(57)【要約】  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；前記マウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；前記マウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；これらの抗ＧＡＰ４３抗体を利用する免疫学的分析方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項２】
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項３】
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項４】
ポリクローナル抗体である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項６】
（１）以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体； 
（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、
（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することと、
を含む、ＧＡＰ４３の免疫学的分析方法。
【請求項７】
神経の発生及び／又は再生を評価するために用いられる、請求項６に記載の免疫学的分析方法。
【請求項８】
前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の検出又は定量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、及び免疫組織化学法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を利用することを含む請求項６又は請求項７に記載の免疫学的分析方法。
【請求項９】
請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法を実行するためのキット。
【請求項１１】
以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体； 
前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬と、
を含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体を含む、成長円錐を検出するための試薬：
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長円錐を特異的に検出可能な抗体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経の発生及び再生では、神経細胞が発生又は再生する段階（１）と、発生又は再生した神経細胞が軸索を正しく伸長し、シナプスを正しく形成する段階（２）とが必要である。発生及び再生した神経細胞の軸索先端部には、成長円錐と呼ばれる運動性の高い扇状の構造体が存在する。この成長円錐は、中央領域（ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ）と、葉状仮足及び糸状仮足を含む辺縁領域（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ）とを有する。成長円錐は、シナプス形成のために、糸状仮足の伸長又は退縮をしながら軸索を適切に誘導する。【０００３】
ｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４３（ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）（以下、「ＧＡＰ４３」という。）は、成長円錐に豊富に存在し、糸状仮足の伸長や神経突起の枝分れで重要な役割を果たす。ＧＡＰ４３はタンパク質キナーゼＣによってリン酸化される一方、カルシニューリンによって脱リン酸化される。非リン酸化ＧＡＰ４３はアクチンキャップタンパク質として機能し、糸状仮足の伸長を低下させる。また、マウスＧＡＰ４３の第４１番目のセリン残基（Ｓ４１）のリン酸化が、糸状仮足の伸長のためのアクチンの安定化に重要であると考えられている（例えば、Denny,JB.、Curr Neuropharmacol.,Vol.4(12):pp.293-304 (2006)参照）。【０００４】
従来、前記段階（２）を評価するために、リン酸化Ｓ４１を認識する抗ＧＡＰ４３抗体が用いられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、前記抗ＧＡＰ４３抗体は、神経細胞全体でＧＡＰ４３に反応し、成長円錐のみを特異的に検出できない。したがって、前記抗ＧＡＰ４３抗体は、神経の発生又は再生を定量的に評価することができない。このように、発生及び再生過程において、成長円錐を特異的に検出できる抗体はほとんどなかった。
本発明の課題は、成長円錐を特異的に検出できる抗体と、該抗体を利用する免疫学的分析方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、成長円錐のリン酸化プロテオミクス解析によって、マウスＧＡＰ４３の第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、及び、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）が顕著にリン酸化される一方、前記Ｓ４１は、ほとんどリン酸化されないことを新たに見出した。この発見は、軸索伸長では、前記Ｔ８９、Ｓ９６及びＴ１７２のリン酸化が重要であることを示す。本発明によれば、前記Ｔ８９、Ｓ９６又はＴ１７２がリン酸化されたＧＡＰ４３を特異的に検出することによって、神経の発生及び／又は再生を定量的に評価することを可能となった。【０００７】
本発明は、配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体を提供する。【０００８】
本発明は、配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体を提供する。【０００９】
本発明は、配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体を提供する。【００１０】
本発明は、（１）本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することとを含む、ＧＡＰ４３の免疫学的分析方法を提供する。【００１１】
本発明の免疫学的分析方法は、神経の発生及び／又は再生を評価するために用いられる場合がある。【００１２】
本発明の免疫学的分析方法において、前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の検出又は定量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、及び免疫組織化学法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を利用する場合がある。【００１３】
本発明の３種の抗ＧＡＰ４３抗体はそれぞれ、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合がある。【００１４】
本発明は、本発明の前述した３種のモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマを提供する。【００１５】
本発明は、本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットを提供する。
前記キットは、本発明の前述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬と、を含む場合がある。【００１６】
本発明は、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体を含む成長円錐を検出するための試薬を提供する。
本発明は、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体の、成長円錐の検出方法における使用を提供する。【００１７】
本明細書において「工程（process）」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。【００１８】
本明細書でアミノ酸を表す場合、セリン、スレオニン等の化合物名で表す場合と、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の慣用の３文字表記で表す場合と、Ｓ、Ｔ等の慣用の１文字表記で表す場合とがある。
本明細書において、用語「非リン酸化ポリペプチド」とは、リン酸化されていないアミノ酸残基のみを含むポリペプチドを意味し、用語「リン酸化ポリペプチド」とは、リン酸化されているアミノ酸残基を少なくとも１つ含むポリペプチドを意味する。【００１９】
配列番号１のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＥＧＤＧＳＡＴＴＤＡＡＰＡである。配列番号２のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＤＡＡＰＡＴＳＰＫＡＥＥである。配列番号３のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＶＴＤＡＡＡＴＴＰＡＡＥＤである。配列番号４のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＤＡＡＡＴＴＰＡＡＥＤである。配列番号５のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＫＡＴＴＤＮＳＰＳＳＫＡである。配列番号６のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＴＤＮＳＰＳＳＫＡＥＤＧである。配列番号７のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＶＴＤＡＡＡＴＴＰＡＡＥＤである。配列番号８のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＫＫＥＧＤＧＳＡＴＴＤＡである。配列番号９のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＤＡＡＰＡＴＳＰＫＡＥである。配列番号１０のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＰＫＡＥＥＰＳＫＡＧＤＡである。配列番号１１のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＳＥＥＫＡＧＳＡＥＴＥＳである。配列番号１２のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＥＴＡＥＳＳＱＡＥＥＥである。配列番号１３のＧＡＰ４３のアミノ酸配列は、GenBank アクセッション番号ＡＡＨ２８２８８の配列である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ラット成長円錐画分（ＧＣＰ）に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真。
【図２】マウスＧＡＰ４３の融合タンパク質の発現検出実験の結果を示すウエスタンブロット写真。
【図３】さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（１）の結果を示すウエスタンブロット写真。
【図４】さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（２）の結果を示すウエスタンブロット写真。
【図５】さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真。
【図６】さまざまな抗ＧＡＰ４３抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図７】抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図８】抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット脊髄後根神経節細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図９】抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体及び抗ニューロフィラメント  モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄後根神経節損傷部位の蛍光顕微鏡写真。
【図１０】抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄損傷部位の蛍光顕微鏡写真。
【図１１】抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、  抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄損傷後７日目の脊髄損傷部位の顕微鏡写真。
【図１２】抗ＧＡＰ４３  ｐS９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、  抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された発生過程の胎児脳のＡ：胎生期１５日目の視床大脳皮質路、Ｂ：胎生期１２日目の嗅覚神経の顕微鏡写真。
【図１３】アカゲザルに対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の抗体は、以下のものである：
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体と、
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体と、
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体。
【００２２】
また、本発明の免疫学的分析方法は、（１）本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することとを含む、ＧＡＰ４３の免疫学的分析方法である。本発明のキットは、前記免疫学的分析方法を実行するためのものであり、あるいは、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体を含み、更に当該抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬を含む場合がある。本発明の成長円錐を検出するための試薬は、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体を含むものである。
本発明では、上述したこれらの３種の抗ＧＡＰ４３抗体（以下、特に断らない限り、これらの３種を総称して「本発明の抗ＧＡＰ４３抗体」と表記することがある）は、Ｔ８６、Ｓ９６又はＴ１７２がリン酸化されたＧＡＰ４３を特異的に認識することができるので、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体の結合状態に基づいて神経の発生及び／又は再生を評価することができる。
以下、本発明について説明する。
【００２３】
本明細書におけるポリペプチドは、生物学的手順で作製されたポリペプチドの場合がある。前記生物学的手順は、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かを用いて発現させて調製することを含むが、これらに限定されない。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞又は組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。代替的には、本明細書におけるポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等を用いる化学的手順で作製された合成ポリペプチドの場合がある。前記ポリペプチドは、精製された状態で使用されることが好ましい。前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、マウスＧＡＰ４３のアミノ酸配列の一部分を含む場合がある。前記ポリペプチドは、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化される場合がある。
【００２４】
前記ポリペプチドは、キャリア高分子と結合した複合体として、本発明の抗体の作製、及び／又は、本発明の免疫学的分析方法の実施に用いられる場合がある。本明細書における「キャリア高分子」とは、ハプテンに免疫原性を付与することのできるいずれかの高分子をいい、タンパク質、多糖類等の生体高分子でも、ポリリジン等の合成高分子でもかまわない。前記複合体のキャリア高分子に用いられるタンパク質は、ウシ血清アルブミン、ニワトリオボアルブミン及びスカシ貝ヘモシアニンを含むがこれらに限定されない。前記キャリア高分子と、配列番号１ないし１２のいずれかのアミノ酸配列が含まれ、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチドとの複合体は、アミノ酸のいかなる官能基とキャリア高分子との間で結合されてもかまわない。例えば、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基とキャリア高分子のいずれかの側鎖とが適当な架橋剤を介して共有結合される場合がある。前記架橋剤は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含むがこれらに限定されない。前記キャリア高分子と、配列番号１ないし１４のいずれかのアミノ酸配列が含まれ、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチドとの複合体は、リン酸化された特定のセリン残基及びスレオニン残基の免疫原性を高めるためにさまざまな保護、修飾等が行われる場合がある。
【００２５】
本発明の抗ＧＡＰ４３抗体それぞれは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体とからなるグループから選択される場合がある。
【００２６】
本発明の抗ＧＡＰ４３抗体及びハイブリドーマは、当業者に知られたさまざまな方法によって調製される場合がある。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）を参照せよ。
【００２７】
前記ポリペプチド又は前記複合体は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を含む抗血清を採取するために、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えばニワトリ）のいずれかの動物宿主に免疫原として注射される。前記免疫原は、前記キャリア高分子と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体は、適当な固体支持体に結合された前記ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって抗血清から精製される場合がある。
【００２８】
本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を産生するハイブリドーマは、免疫されたマウスから調製された脾臓細胞が、例えば、前記マウスと同種又は異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって調製される。前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、その後、ハイブリドーマの増殖は支持するが、ミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度で播種される。選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いることが好ましい。通常約１ないし２週間後、ハイブリドーマのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマを注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。前記モノクローナル抗体は、適当な固体支持体に結合された前記ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される場合がある。
【００２９】
本明細書における「抗体の抗原結合断片」とは、抗原結合に参加する抗体の部分をいう。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。前記抗原結合断片は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体をそれぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンで分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
【００３０】
本発明の抗ＧＡＰ４３抗体において、組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当な哺乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体において、キメラ抗体は、前記本発明の抗ＧＡＰ４３抗体の抗原結合部位が、ＧＡＰ４３のリン酸化されていない特定のセリン残基及びスレオニン残基と、リン酸化された特定のセリン残基及びスレオニン残基とを識別できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質の場合がある。前記特定のセリン残基及びスレオニン残基は、マウスＧＡＰ４３の第８６番目のセリン残基（Ｓ８６）、第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９５番目のスレオニン残基（Ｔ９５）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、第１０３番目のセリン残基（Ｓ１０３）、第１２８番目のセリン残基（Ｓ１２８）、第１４２番目のセリン残基（Ｓ１４２）、第１４５番目のセリン残基（Ｓ１４５）、第１７１番目のスレオニン残基（Ｔ１７１）、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）、又は、第１９２番目のセリン残基（Ｓ１９２）の場合がある。前記キメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＤ）とを含む。前記組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
【００３１】
本発明の免疫学的分析方法における「本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を準備する」工程は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を入手すること、又は本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を調製することを含む。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を入手する方法としては、既に作製された本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を、特定の供給元から無償又は有償で入手することが挙げられる。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を調製する方法は、前述の当業者に知られたさまざまな方法によって実施される場合がある。
【００３２】
本発明の免疫学的分析方法における「被験試料を準備する」工程は、本発明の免疫学的分析方法に適用可能な被験試料を入手すること、又は本発明の免疫学的分析方法に適用可能な被験試料を調製することを含む。被験試料を入手する方法としては、既に調製された被験試料を、特定の供給源から無償又は有償で入手することが挙げられる。被験試料を調製する方法は、生体からの採取、細胞培養等によって実施される場合がある。前記被験試料は、採取した細胞、組織及び器官と、培養細胞と、細胞溶解物と、合成ポリペプチドとを含むがこれらに限定されない。前記被験試料は、配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む、ＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドか、あるいは融合タンパク質を含むことが一般的である。前記融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含むＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドと、タグタンパク質又はタグペプチドとの融合タンパク質の場合がある。前記タグタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）及びシアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含むがこれらに限定されない。前記タグペプチドは、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグを含むがこれらに限定されない。配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む、ＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドと、融合タンパク質とは、リン酸化される場合がある。前記被験試料の生物種は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体によって、リン酸化されていない特定のセリン残基又はスレオニン残基と、リン酸化された特定のセリン残基又はスレオニン残基とを識別できることを条件として、ヒト、サル、マウス及びラットを含むがこれらに限定されない。前記特定のセリン残基及びスレオニン残基は、マウスＧＡＰ４３の第８６番目のセリン残基（Ｓ８６）、第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９５番目のスレオニン残基（Ｔ９５）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、第１０３番目のセリン残基（Ｓ１０３）、第１２８番目のセリン残基（Ｓ１２８）、第１４２番目のセリン残基（Ｓ１４２）、第１４５番目のセリン残基（Ｓ１４５）、第１７１番目のスレオニン残基（Ｔ１７１）、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）、又は、第１９２番目のセリン残基（Ｓ１９２）の場合がある。
【００３３】
本発明の免疫学的分析方法における「前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させる」工程は、前記被験試料が固定された固体支持体を用いて実施される場合がある。前記固体支持体は、前記被験試料の免疫原性を失うことなく固定できるものであればよく、さまざまな材料又は形状の固体を利用することができる。前記固体支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、ゲル、膜、天然繊維、シリコーン、金属及びそれらの複合材料を含むがこれらに限定されない材料から加工される場合がある。前記固体支持体は、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチアレイチップ、センサーチップ又はラテックス凝集法用微粒子のような、自動分析システムによって取り扱うのに適する形状を有する固体支持体が含まれる。前記接触させる工程では、複数の抗ＧＡＰ４３抗体が組み合わせて用いられる場合がある。本発明の免疫学的分析方法は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体以外の他の抗体と、前記被験試料とを接触させる工程を含む場合がある。前記他の抗体は、商業的に入手可能な抗β−アクチン抗体及び抗ニューロフィラメント抗体を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
本発明の免疫学的分析方法における「被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量する」工程は、被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体又は二次抗体等の標識により検出又は定量される場合がある。前記抗ＧＡＰ４３抗体は、ビオチンのような低分子リガンド、酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素等で標識される場合がある。前記抗ＧＡＰ４３抗体に対する二次抗体か、前記ビオチンのような低分子リガンドに特異的に結合するアビジンのような生体高分子かは、酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素等で標識される場合がある。前記酵素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等である。前記酵素は、適切な基質と組み合わせて用いられることが一般的である。検出する工程は、イメージングプレートに感光する工程か、ＣＣＤカメラで撮影する工程か、顕微鏡で観察する工程かを含む場合がある。定量する工程は、既知の濃度又は量の被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体の量を数値化してプロットした検量線を作成する工程と、前記検量線を用いて、未知の濃度又は量の被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の量から該被験試料の濃度又は量を算出する工程とを含む場合がある。検量線を作成するために、濃度又は量が知られた被験試料が少なくとも２種類あればよいが、定量精度を確保するために３種類又は４種類以上あることが好ましい。検出又は定量する工程は、被験試料に結合しなかった抗ＧＡＰ４３抗体及び他の抗体を洗浄により除去する工程を含む場合がある。
【００３５】
本発明の免疫学的分析方法において、神経の発生及び／又は再生を評価するとき、被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体の量が、基準値よりも高い値を示す場合に、神経の発生及び／又は再生は良好であると判断される場合がある。前記基準値は、当業者に周知な統計処理によって算出することができる。前記基準値は、特定の母集団から調製された被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体の量の平均値として決定される場合がある。この場合に用いられる母集団は、正常な被験動物か、神経が再生された被験動物かの場合がある。前記母集団の被験動物と、評価される被験動物とは、生物種、年齢及び性別が同じであることが好ましい。
【００３６】
本発明の免疫学的分析方法における「被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量する」工程は、当業者に知られたさまざまな手法によって実施される場合がある。例えば、前記手法は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、免疫組織化学法、又はこれらの２種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。前記表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法とは、光学現象を利用して、固体支持体上に固定化された分子と、相互作用の相手となる分子との固体支持体上における特異的相互作用を微細な質量変化として測定する手法をいう。ＳＰＲ法を実施するためのシステムとしては、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が利用できる。前記ラテックス凝集法とは、分光光度計を利用して、固体支持体であるラテックス等の微粒子又はナノ微粒子に結合した抗体の量に応じた微粒子の凝集反応の程度を比濁度の変化として測定する手法をいう。
【００３７】
本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットは、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体の他、検量線を作成するための既知の濃度又は量の対照試料を含む場合がある。前記対照試料は、配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分が含まれ、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化された、ＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドか、融合タンパク質かの場合がある。前記特定のセリン残基及びスレオニン残基は、マウスＧＡＰ４３の第８６番目のセリン残基（Ｓ８６）、第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９５番目のスレオニン残基（Ｔ９５）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、第１０３番目のセリン残基（Ｓ１０３）、第１２８番目のセリン残基（Ｓ１２８）、第１４２番目のセリン残基（Ｓ１４２）、第１４５番目のセリン残基（Ｓ１４５）、第１７１番目のスレオニン残基（Ｔ１７１）、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）、又は、第１９２番目のセリン残基（Ｓ１９２）の場合がある。本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットは、更に、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬を含む場合がある。前記試薬としては、前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための手法に応じて適宜選択された試薬を含み、例えば、希釈液としてのリン酸緩衝液等の緩衝液、発色剤を挙げることができる。
【００３８】
本発明は、前記免疫学的分析方法を実行できるように構成される、ＧＡＰ４３の免疫学的分析装置を提供する。前記装置には、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、ＣＣＤカメラ等の検出ユニット、分光光度計、蛍光分光光度計、表面プラズモン共鳴測定器等の測定ユニット、試薬、洗浄液及び／又は試料の注入及び／又は除去のためのディスペンサーユニット、ＥＬＩＳＡ用マルチウェルプレートや表面プラズモン共鳴用センサーチップのハンドリングのためのロボットアームユニット、それらの制御のための制御ユニット等が含まれる。
【００３９】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００４０】
以下の実験は、新潟大学動物実験倫理委員会によって承認された後に実施された（承認番号：新大研第４４号、承認日：２００６年９月２７日）。
【実施例１】
【００４１】
抗ＧＡＰ４３抗体の作製
１  材料及び方法
１．１  ポリペプチドの入手
非リン酸化ポリペプチド１２種類と、リン酸化ポリペプチド１２種類とがシグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社から購入された。前記非リン酸化ポリペプチド１２種類のアミノ酸配列は、配列番号１ないし１２に列挙される。リン酸化ポリペプチド１２種類それぞれについては以下に説明される。
リン酸化ポリペプチド第１番は、配列番号１に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第９番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＴ８９」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第２番は、配列番号２に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ９６」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第３番は、配列番号３に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第９番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第４番は、配列番号４に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第５番は、配列番号５に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第６番は、配列番号６に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第９番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第７番は、配列番号７に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第８番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第８番は、配列番号８に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ８６」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第９番は、配列番号９に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＴ９５」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第１０番は、配列番号１０に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第１１番は、配列番号１１に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第１２番は、配列番号１２に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２」という。）であった。【００４２】
１．２  抗原の作製
１２種類のペプチド抗原が、当業者に周知の方法に従って作製された。簡潔には、１２種類のポリペプチド抗原は、それぞれ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（カタログ番号Ｍ２７８６、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を用いてスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）（カタログ番号Ｈ７０１７、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）と結合された。【００４３】
１．３  抗血清の調製
初回免疫では、前記ペプチド抗原２００μｇがフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（カタログ番号Ｆ５８８１、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）と混合され、ウサギに投与された。初回免疫後、ＧＡＰ４３  ｐＴ８９、ＧＡＰ４３  ｐＳ９６、ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１、及び、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２についてのペプチド抗原１００μｇが、フロイント不完全アジュバント（以下、「ＦＩＡ」という。）（カタログ番号Ｆ５５０６、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）と混合され、７日毎に投与された。採血が初回免疫から４９日後に行われ、抗血清が得られた。初回免疫後、ＧＡＰ４３  ｐＳ８６、ＧＡＰ４３  ｐＴ９５、ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３、ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８、ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）、及び、ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２についてのペプチド抗原１００μｇがＦＩＡと混合され、１４日毎に投与された。採血が初回免疫から８４日後に行われ、抗血清が得られた。【００４４】
１．４  抗ＧＡＰ４３抗体の精製
前記抗血清は、当業者に周知な方法でアフィニティー精製された。簡潔には、前記抗血清はＰＤ−１０カラム（カタログ番号５４８０５、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）で脱塩され、前記リン酸化ポリペプチドを固定化した担体（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）と混合された。前記リン酸化ポリペプチドを固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０４Ｂ担体（カタログ番号１４４７１、東ソー株式会社）と混合された。混合後、沈降した担体はリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という。）で洗浄された。抗体は０．１Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ  ２．５）で溶出され、１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で中和された。前記抗体はＰＢＳ／５０％グリセロール／１５ｐｐｍプロクリン溶液で調製され、−２０℃で保存された。以下、ＧＡＰ４３  ｐＴ８９、ＧＡＰ４３  ｐＳ９６、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）、ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２、ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１、ＧＡＰ４３  ｐＳ８６、ＧＡＰ４３  ｐＴ９５、ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３、ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８、及び、ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２についてのペプチド抗原に対する抗ＧＡＰ４３抗体それぞれを、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ８６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ９５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２抗体という。【００４５】
１．５  ＥＬＩＳＡ法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応性がＥＬＩＳＡ法で調べられた。簡潔には、前記非リン酸化ポリペプチド１２種類と、前記リン酸化ポリペプチド１２種類とが、それぞれ、マルチウェルプレートに添加され、前記プレート上に固定化された。ブロッキング後、前記抗ＧＡＰ４３抗体が、それぞれ、一次抗体として前記プレートに添加された。その後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体が二次抗体として添加された。基質溶液の添加後、吸光度（４０５ｎｍ）がマイクロプレートリーダーによって測定された。【００４６】
１．６  ウエスタンブロット法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
ＧＡＰ４３に対する抗ＧＡＰ４３抗体それぞれの交叉反応性がウエスタンブロット法で調べられた。前記ウエスタンブロット法は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。簡潔には、ラット新生仔の前脳の成長円錐画分（２μｇ／ｍＬ、５０μＬ）（以下、「ＧＣＰ」という。）が用いられた。一次抗体の抗ＧＡＰ４３ウサギ抗体のそれぞれの最終濃度は以下のとおりであった。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ８６抗体（０．７μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体（０．３５μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ９５抗体（０．０９μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体（０．５μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３抗体（０．６μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８抗体（１．２６μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体（１．３７μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体（０．７５μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体（０．７８μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体（０．２６μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（＃２）抗体（０．３７μｇ／ｍＬ）、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）。０．１５６μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号ＮＡ９３４、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が二次抗体として用いられた。検出は、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（カタログ番号ＲＰＮ２１０８、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて実施された。【００４７】
２  結果
２．１  ＥＬＩＳＡ法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ８６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ９５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２抗体は、それぞれ、ＧＡＰ４３  ｐＴ８９、ＧＡＰ４３  ｐＳ９６、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）、ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２、ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５、ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１、ＧＡＰ４３  ｐＳ８６、ＧＡＰ４３  ｐＴ９５、ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３、ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８、及び、ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２に対して交叉反応性を有する一方、非リン酸化ポリペプチドに対して交叉反応性を有さなかった（データは示されない。）。したがって、前記抗体全ては、非リン酸化ポリペプチドと、リン酸化ポリペプチドとを明確に識別できることが示された。【００４８】
２．２  ウエスタンブロット法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
図１は、ラット成長円錐粒子由来の試料（ＧＣＰ）に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体は、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有した。また、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体は、特に強い交叉反応性を有した。なお、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ８６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ９５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１０３抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１２８抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１９２抗体は、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有さなかった（データは示されない。）。【００４９】
本実施例の実験結果から、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体それぞれは、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有することが示された。したがって、前記抗体は、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示唆された。
【実施例２】
【００５０】
抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体の性状解析
１  材料及び方法
抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体の性状が、実施例１に記載のウエスタンブロット法で解析された。緑色蛍光タンパク質（ｍａｘＧＦＰ）か、マウスＧＡＰ４３の融合タンパク質かをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターがＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションされた。前記融合タンパク質は、（１）緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びＧＡＰ４３の融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３」という。）か、（２）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ」という。）か、（３）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄ」という。）か、（４）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ」という。）か、（５）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄ」という。）か、（６）フラッグタグ（ＦＬＡＧ）及びＧＡＰ４３の融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３」という。）か、（７）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ」という。）か、（８）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄ」という。）か、（９）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ」という。）か、（１０）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄ」という。）かであった。前記ｍａｘＧＦＰか、前記融合タンパク質かを含む細胞溶解液が、前記発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞から調製された。なお、ＧＣＰと、未分化神経細胞であるＰＣ１２Ｄ細胞から調製された細胞溶解液（以下、「ＰＣ１２Ｄ」という。）と、神経成長因子（ＮＧＦ）で刺激されたＰＣ１２Ｄ細胞から調製された細胞溶解液（以下、「ＰＣ１２Ｄ／ＮＧＦ（＋）」という。）と、トランスフェクションされていないＣＯＳ−７細胞から調製された細胞溶解液（以下、「ＣＯＳ−７」という。）とが対照として用いられた。ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄの発現を検出するために、最終濃度１μｇ／ｍＬの抗ＥＧＦＰモノクローナル抗体（カタログ番号Ｍ０４８−３、株式会社医学生物学研究所）が一次抗体として用いられ、最終濃度０．１５６μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号ＮＡ９３１、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が二次抗体として用いられた。ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄに対する交叉反応性を比較するために、市販の抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体（カタログ番号Ｇ９２６４、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）と、実施例１で調製された抗ＧＡＰ４３抗体とが一次抗体として用いられた。前記抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体に対する二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号ＮＡ９３１、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が用いられた。【００５１】
２  結果
２．１  融合タンパク質の発現
図２は、マウスＧＡＰ４３の融合タンパク質の発現検出実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。ＣＯＳ−７細胞におけるＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄの発現が確認された。【００５２】
２．２  抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体の性状解析
図３は、さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（１）の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、ＧＣＰ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄに対して交叉反応性を有した一方、ＰＣ１２Ｄ、ＣＯＳ−７、及び、ｍａｘＧＦＰに対して交叉反応性を有さなかった。また、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体は、ＧＣＰ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄに対して交叉反応性を有した一方、ＰＣ１２Ｄ、ＣＯＳ−７、ｍａｘＧＦＰ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄに対して交叉反応性を有さなかった。図４は、さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（２）の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、ＧＣＰ、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３、及び、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａに対して交叉反応性を有した。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体は、ＧＣＰ及びＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３に対して交叉反応性を有した一方、ＥＧＦＰ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａに対して交叉反応性を有さなかった。なお、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体は、ＰＣ１２Ｄ／ＮＧＦ（＋）に対して交叉反応性を有した（データは示されない。）。【００５３】
２．４  抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体の性状解析
図５は、さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３、ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ａ及びＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｓ９６Ｄに対して交叉反応性を有した一方、ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ａ、及び、ＦＬＡＧ−ＧＡＰ４３  Ｔ１７２Ｄに対して交叉反応性を有さなかった。【００５４】
本実施例の実験結果から、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できないことが示された。
これに対して、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体は、第９６番目のセリン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第９６番目のセリン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示された。また、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示された。さらに、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体それぞれは、ＧＣＰに特異的な交叉反応性を有するため、第８９番目のスレオニン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第８９番目のスレオニン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示唆された。
【実施例３】
【００５５】
抗ＧＡＰ４３抗体の免疫細胞化学染色解析
１  材料及び方法
１．１  ラット大脳皮質神経細胞の初代培養
大脳皮質神経細胞は、ラット（ＳＤラット、雌、日本エスエルシー株式会社）の新生仔の脳から調製された。簡潔には、大脳皮質神経細胞が、細胞分散用試薬（Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、フナコシ株式会社）で処理され、０．０５％ポリエチレンイミン（カタログ番号Ｐ３１４３、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）でコーティングしたカバーガラス上に播種された。前記カバーガラスは培養ディッシュ（カタログ番号３５３００２、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に載置され、前記細胞は、Ｂ２７サプリメント（カタログ番号００５０１２９ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（カタログ番号Ｇ６７８４、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を含む市販培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号２１１０３−０４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で３日間培養された。【００５６】
１．２  ラット脊髄後根神経節（ＤＲＧ）細胞の初代培養
脊髄後根神経節細胞は、ラット（ＳＤラット、雌及び雄、生後１日齢、日本エスエルシー株式会社）から調製された。簡潔には、頸椎から腰椎までが摘出され、脊髄後根神経節細胞が採取された。前記脊髄後根神経節細胞は、ポリＬ−リジン（カタログ番号Ｐ４８３２、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）でコーティングしたカバーガラス上に播種された。前記カバーガラスは培養ディッシュ（カタログ番号３５３００２、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に載置され、前記細胞は、Ｂ２７サプリメント（カタログ番号００５０１２９ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（カタログ番号Ｇ６７８４、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を含む市販培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号２１１０３−０４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で３日間培養された。【００５７】
１．３  免疫細胞化学染色
培養後、前記細胞はブアン固定液（飽和ピクリン酸水溶液：ホルマリン溶液＝３：１＜体積比＞）で１０分間固定された。ＰＢＳで洗浄後、前記細胞は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで１０分間透過処理された。その後、免疫細胞化学染色が実施された。【００５８】
染色には、一次抗体として、実施例１で作製された抗ＧＡＰ４３抗体１２種類と、市販の抗リン酸化ＧＡＰ４３ｐＳ４１ポリクローナル抗体（カタログ番号Ｇ８０４３、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体と、抗α−チューブリンモノクローナル抗体（カタログ番号Ｔ９０２６、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）とが、１００〜５００倍希釈で用いられた。また、二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８蛍光標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ１１０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と、Ａｌｅｘａ５６８蛍光標識ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１０３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とが、それぞれ１０００倍希釈で用いられた。その後、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（カタログ番号Ｐ３６９３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で包埋され、倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００、カールツァイス株式会社）で観察された。
結果を図６〜図７に示す。図６において上段の左は抗ＧＡＰ４３Ｓ４１抗体、中央は成長円錐と軸索全体を認識する抗微小管抗体（マイクロチュブリン抗体（カタログ番号ＭＡＢ３４０８，ケミコン株式会社））、右はそのマージ像を示し、下段の左は抗ＧＡＰ４３ｐＴ１７１抗体、中央は抗微小管抗体、右はそのマージ像を示す。マージとは、それぞれリン酸化抗体と他の抗体との２重染色像の重ね合わせを意味する。図８の上段は、抗ＧＡＰ４３ｐＳ９６抗体を用いた結果であり、下段は、抗ＧＡＰ４３ｐＳ１７１抗体を用いた結果であり、それぞれ、左側は位相差顕微鏡像であり、右側は蛍光顕微鏡写真像である。【００５９】
２  結果
２．１  ラット大脳皮質神経細胞の免疫細胞化学染色
図６は、さまざまな抗ＧＡＰ４３抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３ｐＳ４１ポリクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体は、神経細胞全体に反応した（図６下段参照）。一方、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体は、神経細胞の先端に位置する成長円錐、特に中央域で特異的に反応した。【００６０】
図７は、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、樹状突起を含む神経細胞全体で反応した。【００６１】
２．２  ラット脊髄後根神経節細胞の免疫細胞化学染色
図８は、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット脊髄後根神経節細胞の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体は、神経節細胞の成長円錐の中央域で特異的に反応した。【００６２】
ラットＧＡＰ４３及びマウスＧＡＰ４３のアミノ酸配列は、ともに、第４１番目がセリン残基、第８９番目がスレオニン残基、第９６番目がセリン残基、第１７１番目がスレオニン残基、第１７２番目がスレオニン残基である。また、ラットＧＡＰ４３には、配列番号１ないし１２のアミノ酸配列が保存される。そこで、本実施例のリン酸化ＧＡＰ４３特異的抗体は、マウスＧＡＰ４３だけでなく、ラットＧＡＰ４３にも反応すると予測された。本実施例の実験結果からこの予測が確認された。さらに、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体は、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体と比較して成長円錐を特異的に検出できることが示された。また、第８９番目のスレオニン残基、第９６番目のセリン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３は、神経細胞の成長円錐に局在することが示された。さらに、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３は成長円錐に局在し、第１７１番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３は神経細胞全体で存在した。したがって、ＧＡＰ４３のリン酸化は、神経細胞が軸索を正しく伸長し、シナプスを正しく形成するために厳密に制御されていることが示唆された。特に成長円錐では、ＧＡＰ４３の第８９番目のスレオニン残基と、第９６番目のセリン残基と、第１７２番目のスレオニン残基とのリン酸化が、ＧＡＰ４３の第４１番目のセリン残基のリン酸化よりも重要であることが示唆された。なお、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体と同一のリン酸化スレオニンを認識する抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体も成長円錐を特異的に検出できることが示唆された。
【実施例４】
【００６３】
抗ＧＡＰ４３抗体の免疫組織化学染色解析
１  材料及び方法
１．１  脊髄損傷モデルマウスの作製（中枢神経損傷再生モデル）
脊髄損傷処置が当業者に周知な方法で実施された。簡潔には、マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ、雄、８週齢、日本チャールス・リバー株式会社）は麻酔下で背部を切開され、脊椎が露出された。第８−１１番胸椎（Ｔ８−１１）の椎弓が電気ドリルで切除された。その後、市販の装置（ＩＨ  Ｉｍｐａｃｔｏｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、錘（２．５ｇ）が２ｃｍ垂直上方から前記胸椎に３回落下され、脊髄が損傷された。免疫組織化学染色解析が、処置後２１日目に実施された。脊髄損傷処置が施されていないマウスが、対照として用いられた。【００６４】
１．２  末梢神経再生モデルマウスの作製（末梢神経再生モデル）
末梢神経再生モデルマウス作成が当業者に周知な方法で実施された。簡潔には、マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ、雄、８週齢、日本チャールス・リバー株式会社）は麻酔下で足関節部を切開され、筋皮神経を尺骨神経にバイパス移植が行われた。免疫組織化学染色解析が、処置後７日目に実施された。【００６５】
１．３  発生過程の胎児脳
妊娠マウス（Slc:ICR、雌、妊娠１５日齢及び１２日齢、日本エスエルシー株式会社）は麻酔下で切開され、胎児が摘出された。【００６６】
１．４  凍結組織切片の作製
凍結組織切片が当業者に周知な方法で作製された。簡潔には、脊髄損傷処置及び脊髄後根神経節損傷処置後、または胎仔が摘出された後、前記マウスは４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ＰＦＡ液）で灌流固定された。脊髄損傷部位及び脊髄後根神経節損傷部位が摘出され、さらにＰＦＡ液で固定された。固定された前記部位はスクロース溶液で置換され、凍結組織包埋剤（Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ、カタログ番号４５８３、サクラファインテックジャパン株式会社）で包埋された。厚さ１０μｍの切片が凍結切片作製装置（クリオスタット、ライカ  マイクロシステムズ株式会社）によって作製され、ゼラチンでコーティングしたスライドガラスに載置された。【００６７】
１．５  免疫組織化学染色
脊髄損傷モデルマウス実験では、免疫組織化学染色が実施例３に記載の方法に従って実施された。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体と抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体が一次抗体として用いられた。また、Ａｌｅｘａ４８８蛍光標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ１１０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と、Ａｌｅｘａ５６８蛍光標識ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１０３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とが二次抗体として用いられた。【００６８】
発生過程の胎児脳に関する実験では、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体と抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体が一次抗体として用いられた。また、ビオチン標識ウマ抗マウス抗体（カタログ番号ＢＡ-２００１、ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と、ビオチン標識ヒツジ抗ウサギ抗体（カタログ番号ＢＡ−１０００、ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とが二次抗体として用いられた。【００６９】
末梢神経再生モデルマウス実験では、免疫組織化学染色が市販のキット（Ｖｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｋｉｔ、カタログ番号ＰＫ６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、フナコシ株式会社）を用いて製造者の指示書に従って実施された。前記染色では、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体と、抗ニューロフィラメント（ＮＦ）抗体（カタログ番号ａｂ７７７４５、アブカム株式会社）とが一次抗体として用いられた。また、ビオチン標識ヒツジ抗マウス抗体（カタログ番号ＲＰＮ１００１、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）と、ビオチン標識ロバ抗ウサギ抗体（カタログ番号ＲＰＮ１００４、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）とが二次抗体として用いられた。【００７０】
２  結果  （末梢神経・中枢神経双方の再生神経の認識）
２．１  末梢神経再生モデルマウス実験の解析
図９は、尺骨神経にバイパス移植された筋皮神経が尺骨神経内に新しく移植神経からの再生する様子を移植後１週間にて免疫組織化学で解析した写真である。抗ＮＦ（ニューロフィラメント（中間径線維））抗体で染色をするとすべての神経を認識している。  一部の神経は筋皮神経からの再生神経を含んでいるが、抗ＮＦ抗体はすべての神経線維を認識するため再生神経のみをとらえることはできない。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体ではこのうち再生神経のみを正しく認識し反応した。拡大写真からも伸長過程にある形状の筋皮神経からの再生神経に対して反応した。【００７１】
２．２  脊髄損傷モデルマウス（中枢神経再生モデル）の解析
図１０は、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された損傷後２１日目の脊髄損傷部位の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、非損傷部位及び損傷部位の神経細胞に反応した。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体は、非損傷部位の神経細胞に反応しない一方、損傷部位の神経細胞に反応した。
図１１は、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、  抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄損傷後７日目の脊髄損傷部位の顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体は、損傷部位の神経細胞に反応しない。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、損傷部位の神経細胞に反応した。【００７２】
２．３  発生過程の胎児脳に関する解析
図１２は抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、  抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された発生過程の胎児脳のＡ：胎生期１５日目の視床大脳皮質路、Ｂ：胎生期１２日目の嗅覚神経の顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ４１抗体は、Ａ，Ｂの神経回路に反応しない。抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、Ａ，Ｂの神経回路に激しく反応した。【００７３】
２．４  ウエスタンブロット法を用いた哺乳動物間での抗ＧＡＰ４３抗体の交差性の評価
図１３は、アカゲザルに対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、アカゲザルの視覚野に対し強い交叉反応性を有した。なお、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ９６抗体は、アカゲザルに対して特異的な交叉反応性を有さなかった。【００７４】
本実施例の実験結果から、中枢神経及び末梢神経の再生過程の神経細胞は、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体によって選択的に検出できる一方、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体では選択的に検出できないことが示された。また、成長円錐に特異的に反応した抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体と、該抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体と同一のリン酸化スレオニンを認識する抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体とは、前記抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体と同様に、発生及び再生過程の神経細胞を選択的に検出できることが示唆された。【００７５】
結論
これらの実施例の実験結果から、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示された。また、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４２抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７１抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体は、それぞれ、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有するため、第８９番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第８９番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できる。また、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体は、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体と比較して、成長円錐に特異的に反応することが示された。さらに、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３  ｐＴ１７２（♯２）抗体は、中枢神経及び末梢神経の発生・再生過程の神経細胞を検出できることが示唆された。したがって、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体と、該抗体を利用する免疫学的分析方法とは、神経の発生及び／又は再生を定量的に評価するのに有用である。【００７６】
２０１１年１０月２０日に出願された日本国特許出願第２０１１−２３０５７７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月23日(2013.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項２】
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項３】
配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項４】
ポリクローナル抗体である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項６】
（１）以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、
（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することと、
を含む、神経の発生及び再生の少なくとも一方を評価するためのＧＡＰ４３の免疫学的分析方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の検出又は定量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、及び免疫組織化学法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を利用することを含む請求項６に記載の免疫学的分析方法。
【請求項９】
請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項６、請求項８〜請求項９のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法を実行するためのキット。
【請求項１１】
以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬と、
を含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体を含む、成長円錐を検出するための試薬：
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
【請求項１３】
（１）以下の抗体（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、
（Ａ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（Ｂ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
（Ｃ）  配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、
（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することと、
を含む、成長円錐を検出するための方法。
【国際調査報告】
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