(57)【要約】  本発明のバイオフィルム抑制剤は、少なくとも１つの認識糖鎖がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であるレクチンを含有している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの認識糖鎖がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であるレクチンを含有することを特徴とするバイオフィルム抑制剤。
【請求項２】
少なくとも１つの認識糖鎖がシアル酸（Ｓｉａ）であるレクチンを含有することを特徴とするバイオフィルム抑制剤。
【請求項３】
前記レクチンは、ゴーヤ、アメリカヤマゴボウ、ハリエニシダ、マッシュルーム、小麦、及びタチナタマメからなる群より選ばれた１種以上の天然物から抽出される抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のバイオフィルム抑制剤。
【請求項４】
前記レクチンは、マッシュルーム、小麦、又はマッシュルーム及び小麦から抽出される抽出物であることを特徴とする請求項２に記載のバイオフィルム抑制剤。
【請求項５】
前記レクチンは、下記（１）、（２）の少なくとも一方の性質を有することを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のバイオフィルム抑制剤。
（１）付着体に付着したバイオフィルム及びバイオフィルムを形成する菌の少なくとも一方を前記付着体から引き剥がす性質。
（２）バイオフィルムを形成する微生物を凝集させる性質。
【請求項６】
前記バイオフィル抑制剤は、黄色ブドウ球菌、カンジダ菌、緑膿菌、及び大腸菌からなる群より選ばれた１種以上の微生物によって形成されるバイオフィルムを抑制することを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載のバイオフィルム抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互作用】
【０００１】
本国際出願は、２０１２年３月１３日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１２−０５５９３９号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０１２−０５５９３９号の全内容を本国際出願に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、バイオフィルム抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオフィルムは、一種類以上の微生物が集合して様々な物質の表面に付着し、微生物の分泌物等と共に形成される構造体である。環境中の微生物のほとんどはバイオフィルムを形成して存在している。
バイオフィルムは、人体、生活環境、医療分野、において深刻な問題を引き起こすことが知られている。
人体においては、う触、歯周病、口臭等の口腔疾患の原因となる。また、口腔内だけでなく、体中の微生物感染症は、バイオフィルム中で増殖する微生物によって引き起こされると言われている。生活環境においては、台所等の排水溝や配管等のぬめりやつまり、悪臭の原因になる。また、食品加工に必要な機材表面に形成されたバイオフィルムによって、加工後の食品に微生物が付着し食中毒等を引き起こす場合もある。医療分野においては、カテーテルの表面に形成されたバイオフィルムが重篤な感染症を引き起こす原因になる。バイオフィルムを抑制又は除去する方法に関しては数多く報告されている。例えば、特開２００７−１４５８７６号公報には、糖アルコールおよび／またはアミノ酸が配合された口腔用組成物が、バイオフィルムの形成過程において細菌の付着や凝集などを抑制することが報告されている（特許文献１）。特開２００４−１５５６８１号公報には、分子中に酸素原子含有官能基を少なくとも１つ有し、分子量２２０以下のラクトン誘導体および／またはフラン誘導体を有効成分とする口腔バイオフィルム抑制剤が、口腔疾患の原因となる口腔細菌およびバイオフィルムを効率的に制御し得ることが報告されている（特許文献２）。特表２００７−５１８４００号公報には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ種から選択される１種以上の発酵菌由来の無細胞発酵物が、バイオフィルムの形成を防止、存在するバイオフィルムを減少、および細菌の個体群を減少させることが報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１４５８７６号公報
【特許文献２】特開２００４−１５５６８１号公報
【特許文献３】特表２００７−５１８４００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の特許文献１〜特許文献３に記載のバイオフィルムを抑制又は除去する方法では、バイオフィルムが薬剤耐性を有している場合、バイオフィルムを形成する微生物の除去が困難になり、所望のバイオフィルム抑制効果が得られないという問題がある。【０００６】
従って、本発明では、バイオフィルム抑制効果の優れたバイオフィルム抑制剤を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のバイオフィルム抑制剤は、少なくとも１つの認識糖鎖がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であるレクチンを含有することを特徴とする。
本発明のバイオフィルム抑制剤は、少なくとも１つの認識糖鎖がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であるレクチンを含有することによって、バイオフィルムを抑制することができる。【０００８】
本発明の効果（バイオフィルムを抑制することができること）が生じる理由は、次の記載のように推測される。
バイオフィルムの表面には、多糖類の膜が形成されている。多糖類の膜の成分の一つにＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がある。レクチンが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を認識し多糖類の膜に結合することによって、多糖類の膜が除去される。多糖類の膜が除去されることに伴って、バイオフィルムの形成が阻害されるので、バイオフィルムを抑制することができる。【０００９】
また、バイオフィルムは、多糖類の膜と微生物間の物質のやり取りによって、あらゆる薬剤に対して耐性を獲得している。本発明のバイオフィルム抑制剤によれば、多糖類の膜が除去されることになるので、形成されたバイオフィルムの薬剤に対する耐性を低くすることができる。【００１０】
レクチンは、少なくとも１つの認識糖鎖がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）である公知のレクチンを適宜選択して使用することができる。
また、本発明のバイオフィルム抑制剤中に含まれるレクチン濃度は、０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜飽和濃度であることが好ましく、０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬであるとさらに好ましく、０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであるとさらに好ましい。飽和濃度とは、バイオフィルム抑制剤中に含むことが可能なレクチンの最大濃度である。【００１１】
本発明のバイオフィルム抑制剤は、少なくとも１つの認識糖鎖がシアル酸（Ｓｉａ）であるレクチンを含有すると好ましい。
少なくとも１つの認識糖鎖がシアル酸（Ｓｉａ）であるレクチンを含有する場合、レクチンがシアル酸を認識することによって、バイオフィルムを一層抑制することができる。【００１２】
この場合において、本発明の効果（バイオフィルムを抑制することができること）が生じる理由は、次の記載のように推測される。
シアル酸（Ｓｉａ）は、微生物の表面に露出した多糖類の成分の一つである。レクチンが、シアル酸（Ｓｉａ）を認識し微生物表面に結合することによって、微生物が強く凝集することになる。微生物が強く凝集することに伴って、微生物の付着体への付着が阻害されるので、バイオフィルムを抑制することができる。【００１３】
また、バイオフィルムは、多糖類の膜と微生物間の物質のやり取りによって、あらゆる薬剤に対して耐性を獲得している。本発明のバイオフィルム抑制剤によれば、微生物が強く凝集することになるので、形成されたバイオフィルムの薬剤に対する耐性を一層低くすることができる。【００１４】
少なくとも１つの認識糖鎖がシアル酸（Ｓｉａ）であるレクチンは、公知のレクチンを適宜選択して使用することができる。
本発明のバイオフィルム抑制剤において、レクチンは、ゴーヤ、アメリカヤマゴボウ、ハリエニシダ、マッシュルーム、小麦、及びタチナタマメからなる群より選ばれた１種以上の天然物から抽出される抽出物であると好ましい。【００１５】
レクチンが、ゴーヤ、アメリカヤマゴボウ、ハリエニシダ、マッシュルーム、小麦、及びタチナタマメからなる群より選ばれた１種以上の天然物から抽出される抽出物である場合には、レクチンが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を認識し、多糖類の膜に結合することによって、多糖類の膜が除去される。多糖類の膜が除去されることに伴って、バイオフィルムの形成が阻害されるのでバイオフィルムを一層抑制することができる。さらに、レクチンが、マッシュルーム、小麦、又はマッシュルーム及び小麦から抽出される抽出物である場合には、シアル酸（Ｓｉａ）を認識し、微生物表面に結合することによって、微生物が強く凝集することになる。微生物が強く凝集することに伴って、微生物の付着体への付着が阻害されるので、バイオフィルムを一層抑制することができる。【００１６】
また、バイオフィルムは、多糖類の膜と微生物間の物質のやり取りによって、あらゆる薬剤に対して耐性を獲得している。本発明のバイオフィルム抑制剤によれば、多糖類の膜が除去されることになるので、形成されたバイオフィルムの薬剤に対する耐性を一層低くすることができる。さらに、レクチンが、マッシュルーム、小麦、又はマッシュルーム及び小麦から抽出される抽出物である場合には、微生物が強く凝集することになるので、形成されたバイオフィルムの薬剤に対する耐性を一層低くすることができる。【００１７】
レクチンは、ゴーヤ、アメリカヤマゴボウ、ハリエニシダ、マッシュルーム、小麦、及びタチナタマメからなる群より選ばれた１種以上の天然物それぞれから公知の手法を適宜選択して使用することによって得ることができる。例えば、以下に記載の手法を使用することができる。【００１８】
ゴーヤ、アメリカヤマゴボウ、ハリエニシダ、マッシュルーム、小麦、及びタチナタマメからなる群より選ばれた１種以上の天然物それぞれについて、コーヒーミル、ホモジナイザー等の公知の方法により所望の大きさになるまで粉砕する。得られた粉末を、タンパク質の抽出に一般的に用いられる抽出用水溶液（例えば、蒸留水、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液など、特にこれらに限定されない）を用いて抽出し、得られた抽出液にエタノールを加えて沈殿物を得る。沈殿物を乾燥させた後、生理食塩水中に沈殿物を加えた後、遠心分離して、上澄み液を回収することによって粗抽出物を得ることができる。得られた粗抽出物を、糖結合のアフィニティーカラムで精製することによって、レクチンを得ることができる。アフィニティーカラムに結合させる糖は、精製するレクチンの糖特異性に応じ選択する。例えば、ゴーヤの場合はガラクトースを結合させたアフィニティーカラムにより効率的にレクチンを精製することができる。また、必要に応じ、ゲルろ過等の手法を追加してもよい。上記手法に代えて、または加えて、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を１つまたは複数組み合わせて用いて精製することが可能である。【００１９】
また、市販されているゴーヤ、アメリカヤマゴボウ、ハリエニシダ、マッシュルーム、小麦、及びタチナタマメからなる群より選ばれた１種以上の天然物から抽出されるレクチンをそれぞれ適宜選択して使用してもよい。【００２０】
本発明のバイオフィルム抑制剤において、レクチンは、下記（１）、（２）の少なくとも一方の性質を有すると好ましい。
（１）付着体に付着したバイオフィルム及びバイオフィルムを形成する菌の少なくとも一方を付着体から引き剥がす性質。
（２）バイオフィルムを形成する微生物を凝集させる性質。【００２１】
このようなバイオフィルム抑制剤によれば、（１）、（２）の性質を有する場合には、バイオフィルムを一層抑制することができる。
付着体とは、バイオフィルムが付着可能なものであればよく、例えば、歯、義歯、歯垢、洗面、浴室、トイレなどの排水溝、医療用のカテーテル等が挙げられる。【００２２】
本発明のバイオフィルム抑制剤において、バイオフィルム抑制剤は、黄色ブドウ球菌、カンジダ菌、緑膿菌、及び大腸菌からなる群より選ばれた１種以上の微生物によって形成されるバイオフィルムを抑制すると好ましい。【００２３】
黄色ブドウ球菌、カンジダ菌、緑膿菌、及び大腸菌からなる群より選ばれた１種以上の微生物によって形成されるバイオフィルムを抑制する場合には、微生物の生育する場の形成を抑制することができる。したがって、本発明のバイオフィルム抑制剤によれば、これら微生物の除菌が可能になり、微生物が原因となって起こる感染症を抑えることができる。また、これら微生物が付着することによって起こる付着体の汚染を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】クリスタルバイオレット法の説明図である。
【図２】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａはバイオフィルム形成度を示すグラフである。図３Ｂは、各培養液の波長６００ｎｍにおける吸光度を示すグラフである。
【図４】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図５】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【図６】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａはバイオフィルム形成度を示すグラフである。図７Ｂは、黄色ブドウ球菌が凝集した様子を示す図である。
【図８】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図９】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【図１０】バイオフィルム抑制剤１〜バイオフィルム抑制剤５（図では、単に抑制剤１〜抑制剤５と示す）のバイオフィルム形成抑制効果について説明する説明図である。
【図１１】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図１２】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【図１３】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図１４】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【図１５】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図１６】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【図１７】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図１８】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【図１９】図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す図である。
【図２０】バイオフィルム形成度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次に、本発明の実施形態について一例を挙げて説明する。但し、本発明はこれら実施形態になんら限定されるものではない。
１．バイオフィルム抑制剤の製造
（ゴーヤレクチンを含むバイオフィルム抑制剤１）
ゴーヤレクチンを含むバイオフィルム抑制剤１は、特許第３８４９９４５号、特開２０１１−２４１１９２号公報に記載の製造方法に基づいて、次に記載のようにして製造した。
【００２６】
ゴーヤの種子を、コーヒーミルにより粉砕し微粉末体にした。得られた微粉末体を容器の中に入れ、蒸留水を加えてスターラーで撹拌した後、放置してゴーヤの種子成分を抽出した。この抽出液をろ過し、ろ液を遠心分離して上澄み液を回収した。上澄み液にエタノールを加えて撹拌し、４℃で約１２時間インキュベートし、ゴーヤ粗抽出溶液を得た。
【００２７】
ゴーヤ粗抽出液を、ガラクトースを結合させたアフィニティーカラムにより精製することによってバイオフィルム抑制剤１を得た。
（マッシュルームレクチンを含むバイオフィルム抑制剤２）
マッシュルームレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤２を得た。マッシュルームレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１０２のものを使用した。
（アメリカヤマゴボウレクチンを含むバイオフィルム抑制剤３）
アメリカヤマゴボウレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤３を得た。アメリカヤマゴボウレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１１６のものを使用した。
（小麦胚芽レクチンを含むバイオフィルム抑制剤４）
小麦胚芽レクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤４を得た。小麦胚芽レクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１２０のものを使用した。
（ハリエニシダレクチンを含むバイオフィルム抑制剤５）
ハリエニシダレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤５を得た。ハリエニシダレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１１９のものを使用した。
（タチナタマメレクチンを含むバイオフィルム抑制剤６）
タチナタマメレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤６を得た。タチナタマメレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１０３のものを使用した。
（比較例１）
ダイズレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤を得た。ダイズレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１１７のものを使用した。
（比較例２）
エンドウマメレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤を得た。エンドウマメレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１１５のものを使用した。
（比較例３）
レンズマメレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤を得た。レンズマメレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１０７のものを使用した。
（比較例４）
ピーナッツレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤を得た。ピーナッツレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１１４のものを使用した。
（比較例５）
ロータスレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤を得た。ロータスレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１０９のものを使用した。
（比較例６）
ニホンニワトコレクチンの濃度を所望の濃度になるように調製することによってバイオフィルム抑制剤を得た。ニホンニワトコレクチンは、コスモ・バイオ株式会社製、型番Ｊ１１８のものを使用した。
２．バイオフィルム抑制剤の評価
（１）バイオフィルムの形成前にバイオフィルム抑制剤１を加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をグルコース添加８０４培地に加えて培養した。波長６００ｎｍにおける培地の光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）が０．１ＯＤになるまで培養した後、培養液を５００μｌずつ２４穴マルチウェルプレートの各ウェルに入れた。各ウェルにゴーヤレクチンの濃度が、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤１をそれぞれ加えた。その後、培養液を一晩培養した。なお、コントロールとして、バイオフィルム抑制剤を加えていない培養液についても、同様にして培養した。
【００２８】
グルコース添加８０４培地の組成は以下に示す通りである。
ポリペプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １ｇ／Ｌ、グルコース  ５ｇ／Ｌ、蒸留水  １Ｌ
得られた培養液それぞれについて、クリスタルバイオレット法を使用してバイオフィルム形成度を算出した。
【００２９】
図１に、クリスタルバイオレット法について説明した説明図を示す。各培養液を各ウェルから取り除き、各ウェルを水で洗浄し風乾した（図１の（ａ）工程）。図１の（ａ）工程後に、各ウェルに固着して残存していた物をバイオフィルムとした。次に、各ウェルに、クリスタルバイオレット染色液を添加して、バイオフィルムを染色した（図１の（ｂ）工程）。その後、クリスタルバイオレット染色液を除き、水で洗浄し風乾した（図１の（ｃ）工程）。この工程後における各ウェルの染色状態を観察した。最後に、各ウェルにエタノールを加えて脱色させた（図１の（ｄ）工程）。得られた脱色液の波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。バイオフィルム形成度を、測定した吸光度から式１を用いて算出した。計算式を式１に示す。
（式１）バイオフィルム形成度（％）＝Ｘ／Ｙ×１００
（ただし、Ｘは、バイオフィルム抑制剤を加えたウェルについて、図１の（ｄ）工程後の脱色液を測定して得られた吸光度であり、Ｙは、コントロールのウェルについて、図１の（ｄ）工程後の脱色液を測定して得られた吸光度である。）
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図２には、上記図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。図２に示すように、ゴーヤレクチンの濃度が、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１ｍｇ／ｍＬと濃度が高くなるに従って、コントロールと比較して染色度合いは低くなることが示され、バイオフィルムの形成抑制効果が高いことを目視で認識することができた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図３Ａに、バイオフィルム形成度を算出した結果を示す。ゴーヤレクチンの濃度が０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１ｍｇ／ｍＬになるように加えた場合は、バイオフィルム形成度は約６０％であり、コントロールと比較してバイオフィルム抑制効果が高いことが明らかとなった。また、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度ではさらにバイオフィルム形成度が低くなり、バイオフィルム形成抑制効果が向上することが示された。
【００３０】
なお、図３Ｂには、ゴーヤレクチンの濃度が０．０１、０．０５、０．１、０．５、１ｍｇ／ｍＬになるように添加した培養液について、一晩培養後の培養液の波長６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した結果を示す。
【００３１】
図３Ｂに示すように、ゴーヤレクチンの濃度が上昇するにしたがって、吸光度が高くなり、黄色ブドウ球菌の浮遊菌数が累乗関数的に増加することが明らかとなった。この結果から、バイオフィルム抑制剤１は、ゴーヤレクチンが黄色ブドウ球菌のプレートへの付着を抑制または付着した菌を引き剥がすことによってバイオフィルムの形成を抑制する効果を奏することが示唆された。
（２）バイオフィルムの形成前にバイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤５、比較例１〜比較例３のバイオフィルム抑制剤をそれぞれ加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤５、比較例１〜比較例３のバイオフィルム抑制剤をそれぞれ使用すること以外は、上記（１）（１−１）に記載の評価方法と同様にして評価を行った。
【００３２】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図４に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。図４に示すように、バイオフィルム抑制剤１、及びバイオフィルム抑制剤５が、コントロール、及び比較例１〜比較例３のバイオフィルム抑制剤と比較して染色度合いが低くなることが示され、バイオフィルム形成抑制効果が高いことを目視で確認することができた。また、バイオフィルム抑制剤１を使用した場合に、最も染色度合いが低くなり、次にバイオフィルム抑制剤２を使用した場合に、染色度合いが低くなることが示された。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図５に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
図５に示すように、バイオフィルム抑制剤１は、バイオフィルムの形成度が約２０％であり、バイオフィルム抑制剤５は、バイオフィルムの形成度が約４０％であり、コントロール、及び比較例１〜比較例３のバイオフィルム抑制剤と比較してバイオフィルム形成抑制効果が顕著に高いことが示された。
（３）バイオフィルムの形成前に、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤２をそれぞれ加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤１、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤２をそれぞれ使用すること以外は、上記（１）（１−１）に記載の評価方法と同様にして評価を行った。
【００３３】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図６に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。図６に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤２は、コントロールと比較して染色度合いは低くなることが示され、バイオフィルム抑制効果が高いことを目視で確認することができた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図７Ａに、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００３４】
図７Ａに示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤２は、コントロールと比較してバイオフィルム形成度が顕著に低下し、バイオフィルム抑制効果が高いことが示された。
【００３５】
なお、図７Ｂに示すように、バイオフィルム抑制剤２を使用した場合には、バイオフィルム抑制剤２を添加した直後から、黄色ブドウ球菌の凝集が観察された。また、バイオフィルム抑制剤１を添加した場合には、黄色ブドウ球菌の凝集は観察されなかった。（４）バイオフィルムの形成前に、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４、比較例４〜比較例６のバイオフィルム抑制剤をそれぞれ加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４、及び比較例４〜比較例６のバイオフィルム抑制剤をそれぞれ使用すること以外は、上記（１）（１−１）に記載の評価方法と同様にして評価を行った。
【００３６】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図８に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。
【００３７】
図８に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４は、コントロール、及び比較例４〜比較例６のバイオフィルム抑制剤と比較して染色度合いは顕著に低くなることが示され、バイオフィルム抑制効果が高いことを目視で確認することができた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図９に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００３８】
図９に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４は、コントロール、及び比較例４〜比較例６のバイオフィルム抑制剤と比較してバイオフィルム形成度が顕著に低下し、バイオフィルム抑制効果が高いことが明らかとなった。
【００３９】
なお、バイオフィルム抑制剤４を添加した場合には、バイオフィルム抑制剤２を添加した場合と同様に黄色ブドウ球菌の凝集が観察された。
以上の結果をまとめた表を表１に示す。「＋」の数が多いほどバイオフィルム形成抑制効果が高いことを示す。「＋」の数が同じ場合は、同等のバイオフィルム形成抑制効果を有することを示す。また、各バイオフィルム抑制剤に含まれるレクチンが認識する糖鎖も表１に示す。なお、バイオフィルム抑制剤６については、緑膿菌に対する効果を示す。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１に示すように、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を認識糖鎖中に含むレクチンを含有するバイオフィルム抑制剤１〜６は、高いバイオフィルム形成抑制効果を奏することができる。この結果から、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を認識糖鎖中に含むレクチンは、バイオフィルムの形成を抑制することができることが示された。
【００４２】
また、バイオフィルム抑制剤２、バイオフィルム抑制剤４は、菌を強く凝集させてバイオフィルムの形成を抑制することができる。バイオフィルム抑制剤２、及びバイオフィルム抑制剤４には、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に加えてシアル酸）を認識糖鎖中に含むレクチンが含まれていることから、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に加えてシアル酸（Ｓｉａ）を認識糖鎖中に含むレクチンは、菌を強く凝集させてバイオフィルムの形成を抑制することができることが示された（図１０参照。）。なお、図１０では、「バイオフィルム抑制剤」を単に「抑制剤」と記載し、「バイオフィルム形成前（又は形成後）」を単に「形成前（又は形成後）」と記載している。
（５）バイオフィルムの形成後にバイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤２をそれぞれ加えた場合のバイオフィルムの引き剥がし効果の評価
（１−１）評価方法
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をグルコース添加８０４培地に加えて培養した。波長６００ｎｍにおける培地の光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）が０．１ＯＤになるまで培養した後、培養液を５００μｌずつ２４穴マルチウェルプレートの各ウェルに入れた。培養液を一晩培養し、各ウェルにバイオフィルムを形成させた。その後、各ウェルに、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤１、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤２をそれぞれ添加した。
【００４３】
バイオフィルムの形成度は、上記（１）（１−１）に記載と同様にして算出した。
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図１１に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。
【００４４】
図１１に示すように、バイオフィルム抑制剤１は、コントロールと比較して染色度合いは低くなった。これは、各ウェルに付着している形成されたバイオフィルムが引き剥がされたことに起因するものである。したがって、バイオフィルム抑制剤１は、バイオフィルムの引き剥がし効果が高いことを目視で確認することができた。バイオフィルム抑制剤２は、コントロールと比較して染色度合いが増し、バイオフィルムの付着が強化することが目視で確認できた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図１２に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００４５】
図１２に示すように、バイオフィルム抑制剤１を使用した場合は、バイオフィルムの形成度が顕著に低下し、コントロールと比較してバイオフィルムの引き剥がし効果が高いことが明らかとなった。また、バイオフィルム抑制剤２を使用した場合は約２倍バイオフィルムの形成度が増加することから、コントロールと比較してバイオフィルムの引き剥がし効果は低いことが明らかとなった。
（６）バイオフィルムの形成後に、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４をそれぞれ加えた場合のバイオフィルムの引き剥がし効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤１、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤３、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤４をそれぞれ使用すること以外は、上記（５）（１−１）に記載の評価方法と同様にして評価を行った。
【００４６】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図１３に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。
【００４７】
図１３に示すように、バイオフィルム抑制剤１及びバイオフィルム抑制剤３を使用した場合は、コントロールと比較して染色度合いは低くなった。したがって、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３は、バイオフィルムの引き剥がし効果が高いことを目視で確認することができた。バイオフィルム抑制剤４を使用した場合は、コントロールと比較して染色度合いが増したことから、バイオフィルムの付着が強化することが目視で確認できた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図１４に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００４８】
図１４に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３を使用した場合は、バイオフィルムの形成度が顕著に低下し、コントロールと比較してバイオフィルムの引き剥がし効果が高いことが明らかとなった。また、バイオフィルム抑制剤４を使用した場合は、コントロールと比較してバイオフィルムの形成度が増加することから、バイオフィルムの引き剥がし効果は低いことが明らかとなった。
【００４９】
以上の結果をまとめた表を表１に示す。
バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤５は、形成されたバイオフィルムに対して高い引き剥がし効果を奏することができる。バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤５には、Ｌ−フコース−Ｄ−ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を認識糖鎖中に含むレクチンが含まれていることから、Ｌ−フコース−Ｄ−ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を認識糖鎖中に含むレクチンにはバイオフィルムを引き剥がすことができることが示唆された。また、バイオフィルム抑制剤３には、Ｎ−アセチルグルコサミン（連結型（β１−４ＧｌｃＮＡｃ）ｎ）を認識するレクチンが含まれていることから、Ｎ−アセチルグルコサミン（連結型（β１−４ＧｌｃＮＡｃ）ｎ）を認識するレクチンには、バイオフィルムを引き剥がすことができることが示唆された（図１０参照。）。
（７）カンジダ菌によって形成されるバイオフィルムに対して、バイオフィルムの形成前にバイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３をそれぞれ加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルムを形成させる菌としてカンジダ菌を使用し、バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤１、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤３をそれぞれ使用すること以外は、上記（１）（１−１）に記載と同様にして評価した。
【００５０】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図１５に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。
【００５１】
図１５に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３は、コントロールと比較して染色度合いは低くなることが示され、バイオフィルム形成抑制効果が高いことを目視で確認することができた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図１６に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００５２】
図１６に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤３は、コントロールと比較してバイオフィルム形成度が低下することから、バイオフィルム形成抑制効果が高いことが明らかとなった。
（８）緑膿菌によって形成されるバイオフィルムに対して、バイオフィルムの形成前にバイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４及びバイオフィルム抑制剤６をそれぞれ加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルムを形成させる菌として緑膿菌を使用し、バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４、及びバイオフィルム抑制剤６をそれぞれ使用すること以外は、上記（１）（１−１）に記載と同様にして評価した。
【００５３】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図１７に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。
【００５４】
図１７に示すように、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４、及びバイオフィルム抑制剤６は、コントロールと比較して染色度合いは低くなることが示され、バイオフィルム形成抑制効果が高いことを目視で確認することができた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図１８に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００５５】
図１８に示すように、バイオフィルム抑制剤３、バイオフィルム抑制剤４、及びバイオフィルム抑制剤６は、コントロールと比較してバイオフィルム形成度が低下することから、バイオフィルム形成抑制効果が高いことが明らかとなった。
（９）大腸菌によって形成されるバイオフィルムに対して、バイオフィルムの形成前にバイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤４をそれぞれ加えた場合のバイオフィルム形成抑制効果の評価
（１−１）評価方法
バイオフィルムを形成させる菌として大腸菌を使用し、バイオフィルム抑制剤として、レクチンの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるようにバイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤４をそれぞれ使用すること以外は、上記（１）（１−１）に記載と同様にして評価した。
【００５６】
（１−２）結果
［図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色結果］
図１９に、図１の（ｃ）工程後の各ウェルの染色状態を観察した結果を示す。
【００５７】
図１９に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤４は、コントロールと比較して染色度合いは低くなることが示され、バイオフィルム形成抑制効果が高いことを目視で確認することができた。
［バイオフィルム形成度の算出結果］
図２０に、各バイオフィルム抑制剤を使用した場合のバイオフィルム形成度を算出した結果を示す。
【００５８】
図２０に示すように、バイオフィルム抑制剤１、バイオフィルム抑制剤４は、コントロールと比較してバイオフィルム形成度が低下することから、バイオフィルム形成抑制効果が高いことが明らかとなった。
【００５９】
尚、本発明は前記実施の形態になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施し得ることはいうまでもない。
【図３Ａ−３Ｂ】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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