(57)【要約】本発明は、中鎖脱水素酵素／還元酵素（ＭＤＲ）ファミリー酵素の補酵素依存性を変換する酵素改変方法の提供を課題とする。また本発明は、該改変方法により補酵素依存性が転換されたＭＤＲファミリー酵素変異体の提供、および、該酵素を応用して酵素的に光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。ＭＤＲファミリー酵素の補酵素依存性を変換する酵素改変方法を新たに開発し、該酵素改変方法により、ＮＡＤＨを補酵素として利用する有用なＭＤＲファミリー酵素から、ＮＡＤＰＨを補酵素として利用する酵素変異体を論理的に設計し、実際にそのような機能を有する変異体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属し、下記の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１のＡｓｐ−２０１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｌａ、又はＳｅｒである、
（ｂ）配列番号１のＬｙｓ−２０２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｒｇである、
（ｃ）配列番号１のＬｙｓ−２０３と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｓｅｒである、及び、
（ｄ）配列番号１のＡｌａ−２０６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｌｙｓである、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（ｅ）〜（ｈ）：
（ｅ）Ａｓｐ−２０１を、Ａｌａ、又はＳｅｒに置換、
（ｆ）Ｌｙｓ−２０２を、Ａｒｇに置換、
（ｇ）Ｌｙｓ−２０３を、Ｓｅｒに置換、及び、
（ｈ）Ａｌａ−２０６を、Ｌｙｓに置換、
から選択される少なくとも１つの変異が導入されたアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号２〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ：
（Ｂ）配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ：
（Ｃ）配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体の培養物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を変換させて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を得る工程を含む、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のタンパク質を用いて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を変換させて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を得る工程を含む、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法で得られる酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、還元酵素を作用させることによる、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法で得られる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、酸化酵素を作用させることによる、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の形質転換体、または、請求項９に記載の培養物を利用することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の製造方法によって製造された化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール脱水素酵素の補酵素依存性の改変法、特に中鎖脱水素酵素／還元酵素（ＭＤＲ：Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ  Ｄｅｈｙｒｄｒｏｇｅｎａｓｅ／Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の補酵素依存性の改変法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、酸化還元酵素を用いた光学活性アルコール類の製造においては補酵素を必要とするので、反応の進行による補酵素の枯渇を回避するために、酸化還元と並行して補酵素の効率的な再生を行うことが重要な課題である。光学活性アルコール類の製造において必要となる補酵素としては、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ、なお、酸化型をＮＡＤＰ＋と記す）、または、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ、なお、酸化型をＮＡＤ＋と記す）などの、ピリジンヌクレオチド補酵素が挙げられる。これらの補酵素を再生する方法として、例えば、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）などを用いる方法が知られている。【０００３】
従来、優れた物性（安定性、溶剤耐性、酸化耐性）や比活性を有するアルコール脱水素酵素は存在したが、補酵素依存性が最適化されておらず、ＮＡＤＰＨ或いはＮＡＤＨのいずれを再生しても、光学活性アルコール類の生産性が制限されていた。アルコール脱水素酵素の補酵素依存性を、補酵素再生酵素の補酵素依存性、すなわちＮＡＤＰＨ型かＮＡＤＨ型のいずれか、に最適化することが可能となれば、光学活性アルコール等の製造におけるプロセスの最適化が容易となり、より効率的な製造方法を提供し得ると考えられる。【０００４】
補酵素依存性が転換された酵素を変異スクリーニングで取得することは、膨大な労力を要するため、補酵素依存性が転換された酵素変異体を、酵素の立体構造情報を考慮して、論理的に設計する試みがなされてきた（特許文献１、非特許文献１）。【０００５】
アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）も、この論理的設計によって、補酵素依存性が転換された変異体が取得されている代表的な酵素ファミリーと言える。このうち、アミノ酸残基数が２５０程度の短鎖脱水素酵素／還元酵素（ＳＤＲ：Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）ファミリーの酵素については、補酵素依存性の転換に成功した例が近年報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、アミノ酸残基数３５０程度の中鎖脱水素酵素／還元酵素（ＭＤＲ）ファミリーについては、同様の報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０３／００４６５３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｅｎｎｉｎｇ  Ｔ．Ｍ．他  著、「Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．」、２００１年、１０１巻、３０２７−３０４６頁
【非特許文献２】Ｍａｃｈｉｅｌｓｅｎ  Ｒ．他  著、「Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．」、２００８年、９巻、３８−４４頁
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ  Ｒ．他  著、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、２００９年、２１７６−２１８３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アルコール脱水素酵素の、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨのいずれかに対する依存性を最適化し、補酵素再生系を共役させた場合の光学活性アルコール類の生産性を向上させることを課題とする。【０００９】
しかし、種類や相同性が異なる酵素の論理的設計を、ＭＤＲにそのまま適応することは不可能であった。さらに、アルコール脱水素酵素として、約３５０アミノ酸残基からなるＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリー酵素を使用する場合、変異を導入する位置の候補は、１個の変異を導入する場合でも３５０箇所存在し、変異を複数個導入する場合には膨大な数の候補が存在することになる。さらに、それぞれの位置において、少なくとも１９種類のアミノ酸への置換が可能となり、これらの無数の候補から補酵素への依存性を転換させた変異体を同定することは極めて困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリーに属する酵素の補酵素依存性を変換する酵素改変方法を新たに開発し、３５０箇所もの候補から変異を導入する位置を４箇所に絞込み、かつ、変異後のアミノ酸として、１９種類存在する天然アミノ酸の中から、最適なアミノ酸を決定することに成功した。これにより、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋依存性ＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリー酵素からＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋依存性酵素変異体を取得し、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋依存性ＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリー酵素からＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋依存性酵素変異体を取得することに成功した。【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］中鎖酸化還元酵素ファミリーに属し、下記の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１のＡｓｐ−２０１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｌａ、又はＳｅｒである、
（ｂ）配列番号１のＬｙｓ−２０２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｒｇである、
（ｃ）配列番号１のＬｙｓ−２０３と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｓｅｒである、及び、
（ｄ）配列番号１のＡｌａ−２０６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｌｙｓである、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するタンパク質、
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、［１］に記載のタンパク質、
［３］配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（ｅ）〜（ｈ）：
（ｅ）Ａｓｐ−２０１を、Ａｌａ、又はＳｅｒに置換、
（ｆ）Ｌｙｓ−２０２を、Ａｒｇに置換、
（ｇ）Ｌｙｓ−２０３を、Ｓｅｒに置換、及び、
（ｈ）Ａｌａ−２０６を、Ｌｙｓに置換、
から選択される少なくとも１つの変異が導入されたアミノ酸配列からなる、［１］又は［２］に記載のタンパク質、
［４］配列番号２〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
［６］以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ：
（Ｂ）配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ：
（Ｃ）配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡ、
［７］［６］に記載のＤＮＡを含むベクター、
［８］［７］に記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、
［９］［８］に記載の形質転換体の培養物、
［１０］［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を変換させて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を得る工程を含む、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法、
［１１］［１］又は［２］に記載のタンパク質を用いて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を変換させて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を得る工程を含む、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法、
［１２］［１０］に記載の方法で得られる酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、還元酵素を作用させることによる、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法、
［１３］［１１］に記載の方法で得られる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、酸化酵素を作用させることによる、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の製造方法、
［１４］［８］に記載の形質転換体、または、［９］に記載の培養物を利用することを特徴とする、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の製造方法、
［１５］［１０］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法によって製造された化合物、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、特に中鎖脱水素酵素／還元酵素（ＭＤＲ）ファミリーの補酵素依存性が最適化されるので、補酵素再生系を共役させた場合の、光学活性アルコール類の生産性を向上させることができる。【００１３】
ＮＡＤＰ＋還元酵素として、物性に優れる乳酸菌由来ＧＤＨが近年発見されている（国際公開第０９／０４１４１５号パンフレット）。しかし、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）由来のＭＤＲファミリー酵素ＲＭＡは、野生型ではＮＡＤＨ依存性であるため、補酵素再生酵素として、ＮＡＤＰ＋還元酵素である乳酸菌由来ＧＤＨを用いることは難しい。これに対し、補酵素依存性の転換によって得られた本発明のタンパク質であれば、乳酸菌由来の、ＮＡＤＰ＋還元酵素であるＧＤＨを補酵素再生酵素として用いることができ、製造プロセス構築上のメリットは極めて大きい。【００１４】
また、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋依存性酵素を利用する反応と、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋依存性酵素を利用する反応を、一つの反応溶液中で実施する多段階反応の場合において、補酵素依存性を変えることができるので、本技術が反応プロセス最適化に及ぼすメリットは大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例４に係る反応模式図である。
【図２】本発明の実施例４に係る反応における、光学活性アルコールの変換率と光学純度の分析結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。
【００１７】
本発明のタンパク質は、中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属するタンパク質にアミノ酸置換変異を導入して得られる。中鎖脱水素酵素／還元酵素（Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＭＤＲ）ファミリーは、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ、ＥＣ１．１．１．１．）に属するファミリーの１つであり、３５０〜３７５残基からなり、ほとんどが亜鉛（Ｚｎ）を含有する。中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーは、各種バイオインフォマティクス・データーベースで登録・分類・定義付けされている。例えば、Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）のファミリーＩＤ「ＰＦ００１０７」と関連付けられる酵素は、すべて中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属し、２０１１年４月時点で、２０，０００を超える配列が登録されている。中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属する酵素は、アルコール発酵、アルデヒド解毒、リグニンの生合成、脂肪酸の生合成、または、酸化ダメージからの保護、などの幅広い生理的機能に関与する。
【００１８】
中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属するタンパク質は、補酵素としてピリジンヌクレオチドを必要とする。ピリジンヌクレオチドとは、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型をＮＡＤＰＨ、酸化型をＮＡＤＰ＋と記す）、または、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型をＮＡＤＨ、酸化型をＮＡＤ＋と記す）のことを指す。
【００１９】
また、新規に発見された未登録の配列であっても、中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー酵素と配列相同性が高ければ、中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー酵素に分類される。「配列相同性」は、先述のプログラムＢＬＡＳＴを用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析において相同性を評価する際には、Ｅ−ｖａｌｕｅという統計値を用いるのが良く、相同性が高ければ高い程、限りなくこの値が０に近くなる。配列相同性からＭＤＲファミリー酵素であるかどうかを判断するには、公知のＭＤＲファミリー酵素に対して、Ｅ−ｖａｌｕｅが１×１０−５以下であることが好ましく、１×１０−１０以下であることがより好ましく、１×１０−１５以下であることがさらに好ましい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して、利用可能である。
【００２０】
アミノ酸置換変異を導入する対象となる中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー酵素として、プロテイン配列データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）収載の酵素であることが好ましい。ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋依存性に変換する技術を応用できるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋依存性中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー酵素としては、例えば、酵母由来ＡＤＨ１（Ｐ００３３０）、バチルス由来ＡＤＨ−ＨＴ（Ｐ４２３２８）、および、ヒト由来ＡＤＨ１β（Ｐ００３２５）などが挙げられる。同様に、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋依存性に変換する技術を応用できるＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋依存性ＭＤＲファミリー酵素としては、例えば、酵母由来ＡＤＨ６（Ｑ０４８９４）、アメリカヤマナラシ由来シナピルＡＤＨ（Ｑ９４Ｇ５９）、および、ヒト由来ＰＩＧ３（Ｑ５３ＦＡ７）などが挙げられる。なお、括弧内は前記データベース中のコード番号である。
【００２１】
変異導入前のタンパク質は、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）由来のＭＤＲファミリーに含まれる酵素（国際公開第０８／０６６０１８号パンフレット、以下ＲＭＡと略す）に対して、高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。「配列同一性」は、相同な領域の中で完全に一致しているアミノ酸残基の数が占める割合であり、先述のＢＬＡＳＴ分析で求めることができ、「Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ」で表記される。
【００２２】
変異導入前のタンパク質の、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。変異導入前のタンパク質は、最も好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、このタンパク質は、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）由来のＭＤＲファミリー酵素（国際公開第０８／０６６０１８号パンフレット、以下ＲＭＡと略す）である。ＲＭＡは、例えば、ＮＡＤＨを補酵素として、ケトンを還元して、光学活性アルコールを生成する反応を触媒する。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＭＡ）にアミノ酸置換変異を導入して本発明のタンパク質を設計した場合、補酵素依存性をＮＡＤＨ依存性から、ＮＡＤＰＨ依存性に転換することが可能である。本発明はこのＲＭＡ（配列番号１）のモデリング立体構造を利用することにより達成されている。
【００２３】
立体構造上同等な位置のアミノ酸残基とは、アミノ酸配列情報をもとに変異導入前のタンパク質の立体構造を予測して、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の立体構造と比較した場合に、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質においてと同等の位置に存在するアミノ酸残基のことを指す。
【００２４】
以下に、変異導入前のタンパク質として配列番号１を使用した場合の、アミノ酸置換変異の論理的設計方法を例示する。ＲＭＡの立体構造の論理的設計は、ＲＭＡのモデリング立体構造を利用することにより、達成可能である。なお、配列番号１で示される野生型ＲＭＡに関して、Ｘ線結晶構造解析をはじめとする構造解析等の実験は行われておらず、その立体構造は未知である。
【００２５】
ＲＭＡのアミノ酸配列情報に基づき、プログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．他  著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」１９９４年、２２巻、４６７３−８０頁）により、アミノ酸配列ホモロジーを有しかつ立体構造がプロテインデータバンク(ＰＤＢ)に登録されている酵素との多重アミノ酸配列アラインメントを作成する。ＲＭＡとアミノ酸配列ホモロジーを有するタンパク質は、ＰＤＢに登録されたタンパク質のアミノ酸配列を対象に、プログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．他  著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」１９９７年、２５巻、３３８９−３４０２頁）、または、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ(Ｓｈａｆｆｅｒ  Ａ．Ａ．他  著、「Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ」、２０００年、１６４巻、８８−４８９頁)を用いたアミノ酸配列ホモロジーの検索を行うことで選択し得る。
【００２６】
次に、これら立体構造既知のタンパク質の三次元立体構造アラインメントを、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ(Ｇｕｅｘ  Ｎ．他  著、 「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、１９９７年、１８巻、２７１４−２７２３)などの三次元グラフィックス・プログラムや、ＶＡＳＴ  Ｓｅａｒｃｈ（Ｇｉｂｒａｔ  Ｊ．Ｆ．他  著、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．」１９９６年、６巻、３７７−）などの立体構造比較・類似構造検索サーバにより行う。先にアミノ酸配列のみから得られた多重アラインメントを立体構造の類似性に基づいて修正し、得られた配列アラインメントに基づいて、立体構造の類似性が高いと推定されるタンパク質の立体構造（ＰＤＢコード：１ＬＬＵ）を分子モデリングの雛形タンパク質として選択する。この雛形タンパク質をプログラムＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒで表示させ、配列アラインメントに従って、ＲＭＡのアミノ酸配列（配列番号１）に適合するようアミノ酸残基の置換を行う。挿入、欠失部位については、ＰＤＢから最適な類似部分構造を検索し、その部分構造に置換することにより立体構造モデルを構築する。
【００２７】
この立体構造モデルを基に、補酵素結合ポケット周辺を中心に、補酵素との結合に大きく影響を与え、かつ、補酵素結合性以外の機能への影響がほとんどないと予測される部位（残基）を特定する。次に、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨをバーチャルにドッキングさせた立体構造モデル構築、および、そのドッキング構造を利用した計算化学手法による自由エネルギー計算によって、ＮＡＤＨへの親和性が低くなり、かつ、ＮＡＤＰＨへの親和性が高くなる変異を設計する。一般的に、酵素（タンパク質）と補酵素（基質）複合体の安定性については、自由エネルギーによって議論することが可能である（Ａ．Ｒ．リーチ  著、「分子モデリング概説」、２００４年、第１１章）。
【００２８】
分子モデリング構造（主鎖のフレームワーク）を利用すれば、分子力場法を利用した分子シミュレーション計算（エネルギー極小化計算）によって、補酵素が結合していない状態（ａｐｏ）と補酵素が結合している状態（ｈｏｌｏ）の自由エネルギー差分値を算出することができる。この論理の詳細は、目的タンパク質に結合するドラッグをデザインする手法の応用と言える。ＬＢＤＤリガンド・ベースこの自由エネルギー差が、野生型と比べて、ＮＡＤＨの場合にはａｐｏに有利で、かつ、ＮＡＤＰＨの場合にはｈｏｌｏに有利である、という傾向が特に強くなる変異が、補酵素依存性を転換するのに有用であると言える。具体的には、プログラムＳｈｒｉｋｅ（特許公開第２００１−１８４３８１号公報）を用いた計算機スクリーニングにより、アミノ酸変異候補の絞込みを行う。
【００２９】
上記の方法により、３５０残基程度からなるＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリー酵素における補酵素の認識に重要な部位を抽出し、かつ、目的とする補酵素依存性を獲得するために最適な各部位のアミノ酸の種類（および、その組み合わせ）を見出すことができる。ＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリー酵素において、配列番号１における２０１位、２０２位、２０３位、または、２０６位と、立体構造上同等な位置を同定することは、容易である。立体構造上同等な位置は、先述のＶＡＳＴ  Ｓｅａｒｃｈなどの立体構造比較・類似構造検索サーバを利用し、立体構造既知のアミノ酸配列（例えば、今回の発明に用いたＰＤＢコード：１ＬＬＵのアミノ酸配列）と、立体構造をベースにしたアミノ酸配列のアラインメントを行うことで容易に同定することができる。このＶＡＳＴ  ＳｅａｒｃｈもＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して利用可能である。
【００３０】
本発明のタンパク質は、中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属し、下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１のＡｓｐ−２０１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｌａ、又はＳｅｒである、
（ｂ）配列番号１のＬｙｓ−２０２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｒｇである、
（ｃ）配列番号１のＬｙｓ−２０３と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｓｅｒである、及び、
（ｄ）配列番号１のＡｌａ−２０６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｌｙｓである、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有することが好ましい。
【００３１】
さらに、中鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリーに属し、下記（ｅ）〜（ｇ）：
（ｅ）配列番号１のＡｓｐ−２０１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｓｅｒである、
（ｆ）配列番号１のＬｙｓ−２０２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ａｒｇである、及び、
（ｇ）配列番号１のＡｌａ−２０６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基が、Ｌｙｓである、
のアミノ酸残基を全て含むことがより好ましい。
【００３２】
上記（ａ）〜（ｄ）、又は（ｅ）〜（ｇ）の変異導入により、補酵素依存性がＮＡＤＨ（またはＮＡＤ＋）依存性であるアルコール脱水素酵素を、ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＰ＋）依存性に転換することが可能である。
【００３３】
変異導入後のタンパク質の、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。変異導入後のタンパク質は、具体的には、配列番号２〜８に示すアミノ酸配列を有することが好ましく、配列番号２〜３に示すアミノ酸配列を有することがより好ましい。
【００３４】
また、本発明のタンパク質は、アルコール脱水素活性を有し、下記（ｉ）〜（ｌ）：
（ｉ）配列番号１のＡｓｐ−２０１と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基がＡｓｐである、
（ｊ）配列番号１のＬｙｓ−２０２と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基がＬｙｓである、
（ｋ）配列番号１のＬｙｓ−２０３と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基がＬｙｓである、及び、
（ｌ）配列番号１のＡｌａ−２０６と立体構造上同等な位置のアミノ酸残基がＡｌａである、
から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有することが好ましい。
【００３５】
上記（ｉ）〜（ｌ）の変異導入により、補酵素依存性がＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＰ＋）依存性であるアルコール脱水素酵素を、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤ＋）依存性に転換することが可能である。
【００３６】
本発明のタンパク質は、変異導入前に高い酸化（または還元、以後「酸化／還元」と略す）活性を示していた補酵素に対する酸化／還元活性が低下することが好ましい。或いは、変異導入前に低い酸化／還元活性を示していた（または全く示さなかった）補酵素に対する酸化／還元活性が向上することが好ましい。さらに、本発明のタンパク質は、これらの両方の特徴を有することがより好ましい。
【００３７】
補酵素酸化／還元活性比とは、変異導入後に依存性を示した補酵素の酸化／還元活性を、変異導入前に依存性を示したもう一方の補酵素の酸化／還元活性で割った値のことをいう。例えば、ＲＭＡの場合には、補酵素酸化／還元活性比は、酸化活性比（ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ）で表される。補酵素酸化／還元活性比は、１以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましい。変異導入後に依存性を示す補酵素のみを選択的に酸化／還元したい場合、厳密な補酵素選択性を求められるので、２０以上であることがさらにより好ましく、より厳密な補酵素選択性を求める場合には、３０以上であることが最も好ましい。例えば、ニコチンアミド補酵素依存性の酵素を利用する２つの反応を同時に行うときに、お互いの酵素の補酵素依存性が違う場合には、通常は厳密な選択性が求められる。なお、変異導入前の補酵素酸化／還元活性比は高くても０．１程度であり、これより大きければ、そもそも両方に依存性を示す酵素である。
【００３８】
補酵素酸化／還元活性は、ＲＭＡの場合、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）をＮＡＤＰ＋(ＮＡＤ＋)に酸化する酵素活性を１Ｕｎｉｔと定義して算出する。変異導入前後で、補酵素酸化／還元活性を算出するための反応液組成や酵素濃度は同一条件とする。補酵素酸化／還元活性の測定条件は、ＲＭＡの場合、ｐＨ４．０〜１０．０、温度４℃〜８０℃の一定温度下で、一定時間の通気攪拌処理する条件であることが好ましいが、組み合わせる補酵素再生酵素の物性を考慮して設定しても良く、これらに限定されるものではない。本発明のタンパク質は、補酵素依存性が転換されるという特徴を除けば、例えば基質特異性などの、本来の機能を維持している。
【００３９】
本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードする塩基配列からなる。後述する方法に従って、導入された宿主細胞内で本発明のタンパク質を発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。タンパク質を設計できれば、変異を導入する前のタンパク質の起源となる生物より、当業者に公知の方法で変異を導入する前のＤＮＡを取得し、変異を導入することにより、本発明のＤＮＡを取得できる。
【００４０】
野生型ＭＤＲファミリー酵素をコードするＤＮＡへの部位特異的な変異の導入は、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、野生型酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、野生型コード遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異プライマーと前記遺伝子の一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーでもう片側を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニーリング操作後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲ操作することにより、行うことができる。これらの組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法の他に、変異を導入したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成して取得してもよい。
【００４１】
このようにして得られる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００４２】
また、本発明のＤＮＡとして、配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００４３】
また、本発明のＤＮＡとして、配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
ここで、「配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ」とは、配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつ酸化還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを意味する。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００４６】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４７】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２５〜３１のいずれかに記載の塩基配列と、配列同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のＤＮＡを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、酸化還元酵素活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００４８】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００４９】
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡを挿入するための空ベクターは、宿主細胞中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ等のプラスミドＤＮＡや、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を使用可能である。酵母を宿主細胞として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を使用可能である。植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を使用可能であり、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ等をベクターとして使用可能である。
【００５０】
本発明の形質転換体は上記ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる。宿主生物は、コードＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするタンパク質を発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率の点で細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。
【００５１】
形質転換する方法としては、細菌へ組換え体ＤＮＡを導入する場合、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００５２】
本発明の培養物は、上記形質転換体を培地で培養することで得られる。形質転換体を培地で培養し、培養菌体中または培養上清中にタンパク質を生成蓄積させ、前記酵素変異体を採取することにより、本発明のタンパク質を含む培養物を得ることができる。
【００５３】
形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、ＴＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度２０〜４０℃で好気的に培養することにより本発明の酵素変異体を菌体内に蓄積させ、回収する。酵素変異体の精製は、前述した培養法により得られる培養物を遠心分離して回収し、細胞についてはソニケーター等にて破砕し、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。形質転換体の培養物の精製処理とは、酵素活性を失うことなく、目的の酵素以外の不純物を除くことであり、精製処理物とは、前記の処理によって得られた酵素含有物である。精製処理物としては、例えば、細胞を破砕することで得られる無細胞抽出液や、精製して得られた酵素溶液、あるいは、酵素溶液の凍結乾燥物が挙げられる。
【００５４】
アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質に上記（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換変異を導入して得られるタンパク質は、置換変異導入前のタンパク質と比較して、ＮＡＤＰＨに対する依存性が向上し、ＮＡＤＨに対する依存性が低下する。従って、このタンパク質を用いて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を変換させて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を得ることができる。
【００５５】
また、この反応は平衡反応であることから、このタンパク質を用いて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を変換させて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を得ることもできる。
【００５６】
アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質に上記（ｉ）〜（ｌ）から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換変異を導入して得られるタンパク質は、置換変異導入前のタンパク質と比較して、ＮＡＤＨに対する依存性が向上し、ＮＡＤＰＨに対する依存性が低下する。従って、本発明のタンパク質を用いて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を変換させて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を得ることができる。
【００５７】
また、この反応は平衡反応であることから、このタンパク質を用いて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を変換させて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を得ることもできる。
【００５８】
本発明のタンパク質の反応系において補酵素再生系を共役させることにより、光学活性アルコールの生産性を向上させることが可能である。
本発明のタンパク質を用いて製造した酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に、補酵素再生系を作用させることにより、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を製造することが可能である。このような補酵素再生系は、酸化型補酵素を還元する活性を有する酵素であり、具体例として、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、及びリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）が挙げられる。
【００５９】
また、本発明のタンパク質を用いて製造した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に、補酵素再生系を作用させることにより、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を製造することが可能である。このような補酵素再生系は、還元型補酵素を酸化する活性を有する酵素であり、具体例として、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、及びリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）が挙げられる。
【００６０】
これらの還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、或いは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の製造は、上述の形質転換体及びその培養物を使用して行うことができる。
【実施例】
【００６１】
アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２０１位のＡｓｐをＡｌａに置換する変異は、Ｄ２０１Ａと記載する。【００６２】
（実施例１）ＲＭＡ変異体遺伝子を含む組換えベクターの作製、および、組換え大腸菌の作製
キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）由来のＭＤＲ（中鎖脱水素酵素／還元酵素）ファミリー酵素（国際公開第０８／０６６０１８号パンフレット、以下ＲＭＡと略す）の変異体を大腸菌において発現させるために、同文献に記載のｐＮＣＭベクター（ＲＭＡ野生型発現プラスミド）を用いて、各種変異体の発現プラスミドを調製した。【００６３】
変異の導入については、ｐＮＣＭベクターを鋳型として、意図した部位に変異を導入できるよう設計した２種の合成プライマーを用いるクイックチェンジ法にて、各種ＲＭＡ変異体遺伝子を含む組換えプラスミドを得た。クイックチェンジ法に関しては、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコルに従って行った。まず、ｐＮＣＭ（配列番号９）を鋳型ＤＮＡとして、配列番号１０〜１１で示した用いた２種の合成プライマーを用いて、クイックチェンジ法を実施し、変異Ａ２０６Ｋが導入されたＲＭＡ変異体発現プラスミドを調製した。得られた発現プラスミドのコードＤＮＡ配列を配列番号１２に示す。なお、クイックチェンジ法は、形質転換もプロトコルに含む変異導入法であり、本実施例では、大腸菌ＨＢ１０１（Ｔａｋａｒａ社製）を形質転換し、組換え大腸菌を作製した。配列番号９（野生型）、または、配列番号１２（変異体Ｋ２０６Ｒ）のコードＤＮＡを含む発現プラスミドを鋳型として、配列番号１３〜２２の合成プライマーを、上記と同様の手法にて２種類だけ利用したクイックチェンジ法を実施して、配列番号２〜８のアミノ酸配列をコードする各々の発現プラスミド、および、形質転換した組換え大腸菌を調製した（各々の発現プラスミドのコードＤＮＡ配列は、配列番号２５〜３１に示す）。この実験における、各種変異体発現プラスミドのアミノ酸／コードＤＮＡ配列、および、調製時に用いた鋳型ＤＮＡプラスミド／変異導入プライマーの配列番号の対応付けを表１にまとめた。【００６４】
変異体発現プラスミド  配列番号対応表
【表１】
2013002277.tif 000002
【００６５】
（実施例２）組換え大腸菌によるＲＭＡ変異体の発現・無細胞抽出液の調製
実施例１で得たそれぞれの組換え大腸菌ＨＢ１０１を、半合成培地（グリセリン１．５％（ｗ／ｖ）、イーストエキス  ０．３％（ｗ／ｖ）、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．６％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＨＰＯ４  ０．３％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ  ０．２％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５％（ｗ／ｖ）、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃にて６０時間培養し、それぞれの培養液を集菌し培養上清を除いた後、培地と等量の緩衝液（１００ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕法により破砕し、再度遠心によって上清を回収することで、無細胞抽出液を得た。【００６６】
（実施例３）ピリジンヌクレオチドの酸化活性測定
反応基質としてケトン化合物を加えた下記の溶液に、実施例２で得られた各種ＲＭＡ変異体含有無細胞抽出液を添加し、それらのＮＡＤＰＨ酸化活性、および、ＮＡＤＨ酸化活性を測定した。【００６７】
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．６Ｍ  ２−ブタノン（メチルエチルケトン、ＭＥＫ）からなる反応溶液０．９５ｍＬに、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、一定温度（２５℃）での波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に酸化する酵素活性を１Ｕｎｉｔと定義した。なお、測定の便宜上、必要に応じて、１分間に３４０ｎｍの吸光度の減少が０．１〜０．４程度になるように、無細胞抽出液を上記リン酸カリウム緩衝液にて希釈したものを、酵素溶液として用い、希釈倍率を考慮して酵素活性を算出した。また、上記反応において、反応溶液のＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変えるだけで、後は同様の測定にて、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化する酵素活性も求めた。【００６８】
これらの測定結果を表２に示す。なお、酸化活性値は、野生型ＲＭＡとの相対値（％）で表記した。各種ＲＭＡ変異体は、変異導入前に高い酸化活性を示していたＮＡＤＨに対する酸化活性が５０分の１〜５００分の１程度に低下し、かつ、変異導入前に低い酸化活性を示していたＮＡＤＰＨに対する酸化活性が１０倍〜５０倍程度増加した。変異導入前は０．００３程度であった酸化活性比（ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ）が、変異導入後は１００〜２０００倍程度上がった。【００６９】
ＲＭＡ変異体の補酵素酸化活性
【表２】
2013002277.tif 000003
【００７０】
（実施例４）ＲＭＡ変異体によるケトン還元反応におけるＮＡＤＰＨ再生サイクルの構築
ＲＭＡ変異体（Ｄ２０１Ｓ／Ｋ２０２Ｒ／Ａ２０６Ｋ、配列番号２）を用いて、２−ブタノンを（Ｓ）−２−ブタノール（Ｓ−ＭＥＨ）へ還元する反応を行った。この反応系では、ＮＡＤＰＨがＮＡＤＰ＋に酸化されるが、この反応系に、乳酸菌由来ＮＡＤＰ＋依存性ＧＤＨ（ＧＤＨＬＰ、国際公開第０９／０４１４１５号パンフレット）とその基質であるグルコースを加え、ＮＡＤＰＨを再生するサイクルを同時に反応させた。この素反応の反応式（ＮＡＤＰＨ再生サイクル）を、図１に示した。乳酸菌由来ＮＡＤＰ＋依存性ＧＤＨの酵素液は、国際公開第０９／０４１４１５号パンフレットに記載されている手法と同様の手法にて調製した。【００７１】
反応液組成は、以下の通りである。
【表３】
2013002277.tif 000004
【００７２】
上記に記載の順に添加し、３０℃、ｐＨ５．５（ＮａＯＨを用いて下限をスタット）で３５時間反応させた。反応産物の分析はガスクロマトグラフィーの手法を用いて実施した。ガスクロマトグラフィー装置としては、ＳＩＭＡＺＵ  ＧＣ−１４Ｂ（株式会社島津製作所製)を利用した。Ｓ−ＭＥＨへの変換率は、ＴＣ−ＷＡＸ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用いて分析し、Ｓ−ＭＥＨの光学純度はＣｙｃｌｏｄｅｘ−β（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用いて分析した。【００７３】
分析系の条件は以下の通りである。
［Ｓ−ＭＥＨへの変換率：ガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＴＣ−ＷＡＸ（６０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
水素：５０ｋＰａ
カラム温度：５０℃
注入温度：２００℃
検出温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）
溶出時間：２−ブタノン（ＭＥＫ）    ４．８分
２−ブタノール（ＭＥＨ）  ７．１分【００７４】
［Ｓ−ＭＥＨの光学純度：ガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（６０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
水素：５０ｋＰａ
カラム温度：３５℃
注入温度：１５０℃
検出温度：１５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）
溶出時間： ２−ブタノンＭＥＫ  ６．５分
（Ｒ）−２−ブタノール（Ｒ−ＭＥＨ）  １１．０分
（Ｓ）−２−ブタノール（Ｓ−ＭＥＨ）  １１．４分【００７５】
図２に分析結果を示した。反応開始から４時間で変換率９７．１％を達成し、その時の光学純度は９９．７％であった。本発明で得られたＲＭＡ変異体を利用することで、物性に優れた乳酸菌由来ＮＡＤＰ＋依存性ＧＤＨを補酵素再生系として利用することができ、実際に、高価なＮＡＤＰＨを触媒量加えるだけで目的の光学活性アルコールを生産することが可能であることが、この結果から示された。【００７６】
（比較例１）野生型ＲＭＡ
野生型ＲＭＡ（配列番号１）については、鋳型に用いた発現プラスミド（ｐＮＣＭベクター）を用いて、大腸菌ＨＢ１０１（Ｔａｋａｒａ社製）を形質転換し、組換え大腸菌を作製した。実施例２と同様の手法にて無細胞抽出液を調製し、実施例３に倣って、ピリジンヌクレオチドの酸化活性測定を実施した。測定結果については、表２に併せて記載している。
【図１】
2013002277.tif 000005
【図２】
2013002277.tif 000006
【配列表】
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【国際調査報告】
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