(57)【要約】アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を治療又は予防するための医薬を提供することに関する。アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬のスクリーニング方法であって、Ａ）１）エクソソーム、２）中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２）、及び  ３）スフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）からなる群より選択される少なくとも１つの要素と該医薬の候補とを相互作用しうる状態に供する工程；及びＢ）該医薬の候補の、該要素に対する影響を調べる工程を包含し、該要素の少なくとも１つを該候補が該医薬であるかどうかの指標とする、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２）及び／又はスフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）のタンパク質と被験物質を接触させる工程、
(2)該被験物質を接触させた該Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性を、該被験物質を接触させない該Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性と比較する工程、及び
(3)該被験物質を接触させた該Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性が該被験物質を接触させない該Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性と比較して上昇している場合、及び／又は該被験物質を接触させた該ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性が該被験物質を接触させない該ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性と比較して低下している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む、
アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
(1)細胞と被験物質とを接触させる工程、
(2)該被験物質を接触させた該細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の発現を、該被験物質を接触させない対照細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の発現と比較する工程、及び
(3)該被験物質を接触させた該細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２の発現が該被験物質を接触させない該対照細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２の発現よりも上昇している場合、及び／又は該被験物質を接触させた細胞におけるＳＭＳ２の発現が該被験物質を接触させない細胞におけるＳＭＳ２の発現と比較して低下している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む、
アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
(1)細胞と被験物質とを接触させる工程、
(2)該被験物質を接触させた該細胞におけるエクソソーム分泌レベルを、該被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム分泌レベルと比較する工程、及び
(3)該被験物質を接触させた該細胞におけるエクソソーム分泌レベルが、該被験物質を接触させない該対照細胞におけるエクソソーム分泌レベルよりも上昇している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む、
アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞および前記対照細胞は、神経細胞である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物。
【請求項６】
Ｎ−ＳＭａｓｅ２を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物。
【請求項７】
ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物。
【請求項８】
前記物質が核酸である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記核酸がｓｉＲＮＡ及び／又はアンチセンス核酸である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡが下記の（ａ）〜（ｐ）に記載のｓｉＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１つ以上からなる請求項９記載の医薬組成物。
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方が配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方が配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方が配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方が配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方が配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方が配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方が配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１９で表される塩基配列であり、他方が配列番号２０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；；
（ｌ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｍ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｎ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｏ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｐ）一方又は両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失又は置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｏ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）及び中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２、本明細書中Ｎ−ＳＭａｓｅ２とも称する）の新規用途に関する。より詳細には、本発明は、ＳＭＳ２及びｎＳＭａｓｅ２を用いたアミロイドβタンパク質（Ａβ）に関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防若しくは治療用医薬組成物、物質又は予防若しくは処置のための方法に関する。本発明はまた、アミロイドβに関連する疾患の医薬のスクリーニング、エクソソームとアミロイドβとに関連する新たな調節因子のスクリーニング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経細胞（ニューロン）の欠陥及び死の結果として生じる、進行性の記憶能及び認知能の喪失をともなう遅発性の神経障害である。ＡＤは、病理学的には、アミロイドβタンパク質（Ａβ）から構成されるアミロイド原線維の、広範囲にわたる神経細胞外沈着によって特徴付けられる。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の連続的なプロセシングによって生理学的代謝産物として生成され、その後、脳内で、細胞外環境へと分泌される。細胞外Ａβの定常状態のレベルは、脳内でのその生成と分解／クリアランスとの間のバランスによって制御される。いくつか証拠が、その代謝不均衡に寄与するＡβの蓄積の、ＡＤの病態発現との関連性を示唆している（非特許文献１）。実際、Ａβレベルの上昇は、神経毒性を直接誘導することが知られる可溶性オリゴマー、そして不溶性の原線維の形成の増大を生じる（非特許文献２；非特許文献３）。家族性ＡＤの症例では、ＡＰＰ及びプレセニリンといった原因遺伝子の遺伝的変化が、Ａβ生成の顕著な増大により、Ａβの集合を促進するようである（非特許文献４）。他方、この疾患の主要な形態である散発性ＡＤでは、最近、脳内でのＡβ除去レベルの低下が報告されている（非特許文献５）。これは、ＡβがＡＤ患者及び中程度の認知障害を有する患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）内で減少するというこれまでの知見（非特許文献６）と一致しており、そして、例えば、タンパク分解の減少による異化の低下、又は、ＣＳＦ内への血液−脳関門を跨いだ流出の減弱を介したＡβクリアランスの混乱状態を示唆している。しかしながら、遅発性ＡＤにおいて損ねられる厳密なクリアランスプロセスについては議論の余地が残っている。【０００３】
最近、細胞外Ａβの一部分がエクソソームと呼ばれる小胞と結合していることが報告された（非特許文献７）。エクソソームは、種々の細胞型に由来する分泌型の小型膜小胞（直径４０〜１００ｎｍ）の特定のサブタイプである（非特許文献８）。これらは、エキソサイトーシスの様式で原形質膜と融合する、エンドソーム多小胞体（ＭＶＢ）の管内小胞（ＩＬ）に対応する（非特許文献９）。エクソソームの周知の機能は、廃退したか、又はミスフォールディングされたタンパク質及び脂質を除去すること、そして、これらを腸又は尿のような排液系へと分泌することである（非特許文献１０；非特許文献１１）。加えて、蓄積された証拠が、これらが、タンパク質、脂質及びＲＮＡの特定の組み合わせを含む貨物の細胞内送達のためのシャトルとして機能することを示している。ＡＤの病態発現に関して、本発明者らのこれまでの研究（非特許文献１２）は、褐色細胞腫ＰＣ１２由来のエクソソームが、エンドサイトーシス不全の状況下で不溶性のＡβ原線維を強力に誘導することを実証しており、これは、ＡＤ脳の神経細胞に見られる初期の病理学的変化を示すものである。加えて、エクソソームのマーカータンパク質であるＡｌｉｘは、ＡＤ患者の脳に見られるＡβ斑に蓄積することが報告されている（非特許文献１３）。【０００４】
スフィンゴミエリン合成酵素（ＳＭＳ）は、細胞膜に最も多量に存在するスフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリン（ＳＭ）を合成する酵素であり、細胞死及び生存に重要な役割を果たしている（非特許文献１４及び１５参照）。ＳＭＳは、２００４年に同定され、ＳＭＳ１及びＳＭＳ２の２種類が存在することが知られている。ＳＭＳ１はゴルジ体に発現し、ＳＭのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与することが知られている。一方、ＳＭＳ２はゴルジ体及び細胞膜に発現し、生理機能については詳細が不明であり（非特許文献１６参照）、非特許文献１６〜１９において動脈硬化への関与の可能性が示唆されているにすぎなかった。また、本発明者らの一部は、ＳＭＳ２がメタボリックシンドロームに関連することも見出し、その治療又は予防のための方法も開示した（非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hardy  J  et  al.,  Science(2002)297:353-356
【非特許文献２】Hardy  J  et  al.,  Trends  Pharmacol  Sci  (1991)12:383-388
【非特許文献３】McLean  CA  et  al.,  Ann  Neurol  (1999)46:860-866
【非特許文献４】Selkoe  DJ、Science  (1997)275:630-631
【非特許文献５】Mawuenyega  KG  et  al.,  Science  (2010)330:1774
【非特許文献６】Blennow  K  et  al.,  Nat  Rev  Neurol(2010)6:131-144
【非特許文献７】Rajendran  L  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A(2006)103:11172-11177
【非特許文献８】Simons  M  et  al.,  Curr  Opin  Cell  Biol(2009)21:575-581
【非特許文献９】Fevrier  B  et  al.,  Curr  Opin  Cell  Biol(2004)16:415-421
【非特許文献１０】Keller  S  et  al.,  Kidney  Int(2007)72:1095-1102
【非特許文献１１】Gonzales  PA  et  al.,  J  Am  Soc  Nephrol(2009)20:363-379
【非特許文献１２】Yuyama  K  et  al.,  J  Neurochem(2008)105:217-224
【非特許文献１３】Rajendran  L  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A(2006)103:11172-11177
【非特許文献１４】Yamaoka  et  al.,  The  Journal  of  Biological  Chemistry,279,18688-18693,  (2004)
【非特許文献１５】Huitema  et  al.,  The  EMBO  Journal,23,33-44,  (2004)
【非特許文献１６】Tafesse  et  al.,  The  Journal  of  Biological  Chemistry,281,29421-29425,  (2006)
【非特許文献１７】Park  et  al.,  Circulation,110,3465-3471,  (2004)
【非特許文献１８】Liu  et  al.,Arteriosclerosis,Thrombosis,  and  Vascular  Biology,  29,  850-856,(2009)。
【非特許文献１９】Liu  et  al.,  Circulation  Research,105,295-303,  (2009)
【非特許文献２０】Mistutake  S.  et  al.,  J  Biol  Chem.  2011  Aug  12;286(32):28544-55.  Epub  2011  Jun  13
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、スフィンゴミエリンの代謝のエクソソーム及びアミロイドβ（Ａβ）との関連に着目した医薬等調節因子のスクリーニング方法及びそれによって得られる医薬等に関する。また、本発明は、スフィンゴミエリンの合成酵素のアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患への関与及びそれらの予防又は治療のための方法を提供する。【０００７】
本発明は、ＳＭＳ２又はｎＳＭａｓｅ２等を介したスフィンゴ脂質の合成を抑制することによるアミロイドβ（Ａβ）に関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）の処置薬又は予防薬に関する。【０００８】
したがって、より具体的には、本発明は、以下を提供する。【０００９】
１つの局面では、本発明は、
(1)中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２）及び／又はスフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）のタンパク質と被験物質を接触させる工程、
(2)該被験物質を接触させた該Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性を、該被験物質を接触させない該Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性と比較する工程、及び
(3)該被験物質を接触させた該Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性が該被験物質を接触させない該Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性と比較して上昇している場合、及び／又は該被験物質を接触させた該ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性が該被験物質を接触させない該ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性と比較して低下している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む、
アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法を提供する。【００１０】
別の局面では、本発明は、
(1)細胞と被験物質とを接触させる工程、
(2)該被験物質を接触させた該細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の発現を、該被験物質を接触させない対照細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の発現と比較する工程、及び
(3)該被験物質を接触させた該細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２の発現が該被験物質を接触させない該対照細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２の発現よりも上昇している場合、及び／又は該被験物質を接触させた細胞におけるＳＭＳ２の発現が該被験物質を接触させない細胞におけるＳＭＳ２の発現と比較して低下している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む、
アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法を提供する。【００１１】
別の局面では、本発明は、
(1)細胞と被験物質とを接触させる工程、
(2)該被験物質を接触させた該細胞におけるエクソソーム分泌レベルを、該被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム分泌レベルと比較する工程、及び
(3)該被験物質を接触させた該細胞におけるエクソソーム分泌レベルが、該被験物質を接触させない該対照細胞におけるエクソソーム分泌レベルよりも上昇している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む、
アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法を提供する。【００１２】
１つの実施形態では本発明の方法において使用される細胞及び対照細胞は、神経細胞である。【００１３】
別の局面では、本発明は、Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。この局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質として提供されてもよい。あるいは、この局面では、本発明は、被験体におけるアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防の方法であって、そのような処置又は予防を必要とする被験体にＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質の有効量を投与する工程を包含する、方法として提供されてもよい。【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、Ｎ−ＳＭａｓｅ２を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。この局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのＮ−ＳＭａｓｅ２として提供されてもよい。あるいは、この局面では、本発明は、被験体におけるアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防の方法であって、そのような処置又は予防を必要とする被験体にＮ−ＳＭａｓｅ２の有効量を投与する工程を包含する、方法として提供されてもよい。【００１５】
なおさらに別の局面では、本発明は、ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。この局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質として提供されてもよい。あるいは、この局面では、本発明は、被験体におけるアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防の方法であって、そのような処置又は予防を必要とする被験体にＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質の有効量を投与する工程を包含する、方法として提供されてもよい。【００１６】
１つの実施形態では、本発明において使用される上記物質は核酸である。【００１７】
別の実施形態では、本発明において使用される上記核酸はｓｉＲＮＡ及び／又はアンチセンス核酸である。【００１８】
詳細な実施形態では、本発明において使用される上記ｓｉＲＮＡは、
下記の（ａ）〜（ｐ）に記載のｓｉＲＮＡからなる群より選択される：
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｂ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｃ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方が配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｄ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方が配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｅ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方が配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｆ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方が配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｇ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方が配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｈ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方が配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｉ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方が配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｊ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１９で表される塩基配列であり、他方が配列番号２０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｋ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；；
（ｌ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｍ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｎ）  二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｏ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｐ）一方又は両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失又は置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｏ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。【００１９】
本発明のさらなる局面において、本発明は、アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患の処置又は予防のための医薬のスクリーニング方法を提供する。この方法は、Ａ）１）エクソソーム；２）中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２）；及び３）スフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）からなる群より選択される少なくとも１つの要素と該医薬の候補とを相互作用しうる状態に供する工程；並びにＢ）該医薬の候補の、該要素に対する影響を調べる工程を包含し、該要素の少なくとも１つを該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。【００２０】
１つの実施形態において、前記状態、障害又は疾患は、アミロイドβの重合又は繊維化に起因するものである。【００２１】
１つの実施形態において、前記状態、障害又は疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患（例えば、加齢黄斑変性（加齢性黄斑網膜症ともいう）、緑内障等）（日本薬理学雑誌Ｖｏｌ．１３４（２００９），Ｎｏ．６  ３０９−３１４参照）からなる群より選択される１以上である。【００２２】
１つの実施形態では、前記工程Ａ）は、細胞と前記候補とを相互作用しうる状態に供する工程であり、前記工程Ｂ）は、前記エクソソームの分泌レベルを調べる工程であり、ここで、該エクソソームの該細胞からの分泌レベルを、該候補が医薬であるかどうかの指標とする。【００２３】
１つの実施形態では、前記細胞は神経細胞である。【００２４】
ある実施形態では、前記要素にエクソソームを含み、前記医薬の候補の存在下又は不存在下で、該エクソソームと、Ａβ１−４０及び／又はＡβ１−４２と接触させる工程を含み、ここで、該エクソソーム、該Ａβ１−４０、該Ａβ１−４２及びAβ重合体のうちの少なくとも１つの量を該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。【００２５】
別の実施形態では、前記要素にエクソソームを含み、前記医薬の候補の存在下又は不存在下で、該エクソソームと、Ａβ１−４０及び／又はＡβ１−４２、及びミクログリアを接触させる工程を含み、ここで、該エクソソーム及び／又は該Ａβ１−４０及び／又は該Ａβ１−４２の該ミクログリアへの取り込みを該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。【００２６】
さらに別の実施形態では、前記医薬の候補の存在下又は不存在下で、Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の活性を調べる工程を包含し、該Ｎ−ＳＭａｓｅ２の活性低下及び該ＳＭＳ２の活性増加を該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。【００２７】
別の局面では、本発明は、Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質及び／又は発現ベクターを含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。【００２８】
さらに別の局面では、本発明は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。【００２９】
１つの実施形態では、本発明の医薬組成物で用いられる核酸はアンチセンス核酸である。【００３０】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物で用いられる核酸はロックド核酸（ＬＮＡ）を含むアンチセンス核酸である。【００３１】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物で用いられるアンチセンス核酸は、配列番号２９〜４０のいずれか１つ以上からなる。【００３２】
別の局面では、本発明は、下記の（ａ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかの、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのｓｉＲＮＡを提供する：
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方が配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｄ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方が配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｅ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方が配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｆ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方が配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｇ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方が配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｈ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方が配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｉ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方が配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｊ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１９で表される塩基配列であり、他方が配列番号２０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｋ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；；
（ｌ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｍ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｎ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｏ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｐ）一方又は両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失又は置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｏ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。【００３３】
１つの実施形態では、前記アミロイドβに関連する疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患又は加齢性黄斑網膜症からなる群より選択される１又は２以上である。【００３４】
別局面では、本発明は、配列番号２９〜４０のいずれか１つ以上からなる、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのロックド核酸（ＬＮＡ）含有核酸を提供する。【００３５】
１つの実施形態では、前記アミロイドβに関連する疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患又は加齢性黄斑網膜症からなる群より選択される１又は２以上である。【００３６】
別局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患を処置又は予防する方法であって、該方法は、本発明の医薬組成物を該処置又は予防に有効な量で該治療又は予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。【００３７】
１つの実施形態では、前記アミロイドβに関連する疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患又は加齢性黄斑網膜症からなる群より１又は２以上選択される。【００３８】
別局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患を処置又は予防する方法であって、該方法は、本発明のｓｉＲＮＡを該処置又は予防に有効な量で該治療又は予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。【００３９】
１つの実施形態では、前記アミロイドβに関連する疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患又は加齢性黄斑網膜症からなる群より１又は２以上選択される。【００４０】
別の局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患を処置又は予防する方法であって、該方法は、本発明のＬＮＡ含有核酸を該処置又は予防に有効な量で該治療又は予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。【００４１】
１つの実施形態では、前記アミロイドβに関連する疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患又は加齢性黄斑網膜症からなる群より１又は２以上選択される。【００４２】
エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は様々な種類の細胞から放出されるエンドソーム膜由来の二重膜小胞である。近年、神経細胞由来エクソソームにアミロイドβ（Ａβ）が結合していることや、アルツハイマー病における老人班の中心部にエクソソームのマーカータンパク質が局在していることが報告され、脳におけるＡβの動態に関して何らかの役割をもつ可能性が示唆されている。本発明では、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（Ｎ２ａ細胞とも称される。）及び初代培養大脳皮質神経細胞から分泌されるエクソソームを培養上清中から回収し、Ａβ重合及びミクログリアへのＡβ取り込みに与える影響について検討した。その結果、神経細胞由来エクソソームは、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２の重合・繊維化を促進することがわかった。また、エクソソーム表面にはホスファチジルセリン（ＰＳ）が露出しており、ＰＳ依存的にミクログリアへ取り込まれた。Ａβ繊維は単独でもミクログリアに取り込まれるが、エクソソームと共に培養液中に添加すると取り込みが促進された。このエクソソームによるＡβ繊維の取り込み促進は、アネキシンＶを用いてＰＳをブロックすると抑制された。また、エクソソームと共にミクログリアに取り込まれたＡβは、細胞内で分解されることが確認された。以上の結果はエクソソームがＡβクリアランスに関与する可能性を示唆するものである。エクソソームによるＡβ分解促進とアルツハイマー病の病態発現との関係が本発明により示唆された。【００４３】
本発明者らは、エクソソームと結合した細胞外Ａβの運命を調べるための実験を行うことにした。本明細書において、本発明者らは、神経芽細胞腫Ｎ２ａ及びマウス初代培養大脳皮質神経細胞が、構成的にエクソソームを放出し、そして、これらのエクソソームが、可溶性形態からのＡβアミロイド形成を著しく加速したことを実証した。特筆すべきことに、神経細胞由来エクソソームは、ミクログリア内に取り込まれると、ミクログリアによるＡβの取り込み／分解の増強をもたらした。さらに、本発明者は、エクソソームの分泌が、スフィンゴ脂質合成酵素として知られる中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２又はＮ−ＳＭａｓｅ２）及びスフィンゴミエリンシンターゼ２（ＳＭＳ２）によって調節されることを示した。ＳＭＳ２  ｓｉＲＮＡによって媒介されるエクソソーム分泌のアップレギュレーションは、ミクログリアによるＡβ取り込みの促進に十分であり、トランスウェルシステムを用いた神経細胞及びミクログリア細胞の共培養において、細胞外Ａβレベルの有意な減少をもたらした。これらの結果は、エクソソームにより媒介されるＡβクリアランスの新たな機構を提案するものである。【００４４】
アルツハイマー病（ＡＤ）の病因であるアミロイドβペプチド（Ａβ）は、生理学的代謝産物であり、その代謝は、正常な脳では絶え間なく制御されている。最近の研究は、細胞外Ａβの一部分がエンドソーム起源の小型膜小胞であるエクソソームと結合しているものの、エクソソームと一体になったＡβの運命については大部分が不明であることを実証している。本明細書において、本発明者らは、細胞外Ａβに対する神経細胞由来エクソソームの新たな役割、すなわち、エクソソームが、Ａβの非毒性アミロイド原線維への構造変化を駆動し、Ａβのミクログリアへの取り込みを促進することを同定した。エクソソームとともに取り込まれたＡβはさらに、リソソームへと輸送され、ミクログリア内で分解された。本発明者らはまた、アネキシンＶによるエクソソーム表面上でのホスファチジルセリンのブロックが、エクソソームによる取り込みを妨げるだけでなく、ミクログリア内へのＡβの取り込みも抑制することを見出した。加えて、本発明者らは、神経細胞由来エクソソームの分泌が、中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２又はＮ−ＳＭａｓｅ２）及びスフィンゴミエリンシンターゼ２（ＳＭＳ２）を含むスフィンゴ脂質合成酵素の活性によって調節されることを示した。トランスウェル実験では、ＳＭＳ２  ｓｉＲＮＡでの神経細胞の処理によるエクソソーム分泌のアップレギュレーションが、ミクログリア細胞内へのＡβの取り込みを促進し、そして、細胞外Ａβレベルを有意に低下させた。本発明者らの知見は、Ａβのエクソソームとの結合を介した、Ａβのクリアランスを担う新たな機構を示している。小胞の放出及び／又は除去の調節は、ＡＤの危険性を変える可能性がある。【００４５】
以上のように、本発明に関して、アルツハイマー病等の神経疾患・アミロイドβ（Ａβ）に関連する状態、障害又は疾患は複合的な要因で起こることが知られている。よって新しい作用機序を持つ医薬品の登場は、これまでの医薬品の弱点を補うことができる可能性がある。【００４６】
本発明者らは、スフィンゴ脂質の代謝を制御する事で、これまでに無かった作用機序でアルツハイマー病等のアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を改善する方法を開発した。【００４７】
本発明者らは、スフィンゴ脂質の一つスフィンゴミエリンの合成酵素ＳＭＳ２などのスフィンゴミエリン合成酵素を制御することでアルツハイマー病等のアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を改善する方法を提案する。ＳＭＳはスフィンゴミエリンを合成する際に等モル量のセラミドを生成する。本明細書においてエクソソームとの関連が示された。また、本明細書において、アルツハイマー病等の神経疾患のホスファチジルセリン特異的な制御との関連も示された。そして、本明細書において、アミロイドβの凝集とエクソソームとの関連も示された。加えて、本明細書において、ＳＭＳ（スフィンゴミエリナーゼ合成酵素）及びＳＭＳ２とアルツハイマー病等の神経疾患との関連も示された。そこで、本発明は、アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患に関する新たなスクリーニング方法を提供する。【００４８】
そこで、ＳＭＳ２機能を阻害することにより、アルツハイマー病等の神経疾患の予防又は治療効果を期待することができると考え、例えば、新規分子特異的ノックダウン法であるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法の治療への応用を検討した。【００４９】
ＲＮＡｉ法とは、短い干渉ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ））を用いて、特定遺伝子の発現を遺伝子レベルで速やかに発現抑制する技術である。ＲＮＡｉは１９９８年にＦｉｒｅらによって発見された現象（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３９１：８０６−１１，（１９９８））で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。ＲＮＡｉを媒介する分子のうちでも、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、その応用が進んでいる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−８，（２００１））。ＳＭＳ２のｍＲＮＡ配列から、ターゲットとなる配列を複数選択し、そのｓｉＲＮＡを合成し、ＳＭＳ２をノックダウンさせることにより疾患治癒に結びつけられることを見出した。
【発明の効果】
【００５０】
従来、スフィンゴ脂質の合成制御を介したアルツハイマー病等のアミロイドβ（Ａβ）に関連する疾患・神経疾患改善薬は存在しないので、本発明により新しい作用機序を持つ医薬品を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、神経細胞由来エクソソームによるＡβアミロイド生成を示す。Ａ；エクソソームを、実施例に示すとおりに、段階的な遠心分離により、神経芽細胞腫Ｎ２ａの培養上清から回収した。１００，０００×ｇのペレットをロードし、スクロース勾配遠心分離に供した。得られた画分を、エクソソームタンパク質であるＡｌｉｘ及びＴｓｇ１０１、並びにＧＭ１ガングリオシドについて分析した。Ｂ；精製エクソソーム（１００，０００×ｇペレット）を、リンタングステン酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡で観察した。スケールバーは、右側が５００ｎｍであり、左側が１００ｎｍである。Ｃ；Ｎ２ａ細胞の培養培地を段階的遠心分離に供した。得られたペレット、３，０００×ｇ（Ｐ３）、４，０００×ｇ（Ｐ４）、１０，０００×ｇ（Ｐ１０）及び１００，０００×ｇ（Ｐ１００）を２５μＭの可溶性Ａβと混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション混合物中に形成されたアミロイド原線維を、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイで測定した。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。Ｄ；示される時間にわたり、２５μＭのＡβを含み、かつＮ２ａ細胞又は大脳皮質神経細胞の培養上清に由来するエクソソームを含むか又は含まない混合物中でＴｈＴ蛍光強度を測定した。値は、平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔ検定。
【図２】図２は、Ａβのオリゴマー形成及び毒性に対するエクソソームの影響を示す。Ａ；精製Ｎ２ａ由来エクソソームを、２５μＭの可溶性Ａβ１−４２と混合し、３７℃にて、０時間、１時間、３時間、５時間、１０時間及び２４時間インキュベートした。このインキュベーション混合物を、抗オリゴマー抗体（Ａ１１）及び抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）を用いたドットブロット分析に供した。Ｂ；Ａβ１−４２（２５μＭ）を、３７℃で５時間、Ｎ２ａ由来エクソソームと共に、又は、Ｎ２ａ由来エクソソーム無しでインキュベートした。このインキュベーション混合物を、続いて、大脳皮質神経細胞に２４時間曝した。細胞生存率をＷＳＴ−１アッセイを用いて測定した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔ検定。
【図３】図３は、エクソソーム分泌及びＡβアミロイド生成に対するスフィンゴ脂質代謝の状態を示す。Ａ−Ｂ；Ｎ２ａ細胞又は大脳皮質神経細胞を、イミプラミン、ＧＷ４８６９、Ｄ６０９又はそれぞれの小胞で２４時間処理した。次に、培養培地からエクソソームを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットにかけて、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１及びＧＭ１ガングリオシドを検出した。エクソソームのペレットは、５×１０６細胞の培養物から精製した。（Ａ）Ｎ２ａ細胞溶解物及び１００，０００×ｇペレット（エクソソーム）におけるＡｌｉｘの代表的なブロット。細胞溶解物は、２．５×１０５細胞から調製した。（Ｂ）ウェスタンブロットに関する定量的分析。結果は平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｔ検定。Ｃ−Ｄ；ａＳＭａｓｅ、ｎＳＭａｓｅ１、ｎＳＭａｓｅ２、ＳＭＳ１及びＳＭＳ２に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をＮ２ａ細胞内に送達した。エクソソームは、ｓｉＲＮＡ処理した細胞の培地から精製し、そして、エクソソームマーカーの量をウェスタンブロットにより測定した。（Ｃ）細胞溶解物及びエクソソームにおいてＡｌｉｘを検出した。（Ｄ）エクソソームマーカーのバンド強度を分析した。データは、平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｔ検定。Ｅ；Ｎ２ａ細胞を、Ｃ６−セラミド（５０μＭ）又は細菌性ＳＭａｓｅ（１００μＵ／ｍｌ）で２４時間処理した。エクソソームの放出レベルをウェスタンブロットにより評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５；ｔ検定。Ｆ；エクソソームは、示される試薬で処理したＮ２ａ細胞又は初代培養神経細胞の培養物から単離した。次に、これらを、２５μＭの可溶性Ａβ４２と共に３７℃で示される時間にわたりインキュベートした。混合物内に形成されたＡβアミロイド原線維を、ＴｈＴアッセイにより測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔ検定。Ｇ；Ｎ２ａ細胞を示されるｓｉＲＮＡで処理し、そして、精製したエクソソームを２５μＭのＡβ４２と混合した。５時間のインキュベーションの後、ＴｈＴ蛍光を測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表される。＊ｐ＜０．０５；ｔ検定。
【図４】図４は、ミクログリア内へのエクソソームの移動を示す。Ａ；Ｎ２ａ細胞培養から精製したエクソソームを、染料ＰＫＨ２６（赤色染料）で標識し、ミクログリア細胞株ＢＶ−２、又は、ミクログリア若しくは大脳皮質神経細胞の初代培養物へと添加した。エクソソームとともに３時間インキュベーションした後、細胞を固定し、ＤＡＰＩ染色し、そして、共焦点顕微鏡で分析した。Ｂ；Ｎ２ａ由来エクソソームを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合体化アネキシンＶ（ＡＶ）及びコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）に結合させて、それぞれ、表面に露出したホスファチジルセリン（ＰＳ）及びＧＭ１ガングリオシド（ＧＭ１）を検出した。蛍光標識を、共焦点顕微鏡により視覚化した。右のパネルは、位相差（Ｐ．Ｃ）における同じ視野を示す。スケールバーは２００ｎｍである。Ｃ−Ｄ；Ｎ２ａ培養物から回収したエクソソームを、赤色染料ＰＫＨ２６で標識し、その後、ＡＶ若しくはＣＴＢ処理を行うか、又はＡＶ若しくはＣＴＢ処理を行わなかった。標識したエクソソームをＢＶ−２細胞に加え、３時間インキュベートした。その後、細胞を固定し、ＤＡＰＩ染色した。（Ｃ）内在化したエクソソームの共焦点像を示す。（Ｄ）細胞ごとの蛍光強度を画像分析により決定した。エクソソームの内在化を、３回の独立した実験から定量した。値は平均±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔ検定。
【図５】図５は、エクソソームによるミクログリア内へのＡβ取り込みの加速を示す。Ａ−Ｂ；Ｎ２ａ由来エクソソームを、２５μＭのＡβ１−４２とともに３７℃にて５時間インキュベートした。次いで、プレインキュベートした混合物をＢＶ−２細胞又は初代培養ミクログリアに加え（Ａβの最終濃度、０．５μＭ）、さらに、示される時間にわたりインキュベートした。ＢＶ−２細胞（Ａ）及び馴化培地（Ｂ）におけるＡβ１−４２のレベルをＥＬＩＳＡによりて定量した。値は平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔ検定。Ｃ；Ｎ２ａ由来エクソソームを、２５μＭのＡβ１−４２とともに３７℃にて５時間インキュベートし、そしてさらに、アネキシンＶ（ＡＶ）又はコレラ毒素サブユニット（ＣＴＢ）とともに３７℃にてさらに１５分間インキュベートした。次に、これらの混合物を、ＢＶ−２細胞又は初代培養ミクログリアに加え、３時間共培養した。Ａβの細胞内レベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。値は平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１；ｔ検定。
【図６】図６は、ミクログリア内でのＡβの分解を示す。Ａ；Ａβ１−４２（２５μＭ）を、Ｎ２ａ由来エクソソームとともに、又はＮ２ａ由来エクソソーム無しで、３７℃にて５時間インキュベートした。次に、これらのインキュベーション混合物を、ＢＶ−２細胞に対して３時間曝した（Ａβの最終濃度、０．５μＭ）。培地内の遊離Ａβ及びエクソソームを洗い流した後、細胞をさらに４８時間まで追跡した。示される時点において、Ａβ４２の細胞内レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。Ｂ；エクソソームを、ＰＫＨ２６（赤色染料）で標識し、ＢＶ−２細胞の培養物へと加えた。３時間のインキュベーションの後、細胞をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色し、共焦点顕微鏡により分析した。スケールバーは５μｍである。Ｃ；ＰＫＨ２６標識したエクソソームを、蛍光色素ＦＡＭ結合体化Ａβ４２（２５μＭ）と混合した。５時間のインキュベーションの後、これらの混合物をＢＶ−２細胞の培養物に対して３時間曝し、そして、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅで染色した。スケールバーは５μｍである。
【図７】図７は、ＳＭＳ２ノックダウンによるＡβクリアランスの促進を示す。Ａ−Ｃ；インサート内に播種したＮ２ａ細胞を、ＡＰＰ７７０遺伝子と、示されるとおりのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、培地を除き、そして、Ｎ２ａ細胞が付いたインサートを、（Ｂ）ＢＶ−２細胞有り、又は（Ａ）ＢＶ−２細胞無しのウェル上にさらに２４時間置いた。培地（Ａ、Ｂ）及びＢＶ−２細胞（Ｃ）内のＡβのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。値は平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔ検定。Ｄ；Ｎ２ａ細胞を、ＡＰＰ遺伝子と、Ｎ−ＳＭａｓｅ２又はＳＭＳ２についてのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。培地を交換し、さらに２４時間インキュベートした。エクソソームを培地から回収し、グアニジンＨＣｌバッファーで可溶化し、そして、ウェスタンブロット分析に供した。
【図８】図８は、Ａβ代謝におけるエクソソームの役割を示す概略図である。エクソソーム及びＡβはともに、神経細胞から生成され、そして、細胞外空間へと放出される。エクソソームの分泌は、スフィンゴ脂質代謝酵素であるＮ−ＳＭａｓｅ２及びＳＭＳ２によって二方向性に調節される。エクソソームは、その表面上でのＡβアミロイド生成を促進し、その後、ＰＳ依存性の様式でＡβ原線維の一部をミクログリア内へと取り込み、これらを分解する。神経細胞性エクソソームは、Ａβのクリアランスを促進する可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語及び科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００５３】
（定義）
本明細書において、必要に応じて、以下の略語を用いる。
Ａβ：アミロイドβ（βアミロイド）（タンパク質）
ＳＭ：スフィンゴミエリン
ＳＭＳ：スフィンゴミエリン合成酵素
ＳＭＳ１、ＳＭＳ２、Ｎ−ＳＭａｓｅ２：遺伝子名
ＳＭａｓｅ：スフィンゴミエリナーゼ
ＫＯ：ノックアウト
ｗＫＯ：ダブルノックアウト
ＭＥＦ：マウス胚性繊維芽細胞
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＷＴ：野生型
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００５４】
本明細書において、「スフィンゴミエリン合成酵素」（本明細書において「ＳＭＳ」ともいう。）とは、スフィンゴミエリン（本明細書において「ＳＭ」ともいう。）を合成する酵素であって、ホスファチジルコリン（本明細書において「ＰＣ」ともいう。）の存在下で、セラミドをスフィンゴミエリンへと変換する酵素をいい、細胞死及び生存に重要な役割を果たしている（非特許文献１４及び１５参照）。ここで、ホスファチジルコリンは、変換後ジアシルグリセロールに変換される。スフィンゴミエリン合成酵素としては、代表的に、ＳＭＳ１及びＳＭＳ２が知られており、このほかにもホモログがあることが知られている（非特許文献１４及び１５参照）。ＳＭＳ１はゴルジ体に発現し、ＳＭのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与することが知られている。一方、ＳＭＳ２はゴルジ体及び細胞膜に発現し、生理機能については詳細が不明である（非特許文献１６参照）。なお、ＳＭＳ１のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、ＮＭ＿１４７１５６（ヒト）、ＮＭ＿１４４７９２（マウス）であり、ＳＭＳ２は、ＢＣ０２８７０５．１（ヒト）、ＢＣ０４１３６９．２（ヒト）、ＮＭ＿０２８９４３（マウス）である。
【００５５】
本明細書において「アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患」とは、アミロイドβの挙動の変化に関連する任意の状態、障害又は疾患をいう。そのような状態、障害又は疾患としては、アルツハイマー病等の認知症のほか、網膜疾患等が挙げられるがそれらに限定されない。網膜疾患としては、緑内障，糖尿病網膜症，加齢黄斑変性症（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）及び網膜色素変性症等が挙げられ、日本薬理学雑誌Ｖｏｌ．１３４（２００９），Ｎｏ．６  ３０９−３１４等に記載されるように、本発明との関連としては、特に緑内障及び加齢黄斑変性症を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書において「認知症」とは、以前には痴呆症とも称されていた状態であり、後天的な脳の器質的障害により、いったん正常に発達した知能が低下した状態をいい、「知能」の他に「記憶」「見当識」を含む認知の障害や人格障害を伴った症候群として定義される。
【００５７】
本明細書において「アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ＡＤ）」とは、当該分野において使用されるのと同一の意味で用いられ、変形性認知症の一つであり、老人班、神経原線維変化、神経細胞脱落そして認知障害によって特徴付けられる進行性の神経変性疾患であり、認知機能低下、人格の変化を主な症状とする認知症の一種である。病理学的、生化学的な検討から、老人斑の構成物質であるβ−アミロイド４２（Ａβ４２）がＡＤの原因物質であると推測されている。アルツハイマー病には、家族性アルツハイマー病  （Ｆａｍｉｌｉａｌ  ＡＤ；  ＦＡＤ）のほか、アルツハイマー型認知症（ｓｅｎｉｌｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｔｙｐｅ  （ＳＤＡＴ））がある。家族性アルツハイマー病は、完全な常染色体優性遺伝を示し、遺伝性アルツハイマー病ともよばれ、他方、アルツハイマー型認知症は、老年期（６０歳以上）に発症するものをいい、アルツハイマー病の中でほとんどを占めるといわれる。本発明では、いずれのアルツハイマー病も対象としうることが理解される。
【００５８】
本明細書において「スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）」とは、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を加水分解する酵素をいう。スフィンゴミエリンのＳＭａｓｅによる分解により、セラミドとホスホリルコリンとが生成する。本明細書では、「中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２；ｎＳＭａｓｅ２とも表記する）」は、ＳＭａｓｅの一種であり、中性にて至適ｐＨ条件を有するものであるものをいい、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３とも称される。ｎＳＭａｓｅ２のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、ＮＭ＿０１８６６７（ヒト）、ＮＭ＿０２１４９１（マウス）、ＮＭ＿０５３６０５（ラット）である。
【００５９】
本明細書において「ミクログリア」とは、「小膠細胞」とも呼ばれ、中枢神経系の小さな神経膠細胞をいう。ミクログリアは突起を多くもち、病的状態ではアメーバ様に動き、食細胞の機能を示す。小形の神経膠細胞には、細胞体が小さく突起の数も少ない稀突起膠細胞(oligodendroglial  cell)と、細胞体は小さいが分枝に富み活発に異物を摂取するオルテガ細胞(Hortega's  cell)とがある。前者は中枢神経系内の軸索における髄鞘形成を行う。後者は他の神経膠細胞と由来を異にし、中胚葉とされ、そのためmesoglial  cellとよばれ、他の神経膠細胞と別種とする見解もある。小膠細胞(microglial  cell)は後者の別名として用いられる。なお神経鞘は末梢神経系における同質のものとみなされている。
【００６０】
本明細書において「エクソソーム」とは、「エキソソーム」とも表記され、当該分野で通常用いられる定義のとおりに使用され、直径３０〜１００ナノメーターの細胞外小胞顆粒をいう。エクソソームは、あらゆる細胞が分泌しているといわれている。
【００６１】
本明細書において「アミロイドβタンパク質（Ａβ）」とは、当該分野で通常用いられる定義のとおりに使用され、代表的に配列番号８９（ヒトアミロイドβ（１−５５）＝DAEFRHDSGY  EVHHQKLVFF  AEDVGSNKGA  IIGLMVGGVV  IATVIVITLV  MLKKK）の部分配列を有する。ここで、Ａβは多種類あることから、Ａβ（始点）−（終点）、と示し、例えばＡβ１１−４２、Ａβ１７−４２などと示す。１位に始まるものについてはアミノ酸数に基づいてＡβ（数字）と表示されることもあり、これらの数字は下付きで表示されることもある。例えば、Ａβ４２（又はＡβ１−４２）は、配列番号８９のアミノ酸番号１〜４２からなり、Ａβ４０（又はＡβ１−４０）は、配列番号８９のアミノ酸番号１〜４０からなる。
【００６２】
本明細書において「ホスファチジルセリン（ＰＳ）」とは、当該分野で通常用いられる定義のとおりに使用され、極性基がセリンであるリン脂質をいう。
【００６３】
本明細書において「セラミド」とは、当該分野で通常用いられる定義のとおりに使用され、スフィンゴシンを脂肪酸に結合させてえられるアシド類の中の一つと定義される。
【００６４】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写及び翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００６５】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、及びすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００６６】
本明細書において遺伝子発現（例えば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」又は「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定及び免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法又はＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００６７】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチド又はｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、又はノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法又は分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【００６８】
本明細書において「Ｎ−ＳＭａｓｅ２」の「タンパク質」は、Ｎ−ＳＭａｓｅ２の機能を有するものであれば、ＮＭ＿０１８６６７（ヒト）、ＮＭ＿０２１４９１（マウス）、ＮＭ＿０５３６０５（ラット）に示す配列の他、その機能的に等価な改変体又は誘導体であってもよいことが理解される。
【００６９】
本発明の「Ｎ−ＳＭａｓｅ２」の局面の実施形態としては、配列番号８４、８６等からなる群より選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチド、配列番号８４、８６等からなる群より選ばれるアミノ酸配列で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、配列番号８３、８５等からなる群より選択される塩基配列で表されるポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が例示され、いずれもアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を促進する観点から使用される。本発明におけるポリペプチドとしては、配列番号８４、８６等のアミノ酸配列からなるポリペプチド、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスフィンゴミエリナーゼ活性又はアミロイドβに関連する疾患を有するポリペプチド、及びそれらの誘導体、部分ペプチド並びにそれらの塩が例示される。
【００７０】
本明細書において、「ポリペプチドの誘導体」とは、例えば、ポリペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、ポリエチレングリコール化又はアセトアセチル化した誘導体等をいう。これらの中でもＮ末端のアセチル化、Ｃ末端のアミド化、Ｃ末端のメチル化は、末端からポリペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性が付与され、また、グリコシル化又はポリエチレングリコール化によっても生体中における安定性が高くなることが期待されるので当該効果が望まれる場合好ましい。
【００７１】
本発明において使用され得るタンパク質の改変体としては、上記明示された配列からなるタンパク質の「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」を有するものも挙げられ、例えば、（Ａ）配列番号８４、８６等のアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、例えば１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（Ｂ）配列番号８４、８６等のアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、例えば１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（Ｃ）配列番号８４、８６等のアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、例えば１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、又は（Ｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が欠失、置換又は付加されている場合、その欠失、置換又は付加の位置としては、特に限定されない。但し、本発明に使用されるタンパク質は、欠失、置換又は付加によっても、スフィンゴミエリナーゼ又はアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を処置又は予防しうるポリペプチドである。配列番号８４、８６等のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９０％以上又は９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００７２】
本発明において使用され得る「タンパク質の部分ペプチド」としては、前記本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチド等が用いられる。
【００７３】
また、本発明において用いられ得る「部分ペプチド」は、スフィンゴミエリナーゼ又はアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を処置又は予防しうるものであれば、そのアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、例えば１〜５個）のアミノ酸が欠失し、又は、そのアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、例えば１〜５個）のアミノ酸が置換し、又は、そのアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、例えば１〜５個）のアミノ酸が付加されていてもよい。配列番号８４、８６等のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９０％又は９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００７４】
本明細書において、「塩」とは、ポリペプチド又はそれらの誘導体の任意の塩、好ましくは薬学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）をいい、例えば、ポリペプチド又はそれらの誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられる。
【００７５】
上記ポリペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、上記ポリペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
【００７６】
本発明における「Ｎ−ＳＭａｓｅ２」の「発現ベクター」に使用されるポリヌクレオチドとしては、配列番号８３、８５等の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びこれらのポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドであって、かつ、スフィンゴミエリナーゼ活性又はアミロイドβに関連する疾患を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例示される。
【００７７】
ここでいう「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、あるポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、例えば、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ＳａｌｉｎｅＳｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ１：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）のみからなる配列は除外される。
【００７８】
本明細書において「ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。具体的には、例えば、配列番号８３、８５，８９、９０等の塩基配列で表されるポリヌクレオチドについていうと、そのようなポリヌクレオチドとして、配列番号８３、８５，８９、９０等の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
【００７９】
上記ポリヌクレオチドは、公知の方法に準じて調製することができる。また、アミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドやポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、ホスホアミダイト法を利用したＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成機などを用いて行うことができる。
【００８０】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子（ここでは、例えば、目的とするＮ−ＳＭａｓｅ２）及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメント又は制御配列が宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー及び、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、マウス又はヒト等）の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＴＡＴＡボックスなど）を有するＤＮＡ配列をいう。
【００８１】
本明細書において「作動可能に連結」（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいい、プロモーター等の転写翻訳調節配列又は翻訳調節配列についていう場合、所望の配列の発現（作動）がその転写翻訳調節配列又は翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。
【００８２】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。本発明では、プロモーターは単数使用されても良く、複数のプロモーターが使用されても良い。
【００８３】
本発明が使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスをもとに作製できるが、由来するウイルス種は特に限定はされず、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであってもよい。
【００８４】
本発明において使用され得る「レトロウイルス」は、逆転写酵素及びレトロウイルスのビリオンを介して増殖する、１本鎖の、２倍体のＲＮＡウイルスである。レトロウイルスは、複製可能、又は複製不可能である可能性がある。用語「レトロウイルス」は、いずれかの公知のレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのｃ型レトロウイルス）を指す。本発明において使用されうる「レトロウイルス」としてはまた、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２）、及びレトロウイルスのレンチウイルスファミリー（ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、並びにウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）など、しかしこれらに限定されない）が挙げられる。
【００８５】
裸ＤＮＡ（ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ）形態として、プラスミドＤＮＡの形態を好適に例示することができ、かかるプラスミドとしては公知の動物細胞用発現ベクタープラスミドを挙げることができる。かかるベクタープラスミドは、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−１ウイルスＴＫ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）初期プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）プロモーターを含むものが好ましい。その他、トランスフェクトされた細胞を選択又は同定することができるマーカー遺伝子を含んでいてもよく、かかるマーカー遺伝子としては、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｇｐｔ（キサンチングアニンホスホ  リボシルトランスフェラーゼ）遺伝子を挙げることができる。
【００８６】
本明細書において、「（ＳＭＳ２等の遺伝子の）発現を抑制する物質（例えば、核酸）」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを分解する物質（例えば、核酸）、又はｍＲＮＡからの蛋白質の翻訳を抑制する物質（例えば、核酸）であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はこれらの発現ベクター等の核酸などが例示される。その中でも、ｓｉＲＮＡ及びその発現ベクターが好ましく、特にｓｉＲＮＡが好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。なお、１つの実施形態では本発明において標的遺伝子は、ＳＭＳ２遺伝子である。
【００８７】
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、ＳＭＳ２遺伝子のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含んでなるＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡ及び後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計及び製造は当業者の技量の範囲内である。
【００８８】
二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限及び下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
【００８９】
さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の一方又は両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加又は欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、並びにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
【００９０】
さらに、該ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、及びその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
【００９１】
ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
【００９２】
本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、及びその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
【００９３】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体又はその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
【００９４】
本発明のＳＭＳ２等の遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）及び／又はヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；及び他の複素環塩基等が挙げられる。
【００９５】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００９６】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、配列表に記載の配列を好ましく用いることができる。これらのｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を表１に示す。表１中、大文字で示されるのはセンスＲＮＡ配列及びアンチセンスＲＮＡ配列であり、小文字又はｄ＋大文字（デオキシ体を意味する）で示されるのは３’末端オーバーハング配列である。
【００９７】
【表１】
2013054534.tif 000002
【００９８】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物（又は細胞等）に組み込むこと又はそのような遺伝子が組み込まれたか又は欠失若しくは抑制された生物（例えば、動物（マウスなど）を含む）（又は細胞等）をいう。トランスジェニック生物（又は細胞等）のうち、ある遺伝子が欠失又は抑制されているものをノックアウト生物（又は細胞等）という。したがって「ノックアウト」とは、動物又は細胞等について言及するとき、標的となる生来の遺伝子を機能しない状態又は発現しない状態となっていることをいう。
【００９９】
本明細書において「遺伝子導入」は、目的となる遺伝子を細胞、組織、又は動物中に導入することをいい、概念として、「形質転換」、「形質導入」及び「トランスフェクション」などを包含するものであり、当該分野において公知の任意の手法によって実現することができる。また、「遺伝子導入」には導入部位を限定しない導入及び導入部位を限定する相同組換による導入のいずれも含むものである。遺伝子導入の手法としては、例えば、レトロウイルス、プラスミド、ベクター等を用いた手法、あるいは、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法が挙げられるがそれに限定されない。遺伝子導入に使用される細胞は、どのような細胞でもよいが、未分化細胞（例えば、繊維芽細胞など）を利用することが好ましい。
【０１００】
本明細書において、「予防する」とは、本発明の標的とする疾患、障害又は症状が発生する前に、何らかの手段により、その疾患、障害又は症状を生じさせないか又は少なくとも遅延させること、あるいは疾患、障害又は症状の原因自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。
【０１０１】
本明細書において、「治療する」とは、既に発症している本発明の標的とする疾患、障害又は症状の進行を食い止めるか、又は完全又は部分的に拘わらず、本発明の標的とする疾患、障害又は症状の進行が止まるか、又は改善することをいう。
【０１０２】
本明細書において「処置」とは、疾患、障害又は症状に対して何らかの影響を与えるか、そのような疾患、障害又は症状になることを防止することをいい、治療及び予防の両方を含みうる。狭義には、「処置」は、「予防」に対して、発症後の上記行為をさす。
【０１０３】
本明細書において「医薬」とは、当該分野でもっとも広義に解釈され、任意の薬を含み、薬事法上の医薬品、医薬部外品等のほか、骨形成による治療又は予防を意図する任意の用途の薬剤、組成物等を包含することが理解される。そのような例として、医療分野、歯科分野等における応用が挙げられ、例えば、遺伝子治療剤などが挙げられる。通常、医薬は固体又は液体の賦形剤を含むとともに、必要に応じて崩壊剤、香味剤、遅延放出剤、滑沢剤、結合剤、着色剤などの添加剤を含むことができる。医薬品の形態は、錠剤、注射剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、徐放製剤などを含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書において「候補」、「候補物質」及び「被験物質」は交換可能に使用され、医薬、処置物質、予防物質などのスクリーニング目的とする物質の候補であって、スクリーニングの対象となる物質をいう。
【０１０５】
本明細書において物質（例えば、被験物質等）をタンパク質、細胞等の対象に「接触」させるとは、通常の意味で使用され、その物質とその対象とが相互作用する程度に近傍に配置されることをいう。
【０１０６】
本明細書において「対照細胞」とは、被験物質等を接触させた細胞に対する用語であって、対照として使用される、当該被験物質等を接触させていない細胞をいう。
【０１０７】
本明細書において「Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質」とは、Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる任意の物質をいう。このような物質は、Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる限りどのような物質でもよく、Ｎ−ＳＭａｓｅ２をコードする核酸でもよい。そのような物質としては、例えば、標的遺伝子であるＮ−ＳＭａｓｅ２のｍＲＮＡの転写を上昇させる物質、あるいは、Ｎ−ＳＭａｓｅ２をコードする核酸又はその核酸を含む発現ベクター、転写されたＮ−ＳＭａｓｅ２のｍＲＮＡを分解を防止する物質、又はＮ−ＳＭａｓｅ２のｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を上昇させる物質、翻訳されたＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質を分解を防止する物質、翻訳されたＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質を安定化する物質、Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性を上昇させる物質、酵素活性が上昇されたＮ−ＳＭａｓｅ２の改変体、それをコードする核酸又はその核酸を含む発現ベクター等であれば特に限定されるものでなく、核酸（裸のＤＮＡ又はその発現ベクター等）、タンパク質やペプチド、あるいは他の低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー等で合成されうるもの等）、高分子、これらの物質の複合体等も包含されうる。
【０１０８】
本明細書において「ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質」とは、ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる任意の物質をいう。このような物質は、ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる限りどのような物質でもよい。そのような物質としては、例えば、標的遺伝子であるＳＭＳ２のｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたＳＭＳ２のｍＲＮＡを分解する物質（例えば、核酸）、ＳＭＳ２のｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質（例えば、核酸）、翻訳されたＳＭＳ２のタンパク質を分解する物質、翻訳されたＳＭＳ２のタンパク質を不安定化する物質、ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性を低下させる物質（例えば、中和活性を有する抗体）、酵素活性が低減または消失したＮ−ＳＭａｓｅ２の改変体、それをコードする核酸又はその核酸を含む発現ベクター（あるいはこれを組み換えにより天然型を置き換える物質（たとえば、組み換えベクター））等であれば特に限定されるものでなく、核酸（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はこれらの発現ベクター等）、タンパク質やペプチド、あるいは他の低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー等で合成されうるもの等）、高分子、これらの物質の複合体等も包含されうる。かかる物質として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はこれらの発現ベクター等の核酸などが例示されるがそれらに限定されない。
【０１０９】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０１１０】
（医薬探索方法）
１つの局面において、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法を提供する。この方法は、(1)中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２）及び／又はスフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）のタンパク質と被験物質を接触させる工程、(2)該被験物質を接触させた該Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性を、該被験物質を接触させない該Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性と比較する工程、及び(3)該被験物質を接触させた該Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性が該被験物質を接触させない該Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性と比較して上昇している場合、及び／又は該被験物質を接触させた該ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性が該被験物質を接触させない該ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性と比較して低下している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む。
【０１１１】
別の局面において、本発明のアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法は、(1)細胞と被験物質とを接触させる工程、(2)該被験物質を接触させた該細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の発現を、該被験物質を接触させない対照細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の発現と比較する工程、及び(3)該被験物質を接触させた該細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２の発現が該被験物質を接触させない該対照細胞におけるＮ−ＳＭａｓｅ２の発現よりも上昇している場合、及び／又は該被験物質を接触させた細胞におけるＳＭＳ２の発現が該被験物質を接触させない細胞におけるＳＭＳ２の発現と比較して低下している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む。好ましい実施形態では、使用される細胞及び対象細胞は神経細胞であり、さらに好ましくは脳から得た神経細胞である。
【０１１２】
別の局面において、本発明のアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質のスクリーニング方法は、(1)細胞と被験物質とを接触させる工程、(2)該被験物質を接触させた該細胞におけるエクソソーム分泌レベルを、該被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム分泌レベルと比較する工程、及び(3)該被験物質を接触させた該細胞におけるエクソソーム分泌レベルが、該被験物質を接触させない該対照細胞におけるエクソソーム分泌レベルよりも上昇している場合に、該被験物質をアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防物質として選択する工程を含む。好ましい実施形態では、使用される細胞及び対象細胞は神経細胞であり、さらに好ましくは脳から得た神経細胞である。
【０１１３】
さらなる１つの局面において、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬のスクリーニング方法を提供する。この方法は、Ａ）１）エクソソーム、２）中性スフィンゴミエリナーゼ２（Ｎ−ＳＭａｓｅ２）、及び３）スフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）からなる群より選択される少なくとも１つの要素と該医薬の候補とを相互作用しうる状態に供する工程；及びＢ）該医薬の候補の、該要素に対する影響を調べる工程を包含し、該要素の少なくとも１つを該候補が該医薬であるかどうかを指標とする。エクソソームとアミロイドβの凝集又は線維化あるいはそのクリアランスとの関連とがこれまで知られておらず、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬の新たな探索方法を提供するものであり、この点当該分野において注目されるべきである。また、エクソソーム及びアミロイドβの凝集又は線維化と、スフィンゴミエリン代謝（特に、ＳＭＳ２及びｎＳＭａｓｅ２）との関係についても、これまで知られておらず、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬の新たな探索方法を提供するものであり、この点当該分野において注目されるべきである。
【０１１４】
本発明のスクリーニング方法は、インビトロの再構成系で行っても良く、細胞を用いても良い。１つの実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、候補の存在又は不存在下でエクソソームとＡβ１−４０又はＡβ１−４２とを接触させた結果をもとに、Ａβ１−４０又はＡβ１−４２の重合又は繊維化の調節因子をもスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法はまた、候補の存在又は不存在下、そしてエクソソームの存在下で、Ａβ１−４０又はＡβ１−４２とミクログリアとを接触させた結果をもとに、Ａβ１−４０又はＡβ１−４２のミクログリアへの取り込みの調節因子をスクリーニングすることができる。本発明はまた、候補の存在又は不存在下、Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の活性を調べた結果をもとに、エクソソームの分泌の調節因子をスクリーニングすることができる。ここで、Ｎ−ＳＭａｓｅ２の活性低下及び該ＳＭＳ２の活性増加は、該エクソソームの分泌の上昇の指標である。本発明はまた、候補の存在下又は不存在下で、Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の活性を調べた結果をもとに、Ａβ１−４０又はＡβ１−４２の重合又は繊維化の調節因子をスクリーニングすることができる。ここで、Ｎ−ＳＭａｓｅ２の活性低下及び該ＳＭＳ２の活性増加は、Ａβ１−４０又はＡβ１−４２の重合又は繊維化の減少の指標である。
【０１１５】
本発明の方法では、エクソソームの量又はレベル、Ａβ１−４０の量又はレベル、Ａβ１−４２の量又はレベル、ＳＭＳ２の量又はレベル及びＮ−ＳＭａｓｅ２の量又はレベルの測定は、免疫学的又は物理化学的（質量分析などを含む）に、あるいはＳＭＳ２又はＮ−ＳＭａｓｅ２については酵素活性の測定により行なうことができることが理解される。このような酵素活性の測定は、当該分野において公知又は本明細書において説明する任意の手法によって実現することができる。
【０１１６】
例示的には、Ａβ量の測定は、特異的な抗体等を用いて免疫反応、例えば、ＥＬＩＳＡにおいてはＩＢＬ社Ａβ１−Ｘ  ＥＬＩＳＡなどを利用することができ、例えば免疫染色法においてはＡβ断片と結合する抗Ａβ抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ）とプロテインＧセファロース（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と混合させ、適切な条件（例えば、４℃で一晩）免疫沈降し、適切な条件で洗浄し（例えば、洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ製  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗浄、３回超純水で洗浄）することによって精製されたものを、Ａβ  Ｎ末端断端抗体である８２Ｅ１（ＩＢＬ）を用いた免疫染色法によって検出ないしは定量することができる。
【０１１７】
あるいは、例示的な実施形態では、本発明におけるＡβ１−４０、Ａβ１−４２又はこれらを含めたＡβ断片の総量又はレベル等の測定は、γ−セクレターゼアッセイ系によって実施することができる。例えば、そのようなアッセイ系では、適切な緩衝液（例えば、Ｒｏｃｈｅ社から入手可能なＢｕｆｆｅｒ  Ｃ（３００ｍＭクエン酸，ｐＨ６．０，５００ｍＭスクロース，０．５％ＣＨＡＰＳＯ，０．２％ホスファチジルコリン，２０ｍＭベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ），２０ｍＭアマスタチン（Ａｍａｓｔａｔｉｎ），１０ｍＭフェナンスロリン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ），２０ｍＭカプトプリル（Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ），ｘ１０  Ｒｏｃｈｅ製  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））を用い、公知の方法で入手可能な酵素であるγ−セクレターゼ複合体（例えば、Ｋａｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６  Ｍａｙ  ２６；２８１（２１）：１４７７６−８６．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ａｐｒ  ４．により、培養細胞の粗精製膜分画から界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳＯ）で抽出した膜タンパク質分画を抗ｎｉｃａｓｔｒｉｎ抗体で免疫沈降法により精製したもの等）を用いて実施することができる。反応は適切な緩衝液（例えば、上述のＢｕｆｆｅｒ  Ｃ）で希釈した酵素（例えば、精製γ−セクレターゼ酵素）に適切な基質ペプチド（例えば、Ａβ４２（配列番号８９のアミノ酸１〜４２位からなる。））を加え、適切な時間及び温度（例えば、３７℃、１時間）インキュベーションを行うことによって実施することができる。またγ−セクレターゼ特異的切断かどうかを検討するためコントロールとしてγ−セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ（ペプチド研から入手可能））を適切な最終濃度（例えば、１０μＭ）添加した実験も行うことによって対照実験を実施することができる。反応後、適切な方法で（例えば、氷上に置くことで）反応停止し、そのサンプル上清を適切な分析方法（例えば、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析）に供することによって分析を行うことができる。分析に際しては、サンプルは、適宜精製して、その精度を上げることもできる。例えば、サンプル（酵素反応液）の一部は、切断ペプチド又は基質ペプチドあるいはその両方に結合する適切な特異的結合物質（例えば、抗Ａβ抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ））とプロテインＧセファロース（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と混合させ、適切な条件（例えば、４℃で一晩）免疫沈降し、適切な条件で洗浄し（例えば、洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ製  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗浄、３回超純水で洗浄）することによって精製することができる。免疫沈降産物は適切な条件（例えば、三フルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０））で溶出した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ等を用いて質量分析を実施することができる。
【０１１８】
あるいは、各要素は、各々の要素に特異的な抗体等を用いて免疫反応（例えば、ＥＬＩＳＡ）により同定及び／又は検出ないしは定量することができる。
【０１１９】
本発明のスクリーニング方法において、候補物質の他に、医薬活性を有することが知られる物質をポジティブコントロールとして、及び／又は医薬活性を有しないことが知られる物質をネガティブコントロールとして含めることもできる。また、対象となる候補物質は、どのような物質を用いてもよい。
【０１２０】
１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法では、工程Ａ）は、細胞と候補とを相互作用しうる状態に供する工程であり、工程Ｂ）は、エクソソームの分泌レベルを調べる工程であり、ここで、該エクソソームの該細胞からの分泌レベルを、該候補が医薬であるかどうかの指標とする。したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、該エクソソームの該細胞からの分泌レベルを調べた結果に基づいて、該候補が医薬であるかどうかを判定する工程を包含してもよい。ここで、エクソソームの分泌レベルが増大する場合、アミロイドβのクリアランスの能力も増大すると考えられることから、その増大を引き起こす候補は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬としての能力を有しうると判定することができる。好ましい実施形態では、使用される細胞及び対象細胞は神経細胞であり、さらに好ましくは脳から得た神経細胞である。
【０１２１】
１つの実施形態では、本発明では、要素にエクソソームを含み、医薬の候補の存在下又は不存在下で、該エクソソームと、Ａβ１−４０及び／又はＡβ１−４２と接触させる工程を含み、ここで、エクソソーム、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２及びAβ重合体のうちの少なくとも１つの量を該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。ここで、エクソソームの量が増大する場合、アミロイドβのクリアランスの能力も増大すると考えられることから、その増大を引き起こす候補は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬としての能力を有しうると判定することができる。他方、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２及びAβ重合体が減少する場合、その減少を引き起こす候補は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬としての能力を有しうると判定することができる。
【０１２２】
１つの実施形態において、本発明では、要素にエクソソームを含み、医薬の候補の存在下又は不存在下で、該エクソソームと、Ａβ１−４０及び／又はＡβ１−４２、及びミクログリアを接触させる工程を含み、ここで、エクソソーム及び／又はＡβ１−４０及び／又はＡβ１−４２のミクログリアへの取り込みを該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。ここで、フリーのエクソソームが減少する、あるいはエクソソームのミクログリアへの取り込みが増大する場合、アミロイドβのクリアランスの能力が増大した結果であると考えられることから、その現象を引き起こす候補は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬としての能力を有しうると判定することができる。他方、Ａβ１−４０及び／又はＡβ１−４２が減少する、あるいはＡβ１−４０及び／又はＡβ１−４２のミクログリアへの取り込みが増大する場合、その現象を引き起こす候補は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のための医薬としての能力を有しうると判定することができる。
【０１２３】
１つの実施形態では、本発明では、医薬の候補の存在下又は不存在下で、Ｎ−ＳＭａｓｅ２及び／又はＳＭＳ２の活性を調べる工程を包含し、該Ｎ−ＳＭａｓｅ２の活性低下及び該ＳＭＳ２の活性増加を該候補が該医薬であるかどうかの指標とする。
【０１２４】
１つの実施形態では、前記状態、障害又は疾患は、アルツハイマー病、網膜疾患（例えば、加齢黄斑変性症（加齢性黄斑網膜症ともいう）、緑内障等）（日本薬理学雑誌Ｖｏｌ．１３４（２００９），Ｎｏ．６  ３０９−３１４等を参照）からなる群より選択される１以上である。
【０１２５】
（アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患の医薬、予防及び処置）
１つの局面において、本発明は、Ｎ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。この局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質、又は被験体におけるアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防の方法であって、そのような処置又は予防を必要とする被験体にＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質の有効量を投与する工程を包含する、方法として提供されうる。  
【０１２６】
１つの実施形態において、本発明におけるＮ−ＳＭａｓｅ２のタンパク質の酵素活性又は発現を上昇させる物質として、Ｎ−ＳＭａｓｅ２（ｎＳＭａｓｅ２）のタンパク質及び／又は発現ベクターあるいはそれらの機能的に等価な改変体（例えば、誘導体、部分ペプチド等）でありうる。あるいは、このようなＮ−ＳＭａｓｅ２（ｎＳＭａｓｅ２）の因子としては、Ｎ−ＳＭａｓｅ２（ｎＳＭａｓｅ２）を導入する遺伝子治療系であってもよい。遺伝子治療系は、裸の遺伝子であってもよく、あるいは従来のウイルス又は非ウイルスベクターのいずれによっても、またレトロウイルスベクターあるいはリポソーム包摂形態等によって生物に導入してもよい。Ｎ−ＳＭａｓｅ２（ｎＳＭａｓｅ２）の遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＤＮＡ又は合成ＤＮＡであってもよい。
【０１２７】
Ｎ−ＳＭａｓｅ２としては、Ｎ−ＳＭａｓｅ２としては、代表的には、配列番号８４（ヒト）（ＮＭ＿０１８６６７、５２６９  ｂｐ）、配列番号８６（マウス）（ＮＭ＿０２１４９１、５１４８  ｂｐ）、ラット（ＮＭ＿０５３６０５、５０２２  ｂｐ）、（Ｎ−ＳＭａｓｅ２の全長配列）等を挙げることができるが、これ以外にも、Ｎ−ＳＭａｓｅ２として知られる配列であれば、どれでも標的として使用することができることが理解される。このような配列としては、ゲノムデータベース上の複数のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で参照される配列もある。
【０１２８】
上記以外のタンパク質であっても、例えば、これらのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載された配列と高い相同性（通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば、細胞内のスフィンゴミエリンを合成する機能等）を持つタンパク質は、本発明のタンパク質に含まれる。上記タンパク質に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が３０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内であるものも包含されることが理解される。あるいは、上記ヌクレオチド配列に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のＤＮＡ配列と高い相同性を有するものも包含される。高い相同性とは、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、さらには９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の相同性を意味する。この相同性は、ｍＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−８；  Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−７）によって決定することができる。あるいは、本発明の標的となる配列は、上記ヌクレオチド配列に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」及び「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件を挙げることができる。
【０１２９】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、スフィンゴミエリンの分解活性を測定する方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、実施例にて例示的に記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質及び遺伝子に相当する上記タンパク質及び遺伝子、あるいは、上述のタンパク質及び遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質及び遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【０１３０】
Ｎ−ＳＭａｓｅ２などの特定の内在性遺伝子の発現を増大する方法としては、外部から発現ベクター等を導入する方法、例えば遺伝子治療法であってもよい。
【０１３１】
本発明のある実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞において自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、配列番号８３、８５等に示すＮ−ＳＭａｓｅ２の核酸配列又はその機能的に等価な改変体、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。上記ベクターは、公知の方法に準じて調製することができ、本明細書において説明される任意の形態又は公知の他の形態を採用することができることが理解される。
【０１３２】
ある実施態様では、治療的有効量のＮ−ＳＭａｓｅ２は、当業者に「遺伝子治療」として知られる方法によって投与される。本明細書で使用される遺伝子治療は、外因性核酸を、対象の適切な細胞に挿入することによって、対象の病的状態を治療するための一般的な方法を指す。当該核酸は、その機能性を維持するような様式で、例えば、特定のポリペプチドを発現する能力を維持するような様式で細胞に挿入される。いくつかの実施態様では、治療的有効量のＮ−ＳＭａｓｅ２は、ウイルス遺伝子療法を介して、Ｎ−ＳＭａｓｅ２をコードする核酸配列を含むウイルスベクター移入カセット（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスのカセット）を使用して投与される。
【０１３３】
本発明において好ましい被験体は、脊椎動物の被験体である。好ましい脊椎動物は、温血動物である。好ましい温血脊椎動物は哺乳類である。現在開示された方法によって治療される被験体は、好ましくはヒトであるが、本発明の原理は、用語「被験体」に含まれる全ての脊椎動物種に対する有効性を示すことが理解される。この構成において、脊椎動物は、障害の治療が望ましい全ての脊椎動物種であることが理解される。本明細書で使用される「被験体」は、ヒト及び動物の被験体の両方を含む。従って、動物の治療用途が、本発明に従って提供される。
【０１３４】
別の局面において、ＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質を含有するアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防用医薬組成物を提供する。この局面では、本発明は、アミロイドβに関連する疾患の処置又は予防のためのＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質として提供されてもよい。あるいは、この局面では、本発明は、被験体におけるアミロイドβに関連する疾患の処置又は予防の方法であって、そのような処置又は予防を必要とする被験体にＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質の有効量を投与する工程を包含する、方法として提供されてもよい。
【０１３５】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＳＭＳ２のタンパク質の酵素活性又は発現を抑制する物質は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸であってもよい。ここで使用されるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、本明細書において（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）に記載される任意の核酸を用いることができることが理解される。
【０１３６】
あるいは、本発明は、アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患の処置又は予防のためのＳＭＳ２の発現を抑制する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）を提供する。アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患の処置又は予防のために使用されるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、本明細書において（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）に記載される任意の核酸を用いることができることが理解される。
【０１３７】
１つの実施形態では、このような核酸は、ｓｉＲＮＡ及び／又はアンチセンス核酸である。（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）に記載される具体的なｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を例示することができる。
【０１３８】
別の実施形態では、このようなｓｉＲＮＡは、下記の（ａ）〜（ｐ）に記載のｓｉＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１つ以上からなる：
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方が配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｄ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方が配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｅ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方が配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｆ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方が配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｇ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方が配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｈ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方が配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｉ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方が配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｊ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１９で表される塩基配列であり、他方が配列番号２０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｋ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方が配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；；
（ｌ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｍ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｎ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｏ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４３で表される塩基配列であり、他方が配列番号４４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；
（ｐ）一方又は両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失又は置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｏ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【０１３９】
１つの実施形態では、本発明の医薬又は医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。本発明の組成物を医薬又は医薬品として使用する場合、その投与剤型としては、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、徐放製剤、カプセル剤、注射剤などが挙げられる。該医薬品は賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤、着色剤、遅延放出剤などの添加剤を含むことができる。経口製剤の場合、賦形剤として、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロースなど、結合剤として、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマーなど、崩壊剤として、例えば、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチンなど、滑沢剤として、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油など、香味剤として、例えば、ココア末、ハッカ油、桂皮末などが使用できるが、これらに限定されない。必要により、徐放性又は腸溶性製剤とするためのコーティングを施すことができる。注射用製剤の場合には、ｐH調整剤、溶解剤、等張化剤、緩衝化剤などが使用されるが、これらに限定されない。
【０１４０】
本発明の医薬又は医薬組成物は、上記のような生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、上述のような顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤（ネブライザー）あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤、頭蓋内投与注射剤、あるいは鼻腔内投与注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【０１４１】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の核酸又は医薬に賦形剤、崩壊剤、結合剤、及び滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【０１４２】
本発明の医薬又は医薬組成物が錠剤である場合、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【０１４３】
また注射剤は、主成分である本発明の核酸又は医薬を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【０１４４】
また、本発明の医薬又は医薬組成物を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【０１４５】
本発明の医薬又は医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の核酸又は医薬を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【０１４６】
また、本発明の医薬又は医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。肥満、糖尿病、脂質異常症及び脂肪肝の部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ｏｃｈｉｙａ，ＴらのＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：７０７−７１０，１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１  ：３１−５２，２００１より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸又は医薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｆ．  ＰＮＡＳ．（２００３）  １０２（３４）  １２１７７−８２、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ  Ｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ（２００４）  ３２（１３）  ｅ１０９では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
【０１４７】
本発明の医薬又は医薬組成物は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の核酸又は医薬の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師又は獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えば、アデノウイルスの場合の投与量は１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
【０１４８】
また、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えば、アデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【０１４９】
本発明の医薬又は医薬組成物において、さらに有効成分が含まれていてもよい。そのような含まれていてもよいさらなる医薬は、目的に応じ種々考えられる。
【０１５０】
別の局面において、本発明は、アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患の処置又は予防のための医薬を製造するための、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）の使用を提供する。ここで使用されうるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）の節あるいは本節で説明した任意の核酸を使用しうることが理解される。
【０１５１】
１つの別の局面において、本発明の方法は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を含有するアミロイドβに関連する状態、障害又は疾患の処置又は予防用医薬組成物又は医薬を生産する方法であって、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸を薬学的に許容可能な賦形剤と混合する工程を包含する。医薬の形態のほか、当局が認める場合、食品、健康食品、機能性食品なども同様に製造することができる。その場合、薬学的に許容可能な賦形剤に代えて、目的に応じた二次成分を用いることができる。
【０１５２】
本発明の医薬又は医薬組成物の有効量は、本発明の医薬又は医薬組成物が目的とする薬効を発揮することができる量をいい、本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがあり、本明細書の記載に基づいて当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。
【０１５３】
さらなる局面において、本発明は、アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を処置又は予防する方法であって、該方法は、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）を該治療又は予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。ここで使用されうるＳＭＳ２の発現を抑制する核酸としては、（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）の節あるいは本節で説明した任意の核酸を使用しうることが理解される。
【０１５４】
被験者又は個体への投与は、本節で説明されているように、任意の方法を用いることができ、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【０１５５】
本発明の予防若しくは治療方法の対象となる個体は、アミロイドβに関連する状態、障害又は疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【０１５６】
本発明の医薬、組成物において使用される有効成分、あるいは本発明の処置方法又は予防方法において使用される有効成分の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態又は種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（又は患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、及び治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１５７】
本発明の処置方法において使用される成分の種類及び量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態又は種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（又は患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、及び治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１５８】
本発明は、キットなどとして使用されてもよく、その場合、指示書を伴うこともありうる。本明細書において「指示書」は、本発明の治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、適切に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１５９】
（ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸）
本発明は、ＳＭＳ２の発現を抑制する核酸、特にその新たな用途を提供する。本発明の核酸は、核酸の翻訳又は転写等を抑制する働きを有する。そのような核酸としては、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ作用を有する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、リボザイム活性を有する核酸等を挙げることができる。本発明のＳＭＳ２の発現を抑制する核酸は、修飾された核酸を含みうる。
【０１６０】
このような核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸）は、アミロイドβ（Ａβ）の凝集に関連する状態、神経疾患等（例えば、アルツハイマー病等）の改善、処置又は予防のために用いられる。
【０１６１】
本発明のＳＭＳ２のｓｉＲＮＡなどのＳＭＳ２の発現を抑制する核酸の好ましい態様としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される核酸を挙げることができる：（ａ）ＳＭＳ２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物又はその一部に対するアンチセンス核酸（ｂ）ＳＭＳ２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸；及び（ｃ）ＳＭＳ２タンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）。
【０１６２】
ＳＭＳ２としては、代表的には、配列番号７９（ヒト）（ＬｏｃｕｓはＮＭ＿１５２６２１、６２４６ｂｐ）、配列番号８０（マウス）（ＮＭ＿０２８９４３、５７９１ｂｐ）（ＳＭＳ２の全長配列）等を挙げることができるが、これ以外にも、ＳＭＳ２として知られる配列であれば、どれでも標的として使用することができることが理解される。このような配列としては、ゲノムデータベース上の複数のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で参照される配列（例えば、ヌクレオチドデータベースでは、上記以外に、ＮＭ＿００１１３６２５７、ＮＭ＿００１１３６２５８、ＢＣ０４１３６９、ＢＣ０２８７０５（ヒト）等が検索され、タンパク質データベースでは、ＮＰ＿００１１２９７３０、ＮＰ＿６８９８３４、ＮＰ＿００１１２９７２９、Ｑ８ＮＨＵ３、ＡＡＨ４１３６９、ＡＡＨ２８７０５、Ｑ８６ＶＺ５（以上ヒト）、ＮＰ＿０８３２１９（マウス）等）として公共遺伝子データベースＮＣＢＩ上で検索される。
【０１６３】
上記以外のタンパク質であっても、例えば、これらのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載された配列と高い相同性（通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば、細胞内のスフィンゴミエリンを合成する機能等）を持つタンパク質は、本発明の標的となるタンパク質に含まれる。上記タンパク質に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が３０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内であるものも包含されることが理解される。あるいは、上記ヌクレオチド配列に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のＤＮＡ配列と高い相同性を有するものも包含される。高い相同性とは、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、さらには９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の相同性を意味する。この相同性は、ｍＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−８；  Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−７）によって決定することができる。あるいは、本発明の標的となる配列は、上記ヌクレオチド配列に関連するＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号に記載のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」及び「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件を挙げることができる。
【０１６４】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、スフィンゴミエリンの合成活性を測定する方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、実施例にて例示的に記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質及び遺伝子に相当する上記タンパク質及び遺伝子、あるいは、上述のタンパク質及び遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質及び遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【０１６５】
ＳＭＳ２などの特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、及び核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシング又は翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島及び井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，  日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７）。
【０１６６】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のＳＭＳ２をコードする遺伝子の発現及び／又は機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のＳＭＳ２をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域若しくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述ののＳＭＳ２をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のＳＭＳ２をコードする遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、又は５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。このようなＬＮＡ含有アンチセンス核酸としては、配列番号２９〜４０などを挙げることができるがそれに限定されない。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島及び井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．に記載される方法を用いて、配列番号８７及び８８に記載されるＳＭＳ２の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。参考となる配列としては、配列番号配列番号８７及び８８などを用いることができるがこれらに限定されない。例えば、配列番号２９〜４０のようなものが好ましく使用されるがこれに限定されない。これらのアンチセンス核酸を、マウス及び細胞等を用いた当該分野で公知の手法で本発明のアンチセンスの効果を確認することができる。
【０１６７】
ＳＭＳ２の発現の阻害は、リボザイム、又はリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠及び大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
【０１６８】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５又はＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵ又はＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠及び大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８９，１７，７０５９．）。
【０１６９】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いてＳＭＳ２をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【０１７０】
ＳＭＳ２などの内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一若しくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所においても詳述されている。
【０１７１】
上述したように、本発明の上記「ｓｉＲＮＡ」は、当業者においては、該二本鎖ＲＮＡの標的となる上述ＳＭＳ２をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。二重鎖ＲＮＡ部分のセンス鎖の例を示せば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７などを挙げることができるがそれに限定されない。ＳＭＳ２の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【０１７２】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、ＳＭＳ２（例えば、配列番号７９、８０、ＳＭＳ２の全長配列）のｓｉＲＮＡである。このようなｓｉＲＮＡとしては、具体的には、本発明者らが独自に配列設計した配列に基づくｓｉＲＮＡである以下のような（ａ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかに記載のｓｉＲＮＡを挙げることができるがこれらに限定されない：
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ６＞
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ７＞
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ８＞
（ｄ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０４＞
（ｅ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０５＞
（ｆ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０６＞
（ｇ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０７＞
（ｈ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０８＞
（ｉ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号１７で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号１８で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１０９＞
（ｊ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ３＞（ｋ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号２３で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号２４で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１１＞；
（ｌ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号３９で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４０で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ１＞；
（ｍ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４１で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４２で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ２＞；
（ｎ）二重鎖ＲＮＡ部分の一方が配列番号４５で表される塩基配列であり、他方がその相補配列である配列番号４６で表される塩基配列であるｓｉＲＮＡ；＜ＳＭＳ２−ｉ５＞；並びに
（ｐ）一方又は両方の塩基配列において１〜数個のヌクレオチドが付加、挿入、欠失又は置換され、ＳＭＳ２の発現を抑制する活性を有する、（ａ）〜（ｎ）のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【０１７３】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機及びＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１若しくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【０１７４】
さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、本発明のＳＭＳ２の発現を抑制し得る核酸の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、及び該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【０１７５】
（一般技術）
本明細書において用いられる医療器具製造技術、製剤技術、微細加工、分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ及びその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１７６】
本発明で使用される培養方法は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【０１７７】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明及び以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１７８】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、北海道大学において規定される基準を遵守した。【０１７９】
（材料及び方法）
（抗体及び試薬）
一次抗体は以下の供給元から入手した：Ａｌｉｘに対するマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、結合性免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）に対するマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、ＧＭ１３０に対するマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡβに対するマウスモノクローナル抗体（６Ｅ１０、Ｓｉｇｎｅｔ）；Ｔｓｇ−１０１に対するウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＡβオリゴマーに対するウサギポリクローナル抗体（Ａ１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。二次抗体はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、ＨＲＰ結合体化ＣＴＢ、アネキシンＶ（ＡＶ）、イミプラミン、ＧＷ４８６９、Ｄ６０９及び細菌性ＳＭａｓｅ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、Ｓｉｇｍａから入手した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４結合体化ＣＴＢ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合体化ＡＶ並びにＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｎ−ヘキサノイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン（Ｃ６−セラミド、ｄ１８：１／６：０）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから入手した。合成Ａβペプチドは、ヒトＡβ１−４０（Ａβ４０（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）、Ａβ１−４２（Ａβ４２、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及びＦＡＭ結合体化ヒトＡβ４２（ＡｎａＳｐｅｃ）を使用した。【０１８０】
（細胞培養）
マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ（本明細書においてＮ２ａとも表示する）は、１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。マウスミクログリア細胞株ＢＶ−２は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｐｅｒ  ｌａ  Ｒｉｃｅｒｃａ  ｓｕｌ  Ｃａｎｃｒｏ，Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙ）から購入し、１０％胎仔ウシ血清及びＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。【０１８１】
神経細胞の初代培養物は、Ｌｅｖｉらの方法（Ｌｅｖｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ”，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．（１９８９））に従って、胎生１５日目のマウスの脳の大脳皮質から調製した。簡単に述べると、神経細胞は、細胞分散液（住友ベークライト株式会社）を用いて、単離した大脳皮質から調製した。次に、これらの細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）コーティングディッシュ上に５．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  グルタミン及びＢ２７添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。新生仔ラットから調製した初代培養ミクログリアは、住友ベークライト株式会社から購入し、製造業者のプロトコルに従ってミクログリア培養培地（住友ベークライト株式会社）中に維持した。【０１８２】
（エクソソームの単離）
エクソソームは、以前に記載されたとおりに（Ｔｈｅｒｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ：Ｕｎｉｔ  ３．２２（２００６））、Ｎ２ａ及びマウス初代培養大脳皮質神経細胞の培養上清から調製した。エクソソームの調製前日に、培養培地を無血清培地と置き換えた。２４時間後に細胞培養上清を回収し、３，０００×ｇにて１０分間、４，０００×ｇにて１０分間、そして１０，０００×ｇにて３０分間、段階的に遠心分離し、細胞、死細胞及び細胞片を除き、次いで、再度１００，０００×ｇにて１時間スピンダウンして、エクソソームをペレットとして得た。【０１８３】
スクロース勾配分析については、エクソソームペレット（５×１０７細胞からの量に対応）を、１０ｍｌのスクロース勾配（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍｌ中０．２５〜２．３Ｍスクロース）にロードし、１００，０００×ｇで１８時間遠心分離した。遠心分離の後、少量（１ｍｌ）を回収し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで希釈し、そして、１００，０００×ｇにて１時間の遠心分離により沈殿させた。得られたペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、ウェスタンブロットに供した。【０１８４】
（電子顕微鏡検査法）
Ｎ２ａ細胞及び初代培養大脳皮質神経細胞の培養上清から精製した１００，０００×ｇペレットを、ＴＢＳ中に再懸濁させ、コロジオンで覆ったグリッドに載せ、そして、２％リンタングステン酸（日新ＥＭ株式会社）でネガティブ染色した。ＨＤ−２０００走査透過型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いて顕微鏡写真を撮影した。【０１８５】
（シードフリー（ｓｅｅｄ−ｆｒｅｅ）Ａβの調製）
シードフリーＡβ溶液は、本質的に以前の報告（Ｎａｉｋｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  （１９９９）３０９：３０５−３１８）に従って調製した。簡単に述べると、合成Ａβ４０及びＡβ４２を、それぞれ、５００μＭ及び３００μＭで０．０２％アンモニア溶液中に溶解させた。既存のシードとして作用し得る溶解していないＡβ凝集体を除くため、調製した溶液を、５４０，０００×ｇで、４℃にて３時間遠心分離した。得られた上清を回収し、使用時まで−８０℃にて保管した。【０１８６】
（チオフラビンＴアッセイ）
シードフリーＡβ（２５μＭ）を、３７℃にて、０μｌ、１μｌ又は１０μｌのエクソソーム溶液を含むＴＢＳ  １００μｌ中でインキュベートした。１μｌのエクソソーム溶液は、１×１０６細胞の培養上清から回収した。従来の文献（Ｎａｉｋｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  （１９９９）３０９：３０５−３１８）に記載されたとおりに、混合物中のＴｈＴの蛍光強度を、Ａｐｐｌｉｓｋａｎ分光蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。アミロイド原線維の最適な蛍光強度は、５μＭ  ＴｈＴ及び５０ｍＭ  グリシン／ＮａＯＨを含むｐＨ８．５の反応混合物を用い、４４６ｎｍの励起波長及び４９０ｎｍの蛍光波長にて測定した。【０１８７】
（ドットブロット）
シードフリーＡβ４２（２５μＭ）を、３７℃にて示された時間にわたり、エクソソーム（１００，０００×ｇペレット）とともに、又は、ペレット無しで、１００μｌ  ＴＢＳ中でインキュベートし、ニトロセルロースメンブレン上に点を付けた。メンブレンを、Ａβオリゴマーに対する抗体（Ａ１１）及びＡβに対する抗体（６Ｅ１０）でプローブし、続いて、ＨＲＰ結合体化二次抗体でプローブした。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＬＡＳ４０００（富士フィルム株式会社）の組み合わせを用いて、化学発光を検出及び分析した。【０１８８】
（毒性アッセイ）
シードフリーＡβ（２５μＭ）を、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  グルタミン及びＢ２７添加物を補充した神経細胞用基礎培地１００μｌ中、３７℃にて５時間、エクソソームとともに、又はエクソソーム無しで反応させた。続いて、プレインキュベートした混合物を、２４ウェルプレート（ＤＩＶ）上にプレーティングした初代培養大脳皮質神経細胞に加え、２４時間インキュベートした。細胞生存率は、ＷＳＴ−１（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて測定した。【０１８９】
（薬物処理）
イミプラミン（１０μＭ）、ＧＷ４８６９（１０μＭ）、Ｄ６０９（５０μＭ）、Ｃ６−セラミド（５０μＭ）又は細菌性ＳＭａｓｅ（１００μＵ／ｍｌ）での処理は、無血清培地中で２４時間行った。【０１９０】
（ｓｉＲＮＡの送達及びトランスフェクション）
ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）実験に関して、本発明者らは、以下の配列を持つ、Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉＴＭ  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した：
ＳＭＳ１について：
５’−AUACAUUGUAAUACACCGAUACAGG−３’（センス；配列番号４１）及び
５’−CCUGUAUCGGUGUAUUACAAUGUAU−３’（アンチセンス；配列番号４２）；
ＳＭＳ２について：
５’−AUACAUAGUUAUACAGCGAUACAGG−３’（センス；配列番号４３）及び
５’−CCUGUAUCGCUGUAUAACUAUGUAU−３’（アンチセンス；配列番号４４）；
ａＳＭａｓｅについて：
５’−AUUGGUUUCCCUUUAUGAAGGGAGG−３’（センス；配列番号４５）及び
５’−CCUCCCUUCAUAAAGGGAAACCAAU−３’（アンチセンス；配列番号４６）；
ｎＳＭａｓｅ１について：
５’−AAUAGAACCACAUCUGCAUUCUUGG−３’（センス；配列番号４７）及び
５’−CCAAGAAUGCAGAUGUGGUUCUAUU−３’（アンチセンス；配列番号４８）；
ｎＳＭａｓｅ２について：
５’−AAUCGAUGUAGAUCUUGAUCUGAGG−３’（センス；配列番号４９）及び
５’−CCUCAGAUCAAGAUCUACAUCGAUU−３’（アンチセンス；配列番号５０）。【０１９１】
ＳｔｅａｌｔｈＴＭ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｓｉＲＮＡは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従って送達した。【０１９２】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）７７０のｃＤＮＡを、以下のプライマー：
５’−ATGCTGCCCGGTTTGG−３’（センス；配列番号５１）及び
５’−CTAGTTCTGCATCTGCTCAAAGAACTTG−３’（アンチセンス；配列番号５２）
を用いるＰＣＲにより、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。このｃＤＮＡは次いで、以前に記載されたとおりに（Ｍｉｔｓｕｔａｋｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （２０１１）２８６：２８５４４−２８５５５）、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組換えシステムを用いて、ｐＥＮＴＲＴＭＤ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングし、最終的にｐ３×ＦＬＡＧ−ＡＰＰ７７０を構築した。一過的なトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従って実施した。【０１９３】
（エクソソーム放出の測定）
５×１０６細胞の培養物から精製したエクソソームペレットを、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ  ＵＫ、Ｎａｔｕｒｅ  （１９７０）２２７：６８０−６８５）で可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに供した。ブロットは、一次抗体でプローブし、次いで、ＨＲＰ結合体化二次抗体でプローブした。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＬＡＳ４０００（富士フィルム株式会社）の組み合わせを用いて、バンドを検出及び分析した。【０１９４】
（蛍光染色及び内在化アッセイ）
エクソソームを、赤色染料ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）を用い、製造業者のプロトコルに従って蛍光染色した（Ｍｏｒｅｌｌｉ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （２００４）１０４：３２５７−３２６６）。簡単に述べると、エクソソーム（１００，０００×ｇペレット）を、希釈液Ｃ中に再懸濁させ、ＰＫＨ２６で５分間染色し、次いで、１％ウシ血清アルブミンで反応を停止させた。標識したエクソソームを、１００，０００×ｇにて１時間の超遠心分離により再度沈殿させた。ＰＫＨ２６標識したエクソソームを、無血清条件下で、示された時間にわたり、チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）上のＢＶ−２細胞に曝した。阻害実験については、標識したエクソソームを、３７℃にて１５分間、ＡＶ又はＣＴＢ（０μＭ、０．５μＭ又は１μＭ）で予め処理した。エクソソームによるＢＶ−２細胞内へのＡβの移動を観察するために、標識したエクソソームを、２５μの蛍光（ＦＡＭ）標識Ａβ４２とともに、３７℃にて５時間プレインキュベートした。次いで、これらの細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ（登録商標）ＦＶ１０ｉ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）にて共焦点像を得た。蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）により分析した。【０１９５】
（Ａβの測定）
Ａβ４０及びＡβ４２のレベルを、Ｗａｋｏ製のサンドイッチ式酵素固定化免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて測定した。培地及び細胞の両方における凝集したＡβを、４Ｍ  グアニジン−ＨＣｌバッファーを用いて室温にて２時間可溶化させ、次いで、ＥＬＩＳＡにかけた。サンプルは全て二連で測定した。【０１９６】
（トランスウェル実験）
Ｎ２ａ細胞を、２４ウェルプレート用インサート（孔径０．５μｍ、Ｃｏｓｔａｒ）上に５×１０５細胞／ｃｍ２で培養し、次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用い、ｎＳＭａｓｅ２又はＳＭＳ２に対するｓｉＲＮＡと同時に、ＡＰＰ７７０プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、インサートをＢＶ−２細胞を含むウェル上に置いた。さらに２４時間のインキュベーションの後、培地中のＡβのレベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＢＶ−２細胞の細胞内Ａβレベルもまた、上記のようなグアニジンＨＣｌバッファー中での可溶化の後にＥＬＩＳＡを用いて測定した。【０１９７】
（結果）
（図１〜２に関する実験の結果）
（神経細胞由来エクソソームはＡβを駆動してアミロイド原線維を形成させる）
Ｎ２ａ細胞及び初代培養大脳皮質神経細胞の培養倍地を、遠心力を増加させていく段階的遠心分離工程に供し、最終的に１００，０００×ｇペレットを得た。電子顕微鏡分析により、Ｎ２ａ培養物から回収したペレットが、以前に記載された他の細胞培養物から調製したエクソソーム（Ｔｈｅｒｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００２）２：５６９−５７９）と同様に、主として、約４０〜１００ｎｍ（図１Ｂ）の直径を有する小型膜小胞から構成されることが明らかとなった。連続スクロース密度勾配では、エクソソームタンパク質Ａｌｉｘ及びＴｓｇ１０１を、以前に報告されたとおり（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （２００９）２１：５７５−５８１）、画分４及び５（１．１２及び１．１６ｇ／ｍｌのスクロース密度に対応、図１Ａ）で検出した。加えて、エクソソームは、タンパク質と脂質に富んでおり、これらは、脂質ミクロドメインと結合していることが報告されている（ｄｅ  Ｇａｓｓａｒｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （２００３）１０２：４３３６−４３４４）。脂質ミクロドメインにおいて豊富なスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドＧＭ１（ＧＭ１）もまた、Ａｌｉｘ及びＴｓｇ１０１と同じ画分において高度に検出された。これに対し、それぞれ、小胞体（ＥＲ）及びゴルジ装置のマーカータンパク質であるＢｉＰ及びＧＭ１３０は、１００，０００×ｇペレットにおいては観察されなかった。初代培養神経細胞培養物から回収したペレットもまた、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１及びＧＭ１を有する膜小胞と同じサイズ及び密度を有していた（データ示さず）。これらのデータは、１００，０００×ｇペレットが主としてエクソソームから構成されることを確認し、エクソソームが、構成的な様式でＮ２ａ及び初代培養大脳皮質神経細胞から分泌されることを実証する。【０１９８】
Ａβの構造変化に対する神経細胞由来エクソソームの影響を調べるために、本発明者らは、段階的遠心分離（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１０及びＰ１００）から得られたペレットをＡβの２つの主要な種である可溶性Ａβ４０及びＡβ４２と混合し、３７℃にて２４時間インキュベートした。次に、アミロイド原線維の量を、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を用いて決定した。その結果、ＴｈＴ蛍光強度は、Ｐ１００エクソソーム画分によってのみ有意に増強された（図１Ｃ）。図１Ｄは、エクソソームの存在下又は非存在下での、Ａβアミロイド生成の時間経過を示す。Ｎ２ａ由来エクソソーム及び初代培養神経細胞由来エクソソームはともに、時間依存性の様式でＡβ４０及びＡβ４２の原線維形成を有意に加速した。Ａβ４２の場合、アミロイドＡβの量は、プラトー相に達した後に有意に増大した。加えて、オリゴマーＡβの形成に対するエクソソームの影響を検討するために、Ａβと、Ｎ２ａ由来エクソソームとの混合物、又は、Ｎ２ａ由来エクソソームのない混合物を、抗オリゴマー抗体Ａ１１を用いたドットブロット分析にかけた（図２Ａ）。エクソソームの非存在下では、オリゴマーＡβは、３７℃での１時間のインキュベーションの直後に形成された。これに対し、エクソソームの存在下では、オリゴマーＡβは、２４時間のインキュベーションまで、インキュベーション混合物中で検出されなかった。蓄積した証拠が、ＡＤの病態発現における神経変性及びシナプスの損傷が、可溶性Ａβオリゴマーによって直接引き起こされることを示している（Ｓｅｌｋｏｅ  ＤＪ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００２）２９８：７８９−７９１；Ｈａａｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （２００７）８：１０１−１１２）。実際、エクソソーム無しで３７℃にて５時間プレインキュベートしたＡβ溶液は、初代培養神経細胞の顕著な細胞死を誘導した（図２Ｂ）。これに対し、インキュベーション混合物にエクソソームを加えると、神経細胞の死が劇的に防止された。これらの知見は、神経細胞由来エクソソームが、その表面上でのＡβの非毒性アミロイド原線維への急速な構造変化を促進し、毒性オリゴマー種の自発的な形成の減少をもたらすことを示唆している。【０１９９】
（図３に関する実験の結果）
（スフィンゴ脂質代謝はエクソソーム分泌及びＡβ原線維形成に関与する）
エクソソームの生合成は、多小胞エンドソーム内への管内小胞の出芽から始まる。Ｔｒａｊｋｏｖｉｃらは、スフィンゴ脂質セラミドが、管内取り込みを誘発し、エクソソームの放出を誘導することを報告した（Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００８）３１９：１２４４−１２４７）。神経細胞由来エクソソームがスフィンゴ脂質代謝によって調節され得るかどうかを検討するため、本発明者らは、まず、Ｎ２ａ細胞及び初代培養神経細胞を、スフィンゴ脂質代謝酵素のいくつかの阻害剤（ＧＷ４８６９、イミプラミン及びＤ６０９）で処理した（図３Ａ及び３Ｂ）。１００，０００×ｇペレットにおいて、放出されたエクソソームのレベルを、エクソソームマーカーである、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１及びＧＭ１によって評価した。スフィンゴミエリン（ＳＭ）をセラミド（Ｃｅｒ）へと変換する中性スフィンゴミエリナーゼ（ｎＳＭａｓｅ）の阻害剤であるＧＷ４８６９での処理はエクソソームの放出レベルを有意に低減させたが、これは、以前の報告（Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００８）３１９：１２４４−１２４７）と一致している。他方、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭａｓｅ）を選択的に阻害するイミプラミンでの処理は、エクソソームの放出を変化させなかった。Ｄ６０９は、ＳＭａｓｅと反対の反応、すなわちＣｅｒのＳＭへの変換を触媒する、スフィンゴミエリンシンターゼ（ＳＭＳ）を阻害すると報告されている（Ｌｕｂｅｒｔｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９８）２７３：１４５５０−１４５５９）。Ｄ６０９処理は、予想どおり、エクソソーム分泌の有意な増強を示した。エクソソーム分泌に対するスフィンゴ脂質代謝の役割をさらに調べるため、本発明者らは、Ｎ２ａ細胞における内因性ＳＭａｓｅ及びＳＭＳの発現をノックダウンするためにＲＮＡ干渉のアプローチを採用した。以前の報告（Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００８）３１９：１２４４−１２４７）と一致して、ｎＳＭａｓｅ２についてのｓｉＲＮＡでの処理は、エクソソームの放出を低減した（図３Ｃ及び３Ｄ）。他方で、ａＳＭａｓｅ及びｎＳＭａｓｅ１に対するｓｉＲＮＡでの処理は、エクソソームの放出を変化させなかった。逆に、ＳＭＳ１及びＳＭＳ２の両方のノックダウンは、エクソソーム分泌を増加させる顕著な効果を示し、特に、ＳＭＳ２のノックダウンは、ＳＭＳ１と比較して、エクソソームの放出のより明白な増強を示した（対照と比したＡｌｉｘの量の割合、ＳＭＳ１  ｓｉＲＮＡについて１８６．０２±９．７７％、ＳＭＳ２  ｓｉＲＮＡについて４２４．７５±４５．９６％、図２Ｄ）。これらの結果は、Ｃｅｒの生成がエクソソーム分泌に影響していることを示す。実際、外から加えたＣｅｒと、外来性ＳＭａｓｅにより誘導されるＣｅｒ生成は、エクソソームの放出レベルを有意に増大させた（図３Ｅ）。【０２００】
次に、本発明者らは、エクソソーム媒介性のＡβ原線維発生に対するスフィンゴ脂質代謝の役割を検討した。上述のとおり、本発明者らは、阻害剤又はｓｉＲＮＡで処理した細胞の培養上清からエクソソームを回収し、３７℃にて５時間のインキュベーションの後に、エクソソーム及びＡβ４２の混合物におけるＴｈＴ蛍光を測定した（図３Ｆ及び３Ｇ）。ＧＷ４８６９又はｎＳＭａｓｅ２で処理した培養物から精製したエクソソームは、Ａβ原線維発生を有意に低減させたのに対し、Ｄ６０９又はＳＭＳ２で処理した培養物から精製したエクソソームは、逆に、対照からのものと比較して、アミロイドの形成を増大させた。これらのデータから、本発明者らは、Ａβ原線維形成の調節に対するエクソソームの潜在的な能力は、その量と密接に相関しているものと考える。そして、エクソソームの放出レベルは、スフィンゴ脂質合成に関する酵素活性によって調節され得る。【０２０１】
（図４に関する実験の結果）
（ミクログリアはホスファチジルセリン（ＰＳ）依存性の様式でエクソソームを飲み込む）
ミクログリアは、中枢神経系に内在する食細胞である。現在、これらがマクロファージに由来し、脳内の死細胞及び細胞片の除去に貢献することは広く認められてられている（Ｎａｐｏｌｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２００９）１５８：１０３０−１０３８）。いくつかの報告により、マクロファージもまた、炎症性シグナルを伝達するため、又はその除去のために、いくつかの異なる細胞から分泌されたエクソソームを取り込むことが明らかにされている（Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ  ＲＭ、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  （２００７）１０：１５０７−１５０９）。最近、Ｆｉｔｚｎｅｒらは、希突起膠細胞由来のエクソソームが、脳内のミクログリアによって特異的に取り込まれることを報告した（Ｆｉｔｚｎｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  （２０１１）１２４：４４７−４５８）。本明細書では、ミクログリアがまた神経細胞由来のエクソソームも取り込むかどうか評価するため、蛍光染料ＰＫＨ２６で標識したエクソソームを、ミクログリア細胞株ＢＶ−２、初代培養ミクログリア又は初代培養大脳皮質神経細胞に加えた。標識したエクソソームとともに３７℃にて３時間インキュベートした後、細胞を固定し、ＤＡＰＩ染色し、そして、共焦点顕微鏡により分析した。本発明者らは、ＢＶ−２及び初代培養ミクログリアの両方において有意な蛍光を観察した（図４Ａ）。これらの結果は、エクソソームがミクログリア内に効率的に内在化されることを示唆する。これに対して、初代培養神経細胞では蛍光シグナルがほとんど検出されず、ミクログリア内への神経細胞由来エクソソームの選択的な移動をさらに実証したが、これは、希突起膠細胞由来エクソソームによる以前の報告（Ｆｉｔｚｎｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  （２０１１）１２４：４４７−４５８）と一致している。種々の細胞がその表面上にホスファチジルセリン（ＰＳ）を発現するエクソソームを生成しており、そして、原形質膜の外側リーフレット上に露出されたＰＳはしばしば、マクロファージ及びミクログリアによるアポトーシス細胞の飲み込みのための認識シグナルとして使用される（Ｍｉｙａｎｉｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （２００７）４５０：４３５−４３９；Ｍｏｒｅｌｌｉ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （２００４）１０４：３２５７−３２６６）。本発明者らは、外膜の透過処理を行うことなく、蛍光標識したアネキシンＶ（ＡＶ）又はコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）（それぞれ、ＰＳ及びＧＭ１を特異的に認識する）で１００，０００×ｇペレットを染色した。ＡＶ及びＣＴＢの両方の有意な蛍光が観察され（図４Ｂ）、ＰＳがＮ２ａ由来エクソソームの外側リーフレット上に位置していることが示唆された。さらに、ミクログリアによるエクソソーム取り込み機構を明らかにするために、本発明者らは、ＡＶ又はＣＴＢとともにプレインキュベートしたエクソソームをミクログリア培養物に曝し、ＡＶでの処理がＢＶ−２細胞及び初代培養ミクログリア内へのエクソソームの取り込みを有意に抑制したことを見出した（図４Ｃ及び４Ｄ）。ＣＴＢでのエクソソームの処理は、その取り込みを変化させなかった。これらは、ＰＳが、ミクログリアによる神経細胞由来エクソソームの認識及び内在化を促進することを示唆する。【０２０２】
（図５〜６に関する実験の結果）
（エクソソームはミクログリアにおけるＡβクリアランスを促進する）
エクソソームとＡβの間の相互作用は、Ａβ原線維形成の加速をもたらし（図１Ｃ及び１Ｄ）、Ａβアミロイド原線維が、エクソソームを取り囲むように蓄積することを示唆している。実際、エクソソームマーカーであるＡｌｉｘは、ＡＤ脳において、Ａβ原線維の細胞外沈着である老人斑に集中することが観察された（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （２００６）１０３：１１１７２−１１１７７）。さらに、本願は、エクソソームがミクログリアによって取り込まれることを示した（図４Ａ）。これらの知見に基づき、本発明者らは、エクソソームが、ミクログリア内へのＡβアミロイドの移動を支持し、おそらくはＡβ分解を助け得ると仮説を立てた。この仮説を検証するため、本発明者らは、エクソソーム有り又はエクソソーム無しでプレインキュベートしたＡβ４２を、ＢＶ−２細胞又は初代培養ミクログリアに加え、そして、３７℃にて示される時間にわたってインキュベートした後、Ａβ４２の細胞内レベル及び細胞外レベルを測定した。その結果、ＢＶ−２及び初代培養ミクログリアがともに、Ａβ４２単独の場合と比較して、エクソソームの存在下でＡβを劇的に大量に取り込んだ（図５Ａ）。相応して、培地中のＡβレベルもまた徐々に低下し、エクソソーム有りとエクソソーム無しとの間ではその差が有意であった（図５Ｂ）。さらに、本発明者らは、ＡＶによりエクソソームの外側表面上のＰＳをブロックして、エクソソーム取り込みの防止が、ミクログリア内へのＡβ取り込みに影響し得るかどうかを検討した。図５Ｃに示されるように、Ａβ取り込みは、エクソソームをＡＶとともにプレインキュベートした場合にのみ有意に抑制され、ＣＴＢとともにプレインキュベートした場合には有意に抑制されなかった。これらは、エクソソームが、少なくとも部分的に、ＰＳ依存性の様式でＡβ取り込みを媒介し得ることを示唆する。【０２０３】
次に、エクソソームと共に内在化されたＡβが、ミクログリア内で分解されるかどうかを評価するために、本発明者らは、エクソソーム有り又はエクソソーム無しでプレインキュベートしたＡβ４２を、ＢＶ−２細胞に対して３時間曝し、培養培地で２回洗浄し、そしてさらに、示されるとおりのさらなる時間にわたって培養した。その後、細胞を回収し、細胞溶解物中のＡβレベルを測定した。明らかに、ＢＶ−２細胞内のＡβレベルは時間依存的な様式で徐々に減少し、そして、洗浄から４８時間後の時点でほぼ消失した（図６Ａ）。さらに、内在化されたエクソソームとＡβの分解経路に関して見通しを得るために、本発明者らは、後期エンドソーム／リソソームの蛍光マーカーであるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを用いて染色することにより、その局在性を調べた。本発明者らは、ＰＫＨ２６標識したＮ２ａ由来エクソソームを、ＢＶ−２細胞とともに３７℃にて３時間インキュベートした。細胞内で点状の蛍光が認められ、エクソソームの蛍光の一部は、リソソーム区画と同じ場所に局在していた（図６Ｂ）。次に、本発明者らは、ＦＡＭ−Ａβ４２及び標識したエクソソームの共インキュベーション混合物をＢＶ−２細胞に加えた。エクソソームの蛍光とともに、Ａβのシグナルもまた、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒのものと同じ場所に局在していた（図６Ｃ）。これらのデータは、エクソソーム媒介性の様式で内在化されたＡβが、リソソームに運ばれて、ミクログリア内のエンドサイトーシス経路を介して分解されることを実証した。【０２０４】
（図７に関する実験の結果）
（エクソソーム分泌のアップレギュレーションはＡβクリアランスに影響するか？）
最後に、本発明者らは、エクソソーム分泌の調節が、ミクログリアによるＡβのクリアランスに影響し得るかどうかを調べた。本発明者らは、トランスウェル環境のためのインサート上にＮ２ａ細胞をプレーティングし、ＳＭａｓｅ２又はＳＭＳ２についてのｓｉＲＮＡで処理して細胞から放出されるエクソソームの量を調節し、そして同時に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子でトランスフェクトしてＡβを過剰発現させた。トランスフェクションから２４時間後、本発明者らは、インサートを、ＢＶ−２細胞を播種した２４ウェルマルチプレート上に設置した。この実験環境下で、本発明者らは、Ｎ２ａ細胞から分泌されたエクソソーム及びＡβが、細胞間で共有される培地を介してＢＶ−２細胞と相互作用することができると考えた。Ｎ２ａ−ＡＰＰ細胞によるＢＶ−２細胞のチャレンジの２４時間後に、培地中のＡβのレベルを決定した。いくつかの研究がスフィンゴ脂質代謝が、Ａβを生成するためのＡＰＰプロセシングに関与すると報告している（Ｈａｕｇｈｅｙ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）（２０１０）１８０１：８７８−８８６）。しかしながら、下側のウェルにＢＶ−２細胞がないとき、ｎＳＭａｓｅ２及びＳＭＳ２の両方のｓｉＲＮＡでのＮ２ａ−ＡＰＰ細胞の処理を行った場合でも、細胞外Ａβのレベルは不変のままであった（図７Ａ）。これに対し、下側のウェルにＢＶ−２細胞が存在する場合、培養培地中にＡβ４０及びＡβ４２の両方のレベルは、ＳＭＳ２  ｓｉＲＮＡ処理によって有意に減少した（図７Ｂ）。次に、本発明者らは、ｎＳＭａｓｅ２又はＳＭＳ２のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮ２ａ−ＡＰＰ細胞の培地から回収した１００，０００×ｇペレットにおけるＡｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１及びＡβのレベルを、ウェスタンブロットにより分析した（図７Ｃ）。先のデータ（図３Ｃ及び３Ｄ）と一致して、Ａｌｉｘ及びＴｓｇ１０１の量によって推定したエクソソームの放出レベルは、明らかに、ｎＳＭａｓｅ２又はＳＭＳ２ノックダウンによって調節された。加えて、Ａβは、ＳＭＳ２処理培養物からか移出したペレットにおいてのみ検出された。これらの知見は、エクソソーム分泌の加速が、エクソソームと結合したＡβの形成を促進し得、このエクソソームと結合したＡβが、ミクログリアによる取り込みに適応した状態であり得ることを示唆する。実際、ＢＶ−２細胞におけるＡβレベルは、対照ＲＮＡでの処理と比較して、ＳＭＳ２  ｓｉＲＮＡ処理培養物において有意に増大した（図７Ｄ）。【０２０５】
（考察）
本発明者らは、エクソソームが神経細胞によって構成的に分泌され、そして、エクソソームが、その表面上でのＡβアミロイド生成を劇的に促進することを見出した。また、エクソソームと結合した状態の凝集したＡβはさらに、分解する目的で、ミクログリアによって取り込まれた。本発明者らはまた、スフィンゴ脂質代謝の調節によって誘導されたエクソソーム分泌のアップレギュレーションが、神経細胞とミクログリア細胞の共培養においてＡβの細胞外レベルを効率的に減少させたことを実証した。ＣＮＳでは、神経細胞は、ミクログリアによって取り囲まれ、アポトーシス細胞及び退廃したシナプス連結部のような損傷を受けた構造を除去するために調査される（Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ  ＧＷ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  （１９９６）１９：３１２−３１８）。本明細書は、エクソソームを用いたＡβクリアランスのための、神経細胞と隣接するミクログリアとの間の連繋した機構に関する新たな見通しを提供する（図８を参照のこと）。【０２０６】
順序付けられたＡβ凝集体の形成に関しては、これまでに、シード重合理論が提案されている（Ｈａｒｐｅｒ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９９７）６６：３８５−４０７）。Ａβが単量体形態からその重合体へと移行するには、シードとして機能するために、縮合又は特定の他の分子との相互作用によって誘導される単量体Ａβの構造変化が必要とされる（Ｅｓｌｅｒ  ＷＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：６２８８−６２９５）。本明細書において、本発明者らは、神経細胞由来エクソソームが、単量体ＡβからのＡβアミロイド原線維の形成を加速することを見出し（図１Ｃ及び１Ｄ）、シードＡβがエクソソーム表面への単量体Ａβの結合によって生成され得ることが示唆された。ＡｐｏＥ（Ｋｉｍ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  （２００９）６３：２８７−３０３）、Ｚｎ２＋を含む金属イオン（Ｂｕｓｈ  ＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９４）２６５：１４６４−１４６７）、ヘパラン硫酸塩プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）（Ｓｎｏｗ  ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  （１９９４）１２：２１９−２３４；Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  （１９９７）６９：２４５２−２４６５）及び種々のガングリオシド（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （１９９５）１：１０６２−１０６６；Ａｒｉｇａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  （２００８）４９：１１５７−１１７５）などのいくつかの分子的要因が、Ａβ重合を加速すると報告されている。これらのうち、ガングリオシド、特にＧＭ１は、エクソソーム上でのＡβアミロイド生成を促進する有望な候補の一つであると考えられた。蓄積した証拠が、ＧＭ１に結合したＡβの特定の構造が、Ａβ凝集体の形成のためのテンプレートとして機能することを示している（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）  −  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  （２０１０）１８０１：８６８−８７７）。加えて、ＧＭ１に結合したＡβは、ＡＤの初期の病理学的変化を呈する脳において見られている（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （１９９５）１：１０６２−１０６６）。本明細書では、蛍光標識したＣＴＢによるエクソソームの染色が、ＧＭ１がエクソソーム膜の外側リーフレット上に発現されること（図４Ｂ）、そして、１００，０００×ｇペレット内のＧＭ１の量が、明らかにＡβ原線維形成の状態と相関していたこと（図３Ｂ、３Ｄ、３Ｆ及び３Ｇ）を示した。しかしながら、現在、本発明者らは、ＡｐｏＥ、ＨＳＰＧ又は未知のものを含めた他の分子がＡβ原線維発生に関与する可能性を排除できていない。最近、ＧＭ１を含む膜上に形成されるＡβ原線維が、ＰＣ１２細胞に対して有意な毒性を示すことが報告された（Ｏｋａｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （２００８）３８２：１０６６−１０７４）。しかしながら、本明細書では、初代培養大脳皮質培養物に、エクソソームをＡβとともに加えることにより、神経毒性が有意に抑制され、また、その神経毒性は、オリゴマーＡβの量とは逆相関していた（図２）が、エクソソームにより媒介性されたＡβ原線維の量とは逆相関していなかった（図１Ｄ）ことを示した。Ａβ原線維が、最初の集合プロセスの違いによって多形を示すことは周知である（Ｇｏｌｄｓｂｕｒｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （２００５）３５２：２８２−２９８；Ｐｅｔｋｏｖａ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００５）３０７：２６２−２６５）。本発明者らは、エクソソーム媒介性のＡβ原線維発生による機構を同定するためにさらに綿密な試験を必要とする。【０２０７】
本明細書において、本発明者らは、放出されたエクソソームを集め、そして、ＴＢＳ（図１Ｃ又は１Ｄ）又は培養培地（データ示さず）において、Ａβアミロイド生成を促進するその能力について評価した。結果は、エクソソームが、細胞外空間におけるＡβ原線維の形成を有効に促進し得ることを示唆する。しかしながら、最近、ＡＰＰのβ部位切断が、ＭＶＢにおいて生じることが報告された（Ｓｈａｒｐｌｅｓ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２：１４６９−１４７８）。加えて、Ａβ４２は、正常なマウス及びヒトの脳内のＭＶＢに優先的に局在することが分かっている。さらに、ＡＤのマウスモデル及びヒトのＡＤ脳において、神経細胞内Ａβ４２は、加齢とともに徐々に蓄積する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００２）１６１：１８６９−１８７９）。特筆すべきことに、アミロイドシードであるＧＭ１に結合したＡβは、老齢のサルの脳の神経細胞のエンドソーム画分において優先的に観察されるのに対し、若いサルの脳のエンドソーム画分では観察されない（Ｋｉｍｕｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  （２００７）１８：１６６９−１６７３）。このように、ＭＶＢの管内空間が、細胞からエクソソーム及びＡβを放出する前に、Ａβの集合を誘発できる別の環境を提供する可能性を調べるためには、かなり深い分解レベルでのさらに綿密な試験が必要となる。本明細書において、本発明者らは、ｎＳＭａｓｅ２活性の選択的な阻害がエクソソーム分泌を低減したのに対し、ＳＭＳ２活性の選択的な阻害は、エクソソーム分泌を有意に増大させたことを見出した（図３Ｃ及び３Ｄ）。ｎＳＭａｓｅ２は、哺乳動物の脳において特に豊富である（Ｌｉｕ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９８）２７３：３４４７２−３４４７９）。これは、Ｎ末端に２つの推定膜貫通ドメインを有し、主として原形質膜に局在している（Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  （２００４）１８：９６８−９７０）。ＳＭＳ２もまた、推定６つの膜貫通領域を有し、原形質膜におけるＳＭの産生に貢献している（Ｈｕｉｔｅｍａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  （２００４）２３：３３−４４）。外から加えた合成Ｃｅｒ及び細菌性ＳＭａｓｅがエクソソーム分泌を増大させた（図３Ｅ）という本発明の知見と合わせて、これらの知見は、特に、エンドサイトーシスされた膜領域を含む原形質膜における、Ｃｅｒの局所レベルの上昇が、エクソソーム生成の促進に重要であることを示唆している。エクソソーム分泌に対して、ＳＭＳ１がＳＭＳ２よりも貢献していないこと（図３Ｃ及び３Ｄ）は、ゴルジ装置におけるＳＭ生成の大部分を担うＳＭＳ１の局在化に起因する可能性がある（Ｔａｆｅｓｓｅ  ＦＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （２００６）２８１：２９４２１−２９４２５）。エクソソーム生成に対するＣｅｒの役割に関して、１つの考えられる機構は、Ｃｅｒがエンドソーム膜の物理的な形状変化を誘導し、これが、管内小胞の出芽を優先的に促進するというものである。実際、Ｃｅｒは、小さなミクロドメインのより大きなミクロドメインへの融合を誘導し、ドメインにより誘導され���原形質膜の出芽の促進をもたらすことが報告されている（Ｇｕｌｂｉｎｓ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  （２００３）２２：７０７０−７０７７）。そして、細菌性ＳＭａｓｅでの処理は、ＳＭを含む合成の巨大リポソームからの管内膜の出芽を誘導する（Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００８）３１９：１２４４−１２４７）。あるいは、いくつかの証拠が、Ｃｅｒもまた、エンドサイトーシス性の輸送に影響し得ることを示唆している。ａＳＭａｓｅのエキソサイトーシスによって誘導されるＣｅｒ産生が、エンドサイトーシスと原形質膜の修復を促進することが報告されている（Ｔａｍ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （２０１０）１８９：１０２７−１０３８）。また、外から加えた細菌性ＳＭａｓｅがＡＴＰ依存性のエンドサイトーシスを誘導することは公知である（Ｚｈａ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （１９９８）１４０：３９−４７）。これらの知見は、Ｃｅｒがエンドサイトーシスの速度を変えることにより、エクソソーム生成を促進し得るという別の可能性を示唆する。【０２０８】
これまでの研究は、ミクログリアが、Ａβそのものを直接取り込み、後期エンドソーム−リソソーム区画において分解し得ることを示している（Ｍａｊｕｍｄａｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  （２００７）１８：１４９０−１４９６）。このように、Ａβがエクソソームとともに取り込まれるために何が機能的に重要なのかは、定義しにくいままである。一つの重要であると考えられる点は、ミクログリア内へのＡβ取り込み効率の増加である。Ａβがエクソソームの存在下で迅速にアミロイド原線維を形成するという本発明者らによる結果に示されるように（図１Ｃ及び１Ｄ）、ミクログリアは、エクソソームの存在下で、Ａβの過剰生産の後、より迅速にＡβを取り込むことができる。さらに、エクソソームの添加は実際に毒性オリゴマーの形成を抑制するが（図２）、これは、神経細胞の損傷を回避するためには大いに有効である。他方、別の重要であると考えられる点は、ミクログリアによる免疫学的反応の低下であると提唱されている。インビトロ及びインビボ研究からの蓄積された証拠は、原線維Ａβが、炎症促進性サイトカイン及び反応性酸素種の放出を含む、ミクログリア内での炎症応答を促進することを示している（Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  （２０１０）３７：５０３−５０９）。Ａβ原線維の過剰な沈着である老人斑を取り囲む活性型のミクログリアは、ＡＤの病理学的変化を示した脳における慢性的な炎症に寄与する。一般に、ミクログリアによるアポトーシス体の取り込みが抗炎症反応を伴うことは十分に理解されている（Ｍａｇｎｕｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００１）１６７：５００４−５０１０）。加えて、最近、希突起膠細胞由来エクソソームが、免疫学的に休止した様式でミクログリアによって取り込まれることが示されている（Ｆｉｔｚｎｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  （２０１１）１２４：４４７−４５８）。この文献はまた、エクソソームの内在化が、ＭＨＣ  ＩＩの低いレベルを示す炎症性の敏感でないミクログリアと優先的に結合することも報告している。加えて、本発明者らは、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現が、Ｎ２ａ由来エクソソーム取り込みの後に、ＢＶ−２細胞において変化しなかったことを見出した（データ示さず）。さらなる研究が必要とされるが、これらのデータは、神経細胞由来エクソソームが、ミクログリアの炎症促進性反応の防止下で、Ａβを除去し得ることを示唆する。【０２０９】
それぞれパーキンソン病及びクロイツフェルト・ヤコブ病の病態発現を引き起こす、α−シヌクレイン及びプリオン蛋白といった、他の凝集傾向があるタンパク質もまた、神経細胞エクソソームと結合する（Ｆｅｖｒｉｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （２００４）１６：４１５−４２１；Ｅｍｍａｎｏｕｉｌｉｄｏｕ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１０）３０：６８３８−６８５１）。将来的な厄介な研究課題は、エクソソームが、その集合プロセス、そしてミクログリアとの相互作用を介したそのクリアランスに関与するかどうかを決定することである。本発明者らは、ミクログリアの取り込み／クリアランス活性が減少した場合に、これらのタンパク質を有するエクソソームの分泌が、実質的には細胞外空間で生じる病理学的事象を引き起こし得るものと考える。実際、エクソソーム除去細胞の非存在下では、プリオン蛋白の正常に折り畳まれた種と異常に折り畳まれた種の両方に結合するエクソソームが感染性であり、神経細胞間でのその拡散を生じる（Ｆｅｖｒｉｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （２００４）１０１：９６８３−９６８８；Ｖｅｌｌａ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００７）２１１：５８２−５９０）。さらに、エクソソームと結合した状態で分泌されたα−シヌクレインは、レシピエントの神経細胞の細胞質を引き起こす（Ｅｍｍａｎｏｕｉｌｉｄｏｕ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１０）３０：６８３８−６８５１）。Ａβ斑はまた、エクソソームを除去するグリアの活性が欠如した状態で構築される病理学的な構造でもあり得る。実際、ＡＤのマウスモデルにおけるミクログリアの数の減少は、Ａβ沈着の増加をもたらす（Ｅｌ  Ｋｈｏｕｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （２００７）１３：４３２−４３８）。【０２１０】
Ａβクリアランスの改善は、ＡＤ治療の強力な戦略である（Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ  ＫＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１０）３３０：１７７４）。本明細書は、Ａβ除去を目的とした、エクソソームの使用による新たなアプローチを提供し得る。Ｃｅｒ合成経路の選択的な制御によるエクソソーム分泌の調節は、おそらく治療上有用である。加えて、静脈内注射したエクソソームの脳内へのターゲティングを含むエクソソームの送達技術は、現在、治療用途として開発中である（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１１）２９：３４１−３４５）。これはまた、加工したエクソソーム、及び必要とされる量のエクソソームでの処理などの多少の利点により、エクソソームにより媒介されるＡＤにおけるＡβクリアランスに有用となり得る。【０２１１】
（実施例２：他の配列での実験）
上記実施例と同様の実験を、以下のｓｉＲＮＡ配列を用いて行うこともできる。【０２１２】
以下に、用いられるマウス特異的ｓｉＲＮＡの配列を示す。
SMS2-i1 5’-ggucacuuggaaagucaaa-3’ (センス鎖)（配列番号２３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２４）
SMS2-i2 5’-ccggacuacauccagauuu-3’ (センス鎖)（配列番号２５）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２６）
SMS2-i3 5’-ggaugguauugguuggguu-3’ (センス鎖)（配列番号１９）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２０）
SMS2-i4 5’-gcagauuguuguugaucau-3’ (センス鎖)（配列番号９４）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号９５）
SMS2-i11 5’-ggcucuuucugcguuacaa-3’(センス鎖）（配列番号２１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２２）
以下に、用いたヒトとマウスとで相同なｓｉＲＮＡの配列を示す。
SMS2-i5 5’-cauagagacagcaaaacuu-3’ (センス鎖)（配列番号２７）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２８）。
SMS2-i6 5’-gcauuuucuguaucagaaa-3’ (センス鎖)（配列番号１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号２）
SMS2-i7 5’-gucacuucuggugguauca-3’ (センス鎖)（配列番号３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号４）
SMS2-i8 5’-cuguuuuggugguaccauu-3’ (センス鎖)（配列番号５）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号６）
用いたヒト特異的ｓｉＲＮＡの配列を示す。
SMS2-i104 5'-gggcauugccuucauauau-3' (センス鎖)（配列番号７）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号８）
SMS2-i105 5'-ggcuguuucugagauacaa-3' (センス鎖)（配列番号９）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１０）
SMS2-i106 5'-ggugguggauuguccauaa-3'(センス鎖)（配列番号１１）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１２）
SMS2-i107 5'-ggauuguccauaacuggau-3' (センス鎖)（配列番号１３）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１４）
SMS2-i108 5'-ccauaacuggaucacauau-3' (センス鎖)（配列番号１５）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１６）
SMS2-i109 5'-gcacacgaacacuacacua-3' (センス鎖)（配列番号１７）
その相補配列である同アンチセンス鎖（配列番号１８）
コントロールとして使用したｓｉＲＮＡ（ＣＴＲ−ｉ）配列を示す。
CTR-i 5’-uucuccgaacgugucacgu-3’（センス鎖）配列番号９６）
同アンチセンス鎖（配列番号９７）。
（実施例３：ｎＳＭａｓｅ２での実験）
ｎＳＭａｓｅ２又はその発現ベクターを用いて、上記実施例と同様の実験を行う。【０２１３】
当該分野で公知の手法を参酌し、ｓｉＲＮＡの導入方法等と同じ手法で、ｎＳＭａｓｅ２発現ベクタ（例えば、配列番号８３又は８５に記載の配列を含む）をトランスフェクトすることにより、実施例１において記載した手法を行うことにより、ｎＳＭａｓｅ２のアミロイドβに関連する疾患に対する効果を確認することができる。【０２１４】
（実施例４：ｓｉＲＮＡ以外の核酸の例（リボザイム））
次に、例えばＫｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．に記載される方法を用いて、配列番号８７又は８８に記載されるＳＭＳ２の核酸配列に基づき、リボザイム配列を設計する。【０２１５】
これを、上記実施例に記載されるマウス及び神経細胞を用いた手法で本発明のリボザイムの効果を確認することができる。【０２１６】
（実施例５：ＳＭＳ２に対するアンチセンス核酸のスクリーニング）
本実施例では、ヒト及びマウスのＳＭＳ２の塩基配列での相同性領域（１３マー以上の連続相同性領域）をもとに設計したアンチセンス核酸の有効性を実証した。【０２１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、製造し、ヒトＨＥＫ２９３細胞でノックダウン実験を行う。配列の構造の設計はNucleic Acid Research2010, Vol38, No.1 のEfficient gene silencing bydelivery of locked nucleic acidantisense ligonucleotides, unassisted bytransfection reagents.を参考とした。【０２１８】
以下に、本実施例において用いた１３マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列及び形状を示す。使用した核酸は、ＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドとも称されるＬＮＡ含有核酸である。大文字はＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）であり、小文字はＤＮＡである。ＬＮＡはＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の一種で、ＢＮＡは１０種類以上が知られており、このうちＬＮＡは、糖の２’位と４’位とを−Ｏ−ＣＨ２−で架橋しコンフォメーションをＮ型に固定した人工核酸であり、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ等から入手可能である。すべてホスホロチオエート修飾のバックボーンでつながっている。ＬＮＡ部分のＣはすべてメチルシトシンである。以下の例では、５’末端にロックド核酸（ＬＮＡ）が３つ、３’末端にＬＮＡが２つ含まれる。【０２１９】
名称 アンチセンス核酸配列(5’-3’)
1 SMS2-13-003 ⇒ TGAtaccaccaGA  （配列番号２９）
2 SMS2-13-006 ⇒ TGCagatgatcCC  （配列番号３０）
3 SMS2-13-007 ⇒ CGTgttgtgatAT  （配列番号３１）
4 SMS2-13-008 ⇒ ACTtgtctgggAG  （配列番号３２）
5 SMS2-13-009 ⇒ AGAggaagtctCC  （配列番号３３）
6 SMS2-13-010 ⇒ AGAtggggaacCA  （配列番号３４）
7 SMS2-13-011 ⇒ AGTctccattgAG  （配列番号３５）
8 SMS2-13-012 ⇒ CCAgaagtgacGA  （配列番号３６）
9 SMS2-13-014 ⇒ TTGcctgagagTC  （配列番号３７）
10 SMS2-13-017 ⇒ AAGttttgctgTC  （配列番号３８）
11 SMS2-13-019 ⇒ TTGaagcagccAG  （配列番号３９）
12 SMS2-13-020 ⇒ GCAgcaaggaaTT  （配列番号４０）
上記で作製した１２種類のＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞でのノックダウン実験を行った。ＬＮＡ型Ｇａｐｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞培養液に最終濃度５μＭでそのまま添加した。形質転換後７２時間に定量的ＰＣＲを行った。内在性コントロールとしてＧ３ＰＤＨを使用した。
ヒトＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：TCAATGGAGACTCTCAGGC（配列番号９０）；
Ｒｖプライマー：CCGCTGAAGAGGAAGTCTC（配列番号９１）
を用い、
ヒトＧ３ＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：CCTTCCGTGTCCCCACTG（配列番号９２）；
Ｒｖプライマー：ACCCTGTTGCTGTAGCCAA（配列番号９３）
を用いた。【０２２０】
その結果、いずれの実施例でもＳａｌｉｎｅ投与細胞（アンチセンス未添加細胞）と比較してＳＭＳ２の遺伝子発現抑制が確認でき、そして、ＳＭＳ２−１３−００６，００７，００８，０１２，０１４，０１７，０１９＜それぞれ、配列番号３０、３１、３２、３６、３７、３８及び３９＞において、Ｓａｌｉｎｅ投与細胞（アンチセンス未添加細胞）と比較して、５０％以上のＳＭＳ２の遺伝子発現抑制が確認できた。【０２２１】
（実施例６：アンチセンスでの実験）
実施例５で同定されたＳＭＳ２のアンチセンス配列を用いて、実施例１又は２と同様の実験を行う。【０２２２】
本実施例では、当該分野で公知の手法を参酌し、ｓｉＲＮＡの導入方法等と同じ手法で、これらのアンチセンス配列（配列番号２９〜４０）をトランスフェクトすることにより、実施例１において記載した手法を行うことにより、ｎＳＭａｓｅ２のアミロイドβに関連する疾患に対する効果を確認することができる。【０２２３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２２４】
本発明は、アミロイドβに関連する状態、症状又は疾患の治療・予防剤を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【０２２５】
配列番号１：SMS2-i6の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号２：SMS2-i6の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号３：SMS2-i7の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号４：SMS2-i7の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号５：SMS2-i8の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号６：SMS2-i8の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号７：SMS2-i104の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号８：SMS2-i104の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号９：SMS2-i105の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１０：SMS2-i105の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１１：SMS2-i106の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１２：SMS2-i106の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１３：SMS2-i107の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１４：SMS2-i107の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１５：SMS2-i108の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１６：SMS2-i108の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１７：SMS2-i109の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号１８：SMS2-i109の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号１９：SMS2-i3の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号２０：SMS2-i3の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２１：SMS2-i11の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号２２：SMS2-i11の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２３：SMS2-i1の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号２４：SMS2-i1の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２５：SMS2-i2の二重鎖部分のセンス鎖部分の配列
配列番号２６：SMS2-i2の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２７：SMS2-i5の二重鎖部分のセンス鎖の配列
配列番号２８：SMS2-i5の二重鎖部分のアンチセンス鎖の配列
配列番号２９：SMS2-13-003のアンチセンス核酸の配列
配列番号３０：SMS2-13-006のアンチセンス核酸の配列
配列番号３１：SMS2-13-007のアンチセンス核酸の配列
配列番号３２：SMS2-13-008のアンチセンス核酸の配列
配列番号３３：SMS2-13-009のアンチセンス核酸の配列
配列番号３４：SMS2-13-010のアンチセンス核酸の配列
配列番号３５：SMS2-13-011のアンチセンス核酸の配列
配列番号３６：SMS2-13-012のアンチセンス核酸の配列
配列番号３７：SMS2-13-014のアンチセンス核酸の配列
配列番号３８：SMS2-13-017のアンチセンス核酸の配列
配列番号３９：SMS2-13-019のアンチセンス核酸の配列
配列番号４０：SMS2-13-020のアンチセンス核酸の配列
配列番号４１：ＳＭＳ１についての二重鎖部分のセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−AUACAUUGUAAUACACCGAUACAGG−３’
配列番号４２：ＳＭＳ１についての二重鎖部分のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−CCUGUAUCGGUGUAUUACAAUGUAU−３’
配列番号４３：ＳＭＳ２についての二重鎖部分のセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−AUACAUAGUUAUACAGCGAUACAGG−３’
配列番号４４：ＳＭＳ２についての二重鎖部分のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−CCUGUAUCGCUGUAUAACUAUGUAU−３’
配列番号４５：ａＳＭａｓｅについての二重鎖部分のセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−AUUGGUUUCCCUUUAUGAAGGGAGG−３’
配列番号４６：ａＳＭａｓｅについての二重鎖部分のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−CCUCCCUUCAUAAAGGGAAACCAAU−３’
配列番号４７：ｎＳＭａｓｅ１についての二重鎖部分のセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−AAUAGAACCACAUCUGCAUUCUUGG−３’
配列番号４８：ｎＳＭａｓｅ１についての二重鎖部分のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−CCAAGAAUGCAGAUGUGGUUCUAUU−３’
配列番号４９：ｎＳＭａｓｅ２についての二重鎖部分のセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−AAUCGAUGUAGAUCUUGAUCUGAGG−３’
配列番号５０：ｎＳＭａｓｅ２についての二重鎖部分のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列；５’−CCUCAGAUCAAGAUCUACAUCGAUU−３’
配列番号５１：ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）７７０増幅用センスプライマー；５’−ATGCTGCCCGGTTTGG−３’
配列番号５２：ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）７７０増幅用アンチセンスプライマー；５’−CTAGTTCTGCATCTGCTCAAAGAACTTG−３’
配列番号５３：SMS2-i1のセンス鎖部分の配列
配列番号５４：SMS2-i1のアンチセンス鎖の配列
配列番号５５：SMS2-i2のセンス鎖部分の配列
配列番号５６：SMS2-i2のアンチセンス鎖の配列
配列番号５７：SMS2-i3のセンス鎖の配列
配列番号５８：SMS2-i3のアンチセンス鎖の配列
配列番号５９：SMS2-i4のセンス鎖の配列
配列番号６０：SMS2-i4のアンチセンス鎖の配列
配列番号６１：SMS2-i5のセンス鎖の配列
配列番号６２：SMS2-i5のアンチセンス鎖の配列
配列番号６３：SMS2-i6のセンス鎖部分の配列
配列番号６４：SMS2-i6のアンチセンス鎖の配列
配列番号６５：SMS2-i7のセンス鎖部分の配列
配列番号６６：SMS2-i7のアンチセンス鎖の配列
配列番号６７：SMS2-i8のセンス鎖部分の配列
配列番号６８：SMS2-i8のアンチセンス鎖の配列
配列番号６９：SMS2-i11のセンス鎖の配列
配列番号７０：SMS2-i11のアンチセンス鎖の配列  
配列番号７１：SMS2-i104のセンス鎖部分の配列  
配列番号７２：SMS2-i104のアンチセンス鎖の配列
配列番号７３：SMS2-i105のセンス鎖の配列
配列番号７４：SMS2-i105のアンチセンス鎖の配列
配列番号７５：SMS2-i106のセンス鎖の配列
配列番号７６：SMS2-i106のアンチセンス鎖の配列
配列番号７７：SMS2-i107のセンス鎖の配列
配列番号７８：SMS2-i107のアンチセンス鎖の配列
配列番号７９：SMS2-i108のセンス鎖の配列
配列番号８０：SMS2-i108のアンチセンス鎖の配列
配列番号８１：SMS2-i109のセンス鎖の配列
配列番号８２：SMS2-i109のアンチセンス鎖の配列
配列番号８３：ヒトＮ−ＳＭａｓｅ２の核酸配列＜ＮＭ＿０１８６６７＞
配列番号８４；ヒトＮ−ＳＭａｓｅ２のアミノ酸配列
配列番号８５：マウスＮ−ＳＭａｓｅ２の核酸配列＜ＮＭ＿０２１４９１＞
配列番号８６：マウスＮ−ＳＭａｓｅ２のアミノ酸配列
配列番号８７：ヒトＳＭＳ２の核酸配列
配列番号８８：マウスＳＭＳ２の核酸配列
配列番号８９：アミロイドβ（１−５５）＝DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IATVIVITLVMLKKK
配列番号９０：ヒトＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したプライマー配列：Ｆｗプライマー：TCAATGGAGACTCTCAGGC
配列番号９１：ヒトＳＭＳ２の発現量を測定するために使用したプライマー配列：Ｒｖプライマー：CCGCTGAAGAGGAAGTCTC
配列番号９２：ヒトＧ３ＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列：Ｆｗプライマー：CCTTCCGTGTCCCCACTG
配列番号９３：ヒトＧ３ＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列：Ｒｖプライマー：ACCCTGTTGCTGTAGCCAA
配列番号９４：SMS2-i4の二重鎖部分のセンス鎖＝5’-gcagauuguuguugaucau-3’(センス鎖)
配列番号９５：SMS2-i4の二重鎖部分のアンチセンス鎖
配列番号９６：コントロールとして使用したｓｉＲＮＡ（ＣＴＲ−ｉ）配列：CTR-i 5’-uucuccgaacgugucacgu-3’（センス鎖）
配列番号９７：同アンチセンス鎖
配列番号９８：配列番号４３＋ｄＴｄＴ
配列番号９９：ｄＴｄＴ＋配列番号４４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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