(57)【要約】α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を含有するマラリアの予防または治療薬が提供される。
2013118606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を含有するマラリアの予防または治療薬。
【請求項２】
前記化合物が、ABCA1トランスポーター阻害剤、αTTP阻害剤、α-トコフェロール吸収抑制剤、α-トコフェロール代謝促進剤からなる群から選ばれる、請求項１に記載のマラリアの予防または治療薬。
【請求項３】
前記化合物がプロブコールである、請求項１又は２に記載のマラリアの予防または治療薬。
【請求項４】
細胞内に取り込まれるα-トコフェロールエステルを含む培地中で被験化合物の存在下に細胞を培養し、細胞内でエステル加水分解されたα-トコフェロールの細胞外への放出を評価する工程を有することを特徴とする、マラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記α-トコフェロールエステルが標識されたα-トコフェロールエステルである、請求項4に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験化合物の存在下にαTTPの細胞膜への移動を評価する工程を有することを特徴とする、マラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を、マラリアの治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、マラリアの治療または予防方法。
【請求項８】
マラリアの予防または治療薬を製造するための、α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の使用。
【請求項９】
マラリアの予防または治療薬として使用するためのα-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアの予防または治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアはマラリア原虫が生体内に感染することによって引き起こされる病気であり、ワクチンや治療薬の研究が行なわれている。マラリアの特効薬であるキニーネよりも副作用の弱いクロロキンが開発されたが、クロロキンに耐性を持つ原虫が増えていること、抗原が一定でないためワクチンの製造が困難であるなどの理由によりキニーネもいまだに使用されており、決定的な治療法は確立されていない。キニーネ、クロロキン、クロトリマゾールなどの抗マラリア薬の作用機序は、ヘムに対する錯体形成であることが非特許文献１に記載されている。【０００３】
非特許文献２には、過去の疫学的観察では、微量栄養素、特にビタミンEの欠乏が原虫感染に抵抗性を誘導する可能性を示唆していた。非特許文献３、４では血液中のビタミンE（α-トコフェロール）レベルを調節する蛋白質であるα-トコフェロールトランスファープロテイン（αTTP）の欠損したマウスの体内のα-トコフェロール量が減少し、ネズミマラリア原虫感染症に対する耐性を獲得することが記載されている。【０００４】
ビタミンEは多くの食物に比較的多量に含まれることから、ビタミンE欠乏の誘導は困難であり、原虫感染の予防あるいは治療のためにビタミンE欠乏を利用することは非現実的と考えられていた。【０００５】
一方、非特許文献５では、高脂血症治療薬であるプロブコールは、肝臓から血漿中へα-トコフェロールを放出するATP-バインディングカセットトランスポーターA1（ABCA1）蛋白質を阻害する活性を有し、マウスへのプロブコール経口投与により血漿中α-トコフェロール濃度を低下できることを記載している。しかしながら、プロブコールを投与して血漿中のα-トコフェロール濃度を低下させても赤血球中のα-トコフェロール量はほとんど変化しない。【０００６】
非特許文献６は、プロブコールを投与した患者が平均１４％の血漿中ビタミンE濃度の減少が見られたことを開示しているが、この１４％の減少は個人差よりも少なく、プロブコールがビタミンＥの血漿中濃度を有意に低下できることは知られていなかった。【０００７】
非特許文献７は、クロロキンがαTTP媒介αトコフェロール分泌を抑制することが記載されているが、クロロキンの作用機序は上記のように鉄との錯体形成が関与すると考えられていたので、非特許文献７は、クロロキンの新たな抗マラリア作用機序を開示しているとは認識されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】N. T. Huy et al.  J. Biol. Chem., 2002;277:4152
【非特許文献２】Shankar AH.  J Infect Dis. 2000;182 Suppl 1:S37-53.
【非特許文献３】Herbas MS, Suzuki H. et al. Am J Clin Nutr. 2010;91:200-7
【非特許文献４】Herbas MS, Shichiri M, Suzuki H. et al. Malar J. 2010;9:101
【非特許文献５】Shichiri M. et al. J Nutr Biochem. 2010;21:451-6
【非特許文献６】Elinder LS et al. Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 1995;15:1057-63.
【非特許文献７】M. Horiguchi et al. Genes to Cells, 2003;8:789-800
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、副作用がなく、かつ、マラリアの発症を予防することができ、マラリアに罹患した後で投与しても治療効果を有するマラリアの予防または治療薬及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来、αTTP欠損マウス及び ビタミンＥ(αトコフェロール)が欠乏したヒトにおいて、マラリア耐性を獲得できることが示唆されていたが、これらの場合、生体内のビタミンＥ(αトコフェロール)の総量が低下しているため、マラリア原虫の標的である赤血球中のビタミンＥ(αトコフェロール)量が同様に低下しているので、これによりマラリア耐性を獲得できたものと考えられていた。【００１１】
本発明者らは、血漿中のα-トコフェロール濃度を低下できるが、赤血球中のビタミンＥ(αトコフェロール)量がほとんど変化しないプロブコールについてマラリア治療効果を調べたところ、意外にも標的の赤血球の状態は変化していないにもかかわらずマラリアによる死亡率を劇的に低下できることを見出し、さらに検討して本発明を完成した。【００１２】
αTTP欠損マウスのように、生体内のビタミンＥ(αトコフェロール)量を大きく低下させると小脳失調や不妊のような副作用が発現するが、本発明では生体内のビタミンＥ(αトコフェロール)の分布を変えて血漿中ビタミンＥ(αトコフェロール)濃度を低下させているため、有効成分の投与を停止すると速やかに血漿中ビタミンＥ(αトコフェロール)濃度は回復するため、このような不都合は回避できる。【００１３】
本発明の第一態様によれば、α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を含有するマラリアの予防または治療薬が提供される。【００１４】
一実施形態では、化合物が、ABCA1トランスポーター阻害剤、αTTP阻害剤、α-トコフェロール吸収抑制剤、α-トコフェロール代謝促進剤からなる群から選ばれる。【００１５】
別の実施形態では、化合物がプロブコールである。【００１６】
本発明の第二態様によれば、細胞内に取り込まれるα-トコフェロールエステルを含む培地中で被験化合物の存在下に細胞を培養し、細胞内でエステル加水分解されたα-トコフェロールの細胞外への放出を評価する工程を有することを特徴とする、マラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法が提供される。【００１７】
一実施形態では、α-トコフェロールエステルが標識されたα-トコフェロールエステルである。【００１８】
本発明の第三態様によれば、被験化合物の存在下にα-TTPの細胞膜への移動を評価する工程を有することを特徴とする、マラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法が提供される。【００１９】
本発明の第四態様によれば、α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を、マラリアの治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、マラリアの治療または予防方法が提供される。【００２０】
本発明の第五態様によれば、マラリアの予防または治療薬を製造するための、α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の使用が提供される。
本発明の第六態様によれば、マラリアの予防または治療薬として使用するためのα-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、副作用が低く、有効性の高いマラリアの予防または治療薬を提供することができる。【００２２】
本発明のマラリアの予防または治療薬は、クロロキン耐性株に対しても高い有効性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】αトコフェロール放出アッセイによるスクリーニング法の概要
【図２】αトコフェロール放出アッセイによるスクリーニング法での薄層液体クロマトグラフィーの結果
【図３】αトコフェロール放出アッセイによるスクリーニング法でのαトコフェロール放出の割合
【図４】Ａは実験動物の給餌スケジュール、Ｂはプロブコール食から通常食に変更後のマウスの週数に対する血中α−トコフェロール濃度のグラフ。プロブコールがαトコフェロール血中濃度を減少できることが示されている。Controlは通常食を与えたC57BL/6Jマウス、KOは通常食を与えたαTTP KOマウス。両者とも7週齢で採血。
【図５】Ａは実験動物の給餌スケジュール、Ｂは感染後経過日数に対する原虫感染率のグラフ、Ｃは感染後経過日数に対する生存率のグラフ。プロブコールがマラリア感染の死亡率を顕著に減少させることを示す。
【図６】Ａは実験動物の給餌スケジュール、Ｂは感染後経過日数に対する原虫感染率のグラフ、Ｃは感染後経過日数に対する生存率のグラフ。プロブコールがマラリア感染の死亡率を顕著に減少させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、マラリア感染症におけるビタミンEの関連性について検討した。ビタミンEは脂溶性抗酸化物質であり、トコフェロール4種類（α-、β-、γ-、δ-）およびトコトリエノール4種類（α-、β-、γ-、δ-）の総称である。上述8種類のうち、最も活性の高いのはα-トコフェロールであり、ヒトを含め哺乳類の血液中で最も高濃度に存在する。従って、本発明ではα-トコフェロールについて着目したが、本発明のマラリアの予防または治療薬はビタミンEの血中濃度を低下させ、トコフェロールの合計量の血中濃度を低下させるものと考えられる。
【００２５】
本発明の有効成分となる化合物は、α-トコフェロールの血中濃度（血液、血漿又は血清中の濃度）を低下させることができる化合物を広く包含する。当該化合物は、α-トコフェロール(ビタミンE)の血中濃度を低下させるのに必要な量(有効量)をマラリアに感染した患者もしくはマラリア感染の可能性のある被験体に、好ましくはα-トコフェロール(ビタミンE)の血中濃度を有意に低下させるのに必要な量投与されることで、マラリアを予防または治療することができる。
【００２６】
α-トコフェロールの血中濃度（血液、血漿又は血清中の濃度）を低下させるとは、ヒトにおいて血中濃度の平均値が低下すればよく、有意に低下することが望ましい。α-トコフェロールの血中濃度の低下の程度は、有効成分の投与前の血中濃度を基準として、平均で、例えば１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上である。従って、本明細書における「有効量」とは、α-トコフェロールの血中濃度を、有効成分の投与前の血中濃度を基準として、平均で、例えば１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上低下させる濃度である。例えば、有効成分がプロブコールの場合には、１日量として下限が１２００ｍｇ、１４００ｍｇ、１６００ｍｇ、１８００ｍｇ、２０００ｍｇ、２５００ｍｇ、３０００ｍｇ、３５００ｍｇ、４０００ｍｇ、５０００ｍｇが挙げられ、上限は１００００ｍｇ、９０００ｍｇ、８０００ｍｇ、７０００ｍｇ、６０００ｍｇが挙げられる。これらの上限と下限の任意の組み合わせ(例えば１２００ｍｇ〜１００００ｍｇ)がプロブコールの有効量として例示される。プロブコール以外の有効成分の有効量は、プロブコールの有効量を参考にして適宜決定できる。
【００２７】
本発明のマラリアの予防または治療薬の投与により、α-トコフェロールの血中濃度は徐々に低下する。血中濃度低下後のα-トコフェロールの好ましい血漿中濃度(ヒト、成人)は、３．８μＭ以下、３．６μＭ以下、３．４μＭ以下、３．２μＭ以下、３．０μＭ以下、２．８μＭ以下、２．６μＭ以下、２．４μＭ以下、２．２μＭ以下、２．０μＭ以下、１．８μＭ以下、１．６μＭ以下、１．４μＭ以下、１．２μＭ以下、１．０μＭ以下、０．８μＭ以下、０．６μＭ以下、０．４μＭ以下または０．２μＭ以下である。
【００２８】
本発明の有効成分は、α-トコフェロールの血中濃度を低下させればよく、α-トコフェロールが多量に体内にあったとしても、血液中の濃度が低下していればよく、α-トコフェロールの生体内分布を調節する化合物を有効成分としてもよく、α-トコフェロールを分解又は排泄して生体内のα-トコフェロールの総量を低下させてもよい。α-トコフェロールの生体内分布を調節する化合物は、マラリア治療後速やかにα-トコフェロールの血中濃度を回復させることができ、副作用がより低いと推定されるので好ましい。
【００２９】
本発明において、α-トコフェロールの血中濃度が「有意に低下」するとは、統計的な有意差をもってα-トコフェロールの血中濃度が低下することを意味し、具体的にはP<0.05、あるいはP<0.01の場合が含まれる。
【００３０】
本発明のマラリア予防薬は、マラリア感染の３日以上前、好ましくは１週間以上前、より好ましくは２週間以上前に服用することで、マラリア感染に罹患しにくくなり、マラリアに感染した場合でもマラリアの症状は軽度で済み、重症化しにくい。例えば、マラリア感染の可能性のある地域に旅行する場合、旅行者は本発明のマラリア予防または治療薬を旅行前及び旅行中に服用することで、マラリア感染のリスクを大幅に低減することができる。本発明のマラリア予防または治療薬は、副作用が低いので、従来の副作用の強いマラリア治療薬と異なり、予防も含めて長期間服用することが可能である。
【００３１】
本発明のマラリア治療薬は、マラリア感染後に服用した場合でもマラリアの増殖を抑え、マラリアの治癒を促進し、死亡率を低減することができる。
【００３２】
「α-トコフェロール(ビタミンE)の血中濃度を有意に低下させる化合物」としては、例えば、α-トコフェロールの細胞から血液中への放出を抑制する化合物、血液中のα-トコフェロールの代謝および／または分解を促進する化合物、α-トコフェロールの吸収を抑制する化合物などが挙げられ、このような作用を有する化合物をマラリアの予防または治療薬の有効成分として使用することができる。α-トコフェロールの細胞から血液中への放出を抑制する化合物が速効性を有するために有効成分として好ましい。
【００３３】
α-トコフェロールの細胞から血液中への放出を抑制する化合物は、たとえばABCA1トランスポーター阻害剤、αTTP発現阻害剤、αTTPとα-トコフェロールの結合阻害剤、αTTPとABCA1の結合阻害剤など、α-トコフェロールが細胞内から血液中に移行する経路を阻害する化合物を広く包含する。
【００３４】
本発明の好ましい有効成分は、プロブコールおよびそれ以外のABCA1トランスポーター阻害剤、αTTP阻害剤、α-トコフェロール吸収抑制剤、α-トコフェロール代謝促進剤である。
【００３５】
（１）ABCA1トランスポーター阻害剤
以下のi)〜iv)が挙げられる：
i)glyburide
ii)4,4’-diisothiocyanostilbene-2,2‘-disulfonic acid  (DIDS)Am J Clin Nutr. 2009;89(1):177-84.
iii)シクロスポリンA（Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:2155-61.）
iv) ABCA1発現阻害剤
【００３６】
（２）α-トコフェロールトランスファープロテイン（αTTP）阻害剤
αTTPの 発現を阻害する薬剤が広く包含され、例えばsiRNA、shRNA、アンチセンスRNA、miRNA、もしくはリボザイム、又は細胞内でこれらのＲＮＡ分子を放出できる発現ベクターなどが挙げられる。
【００３７】
また、αTTPにα-トコフェロールと競合的に結合することによってαTTPの機能を阻害する薬剤、αTTPが細胞膜へ移動することを阻害し、細胞膜から血液中へα-トコフェロールを放出することを阻害する薬物が挙げられる。
【００３８】
（３）α-トコフェロール吸収抑制剤
α-トコフェロールは食物の成分として小腸から吸収されるが、小腸からの取り込みを抑制する薬剤はα-トコフェロール血中濃度を減少する効果がある。
このような薬剤としては、以下のI)〜III)が挙げられる。
【００３９】
I)コレステロール吸収阻害剤としての陰イオン交換樹脂
医療用医薬品添付文書上に脂溶性ビタミン吸収阻害の記載のあるクエストラン（コレスチラミン）、コレバイン（コレスチミド）など
【００４０】
II)小腸コレステロールトランスポーター（NPC1L1）阻害剤
エゼチミブ（製品名ゼチーア）
高田龍平ら、「コレステロールトランスポーターNPC1L1によるビタミンEの消化管吸収」、ビタミン 84(8), 376-383, 2010-08-25およびNarushima K, et al., Niemann-pick C1-like 1 mediates alpha-tocopherol transport Mol Pharmacol. 2008;74(1):42-9に記載の化合物。これらの文献および該文献中の化合物は、参考として本明細書に援用される。
【００４１】
III)リポ蛋白質リパーゼ（LPL）阻害剤
Triton WR1339など
【００４２】
（４）α-トコフェロール代謝促進剤
α-トコフェロールはシトクロームP450（CYP4F2、CYP4F3など）およびβ酸化によってカルボキシエチルヒドロキシクロマン（CEHC）に代謝される。シトクロームP450による代謝やβ酸化を促進する薬剤はα-トコフェロール血中濃度を減少する可能性がある。シトクロームP450（CYP4F2）は核内レセプターretinoid X receptor (RXR)によって誘導されることが知られており、sterol regulatory element-binding protein (SREBP)によって誘導されることが最近報告されている（Hsu MH, Savas U, Griffin KJ, Johnson EF. Regulation of human cytochrome P450 4F2 expression by sterol regulatory elementbinding protein and lovastatin. J Biol Chem 2007；282, 5225-5236）。
【００４３】
本発明は、さらにマラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００４４】
好ましいスクリーニング方法について、以下に説明する。
１）α-トコフェロール放出アッセイの概要(図１〜３)  トリチウムラベル（[3H]）した酢酸トコフェロール（[3H]α-TocAc）を含んだリポソームを作成し、培地に加える。[3H]α-TocAcは速やかに細胞内に取り込まれ、非特異的な加水分解酵素によりアセテートがはずれ、トリチウムでラベルされたα-Toc（[3H] α-Toc）となり、細胞外に放出される。リポソーム添加24時間後に細胞と培地を別々に回収し脂質の抽出を行い、薄層液体クロマトグラフィー（クロロホルムを使用）にて展開し露光した。酢酸トコフェロール以外にもα-トコフェロールは同様に使用できるが、酢酸トコフェロールが好ましい。
【００４５】
標識は、α-トコフェロールまたはそのエステルの細胞内への取り込みと細胞外への放出に実質的に影響しない限りトリチウムラベル（[3H]）以外の任意の標識を用いることができる。
【００４６】
この方法では細胞内と培地中のα-TocAcとα-Tocを別々に定量化することが可能である（図２）。
【００４７】
α-トコフェロールの放出をグラフ化すると（図３）、αTTPを恒常的に発現させたMcA-TTP21細胞ではMcARH7777 細胞に比べ、細胞外のα-トコフェロールの割合が顕著に増加していることが分かる。
【００４８】
ここで、McA-TTP21細胞はαTTPのある肝細胞を意味し、McA-RH7777細胞はαTTPのない肝細胞を意味する。Arita M, Nomura K, Arai H, Inoue K., alpha-tocopherol transfer protein stimulates the secretion of alpha-tocopherol from a cultured liver cell line through a brefeldin A-insensitive pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(23):12437-41.を参照のこと。
【００４９】
さらにα-トコフェロール放出アッセイの詳細（プロブコール投与時の実験の詳細）を以下(a)-(i)に示す。
【００５０】
(a)ラット肝癌由来細胞株であるMcARH7777 細胞とMcARH7777細胞にαTTPを恒常的に発現させたMcA-TTP21細胞をコラーゲンコート6ウェルディッシュに播種する（1.2×105cells/well）。
【００５１】
(b)播種後24時間後に0.2% BSAおよび10μg/mlのApoA1を含有するDMEMに培地交換し、プロブコールを最終濃度10μM または20μMにて添加するプロブコールはエタノールに40mMの濃度で溶解させる。
【００５２】
(c)プロブコール添加後2時間後に[3H]α-TocAcをリポソームの形で添加する。
リポソーム組成：
リン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ディセチルホスフェイト混合物）    200μl
コレステロール(3mM) 100μl
[3H]α-TocAc  （11,100,000dpm） 300μl
非ラベル化α-TocAc            10μl
上記試薬を混合したものの溶媒（クロロホルム）を窒素ガスを使用して完全乾固する。
0.3M ブドウ糖液200μlを添加し、超音波破砕機にて3分間処理する。
【００５３】
(d) リポソーム添加24時間後に細胞と培地を回収する。
i)培地をチューブに回収する。
ii)細胞を200μlのPBSにて2回洗浄し、0.1％SDS水溶液（6％ピロガロール）で細胞を回収する。
【００５４】
(e)培地および細胞成分に1.5mlの65% エタノール溶液と3mlのヘキサンを加え、5分間振盪混合する。
【００５５】
(f)3000rpm で5分間遠心分離する。
【００５６】
(g)上層のヘキサン層をガラスチューブに移し、エバポレーターにて完全に乾固する。
【００５７】
(h)完全乾固したサンプルに20μlの酢酸エチルを加えて、TLCプレートに一点に滴下、乾燥する。
【００５８】
(i)クロロホルムにて展開し乾燥後、RIイメージングアナライザにて検出解析する。
上記のプロトコールは単なる例示であり、当業者は適宜条件を変更して実施することができる。
その他のスクリーニング法について、さらに以下I）−VIII)に説明する
【００５９】
I）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と電気化学検出器（ECD）を用いてα-トコフェロールを測定する手法を用いる方法。
【００６０】
前述の[3H]α-TocAcではなく、非ラベルの酢酸トコフェロールを同様の方法で細胞に添加して、24時間後に細胞および培地を回収する。（10cm ディッシュ程度の細胞量が必要）  回収した培地および細胞懸濁液に20μM BHT含有クロロホルム/メタノール（2/1）を3倍量添加して1分間振盪混合後、15,000rpm で遠心分離5分間。
【００６１】
クロロホルム層を別のチューブに移し、必要に応じて濃縮した後、HPLC-ECDにて測定する。
HPLC条件
・カラム  Wakosil-II 5C18 RS φ4.6mm×250mm （Wako, Tokyo, Japan）
・還元カラムRC-10 4.0mm×15mm （Shiseido, Tokyo, Japan）
・温度  40℃
・検出器  Nanospace SI-2  （Shiseido, Tokyo, Japan）
・溶離液  50mM NaClO4含有メタノール
・流速  0.7ml/min 
・注入量 10μl
【００６２】
II）質量分析装置によるαトコフェロール測定を用いる方法。
上述I）と同様に非ラベルの酢酸トコフェロールを細胞に添加し、培地中および細胞中のα-トコフェロール含有量を測定する方法として質量分析装置（GC-MSやLC-MS）を用いる方法も本発明のスクリーニング方法において使用することができる。
【００６３】
III）抗αトコフェロール特異抗体を用いた免疫学的測定法を用いたα-トコフェロール測定を用いる方法  上述I）と同様に非ラベルの酢酸トコフェロールを細胞に添加し、培地中および細胞中のα-トコフェロール含有量を測定する方法として抗α-トコフェロール特異抗体を用いた免疫学的測定法(ELISA)も本発明のスクリーニング方法において使用することができる。
【００６４】
IV） マウスに各種薬剤を投与してα-トコフェロールの血中濃度を測定する方法。
各種薬剤を餌への混餌、給水、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与などの方法によって、マウスやラットへ投与し、経時的に血液（EDTA添加）や組織を採取する。
採取した血液サンプルは3500rpm ×5分の遠心処理で血漿分離する。
血漿もしくは組織懸濁液に対し20μM BHT含有クロロホルム/メタノール（2/1）を3倍量添加し1分間振盪混合後、15,000rpm で遠心分離5分間する。
クロロホルム層を別のチューブに移し、HPLC-ECDにて測定する。
HPLC-ECDの条件は上述のI）と同様である。
【００６５】
V）細胞内のαTTPの局在の蛍光顕微鏡観察
肝細胞内でα-トコフェロールに結合したαTTPが細胞膜上に移動してABCA1などの輸送体に受け渡さないと肝細胞内より循環血液中に分配されない。
そこで、αTTPの細胞内移動を阻害する薬剤をスクリーニングすれば、α-トコフェロールの血中濃度抑制因子の候補を選択することができる。
具体的には、
(i)McA-TTP細胞などのαTTPの発現した細胞を用いる。
(ii)試験薬剤投与後、経時的に反応を停止する。PBSで細胞を洗浄後、パラホルムアルデヒドで固定する。
(iii)PBS洗浄後、0.5％トリトン100 PBS溶液で20分間もしくは冷メタノール溶液で2分間処理する。
(iv)PBS洗浄後、牛血清アルブミンPBS溶液などでブロッキングする。
(v)抗αTTP特異抗体を含んだ溶液に置換し1時間から数時間処理する。
(vi)PBS洗浄後、蛍光物質（Alexaなど）付加二次抗体にて処理。
(vii)蛍光顕微鏡を用いてαTTPの細胞内局在を観察する。
【００６６】
VI）細胞内のαTTPの局在を細胞小器官分画処理した分画のウエスタンブロッティングもしくはELISAにて観察する。
【００６７】
上述V）の項と同様にαTTPの細胞膜への移行を阻害する薬剤のスクリーニングの手法である。
具体的には
(i) 細胞内局在するαTTPを細胞小器官ごとに分画精製する（ショ糖やフィコールなどの密度勾配を利用した密度勾配遠心分離法や細胞分画精製Kitを用いる）
(ii)細胞小器官ごとのαTTPの存在する比率、αTTP蛋白量を抗αTTP特異抗体を用いたウエスタンブロッティング法、もしくはELISA定量法によって解析する。
【００６８】
VII）αTTPやABCA1などのα-トコフェロール血中濃度調節に関与するタンパク質の発現調節に関わる薬剤、因子のスクリーニング
αTTPやABCA1などのα-トコフェロール血中濃度調節に関わるタンパク質の遺伝子発現もしくは蛋白質の発現を計測する手法で薬剤のスクリーニングを行う。遺伝子発現のスクリーニング法としてはレポーターアッセイ法や定量的リアルタイムPCR法などが有用と考えられる。蛋白質の発現は上述の抗α-トコフェロール特異抗体を用いたウエスタンブロッティング法、もしくはELISA定量法による評価が可能である。
【００６９】
VIII）αTTPのα-トコフェロール結合部位に結合する化合物、抗体等の探索
αTTPにはα-トコフェロールの結合する部位が特定されているが、この部位に結合する可能性のある化合物、抗体等をスクリーニングすることができれば、αTTPによるα-トコフェロール運搬を阻害し、血中α-トコフェロール濃度を減少させる薬剤を探し出すことが可能である。αTTPおよびα-トコフェロール結合部位のアミノ酸配列、蛋白構造はすでに既知のものであり、蛋白構造から化合物の推定することでスクリーニングができる。
【００７０】
本発明はさらに、α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を、マラリアの治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、マラリアの治療または予防方法、マラリアの予防または治療薬を製造するための、α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の使用、マラリアの予防または治療薬として使用するためのα-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物も提供する。α-トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物およびその有効量については上述した通りである。
【００７１】
1つの実施形態において、本発明は、α-トコフェロールの血中濃度を有意に低下させる化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、マラリアの治療または予防のために使用することができる。医薬組成物は、経口、非経口または局所投与のために使用することができる。これらはたとえば、経口的に、例えば錠剤、被覆錠剤、硬および軟カプセル、液剤、乳剤もしくは懸濁液の形態で、経鼻的に、例えばスプレーの形態で、直腸に、例えば坐剤の形態で、非経口的に、例えば注射溶液もしくは輸液の形態で、または局所的に、例えば軟膏、クリームもしくはローションなどの形態で投与することができる。
【実施例】
【００７２】
以下に本発明を実施例によって説明する。【００７３】
なお、以下の実施例において、プロブコール (WAKO, Japan)および通常食(CLEA, Japan)を使用した。【００７４】
通常食：餌1kg当たり75mgのα-トコフェロールを含有
プロブコール食：餌1kg当たり75mgのα-トコフェロールと10gのプロブコールを含有（1% w/w）【００７５】
実施例１
4週齢のC57BL/6Jマウスの各群6匹（雄3匹、雌3匹）を使用し、プロブコール食を2週間与えたのち、通常食に変更した。【００７６】
プロブコール食投与2週間後と、通常食に変更した後、1週間後と、2週間後とに採血し（図４Ａ）、採血後、3500rpmで5分間遠心処理し血漿成分を分離した。血漿に対し20μM BHT含有クロロホルム/メタノール（2/1）を3倍量添加し1分間振盪混合後、15,000rpm で遠心分離5分間した。【００７７】
クロロホルム層を別のチューブに移し、血漿中のα-トコフェロール濃度をHPLC-ECD により測定した。
HPLC条件
・カラム  Wakosil-II 5C18 RS φ4.6mm×250mm （Wako, Tokyo, Japan）
・還元カラムRC-10 4.0mm×15mm （Shiseido, Tokyo, Japan）
・温度  40℃
・検出器  Nanospace SI-2  （Shiseido, Tokyo, Japan）
・溶離液  50mM NaClO4含有メタノール
・流速  0.7ml/min
・注入量 10μl
結果を図４Ｂに示す。【００７８】
図４Ａ，Ｂ中の0w、1w、2wはプロブコール投与終了後の週数を示す。【００７９】
対照(control)として、通常食を与えているそれぞれ７週齢のC57BL/6JマウスとαTTP KOマウス(Jishage K, Suzuki H. et al.: α-Tocopherol transfer protein is important for the normal development of placental labyrinthine trophoblast in mice. J Biol Chem 2001, 275:1669-1672.)からも採血し、同様に血清中のα-トコフェロール濃度をHPLCにより測定した。有意差検定はtwo way ANOVAにて行い、p<0.05を有意差ありとした。【００８０】
結果
通常食を投与しているC57BL/6Jマウスではα-トコフェロールの血中濃度は雄0.860μM、雌1.30μMであったが、通常食を投与しているαTTP KOでは雄0.027μM、雌0.027μMであった。【００８１】
C57BL/6Jマウスにプロブコール食を投与開始し2週間後には、α-トコフェロールの血中濃度は雄0.078μM、雌0.132μMと減少していた。通常食に変更した後、1週間後には雄0.334μM、雌0.533μM、2週間後には雄0.847μM、雌0.544μMと血中濃度の再上昇がみられた。【００８２】
以上の結果から、プロブコールは経口投与により血漿中のα-トコフェロール濃度を有意に低下させることができることが明らかになった。プロブコールの投与を中止すると、血漿中のα-トコフェロール濃度は２週間で大きく回復するため、副作用は低いことが推定される。【００８３】
実施例２
4週齢のC57BL/6Jマウスの各群6匹（雄3匹、雌3匹）を使用しマラリア原虫感染実験を行った。【００８４】
通常食を与えたC57BL/6Jマウスの群、通常食を与えたαTTP KOマウスの群にマラリア原虫の感染を行った。【００８５】
感染2週間前よりプロブコール食を投与開始し、感染後も継続してプロブコール食を与え続けたC57BL/6Jマウスの群と、上記の２つの群とを比較した。通常食、プロブコール食は、上述と同じものを使用した（図５Ａ−Ｃ）。【００８６】
感染させたマラリア原虫はネズミマラリア原虫Plasmodium.yoelii 17XLで、マラリア原虫に寄生された赤血球を1ml当たり1x105細胞含む赤血球溶液を0.2ml（感染赤血球0.2×105個）腹腔内投与した。【００８７】
マラリア原虫感染後、経時的に採血を行い原虫感染率と生存率を評価した。結果を図５Ｂ，Ｃに示す。【００８８】
原虫感染率(Parasitemia)の評価法
マウスの尾静脈から採取した静脈血をスライドガラス状にスメアを引き、ギムザ染色する。【００８９】
顕微鏡下で原虫の感染している赤血球数と非感染赤血球数を計測し原虫感染率を測定する。【００９０】
結果：図５Ｂ，Ｃに示されるように、通常食を与えているC57BL/6Jマウスでは感染後4日目から原虫感染率が増加し、感染8日目から死亡例が出現し、28日後には全例死亡した。それに対して、αTTP KOでは寄生虫感染率の増加はごく軽度であり、観察期間中の死亡例はなかった。【００９１】
感染前2週間から感染後も継続してプロブコールを与えた群では、感染後6日目から12日目にかけて一過性に原虫感染率が増加するが、その後減少し、26日目には感染率が0となった。また、プロブコールを与えた群では、顕著に死亡率が減少し、28日目にわずかに死亡例があったのみであった。【００９２】
実施例３
次に、前述の実施例２と同様にマウスに通常食もしくはプロブコールを与え、マラリア原虫感染をさせたが、プロブコール投与群で感染後30日目に通常食に餌を変更した（図６Ａ）。【００９３】
マラリア原虫感染の方法および評価項目、評価手法は実施例２の実験と同様である。【００９４】
結果：図６Ｂ，Ｃに示されるように、通常食を与えているC57BL/6Jマウスでは感染後4日目から原虫感染率が増加し、感染8日目から死亡例が出現し、18日後には全例死亡した。
プロブコールを与えた群では、感染後6日目から16日目にかけて一過性に原虫感染率が増加するが、その後減少し、22日目には感染率が0となった。プロブコールを与えた群では、顕著に死亡率が減少し、20日目にわずかに死亡例があったのみであった。感染後30日目から通常食に変更しているが、原虫感染率の再増加および死亡率の増加は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月1日(2013.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を含有するマラリアの予防または治療薬であって、前記化合物がプロブコールであるマラリアの予防または治療薬。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
細胞内に取り込まれるα−トコフェロールエステルを含む培地中で被験化合物の存在下に細胞を培養し、細胞内でエステル加水分解されたα−トコフェロールの細胞外への放出を評価する工程と、
前記α−トコフェロールの細胞外への放出が抑制された被験化合物を非ヒト動物に投与し、マラリア原虫感染後の非ヒト動物の感染率及び／又は生存率を評価する工程と、
を有することを特徴とする、マラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記α−トコフェロールエステルが標識されたα−トコフェロールエステルである、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験化合物の存在下にαＴＴＰの細胞膜への移動を評価する工程と、
前記αＴＴＰの細胞膜への移動を阻害する化合物を非ヒト動物に投与し、マラリア原虫感染後の非ヒト動物の感染率及び／又は生存率を評価する工程と、
を有することを特徴とする、マラリアの予防または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
α−トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の有効量を、マラリアの治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、マラリアの治療または予防方法であって、前記化合物がプロブコールであるマラリアの治療または予防方法。
【請求項８】
マラリアの予防または治療薬を製造するための、α−トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物の使用であって、前記化合物がプロブコールである使用。
【請求項９】
マラリアの予防または治療薬として使用するためのα−トコフェロールの血中濃度を低下させる化合物であって、前記化合物がプロブコールである化合物。
【国際調査報告】
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