(57)【要約】【課題】正常実験動物を脳虚血もしくは脳虚血後再灌流を行う方法により処置して作製したメチルグリオキサール類蓄積モデル動物のメチルグリオキサール類蓄積程度を測定して、メチルグリオキサール類関連疾患を適切に、簡易にかつ短期間に評価しうるメチルグリオキサール類蓄積の評価モデルを提供すること。【解決手段】本発明は、正常実験動物を脳虚血もしくは脳虚血後再灌流を行う方法により処置してメチルグリオキサール類を蓄積させる方法からなっている。また、本発明は、正常実験動物を脳虚血もしくは脳虚血後再灌流を行う方法により処置してメチルグリオキサール類モデル動物を作製し、そのメチルグリオキサール類の蓄積程度を測定して、メチルグリオキサール類関連疾患を検査することからなっている。さらに、本発明は、候補薬剤がＭＧＯ類に関与していると考えられる疾患に効能を有するかどうかを調べるためのスクリーニング方法にも有用である。【選択図】なし
2013054885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト実験哺乳動物を虚血もしくは虚血後再循環を行う方法によってメチルグリオキサール類を蓄積することを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項２】
請求項１に記載のメチルグリオキサール類蓄積方法であって、前記メチルグリオキサール類がメチルグリオキサール残基を含有する化合物または物質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のメチルグリオキサール類蓄積方法であって、前記メチルグリオキサール類が、メチルグリオキサール残基を含有するメチルグリオキサール類修飾タンパク質またはメチルグリオキサール類修飾タンパク質からメチルグリオキサール残基とタンパクアミノ基との結合化合物からなるフリーアダクトであることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類蓄積方法であって、前記メチルグリオキサール類修飾タンパク質が、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン基もしくはアルグピリミジン基またはカルボキシルメチルリジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基を含有するメチルグリオキサール修飾タンパク質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール蓄積方法であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項６】
非ヒト実験哺乳動物を虚血もしくは虚血後再循環を行う方法によって処置して蓄積したメチルグリオキサール類を、抗原・抗体反応、HPLC分析法、質量分析法またはこれらを組み合せた分析手法で測定することを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記メチルグリオキサール類がメチルグリオキサール残基を含有する化合物または物質であることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記メチルグリオキサール類が、メチルグリオキサール残基を含有するメチルグリオキサール類修飾タンパク質またはメチルグリオキサール類修飾タンパク質からメチルグリオキサール残基とタンパクアミノ基との結合化合物からなるフリーアダクトであることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記メチルグリオキサール類修飾タンパク質が、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン基もしくはアルグピリミジン基またはカルボキシルメチルリジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基を含有するメチルグリオキサール修飾タンパク質であることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項１０】
請求項６ないし９のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項１１】
非ヒト実験哺乳動物を虚血もしくは虚血後再循環を行う方法によって処置してメチルグリオキサール類が蓄積されていることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記メチルグリオキサール類がメチルグリオキサール残基を含有する化合物または物質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記メチルグリオキサール類が、メチルグリオキサール残基を含有するメチルグリオキサール類修飾タンパク質またはメチルグリオキサール類修飾タンパク質からメチルグリオキサール残基とタンパクアミノ基との結合化合物からなるフリーアダクトであることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記メチルグリオキサール類修飾タンパク質が、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン基もしくはアルグピリミジン基またはカルボキシルメチルリジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基を含有するメチルグリオキサール修飾タンパク質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
非ヒト実験哺乳動物を虚血もしくは虚血後再循環を行う方法によって処置することによってメチルグリオキサール類が蓄積されたメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物を作製することを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物の製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物の製造方法であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物の製造方法。
【請求項１８】
メチルグリオキサール類蓄積モデル動物にメチルグリオキサール類蓄積抑制物質を探索するための候補化合物を投与して、メチルグリオキサール類蓄積モデル動物におけるメチルグリオキサール類蓄積の抑制程度によってメチルグリオキサール類蓄積抑制物質をスクリーニングすることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチルグリオキサール類蓄積方法、メチルグリオキサール類測定方法、メチルグリオキサール類蓄積モデル動物ならびにその製造方法、およびスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢者社会が進むにつれて、アルツハイマー病、パーキンソン病などの難治性神経変性疾患の患者が急増していて、その対処策を講ずることは急務の課題となっている。例えば、アルツハイマー病の患者は、日本では、すでに１００万人を超えており、６５才以上では１０人に１人が発症すると言われるほど高齢者にとっては身近な病気になっている。しかし、最近では、高齢者ばかりではなく、４０〜５０代においても若年性アルツハイマー病の発症率が増加していて社会問題となっている。
また、パーキンソン病にしても、日本における有病率は１０万人に１００〜１５０名程度であり、５０〜６０歳代で発症することが多いが、２０歳〜８０歳代と幅広く発症する病気である。
これらの難治性神経変性疾患は、薬物治療によっても完治するのが極めて難しい疾患であり、その発症機構の理解と治療法の開発は急務となっている。【０００３】
これらの神経変性疾患の共通点は、いずれも神経細胞内部に異常タンパク質の沈着が見られることである。過去２０年余りの遺伝学的研究から多くの神経変性疾患原因遺伝子が同定され、その多くは沈着する異常タンパク質をつくり出す遺伝子あるいは異常タンパク質を代謝する遺伝子であることが明らかになってきている。一方、異常タンパク質の細胞内沈着が神経細胞の機能をどのように傷害し、神経疾患の発症に至るかについては、依然として不明な点が多く、今日研究が活発に行われている。【０００４】
アルツハイマー病では、神経原線維変化が、海馬や大脳新皮質にまで拡大し、記憶障害から認知症を引き起こすことが知られている。最近の研究では、メチルグリオキサール（Methylglyoxal: ＭＧＯ）がアルツハイマー病に関与しているとの報告がなされている（非特許文献１から３）。これらの報告によると、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）は、リン酸化タウタンパク質と結合して凝集を引き起こし、神経原線維（paired helical filament：PHF）と呼ばれる過剰リン酸化タウタンパク質を形成する役割を果たすと考えられている。さらに、ヒトでは、老化に伴い、神経細胞障害を誘導すると考えられる神経原線維（ＰＨＦ）の凝集体が、脳の嗅内野において形成されることが分かってきた。【０００５】
また、糖尿病についても、日本では、２００７年（平成１９年）の国民健康・栄養調査によると、糖尿病が強く疑われる人が８９０万人と、糖尿病の可能性が否定できない人の１，３２０万人を合わせると、全国で２，２１０万人もいると推定されている。しかも、糖尿病が疑われる人の約４割がほとんど治療を受けたことがないということは由々しき問題である。また、糖尿病のもう一つの大きな問題は、合併症の問題であり、糖尿病による腎臓障害で人工透析を始める人が年間１万５，０００人もいるうえに、糖尿病が原因の視覚障害の起こしている人も年間約３，０００人程度増えている。このように糖尿病の治療を必要とする患者が急増することは、医療保険経済上からも大問題であり、糖尿病の患者を減らすのが急務の課題である。【０００６】
糖尿病においても、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）が関与していることが確認されている（特許文献１、２）。糖尿病患者では、ＭＧＯの血清レベルが高値であり、またストレプトゾトシンにより糖尿病を誘発したラットの眼球レンズに多量に存在することが報告されている（非特許文献４）。また、ＭＧＯは、生体内濃度レベルでタンパク質と反応して蛍光性の産物を生成し、糖尿病や老化との関連性（非特許文献５）あるいはインスリン抵抗性（IR）や血管障害との関連性（非特許文献６）なども報告されている。【０００７】
このメチルグリオキサール（ＭＧＯ）は、メイラード反応前期段階での反応性カルボニル生成物の一つであって、糖の分断反応、解糖時のトリオース・ホスフェートの非酵素的分解、スレオニン・ケトン体・アセトンの異化反応の中間体アセタールの代謝などにより生成する２−オキソアルデヒド分子である。ＭＧＯは、その分子中に反応性が非常に高いケト基とアルデヒド基を有しており、そのケト基またはアルデヒド基は、タンパク質等のアミノ酸側鎖のアミノ基との反応性が非常に高く、特にタンパク質のアルギニン残基またはリジン残基と反応してＭＧＯ修飾アミノ基を有するＭＧＯ修飾タンパク質を生成する。生成したＭＧＯ修飾タンパク質は、さらにタンパク質分解を受けると、そのＭＧＯ修飾アミノ基がタンパク質からフリーアダクト（free adduct）の形で遊離してくる。
その結果、タンパク質本来の構造が変化して、組織再構成に関わるプロテアーゼやコラゲナーゼなどの酵素反応が阻害され、組織障害が引き起こされると考えられている。【０００８】
このようなＭＧＯの有害作用から、ＭＧＯは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病等の神経変性疾患や糖尿病の他、レビー小体型認知症、腎不全、白内障、嚢胞性線維症、リウマチなどの種々のＭＧＯ関連疾患に関与していることが明らかとなってきている（非特許文献７から１７）。【０００９】
上述したように、ＭＧＯは、種々の疾患に関与することが明らかとなってきているが、その酵素反応阻害作用や組織障害作用などにより、病態の悪化に関与する場合も多いことが明らかになってきた。このことから、ＭＧＯは様々な疾患で治療のターゲット分子となる可能性を秘めている。そのため、ＭＧＯ類に関するさらなる研究の進展やＭＧＯをターゲット分子とした薬剤の開発が期待されている。【００１０】
このようなＭＧＯの研究の進展のためには、動物モデルを用いたＭＧＯの評価が不可欠であり、ＭＧＯの発生機序や様々な疾患における生体内作用機構等を適切に評価できる動物モデルが必要である。【００１１】
最近、アルツハイマー病の疾患モデル動物として用いられているトランスジェニックＡＤマウスが海馬領域でＭＧＯを蓄積するとの報告がなされている（非特許文献２）。このことから、トランスジェニックＡＤマウスが、ＭＧＯ生成や薬剤によるＭＧＯ発現の抑制等を評価しうるインビボ評価モデル動物として使用できる可能性があると考えられる。つまり、トランスジェニックＡＤマウスを用いて、ＭＧＯをターゲットとした薬剤の投与等を行い、脳におけるＭＧＯの蓄積程度を評価することにより、ＭＧＯの病態研究や薬効の評価などのインビボ評価が可能になると考えられる。しかしながら、トランスジェニックＡＤマウスをインビボ評価に使用するには、その価格が非常に高価であり、その上ＭＧＯ蓄積に少なくとも約６カ月以上という長期間を要することから、インビボ評価に使用するには経済的また時間的な点からも制約が多いという欠点がある。そこで、ＭＧＯをターゲット分子とした数多くの化合物の活性評価には、ＭＧＯ生成や薬剤による抑制を適切に評価するための廉価で、簡便なかつ再現性の良い評価系が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特願2009-297509
【特許文献２】特願2010-246867
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Naila Ahmed et al.Journal of Neurochemistry. 2005 92 p255-263.
【非特許文献２】Francesc X. Guix et al. Brain. 2009 132 p1335-1345.
【非特許文献３】Martina Krautwald et al. Experimental Gerontology. 2010 45 p744-751.
【非特許文献４】Biochem. Pharmacol., 1993 46, pp. 805-811,
【非特許文献５】Biochim. Biophys. Acta., 1995 1270 pp.36-43,
【非特許文献６】Diabetes, 2006 55 pp. 1289-1299,
【非特許文献７】Han Y, Randell E et al. Clin Biochem. 2009 Jan 3.
【非特許文献８】Ryosuke T et al. YAKUGAKU ZASSHI 2009 129(1) p147-153.
【非特許文献９】Himmelfarb J. et al.Kidney Int. 2000 58 p2571-2578.
【非特許文献１０】Nakayama K etal. Am J Nephrol. 2008 28 p871-878.
【非特許文献１１】Ryoji Nagai et al.Anti-Aging Medicine 2010 7 (10) p112-119.
【非特許文献１２】Ferrante R.J. et al.J Neurochem. 1997 69 p2064-2074.
【非特許文献１３】Shinpo K. et al.Brain Res. 2000 861 p151-159.
【非特許文献１４】Lyras L et al. J Neurochem. 1998 71 p302-312.
【非特許文献１５】Mantle D etal. Clin Chim Acta. 1998 284 p45-58.
【非特許文献１６】Renke J et al.Free Radic Biol Med. 200029 p101-104.
【非特許文献１７】Floor E andWetzel. J Neurochem. 1998 70 p268-275.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したような背景のもとに、本発明者らは、脳梗塞を初めとして広く脳卒中などの病態研究において疾患モデル動物として用いられている中大脳動脈閉塞・再開通モデルマウス（以下、「中大脳動脈閉塞・再開通」を「MCAOR」と略する）がＭＧＯを蓄積するどうかを調べた結果、驚いたことに、脳虚血から再灌流後の所定の期間に、ＭＧＯが線条体領域で増加することを見いだした。本発明者らの知る限りでは、ＭＣＡＯＲモデル動物がＭＧＯを蓄積するとの報告は皆無であるところから、発明者らは、上述した知見より、非ヒト実験哺乳動物において一時的ないし永続的な虚血が線条体領域におけるＭＧＯの蓄積に関与することに想到し、本発明を完成させたものである。【００１５】
したがって、本発明は、非ヒト実験哺乳動物を虚血もしくは虚血後再循環を行う方法（以下、これらをまとめて、「虚血性再循環法」という）により処置することによってメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）を蓄積することからなるメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積方法を提供することを目的としている。【００１６】
なお、本明細書においては、「メチルグリオキサール類」ならびに「ＭＧＯ類」という用語およびそれに関連する用語は、メチルグリオキサールおよびＭＧＯまたはその誘導体をそれぞれ意味する他に、メチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）のアルデヒド基やケト基などがタンパク質の残基やリジン残基などのアミノ酸残基と結合したＭＧＯ類修飾アミノ基を含む「ＭＧＯ類修飾タンパク質」またはそのＭＧＯ類修飾タンパク質からＭＧＯ類修飾アミノ基が脱離したフリーアダクトをもそれぞれ意味して使用している。反対に、単に「メチルグリオキサール」ならびに「ＭＧＯ」という用語も、「メチルグリオキサール類」ならびに「ＭＧＯ類」を包含する意味として使用する場合がある。これらの用語は、当該技術分野に属する当業者であれば、化学常識ならびに本明細書の文脈によって容易に使い分けできるものである。
また、「蓄積」という用語は、細胞に沈着して蓄積している状態の他に、例えば、「増加」という一時的に増加している状態をも包含する意味として使用している。
したがって、本明細書において、「メチルグリオキサール類蓄積」ならびに「ＭＧＯ類蓄積」という用語およびその関連用語は、「メチルグリオキサール」および「ＭＧＯ」自体またはその誘導体の蓄積の他に、「メチルグリオキサール類修飾タンパク質」および「ＭＧＯ類修飾タンパク質」が「蓄積」することをそれぞれ意味して使用していることは、当業者にとって自明のことである。【００１７】
本発明の別の目的は、非ヒト実験哺乳動物を虚血性再循環法にて処置して作製したメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積モデル動物およびその製造方法を提供することである。【００１８】
本発明の更に別の目的は、ＭＧＯ類蓄積モデル動物を用いて生体内、特に脳内に蓄積しているＭＧＯ類を測定するＭＧＯ類測定方法を提供することである。【００１９】
本発明の更に別の目的は、ＭＧＯ類蓄積モデル動物を用いてＭＧＯ類蓄積抑制物質を探索するためのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を達成するために、本発明は、非ヒト実験哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物、サルなどの非ヒト哺乳動物）の虚血性再循環法によるメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積方法を提供する。【００２１】
本発明は、非ヒト実験哺乳動物から虚血性再循環法によって作製されたメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積モデル非ヒト哺乳動物、およびその製造方法を提供する。【００２２】
本発明は、ＭＧＯ類蓄積モデル動物を用いて生体内、特に脳内に蓄積しているＭＧＯ類を測定するＭＧＯ類測定方法を提供する。【００２３】
本発明は、ＭＧＯ類蓄積モデル動物を用いてＭＧＯ類蓄積抑制物質を探索するためのスクリーニング方法を提供することである。この発明のＭＧＯ類蓄積抑制物質を探索するためのスクリーニング方法を使用すれば、ＭＧＯ類蓄積抑制物質の候補物質を、ＭＧＯ類蓄積モデル動物に投与して、ＭＧＯ類蓄積の抑制程度を測定することによってアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病等の神経変性疾患や糖尿病などのＭＧＯ類関連疾患の予防・治療に有効な創薬の探索を可能にする創薬探索のためのスクリーニング方法を提供する。【００２４】
本発明によるその他の課題解決手段は、当該技術分野に属する当業者であれば、本明細書に記載した内容およびその内容から類推できる事項から想到できるものである。したがって、かかるその他の課題解決手段も本発明に１形態として包含されるものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病等の神経変性疾患や糖尿病などのＭＧＯ類関連疾患に関連するＭＧＯ類修飾タンパク質の蓄積の程度を簡便に、短期間にかつ安価に測定することができるという極めて大きな効果を有している。
また、本発明は、ＭＧＯ類蓄積モデル動物を、短期間にかつ安価に、通常の非ヒト哺乳動物を使用して作製することができることも極めて有用である。
したがって、本発明は、かかるＭＧＯ類蓄積モデル動物を用いてＭＧＯ類蓄積をそれぞれ測定することにより、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患や糖尿病などの疾患を早期診断・早期治療に役立てることができ極めて大きな効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例の実験手技を説明した図。
【図２】ＭＣＡＯＲモデルマウス作製１日後のマウス脳組織の免疫組織染色を示した図。
【図３】ＭＣＡＯＲモデルマウス作製３日後のマウス脳組織の免疫組織染色を示した図。
【図４】ＭＣＡＯＲモデルマウス作製７日後のマウス脳組織の免疫組織染色を示した図。
【図５】ＭＣＡＯＲモデルマウス作製１４日後のマウス脳組織の免疫組織染色を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を構成する各形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下に詳説する形態に限定されるものではなく、あくまでも本発明の形態を具体的に説明する例示に過ぎないことを明記する。つまり、本発明は、下記形態から当該技術分野に属する当業者であれば類推できる事項をも発明の１形態として包含するものである。
【００２８】
まず、この発明は、非ヒト実験哺乳動物を虚血性再循環法によって処置することによるメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積方法に関するものである。
【００２９】
そこで、最初に、本発明におけるメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）について詳細に説明する。簡単に上述したように、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）は、その分子中にケト基とアルデヒド基などの反応性の高い反応性基を有することから、その高反応性基は、生体においても、タンパク質等のアミノ酸側鎖のタンパクアミノ基、特にタンパクアルギニン残基またはタンパクリジン残基と反応してＭＧＯ修飾アミノ基を有するＭＧＯ修飾タンパク質を生成する。生成したＭＧＯ修飾タンパク質は、さらにタンパク質分解を受けると、そのＭＧＯ修飾アミノ基がタンパク質からフリーアダクト（free adduct）の形で遊離してくる。
なお、「タンパクアミノ基」という用語ならびにそれに関連する用語は、本明細書においては、タンパク質の構成員であるアミノ基を意味して使用している。したがって、例えば、「タンパクアルギニン基」という用語は、タンパク質の１構成員であるアミノ酸であるアルギニンのアミノ酸残基を意味して使用している。
【００３０】
更に具体的には、例えば、ＭＧＯがタンパクアルギニン残基と反応すると、ＭＧO由来ヒドロイミダゾロン基またはアルグピリミジン（argpyrimidine）基などのＭＧＯ修飾アルギニン基を有するＭＧＯ修飾タンパク質がそれぞれ生成する。また、ＭＧＯがタンパクリジン残基と反応すると、カルボキシメチルリジン基またはカルボキシエチルリジン基などのＭＧＯ修飾リジン基を有するＭＧＯ修飾タンパク質がそれぞれ生成する。これらのＭＧＯ修飾アミノ基（ＭＧＯ修飾アルギニン基、ＭＧＯ修飾リジン基など）を有するＭＧＯ修飾タンパク質は、さらにタンパク質分解を受けると、そのＭＧＯ修飾タンパク質からＭＧＯ修飾アミノ基が、フリーアダクト（free adduct）の形で、つまり、タンパク質から遊離したタンパク質由来アミノ基（タンパク質由来アルギニン基、タンパク質由来リジン基など）にＭＧＯが付加した形で遊離してくる。
【００３１】
したがって、本発明において、メチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）とは、メチルグリオキサール残基（ＭＧＯ残基）を含有する化合物やタンパク質などの物質であればいずれであってもよい。つまり、メチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）は、例えば、メチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）に加えて、ＭＧＯ類のアルデヒド基またはケト基などの反応性基と、タンパクのタンパクアルギニン基またはタンパクリジン基などのタンパクアミノ基との反応生成物であるアルグピリミジン（argpyrimidine）基、ＭＧＯ由来ヒドロイミダゾロン基などのＭＧＯ類修飾タンパクアルギニン基またはカルボキシルメチルリジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基などのＭＧＯ類修飾タンパクリジン基などのＭＧＯ類修飾タンパクアミノ基を含むＭＧＯ類修飾タンパク質、およびＭＧＯ類修飾タンパク質からＭＧＯ類とタンパクアミノ基との結合化合物であるＭＧＯ類修飾タンパクアミノ基が脱離した形のフリーアダクトをも包含している。
【００３２】
本発明において使用可能な非ヒト実験哺乳動物としては、一般に実験哺乳動物として使用されている実験動物であれば特に制限されるものではなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物、サルなどの霊長類などが挙げられ、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物が好ましい。
【００３３】
本発明において用いる虚血性再循環法は、非ヒト実験哺乳動物の脳血管、例えば中大脳動脈（ＭＣＡ）を脳血管閉塞手法で閉塞、または、一定時間閉塞した後、脳血管の血流を再循環させることによって、脳虚血もしくは再灌流後の所定時間内にＭＧＯ類修飾タンパク質を線条体領域に増加させる方法である。本発明で使用できる脳血管閉塞手法は、当該技術分野で慣用されているものであればいずれも使用可能であり、かかる脳血管閉塞手法としては、例えば、結紮法、クリップ法、血管の凝固法、血管内栓子法などを挙げることができる。これらの閉塞手法のうち、いずれを使用するかは、例えば、使用する実験動物の種類によって適宜選択して使用するのがよい。
また、脳血管等の閉塞時間については、用いる実験動物の種類などにより適宜選択することができるが、一般的には０．０あるいは０．５時間〜８時間、再開通する場合は、好ましくは１時間〜５時間の範囲内であるのがよい。さらに、ＭＧＯ類修飾タンパク質が線条体領域に増加・蓄積させるのに必要とする脳虚血もしくは再灌流後の期間についても、用いる実験動物の種類・大きさ・閉塞手法等を考慮して、適宜、選択することができるが、例えば、中大脳動脈閉塞あるいは再開通（MCAOR）後、一般的には１〜２週間前後であるのがよい。
【００３４】
つまり、正常実験動物の脳血管の閉塞もしくは再開通処置を行うことによって、ＭＧＯ類修飾タンパク質の蓄積を促進させることができる。このようにして蓄積したＭＧＯ類の蓄積量を測定することによって、その蓄積ＭＧＯ類量の抑制具合を基準にしてアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病等の神経変性疾患や、糖尿病などのＭＧＯ類疾患の病態などを推察することができる。
【００３５】
本発明において、ＭＧＯ類の測定には、これを特異的に認識する抗ＭＧＯ抗体（例えば、特開2004-309147号公報、国際公開99/64463号パンフレット）を用いた抗原・抗体反応を用いた種々の分析・測定法（例えば、免疫組織染色法、ウェスタンブロット法、ELISAなど）を採用することができる。さらに、ＭＧＯ類は、HPLC分析法や質量分析法、ならびに、これらを組み合せた分析手法（例えば、ＬＣ/ＭＳ、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳなど）を用いて分析することができる。これらの測定方法は、いずれも当該技術分野に属する当業者にとっては慣用の方法であり、測定対象などに応じて適宜選択して使用するのがよい。
【００３６】
次に、本発明に係るメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積モデル動物およびその作製方法について説明する。
本発明のメチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）蓄積モデル動物は、メチルグリオキサール類（ＭＧＯ類）が体内、特に脳内に蓄積したモデル動物であって、非ヒト実験哺乳動物を上述したように虚血性再循環法によって処置することにより作製することができる。
このように作製した本発明のＭＧＯ類蓄積モデル動物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病等の神経変性疾患や糖尿病の他、レビー小体型認知症、腎不全、白内障、嚢胞性線維症、リウマチなどの種々のＭＧＯ関連疾患に対する実験モデル動物として使用することができる。かかる実験モデル動物を使用することによって、種々のＭＧＯ関連疾患に有効な創薬の開発期間を飛躍的に短縮できるとともに、開発費用を大幅に節約できることが期待できる。
【００３７】
また、本発明のＭＧＯ類測定方法は、薬剤によるＭＧＯ類生成やＭＧＯ類発現の抑制等のＭＧＯ類の脳内動態などをインビボで評価することができる。つまり、本発明のＭＧＯ類測定方法では、例えば、ＭＧＯ類生成や発現の抑制等の脳内動態などを調べるための候補化合物などを実験動物に投与して、脳内ＭＧＯ類蓄積量を測定することによって脳内でのＭＧＯ類生成やＭＧＯ類発現の抑制等の状態を評価することができる。その結果、本発明は、ＭＧＯ類生成・発現抑制や分解促進などをターゲットとした薬剤の開発を促進する効果を有する。
【００３８】
したがって、本発明は、ＭＧＯ類生成・発現抑制や分解促進などをターゲットとした候補化合物などをスクリーニングする方法としても有用である。本発明のスクリーニング方法により選択された候補化合物などは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病等の神経変性疾患、糖尿病またはその他の様々なＭＧＯ関連疾患に対する予防薬、治療薬としての開発が期待される。
【００３９】
本発明において、かかる候補化合物などの投与方法については、特に限定する必要はなく、投与する化合物またはその投与剤型により、注射（静脈注射、皮下注射、筋肉内注射）等の経皮投与や経口投与などの種々の投与方法を選択することができる。また、投与剤型としては、特に限定する必要はなく、例えば、液体状、半液体状または固形状であってもよい。投与時期および投与回数についても、かかる候補化合物の種類に応じて、適切な時期および投与回数を適宜選択すればよい。
【００４０】
本発明に係るスクリーニング方法に供することができる候補化合物としては、あらゆる化合物を候補化合物として挙げることができ、その候補化合物が、ＭＧＯ類を直接又は間接的にターゲットとしてその生成抑制や分解促進などの薬効を発揮するよう設計された化合物や薬剤だけではなく、その他のあらゆる既存の化合物や薬剤であってもよい。
【００４１】
なお、ＭＧＯ類を直接ターゲットとして薬効を発揮するとは、例えば、生体内においてＭＧＯ類分子と直接反応することにより、ＭＧＯ類を減少ないし消去させたり、ＭＧＯ類の反応性を減少させたりすることをいう。
【００４２】
一方、ＭＧＯ類を間接的にターゲットとして薬効を発揮するとは、例えば、候補化合物または薬剤が、生体内における生理的分解物質がＭＧＯ類を減少ないし消去する場合や、生体内においてＭＧＯ類と反応する分子を発現・誘導させたり、ＭＧＯ類減少もしくは消去の役割を果たす酵素など（例えば、glyoxalase-1）の発現・増加・活性上昇等を果たし、結果として、ＭＧＯ類を減少ないし消去する場合が挙げられる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明について、実施例を用いて詳述するが、本発明の内容は、当然のことながら、実施例の内容に限定されるものではない。【００４４】
＜実験方法＞
図１に、実験方法の概略を示す。
１．脳閉塞・再開通処置
文献記載（「虚血性脳浮腫の実験的研究 第1報 ラットを用いた血流再開可能な脳梗塞モデル」小泉 仁一、吉田 洋二、中沢 貞二、大根田 玄寿．脳卒中8：1-8、1986）の方法に従い、MCAORマウスの作製を行った。
まず、25-30gのddY系雄性マウスをイソフルラン吸入により、麻酔を導入・維持した。麻酔下でマウスの頚部中央を切開し、左側総頸動脈と外頸動脈を結紮した。次いで、総頸動脈を切開し、塞栓子が中大脳動脈(MCA)の起始部に到達するように内頸動脈を経由して9mm挿入した。この状態で、４時間塞栓子で閉塞した後、塞栓子を手前に引きぬき、再灌流した。【００４５】
２．抗ＭＧＯ抗体を用いた免疫染色
MCA閉塞後、1、3、7、14日後に、イソフルラン麻酔下で断頭、脳を摘出し、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。固定済みのマウス脳を自動固定包埋装置によりパラフィンを浸透させ、パラフィンブロックを作成した。次いで、ミクロトームを用い、パラフィンブロックから厚さ5μmの脳切片を作成した。この脳切片を脱パラフィン後、H2O2、馬血清を用いて、ブロッキングを行った。
続いて、１次抗体として、マウス抗ＭＧＯ抗体(x100)を用い、48時間脳切片と反応させた。また、２次抗体として、抗マウス抗体(x1000)を用い、2時間脳切片と反応させた。このように処理した脳切片を、ABC法を用いて、DAB発色させた。対染色としてヘマトキシリンを用いた。【００４６】
＜結果＞
染色結果を図２から５、および表１に示す。【００４７】
【表１】
2013054885.tif 000003
【００４８】
図２から図５は、ＭＣＡＯＲモデルマウス作製後の、脳切片の免疫組織染色図である。一番左が脳全体、真ん中が梗塞側の線条体周辺、一番右が線条体を拡大した免疫染色図である。
染色結果から示されるように、ＭＣＡＯＲモデルマウス作製１日後では、３例中１例にＭＧＯ修飾タンパク質が見られたのみであり、その量も極めて少なかった（表１参照、不図示）。その他の２例では、線条体にＭＧＯ修飾タンパク質は認められなかった（図２）。ＭＣＡＯＲモデルマウス作製３日後では、３例中１例にＭＧＯ修飾タンパク質が見られ、その量も作製１日後と比較して多いものであった（表１参照、図３(c)矢印）。ＭＣＡＯＲモデルマウス作製７日後では、３例すべてにＭＧＯ修飾タンパク質が見られた。さらにその量についても、作製１日後や３日後と比較すると、非常に多く蓄積していた（表１参照、図４）。なお、ＭＣＡＯＲモデルマウス作製１４日後には、３例中全てで、ＭＧＯ修飾タンパク質は見られなかった。【００４９】
＜まとめ＞
上述した結果をまとめると、次の通りである。
(1)  脳動脈の閉塞・再開通処置により、ＭＧＯ類は、正常マウスの脳線条体に発現・蓄積することが確認できた。
(2)  脳動脈の閉塞・再開通処置後１週間程度経過する間に、ＭＧＯ類は、徐々に増加していき、蓄積量のピークを迎えることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、通常の非ヒト実験動物を用いて、脳動脈の閉塞・再開通処置により、脳組織や細胞に虚血・再灌流をもたらすことにより、トランスジェニックＡＤモデル動物に比べて、極めて安価にかつ短期間に疾患モデル動物を作製することができるという大きな利点がある。
また、かかる疾患モデル動物を使用することによって、ＭＧＯ類の発現・増加をほぼ１週間という極めて短期間に誘導できることから、ＭＧＯ類が関与していると考えられる神経変性疾患や糖尿病などの疾患に対する創薬開発も費用を大幅に節約できると共に、開発期間を大幅に短縮できるという大きな利点がある。一方、トランスジェニックＡＤモデル動物を使用する場合には、単価が高価なことから、開発費用が莫大になり、かつ、ＭＧＯ蓄積に６か月以上という長期間を要することから開発期間も非常に長期になるという欠点がある。
さらに、本発明は、ＭＧＯ類の発生・蓄積の程度を評価することにより、インビボにおけるＭＧＯ類の評価が可能になるという利点もある。
その上、本発明のＭＧＯ類測定方法は、ＭＧＯ類の発生機序の解明にも有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月21日(2013.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト実験哺乳動物を脳虚血もしくは脳虚血後再循環を行う方法によってメチルグリオキサール類を蓄積することを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項２】
請求項１に記載のメチルグリオキサール類蓄積方法であって、前記メチルグリオキサール類がメチルグリオキサール残基を含有する化合物または物質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のメチルグリオキサール類蓄積方法であって、前記メチルグリオキサール類が、メチルグリオキサール残基を含有するメチルグリオキサール類修飾タンパク質またはメチルグリオキサール類修飾タンパク質からメチルグリオキサール残基とタンパクアミノ基との結合化合物からなるフリーアダクトであることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類蓄積方法であって、前記メチルグリオキサール類修飾タンパク質が、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン基もしくはアルグピリミジン基またはカルボキシルメチルリジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基を含有するメチルグリオキサール修飾タンパク質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール蓄積方法であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積方法。
【請求項６】
非ヒト実験哺乳動物を脳虚血もしくは脳虚血後再循環を行う方法によって処置して蓄積したメチルグリオキサール類を、抗原・抗体反応、ＨＰＬＣ分析法、質量分析法またはこれらを組み合せた分析手法で測定することを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記メチルグリオキサール類がメチルグリオキサール残基を含有する化合物または物質であることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記メチルグリオキサール類が、メチルグリオキサール残基を含有するメチルグリオキサール類修飾タンパク質またはメチルグリオキサール類修飾タンパク質からメチルグリオキサール残基とタンパクアミノ基との結合化合物からなるフリーアダクトであることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記メチルグリオキサール類修飾タンパク質が、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン基もしくはアルグピリミジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基を含有するメチルグリオキサール修飾タンパク質であることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項１０】
請求項６ないし９のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類測定方法であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類測定方法。
【請求項１１】
非ヒト実験哺乳動物を脳虚血もしくは脳御虚血後再循環を行う方法によって処置してメチルグリオキサール類が蓄積されていることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記メチルグリオキサール類がメチルグリオキサール残基を含有する化合物または物質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記メチルグリオキサール類が、メチルグリオキサール残基を含有するメチルグリオキサール類修飾タンパク質またはメチルグリオキサール類修飾タンパク質からメチルグリオキサール残基とタンパクアミノ基との結合化合物からなるフリーアダクトであることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物であって、前記メチルグリオキサール類修飾タンパク質が、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン基もしくはアルグピリミジン基またはカルボキシルメチルリジン基もしくはカルボキシルエチルリジン基を含有するメチルグリオキサール修飾タンパク質であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
非ヒト実験哺乳動物を脳虚血もしくは脳虚血後再循環を行う方法によって処置することによってメチルグリオキサール類が蓄積されたメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物を作製することを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物の製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載のメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物の製造方法であって、前記非ヒト実験哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物またはサル等の霊長類であることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積モデル非ヒト哺乳動物の製造方法。
【請求項１８】
メチルグリオキサール類蓄積モデル動物にメチルグリオキサール類蓄積抑制物質を探索するための候補化合物を投与して、メチルグリオキサール類蓄積モデル動物におけるメチルグリオキサール類蓄積の抑制程度によってメチルグリオキサール類蓄積抑制物質をスクリーニングすることを特徴とするメチルグリオキサール類蓄積抑制物質のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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