(57)【要約】コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産を向上させる新規な技術を開発し、異種タンパク質の分泌生産法を提供する。異種タンパク質を分泌生産する能力を有し、かつ、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を有するように改変されたコリネ型細菌を培養し、異種タンパク質を分泌生産する。
2013118544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記コリネ型細菌が、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異を有するように改変され、
前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む、方法。
【請求項２】
前記変異が、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を有さない対照株と比較して、異種タンパク質の分泌生産量を２倍以上に向上させる変異である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記変異が、野生型リボソームタンパク質Ｓ１の１７３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノ酸残基の置換が、グルタミン酸残基からグリシン残基への置換である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナルペプチドがＴａｔ系依存シグナルペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔａｔ系依存シグナルペプチドが、ＴｏｒＡシグナルペプチド、ＳｕｆＩシグナルペプチド、ＰｈｏＤシグナルペプチド、ＬｉｐＡシグナルペプチド、およびＩＭＤシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コリネ型細菌が、さらに、Ｔａｔ系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されている、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔａｔ系分泌装置をコードする遺伝子が、ｔａｔＡ遺伝子、ｔａｔＢ遺伝子、ｔａｔＣ遺伝子、およびｔａｔＥ遺伝子からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４）に由来する改変株である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を有するように改変されたコリネ型細菌であって、
前記変異が、野生型リボソームタンパク質Ｓ１の１７３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異である、コリネ型細菌。
【請求項１４】
前記アミノ酸残基の置換が、グルタミン酸残基からグリシン残基への置換である、請求項１３に記載のコリネ型細菌。
【請求項１５】
コリネバクテリウム属細菌である、請求項１３または１４に記載のコリネ型細菌。
【請求項１６】
コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１５に記載のコリネ型細菌。
【請求項１７】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４）に由来する改変株である、請求項１６記載のコリネ型細菌。
【請求項１８】
細胞表層タンパク質の活性が低下している、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種タンパク質の分泌生産方法および特定の変異を有するコリネ型細菌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物による異種タンパク質の分泌生産としては、これまでに、バチルス属細菌（非特許文献１）、メタノール資化性酵母Pichia pastoris（非特許文献２）、およびAspergillus属糸状菌（非特許文献３、４）等による異種タンパク質の分泌生産が報告されている。【０００３】
また、コリネ型細菌により異種タンパク質を分泌生産する試みもなされている。コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産については、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼ(nuclease)やリパーゼ（lipase）の分泌（特許文献１、非特許文献５）、サチライシン等のプロテアーゼの分泌（非特許文献６）、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質PS1やPS2（CspBともいう）のシグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌（特許文献２）、PS2（CspB）のシグナルペプチドを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌（非特許文献７）、PS2（CspB）やSlpA（CspAともいう）のシグナルペプチドを利用したプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献３）、変異型分泌装置を利用したタンパク質の分泌（特許文献４）、変異株によるプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献５）等の報告がある。【０００４】
一般的なタンパク質分泌経路は、原核生物から真核生物まで広く存在するSec系と呼ばれる経路であるが、近年、Sec系とは全く異なるタンパク質分泌経路が植物細胞の葉緑体のチラコイド膜において見出された（非特許文献８）。この新規な分泌経路は、それにより分泌されるタンパク質のシグナル配列にアルギニン−アルギニンの配列が共通して存在していることから（非特許文献８）、Tat系（Twin-Arginine Translocation system）と名付けられた。Sec系ではタンパク質が高次構造を形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが知られている（非特許文献９）。コリネ型細菌においても、Tat系依存シグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌生産の報告がある（特許文献６）。【０００５】
リボソームタンパク質S1（RpsAタンパク質ともいう）は、リボソームの30Sサブユニットを構成する最大のタンパク質であり、30Sサブユット中の16S rRNAとmRNAのSD配列との結合を制御している（非特許文献１０）。エシェリヒア・コリでは、RpsAタンパク質は生育に不可欠なタンパク質であることが知られている（非特許文献１１）。また、腸内細菌において、RpsAタンパク質の変異はＬ−アミノ酸の生産に有効であることが知られている（特許文献７）。【０００６】
また、リボソームタンパク質S12（RpsLタンパク質ともいう）の変異がストレプトマイシン耐性に関与することが知られており、変異型リボソームタンパク質S12を有する大腸菌の無細胞抽出液が、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成に有用であることが知られている（特許文献８）。【０００７】
しかしながら、コリネ型細菌において、リボソームタンパク質S1の変異が異種タンパク質の分泌生産、特にTat系を利用する異種タンパク質の分泌生産に有効であることは知られていない。また、リボソームタンパク質S1における特定の変異が異種タンパク質の分泌生産に有効であることも知られていない。また、リボソームタンパク質S1の特定の箇所に変異を有するコリネ型細菌についても知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許4965197
【特許文献２】特表平6-502548
【特許文献３】特許第4320769号
【特許文献４】特開平11-169182
【特許文献５】特許第4362651号
【特許文献６】特許第4730302号
【特許文献７】国際公開2011/096554
【特許文献８】特開2004-173627
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Microbiol. rev., 57, 109-137(1993)
【非特許文献２】Biotechnol., 11, 905-910(1993)
【非特許文献３】Biotechnol., 6, 1419-1422(1988)
【非特許文献４】Biotechnol., 9, 976-981(1991)
【非特許文献５】J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)
【非特許文献６】Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995)
【非特許文献７】Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)
【非特許文献８】EMBO J., 14, 2715-2722(1995)
【非特許文献９】J. Biol. Chem., 25;273(52), 34868-74(1998)
【非特許文献１０】RNA, 8(9), 1137-1147(2002)
【非特許文献１１】J. Mol. Biol., 280(4), 561-569(1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産を向上させる新規な技術を開発し、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌を発現ホスト（expression host）として利用する異種タンパク質の生産法において、コリネ型細菌のリボソームタンパク質S1に変異を導入することにより、Tat系分泌装置による異種タンパク質の分泌生産能が向上することを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記コリネ型細菌が、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異を有するように改変され、
前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む、方法。
[２]前記変異が、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を有さない対照株と比較して、異種タンパク質の分泌生産量を２倍以上に向上させる変異である、前記方法。
[３]前記変異が、野生型リボソームタンパク質Ｓ１の１７３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異である、前記方法。
[４]前記アミノ酸残基の置換が、グルタミン酸残基からグリシン残基への置換である、前記方法。
[５]前記シグナルペプチドがＴａｔ系依存シグナルペプチドである、前記方法。
[６]前記Ｔａｔ系依存シグナルペプチドが、ＴｏｒＡシグナルペプチド、ＳｕｆＩシグナルペプチド、ＰｈｏＤシグナルペプチド、ＬｉｐＡシグナルペプチド、およびＩＭＤシグナルペプチドからなる群より選択される、前記方法。
[７]前記コリネ型細菌が、さらに、Ｔａｔ系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されている、前記方法。
[８]前記Ｔａｔ系分泌装置をコードする遺伝子が、ｔａｔＡ遺伝子、ｔａｔＢ遺伝子、ｔａｔＣ遺伝子、およびｔａｔＥ遺伝子からなる群より選択される、前記方法。
[９]前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
[１０]前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
[１１]前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４）に由来する改変株である、前記方法。
[１２]前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌である、前記方法。
[１３]リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を有するように改変されたコリネ型細菌であって、
前記変異が、野生型リボソームタンパク質Ｓ１の１７３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異である、コリネ型細菌。
[１４]前記アミノ酸残基の置換が、グルタミン酸残基からグリシン残基への置換である、前記コリネ型細菌。
[１５]コリネバクテリウム属細菌である、前記コリネ型細菌。
[１６]コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記コリネ型細菌。
[１７]コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４）に由来する改変株である、前記コリネ型細菌。
[１８]細胞表層タンパク質の活性が低下している、前記コリネ型細菌。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株で、E. coliのTorAシグナル配列を融合したプロトランスグルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図２】図２は、各種コリネ型細菌由来RpsAタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。最下段の「*」は完全に一致したアミノ酸を示す。C. glutamicum THM1株、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. efficiens YS-314株、およびC. stationis ATCC6872株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２、４、８、１０、および１２に示す。C. glutamicum ATCC13869株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列はYDK010株のものと同一（配列番号４）である。
【図３】図３は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株で、E. coliのTorAシグナル配列を融合したプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図４】図４は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株で、Arthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼ（シグナル配列を含む）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図５】図５は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株、ならびにそれらのTat系分泌装置増強株で、E. coliのTorAシグナル配列を融合したプロトランスグルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図６】図６は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株、ならびにそれらのTat系分泌装置増強株で、E. coliのTorAシグナル配列を融合したプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図７】図７は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株、ならびにそれらのTat系分泌装置増強株で、Arthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼ（シグナル配列を含む）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図８】図８は、C. glutamicum YDK010株およびそのRpsA(E173G)変異株で、C. stationis ATCC6872のSlpA（CspA）のシグナル配列を融合したプロトランスグルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明の異種タンパク質の製造方法
本発明は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、前記コリネ型細菌がリボソームタンパク質S1遺伝子に変異を有するように改変されている、方法（以下、「本発明の方法」または「本発明の異種タンパク質の製造方法」ともいう）を提供する。
【００１６】
＜１−１＞本発明の方法に用いられるコリネ型細菌
＜１−１−１＞異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌
本発明の方法に用いられるコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物（genetic construct）を有することにより、異種タンパク質を分泌生産する能力を有する。
【００１７】
なお、本発明の方法に用いられるコリネ型細菌を、「本発明の細菌」あるいは「本発明のコリネ型細菌」ともいう。また、本発明の細菌が有する異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を「本発明に用いられる遺伝子構築物」ともいう。
【００１８】
本発明において、タンパク質が「分泌」されるとは、タンパク質が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいう。タンパク質が「分泌」されることには、最終的にそのタンパク質の全分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、そのタンパク質の全分子が菌体表層に存在している場合や、そのタンパク質の一部の分子が培地中に存在し、残りの分子が菌体表層に存在している場合も含まれる。
【００１９】
すなわち、本発明において、「異種タンパク質を分泌生産する能力」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体表層に異種タンパク質を分泌し、培地中または菌体表層から回収できる程度に蓄積する能力をいう。蓄積量は、例えば、培地中での蓄積量として、好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上、さらに好ましくは1 g/L以上であってよい。また、蓄積量は、例えば、菌体表層での蓄積量として、菌体表層の異種タンパク質を回収し培地と同量の液体に懸濁した場合に懸濁液中での異種タンパク質濃度が好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上となるような量であってよい。なお、本発明において分泌生産される「タンパク質」とは、ペプチドあるいはポリペプチドと呼ばれる態様をも含む概念である。
【００２０】
本発明において、「異種タンパク質」（heterologous protein）とは、同タンパク質を発現および分泌させるコリネ型細菌にとって外来性（exogenous）であるタンパク質をいう。異種タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体（multimer）タンパク質であってもよい。多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体においては、１またはそれ以上の分子間ジスルフィド結合が含まれるのが好ましい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも１つのサブユニットが異種タンパク質であればよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。異種タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。また、異種タンパク質は、天然でTat系依存の分泌性タンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。「異種タンパク質」の具体例は後述する。
【００２１】
生産される異種タンパク質は、１種類のみであってもよく、２またはそれ以上の種類であってもよい。また、異種タンパク質がヘテロ多量体である場合には、１種類のサブユニットのみが生産されてもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットが生産されてもよい。すなわち、「異種タンパク質を分泌生産する」ことには、目的の異種タンパク質を構成するサブユニットの内、全てのサブユニットを分泌生産する場合に加えて、一部のサブユニットのみを分泌生産する場合も含まれる。
【００２２】
本発明において、コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性かん菌であり、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属細菌等が挙げられる。なお、コリネ型細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネ型細菌には、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）に分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）に再分類されたものも含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来異種タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
【００２３】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００２４】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００２５】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２６】
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院  微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号305-8566）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。
【００２７】
また、Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) は、昭和62年3月13日に工業技術院  微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号305-8566）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-1539が付与されている。また、Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) は、昭和63年12月24日に工業技術院  微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１  中央第６、郵便番号305-8566）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-2205が付与されている。
【００２８】
また、上述したようなコリネ型細菌を親株として、突然変異法や遺伝子組換え法を利用してタンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜し、宿主として利用してもよい。例えば、紫外線照射またはN-メチル-N'-ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することができる。
【００２９】
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中または菌体表層に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異法または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質のコード領域またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2の欠損株であるC. glutamicum YDK010株（WO2004/029254）が挙げられる。
【００３０】
すなわち、本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下しているものであってよい。以下に、細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。
【００３１】
細胞表層タンパク質は、細菌や古細菌の細胞表層（Ｓ層）を構成するタンパク質である。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumのPS1およびPS2（CspBともいう）、ならびにC. stationisのSlpA（CspAともいう）が挙げられる。これらの中では、PS2タンパク質の活性を低下させるのが好ましい。
【００３２】
C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPS2タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６および２７に示す。
【００３３】
また、例えば、28株のC. glutamicumについて、CspBホモログのアミノ酸配列が報告されている（J Biotechnol., 112, 177-193(2004)）。これら28株のC. glutamicumとcspB遺伝子ホモログのＮＣＢＩデータベースのGenBank accessionナンバーを以下に例示する（カッコ内がGenBank accessionナンバーを示す）。
C. glutamicum ATCC13058（AY524990）
C. glutamicum ATCC13744（AY524991）
C. glutamicum ATCC13745（AY524992）
C. glutamicum ATCC14017（AY524993）
C. glutamicum ATCC14020（AY525009）
C. glutamicum ATCC14067（AY524994）
C. glutamicum ATCC14068（AY525010）
C. glutamicum ATCC14747（AY525011）
C. glutamicum ATCC14751（AY524995）
C. glutamicum ATCC14752（AY524996）
C. glutamicum ATCC14915（AY524997）
C. glutamicum ATCC15243（AY524998）
C. glutamicum ATCC15354（AY524999）
C. glutamicum ATCC17965（AY525000）
C. glutamicum ATCC17966（AY525001）
C. glutamicum ATCC19223（AY525002）
C. glutamicum ATCC19240（AY525012）
C. glutamicum ATCC21341（AY525003）
C. glutamicum ATCC21645（AY525004）
C. glutamicum ATCC31808（AY525013）
C. glutamicum ATCC31830（AY525007）
C. glutamicum ATCC31832（AY525008）
C. glutamicum LP-6（AY525014）
C. glutamicum DSM20137（AY525015）
C. glutamicum DSM20598（AY525016）
C. glutamicum DSM46307（AY525017）
C. glutamicum 22220（AY525005）
C. glutamicum 22243（AY525006）
【００３４】
コリネ型細菌が属する種又は菌株によって、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記塩基配列のバリアントであってもよい。「元の機能が維持された」とは、例えば、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有することであってよい。例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質、例えば、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質、をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、後述するリボソームタンパク質S1およびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
【００３５】
「コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、コリネ型細菌で活性を低下させたときに非改変株、例えば野生株または親株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する能力をコリネ型細菌に付与する性質をいう。非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産するとは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株と比較して好ましくは10 %以上、より好ましくは20 %以上、特に好ましくは30 %以上、さらに好ましくは100 %以上多い量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産するとは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。
【００３６】
コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するかどうかは、コリネ型細菌に属する菌株を基にそのタンパク質の活性が低下するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
【００３７】
本発明において、「細胞表層タンパク質の活性が低下している」ことには、細胞表層タンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌が改変された場合、および、コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合が含まれる。「コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合」には、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合が含まれる。すなわち、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌としては、例えば、もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌が挙げられる。「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合」としては、例えば、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質をコードする遺伝子を有さない場合が挙げられる。なお、「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、コリネ型細菌が、当該コリネ型細菌が属する種の他の株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質をもともと有さないことであってよい。例えば、「C. glutamicumがもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、C. glutamicum株が、他のC. glutamicum株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質、すなわち、例えばPS1および／またはPS2（CspB）、をもともと有さないことであってよい。もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌としては、例えば、もともとcspB遺伝子を有さないC. glutamicum ATCC 13032が挙げられる。
【００３８】
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００３９】
「タンパク質の活性が低下する」とは、標的のタンパク質の活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。
【００４０】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。
【００４１】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００４２】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００４３】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や異種タンパク質生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００４４】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００４５】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線もしくは紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による通常の変異処理が挙げられる。
【００４６】
標的のタンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性は、具体的には、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは０％に低下する。
【００４７】
標的の遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現する標的のタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００４８】
標的の遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００４９】
標的のタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００５０】
標的の遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００５１】
異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌は、上述したようなコリネ型細菌に、本発明に用いられる遺伝子構築物を導入し保持させることにより得ることができる。本発明に用いられる遺伝子構築物やその導入法については後述する。
【００５２】
＜１−１−２＞変異型リボソームタンパク質S1遺伝子の導入
本発明の細菌は、リボソームタンパク質S1遺伝子に変異を有するように改変されている。本発明において、「リボソームタンパク質S1遺伝子に変異を有する」とは、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有することをいう。本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌を、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変した後に、異種タンパク質を分泌生産する能力を付与することによっても得ることができる。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。なお、本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するように改変される前から異種タンパク質を分泌生産できた株から得られたものであってよい。また、本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するように改変される前には異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していても異種タンパク質を分泌生産することができなかった株から得られたものであって、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するように改変されることにより異種タンパク質を分泌生産できるようになったものであってもよい。
【００５３】
以下、リボソームタンパク質S1およびそれをコードする遺伝子について説明する。本発明において、後述する「変異」を有するリボソームタンパク質S1を変異型リボソームタンパク質S1、それをコードする遺伝子を変異型リボソームタンパク質S1遺伝子ともいう。また、本発明において、後述する「変異」を有さないリボソームタンパク質S1を野生型リボソームタンパク質S1、それをコードする遺伝子を野生型リボソームタンパク質S1遺伝子ともいう。
【００５４】
野生型リボソームタンパク質S1遺伝子としては、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. efficiens YS-314株、およびC. stationis ATCC6872株のrpsA遺伝子が挙げられる。これらのrpsA遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号３、７、９、および１１に示す。また、これらのrpsA遺伝子がコードするRpsAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４、８、１０、および１２に示す。
【００５５】
また、野生型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有さず、且つ、リボソームタンパク質S1としての機能を有する限り、上記RpsAタンパク質のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントは、例えば、上記RpsAタンパク質のホモログや人為的な改変体であってよい。本発明において、「リボソームタンパク質S1としての機能」とは、例えば、30Sサブユット中の16S rRNAとmRNAのSD配列との結合を制御する機能であってよい。
【００５６】
野生型リボソームタンパク質S1は、例えば、上記RpsAタンパク質における保存配列を有するのが好ましい。上記各RpsAタンパク質を含むRpsAタンパク質間でのアライメントの結果を図２に示す。
【００５７】
また、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子は、上記RpsAタンパク質やその保存的バリアントをコードする限り、上記rpsA遺伝子のバリアントであってもよい。
【００５８】
上記RpsAタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記のコリネ型細菌のrpsA遺伝子（配列番号３、７、９、または１１）を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記RpsAタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００５９】
野生型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有さず、且つ、リボソームタンパク質S1としての機能を有する限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【００６０】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００６１】
さらに、野生型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有さず、且つ、リボソームタンパク質S1としての機能を有する限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００６２】
また、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子は、後述する「変異」を有さず、且つ、リボソームタンパク質S1としての機能を有するタンパク質をコードする限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、より好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００６３】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００６４】
また、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子は、上記のような野生型リボソームタンパク質S1をコードする限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００６５】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、Tat系分泌装置、細胞表層タンパク質、本発明において分泌生産される異種タンパク質等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００６６】
変異型リボソームタンパク質S1は、上述したような野生型リボソームタンパク質S1のアミノ酸配列において、後述する「変異」を有する。
【００６７】
すなわち、言い換えると、変異型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有する以外は、上述したコリネ型細菌のRpsAタンパク質やその保存的バリアントであってよい。
【００６８】
具体的には、例えば、変異型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有する以外は、配列番号４、８、１０、または１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００６９】
また、具体的には、例えば、変異型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有する以外は、配列番号４、８、１０、または１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００７０】
また、具体的には、例えば、変異型リボソームタンパク質S1は、後述する「変異」を有する以外は、配列番号４、８、１０、または１２に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００７１】
また、言い換えると、変異型リボソームタンパク質S1は、上述したコリネ型細菌のRpsAタンパク質において、後述する「変異」を有し、且つ、当該「変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。
【００７２】
具体的には、例えば、変異型リボソームタンパク質S1は、配列番号４、８、１０、または１２に示すアミノ酸配列において、後述する「変異」を有し、且つ、当該「変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００７３】
変異型リボソームタンパク質S1遺伝子は、上記のような変異型リボソームタンパク質S1をコードする限り、特に制限されない。
【００７４】
以下、変異型リボソームタンパク質S1が有する「変異」について説明する。
【００７５】
「変異」は、上述したような野生型リボソームタンパク質S1のアミノ酸配列が変化するものであれば特に制限されないが、異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるのが好ましい。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するよう改変されたコリネ型細菌が、非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産できることをいう。「非改変株」とは、リボソームタンパク質S1遺伝子に変異を有さない対照株、すなわち変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有さない対照株であり、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株と比較して好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、特に好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは２倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。
【００７６】
ある変異が異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるかどうかは、例えば、コリネ型細菌に属する菌株を基に当該変異を有するリボソームタンパク質S1をコードする遺伝子を有するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
【００７７】
また、「変異」は、野生型リボソームタンパク質S1のいずれかのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるものであるのが好ましい。また、「変異」は、野生型リボソームタンパク質S1の１７３位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるものであるのが好ましい。また、「変異」は、野生型リボソームタンパク質S1の１７３位のアミノ酸残基がグリシン残基に置換されるものであるのが好ましい。また、「変異」は、野生型リボソームタンパク質S1の１７３位のグルタミン酸残基がグリシン残基に置換されるものであるのが好ましい。
【００７８】
本発明において、「野生型リボソームタンパク質S1のＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号４におけるＸ位に相当するアミノ酸残基を意味する。なお、アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端からＸ番目を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。すなわち、上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「野生型リボソームタンパク質S1の１７３位のアミノ酸残基」とは、配列番号４における１７３位に相当するアミノ酸残基を意味し、１７３位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から１７２番目のアミノ酸残基が「野生型リボソームタンパク質S1の１７３位のアミノ酸残基」であるものとする。また、１７３位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から１７４番目のアミノ酸残基が「野生型リボソームタンパク質S1の１７３位のアミノ酸残基」であるものとする。
【００７９】
任意のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号４におけるＸ位に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【００８０】
変異型リボソームタンパク質S1遺伝子は、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を、コードされるリボソームタンパク質S1が上述の「変異」を有するよう改変することにより取得できる。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子は、化学合成によっても取得できる。
【００８１】
以下、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変する手法について説明する。
【００８２】
変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより達成できる。また、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、自然変異や変異原処理によりリボソームタンパク質S1遺伝子に変異を導入することによっても達成できる。
【００８３】
変異型リボソームタンパク質S1遺伝子をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子は、コリネ型細菌で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。本発明の細菌において、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の細菌は、１種類の変異型リボソームタンパク質S1遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有していてもよい。変異型リボソームタンパク質S1遺伝子の導入は、例えば、後述する本発明に用いられる遺伝子構築物の導入と同様に行うことができる。
【００８４】
本発明の細菌は、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を有していてもよく、有していなくともよいが、有していないのが好ましい。
【００８５】
野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を有さないコリネ型細菌は、染色体上の野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型リボソームタンパク質S1遺伝子の破壊は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子のプロモーター領域および／またはコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を破壊できる。なお、リボソームタンパク質S1遺伝子が必須遺伝子である場合には、先に変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を導入してから、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を破壊するのが好ましい。
【００８６】
また、染色体上の野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を変異型リボソームタンパク質S1遺伝子で置換することにより、野生型リボソームタンパク質S1遺伝子を有さず、且つ、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子を有するように改変されたコリネ型細菌を取得できる。このような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００８７】
＜１−１−３＞Tat系分泌装置の増強
また、本発明の細菌は、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されていてもよい。本発明において、このような改変を「Tat系分泌装置の増強」ともいう。Tat系分泌装置をコードする遺伝子の発現を上昇させる手法については特許文献６（特許第4730302号）に記載されている。
【００８８】
Tat系分泌装置をコードする遺伝子としては、C. glutamicumのtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、1571065〜1571382位の配列の相補配列、1167110〜1167580位の配列、および1569929〜1570873位の配列の相補配列に相当する。また、C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_600707 (version NP_600707.1 GI:19552705、locus_tag="NCgl1434")、GenBank accession NP_600350 (version NP_600350.1 GI:19552348、locus_tag="NCgl1077")、およびGenBank accession NP_600706 (version NP_600706.1 GI:19552704、locus_tag="NCgl1433")として登録されている。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子の塩基配列ならびにTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３〜１８に示す。
【００８９】
また、Tat系分泌装置をコードする遺伝子としては、E. coliのtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子が挙げられる。E.coli K-12 MG1655のtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4019968〜4020237位の配列、4020241〜4020756位の配列、4020759〜4021535位の配列、658170〜658373位の配列に相当する。また、E.coli K-12 MG1655のTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418280 (version NP_418280.4 GI:90111653、locus_tag="b3836")、GenBank accession YP_026270 (version YP_026270.1 GI:49176428、locus_tag="b3838")、GenBank accession NP_418282 (version NP_418282.1 GI:16131687、locus_tag="b3839")、およびGenBank accession NP_415160 (version NP_415160.1 GI:16128610、locus_tag="b0627")として登録されている。
【００９０】
また、Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、Tat系分泌装置としての機能を有するタンパク質をコードする限り、上記塩基配列のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「tatA遺伝子」、「tatB遺伝子」、「tatC遺伝子」、および「tatE遺伝子」には、それぞれ、上記塩基配列に加え、そのバリアントが含まれるものとする。上述の野生型リボソームタンパク質S1およびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載は、Tat系分泌装置およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。「Tat系分泌装置としての機能」とは、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質を細胞外に分泌する機能であってよい。
【００９１】
以下に、遺伝子の発現を上昇させる手法について説明する。
【００９２】
本発明において、「遺伝子の発現が上昇する」とは、標的の遺伝子の発現が野生株又は親株等の非改変株に対して上昇していることを意味する。遺伝子の発現は、非改変株と比較して上昇していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇する。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００９３】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００９４】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物への染色体上へ標的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する方法（特開平2-109985号公報、US5,882,888 EP805867B1）や、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えを行うことにより達成できる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、ファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターにより、遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、WO03/040373に記載されているように、染色体上の異種タンパク質の分泌生産に不要な遺伝子を標的にして遺伝子を導入することも可能である。このような方法で標的配列に、遺伝子を１コピー又は多コピー導入することができる。
【００９５】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００９６】
また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-67679号公報に記載のpAM330；特開昭58-77895号公報に記載のpHM1519；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11；特開平10-215883号公報に記載のpVK7、特開平9-070291号公報に記載のpVC7等が挙げられる。
【００９７】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモーター等を用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００９８】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【００９９】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【０１００】
また、遺伝子の発現の上昇は、標的遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、標的遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０１０１】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１０２】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。
【０１０３】
標的の遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子から発現する標的のタンパク質の活性が上昇したことを確認することにより確認できる。標的のタンパク質の活性が上昇したことは、同タンパク質の活性を測定することにより確認できる。Tat系分泌装置の活性が上昇したことは、例えば、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量が増大したことを確認することにより確認できる。Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
【０１０４】
また、標的の遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現する標的のタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０１０５】
標的の遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
【０１０６】
標的のタンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
【０１０７】
＜１−１−４＞異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物
分泌性タンパク質（secretory protein）は、一般に、プレタンパク質（プレペプチドともいう）またはプレプロタンパク質（プレプロペプチドともいう）として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質（mature protein）になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。よって、本発明の方法においては、異種タンパク質の分泌生産にシグナルペプチドを利用する。なお、本発明において、分泌型タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌型タンパク質前駆体」という場合がある。本発明において、「シグナルペプチド」（「シグナル配列」ともいう）とは、分泌性タンパク質前駆体のN末端に存在し、かつ、通常、天然の成熟タンパク質には存在しないアミノ酸配列をいう。
【０１０８】
本発明に用いられる遺伝子構築物は、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター配列の下流に、同プロモーターによる制御を受けてシグナルペプチドが発現するよう連結されていればよい。異種タンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、同シグナルペプチドとの融合タンパク質として異種タンパク質が発現するよう連結されていればよい。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、コリネ型細菌で異種タンパク質遺伝子を発現させるために有効な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。
【０１０９】
本発明で使用されるプロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである限り特に限定されず、コリネ型細菌由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。異種由来のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE.coli由来のプロモーターが挙げられる。その中で、tacプロモーター等の強力なプロモーターが好ましく、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターも好ましい。
【０１１０】
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のPS1、PS2（CspBともいう）、SlpA（CspAともいう）の遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【０１１１】
プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
【０１１２】
本発明で使用されるシグナルペプチドは、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドである限り特に限定されず、コリネ型細菌由来のシグナルペプチドであってもよく、異種由来のシグナルペプチドであってもよい。「コリネ型細菌で機能するシグナルペプチド」とは、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、コリネ型細菌が当該タンパク質を分泌することができるペプチドをいう。
【０１１３】
あるシグナルペプチドがコリネ型細菌で機能するかどうかは、例えば、目的のタンパク質を当該シグナルペプチドと融合させて発現させ、当該タンパク質が分泌されるかを確認することで確認できる。
【０１１４】
本発明で使用されるシグナルペプチドは、Tat系依存シグナルペプチドであるのが好ましい。「Tat系依存シグナルペプチド」とは、Tat系によって認識されるシグナルペプチドをいう。「Tat系依存シグナルペプチド」は、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌されるペプチドであってよい。
【０１１５】
Tat系依存シグナルペプチドとしては、例えば、E. coliのTorAタンパク質（トリメチルアミン-N-オキシドレダクターゼ）のシグナルペプチド、E. coliのSufIタンパク質（ftsIのサプレッサー）のシグナルペプチド、Bacillus subtilisのPhoDタンパク質（ホスホジエステラーゼ）のシグナルペプチド、Bacillus subtilisのLipAタンパク質（リポ酸シンターゼ）のシグナルペプチド、Arthrobacter globiformisのIMDタンパク質（イソマルトデキストラナーゼ）のシグナルペプチドが挙げられる。これらのシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
TorAシグナルペプチド：MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号１９）
SufIシグナルペプチド：MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA（配列番号２０）
PhoDシグナルペプチド：MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS（配列番号２１）
LipAシグナルペプチド：MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH（配列番号２２）
IMDシグナルペプチド：MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA（配列番号２３）
【０１１６】
Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有する。ツイン・アルギニンモチーフとしては、例えば、S/T-R-R-X-F-L-K（配列番号２４）やR-R-X-#-#（#:疎水性残基)（配列番号２５）が挙げられる。
【０１１７】
また、Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有し、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有する限り、上記シグナルペプチドのバリアントであってもよい。上述の野生型リボソームタンパク質S1およびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載は、シグナルペプチドおよびそれをコードする遺伝子にも準用できる。具体的には、例えば、上記シグナルペプチドのバリアントは、上記シグナルペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。なお、シグナルペプチドのバリアントにおける上記「１又は数個」とは、具体的には好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個を意味する。なお、本発明において、「TorAシグナルペプチド」、「SufIシグナルペプチド」、「PhoDシグナルペプチド」、「LipAシグナルペプチド」、および「IMDシグナルペプチド」には、それぞれ、配列番号１９、２０、２１、２２、および２３に記載のペプチドに加え、そのバリアントが含まれるものとする。
【０１１８】
「Tat系依存シグナルペプチドとしての機能」とは、Tat系によって認識されることをいい、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌される機能であってよい。
【０１１９】
あるペプチドがTat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するかどうかは、例えば、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の増強により増大することを確認することや、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の欠損により減少することを確認することにより確認できる。
【０１２０】
シグナル配列は、一般に、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
【０１２１】
本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質としては、例えば、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、ワクチンとして使用される抗原タンパク質、酵素が挙げられる。
【０１２２】
酵素としては、例えば、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼ、およびキチナーゼ等が挙げられる。トランスグルタミナーゼとしては、例えば、Streptoverticillium mobaraense IFO 13819（WO01/23591）、Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852、Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776、Streptomyces lydicus（WO9606931）等の放線菌や、Oomycetes（WO9622366）等の糸状菌の分泌型のトランスグルタミナーゼが挙げられる。プロテイングルタミナーゼとしては、例えば、Chryseobacterium proteolyticumのプロテイングルタミナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。イソマルトデキストラナーゼとしては、例えば、Arthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。
【０１２３】
生理活性タンパク質としては、例えば、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。
【０１２４】
成長因子（増殖因子）として、具体的には、例えば、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vesicular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、角質細胞増殖因子（keratinocyto growth factor；KGF-1またはFGF7, KGF-2またはFGF10）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）が挙げられる。
【０１２５】
ホルモンとして、具体的には、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone；PTH)、カルシトニン(calcitonin)が挙げられる。
【０１２６】
サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。
【０１２７】
なお、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインは互いに厳密に区別されなくともよい。例えば、生理活性タンパク質は、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインから選択されるいずれか１つのグループに属するものであってもよく、それらから選択される複数のグループに属するものであってもよい。
【０１２８】
また、生理活性タンパク質は、タンパク質全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone；PTH)の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなる生理活性ペプチドTeriparatideが挙げられる。
【０１２９】
抗体関連分子とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインまたは２もしくはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のドメインであるＶＬおよびＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、上述の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。
【０１３０】
レセプタータンパク質は、特に制限されず、例えば、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質であってよい。その他の生理活性物質としては、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。また、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。
【０１３１】
ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよい。
【０１３２】
これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および望みの活性を得るために改変することができる。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、これらのタンパク質に１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれるよう改変されてもよい。上述の野生型リボソームタンパク質S1およびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載は、本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。また、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。
【０１３３】
本発明の方法により最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一であってもよく、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と比較して、１又は数個のアミノ酸を余分に付加された、あるいは欠失したものであってもよい。なお上記「１又は数個」とは、目的の異種タンパク質の全長や構造等によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【０１３４】
また、分泌生産される異種タンパク質は、プロ構造部が付加したタンパク質（プロタンパク質）であってもよい。分泌生産される異種タンパク質がプロタンパク質である場合、最終的に得られる異種タンパク質はプロタンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、プロタンパク質はプロ構造部を切断されて成熟タンパク質になってもよい。切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。しかしながら、上述の通り、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、生産される異種タンパク質の種類や使用目的等によっては、天然のタンパク質に比較してN末端がアミノ酸１〜数個分長いあるいは短いタンパク質がより適切な活性を有することがある。本発明において使用できるプロテアーゼには、Dispase（ベーリンガーマンハイム社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。
【０１３５】
本発明に用いられる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、本発明に用いられる遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。なお、本発明の細菌を構築するに当たり、本発明に用いられる遺伝的構築物の導入、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子の導入、およびその他の改変は、任意の順番で行うことができる。
【０１３６】
本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、同遺伝子構築物を含むベクターを用いて宿主に導入できる。ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。ベクターとしては、例えば、コリネ型細菌由来のプラスミドが好ましい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭５7-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等が挙げられる。
【０１３７】
また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって異種タンパク質遺伝子が染色体上に導入される。その他、相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、または宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。なお、異種タンパク質遺伝子が染色体上に導入される場合には、本発明に用いられる遺伝子構築物が染色体上に構成される限り、同遺伝子構築物に含まれるプロモーター配列およびシグナルペプチドをコードする核酸配列のいずれかまたは両方が宿主の染色体上にもともと存在するものであってもよい。具体的には、例えば、宿主の染色体上にもともと存在するプロモーター配列と同プロモーター配列の下流に接続されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をそのまま利用し、同シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された遺伝子のみを目的の異種タンパク質遺伝子に置換することによっても、染色体上に本発明に用いられる遺伝子構築物が構成され、本発明の細菌を構築できる。
【０１３８】
なお、２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、目的の異種タンパク質の分泌発現が達成できるように本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、例えば、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。「２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合」とは、例えば、２またはそれ以上の種類の異種タンパク質が分泌生産される場合や、ヘテロ多量体タンパク質が分泌生産される場合をいう。
【０１３９】
本発明に用いられる遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070)(1989))等を使用することができる。
【０１４０】
＜１−２＞異種タンパク質の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、異種タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の異種タンパク質が得られる。
【０１４１】
本発明の細菌は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、本発明の細菌は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
【０１４２】
炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はpH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１〜７日間程度培養する。また、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系、Tat系のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る（WO01/23591、WO2005/103278参照）。また、異種タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。なお、本発明の方法によれば、生産された異種タンパク質は菌体外に分泌されるため、例えばトランスグルタミナーゼ等の微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であるタンパク質も、致死的影響を受けることなく連続的に生産できる。
【０１４３】
本発明の方法によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。また、ある場合には、培養物や培養上清をそのまま使用してもよい。本発明の方法によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用しても良い。
【０１４４】
目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの分子量を確認することにより確認することができる。また、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、抗体を用いたウェスタンブロットによって確認できる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。また、プロテインシークエンサーを用いて目的タンパク質のN末端アミノ酸配列を決定することによって確認出来る。また、質量分析計を用いて、目的タンパク質の質量を決定することによって確認出来る。また、目的の異種タンパク質が酵素や何らかの測定可能な生理活性を有するものである場合には、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、目的の異種タンパク質の酵素活性または生理活性を測定することにより目的の異種タンパク質が分泌生産されたことを確認できる。
【０１４５】
＜２＞特定の変異を有するコリネ型細菌
また、本発明は、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を有するように改変されたコリネ型細菌であって、前記変異が野生型リボソームタンパク質Ｓ１の１７３位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異である、コリネ型細菌を提供する。当該コリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌生産能を有していてもよく、有していなくともよい。すなわち、当該コリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していてもよく、有していなくともよい。当該コリネ型細菌については、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していなくともよいこと以外は、上述した「本発明の方法に用いられるコリネ型細菌」についての記載を準用できる。当該コリネ型細菌は、例えば、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を保持させることにより、異種タンパク質の分泌生産に好適に利用できる。
【実施例】
【０１４６】
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。【０１４７】
実施例１：C. glutamicum YDK010株由来のRpsA(E173G)変異株の構築
（１）rpsA遺伝子に変異を有する自然変異株の取得
WO2005/103278に記載のプロトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PTG1を用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。なお、pPKT-PTG1はプロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結された大腸菌（E. coli）由来のTorAシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたS. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有するプラスミドであり(WO2005/103278)、C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）の細胞表層タンパク質PS2の欠損株である(WO2004/029254)。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 60 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、48時間培養した。【０１４８】
培養後、rpsA遺伝子に変異が導入された自然変異株を選択し、THM1株と命名した。THM1株が有する変異型rpsA遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードする変異型RpsAタンパク質のアミノ酸配列を、<配列番号01>および<配列番号02>に示す。THM1株の変異型rpsA遺伝子では、YDK010株のrpsA遺伝子の塩基配列<配列番号03>における518位のAがGに変異している。この変異によって、THM1株の変異型RpsAタンパク質では、YDK010株のrpsA遺伝子によってコードされるRpsAタンパク質のアミノ酸配列<配列番号04>における173位のグルタミン酸残基がグリシン残基に置換されている。この変異をRpsA(E173G)変異と命名した。【０１４９】
（２）変異型RpsA(E173G)をコードするrpsA遺伝子置換用ベクターの構築
<配列番号05>および<配列番号06>に記載のプライマーを用いて、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]）調製したC. glutamicum THM1株の染色体DNAを鋳型として、変異型RpsA(E173G)をコードするrpsA遺伝子（変異型rpsA遺伝子）を含む約2.4kbpの領域をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【０１５０】
次に、増幅した約2.4kbpのDNA断片をWizardR SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により回収し、WO2006/057450に記載のpBS5TのSma I部位に挿入した後、E. coli JM109（タカラバイオ社製）のコンピテントセルに導入した。変異型rpsA遺伝子を含むDNA断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収し、変異型rpsA遺伝子がクローン化されたプラスミドpBS5T-RpsA(E173G)を得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１５１】
（３）YDK010株へのRpsA(E173G)変異の導入
実施例１（２）で構築したプラスミドpBS5T-RpsA(E173G)でC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、染色体上の野生型rpsA遺伝子が変異型rpsA遺伝子に置換されたYDK010::RpsA(E173G)株を得た。なお、YDK010::RpsA(E173G)株は、THM1株の染色体DNAを利用せずとも、例えば遺伝子工学的に取得した変異型rpsA遺伝子断片等を利用して再現的に構築できる。【０１５２】
実施例２：RpsA(E173G)変異株によるTorAシグナル配列を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌発現
WO2005/103278に記載のプロトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PTG1を用いて、YDK010株および実施例１（３）で得られたYDK010::RpsA(E173G)株を形質転換し、YDK010/pPKT-PTG1およびYDK010::RpsA(E173G)/pPKT-PTG1を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 60 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、48時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250（バイオラッド社製）にて染色を行った。その結果、YDK010::RpsA(E173G)株はYDK010株と比較してプロトランスグルタミナーゼ分泌量が有意に向上していた（図１）。このことから、RpsA(E173G)変異は、E. coli由来のTorAシグナル配列を用いたプロトランスグルタミナーゼ分泌において、分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。【０１５３】
種々のコリネバクテリウム属細菌のrpsA遺伝子ホモログのアミノ酸配列の173位近傍の配列を比較したところ、173位のグルタミン酸残基はコリネバクテリウム属細菌間で保存性が高いことが判明した。C. glutamicum THM1株、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13869株、C. glutamicum ATCC13032株、C. efficiens YS-314株、およびC. stationis ATCC6872株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを図２に示し、173位のアミノ酸残基を枠で囲んで示した。rpsA遺伝子はE. coliなどでは必須遺伝子とされており、このような遺伝子の保存性が高いアミノ酸残基の変異が、異種タンパク質分泌量の向上をもたらすことを予測することは困難であった。【０１５４】
実施例３：RpsA(E173G)変異株によるTorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現
WO2005/103278に記載のプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PPGを用いて、YDK010株および実施例１（３）で得られたYDK010::RpsA(E173G)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPKT-PPGおよびYDK010::RpsA(E173G)/pPKT-PPGを得た。なお、pPKT-PPGはプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結された大腸菌（E. coli）由来のTorAシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたChryseobacterium proteolyticum由来のプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子を有するプラスミドである(WO2005/103278)。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250（バイオラッド社製）にて染色を行った。その結果、YDK010::RpsA(E173G)株はYDK010株と比較してプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ分泌量が有意に向上していた（図３）。このことから、RpsA(E173G)変異は、E. coli由来のTorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ分泌においても分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。【０１５５】
実施例４：RpsA(E173G)変異株によるIMDシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
WO2005/103278に記載のイソマルトデキストラナーゼ発現プラスミドpPKI-IMDを用いて、YDK010株および実施例１（３）で得られたYDK010::RpsA(E173G)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPKI-IMDおよびYDK010::RpsA(E173G)/pPKI-IMDを得た。なお、pPKI-IMDはイソマルトデキストラナーゼの分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたArthrobacter globiformis由来のIMD遺伝子（IMDシグナル配列のコード領域を含む）を有するプラスミドである(WO2005/103278)。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250（バイオラッド社製）にて染色を行った。その結果、YDK010::RpsA(E173G)株はYDK010株と比較してイソマルトデキストラナーゼ分泌量が有意に向上していた（図４）。このことから、RpsA(E173G)変異は、A. globiformis由来のIMDシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌においても分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。【０１５６】
実施例５：RpsA(E173G)変異とTat系分泌装置増幅の組み合せ効果
WO2005/103278に記載のTat系分泌装置の増幅プラスミドであるpVtatABCを用いて、実施例２で構築したYDK010/pPKT-PTG1およびYDK010::RpsA(E173G)/pPKT-PTG1、実施例３で構築したYDK010/pPKT-PPGおよびYDK010::RpsA(E173G)/pPKT-PPG、実施例４で構築したYDK010/pPKI-IMDおよびYDK010::RpsA(E173G)/pPKI-IMDのそれぞれを形質転換し、Tat系分泌装置増幅株YDK010/pPKT-PTG1/pVtatABC、YDK010::RpsA(E173G)/pPKT-PTG1/pVtatABC、YDK010/pPKT-PPG/pVtatABC、YDK010::RpsA(E173G)/pPKT-PPG/pVtatABC、YDK010/pPKI-IMD/pVtatABC、YDK010::RpsA(E173G)/pPKI-IMD/pVtatABCを得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンおよび5 mg/lのクロラムフェニコールを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250（バイオラッド社製）にて染色を行った。染色後、画像解析ソフト「Multi Gauge Ver3.0」（FUJIFILM）を用いて目的タンパク質のバンド強度の数値化を行った。各サンプルのバンド強度は、pVC7を導入したYDK010株で目的タンパク質を発現させた際のバンド強度に対する相対値として算出した。その結果、いずれの発現株においても、pVC7を導入した対照株と比較して、pVtatABCを導入した株では、それぞれの目的タンパク質の分泌量が有意に向上していた。さらに、RpsA(E173G)変異とTat系分泌装置増幅のそれぞれが単独でなされた株と比較して、これらの改変を組み合わせた株では、それぞれの目的タンパク質の分泌生産量が特に著しく向上していた（図５、６、７）。このことから、RpsA(E173G)変異とTat系分泌装置増幅を組み合わせることで、Tat系によるタンパク質分泌量を飛躍的に向上させることができた。【０１５７】
実施例６：RpsA(E173G)変異がSec系によるタンパク質分泌量に与える影響
WO01/23591に記載のプロトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKSPTG1を用いて、C. glutamicum YDK010株およびYDK010::RpsA(E173G)株を形質転換し、YDK010/pPKSPTG1およびYDK010::RpsA(E173G)/pPKSPTG1を得た。なお、pPKSPTG1はプロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたS. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有するプラスミドである(WO01/23591)。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 60 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、48時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250（バイオラッド社製）にて染色を行った。その結果、YDK010::RpsA(E173G)株においては、親株のYDK010株と比較してプロトランスグルタミナーゼ分泌量が減少していた（図８）。このことから、RpsA(E173G)変異は、Sec系によるタンパク質分泌においては、分泌量を減少させる負の効果を持つ変異であることが分かった。このことから、RpsA(E173G)変異は、Tat系によるタンパク質分泌において特異的に分泌量を向上させる有効変異であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明により、異種タンパク質を効率よく分泌生産することができる。【０１５９】
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. glutamicum THM1株の変異型rpsA遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. glutamicum THM1株の変異型RpsAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：C. glutamicum YDK010株のrpsA遺伝子の塩基配列
配列番号４：C. glutamicum YDK010株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５、６：プライマー
配列番号７：C. glutamicum ATCC13032株のrpsA遺伝子の塩基配列
配列番号８：C. glutamicum ATCC13032株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：C. efficiens YS-314株のrpsA遺伝子の塩基配列
配列番号１０：C. efficiens YS-314株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：C. stationis ATCC6872株のrpsA遺伝子の塩基配列
配列番号１２：C. stationis ATCC6872株のRpsAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：C. glutamicum ATCC13032株のtatA遺伝子の塩基配列
配列番号１４：C. glutamicum ATCC13032株のTatAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：C. glutamicum ATCC13032株のtatB遺伝子の塩基配列
配列番号１６：C. glutamicum ATCC13032株のTatBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：C. glutamicum ATCC13032株のtatC遺伝子の塩基配列
配列番号１８：C. glutamicum ATCC13032株のTatCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：TorAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２０：SufIシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２１：PhoDシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２２：LipAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２３：IMDシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２４、２５：ツイン・アルギニンモチーフのアミノ酸配列
配列番号２６：C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号２７：C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
【図２】
2013118544.tif 000003
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013118544.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013118544.tif 000012
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