(57)【要約】  ペリオスチン遺伝子の発現を抑制する新たな分子を提供する。ペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子は、ペリオスチン遺伝子の発現抑制配列として、配列番号１〜１９のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現抑制核酸分子によれば、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制できるため、例えば、ペリオスチン遺伝子の発現に起因する眼疾患、具体的には、増殖性糖尿病網膜症や黄斑変性症等の治療に使用できる。
2013147140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリオスチン遺伝子の発現抑制配列として、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを含むことを特徴とする、ペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子。
（ａｓ１）配列番号１〜１９のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
【請求項２】
前記発現抑制核酸分子が、一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を含む、請求項１記載のことを特徴とする発現抑制核酸分子。
【請求項３】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結し、
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項２記載の発現抑制核酸分子。
【請求項４】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、ヌクレオチド残基から構成されている、請求項３記載の発現抑制核酸分子。
【請求項５】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、非ヌクレオチド残基から構成されている、請求項３または４記載の発現抑制核酸分子。
【請求項６】
前記非ヌクレオチド残基が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む、請求項５記載の発現抑制核酸分子。
【請求項７】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表される、請求項５または６記載の発現抑制核酸分子。
2013147140.tif 000018
前記式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【請求項８】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（１）および（２）の条件を満たす、請求項２から７のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ  ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項９】
前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差が、下記条件を満たす、請求項８記載の発現抑制核酸分子。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０  ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０  ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０  ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０  ・・・（１８）
【請求項１０】
前記発現抑制配列の長さが、１８〜３２塩基長である、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１１】
前記発現抑制核酸分子の配列が、配列番号８３〜９７からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列である、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１２】
前記発現抑制配列が、さらに、オーバーハング配列を有し、
前記ヌクレオチドの３’末端に、前記オーバーハング配列が付加されている、請求項１記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１３】
前記発現抑制配列が、前記（ａｓ１）のヌクレオチドを含む、配列番号２０〜３８のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドである、請求項１または１２記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１４】
前記発現抑制配列の長さが、１８〜３２塩基長である、請求項１、１２および１３のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１５】
さらに、前記発現抑制配列にアニーリングする相補配列を有し、
前記相補配列は、前記発現抑制配列における前記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む、請求項１および１２から１４のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１６】
前記相補配列における前記ヌクレオチドが、下記（ｓ１）（ｓ２）または（ｓ３）のヌクレオチドである、請求項１５記載の発現抑制核酸分子。
（ｓ１）前記（ａｓ１）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ２）前記（ａｓ２）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ３）前記（ａｓ３）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
【請求項１７】
前記（ｓ１）のヌクレオチドが、配列番号３９〜５７のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチドである、請求項１６記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１８】
前記相補配列が、さらに、オーバーハング配列を有し、
前記ヌクレオチドの５’末端に、前記オーバーハング配列が付加されている、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項１９】
前記相補配列が、前記（ｓ１）のヌクレオチドを含む、配列番号５８〜７６のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドである、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項２０】
前記オーバーハング配列が、１〜３塩基長である、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項２１】
前記発現抑制核酸分子が、２つの一本鎖から構成される二本鎖核酸分子であり、そのアンチセンス鎖が、前記発現抑制配列を有し、そのセンス鎖が、前記相補配列を有する、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２３】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする、眼疾患用医薬。
【請求項２４】
前記眼疾患が、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生および眼の線維瘢痕からなる群から選択された少なくとも1つの疾患である、請求項２３記載の眼疾患用医薬。
【請求項２５】
前記網膜症が、増殖糖尿病網膜症または増殖性硝子体網膜症である、請求項２４記載の眼疾患用医薬。
【請求項２６】
ペリオスチン遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から２１のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする抑制方法。
【請求項２７】
前記発現抑制核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項２６記載の抑制方法。
【請求項２８】
前記発現抑制核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項２６または２７記載の抑制方法。
【請求項２９】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする、眼疾患の治療方法。
【請求項３０】
前記眼疾患が、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生および眼の線維瘢痕からなる群から選択された少なくとも1つの疾患である、請求項２９記載の治療方法。
【請求項３１】
前記網膜症が、増殖糖尿病網膜症または増殖性硝子体網膜症である、請求項３０記載の治療方法。
【請求項３２】
眼疾患の治療のために使用する請求項１から２１のいずれか一項に記載の発現抑制核酸分子。
【請求項３３】
前記眼疾患が、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生および眼の線維瘢痕からなる群から選択された少なくとも1つの疾患である、請求項３２記載の発現抑制核酸分子。
【請求項３４】
前記網膜症が、増殖糖尿病網膜症または増殖性硝子体網膜症である、請求項３３記載の発現抑制核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼疾患の原因となるペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子、ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病患者の増加に伴い、合併症の一つである糖尿病網膜症（Diabetic  Retinopathy：DR）患者が増加している。糖尿病網膜症は、病期によって、単純糖尿病網膜症、前増殖糖尿病網膜症および増殖糖尿病網膜症（Proliferative  Diabetic  Retinopathy：PDR）に分類されている。中でも、増殖糖尿病網膜症は、視力の低下だけでなく、失明に至るおそれがある。【０００３】
また、眼疾患としては、同様に、加齢黄斑変性症（Age-related  Macular  Degeneration：AMD）等の黄斑変性症も問題となっている。黄斑変性症は、加齢やストレス等が原因となり、黄斑が変性して視力が低下する疾患である。この疾患も、重篤な場合は失明に至るおそれがある。【０００４】
これらの眼疾患は、網脈絡膜が酸欠状態等に陥り、酸素を補うために、網膜上下に新生血管が形成されることが発端となる。新生血管は、脆弱なため、破れて出血し易く、出血した血液が光路を遮ること等によって、視力が低下する。また、前記新生血管は、増殖組織といわれる線維性膜へと進展し、これが原因となって牽引性網膜剥離を生じることもある。そして、このような状態が維持され、繰り返されることによって、重篤化すると、失明に至るおそれがある（特許文献１）。このため、これらの眼疾患に関しては、治療薬となりうる新たな候補物質の提供が求められている。【０００５】
これらの眼疾患については、ペリオスチン遺伝子の発現が関与していることが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１‐２２０９６９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S.  Yoshida  et al.,  Investigative  Ophthalmology  ＆  Visual  Science,  2011,  Vol.52,  No.8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制する新たな分子の提供、ならびに、それを用いた発現抑制方法および眼疾患の治療方法等の用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明のペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子は、ペリオスチン遺伝子の発現抑制配列として、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａｓ１）配列番号１〜１９のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド【００１０】
本発明の組成物は、本発明の前記発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明の眼疾患用医薬は、本発明の前記発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。【００１２】
本発明の抑制方法は、ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法であって、本発明の前記発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする。【００１３】
本発明の眼疾患の治療方法は、本発明の前記発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の発現抑制核酸分子によれば、ペリオスチン遺伝子の発現抑制が可能である。このため、本発明は、ペリオスチン遺伝子の発現が原因となる眼疾患、例えば、増殖糖尿病網膜症または黄斑変性症等の各種眼疾患の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例２の結果であり、（Ａ）は、マウスの眼の線維性増殖組織の体積を示すグラフであり、（Ｂ）は、マウスの眼の新生血管の体積を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例３におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例４におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例４におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例５におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１７】
＜発現抑制核酸分子＞
本発明の発現抑制核酸分子（以下、「本発明の核酸分子」ともいう）は、前述のように、発現抑制用の核酸分子であり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制配列として、下記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａｓ１）配列番号１〜１９のいずれか一つの塩基配列からなるヌクレオチド
（ａｓ２）前記（ａｓ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
（ａｓ３）前記（ａｓ１）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有するヌクレオチド
【００１８】
以下、前記（ａｓ１）、（ａｓ２）または（ａｓ３）のヌクレオチドを、ａｓヌクレオチドといい、それぞれ、ａｓ１ヌクレオチド、ａｓ２ヌクレオチド、ａｓ３ヌクレオチドという。
【００１９】
本発明において、ペリオスチン遺伝子の発現の抑制は、特に制限されず、例えば、遺伝子の転写自体の抑制でも、遺伝子の転写産物を分解することによる抑制でもよい。また、ペリオスチン遺伝子の発現の抑制は、例えば、本来の機能を有するペリオスチンタンパク質の発現の抑制であってもよく、タンパク質が発現される場合、前記タンパク質は、例えば、前記機能が阻害されたタンパク質でもよいし、前記機能が欠失したタンパク質でもよい。
【００２０】
前記発現抑制配列は、例えば、前記ａｓヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記ａｓヌクレオチドを含む配列でもよい。
【００２１】
前記発現抑制配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００２２】
前記ａｓ１ヌクレオチドの配列を以下に示す。なお、前記配列番号１〜１９の塩基配列からなるヌクレオチド、前記ヌクレオチドからなる発現抑制配列、前記ヌクレオチドを含む発現抑制配列、および前記ヌクレオチドを含む核酸分子は、それぞれ、以下に示す名称（配列番号の前の名称）で表わすこともある。
ＮＩ−００７９（配列番号１）
5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC-3’
ＮＩ−００８０（配列番号２）
5’- GAAGUAUUUCUUUUUGGUG-3’
ＮＩ−００８１（配列番号３）
5’-AAUCUGGUUCCCAUGGAUG-3’
ＮＩ−００８２（配列番号４）
5’-UUUCUAGGACACCUCGUGG-3’
ＮＩ−００８３（配列番号５）
5’-UUGUUUGGCAGAAUCAGGA-3’
ＮＩ−００８４（配列番号６）
5’-UCAAUAACUUGUUUGGCAG-3’
ＮＩ−００８５（配列番号７）
5’-AGCUCAAUAACUUGUUUGG-3’
ＮＩ−００８６（配列番号８）
5’-UUGCUGUUUUCCAGCCAGC-3’
ＮＩ−００８７（配列番号９）
5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC-3’
ＮＩ−００８８（配列番号１０）
5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG-3’
ＮＩ−００９１（配列番号１１）
5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC-3’
ＮＩ−００９２（配列番号１２）
5’-UACUGUUAUACUGUCACCG-3’
ＮＩ−００９３（配列番号１３）
5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC-3’
ＮＩ−００９４（配列番号１４）
5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG-3’
ＮＩ−００９５（配列番号１５）
5’-AUCAGAUCGUUGAUUUAGG-3’
ＮＩ−００９６（配列番号１６）
5’-UUCAGGAUAUUAGUGACUC-3’
ＮＩ−００９７（配列番号１７）
5’-UCCUUUCUAGGACACCUCG-3’
ＮＩ−００９８（配列番号１８）
5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC-3’
ＮＩ−００９９（配列番号１９）
5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG-3’
【００２３】
前記ａｓ２ヌクレオチドにおいて、「１もしくは数個」は、特に制限されない。「１もしくは数個」は、例えば、１〜７個であり、好ましくは、１〜５個、より好ましくは、１〜４個、さらに好ましくは、１個、２個または３個である。前記ａｓ２ヌクレオチドは、例えば、前記ａｓ１ヌクレオチドと同様の機能を有していればよく、より詳細には、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有していればよい。「および／または」とは、少なくともいずれか１つの意味であり、「からなる群から選択された少なくとも１つの」と表すこともできる（以下、同様）。
【００２４】
前記ａｓ３ヌクレオチドにおいて、同一性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である。前記ａｓ３ヌクレオチドは、例えば、前記ａｓ１ヌクレオチドと同様の機能を有していればよく、より詳細には、ペリオスチン遺伝子の発現抑制機能を有していればよい。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２５】
前記発現抑制配列は、前述のように、前記ａｓヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記ａｓヌクレオチドを含む配列でもよい。後者の場合、前記発現抑制配列は、例えば、さらに、オーバーハングを有する形態があげられる。前記発現抑制配列において、前記オーバーハングは、例えば、前記ａｓヌクレオチドの３’末端および５’末端の少なくとも一方に付加されてもよく、好ましくは前記３’末端に付加されている。
【００２６】
前記オーバーハングは、特に制限されず、例えば、長さおよび配列も、特に制限されない。前記オーバーハングは、例えば、（Ｎ）ｎで表わすことができる。Ｎは、塩基であり、例えば、天然の塩基でもよいし、人工塩基でもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵおよびＴがあげられる。前記ｎは、正の整数であり、オーバーハングの塩基長を示す。前記オーバーハング（Ｎ）ｎの長さ（ｎ）は、例えば、１、２、３塩基長であり、好ましくは１または２塩基長であり、より好ましくは２塩基長である。前記オーバーハング（Ｎ）ｎの長さが２塩基長以上の場合（ｎ≧２）、連続する塩基（Ｎ）は、例えば、同じ塩基でもよいし、異なる塩基でもよい。前記オーバーハング（Ｎ）ｎの配列は、例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンスのオーバーハングが適用できる。前記（Ｎ）ｎは、例えば、３’側または５’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＵＣ、ＧＡ、ＡＧ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＵ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。
【００２７】
前記発現抑制配列が前記オーバーハングを有する場合、前記発現抑制配列は、例えば、前記ａｓ１ヌクレオチドと前記オーバーハングとが連結された配列があげられる。具体例として、前記ａｓ１ヌクレオチドと前記オーバーハングとが連結された配列番号２０〜３８のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドがあげられる。以下の配列において、（Ｎ）ｎは、オーバーハングであり、特に制限されず、前述の通りであり、その長さ（ｎ）は、好ましくは２塩基長である。また、各配列の横に、オーバーハングの一例（5’-3’方向に記載）を示すが、本発明は、これには限定されない。また、下記配列において、（Ｎ）ｎを除く領域が、前記ａｓ２ヌクレオチドまたは前記ａｓ３ヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
ＮＩ−００７９（配列番号２０）
TT      5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC(N)n-3’
ＮＩ−００８０（配列番号２１）
TT      5’-GAAGUAUUUCUUUUUGGUG(N)n-3’
ＮＩ−００８１（配列番号２２）
TT      5’-AAUCUGGUUCCCAUGGAUG(N)n-3’
ＮＩ−００８２（配列番号２３）
TT      5’-UUUCUAGGACACCUCGUGG(N)n-3’
ＮＩ−００８３（配列番号２４）
TT      5’-UUGUUUGGCAGAAUCAGGA(N)n-3’
ＮＩ−００８４（配列番号２５）
TT      5’-UCAAUAACUUGUUUGGCAG(N)n-3’
ＮＩ−００８５（配列番号２６）
TT      5’-AGCUCAAUAACUUGUUUGG(N)n-3’
ＮＩ−００８６（配列番号２７）
TT      5’-UUGCUGUUUUCCAGCCAGC(N)n-3’
ＮＩ−００８７（配列番号２８）
TT      5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC(N)n-3’
ＮＩ−００８８（配列番号２９）
TT      5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG(N)n-3’
ＮＩ−００９１（配列番号３０）
AG      5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC(N)n-3’
ＮＩ−００９２（配列番号３１）
UC      5’-UACUGUUAUACUGUCACCG(N)n-3’
ＮＩ−００９３（配列番号３２）
AU      5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC(N)n-3’
ＮＩ−００９４（配列番号３３）
GU      5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG(N)n-3’
ＮＩ−００９５（配列番号３４）
AU      5’-AUCAGAUCGUUGAUUUAGG(N)n-3’
ＮＩ−００９６（配列番号３５）
CG      5’-UUCAGGAUAUUAGUGACUC(N)n-3’
ＮＩ−００９７（配列番号３６）
UG      5’-UCCUUUCUAGGACACCUCG(N)n-3’
ＮＩ−００９８（配列番号３７）
GU      5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC(N)n-3’
ＮＩ−００９９（配列番号３８）
CU      5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG(N)n-3’
【００２９】
本発明の核酸分子は、さらに、前記発現抑制配列とアニーリングする相補配列を有することが好ましい。前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列における前記ａｓヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド（以下、相補的ヌクレオチドという）を含む。前記相補配列は、前記相補的ヌクレオチドを含む配列でもよいし、前記相補的ヌクレオチドからなる配列でもよい。
【００３０】
前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列とアニーリング可能であればよい。前記相補配列における前記相補的ヌクレオチドと、前記発現抑制配列における前記ａｓヌクレオチドとは、その相補性が、例えば、９０％以上であり、好ましくは、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であり、より好ましくは１００％である。なお、前記発現抑制配列と前記相補配列とは、例えば、前者のａｓヌクレオチドと後者の相補的ヌクレオチドとが、前述のような相補性を示すことが好ましく、前者のａｓヌクレオチド以外の領域および後者の相補的ヌクレオチド以外の領域は、相補的でもよいし、非相補的でもよい。前記発現抑制配列と前記相補配列とをアライメントした際、前者のａｓヌクレオチド以外の領域および後者の相補的ヌクレオチド以外の領域は、例えば、対応する配列が存在してもよいし、存在しなくてもよい。具体例として、前者のａｓヌクレオチド以外の領域および後者の相補的ヌクレオチド以外の領域は、例えば、前記オーバーハングがあげられる。すなわち、前記発現抑制配列と前記相補配列とをアライメントした際、前記発現抑制配列は、３’側（または５’側）にオーバーハングが突出した形状となり、前記相補配列は、５’側（または３’側）にオーバーハングが突出した形状となってもよい。
【００３１】
前記相補的ヌクレオチドは、例えば、下記（ｓ１）（ｓ２）または（ｓ３）のヌクレオチドがあげられる。
（ｓ１）前記（ａｓ１）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ２）前記（ａｓ２）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
（ｓ３）前記（ａｓ３）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド
【００３２】
以下、前記（ｓ１）、（ｓ２）または（ｓ３）のヌクレオチドを、ｓヌクレオチドといい、それぞれｓ１ヌクレオチド、ｓ２ヌクレオチド、ｓ３ヌクレオチドという。
【００３３】
前記相補配列は、例えば、前記ｓヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記ｓヌクレオチドを含む配列でもよい。
【００３４】
前記相補配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。
【００３５】
前記ｓ１ヌクレオチドの配列の具体例を以下に示す。前記配列番号３９〜５７の配列は、それぞれ、前記配列番号１〜１９の塩基配列からなるａｓ１ヌクレオチドに完全に相補的である。なお、前記配列番号３９〜５７の塩基配列からなるヌクレオチド、前記ヌクレオチドからなる発現抑制配列、前記ヌクレオチドを含む発現抑制配列、および前記ヌクレオチドを含む核酸分子を、それぞれ、以下に示す名称（配列番号の前の名称）で表わすこともある。
ＮＩ−００７９（配列番号３９）
5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU-3’
ＮＩ−００８０（配列番号４０）
5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC-3’
ＮＩ−００８１（配列番号４１）
5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU-3’
ＮＩ−００８２（配列番号４２）
5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA-3’
ＮＩ−００８３（配列番号４３）
5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA-3’
ＮＩ−００８４（配列番号４４）
5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA-3’
ＮＩ−００８５（配列番号４５）
5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU-3’
ＮＩ−００８６（配列番号４６）
5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA-3’
ＮＩ−００８７（配列番号４７）
5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA-3’
ＮＩ−００８８（配列番号４８）
5’-CCCAAUUAGGCUUGGCAUC-3’
ＮＩ−００９１（配列番号４９）
5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA-3’
ＮＩ−００９２（配列番号５０）
5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA-3’
ＮＩ−００９３（配列番号５１）
5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA-3’
ＮＩ−００９４（配列番号５２）
5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA-3’
ＮＩ−００９５（配列番号５３）
5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU-3’
ＮＩ−００９６（配列番号５４）
5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA-3’
ＮＩ−００９７（配列番号５５）
5’-CGAGGUGUCCUAGAAAGGA-3’
ＮＩ−００９８（配列番号５６）
5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU-3’
ＮＩ−００９９（配列番号５７）
5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA-3’
【００３６】
前記相補配列は、前述のように、前記相補的ヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記相補的ヌクレオチドを含む配列でもよい。後者の場合、前記相補配列は、例えば、さらに、オーバーハングを有する形態があげられる。前記相補配列において、前記オーバーハングは、例えば、前記相補的ヌクレオチドの３’末端および５’末端の少なくとも一方に付加されてもよく、好ましくは前記３’末端に付加されている。
【００３７】
前記オーバーハングは、特に制限されず、前記発現抑制配列における記載を援用できる。前記相補配列における前記オーバーハング（Ｎ）ｎの配列は、例えば、ｓｉＲＮＡのセンスのオーバーハングが適用できる。前記（Ｎ）ｎは、例えば、５’側または３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＵＣ、ＣＡ、ＡＣ、ＧＡ、ＡＧ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＧＵ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ、ＧＧ等が例示できる。
【００３８】
前記相補配列が前記オーバーハングを有する場合、前記相補配列は、例えば、前記ｓ１ヌクレオチドと前記オーバーハングとが連結された配列があげられる。具体例として、前記ｓヌクレオチドと前記オーバーハングとが連結された配列番号５８〜７６のいずれか一つの塩基配列（ｎは正の整数）からなるヌクレオチドがあげられる。以下の配列において、（Ｎ）ｎは、オーバーハングであり、特に制限されず、前述の通りであり、その長さ（ｎ）は、好ましくは２塩基長である。また、各配列の横に、オーバーハングの一例を示すが、本発明は、これには限定されない。また、下記配列において、（Ｎ）ｎを除く領域が、前記ｓ２ヌクレオチドまたは前記ｓ３ヌクレオチドであってもよい。
ＮＩ−００７９（配列番号５８）
5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８０（配列番号５９）
5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８１（配列番号６０）
5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８２（配列番号６１）
5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８３（配列番号６２）
5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８４（配列番号６３）
5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８５（配列番号６４）
5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８６（配列番号６５）
5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８７（配列番号６６）
5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA(N)n-3’      TT
ＮＩ−００８８（配列番号６７）
5’-CCCAAUUAGGCUUGGCAUC(N)n-3’      TT
ＮＩ−００９１（配列番号６８）
5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA(N)n-3’      UC
ＮＩ−００９２（配列番号６９）
5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA(N)n-3’      AA
ＮＩ−００９３（配列番号７０）
5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA(N)n-3’      CA
ＮＩ−００９４（配列番号７１）
5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA(N)n-3’      GG
ＮＩ−００９５（配列番号７２）
5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU(N)n-3’      UU
ＮＩ−００９６（配列番号７３）
5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA(N)n-3’      GA
ＮＩ−００９７（配列番号７４）
5’-CGAGGUGUCCUAGAAAGGA(N)n-3’      UC
ＮＩ−００９８（配列番号７５）
5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU(N)n-3’      CA
ＮＩ−００９９（配列番号７６）
5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA(N)n-3’      CC
【００３９】
下記表１および表２に、前記ａｓヌクレオチドと前記ｓヌクレオチドとの組合せを例示する。本発明は、これらの例示には制限されない。また、下記配列において、ａｓヌクレオチドおよびｓヌクレオチドが、それぞれ、３’末端に（Ｎ）ｎのオーバーハングを有してもよく、または、５’末端に（Ｎ）ｎのオーバーハングを有してもよく、前記（Ｎ）ｎは、２塩基長が好ましい。
【００４０】
【表１】
2013147140.tif 000003
【００４１】
【表２】
2013147140.tif 000004
【００４２】
本発明の核酸分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。
【００４３】
本発明の核酸分子は、例えば、ＲＮＡ分子である。本発明の核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド残基のみからなるＲＮＡ分子でもよいし、リボヌクレオチド残基の他に、デオキシリボヌクレオチド残基および／または非ヌクレオチド残基を含むＲＮＡ分子でもよい。
【００４４】
本発明の核酸分子は、例えば、前記二本鎖核酸分子でもよいし、前記一本鎖核酸分子でもよい。以下に、本発明の核酸分子について、前記二本鎖核酸分子および前記一本鎖核酸分子を例にあげて説明する。
【００４５】
（１）二本鎖核酸分子
本発明の核酸分子が二本鎖核酸分子の場合、二本の一本鎖核酸を含み、一方の一本鎖核酸が前記発現抑制配列を有していればよい。前記二本鎖核酸分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの前駆体等があげられる。前記二本鎖核酸分子は、例えば、一方の一本鎖核酸、すなわち、そのアンチセンス鎖が、前記発現抑制配列を有し、他方の一本鎖核酸、すなわち、そのセンス鎖が、前記相補配列を有することが好ましい。前記アンチセンス鎖は、例えば、前記発現抑制配列からなる一本鎖核酸でもよいし、前記発現抑制配列を含む一本鎖核酸でもよい。前記センス鎖は、例えば、前記相補配列からなる一本鎖核酸でもよいし、前記相補配列を含む一本鎖核酸でもよい。
【００４６】
前記二本鎖核酸分子において、各一本鎖核酸の長さは、特に制限されない。前記アンチセンス鎖は、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。前記センス鎖は、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。
【００４７】
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖は、それぞれ、３’末端および５’末端の少なくとも一方にオーバーハングを有することが好ましい。前記オーバーハングの長さは、例えば、例えば、１、２、３塩基長であり、好ましくは１または２塩基長であり、より好ましくは２塩基長である。前記オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、前述の例示があげられる。
【００４８】
（２）一本鎖核酸分子
本発明の核酸分子が一本鎖核酸分子の場合、前記発現抑制配列を有していればよく、その他の形態は、特に制限されない。
【００４９】
前記核酸分子は、例えば、１本の一本鎖から構成される一本鎖核酸分子であり、例えば、前記発現抑制配列と前記相補配列とを、アニーリング可能な方向で有している。
【００５０】
前記発現抑制配列と前記相補配列との連結順序は、特に制限されず、例えば、前記発現抑制配列の３’末端と前記相補配列の５’末端とが連結してもよく、前記発現抑制配列の５’末端と前記相補配列の３’末端とが連結してもよく、好ましくは前者である。前記一本鎖核酸分子は、例えば、前記発現抑制配列と前記相補配列とが、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。前記間接的な連結は、例えば、リンカー領域を介した連結があげられる。
【００５１】
前記リンカー領域は、例えば、ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、非ヌクレオチド残基から構成されてもよく、前記ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。
【００５２】
以下に、前記一本鎖核酸分子の具体例として、分子内アニーリングにより１カ所にループを有する第１形態と、２カ所にループを有する第２形態とを例示する。本発明は、これには制限されない。
【００５３】
（２−１）第１形態
前記一本鎖核酸分子の第１形態として、５’側領域および３’側領域が互いにアニーリングして、二本鎖構造（ステム構造）を形成する分子があげられる。これは、ｓｈＲＮＡ（small  hairpin  RNAまたはshort  hairpin  RNA）の形態とも言える。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造をとっており、一般的に、一つのステム領域と一つのループ領域とを有する。
【００５４】
本形態の核酸分子は、例えば、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結された構造があげられる。そして、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であることが好ましく、具体的には、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のうち一方が、前記発現抑制配列を含み、他方が、前記相補配列を含むことが好ましい。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とは、それぞれ、前記発現抑制配列および前記相補配列のいずれかを有するため、前記核酸分子は、例えば、分子内アニーリングにより、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間でステム構造を形成でき、前記リンカー領域（Ｌｘ）がループ構造となる。
【００５５】
前記核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）のいずれに配置してもよく、前記相補配列の上流側、すなわち、前記相補配列よりも５’側に配置することが好ましい。
【００５６】
本形態の核酸分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、前記核酸分子における各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００５７】
前記核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００５８】
前記核酸分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【００５９】
前記領域（Ｘ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみからなる領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、前述の通りである。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは１〜２１塩基であり、より好ましくは１〜１１塩基である。
【００６０】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基、より好ましくは１９〜２５塩基である。
【００６１】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。
【００６２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前述のように、前記ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、前記両者を含んでもよい。
【００６３】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が前記ヌクレオチド残基を含む場合、その長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基、４０塩基、３０塩基、２０塩基、１０塩基である。
【００６４】
前記核酸分子の全長は、特に制限されない。前記核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００６５】
（２−２）第２形態
前記一本鎖核酸分子の第２形態として、５’側領域および３’側領域が、それぞれ別個に分子内アニーリングして、２つの二本鎖構造（ステム構造）を形成する分子があげられる。これは、例えば、国際公開ＷＯ２０１２／００５３６８号公報およびＷＯ２０１２/０１７９７９の開示を援用できる。
【００６６】
本形態の核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含む構造があげられる。前記内部領域（Ｚ）は、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であることが好ましい。そして、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことが好ましい。
【００６７】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
【００６８】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが、例えば、前記核酸分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００６９】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【００７０】
前記核酸分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【００７１】
前記核酸分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有してもよいし、いずれか一方を有してもよい。後者の場合、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有さない、つまり、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが直接連結された形態があげられる。また、後者の場合、例えば、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有さない、つまり、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが直接連結された形態があげられる。
【００７２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前述のように、前記ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、前記両者を含んでもよい。
【００７３】
本形態の核酸分子について、前記リンカー領域を有さない一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、前記核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成される。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００７４】
前記核酸分子について、前記リンカー領域を有する一例を、図３の模式図に示す。図３（Ａ）は、前記核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、ループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００７５】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これに制限されない。
【００７６】
前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記内部５’側領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記５’側領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記内部５’側領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記５’側領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記内部５’側領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的でもよい。
【００７７】
また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記内部５’側領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記５’側領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記内部５’側領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記５’側領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記内部５’側領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記内部５’側領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記５’側領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００７８】
前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記３’側領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記内部３’側領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記３’側領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記内部３’側領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的でもよい。
【００７９】
また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記内部３’側領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記３’側領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記内部３’側領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記３’側領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記内部３’側領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。前記内部３’側領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００８０】
前記核酸分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【００８１】
前記核酸分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【００８２】
前記核酸分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【００８３】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【００８４】
前記（ａ）〜（ｄ）の核酸分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に示す。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含む核酸分子であり、（Ａ）は、前記（ａ）の核酸分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）の核酸分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）の核酸分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）の核酸分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４の核酸分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
【００８５】
前記（ａ）〜（ｃ）の核酸分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、および、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）の核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）の核酸分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）の核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００８６】
他方、前記(ｄ)の核酸分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）の核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００８７】
前記核酸分子について、各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００８８】
前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００８９】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。
【００９０】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、前述の通りである。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは１〜２１塩基であり、より好ましくは１〜１１塩基であり、さらに好ましくは１〜７塩基である。
【００９１】
前記内部領域（Ｚ）において、前記発現抑制配列の位置は、特に制限されず、前述のように、前記内部５’側領域（Ｘ）でもよいし、前記内部３’側領域（Ｙ）でもよいし、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とにわたって配置されてもよい。前記核酸分子が、例えば、前記相補配列を有する場合、その位置も特に制限されず、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）に対応する前記５’側領域（Ｘｃ）でもよいし、前記内部３’側領域（Ｙ）に対する前記３’側領域（Ｙｃ）でもよい。また、前記発現抑制配列が、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とにわたって配置されている場合、例えば、前記相補配列は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とに分断されてもよい。前記相補配列が２つに分断されている場合、例えば、前記フリー塩基に該当する箇所が欠失した配列でもよい。、
【００９２】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜９塩基、１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９３】
前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基である。
【００９４】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜９塩基、１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９５】
前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基である。
【００９６】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【００９７】
前記一本鎖核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の末端は、例えば、分子内アニーリングした状態において、前記内部領域（Ｚ）に対して、５’側または３’側に位置することが好ましい。前者の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）と、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）は、Ｘｃ＜Ｙｃの関係である。そして、塩基数（Ｘｃ）は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜９塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基であり、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）との関係（Ｘｃ／Ｚ）が、例えば、１／５０〜１／２、好ましくは１／４０〜１／３、より好ましくは１／３０〜１／４である。後者の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）と、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）は、Ｘｃ＞Ｙｃの関係である。そして、塩基数（Ｙｃ）は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜９塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基であり、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）との関係（Ｙｃ／Ｚ）が、例えば、例えば、１／５０〜１／２、好ましくは１／４０〜１／３、より好ましくは１／３０〜１／４である。
【００９８】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）は、例えば、前述のように、前記ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、前記両者を含んでもよい。
【００９９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、前述のようにヌクレオチド残基を含む場合、その長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、例えば、同じでも異なってもよく、また、その塩基配列も、同じでも異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基、４０塩基、３０塩基、２０塩基、１０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１００】
前記核酸分子の全長は、特に制限されない。前記核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１０１】
本形態の核酸分子は、例えば、５’末端と３’末端とが、結合してもよいし、未結合でもよい。前者の場合、本形態の核酸分子は、環状の一本鎖核酸分子である。後者の場合、本形態の核酸分子は、例えば、両末端の未結合を維持できることから、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
【０１０２】
（２−３）第３形態
前記一本鎖核酸分子の第３形態として、前記リンカー領域が、非ヌクレオチド構造である分子があげられる。これは、例えば、国際公開ＷＯ２０１２／００５３６８号公報およびＷＯ２０１２/０１７９７９の開示を援用できる。
【０１０３】
本形態の核酸分子は、前記第１形態および前記第２形態の核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、非ヌクレオチド構造を有する以外は、前述の説明を援用できる。
【０１０４】
前記非ヌクレオチド構造は、特に制限されず、例えば、ピロリジン骨格、ピペリジン骨格、ポリアルキレングリコール等があげられる。前記ポリアルキレングリコールは、例えば、ポリエチレングリコールがあげられる。
【０１０５】
前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）と、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【０１０６】
前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）と、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、より好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【０１０７】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【０１０８】
前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化１】
2013147140.tif 000005
【０１０９】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【０１１０】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【０１１１】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【０１１２】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【０１１３】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【０１１４】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【０１１５】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基でもよい。
【０１１６】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.  F.  W.  McOmie,  「Protecting  Groups  in  Organic  Chemistry」  Prenum  Press,  London  and  New  York,  1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【０１１７】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【０１１８】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【０１１９】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）または（Ｌｙ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【０１２０】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【０１２１】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【０１２２】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、前記リンカー領域（Ｌｘ）に、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、前記リンカー領域（Ｌｙ）に、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【０１２３】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【０１２４】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化２】
2013147140.tif 000006
【０１２５】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
【化３】
2013147140.tif 000007
【０１２６】
前記核酸分子において、前記リンカー以外の領域の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１２７】
前記核酸分子において、前記リンカー領域の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１２８】
前記核酸分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
【０１２９】
前記一本鎖核酸分子の具体例として、前記第２形態の核酸分子（以下、ＮＫともいう）および前記第３形態の核酸分子（以下、ＰＫともいう）を以下に示す。
【０１３０】
前記ＮＫの具体例を、以下に示す。各ＮＫは、５’末端から３’末端方向の配列で示し、５’側の四角で囲んだ領域が、前記リンカー（Ｌｘ）であり、３’側の四角で囲んだ領域が、前記リンカー（Ｌｘ）であり、下線部が、前記ａｓヌクレオチドである。核配列において、前記リンカー（Ｌｘ）および前記リンカー（Ｌｙ）の配列は、特に制限されず、各領域内でアニーリングが生じない配列、つまり、ループを形成する配列であることが好ましい。各ＮＫについて、前記リンカー（Ｌｘ）および前記リンカー（Ｌｙ）を任意のｎで示した配列と、具体的な塩基で示した配列とを、例示する。ｎは、例えば、ａ、ｃ、ｇまたはｕである（以下、同様）。なお、これらは例示であって、本発明を限定するものではない。
【０１３１】
【表３】
2013147140.tif 000008
【０１３２】
前記ＰＫの具体例を、以下に示す。各ＰＫは、５’末端から３’末端方向の配列で示し、５’側の四角で囲んだ領域が、前記リンカー（Ｌｘ）であり、３’側の四角で囲んだ領域が、前記リンカー（Ｌｘ）であり、下線部が、前記ａｓヌクレオチドである。核配列において、前記リンカー（Ｌｘ）および前記リンカー（Ｌｙ）の構造は、特に制限されず、前述のような、ピロリジン骨格、ピペリジン骨格の構造があげられる。なお、これらは例示であって、本発明を限定するものではない。
【０１３３】
【表４】
2013147140.tif 000009
【０１３４】
ＮＫ−０１４４（配列番号８４）、ＮＫ−０１４５（配列番号８６）、ＮＫ−０１４６（配列番号８８）、ＮＫ−０１４７（配列番号９０）およびＮＫ−０１４８（配列番号９２）、ならびにＰＫ−００７６（配列番号９３）、ＰＫ−００７７（配列番号９４）、ＰＫ−００７８（配列番号９５）、ＰＫ−００７９（配列番号９６）、ＰＫ−００８０（配列番号９７）について、ステム形成とループ形成の状態を、以下に示す。下記配列において、矢印は、５’末端と３’末端とが未結合であることを示し、５’は、５’末端を示す。また、下記配列において、下線部は、前記ａｓヌクレオチドである。
【０１３５】
【表５】
2013147140.tif 000010
【０１３６】
前記ＮＫおよびＰＫにおける前記ａｓヌクレオチドの種類を以下に示す。
【０１３７】
【表６】
2013147140.tif 000011
【０１３８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明の核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方でもよい。前記核酸分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明の核酸分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２または３個である。
【０１３９】
前記核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基でもよい。前記核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１４０】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１４１】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１４２】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Limbach  et  al．、1994、Summary：the  modified  nucleosides  of  RNA、Nucleic  Acids  Res．22：2183〜2196）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基でもよい。
【０１４３】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【０１４４】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等のハロゲンに置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１４５】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１４６】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１４７】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１４８】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき、前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明の核酸分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１４９】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１５０】
本発明の核酸分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１５１】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子は、例えば、後述するような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の核酸分子の検出等に利用できる。
【０１５２】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１５３】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１５４】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１５５】
本発明の核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１５６】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１５７】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  And  Engineering」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Kroschwitz  J．I．）編、John  Wiley  ＆  Sons、１９９０、およびイングリッシュら（Englischら）、Angewandte  Chemie、International  Edition、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１５８】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１５９】
本発明の核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【０１６０】
本発明の核酸分子は、前述のように、ペリオスチン遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、ペリオスチン遺伝子の発現が原因となる眼疾患の治療剤として使用できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記眼疾患の予防、前記眼疾患の改善、前記眼疾患の予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１６１】
前記眼疾患は、特に制限されず、網膜症、黄斑変性症、翼状片、結膜炎、眼内血管新生、眼手術後の線維瘢痕等があげられ、前記網膜症は、例えば、増殖性糖尿病網膜症、増殖硝子体網膜症等の増殖性網膜症等があげられる。
【０１６２】
本発明の核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記投与対象に、前記核酸分子を投与すればよい。
【０１６３】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物あげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ等の非ヒト哺乳類動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１６４】
前記細胞は、特に制限されず、例えば、ヒトおよびマウス等の、ＡＲＰＥ−１９等の網膜色素上皮細胞、およびＮＩＨ３Ｔ３等の線維芽細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。前記細胞は、例えば、ヒト受精卵、ならびに、ヒト胚およびヒト個体内の細胞を除く。
【０１６５】
本発明の核酸分子に関しては、後述する本発明の組成物、眼疾患用医薬、ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法および眼疾患の治療方法等の記載を参照できる。
【０１６６】
本発明の核酸分子は、前述のように、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制できることから、例えば、眼疾患用医薬として有用である。
【０１６７】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸分子をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記ＤＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、ベクターに発現可能なように前記ＤＮＡが挿入されている。前記ＤＮＡを挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、一般的なベクターが使用でき、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクターがあげられる。
【０１６８】
本発明のベクターによれば、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの投与によって、投与された対象内で、本発明の発現抑制核酸分子を発現できる。
【０１６９】
＜組成物＞
本発明の組成物は、本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。
【０１７０】
本発明の組成物によれば、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制できるため、本発明の組成物は、例えば、抑制用試薬ということもできる。本発明によれば、例えば、ペリオスチン遺伝子が存在する対象、特に、ペリオスチン遺伝子の発現が相対的に高い対象、相対的に高くなると予測される対象に投与することで、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制できる。投与対象は、例えば、前述の通りである。
【０１７１】
また、本発明の発現抑制核酸分子は、前述のように、眼疾患の治療に使用できることから、本発明の組成物は、眼疾患用の薬学的組成物、眼疾患の治療薬、眼疾患用医薬ともいえる。
【０１７２】
本発明によれば、例えば、眼疾患の患者に投与することで、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制し、前記眼疾患を治療できる。前記眼疾患は、例えば、前述の通りであって、増殖糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症等の黄斑変性症等があげられる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記眼疾患の予防、前記眼疾患の改善、前記眼疾患の予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１７３】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が、生体から分離された細胞等の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法、ナノバブル法等があげられる。前記投与対象が生体の場合、例えば、非経口投与、経口投与等があげられる。非経口投与は、例えば、局所投与、静脈内投与等があげられる。前記眼疾患に対する投与部位は、例えば、眼、血管等があげられる。眼へに直接投与する場合、その投与方法は、特に制限されず、例えば、点眼、点入、硝子体内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、前房内投与等があげられる。本発明の組成物の投与条件、例えば、投与回数、投与量等は、特に制限されない。
【０１７４】
本発明の組成物の形態は、特に制限されず、例えば、注射液、点滴静注液、点眼液、眼軟膏等である。
【０１７５】
本発明の組成物において、前記発現抑制核酸分子の配合量は、特に制限されない。前記発現抑制核酸分子の投与条件は、特に制限されない。硝子体注射の場合、例えば、ヒト成人男子の眼球１個に対する１回あたりの投与量（合計）は、例えば、０．０１〜１０ｍｇであり、好ましくは０．１〜１ｍｇであり、投与回数は、例えば、２週間〜８週間に１回である。本発明の組成物において、前記核酸分子の配合量は、例示した投与条件を実現できるような濃度で含まれていることが好ましい。
【０１７６】
本発明の組成物は、例えば、本発明の発現抑制核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物の配合量は、前記発現抑制核酸分子の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１７７】
本発明の組成物において、前記添加物は、例えば、前記発現抑制核酸分子と複合体を形成するものが好ましい。この場合、前記添加物は、例えば、複合化剤ともいえる。本発明の組成物において、前記発現抑制核酸分子を複合体とすることによって、例えば、前記発現抑制核酸分子を効率よくデリバリーできる。前記発現抑制核酸分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体があげられる。
【０１７８】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１７９】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤、基剤、安定化剤、保存剤等があげられる。
【０１８０】
＜ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法＞
本発明の抑制方法は、前述のように、ペリオスチン遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の発現抑制核酸分子、前記本発明の組成物または前記眼疾患用医薬を使用することを特徴とする。本発明の抑制方法は、本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１８１】
本発明の抑制方法は、例えば、ペリオスチン遺伝子が存在する対象、特に、ペリオスチン遺伝子の発現が相対的に高い対象または相対的に高くなると予測される対象に、前記発現抑制核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記発現抑制核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、前述のような、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、前述と同様に、ヒト、前記非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１８２】
本発明の抑制方法は、例えば、前記発現抑制核酸分子を単独で投与してもよいし、前記発現抑制核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択でき、前述の記載が援用できる。
【０１８３】
＜治療方法＞
本発明の眼疾患の治療方法は、前述のように、本発明の発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、眼疾患の治療に、本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明が対象とする眼疾患は、例えば、前述の通りであって、増殖糖尿病網膜症等の網膜症、加齢黄斑変性症等の黄斑変性症等があげられる。
【０１８４】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、前述のように、非経口投与および経口投与のいずれでもよい。
【０１８５】
＜発現抑制核酸分子の使用＞
本発明の発現抑制核酸分子は、ペリオスチン遺伝子の発現またはペリオスチンタンパク質の機能の抑制のための核酸分子、または、眼疾患の治療のための核酸分子である。また、本発明の発現抑制核酸分子は、ペリオスチン遺伝子の発現抑制剤または眼疾患用医薬の製造のための核酸分子である。
【０１８６】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１８７】
（実施例１）
ｓｉＲＮＡを合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。【０１８８】
（１）ｓｉＲＮＡ
実施例のｓｉＲＮＡとして、下記配列の二本鎖ＲＮＡを合成した。各二本鎖ＲＮＡにおいて、上の配列がセンス鎖、下の配列がアンチセンス鎖とした。センス鎖の３’末端のオーバーハングおよびアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングは、いずれも、ｎ＝２であり、ＴＴとした。【０１８９】
【表７】
2013147140.tif 000012
【０１９０】
また、ネガティブコントロールとして、アンチセンス鎖の塩基配列をスクランブルした、下記二本鎖ＲＮＡを使用した。【０１９１】
【表８】
2013147140.tif 000013
【０１９２】
（２）ペリオスチン遺伝子の発現量の測定
細胞は、ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９（American  Type  Culture  Collection：ATCC）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Invitrogen）を使用した。【０１９３】
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ５×１０４細胞／ウェルとなるように分注し、さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen）を用いて、添付プロトコールに従って、前記二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたり、前記二本鎖ＲＮＡと前記トランスフェクション試薬との複合体１００μｌと、前記細胞の懸濁液４００μｌ（５×１０４細胞）とを添加し、全量を５００μｌ、前記二本鎖ＲＮＡの最終濃度を１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０１９４】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した。そして、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名SuperScript  III、Invitrogen）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ペリオスチン遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ペリオスチン遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。前記ＰＣＲにおいて、ペリオスチン遺伝子およびβ−アクチンの増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。発現量は、二本鎖ＲＮＡを添加していない非添加細胞群を1として、相対的に比較した。【０１９５】
ペリオスチン遺伝子増幅用プライマーセット
5’-TGCCCAGCAGTTTTGCCCAT-3’    （配列番号７９）
5’-CGTTGCTCTCCAAACCTCTA-3’    （配列番号８０）
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’  （配列番号８１）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’（配列番号８２）【０１９６】
なお、コントロール１として、前記二本鎖ＲＮＡおよび前記トランスフェクション試薬を添加していない細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記二本鎖ＲＮＡを未添加とし、前記トランスフェクション試薬のみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。【０１９７】
（３）結果
これらの結果を、図５に示す。図５は、ペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図５に示すように、前記実施例の二本鎖ＲＮＡは、コントロール（−およびｍｏｃｋ）およびネガティブコントロールよりも低い値を示したことから、いずれも発現抑制活性を有することが確認できた。中でも、ＮＩ−００７９、ＮＩ-００８２、ＮＩ−００８３、ＮＩ−００８４、ＮＩ−００８５は、極めて強い発現抑制活性を示した。【０１９８】
（実施例２）
脈絡膜新生血管(choroidal  neovascularization：ＣＮＶ)のモデルマウスを使用して、本発明の核酸分子により、新生血管および繊維性増殖組織の形成が抑制されることを確認した。【０１９９】
（１）核酸分子
実施例のｓｉＲＮＡとして、前記実施例１のＮＩ−００７９を使用した。また、実施例の一本鎖核酸分子として、以下に示すＮＫ−０１４４およびＰＫ−００７６を使用した。ＮＫ−０１４４およびＰＫ−００７６において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と共通する配列番号１のａｓ１ヌクレオチドを下線で示す。
【表９】
2013147140.tif 000014
【０２００】
前記ＰＫ−００７６において、リンカー（Ｌｘ）とリンカー（Ｌｙ）の構造は、前記（Ｉ−８ａ）に示す下記構造とした。
【化４】
2013147140.tif 000015
【０２０１】
ネガティブコントロールは、前記実施例１と同じＮＩ−００００を使用した。【０２０２】
（２）モデルマウスの作成
ケタラール（登録商標）注射液（５０ｍｇ／ｍＬ）とセラクタール（登録商標）２％注射液とを、体積比９：１で混合し、この混合液を、カルシウムおよびマグネシウム未添加のＰＢＳ（−）で５倍希釈した。得られた麻酔用希釈液を、１７０μＬ／匹の条件でマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ、オス、６−８週齢、日本クレア）の腹腔に、シリンジで注射し、全身麻酔した。前記マウスに、ミドリン（登録商標）Ｐ  １滴を点眼し、散瞳し、続いて、コンタクトレンズ用の角膜装着補助剤であるスコピゾル眼科溶液  １滴を点眼した。そして、麻酔下のマウスの眼に、下記条件でレーザーを照射した。
機器
ＺＥＩＳＳ  ３０  ＳＬ−Ｍ
設定
ｐｏｗｅｒ：１００ｍＷ
ｓｐｏｔ  ｓｉｚｅ：７５μｍ
ｄｕｒａｔｉｏｎ：０．１ｓｅｃ、４ｓｈｏｔｓ／眼【０２０３】
（３）核酸分子の投与
レーザー照射を行った日および照射7日目のマウスに、ミドリン（登録商標）Ｐ  1滴を点眼し、散瞳し、続いて、前記麻酔用希釈液を、前述と同様の条件で前記マウスに注射し、全身麻酔した。そして、０．１ｎｍｏｌ／μＬに調製した前記核酸分子を、０．１ｎｍｏｌ／ｅｙｅとなるように、前記マウスの硝子体内に注入した。前記注入は、３３Ｇ針付きハミルトンシリンジ(♯７０１)を使用し、手術用顕微鏡で眼球内を観察しながら行った。そして、前記マウスに、抗菌点眼薬クラビット点眼液（商品名）０．５％  １滴を点眼した。【０２０４】
（４）薬効評価
前記核酸分子を投与した前記マウスを、遮光条件下、所定期間（２１日間）飼育した後、過麻酔により安楽死させた。前記マウスから、眼球を摘出し、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で１時間、固定処理した。固定した眼球から、脈絡膜を採取し、前記ＰＢＳ（−）に浸漬した。そして、前記脈絡膜に対して、常法にしたがって、Ｆｌａｔ  Ｍｏｕｎｔ免疫染色を行い、イソレクチンＢ４およびコラーゲンＩ型を染色した。蛍光顕微鏡を用いて、イソレクチンＢ４の染色による新生血管の形成確認およびコラーゲンＩ型の染色による線維性増殖組織の形成確認を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、立体構築画像から、新生血管および線維性増殖組織の体積を定量化した。定量化には、定量化ソフトとしてＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎを使用した。【０２０５】
これらの結果を、図６に示す。図６において、（Ａ）は、繊維性増殖組織の体積を示すグラフであり、（Ｂ）は、新生血管の体積を示すグラフであり、それぞれ、縦軸は、体積（μｍ３）を示す。【０２０６】
図６に示すように、ＮＩ−００００のコントロールと比較して、実施例のＮＩ−００７９、ＮＫ−０１４４およびＰＫ−００７６は、いずれも繊維性増殖組織の体積および新生血管の体積が減少し、実施例の中でも、ＮＫ−０１４４がより優れ、ＰＫ−００７６がさらに優れた結果を示した。これらの結果から、実施例の核酸分子によれば、繊維性増殖組織および新生血管の増加を抑制できることがわかった。【０２０７】
（実施例３）
ｓｉＲＮＡを合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。【０２０８】
実施例のｓｉＲＮＡとして、下記配列の二本鎖ＲＮＡを合成した。各二本鎖ＲＮＡにおいて、上の配列がセンス鎖、下の配列がアンチセンス鎖とした。センス鎖の３’末端のオーバーハングおよびアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングは、いずれも、ｎ＝２とした。そして、これらのｓｉＲＮＡを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、相対遺伝子発現量を測定した。【０２０９】
【表１０】
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【０２１０】
これらの結果を、図７に示す。図７は、ペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図７に示すように、前記実施例の二本鎖ＲＮＡは、コントロール（−およびｍｏｃｋ）およびネガティブコントロールよりも低い値を示したことから、いずれも発現抑制活性を有することが確認できた。【０２１１】
（実施例４）
一本鎖核酸分子を合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。【０２１２】
実施例の一本鎖核酸分子として、下記配列の一本鎖ＲＮＡ（ＮＫおよびＰＫ）を合成した。下記配列において、前記ａｓ１ヌクレオチドを下線で示す。また、一本鎖ＲＮＡである各ＰＫにおいて、リンカー（Ｌｘ）およびリンカー（Ｌｙ）の構造は、それぞれ、前記実施例１に記載した前記（Ｉ−８ａ）の構造とした。そして、これらの一本鎖核酸分子を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、相対遺伝子発現量を測定した。【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
これらの結果を、図８および９に示す。図８は、一本鎖ＲＮＡ（ＮＫ）を使用した場合におけるペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、図９は、一本鎖ＲＮＡ（ＰＫ）を使用した場合におけるペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、両図において、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図８および図９に示すように、前記実施例の一本鎖ＲＮＡは、いずれも、コントロール（−およびｍｏｃｋ）およびネガティブコントロールよりも低い値を示したことから、いずれも発現抑制活性を有することが確認できた。【０２１５】
（実施例５）
ｓｉＲＮＡを合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマウスペリオスチン遺伝子の発現抑制を確認した。【０２１６】
実施例のｓｉＲＮＡとして、ＮＩ−００７９〜ＮＩ−００８８およびＮＩ−００９４〜ＮＩ−００９９を使用した。そして、細胞として、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を使用し、４×１０４細胞／ウェルとなるように培養に使用した以外は、前記実施例１と同様にして、相対遺伝子発現量を測定した。【０２１７】
これらの結果を、図１０に示す。図１０は、ペリオスチン遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図１０に示すように、前記実施例のｓｉＲＮＡは、いずれも、コントロール（−およびｍｏｃｋ）およびネガティブコントロールよりも低い値を示したことから、いずれも発現抑制活性を有することが確認できた。【０２１８】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０２１９】
この出願は、２０１２年３月２９日に出願された日本出願特願２０１２−７８１１４を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明の核酸分子によれば、ペリオスチン遺伝子の発現またはペリオスチンタンパク質の機能を抑制できる。このため、本発明は、ペリオスチン遺伝子の発現またはペリオスチンタンパク質が原因となる眼疾患、具体的には、例えば、増殖糖尿病網膜症および加齢黄斑変性症等の黄斑変性症の治療に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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