(57)【要約】  既存の免疫抑制剤を使用せずに、拒絶反応を抑制することができる移植臓器生着促進剤や、ドナーから摘出後の臓器の鮮度を維持しうる臓器保存液等を提供する。５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はその塩、及び鉄化合物を有効成分とする移植臓器生着促進剤や、臓器保存液を調製する。上記ＡＬＡ類としては、ＡＬＡ、及び同メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等を好適に例示することができ、鉄化合物としては、クエン酸第一鉄ナトリウムを好適に例示することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する移植臓器生着促進剤。
【化１】
2013054470.tif 000005
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする請求項１記載の移植臓器生着促進剤。
【請求項３】
さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の移植臓器生着促進剤。
【請求項４】
鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項３記載の移植臓器生着促進剤。
【請求項５】
鉄化合物が、クエン酸第一鉄ナトリウムであることを特徴とする請求項３記載の移植臓器生着促進剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を、臓器移植前及び／又は後のレシピエントに投与することを特徴とする臓器移植における移植臓器生着促進方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を、臓器移植前のドナー及び臓器移植前及び／又は後のレシピエントに投与することを特徴とする臓器移植における移植臓器生着促進方法。
【請求項８】
ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
【化２】
2013054470.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
を含む移植臓器生着促進キット。
【請求項９】
ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
【化３】
2013054470.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
を同時又は前後して対象に投与することを特徴とする移植臓器生着促進方法。
【請求項１０】
ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
【化４】
2013054470.tif 000008
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
ｃ）臓器移植免疫抑制薬；
を含む移植臓器生着促進剤の組合せ。
【請求項１１】
ａ）請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤；
ｂ）臓器移植免疫抑制薬；
を含む移植臓器生着促進剤の組合せ。
【請求項１２】
臓器移植前及び／又は後のレシピエントに、請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来することを特徴とする単離された免疫細胞。
【請求項１３】
臓器移植前のドナー及び臓器移植前及び／又は後のレシピエントに、請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来することを特徴とする単離された免疫細胞。
【請求項１４】
制御性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の単離された免疫細胞。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか記載の免疫細胞を、該細胞を採取した同一及び／又は別のレシピエントに投与することを特徴とする二次免疫寛容の誘導方法。
【請求項１６】
ドナーから摘出後の臓器又は当該臓器の保存液に対して、請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を投与することを特徴とする、移植用臓器の保存方法。
【請求項１７】
臓器移植前のドナーに、請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤があらかじめ投与されていたドナー由来の臓器であることを特徴とする請求項１６記載の保存方法。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を含むことを特徴とするドナーから摘出後の臓器の保存剤。
【請求項１９】
移植臓器の生着率向上に用いるための下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩。
【化５】
2013054470.tif 000009
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２０】
移植臓器の生着率向上に用いるための下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物。
【化６】
2013054470.tif 000010
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２１】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、移植臓器生着促進剤の製造における使用。
【化７】
2013054470.tif 000011
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２２】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物の、移植臓器生着促進剤の製造における使用。
【化８】
2013054470.tif 000012
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２３】
ドナーから摘出後の臓器の保存剤に用いるための下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩。
【化９】
2013054470.tif 000013
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２４】
ドナーから摘出後の臓器の保存剤に用いるための下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物。
【化１０】
2013054470.tif 000014
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２５】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、ドナーから摘出後の臓器の保存剤の製造における使用。
【化１１】
2013054470.tif 000015
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【請求項２６】
下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物の、ドナーから摘出後の臓器の保存剤の製造における使用。
【化１２】
2013054470.tif 000016
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−アミノレブリン酸（以下「ＡＬＡ」ともいう）若しくはその誘導体又はそれらの塩と鉄化合物等の金属含有化合物とを含有する移植臓器生着促進剤や、かかる移植臓器生着促進剤を含む、ドナーから摘出後の臓器の保存剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植においては、本来は細菌やウイルスなどから生体を防御する免疫機構が、移植臓器を「異物」と認識することにより拒絶反応が起きる。移植医療は、拒絶反応をどれだけコントロールできるかにその成否がかかっているといっても過言ではない。拒絶反応を制御する方法としては、移植臓器の拒絶反応を局所でコントロールする方法と全身の拒絶応答そのものを制御する方法があるとされ、現在、主に行われている方法は後者で、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害剤やステロイド系の薬剤の投与が、移植後の拒絶反応を抑制するために広く行われているが、副作用も多いことが知られている。【０００３】
近年、投与薬剤量の減量を目的に、人工的に免疫寛容を誘導する方法として、ドナーやレシピエントよりＴ細胞を抽出し、特殊な抗体と混合培養し体内に戻す方法が開発されている。例えば、腎移植を受けるレシピエントから採取したＴ細胞を、抗ＣＤ８０抗体又はその抗原結合性断片と抗ＣＤ８６抗体又はその抗原結合性断片の存在下で、腎臓のドナーの同種抗原で刺激することにより得られる、前記レシピエント由来のＴ細胞を有効成分として含有する、腎移植拒絶反応抑制剤（例えば、特許文献１参照）や、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を含む末梢血単核球を含む試料を、ヒトドナーから抽出する工程と、前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮することによって、濃縮ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生成する工程と、前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の集団を増殖させる工程と、前記増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程とを含む、移植片対宿主病の影響を低減させるための方法（例えば、特許文献２参照）や、ａ）レシピエント及びドナーから末梢単核血液細胞を単離すること、ｂ）ドナー及びレシピエントの細胞を体外で混合すること、ｃ）調節組成物で該細胞を処理すること、ｄ）該細胞を増やすこと、ｅ）該細胞を該レシピエントに導入すること、を含む移植拒絶反応を低下させるようにレシピエント細胞を誘導する方法（例えば、特許文献３参照）などが提案されている。【０００４】
また、フラボノイド配糖体を含む臓器保存液（例えば、特許文献４参照）、１，５−アンヒドロフルクトースまたはその誘導体を含有する臓器保存剤（例えば、特許文献５参照）、フラーレン類を含有する臓器保存剤（例えば、特許文献６参照）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含有する臓器保存液（例えば、特許文献７参照）、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼを含有する臓器保存液（例えば、特許文献８参照）、グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸又はその塩を含んでなる臓器保存剤（例えば、特許文献９参照）等が知られている。【０００５】
他方、ＡＬＡは、動物や植物や菌類に広く存在するテトラピロール生合成経路の中間体として知られており、通常５−アミノレブリン酸合成酵素により、スクシニルＣｏＡとグリシンとから生合成される。ＡＬＡを用いた光線力学的療法又は光動力学的治療（以下「ＡＬＡ−ＰＤＴ」ともいう）も開発され、侵襲性が低くＱＯＬが保たれる治療法として注目されており、ＡＬＡ等を用いた腫瘍診断・治療剤等が報告されている。また、ＡＬＡは、成人病、がん、男性不妊の予防改善剤や治療剤として有用であることも知られている（例えば、特許文献１０〜１２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１３１５９８号公報
【特許文献２】特表２０１１−５０５３７８号公報
【特許文献３】特表２００３−５３０１０１号公報
【特許文献４】特開２００９−２２１１２８号公報
【特許文献５】特開２００８−１１５０８９号公報
【特許文献６】特開２００６−３１６０００号公報
【特許文献７】特開２００５−３０６７４９号公報
【特許文献８】特開２００２−６０３０１公報
【特許文献９】特開２０００−１９１４０１号公報
【特許文献１０】国際公開ＷＯ２０１０／０５０１７９
【特許文献１１】特開２０１１−１６７５３号公報
【特許文献１２】国際公開ＷＯ２００９／１３９１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
移植後の移植臓器の機能廃絶の最も大きな原因である拒絶反応を防止するためには、免疫抑制剤を長期服用する必要があるとされる。しかしながら、免疫抑制剤の長期投与により感染症や腎障害、糖尿病、リンパ組織増殖症、悪性腫瘍、心血管系合併症など重篤な副作用を引き起こすという懸念があり、厳密な管理が求められている。上述のＴ細胞を抽出し、特殊な抗体と混合培養し体内に戻す方法等の人工的な免疫寛容誘導方法は、免疫抑制剤の減量は可能となるものの、細胞培養期間が数週間必要となり手順が煩雑であることや、脱毛等の副作用がみられたことから、普及するまでには至っていない。他にも実験的には種々の寛容誘導システムが開発されているものの、実際に臨床応用がなされているものはほとんどない。【０００８】
本発明の課題は、安全かつ従来の薬剤とは作用メカニズムの異なる、臓器移植における移植臓器の生着を促進することができる移植臓器生着促進剤や、ドナーから摘出後の臓器の鮮度を維持しうる臓器保存液等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ＡＬＡの医療への応用に関して様々な検討を続けてきたが、臓器移植の拒絶反応の抑制を検討するに際し、ＡＬＡが移植臓器の生着促進作用を有することを見いだした。また、従来の臓器移植の免疫抑制剤がレシピエントのみに投与されていたのに対し、ＡＬＡ単独又はＡＬＡ類と鉄化合物とを含有する組成物を、移植手術に先立ちドナーに投与し、かかるドナーから摘出した臓器を移植したレシピエントにもまた投与することで、移植臓器の生着率が著しく上昇することを偶然見いだした。さらに、かかる臓器移植後のレシピエントの脾臓細胞を別のレシピエントに投与すると同時にドナーから摘出した臓器を移植した場合、ＡＬＡを投与しなくとも移植臓器の生着が促進されるという二次免疫寛容誘導作用が生起することを見いだした。そしてまた、ＡＬＡがドナーから摘出後の臓器の保存剤として有効であることを見いだした。【００１０】
また、鉄化合物はＡＬＡと協働して、移植臓器の生着促進作用や、二次免疫寛容誘導作用や、ドナーから摘出後の臓器の鮮度保持作用を増強することも見いだした。鉄化合物が十分存在する場合や、鉄化合物を別途摂取する場合は、ＡＬＡ単独の投与で問題がない場合がある。ミネラルの中でも鉄は赤身の肉の摂取量が諸外国に比べて少ない日本人では不足がちである。このため日本人での実施例の一部は同時に添加しているが、貯蔵鉄が十分な人を対象とする場合は必要ない。また、ＡＬＡはポルフィリンに代謝され光照射でＰＤＴ、ＰＤＤ活性を示すことが広く知られているが、本発明の移植臓器生着促進剤には光を必要としない。【００１１】
本発明者らは、さらに投与方法や投与量に関して鋭意検討を重ね、ＡＬＡ類単独、又はＡＬＡ類と鉄化合物とを有効成分とする移植臓器生着促進剤を確立し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）下記式（Ｉ）【００１３】
【化１】
2013054470.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基又はアリール基を表す）で示される化合物又はその塩を含有する移植臓器生着促進剤；【００１５】
（２）Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする上記（１）記載の移植臓器生着促進剤；
（３）さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の移植臓器生着促進剤；
（４）鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記（３）記載の移植臓器生着促進剤；
（５）鉄化合物が、クエン酸第一鉄ナトリウムであることを特徴とする上記（３）記載の移植臓器生着促進剤；
（６）上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を、臓器移植前及び／又は後のレシピエントに投与することを特徴とする臓器移植における移植臓器生着促進方法；
（７）上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を、臓器移植前のドナー及び臓器移植前及び／又は後のレシピエントに投与することを特徴とする臓器移植における移植臓器生着促進方法；
（８）ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、ｂ）鉄化合物とを含む移植臓器生着促進キット；
（９）ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、ｂ）鉄化合物とを同時又は前後して対象に投与することを特徴とする移植臓器生着促進方法；
（１０）ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、ｂ）鉄化合物と、ｃ）臓器移植免疫抑制薬とを含む移植臓器生着促進剤の組合せ；
（１１）ａ）上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤と、ｂ）臓器移植免疫抑制薬とを含む移植臓器生着促進剤の組合せ；
（１２）臓器移植前及び／又は後のレシピエントに、上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来することを特徴とする単離された免疫細胞；
（１３）臓器移植前のドナー及び臓器移植前及び／又は後のレシピエントに、上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来することを特徴とする単離された免疫細胞；
（１４）制御性Ｔ細胞であることを特徴とする上記（１２）又は（１３）記載の単離された免疫細胞；
（１５）上記（１２）〜（１４）のいずれか記載の免疫細胞を、該細胞を採取した同一及び／又は別のレシピエントに投与することを特徴とする二次免疫寛容の誘導方法；
（１６）ドナーから摘出後の臓器又は当該臓器の保存液に対して、上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を投与することを特徴とする、移植用臓器の保存方法；
（１７）臓器移植前のドナーに、上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤があらかじめ投与されていたドナー由来の臓器であることを特徴とする上記（１６）記載の保存方法；
（１８）上記（１）〜（５）のいずれか記載の移植臓器生着促進剤を含むことを特徴とするドナーから摘出後の臓器の保存剤；
（１９）移植臓器の生着率向上に用いるための上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
（２０）移植臓器の生着率向上に用いるための上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物；
（２１）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、移植臓器生着促進剤の製造における使用；
（２２）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物の、移植臓器生着促進剤の製造における使用；
（２３）ドナーから摘出後の臓器の保存剤に用いるための上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
（２４）ドナーから摘出後の臓器の保存剤に用いるための上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物；
（２５）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の、ドナーから摘出後の臓器の保存剤の製造における使用；
（２６）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩、及び、鉄化合物の、ドナーから摘出後の臓器の保存剤の製造における使用；
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の移植臓器生着促進剤によると、移植臓器をストレスから防御し、その鮮度を維持し、臓器移植に伴う拒絶反応を抑制し、移植臓器の生着率を高めることができる。本発明は、既存の免疫抑制剤や、Ｔ細胞を抽出して特殊な抗体と混合培養し体内に戻す方法等の人工的な免疫寛容誘導方法とは全くメカニズムが異なり、副作用がほとんど無く、薬剤を長期間服用する必要もなく、臓器移植における移植臓器の生着促進剤としてきわめて有効である。また、従来の免疫抑制剤等と作用メカニズムが異なるため、既存薬と併用することでより効果を高めることも期待される。また、本発明の臓器の保存剤は、ドナーから摘出後の臓器の鮮度を保持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】異系統マウス心臓移植実験のダイアグラムの例を示す。
【図２】本発明の移植臓器生着促進剤を用いた、異系統マウス心臓移植及び移植後の経過の概要を示す図である。縦軸は心臓拍動率を示す。
【図３】本発明の移植臓器生着促進剤を用いた、他の態様の異系統マウス心臓移植及び移植後の経過の概要を示す図である。縦軸は心臓拍動率を示す。
【図４】臓器移植前のドナーマウス及びレシピエントマウスと、臓器移植後のレシピエントマウスに、本発明の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来する脾臓細胞が移植された同一系統レシピエントマウスに異系統マウス心臓移植を行ったときの移植心臓の生着率の結果を示す図である。
【図５】臓器移植前のドナーマウス及びレシピエントマウスと、臓器移植後のレシピエントマウスに、本発明の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来する脾臓細胞が移植された同一系統レシピエントマウスに異系統マウス皮膚移植を行ったときの写真を示す図である。
【図６】臓器移植前のドナーマウス及びレシピエントマウスと、臓器移植後のレシピエントマウスに、本発明の移植臓器生着促進剤が投与された、レシピエントに由来する脾臓細胞中の制御性Ｔ細胞数の測定結果を示す図である。
【図７】ドナーから摘出後の臓器のＡＬＡ含有保存剤の有効性を、保存中に拍動が停止していた心臓が移植により再び拍動を開始するまでの時間（second）により調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の移植臓器生着促進剤としては、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩（以下、これらを総称して「ＡＬＡ類」ということもある）を有効成分として含むものであれば特に制限されないが、ＡＬＡ類に加えて鉄化合物を含有するものが好ましい。上記本発明の移植臓器生着促進剤、特にＡＬＡ類と鉄化合物を含有する移植臓器生着促進剤を、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなどの対象に投与することにより、臓器移植における移植臓器生着促進を行うことができる。また、本発明において移植臓器の生着促進とは、臓器移植（組織移植を含む）における拒絶反応を抑制し、移植された臓器（組織）が生体において機能し続ける割合である生着率を高めることをいう。
【００１９】
本発明の移植臓器生着促進キットとしては、ＡＬＡ類と鉄化合物とを有効成分として個別の薬剤として含むキットであれば特に制限されず、かかる移植臓器生着促進キットを用いると、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなどの対象における臓器移植における移植臓器生着促進を行うことができる。上記移植臓器生着促進キットには、取扱説明書等の添付文書を含めることができる。
【００２０】
上記移植される臓器としては、移植を行うことができる臓器であれば特に制限されず、ドナーから摘出した臓器のみならず、in vitroで作製した移植片や細胞、再生医療技術により人工的に構築した組織・臓器の他、万能細胞から作製された臓器等でもよい。また、臓器の種類としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、眼球、角膜、毛髪、皮膚等を例示することができるが、中でも、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸を好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の移植臓器生着促進剤の組合せとしては、上記本発明の移植臓器生着促進剤と、臓器移植免疫抑制薬の組合せや、ＡＬＡ類と鉄化合物と臓器移植免疫抑制薬との組合せであれば特に制限されず、これらの組合せを投与することにより、移植臓器の生着促進を行うことができる。上記臓器移植免疫抑制薬としては、アザチオプリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、レフルノミド等の代謝拮抗剤や、シクロフォスファミド等のアルキル化剤や、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害剤や、ステロイド剤などの医薬品を挙げることができる。本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットは、既存の臓器移植免疫抑制薬とは作用メカニズムが異なるため、本発明の移植臓器生着促進剤の組合せを用いると、相加的な、場合によっては相乗的な効果が期待できる。
【００２２】
本発明の移植臓器生着促進剤の有効成分として用いられる化合物としては、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩（以下、これらを総称して「ＡＬＡ類」ということもある）として例示することができる。δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるＡＬＡは、式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子の場合であり、アミノ酸の１種である。ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。
【００２３】
上記ＡＬＡ類の中でも式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子の場合であるＡＬＡ又はその塩を好適に例示することができる。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるアミノ酸の１種である。また、ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。
【００２４】
式（Ｉ）におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。
【００２５】
式（Ｉ）におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。
【００２６】
式（Ｉ）におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。
【００２７】
式（Ｉ）におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。
【００２８】
式（Ｉ）におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。
【００２９】
上記ＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物や、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が好ましく、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、ホルミルとメチル、アセチルとメチル、プロピオニルとメチル、ブチリルとメチル、ホルミルとエチル、アセチルとエチル、プロピオニルとエチル、ブチリルとエチルの組合せなどを好適に例示することができる。
【００３０】
ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるための各種の塩、エステル、または生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することができる。例えば、ＡＬＡ及びその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
【００３１】
以上のＡＬＡ類のうち、望ましいものは、ＡＬＡ、及びＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩であり、ＡＬＡ塩酸塩やＡＬＡリン酸塩を特に好適に例示することができる。
【００３２】
上記ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３３】
上記鉄化合物としては、有機塩でも無機塩でもよく、無機塩としては、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄を挙げることができ、有機塩としては、カルボン酸塩、例えばヒドロキシカルボン酸塩である、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム等のクエン酸塩や、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム等の有機酸塩や、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、硫化グリシン鉄を挙げることができるが、中でもクエン酸第一鉄ナトリウムやクエン酸鉄ナトリウムが好ましい。
【００３４】
上記鉄化合物は、それぞれ単独でも、２種以上を混合して用いてもよい。鉄化合物の投与量としては、ＡＬＡ類の投与量（ＡＬＡ換算）に対してモル比で０．０１〜１００倍であればよく、０．０５倍〜１０倍が望ましく、０．１倍〜８倍がより望ましい。
【００３５】
本発明の移植臓器生着促進剤は、過剰症を生じない範囲で、鉄化合物に代えて、あるいは、鉄化合物に加えて、さらに他の金属化合物を含有するものとすることができる。かかる金属化合物としては、マグネシウム化合物、亜鉛化合物、ニッケル化合物、バナジウム化合物、コバルト化合物、銅化合物、クロム化合物、モリブデン化合物等を挙げることができる。
【００３６】
本発明の移植臓器生着促進方法においては、ＡＬＡ類及び鉄化合物を併用投与することが好ましい。この場合、ＡＬＡ類と鉄化合物とを含む組成物として、あるいは、それぞれ単独で同時又は前後して投与することができる。それぞれ単独で投与する場合は同時に投与することが好ましいが、それぞれ単独で前後して投与する場合は、ＡＬＡ類と鉄化合物との投与が相加的効果、好ましくは相乗的効果を奏することができるように投与することが好ましい。
【００３７】
本発明の移植臓器生着促進剤は、ドナーから摘出した臓器や、ドナーから摘出した臓器を一旦保存液に保管した後の臓器や、再生医療技術を用いて自家移植用に作製した臓器や、これらの臓器をＡＬＡ類に浸漬した後の臓器等を移植した後のレシピエントにのみ投与することもできるが、臓器を摘出する前のドナーにも合わせて投与することが生着率を向上させる点で好ましい。このように、臓器移植前のドナー及び臓器移植後又は移植前後のレシピエントに、本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットを投与することで生着率が向上する点は、本発明の大きな特徴である。
【００３８】
臓器移植前及び／又は後のレシピエントに、本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットが投与された、レシピエントに由来する単離された免疫細胞や、臓器移植前のドナー及び臓器移植前及び／又は後のレシピエントに、本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットが投与された、レシピエントに由来する単離された免疫細胞を、必要に応じて増殖させて、該免疫細胞を採取した同一及び／又は別のレシピエントに投与することにより、該免疫細胞が投与されたレシピエントは、本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットを投与しなくても、個体レベルで免疫寛容が誘導促進される（二次免疫寛容の誘導促進）。この二次免疫寛容の誘導促進は、移植臓器生着促進が免疫寛容誘導によるものであることを示し、養子免疫療法に適用することができる。例えば、一旦、免疫寛容が誘導されたヒトから、免疫細胞を取り出して保管しておけば、免疫寛容が解除された際に（例えば、移植臓器を受け入れなくなったとき等）、本発明の移植臓器生着促進剤を投与しなくても、その細胞を移植することにより、免疫寛容の状態を回復させることができる。この二次免疫寛容の誘導促進は本発明の特に大きな特徴である。
【００３９】
上記免疫細胞としては、脾臓細胞の他、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、ミエロイド由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）等を挙げることができるが、制御性Ｔ細胞や脾臓細胞が好ましい。
【００４０】
本発明の移植臓器生着促進剤や、移植臓器生着促進キットの各成分の投与経路としては、舌下投与も含む経口投与、あるいは、点鼻投与、吸入投与、点滴を含む静脈内投与、パップ剤等による経皮投与、座薬、又は経鼻胃管、経鼻腸管、胃漏チューブ若しくは腸漏チューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができるが、経口投与が好ましい。
【００４１】
本発明の移植臓器生着促進剤や、移植臓器生着促進キットの各成分の剤型としては、上記投与経路に応じて適宜決定することができるが、注射剤、点鼻剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散在、液剤、シロップ等に溶解した水剤、パップ剤、座剤等を挙げることができる。本発明の移植臓器生着促進剤や、移植臓器生着促進キットの各成分は医薬用途の他、錠剤やカプセル剤のサプリメントの形態で投与することもできる。また特に、嚥下することが困難な高齢者や乳幼児等には、口中において速やかな崩壊性を示す崩壊錠の形態や、経鼻胃管投与に適した液剤の形態が好ましい。
【００４２】
本発明の移植臓器生着促進剤、移植臓器生着促進キットを調製するために、必要に応じて、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加することができ、具体的には、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。なお、本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットを水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要があり、アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐこともできる。
【００４３】
本発明の移植臓器生着促進剤は、摘出されたドナーの臓器をレシピエントに移植した場合に惹起されるレシピエント側の免疫応答を抑制し、臓器移植に伴う拒絶反応を抑制し、移植臓器の生着率を高めうる点で有用であり、ドナーから摘出後の臓器の保存剤として用いることができるほか、既存の臓器保存液に添加して、臓器移植における移植臓器生着促進効果を増強することができる。前記拒絶反応としては、臓器移植後の超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応を挙げることができる。
【００４４】
上記超急性拒絶反応とは、異種臓器移植に多く見られ、移植直後から移植後２４時間以内におこる激しい拒絶反応とされ、血管が縫合されて血流を再開した後、数分から数時間以内に、例えば、移植臓器の動脈に血栓が形成されるかどうかを超急性拒絶反応の有無の判断基準とすることができるが、心臓移植の場合には、移植直後から移植後２４時間以内の拍動の停止を判断基準とすることができる。上記急性拒絶反応とは、移植後３日から１週間前後の間に起こる拒絶反応とされ、心臓移植の場合には、移植後２４時間以降の拍動の停止を急性拒絶反応の有無の判断基準とすることができる。上記慢性拒絶反応とは、移植後３ヶ月以降に起こる拒絶反応とされ、詳しいメカニズムは不明であるが、心臓移植の場合には、拍動の停止を慢性拒絶反応の有無の判断基準としてもよい。
【００４５】
本発明におけるドナー及び／又はレシピエントとしては、ヒト、ヒヒ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物を挙げることができ、本発明の移植臓器生着促進剤を用いて行われる臓器移植の態様としては、ドナーからレシピエントへの臓器の移植が可能な態様であれば特に制限されないが、マウスからマウスへ、ラットからラットへ、ウサギからウサギへ、イヌからイヌへ、ネコからネコへ、ブタからブタへ、サルからサルへ、ヒヒからヒヒへ、ヒトからヒトへ等の同種臓器移植や、ブタからヒトへ、ウシからヒトへ、サルからヒトへ、ヒヒからヒトへ等の異種臓器移植を挙げることができる。
【００４６】
本発明の移植臓器生着促進剤を用いての臓器移植は、常法により行うことができ、ドナー等から提供された臓器をレシピエントの対応臓器を取り除いてレシピエントにおける同じ場所に移植する同所性臓器移植であっても、ドナー等から提供された臓器を、レシピエントの臓器を残したままでレシピエントの別の部位に移植する異所性臓器移植であってもよい。
【００４７】
本発明の移植臓器生着促進剤は、臓器が移植された後のレシピエントに投与されることが必要であり、具体的な投与時期としては、例えば、移植当日の次の日〜１０日後、好ましくは移植当日の次の日〜１５日後、より好ましくは移植当日の次の日〜１月後、特に好ましくは、移植当日の次の日〜移植臓器の生着が十分に確認された日を挙げることができるが、必要に応じて長期間投与を続けることも可能であり、移植当日よりも以前から投与することもできる。
【００４８】
前述したように、生着率を向上させるためには、本発明の移植臓器生着促進剤を、臓器を摘出するドナーにあらかじめ投与しておくことが好ましい。しかし、特に脳死移植などの際などドナーに十分量投与する時間的余裕がない場合は、ドナーから摘出した臓器に直接投与するか、又は当該臓器を本発明の移植臓器生着促進剤含有液に浸漬するか、もしくは当該臓器を保管した保管液中 に本発明の移植臓器生着促進剤を添加するなどの、摘出後の臓器への投与によっても同様の効果が得られる。再生医療技術を用いて自家移植用に作製した臓器を用いる場合も、当該臓器の保管液中に添加する手法が採用できる。このように、本発明のドナーから摘出後の臓器の保存剤は、移植臓器生着促進剤を含み、粉末、顆粒、錠剤等の固形タイプや液体タイプとして構成することができる。固形タイプの場合、必要に応じて、分散剤、溶解剤、ｐＨ調節剤を配合しておくことができる。液体タイプの場合、緩衝能を有するものが好ましい。また、液体タイプの場合、濃縮保存液とし、使用時に生理食塩水等で希釈して用いることもできる。
【００４９】
本発明におけるドナーに本発明の移植臓器生着促進剤を投与する場合は、臓器を摘出する前の所定期間投与されることが必要であり、具体的な投与時期としては、臓器の摘出手術の当日の１週間前〜摘出当日、好ましくは５日前〜摘出当日、より好ましくは３日前〜摘出当日、さらに好ましくは２日前〜摘出当日を挙げることができ、臓器の摘出手術後に、臓器を輸送等する必要がある場合は、本発明の移植臓器生着促進剤を保存液に保管する等の措置をとることが好ましい。
【００５０】
本発明の移植臓器生着促進剤や移植臓器生着促進キットは、前記のように、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなど獣医分野でも使用することができる。かかる移植臓器生着促進剤等の投与の量・頻度・期間としては、対象がヒトの場合、年齢、体重、症状等により異なるが、ＡＬＡ類の投与量としては、ＡＬＡモル換算で、成人一人あたり、０．１〜１２ｍｍｏｌ／日、好ましくは０．２〜９ｍｍｏｌ／日、より好ましくは０．３〜６ｍｍｏｌ／日、さらに好ましくは、０．３５ｍｍｏｌ／日〜４ｍｍｏｌ／日 を挙げることができ、投与頻度としては、一日単回〜複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。投与期間は、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することもできる。
【００５１】
本発明の移植臓器生着促進剤を臓器保存液として使用する場合のＡＬＡ類の濃度としては、０．１μＭ〜１００ｍＭを挙げることができ、１μＭ〜１０ｍＭが好ましく、５μＭ〜５ｍＭがより好ましく、１０μＭ〜１ｍＭが最も好ましい。
【００５２】
本発明の移植臓器生着促進剤は、他の既存の臓器移植免疫抑制方法と組み合わせて使用することもできる。既存の臓器移植免疫抑制方法としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４５、Ｂ７等の抗体の免疫抑制性モノクローナル抗体を利用した免疫寛容誘導方法を挙げることができる。これらの薬剤や方法とＡＬＡの臓器移植免疫抑制効果に関するメカニズムはそれぞれ根本的に異なると考えられるため、相加的な、場合によっては相乗的な効果が期待できる。また、既存の臓器移植免疫抑制剤の投与量を減ずることで副作用を減らす効果も期待される。
【００５３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
［異所性同種心臓移植モデルマウスの作製］
移植する心臓を提供するドナーマウスとして、Ｂ１０マウス（雄、平均１０週齢、体重２０〜２５ｇ）を用いた。ドナーから取り出した心臓を移植するレシピエントマウスとして、ＣＢＡマウス（雄、平均１０週齢、体重２０〜２５ｇ）を用いた。マウス異所性同種心臓移植の手順は、臓器移植実験マニュアル（秀潤社）、第１章第２部２−１−５「マウス異所性心移植」の記載にしたがった。以下に概要を示す。【００５５】
ドナーマウスを麻酔後開胸し、冷ヘパリン添加生理食塩水１ｍＬを用いて十分灌流した後心臓を摘出し、摘出した心臓を冷ヘパリン添加生理食塩水に保存した。レシピエントマウスを麻酔後開腹し、ドナーマウスから摘出された心臓を腹部大静脈に移植し、異所性心臓移植モデルマウスを作製した。
【実施例２】
【００５６】
［マウス同種移植心臓の生着効率（１）］
上記の異所性心臓移植モデルマウスを、以下の表１の（１）〜（４）に示される各群の投与パターンに分けて本発明の移植臓器生着促進剤の経口投与実験を行った。被検マウスは、投与組成物の摂取のほか、麻酔処置前及び麻酔が覚めた後は自由に食餌や水を取ることができた。実験の概要を図１に示す。【００５７】
【表１】
2013054470.tif 000003
【００５８】
グループ（１）〜（４）の投与結果を以下に示す。また、経過日数と心臓拍動率の関係を図２に示す。
ドナーマウス・レシピエントマウス双方に滅菌水を投与したグループ（１）では、９日目までに全ての個体について、移植心臓が停止し、長期拍動個体はなかった。より詳細には、移植後６日目に１匹、７日目に２匹、８日目に２匹、９日目に１匹の移植心臓が拍動停止した。
ドナーマウスのみＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（２）では、８日目までに全ての個体について、移植心臓の停止又は個体の死亡があり、長期拍動個体はなかった。７日目に４匹、８日目に２匹の移植心臓が拍動停止した。
レシピエントマウスのみＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（３）では、長期拍動個体がみいだされた。より詳細には、１２日目に２匹の移植心臓が拍動停止した。６６日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が１匹、７０日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が１匹あった。
ドナーマウス・レシピエントマウス双方にＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（４）では、長期拍動継続個体の数が顕著に多かった。より詳細には、８日目に１匹の移植心臓が拍動停止した。６６、７６日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が各２匹あり、９６、１０６日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が各１匹あった。【００５９】
本実験モデルは、侵襲性の大きい手術を施すため、ＡＬＡ類と鉄化合物の投与の有無とは無関係にストレスによる個体死亡が起こるのはある程度予想されることではあった。しかしながら、移植前のドナーに、また、移植後のレシピエントにＡＬＡ類と鉄化合物を経口投与した場合に長期拍動継続個体の数は多く、ＡＬＡ類と鉄化合物を投与することにより、臓器の生着率が顕著に上がることが確認された。グループ（３）のマウスも長期拍動個体があり、移植後のレシピエントに投与するのみでも本発明の移植臓器生着促進剤は、効果があることが確認された。【００６０】
［マウス同種移植心臓の生着効率（２）］
上記の異所性同種心臓移植モデルマウスについて、以下の表２のグループ（ａ）〜（ｅ）に示される各群の投与パターンに分けて、本発明の移植臓器生着促進剤について、鉄化合物の含有量の多寡による効果の相違を検討した。被検マウスは、投与組成物の摂取のほか、麻酔処置前及び麻酔が覚めた後は自由に食餌や水を取ることができた。【００６１】
【表２】
2013054470.tif 000004
【００６２】
グループ（ａ）〜（ｅ）の投与結果を以下に示す。また、経過日数と心臓拍動率の関係を図３に示す。
ドナーマウス・レシピエントマウス双方に滅菌水を投与したグループ（ａ）では、９日目までに全ての個体について、移植心臓が停止し、長期拍動個体はなかった。より詳細には、移植後６日目に２匹、７日目に５匹、８日目に２匹の移植心臓が拍動停止した。
ドナーマウス・レシピエントマウス双方にＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（ｂ）では、８日目までに全ての個体について、移植心臓が停止し、長期拍動個体はなかった。より詳細には、７日目に２匹、８日目に３匹の移植心臓が拍動停止した。
ドナーマウス・レシピエントマウス双方にＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（ｃ）では、長期拍動個体があった。より詳細には、移植後８日目に１匹、１２日目に１匹の移植心臓が拍動停止したが、２５日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が１匹、２９日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が２匹あった。
ドナーマウス・レシピエントマウス双方にＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（ｄ）では、長期拍動継続個体の数が顕著に多く、生存期間が長期にわたる個体が多かった。より詳細には、６３、７３日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が各２匹あった。９３日、１０３日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が各１匹あった。
レシピエントマウスのみＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したグループ（ｅ）では、長期拍動個体があった。より詳細には、１５日目に１匹の移植心臓が拍動停止したが、２９日経過時点で移植心臓が拍動を続ける個体が２匹あった。【００６３】
グループ（ｂ）とグループ（ｃ）及び（ｄ）との比較により、移植前のドナーと、移植後のレシピエントにＡＬＡ類を投与する場合、ＡＬＡ類単独で投与するよりも、ＡＬＡと鉄化合物を組み合わせて投与した方が、有意に免疫抑制効果が増大し、レシピエントの生存率が上がることが確認された。また、鉄化合物の添加量としては、クエン酸第一鉄ナトリウム１１５ｍｇ/ｋｇが投与されたグループ（ｄ）の成績がよかったことが確認された。また、グループ（ｅ）のマウスも長期拍動個体があり、移植後のレシピエントに投与するのみでも本発明の移植臓器生着促進剤は、効果があることが確認された。
【実施例３】
【００６４】
［移植臓器生着の機序は免疫寛容］
ＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を、ドナーマウス・レシピエントマウス双方に心臓移植２日前から移植日まで投与し、心臓移植後はレシピエントマウスのみに１１日目まで一日一回投与し続け、長期生着（＞１００日）した一次移植レシピエントマウス（ＣＢＡ）由来の脾臓細胞を単離し、この脾臓細胞を別のレシピエント系統マウス（ＣＢＡ）に腹腔内注射すると同時に、一次移植時と同じ系統のドナーマウス（Ｂ１０）の心臓を上記レシピエント系統マウス（ＣＢＡ）に移植した。結果を図４に示す。その結果、ＡＬＡ＋ＳＦＣ投与心臓移植を経験した脾臓細胞移植により心臓二次移植の生着率が促進された（二次免疫寛容の誘導）。すなわち、一次移植を行ったレシピエント系統マウス（ＣＢＡ）由来の脾臓細胞をドナーマウス（Ｂ１０）の心臓と同時に移植したマウス（Tolerant；ｎ＝５）は、一次移植を行っていないレシピエント系統マウス（ＣＢＡ）由来の脾臓細胞をドナーマウス（Ｂ１０）の心臓と同時に移植したマウス（Naive；ｎ＝５）と比較し、心臓の生着率が向上した。この結果は、移植臓器生着の機序が免疫寛容であることを示している。【００６５】
［移植臓器生着マウスは個体レベルで免疫寛容］
ＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を、ドナーマウス・レシピエントマウス双方に心臓移植２日前から移植日まで投与し、心臓移植後はレシピエントマウスのみに１１日目まで一日一回投与し続け、長期生着（＞１００日）した一次移植レシピエントマウス（ＣＢＡ）由来の脾臓細胞を単離し、この脾臓細胞を別のレシピエント系統マウス（ＣＢＡ）に腹腔内注射すると同時に、一次移植時と同じ系統のドナーマウス（Ｂ１０）の皮膚を上記レシピエント系統マウス（ＣＢＡ）に移植した。皮膚移植３０日後の結果を図５に示す。その結果、ＡＬＡ＋ＳＦＣ投与心臓移植を経験した脾臓細胞移植により皮膚移植の生着が観察された。この結果は、移植臓器生着マウスは個体レベルで免疫寛容を起こしていることを示している。【００６６】
［脾臓中の制御性Ｔ細胞数］
レシピエント系統マウス（ＣＢＡ）の脾臓中の制御性Ｔ細胞数をフローサイトメーターにより測定した。１）群は滅菌水のみを投与したレシピエント系統マウス（ｎ＝６）、２）群はＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したレシピエント系統マウス（ｎ＝６）、３）群はドナーマウス・レシピエントマウス双方に滅菌水を投与した一次心臓移植レシピエントマウス（ＣＢＡ）由来の脾臓細胞を腹腔内注射した別のレシピエント系統マウス（ｎ＝６）、４）群はＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）を、ドナーマウス・レシピエントマウス双方に心臓移植２日前から移植日まで投与し、心臓移植後はレシピエントマウスのみに１１日目まで一日一回投与し続けた一次心臓移植レシピエントマウス（ＣＢＡ）由来の脾臓細胞を腹腔内注射した別のレシピエント系統マウス（ｎ＝６）をそれぞれ供試した。結果を図６に示す。その結果、４）群のレシピエント系統マウスにおける制御性Ｔ細胞数は、３）群におけるそれよりも有意に多く、脾臓中の制御性Ｔ細胞の比率が増加していることがわかる。この結果は、ＡＬＡ＋ＳＦＣ投与が免疫寛容を誘導していることを示している。
【実施例４】
【００６７】
［ＡＬＡ含有保存液の心臓の保存・移植効果］
ドナーから摘出後の臓器のＡＬＡ含有保存剤の有効性を、臓器の鮮度保持について調べた。臓器の鮮度保持は、保存中に拍動が停止していた心臓が移植により再び拍動を開始するまでの時間（second）、すなわち再鼓動時間（Re-beating time）により調べた。保存・移植する心臓を提供するドナーマウスとして、Ｂ１０マウス（雄、７〜１０週齢、体重２０〜２５ｇ）を用いた。【００６８】
保存液としては、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、リン酸２水素カリウム、及びグルコースを含む基本溶液に、終濃度でＡＬＡが１００μＭ、硫酸鉄が５μＭとなるように添加した保存液Ｇ６（＋）、並びに、上記基本溶液に、終濃度で硫酸鉄が５μＭとなるように添加した保存液Ｇ６（−）を供試した。上記ＡＬＡとしては、ＡＬＡ塩酸塩を用いた。これらの供試保存液の浸透圧は３２６〜３６３Ｏｓｍ／ｋｇであった。また対照として、市販の臓器保存液（アステラス製薬株式会社製「ビアスパン」；保存液ＵＷ）を用いた。これらの保存液の温度を氷冷とし、保存期間は２４時間とした。【００６９】
再鼓動時間の測定には、保存液Ｇ６（＋）、保存液Ｇ６（−）及び保存液ＵＷを供試した。また、再鼓動時間の測定は、臓器移植実験マニュアル（秀潤社）、第１章第２部２−１−５「マウス異所性心移植」の記載、及びEuropean Heart Journal(2011)32,509-516の記載にしたがった。以下に概要を示す。【００７０】
ドナーマウスを麻酔後開胸し、供試保存液１ｍＬを用いて十分灌流した後心臓を摘出し、摘出した心臓を供試保存液中で保存した。レシピエントマウスを麻酔後開腹し、ドナーマウスから摘出・保存された心臓を腹部大静脈に移植し、異所性心臓移植モデルマウスを作製した。その際、心臓への血液の再灌流の開始から心臓の再鼓動開始までの時間を計測し、再鼓動時間とした。【００７１】
［ＡＬＡ含有保存液による再鼓動時間の短縮］
移植用マウスの心臓を保存液Ｇ６（＋）、保存液Ｇ６（−）及び保存液ＵＷの中で２４時間保存した後、異所性同種心臓移植を行い、再鼓動時間（second）を測定した。結果を図７に示す。その結果、ＡＬＡ（１００μＭ）＋硫酸鉄（５μＭ）溶液からなる保存液Ｇ６（＋）の再鼓動時間（秒）の平均値は１０８秒、硫酸鉄（５μＭ）溶液からなる保存液Ｇ６（−）の再鼓動時間（秒）の平均値は１４５秒、対照保存液ＵＷの再鼓動時間（秒）の平均値は２２９秒であった。このように、保存液Ｇ６（＋）を用いると、保存液ＵＷを用いる場合に比べて、再鼓動時間を有意に（ｔ検定；ｐ＝０．０２４４）短縮できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の移植臓器生着促進剤は、医薬・医療の分野で有利に使用することができる。
【図１】
2013054470.tif 000017
【図２】
2013054470.tif 000018
【図３】
2013054470.tif 000019
【図４】
2013054470.tif 000020
【図６】
2013054470.tif 000021
【図５】
2013054470.tif 000022
【図７】
2013054470.tif 000023
【国際調査報告】
2013054470.tif 000024
2013054470.tif 000025
2013054470.tif 000026
2013054470.tif 000027
2013054470.tif 000028
2013054470.tif 000029