(57)【要約】  低値領域において反応性が高く、かつ、ＭＭＰ−１０等の他のＭＭＰファミリーとの交差反応性が認められない、ＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体を用いた、迅速な測定が可能であり検体処理能力が高いＬＴＩＡ法に基づくＭＭＰ−３の検出方法を提供することを課題とし、モノクローナル抗体１４Ｂ１が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体３Ｄ３が担持されたラテックス粒子、を血液検体と接触させることによる抗原抗体反応による凝集をシグナルとして、当該血液検体におけるヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−３を検出するラテックス凝集法による検出方法、並びに、当該検出方法を行うための検出試薬と検出キットを提供することにより、上記の課題を解決することを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体１４Ｂ１が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体３Ｄ３が担持されたラテックス粒子、を血液検体と接触させることによる抗原抗体反応による凝集をシグナルとして、当該血液検体におけるヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−３を検出する、ラテックス凝集法による検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のラテックス凝集法による検出方法を行うための、検出試薬。
【請求項３】
請求項１に記載のラテックス凝集法による検出方法を行うための、検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の生体物質の検出方法に関する発明であり、さらに具体的にはラテックス凝集法によるマトリックスメタロプロテイナーゼ−３の検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−３は、軟骨細胞や滑膜細胞で産生される蛋白質分解酵素であり、関節滑膜増殖時に増加し、プロテオグリカン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリックスの分解作用を有している。よって、血中のＭＭＰ−３濃度は、関節リウマチに認められる関節破壊を反映し関節炎活動性の指標として有用である。現在市販されているＭＭＰ−３測定用試薬には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いた試薬、及び、ラテックス凝集法（ＬＴＩＡ法）を用いた試薬がある。【０００３】
また、ＭＭＰ−３の検出法に関する既存特許関連文献としては、国際公開パンフレット（ＷＯ２０１０／０９００７９）（特許文献１）、特開平４−２３７４９９号公報（特許文献２）、特開平１１−３１８４４９号公報（特許文献３）が挙げられる。また、非特許文献としては、PRESKY,DH.,et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,1993,vol.193,No.1,pp.364-370（非特許文献１）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／０９００７９パンフレット
【特許文献２】特開平４−２３７４９９号公報
【特許文献３】特開平１１−３１８４４９号公報
【特許文献４】特開昭６３−６５３６９号公報
【特許文献５】特開昭５３−２４０１５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】PRESKY,DH.,et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,1993, vol.193,No.1,pp.364-370
【非特許文献２】「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック、安藤民衛、千葉丈  著）、１９９３年８月２０日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように血中ＭＭＰ−３の検出は既に行われているが、上記した既存の測定試薬にも実用上の課題が存在する。すなわち、ＥＬＩＳＡ法を用いた試薬では検体処理能力（迅速性）に問題があり、ラテックス凝集法（ＬＴＩＡ法を）用いた試薬では迅速性は認められるものの、低値領域においてＥＬＩＳＡ法との測定値が解離する現象が認められる。【０００７】
本発明は、血中ＭＭＰ−３をラテックス凝集法に基づいて測定する際に、低値領域における測定値の解離が起こらないモノクローナル抗体を見出し、これを用いたラテックス凝集法による血中ＭＭＰ−３の検出手段を提供することを課題とする。【０００８】
上記の課題を解決し得るモノクローナル抗体は、一般的には低値領域において反応性が高く、かつ、ＭＭＰ−１０等の他のＭＭＰファミリーとの交差反応性が認められないＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体の中に認められると考えられるが、具体的な予測を立てることは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題の解決を目指した本発明者は、遂に、モノクローナル抗体１４Ｂ１が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体３Ｄ３が担持されたラテックス粒子、を血液検体と接触させることにより、血液検体中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−３との抗原抗体反応による凝集をシグナルとして、当該血液検体におけるヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−３を定量的に検出する、ラテックス凝集法による検出方法（以下、本発明の検出方法ともいう）により、上記の課題を解決し得ることを見出した。【００１０】
上記の２種のモノクローナル抗体は常法、例えば、非特許文献２の「単クローン抗体実験操作入門」に基づいて製造した。【００１１】
また、本発明の検出方法において行われる、ラテックス凝集法（ＬＴＩＡ法）は、典型的には上記の特許文献４，５の開示に基づき行うことができる。【００１２】
すなわち、上記の２種のモノクローナル抗体を個別にコーティングしたラテックス粒子を血液検体と共存させ、当該検体におけるヒトＭＭＰ−３とこれらのラテックス粒子上のモノクローナル抗体との結合による、当該ラテックス粒子の凝集を検出するＬＴＩＡ法を行うことにより、当該検体中のヒトＭＭＰ−３を定量することができる。【００１３】
第２に本発明は、上記の検出方法を行うための検出試薬と検出キットを提供する。当該検出試薬及び検出キットには、少なくとも「モノクローナル抗体１４Ｂ１が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体３Ｄ３が担持されたラテックス粒子」が含有される。また、必要に応じて希釈液、洗浄液等を含有させることも可能である。【００１４】
後述するように、これらの２種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、モノクローナル抗体３Ｄ３については「Mouse-Mouse hybridoma 3D3（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２３）」として、モノクローナル抗体１４Ｂ１については「Mouse-Mouse hybridoma 14B1（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２５）」として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにて寄託されている。【００１５】
本発明において「血液検体」とは、血清、血漿、全血等としての検体を意味するものであり、特に血清検体又は血漿検体が好適であり、血清検体がさらに好適である。【００１６】
なお、本明細書において「マトリックスメタロプロテイナーゼ」又は「ＭＭＰ」とは、特に断らない限り、「ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ」又は「ヒトＭＭＰ」を意味するものとする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、低値領域において反応性が維持されていて、かつ、ＭＭＰ−１０等の他のＭＭＰファミリーや、類似蛋白質との交差反応性が認められない、ＭＭＰ−３に対する２種のモノクローナル抗体、「モノクローナル抗体１４Ｂ１」、及び、「モノクローナル抗体３Ｄ３」を用いた、迅速な測定が可能であり検体処理能力が高いＬＴＩＡ法に基づくＭＭＰ−３の検出方法、及び、当該検出方法を行うための検出試薬と検出キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の検出方法による同時再現性と日差再現性を示した図面である。
【図２】本発明の検出方法における検出限界と希釈直線性による測定範囲を示した図面である。
【図３】本発明の検出方法におけるプロゾーンを示した図面である。
【図４】本発明の検出方法における共存物質の影響を示した図面である。
【図５】本発明の検出方法とＥＬＩＳＡ法を用いた市販検出試薬との相関性を示した図面である。
【図６】ＬＴＩＡ法を用いた市販検出試薬においてマイナス値が得られた血液検体に対し、本発明の検出方法について検討した結果を示す図面である。
【図７】ＬＴＩＡ法を用いた市販検出試薬においてプラス値が得られた血液検体に対し、本発明の検出方法との相関性について検討した結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、上記の非特許文献２に記載された方法に従って、組換え蛋白質を用いた免疫によりハイブリドーマを調製することで製造した。
【００２０】
（１）モノクローナル抗体産生クローンの一次選抜
上記により得られたハイブリドーマは、下記（ｉ）〜（iv）の過程を経て一次選択が行われた。その結果、３２クローンに絞り込まれた。
【００２１】
（ｉ）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
それぞれのマウス由来のハイブリドーマを含む９６穴プレートのウェルから、rMMP3固相ELISAに強く反応する上位のウェルを選択した。すなわち、各免疫方法を施したマウスの中で上位のもの、また培養スケールアップ後でも陽性を維持したウェル等の、計５６ウェルをクローニングした。
【００２２】
（ii）限界希釈法によるクローン化
上記において選択された５６ウェルにおける細胞に対して、限界希釈法によるクローン化を行ったところ、３４クローンが樹立できた。
【００２３】
(iii) 抗体のサブクラスタイピング
得られたモノクローナル抗体サブクラスは、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット（ISO-STRIP Mouse IgG Isotyping kit , 1-493-027, Boehringer mannheim)を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。
【００２４】
上記の限界希釈法によりクローン化された３４クローンの抗体サブクラスは、IgG 1kが17クローン、IgG 2akが5クローン、IgG 2bkが10クローン、IgMkが2クローンであった。
【００２５】
(iv)選択
抗体サブクラスIgMは抗体精製方法等が煩雑なため、IgMクラスの上記２クローンは以降の検討から除いた。
【００２６】
（２）モノクローナル抗体クローンの二次選抜
上記のようにして選択された３２クローンそれぞれを、プリスタンを投与したＢＡＬＢｃマウス（雄・８週齢）の腹腔に注射し、１週間前後及びそれ以降に腹水を取り出し、硫安沈殿法、及びProtein A Sepharoseを用いて精製を行って、それぞれのクローンに対応するモノクローナル抗体を得た。それぞれのモノクローナル抗体について、ヒトＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１０に対する反応性を、それぞれの蛋白質を結合させたプレートを用いたＥＩＡ法にて検討した。
【００２７】
次に、ここで絞り込まれた１９種のモノクローナル抗体を、市販の体外診断薬用ラテックス粒子に接触固定させて、ラテックス製品とした場合の性能を検討し、さらなるモノクローナル抗体の絞り込みを行った。すなわち、非特異的なラテックス凝集反応が認められない（単一のモノクローナル抗体では抗原と反応しない）ことを条件としたスクリーニングを行った結果、１２種のモノクローナル抗体が当該条件を満足した。次に、これらの１２クローンについて２種のモノクローナル抗体を組み合わせた６６通りの組を検討し、ＭＭＰ−３に対して特異的なラテックス凝集反応が得られた１９通りの組を候補とした。これらの１９通りのモノクローナル抗体の組について、ラテックス凝集製品として製剤化する場合に適した抗体のサブクラスであるIgG1タイプであり、かつ盲検とした生理食塩水を測定した際に明らかな非特異的凝集反応を示さず、ＭＭＰ−３を測定した際に十分な特異的凝集反応を示した組み合わせを選別した。最後に慢性関節リウマチ患者の血清との特異的反応性を精査した結果、モノクローナル抗体名「１４Ｂ１」、「３Ｄ３」、及び、「８Ａ６」の組み合わせを最終的に選択した。
【００２８】
（３）モノクローナル抗体のキャラクタライズ
上記のごとく確定したモノクローナル抗体のキャラクタライズを行った。
（ｉ）サブクラス
１４Ｂ１抗体：ＩｇＧ１／κ  
３Ｄ３抗体：ＩｇＧ１／κ      
８Ａ６抗体：ＩｇＧ１／κ
（ii）解離定数（Ｍ）
１４Ｂ１抗体：５．３４×１０−１０ 
３Ｄ３抗体：１．９１×１０−９
８Ａ６抗体：２．２０×１０−９
（iii）結合定数（１／Ｍｓ）
１４Ｂ１抗体：２．４５×１０５ 
３Ｄ３抗体：２．０９×１０５
８Ａ６抗体：３．２０×１０５ 
（iv）特異反応性
上述のＥＩＡ法による検討の結果、３つのモノクローナル抗体共に、ＭＭＰ−３に対しては反応するが、ＭＭＰ−１０に対する交差反応性は実質的に認められないことが確認された。
【００２９】
（４）ハイブリドーマの寄託
これらの３種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、モノクローナル抗体３Ｄ３については「Mouse-Mouse hybridoma 3D3（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２３）」として、モノクローナル抗体１４Ｂ１については「Mouse-Mouse hybridoma 14B1（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２５）」として、モノクローナル抗体８Ａ６については「Mouse-Mouse hybridoma 8A6（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２２４）」として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにて寄託されている。
【００３０】
２．本発明の検出方法
上記のモノクローナル抗体「１４Ｂ１」をコーティングしたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体「３Ｄ３」をコーティングしたラテックス粒子を用いた、ＭＭＰ−３検出系（本品ともいう）の評価を行った。さらに併せて上記のモノクローナル抗体「８Ａ６」を用いた試験を行い、モノクローナル抗体「１４Ｂ１」と「３Ｄ３」に係わる本発明の検出方法の独立した優位性を検証した。
【００３１】
さらなる比較用の試薬としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）による市販のＭＭＰ−３検出試薬（パナクリアＭＭＰ−３「プレート」第一ファインケミカル製：既承認製品Ａともいう）、及び、ＬＴＩＡ法による市販のＭＭＰ−３検出試薬（パナクリアＭＭＰ−３「ラテックス」第一ファインケミカル製：既承認製品Ｂともいう）を用いた。検体は、血清検体を用いた。
【００３２】
機器は下記のものを用いた。
７１７０Ｓ型自動分析装置（日立社製）（LTIA試薬の測定に使用した装置）
ＪＣＡ−ＢＭ８０６０自動分析装置（日本電子社製）（LTIA試薬の測定に使用した装置）
ＡｃｃｕＦＬＥＸ  ＥＬ４０００（アロカ社製）（ELISA試薬の測定に使用した装置）
【００３３】
（１）再現性試験
本発明の検出系を用いて、同時再現性と日差再現性についての試験を行った。その結果を図１に示す。図１において左表は同時再現性の結果を示しており、右グラフは日差再現性を示している。具体的には、２種類の濃度の試料を用いて、同時再現性は各１０回測定、日差再現性は各５回、５日間測定した。
【００３４】
図１に示されるように、同時再現性試験においても、日差再現性試験においても、変動係数ＣＶ（％）は３％以内であり、本発明の検出系の再現性は良好であった。
【００３５】
（２）測定範囲の検討
図２は、本発明の検出系における検出限界（左グラフ）と希釈直線性（右グラフ）による測定範囲を示した図面である。
【００３６】
具体的には、検出限界に関しては、試料を生理食塩水にて１０段階希釈し、各１０回測定した。そして平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出し、±２ＳＤ法により検出限界を求めた。希釈直線性に関しては、約１３００ng/mlの高値試料を生理食塩水にて１０段階希釈して試料を調製し、測定した。
【００３７】
図２に示されるように、本発明の検出系のＭＭＰ−３に対する検出限界は８．９ng/ml（左グラフ）であり、上限は１２００ng/mlであることが明らかになった。
【００３８】
（３）プロゾーンの確認
図３は、本発明の検出系におけるプロゾーン現象（抗原又は抗体の過剰による反応抑制現象）の確認を行った結果を示す図面である。具体的には、超高値試料を５段階希釈して試料を調製し、測定した。
【００３９】
図３に示すように、ＭＭＰ−３濃度５０００ng/mlまで上記測定範囲内に測定値が落ち込むことはなく、ヒト由来血液検体の測定においてプロゾーン現象が測定結果に影響を与えることが通常ないことが確認できた。
【００４０】
（４）共存物質の影響の検討
図４は、本発明の検出系における共存物質の検討を行った結果を示す図面である。
【００４１】
具体的には、２種類の濃度の試料に干渉物質を添加し、添加濃度０濃度（１０回測定）の測定値の平均値±１０％を算出した。各添加濃度での測定値が添加濃度０濃度の平均値±１０％以内であるとき、測定値に影響がないと判断した。
【００４２】
図４に示すように、遊離型ビリルビンは２０．０mg/dl、抱合型ビリルビンは２０．０mg/dl、溶血ヘモグロビンは５００．０mg/dl、乳び（高濃度の脂質が存在する溶液）は２０００ＦＴＵ、リウマチ因子は５００．０ＩＵ/ml、の濃度まで共存の影響は認められなかった。
【００４３】
（５）ＥＬＩＳＡ法を用いた既承認製品Ａとの相関性
図５は、本発明の検出系とＥＬＩＳＡ法を用いた既承認製品Ａとの相関性を検討した図面である。
【００４４】
検体を生理食塩水で希釈して、その希釈直線性を検討したところ、ＭＭＰ−３が約１２００ng/mlまで良好な直線性が得られた。本品と既承認製品Ａの相関性は、回帰式ｙ＝１．００２ｘ−１．２、相関係数ｒ＝０．９９５と良好であることが確認できた（検体数６０）。
【００４５】
（６）ＬＴＩＡ法を用いた既承認製品Ｂとの関係（１）
図６は、ＬＴＩＡ法を用いた既承認製品においてマイナス値が得られた血液検体に対し、本発明の検出方法について検討した結果を示す図面である。
【００４６】
既承認製品Ｂでは、ＭＭＰ−３の測定値が低値範囲ではマイナス値となってしまう例がしばしば認められた。そこで、当該製品でマイナス値が示された２８検体を、他のＭＭＰ−３検出系で測定し、結果を比較した。
【００４７】
図６の左グラフにおいて明らかなように、既承認製品Ｂでマイナス値であった検体の全てが、本品とＥＬＩＳＡ法を用いた既承認製品Ａではプラス値となった。また右グラフは、当該マイナス値の検体を生理食塩水で希釈して既承認製品Ａと本品との相関性を検討した結果を示している。その結果、この範囲での本品と既承認製品Ａとの相関関係は良好であることが明らかになった。既承認製品ＡはＥＬＩＳＡ法を測定原理とするために測定感度は優れているが、測定の迅速性と検体処理能力においては問題が認められる。この結果は、本発明の検出系には、ＥＬＩＳＡ法と同等程度に測定感度に優れ、かつ、ＬＴＩＡ法による優れた測定の迅速性と検体処理能力が認められることが明らかになった。
【００４８】
（７）ＬＴＩＡ法を用いた既承認製品Ｂとの関係（２）
図７は、本発明の検出系（本品）と既承認製品Ｂとの相関関係を、既承認製品Ｂを用いた測定においてマイナス値が認められなかった６０検体について、生理用食塩水による希釈において求めた図面である。
【００４９】
図に示すようにこれらの６０検体において、既承認製品Ｂと本品には良好な相関関係が認められることが明らかになった。
【００５０】
ＬＴＩＡ法を用いる本発明の検出方法は、測定範囲がＭＭＰ−３濃度で概ね１０〜１２００ng/mlと広い範囲であることに特徴が認められる。既承認製品Ａは１０〜８００ng/ml程度である。また、生理食塩水による検体希釈が可能であることも明らかとなった。従って、測定レンジオーバーによる再測定（再検査率）を減らすことが可能となり、検査現場での作業効率の向上が期待できる。また、本発明の検出系は、測定感度に優れるＥＬＩＳＡ法を用いる既承認製品Ａとの相関性が良好であり、かつ、ＬＴＩＡ法を用いる既承認製品Ｂのように低値領域においてＭＭＰ−３がマイナス値になる現象は認められない。よって本発明の検出方法は、簡便性と正確性を兼ね備えた、日常の検査における適用に非常に適した試薬性能を有していることが明らかとなった。
【００５１】
（８）本発明の検出系のさらなる優位性の検討
上述したＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体の製造工程において、本発明に係わるモノクローナル抗体「３Ｄ３」と「１４Ｂ１」と共に、最終候補の中に残った「８Ａ６」を担持させたラテックス粒子を用いた場合についての検討を行った。
【００５２】
すなわち、ＬＴＩＡ法を用いた既承認製品Ｂにおいてマイナス値であったにもかかわらず、本発明に係わるモノクローナル抗体「３Ｄ３」と「１４Ｂ１」を用いた上述のラテックス粒子系とＥＬＩＳＡ法による既承認製品ＡではＭＭＰ−３が検出された３検体に対して、モノクローナル抗体「８Ａ６」を担持したラテックス粒子に、「３Ｄ３」のラテックス粒子と「１４Ｂ１」のラテックス粒子を、それぞれ組み合わせた試験系でＭＭＰ−３の検出を行った。併せて、本発明の「３Ｄ３」のラテックス粒子と「１４Ｂ１」のラテックス粒子の組み合わせ、ＥＬＩＳＡ法による既承認製品Ａ、ＬＴＩＡ法を用いた既承認製品Ｂ、による検出も行った。
【００５３】
その結果を表１に示す。なお、７１７０Ｓ型自動分析装置（日立社製）を用いて測定した場合、マイナス値は「０」として表示され、既承認製品Ｂではマイナス値が認められた。
【００５４】
【表１】
2013077332.tif 000002
【００５５】
表１の結果において、本発明の試験系に比してモノクローナル抗体「８Ａ６」を用いた試験系は、検出値が不規則に高くなってしまう傾向が認められた。上述したようにモノクローナル抗体「８Ａ６」は、本発明に係わるモノクローナル抗体「３Ｄ３」と「１４Ｂ１」と共にスクリーニングの最終候補であった。すなわちこの試験の結果は、本発明のラテックス粒子を用いる検出方法が、開示されたスクリーニング手法によって得られるハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体で画一的に可能となるものではないことを示している。
【図１】
2013077332.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013077332.tif 000009
【国際調査報告】
2013077332.tif 000010
2013077332.tif 000011
2013077332.tif 000012
2013077332.tif 000013