(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
a)血漿サンプルを準備するステップ、
b)CO2を部分的に除去するために酸を添加するステップ、
c)CO2を更に除去して乾燥サンプルを得るために、サンプルを凍結乾燥するステップ、
d)乾燥サンプルを再溶解し、緩衝液によりpH値4〜7に中和するステップ、
を含む、血漿サンプルから尿素を単離し、CO2を除去する方法。
【請求項２】
酸を添加する前にステップb)でろ過が行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップd)の後に、減圧下でサンプルが脱気されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ステップd)でサンプルがpH値4〜6に調整されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップd)でサンプルがpH値5〜6に調整されることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
血漿サンプルが、その採取前に13C標識尿素前駆体を服用した被験者又は患者に由来することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
以下のステップ：
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法による尿素を単離するステップ、
- 不活性ガスですすぐステップ、
- CO2を形成するためにウレアーゼを添加するステップ、
- インキュベートするステップ、
- 形成したCO2を放出させるために酸を添加するステップ、
- 放出されたCO2の13C同位体比を測定するステップ、
を含む、血漿サンプル中の尿素の13C同位体比を測定する方法。
【請求項８】
以下のステップ
- 患者の第一血漿サンプルを準備するステップ、
- 請求項7に従って第一血漿サンプル中の尿素の13C同位体比を測定するステップ、
- 前記患者に由来する、少なくとももう一つの血漿サンプルを準備するステップであって、患者が、その採取前に13C標識尿素前駆体を服用したステップ、
- 請求項7に従って、少なくとももう一つの血漿サンプル中の尿素の13C同位体比を測定するステップ、
- 第一血漿サンプル中の、及び少なくとももう一つの血漿サンプル中の尿素の13C同位体比により、形成された尿素量を定量化するステップ
を含む、血漿サンプル中の尿素を測定する方法。
【請求項９】
少なくとももう二つの血漿サンプルが使用されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
さらなる血漿サンプルが、患者が13C標識尿素前駆体を服用してから15〜240分の時間内に採取されたことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
さらなる血漿サンプルが、患者が13C標識尿素前駆体を服用してから15分間隔で採取されたことを特徴とする、請求項9又は10のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液サンプル中の尿素を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿素は、人体において窒素化合物の代謝に関する最終生成物をなす有機化合物である。ヒトの場合、尿と共に尿素が排出される。
【０００３】
尿素形成は、主に肝細胞、そして部分的に腎臓で行われる。体内での尿素形成は、一部は遺伝性の、著しい健康上の障害をもたらしかねない様々な疾患と関係する。尿素形成の測定は、例えば、肝移植又は肝細胞移植において、肝臓の機能を表す一つの指標である。
【０００４】
Tuchman et al.、Pediatric Research、2008年(64)、213頁は、例えば、N-アセチルグルタミン酸合成の欠陥、及び尿素形成の分析を記載する。
【０００５】
尿素形成を測定するために、患者は、13C標識された酢酸ナトリウムの経口投与を受け、この標識酢酸ナトリウムは、体内で、13C標識尿素の形成をもたらす。13C標識酢酸塩から、13CO2が生成し、この13CO2が、13C-カルバモイルリン酸、続いて13C尿素に変換される。
【０００６】
たいていの化学元素は、自然界では、複数の安定同位体又は放射性同位体の混合物として存在する。同位体存在比は、通常、濃縮化合物を用いたトレーサー研究においても、原子組成百分率(atom-%)又はppmで記載される。天然存在比の範囲での変化を記載するために、パーミル(‰)での相対的なデルタスケールが存在する。δ値(例えば、δ13C、δ15N、δ18O)とは、標準物質に対する、サンプルのそれぞれの同位体比R([重い同位体]/[軽い同位体]、例えばR13C=[13C]/[12C])の差異の、この標準物質に対する比と定義される。
【０００７】
δ13C値は、例えば、
【数１】
0005902167.tif 000002
【０００８】
に基づき算出される。
【０００９】
炭素の標準物質は、石灰、PDB(「ピー・ディー・ベレムナイト(Pee Dee Belemnite)」)である。光合成におけるCO2の取り込みによって結合された炭素では、一般的には13Cが減少している。たいていの植物は、カルビンベンソン回路又はC3回路に基づいてCO2を炭水化物に還元する。このため、C3植物(これに属するのは、有用植物のイネ、ジャガイモ、ダイズ、テンサイ、及び穀類である)のバイオマスは、-24〜-32‰の範囲のδ13C値を有する。別の植物は、ハッチ・スラック回路又はC4回路に基づいてCO2を固定する。C4植物(トウモロコシ、キビ、サトウキビ)に由来する生成物のδ13C値は、-10〜-16‰の範囲のδ13C値を有する。それゆえ、有機物質の由来及び原物であること(Originalitaet)を検査するために、δ13C値を使用することができる。
【００１０】
血漿尿素のδ13C値の測定は、通例は、酵素を利用した、尿素のCO2への変換によって行われる。それゆえ、血漿から単離された尿素溶液が外来のCO2を含まないことが重要である。もっとも、通常は常に、溶解した遊離CO2として、又は重炭酸塩の形状での結合CO2として、血漿中にCO2が存在する。血漿から完全にCO2を除去することは容易ではない。さらに、単離の際にCO2がサンプルに導入されることを妨げる必要がある。
【００１１】
血漿から尿素を単離するために、Tuchman et al.は、以下のステップを含む方法を使用する。
【００１２】
0.5mlの血漿サンプルにH2O、0.5mlと60%過塩素酸40μlを混合し、沈殿したタンパク質を分離した。続いて、容器を30分間静置し、CO2を放出させた。新たな容器に移し、1MのKOH、300μlでpHを6〜7の範囲に調整した後に、沈殿した過塩素酸カリウムを分離した。イオン交換カラムを利用して、残余の重炭酸塩を除去した。
【００１３】
10mMのHCl、1mlでカラムを洗浄し、溶出物をガラス容器中におき80℃で乾燥させた。サンプルを一晩、水酸化ナトリウムを浸み込ませたガーゼ一片が一緒に入った密封容器中に静置し、残りのCO2をトラップした。
【００１４】
続いて、容器をヘリウムですすぎ、この容器をゴム栓で気密に閉鎖した。400μl当たり3mgのウレアーゼ酵素を含む0.5Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)400μlを、ゴム栓を通して注入した。1時間後に、CO2を放出させてウレアーゼ反応を停止させるために、20%リン酸100μLを添加した。放出された13CO2を、同位体比質量分析計(IRMS)を利用して測定した。
【００１５】
出願人による研究は、前記の方法が非常に影響を受けやすいことを明らかにした。この方法では、複数の起源の外来CO2が、尿素から生成したCO2の測定デルタ値をゆがめかねない。その上、この方法は、非常に労力もかかる上に長時間要する。尿素の収率が低いため、かなり大量(0.5ml)の血漿が必要となる。このことは、小児の場合は問題を引き起こすかもしれない。米国と欧州との交差検定においても、理解できない差異が結果において見られた。
【００１６】
Tuchman et al.に記載された、血漿からの尿素単離方法では、妨げとなるCO2の除去に完全には成功しないということは、尿素から生成したCO2のδ13C値を比較することによって証明できる。Tuchmann et al.によって観測されたδ13C値は、-25〜-26‰と非常に低い。
【００１７】
血漿中の本来の尿素は、栄養に依存して、-19〜-23‰のδ13C値を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、公知の方法の不利点の少なくともいくつかを克服する方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この課題は、以下のステップ:
a)尿素を含有する血漿サンプルを準備するステップ、
b)CO2を部分的に除去するために酸を添加するステップ、
c)CO2を除去して乾燥サンプルを得るために、サンプルを凍結乾燥するステップ、
d)乾燥サンプルを再溶解し、緩衝液によりpH値4〜7、好ましくは4〜6.9、特に4〜6に中和するステップ、
を含む、血漿サンプル中の尿素を単離し、CO2を除去する方法によって解決される。
【００２０】
血漿サンプル中の尿素を単離するための起点は、尿素を含有する血漿サンプルである。血漿サンプルは、公知の方法で血液サンプルから獲得することができる。本発明による方法の再現性は高いため、体積が0.2〜0.3mlの範囲の血漿サンプルで十分であるが、それより大きい量も使用することができる。
【００２１】
血漿サンプルは、少なくとも、本来の同位体比をもつ尿素を含有する。この血漿サンプルには、付加的に、13C濃縮尿素が混合されていてもよい。しかしながら、この血漿サンプルは、13C標識前駆体、例えば、酢酸塩又は重炭酸塩の投与によって13Cで濃縮されていてもよい。これに関しては、適合性の塩、例えばNa塩又はK塩を投与することができる。
【００２２】
本発明によると、CO2を放出させるための、ウレアーゼによる尿素の変換によって尿素を測定するので、まずは既存のCO2を除去する必要がある。
【００２３】
本発明の一実施形態では、まずろ過を行う。このとき、沈殿させるために溶媒、例えば、アセトニトリル及び/又はギ酸を添加する。このろ過により、血漿からタンパク質及び脂質を分離することができる。このために特に適しているのは、いわゆるHybridSPE(商標)カラムであって、SUPELCO社から入手可能である。このカラムは、特にリン脂質の除去にも適している。
【００２４】
しかしながら、タンパク質及び脂質の分離ステップを省略することも可能であって、それにもかかわらず非常に再現性の良い値が得られることが判明した。ろ過ステップの省略は、一方では時間を節約し、他方では対応するフィルターにかかるコストも節約できる。
【００２５】
本発明によると、酸が添加される。酸の添加により、CO2の一部が血漿サンプルから除去される。適しているのは、例えば、およそ20%の濃度のリン酸である。0.3mlの血漿サンプルに対しては、およそ50μlの量の酸(例えば、リン酸)で十分である。当然のことながら別の酸も使用することができる。
【００２６】
本発明による方法の本質的なステップは、続いて行われる、サンプルの凍結乾燥である。凍結乾燥とは、サンプルを凍結し、含有される水を真空中で昇華させる方法である。本発明によると、この方法は、サンプル中のCO2残存量を除去するために抜群に適している。
【００２７】
得られたサンプルを、続いて再溶解し、4〜7、好ましくは4〜6.9、特に4〜6、好ましくは5〜6の範囲のpH値へと調整する。調整には、特に緩衝液、例えば、pH9.0のリン酸緩衝液が適している。別の緩衝液も使用することができる。Tuchman et alによって使用された苛性カリ溶液は、部分的にかなり大量のCO2を含有しているため特に不都合である。
【００２８】
本発明の一実施形態では、乾燥サンプルを再溶解した後、特に緩衝液の添加に由来する残存の外来CO2を抜くために、この溶液を脱気する。1〜10mbarの範囲の真空を2〜3時間かけることが適していた。
【００２９】
この方法の結果は、血漿に由来する尿素をなおも含有するものの血漿に由来するCO2を本質的に含まないサンプルである。
【００３０】
尿素の同位体比を測定するためには、それ自身公知の方法、ウレアーゼによる変換が起用される。
【００３１】
再び溶解されたサンプルを不活性ガス、例えば、ヘリウム、窒素、又はアルゴンですすぎ、気密に閉鎖する。続いて、既存の尿素からCO2を形成するために、ウレアーゼを添加する。適しているのは、例えば、Sigma社から入手可能なウレアーゼである。0.3mlの血漿サンプルに対する20〜100ユニットの量のウレアーゼが、特に適していると判明した。
【００３２】
続いて、溶液をインキュベーションする。およそ36℃の温度での、およそ60分の時間のインキュベーションが適していると判明した。
【００３３】
その後、さらなるウレアーゼ反応を停止するために酸を添加する。さらに、酸の添加によって、形成されたCO2を放出させる。0.3mlの量の血漿サンプルに関しては、20%のリン酸100μlの使用が適していると判明した。気密容器中では、血漿中の尿素の変換に由来するCO2が放出された。次いでCO2の同位体比を測定することができる。この測定には、特にIRMSが適している。IRMSにおいては、前記のように、13Cと12Cとの間の比が、標準物質に比べて測定される。
【００３４】
実施を点検するためには、ウレアーゼを添加する前に溶液がCO2を含んでいないかどうかを検査することが有効であるかもしれない。これは、例えば、IR-MS分光法を利用して行うことが可能である。
【００３５】
本発明の一適用においては、尿素形成速度を測定するために、13C標識物質を患者に投与して13C標識尿素の形成を測定する。本発明の好ましい一実施形態では、患者が13C標識尿素前駆体を服用する前にまず血液サンプルを採取し(基準値)、続いて患者が13C標識尿素前駆体を服用した後に一回又は好ましくは複数回の血液サンプル採取を行うことによって速度を算定する。これによって、13C標識尿素の形成を点検することができる。
【００３６】
本発明によると、およそ100〜200、又は200〜300mlの血漿サンプルを使用することが可能であって、つまりTuchmanの方法と比較すると、半分の量の血液サンプルで十分である。特に、速度が算定され、かつこの方法が小児で適用される場合には、採血量が特に少量であると有利である。Tuchman et al.の方法と比べると、本発明による方法は、より優れた再現性を示す上に、あまり手間がかからない。
【００３７】
本発明は、特に好ましい実施形態においては、以下の態様に関する。
【００３８】
態様1:以下のステップ、a)血漿サンプルを準備するステップ、b)CO2を部分的に除去するために酸を添加するステップ、c)CO2を更に除去して乾燥サンプルを得るために、サンプルを凍結乾燥するステップ、並びにd)乾燥サンプルを再溶解し、緩衝液によりpH値4〜7、好ましくは4〜6.9、特に4〜6に中和するステップ、を含む、血漿サンプルから尿素を単離し、CO2を除去する方法。
【００３９】
態様2:酸を添加する前に、ステップb)でろ過が行われることを特徴とする、態様1に記載の方法。
【００４０】
態様3:ステップd)の後に、減圧下でサンプルが脱気されることを特徴とする、態様1又は2に記載の方法。
【００４１】
態様4:ステップd)でサンプルがpH値5〜6に調整されることを特徴とする、態様1〜3の少なくともいずれか一つに記載の方法。
【００４２】
態様5:血漿サンプルが、その採取前に13C標識尿素前駆体を服用した被験者又は患者に由来することを特徴とする、態様1〜4の少なくともいずれか一つに記載の方法。
【００４３】
態様6:以下のステップ、態様1〜5のいずれか一つに記載の方法による尿素を単離するステップ、不活性ガスですすぐステップ、CO2を形成するためにウレアーゼを添加するステップ、インキュベートするステップ、形成したCO2を放出させるために酸を添加するステップ、及び放出されたCO2の13C同位体比を測定するステップ、を含む、血漿サンプル中の尿素の13C同位体比を測定する方法。
【００４４】
態様7:以下のステップ、患者の第一血漿サンプルを準備するステップ、態様6に従って第一血漿サンプル中の尿素の13C同位体比を測定するステップ、前記患者に由来する、少なくとももう一つの血漿サンプルを準備するステップであって、患者が、その採取前に13C標識尿素前駆体を服用したステップ、態様6に従って少なくとももう一つの血漿サンプル中の尿素の13C同位体比を測定するステップ、並びに第一血漿サンプル中の、及び少なくとももう一つの血漿サンプル中の尿素の13C同位体比により、形成された尿素量を定量化するステップ、を含む、尿素代謝の診断方法。
【００４５】
態様8:少なくとももう二つの血漿サンプルが使用されることを特徴とする、態様7に記載の方法。
【００４６】
態様9:さらなる血漿サンプルが、患者が13C標識尿素前駆体を服用してから15〜240分の時間内に採取されたことを特徴とする、態様8に記載の方法。
【００４７】
態様10:さらなる血漿サンプルが、患者が13C標識尿素前駆体を服用してから15分間隔で採取されたことを特徴とする、態様8又は9のいずれか一つに記載の方法。
【００４８】
本発明は、特に、以下の態様A)、B)、C)、D)、E)、F)、G)、H)、I)にも関する。
【００４９】
態様A):以下のステップ、a)尿素を含有する血漿サンプルを準備するステップ、b)酸の添加するステップ、c)CO2を除去して乾燥サンプルを得るために、サンプルを凍結乾燥するステップ、d)乾燥サンプルを再溶解し、緩衝液によりpH値5〜7に中和するステップ、e)不活性ガスですすぐステップ、f)CO2を形成させるためにウレアーゼを添加するステップ、g)インキュベートするステップ、h)形成されたCO2を放出させるために酸を添加するステップ、i)放出されたCO2の同位体比を測定するステップ、を含む、血漿サンプル中の尿素の測定方法。
【００５０】
態様B):凍結乾燥前にろ過が行われることを特徴とする、態様A)に記載の方法。
【００５１】
態様C):ステップd)の後にサンプルを40〜70℃の温度に加熱することを特徴とする、態様A)又は態様B)に記載の方法。
【００５２】
態様D):CO2の同位体比を測定するために、IRMSが使用されることを特徴とする、態様A)〜C)の少なくともいずれか一つに記載の方法。
【００５３】
態様E):血漿サンプルの採取前に13C標識酢酸塩が投与されることを特徴とする、態様A)〜D)の少なくともいずれか一つに記載の方法。
【００５４】
態様F):ステップd)においてサンプルがpH値5〜6に調整されることを特徴とする、態様A)〜E)の少なくともいずれか一つに記載の方法。
【００５５】
態様G):以下のステップ、患者からの血液サンプルの採取、血液サンプルからの血漿サンプルの獲得、態様A)〜F)のいずれか一つに記載の方法による血漿サンプル中の尿素の測定、13C標識尿素前駆体の投与、時間間隔をおいた少なくとも二つの血液サンプルの採取、及び態様A)〜F)のいずれか一つに記載の方法による血液サンプルからの血漿サンプルの獲得に続く尿素の測定、を含む、尿素代謝の診断方法。
【００５６】
態様H):尿素前駆体を投与後に、少なくとも二つの血液サンプルが少なくとも120分、好ましくは少なくとも240分の時間にわたって採取されることを特徴とする、態様G)に記載の方法。
【００５７】
態様I):血液サンプルの二回の採取の間の時間が10〜20分であることを特徴とする、態様G)又はH)に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】例3に基づく方法の再現性を示す。
【図２】例4に基づくスパイキング(Spiking)実験の検量線を示す。
【図３】例5に基づく方法の再現性を示す。
【図４】例6に基づくスパイキング実験の検量線を示す。
【図５】例7に基づく尿素形成測定の結果を示す。
【図６】例7に基づく尿素形成測定の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本方法を以下の例によって詳細に説明する。
【００６０】
例1:ろ過を用いた尿素単離
血液サンプルから血漿を獲得した。血漿300μlを脱イオン水200μlで希釈した。このサンプルに、1%ギ酸を含むアセトニトリル100μlを添加した。容器中には沈殿が生じた。HybridSPEカラムを介してサンプルをろ別した。
【００６１】
ろ過液に1Mのリン酸50μlを混合し、凍結し、凍結乾燥した。0.5Mの脱気されたリン酸緩衝液pH9によりサンプルのpH値を5.5に調整した。サンプル容器(Vacutainer)をヘリウムガスですすいだ。続いて、リン酸緩衝液中にSigma社のJack Bean Urease Typ III、15mg/mlを含有する溶液70μlを添加した。サンプルを1時間、36℃でインキュベーションした。続いて、ウレアーゼ反応を停止しCO2を放出させるために、隔膜を介して、20%リン酸60μlを注入した。放出されたCO2から、IRMSを利用して同位体比の測定を行った。
【００６２】
例2:ろ過を伴わない尿素単離
この方法は、例1のように実施されたが、アセトニトリル及びギ酸の添加、並びにろ過を省略した、つまり、酸の添加後に血漿サンプルを直接凍結乾燥した。さらなる手順は同様に行った。
【００６３】
例3:方法の再現性
一つの血漿サンプルを五つのサンプルに分け、それぞれ相互に別々に、例1に基づく方法を行った。得られたそれぞれのCO2サンプルを五回測定した。差異はごくわずかである。図1を参照。
【００６４】
例4:スパイキング実験
例1の血漿サンプルに、99%標識された13C尿素を、0.01mg、0.25mg、0.5mg、0.1mg、0.2mg、0.3mgの量で添加し、このサンプルを方法1により処理した。図2は、対応する測定値を示す。検量線は、相関係数0.99923の直線上に位置する。
【００６５】
例5:再現性
例3に基づく再現性測定を、例2に基づく、フィルターを用いない方法に関して繰り返した。図3は、その結果を示す。ここでも抜群の再現性が維持されている。
【００６６】
例6:スパイキング実験
例4に基づくスパイキング実験を繰り返したが、このとき、例2に基づく方法を使用した。対応する検量線が、図4から読み取れる。その相関係数は、R=0.99959であった。
【００６７】
例7:尿素形成の測定
二人の被験者から採血し、血漿を調製し、各300μlの血漿から、本発明の方法により尿素を単離し、尿素の13C/12C同位体比を測定した。
【００６８】
その際、各サンプルを五回測定し、その平均値から基準値を算定した。続いて、被験者に99%の13C標識酢酸ナトリウム27mg/kgを投与した。
【００６９】
採血処置、及び単離された尿素の13C/12C同位体比の測定を、15、30、45、60、75、90、120、180、及び240分の間隔で繰り返した。13C標識酢酸塩のかなりわずかな部分は、体内で尿素に変換され、測定の感度ゆえに検出可能である。新たに形成された尿素の形成速度が、デルタ値の測定(13C/12C-同位体比の上昇)によって算定された。尿素形成速度を図5及び6に示す。
【図１】
0005902167.tif 000003
【図２】
0005902167.tif 000004
【図３】
0005902167.tif 000005
【図４】
0005902167.tif 000006
【図５】
0005902167.tif 000007
【図６】
0005902167.tif 000008