(57)【要約】  本発明は、Nrf2活性化剤を含有してなる、糖尿病の予防または治療剤、およびNrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法を提供する。これにより、新たな作用機序を持つ糖尿病の予防または治療剤が提供されている。
2013146911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Nrf2活性化剤を含有してなる、糖尿病の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項２】
Nrf2活性化剤のみを有効成分として含有し、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善効果を併せもつことを特徴とする、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Nrf2活性化剤を含有してなる、β細胞保護用医薬組成物。
【請求項４】
Nrf2活性化剤を含有してなる、耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制用医薬組成物。
【請求項５】
Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン抵抗性改善用医薬組成物。
【請求項６】
骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
骨格筋のエネルギー代謝亢進作用及び肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Nrf2活性化剤を含有してなる、骨格筋のエネルギー代謝亢進用医薬組成物。
【請求項９】
Nrf2活性化剤を含有してなる、骨格筋のエネルギー代謝亢進用および肝臓の糖新生抑制用医薬組成物。
【請求項１０】
Nrf2活性化剤を含有してなる、β細胞の機能不全下における高血糖の改善用医薬組成物。
【請求項１１】
Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン非依存性の血糖値低下用医薬組成物。
【請求項１２】
Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン製剤の用量低減用医薬組成物。
【請求項１３】
Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性、およびNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびにNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびに肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化２９】
2013146911.tif 000036
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、請求項1乃至12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
Nrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
１）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、および
２）２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
Nrf2活性として、Cpt1bの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
Nrf2活性として、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
Nrf2活性として、Nr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
Nrf2活性として、Cpt1bの発現レベルの上昇およびNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
Nrf2活性として、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇ならびにNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
Nrf2活性として、骨格筋細胞におけるCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇ならびに肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２７】
Nrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
１）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
２）２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および
３）前記２）の工程で選択された試験化合物について、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
Nrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
１）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
２）２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および
３）前記２）の工程で選択された試験化合物について、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有することを確認する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記１）の工程において、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することを特徴とする、請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３０】
前記３）の工程において、Cpt1bに加え、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
前記３）の工程において、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
前記３）の工程において、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1b およびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
前記３）の工程において、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、骨格筋細胞におけるCpt1b およびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、請求項28に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の予防または治療剤およびそのスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリン作用不足によってもたらされる、持続的な高血糖状態を特徴とする慢性的な代謝性疾患である。インスリン作用不足の原因には、インスリン分泌不全と、インスリン抵抗性の２つがある。インスリン分泌不全は、インスリン分泌を行う膵臓のβ細胞の機能不全に起因する。１型糖尿病では、自己免疫によりβ細胞が破壊され、インスリン分泌不全となる。インスリン抵抗性とは、インスリン分泌は十分であるのに血糖値が下がらない状態であり、骨格筋、脂肪組織および肝臓といったインスリンが作用する主要な組織において、インスリンが十分に作用しないことを意味する。インスリンは、骨格筋においては糖取り込みおよびグリコーゲン合成促進、脂肪組織においては糖取り込みおよび脂肪の合成促進、肝臓においては糖新生の抑制などに働く。インスリン抵抗性がある場合は、各組織におけるこれらの反応が鈍化する。２型糖尿病では、インスリン分泌不全と、インスリン抵抗性の両者が関与する。肥満、過食、運動不足、ストレスといった環境因子は、インスリン抵抗性を惹起し高血糖状態をもたらす。高血糖はβ細胞からの過剰なインスリン分泌を促し、β細胞を疲弊させる。また、高血糖による糖毒性は、β細胞を障害するとともに、インスリン抵抗性を増悪する。病状が進むとβ細胞の機能不全によりインスリン分泌が低下し、インスリン抵抗性とあいまって更なる高血糖状態となる。【０００３】
糖尿病の治療においては、血糖値を正常域に低下させることが目標とされている。その作用機序は、大きくはインスリン分泌促進、インスリン抵抗性改善、および糖吸収抑制に分けられる。既存の糖尿病治療薬としては、インスリン、α‐グリコシダーゼ阻害薬（ボグリボース、アカルボースなど）、速効性インスリン分泌促進薬（ナテグリニド、ミチグリニドなど）、スルホニル尿素薬（グリメピリド、グリクラジドなど）、ＧＬＰ−１受容体作動薬（リラグルチド、エキセナチドなど）、ＤＰＰ−４阻害薬（シタグリプチン、ビルダグリプチンなど）、ビグアナイド薬（メトホルミンなど）、チアゾリジン薬（ピオグリタゾンなど）などが用いられている。α‐グリコシダーゼ阻害薬は、腸官からの糖の吸収を遅らせて食後高血糖を抑制する。速効性インスリン分泌促進薬、スルホニル尿素薬およびＧＬＰ−１受容体作動薬は、β細胞を刺激しインスリン分泌を促進する。ＤＰＰ−４阻害薬は、インクレチン（ＧＬＰ−１およびＧＩＰ）の分解を抑制することでインスリン分泌を促進する。ビグアナイド薬は主に肝臓での糖新生を抑制し、インスリン抵抗性を改善する。チアゾリジン薬は、骨格筋と脂肪組織における糖取り込み、グリコーゲン合成、脂肪合成を促進し、肝臓からの糖放出を抑制して、インスリン抵抗性を改善する。【０００４】
糖尿病については、様々な治療薬が上市されているが、既存の治療薬に抵抗性を示す患者や難治性の患者が存在し、新たな糖尿病の治療方法へのニーズが依然として存在する。また、糖尿病の病態は、インスリン分泌不全とインスリン抵抗性が複雑に関与しており、単独の薬剤では血糖値のコントロールが困難な症例が多く、異なる作用機序を持つ薬剤を組み合わせて用いることが多く行われている。既存とは異なる新たな作用機序をもつ糖尿病薬が提供されれば、治療の選択肢が広がり、患者の病態に即した、より適切な治療が可能となることが期待される。【０００５】
Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)はCNC (Cap’n’collar)転写因子ファミリーに属し、酸化ストレスや親電子性のストレスから細胞を保護する役割を有する。非ストレス条件下では、Nrf2は、細胞質でKeap1によって捕捉され、ユビキチン化を介してプロテアソーム分解される。酸化ストレス、親電子性剤などはKeap1を不活性化し、これによりNrf2は細胞質から核内に移行してMafタンパク質とヘテロ二量体を形成することでARE配列(Antioxidant response element)あるいはEpRE(Electrophil response element)配列に結合し、標的遺伝子を活性化する。Nrf2は抗酸化遺伝子（heme oxygenase 1（Hmox1）、γ-glutamylcysteine ligase（Gcl）、thioredoxin reductase 1（Txrnd1）など）や解毒代謝遺伝子（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1（Nqo1）、glutathione-S-transferases （Gsts）、UDP-glucuronosyltransferase 1A6（Ugt1a6）など）を含め、細胞保護作用を有する遺伝子群の発現を制御する。【０００６】
Nrf2と糖尿病の関係についてはいくつかの報告がある。Nrf2欠失マウスでは、streptozotocin(STZ)投与でβ細胞を破壊することにより１型糖尿病を発症させた場合、高血糖が悪化することが報告されており、肝臓において糖新生関連遺伝子Glucose-6-phosphatase（G6pc）およびphosphoenolpyruvate carboxylase（PEPCK, Pck1）の発現を上昇させることが報告されている（非特許文献１）。Nrf2活性化能をもつとされている化合物sulforaphaneは、STZ誘発１型糖尿病マウスのβ細胞障害を保護したとの報告がある（非特許文献２）。Nrf2活性化能をもつとされている化合物lithospermic acid B(LAB)は、2型糖尿病モデルラットのβ細胞障害を保護したとの報告がある（非特許文献３）。抗がん剤として臨床試験が行われており、Nrf2活性化能をもつとされている化合物oltiprazは、脂肪組織でのインスリンシグナルを改善し、高脂肪食摂取により引き起こされる肝臓の糖新生亢進を阻害することでインスリン抵抗性を予防するとの報告がある（非特許文献４）。米国において糖尿病性腎症の治療薬として臨床試験が行われていた化合物bardoxolone methyl(CDDO-Me)は、Nrf2活性化能を有するとされている（非特許文献５）。CDDO-Meは、２型糖尿病モデルであるdb/dbマウスにおいて血糖値を低下させ、骨格筋の糖取り込みを促進したとの報告がある（非特許文献６）。また、CDDO-Meは、肝細胞において糖新生を抑制し、G6PcおよびPEPCKの発現レベルを低下させたことが報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】L.M.Aleksunesら、The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics Vol.333 pp.140-151 (2010)
【非特許文献２】MY.Songら、Toxicology and Applied Pharmacology Vol.235 pp.57-67 (2009)
【非特許文献３】BW.Leeら、Toxicology and Applied Pharmacology Vol.252 pp.47-54 (2011)
【非特許文献４】Z.Yuら、Diabetologia Vol.54 pp.922-934 (2011)
【非特許文献５】P.E.Pergolaら、The New England Journal of Medicine Vol.365 pp.327-336 (2011)
【非特許文献６】P.K.Sahaら、The Journal of Biological Chemistry Vol.285 pp.40581-40592 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、様々な種類の糖尿病の治療剤が上市されているが、既存の治療薬に抵抗性を示す患者や難治性の患者が存在する。このような状況下、新たな作用機序を持つ糖尿病の予防または治療剤が切望されている。特に、β細胞を保護する機能と、インスリン抵抗性を改善する作用を併せ持つ治療薬はこれまでに知られていない。また、β細胞刺激によるインスリン分泌促進は、いずれβ細胞の疲弊をまねくおそれがあり、かつβ細胞機能不全下においては効果が発揮できないことから、インスリン分泌促進とは異なる作用機序で血糖値を低下させることのできる新たな治療薬が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Nrf2を遺伝学的に活性化したマウスにおいて、血糖低下、β細胞保護、インスリン抵抗性改善などの抗糖尿病作用が認められ、インスリン抵抗性改善には骨格筋のエネルギー代謝亢進および／または肝臓の糖新生抑制が関与していることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、糖尿病の予防または治療剤、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法などを提供する。【００１０】
1.糖尿病の予防または治療剤
[1-1] Nrf2活性化剤を含有してなる、糖尿病の予防または治療用の医薬組成物。
[1-2] Nrf2活性化剤のみを有効成分として含有し、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善作用を併せもつことを特徴とする、上記[1-1]に記載の医薬組成物。
[1-3] Nrf2活性化剤を含有してなる、β細胞保護用医薬組成物。
[1-4] Nrf2活性化剤を含有してなる、耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制用医薬組成物。
[1-5] Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン抵抗性改善用医薬組成物。
[1-6] 骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とする、上記[1-1]乃至[1-5] のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-6A] 肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、上記[1-1]乃至[1-5]のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[1-6B] 骨格筋のエネルギー代謝亢進作用及び肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、上記[1-1]乃至[1-5]のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[1-7] Nrf2活性化剤を含有してなる、骨格筋のエネルギー代謝亢進用医薬組成物。
[1-7A] Nrf2活性化剤を含有してなる、肝臓の糖新生抑制用医薬組成物。
[1-7B] Nrf2活性化剤を含有してなる、骨格筋のエネルギー代謝亢進用および肝臓の糖新生抑制用医薬組成物。
[1-8] Nrf2活性化剤を含有してなる、β細胞の機能不全下における高血糖の改善用医薬組成物。
[1-9] Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン非依存性の血糖値低下用医薬組成物。
[1-10] Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン製剤の用量低減用医薬組成物。
[1-11] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-11A] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10] のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-11B] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-11C] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12A] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10] のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12B] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12C] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12D] Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12E] Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12F] Nrf2活性化剤が、肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12G] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびNr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12H] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性、およびNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12I] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性、および肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12J] Nrf2活性化剤が、Cpt1b、PGC1αおよびNr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12K] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびにNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-12L] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびに肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[1-1]乃至[1-10]、[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-13] Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化１】
2013146911.tif 000003
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ３ は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、上記[1-1]乃至[1-10] のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-13A] Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化２】
2013146911.tif 000004
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ３ は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、上記[1-6A]、[1-6B] 、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-14] Nrf2活性化剤が、下記式：
【化３】
2013146911.tif 000005
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）で表される化合物、または
下記式：
【化４】
2013146911.tif 000006
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化５】
2013146911.tif 000007
である。）で表される化合物
である、上記[1-1]乃至[1-10] のいずれか１項に記載の医薬組成物。
[1-14A] Nrf2活性化剤が、下記式：
【化６】
2013146911.tif 000008
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）で表される化合物、または
下記式：
【化７】
2013146911.tif 000009
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化８】
2013146911.tif 000010
である。）で表される化合物
である、上記[1-6A]、[1-6B]、[1-7A]および[1-7B]のいずれか１項に記載の医薬組成物。
2. 糖尿病の予防または治療方法
[2-1] 糖尿病の予防または治療を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、糖尿病の予防または治療方法。
[2-2] 前記Nrf2活性化剤が、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善作用を併せもつものである、上記[2-1]に記載の方法。
[2-3] β細胞保護を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、β細胞保護方法。
[2-4] 耐糖能異常における２型糖尿病の発症の抑制を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制方法。
[2-5] インスリン抵抗性改善を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、インスリン抵抗性改善方法。
[2-6] 前記Nrf2活性化剤が骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とする、上記[2-1]乃至[2-5] のいずれか１項に記載の方法。
[2-6A] 前記Nrf2活性化剤が肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、上記[2-1]乃至[2-5]のいずれか1項に記載の方法。
[2-6B] 前記Nrf2活性化剤が骨格筋のエネルギー代謝亢進作用及び肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、上記[2-1]乃至[2-5]のいずれか1項に記載の方法。
[2-7] 骨格筋のエネルギー代謝亢進を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、骨格筋のエネルギー代謝亢進方法。
[2-7A] 肝臓の糖新生抑制を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、肝臓の糖新生抑制方法。
[2-7B] 骨格筋のエネルギー代謝亢進および肝臓の糖新生抑制を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、骨格筋のエネルギー代謝亢進および肝臓の糖新生抑制方法。
[2-8] β細胞の機能不全下における高血糖の改善を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、β細胞の機能不全下における高血糖の改善方法。
[2-9] インスリン非依存性の血糖値低下を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、インスリン非依存性の血糖値低下方法。
[2-10] インスリン製剤の用量低減を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、インスリン製剤の用量低減方法。
[2-11] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-11A] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10] のいずれか１項に記載の方法。
[2-11B] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-11C] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12A] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10] のいずれか１項に記載の方法。
[2-12B] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12C] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12D] Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12E] Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12F] Nrf2活性化剤が、肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12G] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびNr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12H] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性、およびNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12I] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性、および肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12J] Nrf2活性化剤が、Cpt1b、PGC1αおよびNr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12K] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびにNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-12L] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびに肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[2-1]乃至[2-10]、[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-13] Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化９】
2013146911.tif 000011
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、上記[2-1]乃至[2-10] のいずれか１項に記載の方法。
[2-13A] Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化１０】
2013146911.tif 000012
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、上記[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
[2-14] Nrf2活性化剤が、下記式：
【化１１】
2013146911.tif 000013
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）で表される化合物、または
下記式：
【化１２】
2013146911.tif 000014
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化１３】
2013146911.tif 000015
である。）で表される化合物
である、上記[2-1]乃至[2-10] のいずれか１項に記載の方法。
[2-14A] Nrf2活性化剤が、下記式：
【化１４】
2013146911.tif 000016
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）で表される化合物、または
下記式：
【化１５】
2013146911.tif 000017
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化１６】
2013146911.tif 000018
である。）で表される化合物
である、上記[2-6A]、[2-6B]、[2-7A]および[2-7B]のいずれか１項に記載の方法。
3. 糖尿病の予防または治療のためのNrf2活性化剤の使用
[3-1] 糖尿病の予防または治療用の医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-2] 前記医薬組成物が、Nrf2活性化剤のみを有効成分として含有し、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善作用を併せもつことを特徴とする、上記[3-1]に記載の使用。
[3-3] β細胞保護用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-4] 耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-5] インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-6] 前記Nrf2活性化剤が骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とする、上記[3-1]乃至[3-5] のいずれか１項に記載の使用。
[3-6A] 前記Nrf2活性化剤が肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、上記[3-1]乃至[3-5]のいずれか1項に記載の使用。
[3-6B] 前記Nrf2活性化剤が骨格筋のエネルギー代謝亢進作用及び肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする、上記[3-1]乃至[3-5]のいずれか1項に記載の使用。
[3-7] 骨格筋のエネルギー代謝亢進用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-7A] 肝臓の糖新生抑制用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-7B] 骨格筋のエネルギー代謝亢進用および肝臓の糖新生抑制用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-8] β細胞の機能不全下における高血糖の改善用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-9] インスリン非依存性の血糖値低下用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-10] インスリン製剤の用量低減用医薬組成物の製造におけるNrf2活性化剤の使用。
[3-11] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]のいずれか１項に記載の使用。
[3-11A] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10] のいずれか１項に記載の使用。
[3-11B] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-11C] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12A] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10] のいずれか１項に記載の使用。
[3-12B] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12C] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12D] Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12E] Nrf2活性化剤が、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12F] Nrf2活性化剤が、肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12G] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびNr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12H] Nrf2活性化剤が、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性、およびNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12I] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性、および肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12J] Nrf2活性化剤が、Cpt1b、PGC1αおよびNr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12K] Nrf2活性化剤が、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびにNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-12L] Nrf2活性化剤が、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびに肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものである、上記[3-1]乃至[3-10]、[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-13] Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化１７】
2013146911.tif 000019
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、上記[3-1]乃至[3-10] のいずれか１項に記載の使用。
[3-13A] Nrf2活性化剤が、下記式(I)：
【化１８】
2013146911.tif 000020
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である））で表される化合物である、上記[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
[3-14] Nrf2活性化剤が、下記式：
【化１９】
2013146911.tif 000021
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）で表される化合物、または
下記式：
【化２０】
2013146911.tif 000022
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化２１】
2013146911.tif 000023
である。）で表される化合物
である、上記[3-1]乃至[3-10] のいずれか１項に記載の使用。
[3-14A] Nrf2活性化剤が、下記式：
【化２２】
2013146911.tif 000024
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）で表される化合物、または
下記式：
【化２３】
2013146911.tif 000025
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化２４】
2013146911.tif 000026
である。）で表される化合物
である、上記[3-6A]、[3-6B]、[3-7A]および[3-7B]のいずれか１項に記載の使用。
4. 糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法
[4-1] Nrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
１）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、および
２）２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする方法。
[4-2] Nrf2活性として、Cpt1bの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-2A] Nrf2活性として、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3] Nrf2活性として、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3A] Nrf2活性として、骨格筋細胞におけるCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3B] Nrf2活性として、Nr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3C] Nrf2活性として、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3D] Nrf2活性として、Cpt1bの発現レベルの上昇およびNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3E] Nrf2活性として、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルの上昇および肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3F] Nrf2活性として、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇ならびにNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-3G] Nrf2活性として、骨格筋細胞におけるCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇ならびに肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記[4-1]に記載の方法。
[4-4] Nrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
１）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
２）２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および
３）前記２）の工程で選択された試験化合物について、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認する工程、
を含むことを特徴とする方法。
[4-4A] 前記３）の工程において、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4]に記載の方法。
[4-4B] Nrf2活性化活性を指標として、糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
１）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
２）２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および
３）前記２）の工程で選択された試験化合物について、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有することを確認する工程、
を含むことを特徴とする方法。
[4-4C] 前記３）の工程において、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4B]に記載の方法。
[4-5]  前記１）の工程において、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することを特徴とする、上記[4-4]に記載の方法。
[4-5A]  前記１）の工程において、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することを特徴とする、上記[4-4A]、[4-4B]および[4-4C]のいずれか１項に記載の方法。
[4-6]  前記３）の工程において、Cpt1bに加え、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4]に記載の方法。
[4-6A]  前記３）の工程において、骨格筋細胞における、Cpt1bに加え、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4]に記載の方法。
[4-6B] 前記３）の工程において、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4B]に記載の方法。
[4-6C] 前記３）の工程において、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4B]に記載の方法。
[4-6D] 前記３）の工程において、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1b およびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4B]に記載の方法。
[4-6E] 前記３）の工程において、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、骨格筋細胞におけるCpt1b およびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記[4-4B]に記載の方法。
[4-6F]  前記１）の工程において、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することを特徴とする、上記[4-6]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、および[4-6E]のいずれか１項に記載の方法。
[4-7]  糖尿病の予防または治療剤が、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善作用を併せもつことを特徴とする、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-7A]  糖尿病の予防または治療剤が、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善作用を併せもつことを特徴とする、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-8]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とするβ細胞保護剤である、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-8A]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とするβ細胞保護剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-8B]  糖尿病の予防または治療剤が、肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とするβ細胞保護剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-8C]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用および肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とするβ細胞保護剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-9]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とする耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制剤である、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-9A]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とする耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-9B]  糖尿病の予防または治療剤が、肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-9C]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用および肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とする耐糖能異常における２型糖尿病の発症抑制剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-10]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤である、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-10A]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用を有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-10B]  糖尿病の予防または治療剤が、肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-10C]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進作用および肝臓の糖新生抑制作用を有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-11]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤である、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-11A]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-11B]  糖尿病の予防または治療剤が、肝臓の糖新生抑制剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-11C]  糖尿病の予防または治療剤が、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤および肝臓の糖新生抑制剤である、上記[4-1]乃至[4-6]、[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-12]  糖尿病の予防または治療剤が、β細胞の機能不全下における高血糖の改善剤である、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-12A]  糖尿病の予防または治療剤が、β細胞の機能不全下における高血糖の改善剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-13]  糖尿病の予防または治療剤が、インスリン非依存性の血糖値低下剤である、上記[4-1]乃至[4-6] のいずれか１項に記載の方法。
[4-13A]  糖尿病の予防または治療剤が、インスリン非依存性の血糖値低下剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
[4-14]  糖尿病の予防または治療剤が、インスリン製剤の用量低減剤である、上記[4-1]乃至[4-5] のいずれか１項に記載の方法。
[4-14A]  糖尿病の予防または治療剤が、インスリン製剤の用量低減剤である、上記[4-2A]、[4-3A]、[4-3B]、[4-3C]、[4-3D]、[4-3E]、[4-3F]、[4-3G]、[4-4A]、[4-4B]、[4-4C]、[4-5A]、[4-6A]、[4-6B]、[4-6C]、[4-6D]、[4-6E]および[4-6F]のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、新たな作用機序をもつ抗糖尿病薬として、Nrf2活性化剤を提供する。Nrf2活性化剤は、β細胞を保護する機能と、インスリン抵抗性を改善する作用を併せ持つ。また、Nrf2活性化剤は骨格筋のエネルギー代謝亢進を介するという新たな機序のインスリン抵抗性改善効果、および／または肝臓の糖新生抑制効果を有することから、糖尿病患者に新たな治療の選択肢を提供することができる。また、Nrf2活性化剤はβ細胞機能不全下においても、インスリン非依存的な血糖低下作用により、高血糖を改善することができる。
本発明は、Nrf2活性化活性を指標とすることで、新たな作用機序をもつ糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例（２−２）における、Nrf2を活性化したマウス（db/db::Keap1flox/-）とコントロールマウス（db/db::control）の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は週齢を表す。n=5、***はP<0.001である。
【図２】実施例（２−２）における、Nrf2を活性化したマウス（db/db::Keap1flox/-）とコントロールマウス（db/db::control）の経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）時の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は糖負荷後の経過時間を表す。n=5、***はP<0.001である。
【図３】実施例（２−２）における、Nrf2を活性化したマウス（db/db::Keap1flox/-）とコントロールマウス（db/db::control）の経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）時の血漿中インスリン値の推移を示すグラフである。縦軸は血漿中インスリン値、横軸は糖負荷後の経過時間を表す。n=5、***はP<0.001、*はP<0.05である。
【図４】実施例（２−２）における、Nrf2を活性化したマウス（db/db::Keap1flox/-）とコントロールマウス（db/db::control）の18週齢における膵臓の組織切片を抗インスリン抗体で免疫組織染色した図である。倍率5倍(×5)の黒線は500μm、倍率20倍(×20)の黒線は100μmを示す。
【図５】図４の免疫組織染色における、インスリン陽性領域を定量化したグラフである。縦軸はインスリン陽性領域（β細胞の存在を示す）の割合を示す。n=5、***はP<0.001である。
【図６】実施例（２−３）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は週齢を表す。n=5-10、***はP<0.001である。
【図７】実施例（２−３）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）の腹腔内糖負荷試験（ipGTT）時の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は糖負荷後の経過時間を表す。n=10、***はP<0.001である。
【図８】実施例（２−３）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）のインスリン負荷試験（ITT）時の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸はインスリン負荷後の経過時間を表す。n=10、***はP<0.001である。
【図９】実施例（２−４）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）について、通常食摂取群（ＳＤ）と高カロリー食摂取群（ＨＣＤ）の体重の変化率の推移を示すグラフである。縦軸は12週齢時点の体重に対する変化率、横軸は12週齢時点で食事を群分けしてからの経過時間を表す。n=5である。
【図１０】実施例（２−４）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）について、通常食摂取群（ＳＤ）と高カロリー食摂取群（ＨＣＤ）の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は12週齢時点で食事を群分けしてからの経過時間を表す。n=5、***はP<0.001、**はP<0.01である。
【図１１】実施例（２−５）における、db/dbマウスに6週齢からNrf2活性化剤を投与した群(Nrf2 activator)と非投与群（vehicle）の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は週齢を表す。n=8、***はP<0.001、**はP<0.01、*はP<0.05である。
【図１２】実施例（２−５）における、Nrf2活性化剤投与群(Nrf2 activator)と非投与群（vehicle）の16週齢における経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）時の血糖値の推移を示すグラフである。縦軸は血糖値、横軸は糖負荷後の経過時間を表す。n=8、***はP<0.001、**はP<0.01である。
【図１３】実施例（３−１）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）について、インスリン感受性組織での代表的なエネルギー代謝関連遺伝子の発現量を比較したグラフである。Liverは肝臓、SkMは下肢骨格筋、WATは精巣上体脂肪組織、BATは褐色脂肪組織である。縦軸はコントロールマウスでの発現量を１としたときの発現量を表す。n=3-5である。
【図１４】実施例（３−２）における、高カロリー食を摂取させた、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）について、下肢骨格筋での代表的なエネルギー代謝関連遺伝子の発現量を比較したグラフである。縦軸はコントロールマウスでの発現量を１としたときの発現量を表す。n=5、***はP<0.001、**はP<0.01、*はP<0.05である。
【図１５】実施例（３−２）における、高カロリー食を摂取させた、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）について、下肢骨格筋でのCpt1bタンパク質の発現量を比較した図である。左はウエスタンブロッティングの図、右はα-tubulin量により標準化したCpt1b発現量を示す図である。縦軸はコントロールマウスでの発現量を１としたときの発現量を表す。n=4、**はP<0.01である。
【図１６】実施例（３−３）における、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1flox/+）について、血漿中の遊離脂肪酸濃度（NEFA、左図）とトリグリセリド濃度（TAG、右図）を比較したグラフである。n=5、***はP<0.001である。
【図１７】実施例４における、STZでβ細胞を破壊したマウスについて、Nrf2活性化剤投与群(Nrf2 activator)と非投与群（vehicle）の血糖値を比較したグラフである。Day6は投与開始前の血糖値、Day12は投与開始後6日目の血糖値である。n=5、**はP<0.01、*はP<0.05である（Dunnett's test）。
【図１８】実施例４における、STZでβ細胞を破壊したマウスについて、Nrf2活性化剤投与群(Nrf2 activator)と非投与群（vehicle）の血漿中インスリン値を比較したグラフである。Day12は投与開始後6日目を表す。n=5である。
【図１９】db/db::Keap1F/+およびdb/db::Keap1F/-マウスの血糖値(左), 血中TG (右)の解析を行った結果を示す図である。血糖値は16週齢、血中TGは17〜18週齢時に解析を行った。 n = 14~16, ***:p < 0.001である。
【図２０】. db/db::Keap1F/+およびdb/db::Keap1F/-マウス肝臓における各種遺伝子発現レベル 17~18週齢時に解析を行った結果を示す図である。 n = 14~16, *:p < 0.05, **:p < 0.01, ***:p < 0.001である。
【図２１】db/db::Keap1F/+およびdb/db::Keap1F/-マウス肝臓におけるNr4a2の遺伝子発現レベルと血糖値及び血中TG濃度との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
1. Nrf2活性化剤
「Nrf2」は、nuclear factor erythroid 2-related factor 2といい、CNC (Cap’n’collar)転写因子ファミリーに属する転写因子である。Nrf2は、非ストレス条件下では、Keap1により細胞質でユビキチン化され、プロテアソーム分解される。一方、ストレス条件下では、Keap1が不活性化され、これによりNrf2は細胞質から核内に移行してMafタンパク質とヘテロ二量体を形成することでARE(Antioxidant response element)配列あるいはEpRE(Electrophil response element)配列に結合し、標的遺伝子を活性化する。Nrf2の標的遺伝子は、例えば、抗酸化遺伝子（Hmox1、Gcl、Txrnd1など）や解毒代謝遺伝子（Nqo1、Gsts、Ugt1a6など）を含む細胞保護作用を有する遺伝子群の遺伝子である。
【００１５】
本発明者らは、Nrf2の新たな標的遺伝子として、脂肪酸をミトコンドリア内に輸送する機能をもつ、Cpt1b（carnitine palmitoyltransferase 1b）を見出だした。Cpt1bの発現が上昇すると脂肪酸のミトコンドリア内への輸送が高まり、脂肪酸はβ酸化によって代謝され、エネルギー代謝は亢進する。また、本発明者らは、骨格筋におけるNrf2の新たな標的遺伝子として、ミトコンドリアタンパク質の産生を促進するPGC1α(peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha）を見出だした。PGC1αの発現が上昇するとミトコンドリアタンパク質の産生が増加し、ミトコンドリア増生ならびにミトコンドリアのエネルギー代謝（β酸化や呼吸鎖を含む）亢進が起こる。さらに、本発明者らはNrf2の活性化により発現が抑制される遺伝子として、糖新生酵素の発現を制御する転写因子Nr4a2(nuclear receptor subfamily 4, group a, member 2)を見出した。Nr4a2の発現が抑制されると、肝臓の糖新生が抑制され、血糖降下が起こる。
【００１６】
本発明において、Nrf2は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトNrf2の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_006164 (gene)（配列番号:1）およびAccession No. NP_006155 (protein) （配列番号:2）としてGenBankに登録されている。マウスNrf2の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_010902 (gene)（配列番号:3）およびAccession No. NP_035032 (protein)（配列番号:4）としてGenBankに登録されている。
【００１７】
本明細書中では、Nrf2は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Nrf2のアミノ酸配列中の1〜複数個(例えば、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個(1〜数個)、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
【００１８】
実質的に同質の活性としては、例えば、Nrf2標的遺伝子の転写促進活性、ARE結合活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、ARE結合活性、Nrf2標的遺伝子の転写促進活性等が同等（例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１９】
なお、本明細書中、「Nrf2」は一般的にNrf2タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Nrf2遺伝子のことを意味する場合もある。
【００２０】
本発明で用いられる「Nrf2活性化剤」は、Nrf2の活性を活性化する物質をいう。「Nrf2の活性」は、例えば、上記したNrf2標的遺伝子の転写促進活性、Nrf2のARE結合活性等が挙げられる。かかる物質としては、低分子化合物もしくは高分子化合物のほか、siRNA、shRNA、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いることができる。
【００２１】
ここで、「低分子化合物」とは、分子量10,000以下(好ましくは分子量5,000以下、より好ましくは分子量2,000以下、特に好ましくは分子量700以下)の有機または無機物質を意味する。「高分子化合物」とは、分子量10,000超(好ましくは分子量50,000以上、より好ましくは分子量100,000以上)の有機物質を意味する。
【００２２】
「Nrf2活性化剤」は、Nrf2の活性の少なくとも1つを活性化する活性を有する物質をいう。Nrf2の活性の活性化は、例えば、(1)Nrf2の発現を促進すること、(2)Nrf2の細胞質から核への移行を促進すること、(3)Nrf2のAREへの結合を促進すること、(4) Nrf2の核から細胞質への移行を阻害することなどによりもたらすことができる。
【００２３】
「Nrf2の発現を促進する」とは、Nrf2遺伝子の発現を促進することであり、Nrf2遺伝子からタンパク質が生成されるまでの一連の事象（例えば、転写(mRNAの生成)、翻訳(タンパク質の生成)を含む）のうちのいずれかの事象を促進することによって、当該タンパク質の生成を促進することを意味する。
【００２４】
「Nrf2の細胞質から核への移行を促進する」とは、Nrf2の分解を調節することで核への移行を促進すること、Nrf2のリン酸化状態を変化させることで核への移行を促進すること、などによりもたらすことができる。生体内ではNrf2の活性は、主に分解により調節されている。従って、Nrf2の分解を阻害し、Nrf2を安定化することは最も好適なNrf2活性化の方法である。Nrf2の分解を阻害し、Nrf2の細胞質から核への移行を促進する方法としては、Keap1のS-アルキル化が知られている。Keap1のCys残基がS-アルキル化されると、Keap1の立体構造が変化し、Keap1に結合したNrf2が分解されることなく留まり続けることでKeap1がNrf2により飽和される（"Hinge and Latch"モデル）。これにより新たなNrf2がKeap1に捕捉・分解されることなく蓄積し核内に移行できるようになる。Keap1のCys151のS-アルキル化によるNrf2活性化剤の例としてbardoxolone誘導体（CDDO誘導体）などが知られている。リン酸化状態を変化させる方法としては、Nrf2をリン酸化するGSK-3β、Fynなどのキナーゼの活性を調節することがNrf2の核内への移行を促進する、ということが知られている。たとえば、GSK-3β阻害剤（SB216763）はKeap1非依存的にNrf2の核内移行を促進する化合物として知られている。
【００２５】
「Nrf2のAREへの結合を促進する」とは、核内に移行したNrf2がMafとヘテロ二量体を形成するのを促進して該Nrf2がARE配列に結合するのを促進すること、などを意味する。
【００２６】
「Nrf2の核から細胞質への移行を阻害する」とは、核内に移行したNrf2が細胞質へ戻ることを阻害することで、Nrf2が核内で転写促進活性を発揮し続けることを促進すること、などを意味する。
【００２７】
Nrf2の活性は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。
例えば、Nrf2の活性のうち転写促進活性は、Nrf2標的遺伝子の発現レベルの上昇を見ることにより、測定することができる。また、Nrf2の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）を連結し、そのレポーター遺伝子の活性を見ることにより、測定することもできる(例えば、Mol. Cancer Cell Vol.6(1) pp.154-162 (2007)など)。あるいは、Nrf2の活性をNrf2タンパク質の安定化（Nrf2の分解の抑制）を指標として捉える事も可能であり、例えば、Nrf2とレポーター遺伝子の融合タンパク質を発現させ、そのレポーター遺伝子の活性を見ることにより、測定することができる(例えば、Genes Cells. Vol.16(4) pp.406-415 (2011)など)。
【００２８】
あるいは、Nrf2の活性のうちNrf2のARE結合活性は、ChIPアッセイなどによりNrf2のAREへの結合を見ることにより測定することができる。ChIPアッセイによる測定は、公知の方法またはそれに準ずる方法により行うことができる（例えば、Cell Vol.103 pp843-852 (2000)など）。
【００２９】
Nrf2活性化剤の例として、CDD0誘導体が挙げられる。CDD0誘導体は、例えば、ＷＯ９９／６５４７８、ＷＯ２００４／０６４７２３、米国特許第６，３２６，５０７号公報、米国特許第６，９７４，８０１号公報、日本特許４５４１５４８号公報に記載の化合物が挙げられる。本発明のいくつかの態様では、CDD0誘導体は、ＷＯ９９／６５４７８に記載の下記式(I)：
【化２５】
2013146911.tif 000027
（式中、
ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ11 は有機ある
いは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ12 は有機
あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、
Ｒ1は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されている有機
あるいは無機の部分であり、
Ｒ2（Ｒ2基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及び
Ｒ3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
ｎは０から１００の数である）の構造を有するものである。「有機部分」及び「無機部分」は、ＷＯ９９／６５４７８の５頁１５行〜７頁１３行に記載の通りである。より具体的には、「有機部分」は、アルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アルキルチオ、及びアルキルカルボキシル等の炭素をベースとする官能基を含む。また、「無機部分」は、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、チオール、及びヒドロキシル等の非炭素をベースとする基または要素を含む。Ｒ1は、例えば、電子吸引基である。「電子吸引基」は、本技術分野で公知であり、水素よりも電子吸引性が大きい基を指す。種々の電子吸引基が公知であり、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード基）、ニトロ、シアノ、−ＮＲ3+、−ＳＲ2+、−ＮＨ3+、−ＳＯ2Ｒ、−ＳＯ2Ａｒ、−ＣＯＯＨ、−ＯＡｒ、−ＣＯＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＯＨ、−Ａｒ及び−ＣＨ＝ＣＲ2を含む（式中、Ａｒはアリールであり、Ｒは任意の適当な有機あるいは無機部分を表す）。式（Ｉ）の好ましい実施の形態としては、Ｂは二重結合であり、ＸはＯである。
本発明のさらに好ましい態様のCDD0誘導体は、下記式：
【化２６】
2013146911.tif 000028
（式中、
Ｒ１は、−ＣＮ、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
Ｒ２は、メチルであり、及び
Ｒ３は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒａは、水素またはアルキルであり、Ｒｂは、アルキルまたはフェニルである。）である。）で表される化合物である。ここで、「アルキル」、「アルコキシ」、「アミノ」等は、ＷＯ９９／６５４７８の５頁２９行〜７頁１３行に記載の通りである。より好ましいCDD0誘導体は、上記式において、Ｒ１は−ＣＮであり、Ｒ２はメチルであり、及びＲ３は、−ＯＨである化合物である。別のより好ましいCDD0誘導体は、上記式において、Ｒ１は−ＣＮであり、Ｒ２はメチルであり、及びＲ３は−ＯＣＨ３である化合物である。
本発明の別のさらに好ましい態様のCDD0誘導体は、ＷＯ２００４／０６４７２３に記載の下記式：
【化２７】
2013146911.tif 000029
（式中、
Ｒは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、ＣＮ、ＣＯ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＡｃ）４、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＮＨ２、
【化２８】
2013146911.tif 000030
である。）の構造を有するものである。
代表的な化合物としては、CDD0-Me（2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid methyl ester）、CDD0-Im（1-[2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oyl]imidazole）である。
これらのCDD0誘導体は、例えば、ＷＯ９９／６５４７８の１５頁１行〜１６頁１５行に記載の方法、ＷＯ２００４／０６４７２３の２２頁１５行〜２４頁１０行に記載の方法、文献(T.Hondaら、Bioorganic & medical Chemistry Letters、Vol.12、pp.1027-1030 (2002))の1027頁右カラム１９行〜1028頁右カラム２９行に記載の方法、またはそれらに準ずる方法により合成することができる。
【００３０】
本発明に用いるNrf2活性化剤は、Cpt1bの発現レベルを変動させる活性を有するものであることが好ましく、Cpt1b の発現レベルを上昇させる活性を有するものであることがより好ましい。具体的には、骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。Cpt1b の発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤は、骨格筋のエネルギー代謝を亢進するという新しい作用機序を有する抗糖尿病薬となり得る。
また、Cpt1bに加えてPGC1αの発現レベルを変動させる活性を有するものであることが好ましく、Cpt1bに加えてPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するものであることが更に好ましい。具体的には、骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。Cpt1bおよびPGC1αの両者の発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤は、より確実な抗糖尿病効果を有することが期待できる。Cpt1b および／またはPGC1αの発現レベルを上昇させる活性は、後述する実施例１に記載の方法等で確認することができる。
本発明の別の態様では、Nrf2活性化剤は、Nr4a2の発現レベルを変動させる活性を有するものであることが好ましく、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するものであることがより好ましい。具体的には、肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するNrf2活性化剤は、肝臓の糖新生を抑制するという作用機序を有する抗糖尿病薬となり得る。
また、Nr4a2に加えてCpt1bの発現レベルを変動させる活性を有するものであることが好ましく、Nr4a2の発現レベルを低下させることに加えて、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するものであることがより好ましい。具体的には、肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性、および骨格筋においてCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。Nr4a2の発現レベルを低下させることに加えて、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤は、肝臓の糖新生を抑制することに加えて、骨格筋のエネルギー代謝を亢進することから、より確実な抗糖尿病効果を有することが期待できる。
さらに、Nr4a2、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルを変動させる活性を有するものであることが好ましく、Nr4a2の発現レベルを低下させることに加えて、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの両方を上昇させる活性を有するものであることがより好ましい。具体的には、肝臓においてNr4a2の発現レベルを低下させる活性、ならびに骨格筋においてCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの両方を上昇させる活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。Nr4a2の発現レベルを低下させることに加えて、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの両方を上昇させる活性を有するNrf2活性化剤は、さらに確実な抗糖尿病効果を有することが期待できる。Cpt1b および／またはPGC1αの発現レベルを上昇させる活性、ならびにNr4a2の発現レベルを低下させる活性は、後述する実施例１、実施例５等に記載の方法等で確認することができる。
【００３１】
2.糖尿病の予防または治療用医薬組成物
本発明は、新たな作用機序を持つ糖尿病の予防または治療剤として、Nrf2活性化剤を提供する。本発明においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、糖尿病の予防または治療剤として用いる。また、本発明においては、糖尿病の予防または治療剤の製造において上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、糖尿病の予防または治療を必要とする対象に、治療的有効量の上述した「Nrf2活性化剤」を投与することを含む、糖尿病の予防または治療方法を提供する。本発明のNrf2活性化剤またはそれを含有してなる医薬組成物は、β細胞保護作用とインスリン抵抗性改善作用を併せもつことを特徴とする。
【００３２】
本発明者らは、遺伝学的にNrf2を活性化したマウスの解析により、Nrf2を特異的に活性化すると、血糖低下、β細胞保護、インスリン抵抗性改善などの抗糖尿病作用を示すことを見出した。また、インスリン抵抗性改善には骨格筋のエネルギー代謝亢進および／または肝臓の糖新生抑制が関与していることを見出した。
【００３３】
本発明は、β細胞保護剤として、Nrf2活性化剤を提供する。本発明においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、β細胞保護用医薬組成物として用いる。また、本発明においては、β細胞保護用医薬組成物の製造において上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、β細胞保護を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、β細胞保護方法を提供する。
β細胞保護作用とは、β細胞の量および／または活性の減少を抑制することをいう。β細胞の量は、後述する実施例（２−２）に記載の方法等で確認することができる。β細胞の活性は、例えば、糖刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）が維持されていることを、後述する実施例（２−２）に記載の方法等で確認する。
Nrf2活性化剤またはそれを含有するβ細胞保護用医薬組成物は、前糖尿病段階ともいえる耐糖能異常の段階で用いると、２型糖尿病の発症抑制、すなわち予防に効果を発揮する。
【００３４】
本発明は、インスリン抵抗性改善剤として、Nrf2活性化剤を提供する。本発明においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、インスリン抵抗性改善用医薬組成物として用いる。また、本発明においては、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造において上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、インスリン抵抗性改善を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、インスリン抵抗性改善方法を提供する。Nrf2活性化剤は、骨格筋のエネルギー代謝亢進を介してインスリン抵抗性を改善するという、新しい作用機序のインスリン抵抗性改善剤である。骨格筋においてミトコンドリアにおけるβ酸化が高まると、細胞内の脂肪酸量が低下する。これにより、脂肪酸によって阻害されていたインスリンの細胞内情報伝達が改善するものと考えられる。また、Nrf2活性化は、正常マウスにおいても血糖値を低下させ、インスリン感受性を向上するという、驚くべき作用を発揮する。この作用は、骨格筋のエネルギー代謝を亢進するという、従来にない作用機序が関与していると考えられる。Nrf2活性化剤は、インスリン感受性向上用医薬組成物として用いることもできる。あるいは、Nrf2活性化剤は、インスリン感受性向上方法に用いることもできる。
本発明のいくつかの態様では、骨格筋のエネルギー代謝を亢進することに加えて、Nrf2活性化剤の肝臓の糖新生を抑制するという作用機序も、上記インスリン抵抗性の改善、および／またはインスリン感受性の向上に寄与する。
【００３５】
インスリン抵抗性改善は、組織でのインスリンの作用に不具合がある場合に、その不具合をできるだけ正常に戻すということを意味する。一方で、インスリン感受性向上とは、組織でのインスリン作用の不具合のあるなしに関わらず、組織（特に骨格筋）でのインスリンに対する反応の基本的能力を底上げする現象と考えられる。Nrf2の活性化により骨格筋のエネルギー代謝が亢進し、骨格筋細胞の糖の処理能力が高まると考えることができる。すなわち、Nrf2が細胞での糖利用の限界値を定めており、Nrf2が活性化することでその限界値が高まるといったメカニズムが考えられる。
【００３６】
インスリン抵抗性改善（またはインスリン感受性向上）は、例えば、インスリン負荷試験での血糖値の低下、HOMA-IRの低下などにより確認することができる。
【００３７】
3.骨格筋のエネルギー代謝亢進用医薬組成物および肝臓の糖新生抑制用医薬組成物
本発明においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤として用いる。また、本発明においては、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤の製造に上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、骨格筋のエネルギー代謝亢進を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、骨格筋のエネルギー代謝亢進方法を提供する。
また、本発明の別のいくつかの態様においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、肝臓の糖新生抑制剤として用いる。また、本発明においては、肝臓の糖新生抑制剤の製造に上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、肝臓の糖新生抑制を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、肝臓の糖新生抑制方法を提供する。
さらに、本発明の別のいくつかの態様においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤および肝臓の糖新生抑制剤の両方の機能を有する薬剤として用いる。また、本発明においては、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤および肝臓の糖新生抑制剤の両方の機能を有する薬剤の製造に上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、骨格筋のエネルギー代謝亢進および肝臓の糖新生抑制を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、骨格筋のエネルギー代謝亢進および肝臓の糖新生抑制方法を提供する。
Nrf2活性化剤を投与する対象としては、β細胞の機能不全状態にある患者が好ましい。Nrf2活性化剤は、β細胞の機能不全下における高血糖を改善する。すなわち、本発明は、Nrf2活性化剤を含有してなる、β細胞の機能不全下における高血糖の改善剤を提供する。また、本発明においては、β細胞の機能不全下における高血糖の改善剤の製造にNrf2活性化剤を使用する。さらに、本発明は、β細胞の機能不全下における高血糖の改善を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、β細胞の機能不全下における高血糖の改善方法を提供する。また、本発明は、Nrf2活性化剤を含有してなる、インスリン非依存性の血糖値低下剤を提供する。また、本発明においては、インスリン非依存性の血糖値低下剤の製造にNrf2活性化剤を使用する。さらに、本発明は、インスリン非依存性の血糖値低下を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、インスリン非依存性の血糖値低下方法を提供する。
【００３８】
本発明者らは、遺伝学的にNrf2を活性化したマウスの解析により、Nrf2を特異的に活性化すると、エネルギー代謝に関わる遺伝子であるCpt1b等の発現が骨格筋において上昇することを見出した。また、β細胞を破壊した糖尿病モデルマウスにおいて、Nrf2を特異的に活性化すると、インスリン分泌増加を伴わないにも関わらず、高血糖が改善することを見出だした。これらの知見は、Nrf2の活性化が、骨格筋のエネルギー代謝を亢進することで、インスリン非依存的に血糖値を低下させることを示している。骨格筋は筋収縮などにより、インスリン非依存的に血糖値を低下させる機能を有する。Nrf2の活性化は、インスリン非依存的な経路においても骨格筋細胞の糖の処理能力を高めていると考えることができる。すなわち、インスリン依存、およびインスリン非依存の両方の経路において、Nrf2が細胞での糖利用の限界値を定めており、Nrf2が活性化することでその限界値が高まるといったメカニズムが考えられる。
本発明のいくつかの態様では、骨格筋のエネルギー代謝を亢進することに加えて、Nrf2活性化剤の肝臓の糖新生を抑制するという作用機序も、上記β細胞の機能不全下における高血糖の改善、および／または上記インスリン非依存性の血糖値低下に寄与する。
【００３９】
骨格筋のエネルギー代謝亢進には、脂質代謝と糖代謝が含まれる。Nrf2の活性化はCpt1bの発現レベルを上昇させ、脂肪酸のβ酸化を亢進する。β酸化で生成したアセチルーCoAをTCA回路で代謝するためには、糖から生成されるオキサロ酢酸の供給が必要であるため、β酸化の亢進に伴い糖代謝も亢進する。骨格筋のエネルギー代謝亢進は、例えば、Cpt1bの発現レベルの上昇、脂肪酸のβ酸化の亢進、ATP合成の亢進、血中脂肪酸の減少、酸素消費量の増加などにより確認することができる。好ましくは、骨格筋におけるCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を確認する。加えて、脂肪酸のβ酸化の亢進、ATP合成の亢進、血中脂肪酸の減少および酸素消費量の増加からなる群より選ばれる少なくとも一つを確認することが更に好ましい。
Nrf2の活性化はNr4a2の発現レベルを低下させ、肝臓の糖新生を抑制することにより血糖降下作用を発揮する。また、Nr4a2の発現レベルを低下させることで、血中及び肝臓の脂質代謝を改善する。肝臓の糖新生抑制は、例えば、Nr4a2の発現レベルの低下、血糖値の低下、肝細胞における糖産生量の低下などにより確認することができ、脂質代謝の改善は、血中トリグリセリド量の低下などにより確認することができる。また、肝臓の糖新生抑制は、Pck1(phosphoenolpyruvate carboxylase), G6pc(Glucose-6-phosphatase), Fbp1(fructose-1,6-bisphosphatase 1)またはPGC1αの発現レベルの低下により確認することができ、これら遺伝子の少なくとも一つの発現レベル低下の確認とNr4a2の発現レベル低下の確認を組み合わせることにより確認することもできる。好ましくは、肝臓における、Nr4a2の発現レベルの低下を確認する。加えて、血糖値の低下、および／または血中トリグリセリド量の低下を確認することが更に好ましい。
【００４０】
β細胞の機能不全下とは、β細胞の機能不全状態にある患者を対象とすることを意味する。β細胞の機能不全状態にある患者とは、β細胞からのインスリン分泌が不足している患者のことであり、１型糖尿病患者、およびインスリン分泌能が低下している状態の２型糖尿病患者が含まれる。インスリン分泌能は、例えば、インスリン分泌指数（Insulinogenic Index）などを指標として評価することができる。インスリン分泌指数は、糖負荷試験において、（負荷30分後のインスリン値−負荷前インスリン値 (μU/ml)）を、（負荷30分後の血糖値−負荷前血糖値 (mg/dl)）で除したものであり、日本人では0.4未満の場合、インスリン分泌能が低下しているとされる。インスリン分泌能の別の指標としては、Ｃ‐ペプチド値（CPR；C-peptide immunoreactivity）を用いることができる。
【００４１】
β細胞の機能不全状態にある患者は、β細胞が疲弊している、または破壊されている状態にあり、インスリンを十分に分泌することができない。そのため高血糖を示す。通常、β細胞の機能不全下における高血糖を改善するには、インスリン自体を補充するインスリン療法を行う必要がある。しかし、インスリン療法は注射による投与が必要であること、また低血糖を引き起こす可能性があることから、経口で投与可能な新たな作用機序の薬剤が求められていた。Nrf2活性化剤は、β細胞の機能不全下において、インスリンを補充しなくとも高血糖を改善することができるので、β細胞の機能不全状態にある患者に対して新たな治療手段を提供する抗糖尿病薬となりうる。
【００４２】
4．インスリン製剤の用量低減用医薬組成物
本発明においては、上述した「Nrf2活性化剤」を含有してなる医薬組成物を、インスリン製剤の用量低減剤として用いる。また、本発明においては、インスリン製剤の用量低減剤の製造に上述した「Nrf2活性化剤」を使用する。さらに、本発明は、インスリン製剤の用量低減を必要とする対象に、治療的有効量のNrf2活性化剤を投与することを含む、インスリン製剤の用量低減方法を提供する。Nrf2活性化剤を投与する対象としては、β細胞の機能不全状態にありインスリン製剤が投与される患者が好ましい。具体的には、１型糖尿病患者、およびインスリン療法を受けている２型糖尿病患者が挙げられる。Nrf2の活性化は、インスリン抵抗性を改善する（または、インスリン感受性を向上する）ので、通常より少量のインスリン製剤でも十分な血糖低下作用が得られる。
【００４３】
Nrf2活性化剤を含有してなる医薬組成物を、インスリン製剤と併せて用いることで、インスリン製剤の使用量を、従来の80％、50％、または20％まで低減することができる。
【００４４】
5.Nrf2活性化剤を含有する医薬組成物の調製
本発明においては、Nrf2活性化剤を常套手段に従って、製剤化し、糖尿病の予防または治療のための医薬組成物として用いることができる。あるいは、本発明においては、Nrf2活性化剤を常套手段に従って、製剤化し、糖尿病の予防または治療方法のために用いることができる。
【００４５】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００４６】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００４７】
なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の糖尿病薬など）を含有してもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、Nrf2活性化剤のみを有効成分として含有する。本発明の医薬組成物は、他の医薬組成物（例えば、他の糖尿病薬など）と併用してもよい。
【００４８】
活性成分(Nrf2活性化剤)の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該活性成分を、約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該活性成分を、約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。人以外の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【００４９】
6. 糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法
本発明は、Nrf2活性化活性を指標として、上記した糖尿病の予防または治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法は、試験化合物のNrf2活性化活性を評価し、Nrf2活性化活性を有する化合物を選択することを含む方法である。本発明のスクリーニング方法により選択されたNrf2活性化活性を有する化合物は、本明細書に記載の糖尿病の予防または治療剤、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤、β細胞の機能不全下における高血糖の改善剤、インスリン非依存性の血糖値低下剤、およびインスリン製剤の用量低減剤のための候補化合物となる。
本発明のいくつかの態様のスクリーニング方法により選択されたNrf2活性化活性を有する化合物は、肝臓の糖新生抑制剤のための候補化合物となる。
また、本発明のいくつかの態様のスクリーニング方法により選択されたNrf2活性化活性を有する化合物は、骨格筋のエネルギー代謝亢進剤および肝臓の糖新生抑制剤の両方の機能を有する薬剤のための候補化合物となる。
【００５１】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2，6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N，N'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００５２】
より具体的には、例えば、(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii)試験化合物をNrf2を発現する細胞に接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行うことを特徴とする、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５３】
本方法においては、まず、Nrf2を発現する細胞に、試験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウスなど由来の細胞であり、好ましくは、ヒト由来の細胞である。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Nrf2を発現する細胞」は、例えば、mouse embryonic fibroblast (MEF)、HEK293細胞、293T細胞などである。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Nrf2を発現する細胞」は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することもできる。
【００５４】
次に、Nrf2活性を測定する。具体的には、例えば、上記（i）と（ii）の場合において、上記細胞を培養し、それぞれの場合のNrf2活性を測定する。
Nrf2活性の測定は、例えば、前述のNrf2活性の測定方法により行うことができる。より具体的には、Nrf2標的遺伝子として、Cpt1bの発現レベルの変動を指標にNrf2の活性を測定することが好ましく、Cpt1bの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することがより好ましい。具体的には、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することが挙げられる。また、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの変動を指標にNrf2の活性を測定することが好ましく、さらに好ましくは、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定する。具体的には、骨格筋細胞におけるCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することが挙げられる。
本発明の別のいくつかの態様では、より具体的には、Nr4a2の発現レベルの変動を指標にNrf2の活性を測定することが好ましく、Nr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することがより好ましい。具体的には、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することが挙げられる。また、Cpt1bおよびNr4a2の発現レベルの変動を指標にNrf2の活性を測定することが好ましく、Cpt1bの発現レベルの上昇およびNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することがさらに好ましい。具体的には、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルの上昇および肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することが挙げられる。あるいは、Cpt1b、PGC1αおよびNr4a2の発現レベルの変動を指標にNrf2の活性を測定することが好ましく、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇およびNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することがより好ましい。具体的には、骨格筋細胞におけるCpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇および肝細胞におけるNr4a2の発現レベルの低下を指標にNrf2の活性を測定することが挙げられる。
この場合、Nrf2、Cpt1b、およびPGC1αを発現する細胞として、骨格筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、HEK293細胞、293T細胞などを用いることができる。Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルは、PCR法、イムノブロット法などの公知の手法を用いて測定できる。
Nrf2、Cpt1b、PGC1α、およびNr4a2を発現する細胞として、骨格筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、HEK293細胞、293T細胞などを用いることができる。Cpt1b、PGC1α、Nr4a2の発現レベルは、PCR法、イムノブロット法などの公知の手法を用いて測定できる。
【００５５】
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Nrf2活性を活性化する化合物を選択する。例えば、上記(i)の場合におけるNrf2活性が、上記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物、特には、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、あるいは50％以上高くなる試験化合物を、Nrf2活性化活性を有する化合物として選択することができる。また、Nrf2-/-のマウス由来のMEFと、Nrf2+/+のマウス由来のMEFとを用いて、両者を比較することで、Nrf2特異的な作用であるかどうかを確認することができる。
【００５６】
このようにして選択された化合物は、Nrf2活性化剤であり、糖尿病の予防または治療薬の候補化合物となる。
特に、Cpt1bの発現レベルの上昇を指標に選択されたNrf2活性化剤は、エネルギー代謝亢進活性を有することから、β細胞の機能不全下における高血糖およびインスリン抵抗性を改善することができ、糖尿病の治療薬として好適である。さらに、Cpt1bおよびPGC1αの発現レベルの上昇を指標に選択されたNrf2活性化剤は、特に優れたエネルギー代謝亢進活性を有することが期待され、糖尿病の治療薬として好適である。
あるいは、Nr4a2の発現レベルの低下を指標に選択されたNrf2活性化剤は、肝臓の糖新生抑制作用を有することから、β細胞の機能不全下における高血糖およびインスリン抵抗性を改善することができ、糖尿病の治療薬として好適である。さらに、Cpt1bおよび／またはPGC1αの発現レベルの上昇、ならびにNr4a2の発現レベルの低下を指標に選択されたNrf2活性化剤は、エネルギー代謝亢進活性に加え肝臓の糖新生抑制作用を有することが期待され、糖尿病の治療薬としてより好適である。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法の好ましい別の態様は、以下の工程を含むことを特徴とする方法である。１）（i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii)試験化合物をNrf2を発現する細胞に接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および、３）前記２）の工程で選択された試験化合物について、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認する工程。
このとき、１）の工程としては、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することが好ましい。また、３）の工程は、Cpt1bに加え、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性も有することを確認することが好ましい。具体的には、３）の工程は、骨格筋細胞におけるCpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することが挙げられる。また、３）の工程は、骨格筋細胞における、Cpt1bに加え、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性も有することを確認することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法の好ましいさらに別の態様は、以下の工程を含むことを特徴とする方法である。１）（i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii)試験化合物をNrf2を発現する細胞に接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、２）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および、３）前記２）の工程で選択された試験化合物について、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有することを確認する工程。
このとき、１）の工程としては、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することが好ましい。また、３）の工程は、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1bおよび／またはPGC1αの発現レベルを上昇させる活性も有することを確認することが好ましい。具体的には、３）の工程は、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルを低下させる活性を有することを確認することが挙げられる。また、３）の工程は、肝細胞におけるNr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、骨格筋細胞におけるCpt1bおよび／またはPGC1αの発現レベルを上昇させる活性も有することを確認することが好ましい。
【００５８】
本発明において、Cpt1bは、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどを用いることができる。ヒトCpt1bの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_004377 (gene)（配列番号:５）およびAccession No. NP_004368 (protein) （配列番号:６）としてGenBankに登録されている。マウスCpt1bの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_009948 (gene)（配列番号:７）およびAccession No. NP_034078 (protein)（配列番号:８）としてGenBankに登録されている。
【００５９】
本発明において、PGC1αは、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどを用いることができる。ヒトPGC1αの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_013261 (gene)（配列番号:９）およびAccession No. NP_037393 (protein) （配列番号:１０）としてGenBankに登録されている。マウスPGC1αの遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_008904 (gene)（配列番号:１１）およびAccession No. NP_032930 (protein)（配列番号:１２）としてGenBankに登録されている。
本発明において、Nr4a2は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどを用いることができる。ヒトNr4a2の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_006186(gene)（配列番号:６６）およびAccession No. NP_006177(protein) （配列番号:６７）としてGenBankに登録されている。マウスNr4a2の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_013613(gene)（配列番号:６８）およびAccession No. NP_038641(protein)（配列番号:６９）としてGenBankに登録されている。
【００６０】
Cpt1b、PGC1α、またはNr4a2に特異的なプライマーやプローブは、上述の配列を元に、配列上特異性の高い領域を選択して適宜設計することができる。プライマーやプローブは通常、10〜40個、好ましくは15〜30個の塩基から構成される。
【００６１】
さらに、選択された候補化合物を実験動物(例、マウス、ラットなど)に投与して、選択された候補化合物の抗糖尿病効果を確認する。抗糖尿病効果を確認するための試験法としては、後述の実施例に記載の試験などが挙げられる。
【００６２】
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2012-072990 (2012年3月28日出願)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００６３】
実施例の結果は、特に記載しない限り、以下の統計分析を行った。
結果を平均±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として表した。統計分析はStudent’s T-testまたはFisher’s least significant difference post hoc testによる分散分析（ＡＮＯＶＡ）にて行った。
（実施例１）Nrf2活性化剤の活性の確認
（１−１）Nrf2活性化活性の確認
Nrf2の分解を阻害することにより、Nrf2を安定化させる、Nrf2活性化剤は以下の方法により確認することができる。N0T-MEF（Nrf2のDNA結合ドメインをLacZに変えた機能ノックアウトマウスより作製した細胞；Hirotsuら、Genes to Cell、Vol.16、pp.406-415（2011））を96 well plateに播種し、一晩インキュベーション (35℃、5% CO2)する。被検物質を添加し、３時間インキュベーション(35℃、5% CO2)する。Beta-Glo Assay Reagent（Promega）を添加し、室温、遮光下で１時間放置した後の発光強度を測定しNrf2活性化能（Nrf2安定化能）を求める。
【００６４】
（１−２）Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性の確認
Nrf2活性化剤を暴露させた培養細胞または組織より、全RNAをISOGEN RNA抽出キット(Nippon Gene)を用いて抽出し、Super−script III(Invitrogen)を用いてcDNAに逆転写する。Cpt1b特異的なプライマーを用いて、qPCRを実施することにより、Cpt1bの発現量を確認する。特異的なプライマーの例は、後述の表１に記載のものを用いることができる。遺伝子発現量はHprt（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase）により標準化する。Nrf2活性化剤を暴露させていない培養細胞または組織でのCpt1bの発現量と比較して、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤を選択する。
同様の方法で、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するかどうかを確認し、Cpt1bとPGC1αの両方の発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤を選択することで、より厳格な選択が可能となる。
【００６５】
（１−３）Nr4a2の発現レベルを低下させる活性の確認
Nrf2活性化剤を暴露させた培養細胞または組織より、全RNAをISOGEN RNA抽出キット(Nippon Gene)を用いて抽出し、Super−script III(Invitrogen)を用いてcDNAに逆転写する。Nr4a2特異的なプライマーを用いて、qPCRを実施することにより、Nr4a2の発現量を確認する。特異的なプライマーの例は、後述の表２に記載のものを用いることができる。遺伝子発現量はHprtにより標準化する。Nrf2活性化剤を暴露させていない培養細胞または組織でのNr4a2の発現量と比較して、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性を有するNrf2活性化剤を選択する。
（１−２）に記載の方法で、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するかどうかを確認し、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1bの発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤を選択することで、両活性を有するNrf2活性化剤の選択が可能となる。また、同様に（１−２）に記載の方法で、PGC1αの発現レベルを上昇させる活性を有するかどうかを確認し、Nr4a2の発現レベルを低下させる活性に加え、Cpt1bとPGC1αの両方の発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤を選択することで、より厳格な選択が可能となる。
【００６６】
（実施例２）Nrf2の活性化による抗糖尿病作用
（２−１）Nrf2を特異的に活性化したマウスの作成
Keap1 knockoutおよびknockdown対立遺伝子(Taguchiら、Mol. Cell. Biol. 30:3016-3026.(2010))は、公知のものを用いた。ICRマウスは日本SLC (Shizuoka, Japan)から、C57BL/KsJ::db/mマウスは日本クレア(Tokyo, Japan)から購入した。Keap1flox/+およびKeap1flox/-マウスは、ICRにbackcrossしたKeap1flox/floxマウスとKeap1+/-マウスの交配により得た。db/db::Keap1+/+マウス、db/db::Keap1flox/+マウスおよびdb/db::Keap1flox/-マウスは、ICRにbackcrossしたdb/+::Keap1flox/+マウスとdb/+::Keap1+/-マウスの交配により得た。マウスには水および齧歯動物用飼料を自由に摂取させ、特定病原体不在の条件下で維持した。全てのマウスは、東北大学の実験動物の人道的な飼育および使用のための基準ならびに日本の文部科学省の動物実験の適正な実施に向けたガイドラインの規程に従って扱った。
【００６７】
（２−２）糖尿病モデルマウス（db/dbマウス）での抗糖尿病作用
糖尿病を自然発症するdb/dbマウスにおいて、Nrf2を活性化したマウス（db/db::Keap1flox/-）とコントロールマウス（db/db::Keap1+/+とdb/db::Keap1 flox /+を含む）の糖尿病発症への影響を比較した。
各群のマウスについて、One touch ultra view blood glucose analyzer (LifeScan, Milpitas, CA, USA)を用いて血糖値を測定した。生後16週までの血糖値を比較したところ、コントロール群では重度の高血糖を示したが、Nrf2活性化群では正常血糖を維持した（図１）。10週以降の体重は両群で差は認められなかった。17-18週令において、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。2g/kg体重のグルコースを14時間絶食後に経口投与した。コントロール群では血糖値が上昇したままであったが、Nrf2活性化群では速やかな血糖値の正常化が認められた（図２）。ＯＧＴＴ時のインスリン分泌は、コントロール群では認められなかったが、Nrf2活性化群では糖刺激性インスリン分泌（glucose-stimulated insulin secretion;ＧＳＩＳ）が維持されていた（図３）。
18週令のマウスの膵臓の組織切片を抗インスリン抗体で免疫組織染色し、β細胞量を検出した。Nrf2活性化群ではβ細胞量が顕著に維持されていた（図４、図５）。
以上の結果から、db/dbマウスにおいて、Nrf2活性化によりβ細胞の量と機能が保護され、糖尿病の発症が抑制されることが示された。
【００６８】
（２−３）正常マウスの血糖値に与える影響
正常マウス（ICRマウス）において、Nrf2を活性化したマウス（Keap1flox/-）とコントロールマウス（Keap1 flox /+）の血糖値への影響を比較した。
生後16週令までの血糖値を比較したところ、10週令以降においてNrf2活性化群ではコントロール群より低い血糖値となった（図６）。8週令において、腹腔内糖負荷試験（ipGTT）を行った。2g/kg体重のグルコースを14時間絶食後に腹腔内投与した。Nrf2活性化群ではコントロール群より速やかな血糖値の低下が認められた（図７）。ipGTT時のインスリン分泌は、30分までは両群に差は無かったが、60分ではNrf2活性化群のほうが低かった。10週令において、インスリン負荷試験（ITT）を行った。0.75U/kg体重のインスリンを0.5時間絶食後に腹腔内投与した。Nrf2活性化群ではコントロール群より大きな血糖値の低下が認められた（図８）。
これらの結果は、Nrf2活性化がインスリン感受性を向上していることを示している。
【００６９】
（２−４）高カロリー食摂取マウスでの抗糖尿病作用
Nrf2を活性化したICRマウス（Keap1flox/-）とコントロールのICRマウス（Keap1 flox /+）について、通常食（3.59kcal/g）と高カロリー食(5.06 kcal/g、カロリーの60％は脂質)を与えた場合の体重と血糖値の変化を比較した。12週令で食事の群分けを行った。高カロリー食は、12週令から8週間与え、15週令からは20％ショ糖液も加えた。
高カロリー食摂取コントロール群は、通常食摂取コントロール群に比べ大幅に体重が増加した。一方でNrf2活性化群では通常食でも高カロリー食でも、通常食摂取コントロール群に比べ体重が減少した（図９）。摂餌量はNrf2活性化群のほうがコントロール群より高かった。
高カロリー食摂取コントロール群は、6週目以降に血糖値の大幅な上昇を認めたが、Nrf2活性化群ではほとんど上昇しなかった（図１０）。血中インスリンレベルは  高カロリー食摂取コントロール群のみ、8週目において大幅に上昇していた。高カロリー食摂取コントロール群では6〜8週目においてインスリン抵抗性が惹起された糖尿病状態となっていたが、Nrf2活性化群では発症を認めなかった。
これらの結果は、Nrf2活性化が高カロリー食摂取による肥満と糖尿病を抑制することを示している。
【００７０】
（２−５）Nrf2活性化剤投与による抗糖尿病作用
糖尿病を自然発症するdb/dbマウスにおいて、Nrf2活性化剤を投与した場合の糖尿病の治療効果を試験した。Nrf2活性化剤としてはCDDO-Imを用い、30μmol/kgを週３回、経口で、6週令から18週令の間投与した。Nrf2活性化剤投与群では、9週令以降、非投与群に比べて血糖値の低下が認められた（図１１）。16週令でのHOMA-IR（空腹時インスリン値(ng/mL)×空腹時血糖値(mg/dL)÷405）は、Nrf2活性化剤投与群では非投与群より低く、インスリン抵抗性の改善が示唆された。16週令において、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。0.5g/kg体重のグルコースを14時間絶食後に経口投与した。Nrf2活性化剤投与群では非投与群に比べ高血糖が改善されていた（図１２）。糖刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）は非投与群では消失していたが、Nrf2活性化剤投与群では回復傾向が認められた。Nrf2活性化剤投与群ではβ細胞量の維持が認められた。
これらの結果は、Nrf2活性化剤の投与は、β細胞の保護とインスリン抵抗性の改善を通して糖尿病の治療効果を発揮したことを示す。
【００７１】
（実施例３）骨格筋におけるエネルギー代謝亢進
（３−１）肝臓、骨格筋、脂肪組織での遺伝子発現の解析
Nrf2を活性化したICRマウス（Keap1flox/-）において、インスリン感受性の亢進と体重減少が認められた。そのメカニズムの解明のため、インスリン感受性組織でのグルコース代謝およびエネルギー消費に関連する代表的な遺伝子の発現を解析した。
マウスは8週令を用いた。組織からの総RNAの抽出は、ISOGEN試薬（Nippongene社）を用いて行った。総RNAは、PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(TakaraBio社)を用い、逆転写反応に供した。得られたテンプレートを定量real-time PCR(pRCR)に供した。qPCRは、7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems社)により、qPCR Mastermix (Eurogentec社)を用い、サイクル条件（50 °C, 2 min, 95 °C, 10 min for 1 cycle; 95 °C, 15 sec, 60 °C, 90 sec for 40 cycles)で行った。qPCRに用いたプライマーとTaqMan probeを表１に示す。遺伝子発現量はHprt（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase）により標準化した。
【表１−１】
2013146911.tif 000031
【表１−２】
2013146911.tif 000032
【表１−３】
2013146911.tif 000033
【表１−４】
2013146911.tif 000034
【００７２】
Nrf2活性化は、肝臓においてInsr（insulin receptor）、Irs1（insulin receptor substrate 1）、およびGck（glucokinase）の遺伝子発現を有意に減少させた。下肢骨格筋においては、Cpt1b、Acox1（acyl-Coenzyme A oxidase 1, palmitoyl）、およびGlut4（solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 4）の遺伝子発現が有意に増加し、PGC1α（peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha）、Ucp3（uncoupling protein 3）、およびHk2（hexokinase 2）の遺伝子発現はわずかに増加した。精巣上体脂肪組織では、変化のある遺伝子は認められなかった。褐色脂肪組織では、Glut1（solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1）は上昇していたがUcp1（uncoupling protein 1）またはUcp2（uncoupling protein 2）は変化しなかった（図１３）。
【００７３】
（３−２）高カロリー食摂取マウスでの骨格筋でのエネルギー代謝亢進
Nrf2を活性化したICRマウス（Keap1flox/-）において、高カロリー食を摂取させた場合の骨格筋のエネルギー代謝関連遺伝子の発現の詳細を解析した。マウスは、高カロリー食を8週間摂取させた20週令を用いた。
Nrf2活性化は、下肢骨格筋においてCpt1b、Ucp3、Tfam（transcription factor A, mitochondrial ） およびPGC1αの遺伝子発現を有意に増加させた（図１４）。下肢骨格筋のCpt1bタンパク質の量をウエスタンブロッティングにより測定したところ、タンパク質発現量も有意に上昇していた（図１５）。
【００７４】
（３−３）血中脂肪酸の解析
Nrf2活性化により、骨格筋でのエネルギー代謝亢進関連遺伝子の発現の上昇が認められたことから、血中脂肪酸への影響を確認した。
Nrf2を活性化したICRマウス（Keap1flox/-）とコントロールのICRマウス（Keap1 flox /+）について、血漿中の遊離脂肪酸とトリグリセリドの濃度を測定した。遊離脂肪酸はQuantification Kit(Bio Vision社)を用いて測定した。トリグリセリドはDRI-CHEM7000(Fuji Film社)を用いて測定した。マウスは8週令を用いた。血漿中の遊離脂肪酸とトリグリセリドの濃度は、Nrf2活性化により有意に減少していた（図１６）。
Nrf2活性化による血漿中の遊離脂肪酸とトリグリセリドの濃度の減少は、骨格筋における脂肪酸β酸化を伴うエネルギー代謝の亢進を反映していると考えられる。
【００７５】
（３−４）酸素消費量の測定
エネルギー代謝亢進の一つの指標として、動物の酸素消費量を用いることができる。酸素消費量の測定は、論文（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ２００９，６２０，１３８−１４４）に従い実施できる。具体的には、小動物代謝計測システム（オキシマックス等流量システム、バイオリサーチセンター）を用いる。マウスを個別にエアタイトチャンバーに入れ、エアー流量0.5-0.8L/minの条件下で、24時間測定する。餌と水は自由摂取させる。チャンバー内外のエアーは5分15秒毎に採取し、サンプル中の酸素濃度（％）、あるいは二酸化炭素濃度（％）を測定する。酸素消費量（VO2: ml/min/100g BW）、あるいは二酸化炭素排出量（VCO2: ml/min/100g BW）は、チャンバー内外の各濃度の差にエアー流量をかけて算出し、マウスの体重100g当たりに補正する。呼吸商(Respiratory quotient: RQ)は、二酸化炭素排出量（VCO2）/酸素消費量（VO2）の計算式で算出する。
【００７６】
（実施例４）β細胞を破壊した糖尿病モデルマウスでのNrf2活性化の効果
5週齢の雄性ICRマウス（日本SLC）に対して生理的食塩水で溶解したストレプトゾトシン（WAKO）を200 mg/kgの用量で腹腔内投与した。投与6日後（Day 6）に血糖値をグルコースCIIテスト（WAKO）を用いて測定し、群分けを行った。Day 7からDay 12まで、Nrf2活性化剤（CDDO-Me、5mg/kg)を1日1回あるいは2回した。溶媒投与群には20% ゲルシアを1日2回経口投与した。Day 12に採血し、血糖値および血漿中インスリン値（モリナガ  インスリン測定キット使用）を測定した。溶媒投与群と比較して、Nrf2活性化剤投与群において有意な血糖低下作用が認められたが（図１７）、低下した血漿中インスリン濃度を改善しなかった（図１８）。この結果は、Nrf2活性化剤はインスリン非依存的なメカニズムにより血糖低下作用を示すことを表す。実施例２および実施例３の結果と併せて考えると、インスリン非依存的なメカニズムは、骨格筋のエネルギー代謝亢進によるものと考えられる。
【００７７】
（実施例５）肝臓における糖代謝抑制
（５−１）糖尿病モデルマウス（db/dbマウス）での抗糖尿病作用
Nrf2を活性化した糖尿病モデルマウス(db/db::Keap1flox/-)およびコントロールの糖尿病モデルマウス(db/db::Keap1flox/+)において、血糖値および血中中性脂肪を測定した。マウスは17〜18週齢の動物を用いた。血糖値はOne touch ultra view blood glucose analyzer (LifeScan, Milpitas, CA, USA)を用いて測定した。また、血漿中のTriglyceride (TG) はDRI-CHEM7000 (Fuji Film, Tokyo, Japan)を用いて測定した。
その結果、Nrf2が恒常的に活性化した状態にあるdb/db::Keap1flox/-マウスにおいては、db/db::Keap1flox/+マウスと比較し、顕著な血糖値低下、血中TGの低下が認められた(図１９)。
【００７８】
（５−２）肝臓での遺伝子発現の解析
（５−１）の血糖低下のメカニズムを解明するため、肝臓の遺伝子発現を定量real-time PCRにて解析した。
（５−１）にて用いたdb/db::Keap1flox/-マウスとdb/db::Keap1flox/+マウスの肝臓組織を採取し、ISOGEN (Nippon Gene)を用いてRNAを抽出した。そのRNAからSuperScript III (Invitrogen)を用いcDNAを作製した。定量PCR解析は、qPCR Master Mix (Nippon Gene)またはqPCR Master Mix SYBR (Nippon Gene)を用い、ABI 7300 system (Applied Biosystems)により行った。Fbp1(fructose-1,6-bisphosphatase 1), G6pc(Glucose-6-phosphatase), Nr4a2, Pck1(phosphoenolpyruvate carboxylase), PGC1αの遺伝子発現量の評価には、表2のPrimerとProbeのセットを用いた。それぞれの遺伝子の発現量はHprt遺伝子の発現量で補正した。【００７９】
【表２】
2013146911.tif 000035
【００８０】
定量PCR解析を行った結果、db/db::Keap1flox/-マウスにおいては、db/db::Keap1flox/+マウスと比較し、糖新生に関与する遺伝子であるPck1, G6pc, Fbp1, PGC1α, Nr4a2の有意な発現減少が見られた(図２０)。【００８１】
（５−３）遺伝子発現と血糖値および血中中性脂肪との相関
（５−２）において測定したdb/db::Keap1flox/-マウスとdb/db::Keap1flox/+マウスの肝臓における遺伝子の発現量について、（５−１）において測定した血糖値および血漿中TG濃度との相関を調べた。その結果、Nr4a2の遺伝子発現量が、db/dbマウスの血糖値および血漿中TG濃度と最もよく相関した(図２１)。【００８２】
この結果から、Nrf2を活性化した際に、肝臓のNr4a2の発現量が下がるほど、より強い抗糖尿病作用が得られると考えられる。
Nr4a2は肝臓における糖新生酵素の発現を制御する転写因子であり、その発現抑制により、糖新生酵素の発現抑制を引き起こすと考えられる(Pei L, et al., (2006) Nat Med. 12, 1048-1055)。また、Nr4a family遺伝子は血中及び肝臓の脂質代謝を改善することも知られている(Pols TW, et al., (2008) Biochem Biophys Res Commun, 366, 910-916)。肝臓でみられたNr4a2の遺伝子変化は、db/db::Keap1flox/-マウスで見られた血糖低下、血中TGの低下、糖新生酵素の発現抑制などの現象を説明づけるものとして合理的である。糖尿病の病態において、体内の各組織は高血糖により生じる酸化ストレスに晒されているが、Nrf2はこの酸化ストレスに対し抗酸化遺伝子を誘導することで防御的に働くことが考えられる。その抗酸化作用に加え、糖代謝、脂質代謝制御を担うNr4a2などの遺伝子を調節することで、より強力な抗糖尿病効果が実現されると考えられる。これらのことから、Nrf2活性化によるNr4a2の遺伝子変化を指標とすることで、より抗糖尿病効果の高いNrf2活性化剤を選別することができると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
[配列番号：１] ヒトNrf2をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_006164)。
[配列番号：２] ヒトNrf2のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_006155)。
[配列番号：３] マウスNrf2をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_010902)。
[配列番号：４] マウスNrf2のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_035032)。
［配列番号：５］ヒトCpt1bをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_004377)。
［配列番号：６］ヒトCpt1bのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_004368)。
［配列番号：７］マウスCpt1bをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_009948)。
［配列番号：８］マウスCpt1bのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_034078)。
［配列番号：９］ヒトPGC1αをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_013261)。
［配列番号：１０］ヒトPGC1αのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_037393)。
［配列番号：１１］マウスPGC1αをコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_008904)。
［配列番号：１２］マウスPGC1αのアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_032930)。
［配列番号：１３〜配列番号：６５］実施例で用いたプライマーまたはプローブである。
［配列番号：６６］ヒトNr4a2をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_006186)。
［配列番号：６７］ヒトNr4a2のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_006177)。
［配列番号：６８］マウスNr4a2をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_013613)。
［配列番号：６９］マウスNr4a2のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_038641)。
［配列番号：７０、配列番号：７１］実施例で用いたプライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図２１】
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【図４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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