(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３６位のリジン残基置換、および５６位、５９位、６９位、または１２２位のアルギニン残基置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドが５つ以下の前記アミノ酸置換を含む、前記核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４】
真核細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
原核細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを生成する方法であって、
前記ポリペプチドを発現させるために好適な条件下で、請求項２に記載のベクターを含む宿主細胞を培養すること、および
任意で前記ポリペプチドを単離すること
を含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって生成される、ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドのＣ末端に付加されたプロリン残基またはグリシン残基をさらに含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
３６位のリジン残基置換、および５６位、５９位、６９位、または１２２位のアルギニン残基置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、前記単離されたポリペプチドが５つ以下の前記アミノ酸置換を含む、前記ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドのＣ末端に付加されたプロリン残基またはグリシン残基をさらに含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、１つ以上のポリマーに共有結合している、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、１つのポリマーに共有結合している、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリマーは、水溶性ポリマーである、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項１３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリマーは、分岐ポリマーである、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、そのアミノ末端に共有結合したＰＥＧ部分を有する、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、２つのポリマーに共有結合している、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
前記２つのポリマーのうちの１つは、水溶性ポリマーである、請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項２０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリマーのうちの１つは分岐している、請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリマーの両方が分岐している、請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドは、そのアミノ末端に共有結合したＰＥＧ部分を有する、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
請求項９に記載の単離されたポリペプチドと、薬学的に許容される製剤用物質と、を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
前記薬学的に許容される製剤用物質は、担体、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
代謝異常を治療するための、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記代謝異常が、糖尿病である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記代謝異常が、肥満である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
３６位のリジン残基置換、および５６位、５９位、６９位、または１２２位のアルギニン残基置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドが５つ以下の前記アミノ酸置換を含み、前記ポリペプチドを配列番号４と少なくとも９０％同一にする付加または欠失を含むが、但し、前記少なくとも１つのアルギニン残基置換は、さらに修飾されず、前記ポリペプチドは血糖値、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールを低下させる能力、体重を減少させる能力、および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を向上する能力から選ばれる１以上の活性を有する、前記単離された核酸分子。
【請求項３１】
請求項３０に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
真核細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
原核細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３０に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを生成する方法であって、
前記ポリペプチドを発現させるために好適な条件下で、請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞を培養すること、および
任意で前記ポリペプチドを単離すること
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって生成される、ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドのＣ末端に付加されたプロリン残基またはグリシン残基をさらに含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
３６位のリジン残基置換、および５６位、５９位、６９位、または１２２位のアルギニン残基置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、前記単離されたポリペプチドが５つ以下の前記アミノ酸置換を含み、前記ポリペプチドを配列番号４と少なくとも９０％同一にする付加または欠失を含むが、但し、前記少なくとも１つのアルギニン残基置換は、さらに修飾されず、前記ポリペプチドは血糖値、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールを低下させる能力、体重を減少させる能力、および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を向上する能力から選ばれる１以上の活性を有する、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドのＣ末端に付加されたプロリン残基またはグリシン残基をさらに含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドは、１つのポリマーに共有結合している、請求項３８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリマーは、水溶性ポリマーである、請求項４０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項４１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項４２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリマーは分岐している、請求項４０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドは、そのアミノ末端に共有結合した単一のＰＥＧ部分を有する、請求項３８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドは、２つのポリマーに共有結合している、請求項３８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
前記２つのポリマーのうちの１つは、水溶性ポリマーである、請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４８】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項４７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４９】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項４８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリマーの両方が水溶性ポリマーである、請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
前記水溶性ポリマーは、独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコール、およびそれらの組み合わせである、請求項５０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５２】
前記水溶性ポリマーの両方がＰＥＧである、請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５３】
前記ポリマーのうちの１つは分岐している、請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５４】
前記ポリマーの両方が分岐している、請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５５】
請求項３８に記載の単離されたポリペプチドと、薬学的に許容される製剤用物質と、を含む、医薬組成物。
【請求項５６】
前記薬学的に許容される製剤用物質は、担体、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
代謝異常を治療するための、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記代謝異常が、糖尿病である、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記代謝異常が、肥満である、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
組成物であって、
３６位のリジン残基置換を有し、および５６位、５９位、６９位、または１２２位のアルギニン残基置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含み、５つ以下の前記アミノ酸置換を含む、第１のポリペプチドを、３６位のリジン残基置換を有し、および５６位、５９位、６９位、または１２２位のアルギニン残基置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含み、５つ以下の前記アミノ酸置換を含む第２のポリペプチドに、リンカーによって結合されて含む、組成物。
【請求項６１】
前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または両方のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣ末端に付加されたプロリン残基またはグリシン残基をさらに含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記リンカーは、ペプチドである、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記リンカーは、水溶性ポリマーである、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または両方のポリペプチドは、前記リンカーに加えて、１つのポリマーにさらに共有結合している、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ポリマーは、水溶性ポリマーである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ポリマーは分岐している、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７１】
前記組成物は、そのアミノ末端に共有結合した単一のＰＥＧ部分を有する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記組成物は、２つのポリマーに共有結合している、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記２つのポリマーのうちの１つは、水溶性ポリマーである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ポリマーの両方が水溶性ポリマーである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７７】
前記水溶性ポリマーは、独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールおよびそれらの組み合わせである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記水溶性ポリマーの両方がＰＥＧである、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ポリマーのうちの１つは分岐している、請求項７２に記載の組成物。
【請求項８０】
前記ポリマーの両方が分岐している、請求項７２に記載の組成物。
【請求項８１】
請求項６０に記載の組成物と、薬学的に許容される製剤用物質と、を含む、医薬組成物。
【請求項８２】
前記薬学的に許容される製剤用物質は、担体、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
代謝異常を治療するための、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記代謝異常が、糖尿病である、請求項８３に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記代謝異常が、肥満である、請求項８３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／１９５，７６１号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする核酸分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む医薬組成物、およびそのような核酸、ポリペプチド、または医薬組成物を使用して代謝異常を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌ポリペプチドである（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３〜６９）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン非依存性であり、また、グルコース、脂質、およびエネルギー代謝の調節におけるホルモンとして機能するという点から、非定型なＦＧＦである。
【０００４】
ＦＧＦ２１は、肝臓ｃＤＮＡライブラリからヘパリン分泌因子として単離された。これは、肝臓および膵臓で高度に発現され、また、主として肝臓で発現される唯一のＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、遅い成長率、低レベルの血漿グルコースおよびトリグリセリドの代謝表現型、ならびに加齢に伴う２型糖尿病、膵島過形成、および肥満の不在を示す。糖尿病のげっ歯類モデルにおける組換えＦＧＦ２１タンパク質の薬理学的投与は、血漿グルコースレベルの正常化、トリグリセリドおよびコレステロールレベルの低下、ならびにグルコース耐性およびインスリン感受性の向上をもたらした。また、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費量、身体活動、および代謝率を増加させることにより、体重および体脂肪を減少させる。実験的研究が、ヒトにおける２型糖尿病、肥満、脂質異常症、および他の代謝疾患または代謝障害の治療のためのＦＧＦ２１の薬理学的投与を支持している。
【０００５】
ヒトＦＧＦ２１は、生体内で短い半減期を有する。マウスおよびカニクイザルでは、ヒトＦＧＦ２１の有効半減期は１〜２時間である。２型糖尿病の治療における治療薬として使用するためにＦＧＦ２１タンパク質を開発する上で、半減期が増加することが望ましい。増大した半減期を有するＦＧＦ２１タンパク質は、タンパク質を投与される患者の投薬頻度を減少させることが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈら、２００４年、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３〜６９
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせである、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせである、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドを配列番号４と少なくとも８５％相同にする付加、欠失、またはさらなる置換を含むが、但し、請求項１（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのアミノ酸置換はさらに修飾されない、単離された核酸を提供する。
【０００９】
また本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１０】
さらなる実施形態において、本発明は、（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせである、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせ、である、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ポリペプチドを配列番号４と少なくとも８５％相同にする付加、欠失、またはさらなる置換を含むが、但し、請求項１（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのアミノ酸置換はさらに修飾されない、単離された核酸を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせである、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号４の前記アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、ポリペプチドを配列番号４と少なくとも８５％相同にする付加、欠失、またはさらなる置換を含むが、但し、請求項１（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのアミノ酸置換はさらに修飾されない、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１３】
また、本発明は、（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせである、少なくとも１つのアミノ酸置換を任意で有する配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む組成物であって、（ａ）３６位、７２位、７７位、１２６位、および１７５位のうちの１つ以上のリジン残基、（ｂ）３７位、３８位、４６位、９１位、６９位、７７位、７９位、８７位、９１位、１１２位、１１３位、１２０位、１２１位、１２５位、１２６位、１７５位、１７０位、および１７９位のうちの１つ以上のシステイン残基、（ｃ）５６位、５９位、６９位、および１２２位のうちの１つ以上のアルギニン残基、（ｄ）１７０位のグリシン残基、（ｅ）１７１位のグリシン残基、ならびに（ａ）〜（ｅ）の組み合わせである、少なくとも１つのアミノ酸置換を任意で有する配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む第２のポリペプチドにリンカーによって結合される、組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの化学修飾された形態も提供する。ポリペプチドの化学修飾された形態は、Ｎ末端および／または自然発生もしくは非自然発生のポリマー結合部位に結合したポリマーを含む。本発明は、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肥満および糖尿病等の代謝異常を治療する医薬組成物および方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明の特定の実施形態は、特定の実施形態および特許請求の範囲についての以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】配列に結合した２つのポリマーを有するＦＧＦ２１分子（例えば、ＰＥＧ分子）を示すイラストである。
【図２】ＰＥＧで化学修飾された単一遺伝子操作されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、およびＨ１２５Ｃ（左上）、Ｄ３８Ｃ、Ｄ４６Ｃ、およびＤ７９Ｃ（右上）、Ｈ８７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、およびＧ１１３Ｃ（左下）、ならびにＧ１２０Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、およびＮ１２１Ｃ（右下）を有する９つのＦＧＦ２１変異体のＰＥＧ化の程度を示す４つのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを含む図である。
【図３】２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で化学修飾された単一遺伝子操作されたポリマー結合部位、すなわち、Ｋ６９Ｃ、Ｒ１７５ＣおよびＹ１７９Ｃを有する３つのＦＧＦ２１変異体のＰＥＧ化の程度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを含む図である。
【図４】２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子の結合によって化学修飾された単一遺伝子操作されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、野生型ＦＧＦ２１、およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（上のプロット）、ならびにＧ１１３Ｃ、Ｎ１２１Ｃ、Ｄ４６Ｃ、野生型ＦＧＦ２１、およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（下のプロット）を有するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに対して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイの結果を示す２つのプロットを含む図である。
【図５】２０ｋＤａのメトキシ−ＰＥＧマレイミドの結合によって化学修飾された単一遺伝子操作されたポリマー結合部位、すなわち、Ｈ１２５Ｃ、Ｇ１２０Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、野生型ＦＧＦ２１、およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（上のプロット）、ならびにＤ７９Ｃ、Ｄ３８Ｃ、野生型ＦＧＦ２１、およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（下のプロット）を有するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに対して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイの結果を示す２つのプロットを含む図である。
【図６】２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子の結合によって化学修飾された単一遺伝子操作されたポリマー結合部位、すなわち、Ｋ６９Ｃ、Ｄ７９Ｃ、野生型ＦＧＦ２１、およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（上のプロット）、ならびにＲ１７５Ｃ、Ｙ１７９Ｃ、野生型ＦＧＦ２１、およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（下のプロット）を有する野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに対して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイの結果を示す２つのプロットを含む図である。
【図７】本発明の連結分子を示すイラストである。
【図８】ビヒクル（ＰＢＳ）、野生型ＦＧＦ２１、またはＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１の単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである。
【図９】ビヒクル（ＰＢＳ）、または２０、３０、もしくは４０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子でＮ末端ＰＥＧ化された野生型ＦＧＦ２１の単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである。
【図１０】ＰＢＳ、あるいは、突然変異Ｒ７７ＣもしくはＲ１２６Ｋ（これらの導入されたポリマー結合部位で、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子ならびにＦｃ分子およびＧ１７０Ｅ  ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む融合物でさらにＰＥＧ化された）を含むＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（上のプロット）；または、突然変異Ｒ７７Ｃ（この導入されたポリマー結合部位で、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子でさらにＰＥＧ化された）およびＰ１７１Ｇを含むＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（下のプロット）の単回投与後０時間〜９日間にわたって、マウスの血糖値レベルにおける変化率を示す２つのプロットを含む図である。
【図１１】ビヒクル（１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール、ｐＨ８）、または導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ９１Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｇ１２０Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、およびＥ３７Ｃ／Ｒ１７５Ｃで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重ＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである。Ｆｃ分子およびＰ１７１Ｇ  ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む融合物についても調べた。
【図１２】ビヒクル（１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール、ｐＨ８）、または導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ９１Ｃ／Ｈ１２１Ｃ、Ｇ１２０Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、もしくはＥ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである。Ｆｃ分子および  Ｇ１７０Ｅ  ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む融合物についても調べた。
【図１３】ビヒクル（１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール、ｐＨ８）、または導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＥ３７Ｃ／Ｒ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである。
【図１４】ビヒクル（１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール、ｐＨ８）；導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＥ９１Ｃ／Ｒ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド；または導入された同じ突然変異、すなわち、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を介して結合されたＲ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ（２ｘ）およびＲ７８Ｃ／Ｐ１７２Ｇ（２ｘ）を有する２つの同一のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む連結分子の単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである。
【図１５】ビヒクル（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）、または導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化され、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、もしくは１ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの単回投与後０時間からのマウスの血糖値レベルにおける変化率を用量の関数として示すプロットである。
【図１６】ビヒクル（１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール、ｐＨ８）、または導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、およびＥ３７Ｃ／Ｒ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの単回投与後０時間からのマウスの体重変化を示すプロットである。
【図１７】ビヒクル（１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール、ｐＨ８）；導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＥ９１Ｃ／Ｒ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド；または導入された同じ突然変異、すなわち、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を介して結合されたＲ３７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ（２ｘ）およびＲ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ（２ｘ）を有する２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチド）を含む連結分子の単回投与後０時間からのマウスの体重変化を示すプロットである。
【図１８】ビヒクル（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）、または導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子でＰＥＧ化され、５つの異なる用量で投与されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの単回投与後０時間からのマウスの体重変化を容量の関数として示すプロットである。
【図１９Ａ】ビヒクル（四角）、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子の週１回の投薬を用いた８週間の腎臓空胞試験の間のマウスの体重変化を示す一連の６つのプロットである。システインを標的とする２つのＰＥＧ−ＦＧＦ２１を投与されたマウスは、持続的な体重減少を示し、連結分子を投与されたマウスは、主として一過性の体重減少を示した。
【図１９Ｂ】ビヒクル（四角）、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子の週１回の投薬を用いた８週間の腎臓空胞試験の間のマウスの体重変化を示す一連の６つのプロットである。システインを標的とする２つのＰＥＧ−ＦＧＦ２１を投与されたマウスは、持続的な体重減少を示し、連結分子を投与されたマウスは、主として一過性の体重減少を示した。
【図１９Ｃ】ビヒクル（四角）、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子の週１回の投薬を用いた８週間の腎臓空胞試験の間のマウスの体重変化を示す一連の６つのプロットである。システインを標的とする２つのＰＥＧ−ＦＧＦ２１を投与されたマウスは、持続的な体重減少を示し、連結分子を投与されたマウスは、主として一過性の体重減少を示した。
【図１９Ｄ】ビヒクル（四角）、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子の週１回の投薬を用いた８週間の腎臓空胞試験の間のマウスの体重変化を示す一連の６つのプロットである。システインを標的とする２つのＰＥＧ−ＦＧＦ２１を投与されたマウスは、持続的な体重減少を示し、連結分子を投与されたマウスは、主として一過性の体重減少を示した。
【図１９Ｅ】ビヒクル（四角）、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子の週１回の投薬を用いた８週間の腎臓空胞試験の間のマウスの体重変化を示す一連の６つのプロットである。システインを標的とする２つのＰＥＧ−ＦＧＦ２１を投与されたマウスは、持続的な体重減少を示し、連結分子を投与されたマウスは、主として一過性の体重減少を示した。
【図１９Ｆ】ビヒクル（四角）、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子の週１回の投薬を用いた８週間の腎臓空胞試験の間のマウスの体重変化を示す一連の６つのプロットである。システインを標的とする２つのＰＥＧ−ＦＧＦ２１を投与されたマウスは、持続的な体重減少を示し、連結分子を投与されたマウスは、主として一過性の体重減少を示した。
【図２０】ビヒクルか、または、導入されたポリマー結合部位、すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ；Ｅ３７／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇ；Ｅ９１Ｃ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇ；Ｅ３７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ；Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ；およびＲ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇで、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子で二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを投与したマウスの８週間の腎臓空胞試験の結果を示す２つの棒グラフである（２つの異なる用量をテストした）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
増大した半減期等の強化された特性を有するヒトＦＧＦ２１タンパク質は、本明細書に記載する方法および標準的な分子生物学的方法を用いて調製することができる。ＰＥＧ分子等の１つ以上の水溶性ポリマーをタンパク質に結合させることによって、そのタンパク質の半減期を延長できることが知られている。したがって、種々の実施形態において、ポリマーがＦＧＦ２１タンパク質に結合できるポイントを形成するようにアミノ酸置換をタンパク質に導入することによって、天然ＦＧＦ２１の半減期を延長することができる。そのような修飾されたタンパク質は、本明細書においてＦＧＦ２１変異体と称され、本発明の実施形態を形成する。またポリマーは、非自然発生ポリマー結合部位の導入と合わせて、ＦＧＦ２１分子のＮ末端に導入されてもよい。
【００１８】
実施例を含む本明細書で使用される組換え核酸方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記述される方法であり、それらの両方が、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
１．一般的な定義
本明細書で使用されるとき、「ａ」という用語は、別途記載のない限り１つ以上を指す。
【００２０】
「単離された核酸分子」という用語は、（１）タンパク質、脂質、炭水化物、もしくは元の細胞から全核酸が単離されると自然に見出される他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された、（２）「単離された核酸分子」が自然において結合するポリヌクレオチドのすべてもしくは一部に連結していない、（３）自然では結合しないポリヌクレオチドに操作可能に結合している、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として自然では発生しない、本発明の核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチドの生成における使用、または治療的、診断的、予防的、もしくは研究的使用を妨げるであろう、任意の他の汚染核酸分子あるいはその自然環境において見出される他の汚染物質を本質的に含まない。
【００２１】
「単離されたポリペプチド」という用語は、（１）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは元の細胞から単離されると自然に見出される他の物質の少なくとも５０パーセントから分離された、（２）「単離されたポリペプチド」が自然において結合するポリペプチドのすべてもしくは一部に（共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって）連結していない（３）自然では結合しないポリペプチドに（共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって）操作可能に連結している、（４）自然では発生しない、本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その治療的、診断的、予防的、もしくは研究的使用を妨げるであろう、任意の他の汚染ポリペプチドまたはその自然環境において見出される他の汚染物質を本質的に含まない。
【００２２】
「ベクター」という用語は、宿主細胞にコード情報を伝えるために使用されえる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指して使用される。
【００２３】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であり、挿入された異種核酸配列の発現を指揮するおよび／または支配する核酸配列を含有するベクターをさす。発現は、これらに限定されないが、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）等のプロセスを含む。
【００２４】
「宿主細胞」という用語は、形質転換された細胞か、または核酸配列を用いて形質転換し、次いで、選択された該当する遺伝子を発現することが可能な細胞を指す。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態または遺伝的構造においてその元の親と同一であるかどうかにかかわらず、親細胞の子孫を含む。
【００２５】
「自然発生」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的物質に関連して使用される場合、自然に見出され、ヒトによって操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で使用される「非自然発生」という用語は、自然に見出されないか、またはヒトによって構造的に修飾もしくは合成された物質を指す。ヌクレオチドに関連して使用される場合、「自然発生」という用語は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン、（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）の塩基を指す。アミノ酸に関連して使用される場合、「自然発生」という用語は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）の２０個のアミノ酸を指す。
【００２６】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現される任意の自然発生の野生型ポリペプチドを指す。本出願の目的のために「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、２０９個のアミノ酸残基（配列番号２）から構成され、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる全長ＦＧＦ２１ポリペプチドと；１８１個のアミノ酸残基（配列番号４）から構成され、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされ、全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端で２８個のアミノ酸残基（すなわち、単一のペプチドを構成する）が除去された、そのポリペプチドの成熟型とを指して、交換可能に使用されてもよい。ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Ｎ末端のメチオニン残基の有無にかかわらず発現させることができ、Ｎ末端のメチオニン残基は、細菌発現系の設計によって、または機能として付加することができる。
【００２７】
「生物学的に活性」という用語は、本明細書に記載されるＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含むＦＧＦ２１ポリペプチドに適用される場合、血糖値、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールを低下させる能力、体重を減少させる能力、および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を向上する能力等の、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの自然に生じる活性を指す。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに適用される場合、この用語はＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに導入された修飾の種類または数に依存しない。例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの中には、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較して若干低いＦＧＦ２１活性レベルを有するが、それにもかかわらず、生物学的に活性なＦＧＦ２１変異体ポリペプチドであると見なされるものがある。特定のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性における相違は、生体内アッセイと生体外アッセイの間で観察することができ、そのような任意の相違は、使用される特定のアッセイに関連する。しかしながら、そのような観察が「生物学的に活性」であるという用語の意味に影響を及ぼすことはなく、任意の生体内および生体外アッセイにおいて、血糖値、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールを低下させる能力、体重を減少させる能力、および耐糖能、エネルギー消費量、またはインスリン感受性を向上する能力等の、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの自然に生じる活性を示すＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、「生物学的に活性」である。
【００２８】
「有効量」および「治療的有効量」という用語は交換可能に使用され、血糖値、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力、または耐糖能、エネルギー消費量、もしくはインスリン感受性を向上する能力等の、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを維持するために使用されるＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの量を指す。
【００２９】
「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、本明細書で使用されるとき、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの送達を達成または強化するために好適な１つ以上の製剤用物質を指す。そのような物質の例は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，  ｓｕｐｒａに見出すことができる。
【００３０】
「連結分子（ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、リンカー分子によって連結された２つ以上のＦＧＦ２１分子を含むコンストラクトを指す。連結分子は、少なくとも１つのＦＧＦ２１ポリペプチドを含み、そのうちの少なくとも１つは本明細書に記載されるようなＦＧＦ２１変異体ポリペプチドであるが、リンカーによって結合された３つ、４つ、もしくはそれ以上のＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含むことができる。したがって、連結分子という用語は、１つもしくは２つのＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの組み合わせのみを含む分子に限定されない。
【００３１】
「ポリマー結合部位」という用語は、ポリマーとの共有結合的会合に化学的に適応可能であるポリペプチド（例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチド）の一次アミノ酸配列の領域を指す（例えば、全ての分子重量のＰＥＧ分子、ポリマーのマンノース、グリカン等）。ポリマー結合部位は、単一のアミノ酸（例えば、システイン、リジン、アルギニン、もしくは好適な非自然発生アミノ酸）を意味することができるか、またはこの用語は、配列もしくは空間のいずれかにおいて互いに隣接する２つ以上のアミノ酸を指すことができる。
【００３２】
「化学修飾された」という用語は、本明細書に開示するようなＦＧＦ２１野生型またはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに関連して使用される場合、その自然に発生した状態から、１つ以上の異種分子の共有結合的結合によって修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。異種分子の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、およびポリビニルアルコールを含む。化学修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドの例は、ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む。
【００３３】
２．ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
種々の態様において、本発明は、生体外活性に与える影響を最小限に抑える一方で、ＦＧＦ２１分子の薬物動態特性を向上させることができる、ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの部位特異的ＰＥＧ化のための一連の方法を開示する。これらのＰＥＧ化されたＦＧＦ２１分子の薬物動態プロファイルの向上は、治療剤への曝露を増加することによって、その分子の生体内での有効性に影響を与える。また、本明細書に記載されるストラテジーは複数のＰＥＧ化部位の作製に対応しており、それによって、分子の薬物動態特性をさらに向上させると同時に、空胞を形成する可能性を低減することができる。本明細書に記載されるように、２つの主要なストラテジーが、これを達成するために用いられる。
【００３４】
一態様において、本発明は、１つ以上の修飾が導入されたＦＧＦ２１配列に関する。したがって、交換可能に使用されてもよい「ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド」および「ＦＧＦ２１変異体」という用語は、野生型ＦＧＦ２１のアミノ酸配列（例えば配列番号２または４）が修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。そのような修飾としては、これらに限定されないが、非自然発生アミノ酸類似体との置換、挿入、および切断を含む、１つ以上のアミノ酸置換が挙げられる。したがって、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体としては、これらに限定されないが、本明細書に記載されるように、非自然発生ポリマー結合部位を導入するか、またはタンパク質分解に対してある程度の耐性を付与する、部位特異的ＦＧＦ２１変異体が挙げられる。本発明のＦＧＦ２１変異体の特定のアミノ酸置換を同定する目的で、切断されたまたは突然変異させたアミノ酸残基のナンバリングは、成熟した１８１残基のＦＧＦ２１ポリペプチドのナンバリングに対応する（すなわち、配列のＮ末端はＨＰＩＰＤで始まり、これらの残基は、それぞれ、１、２、３、４、および５と表される）。Ｎ末端のメチオニン残基は存在してもよいがその必要はなく、このＮ末端のメチオニン残基は、タンパク質のナンバリングスキームには含まれない。
【００３５】
記載したように、非自然発生アミノ酸を含む、１つ以上の置換または挿入を含むＦＧＦ２１の切断された形態を含むＦＧＦ２１変異体が、本発明の実施形態を形成する。そのような挿入または置換は、ポリマー結合のための部位として作用することを含む、種々の特性を付与することができる。そのような場合において、本明細書に記載される種々の突然変異に加えて、非自然発生アミノ酸がＦＧＦ２１配列に組み込まれてもよい。したがって、ＦＧＦ２１変異体は、本明細書に記載される突然変異のうちの１つ以上を含むことができ、また、１つ以上の非自然発生アミノ酸をさらに含むことができる。ＦＧＦ２１配列に挿入されてもよいか、またはＦＧＦ２１配列の野生型残基と置換されてもよい非自然発生アミノ酸の非限定例のリストは、βアミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、および誘導体化された側鎖を含むアミノ酸を含む。例としては、（Ｌ型またはＤ型、括弧内は省略形）：パラ−アセチル−フェニルアラニン、パラ−アジド−フェニルアラニン、パラ−ブロモ−フェニルアラニン、パラ−ヨード−フェニルアラニンおよびパラ−エチニル−フェニルアラニン、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−アミノ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と略される）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシ−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン、４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン酸、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、Ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、および他の同様のアミノ酸、ならびに具体的に列挙されたアミノ酸のうちのいずれかの誘導体化された形態が挙げられる。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ２１アミノ酸配列（例えば、配列番号２または４）に少なくとも約８５パーセント相同であるが、非自然発生ポリマー結合部位をＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに導入する特異的残基はさらに修飾されていないアミノ酸配列を含む。換言すると、タンパク質分解に対する耐性を強化するように、非自然発生ポリマー結合部位または突然変異を導入するために修飾されたＦＧＦ２１変異体配列の残基を除いて、ＦＧＦ２１変異体配列の他のすべてのアミノ酸残基の約１５パーセントが修飾されてもよい。例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドＧ１７０Ｃでは、１７０位のグリシン残基以外のすべてのアミノ酸残基の１５パーセントまでが修飾されてもよい。さらに他の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、野生型ＦＧＦ２１アミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、または８）に少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるアミノ酸配列を含むが、非自然発生ポリマー結合部位を導入するため、またはタンパク質分解耐性を強化するために修飾された特定の残基は、さらに修飾されていない。そのようなＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。
【００３７】
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、ＦＧＦ２１ポリペプチドの特定の位置に、本質的に保存的または非保存的のいずれかであるアミノ酸置換を導入することによって、および自然発生または非自然発生のアミノ酸を用いることによって作製することができる。そのような置換は、ＦＧＦ２１ポリペプチドに望ましい特性を付与するように設計または観察される置換に加えて行われてもよい。例として、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、非自然発生ポリマー結合部位の導入、またはタンパク質分解に対する耐性の強化等の望ましい特性を達成するように設計された置換を含むことができ、また、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの生物学的活性を維持することができるがその必要はない、１つ以上の保存的または非保存的な置換をさらに含むことができる。
【００３８】
ＦＧＦ２１の突然変異は、保存的または非保存的であってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に影響がほとんどないかもしくは全くないように、天然アミノ酸残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所与の位置に見出される残基）を非天然残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所与の位置に見出されない残基）と置換することを含むことができる。また、保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく、典型的には化学的合成によって組み込まれる非自然発生アミノ酸残基も包含する。これらは、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転または反転した形態を含む。
【００３９】
自然発生残基は、共通する側鎖特性に基づいて次のクラスに分類することができる。
【００４０】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。
【００４１】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的のいずれか）は、そのような置換が所望される場合に当業者によって決定されてもよい。アミノ酸置換の代表的な（しかし、限定的ではない）リストを表１に示す。
【００４２】
【表１】
0005878757.tif 000002
【００４３】
２．Ａ．タンパク質分解耐性突然変異を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
ＦＧＦ２１の成熟した形態（すなわち、１８１残基の形態）が生体内分解を受けることが明らかになっており、それは最終的にタンパク質分解攻撃から生じることが分かった。成熟ＦＧＦ２１の生体内分解は、有効半減期の短縮を引き起こすことが明らかになっており、それは分子の治療可能性に有害な影響を与える可能性がある。したがって、タンパク質分解に対する耐性を示すＦＧＦ２１変異体を同定するために、該当する試験を行った。この調査の結果として、特にタンパク質分解を受け易いことが明らかになっている成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの部位は、４〜５位、２０〜２１位、１５１〜１５２、および１７１〜１７２位でアミノ酸残基間にペプチド結合を含む。
【００４４】
許容し難い程度までタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼすことなく、成熟ＦＧＦ２１において観察されたタンパク質分解効果を排除する、本発明において利用することのできる代表的置換の非制限的なリストを表２に表す。表２は、例証的であるに過ぎず、他のタンパク質分解耐性置換が同定され、本発明に利用されてもよい。これらのタンパク質分解耐性置換は、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を導入する置換に加えて行われてもよく、ひいては、それぞれの種類の突然変異によって付与される望ましい特徴を示すＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製する。
【００４５】
【表２】
0005878757.tif 000003
【００４６】
好ましくは、しかし必ずではないが、タンパク質分解耐性突然変異を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ２１の活性と本質的に同じかまたはそれよりも高い生物学的活性を有する。したがって、本発明の別の実施形態は、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含み、タンパク質分解に対して耐性であるが、それでもなお野生型ＦＧＦ２１と同じかまたはそれよりも高い生物学的活性を保持するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを対象とする。いくつかの場合においてはあまり望ましくはないが、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含み、タンパク質分解に対して耐性であるが、若干低めの生物学的活性を示すＦＧＦ２１変異体が、本発明の別の実施形態を形成する。いくつかの場合において、ある程度のタンパク質分解を維持することが望ましい可能性があり、そのため、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含み、タンパク質分解に対して耐性であるが、それでもなお、ある程度のタンパク質分解が起こることを可能にするＦＧＦ２１変異体もまた、本発明の別の実施形態を形成する。
【００４７】
本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと同様に、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、本明細書に記載されるように調製することができる。例えば、標準的な分子生物学技術に精通する等業者は、本開示とともにその知識を利用して、本発明の１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を作製および使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用されてもよい。例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われてもよい。明確に定義されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療のために用いられてもよい。
【００４８】
タンパク質分解に耐性である１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体は、当該技術分野で既知である方法および本明細書に記載される方法を用いて化学修飾することができる。１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを化学修飾すること（例えば、ＰＥＧ化）により、タンパク質分解耐性と、所望の薬物動態および薬力学的特性の両方を示す分子を作製することができる。
【００４９】
２．Ｂ．非自然発生ポリマー結合部位を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
本発明の種々の態様において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが開示される。別の態様において、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、非自然発生ポリマー（例えば、ＰＥＧ化）結合部位（複数化）が導入されたＦＧＦ２１ポリペプチドを含む。本発明のさらに別の態様において、非自然発生ポリマー（例えば、ＰＥＧ）結合部位（複数化）が導入されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの切断された形態が開示される。非自然発生ポリマー結合部位と、野生型ＦＧＦ２１の生物学的活性を維持することができるがその必要はない、１つ以上の保存的または非保存的な置換と、を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが、本発明の別の態様を形成する。本発明の種々のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、本明細書に記載するように、また本明細書に提供される参考文献に記載されるように調製することができる。
【００５０】
一実施形態において、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、非自然発生ポリマー結合部位を導入することによって修飾される。実際、一態様においては、これが本発明のＦＧＦ２１変異体の目的であり、すなわち、半減期を延長するポリマーが、所望の場所でＦＧＦ２１ポリペプチド変異体と結合できるように、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を導入することである。選択されるポリマーは、それが結合するタンパク質が生理的環境等の水性環境において沈殿しないように、典型的には、しかし必ずではないが、水溶性である。好適なポリマーの範囲には、ポリマーの混合物が含まれる。最終生成調製物の治療的使用には、ポリマーは、好適な分子量のＰＥＧ等、薬学的に許容されるものであることが好ましい。またＰＥＧ脂肪酸ブロックコポリマー等の非水溶性ポリマーが、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体と共役されてもよく、本発明の態様を形成する。
【００５１】
本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性は、例えば、実施例１０において本明細書に記載されるように、生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いて、多様な様式においてアッセイすることができる。
【００５２】
また、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性は、実施例１２に示すようにｏｂ／ｏｂマウスを用いて等、生体内アッセイにおいて評価されてもよい。一般に、これらのポリペプチドのうちの１つ以上の生体内活性を評価するために、試験動物の腹腔内にポリペプチドを投与することができる。１つ以上の所望の期間後、血液サンプルを採取し、血糖値レベルを測定することができる。
【００５３】
本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと同様に、これらのポリペプチドは、定方向突然変異によって、または細菌発現プロセスの結果として導入されてもよい、アミノ末端のメチオニン残基を任意で含むことができる。
【００５４】
本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、実施例７に記載するように調製することができる。標準的な分子生物学技術に精通する等業者は、本開示とともにその知識を利用して、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製および使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用されてもよい。例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われてもよい。明確に定義されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療のために用いられてもよい。
【００５５】
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの調製後、ポリペプチドは、実施例９において本明細書に記載されるように、ポリマーの結合によって化学修飾することができる。
【００５６】
３．非自然発生ポリマー結合部位を含む切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
本発明の一実施形態は、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含む変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドの切断された形態を対象とする。そのような切断された変異体ポリペプチドは、化学修飾されてもよいが、その必要はない。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（またはＮ末端）から１つ以上のアミノ酸残基が除去されたか、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドもしくは化学修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドのカルボキシル末端（またはＣ末端）から１つ以上のアミノ酸残基が除去されたか、またはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドもしくは化学修飾されたＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ末端およびはＣ末端の両方から１つ以上のアミノ酸残基が除去された、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドまたは化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを指す。
【００５８】
Ｎ末端で切断された変異体ＦＧＦ２１、Ｃ末端で切断された変異体ＦＧＦ２１、および分子のＮ末端とＣ末端の両方で切断された変異体ＦＧＦ２１分子、ならびにこれらの変異体の化学修飾された形態の活性は、例えば、実施例１０において本明細書に記載される生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いて、多様な様式においてアッセイすることができる。
【００５９】
また、本発明の切断された変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドおよび化学修飾後の切断された変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、実施例１２に示すようにｏｂ／ｏｂマウス等の生体内アッセイにおいて評価されてもよい。一般に、これらのポリペプチドのうちの１つ以上の生体内活性を評価するために、試験動物の腹腔内にポリペプチドを投与することができる。１つ以上の所望の期間後、血液サンプルを採取し、血糖値レベルを測定することができる。
【００６０】
本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、切断された変異体ＦＧＦ２１および化学修飾後の切断された変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドは、定方向突然変異によって、または細菌発現プロセスの結果として導入されてもよい、アミノ末端のメチオニン残基を任意で含むことができる。
【００６１】
本発明の切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、実施例７に記載するように調製することができる。標準的な分子生物学技術に精通する等業者は、本開示とともにその知識を利用して、本発明の切断された変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドを作製および使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用されてもよい。例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われてもよい。明確に定義されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療のために用いられてもよい。
【００６２】
切断された変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドの調製後、ポリペプチドは、実施例９において本明細書に記載されるように、ポリマーの結合によって化学修飾することができる。
【００６３】
４．キャッピングされたＣ末端のＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
別の実施形態において、本発明は、ポリペプチドのＣ末端に別の１つ以上の残基を付加して、アミノ酸配列を野生型タンパク質よりも長くすることによってキャッピングされた、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含む変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドを対象とする。さらに別の実施形態において、本発明は、１つ以上のＣ末端突然変異をさらに含む１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを対象とする。そのようなキャッピングされたＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、化学修飾されていてもよいが、その必要はない。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「キャッピングされたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド」という用語は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドまたは化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基が付加されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドまたは化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを指す。１つ以上のプロリン残基および１つ以上のグリシン残基を含む、任意の自然発生または非自然発生アミノ酸が、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをキャッピングするために使用されてもよい。野生型ＦＧＦ２１配列は１８１残基長に過ぎないが、キャッピングされたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、付加された各キャッピング残基ごとにポリペプチドの長さを１残基分延長し、本開示のナンバリングスキームと一致して、キャップ残基のナンバリングは１８２から開始される。したがって、単一のプロリンでキャッピングされた残基は、Ｐ１８２と表される。より長いキャップも可能であり、それに応じてナンバリングされる（例えば、Ｘ１８２、Ｙ１８３、Ｚ１８４、Ｘ、Ｙ、およびＺは任意の自然発生または非自然発生のアミノ酸）。キャッピング残基は、化学反応によってアミノ酸がポリペプチドのＣ末端に共有結合的に結合する化学的な方法等の任意の従来方法を用いて、変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドに付加することができる。代替として、標準的な分子生物学技術を用いて、キャッピング残基をコードするコドンがＦＧＦ２１変異体ポリペプチドコード化配列に付加されてもよい。所望の場合は、本明細書に記載される変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドのいずれも、１つ以上の残基でキャッピングされてもよい。
【００６５】
Ｃ末端突然変異が、本発明の別の態様を形成する。本明細書で使用されるとき、「Ｃ末端突然変異」という用語は、変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドの残基９１〜１８１（ポリペプチドがキャッピングされている場合は、それよりも長い）の領域における１つ以上の変化を指す。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド配列に導入されるＣ末端突然変異は、非自然発生ポリマー結合部位を導入する１つ以上の突然変異に加えて導入される。Ｃ末端突然変異は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド配列の９１〜１８１の領域における任意の点で導入することができるが、Ｃ末端突然変異の代表的な位置は、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、および１８１位を含む。Ｃ末端突然変異は、本明細書に記載されるような標準的な分子生物学技術を用いて導入することができる。本明細書に記載される変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドのいずれも、Ｃ末端突然変異を含むことができる。
【００６６】
キャッピングされた突然変異および／またはＣ末端の突然変異の位置および同一性の例を表３に示す。
【００６７】
【表３】
0005878757.tif 000004
【００６８】
キャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ならびにこれらの変異体の化学修飾された形態の活性は、例えば、実施例１０において本明細書に記載されるように、生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いて、多様な様式においてアッセイすることができる。
【００６９】
また、本発明のキャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ならびに化学修飾後のキャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性は、実施例１２に示すようにｏｂ／ｏｂマウス等の生体内アッセイにおいて評価されてもよい。一般に、これらのポリペプチドのうちの１つ以上の生体内活性を評価するために、試験動物の腹腔内にポリペプチドを投与することができる。１つ以上の所望の期間後、血液サンプルを採取し、血糖値レベルを測定することができる。
【００７０】
本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、キャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ならびに化学修飾後のキャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、定方向突然変異によって、または細菌発現プロセスの結果として導入されてもよい、アミノ末端のメチオニン残基を任意で含むことができる。
【００７１】
本発明のキャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、実施例７に記載されるように調製することができる。標準的な分子生物学技術に精通する等業者は、本開示とともにその知識を利用して、本発明のキャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製および使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用されてもよい。例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われてもよい。明確に定義されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療のために用いられてもよい。
【００７２】
キャッピングされたおよび／またはＣ末端突然変異させたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの調製後、ポリペプチドは、実施例９に記載されるように、ポリマーの結合によって化学修飾することができる。
【００７３】
５．自然発生システイン残基を含まないＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
本発明のさらなる態様において、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の両方のシステイン残基が、ジスフィルド結合を形成せず、またポリマー結合部位としての役割も果たさないアラニンまたはセリン等の残基と置き換えられた、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを調製することができる。続いて、チオール含有残基（例えば、システイン残基、またはチオール基を有する非自然発生アミノ酸）あるいは遊離アミノ基（例えば、リジン残基もしくはアルギニン残基、または遊離アミノ基を有する非自然発生アミノ酸）の形態で非自然発生ポリマー結合部位を導入するＦＧＦ２１変異体ポリペプチド配列において、置換が行われてもよい。次いで、結合するためにチオール基または遊離アミノ基に依存するＰＥＧ等のポリマーは、既知の位置でＦＧＦ２１変異体ポリペプチド配列に導入されたシステイン、リジン、またはアルギニン残基に標的化されてもよい。このストラテジーは、より効率的かつ制御されたポリマーの配置を促進することができる。
【００７４】
１つの手法において、７５位および９３位に位置する野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの２つの自然発生システイン残基が、チオールを含有しない残基と置換されてもよい。続いて、システイン残基が既知の場所に導入されてもよい。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、さらに多くのポリマー結合部位（例えば、システイン残基）を導入することができる他の突然変異を含んでもよいか、またはいくつかの他の所望の特性を達成するように設計されてもよい。そのようなＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの例は、Ｃ７５Ａ／Ｅ９１Ｃ／Ｃ９３Ａ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＣ７５Ｓ／Ｅ９１Ｃ／Ｃ９３Ｓ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇを含む。これらの例では、７５位および９３位の自然発生システインがアラニンまたはセリン残基に突然変異され、ポリマー結合部位が９１位および１２５位（ＰＥＧ等のチオール反応性ポリマーの場合）に導入され、１７１位で追加の突然変異（すなわち、プロリン１７１とグリシン残基の置換）が行われている。
【００７５】
本明細書に開示されるすべてのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと同様に、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列に見出されるシステインのうちのいずれも含有しないが、その代わりに、導入されたポリマー結合部位と、任意で１つ以上の追加の突然変異と、を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ならびにこれらの変異体の化学修飾された形態の活性は、例えば、実施例１０において本明細書に記載されるように、生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いて、多様な様式においてアッセイすることができる。これらのポリペプチドの生体内活性は、実施例１２に示すようにｏｂ／ｏｂマウスを用いておよび本明細書に記載されるように生体内アッセイにおいて評価することができる。
【００７６】
本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列に見出されるシステインのうちのいずれも含有しないが、その代わりに、導入されたポリマー結合部位と、任意で１つ以上の追加の突然変異と、を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、ならびにこれらのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの化学修飾された形態の活性は、定方向突然変異によって、または細菌発現プロセスの結果として導入されてもよい、アミノ末端のメチオニン残基を任意で含むことができる。
【００７７】
野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列に見出されるシステインのうちのいずれも含有しないが、その代わりに、導入されたポリマー結合部位と、任意で１つ以上の追加の突然変異と、を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、例えば、実施例７において本明細書で記載されるように調製することができる。標準的な分子生物学技術に精通する等業者は、本開示とともにその知識を利用して、これらのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製および使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用されてもよい。例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われてもよい。明確に定義されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療のために用いられてもよい。
【００７８】
野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列に見出されるシステインのうちのいずれも含有しないが、その代わりに、導入されたポリマー結合部位と、任意で１つ以上の追加の突然変異と、を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの調製後、ポリペプチドは、実施例９に記載されるように、ポリマーの結合によって化学修飾されてもよい。
【００７９】
６．「連結分子」
本発明のさらに別の態様において、本明細書に記載されるように「連結分子」を調製することができる。「連結分子」は、リンカー分子によって連結された２つのＦＧＦ２１ポリペプチドを含む分子である。２つのＦＧＦ２１ポリペプチドを結合させることにより、連結分子の有効半減期および強度を、単一のＦＧＦ２１ポリペプチドの有効半減期および強度を超えて拡張することができる。
【００８０】
本発明の連結分子は、リンカーと、２つのＦＧＦ２１ポリペプチドとを含み、それらのポリペプチドは、突然変異が導入されていない２つの自然発生ＦＧＦ２１ポリペプチドか、ＦＧＦ２１ポリペプチドに導入されたリンカー結合部位を有する２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドか、または１つの自然発生ＦＧＦ２１ポリペプチドと１つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドとの組み合わせであってもよい。非自然発生リンカー結合部位および１つ以上の追加の突然変異を有する、少なくとも１つのＦＧＦ２１ポリペプチドを含む連結分子もまた企図され、本発明の別の態様を形成する。したがって、そのような連結分子は、リンカー分子の結合のための部位を形成する突然変異と、連結分子に別の望ましい特性を付与するための別の突然変異とを含むことができる。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「リンカー結合部位」という用語は、リンカーが会合することができる官能基を有する自然発生または非自然発生アミノ酸を意味する。１つの例において、リンカー結合部位は、ＰＥＧ分子と会合することができるチオール基を含有する残基である。
【００８２】
６．Ａ．連結分子のＦＧＦ２１ポリペプチド
連結分子が２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む場合、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、配列に導入された１つ以上の突然変異を含むことができるが、その突然変異は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのそれぞれにおける同じアミノ酸位置にある必要はない。例として、連結分子が２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む場合、一方のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドはＨ１２５Ｃ突然変異を含有することができ、それがリンカー分子のための結合部位を形成してもよい。対照的に、他方のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドはＨ１２５以外の位置で突然変異を含有することができ、それが２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを一緒に連結するリンカーの結合点としての役割を果たすことができる。例え１つまたは２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが用いられたとしても、リンカーはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＮ末端に結合することができ、必ずしも導入された結合点が用いられなくてもよい。
【００８３】
連結分子が１つまたは２つの自然発生ＦＧＦ２１ポリペプチドを含む場合、リンカーは、結合化学を受け入れられるＦＧＦ２１ポリペプチドのある点で結合させられてもよい。例えば、自然発生ジスフィルド結合は減少させられてもよく、システイン残基がＰＥＧ等のリンカーの結合点としての役割を果たすことができる。別の実施形態において、リンカーは、Ｎ末端でまたはリジン側鎖上でＦＧＦ２１ポリペプチドに結合されてもよい。
【００８４】
連結分子のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのうちの一方または両方は、切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含むことができる。本明細書に記載されるように、切断されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方のいずれかにある、任意の数の残基を除去することによって調製することができる。
【００８５】
連結分子はまた、リンカー結合部位としては好ましくないかもしれないが、その代わりに、連結分子にいくつかの他の望ましい特性を付与することができる突然変異をポリペプチド配列に含む、一方または両方のＦＧＦ２１ポリペプチドを含むことができる。したがって、突然変異が連結分子に望ましい特性を付与する１つ以上のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む連結分子が、本発明のさらなる態様を形成する。
【００８６】
連結分子の活性は、例えば、実施例１０において本明細書に記載されるように、生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いて、多様な様式においてアッセイすることができる。
【００８７】
また、本発明の連結分子の活性は、実施例１２に示すようにｏｂ／ｏｂマウスを用いて等、生体内アッセイにおいて評価されてもよい。一般に、これらのポリペプチドのうちの１つ以上の生体内活性を評価するために、試験動物の腹腔内にポリペプチドを投与することができる。１つ以上の所望の期間後、血液サンプルを採取し、血糖値レベルを測定することができる。
【００８８】
本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体と同様に、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド、または両方の組み合わせであってもよい、連結分子を含むＦＧＦ２１ポリペプチドは、定方向突然変異によって、または細菌発現プロセスの結果として導入されてもよい、アミノ末端のメチオニン残基を任意で含むことができる。
【００８９】
標準的な分子生物学技術に精通する等業者は、本開示とともにその知識を利用して、本発明の連結分子を作製および使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用されてもよい。例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様にしたがって、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われてもよい。リンカーをＦＧＦ２１ポリペプチドと会合させるプロセスはリンカーの性質に依存するが、等業者には既知である。リンカー結合化学の例は本明細書に記載される。本発明の連結分子がどのように形成されるかのガイダンスは、例えば、実施例９において本明細書に提供される。
【００９０】
明確に定義されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方および送達、ならびに患者の治療のために用いられてもよい。
【００９１】
６．Ｂ．連結分子のリンカー
２つのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを一緒に連結するために、任意のリンカーが連結分子に用いられてもよい。リンカー分子は、分岐していてもまたは分岐していなくてもよく、本明細書に記載されるような既知の化学を用いてＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合されてもよい。リンカーは主にスペーサとしての役割を果たすため、その化学構造は重要ではない。リンカーは、連結分子（例えば、３つもしくは４つのＦＧＦ２１変異体または野生型ポリペプチドを含む連結分子）に存在してもよい任意の他のリンカー（単数または複数）と、独立して、同じかまたは異なっていてもよい。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から構成されてもよい。これらのアミノ酸のうちのいくつかは、等業者には十分に理解されるように、グリコシル化されていてもよい。例えば、シアル化を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基である。別の実施形態において、リンカー分子は、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａ等の任意のサイズのＰＥＧ分子であってもよい。
【００９２】
ぺプチジルリンカーが存在する（すなわち、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から構成される）実施形態において、それは、好ましくは１個〜最大約４０個のアミノ酸残基、より好ましくは１個〜最大約２０個のアミノ酸残基、最も好ましくは１個〜約１０個のアミノ酸残基の長さで作られる。一実施形態において、リンカーのアミノ酸残基は、２０個の基準アミノ酸のうちのいずれかから選択される。別の実施形態において、リンカーのアミノ酸残基は、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および／またはセリンから選択される。さらに別の実施形態において、ぺプチジルリンカーは、ペプチド結合によって結合されたグリシン、セリン、およびアラニン等の立体障害のないアミノ酸の大部分から構成される。体内循環にタンパク質分解による急速な代謝回転が存在する場合は、それを回避するぺプチジルリンカーが選択されることが望ましいことが多い。したがって、好ましいぺプチジルリンカーは、ポリグリシン、特に、（Ｇｌｙ）４（配列番号６）、（Ｇｌｙ）５（配列番号７）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、およびポリアラニンを含む。他の好ましいぺプチジルリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）、および本明細書に提供される実施例において使用される任意のリンカーを含む。しかしながら、本明細書に記載されるリンカーは代表的なものであって、本発明の範囲内のリンカーは、これより大分長くてもよく、また他の残基を含むことができる。
【００９３】
ペプチドリンカー部分を含む連結分子の実施形態において、例えば、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基等の酸性残基は、リンカー部分のアミノ酸配列に配置される。その例は、以下のペプチドリンカー配列を含む：
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号１１）、
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号１２）、
ＧＥＥＥＧ（配列番号１３）、
ＧＥＥＥ（配列番号１４）、
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１５）、
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１６）、
ＧＤＤＤＧ（配列番号１７）、
ＧＤＤＤ（配列番号１８）、
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、
ＷＥＷＥＷ（配列番号２０）、
ＦＥＦＥＦ（配列番号２１）、
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号２２）、
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号２３）、
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号２４）、または
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号２５）。
【００９４】
他の実施形態において、ぺプチジルリンカーは、例えば以下のようなリン酸化部位を構成する：Ｘ１Ｘ２ＹＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号２６）、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である；Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号２７）、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である；またはＸ１Ｘ２ＴＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号２８）、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である。
【００９５】
ペプチド以外のリンカーも、連結分子に用いることができる。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２〜２０）等のアルキルリンカーが用いられてもよい。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等の立体障害のない任意の基によってさらに置換されてもよい。
【００９６】
連結分子を形成するために、本発明において任意の好適なリンカーが用いられてもよい。１つの例において、本明細書に記載される連結分子を生成するために用いられるリンカーは、以下の一般構造を有するホモ二官能性のビス−マレイミドＰＥＧ分子であり、
Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−Ｘ  
式中、Ｘはマレイミド基である。他の実施形態において、Ｘは、オルトピリジル−ジスルフィド、ヨードアセトアミド、ビニルスルホン、または当該技術分野においてチオール基に特異的であることが知られる任意の他の反応部分であってもよい。さらに別の実施形態において、Ｘは、Ｎ末端または遺伝子操作されたリジル基のいずれかを介して２つの変異体ポリペプチドを一緒に連結するために用いられるアミノ特異的反応部分であってもよい（例えば、Ｐａｓｕｔ  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００６，“ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９２：９５〜１３４を参照のこと）。
【００９７】
さらに別の実施形態において、リンカーは以下の一般構造を有することができ、
Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
式中、ＸおよびＹは、上記の基から選択される異なる反応性部分である。そのようなリンカーは、連結されたヘテロ二量体またはヘテロオリゴマーを作製するために、異なる変異体ポリペプチドの共役を可能にする。
【００９８】
さらなる実施形態において、リンカーは、１〜１００ｋＤａ、好ましくは１０〜５０ｋＤａ（例えば、１０、２０、３０、または４０ｋＤａ）、またより好ましくは２０ｋＤａの分子量を有することができるＰＥＧ分子であってもよい。ペプチドリンカーは、上記と同じ様式で誘導体を形成するように変更されてもよい。
【００９９】
有用なリンカーの他の例は、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる国際公開第２００６／０４２１５１号に開示されるようなアミノエチルオキシエチルオキシ−アセチルリンカーを含む。
【０１００】
本発明の連結分子を形成する場合、リンカーを野生型または変異体のＦＧＦ２１分子と会合させるために標準化学が用いられてもよい。正確な会合の方法は、結合部位（例えば、アミノ酸側鎖）およびリンカーの性質に依存する。リンカーがＰＥＧ分子である場合、標準化学と、システイン残基（突然変異によってＦＧＦ２１ポリペプチド配列内に導入されてもよいか、または自然発生であってもよい）またはリジン（突然変異によってＦＧＦ２１ポリペプチド配列内に導入されてもよいか、または自然発生であってもよい）またはＮ末端アミノ基に見出されるような遊離スルフヒドリル基またはアミノ基と、を用いることによって、結合を達成することができる。
【０１０１】
７．ＦＧＦ２１変異体の化学修飾
本発明の態様において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは化学修飾される。「化学修飾された」という用語は、ポリペプチド上の１つ以上の部位にポリマーを付加することによって修飾されたポリペプチド（例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド）を指す。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの化学修飾された形態の例は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＰＥＧ化およびグリコシル化された形態を含む。
【０１０２】
本発明の化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、ＰＥＧ等の水溶性ポリマーを含む任意の種類のポリマーを含むことができる。代表的なポリマーは、それぞれ任意の分子量であってもよく、分岐していてもまたは分岐していなくてもよい。ポリマーは、それぞれ典型的には、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製において、いくつかの分子は記載した分子量よりも多い重さであり、いくつかはそれよりも少ない重さであることを意味する）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、より好ましくは約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａであり、また最も好ましくは約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａである。
【０１０３】
好適な水溶性ポリマーまたはその混合物は、これらに限定されないが、炭水化物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）、アルコキシ、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤの低分子量デキストラン等）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコールを含む。また、共有結合的に結合したＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の多量体を調製するために用いることのできる二機能性架橋分子も、本発明に包含される。また、ポリシアル酸に共有結合的に結合したＦＧＦ２１変異体も、本発明に包含される。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含む１つ以上の水溶性ポリマーを含むように共有結合的に修正される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、および第４，１７９，３３７号を参照のこと。本発明のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、これらに限定されないが、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、またはそのようなポリマーの混合物を含む、１つ以上のポリマーを含む。
【０１０５】
本発明のさらに他の実施形態において、ペプチドまたはタンパク質は、部位特異的な様式でＦＧＦ２１に共役されてもよいが、上記の遺伝子操作された順番の残基は、ＦＧＦ２１に好ましい特性（例えば、強度、安定性、選択性）を付与する。したがって、本発明は、導入されたポリマー結合部位でヘテロタンパク質またはヘテロペプチドに共役されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを包含する。好適なタンパク質の例は、ＦＧＦ２１に結合しないＨＡＳおよび抗体を含む。
【０１０６】
７．Ａ．ＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
本発明のいくつかの実施形態において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、ＰＥＧサブユニットで共有結合的に修飾される。いくつかの実施形態において、１つ以上の水溶性ポリマーが、ＦＧＦ２１変異体の１つ以上の特異的な位置（例えば、Ｎ末端）で結合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の水溶性ポリマーがＦＧＦ２１変異体の１つ以上の側鎖に結合し、これらの側鎖は自然発生であってもよいか、または遺伝子操作されたポリマー結合部位の構成要素を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療能力を向上するために使用される。特定のそのような方法は、例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１３３，４２６号において考察される。
【０１０７】
ポリマーがＰＥＧである本発明の実施形態において、ＰＥＧ基は任意の都合のよい分子量の基であってもよく、直鎖または分岐鎖であってもよい。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは約２ｋＤ〜約１００ｋＤａ、またより好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲であり、例えば、１０、２０、３０、４０、または５０ｋＤａである。ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、ＮＨＳ、またはマレイミド、ビニルスルホン、アルキルハロゲン化物）によるＦＧＦ２１変異体上の反応基（例えば、アミノ基またはチオール基）へのアシル化または還元的アルキル化を介して、ＦＧＦ２１変異体に結合する。
【０１０８】
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合するポリマー（複数可）がＰＥＧである場、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＰＥＧ化は、当該技術分野で既知であるＰＥＧ化反応のうちのいずれかを用いて、特異的に実行することができる。そのような反応は、例えば、以下の参考文献に記載される：Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９５，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：１５０〜１６５；Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４〜１０；欧州特許第０１５４３１６号および第０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、標的残基がリジン残基（すなわち、反応性アミノ基を持つ残基）である場合、ＰＥＧ化は、本明細書に記載されるように、アミノ反応性ポリエチレングリコール分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）を用いて、アシル化反応またはアルキル化反応を介して実行することができる。アシル化反応には、選択されるポリマーは単一の反応性エステル基を有することができる。還元的アルキル化には、選択されるポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有することができる。反応性アルデヒドは、例えば、水溶性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）である。当業者には、異なるアミノ特異的部分で活性化された種々の反応性ＰＥＧポリマーも既知であり、状況に応じてそれらが用いられてもよい。
【０１０９】
別の例において、標的残基がシステイン残基（すなわち、反応性スルフヒドリル基を持つ残基）である場合、ＰＥＧ化は標準的なマレイミド化学を介して実行することができる。この反応には、選択されるポリマーは、１つ以上の反応性マレイミド基、またはビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド、もしくはヨードアセトアミド等の他のチロール反応性部分を含有することができる。例えば、Ｐａｓｕｔ＆Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００６，“ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９２：９５〜１３４；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９５，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６：１５０〜１６５；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８を参照のこと（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＥＧ基をＦＧＦ２１変異体に結合させるための有用なストラテジーは、溶液中で共役結合を形成することによって、それぞれが他方に対して相互に反応性である特別な官能性を有するＦＧＦ２１変異体とＰＥＧ部分とを合わせることを含む。ＦＧＦ２１変異体は、特異的部位で、適切な官能基で「時前に活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分と反応させる前に精製され、十分に特徴付けられる。ＦＧＦ２１変異体とＰＥＧのライゲーションは、通常は水相で起こり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは逆相分析用ＨＰＬＣによって容易に監視することができる。詳細な分析は、ＬＣ−ＭＳに基づくペプチドのマッピングによって行うことができる。
【０１１１】
７．Ｂ．多糖類ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド
多糖類ポリマーは、タンパク質の修飾に使用することのできる別の種類の水溶性ポリマーである。したがって、本発明のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、本発明の実施形態を形成するように多糖類ポリマーに結合されてもよい。したがって、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの遺伝子操作した非自然発生ポリマー結合部位は、多糖類が結合される残基を含むことができる。デキストランは、主にα１〜６結合によって結合されるグルコースの個別サブユニットを含む多糖類ポリマーである。デキストラン自体は多くの分子量の範囲で使用可能であり、約１ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量で容易に使用可能である。デキストランは、それ自体がビヒクルとして使用される好適な水溶性ポリマーであるか、または、または別のビヒクルと合わせて（例えば、Ｆｃ）使用される好適な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開第９６／１１９５３号を参照のこと。治療用または診断用の免疫グロブリンと共役されたデキストランの使用が報告されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許公開第０３１５４５６号を参照のこと。また本発明は、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａのデキストランの使用を包含する。
【０１１２】
７．Ｃ．ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを化学修飾する方法
一般に、化学修飾（例えば、ＰＥＧ化またはグリコシル化）は、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために用いられる任意の好適な条件下で行うことができる。化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを調製するための方法は、通常、以下の工程：（ａ）ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが１つ以上のポリマー分子に結合する条件下で、ポリペプチドを活性化されたポリマー分子（反応性エステル、マレイミド、またはポリマー分子のアルデヒド誘導体等）と反応させる工程と、（ｂ）反応産物を得る工程、を含む。最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比率が高いほど、結合するポリマー分子の割合が大きい。本発明の一実施形態において、化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、アミノ末端に単一のポリマー分子を有することができ、他の実施形態において、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのＮ末端に１つのポリマー、そしてポリペプチドの別の残基に第２のポリマーのように、一次配列に会合する２つ以上のポリマーを有することができる。代替として、ＦＧＦ２１変異体は、一次配列の２つの異なる残基と会合する２つ以上のポリマーを有することができるが、Ｎ末端にはポリマーを有することはできない。
【０１１３】
一般に、本発明の化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの投与によって緩和または調節することのできる状態は、天然ＦＧＦ２１ポリペプチドについて本明細書に記載されるものを含む。しかしながら、本明細書に開示される化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１変異体と比較して、半減期の増加等の追加の活性を有することができる。
【０１１４】
８．ＦＧＦ２１変異体の治療用組成物およびその投与
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む治療用組成物は、本発明の範囲内であり、特に、強化された特性を示す連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、および化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの同定を考慮して企図される。そのような連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、および化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療用組成物は、投与様式との適合性に合わせて選択される薬学的にまたは生理学的に許容される製剤用物質との混合物中で化学修飾することのできる、治療的有効量の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含むことができる。
【０１１５】
許容される製剤用物質は、好ましくは、用いられる投与量および濃度で受容する側に毒性を示さない。
【０１１６】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出、吸収、または浸透の速度等を、変更、維持、または保存するための製剤用物質を含有することができる。好適な製剤用物質は、これらに限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン等）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウム等）、緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸等）、増量剤（マンニトールもしくはグリシン等）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリン等）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等）、着色剤、香味剤および賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルポロリドン等）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウム等）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素等）、溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等），糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサポール等）、安定性増進剤（スクロースまたはソルビトール等）、等張性増進剤（アルカリ金属ハロゲン化物―好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムまたはマンニトールソルビトール等）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントを含む（例えば、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）およびその続編を参照のこと）。
【０１１７】
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態、および所望の投与量に依存して、等業者によって決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと）。そのような組成物は、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（切断されているか、キャッピングされているか、もしくはＣ末端突然変異されていてもよい）、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの物理的状態、安定性、体内放出の速度、体内クリアランスの速度に影響を与えることが可能である。
【０１１８】
医薬組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、本質的に、水性または非水性のいずれかであってもよい。例えば、注射に好適なビヒクルまたは担体は、非経口投与のための組成物に共通の他の物質が補充された可能性のある、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってもよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる代表的ビヒクルである。他の代表的な医薬組成物は、ソルビトールまたは好適な代替物をさらに含むことができる約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含む。本発明の一実施形態において、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、および化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの組成物は、所望の純度を有する選択された組成物と、任意の製剤用物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｓｕｐｒａ）とを、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することによって、保存のために調製されてもよい。さらに、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、および化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの生成物は、スクロース等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方されてもよい。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、非経口送達のために選択されてもよい。代替として、組成物は、吸入のために、または消化管を介した送達（例えば経口等）のために選択されてもよい。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の技術の範囲内である。
【０１２０】
製剤の成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、組成物を生理学的なｐＨで、または若干低いｐＨで、典型的には、約５〜約８のｐＨ範囲内で維持するために緩衝液が用いられる。
【０１２１】
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む、パイロジェンフリーの、非経口的に許容可能な水溶液の形態であってもよい。非経口注射のために特に好適なビヒクルは滅菌蒸留水であり、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが、その中で、適切に保存された無菌の等張液として処方される。さらに別の調製物は、所望の分子と、後にデポー注射を介して送達されてもよい生成物の制御放出または徐放性放出を提供する、注射用ミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸等）、ビーズ、またはリポソームとの処方物を含むことができる。また、ヒアルロン酸が使用されてもよく、循環における徐放期間を促進する効果を有することができる。所望の分子を導入するための他の好適な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０１２２】
一実施形態において、医薬組成物は、吸入のために処方されてもよい。例えば、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、吸入用の乾燥粉末として処方されてもよい。そのような吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに処方されてもよい。さらに別の実施形態において、溶液は噴霧されてもよい。肺投与は、化学修飾されたタンパク質の肺送達について記載する国際公開第９４／２００６９号にさらに記載される。
【０１２３】
また、特定の処方物が経口投与されてもよいことも企図される。本発明の一実施形態において、この様式で投与される連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（切断されているか、キャッピングされているか、もしくはＣ末端突然変異されていてもよい）、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、錠剤およびカプセル剤等の固体剤形の配合において習慣的に用いられる担体を用いてまたは用いずに処方することができる。例えば、カプセル剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、かつ前全身的な分解が最小化される時に、消化管のポイントで処方物の活性部分を放出するように設計されてもよい。連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（切断されているか、キャッピングされているか、もしくはＣ末端突然変異されていてもよい）、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの吸収を促進するために、追加の物質が含まれてもよい。また、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤が用いられてもよい。
【０１２４】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中に、治療的に有効な量の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（切断されているか、キャッピングされているか、もしくはＣ末端突然変異されていてもよい）、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含むことができる。滅菌水または別の適切なビヒクルに錠剤を溶解することにより、溶液を単位剤形で調製することができる。好適な賦形剤は、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトースもしくはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤、またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア等の結合剤、またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくは滑石等の潤滑剤を含む。
【０１２５】
当業者には、徐放性送達処方物または制御送達処方物中に、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む処方物を含む、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのさらなる医薬組成物が明白である。リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズ、およびデポー注射等の、多様な他の徐放性送達手段または制御送達手段を処方するための技術もまた、当業者に既知である（例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出について記載する国際公開第９３／１５７２２号を参照のこと）。
【０１２６】
徐放性調製物の追加の例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル等の成形された物体の形態の、半透性のポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第００５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７〜５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０１３３９８８号）を含むことができる。また徐放性組成物は、当該技術分野で既知であるいくつかの方法のうちのいずれかによって調製されてもよいリポソームを含むことができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８〜９２；および欧州特許第００３６６７６号、第００８８０４６号、および第０１４３９４９号を参照のこと。
【０１２７】
生体内投与のために用いられる連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの医薬組成物は、典型的には滅菌されなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合は、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれに行なわれてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中に保管されてもよい。また、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用の針で穿刺することができるストッパーを有する静脈注射溶液用のバッグまたはバイアル中に入れられる。
【０１２８】
いったん医薬組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として滅菌バイアル中に保管されてもよいか、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として保管されてもよい。そのような処方物は、すぐに使用できる形態か、または投与の前に再構成する必要のある形態（例えば、凍結乾燥）のどちらで保管されてもよい。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量の投与単位を生成するためのキットを提供する。キットは、それぞれが、乾燥したタンパク質を有する第１の容器と、水性の処方物を有する第２の容器との両方を含むことができる。また、単一チャンバおよびマルチチャンバのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥製剤用シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０１３０】
治療に用いられる連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（切断されているか、キャッピングされているか、もしくはＣ末端突然変異されていてもよい）、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの医薬組成物の治療的有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。したがって、当業者は、治療に適切な投与量レベルは、送達される分子、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが用いられる適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面積、または器官のサイズ）および状態（年齢および総体的な健康）に一部依存して変化することを理解するであろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るように、投与量を滴定し、投与経路を変更することができる。典型的な投与量は、上記の因子に依存して、約０．１ｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。他の実施形態において、投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、例えば０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１３１】
投薬頻度は、使用される処方物における連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単回用量として、または２回以上の用量（同じ量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した連続注入として投与されてもよい。適切な投与量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、当業者によって日常的に行われる作業の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認することができる。
【０１３２】
医薬組成物の投与経路は、例えば、経口；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内の経路による注射；徐放性システムによる；または移植デバイスによる、既知の方法に従う。所望の場合、組成物は、ボーラス注射によって投与されてもよいか、または注入によって連続的に投与されてもよいか、または移植デバイスによって投与されてもよい。
【０１３３】
代替としてまたは追加として、組成物は、所望の分子が吸収されているかまたは封入されている膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植によって、局所的に投与されてもよい。移植デバイスが使用される場合は、デバイスは任意の好適な組織または器官に移植されてもよく、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続的投与を介してもよい。
【０１３４】
１０．ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の治療的使用
本発明の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド（切断されているか、キャッピングされているか、またはＣ末端突然変異されていてもよい）、および化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、これに限定されないが、代謝異常を含む多数の疾患、障害、または状態を治療、診断、寛解、または予防するために使用されてもよい。一実施形態において、治療される代謝異常は糖尿病である。別の実施形態において、代謝異常は肥満である。他の実施形態は、脂質異常症等の代謝疾患または代謝異常、高血圧、非アルコール性脂肪性肝炎等（ＮＡＳＨ）等の脂肪肝、粥状動脈硬化等の循環器疾患、および加齢を含む。
【０１３５】
応用において、糖尿病または肥満等の疾患または障害は、本明細書に記載されるような連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを、それを必要とする患者に治療的に有効な用量で投与することによって治療することができる。投与は、静脈注射、腹腔内注射、筋肉内注射、または錠剤もしくは液体の形態で経口的に等、本明細書に記載されるように行われてもよい。ほとんどの状況において、所望の投与量は、本明細書に記載されるように臨床医によって決定されてもよく、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療的に有効な用量を意味することができる。当業者には、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの治療的に有効な用量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、核酸分子またはポリペプチドが他の治療剤と併用投与されるかどうか、受ける側の免疫状態および健康に依存することは明らかである。「治療的に有効な用量」という用語は、本明細書で使用されるとき、研究者、医師、もしくは他の臨床医に求められる、組織系、動物、もしくはヒトにおける生物学的または医学的な応答（治療しようとする疾患または障害の症状の緩和を含む）を導く、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの量を意味する。
【０１３６】
１１．抗体
本発明の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、および化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドには特異的に結合するが、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドには特異的に結合しない抗体および抗体断片が企図され、本発明の範囲内に含まれる。抗体は、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂｓ）；組換え；キメラ；相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化等のヒト化；ヒト；単鎖；および／または二重特異性、ならびにそれらの断片、変異体、あるいは化学修飾された分子であってもよい。抗体断片は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体のそれらの部分を含む。そのような断片の例は、全長抗体の酵素的切断によって作製されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）断片を含む。他の結合断片は、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現等の、組換えＤＮＡ技術によって作製されるものを含む。
【０１３７】
連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを標的とするポリクローナル抗体は、一般に、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において作製される。キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子等の、免疫しようとする種において免疫原性である担体タンパク質に、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを共役することが有用であり得る。また、免疫応答を強化するためにミョウバン等の凝集剤が用いられる。免疫後に動物から採血し、抗連結分子抗体、抗ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体、または抗化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体の力価について血清をアッセイする。
【０１３８】
連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを標的とするモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の生成をもたらす任意の方法を用いて生成されてもよい。モノクローナル抗体を調製するための好適な方法の例は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜９７）およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１〜６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）を含む。また、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと反応性であるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株も本明細書によって提供される。
【０１３９】
本発明の抗ＦＧＦ２１変異体抗体は、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの検出および定量化のための競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれるＳｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７〜１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７を参照のこと）等の任意の既知のアッセイ法に用いることができる。抗体は、用いられるアッセイ法に適した親和性でＦＧＦ２１変異体ポリペプチドに結合する。
【０１４０】
特定の実施形態において、診断用途のために、抗連結分子抗体、抗ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体、または抗化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体は、検出可能部分で標識されてもよい。検出可能部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能な信号を生成することが可能な任意の部分であってもよい。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ等の放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン等の蛍光または化学発光化合物；あるいはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８〜６３）。
【０１４１】
競合結合アッセイは、限られた量の抗連結分子抗体、抗ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体、または抗化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体と結合しようとして、試験サンプル分析物（例えば、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド）と競合する標識標準（例えば、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、またはその免疫学的に活性な部分）の能力に依存する（分析物による）。試験サンプル中の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定し易くするために、抗体を典型的には競合の前および後で不溶化して、抗体に結合した標準および分析物が、未結合のままの標準および分析物から都合よく分離できるようにする。
【０１４２】
サンドイッチアッセイは、典型的には、検出および／または定量化しようとするタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれ結合可能な、２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプル分析物は、典型的には、固体支持体上に固定された第１の抗体に結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、ひいては不溶性の３成分複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体が検出可能部分によって標識されてもよいか（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、ある種のサンドイッチアッセイは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能部分は酵素である。
【０１４３】
また、本発明の抗連結分子抗体、抗ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体、または抗化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチド抗体は、生体内撮像にも有用である。検出可能部分で標識された抗体は、動物に、好ましくは、血流内に投与されてもよく、宿主内の標識抗体の存在および場所がアッセイされる。体は、核磁気共鳴、放射線医学、または当該技術分野で既知の他の検出手段を用いるかどうかにかかわらず、動物内で検出可能な任意の部分で標識することができる。
【０１４４】
また、本発明は、連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの抗体と、および生物学的サンプル中の連結分子、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチド、または化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのレベルを検出するために有用な他の試薬とを含むキットに関する。そのような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、ならびに検出試薬を含むことができる。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびそれの種々の使用を例示するものである。これらは説明の目的のためのみに記述されているのであって、決して本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【０１４６】
実施例１
ＦＧＦ２１ポリペプチド発現コンストラクトの調製
成熟ＦＧＦ２１配列の５’および３’末端に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする核酸配列を得た。表４に、成熟ＦＧＦ２１配列を増幅するために使用したプライマーを列挙する。
【０１４７】
【表４】
0005878757.tif 000005
【０１４８】
ＦＧＦ２１発現コンストラクトを調製するために使用したプライマーは、配列の方向性クローニングのために制限エンドヌクレアーゼ部位を好適な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはｐＡＭＧ３３（Ａｍｇｅｎ社製、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ））に組み込んだ。発現ベクターｐＡＭＧ３３は、低コピー数のＲ−１００複製開始点、修飾ｌａｃプロモーター、およびカナマイシン抵抗性遺伝子を含む。発現ベクターｐＥＴ３０は、ｐＢＲ３２２由来の複製開始点、誘導性Ｔ７プロモーター、およびカナマイシン抵抗性遺伝子を含む。ｐＡＭＧ３３からの発現がより高いことが分かった一方で、ｐＥＴ３０は、より信頼性の高いクローニングベクターであることが分かった。したがって、本出願に記載されるコンストラクトの大半は、最初にｐＥＴ３０内で作製し、次いで有効性のスクリーニングを行った。次いで、選択された配列をｐＡＭＧ３３に移してさらに増幅した。
【０１４９】
ＦＧＦ２１配列は、４０．６５μＬのｄＨ２Ｏ、５μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ反応緩衝液（１０×）、１．２５μＬのｄＮＴＰ混合物（４０ｍＭ〜４×１０ｍＭ）、０．１μＬのテンプレート（１００ｎｇ／ｍＬ）、１μＬのプライマー１（１０μＭ）、１μＬのプライマー２（１０μＭ）、および１μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含有する反応混合物において増幅した。増幅反応物を９５℃で２分加熱し；その後、所望の産物のキロベース当たり９５℃で２０秒、６０℃で２０秒（１サイクルごとに１℃低くして）、および７２℃で１５秒で１０サイクル；その後、所望の産物のキロベース当たり９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、および７２℃で１５秒で２０サイクル；その後７２℃で３分間加熱することによって行った。制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで増幅産物を消化し、好適なベクターにライゲートし、次いで、コンピテント細胞に形質転換した。
【０１５０】
用いた細菌発現系の結果として、発現された成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基か、またはｆＭｅｔもしくはグルコシル化Ｍｅｔ等の変異体メチオニン残基を含んでいた。
【０１５１】
実施例２
細菌からの野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの精製
以下の実施例では、細菌発現系において野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドを発現させた。以下に記載される発現の後、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドを、別途記載のない限り、本実施例に記載するように精製した。
【０１５２】
細菌性封入体から野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドを精製するために、２回洗浄した封入体（ＤＷＩＢ）を、グアニジン塩酸塩を含有する可溶化緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液中のＤＴＴ（ｐＨ８．５）中で可溶化し、次いで室温で１時間混合し、可溶化混合物を尿素、アルギニン、システイン、およびシスタミン塩酸塩を含有するリフォールディング緩衝液（ｐＨ９．５）に添加し、次いで５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７〜６３；Ｍａｎｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３〜３４；Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，“Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ５７〜９９；およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１〜６を参照のこと）。
【０１５３】
可溶化およびリフォールディングの後、０．４５マイクロメートルのフィルタを通して混合物を濾過した。次いで、膜間差圧（ＴＭＰ）２０ｐｓｉで分子量カットオフ値１０ｋＤのＰａｌｌ社製Ｏｍｅｇａカセットを用いて、リフォールディングしたプールをおよそ１０倍濃縮し、３カラム体積２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いてＴＭＰ２０ｐｓｉで膜分離した。
【０１５４】
次いで、精製されたサンプルを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を用いて陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィに供した。２０ｍＭのＴｒｉｓ中の０〜２５０ｍＭのＮａＣｌの線形塩勾配をｐＨ８．０、５℃で実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりピーク分画を分析してプールした。
【０１５５】
次いで、ＡＥＸ溶出プールを、フェニルセファロースＨＰ樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）に供した。０．７Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムの減少する線形勾配を用いて、ｐＨ８．０および周囲温度でタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりピーク分画を分析（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０〜８５）してプールした。
【０１５６】
分子量カットオフ値１０ｋＤのＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａ０．２ｍ２カセットを用いて、ＴＭＰ２０ｐｓｉで７ｍｇ／ｍＬまでＨＩＣプールを濃縮した。５体積の１０ｍＭのＫＰＯ４、５％ソルビトール（ｐＨ８．０）をＴＭＰ２０ｐｓｉで用いて濃縮物を膜分離し、回収した濃縮物を５ｍｇ／ｍＬに希釈した。最後に、Ｐａｌｌ社製Ｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃ  ０．２μＭ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅ膜を通して溶液を濾過した。
【０１５７】
実施例３
ＦＧＦ２１変異体の同定
野生型ＦＧＦ２１は比較的短い半減期を有するため、ある場合においては、治療剤として野生型ＦＧＦ２１を使用することが望ましくない可能性がある。また、ポリペプチドのＰＥＧ化等、半減期を延長する従来方法は、ＦＧＦ２１配列の好適なＰＥＧ化部位の数および場所によって限定される。野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列には、７つの自然発生ＰＥＧ化部位、すなわち、αアミノ基、４つのリジン残基、および２つシステイン残基が存在する。ＰＥＧ分子は、ＦＧＦ２１がその天然構造を得る能力に有害な影響を与える可能性があるか、または、ＦＧＦ２１とその受容体もしくはβ−ｋｌｏｔｈｏとの間の相互作用に有害な影響を与える可能性があるため、これらの部位はＰＥＧ化には理想的ではない。また、αアミノ基を除いて、これらの反応性残基は、単一の標的の場所での部位特異的なＰＥＧ化を許容しない。したがって、化学修飾に好適な残基に突然変異させることができる野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド内の残基を同定するために該当する集中的な試験を開始した。試験の検討事項には、ＦＧＦ２１配列中の残基の場所、およびタンパク質表面上での残基の位置が含まれた。
【０１５８】
本明細書に記載される化学修飾に有用な残基への突然変異に好適である、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド中の個々の残基を同定する試みで、２つの異なるストラテジーを用いた。
【０１５９】
実施例３．Ａ
相同性モデルを使用して同定された突然変異候補
第１のストラテジーでは、系統的な合理的タンパク質工学アプローチにおいて、相同性モデルを用いて、ＦＧＦ２１の活性を妨害することなくＰＥＧ化に耐える可能性のある表面に露出した側鎖を有する確率の高い残基を同定した。そのような残基を同定するために使用することのできるＦＧＦ２１のＸ線構造またはＮＭＲ構造が発表されていないため、Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から取得したＦＧＦ１９（１ＰＷＡ）の高解像度（１．３Å）Ｘ線結晶構造を用いて、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを使用して、ＦＧＦ２１の３Ｄ相同性モデルを作製した。ＰＤＢに寄託されたタンパク質の中で、アミノ酸配列相同性の点において、ＦＧＦ１９がＦＧＦ２１のタンパク質に最も密接に関連していたため、ＦＧＦ１９をテンプレートとして選択した。
【０１６０】
次いで、ＦＧＦ２１相同性モデルを、ＦＧＦ受容体に結合したＦＧＦ−２１を示すように拡張した。このモデルは、ＦＧＦ２１とその受容体との相互作用を妨害する可能性がある残基を避ける一方で、ＦＧＦ２１分子の表面上に露出する可能性があり、活性化されたポリマー（例えば、ＰＥＧ）部分との反応に使用可能である残基を同定するために使用した。種間における残基の配列保存、および天然側鎖の生化学的特性についても考慮がなされた。このスクリーンによって良好な候補であると同定された残基を、この部位の活性の中断を最小限に留めたＰＥＧ化の成功が予想される確率にしたがってランク付けした。グループＡの残基は最良の候補を示し、グループＤの残基は、実用可能ではあるがあまり好ましくない候補を示す。グループＡは、Ｎ１２１、Ｈ１２５、Ｈ１１２、Ｒ７７、Ｈ８７、Ｅ３７、およびＫ６９を含む。グループＢは、Ｒ１２６、Ｇ１１３、Ｄ７９、Ｅ９１、Ｄ３８、Ｄ４６、およびＧ１２０を含む。グループＣは、Ｓ７１、Ｄ８９、Ｌ８６、Ｔ７０、Ｇ３９、Ｔ４０、Ｒ３６、Ｐ４９、Ｓ４８、Ｓ１２３、Ｋ１２２、Ａ８１、Ａ１１１、Ｅ１１０、およびＲ９６を含む。最後に、グループＤは、Ｑ１８、Ｒ１９、Ａ２６、Ｑ２８、Ｅ３４、Ａ４４、Ａ４５、Ｅ５０、Ｌ５２、Ｑ５４、Ｌ５５、Ｋ５９、Ｇ６１、Ｌ６６、Ｖ６８、Ｒ７２、Ｐ７８、Ｇ８０、Ｙ８３、Ｓ８５、Ｆ８８、Ｐ９０、Ａ９２、Ｓ９４、Ｌ９８、Ｅ１０１、Ｄ１０２、Ｑ１０８、Ｌ１１４、Ｈ１１７、Ｐ１１９、Ｐ１２４、Ｄ１２７、Ｐ１２８、Ａ１２９、Ｐ１３０、Ｒ１３１、およびＰ１４０を含む。
【０１６１】
また、分子のアミノ末端セグメントおよびカルボキシ末端セグメント内の潜在的なＰＥＧ化部位は、分子のこれらの部分に関する利用可能な３次元構造データが存在しないので、側鎖の配列アラインメントおよび生化学的特性に基づいて同定した。突然変異に最も好適であると考えられた残基を同定し、続いて、その残基が一連の選択基準にどれだけ適合するかにしたがってグループ化した。ＦＧＦ２１ポリペプチド配列のＮ末端に関して、残基１〜１３を評価したところ、Ｄ５が突然変異の最良の候補であることが分かり、また残基Ｈ１、Ｐ２、Ｉ３、Ｐ４、およびＳ６も実行可能であることが分かった。ＦＧＦ２１ポリペプチド配列のＣ末端に関して、残基１４１〜１８１を評価したところ、残基Ｙ１７９およびＲ１７５が突然変異の最良の候補であることが分かり、残基Ｐ１４３、Ｐ１７１、Ｓ１７２、Ｑ１７３、Ｇ１７４、Ｓ１７６、Ｐ１７７、Ｓ１７８、Ａ１８０、およびＳ１８１が他の候補グループを形成し、また残基Ｐ１４４、Ａ１４５、Ｐ１４７、Ｅ１４８、Ｐ１４９、Ｐ１５０、Ｉ１５２、Ａ１５４、Ｑ１５６、およびＧ１７０が、突然変異の第３候補グループを形成した。
【０１６２】
実施例３．Ｂ
望ましくない自然発生ポリマー結合部位を除去することによって作製される
ＦＧＦ２１変異体
第２のストラテジーは、ＰＥＧをＦＧＦ２１に結合させるためにアミノ特異的共役化学を用いた。潜在的に空胞を形成する共役の部位選択的な二重ＰＥＧ化は、それらが空胞を形成する可能性を有意に減少させることが可能である（例えば、米国特許第６，４２０，３３９号を参照のこと）。したがって、本発明の一態様において、ＦＧＦ２１の部位選択的な二重ＰＥＧ化は、２つの一次アミノ基のみがＰＥＧ化のために残るようにタンパク質を突然変異させることによって達成される。
【０１６３】
野生型ＦＧＦ２１配列（配列番号４）において太字（Ｒ残基およびＫ残基）と下線（Ｋ残基）で強調されている通り、ＦＧＦ２１タンパク質は４個のリジン残基と１０個のアルギニン残基を含有する。２つの自然発生システイン残基が、太字およびイタリック体で強調されている。
【０１６４】
【化１】
0005878757.tif 000006
【０１６５】
最初に４つの自然発生リジンをアルギニンに突然変異させて、Ｎ末端のαアミノ基として１つの一次アミノ基のみを含有する親分子を作製した。これを生体外活性についてテストしたところ、十分に活性であることが分かった。次に、選択されたアルギニンを段階的にリジンと置き換えて、ＦＧＦ２１分子上の種々の位置でＰＥＧ化のための第２の一次アミノ基を含有する類似体を最大１０個まで作製した。その受容体に結合したＦＧＦ２１の相同性モデルを検討することで（実施例３Ａに記載するように）、推定上の受容体界面に対するそれらの近接性の関数として、提案される共役部位のランク付けをすることができた。埋れていると思われる部位は対象としなかった。
【０１６６】
種々の位置について次のようにランク付けおよび特徴付けを行った：（ａ）溶媒に曝露された、受容体界面に遠位である部位：Ｒ３６、Ｒ７７、Ｋ１２２＆Ｒ１２６；（ｂ）溶媒に曝露された、受容体界面に近位である部位：Ｋ５６、Ｋ５９、Ｋ６９、Ｒ７２＆Ｒ１７５；、および（ｃ）埋れた部位：Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ１３１＆Ｒ１３５。
【０１６７】
それぞれが単一のαアミノ基およびΕアミノ基を含有する最終コンストラクトを精製し、実施例９（共役）および１０（生体外活性アッセイ）に記載されるように、ＰＥＧとの共役の前および後で活性についてテストした。
【０１６８】
実施例４
単一の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の同定
実施例３Ａおよび３．Ｂで上述した合理的タンパク質工学アプローチによって作製した、単一の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の概要を表３に提供する。これらの単一の変異体は、非自然発生ポリマー結合部位、とりわけシステイン残基またはリジン残基を提供し、また組み込む。これらの残基の側鎖は、ＰＥＧ分子等のポリマーの結合による化学修飾に特に好適である。所望の場合は、導入された非自然発生ポリマー結合部位に加えて、ポリマーが任意でタンパク質のＮ末端に結合できることが確認された。
【０１６９】
導入された残基は、野生型レベルのＦＧＦ２１生物学的活性を維持するように設計されたため、これらのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、ＦＧＦ２１の生物学的活性を維持しつつ、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を提供することが予測される。化学修飾（例えば、ＰＥＧ化）後、これらの変異体は、生体内で有意な野生型レベルの生物学的活性を維持する一方で、野生型ＦＧＦ２１よりも長い生体内半減期を有すると予測される。
【０１７０】
突然変異誘発を標的とする位置の数を表５に示すが、それは、１８１個のアミノ酸残基から構成される成熟ＦＧＦ２１タンパク質の残基の位置に対応する。下５に列挙したＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、後に記載する技術を用いて調製した。
【０１７１】
【表５】
0005878757.tif 000007
【０１７２】
実施例５
２つの突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の同定
２つの非自然発生ポリマー結合部位を提供するであろう変異体の組み合わせを同定するために、相同性モデルと単一のシステイン変異体から得られたデータとのさらなる分析を行った。化学修飾後、これらのＦＧＦ２１変異体は、所望の場所でポリペプチドに結合する２つのポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）を有する。本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと同様に、ポリマー自体の性質に依存して、ポリマーはポリペプチドのＮ末端にも結合することができる。二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体を表すイラストを図１に図式化して示す。
【０１７３】
合理的タンパク質工学アプローチによって作製した、２つの突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の概要を表６に提供する。これら２つの変異体は、非自然発生ポリマー結合部位、とりわけシステインを組み込む。これらの残基の側鎖は、ＰＥＧ分子等のポリマーの結合による化学修飾に特に好適である。所望の場合は、導入された非自然発生ポリマー結合部位に加えて、ポリマーが任意でタンパク質のＮ末端に結合できることが確認された。
【０１７４】
導入された残基は、野生型レベルのＦＧＦ２１生物学的活性を維持するように設計されたため、これらのＦＧＦ２１変異体は、ＦＧＦ２１の生物学的活性を保存しつつ、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を提供することが予測される。化学修飾（例えば、ＰＥＧ化）後、これらの変異体は、生体内で相等の強度を維持する一方で、野生型ＦＧＦ２１よりも長い半減期を有すると予測される。
【０１７５】
表６に示した位置の数は、１８１個のアミノ酸残基から構成される成熟ＦＧＦ２１タンパク質の残基の位置に対応する。下の表６に列挙したＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、後に記載する技術を用いて調製した。
【０１７６】
【表６】
0005878757.tif 000008
【０１７７】
実施例６
３つの突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の同定
上記の通り、非自然発生ポリマー結合部位を野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列に組み込むことができる。このことは、ポリペプチドの所望の場所における部位選択的な化学修飾の機会を提供する。また、野生型ＦＧＦ２１配列の残基Ｐ１７１はタンパク質分解を受け易いことが事前に確認されている。したがって、上記修飾の組み合わせ、さらにＰ１７１位の突然変異を導入することにより、強化されたタンパク質分解に対する安定性と部位特異的ポリマー結合部位の両方を有するＦＧＦ２１分子を作製することができる。
【０１７８】
２つの非自然発生ポリマー結合部位を提供するであろう変異体の組み合わせを同定するために、相同性モデルのさらなる分析を行った。化学修飾後、これらの変異体は、所望の場所でポリペプチドに結合する２つのポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）を有するであろう。本発明のすべてのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドと同様に、ポリマー自体の性質に依存して、ポリマーがポリペプチドのＮ末端に結合することができる。分析は、導入された２つのポリマー結合部位の他に、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのタンパク質分解に対する安定性を強化し、選択されたポリマー結合部位および強化されたタンパク質分解に対する安定性を提供する一方で、同時に野生型ＦＧＦ２１の生体内での生物学的活性を維持または強化するように設計された、Ｐ１７１位での突然変異の評価を含んだ。
【０１７９】
並行試験において、前述したように部位選択的な混合化学を用いて（参照により組み込まれる米国特許第６，４２０，３３９号を参照のこと）、αアミノＮ末端および導入されたシステイン突然変異の両方で選択的に部位をＰＥＧ化する目的で、実施例４で示した表５の単一突然変異の選択サブセットを、安定性を強化するＰ１７１突然変異と組み合わせた。これら２つの変異体は、Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＨ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇと表され、実施例４の表５に開示される突然変異を用いることが企図されるかもしれない任意の他の組み合わせを例示するものである。
【０１８０】
Ｐ１７１部位の突然変異に加えて、合理的タンパク質工学アプローチによって作製された２つの突然変異を含むＦＧＦ２１変異体の概要を表７に提供する。これらの変異体は、２つの非自然発生ポリマー結合部位、とりわけシステインを取りこむ。これらの残基の側鎖は、ＰＥＧ分子等のポリマーの結合による化学修飾に特に好適である。所望の場合は、導入された非自然発生ポリマー結合部位に加えて、ポリマーが任意でタンパク質のＮ末端に結合できることが確認された。記載される３つのＦＧＦ２１変異体は、上記の導入されたポリマー結合部位だけでなく、タンパク質分解に対する安定性をもたらす１７１位の突然変異も含む。ＦＧＦ２１の３つの変異体の化学修飾後、この突然変異の組み合わせは、２つのポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）をポリペプチド配列と会合させることによってＦＧＦ２１の半減期を増大させ、また、タンパク質分解による切断部位を排除することによって半減期を増大させる機能を果たす。
【０１８１】
導入された残基は、生体内で野生型レベルのＦＧＦ２１の生物学的活性を維持するように設計されたため、これらのＦＧＦ２１変異体は、ＦＧＦ２１の生物学的活性を維持しつつ、固有の非自然発生ポリマー結合部位を提供することが予測される。化学修飾（例えば、ＰＥＧ化）後、これらの変異体は、生体内で有意な野生型レベルの生物学的活性を維持する一方で、野生型ＦＧＦ２１よりも長い生体内半減期を有すると予測される。
【０１８２】
表７に示した位置の数は、１８１個のアミノ酸残基から構成される成熟ＦＧＦ２１タンパク質の残基の位置に対応する。表７に列挙したＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、後に記載する技術を用いて調製した。
【０１８３】
【表７】
0005878757.tif 000009
【０１８４】
実施例７
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの調製および発現
表３（単一の突然変異）、表４（２つの突然変異）、および表５（３つの突然変異、すなわち、２つの突然変異＋Ｐ１７１Ｇ）に列挙したＦＧＦ２１変異体（この実施例では集合的に「ＦＧＦ２１変異体」）をコードするコンストラクトを、以下に記載するように野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅によって調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築は実施例１に記載）。これらの実験の目的は、１つ以上の非自然発生ポリマー結合部位を含み、またある場合にはタンパク質分解に耐性であるＦＧＦ２１変異体を作製することであった。これらのＦＧＦ２１変異体の化学修飾された形態は、より長い半減期を示し、またある場合にはタンパク質分解に耐性でもあることが予測される。
【０１８５】
ＦＧＦ２１変異体コンストラクトは、突然変異させようとするコドン（または複数のコドン）の上流および下流の領域に相同である配列を有するプライマーを用いて調製した。そのような増幅反応に使用したプライマーはまた、およそ１５ヌクレオチドの重複配列を提供して増幅産物の再環状化を可能にした、すなわち、ベクター全体が所望の変異体を有することになった。
【０１８６】
表８に示すプライマーを用いて、天然グリシン残基（すなわち、Ｇ１７０ＥのＦＧＦ２１変異体ポリペプチド）の代わりに１７０位にグルタミン酸残基を有するＦＧＦ２１変異体をコードする代表的なＦＧＦ２１変異体コンストラクトを調製した。
【０１８７】
【表８】
0005878757.tif 000010
【０１８８】
表６に示すプライマーは、下に示すようなグリシン残基のグルタミン酸残基との置換を可能にし、上の配列はセンスプライマー（配列番号２９）であり、第２および第３の配列（配列番号３０および３１）はＦＧＦ２１発現コンストラクトの一部であり、第４の配列はアンチセンスプライマー（配列番号３２）である。
【０１８９】
【化２】
0005878757.tif 000011
【０１９０】
ＦＧＦ２１変異体コンストラクトは、実質的に実施例１に記載したＰＣＲ条件を用いて調製した。制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで増幅産物を消化し、次いで、コンピテント細胞に形質転換した。得られたクローンの配列決定を行って、ポリメラーゼによるエラーのないことを確認した。
【０１９１】
コンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１  Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）細胞を、特定の変異体をコードするコンストラクトで形質転換することにより、ＦＧＦ２１変異体を発現させた。４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＴＢ培地で、通気量を制限しながら形質転換細胞を一晩成長させ、翌朝通気させて、短時間の回復期間後、０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導から１８〜２０時間後に、遠心分離によってＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを採取した。
【０１９２】
用いた細菌発現系の結果として、Ｎ末端のメチオニン残基を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを発現させた。
【０１９３】
実施例８
細菌からのＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの精製
以下の実施例では、細菌発現系において野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドを発現させた。実施例７に記載される発現後、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを、別途記載のない限り、本実施例に記載するように精製した。
【０１９４】
細菌性封入体からのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを精製するために、２回洗浄した封入体（ＤＷＩＢ）を、グアニジン塩酸塩を含有する可溶化緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液中のＤＴＴ（ｐＨ８．５）中で可溶化し、次いで室温で１時間混合し、可溶化混合物を尿素、アルギニン、システイン、およびシスタミン塩酸塩を含有するリフォールディング緩衝液（ｐＨ９．５）に添加し、次いで５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ，１９９８，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７〜６３；Ｍａｎｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３〜３４；Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，“Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ５７〜９９；およびＩｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１〜６を参照のこと）。
【０１９５】
可溶化およびリフォールディングの後、０．４５マイクロメートルのフィルタを通して混合物を濾過した。次いで、膜間差圧（ＴＭＰ）２０ｐｓｉで分子量カットオフ値５ｋＤのＰａｌｌ社製Ｏｍｅｇａカセットを用いて、リフォールディングしたプールをおよそ１０倍濃縮し、３カラム体積２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いてＴＭＰ２０ｐｓｉで膜分離した。
【０１９６】
次いで、精製サンプルを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を用いて陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィに供した。２０ｍＭのＴｒｉｓ中の０〜２５０ｍＭのＮａＣｌの線形塩勾配をｐＨ８．０、５℃で実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりピーク分画を分析してプールした。
【０１９７】
次いで、ＡＥＸ溶出プールを、フェニルセファロースＨＰ樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）に供した。２０ｍＭのＴＲＩＳを含む０．６Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムの減少する線形勾配を用いて、ｐＨ８．０および周囲温度でタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりピーク分画を分析（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０〜８５）してプールした。
【０１９８】
分子量カットオフ値５ｋＤのＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａ０．２ｍ２カセットを用いて、ＴＭＰ２０ｐｓｉで７ｍｇ／ｍＬまでＨＩＣプールを濃縮した。５カラム体積の２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）をＴＭＰ２０ｐｓｉで用いて濃縮物を膜分離し、回収した濃縮物を約５ｍｇ／ｍＬに希釈した。最後に、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルタを通して溶液を濾過した。
【０１９９】
実施例９
ＦＧＦ２１変異体の化学修飾
表３〜５に示す選択された位置で置換されたシステインを有するＦＧＦ２１の変異体を実施例７に記載するように生成し、次いで、２０ｋＤａメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドを用いてその分子をＰＥＧ化反応に供した。別途記載のない限り、本明細書に開示されるすべてのＰＥＧ化されたＦＧＦ２１野生型および変異体ポリペプチドは、１つ以上の２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミドポリマーを含む。
【０２００】
次いで、部分精製したＦＧＦ２１分子を５モル当量のＴＣＥＰを用いて３０分２５℃で還元した。次いで、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムを用いて、還元したＦＧＦ２１を１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。次いで、緩衝液交換したＦＧＦ２１を、５モル当量の２０ｋＤａメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドで３０分２５℃で反応させた。次いで、得られた反応混合物をイオン交換クロマトグラフィに供して、マルチＰＥＧ化分子および非ＰＥＧ化分子からモノＰＥＧ化種を単離した。ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの大部分がメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドと十分に反応し、主にモノＰＥＧ化産物を高収率で生成した（図２および３）。
【０２０１】
連結分子の生成には、部分精製されたＦＧＦ２１分子を５モル当量のＴＣＥＰを用いて３０分２５℃で還元した。次いで、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムを用いて、還元したＦＧＦ２１を１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。次いで、緩衝液交換したＦＧＦ２１を、０．４５モル当量の２０ｋＤａのＰＥＧビス−マレイミドで６０分４°Ｃで反応させた。次いで、得られた反応混合物をイオン交換クロマトグラフィに供して、他の望ましくない反応産物から連結分子を単離した。追加のイオン交換による精製工程が頻繁に必要とされ、それは、第１のイオン交換プールを約４体積の水で希釈し、再度イオン交換カラムに適用することにより達成した。
【０２０２】
代替として、前述したようにメトキシ−ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドを使用した還元的アルキル化によって、Ｎ末端へのアミン特異的結合を達成した（米国特許第５，８２４，７８４号を参照のこと）。簡単に言うと、約２ｍｇ／ｍｌの変異体ＦＧＦ２１を、酢酸緩衝液中の５倍モル過剰の２０ｋＤのｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒド（ｐＨ５．５）、および１０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムと４℃で一晩反応させた。本明細書に記載されるＦＧＦ２１の野生型分子および変異体分子のＮ末端ＰＥＧ化のいずれもが、このストラテジーを用いて達成することができる。
【０２０３】
Ｎ末端および変異体リジンの両方でアミン特異的二重ＰＥＧ化が必要とされる場合は、メトキシ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を用いた。簡単に言うと、約２ｍｇ／ｍｌの変異体ＦＧＦ２１を、５倍モル過剰（ＰＥＧ：アミノ基）のビシン緩衝液中の２０ｋＤのｍＰＥＧ−ＮＨＳ（ｐＨ７．５）と、４℃で約２時間反応させた。
【０２０４】
ＦＧＦ２１変異体をＮ末端および変異体Ｃｙｓ位置の両方で二重ＰＥＧ化するために混合化学アプローチを適用する場合は、前述したようにメトキシ−ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドおよびメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドの両方を連続的に用いた（米国特許第６，４２０，３３９号を参照のこと）。簡単に言うと、約２ｍｇ／ｍｌの変異体ＦＧＦ２１を、リン酸緩衝液中の１．５倍モル過剰の２０ｋＤのｍＰＥＧ−マレイミド（ｐＨ６．５）と４℃で約２時間反応させ、次いで、ｐＨが約ｐＨ５になるように調節し、５倍過剰の２０ｋＤのｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドを１０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムとともに添加した。最終反応を４℃で一晩継続させた。
【０２０５】
すべての異なる反応混合物の精製は、前述したように、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中の陰イオン交換クロマトグラフィを用いた。
【０２０６】
実施例１０
ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドおよび
化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの生体外活性
次いで、ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの非ＰＥＧ化形態およびＮ末端ＰＥＧ化ＦＧＦ２１と比較して活性を評価するために、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを生体外アッセイに供した。
【０２０７】
これらの実験の１つの目的は、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ生体外アッセイにおいてＦＧＦ２１の活性を保存するＦＧＦ２１変異体ポリペプチドおよび化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを同定することであった。ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイは、２９３Ｔ細胞がβ−ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼ受容体コンストラクトを過剰発現する組換えヒト２９３Ｔ腎細胞系を用いて行った。β−ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２１がそのＦＧＦ受容体の活性化のために必要とする共受容体である。このアッセイに使用されるＦＧＦ受容体は、２９３Ｔ腎細胞で発現される内因性レベルのＦＧＦ受容体である。ルシフェラーゼ受容体コンストラクトは、ＧＡＬ４−ＥＬＫ１をコードする配列と、Ｇａｌ４結合部位のタンデムコピーを５つ含有するプロモーター（５×ＵＡＳ−Ｌｕｃ）によって駆動されるルシフェラーゼ受容体とを含有する。ルシフェラーゼの活性は、リン酸化Ｅｒｋ／ＥＬＫ１のレベルによって調節され、ＦＧＦ２１の活性を間接的に監視および定量化するために用いられる。
【０２０８】
ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイは、異なる濃度の野生型ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの存在下で２９３Ｔ細胞を６時間培養し、次いで、ルシフェラーゼの活性について細胞可溶化物をアッセイすることにより行った。図４〜６および表３〜５は、１つ、２つ、または３つの突然変異を有するポリペプチドを含む、いくつかの代表的なＦＧＦ２１変異体ポリペプチドについて得られた生体外の結果をまとめたものである。
【０２０９】
実施例１０．Ａ
１つの突然変異を含むＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＥＣ５０値
下の表９は、特定の既知の場所に１つの非自然発生ポリマー結合部位を導入する２つの突然変異を含む種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＥＣ５０値をまとめたものである。
【０２１０】
種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製し、その活性を本明細書に記載される生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて判定した。表９は、得られたデータをまとめたものである。
【０２１１】
【表９】
0005878757.tif 000012
表９は、ＰＥＧ化が、本発明の種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのうちのいくつかの生体外活性に与える影響をまとめたものである。
【０２１２】
図４、５、および６は、単一の点突然変異を含むいくつかのＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体について、その結果およびＥＣ５０値を図式化して示す。図４および５は、データを表９に示したＦＧＦ２１変異体のうちのいくつかに関するデータを含む。より具体的には、図４の上のプロットは、ＰＥＧ化Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１、ならびに非ＰＥＧ化ＦＧＦ２１に対して行ったＥＲＫ−ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図４の下のプロットには、ＰＥＧ化Ｇ１１３Ｃ、Ｎ１２１Ｃ、Ｄ４６Ｃ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１、ならびに非ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１についてのデータが示されている。
【０２１３】
図５を参照すると、上のプロットには、Ｈ１２５Ｃ、Ｇ１２０Ｃ、Ｒ１２６Ｃ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１、ならびに非ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１についてのデータが示されている。下のプロットには、Ｄ７９Ｃ、Ｄ３８Ｃ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１、ならびに非ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１についてのデータが示されている。
【０２１４】
続いて図６の上のプロットを見ると、ＰＥＧ化Ｋ６９ＣおよびＤ７９Ｃ変異体、ならびにＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１、そして非ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１についての図式化データが示されている。図６の下のプロットには、ＰＥＧ化Ｒ１７５ＣおよびＹ１７９Ｃ変異体、ならびにＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１、そして非ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１についてのデータが示されている。意外なことに、これらの分子の多くは、非ＰＥＧ化分子の活性に近い生体外活性を有する。
【０２１５】
実施例１０．Ｂ
選択されたＡｒｇ／Ｌｙｓ  ＦＧＦ２１変異体のＥＣ５０値
実施例３に記載したように、突然変異誘発により自然発生ポリマー結合部位（例えば、ＰＥＧ化部位）が除去された一連のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製した。これらのＦＧＦ２１変異体において、最初に反応性Ｌｙｓ基をアルギニンに突然変異させ、Ｎ末端のαアミノ基のみをＰＥＧ化に使用可能とした。次に、天然または変異のいずれかである選択アルギニン残基を１つずつリジンに変換し、そうすることで、ＦＧＦ２１表面上の規定の位置に第２のＰＥＧ化部位を導入した。このストラテジーの１つの目的は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）が１つ以上の特定の既知の場所で共役されるであろうＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製することであった。
【０２１６】
種々のアルギニン／リジンＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製し、その活性を本明細書に記載される生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて判定した。表１０は、得られたデータをまとめたものである。
【０２１７】
【表１０】
0005878757.tif 000013
【０２１８】
実施例１０．Ｃ
２つの突然変異を含む選択されたＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの
ＥＣ５０値
２つの突然変異を含む多くのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性も、本明細書に記載されるＥＲＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて調べた。これらの変異体を、野生型ＦＧＦ２１配列に、２つの非自然発生ポリマー結合部位（システイン残基の形態）と、強化されたタンパク質分解に対する安定性を提供する突然変異（Ｐ１７１Ｇ）とを導入するように遺伝子操作した。
【０２１９】
種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製し、その活性を本明細書に記載される生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて判定した。それらの実験からのＥＣ５０値を下の表１１に示す。
【０２２０】
【表１１】
0005878757.tif 000014
【０２２１】
並行して、実施例１０Ａに由来する単一のシステイン変異体を用いて二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体を調製したが、安定性を強化するＰ１７１Ｇ突然変異も実行した。これらの変異体は、前述したように混合ＰＥＧ化化学を用いてＮ末端および遺伝子操作したシステインの両方で部位選択的にＰＥＧ化した（米国特許第６，４２０，３３９号を参照のこと）。混合ＰＥＧ化化学は、Ｎ末端とシステイン共役部位の区別を可能にするため、異なるポリマーを異なる部位に部位選択的に結合させることも可能である。この場合、一連の共役を調製し、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、および２０ｋＤａのポリマーの組み合わせをＮ末端に結合させ、２０ｋＤａのポリマーを一貫してシステイン変異体に結合させた。これによりＮ末端ＰＥＧ化がＦＧＦ２１の生体外活性に与える影響を評価することができる。これらの共役は、すべて本明細書に記載する生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいてテストした。その結果を表１２に示す。
【０２２２】
【表１２】
0005878757.tif 000015
【０２２３】
実施例１０．Ｄ
３つの突然変異を含む選択された化学修飾ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドのＥＣ５０値
３つの突然変異を含む多くのＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの活性も、本明細書に記載されるＥＲＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて調べた。これらの変異体を、野生型ＦＧＦ２１配列に、２つの非自然発生ポリマー結合部位（システイン残基の形態）と、強化されたタンパク質分解に対する安定性を提供する突然変異（Ｐ１７１Ｇ）とを導入するように遺伝子操作した。
【０２２４】
種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製し、その活性を本明細書に記載される生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて判定した。表１３は、得られたデータをまとめたものである。
【０２２５】
【表１３】
0005878757.tif 000016
【０２２６】
意外なことに、このデータは、これらの二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの大半が、Ｎ末端モノＰＥＧ化分子を超える活性を有することを示している。
【０２２７】
実施例１１
選択されたＦＧＦ２１の連結分子のＥＣ５０値
本発明の連結分子は、リンカー分子によって一緒に連結された２つのＦＧＦ２１ポリペプチド配列を含む。図７は、連結分子の例を図式化して示す。本明細書に記載するように、これらの連結分子は、望ましいレベルの生物学的活性を保持する一方で、より長い半減期を提供するであろうと予想された。
【０２２８】
種々の連結分子を作製し、その活性を本明細書に記載される生体外ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて判定した。作製した連結分子は、突然変異がリンカー結合部位を導入するＦＧＦ２１変異体を含む。ＦＧＦ２１変異体のうちのいくつかは二重変異体であり、タンパク質分解に対する安定性を強化するためのＰ１７１Ｇ突然変異を含む。この生体外試験のための条件および手順は、実施例１０に記載するものと同じであった。表１４は、得られたデータをまとめたものである。
【０２２９】
【表１４】
0005878757.tif 000017
表１４のデータから、連結分子は、非ＰＥＧ化分子の活性と等しいかまたはそれを超える驚くほど高い生体外活性（参考までに、０．６３であることが分かった）を保持することが見て取れる。
【０２３０】
実施例１２
化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの生体内活性
ＦＧＦ２１は、血糖値、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルの低下、体重の減少、または耐糖能、エネルギー消費量、もしくはインスリン感受性の向上を含む、多くの生物学的活性を保持する。実施例１０に記載した最初の生体外評価の後、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを生体内でのＦＧＦ２１の活性についてさらに分析した。ＰＥＧ化ＦＧＦ２１ポリペプチドをインスリン耐性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定のＰＥＧ化ＦＧＦ２１ポリペプチドが血糖値を低下させる能力を測定した。生体内研究のための手順は以下の通りである。
【０２３１】
テストしようとするＰＥＧ化ＦＧＦ２１ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の腹腔内に注射し、単回投与後の種々の時点（例えば、投与後０、６、２４、７２、１２０、および１６８時間）で血液サンプルを採取した。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．社製、Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）で血糖値レベルを測定し、血糖値のベースラインレベル（すなわち、０時間）と比較した血糖値の変化率として結果を表した。
【０２３２】
本明細書に記載されるようにＦＧＦ２１変異体を作製し、典型的にはシステイン残基である導入されたポリマー結合部位の各々に１つずつ、２つの２０ｋＤａメトキシＰＥＧマレイミド分子を付加することによって化学修飾した。突然変異は、２つのＰＥＧ分子に別個の既知の結合点を提供するように選択した。本明細書に記載される方法を用いてＦＧＦ２１変異体のＰＥＧ化を達成した。
【０２３３】
実施例１２．Ａ
Ｎ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１の生体内活性
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて、ポリペプチドのＮ末端ＰＥＧ化により化学修飾した野生型ＦＧＦ２１を調べた。同じ実験で非ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１についても調べ、ＰＢＳを対照として用いた。単一の２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いて野生型ＦＧＦ２１をＮ末端でＰＥＧ化した。図８は、この実験の結果を示す。
【０２３４】
天然の野生型ＦＧＦ２１およびＮ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１の両方が、単回投与後に血糖値レベルを３０〜４０％低減させた。しかしながら、天然の野生型ＦＧＦ２１の投与後２４時間で、血糖値レベルはベースラインに戻った。それに対して、Ｎ末端ＰＥＧ化野生型ＦＧＦ２１は、血糖値を低下させる活性を少なくとも７２時間維持した。この試験の結果は、野生型ＦＧＦ２１のＰＥＧ化が、天然分子の薬力学的効果を延長することを示唆するものである。
【０２３５】
図９を参照すると、２０、３０、または４０ｋＤａのＰＥＧ分子によりＮ末端でＰＥＧ化された野生型ＦＧＦ２１を用いて、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて用量応答試験を行った。図９は、２０ｋＤａのＰＥＧ分子と比較して、３０および４０ｋＤａのＰＥＧ分子は、より高く、長い間グルコースを低下させる有効性を有することを示しており、ＰＥＧのサイズが生体内における薬力学的効果と確実に関連していることを暗示している。
【０２３６】
実施例１２．Ａ．１
Ｎ末端および導入されたポリマー結合部位の両方で共役された、
選択された化学修飾ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの生体内活性
Ｎ末端および第２の遺伝子操作部位の両方で部位選択的にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１のいくつかの化学修飾した変異体をマウスｏｂ／ｏｂモデルにおいて調べた。これらの二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１コンストラクトはすべて、Ｎ末端と、実施例４に記載したような遺伝子操作したリジンまたは実施例６に記載したような遺伝子操作したシステインのいずれかを含む第２の部位とでＰＥＧ化した。
【０２３７】
異なるグループのＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを用いて同様の実験を行った。図１０は、ビヒクル（ＰＢＳ）、またはポリマー結合突然変異、すなわち、Ｎ末端でもＰＥＧ化されたＦＧＦ２１  Ｒ７７ＣおよびＮ末端でもＰＥＧ化されたＦＧＦ２１  Ｒ１２６Ｋ（上のプロット）、ならびに導入されたポリマー結合部位でもＰＥＧ化されたＮ末端ＰＥＧ化Ｆ７７／Ｐ１７１Ｇ（下のプロット）を含む、ＦＧＦ２１変異体のＰＥＧ化形態を注射したマウスの血糖値レベルにおける変化率を示す２つのプロットを含む。２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いた。この実験の結果は、二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体が、少なくとも１２０時間の持続的なグルコース低下を示し、野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して強化された薬動力学を示すことを再度確認するものであった。
【０２３８】
実施例１２．Ｂ
２つまたは３つの突然変異を含む、
選択された化学修飾ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの生体内活性
マウスｏｂ／ｏｂモデルにおいて、多くの化学修飾されたＦＧＦ２１変異体ポリペプチドについて調べた。これらの変異体は、導入されたシステイン残基の各々に１つずつ、また、単一の突然変異を含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドの場合は、ポリペプチドのＮ末端に、２つの２０ｋＤａメトキシＰＥＧマレイミド分子を付加することによって化学修飾した。突然変異は、１つ以上のＰＥＧ分子に別個の既知の結合点を提供するように選択した。いくつかのＦＧＦ２１変異体も、タンパク質分解耐性を強化するためにＰ１７１Ｇ突然変異を含んだ。ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドをマウスに注射し、９日間にわたる試験の間に間隔を空けてマウスから採血した。
【０２３９】
実施例１２．Ｂ．１
グルコースレベルに及ぼす影響
さらに別のグループのＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを用いて実験を行った。図１１は、ビヒクル（ＰＢＳ）か、または突然変異（すなわち、Ｅ９１／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｇ１２０Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｒ１７５Ｃ）を含むＦＧＦ２１変異体の二重ＰＥＧ化形態を注射したマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである（非ＰＥＧ化Ｆｃ−Ｇ１７０Ｅ  ＦＧＦ２１についても調べた）。２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いた。この実験の結果は、二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体が、野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して強化された薬動力学を示すことを再度確認するものであった。
【０２４０】
さらに別のグループのＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを用いて同様の実験を行った。図１２は、ビヒクル（ＰＢＳ）か、または突然変異（すなわち、導入された重合部位でもＰＥＧ化されたＮ末端ＰＥＧ化Ｒ７７Ｃ、導入された重合部位でもＰＥＧ化されたＮ末端ＰＥＧ化Ｒ１２６Ｋ、Ｅ９１／Ｇ１２０Ｃ、Ｇ１２０Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、およびＥ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ）を含むＦＧＦ２１変異体の二重ＰＥＧ化形態を注射したマウスの血糖値レベルにおける変化率を示すプロットである（非ＰＥＧ化Ｆｃ−Ｇ１７０Ｅ  ＦＧＦ２１についても調べた）。２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いた。この実験の結果は、二重にＰＥＧ化されたＦＧＦ２１変異体が、野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して強化された薬動力学を示すことを確認するものであった。
【０２４１】
別の実験において、図１３は、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体が、９日間の試験の間にマウスの血糖値レベルに与える影響を示す。このデータは、天然分子の生体内強度と比較して、ＰＥＧ化分子が強化された生体内強度を有することを示す。図１３では、導入されたポリマー結合部位で二重にＰＥＧ化されたＰＥＧ化Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、およびＥ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇ  ＦＧＦ２１変異体を用いて結果を得た。この試験では、２つの２０ｋＤａメトキシＰＥＧマレイミド分子でＦＧＦ２１変異体を修飾し、使用したビヒクルは１０ｍＭリン酸カリウム、５％ソルビトール（ｐＨ８）であった。
【０２４２】
図１３に示すように、３つの二重変異体の二重ＰＥＧ化分子Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃが血糖値レベルを低下させ、その効果は単回投与後７２時間維持された。興味深いことに、Ｐ１７１Ｇ突然変異を導入することにより生体内作用がさらに延長され、最大グルコース低下活性がさらに２日間維持され、合計作用期間は１２０時間であった。
【０２４３】
また、３つの突然変異を含むいくつかのＦＧＦ２１ポリペプチドのグルコース低下能力を、いくつかの連結分子を用いて調べた。使用した３つの変異体は、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＥ９１Ｃ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇであり、連結分子は、２つの突然変異（すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｐ１７１ＧおよびＲ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ）を含む２つの同一のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含んでいた。ＦＧＦ２１の二重ＰＥＧ化形態、および連結分子のリンカー分子には、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いた。この実験の結果を図１４に示す。連結されたＦＧＦ２１変異体と比較して、二重ＰＥＧ化変異体はさらに強化された薬力学を有する。二重ＰＥＧ化変異体のグルコース低下活性は、連結されたＦＧＦ２１変異体の１２０時間と比較して、少なくとも１６８時間継続した。
【０２４４】
図１５は、ビヒクル（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）または異なる用量の二重にＰＥＧ化されたＥ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ  ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを９日間にわたって注射したｏｂ／ｏｂマウスの血統値における変化率を用量の関数として示すプロットである。この実験の結果は、二重にＰＥＧ化した３つの変異体Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇが、用量依存的な様式でｏｂ／ｏｂマウスの血糖値レベルを低下させたことを示した。０．３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、ほぼ最大グルコース低下活性に到達し、その効果は少なくとも５日間維持された。用量レベルを１ｍｇ／ｋｇに増加した時には、さらに強化された生体内強度および作用期間が観察された。
【０２４５】
実施例１２．Ｂ．２
体重に及ぼす影響
２型糖尿病は、体脂肪および体重の増加を伴うことが多い。したがって、治療分子は、体重を減少させる望ましい効果とともに、血糖値レベルを低下させる望ましい効果も有することが好ましい。したがって、本明細書に記載されるＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体の多くをマウスの体重に与える影響について評価した。
【０２４６】
種々のＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが体重に与える影響を調べるために、ＰＥＧ化野生型およびＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の腹腔内に注射し、単回投与後の種々の時点（例えば、投与後０、２４、７２、１２０、および１６８時間）に体重を監視した。
【０２４７】
図１６は、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体が試験期間中にマウスの体重に与える影響を示す。二重にＰＥＧ化されたＥ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、Ｅ９１Ｃ／Ｒ１７５Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、およびＥ３７Ｃ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１ＧＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを用いて結果を得た。この試験では、２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いてＦＧＦ２１変異体を修飾した。これらのＦＧＦ２１変異体のグルコースレベルにおける変化に関しても調べ、その結果を図１３に示す。総合すると、このデータは、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体を投与されたマウスは、ビヒクル対照と比較して体重増加が少なく、タンパク質分解耐性である突然変異Ｐ１７１Ｇを含むＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、Ｐ１７１野生型ポリペプチドより効果的であることを示している。
【０２４８】
図１７は、ビヒクル、または突然変異（すなわち、Ｅ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、Ｅ９１Ｃ／Ｈ１２５Ｃ／Ｐ１７１Ｇ、Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ）を含むＦＧＦ２１変異体の二重ＰＥＧ化形態、および、１つの例には２つのＥ３７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ  ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含み、別の例には２つのＲ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇ  ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを含む、連結分子を注射したマウスの体重における変化を示すプロットである。ＦＧＦ２１のＰＥＧ化形態には２０ｋＤａのメトキシＰＥＧマレイミド分子を用い、連結分子には２０ｋＤａのＰＥＧビス−マレイミドを用いた。これらのＦＧＦ２１変異体のグルコースレベルにおける変化に関しても調べ、その結果を図１４に示す。総合すると、このデータは、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体を投与されたマウスは、ビヒクル対照と比較して体重増加が少ないことを示している。また、二重にＰＥＧ化したＦＧＦ２１変異体ポリペプチドは、調べた連結分子よりも、より効果的に体重を減少させることが観察された。
【０２４９】
また、二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体ポリペプチドが体重に与える影響について、反復投与試験において検討した。図１８は、ビヒクルまたは異なる用量の二重にＰＥＧ化されたＥ３７Ｃ／Ｒ７７Ｃ／Ｐ１７１Ｇを９日間にわたって注射したｏｂ／ｏｂマウスの体重における変化を用量の関数として示すプロットである。このＦＧＦ２１変異体のグルコースレベルにおける変化に関しても調べ、その結果を図１５に示す。総合すると、このデータは、０．３ｍｇ／ｋｇの用量レベルが、単回投与後のｏｂ／ｏｂマウスの体重増加を減少させるのに十分であることを示している。
【０２５０】
実施例１３
マウス腎臓空胞試験
治療タンパク質の半減期を延長するためにＰＥＧおよび他のポリマーを用いる際に考慮するべき１つの点は、ＰＥＧ化分子が腎臓に空胞を形成する可能性である。ＰＥＧのこの特性は十分に裏付けされており（例えば、Ｂｅｎｄｅｌｅ，ｅｔ  ａｌ  １９９８，“Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：Ｒｅｎａｌ  Ｔｕｂｕｌａｒ  Ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ‐ｇｌｙｃｏｌ‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４２：１５２〜１５７およびＣｏｎｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，“Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｖａｃｕｏｌｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａ  Ｂｏｌｕｓ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧ‐ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ，”Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓ．，ａｎｄ  Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：５９９〜６１１を参照のこと）、予測不可能なことがある。腎臓の空胞形成を誘発するＰＥＧ化分子は、典型的には、必ずではないが、分子を治療タンパク質としてあまり望ましくない状態にする。いくつかの状況において、腎臓の空胞形成はそれほど懸念されるものではなく、許容されてもよい。したがって、マウスにおいて長期の腎臓空胞試験を行った。
【０２５１】
本明細書に記載されるようにＦＧＦ２１変異体ポリペプチドを作製した。１つの試験を以下のように設計して実行した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（３匹／グループ）に、複数のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子を１０ｍｇ／ｋｇの用量で７日間連続的に皮下注射によって投与し、ビヒクル対照（１０ｍＭ  ＫＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）および２つの陽性対照も同様の様式で投与した。第１日目、第３日目、および第６日目に、各用量投与の前と投与後１〜２時間に、すべての動物に対して詳細な臨床的観察を行い、他のすべての投与日には、投与後１〜２時間にケージの外から観察を行った。各用量投与の前および剖検時に体重を測定した。組織学的評価のために腎臓および肝臓をすべての動物から回収した。表１５は、試験の結果をまとめたものである。
【０２５２】
【表１５】
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表１５は、ビヒクル（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）、ＦＧＦ２１のＮ末端ＰＥＧ化形態、および突然変異Ｈ１２５Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｋ６９Ｃ、Ｇ１２０Ｃ、Ｅ３７Ｃ、Ｒ１７５、Ｅ９１Ｃ、Ｎ１２１Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｇ１１３Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｄ４６Ｃ、およびＨ１１２Ｃを含むＦＧＦ２１変異体のＰＥＧ化形態を用いた、７日間にわたるマウス腎臓空胞試験の結果を示す。表中に示すように、１つまたは２つの２０ｋＤａメトキシＰＥＧマレイミド分子を用いた。空胞指数の範囲は、対照と比較して空胞における変化が観察されなかった場合を０とし、重度の空胞形成を４とした。表１５から明らかであるように、モノＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体のすべてが腎臓空胞の形成を誘発した。しかしながら、二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体は、１つも空胞形成を誘発しなかった。また、マウスの肝臓には空胞形成が観察されなかったことも分かった。
【０２５３】
１週間の試験後、８週間にわたる長期試験を開始した。この試験では、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（５／グループ）に、種々のＰＥＧ化ＦＧＦ２１分子を５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で８週間にわたり週に１回皮下注射によって投与し、ビヒクル対照（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）も同様の様式で投与した。投与前には１日１回、投与日には投与後１〜２時間に、投与のない日には１日１回、すべての動物の臨床症状について観察した。第１日目に開始して、３日目の各投与後、および剖検時に、各用量投与の前に体重を測定した。組織学的評価のために腎臓、肝臓、および脾臓をすべての動物から回収した（瀕死期屠殺および最終安楽死）。
【０２５４】
図１９Ａ〜１９Ｆは、ビヒクル（四角）および２つの用量の二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体、すなわち、５ｍｇ／ｋｇ（三角）および２５ｍｇ／ｋｇ（白丸）を用いた８週間の腎臓空胞試験の間に観察された体重変化の結果を示す一連のプロットである。調べたＦＧＦ２１変異体は、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ（図１９Ａ）；Ｅ３７Ｃ、Ｒ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ（図１９Ｂ）；Ｅ３７Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、Ｐ１７１Ｇ（図１９Ｃ）；Ｅ９１Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、Ｐ１７１Ｇ（図１９Ｄ）；Ｅ３７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ（図１９Ｅ）およびＲ７７Ｃ、Ｐ１７１Ｇ（図１９Ｆ）を含む。図１９Ａでは、混合化学アプローチを用いて、ＦＧＦ２１変異体のＮ末端ＰＥＧ化、および導入されたポリマー結合部位である７７位の非自然発生システインでのＰＥＧ化をもたらした。図１９Ｂ〜１９Ｄでは、単一の化学アプローチを用いて、導入されたポリマー結合部位である非自然発生システイン残基（図１９Ｂの３７位および７７位、図１９Ｃの３７位および１２５位、図１９Ｄの９１位および１２５位のシステイン）でのＰＥＧ化をもたらした。最後に、図１９Ｄおよび１９Ｅにおいて、単一のビスマレイミドＰＥＧを用いて、２つのＦＧＦ２１変異体を非自然発生システイン残基で結合させた（図２１Ｅの３７位および図１９Ｆの７７位のシステイン）。
【０２５５】
図２０は、６つの単一ＰＥＧ化もしくは二重ＰＥＧ化ＦＧＦ２１変異体の５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇの２つ用量について、８週間の腎臓空胞試験の間に観察された腎臓空胞の平均スコアを示す２つの棒グラフを含む。スコア０は、対照動物に見られた空胞より多くの空胞は観察されなかったことを意味し、一方、スコア４は、対照と比較して重度の空胞形成があったことを意味する。ＦＧＦ２１変異体は、図１９Ａ〜１９Ｅに記載されるものと同じであった。したがって、一方のコンストラクトには混合化学アプローチを用いて、ＦＧＦ２１変異体のＮ末端ＰＥＧ化、および導入されたポリマー結合部位である７７位の非自然発生システインでのＰＥＧ化をもたらした。他方の３つのコンストラクトには単一化学アプローチを用いて、導入されたポリマー結合部位である非自然発生システイン残基（１つのコンストラクトの３７位および７７位、第２のコンストラクトの３７位および１２５位、または第３のコンストラクトの９１位および１２５位のシステイン）でのＰＥＧ化をもたらした。最後に、単一のビスマレイミドＰＥＧを用いて２つのＦＧＦ２１変異体を非自然発生システイン残基（３７位または７７位のシステイン）で結合させた。Ｐ１７１Ｇ突然変異を６つのコンストラクトの各々に導入した。
【０２５６】
本発明を種々の実施形態に関して説明してきたが、当業者には変形例および修正例が想定されることを理解されたい。したがって、付属の特許請求の範囲は、請求するように本発明の範囲内に含まれるそのような全ての均等な変形例を網羅することが意図される。また、本明細書で用いた項目の見出しは、構成のために使用されているのであって、記載される主題を制限すると見なされるべきではない。
【０２５７】
この開示に挙げたすべての参考文献は、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０】
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【配列表】
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