(57)【要約】  本発明は、生体試料から抽出したDNAに含まれるACTG1、EPHA4およびTSC22D1から選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析し、その解析結果に基づいて、肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する方法に関する。また、本発明は、その方法に用いられる判定用マーカーおよびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程と、
抽出工程で得られたDNAに含まれるACTG1、EPHA4およびTSC22D1から選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、前記生体試料中の肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する工程と
を含む、肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する方法。
【請求項２】
解析工程が、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
判定工程が、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合に、生体試料中に癌細胞が存在すると判定する工程である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
解析工程が、メチル化の頻度を解析する工程である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
判定工程が、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高い場合に、生体試料中に癌細胞が存在すると判定する工程である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである、メチル化解析により肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定するためのマーカー。
【請求項７】
ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む、肝細胞癌由来の癌細胞の存否の判定用キット。
【請求項８】
プライマーセットが、質量分析法およびメチル化特異的PCR法から選択される少なくとも１つの方法によりCpG部位のメチル化の状態を解析するためのプライマーセットである請求項７に記載の判定用キット。
【請求項９】
プライマーセットが、
配列番号１および配列番号２の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３および配列番号４の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号５および配列番号６の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号２０および配列番号２１の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号２２および配列番号２３の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号２４および配列番号２５の塩基配列であるプライマーセット、ならびに
配列番号３４および配列番号３５の塩基配列であるプライマーセット
から選択される少なくとも１つである請求項８に記載の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料における肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する方法に関する。より詳細には、生体試料から抽出したDNAに含まれる所定の遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。また、本発明は、その方法に用いられる判定用マーカーおよび判定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌は原発性肝癌の一つであり、肝細胞から発生する悪性腫瘍である。肝細胞癌は、初期の段階では症状がほとんどないが、腹部のしこり、突然の腹痛、黄疸などの自覚症状が現れる頃には重症化している場合が多い。他方、肝細胞癌は、B型肝炎ウィルス（HBV）またはC型肝炎ウィルス（HCV）に起因する慢性肝炎もしくは肝硬変の患者に頻発することが知られているので、これらの患者をハイリスク群として設定し、積極的に検査を行うことによって、肝細胞癌の早期発見が試みられている。【０００３】
肝細胞癌の検査では、血液中の腫瘍マーカーの測定が行われている。腫瘍マーカーとしては、現在、AFP（α−フェトプロテイン）、PIVKA-II（protein induced by vitamin-K absence II）などが利用されている。しかしながら、これらの腫瘍マーカーの検査は、肝細胞癌患者のスクリーニングに使用されているが、感度、特異度ともに十分でない。例えば、AFPの検査では、比較的小さい肝細胞癌の場合は異常値を示さないことがあり、PIVKA-IIの検査では、ビタミンKの欠乏またはワーファリンの服用により偽陽性を示すことがある。それゆえ、肝細胞癌の確定診断には、腫瘍マーカーの検査に加えて、超音波検査、CTおよびMRIなどの画像検査が行われている。【０００４】
他方で、近年、新たな癌の検出方法として、遺伝子情報に基づく検出方法が研究されている。そのような癌の検出方法としては、例えば、遺伝子のメチル化に関する情報に基づく検出方法が挙げられる。この方法では、所定の遺伝子におけるCpG部位（5'-(CG)-3'）をマーカーとして用い、そのマーカーのメチル化状態を解析して得た情報に基づいて癌を検出する。【０００５】
肝細胞癌においても、遺伝子のメチル化の解析を利用した癌の検出方法の研究が行なわれている。例えば、Ying-Bing Dengらの文献には、BCAN、ZNF141、DUSP4などの遺伝子が正常肝組織および非癌性肝組織ではメチル化されていないが、HCV感染に起因する肝細胞癌では高度にメチル化されていることが開示されている（非特許文献１参照）。また、Ran Taoらの文献には、WNK2、EMLIN2、TLX3などの遺伝子が非癌性肝組織ではメチル化されていないが、HBV感染に起因する肝細胞癌では高度にメチル化されていることが開示されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ying-Bing Dengら、Cancer Sci, June 2010, vol. 101, no. 6, 1501-1510
【非特許文献２】Ran Taoら、ProS ONE, May 2011, Vol. 6, Issue. 5, e19862
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、肝細胞癌において異常メチル化される遺伝子がいくつか報告されている。遺伝子のメチル化解析を利用した肝細胞癌の検出感度は、検出に用いられるマーカーとなる遺伝子の数を増やすことで向上させることができる。しかしながら、肝細胞癌を検出するためのマーカーとして用い得る遺伝子は少数に過ぎない。それゆえ、遺伝子のメチル化解析を利用した肝細胞癌の検出のための新規マーカーのさらなる開発が望まれている。【０００８】
そこで、本発明は、そのような新規マーカーを同定し、そのマーカーについてメチル化の状態を解析することにより、肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定するための方法を提供することを目的とする。また、本発明は、その方法に好適に用い得るキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、肝細胞癌の癌部組織、正常肝組織および慢性肝炎・肝硬変組織のDNAのメチル化状態を解析して、癌部組織に特異的にメチル化が認められる遺伝子領域を、新規マーカーとして同定した。そして、本発明者らは、これらの遺伝子領域中の所定の塩基配列についてメチル化状態を解析し、得られた解析結果に基づいて、肝細胞癌の癌部組織と正常肝組織や慢性肝炎・肝硬変組織とを高精度に区別できることを見出して、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明によれば、
被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程と、
抽出工程で得られたDNAに含まれる、ACTG1（Actin, gamma 1）、EPHA4（EPH receptor A4）およびTSC22D1（TSC22 domain family, member 1）から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、前記生体試料中の肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する工程と
を含む、肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する方法が提供される。【００１１】
また、本発明によれば、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである、メチル化解析により肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定するためのマーカーが提供される。
さらに、本発明によれば、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む、肝細胞癌由来の癌細胞の存否の判定用キットが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、肝細胞癌由来の癌細胞の存否の判定を可能にする新規マーカーを提供することができる。また、本発明は、そのようなマーカーについてメチル化の状態を解析することにより、被験者から採取した生体試料中の肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する方法およびキットを提供することができる。このような本発明を用いれば、該被験者が肝細胞癌を発症しているか否かを判断するための指標を臨床現場の医師などに提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、MassARRAY（登録商標）解析の原理を示す参考図である。
【図２】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるACTG1遺伝子のプロモータ領域のメチル化率を示すグラフである。
【図３】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるEPHA4遺伝子のプロモータ領域のメチル化率を示すグラフである。
【図４】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるTSC22D1遺伝子のプロモータ領域のメチル化率を示すグラフである。
【図５】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるDUSP4遺伝子のメチル化率を示すグラフである。
【図６】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるZNF141遺伝子のメチル化率を示すグラフである。
【図７】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるSFRP1遺伝子のメチル化率を示すグラフである。
【図８】種々の臨床検体から抽出したゲノムDNAにおけるGSTP1遺伝子のメチル化率を示すグラフである。
【図９】正常肝臓組織、肝硬変組織および肝細胞癌組織から抽出したDNAを、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各プライマーセットを用いてメチル化特異的PCR（MSP）法により増幅した結果を示す写真である。
【図１０】健常人および肝細胞癌患者の血漿から抽出したDNAを、TSC22D1のプライマーセットを用いてMSP法により増幅し、得られた増幅産物の量をゲル電気泳動および画像処理によって数値化した結果を示すグラフである。
【図１１】健常人および肝細胞癌患者の血漿から抽出したDNAを、EPHA4のプライマーセットを用いてMSP法により増幅し、得られた増幅産物の量をゲル電気泳動および画像処理によって数値化した結果を示すグラフである。
【図１２】健常人および肝細胞癌患者の血漿から抽出したDNAを、精度管理用プライマーセットを用いてMSP法により増幅し、得られた増幅産物の量をゲル電気泳動および画像処理によって数値化した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する方法（以下、「判定方法」ともいう）では、まず、被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する。
本実施形態において、生体試料は、被験者のDNAを含む生体由来の試料であれば特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体である。臨床検体としては、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、骨髄液、尿、乳頭分泌液、手術または生検により採取した組織などが挙げられる。また、被検者から採取した細胞または組織を培養して得られた培養物を生体試料として用いることもできる。
【００１５】
生体試料からのDNAの抽出は、公知の抽出方法により行うことができる。例えば、生体試料と、細胞または組織を可溶化する界面活性剤（例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって、DNAを抽出することができる。この場合、生体試料と処理液との混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させ、遊離したDNAを含む上清を後述する解析工程に用いることが好ましい。また、得られた上清を当該技術において公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
【００１６】
上記の抽出工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。DNAを適当な長さに断片化することにより、後述するメチル化DNA免疫沈降（MeDIP）法および非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Ｎとなるよう添加し、10〜40℃で５〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行なう場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
【００１７】
本発明の判定方法では、上記の抽出工程で得られたDNAに含まれるACTG1、EPHA4およびTSC22D1から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する。
なお、本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン（C）とグアニン（G）とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
また、本明細書において、「メチル化の状態を解析する」とは、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無、または該プロモータ領域のメチル化の頻度を解析することを意味する。
【００１８】
当該技術において、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列自体は公知である。これらの塩基配列は、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）などの公知のデータベースから知ることができる。上記の遺伝子の各種ID番号を、表１に示す。また、各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を、それぞれ配列番号17〜19で示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
本発明の実施形態において、解析工程は、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の遺伝子から選択される少なくとも１つのプロモータ領域に存在するCpG部位のうち、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。ここで、「メチル化の有無」とは、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位のシトシンがメチル化されているか否かを意味する。この実施形態では、解析するCpG部位は１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。なお、複数のCpG部位は、１つの遺伝子のプロモータ領域から選択してもよく、複数の遺伝子のプロモータ領域のそれぞれの中から選択してもよい。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、解析工程は、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の遺伝子から選択される少なくとも１つのプロモータ領域におけるメチル化の頻度を解析する工程であってもよい。ここで、「メチル化の頻度」とは、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合を意味する。この実施形態では、解析対象は、上記のプロモータ領域の全部であってもよいし、少なくとも１つのCpG部位を含む一部分であってもよい。なお、解析対象は、CpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のCpG部位を含む領域を解析対象とすることが好ましい。また、解析対象は、上記の遺伝子のうちのいずれか１つのプロモータ領域から決定されてもよいし、複数のプロモータ領域から決定されてもよい。
なお、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、本発明の実施形態においては、該プロモータ領域におけるメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度として利用できる。
【００２２】
上記のメチル化の頻度は、DNA中のCpG部位のメチル化状態を、後述するMassARRAY（登録商標）などの質量分析法で解析することにより得られる「メチル化率」であってもよい。MassARRAY（登録商標）では、DNA断片を測定して、メチル化DNA断片に由来するピークと非メチル化DNA断片に由来するピークとの面積比からメチル化率が算出される。
【００２３】
本発明の実施形態では、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域中のいずれのCpG部位、あるいは該CpG部位を含むいずれの領域を解析対象とするかについては、特に限定されない。なお、これらの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、解析対象とするCpG部位または範囲は、後述の公知の解析方法を用いたルーチンの実験の結果に基づいて当業者が適宜決定することができる。
【００２４】
メチル化の状態を解析する方法は、当該技術において種々の方法が公知である。本発明の判定方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、好ましくは、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程とを含む方法である。
【００２５】
メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。
DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT（in vitro transcription）増幅法、SPIA（商標）増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
【００２６】
MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本発明の実施形態において、解析工程は、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、得られたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程であってもよい。また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析することもできる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
【００２７】
非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換する処理である。ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩（バイサルファイト）が好適に用いられる。
バイサルファイトを用いる処理では、DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。
したがって、DNA中のCpG部位のメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い（CおよびU）に変換される。なお、バイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
【００２８】
バイサルファイト処理を行なう場合、バイサルファイトの添加量（濃度）は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されないが、例えば、DNAを含む溶液中の終濃度として１M以上、好ましくは１〜15 M、より好ましくは３〜10 Mである。また、バイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件（温度および時間）は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できるが、例えば、バイサルファイトを終濃度６Mで添加した場合、50〜80℃で10〜90分間インキュベーションする。
【００２９】
DNAに含まれるCpG部位のメチル化状態は、バイサルファイト処理したDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれている。
【００３０】
また、CpG部位のメチル化状態は、質量分析法によって解析することができる。具体的には、バイサルファイト処理したDNAを鋳型として、解析対象とする塩基配列に特異的なプライマーセットを用いてPCR増幅した後、得られたPCR産物をさらにIVT増幅することにより、メチル化シトシンおよびウラシルは、それぞれグアニン（G）およびアデニン（A）となる。得られたIVT増幅産物をRNase Aで切断し、得られた核酸断片間におけるGとAとの質量差（16 Da）をMALDI-TOF（マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置を用いて検出することにより、DNAのメチル化状態を解析できる。この方法はMassARRAY（登録商標）解析と呼ばれる（図１参照）。
図１のAに示されるように、IVT産物においてRNase Aによって切断される部位は、任意の塩基と該塩基に隣接するウラシル（U）またはチミン（T）との間であることが知られている。したがって、RNase Aによって切断されたIVT産物の塩基配列および質量は、鋳型として用いたDNAの塩基配列から予測することが可能である。したがって、MassARRAY（登録商標）で得られた各ピークについて、鋳型としたDNAの塩基配列のどの部分に由来するかを同定できる。例えば、DNA断片中の１か所のCpG部位がメチル化していた場合、MassARRAY（登録商標）で得られるピークは、高質量側（右側）へ16 Daシフトする（図１のCの左パネル参照）。複数のCpG部位を有するDNA断片の解析では、該DNA断片中のCpG部位が２か所メチル化していた場合は32 Daシフトし（図１のCの右パネル参照）、３か所メチル化していた場合は48 Daシフトする。
【００３１】
MassARRAY（登録商標）などの質量分析法では、測定したDNA断片のメチル化率を算出することができる。この計算について、図１のCの左パネルを用いて例示すると、非メチル化DNA断片のピーク（左）とメチル化DNA断片のピーク（右）との面積比が１：３であった場合、この配列のDNA断片のメチル化率は、３／（１+３）＝0.75より、75％となる。なお、メチル化率は理論上、DNA断片が有する全てのCpG部位がメチル化している場合は100％であり、全てのCpG部位がメチル化していない場合は０％である。
【００３２】
CpG部位のメチル化状態は、メチル化特異的PCR（MSP）法によって解析することができる。MSP法とは、バイサルファイト処理したDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによって、CpG部位のメチル化状態（メチル化の有無）を解析する方法である。
上記のMSP法では、解析対象のCpG部位がメチル化されている（すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない）塩基配列は増幅できるが、CpG部位がメチル化されていない（すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている）塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が存在する場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が存在しない場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
【００３３】
MSP法で用いられるプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端またはその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
【００３４】
CpG部位のメチル化状態は、マイクロアレイを用いて解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
【００３５】
マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本発明の判定方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全て
のDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Fluor（商標）などが挙げられる。
このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
【００３６】
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。
シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner3000 7G（Affymetrix社）、Illumina(登録商標) BeadArray Reader (Illumina社)などが挙げられる。
【００３７】
本発明の方法では、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の肝細胞癌に由来する癌細胞の存否を判定する。
本発明の実施形態においては、解析工程においてメチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。反対に、メチル化されたCpG部位が無いという結果が得られた場合に、該生体試料中に癌細胞が存在しないと判定し得る。
なお、上記の判定は、１つのCpG部位の解析結果から行ってもよいが、判定精度を向上させるために、複数のCpG部位の解析結果から判定することが好ましい。
【００３８】
本発明の別の実施形態においては、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高い場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。反対に、メチル化の頻度が所定の閾値より低い場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在しないと判定し得る。
なお、所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定することができる。あるいは、所定の閾値は次のようにして設定してもよい。まず、肝細胞癌に由来する癌細胞を含まないことが予め確認されている生体試料（正常肝組織または正常肝細胞）および癌細胞を含む生体試料のそれぞれから抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、癌細胞を含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く、且つ癌細胞を含む生体試料のメチル化の頻度よりも低い範囲から閾値を設定する。好ましくは、癌細胞を含まない生体試料と癌細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
【００３９】
本発明の別の実施形態においては、上記の判定工程で得られた判定結果に基づいて、生体試料を採取された被験者について確定診断を行う診断工程をさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明の範囲には肝細胞癌の診断方法（以下、「診断方法」ともいう）も含まれる。より具体的には、本発明の診断方法は、次の工程を含む：
被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程；
抽出工程で得られたDNAに含まれる、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程；
解析工程で得られた解析結果に基づいて、前記生体試料中の肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定する工程；および
判定工程で得られた判定結果に基づいて、生体試料を採取された被験者について確定診断を行う工程。
【００４０】
上記の診断工程では、判定工程にて生体試料中に癌細胞が存在すると判定された場合に、該試料を採取された被験者について確定診断を行う。反対に、生体試料中に癌細胞が存在しないと判定された場合は、確定診断を行わない。そのような確定診断の手段としては、肝細胞癌の確定診断に用いられる当該技術において公知の手段であれば特に限定されず、例えば、超音波検査、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（CT）、核磁気共鳴画像法（MRI）または陽電子放射断層撮影（PET）などの画像診断、および生検などが挙げられる。本発明の実施形態においては、これらの手段の少なくとも１種により被験者に肝細胞癌が発見された場合、被験者を肝細胞癌と確定診断することができる。
【００４１】
本発明の範囲には、メチル化解析により肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定するためのマーカー（以下、「判定用マーカー」ともいう）も含まれる。本発明の判定用マーカーは、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである。
本発明の実施形態においては、生体試料から抽出したDNAについて、判定用マーカーのメチル化の状態を上記の解析方法により解析することにより、該生体試料中に肝細胞癌由来の癌細胞が存在するか否かを判定することができる。
【００４２】
また、肝細胞癌由来の癌細胞の存否の判定用キット（以下、「判定用キット」ともいう）も本発明の範囲に含まれる。本発明の判定用キットは、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む。
【００４３】
本発明の実施形態において、判定用キットに含まれるプライマーセットは、MassARRAY（登録商標）などの質量分析法、MSP法、バイサルファイトシーケンス法など、PCR増幅を伴う解析法によりCpG部位のメチル化の状態を解析するためのプライマーセットであればよい。
そのようなプライマーセットに含まれるプライマーの塩基配列は、上記のプロモータ領域の塩基配列に応じて適宜設定できる。例えば、MassARRAY（登録商標）などの質量分析法であれば、配列番号１および配列番号２の塩基配列であるプライマーセット、配列番号３および配列番号４の塩基配列であるプライマーセット、ならびに配列番号５および配列番号６の塩基配列であるプライマーセットが挙げられる。また、MSP法であれば、配列番号２０および配列番号２１の塩基配列であるプライマーセット、配列番号２２および配列番号２３の塩基配列であるプライマーセット、ならびに配列番号２４および配列番号２５の塩基配列であるプライマーセットが挙げられる。
【００４４】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：  肝細胞癌の組織のゲノムDNAからの新規マーカーの同定
（1-1）生体試料
本実施例では、生体試料として、肝切除術により患者から採取した臨床検体を用いた。該臨床検体は、肝細胞癌の癌部組織（100検体）、正常肝組織（３検体）および慢性肝炎・肝硬変組織（39検体）であった。これらの組織は採取された後、ただちに液体窒素で凍結され、使用されるまで−80℃で保存された。【００４６】
（1-2）DNA抽出およびバイサルファイト処理
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。得られたゲノムDNA（500 ng）を、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research社）を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水（10μL）に溶出した。得られたDNA溶液（４μL）に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor（COSMO BIO社製）によって断片化した。【００４７】
（1-3）新規マーカーの同定
断片化したゲノムDNAについて、Infinium HumanMethylation27 BeadChip（Illumina社）を用いたInfinium Methylation Assayを行って、肝細胞癌の癌部組織に特異的にメチル化が認められる新規マーカーを探索した。なお、具体的な操作は、用いたチップに添付されたマニュアルに従って行った。
その結果、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1の各遺伝子のプロモータ領域が、肝細胞癌の癌部組織に特異的にメチル化が認められるマーカーとして同定された。以降の実施例において、これらのマーカーを本発明のマーカーと呼ぶ。【００４８】
実施例２：  質量分析法による本発明のマーカーの性能の検討
（2-1）生体試料
本実施例では、生体試料として、上記の実施例１とは異なる患者から、肝切除術により採取した臨床検体を用いた。該臨床検体は、正常肝組織（２検体）、肝硬変組織（２検体）および肝細胞癌の癌部組織（６検体）であった。これらの組織は採取された後、ただちに液体窒素で凍結され、使用されるまで−80℃で保存された。【００４９】
（2-2）測定用試料および対照試料の作製
（i）ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor（COSMO BIO社製）によって断片化した。
また、質量分析法における検量線を作成するため、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により断片化して、非メチル化DNA断片（０％メチル化DNA）の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片（100％メチル化DNA）の溶液を得た。そして、０％メチル化DNAの溶液と100％メチル化DNAの溶液とを所定の割合で混合して、25％、50％および75％メチル化DNAの溶液を得た。【００５０】
（ii）バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片（１μg）を、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research社）を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水（160μL）に溶出した。【００５１】
（iii）PCRおよびIVTによる増幅
バイサルファイト処理した各DNA断片に含まれるメチル化シトシンおよびウラシルを、PCR法およびIVT増幅法により、それぞれグアニンおよびアデニンに変換した。
なお、PCR法に用いたプライマーセットがメチル化DNAおよび非メチル化DNAのいずれも偏りなく増幅できることは、後述する対照試料を用いたMassARRAY（登録商標）解析によって確認されている。本発明のマーカーに対するプライマーセットの配列を、表２に示した。また、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1遺伝子のプロモータ領域について、表５に示されるプライマーセットで解析される領域の塩基配列を、それぞれ配列番号２８〜３０で示した。【００５２】
【表２】
2013129397.tif 000003
【００５３】
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ以下のタグ配列およびT7プロモータ配列が付加されている。
・タグ配列：AGGAAGAGAG  （配列番号７）
・T7プロモータ配列：CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT （配列番号８）【００５４】
PCR反応液は、下記の試薬類を混合して調製した。
10x Hot Starバッファー（QIAGEN社）              0.5μL
25 mM dNTPミックス                              0.04μL
Hot Star Taq（５U／μL）（QIAGEN社）            0.04μL
プライマーミックス                              2.0μL
DNA溶液                                         1.0μL
水                                              1.42μL   
トータル                                          ５μL【００５５】
上記の反応液について、下記の条件でPCR反応を行った。
94℃で15分を１サイクル、
94℃で20秒、52℃で30秒および72℃で１分を45サイクル、72℃で３分。【００５６】
得られた各PCR産物を、MassCLEAVE（商標）Reagentキット（SEQUENOM社）に含まれるSAP（Shrimp Alkaline Phosphatase）を用いて脱リン酸化処理した。次いで、これらに、上記のキットを用いて調製した下記の反応液を添加した。
5x T7 R&DNAポリメラーゼバッファー       0.89μL
T Cleavageミックス                      0.24μL
100 mM DTT                              0.22μL
T7 R&DNAポリメラーゼ                    0.44μL
RNase A                                 0.06μL
RNaseフリーの水                         3.15μL   
トータル                                  ５μL【００５７】
得られた混合物を37℃で３時間インキュベーションして、IVT反応と、ウラシルまたはチミン特異的切断反応とを行った。そして、得られた各反応物をClean Resin（SEQUENOM社）により精製して、質量分析法のための試料を得た。これらの試料について、上記の臨床検体から抽出したゲノムDNAに由来する試料を測定用試料とし、対照ゲノムDNAに由来する試料を対照試料として、後述する質量分析法に用いた。【００５８】
（2-3）MassARRAY（登録商標）を用いた質量分析法によるメチル化状態の解析
（i）検量線の作成
上記で得られた対照試料を２回ずつ独立に質量分析を行った。得られた解析結果より、各プライマーセットについての検量線を作成し、相関係数を算出した。これにより、用いたプライマーセットは、メチル化DNAおよび非メチル化DNAのいずれにも偏りなく増幅できることが確認された。【００５９】
（ii）測定用試料の解析
上記で得られた測定用試料の質量分析を行い、測定用試料に含まれるDNA断片のピークを得た。次いで、得られた各ピークが、実施例１で同定されたマーカーの塩基配列のどの部分に由来するかを同定した。そして、同一の塩基配列に由来する断片について、メチル化CpG部位を含む断片のピークとメチル化CpG部位を含まない断片のピークとの面積比から、メチル化率を算出した。得られた結果を、図２〜４に示す。なお、これらの図において、縦軸はメチル化率（％）を示す。また、正常肝臓１および２は正常肝組織（２検体）を示し、肝硬変１および２は肝硬変組織（２検体）を示し、肝癌１〜６は肝細胞癌の癌部組織（６検体）を示す。【００６０】
図２〜４より、本発明のマーカーのメチル化率は、正常肝組織および肝硬変組織に比べて、肝細胞癌の癌部組織において顕著に高くなっていることが明らかとなった。すなわち、これらのマーカーは、肝細胞癌の癌部組織において特異的にメチル化されていることがわかった。
したがって、本発明のマーカーについてメチル化の状態を解析することにより、肝細胞癌由来の癌細胞を、正常な肝細胞および肝硬変の肝臓に由来する細胞などの非癌性肝細胞と区別して検出することが可能となる。
よって、生体試料から抽出したDNAおいて、本発明のマーカーに含まれるCpG部位のメチル化の状態を解析すれば、該生体試料中の肝細胞癌由来の癌細胞の存否を判定できることが示された。【００６１】
比較例：  本発明のマーカーと既知マーカーとの性能の比較
肝細胞癌由来の癌細胞において高度にメチル化されていることが既に知られているDUSP4、ZNF141、SFRP1およびGSTP1の各遺伝子（以下、「既知マーカー」という）について、実施例２と同様にしてメチル化の状態を解析した。
生体試料は、実施例２と同じ臨床検体を用いた。また、既知マーカーについての測定用試料の調製は、以下のプライマーセットを用いたことを除いて、実施例２と同様にして行った。既知マーカーに対するプライマーセットの配列を、表３に示した。【００６２】
【表３】
2013129397.tif 000004
【００６３】
得られた測定用試料について、実施例２と同様にしてMassARRAY（登録商標）を用いた質量分析を行った。得られた結果を、図５〜８に示す。
図５〜８より、既知マーカーのメチル化率は、正常肝組織および肝硬変組織に比べて、肝細胞癌の癌部組織において顕著に高くなっていることが明らかとなった。これらの既知マーカーの結果と、実施例２で示された本発明のマーカーの結果とを比較すると、本発明のマーカーは、既知マーカーと同程度またはそれ以上の精度で肝細胞癌由来の癌細胞を検出し得ることが示された。【００６４】
実施例３：  MSP法による本発明のマーカーの性能の検討
（3-1）生体試料
本実施例では、生体試料として、上記の実施例１と同じ正常肝組織（２検体）、肝硬変組織（５検体）および肝細胞癌の癌部組織（６検体）を用いた。【００６５】
（3-2）測定用試料および対照試料の作製
（i）ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor（COSMO BIO社製）によって断片化した。
また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により断片化して、非メチル化DNA断片（０％メチル化DNA）の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることによりCG配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片（100％メチル化DNA）の溶液を得た。
（ii）バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片（500 ng）を、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research社）を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水（80μL）に溶出した。【００６６】
（3-3）メチル化特異的PCR（MSP）
上記（3-2）で得られた測定用試料および対照試料（バイサルファイト処理後のDNA）を用いて、MSPを行った。MSPで用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCRの反応条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DDW（滅菌水）                           16.8μL
10×PCR buffer with MgCl2（Roche社）     2.5μL
2mM dNTP mix                             2.5μL
10μMセンスプライマー                    1.0μL
10μMアンチセンスプライマー              1.0μL
Faststart Taq polymerase（Roche社）      0.2μL
測定用試料または対照試料                 1.0μL   
トータル                                25μL【００６７】
＜プライマーセット＞
上記のMSPで用いたプライマーセットを表４に示す。これらは、増幅される領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセットである。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた（表５参照）。なお、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1遺伝子のプロモータ領域について、表４に示されるプライマーセットで解析される領域の塩基配列を、それぞれ配列番号３１〜３３で示した。【００６８】
【表４】
2013129397.tif 000005
【００６９】
【表５】
2013129397.tif 000006
【００７０】
＜PCR反応条件＞
95℃で６分、
95℃で30秒、Ｘ℃で30秒、72℃で30秒をＹサイクル、
72℃で７分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「Ｘ」および「Ｙ」はそれぞれ、表４および５に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。【００７１】
（3-4）メチル化特異的PCR（MSP）の結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図９に示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を表す。
図９より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRにより全てのレーンにバンドが現れていた。このことから、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。本発明のマーカーについてのPCRでは、正常肝組織および肝硬変組織ではメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。他方で、肝細胞癌組織では、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1はそれぞれ６症例中５症例、６症例中４症例、および６症例中３症例でバンドを検出した。このように、MSP法による本発明のマーカーのメチル化解析では、実施例１のInfinium法の結果と同様に、本発明のマーカーのメチル化と肝細胞癌とが相関することが示された。すなわち、ACTG1、EPHA4およびTSC22D1は、高率に肝細胞癌でメチル化傾向を示すマーカーであることが示唆された。【００７２】
実施例４：  血漿試料を用いたMSP解析
（4-1）生体試料
本実施例では、生体試料として、肝細胞癌患者から採取した末梢血から分離して得た血漿（６検体）を用いた。また、対照検体として、健常人の末梢血から分離して得た血漿（３検体）を用いた。【００７３】
（4-2）測定用試料および対照試料の作製
（i）ゲノムDNAの抽出
上記の各血漿２mLからゲノムDNAを、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。
（ii）バイサルファイト処理
上記で得られた各ゲノムDNAをEZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌水（80μL）に溶出した。【００７４】
（4-3）MSP
上記（4-2）で得られた測定用試料を用いて、MSPを行った。MSPで用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCRの反応条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DW（滅菌水）                            16.8μL
10×PCR buffer with MgCl2（Roche社）     2.5μL
2mM dNTP mix                             2.5μL
10μMセンスプライマー                    1.0μL
10μMアンチセンスプライマー              1.0μL
Faststart Taq polymerase（Roche社）      0.2μL
測定用試料                               1.0μL   
トータル                                25μL【００７５】
＜プライマーセット＞
上記のMSPで用いたプライマーセットを表６に示す。
【表６】
2013129397.tif 000007
【００７６】
＜PCR反応条件＞
95℃で６分、
95℃で30秒、Ｘ℃で30秒、72℃で30秒をＹサイクル、
72℃で７分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「Ｘ」および「Ｙ」はそれぞれ、表６に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。【００７７】
（4-4）MSPの結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２%アガロースゲル電気泳動で確認した。さらに、アガロースゲル電気泳動で確認されたバンドの強度について、ImageJ（オープンソース。http://rsbweb.nih.gov/ij/から入手可能。）のツールを用いて数値化処理を行った。各サンプルの泳動レーンごとに、目的のバンドの数値からバックグラウンドの数値を差し引いた値を検出値とし、グラフを作成した。結果を図１０〜１２に示す。
図１０より、TSC22D1についてのPCRにより、健常人血漿ではバンドを検出せず、肝細胞癌患者血漿では６症例中全症例でバンドを検出することができたことがわかる。また、図１１より、EPHA4についてのPCRにより、健常人血漿ではバンドを検出せず、肝細胞癌患者血漿では６症例中４症例でバンドを検出することができたことがわかる。なお、図１２より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRにより、全てのサンプルにおいてバンドが検出されたことがわかる。これは、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことを示している。このように、本発明のマーカーは、生体試料として血漿を用いた場合でも、肝細胞癌患者においてメチル化傾向を示し、健常人ではメチル化が検出されないことがわかった。よって、本発明のマーカーは、肝細胞癌に特異性の高いマーカーであることが示唆された。【００７８】
本出願は、２０１２年２月２９日に出願された日本国特許出願特願２０１２−０４４３２４号および２０１２年９月１９日に出願された日本国特許出願特願２０１２−２０５７７５号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
2013129397.tif 000008
【図２】
2013129397.tif 000009
【図３】
2013129397.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2013129397000001.app
【国際調査報告】
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2013129397.tif 000021
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