(57)【要約】  本発明は、ヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確、簡便かつ短時間に確認できる試験方法を提供することを目的とする。斯かる課題を解決するための本発明は、(1) p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持する哺乳動物細胞の形質転換体を、被験物質の存在下で所定時間培養する工程、及び(2) 上記工程(1)で培養した形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程を含む変異原性試験方法を提供する。
2013054846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1) p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持する哺乳動物細胞の形質転換体を、被験物質の存在下で４〜１０時間培養する工程、及び
(2) 上記工程(1)で培養した形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程
を含む変異原性試験方法。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子がｌｕｃ２であり、かつ前記形質転換体がＴＫ６細胞に当該組換えベクターを導入したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記最小プロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
p53結合配列、最小プロモーター、及びレポーター遺伝子が、前記組み換えベクターに、上流側から、p53結合配列、最小プロモーター、及びレポーター遺伝子の順に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
p53結合配列が、
5'-WRRCWWGYYY -3'：配列番号１
で示される塩基配列（配列番号１中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
p53結合配列が、
5'-WRRCWWGYYY WRRCWWGYYY -3'：配列番号２
で示される塩基配列（配列番号２中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子の発現量が、標準遺伝子に対する相対値である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持するＴＫ６細胞である、形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を含む、変異原性試験用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１１年１０月１１日に出願された、日本国特許出願第２０１１−２２４２９２号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、被験物質の哺乳動物細胞に対する変異原性ひいては発癌性を確認するための変異原性試験方法、並びに、この方法に用いられる組み換えベクター及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００３】
食品、化粧品、及び医薬品等ヒトが接触する化学物質や、環境中に廃棄される製品に含まれる物質は、発癌性がないことが求められる。変異原性物質は発癌性を有するものが多いため、使用する物質が変異原性を有するか否かを評価することは、これらの物質の安全性評価の必須事項である。【０００４】
既存の変異原性試験としては、化審法や薬事法等で採用されているサルモネラ菌を用いたエイムス（Ames）試験が最も汎用されている。この試験は微生物を用いた試験であるため、この試験で変異原性陽性と判定された化学物質は、必ずしもヒトに対して同様の結果をもたらさない。一方、哺乳類の培養細胞を用いた試験や動物個体を用いた試験、例えば、マウスリンフォーマTK試験、染色体異常試験、及び小核試験等も変異原性試験法として確立されているが、操作が煩雑で、結果が得られるまでに少なくとも２日以上を要する。【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは、(1) p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保有する形質転換体と被験物質とを接触させる工程と、(2) 被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程とを含む変異原性試験方法を開発している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第4243716号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確、簡便かつ短時間に確認できる試験方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために本発明者は研究を重ねた結果、p53結合配列、最小プロモーター及びレポーター遺伝子を含む組み換えベクターを保有する形質転換体と被験物質とを従来よりも短時間接触させ培養する工程を含む変異原性試験方法により、変異原性試験の実施ができることを見出した。特に、特定の組換えベクター及び宿主細胞の組み合わせを用いることにより被験物質との接触時間を大幅に短縮できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づき完成したものである。【０００９】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．(1) p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持する形質転換体を、被験物質の存在下で４〜１０時間培養する工程、及び
(2) 上記工程(1)で培養した形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程
を含む変異原性試験方法。【００１０】
項２．前記レポーター遺伝子がｌｕｃ２であり、かつ前記形質転換体がＴＫ６細胞に当該組換えベクターを導入したものである、項１に記載の方法。【００１１】
項３．前記最小プロモーターがＳＶ４０プロモーターである、項１又は２に記載の方法。【００１２】
項４．p53結合配列、最小プロモーター、及びレポーター遺伝子が、前記組み換えベクターに、上流側から、p53結合配列、最小プロモーター、及びレポーター遺伝子の順に配置されている、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。【００１３】
項５．前記組み換えベクターがｐＧＬ４−Ｌｕｃ２プラスミドに前記p53結合配列及び前記最小プロモーターを挿入したものであり、かつ前記形質転換体がＴＫ６細胞に当該組換えベクターを導入したものである、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。【００１４】
項６．p53結合配列が、
5'-WRRCWWGYYY -3'：配列番号１
に示す塩基配列（配列番号１中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を有するものである項１〜５のいずれか一項に記載の方法。【００１５】
項７．p53結合配列が、
5'-WRRCWWGYYY WRRCWWGYYY -3'：配列番号２
に示す塩基配列（配列番号２中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を有するものである項１〜６のいずれか一項に記載の方法。【００１６】
項８．p53結合配列が、配列番号２に示す塩基配列を３個有するものである項７に記載の方法。【００１７】
項９、前記レポーター遺伝子の発現量が、標準遺伝子に対する相対値である、項１に記載の方法。【００１８】
項１０、p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持するＴＫ６細胞である、形質転換体。【００１９】
項１１、項１０に記載の形質転換体を含む、変異原性試験用キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、従来よりもヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確かつ簡便に確認できる。【００２１】
さらにいえば、本発明の変異原性試験方法は、DNA損傷による表現型の変化を直接評価するのではなく、DNA損傷による生物反応を評価するため、DNA損傷を高感度で検出することができる。【００２２】
また本発明方法は、従来の変異原性試験のように微生物を利用するのではなく、ヒトをはじめとする哺乳類細胞のDNA損傷に対する反応系を利用するため、その試験結果はヒトでの変異原性を正確に反映したものとなる。【００２３】
そして、本発明によれば、形質転換体と被験物質との接触時間を、従来よりも短縮できるため、試験全体としても約１日以内で行うことができ大幅に時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】pGL4.10 プラスミドの塩基配列(Sequence of pGL4.10 plasmid)を示す。
【図２】pGL4.10 プラスミドの塩基配列を示す。
【図３】本発明、実施例５の変異原性試験法において、pGL4-p53R2×3-SV40-Luc2形質転換体及びPGV-p53R2x3-Luc形質転換体をそれぞれアドリアマイシンに接触させた際のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。DMSOは溶媒のみを添加した群、ADM 0.003、ADM 0.01、 ADM 0.03、ADM 0.1、 ADM 0.2、ADM 0.7は、アドリアマイシンをそれぞれ0.003μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.7μg/mL添加した群である。
【図４】実施例６のpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2形質転換体についての、種々のヒト由来細胞におけるアドリアマイシンに対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図５】参考例１のPGV-p53R2x3-Luc形質転換体についての、種々のヒト由来細胞におけるアドリアマイシンに対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図６】参考例２のPGV-p53R2x3-Luc形質転換体についての、種々のヒト由来細胞におけるアドリアマイシンに対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図７】pGL4.11 プラスミドの塩基配列(Sequence of pGL4.11 plasmid)を示す。
【図８】pGL4.11 プラスミドの塩基配列を示す。
【図９】実施例９の変異原性試験法において、pGL4-p53R2x3-Luc2P安定形質転換体をアドリアマイシンに接触させた際のルシフェラーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図１０】実施例１０の変異原性試験法において、pGL4-p53R2x3-Luc2P安定形質転換体を各濃度のアドリアマイシンに接触させた際のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図１１】実施例１２の安定形質転換体を5-aza-dCに接触させた際の、内部標準による補正あり又は補正なしのルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【００２５】
図３、４、５、６、９、１０及び１１において、縦軸は、「ルシフェラーゼ活性（% of 溶媒コントロール）（Luciferase activity (% of Solvent control)）」、すなわち、対照の溶媒コントロール試料のルシフェラーゼ活性に対する相対値で表される、ルシフェラーゼ活性の測定値である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する：
(I)組み換えベクター
本発明の方法で用いる形質転換体は、p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持している。
【００２７】
p53結合配列
p53蛋白質は、化学物質、紫外線又はガンマ線などによるDNA損傷時に、特定部位がリン酸化されることにより活性化し、特定遺伝子群の転写調節領域に結合して、その転写を調節する機能を有する転写因子である。
【００２８】
p53蛋白質のアミノ酸配列は、公知である。例えば、ヒト（Homo sapiens）のp53蛋白質のアミノ酸配列は、GenBank accession No. NP_001119584に記載されている。マウス（Mus musculus）のp53蛋白質のアミノ酸配列は、GenBank accession No. NP_035770に記載されている。
【００２９】
p53結合配列としては、哺乳動物細胞において、DNA損傷を契機としてp53により転写活性が調節される標的遺伝子群の上流又はイントロン中の転写調節領域中に存在するDNA配列が挙げられる。
【００３０】
DNA損傷によりリン酸化された活性型p53が、その転写調節領域を認識し結合することにより、転写が活性化され、転写量が増大する遺伝子群のp53結合配列を用いることが好ましい。p53により転写が活性化される遺伝子としては、具体的には、DNA修復に関わるp53R2、細胞周期調節に関わるp21／Waf-1、アポトーシスの調節に関わるp53AIP1、Bax、p53DINP1等が挙げられる。
【００３１】
天然の哺乳動物細胞においてp53により転写が促進される遺伝子群のp53結合DNA配列は、通常、コンセンサス配列である5'-WRRCWWGYYY -3'（配列番号１：Rはプリン塩基を有するヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を２回繰り返した配列5'-WRRCWWGYYY WRRCWWGYYY -3'（配列番号２：Rはプリン塩基を有するヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を含む。
【００３２】
従って、本発明で用いる組み換えベクターは、p53結合配列として配列番号１のコンセンサス配列を１個以上含むことが好ましい。また本発明で用いる組み換えベクターは、p53結合配列として配列番号２のコンセンサス配列を１個以上含むことが好ましい。当該組み換えベクターは、p53結合配列として配列番号２の塩基配列において数個程度まで、特に１〜２個のヌクレオチドが置換された塩基配列を１個以上含んでいてもよい。
【００３３】
本発明で用いる組み換えベクターは、p53結合配列として、配列番号２の塩基配列又は配列番号２の塩基配列において数個までのヌクレオチドが置換された塩基配列（好ましくは、配列番号３の塩基配列又は配列番号３の塩基配列において数個までのヌクレオチドが置換された塩基配列）を３個程度含むことがより好ましい。配列番号２のコンセンサス配列を２個以上含む場合は、それらは直接連結されていてもよく、間に１〜２０個程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。
【００３４】
天然の哺乳動物細胞においては、p53R2のイントロン1には、5'- TGACATGCCCAGGCATGTCT - 3'（配列番号３：Nature, 404, 42-49 (2000)）が存在し、Baxのイントロン1には5'- GGGCAGGCCCGGGCTTGTCG - 3'（配列番号４：Oncogene,21,990-999 (2002)）が存在し、p53AIP1のイントロン1には5'- TCTCTTGCCCGGGCTTGTCG - 3' （配列番号５：Cell, 102,849-862 (2000)）が存在し、p53DINP1のイントロン２には5'- GAACTTGGGGGAACATGTTT - 3' （配列番号６：Mol. Cell, 8, 85-94(2001)）が存在し、p21／Waf−1の上流には5'- GAACATGTCCCAACATGTTG - 3' （配列番号７：Cell, 75, 817−825(1993)）が存在する。
【００３５】
本発明において、p53結合配列としては、上記コンセンサス配列（配列番号１）に包含される配列番号３が好ましいが、配列番号４、５、６又は７の塩基配列（特に配列番号５の塩基配列）を１個以上含む配列を用いてもよい。また、配列番号２の塩基配列に該当すれば、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列において１〜３個程度のヌクレオチドが置換されている塩基配列を１個以上含む配列であってもよい。特に、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列（特に配列番号３又は５の塩基配列）を３個含む配列が好ましい。また、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列が複数含まれる場合は、これらが組み合わされて含まれていてもよい。このような例として、例えば、配列番号３の配列と配列番号４の配列と配列番号５の配列とが連結された塩基配列が挙げられる。
【００３６】
コンセンサス配列を含むDNA配列は、化学合成することができ、また哺乳動物の染色体DNAを鋳型にして、上記コンセンサス配列に基づき設計したプライマーを用いたPCRにより増幅しクローニングすることによっても調製できる。
【００３７】
本発明においては、p53の結合により転写量が低下するような遺伝子群のp53結合配列を用いることもできる。
【００３８】
また本発明で用いる組み換えベクターにおいては、p53結合配列に代えて、DNA損傷を契機として活性化する他の転写因子の結合配列を用いることもできる。すなわち、哺乳動物細胞においてDNA損傷を契機として転写活性が調節される他の標的遺伝子群の転写因子結合配列を用いることもできる。このような標的遺伝子として、キナーゼ蛋白質であるATM又はATRなどをコードする遺伝子が挙げられる。ATMはDNA損傷に応答してp53をリン酸化するキナーゼである。従ってp53結合配列に代えて、ATM遺伝子の上流域に存在する転写因子結合配列を用いることもできる。また、ATRは主に紫外線などによるDNA損傷に応答してp53をリン酸化するキナーゼである。従って、p53結合配列に代えて、ATM遺伝子の上流域に存在する転写因子結合配列を用いることもできる。
【００３９】
最小プロモーター
哺乳動物細胞で発現可能な最小プロモーターは、コアプロモーターともいわれ、通常、遺伝子の転写開始部位付近の比較的狭い部分にみられる領域である。また、最小プロモーターは、転写調節に関わる主たる機能性エレメントであり、例えば他の転写調節因子の認識配列のような転写調節に関わる他の機能性エレメントを含まないか、または、このような機能性エレメントを含んでいてもそれがp53結合配列と最小プロモーターとによる転写調節機能を本質的に変化させることのない配列である。
【００４０】
本発明で用いる組み換えベクターには、哺乳動物の最小プロモーターとして公知のものを制限なく使用できる。このような最小プロモーターの塩基配列としては、例えば、RNAポリメラーゼIIによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与するDNA領域であるTATAボックスおよび転写開始点近傍の塩基配列が挙げられ、具体的には例えば、マウスのメタロチオネインI遺伝子の5'上流領域の塩基配列（Genbank Accession No.J00605）、チキンオボアルブミン遺伝子の5'上流領域の塩基配列（Genbank accession No.J00895）、単純ヘルペスウイルス（HSV）由来のチミジンキナーゼ（tk）遺伝子の5'上流領域の塩基配列（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,78,1441-1445(1981)）、シミアンウィルス（SV40）の最小プロモーター等が挙げられる。本発明の組み換えベクターにおける最小プロモーターとしては、これらの最小プロモーター配列を用いることが好ましい。上記最小プロモーターのなかでも、特に、SV40が好ましい。また、これらのDNA配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したDNA配列も、哺乳動物細胞において最小プロモーターとして機能する限り使用できる。
【００４１】
また本発明で用いる組み換えベクターは、p53結合配列と最小プロモーターとによる転写調節機能を本質的に変化させない限り、最小プロモーターを含むより広範囲なプロモーター領域を含むものであってもよい。
【００４２】
これらの配列からなるDNAは、その塩基配列に基づいた化学合成などにより調製できる。
【００４３】
レポーター遺伝子
本発明において、レポーター遺伝子とは、その遺伝子の発現を定性的又は定量的に確認できる遺伝子をいう。レポーター遺伝子としては、例えば公知のレポーター遺伝子を広く使用できる。特に、発現量の測定が容易である点で、その転写産物（レポーター蛋白質）の有する酵素活性等に基づいて発現量を測定できる遺伝子が好ましく、このようなレポーター遺伝子として、例えばホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼのような酵素蛋白質をコードする遺伝子、緑色蛍光蛋白質（GFP :green fluorescent protein)のような発光蛋白質をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００４４】
これらのレポーター遺伝子は市販のレポータープラスミドに含まれるものを使用してもよい。好ましいレポーター遺伝子としては、例えば、luc2遺伝子、を挙げることができる。luc2遺伝子は、ホタルルシフェラーゼに由来する改変体ルシフェラーゼをコードする遺伝子である。
【００４５】
本発明において、luc2遺伝子はルシフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなる遺伝子であれば特に限定されるものではない。luc2遺伝子には、図１に示されるプラスミドのうち、luc2 gene sequence（luc2遺伝子配列）と示された部分の塩基配列（配列番号８）だけでなく、配列番号８で示される塩基配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したものも含まれる。また、luc2遺伝子には、配列番号８で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端にタグ配列、シグナル配列などが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列も含まれる。具体例としては、蛋白質分解配列（hPEST）をＣ末端に付加することで、ルシフェラーゼ蛋白質の細胞内での蓄積量が減少するよう改変した改変体であるluc2P遺伝子も含まれる。
【００４６】
luc2P遺伝子は、図７に示されるプラスミドのうち、luc2P gene sequence（luc2P遺伝子配列）と示された部分の塩基配列（配列番号１９）だけでなく、配列番号１９で示される塩基配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したものであって、ルシフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列も含まれる。
【００４７】
また、本発明において、luc2遺伝子には、ルシフェラーゼの発現レベルをさらに増加するように配列番号８又は配列番号１９で示される塩基配列を改変したものも含まれる。
【００４８】
ここで、ルシフェラーゼ（例えば、配列番号８又は配列番号１９で示される塩基配列及びその改変体のホタルルシフェラーゼ）の発現レベルは、例えば、まず、ルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを宿主細胞（例えば、後述する哺乳動物細胞）に導入し、陽性対照物質（例えば、アドリアマイシン）を添加し、そしてルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定し、次に、陽性対照物質を添加しないこと以外上記と同様にして基底レベルのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定し、これらの発現量の比（Ｓ／Ｎ比）をとることにより評価することができる。より具体的には、例えば、まず、ルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドが一過的又は安定的に導入された宿主細胞に陽性対照物質を接触させ、その後PBS（−）等で洗浄し、界面活性剤入りの細胞溶解剤を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質（例えば、ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである場合は、ルシフェリン）を細胞溶解物に添加し、当該基質の分解による発光量をルミノメーターを用いて定量する（陽性対照物質添加群）。次に、陽性対照物質を添加しないこと以外、上記と同様にして基底レベルのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を定量する（対照群）。ルシフェラーゼの発現レベルは、上記対照群に対する陽性対照物質添加群の発光量（発現量）の比率を算出することにより評価することができる。ルシフェラーゼを用いたときのＳ／Ｎ比よりも改変体を用いたときのＳ／Ｎ比が高い場合、当該改変により発現レベルは増加したと評価できる。
【００４９】
細胞選択マーカー遺伝子
本発明で用いる組み換えベクターは、細胞における組み換えベクターの保持を確認できるように、哺乳動物細胞で機能可能な細胞選択マーカー遺伝子が含まれていてよい。「細胞選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子を含むDNAで形質転換された細胞と非形質転換細胞とを見分ける際に目印となり得る表現形質をコードする遺伝子である。「動物細胞で機能可能な」とは、動物細胞で前記形質を発現することができることを意味し、「動物細胞で機能可能な遺伝子」とは、動物細胞で転写開始能を有するプロモーターの制御下にあることにより動物細胞で発現可能な状態にある遺伝子をいう。
【００５０】
動物細胞で有効な細胞選択マーカー遺伝子としては、例えば、動物細胞の増殖を抑制または阻害する薬剤に対する耐性を細胞に付与することの可能な遺伝子を挙げることができる。具体的には、ネオマイシン耐性付与遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子（ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子）等が挙げられ、形質転換細胞の選抜がより短期間で行える点で、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子が好ましい。
【００５１】
構成
本発明で使用する組み換えベクターは、p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む。すなわち、p53結合配列と最小プロモーターとを含む転写調節領域の下流に、レポーター遺伝子が発現可能に連結されている。転写因子結合配列と最小プロモーターとはいずれがより上流に存在していてもよい。組み換えベクターとしては、例えば、レポーター遺伝子として前述したluc2遺伝子配列が連結されたベクターを挙げることができる。
【００５２】
p53結合配列と最小プロモーターとの間には１〜数個程度のヌクレオチドが存在していてもよい。また、p53結合配列及び最小プロモーターを含む転写調節領域とレポーター遺伝子との間には、レポーター遺伝子が発現可能な範囲で、１〜数個程度のヌクレオチドが存在していてもよい。
【００５３】
レポーター遺伝子の上流または下流には、レポーター蛋白質と一体となって発現される（すなわち、融合蛋白質として発現される）ペプチドをコードする塩基配列が存在してもよい。このようなペプチドとして、His-tag、myc-tag、FLAG-tag、HA-tagなどのタグ配列；p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクター（例えば、hPEST配列）、核内移行シグナル配列（例えば、NLS配列）、分泌シグナル配列などのシグナル配列が例示される。
【００５４】
このようなベクターとするために、本発明で用いる組み換えベクターは、最小プロモーター及びその下流に遺伝子挿入部位を有する市販の哺乳動物細胞用発現ベクターを利用し、このベクターにp53結合配列及びレポーター遺伝子を挿入したものとしてよい。このような市販の哺乳動物用発現ベクターとしては、pUC18、pUC19等が挙げられる。また前述したように、本発明で用いる組み換えベクターは、市販のレポータープラスミドとして市販されているベクターにp53結合配列を挿入したものとすることもできる。市販のレポータープラスミドとしては、ルシフェラーゼプラスミドであるpGL4-Luc2、pGL4-Luc2P、pT81lu、pSluc2、pGL3等が挙げられる。本発明で用いる組み換えベクターとしては、pGL4-Luc2プラスミドに前記p53結合配列、前記最小プロモーター等を挿入したもの、あるいはpGL4-Luc2Pプラスミドに前記p53結合配列、前記最小プロモーター等を挿入したものが好ましい。
【００５５】
pGL4-Luc2プラスミド、及びpGL4-Luc2Pプラスミドは、Promega社から市販されているものを入手することができる。当該pGL4-Luc2プラスミドとしては、配列番号９で表される塩基配列からなるもの（pGL4.10 プラスミド）が挙げられる。配列番号９で表される塩基配列を図１及び２に示す。また、本発明において組換えベクターの原料として用いるpGL4-Luc2プラスミドには、上記配列番号９で表される塩基配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したものも含まれる。また、当該pGL4-Luc2Pプラスミドとしては、配列番号２０で表される塩基配列からなるもの（pGL4.11 プラスミド）が挙げられる。配列番号２０で表される塩基配列を図７に示す。また、本発明において組換えベクターの原料として用いるpGL4-Luc2Pプラスミドには、上記配列番号２０で表される塩基配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したものも含まれる。なお、pGL4-Luc2Pプラスミドは、pGL4-Luc2プラスミドにおいて、レポーター蛋白質のコーディング領域の下流にhPEST配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。当該プラスミドは、配列番号８で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列のＣ末端に、蛋白質分解配列（hPEST）をＣ末端に付加した、ルシフェラーゼ蛋白質の細胞内での蓄積量が減少するよう改変した改変体をコードする（luc2P遺伝子）。
【００５６】
本発明で用いる組み換えベクターは、取扱い易く、ベクター分子内または分子間の遺伝子組換えや安定形質転換細胞における染色体からの脱落等が起こる頻度が低くなる点で、コンパクトな大きさであることが望ましく、例えば2〜10kb程度の大きさであることが好ましい。
【００５７】
本発明で用いる組み換えベクターは、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む限り、完全長のプラスミドだけでなく、その一部である遺伝子構築物であってもよい。
【００５８】
本発明の組み換えベクターは、後述する変異原性試験に供する形質転換体を作製するための組み換えベクターとして好適に使用できる。
【００５９】
(II)形質転換体
本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の組み換えベクターを保持する細胞である。本発明の形質転換体は、上記組み換えベクターを一時的に保持していてもよく、安定的に保持していてもよい。
【００６０】
哺乳動物細胞
形質転換体を調製するに際し、組み換えベクターを導入する宿主細胞は哺乳動物であるかぎり、特に限定されない。宿主細胞としては、野生型p53が発現し、正常に機能している哺乳動物細胞を用いることができるが、p53機能が低下、欠損又は変異している異常細胞であっても、野生型p53遺伝子を別途導入することによりp53を発現させてやれば使用することができる。また、野生型p53が発現している細胞であっても、その発現量が少ない場合や組み換えベクター中のプロモーター活性が弱すぎる場合等は、さらに野生型p53遺伝子を別途導入してp53遺伝子の発現量を増大させて使用すればよい。
【００６１】
操作の容易性や再現性等を考慮すると安定に継代可能な樹立細胞株が好ましい。このような細胞株は特に限定されず公知のものを使用できる。p53が正常に発現しかつ安定に継代可能な樹立細胞株としては、ヒトにおけるDNA損傷とp53の活性化との関係を再現でき被験物質のヒト細胞に対する変異原性を正確に評価できる点で、ヒト由来の細胞を用いることが好ましいが、ヒトリンパ芽球由来のTK6細胞が特に好ましい。特に前述したpGL4-Luc2プラスミドあるいはpGL4-Luc2Pプラスミドを用いた組換えベクターとTK6細胞とを組み合わせることにより、被験物質との接触時間を大幅に短縮できるため好ましい。上記の培養細胞は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手できる。例えばTK6細胞は、ATCC番号CRL-8015で表される。但し、これらの細胞を使用するにあたっては、その細胞が野生型のp53を発現していることをDNAシーケンスなどで予め確認することが好ましい。
【００６２】
形質転換方法
形質転換体の調製に当たっては、本発明の組み換えベクターを宿主細胞に一過的又は安定的に導入すればよい。「安定的に導入」とは、「哺乳動物細胞のゲノムに挿入」若しくは「哺乳動物細胞のゲノムに組み込む」と換言することもできる。形質転換率を考慮する必要がない点で、安定的に導入することが好ましい。また、ベクターを宿主細胞に安定的に導入した安定発現細胞は、作業効率の点及び変異原性試験の再現性の点からも好ましい。
【００６３】
ベクター導入方法はすでに周知である。具体的には、例えば、まず105〜107細胞程度の宿主細胞を直径6〜10cm程度のシャーレに播き、5〜10%程度の血清を含有するMEM培地等を用いて、5% CO2および飽和湿度条件下に37℃で数時間〜一晩程度培養することができる。このようにして培養した細胞へ、上記DNAを導入すればよい。宿主細胞に導入されるDNAの純度は、CsCl密度勾配遠心法で精製したプラスミドDNAとほぼ同等であることが望ましい。
【００６４】
導入するDNA量は、例えばシャーレ（ウェル）あたり105細胞程度を播く場合、105細胞あたり0.1〜1.0ngが好ましく、0.2〜0.5ngがより好ましい。
【００６５】
DNA導入法は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等の一般的な方法を制限なく採用できる。操作の簡便性や再現性の観点から、エレクトロポレーション法が好ましい。これらの方法によりベクターを導入した場合は、通常、形質転換体はレポーター遺伝子を一過的に発現できる状態である。従って、DNA導入後直ぐに形質転換体を変異原性試験に供すればよい。
【００６６】
また、発現ベクターが安定的に発現している細胞は、当業者に公知の手段により作製することができる。例えば、以下の方法で組み換えベクターを安定的に導入した細胞を選択することができる。ベクター導入後、例えば、薬物耐性などの細胞選択マーカー遺伝子の活性又は陽性対照物質によるレポーター遺伝子の活性化、又は、これらの遺伝子の存在が検出できることを指標に、組み換えベクターが適切に導入された宿主細胞を選択すればよい。ここで、陽性対照物質を添加したときにルシフェラーゼ活性が基底レベルの2倍以上認められる細胞をレポーター遺伝子が活性化している細胞とみなす。
【００６７】
組み換えベクターを安定的に導入した細胞を作成する別の手段として、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどの、哺乳動物細胞のゲノムに導入遺伝子を組み込むことができるウィルスベクターを用いる手段も挙げられる。当該手段を実施するための具体的方法は、当業者に公知である。
【００６８】
高いルシフェラーゼ活性を得るため、本発明においては、組み換えベクターの導入量は、例えば９６穴プレートを使用する場合は、0.1〜1.0（ng / 穴）が好ましく、0.2〜0.5（ng / 穴）がより好ましい。
【００６９】
本発明の形質転換体は、後述する変異原性試験に供する細胞として好適に使用できる。
【００７０】
本発明の形質転換体の具体的態様として、下記の態様が例示されるが、これに限定されるものではない。
（ａ）p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたｌｕｃ２遺伝子とを含む組み換えベクターを一過的に保持するＴＫ６細胞；
（ｂ）p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたｌｕｃ２遺伝子とを含む組み換えベクターを安定的に保持するＴＫ６細胞；
（ｃ）p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたｌｕｃ２Ｐ遺伝子とを含む組み換えベクターを一過的に保持するＴＫ６細胞；
（ｄ）p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたｌｕｃ２Ｐ遺伝子とを含む組み換えベクターを安定的に保持するＴＫ６細胞。
【００７１】
(III)変異原性試験方法
本発明の変異原性試験方法は、
(1) 上記説明した形質転換体を、被験物質の存在下で培養する工程と、(2) 被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程と
を含む方法である。
【００７２】
被験物質
被験物質の種類は特に限定されない。低分子化合物、高分子化合物等の他に、例えば、食品、食品加工物、廃棄物、ゴミ焼却物等の複数種類の物質の混合物であってもよい。
【００７３】
工程(1)
以下に、工程(1)の具体的態様を例示する。本発明において、被験物質の存在下で培養させる形質転換体は、先ず、形質転換体を細胞培養容器に播種し、８時間〜一晩程度（TK6細胞等の浮遊細胞を用いる場合、０．５〜１時間程度）培養しておくことが好ましい。培養温度は、その細胞に適した温度とすればよく、通常は３６〜３８℃程度、好ましくは３７℃程度とすればよい。培養液は特に限定されず、細胞に適した培養液を使用すればよい。細胞数は特に限定されないが、例えば９６穴プレートを使用する場合は、通常１穴あたり1×104〜1×105個程度の細胞を播種すればよい。
【００７４】
次いで、細胞培養液に被験物質を添加する。被験物質はそのまま又は溶媒に溶解させて添加する。溶媒としては、例えば蒸留水、細胞に影響を与えないPBS（−）のような緩衝液、ジメチルスルフォキシド（DMSO）、エタノール、メタノール等を用いることができる。被験物質は、細胞培養液中の最終濃度が通常0.1〜1重量％程度になるように添加すればよい。食品加工物の場合は、細胞に影響を与えないPBS（−）のような緩衝液で混和したものを培養液に対して１０容量％以内添加するか、被験物質をメタノール等の有機溶媒で抽出、濃縮したものを最終濃度が通常0.1〜1重量％程度になるように添加すればよい。被験物質を溶媒に溶解させて添加する場合は、対照形質転換体の培養液には、その溶媒を被験物質溶液の添加量と同量添加する。
【００７５】
細胞培養液に被験物質を添加した後、好ましくは前記と同様の温度範囲で、通常は４〜１０時間程度、好ましくは５〜９時間程度培養を継続する。本発明の一つの態様においては、６〜１０時間程度、好ましくは７〜９時間程度の培養とすることもできる。
【００７６】
工程(1)の好ましい態様の一つは、
(1) 上記説明した形質転換体を、被験物質の存在下で４〜１０時間程度培養する工程である。
【００７７】
工程(2)
その後、被験物質を接触させた形質転換体と接触させていない形質転換体との間で、レポーター遺伝子の発現量を比較する。以下に、工程(2)の具体的態様を例示する。比較するに当たっては、両細胞のレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、両測定値を比較することができ、又は、両細胞のレポーター遺伝子発現量を目視などにより直接定性的に比較することもできる。あるいは、被験物質を接触させた形質転換体と接触させていない形質転換体との間で比較するレポーター遺伝子の発現量は、測定したレポーター遺伝子の発現量の、別の標準遺伝子の発現量（内部標準）に対する相対値であってもよい。このようなレポーター遺伝子の発現量は、標準遺伝子で標準化若しくは補正したレポーター遺伝子の発現量ともいう。
【００７８】
各レポーター遺伝子の発現量は、レポーター遺伝子の種類に応じた方法で測定すればよい。例えばレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である場合には、各細胞をPBS（−）等で洗浄した後、界面活性剤入りの細胞溶解剤を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを細胞溶解物に添加し、ルシフェリンの分解による発光量をルミノメーターを用いて定量することによりルシフェラーゼ活性を測定することができる。
【００７９】
レポーターアッセイは、マニュアル作業でも行えるが、機械を用いて自動で行ういわゆるハイスループットスクリーニング（組織培養工学、vol123,No.13,521-524、米国特許第5,670,113号）を用いることにより迅速かつ簡便に行うことができる。
【００８０】
レポーター遺伝子の発現量が別の標準遺伝子の発現量に対する相対値である場合、標準遺伝子は、前記レポーター遺伝子と異なる遺伝子であれば、特に限定されない。例えば、標準遺伝子の具体例としては、ハウスキーピング遺伝子（例えば、GADPH遺伝子、β−アクチン遺伝子など。）などの細胞に内在する遺伝子、又は、前記レポーター遺伝子と異なる、外来性の公知のレポーター遺伝子が挙げられる。標準遺伝子としてレポーター遺伝子を用いる場合、SV40プロモーター、TKプロモーター、CMVプロモーターなどの哺乳動物細胞で恒常的に機能するプロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子であることが好ましい。
【００８１】
操作の簡便性の観点から、標準遺伝子は、本発明のレポーター遺伝子と同じ方法で発現量を測定できる遺伝子であることが好ましい。例えば、本発明のレポーター遺伝子が、ホタルに由来するルシフェラーゼもしくはその改変体である場合、ホタル以外に由来するルシフェラーゼ、特にルシフェリン以外が基質であるルシフェラーゼ蛋白質をコードするルシフェラーゼ遺伝子を用いることができる。このようなルシフェラーゼ遺伝子として、ウミシイタケ（Sea pansy, 学名Renilla reniformis）に由来するルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子には、野生型の塩基配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したものであって、ルシフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列も含まれる。なお、ウミシイタケルシフェラーゼは、通常セレンテラジンを基質とする。
【００８２】
標準遺伝子が外来性のレポーター遺伝子である場合、本発明のレポーター遺伝子を含む組み換えベクターを保持する形質転換体を作製する方法に準じて、本発明の標準遺伝子を発現する形質転換体を作製することができる。すなわち、この場合、本発明の形質転換体は、例えば、本発明のレポーター遺伝子を含む組み換えベクター及び上記標準遺伝子を含む組み換えベクターを保持する形質転換体である。本発明の形質転換体は、本発明のレポーター遺伝子を含む組み換えベクターを一時的に保持するものである場合は、上記標準遺伝子を含む組み換えベクターも一時的に、又は、本発明のレポーター遺伝子を含む組み換えベクターを安定的に保持するものである場合は、上記標準遺伝子を含む組み換えベクターも安定的に保持するものであることが好ましい。
【００８３】
p53により転写が活性化される遺伝子群のp53結合配列を用いる場合は、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、被験物質の濃度依存的かつ有意に増加している場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。有意に増加しているか否かの判定基準は、既知の発癌性物質を用いた有意差検定等に基づき適宜設定可能であり、例えば、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、TK6細胞では１３０％以上になる場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。
【００８４】
また、p53により転写が抑制される遺伝子群のp53結合配列を用いる場合は、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、被験物質の濃度依存的かつ有意に低下している場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。有意に低下しているか否かの判定基準は、既知の発癌性物質を用いた有意差検定等に基づき適宜設定可能であり、例えば、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、TK6細胞では７５％以下になる場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。
【００８５】
また、本発明方法において、形質転換体に既知の変異原性物質とともに被験物質を接触させることにより、抗変異原性物質又は抗発癌性物質を選択することもできる。すなわち、対照形質転換体のレポーター遺伝子発現量と、変異原性物質のみ接触させた形質転換体のレポーター遺伝子の発現量と、変異原性物質及び被験物質を接触させた形質転換体のレポーター遺伝子の発現量とを比較して、変異原性物質を接触させることによるレポーター遺伝子発現の変化量が、さらに被験物質を接触させることにより低下し、好ましくは対照形質転換体のレポーター遺伝子発現量に対して有意に増加しなくなる場合に、その被験物質が抗変異原性物質又は抗発癌性物質であると判定できる。このような物質として、抗酸化物質等が挙げられる。
【００８６】
本発明方法において、レポーター遺伝子の発現量として別の標準遺伝子の発現量に対する相対値を用いる態様は、判定の確度が向上するとの観点から、本発明の特に好ましい態様の一つである。
【００８７】
かくして、本発明方法により、被験物質についての変異原性試験が実施される。
【００８８】
(IV)変異原性試験用キット
本発明の変異原性試験方法は、
p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたｌｕｃ２遺伝子とを含む組み換えベクターを保持するＴＫ６細胞を含む、変異原性試験用キットである。本発明のキットにより、前記本発明の変異原性試験を簡便に実施することができる。
【００８９】
このキットの構成は特に限定されるものではない。例えば、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体例としては、細胞を培養するための培地、ルシフェラーゼ活性を測定するための試薬（細胞を溶解するための試薬、ホタルルシフェラーゼの基質など）などの試薬及びこれを適切に保管するための容器；細胞培養を行うためのシャーレなどの道具が挙げられる。
【００９０】
また、本発明のキットには、本発明の変異原性試験を実施する手順に関する記載を含む手順書を含めることもできる。当該手順書には、細胞と被験物質とを接触させた後、４〜１０時間程度、好ましくは５〜９時間程度培養を継続することが記載されていることが好ましい。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例および試験例を示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９２】
実施例１（組み換えベクターの作製）
DNA損傷で発現するp53R2遺伝子イントロンのp53結合配列を3回繰り返し含む塩基配列(5’-CTGACATGCCCAGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCTA-3’：配列番号１０)からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列(5’-GATCTAGACATGCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGCATGTCAGGTAC-3’ ：配列番号１１)からなるオリゴヌクレオチドをDNA合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNAとした。【００９３】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGL4.10（Promega製）を制限酵素KpnI及びBglIIで消化した後、低融点アガロース（NuSieve 3:1 Agarose；BMA製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4214bpのDNAを回収した。このDNA約30ngと、前記のp53結合配列を3回繰り返し含むDNA 1ngとを混合し、T4リガーゼ（DNA Ligation kit；TaKaRa製）で結合させた後、この反応液を大腸菌JM109コンピテントセル（TaKaRa製）へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RVprimer3プライマー（Promega製）及びpGL4.10のマルチクローニングサイトの下流にアニーリングするよう設計したリバースプライマー(5’-CTTAATGTTTTTGGCATCTTCCA-3’：配列番号１２)を用いて、DNAシーケンス（ABI Prism BigDye Terminater v3.0；アプライドバイオシステムズ製）を確認した。正しくp53結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをpGL4-p53R2x3-Luc2と名づけた。【００９４】
実施例２（組み換えベクターの作製；プロモーターのレパートリー；SV40最小プロモーターを含むレポータープラスミドの作成）
特許第4243716号、実施例１に記載の方法にて作成したプラスミドPGV-p53R2x3-Lucを制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロース（NuSieve 3:1 Agarose；BMA製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の198bpのDNAを回収し、SV40最小プロモーターと名づけた（5’-TGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAA-3’：配列番号１３）。【００９５】
実施例１で作成したレポータープラスミドpGL4-p53R2x3-Luc2を制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4257bpのDNAを回収した。このDNA約3ngと、前記のSV40最小プロモーターのDNA 10ngとを混合し、T4リガーゼで結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RVprimer3プライマー及びリバースプライマーを用いて、DNAシーケンスを確認した。正しくSV40最小プロモーター配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをpGL4-p53R2x3-SV40-Luc2と名づけた。【００９６】
実施例３（組み換えベクターの作製；プロモーターのレパートリー；tk最小プロモーターを含むレポータープラスミドの作成）
特許第4243716号、実施例３に記載の方法にて作成したプラスミドPGV-p53R2x3-tk-Lucを制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロース（NuSieve 3:1 Agarose；BMA製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の181bpのDNAを回収し、tk最小プロモーターと名づけた（5’-TAAGAAAATATATTTGCATGTCTTTAGTTCTATGATGACACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGAATTCGAACACGCAGATGCAGTCGGGGCGGCGCGGTCCCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAAA-3’：配列番号１４）。【００９７】
実施例１で作成したレポータープラスミドpGL4-p53R2x3-Luc2を制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4257bpのDNAを回収した。このDNA約3ngと、前記のtk最小プロモーターのDNA 10ngとを混合し、T4リガーゼで結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RVprimer3プライマー及びリバースプライマーを用いて、DNAシーケンスを確認した。正しくtk最小プロモーター配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをpGL4-p53R2x3-tk-Luc2と名づけた。【００９８】
実施例４（組み換えベクターの作製；プロモーターのレパートリー；TATA最小プロモーターを含むレポータープラスミドの作成）
TATA最小プロモーターを含む塩基配列(5’- GATCTCGACTATAAAGAGGGCAGGCTGTCCTCTAAGCGTCACCACGACTTCA-3’：配列番号１５)からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列(5’- AGCTTGAAGTCGTGGTGACGCTTAGAGGACAGCCTGCCCTCTTTATAGTCGA-3’ ：配列番号１６)からなるオリゴヌクレオチドをDNA合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNAとし、TATA最小プロモーターと名付けた。【００９９】
実施例１で作成したレポータープラスミドpGL4-p53R2x3-Luc2を制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4257bpのDNAを回収した。このDNA約3ngと、前記のTATA最小プロモーターのDNA 10ngとを混合し、T4リガーゼで結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RVprimer3プライマー及びリバースプライマーを用いて、DNAシーケンスを確認した。正しくTATA最小プロモーター配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをpGL4-p53R2x3-TATA-Luc2と名づけた。【０１００】
実施例５（pGL4-p53R2×3-SV40-Luc2の反応性）
ヒトリンパ芽球細胞株TK6細胞の野生型p53が正常であることを、シーケンス用プライマーである5’-ACACGCTTCCCTGGATTG-3’（配列番号１７）及び5’-CTGTCAGTGGGGAACAAGAAGTGGAGA-3’（配列番号１８）を用いたDNAシーケンス（ABI Prism BigDye Terminater v3.0；アプライドバイオシステムズ製）により確認した。【０１０１】
TK6細胞に、実施例２で作製されたプラスミドpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を、エレクトロポレーション法により、一過的に導入した。次いで、RPMI1640培地（日水製薬製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞密度が７０〜８０％コンフルエントとなるよう播種した。尚、導入するpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2量は0.25ng / 穴ずつとなるよう調製した。【０１０２】
DNAにインターカレートし、DNAを切断することが知られているアドリアマイシンをこの形質転換体に接触させ、ルシフェラーゼ生産量が増加するか否かを確認した。詳述すれば、得られた形質転換体細胞を７群に分け、そのうちの６群にはそれぞれ、DMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終0.003μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.7μg/mLになるように添加した（最終DMSO濃度0.3％（v/v））。残りの１群にはアドリアマイシン溶液の添加量と同容量のDMSOを添加し、陰性対照とした。アドリアマイシン又はDMSO添加後、これらの細胞を37℃で４、８、１６時間培養した。次いで、培地を除去した後、細胞溶解液（プロメガ製）を25μl / 穴添加し、室温で15分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターLB96P（ベルトールド製）にセットし、30μL / 穴の基質液（プロメガ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１０３】
次に、pGL4-p53R2×3-SV40-Luc2の代わりに特許第4243716号、実施例１にて作成したプラスミドPGV-p53R2x3-Lucを用いる以外、上記と同様の操作を行って、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１０４】
結果を図３に示す。レポータープラスミドpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を導入した細胞においては、細胞に添加されたアドリアマイシン濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。すなわち、アドリアマイシンと４時間接触した時点で、変異原性試験を行うために十分なアドリアマイシン濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。またアドリアマイシンと８時間接触した時点で非常に高いルシフェラーゼ活性が測定された。これに対し、PGV-p53R2x3-Lucを導入した細胞においては、アドリアマイシンとの接触時間８時間で測定されたルシフェラーゼ活性は非常に小さかった。尚、PGV-p53R2x3-Lucを導入した細胞で変異原性試験を行うために十分なルシフェラーゼ活性を測定するには、アドリアマイシンとの接触後１６時間を要した（データ記載せず）。このことから、pGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を導入した細胞では、PGV-p53R2x3-Lucを導入した細胞よりも短時間で、且つ高いルシフェラーゼ活性を確認できることが分かる。【０１０５】
実施例６（異なるヒト由来細胞間の比較）
前記と同様にしてヒトリンパ芽球細胞株TK6の野生型p53が正常であることを確認した。当該TK6細胞に実施例２で作製されたプラスミドpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を一過的に導入した。次いで、RPMI1640培地（日水製薬製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞密度が７０〜８０％コンフルエントとなるよう播種した。尚、導入するpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2量は0.25ng / 穴ずつとなるよう調製した。【０１０６】
プラスミドを導入した細胞にDMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終0.003μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.7μg/mLになるように添加し、8時間培養した。次いで、実施例５の方法に準じて、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１０７】
さらに、野生型p53が正常であるヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト肝癌細胞株HepG2、ヒト肺癌細胞株A549、ヒト結腸癌細胞株HCT116、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293、及びヒト皮膚由来繊維芽細胞株NB1RGBについては、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞を播種し、牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、37℃で一晩培養した。次いで、細胞密度が７０〜８０％となった培養細胞に、実施例２で作製されたプラスミドpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を0.25ng / 穴ずつ、一過的に導入した。【０１０８】
得られたMCF-7細胞、HepG2細胞、A549細胞、HCT116細胞、HEK293細胞、及びNB1RGB細胞の各種形質転換体を用い、前記TK6細胞と同様にして、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。pGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を導入したTK6細胞において、アドリアマイシンとの接触８時間で非常に高いルシフェラーゼ活性が認められた。これに対し、MCF-7細胞、HepG2細胞、A549細胞、HCT116細胞、HEK293細胞及びNB1RGB細胞は、アドリアマイシンとの接触８時間後では、わずかなルシフェラーゼ活性しか認められなかった。このことから、pGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を導入した細胞においてアドリアマイシンと８時間接触させた際のルシフェラーゼ活性の上昇は、TK6細胞において顕著であることが確認できる。【０１０９】
実施例７（組み換えベクターの作製；レポーター遺伝子のレパートリー；luc2P遺伝子を含むレポータープラスミドの作成）
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドとしてpGL4.11（Promega製）を用いること以外、上記実施例１及び２に準じた操作を行い、レポータープラスミドpGL4-p53R2x3-SV40-Luc2Pと名づけた。【０１１０】
実施例８（レポーター遺伝子の安定発現細胞の構築）
TK6細胞に実施例７で作製したプラスミドpGL4-p53R2x3-SV40-Luc2Pを一過的に導入した。次いで、RPMI1640培地（日水製薬製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、培養用96穴プレート（コーニング製＃3595）に細胞が１個/穴となるよう播種した。その後、適宜培地を交換しながら１ヶ月間培養を継続し、得られた細胞コロニーを培養継続用として培養用96穴プレート（コーニング製＃3595）に、及びルシフェラーゼアッセイ用としてルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に分割し、さらに24hr培養した。その後、ルシフェラーゼアッセイ用に分割した細胞について、実施例５の方法に準じて、ルシフェラーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性が認められた細胞をTK6/p53R2x3-Luc2Pと名づけた。【０１１１】
実施例９（TK6/p53R2x3-Luc2Pの反応性）
実施例８で作製した安定発現細胞TK6/p53R2x3-Luc2Pを、RPMI1640培地（日水製薬製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞密度が７０〜８０％コンフルエントとなるよう播種した。【０１１２】
DMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終0.2μg/mLになるように添加した（最終DMSO濃度0.3％（v/v））。細胞を37℃で2、4、6及び8時間培養した。次いで、各培養時間経過後に、実施例５の方法に準じて、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１１３】
結果を図９に示す。安定発現細胞TK6/p53R2x3-Luc2Pにおいては、細胞にアドリアマイシン添加された濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められ、またアドリアマイシンと６時間接触した時点でルシフェラーゼ活性が最大に達した。【０１１４】
実施例１０（TK6/p53R2x3-Luc2Pの反応性）
実施例９の方法に準じて、実施例８で作製した安定発現細胞TK6/p53R2x3-Luc2Pを、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞密度が７０〜８０％コンフルエントとなるよう播種した。【０１１５】
アドリアマイシンをこの形質転換体に接触させ、ルシフェラーゼ生産量が増加するか否かを確認した。詳述すれば、得られた形質転換体細胞を７群に分け、そのうちの６群にはそれぞれ、DMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終0.003μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.7μg/mLになるように添加した（最終DMSO濃度0.3％（v/v））。残りの１群にはアドリアマイシン溶液の添加量と同容量のDMSOを添加し、陰性対照とした。アドリアマイシン又はDMSO添加後、これらの細胞を37℃で6時間培養した。次いで、実施例５に記載の方法に準じて、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１１６】
次に、TK6細胞に実施例２で作製したプラスミドpGL4-p53R2×3-SV40-Luc2を一過的に導入し、アドリアマイシン又はDMSO添加後37℃で8時間培養すること以外、同様の操作を行い、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１１７】
結果を図１０に示す。安定発現細胞TK6/p53R2x3-Luc2P（TK6（Stable expression））においては、細胞に添加されたアドリアマイシン濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。このこと及び前記実施例９の結果から、安定発現細胞TK6/p53R2x3-Luc2Pを用いた場合においても、TK6細胞を用いた一過性発現系（TK6（Transient expression））と同様短時間で、且つ高いルシフェラーゼ活性を確認できることが分かる。【０１１８】
実施例１１（内部標準遺伝子の安定発現細胞の構築）
実施例８で作製した細胞TK6/p53R2x3-Luc2Pに、pRL-SV40-Rlucプラスミド（SV40プロモーターの下流にウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）が連結されたプラスミド）を、実施例８の方法に準じて一過的に導入した。次いで、実施例８の方法に準じて、Luc2P及びRlucを安定して発現する細胞を取得し、TK6/p53R2x3-Luc2P/Rlucと名付けた。【０１１９】
実施例１２（内部標準による補正）
実施例１１で作製した細胞TK6/p53R2x3-Luc2P/Rlucを、実施例９の方法に準じてルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレートに播種した。【０１２０】
次いで、上記２種の細胞に5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-dC）を接触させた。詳述すれば、得られたそれぞれの細胞を７群に分け、そのうちの６群にはそれぞれ、DMSOに溶解させた5-aza-dCを最終0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.7μg/mL、2.2μg/mL、6.7μg/mL及び20μg/mLになるように添加した（最終DMSO濃度0.3％（v/v））。残りの１群には5-aza-dC溶液の添加量と同容量のDMSOを添加し、陰性対照とした。5-aza-dC又はDMSO添加後、これらの細胞を37℃で6時間培養した。【０１２１】
培地を除去した後、Luc2P遺伝子の発現量を、Rluc遺伝子の発現量に対する相対値として求めた。具体的には、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターLB96P（ベルトールド製）を用いて、まず30μL / 穴のホタルルシフェラーゼ測定用基質液（プロメガ製）を分注することによりLuc2P遺伝子の発現量を測定した後、30μL / 穴のウミシイタケルシフェラーゼ測定用基質液（プロメガ製）をさらに分注することによりRluc遺伝子の発現量を求めた。【０１２２】
結果を図１１に示す。ホタルルシフェラーゼ（Luc2P）活性の測定値を内部標準であるウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）活性により補正しない場合（内部標準なし、w/o internal control）、細胞に添加された5-aza-dCの濃度の増加に伴う測定値の上昇が認められた。一方、Luc2P活性の測定値を内部標準であるRluc活性により補正した場合（内部標準あり、with internal control）、測定値は上昇しなかった。【０１２３】
5-aza-dCは、DNAメチル基転移酵素の活性を阻害することにより、DNAの脱メチル化を誘発し、細胞の転写活性を増加することが知られている。一方で、変異原性は大きくないと考えられている。従って、内部標準によりLuc2P活性の補正を行うことで、本発明の変異原性試験の確度を向上できることが分かる。【０１２４】
参考例１
TK6細胞に、特許第4243716号、実施例１に記載の方法で作成したプラスミドPGV-p53R2x3-Lucを一過的に導入した。次いで、RPMI1640培地（日水製薬製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞密度が７０〜８０％となるよう播種した。【０１２５】
プラスミドを導入した細胞にDMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終0.003μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.7μg/mLになるように添加し、8時間培養した。次いで、実施例５の方法に準じて、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１２６】
野生型p53が正常であるヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト肝癌細胞株HepG2、ヒト肺癌細胞株A549、ヒト結腸癌細胞株HCT116、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293、及びヒト皮膚由来繊維芽細胞株NB1RGBについても、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3610）に細胞を播種し、牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、37℃で一晩培養した。次いで、細胞密度が７０〜８０％となった培養細胞に、各培養細胞で反応性が最大となるようPGV-p53R2x3-Lucの濃度を至適化し、一過的に導入した。【０１２７】
得られたMCF-7、HepG2、A549、HCT116、HEK293、及びNB1RGBの各種形質転換体に、DMSOに溶解させたアドリアマイシンを添加し、8時間培養した後、前記TK6細胞と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図５に示す。【０１２８】
図５に示されるように、PGV-p53R2x3-Lucを導入したTK6細胞、MCF-7細胞、HepG2細胞、A549細胞、HCT116細胞、HEK293細胞、及びNB1RGB細胞のいずれにおいても、アドリアマイシンとの接触８時間ではルシフェラーゼ活性はわずかしか上昇しなかった。【０１２９】
参考例２
形質転換体の培養時間を、TK6細胞については16時間、MCF-7、HepG2、A549、HCT116、及びHEK293については24時間、NB1RGBについては18時間培養とする以外、上記参考例１と同様にして、プラスミドPGV-p53R2x3-Lucの導入、培養、及びルシフェラーゼ活性の測定を行った。結果を図６に示す。【０１３０】
図６に示されるように、PGV-p53R2x3-Lucを導入したTK6細胞、MCF-7細胞、HepG2細胞、A549細胞、HCT116細胞、HEK293細胞、及びNB1RGB細胞のいずれにおいても、アドリアマイシンとの接触後、１６時間以上培養することにより高いルシフェラーゼ活性が見られた。各細胞間を比較すると、PGV-p53R2x3-Lucを導入した場合、MCF-7細胞及びHepG2細胞において、その他の細胞よりも高いルシフェラーゼ活性が見られた。図５及び６から、PGV-p53R2x3-Lucを導入した系では、アドリアマイシンとの接触後、１６時間以上もの長時間の培養が必要であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明者らが開発した特許文献１に関する技術は、日本トキシコロジー学会 技術賞を受賞している。本賞は、毒性評価技術の開発において新規開発技術の実用化等、優れた貢献をした本学会会員である若手研究者に対し、年間3人以内にのみ贈られる賞であり、当該技術は社会的に高い評価を得ている。本発明は、特許文献１に係る技術をさらに改良し、試験時間を大幅に短縮したものであるため、産業上非常に有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１３２】
配列番号８  luc2遺伝子
配列番号９  プラスミド
配列番号１２  プライマー
配列番号１７  プライマー
配列番号１８  プライマー
配列番号１９  luc2P遺伝子
配列番号２０  プラスミド
【図１】
2013054846.tif 000003
【図２】
2013054846.tif 000004
【図３】
2013054846.tif 000005
【図４】
2013054846.tif 000006
【図５】
2013054846.tif 000007
【図６】
2013054846.tif 000008
【図７】
2013054846.tif 000009
【図８】
2013054846.tif 000010
【図９】
2013054846.tif 000011
【図１０】
2013054846.tif 000012
【図１１】
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【配列表】
2013054846000001.app
【国際調査報告】
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