(57)【要約】本発明は、目的のタンパク質以外の翻訳領域が充分に短く、かつ高い翻訳効率で回転式タンパク質翻訳を行うために好適な環状ＲＮＡ、及び当該環状ＲＮＡを鋳型としたタンパク質の製造方法を提供する。具体的には、タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上の３の倍数であり、少なくとも１の開始コドンを有しており、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含んでいない環状ＲＮＡを提供する。また、真核細胞の発現系において、前記記載の環状ＲＮＡを鋳型として、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させる、タンパク質の製造方法も提供する。
2013118878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上の３の倍数であり、少なくとも１の開始コドンを有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含んでいない、環状ＲＮＡ。
【請求項２】
全長の塩基数が５６１以下である、請求項１に記載の環状ＲＮＡ。
【請求項３】
前記開始コドンの上流にＫｏｚａｋ配列を有する請求項１又は２に記載の環状ＲＮＡ。
【請求項４】
真核細胞の発現系において、請求項１〜３のいずれか一項に記載の環状ＲＮＡを鋳型として、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させる、タンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の環状ＲＮＡを真核細胞に導入する、又は請求項１〜３のいずれか一項に記載の環状ＲＮＡを真核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させる請求項４に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
前記真核細胞が哺乳細胞である、請求項４又は５に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上３６０以下の３の倍数であり、少なくとも一つの原核細胞由来のリボソームが認識するリボソーム結合部位と、前記リボソーム結合部位の下流１〜２０塩基以内に一つの開始コドンを有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有していない、環状ＲＮＡ。
【請求項８】
原核細胞の発現系において、請求項７に記載の環状ＲＮＡを鋳型として、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させる、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ＲＮＡを用いて回転式タンパク質翻訳を行うことにより、繰り返し配列を有する長鎖タンパク質を製造する方法、及び当該方法に用いる環状ＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
終止コドンを持たない環状ＲＮＡを鋳型として回転式タンパク質翻訳（翻訳により、終わりのないペプチドリピート構造を有するタンパク質を合成する方法、ローリングサークル翻訳ともいう）を行うことにより、理論上無限鎖長の、繰り返し配列を有するタンパク質（タンパク質リピート）を合成できる。通常の翻訳系の場合、タンパク質合成の律速段階は、リボソームがＲＮＡを認識して結合し、ペプチド伸長が開始するまでの開始段階である。【０００３】
例えば、非特許文献１には、大腸菌無細胞翻訳系を用いた環状ＲＮＡの翻訳反応により、タンパク質リピートを合成している。具体的には、ＳＤ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列−開始コドン（ＡＵＧ）−ＤＢ（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｘ）配列の下流に、タンパク質のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を配した環状ＲＮＡを鋳型として、回転式タンパク質翻訳を行っている。【０００４】
真核細胞の翻訳系では、翻訳反応の開始において、様々な翻訳因子がｍＲＮＡの５’末端にあるキャップ構造及び３’末端にあるポリＡ鎖に結合して形成された複合体を、リボソームが認識し結合することによって、翻訳反応が開始する。このため、キャップ構造及びポリＡ鎖を有さない環状ＲＮＡを鋳型とした場合には、これらの構造の代替として機能し得るリボソーム結合部位（リボソームが認識し結合し得る構造）が必要であると考えられていた。そこで、例えば非特許文献２及び特許文献１では、ウサギ網状赤血球由来の無細胞翻訳系を用いた回転式タンパク質翻訳反応において、開始コドンの上流にウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ；Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）を配置した環状ＲＮＡを鋳型としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第１９９７／０７８２５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Perriman, R. and Ares, M., RNA (1998), Vol. 4, pp.1047-1054
【非特許文献２】Sarnow, P. and Chen, C., Science (1995), Vol. 268, pp.415-417
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に記載の方法では、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のタンパク質リピート（ポリＧＦＰ）を合成しているが、環化前の直線ＲＮＡよりも翻訳効率が悪く、さらなる改善を要する。また、スプライシング反応を利用して環状ＲＮＡを調製しているため、環状ＲＮＡの合成自体が非常に複雑であるという問題もある。さらに、大腸菌体内のみで実現しており、動物細胞内での応用例はない。【０００８】
一方、非特許文献２及び特許文献１に記載の方法では、鋳型である環状ＲＮＡが約５００塩基長もあるＩＲＥＳを有しているため、環状ＲＮＡのサイズが大きくなってしまう上に、ＩＲＥＳ部分も翻訳されるため、目的以外のタンパク質翻訳物が生ずるという問題がある。また、安全面での問題が懸念されるため、ＩＲＥＳ配列を含む環状ＲＮＡは医療応用には適さないという問題もある。さらに、非特許文献１に記載の方法と同様、無細胞翻訳系のみで実現しており、動物細胞内での応用例の記載はない。【０００９】
本発明は、目的のタンパク質以外の翻訳領域が充分に短く、かつ高い翻訳効率で回転式タンパク質翻訳を行うために好適な環状ＲＮＡ、及び当該環状ＲＮＡを鋳型としたタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、回転式タンパク質翻訳において、鋳型とする環状ＲＮＡの塩基長を特定の範囲内にすることにより、翻訳効率を飛躍的に改善し得ること、また、真核細胞の翻訳系においても、ＩＲＥＳを有さない環状ＲＮＡを鋳型とした場合であっても、目的の繰り返し配列を有する長鎖タンパク質を合成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明の環状ＲＮＡ及びタンパク質の製造方法は下記［１］〜［８］の構成をとる。
［１］  タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上の３の倍数であり、少なくとも１の開始コドンを有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含んでいない、環状ＲＮＡ。
［２］  全長の塩基数が、５６１以下である、前記［１］に記載の環状ＲＮＡ。
［３］  前記開始コドンの上流にＫｏｚａｋ配列を有する前記［１］又は［２］に記載の環状ＲＮＡ。
［４］  真核細胞の発現系において、前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の環状ＲＮＡを鋳型として、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させる、タンパク質の製造方法。
［５］  前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の環状ＲＮＡを真核細胞に導入する、又は前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の環状ＲＮＡを真核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させる前記［４］に記載のタンパク質の製造方法。
［６］  前記真核細胞が哺乳細胞である前記［４］又は［５］に記載のタンパク質の製造方法。
［７］  タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上３６０以下の３の倍数であり、少なくとも一つのＩＲＥＳと、前記ＩＲＥＳの下流１〜２０塩基以内に一つの開始コドンを有しており、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有していない、環状ＲＮＡ。
［８］  原核細胞の発現系において、前記［７］に記載の環状ＲＮＡを鋳型として、当該環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を発現させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の環状ＲＮＡ及びこれを鋳型として用いた本発明のタンパク質の製造方法により、目的の繰り返し配列を有する長鎖のタンパク質を効率よく合成することができる。特に、ヒト細胞内においても環状ＲＮＡを鋳型とした回転式タンパク質翻訳が実施できることは、本発明によって初めて可能となったものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、合成された環状ＲＮＡの合成スキームを模式的に示した図である。
【図２】実施例１において、Ｌ１２６の合成のためのリガーゼ反応後の反応物の変性ＰＡＧＥの結果に得られた核酸染色像である。
【図３】実施例１において、Ｃ１２６の合成のためのリガーゼ反応後の反応物を電気泳動した後、核酸染色した染色像である。
【図４】実施例１において、Ｌ８４の合成のためのリガーゼ反応後の反応物を電気泳動した後、核酸染色した染色像である。
【図５】実施例１において、Ｃ８４、Ｃ１６８、Ｃ１２６、及びＣ２５２の合成のためのリガーゼ反応後の反応物を電気泳動した後、核酸染色した染色像である。
【図６】実施例１において、Ｌ１２６、Ｌ１２６＋ｓｔｏｐ、Ｃ１２６、及びＣ１２６＋ｓｔｏｐを鋳型とした無細胞翻訳反応の反応液の電気泳動の結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図７】実施例１において、Ｃ８４、Ｃ１２６、Ｃ１６８、及びＣ２５２を鋳型とした無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図８】実施例２において、精製後の環化体を電気泳動した後、核酸染色した染色像である。
【図９】実施例２において、精製後の環化体を電気泳動した後、核酸染色した染色像である。
【図１０】実施例２において、精製後の環化体を電気泳動した後、核酸染色した染色像である。
【図１１】実施例２において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図１２】実施例２において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図１３】実施例２において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図１４】実施例２において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図１５】実施例３において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドの染色像である。
【図１６】実施例４において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質及びアクチンタンパク質のバンドの染色像である。
【図１７】実施例５において、無細胞翻訳反応の反応液を電気泳動した結果得られた、ＦＬＡＧを含むタンパク質及びアクチンタンパク質のバンドの染色像である。
【図１８】実施例６において、１０倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡観察を行った結果を示したものである。
【図１９】実施例６において、６０倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡観察を行った結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［真核細胞の翻訳系用の環状ＲＮＡ］
本発明の環状ＲＮＡのうち、真核細胞の翻訳系において回転式タンパク質翻訳の鋳型となる環状ＲＮＡ（以下、「本発明の真核細胞用環状ＲＮＡ」ということがある）は、タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上の３の倍数であり、少なくとも１の開始コドンを有しており、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにＩＲＥＳを含んでいないことを特徴とする。ＩＲＥＳとは、キャップ構造の代替として機能し得るリボソーム結合部位をいう。ＩＲＥＳを有していない環状ＲＮＡを鋳型とした場合に動物細胞翻訳系において回転式タンパク質翻訳が可能であることや、無細胞系ではなく、動物細胞内で回転式タンパク質翻訳が起こることは、本発明者らによって初めて明らかにされた。
【００１５】
ＩＲＥＳを必須とする環状ＲＮＡの場合、必要な環のサイズが２５６塩基（ＩＲＥＳの全長）ほど大きくなってしまうが、環状ＲＮＡの大きさがあまりに大きくなりすぎると、分解等の影響を受けやすくなり、環状ＲＮＡの安定性が低下してしまうおそれがある。さらに、ＩＲＥＳも翻訳されてしまう結果、目的のタンパク質以外の領域を多く含むタンパク質リピートが合成されてしまう。
【００１６】
これに対して本発明の真核細胞用環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ等のキャップ構造の代替として機能し得るリボソーム結合部位を必要とせず、合成する目的のタンパク質をコードする領域以外の配列を最小化することができる。このため、本発明の真核細胞用環状ＲＮＡを鋳型とした場合、翻訳されたタンパク質中の目的のタンパク質以外の領域を少なくすることができる。例えば、目的のタンパク質をコードする領域の末端同士を環状に連結するための１〜１０塩基のリンカーを有しているだけの環状ＲＮＡや、合成する目的のタンパク質のＯＲＦのみからなるであっても、全長の塩基数が１０２以上の３の倍数であり、かつ少なくとも１の開始コドンを有している限り、回転式タンパク質翻訳の鋳型として機能し得る。
【００１７】
本発明の真核細胞用環状ＲＮＡの全長の塩基数は、１０２以上の３の倍数である。全長の塩基数が３の倍数であるため、翻訳時に読み枠がずれることがない。また、環状ＲＮＡの全長が短すぎる場合には、翻訳反応の鋳型として機能しない場合もあるが、本発明においては、全長の塩基数が１０２以上であるため、回転式タンパク質翻訳の鋳型として機能し得る。本発明の真核細胞用環状ＲＮＡの全長の塩基数の上限値は、回転式タンパク質翻訳の鋳型として機能可能な長さであれば特に限定されるものではないが、翻訳効率がより高いため、５６１以下であることが好ましく、５０１以下であることがより好ましく、４５０以下であることがさらに好ましく、４０２以下であることがよりさらに好ましい。
【００１８】
本発明の真核細胞用環状ＲＮＡは、目的のタンパク質を発現させるための開始コドン（例えば、ＡＵＧ）を少なくとも１つ有している。合成されるタンパク質リピートの均質性の点からは、本発明の真核細胞用環状ＲＮＡが有する開始コドンは１つのみであることが好ましいが、同じ読み枠の開始コドンが２以上あってもよい。同じ読み枠の場合、それぞれの開始コドンから合成されるタンパク質リピートは、Ｎ末端部が相違するものの、同じタンパク質が繰り返し合成されているためである。一方で、目的のタンパク質を発現させるための開始コドンとは異なる読み枠のＡＵＧが存在する場合、目的のタンパク質以外のタンパク質リピートも翻訳されてしまうため、この場合には、異なる読み枠のＡＵＧが存在しないようにコドンを改変することが好ましい。
【００１９】
本発明の真核細胞用環状ＲＮＡは、目的のタンパク質を発現させるための開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有していない。このため、理論上無限鎖長のタンパク質リピートを合成できる。なお、目的のタンパク質を発現させるための開始コドンとは異なる読み枠の終止コドンは、有していてもよい。
【００２０】
また、翻訳効率を向上させることができるため、目的のタンパク質を発現させるための開始コドンの上流に、Ｋｏｚａｋ配列を有することも好ましい。Ｋｏｚａｋ配列の具体的な塩基配列は、発現させるタンパク質をコードする領域の塩基配列、翻訳系の真核細胞の生物種等を考慮して適宜決定することができる。
【００２１】
［原核細胞の翻訳系用の環状ＲＮＡ］
本発明の環状ＲＮＡのうち、原核細胞の翻訳系において回転式タンパク質翻訳の鋳型となる環状ＲＮＡ（以下、「本発明の原核細胞用環状ＲＮＡ」ということがある）は、タンパク質をコードし、全長の塩基数が１０２以上３６０以下の３の倍数であり、１の原核細胞由来のリボソームが認識するリボソーム結合部位と、前記リボソーム結合部位の下流１〜２０塩基以内に少なくとも１の開始コドン（例えば、ＡＵＧ）を有しており、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有していないことを特徴とする。全長の塩基数が１０２以上３６０以下であることにより、原核細胞の翻訳系において、翻訳効率を顕著に高めることができる。
【００２２】
全長の塩基数が上記範囲内であることによって翻訳効率が高められる理由は明らかではないが、リボソームのＲＮＡに対する結合領域が３０〜４０塩基であることから、本発明の原核細胞用環状ＲＮＡには、１の環状ＲＮＡにリボソームが１個のみ結合し、翻訳が起こっていると推察される。１の環状ＲＮＡにリボソームが１個のみ結合するシングルリボソームのタンパク質合成により、ポリリボソームで起こる、リボソーム同士の立体的阻害効果が解消され、翻訳の効率が上がるためと推察される。
【００２３】
本発明の原核細胞用環状ＲＮＡは、本発明の真核細胞用環状ＲＮＡと同様、全長の塩基数が３の倍数であるため、翻訳時に読み枠がずれることがない。また、目的のタンパク質を発現させるための開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有していないため、理論上無限鎖長のタンパク質リピートを合成できる。
【００２４】
本発明の原核細胞用環状ＲＮＡは、少なくとも１のリボソーム結合部位を有している。リボソーム結合部位としては、原核細胞由来のリボソームによって認識され、当該リボソームが結合する部位であれば特に限定されるものでなく、例えば、ＳＤ配列が挙げられる。ＳＤ配列の具体的な塩基配列は、用いる翻訳系の原核細胞の生物種等を考慮して決定することができる。
【００２５】
本発明の原核細胞用環状ＲＮＡは、前記リボソーム結合部位の下流１〜２０塩基以内に１の開始コドンを有している。合成されるタンパク質リピートの均質性の点からは、本発明の原核細胞用環状ＲＮＡが有する開始コドンは、前記リボソーム結合部位の下流１〜２０塩基以内にのみ存在していることが好ましいが、その他の部位にあってもよい。開始コドンがその他の部位にあった場合であっても、リボソーム結合部位の直後にある開始コドンからの翻訳が優先的に行なわれるため、目的のタンパク質リピートを主に合成することができる。
【００２６】
［環状ＲＮＡの合成］
本発明の真核細胞用環状ＲＮＡ及び本発明の原核細胞用環状ＲＮＡ（以下、合わせて「本発明の環状ＲＮＡ」ということがある）の合成方法は特に限定されるものではない。例えば、公知の化学合成反応により一本鎖ＲＮＡを合成した後、これをリガーゼにより連結することで環状ＲＮＡを合成することができる。複数本の一本鎖ＲＮＡを合成した後、これらをそれぞれ適切な順番にリガーゼにより連結することによっても、環状ＲＮＡを合成することができる。リガーゼ反応の際に、非特許文献２に記載の環状ＲＮＡの合成方法と同様に、連結させる２本の一本鎖ＲＮＡの両端とハイブリダイズするＤＮＡプローブを用いることにより、効率よくリガーゼ反応を行うことができる。その他、非特許文献１に記載の環状ＲＮＡの合成方法と同様に、スプライシング反応を利用して調製してもよい。
【００２７】
また、ポリメラーゼによる転写反応を利用して環状ＲＮＡを合成することもできる。まず、プロモーター配列の下流に、合成する目的の環状ＲＮＡと相補的な塩基配列を配置した二本鎖ＤＮＡを鋳型として、無細胞系にてポリメラーゼによる転写反応を行い、一本鎖ＲＮＡを合成する。合成された線状一本鎖ＲＮＡの５’末端と３’末端を連結することにより、目的の環状ＲＮＡを合成することができる。
【００２８】
［タンパク質の合成］
本発明の真核細胞用環状ＲＮＡを真核細胞に導入する、又は真核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該真核細胞用環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を繰り返し配列構造として有するタンパク質リピートが翻訳され、合成される。同様に、本発明の原核細胞用環状ＲＮＡを原核細胞に導入する、又は原核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該原核細胞用環状ＲＮＡがコードしているタンパク質を繰り返し配列構造として有するタンパク質リピートが翻訳され、合成される。本発明の環状ＲＮＡを鋳型とする回転式タンパク質翻訳においては、リボソームが一度環状ＲＮＡに結合し、タンパク質合成を開始すると、原理的には永久にタンパク質合成が進行する。つまり、翻訳開始の律速段階は最初のリボソーム結合時のみであり、それ以降のタンパク質合成は効率よく行われるという利点がある。
【００２９】
本発明の環状ＲＮＡの真核細胞又は原核細胞への導入方法は、特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法等の当該技術分野で公知の手法の中から、細胞種を考慮して適宜選択することができる。本発明の原核細胞用環状ＲＮＡが導入される細胞は、原核細胞であれば特に限定されるものではないが、組換えタンパク質の発現等で汎用されていることから大腸菌であることが好ましい。また、本発明の真核細胞用環状ＲＮＡが導入される細胞は、真核細胞であれば特に限定されるものではなく、酵母や糸状菌等の真菌であってもよく、植物細胞であってもよく、昆虫細胞、哺乳細胞等の動物細胞であってもよい。例えば、ヒトへ適用される医薬品等の材料となるタンパク質リピートを合成する場合には、ヒト由来の培養細胞を用いることが好ましい。
【００３０】
本発明の環状ＲＮＡを添加する無細胞系は、リボゾーム、ｔＲＮＡ等の翻訳に必要な成分を全て含有する細胞外の翻訳系である。無細胞系としては、具体的には、真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。前記真核細胞及び原核細胞としては従来公知のものが何れも使用可能であり、具体的に例示すれば、大腸菌、好熱性細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母などが挙げられ、特に大腸菌由来のもの（例えば大腸菌Ｓ３０細胞抽出液）又は高度好熱菌(Thermus thermophilus)由来のものが高い合成量を得る点において望ましい。
当該大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９（ｒｎａ、ｍｅｔ）、ＢＬ２１、ＢＬ２１ｓｔａｒ、ＢＬ２１コドンプラス株等から公知の方法（Pratt, J.M. et al., Transcription and translation - a practical approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggins, S.J.編、IRL Press, Oxford参照）に従って調製できる。また、プロメガ社やノバジェン社から市販されるものを使用してもよい。また、バッチ法、フロー法の他、従来公知の技術（例えば、Spirin, A et al., Methods in Enzymol., 217, 123-142, 1993参照）がいずれも適用可能である。
【００３１】
本発明の環状ＲＮＡを用いることにより、長鎖のタンパク質リピートを簡単に合成できる。このため、本発明の環状ＲＮＡが繰り返し構造部分をコードする領域を有することにより、シルクやコラーゲン等の繰り返し構造を有するタンパク質をより簡便に合成することができる。また、環状ＲＮＡ内に、目的のタンパク質をコードする領域に加えて、ヒスチジンタグやＦｌａｇタグ等のタグペプチドをコードする領域を有する場合には、繰り返し配列構造内にタグペプチドを有するタンパク質リピートが合成できる。この場合、タグペプチドを利用して、合成されたタンパク質リピートを簡便に精製することができる。
【００３２】
本発明の環状ＲＮＡが、目的のタンパク質をコードする領域とプロテアーゼにより認識され切断されるペプチドをコードする領域とを有する場合、当該環状ＲＮＡを鋳型として合成されたタンパク質リピートをプロテアーゼ処理することにより、一分子のタンパク質リピートから多数分子の目的のタンパク質を得ることができる。また、比較的分子量の小さいペプチドを合成する場合、ペプチドをコードする領域を複数連結させた環状ＲＮＡを鋳型としてもよい。複数のペプチドをコードする領域と、当該領域の間にプロテアーゼにより認識され切断されるペプチドをコードする領域を配置した環状ＲＮＡを鋳型とすることによって、大量のペプチドを合成することができる。
【００３３】
本発明の環状ＲＮＡを用いることにより、医療材料などの機能材料調製に応用できる。例えば、本発明の環状ＲＮＡを細胞内へ導入することによって、生理活性ペプチドを当該細胞内で産生させることができるため、本発明の環状ＲＮＡは、新たな医薬品として使用することもできる。また、原理的には、タンパク質リピートの生成より、シグナル増幅メカニズムとしての利用も可能である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。【００３５】
［実施例１］
１又は複数のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する原核細胞用環状ＲＮＡを合成し、これらを鋳型として無細胞系においてタンパク質を合成した。
＜環状ＲＮＡの合成＞
（１）オリゴヌクレオチドの調製
具体的には、まず、環状ＲＮＡ又は直鎖状ＲＮＡのフラグメントである４種類のＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｆ３５、Ｆ４９、Ｆ４２、Ｆ４２’）、及び酵素Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた連結反応に鋳型として用いる５種類のＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ３’、Ｇ４）をそれぞれ化学合成した。なお、Ｆ４２’は、Ｆ４２の３’末端にＵＡＡＵＡＡを付加した４８塩基長である。各オリゴヌクレオチドの配列を表１、及び配列表の配列番号１〜９に示す。表１中、囲み部分はリボソーム結合配列を表し、太字の塩基（ＡＵＧ）は開始コドンを表し、下線部位はＦＬＡＧコード配列を表し、二重下線部は終止コドンを表す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。【００３６】
【表１】
2013118878.tif 000003
【００３７】
９種全てのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、β−シアノエチルホスホロアミダイト試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、Ｈ−８−ＳＥ  ＤＮＡ合成機（ジーンワールド社製）により合成した。ＲＮＡアミダイト試薬は２’−Ｏ−ＴＯＭ保護体を使用した。その際、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｆ３５、Ｆ４９、Ｆ４２、Ｆ４２’）は、全て化学リン酸化試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて５’末端をモノリン酸化した。合成したＲＮＡは全て定法に従い脱保護し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製した。一方、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ３’、Ｇ４）は合成後、定法に従い脱保護し、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ  ＩＩカートリッジ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により精製した。【００３８】
（２）合成スキーム
２分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する８４塩基の環状ＲＮＡ（Ｃ８４）及び４分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する１６８塩基の環状ＲＮＡ（Ｃ１６８）は、Ｆ３５及びＦ４９を、Ｇ１及びＧ４を鋳型として連結することにより合成した。３分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する１２６塩基の環状ＲＮＡ（Ｃ１２６）及び６分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する２５２塩基の環状ＲＮＡ（Ｃ２５２）は、Ｆ３５、Ｆ４９、及びＦ４２を、Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３を鋳型として連結することにより合成した。各合成スキームを模式的に図１に示す。
また、３分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する１２６塩基の直鎖状ＲＮＡ（Ｌ１２６）は、Ｆ３５、Ｆ４９、及びＦ４２を、Ｇ１及びＧ２を鋳型として連結することにより合成した。３分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域及び終止コドンを有する１３２塩基の直鎖状ＲＮＡ（Ｌ１２６＋ｓｔｏｐ）は、Ｆ３５、Ｆ４９、及びＦ４２’を、Ｇ１及びＧ２を鋳型として連結することにより合成し、３分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域及び終止コドンを有する１３２塩基の環状ＲＮＡ（Ｃ１２６＋ｓｔｏｐ）は、Ｆ３５、Ｆ４９、及びＦ４２’を、Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３’を鋳型として連結することにより合成した。
Ｃ８４、Ｃ１２６、Ｃ１６８、Ｃ２５２、Ｃ１２６＋ｓｔｏｐの配列を表２、及び配列表の配列番号１０〜１４に示す。表２中、囲み部分はリボソーム結合配列を表し、太字の塩基（ＡＵＧ）は開始コドンを表し、下線部位はＦＬＡＧコード配列を表し、二重下線部は終止コドンを表す。また、いずれも、５’末端及び３’末端の両末端で連結された環状構造を形成する。なお、Ｌ１２６及びＬ１２６＋ｓｔｏｐは、それぞれＣ１２６及びＣ１２６＋ｓｔｏｐと同じ塩基配列を有しているが、環状構造を有しない直鎖状ＲＮＡである。【００３９】
【表２】
2013118878.tif 000004
【００４０】
（３）Ｌ１２６の合成
Ｌ１２６は、Ｆ３５、Ｆ４９、及びＦ４２を、Ｇ１及びＧ２を鋳型としてリガーゼにより連結することによって合成した。リガーゼ反応は、５μＭのＦ３５、５μＭのＦ４９、１５μＭのＦ４２、１０μＭのＧ１、２０μＭのＧ２、３５ｕｎｉｔｓ／μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(タカラバイオ社製)、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰ、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００を含む反応液（反応液量：１．７ｍＬ）で行った。
具体的には、ＰＥＧ６０００及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ以外を全て添加した反応液を９０℃で３分間加熱した後、室温まで徐冷した。その後、当該反応液にＰＥＧ６０００及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを加え、３７℃で約５時間インキュベートした。当該反応液に等量のクロロホルムを加えてＰＥＧ６０００を抽出・除去した後、３Ｍの酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．２）及びイソプロピルアルコールを加えて冷却し、ＲＮＡを沈殿させて回収した。回収されたＲＮＡの一部を変性ＰＡＧＥ分析（８％  ポリアクリルアミド、７．５Ｍ  尿素、２５％  ホルムアミド、１×ＴＢＥ）し、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）により染色して可視化し、リガーゼ反応の進行を確認した後、同じく変性ＰＡＧＥを用いて、残りのＲＮＡから連結生成物(Ｌ１２６)を単離した。ＵＶ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液［１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０)］１ｍＬで２回ＲＮＡを抽出した。得られた抽出液を遠心エバポレーターにより濃縮し、さらにマイクロコンＹＭ−３（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮後の前記抽出液からＲＮＡを、アルコール沈殿により脱塩・回収した。得られたＲＮＡ（Ｌ１２６) は超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、収量を算出した（収量：２．１７ｎｍｏｌ、収率：２６％）。図２に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）により変性ＰＡＧＥゲル中の核酸を染色した結果に得られた染色像を示す。レーン１はｓｓＲＮＡマーカーを、レーン２は酵素反応前の反応液を、レーン３は酵素反応後の反応液を、それぞれアプライした。図２に示すように、酵素反応後には、Ｆ３５、Ｆ４９、及びＦ４２からＬ１２６が合成された。【００４１】
（４）Ｃ１２６の合成
Ｌ１２６をリガーゼ反応により環状にすることによって、Ｃ１２６を合成した。リガーゼ反応は、１μＭのＬ１２６、１μＭのＧ３、１７．５ｕｎｉｔｓ／μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(タカラバイオ社製)、６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰ、１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００を含む反応液（反応液量：２ｍＬ）で行った。
具体的には、ＰＥＧ６０００及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ以外を全て添加した反応液を９０℃で３分間加熱した後、室温まで徐冷した。その後、当該反応液にＰＥＧ６０００及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを加え、３７℃で７時間インキュベートした。当該反応液に等量のクロロホルムを加えてＰＥＧ６０００を抽出・除去した後、３Ｍの酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．２）及びイソプロピルアルコールを加えて冷却し、ＲＮＡを沈殿させて回収した。回収されたＲＮＡの一部を変性ＰＡＧＥ分析（６％  ポリアクリルアミド、７．５Ｍ  尿素、２５％  ホルムアミド、１×ＴＢＥ）し、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）により染色して可視化し、リガーゼ反応の進行を確認した後、同じく変性ＰＡＧＥを用いて、残りのＲＮＡから連結生成物(Ｃ１２６)を単離した。ＵＶ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液［１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０) ］０．５ｍＬで２回ＲＮＡを抽出した。得られた抽出液を遠心エバポレーターにより濃縮し、さらにマイクロコンＹＭ−３（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮後の前記抽出液からＲＮＡを、アルコール沈殿により脱塩・回収した。得られたＲＮＡ（Ｌ１２６) は超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、収量を算出した（収量：０．４０ｎｍｏｌ、収率：２０％）。図３に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）により変性ＰＡＧＥゲルを染色した結果に得られた染色像を示す。レーン１はｓｓＲＮＡマーカーを、レーン２は酵素反応前の反応液を、レーン３は酵素反応後の反応液を、それぞれアプライした。図３に示すように、酵素反応後には、Ｌ１２６からＣ１２６が合成された。【００４２】
（５）Ｌ１２６＋ｓｔｏｐ、Ｃ１２６＋ｓｔｏｐの合成
Ｆ４２に代えてＦ４２’を、Ｇ３に代えてＧ３’を、それぞれ用いた以外は、上記（２）及び（３）と同様にして、Ｌ１２６＋ｓｔｏｐ及びＣ１２６＋ｓｔｏｐを合成した。【００４３】
（６）Ｃ８４、Ｃ１６８、Ｃ２５２の合成
図１及び上記（２）で示すように、各フラグメントを適宜用いた以外は、上記（３）Ｌ１２６の合成及び（４）Ｃ１２６の合成と同様にして、Ｃ８４、Ｃ１６８、Ｃ２５２を合成した。
図４に、Ｌ８４（２分子のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する８４塩基の直鎖状ＲＮＡ）を合成するためのリガーゼ反応の反応物を８％変性ＰＡＧＥ分析した結果に得られた染色像を示す。レーン１は酵素反応前の反応液を、レーン２は酵素反応後の反応液を、レーンＭはｓｓＲＮＡマーカーを、それぞれアプライした。図４に示すように、酵素反応後には、Ｆ３５及びＦ４９からＬ８４が合成された。
図５に、環状ＲＮＡ合成反応の反応物を８％変性ＰＡＧＥ分析した結果に得られた染色像を示す。レーン１はＬ８４を鋳型としたリガーゼ反応の反応前の反応液を、レーン２はＬ８４を鋳型としたリガーゼ反応の反応後の反応液を、レーンＭはｓｓＲＮＡマーカーを、レーン３はＬ１２６を鋳型としたリガーゼ反応の反応前の反応液を、レーン４はＬ１２６を鋳型としたリガーゼ反応の反応後の反応液を、それぞれ示す。図５に示すように、酵素反応後には、Ｌ８４からＣ８４及びＣ１６８が、Ｌ１２６からＣ１２６及びＣ２５２が、それぞれ合成された。【００４４】
＜環状ＲＮＡを鋳型としたタンパク質の合成＞
（７）Ｌ１２６、Ｌ１２６＋ｓｔｏｐ、Ｃ１２６、Ｃ１２６＋ｓｔｏｐを鋳型とした無細胞翻訳反応
Ｌ１２６、Ｌ１２６＋ｓｔｏｐ、Ｃ１２６、又はＣ１２６＋ｓｔｏｐを１μＭとなるように無細胞翻訳液（ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製) に加え、３７℃で３時間インキュベートした（反応液量：２５μＬ）。対照として、ＲＮＡ無添加の反応液も同様にインキュベートした。反応液から１μＬサンプリングし、５μＬの２×サンプル緩衝液［０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２％  ＳＤＳ、３０％  グリセロール、０．０２％  ブロモフェノールブルー、５％  ２−メルカプトエタノール］及び４μＬの超純水と混合した。これを９５℃で５分間加熱後、１０−２０％  勾配ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いて電気泳動した（泳動用緩衝液: ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、１９２ｍＭ  グリシン）。ゲル中に展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写後、マウス産生抗ＦＬＡＧ抗体、抗マウスＩｇＧ抗体ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と反応させ、ＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて、ＦＬＡＧ配列特異的にバンドを可視化（Ｌｉｇｈｔ−Ｃａｐｔｕｒｅ、ＡＴＴＯ社製）した。図６に、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。レーン１はＬ１２６を添加した反応液、レーン２はＬ１２６＋ｓｔｏｐを添加した反応液、レーン３はＣ１２６＋ｓｔｏｐを添加した反応液、レーン４はＣ１２６を添加した反応液、レーン５はＲＮＡ無添加の反応液を、それぞれアプライした。図６に示すように、Ｃ１２６を添加した反応液では、Ｃ１２６＋ｓｔｏｐやＬ１２６を添加した反応液で合成された１５〜２０ｋＤａのタンパク質よりもはるかに長鎖のタンパク質が多く発現していた。特に、２５０ｋＤａ以上のタンパク質が発現しており、Ｃ１２６では、リボソームが１０回以上回転して連続的に翻訳反応が進行し、タンパク質リピートが合成されていることが示唆された。【００４５】
（８）Ｃ８４、Ｃ１２６、Ｃ１６８、及びＣ２５２を鋳型とした無細胞翻訳反応
鋳型として、Ｃ８４、Ｃ１２６、Ｃ１６８、又はＣ２５２を用いた以外は、上記（７）と同様にして、無細胞翻訳反応を行い、その後反応液を１０−２０％  勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写後、ＦＬＡＧ配列特異的にバンドを可視化した。図７に、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。レーン１及び３はＲＮＡ無添加の反応液、レーン２はＣ８４を添加した反応液、レーン４はＣ１２６を添加した反応液、レーン５はＣ１６８を添加した反応液、レーン６はＣ２５２を添加した反応液を、それぞれアプライした。図７に示すように、Ｃ８４を鋳型とした場合には、連続的翻訳反応の反応産物である長鎖ペプチドは生成しなかった。一方、Ｃ１２６、Ｃ１６８、及びＣ２５２を鋳型とした場合には、連続的翻訳反応の反応産物である長鎖ペプチド（タンパク質リピート）の生成が観察された。特に、Ｃ１２６及びＣ１６８を鋳型とした場合には、Ｃ２５２を鋳型とした場合よりも、翻訳効率が高く、より大量のタンパク質リピートが合成されていた。【００４６】
［実施例２］
複数のＦＬＡＧペプチドをコードする領域を有する真核細胞用環状ＲＮＡを合成し、これらを鋳型としてウサギ由来の無細胞系においてタンパク質を合成した。
＜環状ＲＮＡの合成＞
真核細胞用環状ＲＮＡは、ポリメラーゼによる転写反応を利用して合成した。まず、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機で合成し（表３のＦｒａｇｍｅｎｔ１〜Ｆｒａｇｍｅｎｔ３；これらの配列を、配列番号１５〜１７に示した）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結させた後、アニーリング又はＰＣＲ法によって１５５、２８４、２９０、４１３塩基対の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（鋳型ＤＮＡ）を合成した（表４及び５）。次いで、当該二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを鋳型としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、１２９、２５８、２６４、３８７塩基の直鎖状の一本鎖ＲＮＡを合成し（表６及び７）、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて５’末端と３’末端を連結して環状ＲＮＡを合成した。詳細を以下に示す。【００４７】
（１）オリゴヌクレオチドの調製
ポリメラーゼ反応の鋳型とした各種オリゴヌクレオチドの配列を表３に示す。表３中、ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
表３中、ＤＮＡオリゴヌクレオチドはβ−シアノエチルホスホロアミダイト試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、Ｈ−８−ＳＥ  ＤＮＡ合成機（ジーンワールド社製）により合成した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ１及びＦｒａｇｍｅｎｔ２は、化学リン酸化試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて５’末端をモノリン酸化した。各オリゴヌクレオチドは、定法に従い脱保護し、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ  ＩＩカートリッジ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により精製した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ１、Ｆｒａｇｍｅｎｔ２、Ｆｒａｇｍｅｎｔ３、及びＦｒａｇｍｅｎｔ１  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｅは、さらに変性ＰＡＧＥにより精製した。【００４８】
【表３】
2013118878.tif 000005
【００４９】
（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡの合成
表３、及び配列表の配列番号１８〜３５に記載の各種オリゴヌクレオチドを用いて、表４及び５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを合成した。表４及び５中、下線部位はＴ７プロモーター配列を表す。【００５０】
【表４】
2013118878.tif 000006
【００５１】
【表５】
2013118878.tif 000007
【００５２】
４×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３６）は、５．２２μＭのＦｒａｇｍｅｎｔ１（配列番号１５）及びＦｒａｇｍｅｎｔ２（配列番号１６）の混合ＤＮＡ（混合モル比＝１：１）、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジンを含む反応液を、９０℃、３分間加熱後、室温まで徐冷することによって得た。
８×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３７）は、Ａｄａｐｔｏｒ１（配列番号１８）を鋳型として、Ｆｒａｇｍｅｎｔ１（配列番号１５）及びＦｒａｇｍｅｎｔ２（配列番号１６）をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた連結物を変性ＰＡＧＥにより精製することによってアンチセンス鎖を合成し、当該アンチセンス鎖とＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２１）をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを合成し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製することによって得た。
１２×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３８）は、Ａｄａｐｔｏｒ２（配列番号１９）及びＡｄａｐｔｏｒ３（配列番号２０）を鋳型として、Ｆｒａｇｍｅｎｔ１（配列番号１５）、Ｆｒａｇｍｅｎｔ２（配列番号１６）、及びＦｒａｇｍｅｎｔ３（配列番号１７）をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた連結物を変性ＰＡＧＥにより精製することによってアンチセンス鎖を合成し、当該アンチセンス鎖とＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２１）をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを合成し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製することによって得た。
８×ＦＬＡＧ（２）  ＤＮＡ（配列番号３９）及び８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＤＮＡ（配列番号４０）は、１２×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３８）を鋳型として、それぞれＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２１）及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ３（配列番号２４）、又はＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号２１）及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ４（配列番号２８）をプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを合成し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製することによって得た。
８×ＦＬＡＧ（３）  ＤＮＡ（配列番号４１）は、８×ＦＬＡＧ（２）  ＤＮＡ（配列番号３９）を鋳型として、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号３５）及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ５（配列番号３１）をプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを合成し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製することによって得た。
８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＤＮＡ（配列番号４２）は、８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＤＮＡ（配列番号４０）を鋳型として、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ２（配列番号３５）及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ６（配列番号３２）をプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを合成し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製することによって得た。【００５３】
（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応による直鎖状の転写ＲＮＡの合成
表４に記載の鋳型ＤＮＡを用いて、表６及び７に記載の直鎖状の転写ＲＮＡを合成した。表６及び７中、囲み部分はＫｏｚａｋ配列を表し、太字の塩基（ＡＵＧ）は開始コドンを表し、下線部位はＦＬＡＧコード配列を表し、二重下線部は終止コドン（ＵＧＡ、ＵＡＧ、ＵＡＡ）を表す。【００５４】
【表６】
2013118878.tif 000008
【００５５】
【表７】
2013118878.tif 000009
【００５６】
４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ（配列番号４３）、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ（配列番号４４）、及び１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ（配列番号４５）は、それぞれ４×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３６）、８×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３７）、及び１２×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ（配列番号３８）を鋳型として合成した。具体的には、Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を使用して行った。４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、各２ｍＭ  ｒＮＴＰ（東洋紡社製）、２０ｍＭ  ＧＭＰ（和光純薬工業社製）、１ｕｎｉｔ／μＬ  Ｒｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社製）、２．５ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡからなる反応液（反応液量：１ｍＬ）を各２本ずつ用意し、これらを４２℃で２時間インキュベートし、転写反応を行った。８×ＦＬＡＧ  ＤＮＡ及び１２×ＦＬＡＧ  ＤＮＡを鋳型とした反応液に対しては、続けてＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を０．０２５ｕｎｉｔｓ／μＬとなるように添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、反応液中の鋳型ＤＮＡの分解反応を行った。その後、各反応液に等量のＴＥ飽和フェノール−クロロホルム混合液（５：１）を加えて核酸を抽出した後、３Ｍの酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．２）及びイソプロピルアルコールを加えてアルコール沈殿法によりＲＮＡを回収し、変性ＰＡＧＥを用いて転写産物である直鎖状ＲＮＡを単離した(５％  ポリアクリルアミド、７．５Ｍ  尿素、２５％  ホルムアミド、１×ＴＢＥ、１ｍｍ厚）。ＵＶ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液［１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０)）で抽出した。抽出液をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）で脱塩した後、５０％  アセトニトリルで溶出し、遠心エバポレーターにより濃縮した後に凍結乾燥した。ＲＮＡは、当該凍結乾燥物からアルコール沈殿により脱塩・回収した。得られたＲＮＡは超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、収量を算出した（４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの収量：３．５６ｎｍｏｌ、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの収量：１０．０６ｎｍｏｌ、１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの収量：５．７５ｎｍｏｌ）。【００５７】
８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ（配列番号４６）、８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ（配列番号４７）、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ（配列番号４８）、及び８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ（配列番号４９）は、それぞれ８×ＦＬＡＧ（２）  ＤＮＡ、８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＤＮＡ、８×ＦＬＡＧ（３）  ＤＮＡ、及び８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＤＮＡを鋳型としてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７  Ｋｉｔ（アンビオン社製）を使用して合成した。具体的には、製品マニュアル通りの反応液に、７５ｍＭ  ＧＭＰ、５ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡを加えて反応液量４００μＬ（但し、８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡは反応液量を６００μＬとした。）とし、各反応液を３７℃、約１６時間（但し、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ及び８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡは６時間）インキュベートし、転写反応を行った。その後、当該Ｋｉｔ付属のＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅを反応液に添加し、製品マニュアル通り鋳型ＤＮＡの分解反応を行った。その後、各反応液に等量のＴＥ飽和フェノール−クロロホルム混合液（５：１）を加えて核酸を抽出した後、３Ｍの酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．２）及びイソプロピルアルコールを加えてアルコール沈殿法によりＲＮＡを回収し、変性ＰＡＧＥを用いて転写産物である直鎖状ＲＮＡを単離した(５％  ポリアクリルアミド、７．５Ｍ  尿素、２５％  ホルムアミド、１×ＴＢＥ、１ｍｍ厚）。ＵＶ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液［１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０)）で抽出した。抽出液全量（但し、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ及び８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡは抽出液全量の１／４量）をアミコンウルトラ−０．５ｍＬ（分画分子量：３Ｋ）（ミリポア社製）又はアミコンウルトラ−４（分画分子量：３Ｋ）（ミリポア社製）で脱塩した後、回収した。８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ及び８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡの残った抽出液（抽出液全量の３／４量）は、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）で脱塩した後、５０％  アセトニトリルで溶出し、遠心エバポレーターにより濃縮した後に凍結乾燥し、ＲＮＡを当該凍結乾燥物からアルコール沈殿により脱塩・回収した。得られたＲＮＡは超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、収量を算出した（８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡの収量：０．９７５ｎｍｏｌ、８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡの収量：２．０１ｎｍｏｌ、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡの収量：１．５６ｎｍｏｌ、８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡの収量：２．３４ｎｍｏｌ）。【００５８】
（４）転写ＲＮＡの環状化反応による環化体（環状ＲＮＡ）の合成
Ａｄａｐｔｏｒ１（配列番号１８）を用いて４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ（配列番号４３）から４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体（４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの環状ＲＮＡ）を、Ａｄａｐｔｏｒ２（配列番号１９）を用いて８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ（配列番号４４）から８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を、Ａｄａｐｔｏｒ３（配列番号２０）を用いて１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ（配列番号４５）から１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を、Ａｄａｐｔｏｒ４（配列番号２９）を用いて８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ（配列番号４６）から８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ環化体を、Ａｄａｐｔｏｒ５（配列番号３０）を用いて８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ（配列番号４７）から８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体を、Ａｄａｐｔｏｒ６（配列番号３３）を用いて８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ（配列番号４８）から８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ環化体を、Ａｄａｐｔｏｒ７（配列番号３４）を用いて８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ（配列番号４９）から８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体を、それぞれリガーゼ反応により合成した。リガーゼ反応は、１μＭの転写ＲＮＡ、５μＭのＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ａｄａｐｔｏｒ１〜７）、０．０１２５ｕｎｉｔｓ／μＬのＴ４  ＲＮＡ リガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、 ０．４ｍＭ  ＡＴＰを含む反応液（反応液量：８００μＬ（但し、４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの反応液は３０００μＬ、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ及び１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの反応液は５０００μＬ、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡの反応液は６００μＬ、８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡの反応液は１０００μＬとした）で行った。【００５９】
具体的には、Ｔ４  ＲＮＡ リガーゼ２以外を全て添加した反応液を９０℃で３分間加熱した後、室温まで徐冷した。その後、当該反応液にＴ４  ＤＮＡリガーゼ２を加え、３７℃で３時間（但し、８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ及び８×ＦＬＡＧ（２  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡの反応液は約１６時間とした）インキュベートした。当該反応液に酢酸ナトリウム水溶液、グリコーゲン水溶液、及びイソプロピルアルコールを加えて冷却し、ＲＮＡを沈殿させて回収し、変性ＰＡＧＥを用いて環化体（環状ＲＮＡ）を単離した(５％  ポリアクリルアミド、７．５Ｍ  尿素、２５％  ホルムアミド、１×ＴＢＥ、１ｍｍ厚）。環化反応後の反応液を変性ＰＡＧＥした後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）により染色した結果、いずれの環状化反応液においても、環化体が形成されていることが確認された。【００６０】
ＵＶ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液［１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０)］で抽出した。抽出液をアミコンウルトラ−０．５ｍＬ（分画分子量：３Ｋ）（ミリポア社製）又はアミコンウルトラ−４（分画分子量：３Ｋ）（ミリポア社製）で脱塩し濃縮した後、ＲＮＡをアルコール沈殿により脱塩・回収した。４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ、及び１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの反応液は、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ等を用いて脱塩し濃縮した後、さらにマイクロコンウルトラセルＹＭ−１０（分画分子量：１０Ｋ）で脱塩し濃縮した後、アルコール沈殿によりＲＮＡを回収した。得られたＲＮＡは超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、収量を算出した（４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体の収量：３７５ｐｍｏｌ（収率：１２．５％）、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体の収量：３９６ｐｍｏｌ（収率：７．９３％）、１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体の収量：２５３ｐｍｏｌ（収率：５．０５％）、８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ環化体の収量：６９．９９ｐｍｏｌ（収率：８．７５％）、８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体の収量：５６．７１ｐｍｏｌ（収率：７．０９％）、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ環化体の収量：３５．５６ｐｍｏｌ（収率：５．９３％）、８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体の収量：８４．８２ｐｍｏｌ（収率：８．４８％））。精製後の各環化体を、変性ＰＡＧＥにより電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社製）により染色した結果に得られた染色像を図８〜１０に示す。図８のレーン１は４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡを、レーン２は４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を、レーン３は８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡを、レーン４は８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を、レーン５は１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡを、レーン６は１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を、それぞれアプライした。図９のレーン１は８×ＦＬＡＧ（２）  ＤＮＡを、レーン２は８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡを、レーン３は８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ環化体を、レーン４は８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＤＮＡを、レーン５は８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡを、レーン６は８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体を、それぞれアプライした。図１０のレーン１は８×ＦＬＡＧ（３）  ＤＮＡを、レーン２は８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡを、レーン３は８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ環化体を、レーン４は８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＤＮＡを、レーン５は８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡを、レーン６は８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体を、それぞれアプライした。【００６１】
＜ＲＮＡ環化体（環状ＲＮＡ）を鋳型としたタンパク質の合成＞
（５）ウサギ網状赤血球抽出液を用いた翻訳反応
１．８４３μＭのＲＮＡ環化体又は１．８４３μＭの環化前の直鎖状の転写ＲＮＡを６５℃、３分間加熱後、氷水で急冷した後、ウサギ網状赤血球抽出液に添加し、翻訳反応を行った。具体的には、４７９．２ｎＭの急冷後のＲＮＡ、７０％  Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（プロメガ社製）、１０μＭ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、１０μＭ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｉｎｕｓ Ｌｅｕｃｉｎｅ（いずれも、Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）に付属）、０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社製）からなる反応液（反応液量：２５μＬ）とし、各反応液を３０℃で１．５〜１９時間インキュベートし、翻訳反応を行った。その後、各反応液から２．５μＬをサンプリングし、２×ＳＤＳサンプル緩衝液［０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２％  ＳＤＳ、 ３０％  グリセロール、０．０２％  ブロモフェノールブルー、５％  ２−メルカプトエタノール］５μＬと混合し、７０℃で１５分間加熱後、５％ポリアクリルアミドゲル又は１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いて電気泳動した（泳動用緩衝液: ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、１９２ｍＭ  グリシン）。ゲル中に展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写後、マウス産生抗ＦＬＡＧ抗体、抗マウスＩｇＧ抗体ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と反応させ、ＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて、ＦＬＡＧ配列特異的にバンドを可視化（Ｌｉｇｈｔ−Ｃａｐｔｕｒｅ、ＡＴＴＯ社製）した。図１１〜１４に、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。図１１〜１４の各レーンには、それぞれ、表８〜１１に記載の反応液をアプライした。【００６２】
【表８】
2013118878.tif 000010
【００６３】
【表９】
2013118878.tif 000011
【００６４】
【表１０】
2013118878.tif 000012
【００６５】
【表１１】
2013118878.tif 000013
【００６６】
この結果、図１１に示す通り、４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合（レーン３）及び８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合（レーン５）において、高分子量の翻訳産物（タンパク質リピート）が検出された。中でも、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合に最も多くのタンパク質リピートが合成されていた。また、図１２に示す通り、翻訳反応の時間が長くなるほど、高分子量の翻訳産物（タンパク質リピート）が多く検出された。また、図１３及び１４に示す通り、終止コドンを有する８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体や８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体でも、少量ではあるが、高分子量の翻訳産物が検出された。【００６７】
［実施例３］
実施例２で合成されたＲＮＡ環化体及び環化前の直鎖状の転写ＲＮＡを鋳型として、ヒト由来の無細胞系においてタンパク質を合成した。
鋳型ＲＮＡを終濃度１．２μＭとなるように、ＡｖｉｄＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ヒトＨｅＬａＳ３細胞由来、Ａｖｉｄｉｔｙ社製）を用いて製品マニュアルどおりに翻訳反応を行った。反応終了後、各反応液から２．５μＬをサンプリングし、実施例２と同様にして１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＦＬＡＧ抗体、抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体を反応させ、ＨＲＰ基質と反応させることでＦＬＡＧ配列特異的なタンパク質のバンドを可視化した。【００６８】
図１５に、ＦＬＡＧを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。図１５の１レーンにはＲＮＡ無添加の反応液を、レーン２は４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン３は４×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、レーン４は８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン５は８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、レーン６は１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン７は１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、それぞれアプライした。図１５に示す通り、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合（レーン５）及び１２×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合（レーン７）において、高分子量の翻訳産物（タンパク質リピート）が検出された。中でも、８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合に最も多くのタンパク質リピートが合成されていた。【００６９】
［実施例４］
実施例２で合成されたＲＮＡ環化体及び環化前の直鎖状の転写ＲＮＡを鋳型として、ヒト細胞内の翻訳系を用いてタンパク質を合成した。
まず、細胞培養用１２ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、１ウェルあたりＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）１４５μＬ及び２．４μＭの鋳型ＲＮＡ溶液５μＬを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社製）２μＬを添加して混合し、１５分間静置した。その後、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン社製）を含有させたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬工業社製）を用いて１ｍＬあたり１００，０００個に希釈したＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部癌由来の培養細胞株、理化学研究所バイオリソースセンターより提供）を８５０μＬ添加して３７℃、５％  ＣＯ２環境下で２４時間培養した（ＲＮＡ終濃度：１２ｎＭ）。１ウェルあたり細胞溶解バッファー（ＣＳＴジャパン社製）２００μＬを添加して細胞を溶解させた後、遠心分離処理を行った。得られた上清７．５μＬをサンプリングし、実施例２と同様にして１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体を反応させ、ＨＲＰ基質と反応させることによって、ＦＬＡＧ配列特異的なタンパク質のバンド又はアクチンタンパク質のバンドを可視化した。【００７０】
図１６に、ＦＬＡＧを含むタンパク質及びアクチンタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。図１６の１レーンにはＲＮＡ無添加の反応液を、レーン２は８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン３は８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、レーン４は８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン５は８×ＦＬＡＧ（ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、それぞれアプライした。図１６に示す通り、８×ＦＬＡＧ（２）  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合（レーン３）において、高分子量の翻訳産物（タンパク質リピート）が検出された。また、アクチンタンパク質のバンドが全てのレーンにおいてほぼ同程度の濃さであったことから、各反応液に添加した細胞溶解液中のタンパク質量が同程度であることが示された。
本実施例により、本発明の真核細胞用環状ＲＮＡを哺乳細胞内へ導入することにより、回転式タンパク質翻訳を行うことが可能であることが示された。【００７１】
［実施例５］
実施例２で合成されたＲＮＡ環化体及び環化前の直鎖状の転写ＲＮＡを鋳型として、ヒト細胞内の翻訳系を用いてタンパク質を合成した。
まず、細胞培養用２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、１ウェルあたりＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）４５μＬ及び２μＭの鋳型ＲＮＡ溶液４μＬを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社製）１μＬを添加して混合し、１５分間静置した。その後、１０％ウシ胎児血清を含有したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬工業社製）を用いて１ｍＬあたり１４３，０００個に希釈したＨｅＬａ細胞を３５０μＬ添加して３７℃、５％  ＣＯ２環境下で２４時間培養した（ＲＮＡ終濃度：２０ｎＭ）。１ウェルあたり細胞溶解バッファー（ＣＳＴジャパン社製）３０μＬを添加して細胞を溶解させた後、遠心分離処理を行った。得られた上清のタンパク量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて測定し、細胞溶解バッファーを用いてタンパク濃度を１．５  ｍｇ／ｍＬに調製した。タンパク質濃度調整後に、７．５μＬをサンプリングし、実施例２と同様にして１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体を反応させ、ＨＲＰ基質と反応させることによって、ＦＬＡＧ配列特異的なタンパク質のバンド又はアクチンタンパク質のバンドを可視化（ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓ、バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）した。【００７２】
図１７に、ＦＬＡＧを含むタンパク質及びアクチンタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。図１７の１レーンにはＲＮＡ無添加の反応液を、レーン２は８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン３は８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、レーン４は８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡを添加した反応液を、レーン５は８×ＦＬＡＧ（３  ｓｔｏｐ）  ＲＮＡ環化体を添加した反応液を、それぞれアプライした。図１７に示す通り、８×ＦＬＡＧ（３）  ＲＮＡ環化体を鋳型とした場合（レーン３）において、高分子量の翻訳産物（タンパク質リピート）が検出された。また、アクチンタンパク質のバンドが全てのレーンにおいてほぼ同程度の濃さであったことから、各反応液に添加した細胞溶解液中のタンパク質量が同程度であることが示された。【００７３】
[実施例６]
実施例２の（４）で合成された８×ＦＬＡＧ  ＲＮＡの環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、蛍光標識した抗-ＦＡＬＧ抗体を用いた細胞染色により、細胞内に導入したＲＮＡの翻訳産物の検出を行った。
まず、カバーガラスを各ウェルに入れた細胞培養用２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、１０％ウシ胎児血清を含有したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬工業社製）を用いて、１ｍＬあたり１００，０００個に希釈したＨｅＬａ細胞を１ウェル当たり５００μｌ添加して、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で一晩培養した。その後、各ウェルから培地を除き、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）を２００μＬ添加した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）３２．５μＬ及び２μｇ／ｍＬの鋳型ＲＮＡ溶液２．５μＬを混合し、この溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）１２μＬ及びＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）３μＬを混合した溶液を添加し、１５分間静置した後、各ウェルに加え、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で６時間培養した。
トランスフェクション６時間後、培地を取り除き、１０％ウシ胎児血清を含有したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬工業社製）を１ウェル当たり５００μＬ加え、更に３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。その後、培地を取り除き、洗浄後、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで細胞を固定化した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで細胞を処理し、次いで１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングを行った後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで調製したマウス抗-ＦＬＡＧ抗体（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を添加して、１時間インキュベートした。洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで調製したＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８標識抗-マウスＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社製）を添加して、１時間インキュベートした。洗浄後、顕微鏡観察を行った。結果を図１８、１９に示す。【００７４】
図１８及び図１９の結果より、環状化体のRNAについては、蛍光が細胞内で広く分布し、直鎖状RNAについては、蛍光は小さな点として検出されることがわかった。また、RNAなしの対照では、発光は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の環状ＲＮＡ及び当該環状ＲＮＡを利用したタンパク質の製造方法により、タンパク質リピートを無細胞系のみならず、細胞内においても、簡便に合成することができるため、研究等の学術分野のみならず、ペプチドやタンパク質を利用する医薬品、飲食品、化粧品、化製品等の製造分野において好適に用いられる。
【図１】
2013118878.tif 000014
【図２】
2013118878.tif 000015
【図３】
2013118878.tif 000016
【図４】
2013118878.tif 000017
【図５】
2013118878.tif 000018
【図６】
2013118878.tif 000019
【図７】
2013118878.tif 000020
【図８】
2013118878.tif 000021
【図９】
2013118878.tif 000022
【図１０】
2013118878.tif 000023
【図１１】
2013118878.tif 000024
【図１２】
2013118878.tif 000025
【図１３】
2013118878.tif 000026
【図１４】
2013118878.tif 000027
【図１５】
2013118878.tif 000028
【図１６】
2013118878.tif 000029
【図１７】
2013118878.tif 000030
【図１８】
2013118878.tif 000031
【図１９】
2013118878.tif 000032
【配列表】
2013118878000001.app
【国際調査報告】
2013118878.tif 000033
2013118878.tif 000034
2013118878.tif 000035
2013118878.tif 000036
2013118878.tif 000037
2013118878.tif 000038
2013118878.tif 000039