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-5-フェニルエチニルシチジンを含むDNAオリゴマー＞
［合成例7-1：2’-デオキシ-4-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-5-フェニルエチニルシチジンの合成］
2’-デオキシ-5-フェニルエチニルシチジンは、非特許文献41に従って合成した。708 mg(2.16 mmol)の2’-デオキシ-5-フェニルエチニルシチジン(分子量327.33)を10 mLのメタノールに溶解した。得られた溶液に、2.0 mL(8.6 mmol)のN,N-ジ(n-ブチル)ホルムアミジンジメチルアセタール(分子量203.32、密度0.87 g/mL)(Dialkylformamidines: depurination resistant N6-protecting group for deoxyadenosine. Froehler, B. C.及びMatteucci, M. D. Tetrahedron Letters 1983年, 11, p. 8031-8036)を加え、25℃で2時間撹拌した。反応液の溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒はCH2Cl2のみ〜5〜10% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、700 mg(1.50 mmol, 収率69 %)の目的物質(分子量466.57)を、うす褐色のオイル状物質として得た。【０２８８】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ8.64 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.43-7.34 (m, 5H), 6.12 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.13 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.26-4.21 (m, 1H), 3.84-3.81 (m, 1H), 3.70-3.44 (m, 6H), 2.26-2.20 (m, 1H), 2.08-2.01 (m, 1H), 1.66-1.52 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 4H), 0.90 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 0.82 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ169.7, 157.4, 153.4, 145.3, 130.7, 128.6, 128.1, 123.2, 97.5, 91.6, 87.6, 85.8, 84.5, 69.7, 60.7, 54.9, 51.4, 45.4, 41.0, 30.4, 28.5, 19.6, 19.1, 13.5; HRMS (ESI): C26H35N4O4に対する計算値: 467.2658 [M+H]+; 実測値: 467.2653.
［合成例7-2：4-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-5-フェニルエチニル-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシシチジンの合成］
700 mg(1.50 mmol)の2’-デオキシ-4-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-5-フェニルエチニル-シチジン (分子量466.57)を、10 mLのピリジンに溶解した。得られた溶液に、763 mg(2.25 mmol)の4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(分子量338.83)を加え、25℃で1時間撹拌した。反応液に約10 mLのメタノールを加え、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に、少量の塩化メチレン及びヘキサンを加えて混合した。前記混合物を3回共沸した後、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は2% Et3N、0〜2〜5% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量の塩化メチレン及びヘキサンを加え共沸した。924 mg(1.20 mmol, 収率80%)の目的生成物を、白色粉末として得た。【０２８９】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ8.65 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.44-6.81 (m, 18H), 6.14 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.31-4.26 (m, 1H), 4.02-3.97 (m, 1H), 3.644 (s, 3H), 3.637 (s, 3H), 3.57-3.49 (m, 4H), 3.23-3.16 (m, 2H), 2.36-2.30 (m, 1H), 2.17-2.10 (m, 1H), 1.66-1.53 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 4H), 0.91 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 0.82 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ169.7, 158.03, 158.01, 157.5, 153.4, 144.7, 144.3, 135.6, 135.4, 130.6, 129.7, 129.6, 128.3, 127.93, 127.86, 127.6, 126.6, 123.0, 113.2, 97.9, 91.7, 86.2, 85.9, 83.9, 70.6, 63.5, 54.9, 54.5, 45.4, 41.2, 30.4, 28.5, 19.6, 19.1, 13.5; HRMS (ESI): C47H53N4O6に対する計算値: 769.3965 [M+H]+; 実測値: 769.3985.
［合成例7-3：4-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-5-フェニルエチニル-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシシチジン-3’-N,N-ジイソプロピル(シアノエチル)ホスホロアミダイトの合成］
109 mg(0.142 mmol)の4-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-5-フェニルエチニル-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシシチジン(分子量768.94)をナスフラスコに入れ、5 mLのCH3CN及び157μL(1.13 mmol)のトリエチルアミン(分子量101.19, 比重0.726 g/mL)を加え、撹拌し、さらに126μL(0.56 mmol)の2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(分子量236.68, 比重1.061 g/mL)を加え、室温で30分間撹拌した。得られた混合物に、25 mLのAcOEtと25 mLの飽和食塩水とを加え、分液し、有機層をさらに2回飽和食塩水で洗った。得られた有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、フィルターでろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去した。アセトニトリルで3回共沸した後、4.7 mLのアセトニトリルを加えた。前記溶液に、少量のモレキュラーシーブを加えた。DNA自動合成機に取り付けてDNA合成に使用した。【０２９０】
［合成例7-4：5-フェニルエチニル-2’-デオキシシチジン(Q)を含むDNAオリゴマーの合成］
通常のDNA自動合成機のDNA合成のプロトコールで、1μmolスケール、DMTr ONでホスホロアミダイト法により合成した。担体からの切り出しは28％アンモニア水で行い、脱保護は25℃で16時間静置することにより行った。脱保護後、アンモニアを遠心濃縮装置により減圧留去し、DNAを含む溶液を0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCによりメインピークを精製し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒とを留去した。得られた残渣に100μLの80%酢酸水溶液を加え、よく混合し、25℃で30分間静置した。その後、前記混合物に蒸留水を約1 mLとなるように加えて、0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCにより13〜14分の保持時間に溶出されたメインピークを精製し(8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒とを留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。合成したDNAオリゴマーは、約500μLの蒸留水を加えて水溶液とした。【０２９１】
以下において、5-フェニルエチニル-2’-デオキシシチジン：
【化３８】
2013150902.tif 000040
【０２９２】
を「Q」で示す。【０２９３】
DNAの濃度決定は、QをCと近似して260 nmのモル吸光係数を計算し、260 nmのUV吸収より濃度を計算した。【０２９４】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図53及び54に示す。【０２９５】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０２９６】
5’-TTTTTTQTTTTTT-3’について13.6分（配列番号26）
5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’について13.1分（配列番号27）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０２９７】
5’-TTTTTTQTTTTTT-3’について分子式C137H173N27O88P12、[M-H]-の計算値 3976.6、実測値 3977.1（配列番号26）
5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’について分子式C154H196N34O99P14、[M-H]-の計算値 4540.0、実測値 4540.0（配列番号27）
＜14. 使用例7: 5-フェニルエチニル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例7-1：メチルアミンによる5-フェニルエチニル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマーの切断反応及び生成物の同定］
スクリューチューブに300μLの5’-T6QT6-3’又は5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度 100μM)と300μLのメチルアミン（40% 水溶液）とを加え、水浴中で70℃、12時間加熱した。反応後は、メチルアミンを遠心濃縮装置で減圧留去し、逆相HPLCにより分析して生成物を分取した(8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。【０２９８】
合成した各DNAオリゴマーの反応後の逆相HPLCクロマトグラムを図55及び56に示す。【０２９９】
各DNAオリゴマーにおける生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するQ由来の部分を意味する。【０３００】
5’-TTTTTTQTTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1842.0
HPLCの保持時間 8.5分
生成物2：TTTTTTpRNu  分子式C66H91N13O45P6 FW 1972.3 [M-H]- 1971.3 実測値 1971.1
HPLCの保持時間 10.6分
5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.3
HPLCの保持時間7.1分
生成物2：TTTTCTTpRNu  分子式C75H103N16O51P7 FW 2261.5 [M-H]- 2260.5 実測値 2260.5
HPLCの保持時間 9.7分
メチルアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、左側の生成物が生成物2に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。
【化３９】
2013150902.tif 000041
【０３０１】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０３０２】
［使用例7-2：メチルアミン又はエチレンジアミンによる5-フェニルエチニル-2’-デオキシシチジンを含むDNAオリゴマーの切断反応速度の比較］
スクリューチューブに30μLの5’-T6(Q)T6-3’又は5’-TTTTCTT(Q)TCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度 100μM)と、30μLのメチルアミン40％水溶液又はエチレンジアミンを加え、水浴中で70℃、2時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析した(8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。5’-T6(Q)T6-3’の反応混合物のHPLCチャートを図57に、5’-TTTTCTT(Q)TCCTTTT-3’の反応混合物のHPLCチャートを図58に、それぞれ示す。【０３０３】
5’-T6QT6-3’の5’-側の切断生成物である5’-T6p-3’のピーク面積に基づき定量したところ、5’-T6QT6-3’の5’-側の切断産物の量は、メチルアミン処理の方がエチレンジアミン処理よりも3.6倍多いことが計算された。また、5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’の5’-側の切断生成物である5’-TTTTCTTp-3’のピーク面積に基づき定量したところ、5’-TTTTCTTQTCCTTTT-3’の5’-側の切断産物の量は、メチルアミン処理の方がエチレンジアミン処理よりも2.6倍多いことが計算された。この結果より、メチルアミン又はエチレンジアミンの一級アミンを用いるDNAオリゴマーの切断反応において、最も反応速度の速いものはメチルアミンを用いる切断反応であることが示唆された。【０３０４】
合成例7で得られたQには、下記に示すように複数の互変異性体が存在する。それ故、Qを含むオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、Qの互変異性体が求核剤と反応することにより、Eの脱離反応及びオリゴデオキシヌクレオチドの切断反応が進行すると考えられる。
【化４０】
2013150902.tif 000042
【０３０５】
上記の反応式において、DNAはオリゴデオキシヌクレオチドを、Nuは求核剤を意味する。【０３０６】
＜15. 合成例8：5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジン(HP)を含むDNAオリゴマー＞
［合成例8-1：5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジン(HP)を含むDNAオリゴマーの合成］
ヌクレオシドレベルで公知の反応に基づき、合成例1で得られたPを含むDNAオリゴマーにおいて、Pの塩基部分を銀イオンで環化させて(A facile synthesis of fluorophores based on 5-phenylethynyluracils. Hudson, H. E. R.及びMoszybski, J. M. Synlett 2006年, 18, p. 2997-3000)、その後、水酸化ナトリウム処理することにより、Pを5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジンに変換した(非特許文献39)。
【化４１】
2013150902.tif 000043
【０３０７】
合成例1で得られた5’-T6PT6-3’水溶液(1 mMストランド濃度)200μLに、硝酸銀水溶液(100 mM)200μLを加え、よく混合し、25℃で16時間静置した。前記混合物に、NaOH水溶液(10規定)20μLを加え、よく混合した。得られた混合物を、25℃で2時間静置した。その後、前記混合物に水を加えて約1 mLとし、酢酸20μLを加えた。得られた溶液を0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCで精製 (8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)し、脱塩した。メインピークとして得られた生成物は、MALDI TOF-MS測定により同定した。【０３０８】
以下において、5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジン：
【化４２】
2013150902.tif 000044
【０３０９】
を「HP」で示す。【０３１０】
DNAの濃度決定は、HPをTと近似して260 nmのモル吸光係数を計算し、260 nmのUV吸収より濃度を計算した。【０３１１】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図59及び60に示す。【０３１２】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０３１３】
5’-TTTTTT(HP)TTTTTT-3’について12.5分（配列番号28）
5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’について11.4分（配列番号29）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０３１４】
5’-TTTTTT(HP)TTTTTT-3’について分子式C137H174N26O90P12、[M-H]-の計算値 3995.6、実測値 3995.6（配列番号28）
5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’について分子式C154H197N33O101P14、[M-H]-の計算値 4559.0、実測値 4559.4（配列番号29）
＜16. 使用例8: 5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマー＞
［使用例8-1：メチルアミンによる5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応及び生成物の同定］
スクリューチューブに300μLの5’-T6(HP)T6-3’又は5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度100μM)と300μLのメチルアミン（40% 水溶液）を加え、水浴中で70℃、12時間加熱した。反応後は、メチルアミンを遠心濃縮装置で減圧留去し、逆相HPLCにより分析して生成物を分取した(8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。【０３１５】
合成した各DNAオリゴマーの反応後の逆相HPLCクロマトグラムを図61及び62に示す。【０３１６】
各DNAオリゴマーにおける生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するHP由来の部分を意味する。【０３１７】
5’-TTTTTT(HP)TTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1841.6
HPLCの保持時間 8.5分
生成物2：TTTTTTpRNu  分子式C66H91N13O45P6 FW1972.3 [M-H]- 1971.3 実測値 1971.0
HPLCの保持時間 10.6分
5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.2
HPLCの保持時間 7.3分
生成物2：TTTTCTTpRNu  分子式C75H103N16O51P7 FW 2261.5 [M-H]- 2260.5 実測値 2260.5
HPLCの保持時間 9.9分
メチルアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、左側の生成物が生成物2に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。
【化４３】
2013150902.tif 000045
【０３１８】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０３１９】
［使用例8-2：メチルアミン又はエチレンジアミンによる5-(2-オキシ-2-フェニルエチル)-2’-デオキシウリジンを含むDNAオリゴマーの切断反応速度の比較］
スクリューチューブに30μLの5’-T6(HP)T6-3’又は5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度100μM)と、30μLのメチルアミン40％水溶液又はエチレンジアミンを加え、水浴中で70℃、2時間加熱した。反応混合物を酢酸で中和し、逆相HPLCにより分析した(8-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。5’-T6(HP)T6-3’の反応混合物のHPLCチャートを図63に、5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’の反応混合物のHPLCチャートを図64に、それぞれ示す。【０３２０】
5’-T6(HP)T6-3’の5’-側の切断生成物である5’-T6p-3’のピーク面積に基づき定量したところ、5’-T6(HP)T6-3’の5’-側の切断産物の量は、メチルアミン処理の方がエチレンジアミン処理よりも2.4倍多いことが計算された。また、5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’の5’-側の切断生成物である5’-TTTTCTTp-3’のピーク面積に基づき定量したところ、5’-TTTTCTT(HP)TCCTTTT-3’の5’-側の切断産物の量は、メチルアミン処理の方がエチレンジアミン処理よりも2.1倍多いことが計算された。この結果より、メチルアミン又はエチレンジアミンの一級アミンを用いるDNAオリゴマーの切断反応において、最も反応速度の速いものはメチルアミンを用いる切断反応であることが示唆された。【０３２１】
合成例8で得られたHPは、合成例1で得られたPの三重結合に水が付加した構造を有する。Pは、求核剤として用いるアミン存在下で加熱することにより、三重結合にアミンが付加したアミン付加体を形成し、さらに互変異性及びアミンの脱離を経由して、HPを形成する可能性がある。
【化４４】
2013150902.tif 000046
【０３２２】
上記の反応式において、RNuは、求核剤付加に伴って生じる基を意味する。上記のオリゴデオキシヌクレオチドは、下記のような分子内環化反応を生じながら非天然塩基に由来する部分が脱離して、切断されると考えられる。
【化４５】
2013150902.tif 000047
【０３２３】
或いは、アミン付加体を含むオリゴデオキシヌクレオチドは、下記のような分子内環化反応を生じた後、切断されるとも考えられる。
【化４６】
2013150902.tif 000048
【０３２４】
＜17. 合成例9：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンンを含むDNAオリゴマー＞
［合成例9-1：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンンの合成］
【化４７】
2013150902.tif 000049
【０３２５】
8-ブロモ-2’-デオキシグアノシンンは、公知文献（Cation-Mediated Energy Transfer in G-Quadruplexes Revealed by an Internal Fluorescent Probe. Dumas A.及びLuedtke, N. W. J. Am. Chem. Soc. 2010年, 132, p. 18004-18007）に従って合成した。3.46 g(10.0 mmol)の8-ブロモ-2’-デオキシグアノシンン(分子量346.14)と3.00 g(20.0 mmol)の2-ホルミルベンゼンボロン酸(分子量149.94)と224 mg(1.00 mmol)の酢酸パラジウム(分子量224.51)と787 mg(3.00 mmol)のトリフェニルホスフィン(分子量262.29)と2.76 g(20.0 mmol)の炭酸カリウムをナスフラスコに加え、そこへ80 mLのアセトニトリルと40 mLの水を加え、80℃で4時間撹拌した。反応液の溶媒を減圧留去し、メタノールを200 mL加え、ろ過した。残渣をメタノールで洗浄した。ろ液を回収し、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は10〜20% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量のメタノールとアセトニトリルで生じる沈殿をろ過し、減圧下で乾燥した。ろ液を濃縮して少量のメタノールとアセトニトリルで生じる沈殿をろ過し、減圧下で乾燥する操作を計3回繰り返し、2.97 g(8.00 mmol, 収率80%)の目的物質(分子量371.35)を、薄黄色粉末として得た。【０３２６】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ10.80 (br, 1H), 9.85 (s, 1H), 7.98 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H),7.84-7.80 (m, 1H), 7.75-7.67 (m, 2H), 6.47 (br, 2H), 5.92 (dd, J = 8.2, 6.4 Hz, 1H), 5.10 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.89-4.86 (m, 1H), 4.21-4.18 (m, 1H), 3.72-3.69 (m, 1H), 3.49-3.38 (m, 2H), 2.98 (ddd, J = 13.2, 8.2, 5.9 Hz, 1H), 4.20 (ddd, J = 13.3, 6.4, 2.3 Hz, 1H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ191.7, 156.5, 153.3, 151.8, 143.4, 135.5, 133.5, 132.5, 131.4, 130.1, 128.4, 117.5, 87.8, 84.6, 71.0, 61.9, 36.8; HRMS (ESI): C17H17N5O5Naに対する計算値: 394.1127 [M+Na]+; 実測値: 394.1115.
［合成例9-2：2-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンンの合成］
【化４８】
2013150902.tif 000050
【０３２７】
2.32 g(6.25 mmol)の8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンン(分子量371.35)を20 mLのメタノールに溶解した。得られた溶液に11.7 mL(50.0 mmol)のN,N-ジ(n-ブチル)ホルムアミドジメチルアセタール(分子量203.32、密度0.87 g/mL) (Dialkylformamidines: depurination resistant N6-protecting group for deoxyadenosine. Froehler, B. C.及びMatteucci, M. D. Tetrahedron Letters 1983年, 11, p. 8031-8036)を加え、25℃で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は5〜10% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量の酢酸エチルとヘキサンで生じる沈殿をろ過し、減圧下で乾燥した。2.10 g(4.11 mmol, 収率66%)の目的物質(分子量510.59)を、薄黄色粉末として得た。【０３２８】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ11.51 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.02-8.00 (m, 1H), 7.87-7.83 (m, 1H), 7.77-7.73 (m, 1H), 7.69-7.67 (m, 1H), 5.92 (dd, J = 7.8, 6.9 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.85-4.82 (m, 1H), 4.33-4.29 (m, 1H), 3.76-3.73 (m, 1H), 3.58-3.35 (m, 6H), 3.14 (ddd, J = 13.7, 7.3, 6.4 Hz, 1H), 2.05 (ddd, J = 13.3, 6.4, 2.8 Hz, 1H), 1.63-1.54 (m, 4H), 1.35-1.23 (m, 4H), 0.94-0.89 (m, 6H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ191.7, 157.8,  157.4, 157.3, 150.5, 144.6, 135.5, 133.6, 132.1, 131.3, 130.2, 128.7, 120.5, 87.8, 85.0, 71.0, 62.0, 51.2, 44.9, 37.3, 30.3, 28.5, 19.6, 19.1, 13.7, 13.5; HRMS (ESI): C26H34N6O5Naに対する計算値: 533.2488 [M+Na]+; 実測値: 533.2481.
［合成例9-3：2-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシグアノシンンの合成］
【化４９】
2013150902.tif 000051
【０３２９】
2.10 g(4.11 mmol)の2-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンン (分子量510.59)を16 mLのピリジンに溶解した。得られた溶液に1.53 g(4.52 mmol)の4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(分子量338.83)を加え、25℃で1時間撹拌した。約10 mLのメタノールを加え、溶媒を減圧留去した。残渣に少量の塩化メチレンとヘキサンを加え、3回共沸した後、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は2% Et3N, AcOEt：n-ヘキサン=8：2〜AcOEt)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量の塩化メチレンとヘキサンを加え共沸した。2.20 g(2.71 mmol, 収率66%)の目的生成物(分子量812.95)を、薄黄色粉末として得た。【０３３０】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ11.52 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.80-7.79 (m, 2H), 7.74-7.70 (m, 1H), 7.31-7.29 (m, 2H), 7.20-7.15 (m, 7H), 6.79-6.72 (m, 4H), 6.00 (dd, J = 8.0, 4.8 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.54-4.48 (m, 1H), 3.84-3.80 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.47-3.43 (m, 2H), 3.31-3.26 (m, 1H), 3.21-3.13 (m, 3H), 3.07-3.04 (m, 1H), 2.17 (ddd, J = 13.7, 8.0, 5.8 Hz, 1H), 1.59-1.51 (m, 2H), 1.45-1.36 (m, 2H), 1.33-1.24 (m, 2H), 1.15-1.09 (m, 2H), 0.93-0.89 (m, 3H), 0.79-0.75 (m, 3H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ191.6, 158.0, 157.9, 157.5, 157.3, 156.9, 150.3, 144.9, 144.8, 135.7, 135.6, 133.4, 132.5, 131.2, 130.1, 129.6, 129.4, 128.3, 127.6, 126.5, 120.4, 112.9, 85.4, 85.2, 84.0, 70.6, 63.6, 55.0, 54.9, 51.2, 45.0, 37.6, 30.2, 28.5, 19.6, 19.0, 13.7, 13.5; HRMS (ESI): C47H53N6O7に対する計算値: 813.3976 [M+H]+; 実測値: 813.3976.
［合成例9-4：2-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシグアノシンン-3’-N,N-ジイソプロピル(シアノエチル)ホスホロアミダイトの合成］
【化５０】
2013150902.tif 000052
【０３３１】
163 mg(0.200 mmol)の2-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシグアノシンン(分子量812.95)をナスフラスコに入れ5 mLのCH3CNと223μL(1.600 mmol)のトリエチルアミン(分子量101.19, 比重0.726 g/mL)を加え、撹拌し、さらに178μL(0.800 mmol)の2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロアミダイト(分子量236.68, 比重1.061 g/mL)を加え、室温で30分間撹拌した。25 mLのAcOEtと25 mLの飽和食塩水を加え、分液し、有機層をさらに2回飽和食塩水で洗った。得られた有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、フィルターでろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去した。アセトニトリルで3回共沸した後、10 mLのアセトニトリルを加えて溶解し、少量のモレキュラーシーブを加えた。DNA自動合成機に取り付けてDNA合成に使用した。【０３３２】
［合成例9-5：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシン(fPG)を含むDNAオリゴマーの合成］
【化５１】
2013150902.tif 000053
【０３３３】
通常のDNA自動合成機のDNA合成のプロトコールで1μmolスケール、DMTr ONでホスホロアミダイト法により合成した。担体からの切り出しは28％アンモニア水で行い、脱保護は25℃で16時間静置することにより行った。脱保護後、アンモニアを遠心濃縮装置により減圧留去し、DNAを含む溶液を0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCによりメインピークを精製し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒を留去した。得られた残渣に100μLの80%酢酸水溶液を加え、よく混合し、25℃で30分間静置した。その後、前記混合物に蒸留水を約1 mLとなるように加えて、0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCにより13〜14分の保持時間に溶出されたメインピークを精製し(5-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒とを留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。合成したDNAオリゴマーは、約500μLの蒸留水を加えて水溶液とした。【０３３４】
以下において、8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンン：
【化５２】
2013150902.tif 000054
【０３３５】
を「fPG」で示す。【０３３６】
DNAの濃度決定は、fPGをCと近似して260 nmのモル吸光係数を計算し、260 nmのUV吸収より濃度を計算した。【０３３７】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図65及び66に示す。【０３３８】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０３３９】
5’-TTTTTT(fPG)TTTTTT-3’について14.6分（配列番号30）
5’-TTTTCTT(fPG)TCCTTTT-3’について14.0分（配列番号31）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０３４０】
5’-TTTTTT(fPG)TTTTTT-3’について分子式C137H173N29O89P12、[M-H]-の計算値 4020.7、実測値 4022.0（配列番号30）
5’-TTTTCTT(fPG)TCCTTTT-3’について分子式C154H196N36O100P14、[M-H]-の計算値 4584.0、実測値 4584.3（配列番号31）
＜18. 使用例9: 8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンン(fPG)を含むDNAオリゴマー＞
［使用例9-1：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシンン(fPG)を含むDNAオリゴマーのメチルアミンによる切断反応と生成物の同定］
スクリューチューブに300μLの5’-T6(fPG)T6-3’又は5’-TTTTCTT(fPG)TCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度100μM)と300μLのメチルアミン（40% 水溶液）とを加え、水浴中で70℃、6時間加熱した。反応後は、メチルアミンを遠心濃縮装置で減圧留去し、逆相HPLCにより分析して生成物を分取した(5-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。【０３４１】
合成した各DNAオリゴマーの反応後の逆相HPLCクロマトグラムを図67及び68に示す。【０３４２】
各DNAオリゴマーにおける生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するfPG由来の部分を意味する。【０３４３】
5’-TTTTTT(fPG)TTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1842.2
HPLCの保持時間 12.0分
生成物2：TTTTTTpRNu  分子式C66H91N13O45P6 FW 1972.3 [M-H]- 1971.3 実測値 1971.0
HPLCの保持時間 13.9分
5’-TTTTCTT(fPG)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.2
HPLCの保持時間11.1分
生成物2：TTTTCTTpRNu  分子式C75H103N16O51P7 FW 2261.5 [M-H]- 2260.5 実測値 2260.5
HPLCの保持時間 13.3分
メチルアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、左側の生成物が生成物2に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。
【化５３】
2013150902.tif 000055
【０３４４】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０３４５】
＜19. 合成例10：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシンを含むDNAオリゴマー＞
［合成例10-1：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシンの合成］
【化５４】
2013150902.tif 000056
【０３４６】
8-ブロモ-2’-デオキシアデノシンは、公知文献（特開2011-37796号公報）に従って合成した。2.20 g(6.66 mmol)の8-ブロモ-2’-デオキシアデノシン(分子量330.14)と2.00g(13.3 mmol)の2-ホルミルベンゼンボロン酸(分子量149.94)と150 mg(0.666 mmol)の酢酸パラジウム(分子量224.51)と525 mg(2.00 mmol)のトリフェニルホスフィン(分子量262.29)と1.84 g(13.3 mmol)の炭酸カリウムをナスフラスコに加え、そこへ40 mLのアセトニトリルと20 mLの水を加え、80℃で4時間撹拌した。反応液の溶媒を減圧留去し、メタノールを200 mL加え、ろ過した。残渣をメタノールで洗浄した。ろ液を回収し、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は10% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量のアセトニトリルに溶かし、塩化メチレンを加え、さらにヘキサンを加えることで生じる沈殿をろ過し、減圧下で乾燥した。1.81 g(5.09 mmol, 収率76%)の目的物質(分子量355.35)を、白色粉末として得た。【０３４７】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ9.93 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.09-8.07 (m, 1H), 7.90-7.80 (m, 2H), 7.74-7.72 (m, 1H), 7.46 (br, 2H), 5.90 (dd, J = 8.5, 6.2 Hz, 1H), 5.49 (dd, J = 8.3, 4.1 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.39-4.35 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 1H), 3.65-3.59 (m, 1H), 3.50-3.44 (m, 1H), 3.19 (ddd, J = 12.8, 8.7, 6.0 Hz, 1H), 2.06 (ddd, J = 13.0, 6.2, 1.8 Hz, 1H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ191.7, 156.2, 152.3, 149.6, 147.4, 135.4, 133.8, 131.5, 131.4, 130.8, 129.5, 119.3, 88.3, 85.7, 71.3, 62.2, 37.4; HRMS (ESI): C17H18N5O4に対する計算値: 356.1359 [M+H]+; 実測値: 356.1364.
［合成例10-2：6-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシンの合成］
【化５５】
2013150902.tif 000057
【０３４８】
1.55 g(4.36 mmol)の8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシン(分子量355.35)を20 mLのメタノールに溶解し、得られた溶液に8.14 mL(34.8 mmol)のN,N-ジ(n-ブチル)ホルムアミドジメチルアセタール(分子量203.32、密度0.87 g/mL)(Dialkylformamidines: depurination resistant N6-protecting group for deoxyadenosine. Froehler, B. C.及びMatteucci, M. D. Tetrahedron Letters 1983年, 11, p. 8031-8036)を加え、25℃で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は2〜5% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量の塩化メチレンを加え、ジエチルエーテルを加え、さらにヘキサンを加えることで生じる沈殿をろ過し、減圧下で乾燥した。1.40 g(2.83 mmol, 収率65%)の目的物質(分子量494.59)を、白色粉末として得た。【０３４９】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ9.92 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.91-7.82 (m, 2H), 7.74 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 7.8, 6.8 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 5.18 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.40-4.36 (m, 1H), 3.81-3.77 (m, 1H), 3.64-3.41 (m, 6H), 3.25-3.18(m, 1H), 2.09-2.04 (m, 1H), 1.62-1.52 (m, 4H), 1.33-1.22 (m, 4H), 0.94-0.83 (m, 6H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ191.8, 159.5, 157.9, 151.7, 151.6, 149.3, 135.5, 133.8, 131.5, 131.3, 130.9, 129.7, 125.8, 88.2, 85.5, 71.2, 62.1, 50.9, 44.4, 37.2, 30.4, 28.7, 19.6, 19.1,13.7, 13.5; HRMS (ESI): C26H35N6O4に対する計算値: 495.2720 [M+H]+; 実測値: 495.2718.
［合成例10-3：6-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシアデノシンの合成］
【化５６】
2013150902.tif 000058
【０３５０】
1.31 g(2.64 mmol)の6-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシグアノシン (分子量494.59)を10 mLのピリジンに溶解した。得られた溶液に991 mg(2.92 mmol)の4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(分子量338.83)を加え、25℃で1時間撹拌した。約10 mLのメタノールを加え、溶媒を減圧留去した。残渣に少量の塩化メチレンとヘキサンを加え、3回共沸した後、シリカゲルカラムで目的物質を精製した(展開溶媒は2% Et3N, 2% MeOH/CH2Cl2)。目的のフラクションの溶媒を減圧留去し、少量の塩化メチレンとヘキサンを加え共沸した。1.24 g(1.56 mmol, 収率59%)の目的生成物(分子量796.95)を、白色粉末として得た。【０３５１】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ9.89 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.06-8.04 (m, 1H), 7.88-7.78 (m, 3H), 7.33-7.31 (m, 2H), 7.21-7.15 (m, 7H), 6.81-6.73 (m, 4H), 5.98 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.57-4.53 (m, 1H), 3.94-3.90 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.59-3.53 (m, 2H), 3.44-3.32 (m, 3H), 3.20-3.12 (m, 2H), 2.11 (ddd, J = 13.0, 7.3, 4.3 Hz, 1H), 1.62-1.52 (m, 4H), 1.34-1.23 (m, 4H), 0.90-0.87 (m, 6H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ191.6, 159.2, 157.9, 157.9, 157.7, 151.8, 149.5, 145.0, 135.7, 135.60, 135.55, 133.6, 131.7, 131.4, 130.7, 129.7, 129.5, 129.1, 127.6, 126.5, 125.6, 113.0, 112.9, 85.8, 85.2, 84.8, 71.0, 63.6, 54.94, 54.90, 50.9, 44.4, 36.3, 30.4, 28.7, 19.6, 19.1, 13.7, 13.5; HRMS (ESI): C47H53N6O6に対する計算値: 797.4027 [M+H]+; 実測値: 797.4046.
［合成例10-4：6-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシアデノシン-3’-N,N-ジイソプロピル(シアノエチル)ホスホロアミダイトの合成］
【化５７】
2013150902.tif 000059
【０３５２】
159 mg(0.200 mmol)の6-N-{N’,N’-ジ(n-ブチル)ホルムアミジン}-8-(2-ホルミルフェニル)-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシアデノシン(分子量796.95)をナスフラスコに入れ5 mLのCH3CNと223μL(1.600 mmol)のトリエチルアミン(分子量101.19, 比重0.726 g/mL)を加え、撹拌し、さらに178μL(0.800 mmol)の2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(分子量236.68, 比重1.061 g/mL)を加え、室温で30分間撹拌した。25 mLのAcOEtと25 mLの飽和食塩水を加え、分液し、有機層をさらに2回飽和食塩水で洗った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、フィルターでろ過し、ろ液の溶媒を減圧留去した。アセトニトリルで3回共沸した後、10 mLのアセトニトリルを加えて溶解し、少量のモレキュラーシーブを加えた。DNA自動合成機に取り付けてDNA合成に使用した。【０３５３】
［合成例10-5：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシン(fPA)を含むDNAオリゴマーの合成］
【化５８】
2013150902.tif 000060
【０３５４】
通常のDNA自動合成機のDNA合成のプロトコールで1μmolスケール、DMTr ONでホスホロアミダイト法により合成した。切り出しは28％アンモニア水で行い、脱保護は25℃で16時間静置することにより行った。脱保護後、アンモニアを遠心濃縮装置により減圧留去し、DNAを含む溶液を0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCによりメインピークを精製し(0-50% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒を留去した。得られた残渣に100μLの80%酢酸水溶液を加え、よく混合し、25℃で30分間静置した。その後、前記混合物に蒸留水を約1 mLとなるように加えて、0.45μmのフィルターに通した後、逆相HPLCで13-14分の保持時間に溶出されたメインピークを精製し(5-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)、遠心濃縮装置と凍結乾燥によりギ酸アンモニウムと溶媒とを留去した。得られたDNAオリゴマーはMALDI TOF-MS測定により同定した。合成したDNAオリゴマーは、約500μLの蒸留水を加えて水溶液とした。【０３５５】
以下において、8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシン：
【化５９】
2013150902.tif 000061
【０３５６】
を「fPA」で示す。【０３５７】
DNAの濃度決定は、fPAをCと近似して260 nmのモル吸光係数を計算し、260 nmのUV吸収より濃度を計算した。【０３５８】
合成したDNAオリゴマーの逆相HPLCクロマトグラムを図69及び70に示す。【０３５９】
合成したDNAオリゴマーの上記逆相HPLCにおける保持時間は以下の通りである。【０３６０】
5’-TTTTTT(fPA)TTTTTT-3’について14.9分（配列番号32）
5’-TTTTCTT(fPA)TCCTTTT-3’について13.8分（配列番号33）
合成したDNAオリゴマーのMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。【０３６１】
5’-TTTTTT(fPA)TTTTTT-3’について分子式C137H173N29O88P12、[M-H]-の計算値 4004.7、実測値 4005.2（配列番号32）
5’-TTTTCTT(fPA)TCCTTTT-3’について分子式C154H196N36O99P14、[M-H]-の計算値 4568.0、実測値 4568.5（配列番号33）
＜20. 使用例10: 8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシン(fPA)を含むDNAオリゴマー＞
［使用例10-1：8-(2-ホルミルフェニル)-2’-デオキシアデノシン(fPA)を含むDNAオリゴマーのメチルアミンによる切断反応と生成物の同定］
スクリューチューブに300μLの5’-T6(fPA)T6-3’又は5’-TTTTCTT(fPA)TCCTTTT-3’の水溶液(ストランド濃度 100μM)と300μLのメチルアミン（40% 水溶液）とを加え、水浴中で70℃、6時間加熱した。反応後は、メチルアミンを遠心濃縮装置で減圧留去し、逆相HPLCにより分析して生成物を分取した(5-20% CH3CN/50 mM ギ酸アンモニウム水溶液, 20分, 254 nmで検出)。分取した生成物は、MALDI TOF-MSにより分子量を測定した。【０３６２】
合成した各DNAオリゴマーの反応後の逆相HPLCクロマトグラムを図71及び72に示す。【０３６３】
各DNAオリゴマーにおける生成物1及び2のMALDI TOF-MSのデータは以下の通りである。以下において、「RNu」は、切断反応に伴って生成するfPA由来の部分を意味する。【０３６４】
5’-TTTTTT(fPA)TTTTTT-3’について
生成物1：pTTTTTT  分子式C60H80N12O43P6 FW 1843.2 [M-H]- 1842.2 実測値 1842.0と4019.5(後者の分子量ピークの方が大きい)
HPLCの保持時間 12.1分
生成物2：TTTTTTpRNu  分子式C66H91N13O45P6 FW 1972.3 [M-H]- 1971.3 実測値 1971.2
HPLCの保持時間 13.9分
5’-TTTTCTT(fPA)TCCTTTT-3’について
生成物1：pTCCTTTT  分子式C68H91N16O48P7 FW 2117.3 [M-H]- 2116.3 実測値 2116.2
HPLCの保持時間11.1分
生成物2：TTTTCTTpRNu  分子式C75H103N16O51P7 FW 2261.5 [M-H]- 2260.5 実測値 2260.6
HPLCの保持時間 13.2分
生成物の分子量より、5’-T6(fPA)T6-3’に関しては、生成物1と同じ保持時間に別の生成物が同時に溶出されたことが予想される。メチルアミンとアデノシン類似体上のアルデヒドにより、安定なイミン(分子式C138H176N30O87P12、分子量4018.7)の生成が予想される。【０３６５】
メチルアミンによるDNAオリゴマーの分解反応を下記に示す。下記反応式において、左側の生成物が生成物2に、右側の生成物が生成物1に、それぞれ対応する。
【化６０】
2013150902.tif 000062
【０３６６】
前記の反応式において、A及びCは、上記で定義された式Iと同様の意味である。生成物の分子量より、RNuは、分解したヌクレオチドに求核剤が一分子付加して非天然型塩基が除去されてできたものと予想される。【０３６７】
fPG又はfPAを含むオリゴデオキシヌクレオチドは、下記のような分子内環化反応を生じながら非天然塩基に由来する部分が脱離して、切断されると考えられる。下記反応式は、fPGを含むオリゴデオキシヌクレオチドの場合であるが、fPAを含むオリゴデオキシヌクレオチドの場合も同様の反応が進行すると考えられる。
【化６１】
2013150902.tif 000063
【０３６８】
＜21. 使用例11: 5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応による比較的長いDNAの増幅及び切断と増幅産物の連結反応＞
［使用例11-1：5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるDNAの増幅］
合成例3と同様の手順で、下記の塩基配列を有する5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNAオリゴマーを合成した。【０３６９】
LL1：  5’-AGG(Pa)GCTTTATGACTCTGCCG-3’（配列番号34）
LL2：  5’-AGGTGCTTTA(Pa)GACTCTGCCG-3’（配列番号35）
LL3：  5’-ACCGAAGCG(Pa)GGTGTTTACGAAGG-3’（配列番号36）
LL4：  5’-AGCG(Pa)GGTGTTTACGAAGG-3’（配列番号37）
LL5：  5’-ACGC(Pa)TCGGTATCGCTCTG-3’（配列番号38）
LL6：  5’-ACGCTTCGG(Pa)ATCGCTCTG-3’（配列番号39）
LL7：  5’-ATAAAGCACC(Pa)CGGTGGTGAAAGG-3’（配列番号40）
LL8：  5’-ACC(Pa)CGGTGGTGAAAGGGCAG-3’（配列番号41）
鋳型DNAとして、λDNA(New England BioLabs社製  カタログ番号 N3011)を、酵素としてKOD FX Neo(TOYOBO 社製  カタログ番号 KFX-201)を用い、前記DNAオリゴマーをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ストランド濃度10μM プライマーを2μL×2、1 ng/μL λDNAを1μL、各2 mM dNTPsを10μL、 KOD Fx neo(東洋紡社製  KFX-201)を1 μL（1 U）、及び製品添付のバッファー（×2）を25μL、ポリメラーゼ連鎖反応用チューブに加えた。前記反応用チューブを、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradient(Takara社製サーマルサイクラ―、カタログ番号 TP600)に装着し、94℃, 2分→[98℃, 10秒→60℃, 30秒→68℃, 2分]×30→4℃の温度サイクルで反応させて、約1.5 kb及び約2.3 kbのDNAを増幅した。LL1又はLL2とLL3又はLL4とのプライマーセットを用いることにより、約1.5 kbのDNAが、LL5又はLL6とLL7又はLL8とのプライマーセットを用いることにより、約2.3 kbのDNAが、それぞれ増幅された。ポリメラーゼ連鎖反応後の反応溶液（0.5μL）を、1％アガロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色して、DNAを蛍光検出した。エチジウムブロマイド染色後のゲルを図73に示す。なお、図中の写真は、白黒を反転させている。【０３７０】
図73において、レーン1のバンドは、DNAマーカー（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500及び2072 bp、強く現れたバンドは、600、1500及び2072 bpのDNAである）を示す。レーン2のバンドは、LL1及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAを示しており、レーン3のバンドは、LL2及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAを示しており、レーン4のバンドは、LL5及びLL8をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAを示しており、レーン5のバンドは、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAを示している。【０３７１】
［使用例11-2：5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNA増幅産物の切断反応及び得られた5’末端リン酸化DNA断片の連結反応（1）］
使用例11-1で調製された2種類のDNA増幅産物を当量混合した。得られた混合物に、1体積分の40％メチルアミン水溶液を加えて、よく混合した。得られた混合物を、25℃で2日間(48時間)静置した。遠心濃縮装置を用いて、加熱せずにメチルアミンを前記溶液中から除去した。その後、水を加えて、元の反応溶液と同じ体積に調製した。この溶液を2μL、水を6.5μL、Taq DNAリガーゼ（New England BioLabs社製  カタログ番号 M0208S）を0.5μL、及び製品添付のバッファー（×10）を1μL、ポリメラーゼ連鎖反応用チューブに加えた。前記反応用チューブを、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradient(Takara社製サーマルサイクラ―、カタログ番号 TP600)に装着し、[80℃, 1分→45℃, 5分]×10、20又は30→4℃の温度サイクルで反応させて、DNAを連結した。連結反応後の反応溶液（4μL）を、1％アガロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色して、DNAを蛍光検出した。エチジウムブロマイド染色後のゲルを図74に示す。なお、図中の写真は、白黒を反転させている。【０３７２】
図74において、レーン1のバンドは、DNAマーカー（0.5, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10及び12 kb）を示す。レーン2及び3のバンドは、10回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン4及び5のバンドは、20回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン6及び7のバンドは、30回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物のDNAを示している。また、レーン2、4及び6のバンドは、LL1及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン3、5及び7のバンドは、LL2及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示している。【０３７３】
図74に示すように、1.5 kb及び2.3 kbの原料DNAを連結反応させることにより、3.8 kbのDNAのバンドが確認された。これは、メチルアミン処理によりDNAが切断されて、1ヌクレオチドギャップ（欠損部位）を有する二つのDNA鎖のハイブリダイゼーションがライゲーションのための加熱及び冷却のサイクル中におきたことを示唆している。リガーゼにより、二つのDNA間に共有結合が生じていると考えられる。しかしながら、どの程度の割合で、リガーゼにより二つのDNAが共有結合で結ばれたかは、アガロースゲル電気泳動による分析の結果のみからは不明である。ハイブリダイズしたDNAを大腸菌などに導入すると、連結されていない場合のニック（切れ目）は一般に修復される。【０３７４】
連結前のDNAと連結後のDNAとを比較するために、これらのDNAを一緒に1％アガロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色して、DNAを蛍光検出した。エチジウムブロマイド染色後のゲルを図75に示す。なお、図中の写真は、白黒を反転させている。【０３７５】
図75において、レーン1のバンドは、DNAマーカー（0.5, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10及び12 kb）を示す。レーン2及び3のバンドは、メチルアミン処理を9時間行ってDNAの切断反応を行った場合の切断反応産物のDNAを示しており、レーン4及び5のバンドは、メチルアミン処理を24時間行ってDNAの切断反応を行った場合の切断反応産物のDNAを示しており、レーン6及び7のバンドは、メチルアミン処理を48時間行ってDNAの切断反応を行った場合の切断反応産物のDNAを示している。レーン8及び9のバンドは、メチルアミン処理を48時間行ってDNAの切断反応を行った後、30回の温度サイクルで連結反応を行った場合の連結反応産物のDNAを示している。また、レーン2、4、6及び8のバンドは、LL1及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを切断反応させた場合の切断反応産物のDNA又は切断反応及び連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン3、5、7及び9のバンドは、LL2及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを切断反応させた場合の切断反応産物のDNA又は切断反応及び連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示している。【０３７６】
DNA増幅産物の切断反応において、DNA増幅産物にメチルアミンを加えて加熱した場合、DNAがアルカリ変性し、鮮明なバンドが検出されなかった。これに対し、図74及び75に示すように、DNA増幅産物をメチルアミン存在下、25℃で反応させた場合、DNAのアルカリ変性が抑えられたことが確認された。また、図75に示すように、連結反応前の状態では、原料DNAを混合しても、連結反応産物に相当する3.8 kbのDNAバンドは生じないことが確認された。これは、切断後のDNAの末端部分には、切断で生じた短いDNA断片が結合しており、切断後のDNAをただ混合したのみではDNAの末端部分同士がハイブリダイゼーションしにくい状態にあることを示唆している。【０３７７】
5位置換2'-デオキシウリジン誘導体は、DNAの複製反応の基質又は鋳型として適していることが知られており、5位置換2’-デオキシウリジン三リン酸を利用したDNAの複製反応の報告は数多い（例えば非特許文献74〜76）。Paと類似の構造の5-(1-プロピニル)-2’-デオキシウリジン三リン酸を利用するDNAの複製及び増幅反応も報告されており、比較的高い忠誠度で複製反応が効率よく進行することが知られている（非特許文献77）。これまで、Paを鋳型とするDNA複製反応の報告は存在しなかった。本使用例で、DNAの連結が確認されたので、Paを鋳型としてDNAの伸長が起きたことが示唆される。【０３７８】
［使用例11-3：5-エチニル-2’-デオキシウリジン（Pa）を含むDNA増幅産物の切断反応及び得られた5’末端リン酸化DNA断片の連結反応（2）］
使用例11-2では、2種類のDNA増幅産物の片側の末端のみが完全に相補的で連結されるように、DNA増幅産物の組み合わせを選択した。本使用例では、2種類のDNA増幅産物の両側の末端が相補的で連結されるように、DNA増幅産物の組み合わせを選択した。使用例11-2と同様の手順でメチルアミン処理したDNAの混合溶液を2又は4μL、水を6.5又は4.5μL、Taq DNAリガーゼ（New England BioLabs社製  カタログ番号 M0208S）又はT4 DNAリガーゼ（New England BioLabs社製  カタログ番号 M0202S）を0.5μL、及び製品添付のバッファー（×10）を1μL、ポリメラーゼ連鎖反応用チューブに加えた。Taq DNAリガーゼを用いる場合、前記反応用チューブを、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradient(Takara社製サーマルサイクラ―、カタログ番号 TP600)に装着し、[80℃, 1分→45℃, 5分]×30→4℃の温度サイクルで反応させて、DNAを連結した。T4 DNAリガーゼを用いる場合、前記反応用チューブを、25℃で18時間静置することにより、DNAを連結した。連結反応後の反応溶液（4又は2μL）を、1％アガロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色して、DNAを蛍光検出した。エチジウムブロマイド染色後のゲルを図76に示す。なお、図中の写真は、白黒を反転させている。【０３７９】
図76において、レーン1のバンドは、DNAマーカー（0.5, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10及び12 kb）を示す。レーン2、3、6及び7のバンドは、LL1及びLL4をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL5及びLL8をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン4、5、8及び9のバンドは、LL2及びLL3をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAと、LL6及びLL7をプライマーセットとして用いた場合の増幅産物のDNAとを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示している。レーン2〜5のバンドは、T4 DNAリガーゼを用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン6〜9のバンドは、Taq DNAリガーゼを用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示している。また、レーン2、4、6及び8のバンドは、2μLの前記増幅産物のDNAの混合溶液を用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示しており、レーン3、5、7及び9のバンドは、4μLの前記増幅産物のDNAの混合溶液を用いてDNAを連結反応させた場合の連結反応産物のDNAを示している。【０３８０】
図76に示すように、本発明の切断反応によって長い突出末端を形成させたDNAを、Taq DNAリガーゼを用いて連結反応させた場合（レーン8及び9）に、最も効率よくDNAがハイブリダイゼーション又は連結されて、非常に長いDNAを生成したことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０３８１】
本発明の方法により、化学反応によって低コスト且つ簡単な実験操作でDNA鎖の切断を行い、さらにポリヌクレオチドキナーゼのような酵素法又はリン酸化アミダイトを用いる合成DNAの末端リン酸化法と比較してより高収率で末端がリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを得ることが可能となる。【０３８２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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