(57)【要約】  組織切片の画像全体の中から効率よく特定タンパクが過剰発現している癌領域を把握することを可能とする。  画像処理装置２Ａによれば、制御部２１は、組織切片のスライドを撮影した明視野画像から細胞核の領域を抽出し、抽出された各細胞核の領域の重心から細胞膜周囲の特定タンパク発現領域を包含する所定の半径の円領域を細胞領域として推定する。また、制御部２１は、同一視野で撮影した蛍光画像から蛍光輝点を抽出する。そして、推定された各細胞領域に含まれる細胞核及び蛍光輝点に基づいて、各細胞領域に関する特徴量を算出し、算出された特徴量に基づいて前記推定された各細胞領域が癌であるか否か及び癌であると判定された領域における特定タンパクの発現状況を判定し、判定結果を出力する。
2013146843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段と、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段と、
前記蛍光画像から蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段と、
前記細胞核抽出手段により抽出された各細胞核の領域の重心から細胞膜周囲の前記特定タンパクの発現領域を包含する所定の領域を定め、前記定められた領域が他の前記定められた領域と重ならない場合には、その定められた領域を一つの細胞を含む細胞領域として推定し、前記定められた複数の領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の領域の外周に囲まれた領域を複数の細胞を含む細胞領域として推定する領域推定手段と、
前記領域推定手段により推定された各細胞領域に含まれる細胞核及び蛍光輝点に基づいて、前記各細胞領域に関する特徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記算出された特徴量に基づいて前記領域推定手段により推定された各細胞領域が癌であるか否か及び癌であると判定された領域における前記特定タンパクの発現状況を判定する判定手段と、
前記判定手段による判定結果を出力する出力手段と、
を備える医用画像処理装置。
【請求項２】
前記領域推定手段によって定められる領域は、前記細胞核抽出手段により抽出された各細胞核の領域の重心を中心とし細胞膜周囲の前記特定タンパクの発現領域を包含する所定の半径の円領域である請求項１に記載の医用画像処理装置。
【請求項３】
前記特徴量算出手段は、前記領域推定手段により推定された各細胞領域に含まれる細胞核に基づいて、前記各細胞領域において細胞核１個当たりが占める面積、及び／又は前記各細胞領域における細胞核の偏在性を示す指標値を算出し、前記各細胞領域に含まれる蛍光輝点に基づいて、前記各細胞領域における蛍光輝点の密度を算出し、
前記判定手段は、前記各細胞領域において細胞核１個当たりが占める面積、及び／又は前記各細胞領域における細胞核の偏在性を示す指標値に基づいて、前記各細胞領域が癌であるか否かを判定し、前記癌であると判定された細胞領域における蛍光輝点の密度に基づいて、当該領域の前記特定タンパクの発現状況を判定する請求項１又は２に記載の医用画像処理装置。
【請求項４】
前記判定手段は、前記癌と判定された細胞領域について算出された蛍光輝点の特徴量が予め定められた複数の閾値を超えるか否かに基づいて、前記癌と判定された細胞領域における前記特定タンパクの発現状況を複数の段階に分類し、
前記出力手段は、前記細胞形態画像上の前記癌と判定された細胞領域を前記特定タンパクの発現状況の分類結果に応じた態様で区分けした画像を前記判定結果として出力する請求項１〜３の何れか一項に記載の医用画像処理装置。
【請求項５】
コンピュータを、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段、
前記蛍光画像から蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段、
前記細胞核抽出手段により抽出された各細胞核の領域の重心から細胞膜周囲の前記特定タンパクの発現領域を包含する所定の領域を定め、前記定められた領域が他の前記定められた領域と重ならない場合には、その定められた領域を一つの細胞を含む細胞領域として推定し、前記定められた複数の領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の領域の外周に囲まれた領域を複数の細胞を含む細胞領域として推定する領域推定手段、  前記領域推定手段により推定された各細胞領域に含まれる細胞核及び蛍光輝点に基づいて、前記各細胞領域に関する特徴量を算出する特徴量算出手段、
前記算出された特徴量に基づいて前記領域推定手段により推定された各細胞領域が癌であるか否か及び癌であると判定された領域における前記特定タンパクの発現状況を判定する判定手段、
前記判定手段による判定結果を出力する出力手段、
として機能させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医用画像処理装置及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
病理診断では、まず採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンによるブロック化といった処理を行った後、２〜８μｍの厚さの薄片に切り、パラフィンを取り除き、染色して顕微鏡観察を行う。病理医は、この顕微鏡像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化等の形態学的な情報、染色情報をもとに診断を行っている。病理診断に用いられる組織染色方法としては、従来の色素染色法（例えばヘマトキシリン−エオジン染色；以下、ＨＥ染色）、酵素を用いた色素染色法（例えばＤＡＢ（ジアミノベンジン）染色）が知られている。【０００３】
病理診断において、組織切片で過剰発現をしているタンパク質及びその発現量を特定することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。【０００４】
例えば、ＨＥＲ２遺伝子のコードするＨＥＲ２タンパクは、細胞膜を貫通する受容体型糖タンパクであり、細胞外、膜貫通、細胞内の３ドメインから構成され、増殖因子が結合すると、チロシン残基のリン酸化により活性化され、シグナル伝達経路を介して細胞の増殖や悪性化に関与するとされている。乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、膀胱癌等においてＨＥＲ２タンパクの過剰発現がみられる。【０００５】
また、ＨＥＲ２タンパクは乳癌の予後因子であるとされており、特にリンパ節転移陽性例では、ＨＥＲ２陽性例の予後が有意に不良であることが知られている。また、ＨＥＲ２タンパクは、分子標的薬（トラスツズマブ）の適応を決める重要な因子として、また、アンスラサイクリン系、タキサン系等の抗癌剤の効果予測因子として注目されている。【０００６】
一般的に、ＨＥＲ２タンパクの過剰発現は免疫組織化学的方法（ＩＨＣ法）で検査され、ＨＥＲ２遺伝子の過剰発現はＦＩＳＨ法で検査されている。ＨＥＲ検査のガイドラインによると、まず簡便なＩＨＣ法で陽性、陰性、境界領域を選別し、陽性の場合にはトラスツズマブの投与を決定する。ＩＨＣ法で境界領域のものについては、さらにＦＩＳＨ法で陽性、陰性を選別する。
ＩＨＣ法とＦＩＳＨ法を比べると、ＩＨＣ法は簡便だが、精度が低いという問題があった。一方、ＦＩＳＨ法は精度が高いが、作業が煩雑でありコストが高い。つまり、ＩＨＣ法でＦＩＳＨ法と同様の精度を出せる手法の開発が望まれている。また、属人性が低く、自動化可能な手法の開発が望まれている。【０００７】
例えば、特許文献１には、ＤＡＢ法により染色された生体組織の画像から細胞核を抽出し、その細胞核に基づいて生体組織の画像から細胞膜を特定し、細胞膜の染色状態を判別し、この判別結果に基づいてＨＥＲ２タンパクの発現を評価するシステムが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１１５５９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ＤＡＢ法は酵素による増幅があり定量性に欠けるため、特許文献１に記載の技術では、精度よくＨＥＲ２タンパクの発現量を把握することはできない。また、特許文献１においては、画像全体の中からユーザから腫瘍領域として指定された領域についてタンパクの発現の評価を行っており、ユーザによる腫瘍領域の見落としを防止することはできない。【００１０】
本発明の課題は、組織切片の画像全体の中から効率よく特定タンパクが過剰発現している癌領域を把握できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明の第１の側面によると、医用画像処理装置は、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段と、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段と、
前記蛍光画像から蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段と、
前記細胞核抽出手段により抽出された各細胞核の領域の重心から細胞膜周囲の前記特定タンパクの発現領域を包含する所定の領域を定め、前記定められた領域が他の前記定められた領域と重ならない場合には、その定められた領域を一つの細胞を含む細胞領域として推定し、前記定められた複数の領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の領域の外周に囲まれた領域を複数の細胞を含む細胞領域として推定する領域推定手段と、
前記領域推定手段により推定された各細胞領域に含まれる細胞核及び蛍光輝点に基づいて、前記各細胞領域に関する特徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記算出された特徴量に基づいて前記領域推定手段により推定された各細胞領域が癌であるか否か及び癌であると判定された領域における前記特定タンパクの発現状況を判定する判定手段と、
前記判定手段による判定結果を出力する出力手段と、
を備える。【００１２】
上記の医用画像処理装置において、
前記領域推定手段によって定められる領域は、前記細胞核抽出手段により抽出された各細胞核の領域の重心を中心とし細胞膜周囲の前記特定タンパクの発現領域を包含する所定の半径の円領域であることが好ましい。【００１３】
上記の医用画像処理装置において、
前記特徴量算出手段は、前記領域推定手段により推定された各細胞領域に含まれる細胞核に基づいて、前記各細胞領域において細胞核１個当たりが占める面積、及び／又は前記各細胞領域における細胞核の偏在性を示す指標値を算出し、前記各細胞領域に含まれる蛍光輝点に基づいて、前記各細胞領域における蛍光輝点の密度を算出し、
前記判定手段は、前記各細胞領域において細胞核１個当たりが占める面積、及び／又は前記各細胞領域における細胞核の偏在性を示す指標値に基づいて、前記各細胞領域が癌であるか否かを判定し、前記癌であると判定された細胞領域における蛍光輝点の密度に基づいて、当該領域の前記特定タンパクの発現状況を判定することが好ましい。【００１４】
上記の医用画像処理装置において、
前記判定手段は、前記癌と判定された細胞領域について算出された蛍光輝点の特徴量が予め定められた複数の閾値を超えるか否かに基づいて、前記癌と判定された細胞領域における前記特定タンパクの発現状況を複数の段階に分類し、
前記出力手段は、前記細胞形態画像上の前記癌と判定された細胞領域を前記特定タンパクの発現状況の分類結果に応じた態様で区分けした画像を前記判定結果として出力することが好ましい。【００１５】
本発明の第２の側面によると、プログラムは、
コンピュータを、
組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像と、前記組織切片の同一範囲における特定タンパクの発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段、
前記細胞形態画像から細胞核の領域を抽出する細胞核抽出手段、
前記蛍光画像から蛍光輝点を抽出する蛍光輝点抽出手段、
前記細胞核抽出手段により抽出された各細胞核の領域の重心から細胞膜周囲の前記特定タンパクの発現領域を包含する所定の領域を定め、前記定められた領域が他の前記定められた領域と重ならない場合には、その定められた領域を一つの細胞を含む細胞領域として推定し、前記定められた複数の領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の領域の外周に囲まれた領域を複数の細胞を含む細胞領域として推定する領域推定手段、
前記領域推定手段により推定された各細胞領域に含まれる細胞核及び蛍光輝点に基づいて、前記各細胞領域に関する特徴量を算出する特徴量算出手段、
前記算出された特徴量に基づいて前記領域推定手段により推定された各細胞領域が癌であるか否か及び癌であると判定された領域における前記特定タンパクの発現状況を判定する判定手段、
前記判定手段による判定結果を出力する出力手段、
として機能させる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、組織切片の画像全体の中から効率よく特定タンパクが過剰発現している癌領域を把握することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。
【図２】図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。
【図３】明視野画像の一例を示す図である。
【図４】蛍光画像の一例を示す図である。
【図５】標識材料Ａを用いた場合の輝点数とＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【図６】標識材料Ｂを用いた場合の輝点数とＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【図７】標識材料Ｃを用いた場合の輝点数とＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【図８】標識材料Ｄを用いた場合の輝点数とＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【図９】各標識材料Ａ〜Ｄについて、各視野の顕微鏡画像から計測された輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値を示す図である。
【図１０】図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。
【図１１】図１０のステップＳ２の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図１２】閾値処理後の二値画像の一例を示す図である。
【図１３】ノイズ処理後の二値画像の一例を示す図である。
【図１４】図１０のステップＳ３の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図１５】図１４のステップＳ３０１において設定されるＲＯＩの一例を示す図である。
【図１６】図１４のステップＳ３０２における処理の詳細フローを示すフローチャートである。
【図１７Ａ】閾値処理前の明視野画像を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａの明視野画像に閾値処理を施した画像を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｂで抽出された細胞核候補から円形度Ｃ＞Ｔｈｃの細胞核を抽出した結果を示す図である。
【図１８】倍率テーブルの一例を示す図である。
【図１９】図１４のステップＳ３０５における処理の詳細フローを示すフローチャートである。
【図２０Ａ】一つの細胞を含む細胞領域を説明するための図である。
【図２０Ｂ】複数の細胞を含む細胞領域を説明するための図である。
【図２１】図１０のステップＳ５の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図２２】蛍光輝点候補画像の一例を示す図である。
【図２３】図１６に示す蛍光輝点候補画像におけるノイズ除去後に得られる蛍光輝点画像の一例を示す図である。
【図２４】Ｍｉｎ（Ｄ（Ｎｉ））を説明するための図である。
【図２５】図１０のステップＳ８の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図２６】解析結果画面の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００１９】
＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、本実施の形態における病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された人体の組織切片の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
【００２０】
図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
【００２１】
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データ（Ｒ、Ｇ、Ｂの画像データ）を生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置１Ａは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
【００２２】
なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２−５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
【００２３】
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現量を定量的に示す特徴量を算出し、算出された特徴量を出力する医用画像処理装置である。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
【００２４】
制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理（図１０参照）を実行し、細胞核抽出手段、蛍光輝点抽出手段、領域推定手段、特徴量算出手段、判定手段としての機能を実現する。
【００２５】
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
【００２６】
表示部２３は、例えば、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施の形態において、表示部２３は、算出された特徴量を出力するための出力手段として機能する。
【００２７】
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、明視野画像と蛍光画像の入力手段として機能する。本実施の形態において、通信Ｉ／Ｆ２４は、入力手段として機能する。
【００２８】
記憶部２５は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。例えば、記憶部２５は、後述する画像解析処理で使用される倍率テーブル２５１をはじめとする各種データを記憶している。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
【００２９】
本実施の形態における画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像（ＨＥ染色画像）及び蛍光画像を用いて解析を行う。
明視野画像は、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色された組織切片を顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織等）を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織等）を染色する。図３に、ＨＥ染色を行った組織切片を撮影した明視野画像の一例を示す。図３に示すように、ＨＥ染色を行った組織切片を撮影した明視野画像においては、組織切片における細胞の形態が表れている。細胞核は、周囲の細胞質よりも濃い色（青紫色）で周囲と区別して表れており、明視野画像では、細胞核の形態をはっきり捉えることができる。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子と呼ぶ）を含む染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質内包ナノ粒子を発光（蛍光）させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織切片における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図４に、蛍光画像の一例を示す。
【００３０】
＜蛍光画像の取得＞
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬（蛍光物質内包ナノ粒子）、染色試薬による組織切片の染色方法等も含めて詳細に説明する。
【００３１】
〔蛍光物質〕
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
【００３２】
蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００３３】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
【００３４】
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
【００３５】
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００３７】
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。
【００３８】
本実施の形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア  ８巻  ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
【００３９】
量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー  ３３巻  ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
【００４０】
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
【００４１】
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
【００４２】
本実施の形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％以下のものを用いることが好ましい。平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００４３】
〔生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合〕
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
【００４４】
生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
【００４５】
また、生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。
【００４６】
蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ  ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
【００４７】
蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００４８】
必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。
【００４９】
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基もつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
【００５０】
特定抗原を認識する抗体としては、M.アクチン,M.S.アクチン,S.M.アクチン,ACTH,Alk-1,α1-アンチキモトリプシン,α1-アンチトリプシン,AFP,bcl-2,bcl-6,β-カテニン,BCA 225,CA19-9,CA125,カルシトニン,カルレチニン,CD1a,CD3,CD4,CD5,CD8,CD10,CD15,CD20,CD21,CD23,CD30,CD31,CD34,CD43,CD45,CD45R,CD56,CD57,CD61,CD68,CD79a,"CD99, MIC2",CD138,クロモグラニン,c-KIT,c-MET,コラーゲン タイプIV,Cox-2,サイクリンD1,ケラチン,サイトケラチン（高分子量）,パンケラチン,パンケラチン,サイトケラチン 5/6,サイトケラチン 7,サイトケラチン 8,サイトケラチン8/18,サイトケラチン 14,サイトケラチン 19,サイトケラチン 20,CMV,E-カドヘリン,EGFR,ER,EMA,EBV,第VIII因子関連抗原,ファッシン,FSH,ガレクチン-3,ガストリン,GFAP,グルカゴン,グリコフォリン A,グランザイムB,hCG,hGH,ヘリコバクターピロリ,HBc 抗原,HBs 抗原,ヘパトサイト特異抗原,HER2,HSV -I,HSV -II,HHV-8,IgA,IgG,IgM,IGF-1R,インヒビン,インスリン,カッパ L鎖,Ki67,ラムダ L鎖,LH,リゾチーム,マクロファージ,メランA,MLH-1,MSH-2,ミエロパーオキシダーゼ,ミオゲニン,ミオグロビン,ミオシン,ニューロフィラメント,NSE,p27 (Kip1),p53,p53,P63,PAX 5,PLAP,ニューモシスティス  カリニ,ポドプラニン（D2-40）,PGR,プロラクチン,PSA,前立腺酸性フォスファターゼ,Renal Cell Carcinoma,S100,ソマトスタチン,スペクトリン,シナプトフィジン,TAG-72,TdT,サイログロブリン,TSH,TTF-1,TRAcP,トリプターゼ,ビリン,ビメンチン,WT1,Zap-70が挙げられる。
【００５１】
〔染色方法〕
以下、組織切片の染色方法について述べる。以下に説明する染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
【００５２】
１）脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００５３】
２）賦活化処理
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０−１３０℃、時間は５−３０分で行うことができる。
次いで、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００５４】
３）生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いた染色
生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子のＰＢＳ分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質内包ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次病理切片に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、ＨＥ染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にＨＥ染色を行う。
【００５５】
〔蛍光画像の取得〕
染色した病理切片に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、広視野の顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
蛍光画像の視野は、３ｍｍ2以上であることが好ましく、３０ｍｍ2以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ2以上であることがさらに好ましい。
【００５６】
＜蛍光輝点とＦＩＳＨスコアとの関係＞
ここで、本件出願人は、以下に説明するように、一実施例として、Ｃｙ５内包シリカナノ粒子（以下、ナノ粒子１という。）を作製し、ナノ粒子１に対して抗ＨＥＲ２抗体を結合させた標識材料Ａを作製した。また、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子（以下、ナノ粒子２という）を作製し、ナノ粒子２に対して抗ＨＥＲ２抗体を結合させた標識材料Ｂを作製した。そして、作製した標識材料Ａ、Ｂ及び比較例としての標識材料Ｃ、Ｄを用いて予めＦＩＳＨスコアを測定したヒト乳房組織の隣接切片を用いて免疫染色を行って視野を変えて複数の蛍光画像を取得し、各蛍光画像に現れている蛍光輝点の数を計測してＦＩＳＨスコアとの関連を調べる実験を行った。
【００５７】
〔蛍光物質内包ナノ粒子の合成〕
（合成例１：蛍光有機色素内包シリカ：Ｃｙ５内包シリカナノ粒子の合成）
下記工程（１）〜（５）の方法により、Ｃｙ５内包シリカナノ粒子（ナノ粒子１）を作製した。
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）とテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
工程（２）：エタノール４０ｍＬと１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（４）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（５）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたナノ粒子１を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立（登録商標）社製Ｓ−８００型）で観察したところ、平均粒径は１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
【００５８】
（合成例２：量子ドット内包シリカ：発光波長６５５ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子の合成）
下記工程（１）〜（５）の方法により、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子（以下、ナノ粒子２という。）を作製した。
工程（１）：ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ６５５）１０μＬとテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
工程（２）：エタノール４ｍＬと１４％アンモニア水１ｍＬを混合した。
工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下で撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
工程（４）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（５）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたナノ粒子２を走査型電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径は１３０ｎｍ、変動係数は１３％であった。
【００５９】
〔蛍光物質内包シリカナノ粒子への抗体の結合〕
下記工程（１）〜（１２）の方法により、蛍光物質内包シリカナノ粒子に対して抗体を結合させた。ここでは、ナノ粒子１を用いた例を示すが、ナノ粒子２についても同様である。
工程（１）：１ｍｇのナノ粒子１を純水５ｍＬに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
工程（２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
【００６０】
工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整した。
工程（５）：工程（４）で調整した溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。
工程（６）：反応混合液を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させた。
【００６１】
工程（８）：抗ＨＥＲ２抗体１００μｇを１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。
【００６２】
工程（１０）：ナノ粒子１を出発原料として工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
工程（１１）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
工程（１２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、抗ＨＥＲ２抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
【００６３】
ナノ粒子１を出発原料として得られた抗ＨＥＲ２抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を標識材料Ａ、ナノ粒子２を出発原料として得られた抗ＨＥＲ２抗体が結合された蛍光物質内包シリカナノ粒子を標識材料Ｂとする。
【００６４】
また、比較例として、Ｃｙ５に抗ＨＥＲ２抗体を結合させ、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液（標識材料Ｄ）を得た。同様に、ＣｄＳｅに抗ＨＥＲ２抗体を結合させたものを標識材料Ｃとして作製した。
【００６５】
〔蛍光物質内包ナノ粒子を用いた組織染色〕
下記工程（１）〜（１０）の方法により、作製した抗体結合標識材料Ａ〜Ｄを用い、予めＦＩＳＨスコアを測定したヒト乳房組織の隣接切片を用いて免疫染色を行った。染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。ＦＩＳＨスコアで１〜９の２４切片を用いた。
【００６６】
工程（１）：キシレンを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に病理切片を３０分浸漬させた。
工程（５）：１２１度で１０分オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を３０分浸漬させた。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体が結合された標識材料Ａ〜Ｄを、各組織切片に載せて３時間放置した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ３０分浸漬させた。
工程（１０）：Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
【００６７】
〔実験結果〕    
各標識材料Ａ〜Ｄを用いて染色した組織切片について、視野（観察面積）を変えて複数の蛍光画像を取得し、画像解析ソフトにより、各蛍光画像から蛍光輝点の数（輝点数）を計測した。
なお、顕微鏡は、カールツアイス社製正立顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２を用い、対物レンズを２０倍に設定し、６３０〜６７０ｎｍの波長を有する励起光を照射して、組織切片から発せられる蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ（モノクロ）により蛍光画像（画像データ）を取得し、画像解析ソフトにより輝点数を計測した。なお、上記カメラは画素サイズ６．４μｍ×６．４μｍ、縦画素数１０４０個、横画素数１３８８個（撮像領域８．９ｍｍ×６．７ｍｍ）を有している。
また、各標識材料Ａ〜Ｄについて、各視野において、計測された輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数Ｒを算出した。ＦＩＳＨスコアは、ＨＥＲ２遺伝子の過剰発現レベルと対応しており、ＦＩＳＨスコアの値が大きいほど、ＨＥＲ２遺伝子の過剰発現レベルが高いことを示している。
【００６８】
図５は、標識材料Ａ（Ｃｙ５内包標識材料）を用いた場合の、複数の異なる視野（０．３ｍｍ2、３ｍｍ2、３２ｍｍ2、３２４ｍｍ2）の蛍光画像から計測された輝点数と、ＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。図中に示すＲ2の値は、輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値である。
【００６９】
図６は、標識材料Ｂ（ＣｄＳｅ内包標識材料）を用いた場合の、複数の異なる視野（０．３ｍｍ2、３ｍｍ2、３２ｍｍ2、３２４ｍｍ2）の蛍光画像から計測された輝点数と、ＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【００７０】
図７は、標識材料Ｃ（ＣｄＳｅ）を用いた場合の、複数の異なる視野（０．３ｍｍ2、３ｍｍ2、３２ｍｍ2、３２４ｍｍ2）の蛍光画像から計測された輝点数と、ＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【００７１】
図８は、標識材料Ｄ（Ｃｙ５）を用いた場合の、複数の異なる視野（０．３ｍｍ2、３ｍｍ2、３２ｍｍ2、３２４ｍｍ2）の蛍光画像から計測された輝点数と、ＦＩＳＨスコアとの関係を示す図である。
【００７２】
表１及び図９に、各標識材料Ａ〜Ｄについて、各視野（観察面積）の蛍光画像から計測された輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値（Ｒ2）を示す。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
標識材料Ａを用いて組織切片を染色し、０．３ｍｍ2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値（Ｒ2）は０．１２４１であり、輝点数とＦＩＳＨスコアには、相関が見られなかった。０．３ｍｍ2の視野では、視野が狭すぎ、ばらつきが大きいためであると考えられる。
【００７５】
標識材料Ａを用いて組織切片を染色し、３ｍｍ2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値（Ｒ2）は０．５３８７であった。この値は、相関係数Ｒに換算すると約０．７３４となり、輝点数とＦＩＳＨスコアには、強い相関があるといえる。
【００７６】
標識材料Ａを用いて組織切片を染色し、３２ｍｍ2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値（Ｒ2）は０．９０１１であった。視野が３２ｍｍ2の場合には、視野が３ｍｍ2の場合と比較して、さらに相関が強いといえる。
【００７７】
標識材料Ａを用いて組織切片を染色し、３２４ｍｍ2の視野の蛍光画像から輝点数を計測した場合には、輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値（Ｒ2）は０．９８８７であった。視野が３２４ｍｍ2の場合には、視野が３２ｍｍ2の場合と比較して、さらに相関が強いといえる。
【００７８】
標識材料Ｂを用いた場合も同様に、３ｍｍ2以上の視野では、輝点数とＦＩＳＨスコアには相関があり、視野が広いほど相関係数が大きくなることがわかった。
【００７９】
また、標識材料Ａ，Ｂを用いた場合の結果から、３２４ｍｍ2の視野では輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関係数の２乗値（Ｒ2）が十分１に近いことがわかった。
【００８０】
一方、標識材料Ｃ又は標識材料Ｄを用いて組織切片を染色した場合には、輝点数とＦＩＳＨスコアには、相関が見られなかった。
【００８１】
また、観察対象となる組織切片の厚さ（通常は数μｍ）の上方、或いは下方部に顕微鏡のピントを若干ずらした場合であっても、上記の状況に大きな差異は見られなかった。
【００８２】
以上の結果から、標識材料Ａ，Ｂを用いて広視野で組織切片を観察した場合に、輝点数とＦＩＳＨスコアとの相関が良好であり、輝点数に基づいてＨＥＲ２の発現レベルを評価することが可能であることがわかった。すなわち、ＦＩＳＨ法のような手間のかかる方法を用いなくても、特定の生体物質を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子の染色試薬で組織切片を染色し、これを顕微鏡で拡大結像して撮影することにより得られた３ｍｍ2以上の視野の画像から輝点数を計測することにより、特定の生体物質の発現レベルを評価することができ、ＦＩＳＨ法に代わる方法として有効である。    
【００８３】
標識材料Ａ，Ｂは、蛍光物質を内包した粒子を用いており、蛍光物質単体を用いた標識材料Ｃ，Ｄと比較して高輝度であるため、画像から輝点の１点１点を捉えやすく、輝点数を精度良く計測することができる。
【００８４】
＜病理診断支援システム１００の動作＞
以下、病理診断支援システム１００において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質（ここでは、乳癌組織におけるＨＥＲ２タンパクとする。以下、特定タンパクと呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織切片を観察対象とする場合例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
【００８５】
まず、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、（ａ１）〜（ａ５）の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
（ａ１）操作者は、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬、及びＨＥ試薬により染色された組織切片を載置したスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに載置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
このように、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいては、同一の組織切片のスライドから同一の撮影倍率で同一範囲（同一視野）の明視野画像及び蛍光画像を取得するので、明視野画像と蛍光画像の同一座標位置は組織切片の同一位置を示していることになり、両画像の位置合わせは不要である。
【００８６】
なお、本願発明者等の検討によれば、ＨＥ染色と蛍光物質内包ナノ粒子による染色を同時に行う場合、組織の自家蛍光とエオジンの発光（バックグラウンド）に対し、１０％（１．１倍）以上の発光量差を蛍光物質内包ナノ粒子の蛍光輝点が有していれば、８ビット（０〜２５５階調）、１２ビット（０〜４０９５階調）の何れの処理系においても、顕微鏡画像（蛍光画像）から蛍光輝点の自動検出処理が可能であった。蛍光物質内包ナノ粒子による染色のみの場合においては、組織の自家蛍光に対し、１０％（１．１倍）以上の発光量差を蛍光物質内包ナノ粒子が有していれば、８ビット（０〜２５５階調）、１２ビット（０〜４０９５階調）の何れの処理系においても蛍光輝点の自動検出処理が可能であった。そのため、蛍光ユニットにおける励起光波長としては５６０〜６３０ｎｍの範囲のものを選択し、前記蛍光物質としては当該励起光により５８０〜６９０ｎｍの範囲、より好ましくは６００〜６３０ｎｍの範囲にピークを有する蛍光を発するものを用いることが好ましい。この範囲にピークを有する蛍光物質であれば、上記範囲の励起光を選択したときに、エオジンの発光を含む組織の自家蛍光と蛍光物質内包ナノ粒子からの蛍光の発光差を確保して両者を区別して認識可能とする（両者の光量差１０％（１．１倍）以上）を確保できるからである。
なお、ＨＥ染色を同時に行わない場合においては、組織の自家蛍光が微弱なため励起光の波長の範囲は、一般的な２００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で特に限定せずとも自家蛍光と蛍光物質内包ナノ粒子からの蛍光の発光差を確保して両者を区別して認識可能とする（両者の光量差１０％（１．１倍）以上）を確保することができる。
【００８７】
画像処理装置２Ａにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図１０に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図１０に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００８８】
まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ１）、明視野画像から細胞核の領域の抽出が行われる（ステップＳ２）。
図１１に、ステップＳ２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００８９】
ステップＳ２においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる（ステプＳ２０１）。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が２値化される（ステップＳ２０２）。図１２に、閾値処理後の二値画像の一例を示す。
【００９０】
次いで、ノイズ処理が行われる（ステップＳ２０３）。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図１３に、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図１３に示すように、ノイズ処理後には、細胞核が抽出された画像（細胞核画像）が得られる。
【００９１】
次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞核のそれぞれにラベルLabel_nucleusが付与される（ステップＳ２０４）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。
なお、後述する蛍光輝点の抽出におけるラベルの番号と区別するため、コンピュータの保持できる最大値をＭＡＸとし、現在までに行ったラベリング回数をLabel_tempとすると、新たな細胞核にはラベルLabel_nucleusとして、ＭＡＸ−Label_tempが付与される。例えば、１０１個目の細胞核にラベルを付与する場合、Label_temp＝100であるので、ＭＡＸ＝65536とすると、Label_nucleusとして65436が付与される。ラベリング処理後、処理は図１０のステップＳ３に移行する。
【００９２】
図１０のステップＳ３においては、ステップＳ２で抽出された細胞核の領域に基づいて、明視野画像における細胞領域の推定が行われる（ステップＳ３）。ここでは、抽出された各細胞核の領域の重心を中心とした半径ｒの円領域を定め、定められた円領域が他の円領域と重ならない場合には、その定められた円領域を一つの細胞を含む細胞領域として推定し（図２０Ａ参照）、前記定められた複数の円領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の円領域の外周に囲まれた領域を複数の細胞を含む細胞領域として推定する（図２０Ｂ参照）。ここで、癌化した細胞の細胞膜の周囲には、特定タンパクの過剰発現が見られる。そこで、半径ｒは、細胞と、その細胞膜周囲に発現する特定タンパクが確実に包含されるサイズとする。
なお、本実施の形態においては、細胞領域を推定するために各細胞核の重心から定める領域を円領域として説明するが、この領域は各細胞核の重心から細胞膜周囲の特定タンパクの発現領域までが包含される領域であればよく、その形状は特に限定されない。
【００９３】
半径ｒは、入力される明視野画像の撮影倍率に応じて変化する。そこで、ステップＳ３においては、予め定められた基準となる細胞核サイズS_baseと、明視野画像から取得される正常の細胞核の平均細胞核サイズS_ave_inを比較することにより、入力された明視野画像の撮影倍率を決定し、決定した撮影倍率に基づいて半径ｒを決定する。ここで、癌化した細胞の細胞核は大きいため、撮影倍率を決定するための基準細胞核サイズ及び平均細胞核サイズには、癌化されていないと推定される正常な細胞核のサイズを用いる。
【００９４】
図１４に、ステップＳ３における処理の詳細フローを示す。ステップＳ３の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
まず、明視野画像に撮影倍率決定用のＲＯＩが設定される（ステップＳ３０１）。ここで、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて取得される明視野画像は、観察対象の組織切片が或る撮影倍率で拡大された画像である。ステップＳ３０１では、この撮影倍率を決定するためのＲＯＩが設定される。図１５に、ステップＳ３０１において設定されるＲＯＩの一例を示す。図１５に示すように、例えば、明視野画像の四隅のｓ画素×ｓ画素の矩形領域がＲＯＩ１〜ＲＯＩ４に設定される。明視野画像は、たいていの場合、医師が注目する切片上の領域を中央に合わせて撮影を行っていることから、画像の中央部は癌化している細胞の可能性が高い。そこで、画像中の四隅をＲＯＩとして設定する。
【００９５】
次いで、設定された各ＲＯＩ領域内の平均細胞核サイズS_ave_inが算出される（ステップＳ３０２）。
図１６に、ステップＳ３０２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ３０２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００９６】
まず、ＲＯＩ領域のみに、ＲＧＢなどの色情報をベースとした細胞核抽出用閾値を用いて閾値処理が行われ、各画素の値が２値化される（ステップＳ３０２１）。細胞核抽出用閾値は、予め定められている。図１７Ａに、元画像、図１７Ｂに、図１７Ａの元画像に閾値処理を施した画像を示す。ＨＥ染色を施した明視野画像においては、図１７Ａに示すように、細胞核は周囲より高い濃度で描画される。よって、図１７Ｂに示すように、閾値処理を施すことにより、細胞核候補を抽出することができる。
【００９７】
次いで、閾値処理後の画像にクロージング処理が施され、ノイズ等の小さい領域が除去される（ステップＳ３０２２）。
【００９８】
次いで、ＲＯＩ領域から抽出されたオブジェクト（細胞核候補）の円形度Ｃが算出される（ステップＳ３０２３）。円形度Ｃは、以下の式（１）により求めることができる。
Ｃ＝（４π×Ｓｋ）÷（Ｌ×Ｌ）  式（１）
ここで、Ｓｋはオブジェクトの面積、Ｌは周囲長である。
【００９９】
次いで、算出された円形度Ｃが予め定められた閾値Ｔｈｃと比較される。Ｃ＞Ｔｈｃではないと判断されると（ステップＳ３０２４；ＮＯ）、処理はステップＳ３０２６に移行する。Ｃ＞Ｔｈｃであると判断されると（ステップＳ３０２４；ＹＥＳ）、オブジェクトの面積Ｓｋが加算される（ΣＳｋ）とともに、カウンタｍが１インクリメントされ（ステップＳ３０２５）、処理はステップＳ３０２６に移行する。図１７Ｃに、図１７Ｂで抽出された細胞核候補から円形度Ｃ＞Ｔｈｃの細胞核を抽出した結果を示す。
【０１００】
ステップＳ３０２６においては、ＲＯＩ領域の全てのオブジェクトについて円形度Ｃの算出が終了したか否かが判断され、まだ円形度Ｃの算出が終了していないオブジェクトがあると判断されると（ステップＳ３０２６；ＮＯ）、処理はステップＳ３０２３に戻り、次のオブジェクトについてステップＳ３０２３〜ステップＳ３０２５の処理が実行される。ＲＯＩ領域内の全てのオブジェクトの円形度算出が終了したと判断されると（ステップＳ３０２６；ＹＥＳ）、ΣＳｋがｍで除算されることにより、平均細胞核サイズS_ave_inが算出され（ステップＳ３０２７）、処理は図１４のステップＳ３０３に移行する。
【０１０１】
図１４のステップＳ３０３においては、記憶部２５に記憶されている基準細胞核サイズS_baseが参照される（ステップＳ３０３）。そして、平均細胞核サイズS_ave_inが基準細胞核サイズS_baseで除算されることにより、推定拡大率Magが算出される（ステップＳ３０４）。
【０１０２】
推定拡大率Magが算出されると、記憶部２５に記憶されている倍率テーブル２５１と推定拡大率Magに基づいて、明視野画像の撮影倍率が決定される（ステップＳ３０５）。図１８に、倍率テーブル２５１の一例を示す。ステップＳ３０５においては、倍率テーブル２５１と推定拡大率Magに基づいて、顕微鏡観察で使用される、例えば６つの撮影倍率のうち、何れの撮影倍率で撮影がされたかが決定される。なお、倍率テーブル２５１の内容は、図１８に示すものに限定されるものではなく、顕微鏡画像取得装置１Ａで撮影可能な撮影倍率により異なる。
図１９に、ステップＳ３０５における処理の詳細フローを示す。ステップＳ３０５の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【０１０３】
まず、変数ｉに５が設定される（ステップＳ３０５１）。
次いでMag≧Table［i］であるか否かが判断される（ステップＳ３０５２）。Mag≧Table［i］であると判断されると（ステップＳ３０５２；ＹＥＳ）、撮影倍率はTable［i］に決定され（ステップＳ３０５３）、処理は図１４のステップＳ３０６に移行する。
Mag≧Table［i］ではないと判断されると（ステップＳ３０５２；ＮＯ）、変数ｉがデクリメントされ（ステップＳ３０５４）、次いでｉ≧０であるか否かが判断される（ステップＳ３０５５）。ｉ≧０であると判断されると（ステップＳ３０５５；ＹＥＳ）、処理はステップＳ３０５２に戻る。ｉ≧０ではないと判断されると（ステップＳ３０５５；ＮＯ）、撮影倍率は等倍に決定され（ステップＳ３０５６）、処理は図１４のステップＳ３０６に移行する。
【０１０４】
ステップＳ３０６においては、決定された撮影倍率と図１０のステップＳ２で抽出された細胞核の領域に基づいて細胞領域が推定される（ステップＳ３０６）。記憶部２５には、予め、倍率テーブル２５１に規定されている撮影倍率のそれぞれに対応する半径ｒが記憶されている。ステップＳ３０６においては、決定された撮影倍率に対応する半径ｒが取得され、各細胞核の重心を中心として半径ｒの円領域が定められる。細胞核の重心は、下記の［数１］により算出することができる。
【数１】
2013146843.tif 000004
そして、図２０Ａに示すように、定められた円領域が他の円領域と重ならない場合には、その定められた円領域が一つの細胞を含む細胞領域として推定される。図２０Ｂに示すように、定められた複数の円領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の円領域の外周に囲まれた領域が複数の細胞を含む細胞領域として推定される。
細胞領域が決定されると、処理は図１０のステップＳ６に移行する。
【０１０５】
一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ４）、蛍光画像から蛍光輝点が抽出される（ステップＳ５）。
図２１に、ステップＳ５における処理の詳細フローを示す。ステップＳ５の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【０１０６】
まず、蛍光画像からＲ成分の抽出が行われる（ステップＳ５０１）。
次いで、Ｒ成分が抽出された画像にＴｏｐｈａｔ変換が施される（ステップＳ５０２）。Ｔｏｐｈａｔ変換は、入力画像の各画素の値から、入力画像に最小値フィルター及び最大値フィルターをこの順でかけた画像の、対応する画素の値を減算する処理である。最小値フィルターは、注目画素の近傍の画素（例えば、３×３画素）のうちの最小値で注目画素の値を置き換えるものである。最大値フィルターは、注目画素の近傍の画素（例えば、３×３画素）のうちの最大値で注目画素の値を置き換えるものである。Ｔｏｐｈａｔ変換により、濃淡プロファイル上の小突起（近傍の画素に比べて輝度の高い領域）を抽出することができる。これにより、蛍光輝点候補画像を得ることができる。図２２に、蛍光輝点候補画像の一例を示す。
【０１０７】
次いで、蛍光輝点候補画像からノイズ除去が行われることにより、蛍光輝点が抽出された画像（蛍光輝点画像）が得られる（ステップＳ５０３）。図２３に、図２２に示す蛍光輝点候補画像におけるノイズ除去後に得られる蛍光輝点が抽出された画像を示す。
【０１０８】
そして、ノイズ除去後の画像にラベリング処理が施され、抽出された蛍光輝点のそれぞれにラベルLabel_pointが付与される（ステップＳ５０４）。Label_pointは、１から順に付与される。ラベリング処理の終了後、処理は図１０のステップＳ６に移行する。
【０１０９】
図１０のステップＳ６においては、細胞核画像の各画素と蛍光輝点画像の対応する画素の値が加算され（ステップＳ６）、この加算画像から、各細胞領域内の蛍光輝点・細胞核に関する特徴量が算出される（ステップＳ７）。
【０１１０】
ここで、癌が発現している領域では細胞が増殖するため、細胞領域が癌領域である場合、その領域内における細胞核の個数ｎは正常な場合に比べて多くなる。即ち、その領域における細胞核１個当たりの占める面積は小さくなる。そこで、ステップＳ７においては、特徴量の１つとして、細胞領域における細胞核の数を表す特徴量である、その領域における細胞核１個当たりの占める面積Ｓ／ｎが算出される。
例えば、細胞領域の面積がπr2である場合、細胞核が１つしか含まれていない細胞領域では、細胞核の数ｎは１であり、細胞領域の面積はπr2であるので、細胞核１個あたりが占める面積Ｓ／ｎは、πr2である。細胞核が２つ含まれている細胞領域では、細胞核の数ｎは２であり、細胞領域の面積はπr2であるので、細胞核１個あたりが占める面積Ｓ／ｎは、πr2/２である。Ｓ／ｎは小さくなるほど癌の可能性は高くなる。
【０１１１】
また、癌が発現している領域では細胞が増殖するため、細胞核が偏在し、細胞数が増えるとともに、細胞間の距離が近くなる。そこで、ステップＳ７においては、特徴量の１つとして、細胞領域の細胞核の個数が多く、細胞核間の距離が近いほど大きな値を示すように設計された指標値Ｆｎｕｍが算出される。
【０１１２】
Ｆｎｕｍの算出にあたっては、まず、各細胞領域内において、細胞核Ｎｉ（ｉ＝１，・・・，ｎ）から他の細胞核Ｎ１〜Ｎｎ（ただしＮｉをのぞく）までの距離Ｄ(Ｎｉ）が算出される。例えば、細胞核Ｎｉと細胞核Ｎｉ+１のＤ（Ｎｉ）は［数２］により算出することができる。
【数２】
2013146843.tif 000005
次いで、Ｄ（Ｎｉ）の最小値Ｍｉｎ（Ｄ（Ｎｉ））が算出される。
例えば、図２４に示すように、細胞領域内に３つの細胞核Ｎｉ、Ｎｉ+１、Ｎｉ+２（ＮｉからＮｉ+１までの距離＞ＮｉからＮｉ+２の距離）が存在するとき、ＮｉからＮｉ+２までの距離がＭｉｎ（Ｄ（Ｎｉ））として算出される。
そして、各細胞領域毎に、算出されたＭｉｎ（Ｄ（Ｎｉ））を用いて下記の［数３］によりＦｎｕｍが算出される。
【数３】
2013146843.tif 000006
【０１１３】
また、癌が発現している細胞の細胞膜周囲には特定のタンパクが過剰発現するため、細胞領域が癌領域である場合、その領域内における蛍光輝点の密度は高くなる。そこで、ステップＳ７においては、特徴量の１つとして、各細胞領域における蛍光輝点の密度Ｄｋが算出される。
例えば、細胞領域内の蛍光輝点の数をＨ、面積をＳ、細胞核の個数をｎとすると、細胞領域内の蛍光輝点密度Ｄｋは、下記の式（２）により求めることができる。
Ｄｋ＝（Ｈ／Ｓ）／ｎ    式（２）
Ｄｋは、細胞領域における特定タンパクの発現量を定量的に示す指標であり、Ｄｋが大きくなるほどその細胞領域の癌の悪性度は高くなる。
【０１１４】
特徴量の算出が終了すると、算出された特徴量に基づいて、各細胞領域が癌領域であるか否かの判定及び癌領域におけるタンパク発現状況の判定が行われる（ステップＳ８）。
【０１１５】
図２５に、図１０のステップＳ８における処理の詳細フローを示す。ステップＳ８の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【０１１６】
まず、判定対象の細胞領域が選択され、Ｓ／ｎが予め定められた閾値Ｔs/nより小さいか否かが判断される（ステップＳ８０１）。Ｓ／ｎが予め定められた閾値Ｔs/nより小さいくないと判断されると（ステップＳ８０１；ＮＯ）、その領域は癌領域ではない（非癌）と判定され（ステップＳ８０３）、処理はステップＳ８０９に移行する。
【０１１７】
Ｓ／ｎが予め定められた閾値Ｔs/nより小さいと判断されると（ステップＳ８０１；ＹＥＳ）、Ｆｎｕｍが予め定められた閾値ＴFnumを超えているか否かが判断される（ステップＳ８０２）。Ｆｎｕｍが予め定められた閾値ＴFnumを超えていないと判断されると（ステップＳ８０２；ＮＯ）、その領域は癌領域ではない（非癌）と判定され（ステップＳ８０３）、処理はステップＳ８０９に移行する。
【０１１８】
Ｆｎｕｍが予め定められた閾値ＴFnumを超えていると判断されると（ステップＳ８０３；ＹＥＳ）、その領域は癌であると判定され、Ｄｋと予め定められた閾値ＴDk1、ＴDk2、ＴDk3、ＴDk4とが比較される（ステップＳ８０４）。ここで、ＴDk1＞ＴDk2＞ＴDk3＞ＴDk4である。
【０１１９】
Ｄｋ＞ＴDk1であると判断されると（ステップＳ８０４；Ｄｋ＞ＴDk1）、その細胞領域は特定タンパクの高発現領域であると判定され（ステップＳ８０５）、処理はステップＳ８０９に移行する。
【０１２０】
ＴDk1≧Ｄｋ＞ＴDk2であると判断されると（ステップＳ８０４；ＴDk1≧Ｄｋ＞ＴDk2）、その細胞領域は特定タンパクの中発現領域であると判定され（ステップＳ８０６）、処理はステップＳ８０９に移行する。
【０１２１】
ＴDk2≧Ｄｋ＞ＴDk3であると判断されると（ステップＳ８０４；ＴDk2≧Ｄｋ＞ＴDk3）、その細胞領域は特定タンパクの低発現領域であると判定され（ステップＳ８０７）、処理はステップＳ８０９に移行する。
【０１２２】
ＴDk3≧Ｄｋ＞ＴDk4であると判断されると（ステップＳ８０４；ＴDk3≧Ｄｋ＞ＴDk4）、その細胞領域は特定タンパクの極低発現領域であると判定され（ステップＳ８０８）、処理はステップＳ８０９に移行する。
【０１２３】
ステップＳ８０９においては、全ての細胞領域について判定が終了したか否かが判断される。全ての細胞領域についての判定が終了していないと判断されると（ステップＳ８０９；ＮＯ）、処理はステップＳ８０１に戻り、次の細胞領域について判定が実行される。全ての細胞領域について判定が終了したと判断されると（ステップＳ８０９；ＹＥＳ）、処理は図１０のステップＳ９に移行する。
【０１２４】
図１０のステップＳ９においては、明視野画像上に、高発現領域、中発現領域、低発現領域、極低発現領域がその分類に応じて異なる表示態様で区分け（例えば、色分け）された画像を含む解析結果画面２３１が生成され、表示部２３に表示出力される（ステップＳ９）。
【０１２５】
図２６に、解析結果画面２３１の一例を示す。図２６に示すように、解析結果画面２３１には、明視野画像２３１ａと、蛍光輝点画像２３１ｂと、タンパク発現状況表示２３１ｃと、が表示されている。
タンパク発現状況表示２３１ｃには、明視野画像上に、特定タンパクの高発現領域、中発現領域、低発現領域、極低発現領域が色分けして表示されている。これらの色で表示された領域は、癌と判定された領域である。よって、医師は、この解析結果画面２３１を閲覧することで、組織切片の画像全体の中のどこに癌が存在するのかを一瞥して認識することができるので、広大な視野内での癌の見落としに対する注意喚起を行うことができる。また、癌と判定された領域は、特定タンパクの発現状況に応じて色分けして表示されるので、医師は、癌の悪性度の指標となる特定タンパクの過剰発現、その広がりを効率よく把握することが可能となり、適切な治療計画を立てることが可能となる。
【０１２６】
なお、解析結果画面２３１の表示方法は、図２６に示すものに限定されない。例えば、タンパク発現状況表示２３１ｃのみを表示することとしてもよい。また、操作部２２からの切り替え指示に応じて明視野画像とタンパク発現状況表示を切り替え表示することとしてもよい。また、解析結果画面２３１に表示する明視野画像２３１ａ、蛍光輝点画像２３１ｂ、タンパク発現状況表示２３１ｃは、観察しやすいように何れか又は全てを拡大縮小して表示することとしてもよい。
【０１２７】
解析結果は、印刷ボタン２３１ｄや送信ボタン２３１ｅを押下することでプリント出力又は外部機器への出力が可能となる。
操作部２２により印刷ボタン２３１ｄが押下されると、制御部２１により解析結果のデータが通信Ｉ／Ｆ２４やＬＡＮ等の通信ネットワークを介して図示しないプリンタに送信され、解析結果が印刷出力される。また、操作部２２により送信ボタン２３１ｅが押下されると、制御部２１により解析結果のデータが通信Ｉ／Ｆ２４やＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器（例えば、ＰＡＣＳ（Picture Archiving and Communication System for medical application））に送信される。
【０１２８】
以上説明したように、画像処理装置２Ａによれば、制御部２１は、組織切片のスライドを撮影した明視野画像から細胞核の領域を抽出し、抽出された各細胞核の領域の重心から細胞膜周囲の特定タンパク発現領域を包含する所定の半径の円領域を定め、定められた円領域が他の円領域と重ならない場合には、その定められた円領域を一つの細胞を含む細胞領域として推定し、定められた複数の円領域が互いに重なり合う場合には、その重なり合う複数の円領域の外周に囲まれた領域を複数の細胞を含む細胞領域として推定する。また、制御部２１は、同一視野で撮影した蛍光画像から蛍光輝点を抽出する。そして、推定された各細胞領域に含まれる細胞核及び蛍光輝点に基づいて、各細胞領域に関する特徴量を算出し、算出された特徴量に基づいて前記推定された各細胞領域が癌であるか否か及び癌であると判定された領域における特定タンパクの発現状況を判定し、判定結果を出力する。
【０１２９】
従って、医師は、組織切片の画像全体の中から見落とし無く、効率よく癌領域及び癌領域における特定タンパクの発現状況を把握することが可能となる。
【０１３０】
例えば、制御部２１は、各細胞領域において細胞核１個当たりが占める面積、及び／又は各細胞領域における細胞核の偏在性を示す指標値に基づいて、各細胞領域が癌であるか否かを判定し、癌であると判定された細胞領域における蛍光輝点の密度に基づいて、当該領域の特定タンパクの発現状況を判定する。従って、癌化した領域では細胞が増殖する、細胞核間の距離が短くなる、という癌領域の細胞の特徴を利用して精度よく癌領域を抽出することが可能となる。また、蛍光輝点の密度を用いて癌領域と判定された領域における特定タンパクの発現状況を精度良く取得することができる。
【０１３１】
また、制御部２１は、癌と判定された細胞領域について算出された蛍光輝点の特徴量が予め定められた複数の閾値を超えるか否かに基づいて、癌と判定された細胞領域における特定タンパクの発現状況を複数の段階に分類し、細胞形態画像上の癌と判定された細胞領域を特定タンパクの発現状況の分類結果に応じた態様で区分けした画像を判定結果として出力する。従って、医師は、細胞領域と推定された各領域が組織切片の画像全体の中のどこに癌が存在するのかを一瞥して認識することができるので、広大な視野内での癌の見落としに対する注意喚起を行うことができる。また、癌と判定された領域は、特定タンパクの発現状況に応じて異なる表示態様で表示されるので、医師は、癌の悪性度の指標となる特定タンパクの過剰発現、その広がりを効率よく把握することが可能となり、適切な治療計画を立てることが可能となる。
【０１３２】
なお、上記実施の形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
【０１３３】
例えば、上記実施の形態においては、好ましい一例として、各細胞領域内の核１個当たりが占める面積及び細胞核の偏在性を表す指標値を用いて各細胞領域が癌であるか否かを判定し、癌領域であると判定された領域について、蛍光輝点の数を用いてタンパク質の発現状況を判定することとしたが、癌領域であるか否かの判定及びタンパク質の発現状況の判定手法はこれに限定されない。例えば、各細胞領域内の核１個当たりが占める面積又は細胞核の偏在性を表す指標値の何れかを用いて癌領域であるか否かを判定することとしてもよいし、蛍光輝点の数を用いて癌領域であるか否かを判定することとしてもよい。
【０１３４】
また、例えば、上記実施の形態においては、特定タンパクの例として乳癌におけるＨＥＲ２タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた特定タンパクの発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。
【０１３５】
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ-ＲＯＭ等の可搬型記録媒
体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
【０１３６】
その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
【０１３７】
なお、明細書、請求の範囲、図面及び要約を含む２０１２年３月３０日に出願された日本特許出願Ｎｏ．２０１２−０７８７２２号の全ての開示は、そのまま本出願の一部に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
医療の分野において、組織切片の顕微鏡画像を処理する医用画像処理装置として利用可能性がある。
【符号の説明】
【０１３９】
１００  病理診断支援システム
１Ａ  顕微鏡画像取得装置
２Ａ  画像処理装置
２１  制御部
２２  操作部
２３  表示部
２４  通信Ｉ／Ｆ
２５  記憶部
２６  バス
３Ａ  ケーブル
【図１】
2013146843.tif 000007
【図２】
2013146843.tif 000008
【図３】
2013146843.tif 000009
【図４】
2013146843.tif 000010
【図５】
2013146843.tif 000011
【図６】
2013146843.tif 000012
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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