(57)【要約】【課題】  正常細胞にほとんど影響を与えることなく癌細胞を死滅させることのできる抗腫瘍水溶液および抗癌剤とそれらの製造方法を提供することである。【解決手段】  癌細胞を死滅させる抗腫瘍水溶液の製造方法は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加した水溶液を準備する水溶液準備工程と、プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを水溶液に照射するプラズマ照射工程と、を有する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞を死滅させる抗腫瘍水溶液の製造方法において、
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加した水溶液を準備する水溶液準備工程と、
プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを前記水溶液に照射するプラズマ照射工程と、
を有すること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記プラズマ照射工程では、
前記プラズマ発生領域におけるプラズマ密度と、前記大気圧プラズマを前記水溶液に照射した時間との積であるプラズマ密度時間積を、
１．２×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上とすること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記プラズマ照射工程の後に、
前記大気圧プラズマを照射した前記水溶液に培養成分を添加する培養成分添加工程を有すること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記水溶液準備工程では、
前記水溶液として、水に培養成分を添加した培養液を準備し、
前記プラズマ照射工程では、
前記大気圧プラズマを前記培養液に照射すること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記プラズマ照射工程では、
前記プラズマ発生領域を前記水溶液に接触させない位置に前記水溶液の液面を配置した状態で前記大気圧プラズマを前記水溶液に照射すること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項６】
請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記プラズマ発生装置は、対向して配置されている第１の電極および第２の電極を有するものであり、
前記プラズマ照射工程では、
前記第１の電極および前記第２の電極を前記水溶液の外部であって前記水溶液の液面を挟まない位置に対向して配置し、前記大気圧プラズマを前記水溶液に照射すること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記第１の電極および前記第２の電極は、それぞれ対向面を有し、
前記対向面のそれぞれには、
微細な凹凸であるホローが形成されていること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項８】
請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の抗腫瘍水溶液の製造方法において、
前記抗腫瘍水溶液は、
前記癌細胞を選択的に死滅させるものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液の製造方法。
【請求項９】
癌細胞を死滅させる抗腫瘍水溶液において、
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に溶かした水溶液に大気圧プラズマを照射したものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗腫瘍水溶液において、
前記大気圧プラズマを照射する際には、
前記大気圧プラズマのプラズマ発生領域におけるプラズマ密度と、前記大気圧プラズマを前記水溶液に照射した時間との積であるプラズマ密度時間積を、
１．２×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上としたものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載の抗腫瘍水溶液において、
前記大気圧プラズマを照射した後の前記水溶液に培養成分を添加したものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１２】
請求項９または請求項１０に記載の抗腫瘍水溶液において、
前記水溶液は培養液であり、
前記大気圧プラズマを前記培養液に照射したものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１３】
請求項９から請求項１２までのいずれか１項に記載の抗腫瘍水溶液において、
前記癌細胞を選択的に死滅させるものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１４】
請求項９から請求項１３までのいずれか１項に記載の抗腫瘍水溶液において、
癌細胞のＡＫＴとＥＲＫとの少なくとも一方のシグナル伝達経路を遮断することにより癌細胞のアポトーシスを誘導するものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１５】
請求項９から請求項１４までのいずれか１項に記載の抗腫瘍水溶液において、
抗癌剤耐性を有する癌細胞を死滅させるものであること
を特徴とする抗腫瘍水溶液。
【請求項１６】
癌細胞を死滅させる抗癌剤の製造方法において、
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加した水溶液を準備する水溶液準備工程と、
プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを前記水溶液に照射するプラズマ照射工程と、
を有すること
を特徴とする抗癌剤の製造方法。
【請求項１７】
癌細胞を死滅させる抗癌剤において、
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に溶かした水溶液に大気圧プラズマを照射したものであり、
癌細胞を選択的に死滅させるものであること
を特徴とする抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍水溶液および抗癌剤とそれらの製造方法に関する。さらに詳細には、癌細胞を死滅させることのできる抗腫瘍水溶液および抗癌剤とそれらの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プラズマ技術は、電気、化学、材料の各分野に応用されている。そして、近年においては、医療への応用が活発に研究されるようになってきた。プラズマの内部では、電子やイオン等の荷電粒子の他に、紫外線やラジカルが発生する。これらには、生体組織の殺菌をはじめとして、生体組織に対する種々の効果があることが分かってきている。【０００３】
例えば、特許文献１には、プラズマの照射により、血液凝固（特許文献１の実施例４、段落［００６３］−［００６８］参照）と、組織滅菌（特許文献１の実施例５、段落［００６９］−［００７４］参照）と、リーシュマニア症（特許文献１の実施例６、段落［００７５］−［００７７］参照）といった、効果があることが記載されている。そして、メラノーマ細胞（悪性黒色腫細胞）を死滅させる効果があると記載されている（特許文献１の実施例７、段落［００７８］参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５３９００７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、このような癌の治療においては一般に、１）癌細胞を死滅させるとともに、２）正常細胞に影響を与えないようにすることが好ましい。たとえ、癌細胞を死滅させることができたとしても、そのために多数の正常細胞を死滅させると、患者に加わる肉体的負担が大きいからである。そのため、このように癌細胞を選択的に死滅させる治療技術が望まれている。しかし、癌細胞を選択的に死滅させることは容易ではない。特許文献１では、正常細胞への影響の程度が明らかではない。【０００６】
本発明は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。すなわちその課題とするところは、正常細胞にほとんど影響を与えることなく癌細胞を死滅させることのできる抗腫瘍水溶液および抗癌剤とそれらの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法は、癌細胞を死滅させる抗腫瘍効果を有する抗腫瘍水溶液の製造方法である。この抗腫瘍水溶液の製造方法は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加した水溶液を準備する水溶液準備工程と、プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを水溶液に照射するプラズマ照射工程と、を有する。【０００８】
この製造方法により製造された抗腫瘍水溶液は、癌細胞を死滅させるとともに、正常細胞をほとんど死滅させることがない。したがって、この抗腫瘍水溶液を直接癌細胞に接触させる方法や、患者に抗腫瘍水溶液を内服させる方法や、患者を開腹等して癌の発生している臓器の周囲を抗腫瘍水溶液で満たす方法を用いることにより、ヒトの癌を治療することができる。【０００９】
第２の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法において、プラズマ照射工程では、プラズマ発生領域におけるプラズマ密度と、大気圧プラズマを水溶液に照射した時間との積であるプラズマ密度時間積を、１．２×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上とする。【００１０】
第３の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法は、プラズマ照射工程の後に、大気圧プラズマを照射した水溶液に培養成分を添加する培養成分添加工程を有する。【００１１】
第４の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法において、水溶液準備工程では、水溶液として、水に培養成分を添加した培養液を準備する。プラズマ照射工程では、大気圧プラズマを培養液に照射する。【００１２】
第５の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法において、プラズマ照射工程では、プラズマ発生領域を水溶液に接触させない位置に水溶液の液面を配置した状態で大気圧プラズマを水溶液に照射する。【００１３】
第６の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法では、プラズマ発生装置は、対向して配置されている第１の電極および第２の電極を有するものである。プラズマ照射工程では、第１の電極および第２の電極を水溶液の外部であって水溶液の液面を挟まない位置に対向して配置し、大気圧プラズマを水溶液に照射する。【００１４】
第７の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法では、第１の電極および第２の電極は、それぞれ対向面を有する。そして、対向面のそれぞれには、微細な凹凸であるホローが形成されている。【００１５】
第８の態様における抗腫瘍水溶液の製造方法では、抗腫瘍水溶液は、癌細胞を選択的に死滅させるものである。【００１６】
第９の態様における抗腫瘍水溶液は、癌細胞を死滅させる抗腫瘍効果を有する。この抗腫瘍水溶液は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に溶かした水溶液に大気圧プラズマを照射したものである。【００１７】
第１０の態様における抗腫瘍水溶液は、大気圧プラズマを照射する際には、大気圧プラズマのプラズマ発生領域におけるプラズマ密度と、大気圧プラズマを水溶液に照射した時間との積であるプラズマ密度時間積を、１．２×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上としたものである。【００１８】
第１１の態様における抗腫瘍水溶液は、大気圧プラズマを照射した後の上記の水溶液に培養成分を添加したものである。【００１９】
第１２の態様における抗腫瘍水溶液では、水溶液は培養液であり、大気圧プラズマを培養液に照射したものである。【００２０】
第１３の態様における抗腫瘍水溶液は、癌細胞を選択的に死滅させるものである。【００２１】
第１４の態様における抗腫瘍水溶液は、癌細胞のＡＫＴとＥＲＫとの少なくとも一方のシグナル伝達経路を遮断することにより癌細胞のアポトーシスを誘導するものである。【００２２】
第１５の態様における抗腫瘍水溶液は、抗癌剤耐性を有する癌細胞を死滅させるものである。【００２３】
第１６の態様における抗癌剤の製造方法は、癌細胞を死滅させる抗癌剤を製造する方法である。この抗癌剤の製造方法は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加した水溶液を準備する水溶液準備工程と、プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを水溶液に照射するプラズマ照射工程と、を有する。【００２４】
第１７の態様における抗癌剤は、癌細胞を死滅させるものである。この抗癌剤は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に溶かした水溶液に大気圧プラズマを照射したものであり、癌細胞を選択的に死滅させるものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、正常細胞にほとんど影響を与えることなく癌細胞を死滅させることのできる抗腫瘍水溶液および抗癌剤とそれらの製造方法が提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】プラズマ照射装置のガス噴出口を走査するロボットアームの構成を説明するための概念図である。
【図２】図２．Ａは第１のプラズマ照射装置の構成を示す断面図であり、図２．Ｂは電極の形状を示す図である。
【図３】図３．Ａは第２のプラズマ照射装置の構成を示す断面図であり、図３．Ｂはプラズマ領域の長手方向に垂直な断面における部分断面図である。
【図４】実験Ａにおいて癌細胞培養地を「プラズマ培養液」に浸した場合の結果を示す顕微鏡写真である。
【図５】実験Ａにおいて癌細胞培養地を「アルゴンガスを照射した培養液」に浸した場合の結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】実験Ａにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」に浸した場合の結果を示す顕微鏡写真である。
【図７】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数１０００個：プラズマ照射時間１分）である。
【図８】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数５０００個：プラズマ照射時間１分）である。
【図９】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数１００００個：プラズマ照射時間１分）である。
【図１０】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数１０００個：プラズマ照射時間３分）である。
【図１１】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数５０００個：プラズマ照射時間３分）である。
【図１２】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数１００００個：プラズマ照射時間３分）である。
【図１３】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数１０００個：プラズマ照射時間５分）である。
【図１４】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数５０００個：プラズマ照射時間５分）である。
【図１５】実験Ｂにおいて癌細胞培養地を「通常の培養液」および「アルゴンガスを照射した培養液」および「プラズマ培養液」に浸した場合の癌細胞生存率を比較するためのグラフ（細胞数１００００個：プラズマ照射時間５分）である。
【図１６】実験Ｃにおいて「プラズマ培養液」の効果を癌細胞と正常細胞とで比較したグラフである。
【図１７】実験Ｄにおいて「プラズマ培養液」の抗腫瘍効果の持続時間を示すグラフである。
【図１８】実験Ｅにおいて細胞のシグナル伝達経路のうちＡＫＴのトータルの発現量と活性化の度合いを示す図である。
【図１９】実験Ｅにおいて細胞のシグナル伝達経路のうちＥＲＫのトータルの発現量と活性化の度合いを示す図である。
【図２０】実験Ｆにおいてアルゴン水素プラズマを照射した培養液の抗腫瘍効果を示す図である。
【図２１】実験Ｆにおいてアルゴン水素プラズマを照射した培養液の抗腫瘍効果の選択性を示す図である。
【図２２】実験Ｇにおいて水にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図２３】実験Ｇにおいてリン酸水素二ナトリウム水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図２４】実験Ｇにおいて炭酸水素ナトリウム水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図２５】実験ＧにおいてＬ−グルタミン水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図２６】実験ＧにおいてＬ−ヒスチジン水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図２７】実験ＧにおいてＬ−チロシン二ナトリウム二水和物水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図２８】実験Ｇにおいて種々の単一成分水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフ（その１）である。
【図２９】実験Ｇにおいて種々の単一成分水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフ（その２）である。
【図３０】実験Ｇにおいて種々の単一成分水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフ（その３）である。
【図３１】実験Ｇにおいて種々の単一成分水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフ（その４）である。
【図３２】実験Ｇにおいて５種類の溶質を溶解させた水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図３３】実験Ｇにおいてリン酸水素二ナトリウム水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果の濃度依存性を調べた結果を示すグラフである。
【図３４】実験Ｇにおいて炭酸水素ナトリウム水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果の濃度依存性を調べた結果を示すグラフである。
【図３５】実験Ｇにおいて塩化カリウム水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図３６】実験Ｇにおいて塩化ナトリウム水溶液にプラズマ照射した後で培養液を添加したプラズマ溶液における抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。
【図３７】実験Ｈにおいて抗癌剤耐性の卵巣癌細胞に対するプラズマ培養液の抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフ（その１）である。
【図３８】実験Ｈにおいて抗癌剤耐性の卵巣癌細胞に対するプラズマ培養液の抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフ（その２）である。
【図３９】実験Ｈにおいて通常の培養液もしくはプラズマ培養液を抗癌剤耐性のある細胞とない細胞とに対して投与した場合の細胞を示す顕微鏡写真（その１）である。
【図４０】実験Ｈにおいて通常の培養液もしくはプラズマ培養液を抗癌剤耐性のある細胞とない細胞とに対して投与した場合の細胞を示す顕微鏡写真（その２）である。
【図４１】実験Ｈにおいて通常の培養液もしくはプラズマ培養液を抗癌剤耐性のある細胞とない細胞とに対して投与した場合の細胞を示す顕微鏡写真（その３）である。
【図４２】実験Ｈにおいて通常の培養液もしくはプラズマ培養液を抗癌剤耐性のある細胞とない細胞とに対して投与した場合の細胞を示す顕微鏡写真（その４）である。
【図４３】実験Ｈにおいて通常の培養液もしくはプラズマ培養液を抗癌剤耐性のある細胞とない細胞とに対して投与した場合の細胞を示す顕微鏡写真（その５）である。
【図４４】実験Ｈにおいて通常の培養液もしくはプラズマ培養液を抗癌剤耐性のある細胞とない細胞とに対して投与した場合の細胞を示す顕微鏡写真（その６）である。
【図４５】実験Ｉにおいて卵巣癌細胞を投与したヌードマウスにプラズマ培養液もしくは通常の培養液を投与した場合を比較する写真（その１）である。
【図４６】実験Ｉにおいて卵巣癌細胞を投与したヌードマウスにプラズマ培養液もしくは通常の培養液を投与した場合を比較する写真（その２）である。
【図４７】実験Ｉにおいて卵巣癌細胞を投与したヌードマウスにプラズマ培養液もしくは通常の培養液を投与した場合の腫瘍の体積変化を示すグラフ（その１）である。
【図４８】実験Ｉにおいて卵巣癌細胞を投与したヌードマウスにプラズマ培養液もしくは通常の培養液を投与した場合の腫瘍の体積変化を示すグラフ（その１）である。
【図４９】実験Ｉにおいて卵巣癌細胞を投与したヌードマウスにプラズマ培養液もしくは通常の培養液を投与して２８日経過した場合の腫瘍の重さを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、具体的な実施形態について、プラズマ溶液とその製造方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。
【００２８】
１．プラズマ溶液製造装置
１−１．プラズマ溶液製造装置の構成
本実施形態のプラズマ溶液製造装置ＰＭは、図１に示すように、プラズマ照射部Ｐ１と、アームロボットＭ１とを有している。プラズマ照射装置Ｐ１は、プラズマを発生させるとともに、そのプラズマを溶液に向けて照射するためのものである。プラズマ照射装置Ｐ１には、後述するように、２種類の方式（第１のプラズマ照射装置１００および第２のプラズマ照射装置２００）がある。そして、いずれの方式を用いてもよい。
【００２９】
アームロボットＭ１は、図１に示すように、プラズマ照射装置Ｐ１の位置をｘ軸、ｙ軸、ｚ軸方向のそれぞれの方向に移動させることができるようになっている。なお、説明の便宜上、プラズマを照射する向きを−ｚ軸方向としている。これにより、溶液の液面と、プラズマ照射部Ｐ１との間の距離を調整することができる。また、このプラズマ溶液製造装置ＰＭは、予めプラズマ照射時間を設定することにより、その時間だけプラズマを照射することができるものである。
【００３０】
１−２．第１のプラズマ照射装置
図２．Ａはプラズマ照射装置１００の概略構成を示す断面図である。ここで、プラズマ照射装置１００は、プラズマを点状に噴出する第１のプラズマ照射装置である。図２．Ｂは、図２．Ａのプラズマ照射装置１００の電極２ａ、２ｂの形状を詳細を示す図である。
【００３１】
プラズマ照射装置１００は、筐体部１０と、電極２ａ、２ｂと、電圧印加部３と、を有している。筐体部１０は、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）を原料とする焼結体から成るものである。そして、筐体部１０の形状は、筒形状である。筐体部１０の内径は２〜３ｍｍである。筐体部１０の厚みは０．２〜０．３ｍｍである。筐体部１０の長さは２５ｃｍである。筐体部１０の両端には、ガス導入口１０ｉと、ガス噴出口１０ｏとが形成されている。ガス導入口１０ｉは、プラズマを発生させるためのガスを導入するためのものである。ガス噴出口１０ｏは、プラズマを筐体部１０の外部に照射するための照射部である。なお、ガスの移動する向きは、図中の矢印の向きである。
【００３２】
電極２ａ、２ｂは、対向して配置されている対抗電極対である。電極２ａ、２ｂの対抗面方向の長さは、筐体部１０の内径より小さい。例えば１ｍｍ程度である。電極２ａ、２ｂには、図２．Ｂに示すように、対向面のそれぞれに凹部（ホロー）Ｈが多数形成されている。そのため、電極２ａ、２ｂの対抗面は、微細な凹凸形状となっている。なお、この凹部Ｈの深さは、０．５ｍｍ程度である。
【００３３】
電極２ａは、筐体部１０の内部であってガス導入口１０ｉの近傍に配置されている。電極２ｂは、筐体部１０の内部であってガス噴出口１０ｏの近傍に配置されている。そのため、プラズマ照射装置１００では、電極２ａの対抗面の反対側からガスを導入するとともに、電極２ｂの対抗面の反対側にガスを噴出するようになっている。そして、電極２ａ、２ｂ間の距離は、２４ｃｍである。電極２ａ、２ｂ間の距離は、これより小さい距離であってもよい。
【００３４】
電圧印加部３は、電極２ａ、２ｂ間に交流電圧を印加するためのものである。電圧印加部３は、商用交流電圧である、６０Ｈｚ、１００Ｖを用いて９ｋＶに昇圧するとともに、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加する。
【００３５】
ガス導入口１０ｉからアルゴンを導入するとともに、電圧印加部３により、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加すると、筐体部１０の内部にプラズマが発生する。図２．Ａの斜線で示すように、プラズマが発生する領域をプラズマ発生領域Ｐとする。プラズマ発生領域Ｐは、筐体部１０に覆われている。
【００３６】
１−３．第２のプラズマ照射装置
図３．Ａはプラズマ照射装置１１０の概略構成を示す断面図である。ここで、プラズマ照射装置１１０は、プラズマを線状に噴出する第２のプラズマ照射装置である。図３．Ｂは、図３．Ａのプラズマ照射装置１１０のプラズマ領域Ｐの長手方向に垂直な断面における部分断面図である。
【００３７】
プラズマ照射装置１１０は、筐体部１１と、電極２ａ、２ｂと、電圧印加部３と、を有している。筐体部１１は、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）を原料とする焼結体から成るものである。筐体部１１の両端には、ガス導入口１１ｉと、多数のガス噴出口１１ｏとが形成されている。ガス導入口１１ｉは、図３．Ａの左右方向を長手方向とするスリット形状をしている。ガス導入口１１ｉからプラズマ領域Ｐの直上までのスリット幅（図３．Ｂの左右方向の幅）は１ｍｍである。
【００３８】
ガス噴出口１１ｏは、プラズマを筐体部１１の外部に照射するための照射部である。ガス噴出口１１ｏは、円筒形状もしくはスリット形状である。円筒形状の場合のガス噴出口１１ｏは、プラズマ領域の長手方向に沿って一直線状に形成されている。ガス噴出口１１ｏの内径は１〜２ｍｍの範囲内である。また、スリット形状場合には、ガス噴出口１１ｏのスリット幅を１ｍｍ以下とすることが好ましい。これにより、安定したプラズマが形成される。ガス導入口１１ｉは、電極２ａと電極２ｂとを結ぶ線と交差する向きにガスを導入するようになっている。
【００３９】
電極２ａ、２ｂおよび電圧印加部３については、図１に示したプラズマ照射装置１００と同じものである。そして、同様に、商用交流電圧を用いて、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加する。これにより、プラズマを一直線状に噴出することができる。
【００４０】
また、この一直線状にプラズマを噴出するプラズマ照射装置１１０を図３．Ｂの左右方向に列状に並べて配置すれば、プラズマをある長方形の領域にわたって平面的に噴出することができる。
【００４１】
後述する実験では、ガス噴出口１１ｏを複数配置することにより、ほぼ円形の平面領域にプラズマを噴出することができるプラズマ照射装置を用いた。
【００４２】
２．プラズマ照射装置により発生されるプラズマ
プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマは、非平衡大気圧プラズマである。ここで、大気圧プラズマとは、０．５気圧以上２．０気圧以下の範囲内の圧力であるプラズマをいう。
【００４３】
本実施の形態では、プラズマ発生ガスとして、主にＡｒガスを用いる。プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマの内部では、もちろん、電子と、Ａｒイオンとが生成されている。そして、Ａｒイオンは、紫外線を発生する。また、このプラズマは大気中に放出されているため、酸素ラジカルや窒素ラジカルを発生させる。
【００４４】
このプラズマのプラズマ密度は、１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内である。なお、誘電バリア放電により発生されるプラズマにおけるプラズマ密度は、１×１０11ｃｍ-3〜１×１０13ｃｍ-3程度である。したがって、プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマのプラズマ密度は、誘電バリア放電により発生されるプラズマのプラズマ密度に比べて、３桁程度大きい。したがって、このプラズマの内部では、より多くのＡｒイオンが生成する。そのため、ラジカルや、紫外線の発生量も多い。なお、このプラズマ密度は、プラズマ内部の電子密度にほぼ等しい。
【００４５】
そして、このプラズマ発生時におけるプラズマ温度は、およそ１０００Ｋ〜２５００Ｋの範囲内である。また、このプラズマにおける電子温度は、ガスの温度に比べて大きい。しかも、電子の密度が１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内の程度であるにもかかわらず、ガスの温度はおよそ１０００Ｋ〜２５００Ｋである。このプラズマの温度は、プラズマの発生しているプラズマ領域Ｐでの温度である。したがって、プラズマの条件や、ガス噴出口から癌細胞までの距離を異なる条件とすることにより、癌細胞の位置でのプラズマ温度を室温程度とすることができる。そのため、このプラズマを癌細胞および正常細胞に照射した場合に、これらの細胞に熱による損傷を与えるおそれはほとんどない。
【００４６】
また、酸素ラジカル密度は、２×１０14ｃｍ-3以上１．６×１０15ｃｍ-3以下の範囲内である。アルゴンガスに対して混入する酸素ガスの量を調整することにより、この酸素ラジカル密度を調整することができる。
【００４７】
３．プラズマ溶液
本実施形態のプラズマ溶液は、原材料溶液に予め定めた時間だけプラズマを照射したものである。ここで、原材料溶液とは、水系溶媒を用いる水溶液である。そして、原材料溶液として、水に培養成分を混入したものを用いるとよい。つまり、原材料溶液とは、細胞等を培養するための培養液である。培養液として、例えば、ＤＭＥＭが挙げられる。そして、ＤＭＥＭには、グルコース等の糖が含まれている。ここで、培養成分とは、細胞等を培養するための培養液に含まれる成分である。例えば、後述する表３（ＤＭＥＭ成分）および表９（ＲＰＭＩ１６４０成分）の双方に記載されているものである。
【００４８】
４．プラズマ溶液の製造方法
本実施形態のプラズマ溶液の製造方法には、２種類の方法がある。よって、それぞれの方法について説明する。
【００４９】
４−１．プラズマ溶液の製造方法（第１の方法）
４−１−１．水溶液準備工程（第１の方法）
まず、第１の方法について説明する。水溶液として、後述する表３（ＤＭＥＭ成分）および表９（ＲＰＭＩ１６４０成分）に示す成分を有する培養液を準備する。つまり、水にこれらの培養成分を添加した培養液を準備する。
【００５０】
４−１−２．プラズマ照射工程（第１の方法）
次に、前述したプラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを培養液に照射する。プラズマを照射する際における液面とプラズマ噴出口との間の距離は、例えば、１ｃｍである。また、この距離は、０．５ｃｍ以上３ｃｍ以下の範囲内で変えてもよい。このプラズマのプラズマ密度は、１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内である。そして、このプラズマにおけるプラズマ温度は、およそ１０００Ｋ〜２５００Ｋの範囲内である。ただし、このプラズマ温度は、液面では、室温程度（３００Ｋ程度）まで下げることもできる。また、酸素ラジカル密度は、２×１０14ｃｍ-3以上１．６×１０15ｃｍ-3以下の範囲内である。これらのプラズマ条件を表１に示す。
【００５１】
［表１］
条件                          数値範囲
液面−噴出口距離            ０．５ｃｍ以上                ３ｃｍ以下
プラズマ密度          １×１０14ｃｍ-3以上      １×１０17ｃｍ-3以下
プラズマ温度                １０００Ｋ以上            ２５００Ｋ以下
酸素ラジカル密度      ２×１０14ｃｍ-3以上  １．６×１０15ｃｍ-3以下
【００５２】
なお、後述する実験のところで説明するように、抗腫瘍効果を有するプラズマ溶液を製造するためには、プラズマ密度時間積を、次の条件を満たすようにする。
１．２×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上
ここで、プラズマ密度時間積とは、プラズマ発生領域におけるプラズマ密度と、大気圧プラズマをこの水溶液に照射した時間（照射時間）との積である。
【００５３】
４−２．プラズマ溶液の製造方法（第２の方法）
４−２−１．水溶液準備工程（第１の方法）
ここでは、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）とのうちの少なくとも１種類を含む溶質を水に添加した水溶液を準備する。
【００５４】
４−２−２．プラズマ照射工程（第２の方法）
次に、前述したプラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを水溶液に照射する。プラズマを照射する際の種々の条件は、第１の方法と同様である。
【００５５】
４−２−３．培養成分添加工程（第２の方法）
次に、大気圧プラズマを照射済みの水溶液に、後述する表３（ＤＭＥＭ成分）および表９（ＲＰＭＩ１６４０成分）に示す成分を添加する。
【００５６】
５．プラズマ溶液を用いた癌の治療
５−１．プラズマ溶液の性質および用途（抗癌剤）
後の実験結果に示すように、このプラズマ溶液は、癌細胞を死滅させる抗腫瘍効果を有する抗腫瘍水溶液である。つまり、このプラズマ溶液は、抗癌作用を有する抗癌剤である。この抗癌作用は、プラズマの照射開始から１８時間未満の時間内に発揮される。また、抗癌作用を有するのは、プラズマの照射時間が１分以上のプラズマ溶液である。そして、本実施形態のプラズマ溶液は、後述するように、正常細胞にはほとんどダメージを与えない。
【００５７】
６．実験Ａ（プラズマ培養液の抗腫瘍効果と浸漬時間）
本実験は、プラズマ培養液の抗腫瘍効果を調べるために行った実験である。また、癌細胞をどの程度の時間プラズマ培養液に曝せば癌細胞が死滅するかを確かめるために行った実験である。ここで、プラズマ培養液とは、培養液にプラズマを照射した溶液である。すなわち、プラズマ溶液の一種である。
【００５８】
６−１．用いた癌細胞
本実験では、グリオーマを用いた。グリオーマは、神経膠細胞（グリア細胞）に発生する神経膠腫である。すなわち、脳腫瘍の一種である。グリオーマとして、具体的には、表２に示すものを用いた。つまり、Ｕ２５１ＳＰおよびＵ８７ＭＧである。
【００５９】
［表２］
細胞名            状態            種類
Ｕ２５１ＳＰ      癌細胞          グリオーマ
Ｕ８７ＭＧ        癌細胞          グリオーマ
ＲＩ−３７１      正常細胞        アストロサイト
【００６０】
６−２．実験方法
６−２−１．癌細胞培養地
上記の癌細胞を、プレートに培養して癌細胞培養地を作成した。プレートは、プラスチック製の容器である。そして、プレートの内部には、培養液を入れた。その培養液は、ＤＭＥＭと血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）とを混合した溶液である。ＤＭＥＭの成分を、表３に示す。
【００６１】
［表３］
塩化カルシウム
硝酸第二鉄・９Ｈ2 Ｏ
硫酸マグネシウム（無水）
塩化カリウム
炭酸水素ナトリウム
塩化ナトリウム
リン酸−ナトリウム（無水）
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ
Ｌ−グルタミン
グリシン
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ2 Ｏ
Ｌ−イソロイシン
Ｌ−ロイシン
Ｌ−リジン・ＨＣｌ
Ｌ−メチオニン
Ｌ−フェニルアラニン
Ｌ−セリン
Ｌ−スレオニン
Ｌ−トリプトファン
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ
Ｌ−バリン
塩化コリン
葉酸
ｍｙｏ−イノシトール
ナイアシンアミド
Ｄ−パントテン酸
ピリドキシン・ＨＣｌ
リボフラビン
チアミン・ＨＣｌ
Ｄ−グルコース
フェノールレッド・Ｎａ
【００６２】
６−２−２．プラズマ培養液の作成
癌細胞培養地を用意するのとは別に、プラズマ培養液を作成した。本実験では、６個の穴が設けられたプレートを用いた。この穴は、非貫通孔である。そのため、穴の内部に溶液を入れることができるようになっている。まず、このプレートの穴に３ｍＬの培養液を入れる。ここで用いた培養液は、前述したＤＭＥＭと血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）とを混合した溶液である。ＤＭＥＭの成分は、表３のとおりである。
【００６３】
次に、プラズマ溶液製造装置ＰＭを用いて、プラズマを培養液に照射する。その際、プラズマ発生領域を培養液に接触させない位置に培養液の液面を配置した状態で大気圧プラズマを水溶液に照射した。そして、プラズマ溶液製造装置ＰＭの対向電極を培養液の外部であって培養液の液面を挟まない位置に対向して配置した。その状態で、大気圧プラズマを水溶液に照射した。このように、プラズマ発生領域は、培養液に接触していないが、プラズマ中で生成される種々のラジカルが培養液に照射される。プラズマがプレートにおける培養液の上方の大気を押し出すようにする。そのため、プラズマ照射時間中には、培養液は大気に触れることがほとんどない。
【００６４】
そのプラズマの条件を、表４に示す。プラズマを発生させるためのガスとしてアルゴンガスのみを用いた。ガスの流量は、２．０ｓｌｍであった。また、プラズマ噴出口と液面との間の距離は、１３ｍｍであった。そして、プラズマ照射時間は、５分であった。また、プラズマ発生領域におけるプラズマ密度は、２×１０16ｃｍ-3であった。
【００６５】
［表４］
ガスの流量                            ２．０ｓｌｍ
プラズマ噴出口と液面との間の距離      １３ｍｍ
プラズマ照射時間                      ５分
プラズマ密度（発生時）                ２×１０16ｃｍ-3
【００６６】
６−２−３．癌細胞培養地へのプラズマ培養液の供給
次に、癌細胞培養地にプラズマ培養液を供給する。具体的には、癌細胞培養地から培養液を除去し、プラズマ培養液を癌細胞培養地に入れる。その際のプラズマ培養液の供給量は、０．２ｍＬである。そして、培養液をプラズマ培養液に交換してから予め定めた時間が経過した後に、培養液を再び交換する。ここで癌細胞培養地に供給する培養液は、通常の培養液である。
【００６７】
このように癌細胞をプラズマ培養液に浸す時間を変えて、癌細胞の生存率を調べた。そして、プラズマ培養液を癌細胞培養地に供給してから１６時間経過後に、癌細胞の生存率を調べた。その際に、顕微鏡観察により、生存している癌細胞の数をカウントした。
【００６８】
６−３．実験結果
実験結果を表５に示す。表５における各癌細胞（Ｕ２５１ＳＰ、Ｕ８７ＭＧ）の下段の数値は、癌細胞の生存率を示している。この数値が「１」の場合には、癌細胞が生きていることを示している。「０」の場合には、癌細胞が全て死滅していることを示している。０．６の場合には、プラズマ培養液を供給する前に比べて６０％程度の数の癌細胞が生きていることを示している。
【００６９】
表５に示すように、浸漬時間が３０分以上となると、癌細胞が死滅する。つまり、癌細胞を死滅させるためには、プラズマ培養液に３０分以上浸漬する必要がある。そして、浸漬時間が３０分以上６０分未満の場合に、プラズマ培養液は抗腫瘍効果を奏する。
【００７０】
なお、表５において、「処置無し」とは、プラズマ培養液ではなく、通常の培養液を用いた場合である。「Ａｒガス」とは、培養液にプラズマでないＡｒガスのみを吹きつけた場合である。これらは、プラズマ培養液に癌細胞の滅菌効果があることを示すための比較例である。
【００７１】
［表５］
浸漬時間            Ｕ２５１ＳＰ          Ｕ８７ＭＧ
１分                    １                  １
５分                    １                  １
１０分                    １                  １
３０分                    １                  １
６０分                ０．１              ０．６
１２０分                    ０                  ０
１６時間                    ０                  ０
処置無し                    １                  １
Ａｒガス                    １                  １
【００７２】
ここで、実際の顕微鏡写真を図４から図６までに示す。これらの癌細胞は、いずれもＵ２５１ＳＰである。図４は、プラズマ培養液による浸漬を行った場合の顕微鏡写真である。この場合は、表５の「１６時間」の場合に対応している。図５は、アルゴンガスを吹きつけた培養液による浸漬を行った場合の顕微鏡写真である。この場合は、表５の「Ａｒガス」の場合に対応している。図６は、通常の培養液を交換した場合の顕微鏡写真である。この場合は、表５の「処置無し」の場合に対応している。
【００７３】
ここで、各図におけるバーは、１００μｍの長さを示している。図４の矢印の箇所に、アポトーシスの誘導により死滅した癌細胞を示す。
【００７４】
このように、プラズマ培養液には、抗腫瘍効果がある。つまり、プラズマ培養液は、抗腫瘍効果のある抗癌剤である。
【００７５】
７．実験Ｂ（プラズマ照射時間と抗腫瘍効果）
７−１．用いた癌細胞
本実験では、癌細胞として、表２に示したＵ２５１ＳＰ（グリオーマ）を用いた。
【００７６】
７−２．実験方法
本実験では、実験Ａと同じように、癌細胞培養地をプラズマ培養液で浸した。ここで、プラズマ培養液と、癌細胞培養地とを、組み合わせて抗腫瘍効果について調べた。プラズマ培養液として、プラズマ照射時間を変えた次の３通りのものを用意した。
プラズマ照射時間          １分
プラズマ照射時間          ３分
プラズマ照射時間          ５分
【００７７】
そして、癌細胞培養地として、癌細胞の数を変えた。すなわち、癌細胞培養地における癌細胞の密度が異なっている。癌細胞の数として、次の３通りのものを用意した。
癌細胞（Ｕ２５１ＳＰ）        １０００個
癌細胞（Ｕ２５１ＳＰ）        ５０００個
癌細胞（Ｕ２５１ＳＰ）      １００００個
【００７８】
そして、これらのプラズマ照射時間（３通り）と癌細胞の数（３通り）とを組み合わせることにより、「プラズマ培養液」に癌細胞を浸した９種類のサンプルについて実験を行った。また、比較例として、「アルゴンガスを照射した培養液」に癌細胞を浸した９種類のサンプルについても同様に実験を行った。また、別の比較例として、通常の培養液に癌細胞を浸した３種類のサンプルについて実験を行った。この場合には、癌細胞の数を変えた。以上、２１種類のサンプルについて実験を行った。
【００７９】
７−３．実験結果
実験結果を、図７から図１５までに示す。各図の縦軸は、任意の単位である。ただし、癌細胞の数を示している。癌細胞が１０００個の場合には、０．５程度の数値を示し、癌細胞が５０００個の場合には、２程度の数値を示し、癌細胞が１００００個の場合には、４程度の数値を示している。
【００８０】
７−３−１．１分照射
図７は、癌細胞１０００個に、プラズマ照射時間が１分のプラズマ培養液を浸したものである。図８は、癌細胞５０００個に、プラズマ照射時間が１分のプラズマ培養液を浸したものである。図９は、癌細胞１００００個に、プラズマ照射時間が１分のプラズマ培養液を浸したものである。図７（１分、１０００個）に示すように、この場合には、プラズマ培養液による抗腫瘍効果がみられた。図８（１分、５０００個）および図９（１分、１００００個）の場合には、抗腫瘍効果が見られなかった。
【００８１】
７−３−２．３分照射
図１０は、癌細胞１０００個に、プラズマ照射時間が３分のプラズマ培養液を浸したものである。図１１は、癌細胞５０００個に、プラズマ照射時間が３分のプラズマ培養液を浸したものである。図１２は、癌細胞１００００個に、プラズマ照射時間が３分のプラズマ培養液を浸したものである。図１０から図１２のまでのいずれの場合であっても、抗腫瘍効果が見られた。
【００８２】
７−３−３．５分照射
図１３は、癌細胞１０００個に、プラズマ照射時間が５分のプラズマ培養液を浸したものである。図１４は、癌細胞５０００個に、プラズマ照射時間が５分のプラズマ培養液を浸したものである。図１５は、癌細胞１００００個に、プラズマ照射時間が５分のプラズマ培養液を浸したものである。図１３から図１５のまでのいずれの場合であっても、抗腫瘍効果が見られた。
【００８３】
このように、プラズマ密度が２×１０16ｃｍ-3の大気圧プラズマを、６０ｓｅｃ以上照射することにより、プラズマ溶液は、抗腫瘍効果を有する。つまり、プラズマ密度時間積を、
１．２×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上
とすればよい。
【００８４】
そして、細胞数が増えるほど、癌細胞の生存率が高い。これは、プラズマ培養液の中で抗腫瘍効果を有する物質が生成され、その抗腫瘍効果を有する物質が癌細胞に効果を及ぼすとともに消費されていることを示している。そのため、プラズマ密度時間積を、
３．６×１０18ｓｅｃ・ｃｍ-3以上
とすると、さらによい。これは、プラズマ密度が２×１０16ｃｍ-3の大気圧プラズマを、１８０ｓｅｃ以上照射した場合に相当する。
【００８５】
８．実験Ｃ（癌細胞への影響と正常細胞への影響との比較）
８−１．用いた癌細胞および正常細胞
本実験では、癌細胞として、表２に示したＵ２５１ＳＰ（グリオーマ）を用いた。一方、正常細胞として、表２に示したＲＩ−３７１（アストロサイト）を用いた。プラズマ培養液の癌細胞への影響と正常細胞への影響とを比較するためである。
【００８６】
８−２．実験方法
癌細胞培養地および正常細胞培養地にプラズマ培養液を供給した。その方法は、前述の実験Ａと同様である。また、本実験では、いずれの培養地においても細胞の数を１００００個とした。そして、これらの培養地をプラズマ培養液に浸した。
【００８７】
８−３．実験結果
その実験結果を、図１６に示す。図１６に示すように、プラズマ培養液に浸した癌細胞（グリオーマ：Ｕ２５１ＳＰ）は死滅している。一方、プラズマ培養液に浸した正常細胞（アストロサイト：ＲＩ−３７１）はほとんど死滅していない。そして、プラズマ培養液に浸した正常細胞の数は、通常の培養液に浸した正常細胞の数とほとんど同じである。これは、癌細胞を死滅させるとともに、正常細胞を死滅させることがほとんどないことを示している。このように、プラズマ培養液を用いることで、癌細胞のみを選択的に死滅させることが可能である。つまり、脳腫瘍癌を治療することができる。
【００８８】
９．実験Ｄ（抗腫瘍効果の持続時間）
ここで、プラズマ培養液の抗腫瘍効果の持続時間について行った実験について説明する。
【００８９】
９−１．用いた癌細胞
本実験では、癌細胞として、表２に示したＵ２５１ＳＰ（グリオーマ）を用いた。
【００９０】
９−２．実験方法
実験Ａで説明したように、癌細胞培養地をプラズマ培養液に浸した。その場合に、プラズマの照射からの経過時間を変えたものをプラズマ培養液を用意して、それぞれの場合について抗腫瘍効果を調べた。用意したプラズマ培養液は、プラズマを１分照射してから、それぞれ０時間、１時間、８時間、１８時間経過したものである。
【００９１】
９−３．実験結果
その実験結果を、図１７に示す。図１７に示すように、プラズマ培養液の抗腫瘍効果は、プラズマ照射直後から少なくとも８時間以上持続する。そして、１８時間を経過する前に、プラズマ培養液の抗腫瘍効果は消失する。すなわち、プラズマ培養液の抗腫瘍効果は、プラズマ照射開始以後プラズマ照射開始から１８時間未満の経過時間だけ持続する。
【００９２】
１０．実験Ｅ（シグナル伝達経路）
１０−１．用いた細胞
本実験では、癌細胞として、表６に示すように、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）を用いるとともに、正常細胞として、ＷＩ−３８（線維芽細胞）を用いた。
【００９３】
［表６］
Ｕ２５１ＳＰ          グリオーマ細胞（癌細胞）
ＷＩ−３８            線維芽細胞（正常細胞）
【００９４】
１０−２．用いた溶液
また、本実験では、表７に示すように、３種類の溶液を用いた。溶液１は、単なる培養液である。溶液２は、培養液にアルゴンガスを５分間だけ照射したものである。溶液３は、培養液にアルゴンプラズマを５分間だけ照射したものである。ここで、培養成分は、実験Ａと同じＤＭＥＭである。ただし、本実験では、血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）とを混合させていない。
【００９５】
［表７］
名称            培養成分        照射
溶液１          ＤＭＥＭ        未照射（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）
溶液２          ＤＭＥＭ        Ａｒガス照射（照射時間：５分）
溶液３          ＤＭＥＭ        Ａｒプラズマ照射（照射時間：５分）
【００９６】
１０−３．実験方法
１０−３−１．サンプルの作製
前述したＵ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）とＷＩ−３８（線維芽細胞）とを、プレート（６ウェルプレート）に播種した。そして、プレート内で２４時間、通常の培養液（ＤＭＥＭ）中でこれらを培養した。そして、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）とＷＩ−３８（線維芽細胞）とのそれぞれについて、培養液１、培養液２、培養液３を投与した。これらの培養液１、２、３中で培養する時間を、４時間とした。このようにして、６種類のサンプルを得た。
【００９７】
１０−３−２．ウェスタンブロット法
得られた６種類のサンプルについて、ＲＩＰＡ細胞溶解液内で溶解させて６種類の細胞溶解液を得た。そして、６種類の細胞溶解液について、ウェスタンブロット法（ウェスタンブロッティング）を用いて、メンブレンに固定する。具体的には、細胞培養液を電気泳動により分離した各細胞をメンブレンに転写した後に、そのまま各細胞をメンブレンに固定する。
【００９８】
この後、各細胞におけるシグナル伝達経路の活性化の程度について測定した。ここでは、ＡＫＴと、ＥＲＫとの２つのシグナル伝達経路について測定した。ＡＫＴについては、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）と、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）と、をそれぞれの活性化の度合いを測定するとともに、ＡＫＴの総量（Ｔｏｔａｌ−ＡＫＴ）についても測定した。
【００９９】
ＥＲＫについては、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）の活性化の度合いについて測定した。ここで、活性化とは、ＡＫＴやＥＲＫがリン酸化していることをいう。なお、ＡＫＴを活性化するためには、Ｓｅｒ４７３と、Ｔｈｒ３０８との２箇所をリン酸化する必要がある。
【０１００】
１０−４．実験結果
１０−４−１．ＡＫＴ
図１８は、ＡＫＴの活性化の度合いを示す図である。Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）では、アルゴンプラズマを照射した培養液３の場合のみ、ＡＫＴが活性化していない。ただし、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）については、わずかに抗体反応が見られる。培養液１、２を投与したＵ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）については、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）と、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）とのいずれも、活性化している。
【０１０１】
一方、正常細胞であるＷＩ−３８（線維芽細胞）では、いずれの培養液であっても、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）の反応が見られなかった。すなわち、Ｓｅｒ４７３でリン酸化がほとんど起きていない。したがって、ＡＫＴは活性化していない。
【０１０２】
１０−４−２．ＥＲＫ
図１９は、ＥＲＫの活性化の度合いを示す図である。Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）については、アルゴンプラズマを照射した培養液３の場合のみ、ＥＲＫの活性化の度合いが弱い。培養液１、２を投与したＵ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）では、ＥＲＫの活性化が生じている。
【０１０３】
一方、正常細胞であるＷＩ−３８（線維芽細胞）では、いずれの培養液であっても、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫの反応が弱かった。すなわち、ＥＲＫのリン酸化はほとんど起きていない。したがって、ＥＲＫは活性化していない。
【０１０４】
１０−５．本実施形態における癌細胞の死滅のメカニズム
本実験では、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）のＡＫＴやＥＲＫの活性化が抑制されていることが明らかとなった。つまり、本実施形態のプラズマ溶液は、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）のＡＫＴおよびＥＲＫの活性化を抑制する。これらのＡＫＴやＥＲＫの活性化は、グリオーマ細胞のアポトーシスを起こさない方向に働く。本実験では、これらＡＫＴおよびＥＲＫの活性化が起こらないようになったために、アポトーシスが積極的に引き起こされることとなる。このため、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）を死滅させることができる。したがって、このプラズマ溶液は、正常細胞にほとんど影響を及ぼさないで癌細胞のみを死滅させる選択性を有していると考えられる。
【０１０５】
１０−６．実験Ｅにおける発明の効果
本実施形態のプラズマ溶液は、ＡＫＴとＥＲＫとの双方の活性化を抑制することができる。つまり、癌細胞のシグナル伝達経路のうち２系統を抑制することができる。そして、その結果、癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【０１０６】
従来の抗癌剤のうちの多くの分子標的薬は、ある特定の因子を標的として作用するのが一般的である。例えば、ＡＫＴのみに作用するものや、ＥＲＫのみに作用するものである。しかし、実際には、ＡＫＴのみの活性化を抑制したとしても、別のシグナル伝達経路、例えば、ＥＲＫをシグナル伝達経路として、癌細胞が増殖するおそれがある。したがって、本実施形態のプラズマ溶液は、従来の分子標的薬に比べて、高い抗癌作用が期待できる。また、従来の抗癌剤を投与しても十分に治療できなかった患者に対して、効果を発揮することが期待される。さらに、本実施形態のプラズマ溶液は、正常細胞にほとんど影響を与えない。そのため、副作用も小さいと考えられる。さらに、ＡＫＴやＥＲＫの活性化により増殖する種類の他の癌細胞に対しても効果を発揮することが期待される。
【０１０７】
１０−７．実験Ｅの評価方法の利用分野
本実験のプラズマ溶液の評価方法は、例えば、患者から取り出した癌細胞におけるＡＫＴ活性とＥＲＫ活性の程度を評価することができる。これにより、その患者の癌細胞のＡＫＴ活性とＥＲＫ活性とで、効き方の違いの個人差について評価することができる。これはあくまで一例であり、これに限らない。
【０１０８】
１１．実験Ｆ（アルゴン水素）
１１−１．用いた細胞
本実験では、癌細胞として、表６に示すように、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）を用いるとともに、正常細胞として、ＷＩ−３８（線維芽細胞）を用いた。
【０１０９】
１１−２．実験方法
プレートに１０００細胞、５０００細胞、１００００細胞をそれぞれ播種した３種類の培養地を用意した。培養時間は、２４時間であった。そして、培養液の成分は、実験Ａと同じであった。また、プラズマの照射に関しては次の３パターンを採用した。
プラズマの種類            照射時間      供給ガス
（プラズマ未照射）                              
アルゴンプラズマ          ２分          Ａｒ    
アルゴン水素プラズマ      ２分          Ａｒ＋Ｈ2 （Ｈ2 ガス：１％）
ここで、Ｈ2 ガスは、ガスの供給量の総和の１％であった。そのため、合計９種類の実験結果が得られた。そして、細胞数の評価にＭＴＳアッセイを用いた。
【０１１０】
１１−３．実験結果
図２０は、上記の９種類の実験結果を示すグラフである。図２０に示すように、アルゴンプラズマおよびアルゴン水素プラズマのいずれも、抗腫瘍効果を示した。アルゴンプラズマを培養液に照射した場合には、１００００細胞に照射した場合に、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）の４０％程度が生存していた。アルゴン水素プラズマを培養液に照射した場合には、１００００細胞に照射した場合であっても、ほとんど全てのＵ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）が死滅した。
【０１１１】
図２１は、アルゴン水素プラズマを照射した場合に、癌細胞を選択的に死滅させることができるか否かを調べた結果を示すグラフである。ＷＩ−３８（線維芽細胞）に対しても、Ｕ２５１ＳＰ（グリオーマ細胞）と同様な条件の細胞を用意し、アルゴン水素プラズマを照射したものと照射しなかったものとで比較した。図２１に示すように、アルゴン水素プラズマを培養液に照射した場合に、正常細胞であるＷＩ−３８（線維芽細胞）はほとんど死滅しなかった。この実験の結果では、アルゴン水素プラズマの照射は、アルゴンプラズマの照射よりも強い抗腫瘍効果を示す。また、アルゴン水素プラズマを照射した場合の選択性は、アルゴンプラズマを照射した場合の選択性とほぼ同等であった。
【０１１２】
１１−４．アルゴン水素プラズマの効果
アルゴン水素プラズマは、水素ラジカルを発生させる。この水素ラジカルの働きとして、２種類の考え方がある。そのうちの一方は、水素ラジカルが細胞の増殖を促進するという考え方である。この細胞の増殖は、水素ラジカルが細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）を還元するために起こると考えられている。他方は、水素ラジカルが細胞に毒性をもたらすという考え方である。水素ラジカルは、高い反応性を有しているからである。本実験では、癌細胞を死滅させる効果を示したが、実験条件によっては、癌細胞を死滅させない場合もありうる。
【０１１３】
１２．実験Ｇ（培養成分と抗腫瘍効果）
前述した実験において、プラズマ溶液は、抗腫瘍効果を示している。本発明者らは当初、大気圧プラズマから発生したラジカルが抗腫瘍効果をもたらしたのであると考えていた。しかしながら、大気圧プラズマから発生したラジカルと、培養液に含まれるいずれか１以上の成分と、が反応することにより、癌細胞を選択的に死滅させる抗腫瘍効果を有する抗腫瘍物質が生成されていると考えるようになった。そのため、いずれかの単一成分水溶液にプラズマを照射して、いずれの成分が抗腫瘍効果をもたらすのかを調べることとした。
【０１１４】
１２−１．用いた細胞
本実験では、癌細胞として、表８に示すように、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）を用いた。
【０１１５】
［表８］
ＳＫＯＶ３            卵巣癌細胞
【０１１６】
１２−２．培養成分
培養液として、ＲＰＭＩ１６４０を用いた。その培養成分を表９に示す。
【０１１７】
［表９］
硝酸カルシウム・４Ｈ2 Ｏ
硫酸マグネシウム（無水）
塩化カリウム
炭酸水素ナトリウム
塩化ナトリウム
リン酸二ナトリウム（無水）
Ｌ−アルギニン
Ｌ−アスパラギン（無水）
Ｌ−アスパラギン酸
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ
Ｌ−グルタミン酸
Ｌ−グルタミン
グリシン
Ｌ−ヒスチジン
ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
Ｌ−イソロイシン
Ｌ−ロイシン
Ｌ−リジン・ＨＣｌ
Ｌ−メチオニン
Ｌ−フェニルアラニン
Ｌ−プロリン
Ｌ−セリン
Ｌ−スレオニン
Ｌ−トリプトファン
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ
Ｌ−バリン
Ｄ−ビオチン
塩化コリン
葉酸
ｍｙｏ−イノシトール
ナイアシンアミド
ｐ−アミノ安息香酸
Ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）
ピリドキシン・ＨＣｌ
リボフラビン
チアミン・ＨＣｌ
ビタミンＢ１２
Ｄ−グルコース
グルタチオン（還元）
フェノールレッド・Ｎａ
【０１１８】
また、上記の表９の他に、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、コハク酸・６Ｈ2 Ｏ・Ｎａ、コハク酸（遊離酸）、重酒石産コリン、ＨＥＰＥＳを培養液に混入してもよい。ただし、これらは必須ではない。
【０１１９】
１２−３．プラズマ溶液の作製
本実験で用いたプラズマ溶液は、培養液にプラズマを照射したものでなく、単一成分水溶液にプラズマを照射した後に、培養液を添加したものである。ここで、単一成分水溶液とは、表９に示す具体的な成分のうちの１種類のみを水に溶かした水溶液である。例えば、Ｌ−グルタミン水溶液やＬ−アルギニン水溶液である。
【０１２０】
その手順を、表１０に示す。まず、表１０の手順１に示すように、水に表９に示す成分のうちのいずれか１つを混入して単一成分水溶液とする。ただし、このとき、通常の培養液（ＲＰＭＩ１６４０）に含まれている単一成分の含有量に対して１０倍の濃度とする。手順２では、その単一成分水溶液を１時間放置する。手順３では、その単一成分水溶液にプラズマを照射する。ここでは、実験Ａで用いたアルゴンプラズマを５分照射する。照射距離等、その他の条件は実験Ａと同じである。
【０１２１】
手順４では、単一成分水溶液に培養液（ＲＰＭＩ１６４０）を添加してプラズマ溶液１を作製する。これにより、プラズマ溶液１における単一成分として選択した成分の濃度は１１倍である。手順５では、プラズマ溶液１をろ過する。手順６では、プラズマ溶液１に血清（ＦＢＳ）と、炭酸水素ナトリウムと、Ｄ−グルコースと、を添加する。この実験Ｈでは、手順６まで実施したプラズマ溶液を用いた。
【０１２２】
［表１０］
手順１      単一成分水溶液を作製する
手順２      単一成分水溶液を１時間放置する
手順３      単一成分水溶液にプラズマを照射する（Ａｒプラズマ、５分）
手順４      単一成分水溶液に培養液（ＲＰＭＩ１６４０）を添加してプラズマ溶液１を作製する（濃度１１倍）
手順５      プラズマ溶液１をろ過する
手順６      プラズマ溶液１にＦＢＳ、炭酸水素ナトリウム、Ｄ−グルコースを添加する
【０１２３】
１２−４．実験方法
上記のプラズマ溶液１と、単一成分水溶液の代わりに水を用いたプラズマ溶液２と、を用いた。プラズマ溶液２は、水にプラズマを照射し、プラズマを照射した水に培養液を加えたものである。９６ウェルプレートに、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）を播種した。１つのサンプルに含まれている細胞数は５０００細胞と、１００００細胞と、２種類を用意した。そして、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）に複数のプラズマ溶液１と、プラズマ溶液２と、のいずれか１つを供給した。そして、各サンプルにおける細胞の生存率についてＭＴＳアッセイにより調べた。なお、前述した手順１で一度に作製した単品水溶液の量は６ｍｌであった。
【０１２４】
１２−５．実験結果
実験結果を図２２から図３６に示す。各グラフの縦軸は、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率を示している。抗腫瘍効果がない溶液の場合には、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は、１００％に近い値を示す。抗腫瘍効果のある溶液の場合には、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は、１００％からずれる。この値が小さいほど、高い抗腫瘍効果を有しているといえる。
【０１２５】
図２２から図２７の左側には、プラズマ溶液２の結果が示されている。プラズマ溶液２は、抗腫瘍効果を有していない。つまり、大気圧プラズマにより発生したラジカル等が水中に供給されたとしても、水中で抗腫瘍効果を有する物質が生成されるわけではない。すなわち、ラジカル等が、１以上の培養成分と反応して、なんらかの抗腫瘍効果を有する物質が生成されていると考えられるのである。
【０１２６】
図２３から図２７に示すように、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）と、のいずれか１つを溶質とする単一成分水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えたものが抗腫瘍効果を示した。
【０１２７】
図２３に示すように、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）の水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は５％以下であった。
【０１２８】
図２４に示すように、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）の水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は４０％程度であった。
【０１２９】
図２５に示すように、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）の水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は５５％程度であった。
【０１３０】
図２６に示すように、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）の水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は２０％程度であった。
【０１３１】
図２７に示すように、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）の水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は４０％程度であった。
【０１３２】
図２８から図３１に示すように、上記以外の水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は１００％程度であった。すなわち、抗腫瘍効果はみられなかった。
【０１３３】
図３２に、抗腫瘍効果を有する物質の原材料となりうる５種類の物質、すなわち、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）と、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）と、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物（Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ）と、を溶質とする水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液の抗腫瘍効果について調べた結果を示す。
【０１３４】
図３２に示すように、５種類の溶質について１１倍の濃度（図３２中では「Ｘ１０」と表記）とした溶液では、５０００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率はほぼ０％であり、１００００細胞の場合におけるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は１０％程度であった。また、これらの溶質の濃度を小さくするほど、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率は上昇する。つまり、これらの５種類の溶質の量が、プラズマを照射することにより生成される抗腫瘍物質の量と結びついていることを示唆している。
【０１３５】
なお、図３３は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）について図３２と同様の実験を行った結果を示すグラフであり、図３４は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3 ）について図３２と同様の実験を行った結果を示すグラフである。これらの溶質の濃度を小さくしても、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞）の生存率はそれほど変わらなかった。
【０１３６】
図３５は、無機塩として、ＫＣｌを溶質とする水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液について抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。図３６は、無機塩としてＮａＣｌを溶質として同様に抗腫瘍効果を調べた結果を示すグラフである。図３５および図３６に示すように、これらの溶質は、抗腫瘍物質の原材料とはなりえない。
【０１３７】
１２−６．実験の考察
以上説明したように、５種類の単一成分水溶液にプラズマを照射した後に培養液を加えた溶液で、抗腫瘍効果が確認された。つまり、必ずしも１種類の成分から抗腫瘍効果物質が生成されているわけではない。また、アミノ酸および無機塩のいずれもが、抗腫瘍効果物質の原材料となりうる。すなわち、これら５種類の物質がプラズマから供給される何らかのラジカル等と反応して、多段階反応の後、抗腫瘍効果物質が生成されると考えられる。
【０１３８】
１３．実験Ｈ（抗癌剤耐性細胞）
１３−１．用いた癌細胞
本実験では、表１１に示すように、通常の卵巣癌細胞と、抗癌剤耐性のある卵巣癌細胞と、を用いた。
【０１３９】
［表１１］
名称                細胞の種類          耐性の有無
ＮＯＳ２            卵巣癌細胞          無し
ＮＯＳ２ＴＲ        卵巣癌細胞          パクリタキセル耐性
ＮＯＳ２ＣＲ        卵巣癌細胞          シスプラチン耐性
ＮＯＳ３            卵巣癌細胞          無し
ＮＯＳ３ＴＲ        卵巣癌細胞          パクリタキセル耐性
ＮＯＳ３ＣＲ        卵巣癌細胞          シスプラチン耐性
【０１４０】
１３−２．実験方法
９６ウェルプレートに表１１に示した卵巣癌細胞のそれぞれを１００００細胞だけ播種して２４時間、通常の培養液で培養した。そして、その後、培養液をプラズマ培養液と交換して２４時間培養した。その後、ＭＴＳアッセイにより卵巣癌細胞の生存率を評価した。なお、用いた培養液は、ＲＰＭＩ１６４０である。そして、ＲＰＭＩ１６４０にプラズマを照射した。なお、実験Ａと同様のアルゴンプラズマについて、１分照射（６０秒）、２分照射（１２０秒）、３分照射（１８０秒）、の３パターンについて調べた。
【０１４１】
１３−３．実験結果
図３７に、ＮＯＳ２系の卵巣癌細胞についての実験結果を示す。図３７に示すように、ＮＯＳ２と、ＮＯＳ２ＴＲと、ＮＯＳ２ＣＲとのいずれの細胞についても、抗腫瘍効果を示した。すなわち、抗癌剤耐性を備える癌細胞に対しても、本実施形態のプラズマ溶液は、抗腫瘍効果を示す。したがって、これらの抗癌剤耐性を有する腫瘍に対しても、本実施形態のプラズマ溶液は、効果を発揮する。特に、ＮＯＳ２ＴＲについては、抗癌剤耐性を有していないＮＯＳ２よりも、本実施形態の抗腫瘍効果が有効であった。
【０１４２】
図３８にＮＯＳ３系の卵巣癌細胞についての実験結果を示す。図３８に示すように、ＮＯＳ３と、ＮＯＳ３ＴＲと、ＮＯＳ３ＣＲとのいずれの細胞についても、抗腫瘍効果を示した。そして、その効果は、ＮＯＳ３と、ＮＯＳ３ＴＲと、ＮＯＳ３ＣＲとのいずれの細胞についても同程度であった。
【０１４３】
図３９から図４４までに、表１１に示したＮＯＳ２系の卵巣癌細胞の顕微鏡写真を示す。図３９は、ＮＯＳ２にプラズマを照射していない培地で培養した卵巣癌細胞を示す写真である。図４０は、ＮＯＳ２にプラズマを照射した培地で培養した卵巣癌細胞を示す写真である。図４１は、ＮＯＳ２ＴＲにプラズマを照射していない培地で培養した卵巣癌細胞を示す写真である。図４２は、ＮＯＳ２ＴＲにプラズマを照射した培地で培養した卵巣癌細胞を示す写真である。図４３は、ＮＯＳ２ＣＲにプラズマを照射していない培地で培養した卵巣癌細胞を示す写真である。図４４は、ＮＯＳ２ＣＲにプラズマを照射した培地で培養した卵巣癌細胞を示す写真である。これらの図に示すように、プラズマを照射した培地で培養した卵巣癌細胞（図４０、図４２、図４４）では、アポトーシスによる細胞死が生じている。
【０１４４】
このように、本実施形態のプラズマ溶液は、抗癌剤耐性を有する癌細胞をも死滅させることができる。それは、前述したように、ＡＫＴおよびＥＲＫの双方のシグナル伝達経路を遮断することができるためであると考えられる。
【０１４５】
１４．実験Ｉ（動物実験：抗癌剤耐性）
１４−１．用いたマウス
本実験では、メスのヌードマウスを用いた動物実験を行った。ヌードマウスの両脇腹皮下に２種類の卵巣癌細胞のうちのいずれかを播種した。用いた卵巣癌細胞は、ＮＯＳ２もしくはＮＯＳ２ＴＲである。そして、１箇所当たり２０００個の卵巣癌細胞を投与するとともに同量のマトリゲルを投与した。
【０１４６】
１４−２．実験方法
マウスに卵巣癌細胞を播種した翌日から、１週間当たり３回だけプラズマ培養液を局所的に投与した。プラズマ培養液は、ＳＦＭに実験Ａで用いたアルゴンプラズマを照射した。ここでは、３ｍｌのＳＦＭに対し、プラズマの照射時間を１０分とした。そして、卵巣癌細胞を播種した１箇所当たり０．２ｍｌを局所的に注入した。また、比較対象とするマウスには、プラズマを照射していない培養液を注入した。
【０１４７】
１４−３．実験結果
図４５は、ＮＯＳ２を播種したマウスの４週目の様子を示す写真である。図４５に左側に、通常の培養液を投与したマウスを示す。図４５の右側に、プラズマ培養液を投与したマウスを示す。通常の培養液を投与したマウスでは、腫瘍による膨らみが見られるが、プラズマ培養液を投与したマウスでは、腫瘍による膨らみはほとんど見られない。
【０１４８】
図４６は、ＮＯＳ２ＴＲを播種したマウスの４週目の様子を示す写真である。図４６に左側に、通常の培養液を投与したマウスを示す。図４６の右側に、プラズマ培養液を投与したマウスを示す。図４５のＮＯＳ２の場合と同様に、通常の培養液を投与したマウスでは、腫瘍による膨らみが見られるが、プラズマ培養液を投与したマウスでは、腫瘍による膨らみはほとんど見られない。
【０１４９】
図４７は、ＮＯＳ２を播種したマウスにおける腫瘍の体積変化を示すグラフである。図４７の横軸は、卵巣癌細胞を播種してからの経過日数である。図４７の縦軸は、卵巣癌の腫瘍の体積である。図４７の実線が、通常の培養液を投与したマウスの結果を示し、破線が、プラズマ培養液を投与したマウスの結果を示している。図４７に示すように、プラズマ培養液を投与したマウスでは、通常の培養液を投与したマウスに比べて、腫瘍の大きさがそれほど大きくならない。すなわち、腫瘍の成長が抑制されている。
【０１５０】
図４８は、ＮＯＳ２ＴＲを播種したマウスにおける図４７と同様の腫瘍の体積変化を示すグラフである。ＮＯＳ２ＴＲの場合も、ＮＯＳ２と同様の傾向が表れている。
【０１５１】
図４９は、卵巣癌細胞を播種してから２８日後のマウスにおける腫瘍の大きさを示すグラフである。ＮＯＳ２を播種して通常の培養液を投与したマウスでは、腫瘍の大きさは９０ｍｇ程度であった。ＮＯＳ２を播種してプラズマ培養液を投与したマウスでは、腫瘍の大きさは３０ｍｇ程度であった。ＮＯＳ２ＴＲを播種して通常の培養液を投与したマウスでは、腫瘍の大きさは８０ｍｇ程度であった。ＮＯＳ２ＴＲを播種してプラズマ培養液を投与したマウスでは、腫瘍の大きさは４０ｍｇ程度であった。
【０１５２】
以上のように、ヌードマウスを用いた動物実験においても、プラズマ培養液の抗腫瘍効果は確かめられた。
【０１５３】
１５．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態に係るプラズマ溶液は、培養液にプラズマを照射したものである。もしくは、特定の培養成分を溶質とする水溶液にプラズマを照射し、その後に培養成分を添加したものである。このプラズマ溶液は、抗腫瘍効果を有している。さらには、癌細胞を死滅させるとともに、正常細胞を死滅させることがほとんどないという効能を有している。つまり、癌細胞を選択的に死滅させることができる。
【０１５４】
本実施形態のプラズマ溶液は、細胞だけでなく、生体にも有効である。つまり、癌細胞のみについてアポトーシスを誘導して、腫瘍を縮小させることができる抗癌剤である。また、この抗癌剤は選択性を有しているので、副作用をほとんど起こさないことが期待される。
【０１５５】
なお、本実施形態は単なる例示にすぎない。したがって当然に、その要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良、変形が可能である。前述の実験で取り扱った癌細胞の他に、ＡＫＴとＥＲＫとの少なくとも一方のシグナル伝達経路が活性化することにより増殖するタイプの癌に効果を発揮するものと考えられる。本実施形態のプラズマ溶液は、ＡＫＴとＥＲＫとの双方のシグナル伝達経路を遮断することにより、癌細胞のみをアポトーシスに導くものだからである。
【０１５６】
また、プラズマ照射装置におけるプラズマ条件を、真空紫外吸収分光法を用いることによりフィードバックをかけることとしてもよい。これにより、電子密度やガス温度、そして酸素ラジカル密度を調整することができる。
【符号の説明】
【０１５７】
１００、１１０…プラズマ照射装置
１０、１１…筐体部
１０ｉ、１１ｉ…ガス導入口
１０ｏ、１１ｏ…ガス噴出口
２ａ、２ｂ…電極
Ｐ…プラズマ領域
Ｈ…凹部（ホロー）
Ｐ１…プラズマ照射装置
Ｍ１…ロボットアーム
ＰＭ…プラズマ溶液製造装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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