(57)【要約】  本発明は、利尿剤を投与しても治療効果が得られない体腔液貯留に対して薬効を有し、全身投与でも治療効果を発揮し得る体腔液貯留抑制剤を提供することを目的としている。本発明は、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を有効成分として含有する体腔液貯留抑制剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を有効成分として含有する、体腔液貯留抑制剤。
【請求項２】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、請求項１記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項３】
前記インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン又はインターフェロン−λである、請求項１又は２記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項４】
前記Ｉ型インターフェロンは、インターフェロン−α又はインターフェロン−βである、請求項３記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項５】
胸水又は腹水の貯留を抑制する、請求項１〜４のいずれか一項記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項６】
前記胸水又は腹水は、癌、肝硬変若しくは腎不全が原因となって貯留する難治性胸水又は難治性腹水である、請求項５記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項７】
全身投与される、請求項１〜６のいずれか一項記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項８】
前記全身投与は、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与及び動脈内投与からなる群から選択される、請求項７記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項９】
制癌剤と併用される、請求項１〜８のいずれか一項記載の体腔液貯留抑制剤。
【請求項１０】
前記制癌剤は、５−ＦＵ、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシル及びカペシタビンからなる群から選択される一以上の制癌剤である、請求項９記載の体腔液貯留抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体腔液貯留抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の体内には多くの水分が含まれており、主に、組織間、体腔内、管内、循環器内を満たしている細胞外液（組織液、体腔液、血液、リンパ液等）のことを体液と呼んでいる。体液の中でも体腔内に存在する液体のことを体腔液（胸水、腹水、心嚢液等）と呼び、健常人の体腔内に少量存在しているものであるが、肝疾患、腎疾患、心疾患、癌、炎症性疾患等では、体腔液が大量に貯留することが知られている。この体腔液貯留が進行すると、胸痛、腹痛、膨満感、呼吸苦等を生じ、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を著しく低下させるため、早期に体腔液を除去する治療が必要となる。【０００３】
体腔液貯留に対する治療法としては、利尿剤を投与する薬物療法が主流であるが、症状が重篤な場合は、体腔内に管を入れて体腔液を直接吸引除去する方法も使用されている。また、臨床研究においては、消化器癌や卵巣癌患者などの体腔内に、高用量のインターフェロン−αやインターフェロン−βを、局所投与することで、癌性胸水や腹水の貯留を抑制することを検討しているが（非特許文献１〜３）、何れも臨床適用可能な体腔液貯留抑制作用は得られていない。【０００４】
一方、ウイルス性肝疾患、多発性硬化症、癌の治療薬として使用されているインターフェロンは、ポリエチレングリコールとの共有結合により生体内持続性を改善させた製剤が開発されている（特許文献１〜６並びに非特許文献４及び５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４９１７８８８号
【特許文献２】国際公開第１９８７／０００５６号
【特許文献３】国際公開第１９９９／５５３７７号
【特許文献４】国際公開第２０００／２３１１４号
【特許文献５】特開平９−２５２９８号
【特許文献６】特許第４８５０５１４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｖｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ、１９９３年、第７１巻、ｐ．２０２７―２０３０
【非特許文献２】涌井ら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、１９８８年、第２巻、ｐ．３３９―３４７
【非特許文献３】Ｇｅｂｂｉａら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ、１９９１年、第５巻、ｐ．５７９―５８２
【非特許文献４】Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００１年、第２９７巻、ｐ．１０５９−１０６６
【非特許文献５】Ｂａｉｌｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、第１２巻、ｐ．１９５−２０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、体腔液貯留の治療のために利尿剤を用いる場合には、投与された患者が電解質バランスを崩して体調不良を起こすリスクがあり、尿排泄が困難になった場合には体腔液貯留が悪化する問題点がある。また利尿剤は、腹膜播種や乳び腹水に対しては体腔液の除去効果が乏しく、その治療効果は限定的である。さらに、体腔液を直接吸引除去する方法の場合には、穿刺による患者負担が大きいにもかかわらず、その効果は一過性であり、アルブミンやグロブリンの損失により栄養状態や免疫状態を悪化させる問題がある。【０００８】
また、癌性胸水および腹水に対しては、インターフェロン−βを単回投与（非特許文献３）、あるいは、インターフェロン−αを間歇投与（非特許文献１）した場合、腹腔に投与（局所投与）した場合であっても臨床的に有意義な体腔液量の抑制効果が得られていない。さらに、癌性腹水に対しては、インターフェロン−βを他の適応症で使用される６００万ユニットの用量で、週に３回、局所投与してもほとんど治療効果はなく、１，８００万ユニットの用量を連日局所投与した場合であっても奏効率は５０％に満たなかった（非特許文献２）。つまり、インターフェロンを体腔内に継続的に局所投与した場合であっても、臨床応用可能な体腔液貯留抑制効果が得られないのが現状であった。【０００９】
そこで本発明は、利尿剤を投与しても治療効果が得られない体腔液貯留に対して薬効を有し、全身投与でも治療効果を発揮し得る体腔液貯留抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体が、体腔液の貯留に対して優れた抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を有効成分として含有する体腔液貯留抑制剤を提供する。【００１２】
上記のポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールであることがより好ましい。【００１３】
上記のインターフェロンは、Ｉ型インターフェロン又はインターフェロン−λであることが好ましく、Ｉ型インターフェロンの中では、インターフェロン−α又はインターフェロン−βが特に好ましい。【００１４】
上記の体腔液貯留抑制剤は、胸水又は腹水の貯留を抑制することが好ましく、この胸水又は腹水は、癌、肝硬変若しくは腎不全が原因となって貯留する難治性胸水又は難治性腹水であることが好ましい。【００１５】
特に、難治性胸水又は難治性腹水は、利尿剤を投与しても効果がない症例がほとんどであるため、上記体腔液貯留抑制剤による治療は臨床的意義が大きいと考えられる。【００１６】
上記体腔液貯留抑制剤は、体腔内に局所投与して用いることが可能であるが、全身投与して用いることがより好ましく、この場合の全身投与は、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与及び動脈内投与からなる群から選択されることがさらに好ましい。【００１７】
全身性投与の場合は、体腔内への局所投与時の内臓の誤穿刺、体腔内感染、体腔内に癌細胞が有る場合に転移促進リスクを低減できる。また、体腔内投与と比較して、投与可能な医療施設、医療従事者の範囲を拡げることが可能である。また、筋肉内投与又は皮下投与であれば自己注射も可能となる。【００１８】
上記の体腔液貯留抑制剤は、１日に１回又は２回の投与間隔で連日投与することが可能であるが、２日以上の期間を隔てて１回の投与間隔で間歇投与することが好ましく、２日〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することがより好ましく、１週間に１回又は２回〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することがさらに好ましく、１週間に１回又は２回の投与間隔で間歇投与することが特に好ましい。【００１９】
さらに、上記の体腔液貯留抑制剤は、制癌剤と併用して用いると効果的であり、その場合の制癌剤は、５−ＦＵ、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシル及びカペシタビンからなる群から選択される一以上の制癌剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の体腔液貯留抑制剤は、局所投与のみならず全身投与においても、体腔液貯留を抑制し、除去できる。このため、本発明の体腔液貯留抑制剤は、体腔液貯留に対して治療効果を発揮し、体腔液の貯留によって引き起こされる、胸痛、腹痛、強い膨満感及び呼吸苦を改善できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスにおける、インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の腹腔内投与による腹水貯留抑制作用を示す図である。
【図２】胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスにおける、インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の皮下投与による腹水貯留抑制作用を示す図である。
【図３】胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスにおける、インターフェロン−αとポリエチレングリコールとの共有結合体の皮下投与による腹水貯留抑制作用を示す図である。
【図４】胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスにおける、インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の腹腔内投与による腹水貯留の再発（腹水穿刺後再貯留）抑制作用を示す図である。
【図５】卵巣癌細胞腹腔内転移モデルマウスにおける、インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の皮下投与による腹水貯留の再発（腹水穿刺後再貯留）抑制作用を示す図である。
【図６】卵巣癌細胞腹腔内転移モデルマウスにおける、インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の皮下投与による生存率改善作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の体腔液貯留抑制剤は、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２３】
上記ポリアルキレングリコールは、インターフェロン１分子に対して、１分子又は２分子以上が結合することができるが、インターフェロン１分子に結合するポリアルキレングリコールの分子量の合計は、５，０００以上２４０，０００以下が好ましく、１０，０００以上８０，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。ただし、インターフェロン１分子に分子量２０，０００のポリアルキレングリコール２分子が共有結合している場合は、インターフェロン１分子に分子量４０，０００のポリアルキレングリコールが共有結合したことを意味する。
【００２４】
また、上記ポリアルキレングリコール１分子に対して、上記インターフェロン１分子又は２分子以上が結合することもできるが、この場合であっても、ポリアルキレングリコール１分子の分子量は、５，０００以上５２０，０００以下が好ましく、１０，０００以上２００，０００以下がより好ましく、３９、０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。
【００２５】
なお、ポリアルキレングリコールは、１個の分子が多数の繰り返しユニットからできており、ポリアルキレングリコールの分子量は個々の分子により異なるのが一般的であるため、平均分子量で表される。したがって、本明細書におけるポリアルキレングリコールの分子量とは、平均分子量の意味である。
【００２６】
上記ポリアルキレングリコールとしては、薬物キャリアとして許容される高分子化合物であり、生体に対して不活性若しくは極めて低活性であり、かつ、無毒若しくは極めて低毒性であるものが好ましく使用できる。
【００２７】
上記インターフェロンは、天然に存在するインターフェロン（以下、天然型インターフェロン）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型インターフェロンのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インターフェロンとしての生物活性（以下、インターフェロン活性）を有するインターフェロンのアミノ酸変異体を包含し、さらに、天然型インターフェロンの糖鎖部分が改変されたインターフェロン及び糖鎖部分を有しないインターフェロンをも包含する。
【００２８】
また、上記インターフェロンは、天然型インターフェロンのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製された組換え型インターフェロンも包含する。
【００２９】
上記インターフェロンは、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、インターフェロンを発現する天然細胞又は組換え細胞を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得ることができる。また、インターフェロンとして、市販のインターフェロンも用いることができる。
【００３０】
上記インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン又はインターフェロン−λであることが好ましい。Ｉ型インターフェロンとしては、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−ω、インターフェロン−ε及びインターフェロン−κが挙げられ、インターフェロン−α又はインターフェロン−βであることがより好ましい。
【００３１】
「インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体」とは、上記インターフェロン１分子に対してポリアルキレングリコール１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているもの、又は、ポリアルキレングリコール１分子に対して上記インターフェロン１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているもの、を意味するが、上記インターフェロン１分子に対してポリアルキレングリコール１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているものが好ましい。なお、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとが直接結合したものであっても、リンカー等を介して結合したものであってもよい。
【００３２】
上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体の投与量は、インターフェロン力価（ユニット；以下、Ｕ）又は質量（ｇ）で表すことができる。上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、ポリアルキレングリコールを共有結合する前のインターフェロンの比活性（重量あたりのインターフェロン活性）と比較して、その比活性が１０％以上維持されているものが好ましい。
【００３３】
ここで、タンパク質に高分子化合物を結合させることを、タンパク質を高分子化合物で化学修飾する又は修飾するともいい、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、ポリアルキレングリコールで化学修飾したインターフェロン、又は、単に、修飾したインターフェロンともいう。特に、上記インターフェロンとポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）との共有結合体は、ＰＥＧ修飾インターフェロン、ＰＥＧ化インターフェロン又はＰＥＧ結合インターフェロンとも呼ばれる。
【００３４】
上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合部位としては、例えば、インターフェロンのアミノ基、チオール基、Ｎ末端、Ｃ末端又は糖鎖が挙げられ、また、公知の遺伝子組換え技術を用いてインターフェロンに導入した非天然アミノ酸も共有結合部位とすることができる。
【００３５】
上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体のインターフェロン活性は、公知の生物学的測定法により測定できる。具体的には、インターフェロンに感受性の高い細胞（例えば、ＦＬ細胞）に対してインターフェロンを含む検体を作用させた後に、これら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）又は水ほう性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶと略される。）等を一定量添加して感染させ、インターフェロンにより誘導されたウイルス抵抗性の程度（以下、抗ウイルス活性）を測定することで、インターフェロン活性を測定できる。抗ウイルス活性は、ウイルス増殖の抑制を指標に測定されるものであり、ウイルス増殖の結果として細胞を破壊させる細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥと略される。）を５０％阻止する検体の希釈倍率から、インターフェロン力価（Ｕ）として算出される（小林茂保ら著、「免疫生化学実験法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年、ｐ．２４５）。
【００３６】
上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、公知の方法で作製することができる。例えば、インターフェロンのアミノ基にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第１９８７／０００５６号に記載されている。インターフェロンのチオール基にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、国際公開第１９９９／５５３７７号に記載されている。インターフェロンのＮ末端に高分子を共有結合する方法は、国際公開第２０００／２３１１４号及び特開平９−２５２９８号に記載されている。インターフェロンの糖鎖にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、１９７８年のＭａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第１７９巻、ｐ．３０１）、米国特許第４，１０１，３８０号又は米国特許第４，１７９，３３７号に記載されている。インターフェロンに導入した非天然アミノ酸にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、２００４年のＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（第１４巻、ｐ．５７４３−５７４５）に記載されている。なお、インターフェロンのＣ末端にポリアルキレングリコールを共有結合する場合は、インターフェロンのＣ末端又はその近傍にシステインや非天然アミノ酸を導入することで可能となる。
【００３７】
上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの結合の方法に応じて、共有結合反応に使用するポリアルキレングリコールの末端を活性化する必要があるが、末端がヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で活性化されたポリアルキレングリコール誘導体を、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合の形成に用いることができ、これらのポリアルキレングリコール誘導体は公知の方法により合成できる。
【００３８】
上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、インターフェロンとＰＥＧとの共有結合体であることが好ましい。また、インターフェロンとＰＥＧとの共有結合体は、１分子のインターフェロンに、分子量５，０００以上２４０，０００以下（好ましくは分子量１０，０００以上８０，０００以下、より好ましくは分子量３９，０００以上４５，０００以下）のＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体であることが好ましい。
【００３９】
上記インターフェロンとＰＥＧとの共有結合体の好ましい例としては、ヒト・インターフェロンβとＰＥＧとの共有結合体を挙げることができ、例えば、特許第４８５０５１４号に記載された方法により作製できる。ヒト・インターフェロンβにおけるＰＥＧの結合部位としては、ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列の第１９番目又は第１３４番目のリジンのアミノ基が好ましく、この部位にＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体がより好ましい。具体的には、ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４０，０００以上（好ましくは、分子量４２，０００）のＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体を例示できる。
【００４０】
ここで、「ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列の１３４番目のリジン」とは、１６６アミノ酸からなるヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端のアミノ酸（メチオニン）を１番としたときに、１３４番目に位置するアミノ酸であるリジンを意味する。すなわち、本明細書では、インターフェロンのＮ末端のアミノ酸を１番として、インターフェロンのアミノ酸残基の位置を表す。
【００４１】
また、上記インターフェロンとＰＥＧとの共有結合体の別の好ましい例として、ヒト・インターフェロンαとＰＥＧとの共有結合体を挙げることができる。具体的には、ヒト・インターフェロンα−２ａのリジン残基（主たる部位：３１番目、１２１番目、１３１番目及び１３４番目）の１箇所に分子量約４０，０００の分枝型ＰＥＧ１分子がアミド結合を介して共有結合したインターフェロン−αとＰＥＧとの共有結合体（一般名：ペグインターフェロン  アルファ−２ａ）、又は、ヒト・インターフェロンα−２ｂのアミノ酸残基（１番目のシステイン、７番目のヒスチジン、３１番目のリジン、３４番目のヒスチジン、４９番目のリジン、８３番目のリジン、１１２番目のリジン、１２１番目のリジン、１２９番目のチロシン、１３１番目のリジン、１３３番目のリジン、１３４番目のリジン、１６３番目のセリン及び１６４番目のリジン）の１箇所に分子量約１２，０００のメトキシＰＥＧ１分子がカルボニル基を介して共有結合したインターフェロン−αとＰＥＧとの共有結合体（一般名：ペグインターフェロン  アルファ−２ｂ）を例示できる。
【００４２】
「体腔」とは、動物の体内で外界との連絡をもたずに形成された腔所をいい、胸腔、腹腔及び心嚢腔が包含される。「体腔液」とは、体腔内に存在する液体をいい、胸腔、腹腔又は心嚢腔に存在する液体をそれぞれ、胸水、腹水又は心嚢液という。
【００４３】
「体腔液貯留」とは、体腔液が正常の量を超えて体腔内に存在する状態をいい、「体腔液貯留抑制剤」とは、体腔液の貯留を抑止し、除去する作用を有する薬剤のことをいう。
【００４４】
上記の体腔液貯留抑制剤が、体腔液の貯留に対して抑制作用を有することは、体腔液の貯留を引き起こす原因疾患（例えば、癌）の病態モデルで評価することができる。このような病態モデルとしては、例えば、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第９４巻、Ｐ．１１２−１１８）、卵巣癌細胞腹腔内転移モデルマウス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｏｅｕｔｉｃｓ、２００７年、第６巻、ｐ．２９５９−２９６６）等が挙げられる。
【００４５】
上記の体腔液貯留抑制剤は、体腔液の貯留の予防又は治療に用いることができ、また、体腔液の物理的な抜き取り後の再発抑制にも用いることができる。上記の体腔液貯留抑制剤は、胸水又は腹水の貯留に対して好ましく用いられる。
【００４６】
体腔液貯留の原因疾患としては、例えば、癌、感染症（例えば、細菌性、結核性、真菌性、非定型肺炎、ウイルス又は寄生虫）、炎症性疾患（例えば、膵炎、サルコイドーシス又はアスベスト肺）、膠原病（例えば、リウマチ、全身性エリテマトーデス、シューグレン症候群、ウェゲナー肉芽腫症又はチャーグ−ストラウス症候群）、内分泌疾患（例えば、粘液水腫）、肝疾患（例えば、肝硬変）、腎疾患（例えば、ネフローゼ症候群）又は心疾患（例えば、うっ血性心不全）が挙げられるが、上記の体腔液貯留抑制剤は、これらの疾患が原因となる体腔液貯留に対して治療効果を発揮できる。
【００４７】
また、上記の体腔液貯留抑制剤は、難治性の体腔液貯留に対しても治療効果を発揮でき、難治性の胸水又は腹水の貯留に対して特に好ましく用いられる。ここで、難治性の体腔液貯留とは、利尿剤等の内科的治療でコントロールが困難な（利尿剤抵抗性又は利尿剤不耐性）体腔液の貯留を意味し、例えば、癌、肝硬変若しくは腎不全が原因となって貯留する難治性胸水又は難治性腹水が該当する。
【００４８】
さらに、難治性胸水又は難治性腹水の中でも、癌を原因疾患として貯留する胸水又は腹水を癌性胸水又は癌性腹水と呼ばれ、症状が重篤であることが知られているが、上記の体腔液貯留抑制剤は、癌性胸水又は癌性腹水の貯留に対しても治療効果を発揮できる。上記の癌性胸水又は癌性腹水は、癌の胸腔内転移若しくは腹膜転移、又は、癌による胸膜炎若しくは腹膜炎が原因となって生じるものである。
【００４９】
上記の体腔液貯留抑制剤は、難治性胸水又は難治性腹水の中でも、特に癌性胸水又は癌性腹水の治療又は予防に用いられることが好ましい。
【００５０】
上記の体腔液貯留抑制剤は、体腔液貯留抑制の効果の補完若しくは増強又は投与量の低減のために、他の薬剤と適量配合又は併用して使用することもできる。
【００５１】
上記の体腔液貯留抑制剤と併用し得る薬物としては、体腔液の貯留の原因疾患の治療に通常用いられる薬剤が挙げられる。例えば、癌性の体腔液の貯留を抑制する場合には、制癌剤と併用することができ、併用する制癌剤としては、分子標的薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ製剤又は抗癌性抗生物質が好ましい。より好ましくは、シスプラチン、カルボプラチン、塩酸イリノテカン、５−ＦＵ、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシル、カペシタビン、タキソール、タキソテール、イマニチブ、スニチニブ等を例示できる。テガフール・ギメラシル・オテラシルとしては、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（商品名：ティーエスワン；登録商標）が特に好ましい。上記制癌剤と併用される体腔液貯留抑制剤は、制癌剤との同時処置に限らず、腹水抑制効果を高めることを目的として、制癌剤処置の前後に時間差をおいて投与することができる。
【００５２】
また、本発明の体腔液貯留抑制剤は、制癌剤との混合剤、又はそれぞれの単剤として同じ部位に投与してもよく、制癌剤とは異なる部位への投与も可能である。  
【００５３】
上記の体腔液貯留抑制剤の投与量（力価）及び投与回数は、被検者の年齢、体重、症状、投与形態、投与ルート等に応じて適宜決定されるが、対象がヒトの場合には、１０，０００Ｕ〜１，８００万Ｕ／回の用量で、１日に１回又は２回の投与間隔で連日投与することが可能であるが、２日以上の期間を隔てて１回の投与間隔で間歇投与することが好ましく、２日〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することがより好ましく、１週間に１回又は２回〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することがさらに好ましく、１週間に１回又は２回の投与間隔で間歇投与することが特に好ましい。
【００５４】
上記の体腔液貯留抑制剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ヒツジ又はヒト）に対する体腔液貯留の治療及び予防に有用な医薬品として用いることができる。
【００５５】
臨床で使用する際には、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を、そのまま用いてもよく、又は、公知の薬理学的に許容される担体若しくは賦形剤等と混合した医薬組成物として用いてもよい。
【００５６】
上記の体腔液貯留抑制剤は、全身投与又は局所投与することができる。ここで、局所投与とは、直接作用が期待される部位への投与、すなわち、体腔液の貯留をきたす又は体腔液が貯留している箇所への投与を意味する。例えば、腹水の貯留に対して、上記の体腔液貯留抑制剤を腹腔内投与することは、局所投与に該当する。また、全身投与とは、消化器系又は消化器系以外の経路で吸収され、全身（非局所的）に効果をもたらす投与方法であって、直接作用が期待される部位以外への投与、すなわち、体腔液の貯留をきたす又は体腔液が貯留している箇所以外への投与を意味し、例えば、経口投与、腹腔内投与（ただし、腹水貯留の場合は除く）、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与又は動脈内投与が挙げられる。なお、腹水の貯留に対して上記の体腔液貯留抑制剤を腹腔内投与することは、局所投与を意味する。上記の体腔液貯留抑制剤は、全身投与することが好ましく、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与又は動脈内投与することがより好ましい。
【００５７】
上記の体腔液貯留抑制剤の好ましい例としては、インターフェロンとＰＥＧとの共有結合体を有効成分として含有するものであって、全身投与、かつ、２日以上の期間を隔てて投与する間歇投与に用いられる体腔液貯留抑制剤を挙げることができる。また、上記の体腔液貯留抑制剤のより好ましい例としては、インターフェロン−α又はインターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体を有効成分として含有するものであって、全身投与、かつ、２日以上の期間を隔てて投与する間歇投与に用いられる体腔液貯留抑制剤を挙げることができる。また、上記の体腔液貯留抑制剤のさらに好ましい例としては、インターフェロン−α又はインターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体を有効成分として含有するものであって、皮下投与、かつ、２日以上の期間を隔てて投与する間歇投与に用いられる体腔液貯留抑制剤を挙げることができる。上記の体腔液貯留抑制剤の特に好ましい例としては、インターフェロン−α又はインターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体を有効成分として含有するものであって、皮下投与、かつ、１週間に１回又は２回の投与間隔で投与されるように用いられ、難治性胸水又は難治性腹水の貯留を抑制するために用いられる、体腔液貯留抑制剤を挙げることができる。
【００５８】
上記の体腔液貯留抑制剤の経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体又は賦形剤を含有するものである。錠剤用の担体及び賦形剤としては、例えば、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。
【００５９】
上記の体腔液貯留抑制剤の非経口投与のための剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤又は局所徐放剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができる。溶液製剤は、例えば、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解又は抽出液に懸濁及び乳化して、リポソームに包埋させた状態で調製することができる。固体製剤は、例えば、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体に、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース又はグルコース等を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製することができる。さらにこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸やグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、例えば、上記インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体を、グリセリン、ＰＥＧ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸若しくはコンドロイチン硫酸等の増粘剤又は多糖に溶解して調製することができる。
【００６０】
いずれの製剤においても、安定化剤として、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクログロブリン又はアミノ酸等を添加することができ、また、分散剤又は吸収促進剤として、インターフェロン活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤等を添加することができる。また、微量金属又は有機酸塩も必要に応じて添加することができる。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。【００６２】
（実施例１）  インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体の調製：
特許第４８５０５１４号の実施例６に記載の方法に従って、組換え型ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」を調製した。具体的には、まず、０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した組換え型ヒト・インターフェロンβ（最終濃度２００μｇ／ｍＬ）に、エチレングリコールを（最終濃度２０％）添加した後、１Ｍ  リン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．６に調整した。これに、ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ＰＥＧ（分子量４２，０００、日油株式会社製；品番６１Ｇ９９１２２Ｂ０１）を加え混合し、４℃で一晩、結合反応させた。この結合反応溶液に５倍容の１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ  ６５０（Ｓ）；東ソー株式会社）に供した。下記の展開溶媒で、タンパク質を溶出及び分画した。
≪展開溶媒≫
溶媒Ａ：１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
溶媒Ｂ：１Ｍ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）【００６３】
上記溶媒Ａ、Ｂの混合液を陽イオン交換カラムの樹脂量に対して４０倍量通液させる間に溶媒Ｂの送液比率を０％から６５％に連続的に上昇させて溶出を行った。溶出された分画は、さらに、ＳＰ−５ＰＷカラム（東ソ株式会社）に供し、組換え型ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「ヒト・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」（以下、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」）を単離した。【００６４】
また、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの調製方法と同一の方法で、組み換え型マウス・インターフェロンβに分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「マウス・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」（以下、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β）を調製した。【００６５】
なお、組換え型ヒト・インターフェロンβは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８０年、第８巻、ｐ．４０５７−４０７４に記載の方法に従って作製し、組み換え型マウス・インターフェロンβは、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８６年、第６巻、ｐ．５１９−５２６に記載の方法に従って作製した。【００６６】
（実施例２）  ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの局所投与による腹水貯留抑制作用：
胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスを作製し、中西らの方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第９４巻、Ｐ．１１２−１１８）に従って、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの局所投与による腹水貯留抑制作用を評価した。【００６７】
理化学研究所のＣｅｌｌ  Ｂａｎｋより入手したヒト胃癌細胞ＧＣＩＹ（Ｎｏ．ＲＣＢ０５５５）にｐＥＧＦＰ−Ｃ１  ｐｌａｓｍｉｄ（クロンテック社）が導入されたＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し維持した。ＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにて回収後、Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で洗浄し、ＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞懸濁液を調製した。雄性ＫＳＮヌードマウス（Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒより入手）の腹腔内に、ＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞懸濁液（２．５×１０６細胞／匹）を移植し、翌日に、大橋らの方法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００５年、第２７巻、ｐ．６３７−６４４）に従ってＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞の生着を確認した。ＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞の生着が確認されたマウスは、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスとして投与実験に用いた。【００６８】
天然型ヒト・インターフェロンβ（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）又は実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βを、いずれも５００万Ｕ／匹／回の用量で、移植翌日から４週間、週１回、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスの腹腔内に投与（局所投与）した（ｎ＝８）。最終投与の１週間後に、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスから麻酔下で腹水を採取し、その液量を測定した。【００６９】
その結果を図１に示した。図中の縦軸は、腹水量（中央値；ｍＬ）を示し、横軸の「ＩＦＮ−β」は、天然型ヒト・インターフェロン−βの局所投与群、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの局所投与群の結果を示す。【００７０】
その結果、天然型ヒト・インターフェロンβの局所投与群は、胃癌細胞の腹腔内転移により生じる腹水の貯留を抑制しなかったが、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの局所投与群は、この腹水の貯留を健常レベルにまで抑制した。すなわち、未修飾のインターフェロン−βは、胃癌細胞が転移している腹腔内に５００万Ｕ／匹／回の高用量を局所投与した場合であっても、週１回の間歇投与では腹水貯留抑制作用を示さなかったが、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、同じ間歇投与スケジュールであっても、顕著な腹水貯留抑制作用を示すことが明らかとなった。【００７１】
この結果より、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体には、腹水貯留抑制作用があり、局所投与することにより体腔液の貯留を顕著に抑制できることが示唆された。【００７２】
（実施例３）  ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの全身投与による腹水貯留抑制作用：
実施例２と同様の方法で、ヒト胃癌細胞であるＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞を雄性ＫＳＮヌードマウスの腹腔内に移植し、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスを作製した。【００７３】
天然型ヒト・インターフェロンβ（フエロン（登録商標）；東レ株式会社製）、又は、実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−β若しくはＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βを、いずれも５０００Ｕ／匹／回の用量で、移植翌日から４週間、週２回、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスの背部に皮下投与（全身投与）した（ｎ＝６）。対照群として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同様に投与した。最終投与の２週間後に、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスから麻酔下で腹水を採取し、その液量を測定した。【００７４】
その結果を図２に示した。図中の縦軸は、腹水量（中央値；ｍＬ）を示し、横軸の「対照（ＰＢＳ）」は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の全身投与群（対照群）、「ＩＦＮ−β」は、天然型ヒト・インターフェロンβの全身投与群、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの全身投与群、「ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β」は、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの全身投与群の結果を示す。【００７５】
その結果、天然型ヒト・インターフェロンβの全身投与群は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の全身投与群よりも腹水の貯留が多く、胃癌細胞の腹腔内転移により生じる腹水の貯留を抑制しなかったが、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの全身投与群及びＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの全身投与群は、いずれも腹水の貯留を顕著に抑制した。すなわち、未修飾のインターフェロン−βは、全身投与では腹水貯留抑制作用を全く示さなかったが、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、全身投与であっても、顕著な腹水貯留抑制作用を示すことが明らかとなった。【００７６】
この結果より、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、臨床用量を間歇投与スケジュールで全身投与した場合であっても体腔液の貯留を顕著に抑制できることが示唆された。【００７７】
（実施例４）  インターフェロン−αとＰＥＧとの共有結合体の全身投与による腹水貯留抑制作用：
実施例２と同様の方法で、ヒト胃癌細胞であるＧＣＩＹ−ＥＧＦＰ細胞を雄性ＫＳＮヌードマウスの腹腔内に移植し、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスを作製した。【００７８】
ティーエスワン（登録商標）カプセル（大鵬薬品工業株式会）（以下、ＴＳ−１）をテガフール量として０．５ｍｇ／匹／日の用量で、移植翌日から４週間、連日、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスに経口投与した。【００７９】
同時に、ペグインターフェロン  アルファ−２ａ（遺伝子組換えインターフェロンα−２ａのリジン残基の１箇所に分子量約４０，０００の分枝型ＰＥＧ１分子がアミド結合を介して共有結合した、インターフェロン−αとＰＥＧとの共有結合体）（ペガシス（登録商標）皮下注、中外製薬株式会社製）を、５０００Ｕ／匹／回の用量で、移植翌日から４週間、週２回、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスの背部に皮下投与（全身投与）した（ｎ＝６）。対照としてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を、移植翌日から４週間、週２回、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスに皮下投与（全身投与）した。【００８０】
最終投与の２週間後に、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスから麻酔下で腹水を採取し、その液量を測定した。【００８１】
その結果を図３に示した。図中の縦軸は、腹水量（中央値、ｍＬ）を示し、横軸の「ＴＳ−１＋ＰＢＳ」は、ＴＳ−１とリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を合わせて投与したＴＳ−１＋ＰＢＳ投与群、「ＴＳ−１＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ」は、ＴＳ−１とペグインターフェロン  アルファ−２ａを合わせて投与したＴＳ−１＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ投与群の結果を示す。【００８２】
その結果、ＴＳ−１＋ＰＢＳ投与群は、胃癌細胞の腹腔内転移により生じる腹水の貯留を抑制するものの、ＴＳ−１＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ投与群は、より顕著に腹水の貯留を抑制した。すなわち、抗癌剤であるＴＳ−１は、腹腔内に転移した胃癌細胞に作用することで腹水の貯留に対して抑制的に作用したが、インターフェロン−αとＰＥＧとの共有結合体と同時投与することで、より顕著な腹水貯留抑制作用を示すことが明らかとなった。【００８３】
この結果より、インターフェロンαとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、間歇投与スケジュールで全身投与した場合であっても体腔液の貯留を顕著に抑制できることが示唆され、抗癌剤と同時投与することで、より顕著な腹水貯留抑制作用を示すことが示唆された。【００８４】
（実施例５）  ＰＥＧ−ＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの局所投与による腹水再貯留抑制作用：
胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスの作製には、ヒト胃癌細胞であるＧＣＩＹ細胞（理化学研究所）を用いた。ＧＣＩＹ細胞は、１５％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し維持した。【００８５】
雄性ＫＳＮヌードマウスの腹腔内に、実施例２と同様の方法により調製したＧＣＩＹ細胞懸濁液（１×１０７細胞／匹）を移植し、胃癌細胞腹腔内転移モデルマウスを作製した。ＧＣＩＹ細胞懸濁液の移植の５週間後に、各個体から腹水を採取した（初回腹水穿刺）。腹水穿刺は、麻酔下で翼付き静注針（１８ゲージ）を腹腔内に穿刺し、針を介して流出する腹水を回収することにより行った。【００８６】
実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βとを混合して調製した混合液（以下、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ）を、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βのそれぞれが１００００Ｕ／匹／回の用量となるように、初回腹水穿刺当日から腹腔内投与（局所投与）した。投与間隔は、ヒトにおける週１回の投与に相当する隔日投与とし、全３回投与した（ｎ＝４）。対照群として、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの代わりに、同容量の、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を、同様に投与した（ｎ＝５）。【００８７】
最終投与の翌日に、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群及び対照群の各個体から麻酔下にて初回腹水穿刺後に再貯留した腹水を腹水穿刺により採取し、その液重量を測定した（２回目腹水穿刺）。腹水を採取した個体は麻酔下にて開腹した後、腹腔内転移した腫瘍塊をピンセットとハサミを用いて摘出し、その重量を測定した。【００８８】
統計解析は、対照群とＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群との間の２群間で行い、等分散性の検定（Ｆ検定）によりＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定又はＷｅｌｃｈ検定を選択して行った。統計解析の結果、Ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意であると判断した。【００８９】
その結果を図４に示した。図４Ａの縦軸は、２回目腹水穿刺の腹水重量（ｎ＝４〜５；平均値±標準誤差）、図４Ｂの縦軸は、腫瘍重量（ｎ＝４〜５；平均値±標準誤差）をそれぞれ示し、横軸の「対照」は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の局所投与群（対照群）、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ」は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βとの混合液の局所投与群を示す。また、図中の記号アスタリスクは、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの局所投与群が対照群と比して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であることを示す。【００９０】
その結果、腹腔内転移した腫瘍の重量は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの局所投与群と対照群との間で有意な変化は認められなかった（図４Ｂ）が、腹腔内転移により生じる腹水の再貯留は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの局所投与群では対照群と比較して有意に抑制された（図４Ａ）。すなわち、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、胃癌細胞の腹腔内転移により腹水が貯留する程度まで病態の進行した状態から局所投与した場合であっても、腹水貯留の再発を抑制し、治療効果を有することが示された。【００９１】
また、インターフェロンには癌細胞の増殖を抑制する作用（以下、抗腫瘍作用）が知られている。しかし、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの投与で認められた腹水再貯留抑制作用は、抗腫瘍作用が十分に現れない場合において認められたことから、インターフェロンの抗腫瘍作用の結果として二次的に起こる作用ではなく、これとは独立した作用であることが強く示唆された。【００９２】
この結果より、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、局所投与により、体腔液を抜き取った後の体腔液の再貯留を抑制する作用を示し、その作用は抗腫瘍作用とは独立した作用であることが示唆された。【００９３】
（実施例６）  ＰＥＧ−ＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの全身投与による腹水再貯留抑制作用及び生存率改善作用：
インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体の全身投与による癌性腹水の貯留に対する治療効果及び生存率への影響について検討した。【００９４】
Ｈｕｙｎｈらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００７年、第６巻、Ｐ．２９５９−２９６６）に従って、卵巣癌細胞腹腔内転移モデルマウスを作製し、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの全身投与による腹水再貯留抑制作用を評価した。【００９５】
ヒト卵巣癌細胞株ＯＶ−９０（ＣＲＬ−１１７３２；Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１５％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し維持した。ＯＶ−９０細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにて回収後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＯＶ−９０細胞懸濁液を調製した。雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ．−１７/ｌｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ−ｊｃｌ；日本クレア）の腹腔内に、ＯＶ−９０細胞懸濁液（５×１０６細胞／匹）を移植した。【００９６】
細胞懸濁液移植の４６日後に、各個体から腹水を採取した（初回腹水穿刺）。腹水穿刺は、覚醒下にて翼付き静注針（１８ゲージ）を腹腔内に穿刺し、針を介して流出する腹水を回収することにより行った。腹水重量（ｇ）を計量し、０．１ｇ以上の腹水貯留が認められた個体を以下の実験に供した。【００９７】
実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βとを混合して調製した混合液（以下、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ）を、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βのそれぞれが５００００Ｕ／匹／回の用量となるように、初回腹水穿刺当日から皮下投与（全身投与）した。投与間隔は、ヒトにおける週１回の投与に相当する隔日投与とした（ｎ＝６）。対照群として、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの代わりに、同容量の、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を、同様に投与した（ｎ＝７）。【００９８】
３回目の投与が終了した翌日（投与開始日から５日後）に、初回腹水穿刺後に再貯留した腹水を、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群及び対照群の各個体から覚醒下にて腹水穿刺により採取し、その液重量を測定した（２回目腹水穿刺）。【００９９】
２回目腹水穿刺後も引き続き、隔日で３回皮下投与（全身投与）し、全６回投与した。投与開始日から１２日後までの各群の生存率を検討した。【０１００】
その結果を図５及び図６に示した。図５の縦軸は、２回目腹水穿刺の腹水重量（ｎ＝６〜７；平均値±標準誤差）を示す。図６の縦軸は、生存率を示し、横軸は、投与開始日をｄａｙ０としたときの経過日数（ｄａｙ）を示す。また、図５の横軸及び図６中の「対照」は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の皮下投与群（対照群）、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ」は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βとの混合液の皮下投与群を示す。【０１０１】
その結果、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの全身投与群は、腹腔内転移により生じる腹水の再貯留を抑制した。すなわち、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、卵巣癌細胞の腹腔内転移により腹水が貯留する程度まで病態の進行した状態から全身投与した場合において、腹水貯留の再発を抑制した。【０１０２】
また、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓの全身投与群は、投与開始日から１２日後まで全個体が生存したが、対照群は、投与開始日から８日後には死亡個体が認められ、１２日後には５割以下の生存率であった。すなわち、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、卵巣癌細胞の腹腔内転移により腹水が貯留する程度まで病態の進行した状態から全身投与した場合において、全身状態の悪化を抑制し、生存率を改善することが示された。【０１０３】
この結果より、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、全身投与によっても、体腔液を抜き取った後の体腔液の再貯留を抑制する作用を示すこと、さらに、体腔液が貯留する程度まで癌の病態の進行した状態から全身投与した場合において、全身状態の悪化を抑制することにより生存率を改善することが示された。【０１０４】
上記の実施例から、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体（好ましくは、インターフェロン−α又はインターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体）は、インターフェロン−α又はインターフェロン−βでは実現できなかった難治性腹水の貯留抑制を可能とすることが示された。より具体的には、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体（好ましくは、インターフェロン−α又はインターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体）は、間歇投与スケジュール（２日以上の期間を隔てて１回の投与間隔スケジュール）において、局所投与のみならず皮下投与などの全身投与によっても、癌性腹水貯留抑制作用を有することが示された。さらに、その作用は、抗腫瘍作用によって二次的に起こるものではないこと、また、癌種に限定されない作用であることが示された。また、従来のインターフェロンの連日投与スケジュールによる処置と比べ、インターフェロンとポリアルキレングリコールとの共有結合体の間歇投与スケジュールによる処置の方が、癌性腹水の治療効果が高まることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明は、医薬の分野において、体腔液貯留抑制剤として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１：ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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