(57)【要約】【課題】  植物体の生育の遅れや矮化を誘発することなく、当該植物体に対して環境ストレスに対する耐性を付与すること。【解決手段】  本発明は、シロイナズナのＮＦ−ＹＣ１０がＤＲＥＢ２Ａと相互作用することを初めて明らかにする。また、本発明は、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子で宿主植物を形質転換すると、当該形質転換体の環境ストレスに対する耐性が向上することを初めて明らかにする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境ストレスに対する向上した耐性を示し、下記の群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子を過剰発現する形質転換植物体：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記（１）のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列のコード化領域のヌクレオチド配列である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項３】
前記（２）における配列相同性が８０％以上である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項４】
環境ストレスが高温ストレスである、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項５】
前記形質転換植物体が種子の形態である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項６】
前記形質転換植物体が苗の形態である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項７】
前記形質転換植物体がカルスの形態である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項８】
前記形質転換植物体が双子葉植物である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項９】
前記形質転換植物体が単子葉植物である、請求項１に記載の形質転換植物体。
【請求項１０】
環境ストレスに対する向上した耐性を示す形質転換植物体の製造方法であって、以下の、
ｉ）植物細胞を形質転換する工程であって、
ａ）植物細胞を下記の群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトして、該細胞に当該ヌクレオチド配列を含む遺伝子を過剰発現させる：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；又は
ｂ）植物細胞内の上記ａ）の（１）〜（３）の群から選択されるヌクレオチド配列を含む内因性遺伝子の調節領域を外来調節エレメントで置換して、該細胞に当該遺伝子を過剰発現させる工程；及び
ｉｉ）上記ｉ）の工程で得られた形質転換植物細胞を、該細胞から植物体を再生させるのに適した条件下で生育させて、形質転換植物体を得る工程
を含む、前記形質転換植物体の製造方法。
【請求項１１】
前記（１）のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列のコード化領域のヌクレオチド配列である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１２】
前記（２）における配列相同性が８０％以上である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１３】
環境ストレスが高温ストレスである、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１４】
前記形質転換植物体が種子の形態である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１５】
前記形質転換植物体が苗の形態である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１６】
前記形質転換植物体がカルスの形態である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１７】
前記形質転換植物体が双子葉植物である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１８】
前記形質転換植物体が単子葉植物である、請求項１０に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１９】
植物体の環境ストレスに対する耐性を向上させる方法であって、
ａ）植物体の細胞を下記の群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトして、該細胞に当該ヌクレオチド配列を含む遺伝子を過剰発現させる：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；又は
ｂ）植物体の細胞内の上記ａ）の（１）〜（３）の群から選択されるヌクレオチド配列を含む内因性遺伝子の調節領域を外来調節エレメントで置換して、該細胞に当該遺伝子を過剰発現させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記（１）のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列のコード化領域のヌクレオチド配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記（２）における配列相同性が８０％以上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
環境ストレスが高温ストレスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物体が種子の形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記植物体が苗の形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物体がカルスの形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物体が双子葉植物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物体が単子葉植物である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体の環境ストレス耐性に関わる遺伝子及び当該遺伝子を利用した組換技術の応用に関する。特に、植物体に高温ストレス耐性を付与する遺伝子の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の急激な人口増加に伴い食料の需要は増大しており、現在、世界中で１０億人以上の人々が飢餓に直面しているという統計もある。つまり、世界の耕作地や食料供給量の増加率は、食糧需要量の増加率を補いきれていない。また、気候変動や、エネルギー資源としての作物の需要量の増大など、安定した食糧作物の生産及び供給に対する様々な問題も存在している。【０００３】
上記のような複雑な問題の解決策として、環境ストレス耐性能を向上させた植物の作出が考えられる。すなわち、環境ストレスは、植物の生育に大きな影響を与える最も重要な因子の一つであり、作物生産においてもその収量を大きく変化させる要因となるから、作物に環境ストレス耐性を付与することで、現在利用できていないような地域を耕作地として利用することや、或いは作物の生育期間中の高温、干ばつ、冠水、低温といった環境ストレスによる収穫量の低下を抑制できる可能性がある。【０００４】
＜ＤＲＥＢ（ＤＲＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）＞
植物は、環境ストレス条件下での致死的な傷害を避けるために、様々な環境ストレス耐性遺伝子を発現し、身を守ることが知られている。ＤＲＥ（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、水ストレス誘導性遺伝子の一つであるＲＤ２９Ａのプロモーター解析により存在が確認された配列である。ＤＲＥのコア配列はＡ／ＧＣＣＧＡＣの６塩基からなるとされる（非特許文献１）。また、酵母のワン・ハイブリッド・スクリーニングにより、この配列に結合する蛋白質として、転写活性因子であるＤＲＥＢ（ＤＲＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が単離された（非特許文献２）。更に、非特許文献２において単離された遺伝子はＤＲＥＢ１Ａ及びＤＲＥＢ２Ａの２つであったが、その後、シロイナズナのゲノム中で６種類のＤＲＥＢ１タイプ遺伝子と８種類のＤＲＥＢ２タイプ遺伝子が確認されている（非特許文献３）。これらの蛋白質はいずれも高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＡＰ２／ＥＲＦドメイン）を有しているが、ＤＲＥＢ１タイプ遺伝子のうち、ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ1Ｂ，ＤＲＥＢ1Ｃは主に低温ストレス時に誘導され、他方、ＤＲＥＢ２Ａタイプ遺伝子のうち、ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ２Ｂは主に乾燥と塩ストレス時に誘導されることが報告されている（非特許文献２及び非特許文献４）。【０００５】
＜ＤＲＥＢ２Ａ＞
ＤＲＥＢ２Ａは、ＤＲＥに対する結合能を有し、また乾燥・塩ストレス時に誘導されることから、植物の水ストレス耐性を向上させる機能を担う可能性が推測されたが、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子を植物体内で過剰発現させても、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質の推定された標的遺伝子であるＲＤ２９ＡのｍＲＮＡ量の増加は確認されず、更に乾燥ストレスへの耐性も向上しなかった（非特許文献２）。しかし、そのときでもＤＲＥＢ２Ａ遺伝子のｍＲＮＡへの転写は確認されていたことから、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質が翻訳後調節を受ける可能性が示唆された。そして、その後、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質の１３６〜１６５位アミノ酸に相当するＮＲＤ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）領域を欠損させると、当該ＮＲＤ領域欠損蛋白質（ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ：ＤＲＥＢ２Ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａcｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ、と呼称される。）が標的遺伝子ＲＤ２９Ａの転写を恒常的に活性化することが明らかになり、更にＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡを過剰発現させた植物体では乾燥及び塩ストレスに対する耐性が向上した。加えて、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡにより示される高転写活性化能力は、ＤＲＥＢ２ＡからＮＲＤ領域を欠損させたことによりＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ蛋白質が安定化することによることが示唆された（非特許文献５）。【０００６】
ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ蛋白質を過剰発現させた植物体のマイクロアレイ解析は、様々な乾燥及び塩ストレス誘導性遺伝子の発現のみならず、高温ストレス誘導性遺伝子の発現に関しても、当該植物体において上昇することを明らかにした（非特許文献５及び非特許文献６）。更に、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ蛋白質を過剰発現させたシロイナズナは、乾燥・塩ストレスだけでなく高温ストレスに対しても向上した耐性を示すことが明らかにされた（非特許文献６）。なお、近年、シロイナズナＤＲＥＢ２Ａのイネ及びダイズでの相同蛋白質としてＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２及びＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２も同定された（非特許文献７及び非特許文献８）。【０００７】
しかしながら、残念なことに、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡを過剰発現させると、植物の生育は遅れ、矮化する（非特許文献６）。【０００８】
＜ＮＦ-Ｙ＞
ＮＦ-Ｙは、現在までに、全ての真核生物が保有していることが知られている転写調節因子である。また、ＮＦ-Ｙは、ＮＦ-ＹＡ、ＮＦ−ＹＢ及びＮＦ−ＹＣがヘテロメリックな三量体を形成して転写を調節することが知られている（非特許文献９及び非特許文献１０）。シロイナズナ等の植物においては、まだ多くの研究はなされていないが、特定の転写因子に対して三量体が機能して、対応する転写因子の活性を正に調節しているとの報告もある（非特許文献１１、非特許文献１２及び非特許文献１３）。【０００９】
しかしながら、これまでに、シロイナズナのＮＦ-ＹＣ蛋白質の一種であるＮＦ−ＹＣ１０の機能に関する決定的な報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．２５１−２６４（１９９４）
【非特許文献２】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１３９１−１４０６（１９９８）
【非特許文献３】Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．２９０，ｐｐ．９９８−１００９（２００２）
【非特許文献４】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．７８１−８０３（２００６）
【非特許文献５】Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１２９２-１３０９（２００６）
【非特許文献６】Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．１８８２２-１８８２７（２００６）
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ＤＲＥＢ２−ｔｙｐｅ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｃｏｄｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ．”
【非特許文献８】Ｍｉｚｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１３，”ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２，  ａ  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ＤＥＨＹＤＲＡＴＩＯＮ−ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥ  ＥＬＥＭＥＮＴ−ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ２−Ｔｙｐｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｓｏｙｂｅａｎ，  Ｉｓ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”
【非特許文献９】Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．１０１５−１０２２（１９９８）
【非特許文献１０】Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐｐ．１５−２７（１９９９）
【非特許文献１１】Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．５８，ｐｐ．８４３−８５６（２００９）
【非特許文献１２】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．７８２−７９６（２０１０）
【非特許文献１３】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．６７，ｐｐ．７６３−７７３（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、植物体に対して環境ストレスに対する耐性を付与することを課題とする。特に、植物体に対して高温ストレスに対する耐性を付与することを課題とする。当該ストレスに対する耐性を付与された植物体は、生育の遅れや矮化を示すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、シロイナズナのＮＦ−ＹＣ１０がＤＲＥＢ２Ａと相互作用することを初めて明らかにする。また、本発明は、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子で宿主植物を形質転換すると、当該形質転換体の環境ストレスに対する耐性が向上することを初めて明らかにする。驚くべきことに、当該形質転換植物は、生育の遅れや矮化を示すことがなく、向上した環境ストレスに対する耐性を有することを除いて、元の宿主植物と同等の生育を示した。【００１３】
従って、本発明の第１の局面は：
＜１＞  環境ストレスに対する向上した耐性を示し、下記の：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子を過剰発現する、形質転換植物体である。【００１４】
より特定的な態様に言及すれば、前記（１）のヌクレオチド配列としては、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子（配列番号１）、イネＮＦ-ＹＣ１６遺伝子（配列番号３）、ダイズＮＦ−ＹＣ２２（配列番号５）又はダイズＮＦ−ＹＣ２３（配列番号７）のコード化領域の配列を利用することができる。従って、本発明の好適な態様は：
＜２＞  前記（１）のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列のコード化領域のヌクレオチド配列である、上記＜１＞に記載の形質転換植物体である。【００１５】
また、前記（２）の“６０％以上の配列相同性”に関して、本発明のアミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義される。しかるに、それらの好適な例としては、当該配列相同性が８０％以上、９０％以上、９５％以上のものも例示できる。或いは、更に、当該アルゴリズムによる配列の同一性パーセンテージが６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％以上のものも本発明の相同蛋白質として例示できる。つまり、それらの相同蛋白質は、シロイナズナＮＦ-ＹＣ１０、イネＮＦ-ＹＣ１６、ダイズＮＦ−ＹＣ２２又はダイズＮＹ−ＹＣ２３の相同遺伝子産物や公知の遺伝子組換技術に基づいた改変体を包含し得、そして当該相同遺伝子産物及び改変体が、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質と実質的に結合して相互作用する能力を保持している限り本発明に利用できる事は、本発明の開示により当業者にとって明らかであろう。従って、本発明の好適な態様は、
＜３＞  前記（２）における配列相同性が８０％以上である、上記＜１＞に記載の形質転換植物体、を含む。【００１６】
本発明による形質転換植物体は特に高温ストレスに対して向上した耐性を示し得ることが実証された。従って、本発明の特に好適な態様は、
＜４＞  環境ストレスが高温ストレスである、上記＜１＞乃至＜３＞のいずれかに記載の形質転換植物体、である。【００１７】
本発明の形質転換体を利用する際に、その用途に応じた形態をとることが好ましいことは容易に理解できるであろう。つまり、作物の場合、当該植物体の種苗形態は、当該種苗として保存や流通される際に高温ストレスに曝されたとしても該ストレスに対して抵抗性を示すという利点があるし、勿論、それらの種苗は、成熟植物体が利用されるまでの全期間に渉って、環境ストレスに対する耐性を示す植物体を与えることができる。また、植物バイオ分野の研究目的の場合などでは、本発明の形質転換体のカルスも有利に利用できよう。従って、本発明の更なる態様は：
＜５＞  前記形質転換植物体が種子の形態である、上記＜１＞乃至＜４＞のいずれかに記載の形質転換植物体；
＜６＞  前記形質転換植物体が苗の形態である、上記＜１＞乃至＜４＞のいずれかに記載の形質転換植物体；及び
＜７＞  前記形質転換植物体がカルスの形態である、上記＜１＞乃至＜４＞のいずれかに記載の形質転換植物体、を含む。【００１８】
食糧作物や園芸作物としての双子葉植物及び単子葉植物の重要性は言うまでもない。従って、本発明の更なる好適な態様は：
＜８＞  前記形質転換植物体が双子葉植物である、上記＜１＞乃至＜７＞のいずれかに記載の形質転換植物体；及び
＜９＞  前記形質転換植物体が単子葉植物である、上記＜１＞乃至＜７＞のいずれかに記載の形質転換植物体、である。【００１９】
また、本発明は、前記形質転換植物体の作製方法も意図する。当該形質転換植物体は、宿主植物に外来性の遺伝子を導入すること、或いは内因性遺伝子の転写を制御する内因性プロモーターを置換又は変異させることにより、前記の遺伝子を植物細胞内で過剰発現させることで作製できることを当業者は理解するであろう。従って、本発明の第２の局面は：
＜１０＞  環境ストレスに対する向上した耐性を示す形質転換植物体の製造方法であって、以下の、
ｉ）植物細胞を形質転換する工程であって、
ａ）植物細胞を下記の群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトして、該細胞に当該ヌクレオチド配列を含む遺伝子を過剰発現させる：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；又は
ｂ）植物細胞内の上記ａ）の（１）〜（３）の群から選択されるヌクレオチド配列を含む内因性遺伝子の調節領域を外来調節エレメントで置換して、該細胞に当該遺伝子を過剰発現させる工程；及び
ｉｉ）上記ｉ）の工程で得られた形質転換植物細胞を、該細胞から植物体を再生させるのに適した条件下で生育させて、形質転換植物体を得る工程
を含む、前記形質転換植物体の製造方法、である。【００２０】
また、本発明の第１の局面について記載した態様は、本発明の第２の局面についても当てはまる。それらの態様は：
＜１１＞  前記（１）のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列のコード化領域のヌクレオチド配列である、上記＜１０＞に記載の形質転換植物体の製造方法；
＜１２＞  前記（２）における配列相同性が８０％以上である、上記＜１０＞に記載の形質転換植物体の製造方法；
＜１３＞  環境ストレスが高温ストレスである、上記＜１０＞乃至＜１２＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法；
＜１４＞  前記形質転換植物体が種子の形態である、上記＜１０＞乃至＜１３＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法；
＜１５＞  前記形質転換植物体が苗の形態である、上記＜１０＞乃至＜１３＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法；
＜１６＞  前記形質転換植物体がカルスの形態である、上記＜１０＞乃至＜１３＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法；
＜１７＞  前記形質転換植物体が双子葉植物である、上記＜１０＞乃至＜１６＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法；及び
＜１８＞  前記形質転換植物体が単子葉植物である、上記＜１０＞乃至＜１６＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法；
を含む。【００２１】
また、本発明は、前記した本発明の利点により、植物体の環境ストレスに対する耐性を向上させる方法も意図する。従って、本発明の第３の局面及び関連する態様は：
＜１９＞  植物体の環境ストレスに対する耐性を向上させる方法であって、
ａ）植物体の細胞を下記の群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトして、該細胞に当該ヌクレオチド配列を含む遺伝子を過剰発現させる：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；又は
ｂ）植物体の細胞内の上記ａ）の（１）〜（３）の群から選択されるヌクレオチド配列を含む内因性遺伝子の調節領域を外来調節エレメントで置換して、該細胞に当該遺伝子を過剰発現させる、
ことを含む、前記方法；
＜２０＞  前記（１）のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列のコード化領域のヌクレオチド配列である、上記＜１９＞に記載の方法；
＜２１＞  前記（２）における配列相同性が８０％以上である、上記＜１９＞に記載の方法；
＜２２＞  環境ストレスが高温ストレスである、上記＜１９＞乃至＜２１＞のいずれかに記載の方法；
＜２３＞  前記植物体が種子の形態である、上記＜１９＞乃至＜２２＞のいずれかに記載の方法；
＜２４＞  前記植物体が苗の形態である、上記＜１９＞乃至＜２２＞のいずれかに記載の方法；
＜２５＞  前記植物体がカルスの形態である、上記＜１９＞乃至＜２２＞のいずれかに記載の方法；
＜２６＞  前記植物体が双子葉植物である、上記＜１９＞乃至＜２５＞のいずれかに記載の方法；及び
＜２７＞  前記植物体が単子葉植物である、上記＜１９＞乃至＜２５＞のいずれかに記載の方法；
を包含する。
言うなれば、本発明の更なる局面は、
＜２８＞  植物体の環境ストレスに対する耐性を向上させるために使用する、下記の：
（１）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の配列相同性を有し、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列；及び
（３）配列番号１、３、５、７、１４、１５、１６又は１７に示すヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子、である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、植物の環境ストレスに対する耐性を向上させることができる。特に、植物の高温ストレスに対する耐性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1は、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子のＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。１８−６３８位の塩基がコード化領域である。
【図２】図２は、イネＮＦ−ＹＣ１６遺伝子のＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。１１１−１０２２位の塩基がコード化領域である。
【図３】図３は、ダイズＮＦ−ＹＣ２２遺伝子のＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。９８-６５８位の塩基がコード化領域である。
【図４】図４は、ダイズＮＦ−ＹＣ２３遺伝子のＤＮＡ配列を示す（配列番号７）。９３−６５０の塩基がコード化領域である。
【図５】図５は、酵母のツーハイブリッドシステムによる、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質とシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質との相互作用解析の結果を示す。“ＮＦ−ＹＣ１０  Ｆｕｌｌ”及び“ＤＲＥＢ２Ａ（１−２０５）＋ＢＤ”の双方を導入した酵母は、ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ／３−ＡＴ（ＱＤＯ）寒天培地上でも生育可能であることが示されている。
【図６】図６は、シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現による、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質とシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質との相互作用解析（ＢｉＦＣ実験）の結果を示す。“ＮＦ−ＹＣ１０  Ｆｕｌｌ＋ＤＲＥＢ２Ａ  Ｆｕｌｌ”を導入したプロトプラストのみがＹＦＰの蛍光シグナルを発生している。“ｂＺＩＰ６３+ｂＺＩＰ６３”は相互作用が既に確認されている陽性対照である。ＣＦＰは遺伝子導入が適切に行われていることを確認するために、同時に導入している。
【図７】図７は、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子を導入しシロイナズナでの当該遺伝子の過剰発現を示す。３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ａ、３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｂ及び３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｃは、導入したシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の発現レベルが高い、独立した３ラインである。ＶＣは、空のベクターのみで形質転換したコントロールである。上段はＮＦ−ＹＣ１０のプローブＤＮＡによるノーザン解析結果であり、下段はエチヂウムブロミドで染色したコントロールである。
【図８】図８Ａは、非ストレス条件下、１％スクロース含有ＧＭＫ培地上で播種から１６日間生育させた後の、本発明の３ラインの形質転換植物（３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ａ、３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｂ及び３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｃ）のロゼッタ葉の生育状態を示している。図８Ｂは、非ストレス条件下、当該３ラインの形質転換植物を１％スクロース含有ＧＭＫ培地上で播種から２週間生育させた後に、鉢に移植して更に２週間生育させた状態を示している。Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌは空のベクターにより形質転換した植物体である。
【図９】図９Ａは、図８Ａの結果をロゼッタ葉の最大半径として計測した結果を示すグラフである。図９Ｂは、図８Ｂの結果を花序の長さとして計測した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナにおけるＤＲＥＢ２Ａの標的遺伝子の発現解析結果を示す。図中、本発明のシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０を高いレベルで発現する３ラインの形質転換植物（３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ａ、３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｂ及び３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｃ）と空のベクターにより形質転換したＶｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ（陰性対照）が比較されている。
【図１１】図１１は、ＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナの内で、ＤＲＥＢ２Ａの下流遺伝子であるＨｓｆＡ３とＡｔ１ｇ７５８６０の発現量の変化が顕著であった独立した２ラインの形質転換体を用いて、高温ストレス後のマイクロアレイ解析を行った結果を示す。Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ植物よりも発現量が２倍以上高く誘導されていた遺伝子が１５個見出された。
【図１２】図１２は、本発明のＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナ（３５Ｓ：ＮＦ−ＹＣ１０−ａ、３５Ｓ：ＮＦ−ＹＣ１０−ｂ及び３５Ｓ：ＮＦ−ＹＣ１０−ｃ）の高温ストレス耐性試験結果を示す。空のベクターにより形質転換したＶｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ（陰性対照）が比較されている。図中の括弧内の数字は試験に用いた植物体数（分母）と生存していた植物個体数（分子）を表し、図には生存率（％）も示されている。
【図１３】図１３は、双子葉植物のシロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０に対応する、ダイズ並びに単子葉植物のイネ及びコケ植物のヒメツリガネゴケ、並びに緑藻類のクラミドモナス、ボルボックスにおける相同遺伝子と本発明者が割り当てた呼称を示す。
【図１４】図１４は、シロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０相同遺伝子及び、ヒト、マウス、酵母のＮＦ−ＹＣファミリー遺伝子の類縁関係を系統樹により示す。図中の黒点は、ブートストラップ値が５０以上であることを示している。
【図１５】図１５は、シロイヌナズナ（ＮＦ−ＹＣ１０：配列番号２４）とイネ（ＯｓＮＦ−ＹＣ１６：配列番号２５）、ダイズ（ＧｍＮＦ−ＹＣ２２：配列番号２６及びＧｍＮＦ−ＹＣ２３：配列番号２７）、ヒメツリガネゴケ（ＰｐＮＦ−ＹＣ１１：配列番号２８）におけるシロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０と最近縁の相同遺伝子の保存領域のアミノ酸配列比較を示している。全ての配列において類似性の高いアミノ酸残基は白抜きで表している。３つ以上の配列で類似性の高いアミノ酸残基は太字で表している。
【図１６】図１６は、酵母のツーハイブリッドシステムによる、(ダイズ)ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２蛋白質及び（イネ）ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２蛋白質とシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質との相互作用解析の結果を示す。“ＮＦ−ＹＣ１０  ｆｕｌｌ＋ＡＤ”と“ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２（１-１３７  ａ．ａ）＋ＢＤ”の双方を導入した酵母、及び“ＮＦ−ＹＣ１０  ｆｕｌｌ＋ＡＤ”と“ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２（１-１４６  ａ．ａ）＋ＢＤ”の双方を導入した酵母は、ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ／３−ＡＴ（ＱＤＯ）寒天培地上でも生育可能であることが示されている。
【図１７】図１７は、シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現による、(ダイズ)ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２蛋白質及び（イネ）ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２蛋白質蛋白質とシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質との相互作用解析（ＢｉＦＣ実験）の結果を示す。“ＮＦ−ＹＣ１０  ｆｕｌｌ＋ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２  ｆｕｌｌ”及び“ＮＦ−ＹＣ１０  ｆｕｌｌ＋ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２  ｆｕｌｌ”を導入したプロトプラストのみがＹＦＰの蛍光シグナルを発生している。“ｂＺＩＰ６３+ｂＺＩＰ６３”は相互作用が既に確認されている陽性対照である。ＣＦＰは遺伝子導入が適切に行われていることを確認するために、同時に導入している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
遺伝子
本発明の課題は、環境ストレスに対する耐性を向上させるべき植物の細胞内で、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子、或いはその相同遺伝子を機能的に過剰発現させることにより解決される。より特定的に言うと、機能的に発現されたシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子或いはその相同遺伝子の産物は、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に対する結合能を示し、そしてそのような機能的発現の結果として形質転換植物体に環境ストレスに対する向上した耐性が付与されるのである。
【００２５】
シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０遺伝子（配列番号１）は、以下のアミノ酸配列からなるシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質をコードする。
【化１】
2013111755.tif 000002
【００２６】
後記実施例のとおり、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質は、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質と実質的に結合して相互作用する能力を有し、それによりＤＲＥＢ２Ａの下流遺伝子、殊に高温誘導性を持つ遺伝子の発現を上昇させることが明らかとなった。
【００２７】
また、イネＮＦ−ＹＣ１６遺伝子（配列番号３）は、後述の系統樹解析の結果からもシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相同遺伝子であることが示される。従って、植物体細胞内でイネＮＦ−ＹＣ１６遺伝子を過剰発現させることで、当該植物に対して向上した環境ストレス耐性を付与し得る。イネＮＦ−ＹＣ１６遺伝子は、以下のアミノ酸配列からなるイネＮＦ−ＹＣ１６蛋白質をコードする。
【化２】
2013111755.tif 000003
【００２８】
また、ダイズＮＦ−ＹＣ２２遺伝子（配列番号５）及びダイズＮＦ−ＹＣ２３遺伝子（配列番号７）は、後述の系統樹解析の結果からもシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相同遺伝子であることが示される。従って、植物体細胞内でダイズＮＦ−ＹＣ２２遺伝子又はダイズＮＦ−ＹＣ２３遺伝子を過剰発現させることで、当該植物に対して向上した環境ストレス耐性を付与し得る。なお、ゲノム配列の解析から、ダイズ染色体は四倍体を起源とするする二倍体と考えられており、多くの遺伝子が重複して存在している。ダイズＮＦ−ＹＣ２２蛋白質及びダイズＮＦ−ＹＣ２３蛋白質は、相同性の高さから、倍数性により重複して存在する蛋白質であることが推測されるので、共にシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質と同様の生理活性を示すことが合理的に理解できる。ダイズＮＦ−ＹＣ２２遺伝子及びダイズＮＦ−ＹＣ２３遺伝子は、それぞれ、以下のアミノ酸配列からなるダイズＮＦ−ＹＣ２２蛋白質及びダイズＮＦ−ＹＣ２３蛋白質をコードする。
【化３】
2013111755.tif 000004
【００２９】
更に、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相同遺伝子には、例えばヒメツリガネゴケＮＦ−ＹＣ１１遺伝子も挙げられる（後述の系統樹解析を参照。）。前記のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに基づくアミノ配列相同性として、イネＮＦ−ＹＣ１６蛋白質及びヒメツリガネゴケＮＦ−ＹＣ１１蛋白質はシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質に対して、それぞれ、約８１％以上と約６８％以上の陽性パーセンテージを示す。更に、ダイズＮＦ−ＹＣ２２蛋白質及びダイズＮＦ−ＹＣ２３蛋白質はシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質に対して、それぞれ、約６３％以上と約７４％以上の陽性パーセンテージを示す。従って、当業者は、例えば上記配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％以上の陽性のパーセンテージを示す相同蛋白質をコードする遺伝子が本発明に利用できることを理解するであろう。更にまた、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０、イネＮＦ−ＹＣ１６、ダイズＮＦ-ＹＣ２２、ダイズＮＦ−ＹＣ２３の修飾蛋白質は、それらが野生型の蛋白質と実質的に類似の活性を有するならば、当該修飾蛋白質分子の一方の構造が野生型蛋白質分子に無くとも、又は２つのアミノ酸配列が完全に同一でなくとも、本発明の相同蛋白質と考えられる。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともあり得る。従って、本発明において、例えば配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列に対して数個程度のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換を含むアミノ酸配列を有する蛋白質は、ＤＲＥＢ２Ａ蛋白質と実質的に結合して相互作用する能力を保持している限り本発明に利用でき、そしてそのような蛋白質をコードするヌクレオチド配列も本発明に利用し得る事を当業者は理解する筈である。
【００３０】
なお、ＤＲＥＢ２ＡとＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質との相互作用性は、酵母のツーハイブリッドシステム又はシロイヌナズナのプロトプラストの系を用いたＢｉＦＣ（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）実験のいずれか又は双方により確認できる。すなわち、当該ツーハイブリッドシステムの典型的な例においては、ＤＲＥＢ２ＡのＣ末端側の転写活性化ドメインを除く領域をコードするｃＤＮＡ（１番目から６１５番目の塩基）をｐＧＢＫＴ７プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に連結し、ＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質の全長ｃＤＮＡをｐＧＡＤＴ７プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に連結する。これらのプラスミドをＡＨ１０９株の酵母に形質転換し、選択培地において酵母の生育が見られれば、ＤＲＥＢ２ＡとＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質が相互作用することが判る。その際に、酵母へのプラスミドＤＮＡの導入は、Ｉｔｏらの方法［Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐｐ.１６３−１６８（１９８３）］により行うことができるし、その他の実験条件についても、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｓｙｓｔｅｍに従えばよい。更に、ＢｉＦＣ実験の典型例では、例えばＤＲＥＢ２Ａの全長ｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＹＦＰのＣ末端側をコードするｃＤＮＡ（４６６番目から７１７番目の塩基）を含むｐＢＩ２２１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に連結し、同様にＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質の全長ｃＤＮＡを、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＹＦＰのＮ末端側をコードするｃＤＮＡ（１番目から４６５番目の塩基）を含むｐＢＩ２２１プラスミドに連結する。次いで、この２種のプラスミドをシロイヌナズナのプロトプラストに導入した後、ＤＲＥＢ２Ａの安定を向上するためにプロテオソーム阻害剤であるＭＧ１３２を添加する。その後、ＹＦＰ蛍光を観察することができれば、プロトプラスト内で、ＤＲＥＢ２ＡとＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質が相互作用していることが判る。その際に、プロトプラストの調製及び該プロトプラストへのプラスミドＤＮＡの導入は、Ｙｏｏらの方法［Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，Ｖｏｌ．２，ｐｐ.１５６５−１５７２（２００４）］によって行うことができる。
【００３１】
更に、本発明に利用できる遺伝子の別の説明として、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質、イネＮＦ−ＹＣ１６蛋白質、ダイズＮＦ-ＹＣ２２及びＮＦ-ＹＣ２３蛋白質、並びにヒメツリガネゴケＮＦ−ＹＣ１１蛋白質のアミノ酸配列のアラインメントにより同定された保存領域が図１５に示されている。そして、当該保存領域中で以下の比較的長い共通アミノ酸配列が見出された。
【化４】
2013111755.tif 000005
【００３２】
従ってまた、本発明のために過剰発現される遺伝子は、上記共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチドと相補的なヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸として同定され得、且つその発現産物がＤＲＥＢ２Ａ蛋白質に結合することを確認することで容易に入手し得るのを当業者は理解するであろう。例えば、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質及びイネＮＦ−ＹＣ１６蛋白質中の上記共通アミノ酸配列をコードする部分配列は、それぞれ、下記の配列番号１４及び配列番号１５のヌクレオチド配列から成り、よって、それらのヌクレオチド配列に相補的な配列から成る核酸のいずれか又は双方にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は本発明において利用可能である。或いは、ダイズＮＦ−ＹＣ２２蛋白質及びダイズＮＦ−ＹＣ２３中の上記保存領域のアミノ酸配列をコードする部分配列は、それぞれ、下記の配列番号１６及び配列番号１７のヌクレオチド配列から成り、よって、それらのヌクレオチド配列に相補的な配列から成る核酸のいずれか又は双方にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は本発明において利用可能である。なお、本明細書でのストリンジェントな条件は、サケ変性精子ＤＮＡ、６ｘＳＳＣ液と５ｘＤｅｎｈａｒｔ液を含む溶液中で４２℃でハイブリダイゼーション、及び０．１％ＳＤＳと１ｘＳＳＣを含む水溶液中で６８℃での洗浄条件として記載される。
【化５】
2013111755.tif 000006
【００３３】
更にまた、本発明の目的に利用できるシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相同遺伝子は、その発現産物がＤＲＥＢ２Ａ蛋白質と実質的に結合して相互作用できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型遺伝子配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７）に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえストリンジェントな条件下で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
【００３４】
発現ベクター
本発明では、前記した遺伝子が形質転換植物体内で過剰発現させられる。そのような形質転換は、典型的には、外来性の上記遺伝子を含む発現ベクターで植物細胞をトランスフェクトすることにより達成される。なお、本明細書において、「外来性」ないし「外来」という用語は、形質転換前の宿主植物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる蛋白質を実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該蛋白質のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性蛋白質活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子ないしヌクレオチド配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。また、本明細書において、「発現ベクター」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写及び翻訳をレギュレートするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現ベクターは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主植物細胞に発現可能に導入される。
【００３５】
具体的に、本発明で好適に利用できる植物導入用（組換）発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ、ｐＧｒｅｅｎ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００等の中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入用に用いる。
【００３６】
前述のとおり、植物体内で外来遺伝子などを発現させるためには、構造遺伝子の前後に、それぞれ植物用のプロモーターやターミネーターなどを配置させる必要がある。本発明において利用可能なプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ転写物［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．６，ｐｐ.３９０１−３９０７（１９８７）］、トウモロコシのユビキチン［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ.６７５−６８９（１９９２）］、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターなどが挙げられ、ターミネーター配列としては、例えば、カリフラワーモザイクウィルス由来のノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどが挙げられる。但し、植物内で機能することが知られているプロモーターやターミネーターであれば、これらのものに限定されるものではない。
【００３７】
また、必要に応じて、プロモーター配列と本発明の遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ.１１８３−１２００（１９８７）］を導入することができる。さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を本発明の遺伝子と併用することが好ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。本発明の遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに共に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いても良い。
【００３８】
形質転換
本発明の形質転換体の宿主は、植物培養細胞、カルス、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、或いは植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれであってもよい。植物種は限定されず、ダイズ等の双子葉植物、イネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物を用いることもできる。形質転換する植物が双子葉植物の場合は、シロイヌナズナ等の双子葉植物由来の本発明遺伝子を導入することが好ましく、形質転換する植物が単子葉植物の場合はイネ等の単子葉植物由来の本発明遺伝子を導入することが好ましい。植物培養細胞、植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターを、採取した植物切片に、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、又はポリエチレングリコール法などで導入して、植物宿主を形質転換することができる。或いは、プロトプラストにエレクトロポレーション法で導入して、形質転換植物を作製することもできる。
【００３９】
例えば、アグロバクテリウム感染法によりシロイヌナズナに遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物にトランスフェクトさせる工程が必須であるが、これはＣｌｏｕｇｈらの花序浸し法［Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ.７３５−７４３（１９９８）］を改変した方法により行うことができる。詳細に言うと、本発明の遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウムをＩｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（０．５ｘＭＳ  ｓａｌｔ、５％（ｗ／ｖ）  Ｓｕｃｒｏｓｅ、１０μｇ／Ｌ  Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ、０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）に懸濁した菌液に、バーミキュライト、パーライトなどを含む土で生育させたシロイヌナズナの蕾を直接浸し、鉢をラップで覆い湿度を保つ。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育させて、種子を収穫する。次いで、種子から目的の遺伝子を有する個体を選択するために、適切な抗生物質を加えたＧＭ寒天培地に播種する。この培地で生育したシロイヌナズナを鉢に移し、生育させることにより、本発明の遺伝子が導入された形質転換植物の種子を得ることができる。つまり、当該条件下で生育させることにより、本発明の遺伝子でトランスフェクトした細胞等から本発明の植物体を好適に再生させることができる。
【００４０】
本発明の遺伝子を導入した形質転換植物及びその次世代に目的の遺伝子が組み込まれていることを確認するには、これらの細胞或いは組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法又はサザン法を用いて導入した遺伝子を検出すればよい。なお、一般に、導入遺伝子は、宿主植物のゲノム中に導入されるが、その導入場所が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションエフェクトと呼ばれる現象が知られている。従って、プローブとして導入遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノーザン法で検定することによって、導入遺伝子がより強く発現している形質転換体を選抜することができる。
【００４１】
また、本発明の別の方法としては、上記した宿主植物の内因性遺伝子の発現を有意に活性化する方法も挙げられる。具体的には、当該内因性遺伝子の調節領域、例えばプロモーターを、前記したカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ転写物、トウモロコシのユビキチン、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成遺伝子のプロモーターなどの外来性の調節エレメントで置換すればよい。そして、そのような方法により内因性遺伝子の発現が有意に活性化している形質転換植物は、プローブとして当該内因性遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノーザン法で検定することにより該遺伝子がより強く発現している個体を選抜することで入手できる。つまり、本発明の遺伝子を導入した形質転換植物における該遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、これらの細胞或いは組織から常法に従ってＲＮＡを抽出し、公知のＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザン法を用いて導入した遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができるのである。或いは、別の方法として、本発明の遺伝子産物を、該遺伝子産物に体する抗体を用いたウェスタン分析等により、直接分析することも可能である。
【００４２】
形質転換植物体の特性化
上記のとおり、本発明の遺伝子は転写調節因子として作用する。本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体内において転写レベルが変化したと考えられる遺伝子群はノーザン法によって同定することができる。例えば、ＧＭ寒天培地等で生育させた植物に、一定時間（例えば３０分〜２４時間）の環境ストレスを与える。環境ストレスとしては、ＤＲＥＢ２Ａが関与する乾燥、高温ストレス等が挙げられる。例えば、乾燥ストレスの付加は、ＧＭ寒天培地から植物体を抜き取り、濾紙上で３０分から２４時間静置することによって与えることができる。また、高温ストレスの付加は、ＧＭ寒天培地上に生育した植物体を、例えば３７℃に３０分から２４時間静置することにより与えることができる。ストレスを与えないコントロール植物と環境ストレスを与えた植物から全ＲＮＡを調製して、電気泳動を行い、発現を確認した遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ノーザン法を行うことにより、発現パターンの変化を解析することができる。
【００４３】
形成転換植物の環境ストレスに対する耐性の評価
本発明の遺伝子を導入した形質転換植物の環境ストレスに対する耐性は、例えばＧＭ寒天培地上で一定期間（例えば２〜３週間）生育した後、バーミキュライト、パーライトなどを含む土を入れた鉢に移植した植物体、或いはＧＭ液体培地に浸した濾紙上で生育した植物体に各種環境ストレスを付加し、その後の生存を調べることによって評価することができる。環境ストレスとしては、ＤＲＥＢ２Ａの関与する乾燥、高温ストレス等が挙げられる。例えば、乾燥ストレスに対する耐性は、植物をＧＭ寒天培地上で一定期間（例えば２〜３週間）生育させた後、バーミキュライト、パーライトなどを含む土に移植してから一定期間（例えば２日〜１週間）生育させた後、２〜４週間水を与えずにおき、次いで１〜２週間、通常条件で生育させ、その生存を調べることによって評価することができる。また、高温ストレスに対する耐性は、ＧＭ液体培地を浸した濾紙上で一定期間（例えば６日〜８日）生育した植物体を、例えば４２℃に１時間静置させた後に、４日〜２週間、通常条件で生育させ、その生存率を調べることにより評価することができる。
【００４４】
以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において得に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
【実施例】
【００４５】
実施例１：酵母のツーハイブリッドシステムによる相互作用解析
酵母のツーハイブリッドシステムによるＤＲＥＢ２ＡとＮＦ−ＹＣ１０の相互作用解析は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｓｙｓｔｅｍのプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＪＰ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ＿ａｎｄ＿Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ／Ｙｅａｓｔ＿Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ／Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ＿Ｇｏｌｄ＿Ｙｅａｓｔ＿Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ＿Ｓｙｓｔｅｍ？ｓｉｔｅｘ＝１００２５：２２３７２：ＵＳ）に従った。【００４６】
具体的には、ＤＲＥＢ２Ａ  ｃＤＮＡにおいて、Ｃ末端側の転写活性化ドメインを除く領域（１-２０５  ａ．ａ．）をコードする１〜６１５番目の塩基配列を連結したｐＧＢＫＴ７プラスミド（Ｆｅｎｇ  Ｑｉｎ博士、独立行政法人  国際農林水産研究センター（日本）から譲渡頂いた。）をベイト遺伝子のベクターとして用いた。また、プレイ遺伝子のベクターは、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の全長ｃＤＮＡを下記のプライマー対でＰＣＲ増幅し、得られた増幅配列をｐＧＡＤＴ７のＣｌａＩ／ＸｈｏＩサイトに導入することにより作製した。
【化６】
2013111755.tif 000007
【００４７】
上記のベイトベクター及びプレイベクターを酵母ＡＨ１０９株に導入した。ＤＲＥＢ２ＡとシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相互作用の存在は、双方のベクターを導入した酵母が、ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ／３−ＡＴ（ＱＤＯ）寒天培地上で生育することにより確認された（図５を参照）。また、当該結果が擬陽性でなかったことは、同じ培地上で、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子（コード化配列の１〜６１５番目の塩基）を挿入していないｐＧＢＫＴ７プラスミドを前記のプレイベクターと共に導入した菌株が生育しなかったことにより確かめられた。【００４８】
実施例２：シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現による相互作用解析
シロイヌナズナの葉肉細胞由来のプロトプラストを用いた一過的発現解析は、Ｙｏｏらの方法［Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，Ｖｏｌ．２，ｐｐ.１５６５−１５７２（２００４）］に従って行った。簡単に説明すると、プロトプラストへ遺伝子導入して１４時間静置した後に、植物体内でＤＲＥＢ２Ａを安定化する目的でプロテオソーム阻害剤であるＭＧ１３２を終濃度５０μＭとなるように添加し、さらに４時間静置した後に、ＹＦＰ蛍光の観察を行った。【００４９】
具体的には、ＤＲＥＢ２Ａの全長ｃＤＮＡ及びシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の全長ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅して、その各々を、ＹＦＰのＮ末端側か、或いはＣ末端側をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターであるｐＢＩ２２１［Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ.１６９３−１７０７（２００８）］のいずれかに連結することにより、ＤＲＥＢ２ＡとシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０を含む２種類のプラスミドを作製し、その双方のプラスミドの一過的発現解析実験を行った。なお、ＤＲＥＢ２Ａの全長ｃＤＮＡを連結したｐＢＩ２２１プラスミドは、Ｆｅｎｇ  Ｑｉｎ博士（独立行政法人  国際農林水産研究センター、日本）から譲渡されたものを用いた。また、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の全長ｃＤＮＡは下記のプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅し、上記発現ベクターのＸｂａＩ／ＣｌａＩサイトに導入することにより作製した。
【化７】
2013111755.tif 000008
【００５０】
ＤＲＥＢ２ＡとシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相互作用の存在は、双方のプラスミドを導入したシロイヌナズナの葉肉細胞由来のプロトプラストのみが、シグナルを発生することにより確認された（図６を参照）。なお、当該図中で、ｂＺＩＰ６３はホモダイマーを形成することが知られている陽性対照である。ＣＦＰは遺伝子導入が適切に行われていることを確認するために、同時に導入している。【００５１】
実施例３：ＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナの表現型解析
シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０とＤＲＥＢ２Ａとの相互作用性が上記の実験によって確認された。従って、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の過剰発現により形質転換植物の生育速度や矮化等の表現型が変化する可能性を検証した。
その目的のために、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０のｃＤＮＡをカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターの制御下で発現する形質転換植物が作製された。具体的には、下記のプライマー対を用いて、ＰＣＲによりシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の全長ｃＤＮＡを増幅し、ｐＧＫＸベクターのＸｂａＩ／ＸｈｏＩサイトに導入した。ｐＧＫＸベクターは、ｐＧｒｅｅｎ００２９に、エンハンサーＥ１２、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ω配列、マルチクローニングサイト及びＮｏｓ-Ｔ配列を挿入したもので、Ｙｏｓｈｉｄａら［Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．３６８，ｐｐ．５１５−５２１（２００８）］の論文中に記載されている。得られた形質転換ベクターを、ｐＧｒｅｅｎ−ＮＦ−ＹＣ１０と命名した。
【化８】
2013111755.tif 000009
【００５２】
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０を過剰発現する形質転換植物は、前記形質転換ベクターｐＧｒｅｅｎ−ＮＦ−ＹＣ１０をアグロバクテリウム・チュメファシエンスのＣ５８系統を用いた花序浸し法［Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ.７３５−７４３（１９９８）］によってシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）に導入することで作製した。そして、この形質転換植物の独立した２０ラインにおいて、ストレス処理をしない状態で導入遺伝子のＮＦ−ＹＣ１０について発現を解析した。更に、表現型の解析をするために、導入したシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の発現レベルが高い、独立した３ラインを選択した。図７に、その３ライン（３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ａ、３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｂ及び３５Ｓ：ＮＦ-ＹＣ１０-ｃ）と空のベクターのみで形質転換したコントロール（ＶＣ；ベクターコントロール）のノーザン解析の結果を示す。各レーンは１０μｇのトータルＲＮＡを泳動した結果であり、下段はエチヂウムブロミドで染色したコントロールである。【００５３】
上記で選択された３ラインの形質転換植物の表現型は、明期１６時間／暗期８時間の照光条件下（４０±１０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ）、２２℃±１℃で、Ｏｓａｋａｂｅらの方法［Ｏｓａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ.１１０５−１１１９（２００５）］に従って２〜３週間ＧＭＫ寒天培地上で植物を育成させることで解析した。なお、ＧＭＫ寒天培地には１％のスクロースを添加した。更に、必要に応じて鉢に植物体を移植して、バーミキュライト、パーライトなどの土壌により、同様の条件下で形質転換植物を生育させた。図８Ａの写真は、１％スクロース含有ＧＭＫ培地上で播種から１６日間生育させた後の、上記で選択された３ラインの形質転換植物の生育状態を示している。また図８Ｂには、当該３ラインの形質転換植物を１％スクロース含有ＧＭＫ培地上で播種から２週間生育させた後に、鉢に移植して更に２週間生育させた時点での写真を示した。更に、各植物のロゼッタ葉の最大半径及び花序の長さを計測した結果も図９Ａ及び図９Ｂに示した。これらの実験において、本発明のシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０を過剰発現した植物体とベクターコントロールの植物の間で生育に有為な差は見られなかったことから、本発明の遺伝子の過剰発現は植物の生育に実質的な影響を与えないことが確認された。【００５４】
実施例４：ＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナにおけるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の下流遺伝子の発現解析
シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０とＤＲＥＢ２Ａとの相互作用性によって、ＲＤ２９ＡやＨｓｆＡ３のようなＤＲＥＢ２Ａの下流遺伝子の転写が変化することを調べた。特に、それらの下流遺伝子の転写を、ＤＲＥＢ２Ａが機能すると考えられている乾燥ストレスや高温ストレス条件下において調べた。下流遺伝子としては、乾燥誘導性のみを持つＲＤ２９ＡとＲＤ２９Ｂ、そして高温誘導性を持つＨｓｆＡ３とＡｔ１ｇ７５８６０の発現を解析した。【００５５】
具体的に、実施例３で選択された３ラインの形質転換植物と空のベクターで形質転換したベクターコントロール植物について実験した。乾燥ストレスは、ＧＭ寒天培地上で一定期間（２〜３週間）生育させた植物体を抜き取り、濾紙上で１〜２４時間静置することによって与えた。また、高温ストレスは、ＧＭ寒天培地で一定期間（２〜３週間）生育した植物体を、ＧＭ寒天培地上で３７℃に１〜２４時間静置することによって与えた。生物学的反復のために、ＲＮＡ抽出では８個体をまとめて一つのサンプルとした。植物から全ＲＮＡを調製して、電気泳動を行い、発現を確認したい遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いてノーザン法を行うことにより、発現パターンの変化を解析した。植物体からの全ＲＮＡの抽出及びＲＮＡゲルブロット解析は、Ｓａｔｏｈらの方法［Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ.３０９−３１７（２００４）］に従い、Ｓａｋｅｍａｓｔｅｒ破砕機（Ｂｉｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。また、ＲＮＡゲルブロット解析のプローブは、Ｍａｒｕｙａｍａらの方法［Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．３８，ｐｐ.９８２−９９３（２００４）］に従って調製した。【００５６】
当該ストレスを１〜１０時間まで付加した場合の結果を図１０に示した。ＲＤ２９ＡとＲＤ２９Ｂについては乾燥、高温ストレス時における発現の変化が確認できなかった。しかし、ＨｓｆＡ３とＡｔ１ｇ７５８６０に関しては、高温ストレス処理５時間で、ベクターコントロールと比較した場合に本発明の形質転換体の２ラインで発現が有意に上昇していた。【００５７】
実施例５：ＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナのマイクロアレイ解析
上記のＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナの内で、ＤＲＥＢ２Ａの下流遺伝子であるＨｓｆＡ３とＡｔ１ｇ７５８６０の発現量の変化が顕著であった独立した２ラインの形質転換体を用いて、高温ストレス後のマイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイは、シロイヌナズナの全遺伝子の発現プロファイルを調べることができるＣｕｓｔｏｍ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，４ｘ４４Ｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。【００５８】
具体的には、ＧＭ寒天培地で２週間生育させた前記の独立した２ラインの形質転換体とベクターコントロールの植物を３７℃で５時間処理した後に回収した。生物学的反復のために、ＲＮＡ抽出は８個体をまとめて一つのサンプルとした。全ＲＮＡをＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ社）で抽出し、Ｃｙ５及びＣｙ３でラベルしたｃＤＮＡプローブの調製に使用した。マイクロアレイ実験はデータ解析も含めて、全て製品に添付されたプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ＧｅｎｅｒｉｃＡ．ａｓｐｘ？ｐａｇｅｔｙｐｅ＝Ｃｕｓｔｏｍ  ＆ｓｕｂｐａｇｅｔｙｐｅ＝Ｃｕｓｔｏｍ＆ｐａｇｅｉｄ＝２０１８）に従って行った。マイクロアレイ解析の再現性を評価するために色素（Ｃｙ５とＣｙ３）を交換しても同じ結果が出ることを確認する実験を行った。Ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ．６．１．１；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、アレイ上の各スポットを特定して定量し、Ｌｏｗｅｓｓ法による標準化を行った。【００５９】
上記マイクロアレイ解析により、３７℃、５時間処理時に、シグナル値が２０００以上、ＦＤＲ（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）が０．０１以下で、ベクターコントロール植物よりも発現量が２倍以上高く誘導されていた遺伝子が１５個見出された（図１１）。その１５個の遺伝子の内の５個がＨＳＰ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、３個はＨＳＦ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ）であった。更に、５個のＨＳＰの内で、３個はＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡ過剰発現体のマイクロアレイ解析［Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ.１０３，ｐｐ.１８８２２-１８８２７（２００６）］でも発現が上昇する遺伝子であった。【００６０】
実施例６：ＮＦ−ＹＣ１０過剰発現シロイヌナズナの高温ストレス及び乾燥ストレス耐性試験
ストレス応答遺伝子の中で、ＨＳＰ、ＨＳＦは高温ストレス耐性に関係していると考えられている［Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ.６５９−６６５（２０１０）、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．３６８，ｐｐ.５１５−５２１（２００８）］。上記実施例５のとおり、高温ストレス条件下において発現が上昇した１５個の遺伝子のうち、８個がＨＳＰ或いはＨＳＦであった。このため、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０過剰発現植物は高温ストレス耐性が向上していることが予想された。このことを確認するために、上記実施例３で選択した、独立した３ラインの高温ストレスへの耐性を試験した。また、ＤＲＥＢ２Ａの関与が推定されている乾燥ストレスに対する耐性についても試験した。【００６１】
具体的に、乾燥ストレスについては、ＧＭ寒天培地上で明期１６時間／暗期８時間の照光条件（５０±１０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ）、２２℃±１℃で、播種後２週間育成させた植物を、パーライト、バーミキュライト等の土を入れた鉢に移植して１週間生育させた。次いで、この植物への給水を３週間停止することで乾燥ストレスを付加した。当該ストレス付加後に再給水を行いつつ２週間生育させ、植物の色で生存あるいは枯死を判断した。なお、植物体の大きさによる影響を最小限にとどめるために、同程度の大きさの植物を実験に使用した。【００６２】
また、高温ストレスについては、ＧＭ液体培地を浸した濾紙上で播種後１週間生育した植物を、Ｓａｋｕｍａらの方法［Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１０３，ｐｐ.１８８２２-１８８２７（２００６）］に従い、４５℃、５０分処理した。その後、１０日間通常条件で生育させた後の状態を観察した。より詳細には、プラスチックシャーレ（９０φｘ２０ｍｍ）内に、８４ｍｍ径の濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を２枚敷き、４ｍｌの液体ＧＭ培地で浸し、その上に滅菌した上記３ラインの本発明の形質転換体の種子を播種した。また、比較対照の植物体も同じシャーレ内に播種した。シャーレの周囲をサージカルテープ(３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ製）でシールし、当該シャーレを、播種から７日後に４５℃に設定したハイブリダイゼーションインキュベーター（機種名ＨＢ−８０：タイテック製）内に設置した１３０ｍｍ  ｘ  １３０ｍｍ  ｘ  ５０ｍｍのフリーズボックス（アシスト社製）の上に置いた。当該フリーズボックス上で５０分間静置した後、シャーレを２２℃のインキュベーターに戻して、１０日間生育させた。全ての実験は少なくとも３回以上繰り返し、各実験で少なくとも３ライン、４０植物体以上を用いた。【００６３】
上記の高温ストレス耐性試験結果を図１２に示す。図中の括弧内の数字は試験に用いた植物体数（分母）と生存していた植物個体数（分子）を表し、図には生存率（％）も示されている。この高温ストレス実験において、ベクターコントロール植物の半数以上が枯死したのに対し、本発明のシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０過剰発現植物、特にライン３５Ｓ：ＮＦ−ＹＣ１０−ｂ及び３５Ｓ：ＮＦ−ＹＣ１０−ｃでは、ほとんどの植物が健全な状態を保っていた。従って、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０を発現することにより、植物の高温ストレス耐性が改善されることが示された。一方、本実施例の乾燥ストレス耐性試験では殆どの植物体が枯死し、ベクターコントロールとＮＦ−ＹＣ１０過剰発現植物の間に有意な生存率の差は見られなかった。【００６４】
実施例７：シロイヌナズナ及び他の動植物におけるＮＦ−ＹＣ１０相同遺伝子の系統樹解析
ＮＦ−ＹＣファミリー遺伝子の保存領域であるＨ２Ａドメインの配列から、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムによってアラインメントを作製した。但し、変数は：ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．００，ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１、のように設定した。なお、最終的には手作業でアラインメントを微調整した。系統樹は、Ｆｕｊｉｔａらの方法［Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．３９，ｐｐ.８６３−８７６（２００４）］に従って、ＭＥＧＡ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）を用いて、近隣結合法により作製した。単系統群の信頼度は、ブーツストラッップ解析（１０００回反復）により計算した。図１３において、双子葉植物のシロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０に対応するダイズ、単子葉植物のイネ及びコケ植物のヒメツリガネゴケにおける相同遺伝子と本発明者が割り当てた呼称を示す。また、図１４には、それらの遺伝子及び、ヒト、マウス、酵母のＮＦ−ＹＣファミリー遺伝子の類縁関係を系統樹により示した。図中の黒点は、ブートストラップ値が５０以上であることを示している。この系統樹により、シロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０は、他の類縁遺伝子と比較しても系統的に離れた遺伝子であること、またダイズ、イネ、ヒメツリガネゴケにおけるシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０相同遺伝子も、同様に他の類縁遺伝子と系統的に離れた遺伝子であることが明らかとなった。図１５は、シロイヌナズナとイネ、、ダイズ、ヒメツリガネゴケにおけるシロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０相同遺伝子の保存領域のアミノ酸配列比較を示している。【００６５】
実施例８：他の植物遺伝子での酵母ツーハイブリッドシステムによる相互作用解析
イネのＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２遺伝子は、シロイナズナのＤＲＥＢ２Ａの相同遺伝子であることが知られている（非特許文献７）。また、ダイズのＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２遺伝子は、シロイナズナのＤＲＥＢ２Ａの相同遺伝子であることが知られている（非特許文献８）。本実施例は、シロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０蛋白質が、他の植物のＤＲＥＢ２Ａ相同蛋白質とも相互作用し得ることを示す。つまり、シロイヌナズナＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質群にける保存領域が、ＮＦ−ＹＣ１０相同蛋白質とＤＲＥＢ２Ａ相同蛋白質の相互作用において決定的な役割を担っていることを示す。【００６６】
実施例１で用いた酵母ツーハイブリッドシステム・プロトコルにおいて、シロイナズナＤＲＥＢ２ＡのＣ末端側転写活性化ドメインを除く領域をコードする塩基配列を連結することに代えて、イネのＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２の当該領域（１-１４６  ａ．ａ．）をコードする塩基配列、又はダイズのＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２の当該領域（１-１３７  ａ．ａ．）をコードする塩基配列を連結し、ベイト遺伝子のベクターとして用いた。具体的に、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２（１-１４６  ａ．ａ．）をコードする塩基配列は、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２の全長ｃＤＮＡ含有ヌクレオチド（配列番号２９）から下記のプライマー（配列番号３０及び３１）によりＰＣＲ増幅した。また、ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２（１-１３７  ａ．ａ．）をコードする塩基配列は、ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２の全長ｃＤＮＡ含有ヌクレオチド（配列番号３２）から下記のプライマー（配列番号３３及び３４）によりＰＣＲ増幅した。それらの配列で、実施例１のｐＧＢＫＴ７プラスミドのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中のシロイナズナＤＲＥＢ２Ａ配列を置き換え、ベイト遺伝子のベクターとした。それ以外は、実施例１と同様にして、シロイナズナＮＦ−ＹＣ１０全長ｃＤＮＡを連結したプレイベクターを、前記のベイトベクターと共に酵母ＡＨ１０９株に導入し、培養した。
【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【００６７】
イネのＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２及びダイズのＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２とシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相互作用の存在が、双方のベクターを導入した酵母のＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ／−Ａｄｅ／３−ＡＴ（ＱＤＯ）寒天培地上での生育により確認された（図１６を参照）。【００６８】
実施例９：他の植物遺伝子でのシロイヌナズナ・プロトプラストを用いた一過的発現による相互作用解析
上記の実施例８に加えて、実施例２の実験を、イネのＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２遺伝子及びダイズのＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２遺伝子を用いて繰り返すことで、前記の相互作用の存在を確認した。すなわち、実施例２でのシロイナズナＤＲＥＢ２Ａ全長ｃＤＮＡに代えて、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２全長ｃＤＮＡ及びＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２全長ｃＤＮＡをｐＢＩ２２１に連結した。なお、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２全長ｃＤＮＡは下記のプライマー（配列番号３５及び３６）によりＰＣＲ増幅した。また、ＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２全長ｃＤＮＡは下記のプライマー（配列番号３７及び３８）によりＰＣＲ増幅した。それらのｃＤＮＡにより、実施例２のｐＢＩ２２１プラスミドのＣｌａＩ／ＸｈｏＩサイト中のシロイナズナＤＲＥＢ２ＡｃＤＮＡを置き換えた。それ以外は、実施例２と同様の実験を繰り返した。
【化１５】
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【００６９】
イネのＯｓＤＲＥＢ２Ｂ２及びダイズのＧｍＤＲＥＢ２Ａ；２とシロイナズナＮＦ−ＹＣ１０の相互作用の存在が、双方のプラスミドを導入したシロイヌナズナの葉肉細胞由来のプロトプラストのみが、シグナルを発生することにより確認された（図１７を参照）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、食用、飼料、園芸作物などの農業生産に利用できる。また、それらの作物生産のための種苗産業において利用され得る。更に、本発明の形質転換植物体は、植物バイオテクノロジー分野の研究及び開発に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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