(57)【要約】  新規カンパニュラフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、及び該遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミドの提供。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９７％以上の配列同一性を有し、かつ、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項２】
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に、請求項１に記載のポリヌクレオチドが作用可能な状態で連結されたプラスミド。
【請求項３】
作用可能な状態でｎｏｓターミネーターがさらに連結されている、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
バラ園芸種（Rosa hybrida）を、請求項２又は３に記載のプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換して、花弁中のデルフィニジン含有量が８０％以上である形質転換バラ植物又はその子孫を生産する方法。
【請求項５】
前記花弁中のデルフィニジン含有量が８５％以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記花弁中のデルフィニジン含有量が９０％以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記花弁中のデルフィニジン含有量が９５％以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法により生産された形質転換バラ植物又はその子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞に外来の遺伝子を導入して遺伝子操作をする技術に関する。より詳しくは、本発明は、新規カンパニュラフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、及び該遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミド、該プラスミドを用いたアグロバクテリウム法による形質転換による、花弁中のデルフィニジン含有量が著しく高められた園芸種バラ植物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の品種改良方法には、（ｉ）オシベとメシベを掛け合わせる交雑、（ｉｉ）自然に又は人為的に生じる突然変異、（ｉｉｉ）遺伝子組換えなどの方法がある。このうち、遺伝子組換え技術を利用すると、その種のもつ遺伝的制約に束縛されることなく、有用な遺伝子を目的植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を付与することが可能となる。このようにして作製された遺伝子組換え植物はすでに世界中で広範囲に栽培されている。【０００３】
花色の成分には、アントシアニン、カロテノイド、ベタレインなどがある。アントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物のメンバーで、フェニルアラニンから多くの酵素の働きにより合成される。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのＢ環の水酸基の数が増加する程青くなる。主要なアントシアニジンであるデルフィニジン、シアニジン、ペラルゴニジンは、この順に、Ｂ環の水酸基の数が多い。多くの青い花にはデルフィニジンに由来するアントシアニンが蓄積している。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基（クマロイル基、カフェオイル基など）の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり（すなわち、吸収極大値が長波長にシフトする）、また、アントシアニンの安定性が増すことが知られている。特に、複数の芳香族アシル基が結合したアントシアニンはポリアシル化アントシアニンと呼ばれ、リンドウやチョウマメなどの青い花弁に含まれる（Plant J. 54, 737-749, 2008参照）。アントシアニンのその生合成に関わる酵素やそれをコードする遺伝子は既に多くの植物から単離されている（Plant J. 54, 737-749, 2008参照）。アントシアニンの色は、それが局在する液胞のｐＨや、その他のフラボノイド、金属イオンなどの存在にも依存する。すなわち、アントシアニンは液胞のｐＨが低いと赤く、中性であると青く変化する。フラボンやフラボノールはコピグメントとも呼ばれ、アントシアニンと共存するとアントシアニンを青く見せる効果がある。また、鉄やアルミニウムイオンはアントシアニンのＢ環の水酸基に配位することにより、アントシアニンを青くすることが知られている。【０００４】
植物は多様な色の花を咲かせるが、全ての色の花を咲かせることができる種は少ない。これは種によって合成できる色素が遺伝的に決まっているからである。例えば、バラ、カーネーション、キク、ユリ、ガーベラなどには、天然には、青や紫色の品種がない。その大きな理由は、これらの植物は、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（以下、「F3’5’H」ともいう。）遺伝子を持っていないからである。F3’5’H遺伝子を花弁中で発現させることにより、デルフィニジンを生産させ、花の色を青くしようとする試みがいくつか報告されている。これらの研究から、花弁中のデルフィニジン含有率を高め、花の色を青い方向に変えるためには、以下に述べるように、種毎に適切なプロモーターと適切なF3’5’H遺伝子を選択することが重要であることが伺えるが、その選択は予測困難である。【０００５】
F3’5’Hが欠損しているペチュニアにおいてF3’5’H遺伝子を発現させるとデルフィニジンに由来するアントシアニン量が増加する（Nature, 1993, 366, 276-279, FEBS Lett. 1999, 461, 241-245）。また、シアニジンを蓄積するタバコ（Nicotiana tabacum）においてF3’5’H遺伝子を発現させるとデルフィニジンが合成され、花色はやや青みを帯びる（FEBS Lett. 1999, 461, 241-245）。【０００６】
以下の非特許文献１には、タバコにおいて、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下でカンパニュラ、トルコギキョウ、ペチュニア由来のF3’5’H遺伝子を発現させた場合、カンパニュラF3’5’H遺伝子が最も効率よくデルフィニジンを生産することが記載されている（同書要約参照）。【０００７】
特許文献１には、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下でペチュニア由来のF3’5’H遺伝子をバラに導入したという記載があるが（同書実施例９参照）、カンパニュラ由来のF3’5’H遺伝子はタバコにおいて導入されているに過ぎず、バラ植物体やバラ花弁でのデルフィニジンの生産、花色の変化については記載されていない。
また、以下の非特許文献２には、チョウマメとバーベナのF3’5’H遺伝子をバーベナで発現させた場合、チョウマメ由来の遺伝子を発現させた場合の方がデルフィニジン生産量が多く、花色も明瞭に変化したことが記載されている。【０００８】
また、以下の特許文献２には、ペチュニア、リンドウ、チョウマメ、サイネリア、トルコギキョウ、パンジー、ラベンダー由来のF3’5’H遺伝子をバラにおいて発現させたところ、パンジー由来のF3’5’H遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター又はバラ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現させた場合に、総アントシアニジンの数１０％のデルフィニジンが生成し、バラではパンジー由来のF3’5’H遺伝子がカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター又はバラ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターの制御下で良好に機能することが記載されている。【０００９】
以下の非特許文献３には、エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（El2 35S）プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターよりも、外来遺伝子を高効率で発現することが記載されている。El2 35Sプロモーターの制御下にあるパンジーF3’5’H遺伝子を導入したバラは、デルフィニジンを生産し、花の色は変化する。導入する品種によっては、デルフィニジンを総アントシアニジン量の95%以上含み、花の色が青紫色に変化したバラを得ることができ、これらの内の１つは既に市販されている（品種登録番号第２０９９２号）。【００１０】
また、以下の特許文献３には、El2 35Sプロモーターの制御下にあるパンジーF3’5’H遺伝子とEl2 35Sプロモーターの制御下にあるアイリスジヒドロフラボノール４−還元酵素（以下、「DFR」という。）遺伝子とバラDFRの二本鎖RNAとを転写するカセットを導入したバラでは、導入バラ品種の中においては品種に拘らず、デルフィニジンの含有率が１００％に近くなり、花の色も変化したことが記載されている。【００１１】
商品として提供しうるバラの花色を変化させるためには、花弁中のデルフィニジン含有量が高くなることは当然に求められるものの、バラの生育に悪影響を与えないことが重要である。これは、デルフィニジンを高発現する遺伝子組換えバラを親として用いて交配育種する際にも重要である。換言すれば、生育の良いバラ園芸種において、花弁中のデルフィニジン含有量をできるだけ高めることができる、すなわち、F3'5'Hを高発現することができる特定の高発現プロモーターと特定配列を有するF3'5'Hの特定の組合せを含む形質転換用プラスミドが必要とされている。【００１２】
ところで、以下の特許文献４には、キク品種インプルーブドレーガン、ダークスプレンデッドレーガンにおいては、バラのカルコンシンターゼプロモーターを用いてパンジー由来のF3’5’H遺伝子を転写させることにより、デルフィニジンが５０％以上蓄積し、花色が青く変化した遺伝子組換えキクが得られたことが記載されている。【００１３】
以下の特許文献５においては、キク品種94-765においては、カンパニュラ、バーベナ、サイネリア、パンジー、ペチュニア、ロベリア由来のF3'5’H遺伝子をキク由来のフラバノン３−水酸化酵素遺伝子由来のプロモーターとタバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を利用して発現したところ、カンパニュラ、バーベナ、サイネリア、パンジー由来のF3’5’H遺伝子が比較的良好に機能し、総アントシアニジンの２５％以上のデルフィニジンを生成した。同書には、これらのうちカンパニュラ由来のF3’5’H遺伝子がキクではもっとも良好に機能し、５０％以上のデルフィニジンを生成したことが記載されている。【００１４】
構成的なプロモーターであるMac1プロモーター、花弁特異的なプロモーターであるキンギョソウ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、花弁特異的なプロモーターであるペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターは、ペチュニアのF3’5’H遺伝子をカーネーションにおいて発現させるために用いられている。この場合、前記した花弁特異的な二種のプロモーターは、Mac1プロモーターよりも多くのデルフィニジンを生成した（以下の特許文献６参照）。カーネーションの花弁においては、ペチュニアＤＦＲ遺伝子のプロモーターやアントシアニジン合成酵素遺伝子のプロモーターは、外来遺伝子を転写させるのに有効であることが示されている（それぞれ、以下の特許文献７と８参照）。その他の花弁特異的なプロモーターとして、パンジーのF3’5’H遺伝子のプロモーター（以下の特許文献９参照）、シソのアントシアニン３−アシル基転移酵素遺伝子プロモーター（以下の特許文献１０参照）、サイネリアF3’5’H遺伝子のプロモーター（以下の特許文献１１）が報告されている。【００１５】
以上に述べたように、異種の植物においてF3’5’H遺伝子を発現させ、デルフィニジンを生産させることはできるものの、目的の植物にどの植物由来のF3’5’H遺伝子をどのプロモーターを利用して発現させればよいかは、予想することは困難であり、デルフィニジンを高効率で生産させる、すなわち全アントシアニジン量のうちのデルフィニジン含有率を８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上にするためには、試行錯誤や複雑高度な実験などが必要である。【００１６】
また、一般に、花の色を青く変化させるためには、デルフィニジンの含有率を、総アントシアニジン量の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％に上昇させる必要があるが、そのためには、単にF3’5’H遺伝子を過剰発現させるだけでは不十分なことが多い。例えば、カーネーションの場合には、ジヒドロフラボノール４−還元酵素（DFR）が欠損している白いカーネーションに、F3’5’H遺伝子とペチュニアDFR遺伝子を発現させることによりデルフィニジンがほぼ１００％になり、花色も青く変化した組換えカーネーションが得られている（以下の特許文献１２参照）。バラにおいては、バンジー由来のF3’5’H遺伝子とアイリス由来のDFR遺伝子を過剰発現させるとともに、バラのDFR遺伝子の発現を抑制することにより、デルフィニジン含有率がほぼ１００％になり、花色が青く変化した組換えバラが得られている（以下の特許文献３参照）。キクに置いては、パンジー由来のF3’5’H遺伝子を過剰発現させるとともに、キクのF3’H遺伝子の発現を抑制することにより、デルフィニジンの含有率を上昇させている（以下の特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許第３４０３１９６号公報（ＷＯ９３／１８１５５）
【特許文献２】ＷＯ２００４／０２０６３７
【特許文献３】ＷＯ２００５／０１７１４７
【特許文献４】ＷＯ２００９／０６２２５３
【特許文献５】ＷＯ２０１０／１２２８４９
【特許文献６】ＷＯ９４／２８１４０
【特許文献７】ＷＯ９６／０３６７１６
【特許文献８】ＷＯ２００９／０６２２５９
【特許文献９】ＷＯ２０１０／１２２８５０
【特許文献１０】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３８８６
【特許文献１１】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０７０５１６
【特許文献１２】ＷＯ０６／３６７１６
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(1), 161-165, 2003
【非特許文献２】Plant Biotechnology 2006, 23, 5-11
【非特許文献３】Plant Cell Physiol. (1996) 37 : 49-59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
かかる状況下、本発明が解決しようとする課題は、生育の良いバラ園芸種において、花弁中のデルフィニジン含有量をできるだけ高めることができる、すなわち、F3'5'Hを高発現することができる特定の高発現プロモーターと特定配列を有するF3'5'Hの特定の組合せを含む形質転換用プラスミドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決すべく、本願出願人らは鋭意検討し、実験を重ねた結果、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に特定配列を有するカンパニュラ由来のF3’5’H遺伝子を含むプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により特定品種のバラ植物を形質転換した結果、花弁で高含有率のデルフィニジンを蓄積する形質転換バラ植物を得ることができることを発見し、本発明を完成するに至った。【００２１】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９７％以上の配列同一性を有し、かつ、フラボノイド−３’、５’−水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；  （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイド−３’、５’−水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。【００２２】
［２］カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に、前記［１］に記載のポリヌクレオチドが作用可能な状態で連結されたプラスミド。【００２３】
［３］作用可能な状態でｎｏｓターミネーターがさらに連結されている、前記［２］に記載のプラスミド。【００２４】
［４］バラ園芸種（Rosa hybrida）を、前記［２］又は［３］に記載のプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換して、花弁中のデルフィニジン含有量が８０％以上である形質転換バラ植物又はその子孫を生産する方法。【００２５】
［５］前記花弁中のデルフィニジン含有量が８５％以上である、前記［４］に記載の方法。【００２６】
［６］前記花弁中のデルフィニジン含有量が９０％以上である、前記［５］に記載の方法。【００２７】
［７］前記花弁中のデルフィニジン含有量が９５％以上である、前記［６］に記載の方法。【００２８】
［８］前記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法により生産された形質転換バラ植物又はその子孫。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のカンパニュラフラボノイド−３’，５’−水酸化酵素遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換すれば、バラ園芸種の花弁中のデルフィニジン含有量を著しく高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のポリヌクレオチド（配列番号１）はカンパニュラ由来のF3’5’Hをコードしており、521残基からなる。本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列、又はその相当のアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものに限定されず、当該塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチド、あるいは当該アミノ酸配列と特定の配列相同性、好ましくは配列同一性を有し、かつ、フラボノイド−３’、５’−水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からも選択される。少なくとも９７％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドが好ましい。
【００３１】
本発明のポリペプチドには、配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつフラボノイド−３’、５’−水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子も含まれる。ここで、本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得ら れるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００３２】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリン ジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃、特に、0.1×SSC、0.1％SDS、65℃、又は0.1×SSC、0.1％SDS、70℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現 することが可能である。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列は、フラボノイド−３’、５’−水酸化酵素活性が維持される限り、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよい。
【００３４】
本明細書中、用語「同一性」及び「相同性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」及び「相同性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」及び「相同性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
【００３５】
また、本明細書に記載される「同一性」及び「相同性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、MacVectorアプリケーション（version 9.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England）のClustalWプログラムを用いて算出される数値である。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
【００３７】
生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
【００３８】
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドはカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターとともにプラスミドに挿入される。３５Ｓプロモーターとして、植物形質転換体で汎用される３５Ｓプロモーターにエンハンサー配列を２つタンデムに並べて連結することにより発現を強化されたEl2 35Sプロモーター（上掲）が好ましい。本発明のポリヌクレオチドと３５Ｓプロモーターは作用可能な状態となるよう連結され、例えばプロモーターの下流に着目のポリヌクレオチドが配置される。本発明のプラスミドはバラ園芸種の形質転換に使用される。
【００４０】
本発明中、用語「バラ園芸種」とは、分類学上の位置付けではバラ科バラ属の植物（学名：Rosa hybrida）のことをいう。バラ園芸種は、樹形と花の大きさにより主にハイブリッド・ティー系、フロリバンダ系、ポリアンサ系などに分けられるが、いずれの系統でも花弁に含まれる主要な色素（アントシアニン）はシアニジン型とペラルゴニジン型の２種類のみである。本発明は、バラの花弁に含まれる主なアントシアニンをデルフィニジン型に変換する技術であり、これらの種や系統に好適に用いることができる。本発明は、シアニジン型の品種（例えば、クールウォーター、オーシャンソング、フェイムなど）、又はペラルゴニジン型の品種（例えば、ノブレス、トップレス、ピーチアヴァランチェなど）のいずれにも適用できる。
【００４１】
本発明のプラスミドはプロモーター以外の因子、例えばターミネーター、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等の調節配列；薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーを更に含んでもよい。ターミネーターはｎｏｓターミネーターが好ましく、着目のポリヌクレオチドの下流に配置される。本明細書中、「ｎｏｓターミネーター」とは、Agrobacterium tumefaciens のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列をいう。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例に従って本発明を具体的に説明する。
［実施例１：カンパニュラF3’5’H cDNAの単離］
DNAデータベースGenBankに登録されているカンパニュラ（Campanula medium）のF3'5'H cDNA（アクセション番号D14590）の翻訳配列に基づいて２種のプライマーCamF1 (5’-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3’、配列番号３)とCamR1 (5’-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3'、配列番号４)を合成した。市販のカンパニュラの蕾の花弁からRNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN社)を用いてRNAを抽出し、RT-PCRキットを用いて1st strand DNAを合成した。この1st strand DNAを鋳型に、上記プライマーを用いてPCRを実施した。得られたDNA断片をpCR-TOPO IIにクローニングした。この内、クローン＃４（pSPB2561）の塩基配列をＤＮＡシークエンサーの解析により決定した（配列番号１）。アクセション番号D14590に登録されているF3’5’Hが523残基からなるのに対し、クローン＃４がコードするF3’5’Hは521残基からなり、D14590に登録されているF3’5’Hに対し９６％の配列同一性を示した。【００４３】
［参考例１：バラ品種「クールウォーター」へのpSPB130の導入（パンジー由来F3’5’H遺伝子とトレニア由来5AT遺伝子の構成的発現）］
特許文献３に記載されたバイナリーベクターpSPB130（パンジーのF3’5’H遺伝子とトレニアのアントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子を植物中で構成的に発現させるベクター）をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを、特許文献３に記載された方法で、藤色系のバラ品種「クールウォーター」に導入し、１６４個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行ったところ、１６４個体のうち５１個体でデルフィニジンの蓄積を確認し、デルフィニジン含有率は最高７６．１％（平均３６．６％）であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表１に示す。【００４４】
【表１】
2013157502.tif 000002
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００４５】
［実施例２：バラ品種「クールウォーター」へのpSPB2564の導入（E12 35Sプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
実施例１で取得したカンパニュラのF3’5’H遺伝子ｃDNAを、特許文献３に記載されたEl2 35Sプロモーターとノパリンシンターゼターミネーター（ｎｏｓターミネーター）の間に挿入した発現カセットをバイナリーベクターpBinPLUS（van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995）に挿入し、得られたプラスミドをpSPB2564とした。pSPB2564をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、特許文献３に記載された方法で、藤色系のバラ品種「クールウォーター」を形質転換し、５５個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行ったところ、５５個体のうち４８個体でデルフィニジンの蓄積を確認し、デルフィニジン含有率は最高９７．３％（平均６１．２2％）であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表２に示す。【００４６】
【表２】
2013157502.tif 000003
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００４７】
［実施例３：バラ品種「フェイム」へのpSPB2564の導入（E12 35Sプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、１１４個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行った１０７個体のうち４６個体でデルフィニジンの蓄積を確認し、デルフィニジン含有率は最高９８．９％（平均５１．２％）であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表３に示す。【００４８】
【表３】
2013157502.tif 000004
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００４９】
［実施例４：バラ品種「フェイム」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、55個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、55個体のうち28個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高98.9％（平均51.4％）であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表４に示す。【００５０】
【表４】
2013157502.tif 000005
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５１】
［実施例５：バラ品種「ノブレス」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてサーモンピンク系のバラ品種「ノブレス」を形質転換し、３個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、3個体すべてでデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高98.9％（平均51.4％）であった。
形質転換体の分析値を以下の表５に示す。【００５２】
【表５】
2013157502.tif 000006
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５３】
［実施例６：バラ品種「オーシャンソング」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いて藤色系のバラ品種「オーシャンソング」を形質転換し、40個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、40個体のうち33個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.2％（平均39.7％）であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表６に示す。【００５４】
【表６】
2013157502.tif 000007
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５５】
［実施例７：バラ品種「ピーチアバランチェ」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いて薄サーモンピンク系のバラ品種「ピーチアバランチェ」を形質転換し、11個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、11個体のうち１個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.3％であった。
デルフィニジンを生産が確認された形質転換体の分析値を以下の表７に示す。【００５６】
【表７】
2013157502.tif 000008
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５７】
［実施例８：バラ品種「トップレス」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてサーモンピンク系のバラ品種「トップレス」を形質転換し、11個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、11個体のうち10個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.4％（平均64.4％）であった。
デルフィニジン生産が確認された形質転換体の分析値を以下の表８に示す。【００５８】
【表８】
2013157502.tif 000009
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５９】
［参考例２：バラ品種「フェイム」へのpSPB5202の導入（パンジー由来F3’5’Hプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
特許文献９に記載されたプラスミドpSFL620をHindIIIとPstIで消化して得られるパンジー由来F3’5’Hプロモーター配列と、実施例１で得られたカンパニュラのｃDNA配列と、プラスミドpRI201-AN（タカラバイオ株式会社）由来の熱ショック蛋白質ターミネーターを連結して、バイナリーベクターpBinPlusに挿入した。得られたバイナリーベクターをpSPB5202とした。pSPB5202をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、特許文献３に記載された方法で、ピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、５６個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行った５２個体のうち、デルフィニジンの蓄積が確認できたのは４個体のみで、デルフィニジン含有率は最高でも１０．８％（平均３．９％）であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表９に示す。【００６０】
【表９】
2013157502.tif 000010
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００６１】
パンジー由来F3’5’Hプロモーターは、パンジー由来のF3’5’H遺伝子をバラにおいて良好に発現させ（特許文献９参照）、また、熱ショック蛋白質ターミネーターは異種遺伝子の植物での発現にきわめて有効である（Plant Cell Physiol（2010） 51, 328-332）とされているにもかかわらず、これらの形質転換バラ花弁ではデルフィニジンの生産が認められたのはごく僅かであり、カンパニュラF3’5’H遺伝子が十分に機能しなかったことが示唆された。これは、特定のバラ品種でデルフィニジンを効率よく生産させるためには、特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子の組み合わせ、あるいは特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子と特定のターミネーター遺伝子の組み合わせの選択が必要であることを示している。【００６２】
［参考例３：バラ品種「フェイム」へのpSPB5204の導入（シソ由来３ＡＴプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
特許文献１０に記載されたプラスミドpSFL205をHindIIIとBamHIで消化することにより、シソ由来アントシアニン3-アシル基転移酵素のプロモーター部分を含む約１．１ｋｂのDNA断片を回収し、HindIIIとBamHIで消化したpBinPlusと連結し、pSPB3756を得た。また、特許文献１０に記載されたプラスミドpSPB3311を鋳型にして、３種の合成ヌクレオチドプライマー、Pf3AT-FW-Sal（5’-ATGTCGACTAAATGTATGTAATTAAC-3’、配列番号５）、Pf3ATt-R1（5’-ACTCAACACTTTATTAATTG-3’、配列番号６）、Pf3ATt-F1（5’-ATGTAACAATTAATTAAGTG-3’、配列番号７）を用いたＰＣＲで、シソ由来アントシアニンアシル基転移酵素のターミネーター部分の５’末端に制限酵素SalI認識配列を付加し、同ターミネーター部分にあるPacI認識部位のうちの5'側にあるPacI認識部位を破壊した。PCRで得られたDNA断片をpTOPOにクローニングした。得られたプラスミドをKpnIとPacIで消化して得られるDNA断片と、pSPB3756をKpnIとPacIで消化して得られるDNA断片とを連結し、pSPB5201とした。SmaIとSpeIで消化したpSPB5201と実施例１で得たカンパニュラｃDNAとを連結し、得られたバイナリーベクターをpSPB5204とした。pSPB5204をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、特許文献３に記載された方法で、ピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、６３個体の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行った６１個体のうち、デルフィニジンの蓄積が確認できたのは８個体のみで、デルフィニジン含有率は最高でも２．８％（平均１．３％）であった。【００６３】
代表的な形質転換体の分析値を以下の表１０に示す。
【表１０】
2013157502.tif 000011
Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００６４】
シソ由来アントシアニン３−アシル基転移酵素プロモーターは、シソ由来アントシアニン３−アシル基転移酵素遺伝子をバラ、ペチュニア、キクにおいて良好に発現させた（特許文献９参照）にも拘らず、これらの形質転換体のバラ花弁ではデルフィニジンの生産が認められたのはごく僅かであり、カンパニュラF3’5’H遺伝子が十分い機能しなかったことが示唆された。このことは、バラでデルフィニジンを効率よく生産させるためには、特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子の組み合わせ、あるいは、特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子と特定のターミネーター遺伝子の組み合わせの選択が必要であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のカンパニュラフラボノイド−３’，５’−水酸化酵素遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換すれば、特定品種のバラ植物の花弁中のデルフィニジン含有量を著しく高めることができる。したがって、本発明は、花色が変更されたバラ植物の生産に好適に利用可能である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2013157502.tif 000013
2013157502.tif 000014
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