(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）：2013147096.tif 000034で表される化合物またはその塩；および、２以上の試料間で標的物質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに質量差を有する２つ以上の該化合物またはその塩を標識化合物として用いて試料中の標的物質を標識することを含むアミノ基含有標的物質の定量分析方法、等を提供する。
2013147096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2013147096.tif 000023
で表される化合物またはその塩。
【請求項２】
式（Ｉ）において質量数１３の炭素を１つ以上有する、請求項１記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
【化２】
2013147096.tif 000024
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２からなる群から選択される１つの化合物である、請求項１記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）：
【化３】
2013147096.tif 000025
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として含む、質量分析計を用いた生体試料中のアミノ基を含有する標的物質の定量用キット。
【請求項５】
質量差が６以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がタンパク質である、請求項４記載のキット。
【請求項６】
質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
またはそれらの塩を含む、請求項５記載のキット。
【請求項７】
式（ＩＩＩ）：
【化４】
2013147096.tif 000026
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を含む、請求項６記載のキット。
【請求項８】
質量差が２以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がアミノ基含有非ペプチド化合物である、請求項４記載のキット。
【請求項９】
質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を２個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を４個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を８個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を１０個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
からなる群から選択される２つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
式（ＩＩ）：
【化５】
2013147096.tif 000027
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２からなる群から選択される２つ以上の化合物を含む、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
質量分析計を用いて２以上の生体試料中のアミノ基を含有する標的物質を定量分析するための方法であって、
（１）分析に供する２以上の生体試料を調製する工程、
（２）試料間で標的物質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）：
【化６】
2013147096.tif 000028
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中の標的物質を標識する工程、
（３）標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
（４）混合物を質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有する標的物質について、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらの標的物質の存在比を求め、得られた存在比と工程（３）における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該標的物質の量比を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
標的物質が、アミノ基を含有する非ペプチド化合物である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
標識化合物が、質量差が２以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
標識化合物が、
質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を２個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を４個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を８個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を１０個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
からなる群から選択される２つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
標識化合物が、式（ＩＩ）：
【化７】
2013147096.tif 000029
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２からなる群から選択される２つ以上の化合物を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程（１）において調製された試料の一つが、既知濃度の標的物質を含有する内部標準試料であり、かつ、
工程（４）における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来の標的物質と、内部標準試料由来の標的物質とのピーク強度の比を求めることを含む、
請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
質量分析計を用いて２以上の生体試料中のタンパク質を定量分析するための方法であって、
（１）分析に供する２以上の生体試料を調製する工程、
（２）試料間で同一タンパク質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）：
【化８】
2013147096.tif 000030
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中のタンパク質を標識する工程、
（３）標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
（４）混合物中のタンパク質を制限酵素により消化してペプチドを得る工程、
（５）得られたペプチドを質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有するペプチドについて、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらのペプチドの存在比を決定する工程、および、
（６）存在比を決定されたペプチドについて、それが由来するタンパク質を特定し、該存在比および工程（３）における試料の混合比から、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
標識化合物が、質量差が６以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
標識化合物が、
質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
またはそれらの塩を含み、３つの生体試料中のタンパク質を定量分析する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
標識化合物が、下記式（ＩＩＩ）：
【化９】
2013147096.tif 000031
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
工程（１）において調製された試料の一つが、他の全ての調製された試料を混合して得られた内部標準試料であり、かつ、
工程（５）における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来のペプチドと、内部標準試料由来のペプチドとのピーク強度の比を求めることを含む、
請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
無水酸存在下で、３−エチル−３−ペンタノール又は３−エチル−２−ペンテンと無水プロピオン酸とを縮合し、式（Ｉ）：
【化１０】
2013147096.tif 000032
の化合物またはその塩を得ることを含む、式（Ｉ）の化合物またはその塩の製造方法。
【請求項２３】
式（ＩＶ）：
【化１１】
2013147096.tif 000033
（式中、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）で表される化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概しては、生体試料分析に関する。より詳細には、本発明は、新規の同位体標識ピリリウム化合物、および、該化合物を用いて、質量分析により２以上の試料中のアミノ基含有化合物を定量分析する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の分析においては、本発明者等の一人により、下記式：【０００３】
【化１】
2013147096.tif 000003
【０００４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す）で表される化合物またはその塩を標識化合物として用いる方法が報告されている（特許文献１）。具体的には、下記式：【０００５】
【化２】
2013147096.tif 000004
【０００６】
で表される、同位体標識により互いに質量差を有する３つの化合物（これらを総称してＰｙ化合物と呼ぶ）が合成されている。該文献に記載の方法では、２以上の分析試料中のタンパク質をＰｙ化合物のいずれかで標識することにより試料間で同一タンパク質に質量差を与えた後、試料を混合し、タンパク質を加水分解する。得られた標識ペプチドを質量分析に供して、ペプチドの構造解析から由来するタンパク質を同定し、更に質量スペクトルに基づいて、同定されたタンパク質の試料間での存在比が算定される。【０００７】
一方、アミノ酸の分析では、２０種以上の生体アミノ酸を１回の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析で相互分離した後でニンヒドリンと反応させ、その生成物の吸光度に基づいて、アミノ酸を定量する方法が一般的である。しかしながら、この方法は感度が低く、低濃度のアミノ酸の分析には適していない。
そのため、より高い感度を実現するために、蛍光標識の使用が提案されており、それにより、約１０倍以上の高感度化が実現されている。
更に、それでも検出できない低濃度のアミノ酸に対しては、液体クロマト分離した後に質量分析して検出する方法が採用されている。この場合、分離したアミノ酸をイオン化し易くするために、アミノ基と反応する試薬を用いてアミノ酸を誘導体化してから、それを液体クロマト分離および質量分析に供する方法が採用されてきた。しかしながら、この方法論に従った場合でも、従来の技術では高感度分析には限界があった。【０００８】
ところで、特許文献２には種々のピリリウム化合物を製造する方法が記載されている。該文献に記載の一般式では２種類の異性体が形成されるが、両者の分離は容易でないので、検出はアンモニアと反応してできるピリジン体のＮＭＲ分析に依存すること、反応に使う酸としてＨｏが−１０〜−５のものが利用できることが述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５６１３９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第４，６４２，３５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
タンパク質の分析において、質量分析に供されるペプチドの分子量は５００〜３０００Ｄａの範囲にあることが多い。そのため、これらのペプチドの質量スペクトルは、天然に存在する同位体に起因して、単一ピークではなく互いに質量差を有する複数ピークとして観察される。各ピークの大きさはペプチドの分子量に依存するが、モノアイソトピックピークが主ピークであり、それより質量が１〜３大きい位置のピークは大きく、以後のピークは次第に小さくなる。従って、上記特許文献１の方法のように、同位体標識により互いに質量差を有する２以上の標識化合物を用いて同一ペプチドに質量差を与える場合、該質量差が小さいと異なるピーク同士で干渉が生じてしまい、分析が複雑になる。本発明者等は、経験的に、モノアイソトピックピークと質量差４のピークとの間では干渉が無視できず、質量差６になると相互干渉は無視できることを見出している。このように、タンパク質の分析のためには、出来るだけ質量差の大きな同位体試薬を開発することが望まれている。【００１１】
一方、アミンやアミノ酸の分析技術の現状から、生体試料中のアミンやアミノ酸をより高感度に定量し得る方法が求められている。また、複数の生体試料を多重定量して、各試料中に存在するアミンやアミノ酸等を網羅的に分析できる技術が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。そのために、本発明者等は先ず、Ｐｙ化合物をリード化合物としてタンパク質標識のためにより良い化合物を探索した。その結果、２位、４位および６位にエチル基を、更に３位および５位にメチル基を有するピリリウム化合物がタンパク質との反応性や水溶性等において優れた特性を持つことを見出した。そこで、同位体標識された該化合物の合成を更に試み、互いに質量差６を有する３種の化合物（後述のＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２）を高純度で合成することに成功した。得られた同位体標識化合物、具体的にはＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を用いて、上記特許文献１と同様にタンパク質の定量分析を試みたところ、これらの同位体標識化合物を用いて高感度で多重定量分析を行い得ること、および該化合物間で質量差が６であるため質量スペクトルにおけるピーク間のオーバーラップが少なく、定量精度が格段に向上し得ることが確認された。
本発明者等は更に、該化合物をアミンやアミノ酸等のアミノ基含有非ペプチド化合物の分析に適用することを試みた。アミノ基含有非ペプチド化合物の分析のためには、標識化合物間に２の質量差があればピーク間の干渉を回避できるので、互いに２の質量差を有して、なるべく多種類の同位体標識化合物を用意できることが分析効率の点で有益である。そこで更に合成実験を重ねた結果、上記ＰｙＩＩ−０に対して質量差２、４、８または１０を有する化合物（後述のＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０）を高純度で合成することに成功した。これらの同位体標識化合物を用いて分析を行うことで、生体試料中のアミノ基含有非ペプチド化合物を高感度に検出し得るのみならず、複数試料を同時に定量して、各試料中に含まれるアミノ基含有非ペプチド化合物を網羅的に分析できることを見出した。また、アミノ基含有非ペプチド化合物のＰｙ誘導体は、ナノ液体クロマトグラフィーシステムにおいて必須である、分析カラムへの導入前に一旦導入されるトラップカラム（ＯＤＳカラム）への結合性が低いため、オートサンプラーを用いた高感度自動分析に繋げることは容易でないことが本発明者等により確認されていた。しかし、ＰｙＩＩ化合物は、Ｐｙ化合物と比べて環の側鎖の疎水性が高く、疎水性吸着能の向上に寄与するため、トラップカラムとしてＯＤＳカラムを利用して、アミノ基含有非ペプチド化合物の高感度分析を自動化する可能性を拓くことが分かった。
本発明者等は上記の知見に基づき更に検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明は即ち、以下を提供する。
［１］式（Ｉ）：【００１４】
【化３】
2013147096.tif 000005
【００１５】
で表される化合物またはその塩。
［２］式（Ｉ）において質量数１３の炭素を１つ以上有する、上記［１］記載の化合物またはその塩。
［３］式（ＩＩ）：【００１６】
【化４】
2013147096.tif 000006
【００１７】
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２からなる群から選択される１つの化合物である、上記［１］記載の化合物またはその塩。
［４］同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）：【００１８】
【化５】
2013147096.tif 000007
【００１９】
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として含む、質量分析計を用いた生体試料中のアミノ基を含有する標的物質の定量用キット。
［５］質量差が６以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がタンパク質である、上記［４］記載のキット。
［６］質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
またはそれらの塩を含む、上記［５］記載のキット。
［７］式（ＩＩＩ）：【００２０】
【化６】
2013147096.tif 000008
【００２１】
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を含む、上記［６］記載のキット。
［８］質量差が２以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含み、かつ標的物質がアミノ基含有非ペプチド化合物である、上記［４］記載のキット。
［９］質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を２個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を４個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を８個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を１０個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
からなる群から選択される２つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、上記［８］記載のキット。
［１０］式（ＩＩ）：【００２２】
【化７】
2013147096.tif 000009
【００２３】
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２からなる群から選択される２つ以上の化合物を含む、上記［９］記載のキット。
［１１］質量分析計を用いて２以上の生体試料中のアミノ基を含有する標的物質を定量分析するための方法であって、
（１）分析に供する２以上の生体試料を調製する工程、
（２）試料間で標的物質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）：【００２４】
【化８】
2013147096.tif 000010
【００２５】
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中の標的物質を標識する工程、
（３）標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
（４）混合物を質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有する標的物質について、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらの標的物質の存在比を求め、得られた存在比と工程（３）における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該標的物質の量比を決定する工程
を含む、方法。
［１２］標的物質が、アミノ基を含有する非ペプチド化合物である、上記［１１］記載の方法。
［１３］標識化合物が、質量差が２以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含む、上記［１２］記載の方法。
［１４］標識化合物が、
質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を２個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を４個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を８個有する式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を１０個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
からなる群から選択される２つ以上の化合物またはそれらの塩を含む、上記［１３］記載の方法。
［１５］標識化合物が、式（ＩＩ）：【００２６】
【化９】
2013147096.tif 000011
【００２７】
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２からなる群から選択される２つ以上の化合物を含む、上記［１４］記載の方法。
［１６］工程（１）において調製された試料の一つが、既知濃度の標的物質を含有する内部標準試料であり、かつ、
工程（４）における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来の標的物質と、内部標準試料由来の標的物質とのピーク強度の比を求めることを含む、
上記［１１］記載の方法。
［１７］質量分析計を用いて２以上の生体試料中のタンパク質を定量分析するための方法であって、
（１）分析に供する２以上の生体試料を調製する工程、
（２）試料間で同一タンパク質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）：【００２８】
【化１０】
2013147096.tif 000012
【００２９】
で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中のタンパク質を標識する工程、
（３）標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程、
（４）混合物中のタンパク質を制限酵素により消化してペプチドを得る工程、
（５）得られたペプチドを質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有するペプチドについて、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらのペプチドの存在比を決定する工程、および、
（６）存在比を決定されたペプチドについて、それが由来するタンパク質を特定し、該存在比および工程（３）における試料の混合比から、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定する工程
を含む、方法。
［１８］標識化合物が、質量差が６以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含む、上記［１７］記載の方法。
［１９］標識化合物が、
質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、
質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、および
質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物
またはそれらの塩を含み、３つの生体試料中のタンパク質を定量分析する、上記［１８］記載の方法。
［２０］標識化合物が、下記式（ＩＩＩ）：【００３０】
【化１１】
2013147096.tif 000013
【００３１】
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を含む、上記［１９］記載の方法。
［２１］工程（１）において調製された試料の一つが、他の全ての調製された試料を混合して得られた内部標準試料であり、かつ、
工程（５）における存在比の決定が、内部標準試料以外の各試料由来のペプチドと、内部標準試料由来のペプチドとのピーク強度の比を求めることを含む、
上記［１７］記載の方法。
［２２］無水酸存在下で、３−エチル−３−ペンタノール又は３−エチル−２−ペンテンと無水プロピオン酸とを縮合し、式（Ｉ）：【００３２】
【化１２】
2013147096.tif 000014
【００３３】
の化合物またはその塩を得ることを含む、式（Ｉ）の化合物またはその塩の製造方法。
［２３］式（ＩＶ）：【００３４】
【化１３】
2013147096.tif 000015
【００３５】
（式中、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）で表される化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の同位体標識化合物は、互いに対して大きな質量差（例、６以上）を有する複数の化合物を提供できるため、タンパク質の網羅的発現差解析において比較的高い分子量のペプチドであっても同位体ピーク間の相互干渉の問題を解決できる。特に、従来の安定同位体標識試薬では質量差６で３種類の化合物を提供できるものは存在しなかったが、本発明によれば質量差６で３種類の安定同位体標識試薬が提供され、質量分析により３つのサンプル間で高感度の多重一斉タンパク質定量分析が可能となり、タンパク質の定量分析における格段の効率化に資する。
本発明の同位体標識化合物はまた、複数試料（例、７種）中に含有されるアミノ基含有非ペプチド化合物を一斉に高感度で分析することを可能とする。更に、トラップカラムを用いた自動化により、フェムトモルレベルの高感度分析を２４時間自動で行うことができる体制を構築し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】合成された各ＰｙＩＩ化合物のＥＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２】合成された各ＰｙＩＩ化合物の１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）スペクトルを示す。
【図３】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）由来ペプチドおよびヒト血清トランスフェリン（ＴＲＦＥ）由来ペプチドの溶出曲線を示す。
【図４】図３における分画５（ＢＳＡ由来ペプチドを含む）（左列）および分画９（ＴＲＦＥ由来ペプチドを含む）（右列）のそれぞれのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。
【図５】図４の質量スペクトルにおける、ＰｙＩＩ−０標識ペプチド由来ピーク、ＰｙＩＩ−６標識ペプチド由来ピーク、およびＰｙＩＩ−１２標識ペプチド由来ピークの間の強度比を示す（上段：ＢＳＡ、下段：ＴＲＦＥ）。
【図６】ＰｙＩＩ試薬による比較定量法のヒト血漿実検体を用いた検証実験における例示的なプロトコルを示す。
【図７】ｃＩＣＡＴ試薬とＰｙＩＩ試薬との定量精度の比較実験の結果を示す。
【図８】蛍光ＤＩＧＥ法によるＰｙＩＩ試薬のタンパク質標識化の実験的証明法の概要（左図）、および２色蛍光標識したＨｅＬａ細胞からの全抽出タンパク質の２次元電気泳動の結果（右図）を示す。
【図９】各ＰｙＩＩ化合物で標識されたドーパミンの質量スペクトルを示す。
【図１０】ＰｙＩＩ試薬を用いたドーパミン測定のために作製された検量線を示す。
【図１１】線条体レベルでのドーパミン含量の測定実験の結果を示す。各四角は脳組織内の部位を示し、四角内の数字は該部位におけるドーパミン含量をｆｍｏｌ単位で示す。
【図１２−１】８種類のアミン／アミノ酸のＰｙＩＩ誘導体についてのイオンクロマトグラフを示す。
【図１２−２】８種類のアミン／アミノ酸のＰｙＩＩ誘導体についてのイオンクロマトグラフを示す。
【図１２−３】８種類のアミン／アミノ酸のＰｙＩＩ誘導体についてのイオンクロマトグラフを示す。
【図１２−４】８種類のアミン／アミノ酸のＰｙＩＩ誘導体についてのイオンクロマトグラフを示す。
【図１３−１】図１２のピーク部分の質量スペクトルを示す。
【図１３−２】図１２のピーク部分の質量スペクトルを示す。
【図１３−３】図１２のピーク部分の質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
（同位体標識化合物）
本発明は、下記式（Ｉ）：
【００４０】
【化１４】
2013147096.tif 000016
【００４１】
で表される化合物またはその塩を提供する。該化合物またはその塩は、例えば質量数１３の炭素によって、１つ以上（例、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個）の同位体標識が為されたものであり得る。以下、同位体標識されていないものも含めて、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を本発明の同位体標識化合物ともいう。
【００４２】
本発明の同位体標識化合物は、通常、塩の形態で利用される。塩としては、アミノ基への標識反応を妨げない限り任意の陰イオン原子または陰イオン分子であってよく、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、過塩素酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル塩、メタンスルホン酸塩等が挙げられ、塩の結晶性がよく比較的安全性が高いトリフルオロメタンスルホン酸塩が特に好ましいものとして挙げられる。また、ヘキサフルオロリン酸塩は、テトラフルオロホウ酸塩にヘキサフルオロリン酸ナトリウムを添加することで容易に得ることができる。
【００４３】
本発明の同位体標識化合物の好適な例として、下記式（ＩＩ）：
【００４４】
【化１５】
2013147096.tif 000017
【００４５】
（式中、黒丸で示された原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）で表されるＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２（以下、これらを総称してＰｙＩＩ化合物ともいう）が挙げられる。
【００４６】
本発明の同位体標識化合物は、無水酸存在下で、３−エチル−３−ペンタノールまたは３−エチル−２−ペンテンと無水プロピオン酸とを縮合することにより、得ることができる。本発明による製造方法によれば、異性体が生じることなく単一の化合物が生成するため、その後の分離操作が簡便である。
無水酸としては、トリフルオロメタンスルホン酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、過塩素酸、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、メタンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩の結晶性がよく比較的安全性が高いトリフルオロメタンスルホン酸が好ましい。
反応温度は、通常４０〜１００℃、好ましくは５０〜６５℃であり、反応時間は通常１０分〜２４時間、好ましくは１〜１．５時間である。
原料化合物の量としては、３−エチル−２−ペンタノールを用いる場合、３−エチル−２−ペンタノールに対して無水プロピオン酸を通常３〜２０モル当量、好ましくは約４モル当量である。一方、３−エチル−２−ペンテンを用いると、無水プロピオン酸の消費量を低減させることが可能であり、具体的には、３−エチル−２−ペンテンに対して無水プロピオン酸は通常３〜１０モル当量、好ましくは約３モル当量とすることができる。トリフルオロメタンスルホン酸等の無水酸は、３−エチル−２−ペンタノールまたは３−エチル−２−ペンテンに対して、通常０．８〜１．２モル当量で添加される。
上記縮合反応後の反応液を自体公知の方法により濃縮、中和、抽出等を行った後、再結晶することにより所望の化合物を得ることができる。
【００４７】
質量数１３の炭素を１つ以上有する任意の本発明の同位体標識化合物についても、原料化合物に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は上記と同様にして製造することができる。
【００４８】
（キット）
上述の本発明の同位体標識化合物であって、同位体標識により質量数が異なる以外は同一の化合物を２つ以上組み合わせて、質量分析計を用いた生体試料中のアミノ基を含有する標的物質の定量用キット（以下、本発明のキットともいう）とすることができる。標的物質としては、アミノ基を含有する限り任意の化合物であってよく、典型的には、アミノ基含有非ペプチド化合物（例、アミン、アミノ酸等）、アミノ基含有ペプチド化合物、およびタンパク質である。
【００４９】
本発明のキットに含められる本発明の同位体標識化合物の組み合わせは特に限定されない。
標的物質がタンパク質の場合、質量スペクトルにおいて同位体ピーク間の干渉を回避できる点で、いずれの化合物間についても質量差が６以上となる組み合わせが好ましい。そのような組み合わせとしては例えば、質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、および質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物、またはそれらの塩を含むものが挙げられる。好ましい組み合わせの具体例としては、上記のＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を含むものが挙げられる。
一方、標的物質がアミノ基含有非ペプチド化合物の場合、いずれの化合物間についても質量差が２以上であれば、同位体ピーク間の干渉を回避できる。そのため、該組み合わせとしては、質量差が２以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含むものが挙げられる。そのような組み合わせとしては例えば、質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を２個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を４個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を８個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を１０個有する式（Ｉ）で表される化合物、および質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物からなる群から選択される２つ以上の化合物、またはそれらの塩を含むものが挙げられる。好ましい組み合わせの具体例としては、上記のＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２のうちの２つ以上を含むものが挙げられる。また、より多くの試料を一括で処理できるという観点から、上記の各例示した組み合わせには、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ以上、更により好ましくは５つ以上、特により好ましくは６つ以上、最も好ましくは７つ含まれる。
【００５０】
本発明のキットは、本発明の同位体標識化合物の組み合わせ以外に、１以上の反応緩衝液、洗浄溶液、または本発明の同位体標識化合物との組み合わせ使用に必要若しくは好適なその他の成分を含んでいても良い。本発明のキットはまた、任意でその使用説明書を含む。また、本発明のキットは、未反応成分除去試薬（洗浄試薬）、制限酵素、精製用カラム、精製用溶媒等を更に含んでいてもよい。
【００５１】
（定量分析方法）
本発明はまた、上述の本発明の同位体標識化合物の２つ以上を利用する、質量分析計を用いて２以上の生体試料中のアミノ基を含有する標的物質を定量分析するための方法（以下、本発明の定量分析方法ともいう）を提供する。標的物質としては、アミノ基含有非ペプチド化合物、アミノ基含有ペプチド化合物、およびタンパク質等が挙げられる。本発明の定量分析方法は、標的物質の種類によらず、本質的には同様のステップに従って実行できる。但し、タンパク質の定量分析方法（以下、本発明のタンパク質分析方法ともいう）については、制限酵素による消化、ペプチド断片からのタンパク質の同定等、特有の処理が通常為されるため、後に別途説明する。また、アミノ酸の個数が一般に２個から十数個程度までであるいわゆるペプチド化合物の定量分析については、後述するタンパク質の分析方法の説明に基づいて当業者は適宜実施し得るため、別段の説明は行わない。以下、アミノ基含有非ペプチド化合物の定量分析方法（以下、本発明の非ペプチド化合物分析方法ともいう）について説明する。
【００５２】
（アミノ基含有非ペプチド化合物の定量分析方法）
本明細書においてアミノ基含有非ペプチド化合物またはアミノ基を含有する非ペプチド化合物とは、分子内に１つ以上のアミノ基を有し、かつ、分子内にペプチド結合を有しない任意の化合物を意味し、ここでアミノ基とは、アンモニア、第一級アミン（即ち、アンモニアの水素原子を任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基で１つ置換した化合物）または第二級アミン（即ち、アンモニアの水素原子を、それぞれ同一または異なる任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基で、２つ置換した化合物）から水素を除去した１価の官能基をいう。従って、アミノ基含有非ペプチド化合物は、ＮＨ３、ＮＨ２Ｒ、またはＮＨＲＲ’（式中、ＲおよびＲ’はそれぞれ同一または異なって、任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基をそれぞれ示す。）の化学式を有する非ペプチド性の化合物である。但し、ＮＨＲＲ’の化学式を有する化合物については、本発明の方法で用いられる標識試薬とは反応しないか、もしくは極めて低反応性であると考えられる。それ故、本発明の方法の対象となるアミノ基含有非ペプチド化合物は、通常、ＮＨ２Ｒ（式中、Ｒは水素または任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）の化学式を有する非ペプチド性の化合物である。
測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の分子量は、本発明の方法を可能とする限り特に限定されないが、一般的には低分子量の化合物である。具体的な分子量としては１７〜１０００であり、好ましくは１７〜７００、より好ましくは１７〜５００である。測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物としては、例えば、生理活性アミン、アミノ酸、薬物、覚醒剤、麻薬、不揮発性腐敗アミン、および、それらの代謝物でアミノ基を保有する化合物等が挙げられる。一度の分析において、複数種類のアミノ基含有非ペプチド化合物を測定の対象とすることもできる。
【００５３】
アミノ基含有非ペプチド化合物のより具体的な例としては、以下に限定されないが、神経系に作用する生理活性アミン（例：Ｌ−ドーパ、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、ドーパミン、トリプタミン、セロトニン、プトマイン、ヒスタミン、チラミン、タウリン等）、種々の生体アミノ酸（例：アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびそれらの修飾体（例：リン酸化体等）等）、薬物や麻薬（例：フェネチルアミン、アンフェタミン、カチン、カチノン、フェンテルミン、メスカリン、MDA、メトキシアンフェタミン、BDB、HMA、２C-B、DOB、DOM、DOET、MMDA、TMA、２C-I、２C-D、２C-N、２C-T-2、２C-T-7、DOI、DON、2,5-DMA、3,4−DMA等）、不揮発性腐敗アミン類（例：スペルミジン、スペルミン、プトレシン、カダベリン等）、ならびに、アミノ基を保有するそれらの代謝物等が挙げられる。
【００５４】
以下、各工程について説明する。
【００５５】
（１）分析に供する２以上の生体試料を調製する工程
【００５６】
分析に供される生体試料の個数は特に限定されない。但し、用意できる互いに質量差を有する本発明の同位体標識化合物の種類数（例、互いに質量差２の７つの同位体標識化合物）よりも多くの試料を分析する場合は、試料を２以上のグループに分割した上で、内部標準試料も用いてグループ毎に分析を行う。内部標準試料については後述する。
【００５７】
分析に供される生体試料は、分析の目的に応じて任意の由来および組織等から自体公知の方法で採取したものを利用できる。具体的には、該生体試料としては例えば、哺乳動物（例：ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット等）の種々の体液（例：血液、骨髄液、髄液、唾液、涙液、胃液、腹水、滲出液、羊膜液、膵液、胆汁等）、排泄物（例：尿、大便等）、および細胞・組織（例：脳、脊髄、眼球、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋等）含有試料等が挙げられるがこれらに限定されない。採取した試料から、固相抽出等の適当な手段を用いて、各生体試料において標的非ペプチド化合物を濃縮することが好ましい。該濃縮は例えば、以下の手順により行うことができる。即ち、採取した試料のそれぞれにおいて、標的非ペプチド化合物とタンパク質とを分離するために、酸抽出等の適当な手段により除タンパク質処理を行う。次いで、除タンパク質液体試料中の標的非ペプチド化合物を、それを選択的に捕捉する陽イオン交換樹脂を用いて捕捉する。次いで、非特異的に樹脂に吸着した酸性または中性の低分子物質をアルコールにより洗浄する。さらに、残存する樹脂結合陽イオンを塩酸等を用いて溶出し、その後塩酸を減圧除去する。このようにして、分析に供される生体試料が調製され得る。
【００５８】
本工程において、分析に供する試料の一つとして内部標準試料も調製されることが好ましい。内部標準試料は、試料中に含有される標的非ペプチド化合物の量の基準となる試料である。分析される複数の試料中にそれぞれ含有される標的非ペプチド化合物の量を、内部標準試料中に含有される該化合物の量との相対値としてそれぞれ求め、互いに比較することにより、該複数の試料間での比較をより高い精度で行うことが可能となる。また、分析される試料の個数が標識のために用意できる互いに質量差を有する本発明の同位体標識化合物の種類数よりも多い場合であっても、分析すべき試料を２以上のグループに分割した上で、同一の内部標準試料を用いてグループ毎に分析を行うことで、全ての分析すべき試料間での比較が可能である。
内部標準試料の調製は例えば、標的非ペプチド化合物の市販品を所定の濃度（例、０．０５Ｍ）のＨＣｌに溶解することによって行うことができる。また、内部標準試料中に存在する、標的非ペプチド化合物の濃度は特に制限されないが、一般には、分析に供される他の試料中での該化合物の想定される濃度と近いことが好ましい。内部標準試料は、通常、標的非ペプチド化合物を既知の濃度で含有する。それにより、試料中に存在する標的化合物の絶対量を決定することが可能となる。
【００５９】
本工程の後、工程（２）の前に、後の工程（３）における試料間の混合比の決定に供するために、分析に供されるいずれの試料にも存在しないアミノ基含有非ペプチド化合物を、混合比の指標となる化合物として全ての試料に既知濃度となるように添加してもよい。混合比の指標となる化合物の例としては、ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）等が挙げられる。混合比の指標となる化合物の添加量は、その後の質量分析に支障を生じさせない限り特に制限されないが、例えば、各試料中の混合比の指標となる化合物の濃度が０．２〜１０ｐｍｏｌ、好ましくは０．５〜５ｐｍｏｌ、より好ましくは１〜３ｐｍｏｌとなるように添加される。また、好ましくは、分析に供される試料のいずれにおいても等しい濃度となるように、混合比の指標となる化合物は添加される。
【００６０】
（２）試料間で標的物質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中の標的物質を標識する工程
【００６１】
本工程では、工程（１）で調製された各試料に対して、異なる本発明の同位体標識化合物を用いて標的アミノ基含有非ペプチド化合物の標識を行う。アミノ基含有非ペプチド化合物は、塩基性を示し、比較的高いｐＫａ値を有する。反応液のｐＨがそのｐＫａ値よりも低い場合、アミノ基は−ＮＨ３＋のイオン型をとるが、反応液のｐＨがそのｐＫａ値よりも２ｐＨ単位高いとＨ＋を離して−ＮＨ２の構造をとる。本発明の同位体標識化合物は、−ＮＨ２に対してより高い反応性を示すことが知られている。そこで、標的非ペプチド化合物のｐＫａ値に応じて、適宜反応液のｐＨを調整すればよい。また、試料中のアミノ基含有非ペプチド化合物を一斉定量する場合には、アミノ基含有非ペプチド化合物のｐＫａの範囲は広いので、ホウ酸緩衝液で保護可能なｐＨ範囲として最高の１０．０を採用してもよい。具体的な反応液の組成は例えば以下の通りである：０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）１０μＬ、アミノ基含有非ペプチド化合物の０．０５Ｍ塩酸溶液（１０ｍＭ）１μＬ、蒸留水、１００ｍＭＰｙＩＩ化合物１μＬ、総量２０μＬ。反応は例えば、５０℃で数分〜２時間行い、１Ｍ塩酸を１μＬ添加して反応を停止させる。
【００６２】
用いられる標識化合物の組み合わせとしては、質量差が２以上である２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を含むものが挙げられる。そのような組み合わせとしては例えば、質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を２個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を４個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を８個有する式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を１０個有する式（Ｉ）で表される化合物、および質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物からなる群から選択される２つ以上の化合物、またはそれらの塩を含むものが挙げられる。好ましい組み合わせの具体例としては、上記のＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−２、ＰｙＩＩ−４、ＰｙＩＩ−６、ＰｙＩＩ−８、ＰｙＩＩ−１０およびＰｙＩＩ−１２のうちの２つ以上を含むものが挙げられる。また、より多くの試料を一括で処理できるという観点から、上記の各例示した組み合わせには、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩が、好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ以上、更により好ましくは５つ以上、特により好ましくは６つ以上、最も好ましくは７つ含まれる。
【００６３】
本発明の同位体標識化合物は、下記の反応式：
【００６４】
【化１６】
2013147096.tif 000018
【００６５】
に従って、アミノ基含有非ペプチド化合物を標識する。異なる試料由来の同一標的非ペプチド化合物は、同位体標識により異なる質量を有する化合物により標識され、結果として互いに質量差を有する。
【００６６】
（３）標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程
【００６７】
本工程では、工程（２）で標識に供された各アミノ基含有非ペプチド化合物含有試料を混合する。混合液の調製に際して各試料から採取される量は等量であることが好ましいが、それに限定されない。また、必ずしも必要ではないが、混合液中に存在する過剰な標識試薬を除去してもよい。過剰な標識試薬の除去は、酢酸エチル等を用いる有機溶媒抽出、または、陽イオン交換樹脂を用いて行うことができる。更に、質量分析に供する前に、該混合液を濃縮することが好ましい。混合液の濃縮は、平衡化した陽イオン交換樹脂（Ｈ＋型）に混合液を付加し、水でよく洗浄してから、１％アンモニア水または０．１Ｍ塩酸により反応物を溶出する。溶出液は、減圧遠心濃縮器で適当な量まで濃縮することにより行うことができる。
【００６８】
（４）混合物を質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有する標的物質について、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらの標的物質の存在比を求め、得られた存在比と工程（３）における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該標的物質の量比を決定する工程
【００６９】
本工程では、上記の手順に従って得られた混合物が質量分析に供される。本発明においては任意の質量分析システムを用いることができるが、高感度での定量を可能とするために、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ナノＬＣ／ＭＳ）システム（例、NanoFrontier eLD（日立ハイテクノロジーズ社製）等）を用いて分析することが好ましい。常法に従い質量分析を行うことにより、質量スペクトルを取得することができる。具体的には、例えば、以下の通りに行うことができる： 
ＬＣ条件は分離用カラムとしてモノリス型のMonoCap for FastFlow (0.05 mm IDx150mmL, ＧＬサイエンス社)、トラップカラムとしてC18-Monolithトラップカラム（0.05mm IDx150mm L ＧＬサイエンス社）を用い、流量200 nl/分、移動層としてA)ギ酸/水/アセトニトリル（0.1：98：2）、B) ギ酸/水/アセトニトリル（0.1：2：98）からなるグラジエント溶出を行う（すなわち、A/B=98/2(0分)−2/98（50分）-2/98（50.1-70分）−98/2(70.1-90分)）。質量測定部設定として、イオン化モードはナノESI(正イオン化)、スプレー電圧は1600 V、検出器電圧は1950 V、カウンター窒素ガス量は0.8 L/分、スキャン範囲は100-500 m/ｚとし、質量分析の記録時間は50分とする。
【００７０】
同位体標識に起因して、異なる試料由来の同種のアミノ基含有非ペプチド化合物は異なる質量を持つため、質量スペクトルにおいては、異なる試料由来の同種のアミノ基含有非ペプチド化合物は分離したピークとして現れる。それらの分離したピークの強度比を求めることにより、前記混合物中でのそれらのペプチドの存在比が得られる。
【００７１】
内部標準試料も分析に供している場合、本工程における存在比の決定は、通常、内部標準試料以外の各試料由来の標的非ペプチド化合物と、内部標準試料由来の質量のみ異なる同一化合物とのピーク強度の比を求めることにより行われる。
【００７２】
また、混合比の指標となる化合物を添加して分析を行っている場合には、本工程において、工程（２）における標識に起因して互いに質量差を有する混合比の指標となる化合物について、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比を決定する。決定された比は、前記混合物中でのそれらの化合物の存在比に対応している。そこで更に、各試料に添加された混合比の指標となる化合物の濃度と、決定された前記混合物中での混合比の指標となる化合物の存在比とから、工程（３）における試料間の混合比を決定することができる。
【００７３】
上記のようにして得られた存在比と、工程（３）における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での標的非ペプチド化合物の量比を決定することができる。
【００７４】
（タンパク質の定量分析方法）
以下、本発明のタンパク質分析方法について、各工程を説明する。
【００７５】
（１）分析に供する２以上の生体試料を調製する工程
【００７６】
分析に供する試料の個数、由来、採取の方法については、本発明の非ペプチド化合物分析方法において上述した通りである。採取した試料から、自体公知の方法によりタンパク質の抽出処理を行うことが好ましい。具体的には、例えば、細胞溶解液（ＣＬＳ；cell lysate solution）と呼ぶ溶液を用いてタンパク質の抽出処理を行うことができる。ＣＬＳの組成は、７Ｍ尿素、３Ｍチオウレア、２％ＣＨＡＰＳ、０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．６である。更に、各試料からの抽出処理により得られた各試料に対して、総タンパク質量を等しくした試料を作製し、そのようにして作製された試料を以後の分析に用いることも、分析の精度を向上させるために好ましい。
【００７７】
本工程において、分析に供する試料の一つとして内部標準試料も調製されることが好ましい。内部標準試料は、試料中に含有されるそれぞれのタンパク質の量の基準となる試料である。分析される複数の試料中にそれぞれ含有される所与のタンパク質の量を、内部標準試料中に含有される該タンパク質の量との相対値としてそれぞれ求め、互いに比較することにより、該複数の試料間での比較をより高い精度で行うことが可能となる。また、分析される試料の個数が標識のために用意できる互いに質量差を有する本発明の同位体標識化合物の種類数（例、互いに質量差６の３つの同位体標識化合物）よりも多い場合であっても、分析すべき試料を２以上のグループに分割した上で、同一の内部標準試料を用いてグループ毎に分析を行うことで、全ての分析すべき試料間での比較が可能である。
上記目的のために、内部標準試料は、分析される試料中に存在するあらゆるタンパク質を含むことが好ましい。そのために、内部標準試料は、例えば、上述のようにして調製された分析される全てのタンパク質含有試料を混合することにより調製されたものであり得る。その場合、上述のようにして調製された各試料から総タンパク質含有量が等しい出発試料をそれぞれ調製した後、該出発試料を混合（例、等量混合）することにより内部標準試料を調製することも、その調製法の例として挙げることができる。
内部標準試料を用いるタンパク質の定量分析方法については、上記特許文献１にも説明されている。
【００７８】
（２）試料間で同一タンパク質に質量差を与えるように、同位体標識により互いに異なる質量を有する２つ以上の式（Ｉ）で表される化合物またはそれらの塩を標識化合物として用いて調製した試料中のタンパク質を標識する工程
【００７９】
本工程では、工程（１）で調製された各試料に対して、異なる本発明の同位体標識化合物を用いてタンパク質標識を行う。そのために、標識前に通常、分析に供される試料中の全タンパク質のＳＨ基を還元・アルキル化する処理を行う。該処理は常法に従って行えばよく、例えば、還元にはジチオスレイトールを、アルキル化にはヨードアセトアミドを用いることができる。標識反応は、塩基性条件下で、適当な溶媒中（例えば、上記のＣＬＳ。但し、標識化合物添加後の最終濃度が尿素６．５Ｍ、チオウレア２．５Ｍ、ＣＨＡＰＳ１．７％以上となるように反応液を調製する。）に溶解したタンパク質含有試料に該標識化合物を添加し、５０℃で２時間反応させることにより行うことができる。標識化合物の量としては、試料中に存在するタンパク質中のリジン残基の１００倍量とすることができる。
【００８０】
用いられる標識化合物の組み合わせとしては、いずれの化合物間についても質量差が６以上となるものが好ましい。そのような組み合わせとしては例えば、質量数１３の炭素原子を含まない式（Ｉ）で表される化合物、質量数１３の炭素原子を６個有する式（Ｉ）で表される化合物、および質量数１３の炭素原子を１２個有する式（Ｉ）で表される化合物、またはそれらの塩を含むものが挙げられる。好ましい組み合わせの具体例としては、上記のＰｙＩＩ−０、ＰｙＩＩ−６およびＰｙＩＩ−１２を含むものが挙げられる。
【００８１】
本発明の同位体標識化合物は、下記の反応式：
【００８２】
【化１７】
2013147096.tif 000019
【００８３】
に従って、タンパク質のリジン残基のε−アミノ基と結合する。稀にα−アミノ基と反応することもある。異なる試料由来の同一タンパク質は、同位体標識により異なる質量を有する化合物により標識され、結果として互いに質量差を有する。
【００８４】
（３）標識に供された全ての試料から混合物を調製する工程
【００８５】
本工程では、工程（２）で標識に供された各タンパク質含有試料を混合する。混合は例えば、各試料からのタンパク質量が等しくなるように等量混合とするのが好適である。未反応の標識化合物は、通常、ゲルろ過法またはタンパク質沈殿試薬によって除去し、標識タンパク質を集めて濃縮する。
【００８６】
（４）混合物中のタンパク質を制限酵素により消化してペプチドを得る工程
【００８７】
本工程は、大別して以下の２つの方法：
（ａ）該混合物を１次元ゲル分離、２次元ゲル分離または適当なクロマトメディアで大まかに分離する等したタンパク質をタンパク質分解酵素で加水分解し、ペプチドを遊離する；
（ｂ）（ａ）のように前以て含有タンパク質を相互分離のためにゲル分離やクロマト展開することなく、該混合物を直接タンパク質分解酵素で分解する、
のいずれかに従う。タンパク質の分解は自体公知の手順に従って行うことができる。一次選択のトリプシン以外に、ＡｒｇペプチダーゼやＧｌｕペプチダーゼ等を二次選択として用いることができるが、Ｌｙｓエンドペプチダーゼは用いない。
【００８８】
ペプチドを遊離した後、該ペプチドを質量分析に付すまでの流れは以下の通りである。
（ａ）の操作により分離したタンパク質から遊離した標識ペプチドおよび非標識ペプチドについては、ペプチドの分離操作無しで直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより質量分析する場合もある。また、液体クロマトグラフによりペプチドを分離後、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析することもできる。
（ｂ）の操作により遊離したペプチドは、２次元液体クロマトグラフシステムによって、例えば、１次元分離をＳＣＸカラムで行い、溶出した成分を第２の逆相樹脂カラムにより分離し、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳに導入することで、標識ペプチドの相対強度とそのアミノ酸配列情報を一度の分析で獲得する。
ここで、次工程のＭＳスペクトルの測定に用いるペプチドの分子量は特に限定されないが、例えば５００〜３０００であり、好ましくは１０００〜２５００である。従って、本工程は、好ましくは、タンパク質の消化産物から、上記範囲の分子量を有するペプチドを単離することを含む。
【００８９】
（５）得られたペプチドを質量分析に供し、該標識により互いに質量差を有するペプチドについて、質量スペクトルにおけるそれらのピーク強度の比に基づいて、該混合物中でのそれらのペプチドの存在比を決定する工程
【００９０】
本工程では、上記の手順に従って得られたペプチドが質量分析に供される。本発明においては任意の質量分析システムを用いることができるが、高感度での定量を可能とするために、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ナノＬＣ／ＭＳ）システム（例、NanoFrontier eLD（日立ハイテクノロジーズ社製）等）を用いて分析することが好ましい。常法に従い質量分析を行うことにより、質量スペクトルを取得することができる。
【００９１】
同位体標識に起因して、異なる試料由来の同種のペプチドは異なる質量を持つため、質量スペクトルにおいては、異なる試料由来の同種のペプチドは分離したピークとして現れる。それらの分離したピークの強度比を求めることにより、前記混合物中でのそれらのペプチドの存在比が得られる。
なお、工程（２）における標識において互いに質量差６以上の標識化合物を用いた場合には通常必要でないが、そうでない場合は、ピーク強度の対比において、例えば特開２００５−１８１０１１に教示されているようにして、天然に存在する同位体元素に起因するペプチドの同位体ピークとの重なりを除去して量比の補正をする点に留意する。
【００９２】
内部標準試料も分析に供している場合、本工程における存在比の決定は、通常、内部標準試料以外の各試料由来のペプチドと、内部標準試料由来の質量のみ異なる同一ペプチドとのピーク強度の比を求めることにより行われる。
【００９３】
（６）存在比を決定されたペプチドについて、それが由来するタンパク質を特定し、該存在比および工程（３）における試料の混合比から、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定する工程
【００９４】
本工程では、工程（５）の質量スペクトルを参照して、アミノ酸配列を特定すべきペプチドを選択し、該ペプチドから生成されるプロダクトイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルによって、該ペプチドのアミノ酸配列を定性すること、および、該ペプチドのアミノ酸配列に基づき、既知ＤＮＡ配列より対応するタンパク質を同定することにより、該ペプチドが由来するタンパク質を特定することができる。
ここで該ペプチドについて工程（５）で得られた存在比は、該ペプチドが由来するタンパク質の前記混合物中での存在比に等しいため、該存在比と、工程（３）における試料の混合比とから、混合物の調製に供された試料間での該タンパク質の量比を決定することができる。
【００９５】
（標識化合物）
本発明は更に、式（ＩＶ）：
【化１８】
2013147096.tif 000020
【００９６】
（式中、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）で表される化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩を提供する。該化合物またはその塩は、式（ＩＶ）中のＲ以外の位置において質量数１３の炭素原子を１つ以上（例、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個）有するものであり得る。以下、同位体標識されていないものも含めて、式（ＩＶ）で表される化合物またはその塩を本発明の標識生成物ともいう。本発明の標識生成物は、例えば、本発明の非ペプチド化合物分析方法における内部標準試料の調製等のために利用できる。
【００９７】
本発明の標識生成物は、例えば、本発明の同位体標識化合物により、上で定義した所与のアミノ基含有非ペプチド化合物を標識することにより生成したものであってよい。すなわち、該標識化合物により上で定義したアミノ基含有非ペプチド化合物を標識することにより得られる化合物はいずれも本発明の標識生成物に包含される。その場合、本発明の標識生成物における１３Ｃの位置は、本発明の同位体標識化合物における１３Ｃの位置に対応する。
【００９８】
従って、式（ＩＶ）中のＲは、本発明の非ペプチド化合物分析方法において上述した、ＮＨ２Ｒ（式中、Ｒは水素または任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）の化学式を有する任意のアミノ基含有非ペプチド化合物におけるＲと同じものであってよい。塩は、任意の塩であってよく、例えば、式（Ｉ）の化合物の塩として例示したもの（例、トリフルオロメタンスルホン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、過塩素酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル塩、メタンスルホン酸塩等）、および硝酸塩、塩酸塩、硫酸塩等である。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例等により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１００】
（１）分析方法
化合物の同定および重水素化率の算出はNMR又はMSを測定することで行った。
（２−１）装置
・ＮＭＲ分析
日本電子株式会社製  フーリエ変換核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置
ＪＮＭ−ＥＣＳ４００
・化学純度分析
GLサイエンス株式会社製  高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置
ＧＬ−７４００シリーズ
・ＥＩ−ＭＳ分析
日本電子株式会社製  電子衝撃質量分析（ＥＩ−ＭＳ）装置
ＪＭＳ−ＡＸ５０５Ｗ
（２−２）同定
・ＧＣ−ＭＳ測定による化合物の同定
重水素化されていない試料と１３C標識された試薬についてＧＣ−ＭＳを測定して、１３C標識に伴う分子量の変化を支持するデータが得られていることを確認することで行った。
・ＮＭＲ測定による化合物の同定
Ｄ２Ｏを用いて試料を溶解し、観測されたピーク情報より確認を行った。１３C標識された炭素に隣接するプロトンは大きくカップリングすることにより、１３C標識部位の確認ができる。
（２−３）１３C濃縮率の算出方法
重水素化されていない試料と１３C標識された試薬について、同条件でＧＣ−ＭＳを測定して、得られたフラグメントのピーク強度比より算出した。
（２−４）化学純度分析
ＨＰＬＣ分析を行い、得られたピーク面積比より化学純度を算出した。
（３）試薬
東京化成工業株式会社製：一般試薬
大陽日酸株式会社製またはＩｓｏｔｅｃ製：１３Ｃ標識原料【０１０１】
実施例１：２，４，６−トリエチル−３，５−ジメチルピリリウムトリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−０）【０１０２】
１０ｍｌフラスコに３−エチル−２−ペンタノール１３６μｌ（１１６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、無水プロピオン酸５１４μｌ（５２０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌しながら、トリフルオロメタンスルホン酸１８０μｌ（２２２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を滴下した。すべて滴下後、６５℃に加温し１．５時間反応させた。その後、反応液を減圧濃縮し中和して有機溶媒で分液抽出した。抽出した有機溶媒を硫酸マグネシウムで脱水し濃縮後、再結晶することで、２，４，６−トリエチル−３，５−ジメチルピリリウムトリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−０）１７６ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ、収率５２％）を得た。
化学純度：９９．６％
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０６（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、１．２７（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、２．３０（６Ｈ、ｓ）、２．８５（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、３．０７（４Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ １９３．１６、ｆｏｕｎｄ  １９３．２ 【０１０３】
実施例２：２，４，６−トリエチル−３，５−ジメチルピリリウム−２，６−１３Ｃ２トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−２）【０１０４】
原料に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は実施例１と同様の操作を行うことで、２，４，６−トリエチル−３，５−ジメチルピリリウム−２，６−１３Ｃ２トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−２）を合成した。
化学純度：９９．６％
13Ｃ濃縮度：９９．３atom％13Ｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０７（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、１．２８（６Ｈ、ｔｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、５．１Ｈｚ）、２．３１（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．３Ｈｚ）、２．８１（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、３．０８（４Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１４．２Ｈｚ、６．３Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  １３Ｃ２Ｃ１１Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ １９５．２９、ｆｏｕｎｄ  １９５．２【０１０５】
実施例３：２，４，６−トリエチル（４−１３Ｃ１）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−４−１３Ｃ１トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−４）【０１０６】
原料に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は実施例１と同様の操作を行うことで、２，４，６−トリエチル（４−１３Ｃ１）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−４−１３Ｃ１トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−４）を合成した。
化学純度：９９．９％
13Ｃ濃縮度：９９．１atom％13Ｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０６（３Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝１２７．８Ｈｚ、）、１．２８（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．３１（６Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２９．８Ｈｚ、３．７Ｈｚ）、２．８６（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１９．９Ｈｚ、６．８Ｈｚ）、３．０８（４Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  １３Ｃ４Ｃ９Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ １９７．２８、ｆｏｕｎｄ  １９７．２ 【０１０７】
実施例４：２，４，６−トリエチル（４−１３Ｃ２）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−３，５−１３Ｃ２トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−６）【０１０８】
原料に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は実施例１と同様の操作を行うことで、２，４，６−トリエチル（４−１３Ｃ２）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−３，５−１３Ｃ２トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−６）を合成した。
化学純度：９８．８％
13Ｃ濃縮度：９９．５atom％13Ｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０６（３Ｈ、ｄｄｔ、Ｊ＝１２８．５Ｈｚ、１２．８Ｈｚ、４．７Ｈｚ）、１．２７（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、２．３０（６Ｈ、ｄｄ、１２９．６Ｈｚ、５．９Ｈｚ）、２．８５（２Ｈ、ｄｍ、Ｊ＝１２９．６Ｈｚ）、３．０７（４Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝１４．８Ｈｚ、７．３Ｈｚ、２．２Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  １３Ｃ６Ｃ７Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ １９９．２６、ｆｏｕｎｄ  １９９．２ 【０１０９】
実施例５：２，４，６−トリエチル（４−１３Ｃ２）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−２，３，５，６−１３Ｃ４トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−８）【０１１０】
原料に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は実施例１と同様の操作を行うことで、２，４，６−トリエチル（４−１３Ｃ２）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−２，３，５，６−１３Ｃ４トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−８）を合成した。
化学純度：９９．８％
13Ｃ濃縮度：９８．４ａｔｏｍ％１３Ｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０６（３Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝１２７．８Ｈｚ、１１．４Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、１．２７（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ、７．１Ｈｚ）、２．３０（６Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１２９．９Ｈｚ、５．１Ｈｚ）、２．８５（２Ｈ、ｄｍ、Ｊ＝１３３．４Ｈｚ）、３．０７（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  １３Ｃ８Ｃ５Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ２０１．２５、ｆｏｕｎｄ  ２０１．２【０１１１】
実施例６：２，４，６−トリエチル（２，６−１３Ｃ４，４−１３Ｃ１）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−２，４，６−１３Ｃ３トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−１０）【０１１２】
原料に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は実施例１と同様の操作を行うことで、２，４，６−トリエチル（２，６−１３Ｃ４，４−１３Ｃ１）−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−２，４，６−１３Ｃ３トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−１０）を合成した。
化学純度：９７．７％
13Ｃ濃縮度：９８．６ａｔｏｍ％１３Ｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０６（３Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝１２７．８Ｈｚ、１１．４Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、１．２７（６Ｈ、ｄｄｔ、Ｊ＝１２９．９Ｈｚ、８．９Ｈｚ、３．３Ｈｚ）、２．３０（６Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１３０．１Ｈｚ、４．１Ｈｚ）、２．８５（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１３３．０Ｈｚ、７．１Ｈｚ）、３．０７（４Ｈ、ｄｍ、Ｊ＝１３１．０Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  １３Ｃ１０Ｃ３Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ２０３．２３、ｆｏｕｎｄ  ２０３．２【０１１３】
実施例７：２，４，６−トリエチル−１３Ｃ６−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−２，３，５，６−１３Ｃ４トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−１２）【０１１４】
原料に１３Ｃ標識化合物を用いる以外は実施例１と同様の操作を行うことで、２，４，６−トリエチル−１３Ｃ６−３，５−ジメチル−１３Ｃ２−ピリリウム−２，３，５，６−１３Ｃ４  トリフルオロメタンスルホン酸塩（ＰｙＩＩ−１２）を合成した。
化学純度：９９．３％
13Ｃ濃縮度：９９．５atom％13Ｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ：１．０６（３Ｈ、ｄｔｄ、Ｊ＝１２９．７Ｈｚ、７．６Ｈｚ、４．２Ｈｚ）、１．２６（６Ｈ，ｄｔｔ，Ｊ＝１２９．５Ｈｚ、８．０Ｈｚ、３．４Ｈｚ）、２．２９（６Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１２９．８Ｈｚ、５．５Ｈｚ）、２．８４（２Ｈ、ｄｍ、Ｊ＝１３２．２Ｈｚ）、３．０６（４Ｈ、ｄｍ、Ｊ＝１３０．９Ｈｚ）
ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ｆｏｒ  １３Ｃ１２Ｃ１Ｈ２１Ｏ＋（Ｍ−ＣＦ３ＳＯ３）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ２０５．２２、ｆｏｕｎｄ  ２０５．２【０１１５】
合成した各PyII化合物の構造式を下記式に示す。式中の黒丸は質量数１３の炭素原子を示す。【０１１６】
【化１９】
2013147096.tif 000021
【０１１７】
図1に各PyII化合物のEI-MSスペクトルを、図2に各PyII化合物の1H-NMR（270MHz, D2O）スペクトルを示す。【０１１８】
実施例８：PyII試薬のプロテオーム解析における有効性評価【０１１９】
PyII試薬が網羅的プロテオーム発現差解析に適するかどうかを、以下の2つの実験で検討した。【０１２０】
（1）PyII試薬（質量差6）による比較定量法の動作確認
モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）およびヒト血清トランスフェリン（Tfn）をそれぞれPyII-0、PyII-6、PyII-12で標識し、全ての試料を下記の混合比で混合した。【０１２１】
【表１】
2013147096.tif 000022
【０１２２】
混合後、比較定量することにより、混合濃度比がスペクトル強度比に反映されるかどうかを検討した。
SCX分画の条件は下記の通りである：
カラム : Poly Sulfoethyl A 4.6x100mm
溶離液 : A=10mM KH2PO4(pH2.8) 25%ACN
B=10mM KH2PO4(pH2.8) 25%ACN 1M KCl
システム : HPLC ELITE Lachrom（日立）
サンプルループ : 2mL、流速: 1mL/min
Detect : 220nm 、8min〜32minまで1min/Tube採取【０１２３】
陽イオン交換（SCX）カラムにより10分画したBSA由来ペプチドとTfn由来ペプチドの溶出曲線を図3に示す。分画5と9にBSA由来ペプチドとTfn由来ペプチドが検出された。その２分画のナノLC/MS/MSの分析例を図4に示す。多くのペプチド由来のイオンが検出されたが、溶出時間37.1分に分子量1819.1314のBSA由来ペプチドが現れた。このペプチドの質量分析が図4の左側最下段である。605.37、607.38、609.38にそれぞれPyII-0、PyII-6、PyII-12で標識されたペプチドの質量分析ピークが認められた。このM/z値は予想質量の丁度3分の１であり、このペプチドは3価イオンとして検出されることが分かった。このイオンは1：2.5：4の強度比を与えた。同様に分画9にはTfn由来のペプチドが28.7分に現れ、1759.9453の3分の１のM/zであることから同様に3価イオンとして検出され、強度比は1：0625：0.25であった。これらの値は、混合比と完全に一致していた（図5）。【０１２４】
質量スペクトルは同位体ピークが含まれる複雑な形状をしている。モノアイソトピックピークはペプチドの全ての元素が最小の質量を持つものから成り立つもので、第一同位体ピークは1つの炭素が13Cであるペプチドのスペクトルである。質量差が4であるPy試薬の場合、4番目の同位体ピークにPy4のモノアイソトピックピークが重なり、その干渉は無視できない。しかし、質量差6になるとその干渉は完全に無視できることが示された。【０１２５】
（2）PyII試薬（質量差6）による比較定量法のヒト血漿実検体による検証
ヒト血漿タンパク質（健常者および動脈硬化患者）をPyII試薬で標識した。健常者由来のタンパク質をPyII-0およびPyII-12で、動脈硬化患者由来のタンパク質をPｙII-6で標識し、図6に示すプロトコルに従って分析した。また、上記検体についての分析結果を、既に実施済みのcICAT解析結果と比較してデータの妥当性を評価した。【０１２６】
同定タンパク質（p<0.05）数は146個で、cICAT試薬での126個より多かった。これは、PyIIはLys修飾であるが、cICATはCys修飾であるという違いを反映している可能性がある。PyII試薬により定量できたタンパク質数は33個で全体の23％であった。
以上から、Lys残基へのPyII導入率は高いことが確認された。【０１２７】
cICAT試薬とPyII試薬の定量精度の比較を行なった。その結果を図7に示す。1) PyII試薬による定量比は、同検体でのcICAT定量比とよく一致した。【０１２８】
以上、PyII試薬のプロテオーム解析への利用の妥当性の評価を行い、市販の試薬との比較も行なった結果：(1) PyII試薬を利用して、血漿実検体を対象にプロテオームレベルでの比較定量解析が可能であることが確認された。(2) PyII試薬（質量差６）は、質量差4のPy試薬と比較してペプチド間のオーバーラップが少なく、定量精度が向上した。(3) 既存試薬であるcICATによる同じ検体での比較定量結果との高い一致度を得た。【０１２９】
実験例１：蛍光２次元電気泳動法（DIGE法）による、PyII試薬による細胞抽出タンパク質の標識の確認【０１３０】
プロテオーム解析の対象として、血清タンパク質の分析の他に細胞・組織の総タンパク質の量的比較も重要である。細胞・組織に存在するタンパク質の種類は、血清と比べても劣らないか、超える数が存在すると言われる。血液中のタンパク質が水に可溶であるのとは対照的に、細胞内タンパク質は可溶性、膜結合性、核内タンパク質、細胞骨格タンパク質等の多様な存在状態を反映して複雑な物理化学的性質を示す。それらを網羅的に抽出して調べる万能の抽出法はないが、比較的安定しているのはDIGEバッファーであり、この実験ではCLS（Cell Lysis Solution）と呼ぶ溶液を用いた。CLSの組成は7M尿素、3Mチオウレア、2％CHAPS、0.2Mホウ酸緩衝液、pH9.6である。
この実験にはヒト由来細胞株のHeLa細胞を１試料あたり106個用い、沈殿した細胞塊に100μLのCLSを加えて溶解し氷上に30分置いた後で15,000回転で20分間遠心して上清に全細胞タンパク質を回収した。これを2群準備し、両者のタンパク質量を等しくし、一方には緑色の蛍光色素のCy3を、もう一方には赤色のCy5を全タンパク質について平均2%位結合するように蛍光量を調節して結合させた。どのタンパク質のリジン残基も平均して2%程度が蛍光色素で標識されたことになる。両者を等量混合して2D-DIGE法で展開し、蛍光色素の分布をレーザー蛍光スキャナーで検出すると、多くの蛍光スポットが透明ゲル板上に検出された。Cy3とCy5は異なった蛍光特性をもつので、Cy3の蛍光とCy5蛍光を区別して見ることができた。両者の蛍光を重ねることも出来た。同じタンパク質をCy3とCy5で蛍光標識し混合して2次元電気泳動分離すると同じ位置にスポットを作り、蛍光が重ね合わさったスポットは混合色である黄色になった（図8の左図の右下の四角内のスポット）。Cy5で標識した方には更にPyII試薬による標識を行なった。即ち、CLS（pH9.6）に溶解したCy5標識タンパク質に対して10mMPyIIにより50℃で3時間標識した。PyII標識タンパク質に等量のPyII標識しないCy3標識タンパク質を混合し2次元電気泳動分離し、蛍光スキャナーで2色蛍光を検出した。両蛍光を重ね合わせた結果が図8の右図である。タンパク質の緑蛍光スポットはゲル一面に分布していた。各スポット近傍の分子量増大方向（上方向）に赤蛍光スポットの移動が認められる。しかも弱い蛍光（タンパク質の含量が低い）スポットでも近傍に赤蛍光が見られることから、PyII標識により分子量が増大したことを反映する結果と見られる。
以上から、PyII標識は、現在の標識法では細胞内蛋白質の多くを標識できる能力を持っていることが示された。【０１３１】
実施例９：質量差2の7種のPyII試薬でのドーパミンの標識【０１３２】
標準ドーパミン2.5 pmol（2.5 μM ドーパミン含有0.05 M塩酸溶液を1 μl）に5 % 過塩素酸を加え総量を10 μlとした。2 Mリン酸K緩衝液、pH 12を20μl加えpH 9に保った。100 mM PyII試薬を1 μl加え、50 ℃で15分間保温しPyII試薬（PyII-0、PyII-2、PyII-4、PyII-6、PyII-8、PyII-10、PyII-12）とドーパミンとを反応させた。その後、各反応液を混合した。
次に、官能基にフェニルホウ酸（PBA）を持つカラム（MonoSpin PBA、GLサイエンス）を用いて試料中のドーパミン−PyII化合物の精製を行った。試料をPBAに結合させ、アセトニトリル、次に100 mM リン酸K緩衝液pH 8.0、さらに0.5 %トリフルオロ酢酸含有5 %アセトニトリル溶液で洗浄してから、0.5 %トリフルオロ酢酸含有30 %アセトニトリル溶液で溶出した。溶出液を減圧遠心濃縮機により濃縮し、孔径0.22 μmのフィルター（DURAPORE PVDF 0.22μm、MILLIPORE）で濾過し、ナノLC/MSシステムにより分析を行った。
その結果を図9に示す。質量326.1から338.2に質量差約2で7種の化合物が生成しているのが確認された。【０１３３】
実験例２：PyII試薬を用いたドーパミン測定のための検量線の作製【０１３４】
標準ドーパミン1250 fmol、625 fmol、313 fmol、0 fmolの検量線の作製をおこなった。1250 fmolの標準ドーパミンはPyII-12と、625 fmolはPyII-10と、313 fmolはPyII-8と、0 fmolはPyII-0と反応させた。内部標準として500 fmolの3,4-dihydroxybenzylamine （DHBA）を用いた。標準ドーパミン溶液（DHBA 500 fmolを含む）に5 % 過塩素酸を加え総量を10 μlとした。その後、実施例９の方法に従いPyII化合物と試料中のドーパミンとを反応させた後に各反応液を混合し、実施例９の方法に従いPBAによる精製と減圧濃縮、フィルター濾過をおこない、ナノLC/MSシステムにより分析を行った。
得られた結果をドーパミンとDHBAの比を縦軸として作図すると直線関係が得られた（図10）。従って、DHBAを内部標準としてPyIIによりドーパミンが定量できることが判明した。【０１３５】
実施例１０：PyII試薬を用いたラット脳ドーパミン含量の測定【０１３６】
ラット頭部にマイクロウェーブの照射（5 kW，1.7秒）を行い（マイクロウェーブアプリケーター、室町機械）、固定を行った。脳摘出後、凍結ミクロトーム（CM3050S，ライカ）により線条体を含む部位の30 μm厚の脳組織切片を作成し、レーザーマイクロダイセクション（ASLMD、ライカ）により、一辺1 mm四方、厚さ30 μmの脳組織を得た。採取された各切片の体積は30 nlに相当する。続いて5 % 過塩素酸10 μlと内部標準物質としてDHBAを各試料あたり500 fmol（500 nM DHBA含有0.05 M塩酸溶液を1 μl）添加し、酸抽出法により除タンパク処理を行った。その後、実施例９の方法に従い、部位ごとに異なるPyII化合物（PyII-0、PyII-2、PyII-4、PyII-6、PyII-8、PyII-10、またはPyII-12）と試料中のドーパミンとを反応させた後に反応液を混合し、やはり実施例９の方法に従いPBAによる精製と減圧濃縮、フィルター濾過をおこない、ナノLC/MSシステムにより分析を行った。【０１３７】
得られた質量分析スペクトルの結果と図10の検量線に基づいて、脳各部位のドーパミンの量を算出したものを図11に示した。図中の黒い四角は測定した30 nl相当の脳組織片の部位を、その中の数字は各脳組織片に含まれたドーパミン含量をfmolで示している。ドーパミン含量は大脳皮質で少なく（123と317 fmol）、線条体で多い（996-1866 fmol）という結果が得られた。これはドーパミンを測定した従来の知見と同じ程度となっている。これらの結果から、PyII試薬を用いた本発明の分析法により、脳組織30 nl中のドーパミン含量の測定が可能であることが確認された。【０１３８】
実施例１１：PyII試薬によるアミンおよびアミノ酸の分析例【０１３９】
1 mMのアラニン、グルタミン酸、グリシン、γ−アミノ酪酸（GABA）、オルニチン、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン標準液（0.05M塩酸溶液に溶解）のうちいずれか一種2 μlに50mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐH 10.2）を10 μｌ、70 mMのPyII試薬（10 mM PyII-0、PyII-2、PyII-4、PyII-6、PyII-8、PyII-10、PyII-12の等量混合液）を2 μl、蒸留水6 μlを加えて全量20 μlとして50 ℃で60分間加熱保温した。終了後１M塩酸を2μl加え、更に0.05M塩酸溶液により100倍希釈してから、その1 μlをnanoLC/MSに導入し、MS分析を行った。
LC条件は分離用カラムとしてモノリス型のMonoCap for FastFlow (0.05 mm IDx150mmL,ＧＬサイエンス社)、トラップカラムとしてC18-Monolithトラップカラム（0.05mm IDx150mm L, ＧＬサイエンス社）を用い、流量200 nl/分、移動層としてA)ギ酸/水/アセトニトリル（0.1：98：2）、B) ギ酸/水/アセトニトリル（0.1：2：98）からなるグラジエント溶出を行った（すなわち、A/B=98/2(0分)−2/98（50分）-2/98（50.1-70分）−98/2(70.1-90分)）。
質量測定部設定は以下の通りである。イオン化モードはナノESI（正イオン化）、スプレー電圧は1600 V、検出器電圧は1950 V、カウンター窒素ガス量は0.8 L/分、スキャン範囲は100-500 m/ｚとし、質量分析の記録時間は50分とした。
今回測定した各々のPyII誘導体について、質量M/z値の示すイオンクロマトグラフを図12に、図12のピーク部分の質量スペクトルを図13に示している。測定した8種それぞれについて、単独のクロマトピークおよび理論値と一致した質量ピークが同定された。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明の同位体標識化合物は、互いに対して大きな質量差（例、６以上）を有する複数の化合物を提供できるため、タンパク質の網羅的発現差解析においていかなる分子量のペプチドであっても同位体ピーク間の相互干渉の問題を解決できる。特に、従来の安定同位体標識試薬では質量差６で３種類の化合物を提供できるものは存在しないため、タンパク質の定量分析における格段の効率化に資する。
本発明の同位体標識化合物はまた、複数試料（例、７種）中に含有されるアミノ基含有非ペプチド化合物を一斉に高感度で分析することを可能とする。更に、トラップカラムを用いた自動化により、フェムトモルレベルの高感度分析を２４時間自動で行うことができる体制を構築し得る。【０１４１】
本出願は日本で出願された特願２０１２−０７９１１０（出願日：２０１２年３月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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