(57)【要約】  本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチド、並びに、前記ペプチドを含む、ＨＰＶワクチンの効果判定のための試薬およびＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、アミノ酸配列 Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号３５）を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列 Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His（配列番号６）を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列 Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号３５）からなるペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号４０）からなるペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列 Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His（配列番号６）からなるペプチド。
【請求項６】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、アミノ酸配列 Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp（配列番号８）を含み、２０〜２５アミノ酸からなるペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列 Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp（配列番号８）からなるペプチド。
【請求項８】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、アミノ酸配列 Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn（配列番号４）を含み、２０〜２５アミノ酸からなるペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列 Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn（配列番号４）からなるペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドを含む、ＨＰＶワクチンの効果を判定するための試薬。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドを含む、ＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬。
【請求項１２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドを含む、ＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬であって、前記ペプチドが、アミノ酸配列 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号４０）を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチドである、試薬。
【請求項１３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドを含む、ＨＰＶワクチンの効果を判定するための試薬であって、前記ペプチドが、アミノ酸配列 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号４０）を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチドである、試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチド、並びに、前記ペプチドを含む、ＨＰＶワクチンの効果判定のための試薬およびＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬に関する。なお、本願は、日本国特許出願第２０１２−０１３３６５号に対して優先権を主張するものであり、参照により該日本国特許出願の内容を本願に一体化させる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６および１８の持続感染が子宮頸がんの原因となっている。これを予防するワクチンとして、ＨＰＶ１６／１８  Ｌ１ウイルス様粒子（ＨＰＶ−ＶＬＰ）が開発され（非特許文献１、２）、臨床で用いられている。しかしながら、現在のところ、接種したワクチンの効果をモニタリングする方法として、安価かつ信頼性ある方法は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２５７６１号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Villa LL, et al Prophylactic quadrivalent human papillomavirus (types 6, 11, 16, and 18) L1 virus-like particle vaccine in young women: a randomized double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial. Lancet Oncol. 2005; 6: 271-278.
【非特許文献２】Harper DM, et al; GlaxoSmithKline HPV Vaccine Study Group. Efficacy of a bivalent L1 virus-like particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randomized controlled trial. Lancet. 2004; 364: 1757-1765.
【０００５】
上記文献は、出典明示により本願明細書の一部とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＨＰＶワクチンの効果をモニタリングするための試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する：
（１）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、アミノ酸配列 Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号３５）を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチド；
（２）アミノ酸配列 Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His（配列番号６）を含む、前記（１）に記載のペプチド；
（３）アミノ酸配列 Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号３５）からなるペプチド；
（４）アミノ酸配列 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号４０）からなるペプチド；
（５）アミノ酸配列 Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His（配列番号６）からなるペプチド；
（６）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、アミノ酸配列 Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp（配列番号８）を含み、２０〜２５アミノ酸からなるペプチド；
（７）アミノ酸配列 Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp（配列番号８）からなるペプチド。
（８）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、アミノ酸配列 Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn（配列番号４）を含み、２０〜２５アミノ酸からなるペプチド；
（９）アミノ酸配列 Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn（配列番号４）からなるペプチド；
（１０）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のペプチドを含む、ＨＰＶワクチンの効果を判定するための試薬；
（１１）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のペプチドを含む、ＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬；
（１２）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドを含む、ＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬であって、前記ペプチドが、アミノ酸配列 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号４０）を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチドである、試薬；および
（１３）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドを含む、ＨＰＶワクチンの効果を判定するための試薬であって、前記ペプチドが、アミノ酸配列 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu（配列番号４０）を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチドである、試薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチドは合成が簡単で安価であることから、本発明によれば、ＨＰＶワクチンの効果判定やＨＰＶ感染の検出を簡便かつ安価に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Balb/cマウスにおける抗体産生（*P＜0.05, n= 6)。
【図２】C57BL/6Nマウスにおける抗体産生 (*, **P＜0.05, n= 18)。
【図３】ペプチド6由来の10 merまたは9 merペプチドに対する抗体の反応性。
【図４】サーバリックス（登録商標）投与者における抗体産生（n= 19)（１）。
【図５】サーバリックス（登録商標）投与者における抗体産生（n= 19)（２）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１  ペプチド
本発明において、「ヒトパピローマウイルスタイプ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチド」とは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６（ＨＰＶ１６とも称する）のＬ１タンパク質（配列番号４１）の部分ペプチドであって、Ｂ細胞エピトープペプチドとしての機能を有するペプチドを意味する。本明細書において、「Ｂ細胞エピトープペプチドとしての機能を有する」とは、生体内でＨＰＶ感染またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチンの投与により誘導される抗体に認識されることを意味する。
【００１１】
本発明における「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン」とは、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質またはその断片を含む、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染に起因する疾患を予防するための医薬を意味する。ＨＰＶ感染に起因する疾患としては、例えば子宮頸がんが挙げられる。「ＨＰＶワクチン」は、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質またはその断片を免疫原として含む限り特に限定されないが、好ましくは、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質またはその断片を構成成分として含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を有効成分とするものが好ましい。本発明に好適なＨＰＶワクチンとしては、「サーバリックス（登録商標）」（グラクソ・スミスクライン株式会社）、「ガーダシル（登録商標）」（ＭＳＤ株式会社）が挙げられる。さらに、「ＨＰＶワクチン」としては、特表２００８−５３９１８４号公報、特開２０１０−９０１５８号公報、および特開２０１０−１４８５１４号公報（これらの文献は出典明示により本願明細書の一部とする）に記載のものが挙げられる。
【００１２】
好ましい態様において、本発明のＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、本発明のＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、本発明のＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号４０、３５、または６に記載のアミノ酸配列は、それぞれＨＰＶ１６のＬ１タンパク質のアミノ酸配列の３０５〜３１３位、３０４〜３１３位、および３００〜３１９位に相当する。更に別の好ましい態様において、本発明のＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号４または８に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号４または８に記載のアミノ酸配列は、それぞれＨＰＶ１６のＬ１タンパク質のアミノ酸配列の１１２〜１３１位および２９３〜３１２位に相当する。
【００１３】
本発明のペプチドの長さは、Ｂ細胞エピトープペプチドとしての機能を有する限り特に制限されないが、６〜３０、好ましくは９〜２５、より好ましくは１０〜２５アミノ酸である。
【００１４】
すなわち、本発明に好適なペプチドは、ＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、配列番号４０、３５、または６に記載のアミノ酸配列を含み、１０〜２５アミノ酸からなるペプチドである。本発明に特に好適なペプチドは、配列番号４０、３５、または６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。更に、本発明に好適なペプチドとして、ＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドであって、配列番号４または８に記載のアミノ酸配列を含み、２０〜２５アミノ酸からなるペプチド、特に好適なペプチドとして、配列番号４または８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００１５】
本発明はまた、ＨＰＶ１６Ｌ１由来Ｂ細胞エピトープペプチドの改変ペプチドであって、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列において、１または数個、好ましくは１または２個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂ細胞エピトープペプチドとしての機能を有するペプチドを提供する。
【００１６】
好ましい態様において、本発明の改変ペプチドは、配列番号４０、３５、６、４、または８に記載のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６のＬ１タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列において、１または数個、好ましくは１または２個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、１０〜２５アミノ酸からなる、Ｂ細胞エピトープペプチドとしての機能を有するペプチドである。
【００１７】
アミノ酸の置換は、いずれの位置でいずれの種類のアミノ酸との間で行ってもよいが、保存的なアミノ酸置換が好ましい。例えば、Ｇｌｕ残基をＡｓｐ残基に、Ｐｈｅ残基をＴｙｒ残基に、Ｌｅｕ残基をＩｌｅ残基に、Ａｌａ残基をＳｅｒ残基に、Ｈｉｓ残基をＡｒｇ残基に置換することが好ましい。アミノ酸の付加および欠失は、いずれの位置で行ってもよいが、ペプチドのＮ末端およびＣ末端で行うことが好ましい。
【００１８】
アミノ酸の置換は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合するペプチドの配列の規則性（モチーフ）に基づいて行うこともできる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４については、８〜１１アミノ酸からなるペプチドの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンとなることが知られている（J. Immunol., 152, p3913, 1994; Immunogenetics, 41: p178, 1995, J. Immunol., 155: p4307, 1994）。ＨＬＡ−Ａ２については、以下のモチーフが知られている（Immunogenetics, 41, p178, 1995; J. Immunol., 155: p4749, 1995）。
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同様に、各種ＨＬＡ−ＤＲに対する結合モチーフも公知である（Curr Opin Immunol, 1995, 7, 85-96; Nature 1991, 353, 622.; Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference. pp. 1065-1220. Oxford, United Kingdom: Oxford University Press, 1992.）。よって、これらのモチーフの範囲内で、アミノ酸を置換してもよい。
【００１９】
ペプチドがＢ細胞エピトープペプチドとしての機能を有するか否かは、以下の実施例に記載の方法にしたがい確認することができる。例えば、ＨＰＶ−１６／１８ウイルス様粒子（ＨＰＶ−ＶＬＰ）ワクチンを投与したマウスから採取した血清と固相化した候補ペプチドとを混合し、当該血清中の抗体により候補ペプチドが認識されるか否かを抗原抗体反応に基づき、例えばLuminex（登録商標）システムを用いて、調べればよい。
【００２０】
本発明のペプチドは、その構成アミノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、Ｎ末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を結合するものや、Ｃ末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等を結合するものが挙げられる。
【００２１】
本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991に記載されている。本発明のペプチドはまた、当該ペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は当業者に周知であり、例えばMolecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983); DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))に記載されている。
【００２２】
２  ＨＰＶワクチンの効果判定およびＨＰＶ感染の検出
【００２３】
本発明のペプチドは、Ｂ細胞エピトープペプチドとしての機能を有することから、ＨＰＶワクチンの効果判定のための試薬およびＨＰＶ感染の有無を検出するための試薬として使用することができる。
【００２４】
ＨＰＶワクチンの効果判定およびＨＰＶ感染の検出は、被験者から採取された血清中の本発明のペプチドを認識する抗体の量（抗体価）を測定することにより行う。測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＩＡ法等が挙げられる。ＨＰＶワクチンの投与前と比較して抗体価が上昇している場合、ＨＰＶワクチンは当該被験者において所望の予防効果を発揮しうると判定される。ＨＰＶワクチンの投与後判定を複数回行うことにより、投与されたＨＰＶワクチンの効果をモニタリングすることができ、ＨＰＶワクチンの投与前と比較して高い抗体価が持続している場合、投与されたＨＰＶワクチンの効果が持続していると判定される。また、本発明のペプチドを認識する抗体が血清中に存在する場合、当該被験者はＨＰＶの感染歴を有することがわかる。
【００２５】
本発明の試薬は、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質またはその断片を免疫原として含むＨＰＶワクチンであればいずれのワクチンにも使用することできるが、「サーバリックス（登録商標）」（グラクソ・スミスクライン株式会社）および「ガーダシル（登録商標）」（ＭＳＤ株式会社）の効果判定に特に好適である。また、本発明の試薬は、特表２００８−５３９１８４号公報、特開２０１０−９０１５８号公報、および特開２０１０−１４８５１４号公報（これらの文献は出典明示により本願明細書の一部とする）に記載のワクチンの効果判定にも使用することができる。
【００２６】
本発明の試薬は、ＨＰＶワクチンの効果判定またはＨＰＶ感染の検出のためのキットに含まれていても良い。キットは、本発明の試薬の他に、プレート、緩衝液、標準物質等を含むことができる。
【００２７】
本発明はまた、被験者から採取された血清中の本発明のペプチドを認識する抗体の量を測定することを含む、ＨＰＶワクチンの効果判定方法およびＨＰＶ感染の検出方法を提供する。
【００２８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は如何なる意味においても当該実施例に限定されない。
【実施例１】
【００２９】
１  方法
（１）マウスの免疫化
本研究で使用した雌Balb/c (H-2d)マウスおよび雌C57BL/6N (H-2b)マウスは6週齢であり、無菌環境下で維持した。H-2dクラスI-A分子に対するペプチドの結合モチーフが日本人の60％に発現するヒト白血球抗原(HLA)クラスI-A2402のものと類似するため、本研究では主にBalb/cマウス(H-2d)を使用した（参考文献１）。二価のHPV-16/18ウイルス様粒子AS04ワクチン（HPV-16 L1 VLPおよびHPV-18 L1 VLPを各2μg、並びに50μgの水酸化アルミニウムおよび5μgの3-脱アシル化モノホスホリルリピドAを含むAS04アジュバントとを含む。）を投与した。Didierlaurentらの報告（参考文献２）に基づき、マウスの大腿部筋肉内に2回（1日目および21日目）HPV16/18 VLP AS04ワクチンを免疫した。【００３０】
（２）血清サンプルの回収
各マウスの血液を眼窩静脈叢から回収した。血液の回収は、ワクチン投与前、および最初の免疫化の3、5、8、11、および14週間後に実施した。各マウスの血液(n=6)を室温で1時間静置して凝集させ、その後遠心および回収を行った。各マウスの血清を密閉し、使用まで-80℃で保存した。IgGレベルの測定は、インビトロバイアスが生じるのを避けるため同時に行った。【００３１】
（３）ペプチド
HLAクラスI (A2またはA24)とHLAクラスII (DR)の両方に対する結合モチーフを有する10種類のHPV16 L1由来ペプチド (19〜21 mer)をウェブソフト(MULTIPRED)で選択した（表１、HLAクラスI分子に対するアンカー残基を太字で示す）。
【表１】
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エピトープマッピングのため、20 merのペプチド6から、8種類の10 merペプチドと1種類の9 merペプチドとを選択した。これらペプチドは、Greiner Bio-One (Thermo Fisher Scientific, Ulm, Germany)から購入した。各ペプチドは、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、-80℃で保存した。【００３２】
（４）xMAPビーズの調製
xMAPカルボキシレートビーズおよびLuminex system platformは、既報のとおりLuminex Corp. (Austin, TX) から入手した（参考文献３）。96穴フィルタープレート (MABVN12) と真空マニホールド装置(MAVM 09601) はMillipore Corp. (Bedford, MA)から入手した。ビオチン化ヤギ抗マウスIgG抗体(γ鎖特異的) (BA 3080) は、Vector Laboratories Inc. (Burligame, CA)から購入した。ストレプトアビジン-PE (S-866) は、Molecular Probes (Eugene, OR)から購入した。1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド (EDC, 22980) は、PIERCE (Rockfrod, IL)から入手した。ペプチドとxMAPビーズとの結合は、既報のとおり（参考文献３）改良版の製造元の説明書にしたがい行った。説明すると、100μlのxMAPビーズを0.1M MES バッファー（pH 7.0）で洗浄し、続いて100μlのペプチド(1 mg/ml、0.1M MESバッファー（pH 7.0）中)と混合した。ペプチドをロードしたビーズをEDC (1 mg/ml)と室温で30分間遮光下にてインキュベートし、次いで同じ条件下でさらに2回インキュベートし、そしてビーズを0.05% Tween 20-PBSにて洗浄した。最後に、ビーズを2-アミノエタノールにて15分間室温で遮光下にて処理し、2回洗浄し、1 mlの0.05% NaN3（Block-Ace中）に再懸濁した。【００３３】
（５）多重ビーズベースLuminexアッセイによる抗ペプチド抗体の測定
各マウスから予定した各時点において血液サンプルを得た。血清中のペプチド特異的IgGレベルは、既報のとおり（参考文献３）、Luminexシステムを用いたフローサイトメトリーアッセイにより測定した。説明すると、血清を100μlのペプチドコード化ビーズと1.5時間室温にてプレートシェーカー上の96穴フィルタープレート中にてインキュベートした。インキュベーション後、プレートを真空マニホールド装置を用いて洗浄し、100μlのビオチン化ヤギ抗マウスIgG抗体(γ鎖特異的)と1時間室温にてプレートシェーカー上でてインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、100μlのストレプトアビジン-PEをウェルに添加し、プレートを40分間室温にてプレートシェーカー上でインキュベートした。結合したビーズを3回洗浄し、続いて100μlのTween 20-PBSを各ウェルに添加し、プレートを3分間プレートシェーカー上で維持した。【００３４】
（６）統計
データの統計的有意差は、Friedman's testおよびWilcoxon rank-sum testにより決定した。0.05未満のP値を統計学的に有意と判断した。【００３５】
参考文献１：Imanishi T, Akazawa T, Kimura A. Allele and haplotype frequencies for HLA and complement loci in various ethnic groups. In Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T. eds. HLA 1991.vol. 1 Oxford: Oxford Scientific Publications, 1992; 1065-1220.
参考文献２：Didierlaurent AM, Morel S, Lockman L, Giannini SL, Bisteau M, Carlsen H, Kielland A, Vosters O, Vanderheyde N, Schiavetti F, Larocque D, Van Mechelen M, Garcon N. AS04, an aluminum salt- and TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity. J Immunol. 2009 Nov 15;183(10):6186-97.
参考文献３：Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh K. New multiplexed flow cytometric assay to measure anti-peptide antibody: a novel tool for monitoring immune responses to peptides used for immunization. Scand J Clin Lab Invest 2004; 64: 535-546.
上記文献は、出典明示により本願明細書の一部とする。【００３６】
２  結果
Balb/cマウスの血清を、免疫化前、並びに最初の免疫化から3、5、8、11、および14週間後に回収し、測定に供した。各群5匹のマウスからなり、各マウスの血清のIgGレベルを独立に測定した。100倍希釈のサンプルを用いて、10種類のHPV16 L1由来ペプチド (19〜21 mer)のそれぞれに反応するIgGのレベルを測定し、結果を蛍光強度単位（FIU）で示した（図１）。【００３７】
その結果、ペプチド4およびペプチド6に対するIgGが3週目に検出可能となり、5週目で最大に達し(P＜0.05)、その後11週目までに減少したが、その他のペプチドに対するIgGは検出されなかった。IgGレベルは14週目に再び幾分か上昇したが、これは最初の注射後3週目での二回目の免疫化の影響の可能性がある。ペプチド8に対する低いIgGレベルが8週目と11週目に検出可能であったが、これらレベルは有意なものではなかった。【００３８】
次いで、ワクチン投与したC57BL/6N (H-2b)マウスの血清におけるIgGレベルを、免疫化前、および免疫化の5週間後に測定し、Balb/cマウスとC57BL/6Nマウスとの相違について検討した。その結果、ペプチド6およびペプチド8に対するIgGが5週目に検出可能であったが(P＜0.05)、その他のペプチドに対するIgGは検出されなかった（図２）。以上の結果から、ペプチド6が、試験した限りこれら2系統に共通の主要なB細胞エピトープであることが示唆された。【００３９】
続いて、ペプチド6のエピトープマッピングを8種類の10 merペプチドを用いて行った（表２）。
【表２】
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295-299位におけるHPV16 L1由来配列の5アミノ酸の配列を1番目の10 merペプチドのN末端に付加し、320-324位における配列を8番目の10 merペプチドのC末端に付加した。これら8種類のペプチドの各々は、互いに7アミノ酸の配列を共有した。その結果、HPV16 L1の304-313位の10 mer（aqifnkpywl）が、抗体に認識される免疫原性部分と決定された（図３）。次いで、HLA-A2結合モチーフとHLA-A24結合モチーフとを有する305-313位の9 merペプチド(qifnkpywl)の免疫化血清に対する反応性を検討した。その結果、この9 merもまた免疫化血清に対する反応性を示した（図３）。
【実施例２】
【００４０】
実施例１と同様にして、ヒトにおいて表１に示す10種類のHPV16 L1由来ペプチドに反応するIgGについて検討した。HPV16/18 L1 HPV-VLPワクチンであるサーバリックス（登録商標）投与者（n= 19）から採取した血清中の各ペプチドに対するIgGレベルを実施例１に記載のとおり測定した。データは、ウィルコクソン符号付順位検定（両側検定）でP<0.05を有意と判断した。【００４１】
その結果、ヒトにおいては、サーバリックス（登録商標）投与後に、ペプチド6とペプチド8に対するIgGレベルの上昇が確認された（図４、５）。抗体価は、サーバリックス（登録商標）の3回投与後に最大となり、1年後には有意に減少した。ペプチド8に対するIgGは、1年後においても投与前に比べて有意に高かった（P＝0.0195）。また、ペプチド4に対しても、値は低いもののIgGレベルの上昇が観察され、初回投与から1年後でも投与前と比較して有意に高いレベルのIgGが検出された。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１２：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１３：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１４：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１５：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１６：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１７：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１８：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号１９：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号２０：ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ
配列番号２１：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２２：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２３：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２４：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２５：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２６：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２７：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２８：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号２９：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号３０：ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ
配列番号３１：合成ペプチド
配列番号３２：合成ペプチド
配列番号３３：合成ペプチド
配列番号３４：合成ペプチド
配列番号３５：合成ペプチド
配列番号３６：合成ペプチド
配列番号３７：合成ペプチド
配列番号３８：合成ペプチド
配列番号３９：合成ペプチド
配列番号４０：合成ペプチド
配列番号４１：ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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