(57)【要約】【課題】組換えプロテオリポソームを用いると共に、ベースラインを十分に減少させることによって、従来には検出が困難であった微量物質を測定する方法であるＬＥＬＩＡ（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）を提供すること。【解決手段】（１）第１の容器中に膜タンパク質を発現した組換えバキュロウイルス出芽ウイルスとリポソームとを融合させて製造した組換えプロテオリポソームを添加して、容器の壁面に吸着させる容器吸着工程、（２）第１の洗浄工程、（３）第１の容器中の液相において、膜タンパク質と膜タンパク質結合物質とを結合させる膜タンパク質結合物質結合工程、（４）第２の洗浄工程、（５）膜タンパク質結合物質を認識する一次抗体を添加して、膜タンパク質に結合した膜タンパク質結合物質と反応させる第１の抗体結合工程、（６）第３の洗浄工程、（７）一次抗体に結合する酵素標識二次抗体を添加して、一次抗体と反応させる第２の抗体結合工程、（８）第４の洗浄工程、（９）溶液を添加し、組換えプロテオリポソームを懸濁した後、この溶液を第２の容器に移す移送工程、および（１０）検出工程を備えることを特徴とする膜タンパク質結合物質の測定方法。
2012173184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）第１の容器中に膜タンパク質を発現した組換えバキュロウイルス出芽ウイルスとリポソームとを融合させて製造した組換えプロテオリポソームを添加して、容器の壁面に吸着させる容器吸着工程、（２）吸着不能の組換えプロテオリポソームを取り除く第１の洗浄工程、（３）第１の容器中の液相において、組換えプロテオリポソームと、膜タンパク質に特異的に結合する膜タンパク質結合物質とを共存させて、膜タンパク質と膜タンパク質結合物質とを結合させる膜タンパク質結合物質結合工程、（４）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の膜タンパク質結合物質を取り除く第２の洗浄工程、（５）膜タンパク質結合物質を認識する一次抗体を添加して、膜タンパク質に結合した膜タンパク質結合物質と反応させる第１の抗体結合工程、（６）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の一次抗体を取り除く第３の洗浄工程、（７）一次抗体に結合する酵素標識二次抗体を添加して、一次抗体と反応させる第２の抗体結合工程、（８）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の酵素標識二次抗体を取り除く第４の洗浄工程、（９）溶液を添加し、組換えプロテオリポソームを懸濁した後、この溶液を第２の容器に移す移送工程、および（１０）酵素標識二次抗体の酵素による反応によって、検出可能となる基質を添加して、酵素標識二次抗体によって反応させて、検出を行う検出工程を備えることを特徴とする膜タンパク質結合物質の測定方法。
【請求項２】
（１）第１の容器中に膜タンパク質を発現した組換えバキュロウイルス出芽ウイルスとリポソームとを融合させて製造した組換えプロテオリポソームを添加して、容器の壁面に吸着させる容器吸着工程、（２）吸着不能の組換えプロテオリポソームを取り除く第1の洗浄工程、（１１）第1の容器中の液相において、組換えプロテオリポソームと、膜タンパク質に特異的に結合する膜タンパク質認識抗体とを共存させて、膜タンパク質と膜タンパク質認識抗体とを結合させる第１の抗体結合工程、（６’）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の膜タンパク質認識抗体を取り除く第２の洗浄工程、（７’）膜タンパク質認識抗体に結合する酵素標識二次抗体を添加して、膜タンパク質認識抗体と反応させる第２の抗体結合工程、（８’）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の酵素標識二次抗体を取り除く第３の洗浄工程、（９）溶液を添加し、組換えプロテオリポソームを懸濁した後、この溶液を第２の容器に移す移送工程、および（１０）酵素標識二次抗体の酵素による反応によって、検出可能となる基質を添加して、酵素標識二次抗体によって反応させて、検出を行う検出工程を備えることを特徴とする膜タンパク質認識抗体の測定方法。
【請求項３】
前記膜タンパク質認識抗体は、前記膜タンパク質の同定・検出・識別・探索用抗体であることを特徴とする請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記膜タンパク質認識抗体は、自己免疫疾患に関連する自己抗体であり、前記自己免疫疾患は、バセドウ病、橋本病、重症筋無力症、拡張性心筋症、持続性心房細動、自己免疫性肝炎、多発性硬化症からなる疾患群のうちから選択されるもののうちの一つであることを特徴とする請求項２または３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記膜タンパク質認識抗体は、膜タンパク質に対する抗体医薬品であることを特徴とする請求項２または３に記載の測定方法。
【請求項６】
前記膜タンパク質認識抗体は、病原体の膜タンパク質に対する抗体であることを特徴とする請求項２または３に記載の測定方法。
【請求項７】
前記膜タンパク質が、膜貫通型であることを特徴とする請求項１〜６８のいずれか一つに記載の測定方法。
【請求項８】
前記リポソームが、一枚膜リポソームまたは多重層リポソームであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の測定方法。
【請求項９】
前記容器の内壁面は、予め非特異的な吸着を防止するブロッキング剤によってブロッキング処理を行っておくことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一つに記載の測定方法。
【請求項１０】
前記結合工程及び洗浄工程に使用する溶液は、界面活性剤を含有しないものであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一つに記載の測定方法。
【請求項１１】
前記洗浄工程に使用する溶液は、フリーリポソームを含有するものであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一つに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えプロテオリポソームを用いた新規な測定法であるLELIA（Liposome-based Enzyme-Linked ImmunoAssay）技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルスDNAと、外来遺伝子を導入したトランスファーベクターとを昆虫細胞にコトランスフェクションさせることにより、外来遺伝子がその昆虫細胞内でバキュロウイルスDNAに取り込まれる。その結果、外来遺伝子がコードするタンパク質が、組換えバキュロウイルスの出芽ウイルスエンベロープ上に発現される（例えば、特許文献１）。本発明者は、この技術を応用して、血中に含まれる抗体を検出するための診断用組換えプロテオリポソームに関する技術を開発した（特許文献２）。しかし、この技術では、測定時のベースラインが十分に減少しない場合があった。
また、微量のサンプルを測定するための技術として、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法が知られている。例えば、図３３には、組換えプロテオリポソームを用いて、膜タンパク質に特異的に反応する自己抗体を測定するための試験系の概要を説明する方法を示した。（Ａ）は、複数のウエルＷを有するプレート１０を、（Ｂ）は、ウエルＷに組換えプロテオリポソーム２を添加する工程を、（Ｃ）は、ウエルＷにサンプルＳ（自己抗体５を含む可能性のある血清サンプル）を滴下し、酵素による発色を行った結果を、（Ｄ）は、そのときにウエルＷの内部において、ストレプトアビジンＳｔＡｖ・ビオチンＢｔ反応を利用して、組換えプロテオリポソーム２をウエルＷの壁面に固定しつつ、膜タンパク質３に反応する自己抗体５に対する酵素標識二次抗体６によって、基質７を反応物８に変化させることで、発色させていることを、それぞれ示している。
本発明者は、図３３に示す試験系に基づき、甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）に対する自己抗体およびアクアポリン４受容体（AQP4）に対する自己抗体の測定を試みた。図３４には、バセドウ病患者（G-1〜G-10）、橋本病患者（H1〜H10）、および健常人（N-1〜N-10）の各血清を用いて、(1)TSHR組換えLUV、(2)リセプター非融合LUV（コントロール）、(3)buffer（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))を測定した結果を示した。健常人（N-1〜N-10）においては、データ値はゼロに近く、抗TSHR抗体（自己抗体）を有する可能性が高い患者群（G-1〜G-10、H1〜H10）では、データ値がゼロよりも高い値を示している。このため一見すると、有効な検出系が確立されているとも思われるが、非特異的な吸着・発色を示すコントロールデータ（上記(2)および(3)）が非常に高い値を示すために、不安定な試験系であると考えられた。
また、図３５に示す多発性硬化症患者および健常人血清を用いたデータでも、これと同様のことが考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】US 6,713,278 B1
【特許文献２】WO 2007/094395
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、膜タンパク質を発現した組換えプロテオリポソームは、大きなポテンシャルを備えたものであると考えられるが、そのポテンシャルを発揮させるためには、従来のELISA法では十分なものとは言えなかった。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、組換えプロテオリポソームを用いると共に、ベースラインを十分に減少させることによって、従来には検出が困難であった微量物質を測定する技術であるLELIA(Liposome-based Enzyme-Linked ImmunoAssay）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
こうして、上記課題を達成するための第一の発明に係る膜タンパク質結合物質の測定方法は、（１）第１の容器中に膜タンパク質を発現した組換えバキュロウイルス出芽ウイルスとリポソームとを融合させて製造した組換えプロテオリポソームを添加して、容器の壁面に吸着させる容器吸着工程、（２）吸着不能の組換えプロテオリポソームを取り除く第１の洗浄工程、（３）第１の容器中の液相において、組換えプロテオリポソームと、膜タンパク質に特異的に結合する膜タンパク質結合物質とを共存させて、膜タンパク質と膜タンパク質結合物質とを結合させる膜タンパク質結合物質結合工程、（４）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の膜タンパク質結合物質を取り除く第２の洗浄工程、（５）膜タンパク質結合物質を認識する一次抗体を添加して、膜タンパク質に結合した膜タンパク質結合物質と反応させる第１の抗体結合工程、（６）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の一次抗体を取り除く第３の洗浄工程、（７）一次抗体に結合する酵素標識二次抗体を添加して、一次抗体と反応させる第２の抗体結合工程、（８）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の酵素標識二次抗体を取り除く第４の洗浄工程、（９）溶液を添加し、組換えプロテオリポソームを懸濁した後、この溶液を第２の容器に移す移送工程、および（１０）酵素標識二次抗体の酵素による反応によって、検出可能となる基質を添加して、酵素標識二次抗体によって反応させて、検出を行う検出工程を備えることを特徴とする。【０００６】
また、第二の発明に係る膜タンパク質認識抗体の測定方法は、（１）第１の容器中に膜タンパク質を発現した組換えバキュロウイルス出芽ウイルスとリポソームとを融合させて製造した組換えプロテオリポソームを添加して、容器の壁面に吸着させる容器吸着工程、（２）吸着不能の組換えプロテオリポソームを取り除く第1の洗浄工程、（１１）第1の容器中の液相において、組換えプロテオリポソームと、膜タンパク質に特異的に結合する膜タンパク質認識抗体とを共存させて、膜タンパク質と膜タンパク質認識抗体とを結合させる第１の抗体結合工程、（６’）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の膜タンパク質認識抗体を取り除く第２の洗浄工程、（７’）膜タンパク質認識抗体に結合する酵素標識二次抗体を添加して、膜タンパク質認識抗体と反応させる第２の抗体結合工程、（８’）組換えプロテオリポソームと液相とを分離して、未結合の酵素標識二次抗体を取り除く第３の洗浄工程、（９）溶液を添加し、組換えプロテオリポソームを懸濁した後、この溶液を第２の容器に移す移送工程、および（１０）酵素標識二次抗体の酵素による反応によって、検出可能となる基質を添加して、酵素標識二次抗体によって反応させて、検出を行う検出工程を備えることを特徴とする。【０００７】
第二の発明によれば、各種の膜タンパク質認識抗体を検出・測定できる。このため、本発明は、広く膜タンパク質の同定・検出・識別・探索などを目的とする抗体の検出に用いることができる。
ゆえに、膜タンパク質認識抗体は、膜タンパク質の同定・検出・識別・探索用抗体であることが好ましい。
また、膜タンパク質認識抗体は、自己免疫疾患に関連する自己抗体であることが好ましく、自己免疫疾患は、バセドウ病、橋本病、重症筋無力症、拡張性心筋症、持続性心房細動、自己免疫性肝炎、多発性硬化症からなる疾患群のうちから選択されるもののうちの一つであることが好ましい。また、膜タンパク質認識抗体は、膜タンパク質（膜受容体、チャネル、担体、ポンプ等）に対する医療用抗体であることが好ましい。また、膜タンパク質認識抗体は、病原体の膜タンパク質に対する抗体であることが好ましい。
また、上記発明においては、前記容器の内壁面は、予め非特異的な吸着を防止するブロッキング剤によってブロッキング処理を行っておくことが好ましい。この場合に、第１の容器と第２の容器のいずれについてもブロッキング処理を行うことが、より好ましい。
また、前記膜タンパク質が、膜貫通型であることが好ましい。
また、前記リポソームが、一枚膜リポソームまたは多重層リポソームであることが好ましい。
また、本発明においては、前記結合工程及び洗浄工程に使用する溶液は、界面活性剤を含有しないものであることが好ましい。そのような溶液として、PBS（Phosphate Buffered Saline）を用いることができる。PBSは、生化学の実験において必須と言えるものであり、常備されている溶液であるため、特殊な試薬を用いる必要がない。また、いずれかの工程で界面活性剤を含有する溶液を用いてしまうと、完全に界面活性剤取り除くことが非常に困難であり、持ち越し（キャリーオーバー）によるアーチファクトが生じるおそれがある。更に、脂質膜であるリポソームを用いる試験系においては、できるだけ界面活性剤を用いない方が、安定した試験結果を得やすい。従来のELISA法では、界面活性剤を含有する溶液が常用され（例えば、PBST（Phosphate Buffered Saline with Tween or Triton））、常に界面活性剤の持ち越しによる影響を考慮しなければならなかった。このような理由から、界面活性剤を用いない本発明の試験系は、非常に有用なものと言える。
また、洗浄工程に使用する溶液は、フリーリポソームを含有するものであることが好ましい。【０００８】
「膜タンパク質」とは、脂質膜に付着、または脂質膜を貫通する部位を備えたタンパク質のことを意味している。膜タンパク質は、膜との関係の強さによって、内在性膜タンパク質と表在性膜タンパク質に分類される。内在性膜タンパク質は、常に膜を貫通しているタンパク質であり、引き離すにはラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤または非極性溶媒を必要とする。この種の膜タンパク質には、複数回に渡って脂質膜を貫通する膜貫通型タンパク質と、一回のみ脂質膜を貫通する一回膜貫通型タンパク質がある。また、表在性膜タンパク質は、疎水性相互作用、静電相互作用など共有結合以外の力によって脂質膜または内在性膜タンパク質と一時的に結合しているタンパク質である。
また、膜タンパク質には、（１）種々のリガンド（膜タンパク質結合物質）を受容することで、何らかの情報を伝達する膜受容体と、（２）それ以外のタンパク質のいずれもが含まれる。膜受容体に結合する膜タンパク質結合物質としては、例えば、低分子の有機化合物、ステロイド、アミノ酸やその誘導体、ペプチド、タンパク質などがある。膜受容体がすべてタンパク質であるのに対して、リガンドの多様性は、きわめて対照的である。膜受容体としては、例えば1回膜貫通型受容体、4回膜貫通型受容体、7回膜貫通型受容体がある。
1回膜貫通型受容体の例としては、I型サイトカイン受容体、細胞質側で酵素活性を持つ酵素共役型受容体が挙げられる。このタイプの受容体では、リガンドの結合によって受容体のリン酸化の程度が変化し、キナーゼ活性やホスファターゼ活性などの酵素活性の作用が発現する。チロシンキナーゼ、セリン・スレオニンキナーゼ活性を持つ受容体がある。
4回膜貫通型受容体の例としては、サブユニット構造を形成し、イオンチャンネルとしての機能をもつものが挙げられる。イオンチャネル型受容体は、リガンドが結合すると、イオンチャネルが開き、イオンの流入や流出が起こって、特有の効果が発現する。具体例としては、ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)、グルタミン酸受容体、GABA受容体がある。【０００９】
7回膜貫通型受容体の例としては，各種Gタンパク質と共役して作用を発現するものが挙げられる。Gタンパク質共役型レセプター（GPCR）は、ドーパミンやセロトニンなどの生体アミン、プロスタグランジンなどの脂質誘導体、アデノシンなどの核酸、GABAなどのアミノ酸、生理活性ペプチド類（例えば、アンジオテンシンII、ブラジキニン、コレシストキニンなど）をリガンドとするレセプターファミリーを形成している。さらに、GPCRは光、味覚、臭覚に関連する生体外情報伝達物質のレセプターともなっている。GPCRは、情報伝達の中核を担う重要な膜タンパク質である。ヒトゲノム配列を解析することにより、GPCRに属するオーファンレセプターが多く見出されるものと期待されている。このようなGPCRに対応するリガンドの発見によって、有効な医薬品開発が可能になると考えられている。従来には、膜受容体をハイスループットスクリーニングに使用するためには、リガンド結合部分を可溶性部位として安定的に発現するか、生物試料を用いる必要があった。しかし、本発明によれば、膜受容体をそのまま使用できるので、簡易かつ安定したシステムを提供できる。【００１０】
7回膜貫通型受容体の具体例としては、ムスカリン性アセチルコリン受容体、Α1アドレナリン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、グループI代謝調節型グルタミン酸受容体（mGluR1/5）、GABAB受容体、ATP受容体、ロイコトリエン受容体、血小板活性化因子（PAF）受容体、オピオイド受容体、オレキシン受容体、エンドセリン受容体、ニューロペプチドPACAP受容体、副腎皮質刺激ホルモン（コルチコトロピン）放出ホルモン受容体(CRHR)、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)、ケモカイン受容体、非神経性ムスカリン受容体、アドレナリン受容体、β3アドレナリン受容体、プロスタノイド受容体、プロスタグランジンE受容体、プロスタグランジンE2受容体、ノシセプチン受容体、アンジオテンシンII受容体、カルシトニン受容体、ブラジキニン受容体、グルカゴンファミリーペプチドホルモン受容体、その他のオーファン7回膜貫通型受容体がある。【００１１】
上記の膜受容体のうち、特に7回膜貫通型受容体は、多種なリガンドに結合し、疾患や医薬品への関与が深いことから、本発明を好適に利用できる。
本発明は、膜受容体に対して特異的に結合する膜タンパク質結合物質を検出・測定することができる。本発明は、特定の膜受容体に結合することで受容体本来の作用を誘起あるいは抑制する未知物質（例えば、膜受容体に結合するアゴニストやアンタゴニストなど）の検出・測定などにも応用できる。
膜受容体ではない膜タンパク質としては、チャネル、担体（キャリアー、トランスポーター）、糖輸送担体、アミノ酸輸送担体、Ｈ＋対向輸送担体等がある。さらに、ポンプ、ＡＴＰ合成酵素、Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ等がある。これらのうち、チャネルとしては、例えばアクアポリン（Aquaporin、AQP）、コネクソン、電位依存性イオンチャネル（カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、陽イオンチャネルなど）が挙げられる。アクアポリンは、細胞膜に存在する細孔を持った膜タンパク質であり、水分子のみを選択的に通過させることができ、細胞への水の取り込みに関係している。【００１２】
本発明において、「膜タンパク質結合物質」とは、例えば、膜受容体に対する本来のリガンド（ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、レクチン、輸送タンパク、毒素、ウイルスを含む）、および本来のリガンドが結合する部位に特異的に結合することにより、その受容体本来の作用を発揮させるもの（アゴニスト）、又は受容体の作用を抑制するもの（アンタゴニスト）を含む。
膜受容体に対して結合する本来のリガンドとして具体的には、次のようなものが例示される。7回膜貫通型受容体のGPCRについては、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、GABA、セロトニン、オピオイド、タキキニン、ドーパミン、ロドプシンなどがある。4回膜貫通型受容体のイオンチャンネルについては、アセチルコリン、グルタミン酸、GABA、グリシン、ジヒドロピリジン、リアノジンなどがある。1回膜貫通型受容体については、インスリン、EGF、PDGF、IGF-I、IGF-II、NGF、CSFなどがある。この他の膜受容体（例えば、造血因子群、免疫グロブリン群、インテグリン群、カドヘリン群、エンドサイトーシス受容体）についても、それぞれのリガンドが対応する。【００１３】
また、ホルモンとしては、下垂体ホルモン放出ホルモン、下垂体ホルモン放出抑制ホルモン、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（因子）(CRH、CRF)、メラニン細胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、性腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、セレクチン、ガストリン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、レプチン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチドなどがある。
また、サイトカインとしては、c-kit、c-fms、EGF、PDGF、VEGF、TGF-β、BMP、アクチビン、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、GM-CSF、LIF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF、NGF、Fas、CD40、IL-8などがある。
この他のリガンドとしては、感染防御・免疫系については、fMet-Ler-Phe、補体、抗原などが例示され、輸送タンパクについては、LDL、HDL、トランスフェリン、トランスコバラミン、卵黄タンパク、マクログロブリン、IgG、IgAなどが例示され、糖タンパクについては、Gal、Man/GlcNAc、GlcNAc、Man-6-Pなどが例示され、植物レクチンについては、コンカナバリンA、PHA、リシンなどが例示され、毒素については、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、エンドトキシンなどが例示され、ウイルスについては、水疱性口内炎ウイルス、セムリキーフォレストウイルス、ホウルプラークウイルスなどが例示される。【００１４】
また、膜受容体に対するアゴニスト（A）、アンタゴニスト（AG）の例としては、ニコチン性アセチルコリン受容体に対して、サクシニルコリン(A)、ニコチン(A)、ｄ−ツボクラリン(AG）、ガラミン(AG)、ヘキサメトニウム（AG）、αブンガロトキシン（AG）が、ムスカリン性アセチルコリン受容体に対して、カルバコール(A)、ピロカルビン（A)、カルバコール(A)、ピレンゼピン(AG)、アトロピン(AG）、スコポラミン(AG)が、アドレナリン及びノルアドレナリン受容体αに対して、フェニレフリン(A)、クロニジン（A)、プラゾシン(AG)、フェノキシベンザミン(AG)、ヨヒンビン(AG)が、アドレナリン及びノルアドレナリン受容体βに対して、イソプロテレノール(A)、ドブタミン(A)、サルブタモール(A)、プロプラノロール(AG)、プラクトロール(AG)、ブトキサミン(AG)が、ドーパミン受容体に対して、アポモルヒネ(A）、SKF38393(A)、アポモルヒネ(A)、リスライド(A)、SCH23390(AG)、cis-フルペンチキソール(AG)、スルピリド(AG)、スピペロン(AG)、ハロペリドール(AG)が、GABA受容体に対して、ムシモール(A)、バクロフェン(A)、ビククリン(AG)、グリシン受容体に対して、ストリキニーネ(AG)が、ヒスタミン受容体に対して、2-メチルヒスタミン(A)、4-メチルヒスタミン(A)、イソプロミジン(A)、メピラミン(AG)、ジフェンドラミン(AG)、メチアミド(AG)、シメチジン(AG)が、セロトニン受容体に対して、メチルセルジド(AG)、LSD(AG)、ケタンセリン(AG)、オピオイド受容体に対して、モルヒネ（A)、ケトシクラゾシン(A)、ダイノルフィン(A)、［D-Ara2, D-Leu5］エンケファリン(A)、β-エンドルフィン(A)、ナロキソン(AG)、Mr2266(AG)、ICI154129(AG)などが例示される。【００１５】
「リポソーム」とは、リン脂質（PL，phospholipid）を含有する脂質二重層を含み、内部に水相を備えた閉鎖小胞を意味する。リポソームの形態としては、脂質二重層が二層以上の複数に渡ってタマネギ状に重なった多重層リポソーム（MLV，multilamellar vesicle）と、小さな一枚膜リポソーム（SUV，small unilamellar vesicle）と、大きな一枚膜リポソーム（LUV，large unilamellar vesicle）、巨大リポソーム（GV, giant vesicle）とに分類される。巨大リポソームには、脂質二重層が一層のもの（GUV, giant unilamellar vesicel）と脂質二重層が二層以上のもの（GMV, giant multilamellar vesicle）がある。本発明の方法では、MLV, SUV, LUV, GVの何れを用いることもできる。
LUVを用いると、組換えプロテオリポソームを調製したときに、膜受容体がプロテオリポソームの全体に良好に配置されることから、後のデータのバラツキが少なくなるので好ましい。SUVやLUVは超音波処理やエクストルーダーを用いて調製することが多い一方、MLVは調製方法が簡易であるので、プロテオリポソームの調製法に掛かる手間が少なくて済むという利点があることから好ましい。また、GVを用いると、MLVに比べて膜表面の膜受容体数が多いという利点があることから好ましい。MLVとGVは、低回転の遠心により沈降させることができる。【００１６】
リン脂質とは、リン酸と脂質とを含む物質を意味する。構成成分に応じて、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質と、スフィンゴシン骨格を有するスフィンゴリン脂質とに分類される。グリセロリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ホスファチジン酸 (PA)等を例示できる。また、スフィンゴリン脂質としては、例えばスフィンゴミエリンを例示できる。本発明に用いるリポソームは、上記各種リン脂質成分を任意の比で混合したものを用いることができる。例えば、PCを主たる成分（例えば、リン脂質全体の約40％〜約100％の割合）とすることができる。PCに加えて、PSを添加することが好ましい。PSは、バキュロウイルスのgp64のレセプターであるため、バキュロウイルスとリポソームとの膜融合が円滑に行われる。この場合に、PSの混合割合としては、PCの1質量部に対して、約1質量部とする。【００１７】
「プロテオリポソーム」とは、一般的には、目的とするタンパク質を発現させ、リポソームに再構成したものを意味する。本発明では、目的とするタンパク質は、エンベロープ上に発現される膜タンパク質である。このため、「組換えプロテオリポソーム」とは、組換えタンパク質である膜タンパク質をリポソームの膜上に備えたプロテオリポソームのことを意味する。このような組換えプロテオリポソームは、例えば特許文献２に記載の技術を用いて製造できる。
バキュロウイルスは、環状二本鎖DNAを遺伝子としてもつ昆虫の病原ウイルスである。具体的には、Nucleopolyhedrovirus(NPVs)とGeanulovirus(GVs)の２種類に加えて、non-occluded virusesが知られている。このうち、NPV（核多角体病ウイルス）は、感染した細胞の核内に核多角体と呼ばれる封入体を全細胞タンパク質の40〜50％に達するほど大量につくるので、バイオテクノロジーに多用されている。以下、特にことわらない限り、バキュロウイルスは、NPVを意味する。【００１８】
バキュロウイルスの感染は、多角体に包埋されたウイルス粒子が幼虫に取込まれることによって開始する。その後、異なった性状を示す包埋ウイルス（Occluded virus; OV）、又は出芽ウイルス（Budded virus; BV）による二段階の融合過程を経て、感染細胞内で多角体が形成され、最終的に感染細胞は死に至る。NPVは、経口感染により広がるといわれている。NPVの多角体は、昆虫の体内に取り込まれた後、中腸内のアルカリ性の消化液とプロテアーゼの働きにより溶ける。ここで、多角体に包埋されていたOVが放出される。その後、OVは中腸微絨毛膜と融合し、中腸基底膜から出芽することにより体液中に放出される。次に、放出されたBVは血球細胞や脂肪細胞を含む細胞に融合後に増殖する。感染末期になると、多角体に包埋されたOVが細胞内に大量に形成され、細胞が死ぬと同時に体外に放出されて別の個体に感染する。
これまでの研究の結果、BVはエンドサイトーシスにより細胞内に侵入する。この細胞内侵入過程には、BVに特異的な膜融合誘起能をもつ膜糖タンパク質gp64が必須であり、エンドソーム内の低pH環境において活性化したgp64がエンドソーム膜との融合を誘起することが示されている。【００１９】
バキュロウイルスのエンベロープ上に膜タンパク質を発現させるには、例えば、目的とする膜タンパク質を発現するためのトランスファーベクターと、バキュロウイルスDNAとを適当な細胞（例えば、昆虫培養細胞（Sf9））にコトランスフェクションさせることにより実施することができる。
この細胞から出芽してきた組換えバキュロウイルスを再度別の細胞に感染させると、その感染細胞から出芽してきたウイルスのエンベロープ上には、膜タンパク質が発現されている。この出芽ウイルスを調製する。出芽ウイルスは、培養上清中に含まれているので、その培養上清をそのまま用いることもできる。但し、培養上清から出芽ウイルスを含む画分を精製することが好ましい。精製方法としては、例えばショ糖密度勾配遠心法、超遠心法、ゲル濾過法などが用いられる。
出芽ウイルスとリポソームとの融合は、リポソーム溶液のモル浸透圧を調整し、出芽ウイルス懸濁液と適当な融合条件溶液中で、攪拌し混和させることで行える。【００２０】
上記方法によって調製された組換えプロテオリポソームは、液相中において、膜タンパク質と結合する物質（リガンド、抗体を含む）と共存させることにより、組換えプロテオリポソームの膜表面上に発現された膜タンパク質と結合する物質の有無を検出するためのシステムに用いられる。
反応用の液相を提供する容器としては、チューブ（プラスチックチューブ、ガラスチューブを含む）、プレート（6穴、48穴、96穴、または384穴などのマイクロタイタープレート）などが使用できる。検出法としては、ラジオイムノアッセイ、ラジオレセプターアッセイ、酵素免疫測定、蛍光免疫測定、化学発光アッセイが挙げられる。本発明の利点に鑑みれば、非放射性の標識系を用いる測定法（すなわち、LELIA法）、蛍光免疫測定が好ましく、LELIA法が最も好ましい。
組換えプロテオリポソームの中には、容器の壁面に吸着できないものが存在する。このため、本発明においては、吸着できない組換えプロテオリポソームを取り除くために、容器吸着工程を実施することが好ましい。
また、容器の内壁面をブロッキング処理して、非特異的な吸着を減少させるためのブロッキング剤としては、生化学研究用の市販のものを使用できる。ブロッキング剤を用いることにより、膜タンパク質に結合する物質の特異的結合が、より明確となるので好ましい。
洗浄工程には、容器の底および壁にプロテオリポソームを集積させる工程と、集積したプロテオリポソームに水溶液を加えて懸濁する工程があるが、集積させる工程には、例えば遠心集積法、磁性体封入リポソームとマグネットを用いた磁気集積法などが例示される。
酵素標識二次抗体に用いられる標識酵素としては、特に限定はなく、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を用いることができる。酵素標識二次抗体を蛍光で検出する蛍光免疫測定の場合には、例えば、Cy3、Cy5、フルオレセイン（FITCなど）のような蛍光物質で二次抗体を標識したものが使用できる。【００２１】
「自己免疫疾患」とは、特定の疾患の発症原因或いは結果として、自己抗体が認められる疾患を意味する。そのような疾患として、例えばバセドウ病、橋本病、重症筋無力症、拡張性心筋症、持続性心房細動、自己免疫性肝炎、多発性硬化症などが挙げられる。
バセドウ病は、ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体（Thyroid Stimulating Hormone Receptor：TSHR）に対する自己抗体が関与する疾患である。TSHRは、甲状腺細胞膜上に存在する甲状腺刺激ホルモン（TSH）の受容体である。脳下垂体から分泌されるTSHが、甲状腺の細胞膜にあるTSHRに結合すると、甲状腺は代謝機能の調節ホルモンであるT3およびT4を分泌する。TSHRは、分子量87000の7回膜貫通型レセプター で、細胞外ドメインの分子量は約45000である。【００２２】
バセドウ病では、甲状腺成分に対する自己抗体が出現し、これが甲状腺ホルモンの生成、分泌を引き起こし、最終的に甲状腺組織崩壊に至ることが明らかになっている。バセドウ病に代表される甲状腺自己免疫疾患診断用の抗原としては、甲状腺ぺルオキシダーゼ（TPO）、サイログロブリン（Tg）、TSHR等がある。これらの抗原に対する自己抗体をマーカーとしたバセドウ病の診断が行われている。特に、抗TSHR自己抗体はバセドウ病に伴う甲状腺機能の異常を最も強く反映することが知られているので、TSHRを抗原として検出できる抗TSHR自己抗体のマーカーとしての重要性が注目されている。抗TSHR自己抗体の測定法として、スミスらによって開発された方法が知られている（Methods in Enzymology，74，405-420，1981、またはEndocr.Rev., 9, 106-120, 1988）。この方法は、TBII測定法（Thyrotropinbinding inhibition immunoglobulin）と呼ばれており、TBII測定キットとして試薬キットが市販されている（商品名：TRAB「コスミック」II、株式会社コスミックコーポレーション製）。この方法は、TSHとTSHRの反応を利用したラジオレセプターアッセイ法に基づいている。可溶化ブタ甲状腺細胞膜画分TSHRと125Ｉ標識ウシTSHと被検血清を加えて反応させ、TSHRと125Ｉ標識TSHの結合反応物をポリエチレングリコールで沈殿させ、その放射能量(cpm)を測定する。被検血清中に抗TSHR自己抗体が存在すると、TSHとTSHRとの結合反応が阻害され、沈殿物中の放射能量が低下する。この放射能量の低下の度合いを125Ｉ−TSHのTSHRへの結合阻害率（TBII値）という。TBII値は、抗TSHR自己抗体の値を反映すると考えられている。【００２３】
市販されている抗TSHR自己抗体測定用の試薬では、放射性同位元素が標識物質として使用されているので、保存条件や実施条件等が厳しく規定されている。このため、試薬の取扱いが面倒である、測定後の廃液まで厳密に管理しなければならない等の問題点がある。また、市販の試薬では、ブタの甲状腺膜画分中のTSHRを必須の成分とするため、工業的な量産が困難であるという問題もある。更に、ブタの甲状腺膜画分中のTSHRと測定対象物であるヒトの抗TSHR自己抗体との反応性が、ヒトのTSHRとヒトの抗TSHR自己抗体との反応性と同一ではないことから、測定系に掛からない自己抗体が存在するという問題もある。さらに、従来のTBII法では、患者が持っている自己抗体のTSHR認識部位と、RIAに用いる抗体の認識部位とが競合していない場合には、データがポジティブとならず、バセドウ病以外の甲状腺疾患をスクリーニングする検査としては使用できなかった。
これらの問題を解決するための技術として、特開平１１−１０６３９７号公報、特開２０００−２３２８８０がある。しかし、未だに完全な測定系は開発されていない。【００２４】
橋本病は、甲状腺に特異性な自己抗体（抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体）ができることにより、甲状腺が徐々に破壊されてしまい、甲状腺機能低下症となる疾患である。臨床的には、甲状腺ホルモンの量が不足するため、新陳代謝が低下し全てが老けていき、無気力で頭の働きが鈍くなり、忘れっぽいという症状が認められる。従来、甲状腺に対する自己抗体を測定するという判定法があるが、十分に感度の高いものは開発されていなかった。
重症筋無力症は、アセチルコリン受容体に対する抗体が関与することが知られている。アセチルコリン受容体には、4種類5個の4回膜貫通型サブユニット（2α、β、γ、δ）からなるチャネル型のニコチン性受容体と、7回膜貫通型のムスカリン性受容体とが存在する。このうち、ニコチン性受容体は、骨格筋の神経筋接合部のシナプス後膜に存在するアセチルコリン受容体（AChR)である。このレセプターに対する自己抗体ができると、神経から筋肉への指令伝達が円滑に行われず、アセチルコリン（ACh）が十分に作用できず筋収縮がうまくいかなくなる。筋力が弱くなり、著しく疲れ易くなるほか、特に同じ動作を繰り返すと力がなくなる症状をもつ重症筋無力症 (myasthenia gravis, MG) となる。重症筋無力症の有病率は、日本人では人口10万あたり5人程度であり、男女比は1:2である。この患者の85％に抗AChR抗体が確認されている。抗AChR抗体の測定には、 AChRと神経毒との結合を阻害する活性に基づいて抗 AChR抗体を検出する方法（阻害型）と、 AChR-神経毒複合物に結合するタイプの抗 AChR抗体を測定する方法（非阻害型）がある。前者ではConcanavalin A-sepharose法（ConA法）、後者ではimmunoprecipitation法（IP法：抗ヒトIgG法）が一般的である。このうち、最も汎用されているのはIP法である。IP法は125I-α-Bungarotoxinと結合させたAChR（AchR-125I-α-BuTx複合物）に、MG患者血清を作用させ、その後に抗ヒトIgG血清と反応させ、免疫沈降物中の125Iの放射活性を測定する。抗AChR自己抗体測定用の試薬では、放射性同位元素が標識物質として使用されているため、保存条件や実施条件等、試薬の取扱いが面倒であり、測定後の廃液まで厳密に管理しなければならない等の問題点があった。このため、未だに完全な測定系は開発されていなかった。【００２５】
拡張型心筋症では、β1アドレナリン受容体に結合する自己抗体が表れることが知られている。心臓におけるアドレナリン受容体の70％〜80％はβ1受容体である。拡張型心筋症患者血清中には、高頻度(31%)にβ1受容体のセカンド細胞外ループに対する自己抗体が検出される。この自己抗体が心筋刺激作用を有し、心毒性作用を発揮することが報告されているので、自己抗体が拡張型心筋症による心不全の病態に関与している可能性が指摘されている。拡張型心筋症以外の慢性心不全患者においても、頻度は少ないものの、抗心筋自己抗体が認められている。また、拡張型心筋症患者血清中に、高頻度(38%)にM2受容体のセカンド細胞外ループに対する自己抗体が検出される。非持続性心室頻拍は、抗β1アドレナリン受容体抗体や抗Na-K-ATPase抗体と関連している。持続性心房細動は、抗M2ムスカリン受容体抗体と関連している。拡張性心筋症を治療しない場合には、心臓のポンプ能力が低下して心臓能力を大いに減退させる。加えて、自己抗体の浸潤による心筋組織の膨張を生じる。しかし、疾患の初期段階で透析によって患者の血液から自己抗体を除去すると、1年以内に心筋が再生し、心筋能力が劇的に向上し、正常値にほぼ回復する。この疾患に対する簡易な自己抗体測定系が開発されることが望まれている。【００２６】
自己免疫性肝炎は、アシアログリコプロテイン受容体（AGPR）に対する自己抗体による疾患であると考えられている。この疾患の年間推定患者数は1,400症例とされている。近年には、症例数が増加傾向を示している。発症年齢は50歳を中心とする一峰性を示す。多くの患者は、中年以降に発症する。近年には、発症年齢の高齢化が認められる。疾患者の男女比は、約1：7で女性の患者が多い。AGPRは、肝実質細胞特異的に発現する膜タンパク質であり、血清中のアシアロ糖タンパク質を肝臓に於いて分解するために取り込む機能を有している。肝硬変、肝癌、再生肝などの肝臓病態に応じて、AGPRの発現が減少することが報告されている（ Stadalnik et al., J.Nucl.Med. 26：1233-1242, 1985)。また、一部の血清中に、AGPR自体が存在していることが報告されている（勝木等、アルコール代謝と肝：第12巻p65〜p68,1992）。自己抗体を測定する方法として、抗アシアロ糖タンパク質受容体抗体(ASGPR)を発現したヒト培養細胞株を使用する方法、大腸菌組換え抗原を用いる方法などが試みられているものの、未だに良好な測定系は確立されていない。【００２７】
多発性硬化症（MS）は原因不明の自己免疫性疾患であり、日本では進行性に視神経と脊髄を冒すアジア型MSが多いのが特徴である。患者数は、約１３，０００人に及ぶ。近年、アジア型MSでは水チャンネルであるアクアポリン４に対する自己抗体（抗AQP4抗体）が陽性であり、臨床症状と抗体価が比例すること、さらに、抗AQP4抗体陽性例では、唯一の治療薬であるインターフェロンの効果がないか、むしろ増悪させる危険性が示されている。抗AQP4抗体価は治療により低下し、再発時には上昇することから、抗AQP4抗体の定量的測定は診断・治療法の決定、予後判定の上で極めて重要であり、測定用ELISAは実用化に至っているが、現状では容易に入手し難く、遺伝子導入でAQP4タンパク質を発現させた細胞を患者血清で染色する定性的検査が、一部の専門施設で行われているのみである。
なお、本発明は、上記に例示した疾患に限られず、その他の膜タンパク質に関する自己抗体関連疾患に応用することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、膜表面に膜タンパク質を発現させた組換えプロテオリポソームを用いて、非特異的反応を軽減させることによってベースラインを十分に減少させることによって、従来には検出が不可能であった微量物質を特異的に測定する技術であるLELIA(Liposome-based Enzyme-Linked ImmunoAssay）を提供できる。これを特に、pLELIA(Proteoliposome-based Enzyme-Linked ImmunoAssay)と称する。また、本発明によれば、反応を行う溶液中には、界面活性剤を添加することが不要となる。
更に、自己免疫疾患に関連する自己抗体を特異的に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明における測定法のイメージを示す図である。この図では、膜タンパク質３に結合する膜タンパク質結合物質４を測定する工程を示す。（Ａ）〜（Ｕ）は、工程が進む順に示しており、各工程におけるチューブ１内の様子を示す模式図である。なお、チューブ１の上側に曲がった矢印で示す工程間の操作である（Ｑ）から（Ｒ）については、別々のチューブに溶液を移し替える操作を示している。それ以外の工程間の操作は、同一のチューブを用いて実施されている。  （Ａ）チューブ１内に膜タンパク質３を発現させた組換えプロテオリポソーム２を添加した様子を示す図、（Ｂ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させ、沈殿しない組換えプロテオリポソームを取り除いた様子を示す図、（Ｃ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｄ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させた様子を示す図、（Ｅ）膜タンパク質３に結合する膜タンパク質結合物質４と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｆ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４複合体を沈澱させ、未結合の膜タンパク質結合物質４を取り除いた様子を示す図、（Ｇ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｈ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｉ）膜タンパク質３に結合した膜タンパク質結合物質４に反応する抗体５と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｊ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を沈澱させ、未結合の抗体５を取り除いた様子を示す図、（Ｋ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｌ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｍ）抗体５を認識する酵素標識二次抗体６と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｎ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させ、未結合の酵素標識二次抗体６を取り除いた様子を示す図、（Ｏ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｐ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｑ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｒ）（Ｑ）の液体を別のチューブに移し替えた様子を示す図、（Ｓ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵���標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｔ）酵素標識二次抗体６の酵素によって反応する基質７（反応物８）を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させ、反応させる様子を示す図、（Ｕ）組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈殿させ、チューブ１内の反応物８を分離する様子を示す図である。
【図２】本発明における測定法のイメージを示す図である。本発明における測定法のイメージを示す図である。この図では、膜タンパク質３に反応する抗体５１を測定する工程を示す。（Ａ）〜（Ｒ）は、工程が進む順に示しており、各工程におけるチューブ１内の様子を示す模式図である。なお、チューブ１の上側に曲がった矢印で示す工程間の操作である（Ｍ）から(N)及び（Ｑ）から（Ｒ）については、別々のチューブに溶液を移し替える操作を示している。それ以外の工程間の操作は、同じチューブを用いて実施されている。  （Ａ）チューブ１内に膜タンパク質３を発現させた組換えプロテオリポソーム２を添加した様子を示す図、（Ｂ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させ、沈殿しない組換えプロテオリポソーム２を取り除いた様子を示す図、（Ｃ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｄ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させた様子を示す図、（Ｅ）膜タンパク質３に結合する抗体５１を含む試料と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｆ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を沈澱させ、未結合の抗体５１を取り除いた様子を示す図、（Ｇ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｈ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｉ）抗体５１を認識する酵素標識二次抗体６と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｊ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させ、未結合の酵素標識二次抗体を取り除いた様子を示す図、（Ｋ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｌ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｍ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｎ）（Ｍ）の液体を別のチューブに移し替えた様子を示す図、（Ｏ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｐ）酵素標識二次抗体６の酵素によって反応する基質７（反応物８）を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させ、反応させる様子を示す図、（Ｑ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈殿させた様子を示す図、（Ｒ）チューブ１内の反応物８を分離する様子を示す図である。
【図３】界面活性剤の有無によって、試験系への影響があるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図４】ブロッキングの有無によって、試験系への影響があるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図５】MLVのPEG修飾の有無によって、試験系への影響があるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図６】酵素反応の前における容器交換の有無によって、試験系への影響があるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図７】GVを用いる場合に、界面活性剤の有無によって、酵素反応の前における容器交換の有無によって、試験系への影響があるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図８】TSHR組換えMLVを用いたpLELIAによって、リガンドであるTSHの濃度を変化させたときに、TSHを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図９】TSHR組換えMLVを用いたpLELIAによって、酵素標識二次抗体（anti-IgG）の濃度を変化させたときに、リガンドであるTSHを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１０】TSHR組換えMLVを用いたpLELIAによって、抗TSHR抗体の濃度を変化させたときに、この抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１１】TSHR組換えMLVを用いたpLELIAによって、酵素標識二次抗体（anto-IgG）の濃度を変化させたときに、抗TSHR抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１２】AQP4組換えMLVを用いたpLELIAにより、多発性硬化症患者血清中の自己抗体（抗AQP4抗体）を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１３】AQP4組換えMLVを用いたpLELIAにより、多発性硬化症患者血清中の自己抗体（抗AQP4抗体）を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１４】TSHR組換えsGVを用いたpLELIAによって、リガンドであるTSHの濃度を変化させたときに、TSHを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１５】TSHR組換えsGVを用いたpLELIAによって、抗TSH抗体の濃度を変化させたときに、ＴＳＨを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１６】TSHR組換えsGVを用いたpLELIAによって、酵素標識二次抗体（anti-IgG）の濃度を変化させたときに、TSHを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１７】TSHR組換えsGVを用いたpLELIAによって、抗TSHR抗体の濃度を変化させたときに、この抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１８】TSHR組換えsGVを用いたpLELIAによって、酵素標識二次抗体（antiIgG）の濃度を変化させたときに、抗TSHR抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図１９】TSHR組換えsGVを用いたpLELIAにより、甲状腺疾患（バセドウ病及び橋本病）患者血清中の自己抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２０】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、リガンドであるα-Bungarotoxin（α-Butx-Alexa）の濃度を変化させたときに、α- Bungarotoxinを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２１】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、抗リガンド抗体（anti-Alexa抗体）の濃度を変化させたときに、α- Bungarotoxinを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２２】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、酵素標識二次抗体（anti-IgG）の濃度を変化させたときに、α- Bungarotoxinを特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２３】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、抗アセチルコリンレセプター抗体（anti-AChRα）の濃度を変化させたときに、抗AChRα抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２４】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、酵素標識二次抗体（anti-IgG）の濃度を変化させたときに、抗AChRα抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２５】AChRα組換えsGUVを用いたLELIAにより、重症筋無力症患者血清の濃度を変化させたときに、患者血清中の自己抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２６】AChRα組換えsGUVを用いたLELIAにより、酵素標識二次抗体（anti-IgG）の濃度を変化させたときに、重症筋無力症患者血清中の自己抗体を特異的にかつ濃度依存的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２７】AChRα組換えsGUVを用いたLELIAにより、重症筋無力症患者血清（1〜5）、および健常人（6〜10）の各血清を用いて、(1)AChRα組換えsGUV、(2)野生型ウイルス融合sGUV（コントロール）、(3)buffer（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))を測定した結果を示すグラフである。
【図２８】AQP4組換えsGUVを用いたLELIAにより、多発性硬化症患者血清の濃度を変化させたときに、患者血清中の自己抗体を特異的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図２９】AQP4組換えsGUVを用いたLELIAにより、酵素標識二次抗体（anti-IgG）の濃度を変化させたときに、多発性硬化症患者血清中の自己抗体を特異的に検出できるか否かを評価した試験結果を示すグラフである。
【図３０】AQP4組換えsGUVを用いたLELIAにより、多発性硬化症患者血清（1〜4）、および健常人（5〜8）の各血清を用いて、(1)AQP4組換えsGUV、(2)野生型ウイルス融合sGUV（コントロール）、(3)sGUV（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))を測定した結果を示すグラフである。
【図３１】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、健常人血清（３，４）の血清を用いて、(1)AChRα組換えsGV、(2)野生型ウイルス融合sGV（コントロール）、(3)buffer（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))の測定におけるフリーリポソームの添加効果を示すグラフである。
【図３２】AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、重症無力症患者（７，９）の血清を用いて、(1)AChRα組換えsGV、(2)野生型ウイルス融合sGV（コントロール）、(3)buffer（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))の測定におけるフリーリポソームの添加効果を示すグラフである。
【図３３】従来技術において、組換えプロテオリポソームを用いて、膜タンパク質に特異的な自己抗体を測定するための試験系の概要を説明するための図である。各図は、それぞれ、（Ａ）複数のウエルＷを有するプレート１０を示す図、（Ｂ）ウエルＷに組換えプロテオリポソーム２を添加する工程を示す図、（Ｃ）ウエルＷにサンプルＳを滴下し、酵素による発色を行った結果を示す図、（Ｄ）ウエルＷの内部において、アビジンＡｖ・ビオチンＢｔ反応を利用して、組換えプロテオリポソーム２をウエルＷの壁面に固定しつつ、膜タンパク質３に反応する自己抗体５に対する酵素標識二次抗体６によって、基質７を反応物８に変化させることで、発色させていることを示す図である。
【図３４】図３３に示す試験系によって、バセドウ病患者（G-1〜G-10）、橋本病患者（H1〜H10）、および健常人（N-1〜N-10）の各血清を用いて、(1)TSHR組換えLUV、(2)リセプター非融合LUV（コントロール）、(3)buffer（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))を測定した結果を示すグラフである。
【図３５】図３３に示す試験系によって、多発性硬化症患者血清（1〜5）、および健常人（6〜10）の各血清を用いて、(1)AQP4組換えLUV（AQP4-PEG LUV）、(2)リセプター非融合LUV（PEG LUVのみ：コントロール）、(3)Buffer（コントロール）、および(4)データ値（(1)-(2))を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。本発明の技術的範囲は、下記実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
図１には、pLELIAの測定時のイメージを示した。なお、図１には、簡易のために液相（反応時の緩衝液など）の記載は省略してある（図２においても同じ）。この図は、膜タンパク質３に結合する物質４（膜タンパク質３の本来のリガンド、アゴニスト、アンタゴニストなどを含む）を測定するときの様子を示している。このpLELIAを説明する図は、それぞれ、（Ａ）内壁面によって囲まれた反応用の空間を備えた容器１（単体としてのチューブ、複数のウエルを備えたプレートなど）の内部に、膜タンパク質３を発現させた組換えプロテオリポソーム２を添加した様子を示す図（容器吸着工程）、（Ｂ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させ、沈殿しない組換えプロテオリポソームを取り除いた様子を示す図、（Ｃ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｄ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させた様子を示す図（（Ｂ）−（Ｄ）は、本発明における「第１の洗浄工程」に該当）、（Ｅ）膜タンパク質３に結合する膜タンパク質結合物質４と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図（膜タンパク質結合物質結合工程）、（Ｆ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４複合体を沈澱させ、未結合の膜タンパク質結合物質４を取り除いた様子を示す図、（Ｇ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｈ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４複合体を沈澱させた様子を示す図（（Ｆ）−（Ｈ）は、本発明における「第２の洗浄工程」に該当）、（Ｉ）膜タンパク質３に結合した膜タンパク質結合物質４に反応する抗体５と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４複合体を浮遊させた様子を示す図（第１の抗体結合工程）、（Ｊ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を沈澱させ、未結合の抗体５を取り除いた様子を示す図、（Ｋ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｌ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を沈澱させた様子を示す図（（Ｊ）−（Ｌ）は、本発明における「第３の洗浄工程」に該当）、（Ｍ）抗体５を認識する酵素標識二次抗体６と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５複合体を浮遊させた様子を示す図（第２の抗体結合工程）、（Ｎ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させ、未結合の酵素標識二次抗体６を取り除いた様子を示す図、（Ｏ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｐ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図（（Ｎ）−（Ｐ）は、本発明における「第４の洗浄工程」に該当）、（Ｑ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｒ）（Ｑ）の液体を別のチューブに移し替えた様子を示す図（移送工程）、（Ｓ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｔ）酵素標識二次抗体６の酵素によって反応する基質７（反応物８）を添加して、組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させ、反応させる様子を示す図、（Ｕ）組換えプロテオリポソーム２／膜タンパク質結合物質４／抗体５／酵素標識二次抗体６複合体を沈殿させ、チューブ１内の反応物８を分離する様子を示す図（検出工程）である。このpLELIAによって、物質４の濃度を測定できる。
【００３１】
図２には、別のスキームによるpLELIAの測定時のイメージを示した。この図は、膜タンパク質３に反応する抗体５１（膜タンパク質３を認識する自己抗体を含む）を測定するときの様子を示している。このpLELIAを説明する図は、それぞれ、（Ａ）チューブ１内に膜タンパク質３を発現させた組換えプロテオリポソーム２を添加した様子を示す図（容器吸着工程）、（Ｂ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させ、沈殿しない組換えプロテオリポソーム２を取り除いた様子を示す図、（Ｃ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図、（Ｄ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２を沈澱させた様子を示す図（（Ｂ）−（Ｄ）は、本発明における「第１の洗浄工程」に該当）、（Ｅ）膜タンパク質３に結合する抗体５１を含む試料と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２を浮遊させた様子を示す図（第１の抗体結合工程）、（Ｆ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を沈澱させ、未結合の抗体５１を取り除いた様子を示す図、（Ｇ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｈ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を沈澱させた様子を示す図（（Ｆ）−（Ｈ）は、本発明における「第２の洗浄工程」に該当）、（Ｉ）抗体５１を認識する酵素標識二次抗体６と緩衝液とを添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１複合体を浮遊させた様子を示す図（第２の抗体結合工程）、（Ｊ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させ、未結合の酵素標識二次抗体を取り除いた様子を示す図、（Ｋ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｌ）再度、チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図（（Ｊ）−（Ｌ）は、本発明における「第３の洗浄工程」に該当）、（Ｍ）緩衝液を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させた様子を示す図、（Ｎ）（Ｍ）の液体を別のチューブに移し替えた様子を示す図（移送工程）、（Ｏ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈澱させた様子を示す図、（Ｐ）酵素標識二次抗体６の酵素によって反応する基質７（反応物８）を添加して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を浮遊させ、反応させる様子を示す図、（Ｑ）チューブ１を遠心して、組換えプロテオリポソーム２／抗体５１／酵素標識二次抗体６複合体を沈殿させた様子を示す図、（Ｒ）チューブ１内の反応物８を分離する様子を示す図（検出工程）である。
このスキームによって、抗体５１（自己抗体を含む）の濃度・有無を評価できる。
次に、図１および図２に示すpLELIAを具体化した実施例について説明することによって、本実施形態を更に詳細に説明する。
＜実験材料と方法＞
【００３２】
１．材料
リポソームを調製するためのリン脂質は、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)（NOF Corporation）、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) （NOF Corporation）、Phosphoethanolamine-N-[Methoxy (Polyethylene Glycol) 2000],1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-,Ammonium Salt (PEG(2000)-DOPE)（Avanti Polar Lipids, Inc.）、及びL-α-Phosphatidylethanolamine-N-Lissamine Rhodamine B Sulfonyl, Ammonium Salt (Rh-PE)（Avanti Polar Lipids, Inc.）を用いた。
pLELIAに使用するリガンドは、Thyrotropic hormone from human pituitary (TSH)（Sigma-Aldrich Co.）あるいはα-Bungarotoxin-Alexa Fluor 488 Conjugate (αButx-Alexa)（Molecular Probes）を用いた。
抗体は、抗TSH抗体 Anti-Human Thyroid Stimulating Hormone Alpha（Leinco Technologies, Inc.）、抗TSHR抗体 Anti-TSHR (H-155)（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、抗Alexa抗体 Anti-Alexa Fluor 488（Molecular Probes）、抗AChRα抗体 Anti-Human Acethylcholine Receptor-Alpha Subunit（Serotec Co., Ltd.）、Anti-Rabbit IgG-HRP（Medical ＆ Biological Laboratories Co., Ltd.）、Anti-Mouse IgG-HRP（Medical ＆ Biological Laboratories Co., Ltd.）、及びAnti-Human IgG-HRP（Medical ＆ Biological Laboratories Co., Ltd.）を用いた。
【００３３】
２．リポソームの調製
多重膜リポソーム（multilamellar vesicle; MLV）は、リン脂質（DOPC/DOPS = 1/1、あるいはDOPC/DOPS/ PEG(2000)-DOPE = 1/1/0.066）を溶かしたクロロホルムを減圧ボルテックス処理により除去し、薄膜状になったリン脂質に10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液を1ml加え、ボルテックスを行い調製した。次に、調製したリポソームを0.4μmのポリカルボネートメンブレンフィルターで加圧濾過した。また、MLV以外のリポソームを除去するために、遠心（10,000×g、10min、4℃）を行い、得られた沈殿物を10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液に懸濁し、得られた上清とその懸濁溶液を再度遠心（10,000×g、10min、4℃）した。懸濁溶液の遠心で得られた沈殿物を10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液に懸濁し、一方懸濁溶液の遠心で得られた上清とその前段階での上清の遠心で得られた沈殿物を混合し、両者をそれぞれ遠心（11,000×g、10min、4℃）した。同様の操作を5回繰り返し、MLVを調製した。調製したMLVは、アルゴンガスを充填し4℃で保存した。
小さな一枚膜リポソーム（small unilamellar vesicle; SUV）は、リン脂質（DOPC/DOPS = 1/1）を溶かしたクロロホルムを減圧ボルテックス処理により除去し、薄膜状になったリン脂質に10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液を1ml加えてボルテックスを行い、まずMLVを調製し、次に、調製したリポソームを超音波破砕装置で、10℃、20分間処理を行って調製した。調製したSUV は、アルゴンガスを充填し4℃で保存した。
比較的小さな糖含有巨大リポソーム（small giant vesicle; sGV）は、クロロホルムに溶かしたリン脂質及びメタノールに溶かしたフルクトースの混合溶液（DOPC/DOPS/Rh-PE/Fructose = 1/1/0.02/2、クロロホルムとメタノールの量比2:1）を、減圧ボルテックス処理により除去し脂質薄膜を形成させた後、さらに1時間減圧を行った。次に、薄膜状になったリン脂質に10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液を1ml加え、穏やかにボルテックスを行い、調製したリポソームを10μmのポリカルボネートメンブレンフィルターで加圧濾過した。また、sGV以外のリポソームを除去するために、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去し得られた沈殿物を10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液に懸濁し、再度遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。同様の操作を4回繰り返し、sGVを調製した。調製したsGV は、アルゴンガスを充填し4℃で保存した。
【００３４】
３．リポソーム濃度の決定
リポソームの濃度はリン脂質濃度で表した。リン脂質濃度はリン脂質を過酸化水素と硫酸により湿式分解し、得られた分解液中の無機リンをFiske-Subbarow試薬により発色させた。まず、サンプル及びコントロールとして使用したKH2PO4溶液に4mmolのH2SO4を加え、170℃で30分以上加熱し、空冷後、過酸化水素を6%となるように加え、170℃で30分間加熱した。次に、空冷したサンプル及びコントロールに、0.25N H2SO4/1.8mM (NH4)6Mo7O24・4H2O溶液を4.6ml加えてボルテックスを行い、さらに、発色試薬（10mM 1-Amino-2-naphthol-4-sulfonic Acid/4mM Na2SO3/15% Sodium Hydrogensulfite）を0.2ml加えてボルテックスを行った後、沸騰水中で10分間加熱した。そして、空冷したサンプル及びコントロールとして使用したKH2PO4の吸光度を830nmで測定し、サンプル中のリン含量を決定した。
【００３５】
４．TSHR組換えバキュロウイルスAcNPVの作製
Clontech社ヒト甲状腺cDNAより以下のPCR プライマーを用いてTSHR（TSH受容体）翻訳領域のクローニングをpfu polymeraseを用いたPCR法により行った。PCR法には、プライマー１（配列番号１：agtcggatccaccatgagccggcggacttgct）と、プライマー２（配列番号２：tgttctcgagcaaaaccgtttgcatatactctt）とを用いた。配列の下線部分は、付加した制限酵素部位（BamH I及びXho I）を意味する。
得られた2.3kbpのDNA断片をプライマーに付加したBamH I、Xho I 制限酵素部位で消化し、Novagen社pET-28a(+) のマルチクローニングサイトのBamH I、Xho I にライゲーションした。得られたクローン(pET/TSHR)をDNAシーケンサーにより塩基配列を決定し、Acc.No.A34990として登録されているTSHR遺伝子翻訳領域と一致した配列のDNA断片が得られたことを確認した。
【００３６】
pET/TSHRをテンプレートとしてバキュロウィルストランスファーベクターを作製するために、次のプライマーによりpfu polymeraseを用いたPCR法を行った。プライマーとして、プライマー３（配列番号３：agtcggatccaccatgagccggcggacttgct）、及びプライマー４（配列番号４：ttcggaattcgttagcagccggatctcagt）を用いた。両プライマーの5'末端側には、それぞれ制限酵素BamH I及びEcoR Iの認識部位（下線部分）を付加した。これらのプライマーを用いることにより、pET-28a(+)由来のHis-Tag がTSHRのC末端に融合されるので、抗His-Tag 抗体によりTSHRの発現確認が容易となる。
得られたDNA断片をBamH I、EcoR I で消化し、BD Biosciences社バキュロウィルストラスファーベクターpVL1393のマルチクローニングサイト、BamH I、EcoR I部位にライゲーションした。得られたクローン(pVL/TSHR)は、DNAシーケンサーによりTSHR翻訳領域およびHis-Tag 配列がpVL1393ベクターに組換えられている事を確認した。
TSHR組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとの両者をSf9細胞にリン酸カルシウム法によりコトランスフェクションし、Sf9細胞内での相同組換えによりTSHR組換えバキュロウィルス（TSHR組換えAcNPV）を作製した。得られたTSHR組換えAcNPVをHigh Five 細胞に感染して、抗His-Tag 抗体にて検出したところ、High Five 細胞にてTSHRが発現していることを確認した。
【００３７】
５．AChRα組換えバキュロウイルスAcNPVの作製
Clontech社のヒト骨格筋cDNAライブラリーを用い、２本のPCR プライマーを用いてAChR α鎖 翻訳領域のクローニングをpfu polymeraseを用いたPCR法により行った。PCR法には、プライマー５（配列番号５：gtagcatatggagccctggcctctcct）と、プライマー６（配列番号６：tttcctcgagtccttgctgatttaattcaatgag）とを用いた。配列の下線部分は、付加した制限酵素部位（NdeI及びXho I）を意味する。
得られた1.4kbpのDNA断片をプライマーに付加したNdeI、Xho I 制限酵素部位で消化し、Novagen社pET-30a(+) のマルチクローニングサイトのNde I、Xho I にライゲーションした。得られたクローン(pET/AChRα)をDNAシーケンサーにより塩基配列を決定し、Acc.No.Y00762として登録されているAChRα遺伝子翻訳領域と一致した配列のDNA断片が得られたことを確認した。
【００３８】
pET/AChRαをテンプレートとしてバキュロウイルストランスファーベクターを作製するために、次のプライマーによりTaKaRa Ex Taq用いてPCR法を行った。プライマーとして、プライマー７（配列番号７：cggaattcgatatggagccctggcctctc）、及びプライマー８（配列番号８：gctctagagctttgttagcagccggatc）を用いた。両プライマーの5’末端側には、それぞれ制限酵素EcoR I及びXba Iの認識部位（下線部分）を付加した。これらのプライマーを用いることにより、pET-30a(+)由来のHis-TagがAChRαのC末端に融合されるので、抗His-Tag抗体によりAChRαの発現確認が容易となる。
得られたDNA断片をEco RI、Xba Iで消化し、BD Biosciences社バキュロウイルストランスファーベクターpVL1392のマルチクローニングサイトのEco RI、Xba I部位にライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテントセルに形質転換し、プラスミドDNAを得た。得られたクローン（pVL/AChRα）は、DNAシーケンサーによりAChRα翻訳領域およびHis-Tag配列がpVL1392ベクターに組換えられていることを確認した。
AChRα組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAを、Cellfectin Reagent (Invitrogen社) を用いてSf9細胞にコトランスフェクションし、Sf9細胞内での相同組換えによりAChRα組換えバキュロウイルス（AChRα組換えAcNPV）を作製した。得られたAChRα組換えAcNPVを含む培養上清を用いて、新たにSf9細胞に感染させ、抗His-Tag抗体により検出したところ、Sf9細胞とAChRα組換えAcNPV出芽ウイルスにAChRαが発現していた。得られたAChRα組換えバキュロウイルスは、プラーク法により純化し、組換えプロテオリポソーム作製用に供した。
【００３９】
６．AQP4組換えバキュロウイルスAcNPVの作製
まず、6×His-hAQP4遺伝子をRecombinant Donor PlasmidであるpDEST10ベクターに挿入し、pDEST10/hAQP4を作製した。次に、作製したpDEST10/hAQP4をBacmidの入ったE.coliであるCompetent DH10Bacにトランスフォームし、E.coli内のBacmidの任意の配列とpDEST10/hAQP4の6×His-hAQP4遺伝子を相同組換えさせ、6×His-hAQP4組換えBacmid DNA （pDEST10/hAQP4/DH10Bac）の入ったE.coliを作製した。さらに、pDEST10/hAQP4/DH10Bacの入ったE.coliをlarge-prepし、pDEST10/hAQP4/DH10Bacを抽出した。
トランスフェクションは、次のようにして行った。まず、6穴プレートの1wellに9×105個のSf9細胞を添加し、さらにSf-900IIを添加して1時間静置し、細胞をプレートに接着させた。次に、pDEST10/hAQP4/DH10BacをSf-900IIで希釈し、同時に、CellfectinをSf-900IIで希釈し、両者を混合して、45分静置した。さらに、1時間静置した6穴プレートをSf-900IIで洗浄後、45分静置した混合液を加えて、27℃で5時間インキュベートした。
インキュベート後、液を除去てSf-900IIを添加し、さらに27℃で72時間インキュベートすることにより、AQP4組換えバキュロウイルス（AQP4組換えAcNPV）を作製した。得られたAQP4α組換えAcNPVを含む培養上清を用いて、新たにSf9細胞に感染させ、抗His-Tag抗体により検出したところ、Sf9細胞とAQP4組換えAcNPV出芽ウイルスにAQP4が発現していた。得られたAQP4組換えバキュロウイルスは、プラーク法により純化し、組換えプロテオリポソーム作製用に供した。
【００４０】
７．野性型及び組換え型AcNPVの感染及び出芽ウイルス（BV）の作製及び回収
Sf-900II Serum Free Medium（Invitrogen Corp.）培地11mlを加えた培養フラスコに、継代していたSf9細胞溶液（細胞数2.0×106個）を加え、野性型あるいは組換え型AcNPVをMOI（感染多重度）＝1で感染させた。感染120時間後の細胞培養液を遠心（1,000×g、5min、4℃）し、培養上清を細胞沈殿から分離回収した。次に、培養上清を超遠心機（Optima L-90K ultracentrifuge、Beckman-Coulter, Inc.）を用いて超遠心（100,000×g、60min、15℃）を行い、得られた野性型あるいは出芽ウイルス（BV）粒子を含む沈殿にリン酸緩衝塩類溶液（phosphate-buffered saline; PBS）[1mM Na2HPO4/10.5mM KH2PO4/140mM NaCl/40mM KCl（pH6.2）]を加えて懸濁し、ショ糖密度勾配[10%,15%,20%,25%,30% sucrose（w/v in PBS pH6.2）]に重層して超遠心（40,000×g、30min、15℃）を行った。このようにして得られた野性型あるいは組換え型AcNPV-BVを含む2つの画分のうち、ウイルスのゲノムを含まない画分を回収し、PBS（pH6.2）で希釈後、超遠心（100,000×g、60min、15℃）を行い、得られた沈殿を10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液に懸濁し、氷中に保存した。
【００４１】
８．ウイルス濃度の測定
ウイルス濃度はBradford法によるタンパク質の定量で決定した。回収した任意の量のウイルス溶液、及びコントロールとして用いた2mg/mlのBSA 2、4、6、8μlに10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）で全体の体積を1.3mlに調製後、Bio-Rad Protein Assay（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を0.2ml加え、ボルテックスを行った。5分間室温で静置した後、吸光度を595nmで測定し、タンパク質の濃度を決定した。
【００４２】
９．野性型及び組換えプロテオリポソームの作製
野性型及び組換えプロテオMLVは、MLV溶液、ウイルス溶液（野生型ウイルス、TSHR組換えウイルス、AChRα組換えウイルス、あるいはAQP4組換えウイルス）、10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液及び10mM 10mM CH3COOH/10mM NaCl 溶液を、MLVリン脂質濃度が30nmol/100μl、ウイルス濃度が1μg/100μl、溶液のpHが4.0となるように撹拌しながら混合し、1時間静置して融合させた後、1M Tris溶液を添加してpHを中性にすることによって作製した。
野性型及び組換えプロテオsGVは、sGV溶液、ウイルス溶液（野生型ウイルス、TSHR組換えウイルス、AChRα組換えウイルス、あるいはAQP4組換えウイルス）、10mM Tris-HCl/10mM NaCl（pH7.5）緩衝液及び10mM 10mM CH3COOH/10mM NaCl 溶液を、sGVリン脂質濃度が10nmol/100μl、ウイルス濃度が1μg/100μl、溶液のpHが4.0となるように撹拌しながら混合し、1時間静置して融合させた後、1M
Tris溶液を添加してpHを中性にすることによって作製した。
【００４３】
＜pLELIAと結果＞
Ｉ．基本操作条件
(1) 緩衝液１
ここでは、MLVとTSHとの非特異的反応におけるTriton X-100の影響を検討した。ブロッキングは行ったが、PEGの添加、容器の交換は行っていない。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBSTあるいはPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Ace（DS Pharma Biomedical Co., Ltd）を1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。インキュベート後ブロッキング溶液を除去してPBSTあるいはPBSで洗浄し、作製したMLVサンプルあるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBSTあるいはPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSTあるいはPBSで任意の濃度に希釈したTSH溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSTあるいはPBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSTあるいはPBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSTあるいはPBSで1000倍に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。
【００４４】
反応後PBSTあるいはPBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSTあるいはPBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。最後に、上清を除去してPBSTあるいはPBSで任意に希釈したAnti-Mouse IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSTあるいはPBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSTあるいはPBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBSTあるいはPBS 1mlで沈殿を懸濁し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダー（MULTISKAN JX、Thermo Fisher Scientific, Inc.）を用い、上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  TSHの濃度を50 nM、抗TSH抗体の希釈率を1:1000、抗TSH抗体に対する二次抗体である抗IgG抗体の希釈率を1:2000と一定にした時の、TSHのMLVと緩衝液との反応性の差ΔAは、緩衝液がPBSTの場合は0.207、PBSの場合は0.175となり、Triton X-100の存在の有無で大差がなかった（図３）。
この結果より、緩衝液として、界面活性剤は不要であることが判った。このため、本発明では、界面活性剤を含有しないPBSを用いれば済む。PBSは、生化学の実験において必須と言えるものであり、常備されている溶液であるため、特殊な試薬を用いる必要がない。また、いずれかの工程で界面活性剤を含有する溶液を用いてしまうと、完全に界面活性剤取り除くことは非常に困難であり、後の工程では、界面活性剤の持ち越し（キャリーオーバー）によるアーチファクトが生じるおそれがある。更に、脂質膜であるリポソームを用いる試験系においては、できるだけ界面活性剤を用いない方が、安定した試験結果を得やすい。従来のELISA法では、界面活性剤を含有する溶液が常用され（例えば、PBST）、常に界面活性剤の持ち越しによる影響を考慮しなければならなかった。このような理由から、界面活性剤を用いない本発明の試験系は、非常に有用なものと言える。
【００４５】
(2) ブロッキング
ここでは、TSHR組換えMLVとTSHとの非特異的反応におけるブロッキングの効果を検討した。界面活性剤及びPEGの添加、容器の交換は行っていない。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行ったものと行わないものとをつくった。ブロッキングを行った場合はブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えMLVサンプルあるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意の濃度に希釈したTSH溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで1000倍に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。
【００４６】
反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。最後に、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Mouse IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  TSHの濃度を100nM、抗TSH抗体の希釈率を1:1000、抗TSH抗体に対する二次抗体である抗IgG抗体の希釈率を1:2000と一定にした時のTSHR組換えMLVの場合の反応性とMLVの場合の反応性の差ΔAは、ブロッキングを行った場合と行わない場合、それぞれ0.108、0.027となり、ブロッキングした場合、TSHR組換えMLVに対するTSHの特異的結合が明確になることが判った（図４）。
この結果より、ブロッキングは必須であることが判った。
【００４７】
(3) PEG
ここでは、TSHR組換えMLVと抗TSHR抗体との特異的反応におけるPEG修飾の効果を検討した。ブロッキングは行ったが、界面活性剤の添加、容器の交換は行っていない。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えPEG修飾及び非修飾MLVサンプル、野性型ウイルス融合PEG修飾及び非修飾MLV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Rabbit IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  抗TSHR抗体の希釈率を1:100とし、抗TSHR抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000とした時のΔAは、PEG修飾MLVを用いた場合0.074、非修飾MLVを用いた場合0.082となり、PEGの有無による相違はなかった（図５）。
この結果より、PEG修飾の必要性はないことが判った。
【００４８】
(4) 容器（移送工程）
ここでは、MLVとTSHとの非特異的反応における容器交換の効果を検討した。ブロッキングは行ったが、界面活性剤及びPEGの添加は行っていない。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去しPBSで洗浄し、作製したMLVサンプルあるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意の濃度に希釈したTSH溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで1000倍に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。
【００４９】
さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Mouse IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。他方、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  TSHの濃度を50 nM、抗TSH抗体の希釈率を1:1000、抗TSH抗体に対する二次抗体である抗IgG抗体の希釈率を1:2000と一定にした時の、TSHのMLVと緩衝液との反応性の差ΔAは、容器交換無しの場合は0.091、容器交換有りの場合は0.261となり、また、緩衝液のみの値は0.055と大きく低減された（図６）。
この結果より、酵素反応を行う前に容器交換して、移送工程を設けることが、極めて有効であることが判った。
【００５０】
(5) 緩衝液２
ここでは、TSHR組換えsGVと抗TSHR抗体との特異的反応におけるTriton X-100Aの影響を、巨大リポソームに注目して検討した。ブロッキング及び容器の交換は行ったが、PEGの添加は行っていない。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBSTあるいはPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSTあるいはPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えsGVサンプル、野性型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBSTあるいはPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSTあるいはPBSで1000倍に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSTあるいはPBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSTあるいはPBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。
【００５１】
さらに、上清を除去してPBSTあるいはPBSで任意に希釈したAnti-Rabbit IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSTあるいはPBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSTあるいはPBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBSTあるいはPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  抗TSHR抗体の希釈率を1:100とし、抗TSHR抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000とした時のTSHR組換えsGVとsGVとの差ΔAは、緩衝液がPBSTの場合は0.11、PBSの場合は0.22となり、Triton X-100の非存在下の方が高い値を示した（図７）。
この結果より、GVの場合も、緩衝液として、界面活性剤は不要であることが判った。
【００５２】
II．MLV-pLELIA
(1) TSHR
(a)TSH
TSHR組換えMLVとTSHとの特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
なお、当業者であれば、各実施例において、どの工程が本発明における各工程に該当するかは容易に理解できるので、各工程名称の記載については、この実施例、(b)抗TSHR抗体、及び(2)AQP4(a)自己抗体（多発性硬化症）に留めた。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Ace（DS Pharma Biomedical Co., Ltd）を1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキング処理を行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えPEG被覆MLVサンプル、AChRα組換えPEG被覆MLV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った（（１）容器吸着工程）。遠心後上清を除去してPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（２）第１の洗浄工程）。
次に、上清を除去してPBSで任意の濃度に希釈したTSH溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（３）膜タンパク質結合物質結合工程）。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（４）第２の洗浄工程）。さらに、上清を除去してPBSで1000倍に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（５）第１の抗体結合工程）。
【００５３】
反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（６）第３の洗浄工程）。最後に、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Mouse IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（７）第２の抗体結合工程）。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（８）第４の洗浄工程）。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキング処理しておいた別の新しいチューブにサンプルを移し（（９）移送工程）、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダー（MULTISKAN JX、Thermo Fisher Scientific, Inc.）を用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した（（１０）検出工程）。
【００５４】
＜結果＞  まず、抗TSH抗体の希釈率を1:1000、抗TSH抗体に対する二次抗体である抗IgG抗体の希釈率を1:1000と一定にし、TSHの濃度を10 nM、20 nM、50 nM、100 nMとした時のTSHR組換えPEG被覆MLVの場合の反応性とAChRα組換えPEG被覆MLVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.060、0.063、0.222、0.270となり、TSH濃度依存的にΔAが増加することが示され、TSHR組換えPEG被覆MLVとTSHが特異的に結合することが判った（図８）。
次に、TSH濃度を50 nM、抗TSH抗体の希釈率を1:1000と一定にし、抗TSH抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:10000、1:5000、1:2000、1:1000とした時のΔAは、それぞれ0.028、0.106、0.210、0.262となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図９）。
以上の結果より、TSHR組換えMLVを用いたpLELIAにより、リガンドであるTSHを特異的に検出できることが判り、リガンド検出におけるpLELIAの有用性が明らかになった。
【００５５】
(b)抗TSHR抗体
TSHR組換えMLVと抗TSHR抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキング処理を行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えMLVサンプル、野性型ウイルス融合MLV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った（（１）容器吸着工程）。遠心後上清を除去してPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（２）第１の洗浄工程）。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（１１）第１の抗体結合工程）。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（６’）第２の洗浄工程）。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Rabbit IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（７’）第２の抗体結合工程）。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（８’）第３の洗浄工程）。
【００５６】
同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し（（９）移送工程）、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した（（１０）検出工程）。
＜結果＞  まず、抗TSHR抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000と一定にし、抗TSHR抗体の希釈率を1:500、1:200、1:100、1:50とした時のTSHR組換えMLVの場合の反応性と野生型ウイルス融合MLVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.120、0.136、0.208、0.349となり、抗TSHR抗体濃度依存的にΔAが増加することが示され、TSHR組換えMLVと抗TSHR抗体が特異的に結合することが判った（図１０）。
次に、抗TSHR抗体の希釈率を1:100と一定にし、抗TSHR抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:10000、1:5000、1:2000、1:1000とした時のΔAは、それぞれ0.030、0.104、0.125、0.180となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図１１）。
以上の結果より、TSHR組換えMLVを用いたpLELIAにより、抗TSHR抗体を特異的に検出できることが判り、特異抗体検出におけるpLELIAの有用性が明らかになった。
【００５７】
(2)AQP4
(a)自己抗体(多発性硬化症)
AQP4組換えMLVと多発性硬化症患者血清中の自己抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したAQP4組換えPEG被覆または非被覆MLVサンプル、PEG被覆または非被覆MLVのみ（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った（（１）容器吸着工程）。遠心後上清を除去してPBS 1mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（２）第１の洗浄工程）。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した患者血清及び健常人血清を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（１１）第１の抗体結合工程）。反応後PBSを1ml添加し遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した（（６’）第２の洗浄工程）。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Human IgG-HRP 抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした（（７’）第２の抗体結合工程）。反応後PBSを1ml添加して遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、上清を除去した後PBSを1ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（13,000×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した（（８’）第３の洗浄工程）。
同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 1mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し（（９）移送工程）、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（13,000×g、10min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した（（１０）検出工程）。
【００５８】
＜結果＞  まず、AQP4組換えPEG被覆MLVと健常人血清との反応性とPEG被覆MLVのみと健常人血清との反応性の差ΔAは、二次抗体の抗IgG抗体希釈率1:1000の場合、−0.002（サンプル番号3）と0.016（サンプル番号4）、抗IgG抗体希釈率1:2000の場合、0.008（サンプル番号3）と0.011（サンプル番号4）となり、ほとんど反応性に差はなかった。一方、AQP4組換えPEG被覆MLVと患者血清との反応性とPEG被覆MLVのみと患者血清との反応性の差ΔAは、抗IgG抗体希釈率1:1000の場合、0.089（サンプル番号1）と0.086（サンプル番号2）、抗IgG抗体希釈率1:2000の場合、0.034（サンプル番号1）と0.023（サンプル番号2）となり、有意な差があった。また、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示され、AQP4組換えPEG被覆MLVと患者血清が特異的に反応することが判った（図１２）。
次に、他のいくつかの患者血清及び健常人血清において、AQP4組換えMLVと血清中の自己抗体との反応性におけるpLELIAの有効性を検討した。AQP4組換えMLVと健常人血清との反応性とMLVのみと健常人血清との反応性の差ΔAは、0.090（サンプル番号5）、−0.008（サンプル番号6）、−0.010（サンプル番号7）、0.011（サンプル番号8）となり、サンプル番号5を除きほとんど反応性に差はなかった。一方、AQP4組換えMLVと患者血清との反応性とMLVのみと患者血清との反応性の差ΔAは、0.033（サンプル番号1）、0.037（サンプル番号2）、0.091（サンプル番号3）、0.046（サンプル番号4）となり、いずれも有意な差が示され、他の患者血清もAQP4組換えMLVと特異的に反応することがわかった（図１３）。
以上の結果より、AQP4組換えMLVを用いたpLELIAにより、多発性硬化症患者血清中の自己抗体を特異的に検出できることが判り、自己免疫疾患診断におけるpLELIAの有用性が明らかになった。
【００５９】
III．sGV-pLELIA
(1) TSHR
(a)TSH
TSHR組換えsGVとTSHとの特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Ace（DS Pharma Biomedical Co., Ltd）を1 ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えsGVサンプル、野性型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意の濃度に希釈したTSH溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで1000倍に希釈した抗TSH抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。最後に、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Mouse IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
【００６０】
＜結果＞  まず、抗TSH抗体の希釈率を1:500、抗TSH抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000と一定にし、TSHの濃度を5 nM、10 nM、20 nM、40 nMとした時のTSHR組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.174、0.222、0.280、0.479となり、TSH濃度依存的にΔAが増加することが示され、TSHR組換えsGVとTSHが特異的に結合することが判った（図１４）。
次に、TSH濃度を20 nM、抗TSH抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000と一定にし、TSHに対する抗TSH抗体の希釈率を1:2000、1:1000、1:500、1:200とした時のΔAは、それぞれ0.157、0.245、0.401、0.429となり、抗TSH抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図１５）。
さらに、TSH濃度を20 nM、抗TSH抗体の希釈率を1:1000と一定にし、抗TSH抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:10000、1:5000、1:2000、1:1000とした時のΔAは、それぞれ0.022、0.072、0.123、0.280となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図１６）。
以上の結果より、TSHR組換えsGVを用いたpLELIAにより、リガンドであるTSHを特異的に検出できることが判り、リガンド検出におけるpLELIAの有用性が確証された。
【００６１】
(b)抗TSHR抗体
TSHR組換えsGVと抗TSHR抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した抗TSHR抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加し遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Rabbit IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加えて37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
【００６２】
＜結果＞  まず、抗TSHR抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000と一定にし、抗TSHR抗体の希釈率を1:500、1:200、1:100、1:50とした時のTSHR組換えMLVの場合の反応性と野生型ウイルス融合MLVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.112、0.279、0.442、1.017となり、抗TSHR抗体濃度依存的にΔAが増加することが示され、TSHR組換えsGVと抗TSHR抗体が特異的に結合することがわかり、さらにTSHR組換えMLVを用いた場合よりも反応性の差が大きくなることがわかった（図１７）。
次に、抗TSHR抗体の希釈率を1:100と一定にし、抗TSHR抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:10000、1:5000、1:2000、1:1000とした時のΔAは、それぞれ0.073、0.079、0.112、0.312となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示され、さらにTSHR組換えMLVを用いた場合よりも反応性の差が概ね大きくなることがわかった（図１８）。
以上の結果より、TSHR組換えGVを用いたpLELIAにより、抗TSHR抗体を特異的に、TSHR組換えMLVを用いたpLELIAよりも高い感度で検出できることが判り、特異抗体検出におけるpLELIAの有用性が確証された。
【００６３】
(c)自己抗体（甲状腺疾患）
TSHR組換えsGVとバセドウ病及び橋本病患者血清中の自己抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去しPBSで洗浄し、作製したTSHR組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいはsGVのみ（コントロール）をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した患者血清及び健常人血清を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Human IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
【００６４】
＜結果＞  バセドウ病及び橋本病患者血清及び健常人血清を用いて、TSHR組換えsGVと血清中の自己抗体との反応性におけるpLELIAの有効性を検討したところ、TSHR組換えsGVと健常人血清との反応性と野生型ウイルス融合sGVと健常人血清との反応性の差ΔAは、0.026（サンプル番号9）、0.020（サンプル番号10）、0.014（サンプル番号11）、0.016（サンプル番号12）となり、ほとんど反応性に差はなかった。一方、TSHR組換えsGVと患者血清との反応性と野生型ウイルス融合sGV と患者血清との反応性の差ΔAは、バセドウ病では、0.305（サンプル番号1）、0.422（サンプル番号2）、0.281（サンプル番号3）、0.278（サンプル番号4）、橋本病では、0.162（サンプル番号5）、0.121（サンプル番号6）、0.639（サンプル番号7）、0.096（サンプル番号8）となり、いずれも明らかな有意差が示され、TSHR組換えsGVとバセドウ病及び橋本病患者血清が特異的に反応することが判った（図１９）。
以上の結果より、TSHR組換えsGVを用いたpLELIAにより、甲状腺疾患（バセドウ病及び橋本病）患者血清中の自己抗体を特異的に検出できることが判り、自己免疫疾患診断におけるpLELIAの有用性が確認された。
【００６５】
(2) AChRα
(a)αButx
AChRα組換えsGVとαButx-Alexaとの特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去しPBSで洗浄し、作製したAChRα組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意の濃度に希釈したαButx-Alexa溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、10min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈した抗Alexa抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。最後に、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Rabbit IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
【００６６】
＜結果＞  まず、αButx-Alexaに対する抗Alexa抗体の希釈率を1:2000、抗Alexa抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:5000と一定にし、αButx-Alexaの濃度を0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μMとした時のAChRα組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.466、0.597、0.921、1.099となり、αButx-Alexa濃度依存的にΔAが増加することが示され、AChRα組換えsGVとαButx-Alexaが特異的に結合することが判った（図２０）。
次に、αButx-Alexa濃度を1μM、抗Alexa抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:5000と一定にし、抗Alexa抗体の希釈率を1:10000、1:5000、1:2000、1:1000とした時のΔAは、それぞれ0.310、0.797、1.256、1.813となり、抗Alexa抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２１）。
さらに、αButx-Alexa濃度を1μM、抗Alexa抗体の希釈率を1:1000と一定にし、抗Alexa抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:10000、1:5000とした時のΔAは、それぞれ0.817、1.508となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２２）。
以上の結果より、AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、リガンドであるα-Bungarotoxinを特異的に検出できることが判り、リガンド検出におけるpLELIAの有用性が再確認された。
【００６７】
(b)抗AChRα抗体
AChRα組換えsGVと抗AChRα抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去してPBSで洗浄し、作製したAChRα組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいは融合時の緩衝液をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、遠心（19,500×g、20min、4℃）をを行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した抗AChRα抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加し遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Mouse IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後、PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え、37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  まず、抗AChRα抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:1000と一定にし、抗AChRα抗体の希釈率を1:1000、1:500、1:200、1:100とした時のAChRα組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.329、0.432、0.762、1.031となり、抗AChRα抗体濃度依存的にΔAが増加することが示され、AChRα組換えsGVと抗AChRα抗体が特異的に結合することがわかった（図２３）。
次に、抗AChRα抗体の希釈率を1:100と一定にし、抗AChRα抗体に対する抗IgG抗体の希釈率を1:10000、1:5000、1:2000、1:1000とした時のΔAは、それぞれ0.271、0.442、0.827、1.253となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２４）。
以上の結果より、AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、抗AChRα抗体を特異的に検出できることが判り、特異抗体検出におけるpLELIAの有用性が再確認された。
【００６８】
(c)自己抗体（重症筋無力症）
AChRα組換えsGVと重症筋無力症患者血清中の自己抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去しPBSで洗浄し、作製したAChRα組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいはsGVのみ（コントロール）をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した患者血清及び健常人血清を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Human IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  まず、患者血清の希釈率を1:80、1:40、1:20、1:10、1:5とした時のAChRα組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.042、0.063、0.101、0.131、0.133となり、血清濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２５）。
次に、二次抗体の抗IgG抗体の希釈率を1:3000、1:2000、1:1000とした時のAChRα組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.031、0.106、0.255となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２６）。
さらに、患者血清及び健常人血清を用いて、AChRα組換えsGVと血清中の自己抗体との反応性におけるpLELIAの有効性を検討したところ、AChRα組換えsGVと健常人血清との反応性と野生型ウイルス融合sGVと健常人血清との反応性の差ΔAは、−0.090（サンプル番号6）、−0.013（サンプル番号7）、−0.051（サンプル番号8）、−0.004（サンプル番号9）、0.006（サンプル番号10）となり、ほとんど反応性に差はなかった。一方、AChRα組換えsGVと患者血清との反応性と野生型ウイルス融合sGV と患者血清との反応性の差ΔAは、0.119（サンプル番号1）、0.255（サンプル番号2）、0.130（サンプル番号3）、0.141（サンプル番号4）、0.082(サンプル番号5)となり、いずれも明らかな有意差が示され、AChRα組換えsGVと患者血清が特異的に反応することが判った（図２７）。
以上の結果より、AChRα組換えsGVを用いたpLELIAにより、重症筋無力症患者血清中の自己抗体を特異的に検出できることが判り、自己免疫疾患診断におけるpLELIAの有用性が再確認された。
【００６９】
(3) AQP4
(a)自己抗体（多発性硬化症）
AQP4組換えsGVと多発性硬化症患者血清中の自己抗体との特異的反応におけるpLELIAの有用性を検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去しPBSで洗浄し、作製したAQP4組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいはsGVのみ（コントロール）をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した患者血清及び健常人血清を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Human IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2]を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  まず、患者血清の希釈率を1:200、1:40、1:10とした時のAQP4組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.110、0.270、0.418となり、血清濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２８）。
次に、二次抗体の抗IgG抗体の希釈率を1:3000、1:2000、1:1000とした時のAQP4組換えsGVの場合の反応性と野生型ウイルス融合sGVの場合の反応性の差ΔAは、それぞれ0.092、0.192、0.381となり、抗IgG抗体濃度依存的にΔAが増加することが示された（図２９）。
さらに、図１３に示した実験で使用した同一の患者血清及び健常人血清を用いて、AQP4組換えsGVと血清中の自己抗体との反応性におけるpLELIAの有効性を検討したところ、AQP4組換えsGVと健常人血清との反応性と野生型ウイルス融合sGVと健常人血清との反応性の差ΔAは、−0.006（サンプル番号5）、−0.011（サンプル番号6）、−0.051（サンプル番号7）、0.029（サンプル番号8）となり、ほとんど反応性に差はなかった。一方、AQP4組換えsGVと患者血清との反応性と野生型ウイルス融合sGV と患者血清との反応性の差ΔAは、0.253（サンプル番号1）、0.119（サンプル番号2）、0.313（サンプル番号3）、0.294（サンプル番号4）となり、いずれも明らかな有意差が示され、AQP4組換えsGVと患者血清が特異的に反応することがわかった（図３０）。
以上の結果より、AQP4組換えsGVを用いたpLELIAにより、多発性硬化症患者血清中の自己抗体を特異的に、AQP4組換えMLVを用いたpLELIAよりも高い感度で検出できることが判り、自己免疫疾患診断におけるpLELIAの有用性が再確認された。
【００７０】
さらに、AChRα組換えsGVと重症筋無力症患者血清中のタンパク質との非特異的反応におけるフリーリポソームの添加効果について検討した。
＜方法＞  まず、サンプルチューブをPBS（pH7.2）で洗浄し、3% Block Aceを0.5ml添加し37℃で1時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後ブロッキング溶液を除去しPBSで洗浄し、作製したAChRα組換えsGVサンプル、野生型ウイルス融合sGV（コントロール）あるいはsGVのみ（コントロール）をそれぞれ100μl添加し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去してPBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルチューブを洗浄した。次に、上清を除去してPBSで任意に希釈した患者血清及び健常人血清を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSあるいはDOPC/DOPS(1:1)-SUV含有PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。さらに、上清を除去してPBSで任意に希釈したAnti-Human IgG-HRP抗体溶液を50μl添加して懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。反応後PBSを0.5ml添加して遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、上清を除去した後、PBSあるいはDOPC/DOPS(1:1)-SUV含有PBSを0.5ml添加して沈殿を懸濁し、再び遠心（19,500×g、20min、4℃）を行ってサンプルを洗浄した。同様の洗浄操作を4回行った後、PBS 0.5mlで沈殿を懸濁し、3% Block Aceで37℃、1時間ブロッキングしておいた別の新しいチューブにサンプルを移し、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行った。遠心後上清を除去し、基質溶液 [0.1M sodium citrate buffer（pH5.2）＋o -phenylenediamine（1mg/ml）＋0.02% H2O2] を100μl加え37℃で10分間インキュベートして発色させ、2N H2SO4を50μl加えて反応を止めた後、遠心（19,500×g、20min、4℃）を行い、マイクロプレートリーダーを用いて上清の492nmにおける吸光度（A492）を測定した。
＜結果＞  まず、健常人血清を用いて、AChRα組換えsGVと血清中のタンパク質との非特異的反応におけるフリーリポソームの添加効果を検討したところ、AChRα組換えsGVと健常人血清との反応性と野生型ウイルス融合sGVと健常人血清との反応性の差ΔAは、サンプル番号７の場合、0.001（無添加）、0.006（100μMフリーリポソーム添加）、0.015（1mMフリーリポソーム添加）、サンプル番号９の場合、−0.023（無添加）、−0.007（100μMフリーリポソーム添加）、0002（1mMフリーリポソーム添加）となり、ほとんど反応性に差はなかった。一方、野生型ウイルス融合sGVと健常人血清との反応性は、サンプル番号７の場合、0.678（無添加）、0.598（100μMフリーリポソーム添加）、0.410（1mMフリーリポソーム添加）、サンプル番号９の場合、0.764（無添加）、0.576（100μMフリーリポソーム添加）、0.435（1mMフリーリポソーム添加）となり、非特異的反応性は低下した（図３１左及び右）。
次に、患者血清を用いて、AChRα組換えsGVと血清中のタンパク質との非特異的反応におけるフリーリポソームの添加効果を検討したところ、AChRα組換えsGVと患者血清との反応性と野生型ウイルス融合sGVと患者血清との反応性の差ΔAは、サンプル番号３の場合、0.097（無添加）、0.224（100μMフリーリポソーム添加）、0.276（1mMフリーリポソーム添加）、サンプル番号４の場合、0.167（無添加）、0.204（100μMフリーリポソーム添加）、0.186（1mMフリーリポソーム添加）となり、特異的反応性は増加傾向にあった。一方、野生型ウイルス融合sGVと患者血清との反応性は、サンプル番号３の場合、0.432（無添加）、0.367（100μMフリーリポソーム添加）、0.186（1mMフリーリポソーム添加）、サンプル番号４の場合、0.252（無添加）、0.225（100μMフリーリポソーム添加）、0.134（1mMフリーリポソーム添加）となり、非特異的反応性は同様に低下した（図３２左及び右）。
以上の結果より、AChRα組換えsGVを用いたpLELIA系へのフリーリポソームの添加により、重症筋無力症患者血清中のタンパク質の非特異的結合を抑制できることが判り、自己免疫疾患診断におけるフリーリポソーム添加の有用性が確認された。
このように本実施形態によれば、膜表面に膜タンパク質を発現させた組換えプロテオリポソームを用いて、非特異的反応を軽減させることによってベースラインを十分に減少させることによって、従来には検出が不可能であった微量物質を特異的に測定する技術であるpLELIA(Proteoliposome-based Enzyme-Linked ImmunoAssay）を提供できた。pLELIAによれば、膜タンパク質に結合する物質（ホルモン、アゴニスト、アンタゴニストなどを含む）や、膜タンパク質を認識して結合する抗体（特に、病的な状態によって認められる自己抗体）を検出できた。
【符号の説明】
【００７１】
１…容器
２…組換えプロテオリポソーム
３…膜タンパク質
４…膜タンパク質結合物質
５…膜タンパク質結合物質に反応する抗体（一次抗体）
６…酵素標識二次抗体
５１…膜タンパク質認識抗体
【図３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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