(57)【要約】  本発明は、生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法を提供する。  本発明は、  生物学的試料中の物質を検出する工程において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させることを含む、非特異的結合を抑制する方法であって、  前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、前記抑制方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の物質を検出する工程において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させることを含む、非特異的結合を抑制する方法であって、
前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、
前記抑制方法。
【請求項２】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体の分子量が、５ないし２０ｋＤａである、請求項１に記載の抑制方法。
【請求項３】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、凝集しない性質を有する、請求項１または２に記載の抑制方法。
【請求項４】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、界面活性剤の非存在下において、あるいは、２℃ないし１０℃の冷蔵条件下において、凝集しない性質を有する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抑制方法。
【請求項５】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、ビオチン結合タンパク質を加熱処理又は薬剤処理することによって得られるものであるか、あるいは、ビオチン結合タンパク質のアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸残基を改変することによって得られるものである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抑制方法。
【請求項６】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、ビオチン結合タンパク質を加熱処理することによって得られるものである、請求項１ないし４のいずれか１項記載の抑制方法。
【請求項７】
ビオチン結合タンパク質が、タマビジン２、タマビジン１、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される、請求項１ないし６に記載の抑制方法。
【請求項８】
単量体が由来するビオチン結合タンパク質が、被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させるためのビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を構成するビオチン結合タンパク質と同種である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の抑制方法。
【請求項９】
前記検出工程において利用する、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介した被検物質に対する特異的結合物質の担体への結合が、下記Ａ）−Ｃ）のいずれかによって達成される、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の抑制方法。
Ａ）ビオチン結合タンパク質が結合した担体に、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる；
Ｂ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質を結合させ、さらに、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる；あるいは
Ｃ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質と被検物質に対する特異的結合物質との融合タンパク質を結合させる；
【請求項１０】
ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を含む、生物学的試料中の物質を検出する工程において非特異的結合を抑制するための剤であって、
前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、
前記剤。
【請求項１１】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体の分子量が、５ないし２０ｋＤａである、請求項１０に記載の剤。
【請求項１２】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、凝集しない性質を有する、請求項１０または１１に記載の剤。
【請求項１３】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、界面活性剤の非存在下において、あるいは、２℃ないし１０℃の冷蔵条件下において、凝集しない性質を有する、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１４】
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、ビオチン結合タンパク質を加熱処理することによって得られるものである、請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１５】
ビオチン結合タンパク質が、タマビジン２、タマビジン１、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される、請求項１０ないし１４に記載の剤。
【請求項１６】
下記のｉ）−ｉｉｉ）の性質を有する、ビオチン結合タンパク質の単量体。
ｉ）実質的にビオチン結合能を有さない；
ｉｉ）分子量が、５ないし２０ｋＤａである；及び
ｉｉｉ）凝集しない
【請求項１７】
以下のいずれかの群：
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列；
ｖ）上記配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列；
ｖｉ）上記配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；
ｖｉｉ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列；
ｉｘ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列；並びに
ｘ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単量体。
【請求項１８】
ビオチン結合タンパク質を加熱処理することによって得られる、請求項１６又は１７に記載のビオチン結合タンパク質の単量体。
【請求項１９】
ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体の、生物学的試料中の物質を検出する工程において非特異的結合を抑制するための、使用。
【請求項２０】
生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法に使用するためのキットであって、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を含む非特異結合抑制剤、を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年８月１日に提出された日本国出願  特願２０１１−１６８４２２に基づく優先権を主張し、その全内容は本明細書中に取り込まれる。【０００２】
本発明は、生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法、当該抑制方法に使用するための剤、等に関する。
【背景技術】
【０００３】
ビオチン結合タンパク質
アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパク質で、ビオチン（ビタミンＨ）と強く結合する。アビジンは等電点が１０を越え、その高い塩基性あるいは糖鎖の存在により、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子に対する非特異的な結合が問題となる場合がある。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来の糖鎖を含まないアビジン様タンパク質である。等電点は中性付近であり、やはりビオチンと強く結合する。【０００４】
アビジン、ストレプトアビジンは、それぞれ四量体を形成し、その分子量は６０ｋＤａ程度である。この四量体は、二量体同士の弱い結合で形成されているが、この二量体は単量体が強く結合したものである。アビジンおよびストレプトアビジンは、単量体当たり１分子のビオチンと結合する性質をもつ。アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの親和性は非常に高く（Ｋｄ＝１０−１５〜１０−１４Ｍ）、生体二分子間の相互作用としては最も強い。【０００５】
タマビジン１およびタマビジン２は、本発明者らが、食用キノコタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見した、新規なアビジン様ビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７）。これらはいずれも、大腸菌で可溶性タンパク質画分に大量に発現させることができ、特にタマビジン２はイミノビオチンカラムを用いた精製により容易に調製できる。タマビジン１およびタマビジン２は、アビジンやストレプトアビジンと同様に、四量体を形成し、ビオチンと極めて強く結合する性質をもつ。またタマビジン２は、アビジンやストレプトアビジンと比べて高い耐熱性を有し、アビジンよりも非特異的な結合が少ないといった点で、優れたビオチン結合タンパク質である。【０００６】
ビオチン結合タンパク質を利用した、生物学的試料中の被検物質に対し特異的に結合する物質の担体への固定化
従来から生物学的試料中の被検物質を検出するために、被検物質に対し特異的に結合する物質が広く用いられている。例えばイムノアッセイの場合、被検物質が抗体であれば抗原を、被検物質が抗原であれば抗体を、マイクロプレートや微小ビーズ、あるいはセンサーチップなどの担体に、被検物質と反応させる前、あるいは反応させた後に固定化し、抗原抗体反応の有無や程度を、検出あるいは測定する。このような場面においてタンパク質を固定化するために、ビオチン結合タンパク質とビオチンとの間の強い相互作用が、しばしば利用される。【０００７】
ビオチン結合タンパク質を利用して、被検物質に対する特異的結合物質（例えば、タンパク質）を担体に固定化する場合、ビオチン結合タンパク質を、共有結合や疎水結合によりマイクロプレートや微小ビーズなどのような担体に固定化し、さらにビオチン化した被検物質に対する特異的結合物質を、ビオチン結合タンパク質と結合させることにより固定化する方法がある。あるいは、ビオチン化した被検物質に対する特異的結合物質は、ビオチン結合タンパク質固定化担体に固定化した後、生体試料に反応させる場合もあれば、生体試料と反応させた後に、ビオチン結合タンパク質固定化担体に固定化する場合もある。【０００８】
一方、ビオチンを結合させた基板に、まずビオチン結合タンパク質を、ビオチン結合タンパク質−ビオチン結合によって固定化し、ここへビオチン化した被検物質に対する特異的結合物質を、ビオチン結合タンパク質の別のビオチンポケットに結合させることで、基板−ビオチン−ビオチン結合タンパク質−ビオチン−被検物質に対する特異的結合物質という順序で固定させる技術が報告されている（特開平４−２３６３５３）。さらに、被検物質に対する特異的結合物質とビオチン結合タンパク質の融合タンパク質を、生体試料と反応させる前、あるいは反応させた後に、ビオチンを固定化した担体に反応させ固定化することもできる。【０００９】
生物学的試料中の物質を検出する工程
上述したビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を結合させた担体は、生物学的試料中の物質を検出する工程に利用することが可能である。しかしながら、このような実験系においては、所望の被検物質と被検物質に対する特異的結合物質との反応、あるいはビオチン結合タンパク質とビオチン間との反応といった、特異的な結合反応だけではなく、例えば、生物学的試料等に含まれる検出対象ではない物質と固相上を構成する物質との間の、望ましくない非特異的な結合反応も起こり得る。こうした非特異相互作用はバックグラウンドシグナルの増加とシグナル散乱の増加をまねき、検出感度を低減させることになる。【００１０】
この問題を解決する方法として、例えば、被検物質に特異的に結合する組換え抗原タンパク質の産生のために使用した細菌成分抽出物を検出用試薬に含有させる方法（特開昭５９−９９２５７）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質の産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法（特開平８−４３３９２）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法（特開２００４−３０１６４６）などが提案されている。これらの方法により、非特異的結合の抑制には一定の効果が見られているものの、未だ十分とはいえない。【００１１】
さらに、ビオチン結合タンパク質−ビオチン間の結合についても、バックグラウンドシグナルへの対処法が提案されている。例えば、不活性化した（ストレプト）アビジンを結合させた固相に試料を接触させた後に、活性（ストレプト）アビジンを結合させた固相に接触させる方法（特開平８−１１４５９０）、（ストレプト）アビジン分子の架橋、断片化、ＢＳＡ等とのカップリングによる、あるいは（ストレプト）アビジン分子のビオチンによる飽和またはビオチン結合活性中心の修飾による不活性化による、干渉の除去（特表平９−５１０２８９）、あるいは遺伝子工学的に、ビオチンに対して低減した結合親和力を有する（ストレプト）アビジンの変異体タンパク質を含む干渉除去剤（特開平１０−２８５８９）が提案されている。【００１２】
あるいはまたアビジン結合固相にビオチン化物質を結合させた後に、ポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体を接触させる方法（特開平１１−２１１７２７）や、ビオチン含有溶液を接触させる方法（特開２００２−４８７９４）などが提案されている。【００１３】
しかしながら、これらの技術は、非特異結合の低減効果の点で、未だ十分とはいえず、さらに手順の煩雑さ、試薬調製の煩雑さと試薬の均一性、組換えタンパク質調製の煩雑さ（アビジン、ストレプトアビジンは、大腸菌において通常不活性な封入体の形で産生されるため、これを適当な条件下で復元させる必要がある）等、実用面の問題点も未だはらんでいる。【００１４】
ビオチン結合タンパク質の単量体
アビジンやストレプトアビジンの四量体は、ビオチンフリーおよびビオチン結合状態において非常に安定である。その四量体は、６Ｍ尿素または６Ｍ塩酸グアニジンのいずれにおいても、より小さいサブユニットに解離しないことが知られている（Ｋｕｒｚａｎ  ｅｔａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６６：１４４７０−１４４７７（１９９１））。このように、野生型のビオチン結合タンパク質由来の単量体は、用途が知られておらず、その作製も困難だったため、これまで注目されてこなかった。【００１５】
これに対して、アビジン、ストレプトアビジンのアミノ酸配列に変異を導入した単量体タンパク質が、これまでに作製されている。【００１６】
アビジン、ストレプトアビジン、タマビジンと、ビオチンとの結合は極めて強いため、ビオチンとの結合反応は不可逆的であり、一度結合すると殆ど解離させることができない。この強い結合のため、野生型のアビジン、ストレプトアビジン、タマビジンは、そのままでは、ビオチン化生体分子の精製のために必要な、例えばアフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ応用することができない。この問題に対処するため、アビジンとストレプトアビジンにおいて、それらのタンパク質のサブユニット同士の接点に関与するアミノ酸に変異導入する方法で、変異タンパク質を作製し、ビオチンへの親和性を下げた例が報告されている。そして、このような変異タンパク質の幾つかは、単量体タンパク質であった（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５−２３２３１）。【００１７】
アビジンやストレプトアビジンは、各サブユニットそれぞれに１つずつビオチン結合サイトを持つが、完全なビオチン結合ポケットを形成するには、隣接するサブユニットのアミノ酸残基の存在が重要である。従って、単量体になると完全なビオチン結合ポケットを形成することができず、ビオチンとの親和性が弱まるものと考えられている。【００１８】
アビジンやストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ応用するためには、解離定数（ＫＤ）を１０−７（Ｍ）程度まで上昇させることが一つの目安となると考えられている。場合にもよるが一般に解離定数がこれ以上小さい場合、ビオチン結合能が強すぎて、所望のビオチン化物質を効率よく解離させることができず、また、解離定数がこれより大きい場合は、ビオチン結合能が弱すぎて所望のビオチン化物質を十分に結合させることができないからである（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ４６：２６８−２７）。実際に作製された変異タンパク質の中で、単量体は、いずれもビオチン結合能が、１０−９（Ｍ）〜１０−６（Ｍ）程度のものであった（Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６４２２−４６４２８）。そして、これらの単量体はいずれも実用化には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】ＷＯ０２／０７２８１７
【特許文献２】特開平４−２３６３５３
【特許文献３】特開昭５９−９９２５７
【特許文献４】特開平８−４３３９２
【特許文献５】特開２００４−３０１６４６
【特許文献６】特開平８−１１４５９０
【特許文献７】特表平９−５１０２８９
【特許文献８】特開平１０−２８５８９
【特許文献９】特開平１１−２１１７２７
【特許文献１０】特開２００２−４８７９４
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｋｕｒｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １４４７０−１４４７７
【非特許文献２】Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ８２１９-８２２４
【非特許文献３】Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ  （２００５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５-２３２３１）
【非特許文献４】Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ４６：２６８−２７
【非特許文献５】Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ４６４２２-４６４２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、生物学的試料中の物質を検出する工程において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させることを含む、非特異的結合を抑制する方法であって、
前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、
前記抑制方法、
を提供することを目的とする。【００２２】
本発明はまた、上記方法に使用するための、新規な非特異結合抑制剤を提供することを目的とする。【００２３】
また、本発明はこのような非特異結合抑制剤に利用できる、ビオチン結合タンパク質単量体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、ビオチン結合タンパク質を利用した検出系において、従来の方法を利用しても、非特異的相互作用を十分に吸収できない血清が、一定程度存在することに気がついた。そこで鋭意研究に努めた結果、ビオチン結合タンパク質を利用した検出・測定系において、従来法では非特異相互作用を吸収できない血清に対して、単量体化したビオチン結合タンパク質を添加した場合に、非特異結合が顕著に低下することを見出し、本願発明を想到した。【００２５】
従来、（ストレプト）アビジンを用いたイムノアッセイにおいて、非特異結合抑制剤として、ビオチン結合活性を低下させた（ストレプト）アビジンを用いる場合、その（ストレプト）アビジンは、ビオチン結合能が改変されたことを除いて、その空間構造は天然の（ストレプト）アビジンと著しく変わっていないことが望まれていた。そのような変異タンパク質は、その天然ポリペプチドとの免疫学的交差反応性が高いことが好ましく、さらに、それらは二量体化または四量体化することができることが望ましいとされていた（特開平１０−２８５８９）。【００２６】
しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、従来の技術常識と反して、単量体化したビオチン結合タンパク質による非特異結合低減効果が、四量体のビオチン結合タンパク質よりも顕著に高いということを見出した。【００２７】
本発明は、以上の発見に基づき、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間の結合を用いて、被検物質と特異的に結合する物質を担体に固定化し、試料中の被検物質を検出・測定する系において、効果的に非特異結合を抑制する方法及び当該方法に使用する剤を提供するものである。【００２８】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
生物学的試料中の物質を検出する工程において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させることを含む、非特異的結合を抑制する方法であって、
前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、
前記抑制方法。
［態様２］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体の分子量が、５ないし２０ｋＤａである、態様１に記載の抑制方法。
［態様３］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、凝集しない性質を有する、態様１または２に記載の抑制方法。
［態様４］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、界面活性剤の非存在下において、あるいは、２℃ないし１０℃の冷蔵条件下において、凝集しない性質を有する、態様１ないし３のいずれか１項に記載の抑制方法。
［態様５］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、ビオチン結合タンパク質を加熱処理又は薬剤処理することによって得られるものであるか、あるいは、ビオチン結合タンパク質のアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸残基を改変することによって得られるものである、態様１ないし４のいずれか１項に記載の抑制方法。
［態様６］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、ビオチン結合タンパク質を加熱処理することによって得られるものである、態様１ないし４のいずれか１項記載の抑制方法。
［態様７］
ビオチン結合タンパク質が、タマビジン２、タマビジン１、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される、態様１ないし６に記載の抑制方法。
［態様８］
単量体が由来するビオチン結合タンパク質が、被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させるためのビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を構成するビオチン結合タンパク質と同種である、態様１ないし７のいずれか１項に記載の抑制方法。
［態様９］
前記検出工程において利用する、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介した被検物質に対する特異的結合物質の担体への結合が、下記Ａ）−Ｃ）のいずれかによって達成される、態様１ないし８のいずれか１項に記載の抑制方法。
Ａ）ビオチン結合タンパク質が結合した担体に、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる；
Ｂ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質を結合させ、さらに、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる；あるいは
Ｃ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質と被検物質に対する特異的結合物質との融合タンパク質を結合させる；
［態様１０］
ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を含む、生物学的試料中の物質を検出する工程において非特異的結合を抑制するための剤であって、
前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、
前記剤。
［態様１１］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体の分子量が、５ないし２０ｋＤａである、態様１０に記載の剤。
［態様１２］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、凝集しない性質を有する、態様１０または１１に記載の剤。
［態様１３］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、界面活性剤の非存在下において、あるいは、２℃ないし１０℃の冷蔵条件下において、凝集しない性質を有する、態様１０ないし１２のいずれか１項に記載の剤。
［態様１４］
前記ビオチン結合タンパク質の単量体が、ビオチン結合タンパク質を加熱処理することによって得られるものである、態様１０ないし１３のいずれか１項に記載の剤。
［態様１５］
ビオチン結合タンパク質が、タマビジン２、タマビジン１、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される、態様１０ないし１４に記載の剤。
［態様１６］
下記のｉ）−ｉｉｉ）の性質を有する、ビオチン結合タンパク質の単量体。
ｉ）実質的にビオチン結合能を有さない；
ｉｉ）分子量が、５ないし２０ｋＤａである；及び
ｉｉｉ）凝集しない
［態様１７］
以下のいずれかの群：
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列；
ｖ）上記配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列；
ｖｉ）上記配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；
ｖｉｉ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列；
ｉｘ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列；並びに
ｘ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む、態様１６に記載の単量体。
［態様１８］
ビオチン結合タンパク質を加熱処理することによって得られる、態様１６又は１７に記載のビオチン結合タンパク質の単量体。
［態様１９］
ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体の、生物学的試料中の物質を検出する工程において非特異的結合を抑制するための、使用。
［態様２０］
生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法に使用するためのキットであって、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を含む非特異結合抑制剤、を含む、前記キット。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によって、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間の結合を利用して、被検物質と特異的に結合する物質を担体に固定化する系において、試料中に存在する被検物質を検出するにあたり、バックグラウンドノイズの原因となる非特異結合を抑制することが可能になる。本発明の非特異結合抑制剤により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常は検出が困難な物質の検出も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は加熱処理によるビオチン結合タンパク質の精製と回収を示しており、８０℃で粗精製したサンプル（１２０℃処理前）とさらに１２０℃で１５分間処理を行ったサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色図である。大腸菌で発現させたタマビジン２（ＴＭ２）（図１Ａ）、大腸菌で発現させた耐熱性タマビジン２（ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ）（図１Ｂ）、並びに市販の精製ストレプトアビジン（８０℃で粗精製はしていない）（図１Ｃ）を実験に供試した。
【図２】図２は加熱処理によるビオチン結合タンパク質の単量体化を示しており、８０℃で粗精製したサンプル（１２０℃処理前）とさらに１２０℃で１５分間処理を行ったサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色図である。大腸菌で発現させたタマビジン２（ＴＭ２）（図２Ａ）、大腸菌で発現させた耐熱性タマビジン２（ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ）（図２Ｂ）、並びに市販の精製ストレプトアビジン（８０℃で粗精製はしていない）（図２Ｃ）を実験に供試した。なお、本ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、タンパク質のサブユニット会合を見るために、サンプルバッファーにＤＴＴは入っておらず、泳動前の加熱処理は行っていない。
【図３】図３は加熱処理によるビオチン結合活性の不活化を示しており、８０℃で粗精製したサンプル（１２０℃処理前）と、さらに１２０℃で１５分間処理を行ったサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サンプルバッファーにＤＴＴは入っておらず、泳動前の加熱処理は行っていない）に供した後に、ＰＶＤＦ膜に転写、その後ビオチン化Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを反応させ、染色した図である。大腸菌で発現させたタマビジン２（ＴＭ２）（図３Ａ）、大腸菌で発現させた耐熱性タマビジン２（ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ）（図３Ｂ）、並びに市販の精製ストレプトアビジン（８０℃で粗精製はしていない）（図３Ｃ）を実験に供試した。
【図４】図４は単量体不活性型ビオチン結合タンパク質画分の血清中ヒトＩｇＧ非特異結合の抑制効果を示しており、血清＃Ｒ１６８３３４（コージンバイオ社から購入）を用いて、ＴＭ２固定化磁性ビーズに対する非特異結合を測定したグラフであり、血清希釈液として２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ（左図）もしくは２％  ＢＳＡ／大腸菌抽出液／ＨＥＰＥＳ（右図）を、非特異結合抑制剤としてＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２（無処理の四量体精製ＴＭ２）、ＡＣ−ＴＭ２（ＴＭ２発現大腸菌抽出液を８０℃処理し、さらに１２０℃で１５分間、オートクレーブ処理したＴＭ２単量体）、ＡＣ−ＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ（ＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ発現大腸菌抽出液を８０℃処理し、さらに１２０℃で１５分間、オートクレーブ処理したＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ単量体）を使用した。
【００３１】
図４の左図、右図とも、黒丸、白丸、及び白三角は、各々Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ＡＣ−ＴＭ２、及びＡＣ−ＴＭ２―Ｎ１１５Ｃの結果を示す。
【図５】図５は血清＃Ｒ１６８３３４を用いて、ＴＭ２固定化磁性ビーズもしくはビオチン化磁性ビーズに対する非特異結合を測定したグラフであり、血清希釈液として２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを、非特異結合抑制剤としてＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２もしくはＡＣ−ＴＭ２を使用した。
【００３２】
図５の黒丸、白丸は、各々Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２もしくはＡＣ−ＴＭ２の結果を示す。×印は、ビオチン化磁性ビーズにＡＣ−ＴＭ２を非特異結合抑制剤として添加した結果を示す。
【図６】図６は、ビオチン結合ＴＭ２による非特異結合抑制効果を示す。具体的には、血清＃Ｒ１６８３３４を用いて、ＴＭ２固定化磁性ビーズに対する非特異結合を測定したグラフであり、血清希釈液として２％  ＢＳＡ／大腸菌粗抽出液／ＨＥＰＥＳを、非特異結合抑制剤としてＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ビオチン結合ＴＭ２（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＴＭ２）もしくはＡＣ−ＴＭ２を使用した。
【００３３】
図６の黒丸、白丸、及び黒三角は、各々Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ＡＣ−ＴＭ２、及びビオチン結合ＴＭ２の結果を示す。
【図７】図７は、精製ＴＭ２をオートクレーブ処理により不活性化・単量体化したタンパク質の非特異結合抑制効果を示す。具体的には、血清＃Ｒ１６８３３４を用いて、ＴＭ２固定化磁性ビーズに対する非特異結合を測定したグラフであり、血清希釈液として２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを、非特異結合抑制剤としてＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ＡＣ−ＴＭ２、ＡＣ−精製  ＴＭ２（ＡＣ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＴＭ２）（精製ＴＭ２を１２０℃で１５分間オートクレーブで熱処理したもの）もしくはＡＣ−ＢＬ２１（大腸菌ＢＬ２１株の抽出物を８０℃処理し、さらに１２０℃で１５分間オートクレーブ処理したもの）を使用した。
【００３４】
図７の黒丸、白丸、黒三角、×印は、各々Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ＡＣ−ＴＭ２、ＡＣ−精製  ＴＭ２及びＡＣ−ＢＬ２１の結果を示す。
【図８】図８は、血清＃Ｒ１６８２１６のＴＭ２固定化磁性ビーズに対する非特異結合と各抑制剤の効果を示す。具体的には、血清＃Ｒ１６８２１６を用いて、ＴＭ２固定化磁性ビーズに対する非特異結合を測定したグラフであり、血清希釈液として２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ（左図）、もしくは２％  ＢＳＡ／ＨＥＰＥＳ／大腸菌粗抽出液（右図）を、非特異結合抑制剤としてＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ビオチン結合ＴＭ２（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＴＭ２）、ＡＣ−ＴＭ２もしくはＡＣ−ＢＬ２１を使用した。
【００３５】
図８は、左図、右図とも、黒丸、白丸、灰色丸、黒四角、×印は各々、Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２、ＡＣ−ＴＭ２、ＡＣ−精製  ＴＭ２、ビオチン結合ＴＭ２及びＡＣ−ＢＬ２１の結果を示す。
【図９】図９は４℃条件下で１ヶ月保存後のＴＭ２単量体並びにＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ単量体の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた結果を示す。４℃で１ヶ月保存していたＴＭ２単量体並びにＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ溶液をそれぞれ０．４、０．８、２．０μｇ／ＬａｎｅとなるようＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢで染色した。
【図１０】図１０は４℃条件下で３ヶ月保存後のＴＭ２単量体の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた結果を示す。４℃で３ヶ月保存していたＴＭ２単量体溶液を０．５、１．０、２．０μｇ／ＬａｎｅとなるようＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢで染色した。なお、本ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、通常のサンプルバッファー（ＤＴＴ入り）で泳動前の加熱処理を行った区（図中ＤＴＴ＋）の他に、タンパク質のサブユニット会合を見るために、サンプルバッファーにＤＴＴは入っておらず、泳動前の加熱処理は行っていない区も設けた（図中ＤＴＴ−）。
【図１１】図１１は４℃条件下で３ヶ月保存後のＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ単量体の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた結果を示す。４℃で３ヶ月保存していたＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ単量体溶液を０．５、１．０、２．０μｇ／ＬａｎｅとなるようＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢで染色した。なお、本ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、通常のサンプルバッファー（ＤＴＴ入り）で泳動前の加熱処理を行った区（図中ＤＴＴ＋）の他に、タンパク質のサブユニット会合を見るために、サンプルバッファーにＤＴＴは入っておらず、泳動前の加熱処理は行っていない区も設けた（図中ＤＴＴ−）。
【図１２】図１２は４℃保存後の凝集析出検討試験の結果を示す。４℃で２週間もしくは３ヶ月保存していたＴＭ２単量体、並びにＴＭ２―Ｎ１１５Ｃ単量体溶液の遠心後上清と沈澱画分をそれぞれ２．０、４．０μｇ／ＬａｎｅとなるようＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色でタンパク質を検出した。なお、沈澱画分については、上清画分で２．０μｇ、または４．０μｇをロードした際と同じ体積の量をロードした。
【図１３】図１３は、加熱処理により不活性化・単量体化したストレプトアビジンの非特異的結合抑制結果について示す。グラフは、ストレプトアビジン固定化磁性ビーズの測定値からビオチン化磁性ビーズの測定値を差し引いた値を、ストレプトアビジンに結合したヒトＩｇＧ量として示したものである。「ＳｔＡｖｉ」、「ＡＣ−ＳｔＡｖｉ」は、各々非特異的結合吸収剤として、ストレプトアビジン（四量体）、加熱処理した不活性化したストレプトアビジン（単量体）を添加した場合の結果を示す。「−」は、何も添加しなかった場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
【００３７】
Ｉ．生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法
本発明における検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである。そして、本発明の、非特異的結合を抑制する方法は、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を生物学的試料と接触させることを含む、ことを特徴とする。
【００３８】
試料
本発明において、検出工程の対象となる試料は、検出対象となる物質が含まれうるものであれば特段限定されないが、好ましくは、生物学的試料である。具体的には、生物から採取された細胞、組織またはその破片等を含む試料、例えば体液、さらに好ましくは、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、汗、尿、涙、リンパ液、及び母乳などである。
【００３９】
これらの体液は、必要に応じ希釈して用いる。希釈率は通常２倍ないし１００００倍程度、好ましくは１００倍ないし１０００倍程度であるが、これに限定されない。希釈するための溶液は任意の緩衝液が使用されうるが、適当なブロッキング剤を含んでも良い。ブロッキング剤としては、非特異的な結合を抑制する効果が高いものが良く、ＢＳＡやカゼイン等、当業者に周知のブロッキング剤を使用することができる。
【００４０】
本発明の被検物質としては、試料中の検出または測定が望まれる物質であれば特段の制限はないが、抗体や抗原などのタンパク質やその断片、ペプチド、核酸、糖質、糖脂質などを好ましく使用することができる。
【００４１】
被検物質に対する特異的結合物質
本発明における、被検物質と特異的に結合する物質、即ち、被検物質に対する特異的結合物質（本明細書において、これを「特異的結合物質」と呼称することがある）としては、タンパク質、核酸、糖質、糖脂質等が挙げられるが、特に制限はない。当該発明による一つの態様としては、例えばこれらに限定されるものではないが、抗原と抗体、ホルモン等のリガンドと受容体、レクチンと糖、核酸の相補的結合等において、その一方を、他方との特異的な複合体形成能力を利用して、被検試料から選択的に分析する。
【００４２】
より詳細には、例えばタンパク質としては、抗体、抗原タンパク質、レクチン、ペプチド、あるいはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、受容体、酵素タンパク質などが挙げられる。抗体としては、ＩｇＧの他、ｓｃＦｖやＦａｂ等の抗原結合部位を含む抗体断片が、抗原タンパク質としては、Ｂ型・Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス等のウイルス由来のタンパク質や、ヘリコバクター・ピロリ等の細菌由来のタンパク質、あるいはＣＥＡ、ＰＳＡ等の腫瘍マーカー、性ホルモンなどが挙げられる。レクチンは、糖結合性タンパク質であり、マンノース特異的レクチン、ＧａｌＮＡｃ特異的レクチン、ＧｌｃＮＡｃ特異的レクチン、フコース特異的レクチン、シアル酸特異的レクチンなどの単糖特異的レクチン、オリゴ糖特異的レクチンなどが挙げられる。また、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質等も挙げられる。更にペプチドとしては、２〜１００アミノ酸からなるもの、好ましくは４〜５０アミノ酸からなるもの、より好ましくは６〜３０アミノ酸からなるものが、例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
また、核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが例として挙げられる。糖質としては単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖、多糖類などが、糖脂質としてはガラクト脂質、スルホ脂質、スフリンゴ糖脂質などが、例として挙げられる。しかしながら、これらに限定されるものではない。
【００４４】
ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を結合させた担体
本発明における検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである。
【００４５】
なお、本発明において、「ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合」を「アビジン−ビオチン結合」と呼称する場合がある。
【００４６】
ｉ）ビオチン
「ビオチン」とは、Ｄ−［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸］の一般名称である。ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ７（ビタミンＢ７）とも呼ばれる、あるいは、ビタミンＨ、補酵素Ｒとも言われることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合し、その吸収が阻害される。そのため、生卵白の大量摂取によってビオチン欠乏症を生じることがある。
【００４７】
本明細書中において「ビオチン」とは、上記ビオチンの他、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４６６６−４６６８）や、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３０８：  ３４３−３５７）、あるいはビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）やＢｉｏｔｉｎ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ等のビオチン類縁体も含む。
【００４８】
ビオチン−アビジン（ビオチン結合タンパク質）複合体を用いたシステムは、生化学、分子生物学、組織免疫学やＤＮＡ分析、あるいは臨床検査などの分野で広く利用されている。本発明においても、アビジン−ビオチン結合を利用して、特異的結合物質を担体に結合させる。
【００４９】
ｉｉ）ビオチン結合タンパク質
本発明において、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するビオチン結合タンパク質としては、特に限定されず、ビオチン結合タンパク質として公知のタンパク質であれば、任意のものを使用可能である。
【００５０】
例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，（２００２），  ３６３：  ６０９−６１７）、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，（２００５），  ２８０：  １３２５０−１３２５５）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  （２００７），４０５：３９７−４０５）、タマビジン（ＷＯ０２／０７２８１７）やこれらの変異体等、ビオチンと強く結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。好ましくは、ビオチン結合タンパク質はビオチンとの解離定数（ＫＤ）が１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１０−１０Ｍ以下、さらに好ましくは１０−１２Ｍ以下である。
【００５１】
限定されるわけではないが、ビオチン結合タンパク質は、好ましくはタマビジン２、タマビジン１、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される。
【００５２】
ビオチン結合タンパク質のビオチン結合活性は、公知の手法のいずれかにより測定することが可能である。例えば、Ｋａｄａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １４２７：  ３３−４３  （１９９９））に記載されるように蛍光ビオチンを用いる方法により測定してもよい。この方法は、ビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用したアッセイ系である。あるいは、表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサーなど、タンパク質とビオチンの結合を測定することが可能なセンサーを用いて、タンパク質のビオチン結合活性を評価することもできる。あるいはまた、ビオチン結合タンパク質を、膜やマイクロビーズ等の担体に固定化した後に、ビオチン化酵素、例えばビオチン化ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等を反応させて、洗浄後に酵素活性を測定することにより、ビオチン結合活性を評価することができる。
【００５３】
タマビジン
特異的結合物質を担体に固定化するためのビオチン結合タンパク質として、特に、タマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見されたビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７、Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７６：  １３８３−１３９７）。タマビジンの変異体としては、例えば、高結合能・低非特異結合タマビジン（ＷＯ２０１０／０１８８５９）等が挙げられる。
【００５４】
本発明における「タマビジン」は、タマビジン１（ＴＭ１：配列番号４のアミノ酸配列、配列番号３の塩基配列）、タマビジン２（ＴＭ２：配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１の塩基配列）、又はそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のタマビジンは典型的には、配列番号４もしくは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号３もしくは配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。
【００５５】
あるいは、本発明のタマビジンは、配列番号４もしくは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号３もしくは配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質の変異体であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、及びそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼称することがある。
【００５６】
タマビジン１又は２の変異体は、配列番号４又は２のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５７】
具体的には、配列番号４又は２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個））のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質である。ここで、アミノ酸配列が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味する。当該欠失、置換、挿入及び／又は付加は、これらのうち２種以上が同時に生じてもよいが、当該欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的に小さいほど好ましい。
【００５８】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよい。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
【００５９】
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Ｋｙｔｅら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３１（１９８２））。また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行ってもよい。
【００６０】
配列番号４又は２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１））等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、好ましくは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。
【００６１】
タマビジン１又は２の変異体はさらに、配列番号４又は２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００６２】
タマビジンの変異体には、さらに、以下のものも含まれる。
【００６３】
−配列番号３もしくは配列番号１の塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質；
−配列番号３もしくは配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質
−配列番号３もしくは配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質
「１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加」とは、好ましくは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のヌクレオチドを意味する。具体的には、配列番号３又は１に示す塩基配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、１〜１２０個、１〜９０個、１〜６０個、１〜４５個、さらに好ましくは３０、２７、２４、２１、１８、１５、１２、９、６又は１−３個））のヌクレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を意味する。
【００６４】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．  及びＷｕｎｓｃｈ，  Ｃ．  Ｄ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータ・プログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ｇ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００６５】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２５，  ｐ．３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００６６】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：  ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４：  ６７４５，  １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，  １９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：  ５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフ���ルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００６７】
タマビジンの変異体はまた、配列番号３又は１の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、タマビジンと同様の結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００６８】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００６９】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００７０】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００７１】
なお、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するビオチン結合タンパク質は、上記のとおり、ビオチンと強く結合することが好ましい。よって、被検物質に対する特異的結合物質を担体に固定化するために使用するタマビジン１又はタマビジン２の変異体は、これらの野生型と比較して、ビオチン結合活性が大きく減少していないことが好ましい。
【００７２】
従って、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するタマビジン１の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列において、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７８、Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０、Ｄ１１８が改変されないことが好ましい。なお表記の、例えばＹ３４は、配列番号４のアミノ酸配列の第３４番目のチロシン残基を意味する。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７８）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、トリプトファン（Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０）の場合は、フェニルアラニン（Ｆ）へ、アスパラギン酸（Ｄ１１８）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
【００７３】
また、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するタマビジン２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）が改変されないことが好ましい。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸、例えばフェニルアラニン（Ｆ）への改変が好ましい。また、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
【００７４】
本発明において、好ましいタマビジン変異体には以下のものが含まれる。（ＷＯ２０１０/０１８８５９）。
【００７５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
【００７６】
より好ましくは、配列番号２において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
【００７７】
ストレプトアビジン
特異的結合物質を担体に固定化するためのビオチン結合タンパク質として、ストレプトアビジンとその変異体を好ましく用いることができる。ストレプトアビジンは、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来の、糖鎖を含まないアビジン様タンパク質である。
【００７８】
ストレプトアビジンのアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に記載しているが、このうち最初の２４個のアミノ酸は、成熟タンパク質となる際に除去される。従ってストレプトアビジンの成熟タンパク質のアミノ酸配列はＤ２５からＱ１８３までである。また、自然界で生じるコアストレプトアビジンと呼ばれる部分は、Ａ３７からＳ１６３までであり、この部分だけでビオチン結合活性を有することが知られている（Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：  ２８２０４−２８２０９）。
【００７９】
本発明における「ストレプトアビジン」は、ストレプトアビジン、又はそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のストレプトアビジンは典型的には、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号５の塩基配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までをコードする配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。
【００８０】
「配列番号５の塩基配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までをコードする配列」は、各々、配列番号５の塩基配列のうち、７３番目の塩基（ｇ）−５５２番目の塩基（ｇ）、及び、１０９番目の塩基（ｇ）−４８９番目の塩基（ｃ）を意味する。
【００８１】
あるいは、本発明のストレプトアビジンは、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号５の塩基配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までをコードする配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質の変異体であって、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってよい。
【００８２】
ストレプトアビジンの変異体は、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までのアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００８３】
ストレプトアビジンの変異体はさらに、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までのアミノ酸配列と好ましくは少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上又は９８％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００８４】
ストレプトアビジンの変異体には、さらに、以下のものも含まれる。
【００８５】
−配列番号５の塩基配列のうち、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までをコードする配列を含んでなる塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質；
−配列番号５の塩基配列のうち、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までをコードする配列を含んでなる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質
−配列番号５の塩基配列のうち、配列番号６のアミノ酸配列のうち、Ｄ２５からＱ１８３まで、若しくは、Ａ３７からＳ１６３までをコードする配列を含んでなる塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、ストレプトアビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質
「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加」、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加」、「％同一」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の意義は、タマビジンについて上述した通りである。
【００８６】
なお、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するビオチン結合タンパク質は、上記のとおり、ビオチンと強く結合することが好ましい。よって、被検物質に対する特異的結合物質を担体に固定化するために使用するストレプトアビジンの変異体は、これらの野生型と比較して、ビオチン結合活性が大きく減少していないことが好ましい。
【００８７】
従って、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するストレプトアビジンの変異体は、配列番号６のアミノ酸配列において、Ｎ４７，Ｓ５１，Ｙ６７，Ｓ６９，Ｎ７３，Ｗ１０３，Ｓ１１２，Ｔ１１４，Ｗ１１６，Ｗ１３２，Ｗ１４４，Ｄ１５２が改変されないことが好ましい。なお表記の、例えばＮ４７は、配列番号６のアミノ酸配列の第４７番目のアスパラギン残基を意味する。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましい。
【００８８】
アビジン
特異的結合物質を担体に固定化するためのビオチン結合タンパク質として、アビジンとその変異体を好ましく用いることができる。アビジンは鳥（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）の卵白由来の塩基性糖タンパク質で、ビオチンと強く結合する。
【００８９】
アビジンのアミノ酸配列は、配列表の配列番号８に記載しているが、このうち最初の２４個のアミノ酸は、成熟タンパク質となる際に除去される。従ってアビジンの成熟タンパク質のアミノ酸配列はＡ２５からＥ１５２までである。
【００９０】
本発明における「アビジン」は、アビジン、又はそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のアビジンは典型的には、配列番号８のアミノ酸配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号７の塩基配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までをコードする配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。
【００９１】
「配列番号７の塩基配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までをコードする配列」は、配列番号７の塩基配列のうち、７３番目の塩基（ｇ）−４５９番目の塩基（ａ）を意味する。
【００９２】
あるいは、本発明のアビジンは、配列番号８のアミノ酸配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号７の塩基配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までをコードする配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質の変異体であって、アビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってよい。
【００９３】
アビジンの変異体は、配列番号８のアミノ酸配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までのアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、アビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００９４】
アビジンの変異体はさらに、配列番号８のアミノ酸配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までのアミノ酸配列と好ましくは少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上又は９８％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、アビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００９５】
アビジンの変異体には、さらに、以下のものも含まれる。
【００９６】
−配列番号７の塩基配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までをコードする配列を含んでなる塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、アビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質；
−配列番号７の塩基配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までをコードする配列を含んでなる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、アビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質
−配列番号７の塩基配列のうち、Ａ２５からＥ１５２までをコードする配列を含んでなる塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、アビジンと同様のビオチン結合活性を有するタンパク質
「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加」、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加」、「％同一」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の意義は、タマビジンについて上述した通りである。
【００９７】
なお、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するビオチン結合タンパク質は、上記のとおり、ビオチンと強く結合することが好ましい。よって、被検物質に対する特異的結合物質を担体に固定化するために使用するアビジンの変異体は、これらの野生型と比較して、ビオチン結合活性が大きく減少していないことが好ましい。
【００９８】
従って、特異的結合物質を担体に固定化するために使用するアビジンの変異体は、配列番号８のアミノ酸配列において、Ｎ３６，Ｓ４０，Ｙ５７，Ｔ５９，Ｔ６２，Ａ６３，Ｔ６４，Ｗ９４，Ｆ９６，Ｓ９７，Ｓ９９，Ｔ１０１，Ｆ１０３，Ｗ１２１，Ｗ１３４，Ｎ１４２が改変されないことが好ましい。なお表記の、例えばＳ４０は、配列番号８のアミノ酸配列の第４０番目のセリン残基を意味する。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましい。
【００９９】
ｉｉｉ）担体
固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン、ニトロセルロース、アガロース、高架橋球形アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ラテックス、ポリスチレンラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク質（アルブミン等）、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
【０１００】
固体担体の形状は、マイクロビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
【０１０１】
発明の一態様において、マイクロビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。
【０１０２】
限定されるものではないが、例えば、高い検出感度が望まれる場合においては、検出すべき物質とこれに特異的に結合する物質との接触頻度や洗浄操作の容易性といった観点から、固体担体として上記のようなビーズを好ましく使用することができる。
【０１０３】
ｉｖ）特異的結合物質の担体への結合方法
本発明の検出工程において利用する、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介した被検物質に対する特異的結合物質の担体への結合の態様は、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を利用するものであれば、特に限定されない。限定されるわけではないが、例えば、下記Ａ）−Ｃ）のいずれかによって達成される。
【０１０４】
Ａ）ビオチン結合タンパク質が結合した担体に、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる；
Ｂ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質を結合させ、さらに、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる；あるいは
Ｃ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質と被検物質に対する特異的結合物質との融合タンパク質を結合させる；
以下、詳述する。
【０１０５】
Ａ）ビオチン結合タンパク質が結合した担体に、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる方法
態様Ａ）において、ビオチン結合タンパク質を担体に直接結合させる方法としては、疎水結合や共有結合を用いる方法などがある。あるいはまた、ＮＥＷ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅキット（住友ベークライト社）のようなマイクロプレートに、キット添付の説明書きに従ってビオチン結合タンパク質を直接結合、固定化させても良い。なお、アビジンやストレプトアビジンは例えばＳＩＧＭＡ社等から、タマビジン２は和光純薬工業（株）から市販されている。
【０１０６】
疎水結合を利用する場合、担体の疎水性表面と、ビオチン結合タンパク質の疎水性部分との相互作用を利用して結合させる。具体的には、ビオチン結合タンパク質溶液を例えば、マイクロプレート等（例えばこれらに限定されるわけではないが、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）  Ｐｌａｔｅ  （Ｎｕｎｃ社）、ＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ−９６  ＨＢ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、あるいはＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ  Ｃｏｒｎｅｒ  Ｎｏｔｃｈ（ＰＩＥＲＣＥ社）等）の担体表面に直接接触させ、一定時間置くことでビオチン結合タンパク質の疎水性部分と担体の疎水性部分との相互作用により結合、固定化させる。
【０１０７】
一方、共有結合の場合は、担体の表面に官能基を配置させ、これとビオチン結合タンパク質中の官能基とを結合させる。このような結合のために、様々な官能基が表面に配置された各種担体が市販されており、好ましく用いることができる。例えばこれらに限定されるわけではないが、官能基が表面に配置されたマイクロプレートとしては、無水マレイン酸プレートとして例えばＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）  Ｍａｌｅｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）が、活性型アミノ基プレートとして例えばＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）−Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅｓ／Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ社）が、あるいはカルボキシル基プレートとして例えばＥＬＩＳＡ用プレートＭＳ−８７９６Ｆ（９６ウェル・Ｃタイプ・平底・カルボ）（住友ベークライト社）が挙げられる。また、官能基が表面に配置されたマイクロビーズとしては、高架橋アガロースビーズとして例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  ヘルスケアバイオサイエンス社）が、磁性ビーズとして例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｄｙｎａｌ社）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ビオチン結合タンパク質と固体担体の連結は、担体に添付された説明書に従えばよい。
【０１０８】
具体的には、これに限定されるわけではないが、以下のような、当業者に公知のタンパク質と固体担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、表面をカルボキシル基が露出するよう修飾された固体担体のカルボキシル基とビオチン結合タンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、ビオチン結合タンパク質と固体担体を連結することができる。あるいは、表面がＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）により活性エステル化された固体担体にビオチン結合タンパク質を、一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和し、固体担体表面のカルボキシル基とビオチン結合タンパク質のアミノ基を結びつけることができる。あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、固体担体表面のアミノ基とビオチン結合タンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、固体担体表面のアミノ基とビオチン結合タンパク質のチオール基を結びつけることができる。
【０１０９】
ビオチン結合タンパク質を固定化した担体としては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓ  （ＰＩＥＲＣＥ社）、Ｎｕｎｃ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）  Ｐｌａｔｅｓ  （Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）等のマイクロプレート類、あるいはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  （Ｄｙｎａｌ社）、ＭａｇｎａＢｉｎｄ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓ  （ＰＩＥＲＣＥ社）等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１０】
被検物質に対する特異的結合物質をビオチン化する方法としては、特に限定するものではなく、例えば、ビオチン標識キット（例えば、非限定的に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＩＥＲＣＥ社）や、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２  （ＤＯＪＩＮＤＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＩＮＣ．社）など）を用いて特異的結合物質にビオチンを結合させてもよい。あるいは特異的結合物質がタンパク質の場合は、該タンパク質をコードする遺伝子を、ビオチン化配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと融合し、この融合遺伝子を発現するベクターを構築、任意の宿主においてビオチン化配列との融合タンパク質として発現させることにより、ビオチン化した特異的結合物質を作製してもよい（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：９６４０−９６４５．）。
【０１１１】
このようなベクターとしてこれに限定されるわけではないが、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅ（商標）タグが含まれるベクターが挙げられる。このうち哺乳類細胞発現用には、ｐｃＤＮＡ（商標）６ベクターが、大腸菌発現用にはｐＥＴ１０４ベクターが、あるいはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現用にはｐＭＴ／ＢｉｏＥａｓｅベクターがある。
【０１１２】
さらには、好ましくは、ビオチン化試薬を用いることができる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ２−Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ２  Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ３−ＬＣ  Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
このようなビオチン化試薬を用いて、特異的結合物質に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、特異的結合物質に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  ヒドロキシクロリド）のようなカルボジイミドを用いて、特異的結合物質のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。
【０１１４】
なお、このようにビオチン化試薬を用いてビオチン化した特異的結合物質を作製する場合は、予め上述のように特異的結合物質を精製しておくことが好ましい。
【０１１５】
以上のようにして準備したビオチン化した特異的結合物質は、ビオチン結合タンパク質を結合させた担体と接触させることにより、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して、担体に結合させることができる。
【０１１６】
Ｂ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質を結合させ、さらに、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質を結合させる方法
ビオチン結合タンパク質の多くが四量体であることを利用して、ビオチンを結合させた担体に、まずビオチン結合タンパク質を、ビオチン結合タンパク質−ビオチン結合によって固定化し、ここへビオチン化した特異的結合物質を、ビオチン結合タンパク質の別のビオチンポケットに結合させることで、担体−ビオチン−ビオチン結合タンパク質−ビオチン−特異的結合物質という順序で固定させることができる。
【０１１７】
担体をビオチン化する方法としては、上記特異的結合物質のビオチン化と同じ方法を用いることができる。例えば、ビオチン化試薬を用いる方法である。ビオチン化試薬として例えば、上記Ａ）で記載したものを利用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
上記ビオチン化試薬を用いて、マイクロプレート、微小ビーズ、あるいはセンサーチップなど所望の担体に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、トシル基、エポキシ基、マレイミド基、活性化エステルなど種々の官能基を持つ担体（例えば磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートなど）を用いる方法がある。この場合、例えばＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、アミノ基を持つ固定化担体に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  ヒドロクロリド）のようなカルボジイミドを用いて固定化担体のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。なお、ビオチン化した固定化担体は、好ましくは未反応の官能基を不活性化した後、ＢＳＡなどでブロッキングする。
【０１１９】
また、ビオチン化された市販担体を利用することもできる。ビオチン化されたマイクロプレートとしては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を利用できるが、これに限定されるものではない。ビオチン化された微小ビーズとしては、例えば、磁性ビーズとして、ＢｉｏＭａｇ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が、ナノ磁性ビーズとして、コアフロント社製のｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ  ｂｉｏｔｉｎ、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−ｓｉｌｉｃａ  ｂｉｏｔｉｎが、ポリスチレン製マイクロビーズとして、Ｂｅａｄｌｙｔｅ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｅａｄｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）が、アガロースとしてＳｉｇｍａ社製の、Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ、２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅが、高架橋アガロースとして、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（バイオリサーチテクノロジー社製）を利用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
また、担体とビオチンと繋ぐリンカーの長さは、限定されるものではないが、好ましくは５Åより長く、より好ましくは１３．５Å以上、さらに好ましくは２２．４Å以上である。
【０１２１】
このようにしたビオチン化担体に、ビオチン結合タンパク質を接触させることにより、ビオチン結合タンパク質を結合させた担体を作製し、さらにこれにビオチン化した特異的結合物質を接触させることによって、特異的結合物質を担体に固定化することができる。
【０１２２】
Ｃ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合タンパク質と被検物質に対する特異的結合物質との融合タンパク質を結合させる方法
本発明においては、特異的結合物質（タンパク質）とビオチン結合タンパク質との融合タンパク質（以下、「ビオチン結合タンパク質融合タンパク質」、又は「融合タンパク質」と呼称する場合がある。）をビオチン化担体に固定してもよい。
【０１２３】
ビオチン化担体は、態様Ｃ）においても、上述の態様Ｂ）と同様の方法で準備することができる。
【０１２４】
ビオチン結合タンパク質融合タンパク質の準備の方法としては、特に限定されず、例えば公知の遺伝子工学的手法を用いて発現させてもよい。例えば、ビオチン結合タンパク質と所望のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌等の発現システムを用いて発現することによって取得することができる。なお大腸菌で高発現させるにはタマビジンやその変異体が好適である。
【０１２５】
ビオチン結合タンパク質融合タンパク質において、ビオチン結合タンパク質と所望の特異的結合物質は直接結合していてもよく、あるいはリンカーを介して結合していてもよいが、アミノ酸のリンカーを介した結合が好ましい。このリンカーの長さは、少なくとも１アミノ酸以上であればよいが、好ましくは５アミノ酸以上、さらに好ましくは６アミノ酸以上である。また、担体と結合しているビオチンとタマビジンとの結合力を一層向上させるためには、好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１２アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、１８アミノ酸以上、更に好ましくは２５アミノ酸以上である。また、このようなリンカーはタマビジン融合タンパク質の活性をも向上させると推測される。このリンカーを構成するアミノ酸は特に限定されないが、好ましくは、グリシン、セリン、あるいはアラニンのような中性アミノ酸の繰り返しからなる。例えば、これらに限定されないが、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧ、ＧＡＳＡＧ、ＧＳＧＡＡ、ＧＳＧＳＡ、ＧＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＡＡＡＡＧＳＧＡＡ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５−２５）などが挙げられる。
【０１２６】
またビオチン結合タンパク質は、所望のタンパク質のＮ末端側、もしくはＣ末端側のどちらに結合させても良い。また所望のタンパク質を発現させるにあたり、例えば大腸菌の細胞質よりもペリプラズム空間の方が適する場合には、ペリプラズムに標的するためのリーダー配列を用いても良い。このようなリーダー配列として、ＰｅｌＢ（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：  ４３７９−４３８３）やＯｍｐＡ（Ｇｅｎｔｒｙ−Ｗｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４：  ７７２９−７７４２）等があるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
ビオチン結合タンパク質融合タンパク質が可溶性画分から得られる場合は、粗タンパク抽出液を精製することなく、ビオチン化担体と接触させ、融合タンパク質をビオチン化担体に結合させてもよい。これをその後十分に洗浄することで、融合タンパク質の精製と担体への固定化が一度でできる。あるいはイミノビオチン等（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：  ４６６６−４６６８）のビオチン類縁体の結合したカラムを用いて精製してから、ビオチン化担体に結合させることもできる。
【０１２８】
あるいはまた、ビオチン結合タンパク質融合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に、さらに精製用のタグを付加しても良い。このようなタグとして例えば、ｃ−ｍｙｃエピトープタグ（Ｍｕｎｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅｌｈａｍ  （１９８６）  Ｃｅｌｌ  ４６：  ２９１−３００）やヒスチジンタグ（Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  ６：  １３２１−１３２５、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：  ７２１１−７２１５）、Ｈａｌｏタグ（Ｌｏｓ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ  （２００７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５６：  １９５−２０８）、Ｆｌａｇタグ（Ｅｉｎｈａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ  （２００１）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：  ４５５−４６５）等があり、あるいはそれらの組合せも考えられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
融合タンパク質が不溶性画分から得られる場合は、例えば尿素や塩酸グアニジンのようなカオトロピック塩を用いて、一度タンパク質を可溶化し、その後透析等を用いて、カオトロピック塩を徐々に抜きながら、タンパク質のリフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を促す、公知の方法が取られる（Ｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  １３７８−１３８１、Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：  １５３４−１５３８）。
【０１３０】
あるいはまた、所望のタンパク質が大腸菌内で不溶性画分に発現する場合、例えば、マルトース結合タンパク質（Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１２：  ７９−９３）や、チオレドキシン（Ｊｕｒａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５７：  ４９−６１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｔｕｄｙｋａ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ  （１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：  ２１８０−２１８７）、あるいはＩｄｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４：  ９９−１０５に記載されているようなシャペロン類を共発現させるか、もしくは融合タンパク質にさらにシャペロンを融合させた３連融合タンパク質を作製してもよい。なお、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、グルタチオンＳトランスフェラーゼは精製用のタグとしても利用できる。
【０１３１】
融合タンパク質の発現システムとして、昆虫細胞や植物細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、枯草菌細胞、無細胞発現系など、他の公知の発現系で発現させてもよい。特に融合相手のタンパク質が植物細胞で発現する場合（例えば植物レクチンなど）は、当該融合タンパク質も植物細胞の発現系で発現させることが好ましい。当業者は、融合相手のタンパク質の性質を考慮し適切な発現系を選択することが可能である。
【０１３２】
以上のようにしてビオチン結合タンパク質融合タンパク質を作製した後、これをビオチン化担体と接触させることにより、アビジン−ビオチン結合を介して担体にタンパク質を結合させることができる。
【０１３３】
Ａ）−Ｃ）のいずれの態様においても、被検物質（を含む生物学的試料）と被検物質に対する特異的結合物質との結合は、被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させる前、同時、後のいずれの時期に行ってもよい。また、ビオチン結合タンパク質の単量体と生物学的試料との接触の時期も限定されない。
【０１３４】
ｖ）ビオチン結合タンパク質の単量体
本発明者らは、生物学的試料中の物質を検出する工程において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させることにより、非特異的検出が抑制されることを見出し、本発明を想到した。
【０１３５】
よって、本発明の抑制方法は、その一態様において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させる、ことを含む。
【０１３６】
ビオチン結合タンパク質の単量体と生物学的試料とを接触させる時期は、通常、被検物質に対する特異的結合物質を被検物質と結合させる、前、同時、後のいずれでもよいが、通常は、前、あるいは、同時である。
【０１３７】
「ビオチン結合タンパク質の単量体」の詳細については、「ＩＩＩ．ビオチン結合タンパク質の単量体」の項目において詳述する。
【０１３８】
ｖｉ）特異的結合物質が結合した担体を利用した被検物質の検出
本発明の「生物学的試料中の物質を検出する工程」は、担体に結合した被検物質に対する特異的結合物質、に結合した披検物質を検出する。検出工程の態様の例について以下に説明する。
【０１３９】
特異的結合物質及び／又は被検物質がタンパク質の場合、被検物質を検出する工程は、所望のタンパク質の性質に基づき、当業者が適切に選択できる。好ましいものとして、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を含む）や放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）などのイムノアッセイ法が挙げられる。特異的結合物質もしくは被検物質が核酸の場合、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法が、特異的結合物質もしくは被検物質がタンパク質もしくは低分子化合物の場合、表面プラズモン共鳴法などのようなアッセイ法が挙げられる。アビジン−ビオチン結合を用いて固相化された、被検物質と特異的に結合・相互作用する物質に対し、被検試料を反応させた後、当該被検物質を検出する。あるいは被検物質と、被検物質と特異的に結合・相互作用する物質をビオチン化したものを、まず反応させた後に、その複合体を、ビオチン結合タンパク質を固定化した担体と接触させ、その後当該被検物質を検出する。
【０１４０】
イムノアッセイにおいて、例えば測定すべき物質が抗体の場合、抗原を固相化し、被検試料中に存在する抗体を抗原と反応させ、当業者に周知の方法で検出される。例えば被検試料がヒト由来の場合、抗原に結合したヒト抗体を、抗ヒト抗体を用いて検出する。この際、この抗ヒト抗体は、蛍光や酵素、あるいは放射性同位元素で標識しておくことで、最終的に蛍光量や酵素活性、あるいは放射性量を測定することで、間接的に抗体の量を測定、定量する。また測定すべき物質が抗原の場合、その抗原のある部分（エピトープ）に対する抗体を固相化し、被検試料中に存在する抗原と反応させた後、さらにその抗原の別のエピトープに対する抗体を反応させる。この別のエピトープに対する二次抗体を上記のように標識しておけば、間接的に抗原の量を測定することが出来る。あるいはまた、核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、測定すべき核酸と相補的な配列領域を有する数十から数百、あるいは数千塩基の核酸をアビジン−ビオチン結合を用いて固相化しておく。ここへ予め蛍光や放射性同位元素で標識した核酸を含む被検試料を反応させ、蛍光量や放射性量を測定する。
【０１４１】
上記標識は当業者に周知の方法で行えばよく、また市販の、蛍光や酵素標識された抗ヒト抗体等を用いてもよい。蛍光標識としては例えばフルオレセインおよびローダミンなどによる標識や、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質による標識も考えられる。酵素標識としてはペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ、あるいはルシフェラーゼやグルコースオキシダーゼ等が利用され得るがこれらに限定されない。これらの酵素による測定のための基質は市販されており、例えばペルオキシダーゼの場合、ＴＢＡやケミルミネッセンス用の基質を用いることが出来る。また、放射性同位元素として例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、およびトリチウム（３Ｈ）、核酸の場合はリン（３２Ｐ）などが挙げられる。
【０１４２】
生物学的試料（サンプル）中に存在する抗原や抗体の量は、例えば、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物（例えば臨床検体の場合、健常者の標準試料若しくは典型的な患者の標準試料）中に存在する量との比較によって簡易に算出され得る。抗原や抗体を検出するためのこのようなアッセイ法は、例えば、ＥＬＩＳＡについて、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １１：  １９−３０  （１９８８）  に記載されている。
【０１４３】
また、特異的結合物質もしくは被検物質が核酸の場合、被検物質を検出する工程は、所望の核酸の種類に基づき、当業者が適切に選択できる。好ましいものの例として、サザンハイブリダイゼーションもしくはノーザンハイブリダイゼーションなどの手法を用いることができる。あるいはまた、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法やＦＩＳＨ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）を用いることが出来るが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
ＩＩ．生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制するための剤
本発明者らは、生物学的試料中の物質を検出する工程において、ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を、生物学的試料と接触させることにより、非特異的結合が抑制されることを見出し、本発明を想到した。
【０１４５】
よって、本発明はその一態様において、
ビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を含む、生物学的試料中の物質を検出する工程において非特異的結合を抑制するための剤であって、
前記検出工程は、被検物質と被検物質に対する特異的結合物質とを結合させる前、あるいは結合させた後に、ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させることを利用するものである、
前記剤
を提供する。
【０１４６】
本発明者らは、生物学的試料中の物質を検出する工程において、特異的結合物質の固定化に用いたビオチン結合タンパク質の四量体を、試料に添加しても、非特異結合が低減しない血清の存在に気がついた。そしてこのような血清における非特異結合を低下させるべく鋭意検討を行った結果、当該タンパク質の単量体を用いることにより、非特異結合を低減させることができることを見出した。
【０１４７】
さらに、本発明者らは検討を続け、このような単量体が、「ビオチンが結合したビオチン結合タンパク質」に結合する物質と結合することを見出した（実施例５）。このことから、限定されるわけではないが、ビオチン結合タンパク質の単量体による非特異的結合抑制の機構について、以下のように考察した。ビオチンがビオチン結合タンパク質に結合した際に、ビオチン結合タンパク質に生じる特異的な構造変化により、通常のビオチン結合タンパク質が持たないエピトープが表面に現れる。ここに試料中の何らかの成分が非特異的に結合してバックグラウンドシグナルが生じる。ビオチン結合タンパク質の単量体は、このような成分を吸着するため、非特異結合を抑制できるのではないか、と推測される。
【０１４８】
本発明の非特異結合抑制剤は、ビオチン結合タンパク質の単量体を含む。限定されるわけではないが、好ましくは、単量体が由来するビオチン結合タンパク質は、被検物質に対する特異的結合物質を担体に結合させるためのビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を構成するビオチン結合タンパク質と同種である。例えば、特異的結合物質を、タマビジンにより担体に固定した場合は、非特異結合抑制剤としてタマビジン単量体を、ストレプトアビジンにより固定した場合は、ストレプトアビジン単量体を、それぞれ含むことが好ましい。
【０１４９】
但し、このようなビオチン結合タンパク質の単量体は、特異的結合物質を担体に固定したビオチン結合タンパク質と完全に同じアミノ酸配列を有する必要はなく、特異的結合物質を担体に固定したビオチン結合タンパク質の変異体を構成する単量体であってもよい。例えば、特異的結合物質を、野生型タマビジンにより固定した場合に非特異結合抑制剤とする単量体は、野生型タマビジンの単量体に限定されず、タマビジン変異体の単量体であってもよい。また、本発明において、非特異結合抑制機能を有するビオチン結合タンパク質単量体の作製の材料として利用するビオチン結合タンパク質四量体については、ビオチン結合能を有するものであっても、ビオチン結合能を有するものでなくてもよい。
【０１５０】
本発明の非特異抑制剤に含まれるビオチン結合タンパク質単量体の濃度には、特段の制限はなく、試料に応じて適切に設定することができる。また、本発明の非特異抑制剤には、ビオチン結合タンパク質単量体の他、ビオチン結合タンパク質単量体を可溶させる適当な緩衝液、あるいは界面活性剤を含んでよい。また、組換えビオチン結合タンパク質産生に使用した細菌成分などを含んでもよく、他の非特異結合抑制剤を含んでもよい。
【０１５１】
また、このようなビオチン結合タンパク質単量体は、可溶性形態に限定されず、固相上に、好ましくは膜、マイクロタイタープレート、微小試薬容器または微小ビーズ上に固定化してもよい。被検物質を含む生物学的試料を、このようなビオチン結合タンパク質単量体が固定化された固相と接触させることにより、非特異結合を抑制することができる。従って、このようなものも、非特異結合抑制剤の一態様である。
【０１５２】
例えば、生物学的試料を先ず、ビオチン結合タンパク質単量体を結合したカラムに通して、生物学的試料中の非特異的結合物質を吸着させ、カラムに通した後の試料を被検物質に対する特異的結合物質と接触させてもよい。
【０１５３】
「ビオチン結合タンパク質の単量体」の詳細については、「ＩＩＩ．ビオチン結合タンパク質の単量体」の項目において詳述する。
【０１５４】
ＩＩＩ．ビオチン結合タンパク質の単量体
ｉ）本発明の単量体の性質
本発明は、非特異結合抑制剤として使用できるビオチン結合タンパク質の単量体を提供する。本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、ビオチン結合能を実質的に有さない。
【０１５５】
本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、限定されるわけではないが、好ましくは、分子量が５ないし２０ｋＤａである。限定されるわけではないが、本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、好ましくは凝集しない。
【０１５６】
本発明の方法は、「ビオチン結合タンパク質の単量体」を生物学的試料に接触させ、被検物質に対する特異的結合物質を予めアビジン−ビオチン結合により固定化した担体に反応させる態様を含む。このとき単量体が強いビオチン結合能を有していると、特異的結合物質を固定化しているビオチン結合タンパク質とビオチンとの間の結合において、ビオチン結合タンパク質が単量体と置換されてしまう可能性がある。
【０１５７】
また、本発明の方法は、まずビオチン結合タンパク質の単量体を試料に添加し、次に、ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質と試料とを反応させ、その後、ビオチン結合タンパク質を固定化させた担体と反応させる態様も含む。この場合、単量体にビオチン結合活性があると、ビオチン化した特異的結合物質と反応してしまい、ビオチン化特異的結合物質が、ビオチン結合タンパク質固定化担体と反応しなくなる可能性が高くなる。
【０１５８】
従って、本発明の単量体は、ビオチン結合能が低いことが好ましく、より好ましくは、ビオチン結合能を実質的に有さない。本発明前に、四量体を構成する野生型のビオチン結合タンパク質のアミノ酸配列に変異を導入して単量体化させたものが知られていた。しかし、このような単量体タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ使用する目的で作製されたものであり、ビオチン結合能はいずれも、１０−９（Ｍ）〜１０−６（Ｍ）程度であった。本発明において、「ビオチン結合能を実質的に有さない」とは、これらよりもビオチン結合能が低いことを意味する。限定されるわけではないが、ビオチンとの解離定数（ＫＤ）が１０−５Ｍ以上であり、好ましくは１０−４Ｍ以上、さらに好ましくは１０−３Ｍ以上、さらに好ましくは１０−２Ｍ以上である。
【０１５９】
本発明のビオチン結合タンパク質の単量体の分子量は、特に限定されないが、２５ｋＤａ以下、好ましくは５ｋＤａから２０ｋＤａ、より好ましくは１０ｋＤａから２０ｋＤａである。
【０１６０】
さらに、本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、界面活性剤の非存在下であってもあるいは冷蔵条件（２〜１０℃）においても凝集しないことが好ましい。なお、「凝集」とは変性したタンパク質同士が多数寄り集まる現象やその構造を意味する。
【０１６１】
本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、好ましくは、上述した性質の全てを有する。即ち、本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、一態様において、下記のｉ）−ｉｉｉ）の性質を有する。
ｉ）実質的にビオチン結合能を有さない:
ｉｉ）分子量が、５ないし２０ｋＤａである；及び
ｉｉｉ）凝集しない。
【０１６２】
また、本発明のビオチン結合タンパク質の単量体は、再会合して四量体に戻らないことが好ましい。すなわち、不可逆型単量体が好ましい。なお、会合とはタンパク質分子同士の結合（例えばサブユニットの会合等）を意味する。
【０１６３】
本発明の単量体は、一態様において、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン１、タマビジン２などのビオチン結合タンパク質又はその変異体の単量体であり、ビオチン結合能が低く、かつ、再会合して四量体に戻らない性質を有し、かつ、冷蔵条件（２−１０℃）もしくは常温（２０−３０℃）で凝集しない。
【０１６４】
本発明の単量体の作製方法は特に限定されないが、上記の、四量体を構成するビオチン結合タンパク質を、加熱処理、薬剤処理することにより作製することができる。あるいは、四量体を構成する野生型のビオチン結合タンパク質のアミノ酸配列に改変を施すことにより、単量体化したものを用いることもできる。
【０１６５】
本発明の単量体は、一態様において、以下のいずれかの群：
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
ｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列；
ｖ）上記配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列；
ｖｉ）上記配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；
ｖｉｉ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列；
ｖｉｉｉ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列；
ｉｘ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列；並びに
ｘ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加」、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加」、「％同一」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の意義は、タマビジンについて上述した通りである。
【０１６７】
本発明の単量体を作製するための材料となる、二量体又は四量体を構成するビオチン結合タンパク質としては、限定されるわけではないが、本明細書の「Ｉii）ビオチン結合タンパク質」に記載された種々のビオチン結合タンパク質およびその変異体を好適に使用することができる。なお、本明細書「Ｉii）ビオチン結合タンパク質」に記載のタンパク質は、ビオチン結合能を有していることが好ましいが、本発明の単量体を作製するための材料となる、二量体又は四量体を構成するビオチン結合タンパク質は、必ずしもビオチン結合能を有していなくてもよい。例えば、野生型のビオチン結合タンパク質にアミノ酸変異を導入して、ビオチン結合能を欠失させたタンパク質であっても、本発明の単量体を作製するための材料として使用することができる。
【０１６８】
ｉｉ）加熱処理による単量体の作製
本発明においては、特に加熱処理による単量体作製方法を好ましく利用することができる。本発明者らは、驚くべきことに、タマビジンやストレプトアビジンに９９．９℃以上の高温処理を行っても、すべてが凝集してしまうことなく、単量体が生成することを見出した。このようにして生成した単量体は、ビオチン結合能を失っているとともに、１〜３ヶ月を経過しても、再会合して四量体に戻ることはなかった。
【０１６９】
すなわち、本発明の単量体は、二量体又は四量体を構成するビオチン結合タンパク質を材料として、これを加熱処理することにより、得ることができる。加熱処理を行う材料として用いる二量体又は四量体ビオチン結合タンパク質は、野生型であっても変異体であってもよい。また、変異体は、これが由来する野生型が二量体又は四量体を構成するビオチン結合タンパク質であれば、変異体自体の四次構造やビオチン結合能の有無・高低を問わない。
【０１７０】
単量体を精製する材料となるビオチン結合タンパク質として、タマビジンやストレプトアビジンを用いる場合、例えばビオチン結合タンパク質の濃度が０．０５ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍＬの溶液を、１２０℃、１５分で加熱処理し得られた可溶性画分から、単量体を得ることができる。なお、このようにして得られた可溶性画分を非特異抑制剤として用いる場合、これに四量体が含まれないことが重要であるが、少量の二量体が含まれていても、その使用に支障はない。
【０１７１】
また、本発明者らは、野生型のタマビジン２のアミノ酸配列（配列番号２）において１１５番目のアスパラギン残基をシステインに置換することにより、９９．９℃で３２分間加熱しても、ビオチン結合活性を維持する、耐熱性タマビジンＮ１１５Ｃ（配列番号１０）を見出している（ＷＯ２０１２/０９１１１０）。このような耐熱性タマビジンを加熱処理する場合の、処理温度は、野生型タマビジンやその他の変異体よりも高く設定してもよい。
【０１７２】
なお、処理の温度を１００℃以上にする場合、適切に圧力を調整する必要があるが、そのために、例えばオートクレーブ装置を好ましく使用することができる。また、ビオチン結合タンパク質は精製されていない場合、前もって粗精製してもよい。例えば、大腸菌で発現させたタマビジン２を８０℃加熱処理により粗精製したものを、上記加熱処理に供してもよい。
【０１７３】
ｉｉ）薬剤処理による単量体の作製
本発明においては、薬剤処理による単量体作製方法も利用することができる。
【０１７４】
ｉｉｉ）アミノ酸配列の改変による単量体の作製
また、本発明においては、四量体を構成する野生型のビオチン結合タンパク質のアミノ酸配列に改変を施し（改変体）、単量体化させたものを用いることもできる。
【０１７５】
例えばアビジン、ストレプトアビジン、タマビジンについては、それらのタンパク質のサブユニット同士の接点に関与するアミノ酸が知られており、これらの箇所に変異導入し、ビオチンへの親和性の低い単量体タンパク質が作製されている（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５−２３２３１、ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１５３０）。また、例えばストレプトアビジンについては、ビオチンとの相互作用に関与するアミノ酸に変異導入し、ビオチンへの親和性の低い単量体ストレプトアビジンが作製されている（例えば、Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６４２２−４６４２８）。
【０１７６】
しかし、このような単量体タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー等の可逆的な結合を必要とする技術分野へ使用する目的で作製されたものであり、ビオチン結合能はいずれも、１０−９（Ｍ）〜１０−６（Ｍ）程度であった（例えば、Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６４２２−４６４２８）。
【０１７７】
これに対し、本発明における単量体のビオチン結合能は低いことが好ましく、結合定数は上記のとおり、１０−５Ｍ以上、好ましくは１０−４Ｍ以上、さらに好ましくは１０−３Ｍ以上、さらに好ましくは１０−２Ｍ以上であり、ビオチンに結合しないことが最も好ましい。
【０１７８】
このような単量体は、サブユニット同士の会合に関与するアミノ酸（例えば、Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：８２１９−８２２４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ２３２２５−２３２３１、ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１５３０）、および／又は、ビオチンとの相互作用に関与するアミノ酸（例えば、Ｌｉｖｎａｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５０７６−５０８０、Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６４２２−４６４２８、Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７６：  １３８３−１３９７）のうち、複数のアミノ酸残基に変異を導入することにより作製することができる。
【０１７９】
なお、当業者は、本願明細書の開示に基づき、上記の改変体の単量体タンパク質を、容易に作製することができる。例えば、変異体及び改変体の作製は、タンパク質のアミノ酸配列に変異を施すための公知の方法によって、行うことができる。
【０１８０】
単量体（変異体及び改変体を含む）のビオチン結合能は、例えば、「ビオチン−ビオチン結合タンパク質間結合を介して被検物質に対する特異的結合物質を結合させた担体」の「ｉｉ）ビオチン結合タンパク質」の項目に記載した方法によって調べることができる。さらに、単量体の分子量、凝集するか否かの性質についても、本願明細書の記載及び／又は周知の技術に基づいて確認することが可能である。
【０１８１】
本発明はまた、上述した加熱処理、薬剤処理あるいはアミノ酸配列の改変によって製造されたビオチン結合タンパク質の単量体であって、ビオチン結合能を実質的に有さない単量体に関する。限定されるわけではないが、加熱処理することによって製造されるビオチン結合タンパク質の単量体が好ましい。限定されるわけではないが、加熱処理の温度は９０℃以上１４０℃以下、好ましくは１００℃以上１３０℃以下、より好ましくは１１０℃以上１３０℃以下であり、最も好ましくは１２０℃である。また、加熱処理の時間は、限定されるわけではないが、好ましくは１分以上１２０分以下であり、選んだ処理温度に応じて当業者は適宜選択可能である。限定されるわけではないが、加熱処理の温度が高いほど、処理時間は短い時間で足りる。
【０１８２】
また、加熱処理に供するビオチン結合タンパク質の濃度は、限定されるわけではないが、０．０１ｍｇ〜５ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬである。適切な濃度は、使用する希釈液などの条件に応じて異なり得る。当業者は本願明細書の開示に基づいて適切な濃度を適宜採用しうる。
【０１８３】
一態様として、タマビジン又はストレプトアビジンを、１２０℃、１５分加熱処理することによって得られるビオチン結合タンパク質の単量体が含まれる。あるいは、野生型のタマビジン２のアミノ酸配列（配列番号２）において１１５番目のアスパラギン残基をシステインに置換されているビオチン結合タンパク質を、１２０℃で１５分加熱処理することによって、得られるビオチン結合タンパク質の単量体であってもよい。
【０１８４】
本発明はさらに、本発明のビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体の、生物学的試料中の物質を検出する工程において非特異的結合を抑制するための、使用も提供する。
【０１８５】
ＩＶ．キット
本発明はさらに、生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明のビオチン結合能を実質的に有さないビオチン結合タンパク質の単量体を含む非特異結合抑制剤、を含むことを特徴とする。
本発明のキットは、一態様において、
ビオチン結合タンパク質を利用して、被検物質に対する特異的結合物質を結合させた担体；並びに、
ビオチン結合タンパク質の単量体を含む非特異結合抑制剤
を含む。
【０１８６】
あるいは本発明のキットは、別の一態様において、
ビオチン化した、被検物質に対する特異的結合物質；
ビオチン結合タンパク質が結合した担体；並びに、
ビオチン結合タンパク質の単量体を含む非特異結合抑制剤；
を含む。
【０１８７】
あるいは本発明のキットは、さらに別の一態様において、
ビオチン結合タンパク質と被検物質に対する特異的結合物質との融合タンパク質と；
ビオチンが結合した担体；並びに、
ビオチン結合タンパク質の単量体を含む非特異結合抑制剤；
を含む。
【実施例】
【０１８８】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１８９】
実施例１  ビオチン結合タンパク質の単量体の調製
タマビジン２（ＴＭ２）およびその変異体ＴＭ２  Ｎ１１５Ｃを用いて、これらの単量体を調製した。なおＴＭ２  Ｎ１１５Ｃは、本発明者らが開発した、タマビジン２の１１５番目のアスパラギン（Ｎ１１５）をシステイン（Ｃｙｓ）に変えた変異体タマビジンであり、９９．９℃で３０分間処理後でも、ほぼ完全にビオチン結合活性を保持する耐熱性タマビジンである（ＷＯ２０１２/０９１１１０。本明細書において、そのすべてを援用する）。【０１９０】
タマビジン２（ＴＭ２）もしくはＴＭ２  Ｎ１１５Ｃの遺伝子が組み込まれた大腸菌発現ベクター（ｐＴｒｃ９９Ａ）を形質転換した大腸菌ＢＬ２１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＬＢ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｍｅｒｋ社製）に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。菌体を遠心で回収し、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後に遠心し、その上清の総可溶性タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量し、１０ｍｇ／ｍｌとなるよう希釈した溶液を調製した。この時、ＴＭ２とＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの濃度は共に約２．５ｍｇ／ｍｌであり、３００ｍＬの培養液からＴＭ２で２５ｍｇ、ＴＭ２  Ｎ１１５Ｃで２８ｍｇのタンパク質が得られた。【０１９１】
ｉ）８０℃加熱処理によるビオチン結合タンパク質の粗精製
ＴＭ２もしくはＴＭ２−Ｎ１１５Ｃを１〜２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、１０ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌの濃度の総可溶性タンパク質画分を１０ｍＬずつ８０℃で３０分間加熱した。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパク質を等量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，２００ｍＭ  ＤＴＴ，２％  ＳＤＳ，２０％  グリセロール）に懸濁し、９９℃で１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質バンドはＣＢＢ染色によって検出した。Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて定量マーカー（ＬＭＷ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ  ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ；  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をもとに検量線を作成し、タンパク質バンドを定量化した。【０１９２】
その結果、８０℃加熱処理画分に含まれるＴＭ２もしくはＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの濃度は共に約１．６ｍｇ／ｍｌであった。【０１９３】
ｉｉ）加熱処理によるビオチン結合タンパク質の単量体化の検討
ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃを発現した大腸菌の総可溶性タンパク質画分、そこから８０℃で熱処理し粗精製した画分、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃのイミノビオチンアフィニティーカラム精製画分を、それぞれ１．６、０．８、０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１ｍｇのＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ  タンパク質／ｍＬ（２０ｍＭ  Ｋｐｉ  ｐＨ７．５）となるよう希釈し、１２０℃で１５分間加熱処理した。その後溶液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。回収した溶液を前述の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥし、溶液に含まれるビオチン結合タンパク質のバンドを定量化した。【０１９４】
その結果、大腸菌総可溶性タンパク質画分と８０℃加熱処理粗精製画分では、０．０２５ｍｇ〜０．２５ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬの濃度で、四量体をほとんど含まない単量体画分が得られた。また、アフィニティーカラム精製画分では、０．０１ｍｇ〜０．５ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬの濃度で、四量体をほとんど含まない単量体画分が得られた。また、大腸菌総可溶性タンパク質画分と８０℃加熱処理粗精製画分、アフィニティーカラム精製画分全てにおいて、０．０５〜０．１ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬの濃度で、１２０℃で１５分間加熱処理した場合に、最も多くのビオチン結合タンパク質が上清に存在していた。なお、大腸菌総可溶性タンパク質画分を直接１２０℃加熱処理した場合、ビオチン結合タンパク質以外の大腸菌由来タンパク質の少量の混入が見られた。【０１９５】
さらに、ＴＭ２およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃを用いて加熱温度及び加熱時間を詳細に検討した。具体的には、ＴＭ２およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの８０℃加熱処理粗精製画分の０．１ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬ溶液を、９０、９９．９、１０５、１１０、１２０、１３０℃でそれぞれ０、５、１０、１５、３０、６０分間加熱処理した後に、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。回収した溶液を、ＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴは無添加）と混和し、加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色した。【０１９６】
ｉｉｉ）加熱処理によるビオチン結合タンパク質単量体の調製
ＴＭ２又はＴＭ２−Ｎ１１５Ｃを発現した大腸菌の総可溶性タンパク質画分を８０℃で熱処理し粗精製した画分（８０℃加熱処理粗精製画分）の０．１ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬ溶液を１２０℃で１５分間加熱処理後、室温に冷却した。溶液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパク質を回収した。一方、ストレプトアビジン精製品（Ｓｉｇｍａ）（濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ）を１２０℃で１５分間加熱処理後、室温に戻してから遠心し、上清の可溶性タンパク質を回収した。こうして回収した加熱処理可溶性画分を、ＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴ＋）と混和し９９℃で１０分処理した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色し、デンシトメーターを用いて定量した（図１）。その結果、１２０℃加熱前と比べた加熱後の可溶性タンパク質の量は、ＴＭ２とＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ共に７０％であり、ストレプトアビジンは約１００％であった。【０１９７】
また、回収した加熱処理可溶性画分を、ＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴ無添加）と混和後、加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色した。この条件では、還元剤を用いず、かつ熱処理を行っていないため、四量体を形成しているビオチン結合タンパク質は、四量体として検出される。図２に示すように、１２０℃加熱処理を行うことで、ＴＭ２、ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ、ストレプトアビジンは、四量体は検出されず、ほぼ完全に単量体になることが明らかとなった。【０１９８】
実施例２  加熱処理で得られたビオチン結合タンパク質単量体のビオチン結合活性
ビオチン化ＨＲＰ結合試験
実施例１のｉｉｉで得られた、１２０℃で加熱処理した単量体化ビオチン結合タンパク質のビオチン結合活性を測定するため、ビオチン化ＨＲＰ結合試験を行った。上記の１２０℃加熱処理前後の可溶性画分を、ＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴ−）と混和後ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し（熱処理なし）、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン、ミリポア社）にブロッティングした。ブロッティング後のメンブレンは３％  ＢＳＡ／ＴＢＳで一晩ブロッキングした後に、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＨＲＰ（ＶＥＣＴＯＲ社製）と反応させ、洗浄後ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア社製）で検出した。【０１９９】
その結果、１２０℃加熱処理後のビオチン結合タンパク質はほぼ完全にビオチン結合能を失っている事が示された（図３）。【０２００】
実施例３  加熱処理によるビオチン結合タンパク質単量体の大量調製
実施例２に続いて、単量体化した各ビオチン結合タンパク質を大量調製するため、ＴＭ２およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの８０℃加熱処理粗精製画分の０．１ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍＬ溶液８００ｍＬを１２０℃で１５分間加熱処理後、室温に冷却した。溶液に含まれる変性タンパク質を除去するため０．４５μｍのフィルターで濾過後、可溶性タンパク質を濃縮するため７０％硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩混和した。硫酸アンモニウム添加溶液を１４，５００ｒｐｍ（２５，０００ｇ）で１０分間遠心後、得られた沈殿物を２５ｍＬの２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ  ７．５）に溶解し、２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ  ７．５）に対して透析した。透析後の溶液は１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパクを回収後、沈殿物を完全に除去するため再度０．４５μｍのフィルターで濾過し、０．０１％となるようアジ化ナトリウムを添加した。【０２０１】
本サンプルを以下の実験に供試した。【０２０２】
実施例４  不活性型ビオチン結合タンパク質単量体の血清非特異結合抑制効果
ｉ）ビオチン固定化磁性ビーズの作製
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ（Ｄｙｎａｌ社製）に１０ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社）を添加し、室温で３０分間転倒混和することでアミノ基とＮＨＳ活性エステル基を反応させ共有結合させた。その後、磁性ビーズを０．１％  ＢＳＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で４回洗浄し、得られた磁性ビーズをビオチン化磁性ビーズとした。【０２０３】
ｉｉ）ＴＭ２固定化磁性ビーズの作製
上記ｉ）で調製したビオチン化磁性ビーズと１ｍｇ／ｍｌ  ＴＭ２溶液を体積比で１：１となるよう添加し、室温で１時間転倒混和することで、ＴＭ２とビオチンとの結合によりＴＭ２を固定化した。その後、０．２％  Ｔｗｅｅｎ１０／ＴＢＳ溶液で４回洗浄し、用いたビオチン化磁性ビーズ量と等量の０．０１％  アジ化ナトリウム／ＰＢＳに懸濁した。【０２０４】
これにより、ビオチンが固定化された磁性ビーズにＴＭ２が結合したＴＭ２固定化磁性ビーズが調製された。【０２０５】
ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ分析
ＴＭ２固定化磁性ビーズに対して非特異的な結合を示すヒト血清（コージンバイオ社  ＃Ｒ１６８３３４）を、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ、もしくは２％  ＢＳＡ／大腸菌（ＢＬ２１株）粗抽出液（５ｍｇ／ｍＬ総可溶性タンパク質）／ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で４００倍希釈した溶液２００μＬに、上記ｉｉ）で調製したＴＭ２固定化磁性ビーズを５μＬ添加し、室温で１時間混和することで、磁性ビーズに固定化されたＴＭ２と血清を反応させた。【０２０６】
この時、非特異結合を抑制するために、実施例３において加熱処理により大量調製した、ビオチン結合タンパク質ＴＭ２の単量体およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの単量体、ならびにイミノビオチンアフィニティで精製したＴＭ２（四量体）を、それぞれ０、０．１、０．２、０．４ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した。磁石（ＤｙｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅ、ベリタス社）で磁性ビーズを回収し、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液で３回洗浄した後、ビーズに固定されたＴＭ２に非特異的に結合したヒトＩｇＧを検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳで５０００倍希釈した溶液を２００μＬずつ添加し、１時間室温で混和した。その後、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液で３回洗浄し、１  ｓｔｅｐ  ＥＬＩＳＡ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（ＰＩＥＲＣＥ社）を１００μＬ添加し、室温で２分間静置した。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ添加することで反応を停止させ、発色度合いをプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社）によって測定した。上記実験は２回反復し、平均と標準偏差を算出した。【０２０７】
その結果、四量体を形成するＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２（アフィニティ精製したもの）の添加は、ＴＭ２固定化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合を多少抑制することができたが、その効果は顕著ではなかった。一方、ＴＭ２固定化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合は、ＴＭ２の単量体もしくはＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの単量体を添加することで大きく抑制することができた（図４）。従って、ＴＭ２単量体ならびにＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ単量体はＴＭ２  四量体の添加により抑制することができなかった、ヒトＩｇＧの非特異結合を顕著に抑制できる事が示された。【０２０８】
なお、本試験で使用したＴＭ２およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの単量体画分は、４℃で１ヶ月保存した後も、単量体は保持され、分解も殆んどなく、さらに非特異抑制効果もほぼ完全に保持しており、保存安定性も高いことが明らかとなった。【０２０９】
実施例５  不活性型ビオチン結合タンパク質単量体の血清非特異結合抑制効果の作用機構の検討
ｉ）加熱処理によるビオチン結合タンパク質単量体の大量調製
不活性型ＴＭ２の非特異抑制効果の原因を検討するため、ＴＭ２の８０℃加熱処理粗精製画分もしくはアフィニティー精製ＴＭ２の０．１ｍｇビオチン結合タンパク質／ｍｌ溶液８００ｍＬを１２０℃で１５分間加熱処理後、室温に冷却した。溶液に含まれる変性タンパク質を除去するために、０．４５μｍのフィルターで濾過後、可溶性タンパク質を濃縮するため７０％硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩混和した。硫酸アンモニウム添加溶液を１４，５００ｒｐｍ（２５，０００ｘｇ）で１０分間遠心後、得られた沈殿物を２５ｍＬの２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ７．５）に溶解し、２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析後の溶液は１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパク質を回収後、沈殿物を完全に除去するため再度０．４５μｍのフィルターで濾過し、０．０１％となるようアジ化ナトリウムを添加した。こうして回収した加熱処理可溶性画分をそれぞれＡＣ−ＴＭ２、  ＡＣ−精製  ＴＭ２とし、ＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴ＋）と混和し９９℃で１０分処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色し、デンシトメーターを用いて定量した。その結果、得られたＡＣ−ＴＭ２、  ＡＣ−精製  ＴＭ２の濃度はそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬであった。また対照として、ＢＬ２１大腸菌抽出液を、８０℃加熱処理により粗精製し、さらにオートクレーブ処理（１２０℃、１５分間）した溶液（ＡＣ−ＢＬ２１）も調製した。【０２１０】
ｉｉ）ビオチン結合ＴＭ２の調製
１ｍｇ／ｍＬ  ＴＭ２（野生型・四量体）溶液６ｍＬ（６ｍｇ相当）には０．４μｍｏｌのビオチンポケットが存在する。その１００倍量である４０μｍｏｌのビオチンを添加し、室温で１時間転倒混和した。その後ビオチン結合ＴＭ２溶液を２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ７．５）に対して透析し、透析後の溶液をＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴ＋）と混和し９９℃で１０分処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色し、デンシトメーターを用いて定量した。【０２１１】
ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ分析
ＴＭ２固定化磁性ビーズに対して非特異的な結合を示すヒト血清（コージンバイオ社＃Ｒ１６８３３４、Ｒ１６８２１６）を、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ、もしくは２％  ＢＳＡ／大腸菌（ＢＬ２１株）粗抽出液（５ｍｇ／ｍＬ総可溶性タンパク質）／ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で４００倍希釈した溶液２００μＬに、実施例４のｉｉ）で作成したＴＭ２固定化磁性ビーズを５μＬ添加し、室温で１時間混和することで、磁性ビーズに固定化されたＴＭ２と血清を反応させた。【０２１２】
この時、非特異結合を抑制するために、上記のように加熱処理により大量調製した８０℃粗精製ＴＭ２の単量体（ＡＣ−ＴＭ２）、アフィニティー精製ＴＭ２の単量体（ＡＣ−精製  ＴＭ２）、ビオチン結合ＴＭ２（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＴＭ２、四量体）、ならびにオートクレーブ処理（１２０℃、１５分間）大腸菌抽出液（ＡＣ−ＢＬ２１）をそれぞれ０、０．１、０．２、０．３ｍｇ／ｍＬとなるよう添加した（ＡＣ−精製  ＴＭ２のみ、０、０．０５、０．１、０．１５ｍｇ／ｍＬ）。また対照として、ＴＭ２を固定化していないビオチン化磁性ビーズを用いて、非特異結合抑制剤としてＡＣ−ＴＭ２を添加した試験区も実施した。【０２１３】
磁石（ＤｙｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅ、ベリタス社）で磁性ビーズを回収し、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液で３回洗浄した後、ビーズに固定化されたＴＭ２に非特異的に結合したヒトＩｇＧを検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで５，０００倍希釈した溶液を２００μＬずつ添加し、１時間室温で混和した。その後、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液で３回洗浄し、１  ｓｔｅｐ  ＥＬＩＳＡ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（ＰＩＥＲＣＥ社）を１００μＬ添加し、室温で約２分間静置した。その後、２Ｍ硫酸を１００μＬ添加することで反応を停止させ、発色度合いをプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社）によって測定した。上記実験は２反復し、平均と標準偏差を算出した。【０２１４】
結果を図５に示す。血清Ｒ１６８３３４を用いた試験の結果、ＴＭ２を固定化していないビオチン化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合は殆ど見られなかったのに対して、ＴＭ２固定化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合が検出された。さらにこの非特異結合は、Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２ではほとんど抑制できない一方で、ＡＣ−ＴＭ２の添加で抑制する事ができた（図５）。従って、ＴＭ２固定化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合は、磁性ビーズの表面や表面に固定化されているビオチンに対する非特異結合ではなく、ＴＭ２に対する非特異結合であり、この非特異結合は四量体を形成するＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２の添加ではあまり抑制できない事が示された。【０２１５】
この結果から、血清＃Ｒ１６８３３４はＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２に対してはほとんど反応しないが、ＴＭ２固定化磁性ビーズのＴＭ２に対して反応する抗体を保持している可能性が考えられた。そこで、ビオチン結合ＴＭ２（四量体）を非特異結合抑制剤として使用した試験区とＮａｔｉｖｅ  ＴＭ２（四量体）を非特異結合抑制剤として使用した試験区を比較したところ、Ｎａｔｉｖｅ  ＴＭ２では抑制できなかった非特異結合をビオチン結合ＴＭ２の添加で抑制することができた（図６）。従って、血清＃Ｒ１６８３３４はビオチンと結合したＴＭ２を認識する抗体を保持していると考えられた。また、ＡＣ−ＴＭ２には、タマビジン２がビオチンと結合する際に特異的に生じる構造が、エピトープとして表面に存在するため、抑制剤として効果があったと考えられた。【０２１６】
さらに、８０℃で粗精製した大腸菌抽出液をオートクレーブ処理（１２０℃、１５分間）したＡＣ−ＴＭ２とアフィニティー精製したＴＭ２をオートクレーブ処理（１２０℃、１５分間）したＡＣ−精製  ＴＭ２を比較したところ、顕著な差は見られなかった。このことから、オートクレーブ処理により調製された不活性型ＴＭ２単量体が、主として効果的に非特異結合を抑制していることが示された（図７）。【０２１７】
一方、血清＃Ｒ１６８２１６における非特異結合抑制剤の効果はＰＢＳの系で、非特異抑制効果はその高い方から順に、ＡＣ−ＴＭ２、ビオチン結合ＴＭ２＝ＮａｔｉｖｅＴＭ２、ＡＣ−精製ＴＭ２」となっていた（図８左）。そして、これらの効果は大腸菌抽出液の系でも同様であった（図８右）。これらの結果から、この血清はＴＭ２とそれに含まれる微量大腸菌成分に反応する検体であり、ＰＢＳ系におけるＡＣ−ＴＭ２とＡＣ−精製ＴＭ２の明らかな効果の差から、ＡＣ−ＴＭ２に含まれる不活性ＴＭ２単量体とさらに含まれる大腸菌成分が非特異抑制効果の源であると考えられた。【０２１８】
実施例６  単量体ビオチン結合タンパク質の保存性試験
ｉ）４℃保存におけるタンパク質の安定性の検討
加熱処理により単量体化させたＴＭ２およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ（Ｎ１１５Ｃ）をそれぞれ０．４ｍｇ  ＴＭ２／ｍＬ  ２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ７．０）となるよう希釈し、４℃で１ヶ月もしくは３ヶ月保存した。その後溶液を等量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８，２００ｍＭ  ＤＴＴ、２％  ＳＤＳ，２０％  グリセロール）と混和し、９９℃で１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。もしくはＤＴＴを含まないＳＤＳサンプルバッファーと混和し、加熱処理をせずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質はＣＢＢ染色によって検出し、分子量はＬＭＷ−ＳＤＳ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて算出した。【０２１９】
その結果、ＴＭ２単量体およびＮ１１５Ｃ単量体は、およそ１０ｋＤａ〜１７ｋＤａの分子量を示した。従って、少なくとも３ヶ月間保存しても分解はほぼ生じていないことが明らかとなった。またＤＴＴを含まず加熱処理もしない試験区において、四量体の位置にバンドが検出されなかったことから、４℃で少なくとも３ヶ月間保存しても、再会合は生じず、単量体を維持することが示された（図９，１０、１１）。【０２２０】
ｉｉ）４℃保存における凝集の検討
加熱処理により単量体化させたＴＭ２およびＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ（Ｎ１１５Ｃ）をそれぞれ０．４ｍｇ  ＴＭ２／ｍＬ  ２０ｍＭ  Ｋｐｉ（ｐＨ７．０）となるよう希釈し、４℃で２週間もしくは３ヶ月保存した。その後溶液を４℃条件下１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。また、沈澱画分には上清と同量の８Ｍ  Ｕｒｅａを含む０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を添加し、混和した。得られた上清と沈澱画分に、等量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，２００ｍＭ  ＤＴＴ，２％  ＳＤＳ，２０％  グリセロール）を添加し、混和した。９９℃で１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質はＣＢＢ染色によって検出した。【０２２１】
その結果、４℃で２週間もしくは３ヶ月間保存した後においても、ＴＭ２単量体およびＮ１１５Ｃ単量体は上清でのみ検出された。従って、ＴＭ２単量体およびＮ１１５Ｃ単量体は、４℃で少なくとも３ヶ月保存しても凝集して析出することなく、緩衝液中に溶解していることが明らかとなった（図１２）。【０２２２】
参考例  ＴＭ２変異体ＴＭ２  Ｎ１１５Ｃ
１．耐熱性向上を志向した改変型タマビジン２の設計
タマビジン２のＮ１１５をシステイン（Ｃｙｓ）に変えた変異体ＴＭ２  Ｎ１１５Ｃを設計した。【０２２３】
２．改変型タマビジン２遺伝子の構築と大腸菌における発現
２−１．遺伝子構築
タマビジン２遺伝子が大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ（ＷＯ０２／０７２８１７）を鋳型としてＰＣＲを行った。使用したプライマーの配列（配列番号１１ないし配列番号１４）を表１に示す。【０２２４】
【表１】
2013018836.tif 000002
【０２２５】
下線は制限酵素サイト、斜体太字は開始および終止コドンを示す。置換したコドンは小文字で示した。【０２２６】
ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃ
ＴＭ２を含むプラスミドＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型にして、Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴＭ２Ｎ１１５Ｃ  ＲＶ、Ｔｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍとＴＭ２Ｎ１１５Ｃ  ＦＷのプライマー組合せで別々にＰＣＲを行った。得られた産物を、低融点アガロースを用いてアガロールゲル電気泳動を行った後、ゲルから精製した。精製した２種のＰＣＲ産物を鋳型にして、Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍの組合せで２回目のＰＣＲ（オーバーラッピングＰＣＲ）を行った。なお、ＰＣＲは、５０μｌ反応液中、プラスミド、１０×ＰｙｒｏＢｅｓｔバッファー（ＴａＫａＲａ社）５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ４μｌ、プライマー各２５ｐｍｏｌｅｓ、ＰｙｒｏＢｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）０．５μｌをそれぞれ含み、９６℃３分を１回、９６℃１分、５５℃１分、７２℃１分を１５回、７２℃６分を１回行った。【０２２７】
得られたＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてプラスミドを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。【０２２８】
目的の変異導入が確認されたクローンを、ＰｃｉＩとＢａｍＨＩで消化した後、低融点アガロースを用いて電気泳動し、精製を行った。大腸菌用発現ベクターは、ｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化し調製した。制限酵素処理したＤＮＡ断片とベクターを、ライゲーションキット（タカラ社）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、コロニーＰＣＲにより挿入遺伝子を含むクローンを決定し、発現実験に用いた。【０２２９】
２−２．大腸菌発現
タマビジン２および上記のように作製したタマビジン２変異体が組み込まれた大腸菌の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地に接種して、３７℃で２時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、発現誘導してさらに５〜６時間培養した。【０２３０】
菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）中に懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後に遠心分離を行い、その上清に２−イミノビオチンアガロース（ＳＩＧＭＡ社）を加え、ＮａＯＨでｐＨ１２に調製した後、室温でインキュベートした。これを、オープンカラムに充填し、カラムの１０倍量の５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）でカラムをよく洗浄した後、カラムの５倍量の５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４）でタンパク質を溶出した。溶出画分を、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で透析したものを以下の解析に用いた。ＴＭ２−Ｎ１１５Ｃは、３００ｍＬの培養液からおよそ１４ｍｇの精製タンパク質が得られた。得られたＴＭ２−Ｎ１１５Ｃの純度は９５％以上であった。
た。【０２３１】
実施例７  不活性型ストレプトアビジン単量体の血清非特異結合抑制効果
ｉ）ビオチン固定化磁性ビーズの作製
実施例４のｉ）と同様の方法で調製した。【０２３２】
ｉｉ）ストレプトアビジン固定化磁性ビーズの作製
上記ｉ）で調製したビオチン化磁性ビーズと１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトアビジン溶液を体積比で１：１となるよう添加し、室温で１時間転倒混和することで、ストレプトアビジンとビオチンとの結合により、ストレプトアビジンを磁性ビーズに固定化した。その後、０．２％  Ｔｗｅｅｎ１０／ＴＢＳ溶液で４回洗浄し、用いたビオチン化磁性ビーズ量と等量の０．０１％  アジ化ナトリウム／ＰＢＳに懸濁した。【０２３３】
これにより、ビオチンが固定化された磁性ビーズにストレプトアビジンが結合したストレプトアビジン固定化磁性ビーズが調製された。【０２３４】
ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡ分析
ストレプトアビジン固定化磁性ビーズに対して非特異的な結合を示すヒト血清（コージンバイオ社  ＃Ｎ１１０２９５）を、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ、もしくは２％  ＢＳＡで１００倍希釈した溶液２００μＬに、ストレプトアビジン固定化磁性ビーズを５μＬ添加し、室温で１時間混和することで、磁性ビーズに固定化されたストレプトアビジンと血清を反応させた。この時、非特異結合を抑制するために、ストレプトアビジンおよび実施例１（ｉｉｉ）記載の加熱処理により調製したストレプトアビジンの単量体を、それぞれ０、０．４ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した。また、磁性ビーズへの非特異結合を測定するための対照として、ビオチン化磁性ビーズを使用する試験区を設けた。【０２３５】
磁石（ＤｙｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅ、ベリタス社）で磁性ビーズを回収し、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液で３回洗浄した後、ビーズに固定されたストレプトアビジンに非特異的に結合したヒトＩｇＧを検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳで１００００倍希釈した溶液を、２００μＬずつ添加し、１時間室温で混和した。その後、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液で３回洗浄し、洗浄液を除去したストレプトアビジン固定化磁性ビーズにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（タカラバイオ社）のＳｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ液を５０μＬ添加し、ストレプトアビジン固定化磁性ビーズを懸濁した。また、プレートリーダーＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ９４１  ｖＴｉのインジェクターにはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（タカラバイオ社）のＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ液をセットした。ストレプトアビジン固定化磁性ビーズ懸濁液をＯｐｔｉｐｌａｔｅ−９６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に移し、プレートリーダーＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ９４１  ｖＴｉにセットした後、ストレプトアビジン固定化磁性ビーズが添加されているウェルにインジェクターでＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ液を５０μＬずつインジェクトし、３０分間の発光量を測定した。上記実験は２反復し、平均と標準偏差を算出した（表２）。【０２３６】
【表２】
2013018836.tif 000003
【０２３７】
さらに測定値から磁性ビーズへの非特異結合の影響を除去するために、ビオチン化磁性ビーズの測定値をストレプトアビジン固定化磁性ビーズの測定値から差し引いた値をストレプトアビジンに結合したヒトＩｇＧ量として採用した（図１３）。【０２３８】
図１３に示した通り、四量体を形成するストレプトアビジンの添加は、ストレプトアビジン固定化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合を多少抑制することができたが、その効果は顕著ではなかった。一方、ストレプトアビジンの単量体を添加した場合、ストレプトアビジン固定化磁性ビーズへのヒトＩｇＧの非特異結合を大きく抑制することができた（図１３）。従って、ストレプトアビジン単量体により、ストレプトアビジン四量体の添加で抑制することができなかったヒトＩｇＧの非特異結合を抑制できることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０２３９】
配列番号１及び２は、各々タマビジン２の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。【０２４０】
配列番号３及び４は、各々タマビジン１の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。【０２４１】
配列番号５及び６は、各々ストレプトアビジンの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。【０２４２】
配列番号７及び８は、各々アビジンの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。【０２４３】
配列番号９及び１０は、各々タマビジン２の変異体ＴＭ２  Ｎ１１５Ｃの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。【０２４４】
配列番号１１−１４は、ＴＭ２  Ｎ１１５Ｃを得るためのＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列を示す。【０２４５】
配列番号１５−２５は、融合タンパク質を作成するために使用しうるリンカーの例のアミノ酸配列を示す。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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