(57)【要約】  未分化状態の幹細胞のみを選択的に染色することにより、幹細胞の分化状態を正確に評価する方法及び未分化状態の幹細胞のみを確実に単離する方法を提供する。被検細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、前記標識に基づいて前記被検細胞への前記プローブの結合の有無を検出する工程と、を含む細胞分化判定方法を提供する。  この細胞分化判定方法では、未分化幹細胞に特異的に反応するプローブを用い、被検細胞への結合の有無を検出することで、被検細胞中の未分化幹細胞の存在又は不存在を検出することができる。（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、
前記被検細胞への前記プローブの結合の有無を検出する工程と、
を含む細胞分化判定方法。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
【請求項２】
前記被検細胞として、未分化幹細胞又は分化誘導処理された幹細胞を用いる請求項１記載の細胞分化判定方法。
【請求項３】
前記未分化幹細胞として、未分化状態を維持するための処理がされた幹細胞又は多能性誘導処理された体細胞を用いる請求項２記載の細胞分化判定方法。
【請求項４】
前記プローブが、検出可能な標識物質を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞分化判定方法。
【請求項５】
被検細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、
前記プローブが結合する細胞と結合しない細胞とを分離する工程と、を含む細胞分離方法。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
【請求項６】
前記プローブが光学的に検出可能な標識を含み、
該プローブが結合する細胞と結合しない細胞との分離を、セルソーターを備えたフローサイトメーターにより行う請求項５記載の細胞分離方法。
【請求項７】
前記プローブが磁気的に検出可能な標識を含み、
前記プローブが結合する細胞と結合しない細胞との分離を磁気細胞分離装置により行う請求項５記載の細胞分離方法。
【請求項８】
体細胞を多能性誘導処理する工程と、
多能性を誘導後の細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、
前記プローブが結合する細胞を単離する工程と、
を含む誘導性多能性幹細胞の製造方法。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
【請求項９】
幹細胞を分化誘導処理する工程と、
分化を誘導後の細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、
前記プローブが結合しない細胞を単離する工程と、
を含む分化細胞の製造方法。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分化判定、細胞の分離、並びに誘導性多能性幹細胞及び分化細胞の製造のための方法に関する。より具体的には、未分化細胞に特異的な糖鎖構造を認識するタンパク質を用いて、被検細胞の分化状態を判定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は体を構成するあらゆる細胞に分化できる性質やその未分化性を維持できる性質により注目を集め、創薬スクリーニングや疾患メカニズム解明への応用のみならず、再生医療の材料として世界中で研究が進められている。【０００３】
2010年に世界で初めてのヒトES細胞を用いた第1相臨床試験が米国で急性脊髄損傷に対して始まり、さらに網膜変性疾患に対するヒトES細胞を用いた第1/2相臨床試験の治験許可申請(IND)がFDAにより承認され、ヒト多能性幹細胞を用いた再生医療研究は飛躍的な発展を続けている。【０００４】
とりわけ、日本発の新たなヒト多能性幹細胞であるiPS細胞は、受精胚を使用しないなどの理由から倫理的な障壁が低く、かつ自家組織からも樹立できるという極めて大きなメリットがあり、再生医療現場からも大きな期待を集めている。我が国では、理化学研究所発生・再生科学総合研究センターや先端医療センターなどが、加齢黄斑変性症の患者を対象に、iPS細胞を使った臨床研究を2013年度から開始する計画であり、慶応大学も2015年に脊髄損傷患者に対しての臨床研究を始める方針である。【０００５】
このように、ES細胞やiPS細胞といったヒト多能性幹細胞の臨床応用が開始されるなか、品質と安全性を確保して細胞を供給する体制に関しては十分に整備がなされていない。多能性幹細胞は、作製の方法、培養条件、保存条件などが、未分化性、分化能、増殖能などの品質に影響を与える。このため適切な方法に基づかずに管理されると、生産者や使用者ごとに違った結果を生じる可能性がある。このことは、幹細胞治療の信頼性の低下、治療による健康被害の発生などの弊害を及ぼす原因となる。そのため、信頼性や再現性の高い維持培養法や計測・評価システムが必要である。【０００６】
例えば、細胞治療には多能性幹細胞をそのまま用いるのではなく、目的の細胞に分化させてから移植に用いるが、目的の細胞に分化させた細胞源に未分化な幹細胞が混入している場合、その未分化幹細胞が腫瘍形成の原因になることが指摘されている。そこで細胞治療に用いる細胞に未分化幹細胞、すなわち腫瘍形成細胞が混入しているかどうかを評価する技術の開発が求められている。【０００７】
一方、体性幹細胞の種類や特性は、ES細胞やiPS細胞といったヒト多能性幹細胞と比べて多種多様ではあるが、臨床への適用が既存技術として存在する。しかしながら、移植に適した品質の細胞を安定的に得ることが容易ではないため、体性幹細胞の品質検証方法の確立と、それに基づいた安定的な培養方法の確立はきわめて重要な課題となっている。また、体性幹細胞を用いた細胞移植の有効性の評価、その機序の理解及びリスク評価を行う上でも、移植前の細胞の品質検証方法の開発が求められている。【０００８】
本発明者らは以前、レクチンマイクロアレイを用いて、５種類の異なる体細胞（皮膚、胎児肺、子宮内膜、胎盤動脈、羊膜）から作製したヒトｉＰＳ細胞（１１４検体）と、ヒトＥＳ細胞（９検体）の糖鎖プロファイルを網羅的に解析した。【０００９】
その結果、元の体細胞が組織毎に異なる糖鎖プロファイルを持っていたにもかかわらず、作製されたｉＰＳ細胞は、いずれもほぼ同じ糖鎖プロファイルを示し、初期化遺伝子の導入により一様にＥＳ細胞と類似の糖鎖構造に収束化することを見出した。ヒトES・iPS細胞とヒト体細胞とのレクチンアレイデータを詳細に解析した結果によると、未分化のヒトES・iPS細胞では、体細胞と比較してα2-6Sia、α1-2Fuc、タイプ1 LacNAcの発現量が顕著に増加していることが推定された。さらに、DNAアレイを用いた糖転移酵素遺伝子の発現解析を用いた方法によって当該推定を裏付けた（非特許文献１）。【００１０】
BC2LCNレクチンは、グラム陰性細菌（Burkholderia cenocepacia）由来のBC2L-Cタンパク質のN末端ドメインに対応したBC2LCNレクチン（YP_002232818）であり、複合糖鎖の非還元末端の「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」並びに「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」糖を認識するレクチンである（非特許文献３）。本発明者らは、BC2LCNレクチンを、形質転換大腸菌で発現させた組換え体（以下、「rBC2LCN」と記載する場合がある。）として得ることに成功した（非特許文献１）。【００１１】
本発明者らは、上述のレクチンアレイを用いた実験において、rBC2LCNレクチンが、全てのヒトES・iPS細胞と反応するものの、分化した体細胞（皮膚、胎児肺、子宮内膜、胎盤動脈、羊膜）とは全く反応しないことを見出した。BC2LCNレクチンは、「α1-2Fuc」、「タイプ1 LacNAc」及び「α2-6Sia」のうちの２つ（α1-2Fuc、タイプ1 LacNAc）を有する「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc（=Hタイプ１構造）」及び「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc（=Hタイプ３構造）」の糖鎖構造と特異的に反応していると解される。これら２つの糖鎖構造は、ヒトＥＳ・ｉＰＳ細胞で高発現しており、分化した皮膚、胎児肺、子宮内膜、胎盤動脈、羊膜の細胞ではほとんど発現のない糖鎖である。【００１２】
このことは、BC2LCNレクチンが認識する糖鎖リガンドは未分化細胞を特徴付ける新規未分化糖鎖マーカーであることを示すものであり、かつ、BC2LCNレクチンは、当該未分化糖鎖マーカー「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」（以下、両者をあわせて「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」ということもある。）に特異的なプローブとして用いることができることを示している。【００１３】
その後、Drukkerらのチームも、「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」を認識する抗体が、未分化状態のＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を認識することを見出しており（非特許文献２）、本発明者らの上記知見が裏付けられた。【００１４】
ただし、Drukkerらの上記抗体は「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc （=Hタイプ１構造）」には特異的に反応するものの、「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc（=Hタイプ３構造）」とは反応しない。このことは、本発明者らのrBC2LCNレクチンと比較すると、未分化幹細胞のうち「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」もしくは「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc含有糖鎖」を検出することができないことであるから、未分化幹細胞マーカーを検出するために用いた場合には、識別性の観点では、本発明者らのrBC2LCNレクチンには及ばないことが予測される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Tateno H，ToyotaM，Saito S，Onuma Y，Ito Y，Hiemori K，FukumuraM，Matsushima A，Nakanishi M，Ohnuma K，Akutsu H，UmezawaA，Horimoto K，Hirabayashi J，Asashima M.,J Biol Chem. 2011 Jun 10;286(23):20345-53.
【非特許文献２】Tang C，LeeAS，Volkmer JP，Sahoo D，Nag D，Mosley AR，InlayMA，Ardehali R，Chavez SL，Pera RR，Behr B，Wu JC，Weissman IL，Drukker M.，Nat Biotechnol. 2011 Aug 14;29(9):829-34.
【非特許文献３】Sulak O，CiociG，Delia M，Lahmann M，Varrot A，Imberty A，WimmerovaM.,Structure. 2010 Jan 13;18(1):59-72.
【非特許文献４】International Stem Cell Initiative.Characterization of human embryonic stem cell lines by the International StemCell Initiative. Nat Biotechnol. 2007 Jul;25(7):803-16.
【非特許文献５】Iijima et al.(2009) ChemBioChem，10，999-1006.
【非特許文献６】Suemori H，YasuchikaK，Hasegawa K，Fujioka T，Tsuneyoshi N，Nakatsuji N. (2006) BiochemBiophys Res Commun 345，926-932.
【非特許文献７】Draper JS，PigottC，Thomson JA，Andrews PW. (2000)J Anat. 200，249-58.
【非特許文献８】Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M.,Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. (2007) Cell 131, 861-872.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
現在、細胞の品質を検査する場合には、細胞の遺伝子発現、エピゲノム状態、細胞表面マーカー等の差異を、シーケンサー、マイクロアレイ、フローサイトメトリー、免疫組織科学等で分析するのが一般的である。これらのうち細胞の状態を判別する方法として最も一般的なのが、フローサイトメトリーや免疫組織化学的手法を用いて、細胞表面マーカーを抗体などの分子プローブで染色する方法である。これらの方法を行うためには、目的細胞のマーカーとなる分子と、それに特異的に結合する分子の存在が必要である。そこで、より明確に細胞の状態を識別でき、望ましくは細胞表面に存在する分子が求められていた。【００１７】
本発明の課題は、幹細胞の分化状態を正確に評価する方法及び未分化状態の幹細胞のみ又は分化細胞のみを確実に単離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上述のように、本発明者らは、未分化幹細胞と分化細胞とを識別する未分化糖鎖マーカーとなる糖鎖構造を確定することに成功し、当該未分化幹細胞マーカーを正確に識別するBC2LCNレクチンを同定した。【００１９】
しかしながら、一般にレクチンは抗体などと比較して、リガンドへの特異性や親和性が低いため、レクチンによる各種糖鎖の検出方法としては、主として本発明者らが開発したエバネッセント波励起蛍光法が用いられてきた。すなわち、被検細胞をすりつぶした細胞抽出液を蛍光標識しておき、スライドグラス上に固定化したレクチンに対して蛍光標識細胞抽出液を反応させ、レクチンと反応した蛍光標識糖鎖との微弱な相互作用をエバネッセント波励起蛍光と呼ばれる特殊な検出スキャナーを用いて高感度に検出する方法である。そのため、未分化幹細胞マーカーが検出できても、細胞自体をすりつぶしてしまうことになるので、コロニーなど３次元的な構造を保った状態で未分化幹細胞の場所を検出する手法、未分化幹細胞と分化細胞とを生きたままで分離するための手法として用いることはできなかった。【００２０】
また、レクチンの場合、上述のようなリガンドへの特異性や親和性が低いという一般的な性質から、細胞の単離のために一般的に用いられているフローサイトメトリーには適用しにくいとされていたこともあり、従来、レクチンは、細胞単離のためのツールとしても、免疫組織化学などの細胞染色のためのプローブとしても一般的ではなかった。【００２１】
こうした中、本発明者らは、たまたま「rBC2LCNレクチン」を蛍光標識し、プラスチックディッシュ上に接着したまま４％パラホルムアルデヒドで化学固定した未分化幹細胞に直接反応させて、顕微鏡観察してみたところ、驚くべきことに、蛍光標識化rBC2LCNレクチンは、未分化状態を維持したヒトES細胞やiPS細胞を大変強く染色（蛍光標識化）するのに対し、フィーダー細胞や分化させた細胞には全く反応しないことがわかった。【００２２】
具体的には、rBC2LCNレクチンは、共培養されているMEFやSNL細胞などのフィーダー細胞とは反応しなかったのに対して、未分化状態を維持したES細胞やiPS細胞と強く反応した。また、rBC2LCNレクチンは、レチノイン酸存在下で培養して分化させたES細胞やiPS細胞とは全く反応しなかったのに対して、レチノイン酸非存在下で未分化状態を維持したES細胞やiPS細胞とは特異的に強く反応した。【００２３】
rBC2LCNレクチンが、このようなリガンドへの強い特異性と共に強い親和性を兼ね備えていることは、従来のレクチンの常識を超えたものであり、発明者ら自身が予想もしなかった結果である。また、上記実験結果は、上記「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」の未分化糖鎖マーカーが、未分化幹細胞の細胞表面には常に存在しているのに対し、分化誘導により分化が進行するにつれ減少して、完全に分化すると当該未分化糖鎖マーカーは消失してしまうことを示すものでもある。このことから、BC2LCNレクチンは、未分化幹細胞特異的に発現している「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」糖鎖を検出するための優れた「未分化幹細胞特異的プローブ」として機能することが期待できる。なお、本発明において、プローブが「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」の糖鎖構造を「特異的に」認識するという場合、当該プローブが、未分化細胞に特異的に発現している前記糖鎖構造を認識し得る（あるいは結合し得る）という程度の特異性を有していることを意味する。【００２４】
本発明者らのさらなる実験により、rBC2LCNレクチンを「未分化幹細胞特異的標識プローブ」として用いた場合に、未分化幹細胞に対する染色性は均一で安定的、且つ再現性高く、バックグラウンドはほとんど観察されず、高感度、高い特異性、細胞表面マーカーに結合すること、など実用的に使用する場合に想定されるあらゆる性能において、従来用いられてきた未分化マーカー（SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81、Nanog、Oct3/4）に対する抗体を遥かに凌ぐものであったことが確認できた。【００２５】
このことは、本発明の蛍光標識BC2LCNレクチンに対しては、抗体を用いた免疫組織化学法では従来から用いられている簡便な技術をそのまま適用できることを示すものである。すなわち、ES細胞、iPS細胞などの未分化状態を評価する場合、未分化幹細胞を分化誘導する際の分化状態を評価する場合には、本発明のBC2LCNレクチンを用いた細胞・組織染色を行い、標識（例えば蛍光等）の有無・強度を確認すればよい。その際、培養細胞をプラスチックディッシュなどの基材上に接着して用いる方法のみならず、未分化状態の幹細胞を溶液中に懸濁し、浮遊状態で標識可能であることを確認できたので、フローサイトメトリー測定法が適用でき、より確実な未分化状態の評価システムを提供できるようになった。また、蛍光標識した溶液中の細胞に対してセルソーターを適用することで、標識された未分化幹細胞と、標識されなかった分化の進んだ細胞とを、効率的に高速分取可能であることも確認できた。
以上の知見を得たことで本発明を完成するに至った。【００２６】
すなわち、本発明は、第一の側面において、被検細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、前記被検細胞への前記プローブの結合の有無を検出する工程と、を含む細胞分化判定方法を提供する。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
この細胞分化判定方法では、未分化幹細胞に特異的に反応するプローブを用い、被検細胞への結合の有無（あるいは結合量）を、例えば該プローブに結合された標識に基づいて検出することで、該結合の有無（あるいは結合量）に基づいて被検細胞の分化状態を判定し、被検細胞中の未分化幹細胞の存在又は不存在を検出することができる。
従って、例えば、被検細胞として未分化状態を維持するための処理がされた幹細胞を用いる場合には、被検細胞が幹細胞としての性質を維持していることを確認でき、幹細胞の品質管理に役立てることができる。
あるいは、被検細胞として多能性誘導処理された体細胞を用いる場合には、被検細胞が脱分化されて幹細胞としての性質を獲得したことを確認でき、得られる多能性誘導性幹細胞の品質管理に役立てることができる。
さらに、被検細胞として分化誘導処理された幹細胞を用いる場合には、被検細胞中への未分化幹細胞の混入を検出でき、得られる分化細胞の品質管理に役立てることができる。【００２７】
また、本発明は、被検細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、前記プローブが結合する細胞と結合しない細胞とを分離する工程と、を含む細胞分離方法を提供する。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
この細胞分離方法では、未分化幹細胞に特異的に反応するプローブを用い、プローブが結合した細胞と結合しなかった細胞とを分離することで、被検細胞中の未分化幹細胞を単離したり、反対に分化細胞を単離したりすることができる。
この細胞分離方法において、前記プローブが光学的に検出可能な標識を含む場合には、該プローブが結合する細胞と結合しない細胞とをセルソーターを備えたフローサイトメーターにより分離することができる。また、前記プローブが磁気的に検出可能な標識を含む場合には、前記プローブが結合する細胞と結合しない細胞とを磁気細胞分離装置により分離することもできる。【００２８】
さらに、本発明は、体細胞を多能性誘導処理する工程と、多能性を誘導後の細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、前記プローブが結合する細胞を単離する工程と、を含む誘導性多能性幹細胞の製造方法を提供する。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
この製造方法では、未分化幹細胞に特異的に反応するプローブを用いて細胞が脱分化されて幹細胞としての性質を獲得したことを確認でき、体細胞の混入のない多能性誘導性幹細胞を製造できる。【００２９】
併せて、本発明は、幹細胞を分化誘導処理する工程と、分化を誘導後の細胞に対して、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなるプローブを接触させる工程と、前記プローブが結合しない細胞とを単離する工程と、を含む分化細胞の製造方法をも提供する。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造を認識するタンパク質。
この製造方法では、未分化幹細胞に特異的に反応するプローブを用いて細胞中への未分化幹細胞の混入を検出でき、未分化幹細胞の混入のない分化細胞を製造できる。【００３０】
また、本発明は、第二の側面において、以下の発明を包含する。
〔１〕  被検幹細胞に対して、標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを反応させ、次いで標識の強度を観察する工程を含むことを特徴とする、標識の強度を指標に幹細胞の分化状態を判別する方法。
〔２〕  分化誘導処理された幹細胞に対して、標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを反応させ、次いで標識の強度を観察する工程を含むことを特徴とする、未分化細胞の混入を検出する方法。
〔３〕  未分化状態を維持するための処理が施されている幹細胞に対して、標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを反応させ、次いで標識の強度を観察する工程を含むことを特徴とする、幹細胞の品質管理方法。
〔４〕  被検幹細胞の分化状態を判別するためのキットであって、標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを含むことを特徴とするキット。
〔５〕  被検幹細胞の分化状態を判別するための装置であって、被検幹細胞に対して標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを供給するための手段もしくは装置と共に前記標識の強度を測定する手段もしくは装置を備えた、装置。
〔６〕  未分化状態の幹細胞のみを単離するための方法であって、幹細胞を溶液中に懸濁させた後に、標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを溶液中に添加して反応させ、次いで当該標識の強度を指標に未分化状態の幹細胞を分離する工程を含むことを特徴とする、未分化状態の幹細胞を単離する方法。
〔７〕  分化細胞のみを単離するための方法であって、一部未分化な幹細胞が混入した分化細胞を溶液中に懸濁させた後に、標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブを溶液中に添加して反応させ、次いで当該標識の強度を指標に未分化状態の幹細胞を除去する工程を含むことを特徴とする、分化細胞を単離する方法。
〔８〕  前記溶液中の幹細胞が脱分化誘導後の脱分化したiPS細胞であって、脱分化できなかった体細胞の混入のないiPS細胞を取得するために用いられる、前記〔６〕に記載の方法。
〔９〕  前記標識が蛍光色素標識であって、未分化幹細胞特異的標識プローブを反応させた後、セルソーターを備えたフローサイトメーターに供給する工程を含む、前記〔６〕，〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  前記標識が磁気ビーズ標識であって、未分化幹細胞特異的標識プローブを反応させた後、磁気細胞分離装置に供給する工程を含む、前記〔６〕，〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１１〕  溶液中に懸濁させた幹細胞から未分化状態の幹細胞のみを単離するためもしくは除去するためのキットであって、
（１）蛍光標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブ、及び
（２）セルソーターを備えたフローサイトメーター
を含むキット。
〔１２〕  溶液中に懸濁させた幹細胞から未分化状態の幹細胞のみを単離するためもしくは除去するためのキットであって、
（１）磁気ビーズ標識化したBC2LCNレクチン又はその改変体からなる未分化幹細胞特異的標識プローブ、及び
（２）磁気細胞分離手段もしくは装置、
を含むキット。【００３１】
本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質」には、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」と、配列番号１記載のアミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」が含まれる。さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質」には、ＢＣ２ＬＣＮレクチン及び／又はＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質の多量体も包含され得る。【００３２】
「類似性」という用語は、タンパク質間のアミノ酸配列の同一性（identity）と、アミノ酸の側鎖の性質も考慮したタンパク質間のアミノ酸配列の類似性（similarity）の両者を包含する概念である。タンパク質アミノ酸配列の欠失、置換、挿入、若しくは付加は、一定の同一性を保持する限り、該タンパク質の機能を保存する。また、アミノ酸はその側鎖によって分子量、酸・アルカリ性、親・疎水性等の性質が異なるが、異なるアミノ酸であってもこれらの性質が近似するアミノ酸同士による、タンパク質アミノ酸配列の置換は、該タンパク質の機能を保存する場合がある。
従って、「配列番号１記載のアミノ酸配列に対して類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、第一に、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン」、及び該アミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」、並びにこれらの多量体を意味する。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列に対して類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、第二に、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が、上記性質の近似するアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン」、及び該アミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」、並びにこれらの多量体を意味する。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列に対して類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質」には、第三に、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されるとともに、１若しくは２以上のアミノ酸が性質の近似するアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン」、及び該アミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」、並びにこれらの多量体も包含される。
アミノ酸配列の類似性は、汎用の解析ツールにより計算することができる。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI)が提供するBLASTが利用できる。【００３３】
「幹細胞」とは、自己以外の特殊化した細胞に分化しうる能力(cell potency)と、細胞分裂を経ても自己と同じ性質を持つ細胞を生み出す能力（自己複製能）を併せ持つ細胞を意味する（「未分化幹細胞」についても同義）。【００３４】
「未分化状態」とは、細胞が自己以外の特殊化した細胞に分化しうる能力と自己複製能を併せ持つ状態を意味する。「未分化状態を維持するための処理」には、幹細胞が自己以外の特殊化した細胞に分化しうる能力と自己複製能を喪失しないように維持するための処理であって、特に限定されないが、例えば細胞培地中へのbFGFやLIFの添加などの処理が含まれる。【００３５】
「誘導性多能性幹細胞」とは、元来体細胞であって、多能性誘導処理によって３胚葉からなるあらゆる性質を持った細胞に分化しうる能力（多能性）と、細胞分裂を経ても自己と同じ性質を持つ細胞を生み出す能力（自己複製能）を併せ持つにいたった細胞を意味する。誘導性多能性幹細胞には、一般にiPS細胞（induced pluripotent stem cell）と称される細胞が含まれる。また、「多能性誘導処理」は、多能性と自己複製能を付与するための処理であって、特に限定されないが、例えばSox2, Oct3/4, Klf4, Mycの４遺伝子を導入するなどの処理が含まれる。【００３６】
「分化細胞」とは、幹細胞のような比較的未分化な細胞が変化し、特殊化した細胞を意味する。「分化誘導処理」は、幹細胞のような比較的未分化な細胞を特殊化させる処理であって、特に限定されないが、例えばBMP及びWnt等の成長因子あるいはレチノイン酸等の分化誘導因子の細胞培地中への添加、MyoD等の遺伝子導入などの処理が含まれる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係るBC2LCNレクチンは、未分化幹細胞特異的に発現している「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」糖鎖を検出できる、優れた「未分化幹細胞特異的プローブ」として用いることができる。本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を標識物質で標識し、被検細胞に対して直接反応させることで、未分化状態の幹細胞のみを特異的に高感度で標識することができる。それにより、被検細胞の分化状態を、簡便かつ効果的に評価することができる。また、本発明の未分化幹細胞特異的プローブを用いて未分化状態の細胞と分化が進んだ細胞とを分取することができるので、再生医療やバイオロジクスなどへの応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】未分化なES細胞(KhES-1株)及び分化誘導処理(レチノイン酸処理)を施したES細胞をCy3ラベルしたrBC2LCNレクチン及び既知の未分化マーカーで染色した。
【図２】未分化なiPS細胞(253G1株)及び分化誘導処理(レチノイン酸処理)を施したiPS細胞をCy3ラベルしたrBC2LCNレクチン及び既知の未分化マーカーで染色した。
【図３】未分化なiPS細胞(253G1株)を蛍光ラベルしたrBC2LCNレクチンとTra-1-60抗体あるいはSSEA-4抗体でフローサイトメトリー法により解析した。
【図４】未分化なES細胞(KhES-3株)及び未分化なiPS細胞(201B7株)をCy3ラベルしたrBC2LCNレクチンで染色した。
【図５】繊維芽細胞(HDF株)、未分化なES細胞(KhES-1株)、未分化なiPS細胞(253G1株)を蛍光ラベルしたrBC2LCNレクチンとTra-1-60抗体あるいはSSEA-4抗体でフローサイトメトリー法により解析した。
【図６】あらかじめミックスされた繊維芽細胞(HDF株)と未分化なiPS細胞(=腫瘍源細胞(2531株))からrBC2LCNを用いて腫瘍源細胞のみを分離できるかを検証した。
【図７】フローサイトメトリー法を用いて、未分化なES細胞(H1株(WA01株))とrBC2LCNの結合力を測定した。
【図８】未分化なES細胞(H1株(WA01株))に高濃度のrBC2LCNを添加し、細胞増殖及びコロニーの形態を観察した。また、生きたまま未分化なES細胞(H1株(WA01株))をFITCラベルしたrBC2LCNで染色した。
【図９】未分化なES細胞(H1株(WA01株))に高濃度のrBC2LCNを添加し、ES細胞の未分化性を表すマーカー遺伝子の発現解析を行った。
【図１０】未分化なES細胞(H1株(WA01株))に高濃度のrBC2LCNを添加し、条件ごとに全遺伝子の網羅的な発現比較を行った。
【図１１】生きたまま未分化なiPS細胞(201B7株)をCy3ラベルしたrBC2LCNで染色した。
【図１２】iPS細胞から分化させた細胞をCy3ラベルしたrBC2LCNで染色した。
【図１３】ES細胞から分化させた細胞をCy3ラベルしたrBC2LCNで染色した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１．本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」が認識する未分化細胞表面で特異的に発現する未分化糖鎖マーカー
本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」は、「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(Hタイプ１糖鎖)」及び「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(Hタイプ３糖鎖)」(以下、両者を併せて「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」ともいう。)を同時に認識する。「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」は、下記の構造を有しており、いずれもヒトES・iPS細胞の細胞表面に顕著に発現している糖タンパク質もしくは糖脂質が有する糖鎖構造である。
【００４０】
本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を用いた観察により、はじめてこれら２種類の糖鎖が、ES細胞、iPS細胞など未分化状態の細胞では、細胞表面に常に提示されているが、分化した体細胞においては、細胞表面に常に提示がないこと、すなわちこれらの糖鎖リガンドは、細胞が未分化状態の場合においてのみ細胞表面に常に提示されることが確認できた。
【００４１】
「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」の糖鎖構造は、GlcNAcの4位の位置の水酸基は単糖(好ましくはフコース)又は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖(好ましくは２〜５の糖からなる糖鎖)で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、未分化細胞の幹細胞表面では、膜構成成分として、GlcNAcの1位の位置で糖タンパク質、糖脂質又は糖類などの非還元末端に結合している糖鎖である。すなわち、下記(式１)として表すことができる。
【化１】
2013128914.tif 000002
(図中、R1はOH基、若しくは任意の糖鎖、例えば、4αFuc基を表す。R2はOH基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子を表す。)
【００４２】
同様に、「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」の糖鎖構造は、GalNAcの1位の位置の水酸基は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖(好ましくは２〜５の糖からなる糖鎖)で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、未分化細胞の幹細胞表面では、膜構成成分として、GalNAcの1位の位置で糖タンパク質、糖脂質又は糖類などの非還元末端に結合している糖鎖であるから、GalNAcの1位の位置で、OH基、又は他の糖類、タンパク質、若しくは脂質、若しくはその他の分子の非還元末端が結合している。すなわち、下記(式２)として表すことができる。
【化２】
2013128914.tif 000003
(図中、R1はOH基、若しくは任意の糖鎖、例えば、Galβ1-4Glc基を表す。R2はOH基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子を表す。)
【００４３】
２．本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」
本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質からなる。このプローブは、好ましくは検出可能な標識を含む。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」(式１)及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(式２)の糖鎖構造を認識するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、かつ「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」(式１)及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(式２)の糖鎖構造を認識するタンパク質。
【００４４】
「BC2LCNレクチン」は、グラム陰性細菌(Burkholderia cenocepacia)から見つかったレクチンであり、BC2L-Cと呼ばれるタンパク質のN末端ドメイン(GenBank／NCBI-GI登録番号：YP_002232818)に相当する(非特許文献３)。BC2LCNはTNF様タンパク質に構造類似性を示し、３量体を形成することが知られている。糖鎖アレイを用いた解析から、このレクチンは「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(Hタイプ１糖鎖)」と「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(Hタイプ３糖鎖)」に対して結合特異性を示すことが明らかになっている。また、糖鎖アレイを用いた解析から、これらの糖鎖構造を含む、Hタイプ１又はHタイプ３糖鎖を含有する糖鎖構造である、「Lewis b糖鎖(Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc)」と「Globo H糖鎖(Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc)」に対しても結合する性質があることも明らかになっている。
【００４５】
「BC2LCNレクチン」は、形質転換細菌によっても大量生産可能である。具体的には、GenBank／NCBI-GI登録番号：YP_002232818(Genome  ID：206562055)のアミノ酸配列(配列番号１)をコードするBC2LCN遺伝子を用い、適宜宿主に対して最適化した後、形質転換した大腸菌から発現させ、通常のタンパク質精製手段により精製することができる。この方法で得られた組換え型BC2LCNは、糖鎖を含まない。本発明に係るBC2LCNは、例えば酵母などの真核生物（細胞）を宿主として用いた遺伝子組換え技術によって得られた糖鎖を有する組換え型BC2LCNであってもよい。ただし、本発明方法を実施する際の条件設定の容易さ等を考慮すると、糖鎖を有さないBC2LCNレクチンであることが好ましい。また、組換え型BC2LCNレクチンを得る際に宿主として用いられる細胞は、取り扱いの容易さ等を考慮すると、大腸菌等の細菌（原核生物、細胞）が好ましい。以下、単に「BC2LCN」という場合、糖鎖を有するBC2LCNと糖鎖を有さないBC2LCNの両方の意味を含む場合がある。また、「rBC2LCN」と記載した場合は、組換え型BC2LCNを意味する。
【００４６】
上記（Ａ)に関し、「配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質」には、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」と、配列番号１記載のアミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」を用いることができる。
【００４７】
融合タンパク質としては、特に限定されないが、ヒスチジンタグなどのタンパク質精製のための付加配列を結合したタンパクや、ＧＦＰなどの蛍光タンパクとの融合タンパク、ＨＲＰやＬａｃＺなどの酵素との融合タンパクなどが挙げられる。さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質」には、ＢＣ２ＬＣＮレクチン及び／又はＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質の多量体も用いられ得る。
【００４８】
また、上記（Ｂ）に関し、「配列番号１記載のアミノ酸配列に対して類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質」には、第一に、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン」、及び該アミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」、並びにこれらの多量体を用いることができる。
【００４９】
この改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンとしては、例えば、アミノ酸の欠失、置換、挿入、若しくは付加によって「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」(式１)及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(式２)の糖鎖構造への結合性を高めたタンパク質が挙げられる。また、改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、配列番号１に対応する全長は必要とせず、例えば、ＢＣ２ＬＣＮレクチンのアミノ酸配列中の「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」(式１)及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(式２)の糖鎖構造の認識部位のアミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよい。この他、改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、アミノ酸の欠失、置換、挿入、若しくは付加によって「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」(式１)及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(式２)の糖鎖構造への結合性は保持しつつ、熱安定性、酸アルカリに対する安定性、タンパク質分解酵素に対する抵抗性等を高めたものであってもよい。
【００５０】
「配列番号１記載のアミノ酸配列に対して類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質」には、第二に、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が、性質の近似するアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン」、及び該アミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」、並びにこれらの多量体を用いることもできる。
【００５１】
この改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンとしては、例えば非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン）間で保存的な置換を行ったタンパク質が挙げられる。この他、保存的置換には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステイン）間での置換などが挙げられる。
【００５２】
「配列番号１記載のアミノ酸配列に対して類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質」には、第三に、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されるとともに、１若しくは２以上のアミノ酸が性質の近似するアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン」、及び該アミノ酸配列に他の１又は２以上のアミノ酸配列が付加されてなる「改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンの融合タンパク質」、並びにこれらの多量体も用いることができる。
【００５３】
これらの改変ＢＣ２ＬＣＮレクチンにおいて、配列番号１記載のアミノ酸配列に対する類似性は、「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」(式１)及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(式２)の糖鎖構造を特異的に認識する機能を保持する限りにおいて特に限定されないが、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上とされる。配列番号１に示されるアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入、若しくは付加されるアミノ酸数も上記機能が保持される限りにおいて特に限定されないが、例えば20個以下、好ましくは10個以下、より好ましくは5個以下とされる。
【００５４】
以下、単に「BC2LCN」又は「rBC2LCN」と記載したときは、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと改変ＢＣ２ＬＣＮレクチン（改変体）の両方を指す場合がある。
【００５５】
３．本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」による未分化幹細胞の解析法及び単離法
（１）BC2LCNレクチン又はその改変体の標識化方法
本発明のBC2LCN又はその改変体は、検出可能な標識物質で標識化されていてもよい。本発明のBC2LCN又はその改変体を標識化するには、常法により蛍光や酵素、ビオチン、磁気ビーズ等を用いる。用途によって好ましい標識物質種は異なる。例えば細胞染色やフローサイトメトリー解析には蛍光標識が好ましく、その際の好ましい蛍光色素としては、「Cy3」、「Cy5」、「FITC」、「Hilyte FluorTM 647」、「phycoerythrin」、「allophycocyanin」などが例示できる。BC2LCN又はその改変体を標識化する際に、アミノ酸配列中の任意の部位に蛍光標識アミノ酸を導入する公知の芳坂らの方法(非特許文献５参照)を用いれば、BC2LCNレクチンの特定の部位に蛍光標識アミノ酸を導入した変異体を作製することができる。細胞分離に用いる際は、蛍光色素以外にも磁気ビーズによる標識も有用である。ベリタス社の手法(http://www.veritastk.co.jp/news.php?id=51)等を用いれば、リガンド上の1級アミノ基、アルデヒド基、ケトン基と結合する化学官能基を有した磁気ビーズを用いて磁気ビーズ標識BC2LCNレクチンを作製することができる。光が透過しない大きな組織内での分布を検証する際は、「horseradish peroxidase」、「alkaline phosphatase」等の酵素や「ビオチン-アビジン反応を利用した検出システム」を用いることができる。その際には、同仁化学研究所の手法(http://www.cosmobio.co.jp/product/koutai_assei/cat436/01440001_2.asp?entry_id=3109)等を用いれば、NHS基やマレイミド基で活性化した酵素やビオチンを、BC2LCNレクチンの一級アミノ基(NH2)やチオール基(SH基、スルフヒドリル基)に標識することが出来る。
【００５６】
（２）対象となる被検幹細胞
本明細書において、対象となる被検細胞は、未分化状態にある「幹細胞」、又は当該細胞を分化誘導して種々の組織特異的に分化した細胞（以下、「分化細胞」と記載する場合がある。）である。その際の「幹細胞」とは、未分化状態にある多能性幹細胞を意味し、胚性幹細胞(ES細胞)、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚組織幹細胞等の様々な体性幹細胞の他、体細胞に幹細胞特異的発現遺伝子などを導入して脱分化させた幹細胞(iPS細胞等)も包まれる。
【００５７】
幹細胞の培養方法としては、培養容器内での接着細胞培養法が一般的に用いられる。接着培養に際しては、フィーダー細胞や細胞外基質抽出物等のコート剤でコートした、もしくは無コートのプラスチックディッシュに幹細胞を接着させる場合、及びビーズ表面などに接着して培養容器内に浮遊させる場合がある。また、培養液中に幹細胞を懸濁して直接浮遊させる浮遊細胞培養法もありうる。
【００５８】
また、ES細胞をはじめとする幹細胞はヒトに限らず哺乳動物ではかなりの部分で共通したしくみで制御されていると考えられるので、本発明の幹細胞としてはヒト以外の哺乳動物、例えばサル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット由来の幹細胞を用いる場合にも適用できる。
【００５９】
ここで、被検幹細胞としてiPS細胞を選択して本発明を実施すれば、iPS細胞を分化誘導する際の判別を行ったり、繊維芽細胞などの分化した体細胞からiPS細胞に脱分化誘導する際に脱分化状態を判定したり、また脱分化によりiPS細胞となった細胞のみを単離することもできる。
【００６０】
本発明の未分化幹細胞特異的プローブは、生きた幹細胞でも化学固定により死んだ幹細胞にも結合する。また、接着している幹細胞や浮遊している幹細胞にも結合する。そのため、検出可能な標識物質で標識化した未分化幹細胞特異的標識プローブを用いて、これらの細胞を標識することができる。ここで、「浮遊している幹細胞」という場合、「浮遊培養した幹細胞」の他に、「接着培養した後、タンパク質分解酵素処理をして、浮遊させた幹細胞」のどちらも含み、培養液中の細胞の場合も、培地成分を取り除いた緩衝液や生理食塩水等の溶液中の細胞のいずれの場合もある。また、「接着している幹細胞」という場合には、ディッシュ等の基材上で接着培養された状態の幹細胞も、ビーズ等の基材上に接着の上、浮遊培養した幹細胞の場合も含む。
【００６１】
（３）幹細胞試料の解析方法（本発明に係る細胞分化判定方法）
本発明に係る細胞分化判定方法は、未分化幹細胞特異的プローブを被検細胞に接触させる工程（接触手順）と、被検細胞へのプローブの結合の有無（あるいは結合量）を検出する工程（検出手順）と、を含む。この細胞分化判定方法に用いられる未分化幹細胞特異的プローブは、検出可能な標識物質で標識化されていることが好ましい。そして、被検細胞へのプローブの結合の有無（あるいは結合量）を例えば該プローブに結合された標識に基づいて検出することで、該結合の有無（あるいは結合量）に基づいて被検細胞の分化状態を判定し、被検細胞中の未分化幹細胞の存在又は不存在を検出することができる（判定手順）。具体的には、被検細胞にプローブが結合した場合（あるいは結合量が多い場合）、該被検細胞は未分化細胞と判定できる。また、被検細胞にプローブが結合しない場合（あるいは結合量が少ない場合）、該被検細胞は分化細胞と判定できる。なお、本発明に係る細胞分化判定方法において、接触手順、検出手順及び判定手順の実施者は、同一であってもよく異なっていてもよい。また、各手順は、連続的に行われてもよく不連続的に行われてもよい。
【００６２】
（３−１）接触手順
接触手順において、未分化幹細胞特異的標識プローブを、溶液中の幹細胞に供給する方法は、培養容器内で基材に接着した状態で幹細胞を培養している場合は、当該標識プローブ溶液をその表面を覆っている溶液中に供給すれば、フィーダー細胞等の存在非存在には影響されずに、未分化状態の幹細胞のみが標識化される。また、懸濁状態で培養している場合であっても、溶液中に当該標識プローブ溶液を供給すれば、未分化状態の幹細胞のみが標識化できる。
【００６３】
このような、懸濁液中の細胞であっても標識化できるという本発明の未分化幹細胞特異的標識プローブの高い特異性と親和性は、特に未分化状態の幹細胞のみを単離する場合に、幹細胞に対する負担を少なくし、かつ簡便に行う為には極めて有利な特性であるといえる。具体的には、幹細胞を接着培養する場合であっても浮遊培養する場合であっても、本発明の未分化幹細胞特異的標識プローブ溶液を、幹細胞の培養液中に添加した後に、幹細胞表面の標識量を測定することで、幹細胞の分化度を正確に評価することができる。また、懸濁液中の細胞であれば、そのままセルソーターや磁気細胞分離装置による未分化幹細胞の単離にも適用できる。必要に応じ、緩衝液や生理食塩水等で液交換をすることで簡単に培地成分の影響をとりのぞくことができる。また、幹細胞の標識量の測定は死細胞でも生細胞と同様に可能であるため、あらかじめ細胞をホルマリンなどによって化学固定することにより取り扱いが簡単になる。特に、標識物質種の種類によっては(例えば、alkaline phosphataseを選択する場合など)は、細胞内のalkaline phosphataseの活性を消すために、ホルマリンによる細胞の化学固定は必須となる。
【００６４】
（３−２）検出・判定手順（基材に接着された幹細胞に適用する場合）
本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」は、ビーズ状、中空糸状もしくは平板状の基材の上で培養した未分化状態の幹細胞又は分化誘導後の細胞を識別する場合に適用できる。その場合は、基材が存在する溶液中に未分化幹細胞特異的プローブを標識物質で標識した未分化幹細胞特異的標識プローブを添加すると、検出が容易になるので望ましい。ここでいう「溶液」とは、培養液または、培地成分を除去した後の緩衝液や生理食塩水等であってよい。
【００６５】
本発明に係る細胞分化判定方法を実施するには、未分化細胞表面で特異的に発現する上記(式１)及び(式２)で表される糖鎖との反応性を、例えば蛍光顕微鏡、ELISAなどを用いて分化幹細胞特異的標識プローブ由来の標識を検出することによって、未分化細胞を検出する等すればよい。このような解析方法によれば、例えば未分化状態の幹細胞を分化誘導処理後、細胞をサンプリングして上記の検出を行う。そして未分化幹細胞特異的標識プローブ由来の標識が検出されなくなった(バックグラウンド値と同レベルになった)場合には、その分化誘導処理した細胞群は、もはや未分化細胞が混入していない分化細胞のみからなると評価できる。また、同様の分化誘導処理を行うことによって未分化細胞の混入のおそれのない分化細胞を大量かつ迅速に取得できる。なお、本発明の未分化幹細胞特異的標識プローブをalkaline phosphataseで標識した標識プローブを用いる際などには、細胞の化学固定処理が必要となる場合もある。
【００６６】
ここで、幹細胞を神経細胞、消化器系細胞などに「分化誘導」する方法としては、どのような手法であってもよく、例えば幹細胞をレチノイン酸存在下で培養して神経系細胞に分化する方法、noggin等の液成因子を用いて幹細胞から心筋細胞を形成させる方法など種々の公知の手法が適用できる。本発明の細胞表面未分化糖鎖マーカーの分化した細胞表面での発現量は無視できる程度であるから、どの分化誘導条件下でもノイズが極めて少ないことが予想される。
【００６７】
また、未分化状態を維持しておきたい幹細胞の品質管理のためには、定期的にもしくは必要に応じて細胞サンプルを採取して、本発明の細胞分化判定方法を実施すれば、細胞が未分化状態に維持されているかどうかを確認することができる。
【００６８】
また、繊維芽細胞などの分化した体細胞からiPS細胞に脱分化誘導する場合、本発明の細胞分化判定方法を用いて、体細胞に脱分化が起きてiPS細胞が樹立されたか否かを判定することができる。
【００６９】
（３−３）検出・判定手順（溶液中に懸濁された幹細胞に適用する場合）
本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」は、溶液中の幹細胞及びそれから分化した細胞を識別する場合にも適用できる。その場合は、溶液中に、未分化幹細胞特異的プローブを添加する。ここでいう「溶液」とは、培養液または、培地成分を除去した後の緩衝液や生理食塩水等であってよい。
【００７０】
本発明に係る細胞分化判定方法により溶液中の未分化幹細胞と分化細胞を識別する方法としては、本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を用い、例えば公知のフローサイトメトリー測定法を実施する方法が挙げられる。例えば本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を標識物質で標識した「未分化幹細胞特異的標識プローブ」を用いてフローサイトメトリーを行う場合、幹細胞コロニーを酵素処理して解離し、未分化幹細胞特異的標識プローブと反応させて、FACS機器を用いてフローサイトメトリー解析を行うことにより、確実な未分化状態の評価システムを提供することができる。
【００７１】
（４）未分化幹細胞あるいは分化細胞の単離方法
前記したように、BC2LCNレクチンは未分化糖鎖マーカーへの強い特異性と共に強い親和性を兼ね備えており、また、後述するように幹細胞に対して非常に強い結合力を示すことから、この性質を利用して、分化細胞と未分化幹細胞を分離することができる。本発明に係る細胞分離方法は、未分化幹細胞特異的プローブを被検細胞に接触させる工程と、プローブが結合する細胞と結合しない細胞とを分離する工程と、を含む。この細胞分離方法では、未分化幹細胞に特異的に反応するプローブを用い、プローブが結合した細胞と結合しなかった細胞とを分離することで、被検細胞中の未分化幹細胞を単離したり、反対に分化細胞を単離したりすることができる。
【００７２】
細胞を分離する具体的な方法としては、本発明の未分化幹細胞特異的プローブが結合した細胞（未分化幹細胞）と、当該プローブが結合していない細胞を分離することができる方法であれば、従来から用いられている細胞の分離方法が、特に制限なく用いることができる。その具体的な条件は、本発明の未分化幹細胞特異的プローブが結合した細胞と、当該プローブが結合していない細胞が分離されるように設定すればよく、その他の条件は、自体公知の方法に準ずればよい。
【００７３】
例えばいわゆるＢ／Ｆ分離によって行う場合は、以下のように行えばよい。すなわち、被検細胞と、固相に結合した本発明の未分化幹細胞特異的プローブを接触させた後、固相と液相を分離することによって、該プローブに結合した細胞と、該プローブに結合しなかった細胞とを分離することができる。
【００７４】
また、公知のフローサイトメトリー技術も本発明の細胞分離方法に適用できる。例えば本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を検出可能な標識物質で標識した「未分化幹細胞特異的標識プローブ」を被検細胞と接触させると、該プローブは未分化状態の幹細胞のみに結合するため、未分化幹細胞が直接蛍光標識などで標識化される。具体的には、幹細胞コロニーを酵素処理して解離し、未分化幹細胞特異的標識プローブと反応させて、FACS機器を用いてフローサイトメトリー解析を行うことにより、確実な未分化状態の評価システムを提供することができる。
【００７５】
また、フローサイトメトリー技術の中でも、散乱光を測定する方法、例えば前方散乱光と測光散乱光を測定する公知の方法を実施すれば、本発明の未分化幹細胞特異的プローブを標識物質で標識せずに用いて、該プローブが結合した細胞と、該プローブが結合していない細胞を分離することができる。
【００７６】
さらに例えば、分析対象となる物質に対して親和性を有する物質（所謂、アフィニティーリガンド）を用い、対象物質とアフィニティーリガンドとの相互作用の結果生じる対象物質の電気泳動移動度の変化を、分離や分析に利用する方法が種々開発されている。そこで、この方法を用いて未分化幹細胞特異的プローブが結合した細胞と該プローブが結合していない細胞を分離することができる。
【００７７】
例えばアフィニティーリガンドを固定化したアガロースゲルやポリアクリルアミドゲル等の不溶性担体を用いるアフィニティー電気泳動法、レクチンを含む泳動ゲル等を用いて電気泳動を行うレクチン親和電気泳動法、イオン性ポリマーに結合したアフィニティーリガンドを用いるアフィノフォレシス、ゲルシフトアッセイ等を応用して、該プローブが結合した細胞（該プローブが結合する細胞）と、該プローブが結合していない細胞（該プローブが結合しない細胞）を分離することができる。
【００７８】
レクチン親和電気泳動により本発明の分離方法を実施する場合、レクチンの代わりに本発明の未分化幹細胞特異的プローブを用い、該プローブを含む泳動ゲル等を用いて電気泳動を行う方法がある。また、後述するキャピラリー電気泳動において、キャピラリー中の液体（緩衝液）に本発明の未分化幹細胞特異的プローブを存在させておき、電気泳動を行えば、被検細胞が電気泳動によってキャピラリーを移動する途中で、未分化幹細胞はキャピラリー中の未分化幹細胞特異的プローブに結合し、その他の細胞は該プローブに結合しない。このため、該プローブが結合した細胞と、該プローブが結合しなかった細胞とを、両者の移動度が異なることを利用して分離できる。
【００７９】
また、物質を不均一な交流電界内に置くと、物質内に正と負の分極が起こり、物質が移動する力が働く現象、いわゆる誘電泳動力（H.A.Pohl: ”Dielectrophoresis”, Cambridge Univ. Press (1978)、T.B.Jones: ”Electromechanics of Particles”, Cambridge Univ. Press(1995)等）を利用した分離方法を用いて、細胞を分離することもできる。この分離方法では、誘電泳動力の大きさは、物質（粒子）の大きさ・誘電的性質に依存するので、この誘電泳動法を用いて、本発明の未分化幹細胞特異的プローブが結合した細胞と、該プローブが結合していない細胞を分離することができる（例えば特許第4671084号公報等）。
【００８０】
さらに、テフロン（登録商標）やシリカ等を材料として作製された内径１mm以下のキャピラリー（細管）を分離カラムとして使用して高電界中で物質の持つ電荷の差を利用して分離を行うキャピラリー電気泳動法や、同様のキャピラリーを用いてカラム担体と物質との相互作用の差を利用して分離を行うキャピラリーカラムクロマトグラフィー法等を行って、本発明の未分化幹細胞特異的プローブが結合した細胞と、該プローブが結合していない細胞を分離することができる。
【００８１】
さらに、本発明の未分化幹細胞特異的プローブが結合した細胞と、該プローブが結合していない細胞の分離を、透過性フィルターを用いて分離する方法、沈降速度の違いにより分離する方法、密度勾配遠心分離により分離する方法、フェロ流体により分離する方法で、行うことができる。
【００８２】
上記した分離方法においては、いわゆる分離向上物質を用いて、未分化細胞と未分化細胞特異的プローブとの結合物（複合体）と、該プローブに結合しなかった細胞との分離操作を行う方法が挙げられる。この方法では、分離向上物質を適宜選択して用いることにより未分化細胞と未分化細胞特異的プローブとの複合体の溶出位置を自在に調節することが可能となること、言い換えれば、適当な分離向上物質を該複合体に結合させることにより該複合体と該プローブに結合しなかった細胞とをより明確に分離することができる（特開平06-066800号公報、特開平07-191027号公報、2001-165905号公報等）。また、分離向上物質を使用する場合には、本発明の未分化幹細胞特異的プローブに分離向上物質を結合させたものを用いればよい。
【００８３】
このような分離向上物質は、行う分離方法の分離原理（サイズ、疎水性、等電点、電荷等）を考慮した上で適宜選択して用いれば足りる。用いられる分離向上物質の具体例、本発明の未分化幹細胞特異的プローブに分離向上物質を結合させる方法、複合体実際の分離操作等は、公知の方法に基づいて適宜選択すればよい。
【００８４】
上記の細胞の分離方法にセルソーターを併用することで、例えば、セルソーターを備えたフローサイトメーターを用いることで、未分化幹細胞のみあるいは分化細胞のみを単離することができる。具体的には、幹細胞コロニーを酵素処理して解離し、未分化幹細胞特異的プローブと反応させて、フローサイトメトリー法により細胞を生きたまま分収出来ることから、未分化幹細胞のみ（あるいは分化細胞のみ）を単離することができる。
【００８５】
また、本発明の未分化幹細胞特異的プローブを磁気ビーズで標識したものを用いる場合には、幹細胞コロニーを酵素処理して解離し、未分化幹細胞特異的磁気ビーズ標識プローブと反応させて磁気細胞分離装置に供給することで未分化状態の幹細胞のみ（あるいは分化細胞のみ）を分収することができる。
【００８６】
本発明の分離方法によって細胞を分離した後、目的の未分化幹細胞又は分化した分化細胞を回収できたことを、本発明の細胞分化判定方法を行って確認してもよい。
【００８７】
本発明により単離された分化細胞は、続いて目的の用途に使用できる。また、本発明により単離された未分化幹細胞は、本発明の未分化幹細胞特異的プローブと結合している。本発明者らは、未分化幹細胞特異的蛍光標識プローブを結合した未分化幹細胞では、数日間の培養後、蛍光が殆ど検出されなくなることを確認した。詳細は不明であるが、該プローブは、細胞培養の間に未分化幹細胞から消失した。このことから、本発明により単離された未分化幹細胞を、未分化幹細胞特異的プローブを含まない条件で数日間（３〜５日）培養することにより、該プローブが結合していない細胞を入手でき、続いて目的の用途に使用することができる。また、プローブが結合していない細胞は、レクチンから糖鎖を分離するための公知の方法によって、本発明により単離された未分化幹細胞からプローブを分離することによって得ることもできる。
【００８８】
（５）本発明の「未分化幹細胞特異的標識プローブ」の糖鎖結合力について
（５−１）測定方法
レクチンなど糖鎖結合活性を有する物質と糖鎖との結合力は、一般に「解離定数」で表す。本発明では、本発明の未分化幹細胞特異的標識プローブの「糖鎖結合力」を、フローサイトメトリー法を利用することで測定している。具体的には、0.01，0.005，0.002，0.001，0.0005，0.0002，0.0001mg/mlの未分化幹細胞特異的蛍光標識プローブ溶液を作製し、幹細胞コロニーを酵素処理して解離し反応させて、シグナル値を測定する。得られた結果を逆数プロットすることにより、解離定数の近似値と考えられるミカエリス定数を算出する。
【００８９】
（５−２）測定結果
本発明に先立ち、rBC2LCNレクチンとそのターゲットの糖鎖である「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」との結合力を、フロンタルアフィニティークロマトグラフで測定したところ、その解離定数はKd=4.0.E-05であって(本発明者らの先願であるPCT/JP2012/006983に記載)一般的なレクチン−糖鎖の解離定数と同程度であり、特別に高い結合力を示さなかった。
【００９０】
しかしながら、本発明において、標識化されたBC2LCNレクチンを未分化幹細胞特異的標識プローブとして未分化幹細胞に対して適用した場合には、通常のレクチン−糖鎖結合からは考えられないほどに非常に強い結合力を示すことが染色の観察結果から予想された。
【００９１】
そこで、前記フローサイトメトリー法を利用した測定方法により、標識化されたrBC2LCNレクチンと未分化幹細胞との解離定数を測定したところ、実際に「rBC2LCNレクチン」と「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」糖鎖との解離定数から予想できないほどに低い、Kd=2.0.E-07という値を示した。このことからも、BC2LCNレクチンは、未分化幹細胞に対して非常に強い結合力を示すことが解離定数の数値からも明らかとなった。
【００９２】
（６）本発明の「未分化幹細胞特異的標識プローブ」に細胞毒性がないことについて
（６−１）「未分化幹細胞特異的標識プローブ」存在下での長期間培養によっても、幹細胞の増殖活性が保たれることについて
（ア）測定方法
細胞に対する毒性の有無は、細胞の増殖能に最も良く反映されることから、本発明においても「未分化幹細胞特異的標識プローブ」を存在させた培地中での幹細胞の増殖活性をコロニーの形態観察により測定した。具体的には、培養中の未分化幹細胞の培地に、本発明の「未分化幹細胞特異的標識プローブ」に用いるrBC2LCNレクチンを1，10，100μg/mlの濃度で添加し、３日間培養した。その後コロニーの形態観察を行い、幹細胞の増殖活性が保たれているか否かを検証した。同時に、蛍光標識したrBC2LCNレクチンを培養中の未分化幹細胞の培地に添加し、同様の観察を行った。ここで、添加量1μg/mlの場合が実際に生染色する際に使用する最大濃度であり、その10倍〜100倍の濃度で添加しても増殖活性が落ちないことが観察されれば、細胞毒性がないことが実証できる。
【００９３】
（イ）測定結果
実施例において後述するように、最も高濃度(100μg/ml)のrBC2LCN又は蛍光標識したrBC2LCNの存在下で培養されたコロニーでも、未処理のコロニーと同様の形態、大きさを示すことが確認できた。これより、「未分化幹細胞特異的標識プローブ」存在下での長期間培養によっても、幹細胞の増殖活性が保たれることが示され、当該プローブに細胞毒性がないことが確認された。
【００９４】
（６−２）「未分化幹細胞特異的標識プローブ」存在下での長期間培養によっても、幹細胞の未分化能が変化しないことについて
（ア）測定方法
前記(６−１)と同様の方法で培養された未分化幹細胞の遺伝子発現解析を、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に行った。
【００９５】
（イ）測定結果
未分化時に特異的に観察される周知のヒトES細胞マーカー遺伝子(非特許文献４)である、NANOG、TDGF、GABRB3、DNMT3B、GDF3、POU5F1、FGF4、GAL、LEFT1、IFITM1、NODAL、TERT、UTF1、FOXD3、LEFT2、LIN28A、LIN28B、GRB7、PODXL、CD9、BRIX1の遺伝子発現には変化がなく、さらにその他全般的な遺伝子発現にも殆ど変化はなかった。このことからも、「未分化幹細胞特異的標識プローブ」存在下での長期間培養によっても、幹細胞の未分化能が変化しないことが示された。
【００９６】
以上の結果から、本発明の「未分化幹細胞特異的標識プローブ」には、幹細胞に対する細胞毒性がないことが実証された。
【００９７】
４．本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を含む、幹細胞の分化状態の判別用キット又は装置
本発明の「未分化幹細胞特異的標識プローブ」を、下記(１)〜(３)の手段と共にキット又は装置とすれば、幹細胞の分化状態の判別用キット又は装置とすることができる。
（１）BC2LCNレクチン又はその改変体を検出可能な標識物質で標識した、未分化幹細胞特異的標識プローブ。
（２）未分化幹細胞特異的プローブを幹細胞の細胞表面に添加する手段、または幹細胞が存在する溶液中に当該プローブを添加する手段。例えば、自動分注装置；ただし、当該手段は手作業でも可能なので必須ではない。
（３）標識を検出するための手段又は装置。例えば、蛍光標識した未分化幹細胞特異的標識プローブを用いる場合は、蛍光顕微鏡またはプレートリーダーであり、酵素標識やビオチン標識の場合は、イメージアナライザーなどがある。
【００９８】
本発明の未分化幹細胞特異的標識プローブと、標識を検出するための手段もしくは装置をセットにすることで、幹細胞の分化状態の判別用キットとすることができる。さらに、当該未分化幹細胞特異的標識プローブを培養幹細胞に添加する手段をセットとすることで、未分化幹細胞の解析を自動化することができる。その際には幹細胞の培養状態を保ったまま、行うことが好ましい。
【００９９】
５．本発明の「未分化幹細胞特異的プローブ」を含む、未分化幹細胞の単離用キット又は装置
下記(１)〜(３)の手段と共にキット又は装置とすれば、未分化状態の幹細胞のみを単離することができる。
(１)未分化幹細胞特異的プローブBC2LCNレクチンまたはその改変体（検出可能な標識物質で標識化していてもよい)。
(２)未分化幹細胞特異的プローブを幹細胞の培養液中に供給する手段。例えば、自動分注装置；ただし、当該手段は手作業でも可能なので必須ではない。
(３)未分化幹細胞又は分化細胞を分離するための手段又は装置。例えば、セルソーターを備えたフローサイトメトリー、または磁気細胞分離装置。
【０１００】
本発明の未分化幹細胞特異的プローブと、未分化幹細胞特異的プローブが結合した未分化幹細胞を分離するための手段もしくは装置をセットにすることで、未分化状態の幹細胞を分化が進んだ幹細胞から分収することができるため、未分化状態の幹細胞を単離することができるばかりでなく、完全に分化が進んだ細胞のみを単離することもできる。また、さらに未分化幹細胞特異的プローブを培養幹細胞に添加する手段をセットとすることで、未分化状態の幹細胞もしくは分化の進んだ細胞の分収を自動化することができる。その際には幹細胞の培養状態を保ったまま、行うことが好ましい。
【実施例】
【０１０１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【０１０２】
（実施例１）ヒトES細胞の細胞染色
本実施例で用いたヒトES細胞(KhES-1株)は京都大学再生医科学研究所から分譲を受けた。Suemoriらの手法(非特許文献６参照)により培養した。ES細胞コロニーを4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した後、蛍光ラベル化(Cy3を結合)したrBC2LCNレクチンを加えて室温で1時間反応させた(図１Ａ)。比較対象として、未分化のES細胞やiPS細胞を特異的に認識するTra-1-60抗体または抗Nanog抗体を反応させた後、二次抗体であるanti-mouse IgM-Alexa488またはanti-rabbit IgG-Alexa594をさらに反応させたES細胞コロニーの染色像を示す(図１Ａ)。蛍光ラベル化されたrBC2LCNレクチンはTra-1-60抗体あるいは抗Nanog抗体と同様にES細胞を強く染色した。上記実験は細胞を破砕せずに行っているため、Tra-1-60抗体がES細胞表面の抗原を認識しているのと同様、BC2LCNレクチンが認識している糖鎖構造の「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」は、未分化状態のES細胞表面で大量に発現している糖タンパク質及び糖脂質の構成糖として、細胞表面を覆うように存在していることが窺われる。【０１０３】
さらにDraperらの方法(非特許文献７参照)に従って、終濃度10-5Mになるようにレチノイン酸を添加して培養することにより、ES細胞の分化誘導を行った(図１Ｂ)。7日間培養し細胞の形態から充分に分化が進んだことを確認して、蛍光標識したrBC2LCNレクチンを細胞と反応させた(図１Ｂ)。比較対象として、Tra-1-60抗体または抗Nanog抗体とそれぞれの二次抗体を反応させた(図１Ｂ)。レチノイン酸処理により分化したES細胞ではrBC2LCNレクチンの蛍光は、未分化マーカーである抗Nanog抗体と同様にほとんど検出されなかった。これに対して、未分化マーカーであるTra-1-60抗体の蛍光の強度は、充分に観察可能な強度を保ったままであった(図１Ｂ)。【０１０４】
この実験結果は、既知の未分化マーカーとして用いられているTra-1-60抗体が認識する糖鎖抗原では分化が進んだ状態でも依然として細胞表面でかなりの発現量を維持しているのに対し、BC2LCNレクチンが認識している糖鎖構造の「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」の場合は、未分化状態では細胞表面を覆うように発現しているが分化が進むとほとんど発現しなくなることを示している。また、BC2LCNレクチンは、上記実験で抗Nanog抗体と同等の極めて優れた未分化幹細胞検出能を持っていることも明らかになった。抗Nanog抗体の抗原は細胞内タンパク質であるのに対して、BC2LCNレクチンが認識している糖鎖構造は細胞表面に存在することから、未分化性を有したES細胞など幹細胞を特異的に認識する優れた分化、未分化判定用のキットとしての高い有用性を有していることが実証された。【０１０５】
（実施例２）ヒトiPS細胞の細胞染色
本実施例で用いたiPS細胞(253G1株)は理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けた。Tatenoらの手法(非特許文献１参照)により培養した。細胞は4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した後、蛍光ラベル化(Cy3を結合)したrBC2LCNレクチンを加えて室温で１時間反応させた(図２)。ネガティブコントロールとしてBSAを蛍光ラベル化したものを用いた(図２)。比較対象として、未分化のES細胞やiPS細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ染色(AP)と抗体染色(抗Nanog抗体、抗Oct3/4抗体、SSEA-4抗体、Tra-1-60抗体、Tra-1-81抗体)を行った(図２)。蛍光ラベル化されたBC2LCNレクチンは未分化のiPS細胞を強く染色し、既知の未分化マーカーであるAP染色と各種抗体染色と同程度またはそれ以上に強くiPS細胞を検出することがわかった(図２Ａ)。【０１０６】
また、Draperらの方法（非特許文献７参照）に従って、終濃度10-5Mになるようにレチノイン酸を添加して培養することによりiPS細胞の分化誘導を行った。5日間培養し細胞の形態から分化が開始していることを確認して、蛍光標識したrBC2LCNレクチンを細胞と反応させた(図２Ｃ)。比較対象として、レチノイン酸を添加せず5日間培養した細胞を用いた(図２Ｂ)。未分化のES細胞やiPS細胞のマーカーであるAP染色と抗体染色(抗Nanog抗体、抗Oct3/4抗体、SSEA-4抗体、Tra-1-60抗体、Tra-1-81抗体)を行った。レチノイン酸処理をして分化したiPS細胞株では、rBC2LCNレクチンの蛍光はiPS細胞コロニー周辺部の抗Nanog抗体や抗Oct3/4抗体が陽性の未分化性を保った細胞で反応が見られたが、コロニー中心部の抗Nanog抗体や抗Oct3/4抗体が陰性の未分化性を失った細胞では検出されなかった(図２Ｃ)。これに対して、Tra-1-60抗体、Tra-1-81抗体の蛍光の強度は、コロニー中心部の抗Nanog抗体や抗Oct3/4抗体が陰性の未分化性を失った細胞でも充分に観察可能な強度を保ったままであった(図２Ｃ)。【０１０７】
以上のことから、BC2LCNレクチンは、分化、未分化を判定するための未分化糖鎖マーカーとして、上記実験で抗Nanog抗体や抗Oct3/4抗体と同等の極めて優れた未分化幹細胞検出能を持っていることが明らかになった。BC2LCNレクチンは、未分化性を有したiPS細胞など幹細胞を特異的に認識する優れた分化、未分化判定用の試薬として高い有用性を有していることがわかった。【０１０８】
（実施例３）蛍光ラベル化BC2LCNレクチンを用いたiPS細胞のフローサイトメトリー
実施例２と同様の方法で調製したiPS細胞(253G1株)を酵素処理して解離し、蛍光ラベル化した(HiLyte Fluor 647を結合した)rBC2LCNレクチンと、既知の未分化検出抗体(Tra-1-60抗体及びSSEA-4抗体)と反応させて、FACS機器を用いてフローサイトメトリー解析を行った(図３)。【０１０９】
その結果、全体の92.5〜94.0％の細胞がTra-1-60抗体とrBC2LCNレクチンとに同時に結合した(図３Ａ，Ｂ)。また、全体の95.8〜96.7％の細胞がSSEA-4抗体とrBC2LCNレクチンとに同時に結合した(図３Ｃ，Ｄ)。このことはBC2LCNレクチンにより、未分化を維持したiPS細胞を有効に選別にすることができることを実証するものである。【０１１０】
また、細胞をrBC2LCNレクチンと先に反応させてTra-1-60抗体あるいはSSEA-4抗体と後に反応させた場合(図３Ａ，Ｃ)と、Tra-1-60抗体あるいはSSEA-4抗体を先に反応させて、rBC2LCNレクチンを後に反応させた場合(図３Ｂ，Ｄ)では、rBC2LCNとTra-1-60抗体あるいはSSEA-4抗体と同時に結合する細胞の割合には差は見られなかった。このことはBC2LCNが既知の未分化検出抗体(Tra-1-60抗体及びSSEA-4抗体)の結合を阻害することなく、両者を組み合わせて未分化検出の感度を向上することができることを示すものである。【０１１１】
本性質を利用して、フローサイトメトリー法により細胞を生きたまま分収できることから、ES細胞、iPS細胞などの幹細胞を保存する際や未分化性を有したまま増殖させようとする際に、望ましくない混入した分化細胞を除去することも可能である。また、本性質を利用し、各種臓器細胞(心筋細胞、肝臓細胞、神経細胞、膵島細胞、軟骨細胞、骨細胞等)をES細胞、iPS細胞などの幹細胞から作製した際、未分化性を有したまま残留している細胞を、フローサイトメトリー法により除去することが可能である。【０１１２】
（実施例４）ヒトES細胞およびiPS細胞の細胞染色
本実施例で用いたヒトES細胞(KhES-3株)は京都大学再生医科学研究所から分譲を受けた。Suemoriらの手法（非特許文献６参照）により培養した。
本実施例で用いたヒトiPS細胞(201B7株)は理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けた。Tatenoらの手法（非特許文献１参照）により培養した。
ES細胞およびiPS細胞は4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した後、蛍光ラベル化(Cy3を結合)したrBC2LCNレクチンを加えて室温で１時間反応させた。蛍光ラベル化されたrBC2LCNレクチンはKhES-3株と201B7株を強く染色し、広範な種類のヒトES細胞およびiPS細胞を検出することがわかった(図４)。【０１１３】
また、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察することにより、蛍光ラベル化されたrBC2LCNレクチンは201B7株の細胞膜を染色していることが確認された(図４Ｂ右図)。このことは、BC2LCNレクチンが認識している糖鎖構造の「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」は、未分化状態のiPS細胞表面で大量に発現している糖タンパク質及び糖脂質の構成糖として、細胞表面を覆うように存在していることを証明するものである。BC2LCNレクチンが認識している糖鎖構造は細胞表面に存在することから、未分化性を有したES細胞など幹細胞を特異的に認識する優れた分化、未分化判定用のキットとしての高い有用性を有していることが実証された。【０１１４】
（実施例５）蛍光ラベル化BC2LCNレクチンを用いたiPS細胞およびES細胞のフローサイトメトリー
実施例１と同様の方法で調製したES細胞(KhES-1株)と、実施例２と同様の方法で調製したiPS細胞(253G1株)と、ATCC社が推奨する方法(http://www.atcc.org/attachments/13049.pdf)で調製したヒト皮膚繊維芽細胞(HDF)を酵素処理して解離し、蛍光ラベル化した(HiLyte Fluor 647を結合した)rBC2LCNレクチンと反応させた。フローサイトメトリー解析の結果、ES細胞とiPS細胞はrBC2LCNレクチンと結合し蛍光ピークの顕著なシフトが見られたが、HDFとの結合は見られなかった(図５Ａ−Ｃ)。【０１１５】
さらに、ES細胞(KhES-1株)を蛍光ラベル化した(HiLyte Fluor 647を結合した)rBC2LCNレクチンと、既知の未分化検出抗体(SSEA-4抗体及びTra-1-60抗体)と反応させて、FACS機器を用いてフローサイトメトリー解析を行った(図５Ｄ−Ｇ)。その結果、全体の99.1〜99.4％の細胞がSSEA-4抗体とrBC2LCNレクチンとに同時に結合した(図５Ｄ，Ｅ)。また、全体の98.0〜98.2％の細胞がTra-1-60抗体とrBC2LCNレクチンとに同時に結合した(図５Ｆ，Ｇ)。このことはBC2LCNレクチンにより、未分化を維持したiPS細胞を有効に選別にすることができることを実証するものである。【０１１６】
また、細胞をrBC2LCNレクチンと先に反応させてSSEA-4抗体あるいはTra-1-60抗体と後に反応させた場合(図５Ｄ，Ｆ)と、SSEA-4抗体あるいはTra-1-60抗体を先に反応させて、rBC2LCNレクチンを後に反応させた場合(図５Ｅ，Ｇ)では、rBC2LCNとSSEA-4抗体あるいはTra-1-60抗体と同時に結合する細胞の割合に差は見られなかった。このことはBC2LCNが既知の未分化検出抗体(SSEA-4抗体及びTra-1-60抗体)の結合を阻害することなく、両者を組み合わせて未分化検出の感度を向上することができることを示すものである。【０１１７】
本性質を利用して、フローサイトメトリー法により細胞を生きたまま分収できることから、ES細胞、iPS細胞などの幹細胞を保存する際や未分化性を有したまま増殖させようとする際に、望ましくない混入した分化細胞を除去することも可能である。また、本性質を利用し、各種臓器細胞(心筋細胞、肝臓細胞、神経細胞、膵島細胞、軟骨細胞、骨細胞等)をES細胞、iPS細胞などの幹細胞から作製した際、未分化性を有したまま残留している細胞を、フローサイトメトリー法により除去することが可能である。【０１１８】
（実施例６）フローサイトメトリー法を用いた腫瘍源細胞分離
実施例５と同様の方法で調製したヒト皮膚繊維芽細胞(HDF)を酵素処理して解離し、CellTrace Violet Cell Proliferation Kit (Invitrogen) を用いてラベル化して、移植用細胞のモデル(移植モデル細胞)として用いた。実施例２と同様の方法で調製した腫瘍源細胞であるiPS細胞(253G1株)と、移植モデル細胞HDFを細胞数１：１で混合し、蛍光ラベル化した(HiLyte Fluor 647を結合した)rBC2LCNレクチンと反応させた(図６Ａ)。フローサイトメトリー解析の結果、iPS細胞はrBC2LCNレクチンと結合し、移植モデル細胞HDFはrBC2LCNレクチンと結合しなかったため、元の混合比(１：１)とほぼ同じ50.4％と46.7％で分離した(図６Ｄ)。この割合は、あらかじめrBC2LCNレクチンと結合させたiPS細胞と移植モデル細胞HDFを細胞数１：１で混合し、フローサイトメトリー解析を行った結果とほぼ同等であった(図６Ｅ)。また、移植モデル細胞HDFのみをrBC2LCNレクチンと反応させた場合では、すべての細胞がrBC2LCNレクチンと結合せず(図６Ｂ)、iPS細胞のみをrBC2LCNレクチンと反応させた場合では、95.3％の細胞がrBC2LCNレクチンと結合した(図６Ｃ)。【０１１９】
このことはBC2LCNレクチンにより、未分化を維持したiPS細胞を有効に選別にすることができることを実証するものである。本性質を利用して、フローサイトメトリー法により細胞を生きたまま分収できることから、ES細胞、iPS細胞などの幹細胞を保存する際や未分化性を有したまま増殖させようとする際に、望ましくない混入した分化細胞を除去することも可能である。また、本性質を利用し、各種臓器細胞(心筋細胞、肝臓細胞、神経細胞、膵島細胞、軟骨細胞、骨細胞等)をES細胞、iPS細胞などの幹細胞から作製した際、未分化性を有したまま残留している細胞を、フローサイトメトリー法により除去することが可能である。【０１２０】
（実施例７）BC2LCNレクチンの幹細胞に対する結合力測定
本実施例で用いたヒトES細胞(H1株(WA01株))はWisconsin  International Stem Cell (WISC) Bankから分譲を受けた。培養方法は、WiCell  Research Instituteのプロトコールに従った。蛍光ラベル化した(HiLyte Fluor 647を結合した)rBC2LCNレクチンの希釈系列溶液(0.01，0.005，0.002，0.001，0.0005，0.0002，0.0001mg/ml)を作製し、酵素処理をして解離したヒトES細胞(H1株(WA01株))と反応させた。フローサイトメトリー解析の結果を逆数プロットすることにより、解離定数の近似値と考えられるミカエリス定数を算出したところ、Kd=2.0.E-07という値を得た(図７Ｂ)。BC2LCNレクチンとそのターゲットの糖鎖である「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」との結合力を、フロンタルアフィニティークロマトグラフで測定した際には、その解離定数はKd=4.0.E-05であり(図７Ａ)(PCT/JP2012/006983)、BC2LCNは、未分化幹細胞に対して非常に強い結合力を示すことが明らかとなった。【０１２１】
（実施例８）BC2LCNレクチンによる幹細胞に対する毒性検査と生体染色
本実施例で用いたヒトES細胞(H1株(WA01株))は、実施例７と同様の方法で調製した。継代の翌日から3日間、毎日培地交換する際に、rBC2LCNもしくはFITCと結合したrBC2LCNを添加し、培養4日目にES細胞の増殖活性をコロニーの形態観察により測定した(図８)。rBC2LCNを1，10，100μg/mlの濃度で添加した場合(図８Ｄ−Ｆ)、FITCと結合したrBC2LCNを1ug/mlの濃度で添加した場合(図８Ｂ)の全ての条件において、無処理のコロニー(図８Ａ)と同様の形態であった。これより、BC2LCN存在下での長期培養によってもES細胞の増殖活性が保たれることが示され、BC2LCNに細胞毒性がないことが確認された。【０１２２】
また、図８Ｂのコロニーを蛍光観察したところ、生きたままの状態で蛍光シグナルが得られることが分かった(図８Ｃ)。これより、蛍光標識したBC2LCNは毒性を示さずにヒト幹細胞と結合し、幹細胞の性質を判別する非侵襲的なツールとして有効であることも確認された。【０１２３】
（実施例９）BC2LCNレクチンによる幹細胞に対する毒性検査
実施例８で得られた各種処理条件のコロニーからRNAを抽出し、アジレント社のSurePrint G3 Human GE マイクロアレイキット8×60K(Agilent  G4851A)を用いて網羅的な遺伝子発現解析を行った。また、実施例１，２，４，５の方法で準備されたヒトES細胞(KhES-1株、KhES-3株)、ヒトiPS細胞(201B7株、253G1株)、ヒト繊維芽細胞(HDF株)のRNAも同様の遺伝子発現解析を行った。未分化時に特異的に観察される周知のヒトES細胞マーカー遺伝子(非特許文献４)である、NANOG、TDGF、GABRB3、DNMT3B、GDF3、POU5F1、FGF4、GAL、LEFT1、IFITM1、NODAL、TERT、UTF1、FOXD3、LEFT2、LIN28A、LIN28B、GRB7、PODXL、CD9、BRIX1の遺伝子発現を、アジレント社のGene-Spring GX12.0 softwareを用いて解析したところ、図８Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆから得られたES細胞において差異はなかった(図９)。これより、BC2LCN存在下での長期間培養によっても、幹細胞の未分化能が変化しないことが示された。【０１２４】
（実施例１０）BC2LCNレクチンによる幹細胞に対する毒性検査
実施例９で得られたDNAマイクロアレイデータを用いて、ヒト全遺伝子の発現パターンの相関を、それぞれのサンプル間で解析した。その結果、図８Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆから得られたES細胞においてヒトES細胞マーカー遺伝子のみならず、全遺伝子の発現量に関して、殆ど差異はなかった(図１０)。これより、BC2LCN存在下での長期間培養によっても、幹細胞の性質が変化しないことが示された。【０１２５】
（実施例１１）BC2LCNレクチンによる幹細胞に対する毒性検査と生体染色
本実施例で用いたヒトiPS細胞(201B7株)は理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けた。Tatenoらの手法（非特許文献１参照）により培養した。継代の翌日から５日間、毎日培地交換する際に、Cy3と結合したrBC2LCNを0.1μg/mlの濃度で添加し、2時間後に培地交換をせずに写真撮影をすることで、iPS細胞の増殖及び生体染色の有無を検証した(図１１)。その結果、位相差顕微鏡像で判定する限り、細胞増殖能の低下、細胞に対する毒性は観察されなかった(図１１Ａ−Ｅ)。これより、BC2LCN存在下での長期培養によってもiPS細胞の増殖活性が保たれることが示され、BC2LCNに細胞毒性がないことが確認された。【０１２６】
また、図１１Ａ-Ｅのコロニーをそれぞれ蛍光観察したところ、生きたままの状態で蛍光シグナルが得られることが分かった(図１１Ａ’−Ｅ’)。これより、蛍光標識したBC2LCNは毒性を示さずにヒト幹細胞と結合し、幹細胞の性質を判別する非侵襲的なツールとして有効であることも確認された。【０１２７】
（実施例１２）iPS細胞から分化させた各種細胞における細胞染色
本実施例で用いたiPS細胞（201B7株）は理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受けた。３胚葉への分化細胞を得るため、胚様体（EB）を作製した。EB は、Takahashiらの手法（非特許文献８参照）により作成した。EBは4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した後、Cy3標識rBC2LCNレクチンと、分化マーカーに対する抗体とを用いて同時に染色した。【０１２８】
結果を図１２に示す。Ａ，Ｂは外胚葉系細胞、Ｃ，Ｄは中胚葉系細胞、Ｅは内肺葉系細胞、Ｆは中胚葉系細胞及び内肺葉系細胞の観察像をそれぞれ示す。Ａ１〜Ｆ１は位相差顕微鏡像、Ａ２〜Ｆ２はrBC2LCNレクチンによる蛍光染色像を示す。Ａ３〜Ｆ３は分化マーカーに対する抗体による蛍光染色像を示し、Ａ３ではTuj1（外胚葉マーカー）、Ｂ３ではGFAP（同）、Ｃ３ではa-SMA（中胚葉マーカー）、Ｄ３ではDesmin（同）、Ｅ３ではAFP（内胚葉マーカー）、Ｆ３ではVimentin（中胚葉及び内胚葉マーカー）を用いた。【０１２９】
分化マーカーに対する抗体による染色によりiPS細胞がEB中において三胚葉へ分化したことが確認された（Ａ３〜Ｆ３参照）。一方、rBC2LCNによる染色では、いずれも陽性像を示さなかった（Ａ２〜Ｆ２参照）。この結果から、BC2LCNは分化細胞を染色しないことが明らかとなった。【０１３０】
（実施例１３）ES細胞から分化させた各種細胞における細胞染色
本実施例で用いたヒトES細胞（H1株（WA01株））はWisconsin International Stem Cell(WISC)Bankから分譲を受けた。上述の方法により、胚様体（EB）を作製し、Cy3標識rBC2LCNレクチンと、分化マーカーに対する抗体とを用いて同時に染色した。【０１３１】
結果を図１３に示す。Ａ，Ｂは外胚葉系細胞、Ｃ，Ｄは中胚葉系細胞、Ｅは内肺葉系細胞、Ｆは中胚葉系細胞及び内肺葉系細胞の観察像をそれぞれ示す。Ａ１〜Ｆ１は位相差顕微鏡像、Ａ２〜Ｆ２はrBC2LCNレクチンによる蛍光染色像を示す。Ａ３〜Ｆ３は分化マーカーに対する抗体による蛍光染色像を示し、Ａ３ではTuj1（外胚葉マーカー）、Ｂ３ではGFAP（同）、Ｃ３ではa-SMA（中胚葉マーカー）、Ｄ３ではDesmin（同）、Ｅ３ではAFP（内胚葉マーカー）、Ｆ３ではVimentin（中胚葉及び内胚葉マーカー）を用いた。【０１３２】
分化マーカーに対する抗体による染色によりES細胞がEB中において三胚葉へ分化したことが確認された（Ａ３〜Ｆ３参照）。一方、rBC2LCNによる染色では、いずれも陽性像を示さなかった（Ａ２〜Ｆ２参照）。この結果から、BC2LCNは分化細胞を染色しないことが明らかとなった。
【図１】
2013128914.tif 000004
【図２】
2013128914.tif 000005
【図３】
2013128914.tif 000006
【図４】
2013128914.tif 000007
【図５】
2013128914.tif 000008
【図６】
2013128914.tif 000009
【図７】
2013128914.tif 000010
【図８】
2013128914.tif 000011
【図９】
2013128914.tif 000012
【図１０】
2013128914.tif 000013
【図１１】
2013128914.tif 000014
【図１２】
2013128914.tif 000015
【図１３】
2013128914.tif 000016
【配列表】
2013128914000001.app
【国際調査報告】
2013128914.tif 000017
2013128914.tif 000018
2013128914.tif 000019
2013128914.tif 000020