(57)【要約】  本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を示す新規ランチオニン誘導体の製造方法、並びに、当該ランチオニン誘導体の中間体化合物、その中間体化合物のCaSRアゴニスト、コク味付与剤及び飲食品原料の製造のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性条件下で反応させることにより下記一般式（I）で示される化合物又はその化学的に許容される塩を式(II)で表される化合物又はその化学的に許容される塩に変換する工程を含む、化合物(II)又はその化学的に許容される塩の製造方法。
【化１】
2013002329.tif 000059
【化２】
2013002329.tif 000060
（式中、R1及びR2はそれぞれ同じでも異なっても良く、水素原子又は置換されていても良い低級アルキル基であり、
R3は水素原子、置換されていても良いアルコキシカルボニル基、置換されていても良いスルホニル基又はアシル基であり、
X及びYは同一若しくは異なっていても良く、Xは、SR4、OR5又はハロゲン原子であり、YはSR6、OR7又はハロゲン原子を示すが、ここで、X及びYの少なくとも一方はSR4あるいはSR6であり、
R4及びR6はそれぞれ同一若しくは異なっていても良く、水素原子、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表し、
R5及びR7はそれぞれ同一若しくは異なっていても良く、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表す。）
【請求項２】
XがSR4であり、YがOR7である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
XがOR5であり、YがSR6である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
XがSR4であり、YがSR6である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
X及びYは同一若しくは異なっていても良く、SH又はO-PO3H2又はO-SO3Hを示すが、ここでX及びYの少なくとも一方はSHを表す、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
XがSR4であり、YがSR6であり、R4又はR6のいずれかが水素原子である、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
XがSR4であり、YがSR6であり、R4及びR6が共に水素原子である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
下記一般式（I−２）で示される化合物又はその化学的に許容される塩を、環化反応により、式(II)で表される化合物又はその化学的に許容される塩に変換する工程を含む、化合物(II)又はその化学的に許容される塩の製造方法。
【化３】
2013002329.tif 000061
【化４】
2013002329.tif 000062
（式中、R1及びR2はそれぞれ同じでも異なっても良く、水素原子又は置換されていても良い低級アルキル基であり、
R3は水素原子、置換されていても良いアルコキシカルボニル基、置換されていても良いスルホニル基又はアシル基であり、
X''及びY''は、SH、SR4、OR5又はハロゲン原子でありここで、X''及びY''の一方はSHであり、かつ、他方はSHでなく、
R4及びR5はそれぞれ同一若しくは異なっていても良く、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表す。）
【請求項９】
アルカリ性条件下で反応させることにより下記式（IV）で表される化合物又はその化学的に許容される塩を化合物(III)で表される化合物又はその化学的に許容される塩に変換させることを特徴とする、化合物(III)又はその化学的に許容される塩の製造方法。
【化５】
2013002329.tif 000063
【化６】
2013002329.tif 000064
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の式（II）で表される化合物におけるR1、R2及び／又はR3が水素原子以外の基である場合に、式(II)で表される化合物又はその化学的に許容される塩から該水素原子以外の基である保護基を脱保護する工程を含む、式（III）で表される化合物又はその化学的に許容される塩の製造方法。
【化７】
2013002329.tif 000065
【請求項１１】
下記式（V）で表される化合物、又はその化学的に許容される塩。
【化８】
2013002329.tif 000066
（式中、R1'及びR2'はそれぞれ同じでも異なっても良く、水素原子又は置換されていても良い低級アルキル基であり、
R3'は水素原子、置換されていても良いアルコキシカルボニル基又は置換されていても良いスルホニル基であり、
X'及びY'のいずれか一方はSHであり、もう一方はOR5'であり、R5'は水素原子、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表す。但し、X'が SHの場合、Y'はOHではない。）
【請求項１２】
γ-Glu-Ser-Cysである、請求項１１記載の化合物、又はその化学的に許容される塩。
【請求項１３】
下記いずれかの化合物、又はその化学的に許容される塩。
【化９】
2013002329.tif 000067
、又は
2013002329.tif 000068
【請求項１４】
請求項１１、１２又は１３のいずれかに記載の化合物、又はその化学的に許容される塩のCaSRアゴニストの製造のための使用。
【請求項１５】
請求項１１、１２又は１３のいずれかに記載の化合物、又はその化学的に許容される塩のコク味付与剤の製造のための使用。
【請求項１６】
請求項１１、１２又は１３のいずれかに記載の化合物、又はその化学的に許容される塩の飲食品原料の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を示す新規ランチオニン誘導体の製造方法、および、当該ランチオニン誘導体の中間体化合物、その中間体化合物のCaSRアゴニスト、コク味付与剤若しくは飲食品原料の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の多様化等により味覚に対する消費者の要求が高まってきており、これに伴い、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味だけでは表すことのできない、厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど上記基本味の周辺の味をも増強した味覚である「コク味」を付与することのできる優れたコク味付与剤へのニーズが高まっている。
一方、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor：ＣａＳＲ）は、カルシウム受容体とも呼ばれるが、当該受容体シグナルは種々の生体内機能を調節し、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質はコク味付与剤として用いることができる（特許文献１、非特許文献１）。
また、古くからコク味付与活性を有する化合物としてグルタチオンが知られている。しかし、グルタチオンは含硫アミノ酸であるシステインを分子内に含むため、安定性や臭いなどの面で課題がある。【０００３】
従って、ＣａＳＲアゴニスト活性を示す新規ランチオニン誘導体の製造方法、並びに、当該ランチオニン誘導体の中間体化合物、その中間体化合物のCaSRアゴニスト、コク味付与剤及び飲食品原料の製造のための使用を提供することが求められている。
非特許文献２は、以下の式Ａで表される化合物の合成方法を開示する。
非特許文献３は、シスチン誘導体からランチオニン誘導体へ変換する反応について開示する。非特許文献４は、セリン硫酸エステルを含むペプチド誘導体の反応について開示する。
【化１】
2013002329.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５５３９３号パンフレット
【特許文献２】特開２０１１−１１５１８６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The Journal of Biological Chemistry (2010), 285 (2), 1016-22
【非特許文献２】Amino Acids (1999), 17, 257-265
【非特許文献３】J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1991 903-904
【非特許文献４】J. Chem. Soc., Perkintrans.1 2002 682-686
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を示す新規ランチオニン誘導体の製造方法、並びに、当該ランチオニン誘導体の中間体化合物、その中間体化合物のCaSRアゴニスト、コク味付与剤及び飲食品原料の製造のための使用を提供することを課題とする。【０００７】
本発明者は、これまでに、種々の化合物を鋭意探索した結果、新規化合物であるランチオニン誘導体が、高いＣａＳＲアゴニスト活性と極めて優れたコク味付与効果を有することを見出し、見出された化合物を添加することにより、コク味の増強した、好ましい飲食品原料が得られることを見出してきた。そして、ここに、本発明者は、当該新規ランチオニン誘導体の製造方法、並びに、当該ランチオニン誘導体の中間体化合物、その中間体化合物のCaSRアゴニスト、コク味付与剤及び飲食品原料の製造のための使用についての新たな知見を得て、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、アルカリ性条件下で反応させることにより下記一般式（I）で示される化合物又はその化学的に許容される塩を式(II)で表される化合物（以下、「化合物（II）」と呼ぶこともある」又はその化学的に許容される塩に変換する工程を含む、化合物(II)又はその化学的に許容される塩の製造方法を提供する。
【化２】
2013002329.tif 000003
【化３】
2013002329.tif 000004
【０００９】
上記式(I)及び(II)中、R1及びR2はそれぞれ同じでも異なっても良く、水素原子又は置換されていても良い低級アルキル基であり、R3は水素原子、置換されていても良いアルコキシカルボニル基、置換されていても良いスルホニル基又はアシル基であり、X及びYは同一若しくは異なっていても良く、Xは、SR4、OR5又はハロゲン原子であり、YはSR6、OR7又はハロゲン原子を示すが、ここで、X及びYの少なくとも一方はSR4あるいはSR6であり、R4及びR6はそれぞれ同一若しくは異なっていても良く、水素原子、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表し、R5及びR7はそれぞれ同一若しくは異なっていても良く、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表す。【００１０】
また、本発明は、下記一般式（I−２）で示される化合物又はその化学的に許容される塩を、環化反応により、式(II)で表される化合物又はその化学的に許容される塩に変換する工程を含む、化合物(II)又はその化学的に許容される塩の製造方法。
【化４】
2013002329.tif 000005
【化５】
2013002329.tif 000006
（式中、R1及びR2はそれぞれ同じでも異なっても良く、水素原子又は置換されていても良い低級アルキル基であり、
R3は水素原子、置換されていても良いアルコキシカルボニル基、置換されていても良いスルホニル基又はアシル基であり、
X''及びY''は、SH、SR4、OR5又はハロゲン原子でありここで、X''及びY''の一方はSHであり、かつ、他方はSHでなく、
R4及びR5はそれぞれ同一若しくは異なっていても良く、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表す。）【００１１】
また、本発明は、アルカリ性条件下で反応させることにより下記式（IV）で表される化合物又はその化学的に許容される塩を化合物(III) 又はその化学的に許容される塩で表される化合物に変換させることを特徴とする、化合物(III)又はその化学的に許容される塩の製造方法を提供する。
【化６】
2013002329.tif 000007
【化７】
2013002329.tif 000008
【００１２】
また、本発明は、上記式（II）で表される化合物におけるR1、R2及び／又はR3が水素原子以外の基である場合に、式(II)で表される化合物から該水素以外の基である保護基を脱保護する工程を含む、式（III）で表される化合物又はその化学的に許容される塩の製造方法をも提供する。
【化８】
2013002329.tif 000009
【００１３】
さらに、本発明は、下記式（V）で表される化合物、又はその化学的に許容される塩をも提供する。
【化９】
2013002329.tif 000010
【００１４】
上記式(V)中、R1'及びR2'はそれぞれ同じでも異なっても良く、水素原子又は置換されていても良い低級アルキル基であり、 R3'は水素原子、置換されていても良いアルコキシカルボニル基又は置換されていても良いスルホニル基であり、X'及びY'のいずれか一方はSHであり、もう一方はOR5'であり、R5'は水素原子、アシル基、置換されていても良い低級アルキル基、PO3H2又はSO3Hを表す。但し、X'が SHの場合、Y'はOHではない。【００１５】
また、本発明は、上記式(V)で表される化合物、又はその化学的に許容される塩のCaSRアゴニスト、コク味付与剤又は飲食品原料の製造のための使用をも提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳述する。
本発明において、「置換されていても良い」とは、修飾される置換基又は原子が１個又は複数個の置換基を有していてもよいことを意味し、当該置換基としては当該分野で慣用される通常の置換基のいずれであってもよいが、特に規定するほか、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル、ハロゲノ低級アルキル、低級アルケニル、アリール基、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、アセトキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基等が挙げられ、好ましくは、低級アルキル、低級アルケニル、アリール基である。
本発明において、「低級アルキル基」とは、直鎖、分岐鎖又は環状の炭素数１〜６個のアルキル基を意味し、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基等が挙げられる。
「アルコキシカルボニル基」とは、アルキル−O−（CO）−を意味し、ここにアルキルとは、前記の炭素数１−６のアルキル基であって、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルなどが挙げられ、特にBoc基が好ましい。また置換基を有する場合の置換基としては、前述の置換基のほか、例えばフェニル基、９H−フルオレニル基などが好ましい。
「アシル基」とは、アルキル−O−を意味し、ここにアルキルとは、上記と同様である。また、置換基を有する場合の置換基としては、前述の置換基のほか、例えば、C1-3アルキル基などが好ましい。
【００１７】
本発明において、一般式（I）又は(II)中、以下のものが好ましい。
XがSR4であり、YがOR7である。
XがOR5であり、YがSR6である。
XがSR4であり、YがSR6である。
XがSR4であり、YがSR6であり、R4及びR6がSO3Hである。
X及びYは同一若しくは異なっていても良く、SH又はOHを示すが、ここでX及びYの少なくとも一方はSHを表す。
XがSR4であり、YがSR6であり、R4又はR6のいずれかが水素原子である。
XがSR4であり、YがSR6であり、R4及びR6が共に水素原子である。
本発明において、一般式（I）又は(II)中、以下のものが特に好ましい。
XがSR4であり、YがSR6であり、R4及びR6がSO3Hであり、R1、R2及びR3がいずれも水素原子である。なお、Ｘ'あるいはＹ'がSHの場合、一般式（I）又は(I-2)で表される化合物２つを、ジスルフィド結合を介して二量化した化合物（酸化型二量体）も本発明に含まれる。
【００１８】
一般式(II)中の３つの不斉炭素について、いずれの立体配置の化合物であってもよいが、下記式(II-1)に示した配置が好ましい。
【化１０】
2013002329.tif 000011
【００１９】
本発明において、「化学的に許容される塩」としては、具体的に例えば、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン、テトラブチルアンモニウム塩等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
【００２０】
本発明の化合物（II）又はその化学的に許容される塩の製造方法は、例えば有機合成化学的手法により達成される。
【００２１】
本発明の化合物(II)又はその化学的に許容される塩の製造方法において用いられる溶媒は、通常用いられるものであれば特に限定されないが、水性溶媒を用いることが好ましい。また、本発明の化合物(II)又はその化学的に許容される塩の製造方法において、「アルカリ性条件下で反応させる」とは、反応液のｐＨを水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン等のアルカリでアルカリ性にした状態で反応させることを意味し、当該アルカリ性反応液のｐＨは、概して、ｐＨ8.0〜14であり、好ましくは、ｐＨ9.0〜13、より好ましくは、ｐＨ9.5〜12.5である。また、反応は、室温でもよいが、加熱することも好ましい。特に、一般式（Ｉ）において、Ｘ及びＹがSHもしくはOHである場合、加熱することが好ましい。加熱する場合は、当該分野で通常用いられる温度及び加熱時間であれば特に限定されないが、好ましくは、４０℃〜１００℃の温度、より好ましくは、６０℃〜１００℃の温度範囲、さらにより好ましくは、８０℃〜１００℃の温度範囲である。また、好ましい加熱時間は、１時間〜２０時間、より好ましくは、２時間〜１２時間、さらにより好ましくは、３時間〜８時間である。
本発明の式（I−２）で表される化合物又はその化学的に許容される塩を環化反応により、化合物（II）又はその化学的に許容される塩に変換する工程において、反応液のｐHは特に限定されないが、概して、ｐＨ8.0〜14であり、好ましくは、ｐＨ9.0〜13、より好ましくは、ｐＨ9.5〜12.5である。又、この際に用いられる溶媒は、通常用いられるものであれば特に限定されないが、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエンなどが挙げられる。温度は、好ましくは、０℃〜１００℃の温度、より好ましくは、４０℃〜１００℃の温度範囲、さらにより好ましくは、８０℃〜１００℃の温度範囲である。式（I−２）において、R1, R2, 及びR3の示す好ましい基としては、式（I）におけるR1, R2, R3の好ましい基が挙げられ、又、X''として好ましい基はチオール基、ホスホニルオキシ基、スルホニルオキシ基、メタンスルホニルオキシ基、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられ、Y''の好ましい基はチオール基、ホスホニルオキシ基、スルホニルオキシ基、メタンスルホニルオキシ基、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられる。
また、R1、R2、R3が水素原子、Xw''およびY''がチオール基である化合物の加熱反応においては、上記アルカリ性条件下加熱の前に、弱酸性条件下で加熱を行うことが好ましい。温度は特に限定されないが、好ましくは、４０℃〜１００℃の温度、より好ましくは、６０℃〜１００℃の温度範囲、さらにより好ましくは、６０℃〜８０℃の温度範囲である。反応液のpHは、概してpH3〜6であり、好ましくはpH3.5〜5.5、より好ましくはpH4.0〜5.0である。さらに、加熱反応初期に、２価あるいは３価の金属塩を加えることが好ましく、鉄、カルシウム、マグネシウム、亜鉛塩がより好ましい。金属塩を添加する場合、加熱反応の途中にキレート能を有する化合物等を加えることが好ましく、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、EGTA（グリコールエーテルジアミン四酢酸）、クエン酸、各種キレート樹脂等が挙げられる。このように、アルカリ性条件下での加熱工程を有する限り、その他工程において弱酸性条件下の加熱工程を有するものであっても本発明の製造方法に含まれる。
【００２２】
本発明の式(IV)で表される化合物又はその化学的に許容される塩を化合物(III)で表される化合物に変換する工程において用いられる溶媒は特に限定されないが、水性溶媒を用いることが好ましい。
本発明の式（IV）で表される化合物又はその化学的に許容される塩を化合物(III)で表される化合物に変換させる工程は、非特許文献３に記載される方法で行うことができるが、その際の「アルカリ条件下で反応させる」とは、反応液のｐＨを水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン等のアルカリでアルカリ性にした状態で反応させることを意味し、当該アルカリ性反応液のｐＨは、概して、ｐＨ8.0〜14であり、好ましくは、ｐＨ9.0〜13、より好ましくは、ｐＨ9.5〜12である。また、反応は、室温でもよいが、加熱することも好ましい。加熱する場合は、当該分野で通常用いられる温度及び加熱時間であれば特に限定されないが、好ましくは、４０℃〜１００℃の温度、より好ましくは、６０℃〜１００℃の温度範囲、さらにより好しくは、８０℃〜１００℃の温度範囲である。
また、好ましい加熱時間は、１時間〜２０時間、より好ましくは、２時間〜１２時間、さらにより好ましくは、３時間〜８時間である。また、加熱反応時に、ジチオスレイトール（DTT）などのチオール類、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine)）などのホスフィン類を加えてもよい。
式（II）で表される化合物におけるR1、R2及び／又はR3が水素以外の基である場合に、式(II)で表される化合物から該水素以外の基である保護基を脱保護する工程を含む、式（III）で表される化合物又はその化学的に許容される塩の製造方法において、脱保護は、Protective Groups in Organic Synthesis 第３版(T.W.Green、P.G.M.Wuts著、JOHN WILLY & SONS,INC.発行、に記載の方法を適時適応できる。
【００２３】
また、本発明の化合物（II）又はその化学的に許容される塩の製造方法は、例えば、適当な出発原料を含有する飲食品原料の処理によっても達成される。例えば、γ-Glu-Cys-Cysやγ-Glu-Ser-Cys、あるいはこれらの誘導体を含有する微生物の培養液などを加熱処理し、反応系においてランチオニン誘導体を得ることもできる。このような方法もまた、本発明の一態様である。
【００２４】
本発明の方法に用いる化合物（I）（本発明の化合物（I-2）及び(V)を含む、以下、単に本発明の化合物（Ｉ）ともいう）又はその化学的に許容される塩は、例えば、有機合成化学的手法により製造することができる。
例えば、Ｘが置換されても良い酸素原子、Yが置換されても良い硫黄原子である前記の化合物（I）は、以下の合成スキームＩに従って合成することができる。
スキームＩ
【化１１】
2013002329.tif 000012
（式中、Prot1からProt5は、それぞれ独立して適当な保護基を示す。）
【００２５】
詳述すると、まずグルタミン酸誘導体(VII)とセリン誘導体を通常用いる縮合剤によりジペプチド（VIII-1）を得る。次に化合物（VIII-1）を加水分解して得られるカルボン酸（IX-1）とシスチン誘導体を縮合し、トリペプチド（X-1）とする。トリペプチド（X-1）について、そのまま脱保護を行うことにより酸化型2量体の化合物（Ｉ）を得ることが出来る。一方、化合物（X-1）のジスルフィド結合を、例えばホスフィン誘導体を用いて還元することにより、チオール化合物（XI-1）が得られ、化合物（XI-1）の保護基を除去することにより還元型の化合物（Ｉ）が得られる。還元型の化合物は、酸化型の化合物（Ｉ）を上記同様ホスフィン誘導体を用いて還元することによっても得られる。このようにして得られる一般式（Ｉ）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
また、化合物（I）若しくは（V）の一例として、R1、R2およびR3（R1'、R2'およびR3'）が水素原子、X(X')が水酸基、Y(Y')がチオール基（含むその酸化型2量体）である化合物は、例えば下記に示す合成スキームＩＩに従い製造することが出来る。
スキームII
【化１２】
2013002329.tif 000013
【００２６】
Ｘが置換されても良い酸素原子、ハロゲン原子、Yが置換されても良い硫黄原子である前記の化合物（I）は、以下の合成スキームIIIに従って合成することができる。
スキームＩＩＩ
【化１３】
2013002329.tif 000014
（式中、Prot1からProt5は、それぞれ独立して適当な保護基を示す。）
【００２７】
詳述するとスキームＩで得られた化合物（X-1）の保護基４（Prot4）を脱保護した化合物（XII-2）を、通常用いられる試薬、例えばホスホニルクロリド、スルホニルクロリドでリン酸誘導体、スルホン酸誘導体に、ハロゲンとホスフィン誘導体などを用いることにより、ハロゲン誘導体に導くことが出来る。得られた（XIII-2）をそのまま脱保護を行うことにより酸化型2量体の化合物（Ｉ）を得ることが出来る。一方、化合物（XIII-2）のジスルフィド結合を、例えばホスフィン誘導体を用いて還元することにより、チオール化合物（XI-2）が得られ、化合物（XI-2）の保護基を除去することにより還元型の化合物（Ｉ）が得られる。還元型の化合物（Ｉ）は、酸化型の化合物（Ｉ）を上記同様ホスフィン誘導体を用いて還元することによっても得られる。このようにして得られる一般式（Ｉ）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
【００２８】
Ｘが置換されても良い酸素原子、ハロゲン原子、Yが置換されても良い硫黄原子である前記の化合物（I）は、以下の合成スキームIＶに従っても合成することができる。
スキームＩＶ
【化１４】
2013002329.tif 000015
【００２９】
詳述すると、まずグルタミン酸誘導体(VII)と置換アラニン誘導体を通常用いる縮合剤によりジペプチド（IX-3）を得る。次に化合物（IX-3）とシスチン誘導体を縮合し、トリペプチド（XIII-2）とする。トリペプチド（XIII-2）について、そのまま脱保護を行うことにより酸化型2量体の化合物（Ｉ）を得ることが出来る。一方、化合物（XIII-2）のジスルフィド結合を、例えばホスフィン誘導体を用いて還元することにより、チオール化合物（XI-2）が得られ、化合物（XI-2）の保護基を除去することにより還元型の化合物（Ｉ）が得られる。還元型の化合物は、酸化型の化合物（Ｉ）を上記同様ホスフィン誘導体を用いて還元することによっても得られる。）を得る。このようにして得られる一般式（Ｉ）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
【００３０】
Ｘが置換されても良い硫黄原子、Yが置換されても良い酸素原子、ハロゲン原子である前記の化合物（I）は、以下の合成スキームＶに従って合成することができる。
スキームＶ
【化１５】
2013002329.tif 000016
（式中、Prot1からProt5は、それぞれ独立して適当な保護基を示す。）
【００３１】
詳述すると、まずグルタミン酸誘導体(VII)とシスチン誘導体を通常用いる縮合剤によりジペプチド（VIII-4）を得る。次に化合物（VIII-4）を加水分解して得られるカルボン酸（IX-4）とセリン誘導体を縮合し、トリペプチド（XII-4）とする。トリペプチド（XII-4）を、通常用いられる試薬、例えばホスホニルクロリド、スルホニルクロリドでリン酸誘導体、スルホン酸誘導体に、ハロゲンとホスフィン誘導体などを用いることにより、ハロゲン誘導体に導くことが出来る。得られた（XIII-4）をそのまま脱保護を行うことにより酸化型2量体の化合物（Ｉ）を得ることが出来る。一方、化合物（XIII-4）のジスルフィド結合を、例えばホスフィン誘導体を用いて還元することにより、チオール化合物（XI-4）が得られ、化合物（XI-4）の保護基を除去することにより還元型の化合物（Ｉ）が得られる。還元型の化合物は、酸化型の化合物（Ｉ）を上記同様ホスフィン誘導体を用いて還元することによっても得られる。このようにして得られる一般式（Ｉ）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
【００３２】
Ｘが置換されても良い硫黄原子、Yが置換されても良い酸素原子、ハロゲン原子である前記の化合物（I）は、以下の合成スキームＶIに従って合成することもできる。
スキームＶI
【化１６】
2013002329.tif 000017
【００３３】
詳述すると、まずグルタミン酸誘導体(VII)とシスチンを通常用いる縮合剤によりジペプチド（IX-4）を得る。次に化合物（IX-4）と置換アラニン誘導体を縮合し、トリペプチド（XII-5）とする。トリペプチド（XII-5）を、そのまま脱保護を行うことにより酸化型2量体の化合物（Ｉ）を得ることが出来る。一方、化合物（XII-5）のジスルフィド結合を、例えばホスフィン誘導体を用いて還元することにより、チオール化合物（XI-5）が得られ、化合物（XI-5）の保護基を除去することにより還元型の化合物（Ｉ）が得られる。還元型の化合物は、酸化型の化合物（Ｉ）を上記同様ホスフィン誘導体を用いて還元することによっても得られる。このようにして得られる一般式（Ｉ）で示される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
【００３４】
本発明の式(V)で表される化合物、又はその化学的に許容される塩は、好ましくは、以下の化合物、又はその化学的に許容される塩である。
【化１７】
2013002329.tif 000018
【００３５】
また、本発明の式(V)で表される化合物、又はその化学的に許容される塩は、好ましくは、γ-Glu-Ser-Cys、γ-Glu-Ser(SO3H)-Cys、γ-Glu-Ser(PO3H2)-Cys、γ-Glu-Ser(Ac)-Cys、γ-Glu-Cys-Ser(SO3H)、γ-Glu-Cys-Ser(PO3H2)、γ-Glu-Cys-Ser(Ac)である。ここで、Ser(SO3H)はセリン硫酸エステル、Ser(PO3H2)はホスフォセリン、Ser(Ac)は、O-アセチルセリンを指す。
さらに本発明の式(V)で表される化合物としては、例えば、Ｘ'あるいはＹ'がSHの場合、２つの式(V)で表される化合物が、ジスルフィド結合を介して二量化した化合物（酸化型二量体）も本発明に含まれる。当該酸化型二量体としては、例えば以下のような化合物が挙げられる。
【化１８】
2013002329.tif 000019
本発明の製造方法により得られる式(II)又は(III)で表される化合物は、公知の分離手段、例えば減圧濃縮、溶媒抽出、晶析、クロマトグラフィーなどにより単離精製することができる。
【００３６】
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体は、優れたＣａＳＲ活性アゴニスト活性、優れたコク味付与効果を有するため、ＣａＳＲアゴニストやコク味付与剤として用いることができる。従って、中間体化合物である式(V)で表される化合物、又はその化学的に許容される塩を、ＣａＳＲアゴニスト、コク味付与剤又は飲食品原料の製造のために使用することができる。中間体化合物である式(V)で表される化合物、又はその化学的に許容される塩をＣａＳＲアゴニストの製造に使用する際には、必要に応じて、医薬的に許容しうる担体、希釈剤等をＣａＳＲアゴニストに含有させてもよく、また、ランチオニン誘導体の量として、ＣａＳＲアゴニストの重量に対して、１０ｐｐｂ〜９９．９％、好ましくは０．０５ｐｐｍ〜９９．９％、より好ましくは０．１ｐｐｍ〜９９．９％、含有するように添加して用いることができる。同様に、中間体化合物である式(V)で表される化合物、又はその化学的に許容される塩をコク味付与剤又は飲食品原料の製造に使用する際には、喫食可能な種々の食品添加物等をそれらに添加してもよく、また、ランチオニン誘導体の量で、コク味付与剤又は飲食品原料の重量に対して、１０ｐｐｂ〜９９．９％、好ましくは０．０５ｐｐｍ〜９９．９％、より好ましくは０．１ｐｐｍ〜９９．９％、含有するように添加して用いることができる。
また、本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体は、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸などの有機酸類、種々の酵母エキスなどから選択される少なくとも１種の他の調味原料と組み合わせて用いることにより、他の調味原料を単独で用いる場合に比べて、よりコク味の増した、好ましい調味料を提供することができる。本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体を上記の他の調味原料と組み合わせて用いる場合の濃度は、当業者であれば官能評価等の検討を経て適宜設定することができるが、一例を挙げると、最終濃度に対して、本発明のランチオニン誘導体を０．１ｐｐｍ〜５００ｐｐｍ程度含有させればよい。
【００３７】
本発明において「コク味」とは、甘味（sweet taste）、塩味（salty taste）、酸味（sour taste）、苦味（bitter taste）、うま味（umami）で表される５基本味（five basic tastes）では表すことのできない味を意味し、基本味だけでなく、厚み（thickness）・ひろがり（growth（mouthfulness））・持続性（continuity）・まとまり（harmony）など基本味の周辺の味（marginal tastes）をも増強した味をいう。ここで、「コク味付与」とは、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味の増強と、それに伴う厚み・ひろがり・まとまりなど基本味の周辺の味を付与することをいう。また、これを呈味増強作用と表現することもできる。したがって、本発明の製造方法により製造される化合物は、呈味増強剤（Flavor Enhancer）と表現することもできる。本発明の製造方法により製造される化合物は、甘味増強剤、塩味増強剤、酸味増強剤、苦味増強剤またはうま味増強剤として使用することもできる。
また、味覚は喫食後の時間経過とともに変化するが、喫食直後から順に、先味（initial taste）、中味（middle taste）及び後味（after taste）と呼ぶ。これらは相対的な概念であるが、概して、先味、中味及び後味は、それぞれ喫食後０から２秒まで、２秒から５秒まで、及び５秒以降に感じる呈味である。また、先味と中味を合わせて「先中味」といい、中味と後味を合わせて「中後味」という。また、０から５秒までを「先中味」といい、２秒以降約３０秒前後までを「中後味」とする。３区分に分けた評価について、喫食者の評価への集中が困難なため、ふつう２区分に分けた評価を常用する。
コク味及び呈味パターンに対するＣａＳＲ活性を有する物質の効果は、ヒトによる味覚試験などの方法によって確認することができる。このようなヒトによる味覚官能試験としては例えば特許文献２（特開２０１１−１１５１８６号公報）の実施例１３で示される試験が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書において、「ＣａＳＲ」とは、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor）を意味し、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものであり、カルシウム受容体とも呼ばれる。本明細書において「ＣａＳＲアゴニスト」とは、上記ＣａＳＲに結合し、ＣａＳＲを活性化する物質を意味する。また、本明細書において、「ＣａＳＲを活性化する」とは、ＣａＳＲにリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、ＣａＳＲに結合し、ＣａＳＲを活性化する性質を「ＣａＳＲアゴニスト活性」という。
【００３９】
上記ＣａＳＲとしては、GenBank Accession No. NM_000388で登録されているヒトＣａＳＲ遺伝子によってコードされるヒトＣａＳＲが好ましく例示できる。尚、ＣａＳＲは、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、ＣａＳＲ機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。なお、ＣａＳＲ機能はこれらの遺伝子を細胞に発現させ、カルシウム添加時の電流の変化や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。
上記ＣａＳＲは、その由来は特に制限されず、上記ヒトのＣａＳＲのみならず、マウス、ラット、イヌなどを含むあらゆる動物由来のＣａＳＲが挙げられる。
【００４０】
上述の如く、ＣａＳＲ活性は、ＣａＳＲ又はその断片を発現した生きた細胞、ＣａＳＲ又はその断片を発現した細胞膜、ＣａＳＲ又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することができる。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、これに限定されるものではない。
ＣａＳＲは、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにＣａＳＲ遺伝子をクリーニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。
ＣａＳＲの発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が観察された卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が観察された培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、被検物質を１μＭ〜１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加し、上記被検物質存在下でのＣａＳＲ活性を測定することで、上記被検物質のＣａＳＲアゴニスト活性を測定する。
又、より具体的には、ＣａＳＲアゴニスト活性試験としては例えばＷＯ２００７／０５５３９３国際公開パンフレットに記載の試験例で示される試験が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体と併用されるアミノ酸又はペプチドは、ＷＯ２００７／０５５３９３号国際公開パンフレットに記載のペプチド類と併用してもよい。
【００４２】
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体は、そのままで、又は飲食品的に許容しうる担体や他の調味原料と混合して、調味料とすることができる。他の調味原料としては、例えば、香料、糖類、甘味料、食物繊維類、ビタミン類、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸などの有機酸類が挙げられ、更には種々の酵母エキスも挙げられる。
【００４３】
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体は塩の形態をも包含する。本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体が塩の形態を形成し得る場合、その塩は化学的、薬理学的に許容される、可食性の塩であればよく、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
【００４４】
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体、CaSRアゴニスト、コク味付与剤、あるいは飲食品原料は、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限なしにあらゆる形態で用いることができる。
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体、CaSRアゴニスト、コク味付与剤、あるいは飲食品原料は、食品、飲料、調味料等の各種飲食品に配合して用いることができる。
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体、CaSRアゴニスト、コク味付与剤、あるいは飲食品原料を食品、飲料、調味料等の各種飲食品に配合して用いる場合の最終的なランチオニン誘導体の量及び併用されるアミノ酸又はペプチドの量は所望の効果が得られる量であれば特に制限されないが、ランチオニン誘導体の量及び／又はアミノ酸若しくはペプチドの量として、食品、飲料あるいは調味料等の全質量を基準として、それぞれについて１０ｐｐｂ〜９９．９％、好ましくは０．０５ｐｐｍ〜９９．９％、より好ましくは０．１ｐｐｍ〜９９．９％、程度である。
【００４５】
本発明の製造方法により製造されるランチオニン誘導体、CaSRアゴニスト、コク味付与剤、あるいは飲食品原料が配合された食品、飲料、調味料等の各種飲食品には、飲食品的に許容しうるあらゆる固体又は液体の担体、適当な調味原料等をさらに配合させてもよい。
上記担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水等が挙げられる。
上記の調味原料は、当業界で用いられるいずれの調味原料であってもよく特に制限されないが、より具体的には既に上述のものが挙げられる。
上記の担体、他の調味原料等はいずれもその含有量は特に制限されない。
上記調味原料のうち、酵母エキスは、由来となる菌体・その培養条件・抽出処理方法のいずれも特に限定されず任意の酵母エキスを用いることができ、更に加熱処理、酵素処理、濃縮、粉末化処理等が施されたものでも良い。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
（参考例）式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の製造
(Fmoc-L-Cys-Ot-Bu)2  (N,N'-difluorenylmethoxycarbonyl-L-cystine di-t-butylester，4.81 mmol)をテトラヒドロフラン（58.5 mL）と水（1.5 mL）に溶解した。氷冷下トリブチルホスフィン(5.28 mmol)を加えて室温に戻し、４時間攪拌した。反応液を冷却し、10%クエン酸水溶液 （60 mL）を加えた。白濁液を室温に戻し、酢酸エチル（60 mL）で抽出した。有機層を食塩水 60 mLで洗浄後、濃縮し油状残渣を得た。残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)にて精製し、化合物1を油状物として得た。
収率 97%。
ESI MS m/z 422.4 (M+Na)+ 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.50 (9H, s), 2.99 (2H, m), 4.23 (1H, t, J=6.8 Hz), 4.41 (2H, m), 4.54 (1H, m), 5.68 (1H, d, J=7.2 Hz), 7.32 (2H, m), 7.41 (2H, t, J=7.2 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.6 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.2 Hz).
【化１９】
2013002329.tif 000020
【００４７】
化合物2の合成
化合物1(6.04 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（60 mL）に溶解し、Boc-iodo-D-Ala-OMe (N-t-butoxycarbonyl-3-iodo-D-alanine methylester)(6.20 mmol)を加えた後、炭酸セシウム (6.02 mmol)を加え、室温で一晩攪拌した。反応液を冷却し10%クエン酸水溶液（50 mL）および水（30 mL）を加えた後、酢酸エチル（60 mL）で抽出後、再び水層を酢酸エチル（60 mL）で抽出した。有機層を合わせ、10%クエン酸水溶液（50 mL）、食塩水（50 mL）で順次洗浄し、有機層を濃縮した。得られた油状残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)を用いて精製し、化合物2を油状物として得た。
収率 66%。
ESI MS m/z 601.2 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 (9H, s), 1.49 (9H, s), 3.01 (4H, m), 3.73 (3H, s), 4.24 (1H, t, J=7.2 Hz), 4.39 (2H, d, J=7.2 Hz), 4.48-4.55 (2H, m), 5.37 (1H, brd, J=6.8 Hz), 5.80 (1H, brd, J=6.8 Hz), 7.32 (2H, m), 7.40 (2H, t, J=7.2 Hz), 7.63 (2H, m), 7.77 (2H, d, J=7.6 Hz).
【化２０】
2013002329.tif 000021
【００４８】
化合物4の合成
（工程１）化合物2(4.01 mmol)をジクロロメタン 70 mLに溶解し、トリフルオロ酢酸（70 mL）を加えて室温で１時間攪拌後、反応液を濃縮し、化合物3を含む残渣が得られた。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
【化２１】
2013002329.tif 000022
【００４９】
（工程２）氷冷下、化合物3（4.01 mmol相当）に脱水ジメチルホルムアミド（60 mL）を加えて均一液とし、そこへジイソプロピルエチルアミン(8.04 mmol)を滴下した。室温に戻してカルボニルビスイミダゾール(8.10 mmol)を加えそのまま一晩攪拌した。冷却攪拌条件下、反応液に10%クエン酸水溶液（50 mL）を加え、室温に戻した後、酢酸エチル（100 mL）で抽出、水層を更に酢酸エチルで抽出して有機層を合わせた。この有機層を10%クエン酸水溶液（50 mL ｘ ２）、食塩水で１回洗浄後濃縮し油状残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)を用いて精製し、化合物4を油状物として得た。
収率 39%（２工程）。
ESI MS m/z 448.5 (M+Na)+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.71 (1H, dd, J=9.2, 14.4 Hz), 2.78-2.90 (2H, m), 3.02 (1H, d, J=14.4 Hz), 3.86 (3H, s), 4.20 (1H, t, J=6.8 Hz), 4.40 (2H, d, J=6.8 Hz), 4.56 (1H, dd, J=5.6, 9.2 Hz), 4.68 (1H, m), 6.30 (1H, d, J=5.6 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.60 (2H, d, J=7.6 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.6 Hz).
【化２２】
2013002329.tif 000023
【００５０】
化合物6の合成
（工程１）化合物4(1.54 mmol)に10%モルホリン−ジメチルホルムアミド溶液（14 mL）を加えて室温にて３０分攪拌した。反応液を濃縮すると化合物5を含む残渣が得られた。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
【化２３】
2013002329.tif 000024
【００５１】
（工程２）Boc-Glu-OtBu (N-t-ブトキシカルボニル-L-グルタミン酸α-t-ブチルエステル)
(1.70 mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（9 mL）に溶解し、HOBt・H2O (1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物)(1.85 mmol)とWSC・HCl(1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド) (1.90 mmol)を加えて室温で１５分攪拌した。そこへジメチルホルムアミド（20 mL）に懸濁した化合物5 (1.54 mmol相当)を加え、室温で一晩反応させた。反応液を濃縮後、残渣に酢酸エチル（50 mL）と水（50 mL）を加えて分液し、水層を更に酢酸エチル（50 mL）で抽出した。有機層を合わせて重曹水（50 mL）と食塩水（50 mL）で洗浄後、濃縮した。得られたペースト状残渣をシリカゲルカラム(n-ヘキサン-酢酸エチル)にて精製し、6を油状物として得た。
収率 81% (２工程)。
ESI MS m/z 490.0 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.44 (9H, s), 1.46 (9H, s), 1.90 (1H, m), 2.17 (1H, m), 2.32 (2H, m), 2.60 (1H, dd, J=10.5, 14.1 Hz), 2.92-2.98 (2H, m), 3.18 (1H, dd, J=6.0, 14.7 Hz), 3.84 (3H, s), 4.46 (1H, m), 4.80 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.32 (1H, d, J=8.1 Hz), 7.09 (1H, brs).
【化２４】
2013002329.tif 000025
【００５２】
化合物8aおよび8bの合成
（工程１）化合物6 (1.25 mmol)をテトラヒドロフラン（30 mL）に溶解し、氷冷攪拌下、0.2M水酸化リチウム水溶液(2.50 mmol)を加えた。３０分後、10%クエン酸水溶液を用いて約pH6に中和した。室温に戻して反応液を濃縮後、酢酸エチル抽出（20 mL ｘ ３）を行った。水層を更に酢酸エチル抽出（20 mL ｘ ３）して有機層を合わせ、食塩水（10 mL）で洗浄した後、有機層を濃縮し化合物7を得た。収率 100%と仮定してそのまま次の反応に用いた。
【化２５】
2013002329.tif 000026
【００５３】
（工程２）化合物7(1.25 mmol相当)に4N塩酸／ジオキサン溶液（25 mL）を加え室温で一晩反応させた後、反応液を濃縮した。得られたペースト状の残渣は強塩基性イオン交換樹脂（アンバーライト IRA400 OH AG）を用いて精製を行い２つの画分を得た。先に溶出した画分の一部を更に逆相分取HPLC（カラム：野村化学社製Develosil RPAQUEOUS-AR-5、移動相：0.1%蟻酸を含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）で精製することにより化合物8aをあめ状物質として得た。一方、後から溶出した画分を濃縮することにより白色の固体が得られ、さらにこの固体を水に溶解後、凍結乾燥することにより得られた残渣を、少量の水でスラリー洗浄し、化合物8bを白色固体として得た。
化合物8a
ESI MS m/z 318.3 (M-H)-
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 2.13 (2H, m), 2.50 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.64 (1H, d, J=15.0 Hz), 2.83 (1H, dd, J=10.8, 15.0 Hz), 3.02 (1H, dd, J=2.4, 15.0 Hz), 3.15 (1H, dd, J=5.4, 15.0 Hz), 3.83 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.55 (1H, dd, J=2.4, 5.4 Hz), 4.91 (1H, dd, J=2.4, 10.8 Hz).
化合物8b
収率 26%(２工程)
ESI MS m/z 318.0 (M-H)-
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 2.12 (2H, m), 2.48 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.72 (1H, d, J=14.4 Hz), 2.76 (1H, dd, J=10.2, 14.4 Hz), 2.89 (1H, dd, J=9.6, 14.4 Hz), 3.05 (1H, d, J=14.4 Hz), 3.78 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.42 (1H, d, J=9.6 Hz), 4.91 (1H, d, J=10.2 Hz).
【化２６】
2013002329.tif 000027
【化２７】
2013002329.tif 000028
【００５４】
実施例１：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（１）
非特許文献２を参考に合成したγ-Glu-Cys-Cys（VI）を超純水に溶解し、濃度53 ppmのpH 3.3標品水溶液を調製した。このpH 3.3標品水溶液の一部をとり、水酸化ナトリウム水溶液を加えpH10に調整した後、1.5mLミクロテストチューブに100μL分注した。分注された水溶液を90℃に加温されたウォーターバスで6時間加熱した。
【化２８】
2013002329.tif 000029
【００５５】
得られた加熱処理サンプルは、下記逆相液体クロマトグラフィーで分離後に、質量分析装置に導入して、サンプル中に含まれる式(III)で表される化合物を定量した。定量の際の表品として、上記の参考例の方法で合成した式(III)で表される化合物を用いた。【００５６】
下記逆相液体クロマトグラフィーによる分離条件は下記の通りである。
（１）HPLC：  Agilent Technologies 1200シリーズ
（２）分離カラム：  Develosil RPAQUEOUS  内径2.0mm、長さ250mm、(野村化学社製)
（３）注入量：    2μL
（４）カラム温度：  25℃
（５）移動相Ａ：  0.1％酢酸/アセトニトリル = 98/2
（６）移動相Ｂ：  0.1％酢酸/アセトニトリル = 10/90
（７）流速：  0.2mL／min
（８）溶出条件：  成分の溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて
行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通り。
0分（0%）、20分（60%）、20.1分（0%）、30分（0%）
質量分析計による定量の条件は下記の通り。
（１）質量分析装置：  Applied Biosystems API4000
（２）検出モード：  Selected Ion Monitoring（ポジティブイオンモード）
（３）選択イオン：
第一のマスアナライザー      第二のマスアナライザー
Q1                            Q3
化合物III            320.2                          190.9
（４）コリジョンエネルギー（CE）：19(V)
（５）定量法：式(III)で表される化合物の標品（上記の参考例で合成した化合物）を用い、外部標準法により行った。【００５７】
実施例２：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（２）
実施例１で調製したpH3.3標品水溶液（８mL）に、水酸化ナトリウム水溶液を加え、pH12に調整した後、1.5mLミクロテストチューブに100μL分注し、実施例１と同様の方法により6時間加熱処理サンプルを作製後、化合物IIIの定量を行った。【００５８】
収率
反応収率は以下に示した通りである。
【表１】
2013002329.tif 000030
【００５９】
実施例３：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（３）
γ-Glu-Cys-Cys（VI）を超純水に溶解し、濃度0.3 mM（106 ppm）のpH 3.3標品水溶液を調製した。pH3.3標品水溶液（0.5 mL）に、200 ppm硝酸鉄（III）水溶液（0.5 mL）を加えた後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH10に調整した。この水溶液を90℃に加温されたウォーターバスでさらに5時間加熱した。この加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６０】
実施例４：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（４）
実施例３で調製したpH3.3標品水溶液（0.5 mL）に、400 ppm炭酸カルシウム水溶液（0.5 mL）を加えた後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH10に調整した。この水溶液を90℃に加温されたウォーターバスでさらに3時間加熱した。この加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６１】
実施例５：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（５）
γ-Glu-Cys-Cys（VI）を超純水に溶解し、濃度106 ppmのpH 3.3標品水溶液を調製した。pH3.3標品水溶液（0.5 mL）に、10 ppm硝酸亜鉛水溶液（0.5 mL）を加えた後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH10に調整した。この溶液を90℃に加温されたウォーターバスでさらに6時間加熱した。この加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６２】
金属塩添加による化合物III収率向上結果は以下に示した通りである。
【表２】
2013002329.tif 000031
【００６３】
実施例６：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（６）
実施例１で調製したpH3.3標品水溶液の一部（８mL）をとり、水酸化ナトリウム水溶液を加え、pH4.6に調整した後、60℃に加温されたウォーターバスで1時間加熱した。その後、水酸化ナトリウムを用いてpH10としたのち、90℃に加温されたウォーターバスでさらに加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６４】
実施例７：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（７）
実施例１で調製したpH3.3標品水溶液の一部（８mL）をとり、水酸化ナトリウム水溶液を加え、pH4.6に調整した後、90℃に加温されたウォーターバスで1時間加熱した。その後、水酸化ナトリウムを用いてpH10としたのち、90℃に加温されたウォーターバスでさらに加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６５】
実施例８：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（８）
非特許文献２を参考に合成したγ-Glu-Cys-Cys（VI）を超純水に溶解し、濃度106ppmのpH 3.3標品水溶液を調製した。このpH3.3標品水溶液（3mL）に、0.1 mM塩化カルシウム水溶液（3mL）を加えた後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH4.6に調整した。この水溶液を60℃に加温されたウォーターバスで1時間加熱した。この加熱水溶液（5mL）に、5 mM EDTA水溶液（0.05mL）を加えた後、水酸化ナトリウムを用いてpH10とし、90℃に加温されたウォーターバスでさらに加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６６】
実施例９：式VIで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（９）
実施例５で調製したpH3.3標品水溶液（3mL）に、0.6mM塩化カルシウム水溶液（3mL）を加えた後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH4.6に調整した。この水溶液を60℃に加温されたウォーターバスで1時間加熱した。この加熱水溶液（5mL）に、5mM EDTA水溶液（0.05mL）を加えた後、水酸化ナトリウムを用いてpH10とし、90℃に加温されたウォーターバスでさらに加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００６７】
反応収率は以下に示した通りである。
【表３】
2013002329.tif 000032
【００６８】
実施例１０：式Vで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（１０）
後述する実施例２５で得られた化合物２６を超純水に溶解し、濃度0.1 mM (154 ppm)水溶液を調製した後、26 mMのTCEP（１ mL）水溶液を加えた。得られた水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加えpH8に調整した後、90℃に加温されたウォーターバスで12時間加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。
【化２９】
2013002329.tif 000033
【００６９】
実施例１１：式Vで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（１１）
実施例１０で調製した化合物２６の0.1mM水溶液に、26mMのTCEP水溶液（１mL）を加えた。得られた水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加えpH10に調整した後、90℃に加温されたウォーターバスで4時間加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。【００７０】
実施例１２：式Vで表される化合物を用いた式(III)で表される化合物（式(II)において、R1、R2及びR3がいずれも水素である化合物）の合成（１２）
後述する実施例２９で得られた化合物３０を超純水に溶解し、濃度0.1mM (77ppm) 水溶液を調製した後、26mMのTCEP水溶液を加えた。得られた水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加えpH10に調整した後、90℃に加温されたウォーターバスで6時間加熱し、加熱処理サンプルを作製した。得られた加熱処理サンプルについて、化合物IIIの定量を行った。
【化３０】
2013002329.tif 000034
【００７１】
反応収率は以下に示した通りである。
【表４】
2013002329.tif 000035
【００７２】
本発明の製造方法、中間体化合物により、CaSRアゴニスト、コク味付与剤及び飲食品原料等として極めて有用なランチオニン誘導体を提供することが可能となり、産業上も非常に有用である。【００７３】
実施例１３：式（V）で表される化合物またはその酸化型二量体である９〜１４の合成
Boc-Glu-Ot-Bu（N-t-ブトキシカルボニルグルタミン酸t-ブチルエステル）（455 mg, 1.50 mmol）のアセトニトリル溶液（15 mL）に、HOAt (1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール)（226 mg, 1.66 mmol）およびWSC・HCl（315 mg, 1.64 mmol）を加え、室温にて1時間攪拌した。反応液にH-Ser(t-Bu)-OMe（350 mg, 1.65 mmol）およびトリエチルアミン（0.3 mL, 2.15 mmol）を加え、さらに15時間攪拌した。反応液を減圧により約2 mLまで濃縮した後、酢酸エチルを加えた。有機層を、10%クエン酸水溶液、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分配洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧により濃縮乾固することにより化合物9（637 mg）を無色あめ状物質として得た。ここで、化合物9の式中、Ｂｏｃは、t-ブトキシカルボニル残基（-COO-t-Bu）を意味する。
収率92%；ESI MS m/z 461.2 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.19 (9H, s), 1.47 (9H, s), 1.49 (9H, s), 1.88 (2H, m), 2.10 (2H, m), 2.38 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.63 (1H, dd, J=3.6, 9.6 Hz), 3.75 (3H, s), 3.80 (1H, dd, J=4.4, 9.6 Hz), 4.00 (1H, m), 4.61 (1H, dd, J=3.6, 4.4 Hz).
【化３１】
2013002329.tif 000036
化合物9（620 mg, 1.35 mmol）をメタノール（5 mL）に溶解後、氷冷下1N水酸化ナトリウム水溶液（2.5 mL, 2.50 mmol）を加え、室温にて2時間攪拌した。減圧により約3 mLまで濃縮した後、10 %クエン酸水溶液を加えpHを十分酸性にした後、酢酸エチルにて分配抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧により濃縮乾固することにより化合物10（578 mg）を無色あめ状物質として得た。
収率96%；ESI MS m/z 447.2 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.20 (9H, s), 1.47 (9H, s), 1.49 (9H, s), 1.89 (2H, m), 2.10 (2H, m), 2.39 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.65 (1H, dd, J=3.6, 9.2 Hz), 3.82 (1H, dd, J=4.4, 9.2 Hz), 4.00 (1H, m), 4.57 (1H, dd, J=3.6, 4.4 Hz).
【化３２】
2013002329.tif 000037
化合物10（357 mg，0.80 mmol）のアセトニトリル溶液（10 mL）に、HOAt（122 mg, 0.90 mmol）およびWSC・HCl（170 mg, 0.89 mmol）を加え、室温にて1時間攪拌した。反応液に (H-Cys-Ot-Bu)2・2HCl(シスチンt-ブチルエステル塩酸塩)（170 mg, 0.40 mmol）およびトリエチルアミン（0.2 mL, 1.43 mmol）を加え、さらに15時間攪拌した。反応液を減圧により約2 mLまで濃縮した後、酢酸エチルを加えた。有機層を、10%クエン酸水溶液、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分配洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧により濃縮乾固することにより化合物11（441 mg）を白色固体として得た。
収率91%；ESI MS m/z 1232.7 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.22 (18H, s), 1.47 (18H, s), 1.49 (18H, s), 1.50 (18H, s), 1.90 (2H, m), 2.11 (2H, m), 2.39 (4H, m), 3.06 (2H, m), 3.21 (2H, m), 3.64 (4H, m), 4.02 (2H, m), 4.55 (2H, m), 4.64 (2H, m).
【化３３】
2013002329.tif 000038
【００７４】
化合物11（82 mg, 0.068 mmol）を4N塩酸ジオキサン溶液（2 mL）に溶解後、氷冷下4時間攪拌した。減圧により溶媒と過剰の試薬を除去することにより、化合物12塩酸塩を白色固体として得た。
収率100%；ESI MS m/z 673.3 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 2.21 (2H, m), 2.29 (2H, m), 2.64 (4H, m), 3.10 (2H, m), 3.30 (2H, m), 3.85 (4H, m), 4.10 (2H, m), 4.54 (2H, m), 4.77 (2H, m).
【化３４】
2013002329.tif 000039
【００７５】
化合物12（100 mg, 0.083 mmol）をクエン酸バッファー／メタノール混合溶液（pH 5）（3 mL）に溶解後、TCEP・HCl (トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロリド（30 mg, 0.10 mmol）を加え、室温にて0.5時間攪拌した。反応液に酢酸エチルを加えた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分配洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧により濃縮乾固することにより化合物13（82 mg）を得た。
収率82 %；ESI MS m/z 628.4 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.23 (9H, s), 1.47 (9H, s), 1.49 (9H, s), 1.50 (9H, s), 1.90 (1H, m), 2.14 (1H, m), 2.40 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.91 (1H, dd, J=5.6, 14.0 Hz), 2.98 (1H, dd, J=4.8, 14.0 Hz), 3.63 (1H, dd, J=5.6, 8.8 Hz), 3.71 (1H, dd, J=4.8, 8.8 Hz), 4.01 (1H, m), 4.48-4.63 (2H, m).
【化３５】
2013002329.tif 000040
【００７６】
化合物13（59 mg, 0.097 mmol）を4N塩酸ジオキサン溶液（2 mL）に溶解後、氷冷下4時間攪拌することにより、化合物14塩酸塩を白色固体として得た。
収率100%; ESI MS m/z 338.0 (M+H)+；1H NMR (400 MHz, D2O) δ 2.12 (2H, m), 2.50 (2H, m), 2.89 (2H, m), 3.80 (2H, m), 3.85 (1H, m), 4.08 (1H, m), 4.56 (1H, m).
【化３６】
2013002329.tif 000041
このようにして得られた化合物14について、例えば水酸基をリン酸エステル、スルホン酸エステルなどの活性化エステルに変換することにより、式(II)で表す化合物又はその化学的に許容される塩の製造方法に用いることができる。【００７７】
実施例１４：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物15の合成
Boc-Glu-Ot-Bu（0.305 g, 1.01 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（9 mL）に、トリエチルアミン（0.21 mL, 1.51 mmol）および塩化ピバロイル（0.185 mL, 1.50 mmol）を加え、0 ℃にて0.5時間攪拌した。反応液に、シスチン（0.24 g, 1.00 mmol）およびトリエチルアミン（0.28 mL, 2.01 mmol）水溶液を加え、0 ℃にてさらに2時間攪拌した。減圧により濃縮した後、10 % クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧により濃縮乾固した。残渣をHPLCを用いて分画（カラム：Waters社製XBridge 1.9 i.d. x 5 cm、0.1 % 蟻酸含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）により精製し、化合物15（0.25 g）を白色固体として得た。
収率61 %；ESI MS m/z 811.0 (M+H)+；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.46 (18H, s), 1.49 (18H, s), 1.90 (1H, m), 2.11 (2H, m), 2.38 (4H, m), 3.03 (2H, dd, J=8.8, 13.9 Hz), 3.29 (2H, dd, J=4.4, 13.9 Hz), 4.01 (2H, m), 4.75 (2H, dd, J=4.4, 8.8 Hz).
【化３７】
2013002329.tif 000042
【００７８】
実施例１５：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物16の合成
化合物15（0.1 g, 0.12 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（3 mL）に、塩化ピバロイル (46μL, 0.37 mmol)およびトリエチルアミン (55μL, 0.39 mmol)を加え、氷冷下0.5時間攪拌した。反応液に、セリン硫酸エステル（93 mg, 0.50 mmol）、10%水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液（1.4 mL, 0.54 mmol）およびトリエチルアミン（70μL，0.50 mmol）を加え、さらに1時間攪拌した。反応液に水を加えた後、10 % クエン酸水溶液でpHを5〜6に調整し、n-ブタノールで抽出した。有機層を減圧により濃縮乾固して得られた残渣を、HPLC（カラム：Waters社製XBridge 1.9 i.d. x 5 cm、0.1 % 蟻酸含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）にて精製し、化合物16（35 mg）を無色あめ状物質として得た。
収率17 %；ESI MS m/z 1384 (M-Bu4N)-; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.04 (24H, t, J=7.2 Hz), 1.41-1.49 (52H, m), 1.68 (16H, m), 1.93 (2H, m), 2.15 (2H, m), 2.41 (4H, m), 2.96 (2H, dd, J=9.6, 14.0 Hz), 3.26 (18H, m), 4.00 (2H, dd, J=4.4, 9.6 Hz), 4.37 (4H, m), 4.67 (2H, t, J=3.2 Hz), 4.83 (2H, dd, J=4.4, 9.6 Hz).
【化３８】
2013002329.tif 000043
【００７９】
実施例１６：式（V）で表される化合物17の合成
化合物16（35 mg、0.021 mmol）をメタノール（0,2 mL）に溶解し、水（0.1 mL）およびTCEP（15 mg，0.06 mmol）を加え、室温にて0.5時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。有機層を減圧により濃縮乾固することにより、化合物１7（28 mg）を無色あめ状物質として得た。
収率80 %；ESI MS m/z 571.7 (M-Bu4N)-；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.05 (12H, t, J=7.2 Hz), 1.43 (8H, m), 1.47 (9H, s), 1.49 (9H, s), 1.69 (8H, m), 1.92 (1H, m), 2.14 (1H, m), 2.44 (2H, m), 2.87-2.99 (2H, m), 3.26 (8H, m), 4.00 (1H, dd, J=4.8, 8.8 Hz), 4.32-4.41 (2H, m), 4.66 (1H, m), 4.83 (1H, m).
【化３９】
2013002329.tif 000044
【００８０】
実施例１７：式（V）で表される化合物１8の合成
化合物１7（25 mg，0.031 mmol）を95 %トリフルオロ酢酸水溶液（0.2 mL）に溶解し、氷冷下2時間攪拌した。減圧により濃縮乾固した。残渣をHPLC（カラム：野村化学社製Develosil RP-AQUEOUS-AR-5 1.0 i.d. x 25 cm、0.1 % ヘプタフルオロ酪酸含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）により精製し化合物１8（3 mg）を白色固体として得た。
収率23%；ESI MS m/z 415.9；1H NMR (400 MHz, D2O) δδ2.04 (2H, m), 2.45 (2H, m), 2.77-2.87 (2H, m), 3.72 (1H, t, J=6.4 Hz), 4.21 (1H, dd, J=3.2, 10.4 Hz), 4.28 (1H, dd, J=4.8, 10.4 Hz), 4.46 (1H, dd, J=5.6, 6.8 Hz), 4.56 (1H, dd, J=3.2, 4.8 Hz).
【化４０】
2013002329.tif 000045
【００８１】
合成例１８：化合物１9の合成
Boc-Glu-Ot-Bu（0.15 g, 0.49 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（6 mL）に、トリエチルアミン（0.105 mL, 0.75 mmol）および塩化ピバロイル（95μL, 0.77 mmol）を加え、0 ℃にて0.5時間攪拌した。反応液に、セリン硫酸エステル（0.186 g, 1.01 mmol）、10 % 水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液（2.6 mL, 1.00 mmol）およびトリエチルアミン（0.14 mL, 1.01 mmol）を加え、0 ℃にてさらに0.5時間攪拌した。反応液に10 % クエン酸水溶液を用いてpHを約5に調整、減圧により約10 mLまで濃縮した後、n-ブタノールで抽出した。n-ブタノール層を減圧により濃縮乾固した後、残渣をHPLC（カラム：Waters製XBridge 1.9 i.d. x 5 cm、0.1 % 蟻酸含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）により精製し、化合物１9（0.227 g）を得た。
収率64 %；ESI MS m/z 469.0 (M-Bu4N)-；1H NMR (400MHz、CD3OD) δ1.04 (12H, m), 1.46 (26H, m), 1.69 (8H, m), 1.93 (1H, m), 2.10 (1H, m), 2.39 (2H, m), 3.26 (8H, m), 3.98 (1H, m), 4.29 (1H, m), 4.35 (1H, m), 4.66 (1H, m).
【化４１】
2013002329.tif 000046
【００８２】
合成例１９：化合物20の合成
ホスフォセリンをセリン硫酸エステルの代わりに使用した以外は、実施例１８と同様の方法により化合物20を合成した。
収率59 %；ESI MS m/z 469.0 (M-Bu4N)-；1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 1.04 (12H, m), 1.46 (26H, m), 1.68 (8H, m), 1.93 (1H, m), 2.09 (1H, m), 2.40 (2H, m), 3.27 (8H, m), 3.98 (1H, m), 4.16 (1H, m), 4.27 (1H, m), 4.57 (1H, m).
【化４２】
2013002329.tif 000047
【００８３】
合成例２０：化合物２１の合成
セリンをセリン硫酸エステルの代わりに使用した以外は、実施例１８と同様の方法により化合物２１を合成した。
収率79 %；m/z 413.0 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.46 (9H, s), 1.49 (9H, s), 1.89 (1H, m), 2.13 (1H, m), 2.40 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.85 (1H, dd, J=3.6, 11.2 Hz), 3.91 (1H, dd, J=4.8, 11.2 Hz), 4.00 (1H, dd, J=4.4, 6.9 Hz), 4.52 (1H, dd, J=3.6, 4.8 Hz).
【化４３】
2013002329.tif 000048
【００８４】
実施例２１：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物２２の合成
実施例１８により得られた化合物19（0.11 g, 0.15 mmol）のTHF溶液（3 mL）に、HOSu（N-ヒドロキシコハク酸イミド）（18 mg, 0.16 mmol）およびWSC・HCl（30 mg, 0.16 mmol）を加え、1時間撹拌した。反応液に、(H-Cys-Ot-Bu)2・2HCl（33 mg, 0.078 mmol）およびトリエチルアミン（22μL, 0.16 mmol）のアセトニトリル溶液（2 mL）を加え、さらに2時間撹拌した。減圧によって得られた濃縮液に、10%クエン酸水溶液を添加してpH5に調整後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧により濃縮乾固した。残渣をHPLC（カラム：Waters製XBridge 1.9 i.d. x 5 cm、0.1 % 蟻酸含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）により精製し、化合物２２（26 mg）を得た。
収率19 %；ESI MS m/z 1496.0 (M-Bu4N)-; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.45 (24H, m), 1.41-1.50 (70H, m), 1.67 (16H, m), 1.95 (2H, m), 2.11 (2H, m), 3.07 (2H, dd, J=8.0, 13.6 Hz), 3.21-3.28 (18H, m), 3.98 (2H, m), 4.27 (4H, m), 4.61 (2H, m), 4.68 (2H, m).
【化４４】
2013002329.tif 000049
【００８５】
実施例２２：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物２３の合成
実施例１９の化合物２０を化合物１９の代わりに使用した以外は、実施例２１と同様の反応により化合物２３を得た。
収率11 %；ESI MS m/z 1255.0 (M-2Bu4N)-; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.05 (24H, t, J=7.2 Hz), 1.41-1.49 (70H, m), 1.69 (16H, m), 1.92 (2H, m), 2.92 (2H, m), 2.41 (4H, m), 3.10 (2H, dd, J=9.2, 14.0 Hz), 3.26 (18H, m), 3.98 (2H, dd, J=4.8, 9.2 Hz), 4.16 (2H, m), 4.27 (2H, m), 4.57 (2H, m), 4.69 (2H, m).
【化４５】
2013002329.tif 000050
【００８６】
実施例２３：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物２４の合成
実施例２０の化合物２１を化合物１９の代わりに使用した以外は、実施例２１と同様の反応により化合物２４を合成した。
収率95 %；ESI MS m/z 1119.2 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.47 (18H, s), 1.49 (36H, s), 1.91 (2H, m), 2.13 (2H, m), 2.41 (4H, m), 3.07 (2H, m), 3.23 (2H, m), 3.82 (4H, m), 4.00 (2H, m), 4.51 (2H, m), 4.64 (2H, m).
【化４６】
2013002329.tif 000051
【００８７】
実施例２４：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物２５の合成
実施例２３の化合物２４（40 mg, 0.1 mmol）のピリジン溶液（0.2 mL）に、無水酢酸（0.1 mL）を加え、氷冷下2時間攪拌した。減圧により溶媒と過剰の試薬を除去したのち、残渣をHPLCを用いて分画（カラム：Waters製XBridge 1.9 i.d. x 5 cm、0.1 % 蟻酸含む水／アセトニトリル系リニアグラジエント）により精製し、化合物２５（16 mg）を白色固体として得た。
収率37 %；ESI MS m/z 1203.1 (M+Na)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.46 (18H, s), 1.47 (36H, s), 1.90 (2H, m), 2.08 (6H, s), 2.10 (2H, m), 2.40 (4H, m), 3.02 (2H, m), 3.24 (2H, m), 4.00 (2H, m), 4.32 (2H, m), 4.39 (2H, m), 4.64 (2H, m), 4.76 (2H, m).
【化４７】
2013002329.tif 000052
【００８８】
実施例２５：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物２６の合成
実施例２１の化合物２２（5 mg, 0.0029 mmol）を95%トリフルオロ酢酸水溶液（0.2 mL）に溶解し、氷冷下2時間撹拌した。減圧により濃縮乾固することにより化合物２６（4.5 mg）を得た。ここで、TFAは、トリフルオロ酢酸を示す。
収率100 %；ESI MS m/z 1072.0 (M-2TFA-Bu4N)-; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ1.05 (24H, t, J=7.6 Hz), 1.46 (16H, m), 1.75 (16H, m), 2.36 (4H, m), 2.73 (4H, m), 3.18 (2H, dd, J=8.8, 14.4 Hz), 3.30 (8H, m), 3.45 (2H, dd, J=4.4, 14.4 Hz), 4.22 (2H, t, J=6.4 Hz), 4.43 (2H, d, J=4.8 Hz), 4.86 (2H, t, J=4.8 Hz).
【化４８】
2013002329.tif 000053
【００８９】
実施例２６：式（V）で表される化合物の酸化型二量体である化合物２７の合成
実施例２４の化合物２５を実施例２２の化合物２３の代わりに使用した以外は、実施例２５と同様の反応により化合物２７を得た。
ESI MS m/z 756.9 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ2.08 (6H, s), 2.19 (4H, m), 2.60 (4H, m), 3.05 (2H, m), 3.25 (2H, m), 4.03 (2H, m), 4.36 (4H, m), 4.76 (4H, m).
【化４９】
2013002329.tif 000054
【００９０】
実施例２７：式（V）で表される化合物２８の合成
実施例２１の化合物２２（5 mg, 0.0029 mmol）をメタノール（0.2 mL）に溶解後、水（0.5 mL）およびTCEP（2 mg, 0.008 mmol）を加え、室温下10分間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、減圧により濃縮乾固することにより、化合物２８（4 mg）を無色あめ状物質として得た。
収率80 %；ESI MS m/z 627.9 (M-Bu4N)-; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.05 (12H, t, J=7.2 Hz), 1.44 (8H, m), 1.50 (9H, s), 1.56 (18H, s), 1.68 (8H, m), 1.93 (1H, m), 2.13 (1H, m), 2.42 (2H, m), 3.04 (1H, m), 3.25 (9H, m), 3.99 (1H, m), 4.25-4.31 (2H, m), 4.54-4.64 (2H, m).
【化５０】
2013002329.tif 000055
【００９１】
実施例２８：式（V）で表される化合物２９の合成
実施例２４の化合物２５を化合物２２の代わりに使用した以外は、実施例２７と同様の方法により化合物２９を得た。
収率77 %；ESI MS m/z 592.0 (M+H)+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.47 (9H, s), 1.49 (9H, s), 1.50 (9H, s), 1.87 (1H, m), 2.08 (3H, s), 2.10 (1H, m), 2.39 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.90 (1H, dd, J=6.4, 14.0 Hz), 2.97 (1H, dd, J=4.8, 14.0 Hz), 4.02 (1H, m), 4.30 (1H, dd, J=6.4, 11.2 Hz), 4.37 (1H, dd, J=4.8, 11.2 Hz), 4.53 (1H, dd, J=4.8, 6.4 Hz), 4.72 (1H, dd, J=4.8, 6.4 Hz).
【化５１】
2013002329.tif 000056
【００９２】
実施例２９：式（V）で表される化合物３０の合成
実施例２７の化合物２８（4 mg, 0.0046 mmol）を95 % トリフルオロ酢酸水溶液（0.2 mL）に溶解し、氷冷下2時間撹拌した。減圧により濃縮乾固することにより化合物３０（3.5 mg）を得た。
収率99 %；ESI MS m/z 415.9 (M-TFA-Bu4N)-; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.05 (12H, t, J=7.2 Hz), 1.41 (8H, m), 1.67 (8H, m), 2.18 (1H, m), 2.28 (1H, m), 2.61 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.92 (1H, dd, J=6.0, 14.0 Hz), 3.03 (1H, dd, J=4.4, 14.0 Hz), 4.07 (1H, t, J=6.4 Hz), 4.26 (1H, dd, J=6.8, 11.2 Hz), 4.33 (1H, dd, J=3.6, 11.2 Hz), 4.66 (1H, dd, J=4.4, 6.0 Hz),4.70 (1H, dd, J=3.6, 6.4 Hz).
【化５２】
2013002329.tif 000057
【００９３】
実施例３０：式（V）で表される化合物３１の合成
実施例２８の化合物２９を化合物２８の代わりに使用した以外は、実施例２９と同様の方法により化合物３１（8 mg）を得た。
収率96 %；ESI MS m/z 377.8 (M-H)-; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ2.08 (3H, s), 2.19 (2H, m), 2.60 (2H, m), 2.92-3.11 (2H, m), 3.84 (1H, m), 4.04-4.08 (2H, m), 4.64 (1H, m), 4.74 (1H, m).
【化５３】
2013002329.tif 000058
【国際調査報告】
2013002329.tif 000069
2013002329.tif 000070