(57)【要約】本発明は、がん治療研究およびがん治療の創薬研究に有用な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞、これらの製造方法、これらの細胞から誘導されたがん細胞、および、これらの細胞の応用を提供することを課題とする。  下記（１）および（２）の要件：（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、または（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常から選択される少なくとも１種の異常を有すること；（２）ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子を発現すること；を特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）および（２）の要件：
（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常、（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常、あるいは（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性、から選択される少なくとも１種の異常を有すること；そして
（２）ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子の４遺伝子を発現すること；
を特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項２】
前記（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常が、以下の表：
【表１】
2013081188.tif 000192
2013081188.tif 000193
2013081188.tif 000194
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に示されたゲノムＤＮＡ（ＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌ＿ＮＯ．）のゲノム開始点の位置からゲノム終止点の位置に存在するＣｐＧのシトシン塩基（Ｃ）の５位のメチル化異常である、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項３】
前記（１）（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異が、パッセンジャー変異を含む、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項４】
前記（１）（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異が、ドライバー変異である、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項５】
前記（１）（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異が、以下の表：
【表２】
2013081188.tif 000214
2013081188.tif 000215
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2013081188.tif 000240
に記載される遺伝子の少なくとも一つにおいて生じるものであるか、または以下の表：
【表３】
2013081188.tif 000241
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2013081188.tif 000252
に記載される遺伝子のアミノ酸変異（変異ＩＤ）の少なくとも一つにおいて示される、請求項１、３または４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項６】
前記（１）（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）が、（１）（ｂ）において記載される遺伝子の少なくとも一つにおいて生じるものである、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項７】
内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常が、内在性がん遺伝子の発現上昇または内在性がん抑制遺伝子の発現低下・消失である、請求項６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項８】
前記（１）（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）が、以下のマイクロＲＮＡ：
【表４】
2013081188.tif 000253
2013081188.tif 000254
において列挙されるマイクロＲＮＡのうちの少なくとも一つのマイクロＲＮＡにおいて生じる、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項９】
前記（１）（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常が、誘導多能性幹細胞と比べてタンパク質の発現上昇または発現低下・消失を示すか、またはがん特異抗原を発現することにより生じる、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１０】
発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を示すタンパク質またはがん特異抗原が、Ｍｕｃ−１、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＨｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、Ｅ２Ｆ３、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＭＰ−９、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１９、Ｅ２Ｆ１、ｃ−ｋｉｔ、Ｍｕｃ−４、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−２０、ｃ−ｍｅｔ、Ｌ−ｍｙｃ、ＭＤＲ１、ｈＣＧβ、ＣＯＸ−２、ＣＡ１２５、ＭＡＧＥ  Ａ１２、ＮＳＥ、ｃ−ｍｙｃ、ＣＤ４４、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＲＣＡＳ１、ｂｃ１−２、ＦＧＦＲ２、ＨＩＦ−１α、ＧＰＣ３、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ｍｄｍ２、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−７、ＭＭＰ−２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｈＴＥＲＴ、Ｇｌｉ１、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＧＡ、ＥＧＦＲ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ３／Ａ６、Ｍｕｃ−７、ＰｒｏＧＲＰ、ＰＳＡ、ＳＣＣ、ＩＧＦ２、ＤＬＫ−１、またはＷＴ−１のいずれかである、請求項９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１１】
前記（１）（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）が、誘導多能性幹細胞と比べてメタボロームの異常を示すか、または誘導多能性幹細胞と比べて解糖系の亢進を示すことを特徴とする、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１２】
前記（１）（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常が、誘導多能性幹細胞比べて糖鎖の発現異常を示すか、またはがん特異的な糖鎖を発現することにより生じる、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１３】
前記（１）（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常が、基準細胞のゲノムＤＮＡと比較して、被検細胞において遺伝子コピー数が増加または減少していることを示す、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１４】
前記（１）（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性が、ミスマッチ修復遺伝子であるＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２におけるマイクロサテライトの反復回数の変異である、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１５】
前記（２）の遺伝子の発現量が、対照となる未分化な胚性幹細胞の遺伝子の発現量と比較して、１／８から８倍である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１６】
細胞がヒトの細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞。
【請求項１７】
発がんした哺乳動物から採取した新鮮がん組織または非がん組織から調製した原料体細胞を、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の遺伝子産物が、前記原料体細胞内に存在する状態におく誘導工程を行うことを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞の製造方法。
【請求項１８】
遺伝子産物が、遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質のいずれかである、請求項１７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞の製造方法。
【請求項１９】
新鮮がん組織が、固形がんの新鮮がん組織、または癌種の新鮮がん組織である、請求項１７または１８に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞の製造方法。
【請求項２０】
原料体細胞が、胃がん、大腸がん、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がんから選択された新鮮がん組織から調製したものである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の誘導悪性幹細胞の製造方法。
【請求項２１】
請求項１に記載された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞から誘導されてなることを特徴とするがん細胞。
【請求項２２】
請求項１に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞、若しくは請求項２１に記載されたがん細胞を用いることを特徴とする、がん治療創薬標的のスクリーニング方法、がん治療薬候補物のスクリーニング方法およびがん診断薬のスクリーニング方法の中から選択された１種のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡなどの核酸、低分子化合物、ペプチド、抗体のいずれか、またはこれらの組み合わせにより行う、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項１に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞、若しくは請求項２１に記載されたがん細胞を用いることを特徴とする、がんワクチンの作製方法。
【請求項２５】
請求項１に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞、若しくは請求項２１に記載されたがん細胞を、実験動物に移植することを特徴とする、がんモデル動物の作製方法。
【請求項２６】
請求項１に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を用いたオミックス解析により、がんに特徴的なメチレーター表現型、ミューテーター表現型、ドライバー変異、または創薬標的の同定方法。
【請求項２７】
オミックス解析が、エピゲノーム解析、ゲノーム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、グリコーム解析、またはメタボローム解析から選択される、請求項２６に記載の同定方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載される同定方法により同定した、がんに特徴的なメチレーター表現型、ミューテーター表現型、ドライバー変異、または創薬標的。
【請求項２９】
請求項２８に記載されるがんに特徴的なメチレーター表現型、ミューテーター表現型、ドライバー変異、または創薬標的に対する、医薬品候補物。
【請求項３０】
ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡなどの核酸、低分子化合物、ペプチド、抗体である、請求項２９に記載の医薬品候補物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は誘導悪性幹細胞に関し、がんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有し、そしてＰＯＵ５Ｆ１遺伝子（ＯＣＴ３／４遺伝子ともいう）、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子の４遺伝子を発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞、これらの製造方法、これらの細胞から誘導されたがん細胞、およびこれらの細胞の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、クローン動物の創造や胚性幹細胞（「ＥＳ細胞」ともいう。本明細書において以下「胚性幹細胞」と記載する）を初めとする幹細胞の研究により、エピジェネティクス（ＤＮＡメチレーションおよびヒストンの修飾）をリプログラミング（「初期化」とも云う。本明細書においては、以下「リプログラミング」と記載する。）することが可能であると考えられるようになってきた。実際、除核した卵細胞にがん細胞であるマウスメラノーマ細胞の核を移植すると、該卵細胞は胚発生を開始し、その胚から得られた胚性幹細胞（ＥＳ細胞とも云う。）は、メラノサイト、リンパ球、繊維芽細胞などの細胞に分化したという実験結果が報告されている（非特許文献１）。【０００３】
最近、ＯＣＴ３／４遺伝子（「ＯＣＴ３遺伝子」、「ＯＣＴ４遺伝子」、または「ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子」と表記される場合もある）、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子およびｃ−ＭＹＣ遺伝子（特許文献１）の導入、あるいは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）存在下におけるＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子およびＫＬＦ４遺伝子（非特許文献２）の導入により、ヒトの体細胞から、誘導多能性幹細胞という、胚性幹細胞と同様な未分化細胞にリプログラミングして作製することができるとの報告がなされた（特許文献２）。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；以下、「ｉＰＳ細胞」とも云う。）は、（１）体を形作るあらゆる細胞になり得る三胚葉への分化多能性と、（２）ヒト胚性幹細胞の増殖培養条件下においてその未分化性を維持したまま培養皿の中で無限に継代培養することのできる、増殖能（自己複製能）という２つの特徴を有することが知られている。そして、このヒト誘導多能性幹細胞は、形態、遺伝子発現、細胞表面抗原、長期増殖能（自己複製能）、テラトーマ（ｉｎ  ｖｉｖｏでの三胚葉への分化）形成能において、ヒト胚性幹細胞に非常に類似しており（非特許文献３、非特許文献４）、さらに、ＨＬＡの遺伝子型は、由来細胞である体細胞と全く同じであるという報告がなされている（非特許文献４）。これらの細胞の作製方法は、前記した遺伝子（すなわち、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子およびｃ−ＭＹＣ遺伝子、あるいはｂＦＧＦ存在下におけるＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子およびＫＬＦ４遺伝子）を導入するだけで、分化した体細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）へ「リプログラミング」されると考えられている。【０００４】
一般的には、がんに関連するゲノムの異常および／またはエピジェネティクスの異常に基づいて、遺伝子発現が上昇・低下または消失するという異常が発生し、これによって細胞ががん化する。従って、上記のようなリプログラミングの技術を用いれば、がん細胞に生じた様々な異常をリプログラムし、正常な細胞に戻すことになり、がん細胞の性質を失うものと考えられている。【０００５】
実際に、最近、国際幹細胞学会（ＩＳＳＣＲ）において、「培養皿でヒト肝がん細胞株由来のがん幹細胞（ＨｕＨ７由来のＣＤ１３３陽性細胞）に抗がん剤など２種類の化学物質（非環式レチノイドおよびトルレスタット）を加えると、２日後には、８５〜９０％のがん細胞が正常の肝臓細胞になったことが報告された。さらに２遺伝子（ＳＯＸ２遺伝子とＫＬＦ４遺伝子）と２種類の化学物質（５−ＡＺＡＣおよびＴＳＡ）を加えるとｉＰＳ細胞になり、肝細胞への分化プロトコールにより、得られた誘導多能性幹細胞を肝細胞（ＡＦＰまたはＡＬＢ陽性細胞）に分化させることに成功した」との発表がなされている（非特許文献５）。また、がん細胞であるマウスメラノーマ細胞を誘導多能性幹細胞へリプログラミングさせたという論文や（非特許文献６）、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子およびｃ−ＭＹＣ遺伝子の導入によりリプログラミングされた結果、発がんの原因であるＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ活性を有する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の細胞株から、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ依存性が消失したｉＰＳ細胞が作製されたという報告がなされている（非特許文献７）。さらに、がん細胞株にＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子およびｃ−ＭＹＣ遺伝子を導入すると、リプログラミングにより薬剤耐性や腫瘍形成能が消失するものの、長期培養後、細胞のゲノムに導入された外来性ｃ−ＭＹＣ遺伝子の活性化を伴うがん化が起こるという報告もなされている（非特許文献８）。【０００６】
しかしながら、自己複製関連遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＺＦＰ４２など）の発現は十分に誘導されておらず、発がんの原因になるｃ−ＭＹＣ遺伝子を細胞のゲノムに導入している（非特許文献８）。このように、遺伝子や化学物質を与えて細胞を正常に戻すリプログラミング療法は、がんの治療につながると期待され、研究が進められている（非特許文献９）。【０００７】
しかしながら、がん細胞が正常細胞にリプログラミングされたとしても、実際にがん治療を実現させるためには、培養皿中ではなく、生体中のがん細胞を１００％の効率で正常細胞へリプログラミングする必要がある。しかも、一般的に画像検査で発見される早期がんでさえも１億個のがん細胞からなると考えられており、仮に９９．９％の効率でがん細胞を正常細胞へリプログラミングできたとしても、１０万個のがん細胞が残存することになるため、前記リプログラミングの効率が１００％でなければ有効ながん治療方法であるということはできない。【０００８】
従来のがん研究では、外来性のＳＶ４０、ＨＰＶのＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子を細胞のゲノムに導入し、強制発現による細胞の不死化培養や、ｃ−ＭＹＣ遺伝子やＲＡＳ遺伝子などのがん遺伝子を細胞のゲノムに導入することによる不死化又はがん化などによってがん細胞株を樹立した後、さらに一般的な従来培地で培養されたがん細胞株が用いられている。【０００９】
しかしながら、このような遺伝子の導入を行わない場合でも、一般的な従来の汎用培地で樹立したがん細胞株では、長期間の培養中に培養後の人工的な（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｒｔｉｆａｃｔ）染色体異常（転座、欠失など）、ゲノム異常（遺伝子変異）や、遺伝子発現異常の原因になるエピジェネティクスの異常が顕著に生じる（非特許文献１０）。そのため、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｒｔｉｆａｃｔな異常を最小限に抑え、元々生体内で発がんや悪性化の原因となったがん細胞に生じた突然変異などの異常を、細胞にそのまま保持させることは難しいという問題がある。これらの細胞株は、何れもｉｎ  ｖｉｔｒｏで自己複製させる培養により樹立・維持された細胞株ではない。【００１０】
がん治療の研究およびがん関連創薬の研究において、このような従来の汎用培地で長期間培養したがん細胞株のゲノム異常およびエピジェネティクスの異常を解析しても、これらの異常が、哺乳動物の元々生体内で発がんや悪性化の原因としてがん細胞に生じた異常であるのか、培養中に生じたＩｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｒｔｉｆａｃｔな異常であるのかを判別することは著しく困難もしくは不可能であるため、これらの解析結果をもとに、適切な発がんや悪性化の原因解明するのは困難である。このような細胞を用いたがん治療創薬標的の探索、がん治療薬候補物のスクリーニング等を行うことは不適切であった。【００１１】
また、創薬の標的としてがん幹細胞の存在が重要視されているものの、新鮮ながん組織に含まれるがん細胞は、階層的であり、且つ異質な細胞集団であり、どのがん細胞ががん幹細胞であるのかを同定するのは容易ではないという問題もある。近年、がん細胞株または初代培養がん細胞から、がん幹細胞を同定するための研究が報告されている（非特許文献１１）が、モノクローナルながん幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、長期培養できたという報告がないだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで創薬に応用したり、がん研究に用いたりするのに必要な数になるまで、増殖させて増幅培養する技術についても未だ報告されていない。【００１２】
前述したように、臨床検体であるがん組織に含まれる細胞は、異質な細胞集団であり、複数種類の正常細胞、非がん細胞、及びがん細胞が混在する。同様に、がん組織に含まれるがん細胞は、階層的であり、また、クローナルな細胞集団ではない（非特許文献１２）。近年、次世代シークエンサーに代表されるような膨大な解析結果を提供できる大規模な多層オミックス解析が、一斉を風靡している。しかしながら、解析対象が、階層的かつ、クローナルではない異質ながん組織の解析では、がん細胞集団の平均的なゲノムか、又は最も多数を占めるがん細胞集団のゲノムのデータを結果として示すことになるが、その結果が、がん組織中に存在する悪性化（進展、転移）の原因となるがん細胞に由来するのかを明らかにすることが出来ないという問題点がある。【００１３】
最近、単一細胞のゲノム解析が可能となり、少数しか存在しないがん細胞のプロファイリングも可能となった（非特許文献１３）。同一のがん組織から複数の単一細胞を解析することができれば、がんの進展、転移および薬剤耐性を示すクローンがマイナーなサブポピュレーションであっても、モニタリングや検出が可能となる（非特許文献１４）。つまり、がん細胞が体細胞変異を蓄積する中でパッセンジャー変異（二次的な変異）ではないドライバー変異（発がん、悪性化において決定的な体細胞性変異）の解明にも有用である。【００１４】
しかしながら、これまでは、解析結果に対応する拡大培養可能な細胞が樹立されておらず、機能解析、ＸＥＮＯＧＲＡＦＴモデル、創薬における標的／化合物スクリーニングに供することが不可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００８−２８３９７２
【特許文献２】特開２００８−３０７００７
【非特許文献】
【非特許文献１】Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ  Ｋ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１８：１８７５−８５，２００４．
【非特許文献２】Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６：１０１−６．
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００７，１３１，８６１−８７２．
【非特許文献４】Ｍａｓａｋｉ  Ｈ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００８，  １，１０５−１１５．
【非特許文献５】国際幹細胞学会、２００９年、抄録番号１７３９（２８５頁）
【非特許文献６】Ｕｔｉｋａｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００９  １２２（Ｐｔ  １９）：３５０２−３５１０．
【非特許文献７】Ｃａｒｅｔｔｅ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１０  Ｍａｒ  １６．
【非特許文献８】Ｎａｇａｉ  ＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０  Ａｐｒ７．
【非特許文献９】Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０，１０７：４０−５．
【非特許文献１０】Ｇｉｓｓｅｌｓｓｏｎ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２０１０，３１６：３３７９−３３８６
【非特許文献１１】Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ＪＥ，Ｌｉｎｄｅｍａｎ  ＧＪ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８，８：７５５−６８．
【非特許文献１２】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１１，１４４：２７−４０
【非特許文献１３】Ｎａｖｉｎ  Ｎ．ａｎｄ  Ｈｉｃｋｓ  Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ２０１１，３：３１
【非特許文献１４】Ｎａｖｉｎ  Ｎ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２：９０−９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明では、特定マーカーに捉われず、また、免疫不全マウスへの移植を介さず、細胞を拡大培養可能とする技術を開発すること、そして医学情報を有するヒトのがん組織又は非がん組織（臨床検体）由来のクローナルな誘導悪性幹細胞を樹立することを目的とした。【００１７】
このような同一がん組織から得られる複数のクローナルながん細胞集団が得られれば、量的な制限で単一細胞では実施できなかった次世代シークエンサーによるゲノム解析（全ゲノム、エクソーム、キノームなどの標的配列）、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化解析、網羅的発現解析（ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）、網羅的なタンパク質の発現解析、網羅的糖鎖解析、メタボローム解析などの多層オミックス解析、Ａｒｒａｙ  ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（アレイＣＧＨ）によるコピーナンバーバリエーション（ＣＮＶ）、マイクロサテライト不安定試験などの多種の解析の対象となり得る。【００１８】
そして、複数のクローナルながん細胞集団を解析することで、その由来となった階層的かつマルチクローナルな異質細胞からなるがんの原因、進展の本態、ドライバー変異の解明につながることが期待される。このような同一がん組織から得られる複数の単一細胞由来のモノクローナルながん細胞集団は、さらなる細胞機能解析、ＸＥＮＯＧＲＡＦＴモデル、創薬における標的／化合物スクリーニングに供する事を可能とする。将来、人種、性、年齢、がん種が異なるドナー組織からこのようなクローナルな誘導悪性幹細胞を樹立してバンク化すれば、ドナーの診療情報、病理学情報、疫学的なデータと統合することによって、医学情報と多層オミックス解析の情報を有する誘導悪性幹細胞のバイオバンク構築が可能となり、革新的ながん治療薬の開発に活用されることが期待される。【００１９】
従って本発明の第１の目的は、がん治療創薬標的、がん治療薬候補物、がん診断薬等のスクリーニング、がんワクチンの作製、がんモデル動物の作製などに使用することができる、がんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を提供することにある。【００２０】
本発明の第２の目的は、がんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を製造する方法を提供することにある。【００２１】
本発明の第３の目的は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を用いた、がん治療創薬標的のスクリーニング、がん治療薬候補物のスクリーニング、がん診断薬のスクリーニング等のスクリーニング方法を提供することにある。【００２２】
本発明の第４の目的は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を用いた、がんワクチンの作製方法を提供することにある。【００２３】
本発明の第５の目的は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を実験動物に移植する、がんモデル動物の作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
即ち本発明の第１の態様において、下記（１）および（２）の要件：
（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常、（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常、あるいは（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性、から選択される少なくとも１種の異常を有すること；
（２）１または複数の自己複製関連遺伝子を発現すること；
を特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を提供する。【００２５】
本発明の第２の態様において、がんに関連するゲノム異常またはエピジェネティクス異常を有する哺乳動物のがん組織から採取した非胚性の原料体細胞から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を製造する方法を提供する。この方法は、発がんした哺乳動物から採取した新鮮がん組織または非がん組織から調製した原料体細胞に対してＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子、ＰＯＵ５Ｆ１  ＲＮＡ、ＳＯＸ２  ＲＮＡ、ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡ、ＫＬＦ４  ＲＮＡ、ＬＩＮ２８  ＲＮＡおよびＮＡＮＯＧ  ＲＮＡから選択される１〜６種類のＲＮＡ、またはＰＯＵ５Ｆ１タンパク質、ＳＯＸ２タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質、ＫＬＦ４タンパク質、ＬＩＮ２８タンパク質およびＮＡＮＯＧタンパク質から選択される１〜６種類のタンパク質、のいずれかを導入する工程を行うことを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な本発明の誘導悪性幹細胞の製造方法を提供する。ここで、細胞が「非胚性」であるという場合、胚性幹細胞、胚、生殖細胞、始原生殖細胞の細胞ではないことを意味する。【００２６】
この方法において、新鮮がん組織は、固形がんの新鮮がん組織、または癌種の新鮮がん組織であり、そして原料体細胞は、胃がん、大腸がん、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がんから選択された新鮮がん組織から調製したものであることを特徴とする。【００２７】
本発明の第３の態様において、がん治療創薬標的のスクリーニング方法、がん治療薬（候補物）のスクリーニング方法およびがん診断薬（候補物）のスクリーニング方法の中から選択された１種のスクリーニング方法であって、本発明の誘導悪性幹細胞を用いることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。【００２８】
本発明の第４の態様において、本発明の誘導悪性幹細胞を用いることを特徴とするがんワクチンの作製方法を提供し、本発明第５の態様において、本発明の誘導悪性幹細胞を実験動物に移植することを特徴とするがんモデル動物の作製方法を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常、（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常、あるいは（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性、等のがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有すると共に、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４とも云う。）遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子等の自己複製関連遺伝子が発現することを特徴とする、誘導悪性幹細胞、その製造方法、およびこれらの細胞の応用を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図１は、誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性が生じていることを示す図である。
図２は、誘導悪性幹細胞の代謝産物の主成分分析を行った結果を示す図である。
図３は、誘導悪性幹細胞のがん関連糖鎖の解析を行った結果を示す図である。
図４は、誘導悪性幹細胞がＥＳ細胞特異的遺伝子を誘導多能性幹細胞と同程度発現することを示す図である。【００３１】
本発明の誘導悪性幹細胞は、原料体細胞が有する（１）（ａ）〜（１）（ｉ）などの異常をそのまま維持するだけでなく、幹細胞の特徴の一つである増殖可能であるという特徴を併せて有する。従って本発明の誘導悪性幹細胞は長期継代培養が可能であり、分化細胞の性質を有するがん細胞へ誘導しやすいため、医学研究、例えば多層オミックス解析（エピゲノーム、ゲノーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、グライコーム、メタボローム等の解析）、分子細胞生物学的解析、創薬スクリーニング（化合物スクリーニング、標的スクリーニング（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ、またはｃＤＮＡスクリーニング））、およびがん診断薬のスクリーニング方法などのスクリーニング方法や、がんワクチンの作製方法、がんモデル動物の作製等、がん治療の研究およびがん関連創薬の研究に非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
現在、体細胞が誘導多能性幹細胞にリプログラミングされるのと同様に、がん細胞をリプログラミングすることによって、がん細胞を正常な細胞に戻すことができるという概念が定着している。【００３３】
これに対して本発明の発明者は、一般に、新鮮がん組織および初代培養がん細胞集団はいずれも不均一なものであり、新鮮がん組織や初代培養がん細胞集団から得られた細胞には、正常細胞と同じかまたは近似したゲノムまたはエピジェネティクスをもった正常細胞や非がん細胞が混在することから、がん細胞が正常細胞にリプログラミングされるのではなく、新鮮がん組織、および初代培養がん細胞集団中に混在する正常細胞が正常な誘導多能性幹細胞に誘導される一方、新鮮がん組織および初代培養がん細胞集団の中に存在する、がんに関連するゲノム異常またはエピジェネティクスの異常等を有するがん細胞から、がんに関連するゲノム異常またはエピジェネティクスの異常等を有する悪性幹細胞が誘導されるという仮説を立てた。【００３４】
この仮説に基づけば、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子およびｃ−ＭＹＣ遺伝子の導入、あるいは、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子およびＫＬＦ４遺伝子の導入などの誘導多能性幹細胞作製技術を応用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を作製することができ、さらに、得られた誘導悪性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させれば、ゲノム的にまたはエピジェネティクス的に原料体細胞が有するがんとしての悪性の性質を維持させた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を、培養条件下で無限増殖させることが可能であると考えられる。【００３５】
そこで、本発明者らはこのような仮説のもとに鋭意研究した結果、原料体細胞として、がんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常などを有する体細胞を用い、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−ＭＹＣ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子等の少なくとも一つの自己複製関連遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を原料体細胞内に存在させることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を得ることができることを見出した。【００３６】
このように、本発明者らは、生体内において原料体細胞が有するがんとしての悪性の性質、即ち、原料体細胞が有するがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を維持すると共に、増殖が可能であり長期継代培養可能な、本発明の誘導悪性幹細胞を見出すと共に、これらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで創薬に応用し、またはがん研究に用いることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００３７】
以下、本発明の誘導悪性幹細胞、これらの製造方法、これらの細胞から誘導されたがん細胞、および、これらの細胞の応用について詳細に説明する。【００３８】
誘導悪性幹細胞
本発明の第１の態様において提供される誘導悪性幹細胞は、下記（１）および（２）の要件：
（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常、（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常、あるいは（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性、から選択される少なくとも１種の異常を有すること；そして
（２）１または複数の自己複製関連遺伝子を発現すること；
を特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞である。【００３９】
ここで、本発明における「誘導悪性幹細胞」とは、がん細胞であって、幹細胞としての機能（実質的には少なくとも増殖能または自己複製能）を有する細胞を意味する。当該技術分野において一般的に「幹細胞」と言う場合、特定の細胞に分化できる能力（分化能）と、細胞分裂を経てももとの細胞と同じ性質（分化能）を維持できる能力（自己複製能）とを持つ細胞のことをいう。このうち、自己複製能という場合、分裂して同じ細胞を作り出すことができることをいい、本発明の誘導悪性幹細胞の場合、少なくとも３日間増殖培養または継代培養が可能であることを意味する。【００４０】
誘導悪性幹細胞におけるがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常
本発明の誘導悪性幹細胞は、がんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有することを特徴としている。具体的には、本発明の誘導悪性幹細胞は、（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常、（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常、あるいは（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性、から選択される少なくとも１種の異常を有することを特徴としている。本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞はまた、この他にも、誘導多能性幹細胞と比べてメタボロームの異常（例えば、誘導多能性幹細胞と比べて解糖系の亢進を示すこと）、誘導多能性幹細胞と比べて解糖系の亢進、または核型の異常または染色体異常、を有していてもよい。これらの異常は、本発明の誘導悪性幹細胞の由来となる原料体細胞が、本来有していた異常を、そのまま承継するものである。【００４１】
本発明においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常を有していてもよい。そのようなメチル化異常を生じる内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域およびメチル化が生じる可能性のある部位としては、以下の表：【００４２】
【表１】
2013081188.tif 000002
2013081188.tif 000003
2013081188.tif 000004
2013081188.tif 000005
2013081188.tif 000006
2013081188.tif 000007
2013081188.tif 000008
2013081188.tif 000009
2013081188.tif 000010
2013081188.tif 000011
2013081188.tif 000012
2013081188.tif 000013
2013081188.tif 000014
2013081188.tif 000015
2013081188.tif 000016
2013081188.tif 000017
2013081188.tif 000018
2013081188.tif 000019
2013081188.tif 000020
2013081188.tif 000021
2013081188.tif 000022
2013081188.tif 000023
【００４３】
に示されたゲノムＤＮＡ（ＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌ＿ＮＯ．）のゲノム開始点の位置からゲノム終止点の位置に存在するＣｐＧのシトシン塩基（Ｃ）の５位のメチル化異常を例としてあげることができる。【００４４】
この様なゲノムＤＮＡ上のがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域におけるメチル化の異常は、細胞からゲノムＤＮＡを調製し、例えば、イルミナＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐやＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２７  ＢｅａｄＣｈｉｐ、シーケノム社のＣａｎｃｅｒ  ＥｐｉＰａｎｅｌ、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｍｅｔｈｙｌ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙシステムなどを使用してメチル化されたゲノムの網羅的な解析を行い、検出されたゲノムメチル化を標準細胞のゲノムメチル化と比較することにより、同定することができる。このうち、Ｃａｎｃｅｒ  ＥｐｉＰａｎｅｌは、４００種類の遺伝子を含み、悪性形質転換およびインプリンティングに関与することが知られている遺伝子のプロモーター領域における、１２０００以上のＣｐＧ部位をカバーすることが知られている。【００４５】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異を有していてもよい。ここで体細胞変異という場合、内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん遺伝子と認められている遺伝子における変異、内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子又はがん遺伝子と認められている遺伝子以外の発がんの原因になっている遺伝子変異であるドライバー変異が含まれる。そのような内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん遺伝子の体細胞変異としては、以下の表：【００４６】
【表２】
2013081188.tif 000024
2013081188.tif 000025
2013081188.tif 000026
2013081188.tif 000027
2013081188.tif 000028
2013081188.tif 000029
2013081188.tif 000030
2013081188.tif 000031
2013081188.tif 000032
2013081188.tif 000033
2013081188.tif 000034
2013081188.tif 000035
2013081188.tif 000036
2013081188.tif 000037
2013081188.tif 000038
2013081188.tif 000039
2013081188.tif 000040
2013081188.tif 000041
2013081188.tif 000042
2013081188.tif 000043
2013081188.tif 000044
2013081188.tif 000045
2013081188.tif 000046
2013081188.tif 000047
2013081188.tif 000048
2013081188.tif 000049
2013081188.tif 000050
2013081188.tif 000051
【００４７】
に記載される遺伝子の少なくとも一つにおいて生じるものであるか、または以下の表：【００４８】
【表３】
2013081188.tif 000052
2013081188.tif 000053
2013081188.tif 000054
2013081188.tif 000055
2013081188.tif 000056
2013081188.tif 000057
2013081188.tif 000058
2013081188.tif 000059
2013081188.tif 000060
2013081188.tif 000061
2013081188.tif 000062
2013081188.tif 000063
【００４９】
に記載される遺伝子のアミノ酸変異（変異ＩＤ）の少なくとも一つにおいて示されるものであることが好ましい。【００５０】
この様ながん抑制遺伝子の体細胞変異またはがん関連遺伝子の体細胞変異は、細胞からゲノムＤＮＡを調製し、そのゲノムＤＮＡに対して全ゲノムシークエンスを行う他、そのゲノムＤＮＡを次世代シーケンサー用ライブラリーの作製、エンリッチメントキット：ＴｒｕＳｅｑｅｘｏｍｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ社）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｎｏｍｅ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）によるエクソンの濃縮などを経て、ＨｉＳｅｑ２０００でのシークエンス（１００ｂｐ，ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄなど）を使用した遺伝子変異の網羅的な解析を利用して配列変異を検出し、検出された変異配列と正常な参照配列との比較解析を行うことにより、遺伝子の体細胞における配列変異を同定することができる。この他に、シーケノム社のＯｎｃｏｃａｒｔａ  Ｖｅｒ１、２、および３による体細胞変異解析などを使用することもできる。【００５１】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を有していてもよい。例えば、（１）（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常としては、内在性がん遺伝子の発現上昇または内在性がん抑制遺伝子の発現低下・消失を挙げることができる。そのような内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）は、（１）（ｂ）において記載される遺伝子の少なくとも一つにおいて生じるものであることが好ましい。【００５２】
この様ながん遺伝子の発現上昇または内在性がん抑制遺伝子の発現低下・消失は、細胞からｍＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡのマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥマイクロアレイキット８ｘ６０Ｋ、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  ＧｅｎｏｍｅオリゴＤＮＡマイクロアレイキットＶｅｒ２．０（４ｘ４４Ｋ）、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  ＧｅｎｏｍｅオリゴＤＮＡマイクロアレイキット（４ｘ４４Ｋ））を使用して網羅的に遺伝子発現を解析し、標準細胞の遺伝子発現と比較することにより、ｍＲＮＡの発現異常を網羅的に同定することにより検出することができる。【００５３】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を有していてもよい。そのような内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）としては、以下のマイクロＲＮＡ：【００５４】
【表４】
2013081188.tif 000064
【００５５】
において列挙されるマイクロＲＮＡのうちの少なくとも一つのマイクロＲＮＡにおいて生じるものであることが好ましい。【００５６】
このようなマイクロＲＮＡの具体的な配列は、いずれも、以下の表（１）（ｄ）−２において示すように、当該技術分野において知られているものである。【００５７】
【表５】
2013081188.tif 000065
2013081188.tif 000066
【００５８】
この様ながん関連のマイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）は、細胞からｍＲＮＡを調製し、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡマイクロアレイＲｅｌ．１２．）を使用して網羅的に遺伝子発現を解析し、標準細胞の遺伝子発現と比較することにより、マイクロＲＮＡの発現異常を網羅的に同定することにより検出することができる。【００５９】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常を有していてもよい。そのような内在性のがん関連タンパク質の発現上昇または発現低下・消失は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）における同じタンパク質の発現状況と比べてそのタンパク質が発現上昇または発現低下・消失を示すこと、またはがん特異抗原を発現すること、を意味している。【００６０】
本発明において、発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を示す内在性のがん関連タンパク質またはがん特異抗原としては、Ｍｕｃ−１、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＨｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、Ｅ２Ｆ３、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＭＰ−９、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１９、Ｅ２Ｆ１、ｃ−ｋｉｔ、Ｍｕｃ−４、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−２０、ｃ−ｍｅｔ、Ｌ−ｍｙｃ、ＭＤＲ１、ｈＣＧβ、ＣＯＸ−２、ＣＡ１２５、ＭＡＧＥ  Ａ１２、ＮＳＥ、ｃ−ｍｙｃ、ＣＤ４４、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＲＣＡＳ１、ｂｃｌ−２、ＦＧＦＲ２、ＨＩＦ−１α、ＧＰＣ３、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ｍｄｍ２、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−７、ＭＭＰ−２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｈＴＥＲＴ、Ｇｌｉ１、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＧＡ、ＥＧＦＲ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ３／Ａ６、Ｍｕｃ−７、ＰｒｏＧＲＰ、ＰＳＡ、ＳＣＣ、ＩＧＦ２、ＤＬＫ−１、またはＷＴ−１のいずれかを例としてあげることができる。【００６１】
この様ながん関連のタンパク質発現異常（発現上昇または発現低下・消失）は、細胞からタンパク質を調製し、ｉＴＲＡＱ（登録商標）（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ社）などを使用して、網羅的なタンパク質発現・相対定量解析・質量分析を行い、標準細胞において発現されるタンパク質と比較することにより、異常発現しているタンパク質を同定することにより行うことができる。ここで、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ社のｉＴＲＡＱ試薬は、４種類、あるいは８種類までの異なる生体サンプル中のすべてのペプチドを同時にラベルし、ＭＳ／ＭＳスペクトルから相対定量、絶対定量を可能にする、アミン特異的な安定同位体試薬セットである。【００６２】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）を有していてもよい。そのような内在性のがん関連代謝異常には、誘導多能性幹細胞と比べてメタボロームの異常を示すもの、あるいは誘導多能性幹細胞と比べて解糖系の亢進を示すもの、が含まれていてもよい。【００６３】
例えば、メタボロームから解糖系の亢進などの代謝異常を解析するには、メタボロームを短時間で一斉に測定する分析技術、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）法などを使用することができる。【００６４】
ＣＥ−ＭＳでは、キャピラリに電圧を印加すると陽イオン性代謝物質はすべて陰極方向に移動する。キャピラリ内で各物質はその物質の電荷と水和イオン半径の違いで分離され、陰極に接続された質量分析計に導入される。質量分析計で各物質は、その質量数に基づき、選択的かつ高感度に検出される。この方法の最も優れている点は、中空のキャピラリを用いているため、一つの分析条件ですべての陽イオン性代謝物質を質量分析計に導入できる点である。反対に陰イオン性代謝物質を測定する場合は、質量分析計を陽極側に接続する。従って、ＣＥ−ＭＳではわずか二つの測定条件で、細胞内代謝物質の一斉分析が可能になる。【００６５】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常を有していてもよい。そのようながん関連の糖鎖の異常として、がん特異的な糖鎖を発現することが含まれていてもよい。【００６６】
この様な内在性のがん関連糖鎖の異常は、細胞から細胞溶解液を調製し、タンパク質に結合しているアスパラギン結合型（Ｎ型）糖鎖の網羅的な構造解析を行い、得られた結果を標準細胞における糖鎖解析の結果とのあいだで比較解析することにより、同定することができる。例えば、タンパク質に結合しているＮ型糖鎖を酵素で切り出した後に３種類の異なるＨＰＬＣカラムによる連続的な分析情報を約６００種類の糖鎖情報を備えたデータベースソフトＧＡＬＡＸＹ（ＧＡＬＡＸＹ：Ｇｌｙｃｏａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  ａｘｅｓ  ｏｆ  ＭＳ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、糖鎖構造決定・予測のための糖鎖マップ）にて検索し、候補糖鎖を絞り込み、標準品候補糖鎖とサンプル糖鎖の共打ちにより構造を同定することができる。【００６７】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｈ）内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子コピー数多型異常、を有していてもよい。ここで☆☆という場合、内在性ゲノムＤＮＡのコピー数が、☆☆である場合が含まれる。そのようなコピー数の多型を生じる内在性ゲノムＤＮＡの例としては、以下の表の遺伝子を挙げることができる。【００６８】
【表６】
2013081188.tif 000067
2013081188.tif 000068
2013081188.tif 000069
2013081188.tif 000070
2013081188.tif 000071
2013081188.tif 000072
2013081188.tif 000073
【００６９】
本発明においてはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）（ｉ）誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性、を有していてもよい。ＤＮＡの中で１〜数塩基の塩基配列が繰り返すマイクロサテライトは、ＤＮＡ複製時に繰り返し回数（反復回数）のエラーが生じやすい部分である。ミスマッチ修復機構の機能低下によって腫瘍組織と正常組織でマイクロサテライトの反復回数に違い（ばらつき）が生じる。これをマイクロサテライト不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＭＳＩ）と呼ぶ。ＭＳＩは、リンチ症候群（遺伝性非ポリポーシス大腸癌）と診断された大腸癌組織の約９０％で認められる。ここでマイクロサテライトにおける不安定性という場合、ミスマッチ修復遺伝子であるＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２の生殖細胞系列の変異が原因であることが知られている。【００７０】
または、本発明におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、核型の異常または染色体異常を有していてもよい。このような核型の異常または染色体異常は、発がんに関連する核型または染色体異常であることが好ましく、例えば、染色体転座、染色体欠失などが含まれる。【００７１】
この様な核型の異常または染色体異常は、Ｇバンド分染法およびマルチカラーＦＩＳＨにより、同定することができる。【００７２】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を作製するために使用する原料体細胞は、発がんした哺乳動物から採取した新鮮がん組織または非がん組織から調製した初代培養又は少ない継代数の細胞であることを特徴とする。ここにおいて新鮮がん組織としては、胃がん、大腸がん、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がんから選択されたものなど、固形がんの新鮮がん組織、または癌種の新鮮がん組織などを使用することができる。【００７３】
誘導悪性幹細胞における遺伝子発現
本発明において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞は、（１）に挙げる特定のがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常に加えて、（２）１または複数の自己複製関連遺伝子を発現することを特徴とする。そこで、次に、本発明における前記（２）の遺伝子について説明する。【００７４】
（２）において列挙する遺伝子は未分化な胚性幹細胞のマーカー遺伝子であり、本発明の誘導悪性幹細胞が、理論的には無限に増殖し、事実上ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞のまま長期継代培養可能な性質を有する細胞であることを特定する遺伝子（自己複製関連遺伝子）である。この自己複製関連遺伝子は、多能性幹細胞において特徴的に発現されている遺伝子として知られている遺伝子である。具体的には、そのような自己複製関連遺伝子としては、以下の表：【００７５】
【表７】
2013081188.tif 000074
2013081188.tif 000075
【００７６】
の遺伝子を挙げることができる。【００７７】
これらの中でも、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞においては、これらの遺伝子のうち、少なくとも、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子の４遺伝子を発現することが好ましい。【００７８】
本発明においてはまた、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子に加えて、ＴＤＧＦ１遺伝子、ＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子、ＧＤＦ３遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、ＧＡＢＲＢ３遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子が発現しているものもまた好ましく、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子、ＣＤ２４遺伝子、ＣＤＨ１遺伝子、ＣＹＰ２６Ａ１遺伝子、ＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子、ＤＰＰＡ４遺伝子、ＥＤＮＲＢ遺伝子、ＦＬＴ１遺伝子、ＧＡＢＲＢ３遺伝子、ＧＡＴＡ６遺伝子、ＧＤＦ３遺伝子、ＧＲＢ７遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、ＮＯＤＡＬ遺伝子、ＰＯＤＸＬ遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、ＴＤＧＦ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子、ＺＩＣ３遺伝子の全てを発現しているものもまた好ましい。【００７９】
本発明においては、未分化であることを維持する観点から、前記表（２）の遺伝子群の中から選択された、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子の４遺伝子を必須遺伝子として発現していることが必要であり、さらに、発現している遺伝子の数が増えるほど好ましい。【００８０】
本発明においては、本発明の誘導悪性幹細胞で発現している前記（２）の内在性自己複製関連遺伝子の発現量は、対照となる未分化な胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して１／８から８倍以内であることが好ましく、１／４〜４倍であることがより好ましく、１／２〜２倍であることが最も好ましい。【００８１】
上記した対象となる未分化な胚性幹細胞としては、ｈＥＳ＿Ｈ９（ＧＳＭ１９４３９０）、ｈＥＳ＿ＢＧ０３（ＧＳＭ１９４３９１）、ｈＥＳ＿ＥＳ０１（ＧＳＭ１９４３９２）の何れかが用いられる。これらの遺伝子発現データは、データベースであるＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ〔ＧＥＯ〕（“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ〔ＧＥＯ〕、［ｏｎｌｉｎｅ］、［２０１０年１月２８日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／＞）から取得することが可能である。【００８２】
本発明の誘導悪性幹細胞は、３日以上増殖培養または継代培養が可能であるが、実質的に、１カ月以上、半年あるいは１年以上という長期に渡って増殖可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞であり、この事は理論的には無限に増殖が可能であることを意味する。【００８３】
使用する培養液および培養方法
本発明の誘導悪性幹細胞を増殖培養または継代培養する培地としては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を増殖培養または継代培養することが可能な培地であれば、特に制限されることはないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養に適した培地が好ましく用いられる。このような培地としては、例えば、ＥＳ培地〔４０％のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、４０％のＦ１２培地（シグマ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ（シグマ社製）、１％の非必須アミノ酸（シグマ社製）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ社製）、１５〜２０％のノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製）、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（インビトロジェン社製）、４〜１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２因子〕（以下ＥＳ培地という）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを除いたＥＳ培地で、マウス胚性繊維芽細胞（以下ＭＥＦ）を２４時間培養した上清である馴化培地に、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を加えた培地（以下ＭＥＦ馴化ＥＳ培地）、ｉＰＳ細胞用最適培地（イプセロン社製）、フィーダー細胞用最適培地（イプセロン社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ〔登録商標〕ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、アニマルプロテインフリーのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地ＴｅＳＲ２〔ＳＴ−０５８６０〕（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル社）、ＲｅｐｒｏＳｔｅｍ（リプロセル社）、ＲｅｐｒｏＦＦ（リプロセル社）などを例示することができるが、これらの培地に制限されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いてもよい。【００８４】
本発明の誘導悪性幹細胞を増殖培養または継代培養する手法については、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養において当業者が通常用いる方法であれば、特に制限されることはない。例えば、細胞から培地を除きＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、１×抗生物質−抗真菌剤およびＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、さらに、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤、ｍＴｅＳＲおよびＹ−２７６３２を加え、ＭＥＦが播種してあるゼラチンコートまたはコラーゲンコートに細胞懸濁液を播種することによって、継代培養する方法などを具体的に例示することができる。【００８５】
前記した培地には、さらに、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を添加することが好ましく、添加量は１〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）は、誘導される体細胞の種に応じて選択され、本発明においては、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ゼブラフィッシュ等を由来とするＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を用いることができる。その他、前記した下垂体抽出物、血清、ＬＩＦ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＡＬＫ５阻害剤、ＰＤ０３２５９１、ＣＨＩＲ００９２１等を添加することも可能である。【００８６】
さらに、Ｒｈｏ関連キナーゼ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）の阻害剤であるＹ−２７６３２（カルビオケム；水溶性）、或いは、ファスジル（ＨＡ１０７７：カルビオケム）は、継代時に培地中に添加することもできる。【００８７】
その他にも、ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＭＥＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）／ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ  １  ａｎｄ  ２）経路、及びＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ）３の三つの低分子阻害剤〔ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２及びＣＨＩＲ９９０２１〕、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＧＳＫ３の二つの低分子阻害剤〔ＰＤ０３２５９０１及びＣＨＩＲ９９０２１〕、ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａの阻害剤である低分子化合物〔ＢＩＸ−０１２９４（ＢＩＸ）〕、アザシチジン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、７−ｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ、ｌｙｓｅｒｇｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ、ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＴＧＦβ  ｒｅｃｅｐｔｏｒＩ  ｋｉｎａｓｅ／ａｃｔｉｖｉｎ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ５（ＡＬＫ５）の阻害剤〔ＥＭＤ６１６４５２〕、ＴＧＦ−β  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＴＧＦＢＲ１）ｋｉｎａｓｅの阻害剤〔Ｅ−６１６４５２及びＥ−６１６４５１〕、Ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅの阻害剤〔ＥＩ−２７５〕、ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２、ＳＢ４３１５４２、抗ＴＧＦ−β中和抗体、Ａ−８３−０１、Ｎｒ５ａ２、ｐ５３阻害化合物、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｐ５３経路の阻害剤等を添加することもできる。【００８８】
また、本発明の誘導悪性幹細胞は、公知の方法により凍結及び解凍することが可能である。凍結方法としては、例えば、細胞から培地を除きＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を加えてセラムチューブに分注し、−８０℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管する方法等を例示することができる。また、解凍方法としては、３７℃の恒温槽中で解凍し、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地に懸濁させて用いる方法等が例示できる。【００８９】
本発明の誘導悪性幹細胞を増殖培養する方法としては、フィーダー細胞上でフィーダー細胞不要胚性幹培地を用いて培養すること、即ち、フィーダー細胞と共培養することが好ましい。フィーダー細胞不要胚性幹培地としては、フィーダー細胞（ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞）フリーで培養できる無血清の培地である、ヒト胚性幹細胞／ヒト誘導多能性幹細胞用培地ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社製）または５〜１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲｅｐｒｏＳｔｅｍ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社）が好ましく用いられる。【００９０】
培地交換は毎日するのが最も好ましい。この場合１週間に１〜２回、トリプシンやコラゲナーゼ、それらの混合物などを用いて、継代培養を行うことが好ましい。【００９１】
本発明者らは、上記増殖培養または継代培養方法によって、正常なヒトｉＰＳ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｒｔｉｆａｃｔの染色体異常を起こすことなく培養されるのか否かを確認するために、マルチカラーＦＩＳＨ法、またはＧバンド分染色法等の分析法を用いて核型分析を行った。その結果、正常なヒトｉＰＳ細胞は全て正常核型であることが確認され、上記培養方法が、培養の途中で染色体異常を起こすことなく長期培養することが可能な、好適な培養方法であることが確認された。従って、誘導された本発明の悪性幹細胞等が正常核型と判定されるような細胞である場合には、原料体細胞も正常核型であると判定される。また、誘導された本発明の悪性幹細胞等ががんに関連した染色体異常を有する細胞である場合には、がんに関連した染色体異常は原料体細胞に由来すると判定される。同様に、誘導された本発明の悪性幹細胞が、がんに関連した異常を有する細胞である場合には、原料体細胞もがんに関連した異常を有すると考えられる。【００９２】
その他、本発明の誘導悪性幹細胞を増殖培養または継代培養する培地としては、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞の培養に適した培地が好ましく用いられる。このような培地としては、例えば、ＥＳ培地〔４０％ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、４０％のＦ１２培地（シグマ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ（シグマ社製）、１％非必須アミノ酸（シグマ社製）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ社製）、１５〜２０％のノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製）、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（インビトロジェン社製）〕（以下ＥＳ培地という）、ＥＳ培地に５〜１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を添加した培地で、マウス胚性繊維芽細胞（以下ＭＥＦ）を２４時間培養した上清であるＭＥＦ馴化ＥＳ培地（以下ＭＥＦ馴化ＥＳ培地）、誘導多能性幹細胞用最適培地（イプセロン社製）、フィーダー細胞用最適培地（イプセロン社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（インビトロジェン社製）、アニマルプロテインフリーのヒト胚性幹細胞／誘導多能性幹細胞維持用無血清培地ＴｅＳＲ２〔ＳＴ−０５８６０〕（ベリタス社製）などを例示することができる。特に、ヒトから採取した体細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地が、好ましい培地として例示される。【００９３】
なお、上記したＥＳ培地のようなフィーダーフリーでない培地を用いる場合には、フィーダー細胞と共培養することが必要である。【００９４】
さらに、Ｒｈｏ関連キナーゼ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）の阻害剤であるＹ−２７６３２（カルビオケム；水溶性）、あるいは、ファスジル（ＨＡ１０７７：カルビオケム）は、継代時に培地中に添加することもできる。【００９５】
上記した培地には、さらに、繊維芽細胞増殖因子の１つであるＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を添加することが好ましく、添加量は１〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。線維芽細胞増殖因子は、誘導される体細胞の種に応じて選択され、本発明においては、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ゼブラフィッシュ等を由来とする線維芽細胞増殖因子を用いることができる。その他、上記したＦＧＦ２以外の繊維芽細胞増殖因子、下垂体抽出物、血清、ＬＩＦ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＡＬＫ５阻害剤、ＰＤ０３２５９１、ＣＨＩＲ００９２１等を添加することも可能である。【００９６】
また、ＩＧＦ−ＩＩ阻害剤や、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体、抗ＩＧＦ−Ｒ１抗体、抗ＴＧＦ−β１抗体、抗アクチビンＡ抗体等の中和抗体を培地に添加することが好ましく、特に、本発明の誘導悪性幹細胞がＩＧＦ−ＩＩ遺伝子、ＩＧＦ−Ｒ１遺伝子、ＴＧＦ−β１遺伝子、または、アクチビンＡ遺伝子を高発現している場合には、これらの成分を添加することが、本発明の誘導悪性幹細胞の増殖を維持する上で好ましい。【００９７】
その他にも、ＦＧＦチロシンキナーゼ受容体、Ｍｅｋ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）／Ｅｒｋ（細胞外シグナル制御キナーゼ１および２）経路、ＧＳＫ３の各々の低分子阻害剤〔ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２およびＣＨＩＲ９９０２１（アクソンメディケム社製：Ｃａｔ  ｎｏ．１３８６）〕；ＦＧＦ受容体の低分子阻害剤〔ＰＤ１７３０７４〕；Ｍｅｋ経路の低分子阻害剤〔ＰＤ０３２５９０１〕；ＧＳＫ３の低分子阻害剤〔ＢＩＯ〕；７−ヒドロキシフラボン；リセルグ酸エチルアミド；ケンパウロン；ＴＧＦβ受容体Ｉキナーゼ／アクチビン様キナーゼ５の阻害剤（Ａｌｋ５阻害剤）〔ＥＭＤ６１６４５２，Ａ−８３−０１（シグマアルドリッチ社製；Ｃａｔ  ｎｏ．Ａ５４８０）〕；ＴＧＦ−β受容体１（ＴＧＦＢＲ１）キナーゼの阻害剤〔Ｅ−６１６４５１〕；Ｓｒｃファミリーキナーゼの阻害剤〔ＥＩ−２７５〕；ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ；ＳＢ４３１５４２；Ｎｒ５ａ２等を添加することもできる。【００９８】
本発明の誘導悪性幹細胞を増殖培養または継代培養する手法は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞の培養において当業者が通常用いる方法であれば、特に制限されるものではない。特に、細胞から培地を除きＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、１×抗生物質−抗真菌剤およびＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、さらに、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤、ｍＴｅＳＲ１およびＹ−２７６３２を加え、ＭＥＦが播種してあるゼラチンコートに細胞懸濁液を播種することによって、継代培養することが好ましい。【００９９】
また、本発明の誘導悪性幹細胞は、公知の方法により凍結および解凍することが可能である。凍結方法としては、特に、細胞から培地を除きＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、１×抗生物質−抗真菌剤およびＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を加えてセラムチューブに分注し、−８０℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管する方法等が好ましい。また、解凍方法としては、３７℃の恒温槽中で解凍し、１×抗生物質−抗真菌剤およびＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地に懸濁して用いる方法等が好ましい。【０１００】
誘導悪性幹細胞の製造方法
本発明の第２の態様において、発がんした哺乳動物から採取した新鮮がん組織または非がん組織から調製した原料体細胞を、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の遺伝子産物が、前記原料体細胞内に存在する状態におく誘導工程を行うことを特徴とする、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞を製造する製造方法を提供する。【０１０１】
詳細には、新鮮がん組織を鋏による細断、コラゲナーゼ処理することにより、原料細胞を調製し、マトリゲルコートした培養皿に播種して１日後、センダイウイルスベクター（原料細胞のゲノム配列を変えずに長期発現させる方法が好ましい）などで、外来性のヒトＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、（ＬＩＮ２８遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子）を導入する。遺伝子の導入から１日後、ヒト胚性幹細胞／誘導多能性幹細胞用培地であるＲｅｐｒｏｓｔｅｍ＋ｂＦＧＦ（５〜１０ｎｇ／ｍＬ）を用いてフィーダー細胞であるマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）と１〜２カ月共培養（培地交換は１〜３日毎、ＭＥＦ播種は７〜１０日毎）すると誘導悪性幹細胞のコロニーが出現する。そのコロニーを、例えば２４ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌに移し、７〜１４日後、６ｗｅｌｌプレートで培養する。さらに、５〜１０日後に直径１０ｃｍの培養皿に継代する。サブコンフルエント後、さらに１〜３回継代する。その後、マトリゲルコート等をした培養皿でフィーダー細胞フリーの培養で、誘導悪性幹細胞を調製することができる。【０１０２】
この方法は、前記原料体細胞を、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の遺伝子産物が、前記原料体細胞内に存在する状態におく誘導工程を行うことを特徴とする。これにより、前記原料体細胞に内在される前記（２）の遺伝子（自己複製関連遺伝子）が発現し、最終的に、本発明の誘導悪性幹細胞が誘導される。なお、ここで「状態におく」とは、そのような状態になるように調節する場合のみならず、そのような状態になっている細胞を選択して調製する場合をも含む概念である。【０１０３】
ここでＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の遺伝子産物という場合、それぞれの遺伝子、そのＲＮＡ、またはそのタンパク質のいずれかのことをいう。【０１０４】
本発明の誘導悪性幹細胞は、本発明の誘導悪性幹細胞の由来となる原料体細胞が本来有していた、（ａ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）、（ｂ）内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異、（ｃ）内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｄ）内在性のがん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）、（ｅ）内在性のがん関連タンパク質発現異常、（ｆ）内在性のがん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）、あるいは（ｇ）内在性のがん関連糖鎖の異常、等のがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常をそのまま継承することを特徴とする。従って、原料となる体細胞は、これらのがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有する発がんした哺乳動物から採取した新鮮がん組織または非がん組織から調製した原料体細胞であることが必要である。【０１０５】
上記原料体細胞を採取する哺乳動物としては、哺乳動物であれば特に制限されることはなく、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタなどのブタ、ウシ、ウマ、カニクイザルなどのサル等の霊長類、ヒト等を挙げることができるが、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタ、ウマ、カニクイザル、ヒトが好ましく、特にヒトが好ましく用いられる。【０１０６】
本発明で用いられる非胚性の原料体細胞としては、固形がんの新鮮がん組織、または癌種の新鮮がん組織から採取された体細胞を用いることができる。具体的には、脳の新鮮がん組織、肝臓の新鮮がん組織、食道の新鮮がん組織、胃の新鮮がん組織、十二指腸の新鮮がん組織、小腸の新鮮がん組織、大腸の新鮮がん組織、結腸の新鮮がん組織、膵臓の新鮮がん組織、腎臓の新鮮がん組織、肺の新鮮がん組織、乳腺の新鮮がん組織、皮膚の新鮮がん組織、骨格筋の新鮮がん組織を使用することができるが、これらには限定されない。特に、胃がん、大腸がん、乳がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がんから選択された新鮮がん組織を使用することが好ましい。これらのほとんどの新鮮がん組織または非がん組織は、がん治療の手術時などに、医療廃棄物として容易に入手することが可能である。【０１０７】
なお、組織中のがん細胞のみを採取することは困難であるため、実際には、実質的にがん細胞を高い含有率で含むがん組織の細胞が好ましく用いられる。その他にも、非常に低い含有率ではあるが、がん細胞を含む可能性が有る非がん組織の細胞も使用することができる。【０１０８】
本発明において哺乳動物から採取された組織は、採取後すぐに用いることが最も好ましいが、運搬などの必要性から、抗生剤や抗真菌剤入りハンクス液などの保存液中に冷蔵して２４時間程度まで保存した後用いることもできる。採取後すぐに用いない場合には、これらの細胞を凍結して、必要時に解凍して用いても良い。【０１０９】
また、短期間培養した後に用いることもできる。用いられる原料体細胞は、培養日数が少ない程好ましい。培地としては、各々の細胞に適した培地を用いる。内胚葉系細胞の培地としては、内胚葉系細胞用、上皮細胞用等の培地や、上記した胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞用培地などを用いる。ヒト細胞の場合には、好ましくはヒト用の培地を用いる。市販されている初代培養用のヒト細胞用培地などが用いられる。しかしながら、原料細胞は短期間しか培養されないので、血清を含む従来培地、例えば１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地で培養することも可能である。【０１１０】
通常、継代を重ねるにつれて細胞の性質が変化するため、本発明においては、初代培養から第４継代培養までの細胞を用いることが好ましく、初代培養から第２継代培養までの細胞を用いることがより好ましい。中でも、初代培養の細胞を用いることが最も好ましい。【０１１１】
ここで、初代培養とは、哺乳動物から体細胞が採取された直後の培養を意味し、初代培養（Ｐ０）を１回継代培養すると第１継代培養（Ｐ１）、さらに１回継代培養すると第２継代培養（Ｐ２）となる。【０１１２】
本発明の誘導悪性幹細胞の前記誘導工程においては、前記原料体細胞を、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の遺伝子産物が、前記原料体細胞内に存在する状態におくことができればよく、その方法としては、例えば誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などがあるが、これに制限されることはない。【０１１３】
本発明の誘導悪性幹細胞の前記誘導工程において、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子としては、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子そのものを用いることができる。原料体細胞中におけるＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子の発現が不十分である場合には、該細胞中に不足した遺伝子または遺伝子産物を導入し、一方原料体細胞中においてＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子が発現している場合には、それ以外の遺伝子またはその遺伝子産物を、これらの遺伝子の代わりに導入しても良い。【０１１４】
ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子の各遺伝子シンボルに対するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は以下の表に記載した通りである。【０１１５】
【表８】
2013081188.tif 000076
2013081188.tif 000077
【０１１６】
ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＯＣＴ遺伝子ファミリー、ＳＯＸ遺伝子ファミリー、Ｍｙｃ遺伝子ファミリー、ＫＬＦ遺伝子ファミリー、ＴＢＸ３遺伝子、ＰＲＤＭ１４遺伝子、Ｌ−ＭＹＣ遺伝子、Ｎ−ＭＹＣ遺伝子、ＳＡＬＬ１遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、ＵＴＦ１遺伝子、ＥＳＲＲＢ遺伝子、ＮＲ５Ａ２遺伝子、ＲＥＭ２  ＧＴＰａｓｅ遺伝子、ＴＣＬ−１Ａ遺伝子、Ｙｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＹＡＰ）遺伝子、Ｅ−カドヘリン遺伝子、ｐ５３ドミナントネガティブ変異体遺伝子、ｐ５３ｓｈＲＮＡ遺伝子、Ｇｌｉｓ１遺伝子、又はＲａｒｇ遺伝子等の誘導多能性幹細胞を樹立できる遺伝子を導入して、本発明の誘導悪性幹細胞を誘導することも可能である。【０１１７】
上記した遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子など）を導入して、これらの遺伝子産物が原料体細胞内に存在する状態におくことにより、細胞内に存在するＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子などの遺伝子の遺伝子産物が、内在性の自己複製開始遺伝子群であるＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子等の自己複製関連遺伝子群の発現誘導を起こす結果、細胞が自己複製を開始する。【０１１８】
すなわち、これは、ＤＮＡ結合性転写活性化因子であるＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子等が標的遺伝子に結合すると、ＰＣＡＦやＣＢＰ／ｐ３００などの転写コアクチベーターがリクルートされるというメカニズムが考えられる。この転写コアクチベーターは、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性をもっており、周辺のヒストンをアセチル化する。ヒストンのリジン残基のアミノ基がアセチル化されると、アミノ基の正電荷が中和され、ヌクレオソーム間の相互作用が緩むと考えられる。このアセチル化が引き金となりクロマチン・リモデリング因子がリクルートされ、クロマチンのリモデリングが誘導され、基本転写因子とＲＮＡポリメラーゼによる転写が開始されると考えられる。【０１１９】
誘導悪性幹細胞への遺伝子産物の導入
ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子およびこれらの遺伝子の代わりに使用される遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質やＲＮＡなどを、前記原料体細胞中に導入する方法としては、誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などを挙げることができるが、これに制限されることはない。【０１２０】
原料体細胞に対して、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子から選択される１〜６種類の遺伝子自体を導入するために使用される方法は、公知の方法であれば特に制限されることはないが、ウイルスベクター、プラスミド、人工染色体（ＨＡＣ）、エピソーマルベクター（ＥＢＶ）、ミニサークルベクター、ポリシストロニック発現ベクター、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを応用したベクター、ファージインテグラーゼを利用したベクター、ピギーバックなどのトランスポゾンなどのベクター等を用いることができる。【０１２１】
体細胞に遺伝子を導入するために使用可能なウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。最も好ましいウイルスベクターは、センダイウイルスベクターである。センダイウイルスベクターは、原料細胞のゲノム配列を変えずに（ウイルスのＲＮＡ遺伝子が細胞のゲノムに挿入されずに）自己複製遺伝子を長期発現させることが可能であり、作製された誘導悪性幹細胞の体細胞変異などを同定するのに有利である。【０１２２】
ウイルスベクタープラスミドとしては、公知のウイルスベクタープラスミドであれば何れも使用することが可能である。例えば、レトロウイルス系としてｐＭＸｓ、ｐＭＸｓ−ＩＢ、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ−ｎｅｏ（但し、ｐＭＸｓ−ＩＢはｐＭＸｓ−ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストシジン耐性遺伝子を搭載したベクターである）［Ｔｏｓｈｉｏ  Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ．ａｌ．，”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ”，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，３１（１１）：１００７−１４］が好ましく、他にもＭＦＧ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７（１９９５）］、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，３５８７−３５９６（１９９０）］、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８１５０−８１５７（１９９８）］等が挙げられる。また、アデノウイルス系としてはｐＡｄｅｘ１［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１（１９９５）］等を用いることができる。センダイウイルスベクターはＤＮＡＶＥＣ社のＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子又はＮＡＮＯＧ遺伝子を搭載したベクターが好んで使用される。【０１２３】
パッケージング細胞は、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組み換えウイルスベクタープラスミドの該欠損するタンパク質を補給できる細胞であればよく、例えばヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３をベースにしたパッケージング細胞などを用いることができる。ＨＥＫ２９３細胞をベースにしたパッケージング細胞としては、ＰＬＡＴ−Ａ細胞およびＰＬＡＴ−ＧＰ細胞が好んで使用される。【０１２４】
パッケージング細胞で補給するタンパク質としては、レトロウイルスベクターの場合はレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどのタンパク質、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ等のタンパク質、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ等のタンパク質を例示することができる。【０１２５】
上記組み換えウイルスベクタープラスミドを上記パッケージング細胞に導入することによって、組み換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入方法は、公知の方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、およびエレクトロポレーション法等の遺伝子導入法を例示することができる。本発明においては、トランスフェクション試薬である、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロッシュ社製）、ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ社製）などを用いることが特に好ましい。【０１２６】
また、上記ウイルスベクターの代わりに、プラスミド、トランスポゾンベクター、エピゾーマルベクター等を用いて上記遺伝子を導入しても良い。【０１２７】
前記誘導工程においては、さらに、誘導悪性幹細胞への誘導効率を上げるために、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている化合物、例えば、ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＭＥＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）／ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ  １  ａｎｄ  ２）経路、ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ）３の三つの低分子阻害剤〔ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２およびＣＨＩＲ９９０２１〕、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路およびＧＳＫ３の二つの低分子阻害剤〔ＰＤ０３２５９０１およびＣＨＩＲ９９０２１〕、ヒストンメチル化酵素Ｇ９ａの阻害剤である低分子化合物〔ＢＩＸ−０１２９４（ＢＩＸ）〕、アザシチジン、トリコスタチン  Ａ（ＴＳＡ）、７−ｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ、ｌｙｓｅｒｇｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ、ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＴＧＦβ  ｒｅｃｅｐｔｏｒＩ  ｋｉｎａｓｅ／ａｃｔｉｖｉｎ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ５（ＡＬＫ５）の阻害剤〔ＥＭＤ６１６４５２〕、ＴＧＦ−β  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＴＧＦＢＲ１）ｋｉｎａｓｅの阻害剤〔Ｅ−６１６４５２およびＥ−６１６４５１〕、Ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅの阻害剤〔ＥＩ−２７５〕、ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２、ＳＢ４３１５４２、抗ＴＧＦ−β中和抗体、Ａ−８３−０１、Ｎｒ５ａ２、ｐ５３阻害化合物、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｐ５３経路の阻害剤等を、本発明の誘導悪性幹細胞を誘導する際に用いられる培地中に添加することができる。さらに、低酸素下で培養することにより、効率よく、本発明の誘導悪性幹細胞を誘導することができる。【０１２８】
また、誘導悪性幹細胞への誘導効率を上げるため、さらに、ｍｉｃｒｏＲＮＡを用いることも可能である。具体的には、ｍｉｃｒｏＲＮＡを前記哺乳動物の細胞に発現ベクターを用いて導入したり、ｍｉｃｒｏＲＮＡを培地に添加したりするなど、当業者が通常行う方法を用いることができる。【０１２９】
誘導悪性幹細胞への誘導効率を上げるためのマイクロＲＮＡを使用する方法としては、ｍｉＲ−１３０／３０１／７２１クラスターの使用；ｍｉＲ−３０２／３６７クラスターの使用；ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの除去；ｍｉｒ−２００ｃ、ｍｉｒ−３０２ｓおよびｍｉｒ−３６９ｓファミリーのｍｉＲＮＡの使用；ｍｉＲ−３０２ｂおよびｍｉＲ−３７２の使用；ｍｉｒ−１０６ａ−３６３クラスターおよびｍｉｒ−３０２−３６７クラスターの２種類のｍｉＲＮＡクラスターの使用、特にｍｉｒ−３０２−３６７クラスターの使用；そしてｍｉＲ−１７−９２クラスター、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターおよびｍｉＲ−１０６ａ−３６３クラスターの使用；を例としてあげることができる。これらのマイクロＲＮＡを使用する方法の中から１種、または、２種以上を組み合わせて用いることができる。【０１３０】
なお、これらのマイクロＲＮＡの情報については、ｍｉＲＢａｓｅのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）から入手することが可能である。このホームページの情報において、かっこ内は、ｍｉＲＢａｓｅのアクセション番号である。【０１３１】
前記誘導悪性幹細胞に誘導する工程においては、上記遺伝子に加え、さらに、繊維芽細胞増殖因子であるＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ２４を使用しても良い。線維芽細胞増殖因子としては、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）を使用することが特に好ましい。これら線維芽細胞増殖因子は、誘導される体細胞の種に応じて選択され、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ゼブラフィッシュ等に由来する線維芽細胞増殖因子を用いることができる。【０１３２】
本発明においては、前記哺乳動物から採取された体細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞に誘導する工程において用いられる培地中に、前記線維芽細胞増殖因子の一つ以上を添加することが好ましく、これらの成分は、培地に１〜１００ｎｇ／ｍｌ程度添加することが好ましい。【０１３３】
また、線維芽細胞増殖因子以外にも、下垂体抽出物、血清、ＬＩＦ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ等を使用することもできる。ＬＩＦは、培地に１０〜１００００単位程度添加することが好ましく、血清は、培地の２〜２０％になるように添加することが好ましい。【０１３４】
さらに、細胞透過性の全カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、カスパーゼの触媒部位に不可逆的に結合し、アポトーシスの誘導を阻害するため、最終濃度が０．１〜１００μＭとなるように培地に加えることが好ましい。【０１３５】
また、ＩＧＦ−ＩＩ阻害剤や、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体、抗ＩＧＦ−Ｒ１抗体、抗ＴＧＦ−β１抗体、抗アクチビンＡ抗体等の中和抗体を培地に添加することが好ましく、特に、本発明の誘導悪性幹細胞が、ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子、ＩＧＦ１Ｒ遺伝子、ＴＧＦ−β１遺伝子、または、アクチビンＡ遺伝子を高発現している場合には、これらの成分を添加することが、誘導悪性幹細胞の増殖を維持する上で好ましい。【０１３６】
さらに、ＦＧＦチロシンキナーゼ受容体、Ｍｅｋ／Ｅｒｋ経路、ＧＳＫ３の各々の低分子阻害剤〔ＳＵ５４０２、ＰＤ１８４３５２およびＣＨＩＲ９９０２１〕；ＦＧＦ受容体の低分子阻害剤〔ＰＤ１７３０７４〕；Ｍｅｋ経路の低分子阻害剤〔ＰＤ０３２５９０１〕；ＧＳＫ３の低分子阻害剤〔ＢＩＯ〕；７−ヒドロキシフラボン；リセルグ酸エチルアミド；ケンパウロン；Ｔｇｆβ受容体Ｉキナーゼ／アクチビン様キナーゼ５の阻害剤（ＡＬＫ５阻害剤）〔ＥＭＤ６１６４５２，Ａ−８３−０１〕；Ｔｇｆ−β受容体１（Ｔｇｆｂｒ１）キナーゼの阻害剤〔Ｅ−６１６４５１〕；Ｓｒｃファミリーキナーゼの阻害剤〔ＥＩ−２７５〕；ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ；ＳＢ４３１５４２；Ｎｒ５ａ２；Ｙ−２７６３２；ファスジル等を添加することもできる。【０１３７】
さらに、本発明においては低酸素下で培養することにより、効率よく誘導することができる。【０１３８】
但し、リジン特異的脱メチル化酵素１阻害剤、メチル基転移酵素〔Ｇ９ａ〕の阻害剤、ＤＮＡメチル化酵素（Ｄｎｍｔ）阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤など、直接エピジェネティクス修飾（ＤＮＡメチレーションとヒストン修飾）に作用する低分子化合物は、原料細胞のエピジェネティクス修飾を変化させるため、添加しないことが好ましい。リジン特異的脱メチル化酵素１阻害剤としては、Ｐａｒｎａｔｅ（別名トラニルシプロミン）等、メチル基転移酵素〔Ｇ９ａ〕の阻害剤としては、ＢＩＸ−０１２９４等、ＤＮＡメチル化酵素（Ｄｎｍｔ）阻害剤としては、５−アザシチジン、ＲＧ１０８、５−アザ−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ）等、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤としては、スベロイラニリド・ハイドロザミック酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）等を例示することができる。【０１３９】
その他、酪酸；５−アザ−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ）、ＲＧ１０８、ＢＩＸ−０１０２９４、バルプロ酸（ＶＰＡ）および酪酸ナトリウム（ＮａＢ）の５つの低分子クロマチン修飾物質等についても、原料細胞のエピジェネティクス修飾を変化させてしまうため、添加しないことが好ましい。【０１４０】
前記誘導悪性幹細胞に誘導する工程は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞の培養に適した培地を用いて培養される。このような培地としては、本発明の誘導悪性幹細胞を培養する培地として例示した、ＥＳ培地、ＭＥＦ馴化ＥＳ培地、誘導多能性幹細胞用最適培地、フィーダー細胞用最適培地、ＳｔｅｍＰｒｏ、アニマルプロテインフリーのヒト胚性幹／誘導多能性幹細胞維持用無血清培地ＴｅＳＲ２〔ＳＴ−０５８６０〕等が挙げられるが、特にＭＥＦ馴化ＥＳ培地を用いることが好ましい。ヒトから採取された体細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いることが好ましい。【０１４１】
また、由来細胞が繊維芽細胞でない場合、例えば、胃または結腸がん患者由来の体細胞のような上皮系細胞を用いる場合には、遺伝子導入後にフィーダー細胞を播種して、共培養を行うことが好ましい。【０１４２】
本発明の誘導悪性幹細胞の製造方法は、上記工程に加え、さらに、１ウェルに１細胞をソーティングして増殖させる工程を含むことが好ましい。この工程は、抗ＡＬＢ抗体、抗ＦＡＢＰ１抗体、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体、抗ＤＬＫ１抗体、抗ＰＤＧＦＲα抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＰＤＧＦＲβ抗体、抗カドヘリン１１抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＩＧＦ−Ｒ１抗体から選択される何れか１つの抗体を使用した特異抗体染色を施した細胞、または、未染色の細胞を、１ウェルに１細胞をソーティングする方法によって増殖させる工程である。【０１４３】
例えば、上記したＥ−カドヘリン等の特異抗体で本発明の誘導悪性幹細胞を染色し、次いで、ＰＥＲＦＬＯＷＴＭＳｏｒｔ（古河電気工業社製）を用いて、１細胞／ウェルとなるように、特異抗体染色を施した細胞を９６ウェルプレート等にシングルソーテイングする方法が挙げられる。特殊抗体で染色した細胞の代わりに、未染色の細胞を用いることも可能である。【０１４４】
本発明の誘導悪性幹細胞の製造方法は、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞の悪性の性質または特異マーカーを同定して選別する工程を含むことが好ましい。【０１４５】
ここで、悪性の性質とは、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関わる性質のことを云う。また、特異マーカーとは、（１）（ａ）〜（１）（ｇ）のがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常のことを云う。これらの（１）（ａ）〜（１）（ｇ）のがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常の検出・同定方法は、前述したとおりである。【０１４６】
前記悪性の性質または特異マーカーを同定して選別する工程は、発がんした哺乳動物から採取した、（１）（ａ）〜（１）（ｇ）のがんに関連するゲノムの異常またはエピジェネティクスの異常を有する非胚性の原料体細胞を誘導処理した本願発明の誘導悪性幹細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞若しくは未分化な胚性幹細胞とを比較することにより行う。ただし、ゲノムの異常に関しては、誘導処理した本願発明の誘導悪性幹細胞のゲノムの異常（体細胞変異など）と誘導処理前の正常細胞が大多数である細胞群（例えば血球細胞）のゲノムや、公共データベース（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＢａｎｋなど）に登録されている参照配列と比較することも可能である。誘導悪性幹細胞は理論上クローナルな細胞であり、１個のがん細胞由来の内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子の体細胞変異または内在性がん関連遺伝子の体細胞変異を有している。【０１４７】
前記比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞としては、様々な時期の哺乳動物の各組織から採取された体細胞であれば特に制限されることはない。このような哺乳動物の各組織としては、前記した本発明の誘導悪性幹細胞を作製するための、原料体細胞として用いられる組織として例示された様々な組織を例示することができる。【０１４８】
前記比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞としては、健常個体の正常細胞、健常新生仔（または新生児）由来の正常細胞、健常新生仔（または新生児）皮膚由来の正常細胞に加え、発がんした哺乳動物の体細胞であっても、実質的に異常を有しない非がん細胞または発がん個体の正常体細胞等を用いることができる。特に、体細胞の中でも、本願発明の原料体細胞が有する様々な異常が実質的にないと考えられる健常個体の、正常細胞、健常新生仔（または新生児）由来の正常細胞、または、健常新生仔（または新生児）皮膚由来の正常細胞を用いることが好ましい。【０１４９】
なお、組織中の１個の正常細胞または非がん細胞のみを選択して採取し、ｉＰＳ細胞を作製することは困難であるため、実際には、正常組織と認められる細胞群が用いられる。【０１５０】
原料体細胞として、発がんした哺乳動物のがん細胞を用いた場合には、前記比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞として、前記発がんした哺乳動物と同一個体の正常細胞または非がん細胞を用いることが好ましい。特に、同一個体の同一臓器から採取した正常細胞または非がん細胞を用いた場合には、個体または臓器に特有の特徴が共通するため、両細胞の悪性度の違いが明確となる。従って、このような原料体細胞を採取した個体と同一の個体の組織を比較する工程は、誘導悪性幹細胞の悪性の性質または特異マーカーを同定するだけでなく、発がん機構の解明等の解析ツールとしても有用であり、後記するがん治療創薬標的のスクリーニング方法としても有用である。【０１５１】
なお、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞として、組織中の１個の細胞のみを採取・解析することは困難であるため、実際には、発がんした哺乳動物の正常組織または非がん組織の細胞群が用いられる。【０１５２】
比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞は、原料体細胞の場合と同様に、新鮮組織または凍結組織の体細胞を用いることが好ましい。【０１５３】
また、比較対象となる体細胞を採取する哺乳動物は、ヒトであることが好ましく、特に、原料体細胞を採取した同一個体であることが好ましい。【０１５４】
また、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞としては、上記の比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導されたものであれば、特に制限されるものではないが、本発明の誘導悪性幹細胞の誘導方法と同様の方法（遺伝子セットや培地など）で誘導して得られたものが好ましく用いられる。【０１５５】
また、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞としては、公知の誘導多能性幹細胞誘導方法により作製されたものであれば、特に制限されるものではないが、本発明の誘導悪性幹細胞の誘導方法と同様の方法で誘導して得られたものが好ましく用いられる。その他、特許文献１および２や、「ヒトｉＰＳ細胞の樹立方法」京都大学  物質―細胞統合システム拠点ｉＰＳ細胞研究センター，ＣｉＲＡ／Ｍ＆Ｍ，ｐ１−１４，２００８．７．４に記載された方法で誘導された誘導多能性幹細胞、理化学研究所バイオリソースセンターや京都大学等の、公知のルートから入手できる誘導多能性幹細胞や、前記したＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ〔ＧＥＯ〕から誘導多能性幹細胞の公知の遺伝子発現データ等を用いることも可能である。【０１５６】
さらに、比較対象としては、未分化の胚性幹細胞を用いることも可能であり、公知の方法で作製されたものであれば、どのようなものであっても使用することができるＴｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８  Ｎｏｖ  ６；２８２（５３９１）：１１４５−７．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８  Ｄｅｃ  ４；２８２（５３９５）：１８２７．や、Ｈｉｒｏｆｕｍｉ  Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｂｌｅ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｂｕｌｋ  ｐａｓｓａｇｅ．”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３４５，９２６−３２（２００６）に記載された方法で得られた未分化の胚性幹細胞、理研バイオリソースセンター、京都大学再生医科学研究所等の、公知のルートから入手できる未分化の胚性幹細胞、ｈＥＳ＿Ｈ９（ＧＳＭ１９４３９０）、ｈＥＳ＿ＢＧ０３（ＧＳＭ１９４３９１）、ｈＥＳ＿ＥＳ０１（ＧＳＭ１９４３９２）等の公知の遺伝子発現データを用いることもできる。これらの遺伝子発現データは、前記したＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ〔ＧＥＯ〕から取得することが可能である。【０１５７】
前記悪性の性質または特異マーカーを同定して選別する工程は、原料体細胞を誘導処理した細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞若しくは未分化な胚性幹細胞とについて、ゲノーム解析、エピゲノーム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、細胞表面抗原解析、糖鎖解析（グライコーム解析）、代謝解析（メタボローム解析）、実験動物への移植後解析等を行い、その結果により誘導悪性幹細胞の悪性の性質または特異マーカーを同定し、悪性と同定されれば本発明の誘導悪性幹細胞として選別する工程である。【０１５８】
従って、本発明の方法により作製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な誘導悪性幹細胞に対してオミックス解析（ゲノーム解析、エピゲノーム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、グライコーム解析、およびメタボローム解析）を行うことにより、がんに特徴的なメチレーター表現型、ミューテーター表現型、ドライバー変異、またはがん治療創薬標的を同定することができる。この様ながんに特徴的なメチレーター表現型、ミューテーター表現型、ドライバー変異、またはがん治療創薬標的は、医薬品候補物、例えば低分子化合物、抗体またはｓｉＲＮＡなど、のスクリーニングのために使用することができ、その結果医薬品候補物を提供することができる。【０１５９】
ここでゲノーム解析とは、特定の生物種のゲノム塩基配列をすべて決定する解析を意味する。具体的には、ゲノムの全塩基配列を決定し、ゲノムに記載されている遺伝子の全てを同定し、最終的に、アミノ酸配列を決定するという解析である。ゲノムの全塩基配列の決定は、ゲノムシークエンス等によって、解析が行われる。【０１６０】
本発明の誘導悪性幹細胞について、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関わる性質を有する遺伝子に変異が確認され同定された場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別される。なお、本発明においては、がん遺伝子、がん抑制遺伝子、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関わる性質を有する遺伝子に変異が確認されれば良く、必ずしも全てのゲノムについて解析を行う必要はない。【０１６１】
エピゲノーム解析とは、遺伝子のＤＮＡには直接影響しないが、遺伝子の発現を変化させる化学的修飾である、ＤＮＡのメチル化とヒストン修飾がある。【０１６２】
本発明の誘導悪性幹細胞について、比較対象となる細胞と比較して、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関わる性質を有する遺伝子やがん関連遺伝子またはがん抑制関連遺伝子の発現異常が確認され、同定された場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別することが可能である。【０１６３】
トランスクリプトーム解析とは、特定の細胞生物学的な状況下において、１個あるいは増殖した、同様の分化状態にある生物の細胞中に存在する、全てのｍＲＮＡ（または、一次転写産物、トランスクリプト）を解析するものである。ｍＲＮＡは、その細胞が発生の過程で受けた細胞外からの影響の積み重ねによって色々と変化するため、現在の細胞の性質を詳細に解析することが可能となる。具体的には、マイクロアレイ等を用いて解析が行われる。【０１６４】
例えば、比較対象となる細胞と比較して、本発明の誘導悪性幹細胞に、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関与するｍＲＮＡや、変異したがん遺伝子に対応するｍＲＮＡや、変異したがん抑制遺伝子に対応するｍＲＮＡ、がん関連遺伝子に対するｍＲＮＡが多く存在する場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別することが可能である。【０１６５】
プロテオーム解析とは、特に構造と機能を対象としたタンパク質の大規模な解析のことであり、ある生物が持つ全てのタンパク質のセット、または、ある細胞がある瞬間に発現している全てのタンパク質のセットを解析するものである。【０１６６】
例えば、本発明の誘導悪性幹細胞および比較対象となる細胞を培養して、各々の細胞から分泌されたタンパク質を抽出し解析した結果、比較対象となる細胞と比較して、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関与するタンパク質が多く存在する場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別することが可能である。【０１６７】
細胞表面抗原解析とは、表面抗原あるいは表面マーカーと呼ばれる、細胞表面に発現しているタンパク質又は糖タンパク質などでできた様々な分子について解析するものである。【０１６８】
例えば、細胞表面抗原解析の結果、本発明の誘導悪性幹細胞に、がん細胞に特異的な表面抗原が発現している場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別することが可能である。【０１６９】
糖鎖解析（グライコーム解析）とは、細胞の表面の細胞膜上に存在するタンパク質や脂質の表面全体をうぶ毛のように覆っている糖鎖を解析するものである。糖鎖は、一般的な糖質とは異なり、複合糖質（糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン）の糖部分を指す。上記の糖鎖は、シアル酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンなどから構成されている。【０１７０】
例えば、糖鎖解析（グライコーム解析）の結果、本発明の誘導悪性幹細胞に、がん細胞に特異的な糖鎖が存在している場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別することが可能である。【０１７１】
メタボローム解析とは、代謝産物を網羅的に解析することを意味し、一般的には、クロマトグラフィー、質量分析計等の計測機器によって、有機化合物（代謝産物）の分離と同定を行うものである。本発明の誘導悪性幹細胞および比較対象となる細胞を培養して、各々の細胞から分泌された有機化合物（代謝産物）を分離して分析した結果、例えば、本発明の誘導悪性幹細胞に、比較対象となる細胞より、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、および再発等に関与する有機化合物（代謝産物）が多く存在する場合には、本発明の誘導悪性幹細胞として選別することが可能である。【０１７２】
誘導悪性幹細胞から誘導されるがん細胞
本発明においてはまた、本発明の誘導悪性幹細胞を、がん細胞に誘導してなるがん細胞を提供する。本発明のがん細胞は、本発明の誘導悪性幹細胞をがん細胞に誘導して得られるものであれば、特に制限されることはない。【０１７３】
具体的には、前記した増殖または継代培養で使用する培地や、誘導悪性幹細胞に誘導する工程で用いた培地に、マトリックス（コラーゲン、ゼラチン、マトリゲルなど）、抗ＴＧＦ−β１抗体、抗アクチビンＡ抗体、抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体、抗ＩＧＦ−Ｒ１抗体等の中和抗体、ＩＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ等の繊維芽細胞増殖因子を添加した場合には、これらの成分を除いた培地で培養を行うことにより、がん細胞に誘導することができる。その他、ＥＳ培地でない培地、例えば１０％血清含有ダルベッコ改変培地で１週間程度かそれ以上培養することによっても、がん細胞に誘導することができる。フィーダー細胞の除去や、浮遊培養することでもがん細胞へ分化誘導ができる。また、後述するがんモデル動物を作製する場合には、そのまま実験動物に移植すれば、がん細胞に誘導される。【０１７４】
誘導悪性幹細胞を用いるスクリーニング方法
本願第３の発明は、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を用いることを特徴とするスクリーニング方法であり、がん治療創薬標的のスクリーニング方法、がん治療薬候補物のスクリーニング方法およびがん診断薬のスクリーニング方法として好適である。【０１７５】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の誘導悪性幹細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞若しくは未分化な胚性幹細胞に、それぞれ被検物質を接触させる工程を含む。【０１７６】
がん治療創薬標的のスクリーニング方法としては、本発明の製造方法における、誘導悪性幹細胞の悪性の性質または特異マーカーを同定して選別する工程と同様の方法がある。即ち、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたと、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞若しくは未分化な胚性幹細胞とを比較することにより、がん治療創薬標的となりうる遺伝子やタンパク質を探索することができる。【０１７７】
探索の結果、がん治療創薬標的と推定される遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡや、低分子化合物、ペプチド、または抗体を、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を培養したシャーレに添加し、添加後の細胞の性状等を確認することにより、がん治療創薬標的となりうるか否かを評価することが可能である。【０１７８】
がん治療薬候補物のスクリーニング方法としては、抗がん剤、ワクチン（がんワクチンなど）の候補となる医薬品を、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を培養したシャーレに添加し、細胞の性状等を評価することにより、薬効を確認することができる。【０１７９】
より具体的には、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を用いて、抗腫瘍試験、がん転移能試験、薬剤耐性能試験、薬物代謝試験および代謝酵素誘導・阻害試験を行うことにより、抗がん剤としての有用性を確認することができる（「癌の薬剤耐性とその克服―基礎と臨床―」圓藤  吟史，萩原  聡，巽  典之編，宇宙堂八木書店、２００１年参照）。【０１８０】
がん診断薬のスクリーニング方法としては、がん診断薬に、様々な種類の本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を添加し、正確にがんと診断されるかどうかを確認することにより、がん診断薬として有効であるかどうか評価することが可能である。【０１８１】
誘導悪性幹細胞を用いたがんワクチンの作製方法
本願第４の発明は、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を用いた、がんワクチンの作製方法である。【０１８２】
より具体的には、ＣＴＬ療法、樹状細胞療法、がんペプチドワクチン療法等に有用ながんワクチンを、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を用いて作製することが可能である。【０１８３】
ＣＴＬ療法（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：細胞傷害性Ｔリンパ球療法）とは、患者から採取したリンパ球に、攻撃対象となるがんの特徴を人工的に学習させて活性化させ、細胞障害性を持った大量のＴリンパ球（ＣＴＬ細胞：細胞障害性Ｔリンパ球）を患者の体内に戻す治療方法である。【０１８４】
一般的にＣＴＬ療法では、リンパ球に学習させるために、患者自身のがん細胞の抗原で行う方法と、人工抗原を用いる方法があり、患者自身のがん細胞の抗原で行った場合の方が、より効果があると言われている。しかしながら、患者自身のがん細胞を用いる場合には、患者のがん細胞を採取する必要があるため、患者の身体的負担が大きく、さらに、得られたがん細胞をあらかじめ体外で十分な数に増やす必要があるものの、その培養が困難であるため、手術で比較的大きな腫瘍が摘出され、抗原の抽出に成功した場合に限られるという問題がある。【０１８５】
本発明の誘導悪性幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能であるため、必要な量の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を準備することが可能であり、加えて、がん細胞の採取によるがん患者の身体的負担を軽減することができるため、非常に有用である。【０１８６】
より具体的な製造方法としては、例えば、成分採血などにより、がん細胞を攻撃できるＴ細胞を患者の血液から抽出し、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞や、これらの細胞を溶解したライセート、さらには、これらの細胞をもとに得られたがん抗原たんぱく質またはペプチドを加えることにより、がん抗原をＴ細胞に学習させる。次いで、抗ＣＤ３抗体等で活性化した後、インターロイキン２等で培養することにより、がんワクチンである細胞障害性を持った大量のＴリンパ球が得られる。なお、誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞や、これらの細胞を溶解したライセートをがん抗原として用いる場合には、治療を受ける患者から手術によって摘出されたがん組織、または、前記患者の腹水等から採取したがん細胞から作製されたものが好ましく用いられる。【０１８７】
樹状細胞療法とは、患者から採取した樹状細胞に、攻撃対象となるがんの特徴を学習させ、その樹状細胞を患者の体内に戻す治療方法であり、体内に戻された樹状細胞が、Ｔリンパ球を刺激し、刺激されたＴ細胞がキラーＴ細胞となって、がん細胞を攻撃することによりがんを治療するものである。【０１８８】
この治療方法は、上記したＣＴＬ療法と同様に、手術で比較的大きな腫瘍が摘出され、抗原の抽出に成功した場合に限られるという問題があり、本発明の誘導悪性幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能であるため、必要な量の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を準備することが可能であり、加えて、がん細胞の採取によるがん患者の身体的負担を軽減することができるため、非常に有用である。【０１８９】
より具体的な製造方法としては、例えば、成分採血等により抽出された樹状細胞に、誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞や、これらの細胞を溶解したライセート、さらには、これらの細胞をもとに得られたがん抗原たんぱく質またはペプチドを加えることにより、がん抗原を樹状細胞に学習させ、がんワクチンである樹状細胞が作製される。なお、誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞や、これらの細胞を溶解したライセートをがん抗原として用いる場合には、治療を受ける患者から手術で摘出されたがん組織、前記患者の腹水等から採取したがん細胞から作製されたものが好ましく用いられる。【０１９０】
上記した樹状細胞は、１個の樹状細胞で数百から数千のリンパ球を刺激することが可能であるため、樹状細胞にがんの特徴を学習させ、体内に戻す治療法は、非常に効率的であると考えられる。しかしながら、樹状細胞の数は白血球の０．１〜０．５％程度であるため、血液中に数多く存在する、樹状細胞に変化可能な単球を成分分離採血法で大量に獲得し、さらに、サイトカイン等の、細胞を刺激する物質を用いて前記単球を樹状細胞へと培養し、これを用いることが可能である。【０１９１】
がんペプチドワクチン療法とは、がん細胞が持つ特異的な抗原としてペプチド（ペプチドワクチン）を注射することによって、患者の有する免疫力を高めてがんの増大を抑える治療方法である。具体的には、このペプチド（９または１０個のアミノ酸がつながった小さいペプチド）を体内に投与すると、ペプチドによって刺激を受けたキラーＴ細胞が活性化し、さらに増殖してがん細胞を攻撃するようになるという性質を利用して、がんを排除（退縮）する治療方法である。【０１９２】
本発明の誘導悪性幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能であり、様々な誘導悪性幹細胞を大量に増幅させることが可能であるため、様々ながん患者由来のがん細胞またはがん組織から作製された本発明の誘導悪性幹細胞を大量に培養させ、目的とするがんワクチンを作製することが可能である。このようにして得られたがんワクチンは、ＣＴＬ療法または樹状細胞療法に用いることも可能である。【０１９３】
上記したようながんワクチンは、がんの予防的治療や、化学療法、放射線療法、外科的療法等の、標準療法後の再発予防に非常に有効である。【０１９４】
誘導悪性幹細胞を用いたがんモデル動物の作製方法
本発明の第５の態様において、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を用いた、がんモデル動物の作製方法を提供する。【０１９５】
本発明のがんモデル動物の作製方法によれば、例えば、マウス等の実験動物に本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞を移植することにより、胆がんマウスを作製することができる。この胆がんマウスに抗がん剤、抗体、ワクチン等を投与した後、胆がんマウスの血液検査、尿検査、剖検等を行うことにより、その薬効を確認することができる。【０１９６】
本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞は、上記したスクリーニング方法、がんワクチン作製方法、がんモデル動物の作製方法以外にも、様々な応用が可能である。【０１９７】
例えば、誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞の遺伝子情報の中から分泌タンパク質および膜タンパク質を網羅的にスクリーニングし、がん診断マーカーとして有用な、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞に特異的な膜タンパク質および分泌タンパク質を同定し、治療または診断用抗体を作製することができる。分泌タンパク質および膜たんぱく質を網羅的にスクリーニングする方法としては、膜たんぱく質および分泌タンパク質に共通して存在するシグナルシークエンスをターゲットとする遺伝子同定を特徴とする「シグナルシークエンスストラップ法」（特許第３２２９５９０号および特許第３４９９５２８号）等が挙げられる。【０１９８】
また、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞について糖鎖構造解析を行うことにより、がん診断マーカーとして有用な、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞に特異的な糖鎖を同定し、治療や、診断用抗体、天然レクチンまたは人工レクチンを作製することができる。【０１９９】
糖鎖構造解析の例としては、次のような方法を例示することができる。まず、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞が産生する糖鎖遺伝子の発現プロファイルから、がん細胞が特徴的に産生する糖鎖構造を推測すると同時に、実際に産生・分泌された糖タンパク質糖鎖をレクチンマイクロアレイ分析し、がん細胞が特徴的に産生する糖鎖に反応するレクチンあるいは抗糖鎖抗体を、プローブとして選択する。次いで、選択されたプローブを用いて、がん細胞分泌糖タンパク質の中からがん性糖鎖を持つ糖タンパク質群（あるいはその断片糖ペプチド）を捕集し、ＩＧＯＴ法などの質量分析を基礎とした方法でそのコア糖タンパク質を同定する。本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞の培養液から、同定された糖タンパク質を精製し、再度レクチンアレイを基礎とした方法等で糖鎖構造変化を確認することにより、糖鎖疾患マーカー候補を見つけることが可能である。【０２００】
種々の哺乳動物に存在するカルシウム依存性のレクチンであるマンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）は、ある種のがん細胞に選択的に結合し、細胞障害作用を示すことが知られており、ヒト結腸がん細胞株ＳＷ１１１６から、ＭＢＰに特異的に結合するリガンド糖鎖が単離されている。このように、本発明の誘導悪性幹細胞または誘導悪性幹細胞から誘導されたがん細胞に特異的に発現している血清レクチンのリガンド糖鎖等を同定し、同定されたリガンド糖鎖に対するクローン抗体を作製することが可能である。このようにして得られた抗体もまた、治療または診断用抗体として有用である。【０２０１】
さらに、本発明の誘導悪性幹細胞の応用としては、これらの細胞のゲノーム解析、エピゲノーム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、細胞表面抗原解析、糖鎖解析（グライコーム解析）、メタボローム解析等で用いられる、ゲノーム、エピゲノーム（ＤＮＡメチローム）、トランスクリプトーム、プロテオーム、全糖鎖（グライコーム）、メタボロームが提供される。また、これらを用いて解析された、ＤＮＡメチル化情報、ヒストン修飾のプロファイリング、ゲノムワイドのＲＮＡ発現情報（トランスクリプトーム情報）、タンパク発現情報（プロテオーム情報）、レクチン結合性プロファイリング情報、メタボローム情報が提供され、創薬応用を行うことが可能である。【０２０２】
例えば、本発明の誘導悪性幹細胞で発現しているｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡや、ノンコ−ディングＲＮＡを含むトータルＲＮＡをもとに、がん治療創薬標的の探索・同定を行うことも可能である。【０２０３】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０２０４】
実施例１：胃がん患者のがん組織由来の細胞（ＧＣ２）からの誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵保存・運搬したドナーＮｏ．１のヒト胃がん患者（医学情報：胃がん、女性、６７歳、日本人、血液型Ｏ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴なし、薬物中毒なし、薬剤治療なし、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮がん組織から細胞を単離した（ＧＣ２）。同様に、新鮮非がん組織から細胞を単離した（ＮＧＣ２）。得られた固形がんである胃がん組織由来の細胞に、ディナベック社製ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ（ＤＶ−０３０１−１）の４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）センダイウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、固形がんである胃がん組織からヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。なお、センダイウイルスベクターは外来性のＤＮＡを細胞のゲノムＤＮＡに挿入しないＲＮＡウイルスベクターである。【０２０５】
手術時に得られた固形がんである胃がん組織の一部（０．５〜１ｇ）を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１４１７５−０９５）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。更に、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して３ｍｌの０．１％コラゲナーゼ（和光純薬社製；Ｃａｔ  ｎｏ．０３４−１０５３３）／１×抗生物質−抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ）添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて、３７℃で９０分間攪拌した。【０２０６】
組織沈殿が十分消化されたことを確認後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を１０ｍｌ加え、マトリゲル（ＢＤ社、３５６２３４）コートした培養皿１００ｍｍ（６０μＬマトリゲル／６ｍＬ／６０ｃｍ２ＰＢＳで１時間コート）に播種し、初代培養した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２０７】
１日後、４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）のセンダイウイルスベクターを添加し、３７℃で１日間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地１０ｍｌに懸濁後、胃がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したマトリゲルコート培養皿１００ｍｍに１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種して共培養した。【０２０８】
その後、ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ培地（１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１×抗生物質−抗真菌剤、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加）又はＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製フィーダー細胞フリー用ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地ｍＴｅＳＲ１（１×抗生物質−抗真菌剤、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加）で１〜３日毎に培地交換した。ＭＥＦは約１週間に１回、１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種した。【０２０９】
ゲンタマイシン（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１５７５０−０６０）
ｂＦＧＦ（ペプロテック社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１００−１８Ｂ）
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ／抗生物質−抗真菌剤（インビトロジェン社製）【０２１０】
遺伝子導入から１カ月以降に３クローン（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿２、ＧＣ２＿４、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿７、ＧＣ２＿１０、ＧＣ２＿１３、ＧＣ２＿１６）のコロニーをピックアップし、ＭＥＦを播種したゼラチン又はマトリゲルコート２４ウェルプレート中に継代した。なお、フィーダー細胞／ＭＥＦはマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に１．５×１０６ｃｅｌｌ／２４ウェルプレートでゼラチン又はマトリゲルコートした２４ウェルプレートに播種した。【０２１１】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。【０２１２】
胃がん患者のがん組織由来の細胞、胃がん患者の非がん組織由来の細胞、及び胃がん患者のがん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、細胞凍結保存は、以下の通りである。【０２１３】
細胞から培地を除き、ＰＢＳ（−）１０ｍｌを用いて、直径１００ｍｍ（面積約６０ｃｍ２）培養皿の細胞を洗浄した後、細胞剥離液を３ｍｌ／１０ｃｍ（約６０ｃｍ２）培養皿に加えた。継代培養時の細胞剥離液としては、０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．２５２００−０５６）を用いた。【０２１４】
３７℃３〜５分間静置した後、細胞剥離液を除き、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ無添加）培地を１７ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を２ｍｌ加えて、セラムチューブ４本に分注した。その後、セラムチューブを動物細胞凍結処理容器（バイセル／ＢＩＣＥＬＬ）に入れて、−８０℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管した。凍結用保存液としてはＴＣプロテクター（ＤＳファーマバイオメデイカル株式会社）を用いた。【０２１５】
以上の様に、胃がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞（外来性のＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに挿入なし）は、マトリゲル又はゼラチンコートした培養皿でＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて作製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（６０μＬ／６０ｃｍ２）培養皿でＲｍＴｅＳＲ１を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。【０２１６】
実施例２：大腸がん患者のがん組織由来の細胞（ＣＣ３）からヒト誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵・運搬したドナーＮｏ．２のヒト大腸がん患者（医学情報：Ｓ状結腸がん、男性、７７歳、日本人、血液型Ａ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴ビール１本／日、薬物中毒なし、薬剤治療なし、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮がん組織から細胞を単離した（ＣＣ３）。同様に、同じドナーの新鮮非がん組織から細胞を単離した（ＮＣＣ３）。得られたヒト大腸がん患者のがん組織由来の細胞に、ディナベック社製ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ（ＤＶ−０３０１−１）の４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）センダイウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、固形がんである大腸がん組織からヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。なお、センダイウイルスベクターは外来性のＤＮＡを細胞のゲノムＤＮＡに挿入しないＲＮＡウイルスベクターである。【０２１７】
手術時に得られた固形がんである大腸がん組織の一部（０．５〜１ｇ）を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１４１７５−０９５）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。更に、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して３ｍｌの０．１％コラゲナーゼ（和光純薬社製；Ｃａｔ  ｎｏ．０３４−１０５３３）／１×抗生物質−抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ）添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて、３７℃で９０分間攪拌した。【０２１８】
組織沈殿が十分消化されたことを確認後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を１０ｍｌ加え、マトリゲル（ＢＤ社、３５６２３４）コートした培養皿１００ｍｍ（６０μＬマトリゲル／６ｍＬ／６０ｃｍ２ＰＢＳで１時間コート）に播種し、初代培養した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２１９】
１日後、４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）のセンダイウイルスベクターを添加し、３７℃で１日間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地１０ｍｌに懸濁後、胃がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したマトリゲルコート培養皿１００ｍｍに１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種して共培養した。【０２２０】
その後、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ培地（１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１×抗生物質−抗真菌剤、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加）又はｍＴｅＳＲ１（１×抗生物質−抗真菌剤、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加）で１〜３日毎に培地交換した。ＭＥＦは約１週間に１回、１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種した。【０２２１】
遺伝子導入から１カ月以降にコロニーの２クローン（ＣＣ３＿５、ＣＣ３＿６）をピックアップし、ＭＥＦを播種したゼラチン又はマトリゲルコート２４ウェルプレート中に継代した。なお、フィーダー細胞／ＭＥＦはマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に１．５×１０６ｃｅｌｌ／２４ウェルプレートでゼラチン又はマトリゲルコートした２４ウェルプレートに播種した。【０２２２】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。【０２２３】
大腸がん患者のがん組織、大腸がん患者の非がん組織、及び大腸がん患者のがん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、本発明の実施例において行われる細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２２４】
胃がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞（外来性のＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに挿入なし）は、マトリゲル又はゼラチンコートした培養皿でＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて作製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（６０μＬ／６０ｃｍ２）培養皿でｍＴｅＳＲ１を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。
なお、細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２２５】
実施例３：レトロウイルスベクターの調製
ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓの３遺伝子のレトロウイルスベクタープラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（ロシュ社製；Ｃａｔ  ｎｏ．４７０９６９１）を用いて、パントロピックレトロウイルスベクター調製用パッケージング細胞であるＰｌａｔ−ＧＰ細胞に導入し、レトロウイルスベクター液を調製した。詳細は、以下の通りである。【０２２６】
＜胃がん組織由来細胞（ＧＣ１）の遺伝子導入用レトロウイルスベクター液の調製＞
ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓは構築したベクターである（表９）。
各ベクターの量は、ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ  ５μｇ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ  ２．５μｇ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓ  １．２５μｇ、Ｖｅｎｕｓ−ｐＣＳ２  １．２５μｇ、ＶＳＶ−Ｇ−ｐＣＭＶ  ５μｇ、ＧＦＰ−ｐＭＸｓ１．２５μｇ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂ製）、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ４５μｌとした。【０２２７】
＜胃非がん組織由来細胞（ＮＧＣ１）の遺伝子導入用レトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓは構築したベクターである（表９）。
各ベクターの量は、ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ  ５μｇ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ  ２．５μｇ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓ  １．２５μｇ、Ｖｅｎｕｓ−ｐＣＳ２  １．２５μｇ、ＶＳＶ−Ｇ−ｐＣＭＶ  ５μｇ、ＧＦＰ−ｐＭＸｓ  １．２５μｇ、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ４５μｌとした。【０２２８】
＜結腸がん組織由来細胞（ＣＣ１）の遺伝子導入用レトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓは構築したベクターである。
各ベクターの量は、ＰＯＵ５Ｆ１−ｐＭＸｓ  ５μｇ、ＫＬＦ４−ｐＭＸｓ  ２．５μｇ、ＳＯＸ２−ｐＭＸｓ  １．２５μｇ、Ｖｅｎｕｓ−ｐＣＳ２  １．２５μｇ、ＶＳＶ−Ｇ−ｐＣＭＶ  ５μｇ、ＧＦＰ−ｐＭＸｓ  １．２５μｇ、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  ４５μｌとした。【０２２９】
レトロウイルスベクタープラスミドを導入したＰｌａｔ−ＧＰ細胞を、４８時間以上培養した後、２４時間毎に３回上清を回収し４℃で保存した。ステリフリップ−ＨＶフィルターユニット：０．４５μｍ径のフィルター（ミリポア社製；Ｃａｔ  ｎｏ．ＳＥ１Ｍ００３Ｍ００）でろ過を行った。以上の手順により３遺伝子のパントロピックレトロウイルスベクター液を調製した。パントロピックレトロウイルスベクターは、様々な細胞に遺伝子導入することが可能であり、ヒト細胞へ高い効率で遺伝子導入することができる。【０２３０】
【表９】
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【０２３１】
実施例４：胃がん患者のがん組織由来の細胞（ＧＣ１）からの誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵・運搬したドナーＮｏ．３のヒト胃がん患者（医学情報：進行がん、男性、６７歳、日本人、血液型ＡＢ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴なし、薬物中毒なし、薬剤治療なし、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮がん組織から細胞（ＧＣ１）を単離した。同様に、同じドナーの新鮮非がん組織から細胞（ＮＧＣ１）を単離した。得られた胃がん患者のがん組織由来の細胞に、実施例３において調製した３遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、固形がん（胃がん）組織からヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２３２】
手術時に得られた固形がんである胃がん組織の一部（０．５〜１ｇ）を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１４１７５−０９５）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。更に、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して５ｍｌの０．１％コラゲナーゼ（和光純薬社製；Ｃａｔ  ｎｏ．０３４−１０５３３）／１×抗生物質−抗真菌剤添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて、３７℃で６０分間攪拌した。【０２３３】
組織沈殿が十分消化されたことを確認後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を５ｍｌ加え、コラーゲンコートディッシュ６０ｍｍ（イワキ社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０１８−００４）に播種し、初代培養した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２３４】
２４時間後に培地を除き、５ｍｌの３遺伝子のレトロウイルスベクターを添加し、３７℃で２４時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞を、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地５ｍｌに懸濁後、胃がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したコラーゲンコートディッシュ６０ｍｍ（イワキ社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０１８−００４）に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２播種し、共培養した。【０２３５】
その後３日毎にＭＥＦ馴化ＥＳ培地の交換を続け、遺伝子導入から１５日後から、ｍＴｅＳＲ１で毎日培地交換を行った。ＭＥＦは約１週間に１回、１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種した。【０２３６】
実施例を通じて使用するＭＥＦ馴化ＥＳ培地、及び、その調製方法は、以下の通りである。【０２３７】
＜ＭＥＦ馴化ＥＳ培地＞
ＭＥＦ
マイトマイシンＣ処理初代マウス胚性繊維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製；Ｃａｔ  ｎｏ．Ｒ−ＰＭＥＦ−ＣＦ）【０２３８】
ＭＥＦ馴化用ＥＳ培地
ノックアウトＤ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１０８２９−０１８）５００ｍｌ
２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（（インビトロジェン社製）
１０％ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１０８２８−０２８）
５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１５７５０−０６０）
ＭＥＭ非必須アミノ酸液（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１１１４０−０５０）
１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ペプロテック社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１００−１８Ｂ）【０２３９】
＜ＭＥＦ馴化ＥＳ培地の調製＞
マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製；Ｃａｔ  ｎｏ．Ｒ−ＰＭＥＦ−ＣＦ）５×１０６ｃｅｌｌを、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地４０ｍｌに懸濁後、ゼラチンコートディッシュ１００ｍｍ（イワキ社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０２０−００６）４枚に播種した。２４時間後に培地を除き、ＭＥＦ馴化用のＥＳ培地を１０ｍｌ加えた。【０２４０】
２４時間毎に回収した上清へ新たに１０％ノックアウト血清リプレースメント、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを加え、ＭＥＦ馴化ＥＳ培地として用いた。【０２４１】
〔胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導悪性幹細胞の樹立〕
３遺伝子の導入２５日後以降から、誘導悪性幹細胞のコロニーを６クローン（ＧＣ１＿４、ＧＣ１＿６、ＧＣ１＿７、ＧＣ１＿８、ＧＣ１＿９、ＧＣ１＿１０）ピックアップし、ゼラチンコート２４ウェルプレート中のイーダー細胞上へ移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２でゼラチンコート２４ウェルプレートに播種した。【０２４２】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。ヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２４３】
継代培養時の細胞剥離液としては、以下の２種類を用いた：
（ｉ）０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．２５２００−０５６）
（ｉｉ）調製剥離液〔１０ｍｇ／ｍｌタイプＩＶコラゲナーゼ（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１７１０４−０１９）１０ｍｌ、１００ｍＭ塩化カルシウム溶液（シグマ）１ｍｌ、ＰＢＳ５９ｍｌ、２．５％トリプシン溶液（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１５０９０−０４６）１０ｍｌ、ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ、インビトロジェン社Ｃａｔｎｏ．１０８２８−０２８）２０ｍｌ；これらを溶解後、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌したもの〕。【０２４４】
３７℃５分間静置したのち、細胞剥離液を除き、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を２０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を１ｍｌ加えて、セラムチューブ２本に分注した。その後、セラムチューブを動物細胞凍結処理容器（バイセル／ＢＩＣＥＬＬ）に入れて、−８０℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管した。【０２４５】
凍結用保存液としては以下の３種類を用いた：
（ｉ）セルバンカー３（日本全薬工業Ｃａｔ  ｎｏ．ＢＬＣ−３Ｓ）
（ｉｉ）５０％ｍＴｅＳＲ１、４０％ＫＳＲ、１０％ＤＭＳＯの混液。
（ｉｉｉ）ＴＣプロテクター（ＤＳファーマバイオメデイカル株式会社）【０２４６】
胃がん患者の胃がん組織由来の誘導悪性幹細胞はマトリゲル又はゼラチンコートした培養皿でＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて、作製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（６０μＬ／６０ｃｍ２）培養皿でｍＴｅＳＲ１を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。【０２４７】
実施例５：胃がん患者非がん組織由来の細胞（ＮＧＣ１）からのヒト誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵・運搬したドナーＮｏ．３のヒト胃がん患者（医学情報：進行がん、男性、６７歳、日本人、血液型ＡＢ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴なし、薬物中毒なし、薬剤治療なし、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮非がん組織から細胞を単離し、初代培養した。得られた胃がん患者非がん組織由来の細胞に、実施例３において調製した３遺伝子レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子を導入することによって、ヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２４８】
手術時に得られた胃がん（進行がん：男性、６７歳、日本人）患者の非がん新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄した後、上清を除去し、組織沈殿に対して５ｍｌ  ０．１％コラゲナーゼ／１×抗生物質−抗真菌剤添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて３７℃、６０分間で攪拌した。【０２４９】
組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。更に、上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を１０ｍｌ加え、コラーゲンコートディッシュ１００ｍｍ（イワキ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０１８−００６）に播種した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２５０】
約２４時間後、培地を除き、１０ｍｌの３遺伝子レトロウイルスベクターを添加し、３７℃で約２４時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞を、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地１０ｍｌに懸濁後、胃がん患者非がん組織由来の遺伝子導入された細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ１００ｍｍ（イワキ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０１８−００６）へ５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２で播種し、共培養された。【０２５１】
〔胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞の樹立〕
それ以降、３日毎にＭＥＦ馴化ＥＳ培地の交換を続け、３遺伝子導入から３１日後、ｍＴｅＳＲ１で毎日培地交換を行った。ＭＥＦは約１週間に１回、１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種した。遺伝子導入から４１日以降に誘導悪性幹細胞のコロニーを２クローン（ＮＧＣ１＿６、ＮＧＣ１＿７）ピックアップし、ゼラチンコート２４ウェルプレート中のフィーダー細胞上へ移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２でゼラチンコート２４ウェルプレートに播種した。【０２５２】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、本発明の実施例において行われる細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２５３】
胃がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞はマトリゲル又はゼラチンコートした培養皿でＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（６０μＬ／６０ｃｍ２）培養皿でｍＴｅＳＲ１を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。【０２５４】
実施例６：大腸がん患者のがん組織由来の細胞（ＣＣ１）からヒト誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵・運搬したドナーＮｏ．４のヒト大腸がん患者（医学情報：Ｓ状結腸がん、男性、５５歳、日本人、血液型Ｂ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴なし、薬物中毒なし、薬剤治療なし、糖尿病なし、空腹時血糖値９４、ＨｂＡ１ｃ値４．８、血中トリグリセリド値５６、ＬＤＬ−コレステロール値１２２、身長１７２ｃｍ、体重６８．６Ｋｇ）、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮がん組織から細胞を単離した（ＣＣ１）。同様に、同じドナーの新鮮非がん組織から細胞を単離した（ＮＣＣ１）。得られたヒト大腸がん患者のがん組織由来の細胞に、実施例３において調製した３遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２５５】
手術時に得られた固形がんである大腸がんの一部をハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄した。次いで、上清を除去し、組織沈殿に対して５ｍｌ  ０．１％コラゲナーゼ／１×抗生物質−抗真菌剤添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて、３７℃で６０分間攪拌した。【０２５６】
組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を１０ｍｌ加え、コラーゲンコートディッシュ１００ｍｍ（イワキ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０１８−００６）に播種した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２５７】
約２４時間後に培地を除き、１０ｍｌの３遺伝子のレトロウイルスベクターを添加し、その５時間後、５ｍｌのＬｕｃ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのレトロウイルスベクターを３７℃で約２４時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったＭＥＦを１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地１０ｍｌに懸濁後、結腸がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ１００ｍｍ（イワキ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．１１−０１８−００６）へ５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２で播種し、共培養された。【０２５８】
〔大腸がん患者のがん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養〕
その後、３日毎にＭＥＦ馴化ＥＳ培地の交換を続け、遺伝子導入２２日後から、ｍＴｅＳＲ１で毎日培地交換を行った。ＭＥＦは約１週間に１回、１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種した。遺伝子導入から３１日以降に１０クローン（ＣＣ１＿１、ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７、ＣＣ１＿８、ＣＣ１＿９、ＣＣ１＿１１、ＣＣ１＿１２、ＣＣ１＿１７、ＣＣ１＿１８、ＣＣ１＿２５）コロニーをピックアップし、ゼラチンコート２４ウェルプレート中のフィーダー細胞上に継代した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２でゼラチンコート２４ウェルプレートに播種した。【０２５９】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。大腸がん患者の非がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２６０】
大腸がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞はマトリゲル又はゼラチンコートした培養皿でＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて作製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（６０μＬ／６０ｃｍ２）培養皿でｍＴｅＳＲ１を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。【０２６１】
実施例７：大腸がん患者のがん組織由来の細胞（ＣＣ４）からの誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵・運搬したドナーＮｏ．５のヒト大腸がん患者（医学情報：大腸がん、女性、７７歳、日本人、血液型ＡＢ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴なし、薬物中毒なし、薬剤治療（アマリール１．５ｍｇ、メリビン２５ｍｇ×３ケ、ミセルディユ２０ｍｇ、クレストール２．５ｍｇ）、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮がん組織から細胞を単離した（ＣＣ４）。同様に、新鮮大腸非がん組織から細胞を単離した（ｎｃｃ４）。得られた固形がんである大腸がん組織由来の細胞（ＣＣ４）に、ディナベック社製ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ（ＤＶ−０３０１−１）の４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）センダイウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、固形がん（大腸がん）組織からヒト誘導悪性幹細胞を作製した。なお、センダイウイルスベクターは外来性のＤＮＡを細胞のゲノムＤＮＡに挿入しないＲＮＡウイルスベクターである。詳細は以下の通りである。【０２６２】
手術時に得られた固形がんである大腸がん組織の一部（０．５〜１ｇ）を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１４１７５−０９５）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。更に、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して３ｍｌの１％コラゲナーゼ（和光純薬社製；Ｃａｔ  ｎｏ．０３４−１０５３３）／１×抗生物質−抗真菌剤添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて、３７℃で９０分間攪拌した。【０２６３】
組織沈殿が十分消化されたことを確認後、１×抗生物質−抗真菌剤を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤及び１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＳｔｅｍＰｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）１０ｍｌを加え、マトリゲルコート培養皿１００ｍｍ（６０μＬマトリゲル／６ｍＬ  ＰＢＳで１時間コート）又は６ｗｅｌｌプレート（６０μＬマトリゲル／６ｍＬ／６ｗｅｌｌ  ＰＢＳで１時間コート）に播種し、初代培養した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２６４】
固形がんである大腸がん組織由来の細胞（ＣＣ４）に４遺伝子のセンダイウイルスベクターを添加し、３７℃で１日間感染させた。マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞を、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）１０ｍｌに懸濁後、大腸がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したマトリゲルコート培養皿１００ｍｍ又は６ｗｅｌｌプレートに１．５×１０６を播種し、共培養した。【０２６５】
その後３日毎にＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）培地の交換を続けた。
遺伝子導入から２週間以降にコロニーの１１クローン（ＣＣ４＿（９）＿５、ＣＣ４＿（９）＿７、ＣＣ４＿（９）＿１１、ＣＣ４＿（９）＿１３、ＣＣ４＿（３）＿１０、ＣＣＣ４＿Ｃ４＿６、ＣＣ４＿３０、ＣＣ４−１０、ＣＣ４−３１、ＣＣ４＿１、２）をピックアップし、ゼラチン又はマトリゲルコート２４ウェルプレート中のマウス胚性繊維芽細胞上に継代した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に１．５×１０６ｃｅｌｌ／６ｗｅｌｌプレートでゼラチン又はマトリゲルコート２４ウェルプレートに播種した。【０２６６】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。【０２６７】
なお、６ｗｅｌｌプレートの各々１ｗｅｌｌ中全てのヒト誘導悪性幹細胞をＣＣ４＿（３）、ＣＣ４＿（４）、ＣＣ４＿（６）として称し、１０ｃｍ培養皿に継代（第１継代）した。【０２６８】
継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞を、１０ｃｍ培養皿に継代と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞を、１０ｃｍ培養皿に継代と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。【０２６９】
大腸がん患者のがん組織、大腸がん患者の非がん組織、及び大腸がん患者のがん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２７０】
大腸がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞はマトリゲル又はゼラチンコートした培養皿でフィーダー細胞であるＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（１μｌ／ｃｍ２）培養皿でＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。【０２７１】
実施例８：大腸がん患者のがん組織由来の細胞（ＣＣ４）からの誘導悪性幹細胞の作製
保存液（カナマイシン、ファンギゾン添加ハンクス液）に数時間冷蔵・運搬したドナーＮｏ．５のヒト大腸がん患者（医学情報：大腸がん、女性、７７歳、日本人、血液型ＡＢ型、化学療法なし、放射線療法なし、免疫抑制療法なし、喫煙歴なし、飲酒歴なし、薬物中毒なし、薬剤治療（アマリール１．５ｍｇ、メリビン２５ｍｇ×３ケ、ミセルディユ２０ｍｇ、クレストール２．５ｍｇ）、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性、ＨＢＶ陰性、梅毒陰性）の新鮮がん組織から細胞を単離した（ＣＣ４）。同様に、新鮮大腸非がん組織から細胞を単離した（ｎｃｃ４）。【０２７２】
遺伝子導入しないで、固形がん（大腸がん）組織からヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２７３】
手術時に得られた固形がんである大腸がん組織の一部（０．５〜１ｇ）を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）（インビトロジェン社製；Ｃａｔ  ｎｏ．１４１７５−０９５）で洗浄し、剪刀を用いて約０．１〜１ｍｍ２に細断した。更に、ハンクス平衡塩液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して３ｍｌの１％コラゲナーゼ（和光純薬社製；Ｃａｔ  ｎｏ．０３４−１０５３３）／１×抗生物質−抗真菌剤添加ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、振盪器を用いて、３７℃で９０分間攪拌した。【０２７４】
組織沈殿が十分消化されたことを確認後、１×抗生物質−抗真菌剤を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を３５ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、１×抗生物質−抗真菌剤を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地を４０ｍｌ加えて、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、一部の細胞に１×抗生物質−抗真菌剤含むｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）１０ｍｌを加え、マトリゲルコート培養皿１００ｍｍ（６０μＬマトリゲル／６ｍＬ  ＰＢＳで１時間コート）又は６ｗｅｌｌプレート（６０μＬマトリゲル／６ｍＬ／６ｗｅｌｌ  ＰＢＳで１時間コート）に播種し、初代培養した。残りの細胞は液体窒素中へ保存液に懸濁して保存した。後日、一部を融解して、初代培養した。【０２７５】
３７℃で１日間培養後、マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）１．５×１０６をＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）１０ｍｌに懸濁後、大腸がん患者のがん組織由来の細胞を培養したマトリゲルコート培養皿１００ｍｍに播種し、共培養した。その後３日毎にＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）培地の交換を続けた。【０２７６】
共培養から２週間以降にコロニーの２クローン（ＣＣ４−ｃ、ＣＣ４−Ｄ）をピックアップし、ゼラチン又はマトリゲルコート２４ウェルプレート中のマウス胚性繊維芽細胞上に継代した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２でゼラチンコート２４ウェルプレートに播種した。【０２７７】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。大腸がん患者のがん組織、大腸がん患者の非がん組織、及び大腸がん患者のがん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２７８】
以上のように、フィーダー細胞であるＭＥＦと共にｍＴｅＳＲ１又はＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて大腸がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞（遺伝子導入無し）を作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。なお、ゲノムＤＮＡ又はトータルＲＮＡを回収する直前の培養は、フィーダー細胞なしのマトリゲル（ＢＤ、３５６２３４）コートした（１μＬ／ｃｍ２）培養皿でＲｅｐｒｏｓｔｅｍ（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ添加）を用いて誘導悪性幹細胞を培養した。【０２７９】
参考例：線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞
市販線維芽細胞（正常組織由来の細胞）に、ディナベック社製ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ（ＤＶ−０３０１−１）の４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）センダイウイルスベクター液又は３遺伝子レトウイウルスベクターを添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導多能性幹細胞などのヒト誘導幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。なお、センダイウイルスベクターは外来性のＤＮＡを細胞のゲノムＤＮＡに挿入しないＲＮＡウイルスベクターである。【０２８０】
新生児線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製ドナー番号７ｆ３９５６（ドナーＮｏ．６）又は７ｆ３９４９（ドナーＮｏ．７））を培養１日後、４遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ）のセンダイウイルスベクター又は３遺伝子レトロウイルスベクターを添加し、３７℃で１日間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、１×抗生物質−抗真菌剤及びＦＢＳを１０％含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地１０ｍｌに懸濁後、遺伝子導入線維芽細胞を培養したマトリゲルコート培養皿１００ｍｍに１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種して共培養した。【０２８１】
その後、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ培地（１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１×抗生物質−抗真菌剤、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加）又はｍＴｅＳＲ１（１×抗生物質−抗真菌剤、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加）で１〜３日毎に培地交換した。ＭＥＦは約１週間に１回、１．５×１０６ｃｅｌｌ／６０ｃｍ２で播種した。【０２８２】
遺伝子導入から１カ月以降に８クローン（ｎｆｂ１＿２、ｎｆｂ１＿４、ｎｆｂ２−１７）のコロニーをピックアップし、ＭＥＦを播種したゼラチン又はマトリゲルコート２４ウェルプレート中に継代した。なお、フィーダー細胞／ＭＥＦはマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導幹細胞のピックアップ前日に１．５×１０６ｃｅｌｌ／２４ウェルプレートでゼラチン又はマトリゲルコートした２４ウェルプレートに播種した。【０２８３】
その後、７〜１０日後に、２４ウェルプレートで増殖したヒト誘導幹細胞（第１継代）を、６ウェルプレートに継代（第２継代）した。継代から７〜１０日後に、６ウェルプレートで増殖したヒト誘導幹細胞（第２継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第３継代）した。継代から７〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導幹細胞（第３継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第４継代）と凍結保存をした。継代から４〜１０日後に、１０ｃｍ培養皿で増殖したヒト誘導幹細胞（第４継代）を、１０ｃｍ培養皿に継代（第５継代）と凍結保存をした。なお、培養皿は、ゼラチン又はマトリゲルコートして用いた。【０２８４】
ヒト誘導幹細胞のゲノムＤＮＡをキアゲン社製ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（６９５０４）で精製し、トータルＲＮＡをキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２１７００４）で精製した。なお、細胞凍結保存は、既述の通りである。【０２８５】
誘導幹細胞ｎｆｂ１＿２（ドナー番号７ｆ３９５６由来／レトロウイルスベクターで作製）、ｎｆｂ１＿４（ドナー番号７ｆ３９５６由来／レトロウイルスベクターで作製）、ｎｆｂ２−１７（ドナー番号７ｆ３９４９／センダイウイルスベクターで作製）は新生児皮膚（正常組織）の細胞由来である。成人皮膚由来の線維芽細胞から作製された誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７と同様に正常なゲノム、エピゲノム、遺伝子発現（ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ）、タンパク質発現、糖鎖、メタボロームを有し、胚性幹（ＥＳ）細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＺＦＰ４２）を発現する細胞である。従って、各種解析の参照細胞として用いた。他にも、ｎｆｂ１＿２、ｎｆｂ１＿４、ｎｆｂ２−１７、２０１Ｂ７は下記表に示す胚性幹（ＥＳ）細胞特異的な遺伝子を発現した。
【表１０】
2013081188.tif 000079
【０２８６】
実施例９：誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡのメチル化異常
本実施例においては、誘導多能性幹細胞、誘導非悪性幹細胞または非がん部位組織と比較して、（１）（ａ）における誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）を検出した。【０２８７】
（９−１）材料
内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）などの市販のメチル化解析用ツールを、製造者の指示にしたがって使用して、検出を行った。【０２８８】
内在性ゲノムＤＮＡのがん抑制遺伝子またはがん関連遺伝子領域のメチル化異常（高メチル化または低メチル化）の解析のための試料としては、
・ドナーＮｏ．１の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１）、
・ドナーＮｏ．２の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿５）、
・ドナーＮｏ．３の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４、ＮＧＣ１＿６）、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）、新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ）、
・ドナーＮｏ．６の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９５６）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ１＿４）、そして
・ドナーＮｏ．７の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９４９）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ２＿１７）、
を使用した。【０２８９】
（９−２）メチル化の網羅的検索
本実施例においては、誘導悪性幹細胞と誘導多能性幹細胞、誘導非悪性幹細胞または非がん部位組織とのあいだで、細胞内でのメチル化を網羅的に比較した。この様な比較は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）などの市販のメチル化解析用ツールを、製造者の指示にしたがって使用して行うことができる。【０２９０】
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）は、可能な限り広く包括的にメチル化状態をとらえることを目的として、プロモータ領域、５’非翻訳領域、第１エクソン、遺伝子内、３’非翻訳領域、において複数部位をターゲットとしており、遺伝子領域全体をカバーすることができる。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりカバーされる遺伝子領域についての情報は、ｉｌｌｕｍｉｎａから公開されている。そして、本実施例における差分解析では、様々な組織、複数の癌腫で確認された正常細胞と癌細胞間で異なるメチル化を示す領域を検出するプローブ（総数６６５９個、詳細な情報はｉｌｌｕｍｉｎａから公開されている）を使用した。ＢｅａｄＣｈｉｐにより、これまでの方法ではメチル化を検出することができなかった領域の遺伝子を含め、９９％の参照配列遺伝子を網羅的に解析することが可能である。【０２９１】
本実施例においては、
・誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ）と正常細胞（ｎｃｃ４）のメチル化比較（表１１）、
・誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）のメチル化比較（表１２）、
・誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）のメチル化比較（表１３）、
・誘導非悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）のメチル化比較（表１４）、
・誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿５）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ２−１７）のメチル化比較（表１５）、
・誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ２−１７）のメチル化比較（表１６）、
・誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４）と誘導非悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６）のメチル化比較（表１７）、
について、試験を行った。【０２９２】
（９−３）メチル化の網羅的検索および比較解析の結果
それぞれの結果は、下記の各表に列挙した。
これらの表中、「ＴａｒｇｅｔＩＤ」は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）でのプローブのＩＤを示し、「ＵＣＳＣ＿ＲｅｆＧｅｎｅ＿Ｎａｍｅ」はメチル化部位に存在する遺伝子の表記を示し、「差分値絶対値」は、２つの細胞のそれぞれにおけるそれぞれのＴａｒｇｅｔＩＤでのメチル化レベルの間の差の絶対値を意味し、正常細胞または誘導多能性幹細胞と比較した場合に、がん細胞または誘導悪性幹細胞でのメチル化レベルが全く同じ場合をゼロとし、上昇している場合および減少している場合を、全く同じメチル化レベルであった場合からの差分値の絶対値として示したものである。また「ＣＨＲ」は、それぞれのメチル化部位が存在する染色体番号を示している。【０２９３】
以下の表１１は、誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ）と正常細胞（ｎｃｃ４）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。【０２９４】
【表１１】
2013081188.tif 000080
2013081188.tif 000081
【０２９５】
上記２０種を含め、ＣＣ４＿ｃサンプルとｎｃｃ４サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは４，５４６個存在した（詳細なデータは示さず）。【０２９６】
以下の表１２は、誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。
【表１２】
2013081188.tif 000082
【０２９７】
上記２０種を含め、ＣＣ１＿１サンプルとｎｆｂ１−４サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは２２８個存在した（詳細なデータは示さず）。【０２９８】
以下の表１３は、誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。
【表１３】
2013081188.tif 000083
【０２９９】
上記２０種を含め、ＧＣ１＿４サンプルとｎｆｂ１−４サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは１７５個存在した（詳細なデータは示さず）。【０３００】
以下の表１４は、誘導悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。
【表１４】
2013081188.tif 000084
2013081188.tif 000085
【０３０１】
上記２０種を含め、ＮＧＣ１＿６サンプルとｎｆｂ１−４サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは３２８個存在した（詳細なデータは示さず）。【０３０２】
以下の表１５は、誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿５）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ２−１７）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。
【表１５】
2013081188.tif 000086
2013081188.tif 000087
【０３０３】
上記２０種を含め、ＣＣ３＿５サンプルとｎｆｂ２−１７サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは２５３個存在した（詳細なデータは示さず）。【０３０４】
以下の表１６は、誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１）と誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ２−１７）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。
【表１６】
2013081188.tif 000088
2013081188.tif 000089
【０３０５】
上記２０種を含め、ＧＣ２−１サンプルとｎｆｂ２−１７サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは３６６個存在した（詳細なデータは示さず）。【０３０６】
以下の表１７は、誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４）と誘導悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６）との間でメチル化比較を比較した結果において、差分値絶対値の上位２０種をリストにしたものである。
【表１７】
2013081188.tif 000090
【０３０７】
上記２０種を含め、ＧＣ１＿４サンプルとＮＧＣ１＿６サンプルの差分値（絶対値）が０．１５以上のプローブは２６個存在した（詳細なデータは示さず）。【０３０８】
本解析では、様々な組織、複数の癌腫で確認された正常細胞と癌細胞間で異なるメチル化を示す領域を検出するプローブ（総数６６５９個）を用い、差分値（絶対値）で０．１５以上の差が見られる場合に、２つのサンプル間のメチル化レベルに違いがあると考えられていることから、メチル化の差分値（絶対値）が０．１５となるプローブを、選択した。【０３０９】
本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、複数の癌腫で確認された正常細胞とがん細胞間で異なるメチル化を示す領域の内在性ゲノムＤＮＡメチル化異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３１０】
好ましくは、本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、複数の癌腫で確認された正常細胞とがん細胞間で異なるメチル化を示す領域の少なくとも２０種類の部位で、差分値（絶対値）が０．１５以上の内在性ゲノムＤＮＡメチル化異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３１１】
さらに好ましくは、本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、複数の癌腫で確認された正常細胞とがん細胞間で異なるメチル化を示す領域の少なくとも２０種類の部位で０．３０以上の内在性ゲノムＤＮＡメチル化異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３１２】
実施例１０：誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡの体細胞変異の検出
本実施例においては、非がん部位組織由来の細胞のゲノムＤＮＡと比較して、（１）（ｂ）における誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡのがん関連遺伝子領域（がん遺伝子、がん抑制遺伝子、キナーゼ遺伝子）の体細胞変異を検出した。【０３１３】
（１０−１）材料
（１）（ｂ）における誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡのがん関連遺伝子領域（がん遺伝子、がん抑制遺伝子、キナーゼ遺伝子）の体細胞変異の検出は、ＳＮＶ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔ）解析により、検出を行った。【０３１４】
（１）（ｂ）における誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡのがん関連遺伝子領域（がん遺伝子、がん抑制遺伝子、キナーゼ遺伝子）の体細胞変異の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．１の個体から採取した新鮮胃非がん部位組織由来の細胞群（ｎｇｃ２）、新鮮胃がん部位組織由来の細胞群（ｇｃ２）および新鮮胃がん組織（ｇｃ２）から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿２、ＧＣ２＿４、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿７、ＧＣ２＿１０、ＧＣ２＿１３、ＧＣ２＿１６）、
・ドナーＮｏ．２の個体から採取した新鮮大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ３）および新鮮大腸がん組織（ｃｃ３）から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿５、ＣＣ３＿６）、
・ドナーＮｏ．３の個体から採取した新鮮胃非がん部位組織由来の細胞群（ｎｇｃ１）、新鮮胃がん組織（ｇｃ１）から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４、ＧＣ１＿６、ＧＣ１＿７、ＧＣ１＿８、ＧＣ１＿９）、及び新鮮胃非がん部位組織（ｎｇｃ１）から作製した誘導非悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６、ＮＧＣ１＿７）、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ１）、および新鮮大腸がん組織（ｃｃ１）から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１、ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７、ＣＣ１＿８、ＣＣ１＿９、ＣＣ１＿１１、ＣＣ１＿１２、ＣＣ１＿１７、ＣＣ１＿１８、ＣＣ１＿２５）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した新鮮大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）、および新鮮大腸がん組織（ｃｃ４）から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿（３）、ＣＣ４＿（６）、ＣＣ４＿（９）＿５、ＣＣ４＿（９）＿７、ＣＣ４＿（９）＿１１、ＣＣ４＿（９）＿１３、ＣＣ４＿（３）＿１０、ＣＣ４＿（４）、ＣＣ４＿６、ＣＣ４＿３０）、
を使用した。【０３１５】
（１０−２）品質評価
試料のゲノムＤＮＡの品質評価は、以下の方法で濃度の適性と品質（分解が少ないこと）を確認した：
・１回目：濃度：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、品質：アガロースゲル電気泳動、純度：ＮａｎｏＤｒｏｐ
・２回目；濃度：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、品質：アガロースゲル電気泳動、純度：ＮａｎｏＤｒｏｐ【０３１６】
（１０−３）ライブラリ作製
ライブラリ作製は、基本的にはＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のプロトコールＶｅｒｓｉｏｎ  １．３．１に従い、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行った。
まず、超音波ＤＮＡ  Ｓｈｅａｒｉｎｇシステム（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、試料のゲノムＤＮＡを超音波処理し、ゲノムＤＮＡを約１５０ｂｐのサイズへランダムに断片化する。この断片化したゲノムＤＮＡの末端修復、３’端への“Ａ”塩基の付加、アダプターライゲーションを経て鋳型となるＤＮＡを精製し、その後、そのＤＮＡ試料を利用してＰＣＲ増幅をした。ＰＣＲ増幅生成物に対してＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｎｏｍｅ  Ｋｉｔを用いてターゲット領域を含む断片の濃縮、ＰＣＲ増幅を行うことにより、ライブラリを作製した。【０３１７】
ここでＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｎｏｍｅ  Ｋｉｔにて標的とされる遺伝子は、以下の表に示すものである。
【表１８】
2013081188.tif 000091
2013081188.tif 000092
2013081188.tif 000093
【０３１８】
（１０−４）シーケンシング
ＤＮＡ鋳型増幅装置（ｃＢｏｔ）（ｉｌｌｕｍｉｎａ）においてＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｖ３  ｃＢｏｔ−ＨＳ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ＤＮＡクラスターを形成した。このクラスターを、ＨｉＳｅｑ２０００（ｉｌｌｕｍｉｎａ）においてＴｒｕＳｅｑ  ＳＢＳ  Ｋｉｔ  ｖ３−ＨＳ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングして、配列を決定した。このシーケンシングの結果、それぞれの細胞／組織のゲノムＤＮＡから以下の表に示すように、１．０３〜４．４６Ｇｂのデータ量のリード配列を得た。
【表１９】
2013081188.tif 000094
2013081188.tif 000095
【０３１９】
（１０−５）バイオインフォマティクス
リードデータからアダプター配列ならびに品質の悪い塩基をｃｕｔａｄａｐｔでトリミングして除去した。その後、ＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてリファレンス配列へのマッピングを行った。
次に、ＧＡＴＫ（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ）を用いてＳＮＶ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｖａｒｉａｎｔ）／ＩｎＤｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を検出した。検出したＳＮＶ／ＩｎＤｅｌに対して、ｄｂＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｄａｔａｂａｓｅ）（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  １３５）、ＣＣＤＳ（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＣＤＳ）（ＮＣＢＩ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１１１１２２）、ＲｅｆＳｅｑ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｄｕｍｐｅｄ  ２０１１１１２２））などのアノテーション情報を付与した。【０３２０】
バイオインフォマティクス解析に使用したデータベースは以下の通りである：
・リファレンス配列：ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｈｇ１９
（ｈｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ／）
・Ｔａｒｇｅｔ領域：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｎｏｍｅ  Ｋｉｔ
・ｄｂＳＮＰ：ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  １３５
（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｈｕｍａｎ＿９６０６／ＡＳＮ１＿ｆｌａｔ／）
・ＣＣＤＳ：ＮＣＢＩ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１１１１２２
（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ＣＣＤＳ／ａｒｃｈｉｖｅ／ＨｓＧＲＣＨ３７．３／ＣＣＤＳ．ｃｕｒｒｅｎｔ．ｔｘｔ）
・ＲｅｆＳｅｑ：ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｄｕｍｐｅｄ  ２０１１１１２２）
（ｆｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ａｐａｃｈｅ／ｈｔｄｏｃｓ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｄａｔａｂａｓｅ／ｒｅｆＧｅｎｅ．ｔｘｔ．ｇｚ）
・Ｅｎｃｏｄｅ：ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ＥＮＣＯＤＥ／ＧＥＮＣＯＤＥ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７
（ｆｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ａｐａｃｈｅ／ｈｔｄｏｃｓ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｄａｔａｂａｓｅ／ｗｇＥｎｃｏｄｅＧｅｎｃｏｄｅＢａｓｉｃ  Ｖ７．ｔｘｔ．ｇｚ）
・１０００Ｇｅｎｏｍｅｓ：ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１１１０１１
（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｖｏｌｌ／ｆｔｐ／ｒｅｌｅａｓｅ／２０１１０５２１／）
※  集計対象サンプル数：１，０９２サンプル（内ＪＰＴ：８９サンプル）【０３２１】
バイオインフォマティクス解析に使用したソフトウェアのバージョンは以下の通りである：
・Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）：０．６．２
（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ−ｂｗａ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）
・Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ）：１．５−３２−ｇ２７６１ｄａ９
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓａ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｔｈｅ＿Ｇｅｎｏｍｅ＿Ａｎａｌｙｓｉｓ＿Ｔｏｏｌｋｉｔ）
・Ｐｉｃａｒｄ：１．７３（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｃｏｍｍａｎｄ−ｌｉｎｅ−ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｓｈｔｍｌ）【０３２２】
４６サンプル５グループ（Ｇｒｏｕｐ１〜Ｇｒｏｕｐ５）について、検出したＳＮＶから以下の基準を用いて一次絞込みを行った：
・ＧＡＴＫのスコア判定によるフィルタリングをパスしたＳＮＶ
・Ｎｏｎ−Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ変異（ミスセンス、ナンセンス、リードスルー）であると予測されたＳＮＶ
・Ｄｅｐｔｈ（ＤｅｐｔｈＯｆＣｏｖｅｒａｇｅ）が８以上のＳＮＶのみを選択。【０３２３】
この様な一次絞り込みを行った後、さらに、以下の基準を用いて二次絞込みを行った：
・Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎと考えられるＳＮＶ（同じグループ内のサンプル間でジェノタイプが異なるＳＮＶ）。【０３２４】
（１０−６）結果
サンプルのグループのそれぞれについて、二次絞込みのＳＮＶについては以下の表：
【表２０】
2013081188.tif 000096
2013081188.tif 000097
2013081188.tif 000098
2013081188.tif 000099
2013081188.tif 000100
2013081188.tif 000101
2013081188.tif 000102
2013081188.tif 000103
2013081188.tif 000104
2013081188.tif 000105
2013081188.tif 000106
2013081188.tif 000107
2013081188.tif 000108
2013081188.tif 000109
2013081188.tif 000110
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2013081188.tif 000113
2013081188.tif 000114
2013081188.tif 000115
2013081188.tif 000116
2013081188.tif 000117
2013081188.tif 000118
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2013081188.tif 000120
2013081188.tif 000121
2013081188.tif 000122
2013081188.tif 000123
にまとめた通りである。
最終的に以下の基準を用いて三次絞込みを行った：
・リードのマッピング結果を目視確認し、目視確認の結果と二次絞込みの結果が一致したＳＮＶ（最右列にＯＫと表示）。各誘導悪性幹細胞のＳＮＶを太枠点線で囲んだ。【０３２５】
サンガーシクエンスで、ＣＴＮＮＢ１、ＤＧＫＢのＳＮＶについて解析した結果、非がん組織の細胞のゲノムＤＮＡ（生殖系列の配列）にはない誘導悪性幹細胞の体細胞変異であることが検証された。このように、次世代シークエンサーで解析し、インフォマティクス解析（１次解析、２次解析、目視判定による３次解析）によって検出されたＳＮＶの正確性が証明された。従って、次世代シークエンサーの解析及びインフォマティクス解析により検出されたＳＮＶは、非がん組織の細胞のゲノムＤＮＡ配列と異なる、誘導悪性幹細胞の体細胞変異と判定できる。また、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｎｏｍｅ  ＤＮＡキットはがん関連遺伝子領域である６１２種のキナーゼ・キナーゼ関連遺伝子・癌関連遺伝子をターゲットにデザインされている事から、調べられた誘導悪性幹細胞は、内在性ゲノムＤＮＡのがん関連遺伝子領域の体細胞変異とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。さらに、がん関連遺伝子領域の体細胞変異であることから、発がんやがんの進展に関わるドライバー変異とも云える。従って、誘導悪性幹細胞は、内在性ゲノムＤＮＡの発がんやがんの進展に関わるドライバー変異とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３２６】
実施例１１：誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡの遺伝子コピー数多型異常の検出
本実施例においては、新鮮非がん部位組織由来の細胞群のゲノムＤＮＡの遺伝子コピー数多型と比較して、（１）（ｈ）における誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡの遺伝子コピー数多型異常を検出した。【０３２７】
（１１−１）材料
遺伝子コピー数多型異常の検出は、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）法に基づいて、誘導悪性幹細胞を、ゲノムワイドなＤＮＡコピー数多型変化を解析するためのマイクロアレイを使用したＡｇｉｌｅｎｔ  ＣＧＨマイクロアレイ（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＣＧＨマイクロアレイ１×１Ｍ）解析に供することにより行った。【０３２８】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＧＨマイクロアレイ解析のための試料としては、
・ドナーＮｏ．２の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ３）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿６）、
・ドナーＮｏ．３の個体から採取した胃非がん部位組織由来の細胞群（ｎｇｃ１）および新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿９）、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ１）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１７）、そして
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）、および新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）並びに、新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４−Ｄ）、
のゲノムＤＮＡを用いた。解析により、誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿６、ＧＣ１＿９、ＣＣ１＿１７、ＣＣ４−Ｄ）の内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子のコピー数多型（ＣＮＶ）異常を検出した。なお、非がん部位組織由来の細胞群のゲノムＤＮＡは正常な内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子のコピー数多型を有する陰性コントロールとして使用した。また、がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）のゲノムＤＮＡは、内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子のコピー数多型異常を有する陽性コントロールとして使用した。【０３２９】
解析に使用したキット、試料の詳細については、以下の表２１を参照。【０３３０】
【表２１】
2013081188.tif 000124
【０３３１】
（１１−２）プロトコル
この解析は、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  ＣＧＨ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ．６．１  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｅｎ−ｕｓ／Ｓｅａｒｃｈ／Ｌｉｂｒａｒｙ／＿ｌａｙｏｕｔｓ／Ａｇｉｌｅｎｔ／ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＳｕｍｍａｒｙ．ａｓｐｘ？ｗｈｉｄ＝５２０１０）に従って、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＣＧＨマイクロアレイキット１×１Ｍを用いて、ターゲット作製、ハイブリダイゼーション、スキャニング、およびデータ解析を行うことにより実施した。【０３３２】
ターゲット作製は、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用して行った。具体的には、まず、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を調製し（０．５〜３μｇ）、このゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｊａｐａｎ）およびＲｓａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｊａｐａｎ）にて酵素消化し、その後にＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔに付属するＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒを添加し、同じくＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔに付属するＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗを用いたＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ反応にて、シアニン３−ｄＵＴＰおよびシアニン５−ｄＵＴＰを用いたＣｙ３標識およびＣｙ５標識されたゲノムＤＮＡを合成した。このＣｙ３標識およびＣｙ５標識された標識ゲノムＤＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡの収量および品質を、以下の（４−３）で言及するゲノムＤＮＡの品質検定により確認した。【０３３３】
その後、ゲノムＤＮＡは、それぞれのＤＮＡサンプルを二本鎖ＤＮＡを特異的に定量する蛍光測定を用いて品質管理した結果算出された濃度に基づいて、それぞれ５００ｎｇとなるように調製した。ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用して、Ｃｙ３標識ｇＤＮＡおよびＣｙ５標識ｇＤＮＡを、ヒトゲノムＣＧＨマイクロアレイ（アジレント・テクノロジー株式会社）にハイブリダイゼーションさせ（６５℃、４０時間、２０ｒ．ｐ．ｍ．）、その後Ｏｌｉｇｏ  ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて洗浄した。【０３３４】
このようにして、マイクロアレイ上にＣｙ３標識ｇＤＮＡおよびＣｙ５標識ｇＤＮＡをハイブリダイズさせた後、レーザースキャナーを用いてＣｙ３およびＣｙ５に最適な波長でマイクロアレイを高解像度マイクロアレイスキャナー（アジレント・テクノロジー株式会社）等のスキャナーを利用してスキャンし、画像を取得した。この取得された画像を、専用解析ソフト（Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；アジレント・テクノロジー株式会社）で画像解析して、試料ゲノムＤＮＡの品質検定、および実験結果のデータを算出した。【０３３５】
（１１−３）試料ゲノムＤＮＡの品質検定
試料について、まず、吸光度およびアガロースゲル電気泳動によりゲノムＤＮＡの品質検定を行い、以下の基準を満たした検体を「検定合格」としてＡｇｉｌｅｎｔ  ａＣＧＨマイクロアレイにおいて解析可能な試料かどうかの検定を行った。具体的な基準として、吸光度測定における基準としては、
（ｉ）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ濃度が２５ｎｇ／μｌ以上である；
（ｉｉ）ＯＤ２６０／２８０が１．８〜２．０であり、かつＯＤ２６０／２３０が２．０以上である；そして
（ｉｉｉ）吸収スペクトラムに異常が認められない。
一方、２）アガロースゲル電気泳動における基準としては、吸光度測定結果より算出した１００ｎｇのゲノムＤＮＡを電気泳動にて検定し、
（ｉ）１０Ｋｂ〜２０Ｋｂ付近にメインバンドが確認される；
（ｉｉ）コンタミバンド（ＲＮＡも含む）が確認されない；
（ｉｉｉ）分解が進んでいることを示すスメアバンドが確認されない；そして
（ｉｖ）吸光度よりの予測濃度と乖離が見られる。
この品質検定の結果、ＡＤ００４０＿０１（ｎｃｃ３）、ＡＤ００４０＿０２（ＣＣ３＿６）、ＡＤ００４０＿０３（ｎｇｃ１）、ＡＤ００４０＿０４（ＧＣ１＿９）、ＡＤ００４０＿０５（ｎｃｃ１）、ＡＤ００４０＿０７（ｎｃｃ４）、ＡＤ００４０＿０８（ｃｃ４）、ＡＤ００４０＿０９（ｎｃｃ４）、ＡＤ００４０＿１０（ＣＣ４−Ｄ）、ＡＤ００４０＿１３（ｎｃｃ１＊１）、ＡＤ００４０＿１８（ＧＣ１＿９＊２）の１１検体は、抽出されたＤＮＡ濃度が基準に満たない状態であったため、検定から除外した。【０３３６】
（１１−４）Ａｇｉｌｅｎｔ  ａＣＧＨ解析
マイクロアレイをスキャンしてＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアより出力されたデータを、ゲノミクス解析ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｏｍｉｃＷｏｒｋｂｅｎｃｈ；アジレント・テクノロジー株式会社）を用いてコピー数解析（ｄｅｆａｕｌｔ値での解析）を行った。得られたデータを以下の表２２にまとめて示した。【０３３７】
この表２２において、ＡＤ００４０＿Ｓｅｔ０１〜ＡＤ００４０＿Ｓｅｔ０５はそれぞれ、上記「３）比較解析」に記載したＳｅｔ０１〜Ｓｅｔ０５に対応する。この表２２では、基準細胞との比較において、被検細胞において遺伝子コピー数異常が検出された場合の染色体（Ｃｈｒ）、染色体上の位置（Ｃｙｔｏｂａｎｄ）、さらに詳細な位置情報（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示し、その場所に適用されたプローブが示されている。そして、ここで示された染色体上の位置に存在することがデータベース上で知られている代表的な遺伝子名およびゲノムアノテーションを、「Ｇｅｎｅ  Ｎａｍｅｓ，Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ」の項に示した。【０３３８】
さらに、遺伝子コピー数の異常に関する状況を、「Ａｍｐ／Ｄｅｌ」および「Ｐ−ｖａｌｕｅ」の項にまとめた。この「Ａｍｐ／Ｄｅｌ」の項において、基準細胞のゲノムＤＮＡと比較して、被検細胞において増加している遺伝子が正の値で、減少している遺伝子が負の値で、それぞれ示されており、この増加または減少の統計解析の結果のＰ値が「Ｐ−ｖａｌｕｅ」の項に示されている。【０３３９】
【表２２】
2013081188.tif 000125
2013081188.tif 000126
2013081188.tif 000127
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2013081188.tif 000132
【０３４０】
このゲノミクス解析の結果から、実施例２の方法により作出されたＣＣ３＿６（Ｓｅｔ０１で試験されたＡＤ００４０＿１７）、実施例４の方法により作出されたＧＣ１＿９（Ｓｅｔ０２で試験されたＡＤ００４０＿２２）、実施例６の方法により作出されたＣＣ１＿１７（Ｓｅｔ０３で試験されたＡＤ００４０＿０６）、実施例８の方法により作出されたＣＣ４−Ｄ（Ｓｅｔ０５で試験されたＡＤ００４０＿２０）の細胞はいずれも、内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子のコピー数の異常を有することが明らかになった。【０３４１】
本実施例の方法で検出されたゲノムコピー数多型（ＣＮＶ）異常は、非がん組織の細胞のゲノムＤＮＡと異なるＣＮＶの場合、誘導悪性幹細胞のゲノムＣＮＶ異常と判定できる。本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、内在性ゲノムＤＮＡ遺伝子のコピー数多型（ＣＮＶ）異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３４２】
実施例１２：誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライト異常の検出
本実施例においては、非がん部位組織由来の細胞群又は正常組織由来の細胞群と比較して、（１）（ｉ）における誘導悪性幹細胞の内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライトにおける不安定性が生じていることの試験を行った。【０３４３】
（１２−１）材料
ＭＳＩ検査は、同一患者（ドナー）の腫瘍部位及び誘導悪性幹細胞、並びに非腫瘍部位及び正常組織からＤＮＡを抽出し、ＭＳＩ解析において推奨されている５つのＢｅｔｈｅｓｄａマーカー（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０）（Ｂｏｌａｎｄ  ＣＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５２４８−５７，１９９８；Ｌｏｕｋｏｌａ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｎ  １；６１（１１）：４５４５−９）について蛍光標識したプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、蛍光シークエンサーを用いたキャピラリー電気泳動を行うマイクロサテライト不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＭＳＩ）解析に基づいて、検出を行った。Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェアによるデータ解析を行った後、各マーカーに対して腫瘍部位及び非腫瘍部位の反復回数の変化の有無を波形パターンの差により判定し、５マーカーの判定結果より総合判定を行う。【０３４４】
マイクロサテライト不安定性の解析のための試料としては、
・ドナーＮｏ．２の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ３）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿５およびＣＣ３＿６）、
・ドナーＮｏ．３の個体から採取した新鮮胃非がん部位組織由来の細胞群（ｎｇｃ１）、新鮮胃非がん部位組織から作製した誘導非悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６）、および新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿６、ＧＣ１＿９、ＧＣ１＿１０）、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ１）、および新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ１）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１、ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７、ＣＣ１＿８、ＣＣ１＿９、ＣＣ１＿１１、Ｃ１＿１２、ＣＣ１＿１７、ＣＣ１＿１８）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）、および新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿（３）、ＣＣ４＿（６）、ＣＣ４＿（３）＿１０、ＣＣ４＿（４）、ＣＣ４＿３０、ＣＣ４−１０、ＣＣ４−３１、ＣＣ４（１）、ＣＣ４（２）、ＣＣ４−Ｄ）、
・ドナーＮｏ．６の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９５６）、およびその細胞から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ１＿２）、そして
・ドナーＮｏ．７の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９４９）、およびその細胞から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ２＿１７）、
を使用した。【０３４５】
（１２−２）検査手順
（１２−２−１）ＤＮＡ抽出
（１２−１）に示した各ドナーから得られた試料から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（５０）６９５０４（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の指示にしたがって使用して、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。得られたゲノムＤＮＡは、１０ｎｇ／μＬとなるように調製した。【０３４６】
（１２−２−２）ＰＣＲ
上記で調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、５つのＢｅｔｈｅｓｄａマーカーそれぞれについてのプライマーセットを使用して、ＰＣＲを行った。それぞれのサンプルについて、下記のミックスを、ＰＣＲプレートまたは８連チューブ中に調製する。ただし、測定毎に試料ゲノムＤＮＡの代わりに、陽性コントロール（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ＭＣＦ−７）（フナコシ）を含む試料、および鋳型となるゲノムＤＮＡを加えない陰性コントロール（ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、１×）の試料を含める。【０３４７】
【表２３】
2013081188.tif 000133
2013081188.tif 000134
【０３４８】
ここで使用したプライマーのヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
・ＢＡＴ２５マーカー：
フォーワードプライマー：ｔｃｇｃｃｔｃｃａａｇａａｔｇｔａａｇｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
リバースプライマー：ｔｃｔｇｇａｔｔｔｔａａｃｔａｔｇｇｃｔｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
・ＢＡＴ２６マーカー：
フォーワードプライマー：ｔｇａｃｔａｃｔｔｔｔｇａｃｔｔｃａｇｃｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
リバースプライマー：ａａｃｃａｔｔｃａａｃａｔｔｔｔｔａａｃｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
・Ｄ２Ｓ１２３マーカー：
フォーワードプライマー：ａａａｃａｇｇａｔｇｃｃｔｇｃｃｔｔｔａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
リバースプライマー：ｇｇａｃｔｔｔｃｃａｃｃｔａｔｇｇｇａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
・Ｄ５Ｓ３４６マーカー：
フォーワードプライマー：ａｃｔｃａｃｔｃｔａｇｔｇａｔａａａｔｃｇｇｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
リバースプライマー：ａｇｃａｇａｔａａｇａｃａａｇｔａｔｔａｃｔａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
・Ｄ１７Ｓ２５０マーカー：
フォーワードプライマー：ｇｇａａｇａａｔｃａａａｔａｇａｃａａｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
リバースプライマー：ｇｃｔｇｇｃｃａｔａｔａｔａｔａｔｔｔａａａｃｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。【０３４９】
すべての構成成分を分注した後、ＰＣＲプレートまたは８連チューブをキャッピングし、ボルテックスにかけて溶液をスピンダウンした。【０３５０】
次に、サーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ−２２０）（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、または、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（９７００）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）または、Ｖｅｒｉｔｉ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のヒートブロックを予め９４℃に上げておき、ＰＣＲプレートまたは８連チューブを予熱したヒートブロックに装着し、以下の条件でＰＣＲを行う。【０３５１】
【表２４】
2013081188.tif 000135
2013081188.tif 000136
【０３５２】
ＰＣＲ反応が終了した後、ＰＣＲプレートまたは８連チューブをヒートブロックから取り出し、ボルテックスにかけて反応溶液をスピンダウンした。ＰＣＲ反応生成物の濃度を吸光度にて確認する。ＰＣＲ産物を希釈する必要がある場合は、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  １×を用いて適切に希釈する。このようにして調製したサンプルを、次にキャピラリー電気泳動にて解析するために使用した。【０３５３】
（１２−２−３）キャピラリー電気泳動
（１２−２−２）にて調製したＰＣＲ生成物を、キャピラリー電気泳動により分離し、増幅されたそれぞれのＤＮＡの長さをサンプルごとに確認した。
Ｈｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  １０μＬ（＋ＲＯＸ）をキャピラリー電気泳動用の９６ウェルプレートに必要サンプルの数、分注する。このキャピラリー電気泳動用の９６ウェルプレートにに対して、各１μＬのＰＣＲ産物を加えたのち、専用のふたを取り付け、ボルテックスにかけて試料溶液をスピンダウンした。【０３５４】
キャピラリー電気泳動は、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（３１００）またはＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（３１３０ｘ１）（いずれも、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、フォワードプライマー由来の蛍光（下記表２５を参照）を検出することにより、目的とするＰＣＲ生成物の長さを測定した。【０３５５】
【表２５】
2013081188.tif 000137
【０３５６】
得られた結果を、図１に示す。また、ここで、それぞれのグラフで示される比較されたサンプルのセットは、以下の表２６に記載のとおりである。【０３５７】
【表２６】
2013081188.tif 000138
【０３５８】
本実施例において解析された誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿（３）、ＣＣ４＿（６）、ＣＣ４＿（３）＿１０、ＣＣ４＿（４）、ＣＣ４＿３０、ＣＣ４−１０、ＣＣ４−３１、ＣＣ４（１）、ＣＣ４（２）、ＣＣ４−Ｄ）は、内在性ゲノムＤＮＡマイクロサテライト異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３５９】
実施例１３：誘導悪性幹細胞の内在性遺伝子の発現（ｍＲＮＡ）異常の検出
本実施例においては、誘導多能性幹細胞と比較して、（１）（ｃ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を検出した。
（１３−１）材料
（１）（ｃ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）の検出は、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ＫｉｎａｓｅまたはＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  ＴａｒｇｅｔｓのｍＲＮＡ発現を網羅的に検出することにより、行った。
（１）（ｃ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん遺伝子または内在性がん抑制遺伝子の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．１の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿１０）、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４−Ｄ）、
・ドナーＮｏ．７の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９４９）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ２＿１７）、
を使用した。【０３６０】
（１３−２）概要
上述した８種類の誘導悪性幹細胞それぞれから、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用してＷｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４Ｋ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて実験を行った。
Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４Ｋ）は、ヒトゲノムにコードされた転写物の包括的な発現解析を行うことができるツールである。このキットで使用するプローブ配列は、複数の信頼性の高いデータベースから集められた配列情報を、ヒトゲノムのアセンブリに照らし合わせて決定されたものである。ｍＲＮＡに加え、ｓｎｏＲＮＡやｐｓｅｕｄｏ  ｇｅｎｅのトランスクリプト等のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ対応のプローブも搭載されている。
このキットは、「４×４４Ｋ」とあるように、１つのスライドグラスに４つのマイクロアレイを搭載しており、各マイクロアレイには約４４，０００（すなわち、４４Ｋ）スポットを搭載している。４つのマイクロアレイを搭載していることから、同時に４サンプルの実験可能になり、ハイスループットな解析が可能である。また、１アレイあたり最少２５ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡで実験可能であるという特徴も有する。【０３６１】
（１３−３）品質評価
試料のゲノムＤＮＡの品質評価は、それぞれ使用する機器により、サンプルＲＮＡ溶液を用いて、
・蛍光検出器Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）では、泳動パターンの確認；そして
・分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）では、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量の定量；
を評価した。【０３６２】
（１３−４）相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成
Ａｇｉｌｅｎｔ社Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社プロトコールに準じて、標的となるＲＮＡから相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成した。各サンプルから調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（１００ｎｇ）から、２本鎖ｃＤＮＡを合成し、作製したｃＤＮＡから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡを合成した。この過程で、Ｃｙａｎｉｎｅ色素で標識されたＣＴＰ（Ｃｙａｎｉｎｅ  ３−ＣＴＰ）を取り込ませ、蛍光標識を行った。【０３６３】
（１３−５）ハイブリダイゼーション
（１３−４）で調製したＣｙａｎｉｎｅ色素で標識したｃＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ社Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４Ｋ）とハイブリダイゼーションさせた。具体的には、標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４Ｋ）上で１７時間ハイブリダイズし、洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ＳｃａｎｎｅｒでＤＮＡマイクロアレイのイメージを読み取り、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．１０．７．３．１）にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。【０３６４】
（１３−６）実験結果
（１３−１）材料において記載したサンプルについて品質評価を行った結果、いずれのサンプルについても、また、泳動パターンの確認においてもｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量の定量においても、品質が保証された。【０３６５】
次に、得られたサンプルを使用して、ｃＲＮＡを合成し、蛍光標識されたｃＲＮＡ量を測定したところ、マイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションに必要なｃＲＮＡ量が得られていることを確認できた。【０３６６】
そこで、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅリストにある遺伝子（下記表２７を参照）、ならびにＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓリスト（下記表２８を参照）にある遺伝子に関して、プローブを設定したマイクロアレイチップに対して、ハイブリダイゼーションを行った。【０３６７】
【表２７】
2013081188.tif 000139
2013081188.tif 000140
2013081188.tif 000141
2013081188.tif 000142
2013081188.tif 000143
【０３６８】
【表２８】
2013081188.tif 000144
2013081188.tif 000145
2013081188.tif 000146
2013081188.tif 000147
【０３６９】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の画像解析の結果、問題なくハイブリダイゼーションが行われたことを確認できた。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析されたハイブリダイゼーション後の画像、数値化データをメディアに保存した。【０３７０】
解析は、被検細胞（誘導悪性幹細胞）サンプルでのハイブリダイゼーションの数値化データのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、対照細胞サンプルでのハイブリダイゼーションの数値化データのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割り算し、その商から発現変動を判定した。商が１（すなわち、ｌｏｇ２１＝０）から離れているプローブは、発現が変動していると判断し、商が２（ｌｏｇ２２＝１）より大きいか、または０．５（ｌｏｇ２０．５＝−１）より小さいプローブを選択した。すなわち、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅリストにある遺伝子、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓリストにある遺伝子に関して、以下の組み合わせで、コントール（１とする）に比べて商が２（ｌｏｇ２２＝１）より大きい、か、または０．５（ｌｏｇ２０．５＝−１）より小さいる遺伝子の各リスト（ｌｏｇ２２も表示）を作成した。解析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  １２．１を用いて行った。【０３７１】
結果を以下の表２９に示す。Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄのカラムにおいて、発現変動を対数値で示している。【０３７２】
【表２９】
2013081188.tif 000148
2013081188.tif 000149
2013081188.tif 000150
2013081188.tif 000151
2013081188.tif 000152
2013081188.tif 000153
2013081188.tif 000154
【０３７３】
【表３０】
2013081188.tif 000155
2013081188.tif 000156
2013081188.tif 000157
2013081188.tif 000158
【０３７４】
具体的には、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ又はＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ遺伝子の発現異常を解析した。本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ又はＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ遺伝子の発現異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０３７５】
実施例１４：誘導悪性幹細胞の内在性マイクロＲＮＡの発現異常の検出
本実施例においては、誘導多能性幹細胞又は誘導非悪性幹細胞と比較して、（１）（ｄ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を検出した。【０３７６】
（１４−１）材料
（１）（ｄ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）の検出は、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｉＲＮＡの発現を網羅的に検出することにより、検出を行った。【０３７７】
（１）（ｄ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．１の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿１０）、
・ドナーＮｏ．３の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿６）、新鮮胃非がん組織から作製した誘導非悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿７）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ）、
・ドナーＮｏ．７の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９４９）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ２＿１７）、
を使用した。【０３７８】
（１４−２）実験手順
（１４−２−１）試料調製
上述した６種類の誘導悪性幹細胞、各１種類の誘導非悪性幹細胞、および誘導多能性幹細胞のそれぞれから、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｒｅｌ．１６．０を用いて、誘導悪性幹細胞の内在性がん関連マイクロＲＮＡのようなノンコーディングＲＮＡの発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を検出した。【０３７９】
（１４−２−２）品質評価
サンプルｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液の品質評価は、下記のチェック：
・蛍光検出器Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒでの評価（泳動パターン確認）；そして
・分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐでの評価（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量の定量）；
を行って品質を検査した【０３８０】
（１４−２−３）ｍｉＲＮＡの蛍光標識
（１４−２−１）において調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ社プロトコールに準じて、ｍｉＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｙｂ  ｋｉｔを用いて蛍光標識した。具体的には、各サンプルｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（１００ｎｇ）について、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）によって脱リン酸化反応を行い、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いてＲＮＡ分子の３’末端側に１分子のＣｙａｎｉｎｅ  ３−Ｃｙｔｉｄｉｎｅ  Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＣｐ−Ｃｙ３）を標識した。【０３８１】
（１４−２−４）ハイブリダイゼーション
（１４−２−３）で標識したＲＮＡサンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ社ｍｉＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｙｂ  ｋｉｔを使用して、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｒｅｌ．１６．０とハイブリダイゼーションさせた。具体的には、標識ＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｒｅｌ．１６．０上で２０時間ハイブリダイズし、洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ＳｃａｎｎｅｒでＤＮＡマイクロアレイのイメージを読み取り、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．１０．７．３．１）にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。【０３８２】
（１４−３）実験結果
（１４−２−３）で標識したＲＮＡサンプルについて品質評価を行った結果、いずれのサンプルについても、また、泳動パターンの確認においてもｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量の定量においても、品質が保証された。次に、得られた蛍光標識されたＲＮＡ全量をハイブリダイゼーションに使用した。
Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｉＲＮＡリストにあるｍｉＲＮＡに関して、以下の組み合わせ：
Ｎｆｂ２−１７（コントロール）ｖｓ  ＧＣ１＿６  ｖｓ  ＮＧＣ１＿７  ｖｓ  ＣＣ４＿ｃ  ｖｓ  ＧＣ２＿１  ｖｓ  ＧＣ２＿５  ｖｓ  ＧＣ２＿１０；
ＮＧＣ１＿７（コントロール）ｖｓ  ＧＣ１＿６；
で、ハイブリダイゼーションを行って、発現を比較して調べた【０３８３】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の画像解析の結果、問題なくハイブリダイゼーションが行われたことを確認できた。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析されたハイブリダイゼーション後の画像、数値化データをメディアに保存した。【０３８４】
ｍｉＲＮＡのＡｎｎｏｔａｔｉｏｎについては、ｍｉＲＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １８のアノテーションを使用し以下の表に示されるｍｉＲＮＡ（上記表３１を参照）に関して、プローブを設定したマイクロアレイチップに対して、ハイブリダイゼーションを行った。【０３８５】
【表３１】
2013081188.tif 000159
2013081188.tif 000160
【０３８６】
解析は、被検細胞（誘導悪性幹細胞）サンプルでのハイブリダイゼーションの数値化データのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値を、対照細胞サンプルでのハイブリダイゼーションの数値化データのＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ値で割り算し、その商から発現変動を判定した。商が１（すなわち、ｌｏｇ２１＝０）から離れているプローブは、発現が変動していると判断し、商が２（ｌｏｇ２２＝１）より大きいか、または０．５（ｌｏｇ２０．５＝−１）より小さいプローブを選択した。すなわち、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅリストにある遺伝子、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓリストにある遺伝子に関して、以下の組み合わせで、コントール（１とする）に比べて商が２（ｌｏｇ２２＝１）以上、０．５（ｌｏｇ２０．５＝−１）以下の発現変動している遺伝子の各リスト（ｌｏｇ２２も表示）を作成した。解析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  １２．１を用いて行った。【０３８７】
結果を以下の表３２に示す。Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄのカラムにおいて、発現変動を対数値で示している。【０３８８】
【表３２】
2013081188.tif 000161
2013081188.tif 000162
2013081188.tif 000163
2013081188.tif 000164
2013081188.tif 000165
【０３８９】
本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｉＲＮＡの発現異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。
実施例１５：誘導悪性幹細胞の内在性がん関連タンパク質の発現異常の検出
本実施例においては、大腸非がん部位組織由来の細胞群と比較して、（１）（ｅ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連タンパク質発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を検出した。【０３９０】
（１５−１）材料
（１）（ｅ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連タンパク質発現異常の検出は、タンパク同定解析（ｉＴＲＡＱ標識）技術を利用して、行った。【０３９１】
（１）（ｅ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連タンパク質発現異常の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）、新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）、および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿Ｄ）、
を使用した。【０３９２】
（１５−２）実験手順
誘導悪性幹細胞の内在性がん関連タンパク質の発現異常（発現上昇または発現低下・消失）を検出するため、タンパク同定解析（ｉＴＲＡＱ標識；ｉｓｏｂａｒｉｃ  Ｔａｇｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）を行った。【０３９３】
（１５−２−１）概要
ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔは、広範囲な自動ペプチド同定（Ｐａｒａｇｏｎアルゴリズムを利用）によって、遺伝的変異や修飾などを同時に検索することにより、効率的にタンパク質を同定し定量することができるソフトウェアである。このソフトウェアを使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｍｍａｒｙ＿ｃｏｎｔｒｏｌ  ｎｃｃ４（大腸非がん組織を陰性コントロール）を使用して、Ｕｎｕｓｅｄのフィルターを使用して実験を行った。
各サンプル中に存在するタンパク質の同定及びｎｃｃ４を基準としたｃｃ４、ｃｃ４−ｄの相対定量比を求めた。【０３９４】
（１５−２−２）試料調製
組織、細胞を調製し、そこから細胞を破砕して、質量分析用タンパク質含有サンプルを調製した。ここで、タンパク質の調製を行う際に、トリプシンやその他のｉＴＲＡＱ標識を妨害する可能性がある物質がバッファー中に含まれる可能性があるため、バッファー置換を行った。バッファーは、限外ろ過カートリッジ（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ，Ｓｐｉｎ  ５Ｋ  ＭＷＣＯ，４ｍＬ  ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ２５（Ｐ／Ｎ５１８５−５９９１）Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、バッファーを５０ｍＭ  ＴＥＡＢに置換した。【０３９５】
得られたサンプルに含まれるタンパク質の濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定し、サンプル間で濃度を同一にした。各試料１００μｇのタンパク質を、Ｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎにより処理し、トリプシン消化、Ｓ−Ｓ切断とメチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）を用いたＳＨ基の保護（アルキル化）の後、個々の試料に対して別個のｉＴＲＡＱ試薬を用いて、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ｉＴＲＡＱ  Ｒｅａｇｅｎｔ−８Ｐｌｅｘ  Ｋｉｔ使用してｉＴＲＡＱ標識し、これらを混合して質量分析用のサンプルとした。その後、陽イオン交換カラムＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＣＥＸカラムにて精製をし、その後８分画にした。【０３９６】
次に、得られたｉＴＲＡＱ標識サンプルを、ＤｉＮａ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｎａｎｏ−ＬＣ；ＫＹＡ  ＴＥＣＨ  Ｃｏｒｐ．）を使用して液体クロマトグラフィによる分離及び濃縮を行った。この際、逆相カラムを用いて分画と同時に測定プレートにスポッティングした。
時間；１１５分
スポッティング時間；１５ｍｉｎから１１０ｍｉｎまで１スポット／３０秒、合計１９１スポットに分離した。【０３９７】
【表３３】
2013081188.tif 000166
【０３９８】
ここで、
・Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ；２％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ
・Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ；７０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ。
・マトリックス；７０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中４ｍｇ／ｍｌα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）
である。【０３９９】
調製した試料を、質量分析装置４８００ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ社）を使用して、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳにより、質量分析を行った。得られたデータを、データ解析用のソフトウェアＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  ｖ４．０にて、検索アルゴリズムであるＰａｒａｇｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを利用して、ＮＣＢＩデータベース中のＨｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓのデータを検索した。【０４００】
（１５−２）実験結果
質量分析を行った結果を以下に示す。その結果、信頼性＞２．０（９９）で３２８個、＞１．３（９５）で４４５個、＞０．４７（６６）で５５２個、そしてＣｕｔｏｆｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ：＞０．０５（１０％）で１１７３個のタンパク質が同定された。【０４０１】
これらのタンパク質のそれぞれについて、ｎｃｃ４におけるタンパク質量に対するＣＣ４−Ｄにおけるタンパク質量の相対比、そしてｎｃｃ４におけるタンパク質量に対するｃｃ４におけるタンパク質量の相対比をそれぞれ詳細に検討し、発現の上昇または発現の低下・消失を、それぞれ検出した。以下の表において、色を濃くした部分が、対照細胞（ｎｃｃ４）と比較してタンパク質量が増加したことを示している。【０４０２】
【表３４】
2013081188.tif 000167
2013081188.tif 000168
2013081188.tif 000169
2013081188.tif 000170
【０４０３】
この様な解析の結果、誘導悪性幹細胞においては、以下のがん関連タンパク質の発現上昇が見られることが明らかになった：
Ｋｅｒａｔｉｎ  ８［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］
ｋｅｒａｔｉｎ  １８  ｖａｒｉａｎｔ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］
ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］
ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８  ｉｓｏｆｏｒｍ  １  ｖａｒｉａｎｔ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］
ＬＧＡＬＳ３［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］。【０４０４】
本実施例において解析された誘導悪性幹細胞は、がん関連タンパク質発現異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０４０５】
実施例１６：誘導悪性幹細胞の内在性がん関連代謝異常の検出
本実施例においては、誘導多能性幹細胞と比較して、（１）（ｆ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連代謝異常（代謝亢進または代謝低下）を検出した。【０４０６】
（１６−１）材料
（１）（ｆ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連代謝異常の検出は、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモード、アニオンモードにより細胞内の種々の代謝物質を測定することにより、行った。
（１）（ｆ）における誘導悪性幹細胞の内在性がん関連代謝異常の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿Ｄ）、そして
・ドナーＮｏ．６の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９５６）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ１＿４）、
を使用した。
これらの細胞はいずれも、１０ｃｍの培養ディッシュに約８０％コンフルエントの状態にまで増殖させた。【０４０７】
（１６−２）実験手順
（１６−２−１）概要
誘導悪性幹細胞４検体（ＣＣ１−２、ＣＣ１−７、ＣＣ４−ｃ、ＣＣ４−ｄ）および誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）について、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）のカチオンモード、アニオンモードによる測定を実施した。本試験では、ＨＭＴ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）代謝物質ライブラリおよびＫｎｏｗｎ−Ｕｎｋｎｏｗｎピークライブラリに登録された物質を対象として解析を行った。【０４０８】
（１６−２−２）手順
（１６−２−２）手順
誘導悪性幹細胞４検体（ＣＣ１−２、ＣＣ１−７、ＣＣ４−ｃ、ＣＣ４−ｄ）および誘導多能性幹細胞（ｎｆｂ１−４）について細胞の培養を行った。試料は、以下のプロトコールに従って洗浄及び回収を行い、その後検出をおこなった。
（ｉ）使用器具の説明
・Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（１０ｍＭ，ＨＭＴ製）
・メタノール（和光純薬ＬＣ／ＭＳ用１３４−１４５２３）
・メスフラスコ（岩城硝子ＴＥ−３２  ５０ｍＬ用）
・マンニトール（Ｗａｋｏ  １３３−００８４５）
・Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水製造装置使用）
・セルスクレーパー（住友ベークライト  ２５０ｍｍ  ｘ  １７ｍｍ  ＭＳ−９３１７０）
・遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｍａｘ  Ｊｒ．１５ｍＬ  ３５２０９７）
・マイクロピペットおよびチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製）
・電動ピペッターおよびピペット（Ｎｕｎｃ  ５ｍＬ  １５９６２５，１０ｍＬ  １５９６３３）
（ｉｉ）試薬の調製
（ｉｉ−１）メタボライト抽出用メタノール溶液の調製
−使用器具および試薬
・Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（１０ｍＭ，ＨＭＴ製）
・メタノール（和光純薬ＬＣ／ＭＳ用１３４−１４５２３）
・メスフラスコ（岩城硝子ＴＥ−３２  ５０ｍＬ用）
Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １をメタノールにて１，０００倍希釈し、
メタボライト抽出用メタノール溶液を調製した。
調製の際はメスフラスコを用いてメスアップを行い、よく混合した。
また、メタボライト抽出用メタノール溶液は用時調製したものを使用した。
（ｉｉ−２）細胞洗浄液の調製
−使用器具および試薬
・マンニトール（Ｗａｋｏ  １３３−００８４５）
・Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水製造装置使用）
マンニトールとＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて、５％（ｗ／ｗ）マンニトール水溶液を調製した。
洗浄液は、培養皿一枚あたり１５ｍＬ程度使用した。
（ｉｉｉ）洗浄
（ｉｉｉ−１）細胞培養液を吸引除去後、細胞洗浄液※１１０ｍＬで培養皿表面を洗浄した。
このとき、洗浄液は室温状態のものを使用した。
（ｉｉｉ−２）洗浄液を除去後、再度、細胞洗浄液２ｍＬで再び洗浄作業を行った。
２回目の洗浄液は培養皿の淵からしっかりと吸引した※２。
※１「（ｉｉ−２）細胞洗浄液の調製」にて作製した５％（ｗ／ｗ）マンニトール水溶液を用いた。
※２洗浄液中のマンニトールは非常に高濃度であるため、メタボライト抽出過程で析出することがあることからしっかりと洗浄液を吸引し、残留マンニトールができるだけ少量になるようにした。
（ｉｖ）剥離
−使用器具および試薬
・セルスクレーパー（住友ベークライト  ２５０ｍｍ  ｘ  １７ｍｍ  ＭＳ−９３１７０）
（ｉｖ−１）洗浄液を吸引除去後、メタボライト抽出用メタノール溶液※１．３ｍＬを培養皿に添加した。
このとき、メタノール溶液は室温状態のものを使用した。
（ｉｖ−２）メタノール溶液が培養皿表面全体を覆うように軽く振倒した。
（ｉｖ−３）セルスクレーパーにて細胞を剥離する際、細胞塊が細かくならないように行い、遊離した細胞を一箇所に集めた。
細胞が培養皿上に残った場合や剥離が不十分な場合、結果がばらつく可能性があるので注意して行った。
※「（ｉｉ−１）タボライト抽出用メタノール溶液の調製」にて作製したメタノール溶液を用いた。
（ｖ）回収
・遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｍａｘ  Ｊｒ．１５ｍＬ  ３５２０９７）
（ｖ−１）細胞の剥離後、培養皿のメタボライト抽出用メタノール溶液を１．０ｍＬ※吸引し、１５ｍＬ遠沈管に移した。
（ｖ−２）培養皿に残った細胞塊を集めて１５ｍＬ遠沈管に移してください。
（ｖ−３）メタノール溶液および細胞塊が入った１５ｍＬ遠沈管で８０℃に保管した。【０４０９】
上記の試料には、１，０００μＬのクロロホルムおよび４００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて撹拌し、遠心分離（２，３００×ｇ、４℃、５分）を行った。遠心分離後、水層を限外ろ過チューブ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ  ＨＭＴ遠心式フィルターユニット、５ｋＤａ）に４００μＬ×２本移し取った。これを遠心（９，１００×ｇ、４℃、１２０分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び２５μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して測定に供した。【０４１０】
（１６−２−３）測定
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件１）および２）で行った。得られたピーク強度、形状から判断して、カチオンモードでの測定には５倍、アニオンモードでの測定には１０倍に希釈した試料を用いた。【０４１１】
１）陽イオン性代謝物質（カチオンモード）
・装置
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＥ−ＴＯＦＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：Ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉ．ｄ．５０μｍ×８０ｃｍ
・測定条件
Ｒｕｎ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐ／ｎ：Ｈ３３０１−１００１）
Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐ／ｎ：Ｈ３３０１−１００１）
Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ５０ｍｂａｒ，１０ｓｅｃ
ＣＥ  ｖｏｌｔａｇｅ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，２７ｋＶ
ＭＳ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＭＳ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：４，０００Ｖ
ＭＳ  ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  ５０−１，０００
Ｓｈｅａｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ：ＨＭＴ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｌｉｑｕｉｄ（ｐ／ｎ：Ｈ３３０１−１０２０）。【０４１２】
２）陰イオン性代謝物質（アニオンモード）
・装置
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＥ−ＴＯＦＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）１号機
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：Ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉ．ｄ．５０μｍ×８０ｃｍ
・測定条件
Ｒｕｎ  ｂｕｆｆｅｒ：Ａｎｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐ／ｎ：Ｈ３３０２−１０２１）
Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ：Ａｎｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐ／ｎ：Ｈ３３０２−１０２２）
Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ５０ｍｂａｒ，２５ｓｅｃ
ＣＥ  ｖｏｌｔａｇｅ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，３０ｋＶ
ＭＳ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ＭＳ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３，５００Ｖ
ＭＳ  ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ  ５０−１，０００
Ｓｈｅａｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ：ＨＭＴ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｌｉｑｕｉｄ（ｐ／ｎ：Ｈ３３０１−１０２０）。【０４１３】
（１６−３）データ処理及び解析
（１６−３−１）データ処理
ＣＥ−ＴＯＦＭＳで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．９．０．９（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比（ｍ／ｚ）、泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ：ＭＴ）とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は下記の式：
相対面積値＝目的ピークの面積値／内部標準物質の面積値
を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ＋やＫ＋などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。【０４１４】
（１６−３−２）候補代謝物質検索
検出されたピークに対してｍ／ｚとＭＴの値をもとにＨＭＴ代謝物質ライブラリ及びＫｎｏｗｎ−Ｕｎｋｎｏｗｎライブラリに登録された全物質との照合、検索を行った。検索のための許容誤差はＭＴで±０．５ｍｉｎ、ｍ／ｚでは±１０ｐｐｍ（質量誤差（ｐｐｍ）＝（実測値−理論値）／実測値×１０６）とした。【０４１５】
（１６−３−３）統計解析（ＰＣＡ、ＨＣＡ）
主成分分析（ＰＣＡ）はＳａｍｐｌｅＳｔａｔ  ｖｅｒ．３．１４（ＨＭＴ開発）を用いて行った。また、階層的クラスタリング解析（ＨＣＡ）及びＨｅａｔｍａｐ表記はＰｅａｋＳｔａｔ  ｖｅｒ．３．１８（ＨＭＴ開発）を用いて行った。クラスタリングの結果は、別途添付するエクセルファイルを参照することによりすべての候補化合物を確認することができる。両解析とも、データの前処理としてピーク単位での標準化（μ＝０、σ＝１）を行っている。【０４１６】
（１６−３−４）代謝経路の描画
代謝物質定量データの代謝経路マップへの描画を実施した。代謝経路の描画には、ＶＡＮＴＥＤ４（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ）を用いた。描画に用いた代謝物質の名称には、一部ＨＭＴ化合物データベースとは異なる略称を用いている。尚、代謝経路はヒトで確認された酵素を基に作成している。掲載は省略。【０４１７】
（１６−４）結果
（１６−４−１）候補代謝物質検索
培養細胞５検体についてＣＥ−ＴＯＦＭＳによるメタボローム解析を行った。ＨＭＴ代謝物質ライブラリ及びＫｎｏｗｎ−Ｕｎｋｎｏｗｎライブラリに登録された物質のｍ／ｚ及びＭＴの値から２０１種（カチオン１０２種、アニオン９９種）のピークに候補化合物が付与された（表３５）。これらについては、別途添付するエクセルファイルを参照することにより確認することができる。【０４１８】
【表３５】
2013081188.tif 000171
2013081188.tif 000172
2013081188.tif 000173
2013081188.tif 000174
2013081188.tif 000175
ＩＤは測定モードの頭文字と通し番号からなり、Ｃはカチオンモード、Ａはアニオンモードを示す。
Ｎ．Ｄ．：Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ．解析対象であるが、検出限界以下であった。
†  検出ピークのｍ／ｚとＭＴからＨＭＴデータベースに照合し得られた候補化合物ピーク強度が飽和したＧＡＢＡ，Ｐｒｏに関しては１３ＣのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ａｒｅａを用いている。ＩＤでソート（昇順）している。【０４１９】
この結果から、
・誘導悪性幹細胞であるｃｃ１−７は、内在性がん関連代謝異常であるフマル酸呼吸（関連代謝物質；Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ，Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ，Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）が亢進していた（表３５の色をつけたカラムを参照）；
・誘導悪性幹細胞であるｃｃ１−２は、内在性がん関連代謝異常であるｗａｒｂｕｒｇ効果（関連代謝物質；Ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ，Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）が亢進していた（表３５の色をつけたカラムを参照）；
・誘導悪性幹細胞であるｃｃ４−ｃ、ｃｃ−４ｄは内在性がん関連代謝異常であるグルタミンからＴＣＡ回路の逆回転流入の亢進（関連代謝物質；Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ，Ｉｓｏｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ，ｃｉｓ−Ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）及びグルタミノリシスが亢進（関連代謝物質；Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ，Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）していた（表３５では四角で囲った）；
ことが明らかになった。【０４２０】
この様に、誘導悪性幹細胞のがん細胞として特徴的な代謝について記載した。フマル酸呼吸とｗａｒｂｕｒｇ効果は、どちらも低栄養状態で起こりうる現象である。ｗａｒｂｕｒｇ効果の亢進についてはピルビン酸、乳酸の蓄積量が判断基準となった。フマル酸呼吸の亢進ではＴＣＡ回路後半、Ｆｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ，Ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ，Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄが連続して蓄積していることが一つの指標となった。【０４２１】
グルタミンからＴＣＡ回路の逆回転流入、グルタミノリシスの亢進は、グルタミンは細胞増殖時の窒素減として重要なため、解糖系以外からも、効率よくエネルギーを得るために亢進していた。【０４２２】
なお、誘導多能性幹細胞であるｎｆｂ１−４はコントロールの正常な幹細胞として用いた。【０４２３】
（１６−４−２）統計解析（ＰＣＡ、ＨＣＡ）
検出されたピークを用いて主成分分析を行った結果を図２に示す。また、階層的クラスタリングを行い、ＨｅａｔＭａｐ表示させた結果を表３６に示す。データの前処理として、Ｎ．Ｄ．にはｅｐｓ（＝０）を代用し、標準化（μ＝０、σ＝１）を行っている。【０４２４】
【表３６】
2013081188.tif 000176
2013081188.tif 000177
2013081188.tif 000178
2013081188.tif 000179
2013081188.tif 000180
【０４２５】
（１６−４−３）代謝経路の描画
これらの候補化合物を解糖系／糖新生、ペントースリン酸経路、クエン酸回路、尿素回路、プリン代謝経路、ピリミジン代謝経路、ニコチン酸・ニコチンアミド代謝経路及び各種アミノ酸代謝経路に描画した。掲載は省略。【０４２６】
本実施例において解析された誘導悪性幹細胞はがん関連糖鎖異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえる。【０４２７】
実施例１７：誘導悪性幹細胞の内在性がん関連糖鎖異常の検出
本実施例においては、誘導多能性幹細胞と比較して、（１）（ｇ）における誘導悪性幹細胞の内在性のがん関連糖鎖の異常（検出または増加或いは低下又は消失）を解析した。【０４２８】
（１７−１）材料
（１）（ｇ）における誘導悪性幹細胞の内在性のがん関連糖鎖の異常の検出は、試料となる細胞から糖鎖を精製し、それをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定による質量分析により分析し、対照試料の糖鎖パターンと比較することにより、検出を行った。
（１）（ｇ）における誘導悪性幹細胞の内在性のがん関連糖鎖の異常の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ１）、新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ１）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７）、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）、新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿Ｄ）、そして
・ドナーＮｏ．６の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９５６）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ１＿４）、
を使用した。【０４２９】
（１７−２）  糖鎖の精製・検出手順
（１７−２−１）培養細胞および組織からの糖鎖の遊離
直径１００ｍｍの培養皿に約８０％コンフルエントにまで培養した細胞を、スクレッパーで剥がし、４０ｍＬのＰＢＳで遠心洗浄し、これに０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液（和光純薬工業、５８２−８３９９１）１２５μＬを加えた。次に、ＱＩＡ  ｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）で細胞を破砕し、純水１２５μＬで洗い流し全量を回収した（溶液トータル２５０μＬ）。【０４３０】
この様にして調製した細胞破砕溶液２５０μＬに対して、下記溶液：
・１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（２５μＬ）（用時調製）（和光純薬工業、０１７−０２８７５）
・１２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ９７７９）水溶液（２５μＬ）（用時調製）
を添加し、ボルテックスで攪拌して完全に溶解させる。【０４３１】
この溶液を６０℃で３０分間静置した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ；和光純薬工業、０９３−０２１５２）水溶液（５０μＬ）を加え、遮光下にて、室温で１時間静置する。この溶液に対して、さらにトリプシン（２０００ｕｎｉｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ−０３０３）を加える。トリプシンは、４０ｕｎｉｔ／μＬで１ｍＭ塩酸に溶解し、５０μＬをサンプル溶液に加えて、２０００ｕｎｉｔとした。トリプシンを含む溶液を、３７℃のインキュベーターで１時間以上静置したのち、９０℃のヒートブロックで５分間加熱することにより、トリプシンを失活させる。【０４３２】
次に、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１３６５１９３００１）（２５μＬ＝５ｕｎｉｔ）を加え、３７℃のインキュベーターで一晩（１２時間以上）静置することにより、細胞から糖鎖を遊離する。【０４３３】
（１７−２−２）糖鎖の精製およびラベル化
上記の方法により培養細胞または組織あるいは糖タンパク質から遊離された糖鎖の精製は、住友ベークライト（株）糖鎖精製キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（登録商標）（ＢＳ−４５６０３）を使用して行った。【０４３４】
以下の手順において、「ポリマービーズを洗浄する」工程は、洗浄液をビーズに加え、卓上遠心機で約５秒間遠心して洗浄液を除去する操作を示す。【０４３５】
また、使用する溶液は、以下の通りの組成である：
・２％（ｖ／ｖ）酢酸／アセトニトリル・・・アセトニトリル（ＡＣＮ）（和光純薬工業、０１５−０８６３３）９．８ｍＬに酢酸（和光純薬工業、０１２−００２４５）２００μＬを加え混合。
・２Ｍグアニジン溶液・・・グアニジン塩酸塩（和光純薬工業、０７０−０１８２５）１．９ｇを純水１０ｍＬに溶解。常温で１ヶ月程度保存可。
・１％トリエチルアミン／メタノール・・・メタノール（和光純薬工業、１３６−０９４７５）９．９ｍＬにトリエチルアミン（和光純薬工業、２０２−０２６４６）１００μＬを加え混合。
・１０ｍＭ塩酸・・・濃塩酸（和光純薬工業、０８３−０１０９５）を純水で適宜希釈。【０４３６】
手順１：ポリマービーズ分注
１）反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）ポリマービーズ（乾燥状態）のチューブに純水５００μＬを加え、ボルテックスで撹拌し、ポリマービーズを分散させる。
３）ポリマービーズ分散液５０μＬをピペットで取り、反応用チューブの底部に注入する。
４）反応用チューブを卓上遠心機で約５秒間遠心し，水を排出する。【０４３７】
手順２：糖鎖捕捉反応
１）反応用チューブを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）２％酢酸／アセトニトリル１８０μＬを添加する。
３）糖鎖サンプル溶液（２０μＬ）を添加する。
４）チューブを８０℃のヒートブロックに挿入し、フタをせず、開放したまま１時間加熱する。
５）溶媒が完全に蒸発し，ビーズがカラカラに乾燥していることを確認する。乾燥していない場合は，さらに１５分加熱を続ける。【０４３８】
手順３：ポリマービーズ洗浄
１）反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入し、卓上遠心機にセットする。
２）ポリマービーズを２Ｍグアニジン溶液２００μＬで２回洗浄する。
３）ポリマービーズを純水２００μＬで２回洗浄する。
４）ポリマービーズを１％トリエチルアミン／メタノール２００μＬで２回洗浄する。【０４３９】
手順４：ポリマービーズ官能基のキャッピング
１）１０％無水酢酸溶液を使用直前に調製する。メタノール９００μＬをエッペンドルフチューブにとり，無水酢酸（和光純薬工業、０１２−０８５４５）１００μＬを加え混合する。
２）反応用チューブを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
３）ポリマービーズに１０％無水酢酸１００μＬを加える。
４）室温で３０分間静置する。【０４４０】
手順５：ポリマービーズ洗浄
１）反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）遠心して無水酢酸溶液を排出する。
３）ポリマービーズを１０ｍＭ塩酸２００μＬで２回洗浄する。
４）ポリマービーズをメタノール２００μＬで２回洗浄する。
５）ポリマービーズをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業、０４８−２１９８５）２００μＬで２回洗浄する。【０４４１】
手順６：シアル酸の保護（メチルエステル化）
１）反応用チューブを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）５００ｍＭ  １−メチル−３−ｐ−トリルトリアゼン（ＭＴＴ）（東京化成工業、Ｍ０６４１：シアル酸メチルエステル化試薬）溶液を使用直前に調製する。ＭＴＴ（７４．６ｍｇ）をエッペンドルフチューブに量り取り，ＤＭＳＯ１ｍＬを加えて溶解させる。
３）ポリマービーズにＭＴＴ溶液（１００μＬ）を加える。
４）チューブをフタをせず、開放したまま、６０℃のヒートブロックで、１時間加熱する。【０４４２】
手順７：ポリマービーズ洗浄
１）反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）遠心してＭＴＴ溶液を排出する。
３）ポリマービーズをメタノール２００μＬで２回洗浄する。
４）ポリマービーズを純水２００μＬで２回洗浄する。【０４４３】
手順８：糖鎖再遊離／ラベル化
１）反応用チューブを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用ラベル化合物（Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳと表示）のチューブに純水２２０μＬを加え，ボルテックスで撹拌して溶解させる（試薬濃度：２０ｍＭ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用ラベル化合物溶液は、溶液を小分けして−２０℃以下で冷凍保存し、凍結融解の繰り返しは行わなかった。
３）ポリマービーズにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用ラベル化合物溶液２０μＬを添加する。
４）２％酢酸／アセトニトリル１８０μＬを添加するる
５）チューブを、フタをせず、開放したまま、８０℃のヒートブロックで１時間加熱する。
６）溶媒が完全に蒸発し，ビーズがカラカラに乾燥していることを確認する。乾燥していない場合は，さらに１５分加熱を続ける。【０４４４】
手順９：ラベル化糖鎖の回収
１）反応用チューブを新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに挿入する。
２）ポリマービーズに純水５０μＬを加える。
３）遠心して溶液をエッペンドルフチューブに回収する。この回収した溶液にはラベル化糖鎖と、未反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用ラベル化合物溶液が含まれる。【０４４５】
手順１０：過剰試薬の除去ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用
下記手順にしたがって過剰試薬の除去を行った。
１）回収した糖鎖溶液（約５０μＬ）に、アセトニトリル９５０μＬを加え、混合する（回収した糖鎖溶液が９５％アセトニトリル溶液になるように希釈）。
２）「クリーンアップカラム」を遠心機にセットする。
３）クリーンアップカラムを純水２００μＬで１回洗浄する。
４）クリーンアップカラムをアセトニトリル２００μＬで２回洗浄する。
５）クリーンアップカラムに１）で調製した糖鎖溶液を全量添加する。
６）１０分間自然落下させる。
７）遠心して残りの溶液を通過させる。
８）チューブに溜まった廃液を捨て、カラムを再度チューブに挿し、遠心機にセットする。
９）クリーンアップカラムをアセトニトリル３００μＬで２回洗浄する。
１０）チューブに溜まった廃液を捨て、クリーンアップカラムを再度チューブに挿し、遠心してよりアセトニトリルを完全に除去する。
１１）クリーンアップカラムを新しい１．５ｍＬエッペンチューブに挿入する。
１２）純水５０μＬを加える。
１３）遠心してラベル化糖鎖溶液をエッペンドルフチューブに回収する。
１４）この様にして回収したサンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定を行う。【０４４６】
（１７−２−３）糖タンパク質からの糖鎖の遊離・精製・ラベル化
住友ベークライト（株）糖鎖精製キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（登録商標）（ＢＳ−４５６０３）操作再現性確認のため、標準試料（ウシ血清由来ＩｇＧ）も使用した。標準試料をＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（登録商標）プロトコルＡ「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定用操作プロトコル」（Ｖｅｒ．１２０６０１）に従って糖鎖精製・ラベル化を行った。精製・ラベル化済み糖鎖溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定を実施し、糖鎖が正しく回収できていることを確認した。【０４４７】
標準試料の糖タンパク質（ウシ血清由来ＩｇＧ）１ｍｇをトリプシン処理、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）処理する場合の操作を以下に示した。【０４４８】
まず、糖タンパク質（１ｍｇ）の入ったチューブに、下記の溶液：
・１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（５μＬ）（用時調製）
・純水（５０μＬ）
・１２０ｍＭ  ＤＴＴ水溶液（５μＬ）（用時調製）
を添加し、ボルテックスで攪拌して糖タンパク質を完全に溶解させる。【０４４９】
この溶液を６０℃で３０分間静置した後、１２３ｍＭ  ＩＡＡ水溶液（１０μＬ）を加え、遮光下にて、室温で１時間静置する。この溶液に対して、さらにトリプシン（４００ｕｎｉｔ）を加える。トリプシンは、４０ｕｎｉｔ／μｌで１ｍＭ塩酸に溶解し、この溶液を１０μＬサンプル溶液に加えて、４００ｕｎｉｔとした。トリプシンを含む溶液を、３７℃のインキュベーターで１時間以上静置した後、９０℃のヒートブロックで５分間加熱することにより、トリプシンを失活させる。【０４５０】
次に、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（５μＬ＝５ｕｎｉｔ）を加え、３７℃のインキュベーターで一晩（１２時間以上）静置することにより、糖タンパク質から糖鎖を遊離する。【０４５１】
この様にして遊離した糖鎖を、「（１７−２−２）糖鎖の精製およびラベル化」に示した手順にしたがって、精製し、そしてラベル化する。【０４５２】
（１７−２−４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定
１）マトリックス溶液を調製する。２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＨＢ，ＭＡＬＤＩ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｒａｄｅ）１０ｍｇをサンプルチューブに測り取り，アセトニトリル（３００μＬ）、純水（７００μＬ）を加えて溶解させる。
２）マトリックス溶液とラベル化糖鎖溶液を１：１で混合する。（例えば１μＬ＋１μＬ）
３）２）のサンプル溶液をＭＡＬＤＩターゲットプレート上に１μＬスポットし，静置して乾燥させる。
マトリックス溶液で１／１０、１／１００、・・・希釈したものを同時にスポット。
４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ‘Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ’を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定を行う。
＊ｍ／ｚ９００〜１１００付近に再遊離試薬由来の莢雑ピークが観測される。ｍ／ｚ１２００以下をカットする条件での測定。【０４５３】
（１７−２−５）質量数の計算について
糖鎖の還元末端はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用ラベル化合物（ｅｘａｃｔ  ｍａｓｓ：４４７．２２）で脱水縮合の形でラベル化されている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，１９７７−１９８９（２００５））。【０４５４】
シアル酸のカルボキシル基はメチルエステル化されている（シアル酸残基１つにつき、質量数＋１４．０２）。【０４５５】
住友ベークライト（株）糖鎖精製キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（登録商標）（ＢＳ−４５６０３）でラベル化された糖鎖は，主にプロトン付加体［Ｍ＋Ｈ］＋で検出される（一部、［Ｍ＋Ｎａ］＋、［Ｍ＋Ｋ］＋も検出される）。【０４５６】
［Ｍ＋Ｈ］＋で検出した場合，糖鎖の質量数Ｍは下式で求められる：
糖鎖の質量数Ｍ＝［観測されたｍ／ｚ］−４４７．２２＋１８．０１−１４．０２×Ｎ−１．００。【０４５７】
（１７−３）  糖鎖解析の結果
調べた細胞のうち、４種類の誘導悪性幹細胞（ＣＣ４−ｃ、ＣＣ４−ｄ、ＣＣ１−２、ＣＣ１−７）に特異的な糖鎖を下記の表３７に示した。
【表３７】
2013081188.tif 000181
2013081188.tif 000182
また、糖鎖比較解析の結果を、図３に示す。この図において、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ１）の糖鎖（図３−１）、新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ１）の糖鎖（図３−２）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７）の糖鎖（図３−３および図３−４）を対比すること、また、
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した大腸非がん部位組織由来の細胞群（ｎｃｃ４）の糖鎖（図３−５）、新鮮大腸がん部位組織由来の細胞群（ｃｃ４）の糖鎖（図３−６）および新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿Ｄ）の糖鎖（図３−７および図３−８）を対比すること、そして
・ドナーＮｏ．６の個体から採取した線維芽細胞（７Ｆ３９５６）から作製した誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ１＿４）の糖鎖（図３−９）を対比すること、
から、本実施例において解析された誘導悪性幹細胞はがん関連糖鎖異常とＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえることが明らかになった。すなわち、本実施例において解析された誘導悪性幹細胞はがん関連糖鎖の構造をもつこととＥＳ細胞特異的な遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＺＦＰ４２）の発現という両者を合わせもつ細胞といえることが明らかになった。【０４５８】
実施例１８：誘導悪性幹細胞の胚性幹（ＥＳ）細胞特異的遺伝子発現の検出（１）
本実施例においては、（２）における誘導悪性幹細胞の、ＥＳ細胞特異的遺伝子（ＳＯＸ２遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＯＣＴ３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子）及びハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を検出した。【０４５９】
（１８−１）材料
（２）における誘導悪性幹細胞のＥＳ細胞特異的遺伝子の検出は、本発明において作製した誘導悪性幹細胞中で、目的とする遺伝子が発現しているレベルを、逆転写反応−定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）法により解析することにより、検出を行った。【０４６０】
（２）における誘導悪性幹細胞のＥＳ細胞特異的遺伝子の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．１の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿１０）、
・ドナーＮｏ．２の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ３＿５、ＣＣ３＿６）、
・ドナーＮｏ．３の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ１＿４、ＧＣ１＿６、ＧＣ１＿７、ＧＣ１＿８、ＧＣ１＿９、ＧＣ１＿１０）及び新鮮胃非がん組織から作製した誘導非悪性幹細胞（ＮＧＣ１＿６、ＮＧＣ１＿７）、
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１、ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７、ＣＣ１＿８、ＣＣ１＿９、ＣＣ１＿１１、ＣＣ１＿１２、ＣＣ１＿１７、ＣＣ１＿１８、ＣＣ１＿２５）、そして
・ドナーＮｏ．５の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ４＿ｃ、ＣＣ４＿（３）、ＣＣ４＿（６）、ＣＣ４＿（３）＿１０、ＣＣ４＿（４）、ＣＣ４＿３０、ＣＣ４−１０、ＣＣ４−３１、ＣＣ４（１）、ＣＣ４（２）、ＣＣ４−Ｄ）、
を使用した。【０４６１】
なお、ＥＳ細胞特異的遺伝子を発現する陽性コントロールとして、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞（ＮＦＢ２−１７細胞、２０１Ｂ７細胞）を用いた。このＮＦＢ２−１７細胞は、本願発明の発明者がドナーＮｏ．７の個体の線維芽細胞から作製した誘導多能性幹細胞であり、２０１Ｂ７細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所で作製された誘導多能性幹細胞であって、理化学研究所バイオリソースセンターから入手したものである。【０４６２】
（１８−２）手順
ＲＮＡ精製
ＲＮＡの精製は、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（５０）（ＱＩＡＧＥＮ；Ｃａｔ．ｎｏ．２１７００４）を、このキットに添付されているＱＩＡＧＥＮによるプロトコールに従って行った。【０４６３】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
上記で精製されたＲＮＡから、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ｑＰＣＲ（ＢＩＯ−ＲＡＤ、５×ｉＳｃｒｉｐｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘおよびｉＳｃｒｉｐｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む）を、このキットに添付されているＢＩＯ−ＲＡＤによるプロトコルにしたがって使用し、０．２ｍＬ  ＰＣＲ８連チューブ（ＷＡＴＳＯＮ、３３７−０２０８−Ｃ）および対応する０．２ｍＬ  ＰＣＲ８連キャップ（ＷＡＴＳＯＮ、３３７−０２ＣＰ−Ｃ）中で反応を行うことにより、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して行った。【０４６４】
逆転写反応は、以下の表：【０４６５】
【表３８】
2013081188.tif 000183
【０４６６】
の組成を有する反応溶液を各反応チューブ中に添加し、４２℃で３０分間インキュベーションして逆転写反応を、次いで８５℃にて５分間インキュベーションして逆転写酵素の不活化を、それぞれ行った。【０４６７】
この様にして調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応は、以下の反応溶液組成：【０４６８】
【表３９】
2013081188.tif 000184
【０４６９】
を使用して、９６ウェルのＰＣＲ用プレート（Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅｓ  ９６Ｗｅｌｌ  ＷＨＴ／ＣＬＲ：ＢＩＯＲＡＤ）中で、ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３０秒間のインキュベーションを行った後、９５℃にて５秒間そして６０℃にて５秒間の温度サイクルを３９回繰り返し、その後９５℃にて５秒間そして６５℃にて５秒間の温度サイクルを１回行うというプロトコルであった。【０４７０】
本実施例のＰＣＲにおいて使用したプライマーは以下の通りである。【０４７１】
【表４０】
2013081188.tif 000185
2013081188.tif 000186
【０４７２】
（１８−３）結果
この様にして行ったＰＣＲの結果を、以下の表４１に示す。【０４７３】
【表４１】
2013081188.tif 000187
2013081188.tif 000188
2013081188.tif 000189
【０４７４】
誘導悪性幹細胞のＥＳ細胞特異的遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子）の発現をｑＲＴ−ＰＣＲ法により、検出した。この結果から、この実施例において調べられた全ての誘導悪性幹細胞はいずれも、ＥＳ細胞特異的遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子）を発現していた。また、誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿１０、ＣＣ３＿５、ＣＣ３＿６、、ＧＣ１＿４、ＧＣ１＿６、ＧＣ１＿７、ＧＣ１＿８、ＧＣ１＿９、ＧＣ１＿１０、ＮＧＣ１＿６、ＮＧＣ１＿７、ＣＣ１＿１、ＣＣ１＿２、ＣＣ１＿７、ＣＣ１＿８、ＣＣ１＿９、ＣＣ１＿１１、ＣＣ１＿１２、ＣＣ１＿１７、ＣＣ１＿１８、ＣＣ１＿２５）は誘導多能性幹細胞（ＮＦＢ２−１７、２０１Ｂ７）とほぼ同等（１／８−８倍以内）にＥＳ細胞特異的遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＺＦＰ４２遺伝子）を発現していた。【０４７５】
実施例１９：誘導悪性幹細胞の胚性幹（ＥＳ）細胞特異的遺伝子発現の検出▲２▼
本実施例においては、（２）誘導悪性幹細胞のＥＳ細胞特異的遺伝子の発現をマイクロアレイで検出した。具体的には誘導悪性幹細胞（ｃｃ１＿１、ｇｃ２＿１、ｇｃ２＿５、ｇｃ２＿１０）の４種類の細胞から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社製Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４Ｋ）を用いて発現を確認した。【０４７６】
（１９−１）材料
（２）における誘導悪性幹細胞のＥＳ細胞特異的遺伝子の検出は、本発明において作製した誘導悪性幹細胞中で、目的とする遺伝子の発現を、マイクロアレイにより解析することにより、検出を行った。【０４７７】
（２）における誘導悪性幹細胞のＥＳ細胞特異的遺伝子の検出のための試料としては、
・ドナーＮｏ．１の個体から採取した新鮮胃がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＧＣ２＿１、ＧＣ２＿５、ＧＣ２＿１０）、そして
・ドナーＮｏ．４の個体から採取した新鮮大腸がん組織から作製した誘導悪性幹細胞（ＣＣ１＿１）、
を使用した。【０４７８】
（１９−２）解析手順
本実施例における解析は、基本的に実施例１３に記載する手順と同様に行った。具体的には、Ａｇｉｌｅｎｔ社Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社プロトコールに準じて、上述した細胞から標的となるＲＮＡから相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成し、Ｃｙａｎｉｎｅ色素で蛍光標識し、Ｃｙａｎｉｎｅ色素で標識したｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ａｇｉｌｅｎｔ社Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４Ｋ）と１７時間ハイブリダイゼーションさせ、洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ＳｃａｎｎｅｒでＤＮＡマイクロアレイのイメージを読み取り、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．１０．７．３．１）にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。【０４７９】
（１９−３）実験結果
（１９−２）材料において記載したサンプルについて品質評価を行った結果、いずれのサンプルについても、また、泳動パターンの確認においてもｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量の定量においても、品質が保証された。【０４８０】
次に、得られたサンプルを使用して、ｃＲＮＡを合成し、蛍光標識されたｃＲＮＡ量を測定したところ、マイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションに必要なｃＲＮＡ量が得られていることを確認できた。【０４８１】
そこで、ヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している以下の２３種類の遺伝子に対する、アジレント社製Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  ＧｅｎｏｍｅオリゴＤＮＡマイクロアレイ（４×４４Ｋ）の３１種類の発現プローブを設定したマイクロアレイチップに対して、ハイブリダイゼーションを行った。以下の表４２に遺伝子シンボル（ＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌ）、ジェンバンクアセッションナンバー（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ）を記載した。【０４８２】
【表４２】
2013081188.tif 000190
2013081188.tif 000191
【０４８３】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の画像解析の結果、問題なくハイブリダイゼーションが行われたことを確認できた。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析されたハイブリダイゼーション後の画像、数値化データをメディアに保存した。【０４８４】
解析はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇを用いた。
表４２に示すヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している２３種類の遺伝子に対する３１種類のプローブすべてが、ＧＣ２−１、ＧＣ２−５、ＧＣ２−１０、ＣＣ１−１のヒト誘導悪性幹細胞でヒト誘導多能性幹細胞ＮＦＢ２−１７とほぼ同程度（１／４〜４倍以内又は１／８〜４倍以内）に発現していた（図４（ａ）〜（ｄ））。この図中のラインは１／４倍と４倍とを示している。【０４８５】
また、ＧＣ２−１、ＧＣ２−５、ＧＣ２−１０、ＣＣ１−１の４種のヒト誘導悪性幹細胞は、誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７とほぼ同等（１／８〜８倍以内）に２３種類のＥＳ細胞特異的遺伝子を発現していたことも明らかになった。
【図１−１】
2013081188.tif 000255
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
2013081188.tif 000259
【図１−６】
2013081188.tif 000260
【図１−７】
2013081188.tif 000261
【図１−８】
2013081188.tif 000262
【図２】
2013081188.tif 000263
【図３−１】
2013081188.tif 000264
【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
2013081188.tif 000269
【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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