(57)【要約】  本発明の目的は、一般的なバイオセンサの測定温度域（１０〜４０℃）において、活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いるグルコースの測定法を提供すること。  本発明は、下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼなどに関する：（１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す；（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％。
2013147206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す；
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％である。
【請求項２】
酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである請求項１記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
至適温度が３０〜４０℃である請求項１又は２記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
糸状菌由来である請求項１〜３の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する糸状菌由来である請求項１〜４の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
糸状菌に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする請求項１〜５の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項７】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２の１７〜５９１番目、配列番号４の１６〜５８９番目、配列番号６の２４〜５９２番目、配列番号８の１７〜５９１番目、配列番号１０の１８〜５８６番目、配列番号１２の１８〜５８６番目、配列番号１４の１８〜５８６番目、配列番号１６の１８〜５８６番目、配列番号１８の１８〜５８６番目又は配列番号２０の１８〜５８６番目に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）からなるポリヌクレオチド：
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１の４９〜１７７３番目、配列番号３の４６〜１７６７番目、配列番号５の７０〜１７７６番目、配列番号７の４９〜１７７３番目、配列番号９の位置５２〜１７５８番目、配列番号１１の５２〜１７５８番目、配列番号１３の５２〜１７５８番目、配列番号１５の５２〜１７５８番目、配列番号１７の５２〜１７５８番目又は配列番号１９の５２〜１７５８番目に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｈ）（ａ）〜（ｃ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１２】
被検試料と請求項１〜５若しくは請求項７の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は請求項６若しくは請求項１１に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコースの測定方法。
【請求項１３】
請求項１〜５若しくは請求項７の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は請求項６若しくは請求項１１に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定試薬。
【請求項１４】
請求項１〜５若しくは請求項７の何れか１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は請求項６若しくは請求項１１に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコース測定用バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースの１位の水酸基を脱水素（酸化）する反応を触媒する、可溶性のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）等に関する。より具体的には、新規なＧＬＤポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、該ＧＬＤの製造方法、該ＧＬＤを使用することを特徴とするグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物及びグルコース測定用のバイオセンサ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコース濃度の迅速且つ正確な測定は、糖尿病を診断するうえで重要である。グルコースの測定法としては、化学法と酵素法があるが、酵素法が特異性、安全性の点で優れている。当該酵素法の中でも、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点から、電気化学的バイオセンサが有利である。【０００３】
そのようなバイオセンサに使用可能な酵素として、酸素を電子受容体とするグルコースオキシダーゼが知られている。しかし、グルコースオキシダーゼは、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があるため、酸素を電子受容体としない、いくつかのグルコースデヒドロゲナーゼが開発されてきた。グルコースデヒドロゲナーゼのうち、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼは、補酵素の添加を必要としないこと及び溶存酸素の影響を受けないことから、グルコースバイオセンサ用の酵素として注目されている（特許文献１〜７）。これらのフラビン結合型デヒドロゲナーゼの中には、基質特異性に優れるもの（特許文献５）、５０℃における活性値を１００％とする場合に、１０℃における活性値が１５％以上、２０℃における活性値が３０％以上、６０℃における活性値が７０％以上であるもの（特許文献６）、アスペルギルス・オリゼ由来のフラビン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの組換え大腸菌の細胞破砕液で、３７℃における活性値を１００％とする場合に２５℃における相対的な活性値が改善された改変型酵素（特許文献７）等がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】国際公開２００７／１３９０１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００８／００１９０３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット
【特許文献５】国際公開２０１０／１４０４３１号パンフレット
【特許文献６】特開２０１０−０５７４２７号公報
【特許文献７】国際公開２０１１／０３４１０８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら従来のグルコースデヒドロゲナーゼの活性は、高温側では反応性が強いが低温側で反応性が低下するものなど、温度帯によって活性の変動が大きかった。そのため、バイオセンサ自体に温度補正機能が付加されているものの、糖尿病患者が血糖値を測定する際に、環境温度によって得られる値が変動する可能性があったため、広い温度帯でより活性の変動が小さい酵素が求められていた。
従って、本発明の課題は、一般的なバイオセンサの測定温度域（１０〜４０℃）において、活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いるグルコースの測定法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明は、種々の微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼを探索したところ、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼの中に、グルコースに対する基質特異性が高く、且つ３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値が２０〜１５０％であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが存在し、これを用いればより広い温度域で正確且つ再現性良く、グルコース濃度が測定できることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］の態様に関する。
［１］下記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す；
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である；
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値が２０〜１５０％である。
［２］酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである［１］記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［３］至適温度が３０〜４０℃である［１］又は［２］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［４］糸状菌由来である［１］〜［３］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［５］クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する糸状菌由来である［１］〜［４］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［６］糸状菌に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする［１］〜［５］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
［７］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２の１７〜５９１番目、配列番号４の１６〜５８９番目、配列番号６の２４〜５９２番目、配列番号８の１７〜５９１番目、配列番号１０の１８〜５８６番目、配列番号１２の１８〜５８６番目、配列番号１４の１８〜５８６番目、配列番号１６の１８〜５８６番目、配列番号１８の１８〜５８６番目又は配列番号２０の１８〜５８６番目に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［８］以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）からなるポリヌクレオチド：
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１の４９〜１７７３番目、配列番号３の４６〜１７６７番目、配列番号５の７０〜１７７６番目又は配列番号７の４９〜１７７３番目、配列番号９の５２〜１７５８番目、配列番号１１の５２〜１７５８番目、配列番号１３の５２〜１７５８番目、配列番号１５の５２〜１７５８番目、配列番号１７の５２〜１７５８番目又は配列番号１９の５２〜１７５８番目に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｈ）（ａ）〜（ｃ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［９］［８］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［１０］［８］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
［１１］［１０］に記載の細胞を培養し、培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
［１２］［１］〜［５］若しくは［７］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は［６］若しくは［１１］に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコースの測定方法。
［１３］［１］〜［５］若しくは［７］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は［６］若しくは［１１］に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを含有するグルコース測定試薬。
［１４］［１］〜［５］若しくは［７］の何れかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ又は［６］若しくは［１１］に記載の方法で製造されたグルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコース測定用バイオセンサ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって一般的なバイオセンサの測定温度域（１０〜４０℃）において、活性の変動が小さいフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供することが出来、該酵素を用いれば、測定環境が低温であっても正確且つ再現性良く、血中グルコースを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）の至適温度の範囲を示す図である。
【図３】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ａ）〜（Ｆ）によるグルコース量測定結果を示す図である。
【図４】本発明グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｆ）のｐＨ安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、可溶性のフラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼであり、補酵素としてのフラビンが結合した状態で活性を示す酵素である。例えば、ＥＣ１．１．９９．１０に分類される酵素である。ここでフラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられる。
【００１１】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、下記の性質（１）〜（３）を有する点に特徴がある。
【００１２】
（１）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値が１０％以下である。
（３）温度特性：３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値が２０〜１５０％である。
【００１３】
まず、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（１）電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す。すなわち、電子受容体の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。フラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼがグルコースに作用すると、補酵素ＦＡＤはＦＡＤＨ２となるが、電子受容体としてフェリシアン化物（例えば、「Ｆｅ（ＣＮ）６」３−）を存在させると、ＦＡＤＨ２はこれをフェロシアン化物（この場合、「Ｆｅ（ＣＮ）６」４−）へと変換し、自らはＦＡＤへと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質を電子受容体とすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
【００１４】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性は、Ｄ−グルコースに対する特異性が高いため、グルコースの測定に適している。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（２）Ｄ−グルコースに対する反応性に対してＤ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する反応性が低く、１０％以下であり、好ましくは８％以下、より好ましくは６％以下、更に好ましくは５％以下である。更に好ましくはＤ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合のＤ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性値は１％以下であって、特に好ましくは０．５％以下である。
【００１５】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの温度特性は、（３）３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値は２０〜１５０％であって、当該１０℃〜４０℃における活性値の下限値は３０％であるのが好ましく、４０％であるのがより好ましく、５０％であるのが更に好ましい。更に、当該１０〜４０℃における活性値の上限値は１４０％であるのが好ましく、１３０％であるのがより好ましく、１２０％であるのが更に好ましく、１１０％であるのが特に好ましい。
即ち、好適範囲は、基質濃度１０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１３０％、より好ましくは４０〜１２０％、更に好ましくは５０〜１１０％；基質濃度５０ｍＭの場合、好ましくは３０〜１４０％、より好ましくは４０〜１３０％、更に好ましくは５０〜１２０％である。
又は、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０℃における活性値が２０％以上であるのが好ましく、基質濃度１０ｍＭの場合、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上である。
又は、３０℃における活性値を１００％とした場合に、２０℃における活性値が４０％以上であるのが好ましく、基質濃度１０ｍＭの場合、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上；基質濃度５０ｍＭの場合、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上である。
【００１６】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、更に以下の（４）〜（６）の性質を有していることが好ましい。即ち、（４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａであるのが好ましく、６５〜７０ｋＤａであるのがより好ましい。酵素タンパクのポリペプチドの分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。
【００１７】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（５）至適温度は、３０〜４０℃であるのが好ましい。より詳細には、該酵素を、各種温度で、後述の酵素活性測定法により測定し、該酵素が最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、３０〜４０℃で相対活性値が５０％以上であるのがより好ましく、６０％以上であるのが更に好ましく、８０℃以上であるのが最も好ましい。
【００１８】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの（６）Ｋｍは、１〜８０ｍＭであるのが好ましく、５〜６０ｍＭであるのがより好ましい。
【００１９】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの具体例としては、後記実施例２〜７に示すような６種を挙げられる。
【００２０】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼの由来は特に制限されないが、糸状菌であるのが好ましく、より好ましくはクロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ亜綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）又はプレオスポラ菌亜綱（Ｐｌｅｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ目（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ）、カプノディウム目（Ｃａｐｎｏｄｉａｌｅｓ）又はプレオスポラ目（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ）に属する糸状菌であり、更に好ましくはドチオラ科（Ｄｏｔｈｉｏｒａｃｅａｅ）、ダビディエラ科（Ｄａｖｉｄｉｅｌｌａｃｅａｅ）又はベンツリア科（Ｖｅｎｔｕｒｉａｃｅａｅ）に属する糸状菌であり、特に好ましくはアウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、カバティエラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属又はフシクラディウム属の何れかに属する糸状菌であり、最も好ましくはアウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、カバティエラ・カウリボラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｃａｕｌｉｖｏｒａ）、カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、クラドスポリウム・エスピー（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、クラドスポリウム・フニクロサム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ）、クラドスポリウム・オキシスポラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、クラドスポリウム・デリカツラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｄｅｌｉｃａｔｕｌｕｍ）、クラドスポリウム・ゴッシピーコラ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｇｏｓｓｙｐｉｉｃｏｌａ）、クラドスポリウム・テヌイッシマム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｅｎｕｉｓｓｉｍｕｍ）又はフシクラディウム・カルポフィラム（Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ）から選ばれる糸状菌である。具体的には、本明細書の実施例１〜１１に記載された１０種類の菌株を挙げることができる。
【００２１】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、例えば、糸状菌に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物から採取することにより製造することができる。
【００２２】
本発明で使用される微生物の培養には、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
【００２３】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌などの方法による好気的条件下で行うのがよく、２０℃から５０℃、且つｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましい。培養期間は２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中、特に培養液中にグルコースデヒドロゲナーゼを生成蓄積することができる。又は該培養方法により、培養微生物内にもグルコースデヒドロゲナーゼを生成蓄積することができる。ついで、培養物中からグルコースデヒドロゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。この方法は、例えば、微生物を培養後、遠心分離などにより微生物を除き培養上清を得る方法、又は微生物を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離などによって上清液を得る方法である。これらの上清液中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００２４】
更に、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを得るための培養は、固体培地も使用できる。培養方法には特に制限はなく、静置培養によってもよく、培養物を常時混合するような回転培養や流動層培養などによっても行うことができるが、設備投資の少ない培養装置としては静置培養が好ましい。次いで、培養物中からグルコースデヒドロゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。すなわち、培養物に水などの抽出剤を加えて攪拌したのち、ふすまなどの培地固形分を遠心分離、ろ過などの分離法により除去して抽出液を得ることにより行うことができる。一方、菌体内に蓄積されたグルコースデヒドロゲナーゼの回収は、上記の抽出液を得た培養物残渣を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離されたグルコースデヒドロゲナーゼを抽出する方法などで行うことができる。又は、全グルコースデヒドロゲナーゼを得るには、培養物全体を海砂などの研磨剤とともに磨砕したのち、水などを加えて、菌体から遊離されたグルコースデヒドロゲナーゼと培地中に分泌されたグルコースデヒドロゲナーゼの両方を一挙に抽出する方法などで行うことができる。これらの上清液中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００２５】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、合成によるグルコースデヒドロゲナーゼや遺伝子工学によって得られた組換え型のグルコースデヒドロゲナーゼであってもよい。当業者は本発明の開示に基づいて容易にこのような組換え型のグルコースデヒドロゲナーゼを得ることができる。例えば、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列をもとに合成法によって得ることができるし、該グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子断片を市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドを使用して大腸菌や糸状菌などの宿主を形質転換し、形質転換体を培養して目的のグルコースデヒドロゲナーゼを得るといった遺伝子工学によって該グルコースデヒドロゲナーゼを工業的に製造することも可能である。
【００２６】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼである。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２の１７〜５９１、配列番号４の１６〜５８９、配列番号６の１７〜５９２、配列番号８の１７〜５９１、配列番号１０の１２〜５８６、配列番号１２の１２〜５８６、配列番号１４の１２〜５８６、配列番号１６の１２〜５８６、配列番号１８の１２〜５８６、配列番号２０の１２〜５８６、配列番号２の２４〜５９１、配列番号４の２３〜５８９、配列番号６の２４〜５９２、配列番号８の２４〜５９１、配列番号１０の１８〜５８６、配列番号１２の１８〜５８６、配列番号１４の１８〜５８６、配列番号１６の１８〜５８６、配列番号１８の１８〜５８６又は配列番号２０の１８〜５８６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙの値に基づく。
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
（ａ）〜（ｄ）のタンパク質は何れも好ましくは上記の性質（１）〜（３）を有するフラビン結合型のグルコースデヒドロゲナーゼであり、更に好ましくは性質（４）〜（６）を有する。
各アミノ酸配列の内、シグナル配列は、配列番号２の１〜１６番目、配列番号６の１〜２３番目及び配列番号１２の１〜１１番目のアミノ酸配列である。配列番号２、６又は１２のシグナル配列から、配列番号４の１〜１５番目、１〜２２番目、配列番号８の１〜１６番目、１〜２３番目、又は配列番号１０、１４、１６、１８若しくは２０の１〜１１番目のアミノ酸配列が、シグナル配列と予測される。
尚、組換え株由来成熟タンパクは本明細書に記載の野生株由来酵素（成熟タンパク）のＮ末端から、数アミノ酸が置換、付加若しくは欠失した改変アミノ酸配列からなるタンパク質でも良い。即ち、組換え株由来成熟タンパクは、野生株由来成熟タンパクのＮ末端に於いて、１〜２５、２０以下、１０以下、９以下、８以下、７以下若しくは６以下のアミノ酸が付加又は置換されていてもよく、又は１〜１０、９以下、８以下、７以下若しくは６以下のアミノ酸が欠失していても上記のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し得る。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）を含むポリヌクレオチドである。
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号１の４９〜１７７３番目、配列番号３の４６〜１７６７番目、配列番号５の４９〜１７７６番目、配列番号７の４９〜１７７３番目、配列番号９の３４〜１７５８番目、配列番号１１の３４〜１７５８番目、配列番号１３の３４〜１７５８番目、配列番号１５の３４〜１７５８番目、配列番号１７の３４〜１７５８番目、配列番号１９の３４〜１７５８番目、配列番号１の７０〜１７７３番目、配列番号３の６７〜１７６７番目、配列番号５の７０〜１７７６番目、配列番号７の７０〜１７７３番目、配列番号９の５２〜１７５８番目、配列番号１１の５２〜１７５８番目、配列番号１３の５２〜１７５８番目、配列番号１５の５２〜１７５８番目、配列番号１７の５２〜１７５８番目又は配列番号１９の５２〜１７５８番目に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｈ）（ａ）〜（ｄ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｉ）（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）の塩基配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。
（ｅ）〜（ｉ）のポリヌクレオチドは何れも上記のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする。
尚、各ポリヌクレオチドの内、シグナル配列をコードするのは、配列番号１の１〜４８番目、配列番号５の１〜６９番目、配列番号１１の１〜３３番目の塩基配列である。配列番号１、５又は１１のシグナル配列をコードする塩基配列から、配列番号３の１〜４５番目、１〜６６番目、配列番号７の１〜４８番目、１〜６９番目、又は配列番号９、１３、１５、１７若しくは１９の１〜３３番目に示される塩基配列と予測される。
更に、上記のような野生株由来酵素（成熟タンパク）のＮ末端から、数アミノ酸が置換、付加若しくは欠失した改変アミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドも利用できる。
【００２８】
アミノ酸配列及び塩基配列の同一性パーセンテージは、基準配列（本発明では（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）の配列）を照会配列として、比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）若しくはＧｅｎｅＤｏｃなどを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
【００２９】
本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％  ＳＤＳ、１０％  デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドのシグナル配列は、前記に記載の通りだが、例えば国際公開２００６／１０１２３９に記載のアスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素配列のシグナル配列（該公報の配列番号２の１〜１９に示されるアミノ酸配列）と比較することや、シグナル配列予測サイト（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いても推定できる。推定されたシグナル配列を削除したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有すると考えられる。
【００３１】
尚、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、具体的にはフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする合成ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ又はそれらを鋳型としてＰＣＲ増幅して得たポリヌクレオチドを含む。「ポリペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合によって連なった化合物で、細胞中のリボソームで合成又は人工的に合成された分子を意味し、更には、これらに糖鎖が付加したものや、人工的に化学的修飾がなされたもの等も含む。
【００３２】
染色体ＤＮＡ又はＲＮＡの由来は特に制限されないが、糸状菌であるのが好ましく、より好ましくはクロイボタケ綱に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ亜綱又はプレオスポラ亜綱に属する糸状菌であり、より好ましくはクロイボタケ目、カプノディウム目又はプレオスポラ目に属する糸状菌であり、更に好ましくはドチオラ科、ダビディエラ科又はベンツリア科に属する糸状菌であり、特に好ましくはアウレオバシジウム属、カバティエラ属、クラドスポリウム属又はフシクラディウム属に属する糸状菌であり、最も好ましくはアウレオバシジウム・プルランス、カバティエラ・カウリボラ、カバティエラ・ゼアエ、クラドスポリウム・エスピー（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス、クラドスポリウム・フニクロサム、クラドスポリウム・オキシスポラム、クラドスポリウム・デリカツラム、クラドスポリウム・ゴッシピーコラ、クラドスポリウム・テヌイッシマム又はフシクラディウム・カルポフィラムである。前記糸状菌から染色体ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。続いて、公知のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、例えば国際公開２００６／１０１２３９に記載のアスペルギルス・テレウス由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、特許文献３記載のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ及び／又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９の同一性を比較したアライメントに基づいて、複数のオリゴヌクレオチドプローブ又は縮重プライマーを作製する。又は、ＤＮＡを適当な制限酵素で切断してプローブ又はプライマーを作製してもよい。前記のプローブ又はプライマーを用いてハイブリダイズ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等、常法によって上記ライブラリーから、本願のポリヌクレオチドを取得することができる。
【００３３】
具体的には、前記アライメントの内、同一性の高い部位から内部配列解読用のフォワードプライマー及びリバースプライマーを作製し、上記ライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う。フォワードプライマーは、好ましくは増幅側（下流側）が少なくとも2塩基一致する部位で、好ましくは15〜40塩基程度の配列長に設計できる部位で、配列番号１の238〜260番目及び394〜417番目の部位が例示できる。リバースプライマーは、好ましくは増幅側（上流側）が少なくとも2塩基一致する部位で、好ましくは15〜40塩基程度の配列長に設計できる部位で、配列番号１の1600〜1625番目、1735〜1757番目の部位が例示できる。この部位から設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う際、アニーリング温度は低く設定し、４０〜５０℃が好ましく、４０〜４５℃がより好ましい。1段階目で使用したプライマーセットの内側のプライマーセットを用いて2段階目のＰＣＲを行っても良い。プライマーに利用した塩基の位置からＰＣＲ産物のサイズを予想し、該当するＰＣＲ産物を解読する。解読したＰＣＲ産物が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９の該当箇所と少なくとも50％の同一性、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％の同一性があれば、本願遺伝子の内部配列を取得できている。次に解読した内部配列から、周知の方法で本発明の遺伝子全長を取得できる。つまり、本発明の遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺を解明するためにプライマーを設計し、該プライマーを用いて、上記ライブラリーを鋳型として５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法を行う。その結果、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺が解明できる。続いて本発明のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする開始コドンから終止コドンまでの全長遺伝子を増幅できるプライマーを設計し、該プライマーを用いて、上記ライブラリーを鋳型として本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を用いて、機能未知の公開配列に対して例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）等のホモロジー検索を行い、同一性が少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性でヒットした５５０〜６５０アミノ酸配列長であるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列から取得することができる。公開配列から全長を取得できるプライマーをデザインし、該遺伝子配列の由来株のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。更に増幅して得た該ポリヌクレオチドを用いて常法により組換えタンパク質を得て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を確認することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、該遺伝子配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、公知のミューテーション導入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作製することができる。更に、染色体ＤＮＡやそのｃＤＮＡライブラリーから、ヌクレオチド配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーションに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、上記ポリヌクレオチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定され、例えば、米国特許No.6,100,037号明細書等に開示されているような、当業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
【００３６】
文献（例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０５：６６１；  Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０−３４４４；  Ｆｒｅｎｋｅｌ(１９９５)Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：７８８６−７８９６；  Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：１０９；  Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９；  米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
【００３７】
本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡ又はそのＯＲＦ領域をインサートとしてフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを生産する場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。宿主に対応して、同一アミノ酸配列であるが、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。更に糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素を製造することが好ましい。
【００３８】
本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。カビは特に限定されないが、好ましくはチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、より好ましくはクロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ユーロチウム菌綱（Ｅｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ズキンタケ綱（Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）又はフンタマカビ綱（Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、更に好ましくはユーロチウム目、特に好ましくはアスペルギルス属に属する菌を使用する。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターと、このベクターによる形質転換大腸菌及び形質転換カビが挙げられる。
【００３９】
本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを微生物で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと終止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ断片を得ることもできる。特に、分泌シグナル配列をコードする遺伝子配列を含む外来遺伝子を用いて、大腸菌などのグラム陰性菌で組換えタンパクを発現させる場合は、組換えタンパクがペリプラズムに移行されるため、生産性が悪い。そのため、組換えタンパクを効率よく回収したい場合は、シグナル配列をコードする遺伝子配列を削除した配列を用いるのが良い。又は、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。原核細胞で発現させて生産させる場合は、イントロンを含まないグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を挿入する必要があり、特にグラム陰性菌の場合、イントロンを含まずシグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば（ｆ）に記載のポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドを挿入することが好ましい。グラム陽性菌の場合、シグナル配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドであっても良く、シグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば（ｆ）に記載のポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドであってもよく、シグナル配列をコードする配列を宿主に適切な配列に置換したポリヌクレオチドを挿入しても良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパクの発現量を向上させても良い。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
【００４０】
一方、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを真核細胞で発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを真核細胞で生産することができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。挿入するポリヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドであっても良く、シグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば（ｆ）に記載のポリヌクレオチドに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドであってもよく、シグナル配列をコードする配列を例えば宿主に適切なシグナル配列に置換したポリヌクレオチドでも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパクの発現量を向上させても良い。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。更に、ｐＩＮＤ／Ｖ５-Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ-ＣＭＶ-２、ｐＥＧＦＰ-Ｎ１、ｐＥＧＦＰＣ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質としてフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドを発現させることもできる。
【００４１】
既に述べたように、本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼは、本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ又はその翻訳領域）を有するベクターからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを作製することができる。
【００４２】
本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加すれば、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
【００４３】
本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５−０．６ｕｎｉｔ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）の酵素活性は、次の方法で測定できる。
（酵素活性測定法）
以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定し、ＧＬＤ活性を調べた。
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、超純水０．６１ｍＬ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト（以下１−ｍ−ＰＭＳという）０．２０ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から式１に従いＧＬＤ活性を算出した。この際、ＧＬＤ活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
【００４４】
【数１】
2013147206.tif 000003
【００４５】
尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍率を表す。
【００４６】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、前述のように酸素の影響を受けず、グルコースに対する特異性が高く、且つ室温でも高い活性を維持しているため、グルコース濃度、特に血中グルコース濃度の測定用酵素として有用である。グルコースを含む被検試料、例えば血液と本発明のグルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程により、被検試料中のグルコースが測定できる。
【００４７】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース測定試薬に用いることができる。該測定試薬は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類（例えば、トレハロースなど）若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等から成る群より選ばれる熱安定化剤、又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませることができる。
【００４８】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、バイオセンサに用いることができる。
本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを反応層に使用したセンサであればよい。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着などの方法を利用して電極系を形成し、更に酸化還元酵素と電子受容体とを含む測定試薬を備えることによって作製される。このバイオセンサの測定試薬に基質を含む試料液を接触させると、測定試薬が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。この他に、発色強度又はｐＨ変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。例えば、酵素に本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを選択すると、試料液中のグルコース濃度を測定できる、酸素の影響を受けないグルコースセンサを作製することができる。
【００４９】
バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた物質を用いることができる。電子の授受能に優れた物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質やタンパク質性の電子メディエータであり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表２００２−５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。
【００５０】
更に本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース酸化還元酵素又は上記の融合体を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。以下の実施例におけるグルコースデヒドロゲナーゼ活性の定量は前記の方法に従って行った。【００５２】
［実施例１］
（本発明のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）の取得）
（１）ＧＬＤ活性の確認
自然界から分離した菌株及び微生物保存機関（独立行政法人  製品評価技術基盤機構：〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から購入した菌株、計約３，８００株からＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ｓ２０、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ＮＢＲＣ４４６４、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｃａｕｌｉｖｏｒａ  ＮＢＲＣ７３１４、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ  ＮＢＲＣ９６６４、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｔ７９９、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｔ８０６、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ４４５９、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ  ＮＢＲＣ６５３７、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ３２５１１、及びＦｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ  ＮＢＲＣ９６４５の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。【００５３】
（２）Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ｓ２０由来ＧＬＤの精製
グルコース１％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、大豆粉２％（昭和産業社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、ヒドロキノン０．１７ｇ/Ｌ（ナカライテスク社製）、キシリジン０．０００６％（和光純薬社製）（ｗ／ｖ）、ＥＤＴＡ０．１５ｍＭ（和光純薬社製）、ビオチン２ｎｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、（＋）−パントテン酸カルシウム０．４μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、イノシトール２μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、ニコチン酸０．４μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、チアミン塩酸塩０．４μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、ｐ−アミノベンゾニックアシッド０．２μｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、ビタミンＢ２ ０．２μｇ／ｍＬ（ナカライテスク社製）、葉酸１０ｎｇ／ｍＬ（和光純薬社製）、及び水からなる液体培地５００ｍＬを２０００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ｓ２０株を植菌し、１５℃で１４日間振とう培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。【００５４】
前記粗酵素液を、６０％飽和硫酸アンモニウム溶液に調整し、４℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。
該上清を、６０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（ＧＥヘルスケア社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平行化したｍｏｎｏＱ５／５（ＧＥヘルスケア社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平行化したＨｉＬｏａｄ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に通液し、その後同緩衝液を用いて、ゲル濾過精製を実施し、活性画分を回収した。回収した活性画分を分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換して野生株由来ＡｐｓＧＬＤサンプルとした。該精製酵素の比活性は３７８Ｕ／ｍｇだった。【００５５】
［実施例２］
（Ａ．Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ｓ２０由来ＧＬＤ（ＡｐｓＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ｓ２０株を接種し、１５℃で９０時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。【００５６】
（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。【００５７】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。【００５８】
（４）ＡｐｓＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＡｐｓＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマーは、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ配列から共通配列を解析し、その共通配列を基に同一性の低いＧＬＤ配列でも増幅するように、縮重塩基を用いてprimer-F1、primer-F2、primer-R1及びprimer-R2を設計した。第１段階目に、実施例２の（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、primer-F1及びprimer-R1を用いてＰＣＲを行った。第2段階目に、第1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer-F2及びprimer-R2を用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ産物を配列解析し、解読した内部配列から、遺伝子の開始コドン周辺及び終止コドン周辺を解明するためのプライマーを設計して、５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法を行った。最終的に下記のprimer-ApsF及びprimer-ApsRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号１に示す全鎖長１，７７６ｂｐのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ｓ２０株由来ＡｐｓＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。
尚、配列番号２記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜１６番目までの１６アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-F1：5’-CGGCACTCAGATYGAYTGGGCRTA-3’
primer-F2：5’-AAGTTGGGHAACAACMTCACMTGG-3’
primer-R1：5’-ATGCGCTCRGCAGCTCTCTCVGC-3’
primer-R2：5’-ACGCCACCGAGHTCCTYSGACATCAT-3’
primer-ApsF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTATCGTTTACTCTCTACATTTG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-ApsR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCCTACTGGTGGCTAGCCTCGATAAC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
primer-GLD-F：5’-CTCCAAGTTAGTCGAC(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳａｌＩ）、括弧内：転写増強因子）【００５９】
（５）ＡｐｓＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（４）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-ApsR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｓＧＬＤ遺伝子を増幅した。次にベクターのプロモーターの下流に、増幅したＡｐｓＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。この発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄ−ｐｒｅｐ ＭＩＮＩ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミド中のインサートの配列解析を行ったところ、ＡｐｓＧＬＤ遺伝子（配列番号１）が確認できた。【００６０】
（６）形質転換体の取得
（５）で抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＡｐｓＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所（〒739-0046日本国広島県東広島市鏡山３−７−１）分譲されているものが入手可能である。【００６１】
（７）組換えカビ由来ＡｐｓＧＬＤの確認
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてＧＬＤ活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（ザルトリウス社製）で濃縮した。本サンプルを組換えＡｐｓＧＬＤサンプルとした。【００６２】
［実施例３］
（Ｂ．Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ＮＢＲＣ４４６４株由来ＧＬＤ（ＡｐｎＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＡｐｎＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＡ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ＮＢＲＣ４４６４のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＡｐｎＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-ApnF及びprimer-ApnRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号３に示す全鎖長１，７７０ｂｐのＡ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ＮＢＲＣ４４６４株由来ＡｐｎＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４に示した。
尚、配列番号４記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１〜１５番目までの１５アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-ApnF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGACTTGCTACCCTCGCCC-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-ApnR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCTTAGTGACTGGCCTTGATGATATC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））【００６３】
（２）ＡｐｎＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-ApnR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｎＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＡｐｎＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、ＡｐｎＧＬＤ遺伝子（配列番号３）が確認できた。【００６４】
（３）形質転換体の取得
（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＡｐｎＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００６５】
（４）組換えカビ由来ＡｐｎＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＡｐｎＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。実施例２の（７）に記載の方法に従い、培養液を限外ろ過で濃縮したサンプルを、組換えＡｐｎＧＬＤサンプルとした。【００６６】
［実施例４］
（Ｃ．Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｃａｕｌｉｖｏｒａ由来ＧＬＤ（ＫｃＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＫｃＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＫ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ＮＢＲＣ４４６４のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＫｃＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-KcF及びprimer-KcRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号５に示す全鎖長１，７７９ｂｐのＫ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ  ＮＢＲＣ７３１４株由来ＫｃＧＬＤ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号６に示した。
尚、配列番号６記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち、１〜１６番目までの１６アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-KcF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGACAAGTTGCTGCTCTCG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-KcR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCTTACAAGTGCTTGGCCTTGATGAG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））【００６７】
（２）ＫｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-KcR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＫｃＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＫｃＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、ＫｃＧＬＤ遺伝子（配列番号５）が確認できた。【００６８】
（３）形質転換体の取得
（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＫｃＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００６９】
（４）組換えカビ由来ＫｃＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＫｃＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。【００７０】
（５）ＫｃＧＬＤの精製
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（３）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で３日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成に０．０１％リボフラビン（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、０．００５％クロラムフェニコール（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液を５０ｍＬ植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで３日間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。【００７１】
前記粗酵素液を、５０％飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ６．０）になるように調整し、４℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。
該上清を、５０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、組換えＫｃＧＬＤサンプルとした。該精製酵素の比活性は１，２００Ｕ／ｍｇだった。【００７２】
［実施例５］
（Ｄ．Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ由来ＧＬＤ（ＫｚＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＫｚＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＫ．ｚｅａｅ  ＮＢＲＣ９６６４のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＫｚＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-KzF及びprimer-KzRのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号７に示す全鎖長１，７７６ｂｐのＫ．ｚｅａｅ  ＮＢＲＣ９６６４株由来ＫｚＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号８に示した。
尚、配列番号８記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号８記載のアミノ酸配列のうち、１〜１６番目までの１６アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-KzF：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTTGGGTCAATTGGCCGCTCTCG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-KzR：5’-CGCTTCTAGAGCATGCTTACTTGTGGCTAGCCTTGATGAG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））【００７３】
（２）ＫｚＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-KzR及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＫｚＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＫｚＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、ＫｚＧＬＤ遺伝子（配列番号７）が確認できた。【００７４】
（３）形質転換体の取得
（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＫｚＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００７５】
（４）組換えカビ由来ＫｚＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＫｚＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。実施例２の（７）に記載の方法に従い、培養液を限外ろ過で濃縮したサンプルを、組換えＫｚＧＬＤサンプルとした。【００７６】
［実施例６］
（Ｅ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｔ７９９株由来ＧＬＤ（Ｃｓ７ＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｓｐ．Ｔ７９９のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。最終的に下記のprimer-Cs7F及びprimer-Cs7Rのプライマー対を用いてＰＣＲを行って、配列番号９に示す全鎖長１，７６１ｂｐのＣ．ｓｐ．Ｔ７９９株由来Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得した。当該遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
尚、配列番号１０記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号１０記載のアミノ酸配列のうち、１〜１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。
primer-Cs7F：5’-(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTGCCACTGCTCGCGACTCTGG-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-Cs7R：5’-CGCTTCTAGAGCATGCCTAGTTGCACTGCTTAATGCGCTC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））【００７７】
（２）Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
（１）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のprimer-Cs7R及びprimer-GLD-Fのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子を増幅した。実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅したＣｓ７ＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、Ｃｓ７ＧＬＤ遺伝子（配列番号９）が確認できた。【００７８】
（３）形質転換体の取得
（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、Ｃｓ７ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００７９】
（４）組換えカビ由来Ｃｓ７ＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、Ｃｓ７ＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。実施例２の（７）に記載の方法に従い、培養液を限外ろ過で濃縮したサンプルを、組換えＣｓ７ＧＬＤサンプルとした。【００８０】
［実施例７］
（Ｆ．Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ由来ＧＬＤ（ＦｃＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＦｃＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＦ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ  ＮＢＲＣ９６４５のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｆ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ  ＮＢＲＣ９６４５株由来ＦｃＧＬＤ遺伝子は、配列番号１１に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１２に示した。
尚、配列番号１２記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によるシグナル配列予測を行い、配列番号１２記載のアミノ酸配列のうち、１〜１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。【００８１】
（２）ＦｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-FcF及びprimer-FcR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＦｃＧＬＤ遺伝子を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-FcF及びprimer-FcR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、ＦｃＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１１に記載の終止コドンをTAAに置換したＦｃＧＬＤ遺伝子が確認できた。
primer-FcF：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCGATCCTCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-FcR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTCTTGAATGCG-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-FcR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTC-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）【００８２】
（３）形質転換体の取得
（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、ＦｃＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００８３】
（４）組換えカビ由来ＦｃＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、ＦｃＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。【００８４】
（５）ＦｃＧＬＤの精製
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（４）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で３日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成に０．０１％リボフラビン（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）を添加した培地５００ｍＬを２０００ｍＬ容坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液を１０ｍＬ植菌し、３０℃、１１０ｒｐｍで３日間振盪培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。【００８５】
前記粗酵素液を５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換したサンプルを、組換えＦｃＧＬＤサンプルとした。該精製酵素の比活性は１９０Ｕ／ｍｇだった。【００８６】
［実施例８］
（Ｇ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｔ８０６由来ＧＬＤ（Ｃｓ８ＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｓｐ．Ｔ８０６のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｓｐ．Ｔ８０６株由来Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子は、配列番号１３に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１４に示した。
尚、配列番号１４記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号１４記載のアミノ酸配列のうち、１〜１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。【００８７】
（２）Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-Cs8F及びprimer-Cs8R1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＣｓ８ＧＬＤ遺伝子を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-Cs8F及びprimer-Cs8R2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、Ｃｓ８ＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１３に記載の終止コドンをTAAに置換したＣｓ８ＧＬＤ遺伝子が確認できた。
primer-Cs8F：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCAGTGCTCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-Cs8R1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTGCTGAATACG-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-Cs8R2：5’-((GTTACGCTTCTAGA))GCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）【００８８】
（３）形質転換体の取得
（２）で抽出したプラスミドを用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、Ｃｓ８ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００８９】
（４）組換えカビ由来Ｃｓ８ＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、Ｃｓ８ＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。【００９０】
［実施例９］
（Ｈ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ由来ＧＬＤ（ＣｃＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＣｃＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ４４５９のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ４４５９株由来ＣｃＧＬＤ遺伝子は、配列番号１５に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
尚、配列番号１６記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１〜１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。【００９１】
（２）ＣｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター１の調製
（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-CcF及びprimer-CcR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＣｃＧＬＤ遺伝子１７６１ｂｐを含む配列を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-CcF及びprimer-CcR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、ＣｃＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１５の終止コドンをTAAに置換したＣｃＧＬＤ遺伝子が確認できた。該遺伝子は終止コドン以外は野生型遺伝子のため、「野生型ＣｃＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-CcF：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCAATTATCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-CcR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTGCTGAATGCGCTC-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-CcR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）【００９２】
（３）ＣｃＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター２の調製
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＧＬＤのシグナル配列（Ａｏシグナル配列：配列番号６４）を用いて、成熟タンパクであるＣｃＧＬＤを菌体外に組換え生産するためのプラスミドベクターを調製した。詳細には、ＣｃＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域に、置換した改変遺伝子を挿入したプラスミドベクターを調製した。
最初に、（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-A-CcF及び上記primer-CcR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｃＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を削除した。次に、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域を付加するために段階的にＰＣＲを行い、最終的に、primer-A-F及びprimer-CcR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列番号１５に記載の配列の内、１〜５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した、プラスミド挿入用の断片を増幅した。
続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、改変ＣｃＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行った。その結果、配列番号１５に記載の配列の内、１〜５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した（配列番号６３記載の６６ｂｐの下流に、配列番号１５記載の５２〜１７６０番目の１７０９ｂｐが融合し、最後がアデニンである）配列番号２４に記載の１７７６ｂｐの改変遺伝子が確認できた。該遺伝子を「改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-A-CcF：5’-CCGGCTGGACGGGCCCATTCCACTCCCAGATACGAC-3’
（下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）
primer-A-F：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTCTTCTCACTGGCATTC-3’
（括弧内：転写増強因子、下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）【００９３】
（４）形質転換体の取得
野生型ＣｃＧＬＤ遺伝子が挿入された（２）又は改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子が挿入された（３）のプラスミドをそれぞれ用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、野生型ＣｃＧＬＤ遺伝子又は改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子を含む組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）をそれぞれ作製した。得られたそれぞれの組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００９４】
（５）組換えカビ由来ＣｃＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、それぞれの組換えカビ由来のＣｃＧＬＤの活性を測定したところ、野生型遺伝子由来ＣｃＧＬＤも改変型遺伝子由来ＣｃＧＬＤも、何れも本発明のＧＬＤ活性が確認でき、何れの組換えカビも同等の生産性であり、何れのＣｃＧＬＤも比活性は同等だった。【００９５】
［実施例１０］
（Ｉ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ由来ＧＬＤ（ＣｆＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＣｆＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ  ＮＢＲＣ６５３７のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｆｕｎｉｃｌｏｓｕｍ  ＮＢＲＣ６５３７株由来ＣｆＧＬＤ遺伝子は、配列番号１７に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１８に示した。
尚、配列番号１８記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１〜１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。【００９６】
（２）ＣｆＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＧＬＤのシグナル配列（Ａｏシグナル配列：配列番号６４）を用いて、成熟タンパクであるＣｆＧＬＤを菌体外に組換え生産するためのプラスミドベクターを調製した。詳細には、ＣｆＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域に、置換した改変遺伝子を挿入したプラスミドベクターを調製した。
最初に、（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-A-CfF及びprimer-CfR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｆＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を削除した。次に、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域を付加するために段階的にＰＣＲを行い、最終的に、前記のprimer-A-F及び下記のprimer-CfR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列番号１７に記載の配列の内、１〜５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した、プラスミド挿入用の断片を増幅した。
続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、改変ＣｆＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行った。その結果、配列番号１７に記載の配列の内、１〜５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した（配列番号６３記載の６６ｂｐの下流に、配列番号１７記載の５２〜１７６０番目の１７０９ｂｐが融合し、最後がアデニンである）配列番号２６に記載の１７７６ｂｐの改変遺伝子が確認できた。該遺伝子を「改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-A-CfF：5’-CCGGCTGGACGGGCCCATTCCACTCCTAGATATGAC-3’
（下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）
primer-CfR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGACTGTGCTGAATACG-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-CfR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGACTGTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）【００９７】
（３）形質転換体の取得
改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子が挿入された（２）のプラスミドをそれぞれ用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子を含む組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【００９８】
（４）組換えカビ由来ＣｆＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、改変型遺伝子由来ＣｆＧＬＤの活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認でき、該ＣｆＧＬＤは実施例９記載の野生型遺伝子由来ＣｃＧＬＤと同等の比活性だった。【００９９】
［実施例１１］
（Ｊ．Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来ＧＬＤ（ＣｏＧＬＤ）の真核細胞による発現）
（１）ＣｏＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２（１）〜（３）に記載の方法に従って調製したＣ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ３２５１１のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、以下のＰＣＲを行った。
第1段階目及び第2段階目のＰＣＲ、並びに５’−ＲＡＣＥ法及び３’−ＲＡＣＥ法は実施例２（４）に記載の方法に従って行った。その結果、Ｃ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ３２５１１株由来ＣｏＧＬＤ遺伝子は、配列番号１９に示す全鎖長１，７６１ｂｐの塩基配列であることが分かった。当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
尚、配列番号２０記載のアミノ酸配列において、ＳｉｇｎａｌＰ３．０によるシグナル配列予測を行い、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１〜１７番目までの１７アミノ酸がシグナル配列と予測された。【０１００】
（２）ＣｏＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター１の調製
（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-CoF及びprimer-CoR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、終止コドンをTAAに置換したＣｏＧＬＤ遺伝子１７６１ｂｐを含む配列を増幅した。次に前記ＰＣＲ産物を鋳型として下記のprimer-CoF及びprimer-CoR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミド挿入用の断片を増幅した。続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、ＣｏＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行ったところ、配列番号１９の終止コドンをTAAに置換したＣｏＧＬＤ遺伝子が確認できた。該遺伝子は終止コドン以外は野生型遺伝子のため、「野生型ＣｏＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-CoF：5’-(CCGCAGCTCGTCAAA）ATGCTCCCAGTGCTCGCGTCT-3’
（括弧内：転写増強因子）
primer-CoR1：5’-GTTCAT(TTA)GTGGCTCTGCTGAATACGCTC-3’
（括弧内：置換した終止コドン）
primer-CoR2：5’-GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCAT(TTA)GTGGCTCTG-3’
（下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ）、括弧内：置換した終止コドン）【０１０１】
（３）ＣｏＧＬＤ遺伝子を含むプラスミドベクター２の調製
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＧＬＤのシグナル配列（Ａｏシグナル配列：配列番号６４）を用いて、成熟タンパクであるＣｏＧＬＤを菌体外に組換え生産するためのプラスミドベクターを調製した。詳細には、ＣｏＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域に、置換した改変遺伝子を挿入したプラスミドベクターを調製した。
最初に、（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として下記のprimer-A-CoF及び上記primer-CoR1のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｏＧＬＤ遺伝子の予想シグナル配列コード領域を削除した。次に、配列番号６３に記載のＡｏシグナル配列コード領域を付加するために段階的にＰＣＲを行い、最終的に、前記のprimer-A-F及び上記のprimer-CoR2のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列番号１９に記載の配列の内、１〜５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した、プラスミド挿入用の断片を増幅した。
続いて、実施例２（５）に記載の方法に従い、プロモーターの下流に、増幅した前記断片を結合させることで、改変ＣｏＧＬＤ遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。更に、実施例２の（５）に記載の方法に従い、該プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を行った。その結果、配列番号１９に記載の配列の内、１〜５１番目の塩基配列を配列番号６３に記載の６６塩基に置換し、終止コドンをTAAに置換した（配列番号６３記載の６６ｂｐの下流に、配列番号１９記載の５２〜１７６０番目の１７０９ｂｐが融合し、最後がアデニンである）配列番号２８に記載の１７７６ｂｐの改変遺伝子が確認できた。該遺伝子を「改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子」と呼ぶ。
primer-A-CoF：5’-CCGGCTGGACGGGCCCATTCTACTCCCAGATACGAC-3’
（下線部：Ａｏシグナル配列コード領域）【０１０２】
（４）形質転換体の取得
野生型ＣｏＧＬＤ遺伝子が挿入された（２）又は改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子が挿入された（３）のプラスミドをそれぞれ用いて、実施例２の（６）に記載の方法に従い、野生型ＣｏＧＬＤ遺伝子又は改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子を含む組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）をそれぞれ作製した。得られたそれぞれの組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。【０１０３】
（５）組換えカビ由来ＣｏＧＬＤの確認
実施例２の（７）に記載の方法に従い、それぞれの組換えカビ由来のＣｏＧＬＤの活性を測定したところ、野生型遺伝子由来ＣｏＧＬＤも改変型遺伝子由来ＣｏＧＬＤも、何れも本発明のＧＬＤ活性が確認でき、何れの組換えカビも同等の生産性であり、何れのＣｏＧＬＤも比活性は同等だった。【０１０４】
［実施例１２］
（Ｎ末端配列解析）
（１）ＡｐｓＧＬＤ
実施例１に記載の精製ＡｐｓＧＬＤのＮ末端配列解析を実施した。その結果、成熟タンパクである該酵素のＮ末端のアミノ酸はＩＰＮＴＬであることが明らかになった。このことから、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜１６番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であり、成熟タンパクであるＡｐｓＧＬＤは配列番号２記載の１７〜５９１番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有していると思われる。更に、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１の４９〜１７７６番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。
尚、該シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測と一致していた。【０１０５】
（２）ＫｃＧＬＤ
実施例４に記載の精製ＫｃＧＬＤのＮ末端配列解析を実施した。その結果、成熟タンパクである該酵素のＮ末端のアミノ酸はＳＴＰＳＲであることが明らかになった。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち、２４〜５９２番目の５６９アミノ酸からなるアミノ酸配列であることが分かった。更に、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち、１〜２３番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であり、該シグナル配列は成熟タンパクとなる過程で切断されていることが分かった。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号５の７０〜１７７６番目の１７０７塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であることが分かった。
尚、該シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測より７アミノ酸長い配列であり、つまり予測のＮ末端は７アミノ酸が付加したＮ末端だった。【０１０６】
（３）ＦｃＧＬＤ
実施例７に記載の精製ＦｃＧＬＤのＮ末端配列解析を実施した。その結果、成熟タンパクである該酵素のＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＶＬであることが明らかになった。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１２記載のアミノ酸配列のうち、１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であることが分かった。更に、配列番号１２記載のアミノ酸配列のうち、１〜１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であり、該シグナル配列は成熟タンパクとなる過程で切断されていることが分かった。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１１の３４〜１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であることが分かった。
尚、該シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ４．１による予測より６アミノ酸短い配列であり、つまり予測のＮ末端は６アミノ酸が欠失したＮ末端だった。【０１０７】
（４）ＡｐｎＧＬＤ
（１）のＡｐｓＧＬＤ又は（２）のＫｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＡｐｎＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＮＴＬ又はＳＴＰＲＹと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１６〜５８９番目の５７４アミノ酸又は２３〜５８９番目の５６７アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号４記載のアミノ酸配列のうち、１〜１５番目又は１〜２２番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号３の４６〜１７６７番目の１７２２塩基又は配列番号３の６７〜１７６７番目の１７０１塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１０８】
（５）ＫｚＧＬＤ
（１）のＡｐｓＧＬＤ又は（２）のＫｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＫｚＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＩＰＳＴＬ又はＨＩＡＲＹと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号８記載のアミノ酸配列のうち、１７〜５９１番目の５７５アミノ酸又は２４〜５９１番目の５６８アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号８記載のアミノ酸配列のうち、１〜１６番目又は１〜２３番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号７の４９〜１７７３番目の１７２５塩基又は配列番号７の７０〜１７７３番目の１７０４塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１０９】
（６）Ｃｓ７ＧＬＤ
（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｓ７ＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＶＰＡＳＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１０記載のアミノ酸配列のうち、１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１０記載のアミノ酸配列のうち、１〜１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号９の３４〜１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１１０】
（７）Ｃｓ８ＧＬＤ
（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｓ８ＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＴＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１４記載のアミノ酸配列のうち、１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１４記載のアミノ酸配列のうち、１〜１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１３の３４〜１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１１１】
（８）ＣｃＧＬＤ
（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｃＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＡＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１〜１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１５の３４〜１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１１２】
（９）ＣｆＧＬＤ
（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｆＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＡＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１〜１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１７の３４〜１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１１３】
（１０）ＣｏＧＬＤ
（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、成熟タンパクであるＣｏＧＬＤのＮ末端のアミノ酸はＡＰＴＡＬと思われる。従って、成熟タンパクのアミノ酸配列は、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われる。更に、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１〜１１番目までのアミノ酸配列がシグナル配列であると思われる。加えて、成熟タンパクをコードしている塩基配列は、配列番号１９の３４〜１７５８番目の１７２５塩基からなる塩基配列（終止コドン含まない）であると思われる。【０１１４】
（１１）改変型遺伝子由来ＧＬＤ
（３）のＦｃＧＬＤの解析結果から、実施例９、１０及び１１で得られた改変型遺伝子由来ＧＬＤは、野生型遺伝子由来の成熟タンパク（野生型ＧＬＤ）と比べて、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＧＬＤであると思われる。【０１１５】
つまり、改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子は、組換え体から得られる成熟タンパクが、配列番号１６記載のアミノ酸配列のうち、１８〜５８６番目の５６９アミノ酸になるように設計したため、成熟タンパクのアミノ酸配列は配列番号２５に示すとおりであって、Ｎ末端のアミノ酸はＨＳＴＰＲである。野生型ＣｃＧＬＤは１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われるため、改変型ＣｃＧＬＤ遺伝子由来ＧＬＤは、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＣｃＧＬＤであると思われる。
同様に、改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子は、組換え体から得られる成熟タンパクが、配列番号１８記載のアミノ酸配列のうち、１８〜５８６番目の５６９アミノ酸になるように設計したため、成熟タンパクのアミノ酸配列は配列番号２７に示すとおりであって、Ｎ末端のアミノ酸はＨＳＴＰＲである。野生型ＣｆＧＬＤは１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われるため、改変型ＣｆＧＬＤ遺伝子由来ＧＬＤは、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＣｆＧＬＤであると思われる。
同様に、改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子は、組換え体から得られる成熟タンパクが、配列番号２０記載のアミノ酸配列のうち、１８〜５８６番目の５６９アミノ酸になるように設計したため、成熟タンパクのアミノ酸配列は配列番号２９に示すとおりであって、Ｎ末端のアミノ酸はＨＳＴＰＲである。野生型ＣｏＧＬＤは１２〜５８６番目の５７５アミノ酸からなるアミノ酸配列であると思われるため、改変型ＣｏＧＬＤ遺伝子由来ＧＬＤは、Ｎ末端の６アミノ酸が欠失した改変型ＣｏＧＬＤであると思われる。【０１１６】
Ｎ末端が欠失した改変型ＧＬＤであっても、実施例９（５）、１０（４）及び１１（５）に示すように、野生型ＧＬＤと同じ活性を有し、組換えカビの生産性も同等であり、比活性も野生型ＧＬＤと同等だった。【０１１７】
［実施例１３］
（本発明のＧＬＤの酵素化学的性質の検討）
実施例２〜７で得られた各ＧＬＤの諸性質を調べた。
（１）吸収スペクトルの測定
各ＧＬＤについて、Ｄ−グルコース添加前後の２００−７００ｎｍにおける吸収スペクトルをプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＰＬＵＳ ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した結果、何れのＧＬＤについても、波長３６０−３８０ｎｍ付近及び波長４５０−４６０ｎｍ付近に認められた吸収極大が、Ｄ−グルコース添加により消失したことから、本発明のＧＬＤは何れもフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。【０１１８】
（２）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
各ＧＬＤのＧＯＤ活性を調べた結果、何れのＧＬＤについてもＧＯＤ活性は見られなかった。よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。ＧＯＤ活性は、以下の方法で測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、２５ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．１０ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．１０ｍＬ、ペルオキシダーゼ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）０．１０ｍＬ、超純水０．６５ｍＬ、Ｄ−グルコース１．００ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５００）を測定し、式２に従いＧＯＤ活性を算出した。この際ＧＯＤ活性は、３７℃、ｐＨ７．０で、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。【０１１９】
【数２】
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【０１２０】
尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．６６は本測定条件におけるモル吸光係数（ｍＭ−１ｃｍ−１）、０．５は１モルの過酸化水素の生成量に対するキノン型色素の生成量、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ５００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍率を表す。【０１２１】
（３）分子量
各ＧＬＤの糖鎖切断前後の分子量を以下の方法で求めた。各ＧＬＤ溶液（各１．０ｍｇ／ｍｇに調製）５μＬと１％ＳＤＳ及び２％β―メルカプトエタノールを含む０．４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５μＬを混合し、１００℃で３分間熱処理を行った。糖鎖切断処理として、熱処理後のサンプルにエンドグリコシダーゼＨ（ロシュ製）を１０μＬ（５０ｍＵ）添加し、３７℃で１８時間反応させた。糖鎖切断処理前後のサンプルをｅ−パジェル７．５％（アトー社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、分子量マーカーより分子量を求めた。結果を図１に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
図１（Ａ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＡｐｓＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＡｐｓＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｂ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＡｐｎＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＡｐｎＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｃ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＫｃＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＫｃＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｄ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＫｚＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＫｚＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｅ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：Ｃｓ７ＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：Ｃｓ７ＧＬＤ糖鎖切断後
図１（Ｆ）
レーン１：分子量マーカー（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製 ＤｙｎａＭａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（１０−１５０ｋＤａ）、上から１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ）
レーン２：ＦｃＧＬＤ糖鎖切断前
レーン３：ＦｃＧＬＤ糖鎖切断後【０１２２】
図１より、糖鎖切断前の各ＧＬＤについて、ＡｐｓＧＬＤの分子量は１００〜１１５ｋＤａ、ＡｐｎＧＬＤの分子量は９５〜１２０ｋＤａ、ＫｃＧＬＤの分子量は８５〜１１５ｋＤａ、ＫｚＧＬＤの分子量は９５〜１１５ｋＤａ、Ｃｓ７ＧＬＤの分子量は９０〜１０５ｋＤａ、ＦｃＧＬＤの分子量は８５〜１１０ｋＤａであり、糖鎖切断後の分子量は、何れも６０〜７０ｋＤａだった。【０１２３】
（４）基質特異性
前記活性測定法に準じ、基質にＤ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース、スクロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース及びトレハロースをそれぞれ用いて、各基質に対する各ＧＬＤの活性を測定した。Ｄ−グルコースに対する活性を１００％として、各基質の相対活性を算出した結果を表１に示す。【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
本発明のＧＬＤは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する反応性が１０％以下で、更にＤ−フルクトース、ソルビトール、ラクトース及びスクロースに対する活性は１％以下であった。【０１２６】
（５）至適温度の範囲
前記活性測定法に準じ、種々の温度にて各ＧＬＤの活性を測定した。基質の終濃度は１０ｍＭ及び５０ｍＭとした。結果を図２に示す（図２（Ａ）はＡｐｓＧＬＤ、図２（Ｂ）はＡｐｎＧＬＤ、図２（Ｃ）はＫｃＧＬＤ、図２（Ｄ）はＫｚＧＬＤ、図２（Ｅ）はＣｓ７ＧＬＤ、図２（Ｆ）はＦｃＧＬＤを示す）。具体的には、基質の終濃度が１０ｍＭの場合、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液０．０３ｍＬ、超純水１．５８ｍＬ、３ｍＭ ＤＣＩＰ０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １−ｍ−ＰＭＳ０．２０ｍＬを混合し、基質の終濃度が５０ｍＭの場合、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液０．１５ｍＬ、超純水１．４６ｍＬ、３ｍＭ ＤＣＩＰ０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １−ｍ−ＰＭＳ０．２０ｍＬを混合し、何れの基質の終濃度の場合も３７℃で保温する代わりに各温度で１０分間保温し、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を測定し、直線部分から前記式１に従いＧＬＤ活性を算出した。その結果、各ＧＬＤが最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、基質濃度１０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上、ＡｐｎＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上、ＫｃＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＫｚＧＬＤは２０〜３０℃で８０％以上、Ｃｓ７ＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＦｃＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上の相対活性で、基質濃度５０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは４０℃で８０％以上、ＡｐｎＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上、ＫｃＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上、ＫｚＧＬＤは３０℃で８０％以上、Ｃｓ７ＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上、ＦｃＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上の相対活性で、何れの基質濃度においても、ＡｐｓＧＬＤは４０℃で８０％以上、ＡｐｎＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上、ＫｃＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＫｚＧＬＤは３０℃で８０％以上、Ｃｓ７ＧＬＤは３０℃で８０％以上、ＦｃＧＬＤは３０〜４０℃で８０％以上の相対活性であった。以上から、本発明のＧＬＤの至適温度は、最大活性を示す温度における活性値を１００％とした場合に、基質濃度１０ｍＭでは３０℃、基質濃度５０ｍＭでは３０又は４０℃で相対活性値が８０％以上であった。【０１２７】
（６）温度特性
前記活性測定法に準じ、各温度にて各ＧＬＤの活性を測定した。基質の終濃度は１０ｍＭ及び５０ｍＭとした。３０℃を１００％とした時の各温度の相対活性を表２に示した。その結果、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値の範囲は、基質濃度１０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは５３．０〜１１１％、ＡｐｎＧＬＤは６２．１〜１０６％、ＫｃＧＬＤは５２．０〜１００％、ＫｚＧＬＤは５８．４〜１００％、Ｃｓ７ＧＬＤは５５．１〜１００％、ＦｃＧＬＤは５１．６〜１１２％で、基質濃度５０ｍＭでは、ＡｐｓＧＬＤは５０．９〜１３６％、ＡｐｎＧＬＤは５５．９〜１１９％、ＫｃＧＬＤは５０．４〜１００％、ＫｚＧＬＤは５６．７〜１００％、Ｃｓ７ＧＬＤは５５．２〜１００％、ＦｃＧＬＤは５１．５〜１１７％であった。
以上から、本発明のＧＬＤは、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０〜４０℃における活性値の範囲が２０〜１５０％であり、３０℃における活性値を１００％とした場合に、１０℃における活性値が２０％以上、２０℃における活性値が４０％以上であることがわかった。よって、本発明のＧＬＤは何れも広い温度範囲で活性の変動が少ない酵素である。【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
（８）ｐＨ安定性
ＦｃＧＬＤを６Ｕ／ｍＬに調製し、終濃度が１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（図中ひし形印でプロット）、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（図中四角印でプロット）、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（図中黒丸印でプロット）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（図中三角印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（図中白丸印でプロット）又は１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（図中×でプロット）になるように各緩衝液を添加し、３０℃で１時間処理した後、前記酵素活性測定方法で酵素活性を測定した。酵素活性の残存率を算出し、安定ｐＨとして図４に示した。
その結果、ＦｃＧＬＤが最も安定だったｐＨの緩衝液で処理した酵素の活性を１００％とした場合に、ｐＨ５．０〜７．５で８０％以上、ｐＨ４．０〜８．０で６０％以上の残存活性だった。尚、同じｐＨであっても緩衝液の種類によって残存活性は異なり、リン酸カリウム緩衝液は、ｐＨが７付近又はアルカリ側で、同じｐＨの他の緩衝液に比べ、安定性が低い傾向がみられた。【０１３０】
（９）グルコースに対するＫｍ値
前記活性測定法に準じ、基質であるＤ−グルコース濃度を変化させて、各ＧＬＤの活性を測定した。５、１５、２５及び５０ｍＭの各グルコース濃度における活性測定値からＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数（Ｋｍ値）を求めた結果、ＡｐｓＧＬＤは８．７８ｍＭ、ＡｐｎＧＬＤは１１．５ｍＭ、ＫｃＧＬＤは２１．６ｍＭ、ＫｚＧＬＤは３７．３ｍＭ、Ｃｓ７ＧＬＤは１３．０ｍＭ、ＦｃＧＬＤは１６．８ｍＭだった。尚、Ｋｍ値は、測定方法や算出するプロットによって値が変動し易いため、ＡｐｓＧＬＤは約５〜２０ｍＭ、ＡｐｎＧＬＤは約５〜２０ｍＭ、ＫｃＧＬＤは約１０〜５０ｍＭ、ＫｚＧＬＤは約１０〜６０ｍＭ、Ｃｓ７ＧＬＤは約５〜３０ｍＭ、ＦｃＧＬＤは約５〜３０ｍＭと考えられる。【０１３１】
［実施例１４］
（本発明のＧＬＤによるグルコースの測定）
本発明のＧＬＤを用いて、前記活性測定法におけるＤ−グルコースの濃度を０．３ｍＭ（５．５ｍｇ／ｄＬ）〜５０ｍＭ（９００ｍｇ／ｄＬ）の範囲に変化させて、吸光度変化を測定した。結果を図３に示す（図３（Ａ）はＡｐｓＧＬＤ、図３（Ｂ）はＡｐｎＧＬＤ、図３（Ｃ）はＫｃＧＬＤ、図３（Ｄ）はＫｚＧＬＤ、図３（Ｅ）はＣｓ７ＧＬＤ、図３（Ｆ）はＦｃＧＬＤを示す）。その結果、何れの本発明のＧＬＤにおいても、９００ｍｇ／ｄLまでのＤ−グルコースを測定できた。これより、本発明のＧＬＤを用いたＤ−グルコースの定量が可能であることが示された。【０１３２】
［実施例１５］
本発明の各ＧＬＤのアミノ酸配列同士（配列番号２：ＡｐｓＧＬＤ、４：ＡｐｎＧＬＤ、６：ＫｃＧＬＤ、８：ＫｚＧＬＤ、１０：Ｃｓ７ＧＬＤ、１２：ＦｃＧＬＤ、１４：Ｃｓ８ＧＬＤ、１６：ＣｃＧＬＤ、１８：ＣｆＧＬＤ及び２０：ＣｏＧＬＤ）をＧＥＮＥＴＹＸのホモロジー検索により比較して、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ％の数値を類似性％として表３にまとめ、ｉｄｅｎｔｉｔｙ％の数値を同一性％として表４にまとめた。
更に、本発明の各ＧＬＤの塩基配列同士（配列番号１：ＡｐｓＧＬＤ、３：ＡｐｎＧＬＤ、５：ＫｃＧＬＤ、７：ＫｚＧＬＤ、９：Ｃｓ７ＧＬＤ、１１：ＦｃＧＬＤ、１３：Ｃｓ８ＧＬＤ、１５：ＣｃＧＬＤ、１７：ＣｆＧＬＤ及び１９：ＣｏＧＬＤ）をＧＥＮＥＴＹＸのホモロジー検索により比較して、ｉｄｅｎｔｉｔｙ％の数値を同一性％として表５にまとめた。【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
表３の結果より、本願では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０の配列と、類似性がそれぞれ少なくとも９０％のアミノ酸配列であり且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。【０１３７】
表４の結果より、本願では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０の配列と、同一性がそれぞれ少なくとも６０％のアミノ酸配列であり且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。【０１３８】
表５の結果より、本願では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９の配列と、同一性がそれぞれ少なくとも６０％の塩基配列であり且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得できたことが確認できた。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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