(57)【要約】【課題】  大量並列塩基配列決定技術を利用した遺伝子診断に基づき、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価する方法、また、そのポリペプチド及び抗体、並びに、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に対する治療薬若しくは予防薬の候補物をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】  骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の変異を検知する工程を備える。Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換、ＺＲＳＲ２遺伝子から翻訳されるタンパク質のすべての不活化変異、ＳＦＲＳ２遺伝子から翻訳されるタンパク質の第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換、ＳＦ３Ｂ１遺伝子から翻訳されるタンパク質の第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換の少なくともいずれかを検知した場合に、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有すると評価し、逆に、それらを検知しなければ素因がない可能性があると間接的に評価してもよい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、
被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の変異を検知する工程を有する
ことを特徴とする骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因の評価方法。
【請求項２】
Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、
Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換、
ＺＲＳＲ２遺伝子から翻訳されるタンパク質のすべての不活化変異、
ＳＦＲＳ２遺伝子から翻訳されるタンパク質の第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換、
ＳＦ３Ｂ１遺伝子から翻訳されるタンパク質の第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換の少なくともいずれかを検知した場合に、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有すると評価する
請求項１に記載の骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因の評価方法。
【請求項３】
Ｕ２ＡＦ３５遺伝子の少なくとも一部から成り、第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、または、第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換の少なくともいずれかを有し、
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得る
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
ＺＲＳＲ２遺伝子の少なくとも一部から成り、いずれかのアミノ酸の不活化変異を有し、
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得る
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
ＳＦＲＳ２遺伝子の少なくとも一部から成り、第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換の少なくともいずれかを有し、
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得る
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくとも一部から成り、第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換の少なくともいずれかを有し、
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得る
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
請求項３ないし６のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、または、置換、付加されたアミノ酸配列から成り、それぞれ請求項３ないし６のいずれかに記載のポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能する
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
請求項３ないし７のいずれかに記載のポリペプチドを認識する
ことを特徴とする抗体。
【請求項９】
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に対する治療薬若しくは予防薬の候補物をスクリーニングする方法であって、
被験物質が、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、
その遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を有する
ことを特徴とする骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の治療薬若しくは予防薬の候補物スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価する方法、また、そのポリペプチド及び抗体、並びに、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に対する治療薬若しくは予防薬の候補物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（Myelodysplastic syndromes：ＭＤＳ）は、骨髄では造血細胞は生産されているが、抹消血液中では赤血球、白血球、血小板が減っている病気であり、しばしば急性白血病に移行することから、幹細胞レベルでの癌化によるものだと考えられている。現在、不応性貧血（refractory anemia：ＲＡ)、鉄芽球性不応性貧血(Refractory anemia with ringed sideroblasts：ＲＡＲＳ)、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（refractory cytopenia with multikineage dysplasia：ＲＣＭＤ)、多血球系異形成を伴う鉄芽球性不応性貧血(ＲＣＭＤ−ＲＳ)、芽球増加型不応性貧血（refractory anemia with excess  blasts：ＲＡＥＢ)、５ｑ−症候群などに分類されている。特に急性骨髄性白血病（acute  myelogenous leukemia：ＡＭＬ）が合併症として最も重要であるが、どのように骨髄異形成症候群から白血病になっていくのかは不明であった。
骨髄性腫瘍も、無秩序な異形成血球産生や急性骨髄性白血病への移行を特徴とし、骨髄異形成症候群の関連障害である。【０００３】
骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍から急性骨髄性白血病への移行を防ぐために、早期診断によって早期治療を開始することが求められているが、従来は血液検査しかなく病気の確定診断にしか使えなかった。【０００４】
骨髄異形成症候群の症状である白血病性形質転換や無効造血が起こる前の臨床経過が緩徐進行型であることから、初発の急性骨髄性白血病に関与する発病とは異なる発病が示唆されるが、これらの障害の遺伝的基礎は十分には解明されていない。いくつかの遺伝子突然変異と細胞遺伝学的変化がその発病に関与していて、ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＮＸ１、ＡＳＸＬ１、ｃ−ＣＢＬ、ＩＤＨ１／２、ＴＥＴ２、ＥＺＨ２が、骨髄異形成で最も頻繁に突然変異を起こしている遺伝子標的の中に含まれる。しかしながら、例えば、症例の約２０％では既知の遺伝子変化が見られないことから、この遺伝子セットの突然変異では、その発病を十分には説明することができない。５ｑ−症候群と関連するＲＰＳ１４とｍｉＲ−１４５／１４６のハプロ不全に関する研究結果から、この問題に関する興味深い洞察が与えられたが、特に、その異形成表現型の原因となる遺伝子変化については不十分にしか理解されていない。【０００５】
一方で、大量並列塩基配列決定技術が最近開発されたことにより、ヒトの癌におけるゲノムまたはタンパク質コード配列全体にわたる遺伝子変化を１ヌクレオチドレベルで探索する新たな機会が現在与えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wahl，M.C.，Will，C.L.＆Luhrmann，R.The spliceosome design principles of a dynamic RNP machine.Cell 136,701-718(2009)
【非特許文献２】Tronchere，H.，Wang,J.＆Fu，X.D.A proteinrelatedto splicing factor U2AF35 that interests with U2AF65 and SR proteins insplicing of pre-mRNA.Nature 388,397-400 (1997)
【非特許文献３】Calvo，S.E.，et al. Hlgh-throughput，pooled sequencingidentifies mutations in NUBPL and FOXRED1 in human complex I deficiency.NatGenet 42,851-858 (2010)
【非特許文献４】Bevilacqua，L.，et al.Apopulation-specific HTR2B stop codon predisposes to severe impulsivity.Nature468，1061-1066 (2010)
【非特許文献５】Chen.M. ＆ Manley，J.L.Mechanisms of alternative splicing regulation insights frommolecular and genomics approaches. Nat Rev Mol Cell Biol 10,741-754 (2009)
【非特許文献６】Subramanian,A.，etal. Gene set enrichment analysis a knowledge-based approach for interpretinggenome-wide expresslon profiles. Proc Natl Acad Sci USA 102,15545-15550 (2005)
【非特許文献７】Bhuvanagiri,M.，Schlitter,A.M，Hentze，M.W.＆Kulozik,A.E.NMD  RNA biology meets human geneticmedicine. Biochem J430,365-377(2010)
【非特許文献８】Maquat，L.E.Nonsense-mediatedmRNA decay splicing，translalion and mRNP dynamics.NatRev Mol Cell Biol 5,89-99(2004)
【非特許文献９】Shen，H.，Zheng，X.,Luecke，S.＆Green，M.R.The U2AF35-related protein Urpcontacts the 3'splice site to promote U12-type intron splicing and the secondstep of U2-type intron splicing.Genes Dev24,2389-2394（2010）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、大量並列塩基配列決定技術を利用した遺伝子診断に基づき、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価する方法、また、そのポリペプチド及び抗体、並びに、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に対する治療薬若しくは予防薬の候補物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因の評価方法は、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子（Ｕ２ＡＦ１とも呼ぶ）、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の変異を検知する工程を有することを特徴とする。【０００９】
ここで、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換、  ＺＲＳＲ２遺伝子から翻訳されるタンパク質のすべての不活化変異、ＳＦＲＳ２遺伝子から翻訳されるタンパク質の第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換、ＳＦ３Ｂ１遺伝子から翻訳されるタンパク質の第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換の少なくともいずれかを検知した場合に、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有すると評価し、逆に、それらを検知しなければ素因がない可能性があると間接的に評価してもよい。
このアミノ酸の置換の検知には、アミノ酸置換に対応する遺伝子の変異を検出してもよいし、それから翻訳されるタンパク質やポリペプチドでの変異を検出してもよい。
なお、アミノ酸の略号は、ＳはSer（セリン）、ＦはPhe（フェニルアラニン）、ＹはTyr（チロシン）、ＱはGln（グルタミン）、ＲはArg（アルギニン）、ＰはPro（プロリン）、ＥはGlu（グルタミン酸）、ＸはXaa（未知またはその他のアミノ酸）、ＨはHis（ヒスチジン）、ＬはLeu（ロイシン）、ＲはArg（アルギニン）、ＫはLys（リシン）、ＤはAsp（アスパラギン酸）、ＮはAsn（アスパラギン）、ＴはThr（トレオニン）を示す。【００１０】
本発明のポリペプチドは、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子の少なくとも一部から成り、第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、または、第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換の少なくともいずれかを有し、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得ることを特徴とする。【００１１】
同様に、本発明のポリペプチドは、ＺＲＳＲ２遺伝子の少なくとも一部から成り、いずれかのアミノ酸の不活化変異を有し、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得るものでもよい。【００１２】
ＳＦＲＳ２遺伝子の少なくとも一部から成り、第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換の少なくともいずれかを有し、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得るものでもよい。【００１３】
ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくとも一部から成り、第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換の少なくともいずれかを有し、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとなり得るものでもよい。【００１４】
上記のいずれかのポリペプチドにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、または、置換、付加されたアミノ酸配列から成り、それぞれ元のポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能するポリペプチドとしてもよい。【００１５】
本発明の抗体は、上記のいずれかのポリペプチドを認識することを特徴とする。【００１６】
本発明の骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の治療薬若しくは予防薬の候補物スクリーニング方法は、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に対する医薬をスクリーニングする方法であって、被験物質が、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、その遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、遺伝子診断によって簡便に精度高く、骨髄異形成症候群や骨髄性腫瘍の診断が可能になり、早期治療や予防に寄与する。また、病態分類や、治療法の選択にも役立てられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】全エキソン解析で明らかにされた３２例中に繰り返し現われる遺伝子突然変異を示す表
【図２】（ａ）スプライシング複合体Ｅ／Ａ及びその構成要素における頻度の高い遺伝子突然変異を示す説明図、（ｂ）骨髄系腫瘍におけるスプライシング複合体Ｅ／Ａの複数の構成要素の突然変異を示す説明図
【図３】（ａ）スプライソソーム経路遺伝子の頻度を示すグラフ、（ｂ）同、分布を示すグラフ
【図４】（ａ）Ｕ２ＡＦ３５のＳ３４Ｆ突然変異体を発現させたウェスタンブロット解析写真、（ｂ）同、ＮＭＤ経路の活性化を示すグラフ、（ｃ）同、ｑＰＣＲの結果を示すグラフ、（ｄ）同、エクソンとイントロンの発現比率を示すグラフ、（ｅ）同、エクソンとイントロンの発現比率を示すグラフ
【図５】（ａ）突然変異体及び野生型Ｕ２ＡＦ３５のドキシサイクリン誘導性を発現させたウェスタンブロット解析写真、（ｂ）同、細胞周期の変化を示すグラフ、（ｃ）同、細胞周期の変化を示すグラフ、（ｄ）同、アポトーシスの誘導を示すグラフ、（ｅ）同、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５の機能解析を示すグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。【００２０】
本発明者は、骨髄異形成症候群患者３２例と健常者の血液サンプルからの体細胞エキソーム解析を行ったところ、ＲＮＡスプライシングに関与する遺伝子に異常があり、アミノ酸置換が起こっている知見を得た。それらの遺伝子異常が、患者サンプルの４０％で見られることから、その遺伝子変異を検査すれば、骨髄性異常かどうか判別できる。また、骨髄異形成症候群患者１５９例や、慢性骨髄単球性白血病（Chronic Myelomonocyte Luekemia：CMML）患者８８例などで調べた結果、同様の異常が４０％近くで確認された。
これは、ＲＮＡスプライシング異常が発病の原因となることを、初めて証明できた例でもある。【００２１】
本発明者は、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の患者に見られるＵ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異を同定した。
詳しくは、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換、ＺＲＳＲ２遺伝子から翻訳されるタンパク質のすべての不活化変異、ＳＦＲＳ２遺伝子から翻訳されるタンパク質の第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換、ＳＦ３Ｂ１遺伝子から翻訳されるタンパク質の第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換である。なお、ＺＲＳＲ２遺伝子の変異に関しては、実施例では第３６２番目のアミノ酸におけるＥからＸへの置換など挙げたが、翻訳されるタンパク質のすべての不活化変異が該当する。【００２２】
これらのいずれかを検知した場合に、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍を生じ得る素因を有すると評価し、逆に、それらを検知しなければ素因がない可能性があると間接的に評価できる。【００２３】
上記いずれかの遺伝子変異を有するポリペプチドは、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍の素因を評価するマーカーとして利用可能である。
なお、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含む。ポリペプチドを検出するために抗体を作製する場合に、ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。【００２４】
本発明によるポリペプチドは、上記の遺伝子産物におけるアミノ酸置換の他に、ポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能する限り、更に、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、付加されたものであってもよい。抗体が認識するエピトープ以外の部位に、このような変異が含まれていてもよい。
このようなポリペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発法などにより作製し、適当な系で発現させることによって調製することも可能である。【００２５】
これらのポリペプチドは、ポリヌクレオチドの発現産物として骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍患者から取得した血球等の試料に含まれている場合に、それから単離する方法や、それぞれの変異アミノ酸残基を含むアミノ酸配列の情報に基づき化学合成によって調製する方法、ポリヌクレオチドを含む適当な組換えベクター等を用いた組換えＤＮＡ技術で適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞により生産する方法などにより調製することができる。【００２６】
また、ポリヌクレオチドは該当するポリヌクレオチドをプローブとして、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍患者から取得した試料の全ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また、野生型の遺伝子のｃＤＮＡに、部位特異的突然変異誘発に基づき市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入して調製することも可能である。【００２７】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍患者から取得した血球等の試料から調製したゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として使用し、適当なプライマーを用いるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated  amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement  Amplification）法などにより増幅することができる。【００２８】
本発明による抗体は、上記のいずれかのポリペプチドを特異的に認識することを特徴とする。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、結合活性を有している限り、元の完全な構造を有する抗体に限らず、断片などの完全な抗体由来の各種誘導体でもよい。これらの抗体は、変異遺伝子の検出方法に用いる検出システムの構成要素として有用である。
抗体は、ポリペプチドまたはそれと適当なアジュバントとの複合体を免疫原として用いて作製できる。例えばポリクローナル抗体の場合には、免疫原で動物を免役した後、血清から得ることができる。【００２９】
ポリペプチドの検知は、例えば、本発明の抗体を用いたＥＩＡやＥＬＩＳＡなどの免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサーなどペプチドのアミノ酸配列分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳやＥＳＩ
Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法などの質量分析によって検出することができる。
【実施例】
【００３０】
対をなすＣＤ３陽性Ｔ細胞または口腔粘膜を生殖系列対照として用いて、骨髄異形成症候群または関連骨髄系腫瘍の患者３２名について、骨髄由来ＤＮＡの全エキソーム塩基配列決定を行なった。非コード突然変異と遺伝子再構成は検出できないが、全エキソームアプローチは、タンパク質コード突然変異の包括的なレジストリを低コストかつ高性能に得るための十分に確立された方法である。平均して、標的配列の７９％が２０倍を上回る深度で解析された。非同義的単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）と小さな挿入／欠失（インデル）の全ての候補（Ｎ＝５０９）をサンガー法による塩基配列決定で集中的に確認した。最終的に、１９１個のミスセンス突然変異、２４個のナンセンス突然変異、９個のスプライス部位突然変異、２４個のフレームシフト誘発インデルを含む２４８個の体細胞突然変異（サンプル当たり７．８個）が確認された。ＳＮＰアレイ核型解析によって得られるゲノムコピー数プロファイルと合わせて、この体細胞突然変異アレイにより、骨髄異形成ゲノムの全体像が得られた。【００３１】
骨髄異形成によく見られる遺伝子標的の大部分が含まれ、典型的なゲノムコピー数プロファイルと合わせて、偏りがない突然変異遺伝子のサンプルセットを用いた。予期した通り、既知の遺伝子標的の突然変異は、検出された全突然変異のわずか１３．３％であり（Ｎ＝３３）、残る２１５個の突然変異は、これらの腫瘍で突然変異していることがこれまで報告されていなかった遺伝子に生じていた。しかし、後者の中でドライバー事象とパッセンジャー事象を区別するのは容易ではなかった。ナンセンス／フレームシフト変異は、多くの場合、タンパク質機能を障害する可能性が高く、その標的は腫瘍抑制遺伝子の候補となる。また、骨髄異形成への関与がこれまでに示唆された一般的な遺伝子経路を含めれば、それらがパッセンジャー事象を示すものではなく、原因となる役割を果たすものであることが裏付けられることになる。【００３２】
したがって、ＴＰ５３関連経路の遺伝子（ＤＡＰＫ１、ＴＰ５３ＢＰ１）やクロマチン調節に関与する遺伝子（ＰＨＦ６、ＤＯＴ１−Ｌ、ＰＨＦ８）の突然変異はドライバー突然変異の妥当な候補であった。例えば、Ｄｏｔ１−Ｌ欠損マウスは、骨髄での赤血球産生に欠陥があるために重度の貧血を発症した報告がある。ＰＨＦ６（Ｘｑ２６．３）及びＰＭＦ８（Ｘｐ１１．２）の先天性のナンセンス突然変異は、Ｘ連鎖精神遅滞症候群の原因である。ＰＨＦ８は、骨髄異形成を含むヒト癌における頻度の高い突然変異標的として広く認められているヒストン脱メチル化酵素ファミリーのタンパク質のメンバーであり、一方、機能喪失型のＰＨＦ６突然変異は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の約３０％で報告されている。【００３３】
また、本実施例の拡大症例シリーズでは、１１個のＰＨＦ６突然変異が骨髄異形成１６４例中１０例で同定された。他方、複数の症例で見られた突然変異は、骨髄異形成において高頻度に存在する可能性が高かったので、特に興味深いドライバー変異である可能性があった。実際、突然変異が頻発して起こる１２個の遺伝子のうちの９個が最も頻度の高い既知の標的に含まれ、骨髄異形成における極めて重要な遺伝子経路に関与していた。【００３４】
残りの３つの遺伝子（ＵＲＡＦ１、ＺＲＳＲ２、ＳＦＲＳ２）は、これまでに報告されたことがなく、ＲＮＡスプライシングの機構、すなわち、スプライソソームとして知られる共通の経路に属していた。図１の表に、全エキソン解析で明らかにされた３２例中に繰り返し現われる遺伝子突然変異を示す。
顕著なことに、単一の症例で突然変異していた３つの遺伝子（ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＰＲＰＦ４０Ｂ）をさらに含めると、スプライシング機構の６つの構成要素が３２例中１５例（４７％）で相互排他的に突然変異していることが分かった。【００３５】
図２（ａ）は、スプライシング複合体Ｅ／Ａ及びその構成要素における頻度の高い遺伝子突然変異を示す説明図である。全エキソーム塩基配列決定によって同定された突然変異構成要素を、矢印で示す。
ＲＮＡスプライシングの初期の段階では、Ｕ１  ｓｎＲＮＰが、転写されている最中のＰｒｅ−ｍＲＮＡの５’ＳＳにリクルートされると同時に、ＳＦ１及びＵ２補助因子（Ｕ２ＡＦ）の大きい方のサブユニットのＵ２ＡＦ２が、分岐点配列（ＢＰＳ）及びその下流のポリピリミジン領域に結合する。Ｕ２ＡＦの小さい方のサブユニット（Ｕ２ＡＦ３５）は、３’ＳＳのＡＧジヌクレオチドに結合し、それぞれ、そのＵＨＤドメインとＳＲドメインを介してＵ２ＡＦ２とＳＦタンパク質（例えば、ＳＦＲＳ２（ｓｃ３５））の両方と相互作用して、最初期のスプライシング複合体（Ｅ複合体）を構成する。ＺＲＳＲ２、すなわち、ＵｒｐもＵ２ＡＦ及びＳＲタンパク質と相互作用して、ＲＮＡスプライシングに不可欠な役割を果たす。これらの因子によって３’ＳＳが認識された後に、ＳＦ３Ａ１とＳＦ３Ｂ１を含む多成分タンパク質／ｓｎＲＮＡ複合体のＵ２  ｓｎＲＮＰが３’ＳＳにリクルートされて、スプライシング複合体Ａを生成する。
骨髄異形成では、これらのスプライシング複合体の複数の構成要素が遺伝子突然変異によって影響を受けていて、ヒト癌における経路突然変異の新規かつ顕著な例を示している。【００３６】
大部分の後生動物遺伝子のコード配列（エキソン）は、ＲＮＡスプライシングと呼ばれるプロセスによって成熟ｍＲＮＡが生成される前に、Ｐｒｅ−ｍＲＮＡから除去される必要がある介在する非コード配列（イントロン）で隔てられている。こうした機能性は、一連の低分子核リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体（Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４／５／６、Ｕ１１／１２）、並びに、多くの他のタンパク質構成要素が、Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上に秩序よくリクルートされ、そこで再編成され、離脱することで達成され、エキソン−イントロン境界の認識が起こり、２つのエステル交換反応が、まず５’−スプライシング部位（５’ＳＳ）と分岐点配列（ＢＰＳ）の間で、次に５’ＳＳと３’ＳＳの間で起こり、連結されたエキソンを残して、ラリアットイントロンが切り出される。【００３７】
これに関連して注意すべき点は、ＲＮＡスプライシングにおける機能が明らかにされていないＰＲＰＦ４０Ｂを除く、全ての突然変異したスプライソソーム構成要素がＲＮＡスプライシングの初期の段階に関与するという事実であった。ＳＦ１や、ＳＦＲＳ１またはＳＦＲＳ２（ｓｃ３５）などのＳＲタンパク質と物理的に相互作用して、Ｕ２ＡＦ２／Ｕ２ＡＦ３５ヘテロ二量体からなるＵ２補助因子（Ｕ２ＡＦ）が、３’ＳＳ及びその近傍のポリピリミジン領域の認識に関与するが、これは、後にＳＦ３Ａ１及びＳＦ３Ｂ１を含むＵ２  ｓｎＲＮＰをリクルートして、スプライシングＡ複合体を樹立するのに必要であると考えられている（非特許文献１）。【００３８】
他方、Ｕｒｐ（Ｕ２ＡＦ３５関連タンパク質）としても知られるＺＲＳＲ２は、スプライシング機構のもう１つの不可欠な構成要素である。Ｕ２ＡＦ３５に極めてよく似た構造を示すために、ＺＲＳＲ２は、ＳＦＲＳ１やＳＦＲＳ２だけでなく、Ｕ２ＡＦ２とも物理的に相互作用し、そのホモログのＵ２ＡＦ３５とは異なる役割を果たしている（非特許文献２）。【００３９】
全エキソーム塩基配列決定における初期の発見を確認し、敷延するために、ＤＮＡプールのハイスループット突然変異スクリーニングと、それに次ぐ候補突然変異の確認／同定により、多数の骨髄系腫瘍（Ｎ＝５８２）における上記の６つの遺伝子と、Ｕ２ＡＦ６５、ＳＦ１、及びＳＲＳＦ１を含むさらに３つのスプライソソーム関連遺伝子の突然変異を調べた（非特許文献３、４）。
その結果、プールＤＮＡスクリーニングにおける３１３の暫定的陽性事象を確認することにより、骨髄系腫瘍標本５８２例中２０９例で計２１９個の突然変異が同定された。４つの遺伝子、Ｕ２ＡＦ３５（Ｎ＝３７）、ＳＲＳＦ２（Ｎ＝５６）、ＺＲＳＲ２（Ｎ＝２３）及びＳＦ３Ｂ１（Ｎ＝７９）の突然変異が突然変異の大部分を説明し、ＳＦ３Ａ１（Ｎ＝８）、ＰＲＰＦ４０Ｂ（Ｎ＝７）、Ｕ２ＡＦ６５（Ｎ＝４）及びＳＦ１（Ｎ＝５）の突然変異率は遙かに小さいものであった。【００４０】
図２（ｂ）は、骨髄系腫瘍におけるスプライシング複合体Ｅ／Ａの複数の構成要素の突然変異を示す説明図である。スプライシング複合体Ｅ／Ａの６つのスプライソソーム構成要素の突然変異を矢印で示し、既知のドメイン構造は四角で示す。
Ｕ２ＡＦ３５及びＳＦＲＳ２（場合によってはＳＦ３Ｂ１も）の突然変異は、異なるホットスポットに関与しているが、ＺＲＳＲ２の突然変異はその全長に沿って広範に分布していて、その大部分は、タンパク質の早期切断を引き起こすナンセンス突然変異またはスプライス部位突然変異、すなわち、インデルである。【００４１】
図３（ａ）は、全エキソーム研究により解析された最初の３２例を含む骨髄系腫瘍５１３例におけるスプライソソーム経路突然変異の頻度を示す。頻度は、腫瘍の各タイプ、すなわち、ＭＤＳ、ＣＭＭＬ、ＡＭＬ／ＭＤＳ（骨髄異形成関連変化を伴うＡＭＬと治療関連ＡＭＬの両方を含む）、初発ＡＭＬ、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）について示されている。
スプライシング機構の突然変異は、環状鉄芽球の増加を伴うＭＤＳ（８４．９％）または環状鉄芽球の増加を伴わないＭＤＳ（４３．９％）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）（５４．５％）、及び治療関連ＡＭＬまたは骨髄異形成関連の変化を伴うＡＭＬ（２５．８％）など、骨髄異形成の特徴を示す疾患に極めて特異的であったが、初発ＡＭＬ（６．６％）及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）（９．４％）では稀であった。なお、鉄芽球性不応性貧血(ＲＡＲＳ)及び多血球異形成を伴う鉄芽球性不応性貧血(ＲＣＭＤ−ＲＳ）は、驚くことにＳＦ３Ｂ１の変異が多く認められ、それぞれ８２．６％、７６％であった。【００４２】
図３（ｂ）は、複数のスプライソソーム経路突然変異の分布を、これら８つの遺伝子について示す。各患者の診断を一番上のレーンの上に示す。
これらのスプライシング経路の遺伝子における突然変異の相互排他的なパターンが、この多数の症例シリーズで確認され、スプライシング調節における異なる遺伝子の突然変異が共通の結果をもたらすことが示唆された。【００４３】
一方、突然変異の頻度は、疾患タイプを超えて有意差を示した。驚くべきことに、ＳＦ３Ｂ１突然変異は、環状鉄芽球の増加を特徴とするＭＤＳ症例、すなわち、鉄芽球性不応性貧血（ＲＡＲＳ）（１９／２３、すなわち、８２．６％）及び多血球系異形成を伴う鉄芽球（≧１５％）性不応性貧血（ＲＣＭＤ−ＲＳ）（３８／５０、すなわち、７６％）の大半に見られ、他の骨髄系腫瘍での突然変異頻度は遙かに小さいものであった。ＲＡＲＳとＲＣＭＤ−ＲＳは、ＭＤＳ症例のそれぞれ４．３％と１２．９％を占め、これらの疾患では、無秩序な鉄代謝が不応性貧血の原因とされている。突然変異頻度と特異性がこれほどまでに高いことから、ＳＦ３Ｂ１突然変異は、環状鉄芽球の増加を特徴とするこれらのＭＤＳサブタイプに特徴的であると言ってもよく、これらのカテゴリーのＭＤＳの発症に強く関与すると考えられた。ＳＲＳＦ２突然変異の頻度は、あまり目立たないけれども有意にＣＭＭＬ症例で高かった。
そのため、異なる突然変異は、Ｅ／Ａスプライシング複合体に共通の影響を及ぼすと同時に、細胞機能に異なる影響も及ぼし、個別の疾患表現型の決定に寄与する可能性がある。例えば、ＳＲＳＦ２がＤＮＡ安定性の調節にも関与することや、ＳＲＳＦ２の減少がＤＮＡ高突然変異性をもたらし得ることが示されている。この関連で興味深いのは、疾患サブタイプを問わず、ＳＲＳＦ２突然変異を有するサンプルが、Ｕ２ＡＦ３５突然変異と比べて、他の遺伝子の突然変異を有意により多く有することが示されたことである（ｐ＝０．００１、重回帰分析）。【００４４】
注目すべきは、１例でのＡ２６Ｖを稀な例外として、Ｕ２ＡＦ３５の突然変異が主に、ＵＨＭドメインに隣接するＮ末端とＣ末端のジンクフィンガーモチーフ内の２つの高度に保存されたアミノ酸位置（Ｓ３４またはＱ１５７）に生じていたことである。ＳＲＳＦ２突然変異は主に、ＲＰＭドメインとＲＳドメインの間にある介在配列内のＰ９５で生じていた。同様に、ＳＦ３Ｂ１突然変異が、大部分はＫ７００Ｅで、そして、それほどではないが、Ｋ６６６、Ｈ６６２及びＥ６２２で生じていて、これらも種を超えて保存されている。
これらのスプライソソーム遺伝子に見られる頻出アミノ酸位置は、これらの突然変異の機能獲得型の性質を強く示唆するが、これは、コドン１２、１３及び６１に生じるＲＡＳ突然変異のみならず、Ｖ６１７Ｆ  ＪＡＫ２突然変異、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ突然変異、そして、ごく最近のＹ６４１  ＥＺＨ２突然変異をはじめとする、他のオンコジーン突然変異でも十分に立証されているシナリオである。【００４５】
他方、ＺＲＳＲ２（Ｘｐ２２．１）における２３個の突然変異はコード領域全体にわたって広く分布していた（図２（ｂ））。これらのうち、１４個の突然変異はナンセンス変異またはフレームシフト変異であったか、あるいは機能喪失をもたらすタンパク質の早期切断または大きな構造変化を引き起こすスプライシングドナー／アクセプター部位に生じていた。この突然変異が男性に強く偏っている（１４／１４）ことを考え合わせると、ＺＲＳＲ２は、Ｘ連鎖劣性の遺伝的作用機序で腫瘍抑制遺伝子として働く可能性が極めて高い。残る９個のＺＲＳＲ２突然変異はミスセンス変異であり、男性（６例）と女性（３例）の両方で見られたが、その体細胞起源は２例でしか確認されなかった。
しかしながら、ｄｂＳＮＰデータベース（ビルド１３１及び１３２）にも、１０００人のゲノムデータベース（２０１１年５月時点のｓｎｐコール）にも、これらのミスセンスヌクレオチドが含まれていなかったので、全てではないにせよ、これらのミスセンスＳＮＶの多くが、特に男性に見られる機能的な体細胞変異を表す可能性が高いことが示唆される。Ｕ２ＡＦ３５及びＳＲＳＦ２におけるこれらの突然変異ホットスポットを調べたが、ＡＬＬ（Ｎ＝２４）または非ホジキンリンパ腫（Ｎ＝８７）などのリンパ系腫瘍では突然変異が見られなかった。【００４６】
いずれの遺伝子変位もＭＤＳに特異的で、他の疾患、特に骨髄系腫瘍における変異頻度は低い。一部のＡＭＬはＭＤＳからの移行した例が含まれるが、これらの遺伝子群の変異頻度は新規ＡＭＬ (de novo AML)より大幅に高く、ＡＭＬとＭＤＳから発症したＡＭＬの鑑別にも有効である。
特にＲＡＲＳではＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異率が高く、実質的にこの病気を決定づける遺伝子変異になっている。ＳＲＳＦ２遺伝子の変異がある群は、他の遺伝子の変異を伴うことが多いことが統計学的に示された。ＳＲＳＦ２遺伝子変異はまたＣＭＭＬに多いことも特徴的である。
現在ＷＨＯ分類でＲＣＭＤと分類される疾患群は、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２遺伝子変異の有無により２つに分けられ、これらの変異のある群の予後は、変異のない群よりも良い可能性があるので、予後の予測に有用である。【００４７】
骨髄異形成におけるスプライソソーム突然変異は、相互に排他的な様式でスプライシング複合体Ｅ／Ａの主要な構成要素に広く影響を及ぼしたので、これらの突然変異の共通の機能的標的が、エキソン−イントロン境界の正確な認識と、その後のこれらの複合体を介するＵ２  ｓｎＲＮＰのＰｒｅ−ｍＲＮＡ上へのリクルートメントであることが論理的に示唆された（非特許文献１、５）。
これを理解するために、そしてまた、これらのスプライシング突然変異が与える生物学的／生化学的な影響に関する洞察を得るために、ＥＧＦＰをマーカーとしたレトロウイルスによる遺伝子導入を用いて、野生型Ｕ２ＡＦ３５及び突然変異体（Ｓ３４Ｆ）Ｕ２ＡＦ３５をＨｅＬａ細胞で発現させ。
図４（ａ）は、ウェスタンブロット解析写真である。遺伝子発現解析に用いられたＨｅＬａ細胞と、ＴＦ−１細胞における導入された野生型Ｕ２ＡＦ３５または突然変異体（Ｓ３４Ｆ）Ｕ２ＡＦ３５の発現を示している。【００４８】
遺伝子導入の４８時間後にＧＦＰ陽性細胞を回収し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ解析と、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を用いて突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、次いで、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を行なった（非特許文献６）。【００４９】
今回のＧＳＥＡでは、発現された全ての遺伝子をまず、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞の間の遺伝子発現の差が大きい順に並べ、次に、その中にエンリッチされている遺伝子セットを探索した。ＧＳＥＡの初期の結果から、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞でエンリッチされているいくつかの遺伝子セットが明らかになり、その中で特に興味深いのは、核からのＲＮＡ輸送に関する遺伝子セットであった（Ｐ＝０．０１２）。この遺伝子セットには、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）に関与する一連の遺伝子（Ｎ＝６）が含まれ、その全てがコアエンリッチメントに関与していたからである。【００５０】
図４（ｂ）は、Ｕ２ＡＦ３５突然変異体によって引き起こされるＮＭＤ経路の活性化を示すグラフであり、ｃ５．ｂｐ．ｖ２．５．ｓｙｍｂｏｌｓ（遺伝子オントロジー）遺伝子セットを用いた初期のＧＳＥＡの結果である。野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と比較し、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入ＨｅＬａ細胞における核からのＲＮＡ輸送遺伝子セットの有意なエンリッチメントを示している。
次の段階で、核からのＲＮＡ輸送遺伝子セットからＮＭＤに関与する遺伝子を選択して、さらなるＮＭＤ関連遺伝子を構築し、より完全なＮＭＤ経路遺伝子セットを構築した。突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入ＨｅＬａ細胞におけるＮＭＤ遺伝子セットのより有意なエンリッチメントを示している。遺伝子セットの有意性は、１，０００遺伝子セットの並べ替えにより実験的に決定された。【００５１】
実際、より完全なＮＭＤ遺伝子セットを含めてＧＳＥＡを実施したとき、このエンリッチメントはさらに有意になった（Ｐ＝０．００２６）（非特許文献７）。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により、マイクロアレイの発現データを確認した。
図４（ｃ）は、ｑＰＣＲの結果である。ＮＭＤ遺伝子セットのコアエンリッチメントに寄与する９つの遺伝子の発現のマイクロアレイ結果が確認されている。野生型Ｕ２ＡＦ３５導入ＨｅＬａ細胞の平均発現（＋Ｓ．Ｅ．）で正規化した後に、模擬導入ＨｅＬａ細胞、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入ＨｅＬａ細胞及び突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入ＨｅＬａ細胞におけるＮＭＤ遺伝子の平均発現（＋Ｓ．Ｅ．）をプロットした。マン−ホイットニーのＵ検定でＰ値を決定した。【００５２】
同様のエンリッチメントは、Ｓ３４Ｆ突然変異体を導入されたＴＦ−１（スプライソソーム突然変異が知られていない骨髄異形成症候群由来細胞株）の遺伝子発現プロファイルでも観察された。
突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入ＴＦ−１細胞のＧＳＥＡの結果によると、Ｕ２ＡＦ３５導入細胞におけるＮＭＤ経路遺伝子セットのエンリッチメントを示された。【００５３】
ｍＲＮＡ品質監視機構として知られるＮＭＤ経路が、翻訳を時期尚早に終結させる異常な転写産物を認識して排除する転写後機構を提供することを考慮すると（非特許文献８）、このＧＳＥＡ解析の結果から、スプライシングされないＲＮＡ種を生成する可能性が極めて高い異常な転写が起こり、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞におけるＮＭＤ活性を誘起することが強く示唆された。【００５４】
これを確認するために、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトエキソン１．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を用いて、これらの細胞に対して全トランスクリプトーム解析を行なった。この解析において、異なるレベルでエキソンであることの証拠を示す２つの別々のプローブセット、すなわち、「コア」（本物のエキソン）セットと「非コア」（イントロンの可能性が高い）セットの挙動を別個に追跡したその結果、コアセットプローブと非コアセットプローブは、野生型導入細胞と突然変異体導入細胞の間で発現に有意差を示すプローブの中に示差的にエンリッチされた（ＦＤＲ＝０．０１）。コアセットプローブが、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と比べて突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞で有意に下方調節されたプローブの中に有意にエンリッチされていたのに対し、非コアセットプローブは、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞で有意に上方調節されたプローブの中に有意にエンリッチされていた。全てのプローブセットを含めた場合であっても、有意差のあるエンリッチメントが示された。
さらに、有意に示差発現したコアセットプローブは、模擬導入細胞と比べて、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞及び突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞において、それぞれ、上方調節及び下方調節される傾向にあり、また逆に、示差発現した非コアセットプローブの場合も同じであった。
すなわち、これらのエキソンアレイの結果から、野生型Ｕ２ＡＦ３５が本物のＲＮＡスプライシングを正しく促進するのに対し、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５はこのプロセスを阻害して非コアを生じさせ、そのために、イントロン配列がスプライシングされないまま残る可能性が高いことが示唆された。【００５５】
エキソンアレイ解析の結果を確認するためと、突然変異体導入細胞におけるスプライシング異常のより直接的な証拠を示すために、野生型Ｕ２ＡＦ３５及び突然変異体（Ｓ３４Ｆ）Ｕ２ＡＦ３５の発現がドキシサイクリンにより誘導されたＨｅＬａ細胞から抽出されたｍＲＮＡの塩基配列決定解析を行なった。コアセットプローブと非コアセットプローブに対応する読取りの直接カウントにより、２つのＨｅＬａサンプル間の両プローブセットの示差的エンリッチメントが再現された。
突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞における異常なスプライシングは、様々な画分、すなわち、エキソン、イントロン、及び遺伝子間領域、並びにエキソン／イントロン接合部での読取りカウントを評価することによって、より直接的に証明された。まず、マッピングされた読取りの総数で調整した後、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞は、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と比べて、エキソン画分での読取りの増加を示したが、他の画分でのカウントの低下を示した。突然変異体導入細胞からの読取りは、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞からの読取りと比べて、より広範囲のゲノム領域にマッピングされたが、これは、非エキソン読取りによってほぼ説明されるものであった。【００５６】
図４（ｄ）（ｅ）は、ＨＥＬＡ細胞に野生（正常）と変異のＵ２ＡＦ３５を発現させて、ＲＮＡシークエンスを行い、野生と変異を比較して、エクソンとイントロンの発現の比率を調べた結果である。野生遺伝子と変異遺伝子をそれぞれ導入した細胞のゲノムにおけるエクソン、イントロン等を、図４（ｅ）に示す。
野生の遺伝子を導入した場合には、エクソンが多く、イントロンがほぼ無く、変異遺伝子を導入した細胞では、この逆で、イントロンが多く、エクソンがほぼ無いことがわかった。【００５７】
また、本物のエキソン／イントロン接合部を含む読取りの数は、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と比べて、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞で有意に増加していた。これらの結果から、スプライシングの失敗が突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞で遍在的に起こることが明白に示された。【００５８】
次に、遺伝子突然変異によるＥ／Ａスプライシング複合体の機能障害が造血細胞の表現型に与える影響を調べた。まず、ＴＦ−１細胞とＨｅＬａ細胞にテトラサイクリン誘導性プロモーターの下でＳ３４Ｆ  Ｕ２ＡＦ３５突然変異体及び野生型Ｕ２ＡＦ３５を発現するレンチウイルスコンストラクトを導入し、その発現を誘導した後、Ｕ２ＡＦ３５突然変異体が細胞増殖に与える影響を調べた。
図５（ａ）は、ウェスタンブロット解析写真である。誘導７２時間後に行なわれたＨｅＬａ細胞及びＴＦ−１細胞において、突然変異体（Ｓ３４Ｆ）及び野生型Ｕ２ＡＦ３５のドキシサイクリン誘導性の発現を示している。【００５９】
予期しないことに、ドキシサイクリンで遺伝子発現を誘導した後、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞は細胞増殖の低下を示し、これは、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞では観察されなかった。
突然変異体Ｕ２ＡＦ３５の機能解析を調べたところ、ＨｅＬａ細胞及びＴＦ−１細胞の細胞増殖アッセイにおいて、Ｕ２ＡＦ３５の発現を誘導した後、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞では成長が有意に抑制されるが、野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞では抑制されなかった。【００６０】
この観察結果を初代細胞で確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）−Ｌｙ５．１マウスの骨髄から調製された高度に純化された造血幹細胞集団（ＣＤ３４−  ｃ−Ｋｉｔ＋  ＳｃａI＋  Ｌｉｎ−、ＣＤ３４−ＫＳＬ）に、レトロウイルスを用いて、各々ＥＧＦＰマーカー遺伝子を有する、突然変異体（Ｓ３４Ｆ、Ｑ１５７Ｐ、Ｑ１５７Ｒ）コンストラクトか、または野生型Ｕ２ＡＦ３５コンストラクトのいずれか、並びに模擬コンストラクトを導入した。
次に、競合的骨髄再構築アッセイで、これらの遺伝子導入細胞の骨髄再構築能を検討した。Ｂ６−Ｌｙ５．１／５．２  Ｆ１マウス由来の全骨髄細胞と混合した後、遺伝子導入細胞を致死量放射線照射Ｂ６−Ｌｙ５．２レシピエントに移植し、その６週間後に、フローサイトメトリーでＧＦＰ陽性細胞由来の末梢血キメリズムを評価した。
エクスビボ追跡調査で遺伝子導入細胞におけるＥＧＦＰ％と全体的な増殖を評価することにより、各レシピエントマウスが、様々なレトロウイルス群間で同程度の数のＧＦＰ陽性細胞を受容したことを確認した。【００６１】
図５（ｂ）（ｃ）は、ＨＥＬＡ細胞に野生（正常）のＵ２ＡＦ３５遺伝子を発現させて、細胞周期がどのように変化するのかを示したグラフである。変異遺伝子が発現すると、細胞がＧ２／Ｍで停止しているものが多いことが分かる。なお、野生のＵ２ＡＦ３５遺伝子を発現させた場合には、何らの遺伝子を発現させないコントロール群と比較しても、同じような細胞周期を示していることが分かり、変異遺伝子が発現したにだけ、細胞周期がＧ２／Ｍで停止していることが示されている。【００６２】
図５（ｄ）は、ＨＥＬＡ細胞に野生（正常）と変異のＵ２ＡＦ３５を発現させて、アポトーシスが誘導されていることを示したグラフである。アポトーシスの誘導は、アネキシンＶがポジティブで、７ＡＡＤがネガティブであることを指標にしたものである。変異遺伝子が発現している群のみが、アポトーシスを起こしていることが分かる。【００６３】
図５（ｅ）は、模擬導入細胞及び野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞と比較した３つのＵ２ＡＦ３５突然変異体のいずれかを導入したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の競合的骨髄再構築アッセイの結果である。横線と縦線は、それぞれ、５匹のマウスから得た結果の平均及びＳ．Ｄ．を示す。外れ値は、グラブズの棄却検定を用いて解析から除外した。ボンフェローニの多重比較検定で差の有意性を決定した。縦軸は、移植６週間後の末梢血中のＧＦＰ陽性Ｌｙ５．１細胞％を示す。
野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞は、模擬導入細胞よりもわずかに高い骨髄再構築能を示した。他方、Ｕ２ＡＦ３５突然変異体のどれかを導入した細胞のレシピエントは、模擬導入細胞または野生型Ｕ２ＡＦ３５導入細胞よりも有意に低いＧＦＰ＋細胞キメリズムを示し、Ｕ２ＡＦ３５突然変異体を発現する造血幹／前駆細胞の骨髄再構築能が障害されていることを示した。野生型Ｕ２ＡＦ３５コンストラクトと突然変異体Ｕ２ＡＦ３５コンストラクトの挙動が反対であることから、これらの突然変異体が、おそらくは野生型タンパク質に対するドミナントネガティブな作用を介して、Ｕ２ＡＦ３５の機能喪失を引き起こすことも示唆された。【００６４】
以上の全エキソーム塩基配列決定研究により、スプライシング機構の複数の異なる構成要素（スプライシング複合体Ｅ／Ａ）に影響を及ぼす骨髄異形成患者の約４０〜６０％に見られる新規の経路突然変異の複雑さが明らかとなった。
ＲＮＡスプライシングシステムは後生動物種に固有の特徴である。このシステムは、コード配列を、ゲノムＤＮＡ上で分かれて存在する複数の断片として用意し、転写後に、介在する配列を欠失させることにより、これらを再結合させて、機能的なｍＲＮＡコピーを生成させる（非特許文献１）。回りくどいまたは無駄の多いやり方のように思われるが、これによって主なタンパク質源が提供され、そのために、遺伝子数が限られているにもかかわらず、選択的スプライシングによって機能的多様性が与えられる（非特許文献５）。
他方、こうした複雑な作業をスプライソソーム機構を用いて精巧に調節することによって、トランスクリプトーム全体の完全性を保証するならば、そのこと自体に当然の代償が必ず伴うことになる。ＲＮＡスプライシングの異常、すなわち、癌特異的選択的スプライシングは、その正確なメカニズムは解明されていないものの、骨髄異形成症候群や他の造血系腫瘍を含むヒト癌の発症への関与が示唆される。【００６５】
今回のエキソーム塩基配列決定は、他のスプライソソーム構成要素を検出するのに十分な範囲と感度を有すると考えられたことを考慮すると、スプライソソーム突然変異は、スプライシング複合体Ｅ／Ａに関与する構成要素に広範かつ特異的に生じていたが、他のスプライソソーム構成要素には影響していなかったといっても差し支えない。これらの突然変異はほぼ完全に相互排他的で、かつ骨髄異形成に極めて特異的であったが、このことから、これらの複合体の機能障害がこれらの突然変異に共通の結果であり、ＲＮＡスプライシングの生理的プロセスを混乱させることによって、この独特なカテゴリーの骨髄系腫瘍の発症に関与することが示唆された。これらの突然変異が、異常にスプライシングされたｍＲＮＡ種を実際に生成することを示す直接的な証拠はないが、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５導入細胞におけるＮＭＤ活性の亢進は、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５が、時期尚早な終止コドンを有するｍＲＮＡ種の産生増加を促進することを強く示唆した。【００６６】
他方、競合的骨髄再構築アッセイ及びインビトロ細胞増殖アッセイの結果の解釈は簡単なものではなく、突然変異体Ｕ２ＡＦ３５は、古典的な癌遺伝子に期待されるように、成長上の利点を付与したり、クローン選択を促進したりするのではなく、細胞の成長／増殖を抑制するようであった。この観察結果に関して、ＨｅＬａ細胞におけるＺＲＳＲ２ノックダウンにより、これらの経路突然変異の共通の結果を裏付けるアポトーシスの誘導が起こることが報告されたのは興味深い（非特許文献９）。この矛盾するように見える表現型に対する明確な答えはないが、これは、Ｕ２ＡＦ３５突然変異の病因的役割が、他の遺伝子における突然変異及び／またはＵ２ＡＦ３５突然変異細胞の腫瘍性成長またはクローン選択と適合する腫瘍細胞環境との関連において理解される必要があることを示している。
骨髄異形成症候群の最も一般的な臨床所見が、無制限の細胞増殖ではなく、アポトーシスの増加を伴う無効造血による複数の細胞系統における重度の血球減少であることは注目に値する。この点について、ＲＰＳ１４のハプロ不全によって、赤血球前駆体のアポトーシスは増加するが、骨髄増殖は増加しないという５ｑ−症候群の発病に関する研究結果が示唆を与え得る。【００６７】
今回のスプライソソーム構成要素における頻度の高い突然変異の発見は、骨髄異形成症候群及び関連骨髄系腫瘍の発病における無秩序なＲＮＡスプライシングの重要性を明白に示した。多くのＺＲＳＲ２突然変異はタンパク質の早期切断を生じさせるが、Ｕ２ＡＦ３５、ＳＦＲＳ２、及びＳＦ３Ｂ１の突然変異は特定のアミノ酸位置を標的とし、機能獲得型であると考えられる。何らかのドミナントネガティブなメカニズムによって、そのような機能獲得が説明され得る。これらの突然変異はＲＮＡスプライシングにおける共通の段階に関与するように思われるが、疾患タイプ間でのその分布には違いも存在し、ＣＭＭＬではＳＦＲＳ２突然変異の頻度がより高く、また、これは、他の一般的な突然変異と重複することが多い。【００６８】
更に、本発明によると、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に対する治療薬若しくは予防薬の候補物をスクリーニングする方法が提供できる。
すなわち、被験物質が、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、その遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を設ける。【００６９】
被験物質を非ヒト動物に投与する工程と、被験物質を投与した非ヒト動物において、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の発現または活性を測定する工程と、その発現または活性を減少させる被験物質を有効物質として選択する工程とを、設けてもよい。【００７０】
同様の治療薬若しくは予防薬の候補物スクリーニング方法として、変異遺伝子に注目してもよい。
すなわち、被験物質が、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の変異遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか否か、または、その活性を阻害し得るか否かを評価する工程と、その変異遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現を抑制し得るか、または、その活性を阻害し得る被験物質を、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を設ける。【００７１】
被験物質を非ヒト動物に投与する工程と、被験物質を投与した非ヒト動物において、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子、ＺＲＳＲ２遺伝子、ＳＦＲＳ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子の変異を測定する工程と、その変異を減少させる被験物質を有効物質として選択する工程とを、設けてもよい。【００７２】
上記遺伝子の変異としては、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第３４番目のアミノ酸におけるＳからＦまたはＹへの置換、Ｕ２ＡＦ３５遺伝子から翻訳されるタンパク質の第１５７番目のアミノ酸におけるＱからＲまたはＰへの置換、ＺＲＳＲ２遺伝子から翻訳されるタンパク質のすべての不活化変異、ＳＦＲＳ２遺伝子から翻訳されるタンパク質の第９５番目のアミノ酸におけるＰからＨまたはＬまたはＲへの置換、ＳＦ３Ｂ１遺伝子から翻訳されるタンパク質の第７００番目のアミノ酸におけるＫからＥへの置換、第６２２番目のアミノ酸におけるＥからＤへの置換、第６６２番目のアミノ酸におけるＨからＱまたはＤへの置換、第６６６番目のアミノ酸におけるＫからＮまたはＴまたはＥまたはＲへの置換を有用に採用できる。【００７３】
被験物質としては、任意の公知化合物や新規化合物が使用でき、例えば、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど）、糖質（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖など）、脂質（飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖、環を含む脂肪酸など）、アミノ酸、蛋白質（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。【００７４】
非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物などが挙げられる。【００７５】
非ヒト動物が用いられる場合、被験物質の非ヒト動物への投与には従来公知の方法が利用できる。例えば、経口投与、非経口投与（静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、局所注入など）が挙げられる。投与量、投与間隔、投与期間等は、用いる被験物質や動物の種類等に応じて適宜設定される。【００７６】
被験物質の有効性の評価には、従来公知の方法が利用でき、例えば、被験物質を投与した非ヒト動物において、上記遺伝子またはその変異遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現量を測定することによって行える。
発現量の測定は、例えば、非ヒト動物から骨髄や血液等の生体試料を採取し、その試料中の転写産物等を測定することにより行ってもよい。【００７７】
また、非ヒト動物の組織や細胞、例えば、骨髄や血液等の生体試料を用いて、スクリーニングを行ってもよい。
上記遺伝子またはその変異遺伝子から翻訳されるタンパク質の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、その発現細胞であり、発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、上記遺伝子またはその変異遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞である。
上記遺伝子またはその変異遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、上記遺伝子またはその変異遺伝子の転写調節領域、その領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。【００７８】
更に、上記遺伝子またはその変異遺伝子を備える細胞または変異を強制発現させた細胞等を用いて、骨髄異形成症候群または骨髄性腫瘍とは別の疾患の素因を有するか否かの評価に利用してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によると、骨髄異形成症候群や骨髄性腫瘍の早期治療や予防に有効であり、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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