(57)【要約】  本発明は、従来よりも簡便かつ迅速に行うことができ、しかも信頼性の高い客観的なデータを得ることができる等電点の測定方法を提供する。本発明に係る等電点の測定方法は、分子間相互作用測定方法を用いて、等電点が未知の物質（被験物質）の等電点を測定する方法であって、分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が前記被験物質であり、前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させる工程（１）、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定する工程（２）、および測定結果に基づき前記被験物質の等電点を推定する工程（３）を含むことを特徴とする。
2013146249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が、等電点が未知の物質（以下「被験物質」と称する。）であるときに、分子間相互作用測定方法を用いて当該被験物質の等電点を測定する方法であって、
前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させる工程（１）、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定する工程（２）、および測定結果とその測定条件に基づき前記被験物質の等電点を推定する工程（３）を含むことを特徴とする、等電点の測定方法。
【請求項２】
前記第２物質が被験物質である場合において、
前記第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液について、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各水溶液の測定結果を比較して、吸着量が最大だった水溶液のｐＨが前記第２物質の等電点であると推定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の等電点の測定方法。
【請求項３】
前記第１物質が被験物質であり、前記第２物質が等電点が既知の物質（以下「参照物質」と称する。）である場合において、
前記第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液について、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各水溶液の測定結果を比較して、吸着量が最大だった水溶液のｐＨが前記第２物質の等電点より高いか低いかによって、前記第１物質の等電点が前記第２物質の等電点より高いか低いかを推定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の等電点の測定方法。
【請求項４】
前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被験物質である場合において、
異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域において、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各領域の測定結果を比較して、吸着量が最大だった領域を形成する前記第１物質の等電点が前記第２物質の等電点であると推定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の等電点の測定方法。
【請求項５】
前記分子間相互作用測定方法がＲＩｆＳに基づくものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の等電点の測定方法。
【請求項６】
表面に、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を含む物質によって形成された領域を備えることを特徴とする、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
【請求項７】
前記領域が、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比率に応じた異なる等電点を有する物質によって形成された２以上の領域を含む、請求項６に記載のセンサーチップ。
【請求項８】
前記２以上の領域が、等電点の高低についての段階的な勾配を形成している、請求項６または７に記載のセンサーチップ。
【請求項９】
前記領域が、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を有するイオン性ポリマーにより形成されている、あるいはカチオン性官能基を有するイオン性ポリマーとアニオン性官能基を有するイオン性ポリマーとの混合物により形成されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載のセンサーチップ。
【請求項１０】
前記センサーチップがＲＩｆＳ用のものである、請求項６〜９のいずれか一項に記載のセンサーチップ。
【請求項１１】
センサーチップ上に形成された２以上の領域のそれぞれにおいて、分子間相互作用による物質の吸着量を測定するための手段を備えることを特徴とする、分子間相互作用測定装置。
【請求項１２】
分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が被験物質であるときに、分子間相互作用測定方法を利用して前記被験物質の等電点を測定するためのシステムであって、
前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定したときの測定結果データと、それに対応する測定条件データとを記憶する記憶手段、および
前記記憶手段から前記測定結果データおよび前記測定条件データを読み出す読出処理と、読み出した測定結果データ同士を比較し、所定の条件を満たす測定結果データとそれに対応する測定条件データに基づき、前記被験物質の等電点を推定する推定処理とを実行するための演算手段
を備えることを特徴とする、等電点測定システム。
【請求項１３】
前記第２物質が被験物質であるとき、
前記記憶手段が、前記測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものと、前記測定条件データとして、第２物質の水溶液のｐＨのデータとを記憶するものであり、
前記演算手段が、前記推定処理として、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照したｐＨを第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含むものである、
請求項１２に記載の等電点測定システム。
【請求項１４】
前記第１物質が被験物質であり、前記第２物質が参照物質であるとき、
前記記憶手段が、前記測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものと、前記測定条件データとして、第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータとを記憶するものであり、
前記演算手段が、前記推定処理として、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高いか低いかによって、第１物質の等電点が第２物質の等電点より高いか低いかの推定結果を提示するステップとを含むものである、
請求項１２に記載の等電点測定システム。
【請求項１５】
前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被検物質であるとき、
前記記憶手段が、前記測定結果データとして、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域についてのものと、前記測定条件データとして、第１物質の等電点のデータとを記憶するものであり、
前記演算手段が、前記推定処理として、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第１物質の等電点を参照するステップと、参照した等電点を第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含むものである、
請求項１２に記載の等電点測定システム。
【請求項１６】
センサーチップ上の所定の領域と接触する水溶液のｐＨを測定する測定環境検知手段を備える、請求項１２に記載の等電点測定システム。
【請求項１７】
センサーチップ上に形成された２以上の領域において分子間相互作用の測定を行う手段を備える、請求項１２に記載の等電点測定システム。
【請求項１８】
分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が被験物質であるときに、分子間相互作用測定方法を利用して前記被験物質の等電点を測定する方法において、測定結果とその測定条件に基づき前記被験物質の等電点を推定する処理をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定したときに記憶された測定結果データと、それに対応する測定条件データを読み出す読出処理、および
読み出した測定結果データ同士を比較し、所定の条件を満たす測定結果データとそれに対応する測定条件データに基づき、前記被験物質の等電点を推定する推定処理
を前記コンピュータに行わせることを特徴とする、等電点測定プログラム。
【請求項１９】
前記第２物質が被験物質であるとき、
前記測定結果データが、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものであり、
前記測定条件データが、第２物質の水溶液のｐＨのデータであり、
前記推定処理が、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照したｐＨを第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含む、
請求項１８に記載の等電点測定プログラム。
【請求項２０】
前記第１物質が被験物質であり、前記第２物質が参照物質であるとき、
前記測定結果データが、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものであり、
前記測定条件データが、第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータであり、
前記推定処理が、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高いか低いかによって、第１物質の等電点が第２物質の等電点より高いか低いかの推定結果を提示するステップとを含む、
請求項１８に記載の等電点測定プログラム。
【請求項２１】
前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被検物質であるとき、
前記測定結果データが、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域についてのものであり、
前記測定条件データが、第１物質の等電点のデータであり、
前記推定処理が、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第１物質の等電点を参照するステップと、参照した等電点を第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含む、
請求項１８に記載の等電点測定プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等電点の測定方法および分子間相互作用測定方法（ＲＩｆＳ等）に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質はペプチド結合により連結した多数のアミノ酸によって構成されるが、このアミノ酸の中には、側鎖が正に荷電しうる塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）および負に荷電しうる酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）が含まれている。そのため、タンパク質はそれを構成するアミノ酸残基の組成によって、生体内環境において通常は正または負に荷電している（タンパク質全体のうちでは負に荷電しているものが多い）が、特定のｐＨにおいて正味の電荷がゼロとなる。このときのｐＨを等電点と呼ぶ。一般的に、塩基性アミノ酸が多いタンパク質の等電点はアルカリ側であり、酸性アミノ酸が多いタンパク質の等電点は酸性側である。タンパク質の等電点は、タンパク質の結晶化や精製の適切な条件を設定する上で、またはタンパク質の構造解析を行う上で有用な情報となる。【０００３】
タンパク質の等電点を測定する方法としては、たとえば、マイナス電荷を有する微粒子へのタンパク質の吸着量がｐＨ依存性であり、等電点付近で吸着量が最大になることに基づき、ＨＰＬＣを用いてその吸着量を測定し、タンパク質の等電点を推定する方法が知られている（非特許文献１）。【０００４】
また、電気泳動によりタンパク質の等電点を測定する方法もある。一般的には、水溶性の両性担体に電気浸透流によりｐＨ勾配を形成させて電気泳動を行う手法が用いられているが、ゲル自体にｐＨ勾配を形成する「固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動」も知られている。固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動用のアクリルアミドゲルは、アクリルアミドとビスアクリルアミドを重合する際に、弱酸または弱塩基の解離基を持つアクリルアミド誘導体を加え、マトリックスの側鎖にその解離基を導入することで、ｐＨ勾配を固定化している。いずれの方法も、電気泳動後に染色をし、タンパク質が吸着した位置からｐＨを決定できる。【０００５】
一方、抗原抗体反応のような生体高分子同士の分子間相互作用を測定することのできる方法として、従来のような放射性物質や蛍光体のような標識を用いない、ノンラベルの分子間相互作用測定方法が開発されている。このような分子間相互作用測定方法は、測定部材（センサーチップ）上で分子間相互作用が起きたときに発生するシグナルを各種の方式で検出するものであり、たとえば、光学薄膜の干渉色変化を利用するＲＩｆＳ（Reflectometric Interference Spectroscopy：反射型干渉分光法）方式、ＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance：水晶発振子マイクロバランス）方式などが知られている。ＲＩｆＳ方式の基本原理は、特許文献１などで言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１３２７９９号公報（特許第３７８６０７３号公報）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】白浜博幸，蛋白質の高分子表面への吸着現象とそのバイオメディカル分野への応用，蛋白質  核酸  酵素, Vol. 37, No. 2, pp.117-129, 1992.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したような従来の方法のうち、ＨＰＬＣを用いる方法は、カラムの作製や操作手法の特性上、実験者や実験条件による差が出やすく、しかもその差が大きいという問題がある、また、実験操作に手間と時間がかかることから、試料数を増やしたり追試をすることにも難点があった。また、電気泳動を用いる方法は、ゲル膜の生成状態や染色による評価方法に実験者ごとの差が大きいことから、客観的な指標としてデータを検証することが困難であった。【０００９】
このような状況の下、本発明は、従来よりも簡便かつ迅速に行うことができ、しかも信頼性の高い客観的なデータを得ることができる等電点の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、分子間相互作用測定方法を応用し、等電点が未知の被験物質と等電点が既知の参照物質とを静電的相互作用によりセンサーチップの表面に吸着させることにより、タンパク質やセンサーチップの表面の物質などの等電点を測定することができることを見いだした。【００１１】
さらに、正の電荷を有する（カチオン性）官能基および負の電荷を有する（アニオン性）官能基の両方を含む物質を用いて形成された、所定の領域を備えた分子間相互作用測定用のセンサーチップが、上記のような等電点の測定方法の特定の実施形態を可能にすることを見いだし、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は下記の事項を包含する。【００１３】
［１］  分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が、等電点が未知の物質（以下「被験物質」と称する。）であるときに、分子間相互作用測定方法を用いて当該被験物質の等電点を測定する方法であって、
前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させる工程（１）、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定する工程（２）、および測定結果とその測定条件に基づき前記被験物質の等電点を推定する工程（３）を含むことを特徴とする、等電点の測定方法。【００１４】
［２］  前記第２物質が被験物質である場合において、
前記第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液について、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各水溶液の測定結果を比較して、吸着量が最大だった水溶液のｐＨが前記第２物質の等電点であると推定する工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の等電点の測定方法。【００１５】
［３］  前記第１物質が被験物質であり、前記第２物質が等電点が既知の物質（以下「参照物質」と称する。）である場合において、
前記第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液について、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各水溶液の測定結果を比較して、吸着量が最大だった水溶液のｐＨが前記第２物質の等電点より高いか低いかによって、前記第１物質の等電点が前記第２物質の等電点より高いか低いかを推定する工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の等電点の測定方法。【００１６】
［４］  前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被験物質である場合において、
異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域において、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各領域の測定結果を比較して、吸着量が最大だった領域を形成する前記第１物質の等電点が前記第２物質の等電点であると推定する工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の等電点の測定方法。【００１７】
［５］  前記分子間相互作用測定方法がＲＩｆＳに基づくものである、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の等電点の測定方法。【００１８】
［６］  表面に、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を含む物質によって形成された領域を備えることを特徴とする、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。【００１９】
［７］  前記領域が、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比率に応じた異なる等電点を有する物質によって形成された２以上の領域を含む、［６］に記載のセンサーチップ。【００２０】
［８］  前記２以上の領域が、等電点の高低についての段階的な勾配を形成している、［６］または［７］に記載のセンサーチップ。【００２１】
［９］  前記領域が、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を有するイオン性ポリマーにより形成されている、あるいはカチオン性官能基を有するイオン性ポリマーとアニオン性官能基を有するイオン性ポリマーとの混合物により形成されている、［６］〜［８］のいずれか一項に記載のセンサーチップ。【００２２】
［１０］  前記センサーチップがＲＩｆＳ用のものである、［６］〜［９］のいずれか一項に記載のセンサーチップ。【００２３】
［１１］  センサーチップ上に形成された２以上の領域のそれぞれにおいて、分子間相互作用による物質の吸着量を測定するための手段を備えることを特徴とする、分子間相互作用測定装置。【００２４】
［１２］  分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が被験物質であるときに、分子間相互作用測定方法を利用して前記被験物質の等電点を測定するためのシステムであって、
前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定したときの測定結果データと、それに対応する測定条件データとを記憶する記憶手段、および
前記記憶手段から前記測定結果データおよび前記測定条件データを読み出す読出処理と、読み出した測定結果データ同士を比較し、所定の条件を満たす測定結果データとそれに対応する測定条件データに基づき、前記被験物質の等電点を推定する推定処理とを実行するための演算手段
を備えることを特徴とする、等電点測定システム。【００２５】
［１３］  前記第２物質が被験物質であるとき、
前記記憶手段が、前記測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものと、前記測定条件データとして、第２物質の水溶液のｐＨのデータとを記憶するものであり、
前記演算手段が、前記推定処理として、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照したｐＨを第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含むものである、
［１２］に記載の等電点測定システム。【００２６】
［１４］  前記第１物質が被験物質であり、前記第２物質が参照物質であるとき、
前記記憶手段が、前記測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものと、前記測定条件データとして、第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータとを記憶するものであり、
前記演算手段が、前記推定処理として、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高いか低いかによって、第１物質の等電点が第２物質の等電点より高いか低いかの推定結果を提示するステップとを含むものである、
［１２］に記載の等電点測定システム。【００２７】
［１５］  前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被検物質であるとき、
前記記憶手段が、前記測定結果データとして、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域についてのものと、前記測定条件データとして、第１物質の等電点のデータとを記憶するものであり、
前記演算手段が、前記推定処理として、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第１物質の等電点を参照するステップと、参照した等電点を第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含むものである、
［１２］に記載の等電点測定システム。【００２８】
［１６］  センサーチップ上の所定の領域と接触する水溶液のｐＨを測定する測定環境検知手段を備える、［１２］に記載の等電点測定システム。【００２９】
［１７］  センサーチップ上に形成された２以上の領域において分子間相互作用の測定を行う手段を備える、［１２］に記載の等電点測定システム。【００３０】
［１８］  分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうちの一方が被験物質であるときに、分子間相互作用測定方法を利用して前記被験物質の等電点を測定する方法において、測定結果とその測定条件に基づき前記被験物質の等電点を推定する処理をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定したときに記憶された測定結果データと、それに対応する測定条件データを読み出す読出処理、および
読み出した測定結果データ同士を比較し、所定の条件を満たす測定結果データとそれに対応する測定条件データに基づき、前記被験物質の等電点を推定する推定処理
を前記コンピュータに行わせることを特徴とする、等電点測定プログラム。【００３１】
［１９］  前記第２物質が被験物質であるとき、
前記測定結果データが、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものであり、
前記測定条件データが、第２物質の水溶液のｐＨのデータであり、
前記推定処理が、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照したｐＨを第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含む、
［１８］に記載の等電点測定プログラム。【００３２】
［２０］  前記第１物質が被験物質であり、前記第２物質が参照物質であるとき、
前記測定結果データが、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものであり、
前記測定条件データが、第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータであり、
前記推定処理が、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高いか低いかによって、第１物質の等電点が第２物質の等電点より高いか低いかの推定結果を提示するステップとを含む、
［１８］に記載の等電点測定プログラム。【００３３】
［２１］  前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被検物質であるとき、
前記測定結果データが、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域についてのものであり、
前記測定条件データが、第１物質の等電点のデータであり、
前記推定処理が、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第１物質の等電点を参照するステップと、参照した等電点を第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含む、
［１８］に記載の等電点測定プログラム。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の等電点測定方法は、簡便かつ迅速に行うことができ、しかも信頼性の高い客観的なデータを得ることできる。このような想定方法は、多数の試料を用いて等電点を測定する際の労力を省くことができ、また再現性も得やすく、実験者間での差がでにくい、好適な等電点測定方法として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施形態に係る分子間相互作用の測定システムの概略構成を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る測定部材の概略構成を示す斜視図である。
【図３】分子間相互作用の測定システムの測定の様子を示す模式図である。
【図４】分子間相互作用の測定システムの回路ブロック図である。
【図５】波長と入射光および反射光それぞれの分光強度との概略的な関係を示す一例のグラフである。
【図６】波長と反射率との概略的な関係を示す一例のグラフである。
【図７】等電点測定方法の第２実施形態に用いられるセンサーチップの一例を示す模式図である。
【図８】実施例１の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例２の測定結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３の測定結果を示すグラフである。なお、1400secの時点において、ラインは上から順に、等電点のｐＨが５，６，４，８，１０の領域のものとなっている。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明において「分子間相互作用測定方法」とは、測定部材（センサーチップ）の表面を構成する物質（第１物質）と、当該表面に接触させる溶液に含まれる物質（第２物質）との間で分子間相互作用が働いて、第１物質に第２物質が吸着し、センサーチップ表面の状態が変化したときに現れるシグナルを観測することにより、その吸着量を定量的に評価することのできる方法の総称である。ただし、前記第２物質として、蛍光色素生成用の酵素、蛍光体、放射性同位体等により標識化された物質を用いる方法は除外される。
【００３７】
上記のような分子間相互作用測定方法の代表例としては、ＲＩｆＳ、ＱＣＭ、ＳＰＲが挙げられる。以下、ＲＩｆＳの実施形態を中心として本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明における分子間相互作用測定方法はＲＩｆＳに限定されるものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、ＲＩｆＳに関する事項をそれに対応するＱＣＭやＳＰＲなどにおける事項に置き換えることで、ＲＩｆＳ以外の分子間相互作用測定方法によって本発明を実施することが可能である。
【００３８】
−等電点測定システム−
まず、図１から図５を参照して、本発明の等電点測定システムを実施するための一実施形態である、ＲＩｆＳ方式に基づく分子間相互作用の測定システム１の概要につき説明する。分子間相互作用の測定システム１は、本発明の等電点測定方法を実行するものであるとともに、システム構成に含まれるコンピュータには、本発明の等電点測定プログラムが反映されたプログラムが実行可能に記憶されている。なお、分子間相互作用の測定システム１は、通常、各種の測定値を出力するよう構成されるが、以下では専ら本発明の等電点測定方法の実施に係る、干渉膜の光学膜厚の測定につき説明する。
【００３９】
図１に示すとおり、分子間相互作用の測定システム１は、分子間相互作用の測定の場（本発明ではすなわち等電点測定の場）となる測定部材１０と、後述する光源や分光器から構成される測定機構とを備えた測定装置８０と、測定装置８０に接続されたコンピュータである制御演算装置５０と、制御演算装置５０に接続されたディスプレイ９１及び入出力装置９２とによって構成されている。
【００４０】
測定システム１において制御演算装置５０は、測定装置８０に内蔵される光源や分光器などの測定機構の制御手段、検出情報の演算手段、及び、制御指令や検出情報の出入力を行う出入力手段（インターフェース）、好ましくはさらに本発明の等電点の推定方法を実行するための演算手段として機能する。
【００４１】
測定装置８０は、下側筺体８２と、下側筺体８２に回動自在に取り付けられた上側筺体８１とを備える。下側筺体８２には測定部材１０を保持するためのテーブル８３が設けられている。上側筺体８１内側には、測定部材１０に接続して試料を流通させるための射出口８５及び吸引口８７と、検出窓８６とを有する接続部８４が設けられている。上側筺体８１内には、後述するように、白色光源２０，分光器３０，光ファイバ４０、４１（図３参照）が設けられており、検出窓８６から光を照射するとともに、検出窓８６から入射する光を受光するように構成されている。測定を行う際は、まず、上側筺体８１を上方に回動させて下側筺体８２上のテーブル８３を開放し、テーブル８３に測定部材１０をセットする。その後、上側筺体８１を下方に回動させて閉じることにより、射出口８５及び吸引口８７が測定部材１０に接続し、また、検出窓８６が測定部材１０に対向し、測定準備を完了する。
【００４２】
図２に示すとおり、測定部材１０は、光学薄膜の設けられたセンサーチップ１２と、センサーチップ１２とともに流路を形成するフローセル１４とによって構成されている。センサーチップ１２はシリコン基板１２ａを有している。シリコン基板１２ａ上にはＳｉＮ膜１２ｂ（窒化シリコン）が蒸着されている。ＳｉＮ膜１２ｂは光学薄膜の一例である。本発明の等電点測定方法の実施形態によっては、ＳｉＮ膜１２ｂの上層に、第１物質としての荷電層１２ｃが形成されていることがある。
【００４３】
フローセル１４はシリコーンゴム製の透明な部材である。フローセル１４には溝１４ａが形成されている。フローセル１４をセンサーチップ１２に密着させると、図３に示すように密閉流路１４ｂが形成される。溝１４ａの両端部はフローセル１４の表面から露出しており、一方の端部がサンプル溶液の流入口１４ｃとして、他方の端部がその流出口１４ｄとしてそれぞれ機能する。
【００４４】
測定部材１０では、センサーチップ１２に対しフローセル１４を貼り替え可能となっており、フローセル１４はディスポーザブル（使い捨て）使用が可能となっている。センサーチップ１２の表面には、シランカップリング剤などにより、表面修飾をおこなってもよく、この場合フローセル１４の貼り替えが容易となる。
【００４５】
先に説明したように、測定部材１０をセットした後、上側筺体８１を下方に回動させて閉じることにより、図３に示すとおり、検出窓８６がフローセル１４に対向し、フローセル１４の密閉流路１４ｂの上方には光ファイバ４０が設置された状態となる。ここで、光ファイバ４０の一方の端部には白色光源２０が接続されている。白色光源２０としては例えばハロゲン光源が使用される。また、例えばＬＥＤ光源のような、可視光波長領域に複数の分光強度ピークを有する疑似白色光源を使用してもよい。光ファイバ４０の他方の端部は検出窓８６に面している。光ファイバ４１の一方の端部には分光器３０が接続され、他方の端部は検出窓８６に面している。白色光源２０が点灯すると、その光が光ファイバ４０を介して密閉流路１４ｂに照射され、その反射光が光ファイバ４１を介して分光器３０で検出される。白色光源２０や分光器３０は制御演算装置５０に接続され、制御演算装置５０はこれらモジュールの動作を制御する。
【００４６】
また、制御演算装置５０は、後述する記憶装置５０３（図４参照）に記憶されたプログラムの実行により、検出動作制御に連動した所定のタイミングでインターフェースを介して反射光の分光特性を表すデータの入力を得るとともに、入力されたデータに基づき反射率極小波長を算出する演算手段などとして機能する。
【００４７】
図４は、本測定システム１の模式的な回路ブロック図である。図４に示すように、制御演算装置５０は、ＣＰＵ５００、ＲＯＭ５０１、ＲＡＭ５０２、ハードディスクなどの記憶装置５０３、通信装置５０４、メモリカード等の記憶媒体のリーダー・ライター５０５、測定装置８０の各部やディスプレイ及び入力装置との間で信号のやりとりを行うためのインターフェース５０６を備える。分子間相互作用測定方法を実行するためのプログラム、好ましくはさらに測定結果とその測定条件に基づき前記被験物質の等電点を推定する処理を実行するためのプログラムは、記憶装置５０３に記憶されており、このプログラムによってＣＰＵ５００が各種の動作を実行するように制御される。
【００４８】
続いて、制御演算装置５０に分光特性が入力されるまでの測定システム１の動作及び測定方法について説明する。
【００４９】
図３に示すとおり、サンプル溶液６０を、流入口１４ｃから密閉流路１４ｂを経て流出口１４ｄに流通させる。このとき制御演算装置５０は、サンプル溶液６０を送液するための送液装置３５（図４参照）の制御を行う。サンプル溶液６０としては、本発明の実施形態に応じて、等電点が既知の物質（参照物質）または等電点が未知の物質（被検物質）としての第２物質が溶解した水溶液などが用いられる。
【００５０】
制御演算装置５０は、サンプル溶液６０を測定部材１０に流入させる前のタイミングにおいて、白色光源２０を点灯させ、分光器３０から分子間相互作用の開始前の光学薄膜（ＳｉＮ膜１２ｂまたは荷電層１２ｃ）の反射光の強度を示すデータを含む分光特性データの入力を得る。
【００５１】
制御演算装置５０は、サンプル溶液６０が密閉流路１４ｂを流通している間も、白色光源２０を点灯させる。白色光はフローセル１４を透過してセンサーチップ１２に照射され、その反射光が分光器３０で検出される。分光器３０により検出された反射光の分光特性は制御演算装置５０に送信される。
【００５２】
この場合に、サンプル溶液６０中の第２物質６２が第１物質（ＳｉＮ膜１２ｂまたは荷電層１２ｃ）と結合すると、光学的厚さ、すなわち光学膜厚が変化し、反射光の特性（例えば、分光器３０による検出強度が最も小さくなる波長）が変化する。制御演算装置５０は、分光器３０から、分子間相互作用の進捗中又は終了後の反射光の強度を示すデータを含む分光特性データの入力を得る。
【００５３】
以上説明するようにして、等電点の測定のために必要な分光特性データが制御演算装置５０に入力される。
【００５４】
さて、以上説明した本測定システム１の構成、機能、動作からわかるように、センサーチップ１２は、基板（シリコン基板１２ａ）上に１又は２以上の干渉膜（ＳｉＮ膜１２ｂ、荷電層１２ｃ）が積層した積層体に相当するものであり、本測定システム１は、積層体における該干渉膜の光学膜厚を反射干渉分光法により測定することができる。
【００５５】
また、光ファイバ４０は、光源（白色光源２０）からの光を積層体（センサーチップ１２）に照射する照射手段に、光ファイバ４１は、積層体（センサーチップ１２）からの反射光を受光する受光手段に、分光器３０は、反射光の分光特性を検出する分光検出手段に相当する。
【００５６】
また、ＲＡＭ５０２は、制御演算装置５０が被検物質の等電点を推定する際に参照するデータ、すなわち第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への第２物質の吸着量を測定したときの測定結果データと、それに対応する測定条件データの記憶手段として機能する。そのデータの読み出し元は、記憶装置５０３、通信装置５０４を介して接続されるサーバ、インターフェース５０６を介して接続される外部記憶装置、リーダー・ライター５０５によって読み取られるメモリカード等のいずれであってもよい。また、通信装置５０４を介して等電点の測定のために必要な分光特性データを受け取った他のコンピュータが等電点の測定のため演算を行う場合など、ハードウエア構成は問わない。その場合、当該他のコンピュータは、本発明の等電点測定システムの組み込まれるとともに、本発明の等電点測定プログラムがインストールされたコンピュータである。
【００５７】
被検物質の等電点を推定する際に参照するデータは、第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への第２物質の吸着量を測定したときの測定結果データと、それに対応する測定条件データである。本発明では、実施形態に応じて、複数の水溶液についてまたはセンサーチップ上に形成された２以上の領域において、複数回の測定を行うので、それぞれの測定結果データおよび測定条件データが蓄積して記憶される。
【００５８】
具体的には、等電点測定方法の第１実施形態においては、測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものが記憶され、測定条件データとして、第２物質の水溶液のｐＨのデータが記憶される。等電点測定方法の第２実施形態においては、測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものが記憶され、測定条件データとして、第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータが記憶される。等電点測定方法の第３実施形態においては、測定結果データとして、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域についてのものが記憶され、測定条件データとして、第１物質の等電点のデータが記憶される。等電点測定方法の各実施形態の詳細は後述する。通常、測定結果データは測定の都度記憶すればよく、測定条件データ（第１物質または第２物質の既知の等電点、第２物質の水溶液のｐＨ）は、測定結果データと対応付けられるようにあらかじめ入力しておけばよい。センサーチップ上の所定の領域と接触する水溶液のｐＨのように、システムが測定環境検知手段（測定装置の測定環境検知部材およびその制御手段など）を備えることで測定することのできる条件であれば、分子間相互作用の測定とともに、その都度記憶させることも可能である。
【００５９】
また、フローセル１４は干渉膜上に流路を形成する部材に相当し、上で説明したように、測定装置８０には、このフローセル１４により形成される流路に接続し、センサーチップ表面の第１物質と相互作用する第２物質を含んだ液体を当該流路に流す送液手段が構成される。
【００６０】
センサーチップ上に形成された２以上の領域において分子間相互作用の測定を行うためには、適切な手段を設ければよい。たとえば、各領域に光ファイバ４０、４１を設ける（システム全体として複数の光ファイバ４０、４１のセットを備える）ようにすれば、それぞれ独立して、リアルタイムで分子間相互作用の測定を行うことができる。また、入射光を導く光ファイバ４０および反射光を導く光ファイバ４１を可動式にする（この場合、検出窓８６は前記領域全体を覆うよう広めに設けることが適切である）、あるいは測定部材１０を保持するためのテーブル８３を可動式にするなどしてもよい。
【００６１】
−等電点測定方法−
本発明に係る等電点の測定方法は、分子間相互作用測定方法を用いて、等電点が未知の物質（被験物質）の等電点を測定する方法であって、分子間相互作用測定用のセンサーチップ上の所定の領域を形成している第１物質および当該領域に接触させるための水溶液に溶解している第２物質のうち、一方が前記被験物質であり、前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させる工程（１）、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定する工程（２）、および測定結果に基づき前記被験物質の等電点を推定する工程（３）を含むことを特徴とする。以下に、上記工程（１）および（２）および（３）の実施形態、ならびに上記等電点の測定方法における３つの典型的な実施形態を順次記載する。
【００６２】
なお、本発明において「等電点が未知の物質」とは、本発明の等電点測定方法を用いて等電点を測定することが意図されている物質を指すのであって、仮に等電点が既知の物質であるとしても、本発明の等電点測定方法を用いて等電点を測定することが意図されている物質であれば、本明細書の説明における「等電点が未知の物質」に該当する。
【００６３】
・工程（１）：接触工程
等電点の測定方法における第１の工程は、第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に第２物質の水溶液を接触させる工程である。この工程は、本発明に係るシステムに関して前述したような「フロー型」の手法によって行うことができる。たとえば、後述する第３の等電点測定方法では、あらかじめ調製した等電点が未知のタンパク質の水溶液を、フロー型のシステムにおいて送液し、所定のセンサーチップの表面と接触させるようにしてもよい。
【００６４】
一方、フロー型のシステムとは別に「浸漬型」の手法によってこの工程をおこなってもよい。たとえば、後述する第１および第２の等電点測定方法では、複数のサンプル溶液（第２物質の水溶液）またはセンサーチップを用いて、複数のパターンの測定結果を比較する必要があるが、サンプル溶液とセンサーチップとの接触処理を完了させるまでに一定時間を要し、フロー型のシステムにおいて順次複数の測定を行っていくのでは時間がかかるような場合には、あらかじめサンプル溶液を入れた容器にセンサーチップを所定の時間浸漬しておき、その後各センサーチップを測定に供するようにすることが好ましい。なお、このようにして作製されたセンサーチップを用いる場合は、フロー型のシステムについて説明したような、フローセルと組み合わせた測定部材を構築する必要がなく、センサーチップをそのまま測定装置にセットして、次の測定工程を行うことができる。
【００６５】
第２物質は、典型的にはタンパク質であり、その水溶液は、所望のｐＨに調整した緩衝液に当該第２物質（タンパク質）を添加して調製することが一般的である。被検物質の等電点の推定においてなるべく正確な推定値を取得するためには、測定に用いる緩衝液のｐＨを所定の範囲内で細かく設定することが好ましい。各種のｐＨを有する緩衝液の組成が公知であるので、適切なものを選択し、必要に応じて微調整することにより、所望のｐＨを有する第２物質の水溶液を調製することが可能である。
【００６６】
・工程（２）：測定工程
等電点の測定方法における第２の工程は、前記工程（１）による、センサーチップの所定の領域への第２物質の吸着量を測定する工程である。この工程も、本発明に係るシステムに関して本明細書中に具体的に記載したような、従来と同様の分子間相互作用測定方法を利用して行うことができる。
【００６７】
ＲＩｆＳ方式の分子間相互作用測定法では、センサーチップへの物質の吸着量は、反射率極小波長（λ）の変化量（Δλ）として表される。Δλの測定および測定データの補整などの手法は特に限定されるものではなく、各種の手法を採用することができる。ＲＩｆＳ方式の分子間相互作用測定法における、Δλの基本的な測定原理は次の通りである。
【００６８】
図５の典型的な一例に示すとおり、無修飾のセンサーチップへの入射光（白色光）そのものの分光強度は実線１０６で表され、その反射光の分光強度は実線１０８で表される。入射光とその反射光との各分光強度から反射率を求めると、図６に示すとおり、実線で表されたボトムピーク（スペクトル曲線における極小部）を有する反射スペクトル１１０が得られる。
【００６９】
無修飾のセンサーチップの表面に物質（たとえば水溶液中の被験物質）が吸着すると、その部位における光学的薄膜の厚さが変化して光路長が変化し、反射干渉効果により干渉波長も変化する。すなわち、反射光の分光強度分布のピーク位置がシフトし、その結果図６に示すとおり、反射スペクトル１１０が反射スペクトル１２２（点線部参照）にシフトする。
【００７０】
あるいは、等電点の測定方法の第２実施形態において、無修飾のセンサーチップの表面にまず被験物質（第１物質）を塗布して当該物質からなる層を形成したときにも、上記と同様に、反射スペクトル１１０から反射スペクトル１２２へのシフトがおきる。この状態において、参照物質（第２物質）の水溶液を接触させて、上記被験物質からなる層の上に参照物質からなる層を形成すると、光学的薄膜の厚さがさらに変化する。これによって、図６に示すとおり、反射スペクトル１２２が反射スペクトル１３２（１点鎖線部参照）にシフトする。
【００７１】
なお、センサーチップ表面への物質の付着は、部分的にみれば不均質な層が形成されることになるが、この不均質層は巨視的にみれば物質の付着量に応じた所定の光学的薄膜の厚さを有する均質層に置き換えられる。従って、入射光の通過する均質層の光学的厚さがアナライト１３０の付着量に応じて変化することとなる。
【００７２】
上記のような反射スペクトル１１０から反射スペクトル１２２へのシフト、または反射スペクトル１２２から反射スペクトル１３２へのシフトにおける、ボトムピークの波長（反射率極小波長）の変化量（Δλ）を測定することにより、分子間相互作用により吸着した物質の量を相対的または絶対的に定量することができる。Δλが０ないし十分に小さい（測定誤差の範囲である）場合、センサーチップへの物質の吸着はなかったとみなすことができる。
【００７３】
また、上記のような反射率極小波長の変化量を経時的に測定することにより、分子間相互作用の進捗度を観察することができるようになっている。フロー型の手法で吸着工程を行う場合にはそのようにして、反射率極小波長の変化がほとんどなくなった時点をもって、センサーチップ表面への物質の吸着が飽和したと判断し、この工程を終了することが好ましい。なお、そのような場合には、接触工程（１）および測定工程（２）が並列的、同時並行的に行われることになる。
【００７４】
・第１の等電点測定方法
等電点測定方法の第１実施形態は、水溶液中の第２物質が等電点が未知の被験物質である場合であって、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液について、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各水溶液の測定結果を比較して、最も吸着量の多かった水溶液のｐＨが第２物質の等電点であると推定する工程を含むものである。
【００７５】
上記第１実施形態は、通常の無修飾の（荷電層の形成されていない）センサーチップを使用して実施することができる。なお、無修飾のＲＩｆＳ用のセンサーチップの表面に形成されているＳｉＮからなる光学薄膜は、表面電位はゼロ付近で一様であり、異なるｐＨを有する水溶液同士で第２物質の吸着量を定量的に比較する上で実質的に問題ない。
【００７６】
・第２の等電点測定方法
等電点の測定方法の第２実施形態は、センサーチップ上の第１物質が等電点が未知の被験物質であり、水溶液中の第２物質が等電点が既知の参照物質となる場合であって、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液について、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各水溶液の測定結果を比較して、最も吸着量の多かった水溶液のｐＨが第２物質の既知の等電点より高いか低いかによって、第１物質の未知の等電点がその第２物質の既知の等電点より高いか低いかを推定する工程を含むものである。具体的には、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高ければ、第１物質の等電点は第２物質の等電点より高いと推定され、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より低ければ、第１物質の等電点は第２物質の等電点より低いと推定される。
【００７７】
上記第２実施形態では、表面に被験物質で形成された領域を備えたセンサーチップを使用する。たとえば、無修飾のＲＩｆＳ用のセンサーチップの表面に形成されたＳｉＮからなる光学薄膜の上面に、被験物質からなる層をコーティング等の公知の手法を用いて積層することにより、そのようなセンサーチップを作製することができる。
【００７８】
カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を含む物質、たとえば、本明細書中で説明するイオン性ポリマーまたはその混合物（樹脂組成物）を上記第２実施形態における被験物質とする場合がある。すなわち、等電点測定方法の第２実施形態において、等電点を測定したい、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を含む物質によって形成された領域を備える、本発明に係るセンサーチップを使用することができる。そのような被検物質が２種類以上ある場合は、次に述べる等電点測定方法の第３実施形態に用いるセンサーチップのように、１枚のセンサーチップ上に、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比率に応じた異なる等電点を有する物質によって形成されている２以上の領域が形成されていてもよく、各領域の被検物質について同時並行的にこの等電点測定方法の第２実施形態を実施することも可能である。
【００７９】
あるいは、無修飾のＲＩｆＳ用のセンサーチップの表面にはＳｉＮからなる光学薄膜が形成されており、その表面電位はゼロ付近で一様であることは既知であるが、厳密に正または負に帯電していないか、換言すれば厳密に荷電がゼロとなる等電点が存在するかどうかが未知であるとすれば、そのＳｉＮからなる光学薄膜を被験物質として扱ってもよい（後記実施例参照）。
【００８０】
・第３の等電点測定方法
等電点の測定方法の第３実施形態は、センサーチップ上の第１物質が等電点が既知の参照物質であり、水溶液中の第２物質が等電点が未知の被験物質となる場合であって、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域において、前記工程（１）および（２）を行った後、前記工程（３）として、各領域の測定結果を比較して、最も吸着量の多かった領域を形成する第１物質の等電点が第２物質の等電点であると推定する工程を含むものである。
【００８１】
上記第３実施形態では、異なる等電点を有する物質（前記第１物質）によって形成された２以上の領域を備えたセンサーチップを使用する。作製および測定の利便性を考慮すると、そのようなセンサーチップとしては、１枚のセンサーチップ（１本の密閉流路）中に、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比率に応じた異なる等電点を有する物質によって形成された２以上の領域を含むものが好適である。ただし、１本の密閉流路につき１種類の等電点を有する物質で１の領域を形成し、そのような密閉流路を複数本備えた１枚のセンサーチップを用いる、あるいは、１枚のセンサーチップにつき１種類の等電点を有する物質で１の領域を形成し、そのようなセンサーチップを複数枚セットで用いるようにしても、等電点測定方法の第３実施形態を実施することは可能である。
【００８２】
また、前記２以上の領域は、作製および測定の利便性を考慮すると、センサーチップの一端から他端（密閉流路の上流側から下流側）に向かって、等電点が高い方から低い方もしくは低い方から高い方へと、段階的な勾配を形成していることが好ましい。
【００８３】
上記第２実施形態および第３実施形態で用いることのできるセンサーチップの詳細については次に述べる。
【００８４】
−センサーチップ−
本発明では、実施形態によって、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を有する物質によって形成された領域（本発明において「荷電層」と称することがある。）を備えるセンサーチップを使用することがある。
【００８５】
具体的には、等電点測定方法の第３実施形態において、等電点が既知の物質（参照物質）として、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比率に応じた異なる等電点を有する物質によって形成されている２以上の領域（荷電層）を備えたセンサーチップを使用することができる（図７参照）。また、等電点測定方法の第２実施形態において、等電点が未知の物質（被検物質）として、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の両方を有する物質を測定に使用することもある。
【００８６】
荷電層の等電点は、そこに含まれるカチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比によって変化するので、荷電層が所望の等電点を有するものとなるよう、前記混合比を適切に調整すればよい。当該混合比の異なる複数の物質を用いることにより、センサーチップの表面に異なる等電点を有する複数の領域を形成することが可能である。
【００８７】
たとえば、等電点の測定方法の第３実施形態で用いるセンサーチップを作製する際には、カチオン性官能基およびアニオン性官能基の混合比を段階的に変化させた複数の材料（たとえばイオン性ポリマーの混合物）を用意し、センサーチップの表面にそれらからなる領域を順次形成していくことで、等電点の勾配を生み出すことができる。
【００８８】
荷電層をセンサーチップ表面に形成するための手法は特に限定されるものではないが、たとえば、次に述べるような、カチオン性官能基、アニオン性官能基、またはその両方（本発明において、これらを「イオン性官能基」と総称することがある。）を有する「イオン性ポリマー」を使用し、これをセンサーチップの表面に塗布することにより荷電層を形成することが好適である。
【００８９】
・カチオン性官能基
カチオン性官能基としては、たとえば、グアニジウムイオン、−ＮＨ3+、−ＮＨ2（ＣＨ3）+、−ＮＨ（ＣＨ3）2+、−Ｎ（ＣＨ3）3+などの第４級アンモニウムカチオンが挙げられる。このようなカチオン性官能基は、分子内塩を形成しているものが好ましいが、塩素、臭素などのハロゲン陰イオン、硫酸陰イオン、スルホン酸陰イオン、燐酸陰イオン、カルボン酸陰イオンなどと結合して対塩を形成していてもよい。高い表面電荷密度を達成するという観点からは、第４級アンモニウムカチオンを用いることが好ましい。このようなカチオン性官能基を含有させるポリマーとしては特に制限はないが、センサー性能の観点から、成膜性が良く、水溶性でないものが好ましい。
【００９０】
・アニオン性官能基
アニオン性官能基としては、たとえば、−ＣＯ2-（カルボン酸基）、−ＳＯ3-（スルホン酸基）、−ＯＳＯ3-（硫酸基）、−ＯＰＯ4-（リン酸基）、−Ｂ（ＯＨ）2（ボロン酸）などが挙げられる。このようなアニオン性官能基は、分子内塩を形成しているものが好ましいが、金属陽イオンまたは有機陽イオンと結合していてもよい。その金属陽イオンとしては、たとえば、Ｎａ+（ナトリウム陽イオン）、Ｋ+（カリウム陽イオン）、Ｃａ+（カルシウム陽イオン）などのアルカリ金属が挙げられ、有機陽イオンとしては、Ｍｅ3Ｎ+Ｈ（トリメチルアンモニウム陽イオン）、Ｅｔ3Ｎ+Ｈ（トリエチルアンモニウム陽イオン）、Ｍｅ2Ｎ+Ｈ2（ジメチルアンモニウム陽イオン）などが挙げられる。
【００９１】
・イオン性ポリマー
本発明では、一分子中にアニオン性官能基およびカチオン性官能基の両方を有するイオン性ポリマーを用いて荷電層を形成してもよいし、一分子中にアニオン性官能基のみを有するアニオン性ポリマーと一分子中にカチオン性官能基のみを有するカチオン性ポリマーとを含有する組成物を用いて荷電層を形成してもよい。
【００９２】
イオン性ポリマーは、アニオン性官能基、カチオン性官能基、またはその両方をあらかじめ有するモノマーを重合して得られたものでもよいし、それらの官能基を誘導または導入しうる他の官能基を有するモノマーを重合した後、当該官能基にそれらの官能基を誘導または導入することによって得られたものでもよい。
【００９３】
なお、イオン性官能基は、主鎖となるポリマーに直接結合していてもよいし、他の結合基Ｒを介してポリマー主鎖に結合していてもよい（Ａ−Ｒ−ポリマー主鎖）。結合基−Ｒ−としては、たとえば、炭素原子数１〜６のアルキレン基、フェニレン基、エチレンオキシ基（（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n）などが挙げられる。
【００９４】
イオン性ポリマーの一例として、炭化水素骨格を主鎖とするものが挙げられる。そのようなイオン性ポリマーを合成するために用いられるモノマーとしては、たとえば、ビニル基、アリル基、ジエンなどを有するモノマーが挙げられる。より具体的には、たとえば、（メタ）アクリルアミドなどのアミド類；（メタ）アクリル酸、または蟻酸ビニル、酢酸ビニル、酢酸アリル、アセト酢酸アリル、ビニルマレイン酸などのカルボン酸またはそのエステル類；スチレンスルホン酸、またはスチレンスルホン酸エステルなどのスルホン酸またはそのエステル類；この他、硫酸エステル、燐酸エステル、ホスホン酸エステルなども挙げられる。
【００９５】
また、イオン性官能基が導入されたウレタン系樹脂、たとえばカチオン性またはアニオン性の水性ポリウレタン樹脂「ハイドラン（登録商標）」シリーズ（ＤＩＣ株式会社）などの製品も、イオン性ポリマーとして挙げられる。
【００９６】
さらに、側鎖にカルボキシル基（アニオン性官能基）を有するポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアルギル酸、または側鎖にアミノ基（カチオン性官能基）を有するポリリジンのようなアミノ酸ポリマーや、カルボキシメチルデキストランのように、デキストラン等の多糖類に、グルコース単位中の水酸基等を介して、カルボキシル基等のイオン性官能基を導入した誘導体も、イオン性ポリマーとして挙げられる。
【００９７】
上記のような各種のイオン性ポリマーは、公知の方法によって合成することができ、市販品として入手することもできる。イオン性ポリマーの性状、たとえば一分子あたりのイオン性官能基の数や数平均分子量などは、目的とするセンサーチップ表面の荷電状態に応じて適宜調整することが可能である。たとえば、末端にアミノ基を有するシランカップリング剤とカルボキシル基を有するシランカップリング剤とを段階的な所望の割合で混合し、その混合物をアガロース等の多糖類と混合して、水酸基間での脱水縮合反応を行うことにより、所望の割合の荷電状態を生み出すイオン性ポリマーを調製することが可能である。
【００９８】
イオン性ポリマーは、ディップコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング等、公知の手法を用いてセンサーチップの表面に塗布することができる。このようなコーティング方法を用いる場合は、イオン性ポリマーの種類に応じて、適切な溶媒に、適切な濃度となるよう溶解させて塗布液を調製し、これを塗布するようにすればよい。たとえば、等電点測定方法の第３実施形態に用いるような、等電点の段階的な勾配が生み出された領域を備えたセンサーチップを作製する場合にも、適切な手法を用いて所望の領域（位置およびサイズ）に所望のイオン性ポリマーを塗布することによりそのような領域を形成することが可能である。
【００９９】
その他の方法として、末端にアミノ基またはカルボキシル基を有するシランカップリング剤等からなるＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）をセンサーチップの表面に形成し、必要に応じてさらに他の化合物を反応させることにより荷電層を形成することもできる。また、開始剤を基板に直接または前記ＳＡＭを介して固定化し、逐次反応で分子長を制御可能なラジカルリビング重合法を用いてin situで荷電層を形成することもできる。
【０１００】
・基板および光学薄膜
センサーチップ１０は、一般的には矩形状で平面の基板１２ａを用いて作製される（必要に応じてフローセル１４を積載して密閉流路を形成する）が、基板１２ａとして、平面ではなく凹凸によって複数の区画が形成された「ウェル型」のものを用いて作製することも可能である。
【０１０１】
基板１２ａは、たとえばＳｉ（シリコン）製が好ましい。一方、光学薄膜１２ｂは、基板の材質（屈折率）に応じて選択される、白色光を用いたときに観測される反射率極小波長が適切な範囲（好ましくは可視光領域）となるような屈折率および厚みを有する材質で形成される。たとえば、基板１２ａがＳｉ基板である場合、光学薄膜１２ｂは、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）などの酸化膜または窒化膜であることが好ましく、ＳｉＮ膜が特に好ましい。これらの酸化膜または窒化膜はいずれも、可視光領域（波長約４００から８００ｎｍの範囲）における屈折率が１．８〜２．４で、Ｓｉ基板の表層側層に形成される光学薄膜としての性能を満たしており、なおかつ当該光学薄膜自体がある程度、非特異的吸着を抑制する効果を有している。たとえば、ＳｉＮ膜の膜厚を約４５〜９０ｎｍとすることにより、ボトムピークをおよそ４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲に調節することができる。
【０１０２】
−プログラム−
本発明の等電点測定プログラムは、本発明の等電点測定方法の工程（３）において、測定結果とその測定条件に基づき被験物質の等電点を推定する処理をコンピュータに実行させる、換言すれば当該コンピュータを当該処理を実行する演算手段として機能させるためのものである。
【０１０３】
このような等電点測定プログラムとして、前記第１物質により形成されたセンサーチップ上の所定の領域に前記第２物質の水溶液を接触させ、当該領域への前記第２物質の吸着量を測定したときに記憶された測定結果データと、それに対応する測定条件データを読み出す読出処理、および読み出した測定結果データ同士を比較し、所定の条件を満たす測定結果データとそれに対応する測定条件データに基づき、前記被験物質の等電点を推定する推定処理をコンピュータに実行させるプログラムを使用することができる。
【０１０４】
前記読出処理および推定処理は、本発明の等電点測定方法の実施形態、典型的には前記第１から第３の実施形態に応じて、適切なものとすることができる。
【０１０５】
等電点測定方法の第１実施形態においては、第２物質が被験物質であり、測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものが記憶されており、測定条件データとして、第２物質の水溶液のｐＨのデータが記憶されている。
【０１０６】
このような第１実施形態のためのプログラムの推定処理は、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照したｐＨを第２物質の等電点の推定値として提示するステップとを含むものとなる。
【０１０７】
等電点測定方法の第２実施形態においては、第１物質が被験物質であり、第２物質が参照物質であり、測定結果データとして、第２物質が同一の濃度で溶解しているがｐＨの異なる複数の水溶液についてのものが記憶されており、測定条件データとして、第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータが記憶されている。
【０１０８】
このような第２実施形態のためのプログラムの推定処理は、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高いか低いかによって、第１物質の等電点が第２物質の等電点より高いか低いかの推定結果を提示するステップとを含むものとなる。
【０１０９】
等電点測定方法の第３実施形態においては、前記第１物質が参照物質であり、前記第２物質が被検物質であり、測定結果データとして、異なる等電点を有する第１物質によってセンサーチップ上に形成された２以上の領域についてのものが記憶されており、測定条件データとして、第１物質の等電点のデータが記憶されている。
【０１１０】
このような第３実施形態のためのプログラムの推定処理は、読み出した測定結果データ同士を比較して吸着量が最大のデータを抽出するステップと、抽出したデータに対応する第２物質の等電点およびその水溶液のｐＨのデータを参照するステップと、参照した水溶液のｐＨが第２物質の等電点より高いか低いかによって、第１物質の等電点が第２物質の等電点より高いか低いかの推定結果を提示するステップとを含むものとなる。
【０１１１】
上記各ステップを実行するプログラムは、常法に従って作製することができる。また、上記プログラムは、ＬＡＮなどを通じてインターネットなどの公衆回線に接続された通信装置５０４を通じて、適宜、最新のものに更新することができる。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例において、ＲＩｆＳ方式の分子間相互作用測定装置としては「ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ」（登録商標、コニカミノルタオプト株式会社）を使用し、無修飾のセンサーチップおよびフローセルとしては、上記「ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ」専用のセンサーチップ（基板：シリコンウェハ、光学薄膜：窒化シリコン）およびフローセル（ＰＤＭＳ製、幅２．５ｍｍ×長さ１６ｍｍ×深さ０．１ｍｍの溝及びこの溝の両末端にそれぞれ直径１ｍｍの貫通口を有する。）を使用し、シリンジポンプとしては「Ｅｃｏｎｏｆｌｏ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  ７０−２２０５」（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ製）を使用した。【０１１３】
［実施例１］
ｐＨが４，５，６，７．４，１０に調製された酢酸緩衝液（ｐＨ４，５，６）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）および炭酸緩衝液（ｐＨ１０）のそれぞれに、ＢＳＡを１０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加して溶解させた。無修飾のセンサーチップ（ＳｉＮからなる光学薄膜の表面電位はゼロ付近で一様である）を、各ＢＳＡ溶液に２４時間または４８時間浸漬した後、取り出して、蒸留水で洗浄して乾燥した。【０１１４】
各センサーチップについて、上記処理の前後それぞれの時点でＲＩｆＳ測定装置により各センサーチップの反射率極小波長（λ）を測定し、その変化量（Δλ）を算出した。【０１１５】
結果を図８に示す。ＢＳＡ溶液のｐＨが５のときに、Δλが最も大きい、すなわちＢＳＡのセンサーチップへの吸着量が最も多く、以下ｐＨ６，４，７．４，１０の順であった。この結果は、緩衝液のｐＨが、ＢＳＡの既知の等電点であるｐＨ４．８に最も近い５のときに、ＢＳＡの電荷が最も０に近くなり、分子内の静電的反発力が最小となるため分子サイズも最小となり、それによりセンサーチップの単位面積あたりの吸着量が最大になるという論理に合致する。したがって、仮にＢＳＡの等電点が未知であった場合に、上記実施例に示した測定結果からＢＳＡの等電点を約５と推定することの妥当性が明らかとなった。【０１１６】
［実施例２］
ｐＨが４．５，４．６，４．８，５．０に調製された酢酸緩衝液のそれぞれに、ＢＳＡを１０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加して溶解させた。無修飾のセンサーチップ（ＳｉＮからなる光学薄膜の表面電位はゼロ付近で一様である）を、各ＢＳＡ溶液に１時間または３時間浸漬した後、取り出して、蒸留水で洗浄して乾燥した。【０１１７】
各センサーチップについて、上記処理の前後それぞれの時点でＲＩｆＳ測定装置により各センサーチップの反射率極小波長（λ）を測定し、その変化量（Δλ）を算出した。【０１１８】
結果を図９に示す。ＢＳＡ溶液のｐＨが５．０のときに、Δλが大きい、すなわちＢＳＡのセンサーチップへの吸着量が多くなった。そのような傾向を示すｐＨがＢＳＡの既知の等電点であるｐＨ４．８よりも高い範囲にあることから、ＳｉＮからなる光学薄膜の表面電位（ゼータ電位）は、ゼロ付近でありながらもプラスである、すなわち、ＢＳＡがややマイナスの電荷を帯びる、ＢＳＡ溶液のｐＨが５．０のときに、ややプラスの電荷を帯びたＳｉＮからなる光学薄膜の表面にＢＳＡがもっとも吸着しやすくなると推定される。換言すれば、ＳｉＮからなる光学薄膜の表面の等電点はｐＨ４．８よりも高いと評価される。【０１１９】
［実施例３］
［１］等電点勾配形成センサーチップの作製
末端にカルボキシル基およびアミノ基を有するシランカップリング剤、Ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄおよび３―Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅをエタノール中に２ｖｏｌ％となるようにそれぞれ加え、Ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄ溶液にはさらに酢酸を２ｖｏｌ％加えて、室温で１時間シランカップリング剤の加水分解を行った。前記加水分解されたシランカップリング溶液を、両者が１０：０，７．５：２．５，５：５，２．５：７．５，０：１０の比率となるように配合し、各溶液と同量の２ｗｔ％アガロース（ゲル化温度３６℃）の水溶液（５０℃）に加えて、５０℃下で１時間反応させた。これにより、アガロースとシランカップリング剤の両水酸基間で脱水縮合が起こり、カルボキシル基とアミノ基が各比率で修飾された５種類のアガロース水溶液を調製できた。前記５０℃のアガロース水溶液を基板（センサーチップ）上にディップコーティングし、室温で冷却することでアガロースをゲル化して基板上に固定化した。前記操作は、５種類の溶液に対して繰り返し行い、基板のディップ深さの位置を上から下にずらしながらコーティングすることで、５種類の等電点を有するアガロースゲルを段階的に形成し、等電点勾配形成センサーチップを作製した。基板は各領域でゼータ電位を測定し、等電点のｐＨが約４〜１０の範囲となる勾配を形成した。【０１２０】
［２］等電点の測定
ｐＨが７．０に調整されたリン酸緩衝液に、ＢＳＡを１０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加して溶解させた。このＢＳＡ水溶液をフロー型のシステムで送液し、前記工程で作製したセンサーチップに接触させた。【０１２１】
ＲＩｆＳ測定装置により、上記接触の前後をリアルタイムでセンサーチップの各領域に対応する位置に設置された光ファイバによる検出により反射率極小波長（λ）を測定し、それぞれの変化量（Δλ）をモニタリングした。【０１２２】
結果を図１０に示す。等電点のｐＨが約５となるよう形成した領域におけるΔλが最も大きい、すなわち当該領域へのＢＳＡの吸着量が最も多かった。実施例１についての考察と同様のことから、上記実施例に示した実施形態によっても被験物質の等電点の推定が可能であることが示された。
【符号の説明】
【０１２３】
１    測定システム
１０    測定部材
１２    センサーチップ
１２ａ  シリコン基板
１２ｂ  ＳｉＮ膜
１２ｃ  荷電層
１４    フローセル
１４ａ  溝
１４ｂ  密閉流路
１４ｃ  流入口
１４ｄ  流出口
２０    白色光源
３０    分光器
３５    送液装置
４０，４１    光ファイバ
５０    制御演算装置
６０    サンプル溶液
６２    被検物質
８０    分子間相互作用測定装置
８１    上側筺体
８２    下側筺体
８３    テーブル
８４    接続部
８５    射出口
８６    検出窓
８７    吸引口
９１    ディスプレイ
９２    入出力装置
５００    ＣＰＵ
５０１    ＲＯＭ
５０２    ＲＡＭ
５０３    記憶装置
５０４    通信装置
５０５    記憶媒体のリーダー・ライター
５０６    インターフェース
【図１】
2013146249.tif 000003
【図２】
2013146249.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013146249.tif 000009
【図８】
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【図９】
2013146249.tif 000011
【図１０】
2013146249.tif 000012
【国際調査報告】
2013146249.tif 000013
2013146249.tif 000014
2013146249.tif 000015
2013146249.tif 000016
2013146249.tif 000017
2013146249.tif 000018
2013146249.tif 000019
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