(57)【要約】簡便でかつ様々な種類の植物細胞及び核酸に広く適用可能な、植物細胞への核酸導入方法を提供することを目的とする。  本発明は、標的植物細胞に核酸を導入する方法であって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを核酸と接触させて複合体を形成させる工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程を含む、前記方法に関する。
2013129698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的植物細胞に核酸を導入する方法であって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを核酸と接触させて複合体を形成させる工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
キャリアペプチド由来のアミン基の数／核酸由来のリン酸基の数が２以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
複合体の平均流体力学的直径が１５０〜５００ｎｍである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
細胞透過性配列がＢＰ１００又はＴａｔ２である、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ポリカチオン配列がリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ポリカチオン配列がＫＨの３〜２０の繰り返し配列又はＲの３〜２０の連続配列を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
複合体を形成させる工程を、オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドの存在下で行う、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
キャリアペプチドがオルガネラ移行配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
複合体を標的植物細胞に接触させるインキュベーション時間が５〜１５０時間である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
標的植物細胞に核酸を導入するためのキャリアペプチドであって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含む前記キャリアペプチド。
【請求項１１】
細胞透過性配列がＢＰ１００又はＴａｔ２である、請求項１０記載のキャリアペプチド。
【請求項１２】
ポリカチオン配列がリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項１０又は１１記載のキャリアペプチド。
【請求項１３】
ポリカチオン配列がＫＨの３〜２０の繰り返し配列又はＲの３〜２０の連続配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項記載のキャリアペプチド。
【請求項１４】
オルガネラ移行配列をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のキャリアペプチド。
【請求項１５】
標的植物細胞に核酸を導入するための複合体であって、請求項１０〜１４のいずれか１項記載のキャリアペプチド及び核酸を含む前記複合体。
【請求項１６】
標的植物細胞に核酸を導入するための複合体であって、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のキャリアペプチド、オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチド、及び核酸を含む前記複合体。
【請求項１７】
キャリアペプチド由来のアミン基の数／核酸由来のリン酸基の数が２以下である、請求項１５又は１６記載の複合体。
【請求項１８】
複合体の平均流体力学的直径が１５０〜３００ｎｍである、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の複合体。
【請求項１９】
標的植物細胞に核酸を導入するためのキットであって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを含む、前記キット。
【請求項２０】
オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドをさらに含む、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
細胞透過性配列がＢＰ１００又はＴａｔ２である、請求項１９又は２０記載のキット。
【請求項２２】
ポリカチオン配列がリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項記載のキット。
【請求項２３】
ポリカチオン配列がＫＨの３〜２０の繰り返し配列又はＲの３〜２０の連続配列を含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の機能的ドメインを含むキャリアペプチドを用いて植物細胞に核酸を導入する方法、該方法に用いるキャリアペプチド、該方法に用いるキット、及び該キャリアペプチドと核酸の複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞に外来遺伝子を導入することによって、交雑育種では付加できない有用な形質を植物に付与することは、今後の農作物の改良と農業の発展に極めて意義がある。また、石油依存の物質生産に替わる新規の物質生産法として、二酸化炭素を原料とした植物による物質生産を実現するためには、植物の遺伝子組換え技術の利用は不可欠である。
植物細胞への遺伝子導入法としては、土壌細菌であるアグロバクテリウムの感染作用を利用したアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びウイルスベクター法などが知られている。アグロバクテリウム法は、植物細胞への遺伝子導入において、最も一般的に用いられる方法である。しかし、このアグロバクテリウム法では遺伝子導入をすることができない経済的に重要な植物が多く存在するのが現状である。パーティクルガン法は、アグロバクテリウム法と比較して汎用性が高いが、装置コストが高く、遺伝子損傷のリスクがあるとともに、形質転換効率も低いという問題がある。ウイルスベクター法は、アグロバクテリウム法と比較して、形質転換効率及び遺伝子発現効率が高いという利点があるが、導入する遺伝子サイズが制限されるとともに、ウイルスの感染能が低いという問題がある。したがって、簡便で、かつあらゆる種類の植物及び遺伝子に広く適用可能な、新しいタイプの遺伝子導入方法が求められていた。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、哺乳類及びヒトの細胞株中の生体膜を通って、当該ペプチド及び他の物質（例えばタンパク質、核酸など）を含む複合体を輸送する機能を有することが知られている。しかし、植物細胞におけるＣＰＰの使用は制限される。動物細胞と異なり植物細胞は、ＣＰＰを含む複合体の内在化に対し、細胞壁及び細胞膜による二重障害を有するからである。ポリカチオン性ペプチドは、負に荷電したＤＮＡをイオン性相互作用で濃縮し、遺伝子送達に使用しうる複合体を形成すること、当該複合体が動物細胞への遺伝子導入において有用であることが示されている（特許文献１：ＷＯ２０１１／００６１３３）。また、ポリカチオン性ペプチドを植物プロトプラストへの遺伝子導入に用いた例も報告されている（特許文献２：特開平７−２１３２８５）。しかし、当該方法では細胞壁の無いプロトプラストを使用しており、また、当該方法における植物細胞への遺伝子導入効率は十分なものとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／００６１３３
【特許文献２】特開平７−２１３２８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便でかつ様々な種類の植物細胞及び核酸に広く適用可能な、植物細胞への核酸導入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを組み合わせた融合ペプチドとしてのキャリアペプチドを構築し、当該キャリアペプチドを核酸と混合して複合体を形成することにより、植物細胞に対して優れたトランスフェクション効率を達成できることを見出し、本発明を完成させるにいたった。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）標的植物細胞に核酸を導入する方法であって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを核酸と接触させて複合体を形成させる工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程を含む、前記方法。
（２）キャリアペプチド由来のアミン基の数／核酸由来のリン酸基の数が２以下である、（１）記載の方法。
（３）複合体の平均流体力学的直径が１５０〜５００ｎｍである、（１）又は（２）記載の方法。
（４）細胞透過性配列がＢＰ１００又はＴａｔ２である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ポリカチオン配列がリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ポリカチオン配列がＫＨの３〜２０の繰り返し配列又はＲの３〜２０の連続配列を含む、（５）記載の方法。
（７）複合体を形成させる工程を、オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドの存在下で行う、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）キャリアペプチドがオルガネラ移行配列をさらに含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）複合体を標的植物細胞に接触させるインキュベーション時間が５〜１５０時間である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）標的植物細胞に核酸を導入するためのキャリアペプチドであって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含む前記キャリアペプチド。
（１１）細胞透過性配列がＢＰ１００又はＴａｔ２である、（１０）記載のキャリアペプチド。
（１２）ポリカチオン配列がリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、（１０）又は（１１）記載のキャリアペプチド。
（１３）ポリカチオン配列がＫＨの３〜２０の繰り返し配列又はＲの３〜２０の連続配列を含む、（１０）〜（１２）のいずれかに記載のキャリアペプチド。
（１４）オルガネラ移行配列をさらに含む、（１０）〜（１３）のいずれかに記載のキャリアペプチド。
（１５）標的植物細胞に核酸を導入するための複合体であって、（１０）〜（１４）のいずれかに記載のキャリアペプチド及び核酸を含む前記複合体。
（１６）標的植物細胞に核酸を導入するための複合体であって、（１０）〜（１３）のいずれかに記載のキャリアペプチド、オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチド、及び核酸を含む前記複合体。
（１７）キャリアペプチド由来のアミン基の数／核酸由来のリン酸基の数が２以下である、（１５）又は（１６）記載の複合体。
（１８）複合体の平均流体力学的直径が１５０〜３００ｎｍである、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の複合体。
（１９）標的植物細胞に核酸を導入するためのキットであって、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを含む、前記キット。
（２０）オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドをさらに含む、（１９）記載のキット。
（２１）細胞透過性配列がＢＰ１００又はＴａｔ２である、（１９）又は（２０）記載のキット。
（２２）ポリカチオン配列がリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、（１９）〜（２１）のいずれかに記載のキット。
（２３）ポリカチオン配列がＫＨの３〜２０の繰り返し配列又はＲの３〜２０の連続配列を含む、（１９）〜（２２）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、簡便でかつ様々な種類の植物細胞及び核酸に広く適用可能な、植物細胞への核酸導入方法が提供される。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１２−０４０６２２号及び米国仮出願Ｎｏ．６１／６９１，８３３の明細書、特許請求の範囲及び図面に記載された内容を参照により組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、本発明のキャリアペプチドと核酸との複合体、ならびに該複合体を用いた植物細胞への核酸導入を示す模式図である。
図２は、キャリアペプチド−ｐＤＮＡ複合体のＡＦＭイメージを示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれＮ／Ｐ比０．５、１及び２０でのＲ９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体のＡＦＭイメージを示す。Ｄ、Ｅ及びＦは、それぞれＮ／Ｐ比０．５、１及び２０での（ＫＨ）９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体のＡＦＭイメージを示す。
図３Ａは、様々なＮ／Ｐ比でのＲ９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体のゼータ電位測定を示す。図３Ｂ及び図３Ｃは、様々なＮ／Ｐ比でのＲ９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体（Ｂ）及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体（Ｃ）ならびにｐＤＮＡ単体のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
図４は、種々のＮ／Ｐ比（Ａ）及び様々なインキュベーション時間（Ｂ）でのタバコ葉におけるＲ９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体のＲｌｕｃ発現結果を示す。エラーバーは試料の標準偏差を表わす（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５で２群間に有意差。
図５は、Ｒ９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体（Ａ）及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体（Ｂ）を解して導入されたＧＦＰ遺伝子を発現するベンサミアナタバコ葉の表皮細胞の蛍光顕微鏡観察イメージを示す。矢印（１）は核を示し、矢印（２）は孔辺細胞を示す。
図６Ａは、ｄｓＲＮＡ単独（４００ｎＭ）、キャリアペプチド単独（８００ｎＭ）及びキャリアペプチド／ｄｓＲＮＡのモル比１〜２０のキャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体の流体力学的直径を示す。図６Ｂは、ｄｓＲＮＡ単独（４００ｎＭ）、キャリアペプチド単独（８００ｎＭ）及び様々なモル比でのキャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体のゼータ電位を示す（キャリアペプチド／ｄｓＲＮＡのモル比で１〜２０）。図６Ｃは、キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体のＣＤスペクトルによる二次構造の分析結果を示す。図６Ｄは、キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体のＲＮａｓｅ耐性を評価した結果を示す。図６Ｅは、キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体を用いた送達系の遺伝子サイレンシング効果を、ｄｓＲＮＡ単独（４００ｎＭ）、キャリアペプチド単独（８００ｎＭ）、及びキャリアペプチド／ｄｓＲＮＡのモル比１〜２０の複合体について測定した結果を示す。複合体を添加して１２時間後のサイレンシング効果を示す。
図７Ａは、キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体を浸透させる前及び浸透させた後のシロイヌナズナの葉の表皮細胞を上に示す。下は、キャリアペプチドのみを浸透させたシロイヌナズナの葉の表皮細胞を示す。ＹＦＰ発現（黄色）とＤＩＣイメージを重ねて示す。図７Ｂは、ＡにおけるＹＦＰ発現のみを示す（黄色）。図７Ｃは、キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体又はキャリアペプチドのみ（対照）を浸透させる前及び浸透させた後のシロイヌナズナの葉の溶解物に対し、ＹＦＰのウェスタンブロット分析を実施した結果を示す。図７Ｄは、図７Ｃのウェスタンブロットのバンド強度を示す。図７Ｅは、Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡとキャリアペプチドの複合体（オレンジ）及びＤＡＰＩで染色した核（青）の細胞内分布を示すＣＬＳＭイメージを示す。
図８左は、ミトコンドリア移行配列を含むキャリアペプチド及びＲｌｕｃ遺伝子を含むプラスミドで複合体を調製してシロイヌナズナに導入し、種々のＮ／Ｐ比でＲｌｕｃ発現を測定した結果を示す。図８右は、ミトコンドリア移行配列を含むキャリアペプチド及びＲｌｕｃ遺伝子を含むプラスミドで複合体を調製してシロイヌナズナに導入し、種々のインキュベーション時間でＲｌｕｃ発現を測定した結果を示す。エラーバーは試料の標準偏差を表わす（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５で２群間に有意差。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
一実施形態において本発明は、標的植物細胞に核酸を導入する方法に関し、該方法は、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを核酸と接触させて複合体を形成させる工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程を含む。標的植物細胞に導入する核酸は線状であってもよいし環状であってもよい。また一本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらにＤＮＡであってもＲＮＡであってもＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドであってもよい。ＤＮＡは、あらゆるタイプ及び大きさのＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ、プラスミド、ゲノムＤＮＡ及びこれらの誘導体を含むＤＮＡが包含されるものとする。また、これに加えてかかる核酸に対しては、キャリアペプチドのポリカチオン配列へのイオン結合を媒介するホスフェートバックボーンの陰電荷が保存される限り、化学的修飾を施すことも可能である。好適な修飾を行った核酸の例としては、例えばチオエートやジチオエートを挙げることができる。この点に関して、別の好適な核酸誘導体については、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０（４），５４４−５８４，１９９０において言及されている。
さらに、ヌクレオチド塩基に化学的修飾を行った核酸も用いることが可能である。例えば、ＲＮＡ分子における１個から数個のヌクレオチドの２’ＯＨ基がＯ−アルキル基、ハロゲン、その他の修飾基で置換されたものも用いることができる。標的植物細胞に導入すべき核酸は、所望により修飾されるＤＮＡ若しくはＲＮＡであることが好ましい。例えば、標的植物細胞に導入される核酸には、該標的植物細胞で発現する遺伝情報を含ませることができる。この方法によって、例えば遺伝子依存性欠陥を除去することが可能である。他方では、該標的植物細胞内で特定の遺伝子の発現を抑制するために、標的植物細胞に導入される核酸はアンチセンスとしての性質（すなわち、核酸が標的植物細胞に現れるｍＲＮＡに対して相補的な核酸である）を有していてもよい。対象となる核酸はリボザイムとしての性質を有していてもよく、すなわち標的植物細胞内の特定のＲＮＡ分子を開裂する能力を有していてもよい。かかるリボザイムの例としては、例えばハンマーヘッドリボザイムが挙げられる（Ｒｏｓｓｉ  ＆  Ｓａｒｖｅｒ，Ｔｉｂｔｅｃｈ，８，１７９−１８３，１９９０）。
本発明においては、ｄｓＲＮＡとキャリアペプチドとの複合体を標的植物細胞に導入することにより、ｄｓＲＮＡが分解されずにサイレンシング機能を発揮することができる。したがって、遺伝子発現の一過性制御が可能になる。この場合、いわゆる遺伝子組み換えにならないため、組換え作物の実施ができない国等でも実施が可能になり、例えば、農薬的な使用の可能性も考えられる。
本発明の核酸導入方法は、核酸の種類やサイズに限定されることなく植物細胞に核酸を導入できることを特徴とし、２０塩基対程度のｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎＲＮＡから数百キロ塩基対程度の二本鎖ＤＮＡを使用することができるが、例えば二本鎖ＤＮＡの場合、導入される核酸のサイズは通常２０塩基対〜２０キロ塩基対、好ましくは５０塩基対〜１０キロ塩基対程度である。
本明細書においては植物細胞への核酸の導入について説明するが、本発明を、動物細胞をはじめとする細胞膜を有する任意の細胞に適用することができる。本発明において植物細胞は、動物細胞以外の細胞、換言すれば細胞壁を持つ細胞を意味する。植物細胞の種類は特に制限されず、単子葉植物及び双子葉植物を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物及び木本植物などいずれの植物細胞にも本発明を適用できる。植物の具体例としては、例えば、ナス科［ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ  Ｌ．）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．ａｎｇｕｌｏｓｕｍ  Ｍｉｌｌ．）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  Ｌ．）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．）等］、イネ科［イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）、ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  Ｌ．）、イタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．）、メドウフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｈｕｄｓ．）、トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．）、オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ  Ｌ．）、チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ  Ｌ．）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ  Ｒｕｐｒ．）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ  Ｌ．）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．，Ｂ．ｎａｐｕｓ  Ｌ．）等］、マメ科［ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、アズキ（Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ  Ｗｉｌｌｄ．）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ  Ｌ．）等］、ウリ科［キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｓｃｈｒａｄ．）、カボチャ（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ  Ｄｕｃｈ．，Ｃ．ｍａｘｉｍａ  Ｄｕｃｈ．）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ）等］、ユリ科［ネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ  Ｌ．）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ  Ｌ．）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｒｏｔｔｌ．）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ｌ．）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．）等］、シソ科［シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  Ｂｒｉｔｔ．ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ）等］、キク科［キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、シュンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ  Ｌ．）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ  Ｌ．）等］、バラ科［バラ（Ｒｏ��ｅ  ｈｙｂｒｉｄａ  Ｈｏｒｔ．）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ  Ｄｕｃｈ．）等］、ミカン科［ミカン（Ｃｉｔｒａｓ  ｕｎｓｈｉｕ）、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ  ＤＣ．）等］、フトモモ科［ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌ）等］、ヤナギ科［ポプラ（Ｐｏｐｕｌａｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ  Ｋｏｅｈｎｅ）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）等］、リンドウ科［リンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｓｃａｂｒａ  Ｂｕｎｇｅ  ｖａｒ．ｂｕｅｒｇｅｒｉ  Ｍａｘｉｍ．）等］、ナデシコ科［カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ  Ｌ．）等］の植物が挙げられる。とりわけナス科植物、中でもタバコが好ましく使用される。
植物細胞としては、任意の組織に由来する植物細胞を使用でき特に制限されないが、例えば、胚、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎及び組織培養物等に由来する植物細胞を使用できる。
本発明で用いるキャリアペプチドは、核酸とのイオン性相互作用によりペプチド−核酸複合体を形成し、植物細胞への核酸導入を促すキャリアとして機能しうるペプチドである。本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むことを特徴とする。本発明においてペプチドは、そのペプチド成分の他に、糖鎖、脂質、及び／又はリン酸残基を含んでいてもよい。
細胞透過性配列とは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の配列を意味する。細胞透過性ペプチドとしては、例えば、ＢＰ１００（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２（５），３３０２，２００６）、ＨＩＶ  Ｔａｔ（Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２，ｐｐ．１６０１０−１６０１７，１９９７）、Ｔａｔ２（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７６８（３），４１９，２００７）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐＶＥＣ、ｐＡｎｔｐ（Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，ｐｐ．１０４４４−１０４５０，１９９４）、ＨＳＶ−１  ＶＰ２２（Ｃｅｌｌ，８８，ｐｐ．２２３−２３３，１９９７）、ＭＡＰ（Ｍｏｄｅｌ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１４１４，ｐｐ．１２７−１３９，１９９８）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２，ｐｐ．６７−７７，１９９８）、Ｒ７（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６，ｐｐ．１２５３−１２５７，２０００）、ＭＰＧ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５，ｐｐ．２７３０−２７３６，１９９７）、及びＰｅｐ−１（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，ｐｐ．１１７３−１１７６，２００１）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのペプチド配列に含まれる１個から数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失したペプチド配列を好適に使用できる場合もある。細胞透過性ペプチドとしては２種以上の細胞透過性ペプチドを組み合わせて用いてもよい。キャリアペプチドは、２種以上の細胞透過性配列を含んでいてもよい。目的の特定の細胞に対して特異的な細胞透過性ペプチドを選択することも好ましい。
細胞透過性配列の具体例としては、例えば次の配列を挙げることができる。ＫＫＬＦＫＫＩＬＫＹＬ（配列番号１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ（配列番号４）、ＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰ（配列番号５）、ＡＩＳＳＩＬＳＫＴＧＤＰ（配列番号６）、ＰＩＬＳＩＦＳＫＩＧＤＬ（配列番号７）、ＰＬＳＳＩＦＳＫＩＧＤＰ（配列番号８）、ＰＬＳＳＩＦＳＨＩＧＤＰ（配列番号９）、ＰＬＳＳＩＦＳＳＩＧＤＰ（配列番号１０）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤ（配列番号１２）、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）、ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１４）、ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ（配列番号１５）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ（配列番号１６）、ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡ（配列番号１７）、ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号１８）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１９）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２０）。
ポリカチオン配列は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸残基を含み、かつ生理学的条件下で核酸と安定した結合を形成するペプチド配列である。正に荷電したアミノ酸残基（カチオン性アミノ酸残基）のリシン、アルギニン及びヒスチジンのほかに、ポリカチオン成分は、その全体的な性質が十分にカチオン性を保持して生理学的条件下で核酸と安定した結合を形成するという条件で、中性アミノ酸を含むこともできる。これは核酸を添加する簡単な実験で検査できる。例えば、アガロースゲル電気泳動において核酸バンドの遅延を起こすのに十分なほど安定しているペプチド−核酸複合体を形成するペプチドが適している。この核酸バンドの遅延は、ペプチド−核酸複合体がアガロースゲル電気泳動の間保持されることを示すものである。
キャリアペプチドのポリカチオン配列は少なくとも３個のリシン、アルギニン又はヒスチジンを含まねばならないが、上限を定めることはできない。ポリカチオン配列は最高４５０個のアミノ酸残基を含むことができ、それでもなお機能することが知られている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４，１９９０）。しかしながら、ポリカチオン配列の長さは５〜１００個のアミノ酸残基であることが好ましく、より好ましくは５〜５０個、さらに好ましくは７〜２０個のアミノ酸残基である。ポリカチオン配列中のカチオン性アミノ酸残基の割合は、好ましくは４０モル％以上であり、より好ましくは６０モル％以上、さらに好ましくは８０モル％以上、最も好ましくは９０モル％以上である。ポリカチオン性アミノ酸残基のみからなるポリカチオン配列が最も好ましく使用される。
ポリカチオン配列は、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、さらに好ましくは７個以上で、好ましくは３０個以下、より好ましくは２５個以下、さらに好ましくは２０個以下のリシン、アルギニン及び／又はヒスチジン残基を含む。さらに、ポリカチオン配列は、一連の３個以上の連続したリシン、アルギニン及び／又はヒスチジン残基を有することが好ましく、一連の５個以上の連続したリシン、アルギニン及び／又はヒスチジン残基を有することがさらに好ましく、一連の７個以上の連続したリシン、アルギニン及び／又はヒスチジン残基を有することが特に好ましい。カチオン性アミノ酸残基のうち、アルギニンの割合が高いと細胞内への導入が早くなる傾向があり、ヒスチジン及びリシンの割合が高いと細胞内への導入が遅くなる傾向がある。例えば、下記のオルガネラ特異的な導入など本発明の複合体の使用目的に応じて、細胞内への導入速度を、ポリカチオン配列を適宜選択することによって制御することができる。ポリカチオン配列の好ましい例として、ＫＨの繰り返し配列、例えば、ＫＨの３〜２０の繰り返し配列、より好ましくはＫＨの５〜１５の繰り返し配列、さらに好ましくは７〜１２の繰り返し配列が挙げられる。アルギニン（Ｒ）の連続配列、例えば、Ｒの３〜２０の連続配列、好ましくはＲの５〜１５の連続配列、さらに好ましくはＲの７〜１２の連続配列、リシン（Ｋ）の連続配列、例えば、Ｋの３〜２０の連続配列、好ましくはＫの５〜１５の連続配列、さらに好ましくはＫの７〜１２の連続配列、ヒスチジン（Ｈ）の連続配列、例えば、Ｈの３〜２０の連続配列、好ましくはＨの５〜１５の連続配列、さらに好ましくはＨの７〜１２の連続配列も例として挙げられる。
ポリカチオン配列の具体例としては、例えば次の配列を挙げることができる。ＲＲＲＲＲＲ（配列番号２１）、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号２２）。
本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列とポリカチオン配列の線状融合体に相当する構成成分を含む。この融合体においては、ポリカチオン配列が細胞透過性配列のＮ末端及び／又はＣ末端に結合されることが好適である。細胞透過性配列に対して上記のポリカチオン配列を１個又は２個以上、好ましくは１個から数個、より好ましくは１個から３個程度結合することができ、特に好ましくは細胞透過性配列に対してポリカチオン配列を１個結合することができる。結合は通常のペプチド結合反応に従い化学的に行ってもよく、あるいはリガーゼのような酵素を用いて生物学的に行うこともできる。例えば、固相法などの一般的なペプチドの合成方法に従って行うこともできる。ポリカチオン配列に対して細胞透過性配列を結合するにあたり、両者の間に適宜のオリゴペプチドリンカーなどを介在させることもできる。例えば、１個から数個のアミノ酸からなるリンカーを介在させることができるが、該リンカーを構成するアミノ酸残基は適宜選択することができる。細胞透過性ペプチドはＮ末端でその特性を示すので、細胞透過性配列はポリカチオン配列のＮ末側に結合することが好ましい。本発明のキャリアペプチドは組み換えＤＮＡ技術により得ることもできる。例えば、ポリカチオン配列をコードするＤＮＡ断片を、細胞透過性配列をコードするＤＮＡ断片の一端又は両端に、適当なＤＮＡアダプターとの連結反応により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により結合する。かかる遺伝子操作法は分子生物学の分野で当業者によく知られている。
本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列及びポリカチオン配列に加えて、オルガネラ移行配列をさらに含むことができる。オルガネラ移行配列は、特定の細胞内オルガネラに対して親和性又は透過性を有するペプチドの配列をさす。ミトコンドリア又は葉緑体に対して親和性又は透過性を有するペプチドの配列を用いるのが好ましい。より具体的には、クラミドモナスフェレドキシン（Ｃｆ）及びクラミドモナスＲｕｂｉｓｃｏアクチバーゼ（ＣＲａ）起源の葉緑体移行ペプチド、ミトコンドリアマトリックス標的シグナルペプチド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２２６，ｐｐ．５６１−５６５，１９９６）、ミトコンドリア内膜標的シグナルペプチドであるＳＳ０１、ＳＳ０２、ＳＳ３１、及びＳＳ２０（Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８，ｐｐ．Ｅ２７７−Ｅ２８３，２００６）、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２８、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２４、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、ＲｕＢｉｓＣｏスモールチェーン、ＬＨＣＩＩ  ｔｙｐｅ  １などを挙げることができるがこれらに限定されない。
これらのペプチド配列に含まれる１個から数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失したペプチド配列を好適に使用できる場合もある。これらのうちの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
細胞透過性配列及びポリカチオン配列を含むキャリアペプチドを核酸と接触させることによる複合体の形成を、オルガネラ移行配列を含む別のキャリアペプチドの存在下で行ってもよい。その場合、オルガネラ移行配列を含むキャリアペプチドも同様に、ポリカチオン配列を含むことが好ましい。このオルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドは、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドと一緒になって、核酸との複合体を形成することができる。オルガネラ移行配列とポリカチオン配列の相対的な配置に限定はないが、オルガネラ移行配列は、ポリカチオン配列のＣ末側に結合することが好ましい。オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチド、ならびにオルガネラ移行配列とポリカチオン配列と細胞透過性配列とを含むキャリアペプチドは、上記と同様の方法により調製することができる。
オルガネラ移行配列の具体例としては、例えば次の配列を挙げることができる。ＭＡＭＡＭＲＳＴＦＡＡＲＶＧＡＫＰＡＶＲＧＡＲＰＡＳＲＭＳＣＭＡ（配列番号２３）、ＭＱＶＴＭＫＳＳＡＶＳＧＱＲＶＧＧＡＲＶＡＴＲＳＶＲＲＡＱＬＱＶ（配列番号２４）、ＭＡＴＭＶＡＧＩＳＬＲＧＰＶＭＳＳＨＲＴＦＳＶＴＫＲＡＳＬＰＱＳＫＬＳＳＥＬＳＦＶＴＳＱＬＳＧＬＫＩＳＳＴＨＦＩＳＳＳＡＰＬＳＶＰＦＫＰＳＬＱＰＶＡ（配列番号２５）、ＭＡＡＬＱＳＳＦＡＧＬＳＴＳＦＦＧＱＲＦＳＰＰＬＳＬＰＰＬＶＫＳＴＥＧＰＣＬＩＱＡ（配列番号２６）、ＭＡＶＳＦＳＬＶＧＡＦＫＧＬＳＬＡＳＳＳＳＦＬＫＧＤＦＧＡＡＦＰＶＡＰＫＦＳＶＳＦＰＬＫＳＰＬＴＩＥＳ（配列番号２７）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号２８）、ＭＡＡＳＴＭＡＬＳＳＰＡＦＡＧＫＡＶＫＬＳＰＡＡＳＥＶＬＧＳＧＲＶＴＭＲＫＴＶ（配列番号２９）、ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫ（配列番号４４）。
オルガネラ移行配列を含むキャリアペプチドを用いることにより、植物細胞に導入された核酸を、さらに細胞内オルガネラに特異的に導入することが可能になる。ミトコンドリアゲノムや葉緑体ゲノムは、核ゲノムと比べると数十〜数千倍のコピー数を持っており、これらの形質転換により、外来タンパク質を大量に生産可能であることが知られている。そのため、核酸を細胞内オルガネラに特異的に導入することにより、植物が有する物質生産機能を最大限に利用し、石油資源の代替となるバイオ物質やその他の有用物質を大量に生産することが可能になる。
オルガネラ移行配列とポリカチオン配列を含むキャリアペプチドは、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドと一緒に、核酸との複合体を形成させることにより、効果的に核酸を細胞内オルガネラに特異的に導入することができるが、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドなしでも、すなわち、オルガネラ移行配列とポリカチオン配列を含むキャリアペプチド単独でも、核酸との複合体を形成させることにより、核酸を細胞内オルガネラに特異的に導入することが可能である。
キャリアペプチドと核酸とを接触させて複合体を形成させる工程においては、キャリアペプチド由来のアミン基の数／核酸由来のリン酸基の数（Ｎ／Ｐ比）が２以下となるように接触させることが好ましく、また、Ｎ／Ｐ比が０．１より大きくなるように接触させることが好ましい。Ｎ／Ｐ比は、より好ましくは０．２以上、さらに好ましくは０．３以上、特に好ましくは０．４以上である。Ｎ／Ｐ比はまた、より好ましくは１．５以下、さらに好ましくは１．０以下、特に好ましくは０．６以下である。Ｎ／Ｐ比０．５で形成される複合体が最も好ましい。本発明者らは、このようなＮ／Ｐ比でキャリアペプチドと核酸とを接触させて複合体を形成することにより、植物細胞に対して高いトランスフェクション効率を達成できることを見出した。なお、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドとは別に、オルガネラ移行配列を含むキャリアペプチドを核酸に接触させる場合は、すべてのキャリアペプチド由来のアミン基の数が基準となる。
また、キャリアペプチドとｄｓＲＮＡとを接触させて複合体を形成させる工程において、キャリアペプチドとｄｓＲＮＡのモル比（キャリアペプチド／ｄｓＲＮＡ）は、５以下となるように接触させることが好ましく、また、モル比が０．１より大きくなるように接触させることが好ましい。モル比は、より好ましくは０．５以上、さらに好ましくは１以上である。モル比はまた、より好ましくは５以下、さらに好ましくは２以下である。モル比１〜２で形成される複合体が最も好ましい。本発明者らは、このようなモル比でキャリアペプチドとｄｓＲＮＡを接触させて複合体を形成することにより、植物細胞に対して高いトランスフェクション効率を達成でき、また高いサイレンシング効果を達成できることを見出した。
キャリアペプチドと核酸とを接触させて複合体を形成させる工程は、例えばキャリアペプチドと核酸とを溶液中で混合することにより実施できるが、その場合、キャリアペプチドの濃度は、通常１０ｕｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｕｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、核酸溶液の濃度は、通常１ｕｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｕｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬである。
上記のように形成されるキャリアペプチドと核酸との複合体はキャリアペプチドと核酸とを接触させることにより得られ、その結合様式や形態に限定はないが、通常粒子の形態であり、その平均流体力学的直径は、好ましくは１５０ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、さらに好ましくは３００ｎｍ以上であり、また、好ましくは５００ｎｍ以下、より好ましくは４００ｎｍ以下、さらに好ましくは３５０ｎｍ以下である。平均流体力学的直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）法によって測定することができる。本発明者らは、このような平均流体力学的直径を有する複合体により、植物細胞に対して高いトランスフェクション効率を達成できることを見出した。
複合体を標的植物細胞に接触させる工程は、当技術分野で公知の方法により実施でき、特に制限されない。例えば本発明のキャリアペプチドと核酸との複合体の溶液を標的植物細胞に浸透させ、２０〜３５℃の温度で、一日当たり１４〜１８時間の一定光の下、インキュベーター中でインキュベートすることにより実施できる。インキュベーション時間は、好ましくは５〜１５０時間、より好ましくは１０〜２０時間である。本発明の核酸導入方法は、比較的短時間にトランスフェクションを行うために特に優れている。
本発明はまた、標的植物細胞に核酸を導入するためのキットに関する。本発明のキットは、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドを含むことを特徴とする。本発明のキットはオルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドをさらに含んでもよい。また、キットは、取り扱い説明書、複合体形成や細胞導入のための試薬、器具などを含んでもよい。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００９】
実施例１  キャリアペプチドの合成
細胞透過性配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドとして、
Ｒ９−ＢＰ１００（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＫＬＦＫＫＩＬＫＹＬ−ＮＨ２（配列番号３０）、理論ｐＩ／Ｍｗ：１２．５５／２８２７．５６Ｄａ）、
（ＫＨ）９−ＢＰ１００（ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＫＬＦＫＫＩＬＫＹＬ−ＮＨ２（配列番号３１）、理論ｐＩ／Ｍｗ：１０．８１／３８０９．７１Ｄａ）、
及び
Ｒ９−Ｔａｔ２（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＫＲＲＱＲＲＲＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＮＨ２（配列番号３２）、理論ｐＩ／Ｍｗ：１３．２８／３９１０．７２Ｄａ）
を標準的な９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成を使用して合成した（Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｎｏｂｌｅ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５（３），１６１（１９９０））。
さらに、オルガネラ移行配列とポリカチオン配列とを含むキャリアペプチドとして、クラミドモナスフェレドキシン（Ｃｆ）及びクラミドモナスＲｕｂｉｓｃｏアクチバーゼ（ＣＲａ）起源の葉緑体移行ペプチドもまたポリカチオン配列（ＫＨ）９と組み合わせた。すなわち、
Ｃｆ−（ＫＨ）９（ＭＡＭＡＭＲＳＴＦＡＡＲＶＧＡＫＰＡＶＲＧＡＲＰＡＳＲＭＳＣＭＡＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ−ＮＨ２（配列番号３３）、理論ｐＩ／Ｍｗ：１２．２０／５７２９．８９Ｄａ）、及び
ＣＲａ−（ＫＨ）９（ＭＱＶＴＭＫＳＳＡＶＳＧＱＲＶＧＧＡＲＶＡＴＲＳＶＲＲＡＱＬＱＶＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ−ＮＨ２（配列番号３４）、理論ｐＩ／Ｍｗ：１２．６２／５８０３．８２Ｄａ）
を固相ペプチド合成によって合成した。
下線部分がポリカチオン配列をさす。ポリペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製し、そして分子量をマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により確認した。（ＫＨ）９、Ｒ９、ＢＰ１００及びＴａｔ２もまた、コントロール用に合成した。
実施例２  種々のＮ／Ｐ比でのキャリアペプチド−ｐＤＮＡ複合体の調製及び特徴付け
様々なＮ／Ｐ比で、キャリアペプチド（Ｒ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００）と、レポーター遺伝子をコードするｐＤＮＡとのイオン性複合体を調製し、そしてこれを動的光散乱（ＤＬＳ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、ゼータ電位計、及びアガロースゲル電気泳動を使用して特徴付けした。ここで、Ｎ／Ｐ比は、キャリアペプチド由来のアミン基の数／ｐＤＮＡ由来のリン酸基の数を指す。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＰ３５Ｓ−ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＴＮＯＳ及びウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）をコードするＰ３５Ｓ−ＲＬｕｃ−ＴＮＯＳの２つの型のｐＤＮＡをレポーター遺伝子として使用した。全てのｐＤＮＡをコンピテントＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔａｋａｒａ）中で増幅し、そしてＥｎｄｏｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。キャリアペプチド−ｐＤＮＡ複合体を調製するために、０．５ｇ／Ｌのキャリアペプチドを、ｐＤＮＡ溶液（約１．０ｍｇ／ｍＬ）と、種々のＮ／Ｐ比（０．５、１、２、５、１０及び２０）で２５℃で混合した。複合体を混合の直後にゼータ電位計（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）及び原子間力顕微鏡（Ｓｅｉｋｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって特徴付けした。
複合体を含有する溶液を、超純水（ＭｉｌｌｉＱ）を使用して８００μＬの最終容量に希釈し、そしてゼータ電位及びサイズの測定のために使用した。試料のゼータ電位及びゼータ偏位をゼータ電位計によって３回測定し、そして平均データをＺｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアｖｅｒ  ６．２０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）を使用して得た。動的光散乱（ＤＬＳ）を行って流体力学的直径を決定し、そして多分散指数（ＰＤＩ）をゼータナノサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアｖｅｒ  ６．２０）を用いて、６３３ｎｍ  Ｈｅ−Ｎｅレーザーを使用して、２５℃で、１７３°の後方散乱検出角度で決定した。ＡＦＭによる観察は、複合体溶液を切断した雲母上に固定し、そして空気中室温でシリコンカンチレバーを使用し、１．３Ｎ／ｍのスプリング定数でタッピングモードで行った。カンチレバーチップ回転効果を算出して、複合体の真の寸法を以前に報告した方法を使用して得た（Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．Ｋｉｋｋａｗａ，Ｔ．Ｔｓｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ６（１），４１，２００６；Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ｔ．Ｈｉｒｏｔａ，Ｙ．Ｋｉｋｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５（６），２１８６，２００４）。ゲル遅延度アッセイのために、１．０μｇのｐＤＮＡを含有する各々の試料４０μＬをローディングバッファーと混合し、そして１％アガロースゲル上で分析し（ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）、臭化エチジウムで染色した。
ＤＬＳの結果（表１）に基づくと、Ｒ９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００−ｐＤＮＡ複合体の両方の平均流体力学的直径は、０．１〜２０の範囲でＮ／Ｐ比が増加するに従って減少した。平均流体力学的直径に基づくと、０．５より大きなＮ／Ｐ比で調製したｐＤＮＡ複合体は首尾よく形成された。他方、Ｎ／Ｐ比０．１のｐＤＮＡ複合体は二峰性分布を示した。このことは、ｐＤＮＡ複合体の不均一な形成を示唆する。Ｎ／Ｐ比０．５及び１で調製した複合体の直径は約３００ｎｍを示し、一方、Ｎ／Ｐ比５、１０及び２０の複合体は約１２０ｎｍの直径を示した。
【表１】
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ｐＤＮＡ複合体を雲母上に固定し、そしてその形態をＡＦＭによってイメージングした（図２）。全ての複合体は均一な球状の複合体を形成し、そしてＮ／Ｐ比０．５、１及び２０でのｐＤＮＡ複合体はそれぞれ幅１９０±２１ｎｍ、高さ１２．８±５．３ｎｍ、幅９８±１７ｎｍ、高さ７．７±１．６ｎｍ、及び幅１２３±１３ｎｍ、高さ９．１±２．２ｎｍを示した（ｎ＝１０）。ｐＤＮＡ複合体の体積に基づくと、ＤＬＳによって決定した寸法はＡＦＭによるものより若干大きかった。これは、雲母上のｐＤＮＡ複合体が空気中での乾燥によって収縮したからである（Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．Ｋｉｋｋａｗａ，Ｔ．Ｔｓｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ６（１），４１，２００６）。ＤＬＳ及びＡＦＭの結果により、両方のキャリアペプチドについて複合体が形成され、そしてそのサイズがＮ／Ｐ比の増加に従って明らかに減少することが確認された。
Ｒ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００両方のｐＤＮＡ複合体についてのゼータ電位は、０．５及び１のＮ／Ｐ比では負の値を示したが、２〜２０の範囲のＮ／Ｐ比では正の値に増加した（図３Ａ）。このゼータ電位の飽和は、５のＮ／Ｐ比でペプチドがｐＤＮＡ複合体の表面を覆ったことを示している。アガロースゲル電気泳動による複合体のイオン性相互作用及び電解安定性の評価結果を図３Ｂ及びＣに示す。０．５〜２のＮ／Ｐ比で調製したＲ９−ＢＰ１００の複合体は、複合体無しのフリーのｐＤＮＡと同様にアガロースゲル電気泳動においてｐＤＮＡの移動を示した。移動したｐＤＮＡの量はＮ／Ｐ比が増加するに従って減少し、Ｎ／Ｐ比１０及び２０では移動は示されなかった。Ｎ／Ｐ比の増加とともにウェル中のバンドの強度が増加することは、ｐＤＮＡがキャリアペプチドと結合して安定な複合体を形成したことを示している。（ＫＨ）９−ＢＰ１００の複合体も同じ挙動を示したが、少量のｐＤＮＡの移動がＮ／Ｐ比１０まで依然として観察された（図３Ｃ）。複合体の負の又は低い正のゼータ電位によって、Ｒ９−ＢＰ１００のｐＤＮＡ複合体についてはＮ／Ｐ比０．５〜５での、（ＫＨ）９−ＢＰ１００についてはＮ／Ｐ比０．５〜１０での、電気泳動の間のアガロースゲル中へのｐＤＮＡの移動が説明される。より低いＮ／Ｐ比でより少量のキャリアペプチドによってもｐＤＮＡとの複合体は依然として形成されたが、これは電気泳動の間十分安定ではなく、いくらかのｐＤＮＡが複合体から遊離した。一方、キャリアペプチドと複合体を形成したｐＤＮＡはウェル中に固着した。より高いＮ／Ｐ比でより多量のペプチドによって、より安定なｐＤＮＡ複合体が形成され、ｐＤＮＡのアガロース中への遊離は少なく、より多くのｐＤＮＡ複合体がウェル中に固着した。Ｒ９−ＢＰ１００のｐＩ及び分子量は１２．５５及び２８２７．５６Ｄａであり、（ＫＨ）９−ＢＰ１００のｐＩ及び分子量（１０．８１及び３８０９．７１Ｄａ）とは若干異なるので、両方の複合体のイオン性相互作用及び安定性は異なる。
実施例３  ｐＤＮＡ複合体による葉の処理
キャリアペプチド−ｐＤＮＡ複合体によりＤＮＡを導入する標的としてベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉を選択した。葉は植物の形質転換において複合的な役割を果たすからである。葉は葉緑体などの色素体（安定形質転換及び一過性形質転換を達成するために植物生物学者によって広く使用されている（Ｐａｌ  Ｍａｌｉｇａ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，５５，２８９，２００４）、ミトコンドリア（Ｖａｌ  Ｒｏｍａｉｎ，Ｅｌｉｚａ  Ｗｙｓｚｋｏ，Ｃｌａｒｉｓｓｅ  Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１（１３），２０１１）及び核（Ｚｏｕｈａｉｒ  Ｅｌｇｈａｂｉ，Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｒｕｆ，ａｎｄ  Ｒａｌｐｈ  Ｂｏｃｋ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６７，９４１，２０１１）などの豊富な資源を含有している。
タバコ葉を用いたインビボトランスフェクション実験を行って、キャリアペプチド−ｐＤＮＡ複合体が細胞壁を透過して植物細胞中へ遺伝子送達する能力を評価した。レポーター遺伝子としてのＲＬｕｃ及びＧＦＰをコードするｐＤＮＡと、Ｒ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００との複合体をベンサミアナタバコ葉中に直接浸透させた。ｐＤＮＡ複合体の最も効率的なＮ／Ｐ比を０．１〜２０の間で決定するために、トランスフェクション効率を、ＲＬｕｃアッセイを使用して定量的に特徴付けした。
標的となる植物は次のように調製した。ベンサミアナタバコの種子を、土壌（Ｐｒｏ−Ｍｉｘ）及びバーミキュライトの２：１混合物を含有する栽培媒体を含むポット中で発芽させた。ベンサミアナタバコ植物を、植物インキュベーター（Ｂｉｏｔｒｏｎ  ＮＫ  Ｓｙｓｔｅｍ）中、２４時間一定光の下で、２９℃の温度で、３週間まで成長させた。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）をコードするｐＤＮＡを含有する複合体溶液約１００μＬを、針無しのシリンジを使用してベンサミアナタバコの十分に広げた葉に直接浸透させた。処理したベンサミアナタバコをそれぞれ２９℃及び２１℃で一日当たり１６時間の一定光の下、植物インキュベーター中で６日間までインキュベートした。ＲＬｕｃ遺伝子発現を定量的に評価するために、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って行った（ｎ＝４）。
簡潔に記載すると、浸透させた葉を、１２時間から１４４時間で定期的に、浸透させた区画の周囲１ｃｍ２を切除することによってサンプリングし、そしてＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶解した。溶解物を手短に遠心分離し、そして上清をＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ及びＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。遺伝子発現を、マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  Ｍ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、光ルミネセンスの強度（相対的光単位）に基づいて評価した。上清中のタンパク質量をＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して決定し、そして相対的光単位／タンパク質重量（ＲＬＵ／ｍｇ）を得た。ＲＬｕｃ遺伝子をコードするｐＤＮＡでのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を、本実験におけるポジティブコントロールとして使用した。
トランスフェクション効率の統計的な差を、両側分布を用いる独立ｔ検定によって決定し、そしてｐ＜０．０５で統計的有意差ありとみなした。細胞生存性実験におけるデータを平均±標準偏差として表わす（ｎ＝４）。
Ｎ／Ｐ比０．１で調製した複合体は有意なトランスフェクションを示さなかった。一方、０．５より高いＮ／Ｐ比で調製した複合体のトランスフェクション効率はＮ／Ｐ比の増加とともに低下した。Ｎ／Ｐ比０．５で調製したＲ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００両方の複合体は、他のＮ／Ｐ比に比較して最高のトランスフェクション効率を示した（図４Ａ）。このことは、動物細胞の場合と同様に（Ｄ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｂｉｅｂｅｒ，Ｙ．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １６（８），１２７３，１９９９）、過剰のポリカチオンが植物細胞に細胞毒性を誘発し、トランスフェクション効率を低下させたことを意味する。
以前の研究によれば（Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ｊ．Ｈａｍａｓａｋｉ，Ｂ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４６（１），１３６，２０１０；Ｋ．Ｎｕｍａｔａ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌ．Ｋａｐｌａｎ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １１（１１），３１８９，２０１０；Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ａ．Ｊ．Ｍｉｅｓｚａｗｓｋａ−Ｃｚａｊｋｏｗｓｋａ，Ｌ．Ａ．Ｋｖｅｎｖｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ，２０１１；Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ｍ．Ｒ．Ｒｅａｇａｎ，Ｒ．Ｈ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２（８），１６０５，２０１１）、動物細胞中へのトランスフェクションのために最適な複合体は、より小さなそして僅かに正に荷電した複合体であった。しかし、本研究において、Ｎ／Ｐ比０．５で調製したキャリアペプチド−ｐＤＮＡ複合体（これは負に荷電しており、そして直径約３００ｎｍである）がタバコ葉中への最良のトランスフェクション効率を示した。細胞壁及び細胞膜の層構造を考慮すると、比較的小さくそして正に荷電したｐＤＮＡ複合体（２より大きなＮ／Ｐ比）はイオン性相互作用及びサイズ効果により細胞壁中に捕捉され、Ｎ／Ｐ比０．５で調製した複合体よりも低いトランスフェクション効率が低くなったものと考えられる。
また、種々の時点で、Ｒ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００とｐＤＮＡとの複合体によるトランスフェクション効率を測定し、本発明の遺伝子送達システムのための至適インキュベーション時間を決定した（図４Ｂ）。Ｒ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００両方のｐＤＮＡ複合体は１２時間で最高のトランスフェクション効率を示し、そしてそのトランスフェクション効率は１４４時間まで徐々に低下した。この経時変化の結果から、本発明のキャリアペプチドによる遺伝子送達が、比較的短時間にトランスフェクションを行うための傑出したシステムであることが示された。Ｒ９−ＢＰ１００及び（ＫＨ）９−ＢＰ１００を用いた場合の全体的な傾向はほぼ同一であったが、そのトランスフェクション効率の経時変化は若干異なっていた（図４Ｂ）。Ｒ９−ＢＰ１００は、（ＫＨ）９−ＢＰ１００と比較してより早くそしてより短いトランスフェクション挙動を示した。トランスフェクション挙動におけるこの差は、細胞内でのプロテアーゼによる（ＫＨ）９配列の分解がＲ９ペプチドに比較して遅いことに起因し得る。キャリアペプチドにおいて適切なアミノ酸配列を選択することにより、トランスフェクション挙動を変化させ、制御できることは注目すべきことである。
コントロール実験として、細胞透過性ペプチドＢＰ１００のみ、又はポリカチオン（ＫＨ）９のみを用いてベンサミアナタバコ葉中へのｐＤＮＡのトランスフェクションを、０．５のＮ／Ｐ比を使用して１２時間行った。その結果、それぞれ１２０±７０及び３４０±６０ＲＬＵ／ｍｇが示された。これらの値は図４に示すような本発明のキャリアペプチドによる遺伝子送達に比較して有意に低かった。コントロールの結果に基づくと、細胞透過性配列とポリカチオン配列とを組み合わせた本発明のキャリアペプチドは、トランスフェクション効率を、細胞透過性ペプチド単独と比較して明らかに、約１２倍増強する。これは、ＤＮＡが、キャリアペプチドにおける細胞透過性配列よりもポリカチオン配列と相互作用し、従って、イオン性複合体の表面に細胞透過性配列が優先的に存在し、そして細胞膜を透過するように機能するためと考えられる。
細胞内部のトランスフェクション挙動をさらに調べるために、ＧＦＰをコードするｐＤＮＡのトランスフェクションを、ベンサミアナタバコ葉を用いて蛍光顕微鏡法によっても観察した。葉において発現されたＧＦＰを蛍光顕微鏡によって直接観察し（Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１、１００×対物；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）、イメージは、ＣＣＤカメラを使用して、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ  ４．８ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて得た（図５）。複合体溶液を浸透させた表皮細胞を、両方のペプチドを使用して部分的にトランスフェクトした。細胞内部を観察したところ、トランスフェクトした表皮細胞の核において最高のＧＦＰ発現が観察された（図５、矢印１）。核におけるＧＦＰ発現もまた、本発明の遺伝子送達システムのトランスフェクション機能を示すものである。
実施例４  キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体の調製及び特徴付け
実施例１で合成したキャリアペプチド（（ＫＨ）９−ＢＰ１００）とｄｓＲＮＡの複合体を調製し、サイズ、表面電荷、ペプチドの二次構造、ＲＮａｓｅ耐性を評価した。また、動物細胞ＨＥＫにおけるＲＮＡｉ実験を実施した。
ｓｉＲＮＡを合成するために、以下の表に示すＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計した（Ｊ．Ｙ．Ｙｕ，Ｓ．Ｌ．ＤｅＲｕｉｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，６０４７，２００２）。
【表２】
2013129698.tif 000004
ｓｉＲＮＡ合成は、Ｔ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。ＲＮＡ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びイソプロパノール沈殿を用いて精製し、２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、ｓｉＲＮＡマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて解析した。ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ二本鎖）の形成のために、ｓｉＲＮＡ鎖を９５℃で５分間加熱し、続いてゆっくりと２５℃に冷却した。
２種類のｄｓＲＮＡ、すなわち、ＧＦＰの発現をサイレンシングするＧＦＰ５ｓｉＲＮＡと、蛍ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の発現をサイレンシングするＧＬ３  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した（表３）。
【表３】
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キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体を調製するために、８００ｎＭのキャリアペプチドをｄｓＲＮＡ溶液（４００ｎＭ）と、種々のキャリアペプチド／ｄｓＲＮＡモル比で（０．５、１、２、５、１０及び２０）、２５℃で混合した。各サンプルにおける最終ｄｓＲＮＡ量は、２０ｐｍｏｌとした。複合体を、ゼータ電位計、円偏光二色性分析（ＣＤ、Ｊ−８２０、ＪＡＳＣＯ）及び原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて特徴づけした。ゼータ電位の測定、ＡＦＭによる観察及びサイズ（流体力学的直径）測定は、実施例２と同様に実施した。
キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体の二次構造を解析するため、ｄｓＲＮＡと複合体を形成する前及び形成した後のキャリアペプチドのＣＤスペクトルを２５℃で測定した。ＣＤスペクトルは、１２ｎｍ・ｓｅｃ−１のスピード及び１ｎｍの解像度で記録し、３回スキャンした。データは、キャリアペプチドの分子量と濃度をそれぞれ３８０９．７１ｇ／ｍｏｌ及び０．８μＭとして、残基モル楕円率で表した（図６Ｃ）。
複合体のＲＮａｓｅ耐性を評価するために、複合体をＲＮａｓｅ（５０ユニット、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）により、２５℃で１２時間処理した。ＲＮａｓｅ処理後のｄｓＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル、ＴＡＥバッファー、１００Ｖ、３０分）で分析し、臭化エチジウムで染色した（図６Ｄ）。
ＨＥＫ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて蛍ルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡをトランスフェクトした。６時間後、培地を交換し、ｄｓＲＮＡ（２０ｐｍｏｌ）とキャリアペプチドを添加した。３７℃で１２時間細胞をインキュベートした後、ルシフェラーゼ遺伝子発現を評価するために、ルシフェラーゼアッセイを実施した（ｎ＝４）。マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  Ｍ３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、光ルミネセンスの強度（相対的光単位）に基づいて、遺伝子発現を評価した。各ウェル中のタンパク質量は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で測定した。そして相対的光単位／タンパク質重量（ＲＬＵ／ｍｇ）を得た。測定値は、ＰＢＳで処理した細胞におけるルシフェラーゼ発現（Ｍｏｃｋ）に対する％で示した（図６Ｅ）。ルシフェラーゼアッセイの統計的な差は、両側分布を用いる独立ｔ検定によって決定し、そしてｐ＜０．０５で統計的有意差ありとみなした。
結果を図６Ａ〜図６Ｅに示す。ｄｓＲＮＡ及びキャリアペプチドの混合モル比が１：２の場合において、直径３００ｎｍ程度、わずかに正の表面電荷を有するキャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体が得られた（図６Ａ−Ｂ）。ペプチドの二次構造は、複合体の形成に伴い、ヘリックスからランダムコイルへと転移することがわかった（図６Ｃ）。さらにキャリアペプチド量が増えるにつれてＲＮａｓｅによる分解から保護されたことが示され（図６Ｄ）、ＲＮａｓｅに対し高い耐性を示し、ＲＮＡキャリアとしての高い可能性を示した。ＲＮＡｉ試験では、７０％程度のサイレンシング効率が示され、キャリアペプチド／ｄｓＲＮＡのモル比が１〜２で最大のルシフェラーゼに対するサイレンシング効果が観察された（図６Ｅ）。
実施例５  キャリアペプチド−ｄｓＲＮＡ複合体によるシロイヌナズナの葉の処理
ｄｓＲＮＡとキャリアペプチド（（ＫＨ）９−ＢＰ１００）からなる複合体（混合モル比１：２）を用いて、ＹＦＰを過剰発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）の葉に対するＲＮＡｉ試験を行った
ＹＦＰ遺伝子を、アグロバクテリウム株ＭＰ９０に導入し、さらに、野生型シロイヌナズナに導入した。トランスジェニック植物の種子を回収した。野生型シロイヌナズナ及びＹＦＰトランスジェニックシロイヌナズナの種子を、土壌（Ｐｒｏ−Ｍｉｘ）及びバーミキュライトの２：１混合物を含有する栽培媒体を含むポット中で発芽させ、植物インキュベーター（Ｂｉｏｔｒｏｎ  ＮＫ  Ｓｙｓｔｅｍ）中、１６時間／８時間の明／暗条件下、２１℃の温度で、成長させた。
ｄｓＲＮＡ（２０ｐｍｏｌ）を含む約１００μＬの複合体溶液を、針無しのシリンジを使用してシロイヌナズナの十分に広げた葉に直接浸透させた（図７Ｄ）。処理したシロイヌナズナを２１℃で一日当たり１６時間の一定光の下、植物インキュベーター中で３６時間までインキュベートした。
浸透させた葉を、浸透させた区画の周囲１ｃｍ２を切除することによってサンプリングし、そしてＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶解した。ＹＦＰ遺伝子発現を、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で直接観察した。ｄｓＲＮＡをＣｙ３で標識した。標識したｄｓＲＮＡ（２０ｐｍｏｌ）と（ＫＨ）９−Ｂｐ１００（キャリアペプチド／ｄｓＲＮＡモル比は２．０）の複合体を、シロイヌナズナの葉に浸透させた。１２時間インキュベートした後、葉を回収してＰＢＳで２回洗浄し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）のＰＢＳ溶液（３００ｎＭ）とともに１０分間、減圧下（約０．０６ＭＰａ）でインキュベートした。Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡ−キャリアペプチド複合体及びＤＡＰＩで染色した核の細胞内における分布を、ＣＬＳＭにより、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ及び５５５ｎｍの励起波長で観察した。
ＲＮＡｉの前及び後のシロイヌナズナの葉をＰＢＳで洗浄して粉砕し、リシスバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動にかけた（Ｂｉｏｒａｄ）。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写した。非特異的結合のブロックは、ＴＢＳ中の３％ＢＳＡ溶液中に転写した膜を配置することにより行った。膜をＹＦＰに対する一次抗体（Ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［６ＡＴ３１６］，Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートし、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、続いて、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）に結合させた二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。タンパク質のブロットはＮＢＴ及びＢＣＩＰ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発色させた。発色強度の定量データは、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．４６ｒ（ＮＩＨ，ＭＤ）を用いて取得した。
結果を図７Ａ〜図７Ｄに示す。ＹＦＰの明らかなサイレンシングがＣＬＳＭ観察により明らかとなり、この結果はウェスタンブロットによる定量的な解析からも支持された。顕微鏡観察及びウェスタンブロットの結果を総合的に検討すると、複合体を葉に導入した９時間から１２時間後に、ＹＦＰのＲＮＡｉが最も顕著に確認された。ｄｓＲＮＡをＣｙ３でラベルし、細胞内の局在を確認したところ、ｄｓＲＮＡが核周辺等の細胞内に導入されていることも観察された（図７Ｅ）。以上の結果から、キャリアペプチドをｄｓＲＮＡキャリアとして用いることで、ｄｓＲＮＡを容易かつ短時間で植物へ導入できることが示された。
実施例６  巨大ＤＮＡの導入
ルシフェラーゼをコードした８０ｋｂｐのプラスミドを枯草菌により調製し、キャリアペプチド（（ＫＨ）９−ＢＰ１００）を用いてシロイヌナズナへ導入した。複合体を導入後１２時間の葉からルシフェラーゼを抽出し、定量解析を行ったところ、有効なルシフェラーゼ活性を確認した。以上の結果から、キャリアペプチドを用いた遺伝子導入法により、パーティクルガン等では導入不可能な巨大遺伝子（プラスミド）も、導入可能であることが示された。
実施例７  オルガネラ選択的な遺伝子導入
ミトコンドリア移行配列（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＶ（酵母））及びポリカチオン配列を含むキャリアペプチドを合成した。すなわち、（ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ）（配列番号４３）を固相ペプチド合成によって合成した。ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫ（配列番号４４）がミトコンドリア移行配列を表し、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨがポリカチオン配列を表す。そして、合成したキャリアペプチドとミトコンドリアで機能するプラスミドベクター（ｐＤＯＮＲｃｏｘ２ｐ：ｒｌｕｃ／ｇｆｐ）との複合体を調製した。上記実施例と同様に、複合体をシロイヌナズナの葉へ導入し、ミトコンドリアにおけるレポーター遺伝子（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発現を定量的に評価した。ミトコンドリア特異的に機能するプロモーター（ｃｏｘ）を使用することにより、ミトコンドリアへの特異的導入が行われたかどうかを判定した。
結果を図８Ａ〜図８Ｂに示す。キャリアペプチドとプラスミドの混合比（Ｎ／Ｐ＝０．５、１及び２）が、ミトコンドリアへの遺伝子導入効率へ与える影響を評価したところ、Ｎ／Ｐ＝０．５が高い優位差を示した（図８Ａ）。遺伝子導入効率の時間変化においては、１２時間から２４時間後において高い遺伝子発現が確認された（図８Ｂ）。以上の結果から、オルガネラ移行配列をキャリアペプチドの配列に加えることで、比較的短時間（１２時間から２４時間）でオルガネラ特異的な遺伝子導入が可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明により様々な植物種を簡単に物質生産技術に利用できるようになり、バイオプラスチックやバイオ燃料等のバイオ物質を二酸化炭素から生産可能な新規植物種を作出できる。本発明により、バイオ物質だけでなく、医薬用タンパク質、食料、エネルギー物質等の幅広い分野の物質生産を、植物及び二酸化炭素を活用した新しい物質生産技術で代替し、新バイオ産業及び低炭素社会の構築を同時に実現できる可能性がある。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参照により本明細書中に組み込むものとする。
［配列表］
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７−２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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