(57)【要約】細胞培養基材表面に光重合開始剤が固定化され、当該表面の一部、もしくは全部において当該開始剤より直鎖状ポリマーが固定化されている、細胞培養用基材であって、該光重合開始剤がチオキサントンである、細胞培養用基材を利用する。これにより、培養用基材の特定の領域に単独、もしくは複数の細胞を効率良く細胞を培養させられ、しかも基材面の温度を変えるだけで効率良く剥離させられるという利点がある。
2013073707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養基材表面に光重合開始剤が固定化され、当該表面の一部、もしくは全部において当該開始剤より直鎖状ポリマーが固定化されている、細胞培養用基材であって、該光重合開始剤がチオキサントンである、細胞培養用基材。
【請求項２】
基材表面に固定化されている直鎖状ポリマーに少なくとも０〜８０℃で水和力が変わる温度応答性ポリマーが含まれる、請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
少なくとも１つの温度応答性ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１〜２のいずれか１項記載の細胞培養用基材。
【請求項４】
温度応答性ポリマーが固定化されたＡ領域と、
（１）Ａ領域に比べ細胞と親和性の高いポリマーが固定化されている領域、
（２）Ａ領域に比べ細胞と親和性の低いポリマーが固定化されている領域、
（３）Ａ領域と異なる量の温度応答性ポリマーが固定化されている領域、
（４）Ａ領域と異なる温度に応答するポリマーが固定化されている領域
のいずれか、または（１）〜（４）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持つ、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養用基材。
【請求項５】
Ａ領域表面に温度応答性ポリマーの固定化量が０．８〜１０．０μｇ／ｃｍ2である、請求項４記載の細胞培養用基材。
【請求項６】
基材表面のＡ領域とＢ領域がパターン状となっている、請求項４、５のいずれか１項記載の細胞培養用基材。
【請求項７】
パターンがラインとスペースからなるものである、請求項６記載の細胞培養用基材。
【請求項８】
細胞培養基材表面に光重合開始剤を固定化し、光重合開始剤が固定化された基材の表面に発光波長のピークが４００ｎｍ又は４００ｎｍより長波長にある光を照射することで当該表面の一部、もしくは全部において当該開始剤より直鎖状ポリマーを固定化させることを特徴とする、細胞培養用基材の製造方法であって、該光重合開始剤がチオキサントンである、細胞培養用基材の製造方法。
【請求項９】
細胞培養基材表面に対する光の照射領域を変えることで、細胞培養基材表面に遮蔽物を置くことなく、当該基材表面に異なる種類の直鎖ポリマー、及び／または異なる量の直鎖ポリマーを固定化する、請求項８記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１０】
基材表面に固定化されている直鎖状ポリマーに少なくとも０〜８０℃で水和力が変わる温度応答性ポリマーが含まれる、請求項８〜９のいずれか１項記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの温度応答性ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１０記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１２】
温度応答性ポリマーが固定化されたＡ領域と、
（１）Ａ領域に比べ細胞と親和性の高いポリマーが固定化されている領域、
（２）Ａ領域に比べ細胞と親和性の低いポリマーが固定化されている領域、
（３）Ａ領域と異なる量の温度応答性ポリマーが固定化されている領域、
（４）Ａ領域と異なる温度に応答するポリマーが固定化されている領域
のいずれか、または（１）〜（４）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持つ、請求項８〜１１のいずれか１項記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１３】
基材表面のＡ領域とＢ領域がパターン状となっている、請求項１２記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１４】
パターンがラインとスペースからなるものである、請求項１３記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１５】
細胞培養基材表面に光重合開始剤を固定化する溶媒が濃硫酸である、請求項８〜１４のいずれか１項記載の細胞培養用基材の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞培養用基材を用いることを特徴とする複数種類の細胞の共培養方法。
【請求項１７】
請求項１６の共培養方法で得られる、複数種類の細胞からなる共培養細胞シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学等の分野において有用な細胞培養用基材及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化するだけでなく、今や細胞やその表層蛋白質を分析することで有用な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で増殖させたり、或いはその細胞の機能を高めて生体内へ戻し治療することも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術は、多くの研究者が注目している一分野である。【０００３】
ところで、ヒト細胞を含め動物細胞の多くは付着依存性のものである。すなわち、動物細胞を生体外で培養しようとするときは、それらを一度、どこかに付着させる必要性がある。そのような背景のもと、以前より多くの研究者らによって細胞にとってより好ましい器材表面の設計、考案がなされてきたが、これらの技術は何れも細胞培養時に関係するものばかりであった。付着依存性の培養細胞は何かに付着する際、自ら接着性蛋白質を産生する。従ってその細胞を剥離させるときには、従来技術ではその接着性蛋白質を破壊しなければならず、通常酵素処理が行われる。その際、細胞が培養中に産生した各種細胞固有の細胞表層蛋白も同時に破壊されてしまうという重大な課題であったにもかかわらず、現実には解決する手段が全くなく、特に検討されていなかった。この細胞回収時の課題の解決こそが、今後動物細胞を対象とした研究開発を飛躍的に発展させる上で強く求められるものと考えられる。【０００４】
このような背景のもと、特許文献１には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで器材表面を固定化した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献２には、この温度応答性細胞培養器材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。さらに、特許文献３には、この温度応答性細胞培養器材を用いて培養細胞の表層蛋白質の修復方法が記載されている。温度応答性細胞培養器材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。【０００５】
しかしながら、ここでの技術は、化学的に不活性なエンジニアプラスチックの表面を電子線等のような高エネルギーを使って固定化加工するものであり、そのためには電子線照射装置のような大掛かりな装置が必要であり、従って、基材の価格もどうしても高くなる問題点があった。【０００６】
そのような課題を解決するために、これまでに幾つかの技術が開発されてきた。その代表的なものが非特許文献１、２のような特定の分子構造を有するポリマーを合成し、基材表面へ固定化する方法が挙げられるが、いずれの技術も従来の細胞培養用基材と同等に細胞を培養でき、上記電子線を用いて作製した細胞培養用温度応答性基材と同等に細胞を温度変化するだけで剥離させ、また、培養細胞がコンフルエントの状態になった場合には細胞シートとして剥離させる技術レベルには達しておらず、その技術レベルを向上させることが求められていた。さらに、このような技術を利用し、基材表面に異なった種類のポリマーをパターン状に固定化したり、異なった量のポリマーをパターン状に固定化するには煩雑な工程が必要であった。細胞培養技術が多種多様化し、高度化された今日、細胞培養基材表面を簡便な操作で高機能化させる技術が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開平０５−１９２１３８号公報
【特許文献３】特開２００８−２２０３５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，５，２９３７−２９４６（２００９）
【非特許文献２】Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，４，１１５１−１１５７（２００７）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な細胞培養用基材を提供することを目的とする。また、本発明は、その製造方法を提供することも目的とする。
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、細胞培養用基材表面へ特定の条件下で簡便に光重合開始剤を固定化することができ、その表面上にモノマー溶液を塗布し、光を照射するだけで、当該開始剤から直鎖状ポリマーを固定化することができることを見出した。さらに、この方法であれば、基材表面上の光を照射する場所を変えれば、照射された場所だけに直鎖状ポリマーを固定化させられ、基材表面上に異なった種類のポリマーや異なった量のポリマーを簡便にパターン状に固定化されられることが判明した。本発明であれば、例えば、あらかじめ、パーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと呼ぶことがある。）に登録し、それをプロジェクタで投写することで複雑なパターン、形状を簡便に基材表面上で異なった種類のポリマーや異なった量のポリマーという形態で反映させられるものと大いに期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．細胞培養基材表面に光重合開始剤が固定化され、当該表面の一部、もしくは全部において当該開始剤より直鎖状ポリマーが固定化されている、細胞培養用基材であって、該光重合開始剤がチオキサントンである、細胞培養用基材。
項２．基材表面に固定化されている直鎖状ポリマーに少なくとも０〜８０℃で水和力が変わる温度応答性ポリマーが含まれる、項１記載の細胞培養用基材。
項３．少なくとも１つの温度応答性ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、項１〜２のいずれか１項記載の細胞培養用基材。
項４．温度応答性ポリマーが固定化されたＡ領域と、
（１）Ａ領域に比べ細胞と親和性の高いポリマーが固定化されている領域、
（２）Ａ領域に比べ細胞と親和性の低いポリマーが固定化されている領域、
（３）Ａ領域と異なる量の温度応答性ポリマーが固定化されている領域、
（４）Ａ領域と異なる温度に応答するポリマーが固定化されている領域
のいずれか、または（１）〜（４）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持つ、項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養用基材。
項５．Ａ領域表面に温度応答性ポリマーの固定化量が０．８〜１０．０μｇ／ｃｍ2である、項４記載の細胞培養用基材。
項６．基材表面のＡ領域とＢ領域がパターン状となっている、項４、５のいずれか１項記載の細胞培養用基材。
項７．パターンがラインとスペースからなるものである、項６記載の細胞培養用基材。
項８．細胞培養基材表面に光重合開始剤を固定化し、光重合開始剤が固定化された基材の表面に、発光波長のピークが４００ｎｍ又は４００ｎｍより長波長にある光を照射することで当該表面の一部、もしくは全部において当該開始剤より直鎖状ポリマーを固定化させることを特徴とする、細胞培養用基材の製造方法であって、該光重合開始剤がチオキサントンである、細胞培養用基材の製造方法。
項９．細胞培養基材表面に対する光の照射領域を変えることで、細胞培養基材表面に遮蔽物を置くことなく、当該基材表面に異なる種類の直鎖ポリマー、及び／または異なる量の直鎖ポリマーを固定化する、項８記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１０．基材表面に固定化されている直鎖状ポリマーに少なくとも０〜８０℃で水和力が変わる温度応答性ポリマーが含まれる、項８〜１０のいずれか１項記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１１．少なくとも１つの温度応答性ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、項１０記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１２．温度応答性ポリマーが固定化されたＡ領域と、
（１）Ａ領域に比べ細胞と親和性の高いポリマーが固定化されている領域、
（２）Ａ領域に比べ細胞と親和性の低いポリマーが固定化されている領域、
（３）Ａ領域と異なる量の温度応答性ポリマーが固定化されている領域、
（４）Ａ領域と異なる温度に応答するポリマーが固定化されている領域
のいずれか、または（１）〜（４）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持つ、項８〜１１のいずれか１項記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１３．基材表面のＡ領域とＢ領域がパターン状となっている、項１２記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１４．パターンがラインとスペースからなるものである、項１３記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１５．細胞培養基材表面に光重合開始剤を固定化する溶媒が濃硫酸である、項８〜１４のいずれか１項記載の細胞培養用基材の製造方法。
項１６．項１〜７のいずれか１項記載の細胞培養用基材を用いることを特徴とする複数種類の細胞の共培養方法。
項１７．項１６の共培養方法で得られる、複数種類の細胞からなる共培養細胞シート。
【００１２】
本発明の細胞培養用基材は、表面に硫酸基が導入されているため、基材表面が親水性でかつ負電荷を帯びており、細胞接着性に優れていると考えられる。
本発明の方法によれば、基材表面上の光を照射する場所を変えれば、照射された場所だけに直鎖状ポリマーを固定化させられ、基材表面上に異なった種類のポリマーや異なった量のポリマーを簡便にパターン状に固定化されられるようになる。また、本発明であれば、例えば、あらかじめ、パーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと呼ぶことがある。）に登録し、それをプロジェクタで投写することで複雑なパターン、形状を簡便に基材表面上で異なった種類のポリマーや異なった量のポリマーという形態で反映させられるようになる。これまでに、従来法の問題点として、機能性表面の作製に極めて煩雑な操作が必要になることを述べた。今回発明した光重合開始剤を固定化した表面では、既製品であるポリスチレン製培養基材などを用いて製造できること、反応工程が少ないことから工業的生産におけるコストも軽減させられるものと考えられる。また、光重合を完全に水系で行え、従来法では不可能であった細胞培養基材での適用が期待できる。さらに、本発明の表面に直鎖状ポリマーが固定化された細胞培養用基材を用いることで多種の培養細胞を2次元的パターンに保ったまま培養させられ、回収、積層化させることもでき生物学、医学、再生医療等の領域への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で得られた光重合開始剤固定化表面の紫外・可視吸光分析の測定結果を示す図である。
【図２】実施例１で得られたポリスチレン製培養皿（Pst）、光重合開始剤固定化表面（TX-Pst）、PIPAAm固定表面（1, 3, 5 wt%PIPAAm-Pst）のX線光電子分光測定結果を示す図である。
【図３】実施例１で得られたポリスチレン製培養皿（Pst）、光重合開始剤固定化表面（TX-Pst）、PIPAAm固定表面（1, 3, 5 wt%PIPAAm-Pst）のFT-IR測定結果を示す図である。
【図４】実施例２で得られた各時間ウシ血管内皮細胞が細胞培養用ポリスチレン表面（TCPS）、PIPAAm固定表面（1, 3, 5 wt%PIPAAm-Pst）に接着した際の位相差顕微鏡写真である。
【図５】実施例２で得られた各時間ウシ血管内皮細胞が5 wt%PIPAAm-Pstに接着し、低温処理によりシート状で剥離した際の位相差顕微鏡写真である。
【図６】実施例３で得られた蛍光標識BSAとウシ血管内皮細胞がPAAmパターン（ストライプ）表面にそれぞれ吸着、接着した際の顕微鏡写真である。上が蛍光像、下が光学像を示す。
【図７】実施例３で得られた蛍光標識BSAとウシ血管内皮細胞がPAAmパターン（スクエア）表面にそれぞれ吸着、接着した際の顕微鏡写真である。左が蛍光像、右が光学像を示す。
【図８】実施例４で得られた各時間ウシ血管内皮細胞がPAAm/PIPAAmパターン表面に接着した際の位相差顕微鏡写真である。
【図９】実施例５で得られたポリカーボネート製培養皿（PC）、光重合開始剤固定化表面（TX-PC）、PIPAAm固定表面（PIPAAm-PC）のX線光電子分光測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、細胞培養基材表面に光重合開始剤が固定化され、当該表面の一部、もしくは全部において当該開始剤より直鎖状ポリマーが固定化されている細胞培養用基材である。その光重合開始剤は、後述するプロジェクタのことや細胞の接着及び剥離の容易性などを考慮して、ＮｏｒｒｉｓｈII型の光重合開始剤であるチオキサントンを用いる。具体的には、２−クロロチオキサントン、２−イソプロピルチオキサントン等が挙げられる。その光重合開始剤の基材表面への固定化法も特に限定されるものではないが、例えば濃硫酸を触媒として利用し、チオサリチル酸を濃硫酸に溶解させ、基材表面上に展開させ、加温する方法が、基材表面へチオキサントンを効率良く固定化できるため好ましい。その際に用いられる濃硫酸は、濃度９０％以上の硫酸であれば特に限定されるものではなく、濃硫酸中のチオサリチル酸の濃度も同様に限定されるものではない。また、加温の際の温度条件も特に限定されるものではないが、５０℃以上が好ましく、さらに好ましくは６０℃以上、最も好ましい温度は６５℃以上である。反応温度が５０℃より低いと基材表面へのチオキサントンの導入効率が悪くなることがある。上限も特に制限されないが、通常、９０℃以下である。得られた基材表面上のチオキサントンの固定化量も特に限定されるものではない。
【００１５】
本発明で使用される細胞培養基材の材質は、通常細胞培養に用いられるポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等の物質のみならず、一般に形態付与が可能であるポリマー化合物等を用いることができる。その形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿に限定されることはなく、プレート、ファイバー、（多孔質）粒子であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器の形状（フラスコ等）を有したものであっても差し支えない。
【００１６】
かくして得られた基材表面上に固定化された光重合開始剤に対し、モノマー共存下で光を照射すると、そのモノマーが当該開始剤よりグラフト重合し、基材表面上に直鎖状のポリマーとして固定化される。その際に用いる光は、発光波長のピークが４００ｎｍ又は４００ｎｍより長波長にあるものを用いる。発光波長のピークが４００ｎｍより長波長にある青色ＬＥＤを用いても、直鎖状のポリマーとして固定化することが可能であった。その光を発生させる装置は特に限定されるものではなく、さらに光を照射したい領域と照射したくない領域を分けるために光を遮蔽するマスク等を用いても良い。しかしながら、例えば、特開２００６−３９０１０号公報で示されるような遮蔽物を使わないマスクレスプロジェクタを用いれば、あらかじめＰＣを用いて基材表面上の下述するような異なった種類のポリマー領域や異なった量のポリマー領域を設計でき、それをそのまま投写でき、本発明として好適である。その際の操作法としては何ら限定されるものではないが、まず、光重合開始剤が固定化された基材表面上へ下述するようなモノマーを塗布し、そのポリマーを基材表面の固定化したいところだけに光を投写し、固定化させる。その後、未反応のモノマーを洗浄し、必要に応じて基材表面を乾燥させる操作を繰り返すことで、基材表面上にポリマーの種類、量を自由に変えて固定化することができる。
【００１７】
本発明においては使用するモノマー種（すなわち、それが重合したポリマー種）は特に限定されるものではないが、基材表面上に０〜８０℃で水和力が変わる温度応答性ポリマーを固定化すれば、上述の通り、培養した細胞を低損傷で剥離させられ、培養条件によっては細胞シートとして剥離させられる。そのような温度応答性ポリマーとは、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）を有するポリマーが挙げられるが、それらのホモポリマー、コポリマー、或いは混合物のいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体、ポリビニルアルコール部分酢化物が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、分離される物質が生体物質であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明における温度応答性ポリマーの固定化量は０．８〜３．０μｇ／ｃｍ2の範囲が良く、好ましくは０．９〜２．０μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは１．３〜１．８μｇ／ｃｍ2である。０．８μｇ／ｃｍ2より少ない固定化量のとき、温度を変えても当該ポリマー上の培養細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなることがある。逆に３．０μｇ／ｃｍ2より多いと、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となることがある。固定化量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法、元素分析法、ＥＳＣＡ等を利用すれば良く、いずれの方法を用いても良い。
【００１８】
本発明では、上述した温度応答性ポリマーを基材表面全面に固定化しても良く、基材表面の一部に固定化しても良い。温度応答性ポリマーを基材表面の一部へ固定化した場合、例えば、温度応答性ポリマーが固定化されたＡ領域と、
（１）Ａ領域に比べ細胞と親和性の高いポリマーが固定化されている領域、
（２）Ａ領域に比べ細胞と親和性の低いポリマーが固定化されている領域、
（３）Ａ領域と異なる量の温度応答性ポリマーが固定化されている領域、
（４）Ａ領域と異なる温度に応答するポリマーが固定化されている領域
のいずれか、または（１）〜（４）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持つ基材表面を作製することでさまざまな細胞培養条件を作り出すことができる。そのような各領域の形態は、上部から観察して、例えば、（I）ラインとスペースからなるパターン、（II）水玉模様のパターン、（III）格子状のパターン、その他特殊な形のパターン、或いはこれらが混ざっている状態のパターンが挙げられるが、何ら限定されるものではない。さらに、各領域の大きさは何ら限定されるものではないが、後述する複数の細胞を共培養する際には、隣接するＡ、Ｂ領域に存在する細胞間で最も長い距離(中心間距離)が１ｃｍ以下、好ましくは０．０５ｍｍ〜８ｍｍ、さらに好ましくは０．１ｍｍ〜３ｍｍが良い。１ｃｍ以上の場合、共培養している異種の細胞間の影響が弱くなり、共培養の効率が悪くなることがある。逆に、０．０５ｍｍ以下であるとＡ，Ｂ領域の何れか、若しくは両方の領域において細胞が増殖するための十分なスペースがなく共培養の効率が悪くなることがある。
【００１９】
上述の（１）で示す細胞との親和性の高いポリマーとしては、例えば、イオン性基、親／疎水性基等を有するもの、また、それらを基材表面に固定化後、グロー放電、コロナ放電などで表面処理を施したもの、さらには、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白質のいずれかもしくは組み合わせたポリマー或いはそれらの処理物で良く、特に限定されるものではない。
【００２０】
上述の（２）で示す細胞との親和性の低い細胞非付着性ポリマーとは、細胞が付着しないものならば何ら制約されるものではないが、例えば、ポリ−Ｎ−アクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース等の親水性ポリマー、或いはシリコーンポリマー、フッ素ポリマー等の強疎水性ポリマー等が挙げられる。
【００２１】
上述の（３）で示すＡ，Ｂ両領域に温度応答性ポリマーが付着されている場合、Ａ，Ｂ間の固定化量の差は少なくとも０．１μｇ／ｃｍ2以上であることが好ましく、より好ましくは０．２０μｇ／ｃｍ2以上、さらに好ましくは０．５０μｇ／ｃｍ2以上である。０．１０μｇ／ｃｍ2以下であるとどちらか一方の上の細胞を剥離させようとしても、他方の領域の細胞も引きずられて剥離してしまうことがある。一方、同じ温度でもポリマーの固定化量が多い領域ほど応答性が速くなる。従って、処理時間の差によって片方の領域の細胞のみを剥離させられる。本発明ではＡ、Ｂどちらの領域の固定化量が多くても良く、目的に合わせ自由に支持体表面を設計することができる。
【００２２】
上述の（４）で示すＡ，Ｂ両領域に異なる温度応答性ポリマーが固定化されている場合、Ａ，Ｂそれぞれのポリマーの応答する温度の差は少なくとも２℃以上必要で、好ましくは４℃以上、さらに好ましくは８℃以上必要である。２℃以下であるとどちらか一方の上の細胞を剥離させようとしても、他方の領域の細胞も引きずられて剥離してしまうことがある。一方、同じ温度でもポリマーの固定化量が多い領域ほど応答性が速くなる。従って、処理時間の差によって片方の領域の細胞のみを剥離させられる。本発明ではＡ、Ｂどちらの領域の固定化量が多くても良く、目的に合わせ自由に支持体表面を設計することができる。
【００２３】
本発明であれば、異種の細胞をパターン化した基材上に培養することで共培養することもできる。例えば、支持体表面にＢ領域として細胞と親和性の高いポリマーを固定化させ、その中にＡ領域としてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＰＩＰＡＡｍとする）を固定化して温度応答性領域をデザインし、この領域上の細胞の接着／脱着を利用する方法で可能となる。すなわち、まず所定の細胞を３７℃で単層（シート）に培養した後に、温度応答ドメイン上の細胞のみを温度低下（例えば、２５℃以下）によって剥離させる。温度を再び３７℃に上昇させた後に違う細胞を播種し、既にドメイン化した安定な所定の細胞中に異種の細胞領域を作る手法である。例えば、肝実質細胞の単一培養系では、一週間後から次第に死んでいくのに対し、本発明の細胞培養支持体を用いる方法によれば、肝実質細胞と内皮細胞系では２週間以上にわたり共培養ができるようになる。
【００２４】
本発明で得られる細胞培養用基材表面に対して、使用される細胞は動物細胞であれば良く、その入手先、作製方法は特に限定されるものではない。本発明の細胞は、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。特に、動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。また、本発明で用いる培地は、動物細胞を培養する培地であれば特に限定されないが、例えば、無血清培地、血清含有培地等が挙げられる。そのような培地は、さらにレチノイン酸、アスコルビン酸等の分化誘導物質を添加しても良い。基材表面への播種密度は常法に従えば良く特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００２６】
[実施例１]
（光重合開始剤を利用した温度応答性ポリマー固定化表面の製造）
95%濃度の硫酸（和光純薬社製）にチオサリチル酸（東京化成社製）を20mMの濃度になるようにゆっくりと加え、10分間撹拌して反応溶液を調製した。次に市販のポリスチレン製ペトリディッシュ（コーニング社製）へ反応溶液を2 mLずつ添加し、室温で1時間静置した後、65 ℃で3時間加温した。反応後のサンプルは室温で一晩静置して温度を下げた。その後、純水で未反応の溶液の除去、洗浄を行い、45℃のオーブンで乾燥させた。本手法で作製したチオキサントン固定化ポリスチレン表面の紫外・可視吸収スペクトルの測定（UV-3101PC, 島津社製）を行った（図１）。その後、光重合開始剤が導入されたポリスチレン表面に、厚み0.5 mmのシリコンゴムシートをスペーサーとして置いて、N−メチルジエタノールアミンを100 mM添加したN−イソプロピルアクリルアミド（IPAAm）モノマー水溶液を滴下した。ここに23 mm角のカバーガラスをかぶせてモノマー溶液を挟み込み、約10 cmの距離から発光波長のピークが400 nm程度にある光（400nmより短波長の光はフィルターによってカットされている。）を照射して重合を行った。その光は可視光であるが、フィルターの性能等によって、400nmより短波長の紫外光が含まれていてもよい。重合反応は、照射時間を30分間に固定し、モノマー溶液濃度を1, 3, 5 wt%と変化させて行った。光源は500 W超高圧水銀ランプを用い、波長405 nmにおけるエネルギー強度を70 mW/cm2に調整した。また、サンプル部には温度可変ステージを設置し、温度を15℃に設定した。反応後、カバーガラス、シリコンゴムシートを取り除き、純水で洗浄して未反応のモノマーおよび未固定のポリマーを除去した。洗浄後、45℃のオーブンで乾燥させ、PIPAAm固定化ポリスチレン表面を得た。作製したPIPAAm-Pst表面を用いてX線光電子分光装置（XPS; K-alpha, ThermoFisher Scientific社製）とフーリエ変換赤外分光装置（FT-IR; Spectrum One, Perkin Elmer社製）による化学組成の分析を行った。【００２７】
（PIPAAm固定化表面製造と表面解析結果）
光重合開始剤固定化表面の紫外可視吸収スペクトルを図１に示す。作製した表面は、ペトリディッシュと比較すると400 nm付近にブロードに吸収領域が存在することを確認した。次にX線光電子分光装置を用いて、市販ポリスチレン製培養皿表面(Pst)、光重合開始剤固定化ポリスチレン表面(TX-Pst)およびPIPAAm固定化ポリスチレン表面(1, 3, 5 wt%PIPAAm-Pst)表面の元素組成比を測定した(図２)。Pst表面と比較して、TX-Pst表面ではSの割合が大きく増大していることから、ポリスチレン表面に硫酸基と光重合開始剤（チオキサントン）が固定化されたことが示された。またPIPAAmを光重合した表面の元素組成比はSの割合が低下し、Nの割合が増大しており、N/Cの値も理論値と精度よく一致していることから、PIPAAmがポリスチレン表面に固定化されたことが確認された。続いて、フーリエ変換赤外分光測定の結果を図３に示す。IRスペクトルより、TX-Pstは1150cm-1付近にチオキサントン由来のブロードのピークが観察された。また、PIPAAmが固定化された表面ではPIPAAmのアミド由来のピークが1650および1543 cm-1 (Amide IおよびAmide II)確認された。また、仕込みモノマー濃度の増加に従いアミド由来のピークが増大する傾向が認められ、温度応答性ポリマー固定量がモノマー濃度を変化させることで制御可能であることが明らかとなった。【００２８】
[実施例２]
（光重合により作製した温度応答性ポリスチレン表面での細胞培養）
実施例1と同様に作製した温度応答性表面を、70%エタノール、もしくは紫外線照射により滅菌を行った。ウシ頚動脈由来内皮細胞(ECs)を5.0 × 104 cells/cm2の密度で播種し、10%FBS含有DMEMを用いて37℃で24時間培養を行った。その後、培地交換を行い、20℃に設定したインキュベーターで2 時間培養し、細胞の剥離挙動を位相差顕微鏡で観察した。【００２９】
（光重合により作製した温度応答性ポリスチレン表面での細胞培養結果）
1 wt%PIPAAm-Pstと3 wt%PIPAAm-Pst表面では、細胞接着は確認されたが、20℃低温処理時における細胞剥離は2時間経過後も観察されなかった。一方、5 wt%PIPAAm-Pst表面では低温処理30分程度で細胞が完全に剥離することを確認した（図４）。また、5wt%PIPAAm-Pst表面に同様の濃度で細胞を播種し、7日間培養したところ、細胞がコンフルエントまで増殖し、低温処理により細胞をシート状で剥離可能なことを確認した（図５）。【００３０】
[実施例３]
（マスクレス照射装置を用いた、光重合による親水性パターン表面の作製）
実施例2と同様の方法で光重合開始剤固定化表面上に、50 wt%アクリルアミド（AAm）モノマー水溶液を挟み込み、マスクレス照射装置で可視光をパターン状に照射し、親水性ポリマーであるAAmを重合した。反応後、カバーガラス、シリコンゴムシートを取り除き、純水で洗浄して未反応のモノマーおよび未固定のポリマーを除去した。洗浄後、45℃のオーブンで乾燥させ、PAAmパターン化表面を得た。次に100 μg/mlの蛍光標識タンパク質溶液（アレクサ488標識ウシ血清アルブミン; Alexa488-BSA）を室温で吸着させ、パターン表面のタンパク吸着量のコントラストを蛍光顕微鏡像から評価した。また、ウシ頚動脈由来内皮細胞(ECs)を5.0 × 104 cells/cm2の密度で播種し、10%FBS含有DMEMを用いて37℃で24時間培養を行い、パターン化PAAm表面上の内皮細胞の接着挙動を位相差顕微鏡により観察した。【００３１】
（マスクレス照射装置を用いた、光重合による親水性パターン表面の作製結果）
2.5〜3分間可視光照射によって、PAAmパターン表面（100 μmストライプ）が作製可能であり、蛍光標識BSAおよび内皮細胞がPAAm固定化領域以外に選択的に吸着および接着することが確認された（図６）。また、図７に示すように、100 μmスクエアなどパターンの形状を変化させても同様のパターン化表面が作製できることが示された。【００３２】
[実施例４]
（マスクレス照射装置を用いた、光重合による温度応答性／親水性パターン表面の作製）
実施例3と同様の方法で100 μmスクエアのPAAmパターン表面を作製した。次に同様の方法で20 wt%IPAAmモノマー水溶液を挟み込み、マスクレス照射装置で可視光を1回目とは逆のパターン状に照射し、温度応答性ポリマーであるPIPAAmを重合した。作製した温度応答性／親水性パターン表面上に、ウシ頚動脈由来内皮細胞(ECs)を5.0 × 104 cells/cm2の密度で播種し、10%FBS含有DMEMを用いて37℃で24時間培養を行った。その後、培地交換を行い、20℃に設定したインキュベーターで2 時間培養し、細胞の剥離挙動を位相差顕微鏡で観察した。【００３３】
（マスクレス照射装置を用いた、光重合による親水性パターン表面の作製結果）
図８に示すように、PIPAAm/PAAmパターン表面上では、内皮細胞の接着領域はAAmによりパターン状に制御された。また、低温処理を行うことでPIPAAm領域上に接着した細胞を剥離させることができることを確認した。これらの結果から本表面用いることで、多種類のポリマーを段階的に固定化できると期待される。【００３４】
[実施例５]
（ポリカーボネート表面への光重合開始剤の導入）
ポリスチレン製ペトリディッシュの代わりにポリカーボネート製培養皿を用いた以外は、実施例１と同様にして、チオキサントン固定化ポリカーボネート表面を作製し、さらに、該表面で、N−イソプロピルアクリルアミド（IPAAm）モノマーを重合させることにより、PIPAAm固定化ポリカーボネート表面を得た。
X線光電子分光装置を用いて、ポリカーボネート製培養皿表面(PC)、光重合開始剤固定化ポリカーボネート表面(TX-PC)およびPIPAAm固定化ポリカーボネート表面（PIPAAm-PC）の元素組成比を測定した(図９)。その結果、PC表面と比較して、TX-PC表面ではSの割合が大きく増大していることから、ポリカーボネート表面に硫酸基と光重合開始剤（チオキサントン）が固定化されたことが示された。またPIPAAmを光重合した表面の元素組成比はSの割合が低下し、Nの割合が増大しており、N/Cの値も理論値と精度よく一致していることから、PIPAAmがポリカーボネート表面に固定化されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明を利用すれば、従来の方法より低コストで、基材表面上において光を照射する場所を変えることによって、照射された場所だけに直鎖状ポリマーを固定化でき、基材表面上に異なった種類のポリマーや異なった量のポリマーを簡便にパターン状に固定化できるようになる。また、本発明であれば、例えば、あらかじめ、パーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと呼ぶことがある。）に登録し、それをプロジェクタで投写することで複雑なパターン、形状を簡便に基材表面上に構築できるようになる。
【図１】
2013073707.tif 000003
【図２】
2013073707.tif 000004
【図３】
2013073707.tif 000005
【図９】
2013073707.tif 000006
【図４】
2013073707.tif 000007
【図５】
2013073707.tif 000008
【図６】
2013073707.tif 000009
【図７】
2013073707.tif 000010
【図８】
2013073707.tif 000011
【国際調査報告】
2013073707.tif 000012
2013073707.tif 000013
2013073707.tif 000014
2013073707.tif 000015