(57)【要約】  ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法、及びロイコ型色原体を含有する液状試薬を提供する。  ロイコ型色原体含有水溶液に、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することにより、ロイコ型色原体含有水溶液が安定に保存される。また、ロイコ型色原体を、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させることにより、ロイコ型色原体が安定化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコ型色原体含有水溶液に、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
【請求項２】
ロイコ型色原体を、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
【請求項３】
フェナジン系化合物が、一般式（Ｉ）
【化１０】
2013118744.tif 000012
（式中、Ｘは、Ｎ、又は、Ｎ＋−Ｒ１を表し、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＬは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ａは、１〜８の整数を表し、Ｙ−は、ＸがＮ＋−Ｒ１の場合に、１価のアニオンを表す。）で表される化合物若しくは塩、又は、一般式（ＩＩ）
【化１１】
2013118744.tif 000013
（式中、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＭは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｂは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
フェノキサジン系化合物が、一般式（ＩＩＩ）
【化１２】
2013118744.tif 000014
（式中、Ｒ４は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＮは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｃは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項５記載の方法。
【請求項７】
ロイコ型色原体と、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種とを含有する液状試薬。
【請求項８】
フェナジン系化合物が、一般式（Ｉ）
【化１３】
2013118744.tif 000015
（式中、Ｘは、Ｎ、又は、Ｎ＋−Ｒ１を表し、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＬは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ａは、１〜８の整数を表し、Ｙ−は、ＸがＮ＋−Ｒ１の場合に、１価のアニオンを表す。）で表される化合物若しくは塩、又は、一般式（ＩＩ）
【化１４】
2013118744.tif 000016
（式中、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＭは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｂは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である請求項７記載の試薬。
【請求項９】
フェノキサジン系化合物が、一般式（ＩＩＩ）
【化１５】
2013118744.tif 000017
（式中、Ｒ４は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＮは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｃは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である請求項７記載の試薬。
【請求項１０】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項７〜９のいずれかに記載の試薬。
【請求項１１】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１０記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法及びロイコ型色原体を含有する液状試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、色素を生成する色原体の１種であり、カップリング型色原体とは異なり、それ単独で色素を生成する色原体であり、フェノチアジン系のロイコ型色原体、トリフェニルメタン系のロイコ型色原体、ジフェニルアミン系のロイコ型色原体等が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。【０００３】
ロイコ型色原体は、カップリング型色原体と同様、血清等の試料中に存在するコレステロールや糖化ヘモグロビン等の定量すべき成分の定量にしばしば使用される。すなわち、試料中の定量すべき成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、ロイコ型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から、試料中の定量すべき成分を定量することが、臨床検査において、しばしば行われている。特に、ロイコ型色原体は、高感度色原体として、試料中に微量しか存在しない定量すべき成分の定量に好適に用いられる（例えば、非特許文献１参照）。【０００４】
この様に、ロイコ型色原体は、高感度色原体として、試料中の微量の定量すべき成分の定量に使用されるが、一方で、その保存安定性が悪く、特に、溶液中では室内照明などの光照射により、自然発色してしまうという欠点を有している。このロイコ型色原体の有する安定性不良という課題に対して、これまで、ロイコ型色原体の溶液中での安定化方法が検討され、報告されている（例えば、特許文献４、５参照）。しかしながら、これらのロイコ型色原体の安定化方法は厳しい条件下で行わなければならない等、必ずしも、満足の行く安定化方法とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５７−０２９２９７号公報
【特許文献２】特開平３−２０６８９６号公報
【特許文献３】特開昭６２−０９３２６１号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０８８３０５パンフレット
【特許文献５】ＷＯ２００７／０８３７０３パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】臨床検査，1997年，Vol.41，No.9，p.1014-1019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法およびロイコ型色原体を安定に保持する試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ロイコ型色原体含有水溶液に、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することにより、ロイコ型色原体が安定に保持される、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］に関する。【０００９】
［１］  ロイコ型色原体含有水溶液に、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
［２］  ロイコ型色原体を、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
［３］  フェナジン系化合物が、一般式（Ｉ）【００１０】
【化１】
2013118744.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｘは、Ｎ、又は、Ｎ＋−Ｒ１を表し、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＬは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ａは、１〜８の整数を表し、Ｙ−は、ＸがＮ＋−Ｒ１の場合に、１価のアニオンを表す。）で表される化合物若しくは塩、又は、一般式（ＩＩ）【００１２】
【化２】
2013118744.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＭは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｂは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である［１］又は［２］記載の方法。
［４］  フェノキサジン系化合物が、一般式（ＩＩＩ）【００１４】
【化３】
2013118744.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ４は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＮは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｃは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である［１］又は［２］記載の方法。
［５］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［５］記載の方法。【００１６】
［７］  ロイコ型色原体と、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種とを含有する液状試薬。
［８］  フェナジン系化合物が、一般式（Ｉ）【００１７】
【化４】
2013118744.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｘは、Ｎ、又は、Ｎ＋−Ｒ１を表し、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＬは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ａは、１〜８の整数を表し、Ｙ−は、ＸがＮ＋−Ｒ１の場合に、１価のアニオンを表す。）で表される化合物若しくは塩、又は、一般式（ＩＩ）【００１９】
【化５】
2013118744.tif 000006
【００２０】
（式中、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＭは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｂは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である［７］記載の試薬。
［９］  フェノキサジン系化合物が、一般式（ＩＩＩ）【００２１】
【化６】
2013118744.tif 000007
【００２２】
（式中、Ｒ４は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＮは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｃは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物である［７］記載の試薬。
［１０］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［７］〜［９］のいずれかに記載の試薬。
［１１］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１０］記載の試薬。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、ロイコ型色原体を水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法、ロイコ型色原体を含有する液状試薬が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（１）ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法とロイコ型色原体の安定化方法
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法に関する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法により、水溶液中でロイコ型色原体が安定に保存される。本発明において、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中でロイコ型色原体が熱に対して安定であるか、又は、光に対して安定であることをいい、ロイコ型色原体が水溶液中で光に対して安定であることが好ましい。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法においては、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種が、ロイコ型色原体含有水溶液に添加される。
【００２５】
本発明におけるフェナジン系化合物としては、フェナジン骨格を有する化合物若しくはその塩、又は、ジヒドロフェナジン骨格を有する化合物若しくはその塩であれば特に制限はなく、例えば以下の一般式（Ｉ）
【００２６】
【化７】
2013118744.tif 000008
【００２７】
（式中、Ｘは、Ｎ、又は、Ｎ＋−Ｒ１を表し、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＬは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ａは、１〜８の整数を表し、Ｙ−は、ＸがＮ＋−Ｒ１の場合に、１価のアニオンを表す。）で表される化合物若しくは塩［以下、化合物（Ｉ）と記す］や、一般式（ＩＩ）
【００２８】
【化８】
2013118744.tif 000009
【００２９】
（式中、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＭは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｂは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩ）と記す］等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ）における塩とは、フェナジニウム塩をいう。
【００３０】
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）におけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜６のメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）におけるアルケニルとしては、例えば炭素数２〜６のビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられる。
【００３１】
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）における置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１−フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００３２】
化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）におけるアルコキシとしては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられる。
【００３３】
化合物（Ｉ）における１価のアニオンとしては、例えばCH3OSO3-、CH3CH2OSO3-、ハロゲンイオン、OH-、PF6-、BF4-、(CF3SO2)2N-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
【００３４】
化合物（Ｉ）の具体例としては、例えばフェナジン（東京化成工業社製）、フェナジニウムメトサルフェート（ＰＭＳ）（ナカライテスク社製）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）（同仁化学研究所社製）、１−ヒドロキシフェナジン（東京化成工業社製）等が挙げられる。化合物（ＩＩ）の具体例としては、例えば５，１０−ジヒドロ−５，１０−ジメチルフェナジン（東京化成工業社製）等が挙げられる。
【００３５】
本発明におけるフェノキサジン系化合物としては、フェノキサジン骨格を有する化合物若しくはその塩であれば特に制限はなく、例えば以下の一般式（ＩＩＩ）
【００３６】
【化９】
2013118744.tif 000010
【００３７】
（式中、Ｒ４は水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ＲＮは、水素原子、水酸基、アルコキシ、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｃは、１〜８の整数を表す。）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ）と記す］等が挙げられる。
【００３８】
化合物（ＩＩＩ）におけるアルキル、アルケニル、アルコキシとしては、それぞれ、例えば前述のアルキル、アルケニル、アルコキシ等が挙げられる。
【００３９】
化合物（ＩＩＩ）における置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えば前述の置換基等が挙げられる。
【００４０】
化合物（ＩＩＩ）の具体例としては、例えばフェノキサジン（東京化成工業社製）、１０−エチルフェノキサジン（シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００４１】
本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法におけるフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物の濃度としては、通常0.0001〜100μmol/Lであり、0.005〜50μmol/Lが好ましい。
【００４２】
本発明のロイコ型色原体の保存方法において、ロイコ型色原体の保存安定性は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
【００４３】
本発明におけるロイコ型色原体含有水溶液とは、ロイコ型色原体が水性媒体中に溶解された水溶液であり、ロイコ型色原体を水性媒体に添加して溶解させることにより調製することができる。ロイコ型色原体が溶解される水性媒体は、ロイコ型色原体が溶解されれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。また、ロイコ型色原体含有水溶液の調製に際して、ロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤として、有機溶媒を用いることもできる。有機溶媒に溶解させたロイコ型色原体を水性媒体に添加し、ロイコ型色原体を水性媒体に溶解させ、ロイコ型色原体含有水溶液を調製することもできる。有機溶媒としては、ロイコ型色原体を溶解させるものであれば特に制限はなく、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【００４４】
水性媒体のpHは、ロイコ型色原体が溶解されるpHであれば特に制限はなく、例えばpH4〜10である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００４５】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）(PIPES)、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(ACES)、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸(BES)、３−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(CHES)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
【００４６】
緩衝液の濃度は、ロイコ型色原体が溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常0.001〜2.0 mol/Lであり、0.005〜1.0 mol/Lが好ましい。
【００４７】
本発明におけるロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(CCAP)、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(MCDP)、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。本発明におけるロイコ型色原体の安定化とは、ロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体が、熱に対して安定化されるか、又は、光に対して安定化されることをいい、ロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体が光に対して安定化されることが好ましい。ここで、ロイコ型色原体の安定化は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
【００４９】
本発明のロイコ型色原体の安定化方法においては、ロイコ型色原体をフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させる。本発明のロイコ型色原体の安定化方法に用いられるフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物としては、前述のフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物等が挙げられる。
【００５０】
本発明の安定化方法において用いられるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液としては、前述のロイコ型色原体の保存方法におけるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液が挙げられる。本発明においてロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体の濃度は、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常0.0001〜2.0 mmol/Lであり、0.0005〜1.0 mmol/Lが好ましい。
【００５１】
本発明において水溶液中にロイコ型色原体と共存させるフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物の濃度としては、通常0.0001〜100μmol/Lであり、0.0005〜50μmol/Lが好ましい。
【００５２】
本発明におけるロイコ型色原体の熱による安定性を測定する方法は、熱に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はないが、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液を、20〜40℃で保存した後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【００５３】
本発明におけるロイコ型色原体の光による安定性を測定する方法は、光に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はないが、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液に4〜12時間光を照射し、照射後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【００５４】
（２）液状試薬
本発明の液状試薬は、ロイコ型色原体と、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種とを含有する液状試薬である。
【００５５】
本発明の液状試薬においては、ロイコ型色原体は、水性媒体中で、フェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種と共存する。本発明の液状試薬におけるロイコ型色原体としては、前述のロイコ型色原体等が挙げられる。本発明の液状試薬における水性媒体としては、前述の水性媒体等が挙げられる。本発明の液状試薬におけるフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物としては、それぞれ前述のフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物等が挙げられる。
【００５６】
本発明の液状試薬におけるフェナジン系化合物及びフェノキサジン系化合物の濃度としては、通常0.0001〜100μmol/Lであり、0.0005〜50μmol/Lが好ましい。本発明の液状試薬におけるロイコ型色原体の濃度としては、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はなく、通常0.0001〜2.0 mmol/Lであり、0.0005〜1.0 mmol/Lが好ましい。ロイコ型色原体の水性媒体への溶解に際しては、前述の有機溶媒を溶解補助剤として用いることもできる。
【００５７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例及び比較例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
【００５８】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、３０％過酸化水素水（和光純薬工業社製）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ；プロメライン社製）、フェナジン［化合物（Ｉ）；東京化成工業社製］、フェナジニウムメトサルフェート（ＰＭＳ）［化合物（Ｉ）；ナカライテスク社製］、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）［化合物（Ｉ）；同仁化学研究所社製］、５，１０−ジヒドロ−５，１０−ジメチルフェナジン［化合物（ＩＩ）；東京化成工業社製］、１−ヒドロキシフェナジン［化合物（Ｉ）；東京化成工業社製］、フェノキサジン［化合物（ＩＩＩ）；東京化成工業社製］、１０−エチルフェノキサジン［化合物（ＩＩＩ）；シグマアルドリッチ社製］。
【実施例１】
【００５９】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
フェナジン                            １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例２】
【００６０】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
ＰＭＳ                                １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例３】
【００６１】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
１−メトキシＰＭＳ                    １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例４】
【００６２】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
５，１０−ジヒドロ−５，１０−ジメチルフェナジン
１０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例５】
【００６３】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
１−ヒドロキシフェナジン              １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例６】
【００６４】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
フェノキサジン                        １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例７】
【００６５】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
１０−エチルフェノキサジン            １０μｍｏｌ／Ｌ【００６６】
[比較例１]
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。【００６７】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ２０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例８】
【００６８】
（１）ＤＡ−６７安定性評価用試料の調製
実施例１で調製したＤＡ−６７含有水溶液に対して、1,300ルクスの光を10時間照射し、光によるＤＡ−６７の安定性を評価した。光照射後のＤＡ−６７含有水溶液をＤＡ−６７安定性評価用試料として用いた。【００６９】
（２）ＤＡ−６７安定性測定用試薬の調製
以下の組成からなるＤＡ−６７安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ−６７安定性測定用試薬＞
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                                ０．００５％【００７０】
（３）ＤＡ−６７含有水溶液中のＤＡ−６７の安定性の評価
実施例１で調製した直後のＤＡ−６７含有水溶液30μLに（２）で調製したＤＡ−６７安定性測定用試薬120μLを添加し、37℃で5分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長660 nm、副波長800 nmで日立７１７０Ｓにて測定した。調製直後のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ−６７安定性測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。【００７１】
同様に、（１）で調製した光照射後のＤＡ−６７含有水溶液（ＤＡ−６７安定性評価用試料）を試料として用いて測定を行い、光照射後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ光）を測定した。【００７２】
測定した△Ｅ光から△Ｅ直後を差し引いた値を、△Ｅ１とし、ＤＡ−６７の光に対する安定性の指標とした。その結果を第１表に示す。△Ｅ１の値が０に近い程、光照射によるＤＡ−６７の着色が抑制されることを示している。
【実施例９】
【００７３】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例２のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。
【実施例１０】
【００７４】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例３のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。
【実施例１１】
【００７５】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例４のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。
【実施例１２】
【００７６】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例５のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。
【実施例１３】
【００７７】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例６のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。
【実施例１４】
【００７８】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例７のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。【００７９】
［比較例２］
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、比較例１のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は実施例８と同様の方法により△Ｅ１を測定した。その結果を第１表に示す。【００８０】
【表１】
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【００８１】
第１表に示される通り、フェナジン系化合物又はフェノキサジン系化合物を含むＤＡ−６７含有水溶液は、フェナジン系化合物もフェノキサジン系化合物も含有しないＤＡ−６７含有水溶液と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。このことから、フェナジン系化合物又はフェノキサジン系化合物を含むＤＡ−６７含有水溶液中のＤＡ−６７が光に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液がフェナジン系化合物又はフェノキサジン系化合物により安定に保存され、ＤＡ−６７がフェナジン系化合物又はフェノキサジン系化合物により安定化されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明により、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法及びロイコ型色原体を含有する液状試薬が提供される。本発明の方法及び試薬は、糖尿病の診断に用いられる糖化ヘモグロビンの測定等に有用である。
【国際調査報告】
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