(57)【要約】本発明により、がん細胞、特に肺がん細胞に対して細胞障害性を示すヒト型抗体軽鎖を有効成分とする抗がん剤が提供される。本発明の抗がん剤は主に、可変領域が配列番号１、９、若しくは１３のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、又は可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖を含有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）可変領域が配列番号１のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（２）可変領域が配列番号７のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（３）可変領域が配列番号９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（４）可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（５）可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（６）可変領域が配列番号３８の１〜１１３番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（７）可変領域が配列番号４０の１〜１１２番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、又は
（８）可変領域が配列番号４１の１〜１０７番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖
を含有することを特徴とする抗がん剤。
【請求項２】
前記（１）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号２のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、
前記（２）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号８のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、
前記（３）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、
前記（４）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号１４のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、
前記（５）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインが削除又はシステイン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、
前記（６）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、
前記（７）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号４０のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、又は
前記（８）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号４１のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖である、
請求項１に記載の抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞、特に肺がん細胞に対して細胞障害性を示すヒト抗体κ型軽鎖を含有する抗がん剤に関する。
本願は、２０１２年３月８日に、日本に出願された特願２０１２−５２３３４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、重鎖（Ｈ鎖：Heavy chain）および軽鎖（Ｌ鎖：Light chain）から構成されている。重鎖および軽鎖は、可変領域（ＶＲ：Variable Region）および定常領域（ＣＲ：Constant Region）から構成されており、可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ：Complementarity Determining Region）を有している。さらに、抗体の軽鎖は、κ型およびλ型に分類される。【０００３】
近年、酵素様活性をもつ抗体、即ち、抗体酵素が注目を集めている。抗体酵素は、抗体の高い分子認識能と酵素活性とを併せ持つため、医療、化学工業、食品工業等といった、多くの面で応用が期待されている。特に、標的分子への特異性が高く、かつ酵素活性によって標的分子に対する障害性を発揮し得る抗体酵素は、副作用の少ない優れた抗がん剤となることが期待される。【０００４】
本発明者らは、これまで、抗体酵素に関して種々の独創的な研究を行ってきている（例えば、特許文献１を参照のこと）。従来、完全ヒト型配列を有する抗体酵素は、多発性骨髄腫患者から得られるベンスジョーンズタンパク（ＢＪＰ）以外には得ることができなかった。多発性骨髄腫患者の患者数は少なく、また酵素活性を有するＢＪＰも少ないため、ヒト型の抗体酵素を取得することは困難であった。しかし、ヒト型の抗体酵素は、人体に投与した際の副作用が少ないと予想されるために、国内外の製薬会社などは、有用なヒト型の抗体酵素が開発されることを待ち望んでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１９７９３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、がん細胞、特に肺がん細胞に対して細胞障害性を示すヒト型抗体軽鎖を有効成分とする抗がん剤を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって過剰免疫されたボランティアから得られた末梢血から新規なヒト型抗体軽鎖を取得し、これらについて検討したところ、驚くべきことに、得られたヒト抗体κ型軽鎖のいくつかが、がん細胞、特に肺がん細胞に対する高い細胞障害性を有していることを見出し、発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明に係る抗がん剤は、
（１）可変領域が配列番号１のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（２）可変領域が配列番号７のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（３）可変領域が配列番号９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（４）可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（５）可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（６）可変領域が配列番号３８の１〜１１３番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
（７）可変領域が配列番号４０の１〜１１２番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、又は
（８）可変領域が配列番号４１の１〜１０７番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖
を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、がん細胞、特に肺がん細胞に対する細胞傷害性が高い抗がん剤を提供できる。本発明の抗がん剤は抗体酵素を有効成分とするため、がん細胞に対する特異性が高い。さらに、当該抗体酵素のアミノ酸配列は完全にヒト型であるため、ヒトに対するアレルギー等の問題がない。このため、本発明の抗がん剤は、活性の高い画期的な新型医薬品、及びその開発のための試料として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】（ａ）は、単量体のヒト型抗体軽鎖を得るためのｃＤＮＡの設計の概略を示し、（ｂ）は、変異導入前のヒト型抗体軽鎖と変異導入後のヒト型抗体軽鎖との組成の概略を示す。
【図３】クローン＃１のポリペプチドを精製した結果を示す図であり、（ａ）は、クローン＃１のポリペプチドを新たに一次精製した結果を示し、（ｂ）は、クローン＃１のポリペプチドを新たに二次精製した結果を示す。
【図４】各クローンのがん細胞に対する細胞障害性を調べた結果を示すグラフである。
【図５】各クローンのがん細胞に対する細胞障害性を調べた結果を示すグラフである。
【図６Ａ】野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｂ】野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｂの続きであり、野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｄ】野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｅ】図６Ｄの続きであり、野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｆ】図６Ｅの続きであり、野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｇ】野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｈ】図６Ｇの続きであり、野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ｉ】野生型のヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】生体内におけるアッセイの結果を示す図である。
【図８】安全性試験（毒性試験）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、がん細胞に対する細胞障害性を有するヒト抗体κ型軽鎖を含む抗がん剤を提供する。本願明細書において、「ヒト抗体κ型軽鎖」は、ヒト由来の免疫グロブリンのκ型の軽鎖（Light chain）を指す。
【００１２】
本願明細書において、「抗がん剤」とは、がん細胞を死滅させる、又は増殖を抑制若しくは阻害する活性を有する薬剤を意味する。
また、本願明細書において、「細胞傷害性」とは、細胞に対して死又は機能障害を与える性質を意味する。
【００１３】
本発明に係る抗がん剤の有効成分であるヒト抗体κ型軽鎖（以下、「本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖」ということがある。）は、具体的には、下記（１）〜（８）のいずれかである。
（１）可変領域が配列番号１のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（２）可変領域が配列番号７のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（３）可変領域が配列番号９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（４）可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（５）可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（６）可変領域が配列番号３８の１〜１１３番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（７）可変領域が配列番号４０の１〜１１２番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
（８）可変領域が配列番号４１の１〜１０７番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
【００１４】
可変領域が配列番号１のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）におけるＣＤＲ１は、配列番号１および２のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号１および２のアミノ酸配列における第５５〜６１番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号１および２のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。
【００１５】
野生型の抗体κ型軽鎖には、ジスルフィド結合を形成するためのシステインが存在しており、二量体を形成する。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）は、野生型と同様に、他の軽鎖とジスルフィド結合を形成するためのシステインを有している。例えばヒト抗体κ型軽鎖（＃１）が配列番号２のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる場合、当該システインは、配列番号２のアミノ酸配列中の２２０番目のシステインである。
【００１６】
ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）は、後記実施例に示すように、がん細胞、特に肺がん細胞に対する細胞障害性を有する。このため、抗がん剤の有効成分として好適である。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の抗がん活性のためには、標的分子に対する高い分子認識能が重要であることから、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の抗がん活性の活性中心は、可変領域にある。
【００１７】
ポリペプチドを構成するアミノ酸残基のうちのいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。なお、本願明細書において、特定のアミノ酸配列Ｘ中の１又は複数のアミノ酸を置換、付加、若しくは欠失させることを、変異させるという。
【００１８】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、二量体を形成しており、可変領域が配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。当該ポリペプチドを、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の変異体と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、２２０番目のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。
【００１９】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖として用いられるヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の変異体は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）と同様に抗がん作用を有する二量体である。このため、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と同一であり（保存されており）、配列番号２のアミノ酸配列中の２２０番目のシステインに相当するシステインも保存されている。つまり、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３以外の領域中のアミノ酸が変異されており、可変領域の他の領域中のアミノ酸が変異されているものであることが好ましい。
【００２０】
可変領域が配列番号９のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号１０に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）におけるＣＤＲ１は、配列番号９および１０のアミノ酸配列における第２４〜４０番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号９および１０のアミノ酸配列における第５６〜６２番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号９および１０のアミノ酸配列における第９５〜１０２番目である。また、他の軽鎖とジスルフィド結合を形成するためのシステインは、配列番号１０のアミノ酸配列中の２２０番目のシステインである。
【００２１】
ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）は、後記実施例に示すように、がん細胞、特に肺がん細胞に対する細胞障害性を有する。このため、抗がん剤の有効成分として好適である。
【００２２】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、二量体を形成しており、可変領域が配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。当該ポリペプチドを、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の変異体と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、２２０番目のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。
【００２３】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖として用いられるヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の変異体は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）と同様に抗がん作用を有する二量体である。このため、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列と同一であり（保存されており）、配列番号１０のアミノ酸配列中の２２０番目のシステインに相当するシステインも保存されている。つまり、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３以外の領域中のアミノ酸が変異されており、可変領域の他の領域中のアミノ酸が変異されているものであることが好ましい。
【００２４】
可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号１４に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）におけるＣＤＲ１は、配列番号１３および１４のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号１３および１４のアミノ酸配列における第５５〜６１番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号１３および１４のアミノ酸配列における第９４〜１０１番目である。また、他の軽鎖とジスルフィド結合を形成するためのシステインは、配列番号１４のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインである。
【００２５】
ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）は、後記実施例に示すように、がん細胞、特に肺がん細胞に対する細胞障害性を有する。このため、抗がん剤の有効成分として好適である。
【００２６】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、二量体を形成しており、可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。当該ポリペプチドを、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）の変異体と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）の変異体は、配列番号１４のアミノ酸配列において、２１９番目のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。
【００２７】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖として用いられるヒト抗体κ型軽鎖（＃７）の変異体は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）と同様に抗がん作用を有する二量体である。このため、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列と同一であり（保存されており）、配列番号１４のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインに相当するシステインも保存されている。つまり、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３以外の領域中のアミノ酸が変異されており、可変領域の他の領域中のアミノ酸が変異されているものであることが好ましい。
【００２８】
可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインが削除又はその他のアミノ酸（例えば、アラニン）に置換されたアミノ酸配列に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）におけるＣＤＲ１は、配列番号１９および２０のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号１９および２０のアミノ酸配列における第５５〜６１番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号１９および２０のアミノ酸配列における第９４〜１０１番目である。
【００２９】
ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）は、後記実施例に示すように、がん細胞、特に肺がん細胞に対する細胞障害性を有する。このため、抗がん剤の有効成分として好適である。
【００３０】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、単量体であり、可変領域が配列番号２０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。当該ポリペプチドをヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）の変異体と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）の変異体は、配列番号２０のアミノ酸配列において、２１９番目のシステインが削除又はその他のアミノ酸に置換されており、かつ２１９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。
【００３１】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖として用いられるヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）の変異体は、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）と同様に抗がん作用を有する単量体である。このため、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列と同一であり（保存されており）、配列番号２０のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインに相当するシステインは、削除又はその他のアミノ酸に置換されている。つまり、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６＿単量体）の変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３以外の領域中のアミノ酸が変異されており、可変領域の他の領域中のアミノ酸が変異されているものであることが好ましい。
【００３２】
また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドを構成するアミノ酸残基のうちの１又は数個のアミノ酸を容易に変異させたり、エピトープ標識ポリペプチド等を付加することができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００３４】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００３５】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００３６】
本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、当該ヒト抗体κ型軽鎖（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて、組換え発現系や無細胞発現系等の当該技術分野で公知の発現系を用いて製造することができる。
【００３７】
組換え発現系を用いる場合、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主（形質転換体）内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。
【００３８】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００３９】
無細胞発現系（無細胞タンパク質合成系）を用いる場合、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、リボソームやｔ−ＲＮＡ等のタンパク質の翻訳・合成に必要な成分を含む溶液に添加し、適当な温度でインキュベートすることにより、合成されたポリペプチドを精製することが好ましい。
【００４０】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液を用いる系が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。これらの合成系としては、種々の市販のキットが用いられ得る。
【００４１】
なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００４３】
宿主の発現系や無細胞タンパク質合成系により合成されたヒト抗体κ型軽鎖は、精製されることが好ましい。ヒト抗体κ型軽鎖を精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００４４】
また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、当該ヒト抗体κ型軽鎖を天然に発現する細胞または組織から精製することもできる。例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖を天然に発現する細胞または組織を同定することができる。細胞や組織からのヒト抗体κ型軽鎖の精製は、宿主の発現系等を用いて合成されたヒト抗体κ型軽鎖を精製する場合と同様に行うこともできる。
【００４５】
その他、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、化学合成することもできる。化学合成の方法は特に限定されず、ポリペプチドを化学合成する際に用いられるいずれの方法で行ってもよい。
【００４６】
本発明に係る抗がん剤は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖を有効成分とする。本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖ががん細胞に対する細胞傷害性を示す作用機序は未だ完全に明らかにされてはいないが、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、がん細胞表面の特定の分子又は構造を特異的に認識して結合すると同時に、自身が有する酵素活性によりがん細胞の一部成分を分解する結果、がん細胞の機能が損なわれ、増殖が阻害されたり、細胞死が誘導されるのではないかと推察される。
【００４７】
本発明に係る抗がん剤は、ヒトまたは動物についての使用のために、直接注入により投与され得る。本発明に係る抗がん剤はまた、非経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与または経皮的投与のために処方され得る。代表的には、組成物中に含まれるタンパク質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。
【００４８】
本発明に係る抗がん剤は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖以外に、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含み得る。治療的使用のための薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的に使用可能なキャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。また、本発明に係る抗がん剤は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含み得る。
【００４９】
異なる送達系に依存して、組成／処方の必要条件は、異なり得る。例示として、本発明に係る抗がん剤は、ミニポンプを使用してまたは粘膜経路により、例えば、吸入のための鼻スプレーまたはエアロゾルとして、あるいは非経口的に送達するために処方され得る（ここで本発明に係る抗がん剤は、例えば、静脈内経路、筋肉内経路もしくは皮下経路による送達のために注射可能形態として処方される）。あるいは、この処方物は、両方の経路により送達されるように設計され得る。例えば本発明に係る抗がん剤は、特に肺がん細胞に対する細胞傷害性が高い。このため、本発明に係る抗がん剤は、吸入のための鼻スプレーまたはエアロゾル等の、鼻や気管支等から肺細胞まで効率よく送達することが可能な形態であることも好ましい。
【００５０】
また、本発明に係る抗がん剤を生体内に投与する用途で用いる場合、有効成分であるヒト抗体κ型軽鎖の生体内における安定性（血中半減期）を向上させるための様々な技術が用いられ得る。例えば、ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）がＦｃに結合すると、ＩｇＧなどの抗体の血中半減期が延長することが知られており（例えば、Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｖｏｌ．７  ７１５−７２５（２００７）参照）、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖のＣ末端を、ＦｃＲｎとの結合活性を有するように改変することができる。また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖をダイマー化すること、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を付加することもできる。
【００５１】
本発明に係る抗がん剤は、例えば、服用の態様についての説明書等とともにキット化することもできる。当該キットには、その他、本発明に係る抗がん剤と併用可能な各種医薬を含めることもできる。
【００５２】
また、本発明に係る抗がん剤は、標的分子の認識能が高い抗体κ型軽鎖を有効成分とするため、抗体κ型軽鎖の標的分子が細胞表面に存在していないがん細胞には細胞傷害性を発揮しない。このため、本発明の抗がん剤は、がんの種類の識別に有用であることが期待される。
【実施例】
【００５３】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００５４】
［実施例１］
（１．ヒト末梢血ｃＤＮＡの調製）
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって過剰免疫されたボランティアから得られた末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いてリンパ球を分離した。ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、分離した約３．０×１０７個のリンパ球からトータルＲＮＡを得た。ＴｈｅｒｏｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして、トータルＲＮＡを逆転写することにより、目的とするｃＤＮＡ（ｃＤＮＡライブラリ−）を調製した。【００５５】
（２．ヒト抗体κ型軽鎖遺伝子の取得）
前記１．で取得したｃＤＮＡを鋳型として、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を増幅するためのプライマーを用いた２段階のＰＣＲ反応を行い、約７５０ｂｐのＰＣＲ産物（サブグループＩＩに属するκ型軽鎖遺伝子）を得た。これらのＰＣＲ産物をクローニングし、シーケンス解析を行い、相同性検索により、それぞれの生殖細胞系列遺伝子（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）におけるＶκ遺伝子を推定した。この結果、得られた１８クローンすべてがサブグループＩＩに属していた。このうち、クローン＃１（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１８ｂ）、クローン＃２（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）、クローン＃４（生殖細胞系列遺伝子型：Ｏ１１／ｏ１）、クローン＃７（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）、クローン＃８（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１８ｂ）、クローン＃９（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１８ｂ）、クローン＃１１（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１８ｂ）、クローン＃１３（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）、及びクローン＃１４（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）の９クローンを以降の実験に用いた。【００５６】
（３．ヒト抗体κ型軽鎖の発現）
前記２．で取得した各クローンをそれぞれ、Ｈｉｓタグ配列サイトを有するプラスミドベクターに導入し、当該プラスミドベクターを大腸菌に導入して形質転換体を作製した。各形質転換体を培養し、ＩＰＴＧによる発現誘導を行ったところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び抗ヒト型（Ｆａｂ’）２抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、大腸菌において発現したタンパク質がヒト型抗体軽鎖であることを同定することができた。得られたヒト型抗体軽鎖は、Ｎ末端にＭ（開始メチオニン）を、Ｃ末端にプラスミドベクター由来のＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）を有していた。【００５７】
（４．ヒト末梢血ｃＤＮＡの調製）
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって被験者を過剰免疫し、血清の中和活性を測定した。血清の中和活性が最も高かった（７．２ＩＵ）被験者をドナーとして末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて当該末梢血からリンパ球を分離した。ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、分離した約３．０×１０７個のリンパ球からトータルＲＮＡを得た。ＴｈｅｒｏｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして、トータルＲＮＡを逆転写することにより、後述するＰＣＲ反応において鋳型とするｃＤＮＡを調製した。【００５８】
（５．ヒト抗体κ型軽鎖遺伝子の取得）
前記４．で取得したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体軽鎖遺伝子を網羅的に増幅するためのプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、約６６０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を精製し、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＬＣＡライブラリを構築した。なお、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにＰＣＲ産物を挿入した発現ベクターからは、当該ＰＣＲ産物がコードするタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグを付加させたタンパク質が発現される。このＬＣＡライブラリのｃＤＮＡを鋳型として、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有するヒト抗体軽鎖遺伝子を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約６６０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これらのＰＣＲ産物をクローニングし、シーケンス解析を行い、解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＩＸ（登録商標）  Ｖｅｒ．８）を用いて、アミノ酸配列ならびに軽鎖の可変領域および定常領域を推定し、それぞれの生殖細胞系列遺伝子（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）におけるＶκ遺伝子を推定した。これらのクローンの中から、クローン２２Ｆ６（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）及びクローン２３Ｄ４（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）の２クローンを以降の実験に用いた。得られたヒト型抗体軽鎖は、Ｎ末端にＭ（開始メチオニン）を、Ｃ末端にプラスミドベクター由来のＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）を有していた。【００５９】
各クローンのシーケンスの結果、クローン＃１に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１＿ＷＴ））の全長は、配列番号２７に示される塩基配列であり、クローン＃８に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃８＿ＷＴ））の全長は、配列番号２８に示される塩基配列であり、クローン＃９に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃９＿ＷＴ））の全長は、配列番号２９に示される塩基配列であり、クローン＃１１に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１１＿ＷＴ））の全長は、配列番号３０に示される塩基配列であり、クローン＃４に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃４＿ＷＴ））の全長は、配列番号３１に示される塩基配列であり、クローン＃２に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃２＿ＷＴ））の全長は、配列番号３２に示される塩基配列であり、クローン＃７に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃７＿ＷＴ））の全長は、配列番号３３に示される塩基配列であり、クローン＃１３に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１３＿ＷＴ））の全長は、配列番号３４に示される塩基配列であり、クローン＃１４に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１４＿ＷＴ））の全長は、配列番号３５に示される塩基配列であり、クローン２２Ｆ６に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（２２Ｆ６＿ＷＴ））の全長は、配列番号３６に示される塩基配列であり、クローン２３Ｄ４に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（２３Ｄ４＿ＷＴ））の全長は、配列番号３７に示される塩基配列であった。【００６０】
各塩基配列から推定されるアミノ酸配列を図１に示す。また、図１には、可変領域、定常領域およびＣＤＲ１〜３の位置も示した。クローン＃１に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１＿ＷＴ））は配列番号２に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃８に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃８＿ＷＴ））は配列番号４に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃９に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃９＿ＷＴ））は配列番号６に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃１１に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１１＿ＷＴ））は配列番号８に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃４に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃４＿ＷＴ））は配列番号１０に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃２に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃２＿ＷＴ））は配列番号１２に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃７に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃７＿ＷＴ））は配列番号１４に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃１３に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１３＿ＷＴ））は配列番号１６に示されるアミノ酸配列であり、クローン＃１４に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（＃１４＿ＷＴ））は配列番号１８に示されるアミノ酸配列であり、クローン２２Ｆ６に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（２２Ｆ６＿ＷＴ））は配列番号２０に示されるアミノ酸配列であり、クローン２３Ｄ４に係るヒト型抗体軽鎖（ヒト型抗体軽鎖（２３Ｄ４＿ＷＴ））は配列番号２２に示されるアミノ酸配列であった。【００６１】
なお、本実施例で使用した野生型のヒト型抗体軽鎖は、図１に示す各アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが、Ｃ末端にプラスミドベクター由来のＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）が付加されたポリペプチドであった。【００６２】
（６．単量体のヒト型抗体軽鎖の作製）  
前記２．及び５．で取得したクローンのヒト抗体κ型軽鎖は、Ｃ末端にあるシステインによりジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合が形成されるため、二量体を形成している。そこで、Ｓ−Ｓ結合に関与するシステイン（図１のアミノ酸配列のＣ末端のシステイン）をアラニンに置換する変異を導入して、単量体のヒト型抗体酵素のみが形成されるように、ｃＤＮＡを設計した。Ｃ末端にプラスミドベクター由来のＬＥＨＨＨＨＨＨを付加したヒト型抗体軽鎖（＃１＿ＷＴ）に対するこの設計の詳細を図２に示す。図２の（ａ）に示すように、全長のヒト型抗体酵素の遺伝子における２２０番目のシステインをコードするＴＧＴを、ＧＣＴに置換した。これによって、図２の（ｂ）に示すように、元のアミノ酸配列では２２０番目がシステインであるために二量体が形成されるが、置換後のアミノ酸では２２０番目がアラニンであるために、Ｓ−Ｓ結合が形成されず、単量体となる。【００６３】
具体的には、野生型の全長のヒト型抗体酵素の遺伝子における上記システインをコードするＴＧＴを、ＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２５）（＋終止コドン）をコードするＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号２６）に置換した。つまり、本実施例で使用した単量体のヒト型抗体軽鎖は、図１に示す各アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加されており、かつＣ末端のシステインに代えてＡＬＥＨＨＨＨＨＨが付加されたポリペプチドであった。なお、こうして得られたＳ−Ｓ結合に寄与するシステインをアラニンに置換した変異体のうち、ヒト型抗体軽鎖（＃１＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃１＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃８＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃８＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃９＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃９＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃１１＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃１１＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃４＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃４＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃２＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃２＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃７＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃７＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃１３＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃１３＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（＃１４＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（＃１４＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（２２Ｆ６＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（２２Ｆ６＿Ｃ２２０Ａ）、ヒト型抗体軽鎖（２３Ｄ４＿ＷＴ）の変異体はヒト型抗体軽鎖（２３Ｄ４＿Ｃ２２０Ａ）とそれぞれ称する。【００６４】
（７．ヒト型抗体軽鎖の精製）  
各ヒト型抗体軽鎖を以下の様に一次精製および二次精製した。図３の（ａ）は、ヒト型抗体軽鎖（＃１＿ＷＴ）及びヒト型抗体軽鎖（＃１＿Ｃ２２０Ａ）の一次精製におけるＮｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。図３の（ｂ）は、二次精製における陽イオン交換クロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
図３の（ａ）左段に示すように、サンプルのアプライ後に素通り画分が流れ切るまで、緩衝液Ａ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を流した。そして、左段のグラフにおける破線に示されるように、イミダゾールの濃度を４０ｍＭから３００ｍＭまで漸次的に上昇させて、ゲルと結合した成分を溶出させた。カラムとしてＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（直径１ｃｍ、２ｍｌ）を用い、精製を通して流速を０．１ｍＬ／分に維持した。図３の（ａ）の右段に示すように、目的とする約３１ｋＤａのバンドが、フラクション番号３０〜３７に検出された。このサンプルを１つにまとめて、次の二次精製を行った。【００６５】
図３の（ｂ）の左段に示すように、サンプルのアプライ後に素通り画分が流れ切るまで、緩衝液Ａ（５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）、０．２ＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を流した。そして、左段のグラフにおける破線に示されるように、ＮａＣｌの濃度を０．２Ｍから０．４Ｍまで漸次的に上昇させて、ゲルと結合した成分を溶出させた。カラムとしてＳＰ５ＰＷ（ＴＯＳＨＯ）を用い、精製を通して流速を０．１ｍｌ／分に維持した。精製前のサンプル、グラフ中の破線に囲まれた「ａ」の領域（フラクション番号１０〜１５）、およびグラフ中の破線に囲まれた「ｃ」の領域（フラクション番号２５〜３０）に含まれる成分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図３の（ｂ）の右段に示すように、還元サンプルにおいて目的とする約３１ｋＤａのバンドが、ａおよびｃにおいて検出された。また、非還元サンプルにおいて約３１ｋＤａのバンドがａのみにおいて検出され、約５１ｋＤａのバンドがｃのみにおいて検出された。上述のように、抗体軽鎖の単量体は約３１ｋＤａであり、二量体は約５１ｋＤａである。したがって、サンプルａは抗体軽鎖の単量体の画分であり、サンプルｃは抗体軽鎖の二量体の画分である。【００６６】
その他のクローンにおいても、クローン（＃１）と同様に、野生型のヒト型抗体軽鎖の発現産物中には二量体と単量体が含まれており、Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラムおよび陽イオン交換クロマトグラムによる２段階精製によって二量体が精製され、Ｓ−Ｓ結合に寄与するシステインをアラニンに変異させた変異体の発現産物中には単量体が含まれており、同様の２段階精製によって単量体が精製された。【００６７】
（８．がん細胞に対する細胞障害性）
各種ヒト抗体κ型軽鎖のがん細胞に対する細胞障害性について試験した。がん細胞は、ＡＴＣＣより購入したＡ５４９（ヒト肺胞上皮がん細胞株）を用い、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有Ｆ−１２Ｋ培地を用いる通常の方法で培養した。【００６８】
まず、凍結されたＡ５４９細胞を融解して回復させた後、５×１０３細胞／ウェルとなるように９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。３７℃で２４時間培養した後、当該９６ウェルプレートに添加されている培地をデカンテーションで除去した後、約１ｍｇ／ｍＬに調製した各ヒト抗体κ型軽鎖を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。ヒト抗体κ型軽鎖を添加してから２４時間後、及び４８時間後（細胞を播種してから４８時間後、７２時間後）に、各ウェルにＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０μＬずつ添加し、１、１．５、及び２時間後に、生成されたホルマザン色素の吸光度（Ａｂｓ４５０ｎｍ）を測定した。得られた吸光度の結果に基づき、ヒト抗体κ型軽鎖を添加しなかったウェル（Ｎ．Ｃ．）の細胞生存率を１００％とし、各ウェルの細胞生存率を求め、添加したヒト抗体κ型軽鎖の細胞障害性を評価した。【００６９】
各ヒト抗体κ型軽鎖について、ヒト抗体κ型軽鎖を添加してから２４時間後及び４８時間後の細胞生存率を、図４、図５、表１及び表２に示す。生殖細胞系列遺伝子型がＡ１８ｂ又はＯ１１／ｏ１であったクローンの結果を図４及び表１に、生殖細胞系列遺伝子型がＡ３／Ａ１９であったクローンの結果を図５及び表２に示した。また、表１および２には、ウェル内におけるヒト抗体κ型軽鎖の濃度も示した。【００７０】
【表１】
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【００７１】
【表２】
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【００７２】
この結果、クローン（＃１＿ＷＴ）、クローン（＃４＿ＷＴ）、クローン（＃７＿ＷＴ）、及びクローン（２２Ｆ６＿Ｃ２２０Ａ）の４つのクローンが、Ａ５４９細胞に４０〜５０％程度の細胞傷害性を示した。その他のクローンについては、Ａ５４９細胞に対してがん細胞障害性は殆ど認められなかった。
当該４クローンのうち、クローン（＃４＿ＷＴ）及びクローン（＃７＿ＷＴ）は特に強い細胞傷害性を示した。中でもクローン（＃７＿ＷＴ）は、ヒト抗体κ型軽鎖添加前（０時間）とヒト抗体κ型軽鎖添加後（４８時間）において、ウェル内の細胞数がほとんど変化しなかったことから、クローン（＃７＿ＷＴ）、すなわちヒト抗体κ型軽鎖（＃７）は、Ａ５４９細胞の増殖を抑制する効果があることが示唆された。
また、今回用いたクローンの結果から、二量体（ＷＴ）のほうが単量体よりも細胞傷害性が強い傾向が観察されたことから、二量体に強い細胞傷害性が存在することも示唆された。
また、他のクローンを含めたものについても、各種細胞株に対し、上記と同様にヒト抗体κ型軽鎖の細胞障害性を評価した。その結果を表３に示す。【００７３】
【表３】
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【００７４】
この結果、クローン（＃１＿Ｈ３１Ｙ  Ｃ２２０Ａ）が、Ａ５４９細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、ＥＳ−２細胞に対し高い細胞傷害性を示した。また、クローン（＃７  ＲＬＩ）、クローン（Ｃ５１）が、ＭＯＬＴ−４細胞に対し高い細胞傷害性を示した。さらに、クローン（＃４）が、ＥＳ−２細胞に対し高い細胞傷害性を示した。
なお、クローン（＃１＿Ｈ３１Ｙ  Ｃ２２０Ａ）のアミノ酸配列は配列番号３８に、クローン（＃７  ＶＬ（Ｉ））のアミノ酸配列は配列番号３９に、クローン（＃７  ＲＬＩ）のアミノ酸配列は配列番号４０に、クローン（Ｃ５１）のアミノ酸配列は配列番号４１に、クローン（Ｃ８７）のアミノ酸配列は配列番号４２に、クローン（＃７  ＥＩ）のアミノ酸配列は配列番号４３に、クローン（＃７  ＴＲ）のアミノ酸配列は配列番号４４に、クローン（＃７  ＶＬ）のアミノ酸配列は配列番号４５に、クローン（Ｓ１３）のアミノ酸配列は配列番号４６に、クローン（Ｓ２１）のアミノ酸配列は配列番号４７に、クローン（Ｓ３８）のアミノ酸配列は配列番号４８に、クローン（＃１０）のアミノ酸配列は配列番号４９に、クローン（Ｃ６７）のアミノ酸配列は配列番号５０に、クローン（Ｃ８２）のアミノ酸配列は配列番号５１に、クローン（Ｃ８８）のアミノ酸配列は配列番号５２に、クローン（＃７  Ｇ）のアミノ酸配列は配列番号５３に、それぞれ記載されている。
また、図７、図８に示す通り、本願のヒト抗体κ型軽鎖を含有する抗がん剤は、動物実験において毒性を全く示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、新規抗がん剤の開発、がん治療の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７】
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【図３】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）可変領域が配列番号９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、又は
（２）可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
を含有することを特徴とする抗がん剤。
【請求項２】
前記（１）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖であり、又は
前記（２）のヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインが削除又はシステイン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖である、
請求項１に記載の抗がん剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
すなわち、本発明に係る抗がん剤は、
（１）可変領域が配列番号９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖、又は
（２）可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖、
を含有することを特徴とする。
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月20日(2014.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示され、かつ肺がん細胞に対する細胞障害性を有するポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖を含有することを特徴とする肺がんに対する抗がん剤。
【請求項２】
前記ヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列中の２１９番目のシステインが削除又はシステイン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示され、かつ肺がん細胞に対する細胞障害性を有するポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖である、請求項１に記載の肺がんに対する抗がん剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
すなわち、本発明に係る肺がんに対する抗がん剤は、可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示され、かつ肺がん細胞に対する細胞障害性を有するポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖を含有することを特徴とする。
【国際調査報告】
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