(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図４に示す配列からなる分離されかつ精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
図４に示す配列からなるポリヌクレオチドの、アルボウイルス症に関連するCHIKVのインビトロ検出のための使用。
【請求項３】
図４に示す配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも含む、アルボウイルス症に関連するCHIKVの検出のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重篤な形の感染を示し、かつヒトアルボウイルス症(arbovirosis)流行病に由来する患者から分離されたチクングンヤウイルスの野生株に関する。本発明は、それらのゲノムに由来するポリペプチド配列及びそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、並びに診断用製品、ワクチン及び／又は免疫原性組成物としてのそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
チクングンヤウイルス(CHIKV)は、トガウイルス科(Togaviridae)に属する蚊伝染性アルファウイルスである[1,2]。これは、1952年のタンザニアでの大発生から最初に分離された[3]。これは、高熱、関節痛、筋肉痛、頭痛及び発疹を特徴とする突然の発症の急性感染の原因である[4,5]。この疾患の特徴的症状である多発性関節痛(Poly-arthralgia)は、非常に苦痛である。症状は、通常、限定された過程を経、1〜10日間継続する。しかし、関節痛又は関節炎性の症状は、数ヶ月又は数年持続し得る。いくらかの患者においては、わずかな出血性の徴候、例えば鼻出血又は歯肉出血(gingivorrhagia)も記載されている。
【０００３】
CHIKVは、アフリカ、インド及び東南アジアに地理的に分布している。アフリカにおいては、このウイルスは、野生の霊長類と、蚊、例えばAedes luteocephalus、Ae. furcifer又はAe. tayloriとの間の野生鳥獣に発生する(sylvatic)伝播サイクルを介して維持される[4]。アジアでは、CHIKVは、ヒトからヒトに、都市型伝播サイクルを介して、Ae. aegypti、及びより少ない程度であるがAe. albopictusにより主に伝播される。1952年のタンザニアでの大発生以来、CHIKVは、東部アフリカ(タンザニア、ウガンダ)、南部アフリカ(ジンバブエ、南アフリカ)、西部アフリカ(セネガル、ナイジェリア)及び中央アフリカ(中央アフリカ共和国、コンゴ民主共和国)で大発生を引き起こしている[4]。最も近年の集団再発現は、1999〜2000年にキンシャサであったことが記録され、ここでは、推定50,000人が感染した[6]。タイのバンコクでの1958年のアジアで最初に記録された大発生以来、タイ、カンボジア、ベトナム、ラオス、ミャンマー、マレーシア、フィリピン及びインドネシアでの大発生が記録されている[4,5]。最も近年の集団再発現は、2001〜2003年に、20年ぶりにジャワであったことが記録されている[7]。アフリカ又はアジアのいずれにおいても、連続する大発生の間の間隔が7〜8年から20年である再発現は、予測不可能である。
【０００４】
2004年の終わり以来、チクングンヤウイルス(CHIKV)は、南西インド洋の島々で出現している。2005年の1月から3月の間に、コモロでは5,000を超える件が報告された。2005年の後半には、ウイルスは、他の島々、すなわちマヨット、セーシェル、レユニオン及びモーリシャスで流布している。2005年12月に始まって、雨季に、ウイルスの流行性の流布が新たに増加した。2006年の1月1日から3月1日の間に、モーリシャス、マヨット及びセーシェルにおいて2,553件、3,471件及び4,650件が報告されている(2006年3月12日)。最も影響を受けた島は、レユニオンであり、2006年3月12日までに推定212,000件がある(全人口：770,000)。より最近では、ウイルスの流布は、マダガスカルで記録されている。
【０００５】
レユニオン島では、最初に記録された件は、2005年3月にコモロから1 ng帰国した患者であった。3月から6月にかけて、3,000を超える件が報告された。伝播は、南半球の冬季に限定され、主な急増は、12月中旬から観察され始め、2006年の1月から3月までに推定210,000件が観察された[8]。2005年の3月以来、CHIKV感染が確定した85人の患者が、重篤な臨床徴候を発生し(髄膜脳炎又は劇症肝炎)、集中治療室での入院加療が必要であった。髄膜脳炎及び主要疼痛症候群(major algic syndrome)のいくつかの件は、ウイルスの垂直感染に関連している9。
【０００６】
現在までに、2つのCHIKV完全ヌクレオチド配列が、ともに1952年のタンザニアでの大発生の間の患者から分離されたRoss株(アクセッション番号：AF490259)及びS27株について決定されている[9]。別の完全ヌクレオチド配列が、1983年のセネガルでの大発生の間にAe. furciferで分離された株について決定されている(アクセッション番号AY726732)。Khanら[9]は、S27ゲノムの構造が、他のアルファウイルスの構造に類似し、オニョンニョンウイルス(ONN)が、CHIKVの最も近縁であることを示した。さらに、アフリカ及びアジアでの分離株からの部分的E1配列に基づく系統発生的分析は、1つは西部アフリカからの全ての分離株を含み、1つはアジアからの分離株を含み、1つは東部、中央及び南部アフリカの分離株に相当する3つの異なるCHIKVの系統群(phylogroups)の存在を明らかにした[10]。コンゴ民主共和国で1999〜2000年に分離された株は、後者の系統群に属する[6]。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の態様は、アルボウイルス症のようなCHIKウイルスに関連する疾患に対する新しい診断用及び免疫学的ツールを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような態様は、特に、インビトロでヒト細胞に感染可能なチクングンヤウイルス(CHIK)の分離されかつ精製された野生株、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用を提供することにより達成される。
【０００９】
本発明の別の態様は、構造タンパク質E1及び／又は構造タンパク質E2に少なくとも1つの変異を含むCHIKVの分離されかつ精製された株、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、配列番号1、2、3、4、5又は6の配列の全体又は一部分を含む分離されかつ精製されたポリヌクレオチド、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、糖タンパク質E2又はE1の外部ドメイン(ectodomain)をコードする本発明のポリヌクレオチドのフラグメント、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
【００１２】
本発明のその他の態様は、本発明により意図されるポリヌクレオチド又はフラグメントを含むベクター又はプラスミド、並びに該ベクター又はプラスミドを含む宿主細胞、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、本発明のポリヌクレオチド又はフラグメントによりコードされる精製されたポリペプチド、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメント、並びにアルボウイルスに関連するCHIKVの検出、又はアルボウイルスを予防及び／又は治療する組成物の製造のためのその使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本研究において、本発明者らは、レユニオン及びセーシェル島を起源とする6人の患者から単離されたウイルスのほぼ完全なヌクレオチド配列を決定した。本発明は、インド洋大発生分離株のゲノム構造及び独特な分子的特徴を決定することを可能にし、これらにより、これらの分離株は、他に報告されたCHIKV及びアルファウイルス配列から区別される。
【００１６】
当業者が認識するように、本発明の独自性は、従来技術のCHIKウイルスから区別されるチクングンヤ(CHIK)ウイルスの新規な株の同定と、及びCHIK株、並びにそれらのゲノムに由来するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドの、アルボウイルス症の診断、予防及び／又は治療における使用である。
【００１７】
第1の態様によると、本発明は、インビトロでヒト細胞に感染し得るチクングンヤウイルス(CHIKV)の分離されかつ精製された野生株に関する。好ましくは、本発明は、分離株05.115、05.61、05.209、06.21、06.27及び06.49からなる群より選択されるものと同じ特徴を示すCHIKウイルスの野生株に関する。好ましい実施形態によると、本発明の範囲内の株は、それらのゲノムが、CHIKウイルスS-27株のゲノム配列(GenBank AF339485)と比較したときに、少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする。本発明の好ましいCHIK株の試料からの細胞培養により成長するか又は得られるいずれの株も、本発明の範囲内である。本発明による好ましい株のゲノムは、図4、5、6、7、8又は9に示す配列(配列番号1、2、3、4、5又は6)を含む。
【００１８】
別の態様によると、本発明は、構造タンパク質E1及び／又は構造タンパク質E2、より具体的には外部ドメイン領域に少なくとも1つの変異を含むチクングンヤウイルス(CHIKV)の分離されかつ精製された株を提供する。好ましい実施形態において、本発明の株は、そのゲノムが、配列番号23の382位、399位、404位、485位、489位、506位、536位、624位、637位、669位、700位又は711位のアミノ酸に相同な位置で、E2タンパク質に少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする(図37)。より具体的には、変異は、表6に示すように、G382K、I399M、G404E、N485T、A489T、L506M、I536T、S629N、T637M、A669T、S700T及びV711Aからなる群より選択されることが好ましい。別の好ましい実施形態によると、本発明の株は、そのゲノムが、配列番号23の1035位、1078位、1093位又は1131位のアミノ酸に相同な位置で、E1タンパク質に少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする。より具体的には、変異は、表6に示すように、A1035V、M1078V、D1093E及びV1131Aからなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、E1タンパク質内の変異は、A1035Vである。
【００１９】
本明細書において用いる場合、タンパク質の「アミノ酸の位置に相同な位置」との表現は、特定の参照タンパク質との配列及び／又は構造アラインメントに基づいて、互いに対応すると決定されるアミノ酸の位置のことをいう。例えば、配列番号1に示すCHIKウイルス構造タンパク質のアミノ酸の位置に対応する位置は、配列番号1に示すアミノ酸配列を、具体的なCHIKウイルス構造タンパク質と整列させることにより、経験的に決定できる。相同な又は対応する位置は、手動のアラインメントを用いて当業者により、又は利用可能な多数のアラインメントプラグラム(例えばBLASTP)により決定できる。相同な又は対応する位置は、例えば、タンパク質構造のアラインメントをシミュレーションするコンピュータを用いることによる構造アラインメントに基づくこともできる。ポリペプチドのアミノ酸が、開示された配列内のアミノ酸に対応するとの記載は、標準的なアルゴリズム、例えばGAPアルゴリズムを用いて、同一性又は相同性を最大限にするような(保存アミノ酸を整列させる)、開示された配列とのポリペプチドのアラインメントにより同定されるアミノ酸のことをいう。本明細書で用いる場合、「相同な位置で」とは、別の参照核酸分子又はタンパク質中の位置に関する核酸分子又はタンパク質中の興味対象の位置(すなわち塩基番号又は残基番号)のことをいう。別の参照タンパク質中の位置に対する興味対象の位置は、例えば、別のCHIK株の同じタンパク質からのアミノ酸配列中にあり得る。相同な位置は、一致するヌクレオチド又は残基の数が最大になるように、例えば、配列間の同一性が95%を超える、好ましくは96%を超える、より好ましくは97%を超える、さらにより好ましくは98%を超える、最も好ましくは99%を超えるように、配列同士を比較及び整列させることにより決定できる。興味対象の位置は、次いで、参照核酸分子中で割り当てられた番号を与えられる。
【００２０】
本発明の別の態様は、図4、5、6、7、8又は9 (配列番号1、2、3、4、5又は6)に示すような配列の全体又は一部分を含む、分離されかつ精製されたポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、糖タンパク質E1又はE2、より好ましくはそれらの外部ドメイン領域をコードすることを特徴とする本発明のポリヌクレオチドのフラグメントに関する。有利には、E2外部ドメインをコードする場合の本発明のフラグメントは、図10、11、12又は13 (配列番号7、8、9又は10)に示すようなヌクレオチド配列を含むか、より好ましくは該配列からなる。
【００２２】
本発明の別の態様は、糖タンパク質E2の可溶形をコードすることを特徴とする本発明のポリヌクレオチドのフラグメントに関する。好ましい実施形態によると、糖タンパク質E2の可溶性フラグメントは、図14、15、16又は17に示すヌクレオチド配列(配列番号11、12、13又は14)を含むか、より好ましくは該配列からなる。
【００２３】
当業者により認識されるように、本発明により意図されるフラグメントは、
-     切断部位が該フラグメントを含むポリヌクレオチド内に存在する制限酵素の使用；
-     該フラグメントについての特異的プライマーを用いる増幅；
-     インビトロ転写；又は
-     化学合成
により得ることができる。
【００２４】
別の態様によると、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はフラグメントによりコードされる、分離されかつ精製されたポリペプチドに関する。本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、交換可能に用いられて、アミノ酸ポリマー又は相互作用若しくは結合している2以上のアミノ酸ポリマーの組のことをいう。
【００２５】
ポリペプチドのことに言及する場合、「分離され」により、指示される分子が、該分子が天然で見出される生物全体から分離され、分けられているか、又は該分子が、同じ種類の他の生物学的巨大分子の実質的非存在下に存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関する用語「分離され」は、それが天然で通常会合している配列を全体又は部分的に含まない核酸分子、又は天然に存在するのと同様であるが、それに組み合わせて異種配列を有する配列、又は染色体から分離された分子である。
【００２６】
広義には、用語「精製されたポリペプチド」又は「精製されたポリヌクレオチド」は、他のタンパク質又はポリヌクレオチド、或いはそれらが天然に会合している炭水化物及び脂質から充分に離れたポリペプチド又はポリヌクレオチドのことである。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、例えば電荷、分子サイズ又は結合親和性に基づいてタンパク質又はポリヌクレオチドが他の成分若しくは化合物から分離される任意のプロセスにより精製できる。
【００２７】
本発明の好ましいペプチドは、S-27株のアミノ酸配列(GenBank AF339485)に比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、本発明のフラグメントによりコードされるタンパク質の配列に由来する。好ましくは、本発明の精製されたポリペプチドは、本発明により意図されるCHIKウイルスORF 1又は2のアミノ酸配列、例えば配列番号24〜29 (ORF 2)又は配列番号30〜34及び78 (ORF 1)のいずれか1つで定義されるものの全体又は一部分を含む。より好ましくは、本発明の精製されたポリペプチドは、本発明により意図される糖タンパク質E2のアミノ酸配列、例えば配列番号15〜18 (図18〜21)のいずれか1つで定義されるものの全体又は一部分を含む。さらにより好ましくは、本発明の精製されたポリペプチドは、本発明により意図される糖タンパク質E2の可溶形のアミノ酸配列、例えば配列番号19〜22 (図22〜25)のいずれか1つで定義されるものの全体又は一部分を含む。
【００２８】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのフラグメントを含むベクターにも関する。本明細書において用いる場合、用語「ベクター」は、1又は複数の種類の細胞の形質導入／トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物のことをいう。ベクターは、例えば、挿入ヌクレオチドの分離、増殖及び複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞内のヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、又は組換えウイルス若しくはウイルス様粒子の産生をもたらすように設計された「ウイルスベクター」、又は1より多い型のベクターの属性を含む「シャトルベクター」であり得る。好ましいベクターは、フランス、75724 パリ  セデックス15、リュ  デュ  ドクトール  28(28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, France)のCNCM (国立培養微生物コレクション(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes))に、2006年3月15日に、アクセッション番号I-3587、I-3588、I-3589及びI-3590の下で寄託されたものである。本発明により意図される別の好ましいベクターは、TRIP-CHIK.sE2と呼ばれるプラスミドであり、これは、フランス、75724 パリ  セデックス15、リュ  デュ  ドクトール  28のCNCM (国立培養微生物コレクション)に、2007年3月14日に、アクセッション番号I-3733の下で寄託されている。このようなベクターは、本発明の糖タンパク質E2の可溶形をコードするフラグメントを含む。この好ましいベクターは、哺乳動物細胞への組換えE2タンパク質の効率的な産生のために最適化されている。本明細書で用いる場合、用語「最適化された」は、ベクターが、所望のコードされたタンパク質を適切に発現するために、シグナルペプチド配列のような調節配列を組み込んでいることを意味する。
【００２９】
関連する態様において、本発明は、上記で定義されるベクターを含む宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」は、天然では互いに連結されていない核酸セグメントの新しい組み合わせを有する細胞のことである。核酸セグメントの新しい組み合わせは、当業者に利用可能な広い範囲の核酸操作法を用いて、生物に導入できる。宿主細胞は、単一の真核細胞、又は単一の原核細胞、又は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ゲノム外(extragenomic)のベクターを有し得る。ゲノム外核酸ベクターは、細胞のゲノムには挿入されない。宿主細胞は、ゲノム内であるベクター又はその一部分をさらに有し得る。ゲノム内との用語は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる核酸構築物と定義される。本発明の好ましい宿主細胞は、E. coli、例えばフランス、75724 パリ  セデックス15、リュ  デュ  ドクトール  28のCNCM (国立培養微生物コレクション)に、2006年3月15日に、アクセッション番号I-3587、I-3588、I-3589及びI-3590の下で、並びに2007年3月14日に、アクセッション番号I-3733の下で寄託された本発明のベクターを含むものである。
【００３０】
本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメントにさらに関する。本明細書で用いる場合、用語「特異的に結合する」とは、本発明のタンパク質の1又は複数のエピトープに比較的高い親和性で結合するが、興味対象のもの以外の分子を実質的に認識せず、結合しない抗体のことをいう。本明細書で用いる場合、用語「比較的高い親和性」とは、少なくとも10-6 M、好ましくは少なくとも約10-7 M、さらにより好ましくは10-8 M〜10-10 Mの抗体と興味対象のタンパク質との間の結合親和性を意味する。このような親和性の決定は、当業者に公知である標準的な競合結合イムノアッセイ条件の下で行うのが好ましい。
【００３１】
本明細書で用いる場合、用語「抗体」は、免疫原での刺激に応答してリンパ系細胞により産生される糖タンパク質のことをいう。抗体は、それらの産生を惹起する抗原決定基若しくはエピトープ、又は同種抗原に近接に関連する抗原決定基とインビトロ及びインビボで、特異的かつ選択的に反応する能力を有する。用語「抗体」は、このような抗体の結合(可変)領域を用いる構築物、及びその他の改変抗体を含むことを意味する。つまり、本発明の方法において有用な抗体は、抗体全体、抗体フラグメント、多官能性抗体凝集物、又は一般的に、抗体からの1若しくは複数の特異的結合部位を含む物質を含み得る。抗体フラグメントは、Fv、Fab又はF(ab')2フラグメント又はその誘導体、例えば単鎖Fvフラグメントのようなフラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、非組換え、組換え又はヒト化されたものであり得る。抗体は、免疫グロブリンアイソタイプ、例えばIgG、IgMなどのものであり得る。さらに、免疫グロブリン又はそのフラグメントの凝集物、ポリマー、誘導体及びコンジュゲートは、適切な場合に用い得る。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明の株、ポリヌクレオチド、フラグメント、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド及び抗体の、アルボウイルス症に関連するCHIKVの検出のため、又はアルボウイルス症を予防及び／又は治療する組成物の製造のための使用である。
【００３３】
本発明の別の態様は、アルボウイルス症を治療及び／又は予防するための組成物に関する。本発明の組成物は、本発明の株、ポリヌクレオチド、フラグメント、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド及び抗体からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含むのが有利である。本発明の組成物は、許容される担体をさらに含む。関連する態様において、本発明は、アルボウイルス症を治療及び／又は予防するための方法を提供する。該方法は、本発明の組成物を、必要とする対象に投与する工程を含む。
【００３４】
本明細書で用いる場合、用語「治療する」は、CHIKVからの感染の発生が影響を受けるか又は完全に排除されるプロセスのことをいう。本明細書で用いる場合、用語「予防する」は、CHIKV感染が妨げられるか又は遅延されるプロセスのことをいう。
【００３５】
本明細書で用いる場合、表現「適切な担体」は、悪影響を及ぼすことなく動物受容者に投与し得る本発明の組成物の成分(又は要素)を含むビヒクルを意味する。当該技術で知られる適切な担体は、限定されないが、金粒子、滅菌水、塩水、グルコース、デキストロース又は緩衝溶液を含む。担体は、限定されないが、希釈剤、安定化剤(すなわち糖及びアミノ酸)、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、増粘添加剤、着色剤などを含む補助剤を含む。
【００３６】
本発明の組成物の成分の量は、治療有効量が好ましい。本発明の組成物の成分の治療有効量は、組成物が投与される受容者において過度に負の影響を引き起こさずに、該成分が、CHIKV感染に対するそれらの予防及び／又は治療の役割を行うことを可能にするために必要な量である。用いられる成分及び投与される組成物の正確な量は、投与の様式及び組成物中の他の成分のような因子により変動する。
【００３７】
本発明の組成物は、種々の投与経路により受容者(例えばヒト)に与えられ得る。例えば、組成物は、滅菌の注射可能な製剤、例えば滅菌の注射可能な水性又は油性の懸濁剤の形で投与され得る。これらの懸濁剤は、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、当該技術において知られる技術を用いて処方できる。滅菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口で許容される希釈剤又は溶剤中の滅菌の注射可能な液剤又は懸濁剤でもあり得る。これらは、非経口で、例えば静脈内、筋肉内又は皮下で、注射、点滴又は経口(per os)により与え得る。適切な用量は、組成物中の各成分の量、所望の効果(短期又は長期)、投与経路、治療される受容者の年齢及び体重のような因子により変動する。当該技術において公知のいずれのその他の方法を、本発明の組成物の投与のために用い得る。
【００３８】
本発明のさらに別の態様は、上記で定義される組成物の、必要とする対象におけるアルボウイルス症を治療及び／又は予防するための医薬品の製造のための使用である。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、本発明の株、ポリヌクレオチド、フラグメント、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド及び抗体からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、アルボウイルス症に関連するCHIKVの検出のためのキットを提供することである。本発明のこの実施形態によるキットは、それぞれの診断試験を行うために必要とされる上記の成分の1又は複数(典型的には濃縮された形)をそれぞれが含むパッケージを含み得る。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、本発明の他の特徴及び利点を強調し、本発明の使用の範囲を説明する役目を果たすが、その範囲を限定しない。改変及び変動は、本発明の範囲を逸脱することなく行い得る。また、本発明を試験又は実施するために、以下に見出されるものに等価な他の方法及び製品を用いることも可能であるが、好ましい材料及び方法は記載されている。
【００４１】
実施例1: インド洋大発生を引き起こしたCHIKウイルスの同定及び特徴決定
本発明者ら(本明細書においてしばしば「我々」という)は、レユニオン、セーシェル、モーリシャス、マダガスカル及びマヨット島からの合計で60人の患者からの6つの選択された臨床分離株のほぼ完全なゲノム配列とともに、糖タンパク質E1の部分配列を報告する。今回の結果は、この大発生が、東部アフリカ分離株に関係する株により開始されたことを示し、この株から、追跡可能な小進化の経過に従ってウイルス変異株が進化した。大発生分離株の独特の分子的特徴が同定された。特に、非構造タンパク質をコードする領域において、10個のアミノ酸の変化が見出され、そのうち3個はnsP2 (ヘリカーゼ、プロテアーゼ、及びRNAトリホスファターゼ活性を有する)及びポリメラーゼnsP4のアルファウイルスで保存されている位置に位置した。患者の脳脊髄液から得られた唯一の分離株は、nsP1 (T301I)、nsP2 (Y642N)及びnsP3 (E460欠失)において独特の変化を示した。構造タンパク質領域では、2つの注目すべき変化(A226V及びD284E)が、膜融合糖タンパク質E1で観察された。相同3Dモデリングにより、これらの2つの変化が、ビリオンの組み立て及び膜融合に重要な領域に位置づけされた。E1-A226Vの変更は、当初の株では存在しなかったが、レユニオンからのその後のウイルス配列の＞85%で観察され、このことは、おそらく蚊ベクターへの適用による進化の成功を示す。
【００４２】
材料及び方法
患者。レユニオン(N=43)、セーシェル(N=3)、マダガスカル(N=7)、マヨット(N=4)及びモーリシャス(N=3)を起源とする部分的又は完全なCHIKVヌクレオチド配列を決定した60人の患者。患者及び生物学的試料の特徴は、表1に列挙する。
【００４３】
ウイルス分離及びRNA抽出。ウイルスは、血清又は脳脊髄液(CSF)のいずれかから分離された(表1)。簡単に、C6-36 Aedes albopictus細胞に、L15培地(Gibco)で1:10に希釈した1 mlの血清又はCSFを接種した。細胞を、28℃にて、5%胎児ウシ血清及び10%トリプトース-ホスフェートを補ったL15中で成長させた。細胞及び上清を、第1継代培養(5日間)及び第2継代培養(7日間)の後に採集した。ウイルス分離株は、CHIKV過免疫腹水を用いる間接的免疫蛍光により、CHIKVと同定された。そのゲノムを配列決定した分離株05.115、06.21、06.27及び06.49の場合、特異的血清を用いる間接的免疫蛍光により、黄熱、デング及び西ナイルウイルスの不在が確認された。RNAを、QIAAmp Viral Minikit (Qiagen, France)を用いて抽出した。
【００４４】
ヌクレオチド配列決定。プライマー(表4)を、S27株のヌクレオチド配列20に基づいて設計した。RT-PCRを、Titan One Tube RT-PCRキット(Roche, France)を用いて行った。RT-PCRフラグメントを、配列決定(Millipore, France)の前に限外ろ過により精製した。配列決定反応は、BigDye Terminator v1.1サイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, USA)を用いて行い、エタノール沈殿により精製した。配列のクロマトグラムを、自動化配列アナライザABI3100又はABI3700 (Applied Biosystems)で得た。全てのアンプリコンの両方の鎖を配列決定した。
【００４５】
ゲノム配列の組み立て及び配列分析。コンティグの組み立てを、BioNumericsバージョン4.5 (Applied-Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium)、又はPhredPhrap / Consed [11]のいずれかを用いて、異なるオペレータ及びソフトウェアにより独立して行った。両方の分析は、全ての株について全く同じコンセンサス配列を示した。11,601 ntの単独のコンティグが5つの分離株について得られ、05.61株については、S27の5,246位から5,649位(nsP3の390位から524位)の間で配列の一部分が欠失していた。配列アラインメント及び置換テーブル(substitution table)の計算を、プログラムBioNumerics, DNASPバージョン4.10 [12]、及びDAMBEバージョン4.2.13 [13]を用いて行った。選択されたアルファウイルス配列に対するヌクレオチド及びアミノ酸配列のアラインメントは、ClustalW1.7ソフトウェア[14]を用いて行った。配列同一性は、Phylipパッケージ[15]を用いて計算した。RNAの2次構造は、Vienna RNA 2次構造サーバ[16]を用いて予測した。近隣結合系統樹(Neighbor-joining trees)を、複数置換のKimura-2パラメータ修正を用いるMEGAバージョン3.1 [17]を用いて構築した。分岐点の信頼度は、1,000個の複製のブートストラップ再サンプリングにより評価した。同義部位あたりの同義置換(Ks)及び非同義部位あたりの非同義置換(Ka)の量を、DNASPを用いて見積もった。RDP2 [18]を用いて、推定モザイク配列を検出した。
【００４６】
3D構造モデル作成。セムリキ森林ウイルス(SFV)の糖タンパク質E1の外部ドメインの中性pHでの結晶構造[19]; Protein Data Bankコード2ALAを鋳型として用いて、インド洋分離株の2つのアミノ酸変異をモデル化し、分析した。図2は、プログラムRIBBONS [20]を用いて作成した。
【００４７】
免疫染色によるウイルスフォーカスの検出。Aedes pseudoscutellaris AP61細胞を、24ウェル組織培養プレートで、10%熱不活化胎児ウシ血清(FCS)含有Leibovitz L-15成長培地中で、24時間成長させた。蚊細胞の単層を、Leibovitz L-15で1回洗浄し、0.2 ml Leibovitz L-15/2% FCSを加えた。細胞に、0.2 mlのLeibovitz L-15/2% FCS中のCHIKウイルスを感染させ、28℃にて1時間インキュベートした。次いで、0.4 mlのLeibovitz L-15/2% FBS及びカルボキシメチルセルロース(CMC) (1.6%)からなる重層培地を加え、組織培養プレートを28℃にて2日間インキュベートした。感染細胞のフォーカスが、フォーカスイムノアッセイ(FIA)により視覚化された。細胞をPBSで洗浄し、PBS中の3%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間固定し、PBS中の0.5% Triton X-100で室温にて4分間、透過にした。固定された細胞を、1:2,000希釈のCHIKVに対する過免疫マウス腹水(HMAF)と、37℃にて20分間インキュベートした。ヤギ抗-マウスIgG、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを、2次抗体(1:100希釈)として37℃にて20分間用いた。フォーカスを、DABペルオキシダーゼ基質(Sigma)を用いて視覚化した。
【００４８】
1. インド洋大発生チクングンヤウイルスのゲノム構造及び分子サイン
ゲノム構成。我々は、チクングンヤウイルスのインド洋大発生の異なる地理的起源、時点及び臨床形(表1)を示す6つのCHIKV分離株(05.115、05.61、05.209、06.21、06.27及び06.49)のほぼ完全なゲノム配列を決定した。1952年のタンザニア分離株S27 (全長11,826 nt)のヌクレオチド配列中の52位(5'NTR)〜11,667位(3'NTR、3番目の反復配列の末端)に相当する11,601ヌクレオチドを決定した。S27とレユニオン分離株との間には3つの挿入／欠失事象があり、そのうち2つは3'NTRで観察された。まず、S27 (11,440-11,443)で見出され、おそらく内部ポリ-A部位[9]に相当する14ヌクレオチドの内部ポリ-Aストレッチが、インド洋分離株において、他のチクングンヤウイルス、例えばRoss株(アクセッション番号: AF490259)で観察されることと同様に、わずか5 Aのストレッチで置き換えられていた。次に、インド洋分離株において、S27の11,625位での5-Aストレッチ中、1つのAが欠失していた。最後に、分離株06.27において、nsP3コドン460に相当する1つのコドンが欠失していたが、ここでは、他のすべてのインド洋分離株が分析され、入手可能なアルファウイルスの配列は、GluをコードするGAAである。
【００４９】
本明細書に示す6つの分離株のゲノム配列は、アルファウイルスについて以前に報告されたものと似ていた[9, 21, 22]。コード配列は、それぞれ非構造ポリタンパク質(2,474アミノ酸)と構造ポリタンパク質(1,248アミノ酸)とをコードする7,422 nt及び3,744 ntの2つの大きいオープンリーディングフレーム(ORF)からなっていた。非構造ポリタンパク質は、タンパク質nsP1 (535 aa)、nsP2 (798 aa)、nsP3 (530 aa)及びnsP4 (611 aa)の前駆体であり、構造タンパク質は、タンパク質C (261 aa)、p62 (487 aa, E3 - 64 aa及びE2 - 423 aaの前駆体)、6K (61 aa)及びE1 (439 aa)の前駆体である。非構造ポリタンパク質及び構造ポリタンパク質中の、アルファウイルスファミリーに特徴的な切断部位は保存されていた。E3、E2及びE1中のグリコシル化部位も保存されていた。65 ntの連結配列が、非構造ORFの停止コドン(TAG, 7499-7501)と、構造ORFの開始コドン(7567-7569)との間で同定された。5'非翻訳領域(5'NTR)は、76位で終結した。3'NTR領域は11,314位で始まり、以前の研究[9]と矛盾しない予測2次構造(図26)を有する3つの反復配列(RSE)を含んでいた。
【００５０】
インド洋大発生分離株とS27株との違い。S27株に比較して、レユニオン分離株05.115は、非構造タンパク質中で28 aaの変化(1.13%)を示した(表5、nsP3で最も高い割合(2.26%)、nsP2で最も低い割合(0.6%))。nsP3中の12個のアミノ酸の変化のうち10個は、326位と524位との間に集中し(5.0%の変動)、これはONNウイルスで見出されたことと似ていた[23]。S27との1つの重要な違いは、インド洋分離株が、S27におけるArg (CGA)の代わりに、nsP3のコドン524でオパール停止コドン(UGA)を示したことである。このオパールコドンは、関連するアルファウイルスで観察され[9, 22, 23]、推定RNAポリメラーゼであるnsP4の発現を、読み過し機構により調節すると考えられている[21, 24]。
【００５１】
S27に比較して、構造タンパク質は、21 (05.115について1.68%)から22 (他の分離株について1.76%)個のアミノ酸置換を、インド洋分離株で示した(表6)。特に、エンベロープタンパク質E2は、14 (3.3%) aaの変更の最も高い変動を示し、これはエンベロープタンパク質E1 (0.68%)及びカプシドタンパク質(0.38%)よりも高かった。S27と05.115分離株との間の同義及び非同義部位の進化の割合の比(Ks/Ka)は、ポリタンパク質全体について11.0であったが、タンパク質E2では6.12でしかなく、このことは、おそらく、この免疫原性タンパク質におけるアミノ酸変化に好ましいポジティブ選択を示すだろう。比較として、Ks/Kaは、非構造ポリタンパク質について18.75であった。
【００５２】
非構造タンパク質におけるインド洋大発生の分子サイン及び表現型の変動。10個の位置(多形の位置を除く)は、他のCHIKV配列と比較したときに、大発生分離株の非構造タンパク質に独特なaaを有していた(表2)。まず、nsP2-54は、インド洋分離株及びSFVではAsnであったが、他のすべての配列ではSerであった。第2に、nsP2-374は、インド洋分離株ではTyrであったが、他のアルファウイルス配列ではHis又はAsnであった(表2)。第3に、nsP4の500位は、インド洋配列ではLeuであったが、4つの他に報告されたCHIKV配列ではGlnであった。興味深いことに、触媒「GDD」モチーフから約30 aaにあるこの位置は、全ての他のアルファウイルスにおいて厳密にGluに保存されている。残りの7つの変化は、比較的可変性の領域で起こっていた。
【００５３】
さらなる特異的変化は、分離株05.209 (S358P)及び06.27で観察された(nsP1-T301I、nsP2-Y642N及びnsP3-460del)。特に、並行して行った我々の表現型アッセイは、06.27株について違いを示した。フォーカスイムノアッセイは、CHIKVストック05.115、06.21、06.27及び06.49が、Ae. Albopictus C6/36 (データ示さず)及びAe. pseudoscuterallis AP61細胞上で、異なるサイズのフォーカスの混合物を形成したことを示した(図27)。興味深いことに、分離株06-27のみが中程度のフォーカスを形成したが、他のものは微小で小さいフォーカスを形成した。06-27の特定の表現型は、ウイルス複製に関与する非構造タンパク質で観察されたaaの違いに連結し得る[21]。
【００５４】
構造タンパク質でのインド洋分子サイン及び3Dモデル作製。構造タンパク質のaa配列を分析する際に、7つの位置(E2にて4つ、6Kにて1つ及びE1にて2つ)が、インド洋大発生からの分離株に独特であることが見出された(表2)。これらの2つは、E2外部ドメインに位置し、我々の分離株ではThr 164及びMet 312が、他のすべての入手可能なCHIKV配列でのAla及びThrの代わりにそれぞれ同定された(表2)。これらの2つの位置の最初は、アルファウイルスにおいて可変である；これは、中和エピトープを含むとして以前に定義された領域に存在する[5, 25]。312位にて、他のCHIKV、ONNV及びSFVにおいてThrが存在するが、他のアルファウイルスでは変動する；これは、E1-E2オリゴマー形成に重要であるとして同定された領域に存在する[5, 25]。
【００５５】
E1において、インド洋分離株に特異的な284残基で1つ、及び6つのインド洋分離株のうち3つ(06.21、06.27及び06.49)に存在する284残基で1つの2つの重要な置換が観察された。両方の変異体は、図1の3D構造で位置決定した(SFV E1の結晶構造からモデルを作製した)。興味深いことに、残基226は、全ての報告されたCHIKV配列において、Alaであり(表2)。ここで配列決定された我々のインド洋分離株の最初のものにおいてもAlaであった(05.61及び05.115、大発生の初期に得られた)。全てのその後の分離株(2005年11月及び12月に採取された患者から得られた)は、この位置においてVal残基を示した。226位はアルファウイルスのうちで比較的可変性であるが、この位置での単独変異(ProからSer)は、SFVが、コレステロール欠損昆虫細胞での成長に適合されることを可能にする[26, 27]。
【００５６】
インド洋分離株からのE1で観察された他の独特なaaは、Glu 284であった。これは、E1で高く保存された位置であり、アルファウイルスのほとんどでAspを示すか、又はSINにおいてAsnを示す(表2)。このアミノ酸は、ビリオンの表面でのE1プロトマー間の界面に位置し、正20面体E1骨格を作り上げる接触に参加する(図1)。
【００５７】
2. 系統発生的分析
E1タンパク質配列に基づく以前の研究は、チクングンヤウイルス種の強い系統地理的(phylogeographic)構造を示した[6, 10]。インド洋大発生分離株が出現した始原系統群を決定するために、我々は、レユニオン、セーシェル、マダガスカル、マヨット及びコモロからの60人の患者からの63の生物学的検体(表1)、及び29の他の入手可能なチクングンヤ配列(表7)からのE1コード配列(271位〜1314位、すなわちコドン91〜438)内の1,044 nt領域を比較した。系統発生的分析(図2)は、現在のインド洋分離株が、東部、中央及び南部アフリカからの分離株を含む広い群(群ECSA)内で均一の(homogeneous)クレードを表すことを明確に証明した(ECSA、図2)。コンゴ民主共和国での大発生からの分離株[6]も、ECSA群内で均一のクレードを形成した。ECSA群のメンバーでは、インド洋分離株と著しくより近い関係を示したものはなかった。アジア分離株は、インド洋分離株とは関係がより低く、ECSA群とは姉妹群を構成したが、西部アフリカ分離株は、さらにより分岐していた。最も近縁の親戚であるONNを含む他のアルファウイルスを含めると、チクングンヤ分離株の始祖は、西部アフリカ系統群に導かれる枝上に位置する(データ示さず)。
【００５８】
インド洋大発生分離株の配列を、S27配列に比較すると、316 (2.7%)ヌクレオチド置換が分離株05.115で明らかになった(表8)。アジアクレードNagpur株は、05.115から5.1%平均ヌクレオチド分岐を示し、西部アフリカクレードセネガル株37997は、15%の違いを示した(表8)。興味深いことに、後者の株は、東部アフリカ及びインド洋大発生分離株と87ヌクレオチド部分(9,958〜10,045、構造タンパク質6KとE1との間の連結)の完全な保存を示した。この部分の配列同一性は、西部アフリカ株と、東部／中央アフリカ株との間の過去の遺伝的組換え事象を反映し得る。これとは異なって、ヌクレオチド多形のS27分離株及びレユニオン分離株の密度においていくらかのゲノム領域は異なっていたが、S27分離株とレユニオン分離株との間の分裂以来、配列モザイク現象又は組換えについての統計学的サポート(P＞7E-2)は、見出されなかった。
【００５９】
3. インド洋大発生分離株間の遺伝子型及び表現型の変動、並びに小進化のシナリオ
非構造タンパク質での特定のaaの変化が、分離株05.209 (S358P)と06.27 (nsP1-T301I、nsP2-Y642N及びnsP3-460del)との間で観察された。構造タンパク質において、変化E1-A226Vが、分離株06.21、06.27及び06.49にて、並びに変化E2-Q146Rが、セーシェル分離株05.209にて観察された。これらの非同義的変化に加えて、05.209、06.27及び06.49にて8つのサイレント置換があった(表3)。
【００６０】
大発生の間に発生した可能性のある配列進化の歴史(図3)は、6つの完全なゲノムの間で観察された14アミノ酸の変動から導かれた(表3)。分離株05.61を、最初にゲノム分析に選択した。なぜなら、これは、大発生が2005年1月から起こっていたコモロ島からの1回転(1 turning)で戻ってきたレユニオン患者から、大発生の開始である2005年3月に単離されたからである。特に、分離株05.61及び05.115 (分析された2番目に初期の分離株であった)、アフリカ分離株S27、並びにアフリカ及びアジアからの無関係の以前のチクングンヤ分離株は、14個の多形部位全てで同一であった。よって、分離株05.61及び05.115のコンセンサス配列(コンセンサス配列1)は、レユニオン大発生の先祖の遺伝子型を示すようである。14個の多形の分布は、この創始者が、4つの工程で進化したであろう3つのコンセンサス配列を増加させたことを示唆する。まず、10,670位のゲノムでの置換(E1のA226Vの変化をもたらす)は、2006年11月後期分離株06.21により表されるコンセンサス配列2を増加させた。次いで、6,547位でのGからAへの同義置換(nsP4)が、中間配列を導き、これ自体が2つの後期の配列：4つのさらなる置換及び1つのコドン欠失(表3)に続くコンセンサス配列3 (分離株06.27)、及び3つの異なる同義置換の後に増加する(表 3)コンセンサス配列4 (06.49)を増加させる。5番目のコンセンサス配列は、セーシェル分離株05.209単独で表され、これは、コンセンサス配列1に比較して(図3)、4つの置換を示す(これらの2つはnsP3 - S358P及びE2 - Q146Rにおいてaa変化を引き起こす)。
【００６１】
レユニオン分離株は、大発生の初期にE1-226A、大発生の初期にE1-266V A、流行の後期にE1-266Vを有したので、インド洋伝染病からの57個のさらなる配列(54個の血清及び3個のCSFからの57個の配列)で残基226を比較した。特に、E1-226の性質は、冬季の前後ではレユニオン島において全く異なった。2005年3月から6月までサンプリングされた患者からの5つの配列(コモロから帰国した旅行者を起源とする配列を含む)は、E1-226Aを有していた。2005年の9月から12月の間に、21個の配列が、E1-226Vを示した。2006年からの17個のレユニオン配列のうち、E1-226Vは12回、E1-226Aは5回観察された(表1)。最初の臨床症例が疑われたとき(すなわちおそらく大発生の最初)に試料が回収されたマダガスカル及びセーシェル配列に対して、E1-226 Alaのみが観察された。マヨット2006配列に対しては、E1-226 Vのみが観察された。モーリシャス2006配列に対しては、E1-226 Ala及びValがともに観察された。
【００６２】
現在までに、蚊又は哺乳動物細胞上で何度も継代されたCHIKV実験室株のみが、その全体が配列決定されている[9]。我々は、インビトロで1又は2回しか継代されていない6つの臨床分離株のほぼ完全なヌクレオチド配列を初めて提供する(M&Mの部分を参照)。感染患者での、変異と天然の選択との間のバランスにより支配される平衡に共存する遺伝子型を有する擬似種と呼ばれる[31〜33]混合ウイルス集団の存在。インド洋分離株でのオパール停止コドンの代わりにS27でArgが存在することは、S27のインビトロでの多数の継代によりおそらく説明される。なぜなら、オパールからArgへの進化は、ONNウイルスにおいて実験的に観察されたからである[23]。ウイルス擬似種にとって、オパールコドンをインビボで維持することが有利であるが、Argコドンは、近縁のセムリキ森林ウイルスで観察されたように[34]、おそらく、インビトロで選択的利点を与える。チクングンヤウイルス擬似種のインビボでの状況は、LCR分離株06.27について観察されるnsP1-T301I多形も説明しうるだろう。実際に、この変化を有する遺伝子型のサブセットについての選択は、LCRの侵入に関連し得るようである[33]。これらの結果は、実験室の「参照」株のゲノム配列が、天然の状況を正確には反映しないであろうことを強調する。なぜなら、インビボ擬似種の遺伝子型の複雑性が、インビトロ選択による侵食(erosion)を受けやすいからである。ここで配列決定されたインド洋分離株は、わずかな世代についてのみインビトロ選択を受けやすいので、これらは、おそらく、以前に配列決定されたチクングンヤ株よりもインビボ遺伝子型により密接に相当するであろう。
【００６３】
大発生1分離株の中から検出されたアミノ酸(aa)の違いは、ウイルスの生物学的又は病原性の特徴に関係し得る。我々のウイルス培養の結果は予備的であるが、これらは、新生児脳症の症例から分離されたCSFからの独特な分離株(06.27)と、疾患の典型的な形又は脳症のいずれかに関連する3つのその他の分離株との間の表現型の違いを明確に示す。06.27を用いる培養で観察されるより大きいフォーカスは、ウイルスのより高い複製速度を反映し、nsP1、nsP2及びnsP3で同定される特定のアミノ酸の変化に連結し得る。Thr/Ile変化(シンドビスウイルスの残基538) [35,36]を含むnsP1における単一アミノ酸変化、及びnsP3における18-nt欠失は、以前に、他のアルファウイルスにおける神経毒性(neurovirulence)に影響することが示されている[35〜37]。しかし、nsP1構造データの非存在下では、06.27分離株で観察されるI301T変化の構造的又は機能的な影響を予測することは困難である。3つの新生児脳症の症例及び成人の髄膜脳炎の症例からの血清又は分離株のいずれかから決定された全てのウイルス配列が、E1-226 Valを有していたことにも注目すべきである。しかし、この遺伝子型は、疾患の典型的な形でも観察されるので、E1-226 Valと神経病因との連結の可能性については、さらに研究する必要がある。疾患の神経学的な形の発生においては、受容者の因子を考慮すべきである。例えば、血液-脳の通過は、若年又は高血圧の受容者に有利であろう。
【００６４】
インド洋大発生のゲノムの独特な分子サインは、それらを全ての他の報告されているアルファウイルス配列と比較して同定した。これらの特徴は、さらなる機能の研究とともに、疫学的フォローアップについての興味深い目標である。ある特に興味深い特徴は、E1-226 Val残基であった(上記を参照)。インド洋大発生ゲノムの別の興味深い分子サインは、E1-284 Aspであった。用いられた骨格の擬似原子モデルは、適度な解像度のものであるが(結晶構造の解像度は限定されており、3Åに近づいており、このモデルは、この構造を9Å解像度の低温電子顕微鏡再構成にフィットさせて得られる)、Asp 284の側鎖が、ビリオン中の近接E1ポリペプチドの主鎖と相互作用するようである。実際に、これは、隣接するE1プロトマーからの主鎖のアミド379からの水素結合を受容するのに適合する位置にある。パッキングが非常に密であるので(図1Bを参照)、より長いグルタミン酸側鎖(Asp又はAsnに比べて余分のCH2基を有する)が、接触位置にわずかな歪を導入し、その影響はビリオンの正20面体T=4対称により増幅されることが可能である。つまり、Asp 284位でのこの変化による協調的な影響は、感染細胞における新しい粒子の組み立てをより効率的でなくするか、又は新しい細胞の侵入の間に粒子の崩壊のプロセスを寄り効率的にするか、又はその組み合わせのいずれかにおいて、役割を演じるだろう。この情報1 tionは、ウイルスサイクルに対するAsp/Glu置換の影響を試験するための、逆遺伝学(reverse genetics)を用いる新しい部位特異的突然変異誘発研究を手引きし得る。
【００６５】
実施例2：CHIKウイルスのE2の可溶形(sE2)の同定及び特徴決定
CHIK 21ウイルス株(Schuffeneckerら, Plos Med., 3:1058, 2006)からのpE2糖タンパク質(E3+E2)をコードするcDNAを含むTOPO/CHIK-21.pE2 (CNCM I-3587)プラスミドを、E2エンベロープ糖タンパク質の外部ドメインのPCRによる増幅のための鋳型として用いた(図29)。gp-E2の外部ドメイン(E2-1〜E2-364; E2の85%)は、2005〜06年の集団発生の間にインド洋で分離されたCHIK-21、-27、49及び115細胞系統の間で厳密に保存されている(図29を参照)。sE2の可溶形は、gp-E2外部ドメインに相当し、これは、その膜貫通アンカー領域のカルボキシル末端で除去される。ウイルス中和抗体を惹起する主要なエピトープを可溶形が有することは、興味深い。PCRプライマーは、図30に示す(配列番号79及び80)：これらは、pMT/BiP/V5-HisAベクター(Invitrogen)のユニークBg/II及びNotl部位の間のsE2配列のクローニングを、一方でN-末端のBiPペプチドシグナルに依存する相において、そして他方でそのカルボキシル末端での連続V5 (His)6タグの連結において、可能にする。
【００６６】
ショウジョウバエS2細胞に、ブラスチシジン耐性遺伝子をコードするプラスミドの存在下で、組換えプラスミドpMT/BiP/CHIK-sE2を感染させた。S2/CHIK-sE2安定細胞系統を、ブラスチシジンの存在下での連続形態により得た。細胞系統を、メタロチオネインプロモーターの活性化の後に、CHIK- sE2ウイルスの効率的な分泌を促進するその能力について選択した。
【００６７】
懸濁中のS2/CHIK-sE2細胞を、Cu2+の存在下で、21日間の間、sE2の分泌について誘導した。細胞上清を0.22μMでろ過し、蠕動ポンプの補助により、5 mlのHiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences)の親和性カラムで16時間濃縮した。CHIK sE2タンパク質は、漸増濃度のイミダゾール(50、100及び500 mM, pH 8)の存在下で親和性カラムから溶出される。CHIK sE2タンパク質は、500 mMイミダゾール(E3溶出)の濃度で、E37フラクションから特異的に溶出される(図31)。sE2タンパク質は、PAGESDS、続いてクーマシーブルー染色において、高度に精製されているように検出される。E39フラクションで溶出されるsE2タンパク質は、IMFH単位で産生されたCHIKウイルスに対して過免疫されたマウスの腹水(HMAF)により特異的に免疫検出される(図32)。抗デング(DEN)又は抗西ナイル(WN) HMAHF及びモノクローナル抗体9D12 抗DEN Eとの交差反応性は観察されなかった。上記のプロトコルにより誘導されたS2細胞クローンの上清から精製された可溶性DEN sEタンパク質(DEN-3及びDEN-4)、並びにWN sEを、抗CHIKマウス抗体の特異性についての対照ウイルス抗原として用いる。
【００６８】
実施例3：本発明によるCHIKウイルスのE2の可溶形(sE2)を発現するTRIPベクターの構築
CHIK sE2タンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスゲノムRNAから得られるcDNAに比較してG+C含量が増加した合成DNAを提供するように、Genecust社(firm)により最適化した。G+Cリッチコドン(アミノ酸E2-1からE2-364、可溶性gp-E2外部ドメイン、sE2)を、ウイルスタンパク質を分泌経路に輸送するために、ヒトカルレティキュリンのシグナルペプチド配列(ssCRT) MLLSVPLLLLGLLGLAA (配列番号77)に融合させた。5'及び3'の酵素制限部位BamHi及びXholは、ssCRT+sE2融合タンパク質をコードする配列のそれぞれの末端に付加した。
【００６９】
合成遺伝子を、ieCMVプロモーターの転写の下で、TRIPベクターのBamHIとXhol部位の間にクローニングした。このようにして作製された非複製で組み込み型のTRIP/CHIK.sE2プラスミドを、293細胞の形質導入の後にsE2タンパク質の発現について確認した。
【００７０】
図33に示すように、本発明者らは、CHIK sE2を発現するベクターを構築した。上記のように、TRIPベクターにクローニングされた元来のCHIK sE2配列は、哺乳動物細胞における発現を改善するために修飾されている(図34)。
図35は、TRIP-CHIK.sE2ベクターで形質導入された293細胞のような哺乳動物細胞を示す。発現されたsE2タンパク質は、IFにより、抗CHIK抗体を用いて明らかにされている。
【００７１】
実施例4：組換えタンパク質sE2及び特異的モノクローナル抗体の作製
本発明者らは、レユニオンCHIKウイルス株からのエンベロープE2-糖タンパク質の可溶形(sE2)を放出する安定な誘導性S2/CHIK.sE2細胞系統を作製した。本発明者らは、組換えレンチウイルスベクターTRIP/CHIK.sE2により形質導入された安定細胞系統293A/CHIK.sE2も作製した。哺乳動物細胞における最適コドン使用に修飾された合成sE2遺伝子を、ヒト繊維芽293A細胞におけるCHIKウイルスsE2の効率的な発現を得るために、用いる必要があった。TRIP/CHIK.sE2ベクターは、現在、実験的感染のマウスモデルにおいて防御免疫を誘導するその能力について評価している。CHIK pE2が主に増加したウイルス懸濁物(E2前駆体又はE3E2)を、Triton X-100を用いて、蚊細胞で成長したCHIKビリオンを可溶化することにより得た。成体マウスを、CHIK構造タンパク質に指向されたハイブリドーマを作製するために、アジュバントの存在下でCHIK pE2を用いて過免疫した。マウスハイブリドーマにより産生された抗CHIK E2モノクローナル抗体を、高度に精製されたCHIKビリオンに対するELISAアッセイ、及び安定細胞系統S2/CHIK.sE2からの分泌sE2に対するウェスタンブロットにより特徴決定した(図50、51及び表9)。細胞内又は表面ウイルス抗原の蛍光免疫検出アッセイも、CHIKウイルスを感染させたVERO細胞、及び安定293A/CHIK.sE2形質導入細胞系統に対して確立した(図52〜55)。本発明者らの抗CHIK.sE2 MAbsは、患者のウイルス血症の血液中のCHIKビリオンの免疫捕捉に基づくCHIK疾患の早期のウイルス診断の開発における使用、並びに免疫学的及びウイルス学的な研究のためのツールとしての使用の可能性を有する。
【００７２】
【表１−１】
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【００７３】
【表１−２】
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【００７４】
【表１−３】
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【００７５】
【表１−４】
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【００７６】
【表２−１】
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【００７７】
【表２−２】
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【００７８】
【表２−３】
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【００７９】
【表３】
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【００８０】
【表４−１】
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【００８１】
【表４−２】
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【００８２】
【表４−３】
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【００８３】
【表５】
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【００８４】
【表６】
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【００８５】
【表７−１】
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【００８６】
【表７−２】
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【００８７】
【表８】
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【００８８】
【表９】
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【００８９】
【表１０】
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【００９０】
【表１１】
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【００９１】
【表１２】
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【００９２】
【表１３】
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【００９３】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】SFV E1の結晶構造から作成された3D構造モデルでのE1変化の位置確認[43] [19]。  A) E1のリボン図、ドメインIを赤、ドメインIIを黄、IIIを青で着色する。緑色のチューブはジスルフィド結合を示す。分子の先端の融合ペプチド(ドメインII内)を橙色に着色し、標識する。結晶中で観察されるN末端及びC末端(膜貫通領域の30 aa上流)も標識する。インド洋分離株で観察された2つの独特の変化は、星で印をつけて標識する：226位(白)及び284位(マゼンタ)。  B) 5回対称軸から見下ろしたビリオンの表面での正20面体E1骨格の部分図(わずかに拡張させた1つの八分空間)。1つのE1プロトマーを、A)でのように色で強調する。その他の全ては、灰色で示す。正20面体対称軸のいくつかの位置を、塗りつぶした黒色の印で示す：5角形は5回軸、三角形は3回軸、楕円形は2回軸(アルファウイルスのT=4格子においては、準6回軸と一致する)。塗りつぶしていない三角形は、ドメインII及び融合ペプチドをカバーし、主要な抗原部位を示す、E1としっかりと相互作用するE2三量体の位置をほぼ示す。塗りつぶしていない三角形は、T=4表面正20面体格子の準3回対称軸も示す。マゼンタのボールは、E1プロトマー間接触部位(inter-E1 protomer contact site)でのGlu 284の位置を示す。この接触は、表面格子にて240倍に増幅される(propagated)(灰色のプロトマー上に描かれた全てのピンク色のボールに注目されたい)。橙色の融合ペプチドが、他のE1プロトマーとの接触から離れて上を指すことに注目されたい。これは、ビリオンの周縁でより容易に見られ、ここではそのうちの1つを標識する(FP)。ビリオンにおいて、E1のこの領域は、E2分子の下に覆われて、近づくことができない[19]。
【図２】部分E1ヌクレオチド配列に基づく、チクングンヤ分離株間の系統発生的関係。インド洋大発生(レユニオン、セーシェル、マヨット、モーリシャス、マダガスカル)からの分離株は、大きい東部、中央及び南部アフリカ(ECSA)系統群内の異なるクレードを示す。主な分岐点に、ブートストラップ再サンプリング値を示す。西部アフリカ系統群につながる枝(約15%の長さ)は、簡便のために短くした。
【００９５】
【図３】1インド洋大発生からのチクングンヤウイルス分離株の提案された進化シナリオ。このシナリオは、RNA抽出物を鋳型として用いて得られたRT-PCR産物の直接配列決定により決定された6つのゲノム配列に基づく。つまり、これらの配列は、共存するゲノム(擬似種(quasispecies))の可能性のある混合物のコンセンサス配列(Cons. Seq.)に相当する。Inset: 部分E1配列に基づく、レユニオン島での種々の時間間隔でのE1-226A及びE1-226Vの件数。E1-226Vは、コンセンサス配列2、3及び4で観察され、よって、部分E1配列に基づいて遺伝子型決定されたほとんどのE1-226V分離株は、これらの遺伝子型に関連しているようである。しかし、他の遺伝子型でのE1-226Vの独立した出現は、排除できない。Int.: 中間配列。島々の位置、サイズ及び相対的位置並びにアフリカの国境を示す。コンセンサス配列1は、2005年3月にコモロから帰国したレユニオンの患者、及びレユニオン島の患者から得られた。配列2〜4は、レユニオン島で採取された。配列5は、セーシェルで採取された。
【００９６】
【図４】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルス株、より具体的には、05.115と呼ばれる好ましい株のゲノムのヌクレオチド配列を示す(配列番号1)。
【図５】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルス株、より具体的には、05.209と呼ばれる好ましい株のゲノムのヌクレオチド配列を示す(配列番号2)。
【００９７】
【図６】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルス株、より具体的には、06.21と呼ばれる好ましい株のゲノムのヌクレオチド配列を示す(配列番号3)。
【図７】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルス株、より具体的には、06.27と呼ばれる好ましい株のゲノムのヌクレオチド配列を示す(配列番号4)。
【００９８】
【図８】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルス株、より具体的には、06.49と呼ばれる好ましい株のゲノムのヌクレオチド配列を示す(配列番号5)。
【図９】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルス株、より具体的には、05.61と呼ばれる好ましい株のゲノムのヌクレオチド配列を示す(配列番号6)。
【００９９】
【図１０】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.21と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインをコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号7)。
【図１１】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.27と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインをコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号8)。
【０１００】
【図１２】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.49と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインをコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号9)。
【図１３】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.115と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインをコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号10)。
【０１０１】
【図１４】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.21と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形をコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号11)。
【図１５】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.27と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形をコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号12)。
【０１０２】
【図１６】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.49と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形をコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号13)。
【図１７】本発明の好ましい実施形態によるCHIKウイルスのフラグメント、より具体的には06.115と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形をコードするフラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号14)。
【０１０３】
【図１８】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.21と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインに関する(配列番号15)。
【図１９】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.27と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインに関する(配列番号16)。
【０１０４】
【図２０】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.49と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインに関する(配列番号17)。
【図２１】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.115と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の外部ドメインに関する(配列番号18)。
【０１０５】
【図２２】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.21と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形に関する(配列番号19)。
【図２３】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.27と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形に関する(配列番号20)。
【０１０６】
【図２４】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.49と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形に関する(配列番号21)。
【図２５】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を示し、より具体的には、06.115と呼ばれる好ましい株の糖タンパク質E2の可溶形に関する(配列番号22)。
【０１０７】
【図２６】3'NTR領域で見出される反復配列(Repeat Sequence Elements)  A. チクングンヤウイルスゲノムの3'NTR領域で見出される反復配列のアラインメント。全ての配列は、保存された安定なステム-ループ構造を形成し、ここでは、20位付近のあまり保存されていないヌクレオチドがループを構成する。3つのRSEが、全てのチクングンヤゲノムで見出される。最初の1つ(RSE1)は、S27ゲノムの内部ポリ-A配列の前に挿入され、他の2つはこのモチーフの下流に見出される。  B. 分離株05-115のRSE1についての予測される2次構造。
【０１０８】
【図２７】フォーカスイムノアッセイによるAP61細胞に対するチクングンヤウイルスのフォーカスの表現型  24ウェルプレート中の蚊AP61細胞に、蚊細胞で成長させたCHIKウイルスストック(ウイルス力価2〜5×10^8 FFU. mL-1)を、0.0001 (上のウェル)又は0.00001 (下のウェル)の感染多重度で感染させた。感染した細胞に、2% FBSを含むLeibovitz L15成長培地中のCMCを2日間重層して、28℃にてフォーカスを生じさせた。細胞を、PBS中の3% PFAで固定し、PBS中のTriton X-100で透過にし、CHIKウイルス複製のフォーカスを、マウス抗-CHIK HMAF (希釈1:2,000)及びペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗-マウスIg (希釈1:100)で免疫染色した。
【０１０９】
【図２８】pE2を含むウイルス調製物。抗-CHIK抗体により検出されたpE2タンパク質。
【図２９】インド洋CHIKウイルス株-21、-27、-49及び-115からのE2糖タンパク質(E2-1〜E2-361)の可溶形をコードするヌクレオチド配列のアラインメント。
【０１１０】
【図３０】CHIKウイルスからのE2の可溶形(E2-1〜E2-364) (N末端及びC末端核酸フラグメント: 配列番号81及び82; N末端及びC末端タンパク質フラグメント: 配列番号83及び84)の増幅及びシャトルベクターpMT2/BiP/V5-HisAへのクローニングのために用いたプライマー配列(配列番号79及び80)。
【０１１１】
【図３１】クーマシーブルーによるCHIK-sE2染色を示すSDS-PAGE。
【図３２】高度に精製されたCHIK sE2タンパク質のイムノブロット分析。
【図３３】レユニオンのチクングンヤウイルス05株からのE2糖タンパク質の分泌された可溶形(sE2)を発現するTRIPベクターの構築。
【０１１２】
【図３４】TRIPベクター中のE2糖タンパク質の分泌された可溶形(sE2)をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号85)。
【図３５】TRIP/CHIK.sE2で形質導入された293細胞に対して抗-CHIK抗体を用いる免疫蛍光(IF)アッセイ。
【図３６】ウェルあたり10-4 mLの濃縮pE2タンパク質を含む直接ELISAを示す。抗原は、それぞれマウス抗-DEN1 (希釈1:1000)、抗-WN (希釈1:1000)及び抗-CHIK (希釈1:10000)を用いて試験した。
【０１１３】
【図３７】CHIK S27株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(GenBank AF339485; 配列番号23)。
【図３８】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち05.61株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号24)。
【０１１４】
【図３９】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち05.209株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号25)。
【図４０】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち05.115株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号26)。
【０１１５】
【図４１】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち06.49株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号27)。
【図４２】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち06.27株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号28)。
【０１１６】
【図４３】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち06.21株のORF 2 (構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号29)。
【図４４】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち05.61株のORF 1 (非構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号30)。
【０１１７】
【図４５】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち05.209株のORF 1 (非構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号31)。
【図４６】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち05.115株のORF 1 (非構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号32)。
【０１１８】
【図４７】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち06.49株のORF 1 (非構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号33)。
【図４８】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち06.27株のORF 1 (非構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号34)。
【０１１９】
【図４９】本発明の好ましい実施形態による好ましいCHIKウイルス、すなわち06.21株のORF 1 (非構造タンパク質)のアミノ酸配列を示す(配列番号78)。
【０１２０】
【図５０】ELISAによる抗-CHIK E2 Mabの反応性の評価。
【図５１】ELISAによるCHIKビリオンに対する抗-CHIK E2 MAbの反応性の評価。
【図５２】CHIKV-感染ベロ細胞に対する抗-CHIK E2 Mabの反応性の免疫蛍光(IF)分析。
【図５３】TRIP/CHIK.sE2で形質導入された293A細胞に対する抗-CHIK E2 Mabの反応性の免疫蛍光(IF)分析。
【０１２１】
【図５４】FACS分析による、CHIKウイルス感染ベロ細胞の細胞表面への抗-CHIK E2 Mabの結合。
【図５５】TRIP/CHIK.sE2で形質導入された293A細胞でのCHIKsE2発現のウェスタンブロット分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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