(57)【要約】  多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の製造方法が開示されている。当該方法は，（ａ）歯髄懸濁物を，細胞増殖能が抑制された支持細胞を含んだ支持細胞培養用容器中で，該支持細胞の通過を阻止できる微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該支持細胞培養用容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく培養するステップと，（ｂ）該膜上で増殖した細胞を回収するステップとを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の製造方法であって，
（ａ）歯髄懸濁物に含まれる歯髄由来細胞を，細胞増殖能が抑制された支持細胞を含んだ支持細胞培養用容器中で，該支持細胞の通過を阻止できる微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該支持細胞培養用容器に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく培養するステップと，
（ｂ）該膜上で増殖した細胞を回収するステップとを含む，製造方法。
【請求項２】
請求項１の製造方法であって，
（ｃ）該回収された細胞を，細胞増殖能が抑制された支持細胞を含んだ支持細胞培養用容器中で，該支持細胞の通過を阻止できる微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該支持細胞培養用容器に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく培養するステップと，
（ｄ）該膜上で増殖した細胞を回収するステップとを，更に少なくとも１回行うことを含む，請求項１の製造方法。
【請求項３】
該膜が，フィブロネクチン又はコラーゲンでコートされたものである，請求項１又は２の方法。
【請求項４】
該微細孔の孔径が，平均０．１〜１．５μｍである，請求項１〜３の何れかの製造方法，
【請求項５】
該支持細胞が，マイトマイシンＣによって細胞増殖能が抑制された哺乳動物細胞である，請求項１〜４の何れかの製造方法。
【請求項６】
該哺乳動物細胞が，ＮＩＨ３Ｔ３細胞である，請求項５の製造方法。
【請求項７】
該培養が，１０〜２５％ウシ胎児血清及び３〜５ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むダルベッコの修正イーグル培地であって，グルコース濃度が５〜７ｍＭである培地を用いて行われるものである，請求項１〜６の何れかの製造方法。
【請求項８】
該培養が，２０％ウシ胎児血清及び４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むダルベッコの修正イーグル培地であって，グルコース濃度が５．５〜５．７ｍＭである培地を用いて行われるものである，請求項１〜６の何れかの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかの製造方法により細胞を回収し，回収された細胞を，1000〜20000細胞／ｃｍ２の密度で培養容器に加え，該培養容器の底面における該細胞の占める割合が70〜100％となるまで培養するステップを更に含む，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れかの方法により細胞を回収し，回収された細胞を，5000〜10000細胞／ｃｍ２の密度で培養容器に加え，該培養容器の底面における該細胞の占める割合が90〜100％となるまで培養するステップを更に含む，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかの方法で得られる，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞。
【請求項１２】
表面抗原マーカーが、CD29，CD44，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり、且つCD34及びCD45が陰性である、上記１１の細胞。
【請求項１３】
軟骨分化能及び骨芽分化能を有し，且つＴ細胞増殖抑制能を有するものである，請求項１２の細胞。
【請求項１４】
１０回以上の分裂能を有する，請求項１１〜１３の何れかの細胞。
【請求項１５】
請求項１１〜１４の何れかの細胞を含んでなる免疫抑制剤。
【請求項１６】
請求項１１〜１４の何れかの細胞を含んでなるＴ細胞増殖抑制剤。
【請求項１７】
請求項１１〜１４の何れかの細胞を含んでなる移植片対宿主病治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，歯髄から得られる多能性幹細胞に関し，詳しくは，軟骨細胞，骨芽細胞への分化能を有し，且つＴ細胞増殖抑制能を有する，歯髄由来の多能性幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数系統の細胞への分化能を有する幹細胞（多能性幹細胞）は，種々の組織から得られることが知られている。骨髄から単離される間葉系幹細胞はその一つであり，骨細胞，心筋細胞，軟骨細胞，脂肪細胞等，種々の細胞に分化する能力を有している（特許文献１〜４）。この分化能を利用して，種々の組織の再生医療への間葉系幹細胞の応用が試みられている。例えば，心筋梗塞により壊死した心筋細胞を再生させるため，間葉系幹細胞の心筋梗塞患者への投与が試みられ，それにより患者の心機能が改善したとの報告がなされている（非特許文献１）。【０００３】
また間葉系幹細胞は，生体内に投与することでＴ細胞を介した免疫反応を制御することができ，移植時における拒絶反応を抑制する薬剤として使用できることも知られている（特許文献５）。このような，間葉系幹細胞の有する拒絶反応を抑制する効果に着目して，米国では，骨髄移植の際に起こる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に対する，ヒト間葉系幹細胞の治療効果を調べるための臨床試験が実施されている（非特許文献２及び３）。これらの臨床試験では，患者にとって同種異系のヒト間葉系幹細胞が用いられている。【０００４】
間葉系幹細胞を，血管新生，自己免疫疾患，炎症応答（アルツハイマー病，パーキンソン病，脳卒中，脳細胞傷害，乾癬，慢性皮膚炎，接触性皮膚炎，骨関節炎，関節リウマチその他の関節炎，炎症性腸疾患，慢性肝炎におけるもの），癌，アレルギー性疾患，敗血症，外傷（火傷，手術，移植），各種組織・臓器の炎症（角膜，水晶体，色素上皮，網膜，脳，脊髄，妊娠中の子宮，卵巣，精巣，副腎）に対して使用することも提唱されている（特許文献６）。しかしながら，同文献では，間葉系幹細胞の機能がin vitroで調べられているに過ぎず，生体内における間葉系幹細胞の効果は評価されていない。【０００５】
骨髄から単離された間葉系幹細胞は，人工培地中で高い増殖能を有し，他の培養細胞と同様に，凍結状態で保存して供給することができる（特許文献７）。従って，ＧＶＨＤに対する同種異系のヒト間葉系幹細胞の臨床試験において，間葉系幹細胞は，凍結状態で医療機関に供給され，患者に投与する直前に解凍されて用いられている。【０００６】
間葉系幹細胞は，骨髄中に限らず，脂肪組織（特許文献８），胎盤組織又は臍帯組織（特許文献９）等，種々の組織から取得できることが知られている。また間葉系幹細胞（若しくはそれに類する細胞）は，歯髄（特許文献１０〜１３，２０），歯小嚢（特許文献１４），歯嚢（特許文献１５，２０），歯乳頭（特許文献１６），歯根膜（特許文献１７）等，種々の歯組織からも取得できる。これらの間葉系幹細胞は，一般に脂肪細胞への分化能を有するとされている。【０００７】
歯髄からの間葉系幹細胞の取得は，概ね以下の手順で行われる（特許文献１９）。抜歯体を破砕して得られた組織をＩ型コラゲナーゼとディスパーゼで処理し，フィルターに通して細胞塊を除去し，細胞の懸濁液を得る。次いで細胞を20％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて培養フラスコ内で増殖させる。培養フラスコの内面に固着して増殖した細胞を，トリプシン処理して剥がし，これを回収する。こうして回収された細胞が間葉系幹細胞である。また，歯髄由来の間葉系幹細胞を培養するための無血清培地についての報告もある（特許文献１８）。【０００８】
歯髄は，歯の歯髄腔を満たす疎繊維性結合組織であり，存在部位により冠部歯髄と根部歯髄に区分される。また歯髄には，間葉系幹細胞以外の多能性を有する未分化細胞が存在する可能性がある。従って，歯髄からは，間葉系幹細胞以外の未分化細胞に由来する，間葉系幹細胞とは性状の異なる多能性幹細胞も取得し得る。このことは，歯髄由来の幹細胞は，脂肪細胞に分化しないとの報告があることからも裏付けられる（特許文献１１）。すなわち，歯髄から取得される幹細胞には，少なくとも，脂肪細胞への分化能の有無により区別される，少なくとも２種類のものが存在すると考えられる。また，乳歯の歯髄から取得される幹細胞は，永久歯の歯髄から取得されるものと比較して，高い増殖能を有し，ＦＧＦ２，ＴＧＦ−β，コラーゲンＩ及びコラーゲンIIIを高発現する等，永久歯の歯髄に存在する幹細胞とは性状が異なることも報告されている（特許文献１９）。その他，歯髄由来の多能性幹細胞は，骨芽細胞への分化誘導に関し，骨髄由来の間葉系幹細胞と性質が異なることを示す報告もある（特許文献２０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５４８６３５９号
【特許文献２】米国特許第５８２７７４０号
【特許文献３】米国特許第６８３５３７７号
【特許文献４】米国特許第６３８７３６９号
【特許文献５】米国特許第６３２８９６０号
【特許文献６】ＷＯ２００５／０９３０４４
【特許文献７】ＷＯ２００９／０５７５３７
【特許文献８】特開２００４−１２９５４９
【特許文献９】特開２００４−２１０７１３
【特許文献１０】特開２０１０−２５２７７８
【特許文献１１】ＷＯ２００２／００７６７９
【特許文献１２】特表２００８−５０７９６２
【特許文献１３】ＷＯ２００９／０７２５２７
【特許文献１４】特表２００９−５２７２２３
【特許文献１５】特表２００５−５１６６１６
【特許文献１６】特開２００６−２３８８７５
【特許文献１７】特開２００８−２９５４２０
【特許文献１８】特開２０１１−１７７１４０
【特許文献１９】特開２０１０−２６８７１５
【特許文献２０】特開２００４−２０１６１２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Katritsis DG. et. al., Catheter Cardiovasc Interv. 65(3): 321-9 (2005)
【非特許文献２】Ringden O. et. al., Transplantation. 81(10): 1390-7 (2006)
【非特許文献３】Zhou H. et. al., Biol Blood Marrow Transplant. 16(3): 403-12 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記背景の下で，本発明の一目的は，ヒト歯髄由来の多能性幹細胞が高い割合を占る細胞の集合を得るための方法を提供することである。本発明の更なる一目的は，軟骨細胞及び骨芽細胞への分化能及びＴ細胞増殖抑制能を共に有するヒト歯髄由来の多能性幹細胞が高い割合を占る細胞の集合を得るための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的に向けた研究において，本発明者は，歯髄から取得した細胞を，支持細胞存在下に培養して得られる増殖能の高い細胞が，軟骨細胞及び骨芽細胞への分化能及びＴ細胞増殖抑制能を共に有する多能性幹細胞であることを見出し，これに基づき本発明を完成させた。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の製造方法であって，
（ａ）歯髄懸濁物に含まれる歯髄由来細胞を，細胞増殖能が抑制された支持細胞を含んだ支持細胞培養用容器中で，該支持細胞の通過を阻止できる微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該支持細胞培養用容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく培養するステップと，
（ｂ）該膜上で増殖した細胞を回収するステップとを含む，製造方法。
（２）上記１の製造方法であって，
（ｃ）該回収された細胞を，細胞増殖能が抑制された支持細胞を含んだ支持細胞培養用容器中で，該支持細胞の通過を阻止できる微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該支持細胞培養用容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく培養するステップと，
（ｄ）該膜上で増殖した細胞を回収するステップとを，更に少なくとも１回行うことを含む，上記１の製造方法。
（３）該膜が，フィブロネクチン又はコラーゲンでコートされたものである，上記１又は２の方法。
（４）該微細孔の孔径が，平均０．１〜１．５μｍである，上記１〜３の何れかの製造方法，
（５）該支持細胞が，マイトマイシンＣによって細胞増殖能が抑制された哺乳動物細胞である，上記１〜４の何れかの製造方法。
（６）該哺乳動物細胞が，ＮＩＨ３Ｔ３細胞である，上記５の製造方法。
（７）該培養が，１０〜２５％ウシ胎児血清及び３〜５ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むダルベッコの修正イーグル培地であって，グルコース濃度が５〜７ｍＭである培地を用いて行われるものである，上記１〜６の何れかの製造方法。
（８）該培養が，２０％ウシ胎児血清及び４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むダルベッコの修正イーグル培地であって，グルコース濃度が５．５〜５．７ｍＭである培地を用いて行われるものである，上記１〜６の何れかの製造方法。
（９）上記１〜８の何れかの製造方法により細胞を回収し，回収された細胞を，1000〜20000細胞／ｃｍ２の密度で培養容器に加え，該培養容器の底面における該細胞の占める割合が70〜100％となるまで培養するステップを更に含む，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の製造方法。
（１０）上記１〜８の何れかの方法により細胞を回収し，回収された細胞を，5000〜10000細胞／ｃｍ２の密度で培養容器に加え，該培養容器の底面における該細胞の占める割合が90〜100％となるまで培養するステップを更に含む，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞胞の製造方法。
（１１）上記１〜１０の何れかの方法で得られる，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞。
（１２）表面抗原マーカーが，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり，且つCD34及びCD45が陰性である，上記１１の細胞。
（１３）軟骨分化能及び骨芽分化能を有し，且つＴ細胞増殖抑制能を有するものである，上記１２の細胞。
（１４）１０回以上の分裂能を有する，上記１１〜１３の何れかの細胞。
（１５）上記１１〜１４の何れかの細胞を含んでなる免疫抑制剤。
（１６）上記１１〜１４の何れかの細胞を含んでなるＴ細胞増殖抑制剤。
（１７）上記１１〜１４の何れかの細胞を含んでなる移植片対宿主病治療剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば，多能性幹細胞の占める割合を高めたヒト歯髄由来細胞を，効率よく取得することができる。また，得られるヒト骨髄由来の多能性幹細胞は，軟骨細胞及び骨芽細胞への分化能を有し，且つＴ細胞増殖抑制能を有する。 
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｐ０培養及びプレ拡大培養における培養容器のセッティングを模式的に示す図。
【図２】拡大培養における多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の増殖能を示す図。縦軸：拡大培養における細胞の積算分裂回数（回），横軸：拡大培養の回数。
【図３】歯髄由来多能性幹細胞のＴ細胞増殖抑制能を示す図。縦軸：チミジン取込み量（対コントロール％），横軸：多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞の細胞密度。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において，歯髄というときは，血管，神経及びリンパ管を含む結合組織と，辺縁部において，象牙質の内側からの沈積と修復を行う能力のある象牙芽細胞層からなる，歯の歯髄腔を満たす疎繊維性結合組織のことをいう。また歯髄は，存在部位により冠部歯髄と根部歯髄に区分することができるが，本発明において歯髄というときは，少なくとも冠部歯髄又は根部歯髄いずれか一方を含むものをいう。
【００１６】
本明細書において，歯髄を取得するための抜歯体は，好ましくは抜歯後２４時間以内，より好ましくは抜歯後１２時間以内のものが用いられる。抜歯体から取り出した歯髄は，ハサミ等の器具を用いて細断された後，タンパク質分解酵素により処理される。このとき用いられるタンパク質分解酵素は，好ましくは，コラゲナーゼタイプIIとディスパーゼの混合液であり，その濃度はそれぞれ，好ましくは１〜２ｍｇ／ｍＬと3000〜7000 単位／ｍＬ，より好ましくは約1.5ｍｇ／ｍＬと約5000単位／ｍＬである。また，タンパク質分解酵素による処理温度は，好ましくは３５〜３７℃，処理時間は１〜３時間である。次いで，タンパク質分解酵素処理後の歯髄をピペッティング等によりほぐすことによって，歯髄懸濁物を得る。歯髄懸濁物は，タンパク質分解酵素を上清とともに除去するため，一旦遠心して細胞等を沈殿させることが好ましい。沈殿させた細胞等は，上清を除去した後，培地に再び懸濁される。このようにして得られる歯髄懸濁物には，歯髄から遊離した細胞に加え，歯髄の組織片も含まれる。本発明において，歯髄懸濁物に含まれる歯髄由来細胞というときは，歯髄懸濁物に含まれる歯髄から遊離した細胞と歯髄の組織片とを合わせたものをいう。
【００１７】
本明細書において，「多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞」とは，ヒト歯髄由来の細胞であって，ヒト歯髄から直接採取される細胞に比して多能性幹細胞の占める割合（個数割合）を高めた，ヒト歯髄由来の細胞の集合をいい，ヒト歯髄から培養等による選択を経て最終的に得られる単離された多能性幹細胞を包含する。
【００１８】
本発明において，支持細胞というときは，歯髄を培養する際に，歯髄に含まれる細胞の増殖を促進するために用いられる細胞のことをいう。支持細胞は，培地中に不足する栄養分や特殊な成長因子を補給等することにより，多能性幹細胞の増殖を促進する機能を有する。支持細胞は，使用に際して，予めその細胞増殖能が抑制されるように処理される。このような処理の方法としては，細胞内におけるＤＮＡの複製を阻害する薬剤による処理，Ｘ線照射等がある。細胞内におけるＤＮＡの複製を阻害する薬剤としては，マイトマイシンＣが好適に使用できる。支持細胞として使用できる細胞としては，歯髄に含まれる多能性幹細胞の増殖を促進できるものである限り，特に制限はないが，ＮＩＨ３Ｔ３細胞，ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞，Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３，間葉系幹細胞等が好適であり，ＮＩＨ３Ｔ３細胞が特に好適である。ここで，支持細胞として使用することのできる間葉系幹細胞は,米国特許公報第５４８６３５９号に開示されている手法で得られる，ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞等である。
【００１９】
本発明において，支持細胞を培養するために用いられる支持細胞培養用容器は，哺乳動物を培養できるものである限り特に制限はないが，細胞を固着させて培養できるものが好ましい。支持細胞としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合，支持細胞培養用容器に加えられた支持細胞は，当該容器の底面に固着する。支持細胞培養用容器の形状は，特に限定はないが，平底の皿型のものが好適である。このような平底の皿型の培養容器としては，例えば，市販の２４プレート，１２ウェルプレート，６ウェルプレート等がある。また，支持細胞培養用容器の底面は，細胞が固着し易いように，フィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等の細胞接着性糖タンパク質，又はこれら細胞接着性糖タンパク質の細胞接着活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドでコーティングされていることが好ましい。
【００２０】
支持細胞培養用容器の内部には，微細孔を有し且つ支持細胞の通過を阻止することができる膜が取り付けられる。この膜は，支持細胞培養用容器の内部に，培養容器の底面と概ね水平に，その下方に支持細胞の培養スペースを確保でき且つその下側面が支持細胞と接触しないように取り付けられる。この膜の材質としては，ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートが好適であり，ポリエチレンテレフタレートが特に好適である。この膜が有する微細孔は，支持細胞の（及び好ましくは更に多能性幹細胞の）通過は阻止するが，培地に溶質として含まれる液性成分は通過することができる孔径のものである。微細孔の孔径は，好ましくは，0.1〜1.5μｍ，より好ましくは0.2〜1.2μｍ，更に好ましくは0.4〜1.0μｍである。支持細胞は（及び多能性幹細胞も）これらの孔径を大きく超えるサイズであるため，浮遊するものがあっても膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，膜を通過する。また，この膜は，予めフィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等でコートしておくことが好ましい。
【００２１】
培養は，この膜上に上記の歯髄懸濁物を添加して行われる。培養時には，膜上に添加された歯髄懸濁物に含まれる細胞が培地に完全に覆われるよう，必要に応じて培地が容器に加えられる。すなわち，当該膜を挟んで下側に支持細胞（但し，膜とは非接触である），上側に歯髄懸濁物が存在する状態で培養が行わる。培養中，支持細胞に由来する成長因子等の成分が，膜の微細孔を通して，膜の上側にも供給される。また，歯髄懸濁物に含まれる組織片から分泌される成分も培地に供給される。従って，歯髄懸濁物を調製するとき，先行技術文献，例えば，特許文献１０，１９等に開示されているように，歯の懸濁物をメッシュ等に通過させて組織片を除去することは好ましくない。何故なら，組織片も，支持細胞と同様に培地中に不足する栄養分や特殊な成長因子を補給し得るからである。
【００２２】
歯髄の培養に用いられる培地は，好ましくは１０〜２５％ウシ胎児血清，３〜５ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン及び５〜７ｍＭのＤ−グルコースを含むダルベッコの修正イーグル培地であり，より好ましくは２０％ウシ胎児血清，４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン及び５．５〜５．７ｍＭのＤ−グルコースを含むダルベッコの修正イーグル培地である。表１は該培地の詳細な組成の一例を示す。各成分は，その等化物に置換可能である。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本明細書において，上記の歯髄懸濁物を，支持細胞培養用容器の内部に取り付けた膜上に添加して開始される培養を，歯髄由来細胞の初代培養（Ｐ０培養）という。Ｐ０培養は，好ましくは，膜上で細胞増殖により形成されたコロニーを目視により観察できるまで行われる。Ｐ０培養中，支持細胞は同一である必要はなく，支持細胞を交換しつつ，例えば，上記膜を膜上の細胞及び組織片ごと新たな支持細胞培養用容器に移し替えつつ，行ってもよい。培養中に支持細胞が支持細胞培養用容器の底面から剥離するようになった場合には，そのような移し替えを行うのが好ましい。
【００２５】
膜上にコロニー形成を確認した場合，膜を（培養に用いたのと同じ若しくは異なる適宜の培地又は細胞に悪影響を及ぼす懸念のない緩衝液等の洗浄液で）洗浄して浮遊細胞及び組織片を取り除いた後，コロニー形成した細胞を膜の表面から剥離して回収する。細胞の回収は，容器に接着する培養細胞一般の回収の場合と同様，慣用の方法で，すなわちトリプシン等のタンパク質分解酵素を添加し，コロニーを形成した細胞を膜から剥離して懸濁させると共に酵素反応を常法により停止させることにより行うことができる。回収した細胞は，支持細胞培養用容器中で，Ｐ０培養と同様の条件で（但し，歯髄の組織片は含めずに），再度膜上に添加して培養される。本明細書において，この培養を歯髄由来細胞の「プレ拡大培養」という。プレ拡大培養は少なくとも１回行うことが好ましい。
【００２６】
Ｐ０培養及びプレ拡大培養において，歯髄由来の細胞のうち多能性幹細胞が最も活発に膜上で増殖する。そのため，膜上で増殖した細胞を回収することにより，ヒト歯髄に元々含まれる他の細胞に比べ，多能性幹細胞の占める割合が大幅に増大した細胞の集合である，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞を得ることができる。
【００２７】
また，プレ拡大培養を反復する度に（又は後述の拡大培養を行う）度に，回収される多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞における多能性幹細胞の占める割合は，多能性幹細胞の増殖速度の速さのため急速に増大するから，培養回数を経ることで，単離された多能性幹細胞が得られる。
【００２８】
プレ拡大培養を複数回行う場合，直前のプレ培養で膜上に形成されたコロニーを回収して得られる細胞懸濁液を，新たな支持細胞培養用容器中で，新たな膜上に添加して行われる。プレ拡大培養の実施回数に特に上限はない。後述の拡大培養に用いるだけの多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞が取得できればよいから，複数回行う場合でも，一般には，２回〜５回程度で十分である。
【００２９】
十分な細胞数の多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞が確保された後は，これを拡大培養に付すことができ，拡大培養は，必要とする細胞数の多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞が確保されるまで繰り返すことができる。
【００３０】
本明細書において，「拡大培養」とは，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞（特に，多能性幹細胞）の細胞数を増やすために支持細胞不存在下で行う培養をいう。多能性幹細胞は，一般に，細胞培養の開始時点における細胞の培養容器中での密度が，ある一定以上の場合に，支持細胞不存在下でも増殖が活発となる。そのような細胞密度は，多くの場合少なくとも500細胞／ｃｍ２，好ましくは1000細胞／ｃｍ２以上であり，より好ましくは3000細胞／ｃｍ２以上，更に好ましくは5000細胞／ｃｍ２以上である。なお，ここでいう細胞の密度は，拡大培養の開始時に培養容器に播種される細胞懸濁液に含まれる生細胞数を，培養容器の底面積で除することにより，求められる。
【００３１】
拡大培養においては，多能性幹細胞は培養容器に固着して増殖させる。従って，拡大培養で用いる培養容器は，哺乳動物を固着させて培養できるものであり，その底面は，細胞が固着し易いように，フィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等の細胞接着性糖タンパク質，又はこれら細胞接着性糖タンパク質の細胞接着活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドでコーティングされていることが好ましい。そのような容器として，動物細胞の培養容器として市販されているものを用いることができる。拡大培養で用いる培養容器の形状は，細胞を固着させて培養できるものである限り特に限定はなく，平底の皿型のものが好適であるが，ローラーボトルタイプのものでもよい。
【００３２】
拡大培養において，細胞は，培養開始時の細胞の密度が，好ましくは1000〜20000細胞／cm2，好ましくは3000〜15000細胞／cm2，より好ましくは5000〜10000細胞／cm2となるように培養容器に播種され，培養容器の底面において細胞の占める割合が，好ましくは70〜100％，より好ましくは80〜100％，更に好ましくは90〜100％となるまで培養されるか，若しくは，好ましくは５〜１０日間，より好ましくは６〜８日間，更に好ましくは７日間培養される。培養後の細胞は，トリプシン等により処理することにより培養容器から回収され，回収された細胞数が所望の量に達するまで，拡大培養により繰り返して培養される。拡大培養においても，多能性幹細胞が最も活発に増殖することから，拡大培養により得られる細胞は，結果として，実質的に多能性幹細胞のみにより構成される。拡大培養により得られる多能性幹細胞は，培養容器に固着した状態で観察したとき，好ましくは均質な紡錘状の形状を呈する。
【００３３】
本発明において多能性幹細胞というときは，増殖能を有し，且つ少なくとも２種以上の細胞への分化能を有する細胞のことをいう。本発明により得られるヒト歯髄由来の多能性幹細胞は，好ましくは，軟骨細胞及び骨芽細胞への分化能を有する。また，本発明により得られるヒト歯髄由来の多能性幹細胞は，表面抗原マーカーの発現パターンが，ヒト間葉系幹細胞と同様に，概ねCD29，CD44，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり，且つCD34及びCD45が陰性である。
【００３４】
本発明における拡大培養において，ヒト歯髄由来の多能性幹細胞は培養開始時から40回以上分裂することが確認されている（実施例参照）。従って，例えば，１個の多能性幹細胞から，理論上，約１×1012以上の細胞を得ることが可能である。このような高い分裂能を有する多能性幹細胞は，材料となる抜歯体の入手が比較的容易なこともあり，骨髄由来の間葉系幹細胞等の多能性幹細胞と比較して，多能性幹細胞の供給源として有力である。但し，多能性幹細胞の増殖能は，分裂を繰り返すに従って低下することから，特に高い増殖能を有する多能性幹細胞を必要とする場合には，拡大培養の回数は，好ましくは12回以下，更に好ましくは10回以下，最も好ましくは５回以下に止められる。
【００３５】
本発明により増殖させて得られる歯髄由来の多能性幹細胞は，骨芽細胞及び軟骨細胞への分化能を有する。従って，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞（最終的に単離されたヒト歯髄由来多能性幹細胞を含む）は，骨及び軟骨組織の破壊をもたらす疾患において，それらの再生を促すための治療薬として使用することができる。また当該多能性幹細胞はＴ細胞増殖抑制能，ひいては免疫抑制作用を有することから，多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞を，Ｔ細胞増殖抑制剤，免疫抑制剤として使用することもできる。当該細胞をＴ細胞増殖抑制剤又は免疫抑制剤として使用する場合，その対象疾患は，例えば，自己免疫疾患（ギランバレー症候群，自己免疫性膵炎，インスリン依存性糖尿病，関節リウマチ，全身性エリテマトーデス等），移植片対宿主病等である。
【００３６】
本発明における多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞は，治療薬として使用する場合，懸濁液の状態で，点滴静注されるか，又は局所に注入される。また，歯髄の提供者である本人に自家投与ができるのみならず，歯髄の提供者以外の他人に他家投与することも可能である。
【００３７】
他家投与を想定する場合，本発明における多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞は，複数の提供者から得た複数の抜歯体を用いて大量に製造して凍結貯蔵しておくことができる。この場合，製薬会社等の製造業者が，それらの細胞を大量に製造して凍結貯蔵し，これを治療薬として，医療機関からの要望に応じて供給することが可能となる。凍結された多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞は，医療機関において解凍されて患者に投与される。
【実施例】
【００３８】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００３９】
〔支持細胞の準備〕
DMEM Low Glucose（Invitrogen社）にFBS（Invitrogen社）とＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを各々終濃度が10％と4mMとなるように添加し，これをDMEM（10％FBS）培地とした。マイトマイシンＣ（SIGMA社）を注射用水で0.2mg/mLの濃度となるように溶解し，これをマイトマイシンＣ溶液とした。また，DMEM Low Glucose（Invitrogen社）にFBS（Invitrogen社）とＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを各々終濃度が20％と4mMとなるように添加し，これをDMEM（20％FBS）培地とした。【００４０】
液体窒素中で凍結保存されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を取り出し，37℃に設定した恒温槽で解凍した。次いで，DMEM（10％FBS）培地を加えて細胞を懸濁し，遠心（1500rpm, 5分）した。上清を捨て，細胞をDMEM（10％FBS）培地で懸濁し，これを75cm2培養フラスコに播種し，細胞の密度が80〜90％に到達するまで，5％CO2存在下，37℃で培養した。細胞をダルベッコリン酸緩衝液（D-PBS，Invitrogen社）で洗浄し，次いで9.6mLのDMEM（10％FBS）培地に0.4mLのマイトマイシンＣ溶液を添加した培地を培養フラスコに加え，5％CO2存在下，37℃で静置した。培地を除去した後，細胞をD-PBSで洗浄し，次いで0.25％トリプシン-EDTA溶液を1mL添加し，37℃に5〜10分間静置し細胞の剥離を確認した後，DMEM（10％FBS）培地を添加して反応を停止させ，細胞を懸濁させた後，血球計算盤にて生細胞数をカウントした。細胞を15mL遠沈管に回収し，遠心（1500rpm, 5分）して細胞を沈殿させ，次いで10％（v/v）DMSOを含む血清溶液で細胞濃度を1×106個/mLとなるように懸濁し，これを2mLずつ細胞凍結保存用チューブに分注した後，-80℃で凍結した。細胞を，-80℃に24時間以上置いた後，液体窒素中に移して保存した。これを支持細胞とした。【００４１】
使用前に支持細胞を液体窒素中から取り出して解凍し，DMEM（20％FBS）培地を添加して懸濁させた後，遠心（1500rpm, 10分）して沈殿させた。次いで支持細胞をDMEM（20％FBS）培地に4×104個/mLの濃度で懸濁させ，セルカルチャーインサートコンパニオンプレート 12ウェル（12ウェルコンパニオンプレート，BD Biosciences社）のボトムウェルに，1ウェル当たり，500μLずつ添加し，ウェルの底面に細胞を固着させた。【００４２】
〔歯髄の単離〕
4mLのD-PBSに，12mgのコラゲナーゼタイプII（CALBIOCHEM社）を加えて混和した後，0.22μmフィルターに通し，これをコラゲナーゼ溶液とした。1mLのD-PBSに，10000 単位のディスパーゼ（合同酒精）を加えて混和した後，0.22μmフィルターに通し，これをディスパーゼ溶液とした。【００４３】
インフォームドコンセントを得て取得した抜歯体を，リンゲル液で軽く洗浄した後，10cmシャーレに移した。シャーレに生理食塩水を加えて抜歯体を洗浄し，次いで0.5％クロルヘキシジン溶液を加えて振とうし，抜歯体の表面を殺菌した。次いで，抜歯体を無菌環境下におき，0.5％クロルヘキシジンが十分に除去されるまで滅菌した生理食塩水で洗浄した。生理食塩水を除いてから，滅菌した歯科用ペンチ及びピンセットを用いて抜歯体を分割して歯髄を暴露させた。歯髄を，手術用ハサミで切除し，これを遠沈管に移し，更に手術用ハサミを用いて細かく切断した。次いで，遠沈管にディスパーゼ溶液及びコラゲナーゼ溶液をそれぞれ150μLずつ添加した後，ピペッティングにより組織を十分にほぐし，37℃下で1〜2時間放置した。【００４４】
次いで，DMEM（20％FBS）培地を5mL添加して酵素反応を停止させ，遠心（1500rpm, 10分）して細胞等を沈殿させた。上清を除去し，得られた沈殿物にDMEM（20％FBS）培地を5mL添加して細胞等を懸濁させ，再度遠心（1500rpm, 10分）して細胞等を沈殿させた。沈殿物に，500μLのDMEM（20％FBS）培地を添加し，ピペッティングで十分に懸濁させて，組織片を含む歯髄由来細胞の懸濁液を得た。【００４５】
〔歯髄由来細胞の初代培養（Ｐ０培養）〕
0.4μm径の孔を有するポリエチレンテレフタレート製の多孔性膜（track etched membrane）を底面に有する12ウェルインサート（BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences社）の多孔性膜にフィブロネクチンを１μg/cm2になるように添加し，37℃で30分以上静置し，多孔性膜をフィブロネクチンでコーティングした。フィブロネクチンは，Horwitz
B. et al., Preparation of fibronectin for therapeutic administration. In: Mosher
DF, editor.New York Academic Press Inc 441-445 (1989)に記載された方法を用いて調製した。【００４６】
先に調製した，ボトムウェルに支持細胞を添加した12ウェルコンパニオンプレートに，フィブロネクチンでコーティングした12ウェルインサートを静置し，この12ウェルインサートに，歯髄の懸濁液（約500μL）を添加し，更に，細胞が全て培地で覆われるまでDMEM（20％FBS）培地を添加し，５％CO2存在下，37℃で初代培養（Ｐ０培養）を開始した。このときの培養容器のセッティングを模式的に図１に示した。培地を３〜４日毎に交換しながら，12ウェルインサート上にコロニーが目視により確認されるまで，培養を継続した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルの底面から剥離するようになった場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた12ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに12ウェルインサートを移して培養を継続した。【００４７】
コロニーが目視により確認された12ウェルインサートを，別のコンパニオンプレートに移し，これに１mLのPBSを添加して12ウェルインサートに固着した細胞を洗浄するとともに，浮遊細胞，組織切片等を除去した。次いで12ウェルインサートに0.25％ トリプシン-EDTA溶液を500μL添加し，37℃で5〜10分間静置して，12ウェルインサートの多孔性膜上に固着した細胞を剥離させた。次いで，DMEM（20％FBS）培地を300μL添加して反応を停止するとともに細胞を懸濁させ，細胞懸濁液を遠沈管に回収した。更に12ウェルインサートに300μLのDMEM（20％FBS）培地を添加して残存した細胞を懸濁させ，これを先の遠沈管に回収した。回収した細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去し，DMEM（20％FBS）培地を1mL添加し細胞を懸濁させて細胞懸濁液とした。【００４８】
〔歯髄由来細胞のプレ拡大培養〕
ボトムウェルに支持細胞を添加した６ウェルコンパニオンプレートを準備し，これにフィブロネクチンコートした６ウェルインサートを静置し，この６ウェルインサートに，Ｐ０培養で得られた細胞懸濁液を添加して，５％CO2存在下，37℃でプレ拡大培養を開始した。このときの培養容器のセッティングを模式的に図１に示した。DMEM（20％FBS）培地を３〜４日毎に交換しながら，６ウェルインサート上にコロニーが目視により確認されるまで，培養を継続した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離するようになった場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた６ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに６ウェルインサートを移して培養を継続した。【００４９】
コロニーが目視により確認された６ウェルインサートを別のコンパニオンプレートに移した後，PBSで細胞を洗浄し，0.25％ トリプシン-EDTA溶液を500μL添加した。37℃で5〜10分間静置し，細胞の剥離を確認した後，DMEM（20％FBS）培地を500μL添加して反応を停止するとともに細胞を懸濁させ，細胞懸濁液を遠沈管に回収した。更に500μLのDMEM（20％FBS）培地でウェルを洗浄して，洗液を先の遠沈管に回収した。回収した細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去し，DMEM（20％FBS）培地を500μL添加して細胞を懸濁させた。【００５０】
〔歯髄由来細胞の拡大培養〕
上記の細胞の懸濁液に含まれる生細胞数を血球計算盤で測定した後，5000〜10000細胞/cm2の密度となるように，培養フラスコに細胞を播種してDMEM（10％FBS）培地を用いて拡大培養を開始した。但し，生細胞数が少なく拡大培養が開始できない場合は，拡大培養を開始するために必要な数の細胞が得られるまでプレ拡大培養を繰り返した。拡大培養開始時に，培養フラスコに播種した細胞を観察したところ，ほぼ全ての細胞が培養フラスコの底面に固着して紡錘状の形状を示し，均質な細胞が分離されたことが分かった。【００５１】
細胞が90〜100％コンフルエントになるまでDMEM（10％FBS）培地で培養した後，PBSで細胞を洗浄し，0.25％トリプシン-EDTAを添加し，37℃に5〜10分間静置して細胞を剥離させた。DMEM（10％FBS）培地を添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁し，15mL遠沈管に細胞を回収した。回収した細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去し，DMEM（10％FBS）培地を添加して細胞を懸濁した。血球計算盤にて生細胞数を計測した後，5000〜10000細胞/cm2の密度となるように，培養フラスコに細胞を播種し，細胞が90〜100％コンフルエントになるまで培養した。拡大培養を16回繰り返し，継代培養終了時毎に細胞数を測定して，細胞の分裂回数を算出した。なお，90〜100％コンフルエントに達しない場合であっても，拡大培養を開始してから7日経過した場合は，細胞を回収し次の拡大培養に供した。４回目の拡大培養以降は，細胞の増殖速度が徐々に低下し，拡大培養を開始してから７日経過後も90〜100％コンフルエントに達することはなかった。【００５２】
〔歯髄由来細胞の凍結保存〕
第２回拡大培養において，90〜100％コンフルエントになるまで培養した細胞の一部を，下記の手法により凍結保存した。PBSで細胞を洗浄した後，0.25％トリプシン-EDTAを添加し，37℃に5〜10分間静置して細胞を剥離させた。DMEM（10％FBS）培地を添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁し，15mL遠沈管に細胞を回収した。回収した細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去した。10％（v/v）DMSOを含むFBS溶液で細胞を１×106個/mLの密度で懸濁し，0.5〜2mLずつクライオチューブに分注した後，予め４℃で冷蔵しておいたBICELL（日本フリーザー）に入れ，-80℃にて凍結した。凍結約24時間後に，細胞を気相式液体窒素に移し保管した。【００５３】
〔歯髄由来細胞の増殖能測定〕
上記の拡大培養において継代培養を16回繰り返し，継代培養終了時毎に生細胞数を測定して，細胞の分裂回数を算出することにより，細胞の増殖能を測定した（図２）。細胞の分裂回数は，各継代培養の開始時の生細胞数と培養終了時の生細胞数から下記の式により算出した。このとき，拡大培養開始時の培養を第１回拡大培養とし，以後，継代培養を繰り返す毎に，第２回拡大培養，第３回拡大培養とし，最後の拡大培養を第１６回拡大培養とした。
細胞の分裂回数＝log２（培養終了時の細胞数/培養開始時の細胞数）【００５４】
第１回から第３回までの３回の拡大培養までにおいて，細胞数は，拡大培養開始時の2.67×104倍に増加した。従って，第３回拡大培養終了時における細胞の総分裂回数は，拡大培養開始時から約14.7回であり，この間の拡大培養毎の細胞の分裂回数は平均約4.9回であった。第４回拡大培養以降は，細胞の増殖能が若干低下し，第４回から第１０回までの７回の拡大培養において，細胞数は5.51×106倍に増加した。従って，第４回拡大培養の開始時から第１０回拡大培養終了時までの細胞の総分裂回数は約22.4回であり，この間の拡大培養毎の細胞の分裂回数は，平均約3.2回であった。拡大培養開始時からの細胞の総分裂回数は約37.1回となり，第１０回拡大培養終了時における細胞数は，理論上，拡大培養開始時の約1.47×1011倍に増加した。第１１回拡大培養以降は，細胞の増殖能は更に低下し，第１６回拡大培養において細胞の分裂はほぼ停止した。第１１回から第１６回までの６回の拡大培養において，細胞数は1.47×102倍に増加した。第１１回拡大培養の開始時から第１６回拡大培養終了時までの細胞の総分裂回数は約7.2回であり，この間の拡大培養毎の細胞の分裂回数は，平均約1.2回であった。拡大培養開始時からの細胞の総分裂回数は約44.3回となり，第１６回拡大培養終了時における細胞数は，理論上，拡大培養開始時の約2.16×1013倍に増加した。【００５５】
Ｐ０培養とプレ拡大培養における細胞の分裂回数は，細胞数を正確に測定することができないので不明であったが，目視により確認できるコロニーに約1000個の細胞が含まれると仮定した場合，Ｐ０培養とプレ拡大培養においてコロニー形成に必要な細胞の分裂回数はそれぞれ５回となり，Ｐ０培養の開始時から第１６回拡大培養終了時までの細胞の分裂回数は，54回以上に達するものと推計された。この結果は，上記の方法により得られた歯髄由来細胞が，極めて高い増殖能を有することを示すものである。【００５６】
〔表面抗原の測定〕
歯髄由来細胞は，ヒト間葉系幹細胞と同じく均質な紡錘状の形状を示した。そこで，ヒト間葉系幹細胞で陽性であることが知られている表面抗原マーカーであるCD29， CD44， CD73，CD90，CD105及びCD166，及び間葉系幹細胞で陰性であることが知られている表面抗原マーカーであるCD34とCD45の発現の有無を，FACSを用いて調べた。【００５７】
リン酸緩衝液生理食塩水 pH 7.4, contains BSA, powder（シグマ社）を純水に溶解し，0.22μmフィルターに通して，PBS-B〔0.138M塩化ナトリウム，0.0027M塩化カリウム，1％(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）〕を調製した。IgG from Human（SIGMA社）を生理食塩液（大塚製薬）溶解し，0.22μmフィルターに通して，25mg/mL
IgG溶液を調製した。4.6mLのPBS-Bに，0.4mLの25mg/mL IgG溶液を加えて，ブロッキング溶液を調製した。2.4mLのPBS-Bに，0.4m LのStreptavidin APC（CALTAG社）を加えて，Streptavidin APC希釈液とした。【００５８】
標識抗体の希釈抗体液を以下のとおり調製した。18μLのPBS-Bに，2μLのBiotin標識マウスIgG1アイソタイプコントロール（CALTAG社）を加えて，Biotin標識マウスIgG1希釈液（IgG1-Biotin希釈液）とした。38μLのPBS-Bに，2μLのBiotin標識マウス抗ヒトCD90抗体（BD社）を加えて，anti-CD90-Biotin希釈液とした。46.5μLのPBS-Bに，3.5μLのBiotin標識マウス抗ヒトCD166抗体（Fitzgerald社）を加えて，anti-CD166-Biotin希釈液とした。FITC標識抗ヒトCD29抗体（anti-CD29-FITC,
BD社），FITC標識抗ヒトCD34抗体（anti-CD34-FITC, BD社），Biotin標識抗ヒトCD44抗体（anti-CD44-Biotin, BD社），FITC標識抗ヒトCD45抗体（anti-CD45-FITC, IMMUNOTECH社），PE標識抗ヒトCD73抗体（anti-CD73-PE,
BD社），PE標識抗ヒトCD105抗体（anti-CD105-R-PE, Ancell社），FITC標識マウスIgG1（anti-IgG1-FITC, IMMUNOTECH社），PE標識マウスIgG1アイソタイプコントロール（IgG1-PE, IMMUNOTECH社）及びBiotin標識マウスIgG2bアイソタイプコントロール（IgG2b-Biotin, BD社）は，市販のものをそのまま希釈抗体液として用いた。【００５９】
（細胞の染色方法）
上記凍結保存した細胞（1×106個/mL）を解凍し，10mLのDMEM（10％FBS）培地を加えて軽く振り混ぜた後，遠心（1500rpm, 5分）して細胞を沈殿させた。上清を除去し，10mLのDMEM（10％FBS）培地を添加して細胞を懸濁し，再度遠心（1500rpm, 5分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をDMEM（10％FBS）培地に懸濁し，5000〜10000細胞/cm2の密度となるように，培養フラスコに播種し，細胞が90〜100％コンフルエントになるまで培養した。PBSで細胞を洗浄し，0.25％トリプシン-EDTAを添加し，37℃に5〜10分間静置して細胞を剥離させた。DMEM（10％FBS）培地を添加して細胞を懸濁し，生細胞数を測定した。歯髄由来細胞（2×107 個）を50mL遠心管に採取し，PBS-Bを加えて全量を28mLにした。細胞を遠心（1,500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去した。次いで，細胞をブロッキング溶液700μLに懸濁し，氷上で20分間静置した。13本の5mL反応チューブ（番号(1)〜(13)）に，各希釈抗体液を表２に示すとおり添加した。次いで，各チューブに，ブロッキング溶液に懸濁させた細胞の懸濁液を50μLずつ添加して軽く振り混ぜ，氷上で20分間静置させて，試液に含まれる抗体と細胞表面に発現する表面抗原マーカーとを結合させた。次いで，PBS-Bを3mLずつ添加して混和した後，細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させて上清を除去し，細胞に結合しない抗体を除去した。この抗体の除去操作を1回繰り返した。【００６０】
【表２】
2013146992.tif 000003
【００６１】
次いで，各反応チューブに，染色試液を表３に示すとおり添加して混和した後，氷上で15分間静置させた。次いで，3mLのPBS-Bを各反応チューブに加え，軽く振り混ぜてから細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去した。再度3mLのPBS-Bを各反応チューブに加え，細胞を懸濁させた後，細胞を遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させて上清を除去し，細胞を洗浄した。細胞洗浄の操作をもう一回繰り返した。【００６２】
【表３】
2013146992.tif 000004
【００６３】
（測定及び解析）
チューブ番号(1)〜(13)の細胞について，APC，FITC及びPEの各蛍光色素の量をFACS
CantoTM（BD社）で測定し，陰性コントロールとの比較により，表面抗原に特異的に結合した抗体を介して細胞表面に結合した蛍光色素の量を求めた。なお，チューブ(2)はチューブ(6)，(7)及び(9)，チューブ(3)は(10)及び(12)，チューブ(4)はチューブ(11)及び(13)，チューブ(5)はチューブ(8)の陰性コントロールである。チューブ(1)は非染色細胞である。
その結果，チューブ番号(6)，(8)，及び(10)〜(13)について，細胞表面に結合した蛍光色素の量は，陰性コントロールより多く，チューブ番号(7)と(9)については，細胞表面に結合した蛍光色素の量は，陰性コントロールと同等であった。これらの結果は，歯髄由来細胞が，ヒト間葉系幹細胞と同様に，CD29，CD44，CD73，DC90，CD105及びCD166が陽性であり，CD34とCD45が陰性であることを示す。【００６４】
〔軟骨分化能の測定〕
軟骨分化能は，Kiani C., et al. Cell Res. 12 19-32 (2002)，Aung
A., et al. Arthritis Rheum. 63 148-58 (2011)の記載を参考にして，下記の方法で調べた。【００６５】
0.4μm径の孔を有するポリエチレンテレフタレート製の多孔性膜（track etched membrane）を底面に有する12ウェルインサート（BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences社）の多孔性膜に，フィブロネクチンを1μg/cm2になるように添加し，37℃で30分以上静置し，多孔性膜をフィブロネクチンでコーティングした。これを12ウェルコンパニオンプレートにセットした。【００６６】
上記凍結保存した細胞（1×106個/mL）を解凍し，10mLのDMEM（10％FBS）培地を加えて軽く振り混ぜた後，遠心（1500rpm, 5分）して細胞を沈殿させた。上清を除去し，10mLのDMEM（10％FBS）培地を添加して細胞を懸濁し，再度遠心（1500rpm, 5分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をDMEM（10％FBS）培地に懸濁し，5000〜10000細胞/cm2の密度となるように，培養フラスコに播種し，細胞が90〜100％コンフルエントになるまで培養した。PBSで細胞を洗浄し，0.25％トリプシン-EDTAを添加し，37℃に5〜10分間静置して細胞を剥離させた。DMEM（10％FBS）培地を添加して細胞を懸濁し，生細胞数を測定した。歯髄由来細胞を，軟骨分化誘導培地であるNH ChondroDiff Medium（Miltenyi Biotec，以下「NH培地」）に3×103個/mLの濃度で懸濁し，上記の12ウェルインサートに１mLずつ播種し，３〜４日毎に培地交換しながら４週間分化培養を行った。これを軟骨分化誘導群とした。同様にして，歯髄由来細胞をDMEM（10％FBS）培地を用いて培養し，これをコントロール群とした。【００６７】
培養後，RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN）により各群の細胞から全RNAを抽出して全RNA抽出液を調製し，次いでマルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いて全RNA抽出液に含まれるRNA濃度を測定した。RNA濃度測定後，TaqManTM RNA-to-CTTM
1-Step キット（Life Technologies）を用いてPCR反応液を調製し，各群の全RNA 25ngを鋳型とし，〔(48℃/15min)×1サイクル,(95℃/10min)×１サイクル, (95℃/15sec, 62℃/1min)×35サイクル〕のPCR条件下でリアルタイムRT-PCRを行い，アグリカン遺伝子とβアクチン遺伝子を増幅させた。PCRプライマーには，アグリカンプローブ(Applied Biosystems社製/Assay ID：Hs00202971_m1)及びβアクチンプローブ(Applied Biosystems社製/ Assay ID：Hs99999903_m1)をそれぞれ用いた。【００６８】
その結果，アグリカンのCt値(Threashold cycle)は，コントロール群では33.8，軟骨分化誘導群では28.2であり，軟骨分化誘導群ではコントロール群と比較してアグリカンのCt値が低いことが判明した。この結果は，軟骨分化誘導群において，軟骨の細胞外マトリクスを構成する主要な分子であるアグリカンの発現量が増加したことを示すものであり，歯髄由来細胞が軟骨細胞への分化能を有することを示すものである。【００６９】
〔骨芽分化能の測定〕
骨芽分化能は，Pittenger MF., et al., Science. 284, 143-7 (1999)，Colter DC., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 98, 7841-5(2001)の記載を参考にして，下記の方法で調べた。【００７０】
上記軟骨分化能の測定で使用したのと同じ手法で調製した歯髄由来細胞を，DMEM（10％FBS）培地に細胞密度（5000〜10000細胞/cm2）で48ウェル培養プレートに播種して１晩培養した。細胞を２群に分け，一方の群の培地を，骨芽細胞分化用基礎培地（Lonza社）にデキサメタゾン，L-グルタミン，アスコルビン酸塩，ペニシリン／ストレプトマイシン，MCGS，β−グリセロフォスフェートを含む骨芽細胞分化用添加因子セット（Lonza社）を添加した骨芽細胞分化誘導培地に入れ換え，３〜４日毎に培地交換しながら３週間分化培養を行った。この群を骨芽細胞誘導群とした。もう一方の群については，培地を新しいDMEM（10％FBS）培地に入れ換え，３〜４日毎に培地交換しながら３週間培養を行った。この群をコントロール群とした。培養後，細胞をPBSで１回洗浄した後，各ウェルに0.2ｍLのPBSと0.2mLの2M塩酸を添加し37℃で１時間静置して細胞内に蓄積したカルシウムを細胞から遊離させた。遊離したカルシウム濃度を，カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬）を用いて定量した。その結果，遊離カルシウム濃度は，コントロール群が1.53mg/dLであるのに対し，骨芽分化誘導群では24.88mg/dLと高値を示した。【００７１】
この結果は，歯髄由来細胞が，骨芽細胞分化誘導培地で培養することにより骨芽細胞へ分化して，細胞内にカルシウムが蓄積することを示すものであり，歯髄由来細胞が骨芽細胞への分化能を有することを示すものである。【００７２】
〔脂肪分化能の測定〕
脂肪分化能は，Gimble JM., et al., J Cell Biochem. 58. 393-402 (1995) の記載を参考にして，下記の方法で調べた。【００７３】
上記軟骨分化能の測定で使用したのと同じ手法で調製した歯髄由来細胞を，DMEM（10％FBS）培地に細胞密度（5000〜10000細胞/cm2）で24ウェル培養プレートに播種して１晩培養し，細胞をプレートに固着させた。細胞を２群に分け，一方の群の培地を，脂肪細胞誘導用基礎培地（Lonza社）にインドメタシン（最終濃度 60μM)，IBMX（最終濃度 0.5mM)，ヒドロコルチゾン（最終濃度 0.5μM)を添加した脂肪細胞分化誘導培地に入れ換え，３〜４日毎に培地交換をしながら５週間分化培養を行った。この群を脂肪細胞誘導群とした。もう一方の群については，培地を新しいDMEM（10％FBS）培地に入れ換え，３〜４日毎に培地交換しながら5週間培養を行った。この群をコントロール群とした。【００７４】
脂肪細胞に分化した細胞は，脂肪球を生じ，脂肪球内に中性脂肪を蓄積することが知られている。そこで，培養後，両群の細胞を，オイルレッドO染色（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）によって染色して中性脂肪の有無を確認した。しかし，いずれに群においても中性脂肪の染色は認められなかった。更に，染色後，抽出液（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）を用いてオイルレッドO色素を抽出し，抽出液の540nmにおける吸光度を両群で比較したが，両群間で有意な差は認められなかった。【００７５】
次いで，脂肪細胞分化マーカーの1つであるLipo Protein Lipaseの発現量の変化を調べた。RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN）により各群の細胞から全RNAを抽出して全RNA抽出液を調製し，次いでマルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて全RNA抽出液に含まれるRNA濃度を測定した。RNA濃度測定後，TaqManTM RNA-to-CTTM
1-Step キット（Life Technologies）を用いてPCR反応液を調製し，各群の全RNA 25ngを鋳型とし，〔(48℃/15min)×１サイクル,(95℃/10min)×１サイクル, (95℃/15sec, 60℃/1min)×40 サイクル〕のPCR条件下でリアルタイムRT-PCRを行い，Lipo Protein Lipase遺伝子とβアクチン遺伝子を増幅させた。PCRプライマーには，Lipo Protein Lipaseプローブ(Applied Biosystems社製/Assay ID：Hs00173425_m1)及びβアクチンプローブ(Applied Biosystems社製/ Assay ID：Hs99999903_m1)をそれぞれ用いた。【００７６】
その結果，Lipo Protein LipaseのCt値(Threashold cycle)は，コントロール群では39.3，脂肪分化誘導群では36.0であり，脂肪分化誘導群ではコントロール群と比較してLPLのCt値が若干低いことが判明した。これらの結果は，脂肪分化誘導群において，細胞内に中性脂肪を蓄積した脂肪球の存在は確認できないものの，脂肪細胞分化マーカーの１つであるLipo Protein Lipaseの発現量が増加したことを示すものであり，歯髄由来細胞が，脂肪細胞への分化能を弱いながらも有することを示すものである。【００７７】
〔Ｔ細胞増殖抑制能の測定〕
ヒト末梢血単核球（Lonza社）を37℃の恒温槽で解凍し，DMEM培地10mLで懸濁した後，遠心（1500rpm, 5分）して沈殿させ，上清を除去した。DMEM（10％FBS）培地を加えて細胞を懸濁し，トリパンブルー染色により生細胞数を測定した後，細胞濃度が6×106個／mLとなるように細胞を懸濁させ，これをPBMC懸濁液とした。PHA-P（SIGMA社）5mgをDMEM（10％FBS）培地5mLに溶解させ，0.22μmフィルターで除菌した後，DMEM（10％FBS）培地で25倍希釈し，これをPHA-P含有培地とした。[メチル−３Ｈ]チミジン（Moravek社）をDMEM（10％FBS）培地で20倍希釈し，これをチミジン溶液とした。【００７８】
96穴ウェルプレートの6ウェルにDMEM（10％FBS）培地を100μLずつ加えた。これを細胞非添加群とした。DMEM（10％FBS）培地で１×105細胞／mL，２×105細胞／mL及び４×105細胞／mLの濃度に懸濁した，上記軟骨分化能の測定で使用したのと同じ手法で調製した歯髄由来細胞懸濁液を，96穴ウェルプレートの6ウェルにそれぞれ100μLずつ加え，それぞれ，1×104細胞群，2×104細胞群及び4×104細胞群とした。5%CO2存在下，37℃で３〜４時間静置し，細胞を各ウェルの底面に接着させた後，PBMC懸濁液を各ウェルに50μLずつ添加した。次いで，各群の６ウェルのうち，３ウェルにPHA-P含有培地50μLを添加し，残りの３ウェルにPHA-P含有培地に代えてDMEM（10％FBS）培地50μLを添加した。プレートミキサーを用いて，溶液を穏やかに混合した後，5％CO2存在下，37℃で３日間培養した。【００７９】
培養後，全てのウェルにチミジン溶液を20μLずつ加え，プレートミキサーを用いて穏やかに混合した後，５％CO2存在下，37℃で更に4時間培養を行った。次いで，セルハーベスター（モレキュラーデバイス社）を用いて細胞をフィルターマットへ回収し，細胞をフィルターマット上で乾燥させた。乾燥させたフィルターマットから細胞を回収した部分をくり抜いてガラスバイアルに入れ，液体シンチレーションカクテル（UltimaGold MV, Perkin Elmer社）0.8mLを加え，ボルテックスミキサーで混合した。液体シンチレーションシステム（LS6500, Beckmann社）により，ガラスバイアルから放射される放射線量を測定することにより，細胞に取り込まれた3Ｈチミジンの量を測定した。【００８０】
各群につき，PHA-P含有培地50μLを添加した３ウェルの測定値の平均値（平均値A）と，PHA-P含有培地に代えてDMEM（10％FBS）培地50μLを添加した３ウェルの測定値の平均値（平均値B）とを算出し，（平均値A）−（平均値B）を，各群における3Ｈチミジンの取り込み量とした。細胞非添加群における3Ｈチミジンの取り込み量を100％とし，1×104細胞群，2×104細胞群及び4×104細胞群における3Ｈチミジンの取り込み量を，細胞非添加群に対する比率（コントロール％）で算出した。【００８１】
その結果，歯髄由来細胞を添加することにより，添加した歯髄由来細胞の濃度依存的に，3Ｈチミジンの取り込み量が減少することが確認された（図３）。例えば，4×104細胞群では，3Ｈチミジンの取り込み量は，細胞非添加群の約3％に留まった。3Ｈチミジンは細胞の分裂，すなわち細胞の増殖時に細胞内に取り込まれるものである。従って，この結果は，末梢血単核球の細胞増殖が，末梢血単核球を歯髄由来細胞とともに培養することによって抑制されることを示すものである。末梢血単核球はＴ細胞等の免疫細胞からなることから，この結果は，歯髄由来細胞が，Ｔ細胞等の免疫細胞の増殖抑制，ひいては免疫抑制作用を有することを示すものである。すなわち，この結果は，歯髄由来細胞が，Ｔ細胞増殖抑制剤，免疫抑制剤として，自己免疫疾患，移植片対宿主病等に対する治療剤として利用できることを示すものである。【００８２】
〔まとめ〕
上記の結果から，上記拡大培養により得られた歯髄由来細胞は，活発な増殖能を有し，且つ軟骨細胞及び骨芽細胞と２種類の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞であることが確認された。また，この多能性幹細胞は，脂肪細胞への分化能をほとんど示さず，Ｔ細胞増殖抑制能を有するという特徴を備えることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は，軟骨細胞及び骨芽細胞への分化能を有し，且つＴ細胞増殖抑制能を有する，歯髄由来の多能性幹細胞を提供に有用である。
【符号の説明】
【００８４】
１．12ウェルインサート又は６ウェルインサート
２．12ウェルコンパニオンプレート又は６ウェルコンパニオンプレート
３．フィブロネクチンコートした多孔性膜
４．歯髄由来細胞
５．支持細胞
６．ボトムウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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