(57)【要約】本発明は、ホップ由来モノテルペン配糖体化酵素及び同酵素を用いたモノテルペン配糖体の製造方法を提供することを目的とする。  本発明は、ホップ由来モノテルペン配糖体化酵素及び同酵素を用いたモノテルペン配糖体の製造方法を提供する。本発明は、ホップ由来モノテルペン配糖体化酵素遺伝子を導入した形質転換体及び当該形質転換体の作製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記モノテルペン化合物が、ゲラニオール又はリナロールである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｅ）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３又は５の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１、３又は５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、モノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
植物体である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項４に記載の形質転換体の抽出物。
【請求項８】
請求項７に記載の抽出物を含む食品、香料、医薬品又は工業原料。
【請求項９】
請求項４に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とする、モノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、モノテルペン化合物とを反応させて前記モノテルペン化合物を配糖化する工程を含む、モノテルペン配糖体の製造方法。
【請求項１１】
前記ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノテルペン化合物が、ゲラニオール又はリナロールである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノテルペンを配糖体化する活性を有するタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチド、同タンパク質を利用したモノテルペン配糖体の製造方法、モノテルペン配糖体化酵素を高発現する形質転換体並びに前記方法により作製されたモノテルペンの配糖体及びその利用に関する。また、本発明は、モノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質の発現が抑制された植物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
テルペノイド、特にモノテルペン（Ｃ１０）やセスキテルペン（Ｃ１５）など分子量が比較的小さいテルペノイド類は植物の主要香気成分であり、食品、酒類のフレーバーのみならず化粧品や香水に至る工業製品にまで幅広く利用されている。リナロールに代表されるモノテルペンは植物細胞内で合成されるが、一部は配糖体として蓄積していることが知られており、たとえばアブラナ科シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）では水酸化リナロールの配糖体が報告されている（非特許文献１）。モデル植物のみならず産業上重要な作物であるアサ科ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）（非特許文献２）やツバキ科チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（非特許文献３−６）やショウガ科ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）（非特許文献７）においてもモノテルペン配糖体が蓄積していることが知られている。さらに植物界に幅広く報告されていることから（非特許文献８）、配糖体は香気成分の前駆体として一般的な形であると考えられる。香気前駆物質であるテルペン配糖体を酵素あるいは非酵素的に糖を切除し、香気成分を揮発させるといった人工制御についても産業応用的な見地から検討されている（非特許文献９）。
しかしながらこれまでにモノテルペン配糖体の糖を切る酵素（β−プリメベロシダーゼ（β−ｐｒｉｍｅｖｅｒｏｓｉｄａｓｅ））はチャから単離されているものの（非特許文献１０）、モノテルペンに糖が付加される（配糖体化される）分子機構については不明である。シロイヌナズナのＵＤＰ−ｓｕｇａｒ依存的配糖体化酵素（ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＵＧＴ）の網羅的活性スクリーニングによって一部のＵＧＴ酵素が試験管内でモノテルペンに反応することが報告されているが、生理的な役割やその活性の意義は示されていない（非特許文献１１）。ミカン科スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）にもモノテルペン配糖体が蓄積している為、モノテルペンに対するＵＧＴのスクリーニングが行われたが、活性のあるＵＧＴ酵素遺伝子の同定に至っていない（非特許文献１２）。
アサ科ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）はビールの主原料であり、主にドイツやチェコのヨーロッパやカナダやアメリカの北米大陸で生産されている。ビールの香気でホップに由来する香気成分としてリナロールに代表されるモノテルペン類が挙げられる。ホップの毬花表皮には、アロマ成分を貯めこむよう特殊に分化したルプリンと呼ばれるトライコームが存在する。多くのアロマ成分はルプリンに蓄積していると考えられている。その一方でホップやビールには香気成分前駆体としてリナロールやゲラニオールの配糖体等のテルペン類の配糖体が蓄積していることが報告されているがその生成酵素については不明である（非特許文献２、１０及び１３）。
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ９７／１１１８４
【非特許文献１】Ａｈａｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５，２８６６−２８８４
【非特許文献２】Ｋｏｌｌｍａｎｎｓｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｓｃｈｒ．Ｂｒａｕｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ５９，８３−８９
【非特許文献３】Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，１５３２−１５３４
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，９２９−９３１
【非特許文献５】Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，１８１５−１８１９
【非特許文献６】Ｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ５６，８１９−８２５
【非特許文献７】Ｓｅｋｉｗａ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３，３８４−３８９
【非特許文献８】Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｕｒｏｕｍｏｕｎｉｓ（１９９７）Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５５，７３−１０５
【非特許文献９】Ｈｅｒｍａｎ（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６，５８３６−５８６３
【非特許文献１０】Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３０，２１６４−２１７６
【非特許文献１１】Ｃａｐｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１４，６６５６−６６６２
【非特許文献１２】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  ５３，８１６−８２３
【非特許文献１３】Ｎｅｄｊｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ７１，１−１３
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは鋭意研究を遂行した結果、ホップにおいてモノテルペンの配糖化反応を触媒する酵素及び同酵素をコードする遺伝子配列を同定することに成功した。本発明は、上記知見に基づくものである。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］  以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれか］に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質
［２］  前記モノテルペン化合物が、ゲラニオール又はリナロールである、前記［１］に記載のタンパク質。
［３］  以下の（ａ）〜（ｅ）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１、３又は５の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１、３又は５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、モノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［４］  前記［３］に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
［５］  前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［４］に記載の形質転換体。
［６］  植物体である、前記［４］に記載の形質転換体。
［７］  前記［４］に記載の形質転換体の抽出物。
［８］  前記［７］に記載の抽出物を含む食品、香料、医薬品又は工業原料。
［９］  前記［４］に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とする、モノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質の製造方法。
［１０］  前記［１］に記載のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、モノテルペン化合物とを反応させて前記モノテルペン化合物を配糖化する工程を含む、モノテルペン配糖体の製造方法。
［１１］  前記ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースである、前記［１０］に記載の方法。
［１２］  前記モノテルペン化合物が、ゲラニオール又はリナロールである、前記［１０］に記載の方法。
本発明のタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを利用することにより、高効率にテルペン化合物の配糖体を製造することができる。また、本発明の形質転換体は、テルペン化合物の配糖体の含有量が高いため、これらの形質転換体から、効率よくテルペン化合物の配糖体を抽出・精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ホップＨｌＵＧＴの組換えタンパク質発現の結果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。
【図２】ホップＨｌＵＧＴ組換えタンパク質のゲラニオール配糖体化活性を示す。
【図３】ホップＨｌＵＧＴの組換えタンパク質のリナロール配糖体化活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１２年２月６日に出願された日本国特許出願（特願２０１２−０２２９８２号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本発明者らは、ホップのモノテルペン化合物の配糖体化反応を担う酵素タンパク質が、ＨｌＵＧＴ１１９、ＨｌＵＧＴ１２７、ＨｌＵＧＴ２７９及びＨｌＵＧＴ２５１であることを初めて解明した。
ＨｌＵＧＴ１１９のＣＤＳ配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２である。ＨｌＵＧＴ１２７のＣＤＳ配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４である。また、ＨｌＵＧＴ２７９のＣＤＳ配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５及び６である。また、ＨｌＵＧＴ２５１のＣＤＳ配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７及び８である。これらのポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
１．ホップ由来モノテルペン配糖体化酵素
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）を提供する。
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質
上記（ａ）〜（ｃ）に記載のタンパク質において、「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列」は、ある実施形態では「配列番号２、４又は６のアミノ酸配列」、「配列番号２又は４のアミノ酸配列」、「配列番号２又は６のアミノ酸配列」あるいは「配列番号４又は６のアミノ酸配列」である。
別の実施形態では、上記（ａ）〜（ｃ）に記載のタンパク質において「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列」は「配列番号８のアミノ酸配列」である。
上記（ｂ）又は（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号２、４、６又は８のポリペプチドの変異体であるが、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７″、″Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）″、″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）″、″Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）″、″Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）″、″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）″等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
本明細書中、「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物のを配糖体化する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、例えば、１〜９５個、１〜９０個、１〜８５個、１〜８０個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６５個、１〜６０個、１〜５５個、１〜５０個、１〜４９個、１〜４８個、１〜４７個、１〜４６個、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
また、このようなタンパク質としては、配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
ここで、「モノテルペン化合物を配糖体化する活性」とは、アグリコンであるモノテルペン化合物のヒドロキシ基に、ＵＤＰ糖に含まれる糖を付加する（配糖体化する）活性を意味する。糖が付加されるヒドロキシ基は特に限定されない。
モノテルペン化合物を配糖体化する活性は、本発明のタンパク質１〜５００ｎｇ（好ましくは、５０〜２００ｎｇ、最も好ましくは１００ｎｇ）、ＵＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ−グルコース）１〜１０００μＭ（好ましくは、１００〜７００μＭ、最も好ましくは５００μＭ）、及びモノテルペン化合物（例えば、リナロール又はゲラニオール）１〜５００μＭ（好ましくは、１００〜５００μＭ、最も好ましくは２５０μＭ）を含むｐＨ６．０〜８．０の中性領域の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムバッファー又はリン酸カリウムバッファー）中において、２０〜４０℃の温度でインキュベートした後に、前記モノテルペンを精製し、精製したモノテルペンをＬＣ−ＭＳ分析化（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
配糖体化反応は、一般に、１分〜１２時間程度で終了する。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
本発明において、「モノテルペン化合物」とは、イソプレン
2013118906.tif 000002
を構成単位とする炭化水素であり、植物、昆虫及び菌類等によって作り出される生体物質の他に、化学的に合成された化合物も含む。
本発明において、モノテルペン化合物は、ヒドロキシ基を有するもの（例えば、リナロールやゲラニオール）であれば特に限定されない。
このようなモノテルペンの例としては、ネロール、ゲラニオール及びリナロール等があるが、これらに限定されるものではない。好ましくはゲラニオール又はリナロールである。
例えば、ホップ由来のゲラニオールは１位に−ＯＨ基を有し、リナロールは３位に−ＯＨ基を有する。そこで、本発明のタンパク質を用いてホップ細胞に含まれるゲラニオールを配糖化する場合、１位の−ＯＨ基に糖が付加される。また、本発明のタンパク質を用いてホップ細胞に含まれるリナロールを配糖化する場合、３位の−ＯＨ基に糖が付加される。
【表１】
2013118906.tif 000003
2013118906.tif 000004
本発明において、「ＵＤＰ−糖」とは、ウリジン二リン酸（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ＤｉＰｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＤＰ）結合型の糖であり、例としては、ＵＤＰ−グルクロン酸及びＵＤＰ−グルコースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ＵＤＰ−糖は、ＵＤＰ−グルコースである。
２．モノテルペン配糖体の製造方法
本発明はタンパク質が有する、モノテルペン化合物の配糖化活性を利用することにより、モノテルペン配糖体を容易かつ多量に製造することが可能である。
そこで、別の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質と、ＵＤＰ糖と、モノテルペン化合物とを反応させて前記モノテルペン化合物を配糖体化する工程を含む、モノテルペン化合物の配糖体の製造方法を提供する。
本発明のモノテルペン配糖体の製造方法において、ＵＤＰ−糖の好ましい例としてはＵＤＰグルコースが挙げられ、また、モノテルペン化合物は、好ましくはゲラニオール又はリナロールである。
本発明に係るモノテルペン配糖体の製造方法は、本発明のタンパク質と、ＵＤＰ糖と、モノテルペン化合物とを反応させて前記モノテルペン化合物を配糖体化する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成したモノテルペン化合物の配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。
モノテルペン化合物の配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ（Ｈｉｇｈ）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
３．モノテルペン配糖体高含有非ヒト形質転換体
モノテルペン配糖体は、本発明のタンパク質を用いて細菌（大腸菌又は酵母など）、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ホップに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するＵＤＰ−糖及びモノテルペン化合物とを反応させることによりモノテルペン配糖体を生成することができる。
そこで、本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を提供する。
（ａ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物のを配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物のを配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、モノテルペン化合物のを配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列」は、ある実施形態では「配列番号２、４又は６のアミノ酸配列」、「配列番号２又は４のアミノ酸配列」、「配列番号２又は６のアミノ酸配列」あるいは「配列番号４又は６のアミノ酸配列」である。
別の実施形態では、上記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列」は「配列番号８のアミノ酸配列」である。
上記（ａ）及び（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、「配列番号１、３、５又は７の塩基配列」は、ある実施形態では「配列番号１、３又は５の塩基配列」、「配列番号１又は３の塩基配列」、「配列番号１又は５の塩基配列」あるいは「配列番号３又は５の塩基配列」である。
別の実施形態では、上記（ａ）及び（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて「配列番号１、３、５又は７の塩基配列」は「配列番号７の塩基配列」である。
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１、３、５若しくは７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号２、４、６若しくは８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″及び″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７″などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃又は０．２  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６０℃、０．２  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６２℃、０．２  ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１、３、５若しくは７の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号２、４、６若しくは８のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１、３、５若しくは７のＤＮＡ、又は配列番号２、４、６若しくは８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｂｌａｓｔｐ、ｔｂｌａｓｔｎやｔｂｌａｓｔｘと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ｂｌａｓｔｎを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ｂｌａｓｔｐを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。
上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物又は植物又はヒトを除く動物が挙げられる。
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６６，ｐ．４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２９，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３，１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）″等を参照することができる。
本発明の１つの態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。
外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７：３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１又はｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が知られている。パーティクルガンを用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）ベンケイソウ（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（ナラ、ブナ、カシワ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）及びアブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロナズナ、アブラナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等）、シソ科（サルビア、シソ、ラベンダー、タツナミソウ等）が挙げられる。植物の好ましい例としては、芳香性を有する植物、例えば、シソやラベンダーなど、あるいは、本来、あまり芳香を有していないが商業的価値の高い園芸植物、例えば、カーネーションなどが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物体（以下、「本発明の植物」又は「本発明の植物体」）は、その野生型と比べてモノテルペン化合物の配糖体を多く含む。
本発明の植物は、本発明の植物の種子、挿し木、球根等を育成することにより、容易に完全な植物体を得ることができる。
よって、本発明の植物には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、球根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
４．  形質転換体の抽出物及びその利用
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、その野生型と比べてモノテルペン配糖体の含有量が高いので、その抽出物には、モノテルペン配糖体が高濃度で含まれると考えられる。
本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザー又はソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。さらに、上記で述べたモノテルペン配糖体の抽出方法により、さらなる抽出工程を施してもよい。
本発明の形質転換体の抽出物は、常法に従って、例えば、食品、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、香料、医薬、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）を提供する。本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、香料、医薬、工業原料の調製は、常法による。このように、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、香料、医薬、工業原料等は、本発明の形質転換体を用いて生成されたモノテルペン配糖体を含有する。
本発明の香料（組成物）又は医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の香料組成物又は医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、香水、パウダー、オーデコロン、歯磨、石鹸、エアロゾル、クレンジングフォーム等の化粧料若しくは皮膚外用薬の他、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤等に用いることができる。
本発明の化粧料組成物は、必要に応じてさらに、その他の油脂、及び／又は色素、香料、防腐剤、界面活性剤、顔料、酸化防止剤等を適宜配合することができる。これらの配合比率は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る（例えば、油脂は、組成物中に、１〜９９．９９重量％、好ましくは、５〜９９．９９重量％、より好ましくは、１０〜９９．９５重量％含有され得る）。また、本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいても良い。
本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。
これらの食品の形態の例としては、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等又は調味料であってもよい。
５．モノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物
植物中に内在的に存在するモノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質の発現を抑制することにより、モノテルペンの配糖体化が阻害される。その結果、当該植物では、より多くのモノテルペンがアグリコンとして存在することになり、より強い芳香が発せられることが期待できる。
そこで、本発明は、モノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質の発現が抑制された植物を提供する。
モノテルペン化合物を配糖化する活性を有するタンパク質（以下、「モノテルペン配糖体化酵素」という）とは、具体的には、以下の（ａ）〜（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされる。
（ａ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１〜９５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、モノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列」は、ある実施形態では「配列番号２、４又は６のアミノ酸配列」、「配列番号２又は４のアミノ酸配列」、「配列番号２又は６のアミノ酸配列」あるいは「配列番号４又は６のアミノ酸配列」である。
別の実施形態では、上記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて「配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列」は「配列番号８のアミノ酸配列」である。
上記（ａ）及び（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、「配列番号１、３、５又は７の塩基配列」は、ある実施形態では「配列番号１、３又は５の塩基配列」、「配列番号１又は３の塩基配列」、「配列番号１又は５の塩基配列」あるいは「配列番号３又は５の塩基配列」である。
別の実施形態では、上記（ａ）及び（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて「配列番号１、３、５又は７の塩基配列」は「配列番号７の塩基配列」である。
（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドの定義等については、「３．モノテルペン配糖体高含有非ヒト形質転換体」で述べたとおりである。
モノテルペン配糖体化酵素の発現を抑制する方法の具体例としては、当該酵素のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量を低下させる物質、例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質及び核酸等が挙げられ、１つの実施態様では、前記酵素をコードする遺伝子の機能又は発現を抑制する核酸である。このような核酸の例としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡを生じさせる、ヘアピン状のｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。阻害の対象となるモノテルペン配糖体化酵素遺伝子は上記（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドからなり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、モノテルペン配糖体化酵素遺伝子のコード領域のみならず、非コード領域を阻害対象領域として使用することも可能である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、複数の段階を経て行われるマルチステッププロセスである。最初に、ＲＮＡｉ発現ベクターから発現したｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡがＤｉｃｅｒによって認識され、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡｓに分解される。次に、ｓｉＲＮＡｓはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）と呼ばれるＲＮＡｉ標的複合体に組み込まれ、ＲＩＳＣとｓｉＲＮＡｓとの複合体がｓｉＲＮＡの配列と相補的な配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡを分解する。標的ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに相補的な領域の中央で切断され、最終的に標的ｍＲＮＡが速やかに分解されてタンパク発現量が低下する。最も効力の高いｓｉＲＮＡ二重鎖は、１９ｂｐの二重鎖の各３’末端にウリジン残基２個の突出部分を持つ２１ヌクレオチド長の配列であることが知られている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ，１５，１８８−２００（２００１））。
一般に、ｍＲＮＡ上の標的配列は、ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列から選択することができる。但し、本発明においてはこの領域に限定されるものではない。
ｓｉＲＮＡ分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくはＡＡ、ＴＡ、ＧＡ又はＣＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基のセグメントを選択することができる。ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、３０〜７０％、好ましくは３５〜５５％である。あるいは、ＲＮＡｉの標的配列は、Ｕｉ−Ｔｅｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，９３６−９４８）の記載に沿って適宜選択することができる。
ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本鎖ＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順でこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するように連結し、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。スペーサーの長さも特に限定されるものではない。
配列Ａは、標的となるモノテルペン配糖体化酵素遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
さらに、本発明は、マイクロＲＮＡを用いてモノテルペン配糖体化酵素の発現を阻害することができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、細胞内に存在する長さ２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）の一種である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
ｍｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに基づく阻害性核酸であるため、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに準じて設計し合成することができる。
ＲＮＡｉ用の発現ベクターは、ｐＭｕｎｉＨ１プラスミド、ｐＳＩＮｓｉベクター（タカラバイオ）、ｐＳＩＦ１−Ｈ１（システムバイオサイエンス社）等をベースに、市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型）を用いて容易に作製することができる。ＲＮＡｉ用の発現ベクターの例としては、例えば、ｐＳＰＢ１８７６（国際公開公報ＷＯ２００４／０７１４６７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＲＮＡｉ用の発現ベクターは、コスモ・バイオ株式会社、タカラ・バイオ株式会社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社等の第三者機関に作製を委託することもできる。
モノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物の製造方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
（１）  宿主植物又はその一部にモノテルペン配糖体化酵素に対するＲＮＡｉ用の発現ベクター（例えば、ｓｉＲＮＡ発現ベクター又はｍｉＲＮＡ発現ベクターを導入する工程
宿主植物へＲＮＡｉ用の発現ベクターを導入する方法は、項目「３．モノテルペン配糖体高含有非ヒト形質転換体」に述べた方法と同様である。宿主植物は、植物体全体、又はその一部である植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれであってもよい。植物の種類についても、項目「３．モノテルペン配糖体高含有非ヒト形質転換体」に述べたものと同様である。
（２）  前記工程（１）により得られた形質転換植物を育成する工程
前記工程（１）で用いた宿主植物が、植物器官、植物組織、植物細胞、プロトプラスト、葉の切片又はカルスといった植物体の一部であった場合には、完全な植物体を形成するまで形質転換体を適切な環境で育成してもよい。植物体の一部から完全な植物体を育成する方法については、以下の文献の記載を参照できる：生物化学実験法４１  植物細胞工学入門  学会出版センター  ＩＳＢＮ  ４−７６２２−１８９９−５。
このようにして得られたモノテルペン配糖体化酵素遺伝子の発現が抑制された植物を栽培することにより、効率的にモノテルペン・アグリコンを製造することができる。
６．モノテルペン配糖体化酵素遺伝子の発現が抑制された植物の加工製品
現代では、生花（例えば、土壌育成植物、鉢植植物、切り花等）のみではなく、生花の加工製品も植物観賞用の製品として販売されている。モノテルペン配糖体化酵素遺伝子の発現が抑制された植物は、芳香が強いため、このような生花の加工製品の材料としても非常に有用である。従って、本発明の別の実施形態として、モノテルペン配糖体化酵素遺伝子の発現が抑制された植物（例えば、生花、切り花）又はその一部（例えば、葉、花弁、茎、根、種子、球根等）の加工製品が挙げられる。前記加工製品の例としては、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、マテリアルフラワー、樹脂密封品等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
７．  モノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物の抽出物及びその利用
本発明はまた、別の実施形態において、上記のモノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物の抽出物を提供する。モノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物は、その野生型と比べてモノテルペン・アグリコンの含有量が高いので、その抽出物には、モノテルペン・アグリコンが高濃度で含まれると考えられる。
上記抽出物の抽出方法は、上記で述べた本発明の形質転換体の抽出物の抽出方法と同様である。
このようにして得られた抽出物は、常法に従って、例えば、食品、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
本発明はまた、別の実施形態において、前記抽出物を含む食品、香料、医薬、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）を提供する。前記抽出物を含む食品、香料、医薬、工業原料の調製は、常法による。このように、モノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物の抽出物を含む食品、香料、医薬、工業原料等は、モノテルペン配糖体化酵素の発現が抑制された植物を用いて生成されたモノテルペン・アグリコンを含有する。
本発明の食品、香料、医薬、工業原料等の種類及び組成などは、先の項目「３．形質転換体の抽出物及びその利用」で述べたものと同様である。
８．テルペン配糖体含有量の高い植物又はモノテルペン・アグリコン含有量の高い植物をスクリーニングする方法
本発明は、モノテルペン・アグリコン含有量の高い植物をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、前記方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）被検植物からｍＲＮＡを抽出する工程
（２）前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡと、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
上記工程（１）は、被検植物から、ｍＲＮＡを抽出することにより行うことができる。ｍＲＮＡを抽出する被検植物の部位は、特に限定されないが、好ましくは、花弁である。ｍＲＮＡを抽出した場合には、逆転写することにより、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製してもよい。
工程（２）は、上記で抽出したｍＲＮＡに対し、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることにより行うことができる。高ストリンジェントな条件は、既に述べたとおりである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５〜５００ｂｐ、より好ましくは、１０〜２００ｂｐ、さらに好ましくは、１０〜１００ｂｐの長さである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託することもできる。
工程（２）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして用いた場合には、工程（３）は、通常のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、又はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）（Ｓｉｅｂｅｎ  Ｖ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７−０６）．ＩＥＴ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（３）：２７−３５）等のハイブリダイゼーション検出方法により行うことができる。一方、工程（２）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして用いた場合には、工程（３）は、ＰＣＲ増幅反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動又はシークエンシング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等によって解析することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
ハイブリダイゼーションがより多く検出された植物体は、他の植物体と比べてモノテルペン化合物のを配糖化する活性を有するタンパク質をより多く発現しているといえるので、テルペン配糖体含有量が高いことが予測される。
一方、ハイブリダイゼーションがより少なく検出された植物体は、他の植物体と比べてモノテルペン化合物を配糖体化する活性を有するタンパク質の発現が低いため、モノテルペン・アグリコン含有量が高く、特に開花時に強い芳香を放つことが予測される。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。
ホップからシロイヌナズナ由来ＵＧＴ８５Ａ３およびＵＧＴ８５Ａ１ホモログのクローニング
ホップからシロイヌナズナ由来の配糖体化酵素ＵＧＴ８５Ａ３酵素遺伝子（シロイヌナズナ国際遺伝子番号Ａｔ１ｇ２２３８０）およびＵＧＴ８５Ａ１酵素遺伝子（シロイヌナズナ国際遺伝子番号Ａｔ１ｇ２２４００）と相同性の高いＵＧＴ遺伝子の単離を試みた。ホップ（信州早生品種）の未成熟および成熟した毬花と葉からＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（シグマ社）を用いてＲＮＡを抽出し、オリゴテックス−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ）によりポリＡ（＋）ＲＮＡを得た。このポリＡ（＋）ＲＮＡ  ５ｕｇを鋳型とし、ラムダＺＡＰ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ／Ｕｎｉ  ＺＡＰ  ＸＲ  ｖｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ／ＧｉｇａＰａｃｌ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（アジレント社））を用いて、同社の推奨する方法によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーは３．１１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。このｃＤＮＡライブライー約５０万プラークをシロイヌナズナのＵＧＴ８５Ａ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ（配列番号９）およびＵＧＴ８５Ａ３遺伝子の全長ｃＤＮＡ（配列番号１０）をプローブにスクリーニングを行った。
即ち、以下のプライマーセット１及び２で増幅される断片をスクリーニングプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。
プライマーセット１
2013118906.tif 000005
プライマーセット２
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プローブはノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、製造者が推奨する条件に従いＰＣＲによりラベルした。この際、鋳型ＤＮＡを１μｌ（前述のＵＧＴ８５Ａ３発現用プラスミド約１ｐｇ）、１ｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ  Ｂｉｏ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、ｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．２５Ｕを含むＰＣＲ反応液を使用した。このＰＣＲ反応液を、９４℃で５分反応させた後、９４℃１分、５２℃１分、７２℃２分の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分間処理した。このＰＣＲ産物からＭｉｎｉ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎカラム（Ｒｏｃｈｅ）でプライマーおよび未反応のｄＮＴＰを除去し、これをスクリーニングプローブとして用いた。
ライブラリーのスクリーニングならびに陽性クローンの検出はノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。ハイブリダイゼーション反応を３０％ホルムアミドを含む５ｘＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、メンブレンの洗浄を５ｘ  ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて５５℃で２０分間行った。約５０万プラークをスクリーニングした。二次スクリーニング後、得られた陽性クローンから、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によってｃＤＮＡ配列を得た。得られたｃＤＮＡ配列をＢｌａｓｔｘプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）によってホモロジー解析することでホップから、シロイヌナズナのＵＧＴ８５Ａ３およびＵＧＴ８５Ａ１のホモログ遺伝子（ＨｌＵＧＴ）を得た。
得られたＨｌＵＧＴは、次の通りである：ＨｌＵＧＴ１１９（ＣＤＳ配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２）、ＨｌＵＧＴ１２７（ＣＤＳ配列：配列番号３、アミノ酸配列：配列番号４）、ＨｌＵＧＴ２７９（ＣＤＳ配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）及びＨｌＵＧＴ２５１（ＣＤＳ配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８）。
これら４種のＨｌＵＧＴのモノテルペン配糖体化活性を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。発現ベクター構築のため、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った。
ＨｌＵＧＴ１１９の増幅用プライマーセット
2013118906.tif 000007
ＨｌＵＧＴ１２７の増幅用プライマーセット
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ＨｌＵＧＴ２７９の増幅用プライマーセット
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ＨｌＵＧＴ２５１の増幅用プライマーセット
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ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、ホップ由来ｃＤＮＡ  １μｌ、１×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａＢｉｏ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．４ｐｍｏｌ／μｌ、ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕからなる組成とした。ＰＣＲ反応は、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を計３０サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型ＤＮＡから推定された約１．４ｋｂのサイズに増幅バンドが得られた。
これらのＰＣＲ産物はｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって挿入断片内にＰＣＲによる変異が無いことを確認した。
その後、得られた４種のＨＩＵＧＴ遺伝子をインビトロジェン社の大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に製造業者推奨の方法で挿入し、大腸菌発現用プラスミドを作成して、以下のようにＨｌＵＧＴ１１９、ＨｌＵＧＴ１２７、ＨｌＵＧＴ２７９及ひＨｌＵＧＴ２５１をＨｉｓＴａｇとの融合タンパク質として発現させた。
上記大腸菌発現用プラスミドで定法に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１０ｇ／ｌ  ｔｙｐｔｏｎｅ  ｐｅｐｔｏｎ，５ｇ／ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）４ｍｌにて、３７℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液４ｍｌを同組成の培地８０ｍｌに接種し、３７℃で振盪培養した。菌体濁度（ＯＤ６００）がおよそ０．５に達した時点で終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１８℃で２０ｈｒ振盪培養した。
以下のすべての操作は４℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（５，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）にて集菌し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓ［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５），２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌ，１４ｍＭ  β−メルカプトエタノール］１ｍｌ／ｇ  ｃｅｌｌを添加して、懸濁した。続いて、超音波破砕（１５ｓｅｃ×８回）を行い，遠心分離（１５，０００×ｇ，１５ｍｉｎ）を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をＢｕｆｆｅｒ  Ｓにて平衡化したＨｉｓ  ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、遠心（７０×ｇ，３０ｓｅｃ）した。Ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、１００ｍＭおよび５００ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むＢｕｆｆｅｒ  Ｓ  各５ｍｌにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、１４ｍＭ  β−メルカプトエタノールにバッファー置換した（透析倍率１０００倍）。
精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したところ、ｃＤＮＡから推定されるサイズにタンパク質の発現が確認できた（図１）。図１中、矢印と四角枠は溶出したヒスチジンタグ融合ＨｌＵＧＴタンパク質を示す。レーンは、左から順にサイズマーカー、ＨｌＵＧＴ１１９、ＨｌＵＧＴ１２７、ＵｌＵＧＴ２７９、ＨｌＵＧＴ２５１を示す。ＨｌＵＧＴ２５１はその他のＵＧＴと比べて精製された発現タンパク質が少ないことが分かる。
次に、これらのタンパク質を用いてモノテルペンとの反応性をＬＣ−ＭＳ分析により検討した。
標準的な酵素反応条件は以下の通りである。反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース，０．２ｍＭ  糖受容体基質，１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），精製ＶｖＵＧＴ酵素溶液２５μｌ）を蒸留水で５０μｌに調製し、３０℃、１時間反応させた。
酵素反応液５μｌを下記の条件でＬＣ−ＭＳ分析を行った。
ＬＣ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８−ＵＧ１２０（２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：Ａ：水（＋０．０５％蟻酸含有），Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：１５分間のＢ濃度１５％から９０％への直線濃度勾配
流速：毎分０．２ｍｌ
カラムオーブン：４０℃
ＭＳ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ＥＳＩ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）
ＳＩＭ  ｍｏｄｅ：（ｍ／ｚ  ３１５，３３８，３６１，３６３，３３１，３５４，３７７，４２９  ｅｔｃ）
上記ＬＣ−ＭＳ分析をＨｌＵＧＴ１１９、ＨｌＵＧＴ１２７、ＨｌＵＧＴ２７９及びＨｌＵＧＴ２５１のそれぞれについて行った。
その結果、４種のＨｌＵＧＴ共にゲラニオールおよびリナロールに対してモノグルコシル化する活性を示した（ゲラニオールに対する活性：図２、リナロールに対する活性：図３）。図２において、各パネルは上から順に、ゲラニオール配糖体（標準品）、ゲラニオールとＨｌＵＧＴ１１９との反応液、ゲラニオールとＨｌＵＧＴ１２７との反応液、ゲラニオールとＨｌＵＧＴ２７９との反応液、ゲラニオールとＨｌＵＧＴ２５１との反応液についてのＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。図２において、四角枠は酵素反応生成物（ゲラニオール配糖体）を示す。また、図３において、各パネルは上から順にリナロール配糖体（標準品）、リナロールとＨｌＵＧＴ１１９との反応液、リナロールとＨｌＵＧＴ１２７との反応液、リナロールとＨｌＵＧＴ２７９との反応液、リナロールとＨｌＵＧＴ２５１との反応液、リナロールと熱変性したＨｌＵＧＴ１１９との反応液、リナロールと熱変性したＨｌＵＧＴ１２７との反応液、リナロールと熱変性したＨｌＵＧＴ２７９との反応液、リナロールと熱変性したＨｌＵＧＴ２５１との反応液についてのＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。図３において四角枠は酵素反応生成物（リナロール配糖体）を示す。
それぞれの熱変性タンパク質では生成物が認められないことから、これらの４種のＵＧＴ酵素はモノテルペンアルコールに配糖体化する活性を有する新規酵素であることが確認できた。同反応条件ではＨｌＵＧＴ２５１は４種の中では生成物量が少なかったが、これは発現しているタンパク質量が他の３種にくらべ極端に少ないことが原因だと考えられる（図１）。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、もしくは宿主細胞に本発明の遺伝子を導入することにより、モノテルペン類にグルコースを一分子転移することが可能となり、新規機能性食品素材の開発や二次代謝分子育種等に貢献し得るテルペン配糖体をより簡便に生産する、もしくは減少させることができる点で、本発明は極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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