(57)【要約】  本発明は、LH法により得られた変異型DNAとプローブのハイブリッド体又は／及び野生型DNAとプローブのハイブリッド体の分離の分離能向上を課題とする。  本発明は、「（１）置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA（変異型DNA）の少なくとも１種又は／及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA（野生型DNA）と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体（変異型ハイブリッド体）又は／及び野生型DNAとのハイブリッド体（野生型ハイブリッド体）を形成させる工程（但し、変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも１種はループ構造を有する）、（２）得られた変異型ハイブリッド体又は／及び野生型ハイブリッド体をインターカレーターと接触させる工程、及び（３）変異型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体又は／及び野生型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離することにより、変異型DNA又は／及び野生型DNAの有無を検出する工程を含む、変異型DNA又は／及び野生型DNAの検出方法」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）を含む、変異型DNA又は／及び野生型DNAの検出方法：
（１）置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA（変異型DNA）の少なくとも１種又は／及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA（野生型DNA）と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体（変異型ハイブリッド体）又は／及び野生型DNAとのハイブリッド体（野生型ハイブリッド体）を形成させる工程（但し、変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも１種はループ構造を有する）、
（２）得られた変異型ハイブリッド体又は／及び野生型ハイブリッド体をインターカレーターと接触させる工程、
（３）変異型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体又は／及び野生型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離することにより、変異型DNA又は／及び野生型DNAの有無を検出する工程。
【請求項２】
ループ構造が、置換塩基、欠損塩基領域又は挿入塩基領域を含むもの、或いは、正常塩基又は正常塩基領域を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ループ構造が、ステム構造を有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
変異型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体又は／及び野生型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離する方法が電気泳動法である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
インターカレーターが、アクリジン色素、エチジウム化合物、ヨウ素化合物、７−アミノアクチノマイシンＤ（7-AAD）、シアニンダイマー系色素、シアニンモノマー系色素、SYTOX系色素、GelRed系色素、DNA二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの、又は、アデニン−チミン配列に特異的に結合するものである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インターカレーターを用いたループハイブリッド法による高精度な変異型DNA又は野生型DNAの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定遺伝子中の変異の有無は、様々な分野で重要視されてきている。例えば、法医学におけるDNA鑑定で、DNA中の変異または多型による１塩基置換の有無を確認することは、個体識別の方法として既によく知られている。また、医学の分野でも、特定の遺伝子多型と薬剤感受性の間に相関性を有することが知られてきており、特定の遺伝子多型を調べることで、薬害リスクの低減を図ることがなされている。また、遺伝性疾患の変異型DNA保有者の検出等にも用いられており、遺伝子の変異の検出は、以前よりも重要度を増している。【０００３】
そして、遺伝子の変異の検出法として、DNA断片のPCR反応後の反応液に一本鎖オリゴDNAを添加して目的のDNA断片とハイブリダイゼーションさせ、得られたハイブリッド体の構造の違いにより電気泳動法で分離し、必要に応じてインターカレーターを反応させて分離された変異遺伝子を判別するループハイブリッド法（LH法）が知られていた（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−６１０８０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Clinica Chimica Acta,412, 1688-1672
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記LH法は、変異型DNAの検出においては有用な方法であるが、塩基数が同じ配列の変異型DNAと野生型DNA、又は塩基数が同じ配列の変異型DNA同士を分離検出するのは難しいという問題点を有していた。そのため、本発明は、LH法により得られた変異型DNAとプローブのハイブリッド体又は／及び野生型DNAとプローブのハイブリッド体の分離能の向上を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記状況に鑑み、本発明者らが鋭意研究した結果、意外なことにLH法により得られたハイブリッド体をインターカレーターと接触させて電気泳動で分離すると、即ち、ハイブリッド体とインターカレーターとの結合体を電気泳動で分離すると分離能が向上し、塩基数が同じ配列の変異型DNAと野生型DNA、又は塩基数が同じ配列の変異型DNA同士を分離検出することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
「以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、変異型DNA又は／及び野生型DNAの検出方法：
（１）置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA（変異型DNA）の少なくとも１種又は／及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA（野生型DNA）と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体（変異型ハイブリッド体）又は／及び野生型DNAとのハイブリッド体（野生型ハイブリッド体）を形成させる工程（但し、変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも１種はループ構造を有する）、
（２）得られた変異型ハイブリッド体又は／及び野生型ハイブリッド体をインターカレーターと接触させる工程、
（３）変異型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体又は／及び野生型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離することにより、変異型DNA又は／及び野生型DNAを検出する工程」に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の検出方法によれば、変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体、或いは変異型ハイブリッド体同士の分離能が高いため、変異型DNAと野生型DNAが同じ塩基数の場合であっても、また変異型DNAが複数あり且つその変異型DNAが同じ塩基数であっても分離識別を可能とし、その結果、種々の多型を有する変異型DNAであっても、変異型DNA及び野生型DNAを検出することができる。特に、電気泳動法を用いた場合、上記効果を顕著に示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１において、EGFR遺伝子における野生型DNA（N）と変異型DNA（G1〜G5）を用いて得たループハイブリッド反応生成物（LH反応生成物）を、インターカレーターの共存下マイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図２】比較例１において、EGFR遺伝子における野生型DNA（N）と変異型DNA（G1〜G5）を用いて得たCy5標識LH反応生成物を、インターカレーターの非共存下マイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図３】比較例２において、EGFR遺伝子における野生型DNA（N）と変異型DNA（G1〜G5）を、インターカレーターの共存下マイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図４】比較例３において、EGFR遺伝子における野生型DNA（N）と変異型DNA（G1〜G5）を用いて得たLH反応生成物を、ゲル電気泳動で泳動した後、インターカレーターを添加して測定した分離分析結果である。
【図５】比較例４において、EGFR遺伝子における野生型DNA（N）と変異型DNA（G1〜G5）を用いて得たCy5標識LH反応生成物を、インターカレーターの非共存下ゲル電気泳動で分離分析した結果である。
【図６】実施例２において、KRAS遺伝子における野生型DNA（ＷＴ）と変異型DNA（G12W）を用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの共存下マイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図７】比較例５において、KRAS遺伝子における野生型DNA（ＷＴ）と変異型DNA（G12W）を用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの非共存下マイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図８】実施例３及び比較例６において、IDH1における野生型DNAと変異型DNAを用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの共存下及び非共存下でのゲル電気泳動で分離分析した結果である。
【図９】実施例４において、IDH1における野生型DNAと変異型DNAを用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの共存下でのマイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図１０】比較例７において、IDH1における野生型DNAと変異型DNAを用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの非共存下でのマイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図１１】実施例５及び比較例８において、ALDH２遺伝子における野生型DNAと変異型DNAを用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの共存下又は非共存下でゲル電気泳動で分離分析した結果である。
【図１２】実施例６及び比較例９において、ALDH２遺伝子における野生型DNAと変異型DNAを用いて得たLH反応生成物を、インターカレーターの共存下又は非共存下でマイクロチップ電気泳動で分離分析した結果である。
【図１３】実施例７において、EGFR遺伝子における野生型DNA（N）と変異型DNA（G1〜G5）を用いて得たLH反応生成物にインターカレーターを添加したものを試料として、ゲル電気泳動で分離分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［本発明に係る変異型DNA・野生型DNA］
本発明に係る変異型DNAは、置換塩基、欠損塩基領域、又は挿入塩基領域（以下、これらを総称して単に変異塩基領域と記載する場合がある。）を有するものであって、且つ少なくともこれら変異塩基領域の前後5〜150塩基について既知である一本鎖DNAであれば何れも用いることができる。尚、本発明に係る変異型DNAは、一塩基置換DNAやマイクロサテライト領域のリピート塩基の数が異なるDNA等の多型DNAも含む。このようなDNAとしては、動物、微生物、細菌、植物等の生物から単離されるゲノムDNA断片、ウイルスから単離可能なDNA断片、およびmRNAを鋳型として合成されたcDNA断片等である。このような変異型DNAの中でも、ヒト細胞由来の癌遺伝子が好ましいものとして挙げられる。また、ハイブリッド体を形成する変異型DNAの鎖長は、通常20〜2000塩基、好ましくは100〜500塩基である。
【００１１】
上記変異塩基領域に関し、置換塩基とは、変異が置換変異である場合に、野生型DNAの正常塩基が変異により置換した置換塩基を表し、欠損塩基領域とは、変異が欠損変異である場合に、野生型DNAの正常塩基が変異により欠損した塩基部分を表し、挿入塩基領域とは、変異が挿入変異である場合に、野生型DNAに変異により挿入された塩基部分を表す。尚、上記欠損塩基領域及び挿入塩基領域は、通常1〜200塩基である。また、本発明に係る変異型DNA及び野生型DNAとハイブリダイズするプローブは、特定の変異塩基領域を検出対象として本発明に係るループ構造を形成するため、検出対象とする変異塩基領域以外に、置換塩基、欠損塩基領域又は挿入塩基領域が本発明に係る変異型DNA中に存在していても構わない。
【００１２】
本発明に係る野生型DNAは、本発明に係る変異型DNAと変異塩基領域を除いた塩基配列が同一のものであり、その長さとしては変異型DNAと同程度のものであり、通常20〜2000塩基、好ましくは100〜500塩基である。
【００１３】
上記した変異型DNAの変異部分に対応する、野生型DNAの正常塩基部分を、正常塩基領域と言う。変異が置換変異である場合は、変異により置換した置換塩基に対する野生型DNAの正常塩基（変異前の塩基）が正常塩基領域（正常塩基）であり、変異が欠損変異である場合は、変異により欠損した塩基部分に対する野生型DNAの正常塩基部分（変異により欠損する塩基部分）が正常塩基領域であり、変異が挿入変異である場合は、変異により挿入された塩基部分に対する野生型DNAの正常塩基部分が正常塩基領域である。以下に、変異塩基領域と正常塩基領域についての模式図を示す。
2013141332.tif 000002
【００１４】
上記本発明に係る変異型DNA及び野生型DNA（以下、これらを合わせて本発明に係るDNAと略記する場合がある）は、上記DNAができる限り精製され、核酸断片以外の余分な成分が取り除かれているものが好ましい。具体的には、例えばシリカ担体を用いたBoom法（Boom et al. J. Clin. Microbiol. 28:495-503 (1990)）、ヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76-2,p615-619 (1979））など、常法に準じて精製されたものが好ましい。また、自体公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR反応）、例えばNucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134-1137に記載の方法により目的とするDNAを増幅させたものを用いてもよい。
【００１５】
本発明に係るDNAが二本鎖を形成している場合には、通常この分野でなされる加熱処理（90〜100℃）やアルカリ処理（水酸化ナトリウム等による処理）等により二本鎖DNAを一本鎖化して本発明に係るDNAを得ればよい。
【００１６】
［本発明に係るプローブ］
本発明に係るプローブは、上記本発明に係る変異型DNA及びそれに対応する本発明に係る野生型DNAとハイブリダイズして、変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体を形成するものであって、形成された変異型ハイブリッド体又は野生型ハイブリッド体の少なくとも一種はループ構造を形成するものである。また、形成されたハイブリッド体の複数がループ構造を形成する場合であっても、それらのループ構造は異なる構造のものとなる。尚、本発明に係るプローブが変異型DNA又は野生型DNAと完全に相補な塩基配列からなる場合、得られるハイブリッド体はループ構造を形成しない。このような本発明に係るプローブは、通常10〜2000塩基、好ましくは10〜300塩基、より好ましくは10〜150塩基である。尚、ループ構造をプローブ側に形成させる場合、その塩基配列を任意に作製することができるので、ハイブリッド体形成時にループ構造を形成する配列が本発明に係るDNAと結合しないように、本発明に係るDNAと相補な配列を含まないようにするのが好ましい。
【００１７】
本発明に係るプローブの具体例については、ハイブリッド体の具体例と併せて後述するが、例えば検出するDNAが置換塩基を有する変異型DNAで、プローブ側にループ構造を作らせる場合には、例えば下記図のようにプローブを設計すればよい。下記図に示されたものの場合、野生型DNA置換塩基に相当する正常塩基を中心としてA部、B部に分け、そのA部、B部の相補鎖（A’とB’）とその間に、ループ構造を形成する配列を挿入するようにプローブを設計する。尚、図中のMは、置換塩基を表し、Nは置換塩基に対応する正常塩基を表す。また、A'部及びB'部は、それぞれA部、B部と相補な塩基領域を表す。
2013141332.tif 000003
【００１８】
このように設計することにより、例えば野生型ハイブリッド体を形成した場合には、設計した通りのループ構造が形成され、一方、変異型ハイブリッド体においては、置換塩基とプローブ中の正常塩基と相補な塩基とが結合しないため、正常塩基と相補な１塩基を含むループ構造が形成されると考えられ、その結果、野生型のループ構造とは異なるものとなる。
【００１９】
［本発明に係るハイブリッド体］
本発明に係るハイブリッド体は、上記本発明に係るプローブが本発明に係る野生型DNA又は変異型DNAにハイブリダイズすることにより形成されるものであるが、その何れか一種は、ループ構造を有する。また、野生型ハイブリッド体と変異型ハイブリッド体のうち複数がループ構造を有する場合、そのループ構造は異なるものである。即ち、野生型ハイブリッド体と変異型ハイブリッド体であっても、変異型ハイブリッド体同士であっても、そのループ構造はそれぞれ異なるものとなる。従って、本発明の検出方法においては、この構造の違いと二本鎖塩基部分にインターカレーターが結合したことにより生じる違いを精度よく分離することができる。
【００２０】
ループ構造を有する本発明に係るハイブリッド体は、２個所の二本鎖塩基部分と、これらに挟まれた（これらの間に存在する）一本鎖塩基部分のループ構造から構成される。なお、該ハイブリッド体は、突出末端を有していてもよいが、分離に影響を及ぼす可能性があるため、突出末端を有さないものが好ましい。また、２箇所の二本鎖塩基部分に挟まれる箇所においては、ループ構造を有する塩基鎖の反対側の鎖にループ構造と相補でない一本鎖塩基部分を有していてもよい。また、該ハイブリッド体は、ループ構造を有する塩基配列の反対側に更に別のループ構造を形成して、ハイブリッド体の両側にループ構造を有するようにしてもよい。更にまた、使用するプローブが、野生型DNA又は変異型DNAの一種の塩基配列と相補な塩基配列（野生型DNA又は変異型DNAの一種の塩基配列の全部又は一部と100%一致する塩基配列）である場合、形成されるハイブリッド体はループ構造を有さないものとなるため、ハイブリッド体は、二本鎖塩基のみを有するハイブリッド体又は二本鎖塩基と突出末端とを有するハイブリッド体となる。
【００２１】
上記本発明に係るハイブリッド体におけるループ構造は、プローブ又はゲノムDNAとハイブリダイズしない（塩基対を形成しない）一本鎖塩基鎖で構成され、ハイブリッド体中でループ状の二次構造（立体構造）を形成するものである。該ループ構造は、通常3〜300塩基、好ましくは5〜100塩基で構成される。
本発明に係るループ構造は、ステムを有していてもよい。該ステムとは、上記一本鎖塩基鎖がそれ自身で二本鎖を形成する構造（二本鎖塩基又は二本鎖塩基鎖部分）を表す。
該ステムは、塩基対が少なくとも１塩基対以上、好ましくは２塩基対以上、より好ましくは３塩基対以上連続するものである。本発明に係るループ構造は、ステムのみで構成されるものであってもよい。即ち、ステムを有するループ構造としては、ステムのみで構成されるもの、ステムがループ構造中の末端に存在するもの、ステムがループ構造中の先端に存在するもの、ステムがループ構造中の中間に存在するもの、これらの組合せ等が挙げられる。その模式図を以下にそれぞれ示す。尚、実線部分はステム構造を表し、点線部はゲノムDNAとプローブとが形成する二本鎖塩基鎖を表す。また、ループ構造中の並行部分はステムを表す。
2013141332.tif 000004
分離性能の点では、ループ構造が上記ステムを有するものが好ましい。
【００２２】
上記ハイブリッド体中の２箇所の二本鎖塩基部分は、それぞれ独立して、通常5〜1000塩基対、好ましくは10〜500塩基対、より好ましくは10〜100塩基対で構成される。
【００２３】
ハイブリッド体のゲノムDNA側及びプローブ側の両側にループ構造を形成する場合、一方のループ構造が変異塩基を識別できる箇所（変異塩基領域に存在する箇所）にあれば、他方のループ構造は任意の位置でかまわない。該ループ構造は、通常3〜300塩基、好ましくは5〜100塩基で構成される。
【００２４】
上記ハイブリッド体の両側にループ構造を有するハイブリッド体としては、何れか一方のループ構造が変異塩基（領域）を認識するように（変異塩基領域に存在するように）設定されていれば、他方のループ構造は任意の位置に任意の大きさで形成されればよい。
【００２５】
上記プローブ並びに上記ハイブリッド体は、変異型DNAの種類（前記置換塩基、欠損塩基領域、又は挿入塩基領域を有する一本鎖DNA）や、変異塩基領域とハイブリダイズするのか若しくは変異塩基領域に対応する正常塩基又は正常塩基領域とハイブリダイズするのかにより、適宜設計して合成すればよいが、具体的なプローブの例については、以下の如く場合分けしてそれぞれ説明する。尚、マイクロサテライト領域を有するDNAを分離する場合には、例えば特願2012-65232号に記載のプローブやハイブリッド体を用いてもよい。
【００２６】
(I)変異型DNAが置換塩基を有するDNAの場合
(I-1)プローブ側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
(I-2)ゲノムDNA側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
(II)変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAの場合 
(II-1)プローブ側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
(II-2)ゲノムDNA側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
(III)変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAの場合
(III-1)ゲノムDNA側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
(III-2)プローブ側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
(IV)ループ構造を有する塩基鎖の反対側の鎖中に更にループ構造を形成させる場合
【００２７】
［本発明に係るプローブ及びハイブリッド体の具体例］
(I)変異型DNAが置換塩基を有するDNAの場合
(I-1)プローブ側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、野生型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、(1)野生型ゲノムDNAの正常塩基(N)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、該正常塩基(N)からA方向とは反対方向（B方向）に１〜１０塩基隣の塩基（X）から同B方向に延びる二本鎖塩基部分とを有し、且つ(2)正常塩基(N)の相補塩基と該正常塩基(N)から１〜１０塩基隣の塩基(X)の相補塩基との間に一本鎖塩基部分のループ構造(C)をプローブ側に有する野生型ハイブリッド体を形成し、一方、変異型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、(1)変異型ゲノムDNAの置換塩基(M)とは塩基対を形成せずに、該置換塩基(M)の隣の塩基から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、A方向とは反対方向（B方向）であって置換塩基(M)の１〜１０塩基隣の塩基(X)から同B方向に延びる二本鎖塩基部分を有し、且つ、(2)置換塩基(M)のA方向に隣の塩基(X’)の相補塩基と、B方向に１〜１０塩基隣の塩基の相補塩基(X)との間に、一本鎖塩基部分のループ構造(C’)をプローブ側に有する変異型ハイブリッド体を形成する、プローブを用いればよい。この場合、野生型ハイブリッド体及び変異型ハイブリッド体の両者にループ構造(C、C’)が形成されるが、プローブは置換塩基(M)とは結合しないため、変異型ハイブリッド体におけるループ構造(C’)は野生型ハイブリッド体のそれ(C)よりも１塩基長いものとなる。尚、上記１〜１０塩基隣の塩基(X)が２〜１０塩基隣の塩基の場合、ハイブリッド体は、二つの二本鎖塩基部分の間のゲノムDNA側に、つまり、ループ構造の反対側に、ループ構造と相補ではない一本鎖塩基部分を有することとなる。以下に、上記１〜１０塩基隣の塩基(X)が１塩基隣の場合のの模式図を記載する。尚、Nは正常塩基、Mは置換塩基、Xは正常塩基又は置換塩基の隣の塩基(５’末端側又は３’末端側の隣の塩基)、X’は置換塩基の隣の塩基（Xと反対方向に隣の塩基）を表す。
2013141332.tif 000005
【００２８】
このようなプローブとしては、具体的には、野生型DNAにおける正常塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、ループ構造を形成する通常3〜300塩基、好ましくは5〜100塩基の塩基配列、野生型DNAにおける正常塩基の３’末端方向に１〜１０塩基隣の塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの、或いは、野生型DNAにおける正常塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、ループ構造を形成する通常3〜300塩基、好ましくは5〜100塩基の塩基配列、野生型DNAにおける正常塩基の５’末端方向に１〜１０塩基隣の塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの等が挙げられる。
【００２９】
2013141332.tif 000006
また、本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、変異型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、(1)変異型ゲノムDNAの置換塩基(M)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、該置換塩基(M)からA方向とは反対方向（B方向）に１〜１０塩基隣の塩基(X)から同B方向に延びる二本鎖塩基部分とを有し、且つ、(2)置換塩基(M)の相補塩基と該置換塩基(M)から１〜１０塩基隣の塩基(X)の相補塩基との間に一本鎖塩基部分のループ構造(C’)をプローブ側に有する変異型ハイブリッド体を形成し、一方、野生型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、(1)野生型ゲノムDNAの正常塩基とは塩基対を形成せずに、該正常塩基の隣の塩基(X’)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、A方向とは反対方向（B方向）であって正常塩基(N)の１〜１０塩基隣の塩基(X)から同B方向に延びる二本鎖塩基部分を有し、且つ(2)正常塩基(N)のA方向に隣の塩基(X’)の相補塩基と、B方向に１〜１０塩基隣の塩基(X)の相補塩基との間に、一本鎖塩基部分のループ構造(C)をプローブ上に有する正常型ハイブリッド体を形成する、プローブを用いてもよい。この場合、野生型ハイブリッド体及び変異型ハブリッド体の両者にループ構造(C、C’)が形成されるが、野生型ハイブリッド体におけるループ構造(C)は変異型ハイブリッド体のそれ(C’)よりも１塩基長いものとなる。尚、上記１〜１０塩基隣の塩基(X)が２〜１０塩基隣の塩基の場合、ハイブリッド体は、二つの二本鎖塩基部分の間のゲノムDNA側に、つまり、ループ構造の反対側に、ループ構造と相補ではない一本鎖塩基部分を有することとなる。以下に、上記１〜１０塩基隣の塩基(X)が１塩基隣の場合の模式図を記載する。尚、Nは正常塩基、Mは置換塩基、Xは正常塩基又は置換塩基の隣の塩基(５’末端側又は３’末端側の隣の塩基)、X’は正常塩基の隣の塩基(Xと反対方向に隣の塩基)を表す。
【００３０】
このようなプローブとしては、具体的には、変異型DNAの置換塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、ループ構造を形成する通常3〜300塩基、好ましくは5〜100塩基の塩基配列、変異型DNAにおける置換塩基の３’末端方向に１〜１０塩基隣の塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの、或いは、変異型DNAの置換塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、ループ構造を形成する通常3〜300塩基、好ましくは5〜100塩基の塩基配列、変異型DNAにおける置換塩基の５’末端方向に１〜１０塩基隣の塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの等が挙げられる。
【００３１】
(I-2)ゲノムDNA側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、野生型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、野生型ゲノムDNAの正常塩基(N)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、該正常塩基(N)の相補塩基(n)からA方向とは反対方向（B方向）に隣の塩基(X)を含む二本鎖塩基部分とを有し、且つ正常塩基(N)の隣の塩基を末端とする一本鎖塩基部分のループ構造(C)をゲノムDNA上に有する野生型ハイブリッド体を形成し、一方、変異型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、変異型ゲノムDNAの置換塩基(M)とは塩基対を形成せずに、該置換塩基(M)の隣の塩基(Y)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、前記置換塩基の隣の塩基(Y)の相補塩基(y)からA方向とは反対方向（B方向）に２塩基隣の塩基(X)からB方向に延びる二本鎖塩基部分とを有し、且つ置換塩基(M)を末端とする一本鎖塩基部分のループ構造(C’)をゲノムDNA上に有する変異型ハイブリッド体を形成するようなプローブを用いればよい。この場合、野生型ハイブリッド体及び変異型ハイブリッド体の両方にループ構造(C、C’)が形成されるが、プローブは置換塩基(M)とは結合しないため、変異型ハイブリッド体におけるループ構造(C’)は野生型ハイブリッド体のそれ(C)よりも１塩基長いものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、Nは正常塩基、Mは置換塩基をそれぞれ表す。
2013141332.tif 000007
【００３２】
このようなプローブとしては、具体的には、野生型DNAの正常塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、野生型DNAにおける正常塩基の３’末端方向の4〜300塩基、好ましくは6〜100塩基隣の塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの、或いは、野生型DNAの正常塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、野生型DNAにおける正常塩基の５’末端方向の通常4〜300塩基、好ましくは6〜100塩基隣の塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの等が挙げられる。
【００３３】
また、本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、野生型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、野生型ゲノムDNAの正常塩基(N)とは塩基対を形成せずに、該正常塩基(N)の隣の塩基(Y)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、前記正常塩基(N)の隣の塩基(Y)の相補塩基(y)からA方向とは反対方向（B方向）に２塩基隣の塩基(X)を含む二本鎖塩基部分とを有し、且つ正常塩基(N)を末端とする一本鎖塩基部分のループ構造(C)をゲノムDNA上に有する野生型ハイブリッド体を形成し、一方、変異型ゲノムDNAとハイブリダイズした場合、変異型ゲノムDNAの置換塩基(M)から一端（A方向）に延びる二本鎖塩基部分と、該置換塩基の相補塩基(m)の隣の塩基(X)からA方向とは反対方向（B方向）に延びる二本鎖塩基部分とを有し、且つ置換塩基の隣の塩基を末端とする一本鎖塩基部分のループ構造(C’)をゲノムDNA上に有する変異型ハイブリッド体を形成するようなプローブを用いればよい。この場合、野生型ハイブリッド体及び変異型ハイブリッド体の両方にループ構造(C、C’)が形成されるが、プローブは正常塩基とは結合しないため、野生型ハイブリッド体におけるループ構造(C)は変異型ハイブリッド体のそれ(C’)よりも１塩基長いものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、Nは正常塩基、Mは置換塩基をそれぞれ表す。
2013141332.tif 000008
【００３４】
このようなプローブとしては、具体的には、野生型DNAにおける正常塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、野生型DNAにおける正常塩基の３’末端方向の通常4〜300塩基、好ましくは6〜100塩基隣の塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの、或いは、野生型DNAにおける正常塩基から３’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖、野生型DNAにおける正常塩基の５’末端方向の通常4〜300塩基、好ましくは6〜100塩基隣の塩基から５’末端方向に通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列の相補鎖をこの順序で連結させたもの等が挙げられる。
【００３５】
(II)変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAの場合 
(II-1)プローブ側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、（ａ）ループ構造を有さない野生型ハイブリッド体を形成し、ループ構造を有する変異型ハイブリッド体を形成するようなプローブ、又は（ｂ）プローブ上にループ構造を有する野生型ハイブリッド体とプローブ上にループ構造を有する変異型ハイブリッド体を形成し、両者のループ構造が異なる構造となるようなプローブを使用すればよい。
【００３６】
上記（ａ）のプローブとしては、野生型DNAの塩基配列全部と相補な塩基配列又は野生型DNAの正常塩基を含む一部の塩基配列と相補な塩基配列（塩基配列の全部又は一部と100%相補な塩基配列）からなるプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体は、ループ構造を形成しないものとなり、変異型ハイブリッド体は、欠損塩基領域に相補な塩基配列がループ構造をプローブ上に形成する。以下に、その模式図を記載する。尚、図中NNNは正常塩基領域を、点線は正常塩基領域の相補鎖をそれぞれ表す。
2013141332.tif 000009
【００３７】
このようなプローブとしては、具体的には、野生型DNAの欠損塩基領域とその両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基を連結させた塩基配列の相補鎖等が挙げられる。言い換えれば、野生型DNAと相補な配列であって、欠損塩基領域とその両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列とからなる配列と相補な塩基配列が挙げられる。
【００３８】
上記（ｂ）のプローブとしては、上記（ａ）のプローブの正常塩基領域に相補な塩基配列中または当該塩基配列の隣に、野生型DNA及び変異型DNAとハイブリダイズしない塩基配列を挿入したプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体は、上記の挿入した野生型DNA及び変異型DNAとハイブリダイズしない塩基配列がプローブ上にループ構造を形成し、変異型ハイブリッド体は正常塩基領域と相補な塩基配列と上記の挿入した野生型DNA及び変異型DNAとハイブリダイズしない塩基配列とでプローブ上にループ構造を形成する。即ち、野生型ハイブリッド体のループ構造と変異型ハイブリッド体のそれとはその構造が異なるものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、図中のNNNは正常塩基領域を、点線は正常塩基領域の相補鎖を、二重線はプローブ上に任意に挿入された塩基鎖を、それぞれ表す。
2013141332.tif 000010
【００３９】
このようなプローブとしては、具体的には、野生型DNAの正常塩基領域中、或いは該正常塩基領域の３’末端の隣の位置又は５’末端の隣の位置の何れかの任意の位置に通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基の塩基配列が挿入された正常塩基領域とその両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基を連結させた塩基配列の相補鎖等が挙げられる。尚、上記挿入される塩基配列が1〜2塩基の場合、野生型ハイブリッド体はループ構造を形成し得ないが、この場合も（ｂ）のプローブに含む。また、上記挿入される塩基配列は、その総塩基数が上記範囲内であれば、上記位置の複数の位置に分けて挿入されていてもよい。
【００４０】
(II-2)ゲノムDNA側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、（ａ）ループ構造を有さない変異型ハイブリッド体を形成し、ループ構造を有する野生型ハイブリッド体を形成するようなプローブ、又は（ｂ）ゲノム上にループ構造を有する変異型ハイブリッド体とゲノム上にループ構造を有する野生型ハイブリッド体を形成し、両者のループ構造が異なる構造となるようなプローブを使用すればよい。
【００４１】
上記（ａ）のプローブとしては、変異型DNAの塩基配列全部又は一部と相補な塩基配列（塩基配列の全部又は一部と100%相補な塩基配列）からなるプローブを使用すればよい。言い換えれば、野生型DNAにおける、変異により欠損する正常塩基領域以外の塩基配列と全部または正常塩基領域の両隣の塩基配列を含む一部の塩基配列と相補な塩基配列からなるプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体は、そのゲノムDNA上で正常塩基領域がループ構造を形成し、変異型ハイブリッド体は、ループ構造を形成しないものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、図中Nは正常塩基領域を表す。
2013141332.tif 000011
【００４２】
このようなプローブとしては、具体的には、変異型DNAの欠損塩基領域の両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基を連結させた塩基配列の相補鎖等が挙げられる。言い換えれば、変異型DNAと相補な配列であって、欠損塩基領域に該当する箇所から両方向に各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列と相補な塩基配列が挙げられる。
【００４３】
上記（ｂ）のプローブとしては、上記（ａ）のプローブから、正常塩基領域の隣の塩基の相補塩基を基点として、変異型ハイブリッド体でループを構成するための塩基配列を除いたプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体はゲノムDNA上に上記で除いた塩基配列と正常塩基領域とでループ構造を形成し、変異型ハイブリッド体は、上記で除いた塩基配列がループ構造を形成する。即ち、野生型ハイブリッド体のループ構造と変異型ハイブリッド体のそれとはその構造が異なるものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、図中の点線は欠損塩基領域に対応する正常塩基領域を表し、二重線は、プローブ設定時にゲノムDNAの相補配列から任意に除かれた塩基鎖を表す。
2013141332.tif 000012
【００４４】
このようなプローブとしては、具体的には、野生型DNAの正常塩基領域の３’側に通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基隣の塩基から通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列と５’側に通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基隣の塩基から通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列とを連結させた塩基配列の相補鎖が挙げられる。但し、正常塩基領域の３’側に1塩基隣の塩基からの塩基配列と５’側に1塩基隣の塩基からの塩基配列とを連結させた塩基配列の相補鎖は除く（上記（ａ）のプローブであるため）。また、正常塩基領域の３’側に1〜300塩基の隣の塩基と５’側に1〜300塩基隣の塩基において、これら隣の塩基の数の和が、4以下の場合、変異型ハブリッド体は、ループ構造を形成することができないが、この場合も、上記（ｂ）のプローブに含む。また、上記隣の塩基の数の和は、通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基である。
【００４５】
(III)変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAの場合
(III-1)プローブ側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、（ａ）ループ構造を有する野生型ハイブリッド体を形成し、ループ構造を有さない変異型ハイブリッド体を形成するようなプローブ、又は（ｂ）プローブ上にループ構造を有する野生型ハイブリッド体とプローブ上にループ構造を有する変異型ハイブリッド体を形成し、両者のループ構造が異なる構造となるようなプローブを使用すればよい。
【００４６】
上記（ａ）のプローブとしては、変異型DNAの塩基配列全部と相補な塩基配列または変異型DNAの挿入塩基領域を含む一部の塩基配列と相補な塩基配列（塩基配列の全部又は一部と100%相補な塩基配列）からなるプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体は、そのゲノムDNA上で挿入塩基領域に相補な配列がループ構造を形成し、変異型ハイブリッド体は、ループ構造を形成しないものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、図中のMMMは挿入塩基領域を、点線は挿入塩基領域に相補な塩基配列をそれぞれ表す。
2013141332.tif 000013
【００４７】
このようなプローブとしては、具体的には、変異型DNAの挿入塩基とその両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基を連結させた塩基配列の相補鎖等が挙げられる。言い換えれば、変異型DNAと相補な配列であって、変異型DNAの挿入塩基とその両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列とからなる配列と相補な塩基配列が挙げられる。
【００４８】
上記（ｂ）のプローブとしては、上記（ａ）のプローブの挿入塩基領域に相補な塩基配列中または当該塩基配列の隣に、野生型DNA及び変異型DNAとハイブリダイズしない塩基配列を挿入したプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体はプローブ上に挿入塩基領域と相補な塩基配列と挿入した塩基配列とでループ構造を形成し、変異型ハイブリッド体は、プローブ上に挿入した塩基配列でループ構造を形成する。即ち、野生型ハイブリッド体のループ構造と変異型ハイブリッド体のそれとはその構造が異なるものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、図中のMMMは挿入塩基領域を、点線は挿入塩基領域に相補な塩基配列を、二重線はプローブ上に任意に挿入された塩基鎖を、それぞれ表す。
2013141332.tif 000014
【００４９】
このようなプローブとしては、具体的には、変異型DNAの挿入塩基領域中、或いは挿入塩基領域の３’末端の隣の位置又は５’末端の隣の位置の何れかの任意の位置に通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基のループ構造を形成するための塩基配列が挿入された挿入塩基とその両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基を連結させた塩基配列の相補鎖等が挙げられる。尚、上記の挿入される塩基配列が1〜2塩基の場合、変異型ハイブリッド体は、ループ構造を形成し得ないが、この場合も上記（ｂ）のプローブに含む。また、上記挿入される塩基配列は、その総塩基数が上記範囲内であれば、上記位置の複数の位置に分けて挿入されていてもよい。
【００５０】
(III-2)ゲノムDNA側にループ構造を有するハイブリッド体を形成させる場合
本ケースにおける本発明に係るプローブとしては、（ａ）ループ構造を有さない野生型ハイブリッド体を形成し、ループ構造を有する変異型ハイブリッド体を形成するようなプローブ、又は（ｂ）ゲノム上にループ構造を有する野生型ハイブリッド体とゲノム上にループ構造を有する変異型ハイブリッド体を形成し、両者のループ構造が異なる構造となるようなプローブを使用すればよい。
【００５１】
上記（ａ）のプローブとしては、野生型DNAの塩基配列全部または一部と相補な塩基配列（塩基配列の全部又は一部と100%一致する塩基配列）からなるプローブを使用すればよい。言い換えれば、変異型DNAにおける、変異により挿入される挿入塩基領域以外の塩基配列全部又は一部と相補な塩基配列（塩基配列の全部又は一部と100%相補な塩基配列を意味する）からなるプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体は、ループ構造を形成しないものとなり、変異型ハイブリッド体は、そのゲノムDNA上で挿入塩基領域がループ構造を形成する。以下に、その模式図を記載する。尚、図中Mは挿入塩基領域を表す。
2013141332.tif 000015
【００５２】
このようなプローブとしては、具体的には、変異型DNAの挿入塩基領域の両隣の各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基を連結させた塩基配列の相補鎖等が挙げられる。言い換えれば、野生型DNAと相補な配列であって、挿入塩基領域に該当する箇所から両方向に各5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列と相補な塩基配列が挙げられる。
【００５３】
上記（ｂ）のプローブとしては、上記（ａ）のプローブから、挿入塩基領域の隣の塩基の相補塩基を基点として、野生型ハイブリッド体でループを構成するための塩基配列を除いたプローブを使用すればよい。このようなプローブを用いた場合、野生型ハイブリッド体は、上記で除いた塩基配列がゲノムDNA上でループ構造を形成し、変異型ハイブリッド体はゲノムDNA上に上記で除いた塩基配列と挿入塩基領域とでループ構造を形成する。即ち、野生型ハイブリッド体のループ構造と変異型ハイブリッド体のそれとはその構造が異なるものとなる。以下に、その模式図を記載する。尚、点線は挿入塩基領域を表し、二重線は、プローブ設定時にゲノムDNAの相補配列から任意に除かれた塩基鎖を表す。
2013141332.tif 000016
【００５４】
このようなプローブとしては、具体的には、変異型DNAの挿入塩基領域の３’側に通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基隣の塩基から通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列と５’側に通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基隣の塩基から通常5〜1000塩基、好ましくは5〜150塩基の塩基配列とを連結させた塩基配列の相補鎖が挙げられる。但し、挿入塩基領域の３’側に1塩基隣の塩基からの塩基配列と５’側に1塩基隣の塩基からの塩基配列とを連結させた塩基配列の相補鎖は除く（上記（ａ）のプローブであるため）。また、挿入塩基領域の３’側に1〜300塩基の隣の塩基と５’側に1〜300塩基隣の塩基において、これら隣の塩基の数の和が4以下の場合、野生型ハブリッド体は、ループ構造を形成することができないが、この場合も、上記（ｂ）のプローブに含む。また、上記隣の塩基の数の和は、通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基である。
【００５５】
(IV)ループ構造を有する塩基鎖の反対側の鎖中に更にループ構造を形成する場合
上記(I)〜(III)で記載した本発明に係るハイブリッド体においては、ループ構造を有する塩基鎖の反対側の塩基鎖に、即ち、ゲノムDNA側にループ構造がある場合にはプローブ側にも、プローブ側にループ構造がある場合にはゲノムDNA側にも、更にループ構造を形成させることにより、変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の分離精度を上げることができる。
【００５６】
その場合のプローブとしては、ゲノムDNA側にループ構造を有する場合（プローブ側に更にループ構造を形成させる場合）には、プローブにループを形成させるための配列（通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基）をプローブに挿入すればよく、プローブ側にループ構造を有する場合（ゲノムDNA側に更にループ構造を形成させる場合）には、ゲノムDNA中にループ構造を形成させるためのゲノムDNA中の塩基配列に対応する相補鎖（通常1〜300塩基、好ましくは5〜100塩基）をプローブから取り除けばよい。
【００５７】
［本発明に係るインターカレーター］
本発明の検出方法においてハイブリッド体と結合体を形成するインターカレーターとしては、具体的には、例えば下記（１）〜（５）のインターカレーター並びに下記（６）及び（７）のインターカレーター類似物質が挙げられる。即ち、（１）アクリジンオレンジ等のアクリジン色素、（２）例えば臭化エチジウム，エチジウムホモダイマー１（EthD-1），エチジウムホモダイマー２（EthD-2），臭化エチジウムモノアジド（EMA），ジヒドロエチジウム等のエチジウム化合物、（３）例えばヨウ素化プロピジウム，ヨウ素化ヘキシジウム等のヨウ素化合物、例えば７−アミノアクチノマイシンＤ（7-AAD）、例えばPOPO-1, BOBO-1, YOYO-1, TOTO-1, JOJO-1, POPO-3, LOLO-1, BOBO-3, YOYO-3, TOTO-3等のシアニンダイマー系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）、（４）例えばPO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, PO-PRO-3, LO-PRO-1, BO-PRO-3, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5等のシアニンモノマー系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）、（５）例えばSYBR Gold, SYBR Green I and SYBR Green II, SYTOX Green, SYTOX Blue, SYTOX Orange等のSYTOX系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）、例えばGelRed(和光純薬社商品名)等のGelRed系色素（６）DNA二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの〔例えば4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI：モレキュラープローブ社商品名）等〕、（７）アデニン−チミン（A-T）配列に特異的に結合するもの〔例えばペンタハイドレ−ト（ビス−ベンズイミド）（Hoechst 33258：モレキュラープローブ社商品名），トリヒドロクロライド（Hoechst 33342：モレキュラープローブ社商品名），ビスベンズイミド色素（Hoechst 34580：モレキュラープローブ社商品名）等、例えば9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン（ACMA），ビス-（6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル）スペルミン（アクリジンホモダイマー）等のアクリジン色素、例えばヒドロキシスチルバミジン等〕等が挙げられる。
【００５８】
［本発明の変異型DNA又は／及び野生型DNAの検出方法］
本発明の変異型DNA又は／及び野生型DNAの検出方法は、
（１）本発明に係る変異型DNAの少なくとも１種又は／及び本発明に係る野生型DNAと、本発明に係るプローブとを接触させて、変異型ハイブリッド体又は／及び野生型ハイブリッド体を形成させる工程、
（２）得られた変異型ハイブリッド体又は／及び野生型ハイブリッド体を本発明に係るインターカレーターと接触させる工程、
（３）変異型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体又は／及び野生型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離することにより、変異型DNA又は／及び野生型DNAの有無を検出する工程からなる。
【００５９】
上記（１）における変異型ハイブリッド体又は／及び野生型ハイブリッド体の形成方法（以下、該反応をLH反応と略記することがある）としては、本発明に係るDNAと本発明に係るプローブを接触させ、DNA分子会合反応に付してハイブリッド体を形成すればよい。尚、本発明に係るDNAが二本鎖を形成している場合には、通常この分野でなされる加熱処理（90〜100℃）やアルカリ処理（水酸化ナトリウム等による処理）等により二本鎖DNAを一本鎖化して本発明に係るDNAとし、該DNAと本発明に係るプローブとを接触させてLH反応に付せばよい。また、該LH反応において得られたハイブリッド体が突出末端を有する場合には、該突出末端を平滑末端化処理するのが好ましい。これにより、ハイブリッド体の末端に一本鎖が存在しなくなるため、一本鎖があることによる分離への影響を低減することができる。該平滑末端処理としては、通常この分野でなされるポリメラーゼ活性を有する酵素を用いたDNA伸長反応やエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いた末端一本鎖DNAの分解反応などが挙げられる。なかでも、ハイブリッド体における二本鎖塩基部分が長い方が本発明に係るハイブリッド体は安定であるため、DNA伸長反応が好ましい。
【００６０】
上記DNA分子会合反応としては、本発明に係るDNAを含有する水又は緩衝液に、本発明に係るプローブを溶液中の濃度が20nM〜2μM、好ましくは100nM〜500nMとなるように添加し、通常30〜55℃で通常1〜600秒、好ましくは1〜30秒反応させることによりなされる。本発明に係るDNAを含有する水としては脱イオン化滅菌水が好ましく、緩衝液としては、この分野で用いられる自体公知の緩衝液であれば特に限定されないが、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲である。
【００６１】
上記末端平滑化反応としては、自体公知の平滑化反応に準じてなされればよく、例えばハイブリッド体 1ng〜1μgを20〜40μLの水又は緩衝液に添加し、更に、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素1〜5Uを、要すれば４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）それぞれを通常0.01〜50nmol、好ましくは、0.1〜20nmolと共に添加して、通常30〜70℃、好ましく35〜60℃で通常10〜120分、好ましくは30〜60分反応させることによりなされればよい。該反応における水又は緩衝液は、上記分子会合反応の項で記載したものと同じものが挙げられる。上記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、例えばT4 DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、pfu DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００６２】
上記DNA伸長反応としては、分子会合反応により得られたハイブリッド体 1ng〜1μgを20〜40μLの水又は緩衝液に添加し、更に、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）それぞれを通常0.01〜50nmol、好ましくは、0.1〜20nmol、及びポリメラーゼ活性を有する酵素 1〜5Uを添加して、通常30〜80℃、好ましくは65〜75℃で、通常10秒〜10分、好ましくは1〜4分で反応させることによりなされる。該反応における水又は緩衝液は、上記分子会合反応の項で記載したものと同じものが挙げられる。また、ポリメラーゼ活性を有する酵素としては、例えばT4 DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、pfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Klenow fragment等が挙げられるが、Taq DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼが好ましい。
【００６３】
上記（１）の反応における本発明に係るDNAは、公知のPCR反応に従って増幅させたものを用いてもよい。その場合、PCR反応産物は、二本鎖DNAであるので、上記の二本鎖DNAを一本鎖化する処理をした後、LH反応に付せばよい。また、PCR反応産物を含むPCR反応液を用いて、LH反応に付し、そのままDNA伸長反応に付す場合、dNTPsやポリメラーゼ活性を有する酵素を添加することなく反応を進めることができるので、該方法を用いるのが好ましい。
【００６４】
本発明に係るLH反応は、分子会合反応の前に加熱による二本鎖DNAの一本鎖化処理を加えてサイクル反応とするのが好ましい。具体的には、例えば本発明に係るDNAを含有する水又は緩衝液に、本発明に係るプローブを溶液中の濃度が20nM〜2μM、好ましくは100nM〜500nMとなるように添加し、その後、例えば、90〜100℃で2〜4分（熱変性）、30〜55℃で1〜30秒（DNA分子会合反応）を１サイクルとする反応を１〜４サイクルさせることにより、ハイブリッド体を形成すればよい。また、更に伸長反応を加えてサイクル反応としてもよく、その場合には、90〜100℃で2〜4分（熱変性）、30〜55℃で1〜30秒（DNA分子会合反応）、65〜75℃で1〜4分（DNA伸長反応）を１サイクルとする反応を１〜４サイクルさせることにより、ハイブリッド体を形成させればよい。尚、伸長反応を行う場合、DNA分子会合反応は、DNA伸長反応時の条件であっても反応が進行するため、LH反応を、90〜100℃で2〜4分（熱変性）、65〜75℃1〜4分（DNA分子会合、DNA伸長反応）を１サイクルとする反応を１〜４サイクルさせることにより行ってもよい。
【００６５】
熱変性、DNA分子会合反応、DNA伸長反応のサイクル反応としては、具体的には、以下の如くなされる。即ち、先ず、例えば対象とするDNA 100ngを溶解した例えば10〜50mMトリス緩衝液(pH8.4〜9.0)等の緩衝溶液20〜40μLに、本発明に係るプローブを溶液中の濃度が20nM〜2μM、好ましくは100nM〜500nMとなるように、より好ましくは100〜200nMとなるように添加する。その後、例えば、90〜100℃で2〜4分（熱変性）、30〜55℃で1〜30秒（DNA分子会合反応）、65〜75℃1〜4分（DNA伸長反応）を１サイクルとする反応を１〜４サイクルさせることによりハイブリッド体は形成される。
【００６６】
前述のように、PCR反応によって本発明に係るDNAを増幅させ、続いてLH反応に付す場合は、具体的には以下の如くなされる。即ち、例えば、鋳型となるDNA1〜100pgを20〜40μLのトリス塩酸緩衝液等の緩衝液に溶解し、目的の領域を増幅させるための２種のプライマー（Forward, Reverse）それぞれを通常1〜100pmol、好ましくは1〜50pmol、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）それぞれを通常0.01〜50nmol、好ましくは、0.1〜20nmolとなるように添加し、Taq DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼを1〜5U共存させて、例えば(1)93〜98℃、10秒〜10分→(2)50〜60℃、10秒〜3分→65〜75℃、1〜5分間を１サイクルとする反応を30〜40サイクル繰り返すことによりなされる。その後、得られた反応溶液に、本発明に係るプローブを鋳型となるDNAの0.1〜10倍量、例えば通常0.1〜500pmol、好ましくは0.1〜50pmol添加し、上記と同様に、LH反応を行うことによりなされる。
【００６７】
また、上記の如くPCR反応により一本鎖DNAを増幅させる場合、該PCR反応と同時にLH反応を行うこともできる。その場合、本発明に係るプローブとしては、３'末端及び５'末端をリン酸基等で修飾したものを用い、該プローブの存在下、上記PCR反応を行えばよい。具体的には、例えば、鋳型となるDNA1〜100pgを20〜40μLの10〜50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4〜9.0)等の緩衝液に溶解し、２種のプライマー（Forward, Reverse）それぞれを通常1〜100pmol、好ましくは1〜50pmol、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）それぞれを通常0.01〜50nmol、好ましくは0.1〜20nmol、３'末端及び５'末端が修飾された本発明に係るプローブを通常0.1〜500pmol、好ましくは0.1〜50pmol添加し、耐熱性DNAポリメラーゼを例えば1〜5U共存させて、例えば(1)93〜98℃、10秒〜10分→(2)50〜60℃、10秒〜3分→(3)65〜75℃、1〜5分間を１サイクルとする反応を30〜40サイクル繰り返すことによりなされる。
【００６８】
上記（２）のハイブリッド体を本発明に係るインターカレーターと接触させる工程としては、ハイブリッド体1ng〜1μgを含有する水又は緩衝液に対して10nmol/L〜10μmol/L、好ましくは10nmol/L〜1μmol/Lとなるようにインターカレーターを添加することによりなされる。尚、該接触工程は、（３）の変異型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体又は／及び野生型ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離する工程（分離工程）と同時に行ってもよく、その場合、インターカレーターは、試料中に添加して分離しても、分離溶液中に添加してもかまわない。この際のインターカレーターの濃度は、試料中の濃度が上記濃度となるように添加すればよい。
【００６９】
上記（３）の分離工程としては、通常この分野で用いられているDNAを分離する方法、特に二本鎖DNAを分離し得る方法であれば特に限定はされないが、分子量、分子構造又は／及び電荷の違い等に基づいて分離する方法が好ましい。該分子量、分子構造又は／及び電荷の違い等に基づいて分離する方法としては、具体的には例えば、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）、電気泳動法、フィルターを用いた分離方法等が挙げられる。中でも、電気泳動法がより好ましい。
【００７０】
ＨＰＬＣ法を用いる場合、例えば、Anal.Chem. 65, 5,613-616(1993)、WO03/014398、WO03/031580、US5585236、US5772889、US5972222等に記載の方法（Ion-pair reverse-phase high pressure liquid chromatography、Matched ion polynucleotide chromatography等）に準じて行えばよい。また、フィルターを用いた分離方法を用いる場合、例えばPanasonic Technical Journal Vol.57 No.3 Oct.2011や、特開2009-125009に記載の方法等に準じて行えばよい。
【００７１】
電気泳動法としては、例えば等電点電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミド電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、誘電泳動法等の電気泳動法が挙げられる。中でも、冷却効率がよく、高電圧をかけることができ、効率よく分離できる等の理由から、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法が好ましく、微量サンプル分析に適しているキャピラリーチップ電気泳動法が特に好ましい。尚、これら分離方法の条件は、自体公知の方法に準じて行えばよく、例えばキャピラリーチップ電気泳動はWO2007/027495等に記載の方法に準じて行えばよい。
【００７２】
上記（３）における分離により変異型DNA又は野生型DNAを検出する方法としては、通常この分野でなされている方法に準じてなされればよく、具体的には例えば、本発明に係る変異型DNAと同じ塩基配列のDNA又は本発明に係る野生型DNAと同じ塩基配列のDNAを用いて、本発明の検出方法によりハイブリッド体とインターカレーターの結合体を分離し、その分離状況（度合い）から変異型DNA又は野生型DNAを検出する方法等が挙げられる。例えば、分離方法が電気泳動法の場合にあっては、その泳動度、泳動距離又は泳動時間等から、変異型DNA又は野生型DNAを検出すればよい。
【００７３】
上記（３）における検出方法は、自体公知の方法であれば何れでも用いることができるが、示差屈折検出器、蛍光検出器、UV検出器等の機器により検出されればよく、中でも、UV検出器、蛍光検出器による検出が好ましく、蛍光検出器による検出がより好ましい。
【００７４】
上記検出を行う場合、ハイブリッド体とインターカレーターの結合体を検出するため、通常はインターカレーターの蛍光を検出すればよいが、予め蛍光標識したプローブを用いて、上記（１）及び（２）の工程後、（３）の分離を行った結合体中のプローブの蛍光標識を検出することにより検出を行ってもよい。また、予め蛍光標識したプローブを用いる場合も、上述のように、上記（１）の工程の後、（２）の工程及び（３）の分離を同時に行い、その後蛍光標識を検出してもよい。
【００７５】
ここで用いられるプローブの蛍光標識としては、例えばシアニン色素が挙げられる。ここでいうシアニン色素とは、２個の複素環をメチン基又はポリメチン基で結合し、且つ該複素環の少なくとも１個が含窒素複素環である化合物であり、前記２個の複素環の両者が含窒素複素環であるものが好ましい。上記シアニン色素由来の置換基としては、例えばUS4,981,977、US 5,268,486、US5,486,616等に記載のCy系色素由来のもの、US6,083,485等に記載のDy系色素由来のもの、WO2006/047452等に記載のHiLyte系色素由来のもの、Alexa系色素由来のもの等が好ましい。また、市販のものに由来するものを用いてもよく、例えばCy系色素由来のものを用いる場合としては、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等由来のもの〔何れもアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）商品名〕が、Dy系色素由来のものとしては、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-734、DY-750、DY-751、DY-752、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782等由来のものが、HiLyte系色素由来のものとしては、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等由来のもの〔何れもアナスペック社（AnaSpec製）商品名〕が、Alexa系色素由来のものとしては、Alexa Fluor Dye 532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等由来のもの〔何れもモレキュラープローブス社（Molecular Probes）商品名〕が好ましいものとして挙げられる。中でもCy系色素由来のものが好ましく、その中でもCy5由来のものが好ましい。尚、プローブの蛍光標識は公知の方法に準じて行えばよい。
【００７６】
本発明の検出方法により、がん患者由来のヒトゲノムDNAについての変異型DNAを検出する場合、具体的には例えば以下のようになされる。
【００７７】
即ち、市販のキット等により抽出・精製したヒトゲノムDNAを試料として、PCR反応を行う。PCR反応用試料は、例えば、検出対象とするDNAのプライマー（ForwardとReverse）それぞれを通常100〜1000nM、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）がそれぞれ通常0.1〜500nM、Taq DNAポリメラーゼが1〜5unitとなるように、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液20μL中に溶解した後、ヒトゲノムDNA 1ng〜100ngを添加して調製する。PCR反応は、例えば(1) 93〜98℃、10〜30秒、(2)50〜60℃、10〜30秒、(3)68〜72℃、1〜3分間のサイクルを35〜40サイクル行い、それにより、対象の一本鎖DNAを増幅する。得られた、対象の一本鎖DNAを含有するPCR反応溶液に、PCRのプライマーの0.1〜10倍量のプローブを添加し、更にハイブリッド反応を行えばよい。即ち、例えばPCR反応溶液に、最終濃度が100〜500nMとなるように本発明に係るプローブを添加し、それを、90〜100℃で2〜4分、30〜55℃で1〜30秒、65〜75℃1〜4分で１〜４サイクルさせることにより、検出目的のDNAのハイブリッド体が得られる。得られた溶液を、インターカレーターを10nmol〜1μmol/L含有する泳動溶液中で電気泳動に付し、例えば蛍光検出器等により検出し、その泳動度に基づいて変異型DNAの有無を検出することができる。
【００７８】
以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
合成例１  EGFR遺伝子エキソン19上における変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルクローンの調製
（１）臨床検体からの標的配列のクローニング
EGFR遺伝子エクソン19上ではコドン747-749から始まる領域においてインフレーム型欠失による遺伝子変異が生じることが知られている（K. Endo, A. Konishi, H. Sasaki et al., Lung Cancer 50 (3), 375 (2005)）。そこで、実際の肺がん患者由来のサンプルから、当該領域を含んでなるDNA配列をPCRにより増幅し、更に、その増幅産物をpGEM-T Vectorシステム（プロメガ社）を用いてプラスミドにクローニングし、これら５種類の変異型DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンを得た。この手順の詳細を以下に示す。【００８０】
即ち、臨床検体として得られたヒト肺腺がん組織切片を複数準備し、Pinpoint Slide DNA Isolation System（Zymo Research社製）を用いて、キットに添付の製品プロトコールに従い、切り出された組織切片（2mm x 4 mm）をproteinaseKで70℃ 5時間処理した。その後、95℃にて10分間の熱処理を加え、各組織断片よりゲノムDNAを抽出した。ここで得られたDNA抽出液30μLのうち、1μLを鋳型材料として使用し、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム（PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製）を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー溶液（EGFR19J: ggactctggatcccagaaggtg [配列番号1] とEGFR19U: ctgaggttcagagccatggac [配列番号2]）1.0μL並びにキットに添付の、PCR反応バッファー2.0μL、アキュプライムTaq酵素0.5μL、及び脱イオン化滅菌水（ddH2O） 16.5μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。その後、各サンプルクローン 2pgをPCR用反応液20μLに懸濁添加し、PCR用試料とした。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクル のPCR反応を行った。【００８１】
＊PCR反応条件
熱変性       ： 95℃、15 秒
アニーリング ： 55℃、15 秒
重合反応     ： 68℃、47 秒
このPCR反応により得られた複数のPCR産物（野生型で 146 bp）それぞれを、pGEM-T Vector System(Promega社) を用いてTAクロ−ニング法によりプラスミド・ベクターpGEM-T easyに挿入した。即ち、PCR増幅産物3.0μLそれぞれに、pGEM-T Easy Vector(Promega社製) 1.0μL及びDNA Ligation Kit（プロメガ(株)製）のRapid Ligation Buffer 5.0μLとT4リガーゼ1.0μLを加え、全量10.0μLとして室温で60分間インキュベートを行い、組換えDNAを得た。
その後、E. coli JM109 Competent Cells（東洋紡社製）を用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えDNAを用いて42℃45秒でE. coli JM109 Competent Cellsの形質転換を行った。その後、100μg/mlのアンピシリン、0.2 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）、40μg/ml X-Galを含むLB-寒天培地に、得られた形質転換体を37℃で16時間プレート培養した。培養後、培地中の白色コロニーをピックアップし、目的のDNA断片を挿入した組み換えDNAが導入された、各クローンに対する形質転換体を得た。その後、QIAGEN社のプラスミド抽出キット（QIAprep Spin Miniprep）を用いて、DNAの抽出・精製までの工程を行った。【００８２】
即ち、5mlの100μg/mlのアンピシリン含有LB液体培地で一夜増殖させた各クローンに対する形質転換体を遠心により集菌し、アルカリ法で溶菌後、酢酸カリウム酸性液で中和し、それらの遠心後の上清液からキットに添付の精製カラムによりプラスミドDNAを精製した。【００８３】
（２）変異型DNAと野生型DNAの配列の確認
（１）でクローニングされた、複数種類の変異型DNAあるいは野生型DNAの配列を含む事が予想される候補クローンを用いて、Big Dye Terminatorキット（アプライドバイオシステムズ社製）により、製品プロトコールに従って以下の手順でシークエンス解析を行った。【００８４】
即ち、サンプルDNA（各クローン）2μL(100ng)、T7プロモータープライマー1μL(5pmol)、並びに、酵素、dNTPs、反応buffer及び蛍光色素を含むキット付属のpremix 8μLの混合物に、総量が20μLとなるようにddH2Oを加え、DNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research社製）を使用して、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。【００８５】
96℃ 2分 → （96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 3分）×25→4℃
得られたシークエンス反応産物をゲルろ過カラム（QIAGEN社製）で精製後、シークエンサー（3130 Genetic Analyzer、Applied Biosystems社製）を用いて機器付属の手順書に従い、候補配列すべてのシークエンス解読を完了した。【００８６】
その結果、EGFR遺伝子エクソン19上において、下記表１の５種類の変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルクローンが作製できたことを確認した。尚、変異型DNAそれぞれのサンプルクローンをG1〜G5、野生型DNAをNと表記した。下表において『-』で示された箇所は、野生型の配列に対して欠損の認められた配列領域である。【００８７】
【表１】
2013141332.tif 000017
（３）サンプルDNAの増幅
上記G1〜5およびNの各サンプルクローンを試料として、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム（PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製）を用いてPCR反応を行った。【００８８】
即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー溶液（EGFR19J: ggactctggatcccagaaggtg [配列番号1]とEGFR19U: ctgaggttcagagccatggac [配列番号2]）1.0μL、並びに、キットに添付の、PCR反応バッファー2.0μL、アキュプライムTaq酵素0.5μL、及びddH2O 16.5μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。その後、各サンプルクローン 2pgをPCR用反応液20μLに懸濁添加し、PCR用試料とした。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクル のPCR反応を行った。
＊PCR反応条件
熱変性       ： 95℃、15 秒
アニーリング ： 55℃、15 秒
重合反応     ： 68℃、47 秒
得られたPCR増幅産物の塩基サイズ及び塩基配列は以下の通りである。【００８９】
【表２】
2013141332.tif 000018
【００９０】
実施例１  インターカレーター共存下でのLH反応生成物の分離検出
（１）ループハイブリッド反応用プローブ（LHプローブ）の作製
野生型DNA（N）とハイブリッドした場合にはループを形成せず、欠失変異領域を有する変異型DNA（G1〜G5）とハイブリッドした場合には欠損塩基領域に対応するLHプローブ上の相補鎖がループを形成するように、LHプローブを設計した。即ち、下記プローブを、LH反応用のプローブとして用いた（EGFR19JWTF）。
ggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgat [配列番号15]）
上記プローブの合成は、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。また、以下の本発明の合成例及び実施例における、プライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチド合成や蛍光色素の標識等は、同様に、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。【００９１】
上記プローブを用いた場合、下記のようなハイブリッド体が形成されると考えられる。
2013141332.tif 000019
【００９２】
（２）LH反応
合成例１(3)で得られた６種のPCR反応溶液各4.5μLに、LHプローブ（ID.= EGFR19JWTF）を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research社製）を使用して、下記の反応条件にて１サイクル反応を行った。
＊LH反応
反応溶液      4.5 μl
LHプローブ   0.5μl（2μM）
105℃    hot lid
95℃       2 分
55℃      30 秒
68℃       4 分
4℃      反応停止【００９３】
（３）LH反応生成物のインターカレーター共存下における電気泳動分離検出（マイクロチップ電気泳動）
上記LH反応で得られた６種のLH反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット（アジレント社製）を使用し、各LH反応生成物1.0μLをアプライした。ここで、LH反応生成物の分離検出に際しては、キットに付属のインターカレーターDyeと泳動用ポリマーとを予め混合したものを使用するため、電気泳動の過程ではLH反応生成物とインターカレーターとが共存した状態で分離検出されることとなる。【００９４】
電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。その結果を図１に示す。【００９５】
この結果から明らかなように、本発明の検出方法によれば、G1〜G5の変異遺伝子全てを分離することが可能であることが示された。特に、G2〜G4の変異遺伝子はその塩基サイズが同一（131bp）であるにもかかわらず、明確に分離できることが判った。【００９６】
比較例１  インターカレーター非共存下でのLH反応生成物の分離検出
実施例１の比較として、LH反応生成物をCy5で蛍光標識したものについて電気泳動で分離検出を行った。
（１）Cy5標識LHプローブの作製
実施例１（１）で使用したLH反応用のプローブ配列；EGFR19JWTF [配列番号15]の５’末端をCy5で蛍光修飾したものを作製した。【００９７】
（２）Cy5標識LHプローブによる蛍光シグナルを指標としたLH反応生成物の検出
上記プローブを用いた以外は、実施例１（２）と同じ方法により、上記合成例１で調製した６種の各サンプルクローンを試料として、LH反応を行った。次いで、得られた６種のLH反応産物を用いて、EGFR遺伝子の欠失変異型DNA検出を行った。具体的には、泳動用ポリマー及び泳動用バッファーを下記のようにした以外は、上記（３）と同様に、LH反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。泳動用ポリマーについては、インターカレーターDyeは添加せず、マイクロチップ電気泳動の光学系における焦点調整に必要な、Cy5-dCTP（GEバイオ社）を終濃度4.9nMとなるように添加したものを用いた。泳動バッファーについては、泳動用ポリマーと同様に、Cy5-dCTP（GEバイオ社）を終濃度4.9nMとなるように添加し、また、電気泳動のピーク移動度算出の補正を目的として含まれている15bp（低分子量マーカー）および1500bp（高分子量マーカー）のDNAフラグメントの代わりに、Cy5標識した15bpおよび1500bpのDNAフラグメントにして泳動バッファー中に添加したものを用いた。即ち、上記電気泳動条件にて、LH反応生成物を、インターカレーター非共存下で分離検出した。
その結果を図２に示す。【００９８】
図２の結果から明らかなように、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の電気泳動分離検出では、G１〜G５のサンプルクローン由来のピークが重なるため、分離検出できないことが判った。即ち、図１の結果より、インターカレーターを共存させて電気泳動中にLH反応生成物とインターカレーターとの結合物を形成させることにより、非共存下では分離できなかったLH反応生成物を明確に分離することができることが判った。【００９９】
ここで、実施例１と比較例１で得られた結果について、電気泳動における各ピークの移動時間の差を表３にまとめ、両者での対比を行った。【０１００】
【表３】
2013141332.tif 000020
【０１０１】
表３の結果より、同じLH反応生成物であっても、インターカレーターを共存させることにより、電気泳動分離における識別能を格段に向上させることが判った。これは、各サンプルクローンに由来するG１〜G５の変異型DNAとLHプローブとで形成するハイブリッド体におけるループの二次構造の違いによって、インターカレーターとの作用（結合）の様式が大きく異なり、その結果、電気泳動における各ピーク移動度の差になったものと考えられた。【０１０２】
なお、いずれの結果においても野生型（N）DNAとのハイブリッド体形成時には該プローブ上でループ状の二次構造が形成されないため、変異型（G1〜G5）で検出されるピーク群との対比ではベースライン検出に留まることを確認した。【０１０３】
比較例２  インターカレーター共存下での二本鎖DNA断片の電気泳動分離検出
インターカレーターが二本鎖DNA全般に分離能向上効果に寄与しているのか、LH法によるハイブリッド体に対する分離能向上効果に寄与しているのかを確認するため、LH法によるハイブリッド体ではない二本鎖DNA（実施例１の表２中のG1、G2、G3、G4、G5）を用いて、インターカレーター存在下での分離検出を行った。【０１０４】
即ち、上記合成例１（３）で得られたG1〜G5の変異型DNAそれぞれを、Agilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット（アジレント社製）を使用し、各PCR増幅産物1.0μLをアプライした。ここで、LH反応生成物の検出に際しては、キットに付属のインターカレーターDyeと泳動用ポリマーとを予め混合したものを使用するため、電気泳動の過程ではPCR増幅産物とインターカレーターとが共存した状態で分離検出されることとなる。【０１０５】
電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。その結果を図３に示す。【０１０６】
図３から明らかな如く、二本鎖DNAの塩基サイズ(bp)がほぼ等しいG2〜G4のピーク移動度に差は見られず、インターカレーター存在下であっても、これらは分離できないことが判った。【０１０７】
上記実施例１の結果と合わせて考察すると、インターカレーターの分離能向上効果は、二本鎖DNAに対して効果を奏するわけではなく、LH法により得られたハイブリッド体、即ち、二本鎖領域と一本差領域の両方を含んでいるもの（LH反応生成物）にインターカレーターを結合させたものの分離に対して優れた効果を奏することが判った。この理由は明らかではないが、LH法は元々ループの構造（一本鎖部分）の違いにより分離することを目的としているため、更に、二本鎖DNA部分にインターカレーターが結合し構造変化が起きたことにより分離能が向上したものと推測された。【０１０８】
比較例３  インターカレーター非共存下でのLH反応生成物の分離検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
実施例１の比較として、電気泳動分離後のインターカレーター染色による検出を利用したLH反応産物の検出を、アクリルアミド重合ゲル電気泳動を用いて行った。
具体的には、実施例１（２）のLH反応で得られた６種のLH反応生成物［（EGFR遺伝子由来の変異型DNAのLH反応生成物（G1〜G5）および野生型DNAのLH反応生成物（N）］を用いて下記の如く電気泳動を行った。即ち、６サンプル各1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加し、非変性10% ポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100 bp ladder for size marker（promega社製）1.5μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミド・ゲルは７cm ｘ ７cm のコンパクトゲル（コンパクトゲルC10L、アトー社製）を用い、トリス・グリシン緩衝液（37.5ｍＭ Tris ， 288mM Glycine ） を泳動緩衝液として小型電気泳動装置（ アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE ）で室温で泳動した。【０１０９】
泳動後、サイバー・グリーンＩ （ タカラバイオ社、F0513） で10分間染色し、水洗後、レーザー・イメージング・スキャナー（アマシャム社、STORM 860）を用いて検出を行った。この際、サイバー・グリーンＩの蛍光検出には励起波長450nm 、検出フィルター520LP を使用した。得られた結果を図４に示す。尚、図中、レーン１は変異型DNA（G1）、レーン２は変異型DNA（G２）、レーン３は変異型DNA（G３）、レーン４は変異型DNA（G４）、レーン５は変異型DNA（G５）を用いた結果を、レーン６は野生型DNA（N）を用いた結果をそれぞれ表す。
図４の結果から明らかなように、LH反応産物であってもインターカレーターとの結合物とせずに泳動させ、電気泳動後にインターカレーターを添加しても、G１〜G５のサンプルクローン由来の泳動バンドの完全な分離検出に寄与しないことが判った。【０１１０】
比較例４  インターカレーター非共存下でのCy5標識LH反応生成物の分離検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
実施例１の比較として、Cy5蛍光標識プローブを利用したLH反応産物の検出を、アクリルアミド重合ゲル電気泳動を用いて行った。
具体的には、比較例２（２）のLH反応で得られた６種のLH反応生成物［（EGFR遺伝子由来の変異型DNAのLH反応生成物（G1〜G5）および野生型DNAのLH反応生成物（N）］を用いた以外は上記比較例３と同様に電気泳動を行った。泳動後、励起波長635nm 、検出フィルター650LPで蛍光検出を行った。得られた結果を図５に示す。尚、図中、レーン１は変異型DNA（G1）、レーン２は変異型DNA（G２）、レーン３は変異型DNA（G３）、レーン４は変異型DNA（G４）、レーン５は変異型DNA（G５）を用いた結果を、レーン６は野生型DNA（N）を用いた結果をそれぞれ表す。
図５の結果から明らかなように、LH反応産物であっても、インターカレーターとの結合物とせずに泳動させて検出した場合には、G１〜G５のサンプルクローン由来の泳動バンドを完全に分離検出することはできないことが判った。【０１１１】
実施例２  KRAS遺伝子の１塩基置換変異型DNA由来LH反応生成物についてのインターカレーター共存下の分離検出
（１）大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAの調製
大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAはキアゲン社QIAamp DNA Mini Kitを用い、凍結したがん組織25mgをホモゲナイズした後、キットに添付のバファーを添加した。更に、proteinaseKを加えて56℃で完全溶解し、RNaseAで処理した。次いで、キットに添付のバッファーにより除タンパクし、遠心分離してその上清をキットに添付のスピン・カラムで抽出・精製した。得られた生成物のうちの25ngをPCRの鋳型材料として、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム（PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製）を用いてPCR反応を行った。【０１１２】
即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー溶液（KRAS-Fw; aaggcctgctgaaaatgactg[配列番号16]とKRAS-Rv; ggtcctgcaccagtaatatgca[配列番号17]）をそれぞれ0.5 μL、並びにキットに添付の、PCR反応バッファー2.0 μL、アキュプライムTaq酵素0.5 μL、及びddH2O 16.5 μLを使用しPCR用反応液20.0 μLを調製した。その後、大腸がん患者由来ヒトゲノムDNA 25ngをPCR用反応液20μLに懸濁添加し、PCR用試料とした。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で36サイクル のPCR反応を行った。【０１１３】
＊PCR反応条件：
熱変性      ： 95℃、15 秒
アニーリング： 55℃、15 秒
重合反応    ： 68℃、47 秒
PCR反応後、ミリポア社のモンタージュPCRにより精製した増幅DNAをサンプルDNAとし、プライマーKRAS-Rv[ ggtcctgcaccagtaatatgca；配列番号17]をシークエンスプライマーとして用い、前述の合成例１の（２）と同様の方法にてシークエンス確認を行い、KRAS遺伝子のコドン12上に一塩基置換変異G12W(TGG)がある事を確認した。得られた増幅DNAの塩基配列は以下の通りである [配列番号18]。
aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagcttggggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggacc【０１１４】
（２）LHプローブの作製
野生型DNAならびに変異型DNAとのハイブリッド体形成時、該プローブ上でループ構造を形成するように設計し、下記LHプローブを合成した（IN1TA9GCT）。
aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatatatatatataggtgtaggcaagagtgccttgacgatacag [配列番号19]）
なお、該プローブを用いた場合、野生型DNAとのハイブリッド体は、atatatatatatatataでループ構造を形成し、変異型DNAとのハイブリッド体形成時には、ggtatatatatatatatataでループ構造を形成する。【０１１５】
（３）大腸がん患者由来ヒトゲノムDNA のLH反応
上記（１）で得られたPCR反応産物4.5μLに対してLHプローブ（ID.= IN1TA9GCT [配列番号19]） を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research社製）を使用して、下記の反応条件にて１サイクル反応を行った。
＊LH反応
PCR反応産物    4.5 μl
LHプローブ      0.5μl（2μM）
105℃      hot lid
95℃       2 分
55℃       0-30 秒
68℃       4 分
4℃       反応停止【０１１６】
（４）LH反応生成物のインターカレーター共存下における電気泳動分離検出（マイクロチップ電気泳動）
上記（３）で得られた反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット（アジレント社製）を使用し、各反応生成物1.0μLをアプライした。ここで、LH反応生成物の検出に際しては、キットに付属のインターカレーターDyeと泳動用ポリマーとを予め混合したものを使用したため、電気泳動の過程ではLH反応生成物とインターカレーターとが共存した状態で分離検出されることとなる。【０１１７】
電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。【０１１８】
その結果を図６−ａ及び図６―ｂに示す。尚、図６−ｂは、図６−ａの○で囲った部分を拡大した図である【０１１９】
比較例５  KRAS遺伝子の１塩基置換変異型DNA由来LH反応生成物についてのインターカレーター非共存下の分離検出
実施例２の比較として、LH反応生成物をCy5で蛍光標識したものについて電気泳動で分離検出を行った。
（１）Cy5標識LHプローブの作製
実施例２（２）で使用したLH反応用のプローブ配列；IN1TA9GCT [配列番号19]  の５’末端をCy5で蛍光修飾したものを作製した。【０１２０】
（２）Cy5標識LHプローブによる蛍光シグナルを指標としたLH反応生成物の検出
上記プローブを用いた以外は、実施例２（３）と同じ方法により、合成例２で調製した大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAを試料として、LH反応を行った。得られたLH反応産物を用いて、KARS遺伝子の１塩基置換変異型DNA検出を行った。具体的には、泳動用ポリマー及び泳動用バッファーを下記のようにした以外は、上記（３）と同様に、LH反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。泳動用ポリマーについては、インターカレーターDyeは添加せず、マイクロチップ電気泳動の光学系における焦点調整に必要な、Cy5-dCTP（GEバイオ社）を終濃度4.9nMとなるように添加したものを用いた。泳動バッファーについては、泳動用ポリマーと同様に、Cy5-dCTP（GEバイオ社）を終濃度4.9nMとなるように添加し、また、電気泳動のピーク移動度算出の補正を目的として含まれている15bp（低分子量マーカー）および1500bp（高分子量マーカー）のDNAフラグメントの代わりに、Cy5標識した15bpおよび1500bpのDNAフラグメントにして泳動バッファー中に添加したものを用いた。従って、該電気泳動においては、LH反応生成物とその２本鎖DNA中に結合するインターカレーターが共存する事なく、分離検出されることとなる。【０１２１】
その結果を図７−ａ及び図７―ｂに示す。尚、図７−ｂは、図７−ａの○で囲った部分を拡大した図である
図６及び７の結果から明らかなように、KRAS遺伝子を用いた場合であってもEGFRの結果と同様、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の電気泳動分離（図７）では分離できなかったKRAS遺伝子上の１塩基置換変異G12Vと野生型DNAとが、インターカレーター共存下で電気泳動分離を行うと（図６）では、明確に分離され、識別検出できることが判った。【０１２２】
即ち、LH反応生成物である二本鎖DNAおよび一本鎖DNAから形成されるハイブリッド体の電気泳動分離において、インターカレーターを存在させてLH反応生成物とインターカレーターとの結合物を形成させてこれを分離することにより、その分離識別能が格段に向上することが判った。【０１２３】
実施例３  IDH1遺伝子配列中の1塩基置換変異R132H およびR132C の識別検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
（１）変異導入PCR用のプライマーの調製
R132H (CGT>CAT)およびR132C (CGT>TGT)を標的DNA中に人為的に組み込むため、２種の変異導入PCR用のプライマーを調製した。これらの配列を下記表に示す。【０１２４】
【表４】
2013141332.tif 000021
【０１２５】
（２）ヒト血液由来ヒトゲノムDNAの調製及び変異導入PCR
QIAamp DNA Blood Midi Kit（キアゲン社）を用いてキット添付のプロトコールに従い、ヒト全血2mlをproteinaseKで70℃で10分処理した後エタノールを添加した。更に、得られた溶液を遠心分離し、その上清をQIAmp Midi カラムに付し、ヒトゲノムDNAを抽出した。ここで得られたDNA抽出液30μL(50ng/uL)のうち1μL(50ng)を2種準備し、そのDNAを鋳型としてアキュプライムTaqポリメラーゼ・システム（PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製）を用いて変異導入PCR反応を行い、２種のDNAを得た。尚、該２種の変異導入PCR反応において、１種は、フォワード・プライマーとしてIDH1F（caaatggcaccatacgaaatattc [配列番号22]）、リバース・プライマーとして上記表４中のIDH1m3Rを使用し、他方では、フォワード・プライマーとしてIDH1F、リバース・プライマーとして上記表４中のIDH1m4Rを使用した。
具体的には、キット添付の製品プロトコールに従い、各10μMのリバースおよびフォワード・プライマー1.0μLおよびキットに添付のPCR反応バッファー2.0μL、アキュプライムTaq酵素0.5μL、ddH2O 16.5μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。このPCR用試料を用い、DNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research社）を使用して、下記の反応条件で36サイクルのPCR反応を行った。
＊PCR反応条件
熱変性      ： 95℃、15 秒
アニーリング： 55℃、15 秒
重合反応    ： 68℃、47 秒【０１２６】
（３）サンプルDNAの増幅
次いで、上記の変異導入PCR反応によって得られた２種のDNAそれぞれを1000倍希釈した後、その1μLをPCR増幅の鋳型として、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム（PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製）を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー（フォワード側のIDH1F: caaatggcaccatacgaaatattc [配列番号22]とリバース側のIDH1S: ttgccaacatgacttacttgatcc [配列番号23]）1.0μLおよびキットに添付のPCR反応バッファー2.0μL、アキュプライムTaq酵素0.5μL、ddH2O 16.5μLを使用し、PCR用反応液20.0μLを調製した。このPCR用反応液を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクルのPCR反応を行った。
＊PCR反応条件
熱変性      ： 95℃、15 秒
アニーリング： 55℃、15 秒
重合反応： 68℃、47 秒
一方、野生型の配列由来のサンプルDNAを調製するにあたっては、上記（２）で調製したヒト血液に由来するDNA抽出液1μL(50ng)を直接の鋳型として、上記方法と同様にしてPCR反応を行った。【０１２７】
（４）LHプローブの作製
野生型DNAならびに変異型DNAのハイブリッド体形成時、標的となるゲノムDNA上でループ構造を形成するようにプローブを設計し、LHプローブを合成した（IDH1D7S）。
ttgccaacatgacttacttgatccccataagcatgacgtgataggttttacccatccac [配列番号24]
尚、下記LH反応においては、該LHプローブの５’末端をCy5（アマシャムバイオサイエンス社）で蛍光修飾したものを使用した。
該プローブを用いた場合、野生型DNAとのハイブリッド体は、tcataggtでループ構造を形成する。一方、変異型(R132H)DNAとのハイブリッド体形成時には、tcataggtcgでループ構造を形成し、変異型(R132C)DNAとのハイブリッド体形成時には、tcataggtcでループ構造を形成する。【０１２８】
（５）LH反応
上記（３）で得られた３種のPCR反応産物4.5μLそれぞれに対してLHプローブ（ID.= IDH1D7S） を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research社製）を使用して、下記の反応条件にて１サイクル反応を行った。
＊LH反応
PCR反応産物    4.5 μl
LHプローブ      0.5μl（2μM）
105℃      hot lid
95℃       2 分
55℃       0-30 秒
68℃       4 分
4℃       反応停止【０１２９】
（６）LH反応によるハイブリッド体の分離検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
上記（５）でLHプローブを用いて得たLH反応生成物（ハイブリッド産物）３種の各1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加する事で電気泳動用の試料とした。ここで、LH反応生成物とインターカレーターとが共存した状態で分離検出された場合の影響を確認するため、インターカレーターの添加濃度による影響の検討を行った。インターカレーターにはGelRed（和光純薬工業（株））及びCellstain PI Solution（よう化プロピジウム1mg/ml水溶液、同仁化学（株））をそれぞれ用い、インターカレーター濃度を原液濃度に対して終濃度がそれぞれ1/100倍、1/1000倍、1/10000倍となるようにしてそれぞれ実験を行った。
電気泳動用のポリアクリルアミド・ゲルには非変性10%で７cm ｘ ７cm のコンパクトゲル（コンパクトゲルC10L、アトー社製）を用い、トリス・グリシン緩衝液（37.5ｍＭ Tris ， 288mM Glycine ） を泳動緩衝液として小型電気泳動装置（ アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE ）で室温で泳動した。泳動後、レーザー・イメージング・スキャナー（アマシャム社、STORM 860）を用いてCy5の蛍光検出（励起波長635nm 、検出フィルター650LP）を行った。【０１３０】
図８には、インターカレーターとしてGelRedを用いて得られた結果を示す。尚、レーン４〜６はインターカレーターの終濃度が1/10000の場合、レーン７〜９はインターカレーターの終濃度が1/1000の場合、レーン10〜12はインターカレーターの終濃度が1/100の場合の泳動結果を示している。また、各レーンにおいて、Wtは野生型、M3はR132H変異型、M4はR132C変異型を測定対象として用いた結果をそれぞれ表す。【０１３１】
比較例６  IDH1遺伝子配列中の1塩基置換変異R132H およびR132C のインターカレーター非共存下での識別検出
実施例３の（６）のLH反応によるハイブリッド体の分離検出において、電気泳動用試料にインターカレーターを添加しなかった以外は、実施例３と同様にして実験を行った。
その結果を図８に実施例３の結果と合わせて示す。尚、図中、レーン１〜３がインターカレーターの添加をせずに行った結果である。また、Wtは野生型、M3はR132H変異型、M3はR132C変異型を測定対象として用いた結果をそれぞれ表す。
図８の結果から明らかなように、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の電気泳動分離検出では、野生型とR132C変異型のサンプル由来の泳動バンド位置が重なるため、分離検出できなかった。これに対して、インターカレーターを共存させることにより、非共存下では分離できなかったLH反応生成物を明確に分離することができることが判った。すなわち、インターカレーターの濃度依存的に、野生型サンプル由来の泳動バンドと2種類の変異型（R132H、R132C）を識別検出できることが判った。また、図には示していないが、よう化プロピジウムを共存させて実験した結果でもGelRedを共存させた場合と同様、野生型とR132C変異型のサンプル由来の泳動バンドの分離能が改善される事を確認できた。【０１３２】
実施例４  IDH1遺伝子配列中の1塩基置換変異R132H およびR132C の識別検出（マイクロチップ電気泳動）
上記実施例３（５）で得たLH反応生成物（ハイブリッド産物）３種をAgilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。
即ち、専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット（アジレント社製）を使用し、各反応生成物1.0μLを用いた。インターカレーターとしては、キットに付属のインターカレーターDyeの代わりにGelRed（和光純薬工業（株））あるいはSYTO62(Molecular Probe社)を用いた。尚、本実施例で使用する該LHプローブについては、５’末端をCy5で蛍光修飾したものを作製しているため、本願比較例１および比較例３で示した如く、バイオアナライザー・システムの検出波長域を利用したマイクロチップ電気泳動におけるLH反応生成物の検出が可能となる。即ち、検証実験として、インターカレーターDyeが有する蛍光波長領域や添加の有無そのものに左右される事のないピーク検出結果が得られる事を意味する。電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。
インターカレーターとしてGelRedをx1/1000終濃度存在させた場合の結果を、図９に示す。【０１３３】
比較例７  IDH1遺伝子配列中の1塩基置換変異R132H およびR132C のインターカレーター非共存下での識別検出
インターカレーターを添加しなかった以外は、実施例４と同様にして実験を行った。
その結果を図１０に示す。
図１０の結果が示す如く、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の電気泳動分離検出では、野生型（Wt）とR132C変異型のサンプル由来の泳動バンド位置が重なるため、分離検出できなかった。これに対して、GelRedを共存させて実験した結果の図９では、非共存下では分離できなかったLH反応生成物を明確に分離することができることが判った。また、図には示していないが、SYTO62を共存させて実験した結果でもGelRedを共存させた場合と同様、バンド位置は重ならずに３つのDNAを分離検出することができた。すなわち、インターカレーターを用いることにより、分離精度が向上し、野生型DNA（Wt）由来の泳動バンドと2種類の変異型DNA（R132H、R132C）由来の泳動バンドとを識別検出できる事が判った。【０１３４】
実施例５、比較例８  ALDH２遺伝子配列中の1塩基置多型の識別検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
（１）ALDH2遺伝子多型を含むヒト血液由来ヒトゲノムDNAの調製
QIAamp DNA Blood Midi Kit（キアゲン社）を用いてキット添付のプロトコールに従い、ヒト全血2mlをproteinaseKで70℃で10分処理した後エタノールを添加した。更に、得られた溶液を遠心分離し、その上清をQIAmp Midi カラムに付し、ヒトゲノムDNAを抽出した。次に、得られたDNA抽出液のうちの50ngをPCRの鋳型材料として、アキュプライムTaqポリメラーゼ・システム（PCR反応用キット、インヴィトロジェン社製）を用いてPCR反応を行った。
即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマー溶液（ALDHF; ggtcaactgctatgatgtgtttg[配列番号25]とALDHR; cagcaggtcccacactcac [配列番号26]）をそれぞれ0.5 μL、並びにキットに添付の、PCR反応バッファー2.0 μL、アキュプライムTaq酵素0.5 μL、及びddH2O 16.5 μLを使用しPCR用反応液20.0 μLを調製した。その後、上記で得られた各ヒトゲノムDNA 50ngをPCR用反応液20μLに懸濁添加し、PCR用試料とした。このPCR用試料を用い、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で36サイクル のPCR反応を行った。
＊PCR反応条件：
熱変性      ： 95℃、15 秒
アニーリング： 55℃、15 秒
重合反応    ： 68℃、47 秒
PCR反応後、ミリポア社のモンタージュPCRにより精製した増幅DNAをサンプルDNAとし、プライマーALDHF [ggtcaactgctatgatgtgtttg；配列番号25]をシークエンスプライマーとして用い、前述の合成例１の（２）と同様の方法にてシークエンス確認を行った。その中から、504 番目のアミノ酸がグルタミン酸（GAA）からリジン（AAA）へ置換されたALDH2*2 多型のホモならびに、野生型DNAとALDH2*2 多型のヘテロ、野生型DNAのホモ３種の検体を得て、これらを試料とした。【０１３５】
（２）LHプローブの作製
野生型DNAならびにALDH2*2 多型を有するDNAとのハイブリッド体形成時、標的となるゲノムDNA上でループ構造を形成するように設計し、下記LHプローブを合成した（ALDH2D13R）。
cagcaggtcccacactcacagttttcacttcagcccgtactcgcccaactcccg [配列番号27]
尚、下記LH反応においては、該LHプローブの５’末端をCy5（アマシャムバイオサイエンス社）で蛍光修飾したものを使用した。
該プローブを用いた場合、野生型DNAとのハイブリッド体は、gcaggcatacactでループ構造を形成する。一方、ALDH2*2 多型DNAとのハイブリッド体形成時には、gcaggcatacactgでループ構造を形成する。【０１３６】
（３）LH反応
上記（２）で得られた3種類のPCR反応産物4.5μLそれぞれに対してLHプローブ（ID.= ALDH2D13R） を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200、MJ Research社製）を使用して、下記の反応条件にて１サイクル反応を行った。
＊LH反応
PCR反応産物    4.5 μl
LHプローブ      0.5μl（2μM）
105℃      hot lid
95℃       2 分
55℃       0-30 秒
68℃       4 分
4℃       反応停止【０１３７】
（４）LH反応によるハイブリッド体の分離検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
上記（３）で得たLH反応生成物（ハイブリッド産物）のうちホモのサンプル1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加する事で電気泳動用の試料とした。ここで、LH反応生成物とインターカレーターとが共存した状態で分離検出された場合の影響を確認するため、インターカレーターとしてGelRed（和光純薬工業（株））あるいは、SYBR Green(Molecular Probe社)を用い、各々x1/1000終濃度となるように上述した電気泳動用試料へ添加して実験を行った。【０１３８】
また、一方で、比較実験として、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の分離検出を並行して行った（比較例８）。【０１３９】
電気泳動用のポリアクリルアミド・ゲルには非変性10%で７cm ｘ ７cm のコンパクトゲル（コンパクトゲルC10L、アトー社製）を用い、トリス・グリシン緩衝液（37.5ｍＭ Tris ， 288mM Glycine ） を泳動緩衝液として小型電気泳動装置（ アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE ）で室温で泳動した。泳動後、レーザー・イメージング・スキャナー（アマシャム社、STORM 860）を用いてCy5蛍光検出（励起波長635nm 、検出フィルター650LP）を行った。【０１４０】
得られた結果を図１１に示す。尚、レーン１はインターカレーター非共存下で行った実験結果、レーン２は1/1000終濃度のGelRed共存下、レーン３は1/1000終濃度のSYBR Green共存下で実験した結果を示す。
図１１の結果から明らかなように、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の電気泳動分離検出では、野生型『G』とALDH2*2 多型『A』由来の各々の泳動バンド位置が重なるため、分離検出できなかった。これに対して、インターカレーターを共存させることにより、非共存下では分離できなかったLH反応生成物を明確に分離することができることが判った。更に、SYBR Green共存下では、Gel Red共存下と比較して分離能が格段に向上していることから、インターカレーターの選択によって、より効果的に分離することが可能となる事が示唆された。【０１４１】
実施例６、比較例９  ALDH２遺伝子配列中の1塩基置多型の識別検出（マイクロチップ電気泳動）
上記実施例５（３）で得たLH反応生成物（ハイブリッド産物）３種をAgilent2100バイオアナライザー・システム（アジレント社）を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。
即ち、専用試薬であるAgilent DNA1000 Assayキット（アジレント社製）を使用し、各反応生成物1.0μLを用いた。インターカレーターとしては、キットに付属のインターカレーターDye又はGelRed（和光純薬工業（株））を用いた。何れも、泳動用ポリマーと予め混合して使用した。
一方で、これら検定との比較実験を行うため、本願比較例１および比較例７で行った同様の手順に従い、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の分離検出を行った。尚、本実施例で使用する該LHプローブについては、５’末端をCy5で蛍光修飾したものを作製しているため、バイオアナライザー・システムの検出波長域を利用したマイクロチップ電気泳動におけるLH反応生成物の検出が可能となる。すなわち、検証実験として、インターカレーターDyeが有する蛍光波長領域や添加の有無そのものに左右される事のないピーク検出結果が得られる事を意味する。
電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、図１２波形解析およびピーク移動度の算出を行った。【０１４２】
その結果を図１２−ａおよび図１２―ｂ、及び図１２―ｃに示す。図１２−ａと図１２−ｂでは、野生型DNAのホモおよびALDH2*2 多型のホモの2種類のサンプルをそれぞれ測定して得られた泳動ピークを重ねて示している。図１２−ａはキット付属のインターカレーターDye共存下での実験、図１２−ｂはインターカレーター非共存下における結果（比較例９）である。図１２−ｃは、野生型DNAとALDH2*2 多型のヘテロ型サンプルを測定したもので、インターカレーターとしてGelRedをx1/1000終濃度共存下で行った実験結果である。
図１２−ｂの結果が示す如く、インターカレーター非共存下におけるLH反応生成物の電気泳動分離検出では、野生型『G』とALDH2*2 多型『A』由来の各々の泳動バンド位置が重なるため、分離検出できなかった。これに対して、インターカレーターを共存させることにより検証を行った図１２−ａあるいは図１２−ｃでは、非共存下では分離できなかったLH反応生成物を明確に分離することができることが判った。すなわち、野生型『G』由来の泳動バンドとALDH2*2 多型『A』由来の泳動バンドを識別検出できる事が判った。【０１４３】
実施例７  EGFR遺伝子エキソン19上における変異型DNAを測定対象としたインターカレーター共存下でのLH反応生成物の分離検出（アクリルアミド重合ゲル電気泳動）
比較例３で得られた結果を基に、アクリルアミド重合ゲル電気泳動の過程においてLH反応生成物とインターカレーターとが共存した状態でLH体を分離検出した場合の影響を確認した。
具体的には、実施例１（２）のLH反応で得られた６種のLH反応生成物を用いて下記の如く電気泳動を行った。まず、６サンプル各1.5μlにゲル・ローディング・バッファー1.5μlをそれぞれ添加する事で電気泳動用の試料とした。インターカレーターにはGelRed（和光純薬工業（株））をx1/1000終濃度となるように上述した電気泳動用試料へ添加してその効果を調べた。
電気泳動用のポリアクリルアミド・ゲルには非変性10%で７cm ｘ ７cm のコンパクトゲル（コンパクトゲルC10L、アトー社製）を用い、トリス・グリシン緩衝液（37.5ｍＭ Tris ， 288mM Glycine ） を泳動緩衝液として小型電気泳動装置（ アトー社、AE-7300 コンパクトPAGE ）で室温で泳動した。泳動後、レーザー・イメージング・スキャナー（アマシャム社、STORM 860）を用いてCy5蛍光検出（励起波長635nm 、検出フィルター650LP）を行った。【０１４４】
このようにして得られた結果を図１３に示す。尚、図中、レーン１は変異型DNA（G1）、レーン２は変異型DNA（G２）、レーン３は変異型DNA（G３）、レーン４は変異型DNA（G４）、レーン５は変異型DNA（G５）を用いた結果を、レーン６は野生型DNA（N）を用いた結果をそれぞれ表す。
図１３の結果より、比較例３では完全な分離検出が難しかったG１〜G５のサンプルクローン由来の泳動バンドについて、本発明の効果が確認されるとともに、各々の変異型を完全に識別検出する事が可能となった事を示した。特に、矢印（→）で示した変異型DNA（G２）、変異型DNA（G３）、変異型DNA（G５）の分離能が向上した事が顕著となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−ａ】
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【図６−ｂ】
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【図７−ａ】
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【図７−ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−ａ】
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【図１２−ｂ】
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【図１２−ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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