(57)【要約】要約［課題］六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料とした高収率の化学品の製造方法を提供すること。［解決手段］微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記微生物がカタボライト抑制を受ける微生物であり、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含む、化学品の製造方法を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記微生物がカタボライト抑制を受ける微生物であり、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含む、化学品の製造方法。
【請求項２】
前記濾過液総量の五炭糖の濃度が５ｇ／Ｌ以下である、請求項１に記載の化学品の製造方法。
【請求項３】
前記発酵原料中に含まれる六炭糖と五炭糖の重量比率が１：９〜９：１である、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
【請求項４】
前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
【請求項５】
前記五炭糖がキシロースである、請求項１から４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、六炭糖および五炭糖を含む発酵原料を使用した連続発酵による化学品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸などの生分解性ポリマー原料やエタノールなどのバイオ燃料に代表されるバイオマス由来の化学品は、大気中への二酸化炭素の排出問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びている。これら生分解性ポリマー原料やバイオ燃料の製造方法としては、とうもろこしなどの可食性バイオマスから精製した六炭糖であるグルコースを微生物の発酵原料に使用し、発酵産物として得るのが一般的であるが、可食性バイオマスを使用すると、食料と競合することから価格高騰が引き起こされ、安定した原料の調達ができなくなる恐れがある。そこで、稲わらなどの非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する試みが行われている（特許文献１参照。）。【０００３】
非可食性バイオマス由来の糖を発酵原料に使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られ、非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する場合、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として使用することになる（特許文献１参照。）。【０００４】
六炭糖と五炭糖の混合糖である非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料とした発酵方法としては連続発酵が採用されうるが、実際に連続発酵した場合の発酵収率については確認されていない（特許文献１参照。）。一方で、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として連続発酵する場合、培地が連続的に発酵に利用されるため、バッチ発酵の場合よりもカタボライト抑制を連続的に受けることによってバッチ発酵よりも発酵収率が著しく低下してしまうことも知られている（非特許文献１参照。）。したがって、六炭糖と五炭糖の混合糖を微生物の発酵原料とした連続発酵によって発酵収率を向上させようとする場合、カタボライト抑制を受けないような微生物を用いる必要があると考えるのがこれまでの技術常識であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０６７７８５
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｏ  Ｙｕｎ  Ｋｉｍ，Ｓｅｏｎｇ  Ｃｈｕｎ  Ｙｉｍ，Ｐｙｕｎｇ  Ｃｈｅｏｎ  Ｌｅｅ，Ｗｏｏ  Ｇｉ  Ｌｅｅ，Ｓａｎｇ  Ｙｕｐ  Ｌｅｅ，Ｈｏ  Ｎａｍ  Ｃｈａｎｇ，Ｂａｔｃｈ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｗｏｏｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｂｙ  Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ＭＢＥＬ５５Ｅ，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５，（２００４），６４８−６５３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生分解性ポリマー原料やバイオ燃料を発酵生産する微生物として、カタボライト抑制を受けるものが数多く知られている。一方、前述のとおり、六炭糖と五炭糖の混合糖を微生物の発酵原料として連続発酵をした場合には、カタボライト抑制により発酵収率が著しく低下してしまうことが知られている。そこで本発明は、六炭糖と五炭糖の混合糖をカタボライト抑制を受ける微生物の発酵原料として連続発酵する場合の発酵収率の向上を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、六炭糖と五炭糖の混合糖を微生物の発酵原料として連続発酵する化学品の製造方法において、カタボライト抑制を有する微生物を、分離膜を用いた連続発酵を行なうことで上記課題を解決することを見出し、本発明に至ったものである。【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（５）の通りである。
（１）微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記微生物がカタボライト抑制を受ける微生物であり、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含む、化学品の製造方法。
（２）前記濾過液総量の五炭糖の濃度が５ｇ／Ｌ以下である、（１）に記載の化学品の製造方法。
（３）前記発酵原料中に含まれる六炭糖と五炭糖の重量比率が１：９〜９：１である、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
（４）前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
（５）前記五炭糖がキシロースである、（１）から（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、六炭糖と五炭糖の混合糖をカタボライト抑制を受ける微生物の発酵原料とするにもかかわらず、化学品を高収率で製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、微生物を発酵原料で培養して化学品を発酵生産する化学品の製造方法において、培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵する化学品の製造方法であって、カタボライト抑制を受ける前記微生物を用い、かつ、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含むことを特徴とする化学品の製造方法である。
【００１２】
本発明の化学品の製造方法においては、発酵原料の炭素源には五炭糖と六炭糖を含む混合糖が含まれる。五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
【００１３】
六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
【００１４】
本発明で使用される混合糖に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことが知られているセルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法は、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１−５０６９３４号公報、特開２００５−２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０〜５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３−２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１−９５５９７号公報）、バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
【００１５】
混合糖に含まれる五炭糖と六炭糖の重量比率は特に制限はないが、混合糖中の五炭糖と六炭糖の重量比率として（五炭糖）：（六炭糖）と表すと、１：９〜９：１が好ましい。これは、混合糖としてセルロース含有バイオマス由来糖液を想定した場合の糖比率である。
【００１６】
本発明に使用する発酵原料に含まれる総糖濃度は特に制限されず、微生物の化学品の生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。具体的には、培地中の炭素源の濃度は、１５〜５００ｇ／Ｌが好ましく、２０〜３００ｇ／Ｌがより好ましい。総濃度が１５ｇ／Ｌ以下であると、五炭糖からの収率向上の効果が低下してしまうことがある。また、総糖濃度が低いと化学品の生産効率も低下してしまう。
【００１７】
本発明に使用する発酵原料に含まれる六炭糖濃度は、上記の総糖濃度、五炭糖と六炭糖の割合の範囲において特に限定されないが、本発明の化学品の製造方法を用いれば、六炭糖を濃度５ｇ／Ｌ以上含む混合糖液においても良好な収率を得ることができる。
【００１８】
本発明で使用する発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。
【００１９】
本発明で使用する窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００２０】
本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００２１】
次に、本発明において分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。
【００２２】
本発明に用いる多孔質膜については特に制限はなく、微生物の撹拌型培養器あるいは撹拌型バイオリアクターによる培養で得られた培養液を微生物から分離濾過する機能を有するものであればよく、例えば多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
【００２３】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
【００２４】
多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
【００２５】
多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【００２６】
本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００２７】
多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００２８】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００２９】
多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００３０】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００３１】
本発明で分離膜として使用される多孔性膜は、特に制限はなく、発酵に使用される微生物が通過できなければよいが、発酵に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりを起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、多孔性分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが好ましい。また、さらに好ましくは、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【００３２】
微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は１μｍ未満であることが好ましい。多孔性膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。
【００３３】
また、微生物が所望の生産物である化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による多孔性膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
【００３４】
平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００３５】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求めることができる。
【００３６】
本発明で用いられる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００３７】
【数１】
2013105651.tif 000002
【００３８】
本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０−１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０−１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００３９】
本発明で用いられる多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
【００４０】
さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、多孔性膜の純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の多孔性膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。多孔性膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００４１】
ここで、多孔性膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置    原子間力顕微鏡装置（Digital Instruments（株）製“Nanoscope IIIa”）
・条件    探針        ＳｉＮカンチレバー（Digital Instruments（株）製）
走査モード  コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲    １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
走査解像度  ５１２×５１２
・試料調製  測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００４２】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００４３】
【数２】
2013105651.tif 000003
【００４４】
本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００４５】
なお、前述の多孔性膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０に記載される製造方法により製造することができる。
【００４６】
また、別の好ましい形態として、本発明における分離膜は、少なくともセラミックスを含む膜であり得る。本発明におけるセラミックスとは金属酸化物を含有し、高温での熱処理により焼き固められたものをさす。金属酸化物としては、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニアなどが例示できる。分離膜は金属酸化物のみから形成されてもよく、シリカや炭化珪素、シリカと金属酸化物の化合物であるムライトやコージェライトなどを含んでもよい。
【００４７】
分離膜を形成するセラミックス以外の成分は、分離膜としての多孔質体をなすことができるものであれば特に限定されない。
【００４８】
分離膜がセラミックスを含む場合もその形状には特に制限はなく、モノリス膜、平膜、管状膜などいずれも用いることができる。容器内への充填効率の観点から柱状構造であり、長手方向に貫通孔を有する構造のものが好ましい。充填効率が上げられる点から、好ましくはモノリス膜である。
【００４９】
長手方向に貫通孔を有することが好ましい理由は以下のとおりである。柱状構造を有する分離膜をモジュール容器に収めて分離膜モジュールとして用いる場合は、分離膜は外圧式および内圧式のうちから好適な態様を選択してモジュール化、濾過することが可能となる。本発明においては、これ以降、分離膜が発酵培養液と接する側を１次側、濾過により化学品を含む濾液が得られる側を２次側とそれぞれ呼ぶこととする。
【００５０】
内圧式モジュールを用いると、１次側の流路が狭いため、クロスフロー濾過を行う場合に循環ポンプの出力が節約できる。さらに、分離膜表面に堆積した濁質をモジュール外に排出する作用が強くなり、分離膜表面が清浄に保たれやすいため好ましい。ただし、この効果を得るためには、内圧式の分離膜が発酵培養液の入り口および出口を有していることが前提となる。このときの入り口および出口は一直線に配された貫通孔の状態であると、通液抵抗が小さくなるため好ましい。さらに分離膜が柱状構造で、貫通孔が長手方向に空いていることによって、分離膜を収める容器を細くすることが可能となる。分離膜モジュールが細いと、製造や取り扱いの観点から好ましく用いることが出来る。
【００５１】
分離膜の気孔率は特に限定されないが、低すぎると濾過効率が悪くなり、高すぎると強度が低下してしまう。濾過効率と分離膜の強度を両立させ、繰り返し蒸気滅菌への耐性も持たせるためには、２０％以上６０％以下であることが好ましい。
【００５２】
なお気孔率は、以下の式より決定される。
気孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]−乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）。
【００５３】
分離膜の平均気孔径は０．０１μｍ以上１μｍ以下であれば好ましく、この範囲の平均気孔径を有する膜であれば分離膜が閉塞しにくく、かつ濾過効率にも優れる。また、平均気孔径が０．０２μｍ以上０．２μｍ以下の範囲であれば、タンパク質、多糖類などに例示される微生物や培養細胞による発酵の副生成物や、培養液中の微生物/培養細胞が死滅して生じる細胞破砕物といった、分離膜を閉塞させやすい物質の閉塞が起きにくくなるため特に好ましい。
【００５４】
貫通孔を有する柱状構造の分離膜は、外表面が２次側となるため、濾過液を集めるためにモジュール容器を設け、モジュール容器内に分離膜を充填したモジュールとして用いることが好ましい。１本のモジュールに充填される分離膜は１本以上である。
【００５５】
モジュール容器は、繰り返しの蒸気滅菌処理に耐えうる原料からなることが好ましい。蒸気滅菌処理に耐えうる原料としては、たとえばステンレス鋼や、平均気孔率の低いセラミックスなどが例示される。
【００５６】
このようなセラミック膜モジュールは、例えばＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される製造方法により製造することができるが、市販のものを利用することもできる。市販のものとして具体的に例示すると、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ精密ろ過膜（Ｐａｌｌ）、セラミック膜フィルターセフィルトＭＦ膜（日本ガイシ）などが挙げられる。
【００５７】
次に、連続発酵について説明する。
【００５８】
本発明の化学品の製造方法においては、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよい。しかし、培養液を濾過するために、有機高分子膜において１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、化学品を生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、発酵培養液の透過水量が十分得られない場合があり、化学品を製造するときの生産性が低下する傾向がある。したがって、本発明の化学品の製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１ｋＰａから１５０ｋＰａの範囲とすることにより、発酵培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０.１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲である。
【００５９】
セラミック膜を用いる場合においても、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよいが、５００ｋＰａ以下が好ましい。５００ｋＰａ以上で運転すると、膜の目詰まりが発生し、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
【００６０】
濾過の駆動力としては、発酵液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホン、またはクロスフロー循環ポンプにより分離膜に膜間差圧を発生させることができる。また、濾過の駆動力として分離膜２次側に吸引ポンプを設置してもよい。また、クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。更に、発酵液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００６１】
本発明では、分離膜を透過した濾過液総量の五炭糖の濃度が５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。六炭糖と五炭糖の混合糖を含む発酵原料を使用して、カタボライト抑制を受ける微生物を用いて連続発酵を行うと、培地が連続的に発酵に利用されるため、バッチ発酵の場合よりもカタボライト抑制を連続的に受け、その結果、五炭糖のみが培養液中に大量に残り、生産収率が低下してしまうが、本発明では、連続発酵に分離膜を使用することでカタボライト抑制を受ける微生物を用いても濾過液総量の五炭糖濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することができ、その結果、分離膜を使用しない連続発酵に比べて化学品の生産収率を向上することができる。分離膜で得られた濾過液総量に五炭糖が５ｇ／ｌ以上残ってしまうと、五炭糖からの収率向上の効果が低下してしまうことがあり、その結果、生産収率も低下してしまうことがある。なお、ここで言う生産収率とは、連続培養における生産収率であり、次の（式３）で計算され、ある一定期間内で原料炭素源を消費し生成された化学品量（ｇ）を、その期間の投入炭素源量（ｇ）で除して求められる。この際に、生産物を生産するのに利用されなかった糖も、投入炭素源量の中に計算される。
生産収率（ｇ／ｇ）＝生産物量（ｇ）÷投入炭素源量（ｇ）・・・（式３）。
【００６２】
濾過液総量の五炭糖の濃度は培養条件によって調節することができる。例えば、発酵原料中に含まれる糖の濃度、糖の供給速度や希釈率を変化させることで、濾過液総量の五炭糖の濃度を減らすことも可能である。あるいは、発酵原料中に含まれる栄養源を増加させることで、微生物の糖の消費を向上させ、濾過液総量の五炭糖の濃度を減らすことも可能である。
【００６３】
本発明において、微生物の発酵培養において、ｐＨ、温度は微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、ｐＨが４〜８で温度が２０〜７５℃の範囲で行われるのが好ましい。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００６４】
また、本発明の化学品の製造方法では、培養初期にバッチ培養またはフェドバッチ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続発酵（培養液の濾過）を開始しても良い。また、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から、培地供給および培養液の濾過を行うことが可能である。培地供給と培養液の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、培地供給と培養液の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００６５】
原料培養液には、菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物の濃度は、化学品の生産性を高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００６６】
本発明の化学品の製造方法では、連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、培地で希釈することによって、培養槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、培地で希釈することで、閉塞から回避することができることがある。また、発酵槽内の微生物濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として、微生物を含んだ培養液の一部を取り除いて培地で希釈することで生産性能を維持させることも可能である。
【００６７】
本発明の化学品の製造方法では、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽の数は問わない。
【００６８】
本発明では、従来のバッチ培養と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい連続発酵生産が可能となる。ここで、連続発酵培養における生産速度は、次の式（４）で計算される。
発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝濾液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式４）。
【００６９】
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈｒ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【００７０】
また、連続培養における収率は、次の式（５）で計算され、ある一定期間内で原料炭素源を消費し生成された化学品量（ｇ）を、その期間の投入炭素源量（ｇ）から微生物が利用できなかった未利用炭素源量（ｇ）を引いた値で除して求められる。本明細書で言う収率とは、特に断らない限りこのことを指す。
収率（ｇ／ｇ）＝生産物量（ｇ）÷｛投入炭素源量（ｇ）−未利用炭素源量（ｇ）｝・・・・（式５）。
【００７１】
本発明で用いられる連続発酵装置は、微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵による化学品の製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、有機高分子膜を使用する際は、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載される装置が使用できる。また、セラミック膜を使用する際は、ＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される装置が使用できる。
【００７２】
次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物について説明する。
【００７３】
本発明で用いられるカタボライト抑制を受ける微生物とは、一般に五炭糖を資化する微生物を発酵する際に、六炭糖と五炭糖を含む混合糖を含む発酵原料を使用すると、五炭糖の消費が抑えられてしまう微生物のことを言うが、本発明においてはより具体的に、グルコースとキシロースの資化能を有する微生物を使用したバッチ培養において、キシロース単独の培地でのキシロースの消費速度よりも、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地でのキシロースの消費速度が遅い微生物について「カタボライト抑制を受ける微生物である」と言う。
【００７４】
ここで、キシロース単独の培地でのキシロースの消費速度とは、下記の（式６）により算出される。
キシロースの消費速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝培養開始時の発酵原料に含まれる総キシロース量（ｇ）÷培養開始から発酵原料に含まれるキシロースを完全に消費し尽くすまでに費やした時間（ｈｒ）÷発酵液量（Ｌ）・・・（式６）。
【００７５】
また、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地でのキシロースの消費速度とは、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地でのグルコース存在下でのキシロースの消費速度のことであり、下記の（式７）により算出される。
キシロースの消費速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝培養開始時から時間Tまでに消費されたキシロース量（ｇ）÷培養開始から時間Ｔまでの時間（ｈｒ）÷発酵液量（Ｌ）・・・（式７）。
【００７６】
（式６）および（式７）において、キシロースの消費速度を算出する際、混合糖でのグルコースとキシロースの重量比率は１：１で行なう。また、キシロースの消費速度を比較する際、糖濃度は微生物が残存糖なく完全に消費できる濃度であれば特に限定されない。また、キシロース単独の培地でのキシロースの糖濃度と、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地での総糖濃度は同じにする。
【００７７】
また（式７）において、時間Ｔはグルコースが完全に消費された時間である。時間Ｔは、サンプリングした培養液をＨＰＬＣまたはキット、センサーによりグルコース濃度を測定し、求めることができる。ただし、グルコースが完全に消費された時間が、キシロースが完全に消費された時間よりも遅い場合は、時間Ｔはキシロースが完全に消費された時間とする。この場合においても時間Ｔはグルコース濃度の測定方法と同様に、キシロース濃度を測定することで求めることができる。また、培養中に中和剤添加やサンプリングなどで発酵液量が変化した場合は、培養液に追加した液量または減らした液量を考慮して計算を行うものとする。
【００７８】
カタボライト抑制を受ける微生物は、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などから選択され、具体例として、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、イッサチェンキア属（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、リンドネラ属（Ｌｉｎｄｎｅｒａ）、ウィッカーハモミセス属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）などの酵母、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属などの腸内細菌類や、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などの乳酸菌類、またアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類やバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アンプラリエラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物から選択されうる。
【００７９】
また、カタボライト抑制を受ける微生物は、自然環境から単離されたものであっても、本来五炭糖を資化しないが突然変異や遺伝子組換えによって五炭糖を資化するように改変された微生物からも選択されうる。遺伝子組換えによって五炭糖を資化するように改変された微生物の具体例としては、遺伝子組換えにより五炭糖の代謝遺伝子を導入あるいは強化された微生物が挙げられる。特に、五炭糖のなかでもキシロースの代謝遺伝子については、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、キシルロースキナーゼなどの酵素が例示され、こうした遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物としては、特表２００６−５２５０２９号公報、特開２００９−１１２２８９号公報、特表２０１０−５０４７５６号公報などに記載された微生物を例示できる。
【００８０】
本発明により製造される化学品としては、上記微生物が発酵培養液中に生産する物質であれば制限はなく、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロール、ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、イソプロパノールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、アジピン酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、また、カタベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組み換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。これら化学品は周知の方法（膜分離、濃縮、蒸留、晶析、抽出等）により濾過液より回収することができる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８２】
（参考例１）グルコース、キシロース、エタノール、２，３−ブタンジオールの分析方法
発酵液中のグルコース、キシロース、エタノールおよび２，３−ブタンジオールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ  硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。【００８３】
（参考例２）乳酸の分析方法
発酵液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。【００８４】
（参考例３）バチルス・コアギュランスでのキシロース消費速度算出
乳酸発酵微生物であるバチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株の乳酸発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表１に示す組成の乳酸発酵キシロース培地と表２に示す乳酸発酵混合糖培地１を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度は参考例１の方法により、生産物である乳酸の濃度は参考例２の方法により測定した。【００８５】
【表１】
2013105651.tif 000004
【００８６】
【表２】
2013105651.tif 000005
【００８７】
バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を炭酸カルシウムと共にフラスコで５０ｍＬの前培養培地(ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を窒素ガスでパージした１Ｌの乳酸発酵キシロース培地、乳酸発酵混合糖培地１にそれぞれ植菌し、以下の条件でバッチ発酵を行った。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：５０（℃）
反応槽通気量（窒素ガス）：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【００８８】
乳酸発酵キシロース培地と乳酸発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表７に示した。この結果から、バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。【００８９】
（参考例４）キャンディダ・トロピカリスでのキシロース消費速度算出
エタノール発酵微生物であるキャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株のエタノール発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表３に示す組成のエタノール発酵キシロース培地と表４に示すエタノール発酵混合糖培地１を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度と、生産物であるエタノールの濃度は参考例１の方法により測定した。【００９０】
【表３】
2013105651.tif 000006
【００９１】
【表４】
2013105651.tif 000007
【００９２】
キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前培養）。前培養液を、２Ｌのエタノール発酵キシロース培地およびエタノール発酵混合糖培地に植菌し、以下の条件でバッチ培養を行った。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【００９３】
エタノール発酵キシロース培地とエタノール発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表７に示した。この結果、キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。【００９４】
（参考例５）パエニバチラス・ポリミキサでのキシロース消費速度算出
２，３−ブタンジオール発酵微生物であるパエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株の２，３−ブタンジオール発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表５に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵キシロース培地と表６に示す２，３−ブタンジオール発酵混合糖培地１を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度と、生産物である２，３−ブタンジオールの濃度は参考例１の方法により測定した。【００９５】
【表５】
2013105651.tif 000008
【００９６】
【表６】
2013105651.tif 000009
【００９７】
パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で５０ｍＬの前培養培地(グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１Ｌの２，３−ブタンジオール発酵キシロース培地と２，３−ブタンジオール発酵混合糖培地にそれぞれ植菌し、以下の条件でバッチ培養を行った。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【００９８】
２，３−ブタンジオール発酵キシロース培地と２，３−ブタンジオール発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表７に示した。この結果、パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。【００９９】
【表７】
2013105651.tif 000010
【０１００】
（比較例１）六炭糖（グルコース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ培養によるＬ−乳酸の製造
Ｌ−乳酸発酵微生物としてバチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を用い、培地として表８に示す組成の乳酸発酵培地を用いた。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を炭酸カルシウムと共にフラスコで５０ｍＬの前培養培地(ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を窒素ガスでパージした１Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、参考例３の条件で９６時間のバッチ培養を行った（表１１）。【０１０１】
【表８】
2013105651.tif 000011
【０１０２】
（比較例２）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ培養によるＬ−乳酸の製造
バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を表２に示す乳酸発酵混合糖培地を用いて比較例１と同様の条件で１２８時間のバッチ培養を行った（表１１）。【０１０３】
（比較例３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの連続培養によるＬ−乳酸の製造
混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした表２に示す組成の乳酸発酵混合糖培地１を用いた分離膜を利用しない連続培養を行なった。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を上記比較例１の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、前培養液を窒素ガスでパージした１.５Ｌの乳酸発酵混合糖培地に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽を窒素で満たし、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、前培養完了後、直ちに発酵液抜きポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう微生物を含む培養液の引き抜き量の制御を行いながら以下の条件で３００時間の連続培養を行い、乳酸を製造した（表１１）。
発酵反応槽容量：：２(Ｌ)
温度調整：５０（℃）
反応槽通気量（窒素ガス）：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
発酵液の抜き量：３（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１０４】
（実施例１）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養によるＬ−乳酸の製造１
混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした表２に示す組成の乳酸発酵混合糖培地を用いた分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては中空糸の形態を採用した。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を上記比較例１の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、前培養液を窒素ガスでパージした１.５Ｌの乳酸発酵混合糖培地に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽を窒素で満たし、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で２９０時間の連続培養を行い、乳酸を製造した（表１１）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４７３（ｃｍ２）
温度調整：５０（℃）
発酵反応槽通気量（窒素ガス）：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
発酵液の抜き量：３（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１０５】
また、使用した膜は以下の性質を持つ膜であり、濾過時の膜間差圧は０．１〜２０ｋＰａの間を推移させた。
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ。【０１０６】
（実施例２）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養２
表９に示す乳酸発酵混合糖培地２を用い、実施例１と同様の条件で３０５時間の分離膜利用連続培養を行い、Ｌ−乳酸を製造した（表１１）。【０１０７】
【表９】
2013105651.tif 000012
【０１０８】
（実施例３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養３
表１０に示す乳酸発酵混合糖培地３を用い、実施例１と同様の条件で３００時間の分離膜利用連続培養を行い、Ｌ−乳酸を製造した（表１１）。【０１０９】
【表１０】
2013105651.tif 000013
【０１１０】
【表１１】
2013105651.tif 000014
【０１１１】
（比較例４）六炭糖（グルコース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物としてキャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、培地として表１２に示す組成のエタノール発酵培地を用いた。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前培養）。前培養液を、１．５Ｌのエタノール発酵培地に植菌し、以下の条件で１６時間のバッチ培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
発酵反応槽容量：２(Ｌ)
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１１２】
【表１２】
2013105651.tif 000015
【０１１３】
（比較例５）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造
表１３に示すエタノール発酵混合糖培地２を用い、比較例４と同様の条件で２３時間のバッチ培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。【０１１４】
【表１３】
2013105651.tif 000016
【０１１５】
（比較例６）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続培養によるエタノールの製造
培地として表１３に示すエタノール発酵混合糖培地２を用いた分離膜を利用しない連続発酵を行った。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前々培養）。１．５Ｌのエタノール発酵混合糖培地２の入った連続発酵装置に前々培養液を植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌して、発酵反応槽の通気量の調整、温度調整を行い、１６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液抜きポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう微生物を含む培養液の引き抜き量の制御を行いながら以下の条件で２９５時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
発酵液の抜き量：１（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１１６】
（実施例４）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続培養によるエタノールの製造
培地として表１３に示す組成のエタノール発酵混合糖培地２を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。分離膜エレメントとしては平膜の形態を採用した。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、連続発酵装置の１．５Ｌのエタノール発酵混合糖培地２に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽の通気量の調整、温度調整を行い、３６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で３００時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
発酵液の抜き量：１（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１１７】
また、使用した膜は実施例１と同様の性質の膜を使用し、濾過時の膜間差圧は０．１〜１９．８ｋＰａの間を推移させた。【０１１８】
【表１４】
2013105651.tif 000017
【０１１９】
（比較例７）六炭糖（グルコース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサのバッチ培養による２，３−ブタンジオールの製造
２，３−ブタンジオール微生物であるパエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を用い、培地として表１５に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地を用いた。【０１２０】
【表１５】
2013105651.tif 000018
【０１２１】
パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で５０ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１Ｌの２，３−ブタンジオール発酵培地に植菌し、以下の条件で２７時間のバッチ培養を行い、２，３−ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵反応槽容量：２(Ｌ)
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１２２】
（比較例８）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサのバッチ培養による２，３−ブタンジオールの製造
表１６に示す混合糖２，３−ブタンジオール発酵培地２を用い、比較例７と同様の条件で５０時間のバッチ培養を行い、２，３−ブタンジオールを製造した（表１７）。【０１２３】
【表１６】
2013105651.tif 000019
【０１２４】
（比較例９）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサの連続培養による２，３−ブタンジオールの製造
混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした分離膜を利用しない連続培養を行なった。パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を上記比較例７の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．２Ｌの表１７に示す混合糖２，３−ブタンジオール発酵培地２に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、前培養完了後、直ちに発酵液抜きポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．２Ｌとなるよう微生物を含む培養液の引き抜き量の制御を行いながら以下の条件で２８０時間の連続培養を行い、２，３−ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整
発酵液の抜き量：０．６（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１２５】
（実施例５）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサの分離膜を利用した連続培養による２，３−ブタンジオールの製造
混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては平膜の形態を採用した。パエニバチラス・ポリミキサ ＡＴＣＣ１２３２１株を上記比較例７の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、前培養液を１．２Ｌの混合糖２，３−ブタンジオール発酵培地２に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．２Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で３１０時間の連続培養を行い、２，３−ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
発酵液の抜き量：０．６Ｌ／Ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１２６】
また、使用した膜は実施例１と同様の性質の膜を使用し、濾過時の膜間差圧は０．１〜２０ｋＰａの間を推移させた。【０１２７】
【表１７】
2013105651.tif 000020
【０１２８】
（参考例６）ピキア・スティピティスでのキシロース消費速度算出
参考例４と同様の条件でバッチ培養を行い、培地として表３に示す組成のエタノール発酵キシロース培地と表４に示すエタノール発酵混合糖培地１を用い、エタノール発酵微生物であるピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株のエタノール発酵時のキシロース消費速度を算出した。【０１２９】
エタノール発酵キシロース培地とエタノール発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表２２に示した。この結果、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。【０１３０】
（参考例７）キャンディダ・ユーティリスでのキシロース消費速度算出
微生物として、ＷＯ２０１０／１４０６０２に開示された方法によって作製したキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用いた。培地として表１８に示す組成のＤ−乳酸発酵キシロース培地と表１９に示すＤ−乳酸発酵混合糖培地１を用いた。ｐＨを１Ｎ  水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は、比較例１と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、Ｄ-乳酸発酵時のキシロース消費速度を算出した。【０１３１】
Ｄ−乳酸発酵キシロース培地とＤ−乳酸発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表２２に示した。この結果、キャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。【０１３２】
【表１８】
2013105651.tif 000021
【０１３３】
【表１９】
2013105651.tif 000022
【０１３４】
（参考例８）エシェリシア・コリＫＯ１１株でのキシロース消費速度算出
エタノール発酵微生物であるエシェリシア・コリＫＯ１１株のエタノール発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表２０に示す組成のエタノール発酵キシロース培地２と表２１に示すエタノール発酵混合糖培地３を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度と、生産物であるエタノールの濃度は参考例１の方法により測定した。【０１３５】
【表２０】
2013105651.tif 000023
【０１３６】
【表２１】
2013105651.tif 000024
【０１３７】
エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ  酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を１．５Ｌのエタノール発酵キシロース培地２とエタノール発酵混合糖培地３にそれぞれ植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１６時間バッチ発酵を行なった。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１３８】
エタノール発酵キシロース培地２とエタノール発酵混合糖培地３でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表２２に示した。この結果、エシェリシア・コリＫＯ１１株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。【０１３９】
【表２２】
2013105651.tif 000025
【０１４０】
（比較例１０）六炭糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスのバッチ培養によるエタノールの製造
微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、比較例４と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した。（表２３）【０１４１】
（比較例１１）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスのバッチ培養によるエタノールの製造
微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、比較例５と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表２３）。【０１４２】
（比較例１２）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの連続発酵によるエタノールの製造
微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、混合糖原料にて分離膜を利用しない連続発酵を行った。前培養時間を４０時間とする以外は比較例６と同様の条件で行い、２９８時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表２３）。【０１４３】
（実施例６）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造１
微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を４８時間とし、膜間差圧を０．１〜１９．８ｋＰａとした以外は実施例４と同様の条件で行い、３０５時間の連続発酵によりエタノールを製造した。【０１４４】
【表２３】
2013105651.tif 000026
【０１４５】
（比較例１３）六炭糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスのバッチ培養によるＤ−乳酸の製造
微生物として、ＷＯ２０１０／１４０６０２に開示された方法によって作製したキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用いた。ｐＨを１Ｎ  水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ−乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は、比較例４と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、Ｄ−乳酸を製造した（表２５）。【０１４６】
【表２４】
2013105651.tif 000027
【０１４７】
（比較例１４）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスのバッチ培養によるＤ−乳酸の製造
微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、ｐＨを１Ｎ  水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ−乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は、比較例５と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、Ｄ−乳酸を製造した（表２５）。【０１４８】
（比較例１５）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの連続発酵によるＤ−乳酸の製造
微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用しない連続発酵を行った。前培養を４０時間とし、ｐＨを１Ｎ  水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ−乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は比較例６と同様の条件で行い、２９０時間の連続発酵によりＤ−乳酸を製造した（表２５）。【０１４９】
（実施例７）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの分離膜を利用した連続発酵によるＤ−乳酸の製造１
微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を５０時間とし、ｐＨを１Ｎ  水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ−乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は実施例４と同様の条件で行い、３１０時間の連続発酵によりＤ−乳酸を製造した。【０１５０】
【表２５】
2013105651.tif 000028
【０１５１】
（比較例１６）六炭糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を表２６に示す組成の１Ｌのエタノール発酵培地２に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１６時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表２８）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ−１）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１５２】
【表２６】
2013105651.tif 000029
【０１５３】
（比較例１７）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
発酵培地として表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地４を用いて、比較例１６と同様の条件で２４時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表２８）。【０１５４】
【表２７】
2013105651.tif 000030
【０１５５】
（比較例３）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの連続発酵によるエタノールの製造
混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用しない連続発酵を行った。エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０ｇ／Ｌ、トリプトン  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地４の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置より分離膜エレメントを除いたもの）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて２４時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、エタノールの製造を行った。表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地３の供給と微生物を含む培養液の引き抜きにはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ−２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いて、培養槽内に直接培地供給を行い、培養槽内から直接微生物を含む培養液の引き抜きを行った。微生物を含む培養液の引き抜き速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しながら２９０時間エタノール製造を行った（表２８）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ−１）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
発酵液の抜き速度：２Ｌ／ｄａｙ
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１５６】
（実施例８）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造
混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用した連続発酵を行った。エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０ｇ／Ｌ、トリプトン  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を、表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地４の入った膜一体型の以下の条件を具備した連続発酵装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて２４時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、エタノールの製造を行った。表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地３の供給と培養液の濾過にはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ−２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いた。培地供給は培養槽内に直接行い、培養液の濾過は分離膜を固定したエレメントを通して行った。培養液の濾過速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ、濾過時の膜間差圧は０．１〜１９．８ｋＰａの範囲を推移させることで、３１０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表２８）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデンろ過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４７３ｃｍ２
分離膜の純水透過係数：５０×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／Ｐａ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：±０．０３５μｍ
分離膜の表面粗さ：０．０６μｍ
温度調整：３０（℃）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
発酵液の抜き速度：２Ｌ／ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１５７】
【表２８】
2013105651.tif 000031
【０１５８】
（比較例１９）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ培養によるＬ−乳酸の製造
発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。乳酸発酵糖液培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に記載のナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を使用し、適宜試薬により表２９に示すとおり調製した。使用した培地と、中和剤を４Ｎ  ＫＯＨにする以外は、比較例２と同様の条件で７０時間バッチ培養を行い、Ｌ−乳酸を製造した（表３０）。【０１５９】
【表２９】
2013105651.tif 000032
【０１６０】
（比較例２０）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの連続培養によるＬ−乳酸の製造
発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。乳酸発酵糖液培地は、比較例１９と同様に表２９記載の培地を用いた。使用した培地と、中和剤を４Ｎ  ＫＯＨにする以外は、比較例３と同様の条件で２５０時間の連続培養を行い、乳酸を製造した（表３０）。【０１６１】
（実施例９）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養によるＬ−乳酸の製造
発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。乳酸発酵糖液培地は、比較例１９と同様に表２９記載の培地を用いた。使用した培地と、中和剤を４Ｎ  ＫＯＨにする以外は、実施例１と同様の条件で２６０時間の分離膜利用連続培養を行い、乳酸を製造した。【０１６２】
【表３０】
2013105651.tif 000033
【０１６３】
（比較例２１）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ培養によるエタノールの製造
発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。エタノール発酵糖液培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に記載のナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を使用し、適宜試薬により表３１に示すとおり調製した。使用した培地以外は、比較例１７と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表３２）。【０１６４】
【表３１】
2013105651.tif 000034
【０１６５】
（比較例２２）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたエシェリシア・コリの連続培養によるエタノールの製造
エタノール発酵糖液培地は、比較例２１と同様に表３１記載の培地を用い、比較例１８と同様の条件で２８５時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表３２）。【０１６６】
（実施例１０）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続培養によるエタノールの製造
表２７に示すエタノール発酵糖液培地を用い、実施例８と同様の条件で２９５時間の分離膜利用連続培養を行い、エタノールを製造した。【０１６７】
【表３２】
2013105651.tif 000035
【０１６８】
（比較例２３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造２
表３３に示すエタノール発酵混合糖培地５を用い、比較例４と同様の条件で４５時間のバッチ培養を行い、エタノールを製造した（表３４）。【０１６９】
【表３３】
2013105651.tif 000036
【０１７０】
（比較例２４）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続培養によるエタノールの製造
表３３に示すエタノール発酵混合糖培地５を用い、比較例６と同様の条件で３５０時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表３４）。【０１７１】
（実施例１１）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続培養によるエタノールの製造２
表３３に示すエタノール発酵混合糖培地５を用い、実施例４と同様の条件で３６０時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表３４）。【０１７２】
（実施例１２）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのセラミック製分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造３
キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、セラミック製分離膜を利用した連続発酵を行った。発酵培地は表３３に示す培地を使用した。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液をＹＰＤ培地５０ｍＬの入った５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに植菌し、一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．５ＬのＹＰＤＸ培地の入った膜分離型の連続発酵装置（ＷＯ２０１２／０８６７６３の図１２に示す装置）に植菌し、培養槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、培養槽の通気速度の調整、温度調整を行い、３６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続発酵を開始した。濾過時の膜間差圧は５００ｋＰａ以下となるよう調整しながら、４００時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表３４）。
培養槽容量：２Ｌ
使用分離膜：Ｃｅｌｆｉｔ精密ろ過膜  モノリス  φ４−１９（日本ガイシ）
膜分離エレメント長さ：５００ｍｍ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
温度調整：３０℃
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし。【０１７３】
【表３４】
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【０１７４】
（実施例１３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサセラミック製分離膜を利用した連続培養による２，３−ブタンジオールの製造２
パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を用い、セラミック製分離膜を利用した連続発酵を行った。パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表１６に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵混合糖培地の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて３０時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、表１６に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵混合糖培地を用いて直ちに連続培養を開始し、２，３−ブタンジオールの製造を行った。濾過時の膜間差圧は５００ｋＰａ以下となるよう調整しながら、３００時間の連続発酵により２，３−ブタンジオールを製造した（表３５）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：Ｃｅｌｆｉｔ精密ろ過膜  モノリス  φ４−１９（日本ガイシ）
膜分離エレメント長さ：５００ｍｍ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６．５に調整【０１７５】
【表３５】
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【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明によって、五炭糖および六炭糖を含む発酵原料を用いた種々の化学品の発酵生産の効率を大幅に向上させることができる。
【国際調査報告】
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