(57)【要約】ＲＮＡを迅速かつ簡易に検出可能な前処理方法を提供する。ヒト鼻腔粘膜を含む生体試料に、例えば、鉄イオン及び炭酸イオンを添加することにより、ヒト鼻腔粘膜に存在するラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を阻害する。前処理された生体試料を用いれば、逆転写酵素を用いてＲＮＡウイルスの遺伝子を増幅することができる。鉄イオン及び炭酸イオンは、ヒト鼻腔粘膜中のリゾチームＣの逆転写酵素阻害を阻害することもできる。また、ヒト鼻腔粘膜を含む生体試料にＳＤＳを添加することにより、ＲＮＡウイルスのエンベロープを除去することが好ましい。
2013002354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを含む生体試料の前処理方法であって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、
前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することを特徴とする生体試料の前処理方法。
【請求項２】
前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することを特徴とする、請求項１記載の生体試料の前処理方法。
【請求項３】
前記生体試料が、動物の鼻腔粘膜、副鼻腔粘膜、気管粘膜、唾液、口腔または咽頭からの分泌液、涙、乳汁、胆汁、血液（白血球）、子宮頸管の粘膜、内外性器の粘膜、羊水、または尿を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の生体試料の前処理方法。
【請求項４】
前記動物が、ヒトであることを特徴とする、請求項３記載の生体試料の前処理方法。
【請求項５】
前記生体試料が、ヒト鼻腔粘膜を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法。
【請求項６】
さらに、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法。
【請求項７】
前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することを特徴とする、請求項６記載の生体試料の前処理方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことを特徴とする請求項７記載の生体試料の前処理方法。
【請求項９】
前記鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を添加した前記生体試料を加熱処理することを特徴とする請求項８記載の生体試料の前処理方法。
【請求項１０】
さらに、前記生体試料に、極性界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法。
【請求項１１】
前記極性界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする請求項１０記載の生体試料の前処理方法。
【請求項１２】
生体試料中のＲＮＡの検出方法であって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、
前記生体試料を前処理する前処理工程と、
前記前処理された生体試料中の前記ＲＮＡを増幅することで検出するＲＮＡ増幅検出工程とを含み、
前記前処理工程が、請求項１から１１のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法により実施されることを特徴とする検出方法。
【請求項１３】
前記前処理工程が、請求項１から９のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法により実施され、
前記ＲＮＡ増幅検出工程において、前記前処理された生体試料中に、さらに、界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１２記載の検出方法。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、非極性界面活性剤であることを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡの増幅が、逆転写酵素を用いた遺伝子増幅方法により実施されることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記遺伝子増幅方法が、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅方法であることを特徴とする請求項１５記載の検出方法。
【請求項１７】
ＲＮＡを含む生体試料の前処理キットであって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、
前記前処理キットが、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を含むことを特徴とする前処理キット。
【請求項１８】
さらに、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を含むことを特徴とする請求項１７記載の前処理キット。
【請求項１９】
前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことを特徴とする請求項１８記載の前処理キット。
【請求項２０】
前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤が、互いに接触しない状態で含まれていることを特徴とする請求項１９記載の前処理キット。
【請求項２１】
さらに、極性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載の前処理キット。
【請求項２２】
前記極性界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする請求項２１記載の前処理キット。
【請求項２３】
さらに、非極性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載の前処理キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡを含む生体試料の前処理方法、ＲＮＡの検出方法及び前処理キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液等の生体試料中のウイルスを検出する方法として、ウイルスの遺伝子を増幅して検出する方法がある。しかし、生体試料中には、遺伝子増幅の阻害物質が含まれていることが多いため、遺伝子増幅に先立ち、生体試料を前処理して阻害物質を除去若しくは不活性化することが実施されている。前処理方法としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤、加熱等により生体試料の処理後、さらに固層担体若しくはイオン交換樹脂により精製を行う方法がある（特許文献１〜３）。しかしながら、これらの方法は、特殊な装置を必要とし、かつ複数の操作工程が必要であるため、煩雑である。【０００３】
特に、ＲＮＡを遺伝子とするウイルスの検出では、ＲＮＡ遺伝子を逆転写酵素によってＤＮＡにしてから増幅操作を行うため、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）及び逆転写酵素不活性化物質も除去若しくは不活性化する必要があるため、従来の前処理方法では、さらに、煩雑な操作が必要となる。例えば、ＲＮＡウイルスを含む生体試料の前処理方法としては、ポリアミンまたは硫酸化多糖の添加が知られている（特許文献４）。しかしながら、ポリアミン若しくは硫酸化多糖の添加は、さらに前処理を煩雑化にすると共に、ポリアミン及び硫酸化多糖は、ＲＮＡ遺伝子及び逆転写酵素によって生成されるＤＮＡに結合するおそれがあり、逆に遺伝子増幅を阻害する可能性もある。【０００４】
ところで、インフルエンザウイルスは、ＲＮＡウイルスの一種であるが、インフルエンザウイルスが新型か季節型かの判断は、臨床的に極めて重要である。また、インフルエンザウイルスの検出のための生体試料として鼻腔粘膜を使用することが一般的である。そして、インフルエンザウイルスの検出は、臨床現場で行う必要がある。このため、ヒトの鼻腔粘膜を用いたインフルエンザウイルスの迅速かつ簡易な検出方法の確立が望まれており、このような要請は、インフルエンザウイルスに限定されず、ＲＮＡウイルスの検出全般に対しても要請されており、さらには、ＲＮＡウイルスの検出だけでなく、遺伝子以外のＲＮＡ自体の検出に対しても要請されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２４７２５０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００７／０９４５０６号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−８７３９４号公報
【特許文献４】特開２００１−２９０７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを迅速かつ簡易に検出することを可能とする生体試料の前処理方法、それを用いたＲＮＡの検出方法、及び、前記生体試料の前処理方法に用いる前処理キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の前処理方法は、ＲＮＡを含む生体試料の前処理方法であって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することを特徴とする。【０００８】
本発明の検出方法は、生体試料中のＲＮＡの検出方法であって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、前記生体試料を前処理する前処理工程と、前記前処理された生体試料中の前記ＲＮＡを増幅することで検出するＲＮＡ増幅検出工程とを含み、前記前処理工程が、前記本発明の生体試料の前処理方法により実施されることを特徴とする。【０００９】
本発明の前処理キットは、ＲＮＡを含む生体試料の前処理キットであって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、前記前処理キットが、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者等は、まず、ヒト鼻腔粘膜試料中に含まれる、ＲＮＡを鋳型とした逆転写／ＤＮＡ増幅反応を阻害する要因が、ラクトフェリンによるＲＮＡ分解活性であることを突き止めた。そして、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理（例えば、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤添加処理）を、ヒト鼻腔粘膜試料に実施するだけで、ＲＮＡ分解を抑制できることを見出した。さらに、ヒト鼻腔粘膜試料に存在する他の逆転写／ＤＮＡ増幅反応阻害要因の一つとして、リゾチームＣが逆転写酵素によるＲＮＡからＤＮＡへの逆転写反応を抑制することを突き止めた。そして、リゾチームＣの逆転写酵素阻害活性抑制剤を添加する事により、逆転写酵素阻害活性を抑制できる事を見出した。しかも、これら逆転写／ＤＮＡ増幅反応阻害要因の抑制処理（抑制剤を含む試薬添加）によってヒト鼻腔粘膜試料を処理した結果、特別な精製工程を経ずに、そのままＲＮＡ遺伝子の増幅が可能であることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを迅速かつ簡易に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の検出方法の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒト鼻腔粘膜中に、ラクトフェリン及びリゾチームＣが存在することを示す電気泳動写真である。
【図３】図３は、鉄イオン及び炭酸イオンのラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害効果を示す電気泳動写真である。
【図４】図４は、鉄イオン及び炭酸イオンの熱処理の効果の一例を示す電気泳動写真である。
【図５】図５は、鉄イオン及び炭酸イオンによるリゾチームＣの逆転写阻害活性の阻害の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、鉄イオン及び炭酸イオンと、ＳＤＳとの相乗効果の一例を示す電気泳動写真である。
【図７ａ】図７ａは、ターンバックプライマーおよびフォールディングプライマーによる核酸増幅反応の機序の一例を示す図である。
【図７ｂ】図７ｂは、ターンバックプライマーおよびフォールディングプライマーによる核酸増幅反応の機序の一例を示す図である。
【図８】図８は、アルミナ添加によるＳＤＳ除去の影響の一例を示すグラフである。
【図９】図９は、鉄イオン濃度の増加および限外濾過フィルターによるＳＤＳ除去の影響の一例を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による、核酸増幅反応中でのＳＤＳの核酸増幅阻害の緩和効果の一例を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒト鼻腔粘膜に含まれたＲＮＡウイルスをＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法により検出できたことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の前処理方法において、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することが好ましい。
【００１３】
本発明の前処理方法において、前記生体試料が、動物の鼻腔粘膜、副鼻腔粘膜、気管粘膜、唾液、口腔または咽頭からの分泌液、涙、乳汁、胆汁、血液（白血球）、子宮頸管の粘膜、内外性器の粘膜、羊水、または尿を含むことが好ましい。
【００１４】
本発明の前処理方法において、前記動物が、ヒトであることが好ましい。
【００１５】
本発明の前処理方法において、前記生体試料が、ヒト鼻腔粘膜を含むことが好ましい。
【００１６】
本発明の前処理方法において、さらに、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することが好ましい。この場合において、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することが好ましい。
【００１７】
本発明の前処理方法において、前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことが好ましい。なお、本発明において、「鉄イオン剤」とは、前記生体試料に鉄イオンを供給可能なものをいう。同様に、本発明において、「炭酸イオン剤」とは、前記生体試料に炭酸イオンを供給可能なものをいう。
【００１８】
本発明の前処理方法において、前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤を添加した前記生体試料を加熱処理することが好ましい。この加熱処理によって、ＲＮＡ分解活性及び逆転写阻害活性を、効率良く阻害可能だからである。
【００１９】
本発明の前処理方法において、さらに、前記生体試料に、界面活性剤を添加してもよく、例えば、極性界面活性剤を添加することが好ましい。ウイルス粒子から遺伝子を露出させるためには、非イオン性界面活性剤を用いてウイルスのエンベロープを除去する必要があるが、非イオン性界面活性剤は、本発明の前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤の機能を阻害する可能性がある。しかし、極性界面活性剤であれば、本発明の前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤の機能を阻害することなくウイルスのエンベロープを除去可能である。前記極性界面活性剤は、ＳＤＳであることが好ましい。なお、ＳＤＳは、遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼを阻害する恐れがあるため、遺伝子増幅に先立ち、カリウム塩又はアルミナを生体試料に添加してＳＤＳを凝集させ、遠心分離若しくはろ過によってＳＤＳを除去することが好ましい。
【００２０】
本発明の検出方法において、前記ＲＮＡの増幅が、逆転写酵素を用いた遺伝子増幅方法により実施されることが好ましい。前記遺伝子増幅方法は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅方法であることが好ましい。
【００２１】
本発明の検出方法において、界面活性剤を用いたウイルス粒子からのＲＮＡ遺伝子の流出は、例えば、以下の２つの工程のどちらかを用いることができる。工程Ｂは、非極性界面活性剤を遺伝子増幅工程において添加し、非極性界面活性剤と遺伝子増幅反応の際の加熱との効果により、ウイルス粒子からＲＮＡ遺伝子を溶出させる手法である。
工程Ａ：前処理過程において検体中に含まれるウイルス粒子を界面活性剤によって破壊し、ウイルスからＲＮＡを溶出させると同時に、ラクトフェリンおよびリゾチームＣのＲＮＡ分解活性及び前記逆転写阻害活性を阻害処理によって抑制し、その前処理液を核酸増幅に供する工程。
工程Ｂ：検体中のウイルス粒子を破壊せず（保持したまま）、ラクトフェリン及びリゾチームＣのＲＮＡ分解活性及び前記逆転写阻害活性を阻害処理によって抑制した後、非極性界面活性剤を含む核酸増幅反応に供し、界面活性剤と熱変性の効果によってウイルス粒子中のＲＮＡゲノムを溶出させ、ウイルスゲノムからの核酸増幅を実施する工程。
【００２２】
前記工程Ａにおいて、前記界面活性剤は、極性界面活性剤を用いることが好ましい。前記極性界面活性剤は、ＳＤＳであることが好ましい。前記工程Ｂにおいて、前記界面活性剤は、核酸増幅反応を阻害しない非極性界面活性剤を使用することが好ましい。
【００２３】
本発明の前処理キットは、さらに、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を含むことが好ましい。
【００２４】
本発明の前処理キットにおいて、前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことが好ましい。前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤が、互いに接触しない状態で含まれていることことが好ましい。
【００２５】
次に、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明において、生体試料に含まれるＲＮＡは特に制限されず、生体からとれるすべてのＲＮＡ、宿主ＲＮＡ、細菌や真菌のＲＮＡが含まれる。遺伝子のＲＮＡであってもよいし、遺伝子以外のＲＮＡであってもよい。遺伝子のＲＮＡの場合、生体試料に含まれるのは、ＲＮＡウイルスが好ましく、特に好ましくは、インフルエンザウイルスである。
【００２７】
本発明において、前記生体試料は、ラクトフェリンを含む試料である。前記生体試料は、中でも、ヒトラクトフェリンを含む試料であることが好ましい。
【００２８】
ラクトフェリンは生体のほとんどの外分泌液中に含まれていることが知られている。したがって、前記生体試料としては、例えば、動物の、鼻腔、副鼻腔、喉頭、気管、気管支、または、肺などの上気道粘膜からの分泌液、口腔または咽頭からの分泌液（例えば唾液等）、消化管粘膜からの分泌液、内・外性器（例えば子宮頸管等）の粘膜からの分泌液、腎尿路系の粘膜からの分泌液、腹腔内粘膜からの分泌液、胸腔内粘膜からの分泌液、心のう内粘膜からの分泌液、皮膚からの分泌液、涙腺分泌液、乳汁、胆汁、血液（白血球）、羊水、尿、糞便などを含む生体試料があげられる。これらの中で、例えば、鼻腔、副鼻腔などの粘膜からの分泌液、唾液、涙、乳汁、胆汁、血液（白血球）、子宮頸管からの分泌液、羊水、尿などの試料が好ましく、これらは、実際にラクトフェリンを含むことが知られている。中でも、ヒト鼻腔粘膜が特に好ましい。また、前記動物は、ヒトが好ましいが、ヒト以外の動物でも良い。ヒト以外の動物の例としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ラットなどがあげられる。
【００２９】
ラクトフェリンは、前述のとおり鼻腔粘膜のみならず、様々な組織において発現し、分泌されるタンパク質である。ヒトの様々な組織において、ラクトフェリンのタンパク質をコードするＲＮＡ発現量がどの程度のものかを、次世代シーケンサーを利用した発現解析を行う手法の一つであるＣＡＧＥ法（Ｋａｎａｍｏｒｉ−Ｋａｔａｙａｍａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  （２０１１）  Ｍａｙ  １９）によるデータを用いて解析、比較したデータが得られているので、参考までに表１に示す。この結果、ラクトフェリンの発現量の高い組織としてさまざまな組織があることが分かり、本発明の前処理方法の適用可能性の広さを示唆するものである。
（表１）
発現ランク      ヒト組織サンプル名      ＣＡＧＥスコア
（スコア１００以上）
１              好中球（１）            ２２１２４
２              好中球（２）            １３５５２
３              好中球（３）            １１１７６
４              気管（１）              １９５８
５              好酸球                  １６３２
６              骨髄球（１）            ７１６
７              目                      ５４８
８              精嚢                    ５２５
９              気管（２）              ４８１
１０            精管                    ４８０
１１            喉                      ３８５
１２            唾液腺                  ３７６
１３            骨髄球（２）            ３５０
１４            大動脈                  ２７３
１５            精巣上体                ２３４
１６            扁桃腺                  ２１４
１７            顎下腺                  １８０
１８            骨髄球（３）            １８０
１９            好塩基球                １４５
２０            腎臓                    １３３
２１            子宮頸管                １１１
２２            前立腺                  １０８
【００３０】
ヒト鼻腔粘膜は、例えば、鼻腔洗浄液やこう鼻（鼻かみ）により採取でき、より好ましくは、スワブによって採取することができる。ヒト鼻腔粘膜は、そのまま、生体試料としてもよいし、生理食塩水または緩衝液等に分散若しくは溶解させて生体試料としてもよい。緩衝液としては、アルカリ化における分解を防ぐため、酸性から中性域における水素イオン濃度に対する緩衝作用を有するものが使用できる。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、および種々のグッド緩衝液（ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ）が使用できる。緩衝液のｐＨは、例えば、４．０〜８．０、好ましくは５．０〜７．０、より好ましくは５．５〜６．０の範囲であり、ＭＥＳ（ｐＫａ＝６．１５）を用いる事が最も好ましい。
【００３１】
生体試料中のＲＮＡを鋳型とした逆転写／ＤＮＡ増幅反応を阻害する要因が、ラクトフェリンによるＲＮＡ分解活性であり、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を阻害すれば、特別な精製処理をしなくても、ＲＮＡウイルスの遺伝子増幅が可能であることを見出したことが、本発明のポイントであることは、前述のとおりである。ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性の阻害処理には、例えば、生体試料へのラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤の添加と、生体試料の熱処理とが含まれる。前記阻害処理は、例えば、ＲＮＡ分解活性阻害剤の添加および前記熱処理の両方により実施してもよい。前記熱処理の温度は、例えば、２５〜１００℃の範囲であり、好ましくは３０〜７５℃の範囲であり、より好ましくは３７〜６５℃の範囲である。前記熱処理の時間は、例えば、１〜６０分の範囲であり、好ましくは２〜４５分の範囲であり、より好ましくは５〜３０分の範囲である。
【００３２】
前記ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性は、ターゲットとなる目的ＲＮＡ以外のＲＮＡ（デコイＲＮＡ）を過剰に添加する事でも低下させることができる。
【００３３】
ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性をより阻害するには、種々の阻害剤を使用できる。阻害剤としては、一般的に分子生物学で使用されるウシ胎盤由来ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを用いる事ができる。また、ラクトフェリンに対し特異的に結合し、ＲＮＡ分解活性を阻害できる特異的ＩｇＧ抗体やＡｆｆｉｂｏｄｙのタンパク質性分子、もしくは核酸由来特異的結合分子としてスクリーニングが可能なＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーを用いる事ができる。さらに、ラクトフェリンに対するｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏ結合分子探索によって見出された、硫酸塩、スルホチオ酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、スルホクロリド酸塩等の低分子有機化合物を用いる事ができる。
【００３４】
ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤として、好ましくは、遷移金属及び典型金属に属する金属イオンを用いる事ができる。金属イオンとしては、遷移金属に属するものとして、銅（Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、鉄（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋）、金（Ａｕ＋、Ａｕ３＋）、および遷移金属の中で軽希土に分類されるスカンジウム（Ｓｃ３＋）、イットリウム（Ｙ３＋）、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）、セリウム（Ｃｅ３＋）、ネオジム（Ｎｄ３＋）が挙げられる。典型金属に属する金属イオンとしては、亜鉛（Ｚｎ２＋）が使用できる。尚、これらの金属は、単独又は複数種の混合試薬として使用する事ができる。
【００３５】
ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤として、より好ましくは、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を同時に用いることが好ましい。これは、ラクトフェリンが、鉄を含まないアポ体（アポラクトフェリン）となった場合に高いＲＮＡ分解活性を引き起こす事、ならびにラクトフェリンの結晶構造において金属結合ドメインに鉄イオンと炭酸イオンを含む構造を取る事に準ずる。金属イオンを含まないアポラクトフェリンに対して鉄イオンに炭酸イオンを同時に供与する事により、アポ体からホロ体（ホロラクトフェリン）に効率よく移行させる事ができ、ＲＮＡ分解活性を抑制する事ができると考えられる。鉄イオン剤だけでもラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害活性があるが、鉄イオン剤単独だと、鉄イオン剤の濃度を高くした場合、鉄イオン剤自身のＲＮＡ分解活性が発現する恐れがある。炭酸イオン剤は、余剰の鉄イオン剤と反応し不溶性の炭酸鉄（Ｆｅ２（ＣＯ３）３）を形成する事ができるため、余剰の鉄イオン自身がＲＮＡを分解することを抑制する手段としての効果を有する。よって、鉄イオン剤と共に、炭酸イオン剤も添加すれば、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を阻害し、かつ、鉄イオン剤自身のＲＮＡ分解活性を阻害できる。
【００３６】
前記鉄イオン剤としては、三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を供給できるものが好ましく、例えば、塩化鉄（ＦｅＣｌ３）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３）及び硫酸鉄（Ｆｅ２（ＳＯ４）３）が好ましく、より好ましくは、これらの水溶液である。なお、水溶液での安定性の観点から、硫酸鉄を用いることが好ましい。
【００３７】
前記炭酸イオン剤としては、炭酸イオン（ＣＯ３２―）を供給できるものが好ましく、例えば、炭酸水素ナトリウムがあげられ、好ましくは炭酸水素ナトリウムの水溶液である。
【００３８】
Ｆｅ３＋とＣＯ３２―が同時に存在する溶液中（生体試料中）において、例えば、Ｆｅ３＋の濃度は、２〜６ｍＭの範囲、また、ＣＯ３２―の濃度は、５〜２０ｍＭの範囲である。また、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤の濃度としては、例えば、Ｆｅ２（ＳＯ４）３の濃度は、１〜３ｍＭの範囲、また、ＮａＨＣＯ３の濃度は、５〜２０ｍＭの範囲である。より好ましくはＦｅ２（ＳＯ４）３の濃度は、２．５ｍＭ程度、また、ＮａＨＣＯ３の濃度は、１０ｍＭ程度である。
【００３９】
前述のように、前記極性界面活性剤であるＳＤＳを前記生体試料に添加する場合、ＳＤＳは、遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼを阻害する恐れがあるため、前述のように、アルミナ等を使用して、前記生体試料からＳＤＳを除去することが好ましい。なお、前記アルミナを使用した場合、前記アルミナには、ＳＤＳ以外の極性分子の吸着も起こり得るため、例えば、前記生体試料に含まれるＲＮＡ及びＤＮＡ等もアルミナに吸着されて、前記生体試料から除去されてしまう場合がある。ここで、ＳＤＳと鉄イオンとは、相互作用により沈殿を形成する。この沈殿形成能を利用して、前記生体試料からＳＤＳを除去することもできる。この観点から、前記生体試料に含まれる鉄イオンの濃度を高く設定することが好ましい。前記鉄イオン（例えば、Ｆｅ３＋）の濃度は、１ｍＭ以上が好ましく、２ｍＭ以上がより好ましく、２．５ｍＭ以上がさらに好ましい。前記鉄イオンの濃度の上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍＭ以下または５ｍＭ以下である。ＳＤＳと鉄イオンとから形成される沈殿は、例えば、遠心分離若しくはろ過によって、前記生体試料から除去することが好ましい。前記ろ過により前記沈殿を除去する場合、前記ろ過には、サイズ排除型フィルター（限外ろ過フィルター）を使用するのが好ましく、例えば、前記限外ろ過フィルターの孔径は、０．１〜０．４５μｍの範囲であってもよく、より好ましくは０．２２μｍである。前記限外ろ過フィルターは、例えば、ミリポア社製の商品名「マイレクスＨＶ（膜孔径０．２２μｍ）等を使用できる。
【００４０】
鼻腔粘膜試料に多く含まれるリゾチームＣは、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する逆転写酵素活性を阻害する。前述のように、本発明では、鼻腔粘膜試料等の生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することが好ましい。リゾチームＣの逆転写阻害活性阻害処理には、例えば、リゾチームＣの逆転写阻害活性阻害剤の添加と、生体試料の熱処理とが含まれる。前記阻害処理は、例えば、ＲＮＡ分解活性阻害剤の添加および前記熱処理の両方により実施してもよい。リゾチームＣの逆転写阻害活性阻害剤としては、例えば、リゾチームＣに対し特異的に結合し、逆転写阻害活性を抑制できる特異的ＩｇＧ抗体やＡｆｆｉｂｏｄｙのタンパク質性分子、もしくは核酸由来特異的結合分子としてスクリーニングが可能なＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーを用いる事ができる。より好ましくは、鉄イオン剤（例えば、三価の鉄イオンを供給できるもの）及び炭酸イオン剤の添加によって抑制することができる。前記熱処理の温度は、例えば、２５〜１００℃の範囲であり、好ましくは３０〜７５℃の範囲であり、より好ましくは３７〜６５℃の範囲である。前記熱処理の時間は、例えば、１〜６０分の範囲であり、好ましくは２〜４５分の範囲であり、より好ましくは５〜３０分の範囲である。
【００４１】
鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を添加した生体試料は、加熱処理することが好ましい。この加熱処理は、ラクトフェリンの構造ゆらぎを生じさせる作用があるものと考えられ、結果的に鉄イオン剤及び炭酸イオン剤のラクトフェリンへの作用を向上させ、よりＲＮＡ分解活性を抑制する事が可能である。加熱処理の条件は、例えば、温度は、３７〜６０℃の範囲であり、時間は、５〜３０分の範囲である。例えば、３７℃の場合は、３０分の加熱処理を行い、６０℃の場合は、５分の加熱処理を行う。
【００４２】
前述した加熱処理を伴わない工程として、微量のタンパク質変性剤を使用する事ができる。具体的には、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアネート、尿素がある（界面活性剤は以下に示す）。
【００４３】
鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を添加した生体試料には、ウイルス粒子のエンベロープ除去のために、極性界面活性剤を添加することが好ましい。極性界面活性剤は、アニオン系のものを使用する事が好ましく、具体的には、サポニン、オクタン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、ペルフルオロノナン酸、ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩、１−ヘキサンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、ペルフルオロブタンスルホン酸、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンジスルホン酸二ナトリウム、ナフタレントリスルホン酸三ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸カリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ｎ−テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、ｎ−ドデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、グリコデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロリソコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウムが使用できる。より好ましくは、ｎ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加する事が好ましい。添加濃度は、例えば、ＳＤＳの場合は、０．１ｗ／ｖ％以下である。なお、ＳＤＳを添加した場合、前記加熱処理をせずとも、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤によるラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を迅速に阻害できる。なお、極性界面活性剤の添加を伴うヒト鼻腔粘膜試料の前処理は、以下の工程Ａに準ずる前処理手法と定義づけられる。
工程Ａ：前処理過程において検体中に含まれるウイルス粒子を極性界面活性剤によって破壊し、ウイルスからＲＮＡを溶出させると同時に、ラクトフェリンおよびリゾチームＣのＲＮＡ分解活性及び前記逆転写阻害活性を阻害剤によって抑制し、その前処理液を核酸増幅に供する工程。
【００４４】
前述した極性界面活性剤の添加は、任意であり、極性界面活性剤の添加が無くても、本発明の前処理により、ＲＮＡウイルスのＲＮＡ遺伝子の増幅が可能である。この場合、ウイルスからのＲＮＡゲノムの放出が核酸増幅反応過程で起こる事が前提となる。ＲＮＡからの核酸増幅において逆転写反応が、例えば、５０〜６０℃で実施される場合、ウイルスエンベロープの熱変性効果が期待でき、ＲＮＡウイルスからのＲＮＡゲノムの放出が可能である。より好ましくは、ウイルスエンベロープを崩壊させる効果があり且つ核酸増幅反応を阻害しない非イオン性界面活性剤を核酸増幅反応液中に添加することができる。具体的な非イオン性界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）、Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤（Ｂｒｉｊ−７６、Ｂｒｉｊ−９６、Ｂｒｉｊ−５６、Ｂｒｉｊ−５８、Ｂｒｉｊ−３５）、Ｓｐａｎ系界面活性剤（Ｓｐａｎ−２０、Ｓｐａｎ−４０、Ｓｐａｎ−６０）、ＰＯＥ（９、１０）ノニルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ−１０１）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ジギトニン、ＡＰＯ−１０、ＡＰＯ−１２、ＢＩＧ  ＣＨＡＰ、シクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デカノイルスクロース、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ＥＬＵＧＥＮＴ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｃ−１００、ＧＥＮＡＰＯＬ  Ｘ−８０、ＧＥＮＡＰＯＬ  Ｘ−１００、ＨＥＣＡＭＥＧ、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＮＰ−４０、ｎ−オクタノイル−β−グルコシルアミン（ＮＯＧＡ）、ｎ−オクタノイルスクロース、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ＰＬＵＰＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−１２７、ノノキシノール、ノノキシノール−９、ラウリン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、が使用できる。
【００４５】
前述のように、前記極性界面活性剤であるＳＤＳを前記生体試料に添加する場合、ＳＤＳは、遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼを阻害する恐れがある。このため、前述のアルミナを使用する方法、鉄イオン濃度を高めてＳＤＳと鉄イオンとの沈殿を形成する方法等により、前記生体試料からＳＤＳを除去している。しかしながら、前記生体試料には、ＳＤＳ除去処理後もＳＤＳが残存する場合がある。本発明において、ＳＤＳが含まれる生体試料を遺伝子増幅する際に、前述の核酸増幅反応を阻害しない非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。このようにすることで、前記生体試料に含まれるＳＤＳが前記非イオン性界面活性剤のミセル中に取り込まれ、ＳＤＳによる遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼ阻害が抑制される。なお、前述のメカニズムは推定であり、この記載により本発明は何ら制限されない。本発明では、前記目的のために、例えば、前述のＳＤＳ除去処理後の生体試料に、遺伝子増幅する際に前記非イオン性界面活性剤を添加してもよいし、前述のＳＤＳ除去処理を行っていない生体試料に、遺伝子増幅する際に前記非イオン性界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、非イオン性界面活性剤を予め核酸増幅（遺伝子増幅）の反応液中に添加しておいてもよい。前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の添加量は、例えば、前記生体試料におけるＳＤＳの濃度により適宜設定できるが、前記生体試料にＳＤＳが、０．１％で含まれている場合には、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が、０．１〜１％の範囲で、前記生体試料に含まれていることがより好ましく、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の濃度は、０．５％であってもよい。
【００４６】
ＳＤＳは、中性のカリウム塩またはアルミナの添加によって除去可能であることは、前述のとおりである。中性のカリウム塩は、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、塩酸カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウムが使用できる。より好ましくは水溶性のものが好ましく、酢酸カリウムがより好ましい。アルミナとしては、例えば、アルミナ粒子（平均粒径１０００ｎｍ以下のもの、好ましくは平均粒径２００ｎｍ以下のもの、より好ましくは平均粒径２０〜１００ｎｍのもの）である。または、活性アルミナ（和光純薬社製、分子量１０１．９６）等も使用できる。
【００４７】
遺伝子増幅法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ法、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅法があるが、前記等温増幅法が好ましい。前記等温増幅法としては、例えば、ＳＤＡ法（特公平７−１１４７１８号公報）、下記のターンバックプライマー（ＴＰ）を用いた増幅方法があげられるが、この中で、ＴＰを用いた等温増幅法が好ましい。
【００４８】
（ターンバックプライマー）
前記ターンバックプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるものである。
【００４９】
ＴＰを用いた等温増幅法において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの双方にＴＰを用いた対称の形態（ＴＰ−ＴＰ）でもよいし、フォワードプライマー及びリバースプライマーの一方にＴＰを用い、他方にその他のプライマー（ＸＰ）を用いた非対称の形態（ＴＰ−ＸＰ）であってもよい。
【００５０】
対称の形態（ＴＰ−ＴＰ）の具体例としては、例えば、ＬＡＭＰ法（国際公開ＷＯ２０００／０２８０８２号パンフレット）があげられる。ＬＡＭＰ法は、一対のＴＰ（ＴＰ−ＴＰ）に加え、一対のアウタープライマー（ＯＰ−ＯＰ）を使用する方法である。ＯＰは、鋳型配列において、ＴＰよりも５’側にアニ―ルし、ＴＰ伸長鎖を鎖置換反応により剥ぎ取る機能を持つプライマーである。
【００５１】
非対称の形態の場合のその他のプライマーとしては、ＰＣＲ法に使用する一般的なプライマー、下記のフォールディングプライマー（ＦＰ）があげられる。非対称の形態では、ＴＰとＦＰの組合せが好ましい。ＴＰとＦＰの組合せの形態としては、ＳｍａｒｔＡｍｐ法（登録商標）（国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット）があげられる。ＴＰとＦＰの組合せの一例を図７ａおよび図７ｂに示す。ＴＰとＦＰの組合せに加え、さらに、ＯＰを使用してもよい。ＯＰの使用は、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方に使用してもよい。
【００５２】
（フォールディングプライマー）
前記フォールディングプライマーは、標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものである。
【００５３】
ＴＰ−ＦＰを用いた等温増幅の仕組みは、例えば、次のとおりである。ＴＰおよびＦＰによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図７（図７ａおよび図７ｂ）を用いて説明する。なお、図７では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、ＴＰが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図７（ａ））。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（Ａ）に新たなＴＰがハイブリダイズし（図７（ｂ））、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（Ｃ）にＦＰがハイブリダイズし（図７（ｃ））、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図７（ｄ））。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図７（ｅ））、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図７（ｆ））。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）にＴＰがハイブリダイズし（図７（ｇ））、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図７（ｈ）および（ｉ））。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図７（ｈ））、そこからの伸長反応により（図７（ｉ））、両端に折返し配列を有し、ＴＰおよびＦＰに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図７（ｊ））。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図７（ｋ））、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図７（ｌ）および（ｍ））。また、図７（ｉ）において脱離したＴＰからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図７（ｎ））、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図７（ｏ））。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、ＴＰおよびＦＰに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００５４】
ＲＮＡ遺伝子を増幅させる場合、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを増幅する。このように、逆転写酵素を用いてＲＮＡを増幅するＳｍａｒｔＡｍｐ法を、ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法という。
【００５５】
本発明の前処理キットの組成は、特に制限されないが、例えば、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ５．８）、２．５ｍＭ  硫酸鉄、２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ及び  ２０ｍｇ／ｍｌアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）という組成があげられる。
【００５６】
硫酸鉄と炭酸水素ナトリウムは、混合溶液として保存した場合、迅速に沈殿を形成する。そのため、本発明の前処理キットでは、Ａ液及びＢ液の２液に分け、硫酸鉄と炭酸水素ナトリウムが別々に提供されることが好ましい。この場合、例えばＡ液は、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ５．８）、４０  ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、０．２％  ＳＤＳの組成とする。Ｂ液は、５ｍＭ  硫酸鉄、４０ｍｇ／ｍｌ  アルミナの組成とする。この場合、硫酸鉄を含むＢ液は遮光保存することが望ましい。Ａ液及びＢ液は、１：１の混合液としてヒト鼻腔粘膜を緩衝液に懸濁時に調製することが好ましい。
【実施例】
【００５７】
次に、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、実施例により制限及び限定されない。【００５８】
［実施例１］
（ヒト鼻腔粘膜中に混合した鋳型ＲＮＡの核酸増幅）
本実施例では、ヒト鼻腔粘膜が有する鋳型ＲＮＡからの核酸増幅阻害活性を、本発明における前処理キットが抑制できるかについて示した。前処理キットとして、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、２．５ｍＭ  硫酸鉄、２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ及び２０ｍｇ／ｍｌ活性アルミナ（和光純薬社製、分子量１０１．９６）を組成とするキット（前処理試薬）を調製した。このキットに、健常人のヒト鼻腔粘膜を懸濁し、さらに、下記において調製した、ウイルス（インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１））と同様の部分配列を有する鋳型ＲＮＡを１０７コピー混合することにより、本実施例での試料とした。この試料を、ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法に供し、ＲＮＡの存在を検出した。なお、比較例として、前記キットにおいて、硫酸鉄及び炭酸水素ナトリウムを添加しなかった以外は、同じ組成のものを調製し、同様の核酸増幅を行った。これらの結果を、図１に示す。同図に示すように、本発明のキットを用いた場合は、ＲＮＡを鋳型とした核酸増幅が達成された。一方、比較例では、核酸増幅できなかった。なお、ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐは、下記のようにして実施した。【００５９】
本実施例におけるＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法では、増幅する鋳型ＲＮＡとしてインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）のＨＡ領域５９５−１０４８塩基までの配列を用いた。鋳型ＲＮＡの調製にあたり、まずＨＡ領域に相補的な配列を有するｃＤＮＡ、以下のプライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）、ならびにＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを実施した。
プライマー１（配列番号１）
５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡ−３’
プライマー２（配列番号２）
５’−ＣＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＡ−３’【００６０】
なお、前記ＰＣＲは、９５℃３０秒、６０℃３０秒、及び７２℃３０秒の３つの温度を３５サイクル反応させた後、７２℃３分のインキュベーションによって達成した。このＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を元に、ＣＵＧＡ７  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用い、鋳型ＲＮＡを合成した。【００６１】
ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法は、容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１２ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．１２５ｕｎｉｔ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む溶液に、以下に示す配列及び濃度のプライマー（配列番号３〜７、ダナフォーム社製）及びエキシトンプライマー（配列番号８、ダナフォーム社製、特許第４３７０３８５号公報参照）を加えたものを反応溶液とした。
ＦＰプライマー（配列番号３、最終濃度１．８２μＭ）
５’−ＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣ−３’
ＴＰプライマー（配列番号４、最終濃度１．８２μＭ）
５’−ＴＴＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＡＣＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣ−３’
ＯＰプライマー１（配列番号５、最終濃度０．２３μＭ）
５’−ＡＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡ−３’
ＯＰプライマー２（配列番号６、最終濃度０．２３μＭ）
５’−ＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＣＴＴ−３’
ＢＰプライマー（配列番号７、最終濃度０．６８μＭ）
５’−ＡＣＣＡＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’
ＢＰエキシトンプライマー（配列番号８、最終濃度０．２３μＭ）
５’−ＡＣＣＡＣＺＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（Ｚはエキシトン標識されたチミン残基を示す）【００６２】
さらに前記合成した鋳型ＲＮＡとヒト鼻腔粘膜を前処理キットで懸濁した試料を加え、反応容積を２５μＬとした後、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。その結果、図１に示すように、本発明における前処理試薬で処理した試料のみにおいて、添加した鋳型ＲＮＡから核酸増幅が達成された。【００６３】
［参考例１］
（ヒト鼻腔粘膜中のラクトフェリン及びリゾチームＣの存在）
図２の電気泳動写真に示すように、ヒト鼻腔粘膜中に、ラクトフェリン及びリゾチームＣの存在を確認した。なお、ヒト鼻腔粘膜中のラクトフェリン及びリゾチームＣの存在は、以下のようにして確認した。【００６４】
健常者の鼻腔粘膜試料（咽頭上部粘膜）をスワブ（メンティップ、日本綿棒社製）によって採取し、スワブ１本あたり３００μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した。得られた懸濁液をゲルろ過クロマトグラフィー（移動相  リン酸緩衝液、カラム  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ、ＧＥヘルスケア製）に供し、４つのフラクション（Ｆ１〜Ｆ４）にサイズ分画した。また、同懸濁液をＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティースピンカラム（同仁化学製）に供し、カラム結合画分を得た。上記、ゲル濾過分画標品及びアフィニティーカラム結合画分をＳｕｐｅｒＳｅｐ  Ａｃｅ１０−２０％リニアグラジエントアクリルアミドゲル（和光純薬工業製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、Ｓｉｌｖｅｒ  ＭＳ  Ｓｔａｉｎ（和光純薬工業製）にて銀染色を行うことでタンパク質のバンドを検出した。図２に四角で囲んだバンドについて、Ｅａｓｙ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（和光純薬工業製）を用いてタンパク質を抽出し、液体クロマトグフィー／タンデムマススペクトロメトリー（ＳＹＮＡＰＴ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に供した。得られたデータからＭＡＳＣＯＴプログラムを用い、マススペクトロメトリーによって得られたペプチドフラグメントの分子量から推定されるタンパク質を検索した。その結果、図２に示す約８０ｋＤａのバンドがヒト由来ラクトフェリン、１４ｋＤａのバンドがヒト由来リゾチームＣであるものと同定された。【００６５】
［実施例２］
（鉄イオン及び炭酸イオンのヒトラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害効果）
図３に示すように、鉄イオン及び炭酸イオンのヒトラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害効果を確認した。【００６６】
本実施例では、前記合成した鋳型ＲＮＡと同様のものをＲＮＡ分解活性（ＲＮａｓｅ活性）に対する基質として使用した。図３左図では、健常者の鼻腔粘膜試料（咽頭上部粘膜）をスワブ（メンティップ、日本綿棒製）によって採取し、２５０μＬの４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で懸濁した。次に、懸濁液９μＬに１．５ｍＭの塩化鉄を添加し、さらにＮａＨＣＯ３を５、１０又は１５ｍＭを加えたものを調製し、最終的に１８μＬとなるよう定容した。その後、懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートした。その２．５μＬの懸濁液に対し、５０ｎｇ／μＬのＲＮＡを１０μＬ加え、２５℃で１０分間インキュベートした。反応終了後、反応液を３．０％  ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色法によりＲＮＡのバンドを検出した。【００６７】
図３右図では、健常者の鼻腔粘膜試料を２５０μＬの４０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．８）で懸濁した後、その懸濁液９μＬにＦｅ２（ＳＯ４）３を１．５、２．０、２．５ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を１０、１５、２０又は２５ｍＭ加え、最終的に１８μＬとなるよう定容した。以降は前述と同様の操作を行い、アガロース電気泳動によってＲＮＡのバンドを検出した。【００６８】
［実施例３］
（鉄イオン及び炭酸イオンの熱処理の効果）
図４に示すように、熱処理をすることによって、短時間で、鉄イオン及び炭酸イオンのＲＮＡ分解活性阻害作用を向上させることができた。【００６９】
本実施例では、健常者の鼻腔粘膜試料を２５０μＬの２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、１０％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で懸濁した後、その懸濁液１０μＬにＦｅ２（ＳＯ４）３を１ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を６．７ｍＭ加え、最終的に１８μＬとなるよう定容した。その後、３７℃で０、１又は５分間のインキュベートを行なった。反応終了後、反応液を３．０％  ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色法によりＲＮＡのバンドを検出することによって、ＲＮＡ分解活性を調べた。【００７０】
［実施例４］
（鉄イオン及び炭酸イオンによるリゾチームＣの逆転写阻害活性の阻害）
図５に示すように、ヒトリゾチームＣの逆転写阻害活性は、鉄イオン及び炭酸イオンによって阻害することができた。【００７１】
本実施例では、前述と同様のＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いて検討した。ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液２５μＬ中、ヒト由来精製リゾチームＣ（ＣＡＬＮＩＯＣＨＥＭ製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで添加し、Ｆｅ２（ＳＯ４）３を０又は２．５ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を０、５、１０又は２０ｍＭのいずれかで反応液に添加した場合の核酸増幅活性を蛍光増幅曲線により比較した。【００７２】
［実施例５］
（鉄イオン及び炭酸イオンと、ＳＤＳとの相乗効果）
図６に示すように、鉄イオン及び炭酸イオンの存在下では、低濃度で、ＲＮＡ分解活性の向上が確認できた。【００７３】
本実施例では、健常者の鼻腔粘膜試料を２５０μＬの４０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．８）で懸濁した後、その懸濁液９μＬにＦｅ２（ＳＯ４）３を２．５ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を２０ｍＭ加え、さらに極性界面活性剤としてＳＤＳ（最終濃度０、０．０１、０．０２、０．０５又は０．１％）もしくは非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ  ２０（最終濃度０、０．０１、０．０２、０．０５、０．１又は０．５％）で添加し、最終的に１８μＬとなるよう定容した。その後、懸濁液を３７℃で１０分間のインキュベートを行った。その２．５μＬの懸濁液に対し、５０ｎｇ／μＬのＲＮＡを１０μＬ加え、２５℃で１０分間インキュベートした。反応終了後、反応液を３．０％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色法によりＲＮＡのバンドを検出した。【００７４】
［参考例２］
（アルミナ添加による前処理試薬からのＳＤＳ除去の影響）
図８に示すように、アルミナを前処理試薬中に添加することにより、本発明における前処理試薬中に含まれるＳＤＳを除去することができ、この結果、鋳型ＲＮＡの核酸増幅が達成された。なお、本参考例では、ＳＤＳの核酸増幅抑制に対する活性のみを判断するため、ヒト鼻腔粘膜を含まない条件で実施した。【００７５】
本参考例におけるＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法では、増幅する鋳型ＲＮＡとしてインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）のＮＡ領域６７５−１０７５塩基までの配列を用いた。鋳型ＲＮＡの調製にあたり、まずＮＡ領域に相補的な配列を有するｃＤＮＡ、以下のプライマー３（配列番号９）及びプライマー４（配列番号１０）、ならびにＰＣＲの酵素としてＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを実施した。
プライマー３（配列番号９）
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＴ−３’
プライマー４（配列番号１０）
５’−ＧＣＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣ−３’【００７６】
なお、前記ＰＣＲは、９８℃１０秒、５５℃５秒、及び７２℃３０秒の３つの温度を３０サイクル反応させた後、７２℃４分のインキュベーションによって達成した。このＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を元に、ＣＵＧＡ７  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用い、鋳型ＲＮＡを合成した。【００７７】
ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法は、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１２ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．１２５ｕｎｉｔ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む溶液に、以下に示す配列及び濃度のプライマー（配列番号１１〜１５、ダナフォーム社製）及びエキシトンプライマー（配列番号１６、ダナフォーム社製、特許第４３７０３８５号公報参照）および前記合成した鋳型ＲＮＡを加えたものを反応溶液とした。
ＦＰプライマー１（配列番号１１、最終濃度１．８２μＭ）
５’−ＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＧＴＧ−３’
ＴＰプライマー１（配列番号１２、最終濃度１．８２μＭ）
５’−ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＡ−３’
ＯＰプライマー３（配列番号１３、最終濃度０．２３μＭ）
５’−ＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣ−３’
ＯＰプライマー４（配列番号１４、最終濃度０．２３μＭ）
５’−ＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣ−３’
ＢＰプライマー１（配列番号１５、最終濃度０．６８μＭ）
５’−ＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧ−３’
ＢＰエキシトンプライマー１（配列番号１６、最終濃度０．２３μＭ）
５’−ＴＧＴＧＺＣＴＧＣＡＧＡＧ−３’（“Ｚ”はエキシトン標識されたチミン残基を示す）【００７８】
前処理試薬として、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、２．５ｍＭ  硫酸鉄、２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含む溶液に０．１％  ＳＤＳを添加した溶液を調製した。この前処理試薬に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの活性アルミナ（和光純薬社製、分子量１０１．９６）を添加し、ボルテックスミキサーにより撹拌して懸濁した。前記懸濁後、ガラス焼結フィルターを有する空カラムMicro  Bio-Spin  Chromatography  Column（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に、前記懸濁液をのせ、１２００×ｇ、1分間の遠心により、ＳＤＳを吸着したアルミナを除去した濾液を得た。また、比較対照として、アルミナを添加しない条件で前述と同様の処理を行い、濾液を得た。得られた濾液を、前記ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液を用いて、核酸増幅活性の有無を調べる事で、ＳＤＳの残存活性（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性）を比較した。【００７９】
前記ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐの反応溶液に、前述の方法で処理を行なった濾液５μＬを加え、１反応あたり２５μＬの溶液となるよう調製し、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。増幅曲線の立ち上がりの有無により、核酸増幅の阻害を生ずるＳＤＳの残存性を評価した結果、図８に示すとおり、アルミナを添加した場合のみ顕著な核酸増幅が達成されることが認められた。よって、アルミナ添加処理によって、本発明における前処理試薬中からＳＤＳを除去する事が可能であると判断された。【００８０】
［参考例３］
（限外濾過フィルターによる前処理試薬からのＳＤＳ除去の影響）
図９に示すように、本発明における前処理試薬中に含まれる鉄イオン濃増加させることにより、ＳＤＳの沈殿形成を促進させ、その沈殿を、前記限外濾過フィルターを通過（濾過）させる処理を施すことにより、前処理試薬中に含まれるＳＤＳを除去することができ、鋳型ＲＮＡの核酸増幅を達成できた。なお、本参考例では、ＳＤＳの核酸増幅抑制に対する活性のみを判断するため、ヒト鼻腔粘膜を含まない条件で実施した。【００８１】
前処理試薬として、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、５ｍＭ  硫酸鉄、２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含む溶液に０．１％  ＳＤＳを添加した溶液を調製した。この前処理試薬における鉄イオン濃度は、前記実施例１の前処理試薬と比較して高く設定されている。この前処理試薬を、マイレクスＨＶ（φ１３ｍｍ、膜孔径０．２２μｍ、ミリポア社製）にシリンジを用いて通過させ、濾液を得た。得られた濾液を、前記参考例２で示したＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液を用いて、核酸増幅活性の有無を調べる事で、ＳＤＳの残存活性（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性）を、前記前処理試薬をフィルター濾過せずに用いた場合と比較した。【００８２】
前記ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ反応溶液に、前述の方法で処理を行なった濾液を５μＬ加え、１反応あたり２５μＬの溶液となるよう調製し、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。増幅曲線の立ち上がりの有無により、核酸増幅の阻害を生ずるＳＤＳの残存性を評価した結果、図９に示すとおり、フィルター濾過を行なっていない場合では、核酸増幅が認められなかったが、０．２２μｍの膜孔径を有する限外濾過フィルターを通過させた場合では、顕著な核酸増幅が達成されることが認められた。よって、前処理試薬中の鉄イオン濃度の増加に伴い生じたＳＤＳの沈殿物を、限外濾過フィルター処理により除去する事で、本発明における前処理試薬中からＳＤＳを除去する事が可能であると判断された。【００８３】
［参考例４］
（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による、核酸増幅反応中でのＳＤＳの核酸増幅阻害の緩和効果）
図１０に示すように、ＳＤＳを、核酸増幅反応溶液に直接添加した場合、核酸増幅反応溶液に非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を添加しておく事により、前処理試薬中に含まれるＳＤＳの核酸増幅阻害を緩和することができた。なお、本参考例では、ＳＤＳの核酸増幅抑制に対する活性のみを判断するため、ＳＤＳを単独でＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐに加えることで実施した。【００８４】
前記参考例２で示したＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液に、最終濃度が０％または０．５％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、さらに、０．１％  ＳＤＳ溶液を５μＬ添加し、１反応あたり２５μＬの反応溶液となるよう調製した。【００８５】
この反応溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。増幅曲線の立ち上がりの有無により、核酸増幅のＳＤＳによる阻害効果を評価した結果、図１０に示すとおり、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を前記反応溶液中に添加した場合、有意な核酸増幅が認められた。よって、核酸増幅反応液中にＳＤＳが共存した場合でも、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によりＳＤＳの核酸増幅阻害を緩和でき、鋳型ＲＮＡからの核酸増幅が達成できると判断された。【００８６】
［実施例６］
（ヒト鼻腔粘膜に含まれたＲＮＡウイルスの検出）
本発明における鉄イオンおよび炭酸イオンを含む前処理試薬にＳＤＳを加えた条件において、前記参考例２〜４で示した工程を施す事により、図１１に示すとおり、ヒト鼻腔粘膜中に含まれたＲＮＡウイルスをＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法によって検出できた。【００８７】
前処理試薬として、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、５ｍＭ  硫酸鉄、２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウムを含む溶液に０．１％  ＳＤＳを添加した溶液を調製した。この前処理試薬５００μＬに、ヒト鼻腔粘膜、および１０４ｐｆｕ／ｍＬ相当のインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）を懸濁した。前記懸濁後、この懸濁液に、ウイルス外膜の破壊のために０．１％  ＳＤＳをさらに添加した後、マイレクスＨＶ（φ１３ｍｍ、膜孔径０．２２μｍ、ミリポア社製）にシリンジを用いて通過させ、得られた濾液を前処理済試料とした。また比較対照として、ウイルス外膜破壊用の０．１％  ＳＤＳを加えずに、前処理得試薬をフィルター濾過した試料を調製した。【００８８】
ＲＴ−ＳｍａｒｔＡｍｐ法は、最終濃度として１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５％  ＤＭＳＯ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、８ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１２ｕｎｉｔ  Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．１２５ｕｎｉｔ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む溶液に、０．５％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、さらに前記参考例２に示した配列及び濃度のプライマー（配列番号１１〜１５、ダナフォーム社製）及びエキシトンプライマー（配列番号１６、ダナフォーム社製、特許第４３７０３８５号公報参照）を加えたものを反応溶液とした。【００８９】
その反応溶液に、前述した前処理済試料５μＬ加え、１反応あたり２５μＬの溶液となるよう調製し、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。その結果、図１１に示すとおり、前処理試薬にウイルス外膜破壊のために０．１％  ＳＤＳを更に添加した前処理済試薬のみ核酸増幅が達成され、ＲＮＡウイルスからの核酸増幅検出が可能であった。
【図１】
2013002354.tif 000003
【図７ａ】
2013002354.tif 000004
【図７ｂ】
2013002354.tif 000005
【図８】
2013002354.tif 000006
【図９】
2013002354.tif 000007
【図１０】
2013002354.tif 000008
【図１１】
2013002354.tif 000009
【図２】
2013002354.tif 000010
【図３】
2013002354.tif 000011
【図４】
2013002354.tif 000012
【図５】
2013002354.tif 000013
【図６】
2013002354.tif 000014
【配列表】
2013002354000001.app
【国際調査報告】
2013002354.tif 000015
2013002354.tif 000016
2013002354.tif 000017
2013002354.tif 000018