(57)【要約】  高い安全性を確保しつつ、ケラチン繊維を効果的に染色する手段を提供することを課題とする。インドール類縁体からなる酸化染料と、ミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サチルス由来のビリルビンオキシダーゼを組み合わせた染色方法及び染色剤が提供される。
2013099296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サチルス由来のビリルビンオキシダーゼ（EC1.3.3.5）を含む、ケラチン繊維染色用の染色剤。
【請求項２】
前記ビリルビンオキシダーゼが、以下の(1)〜(9)のいずれかに記載のタンパク質からなる、請求項１に記載の染色剤：
(1)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(3)配列番号１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質；
(4)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(6)配列番号３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質；
(7)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(8)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(9)配列番号５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【請求項３】
前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、請求項１又は２に記載の染色剤。
【請求項４】
インドール誘導体又はインドリン誘導体からなる酸化染料を組み合わせてなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の染色剤。
【請求項５】
前記酸化染料が５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドリン、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カルボン酸、４−アミノインドール及び５−アミノインドールからなる群より選択される酸化染料である、請求項４に記載の染色剤。
【請求項６】
前記酸化染料と前記ビリルビンオキシダーゼを含有した一剤型である、請求項４又は５に記載の染色剤。
【請求項７】
前記酸化染料を含有する第１要素と、前記ビリルビンオキシダーゼを含有する第２要素とからなる二剤型である、請求項４又は５に記載の染色剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の染色剤でケラチン繊維を処理するステップを含む染色方法。
【請求項９】
pHが7.0〜8.0の条件下で前記処理を行う、請求項８に記載の染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はケラチン繊維の染色に関する。詳しくは、インドール類縁体を酸化染料として利用する染色剤及び染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェニレンジアミン類やアミノフェノール類などの酸化染料を利用した染色法は、様々な色調の染色が可能であることや持続期間が長いこと、更には染色時間が短いことなどの利点を活かし、特にヒト毛髪等、ケラチン繊維の染色に頻用されている。一方、ケラチン染色用の酸化染料としてインドール類縁体も利用されている。例えば、インドール誘導体である５，６−ジヒドロキシインドールはメラニン前駆体であり、酸素存在下において重合し、メラニン色素を形成する。この反応を利用すれば毛髪等の染色が可能である。例えば、特許文献１、２には５，６−ジヒドロキシインドール等のインドール誘導体を利用した空気酸化型染色剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３２６８０９号公報
【特許文献２】特開２００９−１３７８７７号公報
【特許文献３】特表２００４−５１０７９８号公報
【特許文献４】特許第４７４３９５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
５，６−ジヒドロキシインドール等のインドール類縁体はフェニレンジアミン類やアミノフェノール類などの酸化染料に比較して安全性が高いといえる。しかしながら、その染色効果の低さが特に問題とされている。そこで本発明は、インドール類縁体を酸化染料として利用することで高い安全性を確保しつつ、高い染色効果も発揮できる染色法及びそれに用いられる染色剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは酸化酵素の一種であるビリルビンオキシダーゼ（以下、「BO」と略称する）に注目し、インドール類縁体を酸化染料として利用した染毛への適用の可能性を検討した。その結果、BOが高い染色効果をもたらすことが判明した。また、各種BOを用いた比較実験によって、有効性の極めて高い（即ち、特に高い染色効果をもたらす）BOを特定することに成功した。以下に示す発明は主としてこれらの成果に基づく。尚、ケラチン繊維の染色方法を開示する上掲の特許文献３には、酸化酵素としてBO、酸化染料としてインドール類縁体が示されているものの、これらを併用する場合の具体的な記述（例えば実施データ）はなく、ケラチン繊維の染色にこれらの併用が実際に有効であるか否かは全く不明である。しかも、本発明者らが見出した特定のBOに関する言及はない。
［１］ミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サチルス由来のビリルビンオキシダーゼ（EC1.3.3.5）を含む、ケラチン繊維染色用の染色剤。
［２］前記ビリルビンオキシダーゼが、以下の(1)〜(9)のいずれかに記載のタンパク質からなる、［１］に記載の染色剤：
(1)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(3)配列番号１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質；
(4)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(6)配列番号３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質；
(7)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(8)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(9)配列番号５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
［３］前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、［１］又は［２］に記載の染色剤。
［４］インドール誘導体又はインドリン誘導体からなる酸化染料を組み合わせてなることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の染色剤。
［５］前記酸化染料が５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドリン、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カルボン酸、４−アミノインドール及び５−アミノインドールからなる群より選択される酸化染料である、［４］に記載の染色剤。
［６］前記酸化染料と前記ビリルビンオキシダーゼを含有した一剤型である、［４］又は［５］に記載の染色剤。
［７］前記酸化染料を含有する第１要素と、前記ビリルビンオキシダーゼを含有する第２要素とからなる二剤型である、［４］又は［５］に記載の染色剤。
［８］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の染色剤でケラチン繊維を処理するステップを含む染色方法。
［９］pHが7.0〜8.0の条件下で前記処理を行う、［８］に記載の染色方法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】染色試験の結果。左から無処理毛束（試験例２７（染料のみ））試験例２８（過酸化水素）、試験例３４（BO-3）、試験例３１（BODII）の染毛結果を示す。下の数値は染毛度（ΔE*ab）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．染色剤
本発明の第１の局面はケラチン繊維（ヒトの毛髪、ウシ、ウマ、羊、ヤギ、アルパカ、アンゴラウサギ等の毛等）の染色に用いられる染色剤に関する。本発明の染色剤は、酸化酵素であるビリルビンオキシダーゼ（BO）（EC1.3.3.5）を含む。本発明の染色剤は酸化染料に対して作用し、所望の染色効果を発揮する。従って、典型的には、本発明の染色剤を酸化染料と組み合わせて用いる。本明細書において表現「組み合わせて用いる」又は「組み合わせてなる」とは、酸化染料とBOが併用されることをいう。一態様として、本発明の染色剤は、酸化染料とBOが混合された組成物として提供される。当該態様の染色剤を一剤型染色剤と呼ぶ。一方、酸化染料を含む第１要素と、BOを含む第２要素とからなるキットの形態で本発明の染色剤を提供することもできる。当該態様の染色剤を二剤型染色剤と呼ぶ。二剤型染色剤の場合には各要素が別々の容器又は区画に収容された状態で提供され、使用に際して二つの要素が混合される。尚、一剤型染色剤は簡素な構成となることはもとより、より簡便な使用方法を実現できる点において二剤型染色剤に勝るといえる。
【０００８】
（１）染料
本明細書において用語「酸化染料」とは、発色ないし染色に酸化反応が必要な染料のことをいう。酸化染料にはそれ自体が酸化重合して発色する「染料前駆体」と、染料前駆体と重合することによって特有の色調を呈する「染料助剤（カップラー）」が含まれる。本発明では酸化染料としてインドール類縁体を用いる。各種インドール類縁体を使用可能である。好ましくは、インドール誘導体又はインドリン誘導体、或いはその塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、又は酢酸塩等の酸付加塩））に該当する化合物の中から、適切な酸化染料が採用される。インドール誘導体及びインドリン誘導体の具体例は、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、６，７−ジヒドロキシインドール、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドール、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドール、４−ヒドロキシプロピルインドール、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドール、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、７−アミノインドール、６−アミノインドール、５−アミノインドール、４−アミノインドール、５，６−ジヒドロキシインド−ル−２−カルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドールである。好ましい一態様では、５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドリン、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カ��ボン酸、４−アミノインドール及び５−アミノインドールからなる群より選択される１種又は２種以上の酸化染料を使用する。
【０００９】
本発明の染色剤には１種又は２種以上の酸化染料が用いられる。２種以上の酸化染料の併用は、例えば、染色効果の向上や色彩（色調）の調整等に有効である。特に、染料前駆体に分類される酸化染料と染料助剤に分類される酸化染料を併用するとよい。
【００１０】
酸化染料の配合量は特に限定されず、使用する酸化染料の特性や用途等を考慮して配合量を決定すればよい。一剤型染色剤の場合、染色剤全量に対して例えば０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜１０重量％、更に好ましくは０．０１〜１重量％となるように酸化染料を配合することができる。二剤型染色剤の場合には、酸化染料を含有することになる第１要素全量に対して例えば０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜１０重量％、更に好ましくは０．０１〜１重量％となるように酸化染料を配合することができる。
【００１１】
染色に寄与する成分として、酸化染料に加えて直接染料を配合することにしてもよい。直接染料を配合することにより、染色効果を高めたり、染色の色調を調整したりすることができる。直接染料の例を挙げると、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、１−アミノ−４−メチルアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン・塩酸塩、１，４−ジアミノアントラキノン、ニトロ−パラフェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２−アミノ−５−ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ−パラフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ−メタフェニレンジアミン・硫酸塩、ナチュラルオレンジ６（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０である。
【００１２】
直接染料の配合量も特に限定されない。一剤型染色剤の場合、染色剤全量に対して例えば０．０１〜２０重量％となるように直接染料を配合することができる。二剤型染色剤の場合には、酸化染料を含有することになる第１要素及び／又はBOを含有することになる第２要素に直接染料が配合される。この場合の配合量は第１要素全量に対して例えば０．０１〜２０重量％、第２要素全量に対して例えば０．０１〜２０重量％である。尚、酸化染料と同様、直接染料も２種類以上の併用が可能である。
【００１３】
（２）酵素
本発明では酸化酵素であるBOを用いる。具体的には、ミロセシウム・ベルカリア由来のBO又はバチルス・サチルス由来のBOを用いる。換言すれば、本発明で使用するBOの本来の生産菌はミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サチルスである。生産菌は野生株（天然からの分離株であって、遺伝子操作などの変異・改変処理が施されていないもの）であっても変異株であってもよい。ミロセシウム・ベルカリアのBO遺伝子を宿主微生物に導入して得られた形質転換体が産生するBOもミロセシウム・ベルカリア由来BOに該当する。バチルス・サチルス由来BOについても同様である。このように、遺伝子組換え技術によって生産されたBO（組換えBO）を用いることにしてもよい。
【００１４】
本発明で使用するBOの生産菌の具体例を示せば、ミロセシウム・ベルカリアMT-1（FERM-BP 653（アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー、第45巻、2383-2384頁(1981年）参照））、ミロセシウム・ベルカリアIFO 6113、ミロセシウム・ベルカリアIFO 6133、ミロセシウム・ベルカリアIFO 6351、ミロセシウム・ベルカリアIFO 9056、バチルス・サチルスATCC 23857株である。これらの菌株を常法により液体培養又は固体培養し、その培養液から抽出、塩析、透析、イオン交換、ゲルろ過などを行うことによりビリルビンオキシダーゼの精製標品を得ることができる。
【００１５】
ミロセシウム・ベルカリアMT-1株由来のBOのアミノ酸配列を配列番号２（全長であり、シグナル配列を含む）及び配列番号４（成熟体であり、シグナル配列を含まない）に示す。本発明の一態様では、以下の(1)〜(6)のいずれかに記載のタンパク質からなるBOが用いられる。尚、配列番号１の配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列であり、配列番号３の配列は配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列である。
(1)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(3)配列番号１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質；
(4)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(6)配列番号３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【００１６】
バチルス・サチルスATCC 23857株由来のBOは、内胞子皮構成成分タンパク質であり、典型的には配列番号６のアミノ酸配列を有する。そこで本発明の一態様では、以下の(7)〜(9)のいずれかに記載のタンパク質からなるBOが用いられる。尚、配列番号５の配列は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列である。
(7)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(8)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(9)配列番号５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【００１７】
バチルス・サチルス由来のBOの詳細については、特許文献４（特許第４７４３８５４号公報）を参照することができる。
【００１８】
ミロセシウム・ベルカリア由来のBOは製品名BO"Amano"3、略称BO-3として天野エンザイム株式会社より、バチルス・サチルス由来BOは製品名Bilirubin Oxidase、略称BODIIとして旭化成ファーマ株式会社より、それぞれ市販されており、これら市販のBOを本発明に使用することもできる。
【００１９】
（３）その他の成分
本発明の染色剤には、上記の各成分の他、追加の成分（任意成分）が含有され得る。任意成分として、アルカリ性化合物、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の還元剤、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、アミノ酸、各種塩類、保湿剤、防腐剤、紫外線防止剤、アルコール、多価アルコール、香料等を例示することができる。
【００２０】
本発明の染色剤にアルカリ性化合物を含有させてもよい。アルカリ性化合物を含有した染色剤によれば、それを適用した際、ケラチン繊維の膨潤が促され、染色効果が向上する。アルカリ性化合物の配合量は、使用の際に所望のpH（例えばpH7.0〜10.0）を実現できるように設定される。一剤型染色剤の場合の配合量の例は染色剤全量に対して０．０１〜２０重量％である。一方、二剤型染色剤の場合には、原則、酸化染料を含有することになる第１要素にアルカリ性化合物を含有させることになり、配合量としては例えば第１要素全量に対して０．０１〜２０重量％である（但し、第１要素ではなく第２要素にアルカリ性化合物を含有させることにしても、或いは第１要素と第２要素の両者にアルカリ性化合物を含有させることにしてもよい）。尚、アルカリ性化合物の具体例として、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン化合物、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等の無機化合物等を挙げることができる。
【００２１】
本発明の染色剤はペースト（クリーム）状、エアゾール状、ゲル（ジェル）状、液状、泡状等の形態に調製される。第１要素（酸化染料を含有する）と第２要素（BOを含有する）からなる二剤型の場合には、第１要素と第２要素の形態が同一でなくてもよい。
【００２２】
２．染色方法
本発明の第２の局面は、本発明の染色剤を用いた染色方法に関する。本発明の染色方法では、酸素が存在する条件下（即ち酸素雰囲気下）、本発明の染色剤でケラチン繊維を処理する。一剤型の染色剤の場合、例えば、染色剤を必要に応じて希釈した後（希釈は必須ではない）、ケラチン繊維（例えばヒト毛髪）に塗布する。或いは、染色剤を溶解した溶液にケラチン繊維を浸漬する。
【００２３】
二剤型の染色剤の場合には、例えば、第１要素と第２要素を混合した後（必要に応じて希釈したり、溶媒に溶解したりしてもよい）、ケラチン繊維に塗布する。片方（第１要素又は第２要素）をケラチン繊維に塗布した後に他方をケラチン繊維に塗布し、ケラチン繊維の表面等において両要素が混合されるようにしてもよい。また、第１要素と第２要素を溶解した溶液にケラチン繊維を浸漬することにしてもよい。
【００２４】
以上のような操作によって染色剤とケラチン繊維が接触した状態を形成する。そして、所望の染色に必要な時間、当該接触状態を維持する。このときに、染色効果を高めるため又は迅速若しくは効率的な染色のため、保温ないし加温することにしてもよい。ケラチン繊維がヒト毛髪の場合、即ち、本発明の染色方法でヒト毛髪を染色する場合を例にとれば、例えば約１０分〜２時間、好ましくは約２０分〜１時間、接触状態を維持する。
【００２５】
処理時のpH条件は使用する染色剤に依存する。但し、別途pH調整剤を使用してpHを調整することも可能である。処理時のpHは例えばpH7.0〜9.0である。後述の実施例に示す通り、BOを使用した場合、比較的低いpH条件でも高い染色効果を示した。この知見に基づき、本発明の一態様では、pH7.0〜pH8.0の条件下で処理する。当該条件を採用することにより、染色に伴う被染色材料の損傷を低減することができる。当該条件は特にヒト毛髪を染色する際に有効であり、ヒト毛髪の損傷及び皮膚（頭皮）への刺激も低減することが可能となる。
【００２６】
上記処理後、通常はケラチン繊維を洗浄し、最後に乾燥させる。洗浄には例えば水、洗剤等を用いることができる。また乾燥の手段としては、風乾（自然乾燥）、熱風乾燥、スピン乾燥、吸引乾燥、バレル乾燥などを例示できる。
【００２７】
本発明の染色方法では、BOの作用によって酸化染料の酸化、重合が生じ、ケラチン繊維が染色される。本発明では、酸化反応に酵素を利用することから、染色処理に伴う被染色材料の損傷（ダメージ）が少ない。また、毛髪に適用した場合においては頭皮への悪影響（アレルギー反応）などのおそれも少なくなる。本発明の染色剤は、ケラチン繊維などへの影響を低減しつつ、効果的な染色を可能にする。
【実施例】
【００２８】
インドール類縁体を染料とした場合の各酵素の染色効果を検討した。
１．方法
（１）使用酵素
ミロセシウム・ベルカリア由来BO（天野エンザイム株式会社、製品名：BO"Amano"3、略称：BO-3）
バチルス・サチルス由来BO（旭化成ファーマ株式会社、製品名：Bilirubin Oxidase、略称：BODII、製品コード：T-188）
エビタケ（Trachyderma tsunodae）由来BO（タカラバイオ株式会社、製品名：Bilirubin oxidase “TAKARA”）
カワラタケ（Trametes sp.）由来ラッカーゼ（大和化成株式会社）
ウルシ（Rhus vernificerea）由来ラッカーゼ（Sigma-Aldrich社）【００２９】
（２）染毛基剤の調製
EMALEX HC-20(日本エマルジョン株式会社) 2％、乳酸1％、酸化染料剤（５，６−ジヒドロキシインドール、４−アミノインドール、５−アミノインドール）をそれぞれ所定の量、蒸留水に溶解して、モノエタノールアミンを用いて所定のpHに調整した。次に、ヒドロキシエチルセルロース1.5％を加えて混合し、最終重量80％となるように蒸留水を加えた。続いて、酵素又は過酸化水素を加え、最終的に100％となるように調製した。【００３０】
（３）染毛試験
人白髪毛束（10cm, 1g, ビューラックス製）1本につき染毛基剤を2ｇ塗布した（n=3で実施）。30℃で30分反応させた（途中15分で裏返した）。水で洗浄後、さらに1％SDSで洗浄して、水洗を色が抜けるまで行った。最後に一晩放置し、風乾させた。【００３１】
（４）色相評価
分光測色計CM-700d (コニカミノルタ製)を使用し、10°視野、D65 Day Light、SCEモードにて測定した。CIEL*a*b表色系を用いて未処理の白髪との色差（ΔE*ab）で評価した。尚、L*は明度を表す。0〜100の数値があり、数値が高いほど明るいことを示す。また、a*は色彩を示す。-60〜+60の数値があり、-であるほど緑を示し、+であるほど赤を示す。ｂ*は色彩を示す。-60〜+60の数値があり、-であるほど青を示し、+であるほど黄色を示す。ΔE*abは[(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2]1/2で算出される値であり、ヘアカラーの評価において一般的に使用される単位である。基準値（染毛前の白髪の測定値）のL*値、a*値、b*値との差によりΔE*abを算出する。表１に色差の程度とΔE*abの関係を示す。
【表１】
2013099296.tif 000003
【００３２】
２．結果
（１）染毛試験１(５，６−ジヒドロキシインドールを使用（0.3重量%）。pH7.0の条件下で染色)
染毛試験１の結果を表２に示す。
【表２】
2013099296.tif 000004
【００３３】
表２に示す通り、各酵素を比較したところ、試験例１、２と比べて、BODII（旭化成ファーマ株式会社）を使用した試験例３〜５やBO-3（天野エンザイム株式会社）を使用した試験例６〜８は高い染毛性を示した。即ち、ミロセシウム・ベルカリア由来のBO及びバチルス・サチルス由来のBOは、過酸化水素よりも高い染色効果をもたらすことが判明した。一方、他の酵素を使用した試験例９〜１７は、過酸化水素を使用した場合よりも染毛効果が低い。【００３４】
（２）染色試験２(５，６−ジヒドロキシインドールを使用（0.3重量%）。pH9.0の条件下で染色)
アルカリ性の条件下（pH9.0）で染色した場合の染色効果を比較した。結果を表３に示す。
【表３】
2013099296.tif 000005
【００３５】
表２と表３の比較より、BODIIやBO-3を用いた場合には、pH9よりもpH7で染毛した方が高い染毛効果が得られることがわかる。また、pH7の条件の方が、過酸化水素による染毛性とBOによる染毛性の差がより顕著となる。これらの結果より、BOを用いれば、髪にとってより優しい条件下での染毛が可能であるといえる。【００３６】
（３）染毛試験３(５，６−ジヒドロキシインドールを使用（1.0重量%）。pH9.0の条件下で染色)
酸化染料剤（５，６−ジヒドロキシインドール）の濃度を高めた場合（染色基剤全体に対して1.0重量%で配合）の染色効果を比較した。結果を表４及び図１に示す。
【表４】
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【００３７】
表１の試験例３〜５と表４の試験例２８〜３０との比較、及び表１の試験例６〜８と表４の試験例３１〜３３との比較より、５，６−ジヒドロキシインドールの添加量を増加させることによって、染毛効果が高まることが示された。【００３８】
（４）染色試験４（他のインドール誘導体を使用。pH7.0の条件下で染色）
酸化染料剤として４−アミノインドールと５−アミノインドールを使用した場合の染色効果を検討した。結果を表５に示す。
【表５】
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【００３９】
４−アミノインドールと５−アミノインドールを用いた場合にもBODII及びBO-3（試験例３６〜４１）は過酸化水素（試験例３５）と同等の染色性を示した。一方、他の酵素（試験例４２〜４７）については染毛効果が認められない。【００４０】
３．まとめ
現在、多くの染毛剤には皮膚へのアレルギー性が高い染料（パラフェニレンジアミンなど）が使用されている。また、染料の酸化（発色）には通常、過酸化水素が用いられ、しかも、一般に染毛剤がアルカリ条件化（典型的にはpH9〜10）で使用されることから、染毛に伴い髪や頭皮等が損傷を受けやすい。今回の検討の結果、アレルギー性が低いインドール誘導体を使用した染色にBOが有効であり、過酸化水素を使用しなくとも優れた染色効果が得られることが判明した。また、ミロセシウム・ベルカリア由来のBO及びバチルス・サチルス由来のBOが特に優れた染色効果をもたらすことが示された。一方、ミロセシウム・ベルカリア由来のBO及び又はバチルス・サチルス由来のBOはインドール誘導体に温和な条件化（pH7）で良好に作用することも明らかとなった。この事実は、これらのBOによれば、髪や頭皮等に対する影響が一層少ない条件下での染毛が可能であること、換言すれば、BOの使用が実用上、極めて有利であることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の染色剤はケラチン繊維の染色に利用される。特に、毛髪の染色に本発明は有効である。【００４２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月11日(2012.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サチルス由来のビリルビンオキシダーゼ（EC1.3.3.5）を含み、
染料前駆体としての、インドール誘導体又はインドリン誘導体からなる酸化染料を組み合わせてなることを特徴とする、ケラチン繊維染色用の染色剤であって、
前記酸化染料が、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、６，７−ジヒドロキシインドール、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドール、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドール、４−ヒドロキシプロピルインドール、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドール、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、７−アミノインドール、６−アミノインドール、５−アミノインドール、４−アミノインドール、５，６−ジヒドロキシインド−ル−２−カルボン酸及び１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドールからなる群より選択される酸化染料である、ケラチン繊維染色用の染色剤。
【請求項２】
前記ビリルビンオキシダーゼが、以下の(7)〜(9)のいずれかに記載のタンパク質からなる、請求項１に記載の染色剤：
(7)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(8)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が変異、欠損又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
(9)配列番号５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【請求項３】
前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、請求項１又は２に記載の染色剤。
【請求項４】
前記酸化染料が５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドリン、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カルボン酸、４−アミノインドール及び５−アミノインドールからなる群より選択される酸化染料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の染色剤。
【請求項５】
前記酸化染料と前記ビリルビンオキシダーゼを含有した一剤型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の染色剤。
【請求項６】
前記酸化染料を含有する第１要素と、前記ビリルビンオキシダーゼを含有する第２要素とからなる二剤型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の染色剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の染色剤でケラチン繊維を処理するステップを含む染色方法。
【請求項８】
pHが7.0〜8.0の条件下で前記処理を行う、請求項７に記載の染色方法。
【国際調査報告】
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