(57)【要約】  取得しようとする蛋白質（Ｚ）または該蛋白質（Ｚ）部分を有する融合蛋白質を分泌させるための発現ベクター、該発現ベクターを用いた形質転換体の製造方法、該形質転換体、および該形質転換体を用いて蛋白質を製造する方法を提供する。  下記蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）と、前記構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置し、取得しようとする蛋白質である蛋白質（Ｚ）をコードする構造遺伝子配列（ｚ）と、前記蛋白質（Ｙ）部分と前記蛋白質（Ｚ）部分とを含む融合蛋白質を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列とを含む発現カセットを有し、前記蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１（protein disulfide isomerase １）の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質であることを特徴とする発現ベクター。
2013111754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）と、前記構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置し、取得しようとする蛋白質である蛋白質（Ｚ）をコードする構造遺伝子配列（ｚ）と、前記蛋白質（Ｙ）部分と前記蛋白質（Ｚ）部分とを含む融合蛋白質を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列とを含む発現カセットを有し、
前記蛋白質（Ｙ）  がＰＤＩ１（protein disulfide isomerase １）の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質であることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
前記蛋白質（Ｙ）が、ＰＤＩ１の小胞体移行シグナルを有する、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記蛋白質（Ｙ）が、小胞体移行シグナルとａドメインとｂドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質、小胞体移行シグナルとａドメインとｂドメインとｂ’ドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質、または、これらいずれかの部分蛋白質の変異蛋白質である、請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記ＰＤＩ１が、酵母のＰＤＩ１、糸状菌由来のＰＤＩ１またはヒト由来のＰＤＩ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記構造遺伝子配列（ｙ）と前記構造遺伝子配列（ｚ）の間に、細胞内または細胞外で前記蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断される部位として機能するアミノ酸もしくはペプチドからなる切断部位（Ｗ）をコードする構造遺伝子配列（ｗ）を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記切断部位（Ｗ）が、細胞内において前記融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断される部位である、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記切断部位（Ｗ）が、ＫＲ（Ｋ:リジン、Ｒ:アルギニン）である、または前記蛋白質（Ｚ）部分に結合するＣ末端側がＫＲであるアミノ酸数３以上のペプチドである、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記切断部位（Ｗ）が、前記融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断しうるプロテアーゼによって認識される部位である、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記蛋白質（Ｙ）が少なくとも小胞体移行シグナルとａドメインとｂドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現ベクターを宿主細胞へ導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現ベクターを染色体外遺伝子として有することを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現ベクター中の発現カセットを、染色体中に有することを特徴とする形質転換体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液から前記融合蛋白質または前記蛋白質（Ｚ）を取得することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の発現ベクター中の発現カセットを染色体中に有するか、または、請求項８に記載の発現ベクターを染色体外遺伝子として有する形質転換体を培養し、得られた培養液から前記融合蛋白質を取得し、次いでプロテアーゼにより該融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断して前記蛋白質（Ｚ）を製造することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
宿主細胞内で機能しうるプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される下記蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）、該構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置しかつ構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、該宿主細胞内で機能しうるターミネーター配列を有し、
前記蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質であることを特徴とするクローニングベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質を分泌生産するための発現ベクター、該発現ベクターを用いた形質転換体およびその製造方法、並びに該形質転換体を用いた蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子組み換え技術を用いた外来蛋白質の生産は、大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)および枯草菌(Bacillus)属等の微生物、または動物細胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いて盛んに行われてきた。様々な生物由来の蛋白質が生産の対象と考えられ、すでに多くのものがこれらの生物を用いて工業的に生産され、医薬品等に用いられている。特に、外来蛋白質を分泌生産させることは、生産された外来蛋白質が細胞内に蓄積される場合に比べて、精製が容易であるという点で好ましい方法であるばかりでなく、分泌生産される蛋白質は宿主細胞の分泌経路に入るため、適当な処理、たとえばジスルフィド結合の形成や糖鎖の形成がなされ、天然の蛋白質と同じまたは非常に近い立体構造を形成できるという利点がある。【０００３】
外来蛋白質のＮ末端に分泌シグナルペプチドを付加した状態で生産させることによって、外来蛋白質を分泌生産できる。たとえば、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe、以下Ｓ．ｐｏｍｂｅという。)によって認識される分泌シグナルとして、Ｓ．ｐｏｍｂｅの接合に関与する接合フェロモン（Ｐ−ファクター）の前駆体の分泌シグナルに由来するポリペプチドが挙げられる（たとえば、特許文献１参照。）。該ポリペプチドを外来蛋白質のＮ末端に融合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子が導入されたＳ．ｐｏｍｂｅの形質転換体を培養すると、生産された該融合蛋白質はゴルジ装置や小胞体（ＥＲ）中においてシグナルペプチドと外来蛋白質に分離され、外来蛋白質は宿主細胞から培地中に分泌される。【０００４】
また、分泌蛋白質の生産量増大については、ＰＤＩ１を外来の分泌蛋白質と共発現させることにより、該分泌蛋白質の分泌生産量（宿主によって生産されたもののうち、分泌された量）が増大することが知られている（たとえば、非特許文献１参照。）。ＰＤＩ１（Protein  disulfide  isomerase  １）は、分子シャペロン機能を持ち、ＥＲに局在する蛋白質である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第１９９６／２３８９０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｕｋａｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２０１０）ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．４，ｐ１１３５〜１１４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の分泌シグナルペプチドは、取得しようとする蛋白質を、宿主をＳ．ｐｏｍｂｅとする蛋白質発現系で分泌生産でき、かつその大量生産ができる点で非常に優れている。しかし、取得しようとする蛋白質の種類によっては生産量が充分ではない場合もあり、蛋白質をより高い効率で分泌生産させる発現系の構築が求められている。また、前記共発現系においても、取得しようとする蛋白質の種類によっては生産量が充分ではなく、発現させた蛋白質が効率良く分泌経路を通過しない、分泌経路途中での該蛋白質が凝集する等の問題があった。【０００８】
そこで本発明の目的は、取得しようとする蛋白質または該蛋白質部分を含む融合蛋白質を効率よく分泌生産できる発現ベクター、および該発現ベクターが導入された形質転換体から該蛋白質または該融合蛋白質を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、取得しようとする蛋白質である蛋白質（Ｚ）を、分子シャペロン機能を持つことが知られているＰＤＩ１（Protein  disulfide  isomerase  １）に融合させて発現させることにより、該蛋白質（Ｚ）または該蛋白質（Ｚ）部分を含む融合蛋白質を効率よく分泌生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明の発現ベクター、形質転換体の製造方法、形質転換体、蛋白質の製造方法、およびクローニングベクターは下記［１］〜［１５］である。
［１］下記蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）と、前記構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置し、取得しようとする蛋白質である蛋白質（Ｚ）をコードする構造遺伝子配列（ｚ）と、前記蛋白質（Ｙ）部分と前記蛋白質（Ｚ）部分とを含む融合蛋白質を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列とを含む発現カセットを有し、
前記蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１（protein disulfide isomerase １）の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質であることを特徴とする発現ベクター。
［２］前記蛋白質（Ｙ）が、ＰＤＩ１の小胞体移行シグナルを有する、前記［１］の発現ベクター。
［３］前記蛋白質（Ｙ）が、小胞体移行シグナルとａドメインとｂドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質、小胞体移行シグナルとａドメインとｂドメインとｂ’ドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質、または、これらいずれかの部分蛋白質の変異蛋白質である、前記［１］または［２］の発現ベクター。
［４］前記ＰＤＩ１が、酵母のＰＤＩ１、糸状菌由来のＰＤＩ１またはヒト由来のＰＤＩ１である、前記［１］〜［３］のいずれの発現ベクター。
［５］前記構造遺伝子配列（ｙ）と前記構造遺伝子配列（ｚ）の間に、細胞内または細胞外で前記蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断される部位として機能するアミノ酸もしくはペプチドからなる切断部位（Ｗ）をコードする構造遺伝子配列（ｗ）を有する、前記［１］〜［４］のいずれの発現ベクター。
［６］前記切断部位（Ｗ）が、細胞内において前記融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断される部位である、前記［５］の発現ベクター。
［７］前記切断部位（Ｗ）が、ＫＲ（Ｋ:リジン、Ｒ:アルギニン）である、または前記蛋白質（Ｚ）部分に結合するＣ末端側がＫＲであるアミノ酸数３以上のペプチドである、前記［６］の発現ベクター。
［８］前記切断部位（Ｗ）が、前記融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断しうるプロテアーゼによって認識される部位である、前記［５］の発現ベクター。
［９］前記蛋白質（Ｙ）が少なくとも小胞体移行シグナルとａドメインとｂドメインを含む、前記［１］〜［８］のいずれの発現ベクター。【００１１】
［１０］前記［１］〜［９］のいずれの発現ベクターを宿主細胞へ導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。
さらに、形質転換体の製造方法としては、以下の［１０−２］の製造法が好ましい。［１０−２］前記［１］〜［９］のいずれの発現ベクターを宿主細胞へ導入し、前記発現ベクター中の発現カセットを宿主細胞の染色体の少なくとも１か所に組み込むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
［１１］前記［１］〜［９］のいずれの発現ベクターを染色体外遺伝子として有することを特徴とする形質転換体。
［１２］前記［１］〜［９］のいずれの発現ベクター中の発現カセットを、染色体中に有することを特徴とする形質転換体。
また、前記［１１］および［１２］の形質転換体における宿主細胞は、酵母または糸状菌であることが好ましく、さらに前記宿主細胞は、シゾサッカロミセス（schizosaccharomyces）属酵母であることがより好ましい。【００１２】
［１３］前記［１１］または［１２］の形質転換体を培養し、得られた培養液から前記融合蛋白質または前記蛋白質（Ｚ）を取得することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
さらに、蛋白質の製造方法としては、以下の［１３−２］と［１４］の方法が好ましい。［１３−２］前記［６］または［７］の発現ベクター中の発現カセットを染色体中に有するか、または、前記［６］または［７］の発現ベクターを染色体外遺伝子として有する形質転換体を培養し、得られた培養液から前記蛋白質（Ｚ）を取得することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
［１４］前記［８］の発現ベクター中の発現カセットを染色体中に有するか、または、前記［８］の発現ベクターを染色体外遺伝子として有する形質転換体を培養し、得られた培養液から前記融合蛋白質を取得し、次いでプロテアーゼにより該融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断して前記蛋白質（Ｚ）を製造することを特徴とする、蛋白質の製造方法。【００１３】
［１５］宿主細胞内で機能しうるプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される下記蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）、該構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置しかつ構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、該宿主細胞内で機能しうるターミネーター配列を有し、
前記蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質であることを特徴とするクローニングベクター。
さらに、上記クローニングベクターとしては、下記［１５−２］のクローニングベクターが好ましい。［１５−２］前記構造遺伝子配列（ｙ）と前記クローニングサイトの間に、ＫＲをコードする、または、Ｃ末端側がＫＲであるアミノ酸数３以上のペプチドをコードする、構造遺伝子配列（ｗ）を有する、クローニングベクター。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の発現ベクターにより、蛋白質を宿主から分泌された状態で生産可能な形質転換体を製造できる。
また、該形質転換体を用いた本発明の蛋白質の製造方法により、蛋白質を効率よく分泌できる。
形質転換体から分泌させた蛋白質が取得しようとする蛋白質（すなわち、蛋白質（Ｚ））である場合には、培養液から蛋白質（Ｚ）を取得できる。また、分泌させた蛋白質が融合蛋白質の場合には、該融合蛋白質から蛋白質（Ｚ）を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＰＤＩ１の構造の模式図である。
【図２】図２は、酵母、糸状菌およびヒト由来のＰＤＩのアミノ酸配列をアラインメントした図である。
【図３】図３は、試験例１のＣＢＢ染色の染色像である。
【図４】図４は、試験例１の抗ｈＴＦ抗体を用いたウェスタンブロットの染色像である。
【図５】図５は、試験例２のＣＢＢ染色の染色像である。
【図６】図６は、試験例２の各菌株のＰＤＩ１の全長または部分蛋白質の相対分泌量を表したグラフである。
【図７】図７は、試験例３のＣＢＢ染色の染色像である。
【図８】図８は、試験例３の各菌株のｈＴＦの相対分泌量を表したグラフである。
【図９】図９は、試験例４のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１０】図１０は、試験例４の各菌株のＥＧＦＰ（融合蛋白質を含む。）の相対分泌量を表したグラフである。
【図１１】図１１は、試験例５のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１２】図１２は、試験例５のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１３】図１３は、試験例６のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１４】図１４は、試験例６の各菌株のｈＴＦの相対分泌量を表したグラフである。
【図１５】図１５は、試験例７のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１６】図１６は、試験例７の各菌株のｈＴＦの相対分泌量を表したグラフである。
【図１７】図１７は、試験例８のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１８】図１８は、試験例９のＣＢＢ染色の染色像である。
【図１９】図１９は、試験例９の各菌株のｈＴＦの相対分泌量を表したグラフである。
【図２０】図２０は、試験例１０のＣＢＢ染色の染色像である。
【図２１】図２１は、試験例１０の各菌株の各蛋白質の相対分泌量を表したグラフである。
【図２２】図２２は、試験例１１のＣＢＢ染色の染色像である。
【図２３】図２３は、試験例１２のＣＢＢ染色の染色像である。
【図２４】図２４は、試験例１２の各菌株のｈＴＦの相対分泌量を表したグラフである。
【図２５】図２５は、試験例１３のＣＢＢ染色の染色像である。
【図２６】図２６は、試験例１３の各菌株のＥＧＦＰの相対分泌量を表したグラフである。
【図２７】図２７は、試験例１４のＣＢＢ染色の染色像である。
【図２８】図２８は、試験例１４の各菌株のＥＧＦＰの相対分泌量を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［発現ベクター］
本発明の発現ベクターは、下記蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）と、前記構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置し、取得しようとする蛋白質である蛋白質（Ｚ）をコードする構造遺伝子配列（ｚ）と、前記蛋白質（Ｙ）部分と前記蛋白質（Ｚ）部分とを含む融合蛋白質を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列とを含む発現カセットを有し、前記蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質であることを特徴とする。
分泌シグナルペプチドに代えて、ＰＤＩ１の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、または該変異蛋白質を用いることにより、効率よく蛋白質を宿主から分泌された状態で生産できる。分泌された蛋白質が蛋白質（Ｚ）である場合は培養液から該蛋白質（Ｚ）が得られる。分泌された蛋白質が融合蛋白質である場合には、培養液中で、または培養液から分離した後、融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で融合蛋白質を切断して、蛋白質（Ｚ）を得ることができる。
【００１７】
（蛋白質（Ｙ））
蛋白質（Ｙ）は、ＰＤＩ１の全長蛋白質、ＰＤＩ１の部分蛋白質、またはこれらの変異蛋白質である。
ＰＤＩ１は、分子シャペロン機能を持ち、ＥＲに局在する酵素であり、ＥＲ中の蛋白質をリフォールディングする役割を担う。ＰＤＩ１には、分子シャペロン機能を担う部分以外に、リボゾームで合成されたＰＤＩ１がＥＲに移行するためのシグナルとして機能する部分（ＥＲ移行シグナル）、ＰＤＩ１をＥＲに繋ぎ止めるためのシグナルとして機能する部分（ＥＲ局在シグナル）等を有する。
前記のように、ＰＤＩ１を外来の分泌蛋白質と共発現させることにより、該分泌蛋白質の分泌生産量が増大することが知られている。これは、合成された分泌蛋白質がＥＲを通過する際に、ＰＤＩ１の分子シャペロン機能により適切な高次構造形成が促進されるためと推察される。ＰＤＩ１は、ＥＲ局在シグナルにより通常はＥＲに局在しているが、過剰発現させた場合には、細胞外へ分泌される。
【００１８】
ＰＤＩ１は、生体内で蛋白質のリフォールディングを司っている酵素である。図１に、ＰＤＩ１の構造の模式図を示す。ＰＤＩ１はＮ末端から順に、ＥＲ移行シグナル、ａドメイン、ｂドメイン、ｂ’ドメイン、ｘドメイン、ａ’ドメイン、およびＥＲ局在シグナル（ＡＤＥＬ）を含むｃドメインを有する。ａドメインおよびａ’ドメインに１つずつ分子シャペロン活性の活性中心（ＣＧＨＣ）があり、ａドメイン、ｂドメイン、ｂ’ドメイン、およびａ’ドメインの４つともチオレドキシンフォールドを形成している（Cell誌、第124巻、61-73 ページ、2006年）。また、Saccharomyces cerevisiaeでは、Ｃ末端部分は酵素活性に寄与している。
【００１９】
蛋白質（Ｙ）は、リボゾームで合成された蛋白質をＥＲに移行させるためのシグナルとして機能する部分（ＥＲ移行シグナル）を有する蛋白質である。蛋白質（Ｙ）のＣ末端に他の蛋白質を融合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を宿主細胞に導入した場合、得られた形質転換体を培養すると、リボゾームで合成された該融合蛋白質がＥＲに移行する。その後、ＰＤＩ１の過剰発現の場合と同様に、ＥＲ内の該融合蛋白質は形質転換体の細胞外に分泌される。ＥＲおよびゴルジ装置等の形質転換体内において該融合蛋白質の蛋白質（Ｙ）部分と蛋白質（Ｚ）部分との間で切断される場合には、切断によって生じた蛋白質（Ｚ）が形質転換体の細胞外に分泌される。したがって、蛋白質（Ｙ）は、ＥＲ移行シグナルまたはそれと同じ機能を有する部分が必要であり、ＰＤＩ１の部分蛋白質または変異蛋白質の場合、該蛋白質はＥＲ移行シグナルまたはそれと同じ機能を有する部分を有する。
【００２０】
一方、ＥＲ局在シグナルはそれを有する蛋白質をＥＲ内に留めて分泌させない傾向を有することより、融合蛋白質の分泌を阻害するおそれがある。したがって、蛋白質（Ｙ）部分および蛋白質（Ｚ）部分を有する融合蛋白質を分泌させる場合は、蛋白質（Ｙ）はＥＲ局在シグナルを有さない部分蛋白質またはＥＲ局在シグナルと同じ機能を有する部分を有さない変異蛋白質であることが好ましい。また、細胞内で融合蛋白質が蛋白質（Ｚ）とそれ以外の蛋白質（Ｙ）部分を有する蛋白質に切断される場合は、蛋白質（Ｚ）はＥＲ局在シグナルを有さないため、その分泌は阻害されない。したがって、蛋白質（Ｚ）を分泌させる場合には、蛋白質（Ｙ）はＥＲ局在シグナルまたはＥＲ局在シグナルと同じ機能を有する部分を有していてもよい。
【００２１】
ＥＲ内に移行した融合蛋白質が適切な高次構造に変換されることにより、該融合蛋白質または該融合蛋白質の切断により生じた蛋白質（Ｚ）の分泌が促進されると推測されるため、蛋白質（Ｙ）は分子シャペロン機能を少なくとも部分的に維持していることが好ましい。したがって、蛋白質（Ｙ）はａドメインを有していることが好ましく、ａドメインおよびｂドメインを有していることがより好ましい。ａドメインの代わりにａ’ドメインを有していてもよく、ｂドメインの代わりにｂ’ドメインを有していてもよい。
【００２２】
ＰＤＩ１の部分蛋白質は、ＰＤＩ１の全長蛋白質から少なくとも一部の領域が欠損している蛋白質をいう。たとえば、ＰＤＩ１の全長蛋白質からドメインごとに欠損させた部分蛋白質であってもよく、ドメイン内の一部の領域を欠損させた部分蛋白質であってもよい。
【００２３】
前記のように、蛋白質（Ｙ）としてＥＲ移行シグナルが必要であり、また分子シャペロン機能を有していることが好ましいことより、蛋白質（Ｙ）はａドメインを有していることが好ましい。さらに、ｂドメインを有することが好ましい。ＥＲ局在シグナルは蛋白質の分泌を阻害する場合があると考えられることより、蛋白質（Ｙ）はＥＲ局在シグナルがないことが好ましく、またＥＲ局在シグナルが存在するｃドメインがないことも好ましい。
ドメインやシグナルの単位で部分蛋白質を表すと、たとえば、Ｎ末端から順に、ＥＲ移行シグナルとａドメインとｂドメインとから構成される部分蛋白質［以下、ＰＤＩ１（ａｂ）］、ＥＲ移行シグナルとａドメインとｂドメインとｂ’ドメインとから構成される部分蛋白質［以下、ＰＤＩ１（ａｂｂ’）］、ＥＲ移行シグナルとａドメインとｂドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質［以下、ＰＤＩ１（ａｂｘ）］、ＥＲ移行シグナルとａドメインとｂドメインとｂ’ドメインとｘドメインとから構成される部分蛋白質［以下、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）］、ｃドメインがないＰＤＩ１である部分蛋白質［以下、ＰＤＩ１（−ｃ）］、ＥＲ局在シグナルがないＰＤＩ１の部分蛋白質［以下、ＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）］が挙げられる。
【００２４】
前記部分蛋白質におけるドメインやシグナルは、該ドメインまたはシグナルの機能を保持している限り、本来のドメインまたはシグナル領域よりもＮ末端側および／またはＣ末端側が短くなっていてもよい。たとえば、前記ＰＤＩ１（ａｂ）においては、ｂドメインのＣ末端側は本来のｂドメインよりも短くなっていてもよい。また、前記部分蛋白質における各ドメインは、本来そのドメインが隣接していたドメインが存在しない場合、その存在しない隣接ドメインの領域の一部（ただし、下記のように、存在しない隣接ドメインの機能は失われている。）を含んでいてもよい。たとえば、前記ＰＤＩ１（ａｂ）においては、ｂドメインのＣ末端側はｂ’ドメインの側へ伸びてｂ’ドメインのＮ末端側の一部を有していてもよい。同様にＰＤＩ１（ａｂｘ）においては、ｂドメインとｘドメインの間にｂ’ドメインの一部が存在していてもよい。
前記部分蛋白質に存在しないドメインやシグナルは、それらの機能が失われている限り、その一部の領域が前記部分蛋白質に存在していてもよい。たとえば、ＰＤＩ１（−ｃ）においては、そのａ’ドメインのＣ末端側にｃドメインのＮ末端側の一部が存在していてもよい。
【００２５】
ＥＲ移行シグナルは、合成された蛋白質をＥＲに移行させる機能を有する。また、ａドメインおよびａ’ドメインは、分子シャペロン機能の活性中心を担っており、基質蛋白質（ＰＤＩによる分子シャペロン機能が奏される対象の蛋白質）とジスルフィド交換反応を行う。ｂドメインおよびｂ’ドメインは、基質蛋白質と結合する機能を担っている。ｃドメインは、ａ’ドメイン構造の安定化に寄与し、間接的に分子シャペロン機能に寄与する。さらにｃドメインは、ＥＲ局在シグナルを含むため、合成された蛋白質をＥＲに局在させる機能も有する。たとえば、ある部分蛋白質が、ａドメインまたはａ’ドメインの機能を保持しているか否かは、該部分蛋白質についてＳｃＲＮａｓｅアッセイ、Ｄｉ−Ｅ−ＧＳＳＧアッセイ等を行い、分子シャペロン機能を直接測定することにより調べられる。
【００２６】
本発明において、ＰＤＩ１の変異蛋白質とは、ＰＤＩ１の全長蛋白質の変異蛋白質およびＰＤＩ１の部分蛋白質の変異蛋白質を意味する。ＰＤＩ１の変異蛋白質は、ＰＤＩ１の全長蛋白質またはＰＤＩ１の部分蛋白質のうち、１または２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された蛋白質である。ＰＤＩ１の全長蛋白質または部分蛋白質から置換等されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２７】
本発明において、蛋白質（Ｙ）として用いられるＰＤＩ１の変異蛋白質は、ＥＲ移行シグナルの機能を有するものである限り、分子シャペロン機能を保持していてもよく、分子シャペロン機能を消失した変異蛋白質であってもよい。分子シャペロン機能を消失した変異蛋白質としては、ＰＤＩ１の全長蛋白質またはａドメインとａ’ドメインのいずれかを少なくとも含む部分蛋白質に対して、分子シャペロン活性の活性中心（ＣＧＨＣ）中のシステイン残基（Ｃ）を他のアミノ酸、たとえばセリン残基（Ｓ）に置換した変異蛋白質が挙げられる。
【００２８】
本発明においては、蛋白質（Ｚ）および前記融合蛋白質の分泌生産効率が非常に高いため、蛋白質（Ｙ）として、ＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）、または該変異蛋白質を用いることが好ましく、ＰＤＩ１（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いることがより好ましく、ＰＤＩ１（ａｂｘ）を用いることがさらに好ましい。また、これら部分蛋白質内の各ドメインは、前記のように、本来のドメインよりも短くても長くてもよい。
【００２９】
蛋白質（Ｙ）の元となるＰＤＩ１は、宿主細胞において、合成された前記融合蛋白質がＥＲへ移行し、該融合蛋白質やその切断物である蛋白質（Ｚ）が細胞外に分泌されるものであれば、いずれの生物種由来の蛋白質を用いてもよく、発現ベクターが導入される宿主の生物種を考慮して、適宜決定される。本発明の発現ベクターが、酵母または糸状菌を宿主とする発現系に用いられる場合、蛋白質（Ｙ）の元としては、酵母、糸状菌またはヒト由来のＰＤＩ１が好ましく、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、シゾサッカロミセス属酵母、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、カンジダ（Candida）属酵母、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌、トリコデルマ（Trichoderma）属糸状菌、フサリウム（Fusarium）属糸状菌、ペニシリウム（Penicillium）属糸状菌、またはアクレモニウム（Acremonium）属糸状菌由来のＰＤＩ１がより好ましい。シゾサッカロミセス属酵母としては、たとえば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporus）が挙げられる。
【００３０】
酵母または糸状菌由来のＰＤＩ１としては、具体的には、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ＵｎｉＰｒｏｔ（Universal Protein Resource）のＩＤ番号：Ｑ１００５７）（配列番号１）、クリュイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces  marxianus）のＰＤＩ１（ＵｎｉＰｒｏｔのＩＤ番号：Ｑ９Ｙ８Ｆ３）（配列番号２）、サッカロミセス・セレビシエのＰＤＩ１（ＵｎｉＰｒｏｔのＩＤ番号：Ｐ１７９６７）（配列番号３）、ピキア・パストリス（Pichia  pastoris）のＰＤＩ（ＵｎｉＰｒｏｔのＩＤ番号：Ｂ３ＶＳＮ１）（配列番号４）、カンジダ・アルビカンズ（Candida  albicans）のＰＤＩ（ＵｎｉＰｒｏｔのＩＤ番号：Ｃ４ＹＳＷ３）（配列番号５）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma  reesei）のＰＤＩ１（ＰＲＦ（Protein  Research  Foundation）のＩＤ番号：２５２０３４４Ａ）（配列番号６）、およびアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus  oryzae）のＰＤＩＡ（ＵｎｉＰｒｏｔのＩＤ番号：Ｑ００２４８）（配列番号７）が挙げられる。
【００３１】
各酵母および糸状菌由来のＰＤＩのアミノ酸配列をアラインメントした図を図２に示す。なお、図２には、同様にアラインメントしたヒト由来のＰＤＩのアミノ酸配列も示す。図２のアラインメントは、汎用されているアラインメント作成ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ（スコア行列としてＢＬＯＳＵＭスコアマトリクスを採用）を用いて作成した。その他の生物種由来のＰＤＩ１における図１に示すドメイン構造は、たとえば、各種アラインメント作成ソフトウェアを用いて、該ＰＤＩ１のアミノ酸配列をＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１とアラインメントすることにより決定できる。
【００３２】
蛋白質（Ｙ）としては、下記（１）〜（４）のいずれかのアミノ酸配列からなり、合成された蛋白質（Ｙ）部分を有する融合蛋白質がＥＲへ移行する機能を有する蛋白質であってもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１の全長アミノ酸配列である。（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列。（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列。（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と３０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の類似性を有するアミノ酸配列。（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
【００３３】
前記（３）のアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性（相同性）が、３０％以上が好ましく、３５％以上がより好ましく、４０％以上がさらに好ましく、６０％以上がよりさらに好ましく、８０％以上がよりさらに好ましく、９０％以上が特に好ましい。
アミノ酸配列同士の同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入および欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。
相同性の割合の数値は、アミノ酸配列全体を平均した値であり、部分的に該数値よりも高い部分と低い部分が存在しうる。たとえば、蛋白質（Ｙ）としての機能上、必ずしも必要とされていないドメインにおける相同性は低くてもよい。必要とされる機能（ＥＲ移行シグナルとしての機能）を担う部分、存在することが好ましい機能（分子シャペロン機能等）を担う部分のアミノ酸配列の相同性は高い方が好ましい。
【００３４】
また、前記（４）のアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列との類似性が、７０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上がよりさらに好ましい。前記（３）の場合と同様に、類似性の割合もまた、担っている機能によって類似性がさらに低い部分またはさらに高い部分が存在してもよい。
アミノ酸配列同士の類似性（配列類似性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入および欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対して、化学的性質の類似するアミノ酸が一致した割合として求められる。
アミノ酸配列同士の同一性および類似性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の相同性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ（スコア行列としてBLOSUMスコアマトリクスを採用）により得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００３５】
なお、化学的性質の類似するアミノ酸とは、具体的には、以下の組み合わせである。
（１）水酸基を有する親水性の中性アミノ酸であるセリンおよびトレオニン。
（２）嵩高い疎水性の側鎖を有する疎水性アミノ酸であるメチオニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。
（３）親水性の酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸。
（４）カルボキシル基がアミド化した官能基を有する親水性の中性アミノ酸であるアスパラギンおよびグルタミン。
（５）親水性の塩基性アミノ酸であるリジン、アルギニン、およびヒスチジン。
（６）芳香環を有する疎水性アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。
（７）側鎖の構造が類似しているアスパラギンおよびアスパラギン酸、またはグルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせ。
【００３６】
（蛋白質（Ｚ））
本発明の発現ベクターは、蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）と、該構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置し、蛋白質（Ｚ）をコードする構造遺伝子配列（ｚ）を有する。蛋白質（Ｚ）は、本発明の発現ベクターを導入して製造された形質転換体によって生産させる目的の蛋白質である。
【００３７】
蛋白質（Ｚ）は、宿主が元々有している蛋白質であってもよく、宿主以外の生物種由来の蛋白質（異種蛋白質）等の宿主が本来有していない外来蛋白質であってもよい。また、いずれかの生物が元々有している天然型の蛋白質であってもよく、人工的に合成した蛋白質であってもよく、２種類以上の蛋白質を融合させたキメラ蛋白質であってもよい。蛋白質（Ｚ）は、外来蛋白質が好ましく、多細胞生物である動物や植物が産生する蛋白質がより好ましく、哺乳動物（ヒトを含む）の産生する蛋白質がさらに好ましい。さらに、蛋白質（Ｚ）は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ等の蛋白質発現精製分野で公知の各種タグを有していてもよい。
【００３８】
蛋白質（Ｚ）がジスルフィド結合を有する場合、蛋白質（Ｙ）は、分子シャペロン機能を有することが好ましい。蛋白質（Ｙ）の分子シャペロン機能が消失または低減した場合と比較し、分子シャペロン機能を有する場合のほうが、蛋白質（Ｙ）と蛋白質（Ｚ）の融合蛋白質または蛋白質（Ｚ）の分泌生産効率がより高められる。蛋白質（Ｚ）がジスルフィド結合を有していない場合、蛋白質（Ｙ）の分子シャペロン機能の有無は、融合蛋白質または蛋白質（Ｚ）の分泌生産効率にはほとんど影響しない。
【００３９】
蛋白質（Ｚ）をコードする構造遺伝子配列（ｚ）は、蛋白質（Ｙ）をコードする構造遺伝子配列（ｙ）の下流に、構造遺伝子配列（ｙ）と構造遺伝子配列（ｚ）が同じ読み枠となるように結合させる。これにより、蛋白質（Ｙ）部分と蛋白質（Ｚ）部分とを有する融合蛋白質が本発明の発現ベクターにより発現する。
【００４０】
蛋白質（Ｚ）を取得するために、前記構造遺伝子配列（ｙ）と前記構造遺伝子配列（ｚ）の間に、細胞内または細胞外で前記蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断される部位として機能するアミノ酸もしくはペプチドからなる切断部位（Ｗ）をコードする構造遺伝子配列（ｗ）配置することが好ましい。構造遺伝子配列（ｚ）と構造遺伝子配列（ｗ）と構造遺伝子配列（ｙ）とは同じ読み枠となるように結合させる。この場合、リボゾームで合成された融合蛋白質は、蛋白質（Ｙ）、切断部位（Ｗ）および蛋白質（Ｚ）がこの順で結合した構造を有する融合蛋白質（以下、融合蛋白質（ＹＷＺ）という）となる。融合蛋白質（ＹＷＺ）は、そのまま形質転換体細胞から分泌されるか、または形質転換体細胞内でプロセッシング（切断）されて蛋白質（Ｚ）が生成し、該蛋白質（Ｚ）が分泌される。融合蛋白質（ＹＷＺ）が細胞内でプロセッシングされて蛋白質（Ｚ）が分泌される場合、融合蛋白質（ＹＷＺ）はＥＲ内またはそこから移動したゴルジ装置内でプロセッシングされ、プロセッシングにより生成した蛋白質（Ｚ）は分泌小胞を経て細胞外に分泌されると考えられる。
【００４１】
融合蛋白質（ＹＷＺ）のプロセッシングが蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側、すなわち、切断部位（Ｗ）と蛋白質（Ｚ）部分との間で正確に起こるようにするために、切断部位（Ｗ）のＣ末端側は特定のアミノ酸またはペプチドからなることが好ましい。該切断部位（Ｗ）としては、ＫＲ（Ｋ:リジン、Ｒ:アルギニン）なる配列またはＣ末端の配列がＫＲであるアミノ酸数３以上の配列が好ましい。該融合蛋白質（ＹＷＺ）において、ＫＲのＲが蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端アミノ酸と結合している。Ｃ末端の配列がＫＲであるアミノ酸数３以上の配列のアミノ酸数は、限定されるものではないが、２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。切断部位（Ｗ）の長さが長いと融合蛋白質（ＹＷＺ）が大きくなり、細胞内における生産効率が低下するおそれがある。
【００４２】
融合蛋白質（ＹＷＺ）が形質転換体の細胞外に分泌される場合、分泌された融合蛋白質（ＹＷＺ）から蛋白質（Ｚ）部分を切り離すことにより、蛋白質（Ｚ）が製造される。融合蛋白質（ＹＷＺ）からの蛋白質（Ｚ）の製造を容易にするために、切断部位（Ｗ）は、融合蛋白質（ＹＷＺ）の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断されるようにプロテアーゼによって認識される部位であることが好ましい。該プロテアーゼは融合蛋白質（ＹＷＺ）中の切断部位（Ｗ）を認識し、該切断部位（Ｗ）のＣ末端側（すなわち、切断部位（Ｗ）と蛋白質（Ｚ）の間）を切断する。
【００４３】
具体的な前記プロテアーゼとしてはエンテロキナーゼ、ファクターＸａ等が挙げられる。エンテロキナーゼはＤＤＤＤＫ配列を認識して該ペプチド部分のＣ末端側で切断するプロテアーゼであり、ファクターＸａはＩＥＧＲ配列を認識して該ペプチド部分のＣ末端側で切断するプロテアーゼである。ＤＤＤＤＫなる配列またはＣ末端の配列がＤＤＤＤＫであるアミノ酸数６以上の配列を切断部位（Ｗ）として有する融合蛋白質（ＹＷＺ）にエンテロキナーゼを作用させることにより蛋白質（Ｚ）が得られる。同様に、ＩＥＧＲなる配列やＣ末端の配列がＩＥＧＲであるアミノ酸数５以上の配列を切断部位（Ｗ）として有する融合蛋白質（ＹＷＺ）にファクターＸａを作用させることにより蛋白質（Ｚ）が得られる。
Ｃ末端の配列がＤＤＤＤＫであるアミノ酸数６以上の配列またはＩＥＧＲであるアミノ酸数５以上の配列のアミノ酸数は、限定されるものではないが、２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。切断部位（Ｗ）の長さが長いと融合蛋白質（ＹＷＺ）が大きくなり、細胞内における生産効率が低下するおそれがある。
【００４４】
（プロモーターおよびターミネーター）
本発明の発現ベクターは、造遺伝子配列（ｙ）の上流にプロモーターを、構造遺伝子配列（ｚ）の下流にターミネーターを有する。該プロモーターおよびターミネーターにより、蛋白質（Ｙ）部分と蛋白質（Ｚ）部分を有する融合蛋白質が合成される。
【００４５】
プロモーターとターミネーターは、本発明の発現ベクターを宿主に導入した場合に機能して、該宿主内で前記融合蛋白質を発現できるものであればよく、宿主の生物種に応じて、公知のプロモーターおよびターミネーターの中から適宜選択して用いることができる。本発明で用いられるプロモーターおよびターミネーターは、宿主が本来有するものであってもよく、ウイルス由来のプロモーター等の宿主が本来有してないものであってもよい。
【００４６】
宿主としてシゾサッカロミセス属を用いる場合、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）が挙げられる。
シゾサッカロミセス属酵母内で機能でき、かつ外来のプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
シゾサッカロミセス属酵母内で機能するターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００４７】
（ベクター）
本発明の発現ベクターは、プロモーター配列、構造遺伝子配列（ｙ）、構造遺伝子配列（ｚ）、およびターミネーター配列を含む発現カセットを有するベクターである。好ましくは、さらに、構造遺伝子配列（ｙ）と構造遺伝子配列（ｚ）の間に前記構造遺伝子配列（ｗ）を有するベクターである。なお、発現カセットとは、前記融合蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせである。
該発現カセットには、プロモーター配列の下流であり、かつ構造遺伝子配列（ｙ）の上流に５’−非翻訳領域が含まれていることが好ましい。また、構造遺伝子配列（ｚ）の下流であり、かつターミネーター配列の上流に３’−非翻訳領域が含まれていることが好ましい。さらに、構造遺伝子配列（ｚ）の下流であり、かつターミネーター配列の上流に（３’−非翻訳領域が含まれている場合にはその上流に）、終止コドンを備えていてもよい。
また、本発明の発現ベクターは、該発現カセットを１個のみ含んでいてもよく、２個以上含んでいてもよい。
【００４８】
本発明の発現ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットが組み込まれたものである。本発明の発現ベクターを使用して得られる形質転換体としては、該発現カセットが宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体と、該発現カセットが宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体とがある。
前者の形質転換体を作製する場合には、本発明の発現ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence: ARS）を含む発現ベクターであることが好ましい。
後者の形質転換体を作製する場合には、本発明の発現ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、本発明の発現ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識部位を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。本発明の発現ベクターがＡＲＳを有する場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
【００４９】
本発明の発現ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
【００５０】
本発明の発現ベクターは、たとえば、外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイトを備える公知のマルチクローニングベクター中の該クローニングサイトに、前記融合蛋白質の構造遺伝子を挿入することによって構築できる。また、公知のベクターに前記発現カセットを組み込むことによっても構築できる。
本発明の発現ベクターは、前記構造遺伝子配列（ｚ）に代えて該構造遺伝子配列（ｚ）を挿入するためのクローニングサイトを備えた発現カセットを含むクローニングベクターを用いることによっても構築できる。たとえば、本発明の発現ベクターは、下記クローニングベクターのクローニングサイトに、構造遺伝子配列（ｚ）若しくはその部分配列を組み込むことにより構築することもできる。なお、該クローニングサイトには、構造遺伝子配列（ｗ）を構造遺伝子配列（ｚ）と共に組み込むこともできる。
【００５１】
［クローニングベクター］
本発明のクローニングベクターは、宿主細胞内で機能しうるプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される前記構造遺伝子配列（ｙ）、該構造遺伝子配列（ｙ）の下流に位置しかつ構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、該宿主細胞内で機能しうるターミネーター配列を有することを特徴とする。本発明のクローニングベクターは、大腸菌のＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ）を有していることが好ましい。クローニングベクターから発現ベクターを構築する際には、通常、発現ベクターを増幅することが必要であり、発現ベクター増幅のために大腸菌が宿主として使用される。
【００５２】
本発明のクローニングベクターは、さらに、構造遺伝子配列（ｙ）とクローニングサイトとの間に、前記構造遺伝子配列（ｗ）を有していてもよい。特に、ＫＲをコードする、またはＣ末端側がＫＲであるアミノ酸数３以上のペプチドをコードする、前記構造遺伝子配列（ｗ）を有することが好ましい。
【００５３】
本発明のクローニングベクターが備えるクローニングサイトは、該ベクター中、該クローニングサイトにのみ存在する制限酵素認識部位である。本発明のクローニングベクターが備えるクローニングサイトは、制限酵素認識部位を１のみ有していてもよく、２以上の制限酵素認識部位を有するマルチクローニングサイトであってもよい。該マルチクローニングサイトとしては、公知のマルチクローニングベクターが備えるマルチクローニングサイトをそのまま使用でき、また、公知のマルチクローニングサイトを適宜改変したものも使用できる。
【００５４】
本発明のクローニングベクターは、クローニングサイトに蛋白質（Ｚ）の構造遺伝子配列（ｚ）が導入されたか否かを識別するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｌａｃＺ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の大腸菌内で機能し得る薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
【００５５】
本発明の分泌蛋白質用クローニングベクターは、該クローニングサイトの下流であり、かつターミネーター配列の上流に（３’−非翻訳領域が含まれている場合にはその上流に）、終止コドンを備えていてもよい。
【００５６】
本発明の発現ベクターおよび本発明のクローニングベクターを構築するための具体的操作方法としては、公知の方法を使用できる。たとえば、文献［J. Sambrook et al., "Molecular Cloning 2nded.", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］に記載されている操作方法を使用できる。その他、ＰＣＲによる酵素的な増幅法や化学合成法等で構築してもよい。
【００５７】
［形質転換体およびその製造方法］
本発明の形質転換体は、前記発現カセットを、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有することを特徴とする。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含む発現ベクターを細胞内に有するということである。形質転換体の継代培養が容易であることから、該発現カセットを染色体中に有することが好ましい。
本発明の形質転換体は、具体的には、本発明の発現ベクターを宿主細胞へ導入して製造される。
【００５８】
（宿主）
本発明の形質転換体の宿主は、通常、外来蛋白質等を発現させる際に宿主として用いられるいずれの生物種由来の細胞であってもよい。たとえば、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌等の真核細胞微生物であってもよく、哺乳細胞、昆虫細胞等の動物細胞であってもよく、植物細胞であってもよい。
【００５９】
宿主は、野生型の細胞であってもよく、１または複数の遺伝子に変異が導入された変異型の細胞であってもよい。変異型としては、１または複数の遺伝子を欠失または失活させた変異型が好ましい。欠失または失活させる遺伝子としては、たとえば、エネルギー代謝関連遺伝子群、プロテアーゼ関連遺伝子群、減数分裂関連遺伝子群、転写関連遺伝子群、細胞の成長、分裂、ＤＮＡ合成に関連する遺伝子群、蛋白質合成関連遺伝子群、膜輸送関連遺伝子群、細胞構造維持関連遺伝子群、情報伝達関連遺伝子群、またはイオン恒常性関連遺伝子群から選ばれる１種以上が挙げられる。プロテアーゼ関連遺伝子群の中でも特に、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子群）、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子（アミノペプチダーゼ遺伝子群）、カルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子（カルボキシペプチダーゼ遺伝子群）およびジペプチダーゼをコードする遺伝子（ジペプチダーゼ遺伝子群）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子が削除または不活性化された変異型が好ましい。宿主内のＥＲ等に存在する蛋白質（Ｚ）や前記融合蛋白質は、宿主のプロテアーゼにより分解される場合があり、また細胞外へ分泌された後に宿主から分泌されたプロテアーゼ等によって分解される場合もあるが、１または複数のプロテアーゼ関連遺伝子が欠失または失活している宿主を用いることにより、蛋白質（Ｚ）または前記融合蛋白質の分解を抑制できる傾向がある。
【００６０】
特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Latour法（Nucreic  Acids  Research誌、第34巻、e11ページ、2006年；国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（PCR  Methods  Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させることができる。
【００６１】
特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
【００６２】
プロテアーゼ関連遺伝子の削除または不活性化は、遺伝子の全体を削除してもよく、遺伝子の一部を削除して遺伝子を不活性化してもよい。また、プロテアーゼ関連遺伝子の不活性化は、遺伝子の一部を削除することに限られず、プロテアーゼ関連遺伝子を削除なしに改変する場合も意味する。さらに、プロテアーゼ関連遺伝子の配列の中に他の遺伝子やＤＮＡを挿入してプロテアーゼ関連遺伝子を不活性化することもできる。いずれの場合も、プロテアーゼ関連遺伝子を活性のない蛋白質をコードするものとしたり、プロテアーゼ関連遺伝子が転写や翻訳できないものにしたりして、不活性なものとする。なお、１つの細胞がある１種類のプロテアーゼ関連遺伝子を２個以上有する場合には、その全てを削除してもよく、その遺伝子がコードするプロテアーゼの細胞内活性が充分に低下する限り少数の遺伝子は残存してもよい。
【００６３】
さらに宿主には、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。発現ベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、該発現ベクターに該欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。該宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているシゾサッカロミセス属酵母を宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有する発現ベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
【００６４】
本発明において用いられる宿主としては、微生物であり、かつ真核生物である酵母または糸状菌が好ましく、酵母がより好ましい。培養方法も確立しており、エンドトキシンも含まないためである。種々の酵母類の中でもＳ．ｐｏｍｂｅをはじめとするシゾサッカロミセス属酵母が好ましい。シゾサッカロミセス属酵母は、出芽酵母サッカロミセス・セレビジエをはじめとする他の酵母に比べ様々な性質、たとえば細胞周期や染色体の構造、ＲＮＡスプライシング等が高等動物により類似しているといわれ、生産されてくる蛋白質のアセチル化、リン酸化および糖鎖の付加等の翻訳後修飾も動物細胞でのそれにかなり近いと考えられている(Cell誌、第45巻、781-782ページ、1986年; Nature誌、第318巻、78-80ページ、1985年; The Journal of Cell Biology誌、第109巻、2693-2702ページ、1989年)。このため、蛋白質（Ｚ）を製造するための宿主としてシゾサッカロミセス属酵母を用いることによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に近い遺伝子産物が得られることが期待される。培養方法も酵母類で共通の点が多く、他の酵母で知られている知見を容易に応用できる。宿主として用いるシゾサッカロミセス属酵母としては、前記と同様のものが挙げられる。中でも、種々の有用な変異株が利用できることから、Ｓ．ｐｏｍｂｅが特に好ましい。
【００６５】
宿主として好ましいＳ．ｐｏｍｂｅは、野生株であってもよく、１または複数のプロテアーゼ関連遺伝子が欠失または失活された変異株であってもよい。該変異株において欠失または失活されているプロテアーゼ関連遺伝子としては、たとえば以下の遺伝子が例示される。メタロプロテアーゼ遺伝子群：cdb4(SPAC23H4.09)、mas2(SPBC18E5.12c)、pgp1(SPCC1259.10)、ppp20(SPAC4F10.02)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp51(SPAC22G7.01c)、ppp52(SPBC18A7.01)、ppp53(SPAP14E8.04)、oma1(SPAP14E8.04)。セリンプロテアーゼ遺伝子群：isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006. 01)、sxa2(SPAC1296.03c)。システインプロテアーゼ遺伝子群：ppp80(SPAC19B12.08)、pca1(SPCC1840.04)、cut1(SPCC5E4.04)、gpi8(SPCC11E10.02c)、atg4(SPAC19B12.08)。アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群：sxa1(SPAC26A3.01)、yps1(SPCC1795.09)、ppp81(SPAC25B8.17)。メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子：fma2（APBC14C8.03）。
【００６６】
プロテアーゼ関連遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
【００６７】
（形質転換方法）
前記発現ベクターを用いて、宿主を形質転換する。形質転換方法は、公知の形質転換方法をいずれも用いることができる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法等従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法等が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００６８】
形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における蛋白質（Ｚ）または前記融合蛋白質の量を調べ、該蛋白質の分泌発現量がより多い形質転換体を選抜する。また、選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
【００６９】
（培養方法）
本発明の形質転換体は、形質転換前の宿主と同様に培養できる。
本発明の形質転換体の培養のための培養液には、宿主と同種の細胞の培養に用いられる公知の培養培地を用いることができ、宿主細胞が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、宿主細胞の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００７０】
炭素源としては、たとえばグルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、たとえばアンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえばリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００７１】
培養には公知の細胞培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
【００７２】
［蛋白質の製造方法］
本発明の蛋白質の製造方法は、本発明の発現ベクターを宿主細胞へ導入して得られた形質転換体（本発明の形質転換体）を培養し、得られた培養液から蛋白質（Ｚ）または前記融合蛋白質を取得することを特徴とする。
【００７３】
培養条件は、蛋白質（Ｚ）または前記融合蛋白質の種類等を考慮して適宜設定できる。たとえば、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時間、好ましくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であり、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。
【００７４】
形質転換体から前記融合蛋白質が分泌される場合、プロテアーゼ等により該融合蛋白質の蛋白質（Ｚ）部分のＮ末端側で切断して蛋白質（Ｚ）を製造する。該融合蛋白質からの蛋白質（Ｚ）の製造は、培養液から分離された融合蛋白質を用いて行ってもよく、培養液から分離する前に行ってもよい。いずれの場合も、融合蛋白質からは蛋白質（Ｚ）以外の切断物（蛋白質（Ｙ）等）が生じるため、該切断物と蛋白質（Ｚ）を分離することが好ましい。
【００７５】
形質転換体を培養し、培養液から蛋白質（Ｚ）または前記融合蛋白質を分離する場合、公知の蛋白質分離方法を用いることができる。たとえば、培養後、遠心分離処理等により菌体を含む培養液から培養上清を回収し、該培養上清から融合蛋白質を単離・精製できる。また、培養上清から分離された菌体に再び培養液を加えて培養することを繰り返して、連続的に形質転換体を培養して蛋白質（Ｚ）または前記融合蛋白質を分泌産生させることもできる。
【００７６】
培養上清中の融合蛋白質または蛋白質（Ｚ）を取得するための単離・精製法としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法が挙げられる。 
単離・精製した蛋白質の確認方法としては、公知のウエスタンブロッティング法または活性測定法が挙げられる。精製された蛋白質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析等によりその構造を明らかにできる。
【実施例】
【００７７】
以下、試験例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。【００７８】
［試験例１］
Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１の全長蛋白質を蛋白質（Ｙ）として用いた。
（発現ベクターの構築）
まず、公知のクローニングベクターｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１をコードする構造遺伝子の終止コドンを削除してAflIIの制限酵素認識部位を付加した遺伝子配列を挿入した遺伝子融合用ベクターｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩを、それぞれ作製した。
具体的には、Ｓ．ｐｏｍｂｅの野生株（ＡＲＣ０３２株、ＡＴＣＣ３８３６６、９７２ｈ−相当）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号９）および５’末端にSalIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号１０）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にSalIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１フラグメント）を得た。
該ＰＤＩ１フラグメントを制限酵素BspHIおよびSalIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびSalIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１とした。
また、Ｓ．ｐｏｍｂｅの野生株由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号１１）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１遺伝子のＯＲＦ全長のうち終止コドンを削除し、５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３'末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１-ＡｆｌＩＩフラグメント）を得た。
該ＰＤＩ１-ＡｆｌＩＩフラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩとした。【００７９】
次いで、ｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、Ｎ結合型糖鎖付加部位に変異を導入したヒトトランスフェリン（変異型ｈＴＦ）をコードする構造遺伝子を挿入することで、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１と変異型ｈＴＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１−ｈＴＦ、同様にしてＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１および変異型ｈＴＦを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦを、それぞれ作製した。また、ｐＳＬ６Ｐ３中のマルチクローニングサイトに、変異型ｈＴＦをコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰ３ｈＴＦを作製した。ｐＳＬ６は、ｈＣＭＶプロモーターおよびＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備える発現ベクターである。また、ｐＳＬ６Ｐ３は、ｈＣＭＶプロモーター下流にＰ３分泌シグナルペプチド（配列番号８）をコードする遺伝子を配し、該遺伝子とＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備える分泌発現ベクターである。
具体的には、変異型ｈＴＦをコードする人工合成遺伝子（配列番号１２）を鋳型とし、５’末端にAflIIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号１３）および５’末端にXbaIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号１４）とを用いたＰＣＲによって、変異型ｈＴＦ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAflIIの制限酵素認識部位を、３’末端にXbaIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（変異型ｈＴＦフラグメント）を得た。
該変異型ｈＴＦフラグメントおよびｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素AflIIおよびXbaIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１−ｈＴＦとした。
また、変異型ｈＴＦをコードする人工合成遺伝子を鋳型とし、５’末端にAflIIの制限酵素認識部位およびＫＲペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー（配列番号１５）および、配列番号１４のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、変異型ｈＴＦ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAflIIの制限酵素認識部位とＫＲペプチド配列をコードするコドンを、３’末端にXbaIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメント）を得た。
該ＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメント、ｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩおよびｐＳＬ６Ｐ３それぞれを制限酵素AflIIおよびXbaIで二重消化し、ＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントとｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩ、またはｐＳＬ６Ｐ３をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦ、ｐＰ３ｈＴＦとした。【００８０】
（宿主）
本試験例では、宿主として、Ｓ．ポンベのロイシン要求株ＡＲＣ００１（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２）（以下、Ａ０株）の８つのプロテアーゼ遺伝子を欠失させたＡ８株（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８、△ｐｓｐ３、△ｉｓｐ６、△ｏｍａ１、△ｐｐｐ１６、△ｆｍａ２、△ｓｘａ２、△ａｔｇ４、△ｐｐｐ２０）を用いた。Ａ８株は、遺伝子カセットを用いた標的ＯＲＦの遺伝子置換によりあらかじめ構築された株である（国際公開第２００７／０１５４７０号参照。）。【００８１】
（形質転換体の作製）
Ａ８株をＹＥＳ(０．５％酵母エキス、３％グルコース、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＳＰサプリメント)培地で０．６×１０７細胞数／ｍＬになるまで生育させた。集菌、洗浄後１．０×１０８細胞数／ｍＬになるように０．１Ｍ  酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁した。その後、懸濁液１００μＬに前記で得られた各発現ベクターを制限酵素ＮｏｔＩで消化したもの１μｇを加え、さらに５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００)水溶液を２６０μＬ加えてよく撹拌した後、３０℃で３０分間インキュベートし、４３μＬのＤＭＳＯを添加後にさらに４２℃で５分間インキュベートした。遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、洗浄後１５０μＬの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。３〜５日後、形質転換体を得た。
ｐＰ３ｈＴＦを用いて得た形質転換体をＰ３ｈＴＦ株、ｐＰ３ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１を用いて得た形質転換体をＰ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株、ｐＰＤＩ１を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１株、ｐＰＤＩ１−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をＰＤＩ１−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦ株とした。【００８２】
（蛋白質の分泌生産）
各形質転換体およびＡ８株をそれぞれ試験管内の５ｍＬのＹＰＤ＋ＭＥＳ（１％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコース、０．３Ｍ  ２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物）培地（ｐＨ６．０）に植菌し、３２℃で３日間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収された培養上清４ｍＬにＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液を終濃度１０％（ｗ／ｗ）になるよう添加して冷却し、得られた沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１５μＬ（培養上清１．５ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色し、染色像をＬＡＳ４０００イメージングシステム（富士フィルム社製）で検出した。また、該サンプルのうち２．５μＬ（培養液０．２５ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ膜に転写し、ウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロットの一次抗体としては、１：５００に希釈したヤギポリクローナル抗ｈＴＦ抗体（CALBIOCHEM社製、米国）を用い、二次抗体としては、１：１０００に希釈したフォスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗血清（Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.製、米国）を用いた。また、ｈＴＦバンド（ｈＴＦに特異的なシグナル）は、高感度化学発光（BCIP/NBT Phosphatase Substrate、Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.製、米国）により可視化し、検出した。【００８３】
ＣＢＢ染色像を図３に、ウェスタンブロットの染色像を図４に、それぞれ示す。図３および４中、「Ｍ」は分子量マーカーをアプライしたレーンである。この結果、図３に示すように、過剰発現させたＰＤＩ１株では、ＰＤＩ１が大量に分泌されていることが確認できた。また、公知のＰ３分泌シグナルペプチドをＮ末端に付加したｈＴＦ（Ｐ３ｈＴＦ）を発現させた場合、Ｐ３分泌シグナルペプチドが切断されたｈＴＦが培養液中に分泌されていること、ＰＤＩ１と共発現させたＰ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株のほうが、Ｐ３ｈＴＦ株よりもｈＴＦの分泌生産量が多いことが確認できた。また、図３および図４から、ＰＤＩ１−ｈＴＦ株でも、ＰＤＩ１をＮ末端に付加したｈＴＦ（ＰＤＩ１−ｈＴＦ）が培養液中に分泌されることが確認できた。また、ＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦ株では、図３でＰ３ｈＴＦ株とほぼ同じ大きさの位置と、ＰＤＩ１株とほぼ同じ大きさの位置にバンドが検出されており、図４でＰ３ｈＴＦ株とほぼ同じ大きさの位置にバンドが検出されていた。該結果から、ＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦ株では、ｈＴＦはＰＤＩ１と切り離された状態で分泌されることがわかった。【００８４】
［試験例２］
Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１の部分蛋白質の分泌されやすさを調べた。
（発現ベクターの構築）
ｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂ）、ＰＤＩ１（ａｂｘ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ａｂｂ’）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’）、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）、ＰＤＩ１（−ｃ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（−ｃ）、ＰＤＩ１（−ｘ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（−ｘ）、またはＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）を、それぞれ作製した。ＰＤＩ１（−ｘ）は、ＰＤＩ１の全長蛋白質からｘドメインを削除した部分蛋白質である。【００８５】
具体的には、ｐＰＤＩ１を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIの制限酵素認識部位を備える配列番号１６から配列番号２０までの各リバースプライマーを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の１から２３２番目まで、３３９番目まで、３５４番目まで、４６２番目まで、および４８８番目までのアミノ酸それぞれをコードする各構造遺伝子の５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有する各ＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ａｂ）フラグメント、ＰＤＩ１（ａｂｂ’）フラグメント、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）フラグメント、ＰＤＩ１（−ｃ）フラグメント、およびＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）フラグメント）を得た。
また、ｐＰＤＩ１を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIの制限酵素認識部位とＰＤＩ１のｘドメインをコードする遺伝子を備えるリバースプライマー（配列番号２１）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の１から２３２番目までのアミノ酸のＣ末端にｘドメインを配した蛋白質をコードする構造遺伝子の５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ａｂｘ）フラグメント）を得た。
また、ｐＰＤＩ１を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよびｂ’ドメインをコードする遺伝子領域の３’末端２１塩基とａ’ドメインをコードする遺伝子領域の５’末端２２塩基とをオーバーラップさせたリバースプライマー（配列番号２２）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の１から３３９番目までのアミノ酸コードする遺伝子の３’末端にａ’ドメインをコードする遺伝子領域の５’末端２２塩基を有するＰＣＲ産物を得た。一方、ｂ’ドメインをコードする遺伝子領域の３’末端２１塩基とａ’ドメインをコードする遺伝子領域の５’末端２２塩基とをオーバーラップさせたフォワードプライマー（配列番号２３）および配列番号２０のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の３５４から４８８番目までのアミノ酸コードする遺伝子の５’末端にｂ’ドメインをコードする遺伝子領域の３’末端２１塩基を有するＰＣＲ産物を得た。両ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび配列番号２０のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の１から３３９番目までのアミノ酸と３５４から４８８番目までアミノ酸配列を連結させた蛋白質をコードする構造遺伝子の５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（−ｘ）フラグメント）を得た。【００８６】
前記の各フラグメント（ＰＤＩ１（ａｂ）フラグメント、ＰＤＩ１（ａｂｘ）フラグメント、ＰＤＩ１（ａｂｂ’）フラグメント、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）フラグメント、ＰＤＩ１（−ｃ）フラグメント、ＰＤＩ１（−ｘ）フラグメント、およびＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）フラグメント）を制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、各フラグメントとｐＳＬ６をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂ）、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’）、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）、ｐＰＤＩ１（−ｃ）、ｐＰＤＩ１（−ｘ）、およびｐＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）とした。【００８７】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂ）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（ａｂ）株、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（ａｂｘ）株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（ａｂｂ’）株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、ｐＰＤＩ１（−ｃ）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（−ｃ）株、ｐＰＤＩ１（−ｘ）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（−ｘ）株、ｐＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）を用いて得た形質転換体をＰＤＩ１（−ＡＤＥＬ）株とした。【００８８】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体および試験例１で作製したＰＤＩ１株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。ＰＤＩ１株の該サンプルのうち８μＬ（培養上清０．８ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライし、その他の形質転換体については、ＰＤＩ１株のアプライ量を基準として、各形質転換体中で発現させたＰＤＩの分子量に反比例させた量をアクリルアミドゲルにアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色し、染色像をＬＡＳ４０００イメージングシステム（富士フィルム社製）で検出した。検出されたＰＤＩ１のバンドをマルチゲージイメージアナライザー（富士フィルム社製）を用いて定量化し、ＰＤＩ１株のＰＤＩ１の分泌量を１とした場合の各形質転換体のＰＤＩ１の相対分泌量を算出した。【００８９】
ＣＢＢ染色像を図５に、各菌株のＰＤＩ１の全長または部分蛋白質の相対分泌量の算出結果を図６に示す。図５および図６中、「ＰＤＩ１（ｆｕｌｌ）」は、ＰＤＩ１株から得られたサンプルをアプライしたレーンである。また、図５中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ＰＤＩ１の全長蛋白質よりも部分蛋白質のほうが分泌量が高くなり、ＰＤＩ１（ａｂｘ）およびＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を除き、分子量が小さくなるほど分泌量が多くなる傾向が観察された。ＰＤＩ１（ａｂｘ）およびＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）はその他の部分蛋白質よりも明らかに分泌量が多く、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）が最も分泌量が多かった。ＰＤＩ１（-ｘ）は合成された蛋白質が分泌されているものの、ラダー状にバンドが検出され、分解がひどいことがわかった。該結果から、ＰＤＩ１の低分子化により分泌量が増大すること、ｘドメインが分泌発現に重要であることが示唆された。【００９０】
［試験例３］
試験例２で最も分泌生産量が多かったＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を蛋白質（Ｙ）として用いた場合と、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合とで、ｈＴＦの分泌生産量を比較した。
（発現ベクターの構築）
まず、ｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）をコードする構造遺伝子の終止コドンを削除してAflIIの制限酵素認識部位を付加した遺伝子配列を挿入した遺伝子融合用ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩを作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号２４）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）をコードする遺伝子断片のうち終止コドンを削除し、５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメント）を得た。
該ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩとした。【００９１】
次いで、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、変異型ｈＴＦをコードする構造遺伝子を挿入することでＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）と変異型ｈＴＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ、同様にしてＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）および変異型ｈＴＦを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦをそれぞれ作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１−ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化して変異型ｈＴＦフラグメントおよびＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントを回収し、一方で、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、変異型ｈＴＦフラグメントまたはＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントとｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦとした。【００９２】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株とした。【００９３】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例１で作製したＰ３ｈＴＦ株およびＰ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株、試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、並びにＡ８株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例２と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、Ｐ３ｈＴＦ株のｈＴＦの分泌量を１とした場合の各形質転換体のｈＴＦの相対分泌量を算出した。ａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株では、融合蛋白質の全長は分泌量が少ないため、該融合蛋白質の分解によって得られたｈＴＦの相対分泌量を算出した。【００９４】
ＣＢＢ染色像を図７に、各菌株のｈＴＦの相対分泌量の算出結果を図８に示す。図７中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株とａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株はいずれも、Ｐ３ｈＴＦ株よりもｈＴＦ分泌量が多く、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）をＮ末端に有することで、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合よりも分泌生産効率が高いことがわかった。特にａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株は、Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株よりもｈＴＦの分泌量が多かった。ただしａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株では、融合蛋白質ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦの全長蛋白質の量は少なかった。【００９５】
［試験例４］
試験例２で最も分泌生産量が多かったＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を蛋白質（Ｙ）として用いた場合と、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合とで、ＥＧＦＰの分泌生産量を比較した。
（発現ベクターの構築）
ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰをコードする構造遺伝子を挿入することでＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）とＥＧＦＰの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰ、同様にしてＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）およびＥＧＦＰを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを、それぞれ作製した。また、ｐＳＬ６Ｐ３中のマルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰをコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰ３ＥＧＦＰを作製した。
具体的には、ＥＧＦＰをコードする人工合成遺伝子（配列番号２５）を鋳型とし、５’末端にAflIIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号２６）および５’末端にKpnIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号２７）とを用いたＰＣＲによって、ＥＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAflIIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＥＧＦＰフラグメント）を得た。
該ＥＧＦＰフラグメントおよびｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素AflIIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１−ＥＧＦＰとした。
また、ＥＧＦＰをコードする人工合成遺伝子を鋳型とし、５’末端にAflIIの制限酵素認識部位およびＫＲペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー（配列番号２８）および、配列番号２７のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＥＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAflIIの制限酵素認識部位とＫＲペプチド配列をコードするコドンを、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＫＲ付きＥＧＦＰフラグメント）を得た。
該ＫＲ付きＥＧＦＰフラグメント、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＳＬ６Ｐ３、それぞれを制限酵素AflIIおよびKpnIで二重消化し、ＫＲ付きＥＧＦＰフラグメントとｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩまたはｐＳＬ６Ｐ３をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ、ｐＰ３ＥＧＦＰとした。【００９６】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰ３ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をＰ３ＥＧＦＰ株、ｐＰ３ＥＧＦＰおよびｐＰＤＩ１を用いて得た形質転換体をＰ３ＥＧＦＰ＋ＰＤＩ１株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株とした。【００９７】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、およびＡ８株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例２と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、Ｐ３ＥＧＦＰ株のＥＧＦＰの分泌量を１とした場合の各形質転換体のＥＧＦＰ（融合蛋白質を含む）の相対分泌量を算出した。【００９８】
ＣＢＢ染色像を図９に、各菌株のＥＧＦＰの相対分泌量の算出結果を図１０に示す。図９中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ａｂｂ’ｘ−ＥＧＦＰ株とａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株はいずれも、Ｐ３ＥＧＦＰ株よりもＥＧＦＰ分泌量が多く、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）をＮ末端に有することで、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合よりも分泌生産効率が高いことがわかった。また、ＥＧＦＰはジスルフィド結合を有さず、ＰＤＩ１を共発現しても分泌量は増えなかった。【００９９】
［試験例５］
宿主をＳ．ｐｏｍｂｅのＡ０株とし、試験例２で最も分泌生産量が多かったＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を蛋白質（Ｙ）として用いた場合と、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合とで、ｈＴＦおよびＥＧＦＰの分泌生産量を比較した。
（形質転換体の作製）
宿主をＡ０株とし、試験例１〜４で作製した発現ベクターｐＰ３ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ、ｐＰ３ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）、およびｐＰＤＩ１を用いて、試験例１と同様にして形質転換体を作製した。【０１００】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体およびＡ０株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例１と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した。【０１０１】
Ａ０株、Ｐ３ｈＴＦ株、ａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、およびＰＤＩ１株のＣＢＢ染色像を図１１に、Ａ０株、Ｐ３ＥＧＦ株、ａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＥＧＦ株、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、およびＰＤＩ１株のＣＢＢ染色像を図１２にそれぞれ示す。図１１および１２中、「ＰＤＩ１（ｆｕｌｌ）」は、ＰＤＩ１株から得られたサンプルをアプライしたレーンであり、「Ｍ」は図３と同様である。この結果、Ａ０株ではＰＤＩ１の分泌は観察されなかったが、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）の分泌は観察された。Ａ０株で分泌されたＰＤＦ１の全長蛋白質は、Ａ０株が有している各種プロテアーゼによって分解されたためと推察される。また、ｈＴＦでは、Ａ８株とは異なり、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合と比べてＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合は、ｈＴＦの分泌量は増大していなかった。一方でＥＧＦＰでは、Ａ８株と同様に、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合よりもＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合のほうが、ＥＧＦＰの分泌量が多く、分泌生産効率の点でＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）の優位性が確認できた。【０１０２】
［試験例６］
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合とＰＤＩ１（ａｂｘ）を用いた場合とで、ｈＴＦの分泌生産量を比較した。
（発現ベクターの構築）
まず、ｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｘ）をコードする構造遺伝子の終止コドンを削除してAflIIの制限酵素認識部位を付加した遺伝子配列を挿入した遺伝子融合用ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩを作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび配列番号２４のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１（ａｂｘ）をコードする遺伝子断片のうち終止コドンを削除し、５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメント）を得た。
該ＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩとした。
次いで、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、変異型ｈＴＦをコードする構造遺伝子を挿入することで、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｘ）と変異型ｈＴＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ｈＴＦ、同様にしてＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｘ）および変異型ｈＴＦを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦを、それぞれ作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１−ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化して変異型ｈＴＦフラグメントおよびＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントを回収した。一方、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、変異型ｈＴＦフラグメントまたはＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントとｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦとした。【０１０３】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をａｂｘ−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をａｂｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株とした。【０１０４】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株およびＰＤＩ１（ａｂｘ）株、試験例３で作製したａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例３と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、Ｐ３ｈＴＦ株のｈＴＦの分泌量を１とした場合の各形質転換体のｈＴＦの相対分泌量を算出した。【０１０５】
ＣＢＢ染色像を図１３に、各菌株のｈＴＦの相対分泌量の算出結果を図１４に示す。図１３中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株およびＰＤＩ１（ａｂｘ）株の場合とは異なり、蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｘ）を用いたａｂｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株およびａｂｘ−ｈＴＦ株のほうが、それぞれＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いたａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株よりも、ｈＴＦ分泌量が多かった。融合蛋白質全体における蛋白質（Ｙ）の部分が小さくなった効果が表れていると考えられた。【０１０６】
［試験例７］
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合と、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）中の分子シャペロン機能の活性部位に変異を入れた蛋白質を用いた場合とで、ｈＴＦの分泌生産量を比較した。
（発現ベクターの構築）
まず、ｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）のａドメイン中の分子シャペロン活性の活性中心（ＣＧＨＣ）の２つのシステイン残基（Ｃ）をセリン残基（Ｓ）に置換した変異蛋白質ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）をコードする構造遺伝子を挿入したｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）をコードする構造遺伝子の終止コドンを削除してAflIIの制限酵素認識部位を付加した遺伝子配列を挿入した遺伝子融合用ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩをそれぞれ作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよびａドメイン中の分子シャペロン活性の活性中心（ＣＧＨＣ）の２つのシステイン残基（Ｃ）をセリン残基（Ｓ）に置換するようコドンに変異を導入した部分を含むリバースプライマー（配列番号２９）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の１から５５番目までのアミノ酸をコードし、かつ５１番目と５４番目のシステイン残基がセリン残基に置換した蛋白質をコードする部分遺伝子のＰＣＲ産物を得た。一方、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を鋳型とし、配列番号２９のプライマーの相補鎖にあたるフォワードプライマー（配列番号３０）および配列番号１８のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の４９から３５４番目までのアミノ酸をコードし、かつ５１番目と５４番目のシステイン残基がセリン残基に置換した蛋白質をコードする部分遺伝子のＰＣＲ産物を得た。両ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび配列番号１８のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１の１から３５４番目までのアミノ酸をコードし、かつ５１番目と５４番目のシステイン残基がセリン残基に置換した蛋白質をコードする構造遺伝子の５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）フラグメント）を得た。
該ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）フラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）とした。
また、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび配列番号２４のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）をコードする遺伝子断片のうち終止コドンを削除し、５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩフラグメント）を得た。
該ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩフラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩとした。【０１０７】
次いで、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、変異型ｈＴＦをコードする構造遺伝子を挿入することでＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）と変異型ｈＴＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ｈＴＦ、同様にしてＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）および変異型ｈＴＦを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ｈＴＦを、それぞれ作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１−ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化して変異型ｈＴＦフラグメントおよびＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントを回収し、一方で、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、変異型ｈＴＦフラグメントまたはＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントとｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ｈＴＦとした。【０１０８】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）を用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ｈＴＦ株とした。【０１０９】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、試験例３で作製したａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例３と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、Ｐ３ｈＴＦ株のｈＴＦの分泌量を１とした場合の各形質転換体のｈＴＦの相対分泌量を算出した。【０１１０】
ＣＢＢ染色像を図１５に、各菌株のｈＴＦの相対分泌量の算出結果を図１６に示す。図１５中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）株ではＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）はＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）と同様に分泌されていた。蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）を用いたａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ｈＴＦ株は、それぞれＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いたａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株よりも、ｈＴＦ分泌量が３０〜４０％程度低かった。【０１１１】
［試験例８］
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合と、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）中の分子シャペロン機能の活性部位に変異を入れた蛋白質を用いた場合とで、ＥＧＦＰの分泌生産量を比較した。
（発現ベクターの構築）
ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰをコードする構造遺伝子を挿入することでＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）とＥＧＦＰの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＥＧＦＰ、同様にしてＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）およびＥＧＦＰを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを、それぞれ作製した
具体的には、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰおよびｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalI出二重消化してＥＧＦＰフラグメントおよびＫＲ付きＥＧＦＰフラグメントを回収し、一方で、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、変異型ｈＴＦフラグメントまたはＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントとｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ＥＧＦＰとした。【０１１２】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ（Ｃ→Ｓ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ株とした。【０１１３】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、試験例４で作製したａｂｂ’ｘ−ＥＧＦＰ株およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株、試験例７で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例４と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した。【０１１４】
ＣＢＢ染色像を図１７に示す。図１７中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ｈＴＦの場合とは異なり、蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）を用いた菌株とＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた菌株とで、ＥＧＦＰ分泌量に変化はほとんど観察されなかった。ＥＧＦＰはｈＴＦとは異なり、元々ＰＤＩ１による分子シャペロン効果の恩恵を受けないためと推察される。【０１１５】
［試験例９］
ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）に全長蛋白質と同様に分子シャペロン活性があるのか調べた。
（形質転換体の作製）
試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として、ｐＰ３ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いて形質転換体Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株を、ｐＰ３ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）を用いて形質転換体Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）株を、それぞれ作製した。【０１１６】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例１で作製したＰ３ｈＴＦ株、Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株、試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株、試験例３で作製したＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ株およびＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ株、Ａ８株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例３と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、Ｐ３ｈＴＦ株のｈＴＦの分泌量を１とした場合の各形質転換体のｈＴＦの相対分泌量を算出した。【０１１７】
ＣＢＢ染色像を図１８に、各菌株のｈＴＦの相対分泌量の算出結果を図１９に示す。図１８中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株でも、Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株と同様にｈＴＦの分泌量は増大しており、Ｐ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）（Ｃ→Ｓ）株ではＰ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１株やＰ３ｈＴＦ＋ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株よりも分泌量が少なく、分子シャペロン効果が低かった。該結果から、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）はシャペロン活性を有していることが判明し、蛋白質（Ｚ）が元々ＰＤＩ１共発現の恩恵を受ける蛋白質の場合には、該蛋白質のＮ末端側に融合しているＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）は、分子シャペロンとしても機能している可能性が示唆された。【０１１８】
［試験例１０］
試験例２で最も分泌生産量が多かったＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を蛋白質（Ｙ）として用いた場合と、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合とで、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）の分泌生産量を比較した。【０１１９】
（発現ベクターの構築）
ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、ｈＧＨまたはＧＣＳＦをコードする構造遺伝子を挿入することで、ＫＲペプチドを介してＳ．ｐｏｍｂｅのＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）とｈＧＨまたはＧＣＳＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＧＨおよびｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦを、それぞれ作製した。また、ｐＳＬ６Ｐ３中のマルチクローニングサイトに、ｈＧＨまたはＧＣＳＦをコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰ３ｈＧＨおよびｐＰ３ＧＣＳＦを作製した。【０１２０】
具体的には、ｈＧＨをコードする遺伝子（配列番号３１）を鋳型とし、５’末端にAflIIの制限酵素認識部位およびＫＲペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー（配列番号３２）および５’末端にKpnIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３３）とを用いたＰＣＲによって、ｈＧＨ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAflIIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＫＲ付きｈＧＨフラグメント）を得た。
また、ＧＣＳＦをコードする遺伝子（配列番号３４）を鋳型とし、５’末端にAflIIの制限酵素認識部位およびＫＲペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー（配列番号３５）および５’末端にKpnIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３６）とを用いたＰＣＲによって、ＧＣＳＦ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAflIIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＫＲ付きＧＣＳＦフラグメント）を得た。【０１２１】
ＫＲ付きｈＧＨフラグメント、ＫＲ付きＧＣＳＦフラグメント、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＳＬ６Ｐ３、それぞれを制限酵素AflIIおよびKpnIで二重消化し、ＫＲ付きｈＧＨフラグメントまたはＫＲ付きＧＣＳＦフラグメントと、ｐＰＤＩ１−ＡｆｌＩＩまたはｐＳＬ６Ｐ３をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＧＨ、ｐＰ３ｈＧＨ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦ、ｐＰ３ＧＣＳＦとした。【０１２２】
（形質転換体の作製）
作製した発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＧＨを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＧＨ株、ｐＰ３ｈＧＨを用いて得た形質転換体をＰ３ｈＧＨ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＳＣＦを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＧＣＳＦ株、ｐＰ３ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をＰ３ＧＣＳＦ株とした。【０１２３】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された各形質転換体を培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例２と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、Ｐ３シグナル分泌株（Ｐ３ｈＧＨ株およびＰ３ＧＣＳＦ株）の各標的蛋白質（Ｚ）の分泌量を１とした場合の各形質転換体の標的蛋白質（Ｚ）の相対分泌量を算出した。【０１２４】
ＣＢＢ染色像を図２０に、各菌株の各蛋白質の相対分泌量の算出結果を図２１に示す。図２０中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＧＨ株とａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＧＣＳＦ株はそれぞれ対応するＰ３シグナル分泌株よりも標的蛋白質（Ｚ）分泌量が2倍程度向上しており、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）をＮ末端に有することで、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合よりも分泌生産効率が高いことがわかった。【０１２５】
［試験例１１］
Ｓ．ｐｏｍｂｅを発現宿主とした、ヒト由来ＰＤＩ１（ｈＰＤＩ）の部分蛋白質の分泌されやすさを調べ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ1と分泌量を比較した。【０１２６】
（発現ベクターの構築）
まず、ｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ１のシグナルペプチド部分をコードする遺伝子とPvuIIの制限酵素認識部位を付加した遺伝子配列を挿入したＰＤＩ１のシグナルペプチド付加用ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩを作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIおよびPvuIIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３７）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１のシグナルペプチド部分をコードする遺伝子断片の５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIおよびPvuIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩフラグメント）を得た。
ＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩフラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩとした。【０１２７】
次いで、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩのマルチクローニングサイトに、ｈＰＤＩ（ａｂ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂ）、ｈＰＤＩ（ａｂｘ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）、ｈＰＤＩ（ａｂｂ’）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’）、ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）、またはｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）をコードする構造遺伝子を挿入した発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）を、それぞれ作製した。
具体的には、ｈＰＤＩをコードする遺伝子（配列番号３８）を鋳型とし、５’末端にシトシンおよびチミンを付加したフォワードプライマー（配列番号３９）および５’末端にKpnIの制限酵素認識部位を備える配列番号４０から配列番号４３までの各リバースプライマーを用いたＰＣＲによって、ｈＰＤＩの１８から２３６番目まで、３４９番目まで、３６４番目まで、および５０８番目までのアミノ酸それぞれをコードする各構造遺伝子の５’末端にシトシンおよびチミンを、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有する各ＰＣＲ産物（ｈＰＤＩ（ａｂ）フラグメント、ｈＰＤＩ（ａｂｂ'）フラグメント、ｈＰＤＩ（ａｂｂ'ｘ）フラグメント、およびｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）フラグメント）を得た。
また、ｈＰＤＩをコードする遺伝子を鋳型とし、配列番号３９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIの制限酵素認識部位とｈＰＤＩのｘドメインをコードする遺伝子を備えるリバースプライマー（配列番号４４）とを用いたＰＣＲによって、ｈＰＤＩの１８から２３６番目までのアミノ酸のＣ末端にｘドメインを配した蛋白質をコードする構造遺伝子の５’末端にシトシンおよびチミンを、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｈＰＤＩ（ａｂｘ）フラグメント）を得た。【０１２８】
前記の各フラグメント（ｈＰＤＩ（ａｂ）フラグメント、ｈＰＤＩ（ａｂｘ）フラグメント、ｈＰＤＩ（ａｂｂ'）フラグメント、ｈＰＤＩ（ａｂｂ'ｘ）フラグメント、およびｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘｃ）フラグメント）を制限酵素KpnIで消化し、またｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩを制限酵素PvuIIおよびKpnIで二重消化し、各フラグメントとｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ＰｖｕＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂ）、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’）、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）、およびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）とした。これらのプラスミドは、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ1のシグナルペプチドと各ｈＰＤI部分蛋白質との融合蛋白質をコードする構造遺伝子が構成されている。各融合蛋白質を分裂酵母で発現させると、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ1のシグナルペプチドは分泌過程で取り除かれて、ｈＰＤＩ部分蛋白質のみが培地中に分泌されるよう設計されている。【０１２９】
（形質転換体の作製）
作製した各発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂ）を用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂ）株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）を用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’）を用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’）株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）を用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）を用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）株とした。【０１３０】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体および試験例２で作製したＰＤＩ１（ａｂ）株、ＰＤＩ１（ａｂｘ）株、ＰＤＩ１（ａｂｂ’）株、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）株およびＰＤＩ１株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色により蛋白質バンドを可視化した。【０１３１】
ＣＢＢ染色像を図２２に示す。図２２中の「ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘａ’ｃ）」は、ＰＤＩ１株から得られたサンプルをアプライしたレーンである。また、図２２中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、ａｂやａｂｘの部分蛋白質どうしで比較すると、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ１もｈＰＤＩも分泌量に遜色ないが、ａｂｂ’やａｂｂ’ｘ、ａｂｂ’ｘａ’ｃどうしの比較では、ｈＰＤＩの方がＳ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ１よりも明らかに分泌量が多かった。また、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＰＤＩ1同様、ｈＰＤＩも部分蛋白質の方が分泌量が高くなり、ｈＰＤＩ（ａｂｘ）およびｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）は他の部分蛋白質よりも分泌量が多かった。【０１３２】
［試験例１２］
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｘ）やＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合と、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ1のシグナルペプチドとｈＰＤＩ（ａｂｘ）との融合蛋白質（ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ））やＳ．ｐｏｍｂｅ由来ＰＤＩ1のシグナルペプチドとｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）との融合蛋白質（ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ））を用いた場合とで、ｈＴＦの分泌生産量を比較した。【０１３３】
（発現ベクターの構築）
まず、ｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）をコードする構造遺伝子の終止コドンを削除してAflIIの制限酵素認識部位を付加した遺伝子配列を挿入した遺伝子融合用ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩを作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）を鋳型とし、配列番号９のフォワードプライマーおよび５’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号４５）とを用いたＰＣＲによって、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）の各融合蛋白質をコードする各遺伝子断片のうち終止コドンを削除し、５’末端にBspHIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIおよびAflIIの制限酵素認識部位を有する各ＰＣＲ産物（ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメントおよびＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメント）を得た。
ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメントおよびＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩフラグメントを制限酵素BspHIおよびKpnIで二重消化し、またｐＳＬ６を制限酵素AarIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩとした。【０１３４】
次いで、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、変異型ｈＴＦをコードする構造遺伝子を挿入することで、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）と変異型ｈＴＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ、同様にしてＫＲペプチドを介してＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）と変異型ｈＴＦを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦを、それぞれ作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１−ｈＴＦおよびｐＰＤＩ１−ＫＲ−ｈＴＦそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化して変異型ｈＴＦフラグメントおよびＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントを回収した。一方、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、変異型ｈＴＦフラグメントまたはＫＲ付き変異型ｈＴＦフラグメントとｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩまたはｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦとした。【０１３５】
（形質転換体の作製）
作製した各発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ株とした。【０１３６】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例３で作製したａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株、試験例６で作製したａｂｘ−ｈＴＦ株およびａｂｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例３と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、ａｂｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株のｈＴＦの分泌量を１とした場合の各形質転換体のｈＴＦの相対分泌量を算出した。【０１３７】
ＣＢＢ染色像を図２３に、各菌株のｈＴＦの相対分泌量の算出結果を図２４に示す。図２３中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）を用いたｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ株およびｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ｈＴＦ株のほうが、それぞれＰＤＩ１（ａｂｘ）を用いたａｂｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株およびａｂｘ−ｈＴＦ株よりも、ｈＴＦ分泌量が多く、ａｂｘ部分をＳ．ｐｏｍｂｅ由来のものからヒト由来のものに置換することで分泌生産効率が更に高まることがわかった。
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）を用いたｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ株およびｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ株では、それぞれＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いたａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ｈＴＦ株およびａｂｂ’ｘ−ｈＴＦ株よりも、ｈＴＦ分泌量が低下しており、特にｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ｈＴＦ株では蛋白質（Ｙ）と標的蛋白質（Ｚ）との分離が不充分であった。一方で、ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ｈＴＦ株では、蛋白質（Ｙ）と標的蛋白質（Ｚ）の融合蛋白質の分泌効率が高かった。
蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）のいずれの場合でも、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合よりも分泌生産効率が高まっていた。【０１３８】
［試験例１３］
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｘ）やＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合と、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合とで、ＥＧＦＰの分泌生産量を比較した。【０１３９】
（発現ベクターの構築）
ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰをコードする構造遺伝子を挿入することで、ＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）とＥＧＦＰの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＥＧＦＰおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰ、同様にしてＫＲペプチドを介してＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）とＥＧＦＰを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを、それぞれ作製した。
具体的には、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰおよびｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化してＥＧＦＰフラグメントおよびＫＲ付きＥＧＦＰフラグメントを回収した。一方、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、ＥＧＦＰフラグメントまたはＫＲ付きＥＧＦＰフラグメントとｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩまたはｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰとした。【０１４０】
（形質転換体の作製）
作製した各発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をａｂｘ−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をａｂｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ株とした。【０１４１】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例４で作製したａｂｂ’ｘ−ＥＧＦＰ株およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例３と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、ａｂｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株のＥＧＦＰの分泌量を１とした場合の各形質転換体のＥＧＦＰの相対分泌量を算出した。【０１４２】
ＣＢＢ染色像を図２５に、各菌株のＥＧＦＰの相対分泌量の算出結果を図２６に示す。図２５中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、切断部位（Ｗ）としてＫＲ配列を付与した場合、ａｂｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株とｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ株間およびａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＥＧＦＰ株とｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＥＧＦＰ株間でＥＧＦＰ分泌量に殆ど差が認められなかった。一方で、蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）のいずれの場合でも、Ｐ３分泌シグナルペプチドを用いた場合よりも分泌生産効率が高まっていた。
切断部位（Ｗ）を付与しない場合、ａｂｘ−ＥＧＦＰ株よりもｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＥＧＦＰ株で、ａｂｂ’ｘ−ＥＧＦＰ株よりもｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＥＧＦＰ株で、蛋白質（Ｙ）とＥＧＦＰの融合蛋白質の分泌量が明らかに向上しており、ａｂｘやａｂｂ’ｘ部分をＳ．ｐｏｍｂｅ由来のものからヒト由来のものに置換した蛋白質（Ｙ）の優位性が示された。【０１４３】
［試験例１４］
蛋白質（Ｙ）としてＰＤＩ１（ａｂｘ）やＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合と、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）を用いた場合とで、ＧＣＳＦの分泌生産量を比較した。【０１４４】
（発現ベクターの構築）
ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、ＧＣＳＦをコードする構造遺伝子を挿入することで、ＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）とＧＣＳＦの融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＧＣＳＦおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦ、同様にしてＫＲペプチドを介してＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）またはＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）とＧＣＳＦを結合させた融合蛋白質をコードする構造遺伝子を構成させた発現ベクターｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦを、それぞれ作製した。【０１４５】
具体的には、ＧＣＳＦをコードする遺伝子を鋳型とし、５’末端にAarIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号４６）および配列番号３６のリバースプライマーとを用いたＰＣＲによって、ＧＣＳＦ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にAarIの制限酵素認識部位を、３’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＧＣＳＦフラグメント）を得た。ＧＣＳＦフラグメントをAarIおよびKpnIで、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素AflIIおよびKpnIで二重消化し、ＧＣＳＦフラグメントと、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩまたはｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦとした。
また、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化してＫＲ付きＧＣＳＦフラグメントを回収した。一方、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素AflIIおよびSalIで二重消化し、ＫＲ付きＧＣＳＦフラグメントとｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩまたはｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＡｆｌＩＩをライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドそれぞれをｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦ、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦとした。【０１４６】
（形質転換体の作製）
作製した各発現ベクターを用いて、試験例１と同様にしてＡ８株を宿主として形質転換体を作製した。ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をａｂｘ−ＧＣＳＦ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をａｂｂ’ｘ−ＧＣＳＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＧＣＳＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦ株、ｐＰＤＩ１（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をａｂｘ−ＫＲ−ＧＣＳＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦ株、ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦを用いて得た形質転換体をｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＫＲ−ＧＣＳＦ株とした。【０１４７】
（蛋白質の分泌生産）
試験例１と同様にして、作製された形質転換体、試験例Ａで作製したａｂｂ’ｘ−ＫＲ−ＧＣＳＦ株をそれぞれ培養し、ＴＣＡ沈殿で沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、サンプルを調製した。該サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試験例３と同様にして、ＣＢＢ染色像を取得した後、各バンドを定量化し、ａｂｘ−ＫＲ−ＧＣＳＦ株のＧＣＳＦの分泌量を１とした場合の各形質転換体のＧＣＳＦの相対分泌量を算出した。【０１４８】
ＣＢＢ染色像を図２７に、各菌株のＥＧＦＰの相対分泌量の算出結果を図２８に示す。図２７中の「Ｍ」は図３と同様である。この結果、切断部位（Ｗ）としてＫＲ配列を付与した場合、蛋白質（Ｙ）がＰＤＩ１（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）のいずれの場合でも、各形質転換体のＧＣＳＦ分泌量に大きな差は認められなかった。一方で、切断部位（Ｗ）を付与しない場合、ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）−ＧＣＳＦ株において、蛋白質（Ｙ）とＧＣＳＦの融合蛋白質の分泌量が、他の形質転換体よりも明らかに高く、ＧＣＳＦ自体の分泌量も向上していた。この結果より、ＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｂ’ｘ）をＮ末端に有し、かつ切断部位（Ｗ）を付与しない場合、他の分泌様式を用いた場合よりもＧＣＳＦの分泌生産効率が向上することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明の発現ベクターおよび蛋白質の製造方法は、蛋白質を効率よく分泌生産できるため、特に、有用な蛋白質の大量発現のために好適に用いることができる。
なお、２０１２年１月２３日に出願された日本特許出願２０１２−０１０５６９号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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