(57)【要約】  従来知られたアマドリアーゼよりも優れた耐熱性を有するアマドリアーゼを提供する。  配列番号１に示すコニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属由来のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基、１５１位、４３位、５３位、２６７位、３５０位、１８５位、１９６位、２９９位、および３２３位よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換または欠失を有するアマドリアーゼを提供する。  常温流通や長距離輸送、酵素センサーの製造等に供し、より過酷な温度条件にさらされた場合でも保存安定性に優れた酵素および糖化ヘモグロビン測定キットを提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および置換のうちの１以上が導入されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ａ）から（ｊ）：
（ａ）カルボキシル末端からの３アミノ酸残基；
（ｂ）１５１位のアラニン；
（ｃ）４３位のフェニルアラニン；
（ｄ）５３位のヒスチジン；
（ｅ）２６７位のフェニルアラニン；
（ｆ）３５０位のスレオニン；
（ｇ）１８５位のアラニン；
（ｈ）１９６位のグルタミン酸；
（ｉ）２９９位のセリン；
（ｊ）３２３位のバリン
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換または欠失を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、ｐＨ７．０において５５℃、３０分間の熱処理後の残存活性（％）が向上しているアマドリアーゼ。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
（ｋ）カルボキシル末端からの３アミノ酸残基が欠失しているか、
以下の（ｌ）から（ｔ）：
（ｌ）１５１位のアラニンがシステインに置換されている；
（ｍ）４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換されている；
（ｎ）５３位のヒスチジンがアスパラギン、チロシンに置換されている；
（ｏ）２６７位のフェニルアラニンがチロシンに置換されている；
（ｐ）３５０位のスレオニンがアラニンに置換されている；
（ｑ）１８５位のアラニンがセリンに置換されている；
（ｒ）１９６位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されている；
（ｓ）２９９位のセリンがスレオニンに置換されている；又は
（ｔ）３２３位のバリンがグルタミン酸に置換されている；
のいずれかに記載されるアミノ酸残基へと置換されており、前記置換または欠失を有する位置以外の位置で数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および置換のうちの１以上が導入されたアミノ酸配列を有し、前記置換または欠失を有する前のアマドリアーゼと比較して、ｐＨ７．０において５５℃、３０分間の熱処理後の残存活性（％）が向上しているアマドリアーゼ。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、以下の（ｕ）から（ａｅ）：
（ｕ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換および２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｖ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換および１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（ｗ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ｘ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換および２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｙ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ｚ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ａａ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ａｂ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換および３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
（ａｃ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換および３２３位のバリンに対応する位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換；
（ａｄ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ａｅ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換または欠失を有し、前記置換または欠失を有する位置以外の位置で数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および置換のうちの１以上が導入されたアミノ酸配列を有し、前記置換または欠失を有する前のアマドリアーゼと比較して、ｐＨ７．０において６０℃、３０分間の熱処理後の残存活性（％）が向上しているアマドリアーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
以下の工程：
（ｉ）請求項５記載の宿主細胞を培養する工程；
（ii）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（iii）培養物からアマドリアーゼを単離する工程
を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化タンパク質の測定に用いるためのキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る耐熱性に優れたアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡならびに耐熱性に優れたアマドリアーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）もしくはα−フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照。）。実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、正確な測定値が得られないという課題があり、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。【０００６】
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。【０００７】
アマドリアーゼを糖尿病の臨床診断用酵素としてキット試薬に処方する上で要望される性質のひとつに、良好な熱安定性が挙げられる。
実際の測定条件は個々に異なるが、公知の文献中に各種アマドリアーゼの熱安定性に関する開示がみられる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ＧＰ１株由来の真核型アマドリアーゼは、４５℃、１０分間の熱処理で約４０％の残存活性を示す（例えば、非特許文献４参照。）。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓ−１Ｆ４株由来の真核型アマドリアーゼの４５℃、５分間の熱処理後における残存活性は約１０％である（例えば、非特許文献１２参照。）。また、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ  ＡＴＣＣ３６５４７株由来の真核型アマドリアーゼは、３７℃、１０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．  ＴＯ６株、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＹＨ８０７株、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ７４８０株、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ  ｈｅｒｂａｒｕｍ  ＮＢＲＣ３２０１２株、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｕｓ  ＮＢＲＣ６１５８株由来の各真核型アマドリアーゼは、４０℃、３０分間の熱処理後に８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＮＢＲＣ７５９０株由来の真核型アマドリアーゼは、４５℃、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ  ＹＨ９２３株由来の真核型アマドリアーゼは、５０℃、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。カルボキシル末端領域の３４〜３９アミノ酸残基を欠損させたＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｓ由来アマドリアーゼは、４５℃、１０分間の熱処理で４０％の残存活性を示している（例えば、特許文献１２参照。）。Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ  １８５４７株またはＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ９３３０株由来のアマドリアーゼは、４５℃、１０分間の熱処理で８０％以上の残存活性を示している（例えば、特許文献８参照。）。【０００８】
上述のようなアマドリアーゼタンパク質の数個のアミノ酸を置換することにより熱安定性をさらに向上させた耐熱性アマドリアーゼも提案されている。具体的には、変異型Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０株由来アマドリアーゼおよび変異型Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ１８５４７株由来アマドリアーゼ、変異型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ株由来アマドリアーゼ、変異型Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ株由来アマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１６、１７参照。）。中でも、特許文献１６において開示されている大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株が生産する変異型アマドリアーゼ（以降「ＣＦＰ−Ｔ９」と表す。）は、従来のアマドリアーゼと比較して非常に優れた熱安定性を示し、５０℃、６０分間の熱処理においても１００％の残存活性を維持することが示されている。また、特許文献１７において開示されているＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ株由来変異型アマドリアーゼＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙは、５０℃、１０分間の熱処理において９２％の残存活性を維持することが示されている。【０００９】
しかしながら、常温流通や長距離輸送等、酵素が処方されたキットがより過酷な温度条件にさらされることを想定した場合、あるいは、製造工程において加熱処理等を施すことが想定される酵素センサーとしての用途等を考えた場合には、これまでに提案されたアマドリアーゼよりも、さらに優れた耐熱性、少しでも向上した耐熱性を有する酵素に対する強いニーズが依然として存在する。そのような耐熱性酵素は、酵素およびキットの流通において、また、センサー等の用途開発において、多大に貢献することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特許第４２３１６６８号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２００７／１２５７７９号
【特許文献１７】特開２０１０−１１５１８９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  １０４−１１，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，  ３５８−６６，  ２０１０
【非特許文献３】Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０２，  ２４１−３，  ２００６
【非特許文献４】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２，  ４９９−５０５，  １９９６
【非特許文献５】Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８，３４４−５０，２００２
【非特許文献６】Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，６２５−３２，２００４
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，  ４８７−９１，１９９５
【非特許文献８】Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４，  ８１３−８１９，  ２００７
【非特許文献９】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  １２５６−６１，  ２００２
【非特許文献１０】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  ２３２３−２９，  ２００２
【非特許文献１１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７，  ２７−３２，２００５
【非特許文献１２】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  ４８７−９１，  １９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、従来のアマドリアーゼより熱安定性が優れたアマドリアーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記課題解決のため、先に出願人が見出した上述のＣＦＰ−Ｔ９をベースにさらなる耐熱性向上変異体の取得を試み、鋭意研究を重ねた結果、特定のアミノ酸残基の置換および／または欠失を導入することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および置換のうちの１以上が導入されたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ａ）から（ｊ）：
（ａ）カルボキシル末端からの３アミノ酸残基；
（ｂ）１５１位のアラニン；
（ｃ）４３位のフェニルアラニン；
（ｄ）５３位のヒスチジン；
（ｅ）２６７位のフェニルアラニン；
（ｆ）３５０位のスレオニン；
（ｇ）１８５位のアラニン；
（ｈ）１９６位のグルタミン酸；
（ｉ）２９９位のセリン；
（ｊ）３２３位のバリン
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換または欠失を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、ｐＨ７．０において５５℃、３０分間の熱処理後の残存活性（％）が向上しているアマドリアーゼ。
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
（ｋ）カルボキシル末端からの３アミノ酸残基が欠失しているか、
以下の（ｌ）から（ｔ）：
（ｌ）１５１位のアラニンがシステインに置換されている；
（ｍ）４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換されている；
（ｎ）５３位のヒスチジンがアスパラギン、チロシンに置換されている；
（ｏ）２６７位のフェニルアラニンがチロシンに置換されている；
（ｐ）３５０位のスレオニンがアラニンに置換されている；
（ｑ）１８５位のアラニンがセリンに置換されている；
（ｒ）１９６位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されている；
（ｓ）２９９位のセリンがスレオニンに置換されている；又は
（ｔ）３２３位のバリンがグルタミン酸に置換されている；
のいずれかに記載されるアミノ酸残基へと置換されており、前記置換または欠失を有する位置以外の位置で数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および置換のうちの１以上が導入されたアミノ酸配列を有し、前記置換または欠失を有する前のアマドリアーゼと比較して、ｐＨ７．０において５５℃、３０分間の熱処理後の残存活性が向上しているアマドリアーゼ。
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、以下の（ｕ）から（ａｅ）：
（ｕ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換および２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｖ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換および１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（ｗ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ｘ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換および２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｙ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ｚ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ａａ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ａｂ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換および３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
（ａｃ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換および３２３位のバリンに対応する位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換；
（ａｄ）１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失；
（ａｅ）４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換または欠失を有し、前記置換または欠失を有する位置以外の位置で数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および置換のうちの１以上が導入されたアミノ酸配列を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、ｐＨ７．０において６０℃、３０分間の熱処理後の残存活性（％）が向上しているアマドリアーゼ。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
（５）上記（４）記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（６）上記（５）記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（７）以下の工程：
（ｉ）上記（６）記載の宿主細胞を培養する工程；
（ii）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；
（iii）培養物からアマドリアーゼを単離する工程
を含むアマドリアーゼを製造する方法。
（８）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化タンパク質の測定に用いるためのキット。
（９）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る熱安定性の優れたアマドリアーゼおよびそれをコードする遺伝子等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。【００１８】
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、熱安定性が向上したアマドリアーゼの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号１と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。なお、請求の範囲に記載された、熱安定性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。【００１９】
熱安定性が改変されたアマドリアーゼの変異体（改変体）は、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する、または付加する、または欠失させることによって得ることができる。
熱安定性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（１）カルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失。
（２）１５１位のアラニンの置換、例えば、システインへの置換。
（３）４３位のフェニルアラニンの置換、例えば、チロシンへの置換。
（４）５３位のヒスチジンの置換、例えば、アスパラギン、チロシンへの置換。
（５）２６７位のフェニルアラニンの置換、例えば、チロシンへの置換。
（６）３５０位のスレオニンの置換、例えば、アラニンへの置換。
（７）１８５位のアラニンの置換、例えば、セリンへの置換。
（８）１９６位のグルタミン酸の置換、例えば、アスパラギン酸への置換。
（９）２９９位のセリンの置換、例えば、スレオニンへの置換。
（１０）３２３位のバリンの置換、例えば、グルタミン酸への置換。【００２０】
熱安定性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換や欠失を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換または欠失を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換または欠失の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０を有している。
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換または欠失を有している変異体が好ましい。
（１１）１５１位のアラニンの置換および２９９位のセリンの置換、例えば、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換および２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換を有する変異体。
（１２）４３位のフェニルアラニンの置換および１５１位のアラニンの置換、例えば、４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換および１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換を有する変異体。
（１３）４３位のフェニルアラニンの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失、例えば、４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失を有する変異体。
（１４）１５１位のアラニンの置換、１９６位のグルタミン酸の置換および２９９位のセリンの置換、例えば、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換および２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換を有する変異体。
（１５）１５１位のアラニンの置換、２９９位のセリンの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失、例えば、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失を有する変異体。
（１６）４３位のフェニルアラニンの置換、３５０位のスレオニンの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失、例えば、４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失を有する変異体。
（１７）４３位のフェニルアラニンの置換、１５１位のアラニンの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失、例えば、４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失を有する変異体。
（１８）４３位のフェニルアラニンの置換、１５１位のアラニンの置換および３５０位のスレオニンの置換、例えば、４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換および３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換を有する変異体。
（１９）１５１位のアラニンの置換、１９６位のグルタミン酸の置換、２９９位のセリンの置換および３２３位のバリンの置換、例えば、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換および３２３位のバリンに対応する位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を有する変異体。
（２０）１５１位のアラニンの置換、１９６位のグルタミン酸の置換、２９９位のセリンの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失、例えば、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸のスレオニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失を有する変異体。
（２１）４３位のフェニルアラニンの置換、１５１位のアラニンの置換、３５０位のスレオニンの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失、例えば、４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸のチロシンへの置換、１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換およびカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の欠失。【００２１】
本発明の熱安定性の優れたアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、上記の熱安定性の向上をもたらすアミノ酸の置換を有し、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されたアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、熱安定性が向上したアマドリアーゼ変異体を包含する。さらに、上記の熱安定性の向上をもたらすアミノ酸の置換変異、基質特異性等、熱安定性以外の性質を向上させるアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列における前記置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、熱安定性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。【００２２】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、特許文献１６においてｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９と称する組換え体プラスミドを保持する大腸菌が生産するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ９）であり、先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである。このＣＦＰ−Ｔ９は、天然型のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対し、１８４位、２６５位、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した５重変異体である。【００２３】
ＣＦＰ−Ｔ９は、既存の各種アマドリアーゼと比較して非常に高い耐熱性を有しているため、出願人は、さらに優れた耐熱性を有するアマドリアーゼを取得するための改変元酵素の例としてＣＦＰ−Ｔ９が好適であると考え、これを用いて変異点の探索を開始した。このような新規な変異点に関する情報は、各種のアマドリアーゼに耐熱性を付与するための手引きとなる価値を有する。ＣＦＰ−Ｔ９のように既に多数の耐熱性向上等に関する変異点を具備した特定の変異体に追加的に導入される場合であれ、特段に人為的な変異を導入していない天然型酵素に対して導入される場合であれ、変異を導入する前と比較してその耐熱性が向上している限り、本発明の変異を導入した際に熱安定性が向上した改変後のアマドリアーゼは、本発明に包含される。【００２４】
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。【００２５】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。【００２６】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。【００２７】
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特許文献８、１６）の例などが挙げられる。【００２８】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡがｐＫＫ２２３−３  Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・バイオテク社製）に挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特許文献８）が挙げられる。【００２９】
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。【００３０】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。【００３１】
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法 （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。【００３２】
また、一般的なＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。【００３３】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。【００３４】
（形質転換・形質導入）
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ社製）、大腸菌ＢＬ２１株（ニッポンジーン社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。【００３５】
取得した形質転換体から、熱安定性が向上したアマドリアーゼの生産株を選抜するためには任意の方法を用いればよいが、例えば、次のような方法を用いることができる。まず、得られた上記形質転換体がコロニーを形成したＬＢ寒天培地から滅菌したビロード生地等で新しい寒天培地にレプリカを数枚とり、培養する。レプリカをとった寒天培地のコロニーが十分な大きさになったら、リゾチームなどの溶菌剤に浸した膜を培地に重ね、３７℃で、１時間ほど静置し、溶菌させる。このとき溶菌した粗酵素液が膜に吸着する。【００３６】
上述のように粗酵素液を吸着させた膜を、熱安定性を評価する適当な温度条件、例えば、５５℃の条件で３０分間静置した後、基質であるフルクトシルバリン、パーオキシダーゼ、ＴＯＯＳ、４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に浸した膜と重ね合わせ、紫色の発色の度合を観察する。改変前のアマドリアーゼ生産株についても同様の工程で発色試験を行い、その比較により目的とする形質転換体を選抜する。改変前のアマドリアーゼが顕著に失活するような温度条件を選択して熱処理を行うことにより、改変前のアマドリアーゼ生産株のコロニーの発色度合は低くなる。これと比較して発色度合が高いコロニーを選抜することにより、熱安定性が向上した改変型アマドリアーゼを生産するコロニーを選抜することができる。【００３７】
必要により、上述のようにして得た熱安定が向上したアマドリアーゼを生産する形質転換体を用い、上記に示した改変方法により、さらに変異導入を繰り返すことにより、さらに熱安定性の優れた変異型アマドリアーゼおよびその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。【００３８】
例えば、このようにして得られた熱安定性の優れたアマドリアーゼを生産する形質転換体の一例として、ｐＨ７．０において５５℃、３０分間または６０℃、３０分間の熱処理後の残存活性（％）が向上したアマドリアーゼを生産する微生物としては、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１６）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２０）株、（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２６）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３０）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２）株を挙げることができる。【００３９】
（アミノ酸配列の相同性）
アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。【００４０】
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。【００４１】
図１に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７５％以上の相同性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。図１からＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図１には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ（配列番号１６）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２６）、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２７）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２８）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２９）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３０）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号２０）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３１）、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３２）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３３）のアミノ酸配列を示してある。【００４２】
（置換箇所に対応する位置）
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４３位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４３位のフェニルアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。【００４３】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは４３位のチロシン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のチロシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のチロシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４２位のシステイン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のチロシン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のチロシンである。【００４４】
また、「配列番号１記載のアマドリアーゼの５３位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の５３位のヒスチジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００４５】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは５３位のヒスチジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５２位のチロシン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のチロシンである。【００４６】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１５１位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１５１位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００４７】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１５１位のグリシン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５１位のアラニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１４９位のアラニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５０位のグリシン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５１位のアラニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５１位のグリシンである。【００４８】
また、「配列番号１記載のアマドリアーゼの１８５位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１８５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００４９】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１８５位のアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８５位のアラニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１８３位のアラニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８４位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８５位のアラニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８５位のアラニンである。【００５０】
また、「配列番号１記載のアマドリアーゼの１９６位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１９６位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００５１】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のグリシン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のグリシン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１９４位のグリシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９５位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９６位のグリシン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸である。【００５２】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６７位のフェニルアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００５３】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６３位のフェニルアラニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニンである。【００５４】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２９９位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２９９位のセリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００５５】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２９９位のセリン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２９７位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３００位のアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２９７位のアラニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２９９位のアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９９位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２９５位のアラニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９９位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９７位のアラニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９９位のセリンである。【００５６】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３２３位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３２３位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００５７】
すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３２３位のバリン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３２１位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３２４位のグルタミン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３２１位のリジン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３２３位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２３位のアラニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３１９位のバリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２３位のバリン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２１位のバリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２３位のグルタミン酸である。【００５８】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５０位のスレオニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５０位のスレオニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００５９】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３５０位のスレオニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３４８位のスレオニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３５１位のスレオニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３４８位のスレオニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３５０位のスレオニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５０位のスレオニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４６位のスレオニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５０位のスレオニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４８位のスレオニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５０位のスレオニンである。【００６０】
（カルボキシル末端の欠失箇所に対応する位置）
「配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を意味するものである。Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。【００６１】
すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジンおよび４３７位のロイシンからなり、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリジンおよび４５２位のロイシンからなり、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギンおよび４３７位のロイシンからなり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリジンおよび４４１位のロイシンからなり、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンからなっている。【００６２】
なお、真核生物においては、タンパク質をペルオキシソームへ輸送するためのシグナル配列であり、カルボキシル末端の３アミノ酸から構成されるモチーフである「ペルオキシソーム移行シグナル（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ１；ＰＴＳ１）配列」が知られている。よく知られた公知のＰＴＳ１モチーフとしては、（プロリン／セリン／アラニン／システイン）−（リジン／ヒスチジン／アルギニン／アスパラギン）−（ロイシン／メチオニン）配列からなるモチーフがある（例えば、ＦＥＢＳ  Ｊ．，  ２７２，  ２３６２（２００５）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３８，  ７５９  （１９９７），  Ｅｕｒ．  ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７１，  ２４８  （１９９６）参照。）。具体的な検証までは行っていないが、この知見に基づけば、熱安定性向上に寄与する本発明の変異箇所のひとつである「配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」の領域が、アマドリアーゼにおけるいわゆるＰＴＳ１モチーフの領域に相当している可能性も示唆され得る。【００６３】
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた熱安定性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。【００６４】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。
また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。【００６５】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。【００６６】
（本発明のアマドリアーゼにおける熱安定性の向上）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して熱安定性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、本明細書中に記載の活性測定方法および熱安定性評価方法に記載した反応条件下で、所定の熱処理、例えば、「５５℃、３０分間」あるいは「６０℃、３０分間」等の熱処理後の残存活性（％）が、本発明の変異を導入する前と比較して向上していることを特徴とする。【００６７】
残存活性（％）の向上度合は限定されないが、例えば、本発明の変異を導入する前後の残存活性（％）同士の数値比較において３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは４０％以上向上しているアマドリアーゼが本発明に包含される。あるいは、本発明の変異を導入後の残存活性（％）を本発明の変異を導入前の残存活性（％）で割ることにより得られる値（残存活性比率）が、１より大きい、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは５０以上であるアマドリアーゼが本発明に包含される。【００６８】
実際には、測定時の温度条件に加えて、変異導入前のアマドリアーゼの熱安定性の程度によっても相対的な評価結果は異なってくるため、残存活性（％）や残存活性比率数値の大小のみを比較して、各変異体の絶対的な熱安定性を評価することは難しい。本発明のアマドリアーゼの選抜を容易にする意図から変異導入前のアマドリアーゼの残存活性（％）が十分に低く算出される加温条件を選択することにより、一般的には、残存活性（％）の向上度合および残存活性比率が高く算出される傾向を有する。【００６９】
例えば、本発明に包含される、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１６）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２０）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２１）株が生産する本発明のアマドリアーゼを、ｐＨ７．０において５５℃、５０分間の熱処理に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ９の残存活性が約５３％であるのに対し、５５％を上回り、より高いものでは６０％を上回り、さらにより高いものでは８０％を上回る残存活性を示す。また、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２６）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３０）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２）株が生産する本発明のアマドリアーゼを、ｐＨ７．０において６０℃、３０分間の熱処理に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ９の残存活性が約０．３４％であるのに対し、２％を上回り、より高いものでは２０％を上回り、さらにより高いものでは３０％を上回り、さらにより高いものでは４０％を上回り、さらにより高いものでは５０％を上回り、さらにより高いものでは６０％を上回る残存活性を示す。このように熱安定性が向上したアマドリアーゼは、該酵素含有製品等における保存性が著しく向上し、また、製造工程において熱にさらされた場合にも安定であるため、産業上非常に有利である。【００７０】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。【００７１】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。【００７２】
以下、本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特許文献３参照）。【００７３】
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度 ５ｍＭ）
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。【００７４】
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１，１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝  ｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）
ΔＡｓ  ：  反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ0   ：  対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２：  反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．５  ：  １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ    ：  希釈係数【００７５】
（熱安定性測定方法）
アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約０．５Ｕ／ｍｌとなるように、１０％  キシリトールを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、５５℃にて３０分間加温する。上述のＢ．の方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、加熱前の活性を１００とした場合の残加熱後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求めることにより、熱安定性を評価する。【００７６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの調製
ＣＦＰ−Ｔ９遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株（特許文献１６参照）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］１００ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９のＤＮＡ１００μｇを得た。【００７８】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの改変操作
上記組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９ ＤＮＡ１００μｇのうち、２０μｇを用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｒｅｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）（増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすい）をＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って形質転換し、約１５，０００株の形質転換株を得た。【００７９】
上記の形質転換体の全コロニーからプラスミドＤＮＡを回収するために、上記形質転換体を生育させた寒天培地上に適量のＱＩＡＧＥＮ ｓｏｌ Ｉ（キアゲン社製）を加え、スプレッダーを用いてＱＩＡＧＥＮ ｓｏｌ Ｉとともにコロニーを掻き集め、ピペットマンで溶液を回収し、以降は定法に従いプラスミド回収を行って、改変操作を加えた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９のＤＮＡを１００μｇ得た。そのプラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９ ＤＮＡの２０μｇを用いて、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６〜３３１，１９７９）に従って大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、約３，０００株の改変を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得た。【００８０】
（３）熱安定性に優れたアマドリアーゼの探索
まず、得られた上記形質転換体の全てを、ビロード生地を用いて新しいＬＢ−ａｍｐ寒天培地にレプリカした。レプリカプレート上のコロニーをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に浸した。このＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を５５℃で１時間処理した後、２ｍＭ フルクトシルバリン、４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１ｍｇ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン（東京化成社製）、１０ｍｇ／ｍｌ ＴＯＯＳ（同仁化学社製）を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に浸したところ、少数の強い発色を示す株が認められた。
この強い発色に相当するコロニーをマスタープレート上より選択し、２ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地で液体培養することにより、プラスミドにコードされる改変アマドリアーゼを生産させた。【００８１】
培養後、得られた各菌体を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行うことにより、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。この粗酵素液を用いて、上記の（熱安定性測定方法）に従い、改変アマドリアーゼにおける残存活性（％）（処理後の活性／未処理の活性）を算出した。【００８２】
一方、改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ９）を生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株を同様に培養、抽出、熱処理、活性測定に供してを残存活性（％）を算出し、改変アマドリアーゼにおける残存活性（％）と比較することにより、活性残存率が向上した改変された８つのアマドリアーゼとその生産大腸菌を得ることができた。
得られた８株をＬＢ−ａｍｐ培地２ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養し、この培養液からＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いてプラスミドを単離した。該プラスミドをそれぞれｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１１、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１２、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１３、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１４、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１５、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１７、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１８、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１９と命名し、各プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。
その結果、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１１中には、配列番号１記載のアミノ酸配列の１９６番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１２には、配列番号１記載のアミノ酸配列の２９９番目のセリンがスレオニンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１３には、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２３番目のバリンがグルタミン酸に、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１４中には、配列番号１記載のアミノ酸配列の４３番目のフェニルアラニンがチロシンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１５には、配列番号１記載のアミノ酸配列の５３番目のヒスチジンがアスパラギンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１７には、配列番号１記載のアミノ酸配列の１８５番目のアラニンがセリンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１８には、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７番目のフェニルアラニンがチロシンに、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１９には、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５０番目のスレオニンがアラニンに置換する変異が導入されていることが明らかとなった。【００８３】
（５３位のヒスチジンの点変異試験）
特許文献１７によると配列番号１記載のアミノ酸配列の５３位のヒスチジンに対応する位置であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおける５２位のチロシンをヒスチジンへ置換すると耐熱性が向上すると示されている。そこで、ＣＦＰ−Ｔ９においても同様の効果があるか検証するために、配列番号１記載のアミノ酸配列の５３位のヒスチジンをチロシンへ置換したアマドリアーゼの作製を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを鋳型として、ＣＦＰ−Ｔ９の５３位のヒスチジンをチロシンに置換することを意図して、配列番号３、４のＤＮＡ配列よりなるプライマーを、常法により合成した。次に、上記で得た組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９のＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４のプライマー、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。【００８４】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の５３位のヒスチジンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１６）を得た。【００８５】
（４）公知酵素の構造情報に基づくｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの改変（分子内架橋作製を意図した改変）
タンパク質の熱安定性を向上させるひとつの手法として、タンパク質分子内に新規のジスルフィド結合を構築させる手法が知られている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６，５５５−５５７，１９８４参照）。そこで、ＣＦＰ−Ｔ９タンパク質分子内に新たにジスルフィド結合を構築することを意図し、そのための参考情報を得る目的で、既に結晶構造が報告されているタンパク質の中で、ＣＦＰ−Ｔ９と最もアミノ酸配列の相同性が高いＡｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩの立体構造（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８３，２７００７−２７０１６，２００８参照）を参考にして、ＣＦＰ−Ｔ９の立体構造に関する予測を行うことを試みた。なお、Ａｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩとＣＦＰ−Ｔ９は、アミノ酸配列において３４％の同一性を有している。【００８６】
まず、ＷＥＢ上のマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を利用して、ＣＦＰ−Ｔ９（配列番号１）とＡｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩ（配列番号１５）のアミノ酸配列のアラインメントを行い、ＣＦＰ−Ｔ９に含まれる各システイン残基がＡｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩのアミノ酸配列ではどのアミノ酸残基に対応するか同定した。その結果、ＣＦＰ−Ｔ９の９７位、２００位、２３４位、２３５位、２８０位、３４７位、３４９位、３６０位のシステインに対応するアミノ酸残基は、Ａｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩのアミノ酸配列においては、それぞれ、９９位のセリン、１９７位のバリン、２３１位のロイシン、２３２位のアルギニン、２７８位のシステイン、３３５位のシステイン、３３７位のシステインおよび３４８位のアスパラギン酸であった。【００８７】
続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｐｄｂ.ｏｒｇ/ｐｄｂ/ｈｏｍｅ/ｈｏｍｅ.ｄｏ）より、Ａｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩの結晶構造情報が記載されたＰＤＢファイル（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＤＪＤ）をダウンロードし、立体構造表示ソフトＰｙＭＯＬ  ０．９９ｒｃ６(ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社)にてＡｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩの結晶構造を表示させた。続いて、ＰｙＭＯＬ  ０．９９ｒｃ６上で、９９位のセリン、１９７位のバリン、２３１位のロイシン、２３２位のアルギニンおよび３４８位のアスパラギン酸をシステインに置換して表示させ、２７８位のシステイン、３３５位のシステイン、３３７位のシステインも含めた８ヶ所の各システイン残基が分子内ジスルフィド結合を形成する可能性を調査した。その結果、９９位のセリン、および１４８位のグリシンをシステインに置換した場合に、また、３４８位のアスパラギン酸および３５８位のロイシンをシステインに置換した場合に、両残基の間にジスルフィド結合が形成される可能性が示唆された。また、１４８位のグリシンは、先述のＣＦＰ−Ｔ９とＡｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩのアミノ酸配列のアラインメントの結果より、ＣＦＰ−Ｔ９では１５１位のアラニンに対応し、３５８位のロイシンはＣＦＰ−Ｔ９では３７０位のロイシンに対応していた。【００８８】
上記の情報を参考に、新規ジスルフィド結合の形成によるＣＦＰ−Ｔ９の熱安定性向上を狙い、ＣＦＰ−Ｔ９の１５１位のアラニンをシステインに置換することを意図して、配列番号５、６のＤＮＡ配列よりなるプライマーを、常法により合成した。次に、上記で得た組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９のＤＮＡを鋳型として、配列番号５、６のプライマー、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５１位のアラニンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２０）を得た。【００８９】
（５）公知酵素の配列情報に基づくｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの改変（ＰＴＳ１配列様のカルボキシル末端における３アミノ酸の欠失を意図した改変）
Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンからなる。公知の情報を参考にすれば、この配列は、真核生物においてタンパク質をペルオキシソームへ輸送するためのシグナル配列であり、カルボキシル末端の３アミノ酸から構成されるモチーフであるＰＴＳ１に相当する可能性が示唆される。ＣＦＰ−Ｔ９においてもこの配列が存在しており、この領域がＰＴＳ１に相当する可能性も示唆され得る。【００９０】
いわゆるＰＴＳ１配列を欠失させることと、生産されるタンパク質の熱安定性が向上することとの直接的な関連性を示す知見はこれまで全く知られていない。一方、もしこのアマドリアーゼのカルボキシル末端領域に存在する配列がアマドリアーゼにおけるシグナル配列であるＰＴＳ１配列に相当するものであるとすれば、大腸菌組換え体において発現させるにあたってこのシグナル配列を欠失させた場合でも、アマドリアーゼタンパク質としての発現には何ら悪影響を与えることはないのではないかと予測し、そのような見込みから、この領域を削除した変異体を作製することを試みた。具体的には、配列番号７、８のＤＮＡ配列よりなるプライマーを、常法により合成した。次に、上記で得た組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９のＤＮＡを鋳型として、配列番号７、８のプライマー、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基であるプロリン、リジン、ロイシンが欠失された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２１）を得た。【００９１】
上述のようにして得られた各組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１１、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１２、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１３、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１４、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１５、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１６、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１７、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１８、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１９、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２０、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２１を用いて、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換した。【００９２】
（６）各種改変型アマドリアーゼの生産
得られた大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１６）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ１９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２０）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２１）株を、ＬＢ−ａｍｐ培地で３０℃、２０時間培養した。その後、各菌体をｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。【００９３】
（７）各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、上記の熱安定性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価を行った。結果を表１に示す。表１において、ＣＦＰ−Ｔ９は、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株由来のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ９を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、ＣＦＰ−Ｔ９に既に導入済みの各種変異点は含めていない。【００９４】
【表１】
2013100006.tif 000002
【００９５】
【表２】
2013100006.tif 000003
【００９６】
表１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９の残存活性は５２．６％となった。これに対し、ランダム変異導入により選抜された９つの変異体、すなわち、ＣＦＰ−Ｔ９の１９６番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、または２９９番目のセリンがスレオニンに、または３２３番目のバリンがグルタミン酸にそれぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれも５６％以上に向上し、顕著なものでは６０％以上に向上した。また、表２に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９の残存活性は５２．７％となった。表１と表２においてＣＦＰ−Ｔ９の残存活性の値が異なるが、測定日が異なるためである。ＣＦＰ−Ｔ９の残存活性に対し、ランダム変異導入により選抜された４つの変異体、すなわち、ＣＦＰ−Ｔ９の４３番目のフェニルアラニンがチロシンに、または５３番目のヒスチジンがアスパラギンに、または２６７番目のフェニルアラニンがチロシンに、または３５０番目のスレオニンがアラニンにそれぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれも５５％以上向上し、顕著なものでは６０％以上に向上した。すなわち、これらの各変異点が、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる変異点であることが確認された。また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおける５２位のチロシンをヒスチジンへ置換すると耐熱性が向上すると示されているが、表２に示した通り、ＣＦＰ−Ｔ９の５３位のヒスチジンがチロシンに置換された変異体も耐熱性が向上し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの結果と全く逆の知見が得られた。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとＣＦＰ−Ｔ９は、アミノ酸配列において７４％の同一性であり、相同位置におけるアミノ酸置換によって、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。しかし、ＣＦＰ−Ｔ９の５３位に関しては、この推定が当てはまらず、全く予想しえない事実が示された。【００９７】
また、アマドリアーゼの分子内に新たな架橋作製を形成することによる熱安定性の向上を意図して作製した変異体である、１５１番目のアラニンがシステインに変異したアマドリアーゼにおいても、残存活性が８７％を上回り、顕著な向上がみられた。このデータからは、変異体において実際に分子内架橋が形成され、そのことによってアマドリアーゼタンパク質の熱安定性が非常に向上した可能性が示唆される。【００９８】
今回、発明者らは、幸運にも、実施例に記載するような試みをひとつの手がかりとして、新規な熱安定性向上変異箇所を見出すことができた。しかし、今回発明者らが試みた変異箇所は、公知のアマドリアーゼの構造情報からでは容易に着想し得るものではなかったというべきである。なぜなら、結晶構造が報告されているタンパク質の中で、ＣＦＰ−Ｔ９と最もアミノ酸配列の相同性が高いとしてＡｍａｄｏｒｉａｓｅ ＩＩの情報を参考にしたとはいえ、両者は実際のアミノ酸配列としては３４％の同一性を有しているに過ぎない。このように同一性の低いタンパク質の情報しか参考にできない場合、同一性の高い公知のタンパク質の立体構造情報を基に予測するようには、立体構造や活性部位近傍に位置するアミノ酸の予測がうまくいかないことが、当業者にとって通常的に理解される。すなわち、当業者にとって、この程度まで同一性が低いタンパク質間において、両者が同様な機能を有するであろうと予測することは通常的でない。現実に、この程度の配列同一性検索によりヒットする各種公知のタンパク質が同じ酵素であるとも到底言い難いことも、周知であるからである。【００９９】
実際、実施例に記載の予測においては、１５１位以外の変異位置の候補も想定されていた。例えば、３７０位のロイシンをシステインに置換することによって、３６０位のシステインと分子内架橋を形成するという方法も、予測において同程度に有望であると見込まれた。しかしながら、このような変異を実際に導入してみても、作製した改変型アマドリアーゼの熱安定性は向上しておらず、むしろ若干低下する傾向さえ示した。このような事実からも、同一性の低い公知酵素の情報からでは、必ずしも容易に本発明のような効果的な変異箇所を予測することは容易ではないということが裏付けられる。【０１００】
さらに、いわゆるＰＴＳ１配列に相当する可能性を有する、カルボキシル末端の３アミノ酸を欠失させることにより作製した変異体においても、残存活性（％）が６０％を上回り、顕著な向上がみられた。
これまでに、いわゆるＰＴＳ１配列に相当する領域を欠失させることにより、生産されるタンパク質の熱安定性を向上させることができるという知見は全く知られていない。従って、今回の結果は、発明者らとしても予測し得ない顕著な効果であり、驚くべき結果であった。アマドリアーゼタンパク質のカルボキシル末端の数アミノ酸が実際にいわゆるＰＴＳ１配列に相当し得る領域であるか否かは現状定かではなく、また、この領域を削除することが熱安定性を向上させる具体的な作用機序も現時点では不明であるが、実際に、図１に示す複数のアマドリアーゼをみてもわかるように、アミノ酸としては同一でなくとも、いわゆるＰＴＳ１配列モチーフに相当し得るアミノ酸残基の配列を有しているという視点で見た場合、複数のアマドリアーゼにおいてカルボキシル末端の３アミノ酸の削除によって、同様なシグナル配列領域に相当し得る配列が削除され、これにより各種のアマドリアーゼに関しても効果的に熱安定性を付与できる可能性が示唆され得る。【０１０１】
本発明のこれらの変異点は、単独変異として有効であるのみならず、既に知られている各種公知の変異と組み合わせ、また、本発明の変異同士を組み合わせることによって、実用上の利点を有する変異体を創出することに貢献することが期待される。
【実施例２】
【０１０２】
（耐熱性向上型変異の蓄積）
実施例１で見出された１１の熱安定性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらに熱安定性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、多重変異体（２重変異体、３重変異体、４重変異体）の作製による耐熱性向上型変異の蓄積を試みた。【０１０３】
具体的には、表３に示す各種組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型とし、表３に示す各合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする組み合わせで、実施例１と同様の条件下でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。これにより、１５１位のアラニンがシステインに置換され、かつ２９９位のセリンがスレオニンに置換された二重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２２、１５１位のアラニンがシステインに置換され、１９６位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換され、かつ２９９位のセリンがスレオニンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２３、１５１位のアラニンがシステインに置換され、２９９位のセリンがスレオニンに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２４、１５１位のアラニンがシステインに置換され、１９６位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換され、２９９位のセリンがスレオニンに置換され、かつ３２３位のバリンがグルタミン酸に置換された四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２５、１５１位のアラニンがシステインに置換され、１９６位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換され、２９９位のセリンがスレオニンに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２６を得た。
そして、上記と同様の条件で大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換し、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２６）株を得た。【０１０４】
さらに、表４に示す各種組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型とし、表４に示す各合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする組み合わせで、実施例１と同様の条件下でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。これにより、４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつ１５１位のアラニンがシステインに置換された二重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２７、４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した二重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２８、４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、３５０位のスレオニンがアラニンに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２９、４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１５１位のアラニンがシステインに置換され、３５０位のスレオニンがアラニンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３０、４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１５１位のアラニンがシステインに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３１、４３位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１５１位のアラニンがシステインに置換され、３５０位のスレオニンがアラニンに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２を得た。
そして、上記と同様の条件で大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換し、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３０）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２）株を得た。【０１０５】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２２）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２３）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２４）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２５）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２６）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２７）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２８）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ２９）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３０）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３１）株、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２）株を、上記の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた熱安定性測定方法に従って、ただし、加熱条件に関しては、より厳しい加熱条件である６０℃、３０分間の加熱に変更し、各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価を行った。結果を表３、４に示す。【０１０６】
【表３】
2013100006.tif 000004
【０１０７】
【表４】
2013100006.tif 000005
【０１０８】
表３、４に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９の残存活性はわずか０．３４％、０．３６％であり、このように過酷な温度条件下においては、従来のアマドリアーゼの中でも最も優れた熱安定生を有すると考えられるＣＦＰ−Ｔ９であっても、ほとんど活性を失ってしまうことが確認された。
これに対し、実施例１で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種多重変異体においては、残存活性がいずれも顕著に向上していた。具体的には、４３位のフェニルアラニンがアラニンに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した二重変異体における残存活性は２．５％であり、ＣＦＰ−Ｔ９と比較して向上した。さらに、この変異に３５０位のスレオニンがアラニンに置換された三重変異体における残存活性は４．８％であり、ＣＦＰ−Ｔ９と比較してさらに向上した。また、１５１位のアラニンがシステインに置換されたものにおける残存活性は２６％であり、ＣＦＰ−Ｔ９と比較して顕著に向上した。さらに、この変異に別の変異を順次加えて変異を蓄積して得た二重変異体、三重変異体および四重変異体でも、ＣＦＰ−Ｔ９と比較して顕著に残存活性が向上し、これらの多重変異体が、熱安定性が向上したアマドリアーゼの熱安定性を向上させる変異点であることが確認された。
しかも、１５１位のアラニンがシステインに置換された変異体や４３位のフェニルアラニンがアラニンに置換され、かつカルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失した二重変異体に変異を蓄積する都度、得られたさらなる多重変異体の熱安定性は段階的に向上しており、実施例１で確認された本発明の変異点を適宜組み合わせることによって、一層優れた熱安定性を有するアマドリアーゼが作出され得ることが明らかとなった。
【実施例３】
【０１０９】
（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼ遺伝子への点変異導入）
配列番号１６は熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３８８Ｙ）を導入したＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１７）を挿入した組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を大腸菌で発現させることにより、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼの活性が確認されている（特許文献１６参照）。【０１１０】
Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼに耐熱性向上型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号１８、１９の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１６記載のアミノ酸配列の１５１位のグリシンがシステインに置換されたＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｇ１５１Ｃ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換し、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｇ１５１Ｃ）株を得た。
【実施例４】
【０１１１】
（点変異を導入したＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼの耐熱性改善効果の評価）
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｇ１５１Ｃ）株を、実施例１の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた熱安定性測定方法に従って、各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価を行った。結果を表５に示す。【０１１２】
【表５】
2013100006.tif 000006
【０１１３】
表５に示す通り、本実施例の条件下では、ＥＦＰ−Ｔ５の残存活性は０．７７％となった。これに対し、１５１位のグリシンがシステインに置換されたアマドリアーゼの残存活性は５１．２％であり、ＥＦＰ−Ｔ５と比較して顕著に向上した。よって、配列番号１に示すＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼの１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換は、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼにおいても耐熱性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。
【実施例５】
【０１１４】
（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの大腸菌での発現）
Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼを大腸菌で発現させることを試みた。すでに明らかになっているＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２０に示した（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０６，３５８−３６６，２０１０参照）。この配列番号２０で示した４３７アミノ酸をコードし、且つ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号２１で示す１３１４ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号２１の５’末端、３’末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄIIIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの配列と一致していることを確認した。【０１１５】
続いて、取得した配列番号２１の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄIII（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＫＫ２２３−３ Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸを取得し、実施例１と同様の条件でＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換し、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ）株を得た。【０１１６】
上記のようにして得られたＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有する大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ）株を実施例１の方法で培養して、粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた活性測定方法に従ってＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの活性があることを確認した。
【実施例６】
【０１１７】
（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼに耐熱性向上型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸを鋳型にして、配列番号２２、２３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２０記載のアミノ酸配列の１４９位のアラニンがシステインに置換されたＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ−Ａ１４９Ｃ）を得た。
そして、上記と同様の条件で大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換し、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ−Ａ１４９Ｃ）株を得た。【０１１８】
続いて、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼに耐熱性向上型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸを鋳型にして、配列番号２４、２５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２０記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基であるアラニン、アスパラギン、ロイシンが欠失された改変型フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ−ΔＰＴＳ1）を得た。
そして、上記と同様の条件で大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ株を形質転換し、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ−ΔＰＴＳ1）株を得た。
【実施例７】
【０１１９】
（点変異を導入したＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの耐熱性改善効果の評価）
上記のようにして得られた改変型フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有する大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ−Ａ１４９Ｃ）株および大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（ｐＫＫ２２３−３−ＰｎＦＸ−ΔＰＴＳ1）株を、上記の方法で培養して、各種改変型フルクトシルペプチドオキシダーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた熱安定性測定方法に従って、各種改変型フルクトシルペプチドオキシダーゼの熱安定性評価を行った。結果を表６に示す。【０１２０】
【表６】
2013100006.tif 000007
【０１２１】
表６に示す通り、本実施例の条件下では、ＰｎＦＸの残存活性は２５．０％となった。これに対し、１４９位のアラニンがシステインに置換されたフルクトシルペプチドオキシダーゼの残存活性は４６．２％、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失したフルクトシルペプチドオキシダーゼの残存活性は３７．５％であり、ＰｎＦＸと比較して顕著に向上した。よって、配列番号１に示すＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼの１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換およびカルボキシル末端の３アミノ酸残基の欠失は、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼにおいても耐熱性が改善されたフルクトシルペプチドオキシダーゼの作製に有効な置換および欠失であることがわかった。
【図１】
2013100006.tif 000008
【配列表】
2013100006000001.app
【国際調査報告】
2013100006.tif 000009
2013100006.tif 000010
2013100006.tif 000011
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