(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９０のアミノ酸配列を有する抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び配列番号９２のアミノ酸配列を有する抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をコード化する単離した核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
抗ヒトプロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシン９型（ｈＰＣＳＫ９）抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを生産する方法であって、該方法が、請求項２に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入し、抗体又はそのフラグメントの産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させ、そのようにして産生した抗体又はフラグメントを回収する工程を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトプロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に特異的に結合するヒト抗体及びヒト抗体の抗原結合フラグメント、並びにそれらの抗体を用いる治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトプロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、分泌型スブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク質コンバターゼである。コード化タンパク質は、小胞体内で自己触媒的分子内プロセシングを受ける可溶性チモーゲンとして合成される。循環からのＬＤＬクリアランスの主要経路である、肝臓内のＬＤＬエンドサイトーシスを媒介するＰＣＳＫ９が、ＬＤＬ受容体の分解を促進することにより血漿ＬＤＬコレステロールを増加させることを示唆する証拠がある。ＰＣＳＫ９タンパク質の構造は、それがシグナル配列を有し、その後にプロドメイン、保存三つ組残基（Ｄ１８６、Ｈ２２６及びＳ３８６）を含む触媒ドメイン、及びＣ末端ドメインが続くことを示す。それは、ＥＲで自己触媒的切断を受け、１４ｋＤａプロドメイン及び６０ｋＤａ触媒フラグメントを生成する、可溶性の７４ｋＤａ前駆体として合成される。自己触媒活性は分泌に必要なことが示されている。切断後、プロドメインは触媒ドメインと強固に会合する状態を維持する。
【０００３】
ＰＣＳＫ９に対する抗体は、例えば、特許文献１、２、３、４、５、及び６に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際特許公開第２００８／０５７４５７号
【特許文献２】国際特許公開第２００８／０５７４５８号
【特許文献３】国際特許公開第２００８／０５７４５９号
【特許文献４】国際特許公開第２００８／０６３３８２号
【特許文献５】国際特許公開第２００８／１２５６２３号
【特許文献６】米国特許出願第２００８／０００８６９７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
第１の態様では、本発明は、ヒトＰＣＳＫ９（ｈＰＣＳＫ９）に特異的に結合してその活性を中和する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及びその抗原結合フラグメントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの実施態様では、本発明は、ｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含み、以下の事項：
（ｉ）血清総コレステロールを投与前レベルと比べて少なくとも約２５〜３５％減少させ、少なくとも２４日の期間に亘ってその減少を維持することができ、好ましくは血清総コレステロールの減少が少なくとも約３０〜４０％であること；
（ii）血清ＬＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて少なくとも約６５〜８０％を減少させ、少なくとも２４日の期間に亘ってその減少を維持することができること；
（iii）血清トリグリセリドを投与前レベルと比べて少なくとも約２５〜４０％を減少させることができること；
（iv）血清ＨＤＬコレステロールを減少させないこと、又は血清ＨＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて僅か５％しか減少させないこと；
の少なくとも１つを特徴とする。
【０００７】
１つの実施態様では、本発明は、ｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含み、以下の事項：
（ｉ）血清ＬＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて少なくとも約４０〜７０％を減少させ、少なくとも６０又は９０日の期間に亘ってその減少を維持することができること；
（ii）血清トリグリセリドを投与前レベルと比べて少なくとも約２５〜４０％を減少させることができること；
（iii）血清ＨＤＬコレステロールを減少させないこと、又は血清ＨＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて僅か５％しか減少させないこと；
の少なくとも１つを特徴とする。
【０００８】
１つの実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基２３８を含むエピトープを結合することを特徴とする。より具体的な実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基２３８、１５３、１５９及び３４３の1つ又はそれ以上を含むエピトープを結合する。より具体的な実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号７５５の１９２、１９４及び／又は２３７の位置において、アミノ酸残基を含まないエピトープを結合することを特徴とする。
【０００９】
１つの実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基３３８を含むエピトープを結合することを特徴とする。より具体的な実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号７５５の１４７、３６６及び３８０位置において1つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むエピトープを結合する。より具体
的な実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号７５５の２１５及び／又は２３８の位置において、アミノ酸残基を含まないエピトープを結合することを特徴とする。
【００１０】
１つの実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、プラズモン表面共鳴によって測定した場合、ｐＨ７．４でのＫDと比べてｐＨ５．５でｈＰＣＳＫ９に対する結合親和性
（ＫD）の増強を示すことを特徴とする。ある特定の実施態様では、本抗体又はそのフラ
グメントは、プラズモン表面共鳴によって測定した場合、中性ｐＨと比べて酸性ｐＨにおいて、ＰＣＳＫ９に対して少なくとも２０倍、少なくとも４０倍又は少なくとも５０倍の親和性増強を示す。
【００１１】
１つの実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、プラズモン表面共鳴によって測定した場合、中性ｐＨと比べて酸性ｐＨにおいて、ＰＣＳＫ９に対して結合親和性増強を示さないことを特徴とする。ある特定の実施態様では、酸性ｐＨにおける結合は、中性ｐＨにおいてより小さく、Ｔ1/2はより短い。
【００１２】
別の実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、ヒト、ヒトＧＯＦ突然変異Ｄ３７４Ｙ、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ラット及びハムスターＰＣＳＫ９を結合する。
【００１３】
１つの実施態様では、本抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト及びサルＰＣＳＫ９を結合するが、マウス、ラット又はハムスターＰＣＳＫ９を結合しない。
【００１４】
本ｍＡｂｓは、完全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であってもよく、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）2又はｓｃＦｖフラグメント）だけを含んで
もよく、そして機能性に影響を与えるために、例えば、残存エフェクター機能を除去するために修飾してもよい（Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933）。
【００１５】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４７４、４７８、４８２、４９８、５０２、５０６、５２２、５２６、５３０、５４６、５５０、５５４、５７０、５７４、５７８、５９４、５９８、６０２、６１８、６２２、６２６、６４２、６４６、６５０、６６６、６７０、６７４、６９０、６９４、６９８、７１４、  ７１８、７２２、７３８及び７４２、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施態様では、ＨＣＶＲは、配列番号５０、６６、７０、７４、９０、９４、１２２、１３８、１４２、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、３１４、３３０及び３３４から成る群から選択されるアミノ酸配列である。より具体的な実施態様では、ＨＣＶＲは、配列番号９０又は２１８を含む。
【００１６】
１つの実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、４５６、４６６、４７６、４８０、４９０、５００、５０４、５１４、５２４、５２８、５３８、５４８、５５２、５６２、５７２、５７６、５８６、５９６、６００、６１０、６２０、６２４、６３４、６４４、６４８、６５８、６６８、６７２、６８２、６９２、６９６、７０６、７１６、７２０、７３０、７４０及び７４４、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を更に含む。 １つの実施態様では、ＬＣＶＲは、配列番号５８、６８、７２、８２、９２、９６、１３０、１４０、１４４、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、３２２、３３２及び３３６から成る群から選択されるアミノ酸配列である。より具体的な実施態様では、ＬＣＶＲは配列番号９２又は２２６を含む。
【００１７】
特定の実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、５０２／５０４、５０６／５１４、５２２／５２４、５２６／５２８、５３０／５３８、５４６／５４８、５５０／５５２、５５４／５６２、５７０／５７２、５７４／５７６、５７８／５８６、５９４／５９６、５９８／６００、６０２／６１０、６１８／６２０、６２２／６２４、６２６／６３４、６４２／６４４、６４６／６４８、６５０／６５８、６６６／６６８、６７０／６７２、６７４／６８２、６９０／６９２、６９４／６９６、６９８／７０６、７１４／７１６、７１８／７２０、７２２／７３０、７３８／７４０及び７４２／７４４から成る群から選択される、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列ペアを含む。１つの実施態様では、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、配列番号５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、３１４／３２２、３３０／３３２及び３３４／３３６のアミノ酸配列ペアから選択される。より具体的な実施態様では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペアは、配列番号９０／９２又は２１８／２２６を含む。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、配列番号８、３２、５６、８０、１０４、１２８、１５２、１７６、２００、２２４、２４８、２７２、２９６、３２０、３４４、３６８、３９２、４１６、４４０、４６４、４８８、５１２、５３６、５６０、５８４、６０８、６３２、６５６、６８０、７０４及び７２８、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号１６、４０、６４、８８、１１２、１３６、１６０、１８４、２０８、２３２、２５６、２８０、３０４、３２８、３５２、３７６、４００、４２４、４４８、４７２、４９６、５２０、５４４、５６８、５９２、６１６、６４０、６６４、６８８、７１２及び７３６、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特色とする。１つの実施態様では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３配列ペアは、配列番号５６／６４、８０／８８、１２８／１３６、２２４／２３２、２４８／２５６又は３２０／３２８である。より具体的な実施態様では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３は配列番号８０／８８又は２２４／２３２を含む。
【００１９】
更なる実施態様では、本発明は、配列番号４、２８、５２、７６、１００、１２４、１４８、１７２、１９６、２２０、２４４、２６８、２９２、３１６、３４０、３６４、３８８、４１２、４３６、４６０、４８４、５０８、５３２、５５６、５８０、６０４、６２８、６５２、６７６、７００及び７２４、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６、３０、５４、７８、１０２、１２６、１５０、１７４、１９８、２２２、２４６、２７０、２９４、３１８、３４２、３６６、３９０、４１４、４３８、４６２、４８６、５１０、５３４、５５８、５８２、６０６、６３０、６５４、６７８、７０２及び７２６、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２、３６、６０、８４、１０８、１３２、１５６、１８０、２０４、２２８、２５２、２７６、３００、３２４、３４８、３７２、３９６、４２０、４４４、４６８、４９２、５１６、５４０、５６４、５８８、６１２、６３６、６６０、６８４、７０８及び７３２、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号１４、３８、６２、８６、１１０、１３４、１５８、１８２、２０６、２３０、２５４、２７８、３０２、３２６、３５０、３７４、３９８、４２２、４４６、４７０、４９４、５１８、５４２、５６６、５９０、６１４、６３８、６６２、６８６、７１０及び７３４、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的な類似配列から成る群から選択される、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを更に含む、抗体又はそのフラグメントを含む。１つの実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５２、５４、５６、６０、６２、６４；７６、７８、８０、８４、８６、８８；１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、１３６；２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２；２４４、２４６、２４８、２５２、２５４、２５６；及び３１６、３１８、３２０、３２４、３２６、３２８を含む。より具体的な実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号７６、７８、８０、８４、８６、８８；又は２２０、２２２、２２４、２２８、２３０、２３２を含む。
【００２０】
関連する実施態様では、本発明は、ｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、該抗体又はフラグメントが、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、５０２／５０４、５０６／５１４、５２２／５２４、５２６／５２８、５３０／５３８、５４６／５４８、５５０／５５２、５５４／５６２、５７０／５７２、５７４／５７６、５７８／５８６、５９４／５９６、５９８／６００、６０２／６１０、６１８／６２０、６２２／６２４、６２６／６３４、６４２／６４４、６４６／６４８、６５０／６５８、６６６／６６８、６７０／６７２、６７４／６８２、６９０／６９２、６９４／６９６、６９８／７０６、７１４／７１６、７１８／７２０、７２２／７３０、７３８／７４０及び７４２／７４４から成る群から選択される、重鎖及び軽鎖配列ペア中に含まれる重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施態様では、該ＣＤＲ配列は、配列番号５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、３１４／３２２、３３０／３３２及び３３４／３３６のアミノ酸配列ペアから選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ中に含まれる。より具体的な実施態様では、該ＣＤＲ配列は、配列番号９０／９２又は２１８／２２６アミノ酸配列ペアから選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ中に含まれる。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明は、ｈＰＣＳＫ９に特異的に結合して活性を中和する、完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、抗体又はそのフラグメントが以下の特性：
（ｉ）血清総コレステロールを投与前レベルと比べて少なくとも約２５〜３５％減少させ、少なくとも２４日の期間に亘ってその減少を維持することができ、好ましくは血清総コレステロールの減少が少なくとも約３０〜４０％であること；
（ii）血清ＬＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて少なくとも約６５〜８０％減少させ、少なくとも２４日の期間に亘ってその減少を維持することができること；
（iii）血清トリグリセリドを投与前レベルと比べて少なくとも約２５〜４０％減少させることができること；
（iv）血清ＨＤＬコレステロールを減少させないこと、又は血清ＨＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて僅か５％しか減少させないこと；
（ｖ）ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基２３８を含むエピトープを結合すること；
（vi）プラズモン表面共鳴によって測定した場合、ｐＨ７．４でのＫDと比べて、ｐ
Ｈ５．５ではｈＰＣＳＫ９に対する結合親和性（ＫD）の増強を示し、その親和性増強が
約２０〜５０倍の親和性の増加であること；
（vii）ヒト、ヒトＧＯＦ突然変異Ｄ３７４Ｙ、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ラット及びハムスターＰＣＳＫ９を結合すること；
（viii）配列番号８０及び８８を含む重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３配列を含むこと；
（ix）配列番号９０及び９２からのＣＤＲ配列を含むこと；
の１つ又はそれ以上を示す完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２２】
１つの実施態様では、本発明は、ｈＰＣＳＫ９を特異的に結合して活性を中和する、完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、抗体又はそのフラグメントが以下の特性：
（ｉ）血清ＬＤＬコレステロールを投与前レベルと比べて少なくとも約４０〜７０％減少させ、少なくとも６０又は９０日の期間に亘ってその減少を維持することができること；
（ii）血清トリグリセリドを投与前レベルと比べて少なくとも約２５〜４０％減少させることができること；
（iii）投与前レベルと比べて血清ＨＤＬコレステロールを減少させないこと、又は血清ＨＤＬコレステロールを僅か５％しか減少させないこと；
（iv）ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基３６６を含むエピトープを結合すること；
（ｖ）プラズモン表面共鳴によって測定した場合、中性ｐＨと比べて酸性ｐＨにおいてＰＣＳＫ９に対する結合親和性の増強を示さないこと；
（vi）ヒト及びサルＰＣＳＫ９を結合するが、しかしマウス、ラット又は
ハムスターＰＣＳＫ９を結合しないこと；
（vii）配列番号２２４及び２３２を含む重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３配列を含むこと；そして
（viii）配列番号２１８及び２２６を含むＣＤＲ配列を含むこと；
の１つ又はそれ以上を示す、完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２３】
第３の態様では、本発明は抗ＰＣＳＫ９抗体又はそのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。本発明の核酸を持つ組み換え発現ベクター、及び当該ベクターが導入されている宿主細胞も、抗体産生が可能な条件下で宿主細胞を培養することによって抗体を産生させ、そして産生抗体を回収する方法と同様、本発明に包含される。
【００２４】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１、１７、２１、２５、４１、４５、４９、６５、６９、７３、８９、９３、９７、１１３、１１７、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、１６９、１８５、１８９、１９３、２０９、２１３、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、２６５、２８１、  ２８５、２８９、３０５、３０９、３１３、３２９、３３３、３３７、３５３、３５７、３６１、３７７、３８１、３８５、４０１、４０５、４０９、４２５、  ４２９、４３３、４４９、４５３、４５７、４７３、４７７、４８１、４９７、５０１、５０５、５２１、５２５、５２９、５４５、５４９、５５３、５６９、５７３、５７７、５９３、５９７、６０１、６１７、６２１、６２５、６４１、６４５、６４９、６６５、６６９、６７３、６８９、６９３、６９７、７１３、  ７１７、７２１、７３７及び７４１、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、核酸配列によってコード化されるＨＣＶＲを含む抗体又はそのフラグメントを提供する。１つの実施態様では、ＨＣＶＲは、配列番号４９、６５、６９、７３、８９、９３、１２１、１３７、１４１、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、３１３、３２９及び３３３から成る群から選択される核酸配列によってコード化される。より具体的な実施態様では、ＨＣＶＲは、配列番号８９及び２１７から成る群から選択される核酸配列によってコード化される。
【００２５】
１つの実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号９、１９、２３、３３、４３、４７、５７、６７、７１、８１、９１、９５、１０５、１１５、１１９、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、１６７、１７７、１８７、１９１、２０１、２１１、２１５、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、２７３、２８３、２８７、２９７、３０７、３１１、３２１、３３１、３３５、３４５、３５５、３５９、３６９、３７９、３８３、３９３、４０３、４０７、４１７、４２７、４３１、４４１、４５１、４５５、４６５、４７５、４７９、４８９、４９９、５０３、５１３、５２３、５２７、５３７、５４７、５５１、５６１、５７１、５７５、５８５、５９５、５９９、６０９、６１９、６２３、６３３、６４３、６４７、６５７、６６７、６７１、６８１、６９１、６９５、７０５、７１５、７１９、７２９、７３９及び７４３、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、核酸配列によってコード化されるＬＣＶＲを更に含む。１つの実施態様では、ＬＣＶＲは、配列番号５７、６７、７１、８１、９１、９５、１２９、１３９、１４３、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、３２１、３３１及び３３５から成る群から選択される核酸配列によってコード化される。より具体的な実施態様では、ＬＣＶＲは、配列番号９１及び２２５から成る群から選択される核酸配列によってコード化される。
【００２６】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、４１５、４３９、４６３、４８７、５１１、５３５、５５９、５８３、６０７、６３１、６５５、６７９、７０３及び７２７、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、ヌクレオチド配列によってコード化されるＨＣＤＲ３ドメイン；及び配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１、３７５、３９９、４２３、４４７、４７１、４９５、５１９、５４３、５６７、５９１、６１５、６３９、６６３、６８７、７１１及び７３５、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、ヌクレオチド配列によってコード化されるＬＣＤＲ３ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特色とする。１つの実施態様では、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列は、配列番号５５／６３、７９／８７、１２７／１３５、２２３／２３１、２４７／２５５及び３１９／３２７の核酸配列によってそれぞれコード化される。より具体的な実施態様では、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列ペアは、配列番号７９／８７及び２２３／２３１の核酸配列によってコード化される。
【００２７】
更なる実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号３、２７、５１、７５、９９、１２３、１４７、１７１、１９５、２１９、２４３、２６７、２９１、３１５、３３９、３６３、３８７、４１１、４３５、４５９、４８３、５０７、５３１、５５５、５７９、６０３、６２７、６５１、６７５、６９９及び７２３、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、ヌクレオチド配列によってコード化されるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、４１３、４３７、４６１、４８５、５０９、５３３、５５７、５８１、６０５、６２９、６５３、６７７、７０１及び７２５、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、ヌクレオチド配列によってコード化されるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、３５、５９、８３、１０７、１３１、１５５、１７９、２０３、２２７、２５１、２７５、２９９、３２３、３４７、３７１、  ３９５、４１９、４４３、４６７、４９１、５１５、５３９、５６３、５８７、  ６１１、６３５、６５９、６８３、７０７及び７３１、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、ヌクレオチド配列によってコード化されるＬＣＤＲ１ドメイン；そして配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９、３７３、３９７、４２１、４４５、４６９、４９３、５１７、  ５４１、５６５、５８９、６１３、６３７、６６１、６８５、７０９及び７３３、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％それらと相同性を有する、実質的に同一の配列から成る群から選択される、ヌクレオチド配列によってコード化されるＬＣＤＲ２ドメインを更に含む。１つの実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５１、５３、５５、５９、  ６１、６３；７５、７７、７９、８３、８５、８７；１２３、１２５、１２７、１３１、１３３、１３５；２１９、２２１、２２３、２２７、２２９、２３１；２４３、２４５、２４７、２５１、２５３、２５５；及び３１５、３１７、３１９、３２３、３２５、３２７の核酸配列によってコード化される。 より具体的な実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列は、７５、７７、７９、８３、８５、８７；及び２１９、２２１、２２３、２２７、２２９、２３１の核酸配列によってコード化される。
【００２８】
第４の態様では、本発明は、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３を含む、ｈＰＣＳＫ９を特異的に結合する単離抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、ＨＣＤＲ３が、式Ｘ1−
Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19−Ｘ20（配列番号７４７）のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ1はＡｌａ、Ｘ2はＡｒｇ又はＬｙｓ、Ｘ3はＡｓｐ、Ｘ4はＳｅｒ又はＩｌｅ、Ｘ5はＡｓｎ又はＶａｌ、Ｘ6はＬｅｕ又はＴｒｐ、Ｘ7はＧｌｙ又はＭｅｔ、Ｘ8はＡｓｎ又はＶａｌ、Ｘ9はＰｈｅ又はＴｙｒ、Ｘ10はＡｓｐ、Ｘ11はＬｅｕ又はＭｅｔ、Ｘ12はＡｓｐ又は不存在、Ｘ13はＴｙｒ又は不存在、Ｘ14はＴｙｒ又は不存在、Ｘ15はＴｙｒ又は不存在、Ｘ16はＴｙｒ又は不存在、Ｘ17はＧｌｙ又は不存在、Ｘ18はＭｅｔ又は不存在、Ｘ19はＡｓｐ又は不存在、そしてＸ20はＶａｌ又は不存在である；そしてＬＣＤＲ３が、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号７５０）のアミノ酸配列、式中、Ｘ1はＧｌｎ又はＭｅｔ、Ｘ2はＧｌｎ、Ｘ3はＴｙｒ又はＴｈｒ、Ｘ4はＴｙｒ又はＬｅｕ、Ｘ5はＴｈｒ又はＧｌｎ、Ｘ6はＴｈｒ、Ｘ7はＰｒｏ、Ｘ8はＴｙｒ又はＬｅｕ、そしてＸ9はＴｈｒである、を含む単離抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであることを特色とする。
【００２９】
更なる実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号７４５）のＨＣＤＲ１配列、式中、Ｘ1はＧｌｙ、Ｘ2はＰｈｅ、Ｘ3はＴｈｒ、Ｘ4はＰｈｅ、Ｘ5はＳｅｒ又はＡｓｎ、Ｘ6はＳｅｒ又はＡｓｎ、Ｘ7はＴｙｒ又はＨｉｓ、及びＸ8はＡｌａ又はＴｒｐである；式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号７４６）のＨＣＤＲ２の配列、式中、Ｘ1はＩｌｅ、Ｘ2はＳｅｒ又はＡｓｎ、Ｘ3はＧｌｙ又はＧｌｎ、Ｘ4はＡｓｐ又はＳｅｒ、Ｘ5はＧｌｙ、Ｘ6はＳｅｒ又はＧｌｙ、Ｘ7はＴｈｒ又はＧｌｕ、及びＸ8はＴｈｒ又はＬｙｓである；式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12（配列番号７４８）のＬＣＤＲ１の配列、式中、Ｘ1はＧｌｎ、Ｘ2はＳｅｒ、Ｘ3はＶａｌ又はＬｅｕ、Ｘ4はＬｅｕ、Ｘ5はＨｉｓ又はＴｙｒ、Ｘ6はＡｒｇ又はＳｅｒ、Ｘ7はＳｅｒ又はＡｓｎ、Ｘ8はＡｓｎ又はＧｌｙ、Ｘ9はＡｓｎ、Ｘ10はＡｒｇ又はＡｓｎ、Ｘ11はＡｓｎ又はＴｙｒ、及びＸ12はＰｈｅ又は不存在である；式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3（配列番号７４９）のＬＣＤＲ２の配列、式中、Ｘ1はＴｒｐ又はＬｅｕ、Ｘ2はＡｌａ又はＧｌｙ、及びＸ3はＳｅｒである、を更に含む。図１は、３１６Ｐ及び３００ＮｍＡｂｓに対する重鎖及び軽鎖可変領域の配列アラインメントを示す。
【００３０】
第５の態様では、本発明は、ＶH、ＤH及びＪH生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列セグメントによってコード化される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及びＶK及びＪK生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列セグメントによってコード化される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、生殖細胞系配列が、（ａ）ＶH遺伝子セグメント３−２３、ＤH遺伝子セグメント７−２７、ＪH遺伝子セグメント２、ＶK遺伝子セグメント４−１及びＪK遺伝子セグメント２；又は（ｂ）ＶH遺伝子セグメント３−７、ＤH遺伝子セグメント２−８、ＪH遺伝子セグメント６、ＶK遺伝子セグメント２−２８及びＪK遺伝子セグメント４である、ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特色とする。
【００３１】
第６の態様では、本発明は、配列番号７５５のＰＣＳＫ９タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質への本抗体又はそのフラグメントの結合が、本抗体又はそのフラグメントと配列番号７５５のＰＣＳＫ９タンパク質との結合の５０％より小さい、抗体又はその抗原結合フラグメントを特色とする。特定の実施態様では、本抗体又はそのフラグメントは、ＰＣＳＫ９（配列番号７５５）への結合と比較して、約５０％より小さい、約６０％より小さい、約７０％より小さい、約８０％より小さい、約９０％より小さい又は約９５％より小さい結合親和性（ＫD）を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に結合する。
【００３２】
１つの実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質は、配列番号７５５の２３８の位置で少なくとも１つの突然変異を含む。より具体的な実施態様では、該突然変異はＤ２３８Ｒである。１つの実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対する本抗体又は抗体フラグメント結合親和性は、変異体タンパク質が残基２３８において突然変異を含む、配列番号７５５の野生型タンパク質と比べて少なくとも９０％少ない。１つの実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対する本抗体又は抗体フラグメント結合親和性は、変異体タンパク質が残基１５３、１５９，２３８及び３４３の１つ又はそれ以上において突然変異を含む、配列番号７５５の野生型タンパク質と比べて少なくとも８０％少ない。より具体的な実施態様では、突然変異はＳ１５３Ｒ、Ｅ１５９Ｒ、Ｄ２３８Ｒ及びＤ３４３Ｒの１つである。
【００３３】
１つの実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質は、配列番号７５５の３６６の位置で少なくとも１つの突然変異を含む。より具体的な実施態様では、突然変異はＥ３６６Ｋである。１つの実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対する本抗体又は抗体フラグメントの結合親和性は、変異体タンパク質が残基３６６において突然変異を含む配列番号７５５の野生型タンパク質と比べて少なくとも９５％少ない。１つの実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対する本抗体又は抗体フラグメントの結合親和性は、変異体タンパク質が残基１４７、３６６及び／又は３８０の１つ又はそれ以上において突然変異を含む配列番号７５５の野生型タンパク質と比べて、少なくとも７０％、８０％又は９０％少ない。より具体的な実施態様では、突然変異はＳ１４７Ｆ、Ｅ３６６Ｋ及びＶ３８０Ｍの１つである。
【００３４】
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＰＣＳＫ９抗体を包含する。幾つかの応用では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾は有用であり、又は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるフコース部分の除去は有用となり得る（Shield et al. (2002) JBC 277:26733を参照) 。他の応用では、ガラクトシル化の修飾を、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【００３５】
第７の態様では、本発明は、ｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する組み換えヒト抗体又はそのフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特色とする。１つの実施態様では、本発明は、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメント、及び第２の治療薬の組み合わせである組成物を特色とする。第２の治療薬は、本発明の抗体又はそのフラグメントと有利に組み合わされるいずれの薬剤、例えば、セロバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなどの、例えば、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−コエンザイムＡ（ＣｏＡ）レダクターゼを阻害することによるコレステロール合成の細胞枯渇を誘導することができる；コレステロール取り込み及び／又は胆汁酸再吸収を阻害することができる；リポタンパク質異化を増加させることができる（ナイアシンなど）薬剤；及び／又は２２−ヒドロキシコレステロールなどのコレステロール除去の役割を果たすＬＸＲ転写因子のアクチベーターであってよい。
【００３６】
第８の態様では、本発明は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体又は該抗体の抗原結合部分を用いてｈＰＣＳＫ９活性を阻害する方法であって、該治療方法が、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む方法を特色とする。処置される障害は、ＰＣＳＫ９活性の除去、阻害又は減少によって改善し、軽減し、阻害し又は防止するいずれかの疾患又は病態である。本発明の治療法によって処置可能な特定集団としては、ＬＤＬアフェレーシスの適応対象、ＰＣＳＫ９活性化突然変異対象（機能獲得型突然変異、「ＧＯＦ」）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症(ｈ
ｅＦＨ) 対象；スタチン不耐性又はスタチンコントロール不良の原発性高コレステロール血症対象；及び予防的処置可能な高コレステロール血症の発症リスクを有する対象が含まれる。他の適応としては、２型糖尿病のような副因に伴う脂質異常症、胆汁うっ滞性肝疾患（原発性胆汁性肝硬変）、ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下症、肥満；及びアテローム性動脈硬化症及び心血管疾患の予防及び処置が含まれる。
【００３７】
本発明方法の特定の実施態様では、本発明の抗ｈＰＣＳＫ９抗体又は抗体フラグメントは、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、及び／又はアポリポタンパク質Ｂ（アポリポタンパク質Ｂ１００）の上昇を低減するのに有用である。
【００３８】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、単独で又は第２の薬剤、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤及び／又は他の脂質低下薬と併用して使用してよい。
【００３９】
更なる実施態様は、ＰＣＳＫ９仲介疾患又は病態を減弱又は抑制するのに使用するための、上記で定義した抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【００４０】
本発明は、ＰＣＳＫ９仲介疾患又は病態を減弱又は阻害するのに使用するための薬剤の製造における、上記で定義した抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの使用を包含する。特定の実施態様では、ＰＣＳＫ９仲介疾患又は病態は、高コレステロール血症、高脂血症、ＬＤＬアフェレーシス、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合性、スタチン不耐性、スタチンコントロール不良；高コレステロール血症、脂質異常症、胆汁うっ滞性肝疾患、ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下症、肥満、アテローム性動脈硬化症及び心血管疾患の発症リスクである。
【００４１】
他の実施態様は、以下の詳細な説明のレビューから明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】抗体Ｈ１Ｈ３１６Ｐ及びＨ１Ｍ３００Ｎの、重鎖（Ａ）及び軽鎖（Ｂ）可変領域及びＣＤＲの配列比較表
【図２】経時的血清中抗体濃度。３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（□）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（○）；３１６Ｐ：１５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：１５ｍｇ／ｋｇ（●）。
【図３】バッファーコントロールに対する変化率としての血清総コレステロールレベル。コントロール（＊）；３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（▲）；３１６Ｐ：１５ｍｇ／ｋｇ（□）；３００Ｎ：１５ｍｇ／ｋｇ（△）。
【図４】バッファーコントロールに対する変化率としての血清ＬＤＬコレステロールレベル。コントロール（＊）；３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（▲）；３１６Ｐ：１５ｍｇ／ｋｇ（□）；３００Ｎ：１５ｍｇ／ｋｇ（△）。
【図５】バッファーコントロールに正規化した血清ＬＤＬコレステロールレベル。バッファーコントロール（＊）；３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（▲）；３１６Ｐ：１５ｍｇ／ｋｇ（□）；３００Ｎ：１５ｍｇ／ｋｇ（△）。
【図６】バッファーコントロールに対する変化率としての血清ＨＤＬコレステロールレベル。コントロール（＊）；３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（▲）；３１６Ｐ：１５ｍｇ／ｋｇ（□）；３００Ｎ：１５ｍｇ／ｋｇ（△）。
【図７】バッファーコントロールに対する変化率としての血清トリグリセリドレベル。バッファーコントロール（＊）；３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（▲）；３１６Ｐ：１５ｍｇ／ｋｇ（□）；３００Ｎ：１５ｍｇ／ｋｇ（△）。
【図８】単回皮下投与後のベースラインに対する変化率として表わした血清ＨＤＬコレステロールレベル。３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（■）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（●）。
【図９】単回皮下投与後の経時的血清中抗体濃度。３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（●）；３００Ｎ：５ｍｇ／ｋｇ（▲）。
【図１０】肝臓総ホモジネートのマウスＬＤＬ受容体に対するウェスタンブロット。試料は、ＰＢＳ（レーン１〜３）、３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（レーン４〜６）、又は非ｈＰＣＳＫ９特異的ｍＡｂ：５ｍｇ／ｋｇ（レーン７〜８）の投与２４時間後、そしてｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ：１．２ｍｇ／ｋｇ（全レーン）の投与の４時間後に採取した。
【図１１】ＰＣＳＫ９hu/huマウスにおける血清ＬＤＬコレステロールレベルに対する３１６Ｐの効果。
【化１】
0005902122.tif 000002
【図１２】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂの血清薬物動力学的プロファイル。単回用量のコントロールＩｍＡｂ：１０ｍｇ／ｋｇ（●）；３１６Ｐ：１０ｍｇ／ｋｇ（▲）；及び３００Ｎ：１０ｍｇ／ｋｇ（■）。
【図１３】ｈＰＣＳＫ９ヘテロ接合体マウスにおける抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂの血清薬物動力学的プロファイル。単回用量：各１０ｍｇ／ｋｇ；コントロールＩｍＡｂ：（●）；３１６Ｐ（▲）：及び３００Ｎ（■）。
【図１４】普通の食餌で給餌したシリアンハムスターにおける血清ＬＤＬコレステロールレベルに対する３１６Ｐの効果。バッファーコントロール（●）；３１６Ｐ：１ｍｇ／ｋｇ（■）；３１６Ｐ：３ｍｇ／ｋｇ（▲）；３１６Ｐ：５ｍｇ／ｋｇ（▼）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本方法を説明する前に、当然のことながら、本発明は特定の方法に限定されるものではなく、そしてそのような方法及び条件として記載される実験条件は変動してもよい。また当然のことながら、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲のみによって限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、限定することを意図するものではない。
【００４４】
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等のいずれの方法及び材料も、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００４５】
定義
本明細書で使用される用語「ヒトプロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシン９型」又は「ｈＰＣＳＫ９」は、配列番号７５４で示される核酸配列及び配列番号７５５のアミノ酸配列を有するｈＰＣＳＫ９、又はその生物活性フラグメントを指す。
【００４６】
本明細書で使用される用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に連結した４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子を指すことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより良く保存された領域が組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分される。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００４７】
１つ又はそれ以上のＣＤＲ残基の置換又は１つ又はそれ以上のＣＤＲの脱落もまた可能である。１つ又は２つのＣＤＲが結合のために省くことができる抗体は、科学文献に記載されている。Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) は、公表された結晶構造を基準にして抗体とそれらの抗原間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約１／５〜１／３だけが実際に抗原と接触していると結論した。Padlanは、また、 １つ又は２つのＣＤＲが、抗
原と接触したアミノ酸を有さない多くの抗体を見出した(Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428も参照)。
【００４８】
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、ChothiaＣＤＲ外にあるKabatＣＤＲの領域から、分子モデリングにより及び／又は経験的に、過去の研究（例えばＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は頻繁には必要とされない）に基づいて同定することができる。ＣＤＲ又はその残基が脱落している場合、それは通常別のヒト抗体配列又は当該配列のコンセンサス中で対応する位置を占有するアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換位置及び置換するアミノ酸は経験的に選択することもできる。経験的置換は保存的置換又は非保存的置換であってよい。
【００４９】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂｓは、例えばＣＤＲ特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異により又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）によってコード化されないアミノ酸残基を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系から由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植された、ｍＡｂｓを含むことを意図するものではない。
【００５０】
用語「特異的に結合する」等は、抗体又はその抗原結合フラグメントが生理的条件下に相対的に安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０-6Ｍ以下（例えば、小さいＫDはより強固な結合を示す）の平衡解離定数によって特徴付けることができる。２分子が特異的に結合するかどうかを測定する方法は当技術分野で周知であり、そして例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。しかしながら、ｈＰＣＳＫ９を特異的に結合する単離抗体は、他の種からのＰＣＳＫ９分子のような他の抗原に対して交差反応を呈する。更に、ｈＰＣＳＫ９及び１つ又はそれ以上の更なる抗原に結合する多特異性抗体（例えば二重特異体）は、それでも本明細に記載のｈＰＣＳＫ９を「特異的に結合する」検討された抗体である。
【００５１】
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、 BIACORE（商標）又は溶液親和性ＥＬＩＳＡで測定して、少なくとも１０-10Ｍ；好ましくは１０-11Ｍ；尚更に好ましくは１０-12ＭのｈＰＣＳＫ９に結合親和性を有するそれらのｍＡｂｓを指す。
【００５２】
用語「スローオフレート（slow off rate）」、「Ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」では、表面プラズモン共鳴、例えば、 BIACORE（商標）で測定して、１×１０-3ｓ-1以下、好ましくは１×１０-4ｓ-1以下の速度定数でｈＰＣＳＫ９から解離する抗体を意味する。
【００５３】
本明細書で使用される用語、抗体の「抗原結合部分」（又は簡単に「抗体フラグメント」）は、ｈＰＣＳＫ９に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含むフラグメント、又は単離ＣＤＲを含むことができる。
【００５４】
特定の実施態様、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制薬又は放射性同位体などの治療部分に結合することができる（「イムノコンジュゲート」）。
【００５５】
本明細書で使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他のｍＡｂｓ（例えば、ｈＰＣＳＫ９を特異的に結合する単離抗体は、ｈＰＣＳＫ９以外の抗原を特異的に結合するｍＡｂｓを実質的に含んでいない）を実質的に含んでいない抗体を指すことを意図する。しかしながら、ｈＰＣＳＫ９を特異的に結合する単離抗体は、他の種からのＰＣＳＫ９分子など他の抗原に対して交差反応性を有する。
【００５６】
本明細書で使用される「中和抗体」（又は「ＰＣＳＫ９活性」を中和する抗体）は、ＰＣＳＫ９に対するその結合がＰＣＳＫ９の少なくとも１つの生物活性の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。ＰＣＳＫ９の生物活性のこの阻害は、当技術分野で公知の幾つかの１つ又はそれ以上の標準的インビトロ又はインビボ分析で、ＰＣＳＫ９生物活性の１つ又はそれ以上の指標を測定するにより評価することができる（下記の実施例を参照）。
【００５７】
本明細書で使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばBIACORE（商標） システム (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)を用いて、 バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。
【００５８】
本明細書で使用される用語「ＫD」は、特定の抗体抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
【００５９】
用語「エピトープ」は抗体によって結合される抗原の領域を指す。エピトープは構造又は機能と定義される。機能エピトープは一般的に構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するそれらの残基を有する。エピトープは、立体配座性でもあり、すなわち非線形アミノ酸から構成されてもよい。特定の実施態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的活性表面グルーピングである決定因子を含んでもよく、そして特定の実施態様では、特異的３次元構造特性、及び／又は特異的電荷特性を有してもよい。
【００６０】
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の、用語「実質的同一性」又は「実質的に同一の」とは、別の核酸（又はその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失を有して最適に整列した場合に、下記で検討するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰなど配列同一性のいずれか周知のアルゴリズムによって測定して、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００６１】
ポリペプチドに適用した場合に、用語「実質的類似性」又は「実質的に類似の」は、デフォルトギャップ重量を用いてＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムによるなど最適整列した場合に、２つのペプチド配列は、少なくとも９０％の配列同一性、尚より好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は保存アミノ酸置換によって異なる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）をもつ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変えないと考えられる。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なるという場合に、類似性の割合及び程度は、置換の保存的性質を修正するために上方へ調整してもよい。この調整を行なう手段は当業者に周知である。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。類似の化学特性をもつ側鎖を有するアミノ酸群の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖；アスパラギン酸及びグルタミン酸、及び７）含硫黄側鎖：システイン及びメチオニンを含む。好ましい保存アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいはまた、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて、正の値を有するあらゆる変化である。「緩やかな保存」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有するあらゆる変化である。
【００６２】
ポリペプチドの配列類似性は、一般的に配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の修飾に帰属される類似性の尺度を用いて類似配列を整合させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、生物の異なる種からの相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質間の、配列相同性又は配列同一性を決定するために、デフォルトパラメータによって使用することができるＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、また、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムで、デフォルト又は推奨パラメータによるＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー及びサーチ配列間の最良重なり領域のアラインメント及び百分率配列同一性を与える（Pearson (2000）上記）。本発明の配列を異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合に、別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 and (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402を参照されたい。
【００６３】
特定の実施態様では、本発明の方法に使用するための抗体又は抗体フラグメントは、単一特異性、二重特異性、又は多特異性であってよい。多特異性抗体は１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってよく、又は１つの標的ポリペプチドより大きいエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含んでもよい。本発明との関連で使用することができる典型的な二重特異体型は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用であって、第１及び第２のＩｇＣＨ３ドメインが少なくとも１つのアミノ酸で互いに異なり、そして少なくとも１つのアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠いている二重特異体と比べて、プロテインＡに対する二重特性抗体の結合を減少させる、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を包含する。１つの実施態様では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、そして第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少又は停止させる突然変異を含む。第２のＣＨ３はＹ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を更に含む。第２のＣＨ３内に認められる可能性のある更なる修飾は：ＩｇＧ１ｍＡｂｓの場合におけるＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２ｍＡｂｓの場合におけるＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；及びＩｇＧ４ｍＡｂｓの場合におけるＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）を含む。上記の二重特異体型の変異は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００６４】
語句「治療的有効量」は、それが投与されて所望の効果をもたらす量を意味する。正確な量は処置の目的によって決まり、そして公知技術を用いて当業者により確認することが可能である（例えば、Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compoundingを参照）。
ヒト抗体の製造
【００６５】
トランスジェニックマウス中にヒト抗体を生成させる方法は公知である（例えば、米国特許第６５９６５４１号、Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE（商標）を参照）。VELOCIMMUNE（商標）技術は、マウスが抗原刺激に応じてヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域遺伝子座に機能的に連結した、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの作製を包含する。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコード化するＤＮＡが単離され、そしてヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコード化するＤＮＡに機能的に結合される。ＤＮＡはその後完全ヒト抗体を発現することができる細胞に発現する。特定の実施態様では、細胞はＣＨＯ細胞である。
【００６６】
抗体は、補体の固定及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への関与を通した細胞致死、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＤＣ）を通した細胞致死よりむしろ、リガンド−受容体相互作用の遮断又は受容体成分相互作用の抑制に有用と考えられる。従って抗体の定常領域は、抗体が補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する能力において重要である。従って、抗体のイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかを基にして選択してもよい。
【００６７】
ヒト抗体はヒンジ不均一性に関与する２つの型で存在することができる。１つの型では、抗体分子は、２量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって結合している、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４鎖構築物を含む。第２の型では、２量体は鎖間ジスルフィド結合を経て結合せず、約７５〜８０ｋＤａの分子が共有結合軽鎖及び重鎖を構成して形成される（半抗体）。これらの型は、親和性による精製後でも単離することは非常に困難である。
【００６８】
種々のインタクトＩｇＧイソタイプにおける第２の型の発現頻度は、抗体のヒンジ領域イソタイプと関連する構造差に因るが、これに限定されるものではない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の型の出現（Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105）を通常ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて観察されるレベルま
で低下させることができる。本発明は、所望の抗体型の収量を改善するために、例えば、産生に望ましいと考えられるヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３領域において、１つ又はそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。
【００６９】
一般に、VELOCIMMUNE（商標）マウスは、対象とする抗原を投与され、そして抗体を発
現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）が回収される。リンパ細胞は、不死化ハイブリドーマ細胞株を調製するために骨髄腫細胞株で融合してもよく、対象とする抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために、当該ハイブリドーマ細胞株がスクリーニングされ選択される。重鎖及び軽鎖の可変領域をコード化するＤＮＡは、単離し、重鎖及び軽鎖の所望のイソタイプ定常領域に結合してもよい。当該抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞中に産生させてもよい。あるいはまた、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコード化するＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離してもよい。
【００７０】
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。下記のように、該抗体は特徴付けされ、そして親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特性で選択される。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型又は修飾ＩｇＧ１又はＩｇＧ４(配列番号７５１、７５２、７５３)を生成させるために、所望のヒト定常領域で置換される。選択された定常領域は、特定の用途によって変化する可能性があるが、一方で高親和性抗原結合及び標的特異性特性は可変領域に残存する。
エピトープマッピング及び関連技術
【００７１】
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥのその高親和性受容体への結合を遮断する抗体）をスクリーニングするために、Antibodies, Harlow and Lane  (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) に記載のルーチン交差遮断分析を行うことができる。他の方法は、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63)、又はペプチド切断解析を含む。加えて、エピトープ切出、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾を用いることができる（Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)。
【００７２】
用語「エピトープ」は、Ｂ及び／又はＴ細胞が反応する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次元折畳みによって並列した隣接アミノ酸又は非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは一般的に変性溶媒への曝露時に保持されるが、一方で三次元折畳みによって形成されるエピトープは一般的に変性溶媒で処理時に失われる。エピトープは、一般的には少なくとも３、そしてより一般的には少なくとも５又は８〜１０のアミノ酸を特有の空間立体配座の中に含む。
【００７３】
抗原構造ベース抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られる、修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的又は酵素的修飾抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性によって、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を分類する方法である（米国特許出願第２００４／０１０１９２０号）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表わされるエピトープと非常に異なるか又は部分的に重複する特有のエピトープを反映すると考えられる。この技術は、キャラクタリゼーションが遺伝的に異なるｍＡｂｓに焦点を当てることができるように、遺伝的に同一のｍＡｂｓの迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用する場合に、ＭＡＰは所望の特性を有するｍＡｂｓを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を促進すると考えられる。ＭＡＰは、本発明の抗ＰＣＳＫ９ｍＡｂｓをｍＡｂｓ結合性の異なるエピトープ群を仕分けするのに使用してもよい。
【００７４】
種々の実施態様では、抗ｈＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、配列番号７５５の約１５３〜４２５である触媒ドメイン内のエピトープを；更に具体的には、約１５３から約２５０まで又は約２５０から約４２５までのエピトープを結合する。更に具体的には、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、約１５３から約２０８まで、約２００から約２６０まで、約２５０から約３００まで、約２７５から約３２５まで、約３００から約３６０まで、約３５０から約４００まで、及び／又は約３７５から約４２５までのフラグメント内のエピトープを結合する。
【００７５】
種々の実施態様では、抗ｈＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、プロペプチドドメイン（配列番号７５５の残基３１〜１５２）内のエピトープを；更に具体的には、約残基３１から約残基９０まで又は約残基９０から約残基１５２までのエピトープを結合する。更に具体的には、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、約残基３１から約残基６０まで、約残基６０から約残基９０まで、約残基８５から約残基１１０まで、約残基１００から約残基１３０まで、約残基１２５から約残基１５０まで、約残基１３５から約残基１５２まで、及び／又は約残基１４２から約残基１５２までのフラグメント内のエピトープを結合する。
【００７６】
幾つかの実施態様では、抗ｈＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、Ｃ末端ドメイン（配列番号７５５の残基４２６〜６９２）内のエピトープを；更に具体的には、約残基４２６から約残基５７０まで又は約残基５７０から約残基６９２までのエピトープを結合する。更に具体的には、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、約残基４５０から約残基５００まで、約残基５００から約残基５５０まで、約残基５５０から約残基６００まで、及び／又は約残基６００から約残基６９２までのフラグメント内のエピトープを結合する。
【００７７】
幾つかの実施態様では、該抗体又は抗体フラグメントは、触媒的、プロペプチド又はＣ末端ドメイン内、及び／又は２つ又は３つの異なるドメイン（例えば、触媒的及びＣ末端ドメイン内、又はプロペプチド及び触媒的ドメイン内、又はプロペプチド、触媒的及びＣ末端ドメイン内エピトープ）内の１つより多い列挙されたエピトープを含むエピトープを結合する。
【００７８】
幾つかの実施態様では、本抗体又は抗原結合フラグメントは、ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基２３８を含むｈＰＣＳＫ９上のエピトープを結合する。実験結果（表２７）は、Ｄ２３８が突然変異した場合に、ｍＡｂ３１６ＰのＫDが＞４００倍の結合親和性における低下を示し（〜１×１０-9Ｍから〜４１０×１０-9Ｍまで）、そしてＴ1/2が＞３０倍（〜３７から〜１分まで）減少したことを示す。特定の実施態様では、突然変異はＤ２３８Ｒであった。特定の実施態様では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、１５３、１５９、２３８及び３４３の位置において２つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むｈＰＣＳＫ９のエピトープを結合する。
【００７９】
下記のように、アミノ酸残基１５３、１５９又は３４３における突然変異は、約５〜１０倍の親和性低下又は類似のＴ1/2の短縮をもたらした。特定の実施態様では、突然変異はＳ１５３Ｒ、Ｅ１５９Ｒ及び／又はＤ３４３Ｒであった。
【００８０】
幾つかの実施態様では、本抗体又は抗原結合フラグメントは、ｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のアミノ酸残基３６６を含むｈＰＣＳＫ９上のエピトープを結合する。実験結果（表２７）は、Ｅ３６６が突然変異した場合に、ｍＡｂ３００Ｎの親和性は約５０倍の低下（〜０．７×１０-9Ｍから〜３６×１０-9Ｍまで）、そして類似のＴ1/2の短縮（〜１
２０から〜２分まで）を示した。特定の実施態様では、突然変異はＥ３６６Ｋであった。
【００８１】
本発明は、本明細書に記載のいずれかの特異的典型的抗体と同じエピトープに結合する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。同様に、本発明は、本明細書に記載のいずれかの特異的典型的抗体とＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９フラグメントへの結合を競合する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。
【００８２】
抗体が、当技術分野で公知の常法を用いることによって、参照抗ＰＣＳＫ９抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗ＰＣＳＫ９抗体との結合を競合するかどうかは、容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗ＰＣＳＫ９抗体と同じエピトープと結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でＰＣＳＫ９タンパク質又はペプチドに結合するようにすることができる。次いで、試験抗体のＰＣＳＫ９分子への結合能が評価される。試験抗体が参照抗ＰＣＳＫ９抗体との飽和結合後にＰＣＳＫ９分子に結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＰＣＳＫ９抗体と異なるエピトープに結合すると結論することができる。他方で、試験抗体が参照抗ＰＣＳＫ９抗体との飽和結合後にＰＣＳＫ９分子に結合することができない場合、従って試験抗体は、本発明の参照抗ＰＣＳＫ９抗体によって結合したエピトープと同じエピトープに結合すると考えられる。
【００８３】
抗体が参照抗ＰＣＳＫ９抗体との結合を競合するかどうかを決定するために、上記結合方法を２つの方針で行うことができる。第１の方針では、参照抗体を飽和条件下でＰＣＳＫ９分子に結合するようにし、続いてＰＣＳＫ９分子に対する試験抗体の結合の評価を行うようにする。第２の方針では、試験抗体を飽和条件下でＰＣＳＫ９分子に結合するようにし、続いてＰＣＳＫ９分子に対する参照抗体の結合の評価を行うようにする。両方針において、第１の（飽和）抗体だけがＰＣＳＫ９分子に結合する場合、その結果試験抗体及び参照抗体はＰＣＳＫ９への結合を競合すると結論される。当業者には当然のことながら、参照抗体との結合を競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合しないが、しかし重複又は隣接エピトープを結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断すると考えられる。
【００８４】
２つの抗体は、各々が抗原に対するもう一方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じ又は重複エピトープに結合する。即ち、１つの抗体の１、５、１０、２０又は１００倍過剰は、競合的結合測定法（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 1990 50: 1495-1502参照)で測定して、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％又は９９％までも、もう一方の結合を阻害する。あるいはまた、基本的に１つの抗体の結合を低減又は排除する抗原中の全アミノ酸突然変異が、もう一方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。１つの抗体の結合を低減又は排除する幾つかのアミノ酸突然変異が、もう一方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は重複エピトープを有する。
【００８５】
従って、更なるルーチン実験（例えば、ペプチド突然変異及び結合解析）を、試験抗体の実測した結合欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に因るか、又は立体遮断（又は別の現象）が実測した結合欠如に関与しているかどうかを、確認するために行うことができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用できるその他の定量的若しくは定性的抗体結合分析を用いて行うことができる。
【００８６】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号７５５のＰＣＳＫ９タンパク質を結合する抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、ＰＣＳＫ９に対する該抗体又はそのフラグメントと変異体ＰＣＳＫ９タンパク質との結合が、該抗体又はそのフラグメントと配列番号７５５のＰＣＳＫ９タンパク質との結合の５０％より小さい、抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの特定の実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質は、１５３、１５９、２３８及び３４３から成る群から選択される位置において、少なくとも１つの残基の突然変異を含む。更に特定の実施態様では、少なくとも１つの突然変異はＳ１５３Ｒ、Ｅ１５９Ｒ、Ｄ２３８Ｒ及びＤ３４３Ｒである。別の特定の実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質は、３６６から成る群から選択される位置において残基の少なくとも１つの突然変異を含む。１つの特定の実施態様では、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質は、１４７、３６６及び３８０から成る群から選択される位置において少なくとも１つの残基の突然変異を含む。１つの更に特定の実施態様では、突然変異はＳ１４７Ｆ、Ｅ３６６Ｋ及び／又はＶ３８０Ｍである。
【００８７】
イムノコンジュゲート
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制薬又は放射性同位体などの、治療部分（「イムノコンジュゲート」）に結合したヒト抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を包含する。細胞毒性剤は細胞に有害ないずれの薬剤をも含む。イムノコンジュゲートを形成するための好適な細胞毒性剤及び化学療法薬の例は当技術分野で公知であり、例えば、国際特許公開第０５／１０３０８１号を参照されたい。
【００８８】
二重特異体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多特異性であってよい。多特異性ｍＡｂｓは１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり、又は１つより多い標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含んでもよい。例えば、Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69を参照されたい。ヒト抗ＰＣＳＫ９ｍＡｂｓは、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に結合又はそれと共発現し得る。例えば、抗体又はそのフラグメントは、第２の結合特異性を有する二重特異性又は多特異性抗体を産生するために、別の抗体又は抗体フラグメントなどの、１つ又はそれ以上の他の分子実体に機能的に（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合又は別の方法により）結合することができる。
【００８９】
本発明に関連して使用することができる典型的な二重特異体型は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用であって、第１及び第２のＩｇＣＨ３ドメインが少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、そして少なくとも１つのアミノ酸差異が、アミノ酸差異を欠く二重特異体と比べてプロテインＡに対する二重特異体の結合を減少させる使用を包含する。１つの実施態様では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、そして第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減又は停止する突然変異を含む。第２のＣＨ３はＹ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を更に含む。第２のＣＨ３内に認められる可能性のある更なる修飾は：ＩｇＧ１抗体の場合では、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合では、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；及びＩｇＧ４抗体の場合では、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）を含む。上記の二重特異体型の変異体は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００９０】
生物学的同等物
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体及び抗体フラグメントは、記載されたｍＡｂｓのそれから変異しているが、しかしヒトＰＣＳＫ９を結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。当該変異体ｍＡｂｓ及び抗体フラグメントは、親配列と比較した場合に、アミノ酸の１つ又はそれ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、しかし記載されたｍＡｂｓと基本的に同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体コード化ＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合に、ヌクレオチドの１つ又はそれ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、しかし本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体フラグメントと基本的に生物学的に同等な抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体フラグメントをコード化する配列を包含する。当該変異体アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は、上記で検討されている。
【００９１】
２つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えば、それらが、それらの吸収速度及び程度が、類似の実験条件下で同じモル用量で単回用量か又は多数回用量で投与された場合に有意差を示さない、製剤学的同等物又は製剤学的代替物である場合、生物学的に同等と考えられる。幾つかの抗体は、それらがそれらの吸収の程度において同等であるがしかし吸収速度は同等でない場合、同等物又は製剤学的同等物と考えることができ、そして吸収速度の当該差が意図的でそしてラベリングに反映されたものであり、例えば、長期使用時に有効な体内薬剤濃度の達成に必須ではなく、そして特定の試験薬物製剤に対して医学的に無意味と考えられるという理由から、尚生物学的同等性と考えてもよい。１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び有効性に臨床的有意差がない場合、生物学的に同等である。
【００９２】
１つの実施態様では、患者が、当該変更のない連続治療と比べて、免疫原性の臨床的に顕著な変化又は有効性の低下を含む、副作用の予想されるリスクの増加なしに参照製品及び生物学的製剤間で１回又はそれ以上の回数変更できる場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である。
【００９３】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、それら両方が病態又は使用条件に対して共通メカニズム又は作用メカニズムで作用する場合、当該メカニズムが公知の程度まで生物学的に同等である。
【００９４】
生物学的同等性は、インビボ及びインビトロ法で実証することができる。生物学的同等性の尺度としては、例えば 、（ａ）血液、血漿、血清、又は他の生体液中の抗体又はそ
の代謝物の濃度が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物でのインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関して、それが合理的に予測されるインビトロ試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物でのインビボ試験；そして（ｄ）抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティ又は生物学的同等性を確立する対照比較臨床試験が挙げられる。
【００９５】
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の生物学的同等性変異体は、例えば、残基若しくは配列の種々の置換を行ない、又は生物活性に必要ではない末端若しくは内部残基若しくは配列を除去することによって構築することができる。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生時に不要又は不適切な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、除去するか又は他のアミノ酸と置換することができる。
【００９６】
処置集団
本発明は、本発明の組成物を必要とする患者を処置する治療方法を提供する。ライフスタイルの改善及び従来の薬剤処置が、コレステロールレベルの低下にしばしば成功する一方で、すべての患者が当該アプローチにより推奨目標コレステロールレベルを達成できるわけではない。家族性高コレステロール血症（ＦＨ）などの種々の病態は、従来治療法の積極的使用にもかかわらずＬＤＬ−Ｃレベルの低下に抵抗的であるように見える。ホモ接合性及びヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｏＦＨ、ｈｅＦＨ）は、早期アテローム性動脈硬化性血管疾患に関連する病態である。しかしながら、ｈｏＦＨと診断された患者は、従来の薬物療法に大きく抵抗性であり、限定された処置選択肢を有する。特に、コレステロール合成を阻害し、肝ＬＤＬ受容体をアップレギュレートすることによりＬＤＬ−Ｃを減少させるスタチンによる処置は、ＬＤＬ受容体が存在せず又は欠損している患者においてほとんど効果を有さないと考えられる。最近スタチンの最大用量で処置した遺伝子型確認ｈｏＦＨの患者において、わずか約２０％より少ない平均ＬＤＬ−Ｃ減少が報告されている。本レジメンに対してエゼチミブ１０ｍｇ／日の追加は２７％のＬＤＬ−Ｃレベルの総減少をもたらしたが、これは最適から尚かけ離れている。同様に、多くの患者はスタチン不応性であり、スタチン療法でコントロール不良であり、又はスタチン療法に耐容性がなく；一般に、これらの患者は代替治療法によりコレステロールコントロールを達成することができない。現行の治療選択肢の欠点に対処することができる新処置法に対し、満たされていない大きな医学的ニーズがある。
【００９７】
本発明の治療法により処置可能な特定集団としては、ＬＤＬアフェレーシス適応患者、ＰＣＳＫ９活性化（ＧＯＦ）突然変異の対象、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）；スタチン不耐性又はスタチンコントロール不良の原発性高コレステロール血症患者；及び予防的処置可能と考えられる高コレステロール血症発症リスクを有する対象が含まれる。
治療的投与及び製剤
【００９８】
本発明は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明に基づいた医薬組成物の投与は、好適な担体、賦形剤、及び移動、送達、耐容性などの改良を提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤とともに投与することができる。適切な製剤の数量は、すべての製剤化学者に公知の処方集に見出すことができる：Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA
。これらの製剤は、例えば、散剤、パスタ剤、軟膏剤、ジェリー剤、ろう剤、油、脂質類、ベシクル（LIPOFECTIN（商標）など）を含む脂質（陽イオン性又は陰イオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収パスタ剤、水中油及び油中水懸濁剤、懸濁剤カーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル剤、及びカーボワックスを含む半固形混合剤を含む。またPowell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311をも参照されたい。
【００９９】
用量は、投与される対象の年齢及びサイズ、標的疾患、病態、投与経路などによって変動してもよい。本発明の抗体が、高コレステロール血症、ＬＤＬ及びアポリポタンパク質Ｂに関連する障害、及び脂質代謝障害などを含み、ＰＣＳＫ９に関連する種々の病態及び疾患を処置するために使用される場合には、本発明の抗体を、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の通常単回投与で静脈内投与することが有利である。病態の重症度によって、処置の頻度及び持続期間は調整することができる。
【０１００】
種々の送達システムは公知であり、本発明の医薬組成物、例えば、リポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス、を投与するために使用することができる（例えば Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）。導入の方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含むが、これらに限定されるものではない。組成物は、いずれかの好都合な経路により、例えば、輸注又は静脈内ボーラスにより、上皮又は皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、結腸及び腸粘膜など）を通した吸収により投与してもよく、そして他の生理活性物質と一緒に投与してもよい。投与は全身的又は局所的であってよい。
【０１０１】
医薬組成物はベシクルで、特にリポソーム（Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,
Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照; 一般に同書を参照）で送達することもできる。
【０１０２】
特定の状況では、医薬組成物は放出制御システムで送達することもできる。１つの実施態様では、ポンプを使用してもよい（Sefton (1987) CRC Crit. Ref.Biomed. Eng. 14:201を参照）。別の実施態様では、高分子材料を使用してもよい；Medical Applications of
Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974)を参照。尚別の実施態様では、放出制御システムは、組成物標的に近接して留置するこ
とができ、その結果全身投与用量のわずかだけが必要となる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照）。
【０１０３】
注射製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射用剤形、点滴静注などの剤形を含んでよい。これらの注射製剤は公知の方法により調製することができる。例えば、注射製剤は、例えば、通常注射用に便利に使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中で、上記の抗体又はその塩を溶解、懸濁又は乳化することにより調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の助剤などを含む等張液があり、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体）などの適切な可溶化剤との組み合わせで使用してもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの適切な可溶化剤との組み合わせで使用してもよい。このように調製した注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。本発明の医薬組成物は、標準注射針及びシリンジにより皮下又は静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物を送達するのに容易な適用性を有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能又は使い捨て可能となり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、一般的に医薬組成物を含む交換可能カートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になった時点で、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含む別のカートリッジと交換することができる。このようにペン送達デバイスは再使用することができる。使い捨てペン送達デバイスでは、交換式カートリッジはない。むしろ使い捨てペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバに貯められる医薬組成物であらかじめ充填される。リザーバの組成物が空になった時点で、全デバイスは廃棄される。
【０１０４】
多くの再利用可能なペン及び自己注射送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用性を有する。例としては、例えば、わずか数例を挙げると、AUTOPEN（商標） (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK)、DISETRONIC（商標）ペン (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25（商標）ペン、HUMALOG（商標）ペン, HUMALIN 70/30（商標）ペン(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN)、NOVOPEN（商標） I、II及びIII (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、NOVOPEN JUNIOR（商標） (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、BD（商標）ペン (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPEN（商標）、OPTIPEN PRO（商標）、 OPTIPEN STARLET（商標）、及び OPTICLIK（商標） (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)を含むが、それらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物の皮下送達において適用を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、SOLOSTAR（商標）ペン(sanofi-aventis)、FLEXPEN（商標） (Novo Nordisk)、及びKWIKPEN（商標） (Eli Lilly)を含むが、それらに限定されるものでない。
【０１０５】
有利なことには、上記の経口又は非経口使用の医薬組成物は、有効成分の用量に適合させるのに適する単位用量の剤形に調製される。単位用量の当該剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。含まれる前述の抗体量は、一般に単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態では、前述の抗体は約５〜約１００ｍｇで、及び他の剤形に対しては約１０〜約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。
【０１０６】
本発明は、本発明の抗体又は抗体フラグメントが、ｈＰＣＳＫ９に関わる様々な病態と関連する高コレステロール血症を処置するのに有用な治療方法を提供する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体又は抗体フラグメントは、特に高コレステロール血症などの処置に有用である。併用療法には、例えば、（１）セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなどの、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−コエンザイムＡ（ＣｏＡ）レダクターゼを阻害することにより、コレステロール合成の細胞枯渇を誘導する；（２）コレステロール取り込み及び／又は胆汁酸再吸収を阻害する；（３）リポ蛋白質異化作用を増加させる（ナイアシンなど）、１つ又はそれ以上のいずれかの薬剤；及び２２−ヒドロキシコレステロールなどのコレステロール排泄の役割を果たすＬＸＲ転写因子のアクチベーター、又はエゼチミブ＋シンバスタチンなどの固定組み合わせ；胆汁レジン（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）とスタチン、ナイアシン＋スタチンの固定組み合わせ（例えば、ナイアシンとロバスタチン）；と併せた、又はω−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール）などの他の脂質低下薬、と併せた本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を含んでよい。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法及び組成物の作り方および使い方の完全な開示及び説明を提供するために記載するものであり、本発明者らが彼らの発明と考えている範囲を限定することを意図するものではない。使用した数に関して正確さを確保する努力をしているが、ある程度の実験誤差及び偏差は含まれる筈のものである。特に明記しない限り、分子量は平均分子量で、温度は摂氏で、そして圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【０１０８】
〔実施例１〕：ヒトＰＣＳＫ９に対するヒト抗体の作成
VELOCIMMUNE（商標）マウスをＰＣＳＫ９で免疫し、抗体免疫応答を、これらのマウスから得られた血清を用いて抗原特異的免疫アッセイによってモニタリングした。 Ｂ細胞を発現する抗ｈＰＣＳＫ９を、高抗ｈＰＣＳＫ９抗体力価を有することを示した免疫マウスの脾臓から採取し、マウス骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成させた。ハイブリドーマをスクリーニングして選択し、下記の分析法を用いてｈＰＣＳＫ９特異抗体を発現する細胞株を同定した。本分析法により、Ｈ１Ｍ３００、Ｈ１Ｍ５０４、Ｈ１Ｍ５０５、Ｈ１Ｍ５００、Ｈ１Ｍ４９７、Ｈ１Ｍ４９８、Ｈ１Ｍ４９４、Ｈ１Ｍ３０９、Ｈ１Ｍ３１２、Ｈ１Ｍ４９９、Ｈ１Ｍ４９３、Ｈ１Ｍ４９６、Ｈ１Ｍ５０３、Ｈ１Ｍ５０２、Ｈ１Ｍ５０８、Ｈ１Ｍ４９５及びＨ１Ｍ４９２と命名したキメラ抗ｈＰＣＳＫ９抗体を産生する幾つかの細胞株を同定した。
【０１０９】
また、ヒトＰＣＳＫ９特異的抗体は、米国特許出願第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載のように、骨髄腫細胞への融合なしに抗原免疫Ｂ細胞から直接単離した。重鎖及び軽鎖可変領域をクローン化し、Ｈ１Ｈ３１３、Ｈ１Ｈ３１４、Ｈ１Ｈ３１５、Ｈ１Ｈ３１６、Ｈ１Ｈ３１７、Ｈ１Ｈ３１８、Ｈ１Ｈ３２０、Ｈ１Ｈ３２１及びＨ１Ｈ３３４と命名した完全ヒト抗ｈＰＣＳＫ９抗体を作成した。これらの抗体を発現する安定組み換え抗体発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。
【０１１０】
〔実施例２〕遺伝子利用解析
産生ｍＡｂｓの構造を解析するために、抗体可変領域をコード化する核酸をクローン化し配列決定した。可変領域の予測アミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列決定により確認した。核酸配列及びｍＡｂｓの予測アミノ酸配列から、遺伝子使用を各抗体鎖について同定した。
【０１１１】
【表１】
0005902122.tif 000003
【０１１２】
〔実施例３〕抗原結合親和性の測定
前述のハイブリドーマ細胞株によって作成した、ｍＡｂｓに結合するｈＰＣＳＫ９の平衡解離定数（ＫD）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（BIACORE（商標）T100）の表面動力学によって測定した。各抗体は、捕捉抗体表面を形成するために、BIACORE（商標）チップへの直接化学カップリングを通して作出した、ヤギ抗マウ
スＩｇＧポリクローナル抗体表面上で４μｌ／分の流速にて９０秒間捕捉した。５０ｎＭ又は１２．５ｎＭ濃度のｈＰＣＳＫ９−ｍｙｃ−ｍｙｃ−ｈｉｓ（ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ）を、５０μｌ／分の流速で３００秒間捕捉抗体表面上に注入し、そして抗原抗体解離を２５℃か又は３７℃で１５分間モニタリングした（ＫD＝ｐＭ；Ｔ1/2＝分）。
【０１１３】
【表２】
0005902122.tif 000004
【０１１４】
脾細胞の直接単離を経て作成した、ｍＡｂｓへのｈＰＣＳＫ９結合についての平衡解離定数（ＫD）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（BIACORE（商標）T100）において表面動力学によって測定した。選択された各抗体は、捕捉抗体表面を形成するために、BIACORE（商標）チップへの直接化学カップリングを通して作出した、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体表面上で２μｌ／分の流速にて６分間捕捉した。５０ｎＭ又は１２．５ｎＭ濃度のＰＣＳＫ９−ｍｍｈを、７０μｌ／分の流速にて５分間捕捉抗体表面上に注入し、そして抗原抗体解離を２５℃か又は３７℃で１５分間モニタリングした（ＫD＝ｐＭ；Ｔ1/2＝分）。
【０１１５】
【表３】
0005902122.tif 000005
【０１１６】
２５℃におけるタグ付きアカゲザル（Macaca mulata）ＰＣＳＫ９（ｍｍＰＣＳＫ９；配列番号７５６）（ｍｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈ）についての選択ｍＡｂｓの解離速度（ｋｄ）は、前述のようにして決定した。
【０１１７】
【表４】
0005902122.tif 000006
【０１１８】
〔実施例４〕抗原結合親和性に対するｐＨの影響
ＣＨＯ細胞産生完全ヒトｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓへの抗原結合親和性に対するｐＨの影響を、前述のように評価した。試験ｍＡｂｓは、Ｈ１Ｈ３１６Ｐ（「３１６Ｐ」）（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列番号９０／９２；ＣＤＲ配列の配列番号７６／７８／８０及び８４／８６／８８）、及びＨ１Ｍ３００Ｎ（「３００Ｎ」）（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列番号２１８／２２６；ＣＤＲ配列の配列番号２２０／２２２／２２４及び２２８／２３０／２３２）の完全ヒトバージョンである。ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈは抗ｍｙｃｍＡｂ表面上に、高密度（約３５〜４５共鳴単位）（ＲＵ）か又は低密度（約５〜１４ＲＵ）で捕捉した。各抗体は、ＨＢＳＴ（ｐＨ７．４又はｐＨ５．５）中５０ｎＭで、２５℃で１００μｌ／ｍｌの流速にて１.５分間捕捉ｈＰＣＳＫ９表面上に注入し、そして抗原抗体解離を１０分間モニタリングした。コントロールＩ：抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂ配列番号７９／１０１（ＷＯ２００８／０６３３８２）（ＫD＝ｐＭ；Ｔ1/2＝分）。
【０１１９】
【表５】
0005902122.tif 000007
【０１２０】
ｐＨ７．４又はｐＨ５．５での３１６Ｐ及び３００Ｎの抗原結合特性を、上記のように改良BIACORE（商標）アッセイによって測定した。簡潔に言えば、ｍＡｂｓは、アミンカップリングを介してBIACORE（商標）ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。様々な濃度のｍｙｃ−ｍｙｃ−ｈｉｓタグ付きｈＰＣＳＫ９、マウスＰＣＳＫ９（ｍＰＣＳＫ９、配列番号７５７）、Ｄ３７４Ｙの機能獲得型（ＧＯＦ）点突然変異（ｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ））を有するｈＰＣＳＫ９、カニクイザル（Macaca fascicularis) ＰＣＳＫ９（ｍｆＰＣＳＫ９、配列番号７６１）（ｍｆＰＣＳＫ９）、ラット(Rattus norvegicus) ＰＣＳＫ９（ｒＰＣＳＫ９、配列番号７６３）及びｈｉｓ−タグ付きシリアンゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus) ＰＣＳＫ９（ｍａＰＣＳＫ９、配列番号７６２）（ｍａＰＣＳＫ９）を、１１から１００ｎＭまでの範囲で、１００μｌ／ｍｌの流速にて１.５分間抗体表面上に注入し、そして抗原抗体解離を２５℃（表６）か又は３７℃（表７）において５分間リアルタイムでモニタリングした。コントロールII：抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓ配列番号６７／１２（ＷＯ２００９／０２６５５８）。ＮＢ：実験条件下で結合を認めなかった。（ＫD＝ｐＭ；Ｔ1/2＝分）。
【０１２１】
【表６】
0005902122.tif 000008
【０１２２】
【表７】
0005902122.tif 000009
【０１２３】
〔実施例５〕点突然変異Ｄ３７４Ｙを有するｈＰＣＳＫ９への抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの結合
Ｄ３７４Ｙの機能獲得型（ＧＯＦ）点突然変異を有するｈＰＣＳＫに対する、選択抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓ（ｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈ）の結合親和性を、前述のように決定した。各抗体は、捕捉抗体表面を形成するために、BIACORE（商標）チップへの直接化学カップリングを通して作出した、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体表面上に４０μｌ／分の流速にて８〜３０秒間捕捉した。１．７８ｎＭ〜１００ｎＭの種々濃度のｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈを、５０μｌ／分の流速で５分間捕捉抗体表面上に注入し、そしてｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈ及び抗体の解離を２５℃で１５分間モニタリングした。コントロールIII：抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓ配列番号４９／２３（ＷＯ２００９／０２６５５８）（ＫD＝ｐＭ；Ｔ1/2＝分）。
【０１２４】
【表８】
0005902122.tif 000010
【０１２５】
〔実施例６〕抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの結合特異性
３１６Ｐ、３００Ｎ、及びコントロールＩ抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓを、BIACORE（商標）2000のアミン結合抗ｈＦｃＣＭ５チップ上に捕捉した。タグ付き（ｍｙｃ−ｍｙｃ−ｈｉｓ）ヒトＰＣＳＫ９、ヒトＰＣＳＫ１（ｈＰＣＳＫ１）（配列番号７５９）、ヒトＰＣＳＫ７（ｈＰＣＳＫ７）（配列番号７６０）、又はマウスＰＣＳＫ９を、捕捉ｍＡｂ表面上に注入し（１００ｎＭ）、２５℃で５分間結合できるようにした。ＲＵの変化を記録した。結果：３００Ｎ及びコントロールＩはｈＰＣＳＫ９だけに結合し、３１６ＰはｈＰＣＳＫ９及びｍＰＣＳＫ９の両方を結合した。
【０１２６】
抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの結合特異性をＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔に言えば、抗ｈＰＣＳＫ９抗体を９６ウェルプレートにコーティングした。１．２ｎＭのヒトＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍａＰＣＳＫ９−ｈ、ｈＰＣＳＫ１−ｍｍｈ、又はｈＰＣＳＫ７−ｍｍｈを抗体コーティングプレートに加えて、ＲＴで１時間インキュベートした。次に、プレートに結合したＰＣＳＫタンパク質をＨＲＰ結合抗Ｈｉｓ抗体によって検出した。結果は、３１６Ｐはヒト、マウス、及びハムスターＰＣＳＫ９に結合するが、一方で３００Ｎ及びコントロールＩはｈＰＣＳＫ９だけを結合することを示した。いずれの抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓも、ｈＰＣＳＫ１又はｈＰＣＳＫ７に顕著な結合を示さなかった。
【０１２７】
〔実施例７〕抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの交差反応
抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓと、ｍｍＰＣＳＫ９、ｍｆＰＣＳＫ９、ｍＰＣＳＫ９、ｍａＰＣＳＫ９、又はｒＰＣＳＫ９との交差反応は、BIACORE（商標）3000を用いて測定した。
抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓをBIACORE（商標）チップへの直接化学カップリングを通して作出した抗ｈＦｃ表面上で捕捉した。精製タグ付きｈＰＣＳＫ９、ｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）、ｍｍＰＣＳＫ９、ｍｆＰＣＳＫ９、ｍＰＣＳＫ９、ｍａＰＣＳＫ９、又はｒＰＣＳＫ９を、各々１．５６ｎＭ〜５０ｎＭの濃度で２５℃又は３７℃において抗体表面に注入した。３１６Ｐ、３００Ｎ、コントロールＩ、コントロールII、コントロールIII及びＰＣＳＫ９タンパク質間の結合を測定した（ＫD＝ｐＭ；Ｔ1/2＝分）。
【０１２８】
【表９】
0005902122.tif 000011
【０１２９】
【表１０】
0005902122.tif 000012
【０１３０】
【表１１】
0005902122.tif 000013
【０１３１】
【表１２】
0005902122.tif 000014
【０１３２】
【表１３】
0005902122.tif 000015
【０１３３】
〔実施例８〕ｈＰＣＳＫ９とｈＬＤＬＲドメイン間の結合の阻害
選択された抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの、ヒトＬＤＬＲ完全長細胞外ドメイン（ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ配列番号７５８）、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメイン（配列番号７５８のアミノ酸３１３−３５５）、又はｈＬＤＬＲＥＧＦ−ＡＢドメイン（配列番号７５８のアミノ酸３１４−３９３）(LDLR Genbank number NM_000527)へのｈＰＣＳＫ９結合遮断能力を、BIACORE（商標）3000を用いて評価した。簡潔に言えば、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ、ＥＧＦ−Ａ−ｈＦｃ、又はＥＧＦ−ＡＢ−ｈＦｃタンパク質を、受容体又は受容体フラグメント表面を作製するためにＣＭ５チップ上でアミン結合した。選択された抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓを、６２．５ｎＭ（抗原に対して２．５倍過剰）で、２５ｎＭのｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈとプレミックスし、続いて２５℃で４０分インキュベーションして、平衡溶液を形成するために抗体抗原結合が平衡に達することができるようにした。平衡溶液を、２５℃で４０分間２μｌ／分にて受容体又は受容体フラグメント上に注入した。抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ、ＥＧＦ−Ａ−ｈＦｃ、又はＥＧＦ−ＡＢ−ｈＦｃへの結合に因るＲＵの変化を測定した。結果は、Ｈ１Ｈ３１６Ｐ及びＨ１Ｍ３００Ｎは、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈの、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメイン、及びｈＬＤＬＲＥＧＦ−ＡＢドメインへの結合を遮断した；Ｈ１Ｈ３２０Ｐは、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈの、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ及びｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメインへの結合を遮断した；そしてＨ１Ｈ３２１Ｐは、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈのｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメインへの結合を遮断した；ことを示す。
【０１３４】
ｍＡｂｓの、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメイン、又はｈＬＤＬＲＥＧＦ−ＡＢドメインへのｈＰＣＳＫ９結合遮断能力についても、ＥＬＩＳＡベース免疫アッセイで評価した。簡潔に言えば、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏ、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａ−ｈＦｃ又はｈＬＤＬＲＥＧＦ−ＡＢ−ｈＦｃを、各々２  μｇ／ｍｌでＰＢＳ緩衝液中４℃にて一夜９６ウェルプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＢＳＡで遮断した。本プレートを用いて、種々の濃度の抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓで前平衡化した、ＰＣＳＫ９−ｍｍｈ溶液中にて遊離ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈを測定した。一定量のｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ（５００ｐＭ）を、連続希釈法において０から〜５０ｎＭまでの範囲の種々量の抗体とプレミックスし、続いて室温（ＲＴ）において１時間インキュベーションして、抗体抗原結合が平衡に達するようにした。平衡試料溶液を受容体又は受容体フラグメントコーティングプレートに移した。１時間の結合後、洗浄して、結合ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈはＨＲＰ結合ｍｙｃ抗体を用いて検出した。ＩＣ50値（ｐＭ）を、プレートコーティング受容体又は受容体フラグメントに結合したｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈの５０％減少達成に必要な抗体量として測定した。結果は、特異的ｍＡｂｓが、中性ｐＨ（７．２）及び酸性ｐＨ（５．５）の両方で３受容体の結合を機能的に遮断することを示す。
【０１３５】
【表１４】
0005902122.tif 000016
【０１３６】
本ｍＡｂｓの、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメイン又はｈＬＤＬＲＥＧＦ−ＡＢドメインへのｈＰＣＳＫ９ＧＯＦ変異体ｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ−ｍｍｈ結合遮断能力（ｐＭでのＩＣ50値）を、一定量の０．０５ｎＭのｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈを用いて、上記のＥＬＩＳＡに基づく免疫アッセイで評価した。
【０１３７】
【表１５】
0005902122.tif 000017
【０１３８】
本ｍＡｂｓの、ｈＬＤＬＲ−ｅｃｔｏドメイン、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメイン、又はｈＬＤＬＲＥＧＦ−ＡＢドメインへの、ｍｍＰＣＳＫ９か又はｍＰＣＳＫ９結合遮断能力（ｐＭでのＩＣ50値）を、一定量の１ｎＭのｍｍｈタグ付きｍｍＰＣＳＫ９か又は１ｎＭのｍＰＣＳＫ９を用いて、上記のＥＬＩＳＡに基づく免疫アッセイにより、中性ｐＨ７．２で評価した。
【０１３９】
【表１６】
0005902122.tif 000018
【０１４０】
本ｍＡｂｓの、ｈＬＤＬＲＥＧＦ−Ａドメインへの、ｈＰＣＳＫ９、ｍｍＰＣＳＫ９、ｒＰＣＳＫ９、ｍａＰＣＳＫ９、ｍｆＰＣＳＫ９、又はｍＰＣＳＫ９結合遮断能力（ｐＭでのＩＣ50値）を、一定量の０．５ｎＭのｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、１ｎＭのｍｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、１ｎＭのｒＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、１ｎＭのｍａＰＣＳＫ９−ｈ、０．３ｎＭのｍｆＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、又は１ｎＭのｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈを用いて、上記のＥＬＩＳＡに基づく免疫アッセイにより、中性ｐＨ（７．２）（表１７）又は酸性ｐＨ（５．５、表１８）で評価した。
【０１４１】
【表１７】
0005902122.tif 000019
【０１４２】
【表１８】
0005902122.tif 000020
【０１４３】
３１６Ｐ及びコントロールＩの、ｈＬＤＬＲへのｈＰＣＳＫ９結合遮断能力についても測定した。簡潔に言えば、組み換えｈＬＤＬＲ又はｈＬＤＬＲ−ＥＧＦＡ−ｍＦｃをBIACORE（商標） ＣＭ５チップにアミン結合を経て固定化した。１００ｎＭのｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ及び３１６Ｐ、コントロールＩｍＡｂ、又は非ｈＰＣＳＫ９特異的ｍＡｂ（各々２５０ｎＭ）をＲＴで１時間インキュベートし、次いで１０μｌ／ｍｌの流速にて２５℃で１５分間ｈＬＤＬＲ又はｈＬＤＬＲ−ＥＧＦＡ表面上に注入した。ｈＬＤＬＲか又はｈＬＤＬＲ−ＥＧＦＡの混合物における、遊離ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ間の結合に因るＲＵの変化を記録した。ｈＬＤＬＲか又はｈＬＤＬＲ−ＥＧＦＡへのｈＰＣＳＫ９の結合は、３１６Ｐ及び３００Ｎによって完全に遮断されたが、コントロールＩｍＡｂでは遮断されなかった。
【０１４４】
〔実施例９〕エピトープマッピング
エピトープ結合特異性を明らかにするために、特異的ヒトＰＣＳＫ９ドメインがマウスＰＣＳＫ９ドメインで置換された、３種のキメラＰＣＳＫ９−ｍｍｈタンパク質を作成した。キメラタンパク質＃１は、マウスＰＣＳＫ９プロドメイン（配列番号７５７のアミノ酸残基１−１５５）で、続いてヒトＰＣＳＫ９触媒ドメイン（配列番号７５５の残基１５３−４２５）及びマウスＰＣＳＫ９Ｃ末端ドメイン（配列番号７５７の残基４２９−６９４）（ｍＰｒｏ−ｈＣａｔ−ｍＣ−ｔｅｒｍ−ｍｍｈ）で構成される。キメラタンパク質＃２は、ヒトＰＣＳＫ９プロドメイン（配列番号７５５のアミノ酸残基１−１５２）で、続いてマウスＰＣＳＫ９触媒ドメイン（配列番号７５７の残基１５６−４２８）及びマウスＰＣＳＫ９Ｃ末端（ｈＰｒｏ−ｍＣａｔ−ｍＣ−ｔｅｒｍ−ｍｍｈ）で構成される。キメラタンパク質＃３は、マウスＰＣＳＫ９プロドメイン及びマウスＰＣＳＫ９触媒ドメインで、続いてヒトＰＣＳＫ９Ｃ末端ドメイン（配列番号７５５の残基４２６−６９２）（ｍＰｒｏ−ｍＣａｔ−ｈＣ−ｔｅｒｍ−ｍｍｈ）で構成される。加えて、Ｄ３７４Ｙの点突然変異を有するｈＰＣＳＫ９（ｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈ）を作成した。
【０１４５】
ｍＡｂｓの、試験タンパク質ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、マウスＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、キメラタンパク質＃１、＃２、及び＃３、並びにｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈへの結合特異性を、以下のように試験した：本ｍＡｂｓを９６ウェルプレート上で４℃にて一夜コーティングし、次いで各試験タンパク質（１．２ｎＭ）をプレートに加えた。室温で１時間結合後、プレートを洗浄し、結合した試験タンパク質をＨＲＰ結合抗ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて検出した（＋＋＝ＯＤ＞１．０；＋＝ＯＤ０．４〜１．０；−＝ＯＤ＜０．４）。
【０１４６】
【表１９】
0005902122.tif 000021
【０１４７】
３１６Ｐ、３００Ｎ及び対照抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍｆＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｒＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、キメラタンパク質＃１、＃２、及び＃３、並びにｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）−ｍｍｈへの結合特異性を、タンパク質濃度が１．７ｎＭであることを除いて、上記と同じように試験した（−＝ＯＤ＜０．７；＋＝ＯＤ  ０．７〜１．５；＋＋＝ＯＤ＞１．５）。
【０１４８】
【表２０】
0005902122.tif 000022
【０１４９】
選択ｍＡｂｓでの類似の結果をBIACORE（商標）結合分析によって得た。簡潔に言えば、３１６Ｐ、３００Ｎ、又はコントロールＩｍＡｂを、アミン結合抗ｈＦｃＣＭ５チップ上で捕捉し、１００ｎＭの各タンパク質を本ｍＡｂ捕捉表面上に注入した。本ｍＡｂ捕捉表面への各蛋白質の結合に因るＲＵの変化を測定した。
【０１５０】
【表２１】
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【０１５１】
ｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈと交差反応する３１６Ｐの結合特異性を更に評価するために、結合ドメイン特異性を測定する交差競合ＥＬＩＳＡ分析法を開発した。簡潔に言えば、先ず、キメラタンパク質＃１、＃２、又は＃３に特異的なｍＡｂｓの１μｇ／ｍｌを、９６ウェルプレート上に一夜コーティングした。次いで、ヒトＰＣＳＫ９−ｍｍｈ（２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、続いて室温で１時間インキュベーションした。３１６Ｐ（１μｇ／ｍｌ）を加えて、更に１時間室温でインキュベートした。プレートへ結合した３１６Ｐを、ＨＲＰ結合抗ｈＦｃポリクローナル抗体を用いて検出した。ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈへの３１６Ｐ結合は、キメラタンパク質＃２又はキメラタンパク質＃３に特異的なｍＡｂｓの存在によって影響されなかったが、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈへの３１６Ｐの結合は、キメラタンパク質＃１に特異的な抗体の存在で大きく減少した。
【０１５２】
〔実施例１０〕BIACORE（商標）に基づく抗原結合プロファイル評価
抗体結合プロファイルは、BIACORE（商標）1000を用いて、３１６Ｐ、３００Ｎ、コントロールＩ、II、及びIIIｍＡｂｓに対しても確立した。簡潔に言えば、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈは抗ｍｙｃ表面上で捕捉した。第１の抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）をＰＣＳＫ９結合表面上に１０分間、２５℃で１０μｌ／分の流速にて注入した。次いで第２のｈＰＣＳＫ９ｍＡｂ（５０μｇ／ｍｌ）を、第１のｍＡｂ結合表面上に１０分間、２５℃で１０μｌ／分の流速にて注入した。第１のｍＡｂの、第２のｍＡｂ結合遮断能力を測定し、パーセント阻害として表わした。
【０１５３】
【表２２】
0005902122.tif 000024
【０１５４】
〔実施例１１〕抗ｈＰＣＳＫ９抗体によるＬＤＬ取り込みの増加
抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの、インビトロでのＬＤＬ取り込み増加能力を、ヒト肝細胞肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いて測定した。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレート上に、ＤＭＥＭ完全培地中９×１０4細胞／ウェルで接種し、そしてＨｅｐＧ２単層を形成させるために、５％ＣＯ2の存在下で３７℃で６時間インキュベートした。リポ蛋白質欠乏培地（ＬＰＤＳ）中５０ｎＭのヒトＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、及び試験ｍＡｂを、ＬＰＤＳ培地中５００ｎＭから０．９８ｎＭまでの種々の濃度で加えた。データは、各実験でのＩＣ50値で表わした（ＩＣ50＝ＬＤＬ取込みが５０％増加する抗体濃度）。加えて、実験では、また、３１６Ｐ及び３００Ｎの両方は、ＬＤＬ取込みに対するｈＰＣＳＫ９の阻害作用を完全に逆転させることができたが、一方でコントロールＩｍＡｂ又はＨ１Ｍ５０８抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂは、阻害作用を約５０％だけ逆転させることを示した。
【０１５５】
【表２３】
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【０１５６】
抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの、種々の哺乳動物からのＰＣＳＫ９タンパク質によるＬＤＬ取り込みに対する阻害作用逆転能力についても、上記のＨｅｐＧ２細胞株で試験した。簡潔に言えば、ＨｅｐＧ２細胞を、ＬＰＤＳ培地（５００ｎＭから始める）中で抗体の連続希釈法により、及び５０ｎＭのｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍｆＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｍＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、ｒＰＣＳＫ９−ｍｍｈ、又はｍａＰＣＳＫ９−ｈと一夜インキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞を、また、ＬＰＤＳ（５０ｎＭから始める）中で抗体の連続希釈法により、及び１ｎＭのｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）と一夜インキュベートした。表２４に示すように、３１６Ｐは、試験したすべてのＰＣＳＫ９タンパク質によりＬＤＬに対する阻害作用を完全に逆転させることができたのに対して、３００Ｎは、ｈＰＣＳＫ９、ｈＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）、及びｍｆＰＣＳＫ９によるＬＤＬ取り込みへの阻害作用を逆転させることができただけであった。値はｎＭＩＣ50で表わした。
【０１５７】
【表２４】
0005902122.tif 000026
【０１５８】
〔実施例１２〕インビボにおけるｈＰＣＳＫ９の生物学的作用の中和
ＰＣＳＫ９を中和する生物学的作用を評価するために、完全長ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈをコード化するＤＮＡ構築物の流体力学的送達（ＨＤＤ）により、ｈＰＣＳＫ９をＣ５７ＢＬ／６マウスに過剰発現させた。４マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に空ベクター／生理食塩水（対照）を注入し、１６マウスに５０μｇのｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈ−ＤＮＡ／生理食塩水混合物を体重の１０％に相当する分だけ尾静脈に注射した。ＨＤＤの７日後に、ｈＰＣＳＫ９の送達は、総コレステロールの１．６倍上昇、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の３．４倍上昇及び非ＨＤＬコレステロールの１．９倍上昇（対照と比べて）をもたらした。７日目の血清ｈＰＣＳＫ９レベルは、すべて定量的ＥＬＩＳＡで評価して１μｇ／ｍｌより大きかった。
【０１５９】
ＨＤＤ後の６日目に、３実験群（１、５又は１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝４／群）に対して、Ｈ１Ｍ３００Ｎを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を経て投与した結果、血清コレステロールレベルの顕著な減弱をもたらした。１、５又は１０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｍ３００Ｎ処置群において、投与後１８時間に総コレステロールはそれぞれ９．８％、２６．３％及び２６．８％減少し、ＬＤＬ−Ｃは５．１％、５２．３％及び５６．７％減少し、そして非ＨＤＬコレステロールは７．４％、３３．８％及び２８．６％減少した。
【０１６０】
〔実施例１３〕サルでの薬物動力学的及び血清化学的研究
薬物動力学的（ＰＫ）研究を、５〜７ｋｇの体重範囲で３〜５歳のナイーブ雄カニクイザル(Macaca fascicularis) で実施した。
【０１６１】
群割付
サルを５処置群に割り付けた：処置群１（ｎ＝３）は対照緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６、１ｍｌ／ｋｇ）の投与を受けた；処置群２（ｎ＝３）は１ｍｌ／ｋｇの３１６Ｐ（５ｍｇ／ｍｌ）の投与を受けた；処置群３（ｎ＝３）は１ｍｌ／ｋｇの３００Ｎ（５ｍｇ／ｍｌ）の投与を受けた；処置群４（ｎ＝３）は１ｍｌ／ｋｇの３１６Ｐ（１５ｍｇ／ｍｌ）の投与を受けた；そして処置群５（ｎ＝３）は１ｍｌ／ｋｇの３００Ｎ（１５ｍｇ／ｍｌ）の投与を受けた。すべての処置は、ＩＶボーラスで投与し、続いて１ｍｌの生理食塩水洗浄を受けた。総投与量（ｍｌ）は、最新の体重（各動物は環境順化時に２回、そして試験期間を通して毎週１回体重測定した）を基に計算した。試験ｍＡｂ又はバッファーコントロールの単回用量を１日目に投与した。
【０１６２】
動物の保護
動物は温度及び湿度監視環境に入れられた。温度及び相対湿度の目標範囲は、それぞれ１８〜２９°及び３０〜７０％であった。自動照明システムは１２時間の概日周期を与えた。暗周期は研究又は施設関連活動に対して妨害し得た。動物は、動物保護法及び実験動物の保護及び使用に関する指針（National Research Council 1996）に記載の勧告に適合するケージに個別に入れられた。
【０１６３】
飼料及び給餌
動物は、NBL USA SOPに従い１日２回給餌した。動物は特定の処置で必要な場合には絶食させた（例えば、血清化学のための採血、又は採尿の前、又は鎮静を含む処置が実施される場合）。飼料は、定期的に汚染物質を分析し、メーカー規格内であることが認められた。
【０１６４】
実験計画
適正な数の動物をNBL USAストックから選択した。動物の健康は獣医スタッフで審査し、そして血清化学、血液学、及び凝固スクリーニングを実施した。健常が確認された１６匹の雄を、研究に割り付けた。１６匹の雄を特定研究群に割り付けて、残りの動物は予備として利用した。血清コレステロールレベル（順化における２系列の平均を基準）を組み入れた層化ランダム化スキームを用いて、動物を研究群に割り付けた。
【０１６５】
順化期間
既隔離動物を投与開始前に最小１４日間試験室で順化させた。順化段階データは予備を含み全動物から収集した。全動物について、研究結果に影響を与える可能性のある行動異常を評価した。予備動物は１日後にストックに戻した。
【０１６６】
血液採取
血液は、拘束、覚醒動物の末梢静脈から静脈穿刺で採取した。可能な限り、単回採血を経て血液を採取し、次いで適切に分割した。
【０１６７】
ＰＫ研究
血液試料（１．５ｍｌ）は、投与前、２分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、及びその後２４時間毎に１回血清分離管（ＳＳＴ）で採取した。標本保存血清は２バイアルに移して−６０度又はそれ以下で保存した。
【０１６８】
血清試料は、最適化ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）手順を用いて解析した。簡潔に言えば、マイクロタイタープレートを先ずｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈでコーティングした。次いで、試験ｍＡｂ３１６Ｐ又は３００Ｎを、ｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈプレート上に捕捉した。捕捉３１６Ｐ又は３００Ｎは、ビオチニル化マウス抗ｈＩｇＧ４を用いて検出し、続いてNeutrAvidin−ＨＲＰへ結合させた。１００〜１．５６ｎｇ／ｍｌの範囲で種々濃度の３１６Ｐ又は３００Ｎを標準として使用した。３１６Ｐ又は３００Ｎの不存在下に１％のサル血清（分析マトリックス）をゼロ（０ｎｇ／ｍｌ）標準として使用した。図２に示す結果は、血清３１６Ｐ及び３００Ｎレベルの用量依存性増加を示す。ＰＫパラメーターを、WinNonlinソフトウェア（非コンパートメント解析、モデル２０１−ＩＶボーラス投与）を用いて解析した。
【０１６９】
【表２５】
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【０１７０】
血清化学検査
血液試料を、投与前、１２時間、４８時間、及びその後４８時間毎に１回、臨床化学分析、特に脂質プロファイル（即ち、コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド）のために採取した。投与後１２時間試料を除いて、全動物は試料採取前に一夜絶食状態にした。試料量は約１ｍｌとした。化学パラメータは、オリンパス自動分析計を用いて測定した。測定パラメータ（Xybionコード）：アルブミン（ＡＬＢ）；アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）；アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；総ビリルビン（ＴＢＩＬ）；カルシウム（Ｃａ）；総コレステロール（ＴＣｈｏ）；クレアチンキナーゼ（ＣＫ）；クレアチニン（ＣＲＮ）；γグルタミルトランスアミナーゼ（ＧＧＴ）；グルコース（ＧＬＵ）；無機リン（ＩＰ）；総タンパク質（ＴＰ）；トリグリセリド（ＴＲＩＧ）；血中尿素窒素（ＢＵＮ）；グロブリン（ＧＬＯＢ）；アルブミン／グロブリン比（Ａ／Ｇ）；塩化物（Ｃｌ）；カリウム（Ｋ）；ナトリウム（Ｎａ）；ＬＤＬ及びＨＤＬコレステロール。残りの血清は−２０℃又はそれ以下で保存し、分析後１週間以内に廃棄した。
【０１７１】
１０５日の投与後時点を通過した試料の結果を図３〜７に示す。用量に関係なく初回投与後２４時間以内に、３１６Ｐ及び３００Ｎの投与を受けた動物に総コレステロール及びＬＤＬ−Ｃの減少が認められた。血清総コレステロールは急速かつ確実に減少した（〜３５％、図３）。６日までにＬＤＬ−Ｃの〜８０％の確実な減少が見られた（図４〜５）。１５ｍｇ／ｋｇ用量の３００Ｎを投与した動物では、総コレステロール（〜１０−１５％減少）及びＬＤＬ−Ｃ（〜４０％減少）  の両方の減少が、試験の少なくとも８０日まで続いた。加えて、ＨＤＬ−Ｃが１５ｍｇ／ｋｇの３１６Ｐを投与した動物で上昇した（図６）。３１６Ｐか又は３００Ｎの高用量（１５ｍｇ／ｋｇ）投与を受けた動物も、試験期間中トリグリセリドの減少を示した（図７）。３１６Ｐはベースラインと比べて８０％までのＬＤＬ−Ｃレベルの最大抑制を示した。この抑制の長さは、約１８日（５ｍｇ／ｋｇ用量）及び約４５日（１５ｍｇ／ｋｇ用量）持続する、少なくとも６０％抑制（ベースラインＬＤＬ−Ｃレベルと比べて）で用量依存性であった。３００Ｎは３１６Ｐと異なる薬力学的プロファイルを示した。３００ＮによるＬＤＬ−Ｃ抑制は同等の用量で非常に長い期間持続した（５ｍｇ／ｋｇ用量投与後２８日間に５０％ＬＤＬ−Ｃ抑制、及び１５ｍｇ／ｋｇ用量投与後約９０日間に５０％ＬＤＬ−Ｃ抑制）。ＡＬＴ及びＡＳＴ測定で測定して、肝機能の測定可能な変化はほとんど又は全く見られなかった。本試験で抗ＰＣＳＫ９抗体の投与を受けた全動物は、ＬＤＬ−Ｃ及び総コレステロールの急速な抑制を示した。
【０１７２】
３１６Ｐ及び３００Ｎの類似のＬＤＬ−Ｃ低下作用が、５ｍｇ／ｋｇの３１６Ｐか又は５ｍｇ／ｋｇの３００Ｎの単回皮下（ＳＣ）投与を受けたカニクイザルで認められた（図８）。３１６Ｐ及び３００Ｎは両方とも、ＬＤＬ−Ｃレベルを劇的に抑制し、それぞれ約１５及び３０日間ＬＤＬ−Ｃ低下作用を維持した（図８）。薬力学的効果（約４０％のＬＤＬ−Ｃ抑制）は、サル血清中の機能的抗体レベルとほぼ相関するように見える（図９）。抗体レベルが１０μｇ／ｍｌ以下に低下するに従って、ＬＤＬ−Ｃ抑制は同様に低下するように見えた。加えて、３００Ｎは３１６Ｐよりも実質的に長い循環半減期を、従って長い実測ＬＤＬ−Ｃ抑制を示した。
【０１７３】
【表２６】
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【０１７４】
〔実施例１４〕抗ｈＰＣＳＫ９抗体によるＬＤＬ受容体分解の減弱
肝ＬＤＬ受容体レベルに対するＰＣＳＫ９の生物学的効果、及びそれに続く血清ＬＤＬ−Ｃレベルに対する効果を評価するために、ｈＰＣＳＫ９を、ｈＰＣＳＫ９を発現するが、ｍＰＣＳＫ９(ＰＣＳＫ９hu/huマウス) を発現しないマウスに静脈内注射により投与した。具体的には、ＰＣＳＫ９hu/huマウスに、ＰＢＳ（対照）、又は１．２ｍｇ／ｋｇのｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈを尾静脈経由で注射した。ｈＰＣＳＫ９の送達６時間後に、血清中で（ベースラインレベルと比べて）１．４倍の総コレステロール上昇及び２．３倍のＬＤＬ−Ｃ上昇が認められた。ｈＰＣＳＫ９投与の４時間後、動物の別のコホート（ｎ＝３）における肝ＬＤＬ受容体レベルの解析では、肝ホモジネート中において検出可能なＬＤＬ受容体の顕著な低下を示した。
【０１７５】
肝ＬＤＬ受容体レベルに対する抗ｈＰＣＳＫ９の生物学的効果、及びそれに続く血清ＬＤＬ−Ｃレベルに対する効果を評価するために、３１６Ｐ及び非ｈＰＣＳＫ９特異的ｍＡｂを、上記のｈＰＣＳＫ９−ｍｍｈタンパク質注射の２０時間前に、等価用量（５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．）でＰＣＳＫ９hu/huマウスに投与した。ｈＰＣＳＫ９投与の４時間後、マウスを犠牲にし、そして合計８組織（肝臓、脳、肺、腎臓、心臓、回腸、副腎、及び膵臓）を採取して、ＬＤＬ受容体レベルをウェスタンブロット法によって測定した。ＬＤＬ受容体レベルの変化は肝臓だけに認められた。ＰＢＳ対照投与と比べて、３１６Ｐ投与は、総コレステロール及びＬＤＬコレステロールのＰＣＳＫ９媒介増加を顕著に遮断した（ベースラインでＬＤＬ−Ｃ＝２．４９ｍｇ／ｄｌ及びＰＣＳＫ９投与後６時間で３．１ｍｇ／ｄｌ；ビヒクルでの１３５％と比べて２５％増加）。非ｈＰＣＳＫ９特異的ｍＡｂの前投与は、ＰＢＳ単独からＬＤＬ−Ｃ増加を約２７％遮断した（ＰＢＳ５．６ｍｇ／ｄｌと比べてＬＤＬ−Ｃ＝４．１ｍｇ／ｄｌ）。マウスの別のコホート（ｎ＝３／群）におけるＬＤＬ受容体レベルの解析では、ＰＣＳＫ９投与によりＬＤＬ受容体の顕著な低下を示し、これは３１６Ｐによって遮断されたが、非ｈＰＣＳＫ９特異的ｍＡｂでは遮断されなかった（図１０）。
【０１７６】
種々用量の３１６Ｐの効果を、ＬＤＬ−Ｃ上昇及びｈＰＣＳＫ９レベル上昇の両方を示すＰＣＳＫ９hu/huマウスにおいても評価した。ＰＣＳＫ９hu/huマウスを、先ず高炭水化物餌料で８週間飼育して、ＬＤＬ−Ｃ及びｈＰＣＳＫ９レベルの両方を〜２倍上昇させた。３１６Ｐか又は非ｈＰＣＳＫ９特異的ｍＡｂを、各々１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇで，マウスに投与した。血清を２４時間後に採取し、ＬＤＬ−Ｃレベルを解析した。３１６Ｐは、ＬＤＬ−Ｃレベルの低下に用量依存性に有効であった（図１１）。加えて、１０ｍｇ／ｋｇ用量で投与した３１６Ｐは、２４時間以内にＬＤＬ−Ｃレベルを元（給餌前）の値に急速に逆に低下させた（データは示していない）。
【０１７７】
〔実施例１５〕マウスＰＫの研究
ＰＫ研究は、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス及び１１〜１５週齢のｈＰＣＳＫ９ヘテロ接合体マウスで実施した。コントロールＩ、３１６Ｐ、又は３００Ｎの単回注射を、各々１０ｍｇ／ｋｇでＳＣ投与した。血清出血について、０時間（出血前）、６時間、１、３、６、１０、１４、２１、２８、３５、４２及び５６日の全１２時点で、抗ｈＦｃ捕捉及び抗ｈＦｃ検出サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてｈＩｇＧレベルを測定した（図１２及び１３）。すべてのｍＡｂｓは、約３日でそれらのＴｍａｘに到達し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは約４７〜１１５μｇ／ｍｌ及びｈＰＣＳＫ９ヘテロ接合体マウスでは５５〜１９６μｇ／ｍｌの対応Ｃmaxレベルを有した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは５６日に、コントロールＩｍＡｂレベルは約１２μｇ／ｍｌで、そして３００Ｎレベルは約１１μｇ／ｍｌであったのに対して、３１６Ｐレベルは約０．０２μｇ／ｍｌより小さかった。ｈＰＣＳＫ９ヘテロ接合体マウスでは５６日に、コントロールＩｍＡｂレベルは約２９μｇ／ｍｌであったが、一方で３００Ｎ及び３１６Ｐレベルの両方は、０．０２μｇ／ｍｌの定量化限界（ＢＱＬ）以下であった。
【０１７８】
〔実施例１６〕突然変異体／変異体抗ｈＰＣＳＫ９への抗ｈＰＣＳＫ９抗体結合
ｈＰＣＳＫ９と抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓと間の結合を更に評価するために、各変異体が単一点突然変異を含み、そして２つの変異体ｈＰＣＳＫ９タンパク質が各々二重突然変異を含む、２１変異体ｈＰＣＳＫ９タンパク質を作成した。選択された各抗体を、BIACORE（商標）チップへの直接化学カップリングを通して作製したＦ（ａｂ′）2抗ｈＩｇＧ表面上に捕捉して、捕捉抗体表面を形成させた。次いで、１００ｎＭから２５ｎＭまでの種々の濃度で各ｍｍｈタグ付き変異体ｈＰＣＳＫ９を、６０μｌ／分の流速で２４０秒間捕捉抗体表面上に注入し、そして変異体ｈＰＣＳＫ９及び抗体の解離を２０分間２５℃にてリアルタイムでモニタリングした。ｎｂ：結合はこれらの実験条件下で認められなかった（ＫD＝Ｍ×１０-9；Ｔ1/2＝分；ＷＴ＝野生型）。
【０１７９】
【表２７】
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【０１８０】
結果は、残基Ｄ２３８が突然変異した場合に、ｈＰＣＳＫ９に対する３１６Ｐの結合親和性は、１×１０-9Ｍから４１０×１０-9ＭのＫDまで＞４００倍低下し；そしてＴ1/2は３７分から１分まで約３０倍短縮したことを示す。このことは３１６ＰがｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のＤ２３８を含むｈＰＣＳＫ９上でエピトープを結合することを示唆する。加えて、BIACORE（商標）分析は、１５３、１５９又は３４３で残基が突然変異した場合に、３１６Ｐの結合親和性及びＴ1/2が約５〜１０倍低下したことを示す。具体的には、Ｓ１５３、Ｅ１５９又はＤ３４３のいずれか１つが突然変異した場合に、ＫDは約１×１０-9Ｍから約５〜８×１０-9Ｍの間まで低下し；一方でＴ1/2は約３７分から約４〜６分の間まで減少した。
【０１８１】
３６６の位置の残基が突然変異した場合に、ｈＰＣＳＫ９への３００Ｎ結合は約５０倍低下して、約０．７×１０-9Ｍから約３６×１０-9ＭまでのＫDの減少、及び約１２０分から２分までのＴ1/2の短縮をもたらした。これらの結果は、３００ＮがｈＰＣＳＫ９（配列番号７５５）のＥ３６６を含むｈＰＣＳＫ９上でエピトープを結合することを示す。加えて、BIACORE（商標）分析は、１４７又は３８０での残基が突然変異した場合に、３００Ｎ結合親和性及びＴ1/2が２〜＞１０倍の間で減少したことを示す。具体的には、Ｓ１４７又はＶ３８０のいずれかが突然変異した場合に、ＫDは約０．６９×１０-9Ｍから約２〜９×１０-9Ｍの間まで減少し；一方でＴ1/2は約１２０分から約２４〜６６分の間まで短縮した。３１６Ｐと比べて、ｈＰＣＳＫ９への３００Ｎ結合は、残基２３８での突然変異によって低下しなかった。
【０１８２】
対照的に、コントロールＩ抗体は、試験した位置突然変異のいずれにも応じた結合親和性変化又はＴ1/2を示さず；コントロールII抗体は、残基２１５が突然変異（Ｒ２１５Ｅ）（〜０．１×１０-9から〜４．５×１０-9まで）して、Ｔ1/2が約２７倍短縮（〜３３３から１２分まで）した場合に、４０倍の親和性減少を示し；一方で、コントロールIII抗体は、残基２３７が突然変異（ＫDが〜０．６×１０-9から〜５．９×１０-9まで減少し、そしてＴ1/2が〜４８１から〜４３分まで減少）した場合に、親和性減少を示した。
【０１８３】
３１６Ｐ、３００Ｎ、及び対照抗ｈＰＣＳＫ９ｍＡｂｓの、ｈＰＣＳＫ９変異体への結合特異性を、ＥＬＩＳＡに基づく免疫アッセイを用いて試験した。抗ＰＣＳＫ９ｍＡｂｓを、４℃において一夜９６ウェルプレート上でコーティングした。ＣＨＯ−ｋ１一時的トランスフェクション溶解物上清中の各ｍｍｈタグ付き変異体ｈＰＣＳＫ９を、０から５ｎＭまでの範囲の種々の濃度で抗体コーティングプレートに加えた。室温で１時間結合後、プレートを洗浄し、結合変異体ｈＰＣＳＫ９をＨＲＰ結合抗ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて検出した（−＝ＯＤ＜０．７；＋＝ＯＤ０．７〜１．５；＋＋＝ＯＤ＞１．５）。
【０１８４】
【表２８】
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【０１８５】
〔実施例１７〕正脂血性及び高脂血性ハムスターに対する３１６Ｐの効果
抗ＰＣＳＫ９ｍＡｂ３１６Ｐの血清ＬＤＬ−Ｃ低下能力を、正脂血性及び高脂血性ゴールデンシリアンハムスター(Mesocricetus auratus)で試験した。６〜８週齢で８０〜１００ｇ重量の雄のシリアンハムスターを、研究に登録する前７日間で順化するようにした。全動物を、標準固形飼料か又は０．１％コレステロール及び１０％ココナツオイル補充高脂血性固形飼料で飼育した。３１６ＰｍＡｂを、正脂血性ハムスターに対して１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で、そして高脂血性ハムスターに対して３、１０、又は３０ｍｇ／ｋｇの用量で、単回皮下注射によってハムスターに投与した。血清試料を注射後２４時間及び７、１４、及び２２日に全群から採取し、その時点の血清脂質レベルを評価して、本ｍＡｂｓ投与の７日前に採取したベースラインレベルと比較した。正脂血性ハムスター中の循環総コレステロール及びＬＤＬ−Ｃは、ビヒクル注射と比べて用量依存的に顕著に低下した。図１４に示すように、３１６Ｐの投与は、試験した最大用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で注射７日後に、６０％までＬＤＬ−Ｃレベルを効果的に低下させた。３１６Ｐの類似のコレステロール低下効果は高脂血性ハムスターでは認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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