(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アントフィンの製造方法であって、
（ｉ）植物の粉末を第１溶媒と混合して第１混合物を形成する工程；
（ｉｉ）前記第１混合物を加熱および濾過して第１抽出物を得る工程；
（ｉｉｉ）前記第１抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程；
（ｉｖ）前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程；
（ｖ）前記透明溶液を第２溶媒で抽出して第２抽出物を得る工程；および
（ｖｉ）前記第２抽出物を濃縮および精製する工程
を含み、前記植物が、アルビジア・ユリブリッシン（Albizzia julibrissin）、アンチトキシクム・フネブレ（Antitoxicum funebre）、コックルス・ラウリフォリウス（Cocculus laurifolius）、コックルス・ペンデュルス（Cocculus pendulus）、コリダリス・メイフォリア（Corydalis meifolia）、クロトン・スパルシフロウルス（Croton sparsiflours）、クリプトカリヤ・オウバチェンシス（Cryptocarya oubatchensis）、クリプトカリヤ・フィロステモン（Cryptocarya phyllostemon）、クリプトカリヤ・キネンシス（Cryptocarya chinensis）、キナンクム・ハンコキアヌム（Cynanchum hancockianum）、キナンクム・イナモエヌム（Cynanchum inamoenum）、キナンクム・カマロヴィ（Cynanchum komarovi）、キナンクム・パニキュラーツム（Cynanchum paniculatum）、キナンクム・ヴィンセトキシクム（Cynanchum vincetoxicum）、フィクス・フィスツローサ（Ficus fistulosa）、フィクス・セプチカ（Ficus septica）、ペルグラリア・ダエミア（Pergularia daemia）、ステファニア・グラブラ（Stephania glabra）、ティロフォラ・フロリブンダ（Tylophora floribunda）、ティロフォラ・インディカ（Tylophora indica）、ティロフォラ・タナカエ（Tylophora tanakae）、ヴィンセトキシクム・ヒルンディナリア（Vincetoxicum hirundinaria）、ヴィンセトキシクム・ニグルム（Vincetoxicum nigrum）、ヴィンセトキシクム・オフィチナーレ（Vincetoxicum officinale）、ヴィンセトキシクム・プミル（Vincetoxicum pumilu）およびヴィンセトキシクム・ロッシクム（Vincetoxicum rossicum）の少なくとも１種よりなる群から選択され、
前記工程（ｖｉ）の濃縮および精製が体積比２：５の酢酸エチルおよびメタノールで溶離するカラムクロマトグラフィーを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記第１溶媒が水、アルコール、エステル、エーテル、ケトンまたはその組合せを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸が塩酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２溶媒がジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｉｉ）の加熱温度が室温から前記第１混合物の沸点である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｉｉ）の加熱が２時間またはそれ以上続く請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｉｖ）の濾過がセライトまたはクレーを用いる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｖｉ）の精製が再結晶を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アントフィンが下記式：
【化１】
0005902803.tif 000009
で示される化合物である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野は関節炎の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は主に高齢者の疾患であり、罹患率は文明化と共に増加している。関節炎の治療は、炎症の症状を排除し、免疫系を阻害するコルチコステロイドの投与を含むか、あるいは、痛みや炎症を改善する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、ＣＯＸ−１阻害薬、ＣＯＸ−２阻害薬、セレブレックスまたはイブプロフェンなどの投与を含むものである。しかし、これらの薬剤は、重篤な副作用を有し、効果が限定的であるため、新世代の薬剤を開発することが求められている。
【０００３】
関節炎を治療するための新世代の薬剤は、関節炎が進行する際にサイトカインのＴＮＦ−αが果たす役割に着目するものである。関節炎患者におけるＴＮＦ−αの分泌を減少させる一連の生物学的作用物質、例えば、抗ＴＮＦ−α抗体のアダリムマブやインフリキシマブ、ＴＮＦ−α拮抗薬のエタネルセプトなどが開発されている。免疫抑制剤のメトトレキセートとＴＮＦ−α拮抗薬のエタネルセプトとを併用すれば、関節炎の治療効果が向上することを示す研究も存在する（Tracey Dら、腫瘍壊死因子拮抗薬の作用機構（Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action）：包括的レビュー、ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Pharmacology & Therapeutics）117(2008)244-279）。また、関節炎を治療するために他のサイトカインを阻害する薬剤、例えば、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−１β−ｒａなどが知られている。しかし、これらの薬剤は、効力が限定的であり、副作用を有し、単回投与であるため、新しい薬剤を開発することが緊急に求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、関節炎治療用のキナンクム属植物抽出物およびそれに含まれる有効成分、ならびにその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のある態様は、有効量のキナンクム属（イケマ属）植物（Cynanchum sp.）抽出物を、それを必要とする対象者に投与することを含む関節炎の治療方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様は、有効成分であるキナンクム属植物抽出物と薬学的に許容される担体とを含む関節炎治療用の医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明のある態様は、有効量のアントフィンを、それを必要とする対象者を投与することを含む関節炎の治療方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の態様は、有効成分であるアントフィンと薬学的に許容される担体とを含む関節炎治療用の医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明のある態様は、下記工程を含むアントフィンの製造方法を提供する：（ｉ）植物の粉末を第１溶媒と混合して第１混合物を形成する工程；（ｉｉ）前記第１混合物を加熱および濾過して第１抽出物を得る工程；（ｉｉｉ）前記第１抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程；（ｉｖ）前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程；（ｖ）前記透明溶液を第２溶媒で抽出して第２抽出物を得る工程；および（ｖｉ）前記第２抽出物を濃縮および精製する工程；ここで、前記植物は、アルビジア・ユリブリッシン（Albizzia julibrissin）、アンチトキシクム・フネブレ（Antitoxicum funebre）、コックルス・ラウリフォリウス（Cocculus laurifolius）、コックルス・ペンデュルス（Cocculus pendulus）、コリダリス・メイフォリア（Corydalis meifolia）、クロトン・スパルシフロウルス（Croton sparsiflours）、クリプトカリヤ・オウバチェンシス（Cryptocarya oubatchensis）、クリプトカリヤ・フィロステモン（Cryptocarya phyllostemon）、クリプトカリヤ・キネンシス（Cryptocarya chinensis）、キナンクム・ハンコキアヌム（Cynanchum hancockianum）、キナンクム・イナモエヌム（Cynanchum inamoenum）、キナンクム・カマロヴィ（Cynanchum komarovi）、キナンクム・パニキュラーツム（Cynanchum paniculatum）、キナンクム・ヴィンセトキシクム（Cynanchum vincetoxicum）、フィクス・フィスツローサ（Ficus fistulosa）、フィクス・セプチカ（Ficus septica）、ペルグラリア・ダエミア（Pergularia daemia）、ステファニア・グラブラ（Stephania glabra）、ティロフォラ・フロリブンダ（Tylophora floribunda）、ティロフォラ・インディカ（Tylophora indica）、ティロフォラ・タナカエ（Tylophora tanakae）、ヴィンセトキシクム・ヒルンディナリア（Vincetoxicum hirundinaria）、ヴィンセトキシクム・ニグルム（Vincetoxicum nigrum）、ヴィンセトキシクム・オフィチナーレ（Vincetoxicum officinale）、ヴィンセトキシクム・プミル（Vincetoxicum pumilu）およびヴィンセトキシクム・ロッシクム（Vincetoxicum rossicum）の少なくとも１種よりなる群から選択される。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、有効成分であるアントフィンと食品添加物とを含む栄養補助食品を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、有効成分であるキナンクム属植物抽出物と食品添加物とを含む栄養補助食品を提供する。
【００１２】
本願は、２０１１年４月２９日付けで出願された米国仮出願第６１／４８０，５５０の権利を主張するものである。当該仮出願の開示内容は、参照することにより本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本願の開示内容については、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明および実施例を読むことにより、さらに完全に理解することができる。
【図１】図１は、キナンクム・ハンコキアヌムから抽出された結晶のＮＭＲデータであり、キナンクム・ハンコキアヌムからの結晶は、アントフィンであると確認された。
【図２】図２は、キナンクム・ハンコキアヌムから抽出された結晶のＮＭＲデータであり、キナンクム・ハンコキアヌムからの結晶は、アントフィンであると確認された。
【図３】図３は、ある態様にかかるＵ９３７細胞系のＴＮＦ−α阻害および細胞生存率に対するキナンクム・ハンコキアヌムのエタノール抽出物の効果である。
【図４】図４は、ある態様にかかるＵ９３７細胞系のＴＮＦ−α阻害および細胞生存率に対するアントフィンの効果である。
【図５】図５は、ある態様にかかるＬＰＳ誘発性モデルのＴＮＦ−α阻害に対するキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図６】図６は、ある態様にかかるＬＰＳ誘発性モデルのＩＬ−６阻害に対するキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図７】図７は、ある態様にかかるＬＰＳ誘発性モデルのＴＮＦ−α阻害に対するいくつかのキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図８】図８は、ある態様にかかるＬＰＳ誘発性モデルのＩＬ−６阻害に対するいくつかのキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図９】図９は、ある態様にかかるＬＰＳ誘発性モデルのＴＮＦ−α阻害に対するいくつかのキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図１０】図１０は、ある態様にかかるＬＰＳ誘発性モデルのＩＬ−６阻害に対するいくつかのキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図１１】図１１は、ある態様にかかるカラギーナン誘発性ラットモデルの後肢体積に対するキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図１２】図１２は、ある態様にかかるアジュバント誘発性関節炎モデルの関節炎スコアに対するキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図１３】図１３は、ある態様にかかるアジュバント誘発性関節炎モデルの後肢体積に対するキナンクム属植物抽出物の効果である。
【図１４】図１４は、ある態様にかかるコラーゲン誘発性関節炎モデルの関節炎罹患率に対するアントフィン療法の効果である。
【図１５】図１５は、ある態様にかかるコラーゲン誘発性関節炎モデルの体重変化に対するアントフィン療法の効果である。
【図１６】図１６は、ある態様にかかるコラーゲン誘発性関節炎モデルの後肢体積に対するアントフィン療法の効果である。
【図１７】図１７は、ある態様にかかるコラーゲン誘発性関節炎モデルの関節炎スコアに対するアントフィン療法の効果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の詳細な説明では、開示された態様を完全に理解するために、説明を目的として、多くの具体的な詳細が記載されている。しかし、これらの具体的な詳細がなくても、１またはそれ以上の態様を実施できることは明らかである。他の例では、図面を簡単にするために、周知の構造および装置は概略的に示されている。
【００１５】
本発明のある態様は、有効量のキナンクム属植物抽出物を、それを必要とする対象者に投与することを含む関節炎の治療方法を提供する。別の態様では、本発明は、有効成分であるキナンクム属植物抽出物と薬学的に許容される担体とを含む関節炎治療用の医薬組成物を提供する。
【００１６】
ここで、「キナンクム属植物」は、キナンクム・ハンコキアヌム（Cynanchum hancockianum）、キナンクム・イナモエヌム（Cynanchum inamoenum）、キナンクム・コマロヴィイ（Cynanchum komarovii）、キナンクム・パニクラツム（Cynanchum paniculatum）、キナンクム・ヴィンセトキシクム（Cynanchum vincetoxicum）、キナンクム・アトラツム（Cynanchum atratum）またはキナンクム・スタウントニイ（Cynanchum stauntonii）を含むものである。このうち、キナンクム・ハンコキアヌムが好ましい。
【００１７】
本発明のある態様にかかるキナンクム属植物の抽出は、植物種や抽出用組織などに応じて、適宜調整することができる。本発明のある態様では、キナンクム属植物の抽出は、下記工程を含むことができる：
（ｉ）植物の粉末を第１溶媒と混合して第１混合物を形成する工程；
（ｉｉ）前記第１混合物を加熱および濾過して第１抽出物を得る工程；
（ｉｉｉ）前記第１抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程；
（ｉｖ）前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程；
（ｖ）前記透明溶液を第２溶媒で抽出して第２抽出物を得る工程；および
（ｖｉ）前記第２抽出物を濃縮および精製する工程。
【００１８】
より具体的には、第１溶媒は、水、アルコール、エステル、エーテル、ケトンまたはその組合せを含むものである。第１溶媒としてのアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、２−ブタノール、２−メチルプロパノール、２−メチルプロパン−２−オール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノールまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのエステルは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシルまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのケトンは、アセトン、メチルエチルケトン、２−ペンタノン、３−ペンタノンまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのエーテルは、エーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテルまたはその組合せを含むことができる。
【００１９】
本発明のある例では、第１溶媒は８０〜１００質量％の酢酸ブチルおよび０〜２０質量％のエタノールからなる混合物溶媒である。本発明の別の例では、第１溶媒は５０〜１００質量％のイソプロパノール水溶液または９０〜１００質量％のイソプロパノール水溶液である。
【００２０】
本発明によれば、第１抽出物に加えられる酸は特に限定されるものではなく、塩酸が好ましい。本発明のある例では、０．１〜２Ｎの塩酸が用いられる。
【００２１】
本発明のある態様によれば、工程（ｉｉ）の加熱温度は室温から混合物の沸点である。加熱時間は２時間またはそれ以上続くことができる。ある例では、加熱温度は２５〜７５℃であり、７０〜７５℃が好ましい。
【００２２】
本発明のある態様によれば、第２溶媒は、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せ、好ましくはジクロロメタンを含むことができるが、これに限定されるものではない。第２溶媒による抽出は、純度向上のために、少なくとも１回行うことができる。好ましくは、第２溶媒による抽出は、１〜３回行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明のある態様によれば、工程（ｖｉ）の精製は、カラムクロマトグラフィーまたは再結晶を含むことができるが、これに限定されるものではない。再結晶は、濃縮または乾燥した抽出物を極性溶媒と混合し、加熱および溶解後に、この溶液を冷却して結晶化させる工程を含むことができる。極性溶媒は、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せを含むことができる。ある例では、ジクロロメタンが用いられる。
【００２４】
ここで、カラムクロマトグラフィーは、吸収性の固体充填材を詰めたカラムに混合物を通す溶離液によって、この混合物中の成分を分離する方法を意味する。混合物中の各成分は、カラムの充填材に対する親和性が異なり、溶離液に対する溶解度が異なるので、これらの成分は、異なる速度でカラムを通過することにより分離される。溶離液は、メタノール、エタノール、酢酸エチル、酢酸ブチルまたはその組合せを含むことができる。本発明のある例では、体積比２：５の酢酸エチルおよびメタノールからなる溶離液を用いるシリカカラムクロマトグラフィーが採用される。
【００２５】
本発明のある態様によれば、工程（ｉｖ）の濾過は、セライト、クレーなどを用いて、酸を加えた後の粘着物質を除去することができる。
【００２６】
本発明のある態様では、本発明者らは、さらに、キナンクム属植物抽出物中における関節炎治療用の有効成分がアントフィンであることを確認する。他の態様では、キナンクム属植物抽出物は、０．１％〜０．３％のアントフィンを含む。それゆえ、本発明は、ある態様では、さらに、有効量のアントフィンを、それを必要とする対象者に投与することを含む関節炎の治療方法、ならびに、有効成分であるアントフィンと薬学的に許容される担体とを含む関節炎治療用の医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明のある態様にかかるアントフィンは、下記式（１）：
【００２８】
【化１】
0005902803.tif 000002
【００２９】
で示されるフェナントロインドリジジン・アルカロイド、そのエナンチオマーまたは塩を意味する。
【００３０】
ここで、エナンチオマーは、（＋）−アントフィンおよび（−）−アントフィンを含むが、天然に存在する下記式（２）：
【００３１】
【化２】
0005902803.tif 000003
【００３２】
で示される（−）−アントフィンが好ましい。
【００３３】
ここで、アントフィンの塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、炭酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはケイ酸塩を含むことができる。しかし、本発明は、これらに限定されるものではなく、関節炎を治療するアントフィンの活性に影響を及ぼさない塩を含むものである。
【００３４】
本発明のある態様では、アントフィンは、下記植物の抽出物から得ることができる：アルビジア・ユリブリッシン（Albizzia julibrissin）、アンチトキシクム・フネブレ（Antitoxicum funebre）、コックルス・ラウリフォリウス（Cocculus laurifolius）、コックルス・ペンデュルス（Cocculus pendulus）、コリダリス・メイフォリア（Corydalis meifolia）、クロトン・スパルシフロウルス（Croton sparsiflours）、クリプトカリヤ・オウバチェンシス（Cryptocarya oubatchensis）、クリプトカリヤ・フィロステモン（Cryptocarya phyllostemon）、クリプトカリヤ・キネンシス（Cryptocarya chinensis）、キナンクム・ハンコキアヌム（Cynanchum hancockianum）、キナンクム・イナモエヌム（Cynanchum inamoenum）、キナンクム・カマロヴィ（Cynanchum komarovi）、キナンクム・パニキュラーツム（Cynanchum paniculatum）、キナンクム・ヴィンセトキシクム（Cynanchum vincetoxicum）、フィクス・フィスツローサ（Ficus fistulosa）、フィクス・セプチカ（Ficus septica）、ペルグラリア・ダエミア（Pergularia daemia）、ステファニア・グラブラ（Stephania glabra）、ティロフォラ・フロリブンダ（Tylophora floribunda）、ティロフォラ・インディカ（Tylophora indica）、ティロフォラ・タナカエ（Tylophora tanakae）、ヴィンセトキシクム・ヒルンディナリア（Vincetoxicum hirundinaria）、ヴィンセトキシクム・ニグルム（Vincetoxicum nigrum）、ヴィンセトキシクム・オフィチナーレ（Vincetoxicum officinale）、ヴィンセトキシクム・プミル（Vincetoxicum pumilu）、ヴィンセトキシクム・ロッシクム（Vincetoxicum rossicum）またはその組合せ。
【００３５】
アントフィンを得るための抽出は、植物種、抽出用の組織などに応じて、適宜調整することができる。本発明のある態様では、アントフィンを得るための抽出は、下記工程を含む：
（ｉ）植物の粉末を第１溶媒と混合して第１混合物を形成する工程；
（ｉｉ）前記第１混合物を加熱および濾過して第１抽出物を得る工程；
（ｉｉｉ）前記第１抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程；
（ｉｖ）前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程；
（ｖ）前記透明溶液を第２溶媒で抽出して第２抽出物を得る工程；および
（ｖｉ）前記第２抽出物を濃縮および精製する工程。
【００３６】
より具体的には、第１溶媒は、水、アルコール、エステル、エーテル、ケトンまたはその組合せを含むものである。第１溶媒としてのアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、２−ブタノール、２−メチルプロパノール、２−メチルプロパン−２−オール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノールまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのエステルは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシルまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのケトンは、アセトン、メチルエチルケトン、２−ペンタノン、３−ペンタノンまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのエーテルは、エーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテルまたはその組合せを含むことができる。
【００３７】
本発明のある例では、第１溶媒は８０〜１００質量％の酢酸ブチルおよび０〜２０質量％のエタノールからなる溶媒混合物である。
【００３８】
本発明の別の例では、第１溶媒は５０〜１００質量％のイソプロパノール水溶液または９０〜１００質量％のイソプロパノール水溶液である。
【００３９】
本発明によれば、第１抽出物に加えられる酸は特に限定されるものではなく、塩酸が好ましい。本発明のある例では、０．１〜２Ｎの塩酸が用いられる。
【００４０】
本発明のある態様によれば、工程（ｉｉ）の加熱温度は室温から混合物の沸点である。加熱時間は２時間またはそれ以上続くことができる。ある例では、加熱温度は２５〜７５℃であり、７０〜７５℃が好ましい。
【００４１】
本発明のある態様によれば、第２溶媒は、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せ、好ましくはジクロロメタンを含むことができるが、これに限定されるものではない。第２溶媒による抽出は、純度向上のために、少なくとも１回行うことができる。好ましくは、第２溶媒による抽出は、１〜３回行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明のある態様によれば、工程（ｖｉ）の精製は、カラムクロマトグラフィーまたは再結晶を含むことができるが、これに限定されるものではない。再結晶は、濃縮または乾燥した抽出物を極性溶媒と混合し、加熱および溶解後に、この溶液を冷却して結晶化させる工程を含むことができる。極性溶媒は、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せを含むことができる。ある例では、ジクロロメタンが用いられる。
【００４３】
ここで、カラムクロマトグラフィーは、吸収性の固体充填材を詰めたカラムに混合物を通す溶離液によって、この混合物中の成分を分離する方法を意味する。混合物中の各成分は、カラムの充填材に対する親和性が異なり、溶離液に対する溶解度が異なるので、これらの成分は、異なる速度でカラムを通過することにより分離される。溶離液は、メタノール、エタノール、酢酸エチル、酢酸ブチルまたはその組合せを含むことができる。本発明のある例では、体積比２：５の酢酸エチルおよびメタノールからなる溶離液を用いるシリカカラムクロマトグラフィーが採用される。
【００４４】
本発明のある態様によれば、工程（ｉｖ）の濾過は、セライト、クレーなどを用いて、酸を加えた後の粘着物質を除去することができる。
【００４５】
従って、本発明のある態様は、下記工程を含むアントフィンの製造方法を提供する：
（ｉ）植物の粉末を第１溶媒と混合して第１混合物を形成する工程；
（ｉｉ）前記第１混合物を加熱および濾過して第１抽出物を得る工程；
（ｉｉｉ）前記第１抽出物を濃縮した後、酸を加えて粘着物質を含む懸濁液を形成する工程；
（ｉｖ）前記懸濁液を濾過して前記粘着物質を除去し、透明溶液を得る工程；
（ｖ）前記透明溶液を第２溶媒で抽出して第２抽出物を得る工程；および
（ｖｉ）前記第２抽出物を濃縮および精製する工程。
【００４６】
ここで、前記植物は、アルビジア・ユリブリッシン（Albizzia julibrissin）、アンチトキシクム・フネブレ（Antitoxicum funebre）、コックルス・ラウリフォリウス（Cocculus laurifolius）、コックルス・ペンデュルス（Cocculus pendulus）、コリダリス・メイフォリア（Corydalis meifolia）、クロトン・スパルシフロウルス（Croton sparsiflours）、クリプトカリヤ・オウバチェンシス（Cryptocarya oubatchensis）、クリプトカリヤ・フィロステモン（Cryptocarya phyllostemon）、クリプトカリヤ・キネンシス（Cryptocarya chinensis）、キナンクム・ハンコキアヌム（Cynanchum hancockianum）、キナンクム・イナモエヌム（Cynanchum inamoenum）、キナンクム・カマロヴィ（Cynanchum komarovi）、キナンクム・パニキュラーツム（Cynanchum paniculatum）、キナンクム・ヴィンセトキシクム（Cynanchum vincetoxicum）、フィクス・フィスツローサ（Ficus fistulosa）、フィクス・セプチカ（Ficus septica）、ペルグラリア・ダエミア（Pergularia daemia）、ステファニア・グラブラ（Stephania glabra）、ティロフォラ・フロリブンダ（Tylophora floribunda）、ティロフォラ・インディカ（Tylophora indica）、ティロフォラ・タナカエ（Tylophora tanakae）、ヴィンセトキシクム・ヒルンディナリア（Vincetoxicum hirundinaria）、ヴィンセトキシクム・ニグルム（Vincetoxicum nigrum）、ヴィンセトキシクム・オフィチナーレ（Vincetoxicum officinale）、ヴィンセトキシクム・プミル（Vincetoxicum pumilu）およびヴィンセトキシクム・ロッシクム（Vincetoxicum rossicum）の少なくとも１種よりなる群から選択される。
【００４７】
より具体的には、第１溶媒は、水、アルコール、エステル、エーテル、ケトンまたはその組合せを含むものである。第１溶媒としてのアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、２−ブタノール、２−メチルプロパノール、２−メチルプロパン−２−オール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノールまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのエステルは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシルまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのケトンは、アセトン、メチルエチルケトン、２−ペンタノン、３−ペンタノンまたはその組合せを含むことができる。第１溶媒としてのエーテルは、エーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテルまたはその組合せを含むことができる。
【００４８】
本発明のある例では、第１溶媒は８０〜１００質量％の酢酸ブチルおよび０〜２０質量％のエタノールからなる溶媒混合物である。
【００４９】
本発明の別の例では、第１溶媒は５０〜１００質量％のイソプロパノール水溶液または９０〜１００質量％のイソプロパノール水溶液である。
【００５０】
本発明によれば、第１抽出物に加えられる酸は特に限定されるものではなく、塩酸が好ましい。本発明のある例では、０．１〜２Ｎの塩酸が用いられる。
【００５１】
本発明のある態様によれば、工程（ｉｉ）の加熱温度は室温から混合物の沸点である。加熱時間は２時間またはそれ以上続くことができる。ある例では、加熱温度は２５〜７５℃であり、７０〜７５℃が好ましい。
【００５２】
本発明のある態様によれば、第２溶媒は、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せ、好ましくはジクロロメタンを含むことができるが、これに限定されるものではない。第２溶媒による抽出は、純度向上のために、少なくとも１回行うことができる。好ましくは、第２溶媒による抽出は、１〜３回行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
本発明のある態様によれば、工程（ｖｉ）の精製は、カラムクロマトグラフィーまたは再結晶を含むことができるが、これに限定されるものではない。再結晶は、濃縮または乾燥した抽出物を極性溶媒と混合し、加熱および溶解後に、この溶液を冷却して結晶化させる工程を含むことができる。極性溶媒は、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、エーテル、アセトンまたはその組合せを含むことができる。ある例では、ジクロロメタンが用いられる。
【００５４】
ここで、カラムクロマトグラフィーは、吸収性の固体充填材を詰めたカラムに混合物を通す溶離液によって、この混合物中の成分を分離する方法を意味する。混合物中の各成分は、カラムの充填材に対する親和性が異なり、溶離液に対する溶解度が異なるので、これらの成分は、異なる速度でカラムを通過することにより分離される。溶離液は、メタノール、エタノール、酢酸エチル、酢酸ブチルまたはその組合せを含むことができる。本発明のある例では、体積比２：５の酢酸エチルとメタノールとからなる溶離液を用いるシリカカラムクロマトグラフィーが採用される。
【００５５】
本発明のある態様によれば、工程（ｉｖ）の濾過は、セライト、クレーなどを用いて、酸を加えた後に生じる粘着物質を除去することができる。
【００５６】
ある態様では、アントフィンは、下記工程から得ることができる：キナンクム・ハンコキアヌムの粉末を５０〜９５質量％のエタノール水溶液と混合して、混合物を形成する工程；混合物を２時間加熱還流した後、残渣を濾去する工程；濾液を濃縮し、３倍量の０．１〜２Ｎ塩酸を加える工程；酸性溶液をジクロロメタンで抽出して、ジクロロメタン抽出物を得る工程；および、抽出物を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、アントフィンを単離する工程。抽出効率を向上するために、ジクロロメタン抽出の工程を２回またはそれ以上繰り返すことができる。ある例では、ジクロロメタン抽出の工程は、２〜３回繰り返される。濃縮された抽出物は、必要に応じて、さらに再結晶することができる。
【００５７】
ある例では、アントフィンは、キナンクム・ハンコキアヌムの抽出物から製造される。アントフィンを多量に含有し、容易に入手できるからである。しかし、アントフィンは、本明細書で説明する抽出方法により、前記植物から単離することもできる。
【００５８】
本発明のある態様におけるアントフィンの製造方法によれば、溶媒抽出は、アントフィンを多量に単離し、かつ、カラムクロマトグラフィーを繰り返す回数を減少させることができる。それゆえ、９０％以上の収率でアントフィンを得ることができる。従って、本発明にかかるアントフィンの製造は、抽出効率が高く、かつ、産業上の利用可能性が高い。
【００５９】
本発明によれば、アントフィンは、植物から抽出するだけでなく、化学的に合成することでも得ることができる。アントフィンは、プロリンを触媒にした逐次的α−アミノキシル化とアルデヒドのホーナー−ワーズワース−エモンズ（Horner-Wadsworth-Emmons）オレフィン化（ミンボ・クイ（Mingbo Cui）ら、プロリンを触媒にした逐次的α−アミノキシル化とアルデヒドのホーナー−ワーズワース−エモンズオレフィン化による（Ｒ）−アントフィンおよび（Ｒ）−クリプトロイリンの非対称合成（Asymmetric synthesis of (R)-antofine and (R)-cryptoleurine via proline-catalyzed sequential α-aminoxylation and Horner-Wadsworth-Emmons olefination of aldehyde）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.), 2010, 75(20), p.7018-7021）により、化学的に合成できることが知られている。
【００６０】
さらに、関節炎に対するキナンクム属植物抽出物およびアントフィンの効果は、動物モデルで確認することができる。関節炎の動物モデルは、いくつかの研究で確立されている：例えば、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデル（トルベッケ・ジー・ジェイ（Thorbecke G.J.）ら、マウスにおけるＩＩ型コラーゲン関節炎誘発時の内因性腫瘍壊死因子αおよび形質転換成長因子βの関与、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc Natl Acad Sci USA）89, (1992)7375-7379）；アジュバント誘発性関節炎モデル（バーンズ・ディー・エイ（Barnes D.A.）ら、ヒトＲＡＮＴＥＳに対するポリクローナル抗体はルイス・ラット・アジュバント誘発性関節炎モデルの疾患を改善する（Polyclonal antibody directed against human RANTES ameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（J Clin Invest）101, (1998)2910-2919）；またはカラギーナン誘発性足浮腫モデル（メイゾン・イー（Mazzon E.）ら、カラギーナン誘発性急性炎症に対する腫瘍壊死因子−α受容体１遺伝子欠失の効果：エタネルセプトとの比較（Effect of tumor necrosis factor-α receptor 1 genetic deletion on carrageenan-induced acute inflammation: a comparison with etanercept）、ブリティッシュ・ソサイエティ・フォー・イムノロジー（British Society for Immunology）、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー（Clinical and Experimental Immunology）, 153(2008):136-149）である。関節炎の治療に対する薬剤の効力を評価するために、動物モデルが汎用され、かつ、容認されている。本発明者らは、従来技術により確立された動物モデルに対するアントフィンおよびキナンクム属植物抽出物の効力を評価して、かつ、細胞のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６阻害に対するアントフィンおよびキナンクム属植物抽出物の効果を試験して、アントフィンおよびキナンクム属植物抽出物が関節炎治療用の有効成分として強力であることを確認した。
【００６１】
本発明のある態様にかかる関節炎は、関節の炎症を伴う疾患を意味し、腱、靭帯、骨、軟骨または筋肉組織に生じる炎症の症状を含むものである。ここで、関節炎は、感染性関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身性エリテマトーデス、変形性関節症、線維筋痛症、強皮症、脊椎関節症、痛風、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、乾癬性関節炎、滑液包炎または腱炎を含むことができる。ここで、対象者は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウサギ、ウシ、サル、ゴリラ、チンパンジー、ヒトなどを含むことができる。
【００６２】
ここで、薬学的に許容される担体は、有効成分の活性を変化させない薬学的に許容される添加物、例えば、賦形剤、抗酸化剤、乳化剤、分散剤、防腐剤、香料、顔料、緩衝剤、溶媒、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを意味する。本発明のある態様にかかる医薬組成物は、投与用および保存用の剤形、例えば、ペレット剤、カプセル剤、フィルムコーティング錠、発泡剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、シロップ剤などに調剤することができる。また、本発明のある態様における医薬組成物は、単独で投与することもできるし、他の薬剤と共に投与することもできる。
【００６３】
本発明の別の態様は、また、栄養補助食品の有効成分としてアントフィンまたはキナンクム属植物抽出物を含む栄養補助食品を提供する。ここで、栄養補助食品は、そのまま飲食することができる。あるいは、この栄養補助食品は、食料品、例えば、飲料、スープなどに添加することができる。
【００６４】
ここで、栄養補助食品は、必要に応じて、食品添加物、例えば、抗酸化剤、保存料、膨張剤、香料、食用色素、増粘剤、固化剤、分散剤、賦形剤などを含むことができる。ここで、栄養補助食品は、顆粒剤、ペレット剤、錠剤、カプセル剤または散剤に調剤することもできるし、食用および保存用の飲料またはシロップに添加することもできる。
【実施例】
【００６５】
［実施例１］アントフィンの単離
キナンクム・ハンコキアヌムの粉末１ｋｇを容量２２Ｌの三ツ口フラスコに加えた。次いで、９５％エタノール水溶液１０Ｌを加えた。このフラスコを加熱還流し、その温度で２時間保持した。濾液を採取して、次の工程に供した。残渣について、同じ加熱工程を１回繰り返し、濾液を採取して、先に得られた濾液と混合した。この混合物をロータリーエバポレーター（EYELA、N-1000型）で全体積の１／２０まで濃縮した。次いで、３倍体積の０．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液を加えると、粘着物質が生じた。この粘着物質をセライト(R)５４５で濾去し、透明溶液を採取した。同体積のＣＨ２Ｃｌ２を加え、この溶液を３回抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２画分を採取し、濃縮すると、粘度が高くなった。次いで、少量のシリカゲル６０（Merck）を加え、均一に混合した。次いで、この混合物を、シリカゲル６０（Merck）を詰めたカラムに加え、酢酸エチルおよびメタノール（ＥＡ：ＭｅＯＨ＝２：５）で溶離した。濾液をＣＨ２Ｃｌ２で再結晶した。淡黄色結晶４００ｍｇを得た。
【００６６】
次いで、この淡黄色結晶を１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光学で分析した（図１および図２）。
【００６７】
1H NMR(500MHz, CDCl3)δ1.83(m, 1H), δ1.96(m, 1H), δ2.29(m, 1H), δ2.50(td, 1H), δ2.54(m, 1H), δ2.95(dm, 1H), δ3.40(m, 1H), δ3.51(q, 1H), δ3.75(d, 1H), δ4.06(s, 1H), δ4.10(s, 1H), δ4.15(s, 1H), δ4.74(d, 1H), δ7.25(dd, 1H), δ7.36(s, 1H), δ7.86(d, 1H), δ7.95(d, 1H), δ7.96(s, 1H)；
13C NMR(500MHz, CDCl3)δ21.63, 31.33, 33.74, 53.88, 55.09, 55.56, 55.92, 56.06, 60.28, 103.97, 104.09, 104.75, 114.91, 123.59, 124.18, 124.29, 125.60, 126.73, 127.15, 130.22, 148.42, 149.47, 157.53；
MS(EI)(m/z)363；
([M+H]+)364.1912。
【００６８】
前記結晶は、下記式：
【００６９】
【化３】
0005902803.tif 000004
で示される分子量３６３．４５、分子式Ｃ２３Ｈ２５ＮＯ３の（−）−アントフィンであると確認された。
【００７０】
［実施例２］ＴＮＦ−α阻害に対するキナンクム属植物のエタノール抽出物の効果
キナンクム属植物のエタノール抽出物
キナンクム・ハンコキアヌムの粉末０．５ｇを９５％エタノール水溶液２５ｍＬに加えた。このエタノール混合物を室温で一晩振盪した。乾燥および濃縮した後、エタノール抽出物を得た。次いで、このエタノール抽出物を０．４％ＤＭＳＯで希釈して、１９μｇ／ｍＬ、５６μｇ／ｍＬ、１６７μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬのキナンクム・ハンコキアヌムの各エタノール抽出物を得た。これらの抽出物は、次の工程のために保存した。これらの抽出物は、０．１５％アントフィンを含むことが判明した。
【００７１】
Ｕ９３７細胞株
ヒト骨髄性白血病細胞株Ｕ９３７（Rockville, MD）をＡＴＣＣから入手した。この細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。この細胞株は、急速に増殖し続けた。分化を誘導するために、初期濃度４×１０５個／ｍＬの細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ（Sigma）を含有するＴ１５中で２４時間培養した。次いで、細胞をＰＭＡ非含有の新鮮な培地に移し、４８時間培養した。細胞は、次の工程のために、ゴム製ポリスマン（Bellco Glass, Vineland, NJ）で培地ボトルを優しく擦ることにより採取した。
【００７２】
ＴＮＦ−α阻害
活性化Ｕ９３７細胞を９６ウェルプレートに濃度１．６×１０５細胞／ウェルとなるように播種した。様々な濃度のキナンクム・ハンコキアヌムのエタノール抽出物を９６ウェルプレートに１０μＬずつ加えた。各ウェルの最終体積は、１９０μＬであった。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２で３０分間培養した。次いで、各ウェルにＰＢＳ  １０μＬ中の２μｇ／ｍＬリポ多糖類（ＬＰＳ）を加え、３７℃で４時間培養した。上澄みを解析キット（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリス、ＭＮ）で採取した。ＴＮＦ−αの量は、ＥＬＩＳＡ（ＴＮＦ−αデュオセット、Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス、ＭＮ）で解析した。細胞生存率は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、シグマ）で試験した。キナンクム・ハンコキアヌムのエタノール抽出物およびＬＰＳを加えない対照試験を行った。その結果を表１および図３に示す。ＩＣ５０は、１７μｇ／ｍＬであった。
【００７３】
【表１】
0005902803.tif 000005
【００７４】
［実施例３］ＴＮＦ−α阻害に対するアントフィンの効果
実施例２で得られた活性化Ｕ９３７細胞を９６ウェルプレートに濃度１．６×１０５細胞／ウェルとなるように播種した。実施例１で単離したアントフィンを０．４％ＤＭＳＯで１．５２ｎｇ／ｍＬ、４．５７ｎｇ／ｍＬ、１３．７ｎｇ／ｍＬおよび４０．０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、１０μＬずつプレートに加えた。各ウェルの最終容積は、１９０μＬであった。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２で３０分間培養した。次いで、各ウェルにＰＢＳ  １０μＬ中のリポ多糖類（ＬＰＳ）２μｇ／ｍＬを加え、３７℃で４時間培養した。上澄みを解析キット（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリス、ＭＮ）で採取した。ＴＮＦ−αの量は、ＥＬＩＳＡで解析し、細胞生存率は、ＭＴＴで試験した。その結果を図４に示す。ＩＣ５０は、７ｎｇ／ｍＬであった。
【００７５】
［実施例４］ＬＰＳ誘発性モデルのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６阻害に対するキナンクム属植物抽出物の効果
キナンクム属植物抽出物
キナンクム・アトラツムの粉末１．２ｋｇを５０％エタノール水溶液６．０Ｌに加え、室温で一晩振盪した。乾燥および濃縮した後、キナンクム・アトラツム抽出物１３７ｇを得た。
【００７６】
ＬＰＳ誘発性マウスモデル
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを６匹ずつグループ分けし、キナンクム・アトラツム抽出物２５０ｍｇ／ｋｇおよび担体（３０％クレモフォア・エー・エル（ＣｒＥＬ）（BASF）中の５％エタノール）を与えた。抽出物を与えず担体を与えた１つのマウスグループを対照グループとした。２時間後、マウスに１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内注射した。注射してから１．５時間後に採血した。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の血中濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）で分析した。その結果を表２および図５、６に示す。
【００７７】
【表２】
0005902803.tif 000006
【００７８】
［実施例５］ＬＰＳ誘発性モデルのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６阻害に対するキナンクム属植物抽出物の効果
キナンクム属植物抽出物
キナンクム・アトラツム（選別くず（tailings））、キナンクム・スタウントニイ、キナンクム・パニクラツムおよびキナンクム・アトラツム（選別品（erects））の各粉末１．２ｋｇを５０％エタノール水溶液６．０Ｌに加え、室温で一晩振盪した。乾燥および濃縮した後、各キナンクム属植物抽出物を得た。
【００７９】
ＬＰＳ誘発性マウスモデル
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを４匹ずつグループ分けし、各キナンクム属植物抽出物５００ｍｇ／ｋｇおよび担体（３０％ＣｒＥＬ（BASF）中の５％エタノール）を与えた。抽出物を与えず担体を与えた１つのグループを対照グループとした。２時間後、マウスに１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内注射した。注射してから１．５時間後に採血した。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の血中濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）で分析した。その結果を表３および図７、８に示す。
【００８０】
【表３】
0005902803.tif 000007
【００８１】
［実施例６］ＬＰＳ誘発性モデルのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６阻害に対するキナンクム属植物抽出物の効果
キナンクム属植物抽出物
キナンクム・ハンコキアヌムおよびキナンクム・アトラツムの各粉末５０ｇを４０％エタノール水溶液５００ｍＬに加え、１時間加熱還流した。乾燥および濃縮した後、各抽出物を濃度１５±２ｇ、固形分２５±２％で得た。
【００８２】
ＬＰＳ誘発性マウスモデル
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを５匹ずつグループ分けし、各キナンクム属植物抽出物５００ｍｇ／ｋｇおよび担体（３０％ＣｒＥＬ（BASF）中の５％エタノール）を与えた。抽出物を与えず担体を与えた１つのグループを対照グループとした。２時間後、マウスに１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内注射した。注射してから１．５時間後に採血した。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の血中濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）で分析した。その結果を表４および図９、１０に示す。
【００８３】
【表４】
0005902803.tif 000008
【００８４】
［実施例７］カラギーナン誘発性ラットモデルの後肢浮腫に対するキナンクム・アトラツム５０％エタノール抽出物の効果
ロング−エヴァン（Long-Evan）ラットを５匹ずつグループ分けした。各ラットの左後肢足首を試験開始時に後肢体積の基準として測定した。各実験グループには、キナンクム・アトラツム２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇおよび１０００ｍｇ／ｋｇを与えた。担体対照グループには、１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を与えた。陽性対照グループには、インドメタシン３ｍｇ／ｋｇを与えた。１時間後、全ラットの左後肢に１％カラギーナン−食塩水０．１ｍＬを注射した。カラギーナンを注射してから０、１、２および３時間後に、左後肢の体積をプレシスモメーター（PV-01、ディ・アール・インスツルメンツ（DR instrument）、台湾）で測定した。
【００８５】
阻害率は、下記式により算出した：
阻害率（％）＝（Ｎｔ−Ｎｖ）／Ｎｖ×１００
Ｎｔ：実験グループの左後肢体積の純変化
Ｎｖ：担体対照の左後肢体積の純変化。
【００８６】
阻害率が負の値であったので、上記投与は抗炎症効果を有することを示した。その結果を図１１に示す。
【００８７】
［実施例８］アジュバント誘発性関節炎モデルにおけるキナンクム・アトラツムの５０％エタノール抽出物の効果
各ルイスラットの足首を試験開始時に後肢体積の基準として測定した。スクアレン５０μＬに懸濁したマイコバクテリウム・ブチリクム（Mycobacterium butyricum）２０ｍｇ／ｍＬを尾の基部に近い３点に皮下注射した。注射の日から研究が終了するまで、実験グループには、１日あたりキナンクム・アトラツム１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇを与え、担体対照グループには、１日あたり１％ＣＭＣ中の５％エタノールおよび０．０２５％ツイーン（Tween）２０を与え、陽性対照グループには、１日あたりインドメタシン３ｍｇ／ｋｇを与えた。各グループの関節炎の症状を下記スコアに従って評価した：
０：肢が赤く腫れていなかった；
１：肢がわずかに赤く腫れているか、つま先の関節が１箇所赤く腫れていた；
２：肢が明らかに赤く腫れているか、つま先の関節が２箇所以上赤く腫れていた；
３：後肢が歩くように機能することができなかった；
４：足首の関節を動かすことができなかった。
【００８８】
後肢体積をプレシスモメーターで測定し、各ラットの平均体重の百分率として示した。体重測定の精度は０．１ｇ以上であった（メトラー・トルデオ（METTLER TOLDEO）、PB1501）。その結果を図１２に示す。＊はｐ＜０．０５を表し、統計学的に有意な差を示す。
【００８９】
［実験例９］アジュバント誘発性関節炎モデルの抗炎症に対するキナンクム・アトラツム抽出物の効果
各ルイスラットの足首を試験開始時に後肢体積の基準として測定した。スクアレン５０μＬに懸濁したマイコバクテリウム・ブチリクム２０ｍｇ／ｍＬを尾の基部に近い３点に皮下注射した。注射の日から研究が終了するまで、実験グループには、１日あたりキナンクム・アトラツム抽出物（実施例５で得た５０％エタノール抽出物）１６．７ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ、ならびに、キナンクム・アトラツム抽出物（９５％エタノール抽出物）５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを与え、担体対照グループには、１日あたり１％ＣＭＣ中の５％エタノールおよび０．０２５％ツイーン２０を与えた。陰性対照グループを設定した。各グループの関節炎の症状を下記スコアに従って評価した：
０：肢が赤く腫れていなかった；
１：肢がわずかに赤く腫れているか、つま先の関節が１箇所赤く腫れていた；
２：肢が明らかに赤く腫れているか、つま先の関節が２箇所以上赤く腫れていた；
３：後肢が歩くように機能することができなかった；
４：足首の関節を動かすことができなかった。
【００９０】
後肢体積をプレシスモメーターで測定し、各ラットの平均体重の百分率として示した。体重測定の精度は０．１ｇ以上であった（メトラー・トルデオ、PB1501）。その結果を図１３に示す。＊はｐ＜０．０５を表し、統計学的に有意な差を示す。
【００９１】
［実施例１０］コラーゲン誘発性関節炎モデルにおけるアントフィン投与療法の効果
胎児ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ, Chondrex）５０μｇを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ, Sigma）に乳化した。足首体積を後肢体積の基準として測定した。初回免疫の８日後に、ＩＦＡ（Sigma）に乳化したコラーゲン１００μｇを各ラットに注射して関節炎を誘発した。担体対照グループには、２１日目まで２日毎に０．５％ＣＭＣ２ｍＬ／ｋｇを腹腔内注射した。実験グループには、実施例１で単離したアントフィンを下記投与法に従って与えた：
グループ１には、２０日まで２日毎にアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した後、２１〜２３日目に１日あたりアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した；
グループ２には、２０日まで３日毎にアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した後、２１〜２３日目に１日あたりアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した；
グループ３には、２０日まで２日毎にアントフィン２ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した後、２１〜２３日目に１日あたりアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した；
グループ４には、５日間１日あたりアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した後、続く９日間投与を中止し、２１〜２３日目に１日あたりアントフィン３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した；および
陽性対照グループには、１日あたりインドメタシン３ｍｇ／ｋｇを与えた。
【００９２】
全ラットを２４日目に死亡させた。
【００９３】
各グループの罹患率を図１４に示す。体重変化を図１５に示す。これらの結果は、グループ１とグループ４の罹患率が減少し、発症が遅延したが、様々なアントフィン用量および投与法を用いた治療によって体重が大きく変化しなかったことを示した。
【００９４】
各グループの関節炎の症状は、下記スコアに従って評価した：
０：肢が赤く腫れていなかった；
１：肢がわずかに赤く腫れているか、つま先の関節が１箇所赤く腫れていた；
２：肢が明らかに赤く腫れているか、つま先の関節が２箇所以上赤く腫れていた；
３：後肢が歩くように機能することができなかった；
４：足首の関節を動かすことができなかった。
【００９５】
各ラットの後肢体積変化を図１６に示す。関節炎スコアの結果を図１７に示す。
【００９６】
本発明を実施例および好ましい態様によって説明したが、本発明は開示した態様に限定されないことを理解すべきである。むしろ、本発明は（当業者に明らかな）様々な修正や類似した変更を包含することを意図する。それゆえ、添付した特許請求の範囲は、このような修正や類似した変更をすべて含むように最も広く解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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