(57)【要約】  （１）リグノセルロース系バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物を調製した後、固液分離を行って一部のアルカリ水溶液を除去し、熱処理を行う前処理工程、及び（２）前処理工程で得られたリグノセルロース系バイオマスを酵素で分解して糖化液を得る糖化工程を含むことを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法は、リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスに適用でき、前処理工程におけるアルカリ及び水の使用量を低減させ、糖化工程における糖収率を向上させ、反応時間を減らし、バイオマス残渣への酵素吸着量を低減させ、かつ、酵素回収率を向上させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）リグノセルロース系バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物を調製した後、固液分離を行って一部のアルカリ水溶液を除去し、熱処理を行う前処理工程、及び（２）前処理工程で得られたリグノセルロース系バイオマスを酵素で分解して糖化液を得る糖化工程を含むことを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
【請求項２】
前処理工程において、下記（Ｉ）で算出される固液比が、固液分離前の混合物は２〜２０であり、固液分離後の混合物は１〜６であることを特徴とする請求項１に記載の糖化方法。
式（Ｉ）：
固液比＝混合物中の全液体成分の総質量／混合物中のリグノセルロース系バイオマスの固形分質量
【請求項３】
前処理工程において、熱処理を１００〜２００℃で行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の糖化方法。
【請求項４】
糖化工程が、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物の存在下で行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項５】
前処理工程と糖化工程の間に、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物の一部を除去する除去工程を含み、除去工程後のリグノセルロース系バイオマスにおいて、下記式（ＩＩ）で算出される前処理分解物の残存率が２〜２０質量％であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の糖化方法。
式（ＩＩ）：
前処理分解物の残存率＝残存する前処理分解物の固形分質量／リグノセルロース系バイオマスの固形分質量
【請求項６】
糖化工程で得られる糖化液中のＣ５糖の割合が、全糖成分に対して２０〜５０質量％であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項７】
糖化工程で得られる糖化液の全糖濃度が５〜２０質量％であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項８】
糖化工程で得られる未分解のリグノセルロース系バイオマスに吸着した酵素を再利用することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項９】
前処理工程において、酸素を添加して熱処理を行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項１０】
糖化工程に続いて、糖化工程終了後に酵素を回収する酵素回収工程を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項１１】
酵素回収工程において、未分解のリグノセスロース系バイオマスに吸着した酵素をアルカリ処理により脱着させ回収する工程を含むことを特徴とする請求項１０に記載の糖化方法。
【請求項１２】
含水率が３０〜９０％のリグノセルロース系バイオマスを前処理工程に供することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の糖化方法。
【請求項１３】
糖化工程で得られる糖化液であって、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物が、糖化液中の全糖成分に対して、２〜２０質量％含まれることを特徴とする糖化液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスの糖化方法に関するものであり、より詳細には、リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロース系バイオマスを糖化し、発酵原料となる単糖類を得る技術は、食料と競合しない非可食性のバイオマスの資源・エネルギー利用という観点から、極めて重要な技術である。リグノセルロース系バイオマスを糖化する方法は、硫酸等の酸を用いて加水分解する酸糖化法と、酵素を用いて加水分解する酵素糖化法に大別される。酸糖化法は反応速度が高いという利点があるが、耐酸性の反応器を必要とし、使用後の酸を中和・回収する工程が必要となる等の課題を有する。一方、酵素糖化法は、比較的マイルドな反応条件で分解反応が進行するので、酸糖化法と比較してユーティリティー、設備コストが低い、あるいは反応選択性が高いという利点を有する。【０００３】
しかしながら、酵素糖化において高い糖収率を達成するには、バイオマスを酵素分解され易くするための前処理工程が必要であり、前処理工程の効率化、低コスト化が求められている。また、酵素がコストに占める割合も大きく、酵素コストの低減が実用上の大きな課題となっている。【０００４】
酵素糖化の前処理方法として一般的なものは、酸前処理法、アルカリ前処理法、水熱前処理法である。この中でアルカリ前処理法は、ＮａＯＨ等のアルカリ性化合物を用いてバイオマスを前処理するものであり（特許文献１〜３）、リグニン等を効果的に分解することでバイオマスの構造を壊し、酵素作用を高めるものである。酸処理法や水熱処理法と比べて、比較的マイルドな条件で前処理を行うことができ、かつ、糖化されにくいリグニン含量の高いバイオマスにも適用できる点で優れている。また、アルカリの金属腐食性が低いこともメリットである。アルカリ前処理法の課題は、使用するアルカリのコストであり、より少ないアルカリ量で高い糖収率を達成することが求められている。また、前処理における水の使用量削減や、処理条件の更なる緩和、短時間化も求められている。【０００５】
またアルカリ前処理で生成するバイオマスの分解物は発酵阻害を起こすことがあるといわれており、一般的には水洗浄によって除去した後、酵素糖化に供される。この洗浄水を削減しつつ、発酵阻害を起こさない糖化液を得ることが実用上極めて重要である。【０００６】
一方、酵素コストを低減する方策として有効なものが、糖化酵素の回収、再利用であり、種々の方法が知られている（特許文献４〜６、非特許文献１、２）。しかしながら、セルラーゼ等の糖化酵素は、糖質、及びリグニンに対して高い吸着性を示すため、糖化反応後の分解困難なバイオマス残渣に吸着する。この残渣への吸着現象が、酵素の回収、再利用を難しくしている。前処理方法の違いで酵素吸着にも違いが出ることが知られているが、より効果的で低コストに、残渣への酵素吸着を低減できる前処理方法の開発が求められていた。【０００７】
糖化反応後の残渣に吸着した酵素を脱着させ、回収する方法の開発も行われているが、酵素の回収率が十分でない、あるいはコストが高い等の点で改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭５７−２９２９３号公報
【特許文献２】特開昭５８−９８０９３号公報
【特許文献３】特開２０１１−８３２３８号公報
【特許文献４】特開昭６３−８７９９４号公報
【特許文献５】特開２０１０−１３６７０２号公報
【特許文献６】特開２０１０−９８９５１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biotechnology and Bioengineering, 34, 291-298 (1989)
【非特許文献２】Applied Biochemistry and Biotechnology, 143, 93-100 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスに適用でき、前処理工程におけるアルカリ及び水の使用量を低減させ、糖化工程における糖収率を向上させ、反応時間を減らし、バイオマス残渣への酵素吸着量を低減させ、かつ、酵素回収率を向上させることができるリグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供することを課題とする。また、前処理工程で生成する分解物除去の負荷を低減しつつ、発酵特性の優れた糖化液を得ることのできる糖化方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明に関する。
［１］（１）リグノセルロース系バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物を調製した後、固液分離を行って一部のアルカリ水溶液を除去し、熱処理を行う前処理工程、及び（２）前処理工程で得られたリグノセルロース系バイオマスを酵素で分解して糖化液を得る糖化工程を含むことを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
［２］前処理工程において、下記式（Ｉ）で算出される固液比が、固液分離前の混合物は２〜２０であり、固液分離後の混合物は１〜６であることを特徴とする前記［１］に記載の糖化方法。
式（Ｉ）：
固液比＝混合物中の全液体成分の総質量／混合物中のリグノセルロース系バイオマスの固形分質量
［３］前処理工程において、熱処理を１００〜２００℃で行うことを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の糖化方法。
［４］糖化工程が、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物の存在下で行われることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の糖化方法。
［５］前処理工程と糖化工程の間に、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物の一部を除去する除去工程を含み、除去工程後のリグノセルロース系バイオマスにおいて、下記式（ＩＩ）で算出される前処理分解物の残存率が２〜２０質量％であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の糖化方法。
式（ＩＩ）：
前処理分解物の残存率＝残存する前処理分解物の固形分質量／リグノセルロース系バイオマスの固形分質量
［６］糖化工程で得られる糖化液中のＣ５糖の割合が、全糖成分に対して２０〜５０質量％であることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の糖化方法。
［７］糖化工程で得られる糖化液の全糖濃度が５〜２０質量％であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の糖化方法。
［８］糖化工程で得られる未分解のリグノセルロース系バイオマスに吸着した酵素を再利用することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の糖化方法。
［９］前処理工程において、酸素を添加して熱処理を行うことを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の糖化方法。
［１０］糖化工程に続いて、糖化工程終了後に酵素を回収する酵素回収工程を含むことを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載の糖化方法。
［１１］酵素回収工程において、未分解のリグノセルロース系バイオマスに吸着した酵素をアルカリ処理により脱着させ回収する工程を含むことを特徴とする前記［１０］に記載の糖化方法。
［１２］含水率が３０〜９０％のリグノセルロース系バイオマスを前処理工程に供することを特徴とする前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の糖化方法。
［１３］糖化工程で得られる糖化液であって、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物が、糖化液中の全糖成分に対して、２〜２０質量％含まれることを特徴とする糖化液。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスに適用でき、前処理工程におけるアルカリ及び水の使用量を低減させ、糖化工程における糖収率を向上させ、反応時間を減らし、酵素糖化後の酵素吸着量を低減させ、かつ、酵素回収率を向上させることができるリグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供することができる。また、本発明では、回収した酵素をリサイクル使用して糖化工程を行うことにより、酵素使用量を減らし、酵素コストを大幅に低減することも可能となる。また、本発明では、前処理工程で生成する分解物除去の負荷を低減しつつ、かつ発酵特性の優れた糖化液を得ることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１、２及び比較例１の糖収率及び酵素回収率の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、すなわちリグノセルロース系バイオマスを糖化させてなる糖類（グルコース、キシロース、アラビノース等）の製造方法を提供する。本発明の糖化方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物を調製した後、固液分離を行って一部のアルカリ水溶液を除去し、熱処理を行う前処理工程、及び、（２）前処理工程で得られたリグノセルロース系バイオマスを酵素で分解して糖化液を得る糖化工程を含むものであればよい。さらに、前処理工程と糖化工程の間に、前処理工程で生成する可溶化されたリグノセルロース系バイオマスの前処理分解物の一部を除去する除去工程を含んでいてもよい。さらに、糖化工程に続いて、糖化工程終了後に酵素を回収する酵素回収工程を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明の糖化方法の原料は、リグノセルロース系バイオマスを含むものであれば、特に限定されず、リグリン含量が高くてもよい。リグノセルロース系バイオマス（以降、単にバイオマスと称する。）は、主としてセルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成されており、木本植物、草本植物、それらの加工品、それらの廃棄物等が該当する。具体的には、例えば、木材、間伐材、製材残材、建築廃材、樹皮、果房、果実殻、茎葉、わら、バガス、古紙等が挙げられる。好ましくは、アブラヤシ、ナツメヤシ、サゴヤシ、ココヤシ等のヤシ類（幹、茎葉、空果房、果実繊維）、サトウキビ（バガス、葉）、トウモロコシ（穂軸、茎葉）、ユーカリ、ポプラ、スギ等の木材（樹皮、木部）、稲わら、麦わら、スウィッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ミスカンサス、ススキである。より好ましくはヤシ類の空果房、サトウキビバガス、トウモロコシ穂軸、稲わら、麦わら、ユーカリ、スギであり、さらに好ましくはアブラヤシの空果房である。アブラヤシの空果房はパーム油搾油工程で排出されるバイオマスであり、東南アジアに豊富に存在している。しかしながら、アブラヤシの空果房は、リグニン含量が高く、また高含水状態で得られるため、その利用は限られている。本発明の方法は、そのようなバイオマス原料に対して特に有効である。バイオマスの大きさ、形状等は特に限定されないが、裁断、粉砕等により粉体状、チップ状、細片状にしたものや、解繊を行って繊維状にしたものが好ましい。バイオマス原料の大きさは、最長辺の長さとして、好ましくは平均約０．１ｃｍ〜３０ｃｍであり、さらに好ましくは約１ｃｍ〜１０ｃｍである。大きさをこの範囲とすることで、高い酵素糖化性、固液分離性、移送性等を得ることができる。また、バイオマスの水分含有率（含水率）は特に限定されないが、好ましくは含水率が０〜９０％であり、より好ましくは３０〜９０％、さらに好ましくは４０〜８０％であり、特に好ましくは５０〜８０％である。リグニン含量の高いリグノセルロース系バイオマスにおいて、リグニン含量は、固形分（絶乾）基準で、例えば、１０％以上のものが挙げられ、好適には、２０％以上のものが挙げられる。ここで、「％」とは、質量％であり、以降も特に断りがない限り、質量％を表すものとする。
【００１６】
本発明では、バイオマスの酵素糖化効率を高めるために、（１）前処理工程を行う。前処理工程では、バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物を調製した後、固液分離を行って一部のアルカリ水溶液を除去し、熱処理を行う。この前処理工程を行うことにより、より少ないアルカリ、及び水の使用量でも、高い前処理効果を得ることができる。すなわち、糖化工程において、セルロース及びヘミセルロースへの酵素の接触が容易となり、酵素反応の効率が向上し、糖収率が向上する。また糖化反応後のバイオマス残渣への酵素吸着が低減し、残渣からの酵素回収も容易となる。
【００１７】
本発明の前処理方法の技術的特徴は、アルカリをバイオマスに含浸させる際には比較的高い固液比（バイオマス固体と液体の比率）で行い、固液分離を行って固液比を低下させ、続く熱処理は低い固液比で行う、というものである。この方法により、アルカリを高速かつ均一にバイオマスに含浸させ、かつ、効率的にバイオマスに作用させることができる。含水率やリグニン含有率の高いバイオマスにも好適に適用可能である。
【００１８】
前処理工程では、まずアルカリ水溶液を調製する。アルカリ水溶液に用いるアルカリ化合物としては、ナトリウム、カルシウム、カリウム及びマグネシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の水酸化物、酸化物、硫化物、炭酸塩及び炭酸水素塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物等が使用できる。またアンモニアを使用することもできる。好ましくは水酸化ナトリウム、硫化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムであり、より好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムまたは水酸化カリウムである。アルカリ化合物は１種を用いてもよく、複数種の混合物を用いてもよい。これらのアルカリ化合物を水に溶解し、アルカリ水溶液にして使用する。アルカリ水溶液のアルカリ化合物濃度としては、０．１〜３０％が好ましく、０．５〜２０％がより好ましく、１〜１０％が特に好ましい。アルカリ水溶液のｐＨとしては、ｐＨ１１〜１５が好ましく、ｐＨ１２〜１４．５がより好ましく、ｐＨ１２．５〜１４が特に好ましい。また、アントラキノン、スルホン化アントラキノン等のアントラキノン類をアルカリ水溶液に添加してもよい。アントラキノン類の添加量は、本発明の効果を妨げない範囲であれば、特に限定されない。
【００１９】
続いて、バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物（以降、単に混合物と称する）を調製するために、前記アルカリ水溶液をバイオマスと接触させ、アルカリ化合物をバイオマスに含浸させる工程を行う（含浸工程）。具体的には、まずバイオマスとアルカリ水溶液を混合した混合物を調製し、各種条件にて処理し、アルカリ水溶液をバイオマスに含浸させる。含浸工程ではアルカリをバイオマス内部まで速く、均一に含浸させることが重要である。そのために、前記混合物を比較的高い固液比で調製することが好ましく、具体的には、含浸工程における前記混合物の固液比としては、１〜３０であることが好ましく、１〜２０がより好ましく、２〜２０がさらに好ましく、２〜１０が特に好ましい。混合物の固液比は次式により算出する。
固液比＝混合物中の全液体成分の総質量／混合物中のバイオマスの固形分質量
ここで「全液体成分」とは、接触させるアルカリ水溶液、および原料バイオマスが含む水分や、その他の液体全てを合わせた混合物中の液体成分の合計を意味する。また、「バイオマスの固形分質量」とは、水分等の液体成分を含まない原料バイオマスの固形分質量を意味する。含浸工程の混合物（すなわち、固液分離前の混合物）の固液比を前記範囲にすることで、高いアルカリ含浸速度と均一性を達成することができる。
【００２０】
またバイオマスと接触したアルカリ水溶液は、バイオマス内部に吸収、含浸されるが、アルカリ水溶液（もしくは全液体成分）が、バイオマスの最大（飽和）含水量以上存在すると、バイオマスはアルカリ水溶液を吸収しきれずに、空隙（バイオマス同士の空間）にもアルカリ水溶液が存在するようになる。含浸工程では、このように空隙にもアルカリ水溶液が存在するような条件で行うことが好ましい。
【００２１】
またバイオマスと接触したアルカリ水溶液は、バイオマスが含む水分等と混合されると濃度が変化するが、混合物中におけるアルカリ濃度は、全液体成分に対するアルカリ化合物濃度として、０．１〜３０％の範囲が好ましく、０．５〜２０％がより好ましく、１〜１０％が特に好ましい。混合物中の全液体成分のｐＨとしては、ｐＨ１１〜１５が好ましく、ｐＨ１２〜１４．５がより好ましく、ｐＨ１２．５〜１４が特に好ましい。混合物中の全液体成分のｐＨを知るには、例えば、混合物を数倍量の水で希釈洗浄し、その洗浄水のｐＨを測定し、希釈倍率を考慮することで、元のｐＨを見積もることができる。接触させる前記アルカリ水溶液の濃度および量は、バイオマスが含む水分量や、必要なアルカリ濃度等を勘案して、適宜設定することが好ましい。
【００２２】
含浸工程の処理温度は、好ましくは２０〜１００℃、より好ましくは２０〜７０℃、特に好ましくは２０〜５０℃である。含浸工程は常圧で行ってもよいが、減圧条件又は加圧条件で行ってもよい。これらの圧力操作を行うことで、アルカリの含浸速度を高めることができる。加圧条件の場合は、０．０１〜２ＭＰａＧ（ゲージ圧）で行うことが好ましく、０．０５〜０．５ＭＰａＧで行うことがより好ましい。含浸時間は、好ましくは０．１〜１０時間、より好ましくは０．１〜３時間、特に好ましくは０．１〜１時間である。含浸工程は、回分式でも、連続式でも行うことができる。静置状態で行ってもよいが、混合、攪拌、液循環等を行って含浸速度を高めてもよい。
【００２３】
リグノセルロース系バイオマスにアルカリ水溶液を含浸させた混合物を調製した後、固液分離を行い、一部のアルカリ水溶液を除去する。ここで「一部のアルカリ水溶液」とは、固液分離で除去可能なアルカリ水溶液を意味し、含浸工程で調製された混合物中のアルカリ水溶液の一部である。含浸工程で調製された混合物においては、アルカリ水溶液はバイオマスの内部および外部（空隙）に存在すると考えられる。固液分離で除去される一部のアルカリ水溶液は、主にはバイオマスの空隙に存在するアルカリ水溶液であるが、固液分離の条件によっても変化し、バイオマスの内部に存在するアルカリ水溶液を含んでいてもよい。固液分離の目的は、バイオマスの空隙に存在するアルカリ水溶液を主に除去し、固液比を低下させることにある。固液比を低下させることで反応場を制限し、アルカリの固体バイオマスへの作用効率を飛躍的に高めることができる。
【００２４】
固液分離は、ろ過、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、デカンター等を使用することができる。固液分離後に得られる混合物（以降、アルカリ含浸バイオマスと称する）は、次の熱処理工程に供する。固液分離で除去される一部のアルカリ水溶液は、含浸工程に再利用することが好ましい。固液分離で除去される一部のアルカリ水溶液は、微量のバイオマス由来成分を含んでおり、アルカリ含浸速度の向上や、アルカリ削減等の効果が期待できる。必要に応じて減少したアルカリ化合物、又はアルカリ水溶液を補充してから用いてもよい。
アルカリ含浸バイオマス（すなわち、固液分離後の混合物）における固液比（＝混合物中の全液体成分の総質量／混合物中のリグノセルロース系バイオマスの固形分質量）は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、特に好ましくは１〜４である。また固液分離後の混合物において、全液体成分中に存在するアルカリ化合物量（アルカリ含浸量）としては、バイオマス固形分質量に対して、０．１〜３０％であることが好ましく、１〜２０％であることがより好ましく、２〜１５％であることが特に好ましい。
【００２５】
続いて、アルカリ含浸バイオマスに熱処理を行う。熱処理の温度は、２０〜２５０℃が好ましく、１００〜２００℃がより好ましく、１５０〜２００℃が特に好ましい。熱処理の時間は、０．１〜１００時間が好ましく、０．１〜２４時間がより好ましく、０．１〜１時間が特に好ましい。この温度および時間の範囲で熱処理を行うことで、糖収率、および酵素回収率が向上する。
熱処理時の気相部の雰囲気は、酸素ガス、窒素ガス、酸素／窒素混合ガス、空気等、特に限定されない。酸素存在下でアルカリ前処理を行うことで、糖化工程におけるバイオマスへの酵素吸着が低減し、糖収率向上や酵素回収率向上が期待できる。具体的には、酸素濃度が１〜１００体積％であることが好ましく、１０〜９５体積％であることがより好ましく、１５〜８０体積％であることが特に好ましい。好ましい形態の一つとしては、安価に利用できる空気を使用する方法である。また、酸素存在下で熱処理を行う場合、酸素は時間とともに消費されるため、酸素を添加しながら（酸素濃度を維持しながら）熱処理を行うことが好ましい。
【００２６】
熱処理時の圧力（ゲージ圧）は、特に限定されないが、５ＭＰａＧ以下が好ましく、３ＭＰａＧ以下がより好ましく、１ＭＰａＧ以下が特に好ましい。本発明では、空隙のアルカリ水溶液を除去するため、バイオマスの表面積が増大し、効率的に気相部のガスを取り込むことができる。したがって、酸素存在下での前処理は、本発明の好適な実施方法である。
熱処理によってバイオマス（主にはリグニン）は分解、可溶化され、フェノール性水酸基やカルボキシル基を有する化合物を生成する。この分解反応によってアルカリ成分は消費（中和）されるため、バイオマスのｐＨは低下する。熱処理後の混合物中の全液体成分のｐＨとしては、ｐＨ６〜１４が好ましく、ｐＨ７〜１３がより好ましく、ｐＨ８〜１２が特に好ましい。このｐＨ範囲とすることで、含浸アルカリを効率的に利用しつつ、次の除去工程の負荷を低減することができる。なお、熱処理後の全液体成分のｐＨは、上述の方法で見積もることができる。
【００２７】
また、温度、気相部雰囲気、圧力等の熱処理条件は、熱処理の途中で変えてもよい。例えば、酸素を供給しない（制限した）熱処理を先に行い、酸素を供給した熱処理を後に行う前処理方法である。この方法の各段階における熱処理条件は、上記条件と同様であり、それらを組み合わせて実施することができる。
【００２８】
熱処理後のバイオマスはそのまま次の糖化工程に供してもよいが、前処理工程で生成する可溶化されたバイオマスの分解物（以降、前処理分解物と称する）を一部除去する工程（除去工程）を行ってから、糖化工程に供することが好ましい（除去工程後のバイオマスを以降、前処理バイオマスと称する）。前処理分解物は、アルカリによりバイオマスが分解して生成する可溶性の固形分のことであり、主には分解したリグニンや有機酸等（酢酸等）の多種成分で構成される分解物であり、アルカリ成分も含む。前処理分解物を除去する方法としては、水等の洗浄溶媒によるバイオマスの洗浄や、圧搾、遠心分離等による固液分離が上げられ、好ましくは、水を用いた洗浄による方法である。水洗浄によって除去する場合は、水以外の溶媒等を混合して用いてもよい。具体的には、アルコール、ケトン等の有機溶媒、あるいはｐＨ調整のための酸類を添加してもよい。水を含む洗浄溶媒の使用量は、熱処理後のアルカリ含浸バイオマスの質量に対して、０．１〜１００倍量であることが好ましく、０．５〜３０倍量であることがより好ましく、１〜１０倍量であることが特に好ましい。洗浄溶媒を熱処理後のバイオマスに添加して前処理分解物を溶出させた後、固液分離を行って、前処理バイオマスと洗浄液（前処理分解物含有）とに分離する。洗浄操作は、上記含浸工程と同様の条件で行うことができる。洗浄操作は１回でもよく、複数回行ってもよい。回分式、半回分式、連続式でも行うことができるが、効率を高めるために半回分式、または連続式で行うことが好ましい。また洗浄後に乾燥させてもよいが、乾燥させるとバイオマスの構造が強固になる場合があるため、乾燥させずに含水状態のまま次の糖化工程に供することが好ましい。
【００２９】
圧搾や遠心分離等の固液分離によって除去する方法は、水の使用量を削減できる点で有利である。熱処理後のバイオマスを圧搾や遠心分離で処理し、バイオマスが含んでいる液体成分を除去することで、一部の前処理分解物を除去できる。水を用いた洗浄と、圧搾や遠心分離等の固液分離を組み合せてもよい。
【００３０】
前処理分解物は、糖化液中に高濃度に存在すると発酵に悪影響を及ぼす場合があるため、除去工程にて一部を除去することが好ましい。一方、本発明者らは、前処理分解物がバイオマスへの酵素の非特異的吸着を低減させることを見出した。また前処理分解物の存在下にて、糖化工程、及び／又は、酵素回収工程を行うことで、糖収率の向上や、酵素量の低減、酵素回収率の向上等のメリットが得られることを明らかにした。更に、発酵の際に一定の範囲内で前処理分解物が存在する場合には、発酵阻害を起こさず、むしろ発酵において良い影響（生成物の増加、発酵速度の向上等）を及ぼすことを見出した。したがって除去工程では前処理分解物を完全に除去せず、意図的に残存するように除去条件を設定することが好ましい。この場合、前処理バイオマスにおける前処理分解物の残存率としては、好ましくは１〜３０％であり、より好ましくは２〜２０％であり、特に好ましくは５〜２０％である。前処理分解物の残存率は、次式により算出する。
前処理分解物の残存率＝残存する前処理分解物の固形分質量／リグノセルロース系バイオマスの固形分質量
【００３１】
ここで、残存する前処理分解物の固形分質量は、前処理バイオマスを一部サンプリングして十分に洗浄し（前処理分解物を十分に除去し）、得られる洗浄液中の固形分量（すなわち前処理分解物量）を測定することで知ることができる。またリグノセルロース系バイオマスの固形分質量は、前処理分解物を含まない前処理バイオマスの固形分質量であり、十分に洗浄した後の前処理バイオマスの固形分質量である。
上記残存率の範囲にすることで、前処理分解物が糖化工程、酵素回収工程、または発酵においてポジティブな効果を示し、糖収率の向上、酵素回収率の向上、発酵生成物の増加等のメリットを得ることができる。また比較的高い前処理分解物の残存率でも許容されるため、除去工程での負荷が低下し、洗浄水削減等のメリットも得られる。
【００３２】
続く（２）糖化工程では、（１）前処理工程で得られた前処理バイオマスを酵素で分解して糖化液を得る。すなわち、前処理バイオマスに酵素と、必要に応じて水、及びｐＨ調整剤を添加した混合物（以降、反応混合物と称する）を調製し、糖化反応を行う。水、及びｐＨ調整剤を添加する場合は、酵素とともに添加してもよく、別々に添加してもよい。またｐＨ調整剤を前記除去工程の際に添加し、ｐＨ調整を先に行ってもよい。ｐＨ調整を行った後、酵素を添加することが好ましい。用いる酵素は、セルロースを単糖（グルコース）に加水分解できる酵素、又はヘミセルロースを単糖（キシロース、マンノース、アラビノース等）に加水分解できる酵素を含むものであればよい。このような酵素は、一般にセルラーゼ、ヘミセルラーゼと称され、複数の酵素で構成される。本発明の糖化方法に用いる酵素は、セルラーゼ又はヘミセルラーゼを含むものであればよいが、糖化効率を向上させるために、両者を含むものを用いることが好ましい。本発明の前処理方法は、効率的にアルカリ前処理が進行するため、ヘミセルロースが可溶化し難く、前処理バイオマス中のヘミセルロース含有量が高いことも特徴である。したがって、セルラーゼ及びヘミセルラーゼを含む酵素を使用して、セルロースとヘミセルロースを同時に酵素分解する方法は、好適な実施形態である。同時に酵素分解することで、反応時間の短縮、または糖濃度の向上等のメリットが得られる。ヘミセルロースが可溶化される前処理方法（酸処理、水熱処理、または厳しい条件のアルカリ処理等）では、セルロースとヘミセルロースの分解を別々に行う必要がある。
【００３３】
セルラーゼとしては、セロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼを含むものであることが好ましい。ヘミセルラーゼとしては、キシラナーゼ及びβ−キシロシダーゼを含むものであることが好ましい。他のヘミセルラーゼとしては、アセチルキシランエステラーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、キシログルカナーゼ、ペクトリアーゼ、ペクチナーゼ等が挙げられる。また、植物細胞壁分解に関わる他の酵素、例えば、フェルラ酸エステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、プロテアーゼ等を含んでいてもよい。これらの酵素を含有しているか否かは、各酵素の基質を用いて酵素活性を調べることにより、確認することができる。
【００３４】
酵素の由来としては特に限定されないが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の微生物に由来する酵素が挙げられ、好ましくはトリコデルマ属、アクレモニウム属、アスペルギルス属由来の酵素であり、さらに好ましくはトリコデルマ属由来の酵素である。
【００３５】
これらの酵素は市販されており、本発明の製造方法に好適に用いることができる。市販の酵素製剤（商品名）としては、ノボザイムズ社製のセリックシリーズ（シーテック、エイチテック等）、ノボザイム１８８、セルクラスト、パルプザイム、ジェネンコア社製のアクセルラーゼシリーズ（トリオ、デュエット等）、マルチフェクトシリーズ、明治製菓社製のメイセラーゼ、ヤクルト社製のオノズカ、アマノエンザイム社製のセルラーゼ（Ａ、Ｔ）などが挙げられる。好ましくはセリックシリーズおよびアクセルラーゼシリーズである。これらの酵素製剤はセロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼを含んでおり、原料バイオマスの組成や含有酵素活性を考慮して、単独、あるいは複数を組み合わせて用いることができる。セルラーゼ活性の高い酵素製剤とヘミセルラーゼ活性の高い酵素製剤を組み合わせて用いることが好ましく、例えば、セリックシーテックシリーズ（セルラーゼが主成分）とセリックエイチテックシリーズ（ヘミセルラーゼが主成分）を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３６】
また本発明では、バイオマスの未分解残渣に吸着した酵素をアルカリ処理で回収して再利用することが好ましく、再利用を考慮すると、高いアルカリ安定性及び熱安定性を有する酵素を使用することが好ましい。酵素を化学的、または遺伝子工学的（タンパク質工学的）に修飾してもよい。修飾することで酵素安定性を高めたり、残渣への吸着性を低減させたり、酵素回収効率を高めることができるため、本発明で好適に用いることができる。
【００３７】
酵素の使用量としては、特に限定されないが、好ましくは前処理バイオマスの固形分質量に対して、酵素活性成分の固形分質量（タンパク質質量）として、０．０１〜１０％、より好ましくは０．０５〜５％添加する。水の添加量としては特に限定されず、前処理バイオマスが十分な水量を含んでいれば水を添加しなくてもよい。好ましくは前処理バイオマスの固形分質量に対して０〜２０倍量、さらに好ましくは０〜１０倍量添加する。また、反応混合物中の前処理バイオマスの固形分濃度としては、１〜５０％が好ましく、３〜３０％がより好ましく、５〜２５％が特に好ましい。
【００３８】
ｐＨ調整剤としては、酸、アルカリを適宜選択して用いることができる。前処理工程としてアルカリ処理を行った場合には、前処理バイオマスがアルカリ性になっているため、酸を使用して糖化に適したｐＨに調整する。この場合、使用する酸としては特に限定されないが、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、二酸化炭素等が挙げられ、好ましくは硫酸、塩酸、酢酸、二酸化炭素である。糖化工程における反応条件は、酵素による加水分解が進行する条件であれば特に限定されない。反応温度は、通常２０〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは４０〜５５℃である。反応時間は、通常１〜３００時間、好ましくは１０〜１５０時間、より好ましくは２０〜１００時間である。反応ｐＨは、酵素の至適ｐＨに従って設定すればよいが、通常ｐＨ３〜７、好ましくはｐＨ４〜６、より好ましくはｐＨ４．５〜５．５である。ｐＨコントロールのために、前記ｐＨ調整剤を追加したり、バッファー成分を添加してもよい。バッファー成分として具体的には、各種有機酸等が使用でき、酢酸、クエン酸、コハク酸が好ましい。
【００３９】
また酵素の作用効率を高めるために、各種化合物の存在下で糖化工程を実施してもよい。このような化合物としては、タンパク質、界面活性剤、リグニン分解物等が挙げられるが、これらの化合物は酵素のバイオマスへの非特異的吸着を低減する効果を有しており、糖化反応速度や酵素回収率の向上、酵素使用量の低減等のメリットが得られる。好ましくはリグニン分解物であり、より好ましくは、前処理工程で生成する前処理分解物である。前処理分解物はプロセスで生じる副生成物であり安価に得られ、かつ、効果も高いため、前処理分解物の存在下で糖化工程を行う方法は、本発明の好適な実施形態の一つである。糖化工程で前処理分解物を存在させる方法は、前記のように調製した（前処理分解物を残存させた）前処理バイオマスを使用することによって行ってもよいが、前処理分解物を別途添加してもよい。前処理分解物の濃度としては、前処理バイオマスの固形分質量に対して、好ましくは１〜３０％であり、より好ましくは２〜２０％であり、特に好ましくは５〜２０％である。糖化反応の方法としては特に限定されず、反応混合物を攪拌や液循環をしながら、または静置状態で糖化反応を行ってもよい。糖化反応促進のため、攪拌、又は液循環をすることが好ましい。
【００４０】
糖化工程により、糖化液を含む反応混合物が得られる。この反応混合物は、糖化液（バイオマスの加水分解によって生成した可溶性の低分子糖類及び遊離の酵素を含む液体）と残渣（未分解のバイオマスであり、吸着酵素を含む固体）との混合物である。糖化液は、反応混合物の状態のまま（残渣との混合物として）利用してもよいが、固液分離等の方法で残渣と分離してから利用してもよい（この場合、後述の酵素回収工程の一部と考える）。残渣には糖化酵素が吸着しており、残渣に吸着した酵素を再利用することは、本発明の好適な実施形態の一つである。吸着酵素の再利用によって、酵素使用量の削減が可能である。吸着酵素の再利用の方法としては、（ａ）吸着酵素を含む未分解バイオマスをそのまま反応に再利用する方法、及び、（ｂ）吸着酵素を残渣から脱着させて回収し、再利用する方法等があげられる。
（ａ）の具体的方法としては、例えば、糖化反応の途中、または終了後に糖化液と未分解バイオマス（酵素を吸着）を分離し、次の糖化反応にその未分解バイオマスを使用する方法等があげられる。糖化反応の途中に、糖化液の回収（未分解バイオマスとの分離）と、フレッシュなバイオマス原料の追加を逐次的、もしくは連続的に行い、吸着酵素を継続的に利用しながら、糖化反応を行う方法は好ましい方法である。（ｂ）の具体的方法は後述する。
【００４１】
糖化工程終了後に、酵素を回収する酵素回収工程を行うことは本発明の好ましい実施形態である。酵素回収においてはバイオマスへの酵素吸着が問題となるが、本発明の前処理方法によると、酵素吸着を低減させてより効率的に酵素回収を行うことができる。
酵素回収工程では、上述のように、糖化工程で得られた反応混合物を固液分離し、糖化液と残渣とに分離する。固液分離方法は特に限定されず、例えば、ろ過、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、デカンター等を使用することができる。糖化液からは遊離の酵素（非吸着酵素）を回収することができる。残渣からは吸着酵素を回収することができる。上述のように、回収した吸着酵素はそのまま再利用してもよいが、残渣から脱着させて酵素を回収してもよい。
【００４２】
残渣からの酵素回収方法としては特に限定されないが、水を使用して残渣を洗浄する方法、酸を使用して酵素を回収する方法、アルカリを使用して酵素を回収する方法（アルカリ処理）等が挙げられる。好ましくはアルカリ処理を含むものである。アルカリ処理をすると吸着酵素が脱着するため、高い酵素回収率を実現することができる。
【００４３】
上記アルカリ処理の方法は特に限定されず、アルカリを添加して残渣に作用させる方法であればよい。アルカリ処理は反応混合物の固液分離の前でもよく、後でもよい。好ましくは、（Ａ）固液分離の前の反応混合物にアルカリを添加してアルカリ処理を行う工程、（Ｂ）固液分離後の残渣にアルカリ（及び水）を添加してアルカリ処理を行う工程、及び両者を組み合わせた工程を含む方法である。いずれの方法においても重要となるのが、アルカリ処理液（残渣と添加アルカリ、添加水を含む処理液全体、もしくは反応混合物全体を指す）のｐＨを所定の範囲に調整することである。すなわち、酵素と残渣との吸着／脱着状態は処理液のｐＨに依存して変化し、ｐＨを高めるほど脱着酵素が増加する一方、高いｐＨではアルカリによる酵素の失活が問題となる。アルカリ添加後のアルカリ処理液のｐＨは、ｐＨ６〜１１であることが好ましく、ｐＨ７〜１０であることがより好ましく、ｐＨ７．５〜９．５であることが特に好ましい。
【００４４】
アルカリ処理で使用するアルカリ化合物としては、前処理工程で用いるアルカリ化合物と同様のものを使用することができ、好ましい化合物も同様である。
アルカリ化合物は水溶液として添加することが好ましく、添加するアルカリ化合物の濃度、量は、上記ｐＨ範囲を達成するものであればよいが、濃度が低すぎると添加量が多くなり、回収酵素濃度も低下する。添加するアルカリ水溶液のアルカリ濃度は、０．０１〜１０％であることが好ましく、０．１〜５％であることがより好ましい。
【００４５】
アルカリ処理の際、酵素の脱着を促進させるために添加剤を添加してもよい。このような添加剤としては、タンパク質、界面活性剤、リグニン分解物等が挙げられ、好ましくはリグニン分解物である。アルカリ処理の際に、前処理工程で得られる前処理分解物を添加することは、本発明の好適な実施形態である。この場合、添加する前処理分解物の量としては、残渣の固形分質量に対して、１〜３０％であり、より好ましくは２〜２０％であり、特に好ましくは５〜２０％である。
アルカリ処理の際、残渣からの酵素脱着を促進させるために攪拌、加熱等を行ってもよい。アルカリ処理の温度は、５〜６０℃が好ましく、１０〜４０℃がより好ましい。処理時間は、０．１〜１０時間が好ましく、０．１〜１時間がより好ましい。
【００４６】
アルカリ処理後には固液分離を行い、アルカリ処理液（酵素回収液）と残渣とを分離する。この場合の固液分離方法は特に限定されず、例えば、ろ過、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、フィルタープレス、デカンター等を使用することができる。
アルカリ処理から固液分離までの工程は、回分式で行ってもよく、連続式で行ってもよい。上記工程（Ａ）は回分式で行うのが好ましい。上記工程（Ｂ）は回分式でも連続式でもよいが、連続式の方が好ましい。
【００４７】
工程（Ｂ）を回分式で行う場合は、アルカリ処理（及びアルカリ処理液の回収）を１回だけ行ってもよく、複数回行ってもよい。複数回行う場合には、アルカリ処理液のｐＨを漸増させる（徐々に高める）ようにアルカリ処理を行うことが好ましい。工程（Ｂ）を連続式で行う場合にも、アルカリ処理液のｐＨを漸増させるようにアルカリ処理を行うことが好ましい。ｐＨを漸増させてアルカリ処理を行うことで、よりマイルドに効率的に酵素回収を行うことができる。ｐＨを漸増させてアルカリ処理を行う場合、ｐＨ漸増の終点におけるアルカリ処理液（酵素回収液）のｐＨは、ｐＨ６〜１１であることが好ましく、ｐＨ７〜１０であることがより好ましく、ｐＨ７．５〜９．５であることが特に好ましい。
【００４８】
糖化酵素は複数の酵素で構成されており、個々の酵素の吸着／脱着特性は異なることが確認されている。アルカリ処理の工程（Ｂ）をアルカリ処理液のｐＨが漸増するように行う方法は、脱着容易なｐＨ及び安定性が異なる複数の酵素混合物（例えば複数のセルラーゼ及び複数のヘミセルラーゼの混合物）を糖化酵素として使用した場合でも、高い酵素回収率を実現することができる点で非常に有用である。
【００４９】
酵素回収工程で得た酵素回収液は、回収後速やかに酸を添加してｐＨを弱酸性〜中性に調整することが好ましい。酸を添加後の酵素回収液のｐＨとしては、ｐＨ３〜７であるのが好ましく、ｐＨ４〜６であるのがさらに好ましい。
【００５０】
得られた酵素回収液は、糖化工程に再利用することができる。必要に応じて、酵素回収液を限外ろ過等の方法で濃縮してから再利用する。また反応混合物を固液分離して得られた糖化液も遊離の酵素（及び糖類）を含むため、限外ろ過等の方法で酵素と糖類とを分離して酵素を再利用することが好ましい。またバイオマス原料への吸着現象を利用して、酵素を簡便に再利用することもできる。すなわち、糖化液、もしくは酵素回収液をフレッシュのバイオマス原料と接触させる。バイオマス原料には酵素のみが吸着するため、固液分離によって糖類と酵素（バイオマス原料に吸着した状態）を分離することができる。また、糖類を発酵原料として用いる場合には、糖類を含む酵素回収液をそのまま発酵に供してもよい。酵素回収液を糖化反応に再利用する際は、フレッシュな酵素を一部追加してもよい。追加する酵素は、初回に使用した酵素組成と同様でもよいが、回収酵素は酵素構成が変化している場合があるので、回収酵素の活性に合わせて、適宜追加の酵素を選択することが好ましい。例えば、β−グルコシダーゼは反応残渣に吸着しやすく、他の酵素に比べて回収率が低くなる場合があるため、そのような場合はβ−グルコシダーゼを多く含む酵素液を追加することが好ましい。
【００５１】
本発明で得られる生成物としては、低分子の糖類、前処理分解物、及び未分解残渣である。得られる糖類としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖が挙げられ、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、セロビオース、キシロビオース、セロオリゴ糖、キシロオリゴ糖等である。二糖、オリゴ糖類は、酵素等を用いて単糖化してから使用してもよい。
【００５２】
得られた糖類の用途は特に限定されないが、発酵原料、化学品原料、飼料、肥料等に好適に用いることができる。発酵原料として用いる場合には、エタノール、１−ブタノール、イソブタノール、２−プロパノール、乳酸、コハク酸、酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、クエン酸、アクリル酸、イタコン酸、フマル酸、各種アミノ酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール等の化学品の発酵生産に好適に用いることができる。また糖類を発酵に利用する場合、糖化工程と発酵工程を別々に実施してもよいが、糖化工程と発酵工程を同時に実施してもよい。または、糖化工程を単独で途中まで行い、途中から糖化と発酵を同時に行う方法でもよい。前処理工程で生成する前処理分解物は、バイオマスのアルカリ分解によって生成するリグニンの分解物等であり、糖化工程等での添加剤としての利用又はリグニン分解物の化学品としての利用が可能である。除去工程で得られる洗浄液等は、前処理工程で使用するアルカリも含んでおり、アルカリを回収して再利用してもよい。アルカリの回収・再利用方法としては、パルプ製造プロセスで一般的に知られる方法等を用いることができる（黒液濃縮、燃焼、灰の溶解、苛性化）。また残渣はバイオマス燃料として、スチームや電力生産のために利用できる。
【００５３】
各工程で用いる装置は特に限定されないが、前処理工程、及び糖化工程で用いる反応器は、例えばバッチ式、連続式、半連続式の装置等を用いることができる。具体的には、フィルター（ストレーナー）を備えたバッチ式反応槽、スクリューフィーダー式の連続反応器、原料バイオマス添加と反応液抜き出しを連続的、もしくは逐次的に行う半連続式反応槽、カラム式の充填反応槽等が挙げられる。前処理工程では、スクリューフィーダー式の連続反応装置を使用することが好ましい。この場合、スクリューフィーダーの入り口で、固液分離によるアルカリ水溶液の一部除去を行いながら、昇圧を同時に行い、反応器に投入することが可能である。糖化工程では、原料バイオマスを反応器に充填し、固液分離を行いながら、糖化液を循環させて糖化反応を進める形式が好ましい。また前処理工程、除去工程、糖化工程、酵素回収工程を一つの反応器で行うこと（ワンポット反応）も可能である。固液分離装置としては、フィルタープレス、スクリュープレス、遠心分離、遠心ろ過、サイクロン、デカンター等を用いることができる。酵素回収工程では、糖化工程と同様の装置（反応器）を用いることができるが、好ましくはアルカリ水溶液の添加と酵素回収液の抜き出しを連続的に行うことができる装置である。糖化工程の装置をそのまま用いてもよい。また、パルプ製造で用いられる各種装置も本発明の糖化方法に使用することができる。例えば、カミヤ式等で知られる連続式蒸解釜を用いて、本発明の前処理工程を行うことができる。あるいは、酸素漂白塔を使用して、酸素添加をした前処理工程を行うことが可能である。
【００５４】
本発明の糖化方法を用いて回収される酵素の回収率（糖化工程で使用した酵素の酵素活性に対する回収された酵素の酵素活性）は非常に高いので、回収された酵素を有効に再利用することができる。本発明の糖化方法において、残渣から回収される酵素と、糖化液から回収される酵素を合わせると、糖化工程で使用した酵素量に対して、酵素活性として少なくとも５０％以上、条件により７０％以上が回収可能である。したがって、本発明の糖化方法は、酵素の使用量を減らし、酵素コストを大幅に低減することができる点でも、非常に有用な技術である。
【００５５】
本発明で得られるリグノセルロース系バイオマスの糖収率としては、特に限定されないが、グルコース収率（％）として、下記式に従って算出された値が６５％以上のものが好ましく、７５％以上のものがより好ましく、８５％以上のものが特に好ましい。
グルコース収率％＝生成グルコース量／原料バイオマス（固形分基準）から得られるグルコース理論収量
また、本発明で得られるリグノセルロース系バイオマスの糖収率としては、Ｃ５糖収率（％）として、下記式に従って算出された値が８０％以上のものが好ましい。Ｃ５糖とは、キシロース、アラビノース、キシロビオース等を意味する。
Ｃ５糖収率％＝生成Ｃ５糖合計量／原料バイオマス（固形分基準）から得られるＣ５糖合計理論収量
さらに、本発明で得られるリグノセルロース系バイオマスの糖収率としては、グルコースとＣ５糖を含む糖の合計収率が、７０％以上のものが好ましく、７５％以上のものがより好ましく、８０％以上が特に好ましい。
【００５６】
また、糖化工程で得られる糖化液としては、Ｃ５糖の割合が、全糖成分に対して２０〜５０％であることが好ましく、２５〜４５％であることがより好ましく、３０〜４５％であることが特に好ましい。ここで、Ｃ５糖は上述のとおりであり、全糖成分とは、Ｃ５糖、及びＣ６糖（グルコース等）も含む全ての糖成分を示す。Ｃ５糖はＣ６糖に比べて分解しやすく、高い収率を得ることが難しいが、本発明の方法はＣ５糖の収率も高いことが特徴であり、Ｃ５等の割合を上記範囲まで高めることができる。Ｃ５糖の割合を上記範囲とすることで、発酵におけるＣ５糖の利用効率が向上する等のメリットが得られる。
【００５７】
また、糖化工程で得られる糖化液としては、全糖濃度が、５〜２０％であることが好ましく、７〜１５％であることがより好ましい。ここで全糖濃度とは、上記全糖成分の糖化液中の濃度である。全糖濃度を上記範囲とすることで、発酵における糖の利用効率が向上し、かつ、効率的に糖化工程を行うことが可能である。
【００５８】
また本発明は、前処理工程で生成する前処理分解物が、一定の濃度で含まれることを特徴とする糖化液の発明も含む。糖化液中の前処理分解物の含有濃度としては、糖化液中の全糖成分に対して、１〜３０％であることが好ましく、２〜２０％であることがより好ましく、５〜２０％であることが特に好ましい。前処理分解物の含有濃度を上記範囲とすることで、発酵阻害の影響を受けず、かつ、発酵生成物の増加や発酵速度の向上等のメリットが得られる。また、上記糖化液を調製する際には、前処理分解物の除去工程での負荷が低減し、洗浄水の削減や、糖化工程での反応効率の向上、酵素使用量の削減等の効果も得られるため有利である。前処理分解物を糖化液中に含有させる方法としては、前処理分解物を残存させた前処理バイオマスを調製し糖化する方法、または、前処理分解物を糖化工程で添加する方法、または、得られた糖化液に添加する方法等があげられる。糖化液中の前処理分解物の含有濃度を知るには、糖化液を分析し（クロマトグラフ等の方法）、含まれるリグニン分解物（フェノール性の高分子、または単分子化合物）等を定量する方法を用いることができる。定量の際には、単離した前処理分解物を標品として使用し、定量することが好ましい。さらに糖化液中の全糖成分を定量することで、全糖成分に対する前処理分解物の含有濃度を知ることができる。
【００５９】
本発明における酵素回収率は、特に限定されないが、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）の回収率が、４０％以上のものが好ましく、５５％以上のものがより好ましく、６０％以上のものが特に好ましい。β−グルコシダーゼ（ＧＬＤ）の回収率が、１０％以上のものが好ましく、３０％以上のものが好ましく、５０％以上のものが好ましい。β−キシロシダーゼ（ＸＬＤ）の回収率が、３０％以上のものが好ましく、４０％以上のものがより好ましく、５０％以上のものが特に好ましい。カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣ）の回収率が、４０％以上のものが好ましく、４５％以上のものがより好ましく、５０％以上のものが特に好ましい。キシラナーゼ（ＸＹＮ）の回収率が、４０％以上のものが好ましく、４５％以上のものがより好ましく、５０％以上のものが特に好ましい。これらの酵素回収率を合わせてもったものが特に好ましい。
【実施例】
【００６０】
以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。以下の実施例において、ＣＢＨはセロビオハイドロラーゼを意味し、ＧＬＤはβ−グルコシダーゼを意味し、ＸＬＤはβ−キシロシダーゼを意味し、ＣＭＣはカルボキシメチルセルラーゼ（β−グルカナーゼ）を意味し、ＸＹＮはキシラナーゼを意味する。【００６１】
〔実験材料〕
（１）バイオマス
原料のリグノセルロース系バイオマスとして、パーム油を生産する際に排出されるアブラヤシの空果房（以下「ＥＦＢ」という。）を原料に用いた（産地インドネシア）。ＥＦＢの形状としては、パーム油工場にてシュレッダー処理が施された繊維状のＥＦＢを用いた。
（２）糖化酵素
ノボザイムズ社の酵素液セリック  シーテック２（商品名、以下「酵素Ａ」という。）及びセリック  エイチテック２（商品名、以下「酵素Ｂ」という。）を所定の割合で混合して使用した。酵素Ａは主にセルラーゼ（ＣＢＨ、ＧＬＤ、ＣＭＣ）活性、酵素Ｂは主にヘミセルラーゼ（ＸＬＤ、ＸＹＮ）活性を有している。【００６２】
〔分析方法〕
酵素活性の測定には以下の方法を用いた。具体的な測定方法は、特開２０１２−２２３１１３号公報に開示されている方法を用いた。
ＣＢＨ活性：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした比色法。
ＧＬＤ活性：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした比色法。
ＸＬＤ活性：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを基質とした比色法。
ＣＭＣ活性：カルボキシメチルセルロースを基質とした比色法。還元糖量の測定にはＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）法を用いた。
ＸＹＮ活性：可溶性キシランを基質とした比色法。還元糖量の測定はＤＮＳ法を用いた。【００６３】
糖化反応における生成糖類の定量分析は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）を使用して行った。カラムはＳｈｏｄｅｘ（登録商標）、Ｓｕｇａｒ  ＫＳ−８０１（商品名、配位子交換クロマトグラフィ用カラム、粒径６μｍ、使用最大圧力５．０ＭＰａ、常用流量０．５〜１．０ｍＬ／ｍｉｎ、昭和電工社製）を用い、示差屈折計（ＲＩ）にて検出を行った。移動相としては純水を用い、カラム温度は６０℃にて分析を行った。【００６４】
糖類の収率及び酵素回収率は以下のように算出した。
グルコース収率％＝生成グルコース量／原料バイオマス（未処理、固形分基準）から得られるグルコース理論収量
Ｃ５糖収率％＝生成Ｃ５糖合計量／原料バイオマス（未処理、固形分基準）から得られるＣ５糖合計理論収量
糖合計収率％＝（生成グルコース量＋Ｃ５糖合計量）／原料バイオマス（未処理、固形分基準）から得られる糖類合計理論収量
ここでＣ５糖とは、キシロース、アラビノース、キシロビオースを意味する。なお、原料として用いたアブラヤシの空果房（ＥＦＢ）から得られる糖類の理論収率は、グルコースが４２％、Ｃ５糖合計は２６％（キシロース２５％、アラビノース１％）、糖合計では６８％であった（ＥＦＢ固形分基準の質量収率）。
酵素回収率は以下の式に従って算出した。
酵素回収率％＝回収液（反応液、洗浄液）中の酵素活性／糖化反応仕込時の酵素活性【００６５】
〔実施例１〕
（１）前処理工程
１００ｍｌのガラス製反応器に、繊維状ＥＦＢを５．５ｇ（含水率８．９％、固形分として５．０ｇ）を入れ、更にアルカリ水溶液として４．０％のＮａＯＨ水溶液を５０．０ｇ添加して混合物を調製し、十分にＥＦＢ中に含浸させた（減圧下、室温で１５分静置）。なお、この混合物の固液比は、１０．１である（全液体成分０．５＋５０．０ｇ÷ＥＦＢ固形分５．０ｇ）。続いて、ろ過によりアルカリ水溶液を含んだＥＦＢ（アルカリ含浸ＥＦＢ）と、一部のアルカリ水溶液とを固液分離し、それぞれ回収した。アルカリ含浸ＥＦＢの質量は１６．９ｇであり、固液分離後の固液比は２．４であった（全液体成分１１．９ｇ÷ＥＦＢ固形分５．０ｇ）。また、アルカリ含浸ＥＦＢ中に含まれるＮａＯＨの固形分質量は、全液体成分質量より０．４８ｇと見積もられた（＝１１．９ｇ×０．０４、対原料ＥＦＢでのアルカリ含浸量としては９．５％）。固液分離にて回収された一部のアルカリ水溶液は約３８ｇであった。回収されたアルカリ水溶液はリサイクル使用可能なため、実質的なアルカリ使用量は９．５％であると考えられる。続いて、得られたアルカリ含浸ＥＦＢを、温度計と圧力計を備えた１００ｍｌの耐圧反応器に入れ、窒素ガスで反応器内を置換した後、密閉した。反応器をオイルバスに投入し、１００℃（反応器内部温度）で１時間、熱処理をした。【００６６】
（２）前処理分解物の除去工程（洗浄工程）
続いて、水による洗浄操作を行った。熱処理後のＥＦＢ１６．９ｇに５０．０ｇの純水を添加して１０分間攪拌混合し、前処理工程にて生成する可溶化されたバイオマス分解物（前処理分解物）を溶出させた。ろ過により固液分離を行い、前処理ＥＦＢ１２．８ｇ（水ウェット体）とろ液約５３ｇ（前処理液と称する。約３％の前処理分解物を含むアルカリ性水溶液、ｐＨ１２．７）を得た。前処理ＥＦＢは乾燥せずにそのまま次の糖化工程へ供した。【００６７】
（３）糖化工程
５０ｍｌのガラス製反応器内で以下のように反応混合物を調製した。
前処理ＥＦＢ１２．８ｇ、テトラサイクリン塩酸塩１．６ｍｇ、シクロヘキシミド１．２ｍｇ、０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）２０ｍｌ、酵素液（酵素Ａと酵素Ｂの１：１混合液）０．３０ｇを反応器に添加し、１０％酢酸水でｐＨ５．５に調整後、総質量を４０．０ｇに水で調整した。続いて反応器を密閉し、恒温振とう機で振とうしながら、４５℃で７２時間、糖化反応を行った。糖化液（未分解原料を除去した反応液）を一部サンプリングし、生成した糖類をＨＰＬＣで分析した結果、グルコース収率は８１％（対グルコース理論収量）、Ｃ５糖収率は８３％（対Ｃ５糖合計理論収量）、糖合計収率は８２％（対糖合計理論収量）であり、グルコース、Ｃ５糖共に高い糖収率が得られた。【００６８】
（４）酵素回収工程
糖化工程後の反応混合物をろ過し、糖化液（糖類と遊離の酵素を含む）約３５ｇと未分解残渣（ウェット）約５ｇとに固液分離した。残渣に残存している酵素を回収するために、残渣に水１５ｇを加え、３０分間ゆるやかに攪拌混合した後、ろ過を行い、ろ液を回収した（１次処理液、ｐＨ５．５）。更に、同様の水洗操作を行い、２次処理液を得た。糖化液、１次処理液、及び２次処理液を合わせて回収液（約６５ｇ）とした。
回収液中の総酵素回収率を求めたところ、ＣＢＨは６４％、ＧＬＤは１０％、ＸＬＤは６１％、ＣＭＣは５５％、ＸＹＮは５１％であった。ＣＢＨ、ＸＬＤ、ＣＭＣ、ＸＹＮは比較的高い酵素回収率が得られた。ＧＬＤは吸着力が極めて強く回収が困難であることが知られているが、１０％の回収率が得られた。以上の実験条件及び実験結果を、表１及び図１にまとめた。ここで、アルカリ使用量は、アルカリ含浸ＥＦＢ中のアルカリ含浸量である（固形分基準）。【００６９】
〔比較例１〕
実施例１と同等量のＮａＯＨを用いて、固液分離を行わない以下の前処理方法でＥＦＢの糖化実験を行った。
すなわち、温度計と圧力計を備えた１００ｍｌの耐圧反応器に、実施例１と同様に繊維状ＥＦＢを５．５ｇ入れ、アルカリ水溶液として１．０％のＮａＯＨ水溶液を５０．０ｇ添加した（固液比１０．１）。このアルカリ水溶液はＮａＯＨを０．５０ｇ（＝対原料ＥＦＢの使用量としては１０％）を含み、実施例１と同等のＮａＯＨ使用量である。
続いて、アルカリ水溶液を十分にＥＦＢ中に浸透させた後（減圧下、室温で１５分静置）、固液分離を行わずに、そのまま窒素ガスで反応器内を置換し密閉した。更に実施例１と同様に熱処理、洗浄工程を行い、前処理ＥＦＢを得た。ただし洗浄工程では、まずろ過して液体を除去した後、同様の洗浄操作を行った。
続いて実施例１と全く同様に糖化工程及び酵素回収工程（水洗含む）を行い、糖収率及び酵素回収率の測定を行ったところ、下記表１及び図１に示した結果となった。【００７０】
〔実施例２〕
前処理工程における熱処理の際の気相部を窒素雰囲気では無く、８０体積％酸素／２０体積％窒素として熱処理を行った点以外は、実施例１と同様に前処理を行った。その際の圧力は１００℃における全圧で０．２ＭＰａＧ（ゲージ圧）とし、酸素消費による圧力低下分は酸素ガスを追加して圧力を維持した。前処理の後、実施例１と同様に洗浄工程、糖化工程、及び酵素回収工程を行ったところ、下記表１及び図１に示した結果となった。【００７１】
〔実施例３〜７〕
下記表１に示したように種々の条件を変えて、実施例１又は２と同様にＥＦＢの糖化実験を行った。結果を下記表１に示す。なお実施例４では、室温において８０体積％酸素／２０体積％窒素で１．０ＭＰａＧに加圧してから昇温し、酸素消費による圧力低下分は補わずに熱処理を行った。【００７２】
〔実施例８〕
アルカリ含浸ＥＦＢの調製までは実施例５と同様に行い（３％ＮａＯＨ含浸）、熱処理方法を以下のように変更して実験を行った。すなわち、得られたアルカリ含浸ＥＦＢを１００ｍｌのプラスチックビーカーに入れ、そのビーカーを更に２Ｌのプラスチック容器に入れて蓋をした（２Ｌ容器の底には１００ｍｌの水を含ませた布を敷き、熱処理中に容器内が水蒸気で満たされるようにした）。また蓋には小さな穴を開け、内圧が上がらないようにした。このように調製した反応容器を８０℃のオーブンに入れ、１２時間静置して熱処理を行った（気相部の雰囲気は空気であり、酸素は十分に存在する条件。圧力は大気圧である）。熱処理後の工程は実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。【００７３】
〔実施例９、１０〕
表１に示したように条件を変えて、実施例８と同様にＥＦＢの糖化実験を行った。結果を表１に示す。【００７４】
〔実施例１１〕
アルカリ含浸ＥＦＢの調製、及び熱処理までは実施例５と同様に行い、まず、窒素下（酸素制限下）での１００℃、１時間の熱処理を行った。続いて、熱処理後のＥＦＢを実施例８と同様の方法で８０℃、６時間の熱処理を行い（空気雰囲気、大気圧）、酸素供給下での熱処理を行った。熱処理後の工程は実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。【００７５】
〔実施例１２〕
原料として水で膨潤させたＥＦＢ（水ウェットＥＦＢ）を用いて糖化実験を行った。すなわち、１００ｍｌの耐圧容器に、水ウェットＥＦＢを１４．６ｇ（含水率６５．８％、固形分として５．０ｇ）入れ、更にアルカリ水溶液として６．０％のＮａＯＨ水溶液を１５．０ｇ添加した（固液比＝４．９、全液体成分は９．６ｇ＋１５．０ｇ＝２４．６ｇ、ＥＦＢ固形分は５．０ｇ）。更に攪拌棒で軽く混合した後、密閉し、容器を空気で０．２ＭＰａＧに加圧した。これを４０℃で１時間保持し、アルカリ水溶液をＥＦＢ中に含浸させた。以降の工程は実施例８と同様に実験を行った。結果を表２に示す。なお、アルカリ含浸ＥＦＢ中の全液体成分のＮａＯＨ濃度は３．７％、アルカリ含浸量は８．５％と計算された。【００７６】
〔実施例１３〕
アルカリ水溶液の含浸条件を変えた他は実施例１２と同様にＥＦＢ（水ウェット体）の糖化実験を行った。アルカリ含浸条件は大気圧（空気加圧なし）で７０℃、３０分間とした。結果を表２に示す。【００７７】
〔実施例１４〕
酵素回収工程における残渣の処理条件を以下のように変更した以外は実施例１と同様の前処理、糖化条件で実験を行った。残渣の１次処理の際には、まず、水１５ｇを残渣に加えて攪拌混合した後、更に１％ＮａＯＨ水溶液を微量添加し、処理液のｐＨを８．０に調整した。３０分間緩やかに攪拌混合し、アルカリ条件での酵素の脱着処理を行った後、ろ過により１次処理液を回収した。２次処理は実施例１と同様に水で行い、２次処理液を回収した。回収液中の総酵素回収率を測定したところ、表３に示した結果となった。【００７８】
〔実施例１５〜１７〕
表３に示したように、酵素回収工程における残渣の１次処理、及び２次処理の条件を変えて、実施例１４と同様にＥＦＢの糖化実験を行った。結果を表３に示す。なお実施例１５では１次処理のｐＨを９．０に変更した。実施例１６では１次処理をｐＨ８．０で行い、２次処理ではＮａＯＨを更に添加して処理液のｐＨを９．０に段階的に上げて酵素回収を行った。実施例１７では、１次処理の際に、洗浄工程で得られる前処理液を処理液中に１０％添加して実験を行った。結果を表３に示す。【００７９】
〔実施例１８、１９〕
酵素回収工程における残渣の処理条件を変更した以外は実施例２と同様の前処理、糖化条件で行った。残渣の１次処理の際には、表３に示した条件で、実施例１４と同様に行った。結果を表３に示す。【００８０】
〔実施例２０〕
実施例２と同様の方法でＥＦＢの糖化工程まで行った後、実施例１６と同様の方法で酵素回収工程を実施し（残渣のアルカリ処理はｐＨ８．０→ｐＨ９．０）、回収液を得た。得られた回収液全量を限外ろ過（クラボウ社、セントリカットＵ−１０使用、分画分子量１万、膜材質ポリサルホン）にかけ、約１０ｇまで濃縮して回収酵素液とした。この回収酵素液を用いて、ＥＦＢの糖化実験を再度行った（酵素リサイクル反応）。すなわち、実施例２と同様に前処理ＥＦＢを調製し、以下のように反応混合物を調製した。
前処理ＥＦＢ（水ウェット体）、テトラサイクリン塩酸塩１．６ｍｇ、シクロヘキシミド１．２ｍｇ、０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）１０ｍｌ、回収酵素液約１０ｇ、フレッシュ酵素液（酵素Ａと酵素Ｂの１：１混合液）０．０６ｇを混合し、１０％酢酸水でｐＨ５．５に調整後、総質量を４０．０ｇに水で調整した。なお、初回の２０％分の（フレッシュ）酵素液を損失分として補充している。
これを実施例２と同様の条件で糖化した。生成した糖類をＨＰＬＣで分析した結果、グルコース収率は８９％、Ｃ５糖収率は８１％、糖合計収率は８６％（糖収率は回収酵素液から持ち込まれる糖量を考慮した収率）であり、初回と同等の糖収率が得られた。【００８１】
〔実施例２１〕
前処理工程におけるアルカリ水溶液を変えた点以外は、実施例８と同様の条件でＥＦＢ糖化実験を行った。アルカリ水溶液としては５％ＫＯＨを使用した。結果を表１に示す。【００８２】
〔実施例２２〕
実施例１と同様にＥＦＢの糖化実験を行った。ただし、糖化工程での反応混合物調製の際に、洗浄工程で得られた前処理液１０．０ｇを添加し（その分酢酸バッファーを減量、合計４０．０ｇ、ｐＨ５．５）、糖化反応を行った。更に実施例１と同様に酵素回収工程を行った。糖収率はグルコース収率が８３％、Ｃ５糖収率が８５％、糖合計収率は８４％であった。酵素回収率はＣＢＨが７１％、ＧＬＤが３２％、ＸＬＤが６５％であり、実施例１よりも高い糖収率、酵素回収率が得られた。【００８３】
〔実施例２３〕
バイオマス原料を稲わらに変更した点以外は、実施例５と同様の方法で稲わらの糖化実験を行った。すなわち、原料として稲わら５．７ｇ（長野県産、含水率１１．６％、固形分として５．０ｇ）を用い、３％ＮａＯＨを含浸させ（固液比１０）、固液分離を行った。アルカリ含浸稲わらの質量は２３．８ｇであり、固液分離後の固液比は３．８であった。更に実施例５と同様に熱処理以降の工程を行った。ただし、糖化工程では反応時間を２０時間に変更した。糖収率は、対原料稲わら（未処理、固形分基準）の質量収率として、グルコース収率が３２％、Ｃ５糖収率は１３％、糖合計収率は４５％であった。稲わらの糖類理論収率を７０％とすると、対理論収率は６４％であった。酵素回収率はＣＢＨが９５％、ＸＬＤが９０％であり、非常に高い回収率が得られた。【００８４】
〔実施例２４〕
実施例１と同様にアルカリ含浸ＥＦＢを調製した。ただしここでは含浸時の４％ＮａＯＨ水溶液の量を７５ｇとした（固液分離前の固液比１５．１）。固液分離後、アルカリ含浸ＥＦＢを耐圧反応器に入れて空気雰囲気のまま密閉し、オイルバス中に投入して１８０℃（反応器内部温度）で１５分間温度を維持し、熱処理を行った（高温短時間での熱処理）。その後、実施例１と同様に洗浄工程及び糖化工程を実施した。結果を表４に示す。ここでは糖化液の組成として、糖合計濃度（グルコース＋Ｃ５糖濃度）、及びＣ５糖割合（糖合計に対するＣ５糖の質量割合）も合わせて示した。【００８５】
〔実施例２５〜３７〕
表４に示したように種々の条件を変更し、実施例２４と同様に実験を行った。結果を合わせて示す。実施例２５〜３０では、アルカリ水溶液、及び熱処理条件を種々変えて実験を行った。実施例３１では、アルカリ水溶液としてＮａＯＨと炭酸ナトリウムの混合液（濃度は各１％）を用いた。実施例３２では、４％アンモニア水溶液を用いた。
実施例３３では、アルカリ水溶液として酸化カルシウムの０．５％スラリーを用いた。含浸時には減圧処理を行い、さらに反応器を密閉してローテーターにて転回混合しながら５０℃で１時間保持する処理を行った後、固液分離を行い、アルカリ含浸ＥＦＢを得た。
実施例３４では、固液分離前の固液比を低下させた。実施例３５では、固液分離後の固液比を低下させた（固液分離後に、ろ紙を用いて液体分を吸水することで固液比を低下させた）。実施例３６では、アルカリ水溶液の再利用実験を行った。すなわち、実施例２４のアルカリ含浸後の固液分離（ろ過）で得られたろ液をアルカリ水溶液として再利用した。ただしこの際、不足するＮａＯＨ、及び水は、新たに補充して実施例２４と同様のアルカリ水溶液とした。
実施例３７では、熱処理時の気相部を空気雰囲気ではなく、５０体積％酸素／５０体積％窒素として、さらに仕込み時の初期圧を０．６ＭＰａＧとして、熱処理を行った。【００８６】
〔比較例２〜４〕
比較例２では、比較例１と同様に固液分離を行わない方法で前処理を行った。熱処理条件は実施例２４と同じ１８０℃、１５分で行った。比較例３、及び４では、アルカリ水溶液の代わりに純水を用いて、実施例２４と同様の方法で実験を行った。実験条件及び結果を表４に合わせて示す。【００８７】
〔実施例３８〕
未分解原料への吸着酵素を再利用する実験を行った。すなわち、実施例２５と同様の条件で糖化工程まで実験を行った。ただし糖化反応は、途中２４時間の時点で反応を停止した。得られた反応混合物をろ過し、糖化液（約３０ｇ）とウェットの未分解原料（約１０ｇ）に分離した。続いてこの未分解原料と、別途調製した前処理ＥＦＢ（実施例２５と同条件）とを混合し、反応混合物（４０．０ｇ）を再調製して（ただし酵素は０．３０ｇではなく、１／３量の０．１０ｇを添加）、４５℃で糖化反応を再開した。反応をさらに７２時間行った時点で終了し、糖化液を分析した。実験全体の糖収率は（対理論収量、２倍量の原料基準）、グルコースが９０％、Ｃ５糖が８９％、糖合計では９０％であった。【００８８】
〔実施例３９〕
実施例２５と同様にＥＦＢの前処理工程を行った。次の洗浄工程では、実施例１と同じ水洗操作を４回繰り返した。すなわち、熱処理後のＥＦＢに５０．０ｇの純水を添加して１０分間攪拌混合し、前処理分解物を溶出させた。ろ過により固液分離を行い、ＥＦＢ固形分と水洗ろ液（前処理液１）を得た。この水洗操作をさらに３回繰り返し、水洗ろ液（前処理液２〜４）と、十分に洗浄された前処理ＥＦＢを得た。
前処理液１〜４の水分を蒸発させ固形分量（前処理分解物量）を測定した。その結果、前処理液１が１．５４ｇ、前処理液２が０．１６ｇ、前処理液３が０．０３ｇ、前処理液４が＜０．０１ｇの固形分を含んでおり、合計では１．７３ｇであった。この結果より、水洗各段階での前処理分解物の残存量は、水洗操作１回で０．１９ｇ（＝１．７３−１．５４）、２回で０．０３ｇ（＝０．１９−０．１６）、３回で＜０．０１ｇと考えられた。また、４回水洗を繰り返した後の前処理ＥＦＢを乾燥させ、固形分量を測定したところ、３．２ｇであった。したがって、水洗各段階での前処理分解物の残存率（＝残存する前処理分解物の固形分量／前処理ＥＦＢの固形分量）としては、水洗操作１回（洗浄水５０ｇ）で５．９％、２回（同１００ｇ）で０．９％、３回（同１５０ｇ）で＜０．３％と見積もられた。このように洗浄方法を変えることで、種々濃度で前処理分解物を含む前処理原料を調製することができ、さらにそれらを糖化することで、種々濃度で前処理分解物を含む糖化液を調製することも可能である。なお、実施例１（及び同等の実施条件の実施例）においては、前処理ＥＦＢ中の前処理分解物の残存率は、約６％であったことがわかった。また糖化工程では、約６％の前処理分解物の存在下にて糖化反応を行っていたと考えられた。また糖化液中の前処理分解物の含有濃度は、全糖成分に対して、約７％であると考えられた。【００８９】
〔実施例４０〕
前処理分解物の発酵への影響を検討した。実施例２５と同様の方法で、ただしスケールをすべて２０倍（原料ＥＦＢ１００ｇ）としてＥＦＢの糖化実験を行った。洗浄工程では、実施例３９と同様に水洗操作を３回行った（前処理分解物の残存率＜０．３％）。また糖化工程では、テトラサイクリン塩酸塩、及びシクロヘキシミドを添加せず、かつ、前処理ＥＦＢの固形分濃度を高めて糖化した（水を減量して反応混合物量を５４０ｇとした）。反応後の反応混合物を固液分離し、糖化液Ａを得た。糖化液Ａの糖合計濃度は１１．０％であり、Ｃ５糖割合は３８％であった。この糖化液と、水洗操作１回目で得たろ液（前処理液Ａ、前処理分解物を固形分基準で３．３％含有）を表５に示した割合で混合し、前処理分解物を種々の濃度（割合）で含む糖化液Ｂ〜Ｄを調製した。これらは種々の洗浄条件から得られる糖化液を模擬的に調製したものであり、糖化液Ｃが、水洗操作１回（実施例３９を参照）の時に得られる糖化液と同等の組成である。
続いて、糖化液Ａ〜Ｄを用いてブタノール発酵を実施した。培地は、糖濃度４０ｇ／Ｌ（糖合計）に調整し、培地成分（ＴＹＡ培地）を添加し、ｐＨを６〜７に調整して用いた。また対照実験として、ＥＦＢ糖化液の代わりに試薬のグルコース液を用いた実験（対照１）、及び試薬のグルコース＋キシロース（質量比６：４）液を用いた実験（対照２）を実施した。菌株はＡＴＣＣ株のクロストリジウムサッカロパーブチルアセトニカム（ＡＴＣＣ２７０２１株）を用い、前培養の後、３０℃で４８時間、静置条件で発酵を行った。結果を表５に示す。発酵３３時間と４８時間での菌体濃度（ＯＤ６６０）、生成ブタノール濃度、及びブタノール質量収率（対消費糖）を示した。数値は２回の実験の平均値である。【００９０】
【表１】
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【００９１】
【表２】
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【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【００９４】
【表５】
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【００９５】
表１に示されるように、アルカリ含浸後に固液分離を行った実施例１では、固液分離を行わない比較例１に比べて、より少ないアルカリ使用量でも、糖合計収率が１３％高かった。また、実施例１では高い酵素回収率が得られたが、比較例１の酵素回収率は極めて低く、本発明は酵素回収においても優位であることが分かった。また実施例１の前処理における固液比は２．４であり、比較例１の１０に比べて約４分の１の水使用量であり、水の削減が可能であることが分かった。【００９６】
実施例２では、前処理における酸素添加により、糖収率及び酵素回収率の更なる向上が確認された。実施例３では、低濃度の酸素を用いても、高い糖収率、酵素回収率が得られることが分かった。実施例４では、圧力、熱処理条件を変えることで、更に高い糖収率及び酵素回収率が得られることが分かった。特にＧＬＤ回収率が向上した。実施例５、６は、含浸アルカリ濃度を下げた（少ないアルカリ量での）実験であるが、比較例１と比べて、より高い糖収率、酵素回収率が得られており、アルカリ使用量の削減が可能であることが分かった。実施例７では、高温短時間の熱処理条件でも、高い糖収率、酵素回収率が得られた。実施例８〜１０では、常圧、低酸素濃度の空気雰囲気、かつ低温長時間の熱処理条件でも、高い糖収率、酵素回収率が得られることが分かった。実施例１１では、熱処理を２段階（酸素供給なし＋酸素供給下）で行うことで、より短時間でも高い糖収率、酵素回収率が得られた。実施例２１では、ＮａＯＨ以外のアルカリを使用しても良好な結果が得られた。【００９７】
また表２に示されるように、実施例１２、１３は、水ウェット体（高含水率）の原料を使用し、種々のアルカリ含浸条件を変更して行った実験であるが、これらの条件でも高い糖収率、酵素回収率が得られることが分かった。【００９８】
また表３は残渣からの酵素回収を各種条件で行った結果である。実施例１４、１５では、酵素回収工程でのアルカリ添加により、酵素回収率が向上することが確認され、より高いｐＨの方が回収率が高いことが分かった。実施例１６では、アルカリ処理をｐＨを漸増させるやり方で行うことで、より高い酵素回収率が得られた。実施例１７では、前処理分解物を添加して酵素回収を行うことで、同ｐＨ条件の実施例１４に比べて、より高い酵素回収率が得られることが分かった。また実施例１８、１９では、酸素存在下で前処理を行い、更にアルカリ添加を行って酵素回収を行うことで、より高い酵素回収率が得られることが分かった。特にＧＬＤの回収率が向上した。【００９９】
また実施例２０は、回収酵素を再利用した実験であり、１回目の反応と同等の成績が得られたことから、回収酵素は再利用できることが分かった。実施例２２では、前処理分解物を添加して糖化反応を行うことで、糖収率、酵素回収率が向上することが分かった。また実施例２３は、原料として草本系バイオマスである稲わらを用いた実験であり、稲わらを用いても高い糖収率、酵素回収率が得られることが分かった。【０１００】
実施例２４〜３７は、前処理工程の熱処理を高温（１５０℃〜２００℃付近）、短時間で行うことで、糖収率が向上することが分かった。また糖濃度、及びＣ５糖割合を示した。また実施例３６では、固液分離にて回収したアルカリ水溶液が再利用可能であることが分かった。また比較例２〜４と比較して、固液分離を行うこと、及びアルカリを使用することによる糖収率の向上効果が、高温領域においても確認された。
実施例３８では、バイオマスに吸着した酵素を再利用する逐次的な糖化反応を行い、酵素の削減効果、及び糖生産性の向上効果が示された。実施例３９では、前処理分解物の除去工程の検討を行い、洗浄方法と、前処理分解物の残存率の関係を明らかにした。実施例４０では、糖化液の発酵実験を行い、高い発酵成績が得られた。さらには、前処理分解物が糖化液中に存在した場合、発酵生成物濃度の向上、あるいは対糖収率の向上が認められることが分かった。【０１０１】
このように本発明の方法は、アルカリが効率的にバイオマスに作用するため、より少ないアルカリ使用量、水使用量でも、高い糖収率を実現することができ、その上、高い酵素回収率を達成することも可能である。また酸素存在下で前処理を行うことで、更に高い糖収率、及び酵素回収率を得ることができる。また本発明の方法では、前処理分解物除去の負荷を低減しつつ、発酵特性の優れた糖化液を得ることも可能である。【０１０２】
本発明は、上述した各実施形態及び実施例に加えて、本明細書に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、発酵原料となる糖類を得るための、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法として有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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2013111762.tif 000009
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