(57)【要約】  本発明の主な目的は、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害し、アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防為の薬剤の有効成分となる化合物を開発することである。  このような目的を達成するために配列番号１、１３、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有し、βＣＴＦのＮ末端領域に結合するポリペプチド、当該ポリペプチドを含むγセクレターゼ活性阻害剤、βセクレターゼ活性阻害剤、Ａβタンパク質産生抑制剤、及びアルツハイマー病治療及び／又は予防剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、１３、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有し、βＣＴＦのＮ末端領域に結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２〜１４、及び２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２〜８、１０〜１２、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
（項１−３）配列番号３、４、６、１０、１１、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、γセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項６】
配列番号３にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む請求項５に記載の、γセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、βセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項８】
配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む請求項７に記載の、βセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、Ａβタンパク質産生抑制剤。
【請求項１０】
配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む請求項９に記載の、Ａβタンパク質産生抑制剤。
【請求項１１】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、アルツハイマー病治療及び／又は予防剤。
【請求項１２】
配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１１に記載のアルツハイマー病治療及び／又は予防剤。
【請求項１３】
請求項１〜４の何れか１つに記載のポリペプチドを、アルツハイマー病患者に投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療及び／又は予防する方法。
【請求項１４】
アルツハイマー病の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１〜４の何れか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、請求項１〜４の何れか１つに記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβタンパク質の産生を特異的に抑制するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドβタンパク質（以下、本明細書においてＡβタンパク質と称することがある。）は、アルツハイマー病の原因タンパク質の１つとして考えられている。具体的には、このＡβタンパク質が脳内にて蓄積していることが、アルツハイマー病の病態の１つとして認識されている。このようなＡβタンパク質が、脳内にて蓄積することによって剛直な繊維状の分子構造を形成し、脳内の神経細胞を死に至らしめることなり、結果として神経機能が損傷してアルツハイマー病が発症するものと考えられている。【０００３】
Ａβタンパク質は、細胞膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（以下、本明細書にてＡＰＰと称することがある。）がβセクレターゼによって切断された細胞膜貫通タンパク質であるβＣＴＦが、更にγセクレターゼにて切断されて細胞膜から遊離し、脳内にて蓄積するものと考えられている。【０００４】
γセクレターゼにて切断されたβＣＴＦはＡβタンパク質と、ＡＩＣＤとに分けられることが知られており、ＡＰＰがβセクレターゼによって切断されることにより、ｓＡＰＰβが遊離することも知られている（図１）。【０００５】
成熟ＡＰＰを基準にすれば、Ａβタンパク質は６５３〜６９４番目のアミノ酸残基に該当し、βＣＴＦは６５３〜７５１番目のアミノ酸残基に該当する。また、ｓＡＰＰβは１８〜６５２番目のアミノ酸残基に該当し、ＡＩＣＤは７０１〜７５１番目のアミノ酸残基に該当する。【０００６】
以上のことから、γセクレターゼの阻害剤はアルツハイマー病の原因タンパク質である、Ａβタンパク質の蓄積を抑制する効果を発揮する剤として考えられていた。【０００７】
ところが、それぞれ膜貫通タンパク質であるＰｅｎ−２、プレセニリン、ニカストリン、及びＡｐｈ−１を含む複合体として知られるγセクレターゼは、アスパラギン酸プロテアーゼに属し、上述のＡＰＰのみならずＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、Ｎｏｔｃｈ、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ１、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ４４、ＥｒｂＢ４、Ｎｅｃｔｉｎ１、ＬＲＰ１等といった膜貫通タンパク質、レセプター等も基質とするプロテアーゼである。【０００８】
従って、Ａβタンパク質の産生抑制作用を得るために、Ｌ−６８５，４５８、ＤＡＰＴ、ＬＹ−４１１，５７５等といったγセクレターゼの活性阻害剤を使用すれば、上述のβＣＴＦ以外のタンパク質に対するγセクレターゼのプロテアーゼとしての酵素活性までもが抑制されてしまい、斯かる阻害剤をそのまま薬剤として用いれば、副作用が生じるといった可能性が危惧されている。【０００９】
例えば、γセクレターゼの阻害剤の１つであるＬＹ−４１１，５７５は、胸腺を萎縮させることや脾臓における成熟Ｂ細胞の細胞数を減少させること等が報告されており、このような阻害剤をそのまま医薬組成物とした場合、免疫等の点で副作用を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献１）。さらに、γセクレターゼの酵素活性そのものを低下させると、皮膚の異常、扁平上皮ガン、脾臓の肥大等を引き起こすことも報告されている（非特許文献２）。【００１０】
また、Ａβタンパク質の産生機序に鑑みれば、βセクレターゼの酵素活性を阻害する化合物も有効であると考えられるが、βセクレターゼのノックアウトマウスは、出生数が減少するといった報告があり、アルツハイマー病に対する薬剤としては好ましくない。【００１１】
そして、非ステロイド性抗炎症薬（以下、本明細書でＮＳＡＩＤｓと称することがある。）がＡβタンパク質の産生抑制剤として有効であるといった知見が存在するが、いくつかの家族性アルツハイマー病（例えば、プレセニリンの変異を有する場合。）には、効果がないことが知られている（非特許文献３）。さらに軽度認知障害やアルツハイマー病患者から分離したγセクレターゼは活性が変化しており、Ａβ４２を低下させるγセクレターゼモヂュレーターの効果が低いことがわかった（非特許文献４）。【００１２】
また、βＣＴＦの細胞外領域であるＮ末端にＦＬＡＧタグを付して発現させた場合、抗ＦＬＡＧ抗体の存在下では、γセクレターゼによる分解が見られない（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗｏｎｇ，Ｇ．  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９：１２８７６−１２８８２
【非特許文献２】Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７；２７：１３５７９−１３５８０
【非特許文献３】Ｐａｇｅ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８；２８３：６７７−６８３
【非特許文献４】Ｋａｋｕｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１２；４：３４４−３５２
【非特許文献５】Ｓｈａｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００５；１２２：４３５−４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のように、アルツハイマー病の治療及び／又は予防の為には、Ａβタンパク質の蓄積を阻害する化合物の開発が求められているにもかかわらず、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害する化合物に関する知見は何ら得られていない。【００１５】
従って、本発明の主な目的は、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害し、アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防の為の薬剤の有効成分となる化合物を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、Ａβタンパク質の産生を特異的に抑制する化合物を探索するに際して、βＣＴＦに対してγセクレターゼが酵素反応を起こすことにより、Ａβタンパク質を産生するところに着目した。ここで、γセクレターゼそのものの酵素活性を阻害する観点ではなく、γセクレターゼとβＣＴＦとの結合を特異的に阻害する観点から、Ａβタンパク質の産生を特異的に抑制する効果を発揮する化合物の探索を行った。【００１７】
本発明者は、βＣＴＦの細胞外ドメインとなるＮ末端領域に対して特異的に結合するモノクローナル抗体の存在する環境下において、βＣＴＦとγセクレターゼを反応させたところ、Ａβタンパク質の産生を顕著に、且つ特異的に阻害する効果を発揮することを見出した。また、γセクレターゼのβＣＴＦ以外の基質に対する酵素活性には殆ど影響を及ぼさないことも見出した。【００１８】
本発明者は、斯かる知見に基づいて鋭意研究を重ねた結果、Ａβタンパク質の産生を特異的に抑制する効果を発揮する化合物として、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが特に顕著な効果を発揮することを見出した。本発明は、以下に示す態様を広く包含するものである。【００１９】
項１  配列番号１、１３、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有し、βＣＴＦのＮ末端領域に結合するポリペプチド。【００２０】
更に、以下の（項１−１）〜（項１−６）に記載した態様の発明が例示される。
（項１−１）配列番号２〜１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、上記項１に記載のポリペプチド。
（項１−３）配列番号３、４、６、１０、１１、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、上記項１に記載のポリペプチド。
（項１−４）アミド末端がアセチル化及び／又はカルボキシ末端がアミド化された、上記項１、及び項（１ー１）〜（１−３）の何れか１つに記載のポリペプチド。
（項１−５）前記βＣＴＦのＮ末端領域が、配列番号１５にて示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記項１、及び項（１−１）〜（１−４）の何れか１つに記載のポリペプチド。
（項１−６）前記結合が、５０μＭ以下のＫＤ値を満たすことを特徴とする上記項１、及び項（１−１）〜（１−５）の何れか１つに記載のポリペプチド。【００２１】
項２  上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、γセクレターゼ活性阻害剤。【００２２】
更に、以下の（項２−１）〜（項２−３）に記載した態様の発明が例示される。
（項２−１）上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、βＣＴＦ特異的γセクレターゼ活性阻害剤。【００２３】
（項２−２）配列番号３にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む上記項２に記載の、γセクレターゼ活性阻害剤。【００２４】
（項２−３）配列番号３にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む上記項２に記載の、βＣＴＦ特異的γセクレターゼ活性阻害剤。【００２５】
項３  上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、βセクレターゼ活性阻害剤。【００２６】
更に、以下の（項３−１）〜（項３−３）に記載した態様の発明が例示される。
（項３−１）上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、ＡＰＰ特異的βセクレターゼ活性阻害剤。【００２７】
（項３−２）配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む上記項３に記載の、βセクレターゼ活性阻害剤。【００２８】
（項３−３）配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む上記項３に記載の、ＡＰＰ特異的βセクレターゼ活性阻害剤。【００２９】
項４  上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、Ａβタンパク質産生抑制剤。【００３０】
更に、以下の（項４−１）〜（項４−３）に記載した態様の発明が例示される。
（項４−１）上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、Ａβタンパク質特異的産生抑制剤。【００３１】
（項４−２）配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む上記項４に記載の、Ａβタンパク質産生抑制剤。【００３２】
（項４−３）配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む上記項４に記載の、Ａβタンパク質特異的産生抑制剤。【００３３】
項５  上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを含む、アルツハイマー病治療及び／又は予防剤。【００３４】
更に、以下の（項５−１）に記載した態様の発明が例示される。
（項５−１）配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、上記項５に記載の治療及び／又は予防剤。【００３５】
項６  上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドを、アルツハイマー病患者に投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療及び／又は予防する方法。【００３６】
更に、以下の（項６−１）に記載した態様の発明が例示される。
（項６−１）配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを、アルツハイマー病患者に投与する工程を含む、上記項６に記載の方法。【００３７】
項７  アルツハイマー病の治療及び／又は予防における使用のための、上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチド。【００３８】
更に、以下の（項７−１）に記載した態様の発明が例示される。
（項７−１）アルツハイマー病の治療及び／又は予防における使用のための、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、上記項７に記載のポリペプチド。【００３９】
項８  アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、上記項１、及び（項１−１）〜（項１−６）の何れか１つに記載のポリペプチドの使用。【００４０】
更に、以下の（項８−１）に記載した態様の発明が例示される。
（項８−１）アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの、上記項８に記載の、使用。【００４１】
以下に、本発明をより詳細に説明する。【００４２】
本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ等の文献を参照すればよい。【００４３】
ポリペプチド
本発明に係るポリペプチドは、配列番号１、１３、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、配列番号２〜１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号２〜８、１０〜１２、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、配列番号３、４、６、１０、１１、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する。【００４４】
なお、上記配列番号１にて示されるアミノ酸配列のうち、２番目、３番目、４番目、５番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１９番目、２１番目、２２番目及び２３番目の位置のアミノ酸残基は、下記の表１に示すアミノ酸残基の何れかである。【００４５】
【表１】
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【００４６】
なお、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の３番目のアミノ酸残基は、Ｌ−４，４’ビフェニルアラニン残基である。即ち、配列番号１４にて示されるアミノ酸配列を有する本発明にかかるポリペプチドにおいて、２番目のグリシンのカルボキシル基と上記Ｌ−４，４’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合しており、４番目のバリンのアミド基と上記Ｌ−４，４’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合している。【００４７】
同様に、配列番号２２に示されるアミノ酸配列の３番目のアミノ酸残基は、Ｌ−４，４’ビフェニルアラニン残基である。即ち、配列番号２２にて示されるアミノ酸配列を有する本発明にかかるポリペプチドにおいて、２番目のアルギニンのカルボキシル基と上記Ｌ−４，４’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合しており、４番目のバリンのアミド基と上記Ｌ−４，４’ビフェニルアラニンのアミド基がペプチド結合している。【００４８】
本発明に係るポリペプチドは、アミド末端がアセチル化されていてもよく、又はカルボキシ末端がアミド化されていてもよい。そして、アミド末端がアセチル化され、且つカルボキシ末端がアミド化されていてもよい。【００４９】
本発明に係るポリペプチドは、適宜修飾が施されていてもよい。具体的には、ビオチン修飾、蛍光色素修飾、糖鎖修飾、脂質修飾等が挙げられ、これらの何れかに限定されるものではない。【００５０】
このような修飾箇所は、特に限定されるものではなく、ポリペプチド内部、ポリペプチドのＣ末端、又はポリペプチドのＮ末端の何れであってもよい。【００５１】
これらの修飾方法は、公知の方法を採用すればよく、特に限定されるものではない。【００５２】
本発明に係るポリペプチドはβＣＴＦのＮ末端領域に結合する。βＣＴＦとは、ＡＰＰ（例えばＮＣＢＩのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｑ９５２４１．１等に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）が、βセクレターゼによって切断された産物であるために、βＣＴＦのＮ末端領域に結合するということは、ＡＰＰに結合するということ同意である。そして、βＣＴＦのＮ末端領域とは、ＡＰＰからすれば、βセクレターゼの切断認識部位付近に該当するものである。【００５３】
また、βＣＴＦのＮ末端領域付近はγセクレターゼによっても認識及び切断され、切断後の断片がＡβタンパク質（例えばＮＣＢＩのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  １Ｚ０Ｑ＿Ａ、１ＢＡ６＿Ａ）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）として産生されるため、βＣＴＦのＮ末端領域に結合するということは、Ａβタンパク質に結合するということ同じ意味である。【００５４】
本発明に係るポリペプチドが結合する、βＣＴＦのＮ末端領域の具体的なアミノ酸配列は、特に限定はされないが、例えば、配列番号１５等にて示されるアミノ酸配列である。また、配列番号１５にて示されるアミノ酸の一部であってもよい。なお、本発明におけるβＣＴＦのＮ末端領域とは、必ずしもβＣＴＦのＮ末端に存在するＡｓｐ残基を含んでいなくともよい。【００５５】
上述したβＣＴＦのアミノ酸配列として、具体的にはヒト型のβＣＴＦであれば、例えば配列番号２０に示すアミノ酸配列が挙げられる。また、マウス型のβＣＴＦであれば、例えば配列番号２１に示すアミノ酸配列が挙げられる。【００５６】
本発明に係るポリペプチドと、βＣＴＦのＮ末端領域との結合の強さは、特に限定はされないが、例えば解離定数（ＫＤ）にて表すとすれば、通常５０μＭ以下程度の範囲を満たすものであり、好ましくは５μＭ以下程度である。【００５７】
本発明に係るポリペプチドは、種々の溶媒に可溶であり、その具体的な溶媒は特に限定されることはないが、例えば水、ＰＢＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等の溶媒が挙げられる。また、これらの溶媒を二種以上組み合わせて用いてもよい。【００５８】
本発明に係るポリペプチドは、βＣＴＦのＮ末端領域に結合する。上述のように当該領域は、γセクレターゼのβＣＴＦ切断認識部位付近に該当する領域であることから、γセクレターゼの活性阻害剤として有用である。【００５９】
また、本発明に係るポリペプチドは、βＣＴＦのＮ末端領域に結合する。上述のように当該領域は、βセクレターゼのＡＰＰ切断認識付近に該当する領域であることから、βセクレターゼの活性阻害剤として有用である。【００６０】
本発明に係るポリペプチドは、公知の方法によって作製することが出来る。具体的には、ペプチド合成機などを用いた化学的な製造方法を採用してもよいし、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を宿主細胞に導入して、生化学的な合成方法を採用してもよい。【００６１】
なお、製造した本発明に係るポリペプチドはカラムクロマトグラフィー等の公知の方法を用いて精製すればよい。【００６２】
γセクレターゼ活性阻害剤
本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤は、上述の本発明に係るポリペプチドを含む。上述のポリペプチドの中でも、配列番号２〜１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００６３】
このような本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤に含まれる好ましいポリペプチドの中でも、配列番号３、４、６、７、１０、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００６４】
さらに、配列番号３、４、６、１０又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、又は６の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３又は６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの順により好ましく、これらの中でも最も好ましいポリペプチドは、配列番号３にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。【００６５】
本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤に含まれる本発明に係るポリペプチドは、上述のようにβＣＴＦのＮ末端領域に結合する。本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤は、このような現象に基づいて機能を発揮するために、γセクレターゼが認識するβＣＴＦ以外の他の基質に対するγセクレターゼ活性は阻害しない傾向となる。即ち、本発明のγセクレターゼは、βＣＴＦ特異的γセクレターゼ活性阻害剤とすることが好ましい。【００６６】
「βＣＴＦ特異的」とは、γセクレターゼ活性阻害剤がγセクレターゼの活性を阻害する基質として、βＣＴＦとその他の候補基質が同時に存在している場合に、βＣＴＦをより活性を阻害する基質として選択する傾向であることを示す。【００６７】
本発明のγセクレターゼ活性阻害剤をβＣＴＦ特異的γセクレターゼ活性阻害剤とする場合、γセクレターゼ活性阻害剤が競合的な阻害活性を示すことが好ましい。【００６８】
本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤は、上述の本発明のポリペプチドを含むものであるが、当該ポリペプチド以外に成分を含まず、そのままγセクレターゼ活性阻害剤としてもよい。【００６９】
本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤に、本発明に係るポリペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、γセクレターゼの活性阻害効果を減少させない限り、特に限定されるわけではないが、例えば防腐剤、殺菌剤、安定剤等といった公知の剤が含まれていてもよい。そしてこの場合、本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤における本発明に係るポリペプチドの含有割合は、γセクレターゼ活性阻害剤に対して通常０．００１〜９９．９重量％程度とすればよい。【００７０】
上述のように、γセクレターゼはβＣＴＦを基質として認識し、Ａβタンパク質を産生させる。従って、本発明に係るγセクレターゼ活性阻害剤に含まれる本発明に係るポリペプチドは、Ａβタンパク質の産生抑制剤としても有用である。【００７１】
βセクレターゼ活性阻害剤
本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤は、上述の本発明に係るポリペプチドを含む。上述のポリペプチドの中でも、配列番号２〜１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００７２】
このような本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤に含まれる好ましいポリペプチドの中でも、配列番号３〜８、１０〜１２、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００７３】
さらに、配列番号３〜８、１０、１２又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３〜８、１２、又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３〜８又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３〜６、８又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、８又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、又は８の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号４、６、又は８の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号４又は６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの順により好ましく、これらのポリペプチドの中でも最も好ましいのは、配列番号４にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。【００７４】
本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤に含まれる本発明に係るポリペプチドは、上述のようにＡＰＰのβセクレターゼの切断認識部位付近に結合する。本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤は、このような現象に基づいて機能を発揮するために、βセクレターゼが認識するＡＰＰ以外の他の基質に対するβセクレターゼ活性は阻害しない傾向となる。即ち、本発明のβセクレターゼは、ＡＰＰ特異的βセクレターゼ活性阻害剤とすることが好ましい。【００７５】
「ＡＰＰ特異的」とは、βセクレターゼ活性阻害剤がβセクレターゼの活性を阻害する基質として、ＡＰＰとその他の候補基質が同時に存在している場合に、ＡＰＰをより活性を阻害する基質として選択する傾向であることを示す。【００７６】
本発明のβセクレターゼ活性阻害剤をＡＰＰ特異的βセクレターゼ活性阻害剤とする場合、βセクレターゼ活性阻害剤が競合的な阻害活性を示すことが好ましい。【００７７】
本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤は、上述の本発明のポリペプチドを含むものであるが、当該ポリペプチド以外に成分を含まず、そのままβセクレターゼ活性阻害剤としてもよい。【００７８】
本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤に、本発明に係るポリペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、βセクレターゼの活性阻害効果を減少させない限り、特に限定されるわけではないが、例えば防腐剤、殺菌剤、安定剤等といった公知の剤が含まれていてもよい。そしてこの場合、本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤における本発明に係るポリペプチドの含有割合は、βセクレターゼ活性阻害剤に対して通常０．００１〜９９．９重量％程度とすればよい。【００７９】
上述のように、βセクレターゼはＡＰＰを基質として認識してβＣＴＦを産生し、産生されたβＣＴＦはγセクレターゼの働きによって分解されてＡβタンパク質を産生させる。従って、本発明に係るβセクレターゼ活性阻害剤に含まれる本発明に係るポリペプチドは、Ａβタンパク質の産生抑制剤としても有用である。【００８０】
Ａβタンパク質産生抑制剤
本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤は、上述の本発明に係るポリペプチドを含む。上述のポリペプチドの中でも、配列番号２〜１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００８１】
このような本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤に含まれる好ましいポリペプチドの中でも、配列番号３、４、６、１０、１１、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００８２】
さらに、配列番号３、４、６、１０、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、１０、又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、又は６の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３又は６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの順により好ましく、これらのポリペプチドの中でも最も好ましいのは、配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。【００８３】
本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤は、上述の本発明のポリペプチドを含むものであるが、当該ポリペプチドは特にβＣＴＦ特異的γセクレターゼ阻害活性作用、及び／又はＡＰＰ特異的βセクレターゼ活性阻害作用を発揮する。ＡＰＰがβセクレターゼの働きによってβＣＴＦを産生し、当該βＣＴＦはγセクレターゼの働きによってＡβタンパク質を産生することから、本発明に係るポリペプチドを含むＡβタンパク質産生抑制剤は、特にＡβタンパクを特異的に産生抑制する効果を発揮する。【００８４】
従って、本発明に係るＡβタンパク質産生抑制は、Ａβタンパク質特異的産生抑制剤とすることが好ましい。【００８５】
「Ａβタンパク質特異的」とは、本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤が、他の産生抑制候補物質と共存している場合に、他の物質よりもＡβタンパク質をより選択的に産生を抑制する傾向であることを示す。【００８６】
本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤に、本発明に係るポリペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、Ａβタンパク質産生抑制効果を減少させない限り、特に限定されるわけではないが、例えば防腐剤、殺菌剤、安定剤等といった公知の剤が含まれていてもよい。そしてこの場合、本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤における本発明に係るポリペプチドの含有割合は、Ａβタンパク質産生抑制剤に対して通常０．００１〜９９．９重量％程度とすればよい。【００８７】
Ａβタンパク質が産生されて蓄積することは、アルツハイマー病の発症機序の１つであるために、Ａβタンパク質の産生を抑制することは、アルツハイマー病の予防及び／又は治療に有用である。【００８８】
従って、本発明に係るＡβタンパク質産生抑制剤に含まれるポリペプチドは、アルツハイマー病の治療及び／又は予防剤としても有用である。【００８９】
以上のことから、上述した本発明に係るポリペプチドは、アルツハイマー病の治療及び／又は予防における使用に好適である。【００９０】
具体的な『アルツハイマー病の治療及び／又は予防における使用』とは、以下の「アルツハイマー病の治療及び／又は予防剤」にて詳述する使用方法を参照すればよい。【００９１】
また、上述した本発明に係るポリペプチドは、アルツハイマー病の治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための使用に好適である。【００９２】
具体的な『アルツハイマー病の治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための使用』についても、以下の「アルツハイマー病の治療及び／又は予防剤」にて詳述する使用方法を参照すればよい。【００９３】
アルツハイマー病治療及び／又は予防剤
本発明に係るアルツハイマー病治療及び／又は予防剤は、上述の本発明に係るポリペプチドを含む。上述のポリペプチドの中でも、配列番号２〜１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００９４】
このような本発明に係るアルツハイマー病治療及び／又は予防剤に含まれる好ましいポリペプチドの中でも、配列番号３、４、６、１０、１１、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。【００９５】
さらに、配列番号３、４、６、１０、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、１０、又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、６、又は１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、４、又は６の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３又は６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの順により好ましく、これらのポリペプチドの中でも最も好ましいのは、配列番号６にて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。【００９６】
本発明に係るアルツハイマー病治療及び／または予防剤は、上述の本発明のポリペプチドを含むものであるが、当該ポリペプチドは特にＡβタンパク質特異的産生抑制作用を発揮することから、本発明に係るアルツハイマー病治療及び／又は予防剤は、副作用を低いといった顕著な効果を発揮する。【００９７】
本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤に、本発明に係るポリペプチド以外の他の成分が含有される場合、その具体的な他の成分は、アルツハイマー病の治療及び／又は予防効果を減少させない限り、薬学的に許容可能な担体或いは添加物が含まれていてもよい。【００９８】
薬学的に許容可能な担体又は添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、乳化剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、或いは甘味料を意味し、これらの中でも公知のものを適宜採用すればよい。【００９９】
この場合、本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤における本発明に係るポリペプチドの含有割合は、アルツハイマー病の治療及び／又は予防剤に対して通常０．００１〜９９．９重量％程度とすればよい。【０１００】
本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤の剤型は、たとえば錠剤、散剤、シロップ剤、ハップ剤、注射剤、点滴剤等が挙げられ、特に限定はされないが、注射剤又は点滴剤とすることが好ましい。このような注射剤や点滴剤は、水性であっても、非水性であっても、懸濁性であっても良い。また、用時調製型の剤型であってもよい。【０１０１】
本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤は、アルツハイマー病に罹患した患者に投与する工程を含む免疫疾患の治療方法における利用可能性を有している。また、アルツハイマー病の病態や症状を発症していないものの、アルツハイマー病の素因を持ち得る患者に投与する工程を含むアルツハイマー病の予防方法における利用可能性も有する。さらに、アルツハイマー病発症前段階の軽度認知障害（例えばＭＭＳＥ２６点以下等）を呈する者においても利用可能性を有する。【０１０２】
本発明のアルツハイマー病患者とは、特に限定はされないが、例えば、記憶障害、見当識障害、学習障害、注意障害、空間認知機能、問題解決能力の障害等といった、徐々に進行する認知障害等の症状を呈する患者であり、その所見として画像診断等で大脳皮質に老人斑（Ａβタンパク質の沈着像）が存在すると診断される患者；びまん性の脳萎縮が存在すると診断される患者；タウタンパク質、Ａβ等の髄液バイオマーカー、血液バイオマーカー等で診断された患者であればよい。【０１０３】
本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤の投与量並びに投与方法は、対象とする患者の性別、人種、年齢、全身状態、疾患の重篤度等に応じて、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲で適宜設定することができる。【０１０４】
本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防剤は、上記の量を一日に一度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２〜３週毎、毎月、隔月または２〜３ヶ月毎でもよい。投与方法は、例えば経口、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮内、腹腔内、鼻腔内、肺内、眼内、腟内、頸部内、直腸内、皮下等へ投与する方法が挙げられ、特に限定はされない。【０１０５】
アルツハイマー病の治療及び／又は予防方法
本発明に係るアルツハイマー病の治療及び／又は予防方法は、上述の本発明に係るポリペプチドを、アルツハイマー病患者に投与する工程を含む。【０１０６】
具体的な、アルツハイマー病患者、投与方法等については、上記「アルツハイマー病治療及び／又は予防剤」にて詳述したものを参照すればよい。
【発明の効果】
【０１０７】
以下に、本発明に係るポリペプチドが有する効果について列挙する。なお、本発明に係るポリペプチドは、以下の全ての効果を有するポリペプチドに限定されないのは言うまでもない。【０１０８】
本発明に係るポリペプチドは、γセクレターゼ活性阻害剤、特にβＣＴＦ特異的γセクレターゼ活性阻害剤の有効成分として用いることができる。【０１０９】
本発明に係るポリペプチドは、βセクレターゼ活性阻害剤、特にＡＰＰ特異的βセクレターゼ活性阻害剤の有効成分として用いることができる。【０１１０】
本発明に係るポリペプチドは、Ａβタンパク質産生抑制剤、特にＡβタンパク質特異的産生抑制剤の有効成分として用いることができる。【０１１１】
本発明に係るポリペプチドは、アルツハイマー病治療及び／又は予防剤の有効成分として用いることができる。特にヒト等の個体に投与した場合、副作用が少ないアルツハイマー病治療及び／又は予防剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】Ａβタンパク質、βＣＴＦ、ＡＰＰ、ｓＡＰＰβ、及びＡＩＣＤと、γセクレターゼ並びにβセクレターゼの切断部位を示す模式図。
【図２】本発明に係るポリペプチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるγセクレターゼ活性阻害実験結果を示す図。
【図３】本発明に係るポリペプチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるγセクレターゼ活性阻害実験結果を示す図。
【図４】本発明に係るポリペプチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるγセクレターゼ活性阻害実験結果を示す図。
【図５】本発明に係るポリペプチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるβセクレターゼ活性阻害実験結果を示す図。
【図６】本発明に係るポリペプチドの、細胞レベルでのγセクレターゼ活性阻害実験、βセクレターゼ活性阻害実験、並びにＡβタンパク質産生抑制実験結果を示す図。
【図７−１】図６に示す実験結果をグラフ化した図。
【図７−２】図６に示す実験結果をグラフ化した図。
【図８】本発明に係るポリペプチドの、細胞レベルでのγセクレターゼ活性阻害実験、βセクレターゼ活性阻害実験、並びにＡβタンパク質産生抑制実験結果を示す図。
【図９】本発明に係るポリペプチドを、動物個体に投与した実験結果を示す図。
【図１０】本発明に係るポリペプチドの細胞内分布を示す図。（Ａ）は、ＣＨＯーＫ１細胞に対して、本発明に係るビオチン化ポリペプチドを作用させた後に、細胞を固定しＴｒｉｒｏｎ  Ｘ  １００処理し、アビジン修飾化Ａｌｅｘａ４８８を作用させた結果を示す。（Ｂ）は、ＡＰＰを過剰発現させたＣＨＯーＫ１細胞（以下、７ＷＤ１０細胞）に対して、本発明に係るビオチン化ポリペプチドを作用させた後に、細胞を固定しＴｒｉｒｏｎ  Ｘ  １００処理し、アビジン修飾化Ａｌｅｘａ４８８を作用させた結果を示す。（Ｃ）は、７ＷＤ１０細胞に対して、細胞を固定しＴｒｉｒｏｎ  Ｘ  １００処理し、アビジン修飾化Ａｌｅｘａ４８８のみを作用させた結果を示す。なお、これらの図中のバーは、５０μｍを示す。
【図１１】本発明に係るポリペプチドのマウス型Ａβ産生抑制を示す図。（Ａ）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（Ｎ２Ａ）に対して、本発明にかかるポリペプチドを作用させた際のウエスタンブロッティング像を示す。（Ｂ）は、（Ａ）のデータをデンシトメトリーで解析した結果を示す。
【図１２】本発明に係るポリペプチドのマウス腹腔への投与実験結果を示す図。（Ａ−１）及び（Ａ−２）は、腹腔投与後の大脳皮質中におけるＡβの量を解析したウエスタンブロッティング像を示す。（Ｂ）は、（Ａ）のデータをデンシトメトリーで解析した結果を示す。（Ｃ）は、腹腔投与後の海馬における、本発明に係るポリペプチドの局在を示す組織免疫染色像。図中のバーは、５０μｍを示す。
【図１３】本発明に係るポリペプチドの、Ａβタンパク質産生抑制実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
以下に本発明をより詳細に説明するための実施例を記載する。なお、本発明が以下に示す実施例に記載の内容に限定されないのは言うまでもない。
＜実施例＞
〔ポリペプチドの作製〕
βＣＴＦのＮ末端領域に該当するポリペプチドである配列番号１５にて示されるポリペプチド（Ａｍｙｌｏｉｄβ  １−９）に対して特異的に結合するポリペプチドを、特許文献１に示すポリペプチドスクリーニング技術を用いて同定し、製造した。
【０１１４】
【表２】
2013108780.tif 000003
【０１１５】
下記に示す実験において、上述の配列番号２〜１４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは全てＤＭＳＯに溶かした状態で使用した。
【０１１６】
上記のペプチド名「＃４」の配列番号１５に示すアミノ酸配列に対する解離定数（ＫＤ）を測定したところ、２.６２μＭであった。
【０１１７】
〔Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの解析〕
実験例１：γセクレターゼ活性阻害実験１
図２の（Ａ）に示すようなβＣＴＦを含むポリペプチド（Ｃ９９−ＦＬＡＧ：配列番号１６）及びＣ末端側にＦＬＡＧペプチドを有するマウス由来のＮｏｔｃｈタンパク質（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｑ０１７０５．２の改変型；配列番号１７；以後、Ｎｏｔｃｈとする）を、それぞれ最終濃度が５０ｎＭとなるような溶液を調整した。
【０１１８】
これらの溶液に、９−７ポリペプチド、６−５ポリペプチド、＃１ポリペプチド、＃２ポリペプチド、＃３ポリペプチド、及び＃４ポリペプチドを、それぞれの最終濃度が５０μＭとなるように添加し、次いで５０μＬのＣＨＡＰＳＯ可溶化膜画分（γセクレターゼ含有画分）と４時間反応させた。反応温度は３７°Ｃで行った。陰性対照実験として、上記６種類のポリペプチドに代えてＤＭＳＯを用いた。
【０１１９】
反応後の各サンプルを、Ｃ９９−ＦＬＡＧを用いたものは、図２の（Ａ）に示すようにＣ９９−ＦＬＡＧのＮ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体（８２Ｅ−１）で、ウエスタンブロットを行い、γセクレターゼによって分解されることにより産生されるＡβ４０タンパク質の量を測定した。一方、Ｎｏｔｃｈを用いたものは、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体でウエスタンブロットを行い、同じくγセクレターゼによって分解されることによって産生されるＮＩＣＤの量を測定した。結果を図２の（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【０１２０】
図２（Ｂ）は、Ａβタンパク質及びＮＩＣＤの存在を示すウエスタンブロッティング像である。上記６種類のポリペプチドの存在下では、Ｃ９９−ＦＬＡＧはγセクレターゼによって殆ど分解されることはないことを示すＣ９９にて示すバンドが示されている。中でも、＃４、＃２、＃１等のポリペプチドが、γセクレターゼのβＣＴＦに対する切断活性をより阻害することが明らかとなった。
【０１２１】
一方、上記６種類のいずれのポリペプチドも、ＮＩＣＤの存在を示すバンドが示されていることから、γセクレターゼのＮｏｔｃｈに対する切断活性は阻害していないことも明らかとなった。
【０１２２】
図２（Ｃ）は、Ａβタンパク質及びＮＩＣＤを、図２（Ｂ）にて示すウエスタンブロッティング像における各バンドの濃さを基に定量化したグラフである。グラフの縦軸はコントロールとして用いたＤＭＳＯでの結果を１００％とした相対値を示す。上記６種類のポリペプチドの中でも、＃１が特にＡβタンパク質に対するγセクレターゼの切断活性を阻害しており、Ｎｏｔｃｈに対する切断活性を阻害していないことが明らかとなった。以上のことから、＃１ポリペプチドが、最もβＣＴＦに対して選択的にγセクレターゼの切断活性を阻害することが示唆される。
【０１２３】
実験例２：γセクレターゼ活性阻害実験２
使用するポリペプチドを＃１ポリペプチドのみとし、斯かる＃１ポリペプチドの添加量を、最終濃度がそれぞれ０．５、１、５、１０、２０、及び５０μＭとなるように添加した以外は、上記実験例１と同様の実験を行った。
【０１２４】
結果を図３の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。なお、図中にて０μＭとあるのは、陰性対照実験として＃１ポリペプチドの代わりにＤＭＳＯを用いたものである。図３（Ａ）は、Ａβタンパク質及びＮＩＣＤの存在を示すウエスタンブロッティング像である。＃１ポリペプチドは濃度依存的にβＣＴＦに対するγセクレターゼの切断活性をより阻害することが明らかとなった。
【０１２５】
一方、＃１ポリペプチドはその濃度に係らず、ＮＩＣＤの存在を示すバンドが示されていることから、γセクレターゼのＮｏｔｃｈに対する切断活性は阻害していないことも明らかとなった。
【０１２６】
図３（Ｂ）は、Ａβタンパク質及びＮＩＣＤを、図３（Ａ）にて示すウエスタンブロッティング像における各バンドの濃さを基に定量化したグラフである。グラフの縦軸はコントロールとして用いたＤＭＳＯでの結果を１００％とした相対値を示す。＃１ポリペプチドは濃度依存的に、βＣＴＦに対する選択的なγセクレターゼ切断活性を阻害することが示唆される。
【０１２７】
実験例３：γセクレターゼ活性阻害実験３
使用するポリペプチドをＳ４ポリペプチドとし、その添加量を最終濃度がそれぞれ１、５、１０、２０、及び５０μＭとなるように添加した以外は、上記実験例１と同様の実験を行った。本実験例では５０μＭとなるように＃４ポリペプチドも添加した。
【０１２８】
結果を図４に示す。なお、図中にてｃｏｎｔとあるのは、陰性対照実験としてＤＭＳＯを添加したものである。図４は、Ａβタンパク質及びＮＩＣＤの存在を示すウエスタンブロッティング像である。Ｓ４ポリペプチドも、上記＃１ポリペプチドと同様に濃度依存的にβＣＴＦに対するγセクレターゼの切断活性をより阻害することが明らかとなった。
【０１２９】
一方、Ｓ４ポリペプチドも、＃１ポリペプチドと同様に、その濃度に係らず、ＮＩＣＤの存在を示すバンドが示されていることから、γセクレターゼのＮｏｔｃｈに対する切断活性は阻害していないことも明らかとなった。
【０１３０】
以上のことからＳ４ポリペプチドも、＃１ポリペプチドと同様に、βＣＴＦに対して選択的にγセクレターゼ切断活性を阻害することが示唆される。
【０１３１】
実験例４：βセクレターゼ活性阻害実験１
図５の（Ａ）に示すようなＡＰＰを含むポリペプチド（ＡＰＰ−ＥＱ−ＦＬＡＧ：配列番号１８）を、最終濃度が５０ｎＭとなるような溶液を調整した。
【０１３２】
この溶液に、９−７ポリペプチド、６−５ポリペプチド、＃１ポリペプチド、＃２ポリペプチド、＃３ポリペプチド、＃４ポリペプチド、＃５ポリペプチド、＃６ポリペプチド、＃７ポリペプチド、＃８ポリペプチド、＃９ポリペプチド、及び＃１０ポリペプチドを、それぞれの最終濃度が５０μＭとなるように添加し、次いで５０μＬのβセクレターゼ（０．０２Ｕ／μＬ）と４時間反応させた。反応温度は３７°Ｃで行った。陰性対照実験として、上記１２種類のポリペプチドに代えてＤＭＳＯを用いた。
【０１３３】
反応後の各サンプルを、図５の（Ａ）に示すようにＡＰＰ−ＥＱ−ＦＬＡＧのＮ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体（８２Ｅ−１）で、ウエスタンブロットを行い、βセクレターゼによって分解されることにより産生されるＡβ３３−ＦＬＡＧタンパク質の量を測定した。
【０１３４】
結果を図５の（Ｂ）に示す。図５（Ｂ）は、βＣＴＦ（Ａβ３３）の存在を示すウエスタンブロッティング像である。上記１２種類のポリペプチドのうち、＃７を除く１１種類のポリペプチドは、ＡＰＰに対するβセクレターゼの切断活性を阻害することが明らかとなった。
【０１３５】
中でも、＃２、＃４、＃６、＃１、＃３、＃５、＃１０、＃８、及び＃９のポリペプチドの順により好適に、βセクレターゼのＡＰＰに対する切断活性をより阻害することが明らかとなった。
【０１３６】
実験例５：βセクレターゼ活性阻害実験２
使用するポリペプチドをＳ４及び＃４ポリペプチドとし、これらのポリペプチドの添加量を、最終濃度がそれぞれ１、５、１０、２０、５０、及び１００μＭとなるように添加した以外は、上記実験例４と同様の実験を行った。
【０１３７】
結果を図５（Ｃ）に示す。なお、図中にてｃｏｎｔとあるのは、陰性対照実験としてＤＭＳＯを添加したものである。
【０１３８】
Ｓ４ポリペプチドは、＃４ポリペプチドには劣るもののＡＰＰに対するβセクレターゼの切断活性を阻害することが明らかとなった。また、Ｓ４ポリペプチドも＃４ポリペプチドも、濃度依存的にβセクレターゼのＡＰＰに対する切断活性をより阻害することが明らかとなった。
【０１３９】
〔培養細胞での解析〕
実験例６：Ａβタンパク質産生抑制実験１
ＡＰＰタンパク質を安定に発現し、且つ、一過的にＮｏｔｃｈを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（７ＷＤ１０細胞）に対して、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドを作用させて、Ａβタンパク質の産生と、Ｎｏｔｃｈタンパク質の切断を確認する実験を行った。
【０１４０】
上記細胞の培養液に、上記３種類のポリペプチドをそれぞれ最終濃度が１、５、１０、２０、並びに５０μＭとなるように添加した。その後、細胞培養液（Ｍｅｄｉｕｍ）或いは細胞破砕液（Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）中に含まれるｓＡＰＰβ、ＮＩＣＤ、βＣＴＦ（ｃ９９）、及びＡβタンパク質（細胞溶解液中に存在するものをｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａβとし、細胞培養液中に存在するものをｒｅｌｅａｓｅｄ  Ａβとする）それぞれ認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法にて確認した。
【０１４１】
結果を図６、図７−１、及び図７−２にて示す。図中にて１μＭ  Ｌ６８５４５８とあるのは、上記３種類のポリペプチドに代えて、最終濃度が１μＭとなるようにγセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８を添加した実験結果を示す。
【０１４２】
図６では、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れを添加した場合でも、その添加した最終濃度に依存して、細胞溶解液中にｓＡＰＰが存在しなくなることが示されている。このことは、＃１、＃２、及び＃４の全てのポリペプチドが、７ＷＤ１０細胞にて発現しているＡＰＰに対して、内在的なβセクレターゼによる切断活性を好適に阻害していることを示している。一方で、γセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８には、この様な現象は見られなかった。
【０１４３】
また、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れを添加した場合でも、細胞溶解液中のβＣＴＦ（Ｃ９９）並びにＡβタンパク質が、添加した最終濃度に依存して減少することが示されている。このことから、＃１、＃２、及び＃４の全てのポリペプチドは、７ＷＤ１０細胞にて発現しているβＣＴＦか、或いはＡＰＰがβセクレターゼによって切断されたβＣＴＦに対して、内在的なγセクレターゼによる切断活性を好適に阻害していることを示している。この様なβＣＴＦ（Ｃ９９）並びにＡβタンパク質が減少する現象は、γセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８を添加した場合にも見られた。
【０１４４】
そして、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れを添加した場合でも、細胞培養液中のＡβタンパク質も、その添加した濃度に依存して減少し、Ｌ６８５４５８を添加した場合も細胞培養液中のＡβタンパク質が減少することが明らかとなった。
【０１４５】
以上のことから、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れも、ＡＰＰを過剰発現する細胞において、内在的なγセクレターゼ及びβセクレターゼによる切断活性を好適に阻害することが明らかとなった。このことは、＃１、＃２、及び＃４の全てのポリペプチドが、細胞レベルにおいてＡβタンパク質の産生を抑制することを明らかに示している。
【０１４６】
そして、＃１、＃２、及び＃４の全てのポリペプチドを添加した場合には、その添加した濃度に係らず、細胞溶解液中にＮＩＣＤの存在量を減少させないことが明らかに示されている。一方、γセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８を添加した場合には、ＮＩＣＤの量が減少していることも明らかである。
【０１４７】
このことは、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れも、細胞レベルにおいて、ＡＰＰに対するβセクレターゼによる切断活性、並びにβＣＴＦに対するγセクレターゼの阻害活性を特異的に阻害するものであり、延いては細胞レベルにおいて、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害する活性を有していることを示している。
【０１４８】
図７−１及び図７−２は、細胞溶解液中のｓＡＰＰβ、ＮＩＣＤ、及びＡβタンパク質並びに細胞溶解液中のＡβタンパク質の量を、図６にて示すウエスタンブロッティング像における各バンドの濃さを基にして定量化したグラフである。グラフの縦軸はコントロールとして用いたＤＭＳＯでの結果を１００％とした相対値を示す。また、グラフ中の「＊」並びに「＊＊」は、それぞれＡｎｏｖａ，Ｓｃｈｅｆｆ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔによってＰ＜０．０５、並びにｐ＜０．００１の有意差であることを示している。
【０１４９】
図７−１及び図７−２に示すグラフからも、γセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８とは異なり、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れも、細胞レベルにおいて、ＡＰＰに対するβセクレターゼによる切断活性、並びにβＣＴＦに対するγセクレターゼによる切断活性を特異的に阻害するものであり、延いては細胞レベルにおいて、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害する活性を有していることを示している。
【０１５０】
実験例７：Ａβタンパク質産生抑制実験２
使用するポリペプチドをＳ４ポリペプチドのみとし、その添加量を最終濃度が２５及び５０μＭとなるように添加し、使用する細胞をＡＰＰタンパク質を発現し、且つ、一過的にＮｏｔｃｈ並びにβセクレターゼの基質であるシアル酸転移酵素（ｓｔ６ｇａｌ）を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（７ＷＤ１０細胞）を用い、更にＡβタンパク質の産生と、Ｎｏｔｃｈタンパク質の切断を確認に付け加えて、シアル酸転移酵素の切断の確認を行った以外は、上記実験例６と同様の実験を行った。
【０１５１】
結果を図８に示す。Ｓ４ポリペプチドを添加した場合、細胞溶解液中のＡβタンパク質（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａβ）は減少するが、細胞溶解液中のＮＩＣＤの量は減少しないことが明らかとなった。このことから、Ｓ４ポリペプチドは、細胞レベルにおいてもγセクレターゼの阻害活性を有し、延いてはβＣＴＦに対するγセクレターゼの切断活性を特異的に阻害することを示している。
【０１５２】
さらに、Ｓ４ポリペプチドを添加した場合には、細胞培養液中のｓＡＰＰβの産生量を減少させるのに対し、細胞培養液中のｓｔ６ｇａｌの産生量は減少させないことが示されている。このことから、Ｓ４ポリペプチドは、細胞レベルにおいてもβセクレターゼの阻害活性を有し、延いてはＡＰＰに対するβセクレターゼの切断活性を特異的に阻害することを示している。
【０１５３】
そして、Ｓ４ポリペプチドを添加した場合には、細胞培養液中のＡβタンパク質（ｒｅｌｅａｓｅｄ  Ａβ）の量を減少させることも明らかに示されている。以上のことから、Ｓ４ポリペプチドは、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドと同様に、細胞レベルにおいてもＡβタンパク質の産生を特異的に阻害する活性を有していることを示している。
【０１５４】
〔動物への投与〕
実験例８：Ａβタンパク質産生抑制実験
５０％ＤＭＳＯを溶媒とした＃４ポリペプチド溶液をＣ５７ＢＬ／６マウスに０．２ｎｇ／ｇとなるように投与した。投与は、上記マウスの右側海馬に直接投与した。投与後３時間後、右側海馬を摘出し、ＴＢＳと６Ｍ塩酸グアニジンにより抽出したＡβタンパク質の量をサンドウィッチＥＬＩＳＡ法（製品名：ヒト／ラットβアミロイド（４０）ＥＬＩＳＡ  キット  ワコー免疫化学〔型番２９４−６２５０１〕；製品名：ヒト／ラットβアミロイド（４２）ＥＬＩＳＡ  キット  ワコー免疫化学〔型番２９０−６２５０１〕：共に和光純薬）にて測定した。陰性対照実験として、＃４ポリペプチドとは逆順のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｒｅｖ＃４：配列番号１９）を、同一マウスの左側海馬に投与した。
【０１５５】
結果を図９に示す。図９は、マウスから採取したＡβタンパク質を定量化したグラフである。グラフの縦軸はコントロールとして用いた陰性対照実験としてｒｅｖ＃４ポリペプチド投与した際に採取したでのＡβタンパク質の量を１００％とした相対値を示す。
【０１５６】
＃４ポリペプチドは、マウス個体に投与しても上述の実験例６の結果と同様にＡβタンパク質の産生を顕著に抑制することが明らかとなった。そして、この結果から＃１、＃２及びＳ４ポリペプチドをマウス個体に投与しても、＃４ポリペプチドと同様にＡβタンパク質の産生を顕著に抑制することが期待される。
【０１５７】
〔培養細胞での解析：その２〕
実験例９：細胞内分布の検討
公知の方法を用いてビオチン修飾化＃４ポリペプチドを作製した。これをＣＨＯ−Ｋ１細胞、及び上述の７ＷＤ１０細胞に作用させた後に、細胞を固定化し、次いでＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理を施した。その後、アビジン修飾されたＡｌｅｘａ４８８を作用させた。陰性対照として、ビオチン修飾化＃４ポリペプチドを作用させず、アビジン修飾されたＡｌｅｘａ４８８を作用させた実験を行った。結果を図１０に示す。内在性のＡＰＰタンパク質を低レベルで発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞では、細胞内において＃４ポリペプチドがＡＰＰと結合する事が明らかとなった。また、ＡＰＰを過剰発現する７ＷＤ１０細胞では、細胞内のＡＰＰに対しても顕著に結合する事が明らかとなった。
【０１５８】
これらの結果から、＃４ポリペプチドは細胞内に侵入し、細胞表面に露出する前のＡＰＰにも結合する機能を発揮する事が明らかとなった。この事は、結果的にＡβの産生を抑制する事を示唆している。
【０１５９】
実験例１０：マウス型Ａβ産生阻害実験
ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（Ｎ２Ａ）の培養液に、＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドを最終濃度が２０μＭとなるように添加した。コントロールとして、最終濃度が２０μＭとなるようにγセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８及びＤＭＳＯを添加した。
【０１６０】
その後、細胞培養液中に含まれるＡβを、これを認識する抗体（抗マウスＡβ抗体）を用いたウエスタンブロッティング法にて確認した。結果を図１１に示す。
図中にてＬとあるのは、にγセクレターゼの阻害剤であるＬ６８５４５８（最終濃度１μＭ）を示す。＃１、＃２、及び＃４ポリペプチドの何れを添加した場合でも、ＣＨＯ−Ｋ１及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に対しても、Ａβの培地中での産生量が減少することが示されている。ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞の何れも、マウス型のＡＰＰを発現する事から、＃１、＃２、及び＃４の全てのポリペプチドは、マウス型のＡβタンパク質の産生を抑制することを明らかに示している。
【０１６１】
〔動物への投与：その２〕
実験例１１：マウスの腹腔内への投与
１０匹の野生型マウス（Ｃ５７  ＢＬ／６  Ｎ  Ｃｒ  Ｓｌｃ、７週齢）の腹腔内に、ＤＭＳＯに溶解した＃４ポリペプチドを１５０ｍｇ／ｋｇ投与した。投与は３日連続して行い、４日の後にマウスを安楽死させ、大脳を摘出した。
【０１６２】
摘出した大脳を公知の方法で溶解し、抗４Ｇ８抗体で免疫沈降を行った後に、抗マウスＡβ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。陰性対照として、ＤＭＳＯのみを投与した群（１０匹）も同様に実験を行った。
【０１６３】
また、ウエスタンブロッティングでは、５、１０、５０、１００、及び２００ｐｇのゲッ歯類由来のＡβを標準物質として実験を行った。結果を図１０の（Ａ−１）及び（Ａ−２）に示す。
【０１６４】
陰性対照（１〜５及び６〜１０）のＡβを示すバンドと比較して、＃４ポリペプチドを腹腔内投与したマウスでは、大脳中のＡβを示すバンドが減少する事が明らかとなった。また、これらのバンドをデンシトメトリーで定量化した結果を示す図１０のＢからは、＃４ポリペプチドが、優れたＡβの産生抑制効果を発揮する事も明らかとなった。
【０１６５】
次いで、公知の方法を用いて作製した、ＦＩＴＣ修飾化＃４ポリペプチドをマウスの腹腔内に投与した。投与量は１５０ｍｇ／ｋｇで３日間連続して行い、投与から４日後にマウスを安楽死させ、海馬組織周辺の切片を作製した。陰性対照として、ＦＩＴＣ修飾化＃４ポリペプチドに変えて、ＤＭＳＯを投与した。この切片を蛍光顕微鏡解析した結果を図１２のＣに示す。
【０１６６】
図中のＣＡ１とは、ＣＡ１野と呼ばれる部位であり、ここでは陰性対照と比較して、＃４ポリペプチドの存在を示す緑色に染色された部位が確認された。また、図中のＤＧは歯状回（Ｄｅｎｔａｔｅ  Ｇｙｒｕｓ）と呼ばれる部位であり、ここでも、＃４ポリペプチドの存在を示す緑色に染色された部位が確認された。そして、図中のＣＰＬＶとは、脈絡叢と呼ばれる脳脊髄液を産生する部位であり、ここで血管において＃４ポリペプチドの存在を示す緑色に染色された部位が確認された。
【０１６７】
実験例１２：Ａβタンパク質産生抑制実験３
実験例６と同様に、ＡＰＰタンパク質を安定に発現し、且つ、一過的にＮｏｔｃｈを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（７ＷＤ１０細胞）に対して、＃４、Ｌ１３、Ｓ２、及びＳ４ポリペプチドを作用させて、Ａβタンパク質の産生と、Ｎｏｔｃｈタンパク質の切断を確認する実験を行った。
【０１６８】
上記細胞の培養液に、上記４種類のポリペプチドを、図に示すように。それぞれ最終濃度が２５又は５０μＭ（＃４ポリペプチドについては２５μＭのみ）となるように添加した。その後、細胞培養液（Ｍｅｄｉｕｍ）のＡβタンパク質と細胞破砕液（Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）中のＮＩＣＤをそれぞれ認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法にて確認した。
【０１６９】
結果を図１３にて示す。図中にてＤＭＳＯとあるのは、ネガティブコントロールの結果を示している。
【０１７０】
図１３では、Ｓ２ポリペプチドは、最終濃度を５０μＭとして使用した場合に、上述した＃４ポリペプチド及びＳ４ポリペプチドと同程度にＡβタンパク質の産生を抑制する効果を発揮することを明らかに示している。また、ＮＩＣＤについてはなんら影響を及ぼさなかった。従って、Ｓ２ポリペプチドも、Ａβタンパク質の産生を特異的に阻害する活性を有していることを示している。
【０１７１】
一方で、Ｌ１３ポリペプチドは、ＮＩＣＤには何ら影響を及ぼさないが、Ａβの産生量を抑制することはできなかった。
【０１７２】
以上の結果から、本発明に係るポリペプチドは、腹腔内に投与しても脳に到達し、脳内のＡβの産生を抑制する効果を発揮する事が明らかに示された。また、本発明に係るポリペプチドは、マウス型のＡβのみならず、ヒト型のＡβの産生を抑制する事が明らかであるために、ヒトに投与しても、脳内のＡβの産生を抑制する効果を発揮することも示唆される。
【図１】
2013108780.tif 000004
【図２】
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【図３】
2013108780.tif 000006
【図４】
2013108780.tif 000007
【図５】
2013108780.tif 000008
【図６】
2013108780.tif 000009
【図７−１】
2013108780.tif 000010
【図７−２】
2013108780.tif 000011
【図８】
2013108780.tif 000012
【図９】
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【図１０】
2013108780.tif 000014
【図１１】
2013108780.tif 000015
【図１２】
2013108780.tif 000016
【図１３】
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【配列表】
2013108780000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月17日(2013.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、１３、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有し、βＣＴＦのＮ末端領域に結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２〜１４、及び２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２〜８、１０〜１２、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３、４、６、１０、１１、１４、又は２２の何れか１つにて示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、γセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項６】
配列番号３〜６、及び１４の何れか１つにて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、γセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、βセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項８】
配列番号３、４、６、８、又は１４にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、βセクレターゼ活性阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、Ａβタンパク質産生抑制剤。
【請求項１０】
配列番号３、４、６、１４、又は２２にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、Ａβタンパク質産生抑制剤。
【請求項１１】
請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチドを含む、アルツハイマー病治療及び／又は予防剤。
【請求項１２】
配列番号３、４、６、１４、又は２２にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、アルツハイマー病治療及び／又は予防剤。
【請求項１３】
請求項１〜４の何れか１つに記載のポリペプチドを、アルツハイマー病患者に投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療及び／又は予防する方法。
【請求項１４】
アルツハイマー病の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１〜４の何れか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アルツハイマー病を治療及び／又は予防するための、医薬の製造のための、請求項１〜４の何れか１つに記載のポリペプチドの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
［図１３］本発明に係るポリペプチドの、Ａβタンパク質産生抑制実験結果を示す図。
発明を実施するための形態
［０１１３］
以下に本発明をより詳細に説明するための実施例を記載する。なお、本発明が以下に示す実施例に記載の内容に限定されないのは言うまでもない。
＜実施例＞
〔ポリペプチドの作製〕
βＣＴＦのＮ末端領域に該当するポリペプチドである配列番号１５にて示されるポリペプチド（Ａｍｙｌｏｉｄβ  １−９）に対して特異的に結合するポリペプチドを、ポリペプチドスクリーニング技術を用いて同定し、製造した。
［０１１４］
［表２］
2013108780.tif 000018
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
した。投与は３日連続して行い、４日の後にマウスを安楽死させ、大脳を摘出した。
［０１６２］
摘出した大脳を公知の方法で溶解し、抗４Ｇ８抗体で免疫沈降を行った後に、抗マウスＡβ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。陰性対照として、ＤＭＳＯのみを投与した群（１０匹）も同様に実験を行った。
［０１６３］
また、ウエスタンブロッティングでは、５、１０、５０、１００、及び２００ｐｇのゲッ歯類由来のＡβを標準物質として実験を行った。結果を図１２の（Ａ−１）及び（Ａ−２）に示す。
［０１６４］
陰性対照（１〜５及び６〜１０）のＡβを示すバンドと比較して、＃４ポリペプチドを腹腔内投与したマウスでは、大脳中のＡβを示すバンドが減少する事が明らかとなった。また、これらのバンドをデンシトメトリーで定量化した結果を示す図１２のＢからは、＃４ポリペプチドが、優れたＡβの産生抑制効果を発揮する事も明らかとなった。
［０１６５］
次いで、公知の方法を用いて作製した、ＦＩＴＣ修飾化＃４ポリペプチドをマウスの腹腔内に投与した。投与量は１５０ｍｇ／ｋｇで３日間連続して行い、投与から４日後にマウスを安楽死させ、海馬組織周辺の切片を作製した。陰性対照として、ＦＩＴＣ修飾化＃４ポリペプチドに変えて、ＤＭＳＯを投与した。この切片を蛍光顕微鏡解析した結果を図１２のＣに示す。
［０１６６］
図中のＣＡ１とは、ＣＡ１野と呼ばれる部位であり、ここでは陰性対照と比較して、＃４ポリペプチドの存在を示す緑色に染色された部位が確認された。また、図中のＤＧは歯状回（Ｄｅｎｔａｔｅ  Ｇｙｒｕｓ）と呼ばれる部位であり、ここでも、＃４ポリペプチドの存在を示す緑色に染色された部位が確認された。そして、図中のＣＰＬＶとは、脈絡叢と呼ばれる脳脊髄液を産生する部位であり、ここで血管において＃４ポリペプチドの存在を示す緑色に染色された部位が確認された。
［０１６７］
実験例１２：Ａβタンパク質産生抑制実験３
実験例６と同様に、ＡＰＰタンパク質を安定に発現し、且つ、一過的にＮｏｔｃｈを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（７ＷＤ１０細胞）に対して、＃４、
【国際調査報告】
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2013108780.tif 000022
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