(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
真菌を死滅させる方法であって、真菌を、有効量の請求項１に記載のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の培養物と接触させることを含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の培養物を含む組成物。
【請求項４】
１又は２以上の他の微生物を更に含む請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
界面活性剤を更に含む請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
１又は２以上の酵素を更に含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
酵素が、α−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ（pectate lyase）、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、及びプロテアーゼ、又はこれらの混合物からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
分散剤、安定剤、抗微生物剤、香料、染料、及び殺生物剤からなる群より選択される１又は２以上の成分を更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350が、１ｍＬ当たり約１×１０５から１×１０１０の濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は35U.S.C.第119条の下、米国仮出願番号第61/331,203号（2010年５月４日出願）に基づく利益を主張する。その内容は全て引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示発明は寄託微生物に言及する。寄託微生物の内容はは全て引用により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示発明はバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に関する。この菌株は優れたアミラーゼ、界面活性及び抗真菌活性を有するバチルス（Bacillus）細菌として特徴付けられる。更に、本開示発明の菌株は、多数の有用な酵素を産生すると共に、リパーゼ活性、ファージ耐性、並びに、ｐＨ、塩、及び温度に対する高い耐容性を有する。本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株及びそれが産生する酵素は、農業生産、洗剤産業、バイオエタノール産業、及びベーキング産業の分野において、多数の用途を有する。
【背景技術】
【０００４】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、又はＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）は、土壌試料中によく見られる周知の好気性細菌であり、世界のα−アミラーゼ及びプロテアーゼの生産の大部分に関与している。Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）はグラム陽性運動性桿菌であり、連鎖構造を形成する場合が多い。生育上の最適温度は３０〜４０℃であり、１５℃未満や５０℃超の温度では生育しない。本生物は過去にPriest等、Bacillus amyloliquefaciens sp. nov., nom. rev., International Journal of Systematic Bacteriology, 37, 69-71 (1987)（その全体が引用により本明細書に組み込まれる）において記載され、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）から区別された。本生物は低Ｇ＋Ｃ生物としても特徴付けられる。
【０００５】
Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）の一菌株であるBNM122が、化学的農業処置の生態学上有望な選択肢として、農薬の使用及び／又は乱用を代替又は低減するための持続的な農業管理法の開発に使用し得ることが示唆されてきた。例えば、ある研究は、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）の微生物生物防除剤（microbial biocontrol agent：ＭＢＣＡ）としての使用を、植物病害の化学的制御を代替又は低減する環境配慮型の（環境ally friendly）選択肢として特徴付けている。例えば Correa等、Bacillus amyloliquefaciens BNM122, a potential microbial biocontrol agent applied on soybean seeds, causes a minor impact on rhizosphere and soil microbial communities, Applied Soil Ecology 41, 185-194 (2009)（その全体が引用により本明細書に組み込まれる）参照。ここでは、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）のある菌株を種子の被覆剤として施用すると、種子及び根に定着し、特に土壌媒介真菌病原体を防除し得ることが示されている。
【０００６】
Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）の一菌株であるMIR-41も、α−アミラーゼの過剰生産者として報告されている。この菌株は、他の微生物との組み合わせにおいて、でんぷん基質からのエタノール生産に使用されている。例えば Abate等、Production of amylolytic enzymes by Bacillus amyloliquefaciens in pure culture and in co-culture with Zymomonas mobilis, Biotechnology Letters 21, 249-252 (1999)（引用により本明細書に組み込まれる）参照。
【０００７】
関連する先行技術として挙げられる米国特許第６，９６０，３４２号は、広範な抗真菌活性を示すバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に関する。本文献は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株、又は当該菌株を含む抗真菌組成物の、広範な真菌性植物病原体の防除のための使用に関する。
【０００８】
米国特許第６，５８９，５２４号は、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）NRRL B-30517 及び NRRL B-30519、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）NRRL B-30518 及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）NRRL B-30520の群から選択されるバチルス（Bacillus）の特定菌株を含む、生物的防除の組成物及び方法に関する。ここで、前記特定の菌株は、組み合わせにおいて、病原性真菌に対して効果を発揮する。病原性真菌としては、種々のフィトフトラ（Phytophthora）種、例えばＰ．カプシキ（P. capsici）等が挙げられる。
【０００９】
国際公開第ＷＯ／２００５／０５９１１２号は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）KTGB0202、及びこれを用いて植物病原体を防除する方法に関する。この菌株は穀物うどん粉病に対する防除効果と、植物病原性真菌に対する広スペクトルの抗真菌活性とを有し、タバコモザイクウイルス感染を阻害すると共に、これを含む生態系配慮型の（eco-friendly）細菌培養ブロスによりうどん粉病を防除し得る。
【００１０】
関連する先行技術として挙げられる米国特許出願番号第１２／５１１，４９９号、同第１２／５０３，２７２号及び同第１２／４９２，８１６号（これらは何れもその全体が引用により本明細書に組み込まれる）は、それぞれバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50154、NRRL B-50151、及びNRRL B-50141に関すると共に、これらの菌株の組成物及び使用に関する。
【００１１】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株SB3200は、ノボザイムズ（Novozymes）社の販売する、洗浄及び悪臭防止用途の製品（無機土壌による悪臭の吸着及び増強の原因となる有機土壌の除去を酵素によって補助する製品）及び排管／油脂（grease）捕捉用途の製品（目詰まりの原因となる排管堆積物を引き起こす油脂（grease）及び有機物の分解を前記菌株によって補助する製品）に含まれる。
【００１２】
産業用途に適した酵素の優れた産生源及び／又は分泌源となる菌株の同定が、依然として求められている。更に、多数の有用な酵素を産生／分泌し、及び／又は、抗真菌用途を有する新たな菌株の同定が、依然として求められている。単一の菌株として、優れたアミラーゼ、界面活性剤及びアミラーゼ活性を発揮し得る菌株を特定することが好ましい。農業生産、洗剤産業、バイオエタノール産業及びベーキング産業の分野における産業用途を改善するべく、依然として存在する産業上の要請を解決するには、新規菌株の同定が欠かせない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今般、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の新規菌株NRRL B-50350が同定・単離された。本菌株は、優れたアミラーゼ、界面活性剤及び抗真菌活性を有する酵素を産生するバチルス（Bacillus）細菌の菌株として特徴付けられる。更に、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株は、リパーゼ活性、ファージ耐性を有し、極端なｐＨ、塩、及び極端な温度に対して認容である。以下に述べるように、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株及びそれが産生する酵素は、農業生産、洗剤産業、バイオエタノール産業及びベーキング産業の分野の多数の用途に有用である。
【００１４】
より具体的には、本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の生物学的に純粋な培養物に関する。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のバクテリオファージ耐性（ファージ耐性）菌株である。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を、この菌株の広範な用途の実現に十分な数まで増殖させるには、大スケールでの発酵を繰り返し行う必要がある。標準的な大スケール発酵系では、増殖事象やバッチの繰り返しにおいて、天然バクテリオファージの自然導入が生じるおそれがあることが知られている。こうした感染は急速に広がり、数時間又は数日のうちには、培養物が完全に損傷し、実用に即した菌株を提供する能力が失われてしまう場合もある。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、このようなファージに対して耐性を有し、増殖を維持して本明細書記載の利益を実現するものである。
【００１５】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、排管残渣の主要化学成分（例えばでんぷん等）の分解を触媒するアミラーゼを産生する能力を有する。
【００１６】
本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を、水溶液（例えば蒸留水、水道水、塩溶液又は他の水溶液等）中に含む液体組成物にも関する。
【００１７】
本開示発明は、植物の根の発達を促進する製剤、及び、植物成長培地の生物増強剤をも対象とする。
【００１８】
本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む排管洗浄製剤をも対象とする。
【００１９】
本開示発明は、真菌をバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることにより、真菌を死滅させる方法にも関する。
【００２０】
本開示発明は、真菌を死滅させる液体製剤であって、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む製剤にも関する。
【００２１】
本開示発明は、植物種子を処理する方法であって、種子を有効量のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることを含む方法にも関する。
【００２２】
本開示発明は、植物成長培地を処理する方法であって、成長培地を有効量のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることを含む方法にも関する。
【００２３】
本開示発明は、真菌を死滅させる方法であって、真菌を有効量のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることを含む方法にも関する。
【００２４】
本開示発明は、でんぷんを分解する方法であって、でんぷんを有効量のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることを含む方法にも関する。
【００２５】
本開示発明は、ベーキング成分を改質する方法であって、ベーキング成分を有効量のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることを含む方法にも関する。
【００２６】
本開示発明は、油脂を分解する方法であって、油脂を有効量のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に接触させることを含む方法にも関する。
【００２７】
本開示発明は、汚水を処理する方法であって、汚水にバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を添加する工程を含む方法にも関する。
【００２８】
本開示発明は、表面を洗浄する方法であって、表面にバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を接触させる工程を含む方法にも関する。
【００２９】
本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む組成物にも関する。適切な組成物は、１又は２以上の他の微生物を含む。ある実施形態によれば、適切な組成物は、１又は２以上の界面活性剤、及び／又は、１又は２以上の酵素を含む。適切な酵素の非限定的な例としては、１又は２以上のα−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ（pectate lyase）、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、及びプロテアーゼ、又はこれらの混合物が挙げられる。ある実施形態によれば、組成物は更に、分散剤、安定剤、抗微生物剤、香料、染料、及び殺生物剤からなる群より選択される１又は２以上の成分を含む。組成物の実施形態によれば、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、１ｍＬ当たり１×１０５〜１×１０１０の濃度で存在する。
【００３０】
本明細書において「有効量」（effective amount）という語は、有益な効果を提供し得る、又は、不所望の状態を予防、軽減若しくは除去し得る量を意味する。有益な効果の非限定的な例としては、植物種子の質の改善、植物成長培地の質の改善、真菌集団に対する殺生物効果、真菌集団に対する生物静止効果、でんぷんの分解、ベーキング成分の改質、資質の分解、汚水の質の改善、表面の清浄性の改善、及び／又は、悪臭の低減、或いはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
本明細書において「処理する」（treat、treating）又は「処理」（treatment）という語は、１又は２以上の不所望の状態の発生を予め予防し、或いは、既存の１又は２以上の不所望の状態を治療的に軽減するべく、本開示発明の菌株又は組成物を用いることを意味する。本開示発明に係る処理計画は、植物種子の質を改善し、植物成長培地の質を改善し、不所望の真菌を低減及び／又は除去し、及び、表面の清浄性を改善する。
【００３２】
本開示発明の上述の側面及びその他の側面は、以下の詳細な説明を参照すれば、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、アミラーゼ比活性の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、アミラーゼ比活性の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、プロテアーゼ比活性の経時変化を示すグラフである。
【図４】図４は、リパーゼ比活性の経時変化を示すグラフである。
【図５】図５は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の２つの菌株による生物界面活性剤の産生を比較するグラフである。
【図６】図６は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の２つの菌株による生物界面活性剤の産生を比較するグラフである。
【図７】図７は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の２つの菌株間の希釈係数と表面（界面）張力との関係を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350に関する。この菌株は、優れたアミラーゼ、界面活性剤、及び／又は抗真菌活性を有するバチルス（Bacillus）細菌として特徴付けられる。更に、本開示発明の菌株は、多数の有用な酵素を産生するとともに、リパーゼ活性、ファージ耐性、及び塩（例えば最高7.5%の塩化ナトリウム）及び温度（例えば最高50℃）に対する高い耐容性を有する。本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株、及びそれが産生する酵素は、農業生産、洗剤産業、バイオエタノール産業及びベーキング産業の分野において、多数の用途を有する。
【００３５】
ある実施形態によれば、本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の生物学的に純粋な培養物に関する。
【００３６】
ある実施形態によれば、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、種々の組成物及び方法における使用に適している。適切な本開示発明の組成物の非限定的な例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む任意の組成物；バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む水溶液、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350と１又は２以上の他の微生物とを含む組成物；バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350と界面活性剤とを含む組成物；及び、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350と１又は２以上の酵素とを含む組成物が挙げられる。本開示発明に係る使用に適した非限定的な酵素の例としては、α−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ（pectate lyase）、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、及びプロテアーゼ、又はこれらの混合物が挙げられる。他の組成物の非限定的な例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350と、１又は２以上の分散剤、安定剤、抗微生物剤、香料、染料、及び殺生物剤とを含む。
【００３７】
ある実施形態によれば、本開示発明に係る組成物は、水性溶媒を含む液体形態である。
【００３８】
本開示発明の組成物において、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、約１×１０５〜１×１０１０の濃度で存在すると考えられる。
【００３９】
本開示発明に係る適切な組成物の他の非限定的な例としては、排管洗浄用製剤、消毒用製剤、又は消臭用組成物が挙げられる。
【００４０】
ある実施形態によれば、本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を水性媒体中に含む排管洗浄用製剤を対象とする。適切な排管洗浄用製剤の非限定的な例は、更に（１又は２以上の）界面活性剤及び／又は（１又は２以上の）保存料を含んでいてもよい。本開示発明の排管洗浄用製剤の実施態様は、現在利用可能な排管洗浄剤に対して、多数の利点を有する。即ち、中性付近のｐＨでの活性や、石鹸、脂肪、油、及び油脂（greases）の可溶化能等である。ある実施態様によれば、更に、炭水化物に対して特異的な生物活性が提供されるとともに、排管内及び下流表面に生物膜が形成され、天然の生物分解プロセスが持続的に補助される。
【００４１】
ある実施形態によれば、排管洗浄用製剤としては、生存微生物、（１又は２以上の）界面活性剤、保存料、及び任意により香料を、水性媒体中に含む安定な懸濁液が挙げられ、その好適なｐＨは約５〜６である。
【００４２】
微生物が作動し得る濃度範囲は約１×１０６〜１×１０９ＣＦＵ／ｍｌであり、ある実施態様によれば、製剤中の濃度は約１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、例えば約１×１０７ＣＦＵ／ｍｌである。
【００４３】
主に表面のみを清浄する一般的な洗剤とは異なり、本開示発明の製剤の実施態様では、界面活性剤が油脂（grease）を可溶化し、生物が利用可能な状態とする。界面活性剤は、生分解容易な界面活性剤、又は界面活性剤の混合物であって、系内に含まれる微生物に対する毒性が低いものであれば任意である。界面活性剤は、油脂（grease）可溶化能が高いことが好ましい。イオン性界面活性剤、又は、非イオン性／イオン性界面活性剤の混成物であって、親水性／親油性バランスが１０に近いものが、必要な油脂（grease）の可溶化にはとりわけ好ましい。本開示発明における使用に適した界面活性剤の非限定的な例としては、ｎ−アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキルスルホン酸塩が挙げられる。非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、脂肪族アルコールアルコキシレート、アルコールエトキシレート、ポリアルキレンオキシドコポリマー、アルキルフェノールアルコキシレート、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド等が挙げられる。ある実施形態によれば、界面活性剤は、組成物又は製剤全体に対して約３〜１０重量％の濃度で存在する。
【００４４】
排管洗浄用製剤の実施態様において、溶液のｐＨは、十分な細菌活性を確保するとともに、健康上のリスクを最小限に抑えるべく、できる限り中性に近く維持すべきである。但し、界面活性剤の活性に適合するとともに、細菌の生存に寄与する範囲内とする。作動可能なｐＨ範囲は例えば約３〜１０である。
【００４５】
排管洗浄用製剤の実施態様において、製品中における不所望の汚染微生物の生育を抑制又は防止するため、パラベン、メチルパラベン又は１−２−ベンズイソチアゾリン−３−オン等の保存料を加える。保存料の必要性が最も高いのはｐＨが中性に近い場合であり、最も低いのはｐＨが作動可能範囲の両極にある場合である。保存料の濃度は販売者の推奨に応じて決定する。例において使用される保存料の典型的な濃度範囲は、組成物又は製剤全体に対して約０．０７５〜０．７５重量％である。
【００４６】
任意により、特に微生物の胞子形態を保護すべく、更なる保存料を追加してもよい。ある実施形態によれば、アントラニル酸メチルを重量基準で約２５〜５０ｐｐｍ（ｗ／ｖ）の濃度で使用するのが、添加剤としては望ましい。
【００４７】
排管洗浄用製剤の実施態様によれば、任意により、製剤の安定化を強化するべく、キレート剤が添加される。
【００４８】
排管洗浄用製剤の実施態様によれば、任意により、製品の成分の臭いの消去や市場でのアピールのために、香料を添加してもよい。香料は、製剤の他の成分と適合するものでなければならない。
【００４９】
ある実施形態によれば、本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む消毒剤にも関する。製剤は、消毒用組成物の懸濁液、細菌胞子、及び界面活性剤の全てを、水溶液中に含む。斯かる製剤は、良好な表面清浄剤、及び、良好な消毒剤であるとともに、表面上及び表面を濯いだ下水系内の双方について、有益な細菌により病原体を防除し、汚物を分解するという効果を、長期的に提供することができるという利点を有する。
【００５０】
消毒剤又は消毒用組成物と、殺菌消毒薬（disinfectant）とは、同一分類の抗菌（活性）成分に属する。抗菌（活性）成分は、微生物を死滅させ、又はその生育及び繁殖を防止若しくは抑制すると共に、当該成分が含まれる製品の所期の効果に寄与する化合物である。より具体的には、消毒剤は、汚染微生物又は病原体の数を、公共上の健康に関する要請に基づいて安全と判断されるレベルまで低減する剤である。
【００５１】
消毒剤の実施態様において、界面活性剤成分は、土壌、埃、乾燥した尿及び石鹸を除去することにより表面を清浄すると共に、表面を消毒する機能を有する。消毒用組成物は、表面を消毒する（病原体を死滅させる）と共に、不所望の微生物による汚染から製剤を保護する。細菌胞子及び栄養細胞（vegetative cells）は、廃物回収系に、臭いを制御し、病原体の生育を（基質競合、抗生物質産生等により）阻害する健康な優勢微生物集団を提供する機能を有する。
【００５２】
本開示発明の消毒剤の一実施態様によれば、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（プロキセル：Proxel）、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（tetrasodium ethylenediaminetetraacetate：ＥＤＴＡ）、及びイソプロピルアルコール（isopropyl alcohol：ＩＰＡ）を、選択された濃度範囲で含むと共に、これとの組み合わせで他の処方成分を含む組成物が、指標となる生物を効果的に不活性化する。この消毒用組成物は、好ましくは、中性ｐＨであり、且つ、消毒剤に汎用される塩素関連物質を含まない。結果として、この消毒用組成物は、環境への適合性が向上するとともに、腐食性が低減又は解消されている。
【００５３】
ある実施形態によれば、消毒用剤を浴室器具、流し台、便器等に施用する場合、消毒用剤を容器から直接、表面又はブラシに噴霧し、又は絞り出すことができる。その後、１０分未満の時間に亘って、製剤を表面上に放置し、或いはブラシで表面に擦り付ける。続いて製品を水で洗い流し、或いは濯いで、器具から排出する。
【００５４】
ある実施形態によれば、本開示発明の消毒剤は、消毒剤、細菌胞子、及び界面活性剤を含む。また、製剤の臭い及び色を調節するために、それぞれ香料及び染料も加える。所望の用途によっては、製剤は研磨剤を含んでいてもよい。主成分が同一であっても、研磨剤がある場合とない場合とで、異なる増粘剤が使用される場合がある。
【００５５】
消毒剤の多くは表面上の病原体を不活性化するのに用いられるが、それらの全てが本開示発明の実施態様に使用できるわけではない。その理由は、本開示発明で使用される消毒剤は、病原体を効果的に不活性化する必要があるだけでなく、製剤に含まれる細菌胞子の安定性及び活性に負の影響を与えてはいけないからである。更に、消毒剤は、環境適合性が比較的高いことが求められると共に、皮膚感作を起こさない必要があり、且つ、使用対象となる器具の構成素材を浸食しないことが求められる。
【００５６】
ある実施形態によれば、本開示発明の消毒用組成物は、プロキセル、ＥＤＴＡ、及びＩＰＡを、選択された範囲の濃度で含む。皮膚感作を起こすおそれのないプロキセルの最高濃度は約２，９００ｍｇ／Ｌである。指標生物数を１０分で４べき乗低減するためのプロキセル、ヴェルセン（Versene：３９％ＥＤＴＡ含有ヴェルセン）及びＩＰＡの適切な濃度範囲は、それぞれ０．０８７〜０．２９（体積）％、０．３６〜１．１９（体積）％、及び３．５〜７（体積）％である。本発明の製剤には、更なる化合物として、アントラニル酸メチルを使用してもよい。アントラニル酸メチルの使用目的は、製剤の保存を補助する点にある。
【００５７】
ある実施形態によれば、本開示発明の消毒用組成物には、４級アンモニウム化合物（quaternary ammonium compounds：ＱＡＣｓ）、ニトロ含有有機硫黄及び硫黄窒素化合物等の消毒剤を使用してもよい。
【００５８】
消毒剤の実施態様において、微生物が作動可能な濃度範囲は、製剤に対して１×１０５〜１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ、例えば１０７ＣＦＵ／ｍｌ（ＣＦＵ：コロニー形成単位（colony forming unit））である。
【００５９】
ある実施形態によれば、本開示発明の消毒剤には、界面活性剤が含まれる。界面活性剤によれば、汚れた表面上に存在する土（埃を含む）、乾燥した尿、石鹸等を湿潤化し、乳化することができる。更に、界面活性剤は、表面の衛生化を補助する。表面清浄に通常使用される界面活性剤とは異なり、本開示発明に使用される界面活性剤は、製剤内に含まれる微生物に対する毒性が低い。ある実施形態によれば、単一の界面活性剤も、複数の界面活性剤の混合物も使用できる。
【００６０】
消毒剤の実施態様における使用に適した界面活性剤の非限定的な例としては、非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、所望の湿潤化及び乳化作用を提供できると共に、胞子安定性及び活性を顕著に阻害しないからである。非イオン性界面活性剤とは、水性媒体に溶解又は分散させた状態で電荷を有さない界面活性剤をいう。非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、脂肪族アルコールアルコキシレート、アルコールエトキシレート、ポリアルキレンオキシドコポリマー、アルキルフェノールアルコキシレート、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド等が挙げられる。
【００６１】
イオン性界面活性剤、又は、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤との混合物を、本開示発明の製剤に使用してもよい。イオン性界面活性剤とは、水溶液中で陰イオン性又は負荷電状態にある親水性部位を有する界面活性剤をいう。本発明での使用に適した陰イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、スルホン酸、硫酸エステル、カルボン酸及びこれらの塩が挙げられる。
【００６２】
ある実施形態によれば、本開示発明の組成物は、水不溶性の固体粒子である研磨剤（abrasives）を含む。研磨剤を使用する目的は、徹底した研磨及び清浄を得ることにある。用途によっては、本開示発明の製剤に、研磨剤を用いてもよい。適切な研磨剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、シリカ等が挙げられる。ある実施形態によれば、研磨剤のメッシュサイズは、例えば８０〜３２５メッシュである（ASTM E 11-70 (1995)）。
【００６３】
細菌胞子の比重は通常は水よりも高いため、本開示発明において胞子を懸濁せるためには増粘剤が必要である。適切な水性増粘剤の非限定的な例としては、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン等が挙げられる。ある実施形態によれば、細菌胞子を懸濁せるための増粘剤は、ポリアクリル酸（例えばRohm and Haas Co.社製Acrysol TT615）である。製剤に研磨剤を使用する場合には、研磨剤を懸濁液として維持するために、ポリアクリル酸に加えて増粘剤が必要となる場合がある。
【００６４】
ある実施形態によれば、製品の成分の臭いをマスクし、色を調節するために、更には市場での影響を考慮し、香料及び染料を加えてもよい。香料及び染料は、製剤の他の成分と適合性を有するものでなければならない。
【００６５】
ある実施形態によれば、本開示発明は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を水溶液中に含む組成物も対象とする。ある実施形態によれば、水溶液は、短期及び長期の臭い防除効果を提供するように設計され、環境配慮型（environmentally friendly）且つ経済的に使用できる。
【００６６】
ある実施形態によれば、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の作動可能な濃度範囲は、約１×１０５〜１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、例えば約１×１０６〜１×１０８ＣＦＵ／ｍｌである。ある実施形態によれば、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の作動可能な濃度範囲は、約１×１０８ＣＦＵ／ｍｌの量であり、実施態様によっては、製剤の約１×１０７ＣＦＵ／ｍｌである。
【００６７】
ある実施形態によれば、本開示発明の脱臭組成物は、臭い中和剤を含んでいてもよい。臭い中和剤は、臭いを有する化合物と化学反応により迅速に相互作用し、無臭の化合物を産生するものをいう。これらの剤は、臭いを制御する香料のマスキング作用に依存すべきではない。更に、これらの剤は、使用時に安全であり、費用効果にも優れていなければならない。中和剤は微生物成分と適合性を有しなければならない。
【００６８】
本開示発明の一実施態様によれば、中和剤はプロピレン・カーボネートである。その分子式はＣ４Ｈ６Ｏ３である。本開示発明に従う使用に適したプロピレン・カーボネートは、市場メーカー、例えばHuntsman Chemical Corporationから入手可能である。
【００６９】
プロピレン・カーボネートは、組成物の他の成分との組み合わせにおいて、臭いを効果的に低減する。斯かる臭いとしては、アミン及びアンモニアの臭い、例としてはトリメチルアミン、ジメチルアミン、及びアンモニアが含まれる。これらは、主な対象となる臭いを有する化合物である。更に、プロピレン・カーボネートは、微生物成分と長期間接触した場合でも、微生物を不活性化することがない。
【００７０】
他の臭い中和化合物、例えばクエン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムも、本開示発明の実施態様によっては使用することが可能である。
【００７１】
ある実施形態によれば、臭い中和剤又は臭い中和化合物は、組成物全体に対して１〜１５ｗｔ％、例えば２〜１０ｗｔ％の量で存在する。
【００７２】
本開示発明の組成物において、他の微生物成分は、組成物内での使用に適したものである。一般的な家庭、産業、ペット、及び動物の廃棄物において増殖してこれを分解することができ、製剤において生存する能力を有し、製剤と適合性を有し、且つ、使用時に悪臭を発しない生存微生物、或いはこれらの混合物を、本開示発明の実施態様において使用することができる。
【００７３】
本開示発明の組成物において使用可能な他の微生物の非限定的な例としては、アルカリゲネス（Alcaligens）、バシラス（Bacillus）、エンテロバクター（Enterobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、ニトロバクター（Nitrobacter）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）、シュードモナス（Pseudomonas）、及びストレプトコッカス（Streptococcus）の菌株が挙げられる。これらは、カーペットやその他の繊維材料上の臭いを引き起こす有機物を分解する能力を有する酵素を産生する。
【００７４】
本開示発明の組成物には、界面活性剤、香料、染料等のほかの成分を使用してもよい。
【００７５】
組成物の実施態様において、界面活性剤は、処理対象系における不溶性の廃棄物を湿潤化及び乳化させることが可能である。本開示発明の組成物に界面活性剤を含めることにより、組成物に清浄能力を付与することが可能である。更に、界面活性剤を使用して不溶性廃棄物を分解し、微生物分解への利用性を高めることもできる。本開示発明に適した界面活性剤としては、非イオン性及び陰イオン性のものが挙げられる。ある実施形態によれば、界面活性剤は、組成物に対して０〜８ｗｔ％、例えば０−６ｗｔ％の量で存在する。
【００７６】
ある実施形態によれば、本開示発明の組成物の成分の臭いをマスクし、色を調節するために、更には市場での影響を考慮し、香料及び染料を加えてもよい。
【００７７】
香料及び染料は、組成物の他の成分と適合を有しなければならない。
【００７８】
本開示発明の菌株は、極めて強い界面活性剤活性を有することが見出された。更に、本開示発明の菌株は、病原性真菌を制御する用途に適している。病原性真菌の非限定的な一例は、滲出胞子を産生し、立ち枯れ病を引き起こすことが知られている真菌である。ある実施形態によれば、滲出胞子は界面活性剤、例えば本開示発明の菌株が産生する界面活性剤に対して感受性を示す。滲出胞子を本開示発明の菌株及び／又は界面活性剤に接触させることにより、滲出胞子を産生することが知られている真菌に対して、殺生物及び／又は生物静止効果が発揮される。ある実施形態によれば、本開示発明の菌株は、フィチウム（Pythium：フハイカビ）属の菌種に対し、優れた抗真菌活性を有する。ある実施形態によれば、不所望の真菌を有し、処置の必要がある種子及び／又は成長培地に対して、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350及びこの菌株を含む組成物を接触させる。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、真菌に対して殺生物効果を有し、不所望の真菌による状態を軽減する。従って、種子及び／又は植物成長培地は、植物を生育させるのに適した状態へと変更され、或いはその適性が高められる。ある実施形態によれば、本開示発明に係る方法は、フィチウム（Pythium）として知られる寄生卵菌属を死滅させるのに適している。
【００７９】
本開示発明の実施態様において、方法及び組成物は、洗剤領域での使用に適している。驚くべきことに、本開示発明の菌株は、極めて高いアミラーゼ、界面活性剤及び抗真菌活性を有することが見出された。例えば、本開示発明の菌株は、豊富な量のアミラーゼ、界面活性剤を産生するとともに、フィチウム（Pythium）属の菌種に対して優れた抗真菌活性を有する。ある実施形態によれば、処理が必要な汚れた基材に対して、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350、及びこの菌株を含む組成物を接触させる。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、そこに存在するでんぷん及びでんぷん種を分解し、不所望の不清浄な状態を軽減する。従って、例えば布地や表面等の基材は、その概観が清浄な状態に変更され、又はより清浄な状態となる。
【００８０】
ある実施形態によれば、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を含む菌株及び組成物が、種々の方法用途での使用に適している。適切な方法の非限定的な例としては、植物種子を、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の有効量と接触させることにより、種子を処理する方法；成長培地を、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の有効量と接触させることにより、植物成長培地を処理する方法；真菌を、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の有効量と接触させることにより、真菌を死滅させる方法；でんぷんを、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の有効量と接触させることにより、でんぷんを分解する方法；ベーキング成分を、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の有効量と接触させることにより、ベーキング成分を改変する方法；脂質を、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の有効量と接触させることにより、脂質を分解する方法；本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株を汚水に加えるステップを含む、汚水を処理する方法；及び、表面を、本開示発明のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株と接触させることにより、表面を清浄化する方法が挙げられる。本開示発明に係る清浄に適した表面の非限定的な例としては、硬表面、好ましくは金属、プラスチック、ゴム、板、ガラス、木、紙、コンクリート、石、大理石、石膏（gypsum）、及びセラミック材料、例えば陶磁器等、からなる群より選択される１又は２以上の材料からなる硬表面；軟表面、好ましくは繊維、例えば糸、織物、植物繊維、ロックウール、毛髪、皮膚、角質物質、及び内部器官、例えば肺、等からなる群より選択される１又は２以上の材料からなる軟表面、又は多孔質表面等が挙げられる。
【００８１】
ある実施形態によれば、斯かる処理には、有効量の１又は２以上の菌株組成物の施用が含まれる。非限定的な例としては、排管洗浄用製剤、消毒剤、及び消臭組成物が挙げられる。斯かる処理は、不所望の状態を予防し、軽減し、又は除去し得る。
【００８２】
有益な効果の非限定的な例としては、植物種子の質の改善、植物成長培地の質の改善、真菌集団に対する殺生物効果、真菌集団に対する生物静止効果、でんぷん分解、ベーキング成分の改質、脂質の分解、汚水の質の改善、表面の清浄性の改善、及び／又は、悪臭の低減、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８３】
生物材料の寄託
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株は、ブダペスト条約の取極めに従い、農事試験場培養株保存機関（Agrochemical Research Service Culture Collection、1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.）に２０１０年４月１２日付で受託番号NRRL B-50350として寄託された。本寄託は寄託期間において、発効された特許の存続期間を通じて、生存状態で維持されなければならず、また、任意の人又は団体による非商業用途以外の使用において、制限なく、但し当該寄託を規定する法定の条項に従って、利用可能な状態とされていなければならない。
【００８４】
以下の実施例は、本開示発明の例として挙げるものであるが、本開示発明を制限することを意図するものではない。当業者が本明細書に記載の組成物及び方法をより適切に実施できるように、以下の実施例は、本発明の組成物の調製及び本発明の方法の例として供するものである。本開示発明は実施例における実施の詳細に限定されないことを留意すべきである。
【実施例】
【００８５】
実施例１
材料及び方法
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350（「菌株 SB3778」）を、研究所領域において単離した。細菌同定試験；ＤＮＡフィンガープリント試験；生物界面活性剤活性試験；抗真菌活性試験；ストレス耐容性試験；プロテイナーゼ活性試験；及びアミラーゼの遺伝子クローンを含む実験を実施した。
【００８６】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の単離及び同定
１６００塩基の全長１６ｓＤＮＡをバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350単離物から取得し、配列を分析した。この分析によって、細菌単離物がバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）であることが同定された。
【００８７】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、ＳＭプレート上で独自の形態を有する。
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を、公知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の菌株と比較した。具体的に、増殖及び形態を比較した。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、ＳＭ培地上において、形態学的に、他の何れのバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株とも異なっていた。他の全てのＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）菌株が、ＳＭ寒天プレート上でエキソ多糖類を産生したのに対し、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は産生しなかった。
【００８８】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は独自の遺伝子型を有する。
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350を、ＤＮＡフィンガープリント分析により、既知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の菌株と比較した。その結果は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350が、既知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の菌株に対して、７０％の類似性を有することを示していた。
【００８９】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、アミラーゼ産生用の社内菌株である周知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の菌株よりも、高いアミラーゼ活性を示した。
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350のアミラーゼ活性を評価し、アミラーゼ産生菌として既知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の菌株であるDD3（受託番号NRRL B-50154）と比較した。BANを用いたKonelab KNU-B分析によりアミラーゼ活性を決定した。この手法では、α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカノヒドロラーゼ（1,4-α−D-glucanohydrolases）、E.C. 3.2.1.1）が、１，４−α−グルコシド結合の開裂による高分子炭水化物（例えばアミロース、アミロペクチン及びグリコーゲン等）の加水分解を触媒する。多糖類及びオリゴ糖類においては、幾つかのグリコシド結合が同時に加水分解される。斯かる単位のうち最小のものであるマルトトリオースは、マルトース及びグルコースに変換されるが、その速度は極めて遅い。ここに記載する動力学的な方法は、十分に証明されている過程である、４，６−エチリデン−（Ｇ７）−１，４−ニトロフェニル−（Ｇ１）−α，Ｄ−マルトヘプタノシドのα−アミラーゼによる開裂と、それに続く、α−グルコシダーゼの補助を伴う全分解産物の加水分解によるｐ−ニトロフェノールの産生に基づく。これにより発色団が１００％遊離される。
【００９０】
このプロセスは、Konelab Arena 30においては、以下のステップにより自動化されている。即ち、１）２００μＬのＲｌ試薬をピペットでキュベットに入れ、２）１６μＬの試料をキュベットに加え、３）混合物を３００秒インキュベートして温度を３７℃とし、４）２０μＬのＲ２試薬をピペットでキュベットに入れ、混合物を１８０秒インキュベートし、５）１８秒毎に４０５ｎｍでの吸収を各試料につき計７回測定する。
【００９１】
規定のオリゴ糖類はα−アミラーゼの触媒作用により開裂された。その結果得られるＰＮＰ誘導体が、α−グルコシダーゼの作用によって直接ＰＮＰに開裂され、その結果得られるｐ−ニトロフェノールの分光光度法により測定される色強度は、α−アミラーゼ活性に正比例することになる。
【００９２】
【化１】
0005902674.tif 000002
【００９３】
反応（１）は、標準株又は試料から加えられるアミラーゼにより媒介された。反応（２）は、キットにより提供されたグルコシダーゼにより媒介された。その結果によれば、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、既知の菌株、即ちDD3（菌株NRRL B-50154）と比べて、アミラーゼ活性に少なくとも５倍の増加が見られた。
【００９４】
酵素分析：各菌株について単一のコロニーを１０ｍＬのＰＣＢ培地に接種し、一晩放置した。各菌株につきおよそ１ｘ１０４の細胞を１００ｍＬのでんぷん培地に接種した。以下のグラフに示す各時点でＯ．Ｄ．の読み取り値を取得した。各菌株につき、各時点における２ｍＬの無細胞上清材料を１ｍＬの５０％グリセロールと混合し、−２０℃で保存した。全ての試料の酵素活性を、上述したBANを用いたKonelab KNU-B分析により決定した。この手順を繰り返し実施して結果を検証した。
【００９５】
ここで図１を参照すると、本試験によれば、amy1（菌株NRRL B-50350）では、DD3（菌株NRRL B-50154）と比較して、アミラーゼ産生におよそ５倍の増加が見られた。
【００９６】
第２の試験によれば、amy1（菌株NRRL B-50350）では、DD3（菌株NRRL B-50154）と比較して、アミラーゼ産生に４倍の増加が見られた。これらの結果を図２に示す。両試験を通じて、菌株NRRL B-50350は常に、標準菌株よりも優れたアミラーゼ産生能を示した。菌株NRRL B-50350の最高のアミラーゼ産生は約８００ＮＵであった。
【００９７】
規定の単位
BANはノボザイムズ（Novozymes）社より入手可能なα−アミラーゼである。分析標準は３６０ＫＮＵ（Ｂ）／ｇ＝３６０ＮＵ（Ｂ）／ｍｇで提供された。
【００９８】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は、プロテアーゼ及びリパーゼ活性を有する。
プロテアーゼアッセイの設定は、上記のアミラーゼアッセイについて記載したプロトコールに従って行った。Konelab分析は以下のように行った。
【００９９】
【化２】
0005902674.tif 000003
【０１００】
プロテアーゼは、ＤＭＣ（Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼイン）を加水分解する。ペプチド結合が加水分解されると、オリゴペプチドの２つの新たな端部に、カルボン酸及び１級アミンが形成される。続いて１級アミンは、アルカリ条件下でトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応し、着色複合体を形成する。
【０１０１】
【化３】
0005902674.tif 000004
【０１０２】
着色複合体は、Konelab Arena 30によって、以下の手順に従い、４０５ｎｍで速度論的に検出される。すなわち、１）１８０μＬのＤＭＣ溶液をピペットによりキュベットに入れ、２）混合物を４８０秒間インキュベートして温度を５０℃にし、３）３６μＬのＴＮＢＳをピペットによりキュベットに入れて混合し、４）混合物を６０秒間インキュベートして温度を５０℃に回復し、５）１８μＬの試料をピペットによりキュベットに入れて混合し、６）混合物を１２０秒間インキュベートして、４０５ｎｍの吸収を１８秒毎に計７回測定する。１級アミンとＴＮＢＳとの反応はＤＭＣの開裂よりも早いと考えられることから、過剰な基質の存在下における反応は、酵素濃度のみの関数になると予想される。
【０１０３】
図３にプロテアーゼ比活性の比較を示す。バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）amy1（菌株NRRL B-50350）は、DD3（菌株 NRRL B-50154）とほぼ同量のプロテアーゼを産生した。
【０１０４】
リパーゼアッセイの設定は、アミラーゼアッセイについて上述したプロトコールに従って行った。Konelab分析は以下のとおりに行った。
【０１０５】
リパーゼは、特別な種類のエステラーゼ酵素である。リパーゼは一般に、トリグリセリドからグリセロール及び３つの脂肪酸への分解に関与している。リパーゼは、特定の鎖長の脂肪酸を含むトリグリセリドに特異性を示す場合がある一方で、グリセロール部位における脂肪酸の位置化学に特異性を示す場合もある。リパーゼは水油界面で機能する傾向がある。上述の反応では、脂肪酸のｐ−ニトロフェノール誘導体がリパーゼの基質として使用される。このラボラトリアッセイに使用可能な中から選択される脂肪酸鎖長は幾つか存在する。例としては以下が挙げられる。
ｐＮＰ−酪酸：Ｃ４
ｐＮＰ−吉草酸：Ｃ５
ｐＮＰ−パルミチン酸：Ｃ１６
【０１０６】
ｐＮＰ−吉草酸はこのアッセイで最も一般的に用いられる基質である。この基質は無職であるのに対し、開裂産物であるｐ−ニトロフェノールは４０５ｎｍに強い吸収を示す。従って、Ａ４０５の増加を経時的に測定することにより、酵素活性を追跡することができる。反応スキームを以下に示す。
【０１０７】
【化４】
0005902674.tif 000005
【０１０８】
着色複合体は、Konelab Arena 30によって、以下の手順に従い、４０５ｎｍで速度論的に検出される。すなわち、１）１７５μＬのｐＮＰ−吉草酸溶液をピペットによりキュベットに入れ、２）混合物を４８０秒間インキュベートして温度を３７℃とし、３）５０μＬの試料をピペットによりキュベットに入れて混合し、４）混合物を２５０秒間インキュベートして温度を３７℃に回復し、５）混合物を６００秒間インキュベートして、４０５ｎｍでの吸収を５４秒毎に計１２回測定することにより行う。
【０１０９】
図４を参照すると、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）amy1（菌株NRRL B-50350）は、DD3（菌株NRRL B-50154）とほぼ同量のリパーゼを産生する。
【０１１０】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350は抗真菌活性を有する。
菌株NRRL B-50350の抗真菌能力をDD3（菌株NRRL B-50154）と比較した。菌株によれば、DD3（菌株NRRL B-50154）はフィチウム（Pythium）を阻害するものの、Ｒ．ソラニ（R. solani）及びＳ．スクレオチオラム（S. sclerotiorum）に対する阻害の方が強い。菌株 NRRL B-50350はこれら３種の真菌全てを阻害するが、最も強く阻害するのはフィチウム（Pythium）である。比較すると、Ｒ．ソラニ（R. solani）及びＳ．スクレオチオラム（S. sclerotiorum）に対する阻害に関しては、DD3（菌株NRRL B-50154）の方が菌株NRRL B-50350よりも効率が高いのに対して、菌株NRRL B-50350によるフィチウム（Pythium）の阻害はDD3（菌株NRRL B-50154）よりもはるかに強い。このデータが特に興味深いのは、フィチウム（Pythium）阻害剤を見つけるのは困難だからである。結果を以下の表１に示す。
【０１１１】
【表１】
0005902674.tif 000006
【０１１２】
実施例２：温度耐容性
方法：バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350及び社内菌株（比較対照として使用）をＰＣＢに接種し、以下の各温度で一晩インキュベートした。３５℃、４０℃、４５℃、及び５０℃。増殖の有無により耐容性を測定した。
【０１１３】
結果：各菌株とも最高５０℃まで増殖が見られた。従って、本開示発明の菌株は熱耐用性を有する。
【０１１４】
実施例３：塩分耐容性
方法：バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350及び社内菌株（比較対照として使用）を、以下の塩濃度を有するバクトトリプトン（１０ｇ／Ｌ）イーストエキストラクト（５ｇ／Ｌ）培地に接種した。２％、５％、７．５％、１０％、及び１２．５％。増殖の有無により耐容性を測定した。
【０１１５】
結果：バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350については最高７．５％まで増殖が観察されたのに対し、対照は最高１２．５％まで増殖を示した。
【０１１６】
実施例4: 生物界面活性剤活性
方法：バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350（「amy1」、以前は「菌株Ｘ」とも表記した）、及び、生物界面活性剤活性を有する別の既知のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50017（「SB3195」、以前は「菌株Ｙ」とも表記した）を、１００ｍＬの生物界面活性剤培地に接種し、各フラスコのＯ．Ｄ．を０．００１とした。８、２４、５６、及び７２時間の時点で、表面張力及びＯ．Ｄ．を測定した。５６時間の時点で段階希釈を実施し、amy1及びSB3195の生物界面活性強度を決定した。
【０１１７】
結果： amy1及びSB3195を同じ比率で接種したにもかかわらず、SB3195はamy1よりも速い増殖を示した（図５）。５６時間の時点で、SB3195の増殖はamy1の３倍の速さであった。しかしながら、amy1による生物界面活性剤の産生は８時間の時点で始まったのに対して、SB3195が生物界面活性剤の産生を示したのは２４時間の時点であった（図６）。５０ｍＮ／ｍ未満の表面張力により、優れた生物界面活性剤活性が決定された。amy1により産生された生物界面活性剤が生物界面活性剤活性を喪失するには１００倍に希釈する必要があったのに対し、SB3195は２５倍希釈の時点で生物界面活性剤活性を喪失した（図７）。amy1の増殖はSB3195の３分の１だったのに対し、amy1の産生する生物界面活性剤は、希釈倍率によれば、SB3195に対して４倍の活性を有していたことになる。
【０１１８】
本発明は以下に番号付けした項目により記載される。
１．バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350の生物学的に純粋な培養物。
２．植物種子を処理する方法であって、種子を有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
３．植物成長培地を処理する方法であって、成長培地を有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
４．真菌を死滅させる方法であって、真菌を有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
５．でんぷんを分解する方法であって、でんぷんを有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
６．ベーキング成分を改質する方法であって、ベーキング成分を有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
７．脂質を分解する方法であって、脂質を有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
８．汚水を処理する方法であって、汚水に有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株を加えることを含む方法。
９．表面を清浄する方法であって、表面を有効量の項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株に接触させることを含む方法。
１０．表面が、硬表面、好ましくは金属、プラスチック、ゴム、板、ガラス、木、紙、コンクリート、石、大理石、石膏（gypsum）、及びセラミック材料、例えば陶磁器等、からなる群より選択される１又は２以上の材料からなる硬表面；軟表面、好ましくは繊維、例えば糸、織物、植物繊維、ロックウール、毛髪、皮膚、角質物質、及び内部器官、例えば肺、等からなる群より選択される１又は２以上の材料からなる軟表面、又は多孔質表面である、項目９の方法。
１１．当該方法が定期的に繰り返される、項目９又は１０の方法。
１２．表面に、酵素、例えばα−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ（pectate lyase）、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、及びプロテアーゼ、又はこれらの混合物からなる群より選択される酵素を接触させることを更に含む、項目９〜１１の何れかの方法。
１３．表面を、分散剤、界面活性剤、抗微生物剤、及び殺生物剤からなる群より選択される１又は２以上の剤に供することを更に含む、項目９〜１２の何れかの方法。
１４．項目１のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株を含む組成物。
１５．１又は２以上の他の微生物を更に含む項目１４の組成物。
１６．界面活性剤を更に含む項目１４の組成物。
１７．１又は２以上の酵素を更に含む項目１６の組成物。
１８．酵素が、α−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ（pectate lyase）、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、及びプロテアーゼ、又はこれらの混合物からなる群より選択される、項目１７の組成物。
１９．分散剤、安定剤、抗微生物剤、香料、染料、及び殺生物剤からなる群より選択される１又は２以上の成分を更に含む項目１４の組成物。
２０．バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株NRRL B-50350が１ｍＬ当たり約１×１０５〜１×１０１０の濃度で存在する、項目１４の組成物。
２１．バチルス（Bacillus）菌株NRRL B-50350の単離微生物。
【０１１９】
本明細書に記載の実施態様には種々の改変を加えることが可能であると理解すべきである。従って、上述の説明は限定的なものと解すべきではなく、単なる実施態様の例示として解すべきである。当業者であれば、本明細書に添付の特許請求の範囲による範囲及び趣旨を逸脱しないような、他の改変を思いつくであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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