(57)【要約】  老齢人口の比率が高くなっている現在、加齢に伴って発生する皮膚の損傷、すなわち、しみや皺の発生の予防等によって、皮膚を健康な状態に保つことができ、安全性が高く、倫理面での問題がなく、また、十分な量を提供できる、化粧品を提供することを目的とする。  本願発明は、非ヒト哺乳類の骨髄又は歯髄幹細胞培養上清粉末を主成分として含有する化粧品を提供する。また、上記化粧品をイオン導入法によって導入する、タンパク質のイオン導入方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳類の歯髄幹細胞、骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清粉末を主成分として含有する化粧品。
【請求項２】
前記非ヒト哺乳類の幹細胞は、ブタ脱落乳歯の歯髄、ブタ骨髄、及びブタ脂肪組織からなる群から選ばれるいずれかの組織から得られたものであることを特徴とする、請求項１に記載の化粧品。
【請求項３】
前記培養上清粉末は、前記ブタ脱落乳歯歯髄、ブタ骨髄幹細胞、及びブタ脂肪細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清を、アルコール濃縮後、凍結乾燥して得られたものであることを特徴とする、請求項２に記載の化粧品。
【請求項４】
前記培養上清粉末は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも１種以上の成長因子を含有することを特徴とする、請求項１に記載の化粧品。
【請求項５】
液剤、クリーム剤、軟膏剤、ジェル剤、乳液剤、及び硬膏剤からなる群から選ばれるいずれかの剤形であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化粧品。
【請求項６】
前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることを特徴とする、請求項５に記載の化粧品。
【請求項７】
溶解剤を含む第１コンパートメントと、ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清粉末、ブタ骨髄幹細胞培養上清粉末及びブタ脂肪幹細胞培養上清粉末からなる群から選ばれるいずれかの情勢粉末と、担体とからなる有効成分組成物を含む第２コンパートメントと、前記第１及び第２コンパートメントの隔壁を貫通させるための棒状部材とを備える容器に格納された化粧品であって、使用直前に、前記棒状部材によって前記第１及び第２コンパートメントの隔壁に貫通孔を設け、前記有効成分組成物を前記生理食塩水に溶解させることを特徴とする化粧品。
【請求項８】
前記溶解剤は、マイナスイオンチャージされている液体、生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水からなる群から選ばれるいずれかの液体であることを特徴とする、請求項６に記載の化粧品。
【請求項９】
前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の化粧品。
【請求項１０】
請求項３又は７に記載の化粧品をシート状の保湿性の部材に吸収させて、吸収させたい部位に載せ、
プラスに帯電した電極を所望の部位に接触させ、
マイナスに帯電した棒状の電極を、前記シートの上を回転させながら移動させることを特徴とする、タンパク質のイオン導入方法。
【請求項１１】
前記所望の部位は、腕、手、掌、脚、膝の裏、及び足の裏からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１０に記載のタンパク質のイオン導入方法。
【請求項１２】
非ヒト哺乳類の歯髄幹細胞培養上清粉末、骨髄幹細胞培養上清粉末及び脂肪幹細胞培養上清粉末からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清粉末を有効成分として含有する皮膚形成促進剤。
【請求項１３】
前記非ヒト哺乳類の幹細胞は、ブタ脱落乳歯の歯髄、ブタ骨髄及びブタ脂肪組織からなる群から選ばれる組織から得られたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の皮膚形成促進剤。
【請求項１４】
前記培養上清粉末は、前記ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清、前記骨髄幹細胞の培養上清及び前記脂肪幹細胞の培養上清からなる群から選ばれるいずれかの培養上清を、アルコール濃縮後、凍結乾燥して得られたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の皮膚形成促進剤。
【請求項１５】
前記培養上清粉末は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも１種以上の成長因子を含有することを特徴とする、請求項１２〜１４に記載の皮膚形成促進剤。
【請求項１６】
液剤、クリーム剤、軟膏剤、ジェル剤、乳液剤、及び硬膏剤からなる群から選ばれるいずれか剤形であることを特徴とする、請求項１５に記載の皮膚形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト歯髄幹細胞、骨髄幹細胞、及び脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清を原材料とする化粧品等に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴ってしみや皺が増えることはよく知られているが、これは、短波長紫外線（ＵＶＢ）への暴露量が加齢とともに増加することによることが知られている。そして、ＵＶＢは、ヒト真皮中の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）によるコラゲナーゼの産生量を増加させるため、コラーゲンの分解を促進して変性弾性組織の沈着を誘導し、その結果、皮膚にしわや黄変が発現すると考えられている。
化粧品は、古くから、種々の植物由来成分を原材料として製造され、使用されてきているが、最近では、プラセンタ、スクワラン、コラーゲン等の動物由来成分を配合した化粧品が、加齢による皮膚の衰え、例えば、皺や小皺の形成を防ぎ、保湿性を改善すること等を目的として、多数市販されている。
また、同様の目的に、細胞の培養上清を含有する化粧品等も開発されるようになっており、ヒト肺の平滑筋細胞、上皮細胞、繊維芽細胞等を培養し、その細胞破砕物又は培養上清を化粧品用組成物として使用することが提案されている（特開2005−336188号公報参照、以下、従来技術１という）。【０００３】
一方、こうした細胞の培養上清ではなく、ヒトの骨髄や歯髄等から得た幹細胞を、神経疾患治療用医薬組成物として用いる方法も知られている（ＷＯ  02/086108号公報参照、以下、従来技術２という。）。
また、ヒトの脱落乳歯の歯髄幹細胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth; SHED）の培養上清を、損傷部の治療用組成物として使用することが提案されている（国際公開WO 2011/118795号公報参照、以下、従来技術３という。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2005-336188
【特許文献２】国際公開  WO  02/086108号公報
【特許文献３】国際公開  WO  2011/118795号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術１では、白血病阻害因子（Lymphoma inhibition factor: LIF）、LIF類似体、又はLIF模倣体（以下、集合的に「LIF等」という。）を、化粧品用組成物に配合する技術が提案されている。従来技術１は、LIFを含有する培養上清を凍結保存されていた表皮細胞に添加すると、質の良い表皮細胞がin vitroで形成されるという点では優れたものである。
しかし、in vitroの実験結果が、そのままin vivoでの実験にも反映されるという保証がないため、化粧品に配合した場合の効果が実証されていないという問題がある。
また、従来技術２は、通常の細胞よりも増殖能の高い幹細胞を使用しており、それらの産生する生体因子を利用できるという点では優れた技術である。【０００６】
しかしヒト由来の幹細胞を使用しているため、（ａ）加齢とともに採取可能な幹細胞数が減少する、（ｂ）加齢に起因して遺伝子の変異が蓄積されるため、幹細胞を移植する場合の安全性が必ずしも担保されない、（ｃ）骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）の数、増殖能及び分化能は年齢と共に低下するため、幹細胞とはいっても細胞増殖能が低い、（ｄ）骨髄穿刺によって幹細胞を採取することは生体への侵襲度が大きく、危険を伴う、といった問題を抱えている。また、ヒトの細胞を使用することは、十分な幹細胞リソースの提供が難しいことに加えて、倫理面でも問題が多い。【０００７】
従来技術３は、ヒトの歯髄幹細胞の培養上清を使用しているため、細胞自体を使用する場合よりも安全性が高いという点では優れた技術である。
しかし、従来技術２と同様、医療廃棄物と言われる脱落歯とはいえ、ヒトの細胞を使用していることから、倫理面での問題があり、また、十分な幹細胞リソースの提供が難しいという問題がある。【０００８】
一方で、多能性を有する幹細胞は、皮膚組織、骨組織、筋組織その他の種々の組織に分化させることができると考えられている。そして、老齢人口の比率が高くなっている現在、加齢に伴って発生する皮膚の損傷、すなわち、しみや皺の発生の予防等によって、皮膚を健康な状態に保つことに対する社会的な要請がある。また、年齢を問わず、薄毛、抜け毛等の毛髪に関する悩みを解決したいという社会的要請もある。
そして、ＵＶＢからのダメージを軽減させる、又は改善する効果の高い化粧品等に対する強い社会的な要請がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、以上のような課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成したものである。
すなわち、本発明の第１の態様は、非ヒト哺乳類の歯髄幹細胞、骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清粉末を主成分として含有する化粧品である。ここで、前記非ヒト哺乳類の幹細胞は、ブタ脱落乳歯の歯髄、ブタ骨髄、及びブタ脂肪組織からなる群から選ばれるいずれかの組織から得られたものであることが好ましい。また、前記培養上清粉末は、前記ブタ脱落乳歯歯髄、ブタ骨髄幹細胞、及びブタ脂肪細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清を、アルコール濃縮後、凍結乾燥して得られたものであることが好ましい。【００１０】
また、前記培養上清粉末は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも１種以上の成長因子を含有することが好ましい。
さらに、上記化粧品は、液剤、クリーム剤、軟膏剤、ジェル剤、乳液剤、及び硬膏剤からなる群から選ばれるいずれかの剤形であることが好ましい。
また、前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることが好ましい。【００１１】
本発明の第２の態様は、溶解剤を含む第１コンパートメントと、ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清粉末、ブタ骨髄幹細胞培養上清粉末及びブタ脂肪幹細胞培養上清粉末からなる群から選ばれるいずれかの情勢粉末と、担体とからなる有効成分組成物を含む第２コンパートメントと、前記第１及び第２コンパートメントの隔壁を貫通させるための棒状部材とを備える容器に格納された化粧品であって、使用直前に、前記棒状部材によって前記第１及び第２コンパートメントの隔壁に貫通孔を設け、前記有効成分組成物を前記生理食塩水に溶解させることを特徴とする化粧品である。前記溶解剤は、マイナスイオンチャージされている液体、生理食塩水及びはリン酸緩衝生理食塩水からなる群から選ばれるいずれかの液体であることが好ましい。
また、前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることが好ましい。【００１２】
本発明の第３の態様は、上述した化粧品をシート状の保湿性の部材に吸収させて、吸収させたい部位に載せ、プラスに帯電した電極を皮膚の所望の部位に接触させ、マイナスに帯電した棒状の電極を、前記シートの上を回転させながら移動させることを特徴とする、タンパク質のイオン導入方法である。
前記所望の部位は、腕、手、掌、脚、膝の裏、及び足の裏からなる群から選ばれるものであることが好ましい。【００１３】
本発明の第４の態様は、非ヒト哺乳類の歯髄幹細胞培養上清粉末、骨髄幹細胞培養上清粉末及び脂肪幹細胞培養上清粉末からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清粉末を有効成分として含有する皮膚形成促進剤である。ここで、前記非ヒト哺乳類の幹細胞は、ブタ脱落乳歯の歯髄、ブタ骨髄及びブタ脂肪組織からなる群から選ばれる組織から得られたものであることが好ましく、前記培養上清粉末は、前記ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清、前記骨髄幹細胞の培養上清及び前記脂肪幹細胞の培養上清からなる群から選ばれるいずれかの培養上清を、アルコール濃縮後、凍結乾燥して得られたものであることが好ましい。【００１４】
また、前記培養上清粉末は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも１種以上の成長因子を含有することが好ましい。
上記の皮膚形成促進剤は、液剤、クリーム剤、軟膏剤、ジェル剤、乳液剤、及び硬膏剤からなる群から選ばれるいずれか剤形であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ヒト幹細胞やその培養上清を含有する化粧品よりも安全で、かつ優れたしわ取り、美白等の効果、及び発毛、育毛等の効果を有する化粧品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、紫外線照射による皮膚の老化（光による皮膚の加齢）に対する、ブタ幹細胞の培養上清の皮膚再生効果を模式的に示す図である。
【図２】図２は、ブタ骨髄幹細胞（pBMSC）、ブタ歯髄幹細胞（pDPSC）及びブタ脱落乳歯歯髄幹細胞（pSHED）に、ブロモデオキシウリジン（BrdU）を取り込ませたときに、BrdUを取り込んだ細胞の割合を示すグラフである。図２中、*は、ｐ＜0.05を表わす。
【図３】図３は、光による皮膚の老化に対するブタ成長因子（pGF）の効果を示す顕微鏡写真である。図３（Ａ）はpGFを投与していない対照の皮膚、また、図３（Ｂ）はPGFを投与したときの皮膚から、後述するようにしてレプリカを形成し、各レプリカを顕微鏡で観察したときの像を示す顕微鏡写真である。
【図４】図４は、幹細胞培養上清未投与の対照群、ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清投与群（pSHED-CM）、及びブタ歯髄幹細胞投与群（pSHED）の、皮膚の光老化の状態を示すグラフである。
【００１７】
【図５】図５は、図４で示した各群のマウスの皮膚の状態を示す組織染色像である。図中、上側の矢印は表皮を、下側の矢印は真皮をそれぞれ表わす。
【図６】図６は、ＵＶ照射をしていない皮膚の細胞（陰性対照）、ＵＶ照射をした皮膚の細胞（UVS、光老化をした皮膚細胞）、光老化後ブタ成長因子を投与した皮膚細胞（PGF）を示すグラフである。図６中、**は、ｐ＜0.0１を表わす。
【図７】図７は、ブタ骨髄幹細胞（pBMSC）及びブタ歯髄幹細胞（pSHED）の培養３日目、及び７日目の細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
【００１８】
【図８】図８は、試験開始前後のシミの状態を示す写真である。図８（Ａ）は試験開始前、図８（Ｂ）は試験終了後（６月後）のシミの状態を示す。
【図９】図９は、試験開始前後の額のシワの状態を示す写真である。図９（Ａ）は試験開始前、図９（Ｂ）は終了後（１２月後）の額のシワの状態を示す。
【図１０】図１０は、試験開始前後の皮膚から、図３と同様にして作成したレプリカの観察像を示す顕微鏡写真である。図１０（Ａ）は試験開始前、図１０（Ｂ）は試験終了後の状態を示す。
【図１１】図１１は、試験開始前の毛髪の状態を示す写真である。
【図１２】図１２は、試験開始１４日後の毛髪の状態を示す写真である。
【００１９】
【図１３】図１３は、試験開始前の頭皮の状態を示す写真である。
【図１４】図１４は、試験開始３日後の頭皮の状態を示す写真である。
【図１５】図１５は、試験開始５日後の頭皮の状態を示す写真である。
【図１６】図１６は、試験開始７日後の頭皮の状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の化粧品で使用するブタ歯髄幹細胞培養上清粉末は、以下のようにして得ることができる。
まず、ブタの顎は、屠殺直後の食肉用のブタの下顎及び下顎歯を使用することが好ましい。ここで、屠殺食後のものが好ましいのは、得られる細胞の鮮度がよいからである。また、食肉用のものが好ましいのは、歯髄の入手が容易であること、ウイルスや菌に感染しておらず安全性が高いこと、及び低コストだからである。また、生後３月〜12月のブタであることが、下顎及び下顎歯から得られる幹細胞の数の面から好ましく、生後５〜６月のブタであることがさらに好ましい。
【００２１】
まず、入手した屠殺直後の食肉用ブタの下顎歯と顎骨とを、−40〜−30℃で冷蔵して搬送するが、例えば、保冷剤入りのアイスボックス（-30℃）等を使用することができる。
次に、この下顎全体の表面を殺菌するために、例えば、イソジン等の消毒薬を用いて消毒を行う。その後、例えば、歯科用のダイヤモンドポイント等を用いて、歯冠を水平方向に切断し、次いで、髄腔に沿って垂直方向に切削する。このように切断することによって、歯の天蓋をスムーズに除去することができる。その後、以上のように処理した歯冠及び歯根部の双方から、歯髄を、例えば、歯科用手用スケーラー、歯科用手用ファイル等を用いて採取する。
【００２２】
得られた歯髄を、例えば、眼下用穿刀等を用いてチョッピングし、所望の血清や抗生物質を含有する基本培地に懸濁する。ここで使用する基本培地としては、５〜20%（v/v）のウシ血清、５×103〜５×104Ｕ/mLのペニシリン及び５〜50mg/mLのストレプトマイシンを１％（v/v）添加したダルベッコ変法イーグル培地等を挙げることができる。
次いで、所望の濃度のコラゲナーゼとディスパーゼとを含む酵素溶液を調製し、これを用いて歯髄細胞を単離する。例えば、１〜５mg/mLのコラゲナーゼとディスパーゼとを含む酵素溶液に懸濁し、35〜38℃の恒温槽中に、30分〜1.5時間、細胞を処理する。
その後、２〜５分間、好ましくは３分間、遠心操作（例えば、約1,500rpm（約1,000×ｇ））を行って、酵素処理により単離された歯髄細胞を回収する。このとき、セルストレーナーによる細胞選別はSHEDやDPSCの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるため、使用しないことが望ましい。
【００２３】
また、脂肪幹細胞は、以下のようにして得ることができる。細胞の鮮度が高く、また、入手が容易であるため、ブタの腸間膜の脂肪組織を使用する。搬送条件は、食肉用ブタの下顎歯及び顎骨の場合と同様である。まず、屠殺直後の食肉用のブタの腸間膜の脂肪組織を採取し、集める。次いで、得られた脂肪組織についている他の組織を取り除き、細胞をメスやはさみ等でミンスする。
次いで、所望の血清や抗生物質を含有する基本培地に懸濁する。ここで使用する基本培地は、上記の通りである。引き続き、歯髄幹細胞を調製する場合と同様に、上記のようにして、所望の濃度のコラゲナーゼとディスパーゼとを含む酵素溶液を調製し、これを用いて脂肪幹細胞を得る。
【００２４】
次いで、単離された歯髄細胞、骨髄細胞又は脂肪細胞を、所望の培地を用いて培養し、培養上清を得る。例えば、得られた細胞を２〜８mLの上記基本培地に再懸濁し、適当な大きさの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。例えば、直径６cmの上記ディッシュに播種し、培養液（例えば、10%FCS含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium））を添加した後、５％CO2存在下にて、約35〜38℃に調整したインキュベータ中で、約10日〜20日程度培養する。
培地の除去後、PBS等を用いて細胞を1〜数回洗浄する。以上の操作（培地の除去及び細胞の洗浄）に代えて、コロニーを形成した接着性細胞を回収することにしてもよい。この場合には、例えば、0.01〜0.1％トリプシン及び２mMのEDTAを含む溶液にて、５分間、37℃で処理し、ディッシュから細胞を剥離させる。剥離した細胞を回収することによって、付着性の幹細胞を得ることができる。
【００２５】
引き続き、選抜した接着性細胞を培養する。例えば、細胞を上記と同様の付着性細胞培養用ディッシュに播種し、同様の条件下で培養し、必要に応じて継代を行う。例えば、肉眼で観察して、サブコンフルエント（培養容器の底面の約70％が、付着した細胞で覆われている状態）又はコンフルエントに達したときに、上記と同様の処理を行って細胞を培養容器から剥離させて回収し、再度、適当な量の新鮮な同一組成の培養液を含む培養用容器に播種する。継代培養は、必要な細胞数に達するまで、繰り返し行うことができる。例えば、継代培養を１〜８回行うと、細胞数は約1×107個/mLまで増加する。
以上のような培養を行った後に、細胞を回収し、例えば、液体窒素中で保存することにしてもよい。
【００２６】
培養初期は、サブコンフルエントになるまで、必要に応じて、例えば、週２〜３回の頻度で培地を交換する。サブコンフルエントとなった培養フラスコの上清をアスピレータ等を用いて除き、細胞0.01〜0.1％（v/v）のトリプシンを含むHepes溶液をあてて、フラスコの底面から剥離させる。ここに新鮮な培地を適量加えて、剥がれた細胞を懸濁し、滅菌済みの遠心チューブに移す。次いで、800〜1,200×ｇ（約1,500rpm）にて、室温で、２〜５分間、好ましくは３分間遠心する。例えば、0.05％トリプシンを含むHepes溶液を調製し、この溶液を、培地を除去したフラスコに少量加えて底面全体に行き渡るようにし、細胞が剥がれたところで、約５〜８ｍLの新鮮な培地を加えて、約1,500rpmで３分間、室温に遠心分離し、濃縮することができる。濃縮した細胞溶液１ｍLあたりの濃度をバイアブルカウントよって求め、新鮮培地約10〜40ｍLを加えた培養フラスコに約10〜40ｍLを添加して、継代培養し、ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞（pSHED）、骨髄幹細胞又は脂肪幹細胞を得る。
【００２７】
また、ブタの下顎骨体部の下顎前歯部の舌側に、例えば、歯科用ダイヤモンドポイント等で穿孔する。この穴に、例えば、18Gの注射針をつけたシリンジ等を挿入して、骨髄を吸引する。採取した骨髄は、上述したようにサブコンフルエントになるまで培養し、培養フラスコの底面から剥離して遠心により分離して継代培養し、ブタ骨髄幹細胞（pBMSC）を得る。
【００２８】
以上のようにして得られた幹細胞は、間葉系由来の体性幹細胞である、乳歯歯髄幹細胞、骨髄幹細胞又は脂肪幹細胞である。これらの幹細胞の培養上清中には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）−１及び−３、ＴＧＦ−α、ＫＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＳＰＡＲＣその他のサイトカインが分泌されることから、これらの幹細胞を使用することが好ましい。
【００２９】
本発明で使用する幹細胞培養上清を得るため使用する幹細胞は、食用のブタから得られるものであることが、細胞自身の安全性が高いこと、ヒトの組織から採取する必要がないため、こうした採取による侵襲の問題がないこと、及び得られた細胞を利用する際の倫理的な問題もないという大きな利点がある。
また、上記幹細胞の培養上清（pSHED-CM）は、上述したＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ及びＴＧＦ−βからなる群より選択された２つ以上の組み合わせを含むことが、コラーゲンの再形成能の高さの点から好ましい。
なお、上述した幹細胞培養上清に、１以上の公知の対応するサイトカインを添加して使用することもできる。
【００３０】
上記幹細胞上清は、上記の幹細胞を所定の条件で培養し、その後、遠心分離等によって細胞を除去することによって得られる。こうして得た培養上清に、例えば、遠心、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結乾燥、脱塩その他の各種処理を行い、それらを使用することもできる。例えば、ドライアイス−アセトン中で凍結させた後に乾燥させると、上記培養上清の凍結乾燥粉末を得ることができる。
【００３１】
幹細胞の培養液には、基本培地又は基本培地に血清等を添加した培地を使用することができる。基本培地としては、上述したDMEMの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM；GIBCO社製等）、ハムF12培地（HamF12；SIGMA社製、GIBCO社製等）、RPMI1640培地等を用いることができる。また、二種以上の基本培地を併用する混合培地を使用することもできる。混合培地の一例として、IMDMとHamF12を等量混合した培地（例えば商品名：IMDM/HamF12（GIBCO社製）として市販される）を挙げることができる。
【００３２】
また、培地に添加することができる成分としては、例えば、血清（ウシ胎仔血清、ウマ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
なお、血清を含まない上述した「幹細胞の培養上清」を得るためには、幹細胞培養の全過程を通して、又は最後若しくは最後から数回の継代培養の際に、無血清培地を使用することが好ましい。上記幹細胞の培養は、通常用いられる条件をそのまま適用して行うことができる。
【００３３】
本発明の化粧品に含まれるpSHEDは、その中に上述したように各種の成長因子を含む。このため、皮膚に塗布等することによって、これらの成長因子を経皮吸収させることができる。本発明の化粧品に添加することができる成分としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えば、ボルヒール（登録商標））その他の有機系生体吸収性材料；ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリン糊その他の生体親和性が高いゲル化材料を挙げることができる。また、製剤学的に許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等）を添加することもできる。
【００３４】
ここで使用するコラーゲンは、可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）のものであることが、本発明の化粧品への適合性の点から好ましい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができ、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができ、乳化剤としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガントゴム等を用いることができる。懸濁剤としては、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。
【００３５】
安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができ、保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。これら以外にも、ｐＨ調整剤等を含有させることもできる。
本発明の化粧品の最終的な形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、ローション、ゲル、クリーム等にすることができる。
また、前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることが好ましい。
【００３６】
上述した化粧品の製造方法は特に限定されず、例えば、ブタの下顎を使用する場合には、以下のようにして製造されることが好ましい。
まず、上述したようにして得られたブタの下顎から歯髄幹細胞を得る。ブタの下顎に代えて脂肪組織を使用し、上述したようにして脂肪幹細胞を得る。次いで、例えば、無血清培地を用いて上述した条件の下に歯髄幹細胞を培養し、例えば、スポイトやピペット等を用いてそれらの培養上清を回収する。回収した培養上清は、そのまま使用してもよく、又は、遠心、濃縮、透析、凍結乾燥、希釈、及び脱塩等のうちから一以上の処理を行った後に使用することもできる。
なお、後述する実施例に示す通り、得られた幹細胞の培養上清は、高度な精製を行わない状態でも、所望の作用を示す。このことは、本発明の化粧品に使用する組成物を、簡便かつ迅速に製造できることを意味しており、精製中に生じ得る活性の低下を回避できるというメリットもある。
【００３７】
上記のようにして得られた培養上清は、まず、タンパク量を測定し、その後コラーゲンの精製活性を測定して、比活性を求める。比活性を指標とすることにより、品質を一定に保つことができるからである。
比活性が低い場合には、スピンカラム濃縮又はエタノール沈殿により、濃縮をすることができる。スピンカラム濃縮を行う場合には、そのカラムにかけることができる最大量の培養上清を所望のスピンカラムへ移し、3,000×g〜5,000×gで約30〜90分間遠心する。得られた濃縮培養上清と同量の無血清の溶媒を、このチューブに加え、再度3,000×g〜5,000×gで約30〜90分間遠心することによって、培養上清の溶媒を無血清の溶媒に交換することができる。
例えば、スピンカラムとして、Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K（ミリポア社製）を使用する場合、ロードできる最大量は15mLである。このため、約15mLの培養上清をロードし、4,000×gで約60分間、４℃にて遠心すると、200μLまで濃縮することができる。200μLまで濃縮した培養上清と同量の滅菌PBSを加え、再度、4,000×gで約60分間、４℃にて遠心し、培養上清の溶媒をPBSに交換する。得られた溶液をマイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。最終的に得られる量が約200μLとなった場合には、濃縮度は75倍となる。
【００３８】
また、エタノール沈殿の場合には、例えば、以下の手順で行う。まず、ある量の培養上清に対して、９倍容の100%エタノールを加えて混和し、約-10〜30℃で30〜90分間放置する。次いで、約４℃にて、10,000〜20,000×gで約10〜20分間遠心する。上澄みを除去し、１／５溶の90%エタノールを加えてよく攪拌する。引き続き、約４℃にて、10,000〜20,000×gで３〜10分間遠心する。上澄みを除去し、得られたペレットを、所望の量の滅菌水、例えば、500μLの滅菌水に溶解してマイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清を得ることができる。
例えば、５mLの培養上清に対して45mLの100%エタノールを加えてよく混和し、−20℃で60分間静置する。次いで、４℃にて、15,000×gで15分間遠心し、上澄みを除去する。その後、10mLの90%エタノールを加えてよく攪拌する。再び、４℃にて、15,000×gで５分間遠心し、上澄みを除去する。得られたペレットを滅菌水500μlに懸濁させ、マイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。この場合、最初に用いた培養上清が５ｍLであれば、濃縮度は10倍となる。
【００３９】
また、本発明の化粧品に使用する幹細胞の培養上清は、以下のようにして凍結乾燥品とすることもできる。まず、上記ようにして得られた幹細胞の培養上清又は濃縮幹細胞培養上清を、約50〜150mLの容量の容器に一定量ずつ入れ、サンプルチューブの蓋を締めて、約−100℃〜約−60℃で、２時間から半日かけて凍結させる。これらの上清が凍結した後に、サンプルチューブの蓋を開け、凍結乾燥機へセットする。次いで、１〜２日間、凍結乾燥を行い、得られた試料を凍結乾燥幹細胞培養上清とする。この凍結乾燥幹細胞上清は、約−100℃〜−60℃で保存することができる。
例えば、50mLの容量のバイアルビン（ゴム栓付き）８本に約20mLずつ培養上清を入れて、ゴム栓をし、約−30℃で数時間かけて凍結させる。次いで、このバイアルビンの蓋を開け、凍結乾燥機（ヤマト科学（株）製、DC41A）へセットする。次いで、試料が乾燥するまで凍結乾燥を行い、凍結乾燥培養上清を得ることができる。
以上の操作によって、良好な保存安定性を有する培養上清の凍結乾燥品が得られる。
【００４０】
上記の化粧品を、イオン導入法によって皮膚から導入する場合には、前記化粧品をシート状の保湿性の部材に吸収させて、吸収させたい部位に載せ、プラスに帯電した電極を所望の部位に接触させ、−に帯電した棒状の電極を、前記シートの上を回転させながら移動させる。
ここで、前記所望の部位は特に限定されないが、例えば、腕、手、掌、脚、膝の裏、及び足の裏からなる群から選ばれるものであることが、プラスに帯電した電極を安定して接触させることができるために好ましい。
上記シート状の保湿部材としては、不織布で作られた市販のパック用のシート、ガーゼ、コットン等を使用することができる。上述した化粧品が液状又は乳液状である場合には、上記シート状の保湿部材に含浸させて使用すればよい。また、上述した化粧品が、クリーム又はジェルである場合には、皮膚に塗布しその上にこうした保湿部材を載せることとすればよい。
【００４１】
以下に、上記化粧品が化粧水である場合を例に挙げて説明する。
まず、上記の培養上清粉末を、適当な量の生理食塩水等に溶解させて粉末溶解液とし、これを保湿部材から滴り落ちる程度に含浸させる。次に、この保湿部材を所望の部位、例えば、顔全体に載せ、体の一部をプラスに帯電した電極に接触させる。例えば、一方の手でプラスに帯電した電極を握る。
ついで、マイナスに帯電したローラーを保湿部材の上に載せ、ゆっくりと保湿部材上を転がす。このとき、特に力を入れる必要はない。上述した粉末溶解液中に含まれる成長因子は、いずれも負に帯電しているため、ローラーのマイナス荷電と反発し、プラスに帯電した電極側に移動する。この移動によって、成長因子が皮膚から吸収される。
【００４２】
また、上記化粧品は、上記の溶解液をプラスチック製又はガラス製のボトル、プラスチック製又はガラス製のスポイト付きのボトル、細い排出口のついたプラスチック製容器等、種々の容器に保存して使用することができるが、頭皮用又は毛髪用の化粧品とする場合には、細い排出口のついたプラスチック製容器を使用することが、頭皮に付着させる上で好適である。
頭皮及び毛髪に上記化粧品を付着させ、頭皮全体にまんべんなくいきわたらせた後に、上記と同様にしてイオン導入を行う。その後、プラスチック製のフィルム、例えば、ポリエチレンフィルム、等を用いて頭髪全体を包み、パックを行う。
上記のいずれの場合も、蒸気を発生させる装置を、頭部から所定の距離に置き、蒸気を噴霧するようにすると、導入効率が高い。
【００４３】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
また、この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。以下に、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００４４】
ブタSHED/BM/脂肪組織由来の成長因子の製造及び品質評価
＜材料及び方法＞
（１）細胞の分取及び培養
食肉公社（日本国愛知県名古屋市港区）より、生後５〜６ヶ月のブタの顎骨（下顎歯のついた下顎骨）及び腸間膜を入手した。屠殺直後の食肉用ブタの下顎歯、顎骨及び腸間膜は、保冷剤入りのアイスボックス（-30℃）にて搬送した。
上記のブタの歯と下顎骨とから、以下の手順に従って、ブタの歯髄幹細胞（SHED）を得た。【００４５】
搬送したブタの歯と下顎骨をイソジンで消毒し、その後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、下顎骨についている下顎歯の歯冠を水平方向に切断し、次いで、髄腔に沿って垂直方向に切削して天蓋を除去した。このように処理した歯冠及び歯根部より、歯科用手用スケーラーを用いて歯髄を採取した。
得られた歯髄を眼下用穿刀を用いてチョッピングし、２mg/mLのコラゲナーゼ溶液に懸濁した。この懸濁液を、37℃の恒温槽中に１時間おき、細胞を単離した。単離した細胞を10％FBS及び１％Anti-Anti（Invitrogen社製, Carlsbad, CA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；SIGMA社製, St. Louis, MO）中にて、37℃、５％CO2の条件下で、継代用の細胞を得るために予備培養した。【００４６】
まず、培養初期は、サブコンフルエントになるまで、週２〜３回の頻度で培地を交換ながら培養した。サブコンフルエントとなった細胞を、0.05％トリプシンを含むHepes溶液を用いて剥離させ、1,500rpmで、室温にて、３分間遠心分離して集めた。新鮮な培地に得られた細胞を移し、上記と同様の条件の下に、全量を用いて継代培養を行った。
ブタ骨髄（BM）は、ブタの下顎骨の下顎骨体部皮質骨から得た。まず、前記の下顎前歯部舌側を歯科用ダイヤモンドポイントで穿孔し、この穴に18Gの注射針を付けた５mLのシリンジを挿入して骨髄を吸引し、採取した。採取した骨髄を、10％ウシ血清、100U/mLのペニシリン及び100μｇ/mLのストレプトマイシンを含有するDMEM中に移して、上記と同様の条件下に予備培養し、ついで、上記DMEM中で、37℃、５％CO2の条件下でサブコンフレントになるまで培養した。上記の添加量は、すべて終濃度で表示した。【００４７】
ブタSHEDと同様に、上記の0.05％トリプシン溶液を使用して剥離し、1,500rpmで３分間遠心分離し、継代培養した。
ブタの腸間膜から、解剖用はさみ及び穿刀にて脂肪組織を切り出して集め、余分な組織を除去し、生理食塩水中で血液を洗い流した。これ以外は、上記と同様にして脂肪細胞を単離させ、脂肪幹細胞を得た。【００４８】
（２）細胞の増殖状況の分析
BrdU染色キット（Invitrogen社製, Carlsbad, CA）に添付された取扱説明書に従って、ブロモデオキシウリジン（BrdU）を、上記のようにして得られたSHED又はBMに取り込ませ、それぞれの細胞の12時間における増殖速度を評価した。各群の試料１つについて３枚のスライドを準備し、これらを用いて評価を行った。この実験を５回繰り返した。１元配置分散分析後に、テューキー−クレイマー検定（Tukey-Kramer test）によって有意差検定を行った。【００４９】
STRO-1の免疫蛍光染色を行うために、ブタSHED又はブタBMを、３％パラホルムアルデヒドで固定した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２回リンスし、100mMのグリシン溶液で20分間処理した。次いで、0.2％のTriton-X（Sigma-Aldrich社製, St. Louis, MO）溶液で、これらの細胞を30分間、室温にて透過処理した。その後、５％のロバ血清及び0.5％のウシ血清アルブミンを含有するPBSを加え、この溶液中で、20分間、37℃にてインキュベートした。【００５０】
次に、一次抗体のマウス抗ヒトSTRO-1抗体（いずれも、R&D社製, Minneapolis, MN）と細胞とを１：100の割合となるように混合し、PBS中で１時間、室温でインキュベートした。次いで、PBSを吸引によって除去し、二次抗体のヤギ抗マウス免疫グロブリンM-FITC抗体（Southern Biotech社製, Birmingham, AL）とこれらの細胞とを、１：500となるように混合し、30分間、37℃でインキュベートした。その後、ベクタシールドとDAPI（Vector Laboratories Inc社製, Burlingame, CA）とを用いてマウントした。【００５１】
（３）動物実験（図１参照）
５週齢の雌無毛マウス（Hos;HR-1）はSLC社（SLC Inc.社製, 日本国、静岡）から提供された。全マウスを、温度及び湿度を制御した条件（22±１℃、湿度50％）下に、12時間明暗サイクルに置いた。これらの動物には、水及び固形飼料を自由に摂取させるようにし、放射線の暴露中、各動物がケージ中を自由に移動できるようにした。観察は、毎日行った。UVB放射装置ＲＭＸ−３Ｗ（Handok Biotech社製, Seoul, Korea）を用いて、マウスの背中に１週間に５回、ランプから動物の背中までの距離を89cmとして10週間照射した。この照射は、10個のＳＥランプ（（株）東芝製）で列を構成し、UVB用のフィルター処理なしで行った。照射する放射線の波長のピークは312nm付近とした。また、照射量は、290〜320nmの波長を持つ放射線の照射量が、UVB全量の55％に相当する量となるようにした。【００５２】
照射線量は、最初の２週間は1MED（最小紅斑量；60mJ/cm2）、３週目は2MED（120mJ/cm2）、４週目は３MED（180mJ/cm2）、５〜８週目は４ＭＥＤ（240mJ/cm2）とした。全ＵＶＢ線量は約115MED（6.9J/cm2）として、しわ形成を誘導した。
しわ誘導後５週間で、マウスの背中の限定的な領域に、pSHED-CM（100％）を皮下注射した。陽性対照として、PBSに懸濁したブタSHED（４×105）を直接真皮に注射し、陰性対照としてPBSのみを直接皮下に注射した。【００５３】
（４）ブタSH-CMの調製
ブタSHED（４×105細胞）をDMEM/F12（Invitrogen-Gibco-BRL社製, Grand Island, NY）無血清培地中、37℃、５％CO2の条件下で培養した。培養72時間後にブタSHEDの培養上清を回収し、300×ｇで５分間、室温にて遠心し、孔径0.22mmのシリンジ用フィルター（ミリポア社製）を用いて濾過した。【００５４】
（５）皮膚レプリカ及び画像解析
しわ誘導時及び上記の注射を行った１週間後に、シリコーン系印象材フレックスタイム１（Flextime 1；Heraeus Kulzer社製, New York, NY）を用いて背中の皮膚表面のネガ型レプリカを取った。同じ皮膚領域からしわのレプリカを得るために、油性マーカーペンで皮膚に印を付けた。【００５５】
皮膚にブタSH-CM及びブタSHEDを最後に注射してから５週間後に、印をつけた領域から印象を取った。測定し易いように、全レプリカを１ｃｍ四方に切り、同じ印象材を用いて各レプリカの裏を平坦な面に加工した。208°の角度で光を当て、CCDカメラを用いてレプリカから画像を取り込んだ。
ネガ型レプリカの画像を、しわ解析装置スキン・ビジオメーター（skin visiometer）SV 600（Courage & Khazaka社製, Cologne, Germany）を用いて観察した。皮膚のしわの評価に用いたパラメータは、単位面積当たりのしわの数、深さ、及びしわの面積とした。【００５６】
（６）組織学的解析
背中の皮膚（１cm×１cm）を10％（v/v）のホルマリンを含有する中性の緩衝溶液で固定した。次いで、ポリエステルワックス中に包埋し、６mmの切片を作製した。切片をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）にさらし、マッソントリクローム染色を行った。
まず、ヘマトキシリン＆エオシン染色（以下、「H&E染色」と略す）を行った。キシレン（レゾモール）で３槽、脱パラフィン処理を行った。純エタノールで４槽、脱水を行い、流水で３分間洗浄した。次いで、マイヤーヘマトキシリン液に５分間浸漬して核を染色し、約45℃の流水で３分間、水洗した。【００５７】
次に、エオシン液に５分間浸漬し、その後」、純エタノールで４槽、組織の脱水を行い、キシレンで４回処理し、ソフトマウントし、透徹・封入処理を行った。
引き続き、マッソントリクローム染色を行った。ヘマトキシリン＆エオシン染色と同様に切片の脱パラフィンを行って水洗した。10%トリクロロ酢酸（和光純薬工業（株）製、特級）水溶液と10%重クロム酸カリ（和光純薬工業（株）製、特級）水溶液との等量混合液を用いて、第１媒染を行った。次に、３分間水洗し、蒸留水で１分間洗浄した。
1.0ｇのヘマトキシリン（MERCK社製）を含む100mLの95%エタノール（A液）と、２ｇの塩化第二鉄と１mLの塩酸及び95mLの蒸留水を含むB液（いずれも和光純薬工業（株）製、特級）とを使用時に混合してワイゲルトの鉄ヘマトキシリンとし、10分間ここに浸漬した。次いで、10分間水洗した。【００５８】
2.5%リンタングステン酸（和光純薬工業（株）製、特級）水溶液と2.5%リンモリブデン酸（和光純薬工業（株）製、特級）水溶液とを等量混合し、１分間、この溶液中に浸漬して第２媒染を行った。次いで、0.75%オレンジG（和光純薬工業（株）製、1級）液に、２分間浸漬した。１％酢酸水２槽処理を行った。
次いで、ポンソー・キシリジン（CHROMA社製）を１％酢酸水に１％の割合で溶かした溶液を２倍容，酸性フクシン（和光純薬工業（株）製、化学用）を１％酢酸水に１％の割合で溶かした溶液を1容の割合で混和し、ポンソー・キシリジン・酸フクシン液を調製し、この溶液に20分間浸漬した。１％酢酸水で２槽処理を行った。
引き続き、2.5％リンタングステン酸溶液に７分間浸漬し、１％酢酸水で２槽処理を行った。次いで、アニリンブルーで間染色し、１％%酢酸水溶液で２槽処理を行い、イソプロパノールに１枚ずつ浸漬して、ヘマトキシリン＆エオシン染色と同様に透徹・封入処理を行った。【００５９】
（７）ヒト真皮中の皮膚線維芽細胞（HDF）の培養及びUVB照射線量
10％のウシ胎児血清、100Ｕ/mLのペニシリン、及び100mg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEM中で、５％CO2、37℃の条件下でHDFを培養した。無血清培地中で24時間培養した後に、培養フラスコ中の細胞をPBSで洗浄し、３〜４滴のPBSと一緒に、50〜250mJ/cm2の範囲となるようにUVBに暴露した。UVB照射は、上述したUV光源（Waldmann社製, Schwenningen, Germany）を用いて行った。照射後すぐに、PBSを吸引除去して完全培地に置き換えた。UVB照射線量は、最終的に、以降の実験用に70mJ/cm2に固定した。【００６０】
（８）細胞増殖アッセイ
96ウェルプレートの各ウェルに、HDFを５×103細胞／ウェルで播種し、CCK-8キット（Dojindo社製, Gaithersburg, MD）を用いてHDFの増殖速度を測定した。無血清培地で24時間培養した後、ブタSH-CMと一緒に又はブタSH-CMなしで、HDFを24時間連続培養し、次いで、UVB（70mJ/cm2）に90秒間暴露した。
引き続き、UVB照射細胞を完全培地中で24時間培養して回収した。HDF-Ｆを10mLのCCK-8溶液に入れ、３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（TECAN社製, Gro¨ dig, Austria）を用いて450nmの吸収を測定した。
対照群を用いて作成した標準曲線に基づき、各ウェルのOD値から細胞数を求めた。【００６１】
（９）ウェスタンブロット解析
HDF（２×104細胞／ウェル）を24ウェルプレートに播種し、前述したように前処理を行った。次いで、RIPA緩衝液（0.15MのNaCl、１mMのEDTA、１％のTriton X-100、１％のSDS、50mMのNaF、１mMのNa3VO4、５mMのジチオスレイトール、１mg/mLのロイペプチン、及び20mg/mLのPMSFを含む50mMのTris-HCl(pH 7.4)）中で、細胞を溶解させた。この細胞溶解液のタンパク量をビウレット試薬を用いて測定し、50μｇのタンパク質を８％SDS-ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）電気泳動に供した。SDS-PAGE終了後、ゲル電気泳動の泳動パターンを、PVDF膜に転写した。
この膜を、Ｉ型コラーゲンに対する抗体（Santa Cruz社製, Saint Louis, MO）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（MMP-1）に対する抗体（Calbiochem社製, Darmstadt, Germany）と一緒に、室温で15分間インキュベートした。次いで、このPVDF膜を、PBSを用いて洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ヤギIgG抗体（１：100,000、Santa Cruz社製, Saint Louis, MO）と一緒に、室温で15分間インキュベートした。この後、免疫グロブリンウェスタン試薬でブロッティングし、Ｘ線フィルムを重ねて感光させた。【００６２】
＜結果＞
（１）pSHED及びpBMSCの特徴解析
pSHED及びpDPSCはpBMSCと同様な線維芽細胞の形態を示した。免疫蛍光の解析から、pSHED及びpBMSCがSTRO-1陽性細胞を含むことが示された。また、pSHEDの増殖速度は、pBMSCよりも有意に速いことが示された（図２参照）。【００６３】
（２）UVにより誘導されたしわのブタSHED-CMによる軽減
UV暴露期間中、マウスの皮膚の細かいしわを観察した。処置中、pSHED-CM処置群及びpSHED注射群は、PBSのみを注射したPBS投与群よりも、しわが少ないようことが観察された（図３（Ａ）及び（Ｂ）参照、各群についてｎ＝８）。
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）にpSHED-CMの反復投与によって軽減されたことが示された（図中、pSHED-CMの反復投与群は、「pGF」と示した。）。pSHED注射群もpSHED-CM群と同じ傾向を示した。
図４に示すように、スキン・ビジオメーターSV 600でレプリカのしわのパラメータを測定したところ、天然レベルのpSHED-CM（100％）を注射した時に、しわの全パラメータが有意に低下していた。また、pSHED処置は、pSHED-CM処置よりも高い有効性を示した。【００６４】
（３）組織学的観察
UVB照射無毛マウスでは、皮膚の付属器に大きな変化が見られたため、UVB照射無毛マウスでの真皮の厚さに対するpSHED-CMの影響を調べた。
図５に、ヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）による、ヘアレスマウスの皮膚の真皮厚さの組織染色結果を示す。図５（Ａ）〜（Ｃ）に示されるように、コラーゲン線維の量が（図中の上下の矢印で挟まれた部分）が、pSHED-CM処理群（図５（Ｂ）)とpSHED注入群（図５（Ｃ)）において、対照群に対し、有意に多くなっていた。
また、真皮厚みの測定から、pSHED注射群及びpSHED-CM処置群において、真皮厚みが有意に増加していることが示された（図５（Ｂ）及び（Ｃ)）。また、膠原線維束の顕著な増加が上記両群で観察されたが、対照群では観察されなかった（図５（Ａ））。【００６５】
（４）pSHED-CMによるHDFの増殖促進
ブタSHEDによる皮膚のしわの改善に関するパラクリン機構を調べるために、pSHED-CMと一緒に、上記と同様の条件で一次培養したHDFを用いて、細胞増殖アッセイを行った。図６に示すように、UVB照射によりHDFの増殖は有意に低下したが（図６中、「UVS」と表わす）、ブタSHED-CMによる前処理を行うと増殖の低下幅が減少し（図６中、「pGF」と表わす。）、pSHED-CMがHDFに対して保護効果を有することが示された。
上記pSHED-CMは多様な成長因子を含むため、上記ブタSHED-CMによる増殖促進は、pSHEDから分泌された成長因子が仲介するものであることが示唆された。
上記ブタSHED-CMは多様な成長因子を含むため、上記ブタSHED-CMによる増殖促進は、ブタSHEDから分泌された成長因子が仲介するものであることが示唆された。【００６６】
（５）Ｉ型コラーゲン及びMMP1の発現
上記ブタSHED-CM処置したヘアレスマウスにおいて、真皮中のコラーゲン含有量が有意に増加していた。このため、上記pSHED-CM処理後のHDF中におけるＩ型コラーゲン及びMMP1のタンパク質発現を調べた。UVB照射により、明らかにＩ型コラーゲンの発現量が低下し、MMP1の発現が誘導されて増加していた。
また、Ｉ型コラーゲンの発現量はpSHED-CM前処理後に有意に増加したが、逆に、MMP1の発現量pSHED-CM前処理後に低下していた。以上から、pSHED-CM処理を行ったヘアレスマウスの真皮で見られたコラーゲン含有量の増加は、真皮線維芽細胞中でコラーゲン合成が刺激されたこと、及びコラーゲン分解が抑制されたことによって生じたことが示された。
【実施例２】
【００６７】
ブタSHED/BM/脂肪幹細胞由来の成長因子混合物の製造及び品質評価
（１）成長因子混合物（粉末）の調製
上記ブタSHED、ブタBM又はブタ歯髄幹細胞を、ブタ成長因子（pGF）混合物の調製に用いた。10％FCSを含むDMEMを用いて、ブタSHED、ブタBM又はブタ歯髄幹細胞を２〜８代、継代培養し、培養ディッシュ中の細胞が80％コンフルエントになった段階で、10mLの上清（培養培地：CM）をサンプリングし、９倍容のエタノールを加えてエタノール希釈CMとした。このエタノール希釈CMを、−20℃で60分間インキュベートした後、50mL容量のスピンカラムに入れて、４℃にて15,000rpmで15分間遠心し、沈殿物を得た。この沈殿物を、90％エタノールで-20℃にて洗浄し、再度スピンカラムにかけて同様に遠心処理した。
以上のようにして濃縮した沈殿物を凍結乾燥し、成長因子を含む粉末を得た。【００６８】
（２）粉末中の成長因子
粉末中に含まれる各成長因子を、上述したウェスタンブロッティング法で解析した。検出された成長因子は、PDGF、VEGF、IGF、KGF、HGF、及びTGFであった。
（３）品質評価
細胞の培養時に、ブタ培養幹細胞又はブタ骨髄幹細胞の培養上清を加えた結果を図７（Ａ）〜（Ｄ）に示す。いずれも、増殖速度がこれらを加えない場合よりも速いことが観察された。
【実施例３】
【００６９】
非ヒト由来歯髄幹細胞の培養上清の皮膚に対する効果
（１）非ヒト由来歯髄幹細胞の培養上清の調製
実施例２で得られた非ヒト由来(ブタ)の歯髄幹細胞の培養上清液から１ｍＬをとり、凍結乾燥して粉末を得た。
この凍結乾燥粉末を、30ｍLの生理食塩水に溶解させて洗ビンに入れ、皮膚用試料１とし、皮膚に対する効果を検討した。【００７０】
（２）皮膚に対する試験の条件等
皮膚に対する試験は、以下の手順で行った。まず、被験者の皮膚の状態を確認し、被験者自身が、現在、どのような状態であると認識しているかについて、カウンセリングを行った。次に、試験開始前の顔全体の状態をカメラで撮影し（図８（Ａ）参照）、皮膚の状態をマイクロスコープ（200倍）で撮影した（図10（Ａ）参照）。
次いで、試料１の全量をフェイスパック用不織布１（富士紙化学（株）製、フェイスマスク）に含浸させた。この不織布を被検者の顔の上に載せ、実施時間20分／回、実施回数１〜２回／週、0.2〜1mAの条件でイオン導入を行った。
イオン導入中、顔全体に蒸気を当てられるように、スチーマー（タカラベルモント（株）製、ノアージュ）を顔から30〜50cm離れた位置に置いた。その後、フェイスパックを顔から外し、クリーム等で肌を整えて仕上げを行った。被験者は女性７名で、年齢は２０代〜７０代、平均４１歳であった。【００７１】
（３）効果
イオン導入を14回行った結果を試験後として、試験開始前と同様にマイクロスコープで皮膚の状態を確認した。試験前後の皮膚の状態を比較したところ、被検者の肌の色が、試験開始前に比べて全体的に白くなっていた。また、シミが薄くなるとともに（図８（Ａ）及び（Ｂ））、皺（図９（Ａ）及び（Ｂ））も薄くなっていた。
皮膚の状態をマイクロスコープで観察すると、明らかな変化が認められ、シワの部分のへこみが少なくなっていた（図10（Ａ）及び（Ｂ））。
ブタ歯髄幹細胞の培養上清を含む化粧品を使用することにより、しわを薄くする効果及び肌の色を白くする効果があることが示された。
【実施例４】
【００７２】
発毛及び育毛効果の検討
（１）非ヒト由来脂肪幹細胞の培養上清の調製
実施例２で得られた非ヒト由来(ブタ)の脂肪幹細胞の培養上清液から１ｍＬをとり、凍結乾燥して粉末を得た。
この凍結乾燥粉末を、30ｍLの生理食塩水に溶解させて発毛・育毛試験用の試料２とし、洗ビンに入れた。
（２）発毛・育毛試験の条件等
発毛・育毛用試験は、以下の手順で行った。まず、被験者の頭髪及び頭皮の状態を確認し、被験者自身が、現在、どのような状態であると認識しているかについて、カウンセリングを行った。次に、試験開始前の頭髪の状態をカメラで撮影し、また、頭皮の状態をマイクロスコープ（20〜200倍）で撮影した。図13〜16は200倍で撮影したものである。【００７３】
次いで、適量のクレンジングジェル（ナショナル・トータル・プロダクト（株）製、プレジャークレンジングジェル）を掌にとり、これを頭皮に塗布して頭皮のマッサージを行い、毛穴の周囲及び毛穴に詰まった汚れを浮き立たせた。引き続き、市販のシャンプー（（株）コスメ・ニスト製、プレジャーCシャンプー）を用いて浮き上がった汚れを落とした。汚れがひどい場合には、2回、シャンプーを行った。
その後、洗ビンの口を頭皮に接触させるようにして上記のように調整した試料２を頭皮に付着させた。また、毛髪にも付着させた。
実施時間は１５分／回、実施回数を週１〜２回、0.2〜1mAとしてイオン導入を行った。引き続き、ポリエチレンフィルムで頭皮及び毛髪全体をラップし、その上からタオルをターバンのように巻いて、10〜20分間パックを行った。その後、タオルとポリエチレンフィルムをはずし、タオルドライ又はドライヤーで仕上げを行った。被験者８名の内訳は、男性６名、女性２名（年齢：３０代〜５０代、平均３８歳）であった。【００７４】
上記のようにイオン導入を行った後は、被験者自身が、洗髪後のきれいな頭皮（地肌）に試料１又は２を適用することとした。地肌に容器の口の部分を押し付けて直接付着させ、その後手で地肌に擦り込むように、頭皮マッサージを２〜３分行った。また、毛髪に付着させた。
（３）発毛及び育毛効果
男性被験者の毛髪が、試験の前後でどのように変化したかを図１１〜１６に示す。
図１１は、試験開始時の頭髪の状態を示す。また、試験開始７日後の頭髪の状態を図１２に示す。図１１と１２とを対比すると明らかなように、目視でも頭髪が増加していることが確認された。
試験開始後の頭皮の変化を、図１３（試験開始前）、図１４（試験開始３日後）、図１５（５日後）、及び図１６（７日後）に示した。この観察の結果、試験開始３日後で発毛が確認され（図１４の矢印参照）、７日後には、ひとつの毛穴から、複数の毛髪が生えてきていることが確認された（図１６の矢印参照）。【００７５】
８人の被験者全員において発毛及び育毛効果が観察された。具体的には、新たに生えてきた毛髪は、白髪のある被験者の場合でも、白髪ではなく、黒い毛髪であった。また、いずれの被験者においても、毛髪の伸びが速く、毛髪自体も太いため、頭頂部の毛髪のボリュームが多くなっていた。
被験者のうち、最も早い時期に発毛があることが指先で感知されたのは、試験開始翌日（１日後）であった。
以上から、ブタ脂肪幹細胞の培養上清を含む化粧品を使用することにより、発毛及び育毛効果が顕著に表れたことが確認された。
【実施例５】
【００７６】
pSHED/pBMSC由来の成長因子を含有する化粧品の製造例を以下に示す。【００７７】
【表１】
2013118877.tif 000002
【００７８】
【表２】
2013118877.tif 000003
【００７９】
【表３】
2013118877.tif 000004
【００８０】
【表４】
2013118877.tif 000005
【００８１】
【表５】
2013118877.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は化粧品の分野で有用である。
【図１】
2013118877.tif 000007
【図２】
2013118877.tif 000008
【図３】
2013118877.tif 000009
【図４】
2013118877.tif 000010
【図５】
2013118877.tif 000011
【図６】
2013118877.tif 000012
【図７】
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【図８】
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【図９】
2013118877.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2013118877.tif 000018
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2013118877.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月10日(2013.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生後３月〜１２月のブタの脱落乳歯の歯髄から得られた歯髄幹細胞、ブタ骨髄から得られた骨髄幹細胞、及びブタ脂肪組織から得られた脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞を培養して得られる、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも２種以上の成長因子を含有する培養上清粉末を主成分として含有する化粧品。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記培養上清粉末は、前記ブタ脱落乳歯歯髄、ブタ骨髄幹細胞、及びブタ脂肪細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞の培養上清を、アルコール濃縮後、凍結乾燥して得られたものであることを特徴とする、請求項１に記載の化粧品。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
液剤、クリーム剤、軟膏剤、ジェル剤、乳液剤、及び硬膏剤からなる群から選ばれるいずれかの剤形であることを特徴とする、請求項１又は３に記載の化粧品。
【請求項６】
前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることを特徴とする、請求項５に記載の化粧品。
【請求項７】
溶解剤を含む第１コンパートメントと、生後３月〜１２月のブタの脱落乳歯の歯髄から得られた歯髄幹細胞、ブタ骨髄から得られた骨髄幹細胞、及びブタ脂肪組織から得られた脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞を培養して得られる、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも２種以上の成長因子を含有する培養上清粉末と、担体とからなる有効成分組成物を含む第２コンパートメントと、前記第１及び第２コンパートメントの隔壁を貫通させるための棒状部材と、前記溶解剤に溶解させた前記培養上清粉末を頭皮に付着させるための細い排出口とを備える容器に格納された化粧品であって、使用直前に、前記棒状部材によって前記第１及び第２コンパートメントの隔壁に貫通孔を設け、前記有効成分組成物を溶解剤に溶解させることを特徴とする化粧品。
【請求項８】
前記溶解剤は、マイナスイオンチャージされている液体、生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水からなる群から選ばれるいずれかの液体であることを特徴とする、請求項７に記載の化粧品。
【請求項９】
前記化粧品は、頭皮を含む皮膚又は毛髪に適用するものであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の化粧品。
【請求項１０】
請求項１又は７に記載の化粧品をシート状の保湿性の部材に吸収させて、吸収させたい部位に載せ、
プラスに帯電した電極を、前記シート状の保湿性部材を載せた部位とは異なる所望の部位に接触させ、
マイナスに帯電した棒状の電極を、前記シートの上を回転させながら移動させることを特徴とする、タンパク質のイオン導入方法。
【請求項１１】
前記所望の部位は、腕、手、掌、脚、膝の裏、及び足の裏からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１０に記載のタンパク質のイオン導入方法。
【請求項１２】
生後３月〜１２月のブタの脱落乳歯の歯髄、ブタ骨髄及びブタ脂肪組織からなる群から選ばれる組織から得られたものである、歯髄幹細胞、骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞を培養して得られる、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）からなる群から選ばれる、少なくとも２種以上の成長因子を含有する培養上清粉末を有効成分として含有する、皮膚形成促進剤。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
前記培養上清粉末は、前記ブタ脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清、前記骨髄幹細胞の培養上清及び前記脂肪幹細胞の培養上清からなる群から選ばれるいずれかの培養上清を、アルコール濃縮後、凍結乾燥して得られたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の皮膚形成促進剤。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
前記皮膚形成促進剤は、クリーム剤、軟膏剤、ジェル剤、乳液剤、及び硬膏剤からなる群から選ばれるいずれか剤形であることを特徴とする、請求項１２又は１４に記載の皮膚形成促進剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
［００３９］
また、本発明の化粧品に使用する幹細胞の培養上清は、以下のようにして凍結乾燥品とすることもできる。まず、上記ようにして得られた幹細胞の培養上清又は濃縮幹細胞培養上清を、約５０〜１５０ｍＬの容量の容器に一定量ずつ入れ、サンプルチューブの蓋を締めて、約−１００℃〜約−６０℃で、２時間から半日かけて凍結させる。これらの上清が凍結した後に、サンプルチューブの蓋を開け、凍結乾燥機へセットする。次いで、１〜２日間、凍結乾燥を行い、得られた試料を凍結乾燥幹細胞培養上清とする。この凍結乾燥幹細胞上清は、約−１００℃〜−６０℃で保存することができる。
例えば、５０ｍＬの容量のバイアルビン（ゴム栓付き）８本に約２０ｍＬずつ培養上清を入れて、ゴム栓をし、約−３０℃で数時間かけて凍結させる。次いで、このバイアルビンの蓋を開け、凍結乾燥機（ヤマト科学（株）製、ＤＣ４１Ａ）へセットする。次いで、試料が乾燥するまで凍結乾燥を行い、凍結乾燥培養上清を得ることができる。
以上の操作によって、良好な保存安定性を有する培養上清の凍結乾燥品が得られる。
［００４０］
上記の化粧品を、イオン導入法によって皮膚から導入する場合には、前記化粧品をシート状の保湿性の部材に吸収させて、吸収させたい部位、例えば、顔や頭皮、に載せ、プラスに帯電した電極を所望の部位に接触させ、−に帯電した棒状の電極を、前記シートの上を回転させながら移動させる。
ここで、前記所望の部位は特に限定されないが、例えば、腕、手、掌、脚、膝の裏、及び足の裏からなる群から選ばれるものであることが、プラスに帯電した電極を安定して接触させることができるために好ましい。
上記シート状の保湿部材としては、不織布で作られた市販のパック用のシート、ガーゼ、コットン等を使用することができる。上述した化粧品が液状又は乳液状である場合には、上記シート状の保湿部材に含浸させて使用すればよい。また、上述した化粧品が、クリーム又はジェルである場合には、皮膚に塗布しその上にこうした保湿部材を載せることとすればよい。
［００４１］
以下に、上記化粧品が化粧水である場合を例に挙げて説明する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
影した（図１０（Ａ）参照）。
次いで、試料１の全量をフェイスパック用不織布１（富士紙化学（株）製、フェイスマスク）に含浸させた。この不織布を被検者の顔の上に載せ、実施時間２０分／回（腕、手、掌、脚、膝の裏、及び足の裏）、実施回数１〜２回／週、０．２〜１ｍＡの条件でイオン導入を行った。
イオン導入中、顔全体に蒸気を当てられるように、スチーマー（タカラベルモント（株）製、ノアージュ）を顏から３０〜５０ｃｍ離れた位置に置いた。その後、フェイスパックを顔から外し、クリーム等で肌を整えて仕上げを行った。被験者は女性７名で、年齢は２０代〜７０代、平均４１歳であった。
［００７１］
（３）効果
イオン導入を１４回行った結果を試験後として、試験開始前と同様にマイクロスコープで皮膚の状態を確認した。試験前後の皮膚の状態を比較したところ、被検者の肌の色が、試験開始前に比べて全体的に白くなっていた。また、シミが薄くなるとともに（図８（Ａ）及び（Ｂ））、皺（図９（Ａ）及び（Ｂ））も薄くなっていた。
皮膚の状態をマイクロスコープで観察すると、明らかな変化が認められ、シワの部分のへこみが少なくなっていた（図１０（Ａ）及び（Ｂ））。
ブタ歯髄幹細胞の培養上清を含む化粧品を使用することにより、しわを薄くする効果及び肌の色を白くする効果があることが示された。
実施例４
［００７２］
発毛及び育毛効果の検討
（１）非ヒト由来脂肪幹細胞の培養上清の調製
実施例２で得られた非ヒト由来（ブタ）の脂肪幹細胞の培養上清液から１ｍＬをとり、凍結乾燥して粉末を得た。
この凍結乾燥粉末を、３０ｍＬの生理食塩水に溶解させて発毛・育毛試験用の試料２とし、洗ビンに入れた。
（２）発毛・育毛試験の条件等
発毛・育毛用試験は、以下の手順で行った。まず、被験者の頭髪及び頭皮
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
の状態を確認し、被験者自身が、現在、どのような状態であると認識しているかについて、カウンセリングを行った。次に、試験開始前の頭髪の状態をカメラで撮影し、また、頭皮の状態をマイクロスコープ（２０〜２００倍）で撮影した。図１３〜１６は２００倍で撮影したものである。
［００７３］
次いで、適量のクレンジングジェル（ナショナル・トータル・プロダクト（株）製、プレジャークレンジングジェル）を掌にとり、これを頭皮に塗布して頭皮のマッサージを行い、毛穴の周囲及び毛穴に詰まった汚れを浮き立たせた。引き続き、市販のシャンプー（（株）コスメ・ニスト製、プレジャーＣシャンプー）を用いて浮き上がった汚れを落とした。汚れがひどい場合には、２回、シャンプーを行った。
その後、洗ビンの口を頭皮に接触させるようにして上記のように調整した試料２を頭皮に付着させた。また、毛髪にも付着させた。
実施時間は１５分／回（腕、手、掌、脚、膝の裏及び足の裏）、実施回数を週１〜２回、０．２〜１ｍＡとしてイオン導入を行った。引き続き、ポリエチレンフィルムで頭皮及び毛髪全体をラップし、その上からタオルをターバンのように巻いて１０〜２０分間パックを行った。その後、タオルとポリエチレンフィルムをはずし、タオルドライ又はドライヤーで仕上げを行った。被験者８名の内訳は、男性６名、女性２名（年齢：３０代〜５０代、平均３８歳）であった。
［００７４］
上記のようにイオン導入を行った後は、被験者自身が、洗髪後のきれいな頭皮（地肌）に試料１又は２を適用することとした。地肌に容器の口の部分を押し付けて直接付着させ、その後手で地肌に擦り込むように、頭皮マッサージを２〜３分行った。また、毛髪に付着させた。
（３）発毛及び育毛効果
男性被験者の毛髪が、試験の前後でどのように変化したかを図１１〜１６に示す。
図１１は、試験開始時の頭髪の状態を示す。また、試験開始７日後の頭髪の状態を図１２に示す。図１１と１２とを対比すると明らかなように、目視でも頭髪が増加していることが確認された。
【国際調査報告】
2013118877.tif 000023
2013118877.tif 000024
2013118877.tif 000025
2013118877.tif 000026