(57)【要約】  本発明は、インテグリンα４の様々な機能を阻害可能な新規物質を提供すること、及び／又は、インテグリンα４及びインテグリンα９の両方を阻害可能な新規物質を提供することを課題とする。本発明は、ヒトインテグリンα４の細胞外領域の一部を有するインテグリンα４変異体ペプチド等を提供するものであり、具体的には、配列番号４〜９のアミノ酸配列を有するペプチド等及びそれらのペプチドを有効成分として含有するに関する医薬組成物に関する。【選択図】なし
2013001819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインテグリンα４の細胞外領域の一部を有するインテグリンα４変異体。
【請求項２】
ヒトインテグリンα４の細胞外領域が、ヒトインテグリンα４のβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列を含んでいる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ヒトインテグリンα４の細胞外領域が、配列番号９及び配列番号１１〜１４から選択される１の配列である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
更に、配列番号１５〜１９から選択される１の配列がヒトインテグリンα４（配列番号１０）の細胞外領域のＣ末に結合していることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号４〜９から選択される１の配列を有するペプチド。
【請求項６】
インテグリンα４のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４とそのリガンドとの結合を阻害する請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
インテグリンα４のリガンドが、血管細胞接着分子１、フィブロネクチン、接合部接着分子２、粘膜アドレシン細胞接着分子１、ヒトリンパ球発現金属プロテイナーゼ様ディスインテグリン様富システインタンパク質ファミリーメンバーＬ、ヴォンウィルブランド因子及びオステオポンチンからなる群から選択される１の物質である請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
インテグリンα４のリガンドがヴォンウィルブランド因子又はＯＰＮである請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
インテグリンα４のリガンドが配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
更にインテグリンα９のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα９とそのリガンドとの結合を阻害する請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
インテグリンα９のリガンドが、血管細胞接着分子１、フィブロネクチン、接合部接着分子２、粘膜アドレシン細胞接着分子１、ヒトリンパ球発現金属プロテイナーゼ様ディスインテグリン様富システインタンパク質ファミリーメンバーＬ、ヴォンウィルブランド因子及びオステオポンチンからなる群から選択される１の物質である請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
インテグリンα９のリガンドがヴォンウィルブランド因子又はＯＰＮである請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
インテグリンα９のリガンドが配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１４】
可溶性ペプチドである、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１７】
インテグリンα４を認識しない、請求項１６に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンα４及びインテグリンα９が関与する疾患の治療又は予防の分野に関する。より具体的には、本発明は可溶性インテグリンα４変異体による、インテグリンα４及びインテグリンα９が関与する疾患の治療又は予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリン（以下、「ＩＴＧ」という）はα鎖とβ鎖が１：１のヘテロ２量体を形成する細胞膜貫通受容体タンパク質である。インテグリンα４（以下、「ＩＴＧ−α４」という）は主にリンパ球や腫瘍細胞上に発現し、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、フィブロネクチン（Ｆｎ）、接合部接着分子２（ＪＡＭ２）、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ１）、ヒトリンパ球発現金属プロテイナーゼ様ディスインテグリン様富システインタンパク質ファミリーメンバー（ＭＤＣ−Ｌ；ディスインテグリン及び金属プロテアーゼ２８（ＡＤＡＭ２８））、ヴォンウィルブランド因子（ｐｐ−ｖＷＦ）やオステオポンチン（ＯＰＮ）等のリガンドと接着することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。ＩＴＧ−α４はこれらのリガンドと結合し、細胞接着、遊走（例えば、リンパ球、単球、好酸球の炎症部位への遊走等）、リンパ球のホーミング等の多彩な機能を発揮すると考えられている。これまで、ＩＴＧ−α４が癌転移（非特許文献３）、多発性骨髄腫（特許文献１）や関節リウマチ、気管支炎、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症等の炎症性疾患（非特許文献４）、急性中枢神経系損傷（特許文献２）、ＨＩＶ（特許文献３）に関与することが知られており、抗ＩＴＧ−α４抗体が実験的アレルギー性脳脊髄炎、過敏症、Ｉ型糖尿病等のＴ細胞依存性自己免疫疾患モデルにおいて一定の効果を奏することが報告されている。また、同様に、抗ＩＴＧ−α４抗体がアレルギー性肺炎、免疫複合体介在肺障害、急性腎毒性腎炎、遅延性過敏症における皮膚硬化とフィブリンの沈着の抑制に効果があり、血管柄付心臓の同種移植の拒絶反応を抑制することが知られている（非特許文献１）。【０００３】
このようにＩＴＧ−α４が疾患に関与することから、ＩＴＧ−α４の阻害剤を医薬として利用することが期待されている。実際に、ＩＴＧ−α４の機能を阻害する物質として、抗ＩＴＧ−α４抗体、ＩＴＧ−α４アンタゴニスト（特許文献４等）、ＩＴＧ−α４受容体アンタゴニスト（特許文献５等）が検討されており、抗ＩＴＧ−α４抗体であるＴｙｓａｂｒｉは、既に多発性硬化症やクローン病の治療薬として承認されている。また、ＩＴＧ−α４の細胞質内ドメインにおける機能モチーフを標的とした治療方法（特許文献６）が報告されている。【０００４】
抗体を医薬品として利用する場合、エピトープによりその効果が左右される。α４β１ＩＴＧは、ＩＴＧ−α５β１が結合するＲＧＤ配列（配列番号１）とは異なる配列（ＬＤＶ配列（配列番号２）やＱＩＤＳＰＬ配列（配列番号３））を介しそのリガンドと強く結合することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。しかし、例えば、ＩＴＧ−α４におけるＦｎとの結合部位とＶＣＡＭ１との結合部位は互いにオーバーラップするにもかかわらず、ＩＴＧ−α４とＶＣＡＭ１との結合にはカルシウムイオンによる助けが必要であるのに対し、Ｆｎとの結合にはカルシウムイオンは不要であり、一部の抗体はＩＴＧ−α４とＦｎとの結合のみを阻害するなど、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合は異なる特性を有することが知られていた。また、抗ＩＴＧ−α４抗体の主要なエピトープとしてオーバーラップしない３種類のエピトープが存在することが知られていた（非特許文献１）。【０００５】
一方、ＩＴＧ−α４と共通のリガンドを有するＩＴＧとして、インテグリンα９（以下、「ＩＴＧ−α９」という）が存在する。ＩＴＧ−α９は多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）増悪にも関与することが報告されている（非特許文献５）。本発明者らは、これまでＩＴＧ−α９に対する抗体を作製し、関節リウマチ治療効果を見出した（非特許文献６、特許文献７）。【０００６】
ＩＴＧ−α９は、ＩＴＧ−α４と共通するリガンドを有することからＩＴＧ−α４と似たような機能を有すると考えられている。またＩＴＧ−α９アミノ酸配列は、ＩＴＧ−α４のアミノ酸配列と３９％の相同性を有し、ＩＴＧの中で最も相同性が高いことが知られている（非特許文献７）。【０００７】
これまでに本願の発明者は、ＩＴＧ−α９の細胞外領域の一部及び新たなＣ末端アミノ酸からのみから構成されるオルタナティブスプライシングバリアントであるα９変異体（ＳＦα９）が生体内に存在することを発見し、ＳＦα９の構造及び機能について解析を行い報告してきた（非特許文献８）。ＩＴＧ−α４の変異体に関しては、ＩＴＧ−α４の多形に関する報告（特許文献８）はあるものの、オルタナティブスプライシングバリアントに関する報告は無かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ００／１５２４７
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ０１／４３７７４
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ２００８／１４０６０２
【特許文献４】国際公開公報２０１０／１２６９１４
【特許文献５】国際公開公報２００６／０９６９８０７
【特許文献６】国際公開公報ＷＯ２００６／１１２７３８
【特許文献７】国際公開公報ＷＯ２００８／００７８０４
【特許文献８】国際公開公報ＷＯ００／１７３９４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒｏｙ  Ｒ．Ｌｏｂｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１７２２−１７２８
【非特許文献２】Ｒｏｂｅｒｔｏ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｍａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１６：２８９−２９６
【非特許文献３】Ｈｏｌｚｍａｎｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３１：１２５−１４１
【非特許文献４】Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，８：１２２９−１２５３
【非特許文献５】Ｋａｎａｙａｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２：８０１５−８０２５
【非特許文献６】Ｐａｌｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２３：１２８９−１２９７
【非特許文献７】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＰ−０３８−３１
【非特許文献８】Ｋｏｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ． ３１７：１７７４−８４
【発明の概要】
【００１０】
ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９は共通するリガンドを有し、ＥＡＥ等の同様の疾患発症に関与することが考えられる事から、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９を同時に阻害できる物質は、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９が関与する疾患に対する効果的な治療薬となりうることが期待されている。また、メラノーマなどの癌細胞は、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方を発現していることが知られている（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （２００７）  ２１２：３６８−７４．；Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  （２００９）  ３１５：３３１２−２４．)。癌の転移には、血管内でローリング、接着、血管外移動というステップがあることが知られているが、この接着の際にＩＴＧが重要な機能を担っていると考えられている。血管内皮細胞上にＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９に共通するリガンドが発現している場合、抗体等により、片方のインテグリンと当該リガンドとの結合を阻害するだけでは転移をブロックすることはできずＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方に対する抗体が必要となると考えられている。実際に、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９に共通するリガンドであるフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）は血管内皮細胞から産生されることが報告されている（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９７８  Ｊｕｎ，６１（６）：１４９８−５０７．）。リンパ管ではＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方が発現していることが報告されている（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  （２００８）８：６０４−１７．）。よって、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９を同時に阻害できる物質は、効果的な癌転移抑制剤となると考えられている。更に、ＩＴＧ−α４阻害やＩＴＧ−α９阻害による、リンパ管新生・機能への影響が報告されており(Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２０１０）  ７０：３０４２−５１．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  （２００５）  ２４：２８８５−９５．) 、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９を同時に阻害することによってこれまでにない効率的なリンパ管新生抑制剤を提供することが期待されている。
【００１１】
本発明者らは、ＩＴＧ−α４の効果的な阻害剤を探索すべく、ＩＴＧ−α４の新規オルタナティブスプライシングバリアントの同定を試みた。その結果、６種の新規のオルタナティブスプライシングバリアントを同定することに成功した（図１〜３および配列番号４〜９）。本発明者らは、得られたＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントの構造を解析した結果、驚くことに６種類中５種類のオルタナティブスプライシングバリアントは、Ｃ末端側にヒトＩＴＧ−α４（配列番号１０）由来ではない新規で固有のイントロン由来のアミノ酸配列を有していた（それぞれのＩＴＧ−α４オルタナティブスプライシングバリアントのＣ末端側の新規アミノ酸配列を図３に示す）。
【００１２】
本発明者らは、得られたＩＴＧ−α４オルタナティブスプライシングバリアントの機能を解析した結果、これらのオルタナティブスプライシングバリアントがＩＴＧ−α４と複数の異なるリガンドとの結合を阻害可能であることを見出した。更に本発明者らは、得られたＩＴＧ−α４オルタナティブスプライシングバリアントが、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害するのみならず、ＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合をも阻害することを見出した。
【００１３】
即ち、本発明は、ＩＴＧ−α４の様々な機能を阻害可能な新規物質を提供すること、及び／又は、ＩＴＧ−α４及びＩＴＧ−α９の両方を阻害可能な新規物質を提供することを課題とする。また、本発明は、ＩＴＧ−α４の新規オルタナティブスプライシングバリアントを見出したことに基づくものである。具体的には、本発明は、以下の（１）〜（１５）に記載の発明に関する。
（１）  ヒトインテグリンα４（配列番号１０）の細胞外領域の一部を有するインテグリンα４変異体。
（２）  ヒトインテグリンα４（配列番号１０）の細胞外領域が、ヒトインテグリンα４（配列番号１０）のβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列を含んでいる（１）に記載のペプチド。
（３）  ヒトインテグリンα４（配列番号１０）の細胞外領域が、配列番号９及び配列番号１１〜１４から選択される１の配列である、（１）に記載のペプチド。
（４）  更に、配列番号１５〜１９から選択される１の配列がヒトインテグリンα４（配列番号１０）の細胞外領域のＣ末に結合していることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載のペプチド。
（５）  配列番号４〜９から選択される１の配列を有するペプチド。
（６）  インテグリンα４のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４とそのリガンドとの結合を阻害する（１）〜（５）のいずれか１項に記載のペプチド。
（７）  インテグリンα４のリガンドが、ＶＣＡＭ１、Ｆｎ、ＪＡＭ２、ＭＡｄＣＡＭ１、ＭＤＣ−Ｌ（ＡＤＡＭ２８）、ｐｐ−ｖＷＦ及びＯＰＮからなる群から選択される１の物質である（６）に記載のペプチド。
（８）  インテグリンα４のリガンドがｐｐ−ｖＷＦ又はＯＰＮである（６）に記載のペプチド。
（９）  インテグリンα４のリガンドが配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を有するペプチドである（６）に記載のペプチド。
（１０）  更にインテグリンα９のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα９とそのリガンドとの結合を阻害する（１）〜（９）のいずれか１項に記載のペプチド。
（１１）  インテグリンα９のリガンドが、ＶＣＡＭ１、Ｆｎ、ＪＡＭ２、ＭＡｄＣＡＭ１、ＭＤＣ−Ｌ（ＡＤＡＭ２８）、ｐｐ−ｖＷＦ及びＯＰＮからなる群から選択される１の物質である（１０）に記載のペプチド。
（１２）  インテグリンα９のリガンドがｐｐ−ｖＷＦ又はＯＰＮである（１０）に記載のペプチド。
（１３）  インテグリンα９のリガンドが配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を有するペプチドである（１０）に記載のペプチド。
（１４）  可溶性ペプチドである、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のペプチド。
（１５）  （１）〜（１４）のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
（１６）  （１）〜（１４）のいずれか１項に記載のペプチドを特異的に認識（又は結合）する抗体。
（１７）  インテグリンα４を認識しない（又はインテグリンα４と結合しない）、（１６）に記載の抗体。
【００１４】
本発明において、「インテグリンα４変異体」と「ＩＴＧ−α４変異体」とは同意義であり、ＩＴＧ−α４ゲノムに由来してＩＴＧ−α４とは異なるスプライシングにより産生されるＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントペプチド又は該ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。本明細書における「インテグリンα４変異体」は、ヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域（配列番号１０の１〜９７７番目のアミノ酸配列からなる部分）の一部を有し、膜貫通領域及び細胞内領域は含まない。ＩＴＧ−α４とドメインとの関連については、インテグリンαｖの立体構造解析の結果（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）,２９４．３３９−３４５）から、ＩＴＧ−α４アミノ酸配列とのホモロジー解析により類推したものが報告されている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９７）９４：６５−７２）。具体的には、細胞外領域に、シグナル配列（配列番号１０における１番目〜３３番目のアミノ酸配列からなる部分）、β−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒ（配列番号１０における３４番目〜４６５番目のアミノ酸配列からなる部分）、Ｔｈｉｇｈ（配列番号１０における４６６番目〜６１８番目のアミノ酸配列からなる部分）、Ｇｅｎｕ（配列番号１０における６１９番目〜６２６番目のアミノ酸配列からなる部分）、Ｃａｌｆ１（配列番号１０における６２７番目〜７７０番目のアミノ酸配列からなる部分）、及びＣａｌｆ２（配列番号１０における７７１番目〜９７７番目のアミノ酸配列からなる部分）と呼ばれるドメインを有することが知られている。本発明におけるヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部として、好ましくは、β−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン及び／又はＴｈｉｇｈドメインである。例えば、本明細書におけるヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部は、ヒトＩＴＧ−α４のβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列を有する。ここで、β−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列とは、ＩＴＧ−α４のＮ末に位置するβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメインを構成するアミノ酸配列の一部であればどの部位の配列でもよい。ヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部は、例えば、５０アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、１５０アミノ酸以上、１８０アミノ酸以上、若しくは１８５アミノ酸以上のβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン（４３２アミノ酸からなる）を構成するアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有することができる。また、ヒトＩＴＧ−α４のβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１０における３４番目のアミノ酸配列を含む。また、ヒトＩＴＧ−α４のβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列を有するヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部は、β−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列のみからなっていてもよいし、β−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン由来のアミノ酸配列に加えてβ−ｐｒｏｐｅｌｌｏｒドメイン以外のヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域由来のアミノ酸配列を有していてもよい。より具体的には、本明細書におけるヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部は、配列番号１１〜１４に記載のアミノ酸配列（又は、当該アミノ酸配列において、１番目〜３３番目のアミノ酸配列からなるシグナル配列が欠如したアミノ酸配列）、あるいは、配列番号１０の１〜１８５番目、１〜３８４番目、１〜５１３番目、若しくは、１〜６４０番目（又は、配列番号１０の３４〜１８５番目、３４〜３８４番目、３４〜５１３番目、若しくは、３４〜６４０番目）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１５】
また、本明細書において、「インテグリンα４変異体」は、ＩＴＧ−α４に由来しないアミノ酸配列（以下、「ＩＴＧ−α４変異体特異的アミノ酸配列」という）を備えることができる。好ましくは、「ＩＴＧ−α４変異体特異的アミノ酸配列」はＩＴＧ−α４のイントロン由来の配列であり、具体的には、本明細書におけるＩＴＧ−α４変異体特異的アミノ酸配列は、配列番号１５〜１９に記載のアミノ酸配列であってもよい。
【００１６】
すなわち、一の態様において、本明細書における「インテグリンα４変異体」は、前記ヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部のみからなるか、又は前記ヒトＩＴＧ−α４の細胞外領域の一部とＩＴＧ−α４変異体特異的アミノ酸配列からなるペプチド（以下、総称して「ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアント」という）を含む。具体的には、本明細書におけるＩＴＧ−α４変異体は、配列番号４〜９（それぞれ順に、「１−２−１変異体」（配列番号４）、「１−１−２変異体」（配列番号５）、「７−３−２変異体」（配列番号６）、「１０−７−３変異体」（配列番号７）、「１０−７−２変異体」（配列番号８）、及び「９−５−４変異体」（配列番号９）という）に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。また、本明細書におけるＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントは、ＩＴＧ−α４のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害する活性、並びに／あるいは、ＩＴＧ−α９のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合を阻害する活性を有する。
【００１７】
更に、別の態様において、本明細書における「ヒトインテグリンα４の細胞外領域の一部を有するインテグリンα４変異体」は、前記ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと実質的に同一のペプチドを包含する。ここで、実質的に同一のペプチドとは、前記ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと、アミノ酸配列における相同性が高く、当該ペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、及び／又は、少数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、かつ、本明細書におけるＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと同等の生物学的活性を有するペプチドを意味する。
【００１８】
本明細書において、アミノ酸配列の相同性が高いとは、前記ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有することを意味する。例えば、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントとアミノ酸配列における相同性が高いペプチドは、配列番号４〜９のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するであってもよい。ここで、アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて当業者が通常用いる方法により決定することができる。
【００１９】
本明細書において、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるとは、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントをコードするＤＮＡと当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号４〜９のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるペプチドであってもよい。ストリンジェントな条件でハイブリダイズか否かは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ストリンジェントなハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。
【００２０】
本明細書において、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントに少数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドとは、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントを構成するアミノ酸配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸と置換され及び／若しくは欠失したペプチド、及び／又は、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントを構成するアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端に別のアミノ酸配列が付加されたペプチド、及び／又は、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントを構成するアミノ酸配列内に別のアミノ酸が挿入されたペプチドを意味する。例えば、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントに少数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドとしては、配列番号４〜９のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドに少数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドを挙げることができる。置換、欠失、付加、及び／又は挿入されるアミノ酸の数は、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントの生物学的活性に影響を与えない数であれば特に限定されないが、例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、又は１〜３個とすることができる。
【００２１】
上述の通り、前記ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと実質的に同一のペプチドは、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと同等の生物学的活性を有する。ここで、「ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと同等の生物学的活性」とは、ＩＴＧ−α４のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４とそのリガンドとの結合を阻害する活性を意味する。ここで、ＩＴＧ−α４のリガンドは、ＩＴＧ−α４のリガンドとして既に知られているタンパク質又はペプチドであれば特に限定されないが、好ましくは、ＶＣＡＭ１、Ｆｎ（特には、フィブロネクチン  ＥＩＩＩＡ（Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ））、ＪＡＭ２、ＭＡｄＣＡＭ１、ＭＤＣ−Ｌ（ＡＤＡＭ２８）、ｐｐ−ｖＷＦ又はＯＰＮであり、より好ましくは、Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ、ｐｐ−ｖＷＦ又はＯＰＮであり、更に好ましくは、配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を有するペプチドである。ＩＴＧ−α４のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４とそのリガンドとの結合を阻害する場合におけるリガンドの種類は、これらのリガンドの全てである必要はなく、例えば、前述のうち一部のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４と前述のうち一部のリガンドとの結合を阻害してもよい。好ましくは、２又はそれ以上のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４とそのリガンドとの結合を阻害し、当該２又はそれ以上のリガンドは、好ましくは、Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ、ｐｐ−ｖＷＦ及びＯＰＮを含み、より好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するペプチド及び配列番号２１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００２２】
好ましくは、「ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと同等の生物学的活性」は、ＩＴＧ−α４のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害する活性に加えて、ＩＴＧ−α９のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合を阻害する活性を意味する。ここで、ＩＴＧ−α９のリガンドは、ＩＴＧ−α９のリガンドとして既に知られているタンパク質又はペプチドであれば特に限定されないが、好ましくは、ＶＣＡＭ１、Ｆｎ（特には、フィブロネクチン  ＥＩＩＩＡ（Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ））、ＪＡＭ２、ＭＤＣ−Ｌ（ＡＤＡＭ２８）、ｐｐ−ｖＷＦ又はＯＰＮであり、より好ましくは、Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ、ｐｐ−ｖＷＦ又はＯＰＮであり、更に好ましくは、配列番号２０又は２１のアミノ酸配列を有するペプチドである。ＩＴＧ−α９のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα４とそのリガンドとの結合を阻害する場合において、リガンドの種類は、これらのリガンドの全てである必要はなく、例えば、前述のうち一部のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα９と前述のうち一部のリガンドとの結合を阻害してもよい。好ましくは、２又はそれ以上のリガンドと結合し、かつ／又は、インテグリンα９とそのリガンドとの結合を阻害し、当該２又はそれ以上のリガンドは、好ましくは、Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ、ｐｐ−ｖＷＦ及びＯＰＮを含み、より好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するペプチド及び配列番号２１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００２３】
本明細書において、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害する活性、及び、ＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合を阻害する活性は、それぞれ、ＩＴＧ−α４を発現する細胞とＩＴＧ−α４リガンドとの結合（ＩＴＧ−α４を発現する細胞のＩＴＧ−α４リガンドへの細胞接着）を阻害する活性、及び、ＩＴＧ−α９を発現する細胞とＩＴＧ−α９リガンドとの結合（ＩＴＧ−α９を発現する細胞のＩＴＧ−α９リガンドへの細胞接着）を阻害する活性と置き換えてもよい。
上述の通り、本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＩＴＧ−α４のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害する活性、並びに／あるいは、ＩＴＧ−α９のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合を阻害する活性を有する。好ましくは、本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＩＴＧ−α４のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害する活性、並びに、ＩＴＧ−α９のリガンドと結合し、かつ／又は、ＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合を阻害する活性を有する。より好ましくは、本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方が結合する共通のリガンドと結合し、あるいは、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方が結合する共通のリガンドとＩＴＧ−α４との結合、及び、ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方が結合する共通のリガンドとＩＴＧ−α９との結合を阻害する。ＩＴＧ−α４とＩＴＧ−α９の両方が結合する共通のリガンドとしては、Ｆｎ−ＥＩＩＩＡ、ｐｐ−ｖＷＦ及びＯＰＮを挙げることができる。
【００２４】
更に、好ましくは、「ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと同等の生物学的活性」は、以上の活性に加えて、可溶性であることを含んでいてもよい。対象となるペプチドが可溶性であるか否かは、例えば、ＦＬＡＧ等で修飾した当該ペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞に組み換えた後、該細胞を培養後、培養上清中の当該ペプチドの存在を抗ＦＬＡＧ抗体等を用いて確認することにより調べることができる。培養上清中に当該ペプチドが放出されている場合には、可溶性であると判定することができる。本明細書において、「可溶性」とは、産生されたペプチドのほとんど（過半数）が細胞内又は細胞表面に留まることなく培養液中に放出されることを意味し、産生された全てのペプチドが培養液中に放出されることを要するものではない。
【００２５】
本明細書において、「ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントと同等の生物学的活性」とは、原則としては定性的な性質を意味し、上述の活性を有する限りにおいてはその大小を問うものではないが、好ましくは、ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアント（好ましくは、配列番号４〜９に記載のアミノ酸配列を含むペプチド）と同程度（例えば、活性値が±２５％、±２０％、±１５％、又は±１０％の範囲内）である。
【００２６】
また、本明細書における「インテグリンα４変異体」は、必要に応じて構成するアミノ酸が適宜化学修飾を受けていてもよい。また、本明細書における「インテグリンα４変異体」は、ＲＧＤ配列（配列番号１）と結合しないペプチド、及び／又はＲＤＧ配列（配列番号１）とＩＴＧ（特には、ＩＴＧ−α４、及び／又はＩＴＧ−α９）との結合を阻害しないペプチドであってもよい。
【００２７】
また、別の態様において、本発明は、ＩＴＧ−α４変異体を特異的に認識する抗体に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。本発明において、「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものである。更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってＩＴＧ−α４変異体と特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってＩＴＧ−α４変異体と特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）のいずれの定義によるものであってもよい。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＩＴＧ−α４の様々な機能を阻害可能であることから、ＩＴＧ−α４が発症又は増悪に関与する様々な疾患を治療又は予防することが可能である。特に、本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＩＴＧ−α４とそのリガンドとの結合を阻害することに加えて及びＩＴＧ−α９とそのリガンドとの結合をを阻害することが可能であることから、ＩＴＧ−α４及びＩＴＧ−α９が発症又は増悪に関与する様々な疾患を治療又は予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントである、１−２−１変異体、１−１−２変異体、７−３−２変異体、及び１０−７−３変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントである、１０−７−２変異体、及び９−５−４変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントの配列の模式図である。
【図４】ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントのクロモソーム２における遺伝子構造を示す図である。
【図５】６種のＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアント（１−１−２変異体，１−２−１変異体，７−３−２変異体，１０−７−３変異体，１０−７−２変異体，９−５−４変異体）を強制発現させたＣＯＳ細胞の培養上清中の各変異体の発現をウエスタンブロットで確認した結果を示す図である。
【図６】培養上清中のＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントとインテグリンα４のリガンドであるヒトＯＰＮ  ＲＡＡ  Ｎｈａｌｆタンパク質（Ｋｏｎ，  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４：４２０−４３２）又はネガティブコントロール（ウシ血清アルブミン：ＢＳＡ）との結合をリガンド固相ＥＬＩＳＡにて検討した結果を示す。縦軸は、リガンドに結合したインテグリンα４変異体の量の指標となる標識抗体の４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は使用した各ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントを示す。黒のグラフは各ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントとヒトＯＰＮ  ＲＡＡ  Ｎｈａｌｆタンパク質との結合を示し、灰色のグラフは各ＩＴＧ−α４のオルタナティブスプライシングバリアントとＢＳＡとの結合を示す。
【図７】内在的１−２−１変異体の発現をウエスタンブロットにより解析した結果を示す。左の数値はタンパク質の分子量（ｋＤａ)を示す。写真上部の「１−２−１／ＣＯＳ  ｐｏｓｉ−ｃｏｎ」は、１−２−１変異体を強制発現させたＣＯＳ１細胞の培養上清を示し、「Ｊｕｒｋａｔ  ｓｕｐ」は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の培養上清を示し、「Ｒｅｃ−１  ｓｕｐ」は、Ｒｅｃ−１細胞の培養上清を示す。
【図８】１−２−１変異体のインテグリンα４、インテグリンα９を介する細胞接着阻害機能を測定した結果を示す。縦軸は、リガンドに結合した細胞数の指標となる５９５ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は使用した各リガンドを示す。「ｍα４／ＣＨＯ」は、マウスインテグリンα４インテグリンを発現するＣＨＯ細胞を用いたことを意味し、「ｍα９／ＣＨＯ」は、マウスインテグリンインテグリンα９を発現するＣＨＯ細胞を用いたことを意味する。グラフの白抜きは１−２−１変異体未添加（−）を、黒は１−２−１変異体を６．２５μｇ／ｍＬ添加を、点は１２．５μｇ／ｍＬ添加を、斜線は２５μｇ／ｍＬ添加を意味する。
【図９】１−２−１変異体／ＧＳＴタンパク質によるＥＡＥの影響の検討のスケジュールを示す図である。
【図１０】１−２−１変異体タンパク質によるＥＡＥ抑制効果を検討した結果を示す図である。縦軸はＥＡＥスコアを示し、横軸は１−２−１変異体投与後の経過日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（ＩＴＧ−α４変異体）
本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＩＴＧ−α４の構造（図３）及び配列（配列番号１０）を参照しながら当業者周知の方法を採用しながら本明細書の記載を参酌することにより得ることができる。例えば、ＩＴＧ−α４を発現することが知られている細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞等のＴ細胞、Ｒｅｃ−１細胞等）のｃＤＮＡを用いて３’−ｒａｃｅ法を行うことによりＩＴＧ−α４変異体を得ることができる。例えば、ＩＴＧ−α４は、腸、Ｔ細胞、ＩｇＡ産生Ｂ細胞、（単核）白血球等で発現していることが報告されている。具体的には、ＩＴＧ−α４を発現することが知られている細胞からのトータルＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出する。トータルＲＮＡから３’−ｒａｃｅ用ｃＤＮＡ合成は、Ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（ロッシュ）を用いて行うことができる。具体的には、逆転写に使用するプライマーとして３’−ｒａｃｅ用のプライマーＱＴプライマー（例えば、配列番号２２）を用いて、３’−ｒａｃｅ用のｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＱ０プライマー（例えば、配列番号２３）と次に示すＩＴＧ−α４の種々の領域のプライマー（例えば、ヒトＩＴＧ−α４の場合、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６等）を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物を２０倍希釈し、そのうちの１μＬをテンプレートとして利用して、Ｑ１プライマー（例えば、配列番号２７）とＩＴＧ−α４プライマー（（例えば、ヒトＩＴＧ−α４の場合、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８等）を用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行う。得られたバンドを、ゲル抽出により精製し、クローニングを行うことによりＩＴＧ−α４変異体を得ることができる。
【００３１】
または、本発明のＩＴＧ−α４変異体は、１−２−１変異体、１−１−２変異体、７−３−２変異体、１０−７−３変異体、１０−７−２変異体、及び９−５−４変異体をそのまま又は適宜改変する事により得ることができる。ＩＴＧ−α４変異体として、１−２−１変異体、１−１−２変異体、７−３−２変異体、１０−７−３変異体、１０−７−２変異体、及び９−５−４変異体をそのまま使用する場合には、本明細書の実施例２の方法に準じて作製することができる。また、改変は、タンパク質工学の分野で通常用いられる技術を利用して、アミノ酸の置換、欠失、付加、及び又は挿入を行うこと他、アミノ酸を適宜修飾することにより行うことができる。
【００３２】
具体的には、本発明のＩＴＧ−α４変異体は、以下の方法により得ることができる。変異体を得た細胞ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、目的の変異体をコードするＤＮＡを増幅させるためのプライマーを適宜設計し、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を適宜設定した制限酵素で消化後、発現ベクターへ組み込み、宿主細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を用いて作製した発現ベクターを導入し、培養上清を必要に応じて精製する。または、当業者周知の方法を用いて、アミノ酸配列からＤＮＡ配列を設計し、当該ＤＮＡを合成により作製して発現ベクターへの組み込みに用いてもよい。または、１−２−１変異体のような短い変異体は、直接ペプチド合成により作製してもよい。
【００３３】
（結合活性測定方法）
ＩＴＧ−α４変異体が、ＩＴＧ−α４又はＩＴＧ−α９のリガンドと結合能を有しているか否かは、当業者周知の方法を採用しながら本明細書の記載を参酌することにより決定することができる。具体的には、リガンド固相ＥＬＩＳＡを用いて以下の方法により行うことができる。ＩＴＧ−α４又はＩＴＧ−α９のリガンドを固相し、ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、ＦＬＡＧで標識した被験ＩＴＧ−α４変異体を含有する溶液を添加する。１時間４℃で反応後、抗ＦＬＡＧ抗体と抗マウスＩｇＧ混合物を添加後、４℃で３０分間反応させ、洗浄後にＴＭＢ液で発色させて結合能を解析することができる。
【００３４】
（結合阻害活性測定方法）
ＩＴＧ−α４変異体が、ＩＴＧ−α４とそのリガンド又はＩＴＧ−α９とそのリガンドと結合を阻害する活性を有しているか否かは、ＩＴＧ−α４変異体がＩＴＧ−α４又はＩＴＧ−α９を発現する細胞とそれらのリガンドとの結合（細胞接着）を阻害するか否かにより決定することができる。具体的には、ＩＴＧ−α４のリガンド又はＩＴＧ−α９のリガンドにＢＳＡをカップリングさせ、４℃で一晩放置し固相する。ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地で１時間ブロッキング後、インテグリンα４、又はインテグリンα９を発現する細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）と、ＧＳＴ融合被験ＩＴＧ−α４変異体の混合物を添加しＣＯ２インキュベーター内で３７℃で、１時間培養する。ＰＢＳで非接着細胞を除去し、０．５％のクリスタルバイオレットを含む２０％メタノールで接着細胞を固定、染色させる。２０％酢酸で転溶し細胞接着阻害効果を５９５ｎｍの吸光度にて測定、定量することができる。
【００３５】
（医薬組成物）
本発明のＩＴＧ−α４変異体は、タンパク質医薬の分野において当業者が通常用いる知識に基づき、医薬組成物として使用することができる。よって、一の態様において本発明は、本発明のＩＴＧ−α４変異体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。具体的には、本発明の医薬組成物は、癌、癌転移、多発性骨髄腫や関節リウマチ、気管支炎、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症等の炎症性疾患又は自己免疫疾患、急性中枢神経系損傷、ＨＩＶ等の免疫不全、アレルギー性脳脊髄炎、過敏症、Ｉ型糖尿病等のＴ細胞依存性自己免疫疾患、アレルギー性肺炎、免疫複合体介在肺障害、急性腎毒性腎炎、遅延性過敏症（皮膚硬化とフィブリンの沈着等）、動脈硬化、心筋梗塞の治療薬又は予防薬、あるいは血管柄付心臓の同種移植の拒絶反応抑制等の移植時の拒絶反応の抑制剤とすることができる。
【００３６】
本発明のＩＴＧ−α４変異体を医薬組成物として使用する場合、投与部位としては、例えば、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与、経皮投与等を挙げることができる。また、医薬組成物は、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、軟膏等の塗布剤の製剤とすることができる。本発明の抗体は、単独で投与しても良いし、薬理学的に許容される単体と共に投与されてもよい。
【００３７】
（抗体）
本発明の抗体は、以下の方法により得ることができる。まず、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＩＴＧ−α４変異体の全部若しくはその一部を有するポリペプチド（好ましくは、ＩＴＧ−α４に存在しないＩＴＧ−α４変異体特異的アミノ酸配列、例えば、配列番号１５〜１９））をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ（大腸菌用）、ｐｃＤＮＡ３.１（動物細胞発現用）等）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を適切な培地（例えば、ＬＢ培地等）で培養して発現させることにより得ることができる。また、当該配列を有するペプチドを化学合成したものを用いることも可能である。
【００３８】
上記抗原を用いた動物の免疫は、上記抗原をリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）と共に、非ヒト哺乳動物又は鳥類に免疫することにより行われる。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができる。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を複数回（好ましくは、合計２〜５回）行うことができる。ポリクローナル抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００３９】
モノクローナル抗体を作成する場合、上記方法により免疫した免疫感作動物の脾臓等から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。抗体は、ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。
【００４０】
（ヒト型キメラ抗体作製）
本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、ＩＴＧ−α４変異体と結合する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。
【００４１】
（ヒト化抗体の作製）
本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、ＩＴＧ−α４変異体と結合する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２，２０００参照）。非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）がＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
【００４２】
（ヒト抗体）
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、ＩＴＧ−α４変異体又は本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチドを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。
【００４３】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗ＩＴＧ−α４変異体抗体作製方法に準じて抗原（好ましくは、本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチド）を免疫することにより、抗ＩＴＧ−α４変異体ヒト抗体を得ることができる。
【００４４】
（抗体断片の作製）
Ｆ（ａｂ’）２断片（分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明のＩｇＧ抗体をペプシンで処理することにより、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断して得ることができる。Ｆａｂ’断片は、上述の方法により得られたＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡから得ることができる。Ｆａｂ断片（Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明の抗体をパパインで処理することにより、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断して得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明の抗体のＦａｂをコードするＤＮＡから得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築することにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換し、当該システイン残基間をジスルフィド結合により結合させることにより得ることができる。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築することにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を有するペプチドとして設計することにより得ることができる。
【００４５】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４６】
（実施例１）インテグリンα４変異体の同定
新規ヒトα４インテグリン変異体の同定は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒｅｃ−１細胞ｃＤＮＡを用いた３’−ｒａｃｅ法を用いて行った。ヒトＴ細胞細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）とヒトマントル細胞リンパ腫細胞株Ｒｅｃ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３００４）からのトータルＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出した。具体的には、逆転写に使用するプライマーを３’−ｒａｃｅ用のプライマーＱＴプライマー（５’−ＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴTT−３’：配列番号２２）を利用して３’−ｒａｃｅ用ｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＱ０プライマー（５’−ＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧ−３’：配列番号２３）と次に示すヒトインテグリンα４の種々の領域の３種のプライマー（α４−Ｎ:５’−ＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴ−３’：配列番号２４；α４−１２４６：５’−ＡＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＡ−３’：配列番号２５；α４−２１１８：５’−ＣＴＴＴＴＣＧＧＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧ−３’：配列番号２６）を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を２０倍希釈し、そのうちの１μＬをテンプレートとして利用して２ｎｄ  ＰＣＲを行った。２ｎｄ  ＰＣＲ用のプライマーセットとして、Ｑ１プライマー（５’−ＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣ−３’：配列番号２７）と３種のヒトインテグリンα４プライマー（α４−１２４６：５’−ＡＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＡ−３’：配列番号２５；α４−２１１８：５’−ＣＴＴＴＴＣＧＧＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧ−３’：配列番号２６；α４−２５５６：５’−ＣＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣ−３’：配列番号２８）を利用した。得られた複数のバンドは、ゲル抽出により精製し、ＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりクローニングを行い、シークエンスによる塩基配列を決定した。
【００４７】
その結果、６種の新規インテグリンα４変異体を同定することに成功した。同定された新規の変異体を、それぞれ、１−１−２変異体，１−２−１変異体，７−３−２変異体，１０−７−３変異体，１０−７−２変異体，９−５−４変異体と命名した。同定された６種のインテグリンα４変異体、１−２−１変異体、１−１−２変異体、７−３−２変異体、１０−７−３変異体、１０−７−２変異体、及び９−５−４変異体のアミノ酸配列を図１及び図２に示す。また、これらの変異体の配列の模式図を図３に、クロモソーム２における各インテグリンα４変異体の遺伝子構造を図４に示す。
【００４８】
（実施例２）インテグリンα４変異体の発現
得られた全てのインテグリンα４変異体は、インテグリンα４細胞外領域からのみ成り立っているので、それらは分泌性タンパク質であることが推察された。そこで、それぞれの変異体を培養細胞に発現させるため、Ｃ末側にＦＬＡＧタグを付加させたプラスミドを構築した。６種のインテグリンα４変異体（１−１−２変異体，１−２−１変異体，７−３−２変異体，１０−７−３変異体，１０−７−２変異体，９−５−４変異体）の発現ベクター構築は以下のように行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）とＲｅｃ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３００４）ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、α４−Ｎプライマーと各変異体に特異的な３’端のプライマーを用いてＰＣＲを行った。使用した３’端プライマーを以下に示す。それぞれのプライマーには、発現解析の為のＦＬＡＧタグ配列を付加した。
ｈａ４−１−１−２−ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー：５’−ＴＴＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＡＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＴＴ−３’（配列番号２９）；
ｈａ４−１−２−１−ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー：５’−ＴＣＧＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号３０）；
ｈａ４−７−３−２−ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー：５’−ＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＴＧＴＡＧＧＧＣＡＴＡＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３１）；
ｈａ４−１０−６−３−ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー：５’−ＴＴＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号３２）；
ｈａ４−１０−７−２−ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＧＡＧＡＣＡＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣ−３’（配列番号３３）；
ｈａ４−９−５−４−ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー：５’−ＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号３４）。ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩ，ＸｂａＩで消化後、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組み込み、シークエンスにより配列を確認した。
【００４９】
ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５０）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作成した発現ベクターを導入し、２日後の培養上清をＶｉｖａｓｐｉｎ（ＧＥ）により１０倍濃縮したサンプルを用いて、抗ＦＬＡＧ抗体（和光）によりウェスタンブロットを行った。
【００５０】
ウェスタンブロットの結果を図５に示す。図に示される通り、各インテグリンα４変異体は培養上清中に分泌されることが分かった。
【００５１】
（実施例３）インテグリンα４変異体のインテグリンα４リガンドに対する結合能
上清中のインテグリンα４変異体がインテグリンα４のリガンドと結合能を有しているかをリガンド固相ＥＬＩＳＡにて検討した。インテグリンα４のリガンドであるヒトＯＰＮ  ＲＡＡ  Ｎｈａｌｆタンパク質（Ｋｏｎ，  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４：４２０−４３２）又はコントロールとしてＢＳＡを１０μｇ／ｍＬで４℃一晩固相し、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、実施例２で用いたものと同じ１０倍濃縮した培養上清を添加した。１時間４℃で反応後、抗ＦＬＡＧ抗体（和光）と抗マウスＩｇＧ（株式会社免疫生物研究所）混合物を添加後、４℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＴＭＢ液（ＤＡＫＯ）で発色させ結合能を解析した。
結果を図６に示す。９−５−４を除く全ての変異体がインテグリンα４のリガンドであるヒトＯＰＮ  ＲＡＡ  Ｎｈａｌｆタンパク質との結合能を有していた。ウエスタンブロットの結果から、９−５−４変異体は結合能が無いのではなく、培養上清中への分泌量が少ないことが原因と推察される。
【００５２】
（実施例４）内在的１−２−１変異体の発現解析
（１）抗１−２−１変異体抗体の作製
１−２−１変異体特異的アミノ酸配列であるＧＳＩＳＫＹＲＡＲＴ（配列番号１５）を抗原としてウサギポリクローナル抗体を作製し、内在的な１−２−１変異体の発現解析を行った。具体的には、１−２−１変異体特異的アミノ酸配列であるＧＳＩＳＫＹＲＡＲＴ配列（配列番号１５）にウシサイログロブリンをキャリア導入し、ウサギに免疫した。抗血清をＧＳＩＳＫＹＲＡＲＴペプチド（配列番号１５）を結合させたチオールセファロースビーズ（ＧＥ）を用いて精製し、抗１−２−１変異体抗体を得た。
【００５３】
（２）培養上清の調製
ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５０）における一過性のα４インテグリン変異体（１−２−１変異体）の過剰発現は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施例２において作成した１−２−１変異体の発現ベクターをＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５０）に導入することにより行った。ＤＭＥＭ（血清無し）で２日間培養を続け、培養上清と細胞を回収した。培養上清は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（ＧＥ）にて１０倍濃縮し、ウエスタンブロットに使用した。またＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）とＲｅｃ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３００４）をＴＩＬ培地（株式会社免疫生物研究所）で無血清培養し、３日後の培養上清をＶｉｖａｓｐｉｎで２０倍濃縮し、ウエスタンブロットに使用した。
【００５４】
（３）ウエスタンブロッティングによる発現確認
ウエスタンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（ミリポア）に転写した。全てのα４変異体にはＦＬＡＧタグがついているので、ＣＯＳ細胞におけるインテグリンα４変異体（１−２−１変異体）の発現は抗ＦＬＡＧ抗体（和光）にてブロットした。また、内在性インテグリンα４変異体（１−２−１変異体）の発現は上記方法により作製した抗１−２−１変異体抗体にてブロットした。発光・検出はＥＣＬ−ｐｌｕｓ(パーキンエルマー)を使用した。
【００５５】
ウエスタンブロッティングの結果から、Ｒｅｃ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３００４）において、１−２−１変異体を導入したＣＯＳ細胞の培養上清と同じ位置にバンドが確認された（図７）。すなわちＲｅｃ−１細胞には内在的に１−２−１変異体がタンパク質レベルで発現、及び分泌していることが示された。
【００５６】
（実施例５）１−２−１変異体のインテグリンα４、インテグリンα９を介する細胞接着阻害機能
（１）ＧＳＴ融合１−２−１変異体タンパク質の作製
１−２−１変異体の機能を解析するため、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオンセファロースを用いた常法により精製を行った。インテグリンα４変異体（１−２−１変異体）タンパク質を大腸菌にて作製するため、ｐＧＥＸ６Ｐ−１（ＧＥ）へ１−２−１変異体を組み換えた。１−２−１のＮ末のシグナル配列を欠損させるように設計した５’端プライマー（５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＡＧ−３’：配列番号３５）と３’端プライマー（５’−ＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣ−３’：配列番号３６）を用いて、１−２−１変異体発現ベクターをテンプレートにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ制限酵素で消化後、ｐＧＥＸ６Ｐ−１ベクターにフレームがＧＳＴ部と合致するように組み込んだ。配列はシークエンスにて確認した。本プラスミドを大腸菌に形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ培地中、３７℃で増殖させ、対数増殖期に２０℃で１時間培養後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．３ｍＭになるように添加し、２０℃で一晩後培養した。大腸菌を回収し、ＮＥＴＮ１５０（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０）で懸濁後、超音波破砕機で大腸菌をソニケートした。遠心後の上清に、グルタチオンビーズ（ＧＥ）を添加し、４℃で一晩ローテートした。遠心によりビーズを回収しＮＥＴＮ１００（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０)で３回洗浄後、溶出液（２０ｍＭ還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ），１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８））で溶出させた。得られたＧＳＴ融合１−２−１変異体タンパク質はＰＢＳに対して透析後、プロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ）にて定量した。
【００５７】
（２）インテグリンα４、又はインテグリンα９を発現するＣＨＯ細胞（それぞれ「ｍα４／ＣＨＯ」、又は「ｍα９／ＣＨＯ」という）の作製法
マウスα４インテグリン（本明細書において「ｍα４」という）発現ベクターは、ｍα４−Ｆｗプライマー（５’−ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣ−３’：配列番号３７）とｍα４−ＲＶプライマー（５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴ−３’：配列番号３８）を用い、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６４７５）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングを行って作製した。
マウスα９インテグリン（本明細書において「ｍα９」という）発現ベクターは、以下の方法により構築した。ｍα９−Ｆｗプライマー  （５’−ＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＣＧ−３’：配列番号３９）とｍα９-ＲＶプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣ−３’：配列番号４０）を用い、マウス胎盤から作製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりまずはクローニングを行った（ｍα９/ＴＯＰＯ）。シークエンスにてマウスα９インテグリン配列を確認後、ＦＬＡＧタグを付加させたｍα９インテグリン発現ベクターを作製するため、ｍα９−Ｆｗプライマーとｍα９-ＦＬＡＧ−ＲＶプライマー（５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣ−３’：配列番号４１）を用いｍα９/ＴＯＰＯをテンプレートとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組み込み作製した。
マウスα４インテグリンとα９インテグリンのそれぞれについて構築されたベクターはシークエンス法により配列確認を行った。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−６１）にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれの遺伝子導入を行い、抗生物質として１ｍｇ/ｍＬ  Ｇ４１８（ＰＡＡ）を含んだＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳにてセレクション後、限外希釈を行いシングルコロニー中のマウスα４インテグリン、マウスα９インテグリンの発現確認を行った。マウスα４インテグリンの発現は、抗マウスα４インテグリン抗体（Ｒ１−２）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によるフローサイトメトリー解析により行い、マウスα９インテグリンの発現は、抗ＦＬＡＧ抗体（和光）を用いたウエスタンブロットにより行い、最も高発現のクローンを細胞接着阻害活性試験に使用した。
【００５８】
（３）細胞接着阻害活性試験
得られた精製ＧＳＴ融合１−２−１変異体タンパク質（１−２−１／ＧＳＴ）を用いて、細胞接着阻害試験を行った。細胞接着試験に際し、種々の細胞外マトリックスタンパク質の機能部位ペプチド、具体的には次のペプチドをＢＳＡに結合させたものを各種インテグリンリガンドとして用いた：５μｇ／ｍＬのＧＲＧＤＳ（配列番号４２）ペプチド（αｖインテグリン等のＲＧＤ依存性インテグリンを介した細胞接着用ペプチド：ネガティブコントロール）、１０μｇ／ｍＬのＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２０）ペプチド（ＯＰＮの機能ペプチドであり、インテグリンα４、インテグリンα９と結合することで細胞接着能を示す）、１０μｇ／ｍＬのＱＤＨＳＦＳＩＶＩＥＴＶＱ（配列番号２１）ペプチド（ｐｐ−ｖＷＦの機能ペプチドであり、インテグリンα４、インテグリンα９と結合することで細胞接着能を示す）。
ＢＳＡをカップリングさせた細胞外マトリックスタンパク質の機能部位ペプチドを４℃で一晩放置し固相した。０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地で１時間ブロッキング後、α４インテグリン、α９インテグリンを発現するＣＨＯ細胞と、１−２−１／ＧＳＴタンパク質（それぞれ、最終濃度、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、及び２５μｇ／ｍＬ）の混合物を添加しＣＯ２インキュベーター内で３７℃で、１時間培養した。ＰＢＳで非接着細胞を除去し、０．５％のクリスタルバイオレットを含む２０％メタノールで接着細胞を固定、染色させた。２０％酢酸で転溶し５９５ｎｍの吸光度をイムノリーダーで測定することで細胞接着阻害効果を検討した。
【００５９】
（４）結果
１−２−１／ＧＳＴタンパク質は、ＲＧＤ依存性細胞接着には阻害能を全く有さないが、インテグリンα４、インテグリンα９と結合能を有するＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２０）ペプチドやＱＤＨＳＦＳＩＶＩＥＴＶＱ（配列番号２１）ペプチド依存性の細胞接着を濃度依存的に阻害することが分かった（図８）。すなわち、１−２−１／ＧＳＴタンパク質は、インテグリンα４、インテグリンα９を介する細胞接着を同時に阻害する機能を有することが分かった。また、同様にフィブロネクチン  ＥＩＩＩＡについて接着阻害活性を測定した結果、１−２−１／ＧＳＴタンパク質は、インテグリンα４、インテグリンα９を介する細胞接着を同時に阻害する機能を有していた（非図示）。ＯＰＮは動脈硬化、心筋梗塞、癌転移、及び炎症性疾患に関与することが知られている。本発明のＩＴＧ−α４変異体は、ＯＰＮとインテグリンα４及びインテグリンα９の両方を介する接着を阻害可能であることから、より効果的なこれらの疾患の治療薬となりうることが示された。また、ｐｐ−ｖＷＦは、血栓、血小板機能、炎症等に関与することが知られている。本発明のＩＴＧα４変異体は、ｐｐ−ｖＷＦとインテグリンα４及びインテグリンα９の両方を介する接着を阻害可能であることから、より効果的な炎症性疾患（特開２００５−２９８３３６）等の治療剤となりうることが示された。更に。フィブロネクチン  ＥＩＩＩＡ（別名ＥＤＡ）は、癌（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．（２００６）３７２：８３−９３）に関与することが知られている。本発明のＩＴＧα４変異体は、フィブロネクチン  ＥＩＩＩＡとインテグリンα４及びインテグリンα９の両方を介する接着を阻害可能であることから、より効果的な癌の治療薬又は癌転移抑制剤となりうることが示された。
【００６０】
（実施例６）インテグリンα４変異体１−２−１タンパク質によるＥＡＥ抑制効果
ＥＡＥモデルを用いて、１−２−１／ＧＳＴタンパク質による疾患増悪抑制効果について検討を行った。ＥＡＥモデルは、ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列：ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ：配列番号４３）２００μgとＣＦＡのｅｍｕｌｓｉｏｎをＳＪＬ／Ｊマウス（日本チャールズリバー）の尾根部に皮下投与し、同日に百日咳毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（４００ｎｇ）を静脈内注射、さらに２日後にも百日咳毒素（４００ｎｇ）を静脈内注射することにより発症させた。１−２−１／ＧＳＴタンパク質またはＧＳＴタンパク質（ネガティブコントロール）５０μｇを、ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを投与する前日に腹腔内に投与した。ＥＡＥの臨床スコアは次のようにして採点を行った。０．症状無し、１．尾の麻痺、２．運動失調、３．後肢の軽麻痺、４．後肢の麻痺、５．四肢麻痺及び尿失禁、６．瀕死、７．死亡。１−２−１／ＧＳＴタンパク質によるＥＡＥの影響の検討のスケジュールを図９に示した。
【００６１】
本検討を行った結果、１−２−１／ＧＳＴタンパク質は、発症日（オンセット）の遅延、さらにはＥＡＥスコアの劇的なる抑制を示すことが見出された（図９）。ＥＡＥモデルは、多発性硬化症のモデルであることから、本実験の結果から本発明のＩＴＧ−α４変異体が、多発性硬化症の治療薬又は予防薬となることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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