(57)【要約】  本発明は、分析用チップに固定化された選択結合性物質と被検物質との選択的な結合反応を促進させ、特に短時間での被検物質の分析が可能となる手段を提供するものである。  本発明は、分析用チップの凹部に被検物質を含む溶液を注入する際に、凹部の空間に該空間の一部を残して注入し、１×ｇ以上の遠心加速度を与えて分析用チップを旋回回転させて、被検物質溶液を攪拌する方法である。
2013129469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析用チップに注入された被検物質を含む溶液の攪拌方法であって、
該分析用チップは該被検物質を含む溶液が注入される凹部を有し、該凹部の底面表面の全て又は一部に該被検物質と選択的に結合する選択結合性物質が固定化され、
該被検物質を含む溶液は、分析用チップの凹部の空間に該空間の一部を残して注入され、
該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを１×ｇ以上の遠心加速度を与えて旋回回転させる、溶液の攪拌方法。
【請求項２】
該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下の回転半径で旋回回転する、請求項１に記載の溶液の撹拌方法。
【請求項３】
前記被検物質を含む溶液が、前記凹部に１０％以上７０％以下の空間を残して注入される、請求項１又は２に記載の溶液の攪拌方法。
【請求項４】
前記分析用チップが、互いに壁面で区切られた被検物質を含む溶液が注入される複数の凹部を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
【請求項５】
前記分析用チップに前記凹部の全体を覆うカバーが装着されて、前記被検物質を含む溶液が該凹部に密閉される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
【請求項６】
前記被検物質を含む溶液が注入された分析用チップが、前記凹部の底面が水平又は略水平となるよう設置されて水平又は略水平の方向に旋回回転させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法により分析用チップに固定化された選択結合性物質に被検物質を結合させ、選択結合性物質に結合した該被検物質を検出する、被検物質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質を含む溶液の攪拌方法であって、基板上に固定化された被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）に被検物質を含む溶液を接触させて反応させる際の溶液を攪拌する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析用チップは、被検物質と選択的に結合する物質である選択結合性物質（核酸、タンパク質、脂質、糖など）が固定化された基板を有し、この基板上の選択結合性物質と被検物質を通常溶液中でハイブリダイゼーション反応させて、その反応結果から被検物質に含まれる物質の存在有無、状態又は量などを分析するために用いられる。この基板としては、一般にガラス製、金属製、樹脂製のものが用いられる。【０００３】
分析用チップの一態様として、例えば数十〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定することを目的として、基板上にＤＮＡ、蛋白質、糖鎖などの分子を高密度に配置した、マイクロアレイと呼ばれるものがある。マイクロアレイを使用することによって、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量や、蛋白質／蛋白質間、糖鎖／糖鎖間又は糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖の検出・定量が可能となり、例えば各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になる。【０００４】
分析用チップのうち、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）は、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量等に用いられる。ＤＮＡチップとして、例えば、ガラス製の平面基板上に、多数のＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられている。ＤＮＡチップは、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所の蛍光を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法により、サンプル中の各遺伝子を検出し又はその量を測定するために用いられる。また、ＤＮＡチップは、発現遺伝子の検出や定量による遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）の検出等の応用分野においても大きく期待されている。【０００５】
また、分析用チップは、ＤＮＡ等の核酸だけでなく、タンパク質や糖類などの検査、解析手段としても利用されている。とりわけ、プロテイン分析用チップでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定化される。【０００６】
特許文献１には、凹凸構造を有する分析用チップを回転させ、分析用チップ中の微粒子又は気泡を動かして被検物質を含む溶液を攪拌する方法が記載されており、選択結合性物質が固定化された面に微粒子又は気泡が接触しないように微粒子又は気泡を移動させることで、微量の被検物質でも良好なＳ／Ｎ比で強い蛍光シグナルが得られ方法が開示されている。【０００７】
特許文献２には、凹凸構造を有する分析用チップを略水平方向に回転させ、被検物質と選択結合性物質との選択的な反応を行うにあたり、微粒子を用いて被検物質溶液を撹拌することにより簡便かつ安定して行うことができる方法が開示されている。【０００８】
特許文献３には、試料溶液と微粒子が入った容器を回転させて、微粒子を重力方向に落下させることで容器内の試料溶液を攪拌するハイブリダイゼーション方法及び装置が開示されている。【０００９】
特許文献４には、マイクロアレイを配置した専用のハイブリダイゼーション用チャンバーに、空間の一部を残してハイブリダイゼーション溶液を注入し、チャンバーを回転させることで、チャンバー内溶液の空間の位置が変化し、溶液を攪拌するハイブリダイゼーション方法が開示されている。【００１０】
特許文献５には、ターンテーブルに設置したマイクロアレイを公転させながら自身も回転させることで試料溶液を撹拌する、自公転方式のハイブリダイゼーション装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９０９９７号
【特許文献２】特開２００７−２８５８２８号公報
【特許文献３】特開２００３−３３９３７５号公報
【特許文献４】特許第４４７３００７号公報
【特許文献５】米国特許第６３０９８７５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１に記載される溶液の攪拌方法においては、例えば３ｒｐｍといった比較的低い回転数で分析用チップを回転させているが、この場合ハイブリダイゼーション反応に１０時間を要しており、被検物質の迅速な検出に適する方法ではなかった。また、特許文献２に記載される被検物質溶液の撹拌方法においても、ハイブリダイゼーション反応に１６時間を要していることから、特許文献１の方法と同様、被検物質の迅速な検出への適用できる方法ではなかった。また、特許文献３に開示される方法は、ハイブリダイゼーションの時間短縮を効果として謳っているものの、実際にはハイブリダイゼーション反応に６時間を要しており、迅速な診断が要求される分析には適用が困難であった。さらに、特許文献４に開示されるハイブリダイゼーション方法は、チャンバーを回転させることにより、静置で反応させる場合と比べてＣＶ値は良化しているものの、シグナル強度はほとんど変化しておらず、反応の進行を加速させるものではなかった。特許文献５に記載される装置は、少量の検体溶液でマイクロアレイの撹拌を可能とする装置であるが、ハイブリダイゼーションに要する時間やその時間短縮について言及しておらず、迅速診断に適応できるものかどうか不明であった。【００１３】
これら特許文献１〜５に記載の溶液の攪拌方法は、いずれもハイブリダイゼーション反応の効率を高めて検出感度を向上させることを目的としているが、実際にはハイブリダイゼーション反応に６時間から２０時間を要しており、分析用チップを用いた被検物質の検出又は定量のスピードを格段に高めるための技術とはいえない。したがって、分析用チップを用いて行う被検物質の分析において、数分からせいぜい２時間以内といった短時間での検出又は定量が求められる分析、例えばインフルエンザ等の感染症や敗血症等の検査・診断用途において、その要求を満たすようなスピードでの分析を可能とするための被検物質溶液の攪拌方法はこれまで存在しなかった。【００１４】
本発明は、前記課題を解決するもので、分析用チップに固定化された選択結合性物質と被検物質との選択的な結合反応（ハイブリダイゼーション反応）の進行を促進させ、特に短時間での被検物質の分析が可能となる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するため、本発明者らは、分析用チップを用いる被検物質の分析において、被検物質と固定化された選択結合性物質との反応を促進できる被検物質を含む溶液の攪拌方法について鋭意検討した結果、分析用チップの凹部に被検物質を含む溶液を凹部空間の一部を残して注入し、１×ｇ以上の遠心加速度を与えて旋回回転させて溶液を攪拌することで、短時間で安定した選択的結合反応が実現できることを見出し、本発明に到達した。【００１６】
すなわち、本発明は次の（１）〜（７）で構成される。
（１）分析用チップに注入された被検物質を含む溶液の攪拌方法であって、該分析用チップは該被検物質を含む溶液が注入される凹部を有し、該凹部の底面表面の全て又は一部に該被検物質と選択的に結合する選択結合性物質が固定化され、該被検物質を含む溶液は、分析用チップの凹部の空間に該空間の一部を残して注入され、該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを１×ｇ以上の遠心加速度を与えて旋回回転させる、溶液の攪拌方法。
（２）該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下の回転半径で旋回回転する、（１）に記載の溶液の撹拌方法。
（３）前記被検物質を含む溶液が、前記凹部に１０％以上７０％以下の空間を残して注入される、（１）又は（２）に記載の溶液の攪拌方法。
（４）前記分析用チップが、互いに壁面で区切られた被検物質を含む溶液が注入される複数の凹部を有する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
（５）前記分析用チップに前記凹部の全体を覆うカバーが装着されて、前記被検物質を含む溶液が該凹部に密閉される、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
（６）前記被検物質を含む溶液が注入された分析用チップが、前記凹部の底面が水平又は略水平となるよう設置されて水平又は略水平の方向に旋回回転させる、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
（７）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法により分析用チップに固定化された選択結合性物質に被検物質を結合させ、選択結合性物質に結合した該被検物質を検出する、被検物質の分析方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の被検物質溶液の攪拌方法によれば、被検物質と分析用チップに固定化された選択結合性物質との選択的な反応を効果的に促進し、選択結合性物質と被検物質が接近する機会を著しく増大させることができる。そのため、分析用チップを用いて被検物質溶液に含まれる被検物質を短時間で検出又は定量することが可能となる。【００１８】
また、本発明の被検物質溶液の撹拌方法によれば、被検物質を含む溶液が注入される凹部を複数有する分析用チップを用いる場合であっても、各凹部内の溶液を同じ条件で撹拌することができるため、各凹部における選択結合性物質と被検物質との反応を同条件で行うことができ、凹部間における反応ばらつきの発生を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。
【図２】本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。
【図３】本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。
【図４】カバーを装着した本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。
【図５】本発明の分析用チップの凹部の底面の好ましい形状の一例を示す上面図。（ａ）六角形、（ｂ）角がＲ加工された四角形、（ｃ）楕円形。
【図６】本発明の分析用チップに被検物質を含む溶液を注入した際の一態様を示す、分析用チップの断面図。
【図７】本発明の旋回回転を例示する図。
【図８】公転を含む回転様式を例示する図。
【図９】実施例１〜４、比較例１〜３における、反応時間とシグナル強度の関係を示すグラフ。
【図１０】図９のグラフのうち、反応時間が１時間までの部分を拡大したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、分析用チップとは、被検物質が含まれる溶液（以下「被検物質溶液」ということもある。）を当該チップに注入し、被検物質の存在の有無や、被検物質の量、被検物質の性状等を測定するために用いるチップを指す。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や有無を測定する、バイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び細胞を担体表面に固定化した細胞チップ等が挙げられる。
【００２１】
本発明で用いられる分析用チップには、被検物質を含む溶液が注入される凹部が形成されている。凹部は、壁面及び底面から構成される空間を形成しており、凹部の底面の表面の全て又は一部に選択結合性物質が固定化される。
【００２２】
以下に、本発明で用いられる分析用チップの例を、図１〜６を用いて説明する。
【００２３】
図１には、平板の基板１（例えば、スライドガラス）、貫通孔を有する板材２から構成される分析用チップが例示されている。基板１と貫通孔を有する板材２とが接合されて、凹部の壁面３及び凹部の壁面４とで構成される凹部６（又は凹部の空間）が形成されている。（ａ）は凹部６が１個の場合、（ｂ）は凹部６を複数個有する場合の一例であり、（ｃ）は各凹部の断面を示している。選択結合性物質は、基板１の表面（上面）の一部に固定化されているが、その固定化表面は、基板１と板材２とが接合されることにより、凹部６の底面３の一部において選択結合性物質の固定化表面５となる。
【００２４】
図１に例示するような選択結合性物質が固定化される平板の基板と、凹部を形成するための貫通孔を有する板材とから構成される分析用チップにおいて、当該平板基板及び板材の材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等の高分子材料を好適に用いることができる。平板基板と板材との接合方法は特に限定されず、接着剤を用いて実質上着脱できない状態で接着されてもよいし、両面テープや樹脂組成物等の接着層を介して着脱可能な状態で接着されてもよい。また、分析用チップ１枚あたりの凹部の数は分析の目的に合わせて設定することができ、１個でも複数個でもよい。
【００２５】
図２及び図３には、図１に例示する貫通孔を有する板材を用いず、例えば射出成形により、基板１に凹部６を形成した分析用チップを例示している。基板１に形成された凹部６は底面３及び壁面４とで構成される空間を有しており、凹部の底面３の一部が選択結合性物質の固定化表面５となっている。（ａ）は凹部が１個の場合、（ｂ）は凹部を複数個有する場合の一例であり、（ｃ）は凹部の断面の一例を示している。分析用チップ１枚あたりの凹部の数は、分析目的に合わせて任意の数を選択することができる。
【００２６】
図２及び図３に例示する分析用チップにおいて、基板の材質は、上記図１に例示する分析用チップにおける基板と同様のものを用いることができる。
【００２７】
本発明の溶液の攪拌方法において用いられる分析用チップの凹部の深さは特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍが好ましく、０．５〜５ｍｍがより好ましい。図２は凹部６の深さが浅いタイプ、図３は凹部６の深さが深いタイプの分析用チップの例である。
【００２８】
被検物質溶液が注入された分析用チップを旋回回転させる際、図３のような凹部が深い分析用チップを用いる場合は、分析用チップにカバーをせずにそのまま旋回回転させることも可能である。一方、図２のような凹部が浅い分析用チップを用いる場合は、凹部の全体を覆うカバーが装着されて被検物質溶液が凹部に密閉されることが好ましい。分析用チップを旋回回転させる条件（遠心加速度、回転数、回転半径）にあわせて、例えば、凹部の深さが５ｍｍ以下の場合は、カバーを装着することが好ましい。
【００２９】
図４に例示する分析用チップは、凹部６の全体を覆うカバー７が分析用チップに装着されて被検物質溶液が凹部６に密閉される分析用チップの例である。具体的には、図２又は図３に示す分析用チップに平板状のカバー７が装着されたものである。（ａ）は凹部が１個の場合、（ｂ）は凹部を複数個有する場合の一例であり、（ｃ）は凹部の断面を示している。この例では、カバー７には、被検物質溶液を凹部に注入するための注入孔８が備えられている。
【００３０】
カバーとしては、樹脂製、ゴム製、ガラス製等の平板や粘着性テープ等のシール材料を用いることができる。カバーに被検物質溶液を凹部に注入するための注入孔を設けることにより、被検物質溶液を凹部に注入した後でカバーを装着することができる。この場合、注入孔は複数個あることが好ましく、例えば凹部当たり２〜４個設けることができる。一方、被検物質溶液の注入後にカバーを装着する場合は、カバーに注入孔を設けても設けなくてもよく、例えば粘着性テープで開放部を塞いで密閉する方法、開放部の形状に合わせたＯリングを固定した板材を密着させて密閉する方法、粘土様の物質で開放部に蓋をして密閉する方法などを好適に用いることができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーション反応の際、被検物質溶液の蒸発を防いだり、反応温度を厳密に一定に保ったりする必要がある場合、分析用チップの凹部の空間を密閉することが好ましく、その場合は分析用チップにカバーを装着して用いることが好ましい。
【００３２】
本発明の溶液の攪拌方法において用いられる分析用チップの凹部の底面の形状は、分析用チップを旋回回転させるときに、被検物質溶液で満たされていない凹部に残された空間（又は気泡）が移動しやすい形状であることが好ましい。例えば、図５に示すように、凹部の底面の形状が六角形（ａ）、四角形（ｂ）、楕円形（ｃ）である分析用チップを用いることが、凹部に残された空間（又は気泡）９が移動しやすくなるため好ましい。また、凹部の底面の形状が多角形の場合に角がＲ加工されていること（例えば、図５の（ｂ））も、被検溶液で満たされていない凹部に残された空間（又は気泡）が移動しやすくなるため好ましい。
【００３３】
図６は、カバーを装着した分析用チップに被検物質を含む溶液を注入した際の一態様を示す、分析用チップ凹部付近の断面図である。分析用チップの凹部の空間６に被検物質を含む溶液を注入し、溶液で満たされていない空間（又は気泡）９を形成させ、カバー７を装着した状態を示す。図６の状態で分析用チップを旋回回転することで被検物質溶液を攪拌し、ハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
【００３４】
本発明における選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。担体の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
【００３５】
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡが挙げられ、ＰＮＡ、ＬＮＡでも良い。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ、それらの一部である断片などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡやそれらの一部である断片などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、化学的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡ等も含まれる。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Ｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３：２３０３（１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｆａｖａｌｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：７１８（１９８０））等により行うことができる。固定化される核酸としては、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００３６】
蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ´）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
【００３７】
糖類としては、各種単糖、オリゴ糖、多糖などの糖鎖を挙げることができる。
【００３８】
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
【００３９】
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。
【００４０】
これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖、脂質を挙げることができる。
【００４１】
本発明で用いられる被検物質としては、測定すべき核酸（標的核酸）、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の溶液の攪拌方法では、これらの被検物質を含む溶液として、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。ここで、被検物質を含む溶液の粘度は、遠心加速度を与えて分析チップを旋回回転させるときに、被検物質溶液で満たされていない分析チップの凹部の空間が移動可能であれば特に限定されない。
【００４３】
被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型とし、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、本発明の攪拌方法を行った後の測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。また、増幅されていない核酸を被検物質とする場合は、例えばアルカリホスファターゼにより核酸の５’末端のリン酸基を除去して蛍光物質を標識した被検物質を選択結合性物質と反応させ、結合した標識を測定する方法や、選択結合性物質（捕捉プローブ）により被検物質を捕捉した後、被検物質に蛍光物質等で標識した検出プローブを結合させ、検出プローブの標識を測定する方法（サンドイッチハイブリダイゼーション法）が好適に用いられる。
【００４４】
本発明の溶液の攪拌方法においては、上述のような標識、増幅等を施した被検物質を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させて被検物質を含む溶液（被検物質溶液）とする。
【００４５】
本発明の溶液の攪拌方法では、分析用チップの凹部の空間への被検物質溶液の注入は、凹部の空間の一部を残すように行われ、凹部には被検物質溶液で満たされていない空間が形成される。被検物質溶液で凹部の空間を完全に満たさずに被検物質溶液で満たされていない空間を形成することで、分析用チップの旋回回転によって凹部内で空間が移動し、被検物質溶液を攪拌することができる。分析用チップが旋回回転されるとき、凹部に形成された空間は、凹部内で単一の空間として存在してもよいし、複数の空間に分かれて、すなわち複数の気泡となって存在してもよい。
【００４６】
凹部の空間に占める、被検物質溶液で満たされていない空間の割合は、下限が好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、上限が好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である。被検物質溶液で満たされていない空間の割合の範囲は、１０％以上９０％以下が好ましく、１５％以上８０％以下がより好ましい。さらに好ましくは、２０％以上７０％以下である。この空間の割合が５％より少ないと、分析用チップの旋回回転の際、凹部の空間における被検物質溶液の移動が不十分となり、実質上被検物質溶液が攪拌されないおそれがあり、また９０％より多いと、選択結合性物質が固定化された領域に被検物質を含む溶液が接触する機会が減少して反応の進行低下につながる。また、図３のような凹部が深い分析用チップを、カバーを装着せずに旋回回転させる場合は、被検物質溶液で満たされていない空間の割合は、例えば３０％以上９０％以下が好ましく、４０％以上８０％以下がより好ましい。
【００４７】
本発明の溶液の攪拌方法では、被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを旋回回転させることで溶液の撹拌を行う。ここで、旋回回転とは、分析用チップ自体が円運動又は楕円運動により回転軸の周囲を回転することを意味する。詳細には、本発明の旋回回転は、分析用チップ上の任意のいずれの点においても、各固有の回転中心を有する同じ半径の円運動がなされるように行う回転様式のことを指す。図７に、本発明の旋回回転の一例を示す。分析用チップ１０上の任意の点Ａ、Ｂについて、点Ａは、ＯＡを中心とした半径ｒの円軌道上を所定回転数で回転し、点Ｂも同様に、ＯＢを中心とした半径ｒの円軌道上を所定回転数で回転する。このとき、分析用チップ１０上の任意の点Ａ、Ｂを結ぶ直線ＡＢは、円運動の任意の軌道において常に平行となる。例えば、図７において、分析用チップ１０が位置Ｐ１、位置Ｐ２、位置Ｐ３、位置Ｐ４のいずれに位置する場合でも、直線ＡＢは平行となる。一方、公転回転や自公転回転といった、公転を含む回転様式の場合は、図８に示すとおり、公転の中心Ｏから分析用チップ１０上の任意の点Ａ、点Ｂまでの距離（ｒａ、ｒｂ）がそれぞれ異なる。すなわち、公転を含む回転様式は、分析用チップ上の位置によって円運動の回転半径が異なる回転様式である。
【００４８】
分析用チップを旋回回転させる際、分析用チップは、その選択結合性物質が固定化された面が回転面に平行又は略平行になるように設置されることが好ましい。
【００４９】
被検物質を含む溶液が注入される凹部を複数有する分析用チップを用いる場合、旋回回転させることにより、各凹部内の溶液を同じ条件で撹拌できることから、各凹部における選択結合性物質と被検物質との反応を同条件で行うことができ、凹部間の反応ばらつきを低減できるため好ましい。一方、分析用チップを公転させながら自身を回転させる自公転方式や、回転中心が分析用チップの外側にある公転方式によって攪拌する場合は、複数の凹部がそれぞれ異なる条件で撹拌されることになり、凹部間の反応ばらつきが発生するおそれがある。
【００５０】
分析用チップを旋回回転させる際の回転面の方向は特に限定されず、例えば水平又は略水平方向、水平方向から１５度傾いた方向、水平方向から３０度傾いた方向、水平方向から４５度傾いた方向、水平方向から６０度傾いた方向、水平方向から７５度傾いた方向、鉛直又は略垂直方向などを用いることができる。好ましい回転面の方向は、水平又は略水平方向である。ここで、略水平方向とは、分析用チップの選択的結合物質が固定化された面に向かって水平に近い方向を意味し、例えば水平面を基準として０度から３度の範囲で傾いた方向が好ましい。また、略垂直方向とは、分析用チップの選択結合性物質が固定化された面に向かって垂直に近い方向を意味し、例えば垂直面を基準として０度から３度の範囲で傾いた方向が好ましい。
【００５１】
本発明において、分析用チップの旋回回転は、回転数を一定としても、回転数を変化させてもよく、また旋回回転中に一定時間停止させるなど間歇的に行ってもよい。また、回転方向は特に限定されず、時計回りでも反時計回りでもよく、その組み合わせでもよい。
【００５２】
反応時に旋回回転させる時間は、特に限定されず、選択結合性物質と被検物質とが反応するのに十分な範囲で適宜決定することができる。例えば、被検物質が核酸である場合は、選択結合性物質であるプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応に要する時間にあわせて設定することができる。本発明の溶液の攪拌方法では、旋回回転時に１×ｇ以上の遠心加速度を与えることで、被検物質と選択結合性物質との選択的反応を効果的に促進し、被検物質を短時間で検出又は定量することが可能となる特徴を有する。この特徴を活かして、特に検査・診断用途で分析用チップを用いる場合等、迅速な検出又は定量を求められる場合には、旋回回転させる時間は短時間であることが好ましい。例えば、核酸のハイブリダイゼーションの場合、反応時間が３時間以上４時間以内あることが好ましく、２時間以内であることがより好ましく、１時間以内であることがさらに好ましく、０．５時間以内であることが特に好ましい。
【００５３】
一般に、遠心加速度とは、回転運動をする系において、物体に加わる遠心力の大きさを加速度の形で表したものであり、回転の中心からの距離の絶対値及び回転運動の角速度の二乗に比例する。本発明における遠心加速度は、遠心力、すなわち相対遠心加速度（Ｒａｌａｔｉｖｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｆｏｒｃｅ；ＲＣＦ）を指し、以下の式１で算出される。
【００５４】
ＲＣＦ＝１１１８×Ｒ×Ｎ２×１０−８    ・・・（式１）
ＲＣＦ：相対遠心加速度（×ｇ）
Ｒ：回転半径（ｃｍ）
Ｎ：回転数（ｒｐｍ）。
【００５５】
本発明の溶液の攪拌方法では、分析用チップを旋回回転させるときに１×ｇ以上の遠心加速度を与える。遠心加速度の下限は、好ましくは５×ｇ以上、より好ましくは１０×ｇ以上である。遠心加速度の上限は特に限定されないが、好ましくは５０×ｇ以下、より好ましくは４０×ｇ以下であり、さらに好ましくは３０×ｇ以下である。遠心加速度の範囲は、好ましくは１×ｇ以上５０×ｇ以下であり、より好ましくは５×ｇ以上４０×ｇ以下であり、さらに好ましくは１０×ｇ以上３０×ｇ以下である。
【００５６】
本発明の溶液の攪拌方法では、分析用チップを旋回回転させる際の回転数と回転半径を適宜設定することで、目的とする遠心加速度を与えることができる。従って、分析用チップを攪拌させる撹拌装置の仕様にあわせて回転数と回転半径を選択して行うことができる。例えば、回転半径が小さい場合は、回転速度を大きくすることで、大きな遠心加速度を付与できる。
【００５７】
回転半径は、回転数との組合せで所望の遠心加速度が得られる値を適宜選択することができる。回転半径の下限は、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、さらに好ましくは０．３ｍｍ以上である。また、回転半径の上限は、好ましくは２０ｍｍ以下、より好ましくは１０ｍｍ以下、さらに好ましくは５ｍｍ以下である。回転半径の範囲としては、好ましくは０．１〜２０ｍｍ、より好ましくは０．２〜１０ｍｍ、さらに好ましくは０．３〜５ｍｍである。回転半径が２０ｍｍより大きくなると、遠心力が支配的になり、被検物質溶液で満たされていない空間が凹部の外周に押し付けられる傾向があり、撹拌効率の低下や、凹部内での攪拌ムラが生じることがある。一方、回転半径が０．１ｍｍより小さいと、回転方向に働く力が支配的になり、被検物質溶液で満たされていない空間が凹部の中心部に留まる傾向があり、撹拌効率の低下や、攪拌ムラが生じることがある。
【００５８】
また、旋回回転の回転数は、回転半径との組合せで所望の遠心加速度が得られる値を適宜選択することができるが、好ましくは５００ｒｐｍ以上１００００ｒｐｍ以下、より好ましくは７５０ｒｐｍ以上８０００ｒｐｍ以下である。回転半径が小さい方が、反応装置や攪拌装置を小型化でき、本発明の溶液の攪拌方法を具現化する装置をコンパクトに作製できることから、好ましい。
【００５９】
また、分析用チップにカバーを装着せずに旋回回転させる場合は、注入された被検物質溶液がこぼれないようにするため、回転半径の小さい攪拌装置が好適に使用される。例えば、回転半径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上４ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であることが一層好ましい。
【００６０】
本発明において使用する分析用チップを攪拌させる撹拌装置は、旋回回転の回転数と回転半径との組合せで１×ｇ以上の遠心加速度を与えることができるものであれば特に限定されない。市販品では、プレートシェーカーを好適に用いることができ、例えば「ＢｉｏＳｈａｋｅ５０００  ｅｌｍ」、「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ３０００−Ｔ  ｅｌｍ」、「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ３０００  ｅｌｍ」（以上、Ｑ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、「モノシェーク」、「テレシェーク」、「テレシェーク１５３６」（以上、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、「ＭＳ３  ベーシック」、「ＭＳ３  デジタル」、「ＶＸＲ  ｂａｓｉｃ  Ｖｉｂｒａｘ」（登録商標）、「ＶＯＲＴＥＸ  ３」（以上、ＩＫＡ社製）、「マイクロプレートシェーカーＮ−７０４」（日伸理化製）、「プレートシェーカーＫＭ−Ｍ０１」（カジックス製）、「プレートミキサーＰ−１０」（十慈フィールド製）等が挙げられる。自動化装置に組み入れる場合、外部から旋回回転の回転数や駆動時間などを制御できる装置であることが好ましい。
【００６１】
本発明において、凹部内側の空間に撹拌子を添加してもよい。撹拌子としては、微粒子（ビーズ）、マイクロロッド等が挙げられ、特に微粒子が好ましい。微粒子やマイクロロッドの形状は、分析用チップの凹部内で移動可能であって被検物質を含む溶液を攪拌することが可能であれば特に限定されない。微粒子の場合、球状以外に、多角形でも良く、またマイクロロッドの場合、円筒形、角柱形など任意の形状とすることができるが、球状のものが好ましい。また、微粒子のサイズも特に限定されないが、例えば球状の微粒子の場合、直径０．１μｍ以上１０００μｍ以下の範囲とすることができ、撹拌効率を鑑みると、直径５０μｍ以上５００μｍ以下の範囲がより好ましい。マイクロロッドの場合、好ましくは長さ５０μｍ以上５０００μｍ以下、底面直径１０μｍ以上３００μｍ以下の範囲とすることができる。微粒子やマイクロロッドは、撹拌効率などの面から、１種類を選択して用いることもできる他、２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００６２】
前記微粒子やマイクロロッドの材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロンやポリスチレン）等を用いることができる。
【００６３】
本発明で用いる分析用チップは、凹部に、その上部表面に選択結合性物質を固定化するための凸部を有していてもよい。このような構造を有する分析用チップを被検物質の分析に用いることにより、シグナル検出の際、選択結合性物質が固定化された凸部上面にスキャナーの焦点を合わせることで、検出ノイズを大幅に低減でき、Ｓ／Ｎ比を高めることができる。また、本発明で用いる分析用チップは、自家蛍光を低減できる材料により製造されていることが好ましく、例えば選択結合性物質が固定化される凸部には少なくともその一部が黒色であることが好ましい。
【００６４】
本発明において、シグナルの検出の感度を示す指標としてＳ／Ｎ比（シグナル対ノイズ比）を用いることができる。この場合、Ｓ／Ｎ＝２を検出限界として感度を判断することが好ましい。一般に、Ｓ／Ｎ比が２〜３となる被検物質濃度又は量が検出限界として採用されており、Ｓ／Ｎが２以上であれば検出限界以上の信頼性のある検出がされたものと判断することができる。（例えば、丹羽誠著、「これならわかる  化学のための統計手法−正しいデータの扱い方−」、２００８年、化学同人編、１０１頁）
本発明の溶液の攪拌方法は、分析用チップに固定化された選択結合性物質と被検物質との選択的反応の進行を従来より促進させることができるため、被検物質を短時間で検出又は定量することを可能とする。例えば、核酸のハイブリダイゼーションにおいて、従来６〜２０時間の反応時間を要していた反応時間を、大幅に短縮することができる。従って、例えば、数多くの検体を迅速に分析することが求められる検査・診断領域において分析用チップを用いて分析を行う場合、本発明の溶液の攪拌方法を適用することが好ましい。例えば、インフルエンザ等の感染症や、敗血症の検査・診断に好ましく用いることができる。また、検査センターにおいて莫大な数の検体を処理する場合も、迅速に分析を行うことができるので、コストを削減の点から本発明の適用が好ましい。
【実施例】
【００６５】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
参考例１
（１）分析用チップの基板の作製
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成形法により、後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。【００６６】
基板としては、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚さ１ｍｍであり、基板に縦６．４８ｍｍ、横６．９０ｍｍ、深さ０．１２ｍｍの凹部を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１２ｍｍの凸部を５７６箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする。）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部上面と平坦部上面との高さの差は、３μｍ以下であった。また、凸部上面の高さのばらつきは、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチを０．１８ｍｍとした。【００６７】
上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。【００６８】
（２）選択結合性物質の固定化
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。４種の遺伝子ａ〜ｄに対応するオリゴヌクレオチドとして、配列番号１〜４の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド（オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット「Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）  ＡＲＯＳ  Ｖ４．０（各６０塩基）」）を用いた。この各オリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；「Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ−ＩＩ」）を用いて、基板Ａの凸部上面に遺伝子ａに対応する配列番号１の塩基配列で示されるプローブをＮ＝４でスポットしたもの（以下、「分析用チップ１」とする。）、遺伝子ｂ〜ｄに対応する配列番号２〜４の塩基配列で示されるプローブをそれぞれＮ＝２でスポットしたもの（以下、「分析用チップ２」とする。）を用意した。次いで、スポットした各基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。【００６９】
（３）分析用チップ基板へのカバー部材の貼付
選択結合性物質を固定化した上記分析用チップ１、分析用チップ２に対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材は、ＰＭＭＡ平板を切削加工により作製した。作製した該カバー部材には、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを設けた。そして接着部材として両面テープを用い、カバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、当該カバー部材を分析用チップ１、分析用チップ２に貼付した。【００７０】
（４）被検物質の調製
被検物質は、マイクロアレイの被検物質として一般的である、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）を用いて調製した。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製「Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ」）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キット「ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ａＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を使用して調製したａＲＮＡを、Ｃｙ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で蛍光標識して、Ｃｙ５標識ａＲＮＡを得た。【００７１】
（５）選択結合性物質と被検物質とのハイブリダイゼーションのための反応液
以下の実施例、比較例で特に断りのない限り、上記で調製した標識ａＲＮＡを、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液（各濃度はいずれも終濃度）で希釈したものを用いた。【００７２】
実施例１
参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ１００ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して２５μＬとして、被検物質溶液を調製した。被検物質溶液を分析用チップ１に１０μＬ注入した。凹部内の被検物質溶液で満たされていない空間の容積は約３μＬであり、凹部内に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は約２３％であった。以上の分析用チップ１を６セット用意した。各分析チップの注入口をシールして凹部を密閉した状態にして、３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」（Ｑ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；最大回転数５０００ｒｐｍ、回転半径０．６ｍｍ）にセットし、各分析用チップについて５０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌して反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約１７．７×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置（東レ株式会社；「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ」）を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値（ブランクスポットの平均＋２ＳＤ）以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。【００７３】
実施例２
実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」にセットし、３０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約６．０４×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。【００７４】
実施例３
実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＭＳ３デジタル」（ＩＫＡ社；最大回転数３０００ｒｐｍ、回転半径２．２５ｍｍ）にセットし、３０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約２２．６×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。【００７５】
実施例４
実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＭＳ３デジタル」にセットし、１０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約２．５２×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。【００７６】
比較例１
実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブン内に設置した、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」にセットし、１０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、分析用チップに与えられた遠心加速度は、約０．６７１×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈでは、閾値以上のシグナルが検出されなかった。閾値以上のシグナルが検出されたのは、反応開始後１ｈ以降であった。【００７７】
比較例２
実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブン内に設置した、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」にセットし、２５０ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約０．０４２×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈでは、閾値以上のシグナルが検出されなかった。閾値以上のシグナルが検出されたのは、反応開始後１ｈ以降であった。【００７８】
比較例３
実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブン内に設置した、攪拌装置「ＭＳ３デジタル」にセットし、２５０ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、分析用チップに与えられた遠心加速度は、約０．１５７×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈでは、閾値以上のシグナルが検出されなかった。閾値以上のシグナルが検出されたのは、反応開始後１ｈ以降であった。【００７９】
【表１】
2013129469.tif 000003
【００８０】
実施例５
参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ６０ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して１０μＬとして、分析用チップ２（２セット）に６．７μＬ注入した。注入されたＣｙ５標識ａＲＮＡの量は４０ｎｇであり、実施例１〜４と同量であった。凹部内の被検物質溶液で満たされていない空間の容量は約６．３μＬであり、凹部全体に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は約４８％であった。実施例１と同様にして、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」にセットし、それぞれ５０００ｒｐｍで１時間反応させた。各分析用チップについて、３種類の遺伝子ｂ〜ｄに対してハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を表２に示す。１時間の反応時間で、全ての遺伝子のシグナル強度が閾値以上となり有効であった。【００８１】
実施例６
参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ６０ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して１５μＬとして、分析用チップ２（２セット）に１０μＬ注入した。注入されたＣｙ５標識ａＲＮＡの量は４０ｎｇであり、実施例１〜４と同量であった。凹部内の被検物質溶液で満たされていない空間の容量は約６．３μＬであり、凹部全体に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は約２３％であった。実施例１と同様にして、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」にセットし、それぞれ５０００ｒｐｍで１時間反応させた。各分析用チップについて、３種類の遺伝子ｂ〜ｄに対してハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を表２に示す。１時間の反応時間で、全ての遺伝子のシグナル強度が閾値以上となり有効であった。【００８２】
比較例４
参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ６０ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して２０μＬとし、分析用チップ２（２セット）に１３μＬ注入して凹部を満たした（凹部全体に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は０％）。実施例１と同様にして、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」にセットし、それぞれ５０００ｒｐｍで１時間反応させた。各分析用チップについて、３種類の遺伝子ｂ〜ｄに対してハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を表２に示す。１時間の反応時間で、遺伝子ｂのシグナル強度は閾値以上となり有効であったものの、実施例５、６よりシグナル強度が弱かった。また、遺伝子ｃ、ｄのシグナル強度は閾値より低く、無効であった。【００８３】
【表２】
2013129469.tif 000004
【００８４】
参考例２
（１）分析用チップの基板の作製
参考例１と同様の材質で、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚さ２．５ｍｍの基板を射出成形で作製した。基板には長辺４．８ｍｍ、短辺２．４０ｍｍ、深さ１．５ｍｍの楕円形の凹部を４箇所設け、各凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１２ｍｍの凸部を９８箇所設けた基板（以下「基板Ｂ」とする。）を用いた。基板Ｂにおいて、凹部の容積は約１３．５μＬであった。また、凸部上面と平坦部上面との高さの差、凸部上面の高さのばらつきはともに３μｍ以下であった。また、凸部のピッチを０．１８ｍｍとした。【００８５】
（２）選択結合性物質（捕捉プローブ）の固定化
参考例１と同様の作製方法により、選択結合性物質（捕捉プローブ）として、ヒトパピローマウイルスの型判別の研究で報告された文献（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５．ｐ．９０１−９０５）に記載された、配列番号５の塩基配列（被検物質となる１６型ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子領域の配列の一部と相補的な配列）で示されるオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノ基を修飾したものを合成し、基板Ｂの９８箇所の凸部のうちの２２箇所にスポットして固定化することで、分析用チップを得た（以下、「分析用チップ３」とする。）。【００８６】
（３）被検物質の調製
被検物質として、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入したヒトパピローマウイルスのゲノムＤＮＡがクローニングされた組み換えプラスミド（ｐＨＰＶ１６（全長１６，６００塩基対））を、超音波により断片化処理した。１×ハイブリダイゼーション溶液（１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５×ＳＳＣ、１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｎｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％ホルムアミド）で核酸濃度が０．１ａｍｏｌ／μＬとなるように希釈し、検体ＤＮＡ溶液とした。【００８７】
（４）検出プローブ溶液の調製
サンドイッチハイブリダイゼーションに使用する検出プローブとして、ＭＹ１１（配列番号６；被検物質が捕捉プローブと結合した場合の５´末端の塩基位置を基準として、５´末端側５０〜６９番目の塩基配列に対する相補的な配列）、ＧＰ５（配列番号７；ＭＹ１１と同様に、５´末端側１０〜３４番目の塩基配列に対する相補的な配列）、ＧＰ６（配列番号８；被検物質が捕捉プローブと結合した場合の３´末端の塩基位置を基準として、３´末端側６０〜８２番目の塩基配列に対する相補的な配列）、及びＭＹ０９（配列番号９；ＧＰ６と同様に、３´末端側３４０〜３５９番目の塩基配列に対する相補的な配列）の、３’末端及び５’末端にビオチン標識したものをそれぞれ合成した。これらを濃度が１００ｆｍｏｌとなるよう滅菌水で希釈し、各検出プローブ溶液を得た。【００８８】
実施例７
参考例２に記載の検体ＤＮＡ溶液１μＬに、参考例２に記載の検出プローブ溶液１μＬを加えて混和し、サーマルサイクラーで９５℃、５分間加熱した。室温に戻るまで静置後、参考例２に記載の１×ハイブリダイゼーション溶液を８μＬ加えて混和し、被検物質を含むハイブリダイゼーション溶液とした。全量を分析用チップ３の凹部の１箇所に注入し、開口部をアクリル系粘着剤が塗布されたＰＥＴ製フィルムでシールした。このとき、凹部内の溶液で満たされていない空間の容積は約３．５μＬであり、凹部内に占める溶液で満たされていない空間の割合は約２６％であった。サンドイッチハイブリダイゼーション法により、被検物質の検出を行った。３２℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ  ５０００」（Ｑ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）にセットし、３０００ｒｐｍで２ｈ攪拌し、捕捉プローブと被検物質をハイブリダイゼーション反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約６．０４×ｇであった。反応後、開口部を塞いだシールを剥がし、３０℃に加温した洗浄液Ａ（０．５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ）で５分間洗浄した。乾燥後、染色試薬（ストレプトアビジンフィコエリスリン）を希釈液（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）と混合して調製した、５０ｎｇ／μＬストレプトアビジンフィコエリスリン溶液を、凹部に１０μＬ滴下し、３５℃で５分間遮光下でインキュベートした。３０℃に加温した洗浄液Ｂ（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄し、乾燥させた。シグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置（東レ株式会社；「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ」）を用いて測定した。選択結合性物質が固定化された凸部（シグナル）及び固定化されていない凸部（ノイズ）の数値をそれぞれ読み取り、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．８０であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００８９】
実施例８
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を５０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は１６．７７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．５３であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００９０】
比較例５
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．６７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．５６であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【００９１】
実施例９
撹拌装置として「Ｍｉｘ−ＥＶＲ」（タイテック社；最大回転数２５００ｒｐｍ、回転半径１ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は４．４７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．２４であり、検出限界するＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００９２】
実施例１０
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２５００ｒｐｍとした以外は、実施例９と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は６．９９×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．７６であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００９３】
比較例６
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を５００ｒｐｍとした以外は、実施例９と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．２８×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．４８であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【００９４】
実施例１１
撹拌装置に「ＭＳ３デジタル」（ＩＫＡ社）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は１０．０６×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝３．２５であり、一検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００９５】
実施例１２
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を３０００ｒｐｍとした以外は、実施例１０と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は２２．６４×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．７２であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００９６】
比較例７
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を５００ｒｐｍとした以外は、実施例１１と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．６３×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．６１であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【００９７】
実施例１３
製作した撹拌装置（最大回転数１０００ｒｐｍ、回転半径５ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は５．５９×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．３９であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。【００９８】
比較例８
ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２５０ｒｐｍとした以外は、実施例１３と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．３５×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．４９であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【００９９】
比較例９
撹拌装置に「マルチシェーカーＭＭＳ−２１０」（東京理化器械社；最大回転数２５０ｒｐｍ、回転半径１２．５ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２５０ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．８７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．５６であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【０１００】
比較例１０
製作した撹拌装置（最大回転数１０００ｒｐｍ、回転半径２４ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．２７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．３９であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【０１０１】
比較例１１
製作した撹拌装置（最大回転数１０００ｒｐｍ、回転半径７２ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．８０×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．５７であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
実施例１４
参考例２に記載の検体ＤＮＡ溶液４μＬに、参考例２に記載の検出プローブ溶液４μＬを加えて混和し、サーマルサイクラーで９５℃、５分間加熱した。室温に戻るまで静置後、参考例２に記載の１×ハイブリダイゼーション溶液を３２μＬ加えて混和し、被検物質を含むハイブリダイゼーション溶液とした。分析用チップ３の凹部４箇所（凹部Ｎｏ．＃１〜＃４）に、それぞれ１０μＬ注入し、開口部をアクリル系粘着剤が塗布されたＰＥＴ製フィルムでシールした。このとき、凹部内の溶液で満たされていない空間の容積は約３．５μＬであり、凹部内に占める溶液で満たされていない空間の割合は約２６％であった。サンドイッチハイブリ法により、被検物質の検出を行った。３２℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＭＳ３デジタル」（ＩＫＡ社）にセットし、２０００ｒｐｍで２ｈ攪拌し、捕捉プローブと被検物質をハイブリダイゼーション反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約１０．１×ｇであった。反応後、開口部を塞いだシールを剥がし、３０℃に加温した洗浄液Ａ（０．５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ）で５分間洗浄した。乾燥後、染色試薬（ストレプトアビジンフィコエリスリン）を希釈液（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）と混合して調製した、５０ｎｇ／μＬストレプトアビジンフィコエリスリン溶液を、凹部に１０μＬ滴下し、３５℃で５分間遮光下でインキュベートした。３０℃に加温した洗浄液Ｂ（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄し、乾燥させた。シグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置（東レ株式会社；「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ」）を用いて測定した。選択結合性物質が固定化された凸部（シグナル）及び固定化されていない凸部（ノイズ）の数値をそれぞれ読み取り、４箇所の凹部（凹部Ｎｏ．＃１〜＃４）のシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を算出した結果を表４に示す。それぞれＳ／Ｎ＝２．９、２．７、２．８．２．８であり、すべての凹部で検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。また、各凹部内における２２個の凸部スポットのシグナルのＣＶ値がすべて１０％を切る低い値であり、凹部内のシグナルのばらつきも小さかった。さらに、４箇所の凹部全体のシグナル（８８個）のＣＶ値も７．５％と低く、凹部間のばらつきも小さいことが示された。【０１０４】
比較例１２
製作した自公転方式の撹拌装置（公転半径７２ｍｍ）を用い、公転回転数を３５０ｒｐｍとした以外は、実施例１４と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は９．９×ｇであった。４箇所の凹部（凹部Ｎｏ．＃１〜＃４）のＳ／Ｎ比を算出した結果を表４に示す。それぞれＳ／Ｎ＝１．８、１．９、１．７、１．５であり、すべての凹部で検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。また、各凹部内における２２個の凸部スポットのシグナルのＣＶ値は１０％前後でばらつきがあり、さらに、４箇所の凹部全体のシグナル（８８個）のＣＶ値が１５．３％と高く、凹部間のばらつきが大きいことが示された。【０１０５】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の溶液の攪拌方法は、ＤＮＡチップ等の分析用チップを用いる被検物質の検出又は定量に要する時間を従来より大幅に短縮することができる。従って、本発明は、臨床現場や検査センターにおける迅速な疾患の診断・診察等を可能とすることから有用である。
【符号の説明】
【０１０７】
１  基板
２  貫通孔を有する板材
３  凹部の底面
４  凹部の壁面
５  選択結合性物質の固定化表面
６  凹部（又は凹部の空間）
７  カバー
８  注入孔
９  溶液で満たされていない空間（又は気泡）
１０  分析用チップ
【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
2013129469.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
2013129469.tif 000013
【図６】
2013129469.tif 000014
【図７】
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【図８】
2013129469.tif 000016
【配列表】
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【国際調査報告】
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