(57)【要約】  平均直径が１〜５μｍのコラーゲン線維からなり、水分含有量０〜１５（ｗ／ｗ）％、コラーゲン密度５０〜８００ｍｇ／ｃｍ３であることを特徴とするコラーゲン構造体である。コラーゲン酸性溶液を中性にしてコラーゲン線維を生成させた後、濾過などによりコラーゲン濃度１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を形成する。この粗コラーゲン線維を所定形状に成形した後に乾燥して製造することができる。コラーゲン分子が会合してなるコラーゲン線維を材料とするため細胞浸潤性に優れ、かつコラーゲン密度が生体内のコラーゲン組織と等価であるため、生体の欠損部に充填すると組織再生力に優れ、再生医療用人工材料などに好適に使用することができる。
2013105665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均直径が１〜５μｍのコラーゲン線維からなり、水分含有量０〜１５（ｗ／ｗ）％、コラーゲン密度５０〜８００ｍｇ／ｃｍ３であることを特徴とする、コラーゲン構造体。
【請求項２】
更に、細胞走化因子、成長因子、細胞増殖因子、血液凝固因子および抗凝固因子からなる群から選択される１種以上の因子を含む、請求項１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項３】
医療用人工材料、疾患治療用部材、化粧用材料、または細胞培養材料として使用される、請求項１または２記載のコラーゲン構造体。
【請求項４】
コラーゲン酸性溶液を中性にしてコラーゲン線維を生成するコラーゲン線維生成工程、
前記コラーゲン線維を含有する溶液から前記コラーゲン線維を分取してコラーゲン濃度１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を形成する粗コラーゲン線維形成工程、
前記粗コラーゲン線維を所定形状に成形する成形工程、および
前記成形工程で得た成形物を乾燥する乾燥工程とを行うことを特徴とする、コラーゲン構造体の製造方法。
【請求項５】
前記粗コラーゲン線維形成工程に次いで、
前記粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒に分散させた後に前記親水性有機溶媒から前記コラーゲン線維を分取して脱水するコラーゲン線維脱水工程を行い、ついで、
前記脱水したコラーゲン線維を成形する成形工程を行うことを特徴とする、請求項４記載のコラーゲン構造体の製造方法。
【請求項６】
前記コラーゲン線維脱水工程に次いで、
前記脱水したコラーゲン線維を架橋処理および／または薬剤処理を行う処理工程を行い、ついで、
前記処理したコラーゲン線維を乾燥する乾燥工程を行うことを特徴とする、請求項５記載のコラーゲン構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン線維からなるコラーゲン構造体、および前記コラーゲン構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質である。コラーゲンは、動物間で相同性が高いため抗原性が低く、生体親和性や組織適合性に優れ、医用材料の素材として優れた特性を有する。生体組織に何らかの異常が生じた場合に移植組織を安定供給し、免疫拒絶反応を回避できる人工材料等として、コラーゲンを原料とする各種の部材が開発されている。【０００３】
例えば、合成樹脂などからなる担体に、ヘリックス含量が０〜８０％である変性コラーゲンを結合または被覆した細胞侵入性医用材料がある（特許文献１）。コラーゲンは組織親和性に優れるが、生体内でコラゲナーゼによって分解される。このような分解を回避するため架橋処理し、体内での残存性を高めたコラーゲンを使用する、というものである。特許文献１に記載の細胞侵入性医用材料は、生体内に埋入または創傷面に被覆した際に生体内の分解酵素に対して抵抗性を有し、一定期間必要な機械的強度を保持し、かつ細胞、組織に対する親和性が良好であり、増殖した細胞が容易にその内部に入り込みやすい、という。【０００４】
また、酢酸でコラーゲン希釈溶液のｐＨを調整した後にグルタルアルデヒドを添加し、凍結乾燥してなる架橋コラーゲンスポンジを人工皮膚として使用する技術もある（特許文献２）。コラーゲンスポンジを熱傷等の患部に埋植すると、その多孔質の構造により線維芽細胞の増殖に適した無数の孔を提供し、線維芽細胞の増殖を助けることで患部の治癒を促進することが知られているが、従来のコラーゲンスポンジは、コラーゲン溶液を発泡させて調製するため工程が複雑であった。上記特許文献２では、コラーゲン溶液を発泡することなくコラーゲンスポンジを調製できる、という。【０００５】
また、コラーゲンのミクロポーラスなハイドロゲルからなるコラーゲンスポンジもある（特許文献３）。特許文献３では、予め調製されたコラーゲンスポンジを、親水性有機溶剤の水溶液にて湿潤した後に凍結乾燥処理して乾燥することを特徴とする。コラーゲンスポンジは、人工皮膚や創傷被覆材等として使用できるが、従来のものは溶液中に湿潤させて保存するものであり、コラーゲンに変質をきたしやすい。一方、乾燥させて保存すると拘縮が発生する。特許文献３は、このような点に鑑みてなされたものである。実施例では、濃度０．３％の豚の腱由来のアテロコラーゲンを氷冷下でホモジナイズし、方形の型枠に入れて凍結させた後で真空凍結乾燥し、更に真空熱乾燥して架橋させた後、グルタールアルデヒド溶液に浸漬して架橋させている。このように調製されたコラーゲンスポンジを、親水性有機溶剤の水溶液で湿潤し、次いで概ね拘縮の生じ難い−８０℃以下の温度で凍結乾燥すると、顕著に乾燥体のひび割れを低減しうるという。【０００６】
また、コラーゲン溶液を濃縮させつつ管状または面状に成形してコラーゲン構造体を製造する技術もある（特許文献４）。コラーゲン溶液を透過性部材を介してポリエチレングリコールなどの濃縮剤と接触させてコラーゲン濃度５０〜１００ｍｇ／ｍｌに濃縮し、この濃縮溶液を環状に成形することで環状のコラーゲン構造体を形成するというものである。【０００７】
また、線維化をしていないコラーゲン溶液に緩衝能を有する塩水溶液と架橋剤とを同時に接触させてコラーゲン線維同士を架橋してなるコラーゲンゲルもある（特許文献５）。コラーゲンゲルは、細胞担体、医療用材料などとして有効であるが、熱安定性に劣り、ゲル強度が不十分な場合がある。コラーゲンゲルにタンパク質架橋剤を接触させる従来の架橋方法では、コラーゲン線維表面で架橋するがゲルの中心部まで架橋剤が浸透しないため、ゲルの熱安定性が十分に向上しない。特許文献５によれば、コラーゲンの線維化途上に線維間に架橋反応を起こすことで、架橋ならびに線維化によるコラーゲンゲルの機械的強度と熱安定性を向上させることができる、という。【０００８】
また、コラーゲン超微細線維性不織布状多層体を非線維化コラーゲン層で挟んだ積層体からなるコラーゲン材もある（特許文献６）。コラーゲンをナイロンなどの合成高分子材料と組み合わせた医用材料は、合成高分子材料に由来する肉芽形成や炎症などを引き起こす可能性があり、グルタールアルデヒドやエポキシなどによるコラーゲンの架橋では、架橋剤による毒性が問題となるなどの問題に鑑みてなされたものである。【０００９】
また、密度約０．０１から０．３ｇ／ｃｍ３のコラーゲン移植片もある（特許文献７）。アテロペプチドコラーゲンの酸性水溶液にアルカリを添加してコラーゲンを沈澱させ、沈殿物を溶解して分散液を形成し、所望の厚さにキャストした後にフラッシュ凍結してコラーゲンマトリックスを形成し、これを圧縮して厚さが約１から２０ｍｍとしたものである。少なくとも孔の８０％が直径３５〜２８２μｍであるという。【００１０】
更に、コラーゲンと動物細胞とを含む細胞培養液を循環培養し、コラーゲンと動物細胞を高密度に集積させる高密度培養組織の製造方法がある(特許文献８、特許文献９）。特許文献８、特許文献９に記載された方法によれば、簡単な操作でコラーゲンと動物細胞とが高密度に集積した人工組織を迅速に作成できる、という。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特公平０６−０２２５７９号公報
【特許文献２】特許第４６８１２１４号公報
【特許文献３】特公平０７−０００１００号公報
【特許文献４】特許第３２２１６９０号公報
【特許文献５】特許第４０６４４３５号公報
【特許文献６】特許第４２５１６６５号公報
【特許文献７】特許第２８２０２０９号公報
【特許文献８】特許第４６７１３６５号公報
【特許文献９】特開２０１０−１７２２４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生体中のコラーゲンは、細胞外で線維状で存在し、湿重量あたり、皮膚２５％、腱３２％、軟骨１６％、骨２３％、象牙質１８％という高濃度で各種組織を構成している。生体内のコラーゲンは、３本のポリペプチド鎖が螺旋を巻いた構造を有しており、長さ約３００ｎｍ、太さ１．５ｎｍほどのトロポコラーゲンを形成し、このトロポコラーゲンが少しずつずれて会合してコラーゲン細線維と呼ばれるより太く長い線維を形成する。骨基質や軟骨基質は、このコラーゲン細線維で構成されている。また、前記コラーゲン細線維が更に複数会合し、コラーゲン線維と呼ばれる強大な線維を形成する。その太さは数μｍから数十μｍ程度で、皮膚の真皮や腱などを構成している。このように、コラーゲン分子の会合によって組織に適するコラーゲン線維構造を形成し、これによって多様な機能を発揮している。【００１３】
しかしながら、上記特許文献１〜３および特許文献６、特許文献７で製造されるものは、いずれも生体内のコラーゲン濃度より低濃度のコラーゲン溶液を用いて調製され、製品内のコラーゲン濃度が低く、または太くて長いコラーゲン線維を形成しておらず、組織等価物とはなり得ない。例えば、特許文献１の実施例１では、０．３ｗ／ｖ％のアテロコラーゲン溶液を撹拌しながら０．３ｗ／ｖ％の変性アテロコラーゲン溶液を添加し、この溶液を急速凍結および凍結乾燥を行うものである。コラーゲン溶液中では、コラーゲン分子がバラバラに溶解しているため、太くて長いコラーゲン線維は形成されておらず、これを凍結乾燥してなる乾燥物は、コラーゲン線維から構成されるものではない。【００１４】
また、特許文献２の実施例３は、コラーゲン濃度３ｍｇ／ｍｌに、最終のグルタルアルデヒド濃度が０．０５ｍＭになるようにグルタルアルデヒドを添加し、得られたグルタルアルデヒド含有コラーゲン希釈溶液５０ｇを凍結乾燥用のステンレス製枠（１１ｃｍ×８．５ｃｍ）内に流し込み、ステンレス製枠を−４０℃に冷却してコラーゲン発泡液を凍結し、真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）３０℃で２４時間凍結乾燥を行うものである。コラーゲン発泡溶液内では、コラーゲン分子がバラバラに溶解しているため、特許文献１と同様に、太くて長いコラーゲン線維は形成されていないと考えられる。【００１５】
また、特許文献３の実施例１は、濃度０．３％、ｐＨ３．０の豚の腱由来のアテロコラーゲンを氷冷下でホモジナイズし、方形の型枠に入れて凍結させた後で真空凍結乾燥するものであり、特許文献１と同様に太くて長いコラーゲン線維は形成されていない。【００１６】
また、特許文献６の実施例１は、１重量％コラーゲン溶液をシャーレに注いでコラーゲン溶液層を形成し、これを−２０℃で２４時間凍結し、次に−８０℃で２４時間凍結乾燥および圧縮加工し、非線維化コラーゲン層を形成するものである。この非線維化コラーゲン層もコラーゲン線維で構成されるものではない。なお、特許文献７も、コラーゲンマトリックスを製造するためにコラーゲン溶液を−２０℃で２４時間、真空吸引し、残存する水分を除去するため真空中で約８時間乾燥させている。コラーゲン溶液中では、コラーゲン分子がバラバラに溶解しているため、太くて長いコラーゲン線維は形成されておらず、得られたコラーゲンマトリックスもコラーゲン線維から構成されるものではない。【００１７】
一方、コラーゲンはわずかの水分によって膨潤するため、乾燥体の製造は容易でない。しかもコラーゲン溶液を凍結乾燥によって乾燥コラーゲンを得る場合、処理時間が長くおよび乾燥エネルギーが多大であり、所望の形状に成形することも容易でない。従って、コラーゲン濃度が高い人工材料であって、フィルムやシート以外の厚物にも成形でき、かつ容易に製造しうるコラーゲン構造体の製造方法の開発が望まれる。【００１８】
また、前記した特許文献４および特許文献５に記載される製品は、いずれも水和物である。三重螺旋構造を維持する未変性のコラーゲンは保湿性に優れ、かつ各種細胞への接着性に優れるが、溶液に溶解したコラーゲンは熱変性温度が低く常温でも変性し、冷蔵保存が要求される。特許文献４および特許文献５の製品はいずれも水和物であるため熱安定性に劣り、かつ細菌感染等により変性する可能性がある。しかも、含水量が９０（ｗ／ｗ）％以上であるため、保存時や輸送時のコストも高価となる。従って、生体親和性、熱安定性に優れる水分含有量の低い、コラーゲン構造体の開発が望まれる。【００１９】
人工組織や人工骨などの医用の人工材料が再生医療に使用される際には、真皮、骨、関節軟骨、腱などの欠損部位にこれら再生医療材料を適応して空間の保持を行い、ここに細胞が導入されて再生が促される。このような再生が円滑になされるには、医療材料が生体親和性に優れ、細胞の流出を防止でき、かつ細胞が適度に増殖できる必要がある。前記特許文献１記載の細胞侵入性医用材料は、ポリエステル、ポリウレタン、塩化ビニルのような合成樹脂を担体とするが、生体材料のみで構成できれば合成樹脂による炎症その他の発生を回避することができる。また、前記特許文献８や特許文献９記載の方法は、動物細胞を三次元で培養しうる点で優れるが、保存や輸送の簡便性を考慮して乾燥したコラーゲン構造体の開発が望まれる。【００２０】
上記現状に鑑み、本発明は、水分含有量が低く、医療用途など広範囲に使用しうるコラーゲン構造体を提供する事を目的とするものである。【００２１】
また、本発明は、簡便に調製できるコラーゲン構造体の製造方法を提供する事を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、コラーゲン酸性溶液に中性緩衝液を加えてコラーゲン線維を生成し、穏やかに撹拌すると会合が促進されて太くて長いコラーゲン線維が析出すること、この溶液を濾過するとコラーゲン線維の濃度が１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を得ることができること、前記粗コラーゲン線維を分取し、所定形状に成形すると凍結乾燥その他によって乾燥でき、また、前記粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒に分散させると効率的にコラーゲン線維を脱水でき、コラーゲン線維を分取後に所定の形状に成形し、風乾してコラーゲン構造体を製造しうることを見いだし、本発明を完成させた。【００２３】
すなわち本発明は、平均直径が１〜５μｍのコラーゲン線維からなり、水分含有量０〜１５（ｗ／ｗ）％、コラーゲン密度５０〜８００ｍｇ／ｃｍ３であることを特徴とする、コラーゲン構造体を提供するものである。【００２４】
また本発明は、更に、細胞走化因子、成長因子、細胞増殖因子、血液凝固因子および抗凝固因子からなる群から選択される１種以上の因子を含む、前記コラーゲン構造体を提供するものである。【００２５】
また本発明は、医療用人工材料、疾患治療用部材、化粧用材料、または細胞培養材料として使用される、前記コラーゲン構造体を提供するものである。【００２６】
また本発明は、コラーゲン酸性溶液を中性にしてコラーゲン線維を生成するコラーゲン線維生成工程、
前記コラーゲン線維を含有する溶液から前記コラーゲン線維を分取してコラーゲン濃度１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を形成する粗コラーゲン線維形成工程、
前記粗コラーゲン線維を所定形状に成形する成形工程、および
前記成形工程で得た成形物を乾燥する乾燥工程とを行うことを特徴とする、コラーゲン構造体の製造方法を提供するものである。【００２７】
また本発明は、前記粗コラーゲン線維形成工程に次いで、
前記粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒に分散させた後に前記親水性有機溶媒から前記コラーゲン線維を分取して脱水するコラーゲン線維脱水工程を行い、ついで、
前記脱水したコラーゲン線維を成形する成形工程を行うことを特徴とする前記コラーゲン構造体の製造方法を提供するものである。【００２８】
また本発明は、前記コラーゲン線維脱水工程に次いで、
前記脱水したコラーゲン線維を架橋処理および／または薬剤処理を行う処理工程を行い、ついで、
前記処理したコラーゲン線維を乾燥する乾燥工程を行うことを特徴とするを提供するものである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、コラーゲン濃度が１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を所定形状で乾燥して調製されるため、生体内のコラーゲン組織と等価であり、コラーゲンが複数会合してなるコラーゲン線維を原料とするため機械的強度にも優れる。【００３０】
本発明のコラーゲン構造体は水分含有量が０〜１５（ｗ／ｗ）％であるため熱安定性に優れ、かつ細菌などによる変質を効率的に回避することができる。【００３１】
本発明のコラーゲン構造体の製造方法によれば、風乾によって乾燥できるため、シート状物以外の立体物も容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１で製造したシート状のコラーゲン構造体を示す図である。
【図２】実施例１で形成した粗コラーゲン線維の実体顕微鏡像を示す図である。
【図３】実施例１で調製したコラーゲン構造体の表面の走査型電子顕微鏡像（ＳＥＭ）を示す図である。
【図４】実施例１で調製したコラーゲン構造体の断面の走査型電子顕微鏡像（ＳＥＭ）を示す図である。
【図５】実施例１で調製したコラーゲン構造体および、前記コラーゲン構造体を調製する際に使用したコラーゲン溶液の変性温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）にて毎分２℃の昇温速度で測定した結果を示す図である。
【図６】実施例１で得たコラーゲン構造体をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで膨潤させ、１．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞数でＨＦＦを播種し、２０時間後にカルセインＡＭにて細胞を染色した際の蛍光顕微鏡を示す図である。
【図７】実施例２で調製したブロック状のコラーゲン構造体を示す図である。
【図８】比較例１で製造した、コラーゲン濃度０．２（ｗ／ｖ）％のコラーゲン溶液から調製したゲル状物を乾燥した物の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を示す図である。
【図９】比較例１で得たコラーゲンゲルをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで馴化させ、１．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞数でＨＦＦを播種し、２０時間後にカルセインＡＭにて細胞を染色した際の蛍光顕微鏡を示す図である。
【図１０】比較例３で製造した、１（ｗ／ｖ）％のコラーゲン溶液を凍結乾燥してなるコラーゲンスポンジの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の第一は、平均直径が１〜５μｍのコラーゲン線維からなり、水分含有量０〜１５（ｗ／ｗ）％、コラーゲン密度５０〜８００ｍｇ／ｃｍ３であることを特徴とする、コラーゲン構造体である。また、本発明の第二は、医療用人工材料、疾患治療用部材、化粧用材料、または細胞培養材料として使用される、前記コラーゲン構造体である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
（１）コラーゲン構造体
本願明細書において、「コラーゲン」とは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつである。コラーゲンタンパク質のペプチド鎖３本が螺旋を巻いたものを「コラーゲン分子」と称する。本発明において、「コラーゲン線維」とは、コラーゲン細線維が会合したものであり、前記コラーゲン細線維とは、複数のコラーゲン分子が会合したものをいう。
【００３５】
コラーゲンには、従来からＩ〜ＸＸＩＸ型が知られているが、本発明で使用するコラーゲンとしてはいずれであってもよく、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。生体内に含まれるコラーゲンの大部分は水に不溶性であり、本発明では、コラーゲン線維を形成できるものを広く対象とすることができ、例えば、動物の皮や骨等の原料に含まれるコラーゲンをプロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化した「可溶化コラーゲン」を使用することができる。なお、生体内には、動物の皮や骨等の原料には、わずかに中性塩溶液や酸性溶液に溶ける「可溶性コラーゲン」であってもよい。前記「可溶化コラーゲン」や「可溶性コラーゲン」は、化学的処理の際に構成アミノ酸が修飾されていてもよい。
【００３６】
更に、コラーゲン線維を構成するコラーゲン分子は、コラーゲン誘導体であってもよい。本発明において、「コラーゲン誘導体」とは、前記コラーゲン分子を構成するアミノ酸に他の官能基を修飾したものを意味する。例えば、アシル化コラーゲンやエステル化コラーゲンなどがある。アシル化コラーゲンとしては、サクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどがある。例えば、酵素処理によって抽出したアテロコラーゲン溶液をｐＨ９〜１２に調整し、その後、コハク酸、無水フタル酸、無水マレイン酸などの酸無水物を添加してなるサクシニル化コラーゲン、フタル化コラーゲン、マレイル化コラーゲンなどのアシル化コラーゲンなどがある。また、エステル化コラーゲンとしては、可溶化コラーゲンをエステル化したもののほか、不溶性コラーゲンをエステル化した後に酵素反応などで可溶化されたエステル化コラーゲンなどがある。
【００３７】
本発明において、「コラーゲン構造体」とは、所定の形状を有する固形物をいう。従って、粉状物、顆粒状物などの流動体は含まない。所定の形状とは、フィルム状やシート状、円柱、円錐、多角柱、多角錐、球などのブロック状などを含む。所定の形状を維持できればよく、不定形であってもよい。なお、「フィルム状」とは２００μｍ未満の薄膜状を、「シート状」とは２００μｍ以上の膜状をいう。また、「ブロック状」とは、平面状物が高さ方向に厚みを形成した塊状をいう。
【００３８】
本発明のコラーゲン構造体は、乾燥状態での平均直径が１〜５μｍのコラーゲン線維からなる。前記したように、コラーゲン溶液には三重螺旋構造を有するコラーゲン分子がバラバラに溶解しており、このようなコラーゲン溶液を風乾などによってフィルム状に成形すると、コラーゲン分子やその会合体によってフィルムが形成される。コラーゲン分子やその会合体は、細くかつ短いためコラーゲン分子間や前記会合体間の間隙が狭く、細胞はこの間隙を通過することができない。このようなフィルム上で細胞を培養しても細胞はフィルム表面に局在するが内部に浸潤することができない。しかも、上記フィルムは細くて短いコラーゲン分子等で構成されるため機械的強度が低い。しかしながら、本発明では、三重螺旋構造を有するコラーゲン分子が会合したコラーゲン細線維が更に会合してなる平均直径が１〜５μｍの太いコラーゲン線維から構成されるため、コラーゲン線維間の間隙が大きく、細胞が自由に通過できる。このため本発明のコラーゲン構造体を生体に充填すると、コラーゲン構造体の内部にまで細胞が浸潤する。しかも、このようなコラーゲンの線維構造は、生体内の腱や靱帯などの結合組織におけるコラーゲンの線維構造と類似するものである。したがって、コラーゲン自体の機械的強度を高く維持することができる。
【００３９】
本発明のコラーゲン構造体を構成するコラーゲン線維は、乾燥状態での平均直径が１〜５μｍ、より好ましくは２〜３μｍである。この範囲で、細胞浸潤性に優れるコラーゲン構造体を得ることができる。なお、コラーゲン分子を会合してなるコラーゲン線維において、平均直径が１〜５μｍのコラーゲン線維の場合、その後の物理的な切断その他の処理がなければ平均線維長は一般には１〜１０ｍｍである。なお、本発明において、上記したコラーゲン線維の平均直径および平均線維長は、乾燥状態、すなわち水分含有量０〜１５（ｗ／ｗ）％のコラーゲン構造体について、後記する実施例に記載する方法で測定した値とする。
【００４０】
本発明のコラーゲン構造体は、水分含有量が０〜１５（ｗ／ｗ）％、より好ましくは０〜１０（ｗ／ｗ）％である。水分含有量が低い乾燥物であるため熱安定性に優れ、かつ細菌感染などにより変質を回避することができる。しかも、粉末などと相違してフィルム状、シート状、その他、ブロック状などの成形物であるため、生体の欠損部の形状に成形することで生体内への添付や充填も容易となる。なお、本発明における水分含有量は、後記する実施例に記載する方法で測定した値とする。
【００４１】
本発明のコラーゲン構造体は、水分含有量が０〜１５（ｗ／ｗ）％の場合にコラーゲン密度が５０〜８００ｍｇ／ｃｍ３、より好ましくは１１０〜６００ｍｇ／ｃｍ３、特に好ましくは１２０〜４００ｍｇ／ｃｍ３である。コラーゲンは、生体内では不溶性コラーゲンとして存在し、皮膚組織では２５（ｗ／ｖ）％、腱組織では３２（ｗ／ｖ）％と高濃度で結合組織を形成している。動物組織からコラーゲンを抽出するためにはコラーゲンを可溶化する必要があり、この可溶化コラーゲンは粘性が高い。このため高濃度コラーゲン溶液を調製することが困難で、密度の高いコラーゲン構造体は存在しなかった。しかしながら、本発明によれば、コラーゲン密度が５０〜８００ｍｇ／ｃｍ３であり生体内のコラーゲン密度と均等のコラーゲン構造体を提供することができ、このコラーゲン構造体は組織等価物として使用することができる。なお、本発明において、コラーゲン密度は、後記する実施例に示す方法で測定した値とする。
【００４２】
本発明のコラーゲン構造体は、空隙率が２０〜９０％、より好ましくは３０〜８０％、特に好ましくは４０〜７０％である。多孔であるため、溶媒中に浸漬すると迅速に溶媒中で膨潤する。なお、本発明において空隙率は、後記する実施例に示す方法で測定した値とする。
【００４３】
本発明のコラーゲン構造体は、コラーゲン線維からなる多孔であり、平均孔径は１〜５０μｍ、より好ましくは５〜３０μｍである。本発明のコラーゲン構造体は、上記したコラーゲン線維が不織布のように折り重なって構成される。従って、上記孔は他の孔と連通できる連通孔となる。このため孔に細胞が侵入すると、連通孔を介してコラーゲン構造体の内部に細胞が侵入できる。本発明において「平均孔径」は、後記する実施例に記載した方法で測定した値とする。
【００４４】
本発明のコラーゲン構造体には、更に、細胞走化因子、成長因子、細胞増殖因子、血液凝固因子および抗凝固因子からなる群から選択される１種以上の因子を含むものであってもよい。このような成分の添加により、コラーゲン構造体に創傷治癒、腫瘍細胞増殖阻止、免疫調節、骨形成、造血の調節、止血、抗凝血などの効能を付与することができる。
【００４５】
例えば、走化因子としては、エリスロポエチン、インターロイキン１（ＩＬ−１）などのサイトカイン、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＮＡＰ−２、ＭＩＰ−２などのケモカインがある。
【００４６】
また、成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）などがある。
【００４７】
増殖因子としては、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）などがある。
【００４８】
また、凝固因子としては、フィブリノーゲン・フィブリン（第Ｉ因子）、プロトロンビン・トロンビン（第ＩＩ因子）、組織因子（第ＩＩＩ因子、トロンボプラスチン）などがあり、抗凝固因子としては、ヘパリン、アンチトロンビンＩＩＩなどがある。
【００４９】
このような添加物は、コラーゲン構造体に含浸その他によって結合するものであってもよく、結合手を介してコラーゲン構造体に結合するものであってもよく、用途に応じて適宜選択することができる。例えば、コラーゲン構造体を上記成分溶解液に含浸し、上記成分を吸着させた後に乾燥してなるコラーゲン構造体は、これを創傷部に充填すると、上記成分を徐放するため、ドラッグデリバリーシステムなどの一部材として使用することができる。
【００５０】
結合手としては、コラーゲン結合ドメインのポリペプチド鎖を例示することができる。例えば、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインや、コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメインを例示することができる。予め上記成分にコラーゲン結合ドメインのポリペプチド鎖を結合すると、前記結合手を介して成分がコラーゲン線維と安定して結合することができる。
【００５１】
本発明のコラーゲン構造体は、コラーゲン線維内を架橋するものや、コラーゲン線維間を架橋して形成したものであってもよい。コラーゲンは、生体構成物であるため、生体内でコラゲナーゼなどによって分解される。従って、生分解性を回避したい部位や用途、例えば骨材などとして使用する場合には、架橋体構造を導入する。架橋構造の導入によって、生分解性を抑制し、機械的強度を向上させることができる。このような架橋構造は、コラーゲン構造体の表面にのみ導入してもよく、コラーゲン構造体の内部まで導入してもよい。
【００５２】
本発明のコラーゲン構造体は、フィルム状、シート状、ブロック状に成形される。前記ブロック状には、柱状、球状、推状のほか、任意の形状に成形されたものであってもよい。特に、生体組織の特定形状に成形することもできる。例えば、膝関節を構成する半月体、鼓膜、指、鼻、耳等の生体の形状、所定の軟骨の形状などを例示することができる。本発明のコラーゲン構造体を皮下に埋設し、または人工骨として骨折部に充填することで、近傍の細胞を増殖させ、または人工皮膚として塗布することで外界と生体との境界を構成して細菌などの侵入を防止し、再生機能を促成することができる。なお、本発明のコラーゲン構造体に更に他の層が積層されるものであってもよい。
なお、従来のコラーゲンスポンジを圧縮加工すれば、コラーゲン密度の高いシート状物となる。しかしながら、このようなコラーゲンスポンジは、コラーゲン線維で構成されるものではなく、従って、コラーゲン線維によってもたらされる強度を確保することができない。本発明のコラーゲン構造体は、圧縮加工することなく所定形状に形成されたものであり、細胞浸潤性に優れかつこれを含水して使用する場合にもコラーゲン線維による強度を確保することができる。
【００５３】
（２）用途
本発明のコラーゲン構造体は、医療用人工材料、疾患治療用部材、化粧用材料、細胞培養材料、その他に使用することができる。
【００５４】
医療用人工材料としては、真皮、骨、関節軟骨、腱、靱帯、血管などの欠損部位に対して適応し、空間の保持や、細胞の導入などを促進することができる。このような医療用人工材料としては、再生医療を対象とすることができる。また、止血剤を含浸させたフィルム状のコラーゲン構造体は、出血部に被覆して止血用部材として使用することができる。
【００５５】
疾患治療部材としては、例えば、眼の創傷、重度の熱傷、皮膚移植片の供与部位、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、外科手術の切開創またはケロイド形成性創傷などに使用することができる。
【００５６】
化粧材料としては、フィルム状、またはシート状のコラーゲン構造体を顔面形状にカットし、これに化粧水などを含浸させることでパック材として使用することができる。
【００５７】
細胞培養材料としては、細胞の三次元培養基材として使用すれば、細胞を継代培養することができる。また、細胞侵入性や定着性に優れるため、薬物透過性試験用の基材等としても使用することができる。対象とする細胞としては、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの細胞にも適用しうる。
【００５８】
また、医療用人工材料の応用として、ドラックデリバリーシステムの担体として使用することができる。各種成分をコラーゲン構造体に結合して生体に塗布、充填すると、薬剤が経時的に放出され、ＤＤＳとして機能する。
【００５９】
（３）コラーゲン構造体の製造方法
上記コラーゲン構造体の製造方法に限定はない。しかしながら、コラーゲン酸性溶液を中性にしてコラーゲン線維を生成するコラーゲン線維生成工程、前記コラーゲン線維を含有する溶液から前記コラーゲン線維を分取してコラーゲン濃度１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を形成する粗コラーゲン線維形成工程、前記粗コラーゲン線維を所定形状に成形する成形工程、および前記成形工程で得た成形物を乾燥する乾燥工程とにより製造することができる。前記粗コラーゲン線維形成工程に次いで、前記粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒に分散させた後に前記親水性有機溶媒から前記コラーゲン線維を分取して脱水するコラーゲン線維脱水工程を行い、その後に成形および乾燥してコラーゲン構造体を製造することもできる。また、前記コラーゲン線維脱水工程に次いで、前記脱水したコラーゲン線維を架橋処理および／または薬剤処理を行う処理工程を行い、ついで、前記処理したコラーゲン線維を乾燥する乾燥工程を行うことで、架橋コラーゲン構造体を製造することもできる。
【００６０】
本発明で使用するコラーゲンは、ウシ、ブタ、鳥、魚などの動物の皮膚やその他のコラーゲンを含む組織から採取することができる。一般に、コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の三重螺旋構造が壊され、ゼラチンとなる。本発明では、三重螺旋構造を有するコラーゲンを使用する。このようなコラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、酸処理、酵素処理による可溶化法等がある。好ましくは、コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱がある。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するため好ましい。
【００６１】
また、酵素処理してなるコラーゲン溶液としては、例えば、牛皮の真皮層を細砕し、脱脂したものを使用することができる。この組織をコラーゲン終濃度０．５〜５（ｗ／ｖ）％となるよう蒸留水に懸濁後、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整する。コラーゲン重量に対し百分の一量の酸性プロテアーゼを加え２５℃、７２時間可溶化処理を行う。酵素反応停止後、上記酵素可溶化コラーゲン液を塩析し、回収した塩析沈澱をコラーゲン濃度１〜５（ｗ／ｖ）％となるように蒸留水に分散させ、塩酸を加えて均一に溶解してコラーゲン溶液とすることができる。
【００６２】
上記したコラーゲン酸性溶液のｐＨは、１．０〜６．０であることが好ましく、より好ましくは３．０〜４．０である。ｐＨが上記範囲を超えるとコラーゲンの線維化が困難となる場合がある。
【００６３】
本発明では、上記コラーゲン酸性溶液を中性にする。コラーゲン溶液は、酵素処理によって調製した場合も、酸処理によって調製した場合も、溶液中にコラーゲン分子を溶解するため液性が酸性である。このようなコラーゲン酸性溶液にアルカリ性や中性緩衝液を添加する。アルカリ性溶液としては、水酸化ナトリウム溶液や水酸化カリウム溶液などを使用することができる。また、中性緩衝液としては、リン酸とリン酸ナトリウムとからなるｐＨ７．０〜９．５のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ［２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ］緩衝液（ｐＨ６．８−８．２）、クエン酸‐リン酸緩衝液（ｐＨ２．６〜７．０）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、５０ｍＭリン酸（ｐＨ７．４）など、ｐＨ７．０近傍で緩衝作用を有するものを広く使用することができる。なお、中性とはｐＨ６．０〜９．０であればよい。
【００６４】
上記したアルカリ性溶液や中性緩衝液には、ｐＨを変化させない範囲で他の塩などを含んでいてもよい。このような塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを例示することができる。このような塩の添加によってコラーゲン溶液がヒトの体液と等張になると、生体内のコラーゲンと同様に約６７ｎｍのずれをもったコラーゲン線維を形成することができる。従って、添加する塩の量は、中性処理後のコラーゲン溶液の浸透圧が、ヒトの体液と等張にしうる量とすることが好ましい。
【００６５】
本発明では、中性後のコラーゲン溶液のコラーゲン濃度は、０．０１〜５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．１〜５（ｗ／ｖ）％、特に好ましくは０．３〜５（ｗ／ｖ）％である。０．０１（ｗ／ｖ）％より低濃度であるとその後の濃縮も容易でない。一方、コラーゲンは粘性が高いため、５（ｗ／ｖ）％より高濃度のコラーゲン溶液の調製は困難である。
【００６６】
本発明では、上記中性処理後のコラーゲン溶液を、温度４〜４５℃、より好ましくは３０〜３７℃の範囲で静置する。この範囲で、前記コラーゲン溶液に溶解したコラーゲン分子は、上記中性処理により溶液中で会合し、ゲル状物を形成する。
【００６７】
本発明では、次いで上記したゲル状物を含む溶液を緩やかに撹拌する。穏やかな撹拌によりゲル状物を構成するコラーゲン分子相互の会合が促進され、コラーゲン線維の構造を保ちつつ線維間の水分が放出され、太く、かつ線維長の長いコラーゲン線維が前記溶液中に析出する。従って、撹拌の程度は、コラーゲン分子の会合が促進できる程度であればよい。強度の撹拌を行うと生成したコラーゲン線維が物理的に破断され、細く短いコラーゲン線維となる。穏やかな撹拌により析出するコラーゲン線維の溶液中の平均直径は１〜１００μｍであり、線維長さは１〜１０ｍｍである。なお、本発明においてコラーゲン溶液から析出したコラーゲン線維の平均直径や平均線維長は、実体顕微鏡像において観察される線維の内、無作為に選んだ２０本の線維の直径や長さを平均した値とする。
【００６８】
このコラーゲン線維が析出した溶液をろ過し、または遠心分離すると前記コラーゲン線維を分取することができる。本発明では、コラーゲン溶液から分取されたコラーゲン線維を「粗コラーゲン線維」と称する。したがって、粗コラーゲン線維はコラーゲン線維と水分とを主成分とする。粗コラーゲン線維に含まれるコラーゲン線維の濃度が１２（ｗ／ｖ）％に満たない場合には、再度、遠心分離やろ過などを行い、コラーゲン濃度１２〜５０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは１５〜４０（ｗ／ｖ）％、特に好ましくは１８〜３０（ｗ／ｖ）％に濃縮する。
【００６９】
ろ過により上記コラーゲン濃度の粗コラーゲン線維を分取するには、ポアサイズが１μｍ〜１ｍｍ、より好ましくは１０μｍ〜１００μｍのろ紙を使用することが好ましい。ポアサイズが上記範囲であれば、大量のコラーゲン線維を効率的に処理することができる。
【００７０】
一方、前記コラーゲン溶液を遠心分離して、粗コラーゲン線維を分取することもできる。例えば、１００００〜２００００ｒｐｍで１０分から１時間遠心する。なお、上記範囲のコラーゲン濃度に調整するため、遠心分離は複数回行ってもよい。
【００７１】
本発明では、分取した粗コラーゲン線維を所定形状に成形する。成形された粗コラーゲン線維の形状は、フィルム状、シート状のほか、各種の立体構造に成形できる。コラーゲン構造体を組織充填用に使用する場合には、生体内の充填部と嵌合しうる形状に成形してもよい。
例えば、コラーゲン線維が析出したコラーゲン溶液をろ過して粗コラーゲン線維を分取する場合には、例えば、ロートの中間部に形成した多孔のろ紙載置部にろ紙を配設してコラーゲン溶液をろ過すれば、ろ紙上にシート状またはブロック状に粗コラーゲン線維を堆積することができる。予め、前記ろ紙載置部を所定形状に変形して鋳型として使用し、ろ紙載置部に粗コラーゲン線維を堆積させ、所定形状に成形することもできる。上記は、粗コラーゲン線維形成工程と成形工程とを連続して行う態様の一例である。また、ろ紙上に積層した粗コラーゲン線維を所定形状の鋳型に充填して成形してもよい。
【００７２】
上記した成形方法は、遠心分離によって粗コラーゲン線維を形成した場合も同様に応用することができる。例えば、遠心分離の際に、遠心管を鋳型として使用し、遠心分離と同時に粗コラーゲン線維を所定の形状に成形することができる。これは、粗コラーゲン線維形成工程と成形工程とを連続して行う態様の一例である。なお、遠心分離後に粗コラーゲン線維を所定形状の型に充填して成形してもよい。
【００７３】
ついで、成形した粗コラーゲン線維を乾燥する。本発明の製造方法では、コラーゲン濃度が１２〜５０（ｗ／ｖ）％の粗コラーゲン線維を成形したため、成形した粗コラーゲン線維を凍結乾燥や風乾、温熱乾燥、真空吸引その他により脱水および乾燥し、コラーゲン構造体を製造することができる。なお、予め、円柱や角柱などの形状のコラーゲン構造体を得て、これを削るなどの方法で更に造型を行ってもよい。乾燥の程度は、水分含有量０〜１５（ｗ／ｗ）％である。コラーゲン溶液に比較して、保存安定性に優れるからである。
【００７４】
本発明のコラーゲン構造体は、上記乾燥した後に、これを圧縮成形してもよい。本発明のコラーゲン構造体を構成するコラーゲン線維は、平均直径が１〜５μｍであり、その長さは一般に１〜１０ｍｍである。このように太くて長いコラーゲン線維が不織布のように堆積し、細胞浸潤性と強度とが確保されるため、圧縮成形を行っても細胞浸潤性や強度を低下させることなく、コラーゲン濃度を上昇させることができる。このような圧縮成形は、乾燥後に行う以外の工程、例えば、粗コラーゲン線維を所定形状に成形する際などにおこなってもよい。
【００７５】
本発明では、粗コラーゲン線維を分取する前に、粗コラーゲン線維にその３〜２０００質量部、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、特に好ましくは１０〜３０質量部の親水性有機溶媒を添加し、粗コラーゲン線維が分散する親水性有機溶媒を調製し、ついでろ過して粗コラーゲン線維を分取して粗コラーゲン線維を脱水してもよい。本発明で使用する粗コラーゲン線維は、コラーゲン濃度が１２〜５０（ｗ／ｖ）％と従来のコラーゲン溶液と比較してコラーゲン濃度が高い。このため、例えば１００％エタノールなどの高濃度の親水性有機溶媒に分散させることができ、これによって親水性が高い粗コラーゲン線維を効率的に脱水することができる。粗コラーゲン線維が分散する親水性有機溶媒はコラーゲン溶液よりも流動性が高く、溶液のろ過効率および粗コラーゲン線維成形後の乾燥効率を向上させることができる。ろ過操作時の目詰まりが抑制されるため、厚みのあるブロック状のコラーゲン構造体を製造することができる。
【００７６】
従来からエタノールなどによるコラーゲンの脱水は知られて、アルコール濃度を漸次高めつつ脱水することが一般であった。しかしながら、本発明では粗コラーゲン線維のコラーゲン濃度が１２〜５０（ｗ／ｖ）％と高濃度であるため、例えばエタノールを使用する場合でも、１００％エタノールを使用することができる。このため親水性有機溶媒による脱水を簡便かつ効率的に行うことができる。
【００７７】
粗コラーゲン線維を分散させる親水性有機溶媒としては、水と混和しうる炭素含有溶媒であればよく、例えばアルコール、ケトン、エーテル、エステル、極性非プロトン性溶媒などが挙げられる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ‐ブタノール等の炭素数１〜６の一価アルコールやエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコールなどがある。ケトンとしてはアセトン、メチルエチルケトンなどがある。また、エーテルとしてはジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル等のグリコールエーテルや、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテルなどがある。更に、エステルとしては酢酸エチル、乳酸エチルなどがあり、極性非プロトン性溶媒としてはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジンなどがある。中でも好ましくは水と任意の割合で混和しうるもの、例えばアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。中でも、エタノール、アセトン、ジエチルエーテルまたはこれらの混合液を好適に使用することができる。
なお、使用する親水性有機溶媒の温度は、１５℃以下であることが好ましい。コラーゲン線維を変性させず、コラーゲン分子の三重螺旋構造を維持しうるからである。
【００７８】
粗コラーゲン線維を分散した親水性有機溶媒は、ろ過などにより粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒と分離し、結果的に粗コラーゲン線維を脱水することができる。粗コラーゲン線維を含む親水性有機溶媒をろ過する際に、ロートの中間部に形成した多孔のろ紙載置部にろ紙を配設し、前記した粗コラーゲン線維が分散する親水性有機溶媒をろ過すれば、ろ紙上に粗コラーゲン線維がシート状に堆積する。これにより、粗コラーゲン線維の脱水と粗コラーゲン線維の成形とを連続して行うことができる。堆積量を多くしてブロック状に成形することもできる。なお、脱水後の粗コラーゲン線維を所定の鋳型によって形成することもできる。
【００７９】
コラーゲンは、親水性が高いため乾燥は容易でなく、特に立体物の乾燥は容易でない。しかしながら、本発明では、上記コラーゲン濃度の粗コラーゲン線維を使用し、親水性有機溶媒を使用して粗コラーゲン繊維を脱水するためコラーゲン密度が高く立体形状を維持しうるコラーゲン構造体を製造することができる。
【００８０】
成形後の粗コラーゲン線維は、形状やサイズにもよるが、凍結乾燥のほか、風乾によっても乾燥することができる。風乾によれば、安価でありコラーゲン線維の熱変性も防止することができる。
【００８１】
本発明のコラーゲン構造体は、更に架橋構造を有するものであってもよい。架橋構造の導入によって生体に埋設された後の分解を抑制することができる。架橋する方法は、用途に応じて適宜選択することができる。例えば、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース等をコラーゲン線維やコラーゲン構造体に接触させることで導入することができる。また、カルボジイミド系、エポキシド系およびイミダゾール系架橋剤を添加して架橋することもできる。また、紫外線やγ線、電子線などの照射によっても架橋することができる。なお、コラーゲンは、自然乾燥を行うと一部に架橋構造が形成される場合がある。
【００８２】
本発明のコラーゲン構造体は、架橋の有無に関わらず、細胞走化因子、成長因子、細胞増殖因子、血液凝固因子および抗凝固因子からなる群から選択される１種以上の因子を結合することができる。因子の結合は、化学的結合のほか、吸着、担持などの物理的結合であってもよい。
因子を結合する工程は、コラーゲン構造体を製造するいずれの工程で行ってもよい。例えば、粗コラーゲン線維の乾燥工程に先立ついずれかの工程で、コラーゲン線維に細胞走化因子、成長因子、細胞増殖因子、血液凝固因子および抗凝固因子からなる群から選択される１種以上の因子を結合することができる。どの段階で因子を結合するかは、添加する成分の化学的特性その他によって適宜選択することができる。例えば、粗コラーゲン線維に上記因子を添加して均一に撹拌し、物理的に結合した後に、粗コラーゲン線維を所定形状に成形し、および乾燥して、コラーゲン構造体を製造することができる。また、粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒中に分散し、当該溶媒をろ過して脱水した粗コラーゲン線維に上記成分を混合した後、乾燥してコラーゲン構造体を製造することができる。
更に、水分含有量が０〜１５（ｗ／ｗ）％のコラーゲン構造体を製造した後に上記因子の水溶液をコラーゲン構造体に含浸させ、その後に再度水分含有量が０〜１５（ｗ／ｗ）％となるように乾燥させてもよい。
【００８３】
上記因子をコラーゲン構造体に化学的に結合するには、予めコラーゲンとの結合手を形成した因子を使用してもよい。このような結合手として、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインや、コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメインのポリペプチド鎖がある。例えば、上記因子にコラーゲン結合ドメインのポリペプチド鎖を結合させておき、コラーゲン構造体にこのような結合手を有する因子の溶液を含浸すると、前記結合手を介して前記因子が結合する。コラーゲン結合ドメインのアミノ酸配列は、コラーゲンを基質とする酵素コラゲナーゼと同様にコラーゲンに特異的に結合することができる。
【００８４】
本発明のコラーゲン構造体は、コラーゲン密度が高くかつ所望の形状に成形されている点に特徴がある。形状としては、フィルム状、シート状のほか、ブロック状、その他、用途に応じて選択できる。従前から、フィルム状やシート状などの薄層状の成形品は存在し、コラーゲンスポンジや管状コラーゲン構造体は存在したが、コラーゲン濃度が高く、かつブロック状物のコラーゲン構造体は存在しなかった。乾燥前のコラーゲン濃度を向上させることが困難なためである。本発明では、特に粗コラーゲン線維を親水性有機溶媒に分散して粗コラーゲン線維を脱水することで、簡便に粗コラーゲン線維による大きな堆積物を形成することができ、かつ風乾などによって容易に乾燥することができる。なお、大きな堆積物を所定形状の鋳型に充填して成形し、複雑な形状のコラーゲン構造体を製造することもできる。
【実施例】
【００８５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００８６】
（実施例１）
（１）コラーゲン構造体の調製
豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した組織を原料とした。終濃度５ｍｇ／ｍｌのペプシン、５０ｍＭ酢酸となるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５（ｗ／ｖ）％となるように前記原料を懸濁し、４℃、一晩可溶化処理を行った。上記のようにして得た酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５（ｗ／ｖ）％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析し、遠心分離により塩析物を回収した。回収した塩析物を、コラーゲン濃度３（ｗ／ｖ）％となるように蒸留水に分散し、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液とした。
このコラーゲン溶液２．５ｍｌ（温度４℃）に、温度４℃の中性緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を４７．５ｍｌ添加し、温度３７℃で２４時間静置した。
静置によりコラーゲン分子が会合してゲル状物が形成され、これを緩やかに撹拌すると会合が促進してコラーゲン線維が形成され溶液中に分散した。分散した線維を孔径８０μｍのナイロンメッシュ上に注いでろ過し、メッシュ上に粗コラーゲン線維を回収した。この粗コラーゲン線維のコラーゲン濃度は、２０（ｗ／ｖ）％であった。
次いで、メッシュ上のコラーゲン線維を凍結乾燥し、厚さ０．２ｍｍのシート状のコラーゲン構造体を得た。コラーゲン構造体の外観を図１に示す。
（２）水分含有量
下記方法により測定した上記コラーゲン構造体の水分含有量は、９．４（ｗ／ｗ）％であった。
（ｉ）水分含有量の測定方法
コラーゲン構造体の質量（ｗ１）を測定する。ついで、１２０℃で２時間加熱して水分を蒸発させた後、コラーゲン構造体の質量（ｗ２）を測定する。加熱前後の質量変化（ｗ１−ｗ２）を水分量とし、コラーゲン構造体の質量（ｗ１）に対する前記水分量の百分率（％）を水分含有量とする。
（３）粗コラーゲン線維の平均直径および平均線維長
ナイロンメッシュ上の粗コラーゲン線維を実体顕微鏡により観察した。実体顕微鏡像を図２に示す。実体顕微鏡により無作為に粗コラーゲン線維２０本選出して直径および線維長を測定し、２０本の平均を算出した。平均直径は１．１５μｍであり平均線維長さは４．０９ｍｍであった。なお、線維長は、最短が１．９ｍｍであり、最長が８．７５ｍｍであった。【００８７】
（４）走査型電子顕微鏡像(表面）
得られたコラーゲン構造体の表面の線維構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。結果を図３に示す。【００８８】
（５）コラーゲン構造体を構成するコラーゲン線維の平均直径、孔径
上記コラーゲン構造体について、乾燥状態における線維の平均直径、平均孔径を下記方法で測定した。結果を表１に示す。コラーゲン構造体の平均孔径は１８．４７μｍであり、直径が５〜７μｍの細胞を浸潤させる十分な間隙を有していた。
（ｉ）コラーゲン線維の平均直径
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察されるコラーゲン線維の内、無作為に２０本の線維を選出してそれらの直径を測定する。２０本の線維の直径の平均を算出し、平均直径とする。
（ｉｉ）コラーゲン線維の平均孔径
走査型電子顕微鏡像（ＳＥＭ）で観察される線維の内、無作為に選んだ２０カ所の線維孔の直径を測定する。２０ヶ所の孔径の平均を算出し、平均孔径とする。【００８９】
（６）走査型電子顕微鏡像(断面）
コラーゲン構造体の断面の線維構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。結果を図４に示す。【００９０】
（７）変性温度
得られたコラーゲン構造体および対照としてコラーゲン溶液の変性温度を示差走査熱量計（ＤＳＣ）にて毎分２℃の昇温速度で測定した。結果を図５および表２に示す。コラーゲン構造体では１１５．０３℃に変性温度のピークが観察されたが、コラーゲン溶液の変性温度は４２．７５℃であり、コラーゲン構造体はコラーゲン溶液よりも熱安定性に優れることが判明した。【００９１】
（８）コラーゲン密度および空隙率
コラーゲン密度および空隙率を下記方法により測定しところ、コラーゲン密度は２００ｍｇ／ｃｍ３であり、空隙率は４０．９％であった。
（ｉ）コラーゲン密度の測定方法
コラーゲン構造体を１ｃｍ四方に正確に裁断して試験片を調製する。前記試験片をシックネスゲージにより正確な厚みを測定し、体積を算出する。ついで、試験片を５ｍｌの５ｍＭ酢酸溶液に溶解し、ミクロビュレット法にてコラーゲン濃度を測定する。試験片の体積とコラーゲン濃度とから、単位体積当たりのコラーゲン量を算出し、コラーゲン密度とする。
（ｉｉ）空隙率
Ｐａｓｃａｌ  １４０及び４４０（ＣＡＲＬＯ  ＥＲＢＡ  ＩＮＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）を用いた水銀圧入法により測定を行う。【００９２】
（８）細胞浸潤性
得られたコラーゲン構造体をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで膨潤させ、１．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞数でＨＦＦを播種し、２０時間後にカルセインＡＭにて細胞を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図６に示す。【００９３】
（実施例２）
（１）コラーゲン構造体の調製
豚皮の真皮層を肉挽き等で細砕し、脱脂後十分に洗浄した組織を原料とした。終濃度５ｍｇ／ｍｌのペプシン、５０ｍＭ酢酸となるよう混合した可溶化水溶液に、コラーゲン終濃度４．５（ｗ／ｖ）％となるように前記原料を懸濁し、４℃、一晩可溶化処理を行った。上記のようにして得た酵素可溶化コラーゲン液に、終濃度５（ｗ／ｖ）％となるよう塩化ナトリウムを加えて塩析し、遠心分離により塩析物を回収した。回収した塩析物を、コラーゲン濃度３（ｗ／ｖ）％となるように蒸留水に分散させ、塩酸を加えてｐＨ３．０に調整して均一に溶解し、コラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン溶液５ｍｌ（温度４℃）に、温度４℃の中性緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を９５ｍｌ添加し、温度３７℃で２４時間静置した。静置によりコラーゲン分子が会合してゲル状物が形成された。
これを緩やかに撹拌すると会合が促進してコラーゲン線維が形成され溶液中に分散し、沈殿した。１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により沈澱を回収し粗コラーゲン線維を得た。この粗コラーゲン線維のコラーゲン濃度は、２０（ｗ／ｖ）％であった。
次いで、得られた粗コラーゲン線維０．７５ｇを温度２０℃のエタノール１０ｇに投入し、緩やかに１０分間撹拌して分散させた。得られた分散液を濾過して粗コラーゲン線維を分取した。分取した粗コラーゲン線維を直径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍの柱状の型に充填して室温で風乾し、コラーゲン構造体を得た。これを図７に示す。【００９４】
（２）水分含有量、コラーゲン密度、空隙率、コラーゲン線維の平均直径
得られたコラーゲン構造体について、実施例１と同様に水分含有量、コラーゲン密度、空隙率、コラーゲン線維の平均直径を測定したところ、このコラーゲン構造体の水分含有量は６．７（ｗ／ｗ）％であり、コラーゲン密度は１２７ｍｇ／ｃｍ３、空隙率は７６．６％であった。また、コラーゲン線維の平均直径は、１．５９μｍであった。【００９５】
（比較例１）
（１）ゲル凍結乾燥物の調製
実施例１で得られたコラーゲン溶液に蒸留水を添加して濃度０．４（ｗ／ｖ）％に希釈し、ついで等量の２倍濃縮リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を４℃条件下で混和し、細胞培養用のプレートに静かに注ぎ、温度３７℃で２４時間静置してゲル状物を作製した。
上記ゲル状物からコラーゲン線維を分離することなくそのままゲル状物を凍結乾燥した。【００９６】
（２）水分含有量およびコラーゲン密度
実施例１と同様にして水分含有量とコラーゲン密度を測定したところ、この凍結乾燥物の水分含有量は１０〜１５（ｗ／ｗ）％であり、コラーゲン密度は２．０ｍｇ／ｃｍ３であった。【００９７】
（３）コラーゲン線維の平均直径、孔径
実施例１と同様にして、凍結乾燥物を構成するコラーゲン線維の平均直径、孔径を測定した。このフィルムを構成するコラーゲン線維の平均直径は０．１７μｍであった。なお、コラーゲン線維同士が相互に接触しているため、線維長を測定することはできなかった。結果を表１に示す。【００９８】
（４）ゲル状物の走査型電子顕微鏡
凍結乾燥前のゲル状物を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。結果を図８に示す。【００９９】
（５）細胞浸潤性
凍結乾燥前のゲル状物をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで馴化させた後、実施例１と同様にして、１．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞数でＨＦＦを播種し、２０時間後にカルセインＡＭにて細胞を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。実施例１の図６では、焦点の合う細胞と合わない細胞が同時に存在し、細胞が三次元的に配置している様子が観察されたが、図９では、細胞の焦点が合っているため単一面に平面的に存在することが観察された。【０１００】
（比較例２）
実施例１で得られたコラーゲン溶液に、５倍濃縮リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を加えて、コラーゲン濃度が０．０７５（ｗ／ｖ）％になるように調整し、３７℃で一晩強め（６００ｒｐｍ）に撹拌しながらコラーゲン線維を形成させた。このコラーゲン線維を含有する溶液をホモジナイザーで撹拌して物理的に切断し、またはコラーゲン分子の長さ方向の連結を抑制した。この溶液に含まれるコラーゲン会合体の平均直径は１．１３μｍであり、長さは２１３μｍであった。
次いで、１７，５００ｒｐｍ、２０分の遠心分離によりコラーゲン会合体を回収し、コラーゲンの濃度が３０（ｗ／ｖ）％になるまで遠心分離を繰り返した。得られた沈殿物に対し、２０倍量のエタノールを投入し、分散させた後、孔径８０μｍのナイロンメッシュ上に注いでろ過し、メッシュ上に粗コラーゲン会合体を回収した。得られた沈殿物はシートを形成せず、粉末状を呈した。【０１０１】
（比較例３）
実施例１で得られたコラーゲン溶液に蒸留水を添加して濃度０．８（ｗ／ｖ）％に希釈し、中和せずにそのまま凍結乾燥し、コラーゲンスポンジを作製した。このコラーゲンスポンジは、多孔フィルムで形成されたものでありコラーゲン線維で構成されるものではなかった。図１０に、コラーゲンスポンジの電子顕微鏡像を示す。なお、コラーゲン密度は８ｍｇ／ｃｍ３であった。【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
本発明は２０１２年１月１２日に出願された日本国特許出願２０１２−００３８８３号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１２−００３８８３号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明のコラーゲン構造体はコラーゲン密度の高い乾燥体であり、熱安定性が高くかつ組織等価物として再生医療その他に使用でき、有用である。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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