(57)【要約】  親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−オルニチンの取り込み活性を有する蛋白質をコードする１以上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物中から該アミノ酸を採取することにより、該アミノ酸を効率よく製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、以下の［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物中から該アミノ酸を採取することを特徴とする該アミノ酸の製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［３］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
［５］配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
【請求項２】
親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、請求項１の［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、以下の［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたコリネ型細菌であることを特徴とする請求項１記載の製造法。
［７］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［８］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［９］配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
アミノ酸がＬ−アルギニンまたはＬ−シトルリンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸を生成蓄積する能力を有するコリネ型細菌を用いた該アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸の発酵生産において、アミノ酸の細胞内への取り込み活性を低下または喪失させると、微生物の細胞外に排出されたアミノ酸が、再度細胞内に取り込まれて代謝されることを防ぐことができることから、その生産性が向上することが知られている。
例えば、Ｌ−グルタミン酸においては、Ｌ−グルタミン酸の細胞内への取り込み活性を低下または喪失させたコリネバクテリウム・グルタミカムを用いた、Ｌ−グルタミン酸の製造法が報告されている（特許文献１）。また、芳香族アミノ酸においては、芳香族アミノ酸の細胞内への取り込み活性を低下または喪失させたコリネバクテリウム・グルタミカムを用いた、芳香族アミノ酸の製造法が報告されている（特許文献２）。【０００３】
アミノ酸の細胞内への取り込み活性を有する蛋白質としては、大腸菌においては、Ｌ−アルギニンの細胞内へのペリプラズム結合タンパク質依存型の取込み蛋白質が３種類同定されている（非特許文献１）。
コリネ型細菌においては、Ｌ−メチオニンおよびＬ−アラニン（非特許文献２）、Ｌ−グルタミン酸（非特許文献３および非特許文献４）、Ｌ−イソロイシン（非特許文献５）、芳香族アミノ酸（非特許文献６）、Ｌ−リジン（非特許文献７）などのアミノ酸の細胞内への取込み活性を有する蛋白質が報告されている。【０００４】
しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカムのＮＣｇｌ１２７８、ＮＣｇｌ１２７７およびＮＣｇｌ１２７６については、非特許文献８においては、それぞれ、ＢＡＢ９８７２５、ＢＡＢ９８７２４、ＢＡＢ９８７２３と命名され、既知のアミノ酸配列の相同性にもとづいて、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーに分類されるとの記述がなされているのみであり、これらの蛋白質がアミノ酸の取り込み活性を有するとの報告はない。また、これらの蛋白質の活性を低下または喪失させることにより、アミノ酸の生産性が向上したという報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２７０８７２号公報
【特許文献２】特許第３０３６８１９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、２００７、第３７３巻、Ｐ２５１〜Ｐ２６７．
【非特許文献２】ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２００８年、第４７巻、第４８号、ｐ１２６９８〜ｐ１２７０９．
【非特許文献３】ＡＰＰＬＬＩＥＤ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、２００３年、第６０巻、第６号、ｐ７３８〜ｐ７４２．
【非特許文献４】ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、１９９５年、第１７７巻、第５号、ｐ１１５２〜ｐ１１５８．
【非特許文献５】ＡＲＣＨＩＶＥＳ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、１９９８年、第１６９巻、第４号、ｐ３０３〜ｐ３１２．
【非特許文献６】ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、１９９５年、第１７７巻、第２０号、ｐ５９９１〜ｐ５９９３．
【非特許文献７】ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、１９９１年、第５巻、第１２号、ｐ２９９５〜ｐ３００５．
【非特許文献８】ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＣＯＲＹＮＥＢＡＣＴＥＲＩＵＭ  ＧＬＵＴＡＭＩＣＵＭ、２００５年、ｐ１６５、ＥＤＩＴＥＤ  ＢＹ  Ｌ．  ＥＧＧＥＬＩＮＧ  ＡＮＤ  Ｍ．  ＢＯＴＴ、ＣＲＣ  ＰＲＥＳＳ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、コリネ型細菌のＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性を低下または喪失させることにより、該アミノ酸の生産効率を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の（１）〜（４）に関する。
（１）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、以下の［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物中から該アミノ酸を採取することを特徴とする該アミノ酸の製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［３］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
［５］配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
（２）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、上記（１）の［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、以下の［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたコリネ型細菌であることを特徴とする上記（１）記載の製造法。
［７］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［８］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［９］配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである上記（１）または（２）記載の製造法。
（４）アミノ酸がＬ−アルギニンまたはL−シトルリンである上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下、または喪失していることにより、該アミノ酸の生産性が向上したコリネ型細菌を用いた該アミノ酸の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明に用いられるコリネ型細菌
本発明に用いられるコリネ型細菌は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、以下の［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌である。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［３］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
［５］配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質
さらに、本発明に用いられるコリネ型細菌としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、以下の［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該アミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌を挙げることができる。
［７］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［８］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［９］配列番号１で表される塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、該アミノ酸の取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号２、３および４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、配列番号１の３０１〜１１６４、１３１２〜２１５７、および２１７３〜２９２５で表される塩基配列からなるＤＮＡによりそれぞれコードされている。
【００１１】
本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいＤＮＡである。
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。
【００１２】
親株に比べＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性が低下または喪失しており、かつ該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、上記［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子、または上記［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該遺伝子または該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下したコリネ型細菌、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子もしくは該ＤＮＡの転写量、または該遺伝子もしくは該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下したコリネ型細菌をあげることができる。より好ましくは該遺伝子または該ＤＮＡの一部または全部が欠損したコリネ型細菌をあげることができる。
【００１３】
親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、上記［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子、または上記［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡへの、１以上の塩基の欠失、置換または付加の導入は、親株に比べ、該遺伝子または該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の取り込み活性を低下または喪失させる１以上の塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、１塩基以上、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、１塩基以上、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。
【００１４】
１以上の塩基の置換としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。
１以上の塩基の付加としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、1塩基以上、好ましくは50塩基以上、より好ましくは100塩基以上、さらに好ましくは200塩基以上、特に好ましくは500塩基以上、最も好ましくは1kb以上のＤＮＡ断片を付加することをあげることができ、最も好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。
【００１５】
本明細書において、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の取り込み活性とは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸を、好ましくは、Ｌ−アルギニンまたはL−シトルリンを、より好ましくは、Ｌ−アルギニンをコリネ型細菌の細胞外から細胞内に取り込む活性をいう。
【００１６】
親株に比べ、該アミノ酸の取り込み活性が低下していることは、上記［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子、または上記［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡの転写物量をノーザン解析もしくはＲＴ−ＰＣＲで定量し、親株と比較する、または、該遺伝子または該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の生産量をＳＤＳ−ＰＡＧＥもしくは抗体を用いたアッセイにより定量し、親株と比較する、などにより確認することができる。
【００１７】
また、該アミノ酸を単一の炭素源として寒天培地上で培養したときに、一定時間後のコロニーの直径が親株と比較して小さいことをもって、または、生育しないことをもって、親株に比べ、該アミノ酸の取り込み活性が低下または喪失したことを確認することができる。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ  ［ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＡＣＡＤＥＭＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９９３年、第９０巻、第１２号、ｐ５８７３〜ｐ５８７７．］やＦＡＳＴＡ  ［ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１９９０年、第１８３巻、ｐ６３〜ｐ９８．］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９９０年、第２１５巻、ｐ４０３〜ｐ４１０．］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は良く知られている。
【００１８】
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の条件下で特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００１９】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＧＹ、ＡＳＭ  ＰＲＥＳＳ（１９９４年）、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＭＡＮＵＡＬ，  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００２０】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
【００２１】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中に４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。
【００２２】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメーターに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００２３】
本明細書において親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
該アミノ酸を生産することができるとは、本発明に用いるコリネ型細菌を培地に培養したときに、該アミノ酸を細胞または培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。
【００２４】
該アミノ酸を生産することができるコリネ型細菌としては、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化されたコリネ型細菌、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与したコリネ型細菌をあげることができる。
本発明で用いられるコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、またはミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属するコリネ型細菌をあげることができる。
【００２５】
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）等をあげることができ、具体的には、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium glutamicum ATCC13826（旧属種Brevibacterium flavum）、Corynebacterium glutamicum ATCC14020（旧属種Brevibacterium divaricatum）、Corynebacterium glutamicum ATCC13869（旧属種Brevibacterium lactofermentum）、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium herculis ATCC13868、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244等をあげることができる。
【００２６】
ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）等をあげることができ、具体的には、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240等をあげることができる。
【００２７】
ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）等をあげることができ、具体的には、Microbacterium ammoniaphilumATCC15354等をあげることができる。
２．本発明で用いられるコリネ型細菌の製造法
本発明で用いられるコリネ型細菌は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、上記［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子、または上記［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換または付加を導入することにより、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸の生産量が親株に比べ向上したコリネ型細菌を選択することにより製造することができる。
【００２８】
親株の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子への１以上の塩基の欠失、置換または付加の導入は、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等の、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡに変異を導入することができる方法であれば限定されない。
親株は、該アミノ酸を生産する能力を有しており、かつ該アミノ酸の取り込み活性を有するコリネ型細菌であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。
【００２９】
コリネ型細菌に該アミノ酸を生成する能力を人工的に付与する方法としては、
（ａ）該アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）該アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）該アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）該アミノ酸の生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）野生型株に比べ、該アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
【００３０】
上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、又は組み合わせた方法による該アミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem.,39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092、特表2003-511086およびWO2006/001380など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより該アミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌を調製することができる。
【００３１】
上記方法によって調製することができるＬ−アルギニンを生産する能力を有するコリネ型細菌としては、例えば、Ｄ−アルギニン耐性およびアルギニンヒドロキサム酸抵抗性を付与したコリネバクテリウム・グルタミカム［ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、１９７２年、第３６巻、第１０号、ｐ１６７５〜ｐ１６８４．］、ａｒｇＲ遺伝子を欠失させる変異を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム［特開２００２−５１７９０号］をあげることができる。
【００３２】
Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−アルギニンを生産する能力コリネ型細菌としては、例えば、ａｒｇオペロンの脱抑制をもたらすような、ａｒｇＲ遺伝子を欠失させる変異と、アセチルグルタミン酸キナーゼの脱感作をもたらすようなａｒｇＢ遺伝子変異とを付与することで、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−アルギニンの生産性が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム［Ｗ２００６／０３５８３１およびＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２００９年、第７５巻、第６号、ｐ１６３５〜ｐ１６４１．］をあげることができる。
【００３３】
上記したアミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製に用いることができるコリネ型細菌としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法を適用することができるコリネ型細菌又は上記遺伝的形質を有するコリネ型細菌であればいずれであってもよく、好ましくは上記したコリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、またはミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属するコリネ型細菌をあげることができる。
【００３４】
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による、上記［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質をコードする１以上の遺伝子、または上記［７］〜［９］からなる群より選ばれるＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する遺伝子置換法としては、相同組換え等により該遺伝子を親株の染色体に組み込み、さらに相同組換え等により染色体上に元来存在していた該遺伝子を置換する方法をあげることができる。
【００３５】
該遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、他にも、Molecular cloning:a laboratory manual,3rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley& Sons(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,  488(1985)等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
【００３６】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換は、J.Bacteriol., 182, 6884(2000)等に記載の方法に従って行うことができる。
変異が導入された遺伝子を適当なプラスミドベクター等に挿入することにより、組換え体プラスミドを作製する。プラスミドベクターとしては、例えば、親株中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢ［Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)］を有するプラスミドを用いることができる。
【００３７】
該組換え体プラスミドを親株へ導入する方法としては、コリネ型細菌へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法［Appl.  Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)］やプロトプラスト法［J. Bacteriol., 159, 306(1984)］等をあげることができる。
該組換え体プラスミドは親株中で自律複製できないので、該組換え体プラスミドの有する抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
【００３８】
さらに、変異が導入された遺伝子と共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択法［J. Bacteriol.,  174,  5462(1992)］によって、親株の染色体上の当該遺伝子が、変異が導入された遺伝子に置換された株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、コリネ型細菌の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
【００３９】
親株の染色体上の遺伝子に置換、欠失、または付加を導入する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができ、例えば、相田浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法等をあげることができる。
変異を導入する塩基の数および部位は、上記１に記載のとおりである。
親株の染色体上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加を導入することにより、高い蓋然性をもって、該遺伝子がコードする蛋白質の活性を低下または喪失させることができる［Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ． ７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＪＦ， Ｍｉｌｌｅｒ ＪＨ， Ｓｕｚｕｋｉ ＤＴ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ: W.H.Freeman； ２０００．］。
【００４０】
上記［１］〜［６］の蛋白質をコードする遺伝子は、例えばコリネ型細菌に属する微生物から斎藤らの方法［ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ  ＥＴ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ  ＡＣＴＡ、１９６３年、第７２巻、ｐ６１９〜ｐ６２９．］に従い調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１の２１７３〜２９２５、配列番号１の１３１２〜２１５７、または配列番号１の３０１〜１１６４で表される塩基配列に基づき設計、合成したオリゴＤＮＡをプライマーとして用いることで、ＰＣＲにより取得することができる。
【００４１】
取得できる具体的な遺伝子としては、配列番号１の２１７３〜２９２５で表される塩基配列を有するＮＣｇｌ１２７６、配列番号１の１３１２〜２１５７で表される塩基配列を有するＮＣｇｌ１２７７、および、配列番号１の３０１〜１１６４で表される塩基配列を有するＮＣｇｌ１２７８等をあげることができる。
なお、２以上の遺伝子が染色体上に隣接している、またはオペロンＤＮＡに含まれる場合には、当該２以上の遺伝子は、例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づき設計、合成したオリゴＤＮＡをプライマーとして用いることで、ＰＣＲにより１つのＤＮＡとして取得することもできる。
【００４２】
また、上記のＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法、または公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成する方法等によっても取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号２、配列番号３、または配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によっても取得することができる。
【００４３】
ＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列の解析方法、例えばジデオキシ法［ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＡＣＡＤＥＭＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９７７年、第７４巻、第１２号、ｐ５４６３〜ｐ５４６７．］、３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
【００４４】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
細胞内へのアミノ酸の取り込み活性の測定は、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、１９７１年、第２４６巻、第１１号、ｐ３６５３〜ｐ３６６２．に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４５】
以上の方法により、本発明の製造法で用いられるコリネ型細菌を造成することができる。
３．本発明のＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンの製造法
上記の方法で調製することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中にＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物中から該アミノ酸を採取することにより、該アミノ酸を製造することができる。
【００４６】
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩など本発明の微生物の増殖、およびＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれるアミノ酸の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。
【００４７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、アミン等の窒素化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００４８】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
【００４９】
培養は、振とう培養や深部通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは２８〜３８℃である。培地のｐＨは５〜１１の範囲で、好ましくは６〜９の中性付近の範囲に維持して培養を行う。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。
【００５０】
培養時間は、５時間〜６日間、好ましくは１６時間〜３日間である。
培養物中に蓄積した該アミノ酸は、通常の精製方法によって採取することができる。例えばＬ−アルギニンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮、結晶分別等の公知の方法を併用することによって採取することができる。
【００５１】
以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
（１）遺伝子破壊用プラスミドの構築
カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ２９９［ＧＥＮＥ、１９８７年、第６１巻、ｐ６３〜ｐ７４．］を、制限酵素ＰｓｔＩで消化し、切断部位にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株に由来するレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６キロベース（以下、ｋｂと略す）のＤＮＡ断片［ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、１９９２年、第６巻、第９号、ｐ１１９５〜ｐ１２０２．］を連結し、プラスミドｐＥＳＢ３０を得た。【００５３】
ｐＥＳＢ３０を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、抽出精製した後、該ＤＮＡ断片の両末端をＤＮＡ  ブランティングキット（ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を用い、添付の方法に従って平滑化を行った。平滑化したＤＮＡ断片をＴａｑ  ポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）およびｄＴＴＰ存在下で７０℃、２時間反応させ、３’末端にチミンを１塩基付加して、ＰＣＲ断片クローニングに用いることのできるＤＡＮ断片ｐＥＳＢ３０−Ｔを調製した。
（２）ａｒｇＦ遺伝子破壊株造成用プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および添付のバッファーを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲによって得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩで消化し、抽出精製した。【００５４】
該ＤＮＡ断片と、あらかじめＢａｍＨＩによって消化したｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）とを混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用い、ＤＮＡリガーゼ反応を行った。該反応産物を用い、モレキュラー・クローニング第３版記載の方法に準じて、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。
該形質転換体からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法）に準じてプラスミドを調製した。該プラスミドをＮｃｏＩにより消化した後、ＤＮＡリガーゼ反応を行って自己環状化させ、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換して、上記と同様にして、プラスミドを調製した。【００５５】
該プラスミドの構造を数種の制限酵素消化パターンによって調べたところ、該プラスミドは、ａｒｇＦをコードするＤＮＡにおいて３６９塩基対が欠失したＤＮＡ断片を含むことを確認した。該プラスミドを鋳型とし、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行い、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片をＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ベーリンガーマンハイム社製）およびｄＡＴＰ存在下で、７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニンを１塩基付加した。【００５６】
該ＤＮＡ断片と、先に造成したｐＥＳＢ３０−Ｔを混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を行った。該反応産物を用い、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換して得られた形質転換体からプラスミドを調製した。該プラスミドをｐＥａｒｇＦと命名した。
（３）ａｒｇＦ遺伝子破壊株の造成
上のように調製したプラスミドｐＥａｒｇＦを用い、レストらの方法［ＡＰＰＬＬＩＥＤ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、１９９９年、第５２巻、第４号、ｐ５４１〜ｐ５４５．］に準じて電気穿孔法により、トランスポゾンが欠損したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株（以下、ＤＯＩ−３株という。）を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。【００５７】
該カナマイシン耐性株の染色体ＤＮＡを調製し、サザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング  第３版）により調べた結果、ｐＥａｒｇＦがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより組み込まれていることを確認した。
このような株では、染色体上に元来存在しているａｒｇＦ遺伝子を含む領域と、ｐＥａｒｇＦ上のａｒｇＦ遺伝子が欠失した構造を持つ領域とが近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。【００５８】
ｓａｃＢ遺伝子がコードするレバンシュークラーゼはショ糖を自殺基質にするので、ｓａｃＢ遺伝子を有する微生物はショ糖を含有する培地に置いては生育できない。しかし、染色体上で元来存在しているａｒｇＦ遺伝子を含む領域とｐＥａｒｇＦ上のａｒｇＦ遺伝子が欠失した構造を持つ領域との間で２回目の相同組み換えを起こした株においては、いずれかのＤＮＡ領域がｓａｃＢとともに脱落欠失するので、その株はショ糖を含む培地においても生育することができるようになる。このようにして、元来染色体ＤＮＡ上に存在しているａｒｇＦ遺伝子が欠失した構造の微生物を得ることができる。【００５９】
このことを利用して、上記形質転換株をシュークロース寒天培地〔１００ｇ  のショ糖、７ｇの肉エキス、１０ｇのペプトン、３ｇの塩化ナトリウム、５ｇの酵母エキス（ディフコ社製）、および１５ｇのバクトアガー（ディフコ社製）を水１Ｌに含むｐＨ  ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。該菌株をＤＯＩ−３ａｒｇＦ株と命名した。
（４）ａｒｇＦ遺伝子破壊株の栄養要求性の確認
ＤＯＩ−３ａｒｇＦ株はａｒｇＦ遺伝子内に欠失をもつため、Ｌ−シトルリンおよびＬ−アルギニン要求性である。このことは、ＤＯＩ−３ａｒｇＦ株が最少培地では生育しないが、最少培地に５０ｍｇ／ＬのＬ−アルギニンまたは５０ｍｇ／ＬのＬ−シトルリンを添加した培地で生育することをもって確認した。
【実施例２】
【００６０】
（１）ＮＣｇｌ１２７８遺伝子破壊株造成用プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡを反応１のプライマーセットとし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡを反応２のプライマーセットとし、反応１と反応２のＰＣＲを独立に行った。【００６１】
ＰＣＲによって得られた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を抽出、精製した。反応１から得られたＤＮＡ断片と、反応２から得られたＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡを反応３のプライマーセットとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲによって得られた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、制限酵素ＦｂａＩで消化し、再度精製した。【００６２】
該ＤＮＡ断片と、あらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩによって消化し、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）により脱リン酸化したｐＥＳＢ３０とを混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を行った。該反応産物で、エシェリヒア・コリＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換し、該形質転換株からプラスミドを調製した。該プラスミドをｐｄｅｌ１２７８と命名した。
（２）ａｒｇＦおよびＮＣｇｌ１２７８遺伝子破壊株の造成
調製したプラスミドｐｄｅｌ１２７８を用い、実施例１と同様に電気穿孔法によりＤＯＩ−３ａｒｇＦ株を形質転換し、カナマイシン耐性株を得た。以下、実施例１に記載された手法と同様の手法を用いて、ＮＣｇｌ１２７８のＯＲＦが欠失した株を造成し、これをＤＯＩ−３ａｒｇＦ＿Ｄｅｌ１２７８株と命名した。
（３）ＮＣｇｌ１２７８遺伝子産物のＬ−シトルリンおよびＬ−アルギニン取り込み活性の確認
第１表に示すように、ＤＯＩ−３ａｒｇＦ＿Ｄｅｌ１２７８株は、５０ｍｇ／ＬのＬ−アルギニンを含む最少培地寒天プレート上、または、５０ｍｇ／ＬのＬ−シトルリンを含む最少培地寒天プレート上で生育せず、５０ｍｇ／Ｌのアラニルアルギニンを含む最少培地寒天プレート上で生育したことから、ＮＣｇｌ１２７８はＬ−アルギニンおよびＬ−シトルリンの細胞内への取込みに関与する蛋白質をコードする遺伝子であると結論した。【００６３】
非特許文献８においては、ＮＣｇｌ１２７８は、すぐ下流にある２つの遺伝子である、配列番号１の１３１２〜２１５７で表される塩基配列からなるＮＣｇｌ１２７７、配列番号１の２１７３〜２９２５で表される塩基配列からなるＮＣｇｌ１２７６とともに、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーに分類されるとの記述がなされている。
以上のことから、ＮＣｇｌ１２７６、ＮＣｇｌ１２７７およびＮＣｇｌ１２７８の遺伝子産物は、ＡＴＰ結合スーパーファミリーに分類されるトランスポーターを構成し、Ｌ−アルギニンおよびＬ−シトルリンの細胞内への取り込み活性に関与していることが示唆された。【００６４】
【表１】
2013154182.tif 000002
【実施例３】
【００６５】
（１）Ｌ−アルギニン生産株の造成
コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−アルギニン生産菌株ＲＢ２６株（Ｗ２００６／０３５８３１）から染色体ＤＮＡを調製し、それを鋳型として、配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡとをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ａｒｇＣ、ａｒｇＪおよびａｒｇＢ遺伝子を含む全長約3.7ｋｂの領域に相当するＤＮＡ断片を得た。ＲＢ２６株においてはＬ−アルギニンからのフィードバック阻害効果が弱化している変異（Ａ２６Ｖ）がａｒｇＢに含まれることが明らかとなっている（特許文献３）。【００６６】
該3.7ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＫｐｎＩで消化したのち精製し、あらかじめ制限酵素ＳａｌＩおよびＫｐｎＩで消化したのち精製しておいたプラスミドｐＣＳ２９９Ｐ［ＡＰＰＬＬＩＥＤ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、２００４年、第６３巻、第５号、ｐ５９２〜ｐ６０１．］と混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を行うことによりに連結し、プラスミドｐＣＳ＿ａｒｇＣＪＢ２６を得た。【００６７】
実施例２において、ＤＯＩ−３ａｒｇＦ＿Ｄｅｌ１２７８株を造成した手法と同様の手法により、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を親株として、ＮＣｇｌ１２７８を欠失させた株を造成し、この株をＡＴＣＣ１３０３２＿Ｄｅｌ１２７８株と命名した。
上記プラスミドｐＣＳ＿ａｒｇＣＪＢ２６によって、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｄｅｌ１２７８株を、電気穿孔法により形質転換し、カナマイシン耐性となった形質転換株を選択した。これらの形質転換体を、それぞれ、１３０３２／ｐＣＳ＿ａｒｇＣＪＢ２６株および１３０３２＿Ｄｅｌ１２７８／ｐＣＳ＿ａｒｇＣＪＢ２６株と命名した。
（２）ＮＣｇｌ１２７８遺伝子の欠失がＬ−アルギニン生産へ与える影響
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＳ＿ａｒｇＣＪＢ２６株およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｄｅｌ１２７８／ｐＣＳ＿ａｒｇＣＪＢ２６株を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＢＹ寒天培地（７ｇの肉エキス、１０ｇのペプトン、３ｇの塩化ナトリウム、５ｇの酵母エキス、１５ｇのバクトアガーを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）で３０℃、２４時間培養した。【００６８】
５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＢＹ寒天培地上に生育した菌体をそれぞれ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む種培地（２５ｇのショ糖、２０ｇのコーンスティープリカー、２０ｇのペプトン、１０ｇの酵母エキス、０．５ｇの硫酸マグネシウム７水和物、２ｇのリン酸二水素カリウム、３ｇの尿素、８ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの塩化ナトリウム、２０ｍｇのニコチン酸、１０ｍｇの硫酸鉄７水和物、１０ｍｇのパントテン酸カルシウム、１ｍｇの硫酸亜鉛７水和物、１ｍｇの硫酸銅５水和物、１ｍｇのチアミン塩酸塩、１００μｇのビオチンを水１Ｌに含み水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを１０ｇ加えた培地）６ｍｌを含む太型試験管に植菌し、３２℃で振盪しながら２４時間培養した。【００６９】
得られた種培養液２ｍＬを、それぞれ本培養培地（６０ｇのグルコース、５ｇのコーンスティープリカー、３０ｇの硫酸アンモニウム、８ｇの塩化カリウム、２ｇの尿素、０．５ｇのリン酸二水素カリウム、０．５ｇのリン酸水素二カリウム、１ｇの硫酸マグネシウム７水和物、１ｇの塩化ナトリウム、２０ｍｇの硫酸鉄７水和物、２０ｍｇのニコチン酸、２０ｍｇのβ−アラニン、１０ｍｇの硫酸マンガン５水和物、１０ｍｇのチアミン塩酸塩、２００μｇのビオチンを水１Ｌに含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．７に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地）２０ｍＬを含むバッフルつきフラスコに植菌し、３２℃で振盪しながら４８時間培養した。【００７０】
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。ＨＰＬＣ分析は、分離カラムにＡＱ−３１２（ＹＭＣ社製）、移動相にはクエン酸ナトリウム  ２．９４ｇ／Ｌ、硫酸ナトリウム  １．４２ｇ／Ｌ、アセトニトリル  ２３３ｍＬ／Ｌおよびラウリル硫酸ナトリウム  ３ｇ／Ｌを含有するｐＨ６．０の溶液を用い、６０℃で行った。アミノ酸の検出、定量は、分離カラムからの溶出液と、反応液（ホウ酸  １８．５ｇ／Ｌ、ＮａＯＨ  １１ｇ／Ｌ、オルトフタルアルデヒド  ０．６ｇ／Ｌ、メルカプトエタノール  ２ｍｌ／ＬおよびＢｒｉｇｅ−３５  ３ｍＬ／Ｌを含有する溶液）とを混合した後、励起波長３４５ｎｍ、吸収波長４５５ｎｍの蛍光分析により行った。結果を表２に示す。【００７１】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸を効率よく製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【国際調査報告】
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