(57)【要約】  本発明は、リガンド（例えば、パツリン）を高感度に検出できる核酸分子を提供することを目的とする。本発明はまた、リガンド（例えば、パツリン）を高感度に検出できる核酸分子のスクリーニング方法、および、リガンド（例えば、パツリン）を高感度に検出できる核酸分子の最適化に用いられる核酸分子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、リガンド（例えば、パツリン）を含む試料中からリガンドを効果的に除去する方法を提供することを目的とする。本発明によれば、リガンド（例えば、パツリン）を検出するＤＮＡアプタマーとＤＮＡザイムを有するループ構造の核酸分子において、ＤＮＡアプタマー領域とＤＮＡザイムとの間に介在する配列が工夫された核酸分子が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）。
【請求項２】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）。
【請求項３】
アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項４】
ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項５】
ジャンクション領域１およびジャンクション領域２が、それぞれ３塩基長である、請求項４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項６】
アプタマーマスク領域が、４または５塩基長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項７】
アプタマーマスク領域が、リガンド非存在下で、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’側末端または前記ＤＮＡアプタマー領域の５’側末端との間で、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する、請求項６に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項８】
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端またはＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項９】
ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、請求項８に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１０】
アプタマーマスク領域が４塩基長であるＤＮＡ分子であって、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、
リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される、
請求項６〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１１】
アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１２】
アプタマーマスク領域の一部の塩基とジャンクション領域２との間で形成される４個以上の水素結合が、２個の塩基対、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対、または、３個の塩基対により形成される、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１３】
ＤＮＡ分子がリガンド非存在下で二次構造を形成するときの自由エネルギー変化（ｄＧ）が、−１２〜−５（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１４】
ＤＮＡアプタマー領域が、パツリンアプタマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１５】
パツリンアプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１６】
パツリンアプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列（この塩基配列の末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１７】
エフェクター領域が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド依存的に活性化するシグナル発生領域である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物（ここで、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる）。
【請求項１８】
エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化して、リガンド非存在下の２倍以上の活性を発揮できる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１９】
エフェクター領域が、ＤＮＡザイムである、請求項１７または１８に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２０】
ＤＮＡザイムが、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムである、請求項１９に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２１】
塩基配列が、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４０または配列番号：４１の塩基配列である、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物を用いてリガンドを検出する方法であって、該ＤＮＡ構築物または核酸構築物とリガンドとの結合を、還元型ＡＢＴＳの酸化によって生じる吸光度の変化として検出する方法。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項２４】
ＤＮＡ構築物または核酸構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項２３に記載のセンサー素子。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項２６】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項２３若しくは２４に記載のセンサー素子、または、請求項２５に記載のマイクロアレイを用いたリガンドの検出方法。
【請求項２７】
リガンドを検出するＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（Ａ）ＤＮＡアプタマー領域と、リガンド結合依存的に活性化するエフェクター領域と、アプタマーマスク領域とジャンクション領域１およびジャンクション領域２とから形成され、ＤＮＡアプタマー領域とエフェクター領域に介在するモジュール領域とを含んでなり、かつ、リガンド非存在下でループ構造を形成するＤＮＡ分子の塩基配列を設計または改変して、リガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる、スクリーニング方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ分子または核酸分子によるリガンドの検出感度を最適化することに用いられる、請求項２７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ分子のＤＮＡアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域から選択される少なくとも１つの領域を選択してその塩基配列を設計または改変する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物となることを指標としてＤＮＡ分子候補群の塩基配列を得る、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
リガンドが、パツリンである、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２７〜３１のいずれか一項で定義された工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでなるスクリーニングを実施した後に、
下記工程：
（Ａ’）その直前のスクリーニングにより得られたＤＮＡ分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる少なくとも１回のスクリーニングをさらに実施する、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
パツリン結合特異性を示すＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子。
【請求項３４】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項３３に記載のＤＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３５】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列（この塩基配列の末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、請求項３３に記載のＤＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３６】
ＤＮＡアプタマー領域として請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子からなるパツリンアプタマー領域と、該アプタマー領域へのパツリンの結合により活性化するエフェクター領域とを含んでなる、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物。
【請求項３７】
パツリン結合特異性を示す、ＲＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子。
【請求項３８】
塩基配列が、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項３７に記載のＲＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３９】
配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列（この塩基配列の５’末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、請求項３８に記載のＲＮＡ分子または核酸分子。
【請求項４０】
パツリンＲＮＡアプタマー領域と自己切断型リボザイムとを含んでなるＲＮＡ構築物であって、パツリンＲＮＡアプタマー領域の塩基配列が、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子の塩基配列である、ＲＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物。
【請求項４１】
塩基配列が、配列番号：３０、配列番号：３１若しくは配列番号：３２の塩基配列である、請求項４０に記載のＲＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項４２】
請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子、または、  請求項４０若しくは４１に記載のＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子。
【請求項４３】
請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項４０若しくは４１に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を用いてパツリンを検出する方法。
【請求項４４】
請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、請求項４０若しくは４１に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物にパツリンを結合させることを含んでなる、試料中のパツリンを除去する方法。
【請求項４５】
請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、請求項４０若しくは４１に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を固定化したカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドを検出する核酸分子に関する。本発明はまた、そのような核酸分子のスクリーニング方法および核酸分子の感度の最適化方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
標的分子に対して特異的に結合する活性を有する分子として、抗体やアプタマーが知られている。抗体は簡便な方法により抗原特異的な抗体を得ることができる点で優れ、広く抗原の検出などに用いられている。一方、アプタマーは、設計は困難であるが、合成は比較的容易であり、完全に人工的な方法により得ることができる。アプタマーは、毒性を有する抗原や低抗原分子（例えば、低分子化合物）に対して結合する分子など抗体では作製困難な分子に対して特異性を有する分子を得ることができる点や、安価に製造し得る点、乾燥状態等で安定的に保存が可能である点などで、抗体に対して優位性を示す。【０００３】
アプタマーと標的分子との結合の検出は、特に標的分子の標識が困難な場合には、一般的には、アプタマーの構造変化を検出することにより達成される。例えば、アプタマーの構造変化を検出する方法としては、構造変化により引き起こされるアプタマーの自己切断を検出する方法が知られる。例えば、自己切断型ＲＮＡアプタマーでは、アプタマーが標的分子と結合すると自己切断活性が活性化されて分子が開裂し、この開裂したＲＮＡアプタマーの断片を検出することにより、アプタマーと標的分子との結合をモニターすることができる。このようにアプタマーでは、標的分子の検出は、標的分子への結合依存的なシグナルの発生（前述の場合は、自己切断活性によるＲＮＡ断片の生成）をモニターすることにより行われている。【０００４】
ＤＮＡとＲＮＡとを比較すると、ＲＮＡはより構造的に柔軟であることが知られ、生体内で発見された酵素活性を有する核酸はすべてがＲＮＡである。一方でＤＮＡは、構造的な柔軟性には欠けるものの化学的安定性に優れ、遺伝情報の保存などを担っている。そのため、アプタマーのほとんどは、柔軟な立体構造を形成する能力を有し、多彩な機能を発揮するＲＮＡ分子である。しかし、最近になってＤＮＡ分子を用いたアプタマーも報告されている（非特許文献１）。非特許文献１は、ヘアピンループ構造のＤＮＡアプタマーを開示しており、リガンドとしてＡＭＰが結合すると、分子全体の二次構造が変化し、該分子が有する酸化還元酵素活性が発現する。当該酵素活性を測定することでリガンドの検出が可能であるが、検出感度はそれほど高くない。【０００５】
高感度のアプタマーの取得は、通常は、分子進化法によりランダムに配列を改変して得られたアプタマー候補群から、感度を指標としてアプタマーをスクリーニングすることにより行われ（特許文献１、２および３）、一般的に、高感度化のためのアプタマーの設計は容易ではなく、設計のための指針やＤＮＡアプタマーが高感度を発揮するための条件等はほとんど知られていない。【０００６】
ところで、パツリン（patulin）は、ペニシリウム属（アオカビ類）Penicillium expansum、アスペルギルス属（コウジカビ類）によって作られるマイコトキシンの一種であり、腐敗したリンゴから検出されることで知られる。パツリンの毒性は、細胞膜に対する膜透過性を阻害することに起因する臓器出血性のほか、遺伝毒性を持つことが示され、また、動物実験では発癌性の可能性が示唆されている。そのため、リンゴ製品のパツリンの量は製品の品質の基準として用いられている。パツリンの検出や選択的な除去の方法は重要度が高く、パツリンに特異的に結合する物質が得られれば、果汁等のリンゴ製品の品質を簡便に検査すること、および製品からパツリンを効果的に除去することが可能になると期待される。【０００７】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）を用いて作製することができる（特許文献４）。ＳＥＬＥＸ法では、１０１４個程度の配列多様性を有するＲＮＡ、またはＤＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合する核酸分子を取得する。ＳＥＬＥＸ法で使用される核酸プールの核酸分子は、一般的に２０〜４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。ＳＥＬＥＸ法では、この核酸プールを標的物質と接触させて、標的物質に結合した核酸のみを回収する。回収した核酸がＲＮＡの場合はＲＴ−ＰＣＲで増幅するが、ＤＮＡの場合はそのままこれをＰＣＲの鋳型として用いて増幅する。増幅して得たＤＮＡから必要に応じてＲＮＡを転写し、あるいはＤＮＡをそのまま使用してさらに標的物質に特異的に結合する核酸分子を取得する。ＳＥＬＥＸ法では、通常、この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するアプタマーを取得する。【０００８】
一般的なＳＥＬＥＸ法では、アプタマーの標的物質は担体に固定化されており、標的物質への親和性を利用して標的物質への親和性を示す核酸を回収する。一方、Ｂｒｅａｋｅｒらは標的物質を担体に固定化することなくＳＥＬＥＸ法を行う手法を提案した（非特許文献２）。Ｂｒｅａｋｅｒらの方法は、具体的には、自己切断型リボザイムとランダム配列を連結させ、標的物質の存在下でのみ自己切断活性が発揮されるものを選別することにより、ランダム配列の中から標的物質と結合するＲＮＡを取得する方法である。【０００９】
さらに、マイクロアレイを用いてアプタマーをスクリーニングする手法も開発されている（非特許文献３）。マイクロアレイによるスクリーニングは、一度に大量の分子のスクリーニングが可能である点で極めて有益な手法であるが、主にターゲット分子がタンパク質のように蛍光標識可能な分子に限られていた。例えば、蛍光標識が難しい分子や、標識することで物性が大きく変化してしまう低分子に対しては、この手法を適用することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００３−５１２０５９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／８６７７２号
【特許文献３】国際公開第２０１３／５７２３号
【特許文献４】国際公開第１９９１／１９８１３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Teller C., Shimron S., Willner I., Aptamer-DNAzyme hairpins for amplified biosensing. Anal. Chem. (2009) 81:9114-9119
【非特許文献２】Nature structural biology 6, 1062-1071, 1999
【非特許文献３】Nucleic Acids Research, Vol. 37, No. 12 e87, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、リガンド（例えば、パツリン）を高感度に検出できる核酸分子を提供することを目的とする。本発明はまた、リガンド（例えば、パツリン）を高感度に検出できる核酸分子のスクリーニング方法、および、リガンド（例えば、パツリン）を高感度に検出できる核酸分子の最適化に用いられる核酸分子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、リガンド（例えば、パツリン）を含む試料中からリガンドを効果的に除去する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ＤＮＡアプタマー領域とＤＮＡザイム領域を有するループ構造を形成するＤＮＡ分子において、ＤＮＡアプタマー領域とＤＮＡザイム領域との間に配列を介在させた場合、リガンドに対する感度が高いＤＮＡ分子では、その配列が特定の規則を有することを見出した。本発明者らはまた、リガンドを高感度に検出するヘアピンループ構造のＤＮＡ分子は、電気化学的検出法によるマイクロアレイを用いることで、大量のＤＮＡ分子を迅速かつ簡便にスクリーニングできることを見出した。本発明者らはまた、低分子化合物であるパツリンをリガンドとして高感度に検出するＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を見出した。本発明はこのような知見に基づいてなされた発明である。【００１４】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）。
（２）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）。
（３）アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、上記（１）または（２）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。【００１５】
（４）ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（５）ジャンクション領域１およびジャンクション領域２が、それぞれ３塩基長である、上記（４）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（６）アプタマーマスク領域が、４または５塩基長である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（７）アプタマーマスク領域が、リガンド非存在下で、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’側末端または前記ＤＮＡアプタマー領域の５’側末端との間で、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する、上記（６）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。【００１６】
（８）リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端またはＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（９）ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、上記（８）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１０）アプタマーマスク領域が４塩基長であるＤＮＡ分子であって、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、
リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される、
上記（６）〜（９）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１１）アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。【００１７】
（１２）アプタマーマスク領域の一部の塩基とジャンクション領域２との間で形成される４個以上の水素結合が、２個の塩基対、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対、または、３個の塩基対により形成される、上記（１１）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１３）ＤＮＡ分子がリガンド非存在下で二次構造を形成するときの自由エネルギー変化（ｄＧ）が、−１２〜−５（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１４）ＤＮＡアプタマー領域が、パツリンアプタマーである、上記（１）〜（１３）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１５）パツリンアプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、上記（１４）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１６）パツリンアプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列（この塩基配列の末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、上記（１４）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。【００１８】
（１７）エフェクター領域が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド依存的に活性化するシグナル発生領域である、上記（１）〜（１６）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物（ここで、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる）。
（１８）エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化して、リガンド非存在下の２倍以上の活性を発揮できる、上記（１）〜（１７）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（１９）エフェクター領域が、ＤＮＡザイムである、上記（１７）または（１８）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（２０）ＤＮＡザイムが、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムである、上記（１９）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（２１）塩基配列が、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４０または配列番号：４１の塩基配列である、上記（２０）に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
（２２）上記（１９）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物を用いてリガンドを検出する方法であって、該ＤＮＡ構築物または核酸構築物とリガンドとの結合を、還元型ＡＢＴＳの酸化によって生じる吸光度の変化として検出する方法。
（２３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
（２４）ＤＮＡ構築物または核酸構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、上記（２３）に記載のセンサー素子。
（２５）上記（２３）または（２４）に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
（２６）ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、上記（２３）若しくは（２４）に記載のセンサー素子、または、上記（２５）に記載のマイクロアレイを用いたリガンドの検出方法。
（２７）リガンドを検出するＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（Ａ）ＤＮＡアプタマー領域と、リガンド結合依存的に活性化するエフェクター領域と、アプタマーマスク領域とジャンクション領域１およびジャンクション領域２とから形成され、ＤＮＡアプタマー領域とエフェクター領域に介在するモジュール領域とを含んでなり、かつ、リガンド非存在下でループ構造を形成するＤＮＡ分子の塩基配列を設計または改変して、リガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる、スクリーニング方法。
（２８）ＤＮＡ分子または核酸分子によるリガンドの検出感度を最適化することに用いられる、上記（２７）に記載のスクリーニング方法。
（２９）ＤＮＡ分子のＤＮＡアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域から選択される少なくとも１つの領域を選択してその塩基配列を設計または改変する、上記（２８）に記載の方法。
（３０）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物となることを指標としてＤＮＡ分子候補群の塩基配列を得る、上記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の方法。
（３１）リガンドが、パツリンである、上記（２７）〜（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）上記（２７）〜（３１）のいずれかで定義された工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでなるスクリーニングを実施した後に、
下記工程：
（Ａ’）その直前のスクリーニングにより得られたＤＮＡ分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる少なくとも１回のスクリーニングをさらに実施する、上記（２７）〜（３１）のいずれかに記載の方法。【００１９】
（３３）パツリン結合特異性を示す、ＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子。
（３４）配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、上記（３３）に記載のＤＮＡ分子または核酸分子。
（３５）配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列（この塩基配列の末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、上記（３３）に記載のＤＮＡ分子または核酸分子。
（３６）ＤＮＡアプタマー領域として上記（３３）〜（３５）のいずれかに記載のＤＮＡ分子からなるパツリンアプタマー領域と、該アプタマー領域へのパツリンの結合により活性化するエフェクター領域とを含んでなる、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物。
（３７）パツリン結合特異性を示す、ＲＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子。
（３８）塩基配列が、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、上記（３７）に記載のＲＮＡ分子または核酸分子。
（３９）配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列（この塩基配列の５’末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、上記（３８）に記載のＲＮＡ分子または核酸分子。
（４０）パツリンＲＮＡアプタマー領域と自己切断型リボザイムとを含んでなるＲＮＡ構築物であって、パツリンＲＮＡアプタマー領域の塩基配列が、上記（３７）〜（３９）のいずれかに記載のＲＮＡ分子の塩基配列である、ＲＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物。
（４１）塩基配列が、配列番号：３０、配列番号：３１若しくは配列番号：３２の塩基配列である、上記（４０）に記載のＲＮＡ構築物または核酸構築物。
（４２）上記（３７）〜（３９）のいずれかに記載のＲＮＡ分子、または、上記（４０）若しくは（４１）に記載のＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子。【００２０】
（４３）上記（３３）〜（３５）のいずれかに記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、上記（３７）〜（３９）のいずれかに記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または上記（４０）若しくは（４１）に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を用いてパツリンを検出する方法。
（４３）上記（３３）〜（３５）のいずれかに記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、上記（３７）〜（３９）のいずれかに記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または上記（４０）若しくは（４１）に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物にパツリンを結合させることを含んでなる、試料中のパツリンを除去する方法。
（４５）上記（３３）〜（３５）のいずれかに記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、上記（３７）〜（３９）のいずれかに記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または上記（４０）若しくは（４１）に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を固定化したカラム。【００２１】
本発明のＤＮＡ構築物は、電気化学的に簡便かつ迅速にリガンド（例えば、パツリン）を高感度で検出できる点で有利である。本発明のスクリーニング方法は、簡便に高感度のＤＮＡ構築物をスクリーニングできる点で有利である。また、本発明のスクリーニング方法は、高感度を示すＤＮＡ構築物の最適化に有用である。本発明の核酸分子および本発明の核酸構築物は、リガンド（例えば、パツリン）に特異的に結合する点で有利である。本発明の核酸分子および本発明の核酸構築物はまた、リガンド（例えば、パツリン）の検出または除去に用いることができる点で有利である。特に本発明のＤＮＡ構築物は、電気化学的に簡便かつ迅速にリガンド（例えば、パツリン）を検出できる点でさらに有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡ構築物がリガンド非存在下で形成する二次構造の一例の模式図である。図１で示されるＤＮＡ構築物は、エフェクター領域として酸化還元ＤＮＡザイムの配列を有し、ＤＮＡアプタマー領域を有するＤＮＡ構築物であり、ＤＮＡ構築物は一本鎖ＤＮＡであるが、水溶液中ではヘアピンループ構造の二次構造を形成している（すなわち、ヘアピンループ構造のＤＮＡ構築物である）。図１Ａは、本発明のＤＮＡ構築物（a）の一例を示し、図１Ｂは、本発明のＤＮＡ構築物（c）の一例を示し、図１Ｃは、本発明のＤＮＡ構築物（d）の一例を示し、図１Ｄは、本発明のＤＮＡ構築物（b）の一例を示す。なお、図中には、塩基に番号が振られているが、ジャンクション領域の長さが３塩基長で、かつアプタマーマスク領域の長さが４塩基長の場合の各塩基の位置を示す番号である。また、図１Ａ〜Ｄでは末端領域は便宜的に３塩基長で示している。図１Ｅ〜Ｈは、末端領域が４塩基長である場合のＤＮＡ構築物であり、それぞれ図１Ａ〜Ｄに対応する。図１Ｅ〜Ｈでは、ＤＮＡ構築物の末端領域にリンカーとしてｄＴが１４塩基長付加されている。
【図２】図２は、本発明のＤＮＡ構築物がリガンド非存在下で形成する二次構造の一例の模式図である。図２で示されるＤＮＡ構築物は、エフェクター領域として酸化還元ＤＮＡザイムの配列を有し、パツリンアプタマー領域を有するＤＮＡ構築物であり、ＤＮＡ構築物は一本鎖ＤＮＡであるが、水溶液中ではヘアピンループ構造の二次構造を形成している（すなわち、ヘアピンループ構造のＤＮＡ構築物である）。図２Ａは、本発明のＤＮＡ構築物（a）の一例を示し、図２Ｂは、本発明のＤＮＡ構築物（c）の一例を示し、図２Ｃは、本発明のＤＮＡ構築物（d）の一例を示し、図２Ｄは、本発明のＤＮＡ構築物（b）の一例を示す。なお、図中には、塩基に番号が振られているが、ジャンクション領域の長さが３塩基長で、かつアプタマーマスク領域の長さが４塩基長の場合の各塩基の位置を示す番号である。また、図２Ａ〜Ｄでは末端領域は便宜的に３塩基長で示している。図２Ｅ〜Ｈは、末端領域が４塩基長である場合のＤＮＡ構築物であり、それぞれ図２Ａ〜Ｄに対応する。図２Ｅ〜Ｈでは、ＤＮＡ構築物の末端領域にリンカーとしてｄＴが１４塩基長付加されている。
【図３】図３は、マイクロアレイの電極表面に担持させた酸化還元ＤＮＡザイムの活性が、電気化学的に検出することができることを示す図である。
【図４】図４は、電極表面上で本発明のＤＮＡ構築物を合成して電極表面に担持させた場合の、本発明のＤＮＡ構築物の状態を示す模式図である。図中、Ｌはリガンドを示す。
【図５】図５は、実施例Ａ２以降の実施例で用いた酸化還元型ＤＮＡザイムによる酸化還元反応の概略を示す図である。本発明のＤＮＡ構築物に含まれる酸化還元型ＤＮＡザイム部分は、図５左のような立体構造を形成し、ヘミンを伴ってＨ２Ｏ２を還元する。その際、ＡＢＴＳを添加すると、ＤＮＡザイムの働きによりＡＢＴＳが還元型から酸化型に変換され、４１４ｎｍにおいて吸光が生じる（図５右）。
【図６】図６は、電気化学的な検出方法の再現性の高さを示す図である。電気化学的な検出方法による測定シグナルの比（ＡＭＰ濃度５ｍＭ／ＡＭＰ濃度０ｍＭ）がグラフにプロットされている。図６は、横軸を１回目の実験とし、縦軸を２回目の実験とした。図中の黒色の点は、スクリーニングに供したＤＮＡ群が示したシグナル比を示し、図中の灰色の点は、報告されている配列番号２０のＤＮＡアプタマー構築物が示したシグナル比を示す。
【図７】図７は、ＤＮＡ構築物の各領域の長さやＤＮＡ構築物内に形成されるループの数、ＤＮＡ構築物が二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）が、ＤＮＡ構築物のセンサーとしての感度に及ぼす影響を調べた図である。
【図８】図８は、一次スクリーニングにより感度が高いとされた６つのＤＮＡ構築物（ＴＭＰ−１〜６）に関して、ＡＢＴＳの吸光測定によって追試を行った結果である。グラフ中の実線は、それぞれのＤＮＡ構築物の吸光度（λｍａｘ＝４１４ｎｍ）を示し、図８Ａ、ＥおよびＦ中の点線は、報告されている配列番号２０を有するＤＮＡ構築物で観察された吸光度を示す。
【図９】図９は、ＴＭＰ１〜６のそれぞれのＤＮＡ構築物が、リガンド非存在下で形成するステム部分におけるアプタマーマスク領域およびジャンクション領域の二次構造を示す図である。各図に記載されたｄＧは、ＤＮＡ構築物全体が二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）を示す。
【図１０】図１０は、二次スクリーニングでＴＭＰ−５よりも高いシグナル比を示した５５例のうち、アプタマーマスク領域が５’側からＴ（Ｘ）ｎＴＴ（ｎは、１または２）であったＤＮＡ構築物７例の吸光測定の結果を示す図である。各グラフの右隣には、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域の二次構造が示され、ｄＧは、ＤＮＡ構築物全体が二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）を示す。
【図１１】図１１は、二次スクリーニングでＴＭＰ−５よりも高いシグナル比を示した５５例のうちの残りの４８例の中で、良好なリガンド依存的なＤＮＡザイム活性を示した６例の吸光測定の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、次スクリーニングでＴＭＰ−５よりも高いシグナル比を示した５５例のうちの残りの４８例の中で、活性を示さなかった２４例の吸光測定の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ミスマッチ塩基対の種類が、ＤＮＡ構築物のリガンド依存的なＤＮＡザイム活性に及ぼす影響を示す図である。図１３では、グラフの縦軸は、ミスマッチによるｄＧへの影響（ｄｄＧ）を示す。図１３では、吸光測定の結果、リガンドに対する感度の高かったもの（高感度配列）と低かったもの（低感度配列）とでｄｄＧの値が比較されている。図１３ＡおよびＢは、アプタマーマスク領域が４塩基長である場合の結果であり、図１３ＣおよびＤは、アプタマーマスク領域が５塩基長である場合の結果である。図１３ＡおよびＣは、アプタマーマスク領域におけるミスマッチ塩基対によるｄｄＧを示し、図１３ＢおよびＤは、ジャンクション領域におけるミスマッチ塩基対によるｄｄＧを示す。
【図１４】図１４は、ＴＭＰ−５を改変して得られた配列（ＴＭＰ５−１〜５およびＴＧ１）の吸光測定の結果とリガンド結合後の二次構造との関連を示す図である。図１４Ａ〜Ｅは、高感度を示した配列の吸光測定の結果を示す。図１４ＦおよびＧは、高感度を示さなかったＤＮＡ構築物に関する図である。図１４Ａ〜Ｇの矢印は、リガンド結合後の二次構造内でどの箇所がどの箇所と塩基対を形成するかを示している。図１４ＦおよびＧ中のバルジループおよびインターナルループの用語は、リガンド結合後の二次構造においてそれぞれバルジループおよびインターナルループが形成されることを示す。図１４Ｈは、リガンド結合後のＤＮＡアプタマー領域が形成する立体構造を示す図である。図１４Ｈでは、リガンド結合後には、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２とがハイブリダイズし得ることが示されている。
【図１５】図１５Ａは、ＤＮＡアプタマー領域として、配列番号１８のアルギニンアプタマーを用いた場合のＤＮＡ分子の図である。図１５Ａの矢印は、リガンド結合後の二次構造内でどの箇所がどの箇所と塩基対を形成するかを示している。図１５Ｂは、対照として用いたＤＮＡ分子のアプタマーマスク領域およびジャンクション領域のリガンド非存在下での二次構造を示す図である。図１５Ｃは、ＴＭＰ−５Ａｒｇ（実線）と対照（点線）それぞれの分子のアルギニンに対するＡＢＴＳの酸化活性を測定した結果を示す図である。
【図１６】図１６は、ＴＭＰ−５分子のＤＮＡアプタマー領域を改変して作製したパツリンアプタマーの一例（図１６Ａ：配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ構築物）、並びに、電気化学的検出マイクロアレイを用いてスクリーニングを行った分子のうち、電気シグナル比が２倍以上となった分子に関する電気シグナル比を示す（図１６ＢおよびＣ）図である。
【図１７】図１７は、電気シグナル比が２倍以上となった配列として図１６Ｂに示された配列のうち、パツリン濃度５ｍＭでの電気シグナル比の平均が４以上となった６配列（候補群１−１〜１−６）、および、電気シグナル比が２倍以上となった配列として図１４Ｃに示された配列のうち、パツリン濃度１００μＭでの電気シグナル比の平均が３以上、または、パツリン濃度５ｍＭでの電気シグナル比の平均が２以上となった１２配列（候補群２−１〜２−１２）についての、比色試験結果を示す図である。
【図１８】図１８は、候補群２−７についての、比色試験結果が低温で改善されることを示す図である。
【図１９】図１９は、候補群１−５および１−６並びに候補群２−７のパツリンアプタマー領域の二次構造の推定結果を示す図である。
【図２０】図２０は、候補群２−７がパツリンに対して結合特異性を有することを示す図である。
【図２１】図２１は、パツリンＲＮＡアプタマーのスクリーニングに用いた自己切断型リボザイムの二次構造（図２１Ａ）およびスクリーニングにより得られた３種類のパツリンＲＮＡアプタマー領域の二次構造の推計結果（図２１Ｂ）を示す図である。図２１ＡのＮ３５は、Ｎ（それぞれのＮは、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣのいずれかから独立して選択される）が３５塩基並んだ配列であることを意味する。
【図２２】図２２は、自己切断型リボザイムにおける自己切断の検出結果を示す図である。図２２Ａは、スクリーニングにより得られた配列番号３０のＲＮＡ構築物および自己切断によるその断片の８Ｍ尿素を用いた変性ＰＡＧＥによる電気泳動結果を示し、図２２Ｂは、スクリーニングにより得られた３種類のＲＮＡ構築物の自己切断活性（相対値）を示す。すなわち、図２２Ｂでは、パツリン非存在下で切断されたＲＮＡ分子の量を１として、パツリン存在下でのＲＮＡ分子の切断量が相対的に示されている。
【図２３】図２３は、配列番号３０の塩基配列を有するＲＮＡ構築物のパツリンの検出結果を示す図である。図２３では、パツリン非存在下で切断されたＲＮＡ分子の量を１として、パツリン存在下でのＲＮＡ分子の切断量が相対的に示されている。
【図２４】図２４は、配列番号３０の塩基配列を有するＲＮＡ構築物がパツリンに対して結合特異性を有することを示す図である。
【図２５】図２５は、配列番号３１および３２の塩基配列を有するＲＮＡ構築物の、パツリンアプタマー部分の５’末端または３’末端の４塩基を欠失させた場合の自己切断活性の変化を示す図である。切断活性の相対強度（縦軸）は、パツリン添加後の自己切断活性とパツリン添加前の自己切断活性の比を示す。
【図２６】図２６は、パツリンアプタマー領域を有する候補群２−７（ＳＣ−７）のＤＮＡ構築物の改変体（ＳＣ−７−ＣＣＣＡ）によるパツリンの検出結果を示す図である。
【図２７】図２７は、ＴＭＰ−５（配列番号２）の３’末端にＡを付加したＴＭＰ−５−ＣＣＣＡにおけるＡＭＰの検出の結果を示す図である。
【図２８】図２８は、ＳＣ−７−ＣＣＣＡを用いてりんごジュース中のパツリンを検出した結果を示す図である。
【図２９】図２９は、ＳＣ−７−ＣＣＣＡ−ＴＭＰ−７によるパツリンの検出の結果（図２９左）とＴＭＰ−７領域の二次構造（図２９右）を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００２３】
本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの天然の核酸、並びに７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、２−ニトロー４−プロピニルピロール（Ｐｘ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）などの人工核酸などの核酸模倣物を意味する。また、本明細書において、「核酸分子」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、並びに７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、２−ニトロー４−プロピニルピロール（Ｐｘ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）などの核酸模倣物からなる群から選択されるいずれか１つからなる分子、または前記核酸および核酸模倣物のハイブリッドからなる分子を意味する。ここで、ＰＮＡとは、ＤＮＡやＲＮＡの主鎖を構成する糖の代わりにＮ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合した骨格を有する核酸をいい、ＬＮＡとは、主鎖を構成するリボ核酸の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋した環状構造を有する核酸をいう。これらのＰＮＡやＬＮＡからなる核酸分子は、核酸の主鎖骨格が異なるのみであり、塩基部分は、ＤＮＡやＲＮＡと同等の塩基を有するものとすることができ、ＤＮＡまたはＲＮＡと同等の塩基を有するＰＮＡやＬＮＡにすることより、塩基対形成に係る塩基部分の性質を保持させたまま核酸分子としての安定性を向上させることができる。ＤＮＡと同等の塩基を有するＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡとは、ＤＮＡが有する塩基がＡ、Ｔ、ＧまたはＣである場合には、ＲＮＡの場合にはそれぞれ、塩基としてＡ、Ｕ、ＧまたはＣを有するＲＮＡであることを意味し、ＰＮＡおよびＬＮＡの場合にはそれぞれ、塩基としてＡ、Ｔ（またはＵ）、ＧまたはＣを有するＰＮＡおよびＬＮＡであることを意味する。また、ＲＮＡと同等の塩基を有するＤＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡとは、ＲＮＡが有する塩基がＡ、Ｕ、ＧまたはＣである場合には、ＤＮＡの場合にはそれぞれ、塩基としてＡ、Ｔ、ＧまたはＣを有するＤＮＡであることを意味し、ＰＮＡおよびＬＮＡの場合にはそれぞれ、塩基としてＡ、Ｔ（またはＵ）、ＧまたはＣを有するＰＮＡおよびＬＮＡであることを意味する。核酸分子または核酸構築物中の塩基は、修飾されていてもされていなくてもよい。修飾塩基としては、例えば、２−アミノプリンおよびフルオレセインなどの蛍光分子などの分子標識による修飾塩基などが知られており、当業者であれば、核酸分子や核酸構築物に適宜様々な修飾を施すことができる。
【００２４】
本明細書において、「ＤＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」は、好ましくは、後述するパツリンに結合特異性を示すＤＮＡ分子の一部、例えば、配列の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、若しくは３％以下の塩基、または１若しくは２塩基が、該一部と同等の塩基配列を有するＤＮＡ以外の核酸からなり、かつ、本発明のＤＮＡ分子と同等の機能を有するハイブリッド型の核酸分子である。また、本明細書において、「ＲＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」は、好ましくは、後述するパツリンに結合特異性を示すＲＮＡ分子の一部、例えば、配列の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、若しくは３％以下の塩基、または１若しくは２塩基が、該一部と同等の塩基配列を有するＲＮＡ以外の核酸からなり、かつ、本発明のＲＮＡ分子と同等の機能を有するハイブリッド型の核酸分子である。従って、本明細書において、「ＤＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」は、上記のように本発明のＤＮＡ分子と同等の塩基配列を有し、かつＤＮＡとＤＮＡ以外の核酸（例えば、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡ）とからなる。また、「ＲＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」は、上記のように本発明のＲＮＡ分子と同等の塩基配列を有し、かつＲＮＡとＲＮＡ以外の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡ）とからなる。なお、「ＤＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」が該ＤＮＡ分子と同等の機能を有するか否かは、例えば、後述する表面プラズモン共鳴による分子間結合の検出により評価することができる。また、「ＲＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」が該ＲＮＡ分子と同等の機能を有するか否かは、例えば、後述する表面プラズモン共鳴による分子間結合の検出により評価することができる。
【００２５】
また、本明細書において、「ＤＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」は、後述するＤＮＡ構築物の一部、例えば、配列の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、若しくは３％以下の塩基、または１若しくは２塩基が、該一部と同等の塩基配列を有するＤＮＡ以外の核酸からなるハイブリッド型の核酸構築物である。また、本明細書において、「ＲＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」は、後述するＲＮＡ構築物の一部、例えば、配列の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、若しくは３％以下の塩基、または１若しくは２塩基が、該一部と同等の塩基配列を有するＲＮＡ以外の核酸からなるハイブリッド型の核酸構築物である。従って、本明細書において、「ＤＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」は、上記のように本発明のＤＮＡ構築物と同等の塩基配列を有し、ＤＮＡとＤＮＡ以外の核酸とからなり、かつ、本発明のＤＮＡ構築物と同等の機能を有する。また、「ＲＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」は、上記のように、本発明のＲＮＡ構築物と同等の塩基配列を有し、ＲＮＡとＲＮＡ以外の核酸とからなり、かつ、本発明のＲＮＡ構築物と同等の機能を有する。特に、後述する本発明のＤＮＡ構築物のエフェクター領域がリガンド依存的に他の核酸分子とハイブリダイズする場合には、エフェクター領域のＤＮＡをＰＮＡまたはＬＮＡに置き換えることにより、エフェクター領域が他の核酸分子とハイブリダイズする際の特異性を向上させることができる。また、後述する本発明のセンサー素子に担持するＤＮＡ分子のリンカー部分をＰＮＡまたはＬＮＡにより置き換えることができ、それにより、核酸分子の化学的安定性を向上させることができる。なお、「ＤＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」が該ＤＮＡ構築物と同等の機能を有するか否かは後述するリガンド依存的なエフェクター領域の活性化を指標にして評価することができ、例えば、実施例Ａ３に記載された電気化学的検出法やＡＢＴＳを用いた比色試験の手順に従って評価することができる。また、「ＲＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」が該ＲＮＡ構築物と同等の機能を有するか否かは、例えば、リガンド依存的な自己切断活性を指標として評価することができ、例えば、実施例Ｃ１に記載された手順に従って評価することができる。
【００２６】
上記「ＤＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」、「ＲＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」、「ＤＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」および「ＲＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」には、これらの核酸分子および核酸構築物の機能が維持されることを条件に、１〜１０塩基、好ましくは、１、２または３塩基の人工核酸（例えば、ＤｓおよびＰｘ）が挿入または付加されていてもよい。また、上記「ＤＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」、「ＲＮＡ分子と同等の塩基配列を有する核酸分子」、「ＤＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」および「ＲＮＡ構築物と同等の塩基配列を有する核酸構築物」では、これらの核酸分子および核酸構築物の機能が維持されることを条件に、ＤｓおよびＰｘのような、互いと人工塩基対を形成する化合物を核酸分子中に導入することもでき、また、核酸分子または核酸構築物中の塩基対を上記Ｄｓ−Ｐｘの人工塩基対で代替することもできる。
【００２７】
本明細書において、「結合性」とは、リガンドに結合する性質を有することを意味し、「結合特異性を示す」とは、リガンドに特異的に結合する性質を有することを意味する。従って、例えば、「パツリン結合性」とは、パツリンに結合する性質を有することを意味し、「パツリン結合特異性」とは、パツリンに特異的に結合する性質を有することを意味する。
【００２８】
本明細書では、「リガンド」としては、以下に限られないが、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、パツリンおよびアルギニンなどが挙げられ、好ましくはパツリンである。
【００２９】
パツリンは、下記式：
【化１】
2013161964.tif 000002
により表される化学構造を有する化合物である。パツリンは、ペニシリウム属やアスペルギルス属などのカビから分泌されるカビ毒（マイコトキシン）の一種であり、一般的に腐敗したリンゴ、ブドウ、桃などから検出されることで知られている。
【００３０】
本明細書では、「アプタマー」とは、リガンドに結合特異性を示す核酸分子または核酸分子の一部を意味し、リガンドに結合特異性を示すＤＮＡ（またはＲＮＡ）を「ＤＮＡアプタマー」（または「ＲＮＡアプタマー」）ということがある。特にリガンドがパツリンである場合には、「アプタマー」を、「パツリンアプタマー」、特にアプタマーがＤＮＡ（またはＲＮＡ）である場合には、「パツリンＤＮＡアプタマー」（または「パツリンＲＮＡアプタマー」）ということがある。
【００３１】
塩基配列の同一性の数値は、周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用してデフォルトのパラメータを用いて算出することができる。
【００３２】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドが標的となるポリヌクレオチドと相補的なそれぞれの塩基同士の水素結合により二本鎖を形成することをいう。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、例えば、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中での洗浄条件が挙げられる。
【００３３】
以下、図１および２により本発明のＤＮＡ構築物について説明する。
【００３４】
本発明のＤＮＡ構築物は、パツリンアプタマー領域とエフェクター領域とを含んでなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、具体的には、
(i) エフェクター領域、
(ii) ジャンクション領域１、
(iii) アプタマーマスク領域、
(iv) ＤＮＡアプタマー領域、
(v) ジャンクション領域２および
(vi) 末端領域
から構成されるＤＮＡ構築物（以下、本発明のＤＮＡ構築物という）とすることができる。このようなＤＮＡ構築物は、エフェクター領域を介して、リガンドを検出することに用いることができる。従って、本発明では、リガンドの検出に用いるＤＮＡ構築物、すなわち、ＤＮＡセンサー分子が提供される。
【００３５】
以下、図１および２により本発明のＤＮＡ構築物についてさらに詳細に説明する。
【００３６】
本発明のＤＮＡ構築物では、エフェクター領域は、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では、ＤＮＡ分子内の末端領域によりマスキングされて不活性化されているが、ＤＮＡアプタマー領域にそのリガンドが結合すると、マスキングがはずれて活性化する。すなわち、本発明のＤＮＡ分子は、リガンドを検出し、リガンドとの結合依存的にエフェクター領域が活性化するＤＮＡ構築物である。エフェクター領域が活性化すると、例えば、酵素活性が活性化され、あるいは、他の核酸分子とハイブリダイズ可能となって、リガンドの検出やリガンド依存的な細胞機能制御が可能となる。すなわち、本発明のＤＮＡ構築物は、リガンドの検出やリガンド依存的な細胞機能制御を意図したＤＮＡ構築物である。本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡから構成されるため、化学的安定性がＲＮＡやタンパク質よりも高く、また、合成、取扱いおよび保存が容易である。本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡアプタマー領域による少なくとも１つのループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、好ましくは、１つのループ構造を形成するＤＮＡ構築物、すなわち、ヘアピンループ構造のＤＮＡ構築物である。
【００３７】
本発明のＤＮＡ構築物は、(i)〜(vi)が、好ましくは、５’末端から、上記の順番で連結してなるＤＮＡ構築物（以下、「ＤＮＡ構築物(a)」という。図１Ａ、１Ｅ、２Ａおよび２Ｅ参照。）が好ましいが、不活性化されたエフェクター領域がリガンド結合依存的に活性化する限りはこれに限定されるものではない。
例えば、本発明のＤＮＡ構築物は、５’末端から、下記の順番：
(vi) 末端領域、
(v) ジャンクション領域２、
(iv) ＤＮＡアプタマー領域、
(iii) アプタマーマスク領域、
(ii) ジャンクション領域１、および
(i) エフェクター領域
で連結してなるＤＮＡ構築物（以下、「ＤＮＡ構築物(b)」という。図１Ｄ、１Ｈ、２Ｄおよび２Ｈ参照。）であってもよい。
また、本発明のＤＮＡ構築物は上記のＤＮＡ構築物（a）および（b）において、(i)と(vi)とが入れ替わったＤＮＡ構築物、すなわち、５’末端から、
(vi) 末端領域、
(ii) ジャンクション領域１、
(iii) アプタマーマスク領域、
(iv) ＤＮＡアプタマー領域、
(v) ジャンクション領域２、および
(i) エフェクター領域
の順に連結してなるＤＮＡ構築物（以下、「ＤＮＡ構築物（c）」という。図１Ｂ、１Ｆ、２Ｂおよび２Ｆ参照。）、または、５’末端から、
(i) エフェクター領域、
(v) ジャンクション領域２、
(iv) ＤＮＡアプタマー領域、
(iii) アプタマーマスク領域、
(ii) ジャンクション領域１、および
(vi) 末端領域
の順に連結してなるＤＮＡ構築物（以下、「ＤＮＡ構築物（d）」という。図１Ｃ、１Ｇ、２Ｃおよび２Ｇ参照。）であってもよい。本発明のＤＮＡ構築物は、上記ＤＮＡ構築物（a）、(b)、(c)および（d）のいずれかのＤＮＡ構築物であってもよく、好ましくは、ＤＮＡ構築物（a）またはＤＮＡ構築物（b）であり、最も好ましくは、ＤＮＡ構築物（a）である。
【００３８】
すなわち、本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であって、
ＤＮＡアプタマーの３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマーの５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして（すなわち、ＤＮＡ構築物（a）または（c）に対応）、ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成するか、または、ＤＮＡアプタマーの５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマーの３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして（すなわち、ＤＮＡ構築物（b）または（d）に対応）、ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
ＤＮＡアプタマーの３’側に隣接する２〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成（ＤＮＡアプタマーの５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマーの３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズする場合には、ＤＮＡアプタマーの５’側に隣接する２〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成）し、
エフェクター領域が、ジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、ジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し（ＤＮＡアプタマーの５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマーの３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズする場合には、エフェクター領域が、ジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）、かつ、エフェクター領域の少なくとも一部がリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、
ＤＮＡ構築物ということができる。
【００３９】
本明細書では、「エフェクター領域」とは、それ自体が酵素活性を有するシグナル発生領域であるか、または、他の核酸分子とハイブリダイズ可能な配列である。本発明のエフェクター領域は、ＤＮＡアプタマー領域がリガンドと結合していないときには、ＤＮＡ構築物の末端領域でマスキングされて不活性化されているが、リガンドと結合すると遊離状態となって（以下、「エフェクター領域の活性化」という）、シグナル発生領域が有する酵素活性を活性化させるか、他の核酸分子とハイブリダイズ可能となる。本発明では、エフェクター領域の活性化をモニターすることにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる。
【００４０】
本発明の一つの態様では、エフェクター領域がシグナル発生領域である。この態様では、ＤＮＡ構築物のシグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる。
【００４１】
本明細書では、「シグナル発生領域」とは、それ自体が酵素活性を有するＤＮＡからなる領域である。シグナル発生領域としては、ＤＮＡザイムを用いることができ、好ましくは、酸化還元型ＤＮＡザイム、より好ましくは、配列番号１６の配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムを用いることができる。酸化還元型ＤＮＡザイムの活性は、電気化学的に検出することが可能である。配列番号１６の配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムを用いる際には、特に限定されないが、好ましくは、基質として２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を添加することができる。ＡＢＴＳを基質として用いる利点は、容易にＤＮＡザイムの活性を測定することができる点であり、すなわち、ＡＢＴＳを基質として用いると、酸化還元型ＤＮＡザイムにより生成される酸化型ＡＢＴＳの吸光度（λｍａｘ＝４１４ｎｍ）を測定することにより簡便にＤＮＡザイムの活性を測定することができる。電気化学的な測定の際には、必須ではないが、ＡＢＴＳを基質として添加することにより酸化還元反応が促進して電気化学的な検出感度の向上が期待できる上に、比色試験（吸光測定）結果と一貫した結果が得られ易い点で有利である。本発明では、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、ＤＮＡ構築物へのリガンドの結合を検出し、あるいは、リガンドを定量することができる。リガンドの定量は、検量線を用いた方法など当業者に周知の方法を用いて行うことができる。
【００４２】
本発明の一つの態様では、エフェクター領域が他の核酸分子とハイブリダイズする本発明のＤＮＡ構築物が提供される。この態様では、ＤＮＡ構築物への該他の核酸分子のハイブリダイゼーション量を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができ、あるいは、生体内の核酸分子とハイブリダイズすることにより、該生体内の核酸分子の機能を調節することができる。
【００４３】
本発明のエフェクター領域がハイブリダイズする他の核酸分子は、酵素若しくは標識を結合させた核酸分子、または生体内の核酸分子とすることができる。従って、本発明のエフェクター領域は、これらの核酸分子にハイブリダイズ可能な配列、好ましくは、これらの核酸分子と相補的な配列を有するＤＮＡとすることができる。
【００４４】
本発明のエフェクター領域がハイブリダイズする他の核酸分子に結合させることができる酵素や標識としては、特に限定されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）若しくはアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）などの酵素、または、蛍光若しくはＲＩなどの標識を挙げることができる。本発明のＤＮＡ構築物のエフェクター領域の活性化は、ＨＲＰ若しくはＡＰなどの酵素活性または蛍光若しくはラジオアイソトープ（ＲＩ）などの標識を測定することにより、ハイブリダイゼーションする核酸分子の量としてモニタリングすることができ、これにより、ＤＮＡ構築物へのリガンドの結合を検出し、あるいは、リガンドを定量することができる。また、本発明のエフェクター領域がハイブリダイズする他の核酸分子には、金ナノ粒子を結合させてもよい。金ナノ粒子は、凝集すると吸光スペクトルが変化する。例えば、本発明のＤＮＡ構築物にも金粒子を結合させ、両者がハイブリダイズして金粒子間の距離が短くなると、分子の吸光スペクトルが低波長側になる性質を利用すれば、本発明のＤＮＡ構築物とエフェクター領域がハイブリダイズする他の核酸分子との相互作用が確認できる。金ナノ粒子はチオールを介して本発明のＤＮＡ構築物に結合させることができる。
【００４５】
本発明のエフェクター領域がハイブリダイズする生体内の核酸分子としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡやゲノムＤＮＡが挙げられる。本発明の一つの態様では、本発明のＤＮＡ構築物のエフェクター領域は、特定のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な配列からなるＤＮＡであり、エフェクター領域の活性化に伴い、該ｍＲＮＡにハイブリダイズし、該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害する。そのような特定のｍＲＮＡとしては、例えば、癌細胞で過剰に発現しているマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などのｍＲＮＡ分子が挙げられ、そのいくつかは公知である（Liotta L.A., Tryggvason K., Garbisa S., Hart I., Foltz C.M., Shafie S., Metastatic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collagen. (1980) Nature, 284:67-68）。本発明の他の態様では、本発明のＤＮＡ構築物のエフェクター領域は、ゲノムのテロメア領域にハイブリダイズ可能な配列からなるＤＮＡであることができ、この場合、エフェクター領域の活性化に伴い、テロメア領域と一緒になってＧグアドロデュプレックス構造を形成することにより、テロメラーゼによるテロメアの伸長を阻害する。Deng M., Zhang D., Zhou Y., Zhou X., Highly effective colorimetric and visual detection of nucleic acids using an asymmetrically split peroxidase DNAzyme. (2008) J. Am. Chem. Soc., 130 (39):13095-102には、異なるＤＮＡ分子間で、Ｇクアドロデュプレックス構造を形成することが記載されている。あるいは、本発明のＤＮＡ構築物のエフェクター領域は、ゲノムのテロメア領域にハイブリダイズ可能な配列からなるＤＮＡであることができ、この場合、エフェクター領域の活性化に伴い、Ｇグアドロデュプレックス構造を安定化することによりテロメラーゼによるテロメアの伸長を阻害する。Ｇクワドロデュプレックス構造の安定化と
癌治療との関係が、例えば、Balasubramanian S., Hurley L.H., Neidle S., Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? (2011) Nat. Rev. Drug. Discov. 10 (4):261-75に記載されている。エフェクター領域が活性化した際にのみ他の核酸分子とハイブリダイゼーションが生ずるようなＤＮＡ配列を選択する方法やそのハイブリダイゼーションの条件（塩強度、界面活性剤の濃度、温度など）を調整する方法は、当業者に周知である。
【００４６】
本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡアプタマー領域にリガンドが結合するとエフェクター領域をリガンド依存的に活性化させて、リガンド非存在下と比較して、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上の活性を発揮できる。ここで、エフェクター領域の活性とは、エフェクター領域がシグナル発生領域である場合には、シグナル発生領域の酵素活性であり、エフェクター領域が他の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡである場合には、ハイブリダイゼーションする核酸分子の量である。例えば、本発明のＤＮＡ構築物は、リガンド濃度０ｍＭの際のエフェクター領域の活性と比較して、リガンド濃度５ｍＭの際のエフェクター領域の活性は、好ましくは２倍以上であり、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは５倍以上である。また、活性化の程度は、例えば、シグナル発生領域が、酸化還元型ＤＮＡザイムである場合には、本発明のセンサー素子またはマイクロアレイを用いて、酸化還元型ＤＮＡザイムにより生じる酸化還元電流を測定し、測定値をリガンド存在下と非存在下とで比較すればよい。具体的には、例えば、エフェクター領域として酸化還元型ＤＮＡザイムを有する本発明のＤＮＡ構築物を担持した本発明のセンサー素子またはマイクロアレイを用いて、その酸化還元型ＤＮＡザイムにより生じる酸化還元電流を測定し、測定値をリガンド存在下と非存在下とで比較し、リガンド濃度５ｍＭの電気シグナルが０ｍＭの電気シグナルの好ましくは２倍以上であり、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは５倍以上である。ハイブリダイゼーションする核酸分子の量は、酵素活性、蛍光またはＲＩを用いて当業者に周知の方法により測定することができる。
【００４７】
本発明のＤＮＡ構築物の活性は、好ましくは、所望のリガンド濃度領域において上昇する。すなわち、本発明のＤＮＡ構築物は、所望のリガンド濃度領域において、その濃度領域の最高濃度のリガンドを添加した際に、最低濃度と比較して、エフェクター領域が、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは５倍以上の活性を発揮できる。すなわち、所望のリガンド濃度領域における最高濃度のリガンドを添加した際に、エフェクター領域による酵素活性またはハイブリダイゼーション量が、最低濃度と比較して、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは５倍以上となる。例えば、エフェクター領域として酸化還元型ＤＮＡザイムを有する本発明のＤＮＡ構築物を担持した本発明のセンサー素子またはマイクロアレイを用いて、その酸化還元型ＤＮＡザイムにより生じる酸化還元電流を測定し、測定値をリガンド存在下と非存在下とで比較し、その濃度領域の最高濃度のリガンドを添加した際に、電気シグナルが最低濃度と比較して、好ましくは２倍以上であり、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは５倍以上である。
【００４８】
本明細書では、「ＤＮＡアプタマー領域」とは、リガンドと結合する能力を有し、リガンドと結合することにより、その二次構造に変化を引き起こすＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー）から構成される領域である。このようなＤＮＡアプタマー領域として用いられるＤＮＡとしては、パツリンアプタマー、ＡＭＰアプタマーおよびアルギニンアプタマーなどが挙げられる。ＡＭＰアプタマーは、好ましくは、配列番号１７の配列を有するＡＭＰアプタマーである。ＡＭＰアプタマーの場合は、アデノシンやアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）もリガンドとなり得る。また、アルギニンアプタマーは、好ましくは、配列番号１８のアルギニンアプタマーである。
【００４９】
また、ＤＮＡアプタマー領域として用いられるパツリンアプタマーは、例えば、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有するＤＮＡ分子、あるいは、これらの塩基配列と相同な配列を有するＤＮＡ分子とすることができる。この場合、本発明のＤＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長〜３５ヌクレオチド長とすることができ、好ましくは３０ヌクレオチド長とすることができる。
【００５０】
例えば、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と相同な配列を有するＤＮＡ分子としては、配列番号：２４、配列番号：２５、若しくは配列番号：２６の塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を有するＤＮＡ分子、または、配列番号：２４、配列番号：２５、若しくは配列番号：２６の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡ分子（このＤＮＡ分子は少なくとも２５塩基、少なくとも２６塩基、少なくとも２７塩基、少なくとも２８塩基、少なくとも２９塩基または少なくとも３０塩基からなり、全長は３０塩基、３１塩基、３２塩基または３５塩基とすることができる。）が挙げられる。配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と相同な配列を有するＤＮＡ分子としてはまた、好ましくは配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有するＤＮＡ分子に対して、１塩基〜５塩基、より好ましくは１塩基〜４塩基、さらに好ましくは１塩基〜３塩基、さらにより好ましくは１塩基の置換、挿入または欠失がなされた塩基配列を有するＤＮＡ分子とすることができる。本発明のＤＮＡ分子は、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有するＤＮＡ分子に対して、特に限定されないが、１塩基〜５塩基、好ましくは１塩基〜４塩基、より好ましくは１塩基〜３塩基、さらに好ましくは１塩基の欠失がなされた塩基配列を有するＤＮＡ分子とすることができる。塩基の欠失は、例えば、配列の末端（５’末端または３’末端）において行われ得る。
【００５１】
本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡアプタマー領域の二次構造の変化を通じて、リガンド非存在下で少なくともその一部の構築物が、マスキングされているエフェクター領域を活性化させる。ＤＮＡアプタマー領域は、直列的に連結する少なくとも１以上のＤＮＡアプタマーから構成され、好ましくは、２〜３個のＤＮＡアプタマーから構成され、最も好ましくは１つのＤＮＡアプタマーから構成される。ＤＮＡアプタマー領域が、複数のＤＮＡアプタマーから構成される場合には、各ＤＮＡアプタマーが互いに直接連結していてもよいし、各ＤＮＡアプタマーの間にリンカー配列（特に限定されないが、例えば、１〜１０塩基長程度）を介して連結していてもよい。また、個々のＤＮＡアプタマーから構成されるＤＮＡアプタマー領域は、リガンド非存在下で１以上のループ構造を形成するＤＮＡアプタマー領域であり、好ましくは、１〜３個のループ構造を形成するＤＮＡアプタマー領域であり、より好ましくは、１個のループ構造を形成するＤＮＡアプタマー領域である。具体例により説明すると、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡアプタマー領域が１つのＤＮＡアプタマーから構成される場合であって、１つのＤＮＡアプタマーが、リガンド非存在下で２つ以上のループ構造を形成する場合（すなわち、クローバー様構造のＤＮＡアプタマー領域を形成する場合）には、本発明のＤＮＡ構築物は、リガンド非存在下で２つ以上のループ構造を形成するＤＮＡ構築物となり得、１つのみループ構造を形成する場合（すなわち、ループ構造のＤＮＡアプタマー領域を形成する場合）には、リガンド非存在下でヘアピンループ構造を形成するＤＮＡ構築物（すなわち、ヘアピンループ構造のＤＮＡ構築物）となる。また、別の例では、ＤＮＡアプタマー領域が２つ以上のＤＮＡアプタマーから構成される場合には、本発明のＤＮＡ構築物は、リガンド非存在下で２つ以上のループ構造を形成するＤＮＡ構築物となり得る。従って、本発明のＤＮＡ構築物は、リガンド非存在下で少なくとも１つのループ構造を形成するＤＮＡ構築物である。
【００５２】
ある好ましい態様では、本発明のＤＮＡ構築物は、ループ構造を１つのみ形成するＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなる、リガンド非存在下で１つのループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、すなわち、ある好ましい態様では、本発明のＤＮＡ構築物は、ループ構造のＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなる、ヘアピンループ構造のＤＮＡ構築物である。
【００５３】
本明細書では、「アプタマーマスク領域」とは、リガンド非存在時にＤＮＡアプタマー領域の一部をマスキングしている領域である。ＤＮＡアプタマー領域にリガンドが結合すると、このマスキングは解消され、エフェクター領域を活性化させる。アプタマーマスク領域の長さは、３〜５塩基長であり、好ましくは４または５塩基長であり、より好ましくは４塩基長である。
【００５４】
本明細書では、「ジャンクション領域」とは、エフェクター領域とＤＮＡアプタマー領域とを連結している領域である。本明細書では、アプタマーマスク領域と連結している領域をジャンクション領域１といい、ＤＮＡアプタマー領域と連結している領域をジャンクション領域２という。ジャンクション領域１とジャンクション領域２とは、リガンド非存在下では互いにハイブリダイズしているが、リガンドがＤＮＡ構築物に結合すると互いから解離する。ジャンクション領域１とジャンクション領域２は、１〜５塩基長であり、好ましくは２〜５塩基長であり、より好ましくは３〜５塩基長であり、さらに好ましくは３塩基長である。また、ジャンクション領域１およびジャンクション領域２の長さは、好ましくは、同じ長さである。従って、好ましくは、ジャンクション領域１およびジャンクション領域２の長さは等しく、かつ、１〜５塩基長であり、好ましくは２〜５塩基長であり、より好ましくは３〜５塩基長であり、さらに好ましくは３塩基長である。
【００５５】
本明細書では、「末端領域」とは、ＤＮＡ構築物の５’または３’末端に存在し、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では、エフェクター領域の少なくとも一部とハイブリダイズして該エフェクター領域を不活性化している領域である。本発明のＤＮＡ構築物の末端領域は、リガンドがＤＮＡ構築物に結合すると、エフェクター領域から解離して、エフェクター領域を活性化させることから、エフェクターマスク領域ということもできる。末端領域はエフェクター領域の少なくとも一部とハイブリダイズしてエフェクター領域を不活性化状態にできる限り特に限定されないが、好ましくは、２〜５塩基長であり、より好ましくは、３塩基長または４塩基長であり、好ましくは、エフェクター領域内のマスキングされる配列と相補的な配列を有する。
【００５６】
本明細書では、リガンド非存在下において、アプタマーマスク領域とジャンクション領域１およびジャンクション領域２とから形成され、さらに、ＤＮＡアプタマー領域とエフェクター領域とを連結する領域を「モジュール領域」という。モジュール領域は、それ自体が酵素活性や化合物への結合活性を有することを求められるものではないが、リガンドが結合することによるＤＮＡアプタマー領域の二次構造の変化を、エフェクター領域に伝える役割を果たす。
【００５７】
本明細書では、ＤＮＡ分子の二次構造およびＤＮＡ分子が二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）はすべて、ＤＮＡの二次構造予測プログラム（米国ニューヨーク州立大学オールバニ校により無償で提供されるＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８（http://mfold.rna.albany.edu））を用いて、構造形成温度（folding temperature）：３７℃、Ｎａ＋濃度：１ＭおよびＭｇ２＋濃度：０Ｍの予測条件で予想される二次構造および自由エネルギー（ｄＧ）として記載している。ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８では、ＤＮＡの二次構造の予測は、分子内にステム構造やループ構造などの二次構造が形成される際の自由エネルギーが最小値をとる二次構造（最適構造）を該ＤＮＡの二次構造として予測する。従って、ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８では、ＤＮＡの二次構造と共に、その二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）が予想される。予測される二次構造中で、二重鎖核酸中において塩基対を形成する相手の塩基がないものおよびミスマッチ塩基対は、それぞれバルジループおよびインターナルループとされる（ただし、ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８では、Ｔ−Ｇ間のミスマッチ塩基対は、塩基対を形成していると評価され、インターナルループを形成するとは評価されない）。そこで、本明細書では、Ｔ−Ｇ間のミスマッチ塩基対は、インターナルループを形成するものではないとして記載し、Ｔ−Ｇ間のミスマッチ塩基対が形成する水素結合数は２個としてカウントするが、通常の塩基対とは区別して記載する。ＤＮＡ分子内のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）は、ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８では、最近隣法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ）により評価され、塩基対またはミスマッチ塩基対の隣の塩基対の種類を考慮して計算される（SantaLucia, J. Jr., A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95:1460-1465およびSantaLucia, J. Jr., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2004) 33:415-440）。なお、本発明で推定される二次構造は、好ましくは、ＤＮＡの二次構造予測により得られる最適構造（ｄＧが最小値である構造）であるが、準最適構造（ｄＧが最小ではないが、最小値に近い値を取る構造）として予想されたものを含んでいてもよい。
【００５８】
本明細書では、「塩基対」とは、Ａ−Ｔ間の塩基対およびＧ−Ｃ間の塩基対を意味し、「ミスマッチ塩基対」とは、上記以外の組み合わせの塩基対を意味する。本明細書では、ＤＮＡ分子のある領域と別の領域とが領域間で複数の「塩基対」を形成することを「ハイブリダイズする」と表現する。
【００５９】
以下、本発明のＤＮＡ構築物における、アプタマーマスク領域並びにジャンクション領域１およびジャンクション領域２の関係を説明する。
【００６０】
本明細書では、アプタマーマスク領域並びにジャンクション領域１およびジャンクション領域２の関係に関しては、ＤＮＡ構築物（a）を例として詳細に説明する。ＤＮＡ構築物（b）、（c）および（d）については、下記説明の「３’」および「５’」の用語は、上記の連結の順番に照らし合わせて、それぞれ適宜「５’」および「３’」と読み替えることができる。
【００６１】
本発明のＤＮＡ構築物（a）は、リガンド非存在下では、アプタマーマスク領域とＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基とがハイブリダイズし、ジャンクション領域１とジャンクション領域２とがハイブリダイズしている。本発明のＤＮＡ構築物はまた、リガンド非存在下では、エフェクター領域の少なくとも一部がＤＮＡ構築物の３’末端領域に位置する末端領域とハイブリダイズしてマスキングされており、結果としてエフェクター領域が不活性化されている。
【００６２】
本発明のＤＮＡ構築物（a）は、リガンド非存在下では、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基とアプタマーマスク領域とのハイブリダイゼーションおよび／またはジャンクション配列１と２とのハイブリダイゼーションは、好ましくは、完全なハイブリダイゼーションを形成せず（ハイブリダイゼーションした領域において、少なくとも１個の塩基は、塩基対を形成しない）、より好ましくは、少なくとも１個のインターナルループまたはバルジループを形成する。ここで、インターナルループは、特に限定されないが、２個または３個の塩基により形成されるインターナルループであることが好ましい。従って、本発明では、アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、ＤＮＡ構築物が提供される。本発明ではまた、ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、ＤＮＡ構築物が提供される。本発明ではさらに、アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成し、かつ、ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、ＤＮＡ構築物が提供される。
【００６３】
本発明では、本発明のＤＮＡ構築物（a）は、リガンド非存在下では、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基とアプタマーマスク領域との塩基間で、好ましくは、合計４〜１１個の水素結合を形成し、より好ましくは、合計４〜１０個の水素結合を形成し、最も好ましくは、６〜９個の水素結合を形成する。すなわち、本発明のＤＮＡ構築物（a）のアプタマーマスク領域は、リガンド非存在下では、前記ＤＮＡアプタマーの３’側末端部との間で、２個の塩基対および１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する。
【００６４】
従って、本発明のＤＮＡ構築物（a）は、リガンド非存在下では、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基とアプタマーマスク領域との間で、好ましくは、少なくとも１個のインターナルループまたはバルジループを形成し、これらの塩基間では、好ましくは、合計４〜１１個の水素結合を形成し、より好ましくは、合計４〜１０個の水素結合を形成し、最も好ましくは、６〜９個の水素結合を形成する。より具体的には、本発明のＤＮＡ構築物（a）は、好ましくは、リガンド非存在下では、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基とアプタマーマスク領域との間で、４個の塩基対および１個のインターナルループ若しくはバルジループを形成するか、３個の塩基対、１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対および１個のインターナルループ若しくはバルジループを形成するか、３個の塩基対および１個のインターナルループを形成するか、または、２個の塩基対、１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対および１個のインターナルループを形成する。リガンド非存在下でＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基とアプタマーマスク領域との間で形成する、上記の２個の塩基対、１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対および１個のインターナルループは、好ましくは、２個のＡ−Ｔの塩基対、１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対および１個のインターナルループから構成され、より好ましくは、ＤＮＡアプタマー領域に近い側から順に、２個のＡ−Ｔの塩基対、１個のインターナルループおよび１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対が連なって構成される。
【００６５】
本発明の一つの態様では、本発明のＤＮＡ構築物（a）では、リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域は、好ましくはＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基である。
【００６６】
ある特定の態様では、本発明のＤＮＡ構築物（a）は、アプタマーマスク領域が５’側から、Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇである（但し、ｎは、１または２であり、ｎが２である場合は、２つのＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、ＸおよびＺは、（Ｘ）ｎとＺとがインターナルループかバルジループを形成する塩基の組合せから選択され、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）。参考までに、例えば、本発明のＤＮＡ（b）では、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ構築物の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである。この態様では、ＤＮＡアプタマー領域は、好ましくは、ＡＭＰアプタマー領域であり、より好ましくは、配列番号１７の塩基配列を有するＡＭＰアプタマーである。
【００６７】
ある特定の態様では、本発明のＤＮＡ構築物（a）は、アプタマーマスク領域が５’側から、Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｇ−Ｇである。この態様では、ＤＮＡアプタマー領域は、好ましくはパツリンアプタマー領域であり、より好ましくは、配列番号２４〜２６の塩基配列を有するパツリンアプタマー領域であり、さらに好ましくは、配列番号２６の塩基配列を有するパツリンアプタマー領域である。
【００６８】
本発明のＤＮＡ構築物（a）は、ジャンクション領域の長さが１〜５塩基長であり、好ましくは２〜５塩基長であり、より好ましくは、３〜５塩基長であり、さらに好ましくは３塩基長である。リガンド非存在下では、本発明のＤＮＡ構築物のジャンクション領域１とジャンクション領域２との塩基間では、３個以上の水素結合が形成される。ジャンクション領域１とジャンクション領域２との塩基間では、特に限定されないが、Ｇ−Ｃの塩基対数は、好ましくは０または１個であり、好ましくは０個であり、より好ましくは、すべての塩基対が、Ａ−Ｔの塩基対またはＴ−Ｇのミスマッチ塩基対のどちらかから構成される。また、ジャンクション領域１とジャンクション領域２との塩基間では、好ましくは、１個のインターナルループが存在してもよい。ある態様では、本発明のＤＮＡ構築物（a）のジャンクション領域は、ジャンクション領域１が５’側からＡ−Ｇ−Ｃ（または、Ｔ−Ａ−Ｇ）であり、ジャンクション領域２が５’側からＧ−Ａ−Ｔ（ジャンクション領域１が５’側からＴ−Ａ−Ｇの場合は、５’側からＣ−Ｇ−Ａ）である。この態様では、ＤＮＡアプタマー領域は、好ましくは、ＡＭＰアプタマー領域であり、より好ましくは、配列番号１７の塩基配列を有するＡＭＰアプタマーである。
【００６９】
ある特定の態様では、ＤＮＡ構築物（a）のジャンクション領域１は、５’側からＣ−Ｔ−Ｇ（またはＧ−Ａ−Ｔ）であり、かつ、ジャンクション領域２は、５’側からＴ−Ａ−Ｇ（またはＧ−Ｔ−Ｃ）である。この態様では、ＤＮＡアプタマー領域は、好ましくはパツリンアプタマー領域であり、より好ましくは、配列番号２４〜２６の塩基配列を有するパツリンアプタマー領域であり、さらに好ましくは、配列番号２６の塩基配列を有するパツリンアプタマー領域である。
【００７０】
ある特定の態様では、ＤＮＡ構築物（a）の末端領域の塩基配列は、５’からＣ−Ｃ−Ｃ−ＡまたはＣ−Ｃ−Ｃである。この態様では、エフェクター領域の塩基配列は、その５’末端においてそれぞれ５’からＴ−Ｇ−Ｇ−ＧまたはＧ−Ｇ−Ｇであることが好ましく、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムの塩基配列であることがより好ましい。ＤＮＡ構築物（a）の末端領域の塩基配列が５’からＣ−Ｃ−Ｃ−Ａである場合、アプタマーマスク領域は、好ましくは、５’からＴ−Ａ−Ｔ−Ｔであり、かつ、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基は、５’からＡ−Ａ−Ｇ−Ｇである。この態様では、特に限定されないが、ＤＮＡアプタマー領域は、好ましくはＡＭＰアプタマー領域またはパツリンアプタマー領域である。
【００７１】
本発明のＤＮＡ構築物は、リガンド非存在下では、安定化しすぎるとリガンド結合時に構造変化を起こすことができず、結果としてエフェクター領域をリガンドの有無に関わらず常時不活性化してしまう可能性があり、また、不安定化しすぎるとリガンド非結合時であってもエフェクター領域と末端領域とのハイブリダイゼーションが形成されにくくなり、結果としてエフェクター領域がリガンドの有無に関わらず常時活性化してしまう可能性がある。このため、本発明のＤＮＡ構築物が、リガンド非存在下では不活性状態で、リガンド結合依存的に活性化するようにするためには、本発明のＤＮＡ構築物が二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）が一定範囲となるようにすることが好ましい。具体的には、本発明のＤＮＡ構築物（リガンド非存在下）は、本発明のＤＮＡ構築物が二次構造を形成する際の自由エネルギー（ｄＧ）（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）をＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８を用いて予測条件１で予測した場合に、その下限値は、好ましくは、−１４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より好ましくは、−１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、さらに好ましくは、−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、最も好ましくは、−９ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、かつ、その上限値は、好ましくは、−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、より好ましくは、−６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、最も好ましくは、−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。従って、本発明のＤＮＡ構築物のｄＧは、特に限定されないが、例えば、−１２〜−５ｋｃａｌ／ｍｏｌとすることができ、好ましくは、−１０〜−５ｋｃａｌ／ｍｏｌとすることができ、より好ましくは、−９〜−５ｋｃａｌ／ｍｏｌとすることができ、さらに好ましくは、−９〜−６ｋｃａｌ／ｍｏｌとすることができ、最も好ましくは、−９〜−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌとすることができる。このように、本発明のＤＮＡ構築物を設計する際には、予想されるｄＧが上記の範囲に含まれることを目安として設計することができる。
【００７２】
本発明のＤＮＡ構築物（a）は、ＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に、二次構造の変換を起こす。その際、本発明のＤＮＡ構築物（a）は、リガンド結合後は、好ましくは、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２とはハイブリダイズする。リガンド結合後、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２とがハイブリダイズするＤＮＡ構築物は、エフェクター領域の遊離状態（すなわち、活性化状態）を維持しやすいと考えられ、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２とがハイブリダイズしない場合と比べて、ＤＮＡ構築物の高感度化を達成する上で有利であると考えられる。アプタマーマスク領域とジャンクション領域２とは、特に限定されないが、ハイブリダイゼーション領域において、４個以上の水素結合を形成することが好ましく、２個の連続した塩基で塩基対を形成することがより好ましく、３個の連続した塩基対を形成することが最も好ましい。
【００７３】
本発明のＤＮＡ構築物（a）は、アプタマーマスク領域が４塩基長の場合であって、リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、特に限定されるものではないが、好ましくは、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、最も好ましくは、＋２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択される。本発明のＤＮＡ構築物（a）は、アプタマーマスク領域が４塩基長の場合であって、リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、特に限定されるものではないが、好ましくは、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、さらに好ましくは、＋０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、最も好ましくは、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される。また、本発明のＤＮＡ構築物は、アプタマーマスク領域が４塩基長であって、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域のそれぞれにミスマッチを有する場合には、特に限定されるものではないが、ミスマッチ塩基対を形成する塩基はそれぞれ、アプタマーマスク領域におけるミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、好ましくは、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、最も好ましくは、＋２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、ジャンクション領域におけるミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、好ましくは、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、さらに好ましくは、＋０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、最も好ましくは、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される。従って、本発明のＤＮＡ構築物を設計する際には、予想されるｄｄＧが上記の範囲に含まれることを目安としてＤＮＡを設計することができる。ミスマッチ塩基対の組み合わせとｄｄＧとの関係は、SantaLucia, J. Jr., Hicks, D. The thermodynamic of DNA structural motifs. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2004) 33:415-440に記載されており、この記載は、所望のｄｄＧを満たす塩基（または塩基の組み合わせ）を選択する際の指針とすることができる。
【００７４】
ある特定の態様では、本発明のＤＮＡ構築物の塩基配列は、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１およびジャンクション領域２、並びにＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基の塩基配列のいずれか１個、２個、３個、またはすべてが、下記表１に示す組み合わせのいずれか一つから選択される塩基配列である。ある特定の態様では、本発明のＤＮＡ構築物の塩基配列は、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１およびジャンクション領域２、並びにＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基の塩基配列のすべてが、下記表１に示す組み合わせのいずれか一つから選択される。
【表１】
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【００７５】
ある特定の態様では、本発明のＤＮＡアプタマー領域がＡＭＰアプタマー領域であるＤＮＡ構築物の塩基配列は、配列番号１〜１５のいずれか１つの塩基配列である。ある特定の態様では、本発明のＤＮＡアプタマー領域がパツリンアプタマー領域であるＤＮＡ構築物の塩基配列は、配列番号２１〜２３、４０および４１のいずれか１つの塩基配列である。ある特定の態様では、本発明のＤＮＡアプタマー領域がアルギニンアプタマー領域であるＤＮＡ構築物の塩基配列は、配列番号１９の塩基配列である。
【００７６】
本発明のＤＮＡ構築物は、例えば、配列番号：１〜１５、１９、２１〜２３、４０および４１の塩基配列のいずれか一つの塩基配列を有するＤＮＡ構築物のＤＮＡアプタマー領域を改変し、それぞれのリガンドへの結合性を指標として得ることができる。改変（塩基の置換、挿入および欠失）は、本発明のＤＮＡ構築物の条件を満たすように行うことができる。ＲＮＡアプタマー領域がパツリンアプタマー領域である本発明のＲＮＡ構築物は、例えば、配列番号：３０〜３２、３８および３９の塩基配列を有するＲＮＡ構築物のパツリンアプタマー領域を改変し、パツリン結合依存的な自己切断活性を指標として得ることができる。改変（塩基の置換、挿入および欠失）は、本発明のＲＮＡ構築物の条件を満たすように行うことができる。核酸分子の改変の手法は当業者に周知である。
【００７７】
また、ＤＮＡ構築物が、本発明のＤＮＡ構築物の条件を満たすことは、リガンドに対して高感度または特異性を示すＤＮＡ構築物を設計する際の指標となる。本発明のＤＮＡ構築物の条件を満たすように、本発明のＤＮＡ構築物を設計することができる。従って、本発明によれば、リガンドを検出するＤＮＡ構築物を設計する方法が提供される。また、本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のマイクロアレイ上に設計して得られたＤＮＡ構築物をセンサー素子として固定化することにより、リガンドの結合性を指標として得てもよい。
【００７８】
本発明では、本発明のＤＮＡ構築物のエフェクター領域の活性化を、本発明のＤＮＡ構築物を担持させた電極表面を有するセンサー素子を用いて電気化学的に検出することができる。また、本発明のＤＮＡ構築物を担持させた電極表面を有するセンサー素子を備えたマイクロアレイを用いると、下記に説明するように、膨大な種類のＤＮＡ構築物をスクリーニングして、リガンドに対する感度の高いＤＮＡ構築物を一挙に取得することができる。従って、本発明では、本発明のＤＮＡ構築物が電極表面に担持されてなるセンサー素子、および、本発明のセンサー素子を備えたマイクロアレイが提供される。電極表面に担持させる本発明のＤＮＡ構築物は、エフェクター領域は、好ましくは、シグナル発生領域であり、より好ましくは、ＤＮＡザイムであり、さらに好ましくは、酸化還元型ＤＮＡザイムであり、最も好ましくは、配列番号１６の酸化還元型ＤＮＡザイムである。
【００７９】
本発明のＤＮＡ構築物を電極表面に担持する際には、ＤＮＡ構築物と電極との間にリンカーを介在させることができる。従って、本発明によれば、ＤＮＡ構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなるセンサー素子およびセンサー素子を備えたマイクロアレイが提供される。本発明では、リンカーは、特に限定されないが、ＤＮＡとすることができ、その配列は、好ましくは、ＤＮＡ構築物内の他の領域とハイブリダイゼーションしない配列とすることができる。ＤＮＡ構築物内の他の領域とハイブリダイゼーションしない配列は、当業者であれば容易に選択することができる。リンカーは、例えば、ポリＴとすることができ、長さは、例えば、１〜２０塩基長とすることができる。従って、本発明では、リンカーの配列は、好ましくは、１〜２０塩基長のポリＴ、より好ましくは１５塩基長のポリＴとすることができる。本発明によれば、ＤＮＡ構築物と電極との間にリンカーを介在させることで、ＤＮＡ構築物に対する電極の立体障害等の影響を低減し、リガンドの検出感度を向上させることができる。本発明では、リンカーは、ＤＮＡ構築物の５’末端または３’末端に付加することができ、好ましくは、ＤＮＡ構築物の末端領域（すなわち、エフェクター領域が存在する末端とは別の末端）に付加することができる。
【００８０】
本発明では、センサー素子の電極表面上へのＤＮＡ構築物の担持は、公知の様々な方法により行うことができ、例えば、好ましくは、センサー素子の電極上にＤＮＡ構築物をスポッティングすることにより、より好ましくは、センサー素子の電極表面上でＤＮＡ構築物を合成することにより行うことができる。センサー素子の電極表面上でＤＮＡ構築物を合成すると、合成されたＤＮＡは一定の配向で電極表面上に担持させることができるので、リガンドの検出感度の観点で好ましい。従って、本発明では、センサー素子上でＤＮＡ構築物を合成することにより、ＤＮＡ構築物を電極表面に担持させたセンサー素子が提供される。本発明では、本発明のセンサー素子を備えたマイクロアレイを用いることにより、１つのマイクロアレイの電極表面上に複数の、好ましくは１，０００種類以上の、より好ましくは５，０００種類以上の、さらに好ましくは１０，０００種類以上のＤＮＡ構築物を合成することができ、これら膨大な種類のＤＮＡ構築物を一挙にスクリーニングすることができる。センサー素子の電極表面上でのＤＮＡ構築物の合成は、アレイ製造の方法として公知の様々な方法を用いて行うことができ、例えば、特開第２００６−２９１３５９号公報に開示された方法などを用いて行うことができる。本発明では、マイクロアレイとして、特に限定されないが、例えば、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ（商標）マイクロアレイを用いることができる。
【００８１】
本発明では、本発明のセンサー素子またはセンサー素子を備えたマイクロアレイを用いて、ＤＮＡザイムの基質存在下で、電気シグナルを測定することにより、リガンドを検出することができる。本発明のリガンドの検出方法では、ＤＮＡザイムにより生じる電流をセンサー素子の電極上で読み取ることにより、リガンドを検出することができる。ＤＮＡザイムは、特に限定されないが、好ましくは酸化還元型ＤＮＡザイムであり、より好ましくは配列番号１６の酸化還元型ＤＮＡザイムである。本発明では、酸化還元型ＤＮＡザイムが活性化して発生させる酸化還元電流をセンサー素子の電極上で読み取ることにより、リガンドを検出することができる。
【００８２】
本発明のリガンドの検出方法ではまた、エフェクター領域として、リガンド存在下でのみ他の核酸分子とハイブリダイズ可能な配列、すなわち、リガンド存在下でのみＨＲＰなどの酸化還元酵素をコンジュゲートした核酸分子とハイブリダイズ可能な配列を有するＤＮＡ構築物を用いることもできる。このようなＤＮＡ構築物を用いる場合には、ＤＮＡ構築物をセンサー素子に固定し、ＨＲＰなどの酸化還元酵素をコンジュゲートした核酸分子とハイブリダイズ可能な条件で接触させ、その後、酸化還元酵素により生じる酸化還元電流を検出することにより、リガンドの検出を行うことができる。
【００８３】
本発明ではまた、本発明のＤＮＡ構築物の塩基配列をさらに改変して得られるＤＮＡ構築物候補群から、本発明の方法を用いてリガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ構築物をスクリーニングする方法が提供される。
【００８４】
本発明のスクリーニング方法は、リガンドを検出するＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（Ａ）ＤＮＡアプタマー領域と、モジュール領域と、ＤＮＡアプタマー領域へのリガンドの結合依存的に活性化するエフェクター領域とを含んでなり、かつ、リガンド非存在下でループ構造を形成するＤＮＡ分子の塩基配列を設計または改変して、リガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）得られた塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる方法である。以下、上記工程（Ａ）〜（Ｄ）を工程毎に説明する。
【００８５】
工程（Ａ）について
本発明では、スクリーニングは、ＤＮＡアプタマー領域と、モジュール領域と、エフェクター領域を含んでなり、かつ、リガンド非存在下でループ構造を形成するＤＮＡ分子の塩基配列群を得ることから始まる。本発明のスクリーニング方法では、ＤＮＡ分子の塩基配列の設計は、特に限定されないが、例えば、本発明のＤＮＡ構築物であることを指標として行うことができる。または、本発明のＤＮＡ構築物であることを指標としない場合には、ＤＮＡ分子の塩基配列の設計は、ＤＮＡ分子が、リガンド非存在下でエフェクター領域がマスキングされる二次構造のｄＧが最小値を示し、かつ、リガンド結合依存的にエフェクター領域のマスキングが解消された二次構造のｄＧが最小値を示すようになることを指標として行ってもよい。本発明のスクリーニング方法では、改変されるＤＮＡ分子は、ＤＮＡアプタマー領域にリガンドが結合すると、エフェクター領域が活性化して、エフェクター領域が、酸化還元酵素をコンジュゲートした他の核酸分子とハイブリダイズ可能となるか、シグナル発生領域である場合には、その酸化還元酵素活性を活性化させるＤＮＡ分子である。本発明のスクリーニング方法では、改変されるＤＮＡ分子としては、例えば、ＤＮＡアプタマーとＤＮＡザイムとが、例えば、ヘアピンループ構造を形成するように連結したものを用いることができ、特に限定されないが、例えば、本発明のＤＮＡ構築物を用いることができ、リガンドがＡＭＰである場合は、好ましくは配列番号：１〜１５のいずれか一つ、リガンドがアルギニンである場合は、好ましくは配列番号：１９、リガンドがパツリンである場合には、好ましくは配列番号２１〜２３、４０および４１のいずれか一つの塩基配列を有するＤＮＡ分子を用いることができる。また、工程（Ａ’）では、工程（Ａ）の手順と同様に、本発明のスクリーニング方法により既に得られているＤＮＡ分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得てもよい。本発明では、スクリーニングするＤＮＡ分子のエフェクター領域は、好ましくは、シグナル発生領域とすることができ、より好ましくは、ＤＮＡザイムとすることができ、さらに好ましくは、酸化還元型ＤＮＡザイムとすることができ、さらにより好ましくは、配列番号１６の配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムとすることができる。そして、得られたＤＮＡ分子の塩基配列と同等の塩基配列を有する核酸として、得られたＤＮＡ分子の一部（例えば、エフェクター領域、ジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２および末端領域からなる群から選択される少なくとも１つの一部をＤＮＡ以外の核酸（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＲＮＡ）に置き換えることにより、核酸分子を得ることができる。本発明のある態様では、工程（Ａ）は、ループ構造のＤＮＡアプタマー領域と、モジュール領域と、ＤＮＡアプタマー領域へのリガンドの結合依存的に活性化するエフェクター領域とを含んでなるヘアピンループ構造のＤＮＡ分子の塩基配列を設計または改変して、リガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ることである。
【００８６】
ＤＮＡ分子の塩基配列の改変は、ＤＮＡアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域（例えば、末端領域）から選択される１以上の領域に対して行うことができ、好ましくは、いずれかの１領域を選択して行うことができる。ＤＮＡ分子の塩基配列の改変は、塩基の挿入、欠失および置換から選択される１以上により行うことができる。また、ＤＮＡ分子の塩基配列の改変は、スクリーニングを簡便にする観点で、エフェクター領域を、活性の測定容易なもの、例えば、酸化還元型ＤＮＡザイムに置き換える改変を行うことができる。このようにすることで、本来、本発明のスクリーニング方法ではスクリーニングが困難なエフェクター領域を有するＤＮＡ分子であっても、スクリーニングが可能となる。改変は、特に方法は問わず、当業者に周知の方法を用いて適宜行うことができるが、好ましくは、コンピュータ上で行うことができる。
【００８７】
例えば、本発明では、好ましくは、ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８などのＤＮＡ分子の二次構造予測プログラムを用いて、リガンド非存在下で最適構造（または準最適構造）が所望の二次構造（例えば、ヘアピンループ構造）を形成すると推定されるものだけをスクリーニングに供することができる。例えば、ＤＮＡ分子として本発明のＤＮＡ構築物（a）を用いた場合には、例えば、リガンド非存在下で図１Ａまたは図２Ａのようなヘアピンループ構造を形成すると推定されるＤＮＡ分子だけをスクリーニングに供することができる。コンピュータ上で塩基配列の改変を行う場合には、特に限定されないが、例えば、改変された塩基配列を有するＤＮＡ分子のｄＧが本発明のＤＮＡ構築物の条件を満たすことなど、本発明のＤＮＡ構築物の条件を満たすことを指標として改変することができる。このように、本発明では、高い感度を示し得る分子を選択的にスクリーニングに供することが可能であり、ランダムに変異を導入してそのすべてをスクリーニングする手法と比較して、スクリーニングの効率が高い。
【００８８】
工程（Ｂ）について
本発明では、上述のように、ＤＮＡ分子を電極表面上に担持してなるセンサー素子を作製することができる。本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、本発明のセンサー素子を備えたマイクロアレイが用いられる。
【００８９】
工程（Ｃ）について
本発明では、酸化還元電流の測定は、マイクロアレイ用の電気化学的検出器、および電気化学検出用のマイクロアレイを用いて、製造者のマニュアルに記載の通り測定することができる。マイクロアレイ用の電気化学的検出器としては、特に限定されないが、例えば、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ（商標）検出器を用いることができ、電気化学検出用のマイクロアレイとしては、特に限定されないが、例えば、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ（商標）マイクロアレイを用いて行うことができる。
【００９０】
工程（Ｄ）について
本発明では、測定された電流値の大きさは、ＤＮＡ分子または核酸分子のリガンドの検出感度を反映する。例えば、リガンド非存在下と存在下とで測定される電流値の差（または比）が大きいほど、ＤＮＡ分子または核酸分子はリガンドに対する検出感度が高いことを意味する。従って、本発明では、例えば、測定された電流値に基づいてリガンド検出感度が高いＤＮＡ分子または核酸分子を選択することができる。ＤＮＡ分子または核酸分子をスクリーニングする際には、例えば、リガンド検出感度が分子全体の平均よりも高いものを選択してもよいし、リガンド検出感度が最も高いＤＮＡ分子または核酸分子いくつかを選択してもよい。
【００９１】
また、工程（Ａ）で得られた候補配列群では、ＤＮＡ分子毎または核酸分子毎に高い定量性を発揮できるリガンド濃度領域が異なると考えられる。すなわち、あるＤＮＡ分子または核酸分子は、低濃度領域で高い定量性を発揮するが、他のＤＮＡ分子は高濃度領域で高い定量性を発揮するというように、分子によって得意とする濃度領域が異なる。そのため、所望の濃度領域において高い定量性を発揮するＤＮＡ分子または核酸分子を得ることを目的として、当該所望の濃度領域でのリガンドの検出感度に基づいてスクリーニングを行うことができる。従って、本発明では、所望の濃度領域おけるリガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子をスクリーニングすることができる。例えば、０ｍＭ〜５ｍＭの間の濃度領域で高感度を発揮するＤＮＡ分子または核酸分子を得る場合には、その濃度領域でのリガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子のスクリーニングを行うことができる。また、５ｍＭ〜１０ｍＭの間の濃度領域で高い検出感度を発揮するＤＮＡ分子または核酸分子を得る場合には、その濃度領域でのリガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子のスクリーニングを行うことができる。
【００９２】
本発明のスクリーニング方法では、工程（Ｄ）を行った後に、さらに、エフェクター領域を他のエフェクター領域に置き換えてもよい。例えば、酸化還元活性を有しないエフェクター領域を有するＤＮＡ分子または核酸分子であっても、例えば、エフェクター領域を酸化還元型ＤＮＡザイムに置き換えて、リガンドの検出感度を指標として高感度なＤＮＡ分子または核酸分子を選択し、得られたＤＮＡ分子または核酸分子の酸化還元型ＤＮＡザイム部分を、酸化還元活性を有しない元々のエフェクターに置き換えることにより、高感度にリガンドを検出するＤＮＡ分子または核酸分子を得ることができる。同様に、本発明のスクリーニング方法では、工程（Ｄ）を行った後に、さらに、ＤＮＡアプタマー領域を他のＤＮＡアプタマー領域に置き換えてもよい。このようにすることで、たとえ、スクリーニングが困難なＤＮＡ分子または核酸分子であっても本発明のスクリーニングを適用することができる。
【００９３】
本発明では、リガンドの検出感度を指標としてスクリーニングしたＤＮＡ分子または核酸分子の配列をさらに改変して、さらなるスクリーニングに供することにより、ＤＮＡ分子または核酸分子によるリガンドの検出感度を最適化することができる。従って、本発明では、ＤＮＡアプタマー領域とエフェクター領域を含んでなるループ構造を形成するＤＮＡ分子または核酸分子の塩基配列を最適化する方法が提供される。この目的で、ＤＮＡ分子または核酸分子の改変は、ＤＮＡアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域（例えば、末端領域）から選択される少なくとも１つの領域に対して行ってＤＮＡ分子全体または核酸分子全体を最適化してもよいし、いずれかの１領域を選択して設計または改変して、その１領域を集中的に最適化してもよい。また、１領域を集中的に最適化した後に、他の領域を最適化してもよい。このように、スクリーニングのサイクルを回して特定のリガンドに対して高い感度を有するＤＮＡ分子または核酸分子を製造し、取得することができる。
【００９４】
本発明では、ＤＮＡ分子若しくは核酸分子の全体または一部を最適化した後に、ＤＮＡ分子または核酸分子の一部（例えば、一つの領域）を置き換えてもよい。すなわち、ＤＮＡ分子若しくは核酸分子の全体または一部を最適化した後に、エフェクター領域を他の所望のエフェクター領域またはエフェクター領域としての機能が期待されるＤＮＡに置き換えてもよい。このようにすることで、スクリーニングや最適化が困難なエフェクター領域を有するＤＮＡ分子または核酸分子であっても、少なくともエフェクター領域以外の部分の最適化は可能となる。エフェクター領域と同様に、ＤＮＡ分子若しくは核酸分子の全体または一部を最適化した後に、ＤＮＡアプタマー領域を他のＤＮＡアプタマー領域とに置き換えてもよい。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法は、
（Ｅ）リガンド以外の化合物、例えば、リガンドがパツリンであれば、パツリン以外の化合物、例えば、テオフィリン、ベンゾフランおよび（Ｓ）−パツリンメチルエーテルなどのパツリンの類似化合物に対して、結合性を示さない、あるいは、パツリンに対するよりも弱い結合性を示すＤＮＡ分子または核酸分子を選択することをさらに含んでなってもよい。結合性の評価は、上記のようにＡＢＴＳを用いた比色試験や電気化学的手法により行うことができる。リガンド以外の化合物、例えば、パツリン以外の化合物、または、リガンドの類似化合物、例えば、パツリンの類似化合物は、ＤＮＡ分子または核酸分子にどのような結合特異性を持たせたいかにより当業者が自由に設定することができる。具体的には、ある化合物に結合性を示さないＤＮＡ分子または核酸分子を得たい場合には、該化合物との結合性によってＤＮＡ分子または核酸分子を選択することができる。
【００９６】
本発明の一つの態様では、本発明のリガンドの検出感度の最適化は、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）などの人工分子進化の工程、具体的には、エラープローン（error prone）なＤＮＡポリメラーゼ等を用いた変異導入の工程は含まない。本発明では、ＤＮＡ分子は、マイクロアレイの電極上で設計した配列通りに正確に合成されているので、高感度を示したＤＮＡ分子の配列は、設計した配列として既に把握済みである。従って、酵素等を用いて変異を導入するまでもなく、マイクロアレイにおいて高い検出感度を示した各スポット上のＤＮＡ分子の配列情報に基づいて塩基配列をさらに改変して、ＤＮＡ分子の塩基配列を最適化することが可能である。
【００９７】
本発明では、スクリーニングして得られたＤＮＡ分子または核酸分子や最適化して得られたＤＮＡ分子または核酸分子を比較することで、リガンドの検出感度を向上させるためにＤＮＡ分子または核酸分子が満たすべき条件やＤＮＡの塩基配列の設計の指針を得ることができる。
【００９８】
本発明では、スクリーニングして得られたＤＮＡ分子の一部をＤＮＡ以外の同等の核酸（例えば、ＲＮＡ、ＰＮＡ若しくはＬＮＡ）で置き換えてリガンドを検出する核酸分子の候補群を得てもよく、この場合、候補群の各核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製し、得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域（特に、酸化還元ＤＮＡザイムにより構成される）からの酸化還元電流を測定し、リガンドの検出感度を指標として核酸分子を選択して、リガンドを高感度に検出する核酸分子をスクリーニングしてもよい。
【００９９】
次に、本発明により提供される核酸分子について説明する。
【０１００】
本発明により提供される核酸分子は、パツリン結合性の核酸分子である。本発明の核酸分子は、分子内水素結合により水溶液中で高次構造を形成し、パツリンと結合すると考えられる。従って、本発明の核酸分子は、水溶液中で高次構造を形成し得る核酸分子である。
【０１０１】
本発明の核酸分子は、パツリンに対して特異的に結合する。すなわち、本発明の核酸分子は、パツリンに対して結合性を示すが、構造の類似した他の化合物（例えば、ベンゾフラン、（Ｓ）−パツリンメチルエーテルおよびテオフィリンなど）には結合性を示さないか、パツリンに対するよりも弱い結合性を示す。パツリンに対して結合特異性を示す本発明の核酸分子は、測定試料中のパツリンの検出や試料中からのパツリン分子の除去に有利に用いられ得る。また、本発明のＤＮＡ分子、本発明のＲＮＡ分子、および本発明の核酸構築物も同様に、測定試料中のパツリンの検出や試料中からのパツリン分子の除去に有利に用いられ得る。
【０１０２】
本発明のＲＮＡ分子は、例えば、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号３５の塩基配列を有するＲＮＡ分子、あるいは、これらの塩基配列と相同な配列を有するＲＮＡ分子とすることができる。この場合、本発明のＲＮＡ分子は、３０ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長とすることができ、好ましくは３０ヌクレオチド長〜３５ヌクレオチド長とすることができ、より好ましくは３５ヌクレオチド長とすることができる。
【０１０３】
例えば、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列と相同な配列を有するＲＮＡ分子としては、配列番号：３３、配列番号：３４若しくは配列番号３５と８０％以上、８５％以上、９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を有するＲＮＡ分子、または、配列番号：３３、配列番号：３４若しくは配列番号３５の塩基配列の相補配列を有するＲＮＡ分子にハイブリダイズするＲＮＡ分子（このＲＮＡ分子は少なくとも３０塩基、少なくとも３１塩基、少なくとも３２塩基、少なくとも３３塩基、少なくとも３４塩基または少なくとも３５塩基からなり、全長は３５塩基、３６塩基、３７塩基または４０塩基とすることができる。）が挙げられる。配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号３５の塩基配列と相同な配列を有するＲＮＡ分子としてはまた、好ましくは配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列を有するＲＮＡ分子に対して、１塩基〜５塩基、より好ましくは１塩基〜４塩基、さらに好ましくは１塩基〜３塩基、さらにより好ましくは１塩基の置換、挿入または欠失がなされた塩基配列を有するＲＮＡ分子とすることができる。特に、下記実施例によれば、配列番号：３４または３５の塩基配列を有するＲＮＡ分子は、５’末端の４塩基を欠失しても、パツリンへの結合性は保たれた。従って、本発明のＲＮＡ分子は、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号３５の塩基配列を有するＲＮＡ分子に対して、特に限定されないが、１塩基〜５塩基、好ましくは１塩基〜４塩基、より好ましくは１塩基〜３塩基、さらに好ましくは１塩基の欠失がなされた塩基配列を有するＲＮＡ分子とすることができる。本発明のＲＮＡ分子でなされ得る塩基の置換、挿入または欠失は、好ましくは、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列の５’末端、特に５’末端の４塩基の部分で行われる。
【０１０４】
パツリンとの結合の検出を容易にするために、本発明のＲＮＡ分子は、パツリンを検出する領域に連結されていてもよい。例えば、本発明のＲＮＡ分子は、自己切断型リボザイムと組み合わせて、パツリン検出用のＲＮＡ構築物とすることができる。この場合、自己切断活性が自己切断型リボザイムのパツリンとの結合を示す。本発明のＲＮＡ構築物は、本発明のＲＮＡ分子を自己切断型リボザイムの分子内に含んでなることができ、例えば、自己切断型リボザイム（配列：５’−ＧＧＧＣＧＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＧＡＡＡＣＧＧＵＧＡＡＡＧＣＣＧＵＡＧＧＵＵＧＣＣＣ−３’；図２１Ａまたは表１０を参照）の１６番目のＧと１７番目のＣとの間に本発明のＲＮＡ分子が挿入されてなる分子とすることができる。
【０１０５】
本発明のＲＮＡ構築物は、パツリンとの結合依存的に自己切断を起こす。従って、本発明のＲＮＡ構築物は、パツリンに結合すると自己切断を引き起こすＲＮＡ構築物である。ＲＮＡ構築物へのパツリンの結合は、ＲＮＡ構築物の自己切断活性の変化（例えば、上昇）によりモニターすることができる。ＲＮＡ構築物の切断活性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりＲＮＡ分子の分子量の変化として検出することができる。ＰＡＧＥでは、好ましくは、８Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲルを用いた変性ＰＡＧＥにより検出することができる。本明細書では、このようなＲＮＡ構築物中のパツリン結合性を示す領域をパツリンアプタマー領域またはパツリンＲＮＡアプタマー領域ということがある。
【０１０６】
本発明では、本発明のＲＮＡ分子またはＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子が提供される。
【０１０７】
自己切断型リボザイムとしては、特に限定されないが、例えば、リガンド依存的な自己切断活性を示すハンマーヘッド型リボザイム（Makoto Koizumi et al., Nature Structural Biology (1999) 6: 1062-1071）が挙げられる（図２１Ａ参照）。また、本発明のＲＮＡ構築物としては、例えば、本発明の自己切断型リボザイムは、配列番号３０〜３２の塩基配列を有するハンマーヘッド型リボザイムとすることができる。
【０１０８】
本発明のＤＮＡ分子は、例えば、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有するＤＮＡ分子、あるいは、これらの塩基配列と相同な配列を有するＤＮＡ分子とすることができる。この場合、本発明のＤＮＡ分子は、２５ヌクレオチド長〜３５ヌクレオチド長とすることができ、好ましくは３０ヌクレオチド長とすることができる。
【０１０９】
例えば、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と相同な配列を有するＤＮＡ分子としては、配列番号：２４、配列番号：２５、若しくは配列番号：２６の塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を有するＤＮＡ分子、または、配列番号：２４、配列番号：２５、若しくは配列番号：２６の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡ分子（このＤＮＡ分子は少なくとも２５塩基、少なくとも２６塩基、少なくとも２７塩基、少なくとも２８塩基、少なくとも２９塩基または少なくとも３０塩基からなり、全長は３０塩基、３１塩基、３２塩基または３５塩基とすることができる。）が挙げられる。配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と相同な配列を有するＤＮＡ分子としてはまた、好ましくは配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有するＤＮＡ分子に対して、１塩基〜５塩基、より好ましくは１塩基〜４塩基、さらに好ましくは１塩基〜３塩基、さらにより好ましくは１塩基の置換、挿入または欠失がなされた塩基配列を有するＤＮＡ分子とすることができる。本発明のＤＮＡ分子は、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有するＤＮＡ分子に対して、特に限定されないが、１塩基〜５塩基、好ましくは１塩基〜４塩基、より好ましくは１塩基〜３塩基、さらに好ましくは１塩基の欠失がなされた塩基配列を有するＤＮＡ分子とすることができる。塩基の欠失は、例えば、配列の末端（５’末端または３’末端）において行われ得る。
【０１１０】
本発明の核酸分子とリガンド（例えば、パツリン）との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて容易に検出することができる。表面プラズモン共鳴法を用いた分子間結合の検出法は、当業者に周知である。
【０１１１】
本発明では、ＤＮＡ分子とリガンド、例えば、ＡＭＰやパツリンとの結合の検出等を容易にするために、例えば、ＤＮＡ分子は、リガンドの検出のための領域等（例えば、下記のエフェクター領域）に連結され、ＤＮＡ構築物の一部に組み込まれて用いられ得る。すなわち、本発明では、ＤＮＡアプタマー領域（例えば、ＡＭＰアプタマー領域およびパツリンアプタマー領域）と、該アプタマー領域へのリガンドの結合により活性化するエフェクター領域とを含んでなるＤＮＡ構築物が提供される。ある態様では、本発明のＤＮＡ構築物は、例えば、以下の構成のＤＮＡ構築物にパツリンアプタマー領域として組み込まれて用いられ得る。
【０１１２】
次に、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物を用いて、試料中のリガンド（例えば、パツリン）を除去する方法を説明する。
【０１１３】
本発明の核酸分子はリガンドに結合するので、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物は、試料中からリガンドを除去することにも用いられ得る。従って、本発明では、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物を用いて試料中からリガンドを除去する方法が提供される。すなわち、本発明では、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物にリガンドを結合させることを含んでなる、試料中のリガンドを除去する方法が提供される。
【０１１４】
本発明ではまた、試料中からのリガンドの除去は、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物を固定化したカラムを用いて行うことができる。カラムへの核酸分子の固定化は当業者に周知の方法を用いて行うことができる。
【０１１５】
より具体的には、本発明のリガンドの除去方法は、
（ａ）リガンドに結合性を示す、好ましくは、結合特異性を示すＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物を得ること、
（ｂ）得られたＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物をカラムの樹脂に固定化して、リガンド吸着カラムを作製すること、および、
（ｃ）得られたリガンド吸着カラムに試料を接触させて、リガンドをカラムに吸着させること
を含んでなる方法とすることができる。
【０１１６】
本発明によればさらに、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子または核酸構築物が固定化されたリガンド吸着カラム（例えば、パツリン吸着カラム）が提供される。
【実施例】
【０１１７】
実施例Ａ１：化合物検出のためのＤＮＡアプタマーの設計
本実施例では、化合物の検出に用いることができる高感度なＤＮＡ分子の設計を行った。ＤＮＡ分子として、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）アプタマーと酸化還元型ＤＮＡザイムを含んでなるヘアピンループ構造を有する配列番号２０の配列を有するＤＮＡ分子を元にして、配列を改変して高感度なＤＮＡ分子を設計した。【０１１８】
ＤＮＡ分子の設計（改変）は以下のように行った。まず、以降の実施例Ａ１−Ａ６ではいずれも、ＤＮＡ分子のアプタマーマスク配列およびジャンクション領域の配列のみを改変した。設計の際には、アプタマーマスク配列が３または４塩基長（Ｍ＝３または４）であること、アプタマーマスク配列とハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域が５’−ＡＡＧＧ−３’であること、および、ジャンクション領域が１〜５塩基長（Ｊ＝１〜５）であるとの条件を設定した上で、ＤＮＡの二次構造予測プログラム（米国ニューヨーク州立大学オールバニ校により無償で提供されるＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８（http://mfold.rna.albany.edu））を用いて、構造形成温度（folding temperature）：３７℃、Ｎａ＋濃度：１ＭおよびＭｇ２＋濃度：０Ｍの予測条件で予測した際に、ＡＭＰ非存在下で、ヘアピンループ構造の二次構造を形成すると予測されること（例えば、図１Ｅに示される二次構造を形成すると予測されること）を指針としてＤＮＡ分子を設計した。ソフトウェアパッケージは３２ビットのＬｉｎｕｘ（商標）用のプログラムを用いた。なお、二次構造予測は、コマンド「UNAfold.pl --NA=DNA input fasta formatted file (入力ファイル名)」を用いて実行した（予測の際には、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域において、１個以上のインターナルループまたはバルジループが含まれていてもよいこととした）。具体的には、指針として、ＤＮＡアプタマーの３’末端の４塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマーの５’側に隣接する３または４塩基（アプタマーマスク領域）とハイブリダイズする構造を形成すると予測されるＤＮＡ分子を網羅的に設計した。得られた配列をカウントしたところ、上記条件を満たすＤＮＡ配列の数とＭおよびＪとの関係は表２の通りであった。【０１１９】
【表２】
2013161964.tif 000004
【０１２０】
この際、アプタマーマスク配列やジャンクション領域は、完全な塩基対を形成してハイブリダイズする必要はなく、ハイブリダイズした領域中にインターナルループやバルジループが含まれていてもよいこととした。以下の実施例Ａ１〜Ａ６では、すべて、アプタマーマスク領域、アプタマーマスク領域でマスキングされるＤＮＡアプタマー領域の一部、ジャンクション領域１およびジャンクション領域２のみにおいてのみ、配列の改変を行い、それ以外の領域は、配列番号２０の配列を有するＤＮＡセンサーと同一の配列とした。【０１２１】
実施例Ａ２：スクリーニング系の構築
本実施例では、ＤＮＡ分子を大量にかつ簡便にスクリーニングできる系の構築を試みた。【０１２２】
スクリーニング系は、ＤＮＡザイムの活性化を電気化学的に検出する系を用いて行った。電気化学的な検出には、電気化学検出マイクロアレイ（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ１２ｋマイクロアレイ、製品番号：１００００８１）および検出器（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ検出器、製品番号：６１００３６）を用いることを検討した。【０１２３】
まず、マイクロアレイのチップ上に、酸化還元ＤＮＡザイム（配列番号１６；ＧＧＧＴＡＧＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＧ）と、対照として活性を持たないＤＮＡ（ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ）を合成して、ＤＮＡザイム活性が検出できるかを検討した。これらのＤＮＡの３’末端をアレイに固定するため、ＤＮＡの３’末端に５１塩基のポリＴ配列を付加してアレイに固定した。５ｍＭのＡＢＴＳと５ｍＭのＨ２Ｏ２を用いた。反応バッファーは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＤＭＳＯとした。ヘミンは、最終濃度２．４μＭで添加し、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）は、最終濃度５ｍＭで添加した。シグナルは、２５℃の温度条件下で、最終濃度５ｍＭのＨ２Ｏ２添加１分後に測定した。すると、図３に示されるように、電気化学的な検出方法を用いて、ＤＮＡザイムの活性を検出することができた。【０１２４】
上記の電気化学検出マイクロアレイは、半導体電極のシグナル制御によりＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ法を用いて、チップ上で最大１２，０００種類のＤＮＡを合成することができる。従って、電気化学検出マイクロアレイを用いれば、１回で最大１２，０００種類のＤＮＡ分子のスクリーニングができることが示唆された。【０１２５】
実施例Ａ３：一次スクリーニング
配列と検出感度のおおざっぱな関連性を見るために、第１段階目のスクリーニングでは、設計された配列の内の一部について、スクリーニングを行った。【０１２６】
まず、実施例Ａ１により得られた候補配列数が膨大であったため、スクリーニングのために実施例Ａ１で設計したＤＮＡ分子を、二次構造推定により計算されるＤＮＡ分子全体の自由エネルギー（ｄＧ）（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（すなわち、フォールディング前と二次構造形成後の自由エネルギーの差）に基づいて選別し、スクリーニングに供した。具体的には、同一のｄＧを示すＤＮＡ配列については、ランダムにその一つのみを選択してスクリーニングに供することとして、ｄＧに基づいて選別を行った。スクリーニングに供したＤＮＡ配列の数とＭおよびＪとの関係は、表３の通りであった。【０１２７】
【表３】
2013161964.tif 000005
【０１２８】
次に、選別した塩基配列を有するＤＮＡ分子をこのマイクロアレイ上に合成した。合成の際には、上述のようにＤＮＡ分子の３’末端にリンカーとして１５塩基のポリＴ配列を付加した（図４）。このＤＮＡ分子は、ＤＮＡアプタマー領域にＡＭＰが結合すると初めて、配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡザイムが遊離状態になりへミンと錯体を形成して、ＡＢＴＳを酸化し、Ｈ２Ｏ２を還元することができる（図５）。【０１２９】
実施例Ａ２とバッファー条件、基質濃度および温度条件等の測定条件は変えずに、ＡＭＰ濃度のみを０ｍＭまたは５ｍＭ添加し、それぞれ３０分室温でインキュベートしてから、各分子のＤＮＡザイム活性のＡＭＰ濃度依存性を確認した。ＡＭＰを５ｍＭ添加した条件の測定は２回繰り返し行い、添加していない条件は１回行った。ＤＮＡ分子のエフェクター領域の活性化の程度は、ＡＭＰを５ｍＭ添加したときの２回の平均値を、添加しないときの値で割ることにより、測定シグナルのシグナル比として評価した。【０１３０】
測定シグナルの比は、図６に示される通り、２回の繰り返し実験で高い再現性を示した。まずこのことから、電気化学的測定は、再現性が高い測定方法であることが分かった。さらに、ＤＮＡ分子の塩基配列とシグナル比との関連を調べるために、アプタマーマスク配列およびジャンクション領域のそれぞれに対して、その長さ、インターナルループ数およびバルジループ数と、シグナル比との関連を調べ、グラフ化した（図７）。すると、図７Ａに示されるように、アプタマーマスク領域の長さは、４塩基長であることが好ましく、インターナルループ数およびバルジループ数はそれぞれ、１および０であることが好ましいことが明らかとなった（図７ＢおよびＣ）。また、図７Ｄに示されるように、ジャンクション領域の長さは、３塩基長が最も好ましいことが明らかとなった。ジャンクション領域におけるインターナルループ数は、０も１もほとんど違いは見られなかった（図７Ｅ）。【０１３１】
二次構造形成によるＤＮＡ分子全体の自由エネルギー（ｄＧ）（すなわち、フォールディング前と二次構造形成後の自由エネルギーの差）をＵＮＡｆｏｌｄを用いて計算し、得られたシグナル比との関係をグラフ化した（図７Ｆ）。すると、ｄＧの値が小さいほど、シグナル比が小さくなる傾向が見られた。また、ｄＧが、−１４〜−４ｋｃａｌ／ｍｏｌで高いシグナル比を示すものが見られ、−８〜−６ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合に特に高いシグナル比を示すものが見られた。この結果から、ＤＮＡ分子のｄＧが、ある一定の範囲の値であることが、ＤＮＡ分子が高感度にリガンドを検出する上で重要であることが示唆された。【０１３２】
さらに、上記で行ったスクリーニングにより最も高いシグナル比を示したＤＮＡ分子（すなわち、ＡＭＰを最も高感度に検出できるＤＮＡ分子）６種類について、別法による活性の再検証を行うと共に、その配列を調べた。具体的には、ＡＢＴＳはＤＮＡザイムによって酸化されると４１４ｎｍに吸光を示すようになるため、吸光測定法により吸光度の変化を調べることにより、酸化型ＡＢＴＳの量が定量でき、これにより、ＤＮＡザイムの活性化の度合いを評価することができる。そこで、測定バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）に、６種類のＤＮＡ分子それぞれを１２．５μＭとなるように添加し、ヘミンを０．５μＭ、ＡＢＴＳは５ｍＭとなるように添加した。さらに、ＡＭＰを０ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ、２．５ｍＭまたは５．０ｍＭとなるように添加した。吸光は、最終濃度５ｍＭのＨ２Ｏ２を加えて反応を開始させてから５分後に測定した。測定は３回繰り返し行った。４１４ｎｍにおけるＡＢＴＳの吸光度変化ΔＡ４１４ｎｍは、ΔＡ４１４ｎｍ＝［ＡＭＰ添加時の平均吸光度］−［ＡＭＰ無添加時の平均吸光度］−［ＡＭＰを添加しＤＮＡ無添加としたときの平均吸光度］により算出した。【０１３３】
結果は図８に示される通りであった。すなわち、６種類のＤＮＡ分子（ぞれぞれＴＭＰ−１〜６と呼ぶ）のうち、ＴＭＰ−１、５および６は、吸光測定によってもＡＭＰ濃度依存的にＤＮＡザイムの活性が上昇した。一方で、ＴＭＰ−２〜４は、スクリーニングでは高いシグナル比を示したものの、吸光測定によってはＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性の上昇は見られなかった。【０１３４】
ＴＭＰ−１〜６で予測されるアプタマーマスク領域とジャンクション領域の二次構造およびＤＮＡ配列は図９の通りであった。すなわち、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示したＴＭＰ−１、５および６は、いずれも、ＡＭＰ非存在下で、アプタマーマスク領域で２個のＴ−Ａの塩基対と、１個のインターナルループ、および１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成すると予測されるものであった。さらに、アプタマーマスク領域の長さはいずれも４塩基長であり、ジャンクション領域の長さはいずれも３塩基長であった。また、二次構造推定により計算される、塩基対非形成時と塩基対形成時との自由エネルギー（ｄＧ）は、ＴＭＰ−１、５および６のいずれも−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であった。また、ＴＭＰ−１、５および６のいずれのＤＮＡ分子のアプタマーマスク領域およびジャンクション領域も、ＡＭＰ非存在下では、（全長にわたりすべての塩基が塩基対を形成するような）完全なハイブリダイゼーションを形成せず、インターナルループやバルジループを含んでいた。また、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示したＴＭＰ−１および６は、ＡＭＰ非存在下で、ジャンクション領域の配列がすべてＡ−Ｔの塩基対を形成した。【０１３５】
特に、ＴＭＰ−３では、ＴＭＰ−１、５および６と同一のアプタマーマスク配列を有するにも関わらず、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性の上昇を示さなかった。ＴＭＰ−３のｄＧは、−１０．０７ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、また、ジャンクション領域でＧ−Ｃの塩基対を２個形成し、二次構造が安定化しすぎてしまった（すなわち、ｄＧが小さくなりすぎた）ためにＡＭＰの結合の際に構造変化を起こすことができなかったと考えられる。すなわち、この結果から、ｄＧが一定値以上であることが好ましいこと、および、ジャンクション領域ではＧ−Ｃの塩基対は０個か１個であることが好ましいことが示唆された。【０１３６】
ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性の上昇を示さなかったＴＭＰ−２〜４では、二次構造推定により計算される自由エネルギー（ｄＧ）がいずれも−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌより小さく、ＡＭＰ非存在下における二次構造が高度に安定化していることが分かった。すなわち、ＤＮＡザイムが活性を示すためには、ＡＭＰアプタマーへのＡＭＰの結合に伴って、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域の塩基対が解消される必要があり、これらの領域はハイブリダイゼーションにより安定化しすぎていてはならないことが示唆された。また、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示さなかったＴＭＰ−２および４では、ＡＭＰ非存在下で、アプタマーマスク領域のすべての塩基が塩基対を形成し、ＴＭＰ−２では、さらに、ＡＭＰ非存在下で、ジャンクション領域のすべての塩基が塩基対を形成し、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域の全長にわたってすべての塩基が塩基対を形成した。このことから、アプタマーマスク領域またはジャンクション領域のいずれかでは、ＡＭＰ非存在下で、少なくとも１個のインターナルループまたはバルジループが形成されることが好ましいと考えられる。【０１３７】
このように、ＡＭＰアプタマー領域とＤＮＡザイム領域とをつなぐアプタマーマスク領域およびジャンクション領域が、一定の長さを有し、かつ、上記のような一定の規則を有している場合には、ＤＮＡ分子がＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性の上昇を示す高感度なセンサーとして機能することが示唆された。また、二次構造推定により計算される自由エネルギー（ｄＧ）は、大きすぎると構造が不安定となり、ＤＮＡのセンサーとして機能を発揮するための基本的な二次構造（例えば、式（Ｉ）の構造）が取りにくくなり、また、小さすぎると構造が安定化しすぎており、ＡＭＰが分子に結合した際に、二次構造の構造変化を起こしにくくなることが予想され、ＤＮＡ分子のｄＧは、−１０〜−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであることが好ましいことが示唆された。【０１３８】
なお、配列番号２０の配列を有する既知のＤＮＡセンサーと、本実施例で取られたＴＭＰ−５とのＡＭＰセンサーとしての感度を吸光測定により比較したところ、図８Ａ、ＥおよびＦに示されるように、吸光度変化は、既知のＤＮＡセンサーでは約０．１であるのに対して、ＴＭＰ−５では０．３と吸光度変化が大きく、センサーとしての感度に優れることがわかった。また、ダイナミックレンジは、既知のＤＮＡセンサーでは１オーダー程度（約０．０５ｍＭ〜約０．５ｍＭ）であるのに対して、ＴＭＰ−５では３オーダー程度（約０．００５ｍＭ〜約５ｍＭ）であり、幅広い濃度域でセンサーとして用い得る広いダイナミックレンジを有していた。このように、ＴＭＰ−５は、センサーとしての感度およびダイナミックレンジの両方で、配列番号２０の配列を有する既知のＤＮＡセンサーを凌駕した。ＴＭＰ−５同様に、ＴＭＰ−１および６についても、高い感度と広いダイナミックレンジを有していた。なお、配列番号２０の配列を有する既知のＤＮＡセンサーでは、ＡＭＰ非存在下における二次構造形成時の自由エネルギーｄＧは、−１２．７９ｋｃａｌ／ｍｏｌと計算された。【０１３９】
また、これらの結果から、実施例Ａ２において構築したスクリーニング系は、リガンドに対して高感度に反応して活性化する本発明のＤＮＡ分子のスクリーニングに有用であることも明らかとなった。【０１４０】
実施例Ａ４：二次スクリーニング
二次スクリーニングでは、一次スクリーニングから得られたＤＮＡセンサーが高感度となる条件を満たす配列を網羅的にスクリーニングした。【０１４１】
一次スクリーニングの結果によれば、ＡＭＰを高感度で検出できるＤＮＡ分子は、（i）アプタマーマスク領域の長さが４塩基長であり、（ii）ジャンクション領域の長さが３塩基長であり、かつ（iii）ジャンクション領域でのＧ−Ｃの塩基対は多くても１個であるとの条件を満たしていた。また、（iv）アプタマーマスク領域とジャンクション領域が二次構造を形成するときのｄＧは−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上と計算された。【０１４２】
従って、この上記（i）〜（iv）条件をすべて満たし、かつ、ＵＮＡｆｏｌｄを用いてＤＮＡの二次構造を予測した場合に、（v）ＡＭＰ非存在下で、ヘアピンループ構造の二次構造が唯一推定されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子のすべてを二次スクリーニングの対象とした（二次スクリーニングではこれに加えて、アプタマーマスク領域の長さが５塩基長のものも含めた）。予測の際には、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域において、１個以上のインターナルループまたはバルジループが含まれていてもよいこととした。得られたＤＮＡ配列の数とＭおよびＪとの関係は、表４の通りであった。【０１４３】
【表４】
2013161964.tif 000006
【０１４４】
得られた配列の３’末端に１５塩基のポリＴ配列を付加した配列を付加して、実施例Ａ２と同様にアレイ上でＤＮＡ分子を合成した。実施例Ａ２と同様にシグナルを測定し、ＡＭＰの５ｍＭ添加時と非添加時とでシグナルを測定し、シグナル比を計算した。【０１４５】
その結果、実施例Ａ３で得られたＴＭＰ−５よりも、大きなシグナル比を示すＤＮＡ分子が５５例見つかった。これら５５例のＤＮＡ分子それぞれを、実施例Ａ３と同様に吸光測定により再検証した。【０１４６】
５５例のうち７例は、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が見られたＴＭＰ−１、５および６と同様に、アプタマーマスク領域で、２個のＴ−Ａの塩基対と、１個のインターナルループ、および１個のＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成すると予測されるものであった（図１０）。この７例のうち、ｄＧが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満と計算された２例（図１０ＡおよびＢ）は、吸光測定によっても、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が確認され、ｄＧが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であると計算された５例は、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇は確認できなかった（図１０Ｃ〜Ｇ）。【０１４７】
ＴＭＰ−５よりも大きなシグナル比を示す上記以外のＤＮＡ分子４８例を吸光測定すると、そのうちの６例で、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が確認された（図１１）。これらの６例においては、いずれのＤＮＡ分子のｄＧも、−６．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であり、ｄＧが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下と計算された４例は、特に高感度なＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示した（図１１Ａ、Ｃ、ＤおよびＦ）。この６例においては、アプタマーマスク領域で、２個の塩基対および１個のＴ−Ｇミスマッチペアを形成するもの（図１１ＡおよびＢ）、３個の塩基対を形成するもの（図１１ＣおよびＤ）、並びに４個の塩基対を形成するもの（図１１ＥおよびＦ）が見られた。いずれの場合も、アプタマーマスク領域ではインターナルループまたはバルジループのいずれかを有していた。【０１４８】
上記５５例中、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示す上記の６例と同じアプタマーマスク配列を有するものでも、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が見られなかったものも存在した（図１２）。具体的には、２個の塩基対、１個のインターナルループおよび１個のＴ−Ｇミスマッチペアを形成するものに関しては５例（図１２Ａ〜Ｅ）、３個の塩基対を形成するものに関しては１２例（図１２Ｆ〜Ｑ）、４個の塩基対を形成するものに関しては７例（図１２Ｒ〜Ｘ）が見出された。【０１４９】
なお、リガンド依存的なエフェクター領域の活性化を引き起こすＤＮＡ分子において、アプタマーマスク領域とハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域の３’末端は、多くのケースで４塩基長であったが、アプタマーマスク領域が５塩基長のときには、最大で７塩基のＤＮＡ分子が見出された（データ示さず）。【０１５０】
実施例Ａ５：アプタマーマスク領域とジャンクション領域におけるミスマッチ塩基対の種類
本実施例では、一次スクリーニング（実施例Ａ３）および二次スクリーニング（実施例Ａ４）の結果得られた高感度なＤＮＡ分子と低感度なＤＮＡ分子とを比較して、ミスマッチ塩基対の種類がＤＮＡ分子の感度に及ぼす影響を評価した。【０１５１】
ミスマッチ塩基対の存在は、ＤＮＡの二次構造の安定性に影響することが知られている（SantaLucia, J. Jr. and Hick, D. (2004) Annu. Rev. Biophys. Biom.）。また、ミスマッチ塩基対によるＤＮＡの二次構造の安定性への影響は、隣接する塩基対の種類によって変わる。そこで、吸光測定により高感度とされる配列と低感度とされる配列とで、ミスマッチ塩基対によるＤＮＡ分子のｄＧに対する影響を調べた。ｄＧに対するミスマッチ塩基対の影響（ｄｄＧ）の評価は、SantaLucia, J. Jr. and Hick, D. (2004) Annu. Rev. Biophys. Biom.に開示された方法を用いてＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８を用いて行った。調べたＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子全体が二次構造を形成する際のｄＧが、−９〜−６ｋｃａｌ／ｍｏｌのものに限定した。【０１５２】
その結果、図１３に示されるように、アプタマーマスク領域が４塩基長である場合には、アプタマーマスク領域におけるミスマッチ塩基対によるｄＧへの影響は、大きいほど好ましいことが分かった。ｔ検定を行ったところ、吸光測定により高感度であることが確認された５例とそれ以外の１０例では、統計的に有意な差が見られた（図１３Ａ；ｐ＜０．０５）。アプタマーマスク領域が４塩基長である場合にはまた、ジャンクション領域におけるミスマッチ塩基対によるｄＧへの影響は小さいほど良いことが分かった（図１３Ｂ；ｐ＜０．０５）。【０１５３】
このように、インターナルループを形成するミスマッチ塩基対の種類によって、ＤＮＡ分子の感度が変動することが示唆された。【０１５４】
一方、アプタマーマスク領域が５塩基長である場合には、ミスマッチ塩基対によるｄＧへの影響とＤＮＡ分子の検出感度とには統計的に有意な差は見られなかった。【０１５５】
実施例Ａ６：ＤＮＡ分子のセンサーとしての最適化
本実施例では、実施例Ａ３にて得られ高感度なＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示したＴＭＰ−５について、アプタマーマスク領域およびジャンクション領域にのみにおいて配列の改変を行ってＤＮＡ分子のセンサーの最適化を試みた。【０１５６】
まず、作成したＴＭＰ５−１〜５およびＴＧ１について、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を吸光測定により確認した（図１４）。すると、ＴＭＰ５−１、２、５およびＴＧ１（図１４Ｂ〜Ｅ）については、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が確認されたが、ＴＭＰ５−３および４（図１４ＦおよびＧ）については、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇はほとんど示さなかった（ＴＭＰ−５については、図１４Ａを参照）。【０１５７】
配列番号１２の配列を有するＤＮＡセンサー（ＴＭＰ５−１）は、ＡＭＰが結合すると、ＤＮＡアプタマー領域において、図１４Ｈのような立体構造を形成すると考えられる。アプタマーマスク領域とジャンクション領域１とは、ＡＭＰと結合すると、４塩基３’側の塩基と塩基対を形成し（図１４Ｈ）、この状態で安定化することにより、ＤＮＡザイムの活性状態が保たれると考えられる。そこで、作成したＴＭＰ５−１〜５およびＴＧ１について、ＡＭＰ結合時に形成される塩基対を調べた。【０１５８】
ＡＭＰ結合時のアプタマーマスク領域とジャンクション領域２とのハイブリダイゼーションについて検討したところ、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示したＴＭＰ５−１、２、５およびＴＧ１は、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２との間で２個以上の連続した塩基対を形成することが明らかとなった（図１４Ａ〜Ｅの矢印）。また、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇はほとんど示さなかったＴＭＰ５−３および４では、バルジループまたはインターナルループを挟んで２個の塩基対を形成していた（図１４ＦおよびＧ）。また、ＴＭＰ５−１や５−ＴＧ１などのように、ｄＧが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の場合であっても（ＴＭＰ５−１はｄＧが−６．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上）、ＡＭＰ結合時に、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２との間で２個以上の連続した塩基対を形成する場合には、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示した（図１４ＢおよびＥ）。【０１５９】
このことから、ＡＭＰ結合後の構造を安定化させる要因を有することは、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇を示す上で重要であることが示唆された。また、ＡＭＰ非存在下での二次構造が多少不安定であったとしても（例えば、ｄＧが、−６．５〜−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌであっても）、ＡＭＰ結合後の構造を安定化させる要因を有することによって、ＡＭＰ濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が示されることがあることも明らかとなった。また、ＡＭＰ結合後の構造を安定化させる具体的な要因として、ＡＭＰ結合時に、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２との間で２個以上の連続した塩基対を形成することが重要であることが明らかとなった。【０１６０】
実施例Ａ７：アルギニンアプタマーの検出のためのＤＮＡ分子
本実施例では、ＡＭＰアプタマー以外への適用可能性を検証するため、ＤＮＡアプタマー領域をアルギニンアプタマーに置き換えて同様の実験を行った。【０１６１】
まず、ジャンクション領域の長さを３塩基長とし、配列はＴＭＰ−５のジャンクション領域と同一とした。次に、アプタマーマスク領域は、アルギニンアプタマーの３’末端の４塩基との間で３個の塩基対と一つのインターナルループを作るように設計した（配列番号１９の塩基配列を有するＴＭＰ−５Ａｒｇ）。ＵＮＡｆｏｌｄによれば、設計したＤＮＡ分子は、図１５Ａに示される二次構造を形成すると推定された。また、アルギニン結合後の構造は、図１５Ａの矢印で示されるように、アプタマーマスク領域とジャンクション領域２との間で２個の連続した塩基対を形成すると推定された。コントロールＤＮＡ分子としては、図１５ＡのＤＮＡ分子のうち、アプタマーマスク領域は、アルギニンアプタマーの３’末端の４塩基との間で完全な塩基対を４個形成し、ジャンクション領域の長さは２塩基長としたＤＮＡ分子を用いた（図１５Ｂ）。測定条件は、ＡＭＰをアルギニンに置き換える以外は、実施例Ａ３と同様に行った。【０１６２】
すると、図１５Ｃに示されるように、ＴＭＰ−５Ａｒｇは、アルギニン濃度１０ｍＭの場合に、コントロールと比較して、２倍以上の吸光変化を示した。このように、ＡＭＰアプタマーで行われた実施例Ａ１〜５の結果は、アルギニンアプタマーを用いた場合でも普遍的に成立することが明らかとなった。【０１６３】
実施例Ｂ１：パツリンＤＮＡアプタマーの設計
本実施例では、パツリン結合性ＤＮＡアプタマー分子の取得を試みた。【０１６４】
実施例Ａ３において得られたＴＭＰ−５分子を用い、ＤＮＡアプタマー領域のみを改変して、パツリン結合性ＤＮＡアプタマー分子の取得を試みた。【０１６５】
まず、パツリンアプタマー領域の設計を行った。本実施例で用いた、電気化学検出マイクロアレイ（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ１２ｋマイクロアレイ、製品番号：１００００８１）の制約上、スクリーニングに供することができるサンプルが１２，０００サンプルに限られたため、パツリンアプタマーの設計は、以下の制約条件を設けて行った。すなわち、（条件１）パツリンアプタマー領域部分が、３０塩基長であること、（条件２）パツリン非存在下で１つのみループを形成すること、（条件３）ループが３〜７塩基長のヌクレオチドから形成されること、および（条件４）ステム部分で形成する塩基対の数が６〜９個であることの制約条件を設けてＤＮＡ分子を設計した。二次構造予測により、アプタマーマスク領域がアプタマーの３’末端とハイブリダイズし、かつジャンクション領域１がジャンクション領域２とハイブリダイズする構造が予測される配列を絞り込んだところ、候補分子数が、約１２，０００種類になった。アレイ上に合成した候補分子の配列数の内訳は表５の通りであった。【０１６６】
【表５】
2013161964.tif 000007
【０１６７】
実施例Ｂ２：パツリンＤＮＡアプタマーの取得
本実施例では、パツリン結合性ＤＮＡアプタマー分子の取得を試みた。【０１６８】
スクリーニングは、ＤＮＡザイムの活性化を電気化学的に検出する系を用いて行った。電気化学的な検出には、電気化学検出マイクロアレイ（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ１２ｋマイクロアレイ、製品番号：１００００８１）および検出器（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ検出器、製品番号：６１００３６）を用いた。【０１６９】
設計した１２，０００種類のＤＮＡ分子を、１スポット１種類の要領でこのマイクロアレイ上に合成した。合成の際には、上述のようにＤＮＡ分子の３’末端にリンカーとして１５塩基のポリＴ配列を付加した（例えば、図４を参照）。反応バッファーは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＤＭＳＯとした。反応バッファーに５ｍＭと１００μＭのパツリンを添加してから室温で３０分間インキュベートした。ヘミンは、最終濃度２．４μＭで添加し、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）は、最終濃度５ｍＭで添加した。シグナルは、２５℃の温度条件下で、最終濃度５ｍＭのＨ２Ｏ２添加１分後に測定した。各スポットの電気シグナルをパツリン存在下および非存在下で測定し、電気シグナル比（パツリン存在下／パツリン非存在下）を算出した。【０１７０】
図１６には、ＡＭＰアプタマー領域の代わりに実施例Ｂ１で設計したパツリンアプタマー領域を含んでなるＴＭＰ−５分子の二次構造の代表例が示され（図１６Ａ）、また、２つのプローブ両方で２倍以上のシグナルの倍数変化を示した１４配列（パツリン５ｍＭ、図１６Ｂ）および３２配列（パツリン１００μＭ、図１６Ｃ）の電気シグナル比がプロットされている。電気シグナル比が２倍以上となった配列として図１６Ｂに示された配列のうち、パツリン濃度５ｍＭでの倍数変化の２回の実験での平均が４倍以上となった６配列（候補群１（First-Candidate）−１〜１−６）、および、電気シグナル比が２倍以上となった配列として図１４Ｃに示された配列のうち、パツリン濃度１００μＭでの倍数変化の２回の実験での平均が３倍以上、または、パツリン濃度５ｍＭでの電気シグナル比の平均が２以上となった１２配列（候補群２（Second-Candidate）−１〜２−１２）について、ＡＢＴＳを用いた比色試験により再現性の検討を行った。【０１７１】
結果は図１７に示される通りであった。すなわち、候補群１−１〜１−６のＤＮＡ分子のうち２つ（候補群１−５および１−６）、および、候補群２−１〜２−１２のＤＮＡ分子のうち１つ（候補群２−７）が、比色試験によってもパツリン濃度依存的なＤＮＡザイムの活性上昇が確認された。また、測定には高い再現性が見られた。最も感度が高いと思われた候補群２−７については、パツリンを０ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭまたは０．５ｍＭとなるように添加し、低濃度側で検出感度の検討を行った（図１８）。また、４℃で同様の検討を行ったところ、測定誤差が小さくなり、パツリンをさらに高感度に検出できることが分かった（図１８）。その結果、候補群２−７は１０μＭの濃度のパツリンの検出が可能であることが分かった。また、候補群１−５および１−６についても検討したところ、これらの分子は数百μＭオーダーのパツリンの検出が可能であった（データ省略）。それぞれのＤＮＡ分子のパツリンアプタマー領域の二次構造の推定結果を図１９に示した。以下、候補群２−７は、ＳＣ−７とも呼ぶことがある。【０１７２】
また、これらの分子の塩基配列は表６の通りであった。【０１７３】
【表６】
2013161964.tif 000008
【０１７４】
また、これらの分子のパツリンアプタマー領域部分の塩基配列は表７の通りであった。【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
次に、高感度を示したＤＮＡアプタマーの結合特異性を確認するため、配列番号：２３の塩基配列を有するパツリンＤＮＡアプタマーを用いて、パツリンと構造の近いベンゾフランおよび（Ｓ）−パツリンメチルエーテル（図２０）を用いて結合特異性を確認した。すると、得られたパツリンＤＮＡアプタマーは、ベンゾフランおよび（Ｓ）−パツリンメチルエーテルには結合せず、パツリンに対して結合特異性を示すことが明らかとなった（図２０）。【０１７７】
実施例Ｃ１：パツリンＲＮＡアプタマー分子の取得
本実施例では、パツリンに結合するＲＮＡアプタマー分子の取得を試みた。【０１７８】
検出対象となるパツリンは、和光純薬社製のパツリンを用いた。パツリンＲＮＡアプタマー分子は、約６×１０１４の多様性を有する３５ヌクレオチドのランダムＲＮＡのプールからパツリンへの結合を指標としてＲＮＡ分子をスクリーニングする手法を採用した。パツリンとの結合を検出するために、ＲＮＡ分子は自己切断型リボザイムに組み込んで合成し（図２１Ａ参照）、パツリン結合依存的に生じる自己切断を検出することにより、パツリンＲＮＡアプタマーをスクリーニングすることとした。また、スクリーニングの際には、改良ＳＥＬＥＸ法（Makoto Koizumi et al., Nature Structural Biology (1999) 6: 1062-1071）を用いて、高いパツリン結合性を有するＲＮＡアプタマーの取得を試みることとした。【０１７９】
約６×１０１４の多様性を有する３５ヌクレオチドのランダムＲＮＡを自己切断型リボザイムの領域に組み込んだＲＮＡ構築物（図２１Ａ参照）は、化学合成によって得られた鋳型ＤＮＡ（配列番号：２７）を、フォワードプライマー（配列番号：２８）およびリバースプライマー（配列番号：２９）を用いてＰＣＲを行った。【０１８０】
ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（フナコシ社製、製品番号：Ｅ００００７）を用いて表８の組成で、９４℃３０秒、６１℃３０秒のサイクルを４回繰り返すことにより行った。【０１８１】
【表８】
2013161964.tif 000010
【０１８２】
ＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡおよびプライマーは表９の通りとした。【０１８３】
【表９】
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【０１８４】
得られたＰＣＲ産物１００μｇをＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて転写してＲＮＡ分子を合成した。【０１８５】
パツリン依存的なＲＮＡの自己切断は以下のように検出した。すなわち、１μＭのＲＮＡプールを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に溶解し、アプタマーに正しい立体構造をフォールディングさせるために、９５℃で２分間加熱した後、室温で３０分〜２時間冷却した。【０１８６】
パツリン非存在下でも自己切断が生じてしまう分子を除去するため（ネガティブセレクション）に、まず、パツリン非存在下で、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加してから室温で３０分〜１２時間ＲＮＡをインキュベートした。１０％変性ＰＡＧＥ（８Ｍ尿素含有ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分離によって、パツリン非存在下においても自己切断されてしまうパツリン非結合ＲＮＡを除去した。自己切断を起こさなかったＲＮＡは、自己切断を起こしたＲＮＡからバンドとして明確に分離し、ゲルを切り出して溶出することにより容易に回収することができた。続いて、回収したＲＮＡを１μＭの濃度になるように５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に溶解した。その後、アプタマーに正しい立体構造をフォールディングさせるために、再度９５℃で２分間加熱した後、室温で３０分〜２時間冷却した。その後、パツリンおよび２０ｍＭのＭｇ２＋を含有する溶液を添加し、室温で５分〜３０分インキュベートすることにより、パツリン依存的なＲＮＡ分子の自己切断を誘導した。インキュベート後、再び変性ＰＡＧＥによりパツリンと結合して自己切断を起こしたＲＮＡ分子を回収した。【０１８７】
回収されたパツリンＲＮＡアプタマーのプールに含まれるＲＮＡに対して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（インビトロジェン社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡプールを得た。得られたｃＤＮＡプールに対して、Ｔ７プロモーター配列を含む配列番号：２８のフォワードプライマーと、自己切断により欠損した配列を含む配列番号：２９のリバースプライマーとを用いて、ＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター配列および自己切断前の配列を含むＤＮＡプールを取得した。その後、ＰＣＲ産物をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて転写して次のラウンドに用いるＲＮＡプールを得た。【０１８８】
上記、フォールディング、ネガティブセレクション、ポジティブセレクション、変性ＰＡＧＥ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＲＮＡ分子への転写のサイクル（改変ＳＥＬＥＸ法）のサイクルを１１ラウンド行い、パツリンＲＮＡアプタマーをコードするＤＮＡ分子を得た。得られたＤＮＡ分子は、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化し、塩基配列を決定した。【０１８９】
このようにして得られたＤＮＡ分子から、パツリンＲＮＡアプタマーおよびＲＮＡ構築物の配列を推定したところ、配列番号：３３のパツリンＲＮＡアプタマーを含む配列番号：３０のＲＮＡ構築物、および配列番号：３４のパツリンＲＮＡアプタマーを含む配列番号：３１のＲＮＡ構築物を得た。また、別プールの鋳型を用いて上記と同様の方法で改変ＳＥＬＥＸ法のサイクルを９ラウンド行った結果、配列番号：３５のパツリンＲＮＡアプタマーを含む配列番号：３２のＲＮＡ構築物を得た。【０１９０】
得られたＲＮＡ構築物の配列は表１０の通りであった。【０１９１】
【表１０】
2013161964.tif 000012
【０１９２】
また、得られたＲＮＡ構築物中のパツリンＲＮＡアプタマー部分の塩基配列は表１１の通りであった。【０１９３】
【表１１】
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【０１９４】
また、配列番号３０〜３２のパツリンＲＮＡアプタマー部分の二次構造をＭｆｏｌｄプログラム（http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi）を用いて分析したところ、図２１に示される二次構造が予測された。【０１９５】
実施例Ｃ２：得られたパツリンＲＮＡアプタマーを含むＲＮＡ構築物の検出感度の測定
本実施例では、実施例Ｃ１で得られたＲＮＡ構築物についてパツリン検出感度を確認した。【０１９６】
配列番号３０〜３２のＲＮＡ構築物の塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するＤＮＡ（塩基配列中のＵはＤＮＡではＴに対応する）を鋳型にして、配列番号：２８のフォワードプライマーと配列番号：２９のリバースプライマーを用いて実施例Ｃ１と同様の方法により、ＰＣＲを行った。その結果生じたＤＮＡ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、キアゲン）を用いて精製した。  得られたＤＮＡを鋳型としてＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ）を用い、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ転写によりＲＮＡを合成し、変性ＰＡＧＥにより精製して、ＲＮＡ構築物を得た。【０１９７】
各ＲＮＡ構築物（１μＭ）を９５℃で２分間加熱した後、室温で３０分〜２時間冷却し、次いで、０ｍＭ（コントロール）または１ｍＭのパツリンと共に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むバッファー中にて２５℃で８分間インキュベートして、各ＲＮＡ構築物とパツリンとを結合させ、ＲＮＡ構築物の自己切断を誘導した。得られた反応産物を、変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、ゲル中のＲＮＡをＬａｓ−４０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を使用して視覚化した。各バンドの強度は、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  Ｖｅｒ３．０ソフトウェア（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を使用して各レーンにロードしたＲＮＡ量で標準化して決定した。パツリン非存在下でもＭｇ２＋イオン存在下では自己切断が見られる場合があるが、パツリン存在下では、自己切断を起こしたＲＮＡ分子が有意に増加した（図２２ＡおよびＢ）。【０１９８】
次に得られた配列番号３０を有するＲＮＡ構築物についてパツリン検出感度を確認した。このＲＮＡ構築物は、１００μＭの濃度のパツリンを検出することができ、１００μＭ〜５ｍＭの濃度範囲でパツリンに対する用量依存的な自己切断活性の増加を示した（図２３）。【０１９９】
さらに、得られたＲＮＡ構築物のパツリンに対する結合特異性を確認するため、配列番号：３０の塩基配列を有するＲＮＡ構築物を用いて、パツリンと構造の近いテオフィリン（和光純薬社製）を用いて結合特異性を確認した。具体的には、パツリンの代わりに１ｍＭテオフィリンを添加した反応溶液を用いて、自己切断が生じるか否かを確認した。当該ＲＮＡ構築物は、パツリンにより自己切断が生じたが、テオフィリンによっては自己切断が生じず、パツリンに対して特異性を示すことが明らかとなった（図２４）。【０２００】
このように、本実施例では、パツリンに結合特異性を有する３種類のパツリンＲＮＡアプタマー分子、およびパツリンＲＮＡアプタマーと自己切断型リボザイムとを含むＲＮＡ構築物を得ることができた。【０２０１】
実施例Ｃ３：パツリンＲＮＡアプタマー領域における塩基の欠失
本実施例では、実施例Ｃ１で得られたＲＮＡ構築物の５’末端または３’末端を欠失させたときの自己切断活性を調べた。【０２０２】
配列番号：３４および配列番号：３５の塩基配列を有する２種類のパツリンＲＮＡアプタマーの５’末端または３’末端をそれぞれ４塩基ずつ欠失させ、欠失させたパツリンＲＮＡアプタマーを実施例Ｃ１と同様の方法で自己切断型リボザイムに組み込んでＲＮＡ構築物を調製した。【０２０３】
得られた２種類のＲＮＡ構築物それぞれを、２０ｍＭのＭｇ２＋を含有する溶液（組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中でパツリンと混合し、自己切断の有無をゲル電気泳動により確認した。【０２０４】
結果は、図２５に示す通りであった。確認した２種類のＲＮＡ構築物のいずれも、パツリンＲＮＡアプタマー部分の３’末端を欠失させた場合には活性が見られなくなったが、パツリンＲＮＡアプタマー部分の５’末端を欠失させた場合には自己切断活性が見られた。従って、確認した２種類のＲＮＡ構築物では、パツリンＲＮＡアプタマー部分の５’末端の塩基配列はパツリンを検出する上では必須ではなく、欠失させることが可能であることが示された。配列番号：３４および配列番号：３５の塩基配列を有する２種類のパツリンＲＮＡアプタマーの５’末端を４塩基欠失させたパツリンＲＮＡアプタマーの塩基配列はそれぞれ、配列番号：３６および配列番号：３７であり、これらを組み込んで得られたＲＮＡ構築物の塩基配列はそれぞれ、配列番号：３８および配列番号：３９である。すなわち、得られたＲＮＡ構築物の配列は表１２の通りであった。【０２０５】
【表１２】
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【０２０６】
このようにして、パツリンに結合性を示すパツリンＲＮＡアプタマーおよびパツリンＤＮＡアプタマーを取得することに成功した。また、これらのＲＮＡおよびＤＮＡはそれぞれ、自己切断型リボザイムや酸化還元型ＤＮＡザイムを用いた核酸構築物に組み込むことにより、パツリンとの結合を容易に検出することが確認できた。また、これらのパツリンＲＮＡアプタマーおよびパツリンＤＮＡアプタマーは、パツリンへの結合特異性も示した。従って、パツリンＲＮＡアプタマーおよびパツリンＤＮＡアプタマーは、サンプル中のパツリンのみを特異的に検出する系を構築する際に有用であることが示唆された。【０２０７】
実施例Ｄ１：パツリンアプタマー領域を含む本発明のＤＮＡ構築物である候補群２−７の高感度化
本実施例では、リガンド検出の高感度化を目的として、実施例Ｂ２で得られた候補群２−７のＤＮＡ構築物について、末端領域およびモジュール領域（すなわち、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２およびパツリンアプタマー領域の３’末端の４塩基）の塩基配列の最適化を試みた。【０２０８】
具体的には、まず、実施例Ｂ２で得られた候補群２−７（ＳＣ−７）のＤＮＡ構築物の末端領域の３塩基を５’−ＣＣＣ−３’から５’−ＣＣＣＡ−３’に変更した。【０２０９】
パツリンの検出は、吸光光度に基づき、実施例Ｂ２に記載した通りに行った。【０２１０】
その結果、末端領域の３塩基を５’−ＣＣＣＡ−３’に改変したＤＮＡ構築物では、濃度依存的な吸光度の変化が顕著となった（図２６）。以下、上記改変したＤＮＡ構築物をＳＣ−７−ＣＣＣＡ（配列番号：４０）とよぶ。また、ＴＭＰ−５の末端領域の３塩基を５’−ＣＣＣ−３’から５’−ＣＣＣＡ−３’に改変したＴＭＰ−５−ＣＣＣＡを用いた場合でも濃度依存的な吸光度の変化が顕著となった（図２７）。【０２１１】
実施例Ｄ２：りんご製品中のパツリンの検出
本実施例では、実施例Ｄ１で得られたＳＣ−７−ＣＣＣＡを用いてりんごジュースサンプル中のパツリンの検出が可能であるかを確認した。【０２１２】
りんご製品のパツリンの量は製品の品質の基準として用いられている。厚生労働省は２００３年１１月、りんご果汁にパツリンの規格基準５０ｐｐｂ以下（３２４ｎＭ以下) を設定 した(WHOの規格基準と同一)（http://www.nihs.go.jp/dmb/paturin.html）。そこで、ＳＣ−７−ＣＣＣＡを用いて、実際のりんごジュースサンプルに３００ｎＭの濃度（すなわち、上記規格基準以下）になるようにパツリンを溶解し検出することを試みた。【０２１３】
パツリン無添加のサンプルと比較して視覚的な判断を行うには０．１程度の吸光度差が必要である。パツリンを最終濃度３００ｎＭとなるように添加した場合、０．１の吸光度差を得るためには、リンゴジュースを１００倍濃縮して３０μＭ程度になるように調整する必要があると考えられた（例えば、図２６参照）。そこで、りんごジュースサンプル（パツリン濃度３００ｎＭ）に含まれるパツリンは、POLYINTELL社のAFFINIMIP（商標）パツリン（リンゴジュース）として販売されるパツリン精製用のカラムを利用し、製造者マニュアルに従って精製した。【０２１４】
溶出した液は、エバポレーターにより減圧濃縮し、乾固させた。乾燥させたサンプルは反応バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＤＭＳＯ）により溶解した。得られた溶解液中のパツリンの最終的な濃度は２０μＭであった（高速液体クロマトグラフにより測定）。【０２１５】
得られた溶解液を用いて、実施例Ｂ２に記載するようにパツリンの検出を行った。その結果、無添加サンプルと比較して、パツリンを添加したサンプルでは、０．１程度の吸光度差を示し、結果として、りんごジュース中の規格基準５０ｐｐｂ以下の濃度のパツリンを視覚的に検出することができた（図２８、ｔ検定でｐ＝０．０３２）。【０２１６】
実施例Ｄ３：ＳＣ−７−ＣＣＣＡのモジュール領域の最適化
次に末端領域の配列を５’−ＣＣＣＡ−３’としたＳＣ−７−ＣＣＣＡのモジュール領域部分の最適化を試みた。【０２１７】
ＳＣ−７−ＣＣＣＡのモジュール領域部分は以下の条件を満たすように設計した：
条件１：アプタマーマスク領域の塩基長が４または５であり、
条件２：ジャンクション領域１および２の塩基長が３であり、
条件３：ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８の二次構造推定により計算されるＤＮＡ構築物のｄＧが、−１２〜−６（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、かつ、
条件４：アプタマーマスク領域とパツリンアプタマー領域の３’末端とで１つのインターナルループを形成する。【０２１８】
その結果、アプタマーマスク領域の塩基長が４である配列が２，７３７配列設計されたので、実施例Ｂ２に記載されたように電気化学検出マイクロアレイに１配列につき５スポットのＤＮＡを合成した。但し、本実施例では、ＤＮＡの３’末端に１塩基長のデオキシチミン（ｄＴ）付加した。【０２１９】
また、アプタマーマスク領域の塩基長が５である配列が８，５３５配列取得されたので、下記のルールに基づいて３，７５３配列に絞り込み、実施例Ａ２に記載されたように電気化学検出マイクロアレイに１配列につき３スポットのＤＮＡを合成した。本実施例では、ＤＮＡの３’末端に１塩基長のデオキシチミン（ｄＴ）付加した。３，７５３配列への絞り込みは、ＵＮＡｆｏｌｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８の二次構造推定により計算されるＤＮＡ構築物のｄＧを指標として１（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）毎にＤＮＡ構築物を分類してそれぞれグループを作り、各グループから、（各グループに分類された配列数）×約３，７５３個／８，５３５個の配列をランダムに選び出した。例えば、ｄＧが−８〜−７（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のＤＮＡ構築物の群を１つのグループとし、ｄＧが−７〜−６（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のＤＮＡ構築物の群を別の１つのグループとして分類した。【０２２０】
次に、実施例Ｂ２に記載した通りにパツリンの検出を行った。その後、パツリンの検出に適したＤＮＡ構築物を以下の基準で選抜した：
基準１：パツリン濃度１０μＭと１μＭとの電気シグナル比が２以上であり、かつ、
基準２：パツリン濃度１μＭと０μＭとの電気シグナル比が１以上である。【０２２１】
すると、基準１および２により１１個の候補配列が得られた。【０２２２】
次に、この１１の候補配列を有するＤＮＡ構築物を吸光測定法を用いて以下の基準でさらに選抜した：
基準３：パツリン濃度が０μＭであるときの吸光度の標準偏差σをＤＮＡ構築物それぞれについて算出し、吸光度がσ以上上昇するパツリン濃度がＳＣ−７−ＣＣＣＡより低いこと。【０２２３】
すると、基準３により１個のＤＮＡ構築物（配列番号：４１）が得られた。得られたＤＮＡ構築物をＳＣ−７−ＣＣＣＡ−ＴＭＰ−７と命名し、そのモジュール領域をＴＭＰ−７と命名する。このＤＮＡ構築物は、基準３におけるパツリン濃度が５μＭであり、ＳＣ−７−ＣＣＣＡの１０μＭよりも低かった（図２９）。また、パツリンの検量線の傾きは、このＤＮＡ構築物では、０．００２６であったのに対して、ＳＣ−７は０．０００５であり、ＳＣ−７−ＣＣＣＡは０．００３７であった。【０２２４】
得られたＳＣ−７−ＣＣＣＡとＳＣ−７−ＣＣＣＡ−ＴＭＰ−７の塩基配列を表１３に示す。
【表１３】
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【０２２５】
このように、本発明者らは、配列番号２０のＤＮＡ構築物を出発材料として、実施例Ａ３にて、モジュール領域以外を固定してモジュール領域だけを改変し、ＡＭＰを高感度に検出できる配列番号１〜１５の塩基配列を有するＤＮＡ構築物を得た。そして、実施例Ｂ２にて、得られたＴＭＰ−５をモジュール配列として有するＤＮＡ構築物のＤＮＡアプタマー部分のみを改変し、パツリンを検出できる配列番号２１〜２３の塩基配列を有するＤＮＡ構築物を得た。さらに、実施例Ｄ１にて、配列番号２３の塩基配列を有するＤＮＡ構築物（候補群２−７；ＳＣ−７）の末端領域を改変して、配列番号４０の塩基配列を有するＤＮＡ構築物（ＳＣ−７−ＣＣＣＡ）を得、また、モジュール領域を改変して、配列番号４１の塩基配列を有するＤＮＡ構築物（ＳＣ−７−ＣＣＣＡ−ＴＭＰ−７）を得た。【０２２６】
このようにして、本発明者らは、ＤＮＡ構築物の全体または一部を最適化した後に、ＤＮＡ構築物中の少なくとも１つの領域に対して改変を加えてＤＮＡ構築物をさらに最適化することができた。具体的には、実施例Ａ３およびＤ１において、モジュール領域を改変してＤＮＡ構築物のそれぞれＡＭＰおよびパツリンの検出感度を改善させ。また、実施例Ｄ１において、末端領域を改変してＤＮＡ構築物をさらに最適化することができた。【０２２７】
また、本発明者らは、実施例Ｂ２において、ＤＮＡ構築物の一部の領域、すなわち、ＡＭＰアプタマー領域をパツリンアプタマー領域に置き換えてもＤＮＡ構築物の最適化が可能であることも示した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月22日(2014.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）。
【請求項２】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）。
【請求項３】
アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項４】
ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項５】
ジャンクション領域１およびジャンクション領域２が、それぞれ３塩基長である、請求項４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項６】
アプタマーマスク領域が、４または５塩基長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項７】
アプタマーマスク領域が、リガンド非存在下で、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’側末端または前記ＤＮＡアプタマー領域の５’側末端との間で、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する、請求項６に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項８】
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端またはＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項９】
ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、請求項８に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１０】
アプタマーマスク領域が４塩基長であるＤＮＡ分子であって、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、
リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される、
請求項６〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１１】
アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１２】
アプタマーマスク領域の一部の塩基とジャンクション領域２との間で形成される４個以上の水素結合が、２個の塩基対、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対、または、３個の塩基対により形成される、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１３】
ＤＮＡ分子がリガンド非存在下で二次構造を形成するときの自由エネルギー変化（ｄＧ）が、−１２〜−５（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１４】
ＤＮＡアプタマー領域が、パツリンアプタマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１５】
パツリンアプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１６】
パツリンアプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列（この塩基配列の末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１７】
エフェクター領域が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド依存的に活性化するシグナル発生領域である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物（ここで、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる）。
【請求項１８】
エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化して、リガンド非存在下の２倍以上の活性を発揮できる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１９】
エフェクター領域が、ＤＮＡザイムである、請求項１７または１８に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２０】
ＤＮＡザイムが、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムである、請求項１９に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２１】
塩基配列が、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４０または配列番号：４１の塩基配列である、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物を用いてリガンドを検出する方法であって、該ＤＮＡ構築物または核酸構築物とリガンドとの結合を、還元型ＡＢＴＳの酸化によって生じる吸光度の変化として検出する方法。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項２４】
ＤＮＡ構築物または核酸構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項２３に記載のセンサー素子。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項２６】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項２３若しくは２４に記載のセンサー素子、または、請求項２５に記載のマイクロアレイを用いたリガンドの検出方法。
【請求項２７】
リガンドを検出するＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（Ａ）ＤＮＡアプタマー領域と、リガンド結合依存的に活性化するエフェクター領域と、アプタマーマスク領域とジャンクション領域１およびジャンクション領域２とから形成され、ＤＮＡアプタマー領域とエフェクター領域に介在するモジュール領域とを含んでなり、かつ、リガンド非存在下でループ構造を形成するＤＮＡ分子の塩基配列を設計または改変して、リガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる、スクリーニング方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ分子または核酸分子によるリガンドの検出感度を最適化することに用いられる、請求項２７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ分子のＤＮＡアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域から選択される少なくとも１つの領域を選択してその塩基配列を設計または改変する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物となることを指標としてＤＮＡ分子候補群の塩基配列を得る、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項９に記載のＤＮＡ構築物となることを指標としてＤＮＡ分子候補群の塩基配列を得る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
リガンドが、パツリンである、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２７〜３２のいずれか一項で定義された工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでなるスクリーニングを実施した後に、
下記工程：
（Ａ’）その直前のスクリーニングにより得られたＤＮＡ分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる少なくとも１回のスクリーニングをさらに実施する、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
パツリン結合特異性を示すＤＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子。
【請求項３５】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項３４に記載のＤＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３６】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列（この塩基配列の末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、請求項３４に記載のＤＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３７】
ＤＮＡアプタマー領域として請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子からなるパツリンアプタマー領域と、該アプタマー領域へのパツリンの結合により活性化するエフェクター領域とを含んでなる、ＤＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物。
【請求項３８】
パツリン結合特異性を示す、ＲＮＡ分子またはそれと同等の塩基配列を有する核酸分子。
【請求項３９】
塩基配列が、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項３８に記載のＲＮＡ分子または核酸分子。
【請求項４０】
配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５の塩基配列（この塩基配列の５’末端の１〜５塩基が欠失していてもよい）を有する、請求項３９に記載のＲＮＡ分子または核酸分子。
【請求項４１】
パツリンＲＮＡアプタマー領域と自己切断型リボザイムとを含んでなるＲＮＡ構築物であって、パツリンＲＮＡアプタマー領域の塩基配列が、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子の塩基配列である、ＲＮＡ構築物またはそれと同等の塩基配列を有する核酸構築物。
【請求項４２】
塩基配列が、配列番号：３０、配列番号：３１若しくは配列番号：３２の塩基配列である、請求項４１に記載のＲＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項４３】
請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子、または、請求項４１若しくは４２に記載のＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子。
【請求項４４】
請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項４１若しくは４２に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を用いてパツリンを検出する方法。
【請求項４５】
請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、請求項４１若しくは４２に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物にパツリンを結合させることを含んでなる、試料中のパツリンを除去する方法。
【請求項４６】
請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、請求項４１若しくは４２に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を固定化したカラム。
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月30日(2014.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
ＤＮＡアプタマー領域がパツリン結合性アプタマーであり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同一の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）。
【請求項２】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
ＤＮＡアプタマー領域がパツリン結合性アプタマーであり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同一の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）。
【請求項３】
アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項４】
ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項５】
ジャンクション領域１およびジャンクション領域２が、それぞれ３塩基長である、請求項４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項６】
アプタマーマスク領域が、４または５塩基長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項７】
アプタマーマスク領域が、リガンド非存在下で、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’側末端または前記ＤＮＡアプタマー領域の５’側末端との間で、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する、請求項６に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項８】
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端またはＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項９】
ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、請求項８に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１０】
アプタマーマスク領域が４塩基長であるＤＮＡ分子であって、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、
リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される、  請求項６〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１１】
アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１２】
アプタマーマスク領域の一部の塩基とジャンクション領域２との間で形成される４個以上の水素結合が、２個の塩基対、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対、または、３個の塩基対により形成される、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１３】
ＤＮＡ分子がリガンド非存在下で二次構造を形成するときの自由エネルギー変化（ｄＧ）が、−１２〜−５（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１４】
パツリン結合性アプタマーが、配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１５】
エフェクター領域が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド依存的に活性化するシグナル発生領域である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物（ここで、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる）。
【請求項１６】
エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化して、リガンド非存在下の２倍以上の活性を発揮できる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１７】
エフェクター領域が、ＤＮＡザイムである、請求項１５または１６に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１８】
ＤＮＡザイムが、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムである、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１９】
塩基配列が、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４０または配列番号：４１の塩基配列である、ＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物を用いてリガンドを検出する方法であって、該ＤＮＡ構築物または核酸構築物とリガンドとの結合を、還元型ＡＢＴＳの酸化によって生じる吸光度の変化として検出する方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項２２】
ＤＮＡ構築物または核酸構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項２１に記載のセンサー素子。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項２４】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項２１若しくは２２に記載のセンサー素子、または、請求項２３に記載のマイクロアレイを用いたリガンドの検出方法。
【請求項２５】
リガンドを検出するＤＮＡ分子または核酸分子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（Ａ）（ｉａ）または（ｉｂ）を満たし、かつ、（ｉｉ）を満たすことを指標としてＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群を得ることと：
（ｉａ）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ分子または同一の塩基配列を有する核酸分子
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）；または、
（ｉｂ）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ分子または同一の塩基配列を有する核酸分子
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）；
（ｉｉ）ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）；
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる、スクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項２５で定義された工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでなるスクリーニングを実施した後に、
下記工程：
（Ａ’）その直前のスクリーニングにより得られたＤＮＡ分子または核酸分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群または核酸分子群を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる少なくとも１回のスクリーニングをさらに実施する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記（Ａ）の工程において、ＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群が、下記（ｉｉｉ）をさらに満たす、請求項２５または２６に記載のスクリーニング方法：
（ｉｉｉ）アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する。
【請求項２８】
ＤＮＡ分子または核酸分子によるリガンドの検出感度を最適化することに用いられる、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ分子または核酸分子のアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域から選択される少なくとも１つの領域を選択してその塩基配列を設計または改変する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
リガンドが、パツリンである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２５または２７の工程（Ａ）において得られるＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項３２】
ＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項３１に記載のセンサー素子。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項３４】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項３１若しくは３２に記載のセンサー素子、または、請求項３３に記載のマイクロアレイを用いた、ＤＮＡ分子または核酸分子のスクリーニング方法。
【請求項３５】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有する、ＤＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３６】
塩基配列が、配列番号：３３、配列番号：３４若しくは配列番号：３５の塩基配列、または、配列番号：３４若しくは配列番号：３５の塩基配列の５’末端が１〜５塩基欠失した塩基配列を有する、ＲＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３７】
パツリンＲＮＡアプタマー領域と自己切断型リボザイムとを含んでなるＲＮＡ構築物であって、パツリンＲＮＡアプタマー領域の塩基配列が、請求項３６に記載のＲＮＡ分子の塩基配列である、ＲＮＡ構築物またはそれと同一の塩基配列を有する核酸構築物。
【請求項３８】
塩基配列が、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３８または配列番号：３９の塩基配列である、ＲＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項３９】
請求項３６に記載のＲＮＡ分子、または、請求項３７若しくは３８に記載のＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子。
【請求項４０】
請求項３５に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３６に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜１９に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項３７若しくは３８に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を用いてパツリンを検出する方法。
【請求項４１】
請求項２５〜３０および３４のいずれか一項に記載の方法によりＤＮＡ分子または核酸分子を得ることと、得られたＤＮＡ分子または核酸分子を用いてリガンドを検出することとを含んでなる、リガンドを検出する方法。
【請求項４２】
請求項３５に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３６に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項３７若しくは３８に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物にパツリンを結合させることを含んでなる、試料中のパツリンを除去する方法。
【請求項４３】
請求項３５に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３６に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項３７若しくは３８に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を固定化したカラム。
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月26日(2014.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
ＤＮＡアプタマー領域がパツリン結合性アプタマーであり、該パツリン結合性アプタマーが配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６の塩基配列またはその塩基配列と９０％以上の配列同一性を示し、かつ、パツリン結合性である塩基配列を有するものであり、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基であり、
アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、
エフェクター領域がＤＮＡザイムであり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同一の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する４〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）。
【請求項２】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
ＤＮＡアプタマー領域がパツリン結合性アプタマーであり、該パツリン結合性アプタマーが配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６の塩基配列またはその塩基配列と９０％以上の配列同一性を示し、かつ、パツリン結合性である塩基配列を有するものであり、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基であり、
アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、
エフェクター領域がＤＮＡザイムであり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物またはそれと同一の塩基配列を有する核酸構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する４〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）。
【請求項３】
アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項４】
ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項５】
ジャンクション領域１およびジャンクション領域２が、それぞれ３塩基長である、請求項４に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項６】
アプタマーマスク領域が、リガンド非存在下で、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’側末端または前記ＤＮＡアプタマー領域の５’側末端との間で、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項７】
アプタマーマスク領域が４塩基長であるＤＮＡ分子であって、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、
リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される、請求項６に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項８】
アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項９】
アプタマーマスク領域の一部の塩基とジャンクション領域２との間で形成される４個以上の水素結合が、２個の塩基対、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対、または、３個の塩基対により形成される、請求項８に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１０】
エフェクター領域が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド依存的に活性化するシグナル発生領域である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物（ここで、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる）。
【請求項１１】
エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化して、リガンド非存在下の２倍以上の活性を発揮できる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１２】
ＤＮＡザイムが、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１３】
塩基配列が、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４０または配列番号：４１の塩基配列である、ＤＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物を用いてリガンドを検出する方法であって、該ＤＮＡ構築物または核酸構築物とリガンドとの結合を、還元型ＡＢＴＳの酸化によって生じる吸光度の変化として検出する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または核酸構築物が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項１６】
ＤＮＡ構築物または核酸構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項１５に記載のセンサー素子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項１８】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項１５若しくは１６に記載のセンサー素子、または、請求項１７に記載のマイクロアレイを用いたリガンドの検出方法（但し、ＤＮＡ構築物および核酸構築物のエフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）。
【請求項１９】
リガンドを検出するＤＮＡ分子または核酸分子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（Ａ）（ｉａ）または（ｉｂ）を満たし、かつ、（ｉｉ）を満たすことを指標としてＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群を得ることと：
（ｉａ）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり（但し、エフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ分子または同一の塩基配列を有する核酸分子
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）；または、
（ｉｂ）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり（但し、エフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ分子または同一の塩基配列を有する核酸分子
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）；
（ｉｉ）ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）；
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる、スクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１９で定義された工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでなるスクリーニングを実施した後に、
下記工程：
（Ａ’）その直前のスクリーニングにより得られたＤＮＡ分子または核酸分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群または核酸分子群を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子または核酸分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子または核酸分子を選択すること
を含んでなる少なくとも１回のスクリーニングをさらに実施する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２１】
前記（Ａ）の工程において、ＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群が、下記（ｉｉｉ）をさらに満たす、請求項１９または２０に記載のスクリーニング方法：
（ｉｉｉ）アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する。
【請求項２２】
ＤＮＡ分子または核酸分子によるリガンドの検出感度を最適化することに用いられる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ分子または核酸分子のアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域から選択される少なくとも１つの領域を選択してその塩基配列を設計または改変する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リガンドが、パツリンである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９または２１の工程（Ａ）において得られるＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項２６】
ＤＮＡ分子候補群または核酸分子候補群がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項２５に記載のセンサー素子。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項２８】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項２５若しくは２６に記載のセンサー素子、または、請求項２７に記載のマイクロアレイを用いた、ＤＮＡ分子または核酸分子のスクリーニング方法（但し、ＤＮＡ構築物および核酸構築物のエフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）。
【請求項２９】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有する、ＤＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３０】
塩基配列が、配列番号：３３、配列番号：３４若しくは配列番号：３５の塩基配列、または、配列番号：３４若しくは配列番号：３５の塩基配列の５’末端が１〜５塩基欠失した塩基配列を有する、ＲＮＡ分子または核酸分子。
【請求項３１】
パツリンＲＮＡアプタマー領域と自己切断型リボザイムとを含んでなるＲＮＡ構築物であって、パツリンＲＮＡアプタマー領域の塩基配列が、請求項３０に記載のＲＮＡ分子の塩基配列である、ＲＮＡ構築物またはそれと同一の塩基配列を有する核酸構築物。
【請求項３２】
塩基配列が、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３８または配列番号：３９の塩基配列である、ＲＮＡ構築物または核酸構築物。
【請求項３３】
請求項３０に記載のＲＮＡ分子、または、請求項３１若しくは３２に記載のＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子。
【請求項３４】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３０に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜１３に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項３１若しくは３２に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を用いてパツリンを検出する方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３０に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項３１若しくは３２に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物にパツリンを結合させることを含んでなる、試料中のパツリンを除去する方法。
【請求項３６】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項３０に記載のＲＮＡ分子若しくは核酸分子、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物若しくは核酸構築物、または請求項３１若しくは３２に記載のＲＮＡ構築物若しくは核酸構築物を固定化したカラム。
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月26日(2015.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
ＤＮＡアプタマー領域がパツリン結合性アプタマーであり、該パツリン結合性アプタマーが配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６の塩基配列またはその塩基配列と９０％以上の配列同一性を示し、かつ、パツリン結合性である塩基配列を有するものであり、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基であり、
アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、
エフェクター領域がＤＮＡザイムであり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する４〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）。
【請求項２】
ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
ＤＮＡアプタマー領域がパツリン結合性アプタマーであり、該パツリン結合性アプタマーが配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６の塩基配列またはその塩基配列と９０％以上の配列同一性を示し、かつ、パツリン結合性である塩基配列を有するものであり、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域との塩基間で水素結合を形成するＤＮＡアプタマー領域が、ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基であり、
アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）、
エフェクター領域がＤＮＡザイムであり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ構築物
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する４〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）。
【請求項３】
アプタマーマスク領域が、ハイブリダイズするＤＮＡアプタマー領域との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
ジャンクション領域１が、ジャンクション領域２との塩基間で、少なくとも１個のバルジループまたはインターナルループを形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
ジャンクション領域１およびジャンクション領域２が、それぞれ３塩基長である、請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
アプタマーマスク領域が、リガンド非存在下で、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’側末端または前記ＤＮＡアプタマー領域の５’側末端との間で、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対を形成するか、または、３個若しくは４個の塩基対を形成する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
アプタマーマスク領域が４塩基長であるＤＮＡ分子であって、
リガンド非存在下でアプタマーマスク領域にミスマッチ塩基対を有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、アプタマーマスク領域のミスマッチ塩基対による分子全体の二次構造のｄＧの増加量（ｄｄＧ）が、＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である塩基の組み合わせから選択され、および／または、
リガンド非存在下でジャンクション領域にミスマッチを有する場合には、ミスマッチ塩基対を形成する塩基は、ジャンクション領域のミスマッチによる分子全体の二次構造のｄＧの増加量が、＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である塩基の組み合わせから選択される、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
アプタマーマスク領域の一部の塩基とジャンクション領域２との間で形成される４個以上の水素結合が、２個の塩基対、２個の塩基対およびＴ−Ｇのミスマッチ塩基対、または、３個の塩基対により形成される、請求項８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
エフェクター領域が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド依存的に活性化するシグナル発生領域である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物（ここで、シグナル発生領域の酵素活性を測定することにより、リガンドを検出し、あるいは定量することができる）。
【請求項１１】
エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化して、リガンド非存在下の２倍以上の活性を発揮できる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
ＤＮＡザイムが、配列番号１６の塩基配列を有する酸化還元型ＤＮＡザイムである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
塩基配列が、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４０または配列番号：４１の塩基配列である、ＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を用いてリガンドを検出する方法であって、該ＤＮＡ構築物とリガンドとの結合を、還元型ＡＢＴＳの酸化によって生じる吸光度の変化として検出する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項１６】
ＤＮＡ構築物がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項１５に記載のセンサー素子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項１８】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項１５若しくは１６に記載のセンサー素子、または、請求項１７に記載のマイクロアレイを用いたリガンドの検出方法（但し、ＤＮＡ構築物のエフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）。
【請求項１９】
リガンドを検出するＤＮＡ分子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（Ａ）（ｉａ）または（ｉｂ）を満たし、かつ、（ｉｉ）を満たすことを指標としてＤＮＡ分子候補群を得ることと：
（ｉａ）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり（但し、エフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域１、アプタマーマスク領域、ＤＮＡアプタマー領域、ジャンクション領域２の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ分子
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の５’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の３’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の５’側に隣接する。）；または、
（ｉｂ）ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１、ジャンクション領域２、エフェクター領域および末端領域を含んでなり（但し、エフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）、かつ、各領域がＤＮＡ構築物の５’側からジャンクション領域２、ＤＮＡアプタマー領域、アプタマーマスク領域、ジャンクション領域１の順番で連結してなる、ループ構造を形成するＤＮＡ構築物であり、
エフェクター領域の少なくとも一部が、ＤＮＡアプタマー領域のリガンド非存在下では２〜５塩基長の末端領域とハイブリダイズして不活性化されており、該エフェクター領域がＤＮＡアプタマー領域へのリガンド結合依存的に活性化する、ＤＮＡ分子
（ここで、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４〜７塩基が、リガンド非存在下で、ＤＮＡアプタマー領域の３’側に隣接する３〜５塩基長のアプタマーマスク領域とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計４〜１１個の水素結合を形成し、
・ＤＮＡアプタマー領域の５’側に隣接する１〜５塩基長のジャンクション領域２が、リガンド非存在下で、アプタマーマスク領域の３’側に隣接するジャンクション領域１とハイブリダイズして、該ハイブリダイズ領域の塩基間で合計３個以上の水素結合を形成し、かつ、
・エフェクター領域がジャンクション領域１の３’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域２の５’側に隣接するか、あるいは、エフェクター領域がジャンクション領域２の５’側に隣接し、末端領域がジャンクション領域１の３’側に隣接する。）；
（ｉｉ）ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の３’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−（Ｘ）ｎ−Ｔ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の３’末端の４塩基が、５’側からＡ−Ａ−Ｚ−Ｇであり、ＤＮＡアプタマー領域がアプタマーマスク領域の５’側に隣接するＤＮＡ分子の場合には、アプタマーマスク領域が、５’側からＴ−Ｔ−（Ｘ）ｎ−Ｔであり、かつ、前記ＤＮＡアプタマー領域の５’末端の４塩基が、５’側からＧ−Ｚ−Ａ−Ａである（但し、ｎは、１または２であり、かつ、ｎが２である場合は、２個のＸは同じ塩基でも異なる塩基でもよく、（Ｘ）ｎとＺとは、インターナルループかバルジループを形成し、ｎが１である場合は、ＸとＺは、ＸとＺとの間でインターナルループを形成する塩基の組み合わせから選択される）；
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子を選択すること
を含んでなる、スクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１９で定義された工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を含んでなるスクリーニングを実施した後に、
下記工程：
（Ａ’）その直前のスクリーニングにより得られたＤＮＡ分子をさらに改変してリガンドを検出するＤＮＡ分子候補群を得ること、
（Ｂ）設計または改変した塩基配列を有するＤＮＡ分子を電極表面に担持してなるセンサー素子を備えたマイクロアレイを作製すること、
（Ｃ）得られたマイクロアレイを用いて電気化学的にエフェクター領域からの酸化還元電流を測定すること、および、
（Ｄ）リガンドの検出感度を指標としてＤＮＡ分子を選択すること
を含んでなる少なくとも１回のスクリーニングをさらに実施する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記（Ａ）の工程において、ＤＮＡ分子候補群が、下記（ｉｉｉ）をさらに満たす、請求項１９または２０に記載のスクリーニング方法：
（ｉｉｉ）アプタマー領域にリガンドが結合すると、アプタマーマスク領域の一部の塩基が、ジャンクション領域２とハイブリダイズして、４個以上の水素結合を形成する。
【請求項２２】
ＤＮＡ分子によるリガンドの検出感度を最適化することに用いられる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ分子のアプタマー領域、モジュール領域、エフェクター領域、およびそれ以外の領域から選択される少なくとも１つの領域を選択してその塩基配列を設計または改変する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リガンドが、パツリンである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９または２１の工程（Ａ）において得られるＤＮＡ分子候補群が電極表面に担持されてなる、センサー素子。
【請求項２６】
ＤＮＡ分子候補群がリンカーを介して電極表面に担持されてなる、請求項２５に記載のセンサー素子。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のセンサー素子を備えてなる、マイクロアレイ。
【請求項２８】
ＤＮＡザイムの基質存在下での電気シグナルを測定することを含んでなる、請求項２５若しくは２６に記載のセンサー素子、または、請求項２７に記載のマイクロアレイを用いた、ＤＮＡ分子のスクリーニング方法（但し、ＤＮＡ構築物のエフェクター領域は酸化還元型ＤＮＡザイムである）。
【請求項２９】
配列番号：２４、配列番号：２５、または配列番号：２６の塩基配列を有する、ＤＮＡ分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子または請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を用いてパツリンを検出する方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子または請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物にパツリンを結合させることを含んでなる、試料中のパツリンを除去する方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子または請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を固定化したカラム。
【国際調査報告】
2013161964.tif 000061
2013161964.tif 000062
2013161964.tif 000063
2013161964.tif 000064