(57)【要約】  本発明は、高輝度の蛍光標識材料を用いてもバックグラウンドノイズが高くならず、Ｓ／Ｎ比が向上した定量性の高い免疫組織染色方法に好適な検出方法を提供することを目的とする。本発明は、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用することにより、Ｓ／Ｎ比が向上した定量性の高い免疫組織染色方法に好適な検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する検出方法。
【請求項２】
上記生体物質が、組織切片を構成するものである、請求項1に記載の検出方法。
【請求項３】
上記蛍光体内包ナノ粒子の母体と、上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の母体とが、同じ組成を有する、請求項1または2に記載の検出方法。
【請求項４】
上記蛍光体内包ナノ粒子および上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の粒子表面の少なくとも一部が、それぞれ、生体物質に吸着しづらい同じ有機分子で被覆されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
上記蛍光体内包ナノ粒子の平均粒径と、上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の平均粒径との差が、25％以内である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質の検出方法に関する。さらに詳細には、本発明は、蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とを併用する生体物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに、成人の死亡原因を二分する疾患である。例えば、乳がん罹患率は、日本人では欧米諸国に比べて低いが、近年では増加傾向にあり、1998年には胃がんの罹患率を抜いて女性罹患率の第1位となった。最近の報告である2005年の厚生労働省統計によれば、乳がんの年間罹患数は5万人を超えている。世界でも同様にその数は年々増加しており、2008年のＷＨＯの報告によれば、乳がんは男女合わせても第1位の罹患率となっており、その年間罹患数は138万人を超え、女性のがん全体の約23％を占めている。【０００３】
がんの診断にはＸ線ＣＴやＭＲＩ等の画像診断のほか、特定のがんに特異的に発現するがんマーカーや、血液、組織中に漏出するがんマーカー等を検出する方法も汎用されている。乳がんの一般的なスクリーニング検査としては、問診、触診、軟Ｘ線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が実施され臨床的に疑いが生じると、細胞診や生検が実施され病理学的診断によりがんであるかどうか判別される。がん治療や予後の経過を判定するために、病理学診断は重要であり、この診断の中心となるのは「形態観察を行うためのＨＥ〔ヘマトキシリン・エオジン〕染色法」と「がんマーカー因子に対する抗体を用いた免疫組織化学法」である。特に近年の抗体医薬の登場により、免疫組織化学の重要性は著しく高まっている。例えば、がんの増殖に関与する因子であるヒト上皮成長因子受容体2〔human epidermal growth factor receptor-2；ＨＥＲ2〕を標的とした抗体医薬であるハーセプチン〔Herceptin；登録商標〕として市販されているトラスツズマブ〔Trastuzumab〕は、乳がんの代表的な抗がん剤であることが知られている。この薬剤投与の有効性の判定方法として、ＨＥＲ2タンパク質等の発現を解析する免疫組織化学〔Immunohistochemistry；ＩＨＣ〕法と、ＨＥＲ2遺伝子等の増幅を解析するＦＩＳＨ〔Fluorescence in situ hybridization〕法とが臨床の場で広く用いられている。ＩＨＣ法により、ＨＥＲ2抗原部位に結合したＨＥＲ2抗体をＤＡＢ〔Diaminobenzidine；ジアミノベンジジン〕を用いて染色し、可視化することでＨＥＲ2の発現量を検出することができる。しかし、その判定基準は染色レベルをスコア0〜3とした四段階のみによる大雑把な判定基準であるため、定量性に欠けており、さらに病理医の熟練度により判定基準が左右されることから、臨床的に問題となっている。他方、ＦＩＳＨ法は、ＨＥＲ2遺伝子を検出するプローブと、17番染色体セントロメアを検出するプローブを用いて行われ、このＦＩＳＨ法により解析された17番染色体1本あたりのＨＥＲ2の遺伝子コピー数を基に、ＨＥＲ2遺伝子の増幅の有無を判定することができる。ＦＩＳＨ法は定量的検査法ではあるが、ＨＥＲ2タンパク質量やＨＥＲ2の細胞内局在を直接評価する方法ではない。かかる事情から、高精度な抗体を成分として含む医薬品の有効性を判定する方法の開発が必要とされている。【０００４】
このような状況から蛍光色素や半導体ナノ粒子等の蛍光体を抗体に結合し標的分子の有無を判断する方法も為されてきた。蛍光染色はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある（非特許文献1）。しかしながら、一般的な蛍光色素や半導体ナノ粒子は蛍光量が少ないため、自家蛍光をきちんと分離除去しないと、蛍光による標的分子の判断ができず、形態情報は依然として、別切片でのＨＥ染色が必要であった。【０００５】
このような理由から、蛍光色素や半導体ナノ粒子を包含させて一標識体当たりの蛍光量を多くする方法が考えられた。例えば、特許文献1には、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に半導体ナノ粒子への吸着性が良い有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル−ゲル法とを組み合わせることにより、半導体ナノ粒子を内部に分散固定したガラス蛍光体ナノ粒子が開示されている。しかしながら、このような手段では蛍光量が多くなり、標的分子の判断が可能になるものの、わずかな非特異的な結合があってもバックグラウンドノイズが高くなる原因となるため、高感度に定量検出する為の大きな課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2005-281019号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「病理と臨床  Vol.25  2007年臨時増刊号  診断に役立つ免疫組織化学」,2007年3月12日発行,文光堂
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、高輝度の蛍光標識材料を用いてもバックグラウンドノイズが高くならず、Ｓ／Ｎ比が向上した定量性の高い免疫組織染色法に好適な検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、発色剤として蛍光体内包ナノ粒子を使用する免疫組織染色法において、通常ブロッキング剤として使用するウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕より、蛍光体を内包しないナノ粒子の方が、ブロッキング能が有意に優れることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、上述した目的の少なくとも１つを実現するために、本発明の一側面を反映した検出方法は、
特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用することを含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、特定の生体物質の検出において、高輝度の蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子をブロッキング剤として使用することによって、Ｓ/Ｎ比の向上した組織染色画像が観察でき、病理医の診断精度の向上を図ることができる。【００１２】
なお、本発明において蛍光体を内包しないナノ粒子がブロッキング剤として好ましく機能することの理由としては、例えば、従来のＢＳＡ等のタンパク質のブロッキング剤が抗原抗体反応に関する非特異的吸着を防止するためのものである（従って蛍光体内包ナノ粒子に結合された抗体等の非特異的吸着は防止できる）のに対し、本発明では上記のブロッキング剤によって、ナノ粒子を構成する母体の組成、ナノ粒子の表面を被覆する有機分子、ナノ粒子のサイズ等に依存して起きる非特異的吸着を防止することができるためであると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に係る特定の生体物質を検出する方法について詳細に説明する。
本発明は、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する。
【００１４】
＜特定の生体物質を検出する方法＞
本発明に係る特定の生体物質を検出する方法として、具体的には、従来公知であるイムノクロマト法、イムノアッセイ、ウエスタンブロティング法、ノーザンブロティング法、サザンブロッティング法、ＤＮＡアレイ（またはＤＮＡマイクロアレイもしくはＤＮＡチップ）を使用するハイブリダイゼーション法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法などを例示できる。これらのうち、組織切片を蛍光染色する方法が好ましく、特に免疫組織化学法が好ましい。
【００１５】
＜蛍光体＞
本発明で用いられる蛍光体としては、蛍光有機色素および半導体ナノ粒子を包含する蛍光物質を挙げることができる。200〜700ｎｍの波長範囲である紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜900ｎｍの波長範囲である可視〜近赤外光の発光を示す蛍光体が好ましい。
【００１６】
（有機蛍光色素）
有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００１７】
具体的には、5-カルボキシ-フルオレセイン、6-カルボキシ-フルオレセイン、5,6-ジカルボキシ-フルオレセイン、6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン、6-カルボキシ-2',4,7,7'-テトラクロロフルオレセイン、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、5-カルボキシ-ローダミン、6-カルボキシ-ローダミン、5,6-ジカルボキシ-ローダミン、ローダミン6Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ-ローダミン、および、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 350、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 405、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 430、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 488、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 500、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 514、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 532、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 546、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 555、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 568、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 594、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 610、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 633、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 635、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 647、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 660、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 680、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 700、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 750、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ 493/503、ＢＯＤＩＰＹ 530/550、ＢＯＤＩＰＹ 558/568、ＢＯＤＩＰＹ 564/570、ＢＯＤＩＰＹ 576/589、ＢＯＤＩＰＹ 581/591、ＢＯＤＩＰＹ 630/650、ＢＯＤＩＰＹ 650/665（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ5、Ｃｙ5.5、Ｃｙ7等を挙げることができる。一種単独でも二種以上を併用してもよい。
【００１８】
（半導体ナノ粒子）
本発明に用いる半導体ナノ粒子とは、コア/シェル構造を有するものであり、後述する半導体を形成する材料（素材）を含有するナノサイズ（1〜1,000ｎｍ）の粒径を有する粒子であって、コア部（芯部）とそれを被覆するシェル部（被覆部）で構成される多重構造を有する粒子をいう。II−VI族化合物，III−Ｖ族化合物またはIV族元素を成分として含有する半導体ナノ粒子（それぞれ「II−VI族半導体ナノ粒子」「III−Ｖ族半導体ナノ粒子」「IV族半導体ナノ粒子」ともいう。）のいずれかを用いることができ、一種単独でも二種以上併用してもよい。
【００１９】
コア部（「コア粒子」ともいう。）を形成するための素材としては、例えば、ケイ素〔Ｓｉ〕，ゲルマニウム〔Ｇｅ〕，窒化インジウム〔ＩｎＮ〕，リン化インジウム〔ＩｎＰ〕，ヒ素化ガリウム〔ＧａＡｓ〕，セレン化アルミニウム〔ＡｌＳｅ〕，セレン化カドミウム〔ＣｄＳｅ〕，ヒ素化アルミニウム〔ＡｌＡｓ〕，リン化ガリウム〔ＧａＰ〕，テルル化亜鉛〔ＺｎＴｅ〕，テルル化カドミウム〔ＣｄＴｅ〕，ヒ素化インジウム〔ＩｎＡｓ〕，インジウム−ガリウム−リン〔ＩｎＧａＰ〕などの半導体またはこれらを形成する原料を用いることができる。本発明においては、特に、ＩｎＰ，ＣｄＴｅまたはＣｄＳｅがより好ましく用いられる。
【００２０】
シェル部を形成するための素材としては、II−VI族，III−Ｖ族，IV族の無機半導体を用いることができる。例えば、Ｓｉ，Ｇｅ，ＩｎＮ，ＩｎＰ，ＧａＡｓ，ＡｌＳｅ，ＣｄＳｅ，ＡｌＡｓ，ＧａＰ，ＺｎＴｅ，ＣｄＴｅ，ＩｎＡｓなどの各コア部形成無機材料よりバンドギャップが大きく、毒性を有さない半導体またはこれらを形成する原料が好ましい。より好ましくは、ＩｎＰ，ＣｄＴｅまたはＣｄＳｅのコア部に対してＺｎＳをシェル部として適用される。
【００２１】
以下、本明細書において、半導体ナノ粒子の表記法として、例えば、コア部がＣｄＳｅであり、シェル部がＺｎＳである場合、「ＣｄＳｅ/ＺｎＳ」と表記することがある。
半導体ナノ粒子としては、例えば、ＣｄＳｅ/ＺｎＳ，ＣｄＳ/ＺｎＳ，ＩｎＰ/ＺｎＳ，ＩｎＧａＰ/ＺｎＳ，Ｓｉ／ＳｉＯ2，Ｓｉ/ＺｎＳ，Ｇｅ／ＧｅＯ2，Ｇｅ/ＺｎＳなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
【００２２】
半導体ナノ粒子は、必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。このような半導体ナノ粒子としては、例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ/ＺｎＳ（インビトロジェン社製）や表面アミノ基を有するＣｄＳｅ/ＺｎＳ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。
【００２３】
＜蛍光体内包ナノ粒子・蛍光体を内包しないナノ粒子＞
本発明で用いる蛍光体内包ナノ粒子とは、蛍光体がナノ粒子の内部に分散されたものを言い、ナノ粒子を構成する材料（本発明において「母体」と称することがある。）と蛍光体とは、化学的に結合していても、していなくてもよい。一方、本発明でブロッキング剤として用いる蛍光体を内包しないナノ粒子とは、蛍光体をナノ粒子の内部に含まないナノ粒子、典型的には上記のような母体のみからなるナノ粒子を言う。
【００２４】
ナノ粒子を構成する材料は特に限定されるものではなく、例えば、シリカ、メラミン、ポリスチレン、ポリ乳酸などが挙げられ、一種単独で用いても二種以上を併用してもよい。なお、本明細書において、例えば、母体がシリカからなる場合のナノ粒子を、単に「シリカナノ粒子」と称することがある。
【００２５】
蛍光体内包ナノ粒子がその母体の組成によって非特異吸着を起こす可能性のある部位を、蛍光体を内包しないナノ粒子を用いてブロッキングするという作用効果を考慮すると、蛍光体内包ナノ粒子の母体と、蛍光体を内包しないナノ粒子の母体とは、組成が同じである（同じ原料を用いて合成される）ことが好ましいが、同等のブロッキング能、あるいはより高いブロッキング能が得られる場合は、それらの母体の組成は同じである必要はない。また、異なる複数の組成を用いても何ら問題はなく、さらにはＢＳＡなどの従来使用されているブロッキング剤と併用しても構わない。
【００２６】
本発明で用いる蛍光体内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することができる。有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、例えば、ラングミュア,8巻,2921頁(1992年)に記載されているＦＩＴＣ内包シリカナノ粒子の合成を参考にして作製することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の有機蛍光色素を用いることによって、種々の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成できる。
【００２７】
半導体ナノ粒子を内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー,33巻,561頁(2009年)に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考にして作製することができる。
【００２８】
有機蛍光色素を内包したメラミンナノ粒子は、例えば、公開特許公報昭62-68811(1987年)に記載されている蛍光増白剤を用いたメラミンナノ粒子の合成を参考にして作製することができる。蛍光増白剤の代わりに所望の有機蛍光色素を用いることによって、種々の有機蛍光色素内包メラミンナノ粒子を合成することができる。
【００２９】
有機蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、例えば、米国特許第4326008号(1982年)に記載されている重合性官能基を有する有機色素を用いた共重合法や、米国特許第5326692号(1992年)に記載されているポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含浸法などを用いて作製することができる。
【００３０】
また、半導体ナノ粒子を内包したポリマーナノ粒子は、例えば、ネイチャー バイオテクノロジー,19巻,631頁(2001年)に記載のポリスチレンナノ粒子への半導体ナノ粒子の含浸法などを参考にして作製することができる。
【００３１】
このような含浸法において、溶剤中でポリスチレンナノ粒子を膨潤させて蛍光体を含浸させた後、水中で収縮させることを行うため、ポリスチレンナノ粒子内に一旦取り込まれた蛍光体は、他の水中（水溶液中）に分散させても、蛍光体はポリスチレンナノ粒子外に拡散することはほとんどない。
【００３２】
一方、蛍光体を内包しないナノ粒子の製造方法としては、例えば、上述した蛍光体内包ナノ粒子の製造方法において、蛍光体を使用しない（添加しない）以外は、蛍光体内包ナノ粒子の製造方法と同様の製造方法などが挙げられる。
【００３３】
蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とで用いるナノ粒子において、それら粒子表面の少なくとも一部、望ましくは全部が、生体物質に吸着しづらい同じ有機分子で被覆されていることが好ましい。生体物質に吸着しづらい有機分子とは、少なくともそれ自身が何らかの生体物質に特異的に結合する能力を有さず、非特異的にも結合しないか、吸着しづらい有機分子（好ましくは有機高分子）を言い、例えば、ポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などが挙げられる。
【００３４】
蛍光体内包ナノ粒子がその表面を被覆する有機分子によって非特異吸着を起こす可能性がある部位を、蛍光体を内包しないナノ粒子を用いてブロッキングするという作用効果を考慮すると、蛍光体内包ナノ粒子を被覆する有機分子と蛍光体を内包しないナノ粒子を被覆する有機分子とは、同じである（同じ物質を用いて被覆処理をする）ことが好ましいが、同等のブロッキング能、あるいはより高いブロッキング能が得られる場合は、それらの有機分子は同じである必要はない。なお、後述するように、蛍光体内包ナノ粒子は粒子表面を修飾するこのような有機分子（例えばＰＥＧ）の一部に生体物質認識分子（例えば抗体）を結合させている場合もあるが、「生体物質認識分子が結合した有機分子」は、上記の記載における「生体物質に吸着しづらい有機分子」とは区別される存在である。
【００３５】
蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とで用いるナノ粒子において、その平均粒径は特に限定されないが、約30〜800ｎｍ程度である。また、粒径のばらつきを示す変動係数は特に限定されないが、20％程度以下が好ましい。
【００３６】
なお、本発明において、ナノ粒子の平均粒径とは、走査型電子顕微鏡〔ＳＥＭ〕を使用して電子顕微鏡写真を撮影し、1,000個のナノ粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求め、その算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1,000個の粒子の粒径分布から算出される値とした。
【００３７】
蛍光体内包ナノ粒子がそのサイズによって非特異吸着を起こす可能性がある部位を、蛍光体を内包しないナノ粒子を用いてブロッキングするという作用効果を考慮すると、蛍光体内包ナノ粒子と蛍光体を内包しないナノ粒子とで用いるナノ粒子それぞれの平均粒径の差は、好ましくは25％以内、より好ましくは5％以内である。なお、当該平均粒径の差は、蛍光体内包ナノ粒子の平均粒径をＸ（ｎｍ）とし、蛍光体を内包しないナノ粒子の平均粒径をＹ（ｎｍ）とするとき、｜(Ｘ−Ｙ)／Ｘ｜×100（％）の式から算出することができる。
【００３８】
＜生体物質認識分子・蛍光体内包ナノ粒子との結合＞
本発明で用いる生体物質認識分子とは、標的とする特定の生体物質を認識し、該生体物質に特異的に結合および/または反応する分子を言う。
【００３９】
本発明において標的となりうる生体物質としては、例えば、生体由来のヌクレオチド鎖、タンパク質、脂質、糖鎖などが挙げられる。従って、生体物質認識分子としては、それらの生体物質と特異的に結合および/または反応する分子、例えば、ヌクレオチド鎖（生体物質が相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖等である場合）、抗体（生体物質が抗原となるタンパク質等である場合）、レクチン（同じく糖鎖等である場合）、等が挙げられる。より具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ2に特異的に結合する抗ＨＥＲ2抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体〔ＥＲ〕に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体などが挙げられる。なかでも抗ＨＥＲ2抗体および抗ＥＲ抗体は乳がんの投薬選定に用いることができるという観点から好ましい。
【００４０】
生体物質認識分子と蛍光体内包ナノ粒子との結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着などが挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００４１】
また、スペーサーとして、生体物質認識分子と蛍光体内包ナノ粒子との間を連結する有機分子があってもよい。例えば生体物質との非特異的な吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖を用いることができ、具体的には、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の「ＳＭ(ＰＥＧ)12」などの市販品が例示できる。なお、生体物質認識分子と結合していないポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕鎖それ自身は、上述したような「生体物質に吸着しづらい有機分子」としての機能も有する。
【００４２】
蛍光体内包シリカナノ粒子に生体物質認識分子を結合させる際、蛍光体として有機蛍光色素を使用する場合であっても、半導体ナノ粒子を使用する場合であっても、同様の方法を適用することができる。例えば、無機物と有機物とを結合させるために広く用いられる化合物であるシランカップリング剤を使用することができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖を有するシランカップリング剤（例えばＧｅｌｅｓｔ社製「ＰＥＧ-ｓｉｌａｎｅ ｎｏ.ＳＩＭ6492.7」）などが挙げられる。シランカップリング剤として、一種単独で用いても二種以上を併用してもよい。
【００４３】
蛍光体内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知のものを用いることができる。具体例として、得られた蛍光体内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で12時間反応させる。反応終了後、遠心分離またはろ過により、表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光体内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ〔1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride〕（Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００４４】
必要により、有機分子修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子に直接結合し得る部位と、生体物質認識分子に結合し得る部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基に選択的に反応する部位とメルカプト基に選択的に反応する部位の両方を有するｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ〔Sulfosuccinimidyl 4[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate〕（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランにより修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基とを結合させることで、抗体が結合した蛍光体内包シリカナノ粒子を作製できる。
【００４５】
蛍光体内包メラミンナノ粒子に生体物質認識分子を結合させる場合、蛍光体として有機蛍光色素を使用する場合であっても、半導体ナノ粒子を使用する場合であっても、同様の手順を適用することができる。例えば、メラミンナノ粒子上のアミノ基を介してＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体が結合した蛍光体内包メラミンナノ粒子を作製できる。
【００４６】
蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子に生体物質認識分子を結合させる場合、蛍光体として有機蛍光色素を使用する場合であっても、半導体ナノ粒子を使用する場合であっても、同様の手順を適用することができる。例えば、上述の含浸法を用いてアミノ基などの官能基を有するポリスチレンナノ粒子中に有機蛍光色素または半導体ナノ粒子を含浸することにより、アミノ基などの官能基を有する蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体が結合した蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
【００４７】
＜検出方法の手順＞
本発明は、上述のとおり、特定の発色剤とブロッキング剤とを併用する検出方法であり、組織切片を蛍光染色する従来公知の方法に好適である。組織切片は生体物質から構成されるが、病理組織切片には限定されず、また、細胞染色にも適用することができる。
【００４８】
本発明に係る検出方法が適用可能な組織切片の作製方法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを使用することができる。
以下、本発明の検出方法に含まれる下記の工程を順に説明する。
【００４９】
(1) 脱パラフィン工程：
キシレンを入れた容器に、組織切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3〜30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
【００５０】
次いで、エタノールを入れた容器にこの切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3〜30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
【００５１】
次いで、水を入れた容器に、この切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3〜30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００５２】
(2) 賦活化処理工程：
公知の方法にならい、特定の生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ6.0）、1ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ8.0）、5％の尿素、0.1Ｍのトリス塩酸緩衝液などを含有する溶液を用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50〜130℃、時間は5〜30分間で行うことができる。
【００５３】
次いで、水とＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3〜30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００５４】
(3) 生体物質認識分子を結合した蛍光体内包ナノ粒子（発色剤）による染色工程：
この組織化学染色工程(3)において、まず、生体物質認識分子を結合した蛍光体内包ナノ粒子のリン酸緩衝液生理的食塩水〔ＰＢＳ〕分散液を調整し、切片に乗せ、特定の生体物質との反応を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、5分間〜24時間であることが好ましい。特定の生体物質と生体物質認識分子との反応に適した環境を安定して維持するための溶媒として、上記ではＰＢＳを例示したが、ＰＢＳ以外に、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸-リン酸緩衝液なども用いることができる。
【００５５】
本発明においては、蛍光体内包ナノ粒子による染色を行う前に、ブロッキング剤を滴下する。ブロッキング剤として、蛍光特性を持たないナノ粒子、すなわち蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する。好ましい態様としては、蛍光体包含ナノ粒子と当該蛍光特性を持たないナノ粒子の母体組成が同一である。より好ましくは、さらに双方の平均粒径の差が25％以下であり、特に好ましくは、さらに蛍光特性を持たないナノ粒子表面がポリエチレングリコールで覆われていることである。
【００５６】
ブロッキング剤の使用量は特に限定されないが、一般的には発色剤の0.5〜10倍量が好適である。本発明に係るブロッキング剤は、一種単独で用いてもよいし、ＢＳＡやスキムミルク等の公知のブロッキング剤と併用してもよい。
【００５７】
次いで、ＰＢＳを入れた容器に染色後の切片を浸漬させ、未反応の蛍光体内包ナノ粒子の除去を行う。ＰＢＳ溶液にはＴｗｅｅｎ20等の界面活性剤を含有させてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3〜30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００５８】
(4) 固定処理工程：
本発明において所要の固定処理工程は、上記の染色工程(3)により導入された標識化プローブ生体物質を、組織切片に固定化する工程である。
【００５９】
本発明で用いられる固定処理溶液としては、例えば、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤、細胞膜透過物質などが挙げられる。
【００６０】
本発明において、固定処理は、従来公知の手法により行うことができる。固定処理は、
具体的には、このような固定処理溶液に、組織化学染色工程(3)により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、稀パラホルムアルデヒド水溶液中に、組織化学染色工程(3)により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
【００６１】
(5) 蛍光顕微鏡下の観察工程：
このようにして得られる切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、特定の生体物質の発現レベルを輝点数または発光輝度を基に計測することができる。用いた蛍光体の吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターは、当業者であれば適宜選択することができる。
【００６２】
輝点数または発光輝度の計測は、画像解析ソフト、例えば公開解析ソフトであるImageJ、(株)ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Countなどを用いて行うことができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜ブロッキング剤の製造＞
ブロッキング剤として「蛍光体を内包しないナノ粒子」を、以下のようにして数種類製造した。これらの粒子は、母体の組成・平均粒径・ポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕で被覆されているか否かの点で種類が異なるものである。【００６４】
［製造例1］ＰＥＧで被覆されたポリスチレンナノ粒子
工程(1-1)：ポリスチレンナノ粒子（Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」；平均粒径：100ｎｍ）1ｍgに対して、エチレンジアミン四酢酸〔ＥＤＴＡ〕を2ｍＭ含有したリン酸緩衝液生理的食塩水〔ＰＢＳ〕を用いて3ｎＭに調整した。【００６５】
工程(1-2)：工程(1-1)で調整した溶液に、最終濃度10ｍＭとなるよう「ＳＭ(ＰＥＧ)12」（サーモサイエンティフィック社製のsuccinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester）を混合し、3時間反応した。【００６６】
工程(1-3)：工程(1-2)の反応混合液を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(1-4)：工程(1-3)の沈殿物に、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加え、分散させて、再度遠心分離を行い、上澄みを除去するという洗浄を行った。同様の手順による洗浄を、さらに二回行った。その後、500μＬのＰＢＳで再分散させた。その結果、ＰＥＧで被覆された、蛍光体を内包しないポリスチレンナノ粒子が得られた。【００６７】
［製造例2］メラミンナノ粒子
工程(2-1)：メラミン15ｇと37％ホルマリン29ｇと28％アンモニア水溶液1.5ｇとを混合して、ｐＨ8に調整した。【００６８】
工程（2-2）：工程(2-1)の混合溶液を撹拌しながら70℃に昇温して30分間反応させて、初期縮合物を得た。
工程(2-3)：「ネオペレックスＧ-15」（花王(株)製）0.12ｍｌを水22ｍｌ中に溶解して、90℃に昇温したサンプルを四本準備した。【００６９】
工程(2-4)：工程(2-2)で得られた初期縮合物1ｇを、工程(2-3)の各サンプルに投入した後、ドデシルベンゼンスルホン酸0.5ｍＬ、0.7ｍＬ、0.85ｍＬ、0.9ｍＬをそれぞれに添加して、6時間撹拌した。【００７０】
工程(2-5)：工程(2-4)の各反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、エタノールを加え、沈降物を分散させて、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。【００７１】
このようにして得られた、蛍光体を内包しないメラミンナノ粒子それぞれを走査型電子顕微鏡〔ＳＥＭ〕（(株)日立製作所製S-800型）で観察したところ、平均粒径（変動係数）がそれぞれ72ｎｍ（10.5％）、83ｎｍ（11.3％）、91ｎｍ（9.5％）、98ｎｍ（9.3％）
であった。【００７２】
［製造例3］ＰＥＧで被覆されたメラミンナノ粒子
製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、製造例2で得られた平均粒径が98ｎｍのメラミンナノ粒子を用いた以外は、製造例1と同様にして、ＰＥＧで被覆されたメラミンナノ粒子を製造した。【００７３】
［製造例4］シリカナノ粒子
工程(4-1)：エタノール40ｍＬと14％アンモニア水9.7ｍＬとを混合した。
工程(4-2)：工程(4-1)の混合液を室温で撹拌しているところに、テトラエトキシシラン400μＬ（1.796ｍｍｏｌ）を添加した。添加開始から7時間撹拌を行った。【００７４】
工程(4-3)：工程(4-2)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。【００７５】
このようにして得られた、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子について、ＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径が69ｎｍ、変動係数は17％であった。
また、工程(4-1)において、14％アンモニア水の配合量を9.7ｍＬから、それぞれ10ｍＬ、11.5ｍＬ、13ｍＬに変更した以外は、工程(4-1)〜(4-3)と同様にして、それぞれ平均粒径の異なる三種類のシリカナノ粒子を製造した。得られたシリカナノ粒子の平均粒径（変動係数）はそれぞれ、79ｎｍ（10％）、88ｎｍ（12.6％）、99ｎｍ（11.3％）であった。【００７６】
［製造例5］ＰＥＧで被覆されたシリカナノ粒子
工程(5-1)：製造例4で得られた平均粒径が99ｎｍのシリカナノ粒子1ｍｇを、純水5ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン100μＬを添加し、室温で12時間撹拌した。【００７７】
工程(5-2)：工程(5-1)の反応混合物を10,000×ｇで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(5-3)：工程(5-2)の沈殿物にエタノールを加えて、分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。【００７８】
得られたアミノ基修飾シリカナノ粒子のＦＴ-ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基により修飾されていることが確認された。
以下、製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、工程(5-3)で得られたアミノ基修飾シリカナノ粒子を用いた以外は、製造例1と同様にして、ＰＥＧで被覆された、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子を製造した。【００７９】
＜発色剤の製造＞
発色剤として「特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子」を四種類製造した。それらは、いずれもＰＥＧで被覆され、その粒子表面に抗ＨＥＲ2抗体が結合しているが、蛍光体の種類・母体の組成・平均粒径の点で異なるものである。【００８０】
［製造例6］発色剤〈Ａ〉
工程(6-1)：ポリスチレンナノ粒子（Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」；平均粒径：100ｎｍ）10ｇを、水：エタノール＝2:8の混合溶媒中に分散し、室温で3時間撹拌した。【００８１】
工程(6-2)：工程(6-1)の分散液中にＣｙ5（ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)製）1ｍｇ（0.00126ｍｍｏｌ）を加えて、60℃で12時間撹拌した。
工程(6-3)：工程(6-2)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。その結果、蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子が得られた。【００８２】
工程(6-4)：工程(6-3)の蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子1ｍgに対して、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを用いて3ｎＭに調整した。
工程(6-5)：工程(6-4)の溶液に、最終濃度10ｍＭとなるよう「ＳＭ(ＰＥＧ)12」を混合し、3時間反応した。【００８３】
工程(6-6)：工程(6-5)の反応混合液を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(6-7)：工程(6-6)の沈殿物に、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加えて分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μＬのＰＢＳを用いて再分散させることによって、ＰＥＧで被覆されたポリスチレンナノ粒子の粒子分散液が得られた。【００８４】
工程(6-8)：抗ＨＥＲ2抗体100μｇを100μＬのＰＢＳに溶解させたところに、1Ｍジチオスレイトール〔ＤＴＴ〕を添加し、30分間反応させた。
工程(6-9)：工程(6-8)の反応混合物について、ゲルろ過カラムで過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ2抗体溶液を得た。【００８５】
工程(6-10)：工程(6-7)の粒子分散液と、工程(6-9)の還元化抗ＨＥＲ2抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、1時間反応させた。
工程(6-11)：工程(6-10)の反応液に、10ｍＭメルカプトエタノール4μＬを添加し、反応を停止させた。【００８６】
工程(6-12)：工程(6-11)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μＬのＰＢＳを用いて再分散させて、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（Ｃｙ5）内包ポリスチレンナノ粒子（すなわち発色剤〈Ａ〉）の粒子分散液が得られた。【００８７】
［製造例7］発色剤〈Ｂ〉
工程(7-1)：メラミン15ｇと37％ホルマリン29ｇと28％アンモニア水溶液1.5ｇとを混合して、ｐＨ8に調整した。【００８８】
工程(7-2)：工程(7-1)の混合物を撹拌しながら70℃に昇温して30分間反応させて、初期縮合物を得た。
工程(7-3)：「ネオペレックスＧ-15」を0.12ｍｌと、Ｃｙ5を1ｍｇ（0.00126ｍｍｏｌ）とを水22ｍＬ中に溶解して90℃に昇温した。【００８９】
工程(7-4)：工程(7-2)の初期縮合物1ｇを工程(7-3)の溶液に投入した後、ドデシルベンゼンスルホン酸0.93ｍＬを添加して、6時間撹拌した。
工程(7-5)：工程(7-4)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。このようにして得られた蛍光体内包メラミンナノ粒子をＳＥＭにより観察したところ、平均粒径が97ｎｍ、変動係数が10％であった。【００９０】
以下、工程(6-4)において蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子の代わりに、蛍光体内包メラミンナノ粒子を用いた以外は工程(6-4)〜(6-12)と同様にして、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（Ｃｙ5）内包メラミンナノ粒子（すなわち発色剤〈Ｂ〉）の粒子分散液を製造した。【００９１】
［製造例8］発色剤〈Ｃ〉
工程(8-1)：Ｃｙ5のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア・ジャパン(株)製）1ｍｇ（0.00126ｍｍｏｌ）をテトラエトキシシラン420μＬ（1.796ｍｍｏｌ）と混合した。【００９２】
工程(8-2)：エタノール40ｍＬを14％アンモニア水13.8ｍＬと混合した。
工程(8-3)：工程(8-2)の混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(8-1)の混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。【００９３】
工程(8-4)：工程(8-3)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。このようにして得られた蛍光体内包シリカナノ粒子をＳＥＭにより観察したところ、平均粒径が99ｎｍ、変動係数が12％であった。【００９４】
工程(8-5)：工程(5-1)において、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子の代わりに、工程(8-4)の蛍光体内包シリカナノ粒子を用いた以外は、工程(5-1)〜(5-3)と同様にしてアミノ基が修飾された蛍光体内包シリカナノ粒子を製造した。【００９５】
工程(8-6)：製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、上記のように製造されたアミノ基修飾蛍光体内包シリカナノ粒子を用いた以外は製造例1と同様にして、ＰＥＧで被覆された蛍光体内包シリカナノ粒子を製造した。【００９６】
工程(8-7)：工程(8-6)の粒子分散液と、工程(6-9)の還元化抗ＨＥＲ2抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、1時間反応させた。
工程(8-8)：工程(8-7)の反応液に、10ｍＭメルカプトエタノール4μＬを添加し、反応を停止させた。【００９７】
工程(8-9)：工程(8-8)の反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを2ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μＬのＰＢＳを用いて再分散させて、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（Ｃｙ5）内包シリカナノ粒子（平均粒径：135ｎｍ）（すなわち発色剤〈Ｃ〉）の粒子分散液が得られた。【００９８】
［製造例9］発色剤〈Ｄ〉
工程(9-1)：発光波長655ｎｍを有するＣｄＳｅ/ＺｎＳのデカン分散液（インビトロジェン(株)製「Ｑｄｏｔ655」）10μＬとテトラエトキシシラン40μＬとを混合した。【００９９】
工程(9-2)：エタノール4ｍＬと14％アンモニア水2.5ｍＬとを混合した。
工程(9-3)：工程(9-2)の混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(9-1)の混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。【０１００】
工程(9-4)：反応混合物を10,000×ｇで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。得られた蛍光体内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径が130ｎｍ、変動係数が13％であった。【０１０１】
以下、工程(8-5)において、工程(8-4)の蛍光体内包シリカナノ粒子の代わりに、工程(9-4)の蛍光体内包シリカナノ粒子を用いた以外は、工程(8-5)〜(8-9)と同様にして、抗ＨＥＲ2抗体が結合しＰＥＧで被覆された蛍光体（ＣｄＳｅ/ＺｎＳ）内包シリカナノ粒子（平均粒径：101ｎｍ）（すなわち発色剤〈Ｄ〉）の粒子分散液を製造した。【０１０２】
＜ＨＥＲ2の免疫組織染色における検出方法の実施＞
［比較例］ブロッキング剤としてＢＳＡを使用
発色剤として、製造例6〜9で得られた発色剤〈Ａ〉〜〈Ｄ〉それぞれを使用して、ＤＡＢ染色により判定結果が既知のヒト乳房組織の隣接切片を用い、下記の工程に従って免疫組織染色を行った。該切片として、コスモ・バイオ(株)製の組織アレイスライド「ＣＢ-Ａ712」を用いた。【０１０３】
工程(C-1)：キシレンを入れた容器に、上記切片を30分間浸漬させた。途中三回キシレンを交換した。
工程(C-2)：この切片を、エタノールを入れた容器に30分間浸漬させた。途中三回エタノールを交換した。【０１０４】
工程(C-3)：この切片を、水を入れた容器に30分間浸漬させた。途中三回水を交換した。
工程(C-4)：この切片を、10ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ6.0）に30分間浸漬させた。【０１０５】
工程(C-5)：121℃で10分間オートクレーブ処理を行った。
工程(C-6)：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分間浸漬させた。【０１０６】
工程(C-7)：ブロッキング剤として1％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織に乗せて、1時間放置した。
工程(C-8)：1％ＢＳＡ含有ＰＢＳで0.05ｎＭに希釈した発色剤〈Ａ〉〜〈Ｄ〉それぞれを各切片に乗せて、3時間放置した。【０１０７】
工程(C-9)：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ30分間浸漬させた。
工程(C-10)：Merck Chemicals社製「Ａｑｕａｔｅｘ」を滴下後、カバーガラスを乗せ封入した。【０１０８】
蛍光顕微鏡下の観察：続いて、染色した切片に対し、オリンパス(株)製の蛍光顕微鏡「ＢＸ53」を用いて、目的とする生体物質、すなわちＨＥＲ2の発現を輝点数から特定し、イメージＪを用いた二値処理およびノイズ除去処理後に輝点計測を行い、10細胞当たりの輝点数を計測した。輝点の計測はスライド上の20のスポットについて行った。【０１０９】
［実施例1］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：70ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Thermo Fisher Scientific社製「3070Ａ」；平均粒径：70ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１０】
［実施例2］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：80ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Thermo Fisher Scientific社製「3080Ａ」；平均粒径：80ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１１】
［実施例3］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：90ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Thermo Fisher Scientific社製「3090Ａ」；平均粒径：90ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１２】
［実施例4］ブロッキング剤としてポリスチレンナノ粒子（平均粒径：100ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、ポリスチレンナノ粒子（Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」；平均粒径：100ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１３】
［実施例5］ブロッキング剤としてＰＥＧ被覆ポリスチレンナノ粒子（平均粒径：100ｎｍ）  比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例1で得られたＰＥＧ被覆ポリスチレンナノ粒子含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１４】
［実施例6］ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：72ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：72ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１５】
［実施例7]ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：83ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：83ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１６】
［実施例8]ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：91ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：91ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１７】
［実施例9]ブロッキング剤としてメラミンナノ粒子（平均粒径：98ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子（平均粒径：98ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１８】
［実施例10]ブロッキング剤としてＰＥＧ被覆メラミンナノ粒子（平均粒径：98ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例3で得られたＰＥＧ被覆メラミンナノ粒子含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１１９】
［実施例11］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：69ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：69ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１２０】
［実施例12］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：79ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：79ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１２１】
［実施例13］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：88ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：88ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１２２】
［実施例14］ブロッキング剤としてシリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１２３】
［実施例15］ブロッキング剤としてＰＥＧ被覆シリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）
比較例において、1％ＢＳＡ含有ＰＢＳの代わりに、製造例5で得られたＰＥＧ被覆シリカナノ粒子（平均粒径：99ｎｍ）含有ＰＢＳ分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１２４】
これらの結果を表1に示す。なお、表1において、ブロッキング剤がＰＥＧで被覆されている場合を「＋」、されていない場合を「−」として示し、平均粒径の差は、発色剤の平均粒径をＸ（ｎｍ）とし、ブロッキング剤の平均粒径をＹ（ｎｍ）とするとき、｛(Ｘ−Ｙ)／Ｘ｝×100（％）の式から算出し、輝点数は、比較例の発色剤〈Ａ〉〜〈Ｄ〉それぞれの陰性を1とした相対値で表わす。【０１２５】
【表１】
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《考察》
表1から、ブロッキング剤として通常使用するＢＳＡより、蛍光体を内包しないナノ粒子の方が有意にブロッキング能に優れていることがわかった。これは、おそらくＢＳＡが抗原抗体反応に関する非特異吸着を防止しているのに対して、蛍光体を内包しないナノ粒子は、抗原抗体反応に関する非特異吸着のみならず、ナノ粒子のサイズ等に依存して起きる非特異的吸着についても、粒子どうしの立体的な障害によって防止することができるためであろうと考えられる。
【国際調査報告】
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