(57)【要約】  Ａβに対する高い結合特異性、高い血液脳関門の透過性、及び脳からの速やかな消失性を有し、更に生体透過に優れる近赤外光を放出する化合物を提供することを目的として、ベンザオキサゾール骨格を有する化合物、及びジメチルアミノ基とジシアノビニル基などを有する芳香環化合物を提供する。2013027694.tif 000023  〔式中、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方が電子供与基であり、他方が電子吸引基であり、Ｘ及びＹは同一又は異なって、炭素原子、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子であり、ｍは０〜５の整数を表す。〕
2013027694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（IV）
【化１】
2013027694.tif 000019
【化２】
2013027694.tif 000020
【化３】
2013027694.tif 000021
〔式中、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方が電子供与基であり、他方が電子吸引基であり、Ｘ及びＹは同一又は異なって、炭素原子、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子であり、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、ｍは０〜５の整数を表す。〕
で表される化合物又はその医薬上許容される塩。
【請求項２】
電子供与基がヒドロキシル基、メトキシ基、メチル基、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノフェニル基、又はジメチルアミノフェニル基であり、電子吸引基がニトロ基、ニトロビニル基、シアノ基、ジシアノビニル基、トリシアノビニル基、又はホルミル基である請求項１に記載の化合物又はその医薬上許容される塩。
【請求項３】
一般式（III）
【化４】
2013027694.tif 000022
〔式中、Ｒ３はヒドロキシ基、Ｃ１−３アルコキシ基、放射性炭素原子を含むＣ１−３アルコキシ基、ハロゲン原子、放射性ハロゲン原子、放射性金属に結合されたキレート部、又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−Ａ〔式中、ｉは１〜１０の整数を表し、Ａはハロゲン原子、放射性ハロゲン原子、又は放射性金属に結合されたキレート部を表す。〕で表される基を表し、Ｒ４はヒドロキシ基、メトキシ基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｊ−ＯＨ〔式中、ｊは１〜１０の整数を表す。〕で表される基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−Ｆ〔式中、ｋは１〜１０の整数を表す。〕で表される基、又は−ＮＲａＲｂ〔式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して水素原子及びＣ１−３アルキル基のいずれかを表す。〕で表される基であり、ｎは０〜５の整数を表す。〕
で表される化合物又はその医薬上許容される塩。
【請求項４】
放射性ハロゲン原子が、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ又は１２５Ｉである請求項３に記載の化合物又はその医薬上許容される塩。
【請求項５】
放射性金属に結合されたキレート部が、９９ｍＴｃ又は６８Ｇａと結合するキレート部である請求項３に記載の化合物又はその医薬上許容される塩。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の化合物を含有するコンフォメーション病診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外蛍光化合物、及びベンゾオキサゾール誘導体に関する。これらの化合物は、コンフォメーション病の診断に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年の急速な高齢化に伴い、アルツハイマー病(AD)をはじめとする痴呆性疾患の増加が大きな社会問題のひとつになっている。現在、ADの臨床診断法には、長谷川式、ADAS、MMSEがあり、いずれもADが疑われる個体の認知機能の低下を定量的に評価する方法が一般的に用いられる。この他画像診断法（MRI, CT等）が補助的に用いられるが、これらの診断法ではADを確定診断するには不十分であり、確定診断には生前における脳の生検、死後脳の病理組織学的検査において、老人斑と神経原繊維の出現を確認することが必要である。したがって、現在の診断方法では、広範な脳障害が生じる前の早期段階でADを診断するのは困難である。これまでにADの生物学的診断マーカーとしていくつかの報告があるが、臨床上実用的なものはいまだ開発されていない。このような状況下、ADの早期診断に対する社会的要求は高く、その早急な開発が強く望まれている。【０００３】
老人斑はADの最も特徴的な脳病変であり、その主構成成分はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白（Aβ）である。体外からの老人斑の画像化はADの有効な診断法の確立につながると考えられるが、画像化には、Aβと特異的に結合するアミロイドイメージングプローブが必要である。アミロイドイメージングプローブには、PETやSPECTに用いられる放射性プローブ（特許文献１）やドナー・アクセプター型蛍光分子を利用した蛍光プローブ（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表2008-546804号公報
【特許文献２】国際公開2010/125907
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アミロイドイメージングプローブとして使用する化合物には、Aβに対する高い結合特異性、高い血液脳関門の透過性、脳からの速やかな消失性が求められる。更に、蛍光プローブとして使用する化合物には、生体透過に優れる近赤外光を放出することも求められる。【０００６】
本発明は、以上のような性質を備えた新規な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ベンザオキサゾール骨格を有する化合物がAβに対する高い結合特異性、高い血液脳関門の透過性、及び脳からの速やかな消失性を持つこと、並びにジメチルアミノ基とジシアノビニル基を有する芳香環化合物などが近赤外蛍光を発することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（６）を提供する。
（１）一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（IV）【０００９】
【化１】
2013027694.tif 000003
【００１０】
【化２】
2013027694.tif 000004
【００１１】
【化３】
2013027694.tif 000005
【００１２】
〔式中、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方が電子供与基であり、他方が電子吸引基であり、Ｘ及びＹは同一又は異なって、炭素原子、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子であり、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、ｍは０〜５の整数を表す。〕
で表される化合物又はその医薬上許容される塩。
（２）電子供与基がヒドロキシル基、メトキシ基、メチル基、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノフェニル基、又はジメチルアミノフェニル基であり、電子吸引基がニトロ基、ニトロビニル基、シアノ基、ジシアノビニル基、トリシアノビニル基、又はホルミル基である（１）に記載の化合物又はその医薬上許容される塩。
（３）一般式（III）【００１３】
【化４】
2013027694.tif 000006
【００１４】
〔式中、Ｒ３はヒドロキシ基、Ｃ１−３アルコキシ基、放射性炭素原子を含むＣ１−３アルコキシ基、ハロゲン原子、放射性ハロゲン原子、放射性金属に結合されたキレート部、又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−Ａ〔式中、ｉは１〜１０の整数を表し、Ａはハロゲン原子、放射性ハロゲン原子、又は放射性金属に結合されたキレート部を表す。〕で表される基を表し、Ｒ４はヒドロキシ基、メトキシ基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｊ−ＯＨ〔式中、ｊは１〜１０の整数を表す。〕で表される基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−Ｆ〔式中、ｋは１〜１０の整数を表す。〕で表される基、又は−ＮＲａＲｂ〔式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して水素原子及びＣ１−３アルキル基のいずれかを表す。〕で表される基であり、ｎは０〜５の整数を表す。〕
で表される化合物又はその医薬上許容される塩。
（４）放射性ハロゲン原子が、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ又は１２５Ｉである（３）に記載の化合物又はその医薬上許容される塩。
（５）放射性金属に結合されたキレート部が、９９ｍＴｃ又は６８Ｇａと結合するキレート部である（３）に記載の化合物又はその医薬上許容される塩。
（６）（１）乃至（５）のいずれかに記載の化合物を含有するコンフォメーション病診断用組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の化合物は、Aβに対する高い結合特異性を持つことから、ADなどのコンフォメーション病の早期かつ正確な診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の近赤外蛍光化合物の合成経路。
【図２】実施例１の近赤外蛍光化合物の蛍光スペクトル。上側の曲線がAβ存在下、下側の曲線がAβ非存在下で測定した。
【図３】実施例１の近赤外蛍光化合物のAβ42凝集体への飽和結合アッセイの結果を示す図。
【図４】実施例１の近赤外蛍光化合物を用いたTgモデルマウス脳組織切片の蛍光染色。
【図５】KR-5を用いたTgモデルマウスの蛍光イメージング。
【図６】KR-5を用いたTgモデルマウス脳組織切片の蛍光染色。
【図７】実施例２の近赤外蛍光化合物（以下「DANIR」という場合がある）の合成経路。
【図８】実施例２の近赤外蛍光化合物の蛍光スペクトル（Ａ及びＢ, DANIR-1; Ｃ及びＤ, DANIR-2; Ｅ及びＦ, DANIR-3; Ｇ及びＨ, DANIR-4; 左, EX 右, EM）。上側の曲線がAβ1-42 繊維を添加して測定した場合、下側の曲線がPBS中で測定した場合。
【図９】ADヒト(93 years old, female)からの脳組織の切片のDANIR 2-4の蛍光染色。DANIR-2 (A, Tx-red); DANIR-3 (C, Cy5); DANIR-4 (E, Cy5.5)。A, C, E: Aβ プラーク; B, D, F: NFTs（神経原線維変化）。
【図１０】Tg モデルマウス (C57-APP/PS1, 12 months old, male)から得られた脳組織切片のDANIR 1-4 (A, C, E, G)の蛍光染色。標識されたプラークは、隣接する切片のチオフラビンSによる染色によって確認された(B, D, F, H)。
【図１１】溶液中の凝集Aβ1-42を用いた結合アッセイの結果を示す図。
【図１２】Aβ1-42凝集体への各DANIRの飽和結合アッセイの結果を示す図。
【図１３】ヌードマウスにおけるin vivoでのDANIR-3の脳蛍光イメージング。
【図１４】APPマウス及び野生型マウスにおけるin vivoでのDANIR-3の脳蛍光イメージング。
【図１５】APPマウス及び野生型マウスにおけるDANIR-3の時間強度曲線。
【図１６】[18F]化合物7の合成経路。図中の番号は、実施例３中の化合物の番号と対応する。試薬と条件: (a) Pd/C, MeOH, r.t.; (b) 4-メチルアミノ安息香酸, PPA, 180℃; (c) BBr3(1 M in CH2Cl2), CH2Cl2, -78℃- r.t.; (d) 2-[2-(2-クロロエトキシ) エトキシ] エタノール, K2CO3, DMF, 110℃; (e) TBMSCl, イミダゾール, CH2Cl2, r.t.; (f) DAST, CH2Cl2, -78℃- r.t.; (g) (Boc)2O, THF, reflux; (h) TBAF(1 M in THF), THF, r.t.; (i) MsCl, Et3N, CH2Cl2, r.t.; (j) 18F-, K2CO3, Kryptofix-2.2.2, アセトニトリル, 120℃; (k) HCl(1 M), 120℃。
【図１７】[18F]化合物15の合成経路。図中の番号は、実施例３中の化合物の番号と対応する。試薬と条件: (a) Pd/C, MeOH, r.t.; (c) BBr3(1 M in CH2Cl2), CH2Cl2, -78℃- r.t.; (d) 2-[2-(2-クロロエトキシ) エトキシ] エタノール, K2CO3, DMF, 110℃; (l) 4-(ジメチルアミド) 安息香酸, PPA, 180℃; (m) TsCl, ピリジン, r.t.; (n) TBAF(1 M in THF), THF, reflux.
【図１８】化合物7(左)及び[18F]化合物7(右)のHPLC プロファイル。HPLC条件: Cosmosil C18 column (Nakalai Tesque, 5C18-AR-II, 4.6mm × 150mm), CH3CN/H2O = 50/50, 1 mL/min, UV, 254 nm。
【図１９】化合物15(左)及び[18F] 化合物15(右)のHPLC プロファイル。HPLC 条件: Cosmosil C18 column (Nakalai Tesque, 5C18-AR-II, 4.6mm × 150mm), CH3CN/H2O = 60/40, 1 mL/min, UV, 254 nm。
【図２０】[125I]IMPYのAβ1-42凝集体への結合に対する阻害曲線。
【図２１】マウス脳切片(A: Tg mouse, C57-APP/PS1, 12 months old, male; C: Wild-type, C57, 12 months old, male)とヒト脳切片(E: AD, 93 years old, female; G: Normal, 71 years old, male)の[18F] 化合物7のin vitroオートラジオグラフィー。切片中のプラークの存在と分布は、チオフラビンS(B, D)とモノクローナルAβ抗体(F, H)を用いた免疫組織化学的染色によって確認された。
【図２２】マウス脳切片(A: Tg mouse, C57-APP/PS1, 12 months old, male; C: Wild-type, C57, 12 months old, male)とヒト脳切片(E: AD, 93 years old, female; G: Normal, 71 years old, male)の[18F] 化合物15のin vitroオートラジオグラフィー。切片中のプラークの存在と分布は、チオフラビンS(B, D)とモノクローナルAβ抗体(F, H)を用いた免疫組織化学的染色によって確認された。
【図２３】18月齢トランスジェニックマウス(APPswTg2576, C57BL6)及び野生型コトンロール (C57BL6, 18 month)を用いた[18F] 化合物7 (上) 及び [18F] 化合物15 (下)のex vivoオートラジオグラフィー。プラークも、チオフラビンSによる同一切片の染色によって確認された。
【図２４】31月齢トランスジェニックマウス(APPswTg2576, C57BL6)（右）と野生型コントロール(C57BL6, 31 month) (左)を用いた[18F] 化合物7のin vivoマイクロPET研究。
【図２５】トランスジェニックマウス(APPswTg2576, C57BL6)（右）と野生型コントロール(C57BL6, 31 month) (左)の脳中の[18F]7の時間放射能曲線。
【図２６】実施例４の近赤外蛍光化合物の合成経路。図中の番号は、実施例４中の化合物の番号と対応する。試薬:(a)ジメチルアミン, H2O; (b)マロノニトリル, ピリジン, 2-プロパノール; (c) (1,3-ジオキサラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド, NaH, 18-crown-6, THF。
【図２７】Tg2576マウスの脳切片の蛍光染色。A、C、E、G、I、及びKは、それぞれDTA-0、DTA-1、DFA-1、DTA-2、DFA-2、及びDTA-3で染色した画像。B、D、F、H、J、及びLは、それぞれA、C、E、G、I、及びKの隣接切片をチオフラビンSで染色した画像。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物
一般式（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２は、いずれか一方が電子供与基で、他方が電子吸引基であればよいが、Ｒ１が電子供与基で、Ｒ２が電子吸引基であることが好ましい。
【００１８】
一般式（Ｉ）におけるＲ１は、複素環上のどの位置にあってもよいが、６位（複素環をベンゾチアゾールであると仮定した場合の位置）にあることが好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）における電子供与基は、好適には、ヒドロキシル基、メトキシ基、メチル基、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノフェニル基、又はジメチルアミノフェニル基であり、更に好適には、ジメチルアミノ基である。
【００２０】
一般式（Ｉ）における電子吸引基は、好適には、ニトロ基、ニトロビニル基、シアノ基、ジシアノビニル基、トリシアノビニル基、又はホルミル基であり、更に好適には、ジシアノビニル基である。
【００２１】
一般式（Ｉ）におけるＸは、好適には、窒素である。
【００２２】
一般式（Ｉ）におけるＹは、好適には、硫黄である。
【００２３】
一般式（Ｉ）におけるｍは、０〜５の整数であればよいが、好適には、１、２である。なお、ｍが０の場合、Ｒ２が直接複素環に結合することを意味する。
【００２４】
一般式（Ｉ）で表される化合物のうち代表的なものを下表に示す。なお、表中の「Me」はメチル基を表し、「Dicyano」はジシアノビニル基を表し、「Tricyano」はトリシアノビニル基を表し、「6-」は6位（一般式（Ｉ）の複素環をベンゾチアゾールであると仮定した場合の位置）の基であることを表す。
【００２５】
【表１】
2013027694.tif 000007
【００２６】
上記化合物のうちで、好ましい化合物としてI-23（KR-5）、I-35（KR-7）、I-47（KR-9）を挙げることができる。
【００２７】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、ベンゾチアゾールなどの複素環化合物に直接又は不飽和炭素鎖を介して電子供与基及び電子吸引基を結合させることにより、合成することができる。
（Ｂ）一般式（II）で表される化合物
一般式（II）におけるＲ１及びＲ２は、いずれか一方が電子供与基で、他方が電子吸引基であればよいが、Ｒ１が電子供与基で、Ｒ２が電子吸引基であることが好ましい。
【００２８】
一般式（II）におけるＲ１は、ベンゼン環上のどの位置にあってもよいが、パラ位にあることが好ましい。
【００２９】
一般式（II）における電子供与基は、好適には、ヒドロキシル基、メトキシ基、メチル基、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノフェニル基、又はジメチルアミノフェニル基であり、更に好適には、ジメチルアミノ基である。
【００３０】
一般式（II）における電子吸引基は、好適には、ニトロ基、ニトロビニル基、シアノ基、ジシアノビニル基、トリシアノビニル基、又はホルミル基であり、更に好適には、ジシアノビニル基である。
【００３１】
一般式（II）におけるｍは、０〜５の整数であればよいが、好適には、２、３である。なお、ｍが０の場合、Ｒ２が直接ベンゼン環に結合することを意味する。
【００３２】
一般式（II）で表される化合物のうち代表的なものを下表に示す。なお、表中の「Me」はメチル基を表し、「Dicyano」はジシアノビニル基を表し、「Tricyano」はトリシアノビニル基を表し、「p-」はパラ位の基であることを表す。
【００３３】
【表２】
2013027694.tif 000008
【００３４】
上記化合物のうちで、好ましい化合物としてII-11（DANIR-1）、II-23（DANIR-2）、II-35（DANIR-3）、II-47（DANIR-4）を挙げることができる。
【００３５】
一般式（II）で表される化合物は、ベンゼン環を持つ化合物に直接又は不飽和炭素鎖を介して電子供与基及び電子吸引基を結合させることにより、合成することができる。
（Ｃ）一般式（III）で表される化合物
一般式（III）において、「Ｃ１−３アルコキシ基」とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、又はイソプロポキシ基である。
【００３６】
一般式（III）において、「Ｃ１−３アルキル基」とは、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又はイソプロピル基である。
【００３７】
一般式（III）において、「ハロゲン原子」とは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである。
【００３８】
一般式（III）において、「放射性ハロゲン原子」とは、例えば、18Ｆ、131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、77Ｂｒ、又は76Ｂｒである。
【００３９】
一般式（III）において、「放射性炭素原子」とは、例えば、１１Ｃである。
【００４０】
一般式（III）において、「放射性金属」とは、例えば、９９ｍＴｃ、６２Ｃｕ、６７Ｇａ、又は６８Ｇａである。これらの放射性金属としては、９９ｍＴｃ、６８Ｇａが好適である。
【００４１】
一般式（III）において、「放射性金属に結合されたキレート部」とは、例えば、上記放射性金属と結合されたN2S2型の金属キレート部である。
【００４２】
一般式（III）におけるＲ３は、好適には、放射性ハロゲン原子であり、更に好適には、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ又は１２５Ｉである。
【００４３】
一般式（III）におけるＲ４は、好適には、−ＮＲａＲｂで表される基であり、更に好適には、ジメチルアミノ基、又はメチルアミノ基である。
【００４４】
一般式（III）におけるｎは、０〜５の整数であればよいが、好適には、１、２、３である。なお、ｎが０の場合、Ｒ３が直接ベンゾオキサゾール環に結合することを意味する。
【００４５】
式：−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−Ａにおけるｉは、好適には、１、２、３である。
【００４６】
式：−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｊ−ＯＨにおけるｊは、好適には、１、２、３である。
【００４７】
式：−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−Ｆにおけるｋは、好適には、１、２、３である。
【００４８】
一般式（III）で表される化合物のうち代表的なものを下表に示す。なお、表中の「Me」はメチル基を表す。
【００４９】
【表３】
2013027694.tif 000009
【００５０】
上記化合物のうちで、好ましい化合物としてIII-26（[１８Ｆ]化合物７）、III-27（[１８Ｆ]化合物１５）を挙げることができる。
【００５１】
一般式（III）で表される化合物は、実施例に記載された方法に従って、あるいはその記述を参照しつつそれらの方法に適宜に改変や修飾を加えた方法に従って合成することができる。
（Ｄ）一般式（IV）で表される化合物
一般式（IV）におけるＲ１及びＲ２は、いずれか一方が電子供与基で、他方が電子吸引基であればよいが、Ｒ１が電子供与基で、Ｒ２が電子吸引基であることが好ましい。
【００５２】
一般式（IV）におけるＲ１は、複素環上のどの位置にあってもよいが、５位（複素環をチオフェンであると仮定した場合の位置）にあることが好ましい。
【００５３】
一般式（IV）における電子供与基は、好適には、ヒドロキシル基、メトキシ基、メチル基、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノフェニル基、又はジメチルアミノフェニル基であり、更に好適には、ジメチルアミノ基である。
【００５４】
一般式（IV）における電子吸引基は、好適には、ニトロ基、ニトロビニル基、シアノ基、ジシアノビニル基、トリシアノビニル基、又はホルミル基であり、更に好適には、ジシアノビニル基である。
【００５５】
一般式（IV）におけるｍは、０〜５の整数であればよいが、好適には、１、２である。なお、ｍが０の場合、Ｒ２が直接チオフェン環等に結合することを意味する。
【００５６】
一般式（IV）で表される化合物のうち代表的なものを下表に示す。なお、表中の「Me」はメチル基を表し、「Dicyano」はジシアノビニル基を表し、「Tricyano」はトリシアノビニル基を表し、「5-」は5位（一般式（IV）の複素環をチオフェンであると仮定した場合の位置）の基であることを表す。
【００５７】
【表４】
2013027694.tif 000010
【００５８】
【表５】
2013027694.tif 000011
【００５９】
上記化合物のうちで、好ましい化合物としてIV-23（DTA-1）、IV-35（DTA-2）、IV-47（DTA-3）、IV-71（DFA-1）、IV-83（DFA-2）を挙げることができる。
【００６０】
一般式（IV）で表される化合物は、チオフェン環又はフラン環を持つ化合物に直接又は不飽和炭素鎖を介して電子供与基及び電子吸引基を結合させることにより、合成することができる。
（Ｅ）コンフォメーション病診断用組成物
上述した一般式（Ｉ）〜(IV)で表される化合物を含有する組成物は、コンフォメーション病の診断に利用できる。
【００６１】
また、一般式（Ｉ）〜(IV)で表される化合物の代わりに、医薬上許容される塩を使用することも可能である。医薬上許容される塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩）、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩などを例示できる。
【００６２】
「コンフォメーション病」とは、Aβ、タウ蛋白、プリオンなどコンフォメーション変換によって異常化したタンパク質が原因の疾患群を意味し、ADのほか、ダウン症候群、オランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血症（hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis─Dutch type: HCHWA-D）、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)やウシ海綿状脳症(BSE)、二型糖尿病などが含まれる。また、診断対象となる疾患には、一般には「疾患」と認識されない疾患の前駆症状も含まれる。このような疾患の前駆症状としては、ADの発症前にみられる軽度認知障害（MCI）などを例示できる。
【００６３】
上記組成物によるコンフォメーション病の診断は、通常、この組成物を診断対象者又は実験動物などに投与し、その後、脳の画像を撮影し、画像における一般式（Ｉ）〜(IV)で表される化合物の状態（量、分布等）に基づいて行う。組成物の投与方法は特に限定されず、化合物の種類、標識物質の種類などに応じて適宜決めることができるが、通常は、皮内、腹腔内、静脈、動脈、又は脊髄液への注射又は点滴等によって投与する。組成物の投与量は特に限定されず、化合物の種類、標識物質の種類などに応じて適宜決めることができるが、成人の場合、一般式（Ｉ）〜(IV)で表される化合物を１日当たり10-10〜10-3mg投与するのが好ましく、10-8〜10-5 mg投与するのが更に好ましい。
【００６４】
上記のようにこの組成物は、通常、注射又は点滴によって投与するので、注射液や点滴液に通常含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、液体担体（例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコールなど）、抗菌剤、局所麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン、塩酸ジブカインなど）、緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）、浸透圧調節剤（例えば、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウムなど）を例示できる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００６６】
〔実施例１〕  ベンゾチアゾール環を持つ近赤外蛍光化合物
（１）1,3-ベンゾチアゾール-6-アミンの合成
6-ニトロベンゾチアゾール (5.0 g, 27.8 mmol)とcHCl (3.86 mL)の混合物に80% EtOH (126 mL)を加え、鉄粉(7.4 g)を入れて1時間還流攪拌した。混合物を室温まで冷まして濾過し、EtOAcとH2Oで3回抽出した。有機層をNa2SO4により脱水乾燥し、溶媒を減圧留去し、得られた個体をシリカゲルクロマトグラフィー(CHCl3 : CH3OH = 49 : 1)により精製した(3.24 g, 77.6%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 8.70 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 3.85 (br, s, 2H).【００６７】
（２）N,N-ジメチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミンの合成
THF (65 mL)に1 (2.41 g, 16.0 mmol)を溶かし、HCHO (11.9 mL)、30% H2SO4 (13.3 mL, 49.2 mmol)を加え、鉄粉 (7.14 g, 128.5 mmol)を入れ、1.5時間激しく攪拌した。混合物を濾過し、EtOAcで2回洗った。2N NaOHにより塩基性にし、EtOAc (50 ml × 2)で分液後、有機層をNa2SO4により脱水乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた粘性の残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(CHCl3100%)により精製した(766.3 mg, 26.9%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 8.66 (s, 1H), 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 3.02 (s, 6H).【００６８】
（３）6-(ジメチルアミノ)-1,3-ベンゾチアゾール-2-カルバルデヒドの合成
-78℃、N2充填下で、脱水THF (5.8 mL)にn-BuLi (0.5 mL, 1.3 mmol)を加え、激しく攪拌しながらN,N-ジメチル-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミン(2.22 g, 1.22mmol)を静かに加えた。2時間攪拌後、室温に戻し、脱水DMF (0.38 mL)をゆっくり加え、1.5時間攪拌した。飽和NH4Clで中和し、EtOAcで2回抽出後、有機層をNa2SO4により脱水乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー(Hexane : EtOAc = 2 : 1)により精製した(153 mg, 60.8%)。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 10.05 (s, 1H), 8.01 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.06-7.04 (m, 2H), 3.1 (s, 6H).【００６９】
（４）3-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)アクリルアルデヒドの合成
N2充填下で、6-(ジメチルアミノ)-1,3-ベンゾチアゾール-2-カルバルデヒド(78.9 mg, 0.38 mmol)、(1,3-ジオキソラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド(325.3 mg, 0.76 mmol)、18-crown-6 (c.a. 5 mg)を入れ、脱水THF (23 mL)を加えた。これに、NaHをゆっくり加え、1時間撹拌後、氷冷しながらH2Oを加え、反応を止めた。EtOAcで2回抽出後、有機層をNa2SO4により脱水乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた物質をTHFに溶解し、10%シュウ酸二水和物を加え、2時間撹拌した。飽和NaHCO3水溶液を加え、中性〜塩基性にした後、THFを減圧留去し、EtOAcで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗い、Na2SO4で脱水乾燥後、減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 49 : 1)により精製した(36.7 mg, 41.6%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.04-6.97 (m, 2H), 6.82-6.76 (m, 1H), 3.09 (s, 6H).【００７０】
（５）2-(3-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)アリリデン)マロノニトリル（KR-5）の合成
3-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)アクリルアルデヒド(25.0 mg, 0.11 mmol)、マロノニトリル (10.9 mg,0.165 mmol)、ピリジン(0.10 mL)を2-プロパノールに入れ、30分間還流撹拌した。混合物をEtOAcで2回抽出し、Na2SO4で脱水乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー(hexane : EtOAc = 1 : 1)により精製した(15.6 mg, 50.6%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 7.37-7.34 (m, 1H), 7.06-7.01 (m, 2H), 3.12 (s, 6H). HRMS (EI): m/z calcd for C15H12N4S 280.0782; found 280.0775.【００７１】
（６）5-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ペンタ-2,4-ジエナールの合成
3-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)アクリルアルデヒド(210.7 mg, 0.92mmol)、(1,3-ジオキソラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド (780.0 mg, 1.82 mmol)、18-crown-6 (c.a. 5mg)を入れ、THF (50 mL)を加えた。さらに、NaH (91 mg, 3.8 mmol)を加え、1.5時間撹拌後、氷冷しながらH2Oを加え、反応を止めた。EtOAc (50 mL × 1、30 mL × 2)で分液後、有機層をNa2SO4により脱水乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた物質をTHF (100 mL)に溶解し、10%シュウ酸二水和物を加え、45分間撹拌した。飽和NaHCO3水溶液を加え、中性〜塩基性にした後、THFを減圧留去し、EtOAc (100 mL × 2)で分液した。有機層を飽和食塩水で洗い、Na2SO4で脱水乾燥後、減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー(hexane : EtOAc = 65 : 35)により精製した(100.4 mg, 42.3%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.25-7.05 (m, 4H), 6.96 (dd, J= 9.2, 2.4 Hz, 1H), 6.38-6.33 (m, 1H), 3.07 (s, 6H).【００７２】
（７）2-(5-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ペンタ-2,4-ジエン-1-イリデン)マロノニトリル（KR-7）の合成
5-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ペンタ-2,4-ジエナール(22.3 mg, 0.086 mmol)、マロノニトリル (11.6 mg, 0.18 mmol)、ピリジン (0.10 mL)を2-プロパノールに入れ、1時間還流撹拌した。混合物をEtOAcで2回分液し、Na2SO4で脱水乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 49 : 1)により精製した(7.9 mg, 28.5%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 7.13-7.02 (m, 3H), 6.97 (dd, J = 9.2, 2.4Hz, 1H), 6.91-6.85 (m, 1H), 3.09 (s, 6H). HRMS (EI): m/z calcd for C17H14N4S 306.0939; found 306.0930.【００７３】
（８）7-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ヘプタ-2,4,6-トリエナールの合成
5-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ペンタ-2,4-ジエナール(93.8 mg, 0.36 mmol)、(1,3-ジオキソラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド(298.5 mg, 0.72 mmol)、18-crown-6 (c.a. 5 mg)を入れ、THF (25 mL)を加えた。さらに、NaHを(35.6 mg, 1.48 mmol)を加えて1.5時間撹拌し、その後同量のNaHを再び加えた。2時間撹拌後、氷冷しながらH2Oを加え、反応を止めた。EtOAc (50 mL × 2)で分液後、有機層をNa2SO4により脱水乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた物質をTHF (50 mL)に溶解し、10%シュウ酸二水和物を加え、30分撹拌した。飽和NaHCO3水溶液を加え、中性〜塩基性にした後、THFを減圧留去し、EtOAc (50 mL×2)で分液した。有機層を飽和食塩水で洗い、Na2SO4で脱水乾燥後、減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー(hexane:EtOAc=60:40)により精製した(75.8 mg, 74.0%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.21-9.58 (m, 1H), 7.81 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.43-6.6 (m, 7H), 6.24-5.91 (m, 1H), 3.04 (s, 6H).【００７４】
（９）2-(7-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン)マロノニトリル（KR-9）の合成
7-(6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)ヘプタ-2,4,6-トリエナール(72.3 mg, 0.254 mmol)、マロノニトリル (25.2 mg, 0.381 mmol)、ピリジン (0.30 mL)を2-プロパノールに入れ、1.75時間還流撹拌した。マロノニトリル (21.4 mg, 0.32 mmol)をさらに加え、一晩撹拌した。混合物をEtOAc (150 mL×1、50 mL×1)で分液し、Na2SO4で脱水乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた物質をシリカゲルクロマトグラフィー (CHCl3 : MeOH = 49 : 1)により精製した(38.1 mg, 45.1%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.82 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.10-6.93 (m, 5H), 6.89-6.75 (m, 2H), 6.67-6.6 (m, 1H), 3.07 (s, 6H). HRMS (EI): m/z calcd for C19H16N4S 332.1096; found 332.1090.【００７５】
（１０）蛍光特性の検討
試料をCHCl3に溶かしたものを100 μL、さらにCHCl3 400 μLをセルに入れ、吸収、蛍光、励起波長を測定した。量子収率は試料をCHCl3に溶かしたものを200 μL、さらにCHCl3 800 μLを専用キュベットに入れ、測定した（表６）。【００７６】
【表６】
2013027694.tif 000012
【００７７】
いずれの化合物も530-550 nmの範囲に、吸収波長および励起波長を示した一方で、蛍光波長はビニル基の伸張とともに長波長化し611-716 nmの範囲に極大を示した。また、蛍光量子収率は既報のPP-BTA-1〔2-((6-(ジメチルアミノ)ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)メチレン)マロノニトリル〕が45.5％であったのに対して、ビニル基の伸張とともにその値は低下し、KR-9では0.7%となった。【００７８】
（１１）Aβ存在下、非存在下での蛍光特性の検討
各試料の濃度が12.5 μMとなるように50% EtOHに溶解した。この溶液90 μL、PBS 504 μL、Aβ42凝集体(57 nM) 396 μLを混和し、30分静置後、蛍光波長を測定した。また、Aβ42凝集体を混合しない試験溶液も作製し、同様に蛍光波長を計測した（図２）。【００７９】
いずれの化合物もAβ存在下において、Aβ非存在下では検出されない波長域に新たな蛍光ピークが観察された。本結果より、これら化合物はAβと結合することにより新たな波長を持つ蛍光を発することから、Aβ特異的イメージングへ応用できる可能性が示された。【００８０】
（１２）Aβ42凝集体を用いたインビトロ結合性実験
種々の濃度に調製したPP-BTA-1, KR-5, KR-7, KR-9の10%エタノール溶液30 μL、PBS 168 μL、Aβ42凝集体(57 nM)132 μLを混和し、30分間静置した。また、Aβ42凝集体を入れずに、各試料30 μL、PBS 300 μLを混合した試験溶液を作製した。それぞれの蛍光強度を測定し、飽和曲線より、それぞれの化合物の解離定数(Kd)を算出した（図３）。【００８１】
いずれの化合物もAβ凝集体への結合性をnMオーダーで示し、PP-BTA-1 < KR-5 < KR-9 < KR-7の順で結合性は向上した。【００８２】
（１３）Tg2567マウス脳切片を用いたインビトロ蛍光染色の検討
各化合物のマウス老人斑への結合性を評価するため、32ヵ月齢Tg2576マウスの凍結脳切片を用いた蛍光染色実験を行った。100 μMの濃度に調製した各化合物の50%エタノール溶液150 μLを脳切片と染色し、10分間静置後、50%EtOHで2回、1分間洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。また隣接する脳切片を用いて、チオフラビンS (100 μM, 150 μL)による染色を行い、蛍光顕微鏡による観察を行った（図４）。【００８３】
いずれの化合物もTg2576マウス脳切片上に多数の蛍光像が観察され、この蛍光像は、隣接脳切片上のチオフラビンSの染色像と一致した。この結果より、これらの化合物はいずれもマウス老人斑への結合性を有することが示された。【００８４】
（１４）Tg2576マウスを用いたインビボ撮像実験
KR-5溶液50 μL (1.6×10-2 mg/匹, 20% DMSO, 80% propylene glycol)を、Tg2576マウス(24ヶ月齢)とwildマウス(5週齢)に投与した。その後、5 min、30 min、60 minにおいて蛍光イメージング装置（IVIS Spectrum）を用いて励起波長535 nm、蛍光波長660 nmで撮像した（図５）。また、1時間後に屠殺して脳を摘出し、IVISにより撮像を行った（図５）。さらに、Tg2576マウスの脳は凍結後、厚さ20 μmで切片を作製し、切片を蛍光顕微鏡により観察した（図６）。この切片を50%EtOHで20分間洗浄後、KR-5の蛍光像が完全に洗浄できていることを確認し、チオフラビンS (100 μM) 150 μLと2分間反応した。その後、50% EtOHで洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した（図６）。【００８５】
KR-5をマウスに投与後、マウス脳への蛍光集積が認められたことから、KR-5は脳移行性を示すことが示唆された。その後、経時的に脳からの蛍光の消失が観察され、化合物の非特異的結合は少ないことが示唆された。さらに脳を摘出後、蛍光イメージング装置で野生型マウス脳と比較したところ、Tg2576マウス脳には野生型に比べて顕著な蛍光集積が確認された。イメージング後、凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡で観察を行ったところ、同一切片でチオフラビンSの蛍光像にほぼ対応した化合物由来の蛍光像が観察された。これらの結果より、KR-5はマウス脳への移行性を示すとともに、脳内の老人斑に結合性を有することが明らかとなった。【００８６】
〔実施例２〕  ベンゼン環を持つ近赤外蛍光化合物
（１）(2E,4E)-5-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ペンタ-2,4-ジエナールの合成
175 mgの4-N,N-ジメチルシンナムアルデヒド(1.0 mmol)、53 mgの18-クラウン-6 (0.2 mmol)及び132 mg の(1,3-ジオキソラン-2-イル) メチルトリフェニルホスホニウムブロミド (1.0 mmol) を含む20 mLのTHF溶液に、80 mg のNaH (2.0 mmol)を加えた。反応混合物は、室温で3時間攪拌された後、5 mLの濃塩酸が加えられ、室温で更に1時間攪拌され、次に、K2CO3で中和された。混合物は、CHCl3 (30 mL)で抽出された。溶媒が除かれた後、残渣は、シリカゲルクロマトグラフィーで精製され、84.4 mgの生成物を得た。収率は42%であった(cis-trans 異性体)。【００８７】
（２）(2E,4E,6E)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ヘプタ-2,4,6-トリエナールの合成
(2E,4E)-5-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ペンタ-2,4-ジエナールについて記述した同じ反応を用いた。茶色の油状物質が得られた。収率は33%であった。【００８８】
（３）2-(4-(ジメチルアミノ)ベンジリデン)マロノニトリル (DANIR-1)の合成
300 mg の4-N,N-ジメチルシンナムアルデヒド (2.0 mmol) 及び132 mgのマロノニトリル(2.0 mmol)を含む20 mLの EtOH溶液に、200 μL ピペラジンが加えられた。反応混合物は、室温で10分間攪拌され、黄色結晶(362 mg)が形成された。収率は92%であった。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 7.82 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 6.69 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 3.14 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.98, 154.19, 133.73, 119.19, 115.96, 114.89, 111.54, 71.65, 40.02. HRMS (EI): m/z calcd for C12H11N3 197.0953; found 197.0948. Anal. Calcd: C 73.07, H 5.62, N 21.30; Found: C 73.02, H 5.68, N 21.25.【００８９】
（４）(E)-2-(3-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)アリリデン) マロノニトリル(DANIR-2) の合成
DANIR-1について記述した同じ反応を用いた。暗赤色の結晶が得られた。収率は90%であった。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 7.48 (m, 3H), 7.17 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 14.8, 11.7 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.10 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 160.44, 153.02, 151.53, 131.57, 121.76, 117.16, 114.98, 113.07, 111.89, 40.04. HRMS (EI): m/z calcd .for C14H13N3 223.1109; found 223.1115. Anal. Calcd: C 75.31, H 5.87, N 18.82; Found: C 75.08, H 5.94, N 18.76.【００９０】
（５）2-((2E,4E)-5-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ペンタ-2,4-ジエン-1-イリデン) マロノニトリル (DANIR-3) の合成
DANIR-1について記述した同じ反応を用いた。紫色固体が得られた。収率は69.0%であった。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 7.42 (m, 3H), 7.06 (dd, J = 14.4, 11.2 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 3.06 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 159.52, 152.10, 151.88, 146.40, 130.00, 123.36, 123.09, 121.99, 114.73, 112.72, 111.94, 40.06. HRMS (EI): m/z calcd for C16H15N3 249.1266; found 249.1259. Anal. Calcd: C 77.08, H 6.06, N 16.85; Found: C 76.95, H 6.04, N 16.73.【００９１】
（６）2-((2E,4E,6E)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン) マロノニトリル(DANIR-4) の合成
DANIR-1について記述した同じ反応を用いた。黒色固体が得られた。収率は31%であった。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 7.37 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.94 (dd, J = 14.3, 11.5 Hz, 1H), 6.89 - 6.58 (m, 6H), 6.41 (dd, J = 13.6, 11.8 Hz, 1H), 3.17 - 2.68 (m, 6H). HRMS (EI): m/z calcd for C18H17N3 275.1417; found 275.1421.【００９２】
（７）Tgマウス及びADヒト脳を用いたAβプラークの蛍光染色（図９及び図１０）
ADの動物モデル(the C57-APP/PS1 mouse, 12 months old)及びADヒト(93 years old, female)からのパラフィン包埋脳組織がin vitro蛍光染色に用いられた。脳切片は、2 × 20 分のキシレン中の洗浄、2 × 5 分の100 % エタノール中の洗浄、5 分の90 % エタノール/H2O中の洗浄、5 分の80 % エタノール/H2O中の洗浄、5 分の60 % エタノール/H2O中の洗浄、及び 10 分の水道の流水中の洗浄によって脱パラフィン化され、次に、PBS (0.2 M, pH = 7.4)中で30分間インキュベートされた。次いで、それらは、プローブの10%エタノール溶液(1 μM)で10分間インキュベートされた。プラークの位置は、チオフラビンS(1 μM)による隣接する切片の染色によって確認された。【００９３】
（８）溶液中の凝集Aβ1-42を用いた結合アッセイ（図１１）
100μLの凝集したAβ繊維(最終アッセイ混合物中濃度：60 nM)が、適当な濃度の100μL の放射性リガンド([125I]IMPY)、10 μL のインヒビター（エタノール中の濃度が10-5-10-10 Mである。）及び790μL のPBS (0.2 M, pH = 7.4)を含み、最終的な容量が1 mLである混合物に加えられた。非特異的な結合は、1μMのIMPYの存在下で定義された。混合物は、2時間、37℃で、絶えず揺らしながら、インキュベートされた。次に、結合及びフリーの放射能は、ホウケイ酸塩ガラス繊維フィルタ(Whatman GF/B)を通し、M-24 cell harvester (Brandel, Gaithersburg, MD)を用いた減圧濾過によって分離された。結合125Iリガンドを含むフィルタの放射能は、70%の効率で、γ-カウンター(WALLAC/Wizard 1470, USA)で測定された。そのアッセイ条件下で、特異的結合画分は、総放射能の10%を占めた。半最大阻害濃度 (IC50)は、 GraphPad Prism 4.0を用いて決められ、阻害定数(Ki)はCheng-Prusoffの式: Ki = IC50/(1 + [L]/Kd)を用いて計算された。【００９４】
（９）Aβ1-42凝集体へのDANIRsの飽和結合アッセイ（図１２、表７）
100μLの凝集したAβ繊維(最終アッセイ混合物中10μg)が、100 μL の DANIRs (10-5.5-10-10 nM in EtOH) 及び 800 μL のPBS (0.2 M, pH = 7.4)を含み、最終的な容量が1 mLである混合物に加えられた。非特異的結合は、DANIRsなしで定義された。混合物は30分間室温でインキュベートされ、次に、溶液は96穴プレートに移され、蛍光強度はUV マイクロプレートリーダーによって測定された。飽和実験の結果は、GraphPad Prism 4.0を用いて計算された。【００９５】
【表７】
2013027694.tif 000013
【００９６】
（１０）ヌードマウスにおけるin vivoでのDANIR-3の脳蛍光イメージング（図１３）
50 μLの DANIR-3 (0.4 mg/kg, 20% DMSO, 80% propylene glycol)は、in vivoで、ヌードマウスに注入された。脳からの蛍光シグナルは、プローブの静脈内注入の後2、5、10、30、60、及び240分に、Xenogen’s IVIS 200 Imaging stationによって、記録され、データはLiving Image Softwareによって解析された。【００９７】
（１１）正常及びTgマウスにおけるin vivoでのDANIR-3の脳蛍光イメージング（図１４、１５）
50 μLの DANIR-3 (0.4 mg/kg, 20% DMSO, 80% propylene glycol)は、in vivoで、正常C57-BL6 及びTg-2576(20 months) マウスに注入された。脳からの蛍光シグナルは、注入後の様々な時点で、Xenogen’s IVIS 200 Imaging stationによって、記録され、データはLiving Image Softwareによって解析された。ROI は脳領域の周囲に描かれ、時間強度曲線が描かれた。【００９８】
〔実施例３〕ベンゾオキサゾール誘導体
（１）総説
別の方法で示さない限り、すべての試薬を商業的に入手し、さらなる精製をせずに使用した。400MHzで、JEOL JNM-AL400NMRスペクトロメータを用い、CDCl3溶液中で、TMSを内部標準として、1H-NMRスペクトルを得た。化学シフトは、内部標準のTMSに相対するδ値として報告される。結合定数はHertzで報告される。s(一重線)、d(二重線)、t(三重線)、およびm(多重線)によって多重度は定義される。マススペクトルは、Shimadzu GC MS-QP2010 Plus(APCI)によって得た。1.0mL/分の流速で送られる移動相としてのアセトニトリル/水とCosmosil C18カコラム(Nakalai Tesque、5C18AR II、4.6mm×150mm)を用いて、島津製作所システム(a LC-20AT pump with a SPD-20A UV detector, λ = 254 nm)で、HPLCは実行された。GFPフィルタセットを備えている蛍光顕微鏡(KEYENCE BioRevo BZ-9000)で観測をした。結合アッセイはセルハーベスター(Brandel, M-24, Gaithersburg, MD)で実行された。【００９９】
（２）2-アミノ-4-メトキシフェノール(化合物2)の合成
化合物1（5.1g、40mmol）とPd/C（10%、0.5g）の混合物は、水素雰囲気下(balloon)で、無水メタノール（200mL）中で、室温で、24時間、強く攪拌された。混合物は濾過されて、濾液はメタノール(20mL)で洗われ、減圧下で濃縮され、化合物2(3.72gと、89.2%)が得られた。【０１００】
（３）4-(5-メトキシベンゾ[d] オキサゾール-2-イル)-N-メチルアニリン(化合物3) の合成
化合物2(1.39g、10mmol)と4-メチルアミノ安息香酸(1.51g、10mmol)の混合物に、ポリリン酸(10g)が加えられた。混合物は、30分間、180℃で攪拌され、氷水(400mL)が加えられ、K2CO3によって中和された。混合物は、酢酸エチル(200mL)によって抽出され、有機相が分離され、Na2SO4の上で乾燥された。溶媒を取り除いた後に、シリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製し、化合物3(783mgと、30.8%)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.94 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.85 (s, 3H). MS(ESI): m/z calcd for C15H14N2O2 254.11; found 255.10 (M+H+).【０１０１】
（４）2-(4-(メチルアミノ)フェニル)ベンゾ[d]オキサゾール-5-オール(化合物4) の合成
BBr3 (1 M in CH2Cl2, 10 mL)の液滴を、乾燥氷アセトンバス中で、化合物3(510mg、2mmol)の溶液に加えた。反応混合物が、-78℃で1時間、次いで室温で12時間、攪拌され、次に、氷水(50mL)が加えられ、K2CO3によって中和された。混合物は、クロロホルム(100 mL)によって抽出され、有機相が分離され、Na2SO4の上で乾燥された。濾過され、シリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製し、化合物4(437 mg, 91.1%)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.93 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 2.85 (s, 3H). MS(ESI): m/z calcd for C14H12N2O2 240.09; found 241.10 (M+H+).【０１０２】
（５）2-(2-(2-((2-(4-(メチルアミノ) フェニル) ベンゾ[d]オキサゾール-5-イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール(化合物5) の合成
化合物4 (480 mg, 2 mmol)の溶液とDMF (15 mL)中の2-[2-(2-クロロエトキシ)-エトキシ]エタノール (50 μL, 0.66 mmol)に無水K2CO3 (830 mg, 6 mmol)が加えられた。反応混合物は、105℃で4時間攪拌され、水に注がれ、クロロホルムで抽出された。有機層は結合され、Na2SO4上で乾燥された。溶媒を蒸発させ、残渣を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物5 (550 mg, 73.9%)を得た。 1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.05 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.24 - 4.14 (m, 2H), 3.91 - 3.86 (m, 2H), 3.79 - 3.68 (m, 6H), 3.67 - 3.61 (m, 2H), 2.92 (s, 3H). MS(ESI): m/z calcd for C20H24N2O5 372.17; found 373.15 (M+H+).【０１０３】
（６）N-メチル-4-(5-((2,2,3,3-テトラメチル-4,7,10-トリオキサ-3-シラドデカン-12-イル)オキシ)ベンゾ[d]オキサゾール-2-イル)アニリン(化合物6) の合成
化合物5 (372 mg, 1 mmol)の溶液、 TBDMSCl (226 mg, 1.5 mmol)及びジクロロメタン(10 ml)中のイミダゾール(140 mg, 2 mmol)を室温で3時間攪拌した。白色固体が生成し、それを濾過した。濾液を蒸発させた後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物6 (302 mg, 62.1 %)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 7.96 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.22 (s, 1H), 4.13 - 4.04 (m, 2H), 3.84 - 3.79 (m, 2H), 3.71 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.69 - 3.61 (m, 4H), 3.51 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.81 (s, 3H), 0.83 (s, 9H). MS(ESI): m/z calcd for C26H38N2O5Si 486.25; found 487.30 (M+H+).【０１０４】
（７）4-(5-(2-(2-(2-フルオロエトキシ)エトキシ)エトキシ)ベンゾ[d]オキサゾール-2-イル)-N-メチルアニリン(化合物7) の合成
化合物5 (74 mg, 0.2 mmol)の CHCl3 (10 mL)溶液に、乾燥氷アセトンバス中で、DAST (100 mg, 0.6 mmol)を加えた。反応混合物は、2時間、室温で攪拌され、次に、飽和NaHSO3 溶液に注がれ、クロロホルムで抽出された。有機相が分離され、MgSO4上で乾燥され、濾過された。残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製され、化合物7 (7.1 mg, 9.6%)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.04 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.63 (dd, J = 4.5, 3.9 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 6.0, 2.3 Hz, 1H), 4.23 - 4.13 (m, 2H), 3.95 - 3.86 (m, 2H), 3.84 - 3.79 (m, 2H), 3.78 - 3.71 (m, 4H), 2.92 (s, 3H). HRMS(EI): m/z calcd for C20H23FN2O4 374.1642; found 374.1637 (M+H+).【０１０５】
（８）tert-ブチルメチル (4-(5-((2,2,3,3-テトラメチル-4,7,10-トリオキサ-3-シラドデカン-12-イル)オキシ)ベンゾ[d]オキサゾール-2-イル)フェニル) カルバメート(化合物8) の合成
窒素雰囲気下、化合物6 (300 mg, 0.62 mmol)は、無水THF (20 ml)、次いで、Boc無水物(1.35 g, 6.2 mmol)中で溶かされた。溶液は48時間還流された。反応が完了した後、溶媒は除かれ、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製され、化合物8 (273 mg, 74.7 %)を得た。 1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.11 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 4.19 - 4.09 (m, 2H), 3.88 - 3.80 (m, 2H), 3.71 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.69 - 3.61 (m, 4H), 3.51 (dd, J = 5.6, 5.1 Hz, 2H), 3.26 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 0.83 (s, 9H). MS(ESI): m/z calcd for C31H46N2O7Si 586.31; found 587.40 (M+H+).【０１０６】
（９）tert-ブチル(4-(5-(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)ベンゾ[d]オキサゾール-2-イル)フェニル)(メチル)カルバメート(化合物9) の合成
乾燥THF(10 mL)中の化合物8 (270 mg, 0.46 mmol)溶液に、無水TBAF (1.0 mL, 1 M in THF)を加えた。溶液は、室温で2時間、攪拌された。THFの除去後、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製され、化合物9 (281 mg, 75.7 %)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.09 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39 - 7.30 (m, 3H), 7.22 (s, 1H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 6.2, 2.9 Hz, 2H), 3.88 - 3.75 (m, 2H), 3.70 - 3.60 (m, 6H), 3.58 - 3.51 (m, 2H), 3.24 (s, 3H), 1.41 (s, 9H). MS(ESI): m/z calcd for C25H32N2O7 472.22; found 473.30 (M+H+).【０１０７】
（１０）2-(2-(2-((2-(4-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)フェニル)ベンゾ[d]オキサゾール-5-イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エチルメタンスルホン酸 (化合物10) の合成
メタンスルホン酸(10 ml)中の化合物9 (281 mg, 0.6 mmol)溶液に、トリエチルアミン(121 mg, 1.2 mmol)を加えた。次いで、メタンスルホニルクロリド(137 mg, 1.2 mmol)がシリンジで加えられた。溶液は、室温で2時間、攪拌された。次に、20 mLの水が加えられ、CHCl3で抽出された。有機層は、MgSO4で乾燥された。溶媒が除去された後、残渣はシリカゲルクロマトグラフィーで精製され、化合物10 (173 mg, 52.4%)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.17 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.97 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 4.42 - 4.35 (m, 2H), 4.21 - 4.14 (m, 2H), 3.88 (dd, J = 5.3, 4.0 Hz, 2H), 3.81 - 3.77 (m, 2H), 3.76 - 3.69 (m, 4H), 3.33 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 1.49 (s, 9H). MS(ESI): m/z calcd for C26H34N2O9S 550.20; found 551.25 (M+H+).【０１０８】
（１１）4-(5-メトキシベンゾ[d]オキサゾール-2-イル)-N,N-ジメチルアニリン (化合物11) の合成
化合物3を調製した上記反応を用いて、化合物11を収率25.1%で得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.08 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.07 (s, 3H). MS(ESI): m/z calcd for C16H16N2O2 268.12; found 269.15 (M+H+).【０１０９】
（１２）2-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ベンゾ[d]オキサゾール-5-オール(化合物12) の合成
化合物4を調製した上記反応を用いて、化合物12を収率88.0%で得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.99 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.78 (ddd, J = 8.8, 2.4, 0.8 Hz, 1H), 3.07 (s, 6H). MS(ESI): m/z calcd for C15H14N2O2 254.11; found 255.10 (M+H+).【０１１０】
（１３）2-(2-(2-((2-(4-(ジメチルアミノ) フェニル)ベンゾ[d]オキサゾール-5-イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール(化合物13) の合成
化合物5を調製した上記反応を用いて、化合物13を収率43.1%で得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.05 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 4.9, 3.8 Hz, 2H), 3.86 (dd, J = 4.9, 3.8 Hz, 2H), 3.78 - 3.42 (m, 8H), 3.02 (s, 6H). MS(ESI): m/z calcd for C21H26N2O5 386.18; found 387.27 (M+H+).【０１１１】
（１４）2-(2-(2-((2-(4-(ジメチルアミノ) フェニル) ベンゾ[d] オキサゾール-5-イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エチル 4-メチルベンゼンスルホン酸 (化合物14) の合成
ピリジン(10 mL)中の化合物13 (250 mg, 0.65 mmol)溶液に、塩化トシル(248 mg, 1.30 mmol)を加えた。反応混合物は、室温で3時間、攪拌され、50 mLの水が加えられ、混合物はCHCl3で抽出された。有機層は、Na2SO4で乾燥され、溶媒の蒸発によって残渣を得た。この残渣はシリカゲルクロマトグラフィーで精製され、化合物14 (173 mg, 52.4%)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.06 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 4.20 - 4.11 (m, 4H), 3.88 - 3.81 (m, 2H), 3.74 - 3.56 (m, 6H), 3.04 (s, 6H), 2.40 (s, 3H). MS(ESI): m/z calcd for C28H32N2O7S 540.19; found 541.29 (M+H+).【０１１２】
（１５）4-(5-(2-(2-(2-フルオロエトキシ)エトキシ)エトキシ)ベンゾ [d]オキサゾール-2-イル)-N,N-ジメチルアニリン (化合物15) の合成
10 mLの乾燥テトラヒドロフラン(THF)中の化合物14 (54 mg, 0.1 mmol)に、無水TBAF (300 μL, 1 M in THF)が加えられた。反応混合物は、3時間還流された。THFの除去後、残渣はシリカゲルクロマトグラフィーで精製され、化合物15 (22 mg, 56.7 %)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCL3) δ 8.08 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 4.67 - 4.59 (m, 1H), 4.55 - 4.45 (m, 1H), 4.24 - 4.14 (m, 2H), 3.93 - 3.85 (m, 2H), 3.84 - 3.65 (m, 6H), 3.07 (s, 6H). HRMS(EI): m/z calcd for C21H25FN2O4 388.1798; found 388.1805 (M+H+).【０１１３】
（１６）[18F]7 及び [18F]15の標識化の手順
[18F]フッ化物は、JSW typeBC3015 サイクロトロンによって 18O(p,n)18F 反応で作り出され、18O濃縮水中の溶液としてSep-Pak Light QMA カートリッジ(Waters)を通過させた。カートリッジは、気流で乾燥され、18F-活性はK2CO3溶液(33 mM)で溶出させた。Kryptofix 222 (6 - 8 mg)は、[18F] フッ化物水溶液中に溶解させた。溶媒は、120℃、窒素気流下で除去された。残渣は、120℃、窒素気流下で、0.3 mLの無水アセトニトリルによって二回共沸して乾燥させられた。【０１１４】
[18F]7のために、CH3CN (0.2 mL)中のメシレート前駆体10 (1.0 mg)の溶液が、18F-活性を含む反応器に加えられた。混合物は、120℃で6分加熱された。溶液が室温まで冷やされた後、HCl(1 M 水溶液、0.2 mL)が加えられ、混合物は再度120℃で5分加熱された。K2CO3水溶液が、pHを塩基性(pH 8-9)に調整するために、加えられた。水(5 mL)が加えられ、混合物は、予め調整されたSep-Pak Plus PS-2 カートリッジ(Waters)を通された。カートリッジは、20 mLの水で洗浄され、標識された化合物は、3 mLのアセトニトリルで溶出された。溶媒が除去された後、残渣は、CH3CN中に溶かされ、精製のためHPLCに供された(Nakalai Tesque, 5C18-AR-II, 4.6 mm × 150 mm, CH3CN/water = 1/1; flow rate = 1 mL/min)。このHPLCシステムにおける[18F]7の保持時間は、8.22 分であった（図１８）。調製に60分要し、放射化学収率は30％（減衰補正されている）であった。【０１１５】
[18F]15のために、CH3CN (0.2 mL) 中のトシレート前駆体14の溶液が、18F-活性を含む反応器に加えられた。混合物は、120℃で6分加熱された。水(5 mL)が加えられ、混合物は、予め調整されたSep-Pak Plus PS-2 カートリッジ(Waters)を通された。カートリッジは、20 mLの水で洗浄され、標識された化合物は、3 mLのアセトニトリルで溶出された。溶出された化合物は、HPLC(Nakalai Tesque, 5C18-AR-II, 4.6 mm × 150 mm)によって精製された。このHPLCシステム(CH3CN/ water = 6/4; flow rate = 1 mL/min)における[18F]15の保持時間は、7.55 分であった（図１９）。調製に40分要し、放射化学収率は60％（減衰補正されている）であった。両トレーサーの放射化学的純度は98%以上であった。【０１１６】
（１７）分配係数の測定
放射性標識化合物([18F]化合物7 又は [18F]化合物15) (10 μCi)は、3 gのn-オクタノールと3gのPBS(0.05 M, pH = 7.4)を含む試験管中の予混合懸濁液に加えられた。試験管は3分間、室温でボルテックスされ、5分間、3000rpmで遠心分離された。n-オクタノール(100 μL)層とバッファー(500 μL)層からの二つの加重サンプルが測定された。分配係数は、n-オクタノール対PBSからのグラムあたりのカウントの比率の対数として表された。一貫した分配係数値が得られるまで、n-オクタノール層からのサンプルは再分配された。測定は三つ組で行われ、3回繰り返された。【０１１７】
（１８）Aβ凝集体を用いたin vitro結合アッセイ（図２０、表８）
阻害実験は、以前に記述される手順を幾つか修正した手順に従って、12×75mmのホウケイ酸塩ガラス管で行われた。手短に言うと、100μLの凝集したAβ繊維(最終アッセイ混合物中濃度：60 nM)が、適当な濃度の100μL の放射性リガンド([125I]IMPY)、10 μL のインヒビター（エタノール中の濃度が10-5-10-10 Mである。）及び790μL のPBS (0.2 M, pH = 7.4)を含み、最終的な容量が1 mLである混合物に加えられた。非特異的な結合は、1μMのIMPYの存在下で定義された。混合物は、2時間、37度で、絶えず揺らしながら、インキュベートされた。次に、結合及びフリーの放射性画分は、ホウケイ酸塩ガラス繊維フィルタ(Whatman GF/B)を通し、M-24 cell harvester (Brandel, Gaithersburg, MD)を用いた減圧濾過によって分離された。結合125Iリガンドを含むフィルタからの放射能は、70%の効率で、γ-カウンター(WALLAC/Wizard 1470, USA)で測定された。そのアッセイ条件下で、特異的結合画分は、総放射能の10%を占めた。半最大阻害濃度 (IC50)は、 GraphPad Prism 4.0を用いて決められ、阻害定数(Ki)はCheng-Prusoffの式: Ki = IC50/(1 + [L]/Kd)を用いて計算された。【０１１８】
【表８】
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【０１１９】
（１９）Tg マウス及びヒトAD脳を用いたin vitroオートラジオグラフィー（図２１、２２）
パラフィン包埋マウス脳切片(Tg: C57-APP/PS1, 12 months old, male; Wild-type: C57, 12 months old, male)とヒト脳切片(AD: 93 years old, female; Normal: 71 years old, male)は、2 × 20 分のキシレン中の洗浄、2 × 5 分の100 % エタノール中の洗浄、5 分の90 % エタノール/H2O中での洗浄、5 分80 % エタノール/H2O中での洗浄、5 分60 % エタノール/H2O中での洗浄、 及び 10 分の水道の流水中での洗浄によって脱パラフィン化され、次いで、PBS (0.2 M, pH = 7.4)中で30分間インキュベートされた。切片は、放射標識トレーサー(10 μCi / 100 μL)で1時間、室温でインキュベートされ、次いで、50 %エタノールで1時間洗浄され、1分水ですすがれた。乾燥後、標識された切片は、富士フイルムイメージングプレートに一晩露出された。in vitroオートラジオグラフィー画像は、BAS5000 scanner system (Fuji Film)を用いて得られた。切片中のプラークの存在と位置は、チオフラビンSを用いた蛍光染色又はモノクローナルAβ1-42 抗体であるBC05 (Wako)を用いた免疫組織化学的染色によって確認された。【０１２０】
（２０）正常ddYマウスを用いたin vivo体内分布実験（表９、１０）
体内分布実験は、正常な雄ddYマウス(5 weeks, 20-22 g, n = 5)中で行われ、animal care committee of Kyoto Universityによって認可された。放射標識トレーサー(10 μCi/100 μL saline, 5% EtOH)を含む生理食塩水は、尾に直接注入された。マウスは、注入後、様々な時点で屠殺された。目的の器官を摘出し、重さを計り、そして、自動γカウンター(WALLAC/Wizard 1470, USA)で放射能を測定した。湿組織のグラムあたりのパーセント線量は、適切に希釈された注入物質の分量への組織のカウントの比較によって計算された。【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
（２１）ADモデルマウスを用いた[18F]化合物7 及び [18F]化合物15のex vivoオートラジオグラフィー（図２３）
オートラジオグラフィーは、Tg2576トランスジェニックマウス(female, 18-month-old)と野生型マウス(female, 18-month-old)を用いて行われた。1.1 mCiの[18F]7 又は [18F]15の生理食塩水(100 μL, 5 % EtOH)は、in vivoで大腿静脈を通して注入され、動物は、30分後に断頭によって屠殺された。脳は摘出され、直ちに粉末ドライアイス中で凍らされた。20 μmの切片は、切り出され、BAS イメージングプレート(Fuji Film, Tokyo, Japan)に8時間露出された。オートラジオグラフィー画像は、BAS5000 scanner system (Fuji Film)を用いて得られた。オートラジオグラフィー検査の後、アミロイドプラークの存在は、in vitroでのチオフラビンSによる同一切片の染色によって確認された。【０１２４】
（２２）ADモデルマウス及び野生型マウスに関する[18F]7のマイクロPET研究（図２４、２５）
雌のTg2576マウス(C57BL6, 31-month-old)と雌の野生型マウス(C57BL6, 31-month-old)は、流速1-2 L/分の酸素中で、イソフルラン(1.5-2.5%によって麻酔され、1.1 mCiの [18F]7 (100 μL, 5 % EtOH)を尾の血管を通して注入された。動的マイクロPET画像は、60分間で得られ、RAMP フィルタによるフィルタ補正逆投影を用いて再構築された。データは、PMODソフトウェアを用いて分析され、目的の量(VOIs)は、要約された画像に関して定義され、時間放射能曲線（TACs）が描かれる。【０１２５】
〔実施例４〕  チオフェン環又はフラン環を持つ近赤外蛍光化合物
（１）5-ジメチルアミノ-2-チオフェンカルボキシアルデヒド（化合物101）の合成
5-ブロモ-2-チオフェンカルボキシアルデヒド (1g, 5.23 mmol)とジメチルアミン (1.64 mL, 15.69 mmol)を混和し、水 (3mL)を加えた。1時間加熱還流後、クロロホルムで抽出し、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル : ヘキサン = 1 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーにより精製し、203 mg (収率 : 25.0%)の化合物101を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.09 (s, 6H), 5.93 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 9.49 (s, 1H).【０１２６】
（２）5-ジメチルアミノ-2-フルアルデヒド（化合物102）の合成
5-ブロモ-2-フルアルデヒド (915 mg, 5.23 mmol)とジメチルアミン (1.64 mL, 15.69 mmol)を混和し、水 (3mL)を加えた。1時間加熱還流後、クロロホルムで抽出し、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル : ヘキサン = 3 : 2を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーにより精製し、322 mg (収率 : 44.3 %) の化合物102を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.07 (s, 6H), 5.24 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 8.97 (s, 1H).【０１２７】
（３）2-((5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)メチレン)マロノニトリル（化合物103, DTA-0)の合成
化合物101 (118 mg, 0.76 mmol) を2-プロパノールに溶解し、マロノニトリル  (50 mg, 0.76 mmol) およびピリジン (91 μL) を加え、4時間加熱還流した。反応終了後、反応溶液を室温に冷却し、析出した固体を吸引瀘取することで28 mg (収率 : 18.1%) の化合物103を得た。MS m/z 203 (M+).【０１２８】
（４）(E)-3-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)アクリルアルデヒド（化合物104）の合成
化合物102(360 mg, 2.32 mmol)と(1,3-ジオキサラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド (1919 mg, 4.47 mmol) をTHF (10 mL) に溶解し、NaH (230 mg, 9.6 mmol)および18-crown-6 (5 mg) を加え、室温で12時間撹拌した。濃塩酸 (1 mL)をゆっくり加えた後、飽和NaHCO3溶液で中和した。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル : ヘキサン = 1 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、315 mg (収率 : 74.9%) の化合物104を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.06 (s, 6H), 5.86 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 8.0, 15.0 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 9.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H).【０１２９】
（５）(E)-3-(5-(ジメチルアミノ)フラン-2-イル)アクリルアルデヒド（化合物105）の合成
化合物103(287 mg, 2.06 mmol)と(1,3-ジオキサラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド (1704 mg, 3.97 mmol) をTHF (10 mL) に溶解し、NaH (205 mg, 8.51 mmol)および18-crown-6 (5 mg) を加え、室温で12時間撹拌した。濃塩酸 (1 mL) をゆっくり加えた後、飽和NaHCO3溶液で中和した。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルム : メタノール = 99 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、103 mg (収率 : 30.2%) の化合物105を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.00 (s, 6H), 5.21 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.22 (dd, J = 8.2, 14.7 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 9.44 (d, J = 8.2 Hz, 1H).【０１３０】
（６）2-((E)-3-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)アリリデン)マロノニトリル（化合物106, DTA-1）の合成
化合物104(111 mg, 0.61 mmol)を2-プロパノールに溶解し、マロノニトリル(40 mg, 0.61 mmol) およびピリジン(73 μL)を加え、17時間加熱還流した。反応終了後、水を加え酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムを溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、93 mg (収率 : 66.2%) の化合物106を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.15 (s, 6H), 5.96 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 6.08 (dd, J = 12.4, 14.0 Hz, 1H), 7.18-7.21 (m, 2H), 7.33 (d, J = 11.9 Hz, 1H). MS m/z 229 (M+).【０１３１】
（７）2-((E)-3-(5-(ジメチルアミノ)フラン-2-イル)アリリデン)マロノニトリル（化合物107, DFA-1）の合成
化合物104 (38 mg, 0.23 mmol) を2-プロパノールに溶解し、マロノニトリル(15 mg, 0.23 mmol) およびピリジン(28 μL)を加え、1時間加熱還流した。反応終了後、水を加え酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルム : メタノール = 99 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、15 mg (収率 : 30.6%) の化合物107を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.12 (s, 6H), 5.40 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.55-6.70 (m, 2H), 6.93 (s, 1H), 7.29 (d, J = 11.9 Hz, 1H). MS m/z 213 (M+).【０１３２】
（８）(2E,4E)-5-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)ペンタ-2,4-ジエナール（化合物108）の合成
化合物105 (315 mg, 1.73 mmol)と(1,3-ジオキサラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド (1430 mg, 3.33 mmol) をTHF (10 mL) に溶解し、NaH (170 mg, 7.1 mmol)および18-crown-6 (5 mg) を加え、室温で23時間撹拌した。濃塩酸 (1 mL)をゆっくり加えた後、飽和NaHCO3溶液で中和した。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル : ヘキサン = 1 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、335 mg (収率 : 92.9%) の化合物108を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.02 (s, 6H), 5.78 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.08 (dd, J = 8.4, 14.6 Hz, 1H), 6.36 (dd, J = 10.8, 15.0 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 11.2, 15.0 Hz, 1H), 9.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H).【０１３３】
（９）(2E,4E)-5-(5-(ジメチルアミノ)フラン-2-イル)ペンタ-2,4-ジエナール（化合物109）の合成
化合物106(103 mg, 0.54 mmol)と(1,3-ジオキサラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド(447 mg, 2.23 mmol) をTHF (10 mL) に溶解し、NaH (53.3 mg, 2.23 mmol)および18-crown-6 (5 mg) を加え、室温で23時間撹拌した。濃塩酸 (1 mL)をゆっくり加えた後、飽和NaHCO3溶液で中和した。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル : ヘキサン = 1 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、26 mg (収率 : 21.8%) の化合物109を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ2.98 (s, 6H), 5.12 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.12 (dd, J = 8.2, 14.7 Hz, 1H), 6.48-6.60 (m, 3H), 7.17 (dd, J = 10.5, 14.7 Hz, 1H), 9.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H).【０１３４】
（１０）2-((2E,4E)-5-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)ペンタ-2,4-ジエニリデン )マロノニトリル（化合物110, DTA-2）の合成
化合物108(83 mg, 0.4 mmol) を2-プロパノールに溶解し、マロノニトリル  (26.4 mg, 0.4 mmol) およびピリジン (48 μL) を加え、12時間加熱還流した。反応終了後、水を加え酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムを溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、62 mg (収率 : 60.6%) の化合物110を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.09 (s, 6H), 5.87 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.32 (dd, J = 11.6, 14.6 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 12.4, 13.7 Hz, 1H), 6.94-7.05 (m, 3H), 7.35 (d, J = 12.0 Hz, 1H). MS m/z 255 (M+).【０１３５】
（１１）2-((2E,4E)-5-(5-(ジメチルアミノ)フラン-2-イル)ペンタ-2,4-ジエニリデン )マロノニトリル（化合物111, DFA-2）の合成
化合物109(26 mg, 0.13 mmol) を2-プロパノールに溶解し、マロノニトリル  (8.5 mg, 0.13 mmol) およびピリジン (16 μL) を加え、1.5時間加熱還流した。反応終了後、水を加え酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムを溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、12 mg (収率 : 36.3%) の化合物111を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.06 (s, 6H), 5.27 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 11.5, 14.2 Hz, 1H), 6.56-6.63 (m, 2H), 6.71 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 11.5, 13.7 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 11.9 Hz, 1H). MS m/z 239 (M+).【０１３６】
（１２）(2E,4E,6E)-7-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)ヘプタ-2,4,6-トリエナール（化合物112）の合成
化合物108 (335 mg, 1.62 mmol)と(1,3-ジオキサラン-2-イルメチル)トリフェニルホスホニウムブロミド(1336 mg, 3.11 mmol) をTHF (10 mL) に溶解し、NaH (159 mg, 6.6 mmol)および18-crown-6 (5 mg) を加え、室温で23時間撹拌した。濃塩酸 (1 mL)をゆっくり加えた後、飽和NaHCO3溶液で中和した。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル : ヘキサン = 1 : 1を溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、93 mg (収率 : 24.7%) の化合物112を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.01 (s, 6H), 5.76 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.09 (dd, J = 8.2, 15.1 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 11.0, 14.9 Hz, 1H), 6.38 (dd, J = 11.5, 14.7 Hz, 1H), 6.71-6.82 (m, 3H), 7.15 (dd, J = 11.5, 15.1 Hz, 1H), 9.52 (d, J = 7.8 Hz, 1H).【０１３７】
（１３）2-((2E,4E,6E)-7-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)ヘプタ-2,4,6-トリエニリデン)マロノニトリル（化合物113, DTA-3）の合成
化合物112(93 mg, 0.40 mmol) を2-プロパノールに溶解し、マロノニトリル  (26 mg, 0.40 mmol)およびピリジン (10 μL) を加え、21時間加熱還流した。反応終了後、水を加え酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。残渣をクロロホルムを溶出溶媒とする中圧分取クロマトグラフィーによって精製し、66 mg (収率 : 53.5%) の化合物113を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.04 (s, 6H), 5.81 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.30-6.37 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 11.9, 14.0 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 11.5, 14.2 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 11.9, 14.2 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 11.9 Hz, 1H). MS m/z 281 (M+).【０１３８】
（１４）蛍光波長測定
DTAおよびDFA誘導体を10μMになるようにクロロホルムに溶解し、各化合物のクロロホルム中の吸収、励起および蛍光波長の測定を行った。結果を下表に示す。【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
（１５） Aβ(1-42)凝集体の調製
PBS (pH 7.4) を用い、Aβ(1-42) が 0.25 mg/mL の濃度になるように調製した。37℃で42時間インキュベートすることにより、Aβ(1-42)凝集体溶液を調製した。凝集体溶液は実験に用いるまで、-80℃で保存した。【０１４１】
（１６）Aβ凝集体を用いた蛍光飽和実験 : Kd値の算出
PBS (168 μL)、0 - 37.5 μMに希釈したサンプル溶液 (30 μL) を混和し、最後に25 μg/mLのAβ凝集体溶液 (132 μL) を加えてボルテックスし、30分間室温で静置した。プレートリーダー (Tecan) でそれぞれに適した励起・蛍光波長で測定し、Graph Pad Prism4.0で飽和曲線を作成しKd値を求めた。結果を下表に示す。【０１４２】
【表１２】
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【０１４３】
DTA1-3およびDFA-1,2はAβ凝集体に対して結合親和性を有した。一方、DTA-0はAβ凝集体に対する結合親和性を示さなかった。【０１４４】
（１７）Tg2576マウスの脳切片を用いた蛍光染色
アミロイド前駆蛋白質を過剰発現するモデルマウスとして、Tg2576マウス (28ヶ月齢) を選択した。DTAおよびDFA誘導体を50%EtOH溶液を用いて100 μMに希釈した。化合物溶液 (150 μL) と5分間反応させた後、50%EtOHで1分×2回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。さらに、隣接切片においてチオフラビンS溶液 (150 μL) と反応させ、上記と同様の方法で洗浄、観察を行った。結果を図２７に示す。【０１４５】
DTA-0を除く5種の化合物は、モデルマウス脳切片上に蓄積したアミロイド斑に対して選択的に結合した。また、隣接切片を用いてチオフラビンSで染色したところ、各化合物の染色部位と一致した。この結果は、蛍光飽和実験の結果を反映する物であった。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
ADの診断を目的としたAβのイメージング試薬の開発、Aβを標的とする治療薬の開発支援、AD患者のAβの蓄積を指標とした病状判定、などに利用できる。【０１４７】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2011-182148号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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