(57)【要約】  本発明は、生体試料から核酸を精製することなく、当該生体試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出又は定量することができる、新規の核酸検出用又は定量用試薬キット及び検出又は定量方法の提供を目的とする。  本発明は、標的核酸の検出又は定量用試薬キットであって、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを含む、前記試薬キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の検出又は定量用試薬キットであって、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを含む、前記試薬キット。
【請求項２】
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを含む、請求項１に記載の試薬キット。
【請求項３】
標的核酸が、尿、唾液、羊水、母乳、血清及び血漿からなる群から選ばれる少なくとも一つの生体試料に含まれるものである、請求項１又は２に記載の試薬キット。
【請求項４】
標的核酸が微生物由来のDNA又はRNAである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項５】
微生物がウイルス又は細菌である、請求項４に記載の試薬キット。
【請求項６】
ウイルスがヘルペスウイルスである、請求項５に記載の試薬キット。
【請求項７】
ウイルス感染又は細菌感染の診断に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項８】
標的核酸を検出又は定量する方法であって、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、被験試料と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを混合し、当該混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する方法。
【請求項９】
下記の工程を含む、標的核酸を検出又は定量する方法。
(a) エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに
(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程
【請求項１０】
下記の工程を含む、ウイルス感染又は細菌感染を検出する方法。
(a) エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、ウイルス又は細菌由来の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに
(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出又は定量方法及び検出又は定量用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、血液等の生体試料に含まれる核酸を検出する方法として、PCR（polymerase chain reaction）などの核酸増幅反応を利用する方法が知られている。そして、この方法を利用する場合、核酸増幅反応の前処理として、生体試料から核酸を単離又は精製する方法が一般に用いられている。
他方、核酸の単離や精製などの前処理を行うことなく、生体試料を核酸増幅反応に直接用いる方法も開発されている。このような方法としては、例えば、両性イオン性緩衝液及び／又は非還元性炭水化物を含む反応混合物を利用する方法（特許文献１）、PCR反応液のpHを特定の範囲にすることを特徴とする方法（特許文献２）、加温処理又は糖分解酵素による処理を行うことを特徴とする方法（特許文献３）、反応混合液中の正の一価イオン及び二価イオンの濃度を特定の範囲にすることを特徴とする方法（特許文献４）などが知られている。
しかしながら、研究や臨床においては、生体試料に含まれる標的核酸をより迅速かつ高精度に検出することが必要とされており、新たな検出用試薬及び検出方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５３１０３９号公報
【特許文献２】特開平９−２３８６８７号公報
【特許文献３】特開平１０−８０２８０号公報
【特許文献４】特開平６−２７７０６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、被験試料から核酸を精製することなく、当該被験試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出又は定量することができる、新規の核酸検出用又は定量用試薬キット及び検出又は定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）又は1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）と標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドと被験試料とを混合し、当該混合液を核酸増幅反応に用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、被験試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出又は定量することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）標的核酸の検出又は定量用試薬キットであって、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを含む、前記試薬キット。
（２）エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを含む、上記（１）に記載の試薬キット。
（３）標的核酸が、尿、唾液、羊水、母乳、血清及び血漿からなる群から選ばれる少なくとも一つの生体試料に含まれるものである、上記（１）又は（２）に記載の試薬キット。
（４）標的核酸が微生物由来のDNA又はRNAである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の試薬キット。
（５）微生物がウイルス又は細菌である、上記（４）に記載の試薬キット。
（６）ウイルスがヘルペスウイルスである、上記（５）に記載の試薬キット。
（７）ウイルス感染又は細菌感染の診断に使用するための、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の試薬キット。
（８）標的核酸を検出又は定量する方法であって、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、被験試料と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを混合し、当該混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する方法。
（９）下記の工程を含む、標的核酸を検出又は定量する方法。
(a) エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに
(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程
（１０）下記の工程を含む、ウイルス感染又は細菌感染を検出する方法。
(a) エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、ウイルス又は細菌由来の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに
(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、被験試料から核酸を精製することなく、当該被験試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出又は定量することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2012年3月29日に出願された日本国特許出願（特願2012-077174号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【０００８】
１．概要
本発明は、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、これらの誘導体又はこれらの塩と標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドと被験試料とを混合し、当該混合物を用いて核酸増幅反応を行い、当該被験試料に含まれる標的核酸を検出又は定量する方法、及び当該方法に使用することができる試薬キットに関するものである。
一般に、生体試料は核酸増幅反応を阻害する物質や性質を有するため、生体試料に含まれる標的核酸を核酸増幅反応により増幅して検出又は定量しようとする場合、生体試料に含まれる核酸を精製する方法が採用されている。
他方、生体試料から核酸を精製することなく、生体試料に含まれる標的核酸を核酸増幅反応により増幅して検出又は定量しようとする場合、生体試料中の核酸増幅反応を阻害する因子を何らかの方法で抑制する必要がある。
しかしながら、生体試料には核酸増幅反応を阻害する因子（夾雑物、物性等）が多数存在し、これらの因子が複雑に関与して核酸増幅反応を阻害するため、ある因子を抑制したからといって必ずしも核酸増幅反応の阻害を排除できるとは限らず、どの因子に対してどのように対処すれば核酸増幅反応が正常に進行するかを予測することは容易でない。また、生体試料中の核酸増幅反応の阻害因子を抑制する操作については、簡便性が求められる。
そこで、この点について本発明者が鋭意研究を行ったところ、本発明者は、生体試料とEGTA、BAPTA、これらの誘導体又はその塩とを混合し、当該混合物を核酸増幅反応に用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、被験試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出又は定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを含む、標的核酸の検出又は定量用試薬キットを提供する。
更に、本発明は、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを含む、標的核酸の検出又は定量用試薬キットを提供する。
また、本発明は、標的核酸を検出又は定量する方法であって、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、被験試料と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを混合し、当該混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する方法を提供する。
また、本発明は、標的核酸を検出又は定量する方法であって、(a) EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程を含む、前記方法を提供する。
本発明の試薬キット及び検出又は定量方法により、被験試料から核酸を精製することなく、当該被験試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出又は定量することができる。
【００１０】
２．標的核酸
本発明において、「標的核酸」とは、増幅又は検出若しくは定量の対象となる核酸をいい、「標的核酸配列」とは、標的核酸の塩基配列をいう。標的核酸は、検出又は定量の目的に応じて適宜選択することができるが、微生物由来のDNA又はRNAであることが好ましい。DNAには、全DNA、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAが含まれる。RNAには、mRNA、rRNA、ゲノムRNA及び合成RNAが含まれる。
本発明において、標的核酸が由来する微生物は、核酸ゲノムを有するものであれば限定されるものではないが、病原性を有する微生物が好ましい。本発明において、微生物としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌、酵母、粘菌などが挙げられるが、ウイルス又は細菌が好ましい。
本発明において、ウイルスには、DNAをゲノムとして有するDNAウイルス及びRNAをゲノムとして有するRNAウイルスが含まれるが、DNAウイルスが好ましい。DNAウイルスには、二本鎖DNAウイルス及び一本鎖DNAウイルスが挙げられるが、好ましくは二本鎖ウイルスである。二本鎖DNAウイルスとしては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスなどが挙げられるが、ヘルペスウイルスが好ましい。
【００１１】
ヘルペスウイルスは、動物を宿主とするウイルスであり、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類などから多数発見されている。本発明の対象とする標的核酸が由来するヘルペスウイルスとしては、ヒトを宿主とするヘルペスウイルス（ヒトヘルペスウイルス）が好ましい。ヒトヘルペスウイルスとしては、限定されるものではないが、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）、単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）、水痘帯状疱疹ウイルス（VSV）、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）、ヒトヘルペスウイルス7（HHV-7）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV、HHV-8）が挙げられるが、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）が好ましい。
【００１２】
ヒトヘルペスウイルスは、それぞれ様々な疾患の要因となっている。HCMVは、HCMV感染症、間質性肺炎、CMV網膜症、CMV単核球症、先天性巨細胞封入体症に関与し、HSV-1は、口唇ヘルペス、性器ヘルペス、カポジ水痘様発疹症、ヘルペス脳炎、角膜ヘルペス、ベル麻痺などに関与する。また、HSV-2は、性器ヘルペス、新生児ヘルペス、脊髄炎、無菌性髄膜炎、急性網膜壊死に関与し、VSVは、水痘、帯状疱疹、ラムゼー・ハント症候群に関与する。また、EBVは、伝染性単核球症、慢性活動性EBV感染症、上咽頭癌、バーキットリンパ腫、EBV関連胃癌に関与し、HHV-6は、突発性発疹症、脳炎・脳症に関与する。さらに、HHV-7は、突発性発疹症に関与し、HHV-8は、カポジ肉腫（エイズ関連型、古典型、アフリカ型）、キャッスルマン病、悪性Bリンパ腫に関与する。
【００１３】
一本鎖DNAウイルスとしては、例えば、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルス等）が挙げられる。また、RNAウイルスには、二本鎖RNAウイルス及び一本鎖RNAウイルスが含まれる。一本鎖RNAウイルスとしては、レトロウイルス（RNA腫瘍ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなど）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルスなど）、パラミクソウイルス（センダイウイルス、ムンプスウイルス、はしかウイルスなど）、オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサウイルスなど）、コロナウイルス（SARS（Severe Acute Respiratory Syndrome）ウイルスなど）、ノロウイルスなどが挙げられる。
【００１４】
ウイルス由来の標的核酸としては、ウイルス由来のDNA又はRNAの任意の領域を選択することができるが、例えば、遺伝子変異の少ない保存領域のDNA又はRNAを標的核酸として選択することができる。ヒトサイトメガロウイルスにおいては、例えば、糖タンパク質B遺伝子（配列番号１）、糖タンパク質H遺伝子（配列番号２）、マトリクスリン酸化タンパク質pp65遺伝子（配列番号３）などの塩基配列を含むDNAを標的核酸として選択することができる。これらの遺伝子情報は、公知の遺伝子情報データベース（例えば、European Bioinformatics Institute（EBI）のENA等）から入手することができる。
【００１５】
本発明において、細菌には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）等のブドウ球菌属細菌、ストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）等のバチラス属細菌、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）等のマイコバクテリウム属細菌、マイコプラズマ属細菌、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリヌム）、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス）等のクロストリジウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）等のシトロバクター属細菌、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）等のクラミジア属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、コレラ菌（Vibrio cholerae）等のビブリオ属細菌、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）等のヘモフィルス属細菌、サルモネラ属細菌、プロテウス（Proteus）属細菌、シュードモナス属細菌、淋菌等が挙げられる。
【００１６】
本発明においては、細菌由来のDNAにおいて任意の領域を標的核酸として選択することができるが、例えば、疾患を引き起こす原因となる遺伝子（病原遺伝子）を含む領域のDNAを標的核酸として選択することができる。このような病原遺伝子としては、例えば、リステリア属細菌のリステリオリシンO（hlyA）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン（enterotoxin）遺伝子やinvasion（invA）遺伝子、病原性大腸菌O-157のベロ毒素遺伝子、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
【００１７】
微生物由来の標的核酸は、当業者であれば、公知の遺伝子情報及び遺伝子データベース（例えばNCBIのGenBank等）に基づき、微生物由来のDNA又はRNAの任意の領域を選択し、当該領域を増幅できるプライマーを用いて、核酸増幅反応により増幅することができる。増幅する核酸配列は、標的核酸配列の全長又は一部のいずれでもよい。
ヒトサイトメガロウイルスの場合、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質H遺伝子の塩基配列を含むDNAを標的核酸として選択し、当該標的核酸の全部又は一部を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、当該標的核酸を核酸増幅反応により増幅し、検出又は定量することができる（Eiko Fukushima, et al., Journal of Virological Methods 151 (2008) 55-60）。当業者であれば、その他の微生物由来の標的核酸についても、同様の手法を用いて検出又は定量することが可能である。
【００１８】
検出又は定量の対象となる標的核酸の塩基配列は、例えば二本鎖核酸であればセンス側の塩基配列であってもアンチセンス側の塩基配列であってもよい。例えば、アンチセンス側の核酸配列を検出又は定量することによってその相補的であるセンス側の核酸配列を検出又は定量することができる。
【００１９】
本発明において、「被験試料」とは、標的核酸の存在の有無又は量を検査する対象となる試料をいい、標的核酸は、被験試料に含まれるものが挙げられる。被験試料は、生体試料、食品、医薬品、天然由来の水等の試料（以下「生体試料等」という）そのものであってもよいし、これを希釈又は濃縮したものであってもよい。すなわち、被験試料としては、生体試料等を含むものを使用できる。また、被験試料は、生体試料等の試料のほか、他の成分、微生物、溶媒などを含むものであってもよい。なお、被験試料が生体試料を含む場合、「被験試料に含まれる標的核酸」と「生体試料に含まれる標的核酸」とは同じ意味を表す。
【００２０】
本発明において、生体試料は、生体に由来する試料をいい、例えば、体液試料、粘膜（口腔粘膜、胃粘膜、気道粘膜）及びその細胞、糞、皮膚、その他の細胞（培養細胞を含む）、各組織の一部などが挙げられるが、好ましくは体液試料である。体液試料は、生体由来の体液を含む試料をいい、例えば、尿、唾液、羊水、母乳、血液（全血、血清、血漿）、髄液、滑液、腹水、胸水、耳漏、鼻汁、膿、胆汁、喀痰、汗、その他細胞又は組織の粉砕液などが挙げられる。体液試料としては、尿、唾液、羊水、母乳、血清及び血漿からなる群から選択されるものが好ましく、尿、唾液、羊水及び母乳からなる群から選択されるものがより好ましい。体液試料は、細胞を含有するものであってもよい。本発明において、生体としては、動物個体、動物組織、動物細胞（培養細胞を含む）などが含まれる。動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、ブタ、アカゲザル、コモンマーモセット、ニワトリなどが挙げられるが、好ましくはヒト、マウス、ラットであり、より好ましくはヒトである。
また、ヒト由来の生体試料の場合、対象となるヒトの年齢（月齢、日齢を含む）は限定されるものではなく、検出の目的に応じて胎児期から120歳までの範囲で適宜選択することができ、例えば、先天性サイトメガロウイルス感染症を診断又は検出する場合には胎児期から生後21日以内が好ましく、後天性サイトメガロウイルス感染症を診断又は検出する場合には生後1ヶ月から12歳が好ましく、免疫不全のヒトにおけるサイトメガロウイルス感染を検出又は診断する場合には、年齢を問わず継続的に検出することが好ましい。
【００２１】
本発明において、生体試料は、標的核酸の精製がされていない生体試料が好ましい。但し、本発明の生体試料には、標的核酸の精製以外の処理、例えば、加熱、冷却、遠心分離、酵素処理（糖分解酵素、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素等の酵素による処理）等で処理された生体試料を使用してもよい。また、生体試料中に細胞又は細菌が含まれる場合には、当該細胞又は細菌を破壊するために界面活性剤で処理することも可能である。これにより、例えば、血液中に含まれる細胞の細胞膜、細菌の細菌膜などを破壊することが可能である。
【００２２】
３．標的核酸の検出又は定量用試薬キット
本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬キットは、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩（以下「本発明の化合物等」ともいう）と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを含むものである。
本発明は、本発明の化合物等と前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを一つの試薬に含むものであってもよいし、それぞれ別の試薬に含むものであってもよい。すなわち、本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬キットは、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを含むものであってもよい。
本明細書においては、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む試薬を「第一の試薬」と称することがあり、また、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む試薬を「第二の試薬」と称することもある。さらに、本明細書においては、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩、並びに標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む試薬を「測定試薬」と称することがある。
【００２３】
（１）化合物
本発明に使用される化合物は、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N, N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるものである。これらの化合物は、その化学構造がエーテル結合及び４個のカルボキシル基を有する点で共通する。
EGTAは、下記の化学式で示される化合物であり、二価および三価の金属イオンと反応し錯体を形成する。
【化１】
2013147043.tif 000002
EGTAの誘導体は、エーテル結合及び４個のカルボキシル基を含む構造を有する化合物であり、EGTAの化学構造の一部の構造（例えば置換基）が別の構造に置換されているものをいう。エーテル結合の数は1〜3個であることが好ましい。このような誘導体としては、例えば8-アミノ-2-[(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)メチル]-6-メトキシキノリン-N,N,N',N'-四酢酸が挙げられる。
【００２４】
BAPTAは、下記の化学式で示される化合物であり、二価の金属イオンと反応し錯体を形成する。
【化２】
2013147043.tif 000003
【００２５】
BAPTAの誘導体としては、エーテル結合及び４個のカルボキシル基を含む構造を有する化合物であり、BAPTAの化学構造の一部の構造（例えば置換基）が別の構造に置換されているものをいう。エーテル結合の数は1〜3個であることが好ましい。このような誘導体としては、例えば、O，O'‐ビス（2‐アミノフェニル）エチレングリコール‐N，N，N'，N'‐四酢酸テトラアセトキシエステル、1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸、1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル、1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸、1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル、1-[2-アミノ-5-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル、1-[2-アミノ-5-(6-カルボキシ-2-インドリル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸、1-[2-アミノ-5-(6-カルボキシ-2-インドリル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル、1-[2-アミノ-5-(3-ジメチルアミノ-6-ジメチルアンモニオ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸などが挙げられる。
【００２６】
本発明において使用される化合物は、塩や水和物を形成してもよい。塩は、本発明の効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。
酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸を挙げることができる。塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、塩化物塩などを挙げることができる。
本発明において、化合物の塩としては、例えば、8-アミノ-2-[(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)メチル]-6-メトキシキノリン-N,N,N',N'-四酢酸四カリウム塩、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N, N',N'-四酢酸四ナトリウム塩、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N, N',N'-四酢酸四カリウム塩、1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸五カリウム塩、1-[2-アミノ-5-(6-カルボキシ-2-インドリル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸五カリウム塩、1-[2-アミノ-5-(3-ジメチルアミノ-6-ジメチルアンモニオ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸塩化物などが挙げられる。
また、本発明の化合物の水和物としては、例えば、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N, N',N'-四酢酸四カリウム塩水和物が挙げられる。なお、本明細書においては、便宜上、化合物の塩及びその水和物を化合物名のみで表記する場合もある。
本発明において使用される化合物は、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することもできる。
上記化合物及びその塩は市販されており、例えば、株式会社同仁化学研究所などから購入することができる。
【００２７】
本発明の化合物等は、標的核酸を含む被験試料と混合することにより、被験試料中に存在する、核酸増幅反応の阻害物質に対して抑制的に作用する機能を有する。すなわち、本発明においては、本発明の化合物等の機能により、被験試料から核酸を精製することなく、当該被験試料を核酸増幅反応に使用することができる。
【００２８】
また、本発明においては、本発明の化合物等の濃度が、生体試料を含む被験試料と本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬との混合物（以下「反応混合物」ともいう）の総量中の生体試料の濃度に対して一定の範囲にあるときに、被験試料に含まれる標的核酸をより迅速かつ高精度に検出又は定量することができる。
すなわち、本発明のある態様において、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩は、生体試料を含む被験試料と本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬とを混合したときに、その混合物の総量中の生体試料の濃度に対する濃度がある一定濃度（mM）以上となるように反応混合物中に含まれる。反応混合物中の本発明の化合物等の濃度としては、例えば、0.01 mM以上、0.03 mM以上、0.05 mM以上、0.09 mM以上、0.1mM以上、0.15mM以上、0.2 mM以上、0.3mM以上、0.45 mM以上、0.5 mM以上、0.6 mM以上、0.8 mM以上、1 mM以上、1.5 mM以上又は2.4 mM以上の濃度が挙げられ、好ましくは、0.1mM以上、0.15mM以上、0.2 mM以上、又は0.3mM以上の濃度であり、より好ましくは、0.2 mM以上又は0.3mM以上の濃度であるが、これらに限定されない。また、反応混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度の上限は限定されるものではないが、例えば、10mM以下の濃度が挙げられる。
被験試料、本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬の容量は、任意に定めることができ、当業者であれば、被験試料、本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬の各容量及びこれらの混合物の総量に応じて、検出又は定量用試薬に含まれる本発明の化合物等の量や濃度を決定し、前記混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度が上記で例示した濃度となるように検出又は定量用試薬を製造することができる。
例えば、生体試料を希釈せず被験試料としてそのまま使用する場合であって、被験試料が2μl、本発明の化合物等を含む試薬が2μl、オリゴヌクレオチドを含む試薬が16μlでこれらの混合物の総量が20μlである場合、本発明の化合物等を含む試薬は、本発明の化合物等を、本発明の化合物等を含む試薬中に2 mM以上の濃度で含むことにより、前記混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度が0.2 mM以上となるように本発明の化合物等を含むことができる。
また別の例において、生体試料を希釈せず被験試料としてそのまま使用する場合であって、被験試料が4μl、本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬が16μlでこれらの混合物の総量が20μlである場合、本発明の化合物等を含む試薬は、本発明の化合物等を検出又は定量用試薬中に0.75 mM以上の濃度で含むことにより、前記混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度が0.6 mM以上となるように本発明の化合物等を含むことができる。
更に別の例において、生体試料を５倍希釈した被験試料を使用する場合であって、被験試料が10μl（生体試料2μl＋希釈液8μl）、本発明の化合物等を含む試薬が4μl、オリゴヌクレオチドを含む試薬が6μlでこれらの混合物の総量が20μlである場合、本発明の化合物等を含む試薬は、本発明の化合物等を1.5 mM以上の濃度で含むことにより、前記混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度が0.3 mM以上となるように本発明の化合物等を含むことができる。
【００２９】
また本発明の別の態様において、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩は、生体試料を含む被験試料と本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬とを混合したときに、その混合物の総量中の濃度が下記式Aで算出される濃度以上となるように検出又は定量用試薬に含まれるものであり、より好ましくは、下記式Bで算出される濃度以上となるように検出又は定量用試薬に含まれるものである。また、前記混合物の総量中のEGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩の濃度の上限は限定されるものではないが、例えば、10mM以下の濃度が挙げられる。
【００３０】
式A
｛［被験試料中の生体試料（容量）］／［被験試料と検出又は定量用試薬との混合物の総量（容量）］｝×2 (mM)
式B
｛［被験試料中の生体試料（容量）］／［被験試料と検出又は定量用試薬との混合物の総量（容量）］｝×3 (mM)
【００３１】
生体試料を希釈せず被験試料としてそのまま使用する場合であって、被験試料が2μl、本発明の化合物等を含む試薬が2μl、オリゴヌクレオチドを含む試薬が16μlでこれらの混合物の総量が20μlである場合、式Aを適用して計算すると下記のようになる。
［被験試料と本発明の化合物等を含む試薬とオリゴヌクレオチドを含む試薬との混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度］は、(2/20)×2(mM)＝0.2(mM)以上
すなわち、この例において、本発明の化合物等は、生体試料を含む被験試料と、本発明の化合物を含む試薬とオリゴヌクレオチドを含む試薬とを混合したときに、その混合物の総量中の濃度が0.2 mM以上となるように本発明の化合物等を含む試薬に含まれる。
【００３２】
また別の例において、生体試料を希釈せず被験試料としてそのまま使用する場合であって、被験試料が4μl、本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬が16μlでこれらの混合物の総量が20μlである場合、式Bを適用して計算すると下記のようになる。
［被験試料と本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬との混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度］は、(4/20)×3 (mM)＝0.6 (mM)以上
すなわち、この例において、本発明の化合物等は、生体試料を含む被験試料と本発明の化合物等及びオリゴヌクレオチドを含む検出又は定量用試薬とを混合したときに、その混合物の総量中の濃度が0.6 mM以上となるように検出又は定量用試薬に含まれる。
更に別の例において、生体試料を５倍希釈した被験試料を使用する場合であって、被験試料が10μl（生体試料2μl＋希釈液8μl）、本発明の化合物等を含む試薬が4μl、オリゴヌクレオチドを含む試薬が6μlでこれらの混合物の総量が20μlである場合、式Bを適用して計算すると下記のようになる。
［被験試料と本発明の化合物等を含む試薬とオリゴヌクレオチドを含む試薬との混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度］は、(2/20)×3(mM)＝0.3(mM)以上
すなわち、この例において、本発明の化合物等は、生体試料を含む被験試料と本発明の化合物等を含む試薬とオリゴヌクレオチドを含む試薬とを混合したときに、その混合物の総量中の濃度が0.3 mM以上となるように本発明の化合物等を含む試薬に含まれる。
【００３３】
このように、当業者であれば、上記式A又はBを用いることにより、前記混合物の総量中の本発明の化合物等の濃度を決定することができる。また、当該濃度が決定すれば、上記と同様、本発明の化合物等を含む試薬に使用する本発明の化合物等の量や濃度を決定することができる。
これにより、本発明はより有効に機能し、被験試料に含まれる標的核酸をより迅速かつ高精度に検出又は定量することができる。
【００３４】
本発明の検出又は定量用試薬には、本発明の化合物等又はその水和物をそのままの形態で使用することもできるし、溶媒に溶解して溶液の形態で使用することもできる。そのような溶媒としては、例えば、水、緩衝液が挙げられる。緩衝液の種類は限定されるものではなく、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸−クエン酸緩衝液、MES、ADA、PIPES、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES、Tricine、Bicine、TAPS、CHES及びCAPS等を用いることができる。緩衝液のpHは、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、pH 6.0〜10.0であり、好ましくはpH 7.0〜9.0であり、より好ましくはpH 8.0〜8.5である。
【００３５】
（２）オリゴヌクレオチド
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドは、標的核酸の増幅に寄与するものであれば限定されるものではなく、例えばオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。当該オリゴヌクレオチドは、検出又は定量の対象となる標的核酸の塩基配列及び使用する核酸増幅法に応じて、当業者であれば容易に設計し、合成することができる。例えば、標的核酸が由来する微生物の塩基配列情報を、公知の遺伝子情報及び遺伝子データベース（例えばNCBIのGenBank等）から入手し、その微生物に特異的な領域（例えば、ウイルスの場合は保存領域、毒素を有する細菌の場合は毒素タンパク質をコードする領域）の塩基配列を選択し、その塩基配列を有する核酸を標的核酸として選択する。次に、標的核酸の全部又は一部を任意の核酸増幅法により増幅することができるように、公知の遺伝子情報及び遺伝子データベース（例えばNCBIのGenBank等）に基づき、Primer express（アプライドバイオシステムズ社製）などの作製ソフトを使用することにより設計することが可能である。プライマーは、例えば、少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも20塩基の長さを有する。また、既に特定の標的核酸を増幅又は検出若しくは定量するために特異的にデザインされ、製品化されたオリゴヌクレオチドを用いることもできる。
例えば、ヒトサイトメガロウイルスの場合、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質H遺伝子を含むDNAを標的核酸として選択し、当該標的核酸の全部又は一部を増幅することができるようにプライマーを設計することができる（Eiko Fukushima, et al., Journal of Virological Methods 151 (2008) 55-60）。
また、核酸増幅反応に使用されるプライマーは、複数のプライマーの組み合わせ（プライマーセット）で使用することができる。プライマーセットに含まれるプライマーの数は限定されるものではなく、後述する核酸増幅法の種類に応じて適宜設定することができる。
【００３６】
（３）核酸増幅法
本発明において、標的核酸の増幅は、任意の核酸増幅法により行うことができる。本発明において使用することができる核酸増幅法としては、温度変化（温度サイクル）を伴う反応を利用する方法と等温核酸増幅反応を利用する方法（以下、「等温核酸増幅法」ともいう）が挙げられる。本発明においては、標的核酸の増幅は等温核酸増幅法により行うことが好ましい。
温度変化を伴う反応を利用する方法としてはPCR法（White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、RT-PCR法、LCR法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）などが挙げられる。また、等温核酸増幅法としては、SmartAmp(Smart Amplification Process)法（特許第3897805号公報）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（特許第3313358号公報）、SDA法（Strand Displacement Amplification：Edward L. Chan et al, Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、TMA（Transcription Mediated Amplification）法、NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、RCA（rolling circle amplification）法、TRC（Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction）法、HDA（Helicase-dependent isothermal DNA amplification）法が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明においては、標的核酸の増幅は、PCR法、RT-PCR法、LCR法、SmartAmp法、LAMP法、RT-LAMP法、SDA法、ICAN法、TMA法、NASBA法、RCA法、TRC法及びHDA法からなる群から選択される方法によるものであることが好ましく、増幅反応操作の簡便性及び迅速性の観点から、SmartAmp法又はLAMP法によるものであることがより好ましい。なお、本発明において、「SmartAmp法」には、SmartAmp2（Smart Amplification Process 2）法も含まれる。
【００３７】
PCR法、RT-PCR法、LCR法、SmartAmp法、LAMP法、SDA法、ICAN法、TMA法、NASBA法、RCA法、TRC法及びHDA法は当業者に周知の技術であり、当業者であれば公知の情報に基づいて容易に実施することができる。
【００３８】
PCR法は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用した核酸増幅反応であり、二つのプライマーで挟まれたDNA部分を試験管内で大量に増幅させることができる方法である。PCR法は、DNAの熱変性、プライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによる伸長反応という反応サイクルにより核酸を増幅させる方法であり、温度変化(温度サイクル)を伴う。PCR法には様々な改良法があり、例えばRT-PCR法が挙げられる。
RT-PCR法は、生体試料から抽出したRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、当該cDNAを鋳型としてPCR法により核酸を増幅する方法である。PCRにより増幅されたDNA断片は、例えば、アガロースゲル電気泳動の後、DNAに特異的に結合するエチジウムブロマイドやSYBER（登録商標） GREENＩおよびIIなどの蛍光物質で標識することにより視覚化し、定量することができる。
【００３９】
SmartAmp法は、等温核酸増幅反応を利用した核酸増幅方法であり、2〜6本のプライマーセット及び鎖置換（strand displacement）型DNAポリメラーゼを用いる方法である。この方法は、鎖置換反応を利用した核酸の増幅法において、標的核酸が増幅された場合にのみステム−ループ形成可能なプライマーと、5’末端部分に折返し配列を有するプライマーとを組み合わせて用いる方法である。この方法によれば、等温条件下で連続して標的核酸を合成することが可能となるとなるため、サーマルサイクラー等の特別な装置を必要とせず、また、温度変化に要する時間も必要ないため、短時間で増幅産物を得ることができ、上記PCR法よりも迅速かつ高精度で核酸増幅を行うことができる。
【００４０】
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。そのような変性法としては、温度を約95〜98℃に上昇させる方法が挙げられる。他の方法として、pHを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにpHを低下させる必要がある。
【００４１】
SmartAmp法に使用することができる鎖置換型DNAポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、又は耐熱性のいずれのものも使用することができる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、DNAポリメラーゼが挙げられる。さらに、このDNAポリメラーゼは、実質的に5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなDNAポリメラーゼとしては、中等度好熱好酸菌 Alicyclobacillus acidocaldarius（Aac）由来の鎖置換活性を有するAac DNA ポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のBst DNAポリメラーゼ、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）由来のBca DNAポリメラーゼ、Csa DNAポリメラーゼ、大腸菌（E．coli）由来DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント等が挙げられるが、Aac DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ及びCsa DNAポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも一つのDNA ポリメラーゼが好ましく、Aac DNAポリメラーゼがより好ましい。
【００４２】
上記プライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。従って、この核酸増幅反応は、本発明における被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物を等温でインキュベートする工程を含む。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
【００４３】
一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Tm）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Tm）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは約20℃〜約75℃であり、より好ましくは約35℃〜約65℃であり、さらにより好ましくは約60℃〜約65℃である。
【００４４】
SmartAmp法の核酸増幅機構などの詳細については、国際公開WO 2005/063977号公報（特許第3897805号公報）及び国際公開WO 2004/040019号公報（特許第3867926号公報）などに記載されており、当業者であればこれらの文献および本明細書の記載に基づいてプライマーを設計し、SmartAmp法を実施することができる。
上記SmartAmp法により核酸を増幅するための試薬は、株式会社ダナフォームから入手することができる。
【００４５】
LAMP法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。
LAMP法においては、インナープライマーペア又はこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、2種、4種又は6種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下で標的核酸を増幅する。
【００４６】
LAMP法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を1本鎖に解離させていく。解離した1本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、LAMP法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、DNAの増幅が指数関数的に、しかも等温条件下で達成され、微量核酸を効率的に増幅することができる。
【００４７】
LAMP法のプライマーや反応機序などの詳細については、国際公開WO 00/28082号公報（特許第3313358号公報）などに記載されており、当業者であればこれらの文献および本明細書の記載に基づいてプライマーを設計し、LAMP法を実施することができる。
LAMP法により核酸を増幅するための試薬は、栄研化学株式会社などから入手することができる。
【００４８】
本発明においては、上記核酸増幅法と組み合わせてリアルタイムPCRの装置を用いてリアルタイム検出又は定量を行うことが好ましい。リアルタイムPCR装置には、例えば、Mx3000p QPCR System（アジレントテクノロジー株式会社）、ABIPRISM7500（アプライドバイオシステムズ社製）などのリアルタイムPCR装置があり、増幅産物をリアルタイムに検出及びモニタリングし、標的核酸を検出又は定量することが可能である。増幅されるDNAは前述のSYBER GREEN Iなどの蛍光物質で検出できる。また、リアルタイムPCR法では、プライマーと合わせて蛍光プローブを用いることができる。
【００４９】
また、リアルタイムPCR装置においては、検出されるある蛍光強度（Fluorescence）において閾値（threshold）を設定し、被験試料を増幅したときの検出蛍光強度が閾値に達する時間を、濃度既知の標的核酸を増幅したときの検出蛍光強度が閾値に達する時間と比較することにより、より正確に被験試料に含まれる標的核酸を定量（または測定）することができる。閾値は、試料間で比較できるように設定した値であれば限定されるものではないが、例えば、核酸の増幅曲線の対数増幅期の蛍光強度の範囲に設定することができる。そのような閾値の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。また、被験試料に含まれる標的核酸の存在の有無（陽性又は陰性）の判定については、増幅反応に伴う蛍光強度が増幅前の蛍光強度と比較して十分識別できる値を閾値と設定し、一定時間内に蛍光強度が閾値に達した被験試料を陽性と判定し、一定時間内に蛍光強度が閾値に達しない被験試料を陰性と判定することができる。
【００５０】
（４）その他の試薬
本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬には、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドのほか、核酸を増幅及び／又は検出若しくは定量するための試薬を含むことができる。そのような試薬としては、限定されるものではないが、例えば、核酸増幅反応用混合物、発色用試薬、DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
【００５１】
核酸増幅反応用混合物には、限定されるものではないが、例えば、dNTPs等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液、塩化マグネシウム（MgCl2）、塩化カリウム（KCl）、硫酸アンモニウム(NH4)2SO4及び硫酸マグネシウム（MgSO4)などの触媒、界面活性剤（Tween20等）が含まれる。また、その他、蛍光プローブを含むことができる。
【００５２】
また、増幅反応用混合物には、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を添加することができる。本発明に用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。
融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（DMSO）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせであり、より好ましくはジメチルスルホキシド（DMSO）又はベタインである。
【００５３】
発色用試薬は、核酸に結合して蛍光を発する試薬であり、蛍光プローブの代わりに使用することができる。本発明に使用する発色用試薬としては、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬、例えば、SYBR（登録商標） GreenＩが挙げられるが、これに限定されない。SYBR（登録商標） GreenＩを用いるリアルタイムPCR（定量PCR、qPCR）は、標的核酸ごとに特別な蛍光標識プローブを用意する必要がなく、コスト的にも安価であるため、手軽に実験を行うことができる。
【００５４】
DNAポリメラーゼとしては、上述の通り、Aac DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ（BcaBEST DNAポリメラーゼ、Bca（exo-）DNAポリメラーゼ等）、Bst DNAポリメラーゼ、Csa DNAポリメラーゼ、クレノウフラグメント、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ29ファージDNAポリメラーゼ、MS-2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminater DNAポリメラーゼ、等が挙げられるが、Aac DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ及びCsa DNAポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも一つのDNA ポリメラーゼが好ましい。また、DNAポリメラーゼの種類は、当業者であれば使用する核酸増幅法に応じて適宜選択することができる。例えば、SmartAmp法を用いる場合にはAac DNAポリメラーゼを選択することができ、LAMP法を用いる場合にはBst DNAポリメラーゼ又はCsa DNAポリメラーゼを選択することができるが、これらに限定されない。
【００５５】
さらに、本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬には、酵素安定化剤を添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤としては、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
さらに、本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬には、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物が挙げられる。
【００５６】
本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬キットは、少なくとも本発明の化合物等とオリゴヌクレオチドを含む試薬を含むものであればよく、その他の構成要素を含むことができる。その他の構成要素としては、例えば、反応用容器（試験チューブ等）、取扱説明書などが挙げられる。また、検出又は定量用試薬の構成要素の一部を別個の試薬としてキット内に含めることもできる。
本発明において、標的核酸の「検出」とは、標的核酸の増幅を確認することをいう。例えば、核酸の増幅反応を行った場合に、標的核酸を含まない対照と比較して、被験試料に含まれる標的核酸の増幅量が高ければ、被験試料に含まれる標的核酸を検出したといえる。また、より好ましい態様においては、被験試料に含まれる標的核酸の増幅量が、一定時間内に一定の値に達した場合、標的核酸を検出したといえる。また、本発明において、標的核酸の「定量」とは、被験試料に含まれる標的核酸の量（例えばコピー数）を測定することをいう。
【００５７】
本発明においては、ウイルス又は細菌由来の標的核酸を増幅し、検出又は定量することができる。従って、例えば、動物から採取した生体試料中に含まれるウイルス又は細菌由来の標的核酸を検出又は定量することにより、ウイルス感染又は細菌感染の検出又は診断をすることができる。すなわち、本発明の標的核酸の検出又は定量用試薬キットは、ウイルス感染又は細菌感染の検出又は診断に使用することができるため、ウイルス感染又は細菌感染の診断用キットとして使用することができる。
例えば、本発明の検出又は定量用キットを使用して、ヒトの患者から採取した尿中に含まれるヘルペスウイルス由来の標的核酸を検出又は定量することにより、その患者におけるヘルペスウイルスの感染の有無の診断をすることができる。より具体的には、生後3週間以内の新生児から採取した尿中に含まれるヒトサイトメガロウイルス由来の標的核酸を検出又は定量することにより先天性サイトメガロウイルス感染の診断をすることが可能であり、又、乳幼児から採取した尿中に含まれるヒトサイトメガロウイルス由来の標的核酸を検出又は定量することにより、後天的なサイトメガロウイルス感染を含めた感染の有無の診断をすることが可能である。
ヒトサイトメガロウイルス由来の標的核酸としては、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質H遺伝子の塩基配列を含むDNAを選択することができる。
【００５８】
４．標的核酸の検出又は定量方法
本発明は、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、被験試料と、前記標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを混合し、当該混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する方法を提供する。
また、本発明は、(a) エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程を含む、標的核酸を検出又は定量する方法を提供する。
【００５９】
上記工程(a)は、第一の試薬と被験試料とを混合し、その混合物の全部又は一部と第二の試薬とを混合する工程であってもよいし、第一の試薬と第二の試薬とを混合し、その混合物の全部又は一部と被験試料とを混合する工程であってもよい。また、被験試料と第二の試薬とを混合し、その混合物の全部又は一部と第一の試薬とを混合する工程であってもよい。
上記工程において、第一の試薬と第二の試薬との混合物（すなわち、本発明の化合物等と標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを含む試薬）は、単一の測定試薬として使用することができる。
すなわち、上記工程(a)は、EGTA、BAPTA及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩並びに標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む試薬と、被験試料とを混合する工程であってもよい。
第一の試薬、被験試料及び第二の試薬の説明は上記の通りである。本発明において、混合は、通常用いられている方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、ピペッティング、タッピング、撹拌機（Vortex mixer等）による撹拌などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、工程(a)において、混合物の「全部」とは、混合物の全量を意味する。例えば、第一の試薬と被験試料との混合物の全部と第二の試薬との混合には、第一の試薬と被験試料との混合物に第二の試薬を添加する場合、あるいは、第二の試薬に、第一の試薬と被験試料との混合物を添加する場合が挙げられる。また、混合物の「一部」とは、混合物の一部の溶液を意味する。例えば、第一の試薬と被験試料との混合物の一部と第二の試薬との混合には、第一の試薬と被験試料との混合物から一部を採取し、これを第二の試薬に添加する場合、あるいは、第二の試薬を当該混合物の一部に添加する場合が挙げられる。他の試薬の混合についても同様である。
【００６０】
工程(b)は、第一の試薬と被験試料と第二の試薬との混合物（反応混合物）中の標的核酸を核酸増幅反応により増幅し、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程である。
本発明に使用することができる核酸増幅法の説明は上記の通りである。核酸増幅反応には、反応混合物の全部を用いることができるし、その一部の溶液を用いることもできる。
核酸増幅反応により増幅された標的核酸は、任意の方法により検出又は定量することができる。そのような方法としては、例えば、リアルタイムPCR装置、一般的なゲル電気泳動、標識プローブを用いる方法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット、免疫クロマトグラフィーを用いる方法などが挙げられるが、リアルタイムPCR装置を用いる方法が好ましい。リアルタイムPCR装置による検出又は定量は、例えば、Mx3000p QPCR System（アジレントテクノロジー株式会社）、ABIPRISM7500（アプライドバイオシステムズ社製）などのリアルタイムPCR用装置を使用して行うことができる。ゲル電気泳動による検出においては、例えば、エチジウムブロマイドやSYBR（登録商標） GreenＩ等の蛍光物質により検出できる。標識プローブを用いる方法としては、例えばビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出する方法が挙げられる。
【００６１】
また、本発明の標的核酸を検出又は定量する方法において、標的核酸としてウイルス又は細菌由来の標的核酸を選択することにより、ウイルス感染又は細菌感染を検出することができる。
すなわち、本発明は、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩と、被験試料と、ウイルス又は細菌由来の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドとを混合し、当該混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程を含む、ウイルス感染又は細菌感染を検出する方法を提供する。
また、別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、ウイルス感染又は細菌感染を検出する方法を提供する。
(a) エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物又はその塩を含む第一の試薬と、被験試料と、ウイルス又は細菌由来の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬とを混合する工程、並びに
(b) 工程(a)により得られた混合物中の標的核酸の増幅反応を行い、増幅された標的核酸を検出又は定量する工程。
上記工程(a)及び(b)に関する説明は、上記標的核酸を検出又は定量する方法と同様である。
【００６２】
本発明においては、被験試料に含まれる当該標的核酸の増幅が起これば、ウイルス感染又は細菌感染を検出したと判断できる。また、より好ましい態様においては、被験試料に含まれるウイルス又は細菌由来の標的核酸の増幅量が、一定時間内に一定の値に達した場合、ウイルス感染又は細菌感染を検出したと判断できる。
検出方法としてリアルタイムPCR装置を用いた場合には、検出されるある蛍光強度（Fluorescence）において閾値（threshold）を設定し、被験試料を増幅したときの検出蛍光強度が規定時間内に閾値に達する時間を、濃度既知の標的核酸を増幅したときの検出蛍光強度が閾値に達する時間と比較することにより被験試料に含まれる標的核酸を定量（または測定）することができ、従ってより正確にウイルス感染又は細菌感染を検出することができる。閾値は、試料間で比較できるように設定した値であれば限定されるものではないが、例えば、核酸の増幅曲線の対数増幅期の蛍光強度の範囲に設定することができる。また、ウイルス感染又は細菌感染の有無（陽性又は陰性）の検出又は診断については、増幅反応に伴う蛍光強度が増幅前の蛍光強度と比較して十分識別できる値を閾値と設定し、一定時間内に蛍光強度が閾値に達した被験試料を陽性として検出又は診断し、一定時間内に蛍光強度が閾値に達しない被験試料を陰性として判定又は診断することができる。すなわち、本発明の方法は、ウイルス感染又は細菌感染の検出方法に加え、その診断方法も提供する。核酸増幅反応の開始から検出までの一定時間は限定されるものではないが、例えば、約30〜90分、好ましくは約30分〜60分、より好ましくは約40分〜60分である。
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
試薬の調製
１．第一の試薬
第一の試薬は、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA（GEDTA））及び1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N, N',N'-四酢酸（BAPTA）（株式会社同仁化学研究所）を、それぞれ10 mM Tris-HCl (pH8.0) 溶液に溶解することにより作製した。【００６５】
２．第二の試薬
第二の試薬は、各種核酸増幅方法を用いてリアルタイムPCRを実施できるように作製した。本実施例では、第二の試薬として、SmartAmp法を実施するための試薬（SmartAmp法試薬）及びLAMP法を実施するための試薬（LAMP法試薬）を作製した。各試薬の組成及び作製方法を以下に示す。各試薬の組成における濃度は、被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の総量に対する最終濃度を示す。
（１）SmartAmp法試薬
(i) 試薬の組成
2 x Reaction Mix (D)      dNTPs                   各1.4 mM
DMSO                         5%
Tris-HCl(pH8.0)             20 mM
KCl                         10 mM
(NH4)2SO4                    10 mM
MgSO4                        8 mM
Tween20                     0.1%
SYBR（登録商標） Green I                            0.0012%
Aac DNA ポリメラーゼ                                  4.8 U
プライマー混合液                                        6 μM
上記組成において、2 x Reaction Mix (D)及びAac DNA ポリメラーゼは株式会社ダナフォームから購入し、SYBR（登録商標） Green Iはタカラバイオ株式会社から購入した。また、プライマー混合液はシグマ アルドリッチ(Sigma-Aldrich)株式会社から購入し、試薬に用いる水（PCR Grade）は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社から購入した。【００６６】
(ii)プライマー混合液
上記プライマー混合液は、以下に示すTP、FP、BP、OP1及びOP2の各プライマー（100μM）を8:8:4:1:1の比率で混合して作製した。
TP    5'- CGCGTCTCTCCAAGAACTCTACCTCATG (配列番号４)
FP    5'- TTTATATATATATAAACGTTTCTACGATGAAGAT (配列番号５)
BP    5'- CATGGAGTGGACGA (配列番号６)
OP1   5'- GCCGACTTTGCCCTA (配列番号７)
OP2   5'- CAACTGCGTAAAGTGTG (配列番号８)【００６７】
（２）LAMP法試薬
(i) 試薬の組成
2 x Reaction Mix          dNTPs                   各1.4 mM
Betaine                    0.8 M
Tris-HCl(pH8.8)             20 mM
KCl                         10 mM
(NH4)2SO4                    10 mM
MgSO4                        8 mM
Tween20                     0.1%
SYBR（登録商標） Green I                            0.0012%
Bst DNA ポリメラーゼ                                     4%
プライマー混合液                                        5 μM
上記組成において、2 x Reaction Mix (RM)及びBst DNA ポリメラーゼは、Loopamp DNA増幅試薬キット（栄研化学株式会社）のものを使用した。SYBR（登録商標） Green I、プライマー混合液及び水（PCR Grade）の入手先は上記と同様である。【００６８】
(ii)プライマー混合液
上記プライマー混合液は、以下に示すFIP、BIP、LPF、LPB、F3及びB3の各プライマー（100μM）を8:8:4:4:1:1の比率で混合して作製した。各プライマーの塩基配列は、Eiko Fukushima, et al., Journal of Virological Methods 151 (2008) 55-60のTable 1に従った。
FIP (F1c-F2) 5'- gatttcgcgtctctccgtcgt-gaactctacctcatgggcag (配列番号９)
BIP (B1-B2c) 5'- catcgtagaaacgggcctctg-tgcggatgagctagcaactg (配列番号１０)
LPF (LPFc)    5'- tgtaccaacatggagtggac (配列番号１１)
LPB (LPB)    5'- cattggccgagctatcacactt (配列番号１２)
F3 (F3)    5'- ggcctcttttctttcagcct (配列番号１３)
B3 (B3c)    5'- gggtgtgtacaggtcgct  (配列番号１４)
【実施例２】
【００６９】
EGTA含有試薬及びSmartAmp法試薬を用いたウイルス陽性尿中の標的核酸の検出
１．ウイルス陽性尿の調製
本実施例では、リアルタイムPCRの結果CMV陰性と判定された尿にヒトサイトメガロウイルス（HCMV）溶液を添加した試料（ウイルス陽性尿）を被験試料として用いた。被験試料に含まれるHCMV溶液の割合は0.25%である。
上記陰性尿（HCMVが含まれていない尿）は、健常のヒトから採尿パック又は紙コップにて採取した。
上記HCMV溶液は、以下のようにして調製した。
まず、HCMV towne株をATCC（American Type Culture Collection）より入手し、ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞株（HFL-III）に接種した。接種した細胞株は、D-MEM/Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red（Wako）にFBSを添加した培地で培養し、一般的な方法で増殖させた。当該細胞の増殖後の培養液を遠心し、遠心後の上清を回収したものをHCMV溶液として用いた（5×106pfu/mL）。【００７０】
２．ウイルス陽性尿中の標的核酸の検出
（１）方法
0.2 mL用のPCRチューブ（Agilent Technologies社）に被験試料を下記の表１に示す量（2、3又は4 μl）で添加し、EGTAを表２〜４に示す各濃度で含む第一の試薬2 μlをさらに添加し、スピンダウンした。次に加熱処理（98℃で30秒）を行い、その後氷冷した。これに表１に示す通り第二の試薬を添加してスピンダウン後、Mx3000p QPCR System（Agilent Technologies Inc.）を用いてSmartAmp法による核酸増幅反応及び標的核酸の検出を行った。下記の表１は、被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。下記組成のうち、水の容量は、被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物の容量が20μlとなるように、被験試料の添加量に応じて適宜2、3又は4μlを選択した。
表１
【表１】
2013147043.tif 000004
【００７１】
SmartAmp法による核酸増幅反応及び標的核酸の検出は、以下の条件にて行った。
反応時間：60℃、60分間の反応。
測定波長：励起 492nm、蛍光 516nmにて検出。
検出の判定基準：増幅前の蛍光強度に対する蛍光強度の変化量（以下「Fluorescence（dR）」という）が4000に到達する時間（分）を比較し、60分以内に4000に到達した場合を陽性と判定した。【００７２】
（２）検出結果
(i) 反応混合物総量に対する被験試料の割合が10％の場合の検出結果
検出結果を以下の表２に示す。
表２
【表２】
2013147043.tif 000005
上記表２に示すように、EGTAを含まない（0 mM）第一の試薬を用いた場合は、検体１〜３のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、EGTAの濃度が1 mM(反応混合物の総量に対する濃度は0.1 mM)以上の第一の試薬を用いた場合、検体１においては60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。また、EGTAの濃度が2 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.2 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体１〜３のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。【００７３】
(ii) 反応混合物総量に対する被験試料の割合が15％の場合の検出結果
検出結果を以下の表３に示す。
表３
【表３】
2013147043.tif 000006
【００７４】
上記表３に示すように、EGTAを含まない（0 mM）第一の試薬を用いた場合は、検体４〜６のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、EGTAの濃度が1.5 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.15 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体５において60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。また、EGTAの濃度が4.5 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.45 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体４〜６のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。【００７５】
(iii) 反応混合物総量に対する被験試料の割合が20％の場合の検出結果
検出結果を以下の表４に示す。
表４
【表４】
2013147043.tif 000007
表中、「−」は、測定していないことを示す。【００７６】
上記表４に示すように、EGTAを含まない（0 mM）第一の試薬を用いた場合は、検体７及び８のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、EGTAの濃度が4 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.4 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体８においては60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。また、EGTAの濃度が6 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.6 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体７及び８のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。【００７７】
以上、本実施例の結果から、EGTAを含む第一の試薬、及びSmartAmp法により標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬を用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、尿に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。また、反応混合物の総量に対するEGTAの濃度が上記式A又はBで算出される濃度以上となるようにEGTAを含む第一の試薬を用いることにより、EGTAを含まない試薬を用いた場合には検出されなかった尿中のHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。
【実施例３】
【００７８】
BAPTA含有試薬及びSmartAmp法試薬を用いたウイルス陽性尿中の標的核酸の検出
１．方法
本実施例では、EGTAの代わりにBAPTAを表６に示す各濃度で含む第一の試薬を用いた以外は、実施例２と同様の手法を用いた。
下記の表５は、本実施例における被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。下記組成のうち、水の容量は、被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物の容量が20μlとなるように、4μlを添加した。
表５
【表５】
2013147043.tif 000008
【００７９】
２．検出結果
検出結果を以下の表６に示す。
表６
【表６】
2013147043.tif 000009
【００８０】
上記表６に示すように、BAPTAを含まない（0 mM）第一の試薬を用いた場合は、検体９〜１１のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、BAPTAの濃度が2 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.2mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体９〜１１のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。【００８１】
本実施例の結果から、BAPTAを含む第一の試薬、及びSmartAmp法により標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬を用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、尿に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。また、反応混合物の総量に対するBAPTAの濃度が0.2 mM以上となるようにBAPTAを含む第一の試薬を用いることにより、60分以内に尿に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。さらに、反応混合物の総量に対するBAPTAの濃度が上記式A又はBで算出される濃度以上となるようにBAPTAを含む第一の試薬を用いることにより、BAPTAを含まない試薬を用いた場合には検出されなかった尿中のHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。
【実施例４】
【００８２】
EGTA含有試薬及びLAMP法試薬を用いたウイルス陽性尿中の標的核酸の検出
１．方法
本実施例では、第二の試薬としてSmartAmp法試薬の代わりにLAMP法試薬を用いた以外は、実施例２と同様の手法を用いた。
下記の表７は、本実施例における被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。下記組成のうち、水の容量は、被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物の容量が20μlとなるように、3μlを添加した。
表７
【表７】
2013147043.tif 000010
【００８３】
LAMP法による核酸増幅反応及び標的核酸の検出は、以下の条件にて行った。
反応時間：60℃、45分間の反応。
測定波長：励起 492nm、蛍光 516nmにて検出。
検出の判定基準：Fluorescence（dR）が1000に到達する時間（分）を比較し、LAMP法での一般的な判定時間である45分以内に1000に到達した場合を検出した。【００８４】
（２）検出結果
検出結果を以下の表８に示す。
表８
【表８】
2013147043.tif 000011
【００８５】
上記表８に示すように、標的核酸の増幅をLAMP法により行った場合、EGTAを含まない（0 mM）第一の試薬を用いた場合は、検体１３において45分以内にFluorescence（dR）が1000に到達しなかった。これに対し、EGTAの濃度が1.5 mM (反応混合物の総量に対する濃度は0.15 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体１２及び１３のいずれにおいても45分以内にFluorescence（dR）が1000に到達した。【００８６】
本実施例の結果から、EGTAを含む第一の試薬、及びLAMP法により標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬を用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、尿に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。また、反応混合物の総量に対するEGTAの濃度が0.45 mM以上となるようにEGTAを含む第一の試薬を用いることにより、45分以内に尿に含まれるHCMV由来の標的核酸を迅速に検出できることが示された。さらに、反応混合物の総量に対するEGTAの濃度が上記式A又はBで算出される濃度以上となるようにEGTAを含む第一の試薬を用いることにより、EGTAを含まない試薬を用いた場合には検出されなかった尿中のHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。
【実施例５】
【００８７】
EGTA含有試薬及びSmartAmp法試薬を用いたウイルス陽性唾液中の標的核酸の検出
１．ウイルス陽性唾液の調製
本実施例では、リアルタイムPCRの結果CMV陰性と判定された唾液にヒトサイトメガロウイルス（HCMV）溶液を添加した試料（ウイルス陽性唾液）を被験試料として用いた。被験試料に含まれるHCMV溶液の割合は0.25%である。
上記陰性唾液（HCMVが含まれていない唾液）は、健常のヒトから1.5 mlチューブに採取した。
上記HCMV溶液は、実施例２に記載の方法と同じ方法で調製した。【００８８】
２．ウイルス陽性唾液中の標的核酸の検出
（１）方法
本実施例では、被験試料としてウイルス陽性尿の代わりにウイルス陽性唾液を用いた以外は、実施例２と同様の手法を用いた。
下記の表９は、本実施例における被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。下記組成のうち、水の容量は、被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物の容量が20μlとなるように、4μlを添加した。
表９
【表９】
2013147043.tif 000012
【００８９】
SmartAmp法による核酸増幅反応及び標的核酸の検出は、以下の条件にて行った。
反応時間：60℃、60分間の反応。
測定波長：励起 492nm、蛍光 516nmにて検出。
検出の判定基準：Fluorescence（dR）が1000に到達する時間（分）を比較し、60分以内に1000に到達した場合を陽性と判定した。【００９０】
（２）検出結果
検出結果を以下の表１０に示す。
表１０
【表１０】
2013147043.tif 000013
【００９１】
上記表１０に示すように、被験試料としてウイルス陽性唾液を用いた場合、EGTAを含まない（0 mM）第一の試薬を用いたときは検体１４及び１５のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が1000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、EGTAの濃度が10 mM (反応混合物の総量に対する濃度は1 mM)以上の第一試薬を用いた場合、検体１４及び１５のいずれにおいても60分以内にFluorescence（dR）が1000に到達し、陽性を示した。【００９２】
本実施例の結果から、EGTAを含む第一の試薬、及びSmartAmp法により標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬を用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、唾液に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。また、反応混合物の総量に対するEGTAの濃度が1 mM以上となるようにEGTAを含む第一の試薬を用いることにより、唾液に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。
【実施例６】
【００９３】
EGTA含有試薬及びSmartAmp法試薬を用いた陽性尿中の標的核酸の検出
１．陽性尿の調製
本実施例では、実施例２〜４で使用したウイルス陽性尿とは異なり、実際にHCMVに感染したヒトから採取した尿（陽性尿）を被験試料として用いた。当該ヒトの年齢は０〜６歳である。
本実施例で陽性尿に含まれる標的核酸を検出できることを実証するため、事前に、被験試料が陽性尿であること（尿中にHCMVゲノムが含まれていること）を確認する予備試験を以下のようにして行った。
まず、5人のヒトから採取した尿を、それぞれQIAamp DNA Mini kit（QIAGEN社）にてゲノム精製した後、測定装置：Mx3000p QPCR System （Agilent Technologies社）、測定試薬：Brilliant III Ultra-Fast QPCR Master Mix プローブ用 （Agilent Technologies社）を用いてリアルタイムPCRを実施し、CMVゲノムを定量した。リアルタイムPCRに用いたプライマーおよびプローブは、Eiko Fukushima, et al., Journal of Virological Methods 151 (2008) 55-60の記載に従って作製した。
リアルタイムPCRによる定量の結果CMV陽性と判定された尿5検体（CMVゲノム：5000copies/mL尿以上）を、未精製のまま、本実施例における陽性尿として用いた（検体番号S1〜S5）。
また、この陽性尿5検体のほか、CMVゲノムが106copies/mL尿以上含まれていることが明らかとなっている未精製の尿（以下「CMVゲノム強陽性尿」という）を、11人のヒトから採取した未精製の陰性尿検体にそれぞれ10％の割合で添加した陽性尿（以下「強陽性尿」という）を調製した（検体番号S6〜S15）。【００９４】
２．陽性尿中の標的核酸の検出
（１）方法
本実施例では、ウイルス陽性尿の代わりにHCMVに感染したヒトから採取した陽性尿又は強陽性尿を使用した以外は実施例２と同様の手法を用いた。第一の試薬については、EGTAを0又は10 mMの濃度で含むものを用いた。
下記の表１１は、本実施例における被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。なお、下記の表において、「陽性尿」とは、陽性尿又は強陽性尿を表す。
表１１
【表１１】
2013147043.tif 000014
【００９５】
（２）検出結果
(i) 強陽性尿の検出結果
強陽性尿の検出結果を以下の表１２に示す。
表１２
【表１２】
2013147043.tif 000015
【００９６】
上記表１２に示すように、被験試料として強陽性尿を用いた場合、検体番号S6〜S15のいずれにおいても、EGTAを含まない第一の試薬（EGTA−（0 mM））を用いたときとEGTAの濃度が10 mM (反応混合物の総量に対する濃度は1 mM)の第一の試薬を用いたときとで顕著な差が確認された。
特に、検体番号S10、S12及びS15については、EGTA−の第一の試薬を用いたときは、60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達しなかった。これに対し、EGTAの濃度が10 mM (反応混合物の総量に対する濃度は1 mM)の第一試薬を用いた場合、全ての検体において60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。【００９７】
(ii) 陽性尿の検出結果
陽性尿の検出結果を以下の表１３に示す。
表１３
【表１３】
2013147043.tif 000016
【００９８】
上記表１３に示すように、被験試料として陽性尿を用いた場合、検体番号S2〜S5において、EGTAを含まない第一の試薬（EGTA−（0 mM））を用いたときとEGTAの濃度が10 mM (反応混合物の総量に対する濃度は1 mM)の第一の試薬を用いたときとで顕著な差が確認された。
特に、検体番号S2及びS5については、EGTA−の第一の試薬を用いたときは、60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、EGTAの濃度が10 mM (反応混合物の総量に対する濃度は1 mM)の第一試薬を用いた場合、全ての検体において60分以内にFluorescence（dR）が4000に到達し、陽性を示した。【００９９】
以上、本実施例の結果から、CMVに感染したヒトから採取した陽性尿を用いた場合にも、EGTAを含む第一の試薬、及びSmartAmp法により標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第二の試薬を用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、尿に含まれるHCMV由来の標的核酸を検出できることが示された。また、EGTAを含まない試薬を用いた場合には検出できなかった尿中のHCMV由来の標的核酸を、本発明により検出できることが示された。
【実施例７】
【０１００】
単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）陽性尿中の標的核酸の検出
本実施例では、単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）の標的核酸の検出を行った。また、標的核酸の検出に用いる試薬を第一の試薬と第二の試薬とに分けることなく、EGTAとLAMP法試薬とを含む単一の試薬を用いて検出を行った。【０１０１】
１．試薬の調製
まず、EGTAとLAMP法試薬とを含む試薬（以下「測定試薬」と称する）を調製した。測定試薬の組成及び作製方法を以下に示す。測定試薬の組成における濃度は、被験試料と測定試薬との混合物（反応混合物）の総量に対する最終濃度を示す。
（１）測定試薬の組成
2 x Reaction Mix          dNTPs                   各1.4 mM
DMSO                          5%
Tris-HCl(pH8.0)             20 mM
KCl                         10 mM
(NH4)2SO4                    10 mM
MgSO4                        8 mM
Tween20                     0.1%
SYBR（登録商標） Green I                            0.0012%
Aac DNA ポリメラーゼ                                     6U
プライマー混合液                                        5μM
EGTA                                                  0-5 mM
上記組成において、2 x Reaction Mix (D)及びAac DNA ポリメラーゼは株式会社ダナフォームから購入し、SYBR（登録商標） Green Iはタカラバイオ株式会社から購入した。また、プライマー混合液はシグマ アルドリッチ(Sigma-Aldrich)株式会社から購入した。【０１０２】
（２）プライマー混合液
上記プライマー混合液は、以下に示すHSV1 FIP、HSV1 BIP、HSV1 LPF、HSV1 LPB、HSV1 F3及びHSV1 B3の各プライマー（100μM）を8:8:4:4:1:1の比率で混合して作製した。各プライマーの塩基配列は、A.K. Reddy et al., Clin. Microbiol Infect, 2011; 17: 210-213のTable 1に従った。
HSV1 FIP (F1-F2)  5'- ccagacgttccgttggtaggtcttttactttgactgttcgcgcacc (配列番号１５)
HSV1 BIP (B1-B2)  5'- ccatcatcgccacgtcggactttttcggcgtctgctttttgtg  (配列番号１６)
HSV1 LPF  5'- aaatcctgtcgccctacacagcgg (配列番号１７)
HSV1 LPB  5'- caccccgcgacgggacgccg (配列番号１８)
HSV1 F3  5'- cagccacacacctgtgaa (配列番号１９)
HSV1 B3  5'- tccgtcgaggcatcgttag (配列番号２０)【０１０３】
２．単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）のウイルス陽性尿
健常のヒトから採取された尿にHSV-1溶液を添加した試料（ウイルス陽性尿）を被験試料として用いた。被験試料に含まれるHSV-1溶液の割合は0.25%である。尿は採尿パック又は紙コップにて採取した。また、HSV-1は ABI社（Advanced Biotechnologies Inc.）から購入することにより得た。【０１０４】
３．ウイルス陽性尿中の標的核酸の検出
（１）方法
0.2 mL用のPCRチューブ（Agilent Technologies社）に加熱処理（９５℃で３０秒）を行った被験試料及び上記測定試薬を添加し、スピンダウンした後、Mx3000p QPCR System（Agilent Technologies Inc.）を用いてLAMP法による核酸増幅反応及び標的核酸の検出を行った。下記の表１４は、被験試料と測定試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。
表１４
【表１４】
2013147043.tif 000017
【０１０５】
LAMP法による核酸増幅反応及び標的核酸の検出は、以下の条件にて行った。
反応時間：65℃、45分間の反応（下記の検討１）。
63℃、45分間の反応（下記の検討２）。
測定波長：励起 492nm、蛍光 516nmにて検出。
検出の判定基準：Fluorescence（dR）が1000に到達する時間（分）を比較し、LAMP法での一般的な判定時間である45分以内に1000に到達した場合を検出した。【０１０６】
（２）検出結果
（２−１）検討１
上記反応混合物中のEGTAの濃度を変化させ、被験試料（ウイルス陽性尿（検体１６））における標的核酸の検出を行った。その結果を表１５に示す。
表１５
【表１５】
2013147043.tif 000018
【０１０７】
その結果、上記表１５に示すように、EGTAを含まない（0 mM）測定試薬を用いた場合は、検体１６において45分以内にFluorescence（dR）が1000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、反応混合物の総量に対する濃度が0.2mM以上となる濃度でEGTAを含む測定試薬を用いた場合、45分以内にFluorescence（dR）が1000に到達し、陽性を示した。【０１０８】
（２−２）検討２
次に、複数の被験試料（検体１７〜２０）における標的核酸の検出を行った。測定試薬としては、EGTAを含まない（0 mM）測定試薬と、反応混合物の総量に対する濃度が1mMとなる濃度でEGTAを含む測定試薬を用いた。
検出結果を以下の表１６に示す。
表１６
【表１６】
2013147043.tif 000019
【０１０９】
上記表１６に示すようにEGTAを含まない（0 mM）測定試薬を用いた場合は、全ての検体において45分以内にFluorescence（dR）が1000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。これに対し、反応混合物の総量に対する濃度が1mMとなる濃度でEGTAを含む測定試薬を用いた場合、全ての検体において45分以内にFluorescence（dR）が1000に到達し、陽性を示した。【０１１０】
本実施例の結果から、EGTAと標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドとを含む測定試薬を用いることにより、被験試料から核酸を精製することなく、尿に含まれるHSV-1由来の標的核酸を検出できることが示された。また、反応混合物の総量に対するEGTAの濃度が0.2 mM以上となるようにEGTAを含む測定試薬を用いることにより、45分以内に尿に含まれるHSV-1由来の標的核酸を迅速に検出できることが示された。さらに、反応混合物の総量に対するEGTAの濃度が上記式A又はBで算出される濃度以上となるようにEGTAを含む測定試薬を用いることにより、EGTAを含まない試薬を用いた場合には検出されなかった尿中のHSV-1由来の標的核酸を検出できることが示された。【０１１１】
また、上記の結果により、本発明によってウイルス感染又は細菌感染が検出できることが示された。さらに、検出蛍光強度の閾値（Threshold）に達する時間を基準として陽性及び陰性を判断することにより、本発明はウイルス感染又は細菌感染の診断に使用することができることが示された。【０１１２】
［比較例］
その他の金属イオン結合性化合物を含む試薬及びSmartAmp法試薬を用いたウイルス陽性尿中の標的核酸の検出
１．方法
本比較例では、本発明で使用される化合物に代えて、その他の金属イオン結合性化合物を用いてウイルス陽性尿に含まれる標的核酸の検出試験を行った。
その他の金属イオン結合性化合物としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸ナトリウム及びシュウ酸ナトリウムを用いた。
本発明の化合物の代わりにこれら金属イオン結合性化合物を使用した以外は、実施例２と同様に検出試験を行った。
下記の表１７は、本比較例における被験試料と第一の試薬と第二の試薬との混合物（反応混合物）の組成を示す。
表１７
【表１７】
2013147043.tif 000020
【０１１３】
（２）検出結果
検出結果を以下の表１８に示す。
表１８
【表１８】
2013147043.tif 000021
表中、「−」は、測定していないことを示す。【０１１４】
上記表１８に示すように、本発明で使用される化合物に代えて、EDTA、クエン酸ナトリウム、又はシュウ酸ナトリウムなどの金属イオン結合性化合物を用いた場合、いずれの濃度においても、60分以内に検出蛍光強度Fluorescence（dR）が4000に到達しなかった（すなわち検出結果は陰性であった）。【０１１５】
本比較例の結果から、本発明に使用される化合物に代えて、EDTA、クエン酸ナトリウム、又はシュウ酸ナトリウムなどの金属イオン結合性化合物を用いた場合、尿に含まれるHCMV由来の標的核酸は一定時間内に検出できないことが示された。
この結果は、本発明に使用される化合物が、一般にキレート剤として知られるEDTA、クエン酸ナトリウム、又はシュウ酸ナトリウムなどの金属イオン結合性化合物から予測できるものではなく、また、これらの金属イオン結合性化合物と比較して顕著な効果を有することを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明により、生体試料から核酸を精製することなく、当該生体試料に含まれる標的核酸を迅速かつ高精度に検出することができる、新規の核酸検出用試薬キット及び検出方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号４〜２０：合成DNA
【配列表】
2013147043000001.app
【国際調査報告】
2013147043.tif 000022
2013147043.tif 000023
2013147043.tif 000024
2013147043.tif 000025
2013147043.tif 000026
2013147043.tif 000027
2013147043.tif 000028
2013147043.tif 000029