(57)【要約】 Aspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子（bgl1）をTrichoderma属微生物のegl1のプロモーターの制御下で発現するTrichoderma属に属する微生物を得た。この形質転換体が生産する糖化酵素を用いることにより、セルロース系バイオマスを効率的に糖化しうることを見出した。また、こうして糖化したセルロース系バイオマスを発酵させることにより、効率的にエタノールを製造しうることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Trichoderma属に属する微生物のegl1プロモーターに連結され発現可能になっているAspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子が導入されたTrichoderma属に属する微生物。
【請求項２】
Trichoderma属に属する微生物がTrichoderma reesei（Hypocrea  jecorina）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
Aspergillus属に属する微生物がAspergillus aculeatusである、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の微生物から生産されたセルロース系バイオマスの糖化酵素。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の微生物を培養する工程を含む、請求項４に記載の糖化酵素の生産方法。
【請求項６】
請求項４に記載の糖化酵素で、セルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの糖の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法を実施することにより得られた糖を発酵する工程を含む、エタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系バイオマスを糖化することによる糖の製造方法、該方法により製造された糖を発酵することによるエタノールの製造方法、及びこれら方法に用いられるセルラーゼ生産菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
食糧や飼料と競合しない、農産廃棄物や木材などのセルロース系バイオマスから、エタノールなどの化学品を開発するための数多くの試みがなされてきた。例えば、木材などを硫酸で糖化し、グルコースやキシロースのような単糖類とした後に、この単糖類を酵母やバクテリアで発酵させ、エタノールを得る方法が開発されてきた（非特許文献１から３）。しかしながら、この方法には、使用した強酸を回収して再利用することが困難である点や、廃棄物処理する場合の環境性の点などにおいて問題があった。【０００３】
そこで、より温和で環境に優しいバイオマスの糖化方法として、酵素を用いる方法も開発されてきた。この方法においては、一般的に、各種微生物が生産するセルラーゼやヘミセルラーゼが使用されている。セルラーゼは、種々の作用機作を有する酵素タンパク質から構成されている。バイオマス中のセルロースに作用する酵素としては、非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖に切れ目を入れるエンドグルカナーゼ（EG）、並びに、結晶性及び非結晶性のセルロース繊維の末端から、セロビオース単位で糖を切り出すセロビオヒドロラーゼ（CBH）がある。また、これら酵素の作用により生成したセロビオースを加水分解してグルコースを生成するβ-グルコシダーゼ（BGL）がある。一方、バイオマス構成成分であるヘミセルロースに作用するヘミセルラーゼとして、キシラナーゼやβ-キシロシダーゼなどがある。セルロース系バイオマスの糖化酵素には、以上のような酵素などが含まれるが、実際には、これらの各酵素は、さらに、糖質加水分解酵素ファミリーにより分類される多数の成分から構成されており、非常に複雑である。【０００４】
セルラーゼ生産菌としては、Trichoderma属に属する菌株、例えば、Trichoderma reeseiやTrichoderma virideが有名であり、工業的に使用されてきた（非特許文献４）。しかしながら、Trichoderma属に属する菌株により生産されるセルラーゼを用いたバイオマス糖化に関する研究が進む中で、このセルラーゼの最大の欠点として、β-グルコシダーゼ活性が他の酵素活性（エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性など）に比べ相対的に低いことがクローズアップされてきた。これに伴い、β-グルコシダーゼ活性を強化した改良品として、例えば、Cellic  CTec、Cellic  CTec2（Novozymes社）やAccellerase1500(Genencor社)が開発された。【０００５】
しかしながら、バイオエタノールの実用化のためには、その製造コストをさらに低減させる必要があり、この目的を達成するために、これら改良型酵素と比較して、より少量でバイオマス糖化を完結させることが可能な、新たな高機能糖化酵素の開発が強く望まれている。【０００６】
このような状況の下、本発明者らは、Aspergillus属由来でセロビオースに高い比活性を示すβ-グルコシダーゼ(BGL)の遺伝子(bgl1)をTrichoderma属微生物の保有するキシラナーゼ3の遺伝子(xyn3)のプロモーターの制御下で発現させたTrichoderma属微生物の形質転換体を作製した（特許文献１）。従来、Trichoderma属微生物が生産するセルラーゼは、BGL活性が低いことが最大の欠点と言われてきたが、このTrichoderma属微生物の形質転換体が生産する改良型セルラーゼは、BGL活性が大幅に増強されており、各種セルロース系バイオマスの前処理物の糖化において、各種最新型市販セルラーゼに比較して極めて優れた糖化能を示した。また、この改良型セルラーゼを用いて各種セルロース系バイオマスを糖化することで糖化に必要な酵素コストを低減できることを示した。さらに、本発明者らはこの改良型セルラーゼを用いて各種セルロース系バイオマスを糖化し、得られた糖から各種微生物によりエタノールを生産することが可能であることも示した。【０００７】
しかしながら、エタノールの製造コストの低減化の追求という経済原則の上から、さらに高機能のセルラーゼの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2012-016329号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jonathan  R.  Mielenz,  (2001)  Current  Opinion  in  Microbiology,  p324-329
【非特許文献２】種田大介、OHM2006年11月号、オーム社、p42-45
【非特許文献３】種田大介、バイオリファイナリー技術の工業最前線、シーエムシー出版、第2章3、濃硫酸法バイオエタノール製造プロセス
【非特許文献４】森川  康、セルロース利用技術の最先端、2008、シーエムシー出版、p362-376
【非特許文献５】Rahman  Z,  et  al.,Appl  Microbiol  Biotechnol.  2009  Apr;82(5):899-908
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、セルロース系バイオマスに対して高い糖化能を有する酵素を生産する微生物を開発し、当該微生物の生産する酵素を用いて、効率的にセルロース系バイオマスを糖化しうる方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、こうしてセルロース系バイオマスから得られた糖を発酵することによる、エタノールの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、より高い糖化能を有するセルラーゼの開発を行うべく、Aspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子（bgl1）をTrichoderma属微生物において発現させるためのプロモーターにつき、さらなる検討を行った。一般的に、Trichoderma属微生物のセルラーゼの主要成分とされるセロビオヒドロラーゼＩ（CBH1）やエンドグルカナーゼＩ(EG1)などの酵素の遺伝子のプロモーターを用いて、Trichoderma属微生物において外来酵素遺伝子を発現させた場合、主要成分のバランスが崩れ、セルラーゼとしての性能が低下することが知られている（非特許文献５）。【００１２】
本発明者らはこの点を確認すべく、Trichoderma reesei  PC-3-7株のCBH1遺伝子のプロモーター（cbh1プロモーター）又はEG1遺伝子のプロモーター（egl1プロモーター）にAspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子（bgl1）を連結し、これを導入した形質転換体を作製し、当該形質転換体が生産する糖化酵素の特性を比較評価した。【００１３】
その結果、セロビオースを基質としたBGL活性で評価した場合、cbh1プロモーターを利用して生産したセルラーゼが、egl1プロモーターを用いて生産したセルラーゼと比較して3倍程度高かったのに対して、FPU活性、CMC分解活性など一般的なセルロース分解活性やβ-キシロシダーゼ活性についてはほとんど同程度であった（表1）。キシラナーゼ活性については逆にegl1プロモーターを用いたものが若干高かった（表1）。【００１４】
次に、各種のバイオマス前処理物に対する糖化能を各種最新型市販酵素を対照として比較評価した。その結果、BGL活性が非常に高いcbh1プロモーターを用いて生産した糖化酵素は、市販酵素よりも大きな糖化効果が認められた。驚くべきことに、egl1プロモーターを用いて生産した糖化酵素の場合、上記の従来の技術常識（非特許文献5）や種々の酵素活性を測定した結果（表1）からの予測に反して、cbh1プロモーターを用いて生産した糖化酵素よりもさらに高い糖化能を示した（表2〜5）。しかも、egl1プロモーターを用いて生産した糖化酵素は、ヘミセルロース含量の多いバイオマス前処理物だけではなく、ヘミセルロース含量の少ないバイオマス前処理物や結晶セルロースに対しても、市販酵素やcbh1プロモーターを用いて生産した糖化酵素よりも高い糖化能を示した。【００１５】
すなわち、本発明は、Trichoderma属微生物のegl1のプロモーターを用いてAspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子（bgl1）を発現させた形質転換体、該形質転換体から産生される高機能化糖化酵素を用いるセルロース系バイオマスの糖化方法、並びにそのようにして製造された糖を原料にしてエタノールを製造する方法に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  Trichoderma属に属する微生物のegl1プロモーターに連結され発現可能になっているAspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子が導入されたTrichoderma属に属する微生物。
（２）  Trichoderma属に属する微生物がTrichoderma reesei（Hypocrea  jecorina）である、（１）に記載の微生物。
（３）  Aspergillus属に属する微生物がAspergillus aculeatusである、（１）又は（２）に記載の微生物。
（４）  （１）から（３）のいずれかに記載の微生物から生産されたセルロース系バイオマスの糖化酵素。
（５）  （１）から（３）のいずれかに記載の微生物を培養する工程を含む、（４）に記載の糖化酵素の生産方法。
（６）  （４）に記載の糖化酵素で、セルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの糖の製造方法。
（７）  （６）に記載の方法を実施することにより得られた糖を発酵する工程を含む、エタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
Trichoderma属に属する微生物のegl1プロモーターの制御下でAspergillus属に属する微生物由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現するTrichoderma属に属する微生物は、極めて優れた糖化能を有する糖化酵素を産生することができる。本発明の形質転換体が産生する糖化酵素を用いれば、従来の糖化酵素と比較して、極めて少量でセルロース系バイオマスの糖化を完結させることができる。さらに、こうしてセルロース系バイオマスから得られた糖を発酵させることにより、効率的にエタノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Aspergillus aculeatusのβ-グルコシダーゼ遺伝子をegl1プロモーターを用いて発現させた場合の発現カセットの構築を示す図である。
【図２】Aspergillus aculeatusのβ-グルコシダーゼ遺伝子をegl1プロモーターを用いて導入したTrichoderma reeseiの培養上清をSDS-PAGEに供した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】Aspergillus aculeatusのβ-グルコシダーゼ遺伝子をcbh1プロモーターを用いて発現させた場合の発現カセットの構築を示す図である。
【図４】Aspergillus aculeatusのβ-グルコシダーゼ遺伝子をcbh1プロモーターを用いて導入したTrichoderma reeseiの培養上清をSDS-PAGEに供した結果を示す電気泳動写真である。
【図５】水熱処理ネピアグラス前処理物を各種酵素で処理した際の糖化率を経時的に示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、Trichoderma属に属する微生物のegl1プロモーターに連結され発現可能になっているAspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子が導入されたTrichoderma属に属する微生物を提供する。
【００１９】
本発明に用いるβ-グルコシダーゼ遺伝子の由来する「Aspergillus属に属する微生物」としては、その産生するβ-グルコシダーゼのセロビオースに対する比活性が、Trichoderma属に属する微生物が産生するβ-グルコシダーゼの場合と比較して高い微生物であれば特に制限はないが、好ましくは、Aspergillus aculeatusである。Aspergillus aculeatusのβ-グルコシダーゼ１（BGL1）は、Trichoderma reesei由来のβ-グルコシダーゼ１（BGL1）と比較して、セロビオースに対する比活性が極めて高いという特性を有する（本発明者らによる測定の結果、Trichoderma reesei由来のBGL1は、比活性が19U/mgであるのに対し、Aspergillus aculeatus由来のBGL1は、比活性が186U/mgであった）。本発明に用いるβ-グルコシダーゼ遺伝子は、目的の活性を有する限り、天然型の配列を有する遺伝子であってもよく、1若しくは複数の変異（塩基の付加、欠失、置換、挿入）が導入されていてもよい。なお、Aspergillus aculeatus由来のβ-グルコシダーゼ１（BGL1）のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該cDNAがコードするアミノ酸配列を配列番号：２に示した。
【００２０】
本発明において宿主として用いる「Trichoderma属に属する微生物」としては、Aspergillus属に属する微生物に由来するβ-グルコシダーゼ遺伝子の導入により、セルロース系バイオマスの糖化能を高めることが可能なものであれば特に制限はない。好ましくは、Trichoderma reeseiであり、より好ましくはTrichoderma reeseiに由来する変異株であるPC-3-7株及びその派生株である。
【００２１】
β-グルコシダーゼ遺伝子によるTrichoderma属に属する微生物の形質転換においては、形質転換体の産生する酵素が優れた糖化活性を示すことができるよう、Trichoderma属に属する微生物が本来有する酵素活性を減少させることなく、外因性のβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現させることが必要である。
【００２２】
この目的のため、本発明においては、Trichoderma属に属する微生物のegl1プロモーターを用いる。egl1プロモーターの制御下でβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現させたTrichoderma属に属する微生物が、xyn3プロモーターやcbh1プロモーターの制御下でβ-グルコシダーゼ遺伝子を発現させたTrichoderma属に属する微生物と比較して、より高い糖化能を有する糖化酵素を産生することは、予想外の驚くべき知見である。egl1プロモーターの由来するTrichoderma属に属する微生物は、好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００２３】
Trichoderma reeseiのegl1プロモーターの塩基配列を配列番号：7に示す。本発明に用いるegl1プロモーターは、その下流に連結する遺伝子を発現する活性を有する限り、天然型の配列を有するものであってもよく、1若しくは複数の変異（塩基の付加、欠失、置換、挿入）が導入されていてもよい。
【００２４】
β-グルコシダーゼ遺伝子をTrichoderma reeseiのゲノムDNAに導入する場合においては、egl1遺伝子領域を標的領域とすることができる。egl1遺伝子領域を標的領域とする場合には、組み換えベクターを用いることができ、この組み換えベクターは「egl1遺伝子のプロモーター領域-β-グルコシダーゼ遺伝子-egl1遺伝子のターミネーター領域」からなる構造を含むことができる。本実施例に示した通り、egl1遺伝子の上流下流3kbを含んでいるベクターである「pPegl1-gus」において、そのgus領域をβ-グルコシダーゼ遺伝子（例えば、Aspergillus aculeatus由来egl1  cDNA）と置換することにより、組み換えベクターを構築することができる。遺伝子組み換えや宿主へのベクターの導入などの一般的な遺伝子操作は、当業者に公知の手法を用いることができる。
【００２５】
こうして作製された形質転換体は、優れたセルロース系バイオマスの糖化酵素を生産する。一般的に、セルロースを分解する酵素をセルラーゼ、ヘミセルロースを分解する酵素をヘミセルラーゼと称するが、本発明における「セルロース系バイオマスの糖化酵素」は、これら酵素の双方を含む意である。本発明の形質転換体により生産される糖化酵素は、ヘミセルロース含量の多いバイオマス前処理物だけではなく、ヘミセルロース含量の少ないバイオマス前処理物や結晶セルロースに対しても、市販酵素やcbh1プロモーターを用いて生産した糖化酵素よりも高い糖化性能を示す。このため、本発明の微生物を用いることにより、最終的なエタノールの製造効率を顕著に向上させることができる。
【００２６】
糖化酵素を生産させるための形質転換体の培養は、当業者において、通常用いられる培養条件で実施することができる。培養に用いる糖源としては、各種セルロース、例えば、アビセル、濾紙粉末、セルロースを含むバイオマスや乳糖などが、窒素源としては、例えば、硫安、ポリペプトン、肉汁、CSL、大豆かすなどが用いられる。その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。さらに、各種キシラン成分を培地に添加することで、キシラナーゼを増産することも可能である。これら菌株の培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養又は撹拌培養である。培養温度は、通常、20℃〜35℃、好ましくは25℃〜31℃であり、培養時間は、通常、4〜10日、好ましくは4〜9日である。
【００２７】
このように、本発明は、上記形質転換体物から生産されたセルロース系バイオマスの糖化酵素、および上記形質転換体を培養する工程を含むセルロース系バイオマスの糖化酵素の生産方法を提供する。
【００２８】
本発明は、また、上記本発明の形質転換体が生産するセルロース系バイオマスの糖化酵素で、セルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの糖の製造方法を提供する。本発明において使用する「セルロース系バイオマス」としては、草本植物であっても、木本植物であってもよく、また、それらの加工物や廃棄物であってもよい。草本植物としては、イネ、エリアンサス、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ、ソルガム、ネピアグラス、スイッチグラス、ミスカンサスなどを挙げることができ、一方、木本植物としては、スギ類、ユーカリ、ヒノキ、マツ類、米ツガ、ポプラ、シラカバ、ヤナギ、クヌギ、ナラ類、カシ、シイ、ブナ、アカシア、タケ、ササ、アブラヤシ、サゴヤシなどを挙げることができるが、これらに制限されない。
【００２９】
一般的に、バイオマスは、そのままの形では、セルラーゼによる糖化を受け難い。このため、セルラーゼによる糖化を行う前に、セルロース系バイオマスを、酵素による糖化を受けやすい形態へと変化させるための処理を行うことが好ましい。本発明における、セルロース系バイオマスの前処理方法としては、特に制限はないが、メカノケミカル粉砕法、水熱処理、アルカリ処理（例えば、苛性ソーダ（NaOH）、KOH、Ca(OH)2、Na2SO3、NaHCO3、NaHSO3、Mg(HSO3)2、Ca(HSO3)2、アンモニア類（NH3、NH4OH）など）、希硫酸処理、水蒸気爆砕処理、ソルボリシス処理、微生物処理、又はこれらの複合処理が挙げられる。
【００３０】
このような前処理を行うことにより、原料バイオマス中に存在するセルロース及びヘミセルロースが、処理方法や処理条件に依存して、固形分残渣側に残存したり、加水分解されて可溶化画分に移行したりする。ここで、前処理方法や条件の設定により、セルロースやヘミセルロースを加水分解し、オリゴ糖あるいは単糖として可溶化画分に回収する方法も検討されているが、一般的に前処理条件が過酷になると、バイオマス中の各種成分が過分解を受け、その結果として、酢酸、蟻酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、リグニン分解物などのアルコール発酵工程における阻害物質を生成し、好ましくない。
【００３１】
このようにバイオマスの前処理方法や条件の選択においては種々のメリット、デメリットが想定されるので、使用するバイオマスや製造方法により最適なものが選ばれる。
【００３２】
原料バイオマスの粉砕物を水熱処理、苛性ソーダ処理、希硫酸処理、アンモニア処理する際は、例えば、スラリー濃度として1〜30（w/v）％、好ましくは3〜20（w/v）％で耐圧性の反応容器（オートクレーブ）に仕込み、バッチワイズに所定温度で所定時間処理する。また、流通式装置により、同等な条件の基で連続的に処理することも可能である。
【００３３】
ここで水熱処理の場合、温度は、通常、150〜250℃、より好ましくは200〜230℃である。処理時間は、通常、3〜60分、より好ましくは5〜30分である。
【００３４】
苛性ソーダ処理の場合、苛性ソーダ濃度は、通常、0.1〜3(w/v)%、より好ましくは0.3〜1(w/v)%である。処理温度は、通常、50〜230℃、より好ましくは80〜210℃である。処理時間は、通常、3分〜1時間、より好ましくは5〜30分である。希硫酸処理の場合、硫酸濃度は、通常、0.3〜3(w/v)％、より好ましくは0.5〜1(w/v)％である。処理温度は、通常、100〜200℃、より好ましくは150〜180℃である。処理時間は、通常、3〜30分、より好ましくは3〜15分である。
【００３５】
アンモニア処理の場合、アンモニア濃度は、通常、1〜10(w/v)％、より好ましくは3〜5(w/v)％である。処理温度は、通常、室温から170℃、より好ましくは50〜170℃である。処理時間は、通常、5分〜14日、より好ましくは3〜14日である。
【００３６】
水蒸気爆砕の条件は、1.25MPaの場合、通常、3〜30分、好ましくは5〜15分である。2.33MPaの場合、通常、3〜20分、より好ましくは5〜10分である。2.8MPaの場合、通常、1〜15分、より好ましくは3〜10分である。3.35MPaの場合、通常、1〜10分、より好ましくは3〜10分である。
【００３７】
このようにして原料バイオマスを前処理した後、ろ過、遠心分離などにより固液分離し、前処理固形物とろ液を得る。ここで、原料バイオマス及び前処理固形物中のセルロース及びヘミセルロースを定量分析する方法としては種々の方法を採用できるが、世界的に標準処方として使用される米国NREL（National  Renewable  Energy  Laboratory）のLaboratory  Analytical  Procedure(LAP)  Determination  of  Structural  Carbohydrates  and  Lignin  in  Biomassに準拠した方法が好適である。この方法は、原料バイオマス、及び前処理固形物を硫酸で加水分解した後に、これらサンプルに含まれるグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースなどの構成糖の含量をHPLC法で分析定量し含有率を求める方法である。この方法において、求められたグルコースは、セルロースに由来するもの、それ以外のキシロース、マンノース、ガラクトースなどの成分はヘミセルロースに由来のものとみなしてそれぞれの含有率を求める。
【００３８】
こうして前処理したセルロース系バイオマスを、本発明の形質転換体から産生された糖化酵素により糖化する場合の条件は、次の通りである。前処理物の残渣固形分を糖化処理する場合の固形分濃度は、通常、1〜20（w/v）％、好ましくは、5〜10（w/v）％程度である。pHは、通常、3〜9、好ましくは、4〜6の範囲である。温度は、10〜80℃、好ましくは、40〜60℃である。酵素濃度は、バイオマス前処理物の乾物重量当りのタンパク質量基準で、1〜20mg/g-バイオマス重量、好ましくは1〜10mg/g-バイオマス重量である。これら条件下、例えば、振とう、又は静置で、糖化反応を進行させることができる。また、この糖化反応において、雑菌汚染を防止する目的でアジ化ナトリウムなどの殺菌剤を添加することもできる。この際は、後の糖化液の発酵工程に悪影響を及ぼさない化合物と濃度を選択することが好ましい。糖化率は、糖化液中の生成物を各種還元糖定量法やHPLC法で分析することにより求めることができる。
【００３９】
前処理方法、条件によってはバイオマス成分中のヘミセルロースの構成糖であるキシロースなどは可溶画分に単糖あるいはオリゴ糖として得られる場合もある。この場合は、可溶画分中の糖類を単糖であればそのまま、オリゴ糖であれば更に各種ヘミセルラーゼ等を作用させ、単糖に加水分解した後に、エタノール原料用の糖として利用することができる。
【００４０】
また、本発明は、上記のセルロース系バイオマスからの糖の製造方法を実施することにより得られた糖を発酵する工程を含む、エタノールの製造方法を提供する。
【００４１】
糖化液からのエタノールの製造は、一般的な方法を適用することができる。エタノールの製造に用いる微生物としては、例えば、Saccharomyces属、Zymomonas属、Pichia属、Zymobacter属、Corynebacterium属、Kluyveromyces属、及びEscherichia属に属する微生物が挙げられるが、これらに制限されない。糖をエタノールに変換するための代謝系に関連する遺伝子を組み込んだ微生物あるいはこれらの変異株を利用することも可能である。糖化液に、これら微生物を植菌して培養することにより、エタノールを製造することが可能である。用いる糖化液は、糖濃度が3〜15％で、pHは3〜7が好ましい。培養温度は、20〜40℃が好ましい。エタノール発酵は、回分法でも連続法でも行うことが可能である。エタノール発酵は、上記のセルロース系バイオマスの糖化反応と同時に行うことができる（並行複発酵）。この場合は、糖化反応の条件とエタノール発酵の条件を組みあわせ、全体として生産性が最も高くなる糖濃度、温度、pHなどの条件が適宜選択すればよい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４３】
［実施例１］
下記に記載するオリゴヌクレオチドプライマー「e1Saabgl1+9:5’-cttagtccttcttgttgtcccaaaATGAAGCTCAGTTGGCTTGAG-3’（配列番号：3）」及び「e1aaabgl1+9:5’-acagaccagaggcaagtcaacgctTCATTGCACCTTCGGGAGCG-3’（配列番号：4）」を用いて、Aspergillus aculeatusのBGL1のcDNAの挿入されたプラスミドベクター「pBxyn3Aabgl1」を鋳型に、PCRを行った。【００４４】
In-fusion  PCR反応を使用してpPegl1-gusのgus遺伝子部分とPCR産物であるAspergillus aculeatus由来のbgl1遺伝子とを置換えるために、プライマーにおいては、PCR産物の両末端に、pPegl1-gusと24bpの相同領域が付加するように設計した（図1）。【００４５】
PCRの反応条件は、98℃10秒、55℃5秒、72℃3分の3段階の反応を1サイクルとし、これを30サイクル繰返した。また、PCR反応には、PrimeSTAR  HS  DNA  polymerase（タカラバイオ社）を使用した。【００４６】
[実施例２]
得られたPCR増幅断片(bgl1cDNA,  2583bp)を、Inverse  PCRによって、オリゴヌクレオチドプライマー「E1AB1inverts:5’-AGCGTTGACTTGCCTCTGGTCTGTC-3’（配列番号：5）」及び「E1AB1inverta:5’-TTTGGGACAACAAGAAGGACTAAGATAGGGG-3’（配列番号：6）」とpegl1-gusを鋳型として増幅したべクターに連結した。【００４７】
Inverse  PCRの条件は、98℃で1分の後、「98℃で10秒、68℃で10分」の2段階の反応を1サイクルとし、これを40サイクル繰返した。PCR反応には、PrimeSTAR  GXL  DNA  polymerase（タカラバイオ社）を使用した。【００４８】
PCR増幅断片のべクターへの連結には、In-fusion  kit(TaKaRa社)を使用した。In-fusion反応は、200ngのPCR産物、400ngの増幅ベクター、5×In-fusion  buffer  2μL、水1μL、In-fusion  enzyme  2μLを混和し、37℃で30分保温した後、50℃で15分保温することにより行った。得られたT.reesei発現カセットのegl1上流配列（配列番号：7）、bgl1cDNA配列、マーカー配列（amdS:3089bp／配列番号：8）の塩基配列決定を行い、PCRエラーがないことを確認した。塩基配列の決定には、CEQTM2000XL  DNA  Analysis  System（BECKMAN  COULTER社）を使用し、操作の詳細は、付属の取扱説明書に従った。【００４９】
[実施例３]
実施例2で構築したベクターを、それぞれTrichoderma reesei  PC-3-7株（WT）に導入した。導入は、プロトプラストPEG法で行った。形質転換体をアセトアミド資化能用選択培地で選抜した。培地の組成は次の通りである。【００５０】
2％  グルコース、1.1M  ソルビトール、2％  agar、0.2％  KH2PO4(pH5.5)、0.06％  CaCl2・2H2O、0.06％  CsCl2、0.06％  MgSO4・7H2O、0.06％  Acetamide  solution、0.1％  Trace  element  得られた3株の形質転換体のBGL1の発現を確認するために、胞子106個を、Trichoderma reesei用液体培地5mLを含むφ20試験管に植菌した。培地の組成は次の通りである。【００５１】
1％  Avicel、0.14％  (NH4)2SO4、0.2％  KH2PO4、0.03％  CaCl2・2H2O、0.03％  MgSO4・7H2O、0.1％  Bacto  Polypepton、0.05％  Bacto  Yeast  extract、0.1％  Tween  80、0.1％  Trace  element、pH4.0  終濃度で50mM  Tartrate  buffer
なお、Trace  elementの組成は次の通りである。【００５２】
6mg  H3BO3、26mg  (NH4)6MO7O24・4H2O、100mg  FeCl3・6H2O、40mg、CuSO4・5H2O、8mg  MnCl2・4H2O、200mg  ZnCl2を蒸留水で100ml
120spm、28℃で3日間培養した培養液を、10000rpm、5分、4℃で遠心分離し、培養上清10μLを採取し、SDS-PAGEに供した。その結果を図2に示す。形質転換体No.1とNo.3について野生株と顕著な違いは観察されなかったが、形質転換体No.2では、PC-3-7株に見られない130kDa程度の分子量のややスメアなタンパク質バンドが認められたことから、A.aculeatus由来BGL1が発現していることが判明した。【００５３】
[実施例４]
Trichoderma reesei  PC-3-7株（WT）と実施例3で作製された形質転換体No.2の胞子107個をTrichoderma reesei用液体培地（実施例3と同様）50mLを含む300mL三角フラスコに植菌した。220rpm、28℃で7日間培養後、培養液を3000rpm、15分遠心し、分離した培養上清をさらにSartolab  RF1000  filtersystem(Sarutorius社)にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。【００５４】
［実施例５］
実施例3で作製した形質転換体No.2の胞子107個を、Trichoderma reesei用液体培地（実施例3と同様）に0.5％バーチウッドキシランを添加した培地を50mL含む300mL三角フラスコに植菌した。220rpm、28℃で7日間培養後、培養液を3000rpm、15分遠心し、分離した培養上清をさらに、Miracloth(コスモバイオ社)にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。【００５５】
［比較例１］
下記に記載するオリゴヌクレオチドプライマー「Saabgl1-cbh+9:5’-atagtcaaccgcggactgcgcatcATGAAGCTCAGTTGGCTTGAG-3’（配列番号：9）」及び「Aaabgl1-cbh+9:5’-aggctttcgccacggagcactagtTCATTGCACCTTCGGGAGCG-3’（配列番号：10）」を用いて、Aspergillus aculeatusのBGLIcDNAが挿入されたプラスミドベクター「pABG7」を鋳型に、PCRを行った。【００５６】
In-fusion  PCR反応を使用してpcbh1-svのcbh1遺伝子部分とPCR産物であるAspergillus aculeatus由来のbgl1遺伝子とを置換えるために、プライマーにおいては、PCR産物の両末端に、pcbh1-svと24bpの相同領域が付加するように設計した（図3）。【００５７】
PCRの反応条件は、98℃10秒、55℃5秒、72℃3分の3段階の反応を1サイクルとし、これを30サイクル繰返した。また、PCR反応には、PrimeSTAR  HS  DNA  polymerase（タカラバイオ社）を使用した。【００５８】
[比較例２]
得られたPCR増幅断片(bgl1cDNA,  2583bp)を、オリゴヌクレオチドプライマーとしての「cbh1vector  prom:5’-GATGCGCAGTCCGCGGTTGACTATTG-3’（配列番号：11）」及び「cbh1vector  term:5’-ACTAGTGCTCCGTGGCGAAAGCCT-3’（配列番号：12）」と鋳型としてのpcbh1-svとを用いたInverse  PCRによって増幅したべクターに連結した。【００５９】
Inverse  PCRの条件は、98℃で1分の後、「98℃で10秒、68℃で10分」の2段階の反応を1サイクルとし、これを40サイクル繰返した。PCR反応には、PrimeSTAR  GXL  DNA  polymerase（タカラバイオ社）を使用した。【００６０】
PCR増幅断片のべクターへの連結には、In-fusion  kit(TaKaRa社)を使用した。In-fusion反応は、200ngのPCR産物、400ngの増幅ベクター、5×In-fusion  buffer  2μL、水1μL、In-fusion  enzyme  2μLを混和し、37℃で30分保温した後、50℃で15分保温することにより行った。得られたT.reesei発現カセットのcbh1上流配列、bgl1cDNA配列、マーカー配列（amdS:3089bp）の塩基配列決定を行い、PCRエラーがないことを確認した。塩基配列の決定には、CEQTM2000XL  DNA  Analysis  System（BECKMAN  COULTER社）を使用し、操作の詳細は、付属の取扱説明書に従った。【００６１】
[比較例３]
比較例2で構築したベクターを、それぞれTrichoderma reesei  PC-3-7株（WT）に導入した。導入は、プロトプラストPEG法で行った。形質転換体をアセトアミド資化能用選択培地で選抜した。培地の組成は次の通りである。【００６２】
2％  グルコース、1.1M  ソルビトール、2％  agar、0.2％  KH2PO4(pH5.5)、0.06％  CaCl2・2H2O、0.06％  CsCl2、0.06％  MgSO4・7H2O、0.06％  Acetamide  solution、0.1％  Trace  element
得られた5株の形質転換体のBGL1の発現を確認するために、胞子106個を、Trichoderma reesei用液体培地5mLを含むφ20試験管に植菌した。培地の組成は次の通りである。【００６３】
1％  Avicel、0.14％  (NH4)2SO4、0.2％  KH2PO4、0.03％  CaCl2・2H2O、0.03％  MgSO4・7H2O、0.1％  Bacto  Polypepton、0.05％  Bacto  Yeast  extract、0.1％  Tween  80、0.1％  Trace  element、pH4.0  終濃度で50mM  Tartrate  buffer
なお、Trace  elementの組成は次の通りである。【００６４】
6mg  H3BO3、26mg  (NH4)6MO7O24・4H2O、100mg  FeCl3・6H2O、40mg、CuSO4・5H2O、8mg  MnCl2・4H2O、200mg  ZnCl2を蒸留水で100ml
120spm、28℃で3日間培養した培養液を、10000rpm、5分、4℃で遠心分離し、培養上清10μLを採取し、SDS-PAGEに供した。その結果を図4に示す。形質転換体には、PC-3-7株に見られない130kDa程度の分子量のややスメアなタンパク質バンドが認められたことから、A.aculeatus由来BGL1が発現していることが判明した。【００６５】
[比較例４]
比較例3で作製された形質転換体No.3の胞子107個をTrichoderma reesei用液体培地（実施例3と同様）50mLを含む300mL三角フラスコに植菌した。220rpm、28℃で7日間培養後、培養液を3000rpm、15分遠心し、分離した培養上清をさらに、Sartolab  RF1000  filtersystem(Sarutorius社)にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。【００６６】
［比較例５］
比較例3で作製された形質転換体No.3の胞子107個を、Trichoderma reesei用液体培地（実施例3と同様）に0.5％バーチウッドキシランを添加した培地を50mL含む300mL三角フラスコに植菌した。220rpm、28℃で7日間培養後、培養液を3000rpm、15分遠心し、分離した培養上清をさらに、Miracloth(コスモバイオ社)にて濾過し、得られた濾液を酵素液として使用した。【００６７】
［実施例６］
実施例4,5及び比較例4、5で得られたそれぞれの酵素液について、FPU活性、CMC分解活性、セロビオースを基質としたBGL活性、キシラナーゼ活性、及びβ-キシロシダーゼ活性を測定した。比較例として、Accellerase1500（Genencor社）とCellic  CTec2（Novozymes社）について同様に活性測定した。ここで、FPU活性は、NREL(National  Renewable  Energy  Laboratory:USA)のMeasurment  of  Cellulase  Activities  Laboratory  Analytical  Procedure(LAP)に準拠して測定した。CMC分解活性は、Sigma社のカルボキシメチルセルロース（Low  viscosity）を用い、基質濃度1(w/v)％、pH5.0、50℃、15分間の反応により生成した還元糖を3,5-ジニトロサリチル酸を用いる定量法(DNS法)でグルコースを標準にして定量し測定した。BGL活性は、基質セロビオース濃度20mM、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成したグルコースを酵素法（和光純薬：グルコースCIIテストワコー）で定量し測定した。キシラナーゼ活性は、Sigma社のBirchwood  xylanを用い、基質濃度1(w/v)％、pH5.0、37℃、10分間の反応により生成したキシロースをDNS法によりキシロースを標準にして定量し測定した。β-キシロシダーゼ活性は、Sigma社の4-Nitrophenyl  β-D-xylopyranosaideを用い、基質濃度1mM、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成した4-Nitrophenylを定量し測定した。また、タンパク質量は、Bio-rad  Laboratories,  Inc.のQuick  Start  Bradford  Protein  Assay  キットによりBovine  Gamma  Globulinを標準として定量した。これらの酵素活性の値とタンパク質量から比活性（U/mg）を求めた。得られた結果を表１に示した。【００６８】
【表１】
2013115305.tif 000002
【００６９】
［実施例７］
稲わら（多収穫米K226）粉砕物（100〜200μm）21gを0.5(w/v)％苛性ソーダ溶液700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で100℃で5分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた処理物（サンプルNo.K209）の組成は、セルロース50.1（w/w）％、ヘミセルロース24.9(w/w)％、リグニン7.1(w/w)％、灰分5.4(w/w)％であった。【００７０】
この稲わらの前処理物K209を基質として用い、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例4、5及び比較例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500（DANISCO社）、Cellic  CTec、Cellic  CTec2（Novozymes社）の酵素を種々の濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。その後、HPLC法によって、生成したグルコース及びキシロースを定量し、糖化率を求めた。基質としたバイオマス前処理物に含まれるセルロース及びヘミセルロースを単糖に換算し、それらに対する遊離生成糖の割合として糖化率を算出した。次に、このようにして求めた糖化率を、反応に用いた前処理バイオマスg重量あたりの酵素タンパク質量に対してプロットし、80％糖化率を示す酵素タンパク質量を算出した。その結果を表２に示した。【００７１】
【表２】
2013115305.tif 000003
【００７２】
ヘミセルラーゼが大部分残存しているアルカリ処理稲わらでは本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は、最新型市販酵素（Cellic  CTec2）と比較して2.4〜2.9倍、Cbh1プロモーター利用糖化酵素と比較して1.3〜1.6倍、高機能であることが判明した。【００７３】
なお、ここで得られた前処理物の分析は、NRELのLAP法に準拠して以下の方法で行った。前処理物を恒温乾燥機にて水分含量がおよそ10％以下になるように乾燥し、100μmのメッシュを通る程度にミルミキサーなどで粉砕した。この粉砕物を水分含量計にかけて水分を測定した。この粉砕物約100mgを耐圧ガラス管に秤り取り、72％硫酸を1mL加え、ガラス棒で1分間よく混合し、恒温水槽で30℃にて60分間インキュベートした。インキュベート中に、時々、ガラス棒で混合した。60分後、28mLの純水を加えてよく混合し、オートクレーブで121℃にて1時間処理した。よく冷めた後、絶乾したガラスフィルター（Whatman、ポアサイズ1.0mm）でろ過し、残渣をガラスフィルターごと絶乾した秤量ビンに移した。残渣は、一旦、70〜80℃で乾燥させて水分を蒸発させた後、105℃にて3時間以上乾燥し、乾燥重量を測定した。ろ液に、炭酸カルシウムを少しずつ加え、pH試験紙で確認しながら、pHを5-6に調整した。これを遠心分離（2000rpm、5分間）し、その上清を0.2μmのシリンジフィルターに通し、ポストカラム法による蛍光検出器を用い、HPLC法（カラム：Asahipak  NH2P-50  4E、4mmx250mm、Lot:080806、Shodex)にて、サンプル中の糖類を定量分析した。得られた定量値から、グルコースについてはセルロース由来と、キシロース、マンノース、及びガラクトースなどはヘミセルラーゼ由来とみなし、含有率(w/w)を求めた。以下の実施例におけるセルロース及びヘミセルロースの定量もこの方法で行った。【００７４】
［実施例８］
ユーカリ粉砕物21gを水700mlにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で210℃、15分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.Y134）の組成は、セルロース60.9(w/w)％、ヘミセルロース0.8(w/w)％、リグニン33.6(w/w)％、灰分0.4(w/w)％であった。【００７５】
このようにして調製したユーカリ前処理物Y134を用いて、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例4、5及び比較例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500（DANISCO社）、Cellic  CTec、Cellic  CTec2（Novozymes社）の酵素を種々の濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。実施例7と同様に糖化率を算出し80％糖化率を示す酵素タンパク質量を算出した。その結果を表3に示した。【００７６】
【表３】
2013115305.tif 000004
【００７７】
水熱処理ユーカリでは本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は、最新型市販酵素（Cellic  CTec2）と比較して1.2〜1.3倍、Cbh1プロモーター利用糖化酵素と比較して1.1〜1.6倍、高機能であることが判明した。【００７８】
[実施例９]
エリアンサス粉砕物（100-200μm）150gを0.5％(w/v)苛性ソーダ溶液5Lにスラリー濃度3％(w/v)になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で120℃で5分間加熱処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.E71）の組成は、セルロース56.0(w/w)％、ヘミセルロース22.2(w/w)％、リグニン6.2(w/w)％、灰分1.6(w/w)％であった。【００７９】
このようにして調製したエリアンサス前処理物E71を用いて、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例4、5及び比較例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500（DANISCO社）、Cellic  CTec、Cellic  CTec2（Novozymes社）の酵素を種々の濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。実施例７と同様に糖化率を算出し80％糖化率を示す酵素タンパク質量を算出した。その結果を表4に示した。【００８０】
【表４】
2013115305.tif 000005
【００８１】
苛性ソーダ処理エリアンサスでは本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は、最新型市販酵素（Cellic  CTec2）と比較して1.3〜1.4倍、Cbh1プロモーター利用糖化酵素と比較して1.2〜1.3倍、高機能であることが判明した。【００８２】
[実施例１０]
スギチップを2L容の水蒸気爆砕装置（月島機械製）に200ｇ充填し、240℃(3.35MPa)にて10分間水蒸気にて過熱処理した。その後、爆砕処理して前処理物を調製した。この前処理物（サンプルNo.EC11）の組成は、セルロース40.1(w/w)％、ヘミセルロース0.4(w/w)％、リグニン53.4(w/w)％、灰分0.1(w/w)％であった。【００８３】
このようにして調製したスギ前処理物EC11を用いて、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例4、5及び比較例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500（DANISCO社）、Cellic  CTec2（Novozymes社）の酵素を種々の濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。実施例7と同様に糖化率を算出し80％糖化率を示す酵素タンパク質量を算出した。その結果を表5に示した。【００８４】
【表５】
2013115305.tif 000006
【００８５】
爆砕処理スギ前処理物では、本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は、最新型市販酵素(Cellic  CTec2)と比較して1.9〜2.1倍、Cbh1プロモーター利用糖化酵素と比較して1.1〜1.3倍、高機能であることが判明した。【００８６】
[実施例１１]
基質として微結晶性セルロース（セオラスPH-101（旭化成））を用い、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02（ｗ/v）%、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5)の反応系を構築した。この反応系に、実施例4、5及び比較例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500（DANISCO社）、Cellic  CTec2（Novozymes社）の酵素を種々の濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。実施例7と同様に糖化率を算出し80％糖化率を示す酵素タンパク質量を算出した。その結果を表6に示した。【００８７】
【表６】
2013115305.tif 000007
【００８８】
微結晶セルロースでは、本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は、最新型市販酵素(Cellic  CTec2)と比較して2.3〜2.8倍、Cbh1プロモーター利用糖化酵素と比較して1.4〜1.6倍、高機能であることが判明した。【００８９】
[実施例１２]
実施例7記載の稲わらの苛性ソーダ前処理物K209の10g（乾燥重量基準）を、500ml容ポリ瓶に秤採った。ポリ瓶に、50mM酢酸緩衝液（ｐH5.0）を160ml、2(w/v)％アジ化ナトリウム溶液を2ml、実施例4で調製したT.reeseiのBGL組換え株の酵素をタンパク質量80mg相当分、を加え、さらに水分が合計で200mlになるように水を添加した。この反応液を50℃、100ストローク往復振とうで72時間反応させた。この反応液を沸騰水中で5分加熱処理した後、遠心分離（13000rpm、5分）し、上清液180mlを得た。このサンプルについて、HPLC法で生成物を定量したところ、グルコースが26.8mg/ml、キシロースが12.2mg/mlであった。この結果から稲わら前処理物K209、10g(乾燥重量基準)からグルコースが4.82ｇ、キシロースが2.20g調製できた。【００９０】
[実施例１３]
実施例8記載のユーカリの水熱前処理物Y134、7g（乾燥重量基準）を200ml容ポリ瓶に秤り採った。ポリ瓶に、50mM酢酸緩衝液（pH5.0）を80ml、2(w/v)％アジ化ナトリウム溶液を1ml、実施例4で調製したT.reeseiのBGL組換え株の酵素をタンパク質量50mg相当分、を加え、さらに水分が合計で100mlになるように水を添加した。この反応液を50℃、100ストローク往復振とうで72時間反応させた。この反応液を沸騰水中で5分加熱処理した後、遠心分離（13000rpm、5分）し、上清液90mlを得た。このサンプルについて、HPLC法で生成物を定量したところ、グルコースが40.1mg/mlとなった。この結果から、ユーカリ前処理物7gからグルコースが3.61g調製できた。【００９１】
[実施例１４]
実施例9記載のエリアンサス苛性ソーダ前処理物E71  10g（乾燥重量基準）を500ml容ポリ瓶に秤り採った。ポリ瓶に、50mM酢酸緩衝液（pH5.0）を160ml、2(w/v)％アジ化ナトリウム溶液を2ml、実施例5で調製したT.reeseiのBGL組換え株の酵素をタンパク質量80mg相当分、を加え、さらに水分が合計で200mlになるように水を添加した。この反応液を50℃、100ストローク往復振とうで72時間反応させた。この反応液を沸騰水中で5分加熱処理した後、遠心分離（13000rpm、5分）し、上清液185mlを得た。このサンプルについて、HPLC法で生成物を定量したところ、グルコースが27.5mg/ml,キシロースが10.5mg/mlとなった。この結果から、エリアンサス前処理物10gからグルコースが5.09g、キシロースが1.94ｇ調製できた。【００９２】
[実施例１５]
実施例11で調製した苛性ソーダ処理稲わら（K209）の酵素糖化液180mlをロータリーエバポレーターにて濃縮し、得られた濃縮液35mlを滅菌吸引濾過装置により無菌濾過し32mlの無菌濾液を得た。この濾液の糖組成はHPLC法による分析からグルコース136mg/ml、キシロース62mg/mlであった。【００９３】
300mlの三角フラスコに25mlの培地溶液を入れ滅菌し、ここに30mlの無菌濾液を無菌的に添加した。糖以外の培地成分（終濃度）は、酵母エキス（0.45％）とペプトン（0.75％）であり、培地溶液のpHは5.0に調整した。ここに、5mlの別途種培養（2％グルコース、0.45％酵母エキス及び0.75％ペプトン、pH5.0、48時間）した酵母Kluyveromyces cellobiovorus（ATCC60381）の培養液を5ml添加し、アルコール発酵（フラスコを100rpmで振とうさせ、28℃で72時間）を行わせた。培養後、上清液を分析したところ、グルコースとキシロースはすべて消失しており、エタノール濃度は4.2％（w/v）であった。このアルコール収率は理論量の84％であった。【００９４】
[実施例１６]
エリアンサス粉砕物（100-200μm)21gを1(w/v)％希硫酸溶液700mlにスラリー濃度3(w/v)%になるように懸濁し、バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で180℃、7分間処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.E-117）の組成は、セルロース51.6(w/w)％、ヘミセルロース1.2(w/w)％、リグニン35.4(w/w)％、灰分5.7(w/w)％であった。【００９５】
このようにして調製したエリアンサス前処理物E-117を用いて、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02(w/v)％、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5.0)の反応系を構築した。この反応系に実施例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500(DANISCO社)、Cellic CTec2（Novozymes社）の酵素を種々の濃度で添加し、振とうしながら、50℃で72時間、糖化反応を行った。実施例７と同様に糖化率を算出し、80%糖化率を示す酵素タンパク質量を算出した。その結果を表７に示した。【００９６】
【表７】
2013115305.tif 000008
【００９７】
希硫酸処理エリアンサス前処理物では本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は、最新型市販酵素Cellic  CTec2と比較して1.7倍高機能であることが判明した。【００９８】
[実施例１７]
ネピアグラス粉砕物（100-200μm）400gを水４Lに懸濁し、5L容バッチ式前処理装置（東洋高圧社製）で220℃、15分間処理した。その後、この処理物を濾過し、水で洗浄した。こうして得られた前処理物（サンプルNo.N-9）の組成は、セルロース48.2(w/w)％、ヘミセルロース1.6(w/w)％、リグニン35.3(w/w)％、灰分6.2(w/w)％であった。【００９９】
このようにして調製したネピアグラス前処理物N-9を用いて、基質濃度5(w/v)％、最終アジ化ナトリウム濃度0.02(w/v)％、最終酢酸緩衝液濃度100mM(pH5.0)の反応系を構築した。この反応系に実施例4、5で調製したそれぞれの酵素液、並びにAccellerase1500(DANISCO社)、Cellic  CTec2（Novozymes社）を3mgタンパク質/g-バイオマス基質になるように添加し、振とうしながら、50℃で糖化反応を行った。24、48、72時間目に100μlづづサンプリングし、沸騰水中で5分加熱処理後、遠心分離により上清を得た。この上清中の生成還元糖を3,5−ジニトロサリチル酸法(DNS法)でグルコースを標準として定量した。基質として用いた前処理物に含まれるセルロース及びヘミセルロースを単糖に換算し、それらに対する遊離生成糖の割合から糖化率を算出した。得られた結果を図5に示した。【０１００】
水熱処理ネピアグラス前処理物では、本発明の形質転換体から生産される糖化酵素は最新型市販酵素（Cellic  CTec2）と比較して高機能であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の形質転換体が産生する糖化酵素は、ヘミセルロース含量の多いバイオマス前処理物だけではなく、ヘミセルロース含量の少ないバイオマス前処理物や結晶セルロースに対しても、市販酵素やcbh1プロモーターを用いて生産した糖化酵素よりも高い糖化性能を示すため、これを用いることにより、少量でセルロース系バイオマスの糖化を完結させることができる。さらに、こうして糖化したセルロース系バイオマスを発酵させることにより、エタノールを製造することができる。本発明によれば、低価格でバイオエタノールを製造することが可能となるため、バイオエタノールの産業化に大きく貢献しうるものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号３〜６、９〜１２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
2013115305.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2013115305000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月12日(2013.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）のｅｇｌ１プロモーターに連結され発現可能になっているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓに由来するβ−グルコシダーゼ遺伝子が導入されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１に記載の微生物から生産されたセルロース系バイオマスの糖化酵素。
【請求項５】
請求項１に記載の微生物を培養する工程を含む、請求項２に記載の糖化酵素の生産方法。
【請求項６】
請求項４に記載の糖化酵素で、セルロース系バイオマスを糖化する工程を含む、セルロース系バイオマスからの糖の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法を実施することにより得られた糖を発酵する工程を含む、エタノールの製造方法。
【国際調査報告】
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