(57)【要約】本発明の目的は、木材などの結晶性セルロースを酵素法により糖化するのに適した、結晶性セルロースを加水分解してグルコースを生成する活性を有するセルラーゼ、該セルラーゼを利用した結晶性セルロースからのグルコースおよびアルコールを製造する方法を提供することにある。上記目的は、結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成し、かつ、副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有するセルラーゼおよび該セルラーゼを利用した結晶性セルロースからのグルコースおよびアルコールを製造する方法により解決される。
2013133354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、セルラーゼ。
【請求項２】
結晶性セルロースを加水分解して副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項３】
非結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成する活性を有し、かつ、結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコースの量が非結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコース量の１／１００以上である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項４】
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）において３５℃で５時間である反応条件下で、５％（ｗ／ｖ）  おがくずを加水分解して主生成物として１μｇ／ｍＬ以上のグルコースを生成する活性を有する、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項５】
主生成物であるグルコースおよび副生成物であるセロビオースのモル比は１．５：１〜２．５：１である、請求項２に記載のセルラーゼ。
【請求項６】
前記結晶性セルロースがおがくず、紙、繊維、木材およびアビセル、ならびに植物の茎、根、花および葉からなる群から選ばれる、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項７】
前記非結晶性セルロースがカルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、およびセルロースキサントゲン酸ナトリウムからなる群から選ばれる、請求項３に記載のセルラーゼ。
【請求項８】
前記セルラーゼはカイコウオオソコエビ（Ｈｉｒｏｎｄｅｌｌｅａ  ｇｉｇａｓ）に由来するセルラーゼである、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項９】
前記セルラーゼは分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５５，０００〜６３，０００である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項１０】
前記セルラーゼは至適ｐＨが５．４〜５．８である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項１１】
前記セルラーゼは至適温度が２５〜４０℃である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項１２】
前記セルラーゼは、配列表の配列番号８に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項１３】
結晶性セルロースおよび／または非結晶性セルロースと請求項１に記載のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程を含む、
グルコースの製造方法。
【請求項１４】
結晶性セルロースおよび／または非結晶性セルロースと請求項１に記載のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程、および
生成したグルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程を含む、
アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１２年３月８日出願の日本特願２０１２−０５２３１３号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、おがくずなどの結晶性セルロースをグルコースへと加水分解する活性を有するセルラーゼに関する。
【背景技術】
【０００３】
セルロースは地球上で最も存在量が多い炭化水素の一種であり、バイオエタノールを製造するための原材料として期待されている。しかし、セルロースは高分子であることから、セルロースをバイオエタノールの原材料とするためには、セルロースをより低分子量の糖類へと変換する糖化が必要である。【０００４】
セルロースの糖化としては、酸加水分解法、亜臨界水法および酵素法が知られている。このうち、酸加水分解法は、酸を使用することにより反応槽が劣化すること、反応後に得た生成物を中和しなければならないこと、中和後に塩と糖とを分離しなければならないことなどの問題がある。亜臨界水法は、亜臨界水により反応槽が劣化すること、糖化を超えてセルロースを二酸化炭素と水にまで分解してしまうことなどの問題がある。【０００５】
それに対して、酵素法は、酸加水分解法や亜臨界水法と比べて、反応槽への影響が小さいこと、主生成物として低分子量の糖類が得られること、生成物の分離が容易であることといった利点がある。酵素法では、セルロースを糖化するのにセルラーゼが用いられる。【０００６】
セルラーゼとは、セルロースの加水分解を触媒する酵素の総称であり、代表的なものとしてセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）およびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）などが知られている。このうち、セルラーゼはエンドセルラーゼともよばれており、セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼはセロビオヒドラーゼともよばれている。【０００７】
シロアリなどの無脊椎動物の一部は、体内で合成されるセルラーゼを利用して木質を資化することができる。しかし、単一のセルラーゼのみでは木質から栄養素を取り出すのは難しいことから、シロアリなどの腐食性動物は３種のセルラーゼを活用している（下記の非特許文献１を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。すなわち、セルロース分子をセロオリゴ糖へ加水分解することを触媒するエンドセルラーゼ、セロオリゴ糖をセロビオースへ加水分解することを触媒するセロビオヒドラーゼ、およびセロビオースをグルコースへ加水分解することを触媒するβ−グルコシダーゼである。【０００８】
エンドセルラーゼ、セロビオヒドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの３種のセルラーゼを混合して用いれば、木材などの結晶性セルロースからグルコースを一貫して生産することが理論的に可能とされている。しかし、このようなグルコース一貫生産については実用化に至っていない。【０００９】
一般に、２種以上の精製酵素を混合して用いる場合、条件１として、各酵素の反応生成物が他の酵素の反応を阻害しないこと、および、条件２として、各酵素の至適温度および至適ｐＨが一致していることが必要である。しかしながら、エンドセルラーゼはセロビオヒドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの反応生成物であるセロビオースおよびグルコースにより阻害される。また、セロビオヒドラーゼはβ−グルコシダーゼの反応生成物であるグルコースにより阻害される。したがって、エンドセルラーゼ、セロビオヒドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの３種のセルラーゼを混合して用いるセルロースの糖化は、上記条件１を満たすことができない（下記の非特許文献２を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【００１０】
そこで、上記条件１を勘案して、セロビオースにより阻害されることのない、好アルカリ性細菌が生産するエンドセルラーゼの利用が期待されている（下記の特許文献１を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。しかし、好アルカリ性細菌由来のエンドセルラーゼの至適ｐＨはアルカリ性側にある。そこで、このようなアルカリ性エンドセルラーゼに合わせてアルカリ性条件で反応した場合、エンドセルラーゼの反応生成物であるセロオリゴ糖は異性化されるので、その後の反応に供されるセロビオヒドラーゼの基質としては不適なものとなる。また、一般的なβ−グルコシダーゼはアルカリ性条件下では活性が低い。よって、上記条件１に適合しようとして好アルカリ性細菌由来のエンドセルラーゼを用いる場合、今度は上記条件２が満たされないようになる。【００１１】
したがって、上記条件１および２を満たすようなエンドセルラーゼ、セロビオヒドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの組み合わせはこれまでにないことから、これら３種のセルラーゼを用いた木材等の天然セルロースからのグルコース一貫生産は未だ実現できていない。そこで、非結晶性セルロース分子を加水分解する活性を有するセルラーゼを使って、単一酵素系により木材などの天然セルロースを糖化する試みがなされている（下記の特許文献２および３を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【００１２】
一方、シロアリと同様にセルラーゼを利用して木質を資化することができる腐食性動物として、端脚類動物であるカイコウオオソコエビ（Ｈｉｒｏｎｄｅｌｌｅａ  ｇｉｇａｓ；ヒロンデリア・ギガス）が知られている（下記の非特許文献３を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。カイコウオオソコエビはマリアナ海溝チャレンジャー海淵の世界最深部に生息するヨコエビの一種である。１９９８年に、無人探査機「かいこう」が１００個体以上のカイコウオオソコエビを捕獲したことを契機として、カイコウオオソコエビの研究が盛んになった（下記の非特許文献４を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【００１３】
カイコウオオソコエビの破砕物がプロテアーゼ、α−グルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、およびグルコマンナン分解酵素の活性を有することがこれまでに知られているが、これらの酵素が個別に単離されたという報告はない（下記の非特許文献５を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００１−３４００７４号公報
【特許文献２】特開昭６３−１０９７７８号公報
【特許文献３】特開２０１１−２２３９６２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Watanabe,H. et al., Nature, 394, 330-331 (1998)
【非特許文献２】NicoleCreuzet et al, Biochimie, 64, 149-156 (1983)
【非特許文献３】T.Treude et al., Deep Sea Res. Part I Oceanogr. Res. Pap. 49, 1281-1289 (2002).
【非特許文献４】H.Kobayashi et al., JAMSTEC J. Deep Res. 17, 19-22 (2000)
【非特許文献５】小林英城ら、「カイコウオオソコエビの消化酵素と成分分析−カイコウオオソコエビは甘い？−BlueEarth 2011, BE11-39
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
特許文献２および３に記載のセルラーゼを用いれば、非結晶性セルロースを糖化することが可能であるように思える。しかし、特許文献２には、特許文献２に記載のＣＭＣアーゼＩＩは僅かなＣ１活性を有するとの記載はあるが、結晶性セルロースであるアビセルや濾紙片を基質とした場合、基質特異性の評価の指標としたのは還元糖であり、グルコースではないことが記載されている（引用文献２の第７頁右上欄第２０行−左下欄第２行を参照）。一般に、還元糖はグルコースだけでなく、二糖類、三糖類、四糖類その他のオリゴ糖類が含まれる。また、生成された還元糖の量は非結晶性セルロースであるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした場合のグルコース生成量と比べて０．３％以下である（引用文献２の第１表を参照）。【００１７】
以上の事項を勘案すれば、引用文献２に記載のＣＭＣアーゼＩＩは、実質的に結晶性セルロースを分解し得るものではなく、仮に結晶性セルロースを分解し得るとしても、生成するのは多様な還元糖であり、グルコースには限定されないことから、その活性は結晶性セルロースをその分子内部で加水分解し得るエンドセルラーゼ活性である蓋然性が高い。また、そうであれば、引用文献２に記載のＣＭＣアーゼＩＩは結晶性セルロースを加水分解し得るとしても、グルコースは生成すらされない蓋然性が非常に高い。【００１８】
同様に、特許文献３には、特許文献３に記載のＣＭＣ１−ＣＢＤＣＢＨＩについて、結晶性セルロースであるアビセルを加水分解し得ることが記載されているが（引用文献３の表１３を参照）、検出された生成物は還元糖であり、グルコースではないことが記載されている（同段落０１２７を参照）。また、ＣＭＣ１−ＣＢＤＣＢＨＩのうち、エキソセルラーゼ活性を示し得るのはＣＢＤＣＢＨＩ部ではあるが、引用文献３の段落０００４の記載によれば、ＣＢＨ（セロビオヒドロラーゼ）は二糖類であるセロビオースを生成する活性を有するものである。したがって、特許文献３に記載のＣＭＣ１−ＣＢＤＣＢＨＩを結晶性セルロースに作用したとしても、主として生成される還元糖はセロビオースであり、グルコースではない。【００１９】
一方、非特許文献５は本発明者およびその他の共同研究者らによって記載されたものであるが、非特許文献５には、カイコウオオソコエビの破砕物によって示されるセルラーゼ活性がいかなる酵素に依拠するものであるかの記載はない。実際に、カイコウオオソコエビ破砕物のセルラーゼ活性は、ＡＺＯ−ＣＭ−セルロース（メガジム社）を用いてエンドセルラーゼ活性として測定されている。したがって、非特許文献５の発表時においては、カイコウオオソコエビ破砕物が有するセルラーゼ活性は、非結晶性セルロースを分子内部から加水分解するエンドセルラーゼ活性であると認識されていたのである。【００２０】
以上のとおり、特許文献２および３に記載のセルラーゼは、結晶性セルロースを加水分解する活性を有するとしても、主として生成されるのはセロビオースなどのオリゴ糖であり、グルコースは生成すらされない蓋然性が高い。また、非特許文献５に記載のカイコウオオソコエビ抽出物が有するセルラーゼ活性はエンドセルラーゼ活性として測定されていた。したがって、特許文献２および３に記載のセルラーゼ、ならびに非特許文献５に記載のカイコウオオソコエビ抽出物を用いたとしても、木材などの結晶性セルロースを基質として、グルコースを主生成物として得ることは事実上不可能である。【００２１】
そこで、本発明の第１の目的は、木材などの結晶性セルロースを酵素法により糖化するのに適した、結晶性セルロースを加水分解してグルコースを生成する活性を有するセルラーゼを提供することにある。また、本発明の第２および第３の目的は、本発明の酵素を利用した結晶性セルロースからのグルコースおよびアルコールを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、上記目的を達成するために、結晶性セルロースを加水分解する活性を有するセルラーゼについて鋭意検討を進めた。そして、カイコウオオソコエビが有するセルラーゼについて着目するに至った。【００２３】
本発明者らは、カイコウオオソコエビからセルラーゼ活性を有する酵素を単離するために、まずカイコウオオソコエビを解体し、外殻を取り除いた後、市販の手もみ式簡易破砕容器を用いて破砕した。次いで、得られたカイコウオオソコエビ破砕物をカイコウオオソコエビ１個体あたり１ｍＬの蒸留水で３回浸して、合計３ｍＬのタンパク質抽出液を得た。次いで、このタンパク質抽出液を終濃度が８０％（飽和％）となるように硫酸アンモニウムを加えて（硫安沈殿）、タンパク質抽出液中の全タンパク質を沈殿させた。次いで、沈殿タンパク質を１ｍＬの蒸留水に溶解し、限外濾過カラムを用いて脱塩および濃縮して、０．２ｍＬのタンパク質濃縮液を得た。【００２４】
このようにして得られたタンパク質濃縮液は、エンドセルラーゼ活性を示したが、同時にプロテアーゼ、α−グルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グルコマンナン分解酵素の活性を示した。すなわち、該タンパク質濃縮液は、カイコウオオソコエビ体内のすべての酵素を含む溶液であった。【００２５】
また、本発明者らは、硫安沈殿の際に、硫酸アンモニウムの濃度を変えた硫安分画を実施したところ、硫酸アンモニウムが５０〜６０％（飽和％）の分画において、タンパク質抽出液中の全成分が沈殿したので、セルラーゼ活性のみを示す分画を得ることができなかった。これは、カイコウオオソコエビは超深海生物であり、非常に多くの脂質や油分を含んでいることから、上記した通常のタンパク質抽出方法では、酵素などのタンパク質だけではなく、カイコウオオソコエビ体内にある脂質、油分、体液などが同時に抽出されて、エマルションを形成することに起因すると推測される。【００２６】
また、本発明者らは、タンパク質濃縮液を陰イオンまたは陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーや、ブチル基やフェニル基がある疎水性樹脂を用いた疎水クロマトグラフィーにかけて、タンパク質濃縮液からセルラーゼを単離することを試みた。しかし、イオン交換樹脂はその有効範囲（ｐＨ  ３〜１０）でタンパク質を吸着することができず、また、疎水性樹脂に吸着させたタンパク質は４Ｍ  ＮａＣｌを添加しても溶出できなかった。したがって、タンパク質濃縮液のエマルションの疎水性度が非常に高いことにより、セルラーゼを含む全てのタンパク質の周囲が脂質や油分によって覆れていると推察され、タンパク質濃縮液中にある特定のタンパク質（酵素）を単離するのは非常に困難であった。【００２７】
次に、本発明者らは、カイコウオオソコエビ体内の油分を利用して、カイコウオオソコエビを室温で放置すれば、体液とともにセルラーゼが体外へ流出してくると考えた。しかし、水中に室温でカイコウオオソコエビを放置して得た抽出液からは、セルラーゼ活性を検出できなかった。そこで、体外へ溶出されたセルラーゼがカイコウオオソコエビ体内のプロテアーゼにより分解されていると考え、プロテアーゼ阻害剤を添加することにした。しかし、プロテアーゼを添加しない条件と同様に、セルラーゼ活性は検出できなかった。【００２８】
本発明者らは、このように試行錯誤を繰り返しながら、カイコウオオソコエビ体内にあるセルラーゼを単離することについて多種多様な実験および検討を積み重ねた結果、後述する実施例に記載の方法によって、精製セルラーゼであるＨＧｃｅｌを得ることに成功した。しかも、驚くべきことに、ＨＧｃｅｌは、非特許文献５において認められたエンドセルラーゼ活性ではなくエキソセルラーゼ活性を示し、結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成し、かつ、副生成物としてセロビオースを生成し得るものであった。本発明は、このような本発明者らによってはじめて成し遂げられたカイコウオオソコエビからＨＧｃｅｌを単離し、かつ、ＨＧｃｅｌの理化学的性状を明らかにした研究成果に基づいて完成された発明である。【００２９】
したがって、本発明によれば、結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、セルラーゼが提供される。【００３０】
好ましくは、結晶性セルロースを加水分解して副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する。【００３１】
好ましくは、非結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成する活性を有し、かつ、結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコースの量が非結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコース量の１／１００以上である。【００３２】
好ましくは、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）において３５℃で５時間である反応条件下で、５％（ｗ／ｖ）  おがくずを加水分解して主生成物として１μｇ／ｍＬ以上のグルコースを生成する活性を有する。【００３３】
好ましくは、主生成物であるグルコースおよび副生成物であるセロビオースのモル比は１．５：１〜２．５：１である。【００３４】
好ましくは、前記結晶性セルロースがおがくず、紙、繊維、木材およびアビセル、ならびに植物の茎、根、花および葉からなる群から選ばれる。【００３５】
好ましくは、前記非結晶性セルロースがカルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、およびセルロースキサントゲン酸ナトリウムからなる群から選ばれる。【００３６】
好ましくは、前記セルラーゼはカイコウオオソコエビ（Ｈｉｒｏｎｄｅｌｌｅａ  ｇｉｇａｓ）に由来するセルラーゼである。【００３７】
好ましくは、前記セルラーゼは分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５５，０００〜６３，０００である。【００３８】
好ましくは、前記セルラーゼは至適ｐＨが５．４〜５．８である。【００３９】
好ましくは、前記セルラーゼは至適温度が２５〜４０℃である。【００４０】
好ましくは、前記セルラーゼは、配列表の配列番号８に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。【００４１】
本発明の別の側面によれば、結晶性セルロースおよび／または非結晶性セルロースと本発明のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程を含む、
グルコースの製造方法が提供される。【００４２】
本発明の別の側面によれば、結晶性セルロースおよび／または非結晶性セルロースと本発明のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程、および
生成したグルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程を含む、
アルコールの製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００４３】
木材などの天然セルロースの酵素法による糖化では、使用すべき酵素の種類が少ないほど、簡便性および迅速性が増進する。本発明のセルラーゼはこの目的に合致するものであり、本発明のセルラーゼはそれ単体で、天然セルロースをグルコースへと変換することができる。また、本発明のセルラーゼは、天然セルロースをグルコースとセロビオースへと変換することができ、これらは共に微生物等によって資化可能なものであることから、本発明のセルラーゼを天然セルロースに作用させて得た反応液を利用すれば、発酵法によってバイオエタノールを非常に効率良く生産することが可能である。【００４４】
また、本発明のセルラーゼは、結晶性セルロースを加水分解することができることから、食用として価値の高いコーンやサトウキビなどを用いることなく、非食用の作物や、コーン、サトウキビの茎、廃材などからグルコースおよびアルコールを生産することが可能である。このことは、本発明のセルラーゼを用いたグルコースおよびアルコールの生産は経済性に非常に優れていることを示しており、特に工業的規模でのこれらの生産が期待できる。【００４５】
本発明のセルラーゼの具体例の一つであるＨＧｃｅｌは、反応至適温度が低いことから、加温することなく酵素反応が実施できるので、省エネに優れたグルコース生産が可能である。さらにエタノール発酵の際に使用される一般的な酵母の培養温度は、ＨＧｃｅｌの反応至適温度と重複していることから、グルコース生産およびバイオエタノール生産を同一系内で温度を変えることなく実施できる。【００４６】
樹木には、セルロース、マンナンやキシランといったヘミセルロース、リグニンなどが含まれる。そこで、樹木由来の木質を従前のエンドセルラーゼで処理する際には、アルカリ処理によるリグニンの除去など、セルロース中の結晶構造を事前に破壊しなければならなかった。しかし、本発明のセルラーゼによれば、セルロース分子の非還元末端部を加水分解する活性を有していることから、アルカリ処理などの樹木の前処理を要せず、さらに樹木を加工する際に発生するおがくずを利用してより簡便にグルコースを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】約５０個体のカイコウオオソコエビを含む餌付き仕掛けの一例を示した図である。
【図１ｂ】図１ａに示す餌付き仕掛け中のすべての個体が同一の形態をしており、かつ、体長が約３〜５ｃｍの端脚類動物であることを示した図である。
【図１ｃ】スターチ・アズール（アミラーゼ）、ＣＭＣトリパン・ブルー（セルラーゼ）、グルコマンナン（マンナナーゼ）、およびキシラン（キシラナーゼ）を含有する寒天平板におけるハロー形成によって評価した分解酵素活性を示した図である。アミラーゼ活性およびセルラーゼ活性によって生成されたハローは直接的に視覚化されているが、マンナナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を示すハローは、０．５％  コンゴー・レッドを用いて染色し、次いで脱イオン化蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄した後に検出された。
【図１ｄ】反応速度をＴＬＣによって測定した図である。破砕したカイコウオオソコエビから得られたタンパク質抽出物と０．５％（ｗ／ｖ）  デンプンとを、３０℃にて１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）中で反応させた。
【図１ｅ】反応速度をＴＬＣによって測定した図である。破砕したカイコウオオソコエビから得られたタンパク質抽出物と０．２％（ｗ／ｖ）  グルコマンナンとを、３０℃にて１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）中で反応させた。
【図１ｆ】反応速度をＴＬＣによって測定した図である。破砕したカイコウオオソコエビから得られたタンパク質抽出物と１％（ｗ／ｖ）  ＣＭＣとを、３０℃にて１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）中で反応させた。
【図１ｇ】アミラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の各ｐＨ依存性を、破砕したカイコウオオソコエビから得られたタンパク質抽出物を用いて測定した図である。酵素反応は、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４．４〜５．６）または１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．２〜６．８）中で３０℃にて実施した。最も活性が高かったｐＨ  ５．６の値を基準とした相対活性を示す。
【図２ａ】破砕したカイコウオオソコエビ全体から得られた抽出物中に存在するオリゴ糖類を同定した結果を示した図である。３体の破砕したカイコウオオソコエビからＤＤＷを用いてオリゴ糖類を抽出し、ＴＬＣ上で分離した。次いでオリゴ糖類を硫酸で染色し（左）、またはグルコースＣＩＩキット（和光純薬工業株式会社）を用いてグルコースを染色した（右）。
【図２ｂ】破砕したカイコウオオソコエビ全体から得られた抽出物中に存在するオリゴ糖類を同定した結果を示した図である。マルトースまたはセロビオースの含有量を、該抽出物をα−またはβ−グルコシダーゼ処理した後に、増加したグルコース含有量に基づいて測定した。
【図３ａ】後述する実施例で述べられているとおりに、陰イオン交換カラムクロマトグラフイーを用いて破砕カイコウオオソコエビ抽出物から精製して得られたＨＧｃｅｌがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％のグラジエント・ゲル）上で５９ｋＤａの単一バンドとして同定されたことを示す図である。
【図３ｂ】ＨＧｃｅｌの酵素活性とｐＨとの関係を示した図であり、最も活性が高かったｐＨ  ５．６の値を基準とした相対活性により示されている。酵素活性は、１％（ｗ／ｖ）  カルボキシメチルセルロースを基質として、３０℃で２０分反応後、生成したグルコースをグルコースＣＩＩキットで測定した。ｐＨ  ５．６の生成グルコース量を１００％として各ｐＨの相対値を算出した。
【図３ｃ】ＨＧｃｅｌの酵素活性と温度との関係を示した図であり、最も活性が高かった３０℃の値を基準とした相対活性（○）、および残存活性（●）により示した図である。酵素活性は、１％（ｗ／ｖ）  カルボキシメチルセルロースを基質として、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）中にて、各温度で２０分反応後、生成したグルコースをグルコースＣＩＩキットで測定した。３０℃の生成グルコース量を１００％として各反応温度での相対値を算出した。図は酵素活性が最大値を示す至適温度が２５〜３５℃であること、および、温度安定性が確認される温度は残存活性が８０％以上である５〜３５℃であることを示す。
【図３ｄ】ＨＧｃｅｌがカルボキシメチルセルロースをグルコース（Ｇｌｕ）およびセロビオース（Ｃ２）へ変換したことを示す図である。２００ｍＵのＨＧｃｅｌを５００μＬの５％（ｗ／ｖ）  セルロース溶液（ｐＨ  ５．６）へ加えて、３０℃にて９６時間、１９２時間および２８８時間反応させた後のグルコースおよびセロビオースの含有量を示す（＋Ｅ）。ＨＧｃｅｌを加えずに同じように測定したものをコントロールとした（Ｒ）。
【図３ｅ】ＨＧｃｅｌを用いたセルロースからのグルコース生成の反応速度を示した図である。
【図３ｆ】セロビオース（Ｃ２）、セロトリオース（Ｃ３）、セロテトラオース（Ｃ４）およびセロペンタオース（Ｃ５）を基質としてＨＧｃｅｌに反応させた生成物についてのＴＬＣ分析結果を示した図である。ＨＧｃｅｌ（１２ｍＵ）と反応させた系は「＋」とし、コントロールとしてＨＧｃｅｌを加えなかった系は「−」として示した。ＨＧｃｅｌはセロトリオース以上のセロオリゴ糖類を加水分解する活性を有していることが示される。
【図３ｇ】ＨＧｃｅｌ（１２ｍＵ）を３５℃にて１時間ｐ−ニトロフェニルセロオリゴ糖類と反応させ、次いでｐ−ニトロフェニル基をセロオリゴ糖類の還元末端へ結合した後の、グルコースまたはｐ−ニトロフェノールの遊離量（μｇ／ｍＬ）を示した図である。
【図３ｈ】酵素活性に対する静水圧（１００ＭＰａ）の影響を示した図である。大気圧（０．１ＭＰａ）下の酵素活性を基準とした相対活性（％）により示される。酵素反応は、２℃の気密性プラスチックチューブ内で、１％  ＣＭＣ溶液を含有する１０ｍＵのＨＧｃｅｌを使用することにより実施した。８時間および１６時間のインキュベーション後に酵素活性を測定した。
【図３ｉ】ＨＧｃｅｌによるＣＭＣおよびおがくずの分解に係る反応速度をグルコース生成量を測定することにより測定した図を示す。ＨＧｃｅｌ（３８０ｍＵ）は３５℃にてＣＭＣまたはおがくずと反応させた。
【図４ａ】１０，０００ｍ級の自由落下カメラ−堆積物試料採取器システム「アシュラ（ＡＳＨＵＲＡ）」を示した図である。アシュラはカメラおよび土壌試料を回収するための３個のコア試料採取器を装備したものである。チャレンジャー海淵の海底へアシュラを下降させ、位置をソナーによりトレースした。
【図４ｂ】側棒に取り付けた餌付き仕掛けを示した図である。３個の餌付き仕掛けを側棒へ取り付けてある。餌付き仕掛けには切り身のサバが含まれる。
【図５】ＤＥＡＥ−トーヨーパールを用いたＨＧｃｅｌ精製の最終工程を示した図である。ＨＧｃｅｌを１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．６）を用いて平衡化した０．５ｍＬのＤＥＡＥ−トーヨーパールから溶出した。ＨＧｃｅｌを０〜０．６Ｍの塩化ナトリウムで０．２Ｍ毎に連続的に溶出した。各溶出緩衝液の容量は１．５ｍｌだった。また、分画量は約０．１ｍｌだった。セルラーゼ活性を、後述する実施例にて述べられているとおりに、グルコース濃度として測定した。第４０番目の分画はセルラーゼ活性を含んでおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて唯一のバンドとして確認された（図３ａを参照）。
【図６】カイコウオオソコエビ中の細菌（Ｂａｃ）または古細菌（Ａｒｃ）の１６ＳリボソームＤＮＡに対するＰＣＲ分析結果を示した図である。ミトコンドリアのチトクロム酸化酵素サブユニットＩ（ＣＹＯ）ＤＮＡを陽性対照としてＰＣＲ反応に供した。また、大腸菌ＨＢ１０１およびハロバクテリウム・サリナリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ２９３４１のＤＮＡを、それぞれ細菌および古細菌用の陽性対照として使用した。図中の「Ｍ」はＤＮＡマーカーを示す。
【図７ａ】ＨＧｃｅｌによるコピー用紙からのグルコース生産を示した図である。矢印は、ＨＧｃｅｌ酵素溶液を滴下したスポットを示す。
【図７ｂ】ＨＧｃｅｌによるコピー用紙からのグルコース生産を示した図である。矢印は、ＨＧｃｅｌ酵素溶液を滴下したスポットによりグルコース生産が認められたことを示す。
【図７ｃ】ＨＧｃｅｌによるおがくずからのグルコース生産を示した図である。図は、ＨＧｃｅｌを含有していない溶液におがくずを添加してもグルコース生産を示す呈色が認められない（右バイアル）ことに対して、ＨＧｃｅｌを含有する溶液におがくずを添加するとグルコース生産を示す呈色が認められた（左バイアル）ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明の詳細について説明する。
本発明のセルラーゼは、結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースの両方に作用して、主生成物としてグルコースを生成し、かつ、副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する。
【００４９】
本発明のセルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する酵素であるという点はその他のセルラーゼと共通するが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの非結晶性セルロースのみならず、おがくずやアビセルなどの結晶性セルロースにも作用し、主生成物としてグルコースを生成するという、他のセルロースには見られない特有の活性を示す。
【００５０】
本明細書において「主生成物」とは、セルラーゼをセルロースに作用させた際に生成される糖類の中で最もモル濃度の高いものをいう。また、本明細書において「副生成物」とは、セルラーゼをセルロースに作用させた際に生成される糖類の中で２番目にモル濃度の高いものをいう。
【００５１】
本発明のセルラーゼが結晶性セルロースに作用してグルコースおよびセロビオースを生成することができる理由の一つとしては、本発明のセルラーゼが結晶性セルロースに結合するドメインを有し、さらにその活性がエキソセルラーゼ活性であるからだと推測される。これにより本発明のセルラーゼは、結晶性セルロースに付着することができ、さらに結晶性セルロースの末端部を加水分解してグルコースおよびセロビオースを遊離することができると推察される。しかし、種々の問題により、本発明のセルラーゼの具体例の一つであるＨＧｃｅｌの構造は未だ明らかではないことから、上記の推測や推察は断定的に捉えることはできず、本発明の技術的範囲を狭く解釈する理由とはならない。
【００５２】
本発明のセルラーゼが作用する結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースは特に限定されるものではない。本明細書において、結晶性セルロースとは、セルロース分子における結晶部分の割合が比較的多いものを指し、その割合が概ね１０％（ｗ／ｗ）を越えるものをいう。本明細書においては、結晶性セルロース以外のセルロースを非結晶性セルロースとよぶ。本発明のセルラーゼが作用する結晶性セルロースの具体例としては、おがくず、紙、繊維、木材およびアビセル、ならびに植物の茎、根、花および葉などの自然界に存在する天然セルロースの他に人工的に合成、化学修飾および加工された人工セルロースなどが挙げられる。本発明のセルラーゼが作用する非結晶性セルロースの具体例としては、カルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、セルロースキサントゲン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５３】
本発明のセルラーゼは結晶性セルロースと非結晶性セルロースとの両方のセルロース材料を加水分解してグルコースを生成できるが、同一の濃度（重量（質量）パーセント濃度）であるとしてもセルロース材料の種類によって生成するグルコース量が変化する場合がある。たとえば、本発明のセルラーゼにより結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコースの量は非結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコース量より小さい場合があり、具体的には１／１００以上である。本発明のセルラーゼの具体的態様の一つであるＨＧＣｅｌにより５％（ｗ／ｖ）  おがくずを加水分解して生成されるグルコースの量は５％（ｗ／ｖ）  カルボキシメチルセルロースを加水分解して生成されるグルコース量の約１／５である。
【００５４】
本発明のセルラーゼの活性の強度は、基質の種類や反応条件によって影響を受けるので、特に限定されるものではないが、たとえば、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）において３５℃で５時間である反応条件下で、５％（ｗ／ｖ）  おがくずを加水分解した場合に、主生成物として生成されるグルコースの量（濃度）は１μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは５μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以上である程度の活性である。
【００５５】
本発明のセルラーゼは、結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースのいずれのセルロース材料を基質とした場合にでも、主生成物としてグルコースが生成され、かつ、副生成物としてはセロビオースが生成されるが、生成されるグルコースおよびセロビオースのモル比は特に限定されるものではなく、たとえば、１．５：１〜２．５：１であり、好ましくは１．８：１〜２．２：１であり、より好ましくは２：１である。
【００５６】
本発明のセルラーゼは、それ単体で結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースに作用してグルコースを生成することができる非常に画期的な酵素である。このことを利用した本発明のセルラーゼの使用方法としては、たとえば、木材を破断する際に生じるおがくずや市販のコピー用紙などのセルロース材料を本発明のセルラーゼに適したｐＨで調製された緩衝液に加えてセルロース試料溶液を用意し、次いでこの試料溶液に本発明のセルラーゼを加えて、本発明のセルラーゼに適した温度でセルロース材料と本発明のセルラーゼとを反応させてグルコースを生成させるとの方法が挙げられる。その他にも、たとえば、セルロース材料の上に、本発明のセルラーゼを本発明のセルラーゼに適したｐＨで調製された緩衝液に加えることによって調製した酵素液を滴下して、本発明のセルラーゼに適した温度に維持して、セルロース材料の酵素液を滴下した部分においてグルコースを生成させるとの方法が挙げられる。このように本発明のセルラーゼの使用方法としては、セルロース材料の全部または一部からグルコースを生成する方法が挙げられる。
【００５７】
本発明のセルラーゼのエキソセルラーゼ活性は、特に別段の記載がない限り、本発明のセルラーゼとセルロース材料とを適当な濃度になるようにｐＨ  ５．６に調製した緩衝液中に懸濁し、３５℃にて両者を反応させた後に、反応系の水相中に存在するグルコース濃度およびセロビオース濃度を検出することによって測定できる。グルコース濃度はグルコースＣＩＩキット（和光純薬工業株式会社）により測定できる。セロビオース濃度は、上記反応後の溶液に１Ｕのβ−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母株式会社）を加えて３７℃で１６時間反応させた後に、グルコース濃度を測定することにより算出できる。本発明について、１ユニットのセルラーゼ活性は、セルロース材料を加水分解して１分間に１μｇのグルコースを生成する量として定義する。セルロース材料として、天然セルロースを用いる場合は、天然セルロースに付着している細菌等のコンタミネーションを防ぐ観点で、事前に適当な方法で洗浄、殺滅菌および乾燥などをすることが望ましい。
【００５８】
本発明のセルラーゼの具体例の一つが、後述する実施例において記載されているＨＧｃｅｌである。以下に、本発明のセルラーゼの好ましい態様が示す理化学的性状について、ＨＧｃｅｌの理化学的性状を参酌して説明する。
【００５９】
本発明のセルラーゼの至適ｐＨは、アルカリ条件では基質であるセルロース材料の結晶構造などに影響する可能性があることから、酸性〜中性であることが好ましく、たとえば、ｐＨ  ４．０〜８．０、より好ましくは４．５〜７．５、さらに好ましくは５．０〜７．０である。本発明のセルラーゼの具体例であるＨＧｃｅｌの至適ｐＨは、５．４〜５．８である。
【００６０】
本明細書において「至適ｐＨ」とは、セルラーゼ活性測定において、セルロース基質溶液のｐＨを酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、ＴＡＢＳ緩衝液などを用いて変化させた場合に、そのｐＨを５．６にして温度を３５℃に設定したときのセルラーゼ活性を１００％として、８０％以上の相対活性が観測されたｐＨをいう。
【００６１】
本発明のセルラーゼの至適温度は、常温下での反応に適した温度であることが好ましく、たとえば、０℃〜６０℃であり、より好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４０℃である。本発明のセルラーゼの具体例であるＨＧｃｅｌの至適温度は、２５〜３５℃である。
【００６２】
本明細書において「至適温度」とは、本発明のセルラーゼとセルロース材料とを含む混合緩衝液（ｐＨ  ５．６）を反応させる温度を変化させた場合に、その温度を３５℃に設定したときのセルラーゼ活性を１００％として、８０％以上の相対活性が観測された温度をいう。
【００６３】
本発明のセルラーゼの温度安定性は、本発明のセルラーゼが常温下での反応に適したものであることが好ましいことから、たとえば、０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜５０℃、さらに好ましくは０℃〜４０℃である。本発明のセルラーゼの具体例であるＨＧｃｅｌの温度安定性は、０〜３５℃である。
【００６４】
本明細書において「温度安定性」は、本発明のセルラーゼの残存活性が８０％以上である温度をいう。本発明のセルラーゼについて、温度条件を変えて残存活性を測定する場合は、凍結保存していた酵素を解凍直後に測定したセルラーゼ活性の値を基準として、各温度で２時間インキュベートした後にセルラーゼ活性を測定し、これらの活性の比率によって測定する。
【００６５】
本発明のセルラーゼの分子量は特に限定されないが、ＨＧｃｅｌの分子量の観点から、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５５，０００〜６３，０００であることが好ましい。なお、ＨＧｃｅｌの分子量は約５９，０００である。
【００６６】
本発明のセルラーゼは、上記したセルラーゼ活性の他に、本発明のセルラーゼの具体的態様の一つであるＨＧｃｅｌの至適ｐＨ、至適温度および分子量などを指標として、種々の生物体、たとえば、腐食性の微生物、無脊椎動物、脊椎動物、好ましくは腐食性の端脚類動物であるヨコエビの体内外の物質を分析および評価することにより採取することが可能である。
【００６７】
本発明のセルラーゼを生産する生物体として好ましいのは、カイコウオオソコエビ（Ｈｉｒｏｎｄｅｌｌｅａ  ｇｉｇａｓ）である。カイコウオオソコエビから本発明のセルラーゼを単離する方法は特に限定されないが、たとえば、後述する実施例に示す方法が挙げられる。
【００６８】
また、本発明のセルラーゼをカイコウオオソコエビ以外の生物体から得るには、配列番号５〜７として示されるＨＧｃｅｌの内部配列を指標として、生物体の酵素抽出液からウェスタンブロッティング法などの生物工学的手法を利用して取得することができる。
【００６９】
配列表の配列番号８に記載の塩基配列（ＡＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡＡＴＧＣＣＣＴＡＡＧＴＡＧＴＣＧＡＴＣＧＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴ）は、ＨＧｃｅｌのアミノ酸配列の一部と推定されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である。また、ＨＧｃｅｌは、配列番号８に記載の塩基配列の上流部分に、α−グルコシダーゼの保存領域の一部と相同性のあるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むと推定され、当該アミノ酸配列はＡＣＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧ（配列表の配列番号９）がコードするアミノ酸配列である。さらにＨＧｃｅｌは、セロビオヒドラーゼのドメイン領域の一部と相同性があるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むと推定される（ＧＡＴＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣ；配列表の配列番号１０）。このようにＨＧｃｅｌは、α−グルコシダーゼの一部とセロビオヒドラーゼの一部とを含むと推定される、非常に特異的なアミノ酸配列からなる。
【００７０】
配列番号８に記載の塩基配列の上流部分に配列番号９を付加した配列表の配列番号１１に記載の塩基配列（ＡＣＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡＡＴＧＣＣＣＴＡＡＧＴＡＧＴＣＧＡＴＣＧＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴ）について、第１位のＡを除いてＢＬＡＳＴ検索によって相同性検索（同一性；Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を実施すると、糖質分解酵素として最も同一性が高いものは、１，４−ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ［Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＡＴＣＣ２７０２９］であり、その同一性は約５２％（１１／２１アミノ酸配列）である。
【００７１】
ＨＧｃｅｌをコードする塩基配列はα−グルコシダーゼの一部およびセロビオヒドラーゼの一部をコードするユニークな塩基配列であることから、ヨコエビに由来し、かつ、配列番号８に記載の塩基配列のうち連続する５０塩基以上、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１５０塩基以上、さらに好ましくは１８０塩基以上の塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明のセルラーゼである蓋然性がある。
【００７２】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーもしくはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載されている方法に準じて実施することができる（これらの文献の記載は、ここに特に開示として援用される）。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、本発明のセルラーゼをコードする塩基配列を得るための条件を設定することができる。
【００７３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ断片としては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性（同一性）を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡ断片が挙げられる。
【００７４】
配列番号８や配列番号１１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、配列番号８や配列番号１１に記載の塩基配列において１から数個、好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の塩基の欠失、置換および／または付加された塩基配列を含む。
【００７５】
「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落もしくは消失があること、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていること、および、「塩基の付加」とは塩基が付け加えられていることをそれぞれ意味する。
【００７６】
配列番号８や配列番号１１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸を含むタンパク質が本発明のセルラーゼが有するエキソセルラーゼ活性を有するか否かは、例えば、配列番号８や配列番号１１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と薬剤耐性遺伝子とを連結させた組換えベクターを用意し、次いで該組換えベクターを宿主体に導入して形質転換体を製造し、次いで薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で該形質転換体を培養し、次いで該形質転換体や培養液からセルラーゼ活性を有するタンパク質の存在を確認することを含む。
【００７７】
本発明の別の側面によれば、本発明のセルラーゼを用いたグルコースを製造する方法が提供される。本発明のグルコースの製造方法は、結晶性セルロースもしくは非結晶性セルロース、または結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースの両方と本発明のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程を含む限り、特に限定されない。
【００７８】
本発明のグルコース製造方法の具体例としては、特に限定されないが、次の方法が挙げられる。おがくずを洗浄および滅菌処理した後、乾燥させる。次いで、乾燥したおがくずと本発明のセルラーゼを含む酵素調製液とを酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）に加え、２５〜３５℃で数時間から数十時間反応させてセルラーゼ反応液を得る。次いで、セルラーゼ反応液にβ−グルコシダーゼを加えて、β−グルコシダーゼの活性に適した条件で数時間から数十時間反応させてグルコシダーゼ反応液を得る。さらに必要であれば、得られたグルコシダーゼ反応液を乾燥してグルコース固体物や、クロマトグラフィー法などの当業者により通常知られているグルコース分離法または濃縮法を実施してグルコース濃縮液を得てもよい。
【００７９】
本発明の別の側面によれば、本発明のセルラーゼや本発明のグルコースの製造方法を利用したアルコールの製造方法が提供される。本発明のアルコールの製造方法は、結晶性セルロースもしくは非結晶性セルロース、または結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースの両方と本発明のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程、および生成したグルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程を含む限り、特に限定されない。
【００８０】
グルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程は、当業者により通常知られているアルコール発酵法を適用すればよく、特に限定されるものではないが、たとえば、グルコース生成工程により得られた溶液にアルコール発酵に適した酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳ．ｐｏｍｂｅなど）および栄養素を加え、使用する酵母に適した培養条件下で、増殖と発酵を２段階で、または連続的に嫌気的または好気的に培養することにより実施することができる。製造されるアルコールの種類は特に限定はないが、好ましくはエタノールである。
【００８１】
本発明のセルラーゼは、本発明のセルラーゼに適したｐＨ  ５．４〜５．８の緩衝液とともに、グルコース製造用キットとすることができる。ｐＨ  ５．４〜５．８の緩衝液としては、特に限定されないが、たとえば、ｐＨ  ５．４〜５．８の酢酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液などが挙げられる。
【００８２】
本発明のセルラーゼを含むキットは、本発明のセルラーゼとｐＨ  ５．４〜５．８の緩衝液とがそれぞれ個別に包装されていてもよく、それらが混合した状態で存在していてもよい。
【００８３】
本発明のセルラーゼを含むキットの各構成成分のセルロース材料への添加順序は特に限定されないが、それぞれ個装されている場合には、セルロース材料をｐＨ  ５．４〜５．８の緩衝液に加えた後で本発明のセルラーゼを加えてもよいし、本発明のセルラーゼをｐＨ  ５．４〜５．８の緩衝液に加えた後にセルロース材料を加えてもよい。
【００８４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８５】
１．材料および方法
（１）カイコウオオソコエビ（Ｈｉｒｏｎｄｅｌｌｅａ  ｇｉｇａｓ）の捕獲
４個の餌付き仕掛けを取り付けた１１，０００ｍ級のカメラシステム（ＡＳＨＵＲＡ）を用意し、２．５時間、マリアナ海溝（緯度１１°２２．１１’Ｎ、経度１４２°２５．８６’Ｅ、深さ：１０，８９７ｍ）の最深部へ到達するように該餌付き仕掛けを投下した（図４ａおよび４ｂを参照）。端脚類動物（カイコウオオソコエビ）の１８５個体のみが捕獲された。カイコウオオソコエビを−８０℃の急速冷凍庫に保管するか、または、４℃のメタノール：クロロホルム混合液（１：１）中に浸漬した。【００８６】
（２）堆積物のＴＯＣ測定
１００ｍＭ  リン酸ナトリウム／５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を用いて２ｇの乾燥堆積物から全炭素（ＴＣ）を測定し、ＴＣと総無機体炭素との差からＴＯＣを計算した。ＴＣおよびＴＯＣはＩＳＯ８２４５（ＩＳＯ８２４５：１９９９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（２００７）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）に従って、燃焼酸化赤外分光光度法によって測定した。【００８７】
（３）カイコウオオソコエビにおけるグルコースおよび二糖類の含有量
５個体のカイコウオオソコエビを凍結乾燥した後に破砕し、次いで１ｍｌの蒸留水を用いて破砕したカイコウオオソコエビを３度抽出した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して不溶性微粒子を除去した後に、抽出物を１０ＫＤａカット・オフのミクロコン遠心濾過デバイス（ミリポア社、ビレリカ、ＭＡ）を用いて遠心分離し、酵素その他の高分子量成分を除去した。次いで、得られた上清中のグルコース含有量をグルコースＣＩＩキット（和光純薬株式会社）により測定した。マルトース含有量は、１Ｕのα−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母株式会社）と３７℃で１６時間反応させた後に、グルコースの増加量から算出した。セロビオース含有量もまた、１Ｕのβ−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母株式会社）と３７℃で１６時間反応させた後に、グルコースの増加量から算出した。【００８８】
（４）カイコウオオソコエビ抽出物における加水分解酵素活性
破砕したカイコウオオソコエビを、０．５ｍｌの蒸留水を用いて３度抽出した。酵素活性はすべて３０℃で測定した。プロテアーゼ活性は改良アンソンアッセイにより測定した。該アッセイでは、１ユニットの活性は、ハンメルシュタイン・カゼインを加水分解して、ｐＨ  ５．６で１分あたりに１μモルのチロシンと等価の発色を生じるのに必要とされる抽出物の量と定義した（Ｍ．Ｌ．Ａｎｓｏｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２，７９−８９（１９３８）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【００８９】
アミラーゼ活性は、カイコウオオソコエビ抽出物とｐＨ  ５．６で１％（ｗ／ｖ）の可溶性澱粉とをインキュベートした後にヨウ素を用いて検出した。１ユニットの活性は、可溶性澱粉を加水分解して、６２０ｎｍでの吸光度を１分あたり１％減少させる抽出物の量として定義した。【００９０】
セルラーゼ活性は、１％（ｗ／ｖ）のアゾ−ＣＭ−セルロースを用いたセルラーゼ・アッセイ・キット（メガジム社）で測定した。１ユニットは製造業者のプロトコールに従って定義した。ＨＧｃｅｌを精製する間に、カイコウオオソコエビ抽出物のセルラーゼ活性をＣＭＣからのグルコース生成量として測定した。１ユニットのセルラーゼ活性は、ＣＭＣを加水分解して１分間に１μｇのグルコースを生成する量として定義した。【００９１】
マンナナーゼ活性は、ｐＨ  ５．６で０．２％（ｗ／ｖ）  グルコマンナンと反応した後、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）アッセイによって検出した還元糖の量として測定した（Ｍ．Ｇ．Ｌｏｒｅｎｚ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３１，４２６−４２８（１９５９）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。１ユニットは、グルコマンナンを加水分解して、１分間に１μモルの還元糖を生成するのに必要とされるカイコウオオソコエビ抽出物の量として定義した。【００９２】
キシラナーゼ活性はエンド−β−キシラナーゼ・アッセイ・キット（メガジム社）を用いて測定した。１ユニットは、該キットに含まれているコントロールのキシラナーゼ（トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ））の活性から算出した。【００９３】
α−グルコシダーゼ活性は、ｐＨ  ５．６で１％（ｗ／ｖ）  マルトースを基質として生成したグルコース量として測定した。１ユニットは、ｐＨ  ５．６でマルトースを分解して、１分間に１μモルのグルコースを生成する量として定義した。【００９４】
すべての酵素活性は試料溶液のタンパク質含有量に基づいて計算した。タンパク質は標準物質としてウシ血清アルブミンを使用した、ブラッドフォード・アッセイによって測定した（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４（１９７６）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【００９５】
（５）オリゴ糖のＴＬＣ分析
可溶性澱粉（１．０％（ｗ／ｖ））とカイコウオオソコエビ抽出物とを５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）に加え、４０℃にてインキュベートした。間隔をあけて得た試料を５分間沸騰させた。生成物を、ブタノール／酢酸／水（２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））溶媒を用いたＴＬＣにより分析した。「Ｓ」はマルトオリゴ糖またはセロオリゴ糖を表す（図２）。【００９６】
（６）おがくずを基質として使用した試験
安達製材工場（Ａｄａｃｈｉ  Ｓａｗｍｉｌｌ）から購入したライブ・オークのおがくずを水で２度洗浄し、１２１℃で１５分間オートクレーブし、ＤＤＷで２度洗浄した後に、室温にて空気中で乾燥した。乾燥おがくずを５％（ｗ／ｖ）の濃度で酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）中に懸濁し、次いで３５℃にて酵素調製物とともにインキュベートした。おがくずの分解率は、反応混合物の水相中にあるグルコース濃度およびセロビオース濃度を測定することにより算出した。なお、カルボキシメチルセルロースおよびおがくずのいずれを基質とした場合においても同一の酵素量を用いて実験した。【００９７】
（７）ＨＧｃｅｌの精製
５０ｍｌチューブに加えたカイコウオオソコエビの１０個体を破砕せずに、２００μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライ社）を含む２０ｍｌのＤＤＷに加え、４℃にて１４時間、緩やかに震盪させながらインキュベートした。【００９８】
カイコウオオソコエビ  １０個体を５０ｍｌチューブに入れ、２００μｌのプロテアーゼ阻害剤混合液を含む２０ｍｌの滅菌蒸留水を加え、４℃にて１４時間振盪した。上清を遠心分離（１０００ｘｇ、１０分、４℃）にて取得した。残ったカイコウオオソコエビに再度、１００μｌのプロテアーゼ阻害剤混合液を含む１０ｍｌの滅菌蒸留水を加えて氷上にて撹拌し、上清を遠心分離（１０００ｘｇ、１０分、４℃）することにより取得した。本操作を２回繰り返し、得られた上清を一つに合わせて、上清混合液を得た。【００９９】
飽和硫酸アンモニウムを回収した上清混合液に加え、最終濃度を３０％（ｗ／ｖ）とした。氷上で３０分間インキュベートした後、抽出物を遠心分離（８，０００ｘｇ、３０分間、４℃）した後に、上清を回収した。次いで回収した上清を６０％  硫酸アンモニウムに調整し、次いで氷上で３分間インキュベートした。セルラーゼ活性を示す沈殿物を遠心分離（８，０００ｘｇ、３０分間、４℃）して回収し、２ｍｌのＤＤＷ中に懸濁した。２ｍｌの等分分画を脱塩し、次いでアミコン・ウルトラ  ５０Ｋ（ミリポア社）を使用して、５０μｌにまで濃縮した。次いで、５０μＬの酵素濃縮物を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）（アマルシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いて平衡化した１ｍｌのハイトラップＭｏｎｏ−Ｑセファロース陰イオン交換カラム（東ソー株式会社）へアプライし、次いで０．１ＭのＮａＣｌのインクリメントを含む３ｍｌの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）で連続的に溶出し、最終塩濃度を０．６Ｍとした。【０１００】
セルラーゼ活性を０．５Ｍ  ＮａＣｌ分画内で検出し、この分画をＤＤＷで希釈し、アミコン・ウルトラ  ５０Ｋを用いて５０μＬにまで濃縮した。濃縮物を上記した平衡化したカラムへアプライし、上記したとおりに溶出したが、最終塩濃度は０．５Ｍとした。セルラーゼ含有画分を回収し、ＤＤＷで洗浄し、アミコン・ウルトラ  ５０Ｋを用いて５０μＬにまで濃縮し、次いでＤＥＡＥ−トーヨーパール陰イオン交換カラム（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．６））に通した。カラムを０〜０．６Ｍ  ＮａＣｌで０．２Ｍごとに連続して溶出した。セルラーゼ活性は、１％（ｗ／ｖ）のＣＭＣ（ｐＨ  ５．６）と反応させた後に生成したグルコースの量によって測定した。最終酵素調製物の純度および分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した（図３ａ）。【０１０１】
（８）ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅および配列決定
端脚類動物（カイコウオオソコエビ）を回収してクロロホルムに浸漬した。ＤＮＡをＤＮイージー・血液＆組織キット（キアゲン社）を使用して、製造業者の指示に従って、１ｇの該端脚類動物から抽出した。細菌および古細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、共通プライマー対「Ｂａｃ２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号１）」および「Ｂａｃ１４９２ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列番号２）」、または「Ａｒｃｈ２１Ｆ（５’−ＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＣＣＹＧＣＣＧＧＡ−３’）（配列番号３）」および「Ａｒｃｈ９５８Ｒ（５’−ＹＣＣＧＧＣＧＴＴＧＡＭＴＣＣＡＡＴＴ−３’）（配列番号４）」の組み合わせを使用することにより、ＰＣＲに供した。ＰＣＲ増幅（２５μｌの反応系）を、スピードスター−ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いてジーン・アンプ  ＰＣＲシステム９７００（アプライド・バイオシステムズ社）を使用して実施し、緩衝液を酵素とともに供給した。【０１０２】
ＰＣＲの条件は次のとおりとした：９６℃にて３０秒間の開始インキュベーション；９８℃にて５秒間を３０サイクル；５５℃にて１０秒間のインキュベーション；７２℃にて１５秒間のインキュベーション；および７２℃にて２分間の最終延長工程。【０１０３】
ＰＣＲ生成物を１％  アガロースゲル電気泳動によって分析し、エキソヌクレアーゼＩ（ＵＳＢ社）および小エビのアルカリンフォスファターゼ（ＳＡＰ、プロメガ社）を用いて、３７℃にて２０分間エキソ−ＳＡＰ分解で精製し、次いで８０℃にて３０分間処理して、酵素を不活性化した。メガＢＡＣＥ  １０００（アマルシャム・バイオサイエンス社）自動シークエンサーにより、上記のプライマーおよびＤＹＥナミック・ＥＴ・ダイ・ターミネーター試薬（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社）を用いてＰＣＲ生成物の配列を決定した。シークエンチャー  ３．７ソフトウェア（ジーン・コード株式会社）を使用して、ヌクレオチド配列をトリミングし、アッセンブルし、および翻訳した。【０１０４】
（９）精製ＨＧｃｅｌのアミノ酸シークエンシング解析
端脚類動物（カイコウオオソコエビ）の１０個体に由来するＨＧｃｅｌを部分的に精製した（上記のとおりに、６０％  硫酸アンモニウム沈澱、およびその後のＤＥＡＥトーヨーパール陰イオン交換クロマトグラフィー）。セルラーゼ含有画分を回収およびプールし、次いで脱塩および濃縮した。セルラーゼ調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシー・ブリリアント・ブルー  Ｒ−２５０（シグマ・オールドリッチ社）でゲルを染色することにより視覚化した。観察された単一の５９ｋＤａのバンドをゲルから切り出し、トリプシン処理した。処理後のペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＨＰＬＣ：パラダイムＭＳ２、ミクローム・バイオリソース社；ＭＳ：Ｑ−Ｔｏｆ２、ウォータース・マイクロマス）を使用して解析した。ＭＳ（質量分析）のデータはすべて、マスコット・サーバー（マトリックス・サイエンス株式会社）を使用して解析した。【０１０５】
（１０）精製ＨＧＣｅｌによるコピー用紙からのグルコース生産
コピー用紙片  ３．８ｍｇに０．２８ＵのＨＧＣｅｌを含む酵素調製液を滴下した後、風乾した。室温（２５℃）にて１５時間反応させた後、グルコースＣＩＩキット試薬（和光純薬工業株式会社）を用いてグルコースの生成量を測定した。【０１０６】
２．結果
（１）カイコウオオソコエビの捕獲
カイコウオオソコエビの海洋最深部での生育態様を観察するために、チャレンジャー海淵内にカメラ・システム「アシュラ（ＡＳＨＵＲＡ）」を用いて１０，０００ｍ級の自由落下−堆積物試料採取器を下降させ、カイコウオオソコエビを観察した。また、餌付き仕掛けを用いてカイコウオオソコエビを捕獲した（１１°２２．１１’Ｎ、１４２°２５．８６’Ｅ、深さ：１０，８９７ｍ）。その結果、本発明者らは、３時間の間に１８５個体を捕獲するのに成功した。【０１０７】
カイコウオオソコエビは捕獲し得た唯一の生物体であり（図１ａを参照）、捕獲したものは長さ２〜５ｃｍであり、かつ、乾燥質量で０．３〜０．６ｇであった（図１ｂを参照）。【０１０８】
（２）カイコウオオソコエビ体内の加水分解酵素
カイコウオオソコエビが合成する加水分解酵素について、カイコウオオソコエビを破砕して得た抽出物を用いて、それぞれの基質を含む寒天平板上に形成されたハローを観察することにより確認した。デンプン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、グルコマンナン、およびキシランを基質として含む寒天平板上でハローを確認することができた（図１ｃを参照）。アミラーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、α−グルコシダーゼおよびプロテアーゼの各活性を、任意に選択したカイコウオオソコエビの５個体を用いて測定した（表１を参照）。
【表１】
2013133354.tif 000003
【０１０９】
個体間差として、１．５〜５倍の活性の相違を確認した。これらの多糖類ヒドロラーゼは、木質由来のセルロースやヘミセルロースを資化することに使用されると考えられる（Ｂ．Ｇｏｏｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，１３３−１６２（１９９７）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。上記酵素が検出されたのとは対照的に、リグナーゼ活性は検出されなかった。さらに、仕掛けで使用された餌の酵素活性もまた検出されなかった。【０１１０】
（３）加水分解酵素の反応生成物
破砕したカイコウオオソコエビの８０％  飽和硫酸アンモニウム沈殿物を粗酵素として使用して、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により基質分解生成物を測定した。粗酵素におけるアミラーゼ活性により、３０℃にて、ジャガイモ澱粉からグルコース、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースを生成した（図１ｄを参照）。粗酵素におけるマンナナーゼ活性により、グルコマンナンを分解して、多くの低分子量多糖類を生成した。グルコマンナンの消化パターンは典型的なエンド型多糖類ヒドロラーゼの特性を示していた（図１ｅを参照）。ガラクトマンナンおよびカードランについては検出できなかった。【０１１１】
（４）粗酵素としてのカイコウオオソコエビ抽出物の至適ｐＨ
カイコウオオソコエビ抽出物は、ｐＨ  ５．２〜６．０の間に最大の触媒活性があり、ｐＨ  ８．０では活性が失われた（図１ｇを参照）。チャレンジャー海淵がｐＨ  ８．０であることからすると、上記結果は、これらの多糖類ヒドロラーゼがカイコウオオソコエビの体内において活性があることを示唆する。さらに、木質をセルロースおよびヘミセルロースへ加水分解する酵素活性の能力は、カイコウオオソコエビが海淵の最深部において、木質から栄養素を引き出す蓋然性を強く示唆する。【０１１２】
（５）カイコウオオソコエビ体内のオリゴ糖組成
上記仮説を検証するために、カイコウオオソコエビ体内のオリゴ糖組成を測定した。カイコウオオソコエビの２個体はグルコースおよび二糖類を含み、体内に多糖類ヒドロラーゼ活性があることが証明された（図２ａ）。平均グルコース含有量は、０．４３±０．１％（ｗ／ｗ）（乾燥質量）（ｎ＝５）であったが、二糖類含有量は大きな個体間差が見られた。そこで、３０個体のカイコウオオソコエビを用いて、体内の二糖類の組成を測定したところ、マルトースおよびセロビオースの含有量はそれぞれグルコース含有量の３５％および１７％であった（図２ｂを参照）。【０１１３】
（６）カイコウオオソコエビ抽出物由来の精製酵素であるＨＧｃｅｌの性状
１０個体のカイコウオオソコエビから新規セルラーゼであるＨＧｃｅｌを精製した。ＨＧｃｅｌの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより５９ｋＤａであると判明した（図３ａおよび図５を参照）。セルロースを加水分解するセルラーゼ活性の至適ｐＨは５．６であった（図３ｂを参照）。また、セルラーゼ活性はｐＨ  ７．８（海底と同一のｐＨ）では検出されなかった。ｐＨ  ５．６における至適温度は２５〜３５℃であった（図３ｃを参照）。驚くべきことに、酵素は４℃条件下でも活性の２０％以上を維持し、３５℃で最も安定していた。さらに、４０℃を超えると活性は消失し始めた（図３ｃを参照）。【０１１４】
酵素のＮ末端がブロックされていたので、トリプシン性ペプチドを用いた質量分析法によってＨＧｃｅｌの内部アミノ酸配列を決定した。３種のペプチド、すなわちＰ１、Ｐ２およびＰ３のアミノ酸配列を、それぞれＴＰＰＭＧＷＬＡＷＥＲ（配列番号５）、ＳＱＭＡＬＷＡＩＭＡＡＰＬＦＭＳＮＤＬ（配列番号６）およびＡＶＩＡＶＮＱＤＰＬＧＩＱＧＲ（配列番号７）であることを確認した。Ｐ１およびＰ２の配列は種々のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのものと同一の配列であった［それぞれ、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（アセッションＮｏ．ＸＰ＿００１１１７３４２）、ナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ様タンパク質（アセッションＮｏ．ＸＰ＿００１１１７３４２）およびクロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｖｉｒｉｌｉｓ）のＧＨＦ３１（アセッションＮｏ．ＸＰ＿００２０５９８８１．１）（Ａ．Ｇ．Ｃｌａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４５０，２０３−２１８（２００７）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）］。Ｐ３配列とα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの配列をアラインメントしたところ、これらの間に１個もしくは２個の欠失またはミスマッチがあることが判明した（Ｚ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，２０３１３−２０３１８（２００３）を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【０１１５】
ＨＧｃｅｌは２：１のモル比でＣＭＣからグルコースおよびセロビオースを生成し、さらに結晶性セルロースを分解してグルコースおよびセロビオースを生成した（図３ｄ、ｅを参照）。さらにＨＧｃｅｌはセロトリオースより大型のセロオリゴマーを分解し、グルコースを生成した（図３ｆを参照）。【０１１６】
ＨＧｃｅｌはセロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースを加水分解してグルコースを生成し、かつ、これらの還元末端をｐ−ニトロフェニルとカップリングさせた；ｐ−ニトロフェノールの吸光度は検出されなかった（図３ｇを参照）。【０１１７】
以上の結果から、ＨＧｃｅｌは新規なエキソ型のセルラーゼであり、セルロースの非還元末端を加水分解して、グルコースおよびセロビオースを生成し得る活性を有することが確認された。ＨＧｃｅｌの加水分解様式は、草食性動物または微生物のエンド−β−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）、およびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）のものと異なる（Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３９４，３３０−３３１（１９９８）およびＨ．  Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８，１１６７−１１７８（２００１）．を参照、該文献の記載はここに開示として援用される）。【０１１８】
ＨＧｃｅｌの酵素活性は、カイコウオオソコエビの生息環境に近い高静水圧条件下（２℃にて１００ＭＰａ）で増加した（図３ｈを参照）。また、ＨＧｃｅｌは、３５℃にて、非結晶性セルロースであるＣＭＣだけでなく、結晶性セルロースであるおがくずもまたグルコースへ分解した（図３ｉを参照）。ＨＧｃｅｌによるおがくずを基質とした場合のグルコースおよびセロビオースの生成モル比は、ＣＭＣを基質とした場合と同じく、２：１であった。しかし、おがくずからのグルコースの生成量は、ＣＭＣからの生成と比較して約１／５程度であった。【０１１９】
ＰＣＲを利用してカイコウオオソコエビから細菌、古細菌または真核生物のｒＤＮＡを検出することを試みた。しかしながら、明らかなＰＣＲシグナルを検出できなく、カイコウオオソコエビから微生物を単離することはできなかった（図６を参照）。このことから、ＨＧｃｅｌはカイコウオオソコエビの内因性生産物であると結論付けられる。超深海域の高静水圧が他の生物体の生育に対しての障壁となっていると推測される。【０１２０】
（７）ＨＧｃｅｌによるコピー用紙およびおがくずからのグルコース生産
０．２８ＵのＨＧｃｅｌを含む酵素調製液を用いて３．８ｍｇのコピー用紙片から生成されたグルコース量は０．８２μｇであった。また、ＨＧｃｅｌ酵素溶液をコピー用紙に滴下し（図７ａを参照）、室温（２５℃）で１５時間おいて加水分解反応に供したところ、滴下した箇所を中心にグルコースが生産されていることが、グルコースＣＩＩキット試薬を用いたピンク色の呈色により確認できた（図７ｂを参照）。同様にＨＧｃｅｌ酵素溶液中におがくずを加えて加水分解反応に供したところ、グルコース生成による呈色が確認できた（図７ｃを参照）。これらの結果から、ＨＧｃｅｌを含む酵素溶液を用いれば、セルロース固形材料からグルコースを生産できることが示された。【０１２１】
（８）ＨＧｃｅｌの塩基配列の取得
配列表の配列番号５〜７に記載のアミノ酸配列の情報に基づいて混合塩基プライマー（配列表の配列番号１２〜１７）を作成した。すなわち、配列番号５（ＴＰＰＭＧＷＬＡＷＥＲ）のアミノ酸配列に対してＰｒｉｍｅｒ  ２１１−Ｆ（ＡＣＮＣＣＮＣＣＮＡＴＧＧＧＮＴＧＧＹＴＮＧＣＮＴＧＧＧＡ：配列番号１２）およびＰｒｉｍｅｒ  ２１１−Ｒ（ＴＣＣＣＡＮＧＣＮＡＲＣＣＡＮＣＣＣＡＴＮＧＧＮＧＧＮＧＴ：配列番号１３）を作成し；配列番号６（ＳＱＭＡＬＷＡＩＭＡＡＰＬＦＭＳＮＤＬＲ）のアミノ酸配列に対して、Ｐｒｉｍｅｒ  ２１２−Ｆ（ＡＴＧＧＣＮＹＴＮＴＧＧＧＣＮＡＴＨＡＴＧＧＣＮＧＣＮＣＣＮＹＴＮＴＴＹＡＴＧ：配列番号１４）およびＰｒｉｍｅｒ  ２１２−Ｒ（ＣＡＴＲＡＡＮＡＲＮＧＧＮＧＣＮＧＣＣＡＴＤＡＴＮＧＣＣＣＡＮＡＲＮＧＣＣＡＴ：配列番号１５）を作成し；ならびに、配列番号７（ＡＶＩＡＶＮＱＤＰＬＧＩＱＧＲ）のアミノ酸配列に対してＰｒｉｍｅｒ  ２２−Ｆ（ＧＣＮＧＴＮＡＴＨＧＣＮＧＴＮＡＡＹＣＡＲＧＡＹＣＣＮＹＴＮＧＧＮＡＴＨＣＡＲＧＧ：配列番号１６）およびＰｒｉｍｅｒ  ２２−Ｒ（ＣＣＹＴＧＤＡＴＮＣＣＮＡＲＮＧＧＲＴＣＹＴＧＲＴＴＮＡＣＮＧＣＤＡＴＮＡＣＮＧＣ：配列番号１７）を作成した。【０１２２】
次いで、深海性ヨコエビより全ＲＮＡを取得し、クロンテックのＳＭＡＲＴｅｒ  ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを作成した。次いで、作成したｃＤＮＡをテンプレートとして混合塩基プライマーとｄＴ２０を用いてＰＣＲを行い、ＴＡクローニングし、取得したクローンの遺伝子配列を決定および選択した。その結果、得られた塩基配列が配列番号１１に記載の塩基配列である。配列番号１１に記載の塩基配列のうち、ヨコエビ由来の塩基配列と推定されるものが配列番号８に記載の塩基配列であった。取得した塩基配列はセルラーゼ遺伝子の一部であり、分子量からｍａｔｕｒｅ配列は約２ｋｂと推定された。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
セルロースは地球上で最も多い炭化水素の一種であり、バイオエタノールを製造するための原材料として期待されている。しかし、セルロースをバイオエタノールの原材料とするためには、予めセルロースをグルコースへと変換する必要がある。従前はこの変換を３種の加水分解酵素により実施していた。さらに、天然セルロースをなんら処理しないまま酵素処理するのは困難であった。【０１２４】
しかし、本発明のセルラーゼによれば、本発明のセルラーゼ以外の酵素を用いることなく、天然セルロースをグルコースへと変換することができる。したがって、本発明のセルラーゼは、バイオエタノールの工業的生産に資する有用な酵素である。
【図１ａ】
2013133354.tif 000004
【図１ｂ】
2013133354.tif 000005
【図１ｃ】
2013133354.tif 000006
【図１ｄ】
2013133354.tif 000007
【図１ｅ】
2013133354.tif 000008
【図１ｆ】
2013133354.tif 000009
【図１ｇ】
2013133354.tif 000010
【図２ａ】
2013133354.tif 000011
【図２ｂ】
2013133354.tif 000012
【図３ａ】
2013133354.tif 000013
【図３ｂ】
2013133354.tif 000014
【図３ｃ】
2013133354.tif 000015
【図３ｄ】
2013133354.tif 000016
【図３ｅ】
2013133354.tif 000017
【図３ｆ】
2013133354.tif 000018
【図３ｇ】
2013133354.tif 000019
【図３ｈ】
2013133354.tif 000020
【図３ｉ】
2013133354.tif 000021
【図４ａ】
2013133354.tif 000022
【図４ｂ】
2013133354.tif 000023
【図５】
2013133354.tif 000024
【図６】
2013133354.tif 000025
【図７ａ】
2013133354.tif 000026
【図７ｂ】
2013133354.tif 000027
【図７ｃ】
2013133354.tif 000028
【配列表】
2013133354000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月12日(2014.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、カイコウオオソコエビ（Ｈｉｒｏｎｄｅｌｌｅａ  ｇｉｇａｓ）に由来するセルラーゼ。
【請求項２】
結晶性セルロースを加水分解して副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項３】
非結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成する活性を有し、かつ、結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコースの量が非結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコース量の１／１００以上である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項４】
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．６）において３５℃で５時間である反応条件下で、５％（ｗ／ｖ）  おがくずを加水分解して主生成物として１μｇ／ｍＬ以上のグルコースを生成する活性を有する、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項５】
主生成物であるグルコースおよび副生成物であるセロビオースのモル比は１．５：１〜２．５：１である、請求項２に記載のセルラーゼ。
【請求項６】
前記結晶性セルロースがおがくず、紙、繊維、木材およびアビセル、ならびに植物の茎、根、花および葉からなる群から選ばれる、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項７】
前記非結晶性セルロースがカルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、およびセルロースキサントゲン酸ナトリウムからなる群から選ばれる、請求項３に記載のセルラーゼ。
【請求項８】
前記セルラーゼは分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５５，０００〜６３，０００である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項９】
前記セルラーゼは至適ｐＨが５．４〜５．８である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項１０】
前記セルラーゼは至適温度が２５〜４０℃である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項１１】
配列表の配列番号８に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成するエキソセルラーゼ活性を有するセルラーゼ。
【請求項１２】
結晶性セルロースおよび／または非結晶性セルロースと請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程を含む、
グルコースの製造方法。
【請求項１３】
結晶性セルロースおよび／または非結晶性セルロースと請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程、および
生成したグルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程を含む、
アルコールの製造方法。
【国際調査報告】
2013133354.tif 000029
2013133354.tif 000030
2013133354.tif 000031
2013133354.tif 000032
2013133354.tif 000033