(57)【要約】癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、その検出用キット、プローブセット、及びプライマーセットを提供することなどを課題とする。また、癌治療用医薬組成物を提供することを課題とする。前記検出方法では、ＦＧＦＲ３遺伝子の一部とＴＡＣＣ３遺伝子の一部との融合遺伝子、あるいは、それがコードする融合蛋白質を検出する。前記プライマーセット、プローブセット又は検出用キットは、ＦＧＦＲ３をコードする部分から設計されるセンスプライマー、プローブセットと、ＴＡＣＣ３をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマー、プローブセットとを含む。前記ポリペプチドの阻害剤が抗腫瘍効果を示したことから、前記融合遺伝子陽性又は当該ポリペプチド陽性の癌治療用医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た試料中の、下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ファイブロブラストグロースファクターレセプター３（ＦＧＦＲ３）遺伝子とトランスフォーミング  アシディック  コイルド−コイル  コンテイニングプロテイン３（ＴＡＣＣ３）遺伝子との融合遺伝子又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｅ）からなる群より選択されるプライマーセット：
ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｃ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
ｄ）配列番号２５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｅ）配列番号２７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
【請求項１２】
配列番号１の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２２８１〜２８５６の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１３】
配列番号３の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２２８１〜２９６１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１４】
配列番号５の塩基番号１〜２３６８の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号２３６９〜３００３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１５】
配列番号２５の塩基番号１〜２２４２の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号２５の塩基番号２２４３〜３１４４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１６】
配列番号２７の塩基番号１〜２２３３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号２７の塩基番号２２３４〜３１３５の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１７】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブセットであって、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるプローブセット：
ａ）配列番号１の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなる複数種のプローブセット、及び、配列番号１の塩基番号２２８１〜２８５６の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなる複数種のプローブセットを含むプローブセット、
ｂ）配列番号３の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット、及び、配列番号３の塩基番号２２８１〜２９６１の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセットを含むプローブセット、
ｃ）配列番号５の塩基番号１〜２３６８の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット、及び、配列番号５の塩基番号２３６９〜３００３の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセットを含むプローブセット。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び請求項１７記載のプローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する工程、並びに前記のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれかに記載のＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子の検出方法。
【請求項１９】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するための請求項１７に記載のプローブセット及びハイブリダイズしたシグナルを増幅する試薬を含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子の検出用キット。
【請求項２０】
前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、ｉ）被験者から得た試料に該ポリペプチドのＦＧＦＲ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＴＡＣＣ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程、ｉｉ）該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結したそれぞれの二次抗体を添加する工程、ｉｉｉ）該二次抗体が連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｖ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、ｖｉ）該標識シグナルを検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれかに記載のＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法で使用するための、前記融合ポリペプチドのＦＧＦＲ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び前記融合ポリペプチドのＴＡＣＣ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体、該二次抗体に連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することのできるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出用キット。
【請求項２２】
下記に記載のポリペプチドを阻害する物質を含有する、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７ 、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドを阻害する物質が、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８又はＬＹ２８７４４５５である、請求項２２〜請求項２７のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項２９】
前記癌が、肺癌又は膀胱癌である、請求項２２〜請求項２７のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項３０】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物の製造のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項３１】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項３２】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項３３】
下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の有効量を対象に投与することからなる、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌の治療方法：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦＲ３キナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子又は各融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法に関する。また、当該融合蛋白質を阻害する物質を含有する、当該融合遺伝子陽性又は当該融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファイブロブラストグロースファクターレセプター３（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；ＦＧＦＲ３）遺伝子は染色体４番短腕に存在し、コードする蛋白質は受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有する。アミノ末端側のスプライシングの違いにより、ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃのアイソフォームが知られており、ＦＧＦＲ３ｂはＦＧＦ−１及びＦＧＦ−９、ＦＧＦＲ３ｃはＦＧＦ−１、−２、−４、−８、−９、−１７、−１８、−２３をリガンドとし、二量体を形成することで自己のチロシンをリン酸化し活性化する（非特許文献１及び非特許文献２）。
多発性骨肉腫において、ＦＧＦＲ３遺伝子が染色体間転座によりＩｇＨ遺伝子と融合し、この転座によって形成された蛋白質の異常により細胞の異常増殖がおこり軟骨発育不全症の原因遺伝子となることが知られている（非特許文献３）。また、末梢性Ｔ細胞悪性リンパ腫において、染色体間転座によりＦＧＦＲ３遺伝子とＥＴＶ６遺伝子との融合が知られている（非特許文献４）。また膀胱癌などにおいてＦＧＦＲ３遺伝子の活性化点変異が知られており、これらの活性化点変異遺伝子をマウス正常細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入すると癌細胞様に形質転換することが知られているが、野生型のＦＧＦＲ３単独では形質転換はおこらないことが知られている（非特許文献５）。
トランスフォーミング  アシディック  コイルド−コイル  コンテイニングプロテイン３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ，  ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３；ＴＡＣＣ３）遺伝子はＦＧＦＲ３遺伝子と同じ染色体４番短腕に存在し１６個のエキソンからなる。コードする蛋白質はスピンドルモーター蛋白質として、有糸分裂紡錘体の安定化に関わることが知られている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「サイトカイン・アンド・グロースファクター・レビュー（Cytokine&Growth Factor Review）,（英国）、２００５年、１６巻、ｐ．１３９−１４９」
【非特許文献２】「バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical journal）, （(英国), ２０１１年、４３７巻、ｐ．１９９−２１３）」
【非特許文献３】「ブラッド（Blood）、（（米国）、２００２年、１００巻、ｐ．１５７９−１５８３）」
【非特許文献４】「キャンサーレサーチ（Cancer Reserch）、（（米国）、２００１年、６１巻、ｐ．８３７１−８３７４）」
【非特許文献５】「オンコジーン（Oncogene）、（(英国)、２００９年、２８巻、ｐ．４３０６−４３１６）」
【非特許文献６】「トレンズ・イン・セルバイオロジー（Trends in Cell Biology）、（（英国）、２００８年、１８巻、ｐ．３７９−３８８）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びその検出用キット、プライマーセット及びプローブセットを提供することを課題とする。また、これらの融合蛋白質を発現する癌患者への本発明のポリペプチドを阻害する薬物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、肺癌患者及び膀胱癌患者検体から得たキナーゼであるＦＧＦＲ３の一部とＴＡＣＣ３遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１、２、３及び２３）、これらの融合遺伝子が肺癌患者検体及び膀胱癌患者検体に存在すること（実施例４、５、６、２０及び２３）、またこれらの融合遺伝子を発現させるためレトロウイルスを作製し（実施例７、１０及び２４）、感染細胞が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例８、１１及び２５）。該新規融合遺伝子及び該新規融合遺伝子によりコードされる融合蛋白質をヒト膀胱癌患者由来細胞株や肺癌患者検体及び膀胱癌患者検体から検出する方法を構築した（実施例４、５、６、１９、２０、２７及び２８）。また、該融合遺伝子によりコードされる融合蛋白質の阻害作用をもつ薬物が感染細胞の腫瘍形成能を阻害することから、この融合蛋白質又はこれをコードする融合遺伝子を発現する癌患者（すなわち、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌患者）に対して該融合蛋白質の阻害剤が有効であることを見出した（実施例９、１２、１３、１４、１６、２２及び３０）。
これまで、野生型のＦＧＦＲ３単独では、癌細胞に形質転換しないものと考えられていたが、野生型であってもＴＡＣＣ３と融合することで、癌細胞に形質転換することは、非常に驚くべきことであった。また、このＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質は、驚くべきことに、ＦＧＦＲ３キナーゼのカルボキシ末端側で融合していることが確認されており、現在までに知られているアミノ末端での融合キナーゼとは異なる構造をしていた。
本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子の検出法を構築し、そのためのキット、プライマーセット及びプローブセットを提供し、これらの融合遺伝子又はそれにコードされる融合蛋白質を検出することにより、融合蛋白質の阻害剤による薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。さらに、該融合蛋白質阻害剤（特には、化合物Ａ〜Ｅ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８又はＬＹ２８７４４５５）がＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の活性を阻害し、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質を発現する（すなわち、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の）癌（例えば肺癌や膀胱癌）などに有効であることを見出した。【０００６】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］被験者から得た試料中の、下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ファイブロブラストグロースファクターレセプター３（ＦＧＦＲ３）遺伝子とトランスフォーミング  アシディック  コイルド−コイル  コンテイニングプロテイン３（ＴＡＣＣ３）遺伝子との融合遺伝子又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［２］前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法、
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法、
［４］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法、
［５］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載の方法、
［６］下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［７］前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［６］に記載のキット、
［８］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［６］に記載のキット、
［９］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［６］に記載のキット、
［１０］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［６］に記載のキット、
［１１］ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｅ）からなる群より選択されるプライマーセット：
ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
ｃ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｄ）配列番号２５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｅ）配列番号２７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
［１２］配列番号１の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２２８１〜２８５６の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１３］配列番号３の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２２８１〜２９６１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１４］配列番号５の塩基番号１〜２３６８の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号２３６９〜３００３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１５］配列番号２５の塩基番号１〜２２４２の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号２５の塩基番号２２４３〜３１４４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１６］配列番号２７の塩基番号１〜２２３３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号２７の塩基番号２２３４〜３１３５の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１７］ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブセットであって、下記ａ）〜ｃ）からなる群より選択されるプローブセット：
ａ）配列番号１の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）、及び、配列番号１の塩基番号２２８１〜２８５６の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）を含むプローブセット、
ｂ）配列番号３の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）、及び、配列番号３の塩基番号２２８１〜２９６１の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）を含むプローブセット、
ｃ）配列番号５の塩基番号１〜２３６８の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）、及び、配列番号５の塩基番号２３６９〜３００３の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数種の隣接したプローブペアからなるプローブセット（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）を含むプローブセット、
［１８］前記ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び［１７］記載のプローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する工程、並びに前記のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載のＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子の検出方法、
［１９］ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するための［１７］に記載のプローブセット及びハイブリダイズしたシグナルを増幅する試薬を含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子の検出用キット、
［２０］前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、ｉ）被験者から得た試料に該ポリペプチドのＦＧＦＲ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＴＡＣＣ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程、ｉｉ）該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結したそれぞれの二次抗体を添加する工程、ｉｉｉ）該二次抗体が連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｖ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、ｖｉ）該標識シグナルを検出する工程を含むことを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載のＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法、
［２１］［１］〜［５］のいずれかに記載のＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法で使用するための、前記融合ポリペプチドのＦＧＦＲ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び前記融合ポリペプチドのＴＡＣＣ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体、該二次抗体に連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出用キット、
［２２］下記に記載のポリペプチドを阻害する物質を含有する、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［２３］前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７ 、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［２２］に記載の医薬組成物、
［２４］前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［２２］に記載の医薬組成物、
［２５］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［２２］に記載の医薬組成物、
［２６］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［２２］に記載の医薬組成物、
［２７］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである［２２］に記載の医薬組成物、
［２８］前記ポリペプチドを阻害する物質が、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８又はＬＹ２８７４４５５である、［２２］〜［２７］のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物、
［２９］前記癌が、肺癌又は膀胱癌である、［２２］〜［２７］のいずれかに記載の癌治療用医薬組成物。
［３０］ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌治療用医薬組成物の製造のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［３１］ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の使用：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［３２］ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌の治療のための、下記に記載のポリペプチドを阻害する物質：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［３３］下記に記載のポリペプチドを阻害する物質の有効量を対象に投与することからなる、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌の治療方法：
配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２又は配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。【０００７】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の存在の検出方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
該ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び前記［１７］記載の標識プローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、並びに前記標識のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、本段落に記載のＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の存在の検出方法、
に関する。【０００８】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
該ポリヌクレオチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料及び前記［１７］記載の標識プローブセットを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、並びに前記標識のシグナルの重なりを検出する工程を含むことを特徴とする、本段落に記載のＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の診断方法、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記２つの態様の診断方法によりＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）と診断された患者に対して本発明のポリペプチドを阻害する物質（ある態様では化合物ＡＺＤ４５４７、化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、化合物ＢＧＪ３９８又は化合物ＬＹ２８７４４５５）を投与することを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の治療方法、
に関する。【０００９】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の存在の検出方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［１１］〜［１６］のいずれかに記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。【００１０】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の診断方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［１１］〜［１６］のいずれかに記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）と診断された患者に対して本発明のポリペプチドを阻害する物質（ある態様では化合物ＡＺＤ４５４７、化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、化合物ＢＧＪ３９８又は化合物ＬＹ２８７４４５５）を投与することを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の治療方法、
に関する。【００１１】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。【００１２】
さらに、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＦＧＦＲ３遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ（第一プローブ）、及びiii）ＴＡＣＣ３遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ（第二プローブ）を用い（ここで、第一プローブと第二プローブの蛍光は異なる）、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。【００１３】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の存在の検出方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＦＧＦＲ３遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ（第一プローブ）、及びiii）ＴＡＣＣ３遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ（第二プローブ）を用い（ここで、第一プローブと第二プローブの蛍光は異なる）、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。【００１４】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の診断方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＦＧＦＲ３遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ（第一プローブ）、及びiii）ＴＡＣＣ３遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブ（第二プローブ）を用い（ここで、第一プローブと第二プローブの蛍光は異なる）、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）と診断された患者に対して本発明のポリペプチドを阻害する物質（ある態様では化合物ＡＺＤ４５４７、化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、化合物ＢＧＪ３９８、又は化合物ＬＹ２８７４４５５）を投与することを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の治療方法、
に関する。【００１５】
また、本発明は、
下記（１）〜（３）に記載のポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」とも称する）又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）：
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。【００１６】
また、本発明は、被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質の検出方法：
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。【００１７】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の存在の検出方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。【００１８】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７（又は配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２（又は配列番号４）、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６（又は配列番号６）、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３（又は配列番号２６）又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０（又は配列番号２８）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）と診断された患者に対して、上記（１）〜（３）に記載のポリペプチドを阻害する物質（ある態様では化合物ＡＺＤ４５４７、化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、化合物ＢＧＪ３９８、又は化合物ＬＹ２８７４４５５）を投与することを含むＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の治療方法、
に関する。【００１９】
Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  Ｓｅｐ  ７；３３７（６０９９）：１２３１−５．  Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｌ  ２６．には、癌化能を示すＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子が存在すること、ＦＧＦＲ阻害剤ＰＤ１７３０７４、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子発現細胞の増殖を阻害すること、ＦＧＦＲ阻害治療が有益なグリオブラストーマ患者群の同定にＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子発現が寄与する可能性を示唆する報告がなされているが、本願最先の優先日（２０１２年３月８日）後の文献である。当該文献には、本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２と融合点を同じくする遺伝子断片の配列が記載されているが、その全長は明らかにされておらず、本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ、及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂやその検出方法プライマーセット、プローブセット、検出キットは全く開示も示唆もされていない。また、肺癌及び膀胱癌についての記載も示唆もない。
また、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１２．  Ｎｏｖ２１（Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１３  Ｆｅｂ  １５；２２（４）：７９５−８０３）には、癌化能を有するＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合遺伝子（本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１）が膀胱癌に存在することが報告されているが、本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を開示した本願最先の優先日（２０１２年３月８日）及び本願第２の優先日（２０１２年９月５日）後の文献である。当該文献には、本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ、及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂやその検出方法プライマーセット、プローブセット、検出キットは全く開示も示唆もされていない。また、肺癌についての記載も示唆もない。
さらに、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１３  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １；  １２３（２）：  ８５５_８６５．にはいくつかの癌化能を有するＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子がグリオブラストーマに存在することが報告されているが、本文献は、本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２を開示した本願最先の優先日（２０１２年３月８日）、本願第２の優先日（２０１２年９月５日）及び本願第３の優先日（２０１２年１２月２１日）より後に出版された文献である。当該文献には、本発明のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ、及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂやその検出方法プライマーセット、プローブセット、検出キットは全く開示も示唆もされていない。また、肺癌及び膀胱癌についての記載も示唆もない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の検出方法は、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法は、染色体の再構成を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、本発明のポリペプチドを阻害する物質による治療の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。本発明の検出用キット、プライマーセット及びプローブセットは、本発明の検出方法に用いることができる。また、本発明のポリペプチドを阻害する物質は、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又はＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質陽性の癌（特に肺癌又は膀胱癌）の治療用医薬組成物として使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜本発明の検出方法＞
本発明の検出方法は、融合遺伝子又は融合蛋白質を検出する方法であり、該方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチド、又は、ポリペプチドの存在を検出する工程を含む。被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された組織、体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、尿中癌細胞、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部又は膀胱患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。また、試料をフォルマリン固定してパラフィンに包埋して安定化した標本（ＦＦＰＥ）を用いることができる。ＦＦＰＥを薄くスライスしたＦＦＰＥ切片中を用いてもよい。ＦＦＰＥ切片中を用いれば、そこに存在するポリヌクレオチドやポリペプチドを直接検出することができる。
【００２２】
融合遺伝子の検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリヌクレオチド（以下、「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）は、「ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子」であり、これは、ＦＧＦＲ３遺伝子の一部とＴＡＣＣ３遺伝子の一部とを含む遺伝子である。
【００２３】
「ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子」としては、ＦＧＦＲ３の機能ドメインの一つであるキナーゼドメインをコードする配列とＴＡＣＣ３の機能ドメインの一つであるコイルド−コイルドメインをコードする配列を有する融合遺伝子があげられる。癌を引き起こす融合遺伝子としてＰＴＣ−ＲＥＴ（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；７１１９−７１２３）、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９；３１４３−３１４９）、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；Ｆｅｂ  １２；Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２０１２  Ｆｅｂ  １２；１８（３）：３７５−７）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；５６１−５６６）などが知られており、これらの融合遺伝子は５’末端側にコイルド−コイルドメインを持つ蛋白質の遺伝子と３’末端側にリガンド結合部位を欠損したキナーゼ遺伝子が結合した融合遺伝子であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に強制的に発現させると形質転換を引き起こすことが知られている。例えば、リガンド結合部位を有さないＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子を発現させた３Ｔ３細胞は、リガンド非依存的にＲＥＴキナーゼ活性化に重要である９０５番目のチロシン自己リン酸化が引き起こされ活性化される。この自己リン酸化は、ＲＥＴ阻害剤であるＶａｎｄｅｔａｎｉｂにより阻害され細胞死を引き起こすことが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；Ｆｅｂ  １２；Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２０１２  Ｆｅｂ  １２；１８（３）：３７５−７）。また、同様にリガンド結合部位を有さないＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を内在的に発現している細胞株でもＡＬＫのキナーゼ活性に重要である１６０４番目のリン酸化が引き起こされており、ＡＬＫに阻害活性をもつＴＡＥ６８４によりリン酸化が阻害され増殖が阻害されることが知られている（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；４２７５−４２８３）。さらに、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現している肺癌患者に対し、ＡＬＫキナーゼ阻害剤であるＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂが有効な治療薬であることが示唆されている（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  Ｄｅｖｅｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１１；  ４７１−４８５）。これらの融合遺伝子にコードされる融合蛋白質の活性化機構として、コイルド−コイルドメインを介したホモ二量体化により、融合しているキナーゼドメインのリガンド非依存的な恒常的活性化が引き起こされることが示唆されている。さらには、融合しているキナーゼの阻害剤を使用することにより、このように融合蛋白質の機能を阻害することができることが示唆されている。従って、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子についても、ＦＧＦＲ３のキナーゼドメインとＴＡＣＣ３のコイルド―コイルドメインが癌化を引き起こす重要なドメインと予測される。従って、前記「検出対象ポリヌクレオチド」としては、例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子のうち、ＦＧＦＲ３のキナーゼドメインとＴＡＣＣ３のコイルド―コイルドメインに該当する配列をコードする配列を有するポリヌクレオチドである、下記（１）〜（３）��記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ある態様において、これらの領域内の部分を検出することによっても、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
（１）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド[以下、「相同ポリペプチド」とも称する]、
（２）配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号４６１〜９４７、配列番号４のアミノ酸番号４６１〜９８２、配列番号６のアミノ酸番号４６１〜９９６、配列番号２６のアミノ酸番号４６１〜１０４３又は配列番号２８のアミノ酸番号４６１〜１０４０に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド[以下、「機能的等価改変体ポリペプチド」とも称する]、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２４】
好ましい前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２５】
さらに好ましい前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２５又は配列番号２７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３遺伝子バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１６３２１３.１）の塩基番号２５７（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２５３６（エキソン１８の３’末端に対応）とＴＡＣＣ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４２．１）の塩基番号２０５０（エキソン１１の５’末端に対応）から２６２５（エキソン１６のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２２８０の配列はＦＧＦＲ３遺伝子に由来し、塩基番号２２８１〜２８５６の配列はＴＡＣＣ３遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１と称する。配列番号１の塩基番号１〜２８５６は、融合蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２７】
配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３遺伝子バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１６３２１３.１）の塩基番号２５７（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２５３６（エキソン１８の３’末端に対応）とＴＡＣＣ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４２．１）の塩基番号１９４５（エキソン１０の５’末端に対応）から２６２５（エキソン１６のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２２８０の配列はＦＧＦＲ３遺伝子に由来し、塩基番号２２８１〜２９６１の配列はＴＡＣＣ３遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２と称する。配列番号３の塩基番号１〜２９６１は、融合蛋白質のＯＲＦであり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２８】
配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３遺伝子バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１６３２１３.１）の塩基番号２５７（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２６２４（エキソン１９の途中に対応）とＴＡＣＣ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４２．１）のイントロン５９塩基を挟み、塩基番号２０５０（エキソン１１の５’末端に対応）から２６２５（エキソン１６のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号５に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２３６８の配列はＦＧＦＲ３遺伝子に由来し、塩基番号２３６９〜２４２７の配列はＴＡＣＣ３のゲノム配列に由来し、塩基番号２４２８〜３００３の配列はＴＡＣＣ３遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３と称する。配列番号５の塩基番号１〜３００３は、融合蛋白質のＯＲＦであり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２９】
配列番号２５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３遺伝子バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１６３２１３.１）の塩基番号２５７から２４９８（ただし、１９８０番目はＣではなくＧ）とＴＡＣＣ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４２．１）の塩基番号１７７１から２６７２までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号２５に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２２４２の配列はＦＧＦＲ３遺伝子に由来し、塩基番号２２４３〜３１４４の配列はＴＡＣＣ３遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａと称する。配列番号２５の塩基番号１〜３１４４は、融合蛋白質質のＯＲＦであり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号２６に示す。
【００３０】
配列番号２７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３遺伝子バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１６３２１３.１）の塩基番号２５７から２４９８とＴＡＣＣ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４２．１）の塩基番号１７７１から２６７２までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ただし、一部にポリヌクレオチドの欠失と挿入が存在する。欠失している部分は、ＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）の６９０番目から７０１番目（エキソン４の３’側の配列）に相当する。挿入されている部分は、ＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）の１５２８番目と１５２９番目の間（エキソン１０とエキソン１１の間）に相当し、ＣＡＧという配列が挿入されている。配列番号２７に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２２３３の配列はＦＧＦＲ３遺伝子に由来し、塩基番号２２３４〜３１３５の配列はＴＡＣＣ３遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂと称する。配列番号２８の塩基番号１〜３１３５は、融合蛋白質のＯＲＦであり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号２８に示す。
【００３１】
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂを総称してＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチドと称する。
【００３２】
別の態様における前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１の塩基番号１３８１〜２８４１に対応するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１の部分配列、配列番号３の塩基番号１３８１〜２９４６に対応するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２の部分配列、配列番号５の塩基番号１３８１〜２９８８に対応するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３などが挙げられる。
【００３３】
好ましい「相同ポリペプチド」としては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が挙げられるが、該同一性が、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが特に好ましい。
【００３４】
好ましい「機能的等価改変体ポリペプチド」としては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が特に好ましい。
【００３５】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００３６】
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後記実施例８に記載の方法で確認する。具体的には、当該融合遺伝子をＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、スフェロイドプレートを用いて足場非依存的な細胞増殖作用を確認する方法が挙げられる。また、当該融合遺伝子を導入した細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、一定期間観察し、腫瘍形成を確認する方法であっても良い。
【００３７】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２６又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００３８】
本発明の融合遺伝子の検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の検出対象ポリヌクレオチド（融合点を含むゲノム配列）の存在を検出すること、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、検出対象ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出すること、あるいは、必要に応じて前処理した被験者から得た試料中の検出対象ポリヌクレオチドの存在をインサイチュハイブリダイゼーションにより検出することにより実施する。
【００３９】
ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。
【００４０】
検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば、遺伝子検出法として常用されるＰＣＲ、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ  ＴＭＡ  ｓｙｓｔｅｍ）、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法、更にマイクロアレイなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。
【００４１】
具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えば、ｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ; アプライドバイシステムズ社）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００４２】
より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＦＧＦＲ３遺伝子領域内の任意の部分）から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＴＡＣＣ３遺伝子領域内の任意の部分）から設計する。あるいは、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、該融合ポリヌクレオチドの融合点（後述）を含む領域に対応するように設計してもよい。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーセットを用い、更に好ましくは、本発明の検出用キットに最も好適に含まれるプライマーセットを用いる。ＰＣＲ増幅モニター法では、各遺伝子に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての検出対象ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）を設計することもできる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【００４３】
本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
【００４４】
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる配列（具体的には、配列番号１に示される塩基配列の第２２６５番〜第２２９６番（第２２８０番／第２２８１番）、又は配列番号３に示される塩基配列の第２２６５番〜第２２９６番（第２２８０番／第２２８１番）、配列番号５に示される塩基配列の第２３５３番〜第２３８４番（第２３６８番／第２３６９番）配列番号２５に示される塩基配列の第２２２７番〜第２２５８番（第２２４２番／第２２４３番）、又は配列番号２７に示される塩基配列の第２２１８番〜第２２４９番（第２２３３番／第２２３４番）。なお、括弧内の塩基番号は融合点を示す。）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。
【００４５】
なお、本明細書における融合点とは、ＦＧＦＲ３遺伝子由来の部分とＴＡＣＣ３遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。
【００４６】
インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のＦＩＳＨ法（fusion assay）に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。
【００４７】
インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のＲＮＡ  ＦＩＳＨ法（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．  ２０１２；  ２２−２９）に従って実施することができる。より具体的には、検出プローブをＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＦＧＦＲ３遺伝子領域内の任意の部分）から、別の検出プローブをＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＴＡＣＣ３遺伝子領域内の任意の部分）から設計する。被験者から得た試料と該プローブのハイブリダイゼーションを行う。引き続き、シグナルを増幅させる試薬のハイブリダイゼーションを行い、シグナルを増幅させる。ＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分からのシグナルとＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分からのシグナルとのシグナルの重なりを検出する。上記ＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分から設計したプローブとＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分から設計したプローブを検出する蛍光試薬又は発色試薬を別することにより、当該由来の異なる二種のプローブが同じ場所（同一分子内）にあるか否かを観察することができる。当該二種のプローブが同じ場所（同一分子内）にあることを観察することにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。シグナルを増幅させるために用いる試薬としては、ＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、及びＬａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いることができる。
【００４８】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００４９】
さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ６（１０），  ９８６，  １９９６）を用いることにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（アプライドバイシステムズ社）を用いることができる。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
【００５０】
本発明における融合遺伝子又は融合蛋白質の検出は、被験者から得た試料における、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（以下、「検出対象ポリペプチド」と称する）の存在を直接検出することによって実施してもよい。「ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合蛋白質」は検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（すなわち、検出対象ポリペプチド）である。検出対象ポリペプチドのうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ１、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ３、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ５ａ、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ５ｂと称する。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ１、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ５ａ、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ５ｂを総称してＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合蛋白質）と称する。
【００５１】
例えば、検出対象ポリペプチドを検出する工程において、検出は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合ポリペプチドを構成する各蛋白質に対する抗体（例えば、ＦＧＦＲ３に対する抗体とＴＡＣＣ３に対する抗体）を組み合わせることによる免疫学的測定法及び酵素活性測定法を組み合わせた方法等により実施してもよい。また、適宜前処理（例えば、パラフィンの除去）してある被験者から得た試料（例えば、ＦＦＰＥ切片）に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合ポリペプチドを構成する各蛋白質に対する抗体（例えば、ＦＧＦＲ３に対する抗体とＴＡＣＣ３に対する抗体）を組み合わせることによる免疫組織染色技術により検出を実施してもよい。これらの手法としては、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織染色等の手法が挙げられる。
【００５２】
免疫組織染色技術を利用した検出は、一分子単位で目的ポリペプチドを特異的に検出する公知の技術Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６;  ９９５−１０００）に従って実施することができる。より具体的には、前記融合ポリペプチドのＦＧＦＲ３遺伝子由来部分を認識する抗体と、前記融合ポリペプチドのＴＡＣＣ３遺伝子由来部分を認識する抗体を用いて、当該二つの抗体が同一分子を認識していることを上記技術によって検出することにより、検出対象ポリペプチドの存在を検出することができる。さらに具体的には、検出は、ｉ）被験者から得た試料に前記融合ポリペプチドのＦＧＦＲ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び前記融合ポリペプチドのＴＡＣＣ３遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程、ｉｉ）該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体、二次抗体に連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際にライゲーションさせて該二次抗体間に環状構造を形成することができるライゲースを含有する溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｖ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、ｖｉ）該標識シグナルを検出する工程により、実施することができる。ある態様としては、ＰＬＡプローブやＤｕｏｌｉｎｋ  II試薬キットならびにＤｕｏｌｉｎｋ  II  Ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ試薬キット（Ｏｌｉｎｋ社）に含まれる試薬を用いることができる。
【００５３】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、当該ポリヌクレオチド又は当該ポリペプチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、本発明のポリペプチドを阻害する物質（ある態様では化合物ＡＺＤ４５４７、化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、化合物ＢＧＪ３９８又は化合物ＬＹ２８７４４５５）による治療の適用対象となる。
【００５４】
＜本発明の検出用キット、本発明のプライマーセット、本発明のプローブセット＞
本発明のプライマーセットを含む検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（プライマーセットとも称する）が含まれる。本発明のプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
【００５５】
本発明のプライマーセットには、
ＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分から設計されるセンスプライマー及びＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、該アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、該センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる、プライマーセット
が含まれる。
本発明のプライマーセットにおいて、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、該融合ポリヌクレオチドの融合点（前述）を含む部分に対応するように設計してもよい。
【００５６】
本発明のプライマーセットの具体的な態様として、以下（１）〜（５）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１の塩基番号１から２２８０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２２８１から２８５６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（２）配列番号３の塩基番号１から２２８０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２２８１から２９６１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（３）配列番号５の塩基番号１から２３６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号２３６９から３００３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（４）配列番号２５の塩基番号１〜２２４２の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号２５の塩基番号２２４３〜３１４４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１６］配列番号２７の塩基番号１〜２２３３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号２７の塩基番号２２３４〜３１３５の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット
【００５７】
前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００５８】
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００５９】
本発明のプローブセットを含む検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズできるように設計した、ＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＦＧＦＲ３遺伝子領域内の任意の部分）から設計したプローブセット及びＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＴＡＣＣ３遺伝子領域内の任意の部分）から設計したプローブセット（プローブセットとも称する）及びハイブリダイズしたシグナルを増幅する試薬が含まれる。該プローブセットは、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブセットとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
【００６０】
本発明のプローブセットには、
ＦＧＦＲ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＦＧＦＲ３遺伝子領域内の任意の部分）から設計したプローブとＴＡＣＣ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＴＡＣＣ３遺伝子領域内の任意の部分）から設計したプローブとを含む、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブセットであって、各プローブは「検出対象ポリヌクレオチド」にハイブリダイズする核酸分子からなる、プローブセットが含まれる。
ある態様では、各プローブは、分岐ＤＮＡプローブ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ）であり、配列情報に基づいた分岐ＤＮＡプローブはアフィメトリクス社より入手できる。
【００６１】
本発明のプローブセットの具体的な態様として、以下（１）〜（３）からなる群より選択されるプローブセットが挙げられる。
（１）配列番号１の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）、及び、配列番号１の塩基番号２２８１〜２８５６の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）を含むプローブセット、
（２）配列番号３の塩基番号１〜２２８０の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）及び配列番号３の塩基番号２２８１〜２９６１の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）を含むプローブセット、
（３）配列番号５の塩基番号１〜２３６８の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）及び配列番号５の塩基番号２３６９〜３００３の任意の連続する少なくとも１６塩基に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアからなるプローブセットを複数種（好ましくは、２０種のプローブセットを含む）を含むプローブセット。
ここで、隣接したプローブペアからなるプローブセットは、多い方がシグナルが得られやすいため、好ましい。ある態様では、２０種程度が用いられる。
【００６２】
本発明のプローブセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために用いることができる。また、本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００６３】
＜本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療用医薬組成物＞
癌患者の検体から単離同定した融合ポリヌクレオチド（実施例１〜３）は、癌の原因遺伝子であることが示され（実施例８、実施例１１）、一部の肺癌又は膀胱癌患者に融合ポリヌクレオチドの存在が検出された（実施例４〜６）。更に、本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害することにより足場非依存性の細胞増殖が阻害される（すなわち抗癌作用が示される）という本発明者らが見出した新規な知見（実施例９、実施例１２、実施例１３、実施例１４、実施例１６）から、本発明のポリペプチドを阻害（本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害）する物質は、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療効果を有することがわかった。
本発明には、本発明のポリペプチドを阻害する物質（例えば、後述の医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法のいずれかによって得られた物質［例えば、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］）を有効成分とする本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療用医薬組成物が包含される。
【００６４】
本発明の医薬組成物における有効成分は、後述の医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法により選択することができる。例えば後述の実施例９記載の化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ２０１１；  １７:７４５１−７４６１に記載の化合物、４−Ａｍｉｎｏ−５−ｆｌｕｏｒｏ−３−［６−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−１Ｈ−ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−２（１Ｈ）−ｏｎｅ）、ＡＺＤ４５４７（ＷＯ２００８０７５０６８  Ｅｘａｍｐｌｅ  １５４とＡＡＣＲ２０１１，  ｐｏｓｔｅｒ  ３５６８；タイトル：「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＺＤ４５４７：  Ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ，  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＦＧＦＲ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  １，２  ａｎｄ  ３」に記載の化合物、Ｎ−｛５−［２−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］−２Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ｝−４−［（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、及びＢＧＪ３９８（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１；５４；７０６６−７０８３に記載の化合物、３−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−１−｛６−［４−（４−ｅｔｈｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）、実施例２１に記載の化合物ＬＹ２８７４４５５（ＷＯ２０１０１２９５０９    Ｅｘａｍｐｌｅ  １；Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，  ２０１１，  １０，  ２２００−２２１０；（Ｒ）−（Ｅ）−２−｛４−［２−｛５−［１−（３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］−１Ｈ−ｉｎｄａｚｏｌ−３−ｙｌ｝ｖｉｎｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−１−ｙｌ｝ｅｔｈａｎｏｌ）を挙げることができる。また、製造例１から５、実施例２９及び実施例３０に記載された化合物である、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}ピリミジン-2-アミン(化合物A)、2-[4-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]エタノール(化合物B)、(2R)-3-[4-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]プロパン-1,2-ジオール(化合物C)、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]ピリミジン-2-アミン（化合物D）、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミン(化合物E)を挙げることができる。
また、公知のＦＧＦＲ３阻害活性を有する低分子化合物（ＦＧＦＲ３阻害剤）から後述の医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法によって選択した化合物を本発明の医薬組成物における有効成分として用いることができる。特に、化合物ＡＺＤ４５４７、化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、化合物ＢＧＪ３９８及び化合物ＬＹ２８７４４５５を例示することができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物の有効成分として例示される二重鎖核酸は、二重鎖の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３'末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼによって生じる２１〜２３塩基の二重鎖核酸を介して起こる（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５， ４８５−４９０， ２００１）。３'側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸であるが、２塩基が好ましい。なお、前記塩基数（２１〜２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
【００６６】
二重鎖核酸の３'側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３'側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。
【００６７】
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、二重鎖部分が配列番号１、配列番号３及び配列番号５に記載の塩基に基づいて設計される、本発明のポリペプチドの発現阻害活性を有する二重鎖核酸である。
【００６８】
本発明のポリペプチドを阻害する物質（例えば、後述の医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法により得られた物質［例えば、二重鎖核酸、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］）を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
【００６９】
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注（点滴を含む）、筋注、若しくは皮下注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は膀胱内注入や経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
【００７０】
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
【００７１】
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
【００７２】
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
【００７３】
投与量は、有効成分すなわち医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法により得られた物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。好ましくは、腫瘍付近の血中濃度又は腫瘍内濃度が薬剤が本発明のポリペプチドの活性又は発現を５０％阻害する濃度の３〜３０倍、例えば、１０倍になるような量で、投与量は経路によって算出することができる。例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【００７４】
本発明の医薬組成物による治療対象は、本発明のポリヌクレオチド及び／又は本発明のポリペプチドの存在が検出された被験者（すなわち、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌患者）である。本発明のポリヌクレオチドによって癌化した細胞が本発明のポリペプチドを阻害する物質により死滅することから、本発明のポリペプチドを阻害する物質が本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）の有効な治療剤になる。
【００７５】
以下に、化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、及び化合物Eの製造法を示す。なお、文章中において、「ESI+」は質量分析におけるm/z値（イオン化法ESI、(M+H)+）を、「APCI/ESI+」は質量分析におけるm/z値（イオン化法APCIとESIの同時測定、(M+H)+）を、「NMR1」はジメチルスルホキシド-d6中の1H-NMRにおけるδ(ppm)を、「NMR2」はCDCl3中の1H-NMRにおけるδ(ppm)をそれぞれ示す。
【００７６】
製造例１  化合物Aの製造
（１）3,5-ジメトキシ安息香酸メチル(1g)とアセトニトリル(20mL)の混合物を氷冷し、N-フルオロ-N'-(クロロメチル)トリエチレンジアミンビス(テトラフルオロボラート) (4.09g)を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム及び塩基性シリカゲルを加え、30分間撹拌した後、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシ安息香酸メチル(292mg)を得た。
ESI+:233.
（２）2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシ安息香酸メチル(10g)とテトラヒドロフラン(50mL)の混合物を氷冷し、水素化ホウ素リチウム(3.0M テトラヒドロフラン溶液, 43mL)を加えた後、室温で65時間撹拌した。反応混合物を再び氷冷し、さらに水素化ホウ素リチウム(3.0M テトラヒドロフラン溶液, 14mL)を加え、室温で22時間撹拌した。反応混合物を氷冷し、氷水(300mL)の中にゆっくり加えた。さらに濃塩酸(25mL)をゆっくり加えて、室温で1時間撹拌した。トルエン/酢酸エチル(1:1)で抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮し、(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシフェニル)メタノール(8.67g)を得た。
ESI+:205.
（３）(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシフェニル)メタノール(1.71g)、トリエチルアミン(2.57mL)及びテトラヒドロフラン(34mL)の混合物を氷冷し、メタンスルホニル クロリド(716μL)を加えた後、1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル メタンスルホネート(2.32g)を得た。
NMR2:3.04(3H,s),3.88(6H,s),5.34(2H,s),6.72(1H,t,J=8.2Hz).
（４）2-クロロ-5-ヒドロキシピリミジン(4.38g)、炭酸カリウム(9.27g)及びN,N-ジメチルホルムアミド(79mL)の混合物に、2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル メタンスルホネート(7.89g)を加えた後、60℃で1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、生じた固体を濾取し、水で洗浄した後、減圧乾燥し、2-クロロ-5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(8.53g)を得た。
APCI/ESI+:317.
（５）アルゴン雰囲気下、2-クロロ-5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(1.03g)、3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]アニリン(1.29g)、1,1'-ビナフタレン-2,2'-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)(609mg)、炭酸セシウム(3.19g)及びジオキサン(20.6mL)の混合物に、酢酸パラジウム(146mg)を室温で加え、100℃で4時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/濃アンモニア水)、続いて塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル)で精製した後、酢酸エチル、続いてエタノールで再結晶し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}ピリミジン-2-アミン(化合物A：830mg)を得た。
ESI+:585.
NMR1:1.45-1.60(2H,m),1.73-1.84(2H,m),2.14(3H,s),2.17-2.58(11H,m),3.24-3.36(2H,m),3.75(3H,s),3.87(6H,s),5.16(2H,s),6.79(1H,d,J=8.8Hz),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.24(1H,dd,J=8.8,2.4Hz),7.32(1H,d,J=2.4Hz),8.29(2H,s),9.21(1H,s).
【００７７】
製造例２  化合物Bの製造
（１）アルゴン雰囲気下、製造例１（４）と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[ (2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(800mg)、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)エタノール(642mg)、1,1'-ビナフタレン-2,2'-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)(472mg)、炭酸セシウム(2.47g)及びジオキサン(16mL)の混合物に、酢酸パラジウム(113mg)を室温で加え、100℃で6時間撹拌した。反応混合物に水とクロロホルムを加え、不溶物をセライト濾過で濾別した後、濾液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製し、2-[4-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]エタノール(化合物B：139mg)を得た。
ESI+:408.
NMR1:3.69(2H,dd,J=11.0,5.6Hz),3.87(6H,s),4.07(2H,t,J=5.6Hz),4.83(1H,t,J=5.4Hz),5.14(2H,s),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.45(1H,d,J=0.6Hz),7.88(1H,d,J=0.6Hz),8.26(2H s),9.20(1H,s).
【００７８】
製造例３  化合物Cの製造
（１）アルゴン雰囲気下、製造例１（４）と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン(1.33g)、1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-アミン(913mg)、1,1'-ビナフタレン-2,2'-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)(785mg)、炭酸セシウム(4.11g)及びジオキサン(26.6mL)の混合物に、酢酸パラジウム(189mg)を室温で加え、100℃で4時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]ピリミジン-2-アミン(1.73g)を得た。
APCI/ESI+:448.
（２）5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[1-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]ピリミジン-2-アミン(3.59g)及びメタノール(20mL)の混合物に、4M塩化水素/ジオキサン溶液(40mL)を加え、室温で6時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣に飽和重曹水を加えた。生じた固体を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(2.9g)を得た。
APCI/ESI+: 364.
（３）5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(50mg)、炭酸カリウム(57mg)及びN,N-ジメチルホルムアミド(1mL)の混合物に[(4S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]メチル 4-メチルベンゼンスルホネート(118mg)を加え、60℃で1時間、110℃で4日間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1-{[(4R)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]メチル}-1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(39mg)を得た。
APCI/ESI+:478.
（４）5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-(1-{[(4R)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル]メチル}-1H-ピラゾール-4-イル)ピリミジン-2-アミン(45mg)及びテトラヒドロフラン(2mL)の混合物に1M塩酸(1mL)を加え、50℃で3時間撹拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製した後、酢酸エチルで固化し、(2R)-3-[4-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]プロパン-1,2-ジオール(化合物C：25mg)を得た。
ESI+:438.
NMR1:3.23-3.38(2H,m),3.72-3.80(1H,m),3.84-3.96(7H,m),4.15(1H,dd,J=13.8,4.1Hz),4.67(1H,t,J=5.6Hz),4.91(1H,d,J=5.3Hz),5.14(2H,s),7.06(1H,t,J=8.4Hz),7.45(1H,d,J=0.6Hz),7.87(1H,d,J=0.6Hz),8.26(2H,s),9.21(1H,s).
【００７９】
製造例４  化合物Dの製造
（１）製造例１（５）と同様にして、4-(4-メチルピペラジン-1-イル)アニリン、及び、製造例１（４）と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジンを原料として用いて、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]ピリミジン-2-アミン（化合物D）を得た。
ESI+:472.
NMR1:2.21(3H,s),2.41-2.48(4H,m),2.98-3.08(4H,m),3.87(6H,s),5.15(2H,s),6.81-6.90(2H,m),7.07(1H,t,J=8.4Hz),7.47-7.55(2H,m),8.26(2H,s),9.15(1H,s).
【００８０】
製造例５  化合物Eの製造
（１）(1-メチル-3-ニトロ-1H-ピラゾール-5-イル)メタノール(398mg)、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(459μL)及び酢酸エチル(8mL)の混合物に、p-トルエンスルホン酸 一水和物(96mg)を加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(459μL)及びp-トルエンスルホン酸 一水和物(96mg)を加え、室温で1.5時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル)で精製し、1-メチル-3-ニトロ-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール(487mg)を得た。
APCI/ESI+:242.
（２）アルゴン雰囲気下、1-メチル-3-ニトロ-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール(487mg)、テトラヒドロフラン(4.9mL)及びエタノール(4.9mL)の混合物に、10%パラジウム-炭素(50mg)を加えた。水素雰囲気下、12時間撹拌した後、セライト濾過により不溶物を除いた。濾液を減圧濃縮し、1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-アミン(426mg)を得た。
APCI/ESI+:212.
（３）製造例３（１）と同様にして、1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-アミン、及び、製造例１（４）と同様の方法で製造した2-クロロ-5-[(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジンを原料として用いて、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミンを得た。
APCI/ESI+:492.
（４）5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミン(706mg)とメタノール(8mL)の混合物に4M塩化水素/ジオキサン溶液(8mL)を加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メタノール(444mg)を得た。
ESI+:408.
（５）[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メタノール(350mg)、トリエチルアミン(359μL)、ジクロロメタン(7mL)及びテトラヒドロフラン(7mL)の混合物を氷冷し、メタンスルホニル クロリド(120μL)を加えた後、室温で3時間撹拌した。反応混合物に水及び酢酸エチルを加え、生じた固体を濾取した後、減圧乾燥し、[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メチル メタンスルホネート(218mg)を得た。
NMR2:2.96(3H,s),3.85(3H,s),3.89(6H,s),5.16(2H,s),5.25(2H,s),6.68(1H,t,J=8.0Hz),6.91(1H,s),7.63(1H,brs),8.24(2H,s).
（６）[3-({5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]ピリミジン-2-イル}アミノ)-1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル]メチル メタンスルホネート(795mg)とN-メチルピロリドン(15.9mL)の混合物に、1-メチルピペラジン(901μL)を加え、80℃で2時間撹拌した。反応混合物に水及び飽和重曹水を加え、生じた固体を濾取した後、濾液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣を先に濾取した固体と合わせた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)、続いて塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール)で精製した後、エタノール/ジイソプロピルエーテルにて固化し、5-[(2,6-ジフルオロ-3,5-ジメトキシベンジル)オキシ]-N-{1-メチル-5-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-1H-ピラゾール-3-イル}ピリミジン-2-アミン(化合物E：168mg)を得た。
ESI+:490.
NMR1:2.14(3H,s),2.18-2.53(8H,m),3.45(2H,s),3.67(3H,s),3.87(6H,s),5.15(2H,s),6.46(1H,s),7.06(1H,t,J=8.4Hz),8.26(2H,s),9.42(1H,s).
【００８１】
＜医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法＞
医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法には、［１］本発明のポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする方法と、［２］本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤をスクリーニングする方法とが含まれる。
［１］本発明のポリペプチドを阻害（本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害）する物質をスクリーニングする方法
本発明のポリペプチドを阻害する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む限り、特に限定されるものではない：
（ｉ）本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）該ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
（ｉｉｉ）該ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程。
【００８２】
本スクリーニング方法には、以下の方法が含まれる。
（ａ）インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）型スクリーニング方法；
（１）本発明のポリペプチドに試験物質を接触させる工程、（２）該ポリペプチドの活性が阻害されるか否かを分析する工程、及び（３）該ポリペプチドの活性を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【００８３】
（ｂ）細胞型スクリーニング方法；
（１）本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）該ポリペプチドの活性が阻害されるか否かを分析する工程、及び（３）該ポリペプチドの活性を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【００８４】
（ｃ）発現阻害型スクリーニング方法；
（１）本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）該ポリペプチドの発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び（３）該ポリペプチドの発現を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【００８５】
各スクリーニング方法について以下に説明する。本発明のポリペプチドを発現している細胞には、本発明のポリペプチドを天然に発現している細胞と、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質転換することにより、本発明のポリペプチドを発現させた細胞とが含まれるが、本発明のポリペプチドを発現している細胞としては、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質転換することにより、本発明のポリペプチドを発現させた細胞が好ましい。
【００８６】
（ａ）インビトロ型スクリーニング方法
インビトロ型スクリーニング方法には、精製した本発明のポリペプチドに試験物質を添加して接触させ（接触させる工程）、該試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの活性に比較して分析し（分析する工程）、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質（すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤）を選択する方法が含まれる。
【００８７】
医薬組成物の有効成分をスクリーニング方法において、各工程は、具体的には、例えば、以下のように実施できる。精製した本発明のポリぺプチドに試験物質を添加し接触させた後、ＡＴＰを添加し、該ポリペプチドの活性を測定する。コントロールとして、該精製したポリぺプチドと試験物質の溶媒（例えばＤＭＳＯ）とを混合し接触させた後、ＡＴＰを添加し、該ポリペプチドの活性を測定する。バックグラウンドコントロールとして、ＡＴＰを添加しない条件を設定することができる。試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かを分析する。試験物質により本発明のポリペプチドの活性（すなわち自己リン酸化活性）が阻害されたか否かは、試験物質による本発明のポリペプチドのチロシンリン酸化レベルの変化を分析することにより判定できる。すなわち、溶媒コントロール添加（すなわち接触）時に比較し、試験物質添加（すなわち接触）時に本発明のポリペプチドの活性（すなわち自己リン酸化活性）が阻害されていた場合、その試験物質を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質（すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤）として選択する。上記工程において、ＡＴＰを添加する前にペプチド基質を添加して混合すること、及び、該ペプチド基質に対するリン酸化活性を本発明のポリペプチドの活性として分析する（すなわち、試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、本発明のポリペプチドによるペプチド基質のリン酸化レベルの変化を分析することによって判定する）以外は上記と同様にして行うスクリーニング方法も、本発明のインビトロ型スクリーニング方法に含まれる。上記記載の方法で、５０％以上活性を阻害する濃度が１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質として選択する。例えば、実施例２１の方法を本発明のインビトロ型スクリーニング方法として用いることができる。
【００８８】
（ｂ）細胞型スクリーニング方法
細胞型スクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質を混合（すなわち添加）して接触させ（接触させる工程）、該試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの活性に比較して分析し（分析する工程）、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質（すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤）を選択する方法が含まれる。具体的には、例えば以下のように実施できる。
【００８９】
まず、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質又は溶媒コントロール（例えばＤＭＳＯ）とをそれぞれ接触させる。一定時間細胞を培養した後、培養した細胞を溶解して調製した細胞溶解液を用いて、公知のＳＤＳ電気泳動法及び抗リン酸化ＦＧＦＲ３抗体（例えばＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたイムノブロッティングにより本発明のポリペプチドの活性（すなわち自己リン酸化活性）を測定することによって、試験物質により本発明のポリペプチドの活性（すなわち自己リン酸化活性）が阻害されたか否かを分析する。試験物質により本発明のポリペプチドの活性が阻害されたか否かは、試験物質による本発明のポリペプチドのチロシンリン酸化レベルの変化を分析することにより判定できる。すなわち、溶媒コントロール添加（すなわち接触）時に比較し、試験物質添加（すなわち接触）時に本発明のポリペプチドの活性が阻害されていた場合、その試験物質を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質（すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤）として選択する。
【００９０】
（ｃ）発現阻害型スクリーニング方法
発現阻害型スクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質を混合（すなわち添加）して接触させ（接触させる工程）、該試験物質により本発明のポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの発現に比較して分析し（分析する工程）、本発明のポリペプチドの発現を阻害する物質（すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療剤（特には肺癌又は膀胱癌）治療剤）を選択する方法が含まれる。具体的には、例えば以下のように実施できる。
【００９１】
本発明のポリペプチドを発現している任意の細胞と試験物質又は溶媒コントロール（例えばＤＭＳＯ）とをそれぞれ接触させる。培養後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を用いて、試験物質により本発明のポリペプチドの発現が阻害されたか否かを分析する。本発明のポリペプチドの発現が阻害されたか否かは、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡ又は蛋白質の発現が阻害されたか否かにより分析することができる。より具体的には、前記細胞抽出液に存在する本発明のポリペプチドのｍＲＮＡ又は蛋白質の量を公知の発現量分析方法、例えば、ノーザンブロット法や定量的ＰＣＲ法又はイムノブロット法やＥＬＩＳＡ法等で同定する。試験物質により本発明のポリペプチドの発現が阻害されたか否かは、試験物質による本発明のポリペプチドの発現量の変化を分析することにより判定できる。すなわち、溶媒コントロール接触時に比較し、試験物質接触時に本発明のポリペプチドの発現量（ｍＲＮＡ又は蛋白質量）が低下していた場合、その試験物質を、本発明のポリペプチドの発現を阻害する物質（すなわち本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤）として選択する。
【００９２】
［２］本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法
本発明のポリペプチドを阻害（本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害）する物質をスクリーニングする方法は、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（好ましくは肺癌又は膀胱癌）治療剤をスクリーニングする方法として利用できる。すなわち、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法は、上記［１］本発明のポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする方法のi)、ｉｉ）及びｉｉｉ）を含む。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法では、試験物質が本発明のポリペプチドを阻害するか否かを分析し、本発明のポリペプチドを阻害する物質を選択した後、選択された試験物質が、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）治療活性を有することを確認する工程を更に含むことが好ましい。
【００９４】
選択された試験物質が、本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌治療活性を有することを確認する工程；
選択された物質が本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）治療活性を有することを確認する工程としては、公知の評価方法又はそれを改良した方法、例えば、本発明のポリペプチドを発現した培養細胞や腫瘍モデル動物に選択された物質を処置し分析する方法を実施する工程が挙げられる（臨床腫瘍学 セカンドエディション、癌と化学療法社）。
【００９５】
選択された物質が本発明のポリヌクレオチド陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（特には肺癌又は膀胱癌）治療活性を有することを確認する工程として好ましいのは、（１）ヒト癌（特には肺癌又は膀胱癌）由来の内在的に本発明のポリペプチドを発現する癌細胞を用いて、選択された試験物質が該細胞の増殖阻害作用及び／若しくは細胞死誘導作用を有することを確認する工程、（２）選択された試験物質が本発明のポリペプチドを発現させた形質転換細胞の足場非依存的増殖に対する阻害作用を有することを確認する工程、並びに／又は、（３）選択された試験物質が本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞をヌードマウスに接種し形成した腫瘍増殖に対する阻害作用を有することを確認する工程である。
【００９６】
上記ヌードマウスを用いた方法では、本発明のポリペプチドを内在性に発現する癌細胞や、本発明のポリペプチドの発現により形質転換させた細胞を皮下、皮内、腹腔や各臓器に移植した腫瘍モデル動物である担癌モデル動物（例えば本発明のポリペプチドを発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞を移植したヌードマウスなど）を用いることができる。
【００９７】
医薬組成物の有効成分をスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ， ４（１）：４１，１９９９）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、二重鎖核酸、抗体又は抗体断片、あるいは、医薬組成物の有効成分をスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。【００９９】
［実施例１］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１の単離
肺癌臨床検体（米国アステランド社）２００検体に対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びランダムプライマー（ランダムプライマーズ、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号７で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ＲＴ＿Ｆ及び配列番号８で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ＲＴ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１分３０秒を３０サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号９で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｎｅｓｔｅｄ＿Ｆ及び配列番号１０で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｎｅｓｔｅｄ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、サンプルＬｇ３４４のみで、約５００ｂａｓｅ  ｐａｉｒ（ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
その後、ＰＣＲ産物をダイデオキシシーケンス法により配列決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、約５００ｂｐのＰＣＲ産物は、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のエキソン１８の３'末端が、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のＣＤＳのエキソン１１の５’末端と融合している配列であることが明らかになった。
扁平上皮肺癌患者肺癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｌｇ３４４検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ  （ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号１１で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｆ及び配列番号１２で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、６０℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１３で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＢａｍＨＩ＿Ｆ及び配列番号１４で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、約２．９ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、約２．９ｋｂｐのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳの５'末端からエキソン１８の３'末端までが、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のＣＤＳのエキソン１１の５’末端からＣＤＳの３’末端までと融合している転写産物（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１）（配列番号１）が存在していることが明らかになった。配列番号１によりコードされるポリペプチドを配列番号２に示す。
また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１のＯＲＦ全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトにクローニングし発現プラスミド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）を構築した。【０１００】
［実施例２］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２の単離
膀胱癌臨床検体（米国アステランド社）５９検体に対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びランダムプライマー（ランダムプライマーズ、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号７で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ＲＴ＿Ｆ及び配列番号８で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ＲＴ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１分３０秒を３０サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号９で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｎｅｓｔｅｄ＿Ｆ及び配列番号１０で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｎｅｓｔｅｄ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、サンプルＢｄ１０６検体で、約６００ｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。
その後、ＰＣＲ産物をダイデオキシシーケンス法により配列決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、約６００ｂｐのＰＣＲ産物は、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳのエキソン１８の３'末端が、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のＣＤＳのエキソン１０の５’末端と融合している配列であることが明らかになった。
膀胱癌患者膀胱癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｂｄ１０６検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ  （ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号１１で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｆ及び配列番号１２で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、６０℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１３で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＢａｍＨＩ＿Ｆ及び配列番号１４で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、約３．０ｋｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ）。この結果、約３．０ｋｂｐのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳの５'末端からエキソン１８の３'末端までが、ＴＡＣＣ３（ＮＭ＿００６３４２．１）のＣＤＳのエキソン１０の５’末端からＣＤＳの３’末端までと融合している転写産物（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２）（配列番号３）が存在していることが明らかになった。配列番号３によりコードされるポリペプチドを配列番号４に示す。
また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２のＯＲＦ全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトにクローニングし発現プラスミド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）を構築した。【０１０１】
［実施例３］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３の単離
膀胱癌臨床検体（米国アステランド社）５９検体に対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びランダムプライマー（ランダムプライマーズ、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号７で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ＲＴ＿Ｆ及び配列番号８で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ＲＴ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１分３０秒を３０サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号９で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｎｅｓｔｅｄ＿Ｆ及び配列番号１０で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｎｅｓｔｅｄ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、サンプルＢｄ０２１検体で、約６５０ｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。
その後、ＰＣＲ産物をダイデオキシシーケンス法により配列決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、約６５０ｂｐのＰＣＲ産物は、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳのエキソン１９の途中配列が、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のイントロン１０−１１の一部に融合し、さらにＴＡＣＣ３遺伝子のＣＤＳのエキソン１１の５’末端と融合している配列であることが明らかになった。
膀胱癌患者膀胱癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｂｄ０２１検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ  （ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号１１で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｆ及び配列番号１２で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、６０℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１３で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＢａｍＨＩ＿Ｆ及び配列番号１４で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、約３．０ｋｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、約３．０ｋｂｐのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳの５'末端からエキソン１９の途中配列が、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のイントロン１０−１１の一部に融合し、さらにＴＡＣＣ３のＣＤＳのエキソン１１の５’末端からＣＤＳの３'末端までと融合している転写産物（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３）（配列番号５）が存在していることが明らかになった。配列番号５によりコードされるポリペプチドを配列番号６に示す。
また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３のＯＲＦ全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトにクローニングし発現プラスミド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）を構築した。【０１０２】
［実施例４］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１の検出
肺癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）２００サンプルからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを基質とし、配列番号１５で示されるＦＧＦＲ３-ＴＡＣＣ３（Ｆ１８Ｔ１１）＿ｑＰＣＲ＿Ｆ及び配列番号１６で示されるＦＧＦＲ３-ＴＡＣＣ３（Ｆ１８Ｔ１１）＿ｑＰＣＲ＿Ｒをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、肺癌検体においては上述のサンプルＬｇ３４４のみで増幅が確認された。また、膀胱癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）５９サンプルからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを基質として同様に実施し、複数の検体から増幅が確認された。【０１０３】
［実施例５］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２の検出
膀胱癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）５９サンプルからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを基質とし、配列番号１７で示されるＦＧＦＲ３-ＴＡＣＣ３（Ｆ１８Ｔ１０）＿ｑＰＣＲ＿Ｆ及び配列番号１８で示されるＦＧＦＲ３-ＴＡＣＣ３（Ｆ１８Ｔ１０）＿ｑＰＣＲ＿Ｒをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒  を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、膀胱癌検体において複数の検体から増幅が確認された。【０１０４】
［実施例６］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３の検出
膀胱癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）５９サンプルからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを基質とし、配列番号１９で示されるＦＧＦＲ３-ＴＡＣＣ３（Ｆ１９Ｔ１１）＿ｑＰＣＲ＿Ｆ及び配列番号２０で示されるＦＧＦＲ３-ＴＡＣＣ３（Ｆ１９Ｔ１１）＿ｑＰＣＲ＿Ｒをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒  を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、膀胱癌検体において複数の検体から増幅が確認された。【０１０５】
[実施例７] ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１のレトロウイルス溶液の作製
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ（実施例１）を９μｇ、トランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ、Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション２４時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ培地；インビトロジェン社）を交換し、さらに２４時間の培地上清を採取しレトロウイルス溶液を作製した。【０１０６】
[実施例８] ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１の足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例７においてＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作製したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加し感染させた。添加６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地に交換し、感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）及び１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に交換し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を取得した。（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と命名した。）
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト社）にＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及び空ベクターであるｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｍｏｃｋ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を、それぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）及び４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置を用いた。Ｍｏｃｋ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対してＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約３．１倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。【０１０７】
［実施例９］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する融合ポリペプチド阻害剤の足場非依存的細胞増殖阻害作用
足場非依存的な細胞増殖の測定（コロニー法など）は、化合物の抗癌作用（薬理効果）を検討する系として知られている（臨床腫瘍学  セカンドエディション、癌と化学療法社）。コロニー法に代わる細胞非接着性の増殖を測定する方法として、前述のようなスフェロイドプレートを用いる方法がある。
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト社）に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で播種した。また、ポジティブコントロール用に培地のみ添加したウェルを調製した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて一晩培養後、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８を最終濃度１００ｎＭで添加した。ネガティブコントロールとして化合物の溶媒であるＤＭＳＯを化合物添加時と同濃度（０．１％）になるように添加した。その後、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４日間培養し、細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し２０分撹拌した後、発光測定装置を用いて測定した。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの値をそれぞれ１００％阻害値、０％阻害値として各化合物の増殖阻害％を算出した。その結果、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の阻害％はそれぞれ４０％、７４％、９２％であった。
以上の結果は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を発現する癌細胞や腫瘍の増殖をＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの阻害剤が阻害できることを示している。
本発明のポリペプチド阻害剤による治療の有効性が期待される適用対象者を本発明の検出方法により識別することで、テーラーメード医療が実践できることが示された。【０１０８】
[実施例１０] ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３のレトロウイルス溶液の作製
実施例２及び３で作製したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを用い、実施例７の方法に従いレトロウイルス溶液を作製した。【０１０９】
[実施例１１] ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３の足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例１０においてＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２／ｐＭＸs−ｐｕｒｏ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作製したウイルス溶液を用いて、実施例８の方法に従いＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を取得した。（それぞれＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と命名した。）
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、実施例８と同様の方法で検討した。Ｍｏｃｋ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２．８倍の細胞数のカウントの増加が確認された。また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２．３倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。【０１１０】
［実施例１２］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する本発明のポリペプチド阻害剤の足場非依存的細胞増殖阻害作用
実施例９と同様の方法でＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞増殖阻害作用の評価を行った。その結果、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＤｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の阻害％はそれぞれ２１％、６０％、９０％であった。また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＤｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の阻害％はそれぞれ３２％、５１％、８７％であった。
以上の結果は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３を発現する癌細胞や腫瘍の増殖をＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤が阻害できることを示している。
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤による治療の有効性が期待される適用対象者を本発明の検出方法により識別することで、テーラーメード医療が実践できることが示された。【０１１１】
［実施例１３］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤の抗腫瘍試験
リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、  ＰＢＳ）に懸濁したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞３×１０6個を４週齡の雄性ｃａｎｎ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１Ｎｕ／Ｃｒｌｃｒｌｊ（Ｎｕ／Ｎｕ）ヌードマウス（日本チャールズリバー社）の背部皮下に注射して植えつけた。植付け３日後にＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤であるＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物群を各４匹から５匹で行い、０．５％メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌＣＥＬＬＵＬＯＳＥ、信越化学工業株式会社）／９９．５％蒸留水の組成の溶媒にＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８を懸濁し、それぞれ３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。投与は１１日間１日１回行い、体重及び腫瘍径を２日から３日毎に測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
［腫瘍体積（ｍｍ3）］＝［腫瘍の長径（ｍｍ）］×［腫瘍の短径（ｍｍ）］2×０．５
化合物投与開始日及び投与終了日の溶媒群の腫瘍体積をそれぞれ１００％阻害、０％阻害としてＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の阻害率を算出した。結果、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８はＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞（腫瘍）の増殖をそれぞれ５１％、９０％阻害した。
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する抗腫瘍作用も同様に検討した。結果、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞（腫瘍）の増殖をそれぞれ６１％及び９０％阻害した。またＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞（腫瘍）の増殖をそれぞれ７３％及び８８％阻害した。【０１１２】
［実施例１４］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞腫瘍に対するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤投与によるキナーゼ阻害作用
下記以外は実施例１３と同様にして、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８のキナーゼ阻害作用を観察した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞３×１０6個を植えつけ、植付け３日後にＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物群各５匹で行い、最終投与４時間後に解剖して腫瘍を摘出した。その後、溶解液（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ社）を用いて腫瘍の蛋白質抽出液を速やかに調製し、腫瘍内の総ＦＧＦＲ３及びリン酸化ＦＧＦＲ３の測定をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて実施した。ＥＬＩＳＡは添付の手順書に従って実施したが、検出は化学発光試薬（ＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ基質；Ｒｏｃｈｅ社）及び発光測定装置（ＡＲＶＯ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）による化学発光の検出へと変更した。
リン酸化ＦＧＦＲ３値を総ＦＧＦＲ３値で補正した値（リン酸化ＦＧＦＲ３／総ＦＧＦＲ３）をリン酸化レベルとし、溶媒群のリン酸化レベルを０％阻害、絶対値０を１００％阻害として各化合物群のチロシン自己リン酸化阻害率を算出した。結果、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８群では溶媒群に比べ腫瘍内のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ１のチロシン自己リン酸化がそれぞれ５８％、７７％減少していた。
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対しても同様に検討した結果、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８群では溶媒群に比べ、腫瘍内のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２のチロシン自己リン酸化がそれぞ５４％、６６％減少していた。また、腫瘍内のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３のチロシン自己リン酸化がそれぞれ７８％、８５％減少していた。
これらの結果から、上記動物モデルにおけるＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の抗腫瘍作用が腫瘍内のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドのキナーゼ活性を阻害する作用に基づくことが確認された。【０１１３】
［実施例１５］膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１の単離
膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨより購入）より精製したＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ  （ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号１１で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｆ及び配列番号１２で示されるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、６０℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１３で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＢａｍＨＩ＿Ｆ及び配列番号１４で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒのプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃３分３０秒を２５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動した結果、約２．９ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングし、インサートをダイデオキシシーケンス法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）により配列を決定した結果、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳの５'末端からエキソン１８の３'末端までが、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のＣＤＳのエキソン１１の５’末端からＣＤＳの３'末端までと融合している転写産物（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１）（配列番号１）と同一であることが明らかになった。【０１１４】
[実施例１６] 膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２に対するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤の足場非依存的細胞増殖阻害作用
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＲＴ−１１２細胞を、１ウェル当り２×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で播種した。また、ポジティブコントロール用に培地のみ添加したウェルを調製した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて一晩培養後、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８を最終濃度１００ｎＭでそれぞれ添加した。ネガティブコントロールとして化合物の溶媒であるＤＭＳＯを化合物添加時と同濃度（０．１％）になるように添加した。その後、５％ＣＯ2存在下、３７℃で５日間培養し、細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し２０分撹拌した後、発光測定装置を用いて測定した。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの値をそれぞれ１００％阻害値、０％阻害値として各化合物の増殖阻害％を算出した。その結果、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８の阻害％はそれぞれ８０％、９０％、９０％であった。【０１１５】
［実施例１７］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの検出
細胞中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドを検出する方法を以下の通り構築した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びネガティブコントロールとしてＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養した。ＰＢＳにて１回洗浄後、細胞を溶解液（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ社）にて氷上で１０分溶解させた。遠心後得られた上清に対して抗ＦＧＦＲ３抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を添加し４℃にて一晩反応させた。その後、プロテインＧビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を添加し４時間免疫沈降を行った。遠心後に沈降物を洗浄液（組成は上述の溶解液と同様）にて４回洗浄し、ＳＤＳ溶液添加後５分間煮沸させ沈殿物を懸濁した。遠心後この上清に対して抗ＴＡＣＣ３抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたイムノブロッティングを行った。結果、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫沈降物では、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ１が検出されたが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では検出されなかった。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対しても同様に検討した結果、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫沈降物において、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ３がそれぞれ検出された。また、ＲＴ−１１２細胞に対しても同様の方法で検討した結果、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドｖ１が検出された。
以上の結果から、抗ＦＧＦＲ３抗体及び抗ＴＡＣＣ３抗体を組み合わせて用いることで、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドを発現している癌細胞や癌組織中の本発明のポリペプチドの存在を検出することが可能となり、本発明のポリペプチド陽性癌患者を判定することが可能であることが明らかとなった。【０１１６】
［実施例１８］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法による検出
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞又はＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を４週齡雄ヌードマウス（ＣＡｎＮ・Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ/ＣｒｌＣｒｌｊ（ｎｕ/ｎｕ）、日本チャ−ルスリバー）の皮下に３×１０6個にて移植し、１５日後、細胞塊の増殖を確認し担癌マウスを作製した。
作製した担癌マウスから、増殖した癌細胞を含む組織を切り出し、生理食塩水で洗浄後、１０％中性緩衝ホルマリン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）で室温で４８〜１４４時間固定し、自動包埋装置（ティッシューテックＶIＰ、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて定法に従い脱水したのち、パラフィン（ティッシュプレップ、株式会社ファルマ）に包埋した。パラフィン包埋後の組織サンプルを厚さ５μｍで切り出しＦＦＰＥ切片とした。
準備したＦＦＰＥ切片をヒートブロック（ＭＧ−２２００；東京理化器械株式会社）上で６０℃、１５分間加熱したのち、１０％ホルマリン（和光純薬工業株式会社）で室温、３０分間固定した。ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３回洗浄、完全に乾燥し、キシレン（和光純薬工業株式会社）で室温、１０分間処理した。次に、ＦＦＰＥ切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で１００℃、１０分間煮沸した。さらに、精製水で２回、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）でインキュベータ（ＨｙｂＥＺ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）内で４０℃、２０分間処理した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルマリン（和光純薬工業株式会社）で室温、５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＦＧＦＲ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００１４２.３）の塩基配列のうち、全てのバリアントに共通する塩基番号２８５１〜４２８１に特異的なｂｒａｎｃｅｄＤＮＡプローブ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｔｙｐｅ４；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、及びＴＡＣＣ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４２．１）の塩基配列のうち塩基番号２２００〜２８３８に特異的なｂｒａｎｃｅｄＤＮＡプローブ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｔｙｐｅ１；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を、Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で４０倍希釈し、Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。本溶液をＦＦＰＥ切片に添加し、インキュベータ内で４０℃、２時間反応させ、ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）にハイブリダイゼーションさせた。その後、ＦＦＰＥ切片をＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で３回洗浄し、ＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）でインキュベータ内で４０℃、２５分間反応させた。さらに、ＦＦＰＥ切片をＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）でインキュベータ内で４０℃、１５分間反応させた。Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を２５分の１容量含むＬａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＱＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）でインキュベータ内で４０℃、３０分間反応させた。次に、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで２回、ＰＢＳで１回洗浄し、蛍光色素ＤＡＰＩ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を含むＰＢＳで室温、１５分間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄したあと、封入剤ＥｃｏＭｏｕｎｔ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社）で封入し、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）で蛍光観察した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＦＦＰＥ切片のいずれにおいてもＦＧＦＲ３のシグナル及びＴＡＣＣ３のシグナルが検出され、さらにＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルのほとんどが共局在した。これによりＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子を強制的に発現させた細胞を含むＦＦＰＥ切片では、ＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルが共局在することが示された。【０１１７】
［実施例１９］ＲＴ−１１２細胞におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＩＳＨ法による検出
実施例１８と同様の手順でヒト膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２細胞及びヒト胃癌患者由来細胞株ＨＳＣ−３９細胞のＦＦＰＥ標本を作製し、ＩＳＨ法によるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）の検出を行った。実施例１８のヒートブロックによる処理以降の方法で処理し、封入後の標本を蛍光観察した。取得した画像をＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で解析したところ、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を発現するＲＴ−１１２細胞（実施例１５）のＦＦＰＥ切片では共局在するＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルが多数検出されたのに対し、実施例番号２３記載のＲＴ−ＰＣＲによってＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）を発現しないことを確認しているＨＳＣ−３９細胞のＦＦＰＥ切片では共局在するＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルはほとんど検出されなかった。これにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子を内在的に発現する細胞を含むＦＦＰＥ切片においてＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルが共局在し、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子を発現しない細胞では共局在しないことから、このような共局在シグナルを測定することにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子の有無を判定できることが示された。【０１１８】
［実施例２０］膀胱癌患者由来ＦＦＰＥ切片におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＩＳＨ法による検出
米国アステランド社から購入した膀胱癌患者由来組織のＦＦＰＥ切片を、実施例１８のヒートブロックによる処理以降の方法で処理し、封入後の切片を蛍光観察した。取得した画像をＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で解析したところ、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）を発現しないことを実施例２３記載のＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片と比較して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２を発現することを実施例２３記載のＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片では、共局在するＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルの数が明らかに多かった。
英国ティッシュソリューションズ社から購入した複数の膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片についても同様の方法にて、ＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルの共局在を調べた。その結果、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）を発現しないことを実施例２３記載のＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片と比較して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）を発現することを前述の実施例記載のＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片では、共局在するＦＧＦＲ３のシグナルとＴＡＣＣ３のシグナルの数が明らかに多かった。
これにより、膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片においても、共局在するシグナルを観察することにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子の有無を判定できることが示された。【０１１９】
［実施例２１］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する化合物の阻害作用
（１）ＦＬＡＧタグ融合発現プラスミド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋））の構築
５’末端にＦＬＡＧタグを融合させたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリヌクレオチドを取得するために、実施例１、２及び３でクローニングしたベクターを鋳型として用いて、５’末端にＦＬＡＧタグを付加させるＰＣＲを実施した。配列番号２１で示されるＦＧＦＲ３＿Ｎ＿ＦＬＡＧ＿ＢａｍＨＩ及び配列番号１４で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｒのプライマー及びＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃３分３０秒を１２サイクル）を行った。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）へクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、ＰＣＲ産物は配列番号１、配列番号３及び配列番号５に記載されている配列のうち、ファーストメチオニンをコードする３塩基（ＡＴＧ）が削除され、開始コドンとＦＬＡＧタグをコードする核酸配列（配列番号２２）が５’末端に付加された核酸配列であることを確認した。これらによりコードされるポリペプチドを、それぞれＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドと称し、これらを総称してＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドと称する。また、これらのＦＬＡＧ配列を付加したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）のＯＲＦ全長を蛋白質として発現する発現ベクター構築のため、上記クローニングベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトにクローニングし発現プラスミド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋））を構築した。【０１２０】
（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドの取得
トランスフェクション実施前日に、コラーゲンコートされた１５ｃｍディッシュ１枚あたり０．５×１０7個のＨＥＫ２９３細胞を１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１０枚培養した。トランスフェクション当日に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）をそれぞれディッシュ１枚あたり２７μｇ、トランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社）を８１μＬ用いて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション２４時間後に培地を取り除きＰＢＳにて３回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳを加えセルスクレイパー（コーニング社）により細胞を剥がした後、ポリプロピレン製チューブに回収した。１２００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を取り除き１５０μＬの細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルｃｏｍｐｌｅｔｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社））を加え氷上にて３０分間インキュベーションし細胞を溶解させた。遠心後得られた上清中に存在するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドをそれぞれＭ２抗体アフィニティゲル（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて製品情報に記載された方法に従って精製した。洗浄及び溶出は洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルｃｏｍｐｌｅｔｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社））、溶出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍＬ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ）をそれぞれ使用し、１００μＬの溶出液を得た。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドが得られたことを溶出液に対して抗ＦＧＦＲ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いたイムノブロッティングならびに銀染色を行い、確認した。【０１２１】
（３）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性の検出
上記で精製したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性をキナーゼ活性検出キット（ＨＴＲＦ ＫｉｎＥＡＳＥ−ＴＫ；Ｃｉｓｂｉｏ社）を用いて検討した。３８４ウェルのＬｏｗ−ｖｏｌｕｍｅ  Ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ（コーニング社）を用い、上記溶出液の１倍希釈溶液、３倍希釈溶液又は１０倍希釈溶液の各１μLを酵素源として、キット同封の５×Ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒにＤＴＴ及びＭｇ2+をそれぞれ最終濃度１ｍＭ及び５ｍＭとなるように添加し反応溶液とした。基質として、キット同封のＴＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを最終濃度が２．０μＭとなるように、ＡＴＰ未添加及びＡＴＰの最終濃度が１００μＭとなるように添加し、最終容量５．０μＬとしてそれぞれ室温にて１時間反応させた。反応後、キット推奨の方法に従いＳａ−ＸＬ６６５及びＴＫ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｅｕ（Ｋ）溶液を調製し、それぞれ２．５μＬ添加し、室温にて１時間反応後、ＨＴＲＦのカウント（すなわちペプチド基質のリン酸化）を検出した。その結果、ＡＴＰ未添加に対しＡＴＰ添加では、ＨＴＲＦのカウントが、上記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド又はＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドを含む各溶出液１倍希釈溶液１μＬを添加した時は、それぞれ約３８倍、約４０倍及び約３８倍増加、上記溶出液３倍希釈溶液１μＬを添加した時は、それぞれ約２７倍、３４倍、３１倍、上記溶出液１０倍希釈溶液１μＬを添加した時は、それぞれ５倍、１８倍、１１倍に増加していることが明らかとなった。
以上のように、キナーゼ活性検出キットを用いることにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性を検出することが可能であった。【０１２２】
（４）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する化合物の阻害作用
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８及びＬＹ２８７４４５５の阻害作用を上記キナーゼ活性検出キット及び同様の３８４ウェルプレートを用いて検討した。１．０μＬの各化合物溶液を、ＤＭＳＯの最終濃度が０．１％、化合物の最終濃度がＤｏｖｉｔｉｎｉｂは１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、ＡＺＤ４５４７及びＢＧＪ３９８はそれぞれ１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、ＬＹ２８７４４５５は１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭになるように添加し、又はコントロールとしてＤＭＳＯを０．１％となるように添加して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドについては上記溶出液２倍希釈溶液１μＬ、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドについては上記溶出液３倍希釈溶液１μＬ、及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドについては上記溶出液３倍希釈溶液１μＬを添加した。ついで、基質として、キット同封のＴＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを最終濃度が２．０μＭとなるように添加し、室温にて１５分間反応させた。次に、ＡＴＰ未添加及びＡＴＰの最終濃度が１００μＭとなるように添加し、、最終容量５．０μＬとしてそれぞれ室温にて一時間反応させた。その他は、上述の（３）の方法と同様に調製したＳａ−ＸＬ６６５及びＴＫ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｅｕ（Ｋ）溶液をそれぞれ２．５μＬ添加し、室温にて１時間反応後、ＨＴＲＦのカウントを検出した。化合物非存在下（ＤＭＳＯを化合物添加時と同濃度である０．１％）でのＡＴＰ未添加及び添加時のリン酸化のカウントをそれぞれ１００％阻害、０％阻害として、化合物によるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのキナーゼ活性の阻害％を以下の式より算出した。
［化合物によるキナーゼ活性阻害（％）］＝（１−［化合物添加ＡＴＰ添加時のリン酸化のカウント−化合物未添加ＡＴＰ未添加時のリン酸化のカウント］／［化合物未添加ＡＴＰ添加時のリン酸化のカウント−化合物未添加ＡＴＰ未添加時のリン酸化のカウント］）×１００    
その結果、精製ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性を化合物Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８及びＬＹ２８７４４５５が阻害すること見出した。各化合物の各々の最終濃度でのペプチド基質に対する阻害割合（％）を表１に示す。【０１２３】
【表１】
2013133351.tif 000002
【０１２４】
［実施例２２］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＬＹ２８７４４５５化合物の足場非依存的細胞増殖阻害作用
ＬＹ２８７４４５５化合物の最終濃度が１０ｎＭとなるようにした以外は、実施例９と同様の方法を用いてＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞増殖阻害作用の評価を行った。その結果、ＬＹ２８７４４５５の阻害％はそれぞれ８８％、９０％、８９％であった。
以上の結果は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３を発現する癌細胞や腫瘍の増殖をＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチド阻害剤であるＬＹ２８７４４５５が阻害できることを示している。【０１２５】
［実施例２３］ヒト浸潤性膀胱癌検体からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂの単離
ヒト浸潤性膀胱癌検体（英国ティッシュソリューション社）に対して、逆転写酵素キット（スーパースクリプIIIファーストストランドシンセテーススーパーミックス；ライフテクノロジーズ社）のプロトコールにしたがい、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、ＦＧＦＲ３＿Ｆ００２プライマー（配列番号２３）及びＴＡＣＣ３＿Ｒ００２プライマー（配列番号２４）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ；タカラバイオ式会社）を用いてＰＣＲ（９４℃２分の後、９８℃１０秒、６８℃３．５分を４０サイクル）を行った。
これらのプライマーはそれぞれＦＧＦＲ３遺伝子の５’ＵＴＲおよびＴＡＣＣ３の３’ＵＴＲに該当するので、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合遺伝子が存在すれば、バリアントを問わず全ての融合遺伝子を検出することができる。
得られたＰＣＲ産物をクローニングベクター（Ｚｅｒｏ  ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングし、インサートをダイデオキシシーケンス法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）により配列を決定した。その結果、ＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のＣＤＳの５’からエキソン１８の途中まで（２５７番目から２４９８番目）が、ＴＡＣＣ３遺伝子（ＮＭ＿００６３４２．１）のＣＤＳのエキソン７の途中（１７７１番目から２６７２番目）と融合している転写産物（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ）と一塩基を除いて同一であることが明らかになった（配列番号２５）。その一塩基はＮＣＢＩに登録されているＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）の１９８０番目にあり、登録ではＣであるが決定した配列はＧであった。また、同時に、ＦＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）のエキソン４の３’側の配列（６９０番目から７０１番目）が欠失し、また、エキソン１０とエキソン１１の間にＣＡＧ配列が挿入された配列を持つ転写産物（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ）（配列番号２７）も存在することが明らかとなった。配列番号２５によりコードされるポリペプチドを配列番号２６に、配列番号２７によりコードされるポリペプチドを配列番号２８に示す。【０１２６】
［実施例２４］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂのレトロウイルス溶液の作製
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂのＯＲＦ全長を蛋白質として発現するため、レトロウイルス溶液作製用発現プラスミドを以下の通り構築した。実施例２３で作製した、クローニングしたベクターをそれぞれ鋳型として用いて、配列番号７で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＢａｍＨＩ＿Ｆ及び配列番号８で示されるＦＧＦＲ３＿ＴＡＣＣ３＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｆのプライマー、並びにＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃３分３０秒を１５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、それぞれ目的サイズののＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、ＰＣＲ産物は、それぞれ、配列番号２５又は配列番号２７を含むことを確認した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂのＯＲＦ全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトにクローニングし発現プラスミド（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）を構築した。
これらの構築ベクターを用いて実施例７の方法に従いレトロウイルス溶液を作製した。【０１２７】
［実施例２５］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ及び及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂの足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例２４においてＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ／ｐＭＸs−ｐｕｒｏ及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作製したウイルス溶液を用いて、実施例８の方法に従いＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ及び及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂを安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を取得した。（それぞれＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と命名した。）
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、実施例８と同様の方法で検討した。Ｍｏｃｋ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２．６倍の細胞数のカウントの増加が確認された。また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２．７倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ａ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ５ｂ発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖亢進作用を示すことが明らかとなった。【０１２８】
［実施例２６］  ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞のホルマリン固定標本におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの免疫染色法による検出
（１）サンプル調製
実施例８で作製されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞をカバーグラス上で一晩培養した。翌日培養液を除いた後、３．７％ホルムアルデヒドで室温１０分間反応させて細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライ社）にて室温１０分間反応させた後、０．５％ＳＤＳにて室温２５分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｏｌｉｎｋ社）でブロッキングした。
（２）目的融合ポリペプチドの検出
上記（１）で調製したサンプルを、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ（東洋紡株式会社）で希釈したＦＧＦＲ３抗体（宿主：マウス  Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）とＴＡＣＣ３抗体（宿主：ヤギ  Ｒ＆Ｄ社）で、４℃、一晩インキュベートした。
翌日Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（Ｏｌｉｎｋ社）で洗浄後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡで希釈をしたＤｕｏｌｉｎｋ  ＩｎＳｉｔｕ  ＰＬＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＭＩＮＵＳとＤｕｏｌｉｎｋ  ＩｎＳｉｔｕ  ＰＬＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＰＬＵＳ（いずれもＯｌｉｎｋ社）でカバーグラスを室温、１時間浸した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した後、Ｄｕｏｌｉｎｋ  ＩＩ試薬キットのＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｌｉｇａｓｅ溶液（Ｏｌｉｎｋ社）に浸し、３７℃、３０分間インキュベートした。この工程により十分近接した位置にある２種類のＩｎＳｉｔｕ  ＰＬＡ  ｐｒｏｂｅ抗体の間に環状オリゴヌクレオチドが形成される。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した後、同キットのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ溶液（Ｏｌｉｎｋ社）を添加し、３７℃で１００分間インキュベートした。この工程により環状オリゴヌクレオチドを鋳型として核酸が伸長し、且つその伸長した核酸に蛍光標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（Ｏｌｉｎｋ社）で２回、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂを水で１００倍希釈した溶液で１回洗浄した後、Ｄｕｏｌｉｎｋ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｏｌｉｎｋ社）で封入し、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて蛍光観察した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞では多数の蛍光ドットが存在する細胞が観察されるのに対して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においては蛍光ドットはほとんど観察されなかった。この蛍光ドットは環状オリゴヌクレオチドを鋳型として伸長した核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドに由来し、２種類の抗原すなわちＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３が十分近接した状態すなわち同一分子内に存在していることに由来する。従って本実施例の方法で、蛍光ドットの有無を観察することによって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの存在の有無が判定（検出）できることが示された。【０１２９】
［実施例２７］  ＲＴ−１１２細胞におけるのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの免疫染色法による検出
（１）サンプル調製
実施例１９で作製した、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を発現するＲＴ−１１２細胞と発現しないＨＳＣ−３９細胞のＦＦＰＥ標本をキシレンとエタノールにそれぞれ３回、各８分間浸すことでパラフィンを除き、イムノセーバー（日新ＥＭ株式会社）に浸して煮沸した。ＰＢＳで切片を洗浄した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温１０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ（Ｄａｋｏ社）でブロッキングした。
（２）目的融合ポリぺプチドの検出
実施例２６（２）と同様の手順で免疫染色法による検出を行い、蛍光観察した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を発現するＲＴ−１１２細胞では多数の蛍光ドットが観測されたのに対して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を発現していないＨＳＧ−３９細胞でにはそのような蛍光ドットはほとんど観測されなかった。これにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合遺伝子を内在的に発現する細胞を含むＦＦＰＥ切片において蛍光ドットを観察することにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの存在の有無を判定（検出）できることが示された。【０１３０】
［実施例２８］  膀胱癌患者由来ＦＦＰＥ切片におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの免疫染色による検出
（１）サンプル調製
英国ティッシュソリューションズ社から購入した膀胱肺癌臨床検体のＦＦＰＥ切片をキシレンとエタノールにそれぞれ３回、各８分間浸すことでパラフィンを除き、イムノセーバー（日新ＥＭ株式会社）に浸して煮沸した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水でＦＦＰＥ切片を洗浄した後、３％過酸化水素水で３０分室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温１０分間反応させた後、０．５％ＳＤＳ溶液で２０分反応させた。ＰＢＳで洗浄後Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ（Ｄａｋｏ社）でブロッキングした。
（２）目的融合ポリペプチドの検出
Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ（東洋紡）で希釈したＦＧＦＲ３抗体（宿主：マウス  Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）とＴＡＣＣ３抗体（宿主：ヤギ  Ｒ＆Ｄ社）でＦＦＰＥ切片を４℃一晩インキュベートした。
翌日のＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（Ｏｌｉｎｋ社）で洗浄後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  ＳｏｌｕｔｉｏｎＡで希釈をしたＤｕｏｌｉｎｋ  ＩｎＳｉｔｕ  ＰＬＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＭＩＮＵＳとＤｕｏｌｉｎｋ  ＩｎＳｉｔｕ  ＰＬＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＰＬＵＳ（いずれもＯｌｉｎｋ社）でＦＦＰＥ切片を室温で１時間浸した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した後、Ｄｕｏｌｉｎｋ  ＩＩ  Ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ試薬キットのＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｌｉｇａｓｅ溶液（Ｏｌｉｎｋ社）に浸し、３７℃で３０分間インキュベートした。この工程で実施例２６、２７と同様に環状オリゴヌクレオチドが形成される。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄後、同キットのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ溶液（Ｏｌｉｎｋ社）で３７℃で１２０分間インキュベートした。この工程により環状オリゴヌクレオチドを鋳型として核酸が伸長する。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄後同キットのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに浸して室温で１時間浸した。この工程により、先の工程で伸長した核酸にＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄後、同キットのＳｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、室温で１０分から１５分反応させた。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄した後、同キットのＮｕｃｌｅａｒ  ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、室温で２分反応させた後、水道水で洗浄した。その後エタノールとキシレンを用いて脱水と透徹をした後、封入した。
顕微鏡（ＢＺ−９０００；ＫＥＹＥＮＣＥ社）で明視野観察すると、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１を発現することが実施例２３の方法で確認されている膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片では赤い染色が観察されているのに対して、実施例２３の方法でＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３との融合遺伝子の発現が確認されていない患者組織由来切片では赤い染色が観察されなかった。この赤い染色は環状オリゴヌクレオチドを鋳型として伸長した核酸にハイブリダイズしたＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドに由来し、実施例２６及び２７と同様にＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３が同一分子内に存在していることに由来する。従って赤い染色が観察された切片においてＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３が融合した状態で存在することが示された。これにより、本実施例の方法で、膀胱癌患者組織由来ＦＦＰＥ切片においても、赤い染色を観察することにより、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合ポリペプチドの存在の有無を判定（検出）できることが示された。【０１３１】
［実施例２９］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの阻害作用
実施例２１（４）の方法に従い、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのインビトロキナーゼ活性に対する阻害作用を検討した。ただし、各化合物の最終濃度は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭとなるように添加した。
その結果、精製ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチド及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３（Ｎ−ＦＬＡＧ）融合ポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性を化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥが阻害すること見出した。各化合物の各々の最終濃度でのペプチド基質に対する阻害割合（％）を表２に示す。【０１３２】
【表２】
2013133351.tif 000003
【０１３３】
［実施例３０］ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及び膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２に対する化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの足場非依存的細胞増殖阻害作用
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞については、実施例９と同様の培地を用いて、膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２については、1ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛胎児血清及び２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で播種した。また、各化合物の最終濃度は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭとなるように添加した。そのほかの条件は実施例９と同様の方法を用いて、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及び膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２の増殖阻害作用の評価を行った。その結果、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及び膀胱癌患者由来細胞株ＲＴ−１１２の足場非依存的増殖亢進作用を阻害することを見出した。各化合物の各々の最終濃度での細胞増殖に対する阻害割合（％）を表３に示す。
以上の結果により、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ１、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ２及びＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３＿ｖ３を発現する癌細胞や腫瘍の増殖が、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦにより阻害できることが明らかとなった。【０１３４】
【表３】
2013133351.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌患者の判定に使用できる。また、本発明の検出用キット、プライマーセット及びプローブセットは、前記検出方法に用いることができる。また、本発明のポリペプチドを阻害する物質は、ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子との融合遺伝子陽性又は本発明のポリペプチド陽性の癌（特に肺癌又は膀胱癌）の治療用医薬組成物として使用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１３、１４、及び２１で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列表の配列番号２２で表される各塩基配列は、人工的に合成したＦＬＡＧタグ配列である。
【配列表】
2013133351000001.app
【国際調査報告】
2013133351.tif 000005
2013133351.tif 000006
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