(57)【要約】  新規で且つ有効な抗線維化剤を取得する。  インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤を用いる。又は、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤を用いる。又は、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤を用いる。なお上記アンタゴニストは、例えばヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体であってもよい。
2013147076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤。
【請求項２】
前記アンタゴニストが、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1に記載の抗線維化剤。
【請求項３】
前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1又は2に記載の抗線維化剤。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1〜3いずれかにに記載の抗線維化剤。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、ヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体である、請求項2〜4いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖の1つ以上のキャップサブドメイン変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1〜5いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項７】
前記アンタゴニストが、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1〜6いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項８】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、モノクローナル抗体である、請求項2〜7いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項９】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、抗原結合性断片である、請求項2〜8いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項１０】
インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗線維化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、一般的に、コラーゲンなどを構成要素とする結合組織が増生し正常組織に置きかわることによって、組織が硬化し正常な機能が失われることによって生じる疾患として知られている。肝臓、肺、腎臓、心臓、皮膚などに生じる。例えば、肝組織に多量の線維化が生じた場合には、肝硬変に至る。【０００３】
線維症の研究例としては、非特許文献1に、線維症を発症した肺の遺伝子発現を調べた結果が記載されている。その結果によれば、線維化した肺組織では178個の遺伝子が高発現しており、有意差(p<0.01 in TNoM and Student's t-test)に囚われなければおおよそ1000個程度の遺伝子が高発現している。また非特許文献2には、線維症を発症した肺でインテグリンα8β1が高発現したことが記載されている。また特許文献1には、インテグリンα8β1とそのリガンドの結合を阻害する抗体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2011/049082号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】"Up-regulation and profibrotic role of osteopontin in human idiopathic pulmonary fibrosis." Pardo et al., PLoS Med. 2005 Sep;2(9):e251. Epub 2005 Sep 6.
【非特許文献２】"Expression of the integrin alpha8beta1 during pulmonary and hepatic fibrosis." Levine et al., Am J Pathol. 2000 Jun;156(6):1927-35.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記非特許文献1〜2及び特許文献1には、線維症を治療した結果は記載されていない。線維症は、種々の疾患の中でも特に治療の難しい疾患である。それは、現存する市販の治療薬が、本願発明者らの知っている限りでたったの一つしかないことが物語っている。その一つとは、一般名ピルフェニドン(塩野義製薬(株))である。しかも、そのたった一つの治療薬でさえ、日本でのみ承認された治療薬であり、米国のFDAでは薬剤としての効果が不十分であるとして承認されなかったという経緯がある。【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規で且つ有効な抗線維化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、後述する実施例に記載の通り、線維症モデルマウスにおいて、１）病理組織像における線維化所見の改善、２）コラーゲンα1(I)及び平滑筋アクチン(α-SMA)の遺伝子発現量あるいは蛋白量の増加の抑制、３）線維化の指標となるコラーゲンの集積量を反映するヒドロキシプロリン量の増加の抑制に成功した。この抑制には、インテグリンα8β1の機能を阻害する物質を投与することが有効であった。【０００９】
なお、上述の通り非特許文献1及び2では、線維化組織における遺伝子の発現量の増減や分布のパターンが調べられていた。しかしながら、量や分布は、必ずしもその分子の作用が必要とされなくとも、他の分子と発現調節機構を共有しているために変化することがある。そのため、一般的に一つの病態において発現が亢進する分子は数多く存在する。インテグリンα8β1に関しては、過去に誰も線維化に関与する機能的な証拠を示すことができなかったが、本願発明者らは後述する実施例で初めてこれを明らかにした。この実施例において、動物レベルで、はっきりと、病理組織所見の変化(改善)、及び上記指標の抑制が観測されたことは驚くべきことであった。【００１０】
即ち本発明によれば、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤が提供される。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００１１】
また本発明によれば、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤が提供される。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００１２】
また本発明によれば、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬が提供される。この治療薬を用いれば、線維化の進行に伴って生じる疾患を治療することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、新規で且つ有効な抗線維化剤を用いることによって、線維化を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、ヒトα9導入ニワトリ細胞株を界面活性剤で融解させ、抗ヒトα9抗体Y9A2で免疫沈降した結果を表した図である。
【図２】図2は、ヒトα9導入ニワトリ細胞株と抗ヒトα9抗体Y9A2を用いてFACS解析を行った結果を表した図である。
【図３】図3は、インテグリンα8β1の野生型、R120変異体、及びP161変異体に対して、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体を反応させ、FACS解析を行った結果を表した図である。
【図４】図4は、インテグリンα8β1のR120変異体(安定発現株)に対して、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体又は対照α8抗体を反応させ、FACS解析を行った結果を表した図である。
【図５】図5は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、インテグリンα8β1に対する阻害活性を測定した結果である。
【図６】図6は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、ヒト及びマウス インテグリンα8β1への交差反応性を、FACS解析により測定した結果である。
【図７】図7は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、ヒト及びラット インテグリンα8β1への交差反応性を、FACS解析により測定した結果である。
【図８】図8は、各腫生物由来のインテグリンα8β1のR120及びその周辺領域のアミノ酸配列に関して、アライメントを行った結果である。
【図９】図9は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、BDLマウスへの投与スケジュールを説明するための図である。
【図１０】図10は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、BDLマウスの肝切片をマッソントリクローム染色したときの写真である。
【図１１】図11は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、BDLマウスの肝臓におけるCol α1(I)とα-SMAの遺伝子発現量を測定した結果である。
【図１２】図12は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、BDLマウスの肝臓における、ヒドロキシプロリン含有量を測定した結果である。
【図１３】図13は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、CCl4マウスへの投与スケジュールを説明するための図である。
【図１４】図14は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、CCl4マウスの肝切片をマッソントリクローム染色したときの写真である。
【図１５】図15は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、CCl4マウスの肝臓におけるα-SMAの蛋白発現量を測定した結果である。
【図１６】図16は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、CCl4マウスの肝臓における、ヒドロキシプロリン含有量を測定した結果である。
【図１７】図17は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、肺線維症マウスへの投与スケジュールを説明するための図である。
【図１８】図18は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの肺切片をHE染色したときの写真である。
【図１９】図19は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの肺におけるCol α1(I)とα-SMAの遺伝子発現量を測定した結果である。
【図２０】図20は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの体重の推移を測定した結果である。
【図２１】図21は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体投与又は非投与のときの、肺線維症マウスの肺における、ヒドロキシプロリン含有量を測定した結果である。
【図２２】図22は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、インテグリンα8β1に対する阻害活性を測定した結果である。
【図２３】図23は、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体の、ヒト及びマウス インテグリンα8β1への交差反応性を、FACS解析により測定した結果である。
【図２４】図24は、インテグリンα8β1のS132変異体(安定発現株)に対して、実施例に係る抗インテグリンα8β1抗体又は対照α8抗体を反応させ、FACS解析を行った結果を表した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。【００１６】
本発明の一実施形態は、新規の抗線維化剤である。この抗線維化剤は、例えば、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００１７】
なお「線維化」は、典型的には、コラーゲンなどを構成要素とする結合組織が増生し正常組織に置きかわることによって、組織が硬化し正常な機能が失われることによって生じる疾患として知られている。例えば、肝臓、肺、腎臓、心臓、皮膚などに生じる。また例えば、肝組織に多量の線維化が生じた場合には、肝硬変に至る。また肝硬変以外にも、線維化の進行に伴い、各組織に悪性腫瘍が生じることがある。【００１８】
また「インテグリンα8β1」は、典型的には、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーとして細胞膜表面に存在する受容体蛋白質である。インテグリンα8β1のDNA配列およびアミノ酸配列は、例えばNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースであるGenBank等を参照できる。α鎖のアミノ酸配列は、例えば配列番号7のアミノ酸配列であってもよい。β鎖のアミノ酸配列は、例えば配列番号8のアミノ酸配列であってもよい。α鎖とβ鎖は、シグナルペプチドを含む形態、又は含まない形態を含む。またリガンドとしては、例えばオステオポンチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、又はテネイシンを挙げることができる。【００１９】
本明細書においてアンタゴニストの形態は特に限定されないが、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、ヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8β1の機能を阻害する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号1、2、及び3のアミノ酸配列を含み、且つ軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号4、5、及び6のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体であることが好ましい。又は、上記アンタゴニストは、インテグリンα8β1とそのリガンドの結合を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば抗体、蛋白質、低分子化合物、高分子化合物、又は核酸であってもよい。【００２０】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域と特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域を特異的に認識する抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００２１】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸、又はそのアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００２２】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００２３】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8鎖の1つ以上のキャップサブドメイン変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。なお、インテグリンα8鎖のキャップサブドメイン変異体とは、キャップサブドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸が変異している変異型のインテグリンα8鎖である。ここで、キャップサブドメイン変異体に結合性を有さない抗体は、少なくとも1つの変異体に対して結合性を有さなければよく、その変異体とは別のキャップサブドメイン内のアミノ酸が変異している変異体に対しては結合性を有していてもよい。【００２４】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1の機能を阻害する抗インテグリンα8β1抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1の機能を阻害する抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、上記ポリヌクレオチドから上記抗インテグリンα8β1抗体が発現した結果、線維化を抑制することができる。【００２５】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストの前駆体を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、上記前駆体から上記アンタゴニストが生じた結果、線維化を抑制することができる。【００２６】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1の機能阻害剤を含む、抗線維化剤である。インテグリンα8β1の機能を阻害すると、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００２７】
また本発明の一実施形態は、本実施形態に係るアンタゴニスト又は抗線維化剤を用いた、線維化を抑制又は治療する方法である。この方法によれば、線維化を抑制することによって、線維化又は線維化の進行に伴って生じる疾患を治療できる。【００２８】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、コラーゲン集積抑制剤である。又は、コラーゲンの集積を抑制する方法である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、コラーゲンの集積を抑制することができる。そのため、上記構成を有するコラーゲン集積抑制剤を用いれば、コラーゲンの集積を抑制することができる。【００２９】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現抑制剤である。又は、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現を抑制する方法である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、コラーゲンα1(I)及びα-SMAの発現を抑制することができる。そのため、上記構成を有するコラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現抑制剤を用いれば、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現を抑制することができる。なお、コラーゲンα1(I)及びα-SMAのアミノ酸配列及びDNA配列はGenBank等を参照できる。【００３０】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを含む、ヒドロキシプロリン産生抑制剤である。又は、ヒドロキシプロリンの産生を抑制する方法である。インテグリンα8β1のアンタゴニストは、後述する実施例で実証されているように、ヒドロキシプロリンの産生を抑制することができる。そのため、上記構成を有するヒドロキシプロリン産生抑制剤を用いれば、ヒドロキシプロリンの産生を抑制することができる。なおヒドロキシプロリンの定量は、例えば、後述の実施例に記載の手順で行ってもよく、又は"Inayama et al., Keio J Med. Vol.27, No.1, 43-46 (1978) "に記載の方法等で行ってもよい。【００３１】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1を発現し、且つコラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現量が正常細胞に比べて増加している非正常細胞の、上記コラーゲンα1(I)又は上記α-SMAの発現を阻害する方法であって、インテグリンα8β1のアンタゴニストと、上記非正常細胞とを接触させる工程を含む、方法である。この方法によれば、コラーゲンα1(I)又はα-SMAの発現を阻害することによって、疾患を抑制することができる。【００３２】
また本発明の一実施形態は、インテグリンα8β1を発現し、且つヒドロキシプロリンの産生量が正常組織に比べて増加している非正常組織の、上記ヒドロキシプロリンの産生を阻害する方法であって、インテグリンα8β1のアンタゴニストと、上記非正常組織とを接触させる工程を含む、方法である。この方法によれば、ヒドロキシプロリンの産生を阻害することによって、疾患を抑制することができる。【００３３】
本明細書においてインテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域は、インテグリンα8鎖の114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、又は126位のアミノ酸配列を含む領域が好ましい。又は、インテグリンα8鎖の配列番号9のアミノ酸配列を含む領域であってもよい。この周辺領域は、上記抗インテグリンα8β1抗体のエピトープとなる領域を含んでいれば特に限定されない。なお、上記の114〜126位は、シグナルペプチドを含む場合のインテグリンα8鎖を基準として計算したときの位置である。そのため、インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の114〜126位は、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、及び88位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。なお、抗体が特定の領域に特異的に結合することは、抗体が特定の領域をエピトープとして認識することを含む。エピトープとして認識するとは、エピトープの一部として認識することを含む。抗体が特定のアミノ酸及びその周辺領域に特異的に結合することは、抗体が特定のアミノ酸及びその周辺の立体構造を特異的に認識して結合することを含む。【００３４】
本明細書においてインテグリンα8鎖のS132及びその周辺領域は、インテグリンα8鎖の126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、又は138位のアミノ酸配列を含む領域であってもよい。なお、上記の126〜138位は、シグナルペプチドを含む場合のインテグリンα8鎖を基準として計算したときの位置である。そのため、インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の126〜138位は、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、及び100位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。上記のアミノ酸の周辺領域は、例えば、本実施形態に係る抗体がエピトープとして認識する領域である。上記のアミノ酸の周辺領域は、抗体がエピトープとして認識する領域であれば、そのアミノ酸の前後1、2、3、4、5、又は6アミノ酸を含んでいてもよい。【００３５】
本明細書においてインテグリンα鎖のキャップサブドメインは、キャップサブドメインインサート1〜4を含んでいてもよい。本実施形態に係る抗体が結合するα鎖の部位は、安定的に線維化を抑制する観点からは、インサート1内にあることが好ましい。インサート1は、例えば、インテグリンα鎖の113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、又は132位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の113〜132位は、75〜94位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インサート2は、例えば、インテグリンα鎖の154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、又は171位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の154〜171位は、116〜133位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インサート3は、例えば、インテグリンα鎖の187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、又は199位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の187〜199位は、149〜161位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インサート4は、例えば、インテグリンα鎖の233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、又は250位であってもよい。インテグリンα8鎖がシグナルペプチドを含まない場合には、上記の233〜250位は、195〜212位に該当するアミノ酸をそれぞれ意味していてもよい。インテグリンファミリーのキャップサブドメインの位置の例は、例えば、Xiao et al., Nature. 2004 Nov 4;432(7013):59-67.に記載されている。【００３６】
本明細書において、抗インテグリンα8β1抗体によってインテグリンα8β1の機能に阻害が生じている状態は、例えば、インテグリンα8β1とそのリガンドとを反応させたときの結合量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。有意に減少とは、例えば、上記結合量が0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、又は0倍に減少している状態であってもよい。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。インテグリンα8β1の機能が特に明確に阻害される点からは、0.5倍以下に減少していることが好ましく、0.1倍以下に減少していることがさらに好ましい。なお上記結合量は、例えば、後述の実施例に記載の方法のように、リガンドを固定化したプレートにインテグリンα8β1発現細胞を接触させ、接着した細胞数を染色後に吸光度で測定することによって測定してもよい。また本明細書において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定(片側又は両側)を使用して評価し、p<0.05であるときを含んでいてもよい。又は、実質的に差異が生じている状態を含む。【００３７】
本明細書において抗体が抗原に結合性を有さない状態は、抗体が抗原に完全に結合しない状態、又は抗体の抗原への結合量が著しく低い状態を含む。抗体と抗原の結合性は、例えば、抗体と抗原発現細胞を反応させた後、フローサイトメトリー (FACS)解析によって測定してもよい。FACS解析とは、典型的には、フローセル内を流れる細胞にレーザー光をあて、細胞からの前方散乱光、側方散乱光からパラメータを測定し、細胞の特性を決める解析手法である。例えば、抗体と抗原非発現細胞を反応させたときのピークに比べて、抗体と抗原発現細胞を反応させたときのピークが、実質的に又は有意に変動していない場合に、抗体が抗原に結合性を有さない状態と判断してもよい。一方で、抗体と抗原非発現細胞を反応させたときのピークに比べて、抗体と抗原発現細胞を反応させたときのピークが、実質的に又は有意に変動した場合に、抗体が抗原に結合性を有する状態と判断してもよい。又は、結合性を有さない状態は、表面プラズモン共鳴測定装置によって測定した結合速度定数(Ka)が、結合性を有する場合と比べて、0.2、0.1、0.05、又は0.01倍の状態であってもよい。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００３８】
本明細書において、遺伝子の発現が阻害されている状態は、遺伝子の発現が有意に阻害されている状態を含む。又は、40、50、60、70、80、90、又は100％阻害されていてもよい。この割合は、ここで例示したいずれか1つの値以上、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。線維化を抑制する観点からは、50％以上が好ましく、70％以上がさらに好ましい。又は、例えば、線維化が生じている組織における遺伝子の発現量に比べて、発現量が0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、又は0倍に減少している状態であってもよい。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。線維化を抑制する観点からは、0.5倍以下に減少していることが好ましく、0.1倍以下に減少していることがさらに好ましい。なお、本明細書において遺伝子の発現量が抑制されている状態は、上記の遺伝子の発現量が減少している状態と同様の状態である。【００３９】
本明細書において、ヒドロキシプロリンの産生が阻害されている状態は、ヒドロキシプロリンの産生が有意に阻害されている状態を含む。又は、40、50、60、70、80、90、又は100％阻害されていてもよい。この割合は、ここで例示したいずれか1つの値以上、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。又は、例えば、線維化が生じている組織におけるヒドロキシプロリンの産生量に比べて、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.2、0.1、又は0倍に減少している状態を含む。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以下、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。線維化を抑制する観点からは、0.9倍以下に減少していることが好ましい。なお、本明細書においてヒドロキシプロリンの産生量が抑制されている状態は、上記のヒドロキシプロリンの産生が阻害されている状態と同様の状態である。【００４０】
本明細書において増加は、例えば1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、5、10、又は40倍に増加している状態を含む。この倍率は、ここで例示したいずれか1つの値以上、又はいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００４１】
本明細書においてリガンドの前駆体とは、in vivo又はin vitroにおいて任意の物質と反応し構造変化が起こった結果、上記リガンドと同じ構造になり得る物質を含む。【００４２】
本明細書においてアミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。一般的に、蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばN末端修飾(例えば、アセチル化、ミリストイル化等)、C末端修飾(例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等)、又は側鎖修飾(例えば、リン酸化、糖鎖付加等)等が知られている。【００４３】
本明細書においてポリヌクレオチドは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、DNA塩基又はRNA塩基を含む。上記の等価物は、例えばDNA塩基又はRNA塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。「塩基配列」とは、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド又はその等価物の配列である。塩基配列の記載において、A、T、G、Cは、それぞれアデニン及びその等価物、チミン及びその等価物、グアニン及びその等価物、シトシン及びその等価物を含む。また、TとU (ウラシル)は、用途に合わせて互いに読み替えることが可能である。なお、ポリヌクレオチドはDNA／RNA合成装置を用いて合成可能である。その他、DNA塩基又はRNA塩基合成の受託会社(例えば、インビトロジェン社等)から購入することもできる。またポリヌクレオチドはベクター又はプラスミドであってもよい。【００４４】
上記のベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド(例えばpET-Blue)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110)、酵母由来プラスミド(例えばpSH19)、動物細胞発現プラスミド(例えばpA1-11)、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、蛋白質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。【００４５】
本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体をコードするポリヌクレオチド又はベクターで細胞を形質転換することができる。この形質転換体を用いれば、当該技術分野で公知の方法によって、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体を作製できる。形質転換体は、ヒトや他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等)の細胞であってもよい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、サル細胞COS-7などが挙げられる。又は、形質転換体はEscherichia属菌、酵母等であってもよい。【００４６】
上記のポリヌクレオチド又はベクターの細胞への導入と抗体の生産は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。ポリヌクレオチド又はベクターの細胞への導入方法として例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスによる方法、レトロウイルスによる方法、又はマイクロインジェクションなどを使用できる(改訂第4版 新 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社(2003):152-179.)。抗体の細胞を用いた生産方法としては、例えば、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):128-142."に記載の方法を使用できる。【００４７】
抗体の精製方法は、例えば、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、プロテインA、プロテインG、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、又はレクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる(タンパク質実験ハンドブック, 羊土社(2003):27-52.)。【００４８】
本明細書において「結合する」とは、物質間の連結を意味する。連結は共有結合又は非共有結合のいずれであってもよく、例えば、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、又は親水性相互作用が挙げられる。本明細書において抗原抗体反応における「認識する」とは、抗体工学分野で通常用いられる意味で使用でき、例えば、特異的に結合するという意味を含む。【００４９】
本明細書において「1種以上」とは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは20種であっても良く、それらいずれかの値以上、又は範囲内であっても良い。【００５０】
本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体が結合するインテグリンα8β1の由来は特に限定されないが、ヒト、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、及びチンパンジーのいずれか1種以上であってもよい。この中でも、抗インテグリンα8β1抗体を治療薬として使用する観点からはヒトが好ましい。又は、非臨床試験で使用するモデル動物として特に適しているという観点からは、マウス及びラットが好ましい。【００５１】
本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、ポリクローナル抗体に比べて、効率的にインテグリンα8β1に対して作用させることができる。【００５２】
本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、抗原結合活性を有する抗体断片(以下、「抗原結合性断片」と称することもある)であっても良い。この場合、安定性が上昇する、又は抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。【００５３】
本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体は、インテグリンα8β1の野生型又は変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のDNA配列の差異に起因するものを含む。但し、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体には結合性を有さないことが好ましい。野生型又は変異型のα鎖のアミノ酸配列は、配列番号7に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは80％以上の相同性を有し、より好ましくは90％以上の相同性を有し、特に好ましくは95％以上の相同性を有している。野生型又は変異型のβ鎖のアミノ酸配列は、配列番号8に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは80％以上の相同性を有し、より好ましくは90％以上の相同性を有し、特に好ましくは95％以上の相同性を有している。【００５４】
本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体のクラスは特に限定されないが、例えばIgM、IgD、IgG、IgA、又はIgEであってもよい。【００５５】
また本発明の一実施形態は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号1、2、及び3のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号4、5、及び6のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この特定のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体は、後述する実施例で実証されているように、線維化を抑制することができる。そのため、上記構成を有する抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００５６】
また本発明の一実施形態は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号10、11、及び12のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号13、14、及び15のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。また本発明の一実施形態は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号16、17、及び18のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号19、20、及び21のアミノ酸配列を含む抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤である。この抗線維化剤を用いれば、線維化を抑制することができる。【００５７】
なお一般的に、抗体のアミノ酸配列にある程度の欠失、置換、挿入、付加等が生じても、抗体の機能はある程度保たれることが知られている。そのため、上記のアミノ酸配列が特定された抗インテグリンα8β1抗体は、ある程度の欠失、置換、付加等が生じていてもよい。そのような欠失、置換、付加等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、又は抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD -Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.)を使用できる。欠失、置換、付加等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。【００５８】
また上記抗インテグリンα8β1抗体は、インテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、野生型の時に比べて、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。又は、インテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、野生型の時に比べて、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。又は、インテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、野生型のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列にコードされているアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。【００５９】
上記の配列番号1、5、10、14、16、又は20のアミノ酸配列は、上記抗インテグリンα8β1抗体がインテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、それぞれのアミノ酸配列の1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列であってもよい。また、上記の配列番号2、3、4、6、11、12、13、15、17、18、19、又は21のアミノ酸配列は、上記抗インテグリンα8β1抗体がインテグリンα8β1とそのアゴニストとの結合を阻害する機能を有している限り、それぞれのアミノ酸配列の1、2、又は3個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列であってもよい。【００６０】
上記抗インテグリンα8β1抗体において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加している場合、「複数個」は15、10、8、6、4、又は2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。この数は少ないほど好ましい。なぜならば、上記「複数個」が少ないほど、もとの抗インテグリンα8β1抗体に近い特性を有していることになるからである。なお一般に、1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)。【００６１】
上記抗インテグリンα8β1抗体において、1又は複数個のアミノ酸が別のアミノ酸に置換している場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、及び芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)を挙げることができる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は「保存的置換」と総称される。【００６２】
上記抗インテグリンα8β1抗体において、アミノ酸配列の同一性を表すときに用いる「90％以上」は、例えば90、95、98、99、又は100％であってもよい。又はそれらいずれかの値以上、又は範囲内であってもよい。この数は大きいほど好ましい。なぜならば、上記「90％以上」が大きいほど、もとの上記抗インテグリンα8β1抗体に近い特性を有していることになるからである。【００６３】
本明細書において同一性は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において同一なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、及びそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えばBLAST、GENETYX等)。本明細書において「同一性」は、特に断りのない限りNCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのAlgorithmには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositives又はIdentitiesとして数値化される。【００６４】
本明細書においてストリンジェントな条件は、例えば以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v／v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％のポリビニルピロリドン／50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、又は(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、及び20mg／mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％又はそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、又はそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照することができる。【００６５】
また上記抗インテグリンα8β1抗体は、受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828のプラスミドにコードされる重鎖、VH、重鎖CDR1〜3、又は重鎖FR1〜4を含んでいてもよい。又は、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドにコードされる軽鎖、VL、軽鎖CDR1〜3、又は軽鎖FR1〜4を含んでいてもよい。【００６６】
また上記抗インテグリンα8β1抗体は、受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828のプラスミドを含む細胞から得ることができる、抗インテグリンα8β1抗体であってもよい。またこの細胞は、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドをさらに含んでいてもよい。【００６７】
また上記抗インテグリンα8β1抗体は、受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828のプラスミドにコードされる抗インテグリンα8β1抗体の重鎖又はVHをコードするベクターを含む細胞から得ることができる、抗インテグリンα8β1抗体であってもよい。このベクターは、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドにコードされる抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖又はVLをさらにコードしていてもよい。またこの細胞は、受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829のプラスミドにコードされる抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖又はVLをコードずるベクターをさらに含んでいてもよい。【００６８】
なお、上記受託番号NITE BP-824のプラスミドのサイズは約6.8 kbpである。このプラスミドにおいて抗インテグリンα8β1抗体の重鎖をコードする領域のサイズは約1.7 kbpである。この抗インテグリンα8β1抗体の重鎖をコードする領域の上流及び下流には、それぞれKpn I及びPinA Iの制限酵素サイトがある。そのため、受託番号NITE BP-824のプラスミドをKpn I及びPinA Iで処理することによって、抗インテグリンα8β1抗体の重鎖をコードする領域を含むポリヌクレオチドを単離することができる。また、上記受託番号NITE BP-825のプラスミドのサイズは約6.5 kbpである。このプラスミドにおいて抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖をコードする領域のサイズは約1 kbpである。この抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖をコードする領域の上流及び下流には、それぞれHind III及びXba Iの制限酵素サイトがある。そのため、受託番号NITE BP-825のプラスミドをHind III及びXba Iで処理することによって、抗インテグリンα8β1抗体の軽鎖をコードする領域を含むポリヌクレオチドを単離することができる。また、上記受託番号BP-826、NITE BP-828、NITE BP-827、NITE BP-829のプラスミドについても、公知の手法を用いて,抗体重鎖又は抗体軽鎖をコードする領域を含むポリヌクレオチドを単離することができる。【００６９】
本明細書において抗体は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子又はその集団を含む。また抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。また抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、diabody、一本鎖抗体(例えば、scFv)、dsFv、多価特異的抗体(例えば、二価特異的抗体)、抗原結合性を有するペプチド又はポリペプチド、キメラ抗体(例えば、マウス-ヒトキメラ抗体等)、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はそれらの同等物(又は等価物)からなる群から選ばれる1種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物又は抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。【００７０】
ポリクローナル抗体は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等)、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、及び所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント(完全又は不完全)、ミネラルゲル(水酸化アルミニウム等)、又は界面活性物質(リゾレシチン等)等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある(タンパク質実験ハンドブック, 羊土社(2003):86-91.)。【００７１】
モノクローナル抗体は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。又は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本明細書におけるモノクローナル抗体は、"Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。又は、本明細書におけるモノクローナル抗体は、"Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-628."又は"Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。又は、"タンパク質実験ハンドブック, 羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法でよって作製してもよい。【００７２】
Fvは、抗原認識部位を含む抗体である。この領域は、非共有結合による1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を形成することができる。【００７３】
Fabは、例えば、Fab領域及びFc領域を含む抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体が一部のジスルフィド結合を介して結合した抗体である。Fabは、例えば、Fab領域及びFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体を、蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。【００７４】
F(ab')2は、例えば、Fab領域及びFc領域を含む抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabに相当する部位を2つ含む抗体である。F(ab')2は、例えば、Fab領域及びFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体を、蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、例えば、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで、作製することができる。【００７５】
Fab'は、例えば、F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗体である。例えば、F(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。【００７６】
scFvは、VHとVLとが適当なペプチドリンカーを介して連結した抗体である。scFvは、例えば、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、VH-ペプチドリンカー-VLをコードするポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。【００７７】
diabodyは、二価の抗原結合活性を有する抗体である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、例えば、scFvをコードするポリヌクレオチドをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。【００７８】
dsFvは、VH及びVL中にシステイン残基を導入したポリペプチドを、上記システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体である。システイン残基に導入する位置はReiterらにより示された方法(Reiter et al., Protein Eng. 1994 May;7(5):697-704.)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。【００７９】
抗原結合性を有するペプチド又はポリペプチドは、抗体のVH、VL、又はそれらのCDR1、2、もしくは3を含んで構成される抗体である。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。【００８０】
上記のFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、抗原結合性を有するペプチド又はポリペプチド(以下、「Fv等」と称することもある)の生産方法は特に限定しない。例えば、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体におけるFv等の領域をコードするDNAを発現用ベクターに組み込み、発現用細胞を用いて生産できる。又は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBOC法(t-ブチルオキシカルボニル法)などの化学合成法によって生産してもよい。なお本明細書において、抗原結合性断片は上記Fv等の1種以上であってもよい。【００８１】
キメラ抗体は、典型的には、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。キメラ抗体を生成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、マウス-ヒトキメラ抗体は、"Roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列及び可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。又は、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列及び可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖定常領域及びヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を、L鎖のものについてはCλ又はCκを各々挙げることができる。【００８２】
ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、及びヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域(FR)、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagro et al., FRont Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング(Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930.)、Re-surfacing (roguska et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-973.)、又はFRシャッフル(Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.)などが挙げられる。抗原結合を改変するために(好ましくは改善するために)、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である(Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-327.)。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。又は、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。【００８３】
ヒト抗体は、典型的には、抗体を構成する重鎖の可変領域及び定常領域、軽鎖の可変領域及び定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコート蛋白質(g3pやg10pなど)のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合蛋白質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughan et al., Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。【００８４】
また抗体は、CDR-grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11):3922-3930.)によって任意の抗体に本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体の重鎖CDR又は軽鎖CDRをグラフティングすることで作製してもよい。又は、本発明の実施形態に係る抗インテグリンα8β1抗体の重鎖CDR又は軽鎖CDRをコードするDNAと、公知のヒト又はヒト以外の生物由来の抗体の、重鎖CDR又は軽鎖CDRを除く領域をコードするDNAとを、当該技術分野で公知の方法に従ってベクターに連結後、公知の細胞を使用して発現させることによって得ることができる。このとき、抗インテグリンα8β1抗体の標的抗原への作用効率を上げるために、当該分野で公知の方法(例えば、抗体のアミノ酸残基をランダムに変異させ、反応性の高いものをスクリーニングする方法、又はファージディスプレイ法など)を用いて、重鎖CDR又は軽鎖CDRを除く領域を最適化してもよい。また、例えば、FRシャッフル(Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.)、又はバーニヤゾーンのアミノ酸残基又はパッケージング残基を置換する方法(特開2006-241026、又はFoote et al., J Mol Biol.1992 Mar 20;224(2):487-499.)を用いて、FR領域を最適化してもよい。【００８５】
重鎖 (heavy chain)は、全長抗体の主な構成要素である。典型的には、軽鎖 (light chain)とジスルフィド結合及び非共有結合によって結合している。重鎖のN末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域(VH)と呼ばれる領域が存在し、一般的に、VHが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、"Reiter et al., J Mol Biol. 1999 Jul 16;290(3):685-98."にはVHのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、"Wolfson W, Chem Biol. 2006 Dec;13(12):1243-1244."にはラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。【００８６】
CDR (相補性決定領域、complementarity determining region)は、抗体において、実際に抗原に直接接触して結合部位を形成している領域である。一般的にCDRは、抗体のFv (可変領域：重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む)上に位置している。また一般的にCDRは、5〜25アミノ酸残基程度からなるCDR1、CDR2、CDR3が存在する。そして、特に重鎖のCDRが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またCDRの中でも、CDR3が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、"Willy et al., Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 356, Issue 1, 27 April 2007, Pages 124-128"には重鎖CDR3を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。また、CDRは抗体の抗原に対する特異性を決定する領域であるため、抗体間でアミノ酸配列が大きく異なり、超可変領域ともよばれている。CDR以外のFv領域はフレームワーク領域(FR)と呼ばれ、FR1、FR2、FR3およびFR4からなり、抗体間で比較的よく保存されている(Kabat et al.,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983.)。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因は重鎖CDR3であり、次に重鎖CDRであるといえる。【００８７】
CDRの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Kabatの定義 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))、又はChothiaの定義(Chothia et al., J. Mol. Biol.,1987;196:901-917)を採用してもよい。本明細書においては、Kabatの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるCDRの重複部分を、又は各々の定義によるCDRの両方を含んだ部分をCDRとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular's AbM antibody modeling softwareを用いたMartinらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989;86:9268-9272)がある。【００８８】
本明細書において抗線維化剤は、線維化抑制用の治療薬を含む。又は、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬を含む。又は、抗線維化剤は再生医療に用いるための線維化抑制用の薬剤であってもよい。なお本明細書において治療は、被験者の疾患（線維化を含む）又は疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることをいう。治療薬は予防薬を含む。【００８９】
また抗線維化剤は、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体を含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また抗線維化剤は、有効成分を単独で用いるものであってもよいし、任意の成分と混合して用いるものであってもよい。また上記担体の形状は特に限定されない。【００９０】
投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。抗体医薬を投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、又はステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、又はNaOH等を配合してもよい。また抗線維化剤は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。【００９１】
投与量は特に限定されないが、例えば、一回につき0.25又は0.5mg/bodyであってもよく、それらの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、2週間、3日毎に投与してもよく、4週間、週に2回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、被験者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択することが可能である。また、適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。また抗線維化剤は、治療有効量、又は所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。なお上記のコラーゲン集積抑制、コラーゲンα1(I)及びα-SMAの発現抑制剤、ヒドロキシプロリン産生抑制剤についても、抗線維化剤と同様の投与方法を用いることが好ましい。【００９２】
本明細書において被験者は、ヒト又はヒトを除く哺乳動物(例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、及びチンパンジー等のいずれか1種以上)を含む。【００９３】
本明細書において「又は」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。【００９４】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９６】
＜実施例１＞抗インテグリンα8β1抗体の作製
（１）免疫
マウス インテグリンα8鎖のcDNAをほ乳動物発現ベクターにクローニングした。次に、その発現ベクターをニワトリリンパ芽球様細胞株にエレクトロポレーション法でトランスフェクトした後、薬剤を添加して発現細胞の選択をおこなった。得られたマウス インテグリン α8鎖発現細胞株をニワトリに過免疫した。ニワトリ血清中抗体価の測定はフローサイトメトリ(FACS)解析にて実施した。FACS解析に関してはFACSCalibur (BD,USA)の一般的なプロトコールに従った。【００９７】
なお、インテグリンα8鎖はβ1鎖とヘテロダイマーを形成することが鳥類、ほ乳類いずれにおいても確かめられている(Bossy B, et al, EMBO J 10(9): 2375-2385, 1991； J Cell Sci 108:537-544,1995)。但し、ほ乳類のα鎖と鳥類のβ鎖がヘテロダイマーを形成できるかについての具体的な実験データは公表されていない。そのため、ヒトのα9とニワトリのβ1がヘテロダイマーを形成し、インテグリン分子として細胞膜表面に発現するかを、以下の手順で確かめた。まず、ヒトα9 cDNAをニワトリ細胞株に導入し薬剤選択により安定発現株を得た。次に、このヒトα9導入ニワトリ細胞株を界面活性剤で融解させ、抗ヒトα9抗体Y9A2で免疫沈降した(図1)。レーン1に二本のバンドが現れ、ヒトα9鎖が他の分子と複合体を形成していることがわかる。レーン2はインテグリンα9β1を発現しているα9-transfected SW480 (ヒト大腸癌細胞株)の免疫沈降であり、比較するとレーン1の二つのバンドはα9鎖とβ1鎖であることがわかる。【００９８】
さらに、ヒトα9導入ニワトリ細胞株と抗ヒトα9抗体Y9A2を用いてFACS解析を行った(図2)。無染色細胞のヒストグラムに比べ抗体と反応させた場合ヒストグラムが右にシフトしており、ヒトα9が膜表面に発現している事がわかる。従って上記インテグリンα8鎖発現細胞株においても、同様にα8鎖とβ1鎖とのヘテロダイマーが形成されていると考えられる。なお、上記のマウス インテグリンα8鎖のアミノ酸配列は、配列番号7に示すアミノ酸配列である。【００９９】
（２）scFv ファージ抗体ライブラリーの作製
免疫をおこなったニワトリから脾臓を摘出した後、リンパ球を分離した。得られたリンパ球からRNAを抽出してcDNAの合成を行いscFv ファージ抗体ライブラリーを作製した。 ファージ抗体ライブラリーの作製に関しては、"nakamura et al., J Vet Med Sci. 2004 Jul;66(7):807-14"に記載の一般的な手法に従った。【０１００】
（３）パニング選択
scFv ファージ抗体ライブラリーをマウス インテグリンα8鎖非発現細胞株に添加して非特異ファージの吸収操作をおこなった後、マウス インテグリンα8鎖発現細胞株と反応させた。有機溶媒で洗浄後、マウス インテグリンα8鎖発現細胞株に特異的に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させた。4回パニングをおこなった後、ライブラリーの反応性をマウス インテグリンα8鎖発現細胞株を用いたFACS解析で確認した。3rd ライブラリーの反応性が高かったため、3rd ライブラリーからファージのクローニングを行い、陽性クローンを選択した後、配列を決定した。細胞パニングに関しては、"Giordano et al., Nat Med. 2001 Nov;7(11):1249-53."に記載の方法に従った。【０１０１】
（４）ヒトインテグリンα8鎖交差クローンの選択
ヒトインテグリンα8鎖にも交差反応する抗体を取得するため、ヒト インテグリンα8鎖発現ニワトリリンパ芽球様細胞株を作製した。FACS解析によりヒトインテグリンα8鎖発現細胞株にも交差反応するクローンの選択をおこなった。【０１０２】
（５）組換えIgY (rIgY)抗体への組換え
以上の実験により得られたscFv ファージ抗体をコードするDNA鎖を鋳型にして、VH、VLのPCR増幅をおこなった後、ニワトリ抗体のleader配列、定常領域とoverlap PCRを行いrIgY発現ベクターへクローニングした。作製したH鎖、L鎖のコンストラクトをほ乳類培養細胞にトランスフェクトした後、発現した抗体の精製をおこなった。rIgY抗体への組換えに関しては、"Shimamoto et al., Biologicals. 2005 Sep;33(3):169-74."に記載の手法に従った。以上の手順により、抗インテグリンα8β1抗体(モノクローナル抗体)を3種（#3抗体、#5抗体、#26抗体）作製した。【０１０３】
なお、#3抗体、#5抗体、又は#26抗体の重鎖をコードするDNA配列を含むプラスミドは、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)にそれぞれ2009年10月16日付で国内寄託されている。さらにその後、国内寄託した上記プラスミドは、2010年10月12日付でそれぞれ受託番号NITE BP-824、NITE BP-826、又はNITE BP-828として、ブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。【０１０４】
また、#3抗体、#5抗体、又は#26抗体の軽鎖をコードするDNA配列を含むプラスミドは、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにそれぞれ2009年10月16日付で国内寄託されている。さらにその後、国内寄託した上記プラスミドは、2010年10月12日付でそれぞれ受託番号NITE BP-825、NITE BP-827、又はNITE BP-829として、ブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。これら寄託したプラスミド6つは、上記（５）において発現ベクターを用いて作製したものである。【０１０５】
また、#3抗体の重鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SYDMV (配列番号1)、IYSAGSGPQYAPAVKG (配列番号2)、ADSTYCASGSCYAADSID (配列番号3)である。また、#3抗体の軽鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SGGGSWYG (配列番号4)、DNTNRPS (配列番号5)、GSADSTDAV (配列番号6)である。CDRは抗インテグリンα8β1抗体の抗原結合特異性に関わる部位である。#5抗体の重鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SYDMA (配列番号10)、IDDDDSFTLYGAAVKG (配列番号11)、VGDGYCGWSACGGSID (配列番号12)である。また、#5抗体の軽鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SGDESYYG (配列番号13)、SNDKRPS (配列番号14)、GXYDSSTYAGI (配列番号15)である。#26抗体の重鎖CDR1、2、3はそれぞれ、GHDMA (配列番号16)、IGSSGSNTNYGTAVKG (配列番号17)、PGSCYGCTPDAGEID (配列番号18)である。また、#26抗体の軽鎖CDR1、2、3はそれぞれ、SGSSGSYYG (配列番号19)、ESTKRPS (配列番号20)、GNEDSSYVGI (配列番号21)である。なお、Xはアミノ酸解析において解析不能であったアミノ酸を表す。【０１０６】
＜実施例２＞エピトープの評価
8種のヒトα8鎖cDNA (R120、K125、S132、P161、Y199、A238、A260、S261)を作製し、CHO細胞に一過性発現をさせ、#3抗体と反応させた。#3抗体は、野生型、及び7種の変異体(K125、S132、P161、Y199、A238、A260、S261)に対しては反応性を保持したが、R120を変異させたもの(R120変異体)には反応しなかった。#3抗体と、野生型、R120変異体、及びP161変異体とを反応させ、FACS解析を行った結果を図3に示す。次に、一過性発現法のためR120K変異体が十分に発現していない可能性を除外するため、安定発現株を作製し同様に反応させたところやはり反応がみられなかった。また、R120K変異体は対照α8抗体とは良く反応し、十分に発現している事を確認した(図4)。これら結果は、#3抗体が認識するエピトープは、R120及びその周辺領域であることを示している。【０１０７】
＜実施例３＞インテグリンα8β1に対する阻害活性評価
96-wellプレートにマウスオステオポンチン(2.5 mg/ml)を固相化した。次に、そのプレートにα8発現K562細胞を1x10 E5細胞/wellで加えるとともに、#3抗体を図5に示した濃度で加えた。図5において、A570nmは接着細胞を検出している。A570nmの値が低いほど、α8発現K562細胞とオステオポンチンの結合が少ないことを表している。【０１０８】
その結果、#3抗体は、α8発現K562細胞とオステオポンチンとの結合を阻害していた(図5)。即ち、#3抗体はインテグリンα8β1のアンタゴニストとして機能していた。また、抗体非添加時を100とすると、抗体濃度が0.05 μg/mlで60％以上の阻害活性がみられた。また、抗体濃度が0.10 μg/mlで70％以上、抗体濃度が0.25 μg/ml以上で95％以上の阻害活性がみられた。【０１０９】
＜実施例４＞交差反応性の評価
（１）ヒト及びマウスインテグリンα8β1への反応性評価
#3抗体を用いて、ヒト インテグリンα8鎖発現SW480細胞株、及びマウス インテグリンα8鎖発現SW480細胞株への交差反応性を、FACS解析により調査した。その結果を図6に示す。ヒト インテグリンα8鎖発現SW480細胞株、及びマウス インテグリンα8鎖発現SW480細胞株のどちらを用いたときにも、#3抗体を反応させると、反応させないときに比べて、ピークの位置が明確に右側にシフトした。またMockのときにはピークに変動はなかった。このことから、#3抗体は、ヒト及びマウス両方のインテグリンα8β1に結合できることが示された。【０１１０】
（２）ラットインテグリンα8β1への反応性評価
ラットインテグリンα8鎖cDNAをクローニングしCHO細胞に一過性発現させ、#3抗体との反応性をFACSで確かめた。ポジティブコントロールとして、ヒトインテグリンα8サブユニットの一過性発現細胞を用いた。図7に示すように、#3抗体は、ラットインテグリンα8鎖と反応した。その反応性は、ヒトインテグリンα8鎖と反応させたときと同程度であった。【０１１１】
（３）その他生物由来インテグリンα8β1への反応性評価
上記実施例2の結果によれば、#3抗体の認識するエピトープは、R120及びその周辺領域である。この部分のラットのアミノ酸配列を調べたところ、マウス、及びヒトと全く同じであった。そこで、他の種の配列もデータベースから収集しアラインメントを行った(図8)。その結果、ウシ、ブタ、イヌ、ハムスター、マーモセット、アカゲザル、テナガザル、チンパンジーもR120およびN-末6残基、C-末6残基の合計13残基(TNNRKIRVNGTKE、配列番号9)において100％の相同性を認めた。従って、#3抗体は、ハムスター、ウシ、ブタ、イヌ、マーモセット、アカゲザル、テナガザル、チンパンジーのインテグリンα8β1とも反応性を有すると考えられる。【０１１２】
＜実施例５＞胆管結紮による線維化モデルマウス(Bile Duct Ligation (BDL)マウス)を用いた治療効果の評価
（１）BDLマウスへの投与
図9に示すように、Day 0で、肝線維化の誘導のためにマウスの胆管を結紮し、肝内胆管周辺に線維化を生じる所謂BDLマウスを作製した。また、エンドトキシンフリーの#3抗体を0.5 mg/bodyでマウスの腹腔内に2週間、3日毎に投与した。比較のため、抗インテグリンα8β1抗体非投与のBDLマウスも作製した。さらに、以下の通り線維化の指標を測定した。【０１１３】
（２）マッソントリクローム染色
BDLマウスの肝組織の線維化を検討するため、マッソントリクローム染色を行った。図10は胆管、門脈、肝動脈からなる三つ組(biliary triad)の周辺の組織像である。上パネルは、#3抗体非投与の場合である。上パネルでは、青色に染色されたコラーゲン線維の量が増加しており、新規に形成された微小胆管が認められ胆管増生を生じている。また比較的大きな胆管では上皮が増殖しており、また胆管周辺には炎症細胞の浸潤が見られる。赤色は肝実質細胞である。下パネルは、#3抗体投与の場合である。下パネルでは上パネルと比較すると、微小胆管の増生は同様に認められるもののコラーゲン線維の増加の程度が著しく少ない。胆管の結紮により胆管内圧が上がり胆管の増生を来しているが、それに伴う線維化は抗体投与により抑制されていることがわかる。【０１１４】
（３）Col α1(I)とα-SMAの遺伝子発現の測定
BDLマウスの肝臓における、コラーゲンα1(Col α1(I))とα平滑筋アクチン(α-SMA)の遺伝子発現を、定量PCR法で分析し、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。。正常マウスのものを1とした場合の相対発現量を図11に示す。【０１１５】
Col α1(I)の発現は、BDLマウスにおいて、正常マウスの40倍以上に増加した。この値は、#3抗体投与によって10倍以下の値まで減少した。即ち、#3抗体投与によってBDLマウスのCol α1(I)の発現が、75％以上阻害された。また、α-SMAの発現は、BDLマウスにおいて、正常マウスの約9倍以上に増加した。この値は、#3抗体投与によって5倍以下の値まで減少した。即ち、#3抗体投与によってBDLマウスのCol α1(I)の発現が、約50％阻害された。【０１１６】
（４）ヒドロキシプロリンの定量
ヒドロキシプロリンは組織中のコラーゲン量を反映し、線維化定量の標準的な方法として用いられる。BDLマウスの肝臓におけるヒドロキシプロリン量を、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。その結果を図12に示す。BDLマウスのヒドロキシプロリンの量は、#3抗体投与によって240 μg/g肝臓組織から150μg/g肝臓組織に減少した。【０１１７】
なお、ヒドロキシプロリンの測定は以下の手順で行った。まず、マウス肝組織を6N HCl中でホモジナイズし100 mg/mlとした。次に110 ℃で24時間静置後、800 x gで15分間遠心分離し上清を回収した。上清20 μlに8 N NaOHを14 μl 添加して中和した後、dH2Oを266 μl 加えてトータル0.3 mlとした。さらに、等量のisopropanolと混和後、0.1 mlのクロラミン-T溶液を加えた。室温で10分間静置後、0.5 mlのジメチルアミノベンズアルデヒド溶液を添加し、よく混和し、スピンダウンさせた。呈色反応は50 ℃で90分間行った。その後、室温で5分間クールダウンさせた後、プレートに150 μl分注してA590を測定した。そして、標品をから作製した検量線を用いて定量した。なお、クロラミン-T溶液は、クロラミン-Tを0.336 g (final 0.84%)、3M NaOAcを0.56 ml (final 42 mM)、クエン酸を0.02 g (final 2.6 mM)、isopropanolを15.8 ml (final 39.5%)含み、dH2Oでトータル40 mlになるように調整した溶液を使用した。またジメチルベンズアルデヒド溶液は、p-dimethylaminobenzaldehydeを0.248 g、過塩素酸(60 %)を0.27 ml、isopropanolを0.73 ml混合した溶液を使用した。【０１１８】
＜実施例６＞四塩化炭素誘導性の線維化モデルマウス(CCl4マウス)を用いた治療効果の評価
（１）CCl4マウスへの投与
図13に示すように、Day 1で、肝線維化の誘導のために、オリーブオイルを溶媒とした50％四塩化炭素をマウスの皮下に2 ml/kg bodyで投与し、CCl4マウスを作製した。また、エンドトキシンフリーの#3抗体を0.25 mg/bodyでマウスの腹膜内に4週間、週に2回投与した。比較のため、抗インテグリンα8β1抗体非投与のCCl4マウスも作製した。さらに、以下の通り線維化の指標を測定した。【０１１９】
（２）マッソントリクローム染色
CCl4マウスの肝切片をマッソントリクローム染色した。その結果を図14に示す。上パネルは、#3抗体非投与の場合である。上パネルでは、肝小葉周辺のグリソン鞘(Grisson's capsules)に一致してコラーゲンの増生が見られた。青く染まっているのがコラーゲン線維であり、肝の小葉構造に従って6角形状に増生している。下パネルは、#3抗体投与の場合である。下パネルでは、上パネルでみられた肝小葉周辺のグリソン鞘の肥厚が、ほとんど見られない。【０１２０】
（３）α-SMAの発現量
正常マウスと#3抗体投与／非投与CCl4マウスの肝臓におけるα-SMAの発現量をウエスタンブロッティングで観察した。その結果を図15に示す。CCl4マウスでは、#3抗体非投与のとき、ノーマルマウスに比べてα-SMAの発現量が増加した(抗体(-)、n=3)。一方で、抗インテグリンα8β1抗体投与によって、α-SMAの発現量が減少した(抗体(+)、n=3)。右端レーンはポジティブコントロール(LX2細胞の抽出物)を表している。【０１２１】
（４）ヒドロキシプロリンの定量
CCl4マウスの肝臓におけるヒドロキシプロリン量を、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。その結果を図16に示す。CCl4マウスのヒドロキシプロリンの量は、#3抗体投与によって220 μg/g肝臓組織から177 μg/g肝臓組織に減少した。【０１２２】
以上の実施例5及び6の結果、#3抗体を用いることによって、１）肝線維モデルマウスの病理組織学的線維化所見の改善、２）コラーゲンα1(I)及びα-SMAの遺伝子発現量の増加の抑制、３）ヒドロキシプロリン量の増加の抑制ができることが明らかになった。このように、動物レベルで、はっきりと、病理組織所見の変化が観測されたことは驚くべきことであったが、それは線維化に伴い産生される分子を定量化した数値により裏付けられていた。【０１２３】
＜実施例7＞ブレオマイシン誘発性の肺線維症モデルマウス（肺線維症マウス）を用いた治療効果の評価
（１）肺線維症マウスへの投与
図17に示すように、Day 0で、肺線維化の誘導のために、ブレオマイシン（日本化薬）をマウスの気管内に1.25 U/kg bodyで投与し、ブレオマイシン誘導肺線維症モデルマウスを作製した。また、エンドトキシンフリーの#3抗体を10 mg/bodyでマウスの腹腔内に2週間、3日毎に投与した。対照として、生理食塩水を腹腔に投与したブレオマイシン誘誘導肺線維症モデルマウスも作製し比較した。さらに、以下の通り線維化の指標を測定した。【０１２４】
（２）病理像
ブレオマイシン誘導肺線維症マウスの、ブレオマイシン投与21日後の病理像（HE染色）を示す（図18）。左の対照群のマウスでは著しい線維化が生じており、炎症性細胞の浸潤や線維芽細胞増成、線維素の沈着などにより正常肺胞構造が失われている。一方、右の抗体投与群マウスでは、正常肺に比べれば肺胞隔壁の肥厚や炎症細胞浸潤が認められるが、肺胞構造は保たれており、対照群に比べ線維化は強く抑制されている。【０１２５】
（３）体重の推移
ブレオマイシン誘導肺線維化マウスにおいては、線維化の程度に関連して、体重の増加抑制や減少が認められる。上記の肺線維症マウスの体重の推移を測定した（図19）。その結果、#3抗体非投与マウスでは、ブレオマイシン投与3日後から7日後にかけて平均1.8g（約10%）の体重減少が認められた。一方で、#3抗体投与マウスでは、ほとんど体重の減少が見られなかった。即ち、#3抗体投与によって、線維化に起因する体重減少が抑制されたと考えられる。【０１２６】
（４）Col α1(I)とα-SMAの遺伝子発現の測定
上記の肺線維症マウスの肺における、Col α1(I)とα-SMAの遺伝子発現を、定量PCR法で分析し、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。#3抗体投与マウスにおける発現量を1とした場合の相対発現量を図20に示す。【０１２７】
抗体非投与マウスでは#3抗体投与群に比べα-SMAの発現は4倍以上、Col α1(I)は8倍以上であった。#3抗体投与により、ブレオマイシンモデルにおける線維化関連遺伝子の肺における発現が抑制されていた。【０１２８】
（５）ヒドロキシプロリンの定量
上記の肺線維症マウスの肺におけるヒドロキシプロリン量を、#3抗体投与／非投与マウス間で比較した。その結果を図21に示す。肺線維症マウスのヒドロキシプロリンの量は、#3抗体投与によって840.7 μg/g肺組織から602.8 μg/g肺組織に減少した。【０１２９】
＜実施例8＞インテグリンα8β1に対する#5抗体及び#26抗体の阻害活性評価
96-wellプレートにネフロネクチン(2.5 mg/ml)を固相化した。次に、α8β1を強制発現させたK562細胞を0.05〜5μg/mlの濃度の#3抗体、#5抗体、又は#26抗体で処理した後、1x10 E5細胞/wellとなるように上記プレートに加え、１時間培養後、附着細胞を染色し吸光度を測定した。【０１３０】
その結果、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体は、α8β1発現K562細胞とネフロネクチンとの結合を阻害していた（図22）。この結果は、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体が、インテグリンα8β1のアンタゴニストとして機能していることを示している。またこのことから、#5抗体及び#26抗体は、#3抗体と同様に線維化を抑制する性質を有していると考えられる。【０１３１】
＜実施例9＞#5抗体及び#26抗体の交差反応性の評価
インテグリンα8β1を発現したヒト及びマウス由来の乳がん細胞株（それぞれHs578T、4T1）を用いて、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体の交差反応性をFACS解析により調査した。その結果、ヒト及びマウス由来細胞のどちらを用いたときにも、#3抗体、#5抗体、及び#26抗体それぞれを反応させると、反応させないときに比べて、ピークの位置が明確に右側にシフトした（図23）。このことから、#5抗体及び#26抗体それぞれは、ヒト及びマウス両方のインテグリンα8β1に結合できることが示された。【０１３２】
＜実施例10＞#5抗体のエピトープの評価
α8β1阻害作用をもつ#5抗体は、#3抗体同様ニワトリを宿主として作製したものであり、ヒトα8鎖配列の中でニワトリα8β1配列と異なる部位を認識しているはずである。そこで、ヒトα8鎖配列の中でニワトリα8β1配列と異なるアミノ酸に変異を入れた、計22種のヒトα8鎖変異体cDNAを作製した。このヒトα8鎖変異体をCHO細胞に一過性発現させ、#5抗体と反応させた。#5抗体は、S132変異体とは反応せず、野生型、及びその他の21種の変異体に対しては反応性を保持していた。次に、一過性発現法ではS132変異体が十分に発現していない可能性を除外するため、安定発現株を作製し同様に反応させたが、やはり反応がみられなかった。S132変異体は対照α8抗体とは良く反応し、十分に発現している事を確認した(図24)。この対象α8抗体は、上記22種の変異部位以外の部位を認識する抗体である。これら結果は、#5抗体が認識するエピトープは、S132及びその周辺領域であることを示している。【０１３３】
#5抗体が認識したα鎖のS132と、#3抗体が認識したR120は、いずれもα鎖のキャップサブドメインに位置している。従って、インテグリンα8β1とオステオポンチンとの結合を阻害する抗体であるためには、キャップサブドメイン内のアミノ酸を認識することが重要であることが示唆された。【０１３４】
以上の実施例1〜10の結果は、インテグリンα8β1のアンタゴニストを用いることによって、線維化を抑制できることを示している。また、インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域を認識する、抗インテグリンα8β1抗体を用いることによって、線維化を抑制できることを示している。【０１３５】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月6日(2014.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグリンα８鎖のＲ１２０及びその周辺領域、又はＳ１３２及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα８β１とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα８β１抗体を含む、抗線維化剤。
【請求項２】
前記抗インテグリンα８β１抗体が、ヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα８β１にも結合できる抗インテグリンα８β１抗体である、請求項１に記載の抗線維化剤。
【請求項３】
前記抗インテグリンα８β１抗体が、インテグリンα８鎖の１つ以上のキャップサブドメイン変異体に結合性を有せず、インテグリンα８鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα８β１抗体である、請求項１又は２に記載の抗線維化剤。
【請求項４】
前記抗インテグリンα８β１抗体が、インテグリンα８鎖のＲ１２０Ｋ変異体又はＳ１３２Ａ変異体に結合性を有せず、インテグリンα８鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα８β１抗体である、請求項１〜３いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項５】
前記抗インテグリンα８β１抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜４いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項６】
前記抗インテグリンα８β１抗体が、抗原結合性断片である、請求項１〜５いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項７】
インテグリンα８鎖のＲ１２０及びその周辺領域、又はＳ１３２及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα８β１とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα８β１抗体を含む、線維化の進行に伴って生じる疾患の治療薬。
【請求項８】
インテグリンα８鎖のＲ１２０及びその周辺領域、又はＳ１３２及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα８β１とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα８β１抗体を含む、線維化に起因する体重減少抑制剤。
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月20日(2015.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体を含む、抗線維化剤。
【請求項２】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、ヒト、マウス、及びラット由来のいずれのインテグリンα8β1にも結合できる抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1に記載の抗線維化剤。
【請求項３】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、インテグリンα8鎖の1つ以上のキャップサブドメイン変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1又は2に記載の抗線維化剤。
【請求項４】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、インテグリンα8鎖のR120K変異体又はS132A変異体に結合性を有せず、インテグリンα8鎖の野生型に結合性を有する抗インテグリンα8β1抗体である、請求項1〜3いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項５】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1〜4いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項６】
前記抗インテグリンα8β1抗体が、抗原結合性断片である、請求項1〜5いずれかに記載の抗線維化剤。
【請求項７】
インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体を含む、線維症の治療薬。
【請求項８】
インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体を含む、病理学的に組織線維化が見られる疾患の治療薬。
【請求項９】
インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体を含む、線維化の進行に伴って生じる肝硬変又は悪性腫瘍の治療薬。
【請求項１０】
インテグリンα8鎖のR120及びその周辺領域、又はS132及びその周辺領域に特異的に結合し、インテグリンα8β1とリガンドとの結合を阻害する抗インテグリンα8β1抗体を含む、線維化に起因する体重減少抑制剤。
【国際調査報告】
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2013147076.tif 000028
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2013147076.tif 000030
2013147076.tif 000031
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