(57)【要約】  本発明は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、生合成法による製造プロセスに汎用されている細菌であるエシェリヒア・コリを利用することにより、簡便安価に製造する方法を提供する。具体的には、本発明は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ、およびこのようなエシェリヒア・コリを用いる３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ。
【請求項２】
染色体上のｎｈｏＡ遺伝子が変異または欠損されたことによりＮｈｏＡ活性が低下した、請求項１に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項３】
前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、請求項１または２に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項４】
前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨである、請求項３に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項５】
前記ＧｒｉＩが、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記ＧｒｉＨが、下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、請求項４に記載のエシェリヒア・コリ：
（Ａ）配列番号５または配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号７または配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｆ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を含む、請求項３に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項７】
ｇｒｉＩ遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡであり、かつ、ｇｒｉＨ遺伝子が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つに記載のＤＮＡである、請求項６に記載のエシェリヒア・コリ：
（ａ）配列番号６または配列番号１５の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８または配列番号１７の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｅ）上記（ｄ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）上記（ｄ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するＤＮＡ。
【請求項８】
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子が放線菌由来である、請求項７に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項９】
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス属由来である、請求項７に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項１０】
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス・グリセウス由来である、請求項７に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項１１】
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来である、請求項７に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項１２】
フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のエシェリヒア・コリ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のエシェリヒア・コリを培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により製造した３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリ、およびそれを用いたアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノヒドロキシ安息香酸類は、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体や、高性能耐熱性高分子ポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用である。３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）を基質として、アミノ基を持ったＣ４化合物とＣ３あるいはＣ４化合物との炭素−炭素結合反応を触媒する酵素であるＧｒｉＩ、ならびにＣ７化合物の環化あるいはＣ８化合物の脱炭酸を伴った環化を触媒する酵素であるＧｒｉＨの双方によって２段階で生合成される。【０００３】
【化１】
2013129001.tif 000002
【０００４】
本発明に関連する先行技術としては、以下がある。
特許文献１には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨを導入したストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）を用いる３，４−ＡＨＢＡの製造方法が開示されている。特許文献１はまた、３，４−ＡＨＢＡの副生物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）が生成すること、および３，４−ＡｃＡＨＢＡを脱アセチル化処理して３，４−ＡＨＢＡを生成することを開示している。３，４−ＡｃＡＨＢＡの具体的な脱アセチル化処理方法としては、水酸化ナトリウムなどの強塩基や塩酸などの強酸の使用を例示しており、強塩基や強酸を使用しなければならないという課題がある。
特許文献２には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いることにより３，４−ＡＨＢＡが生成されることが開示されている。
非特許文献１には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨのエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）への導入により３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡが生成されることが開示されている。
非特許文献２には、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてアリールアミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎａｔＡ）を欠失させると、培養中に３，４−ＡｃＡＨＢＡが生成されなくなることが開示されている。
非特許文献３には、エシェリヒア・コリ由来のＮ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｈｏＡ）の機能として、芳香族アミノ基に対するアセチル化を触媒することが開示されている。一方、非特許文献４には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１株が３，５−ＡＨＢＡ（３，４−ＡＨＢＡの構造異性体）の副生物としてＮ−アセチル化体（３，５−ＡｃＡＨＢＡ）を生成すること、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１のｎｈｏＡ遺伝子欠損株（ＭＡＲ１株）においても、３，５−ＡｃＡＨＢＡが副生するため、ＮｈｏＡが３，５−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化の主要な要因ではないと考えられることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２８３１６３号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／００５０９９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６），３６９４４−３６９５１
【非特許文献２】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９（２００７），２１５５−２１５９
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４７５（２０００），１０−１６
【非特許文献４】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，ｖｏｌ．５９（２００６），ｐ．４６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、生合成法による製造プロセスに汎用されている細菌であるエシェリヒア・コリを利用することにより、簡便安価に製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、エシェリヒア・コリにおける３，４−ＡＨＢＡからの３，４−ＡｃＡＨＢＡの副生にはｎｈｏＡが関与すること、したがって、ＮｈｏＡ活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリの使用により、アセチル化されていない３，４−ＡＨＢＡを大量生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ。
〔２〕染色体上のｎｈｏＡ遺伝子が変異または欠損されたことによりＮｈｏＡ活性が低下した、〔１〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔３〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔１〕または〔２〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔４〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨである、〔３〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔５〕前記ＧｒｉＩが、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記ＧｒｉＨが、下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔４〕に記載のエシェリヒア・コリ：
（Ａ）配列番号５または配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号７または配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｆ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
〔６〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を含む、〔３〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔７〕ｇｒｉＩ遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡであり、かつ、ｇｒｉＨ遺伝子が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つに記載のＤＮＡである、[６]に記載のエシェリヒア・コリ：
（ａ）配列番号６または配列番号１５の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８または配列番号１７の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｅ）上記（ｄ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）上記（ｄ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するＤＮＡ。
〔８〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子が放線菌由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔９〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス属由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔１０〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス・グリセウス由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔１１〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔１２〕フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子を有する、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のエシェリヒア・コリ。
〔１３〕〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載のエシェリヒア・コリを培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
〔１４〕〔１３〕に記載の方法により製造した３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法。
〔１５〕前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、〔１４〕の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、簡便安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、（ａ）エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の培養上清液、（ｂ）エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株の培養上清液および（ｃ）３，４−ＡＨＢＡ標準品の、逆相カラムクロマトグラフィーでの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する細菌、エシェリヒア・コリを提供する。本発明の細菌では、アセチル化された副生物（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）の生成が抑制され得る。
【００１３】
＜１＞Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性を低下させる改変
本発明の細菌は、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性を低下させるように改変することにより、アセチル化された副生物の生成が抑制され得る。ＮｈｏＡ活性とは、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性であり、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）との関係では、３，４−ＡＨＢＡから３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）を生成する活性をいう。
【００１４】
「ＮｈｏＡ活性を低下させるように改変された」とは、ＮｈｏＡ活性が、非改変株、例えば、野生株のエシェリヒア・コリの比活性よりも低くなったことをいう。ＮｈｏＡ活性は、非改変株と比較して、菌体当たり５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに望ましくは菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。本発明のエシェリヒア・コリは、野生株又は非改変株よりＮｈｏＡ活性が低下していればよいが、さらにこれらの株に比べて３，４−ＡＨＢＡの蓄積が向上していることがより望ましい。また、「ＮｈｏＡ活性を低下させるように改変された」とは、例えば、細胞あたりのＮｈｏＡの分子数が低下した場合や、分子あたりのＮｈｏＡ活性が低下した場合等が該当する。具体的には、ＮｈｏＡ活性を低下させるための改変は、通常の変異誘発処理又は遺伝子工学的な処理により導入され得る。変異誘発処理の例としては、Ｘ線又は紫外線照射、変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる処理等が挙げられる。このような改変の例としては、ＮｈｏＡ活性が非変異株と比較して低減されるか又は消失されるよう、染色体上のｎｈｏＡ遺伝子（発現調節領域を含む）に変異を導入するか又はｎｈｏＡ遺伝子の一部もしくは全体を欠損させることが挙げられる。遺伝子を変異させるか又は欠損するための方法の例としては、プロモーター及びシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列などの発現調節配列の改変、オープンリーディングフレーム中へのミスセンス変異、ナンセンス変異又はフレームシフト変異の導入、並びに遺伝子の一部分の欠失が挙げられる（J  Biol  Chem.  1997,  272  (13):  8611-7）。また、ｎｈｏＡ遺伝子の変異または欠損は、染色体上の野生型遺伝子を変異または欠損を有する遺伝子に置き換える相同組換え法を用いることにより、或いはトランスポゾン又はＩＳ因子を用いることにより、微生物中に導入され得る。相同組換え法としては、線状ＤＮＡ、温度感受性プラスミド及び非複製プラスミドを用いる方法が挙げられる。これらの方法は、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  Ｊｕｎ  ６；９７（１２）：６６４０−５、米国特許第６３０３３８３号、特開平０５−００７４９１号公報等に記載されている。
【００１５】
標的酵素の活性及び活性の低下の程度は、候補菌株から得られる細胞抽出物又はその精製分画を用いて酵素活性を測定し、それを野生株又は非改変株の活性と比較することにより確認され得る。例えば、ＮｈｏＡ活性は、非特許文献３に記載の方法により測定され得る。
【００１６】
ＮｈｏＡ活性が低下するように改変されるエシェリヒア・コリとしては、３，４−ＡＨＢＡ産生能を固有に有するエシェリヒア・コリ、および３，４−ＡＨＢＡ産生能を固有に有しないものの、３，４−ＡＨＢＡ産生能が付与されたエシェリヒア・コリが挙げられる。３，４−ＡＨＢＡ産生能の付与は、後述する方法により行うことができる。本発明で用いられるエシェリヒア・コリとしては、任意の適切な株を用いることができるが、例えば、Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）またはその亜株（例、ＢＷ２５１１３（ＣＧＳＣ７６３０）、ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３７４７）、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５））、Ｂ株またはその亜株（例、ＢＬ２１（ＡＴＣＣＢＡＡ−１０２５）、ＲＥＬ６０６（ＣＧＳＣ１２１４９））が挙げられる。上記菌株のうち、ＣＧＳＣ番号が記載されているものは、Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）から分譲を受けることができる。また、上記菌株のうち、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）から分譲を受けることができる。
【００１７】
ＮｈｏＡとしては、配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、ｎｈｏＡ遺伝子としては、配列番号２３の塩基配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００１８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１９】
エシェリヒア・コリの株によってｎｈｏＡ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがある。例えば、ｎｈｏＡ遺伝子をコードするタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつＮｈｏＡ活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から５０個、さらに好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、ｎｈｏＡ遺伝子を保持する微生物の個体差に基づき天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
【００２０】
ｎｈｏＡ遺伝子はまた、配列番号２３の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００２１】
＜２＞ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を増大させる改変
本発明の細菌は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）を生成する活性が増大するように改変されたものであってもよい。このような改変は、例えば、ＤＨＡＰとＡＳＡから３，４−ＡＨＢＡを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで本発明の細菌を形質転換することにより達成できる。ＤＨＡＰとＡＳＡから３，４−ＡＨＢＡを生成する活性を有するタンパク質は、ＤＨＡＰおよびＡＳＡからの３，４−ＡＨＢＡの生成に資するものである限り特に限定されず、例えば、ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性（以下、アルドラーゼ活性と略することがある）を有するタンパク質、およびＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性（以下、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性と略することがある）を有するタンパク質が含まれる。以下、両活性を併せて、３，４−ＡＨＢＡ生合成能ということがある。
【００２２】
ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＩ遺伝子、又は、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログ（ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＩ遺伝子ホモログを併せて、単にｇｒｉＩ遺伝子ということがある）が挙げられる。ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Ｂｌａｓｔ検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のｎｓｐＩ遺伝子（配列番号１４、１５）、フランキア・エスピー由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ  （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＹＰ＿４８３２８２）、同Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７２）、ストレプトマイセス・スカビエス由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ）、バークホルデリア・エスピー３８３由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ３９ＮＱ９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ＿２４７３７４）、エシェリヒア・コリ由来のｄｈｎＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）。
【００２３】
ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＨ遺伝子、又は、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログ（ｇｒｉＨ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子ホモログを併せて、単にｇｒｉＨ遺伝子ということがある）が挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Ｂｌａｓｔ検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のｎｓｐＨ遺伝子（配列番号１６、１７）、フランキア・エスピー由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８３２８３）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７１）、バークホルデリア・エスピー３８３由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＹＰ＿３６６５５２）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿３６６５５３）、ストレプトマイセス・スカビエス由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（〈ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ〉）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ＿２４８２４４）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）。
【００２４】
本発明で用いられるＧｒｉＩおよびＧｒｉＨ、またはｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、任意の生物に由来するものを用いることができる。例えば、上述したような細菌または放線菌等の微生物に由来するものであってもよく、好ましくは、放線菌に由来するものであってもよい。放線菌としては、例えば、ストレプトマイセス属の微生物が挙げられる。ストレプトマイセス属に属する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒａｙａｍａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）が挙げられる。ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨ、またはｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、同一の微生物に由来していてもよいし、異なる微生物に由来していてもよい。
【００２５】
ＧｒｉＩホモログとしては、上記ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号５または１４に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が挙げられる。また、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとしては、上記ｇｒｉＩ遺伝子の塩基配列である配列番号６または１５に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、特許文献２の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８または２０が挙げられる。
【００２６】
ＧｒｉＨホモログとしては、上記ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号７または１６に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が挙げられる。また、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとしては、上記ｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列である配列番号８または１７に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、特許文献２の配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４が挙げられる。
【００２７】
アミノ酸配列において変異により活性に影響を与えないアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして、タンパク質変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、１）複数のホモログタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。なお、特許文献２は、上記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント（特許文献２の図１及び図２）、上記ｇｒｉＨ遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント（特許文献２の図３及び図４）、これらのコンセンサス（共通）配列（特許文献２の配列番号３６、３７）を開示している。前記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログには、特許文献２の配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログには、特許文献２の配列番号３７のアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。
【００２８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、上述したように決定することができる。
【００２９】
微生物の種や菌株によってｇｒｉＩ遺伝子やｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、エシェリヒア・コリ内で発現することにより、例えば、発現を増強することにより、エシェリヒア・コリの３，４−ＡＨＢＡの生産能を向上させることができるものであればよい。例えば、ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質としては、ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号５または１４）において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつアルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質としては、ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号７または１６）において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつ３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から５０個、さらに好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異は、上述したとおりである。
【００３０】
さらに、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、エシェリヒア・コリで使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、エシェリヒア・コリの３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、Ｃ末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で５０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。より具体的には、Ｎ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸、又はＣ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
【００３１】
このようなｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むようにそのアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２，２８（１９９２））、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９（１９９４））、ＳｔＥＰ−ＰＣＲ（Ｚｈａｏ，Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２５８（１９９８））によって、遺伝子組換えにより人工的にｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子に変異を導入して活性の高い酵素をコードする遺伝子を取得することが出来る。
【００３２】
ｇｒｉＩ遺伝子はまた、ｇｒｉＩ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列（例、配列番号６または１５、あるいは特許文献２の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８または２０）に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。ｇｒｉＨ遺伝子はまた、ｇｒｉＨ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列（例、配列番号８または１７、あるいは特許文献２の配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４）に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。「ストリンジェントな条件」は、上述したものと同様である。
【００３３】
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の遺伝子についても同様に適用される。
【００３４】
これらのｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子ならびにそれらのホモログ遺伝子が発現することにより３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、これらの遺伝子をフィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有する細菌等に導入し、３，４−ＡＨＢＡ生成活性が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。その場合、例えば鈴木らの方法［Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８１，８２３−８３３（２００６）］に従い、３，４−ＡＨＢＡを逆相クロマトグラフィーにより定量することでより明確に効果を検証することができる。
【００３５】
＜３＞組換えベクター
所望の遺伝子を発現ベクターに導入することによって、本発明に用いられ得る組換えベクターを得ることができる。例えば、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨの双方が用いられる場合、それぞれ発現可能な状態で形質転換体に含まれる限り、それぞれ別の組換えベクターに搭載して形質転換に用いても良いし、ｇｒｉＩとｇｒｉＨを適当なスペーサーにより連結して、同一の組換えベクターに搭載し、形質転換に用いても良い。また、ｇｒｉＩとｇｒｉＨは同一の微生物に由来する遺伝子であってもよいし、異種微生物に由来する遺伝子であってもよい。同一の微生物に由来する遺伝子であり、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨは染色体上の近接した位置に存在する場合は、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨの双方を含む部位においてＤＮＡを切り出し、ベクターに搭載しても良い。
【００３６】
本発明に使用する組換えベクターは、一般にプロモーター、前述の本発明のＤＮＡ、例えばｇｒｉＩおよびｇｒｉＨ、およびエシェリヒア・コリ中で該遺伝子を発現させるために必要な制御領域（オペレーターやターミネーター）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。
【００３７】
組換えベクターとして使用できる発現ベクターは特に制限されず、エシェリヒア・コリ中で機能し得るベクターであればよく、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。具体的には、発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＴＶ（例、ｐＳＴＶ２８）、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８、ｐＭＷ２１９）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ）およびその誘導体が挙げられる。
【００３８】
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に通常用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００３９】
＜４＞形質転換体
本発明の細菌は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有し、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性が低下するように改変されているエシェリヒア・コリである限り特に限定されないが、好ましくは形質転換体である。本発明の形質転換体は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることが好ましい。
【００４０】
宿主として用いられるエシェリヒア・コリは、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを効率的に供給できる株であることが好ましい。エシェリヒア・コリは、非共役酵素であり、単独で機能するアスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）を有する。エシェリヒア・コリのＡＫＩＩＩは、本来、リジンによるフィードバック阻害を受ける。エシェリヒア・コリとしては、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異を持ったＡＫＩＩＩ遺伝子を有するものが好ましい。
【００４１】
リジン等のアミノ酸によるフィードバック阻害を解除し得る変異は、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、セラチア・マルセッセンス等の種々の微生物由来のアスパルトキナーゼについて報告されている。エシェリヒア・コリのＡＫＩＩＩについて、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異としては、例えば、２５０位のグルタミン酸のリジンへの変異（Ｅ２５０Ｋ）、３１８位のメチオニンのイソロイシンへの変異（Ｍ３１８Ｉ）、３４４位のスレオニンのメチオニンへの変異（Ｔ３４４Ｍ）、３４５位のセリンのロイシンへの変異（Ｓ３４５Ｌ）、３５２位のスレオニンのイソロイシンへの変異（Ｔ３５２Ｉ）が報告されている（例、Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７３，２１１−２１５（１９９９）、およびＦａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，５７７−５８２（１９９５）を参照）。したがって、本発明では、このような変異が導入されたＡＫＩＩＩ遺伝子を有するエシェリヒア・コリを用いることができる。なお、ＡＫＩＩＩについては、野生型であってもその由来するエシェリヒア・コリの株によって数個のアミノ酸残基の相違があるものがあり、このようなアレル変異体を用いてもよい。アレル変異体について前記フィードバック阻害を解除するための改変部位は、当業者にとって公知の配列アラインメントを実施することにより対応する箇所を特定することができる。ＡＫＩＩＩのフィードバック阻害を解除するための改変は、当業者にとって公知の方法、例えば、２−アミノエチルシステイン等のリジンアナログに耐性を有する変異株の取得や相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入によって達成できる。また、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫＩＩＩ遺伝子を含むプラスミドを用いてエシェリヒア・コリを形質転換することによっても、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫＩＩＩの活性を強化したエシェリヒア・コリを得ることができる。
【００４２】
また、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫＩＩＩ遺伝子を有するエシェリヒア・コリは、さらにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したものであってもよい。
【００４３】
ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターによるエシェリヒア・コリの形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，１０６７−１０７０（１９８９））等を使用することができる。ＡＫＩＩＩのフィードバック阻害を解除するための形質転換を行う場合、３，４−ＡＨＢＡ生成活性を付与するための形質転換とＡＫＩＩＩのフィードバック阻害を解除するための形質転換のいずれを先に行っても良い。
【００４４】
＜５＞３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類およびそれを構成単位として含むポリマーの製造方法
本発明はまた、本発明の細菌を培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。
【００４５】
本発明における３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類には、以下の構造を有する３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸(以下、「３，４−ＡＨＢＡ」と略すことがある)並びにその誘導体およびその塩が含まれる。
【００４６】
【化２】
2013129001.tif 000003
【００４７】
３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の誘導体は、（１）１位のカルボキシル基、３位のアミノ基および４位のヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１つの基が誘導体化されているか、または（２）１位のカルボキシル基、３位のアミノ基および４位のヒドロキシル基を保持し、かつ２位、５位および６位の炭素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つの炭素原子上の水素原子が他の原子または基により置換されているか、あるいは（３）上記（１）および（２）の組合せによるものである。上記（２）における他の原子または基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素原子数１〜６個のアルキル基）、ヒドロキシル基、アルキルオキシ基（アルキル部分は、上記と同様）、アミノ基、モノまたはジアルキルアミノ基（アルキル部分は、上記と同様）、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、カルボキシル基が挙げられる。具体的には、上記（１）の誘導体としては、例えば、１位のカルボキシル基が誘導体化された誘導体（例、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸のカルボキシル基がアルデヒド化された３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、３位のアミノ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、３−アルキルアミノ誘導体）、および４位のヒドロキシ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、４−モノまたはジアルキルアミノ誘導体）が挙げられる。
塩としては、カルボン酸のアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。
【００４８】
本発明の細菌を培養し、培地中で生産される３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収することによって、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。
【００４９】
本発明の細菌を培養するための培地は、エシェリヒア・コリが生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。培養温度は、通常、２５℃〜４２℃であり、ｐＨは５〜８に制御することが望ましい。培養時間は、通常、２０時間〜９０時間である。
【００５０】
本発明の細菌の培養は、酸素供給律速条件下で行うことが望ましい。具体的には菌体生育が対数増殖期に移行した段階で２．０ｐｐｍ以下に保持されることが望ましい。
【００５１】
該培養液から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収・精製する工程で用いる回収方法は、公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、該培養液を３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の溶解性の高い酸性ｐＨに調整してから、菌体を遠心分離や膜ろ過等の方法により除去した培養液上清から回収することが好ましい。菌体を除去した培養液上清からからの３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の回収方法としては、多孔性吸着剤による精製、晶析、沈殿化などが挙げられる。
【００５２】
本発明において使用される多孔性吸着剤とは、表面積の大きな多孔質の固型吸着剤であり、具体的には、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、ボーキサイト、マグネシア、活性白土、アクリル系合成吸着剤等に代表される親水性吸着剤、木炭、骨炭、活性炭、芳香族系合成吸着剤等に代表される疎水性吸着剤が挙げられる。本発明においては、不純物を吸着することよって３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上できるものであれば特に限定なく使用できる。ただし、多孔性吸着剤によって吸着される不純物とは、主として生化学的合成の過程において生産される芳香族系化合物が多く含有されるので、本発明においてはこれらの化合物が吸着しやすい活性炭や芳香族系合成吸着剤に代表される疎水性吸着剤が好適に用いられる。これら疎水性吸着剤は単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５３】
活性炭が使用される場合には、その原料としては特に限定はなく、例えば木粉、ヤシ殻などの植物原料、無煙炭、石油ピッチ、コークス等の石炭、石油系原料、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂などの合成樹脂系原料などが挙げられる。また活性炭の形状としては粉末状、粒状、繊維状、フィルターやカートリッジ状の二次加工品等があるが特に限定はなく適宜取り扱いやすいものを選択すればよい。
【００５４】
一方、芳香族系合成吸着剤が使用される場合には、その原料としては特に限定はないが、例えば１）無置換基型の芳香族系樹脂、２）疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、３）無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂等の多孔性樹脂が使用できる。具体的化合物としては、例えばスチレン‐ジビニルベンゼン系樹脂等が挙げられる。
【００５５】
前述したように該培養液中の３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を多孔性吸着剤に接触させる目的は、不純物を多孔性吸着剤に吸着せしめ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上させることにあるが、不純物と同時に目的生成物である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類も該多孔性吸着剤に少なからず吸着されてしまう場合がある。そこで該培養液中の３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を接触させた後、該多孔性吸着剤に極性有機溶媒を接触させ、該多孔性吸着剤から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に溶離させることでも３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を単離、回収することが可能である。本発明において使用される極性有機溶媒とは高い誘電率をもつ極性分子からなる有機溶媒のことをいい、上記したように、多孔性吸着剤から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を溶離させることができるものであれば特に限定されることなく使用できる。極性有機溶媒は単独で使用しても構わないし、２種類以上を所望の配合比で組み合わせて使用しても良い。
【００５６】
本発明における晶析または沈殿化とは、目的物質が溶解している溶媒を蒸発させて濃縮したり、あるいは温度を下げたり、あるいは目的物質が溶解している溶媒に貧溶媒を加えたりすることによって、飽和溶解度よりも濃度を高くすることにより結晶または沈殿を生じさせる操作のことを言い、従来公知の方法を含め特に限定されるものではない。また生成した結晶または沈殿は、沈降、濾過、遠心分離などによって分離することができる。
【００５７】
本発明はまた、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法を提供する。本発明のポリマーの製造方法は、前述の本発明の方法により得られる３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、少なくとも一つのポリマー構成成分としてポリマー化する工程を含む。例えば、前述したように、本発明の細菌の培養液中から多孔性吸着剤を用いて、あるいは、晶析、沈殿化などによって純度を向上させた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、高温においてメタンスルフォン酸、もしくは、ポリリン酸のような非酸化溶媒酸中で、重縮合によって重合することによってポリマー化される（例、国際公開第９１／０１３０４号参照）。本発明のポリマーの製造方法では、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、他のポリマー構成成分とポリマー化させてもよい。他のポリマー構成成分としては、例えば、テレフタル酸およびビスフェノールＡ、またはテレフタル酸およびｐ−フェニレンジアミンが挙げられる。ポリマー化の方法は種々の公知の方法を適用することによって実施可能である（米国特許５１４２０２１号公報、米国特許５２１９９８１号公報、米国特許５４２２４１６号公報、Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ  ｅｔ．  ａｌ．，（１９９２）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９３，２４６７−２４７６、Ｍａｒｃｏｓ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００１）Ｐｏｌｙｍｅｒ，４２，７９３３−７９４１）。本発明の方法により製造される、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーとしては、例えば、ポリベンゾオキサゾールポリマー、ポリエステル、ポリアミドが挙げられる。
【実施例】
【００５８】
実施例１：エシェリヒア・コリが有する３，４−ＡＨＢＡの変換を触媒する酵素の探索
（１）エシェリヒア・コリのゲノム情報をもとにした３，４−ＡＨＢＡ変換酵素の探索
ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株において、アリールアミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（同意語：ＮａｔＡ；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＢＡＦ４６９７１．１）が３，４−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化反応を触媒することが報告されており、ＮａｔＡのアミノ酸配列が公知となっている［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８９，２１５５−２１５９］。
ＮａｔＡのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＮａｔＡと同様の機能を有する酵素を探索するため、エシェリヒア・コリＫ−１２株のゲノム情報から、ＮａｔＡと相同性を示す配列を検索した。公開されているデータベース（ＥｃｏＣｙｃ，ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／，Ｋｅｓｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３，３３４−３３７）を利用し、ｂｌａｓｔｐを用いて検索を行った結果、エシェリヒア・コリＫ−１２株のＮ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（同意語：ＮｈｏＡ，ＥＣ：２．３．１．１１８，ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＮＰ＿４１５９８０．１）が、ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株由来ＮａｔＡと４９％の相同性を示すことを見出した。ＮｈｏＡのアミノ酸配列を配列番号２に示す。【００５９】
（２）エシェリヒア・コリｎｈｏＡ遺伝子欠損株および野生株の３，４−ＡＨＢＡ変換能の解析
ＮｈｏＡをコードする遺伝子（同意語：ｎｈｏＡ，ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＣ＿０００９１３．２，ＧＩ：９４７２５１）が欠損された株として、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ（同株：ＪＷ１４５８，Ｋｅｉｏ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）株を利用した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株は、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株（Ｈａｌｄｉｍａｎｎ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３，６３８４−６３９３）（ＣＧＳＣ７６３０）からｎｈｏＡ遺伝子を欠損した株である（Ｂａｂａ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，２，２００６−２００８）。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株は、国立遺伝学研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）から分譲を受けることができる。また、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株は、Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）から分譲を受けることができる。
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株とＢＷ２５１１３株の３，４−ＡＨＢＡ変換能を以下の手順に従って算出した。それぞれの株をＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を試験管中の４ｍＬのＭＳグルコース／３，４−ＡＨＢＡ培地に接種し、往復振とう培養装置で３０℃にて３０時間培養した。ＭＳグルコース／３，４−ＡＨＢＡ培地の組成は以下の表１に記載のとおりである。【００６０】
【表１】
2013129001.tif 000004
【００６１】
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、１２０℃で２０分オートクレーブを行なった。但し、ＧｌｕｃｏｓｅとＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは混合し、別殺菌した。ＣａＣＯ３は乾熱滅菌後に添加した。３，４−ＡＨＢＡは２０（ｇ／Ｌ）となるように蒸留水に溶解した後にＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、ろ過滅菌した後に終濃度２．０（ｇ／Ｌ）になるように添加した。【００６２】
培養終了後、培養液の６００ｎｍでのｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーを用いて分離し、濃度を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。各菌株の、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度および３，４−ＡＨＢＡ変換率を表２に示した。３，４−ＡＨＢＡ変換率は以下の算式によって求めた。
［３，４−ＡＨＢＡ変換率（％）］＝１００×｛２（ｇ／Ｌ）−［培養終了後の培養液上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度（ｇ／Ｌ）］｝／２（ｇ／Ｌ）【００６３】
【表２】
2013129001.tif 000005
【００６４】
この結果、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の培養上清液中では３，４−ＡＨＢＡ濃度は初発濃度の３０％までに減少した。一方、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株の培養上清液中では、３，４−ＡＨＢＡ濃度の減少は１０％程度に留まった。したがって、ＮｈｏＡが３，４−ＡＨＢＡの変換反応を触媒することが強く示唆された。
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の培養上清液、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株の培養上清液、および３，４−ＡＨＢＡ標準品（東京化成工業株式会社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ａ０８５９）に対する逆相カラムクロマトグラフィーのチャートを、図１に示した。これにより、３，４−ＡＨＢＡは、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株によって溶出時間（Ｒ．Ｔ．）９．５ｍｉｎ．に検出される化合物に変換されていることが示唆された。【００６５】
（３）３，４−ＡＨＢＡ変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）の分子量の同定
実施例１（２）に記載の、ＢＷ２５１１３株培養後の培養上清液中に含まれる３，４−ＡＨＢＡ変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）の分子量を、ＬＣ／ＭＳで同定した。分析条件は以下のとおりである。【００６６】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ２μｍ  ２．１×７５ｍｍ  （ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
移動相：Ａ＝０．１％  ギ酸／Ｈ２Ｏ
Ｂ＝０．１％  ギ酸／アセトニトリル
グラジェントプログラム  ０ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝１００／０
３ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝１００／０
２３ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝２０／８０
２５ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝２０／８０
流速：０．２（ｍＬ／ｍｉｎ．）
カラム温度：室温（２５℃）
検出波長：２５４ｎｍ（ＰＤＡ）
ＭＳイオン化モード：ＥＳＩ
分析機種：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０（ＬＣ）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳ  ６１３０（ＭＳ）【００６７】
分析の結果、変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）のｍ／ｚ値は１９５．１であり、３，４−ＡＨＢＡのアセチル化体の計算上のｍ／ｚ値（１９５．１）と一致した。以降、変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）を３，４−ＡｃＡＨＢＡと呼ぶ。【００６８】
実施例２：ストレプトマイセス・グリセウス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群の導入による３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築および３，４−ＡＨＢＡ、３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
次に、３，４−ＡＨＢＡ生産菌において、ｎｈｏＡ欠損が３，４−ＡＨＢＡの蓄積に与える効果を検証した。まず、３，４−ＡＨＢＡの生産能を付与する為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。
始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）およびエシェリヒア・コリ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片を化学合成した（塩基配列を配列番号３に示す）。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにて消化処理し、ＰｔａｃおよびＴｔｒｐを含むＤＮＡ断片を得た。精製したＤＮＡ断片と、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号４に示す）。本プラスミドのＰｔａｃ下流に目的遺伝子をクローニングすることで、目的遺伝子の発現増幅が可能となる。【００６９】
（２）エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子（ｇｒｉＩＨ遺伝子）の化学合成
ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株において、３，４−ＡＨＢＡの合成はアルドラーゼ（同意語：ＳＧＲ＿４２４９，ＧｒｉＩ）および３，４−ＡＨＢＡシンターゼ（同意語：ＳＧＲ＿４２４８，ＧｒｉＨ）からなる３，４−ＡＨＢＡ合成酵素群によって触媒される事が既に知られており、これらをコードする遺伝子の配列が公知となっている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。ＧｒｉＩは、ｇｒｉＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ２５９６６３．１、ヌクレオチド１３９５６〜１４７８０；ＧＩ：１１７６７６０６０）によりコードされている。ＧｒｉＩタンパク質のアミノ酸配列およびｇｒｉＩ遺伝子の塩基配列を配列番号５および配列番号６にそれぞれ示す。また、ＧｒｉＨは、ｇｒｉＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ２５９６６３．１、ヌクレオチド１２６９０〜１３８８０；ＧＩ：１１７６７６０５９）によりコードされている。ＧｒｉＨタンパク質のアミノ酸配列およびｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列を配列番号７および配列番号８にそれぞれ示す。
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをＥｃＧｒｉＩＨと名付けた。ＥｃＧｒｉＩＨの５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った（配列番号９に示す）。両末端に制限酵素認識配列が付与されたＥｃＧｒｉＩＨは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉと名付けた。ｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉの全長配列を配列番号１０に示す。【００７０】
（３）ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子（ｇｒｉＩＨ遺伝子）発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉを鋳型として、配列番号１１に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号１２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、反応条件は９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて１５０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥｃＧｒｉＩＨ遺伝子断片を含む、約２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＥｃＧｒｉＩＨ遺伝子断片と、ＳｍａＩで消化処理されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｇｒｉＩＨ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉと名付けた。ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉの全長配列を配列番号１３に示す。【００７１】
（４）３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株、並びにＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＢＷ２５１１３株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と名付け、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉが導入された株をＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と名付けた。【００７２】
（５）３，４−ＡＨＢＡ生産培養評価
ＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株、及びＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を試験管中の３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび０．１（ｍＭ）のイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含むＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃、４８時間の培養を行った。ＭＳグルコース／Ａｓｐ培地の組成は以下の表３に記載のとおりである。【００７３】
【表３】
2013129001.tif 000006
【００７４】
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、１２０℃で２０分オートクレーブを行なった。但し、ＧｌｕｃｏｓｅとＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは混合し、別殺菌した。ＣａＣＯ３は乾熱滅菌後に添加した。【００７５】
培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、濃度を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２００６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度および３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度を表４に示した。ＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株では３，４−ＡｃＡＨＢＡが検出されず、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と比べて、大幅に３，４−ＡＨＢＡの濃度が上昇した。【００７６】
【表４】
2013129001.tif 000007
【００７７】
実施例３：ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群の導入による３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築および３，４−ＡＨＢＡ、３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子の化学合成
ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒａｙａｍａｅｎｓｉｓ）（Ｆｕｒｕｓａｋｉ  ｅｔ.  ａｌ．，（１９７２）Ｉｓｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１０，１７３−１８７）において、３，４−ＡＨＢＡの合成はアルドラーゼ（同意語：ＮｓｐＩ；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＢＡＪ０８１７１．１）および３，４−ＡＨＢＡシンターゼ（同意語：ＮｓｐＨ；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＢＡＪ０８１７２．１）からなる３，４−ＡＨＢＡ合成酵素群によって触媒される事が既に知られており、これらをコードする遺伝子の配列が公知となっている（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４１−６４３）。ＮｓｐＩは、ｎｓｐＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ５３０１３６、ヌクレオチド８７３０〜９５８４；  ＧＩ：  ２９６７８４９４３）によりコードされている。ＮｓｐＩタンパク質のアミノ酸配列およびｎｓｐＩ遺伝子の塩基配列を配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示す。また、ＮｓｐＨは、ｎｓｐＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ５３０１３６、ヌクレオチド９５９９〜１０７０２；ＧＩ：２９６７８４９４４）によりコードされている。ＮｓｐＨタンパク質のアミノ酸配列およびｎｓｐＨ遺伝子の塩基配列を配列番号１６および配列番号１７にそれぞれ示す。
ｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをＥｃＮｓｐＩＨと名付けた。ＥｃＮｓｐＩＨの５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った（配列番号１８に示す）。両末端に制限酵素認識配列が付与されたＥｃＮｓｐＩＨは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ５７−ＥｃＮｓｐと名付けた。ｐＵＣ５７−ＥｃＮｓｐの全長配列を配列番号１９に示す。【００７８】
（２）ｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子（ｎｓｐＩＨ遺伝子）発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＥｃＮｓｐを鋳型として、配列番号２０に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号２１に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、反応条件は９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて１５０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥｃＮｓｐＩＨ遺伝子断片を含む、約２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＥｃＮｓｐＩＨ遺伝子断片と、ＳｍａＩで消化処理されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（実施例２に記載）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｎｓｐＩＨ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐと名付けた。ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐの全長配列を配列番号２２に示す。【００７９】
（３）３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株、並びにＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＢＷ２５１１３株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と名付け、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐが導入された株をＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と名付けた。【００８０】
（４）３，４−ＡＨＢＡ生産培養評価
ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株、及びＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を試験管中の３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび０．１（ｍＭ）のイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む表３に記載のＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃、４８時間の培養を行った。【００８１】
培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、濃度を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度および３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度を表５に示した。ＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株では３，４−ＡｃＡＨＢＡが検出されず、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と比べて、大幅に３，４−ＡＨＢＡの濃度が上昇した。【００８２】
【表５】
2013129001.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によって、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体やポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用であるアミノヒドロキシ安息香酸類を簡便安価に製造することができる。よって、例えば、本発明によって得られた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を重合することでポリベンゾオキサゾール（ＰＢＯ）が得られ、これにより高強度、高弾性率、高耐熱性を有するＰＢＯ繊維やＰＢＯフィルムなどを安価に提供することが可能となる。また、原料である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生合成によって製造することが可能であることから、本発明の方法は環境低負荷型のプロセスとなり、地球環境に対して優しい製造方法である。
【図１】
2013129001.tif 000009
【配列表】
2013129001000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月18日(2014.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリ、およびそれを用いたアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノヒドロキシ安息香酸類は、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体や、高性能耐熱性高分子ポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用である。３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）を基質として、アミノ基を持ったＣ４化合物とＣ３あるいはＣ４化合物との炭素−炭素結合反応を触媒する酵素であるＧｒｉＩ、ならびにＣ７化合物の環化あるいはＣ８化合物の脱炭酸を伴った環化を触媒する酵素であるＧｒｉＨの双方によって２段階で生合成される。
【０００３】
【化１】
2013129001.tif 000010
【０００４】
本発明に関連する先行技術としては、以下がある。
特許文献１には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨを導入したストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）を用いる３，４−ＡＨＢＡの製造方法が開示されている。特許文献１はまた、３，４−ＡＨＢＡの副生物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）が生成すること、および３，４−ＡｃＡＨＢＡを脱アセチル化処理して３，４−ＡＨＢＡを生成することを開示している。３，４−ＡｃＡＨＢＡの具体的な脱アセチル化処理方法としては、水酸化ナトリウムなどの強塩基や塩酸などの強酸の使用を例示しており、強塩基や強酸を使用しなければならないという課題がある。
特許文献２には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いることにより３，４−ＡＨＢＡが生成されることが開示されている。
非特許文献１には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨのエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）への導入により３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡが生成されることが開示されている。
非特許文献２には、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてアリールアミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎａｔＡ）を欠失させると、培養中に３，４−ＡｃＡＨＢＡが生成されなくなることが開示されている。
非特許文献３には、エシェリヒア・コリ由来のＮ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｈｏＡ）の機能として、芳香族アミノ基に対するアセチル化を触媒することが開示されている。一方、非特許文献４には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１株が３，５−ＡＨＢＡ（３，４−ＡＨＢＡの構造異性体）の副生物としてＮ−アセチル化体（３，５−ＡｃＡＨＢＡ）を生成すること、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１のｎｈｏＡ遺伝子欠損株（ＭＡＲ１株）においても、３，５−ＡｃＡＨＢＡが副生するため、ＮｈｏＡが３，５−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化の主要な要因ではないと考えられることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２８３１６３号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／００５０９９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６），３６９４４−３６９５１
【非特許文献２】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９（２００７），２１５５−２１５９
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４７５（２０００），１０−１６
【非特許文献４】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，ｖｏｌ．５９（２００６），ｐ．４６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、生合成法による製造プロセスに汎用されている細菌であるエシェリヒア・コリを利用することにより、簡便安価に製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、エシェリヒア・コリにおける３，４−ＡＨＢＡからの３，４−ＡｃＡＨＢＡの副生にはｎｈｏＡが関与すること、したがって、ＮｈｏＡ活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリの使用により、アセチル化されていない３，４−ＡＨＢＡを大量生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ。
〔２〕染色体上のｎｈｏＡ遺伝子が変異または欠損されたことによりＮｈｏＡ活性が低下した、〔１〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔３〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔１〕または〔２〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔４〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨである、〔３〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔５〕前記ＧｒｉＩが、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記ＧｒｉＨが、下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔４〕に記載のエシェリヒア・コリ：
（Ａ）配列番号５または配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号７または配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｆ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
〔６〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を含む、〔３〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔７〕ｇｒｉＩ遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡであり、かつ、ｇｒｉＨ遺伝子が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つに記載のＤＮＡである、[６]に記載のエシェリヒア・コリ：
（ａ）配列番号６または配列番号１５の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列番号８または配列番号１７の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｅ）上記（ｄ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）上記（ｄ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するＤＮＡ。
〔８〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子が放線菌由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔９〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス属由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔１０〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス・グリセウス由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔１１〕ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子がストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来である、〔７〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔１２〕フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子を有する、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のエシェリヒア・コリ。
〔１３〕〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載のエシェリヒア・コリを培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
〔１４〕〔１３〕に記載の方法により製造した３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法。
〔１５〕前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、〔１４〕の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、簡便安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、（ａ）エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の培養上清液、（ｂ）エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株の培養上清液および（ｃ）３，４−ＡＨＢＡ標準品の、逆相カラムクロマトグラフィーでの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する細菌、エシェリヒア・コリを提供する。本発明の細菌では、アセチル化された副生物（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）の生成が抑制され得る。
【００１３】
＜１＞Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性を低下させる改変
本発明の細菌は、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性を低下させるように改変することにより、アセチル化された副生物の生成が抑制され得る。ＮｈｏＡ活性とは、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性であり、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）との関係では、３，４−ＡＨＢＡから３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）を生成する活性をいう。
【００１４】
「ＮｈｏＡ活性を低下させるように改変された」とは、ＮｈｏＡ活性が、非改変株、例えば、野生株のエシェリヒア・コリの比活性よりも低くなったことをいう。ＮｈｏＡ活性は、非改変株と比較して、菌体当たり５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに望ましくは菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。本発明のエシェリヒア・コリは、野生株又は非改変株よりＮｈｏＡ活性が低下していればよいが、さらにこれらの株に比べて３，４−ＡＨＢＡの蓄積が向上していることがより望ましい。また、「ＮｈｏＡ活性を低下させるように改変された」とは、例えば、細胞あたりのＮｈｏＡの分子数が低下した場合や、分子あたりのＮｈｏＡ活性が低下した場合等が該当する。具体的には、ＮｈｏＡ活性を低下させるための改変は、通常の変異誘発処理又は遺伝子工学的な処理により導入され得る。変異誘発処理の例としては、Ｘ線又は紫外線照射、変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる処理等が挙げられる。このような改変の例としては、ＮｈｏＡ活性が非変異株と比較して低減されるか又は消失されるよう、染色体上のｎｈｏＡ遺伝子（発現調節領域を含む）に変異を導入するか又はｎｈｏＡ遺伝子の一部もしくは全体を欠損させることが挙げられる。遺伝子を変異させるか又は欠損するための方法の例としては、プロモーター及びシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列などの発現調節配列の改変、オープンリーディングフレーム中へのミスセンス変異、ナンセンス変異又はフレームシフト変異の導入、並びに遺伝子の一部分の欠失が挙げられる（J  Biol  Chem.  1997,  272  (13):  8611-7）。また、ｎｈｏＡ遺伝子の変異または欠損は、染色体上の野生型遺伝子を変異または欠損を有する遺伝子に置き換える相同組換え法を用いることにより、或いはトランスポゾン又はＩＳ因子を用いることにより、微生物中に導入され得る。相同組換え法としては、線状ＤＮＡ、温度感受性プラスミド及び非複製プラスミドを用いる方法が挙げられる。これらの方法は、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  Ｊｕｎ  ６；９７（１２）：６６４０−５、米国特許第６３０３３８３号、特開平０５−００７４９１号公報等に記載されている。
【００１５】
標的酵素の活性及び活性の低下の程度は、候補菌株から得られる細胞抽出物又はその精製分画を用いて酵素活性を測定し、それを野生株又は非改変株の活性と比較することにより確認され得る。例えば、ＮｈｏＡ活性は、非特許文献３に記載の方法により測定され得る。
【００１６】
ＮｈｏＡ活性が低下するように改変されるエシェリヒア・コリとしては、３，４−ＡＨＢＡ産生能を固有に有するエシェリヒア・コリ、および３，４−ＡＨＢＡ産生能を固有に有しないものの、３，４−ＡＨＢＡ産生能が付与されたエシェリヒア・コリが挙げられる。３，４−ＡＨＢＡ産生能の付与は、後述する方法により行うことができる。本発明で用いられるエシェリヒア・コリとしては、任意の適切な株を用いることができるが、例えば、Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）またはその亜株（例、ＢＷ２５１１３（ＣＧＳＣ７６３０）、ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３７４７）、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５））、Ｂ株またはその亜株（例、ＢＬ２１（ＡＴＣＣＢＡＡ−１０２５）、ＲＥＬ６０６（ＣＧＳＣ１２１４９））が挙げられる。上記菌株のうち、ＣＧＳＣ番号が記載されているものは、Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）から分譲を受けることができる。また、上記菌株のうち、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）から分譲を受けることができる。
【００１７】
ＮｈｏＡとしては、配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、ｎｈｏＡ遺伝子としては、配列番号１８の塩基配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００１８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１９】
エシェリヒア・コリの株によってｎｈｏＡ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがある。例えば、ｎｈｏＡ遺伝子をコードするタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつＮｈｏＡ活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から５０個、さらに好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、ｎｈｏＡ遺伝子を保持する微生物の個体差に基づき天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
【００２０】
ｎｈｏＡ遺伝子はまた、配列番号１８の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００２１】
＜２＞ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を増大させる改変
本発明の細菌は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）を生成する活性が増大するように改変されたものであってもよい。このような改変は、例えば、ＤＨＡＰとＡＳＡから３，４−ＡＨＢＡを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで本発明の細菌を形質転換することにより達成できる。ＤＨＡＰとＡＳＡから３，４−ＡＨＢＡを生成する活性を有するタンパク質は、ＤＨＡＰおよびＡＳＡからの３，４−ＡＨＢＡの生成に資するものである限り特に限定されず、例えば、ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性（以下、アルドラーゼ活性と略することがある）を有するタンパク質、およびＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性（以下、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性と略することがある）を有するタンパク質が含まれる。以下、両活性を併せて、３，４−ＡＨＢＡ生合成能ということがある。
【００２２】
ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＩ遺伝子、又は、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログ（ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＩ遺伝子ホモログを併せて、単にｇｒｉＩ遺伝子ということがある）が挙げられる。ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Ｂｌａｓｔ検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のｎｓｐＩ遺伝子（配列番号１４、１５）、フランキア・エスピー由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ  （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＹＰ＿４８３２８２）、同Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７２）、ストレプトマイセス・スカビエス由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ）、バークホルデリア・エスピー３８３由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ３９ＮＱ９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ＿２４７３７４）、エシェリヒア・コリ由来のｄｈｎＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）。
【００２３】
ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＨ遺伝子、又は、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログ（ｇｒｉＨ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子ホモログを併せて、単にｇｒｉＨ遺伝子ということがある）が挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Ｂｌａｓｔ検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のｎｓｐＨ遺伝子（配列番号１６、１７）、フランキア・エスピー由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８３２８３）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７１）、バークホルデリア・エスピー３８３由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＹＰ＿３６６５５２）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿３６６５５３）、ストレプトマイセス・スカビエス由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（〈ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ〉）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ＿２４８２４４）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）。
【００２４】
本発明で用いられるＧｒｉＩおよびＧｒｉＨ、またはｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、任意の生物に由来するものを用いることができる。例えば、上述したような細菌または放線菌等の微生物に由来するものであってもよく、好ましくは、放線菌に由来するものであってもよい。放線菌としては、例えば、ストレプトマイセス属の微生物が挙げられる。ストレプトマイセス属に属する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒａｙａｍａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）が挙げられる。ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨ、またはｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、同一の微生物に由来していてもよいし、異なる微生物に由来していてもよい。
【００２５】
ＧｒｉＩホモログとしては、上記ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号５または１４に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が挙げられる。また、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとしては、上記ｇｒｉＩ遺伝子の塩基配列である配列番号６または１５に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、特許文献２の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８または２０が挙げられる。
【００２６】
ＧｒｉＨホモログとしては、上記ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号７または１６に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が挙げられる。また、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとしては、上記ｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列である配列番号８または１７に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、特許文献２の配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４が挙げられる。
【００２７】
アミノ酸配列において変異により活性に影響を与えないアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして、タンパク質変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、１）複数のホモログタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。なお、特許文献２は、上記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント（特許文献２の図１及び図２）、上記ｇｒｉＨ遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント（特許文献２の図３及び図４）、これらのコンセンサス（共通）配列（特許文献２の配列番号３６、３７）を開示している。前記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログには、特許文献２の配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログには、特許文献２の配列番号３７のアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。
【００２８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、上述したように決定することができる。
【００２９】
微生物の種や菌株によってｇｒｉＩ遺伝子やｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、エシェリヒア・コリ内で発現することにより、例えば、発現を増強することにより、エシェリヒア・コリの３，４−ＡＨＢＡの生産能を向上させることができるものであればよい。例えば、ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質としては、ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号５または１４）において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつアルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質としては、ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号７または１６）において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつ３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献２の配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から５０個、さらに好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異は、上述したとおりである。
【００３０】
さらに、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、エシェリヒア・コリで使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、エシェリヒア・コリの３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、Ｃ末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で５０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。より具体的には、Ｎ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸、又はＣ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
【００３１】
このようなｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むようにそのアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２，２８（１９９２））、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９（１９９４））、ＳｔＥＰ−ＰＣＲ（Ｚｈａｏ，Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２５８（１９９８））によって、遺伝子組換えにより人工的にｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子に変異を導入して活性の高い酵素をコードする遺伝子を取得することが出来る。
【００３２】
ｇｒｉＩ遺伝子はまた、ｇｒｉＩ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列（例、配列番号６または１５、あるいは特許文献２の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８または２０）に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。ｇｒｉＨ遺伝子はまた、ｇｒｉＨ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列（例、配列番号８または１７、あるいは特許文献２の配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４）に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。「ストリンジェントな条件」は、上述したものと同様である。
【００３３】
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の遺伝子についても同様に適用される。
【００３４】
これらのｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子ならびにそれらのホモログ遺伝子が発現することにより３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、これらの遺伝子をフィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有する細菌等に導入し、３，４−ＡＨＢＡ生成活性が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。その場合、例えば鈴木らの方法［Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８１，８２３−８３３（２００６）］に従い、３，４−ＡＨＢＡを逆相クロマトグラフィーにより定量することでより明確に効果を検証することができる。
【００３５】
＜３＞組換えベクター
所望の遺伝子を発現ベクターに導入することによって、本発明に用いられ得る組換えベクターを得ることができる。例えば、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨの双方が用いられる場合、それぞれ発現可能な状態で形質転換体に含まれる限り、それぞれ別の組換えベクターに搭載して形質転換に用いても良いし、ｇｒｉＩとｇｒｉＨを適当なスペーサーにより連結して、同一の組換えベクターに搭載し、形質転換に用いても良い。また、ｇｒｉＩとｇｒｉＨは同一の微生物に由来する遺伝子であってもよいし、異種微生物に由来する遺伝子であってもよい。同一の微生物に由来する遺伝子であり、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨは染色体上の近接した位置に存在する場合は、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨの双方を含む部位においてＤＮＡを切り出し、ベクターに搭載しても良い。
【００３６】
本発明に使用する組換えベクターは、一般にプロモーター、前述の本発明のＤＮＡ、例えばｇｒｉＩおよびｇｒｉＨ、およびエシェリヒア・コリ中で該遺伝子を発現させるために必要な制御領域（オペレーターやターミネーター）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。
【００３７】
組換えベクターとして使用できる発現ベクターは特に制限されず、エシェリヒア・コリ中で機能し得るベクターであればよく、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。具体的には、発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＴＶ（例、ｐＳＴＶ２８）、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８、ｐＭＷ２１９）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ）およびその誘導体が挙げられる。
【００３８】
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に通常用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００３９】
＜４＞形質転換体
本発明の細菌は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有し、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性が低下するように改変されているエシェリヒア・コリである限り特に限定されないが、好ましくは形質転換体である。本発明の形質転換体は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることが好ましい。
【００４０】
宿主として用いられるエシェリヒア・コリは、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを効率的に供給できる株であることが好ましい。エシェリヒア・コリは、非共役酵素であり、単独で機能するアスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）を有する。エシェリヒア・コリのＡＫＩＩＩは、本来、リジンによるフィードバック阻害を受ける。エシェリヒア・コリとしては、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異を持ったＡＫＩＩＩ遺伝子を有するものが好ましい。
【００４１】
リジン等のアミノ酸によるフィードバック阻害を解除し得る変異は、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、セラチア・マルセッセンス等の種々の微生物由来のアスパルトキナーゼについて報告されている。エシェリヒア・コリのＡＫＩＩＩについて、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異としては、例えば、２５０位のグルタミン酸のリジンへの変異（Ｅ２５０Ｋ）、３１８位のメチオニンのイソロイシンへの変異（Ｍ３１８Ｉ）、３４４位のスレオニンのメチオニンへの変異（Ｔ３４４Ｍ）、３４５位のセリンのロイシンへの変異（Ｓ３４５Ｌ）、３５２位のスレオニンのイソロイシンへの変異（Ｔ３５２Ｉ）が報告されている（例、Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７３，２１１−２１５（１９９９）、およびＦａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，５７７−５８２（１９９５）を参照）。したがって、本発明では、このような変異が導入されたＡＫＩＩＩ遺伝子を有するエシェリヒア・コリを用いることができる。なお、ＡＫＩＩＩについては、野生型であってもその由来するエシェリヒア・コリの株によって数個のアミノ酸残基の相違があるものがあり、このようなアレル変異体を用いてもよい。アレル変異体について前記フィードバック阻害を解除するための改変部位は、当業者にとって公知の配列アラインメントを実施することにより対応する箇所を特定することができる。ＡＫＩＩＩのフィードバック阻害を解除するための改変は、当業者にとって公知の方法、例えば、２−アミノエチルシステイン等のリジンアナログに耐性を有する変異株の取得や相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入によって達成できる。また、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫＩＩＩ遺伝子を含むプラスミドを用いてエシェリヒア・コリを形質転換することによっても、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫＩＩＩの活性を強化したエシェリヒア・コリを得ることができる。
【００４２】
また、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫＩＩＩ遺伝子を有するエシェリヒア・コリは、さらにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したものであってもよい。
【００４３】
ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターによるエシェリヒア・コリの形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，１０６７−１０７０（１９８９））等を使用することができる。ＡＫＩＩＩのフィードバック阻害を解除するための形質転換を行う場合、３，４−ＡＨＢＡ生成活性を付与するための形質転換とＡＫＩＩＩのフィードバック阻害を解除するための形質転換のいずれを先に行っても良い。
【００４４】
＜５＞３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類およびそれを構成単位として含むポリマーの製造方法
本発明はまた、本発明の細菌を培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。
【００４５】
本発明における３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類には、以下の構造を有する３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸(以下、「３，４−ＡＨＢＡ」と略すことがある)並びにその誘導体およびその塩が含まれる。
【００４６】
【化２】
2013129001.tif 000011
【００４７】
３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の誘導体は、（１）１位のカルボキシル基、３位のアミノ基および４位のヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１つの基が誘導体化されているか、または（２）１位のカルボキシル基、３位のアミノ基および４位のヒドロキシル基を保持し、かつ２位、５位および６位の炭素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つの炭素原子上の水素原子が他の原子または基により置換されているか、あるいは（３）上記（１）および（２）の組合せによるものである。上記（２）における他の原子または基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素原子数１〜６個のアルキル基）、ヒドロキシル基、アルキルオキシ基（アルキル部分は、上記と同様）、アミノ基、モノまたはジアルキルアミノ基（アルキル部分は、上記と同様）、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、カルボキシル基が挙げられる。具体的には、上記（１）の誘導体としては、例えば、１位のカルボキシル基が誘導体化された誘導体（例、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸のカルボキシル基がアルデヒド化された３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、３位のアミノ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、３−アルキルアミノ誘導体）、および４位のヒドロキシ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、４−モノまたはジアルキルアミノ誘導体）が挙げられる。
塩としては、カルボン酸のアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。
【００４８】
本発明の細菌を培養し、培地中で生産される３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収することによって、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。
【００４９】
本発明の細菌を培養するための培地は、エシェリヒア・コリが生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。培養温度は、通常、２５℃〜４２℃であり、ｐＨは５〜８に制御することが望ましい。培養時間は、通常、２０時間〜９０時間である。
【００５０】
本発明の細菌の培養は、酸素供給律速条件下で行うことが望ましい。具体的には菌体生育が対数増殖期に移行した段階で２．０ｐｐｍ以下に保持されることが望ましい。
【００５１】
該培養液から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収・精製する工程で用いる回収方法は、公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、該培養液を３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の溶解性の高い酸性ｐＨに調整してから、菌体を遠心分離や膜ろ過等の方法により除去した培養液上清から回収することが好ましい。菌体を除去した培養液上清からからの３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の回収方法としては、多孔性吸着剤による精製、晶析、沈殿化などが挙げられる。
【００５２】
本発明において使用される多孔性吸着剤とは、表面積の大きな多孔質の固型吸着剤であり、具体的には、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、ボーキサイト、マグネシア、活性白土、アクリル系合成吸着剤等に代表される親水性吸着剤、木炭、骨炭、活性炭、芳香族系合成吸着剤等に代表される疎水性吸着剤が挙げられる。本発明においては、不純物を吸着することよって３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上できるものであれば特に限定なく使用できる。ただし、多孔性吸着剤によって吸着される不純物とは、主として生化学的合成の過程において生産される芳香族系化合物が多く含有されるので、本発明においてはこれらの化合物が吸着しやすい活性炭や芳香族系合成吸着剤に代表される疎水性吸着剤が好適に用いられる。これら疎水性吸着剤は単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５３】
活性炭が使用される場合には、その原料としては特に限定はなく、例えば木粉、ヤシ殻などの植物原料、無煙炭、石油ピッチ、コークス等の石炭、石油系原料、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂などの合成樹脂系原料などが挙げられる。また活性炭の形状としては粉末状、粒状、繊維状、フィルターやカートリッジ状の二次加工品等があるが特に限定はなく適宜取り扱いやすいものを選択すればよい。
【００５４】
一方、芳香族系合成吸着剤が使用される場合には、その原料としては特に限定はないが、例えば１）無置換基型の芳香族系樹脂、２）疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、３）無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂等の多孔性樹脂が使用できる。具体的化合物としては、例えばスチレン‐ジビニルベンゼン系樹脂等が挙げられる。
【００５５】
前述したように該培養液中の３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を多孔性吸着剤に接触させる目的は、不純物を多孔性吸着剤に吸着せしめ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上させることにあるが、不純物と同時に目的生成物である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類も該多孔性吸着剤に少なからず吸着されてしまう場合がある。そこで該培養液中の３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を接触させた後、該多孔性吸着剤に極性有機溶媒を接触させ、該多孔性吸着剤から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に溶離させることでも３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を単離、回収することが可能である。本発明において使用される極性有機溶媒とは高い誘電率をもつ極性分子からなる有機溶媒のことをいい、上記したように、多孔性吸着剤から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を溶離させることができるものであれば特に限定されることなく使用できる。極性有機溶媒は単独で使用しても構わないし、２種類以上を所望の配合比で組み合わせて使用しても良い。
【００５６】
本発明における晶析または沈殿化とは、目的物質が溶解している溶媒を蒸発させて濃縮したり、あるいは温度を下げたり、あるいは目的物質が溶解している溶媒に貧溶媒を加えたりすることによって、飽和溶解度よりも濃度を高くすることにより結晶または沈殿を生じさせる操作のことを言い、従来公知の方法を含め特に限定されるものではない。また生成した結晶または沈殿は、沈降、濾過、遠心分離などによって分離することができる。
【００５７】
本発明はまた、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法を提供する。本発明のポリマーの製造方法は、前述の本発明の方法により得られる３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、少なくとも一つのポリマー構成成分としてポリマー化する工程を含む。例えば、前述したように、本発明の細菌の培養液中から多孔性吸着剤を用いて、あるいは、晶析、沈殿化などによって純度を向上させた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、高温においてメタンスルフォン酸、もしくは、ポリリン酸のような非酸化溶媒酸中で、重縮合によって重合することによってポリマー化される（例、国際公開第９１／０１３０４号参照）。本発明のポリマーの製造方法では、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、他のポリマー構成成分とポリマー化させてもよい。他のポリマー構成成分としては、例えば、テレフタル酸およびビスフェノールＡ、またはテレフタル酸およびｐ−フェニレンジアミンが挙げられる。ポリマー化の方法は種々の公知の方法を適用することによって実施可能である（米国特許５１４２０２１号公報、米国特許５２１９９８１号公報、米国特許５４２２４１６号公報、Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ  ｅｔ．  ａｌ．，（１９９２）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９３，２４６７−２４７６、Ｍａｒｃｏｓ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００１）Ｐｏｌｙｍｅｒ，４２，７９３３−７９４１）。本発明の方法により製造される、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーとしては、例えば、ポリベンゾオキサゾールポリマー、ポリエステル、ポリアミドが挙げられる。
【実施例】
【００５８】
実施例１：エシェリヒア・コリが有する３，４−ＡＨＢＡの変換を触媒する酵素の探索
（１）エシェリヒア・コリのゲノム情報をもとにした３，４−ＡＨＢＡ変換酵素の探索
ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株において、アリールアミン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（同意語：ＮａｔＡ；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＢＡＦ４６９７１．１）が３，４−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化反応を触媒することが報告されており、ＮａｔＡのアミノ酸配列が公知となっている［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８９，２１５５−２１５９］。
ＮａｔＡのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＮａｔＡと同様の機能を有する酵素を探索するため、エシェリヒア・コリＫ−１２株のゲノム情報から、ＮａｔＡと相同性を示す配列を検索した。公開されているデータベース（ＥｃｏＣｙｃ，ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／，Ｋｅｓｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３，３３４−３３７）を利用し、ｂｌａｓｔｐを用いて検索を行った結果、エシェリヒア・コリＫ−１２株のＮ−ヒドロキシアリールアミン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（同意語：ＮｈｏＡ，ＥＣ：２．３．１．１１８，ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＮＰ＿４１５９８０．１）が、ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株由来ＮａｔＡと４９％の相同性を示すことを見出した。ＮｈｏＡのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００５９】
（２）エシェリヒア・コリｎｈｏＡ遺伝子欠損株および野生株の３，４−ＡＨＢＡ変換能の解析
ＮｈｏＡをコードする遺伝子（同意語：ｎｈｏＡ，ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＣ＿０００９１３．２，ＧＩ：９４７２５１）が欠損された株として、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ（同株：ＪＷ１４５８，Ｋｅｉｏ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）株を利用した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株は、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株（Ｈａｌｄｉｍａｎｎ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３，６３８４−６３９３）（ＣＧＳＣ７６３０）からｎｈｏＡ遺伝子を欠損した株である（Ｂａｂａ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，２，２００６−２００８）。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株は、国立遺伝学研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）から分譲を受けることができる。また、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株は、Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）から分譲を受けることができる。
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株とＢＷ２５１１３株の３，４−ＡＨＢＡ変換能を以下の手順に従って算出した。それぞれの株をＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を試験管中の４ｍＬのＭＳグルコース／３，４−ＡＨＢＡ培地に接種し、往復振とう培養装置で３０℃にて３０時間培養した。ＭＳグルコース／３，４−ＡＨＢＡ培地の組成は以下の表１に記載のとおりである。
【００６０】
【表１】
2013129001.tif 000012
【００６１】
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、１２０℃で２０分オートクレーブを行なった。但し、ＧｌｕｃｏｓｅとＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは混合し、別殺菌した。ＣａＣＯ３は乾熱滅菌後に添加した。３，４−ＡＨＢＡは２０（ｇ／Ｌ）となるように蒸留水に溶解した後にＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、ろ過滅菌した後に終濃度２．０（ｇ／Ｌ）になるように添加した。
【００６２】
培養終了後、培養液の６００ｎｍでのｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーを用いて分離し、濃度を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。各菌株の、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度および３，４−ＡＨＢＡ変換率を表２に示した。３，４−ＡＨＢＡ変換率は以下の算式によって求めた。
［３，４−ＡＨＢＡ変換率（％）］＝１００×｛２（ｇ／Ｌ）−［培養終了後の培養液上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度（ｇ／Ｌ）］｝／２（ｇ／Ｌ）
【００６３】
【表２】
2013129001.tif 000013
【００６４】
この結果、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の培養上清液中では３，４−ＡＨＢＡ濃度は初発濃度の３０％までに減少した。一方、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株の培養上清液中では、３，４−ＡＨＢＡ濃度の減少は１０％程度に留まった。したがって、ＮｈｏＡが３，４−ＡＨＢＡの変換反応を触媒することが強く示唆された。
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株の培養上清液、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株の培養上清液、および３，４−ＡＨＢＡ標準品（東京化成工業株式会社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ａ０８５９）に対する逆相カラムクロマトグラフィーのチャートを、図１に示した。これにより、３，４−ＡＨＢＡは、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株によって溶出時間（Ｒ．Ｔ．）９．５ｍｉｎ．に検出される化合物に変換されていることが示唆された。
【００６５】
（３）３，４−ＡＨＢＡ変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）の分子量の同定
実施例１（２）に記載の、ＢＷ２５１１３株培養後の培養上清液中に含まれる３，４−ＡＨＢＡ変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）の分子量を、ＬＣ／ＭＳで同定した。分析条件は以下のとおりである。
【００６６】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ２μｍ  ２．１×７５ｍｍ  （ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
移動相：Ａ＝０．１％  ギ酸／Ｈ２Ｏ
Ｂ＝０．１％  ギ酸／アセトニトリル
グラジェントプログラム  ０ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝１００／０
３ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝１００／０
２３ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝２０／８０
２５ｍｉｎ．Ａ／Ｂ＝２０／８０
流速：０．２（ｍＬ／ｍｉｎ．）
カラム温度：室温（２５℃）
検出波長：２５４ｎｍ（ＰＤＡ）
ＭＳイオン化モード：ＥＳＩ
分析機種：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０（ＬＣ）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳ  ６１３０（ＭＳ）
【００６７】
分析の結果、変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）のｍ／ｚ値は１９５．１であり、３，４−ＡＨＢＡのアセチル化体の計算上のｍ／ｚ値（１９５．１）と一致した。以降、変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）を３，４−ＡｃＡＨＢＡと呼ぶ。
【００６８】
実施例２：ストレプトマイセス・グリセウス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群の導入による３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築および３，４−ＡＨＢＡ、３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
次に、３，４−ＡＨＢＡ生産菌において、ｎｈｏＡ欠損が３，４−ＡＨＢＡの蓄積に与える効果を検証した。まず、３，４−ＡＨＢＡの生産能を付与する為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。
始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）およびエシェリヒア・コリ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片を化学合成した（塩基配列を配列番号３に示す）。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにて消化処理し、ＰｔａｃおよびＴｔｒｐを含むＤＮＡ断片を得た。精製したＤＮＡ断片と、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号４に示す）。本プラスミドのＰｔａｃ下流に目的遺伝子をクローニングすることで、目的遺伝子の発現増幅が可能となる。
【００６９】
（２）エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子（ｇｒｉＩＨ遺伝子）の化学合成
ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株において、３，４−ＡＨＢＡの合成はアルドラーゼ（同意語：ＳＧＲ＿４２４９，ＧｒｉＩ）および３，４−ＡＨＢＡシンターゼ（同意語：ＳＧＲ＿４２４８，ＧｒｉＨ）からなる３，４−ＡＨＢＡ合成酵素群によって触媒される事が既に知られており、これらをコードする遺伝子の配列が公知となっている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。ＧｒｉＩは、ｇｒｉＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ２５９６６３．１、ヌクレオチド１３９５６〜１４７８０；ＧＩ：１１７６７６０６０）によりコードされている。ＧｒｉＩタンパク質のアミノ酸配列およびｇｒｉＩ遺伝子の塩基配列を配列番号５および配列番号６にそれぞれ示す。また、ＧｒｉＨは、ｇｒｉＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ２５９６６３．１、ヌクレオチド１２６９０〜１３８８０；ＧＩ：１１７６７６０５９）によりコードされている。ＧｒｉＨタンパク質のアミノ酸配列およびｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列を配列番号７および配列番号８にそれぞれ示す。
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをＥｃＧｒｉＩＨと名付けた。ＥｃＧｒｉＩＨの５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った（配列番号９に示す）。両末端に制限酵素認識配列が付与されたＥｃＧｒｉＩＨは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉと名付けた。ｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉの全長配列を配列番号１０に示す。
【００７０】
（３）ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子（ｇｒｉＩＨ遺伝子）発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉを鋳型として、配列番号１１に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号１２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、反応条件は９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて１５０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥｃＧｒｉＩＨ遺伝子断片を含む、約２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＥｃＧｒｉＩＨ遺伝子断片と、ＳｍａＩで消化処理されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｇｒｉＩＨ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉと名付けた。ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉの全長配列を配列番号１３に示す。
【００７１】
（４）３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株、並びにＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＢＷ２５１１３株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と名付け、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉが導入された株をＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と名付けた。
【００７２】
（５）３，４−ＡＨＢＡ生産培養評価
ＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株、及びＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を試験管中の３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび０．１（ｍＭ）のイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含むＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃、４８時間の培養を行った。ＭＳグルコース／Ａｓｐ培地の組成は以下の表３に記載のとおりである。
【００７３】
【表３】
2013129001.tif 000014
【００７４】
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、１２０℃で２０分オートクレーブを行なった。但し、ＧｌｕｃｏｓｅとＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは混合し、別殺菌した。ＣａＣＯ３は乾熱滅菌後に添加した。
【００７５】
培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、濃度を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２００６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度および３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度を表４に示した。ＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株では３，４−ＡｃＡＨＢＡが検出されず、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と比べて、大幅に３，４−ＡＨＢＡの濃度が上昇した。
【００７６】
【表４】
2013129001.tif 000015
【００７７】
実施例３：ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群の導入による３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築および３，４−ＡＨＢＡ、３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子の化学合成
ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒａｙａｍａｅｎｓｉｓ）（Ｆｕｒｕｓａｋｉ  ｅｔ.  ａｌ．，（１９７２）Ｉｓｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１０，１７３−１８７）において、３，４−ＡＨＢＡの合成はアルドラーゼ（同意語：ＮｓｐＩ；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＢＡＪ０８１７１．１）および３，４−ＡＨＢＡシンターゼ（同意語：ＮｓｐＨ；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：ＢＡＪ０８１７２．１）からなる３，４−ＡＨＢＡ合成酵素群によって触媒される事が既に知られており、これらをコードする遺伝子の配列が公知となっている（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４１−６４３）。ＮｓｐＩは、ｎｓｐＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ５３０１３６、ヌクレオチド８７３０〜９５８４；  ＧＩ：  ２９６７８４９４３）によりコードされている。ＮｓｐＩタンパク質のアミノ酸配列およびｎｓｐＩ遺伝子の塩基配列を配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示す。また、ＮｓｐＨは、ｎｓｐＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ５３０１３６、ヌクレオチド９５９９〜１０７０２；ＧＩ：２９６７８４９４４）によりコードされている。ＮｓｐＨタンパク質のアミノ酸配列およびｎｓｐＨ遺伝子の塩基配列を配列番号１６および配列番号１７にそれぞれ示す。
ｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをＥｃＮｓｐＩＨと名付けた。ＥｃＮｓｐＩＨの５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った。両末端に制限酵素認識配列が付与されたＥｃＮｓｐＩＨは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ５７−ＥｃＮｓｐと名付けた。
【００７８】
（２）ｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子（ｎｓｐＩＨ遺伝子）発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＥｃＮｓｐを鋳型として、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、反応条件は９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて１５０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥｃＮｓｐＩＨ遺伝子断片を含む、約２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＥｃＮｓｐＩＨ遺伝子断片と、ＳｍａＩで消化処理されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（実施例２に記載）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｎｓｐＩＨ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐと名付けた。
【００７９】
（３）３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株、並びにＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＢＷ２５１１３株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と名付け、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐが導入された株をＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と名付けた。
【００８０】
（４）３，４−ＡＨＢＡ生産培養評価
ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株、及びＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を試験管中の３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび０．１（ｍＭ）のイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む表３に記載のＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃、４８時間の培養を行った。
【００８１】
培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、濃度を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度および３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度を表５に示した。ＢＷ２５１１３ΔｎｈｏＡ／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株では３，４−ＡｃＡＨＢＡが検出されず、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と比べて、大幅に３，４−ＡＨＢＡの濃度が上昇した。
【００８２】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によって、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体やポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用であるアミノヒドロキシ安息香酸類を簡便安価に製造することができる。よって、例えば、本発明によって得られた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を重合することでポリベンゾオキサゾール（ＰＢＯ）が得られ、これにより高強度、高弾性率、高耐熱性を有するＰＢＯ繊維やＰＢＯフィルムなどを安価に提供することが可能となる。また、原料である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生合成によって製造することが可能であることから、本発明の方法は環境低負荷型のプロセスとなり、地球環境に対して優しい製造方法である。
【国際調査報告】
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