(57)【要約】  本発明は、総分岐鎖アミノ酸濃度の測定に有用な手段および方法を提供する。具体的には、本発明は、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性（例、総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性、任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性、およびロイシン脱水素酵素の熱安定性）を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素；および当該改変酵素を用いて被検試料中に含まれる総分岐鎖アミノ酸を測定することを含む、総分岐鎖アミノ酸の分析方法などを提供する。
2013146940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性；
（ｂ）任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性；および
（ｃ）ロイシン脱水素酵素の熱安定性；
からなる群より選ばれるロイシン脱水素酵素の１以上の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素。
【請求項２】
変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のＴＧＩモチーフ中のイソロイシンの置換である、請求項１記載の改変酵素。
【請求項３】
ＴＧＩモチーフ中のイソロイシンが、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンに置換されている、請求項２記載の改変酵素。
【請求項４】
変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のＧＶＩモチーフ中のイソロイシンの置換である、請求項１〜３のいずれか一項記載の改変酵素。
【請求項５】
ＧＶＩモチーフ中のイソロイシンが、フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンに置換されている、請求項４記載の改変酵素。
【請求項６】
ロイシン脱水素酵素が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する、請求項１〜５のいずれか一項記載の改変酵素。
【請求項７】
以下（１）あるいは（２）のタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項記載の改変酵素：
（１）配列番号２のアミノ酸配列において、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシンが、下記（ｉ）および／または（ｉｉ）のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、タンパク質：
（ｉ）ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン
メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンへの置換；および／または
（ｉｉ）ＧＶＩモチーフ中のイソロイシン
フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンへの置換；あるいは
（２）配列番号２のアミノ酸配列におけるＴＧＩモチーフ中のイソロイシン、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシンが、上記（ｉ）および／または（ｉｉ）のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる１以上の特性が改善されている、タンパク質：
（ａ）総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性；
（ｂ）任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性；および
（ｃ）ロイシン脱水素酵素の熱安定性。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の改変酵素を用いて被検試料中に含まれる総分岐鎖アミノ酸を測定することを含む、総分岐鎖アミノ酸の分析方法。
【請求項９】
被検試料をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）と混合し、改変酵素の作用によりＮＡＤ＋から生成したＮＡＤＨを検出することを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項記載の改変酵素を用いて分岐鎖アミノ酸からその誘導体を生成することを含む、分岐鎖アミノ酸の誘導体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項記載の改変酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１４】
総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた改変酵素を、請求項１３記載の形質転換体を用いて生成することを含む、改変酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項記載の改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
【請求項１６】
反応用緩衝液または緩衝塩、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の少なくとも一つをさらに含む、請求項１５記載の総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
【請求項１７】
（ａ）検出用電極、および（ｂ）検出用電極に固定または配置された、請求項１〜７のいずれか一項記載の改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用酵素センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変ロイシン脱水素酵素、およびそれを用いる総分岐鎖アミノ酸の分析方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのアミノ酸は、健康状態の指標となり得ることが知られている。特に、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ：Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン）は、種々の生体由来試料中あるいは食料品および飲料品中に多く含まれる重要なアミノ酸である。分岐鎖アミノ酸は、生体においては、筋肉に多く含まれており、タンパク質栄養のマーカーとして知られている。肝硬変や肝性脳症の患者では、血液中の分岐鎖アミノ酸濃度が低下することが知られており、フィッシャー比やＢＴＲ値といった指標が、肝臓の健康状態の診断および経過観察に利用されている。【０００３】
アミノ酸の測定方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法やＬＣ−ＭＳ法といった分析機器を用いた方法が広く用いられている。総分岐鎖アミノ酸の測定では、ロイシン脱水素酵素を利用してＢＴＲ値を測定する酵素キット（例えば、特許文献１）、ならびに、ロイシン脱水素酵素を利用して電気化学的に総分岐鎖アミノ酸を測定するバイオセンサー（例えば、特許文献２）が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７―２８９０９６号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０７５９７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ロイシン脱水素酵素による総分岐鎖アミノ酸濃度の測定には、幾つかの改善すべき点がある。
例えば、酵素キットでは、ロイシン脱水素酵素を用いて総分岐鎖アミノ酸濃度が測定されている。しかしながら、本方法では、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法が利用されている。この理由は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対するロイシン脱水素酵素の基質特異性（反応速度）が異なるためである。野生型のロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシンに比べてＬ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対する基質特異性が低く、反応速度が遅い。したがって、ロイシン脱水素酵素を用いる酵素キットでは、総分岐鎖アミノ酸濃度の測定に長い反応時間を要するという欠点があった。【０００６】
また、バイオセンサーでは、ロイシン脱水素酵素の基質である複数のアミノ酸が存在する場合、複数の分岐鎖アミノ酸の濃度を独立に測定することはできなかった。この理由は、ロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシンのみならず、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対しても反応するためである。また、上記のような場合、一般に、複数の分岐鎖アミノ酸の総濃度を測定することもできなかった。この理由は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対するロイシン脱水素酵素の基質特異性（反応速度）が異なるためである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、総分岐鎖アミノ酸濃度を迅速に測定するためには、分岐鎖アミノ酸の各アミノ酸に対する、特にＬ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対するロイシン脱水素酵素の活性を向上等させて、分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性を改善することにより、レート法（初速度法）を利用して総分岐鎖アミノ酸濃度を測定すればよいことを着想し、そして、分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性を改善するように改変されたロイシン脱水素酵素を開発することに成功した。本発明者らはまた、総分岐鎖アミノ酸濃度の測定に関連するロイシン脱水素酵素の他の特性を改善することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下：
（ａ）総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性；
（ｂ）任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性；および
（ｃ）ロイシン脱水素酵素の熱安定性；
からなる群より選ばれるロイシン脱水素酵素の１以上の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素。
〔２〕変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のＴＧＩモチーフ中のイソロイシンの置換である、〔１〕の改変酵素。
〔３〕ＴＧＩモチーフ中のイソロイシンが、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンに置換されている、〔２〕の改変酵素。
〔４〕変異が、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のＧＶＩモチーフ中のイソロイシンの置換である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの改変酵素。
〔５〕ＧＶＩモチーフ中のイソロイシンが、フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンに置換されている、〔４〕の改変酵素。
〔６〕ロイシン脱水素酵素が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する、〔１〕〜〔５〕のいずれかの改変酵素。
〔７〕以下（１）あるいは（２）のタンパク質である、〔１〕〜〔６〕のいずれかの改変酵素：
（１）配列番号２のアミノ酸配列において、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシンが、下記（ｉ）および／または（ｉｉ）のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、タンパク質：
（ｉ）ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン
メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはトリプトファンへの置換；および／または
（ｉｉ）ＧＶＩモチーフ中のイソロイシン
フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、チロシン、ロイシン、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、セリン、システイン、アラニン、グリシン、バリン、トリプトファン、またはメチオニンへの置換；あるいは
（２）配列番号２のアミノ酸配列におけるＴＧＩモチーフ中のイソロイシン、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシンが、上記（ｉ）および／または（ｉｉ）のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる１以上の特性が改善されている、タンパク質：
（ａ）総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性；
（ｂ）任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性；および
（ｃ）ロイシン脱水素酵素の熱安定性。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変酵素を用いて被検試料中に含まれる総分岐鎖アミノ酸を測定することを含む、総分岐鎖アミノ酸の分析方法。
〔９〕被検試料をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）と混合し、改変酵素の作用によりＮＡＤ＋から生成したＮＡＤＨを検出することを含む、〔８〕の方法。
〔１０〕〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変酵素を用いて分岐鎖アミノ酸からその誘導体を生成することを含む、分岐鎖アミノ酸の誘導体の製造方法。
〔１１〕〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔１２〕〔１１〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１３〕〔１２〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１４〕総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた改変酵素を、〔１３〕の形質転換体を用いて生成することを含む、改変酵素の製造方法。
〔１５〕〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
〔１６〕反応用緩衝液または緩衝塩、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の少なくとも一つをさらに含む、〔１５〕の総分岐鎖アミノ酸分析用キット。
〔１７〕（ａ）検出用電極、および（ｂ）検出用電極に固定または配置された、〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用酵素センサー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の改変酵素は、その基質特異性が改善されていることから、エンドポイント法だけではなく、レート法（初速度法）による総分岐鎖アミノ酸濃度の迅速な測定に有用である。本発明の改変酵素はまた、分岐鎖アミノ酸に対する活性が向上しているため、任意の分岐鎖アミノ酸の測定、および／または任意の分岐鎖アミノ酸の誘導体（例、２−オキソ誘導体）の製造に有用である。本発明の改変酵素はさらに、水溶液中での熱安定性に優れることから、安定性に優れる。したがって、本発明の改変酵素は、特に液状試薬として有用である。本発明の分析方法は、例えば、肝硬変、肝性脳症等の疾患の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、各分岐鎖アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン）に対する各野生型ロイシン脱水素酵素の基質特異性を示す図である。
【図２】図２は、野生型または改変酵素Ｉ１３６Ｒへ各分岐鎖アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン）を作用させた際の吸光度の経時変化（ｎ＝３の平均値）を示す図である。
【図３】図３は、種々の濃度の各分岐鎖アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン）に対する野生型および改変酵素Ｉ１３６Ｒの活性を吸光度の変化量（ｎ＝３の平均値）で示し、またその値から作成した検量線を示す図である。
【図４】図４は、酵素法およびアミノ酸分析計により測定された、ラット血漿サンプル中の総ＢＣＡＡ濃度（ｎ＝３の平均値）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、改変酵素を提供する。本発明の改変酵素は、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものであり得る。
【００１２】
アミノ酸残基の変異としては、例えば、置換、欠失、付加および挿入が挙げられるが、置換が好ましい。
【００１３】
変異されるアミノ酸残基は、天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。
【００１４】
分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）とは、天然のＬ−α−アミノ酸のうち、側鎖として分岐鎖を有するＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−バリンをいう。総分岐鎖アミノ酸の測定では、全ての分岐鎖アミノ酸（即ち、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン）が測定される。
【００１５】
ロイシン脱水素酵素は、以下の反応を触媒する酸化還元酵素である（ＥＣ  １．４．１．９）。
【００１６】
Ｌ−ロイシン＋Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤ＋
→  ４−メチル−２−オキソペンタン酸＋ＮＨ３＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋
【００１７】
野生型のロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシンのみならず、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対しても作用するものの、Ｌ−ロイシンに比べてＬ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対する活性が低いことが知られている。図１に、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）およびゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する野生型ロイシン脱水素酵素のＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンに対する基質特異性を、Ｌ−ロイシンに対する相対活性を１００として相対活性により示す。図１に示すように、上記の野生型ロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシン以外の分岐鎖アミノ酸に対する活性は相対的に低く、特に、Ｌ−ロイシンに対するＬ−イソロイシンの相対活性は７５以下である。
【００１８】
本発明の改変酵素が由来するロイシン脱水素酵素としては、例えば、任意の生物（例、細菌、放線菌および真菌等の微生物、ならびに昆虫、魚類、動物、および植物）に由来する酵素を用いることができ、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびこの近縁属に属する生物に由来する酵素が挙げられる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の近縁属としては、例えば、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属が挙げられる。バチルス属のこれらの近縁属は、バチルス属と同様に、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する。
【００１９】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびその近縁属に属する微生物としては、例えば、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。
【００２０】
ロイシン脱水素酵素において変異が導入される位置は、好ましくは、ロイシン脱水素酵素の活性中心付近にあるアミノ酸残基である。当業者は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス由来のロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列を他のロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列と整列（ａｌｉｇｎ）させることができるので、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス以外の生物に由来するロイシン脱水素酵素についても、活性中心付近にあるアミノ酸残基を容易に特定することができる。
また、ロイシン脱水素酵素については、立体構造の解析結果が報告されている（例、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３：６９３−７０５（１９９５）を参照）。したがって、当業者は、立体構造の解析結果に基づき、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス以外の生物に由来するロイシン脱水素酵素についても、活性中心付近にあるアミノ酸残基を容易に特定することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善する変異は、野生型ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の置換である。ＴＧＩモチーフは、スレオニン（Ｔ）−グリシン（Ｇ）−イソロイシン（Ｉ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。野生型ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列中のＴＧＩモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列中のＴＧＩモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきイソロイシン（Ｉ）の位置を特定できる。通常、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列において、ＴＧＩモチーフは１３４〜１３８位のアミノ酸領域内にあり、イソロイシン（Ｉ）は１３６〜１３８位にある（例、表１を参照）。
【００２２】
【表１】
2013146940.tif 000003
【００２３】
別の好ましい実施形態では、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善する変異は、野生型ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列のＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の置換である。ＧＶＩモチーフは、グリシン（Ｇ）−バリン（Ｖ）−イソロイシン（Ｉ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。野生型ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列中のＧＶＩモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列中のＧＶＩモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきイソロイシン（Ｉ）の位置を特定できる。通常、ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列において、ＧＶＩモチーフは２９０〜２９４位のアミノ酸領域内にあり、イソロイシン（Ｉ）は２９２〜２９４位にある（例、表２を参照）。本発明の改変酵素は、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性を改善する変異として、ＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の置換に加えて、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の上記置換をさらに有していてもよい。
【００２４】
【表２】
2013146940.tif 000004
【００２５】
総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性としては、以下が挙げられる：
（ａ）総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性；
（ｂ）任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性；および
（ｃ）ロイシン脱水素酵素の熱安定性。
本発明の改変酵素は、上述した特性のうち１つのみを有していてもよいが、上述した特性のうち２つまたは３つの特性を併有していてもよい。
【００２６】
ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）について、特性（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異としては、例えば、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、およびトリプトファン（Ｗ）への置換が挙げられる。
【００２７】
ＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）について、特性（ａ）〜（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異としては、例えば、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびメチオニン（Ｍ）への置換が挙げられる。
【００２８】
本発明の改変酵素は、任意のｐＨ条件で使用することができるが、中性条件下および／またはアルカリ性条件下での使用に好適である。
本発明の改変酵素が好適に使用される中性条件とは、ｐＨ６．０以上８．０以下の範囲内にある任意のｐＨ条件をいう。好ましくは、中性条件は、ｐＨ７．０以上８．０以下の範囲内にある任意のｐＨ条件（例、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５またはｐＨ８．０）である。
本発明の改変酵素が好適に使用されるアルカリ性条件とは、ｐＨが８．０よりも大きく１１．０以下の範囲内にある任意のｐＨ条件をいう。アルカリ性条件におけるｐＨ範囲の上限値は、１０．５以下であることが好ましく、１０．０以下であることがより好ましい。特に好ましくは、アルカリ性条件は、ｐＨ８．５以上９．５以下の範囲内にある任意のｐＨ条件（例、ｐＨ９．０）である。
【００２９】
一実施形態では、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性として、総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性が、改善される。総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性の改善とは、特定の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性の向上を意図するものではなく、全ての分岐鎖アミノ酸（即ち、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−バリン）に対する基質特異性（反応速度）がより等しくなるようにすることをいう。具体的には、総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性の改善は、ロイシンに対するロイシン脱水素酵素の相対活性を１００としたときに、イソロイシンおよびバリンに対する改変酵素の各相対活性が、イソロイシンおよびバリンに対する野生型酵素の各相対活性よりも１００に近い場合に、達成され得る。総分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の基質特異性は、ロイシンに対するロイシン脱水素酵素の相対活性を１００としたときにイソロイシンおよびバリンの双方に対する相対活性が８０以上１２０以下であることが好ましく、８５以上１１５以下であることがより好ましく、９０以上１１０以下であることがさらにより好ましく、９５以上１０５以下であることが特に好ましい。ロイシンに対するロイシン脱水素酵素の相対活性を１００としたときにイソロイシンおよびバリンの双方に対する相対活性が８０以上１２０以下である本発明の改変酵素としては、例えば、１）アルカリ性条件下での基質特異性の改善に好適である、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、ならびに、２）中性条件下での特性の改善に好適である、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換が挙げられる。
【００３０】
１）アルカリ性条件下での基質特異性の改善に好適である置換
（ａ）１３６位の置換後のアミノ酸残基（アルカリ性条件）
メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、リジン（Ｋ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、またはセリン（Ｓ）
（ｂ）２９２位の置換後のアミノ酸残基（アルカリ性条件）
フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、またはグリシン（Ｇ）
【００３１】
２）中性条件下での基質特異性の改善に好適である置換
（ｃ）１３６位の置換後のアミノ酸残基（中性条件）
アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、またはチロシン（Ｙ）
（ｄ）２９２位の置換後のアミノ酸残基（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）
【００３２】
別の実施形態では、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性として、任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性が、改善される。任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性の改善とは、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸に対する改変酵素の活性が、野生型酵素のものに比べてより向上することを意味する。具体的には、任意の分岐鎖アミノ酸に対するロイシン脱水素酵素の活性の改善は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンからなる群より選ばれる任意のアミノ酸に対する野生型ロイシン脱水素酵素の活性を１００としたときに、当該アミノ酸に対する改変酵素の活性が１００よりも大きい場合に、達成され得る。このような改変酵素は、個々の分岐鎖アミノ酸の迅速な測定を可能にし、結果として総分岐鎖アミノ酸の測定に有用である。野生型酵素に対する改変酵素の活性の向上の程度は、１．３倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、１．７倍以上であることがさらにより好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。野生型酵素に対する改変酵素の活性の向上の程度が１．３倍以上である本発明の改変酵素としては、例えば、１）アルカリ性条件下での活性の改善に好適である、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、ならびに、２）中性条件下での特性の改善に好適である、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換が挙げられる。
【００３３】
１）アルカリ性条件下での活性の改善に好適である置換
１−１）１３６位の置換後のアミノ酸残基（アルカリ性条件）
（ｉ）Ｌ−ロイシンに対する活性の向上（アルカリ性条件）
メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、またはトリプトファン（Ｗ）
（ｉｉ）Ｌ−イソロイシンに対する活性の向上（アルカリ性条件）
メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、またはトリプトファン（Ｗ）
（ｉｉｉ）Ｌ−バリンに対する活性の向上（アルカリ性条件）
メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、またはトリプトファン（Ｗ）
【００３４】
１−２）２９２位の置換後のアミノ酸残基（アルカリ性条件）
（ｉｖ）Ｌ−ロイシンに対する活性の向上（アルカリ性条件）
フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）
（ｖ）Ｌ−イソロイシンに対する活性の向上（アルカリ性条件）
フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、またはトリプトファン（Ｗ）
（ｖｉ）Ｌ−バリンに対する活性の向上（アルカリ性条件）
フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、またはバリン（Ｖ）
【００３５】
２）中性条件下での活性の改善に好適である置換
２−１）１３６位の置換後のアミノ酸残基（中性条件）
（ｉ’）Ｌ−ロイシンに対する活性の向上（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）
（ｉｉ’）Ｌ−イソロイシンに対する活性の向上（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）
（ｉｉｉ’）Ｌ−バリンに対する活性の向上（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）
【００３６】
２−２）２９２位の置換後のアミノ酸残基（中性条件）
（ｉｖ’）Ｌ−ロイシンに対する活性の向上（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）
（ｖ’）Ｌ−イソロイシンに対する活性の向上（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）
（ｖｉ’）Ｌ−バリンに対する活性の向上（中性条件）
アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、またはチロシン（Ｙ）
【００３７】
さらに別の実施形態では、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性として、ロイシン脱水素酵素の熱安定性が、改善される。ロイシン脱水素酵素の熱安定性の改善とは、改変酵素の熱安定性が、野生型酵素のものに比べてより向上することを意味する。具体的には、ロイシン脱水素酵素の熱安定性の改善は、水溶液中において６０℃で１時間処理した場合に、改変酵素の残存活性が野生型酵素のものよりも大きい場合に、達成され得る。水溶液中におけるロイシン脱水素酵素の熱安定性試験は、ロイシン脱水素酵素の安定性（特に液状安定性）を評価するための加速試験としての意義を有し得る。したがって、水溶液中における改変酵素の熱安定性が高い場合、改変酵素の安定性（特に液状安定性）も高い傾向がある。液状安定性が高い酵素は、液状でより長期保存することができるので、このような改変酵素は、液状試薬として、総分岐鎖アミノ酸の測定に有用である。野生型酵素に対する改変酵素の熱安定性の向上の程度は、１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましい。野生型酵素に対する改変酵素の熱安定性の向上の程度が１．１倍以上である本発明の改変酵素としては、例えば、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）の下記アミノ酸残基への置換が挙げられる。
【００３８】
１３６位の置換後のアミノ酸残基
メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはリジン（Ｋ）
【００３９】
２９２位の置換後のアミノ酸残基
フェニルアラニン（Ｆ）
【００４０】
本発明の改変酵素はまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明の改変酵素に付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
【００４１】
本発明の改変酵素は、上述した特性が保持される限り、上記変異を有するロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列に対して、１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異を導入され得るアミノ酸残基の個数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜４０個、さらにより好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２０個または１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような改変酵素を適宜作製することができる。
【００４２】
したがって、本発明の改変酵素は、以下（ｉ）または（ｉｉ）であってもよい：
（ｉ）ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列において、ＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）が変異（例、置換）したアミノ酸配列を含み、かつ、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性が改善されている、タンパク質；または
（ｉｉ）ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列におけるＴＧＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）、および／またはＧＶＩモチーフ中のイソロイシン（Ｉ）が変異（例、置換）したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、総分岐鎖アミノ酸の測定に関連するロイシン脱水素酵素の特性が改善されている、タンパク質。
【００４３】
本発明の改変酵素は、上述した変異および追加変異の双方を有することにより、変異前の（野生型）ロイシン脱水素酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００４４】
アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００４５】
アミノ酸配列において追加変異を導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして追加変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例、配列番号２で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。また、ロイシン脱水素酵素については、上述したように立体構造の解析結果が報告されているので、当業者は、立体構造の解析結果に基づき、上述した特性の保持を可能にするように、追加変異を導入することができる。
【００４６】
アミノ酸残基の追加変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００４７】
本発明の改変酵素は、本発明の改変酵素を発現する本発明の形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の改変酵素の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ本発明の発現ベクターを作製して適切な宿主に導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。本発明の改変酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中にベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００４８】
本発明の形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は、２５℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１ｈ〜１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３％〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。
【００４９】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモータとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００５１】
また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改変」とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００５３】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）〕。
【００５４】
得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、本発明の改変酵素を得ることができる。
【００５５】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
【００５６】
本発明の改変酵素を回収するには、以下の方法などがある。本発明の改変酵素は、本発明の形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の改変酵素を得ることができる。
【００５７】
本発明は、総分岐鎖アミノ酸の分析方法を提供する。本発明の分析方法は、本発明の改変酵素を用いて、被検試料中に含まれる総分岐鎖アミノ酸を測定することを含み得る。
【００５８】
被検試料としては、任意の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、全ての総分岐アミノ酸）を含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）や食飲料品（例、栄養ドリンクやアミノ酸飲料など）が挙げられる。
【００５９】
本発明の分析方法は、本発明の改変酵素を用いて総分岐鎖アミノ酸を測定できる限り特に限定されないが、例えば、アルカリ性または中性条件下において、好ましくは、アルカリ性緩衝液中において、被検試料をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）と混合し、次いで、混合試料を本発明の改変酵素を用いる酵素反応に供し、最後に、本発明の改変酵素の作用によりＮＡＤ＋から生成されるＮＡＤＨを検出することにより、総分岐鎖アミノ酸が測定される。具体的には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の存在下、アルカリ性緩衝液中において、改変酵素を被検試料に作用させることにより、生体由来試料中に含まれる基質のアミノ基が酸化的脱アミノ化されるとともに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）から還元型（ＮＡＤＨ）が生成される。したがって、ＮＡＤＨを、吸光度（３４０ｎｍ）等により検出することにより、総分岐鎖アミノ酸の定量を行うことができる。このような方法論によるアミノ酸の測定方法は、知られている（例、Ｕｅａｔｒｏｎｇｃｈｉｔ  Ｔ，Ａｓａｎｏ  Ｙ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１  Ｍａｒ  １；４１０（１）：４４−５６を参照）。また、生成したＮＡＤＨにより色素を還元し、その還元性色素の発色を吸光度等として検出することで、総分岐鎖アミノ酸の測定を行うこともできる。更に、電気化学的な手法によるＮＡＤＨの検出も可能である。例えば、アルカリ性または中性条件下において、改変酵素を被検試料に作用させることにより生成したＮＡＤＨを電気化学的に酸化し、その酸化電流を測定する他、生成したＮＡＤＨにより共存する電子メディエーターを還元し、その還元型電子メディエーターの電気化学的酸化電流を測定することで、総分岐鎖アミノ酸を測定することが可能である。ＮＡＤＨと電子メディエーター間の電子移動において、触媒が介在しても良い。なお、総分岐鎖アミノ酸の測定は、好ましくは、レート法（初速度法）により行われる。
【００６０】
本発明の改変酵素は、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸に対して反応しないか、またはそれに対する反応性が低い。したがって、被験試料中に、分岐鎖アミノ酸のみならず、他のアミノ酸が含まれている場合にも、本発明の改変酵素を用いることで、被験試料中の分岐鎖アミノ酸の量を評価することができる。
【００６１】
さらに、本発明は、本発明の改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用キットを包含する。
本発明のキットは、反応用緩衝液または緩衝塩、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の少なくとも一つをさらに含むことができる。
【００６２】
反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために用いられる。反応用緩衝液または緩衝塩は、例えば、アルカリ性または中性であり、好ましくはアルカリ性である。
【００６３】
本発明のキットがニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を含む場合、本発明のキットはＮＡＤＨにより還元される色素をさらに含んでいてもよい。この場合、本発明の改変酵素の作用によりＮＡＤ＋から生成するＮＡＤＨにより色素が還元され、その還元性色素の発色を吸光度等により検出することができる。色素の還元には、電子メディエーターとして働く物質などが関与してもよい。
【００６４】
本発明はまた、（ａ）検出用電極、および（ｂ）検出用電極に固定または配置された本発明の改変酵素を含む、総分岐鎖アミノ酸分析用酵素センサーを提供する。本発明の改変酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。
【００６５】
前記の検出用電極としては、例えば、本発明の改変酵素により総分岐鎖アミノ酸から生じた生成物または副生物（ＮＨ３＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋）を直接的または間接的に検出するバイオセンサーを用いることが可能であり、より具体的には、本発明の改変酵素およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を利用した検出用電極などが例として挙げられる。このような検出用電極としては、例えば、国際公開第２００５／０７５９７０号、国際公開第００／５７１６６号に記載のものを使用することができる。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６７】
（酵素定量法）
Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンの酵素定量法では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の存在下、アルカリ性緩衝液中において、ロイシン脱水素酵素を生体由来試料（例、血漿）に作用させ、生体由来試料中に含まれる基質のアミノ基を酸化的脱アミノ化するとともに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）から還元型（ＮＡＤＨ）を生成させた。ＮＡＤＨの生成量は、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ，モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。【００６８】
実施例１：改変酵素（Ｉ１３６Ｒ）の作製
（１）鋳型ｌｄｈ遺伝子の調製
（ａ）培養および染色体ＤＮＡの精製
行政独立法人  製品評価技術機構  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手したＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＢＲＣ  １２５５０の凍結乾燥ペレットは、ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ  ７０２にて懸濁し、ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ  ８０２寒天培地に塗布したものを、５０℃にて一晩培養した。コロニーを５ｍｌのｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ  ７０２に植菌した後、５０℃にて３０時間静置培養を行った。この細胞培養液５ｍｌより、染色体ＤＮＡを精製し、下記の実験に供した。
培地の調製の詳細は、以下の表３に記載されるとおりであった。【００６９】
【表３】
2013146940.tif 000005
【００７０】
（ｂ）プラスミドの調製
Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００９；７３：７２９−７３２に記載の方法にて作成されたｐＵＣ１８Ｈｉｓプラスミドの精製は、ベクターを組込んだ組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８Ｈｉｓ）培養液より、Ｉｎｖｉｓｏｒｂ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｋ社製）を用いて、プロトコールに従って行った。精製プラスミドｐＵＣ１８ＨｉｓのベクターＤＮＡを７μｌ、１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ（株）社製）を２．５μｌ、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ０．８μｌを加え、滅菌超純水で反応液総量を２５μｌとし、３７℃にて３時間制限酵素処理した。上記の反応液２５μｌに、それぞれシュリンプ由来アルカリフォスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を２μｌ、×１０アルカリフォスファターゼバッファーを５μｌ加え、滅菌超純水にて反応液総量を５０μｌとし、３７℃にて１時間反応させた。反応液はフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製し、ＴＥ溶液に溶解して脱リン酸化ｐＵＣ１８ＨｉｓベクターＤＮＡ  ２０μｌを得た。【００７１】
（ｃ）ロイシン脱水素酵素遺伝子の増幅
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ロイシン脱水素酵素遺伝子の増幅では、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＩＦＯ  １２５５０のロイシン脱水素酵素遺伝子（配列表１；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，９０５６（１９８８））を基に作成したＢａｍＨＩ認識部位配列を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー１：５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔｇｔｔｃａａａｔａｔａｔｇｇａａａｃ−３’（配列番号１１）（北海道システム・サイエンス（株）社製）およびＰｓｔＩ認識部位配列を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー２：５’−ａｃｔｇｃａｇｔｔａｔａｔｔｇｃｃｇａａｇｃａｃｃ−３’（配列番号１２）（北海道システム・サイエンス（株）社製）を用いた。ＰＣＲ反応液組成を５０ｎｇの染色体ＤＮＡ，１００ｐｍｏｌ／μｌの合成ヌクレオチドプライマーをそれぞれ１μｌ、ＥｘＴａｑ  ×１０  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ（株）社製）を５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ（株）社製）を５μｌ、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）社製）を１μｌ加え、滅菌超純水で反応液総量を５０μｌとした。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ペルチェ・サーマルサイクラー（ＭＪリサーチ・ジャパン（株）社製）を用い、反応条件は、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分の反応サイクルを３０回繰り返した。
ＰＣＲ産物の電気泳動を行い、紫外線照射下において切り出した２つの増幅産物（１４００ｂｐおよび１９００ｂｐ付近）を、ゲル抽出キットＧｅｌ−ＭＴＭ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社製）にて抽出、精製して、５０μｌの精製産物を得た。精製産物４μｌに対し、１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ（株）社製）を６μｌ、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ１μｌずつ加え、滅菌超純水で反応液総量を６０μｌとし、３７℃にて３時間反応させ、精製ＰＣＲ産物両端の制限酵素処理を行った。反応液は、６０℃にて１５分インキュベートし、制限酵素を失活させた後、エタノール沈殿を行い、精製挿入断片を得た。【００７２】
（ｄ）ライゲーションおよび形質転換
上記で得られた脱リン酸化プラスミドを１μｌ、精製挿入断片を５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘ（タカラバイオ（株）社製）６μｌを混合し、反応液総量を１２μｌとして１６℃にて一晩ライゲーション反応を行った後、反応液６μｌでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１０時間培養した。得られたコロニーをマスタープレートに植菌し、コロニーを形成したものを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、一晩培養した。培養液からプラスミドＤＮＡを精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列解析を行い、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ロイシン脱水素酵素遺伝子の正しいヌクレオチド配列が確認されたクローンを、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＣＨｉｓＬＤＨとした。【００７３】
（２）ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスに由来するロイシン脱水素酵素の改変酵素の作出
改変酵素（Ｉ１３６Ｒ）の発現用プラスミドは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、製品添付のプロトコルに従い、ｐＵＣＨｉｓＬＤＨに対して部位特異的変異を導入することによって作製した。その際、変異コドンを含むセンスプライマーとして、５’−ＧＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＴＣＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧ−３’（配列番号９）、アンチセンスプライマーとして、５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＴＡＧＴＣ−３’（配列番号１０）を用い、また形質転換や培養、プラスミド抽出などの関連する実験操作については定法に従い行った。目的のヌクレオチド配列が確認されたクローンをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＣＨｉｓＬＤＨ変異体として以降の実験に使用した。【００７４】
（３）改変酵素の発現および精製
先述のとおり構築された改変酵素の発現および精製について以下に示す。改変酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＨｉｓＬＤＨ変異体によって形質転換された組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＣＨｉｓＬＤＨ変異体）のコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン塩を含むＬＢ培地５ｍｌが入った試験管にて３７℃で１６時間振とう培養した。前記培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン塩を含むＬＢ培地１００ｍｌの入った０．５リットル容坂口フラスコに植菌し、３７℃でＯ．Ｄ．１．０に達するまで振とう培養し、１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ；ナカライテスク社製）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに５時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分、４℃；日立高速冷却遠心機ｈｉｍａｃ  ＣＲ２１Ｇ、日立社製）し、培養菌体を沈澱させ上清を除去した。得られた菌体を、３００  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０  ｍＭ  イミダゾールを含む５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁させた後、超音波破砕装置（ＫＵＢＯＴＡ  ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ｍｏｄｅｌ  ２０１Ｍ、久保田社製）を用いて１８０Ｗ、１５分、４℃にて菌体の破砕および酵素の抽出を行った。破砕液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分、４℃；日立高速冷却遠心機ｈｉｍａｃ  ＣＲ２１Ｇ、日立社製）し、上清を無細胞抽出液として酵素タンパク質の精製に用いた。緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社製）１ｍｌの充填されたカラムに添加した。洗浄用緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．５）５ｍｌにて樹脂の洗浄を行い、その後、溶出用緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ８．０）５ｍｌにて結合した酵素タンパク質の溶出を行った。溶出画分を限外ろ過膜（例えば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ６  １００ｋＤａ  ＭＷＣＯ；ＧＥヘルスケア社製）を用いて濃縮した。タンパク質濃度の算出は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて牛血清アルブミンの所定濃度で作成した検量線をもとに行った。精製酵素の純度の確認は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により行った。得られた精製酵素を用いて以降の実験を行った。【００７５】
実施例２：基質特異性の評価
ロイシン脱水素酵素の活性測定は、浅野らの方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６８（１），１５３−１５９）に従い、キュベットの利用も可能なマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、モレキュラーデバイス社製）を用いて、光路長１ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）で測定した。反応液の組成は、以下のとおりであった。０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＫＣｌ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）を０．５ｍｌ、２５ｍＭ  ＮＡＤ＋（シグマ社製）溶液を０．０４ｍｌ、０．１Ｍ  Ｌ−ロイシン（シグマ社製）もしくはＬ−イソロイシン（シグマ製）あるいはＬ−バリン（シグマ社製）などの水溶液を０．１ｍｌおよび適量の酵素溶液を加えて反応液総量を１．０ｍｌとした。酵素反応は、室温で１分間行い、３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。その結果を図２に示す。野生型（ＷＴ）を鋳型として変異導入した改変酵素Ｉ１３６Ｒは、各ＢＣＡＡに対する相対活性が改善されていた。なお、以降は野生型をＷＴと示す場合がある。【００７６】
実施例３：改変酵素（Ｉ１３６Ｒ）によるＢＣＡＡの検量線の作成
０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＫＣｌ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）を０．５ｍｌ、２５ｍＭ  ＮＡＤ＋（シグマ社製）溶液を０．０４ｍｌ、既知濃度のＬ−ロイシン水溶液またはＬ−イソロイシン水溶液またはＬ−バリン水溶液、ＭｉｌｌｉＱ水で総量が０．９６ｍｌになるように調製し、キュベットに添加した。この溶液に、０．５ｍｇ／ｍｌの酵素混合溶液０．０４ｍｌを加えて総量を１ｍｌとし，転倒混和した。酵素反応は、室温で１分間行い、３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。【００７７】
上述の測定結果を図３に示す。ＢＣＡＡ濃度が１４０〜５６０μＭ（１４０、２８０、４２０、５６０μＭの４点で測定）の場合、ＷＴでは、各ＢＣＡＡに対する活性が異なるため、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの検量線は、それぞれ大きく異なっていた。一方、改変酵素Ｉ１３６Ｒでは、各ＢＣＡＡに対する活性はほぼ等しいため、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの検量線は、ほぼ同一であった。以上より、改変酵素Ｉ１３６Ｒでは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちいずれか２つあるいは全てが混合して含まれる検体であっても、総ＢＣＡＡ濃度をＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのいずれか１つの濃度とみなすことが可能であることが明らかになった。【００７８】
実施例４：改変酵素（Ｉ１３６Ｒ）による実試料の総ＢＣＡＡ定量
実試料としてラット血漿サンプル（ＳＤ系、メス、２０週齢、日本チャールズリバー製）を用いて、ＬｅｕＤＨ  ＷＴ及びＬｅｕＤＨ  Ｉ１３６Ｒによる試料中の総ＢＣＡＡ測定評価を行った。その評価は、酵素法によって算出された総ＢＣＡＡ測定値とアミノ酸分析計Ｌ−８９００（日立ハイテク社製）から得られた総ＢＣＡＡ測定値とを比較することにより行った。【００７９】
酵素法による総ＢＣＡＡ定量は、以下の手順に従い実施した。０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＫＣｌ−ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）を０．５ｍｌ、２５ｍＭ  ＮＡＤ＋（シグマ社製）溶液を０．０４ｍｌ、既知濃度のＬ−バリン水溶液もしくはラット血漿試料０．０４ｍｌまたは０．０２ｍｌを加え、ＭｉｌｌＱ水で総量が０．９６ｍｌになるように調製し、キュベットに添加した。この溶液に、０．５ｍｇ／ｍｌの酵素混合溶液０．０４ｍｌを加えて総量を１ｍｌとし，転倒混和した。酵素反応は、室温で、１分間おこない、３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。また、Ｌ−バリン水溶液を使用して作製した検量線を用いて、血漿サンプル中総ＢＣＡＡの定量を行った。【００８０】
アミノ酸分析計での測定用ラット血漿サンプルは、スルホサリチル酸により除タンパク処理をおこなった。【００８１】
図４に、ラット血漿サンプルの総ＢＣＡＡ濃度について酵素法及びアミノ酸分析計により求めたそれぞれの測定値を比較したグラフを示す。その結果、酵素法により求めた実試料中の総ＢＣＡＡ測定値は、アミノ酸分析計により求めた総ＢＣＡＡ測定値とほぼ同一の値を示した。野生型のロイシン脱水素酵素は、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸に対する触媒活性を殆ど有しないことが知られており、今回の実験で複数のアミノ酸を含む血漿中のＢＣＡＡを定量できたことから、本発明の改変酵素は、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸に対する触媒活性を殆ど有しないという野生型酵素の特性を保持していると予想される。以上より、本発明の改変酵素は、実試料中の総ＢＣＡＡの特異的な測定に有用であることが示された。【００８２】
実施例５：セルフリー系を用いた改変酵素の合成、および改変酵素の精製
野生型の遺伝子または目的とする変異体の遺伝子を鋳型に、２−ＳｔｅｐＰＣＲ法でヒスチジンアフィニティタグおよびＴＥＶプロテアーゼ認識配列をＮ末端側に融合させ、目的変異が導入されたコンストラクトの直鎖状ＤＮＡを調製し、このＤＮＡを鋳型として用いて、大腸菌由来のセルフリー合成反応系でタンパク質を合成した。反応スケール１ｍＬ、透析法で６時間合成を行った産物の遠心後の上清画分について、Ｎｉに対するａｆｆｉｎｉｔｙ精製の溶出画分を得た。続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＹＰＲＯ  ＯＲＡＮＧＥ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いた染色により、目的酵素と考えられるタンパク質の存在を確認した。得られた溶出画分について、ＢＳＡを標準物質としたＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を定量し、必要に応じ目的の濃度に調製した後、評価に供した。野生型酵素についても同様の手順で、直鎖状ＤＮＡの調製、セルフリー合成、酵素の精製および分析を行った。野生型の遺伝子をＰＣＲの鋳型として用いて調整した酵素を表４に、目的変異を導入した遺伝子をＰＣＲの鋳型として用いて調整した酵素を表５および６に示す。なお、精製に用いたレジンと緩衝液は、以下のとおりである。
レジン：Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）
緩衝液：
Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＣｌ  ７５０ｍＭ，ＮａＰｉ  ２０ｍＭ，ｐＨ８．０）
Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＣｌ  ７５０ｍＭ，ＮａＰｉ  ２０ｍＭ，ｐＨ８．０）
回収・測定Ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ，ＮａＰｉ  ５０ｍＭ，ＥＤＴＡ  ３４ｍＭ，ｐＨ７．０，１０％  Ｄ２Ｏ，０．０１％  ＮａＮ３）【００８３】
実施例６：活性および基質特異性の評価
実施例５で合成された野生型酵素および改変酵素の活性および相対活性の評価は、実施例２の方法に従って行った。その結果を表４、５、および６に示す。表４、５におけるＷＴの値は、野生型３サンプルでの結果の平均値を用いた。また、表６の結果は、同一サンプルについて３回実験を行った際の平均値より算出した。なお、変異を複数導入した改変酵素を示す場合、導入した変異を／で区切り、続けて記載した。例えば、Ｉ１３６Ｒ／Ｉ２９２Ｆは、Ｉ１３６ＲとＩ２９２Ｆの２つの変異を有する改変酵素であることを示す。変異の導入により、ＷＴに比べ活性が向上および／または各ＢＣＡＡに対する活性がより等しくなった。また、各ＢＣＡＡに対する活性の相対値がＷＴより等しくなる変異を２つ導入することで、１変異の場合に比べ、相対値がより等しくなった。【００８４】
【表４】
2013146940.tif 000006
【００８５】
【表５】
2013146940.tif 000007
【００８６】
【表６】
2013146940.tif 000008
【００８７】
また、光路長１ｃｍのキュベットの代わりに９６穴マイクロウェルプレートを用い、下記の反応液で３０℃にて酵素反応を１分間行った際の、３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。使用した酵素は、実施例５に示すように、野生型の遺伝子を鋳型に調製した直鎖状ＤＮＡを用いて合成および精製して調製した。反応液は、０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．２８Ｍ  塩化ナトリウム、８．４ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム  バッファ（ｐＨ  ７．０または７．５または８．０）  １５０μｌ、２５ｍＭ  ＮＡＤ＋水溶液  ３０μｌ、１Ｍ  塩化カリウム水溶液  １．５μｌ、１０ｍＭのＬ−ロイシン水溶液またはＬ−イソロイシン水溶液またはＬ−バリン水溶液  ３μｌ、ＭｉｌｌｉＱ水１００．５μｌを混合して調製し、この溶液に１ｍｇ／ｍｌの酵素液  １５μｌを混合して調製した。結果を表７、８に示す。各値は、Ｉ１３６ＫおよびＩ１３６Ｒは１回の実験結果より、他の酵素は同一サンプルについて２回実験を行った際の平均値より算出した。表７は改変酵素のＷＴに対する活性の相対値を、表８は酵素の各ＢＣＡＡに対する活性の相対値を示す。【００８８】
【表７】
2013146940.tif 000009
【００８９】
【表８】
2013146940.tif 000010
【００９０】
実施例７：熱安定性の評価
実施例５で合成されたＬｅｕＤＨ  ＷＴおよび下記改変酵素５種の酵素溶液を６０、７０、８０℃にて１時間熱処理した後、活性測定を行った。熱処理後の各酵素溶液の残存活性を表９に示す。いずれの改変酵素も、６０℃、７０℃での熱処理後の残存活性は、野生型より高かった。【００９１】
【表９】
2013146940.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の改変酵素は、総分岐鎖アミノ酸濃度の迅速な測定に有用である。本発明の改変酵素はまた、任意の分岐鎖アミノ酸の測定、および／または任意の分岐鎖アミノ酸の誘導体の製造に有用である。本発明の改変酵素はさらに、液状試薬として有用である。本発明の分析方法は、例えば、肝硬変、肝性脳症等の疾患の診断に有用である。
【図１】
2013146940.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2013146940000001.app
【国際調査報告】
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