(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクルまたはアジュバントを有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、
ｉ）配列番号１及び配列番号９〜２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちのいずれかであるか；又は
ｉｉ）スペーサ及び／又はＴヘルパーエピトープと共有結合的に結合する、配列番号１及び配列番号９〜２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちのいずれかである、ＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項２】
前記Ｔヘルパーエピトープは、配列番号１及び配列番号９〜２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちのいずれかのアミノ末端に共有結合的に結合する請求項１記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項３】
前記スペーサが少なくとも１つのアミノ酸を有し、前記Ｔヘルパーエピトープが、該スペーサを介して、配列番号１及び配列番号９〜２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちのいずれかのアミノ末端に共有結合的に結合する請求項１又は２記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項４】
前記Ｔヘルパーエピトープが配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１〜３のいずれか１項記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項５】
前記スペーサが配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１〜４のいずれか１項記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項６】
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの３つのＰＣＶ２  Ｔヘルパーエピトープペプチドの等モル混合物をさらに有する請求項１〜５のいずれか記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項７】
ペプチド抗原の総量が１０μｇ〜１ｍｇである請求項１〜６のいずれか記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項８】
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの等モル混合物の総量が１μｇ〜１００μｇである請求項６又は７記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項９】
前記送達ビヒクル及びアジュバントが、オレイン酸マンニドおよび鉱油の油性アジュバント組成物、ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタン、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ペプチド抗原が配列番号１又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１〜９のいずれか記載のＰＣＶ２ワクチン組成物。
【請求項１１】
ＰＣＶ２感染に対してＰＣＶ２  ＭＤＡ陽性であるかまたはＰＣＶ２  ＭＤＡ陽性ではない子ブタを保護する方法であって、請求項１〜１０のいずれか記載のＰＣＶ２ワクチン組成物を投与する工程を有する、上記方法。
【請求項１２】
ＰＣＶ２感染の診断方法であって、
ａ）ペプチド抗原を固体支持体に付着させる工程であって、
前記ペプチド抗原が
ｉ）配列番号１及び配列番号９〜２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちのいずれかであるか；又は
ｉｉ）スペーサ及び／又はＴヘルパーエピトープと共有結合的に結合する、配列番号１及び配列番号９〜２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちのいずれかである、工程；
ｂ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、抗体を含むブタ血液、血清または血漿サンプルに、前記ペプチドへの前記抗体の結合を促す条件下で、曝露する工程、及び
ｃ）前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程
を有する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本開示は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）に対するペプチドベースのワクチン及びＰＣＶ２に対する母体由来抗体、寿命が短いが比較的高力価の母体由来抗体にもかかわらず、ＰＣＶ２感染に対して、子ブタを保護するためのそのようなワクチンを製造する方法に関する。
【０００２】
本発明の様々な態様のワクチン製剤は、オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）によってコードされるキャプシドタンパク質に由来するペプチドを含む。該ペプチドはＢ細胞免疫原性を増強する人工Ｔヘルパーエピトープに任意に連結していてもよく、ＰＣＶ２  Ｔヘルパーエピトープのクラスターを含むＰＣＶ２  ＯＲＦ１及びＯＲＦ３由来のペプチドの混合物を任意に補充してもよい。該ペプチドは、ワクチン製剤として獣医学的に許容可能な送達系において調製される。
【発明の背景】
【０００３】
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、１９７４年にブタ腎臓組織培養細胞株（ＰＫ１５）のピコルナウイルス様夾雑物として同定された（１）。１９９８年に、抗原的におよび遺伝的に異なるＰＣＶが、ブタ組織から単離され、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）と命名された；ＰＣＶ２は、ブタの臨床疾患に関連する（２）。
【０００４】
ブタにおける経済的に重要な疾患である新興の離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）は、ＰＣＶ２によって引き起こされる。しかしながら、証拠から、ＰＭＷＳの徴候の発現には、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）などの病原体又は類似の免疫刺激物質との同時感染、ストレスまたは補助因子が必要であると示唆される。この症候群は、発育不良、呼吸窮迫、リンパ節の腫大、下痢、蒼白および黄疸を伴って、７〜１５週齢のブタを衰弱させる。また、肉眼的病変および組織学的病変が、複数の器官系に及び得、間質性肺炎、リンパ節腫脹、肝炎、腎炎、心筋炎、腸炎、皮膚炎および膵炎を伴う（１，３）。
【０００５】
ＰＣＶ２に特異的な抗体は、１９７３年までさかのぼってブタ血清中で遡及的に検出された（４）。ＰＭＷＳの診断は、ＰＣＶ２特異的核酸または罹患組織における病変に付随する抗原の検出に依存する。このウイルスは、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、唾液腺、リンパ節、甲状腺、胸腺、消化管、便、膵臓、精巣および脳から単離されている（１，５）。
【０００６】
主な伝播経路は不明であるが、証拠から、ＰＣＶ２は、水平的および垂直的の双方で伝播することができると示唆される。ＰＣＶ２は、自然感染したブタ由来の眼球、鼻及び便のサンプルにおいて検出される。流産したブタ胎仔組織からのＰＣＶ２の単離は、垂直伝播を示唆する。自然感染及び実験的に感染した成雄ブタの精液中のＰＣＶ２核酸の検出は、成雄ブタからＰＣＶ２ナイーブ若雌ブタ及びその同腹仔への伝播を示唆する（５）。
【０００７】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する小型の非エンベロープウイルスである。そのゲノムは、推定タンパク質をコードする６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し（２）、４つのＯＲＦが、非病原性ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）由来の類似のＯＲＦと著しい相同性を共有する（６）。ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３によってコードされるタンパク質だけが、ＰＣＶ２感染細胞において検出される。ＯＲＦ１は、３１２アミノ酸のレプリカーゼタンパク質をコードし、１６８アミノ酸のスプライス変異も生じ、それらの両方が、ＰＣＶ２の複製にとって必須である（７）。構造キャプシドタンパク質は、ＯＲＦ２によってコードされ（８）；ＯＲＦ３は、複製にとって必須ではないが、ＰＣＶ２によって誘導されるアポトーシスおよび病原性において重要な役割を果たす高度に保存されたタンパク質をコードする（９）。
【０００８】
ＰＣＶ２  ＯＲＦ２によってコードされる表面露出化キャプシドタンパク質だけが、宿主免疫系のＢ細胞による防御抗体応答を誘発することができる（１０）。その知見と一致して、ＰＥＰＳＣＡＮマッピング研究は、ＰＣＶ２、主にＰＣＶ２キャプシドタンパク質上の領域に対して特異性を有する免疫優性Ｂ細胞エピトープのクラスターの位置を残基６５〜８７、１１３〜１３９、１６９〜１８３および１９３〜２０７と特定した（１１）。Ｂ細胞エピトープに加えて、ヘルパーＴ細胞エピトープを含む免疫優性Ｔ細胞エピトープが、ウイルスの抗原性に影響する別の重要な因子である。Ｔヘルパー細胞エピトープは、Ｂ細胞に抗体を産生するようにシグナル伝達する防御的なＴヘルパー細胞（Ｔｈ）応答を誘発する。Ｂ細胞エピトープがキャプシドタンパク質に局在化する（１１）のとは対照的に、２０ｍｅｒのペプチドを用いたＰＣＶ２のＴ細胞エピトープマッピングおよびリンパ球増殖アッセイから、免疫優性Ｔｈ応答が、ＯＲＦ１およびＯＲＦ３の非構造タンパク質上のエピトープに最も一貫して局在化されるのに対し、ＯＲＦ２によってコードされる直鎖状のＴｈエピトープが免疫優勢を示さなかったことが示唆された（１２）。
【０００９】
合成ペプチドによる免疫系へのＴｈ決定基の提示は、合成ペプチドの免疫原性を制御する重大な要素である。免疫優性でありかつ乱雑な（promiscuous）Ｔｈエピトープは、多岐にわたるＭＨＣタイプの集団において高度かつ広範に反応性である（１３）。したがって、キャプシドタンパク質上の免疫優性Ｔｈ部位の不足は、ＰＣＶ２に対するサブユニットキャプシドワクチンの限られた免疫原性の説明の一助となる。ペプチドサブユニット免疫原の免疫原性は、標的にされるＢ細胞エピトープと、選択された外来性の乱雑なＴｈ部位との共有結合によって強化され得る。該Ｔｈ部位は、コンビナトリアルケミストリーによって拡大された遺伝的反応性を有する乱雑なＴｈエピトープを含む（１４，１５，１６）。さらに、ブタにおけるワクチンの免疫力価（immunopotency）およびそのワクチンによってもたらされるウイルス感染からブタを保護することは、そのウイルスの複数のＴｈエピトープによって影響を受け得、これらは、種々のタンパク質由来のＢ細胞エピトープとともに交差防御的であり得る（１７）。
【００１０】
ＰＭＷＳなどのＰＣＶ２関連疾患から子ブタを保護する低コストで高度に特異的なワクチンが必要とされている。従来のブタ用ワクチンは、不活性化された全ＰＣＶ２ウイルスに基づいている。しかしながら、ＰＣＶ２は、細胞培養では高力価に複製しないことから、従来のワクチンは、高価であり、低力価である。代替のワクチンは、組換えＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原に基づいている。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２キャプシドサブユニットは、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系をはじめとした様々な発現系において発現されている（３，１０）。ほとんどの用途において、組換えＰＣＶ２キャプシドタンパク質を産生する昆虫細胞を溶解し、用いられるワクチンに製剤化されて子ブタにワクチン接種される。そのような組換え抗原は、宿主細胞およびベクター−コード化抗原を含むことが多く、ゆえに、そのワクチンが非特異的になり、アナフィラキシーを含む重篤な有害免疫応答を引き起こし得る。
【００１１】
不活性化ウイルスＰＣＶ２ワクチンでの他の問題、及び組換えウイルス溶解産物または精製されたタンパク質としてのサブユニットキャプシドワクチンでの他の問題として、通常の野外の子ブタに用いるときの、その比較的低い力価がある。野外のブタは、母体由来抗体（ＭＤＡ）を有することが多いので、それらは、通常、特定病原体除去（ＳＰＦ）子ブタまたは帝王切開由来初乳未摂取（ＣＤＣＤ）子ブタにおいて試験される。これらの母体の抗体は、通常、保護をもたらすには力価が低すぎかつ持続期間が短すぎるが、それでもなお、ワクチン接種を干渉するには十分高い。このＭＤＡによる干渉は、高用量の組換えＯＲＦ２キャプシド抗原の投与によって、部分的に克服され得る（１８）。組換え完全長ＯＲＦ２抗原は、US2009/0022749A1に開示するバキュロウイルス発現系によって培地中に分泌された（１９）。この系は、低い収率および純度の問題を部分的に軽減するが；しかしながら、この系および他の生物学的発現系は、完全長ＰＶＣ２抗原調製物の本質的に限られた免疫原性に悩まされ、それらは、非再現性、低収率および複雑な品質管理プロトコルが原因であるコストの問題を抱えている。したがって、免疫原性ペプチドをデザインして合成する合理的なデザイン方法によってＰＣＶ２ワクチンを開発することが望まれている。そのようなペプチドベースのワクチンは、キャプシド特異的Ｂ細胞エピトープ、強力な外来性Ｔｈエピトープ、および他のＰＣＶ２タンパク質に由来するＰＣＶ２  Ｔｈエピトープを含むようにデザインすることができ、ワクチン製剤の重要な成分として組合せて用いることにより、子ブタにおけるＰＣＶ２感染に的確に立ち向かう抗キャプシド抗体応答が誘発される。
【００１２】
ウイルスワクチン用の免疫原性ペプチドの合理的なデザインは、エピトープマッピングによる免疫優性エピトープの同定から開始される。エピトープマッピングは、ターゲット化ウイルスタンパク質上の目的の領域に対応する一連の重複ペプチドを使用して、免疫原性決定基として免疫系との相互作用に関与する部位を同定する。最も一般的には、エピトープマッピングは、直鎖状の決定基を正確に検出するために、比較的短鎖長のペプチドを用いる。「ＰＥＰＳＣＡＮ」として知られるエピトープマッピングの迅速な方法は、固体支持体に結合した、数百の重複ペプチドを同時に合成することに基づいている。結合したペプチドは、抗体に結合する能力またはＴ細胞増殖を刺激する能力について試験される。このアプローチは、直鎖状Ｂ細胞決定基及び直鎖状Ｔ細胞決定基の位置を特定する際に有効であるが；しかしながら、ワクチン開発にとって不可欠な、標的とされるウイルスまたはタンパク質の免疫優性Ｂ細胞エピトープは、通常、ＰＥＰＳＣＡＮ法によって定義しにくい高親和性の非連続的な長いエピトープである（２０）。
【００１３】
管理され且つ再現性ある固相ペプチド合成による、ミリグラムからキログラムの量で化学合成できる非連続的な長いエピトープを有する免疫原性ＰＣＶ２ペプチドを同定することにニーズがある。このＰＣＶ２キャプシド免疫原を合成するための管理された工業規模での方法は、そのようなペプチド産物を特徴付ける簡単な手段と共に、ＰＣＶワクチン製剤の低コストでの工業規模による製造および品質管理に対する枠組みを提供するであろう（２１）。
【００１４】
参考文献：
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２７．Sokoll KK. Stabilized synthetic immunogen delivery system. United States Patent Application Publication No. US 2003/0165478.
【発明の簡単な説明】
【００１５】
本開示は、ペプチドまたはペプチド組成物を有するブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ワクチンに関し、該ペプチドまたはペプチド組成物は、重複する短鎖及び長鎖のＰＣＶ２キャプシドペプチドを血清学的反応性についてスクリーニングすることにより最適化する。そのような経験的知見から、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ６２７６６によって例示されるようなＰＣＶ２キャプシドタンパク質内の免疫優性Ｂ細胞エピトープのクラスターが検出された。具体的には、その免疫優性Ｂ細胞エピトープのクラスターは、ＰＣＶ２キャプシドタンパク質の１５４アミノ酸長のペプチド上に見られた（ペプチドＣａｐ１、配列番号１、表１にも示す）。このペプチドは、ＰＣＶ２感染に対する防御抗体および細胞性免疫応答を誘発する重要な免疫原としてペプチドベースのワクチンに組み込まれ、さらなる外来性およびＰＣＶ２由来のＴ細胞エピトープによって増強された。前記ペプチド免疫原は、ＰＣＶ２に対するワクチンの製剤化にとって有用である。
【００１６】
本発明の様々な態様は、ＰＣＶ２感染に対して子ブタを保護することができる免疫応答を誘発するためのワクチンとして、そのようなペプチド、ペプチド組成物および医薬製剤を製造する方法、並びにＰＣＶ２感染の検出用診断キットを製造する方法に関する。
【００１７】
本発明の様々な態様は、ＯＲＦ２キャプシドタンパク質由来の、デザインされたＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド（配列番号１）、並びにそのホモログ及び類似体を含むワクチン製剤に関する。これらの製剤中のＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドは、優先的にであるが任意に、Ｂ細胞免疫原性を増強するコンビナトリアル人工Ｔヘルパーエピトープ（配列番号２、表１にも示す）に結合してもよい。そのＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドは、任意に、ＰＣＶ２  Ｔｈエピトープのクラスターを含むＰＣＶ２  ＯＲＦ１（配列番号３および４）ペプチドとＯＲＦ３（配列番号５）ペプチドとの混合物とも混合してもよい（表１にも示す）。そのようなペプチドベースのＰＣＶ２ワクチン製剤は、ワクチン接種を干渉することができる母体由来抗体（ＭＤＡ）を有してもよい子ブタを含む子ブタにおいてＰＣＶ２感染に対して保護するＰＣＶ２特異的抗体応答を誘発する。そのようなデザインされたペプチドベースワクチンは、産業上の利用のためにミリグラムからキログラムのスケールで化学合成することができ、且つ容易に品質管理することができる免疫原としてペプチド組成物を含む。
アジュバントおよび／または送達ビヒクルならびに日常的にワクチン製剤に組み込まれる他の成分も、本発明の様々な態様は提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、コトランスフェクトされたＨＴＫ細胞株細胞の核の内部のキャプシドに結合したＰＣＶ２キャプシドタンパク質に対する抗体を、本発明の態様の免疫蛍光法により検出するメカニズムを示す説明図である。この説明図は、Ｔ７ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルス（Ｔ７／ｖａｃ）（２２）に感染し、lipofectamineＴＭ（Invitrogen）によってｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミドでコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞を示す。その組換えキャプシドタンパク質は、翻訳後に核に輸送される（２３）。本発明のある態様の抗キャプシド抗体は、トランスフェクトされたＨＴＫ宿主細胞の核に結合し、それらは、標識化二次抗体の免疫蛍光法によって検出される。この方法によって、ＨＴＫ細胞内で、原核生物Ｔ７プロモーターにより媒介される完全長ＰＣＶ２キャプシドタンパク質の一過性の真核生物の発現によって、真のＰＣＶ２キャプシドタンパク質に対する抗体が高特異的に検出される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに記載されるメカニズムにしたがって行われる免疫蛍光法アッセイ（ＩＦＡ）である。核の内部のキャプシドに結合したＰＣＶ２キャプシドタンパク質に対する抗体を有するコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞株細胞が検出される。
【図２】図２は、表５に記載するような８種のＣａｐ１ペプチドベースのＰＣＶ２ワクチン製剤および用量で免疫化された、固有のＰＣＶ２感染を有する通常の農場で飼育された子ブタの免疫原性を報告するグラフである。ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって免疫原性を評価した（Ｌｏｇ１０を単位とする力価）。
【図３Ａ】図３Ａは、ワクチン接種を受けていないＰＣＶ２に感染したブタの腎臓の写真である。病変を括弧（＊）で示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ワクチン接種を受けた未感染のブタ由来の腎臓の写真であり、一方は切開されており（左）、他方はそのままである（右）。フラッシュによる光反射を括弧（＊＊）で示す。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
ペプチド抗原は、免疫学的応答を検出することができ、あるペプチド抗原も、免疫学的応答を刺激することができる。多くのペプチド抗原は、免疫応答の高感度かつ特異的な検出のために用いることができるが、ほとんどの場合、それだけでは免疫原として作用しない。ペプチド免疫原は、免疫応答を刺激し且つそれらを検出するのに用いることができる特殊な種類のペプチド抗原である。本発明のある態様によると、ＰＣＶ２ワクチンのペプチド抗原は、ＰＣＶ２感染に対する免疫応答を検出することができる他、防御免疫応答の発生を刺激するように一緒に作用するＢ細胞エピトープおよびＴヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープの双方を有するペプチド免疫原である。
【００２０】
Ｂ細胞エピトープを同定する方法の１つは、代表的には２０〜６０残基またはそれ以上の長さの、多様な鎖長のネステッド（nested）ペプチドでありかつ重複するペプチドのセットに依存する。これらのより長鎖のペプチドは、迅速かつ同時のＰＥＰＳＣＡＮ合成ではなく、面倒な一連の独立した固相ペプチド合成によって合成される。次いで、得られたネステッド（nested）ペプチドでありかつ重複するペプチドのセットは、抗体結合研究および実験的な免疫化において使用することにより、非連続の立体配置的なＢ細胞エピトープを含む免疫優性決定基を最もうまく提示する長鎖ペプチドを同定することができる。この方法を利用して、ＨＩＶのｇｐ１２０糖タンパク質による結合を阻止するためのワクチンにおいて使用されているＣＤ４上の非直鎖状の決定基を選択し（２４）、且つ口蹄疫ウイルスのＶＰ１タンパク質のＧ−Ｈループドメインから強力なペプチド抗原をデザインしている（２５）。
【００２１】
本発明のある態様は、最適な抗体認識のためのＢ細胞エピトープのクラスターを有する１５４ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号１、表１にも示す）を有するＰＣＶ２  ＯＲＦ２コード化キャプシドペプチドを提供する。これらの抗原ペプチドは、経験的に同定され、ＰＣＶ２に感染した子ブタ由来の血清サンプルおよびＥＬＩＳＡイムノアッセイ形式を用いて最適化された。ペプチド抗原を有する抗体捕捉相に適合できる任意のイムノアッセイ形式、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、ＰＣＶ２に感染したブタ由来の血液、血清または血漿サンプル中のＰＣＶ２キャプシドタンパク質の特定のフラグメントに結合する抗体を検出し且つ定量することができる。
【００２２】
特定の態様において、完全長ＰＣＶ２タンパク質のアミノ酸残基４７〜２０２に対応する約１５４アミノ酸の最適化ＰＣＶ２抗原ペプチド（配列番号１）は、ワクチン接種による防御抗体の産生およびＥＬＩＳＡによる診断のための抗体の検出の双方に対して最も有用である、ＰＣＶ２キャプシドの免疫原性部位および抗原性部位を提示する。この高抗原性および高免疫原性のキャプシドペプチドは、鎖長２０〜１７０残基の、５０個を超える重複ペプチドのコレクションの中から同定された。この５０個を超える重複ペプチドは、デザインされ、合成され、感染子ブタ由来のＰＣＶ２陽性血清のパネルに対する反応性について試験された。試験された５０個を超える候補ペプチド抗原のうち、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチド（配列番号１）が、免疫優性Ｂ細胞エピトープのクラスターを有すると見出され、ＰＣＶ２陽性血清パネルに対して最も著しい一貫した抗原性を有した。そのＣａｐ１ペプチドは、このペプチド配列を有するワクチンの治験において試験したとき、高い免疫原性であることも証明された。ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原性／免疫原性ペプチド（例えば、配列番号１）を有するワクチンの産生及び使用は、本発明の様々な例示的な態様の範囲内にある。
【００２３】
本発明のＰＣＶ２Ｃａｐ１免疫原性／抗原ペプチドの特定の態様は、さらに配列番号１の免疫学的に機能的なホモログであると定義され、これらは、ＰＣＶ２の突然変異株および変異（variant）株由来の対応する配列および立体配置成分を有する。相同的なＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドは、起源であるＰＣＶ２変異株のキャプシドタンパク質のおよそ４７〜２０２位と相関するアミノ酸残基を有する。そのようなホモログは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Julie D. Thompson, Toby Gibson of European Molecular Biology Laboratory, Germany 及びDesmond Higgins of European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK. Algorithmicが作成した）などの配列アラインメントプログラムによって容易に立証される。表２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって特定されたＰＣＶ２の多種多様な株から得た１１個のＣａｐ１抗原配列のＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントを示す。表２のアラインメントされたＣａｐ１ホモログの起源となるＰＣＶ株は、遺伝子型２ａ、２ｂ、２ｄ、１／２ａのウイルスを含み、これらの多種多様な株は、台湾、中国、米国、カナダ、ブラジル、スペイン、ドイツおよびデンマークにおける動物から単離された。表２はまた、コンセンサスＣａｐ１配列であるホモログを例示し、可変（variable）位置に割り当てられたアミノ酸は、それらの位置に対して最も頻繁に適用されるアミノ酸である。ある態様において、そのホモログは、ＰＣＶ２キャプシドタンパク質の約アミノ酸４７位〜約アミノ酸２０２位のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明のホモログはさらに、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有すると定義される。ある態様において、変異株ホモログは、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する。他の態様において、変異株ホモログは、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する。また、他の態様において、変異株ホモログは、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する。
【００２５】
本発明の他の態様は、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体を提供する。Ｃａｐ１ペプチドの免疫学的に機能的な類似体は、配列番号１の変異、ならびに元の抗原ペプチドと実質的に同じ抗原性および免疫原性を保持するホモログを含む。例えば、配列番号１またはホモログの機能的な類似体である変異は、あるアミノ酸位置における保存的置換；全体的な電荷の変化；別の部分との共有結合；あるいは小さい付加、挿入、欠失もしくは保存的置換および／またはそれらの任意の組合せを有することができる。したがって、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチド（例えば、配列番号１）に結合する抗体は、そのＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体にも実質的に類似の効力で結合することができる。ある態様において、その機能的な類似体は、配列番号１またはホモログに対して少なくとも５０％の同一性を有する。他の態様において、その機能的な類似体は、配列番号１またはホモログに対して少なくとも８０％の同一性を有する。また、他の態様において、その機能的な類似体は、配列番号１またはホモログに対して少なくとも８５％の相同性を有する。さらに他の態様において、その機能的な類似体は、配列番号１またはホモログに対して少なくとも９０％の相同性を有する。
【００２６】
ある態様として、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体は、保存的置換および挿入または欠失によって改変されるＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドのバージョンを包含する。この態様において、免疫学的に機能的な類似体は、配列番号１または配列番号１のホモログから、保存的な置換によって改変することができる。
【００２７】
保存的置換は、１つのアミノ酸残基が、類似の化学特性を有する他のアミノ酸残基の代わりに用いられるときの置換である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正に帯電した（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；負に帯電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００２８】
他の態様として、免疫学的に機能的な類似体は、Ｎ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加、及び／又はペプチドの中央への挿入によって改変することができる。本発明の様々な態様において、付加は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端への付加である。付加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基の付加とすることができる。そのような付加は、ＰＣＶ２キャプシドに存在せず、かつそのペプチドのＰＣＶ２キャプシドの部分の免疫原性を変更しない、アミノ酸配列を構成してもよい。ＰＣＶ２キャプシドに存在しない付加として、小さい荷電配列（例えば、リジン−リジン−リジン）、分岐鎖構造の形成が可能なアミノ酸（例えば、εＮ−リジン）または環化構造の形成が可能なアミノ酸（例えば、システイン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある態様では、ＰＣＶ２Ｃａｐ１に存在しないアミノ酸配列の付加は、５アミノ酸以下の付加である。アミノ酸の付加は、古典的又は非古典的なアミノ酸のいずれか、もしくはそれらの混合物とすることができる。
【００２９】
他の特定の態様として、免疫学的に機能的な類似体は、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端および／または中央に対する欠失によって改変することができる。様々な態様において、欠失は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する欠失である。欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸残基の欠失とすることができる。特定の態様において、アミノ酸配列の欠失は、１０アミノ酸以下の欠失である。
【００３０】
他の態様において、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体は、電荷の変更によって改変されるＰＣＶ２ｃａｐ抗原ペプチドを包含する。そのような電荷の変更は、アミノ酸の置換、付加もしくは欠失または荷電分子の共有結合の結果とすることができる。その電荷の変更は、未改変のペプチドと比べてそのペプチドをより塩基性に、より酸性に、またはより中性にした結果とすることができる。特定の態様において、そのペプチドは、１〜５個のリジン残基をＮ末端またはＣ末端に付加することによってより塩基性となる。より特定の態様では、そのペプチドは、３個のリジン残基をＮ末端に付加することによってより塩基性となる。
【００３１】
非限定的な例として、本発明のペプチドの免疫学的に機能的な類似体は、末端のアミノ酸に付加された１〜約５個の追加のアミノ酸（古典的および非古典的）を有することができる。例えば、電荷を変更するために、配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを、このＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドのアミノ末端に付加することができる。
【００３２】
上記ペプチドは、標準的な手法（例えば、Merrifield固相合成法およびその方法に対する無数の利用可能な改良法）を用いて容易に合成することができる。上記ペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いても作製することができる。そのようなとき、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドおよびＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子ならびにその相補体（compliments）が、本発明の様々な例示的な態様によって包含される。ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドおよび免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子を有する、ベクター、特に発現ベクターをも、本発明の様々な例示的な態様は、包含する。それらのベクターを含む宿主細胞をも、本発明の様々な例示的な態様は、包含する。
【００３３】
本発明の様々な例示的な態様は、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドおよびＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体を産生する方法も包含する。例えば、その方法は、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドおよび／またはＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチドの免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子を有する発現ベクターを含む宿主細胞を、そのＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドおよび／またはＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドの免疫学的に機能的な類似体が発現されるような条件下で、インキュベートする工程を有することができる。この態様は、そのような細胞の溶解産物または分泌物に由来する管理され且つ十分に定義された免疫原を使用することができる。
【００３４】
本発明のある態様として、固相合成によって産生したペプチド組成物が提供される。この態様の化学的方法によって産生した抗原の質は、管理されかつ定義されるので、結果として、抗原性、免疫原性および収率の再現性を保証することができる。また、ペプチド抗原の製造において生体有害材料が用いられないので、リスクが低下し、費用のかかる生物学的封じ込めの必要性がなくなる。部位特異的免疫原は、高モル濃度の選択されたエピトープを提示するので、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチド組成物を使用するワクチンの安全性および免疫力価の双方が保証される。
【００３５】
ある態様として、本発明のペプチドは合成される。定義されたＣａｐ１合成ペプチドを用いることにより、子ブタにおける抗体検出及び診断のための抗原として用いられるとき、偽陽性の結果を最小限にする。知られているＢ細胞エピトープおよびＴｈエピトープを有する、定義された合成ペプチドを免疫原として用いることにより、ワクチンの免疫原性成分として用いられるとき、ＰＣＶ２感染化又は組換えウイルス感染化宿主細胞、並びにＰＣＶ２ウイルス及び／又は組換えタンパク質と同時に精製することができる組換えタンパク質発現系を起源とする抗原性材料の存在によって引き起こされる、望まれない非ＰＣＶ２特異的免疫応答が排除される。例えば、ブタ由来の血清は、宿主細胞、または組換えEscherichia coli、酵母もしくはバキュロウイルスに対する抗体を有する可能性があり、それらは後に、生物学的に得られた抗原に基づく診断検査において使用される抗原性材料と交差反応性となり、これらの外来性の免疫原を成分として有するワクチンによってもたらされるそのような免疫応答は、防御的でないことがある。対照的に、本発明のＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドワクチンを投与されたブタは、宿主細胞または発現ベクターを起源とするタンパク質、例えば、生物学上由来のＰＣＶ２抗原と同時に精製される組換えEscherichia coli、酵母またはバキュロウイルス由来のタンパク質に対する都合の悪い抗体及び他の免疫応答がない、明確な免疫応答を起こす。
【００３６】
合成ペプチドのこの態様は、産生中に生じる不純物による干渉も最小限にする。長い合成の場合、結合効率の厳格な管理にもかかわらず、伸長サイクル中の事象（アミノ酸の挿入、欠失、置換および中途での終結を含む）に起因してペプチド類似体も産生され、ゆえに、標的とするペプチド合成物とともに複数のペプチド類似体が生成する。それにもかかわらず、そのようなペプチド類似体は、免疫診断用の固相抗原として、またはワクチン接種用の免疫原として免疫学的用途で用いられるとき、抗原性および免疫原性に寄与するものとしてペプチド調製物においてなおも好適である。
【００３７】
合成ペプチドの免疫学的用途における２５年の経験において、本発明者らは、意図される免疫学的活性の保持を可能にする構造的可変性の範囲が、小分子薬物による特定の薬物活性、または生物学的に得られる薬物と同時に生成される大分子に見られる所望の活性および望まれない毒性の保持を可能にしている構造的可変性の範囲よりもはるかに融通のきくものであることを見出した。これは、意図的にデザインされたか、または合成法の誤りによって、意図されるペプチドと類似のクロマトグラフィー特性および免疫学的特性を有する欠失配列副産物の混合物として不可避的に生成された、ペプチド類似体が、所望のペプチドの精製された調製物と同程度に有効であることが多い理由である。これらのペプチドを使用して最終生成物の再現性および有効性を保証するように、製造方法および生成物評価方法の両方をモニターする鑑定力のあるＱＣ手順が開発されている限り、デザインされた類似体および意図されない類似体混合物は、有効である。
【００３８】
本発明の他の態様として、Ｔｈペプチドが、ワクチン組成物中に含められる。Ｔｈペプチドが存在することにより、ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドワクチンの免疫原性を改善することができる。ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド（上述のホモログおよび類似体を含む）は、Ｔｈエピトープに共有結合的に結合するか、及び／又はＴｈエピトープと混合することができる。
【００３９】
ある態様として、配列番号３〜５として記載し（表１にも示す）且つＣａｐ１免疫原に結合しない、ＯＲＦ１およびＯＲＦ３由来の免疫優性ＰＣＶ２  Ｔｈエピトープのクラスターを有するＴｈペプチドを用いて、ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドワクチンの免疫原性を補うことができる。共有結合を有しない遊離ペプチドとして配列番号３〜５を含めることにより、ワクチン製剤の免疫原性を改善することができる。
【００４０】
他の態様として、ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド（上述のホモログおよび類似体を含む）は、スペーサあり又はスペーサなしで、Ｔｈエピトープを含むと知られている配列を含むペプチドに共有結合的に結合することができる。この態様は、共有結合的に結合したＴｈエピトープを有しない等価なＣａｐ１免疫原よりも増強された免疫原性をもたらすことができる。特定の態様において、そのＴｈエピトープを含むペプチドは、ＰＣＶ２ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に共有結合的に結合する。他の特定の態様において、スペーサは、表１にも示す配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓ（配列番号７）を有する。ある態様において、Ｔｈエピトープを含むペプチドは、ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドのアミノ末端に共有結合的に結合する。特定の態様において、Ｔｈエピトープを含むペプチドは、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓスペーサを介してアミノ末端に結合したコンビナトリアル人工Ｔｈペプチド配列番号２（表１に示す）であり、配列番号６（表１にも示す）としても示す。
【００４１】
本発明の様々な態様は、ＰＣＶ２に対してブタを保護するためのワクチン組成物に関する。例示的な態様において、該ワクチンは、免疫原性ペプチド抗原及び許容可能な送達ビヒクルまたはアジュバントを有する。様々な態様において、ＰＣＶ２ワクチン組成物は、ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクルまたはアジュバントを有し、該ペプチド抗原は、
ａ）ＰＣＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸約４７位〜アミノ酸約２０２位；
ｂ）配列番号１；
ｃ）（ｂ）のホモログ；
ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の抗原的且つ免疫学的に機能的な類似体；
ｅ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換、アミノ酸付加及び／又はアミノ酸欠失を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）；及び
ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
ＰＣＶ２ワクチンの態様において、ペプチド抗原の電荷は、１〜５個のアミノ酸を付加するかまたは欠失させることによって変更される。ＰＣＶ２ワクチンの他の態様において、抗原的且つ免疫学的に機能的なホモログまたは類似体は、ＰＣＶ２キャプシドタンパク質のおよそ４７〜２０２位であるアミノ酸配列の抗原と少なくとも８０％の同一性を有する。特定の態様において、そのペプチド抗原は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４３】
ＰＣＶ２ワクチンの別の態様において、ペプチド抗原は、該ペプチド抗原のＮ末端又はＣ末端に共有結合的に結合したＴヘルパーエピトープをさらに有する。特定の態様において、そのＴヘルパーエピトープは、そのペプチド抗原のアミノ末端に共有結合的に結合する。他の特定の態様において、そのＴヘルパーエピトープは、少なくとも１つのアミノ酸を有するスペーサを介してペプチド抗原に共有結合的に結合する。特定の態様において、そのＴヘルパーエピトープは配列番号２である。なおも別の特定の態様において、スペーサは配列番号７である。特定の態様において、ペプチド抗原は配列番号１又は配列番号６である。
【００４４】
様々な例示的な態様において、免疫原性ペプチド抗原を任意量用いて、動物における免疫応答を誘発することができる。特定の態様において、ペプチド抗原の量は、約０．１μｇ〜約１００ｍｇである。他の特定の態様において、ペプチド抗原の量は、約１μｇ〜約１０ｍｇである。なおも他の態様において、ペプチド抗原の量は、約１０μｇ〜約１ｍｇである。
【００４５】
ＰＣＶ２ワクチン組成物の様々な態様において、該組成物は、配列番号３、配列番号４および配列番号５の３つのＰＣＶ２  Ｔヘルパーエピトープペプチドの等モル混合物をさらに有する。特定の態様において、配列番号３、配列番号４および配列番号５の等モル混合物の量は、約０．１μｇ〜約１ｍｇである。より特定の態様において、配列番号３、配列番号４および配列番号５の等モル混合物の量は、約１μｇ〜約１００μｇである。
【００４６】
様々な例示的な態様において、任意のタイプまたは量の送達ビヒクル又はアジュバントを用いることができる。特定の態様において、その送達ビヒクル及びアジュバントは、MontanideＴＭISA 50V2（油中水型エマルション生成用の、鉱油およびオレイン酸マンニド（mannide oleate）を有してなる油性ワクチンアジュバント組成物）、Tween（登録商標）80（ポリソルベート80またはポリオキシエチレン（20）モノオレイン酸ソルビタンとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／又はそれらの任意の組合せである。
【００４７】
特定の態様において、ＰＣＶ２ワクチン組成物は、配列番号６のペプチド抗原および獣医学的に許容可能な送達ビヒクルまたはアジュバントを有し、ペプチド抗原の量は約１０μｇ〜約１ｍｇである。
【００４８】
本発明の別の態様は、ＰＣＶ２  ＭＤＡ陽性であるかまたはＰＣＶ２  ＭＤＡ陽性でない子ブタをＰＣＶ２感染に対して保護する方法に関し、該方法は、上述の例示的な態様のいずれかに包含されるワクチンを投与する工程を有する。
【００４９】
本開示に従って調製されるＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドを用いて、該ペプチドをイムノアッセイの捕捉相、例えば、ＥＬＩＳＡ試験キットの固相免疫吸着剤において抗原的に有効な量で使用することによって、ＰＣＶ２抗体を検出することもできる。本発明の態様によると、任意の適合性のイムノアッセイ形式を、対象のペプチドと共に用いることができる。そのような形式は、当業者に周知であり、多くの標準的な免疫学マニュアルおよびテキストに記載されている。例えば、Harlow et al. 1988（２６）を参照のこと。これらとして、他の周知のイムノアッセイ形式の中でも、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、凝集アッセイ、抗体−ペプチド−抗体サンドイッチアッセイ、ペプチド−抗体−ペプチドサンドイッチアッセイが挙げられる。ある態様において、イムノアッセイは、ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド組成物でコーティングされた固相を用いるＥＬＩＳＡである。
【００５０】
本発明のある態様によると、該ペプチドは、雌ブタおよび若雌ブタ、成雄ブタおよび去勢ブタならびに子ブタ由来の血清をスクリーニングＥＬＩＳＡによってＰＣＶ２感染について、ワクチン接種を受ける前の子ブタ由来の血清を母体由来の抗ＰＣＶ２抗体のレベルについて、およびワクチン接種を受けた子ブタにおける、ＰＣＶ２Ｃａｐ１抗原ペプチド、完全長キャプシドタンパク質または不活性化されたＰＣＶ２ビリオンを使用したワクチンに対する免疫応答のレベルを測定するために、試験することができる。
【００５１】
特定の態様において、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて、抗ＰＣＶ２抗体の存在についてブタの血液、血清または血漿サンプルを試験することができ、そのアッセイは、
ｉ．ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドを固体支持体に付着させる工程、
ｉｉ．前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、抗体を含むブタの血液、血清または血漿サンプルに、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、曝露する工程、及び
ｉｉｉ．前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程
を有する。
【００５２】
対象のＥＬＩＳＡキットの例示使用において、試験されるブタ血清サンプルは、サンプル希釈剤で希釈され、次いで、上述のＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドの１つ以上と、ある時間にわたって任意の抗体が、存在する場合、ペプチド感作固相に結合する条件下で接触させる。未結合の材料を除去した後（例えば、リン酸緩衝食塩水で洗浄することによって）、二次複合体は、ブタ特異的ＩｇＧに対するラベル化抗体又はラベル化プロテインＡ、ラベル化プロテインＧ、もしくはラベル化プロテインＡ／Ｇと接触させる。これらの抗体またはプロテインＡ、ＧもしくはＡ／Ｇは、その二次複合体に結合して三次複合体を形成し、その二次抗体あるいはプロテインＡもしくはＧまたはＡ／Ｇが、レポーター分子でラベル化しているので、その三次複合体は、検出手段に供されると検出される。そのレポーター分子は、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、生物発光分子、化学発光分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどとすることができる。ＥＬＩＳＡの場合、レポーター分子は、好ましくは、酵素である。
以下の実施例は、本発明を例証するために役立つものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
【００５３】
【表１】
0005902160.tif 000002
【００５４】
【表２】
0005902160.tif 000003
【実施例１】
【００５５】
ＰＣＶ２に対する抗体の検出用の、コトランスフェクトされたＨＴＫ細胞の核内のキャプシドタンパク質を用いる免疫蛍光アッセイ
【００５６】
ＰＣＶ２に対する抗体は、ＰＣＶ２キャプシドタンパク質でコトランスフェクトされたＨＴＫ細胞を用いる免疫蛍光法（immunofluoresence）によって検出することができる。本方法は、ＨＴＫ細胞において完全長ＰＣＶ２キャプシド抗原の一過性の発現をもたらす。本イムノアッセイ法はまた、合成段階および成熟段階において、天然のキャプシドタンパク質コンフォメーションを確実に保存しつつ、組換えウイルス感染によってキャプシドタンパク質の発現をもたらすことにより、高特異性かつ高感度の抗体検出のための条件を提供する。
【００５７】
図１Ａに図示するメカニズムにしたがって、ＨＴＫ細胞株細胞を、Ｔ７ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルス（Ｔ７／ｖａｃ）（２２）に感染させ、リポフェクタミン（商標）（lipofectamineＴＭ）（(Invitrogen)）によってｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミド（２３）でコトランスフェクトした。具体的には、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターによって媒介される天然のＰＣＶ２キャプシドタンパク質の発現のためのｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミドの構築を、以下のとおり行った：完全長のＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子（台湾ＰＣＶ２株Ｃｙｃ０８由来；７７位にＮ→Ｓ突然変異を有するアクセッション番号ＡＡＮ６２７６６）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミドベクター（Invitrogen）にクローニングした。ｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミドの発現能力を、ＰＣＶ２株Ｃｙｃ０８（２３）由来のＯＲＦ２に対する完全なヌクレオチド配列を示す配列決定によって確認した。
【００５８】
ＨＴＫ細胞を、９６ウェルプレートにおいて８０％コンフルエンスまで生育し、Ｔ７ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルス（Ｔ７／ｖａｃ）（２２）に感染させ、次いで、lipofectamineＴＭ（Invitrogen）によってｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミドでコトランスフェクトした（co-transected）。そのｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミドでコトランスフェクトされた細胞は、ＨＳＫ細胞の核内でＰＣＶキャプシド抗原を確かに発現すると見出されたので、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるＰＣＶ２キャプシドタンパク質に対する抗体の捕捉及び検出のために用いるのに適していた。
【００５９】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるＰＣＶ２抗体の力価測定
天然のＰＣＶ２キャプシドタンパク質を抗原として有するプレートを、トランスフェクトされたＨＴＫ細胞でコーティングすることによってバッチで調製し、−８０℃で保管した。確実に品質管理するために毎回１００というバッチで、抗原がコーティングされたプレートを調製した。最初に血清サンプルをＰＢＳで５０倍希釈し、その後、２倍の段階希釈を行った。各テストランのために、ＰＣＶ２感染ＳＰＦブタ由来のポジティブコントロール血清及び未感染ＳＰＦブタ由来のネガティブコントロール血清の双方を含めて、ＨＳＫ細胞の核内でのｐＣＲ−ｏｒｆ２プラスミドによるキャプシドタンパク質の発現を確証した。１：５０よりも高い希釈度において核に局在化された蛍光シグナルをもたらす血清サンプル（図１Ｂに示す）を、＞５０のＩＦＡ力価を有するとスコア付けした；これらの力価から、ＰＣＶ２に感染した動物またはワクチン接種の結果として抗ＰＣＶ抗体を産生した動物が示唆された。ＩＦＡによる観察は、核に局在する特異的な抗キャプシド抗体の結合と非特異的なタンパク質の結合を区別することによって、真陽性抗体シグナルと偽陽性シグナルとの識別を容易にすることもできる。
【００６０】
自然感染したブタ又はＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドベースのワクチンを投与したブタから回収した血清サンプルの試験全てを、コードのもとに行った。
【実施例２】
【００６１】
ＰＣＶ２に自然感染したブタ及びＣＡＰ１ペプチドベースのＰＣＶ２ワクチンを投与されたブタを識別するための血清抗体を検出するＥＬＩＳＡ法
特記しない限り、９６ウェルプレートのウェルを、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５中の２μｇ／ｍＬの１００μＬの個別のＰＣＶ２キャプシドペプチドで、例えば、配列番号１のペプチド（ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド）で、３７℃において１時間別々にコーティングした。
【００６２】
ペプチドコーティング化ウェルを、２５０μＬの３重量％ゼラチンのＰＢＳ溶液と共に３７℃で１時間インキュベートして、非特異的なタンパク質結合部位をブロッキングした後、０．０５体積％TWEEN（登録商標）20を含むＰＢＳで３回洗浄し、乾燥した。ＰＣＶ２抗体に対してＩＦＡで陽性であるブタ血清及びネガティブコントロール血清を、特記しない限り、２０体積％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび０．０５体積％TWEEN（登録商標）20を含むＰＢＳで１：２０希釈した。その希釈した１００マイクロリットルの検体を各ウェルに加え、３７℃で６０分間反応させた。
【００６３】
次いで、未結合の抗体を除去するために、そのウェルを０．０５体積％TWEEN（登録商標）20のＰＢＳ溶液で６回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ブタＩｇＧをラベル化トレーサとして用いて、陽性ウェルにおいて形成される抗体／ペプチド抗原複合体と結合させた。０．０５体積％TWEEN（登録商標）20のＰＢＳ溶液を有する１体積％正常ヤギ血清中であって、予め力価測定済みの最適希釈度でのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ブタＩｇＧ  １００マイクロリットルを各ウェルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。未結合の抗体を除去するためにそのウェルを、０．０５体積％TWEEN（登録商標）20のＰＢＳ溶液で６回洗浄し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に０．０４重量％３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および０．１２体積％過酸化水素を含む１００μＬの基質混合物とさらに１５分間反応させた。この基質混合物を用いて、有色の生成物を形成することによりペルオキシダーゼ標識化を検出した。１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ加えることによって反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）を測定した。
【００６４】
動物血清中のＰＣＶ２抗体を検出する目的に従って血清希釈を行った：（ａ）潜在的な自然感染を識別するために、１：２０の希釈を用いて、Ａ４５０の読みを記録し、カットオフ計算用の生来の内因性のネガティブコントロールを用いるか；又は（ｂ）ペプチドベースのＰＣＶ２ワクチン製剤を投与されたブタの抗体価を測定するために、１：１０から１：１０，０００の１０倍段階希釈の血清を試験し、試験された血清の力価を、Ｌｏｇ１０として表現し、Ａ４５０の線形回帰分析によって算出した。
【００６５】
ＥＬＩＳＡの結果と、高度に特異的な天然のキャプシドベースのＩＦＡの結果（実施例１）との高い相関係数（表３に示す０．７８２）から、ＰＣＶ２感染を検出するためのＣａｐ１ベースのＥＬＩＳＡの血清学的妥当性が確認された。
【実施例３】
【００６６】
ワクチン用途および診断用途の双方用に最適なＰＣＶ２キャプシドペプチドを識別するための部位特異的血清学
ＰＣＶ２単離株1010-Stoon（２）および台湾株Ｃｙｃ０８の以前に公開された配列からのＰＣＶ２のゲノム配列を用いてオープンリーディングフレームからタンパク質配列を推定し、その２つのＯＲＦ２配列から得られたデータを用いて免疫学的試験用に候補ペプチド抗原をデザインした。ＰＣＶ２感染に関連するＢおよびＴ細胞認識に対する標的である抗原ペプチドを同定する目的で、約２０から１７０超のアミノ酸長の重複配列を含む７０個を超えるキャプシドペプチドを、血清学的確認のためにデザインし、合成した。次いで、最適なＢ細胞エピトープを有するキャプシドペプチドを、血清学的確認の方法によって同定した。長鎖及び短鎖のペプチドを用いるエピトープマッピングのためのこの方法は、非連続の立体配置的なエピトープ及び直鎖状エピトープを同定する（２４、２５）。実施例１に記載したＩＦＡ試験によって抗ＰＣＶ２キャプシドタンパク質の反応性について特徴づけられた２４個の血清のパネルを、該ペプチドの血清学的確認のために使用した。それらの血清を用いて、重複するＰＣＶ２キャプシドペプチドを、診断に有用であり且つ抗体によって媒介される防御的免疫原性の予測に有用とできる強力かつ一貫した抗原性についてスクリーニングした。このＰＣＶ２反応性パネルを構築するのに用いた血清は、自然感染を有すると見出された野外のブタまたはＰＣＶ２未感染であると判明している通常のブタおよびＳＰＦブタから回収され、その各々は、表３に示すＩＦＡによって力価測定された抗ＰＣＶ２キャプシドタンパク質反応性をそれぞれ有した。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
重複するペプチドのうち、約２０アミノ酸を含む短鎖ペプチドを、Applied BioSystems Inc.自動ペプチド合成装置Model 1433（Lexington, KY）で合成し；約２５から約１７０までのアミノ酸を含むより長鎖ペプチドを、Ｆｍｏｃ化学を用いて、Applied BioSystems Peptide Synthesizer Model 430A、431及び433を用いて合成した。
【００６９】
末端に対するＦｍｏｃ保護および三官能性アミノ酸の側鎖保護基を用いて、固相支持体上での独立した合成によって、各ペプチドを作製した。完成したペプチドを固体支持体から切り離し、９０％トリフルオロ酢酸によって側鎖保護基を除去した。合成ペプチド調製物を、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型（ＭＡＬＤＴＯＦ）質量分析によって正しい組成について、ならびに逆相ＨＰＬＣによって合成プロファイル、含有量および濃度を含む内容について特徴づけた。長い合成の場合、結合効率の厳格な管理にもかかわらず、アミノ酸の挿入、欠失、置換および中途での終結を含む伸長サイクル中の事象に起因してペプチド類似体も生成され、ゆえに、標的とされるペプチド合成物とともに複数のペプチド類似体が生成した。それにもかかわらず、そのようなペプチド類似体は、免疫診断用の固相抗原として、またはワクチン接種用の免疫原として免疫学的用途で使用されるとき、抗原性および免疫原性に寄与するものとしてペプチド調製物においてなおも好適であった。これらのペプチドを使用して最終生成物の再現性および有効性を保証するために、製造方法および生成物評価方法の両方をモニターする鑑定力のあるＱＣ手順が開発されている限り、概して、意図的にデザインしたか又は合成法によって副産物の混合物として生成した、そのようなペプチド類似体は、所望のペプチドの精製した調製物と同程度に有効であることが多い。
【００７０】
合成された様々な長さのペプチドの抗原性を、上記血清パネルを用いて最初の反応性プロファイルについて試験した。自然感染したブタ由来の血清パネル中に存在する抗体は、鎖長が長いほどＰＣＶ２キャプシドペプチドに対する反応性が高まるという傾向にしたがっていた。表３の下のパネルの血清を用いて取得された広範な血清学的スクリーニングデータの結果として、「Ｃａｐ１」と命名された１５４アミノ酸長の長いキャプシドペプチド（配列番号１）は、著しく高感度のＥＬＩＳＡをもたらした。そのＣａｐ１ペプチドはまた、表３の上のパネルに示すＩＦＡによって確証された陰性ブタ血清との低い反応性によって、このＥＬＩＳＡに対する高特異性をもたらした。実際に、ＰＣＶ感染したブタの主な血清学的反応性は、Ｃａｐ１  １５４ｍｅｒペプチド（配列番号１）とだけ関連した。ゆえに、ＰＣＶ２感染したブタにおいて示される血清学的反応性の大部分が、その長鎖ペプチド上でだけ提示されたＢ細胞エピトープのクラスターを認識する抗体に起因すると仮定することは合理的である。なお、その１５４ｍｅｒの予期し得ない免疫優性抗原性は、長く連続するエピトープ及び非連続のエピトープの列を提示するキャプシドタンパク質上の大きな露出面を表すその長鎖ペプチドと一致する。これらのエピトープは、Ｂ細胞抗体応答の刺激のために不可欠なＴヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに結合するＢ細胞エピトープを有する。
【実施例４】
【００７１】
ＣＡＰ１ペプチドベースのＥＬＩＳＡおよび天然のキャプシドベースのＩＦＡによる、最初の免疫原性の評価およびワクチン接種を受けた動物の抗体価の相関のための、ＰＣＶ２ＣＡＰ１ペプチドを用いて製剤化されたワクチンによるモルモットの免疫化
モルモットの免疫化
本発明のワクチンの例示される使用において、外来性Ｔｈエピトープとの結合を有しない（例えば、配列番号１）か、またはアミノ末端およびＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓ（配列番号７）スペーサを介したＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号２）などの外来性Ｔヘルパーエピトープとの共有結合を有する（例えば、配列番号６）Ｃａｐ１抗原ペプチドを有するペプチドを免疫原として有するワクチンを、商業上入手可能な油性ワクチン送達ビヒクルであるモンタニドISA 50V2を用いて油中水型エマルションに製剤化した。２群のモルモットを、表４に示すようにペプチドベースのワクチンで免疫化した。
【００７２】
これは、一連の抗体応答によって血清パネルを得るための通常使用される油中水型エマルション製剤において、外来性Ｔヘルパー部位であるＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号２）との共有結合を有するおよび有しないＣａｐ１ペプチド（配列番号１）の免疫原性を評価するために小動物において行われた最初の研究であった。結合していないＣａｐ１ペプチドは、配列番号１と命名された（表１）。スペーサを介してアミノ末端で外来性Ｔヘルパー部位に結合したＣａｐ１ペプチドは、配列番号６と命名された（表１）。３匹のDuncan Hartleyモルモット（雌、９週齢、４５０ｇ、ウイルスなし）の２つの実験群の各々を、表４に示す、このＰＣＶ２Ｃａｐ１ワクチン製剤の免疫原性研究において使用した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
各動物の筋肉内に免疫化した。Ａ群の場合、ペプチドＰＣＶ２Ｃａｐ１（配列番号１）を免疫原として用いた。これは、ブタワクチンのために通常使用されるオレイン酸マンニドおよび鉱油の油性アジュバント組成物であるモンタニド（商標）（MontanideＴＭ）ISA 50V2（Seppic, Paris France）を有し、等体積の水相のペプチドのＰＢＳ溶液で乳化した油中水型エマルションに製剤化された。Ｂ群に投与されたワクチンの場合、Ｃａｐ１ペプチドは、標的とされるＰＣＶ  Ｃａｐ１  Ｂ細胞エピトープとＵＢＩＴｈ（登録商標）３Ｔ細胞エピトープとを架橋する配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−εＮＬｙｓ（配列番号７）のスペーサを介してコンビナトリアル人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）３Ｔヘルパーエピトープ（配列番号２）にアミノ末端において共有結合的に結合し、配列番号６（表１）と命名されるペプチド免疫原が得られ、Ａ群に対して用いたような油中水型エマルションに製剤化された。Ａ群及びＢ群のモルモットに２５μｇの用量が、０週目（初回）および２週目（追加）に筋肉内経路によって投与された。ＥＬＩＳＡおよびＩＦＡの両方による血清の免疫原性試験のために、最初の免疫の０および４週間後（ｗｐｉ）に、そのモルモットから採血した。後述するように、共有結合的に結合するスペーサおよび人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）３を有しないペプチド免疫原（配列番号１）を有するワクチンは、抗Ｃａｐ１抗体応答を誘発した；配列番号６における、結合したＵＢＩＴｈ（登録商標）３Ｔヘルパーエピトープを用いることによって、いずれのアッセイ法によっても評価されるように、改善された免疫原性の証拠に対して、より印象的な抗キャプシド力価がもたらされた（表４）。
【００７５】
免疫原性の評価
デザイン化ＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチドワクチン製剤の免疫原性試験を、１ウェルあたり１００μＬにおいて２μｇ／ｍＬでウェル上にコーティングした固相抗原としてＰＣＶ２ペプチドＣａｐ１（配列番号１）を用いる標的ペプチドベースのＥＬＩＳＡにより、行った。１：１０から１：１０，０００まで段階希釈された実験動物の血清を試験し、陽性の力価を、希釈度の逆数（reciprocal dilution）のＬｏｇ１０として表現した。血清陽性のサンプルを群別にプールし、そのプールに対する免疫原性の結果を、Ｃａｐ１ＥＬＩＳＡおよびＩＦＡ法（免疫蛍光アッセイ）によって測定した。このように、Ｃａｐ１ペプチドに対する反応性によって評価したＥＬＩＳＡ免疫原性を、ＨＴＫ細胞株細胞内で発現した、完全長の天然形成のＰＣＶ２キャプシドタンパク質に対する反応性によって評価したＩＦＡ力価と比較した（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【００７６】
結果
Ａ群に対する結果は、油中水型エマルション中のＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド（配列番号１）が、２５μｇの用量において、人工Ｔｈエピトープ（配列番号２）への結合なしでそのままで免疫原性であったことを示している。多リジンスペーサを介してコンビナトリアル人工Ｔｈエピトープを付加することにより、ＥＬＩＳＡによって検出されるように免疫原性がおよそ５倍増強した（４．２６８−３．５７８＝０．６９Ｌｏｇ１０力価）。Ｃａｐ１  ＥＬＩＳＡを確証するために役立つＣａｐ１ベースのＥＬＩＳＡの結果との正の相関において、Ａ群及びＢ群に対する免疫原性を測定するための天然のキャプシドベースのＩＦＡ法もまた、Ｃａｐ１ペプチド単独（配列番号１）よりも人工Ｔｈエピトープに連結したＰＣＶ２ペプチド（配列番号６）について改善された応答を示唆したが、より正確でない免疫蛍光アッセイは、キメラの配列番号６免疫原の場合の４００に対して１００という４倍の改善しか示唆しなかった。同様に、ＵＢＩＴｈ（登録商標）３Ｔヘルパーエピトープ（配列番号２）との結合を有しないＣａｐ１ペプチド（配列番号１）または有するペプチド（配列番号６）で免疫化された子ブタもまた、配列番号２のＴヘルパーエピトープとの結合によって著しく改善された応答という強力な抗Ｃａｐ１抗体応答を示す（実施例５、表５）。
【００７７】
次いで、より免疫原性の配列番号６キメラペプチドを、モルモットにおいて、追加のアジュバントと共により高投与量で投与することによって、より上の範囲の免疫原性について試験した。ペプチド免疫原が表５記載の量でＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバント（配列番号８）（２７）と複合体化される、初回用量４００μｇを注射した後、２ｗｐｉにおいて、追加用量１００μｇのＣｐＧ増強免疫原を注射した。このより高投与量のＣｐＧ増強ワクチン接種プロトコルによって発揮された免疫原性は、ＥＬＩＳＡによって予想外の１０倍の免疫原性の増大をもたらし、これはＥＬＩＳＡ力価の増加と一致するが、ＩＦＡによって１６倍増大した。すなわち、表４に示すプールされたＢ群の４００というＩＦＡ力価と比較すると、より高投与量のＣｐＧ増強ワクチンプロトコルによって免疫化されたモルモット群は、１６００という印象的なＩＦＡ力価に達した。
【実施例５】
【００７８】
通常の農場で飼育された子ブタにおける、ＰＶＣ２ＣＡＰ１ペプチドワクチン製剤の様々な用量での免疫原性の評価
子ブタの免疫化
表５に示すように、特定病原体除去（ＳＰＦ）ではない、通常の農場の４週齢の子ブタ８０頭を、８つの群に分けた（１０頭の子ブタ／群）。これらの群を０および４週目にワクチンで筋肉内に免疫化した。該ワクチンは、ペプチドＣａｐ１（配列番号１）５０μｇおよびTween（登録商標）80；又はＵＢＩＴｈ（登録商標）３人工Ｔｈエピトープに結合したペプチドＣａｐ１（配列番号６）を５０〜４００μｇのいずれかを含む１：１（ｖ／ｖ）油中水型エマルションとしてモンタニドISA 50V2中に均質化した。様々な用量の配列番号６免疫原を、Tween（登録商標）80の存在下または非存在下において油中水型エマルションに製剤化する前に、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（配列番号７）と複合化するか（２７）又は複合化しなかった（表５）。
【００７９】
最初のワクチン接種時ならびに４および６ｗｐｉにおいてＥＬＩＳＡ解析用の血液サンプルを回収した。個別の血清を調製し、実施例２および３に記載されるＥＬＩＳＡによってＰＣＶ２抗体について調べた。各群からの血清をプールし、さらなるＥＬＩＳＡ試験に供した。
【００８０】
結果
その血清プールに対するＥＬＩＳＡによる免疫原性の結果を、表５および図２に群別に示す。すべてのワクチン製剤が、低い用量である５０μｇでさえも免疫原性だった。初回および追加の両方に対して低い５０μｇの用量で増強なしの免疫原Ｃａｐ１ペプチド（配列番号１）が投与された第８群の子ブタを除いて、各群の子ブタすべてが、第４週および第６週までに１：１，０００以上、群プールの場合は第６週までに１：１０，０００超というＥＬＩＳＡ力価の個別の免疫応答をもたらした。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
０、４、６および１０週目の個別のブタ由来の血清も、実施例１に記載したＩＦＡによる抗キャプシド抗体について評価した。そのＩＦＡ力価は、第１０週までの動物の大部分において４００〜１６００の範囲であると見出され、第３群由来のいくつかの血清が、ワクチンを２回投与された後に６，４００もの予想外に高いＩＦＡ力価を有した。これらのいずれのブタにおいても、注射部位の反応原性は見られなかった。
【００８３】
免疫化された子ブタ８０頭のうち、８頭が、表６に示すように、０週目の最初の免疫化の前にＩＦＡによって検出した母体由来抗体（ＭＤＡ）を有することがわかった。ＭＤＡは概して、台湾の通常の農場で飼育された子ブタに存在し、それらは通常、抗ＰＣＶキャプシド応答を阻害するように作用する。ＭＤＡを有する子ブタ８頭すべてにおいて、抗Ｃａｐ１抗体の力価が、投与された用量および製剤に関係なく、４週目と６週目との間で徐々に高まったと、ＥＬＩＳＡにより検出された（表６）。したがって、ＭＤＡを有する動物８頭のすべてにおいて、母体由来抗体が存在することによる干渉にもかかわらず、ＰＣＶ２Ｃａｐ１ワクチン製剤に対するワクチン反応が成功した。これは、本発明のワクチンに対する応答の明確な性質に対する証拠として役立つ。
【００８４】
最初の免疫化の１０週間後にＭＤＡ陽性動物２６、２７、８６及び８７から回収した免疫血清に対するＩＦＡ力価は、それぞれ６４００、３２００、３２００および３２００という前例のないＩＦＡ力価を有した。ＭＤＡを有する同等の子ブタを、不活性化ウイルスワクチンであるＰＣＶ２に対するFt. Dodge/Wyeth（現在のPfizer Animal Health）Suvaxyn（登録商標）ワクチン、及び組換え完全長ＰＣＶ２  ＯＲＦ２キャプシドタンパク質ワクチンであるBoehringer Ingleheim Inglevac（登録商標）CircoFLEX（登録商標）ワクチンを用いたＰＣＶ２ワクチン研究に含めた。それらの子ブタは、５０〜１００という通常の範囲を超えなかったＩＦＡ力価でそれらのワクチンに応答し、５〜１０％しか、最大４００のＩＦＡ力価に達しなかった。したがって、デザインされたＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド免疫原に対する応答の「明確な」性質は、本ペプチドベースのワクチンとすでに利用可能なタイプのＰＣＶ２ワクチンとを区別する。
【００８５】
【表６】
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【００８６】
研究期間全体にわたって、２回の様々なペプチドＣａｐ１ＰＣＶ２ワクチンによるワクチン接種を受けた８０頭のブタの生存率は９３％であったが、この通常の農場の同じ小屋に収容されていたワクチン接種を受けていない４００頭のブタの生存率は、８２％であった。ワクチン接種を受けたブタの生存率９３％は、この通常の農場の他の収容施設で飼育された５０００頭のブタの平均生存率８０％に対して大きな改善である。この免疫原性研究に対する意図されない結果であるこの予想される損失数の顕著な減少によって、Ｃａｐ１ペプチドベースのＰＣＶ２ワクチンの有効性がさらに立証された。
【００８７】
要約すると、Ｃａｐ１ペプチドＰＣＶ２ワクチンは、４週目のＥＬＩＳＡ力価で示すようにほんの１回の投与によって著しい免疫原性を示し、２回投与した後の第６週までに優れた免疫原性を示した（第３群の動物においてＩＦＡ力価が６４００もの高さに達した）。母体由来抗体を有すると見出される動物８頭の全てが、投与量及び製剤に関係なく、Ｃａｐ１ワクチンに対して免疫原性の応答を有した。同じ建物に収容されていたワクチン接種を受けていない４００頭の子ブタの生存率８２％と比較して、及びこの通常の農場の他の施設に収容されていた別の５０００頭のブタの生存率８０％と比較して、デザインされたペプチドベースのＰＣＶ２ワクチンは、ワクチン接種を受けた通常の（非ＳＰＦ）子ブタに９３％という生存率をもたらすため、著しい経済利益に対する証拠が提供された。
【実施例６】
【００８８】
ＰＣＶ２のＯＲＦ１及びＯＲＦ３タンパク質由来のクラスター化Ｔヘルパー細胞ペプチドの製剤化に加えてワンショット保護用に改善されたＣＡＰ１ペプチドＰＣＶ２ワクチン
Ｃａｐ１ペプチドＰＣＶ２ワクチンの免疫原性は、表１に示すＯＲＦ１およびＯＲＦ３によってコードされるＰＣＶ２  Ｔ細胞エピトープペプチドを組み込むことによってさらに改善された。これらのエピトープは、最初に、Stevensonらによって、ブタにおけるＴ細胞増殖の誘導について試験された（１２）。３つの短鎖ＰＣＶ２  Ｔｈペプチド（配列番号３、４および５）の等モル組合せと１：１から１：０．１〜１：０．０５のモル比で混合したＰＣＶ２Ｃａｐ１ペプチド（例えば、配列番号１又は６）を、エマルション調製の前に水相中に製剤化した。これらの免疫優性ＰＣＶ２  Ｔｈエピトープが補充されたＰＣＶ２Ｃａｐ１ワクチン製剤を子ブタで試験することにより、単回のワクチン投与後の、サイトカイン産生を含むＰＣＶ２に関連するＴ細胞応答の刺激を介した免疫応答に対する効果を判定した。
【００８９】
結果
表７に示すように、補助的なＰＣＶ２  Ｔｈペプチドを有する、より低用量のＰＣＶ２Ｃａｐ１ワクチン製剤が投与された子ブタにおいて、著しく増加したＩＦＡ力価が観察された。３つの追加のＰＣＶ２  Ｔｈペプチド免疫原を含まない配列番号６Ｃａｐ１免疫原を２００μｇ有するワクチンを１回投与した、第９群の子ブタの４週目に見られたＩＦＡ力価：＜５０から５０と比較して、３つのＰＣＶ２  Ｔヘルパーペプチド免疫原（配列番号３、４、５）２０μｇと混合した、結合したＵＢＩＴｈ（登録商標）３を有するＣａｐ１ペプチド免疫原（配列番号６）を５０μｇ有するワクチンを１回投与した、第１０群の子ブタの第４週までのＩＦＡ力価：５０〜４００がもたらされた。
【００９０】
よって、他のＰＣＶ２タンパク質由来の免疫優性Ｔｈペプチド（配列番号３、４および５）の等モル混合物とともに主にＢ細胞エピトープがクラスター化されたＰＣＶ２キャプシドペプチド（配列番号６）を含むワクチン製剤は、バランスのとれたＢ細胞抗体応答とＴ細胞応答を維持しつつ、より少ない総用量の免疫原含有量を可能にすることによって免疫原の節約をもたらし、それにより、より低用量のペプチド免疫原によって、感染に対する効果的な防御免疫応答が発揮された。ＵＢＩＴｈ（登録商標）３が結合していないＣａｐ１免疫原（配列番号１）が、補助的なＴｈ免疫原を含むおよび含まない同等のワクチン製剤中の標的Ｂ細胞免疫原性ペプチドであるとき、その３つの補助的なＰＣＶ  Ｔｈペプチドによって、著しい免疫原節約の結果も得られた（表８）。この結果では、補助的なＴｈペプチド１０μｇと共に配列番号１  ５０μｇを有する用量が、３つの補助的なＴｈペプチドを含まない配列番号１の用量１００μｇおよび２００μｇよりも有効であった。そのような組合せＣａｐ１ワクチン製剤は、緊急時の使用が意図された安価な低用量のワンショットワクチンとして供給されるとき、特に有効であるはずである。
【００９１】
【表７】
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【実施例７】
【００９２】
ＰＣＶ２に感染したブタへの曝露によって引き起こされるウイルスの伝播および病原性から子ブタを保護する能力について試験されたＣＡＰ１ペプチドＰＣＶ２ワクチン
種々の用量および製剤においてＣａｐ１ペプチドＰＣＶ２ワクチンが防御免疫を誘発する能力を評価する野外試験をデザインした。別の病原体を有しないＰＣＶ２感染子ブタと一緒に収容することによってＰＣＶ２に曝露されたＳＰＦ（特定病原体除去）子ブタに、Ｃａｐ１ワクチンでワクチン接種した。特別に収容したトランスジェニックブタの、ＰＣＶ２の自然伝播による感染に対する脆弱性を試験するのに設計したこれらの条件は、ＰＣＶ２ワクチンによって提供される防御免疫の評価に理想的に適している。
【００９３】
ＰＣＶ２に感染した動物および無菌動物に対する収容条件
この野外試験のために使用された施設は、台湾北部のXiang Hill Ranchにおける「トランスジェニック動物試験場（Transgenic Animal Testing Station）」（ＴＡＴＳ）である。ＴＡＴＳは、野外に意図的に開放する前に隔離下で維持されるトランスジェニックブタの安全性試験のために使用されている。ＴＡＴＳは、台湾動物工業研究所の動物薬学部（Department of Animal Medicine of the Animal Technology Institute of Taiwan）（ＡＴＩＴ）によって管理されている（２３）。この研究所、動物収容および動物管理の慣行は、ＩＳＯ／ＩＥＣ１７０２５：２００５およびＩＳＯ９００１（ＳＧＳ  ＴＷ０７／０３５６５）のガイドラインに従っている。この農場のトランスジェニックブタは、ブタコレラ（Classical Swine Fever）、仮性狂犬病ウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタコレラ（hog cholera）ウイルス、萎縮性鼻炎、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）、口蹄疫ウイルス、ブタの赤痢、疥癬、トキソプラズマおよびアクチオバシラス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）に対する観察および定期検査によって、ＳＰＦ状態について日常的にモニターされている。日常的なモニタリングから、これらの感染症および感染物質の存在に対する証拠は見出されなかった。
【００９４】
さらに、実施例１に記載された最近開発されたＩＦＡ検査によるＰＣＶ２感染に対する試験が、過去２年間用いられており、このブタ集団は、広範なＰＣＶ２感染を有すると見出された。血清学的サーベイランスによって測定された、この農場のＰＣＶ２陽性率は、８９．４％（４７／５２）もの高さに達した。これらの別のＳＰＦ動物は、唯一の循環病原体としてＰＣＶ２を有する。
【００９５】
ＰＣＶ２ワクチン接種および曝露に対する条件
この「ＰＣＶ２だけの」環境から無菌子ブタを選択することを、最初は血清中、後に初乳中のＰＣＶ２抗体が陰性である妊娠中の雌ブタを、ＰＣＶ２のＩＦＡ力価で、同定することによって、開始した。血清および初乳の双方が陰性であった雌ブタからの子ブタを、約４週齢においてこの試験に登録した。この時点で、その無菌子ブタを５つの群にランダムに分けた（ワクチン群１１〜１３については１群あたり５頭の子ブタ、ワクチン群１４については１５頭の子ブタ、およびコントロール群１５については６頭の子ブタ）。次いで、ワクチン群に、表８に記載する初回用量のＰＣＶ２Ｃａｐ１ワクチン（配列番号１  １００μｇ又は２００μｇ、もしくは配列番号１  ５０μｇ＋等重量の配列番号３、４及び５  ５０μｇ又は配列番号１  ５０μｇ＋等重量の配列番号３、４及び５  １０μｇのいずれか）を筋肉内注射（ｉ．ｍ．）によって投与した。最初の免疫化の４週間後（ｗｐｉ）に、同じワクチンをその群に追加用量投与した。２、６および１０ｗｐｉにおいて抗体応答をＩＦＡによってモニターした。ＩＦＡ力価は、表８に示すように、２ｗｐｉにおける全ての群に対して、ベースラインレベルであった。ワクチン接種を受けたすべての群に対して第６週までに高い抗体応答が達成されたが、それらの群に対する免疫原性は、６および１０ｗｐｉにおいて様々だった。コントロール群に対する力価は、血清学的試験の期間全体にわたってベースラインに留まっていた。
【００９６】
ワクチン接種を受けた群およびコントロール群の双方の無菌子ブタを、「ＰＣＶ２のみ」のトランスジェニックブタの母集団と一緒の小屋に約２ヶ月間収容して、ＰＣＶ２の伝播に対するリスクに曝した。この期間の後、すべての実験ブタの体重がおよそ１２０ｋｇ生体重に達したら（５〜６月齢）、その動物を屠殺し、剖検によってＰＣＶ２感染の証拠について調べた。
【００９７】
その２ヶ月間の曝露期間の回復後、ＰＣＶ２感染の徴候はわずかであり、ＰＣＶ２感染中に出現する多くの病理学的病変は見られなかった。よって、剖検手順、即ち伝播された病原体による感染の徴候についてワクチン／負荷研究または野外試験のワクチン接種を受けた動物を調べるために用いられる通常のより直接的な方法よりも感度の高い診断を提供する手順を、ワクチン接種を受けた／曝露された動物における感染を検出する方法として用いた。剖検検査は、リンパ節、肺および腎臓の観察を含んだ。コントロール動物の腎臓における病変の徴候を除いて、感染に対する証拠はほとんど見出されなかった。図３Ａ（＊）に示すように、ワクチン接種を受けていない感染動物の腎臓の表面上に線維症の徴候として白色の斑点および条斑が保持されていたが、病変の履歴を特徴づけるそのような徴候は、図３Ｂに示すように病変を有しないとスコア付けされたワクチン接種を受けたブタの腎臓には存在しなかった（図３Ｂに見られる鈍い白色の条斑は反射光である（＊＊））。
【００９８】
表９に示す実験ブタに対する剖検からスコア付けされた病理学の結果は、以前の感染を主に示唆する腎被膜上の白色の斑点として得られた。この試験は、ＰＣＶ２ペプチドワクチン製剤を用いてコードのもとに行われた。
【００９９】
結果および結論
コントロール試験群およびワクチン試験群の両方に対するＰＣＶ２  ＩＦＡによるＰＣＶ２抗体価の結果である表８から、ワクチン接種を受けた動物において、より高い応答によって１０ｗｐｉまで時間とともに抗体応答が増大することがわかる。Ｃａｐ１ペプチドベースのＰＣＶ２ワクチン製剤の免疫原性は様々であり、最大の群である第１４群に投与された製剤が最も免疫原性であった。
【０１００】
コントロール群の６頭のうち３頭のブタ（５０％）が、ＰＣＶ２感染の履歴を特徴づける典型的な病変として腎被膜上に白色の斑点を有すると見出された（図３Ａ）。コントロールブタのうちの１頭が、わずかな病変を有し、２頭が、中程度の病変を有した。対照的に、ワクチン接種を受けた３０頭のうち２頭のブタ（６．７％）だけが、病理学的変化を示し、これらの両方が、腎臓病理学のわずかな証拠を有するとスコア付けされた（表９）。これらの２頭は、１５頭のブタを含むワクチン接種を受けたブタの最大の群である第１４群だけに見られた。病理学的変化は、ワクチン接種を受けたブタのリンパ節および肺では全く観察されず、ワクチン接種を受けたブタのうち２頭に対してわずかな腎臓病変だけが観察された。よって、本開示のペプチドベースのＰＣＶ２ワクチンの複数の製剤および用量に対して、防御的な有効性が立証される。
【０１０１】
本明細書において、本発明者らは、可能性のある全ての変形を徹底的に列挙するようには試みなかった。代替の態様が、本発明の特定の一部に対して示されていない可能性があること、および記載された一部の異なる組み合わせによって生じる可能性があること、または他の記載されていない代替の態様が、ある一部に対して利用可能であり得ることは、それらの代替の態様の否認とみなされるべきでない。記載されていない態様の多くが以下の請求項の文字通りの範囲内であり、その他のものが等価であることが認識されるだろう。さらに、本明細書全体にわたって引用される全ての参考文献、刊行物、米国特許及び米国特許出願公報は、本明細書中に完全に示されたかのように本明細書によって参照として援用される。
【０１０２】
【表８】
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【０１０３】
【表９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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