(57)【要約】  ペプチドを０．１％から１．０％含有する粘膜隆起剤であって、該ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、生理的ｐＨおよび／または陽イオンの存在下、水溶液中でβ構造を示す自己組織化ペプチドである粘膜隆起剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを０．１％から１．０％含有する粘膜隆起剤であって、該ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、生理的ｐＨおよび／または陽イオンの存在下、水溶液中でβ構造を示す自己組織化ペプチドである粘膜隆起剤。
【請求項２】
前記ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニンからなる配列、イソロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、およびリジンからなる配列、または、リジン、ロイシン、アスパラギン酸の及びロイシンからなる配列の繰り返し配列を有する、請求項１記載の粘膜隆起剤。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３記載のアミノ酸配列からなる、請求項１または２記載の粘膜隆起剤。
【請求項４】
さらに、薬剤を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項５】
前記薬剤が薬学的に許容され得る色素である、請求項４記載の粘膜隆起剤。
【請求項６】
前記薬剤が、ブドウ糖、白糖、精製白糖、乳糖、麦芽糖、トレハロース、デキストラン、ヨウ素、塩化リゾチーム、ジメチルイソプロピルアズレン、トレチノイントコフェリル、ポピドンヨード、アルプロスタジルアルファデクス、アニスアルコール、サリチル酸イソアミル、α，α−ジメチルフェニルエチルアルコール、バグダノール、ヘリオナール、スルファジン銀、ブクラデシンナトリウム、アルプロスタジルアルファデクス、硫酸ゲンタマイシン、塩酸テトラサイクリン、フシジン酸ナトリウム、ムピロシンカルシウム水和物および安息香酸イソアミルからなる群から選択される、請求項４記載の粘膜隆起材。
【請求項７】
粘膜と筋層の間に注入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項８】
粘膜が消化器粘膜である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項９】
粘膜切除術に用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項１０】
粘膜下層剥離術の用いられる請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項１１】
追加注入が可能である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項１２】
シリンジに充填された形態にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項１３】
創傷治癒効果を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤を含む、のある粘膜隆起剤。
【請求項１４】
瘢痕予防又は狭窄予防効果を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項１５】
止血効果を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【請求項１６】
液状の形態であり、体内ではゲル化する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粘膜隆起剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己組織化ペプチドハイドロゲルを含有することを特徴とする粘膜隆起剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管のポリープや癌等の病変部を低侵襲で切除可能な内視鏡的粘膜切除術（以下、ＥＭＲ）および内視鏡的粘膜下層剥離術（以下、ＥＳＤ）は内視鏡技術の進歩に伴い、手術の第一の選択肢となっている。【０００３】
内視鏡的手術は開腹せずに病変部を切除する方法であり、病変部を含めた粘膜下層に高張の生理食塩水や高分子ポリマーの溶液を注入し、粘膜を膨隆・拳上させ、高周波治療機器にて切除・剥離する。【０００４】
近年、手術適応が広がっているＥＳＤはＥＭＲよりも粘膜下層を広範囲に剥離するため、固有筋膜の切開による穿孔の可能性が高く、剥離が完了するまでの間は、十分な高さの粘膜下層の膨隆・拳上維持が必要となる。【０００５】
ＥＭＲまたはＥＳＤでは病変部の切除・剥離に電気メスなどの高周波治療機器を用いるが、粘膜隆起剤がその電気的な効果や操作性に悪影響を与えることは避ける必要がある。【０００６】
既存の粘膜隆起剤としては、ヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。ヒアルロン酸ナトリウムは効果的な粘膜隆起剤として、臨床でしばしば利用されているが、これらの欠点は１）生物由来製品であるため感染症の危険性がある、２）シリンジに充填されていない、点が挙げられる。【０００７】
自己組織化ペプチドは、そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己会合体を形成する特性を有する。近年、その物理的、化学的、生物学的性質から、新規マテリアルとして注目を浴びている。
自己組織化ペプチドは、電荷を帯びた親水性アミノ酸と電気的に中性な疎水性アミノ酸が交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布する構造をもち、生理的なｐＨと塩濃度においてβ構造をとる。【０００８】
親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸、およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシンを使用することができる。【０００９】
当該ペプチドの自己組織化は、以下の条件下で生じる。
（１）水溶液中でペプチド分子がβ構造を取ることで、電荷をもつ親水性アミノ酸と電気的に中性な疎水性アミノ酸がペプチド分子の２面に偏在する。
（２）β構造をとったとき、隣分子と相補的な電化分布になる。
（３）β構造をとったとき、隣分子と十分な疎水結合を形成する。
（４）1価の無機塩によりアミノ酸側鎖の電荷がスクリーニングされる。
（５）ペプチドの等電点近くで、分子が静電的に中性になる。【００１０】
上述の条件が整ったとき、以下の機序で自己組織化が進むと考えられている。
（１）交互に分布するペプチド分子の正電荷と負電荷によって分子同士が引き合って近づく。
（２）隣分子の中性アミノ酸側鎖間で疎水結合が形成される。
（３）正負の電化分布により隣分子同士の相対的な配置が整えられ、分子間の会合力が強まる。
（４）分子の集合体が徐々に伸長し、ナノファイバーを形成する【００１１】
ナノファイバーは太さ１０nm〜２０nm程の極細繊維で、網目上に集合し、巨視的にはゲル状を呈することが報告されている。【００１２】
ゲルの網目構造は、ファイバーサイズおよびポアサイズなどが天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と非常に似ており、細胞培養の足場としての利用が研究されている。【００１３】
このペプチドハイドロゲルは、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことから、細胞の生着や増殖に適している。【００１４】
自己組織化ペプチドは固相合成法による化学合成品であり動物由来の感染症などの心配がないため、近年狂牛病など、動物からのウイルスやそのほか未知の感染症への懸念が高まったことから、ヒアルロン酸ナトリウムやコラーゲンなどの代替品として、さらに注目されている。【００１５】
自己組織化ペプチドの粘膜隆起剤への応用は特許文献1に示されているが、実施例に引用されたイヌの膀胱粘膜における粘膜隆起実験では粘膜隆起維持効果および内視鏡下での隆起効果は報告されていない。したがって、自己組織化ペプチドの粘膜隆起剤の粘膜隆起効果を臨床応用可能なレベルにまで引き出すためには、さらなる改良が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０４１６３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、ヒトを含む大型哺乳動物において内視鏡下で消化器粘膜を臨床上、十分な時間に渡り隆起・膨隆維持でき、かつウイルスなどの感染性の懸念がない自己組織化ペプチド粘膜隆起剤とその使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、細胞培養の足場として利用されている自己組織化ペプチドハイドロゲルを粘膜隆起に適用することにより、既存粘膜隆起剤と同等以上の粘膜隆起効果を示すことを見出し、本発明を完成した。また、特許文献１で報告されている３％濃度のペプチド水溶液を粘膜下層に注入すると、粘膜を隆起させる効果は得られるが、ペプチド溶液自体の粘性が高いため、注入が困難であった。また、３％濃度のペプチド水溶液が自己組織化して形成したゲルの硬度によって注入箇所への再注入が困難であること、電気メスなどの高周波治療機器での粘膜切除・剥離時に組織の切除を妨げる場合があること、内視鏡にゲルが付着して視野を妨げる場合があること、の課題があった。そこで、鋭意研究の結果、ペプチド水溶液の濃度を低濃度、具体的には１％濃度以下にすると３％濃度のペプチド水溶液にみられた課題を解消したうえで十分な粘膜隆起維持効果が認められ、切除・剥離効果が得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１９】
すなわち、本発明は、下記のとおりである。
［１］ペプチドを０．１％から１．０％含有する粘膜隆起剤であって、該ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、生理的ｐＨおよび／または陽イオンの存在下、水溶液中でβ構造を示す自己組織化ペプチドである粘膜隆起剤、
［２］前記ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニンからなる配列、イソロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、およびリジンからなる配列、または、リジン、ロイシン、アスパラギン酸の及びロイシンからなる配列の繰り返し配列を有する、［１］記載の粘膜隆起剤、
［３］前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３記載のアミノ酸配列からなる、［１］または［２］記載の粘膜隆起剤、
［４］さらに、薬剤を含有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［５］前記薬剤が薬学的に許容され得る色素である、［４］記載の粘膜隆起剤、
［６］前記薬剤が、ブドウ糖、白糖、精製白糖、乳糖、麦芽糖、トレハロース、デキストラン、ヨウ素、塩化リゾチーム、ジメチルイソプロピルアズレン、トレチノイントコフェリル、ポピドンヨード、アルプロスタジルアルファデクス、アニスアルコール、サリチル酸イソアミル、α，α−ジメチルフェニルエチルアルコール、バグダノール、ヘリオナール、スルファジン銀、ブクラデシンナトリウム、アルプロスタジルアルファデクス、硫酸ゲンタマイシン、塩酸テトラサイクリン、フシジン酸ナトリウム、ムピロシンカルシウム水和物および安息香酸イソアミルからなる群から選択される、［４］記載の粘膜隆起材、
［７］粘膜と筋層の間に注入される、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［８］粘膜が消化器粘膜である、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［９］粘膜切除術に用いられる、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［１０］粘膜下層剥離術の用いられる［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［１１］追加注入が可能である、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［１２］シリンジに充填された形態にある、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［１３］創傷治癒効果を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤。
［１４］瘢痕予防又は狭窄予防効果を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤、
［１５］止血効果を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤。
なお、本発明で％は、重量／容量（w/v）を意味する。
［１６］液状の形態であり、体内ではゲル化する、［１］〜［６］のいずれかに記載の粘膜隆起剤。【００２０】
前記色素は、薬学的に許容され得る色素であり、好ましくは、インジゴカルミン、ブリリアントブルーＦＣＦ、ファストグリーンＦＣＦ、インドシアニングリーンから選択される。【００２１】
本発明は、上記の粘膜隆起剤を含む、ＥＭＲまたはＥＳＤにおける切除・剥離部分を隆起させるための粘膜下層への注入剤、または、粘膜下層に液体を注入することによって隆起された粘膜組織部分を切除する方法にも関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の組織閉塞剤は、その主要成分である自己組織化ペプチドが粘膜隆起剤としての役割以外にも、遊走細胞の足場になることができ、術後により高い治癒効果をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ウサギ胃粘膜における１％ペプチド水溶液、０．５％ペプチド水溶液、０．２５％ペプチド水溶液、ムコアップの粘膜隆起効果の比較（注入前）
【図２】ウサギ胃粘膜における１％ペプチド水溶液、０．５％ペプチド水溶液、０．２５％ペプチド水溶液、ムコアップの粘膜隆起効果の比較（注入直後）。(a）１％ペプチド水溶液、(b）０．５％ペプチド水溶液、(c）０．２５％ペプチド水溶液、(d）０．１％ペプチド溶液、(e）ムコアップ
【図３】ウサギ胃粘膜における１％ペプチド水溶液、０．５％ペプチド水溶液、０．２５％ペプチド水溶液、ムコアップの粘膜隆起効果の比較（１５分後）。(a）１％ペプチド水溶液、(b）０．５％ペプチド水溶液、(c）０．２５％ペプチド水溶液、(d）０．１％ペプチド溶液、(e）ムコアップ。
【図４】ミニブタ胃粘膜における０．２５％ペプチド水溶液による粘膜下層剥離術の結果。(a）初回注入前、(b）初回注入後、(c）剥離中、(d）追加注入後、(e）剥離完了後。
【図５】ミニブタ胃粘膜下層剥離術での剥離検体の病理学的切片観察。(a）○×○、(b）○×○。
【００２４】
また、本発明の粘膜隆起剤の主要成分である自己組織化ペプチドは、合成により製造することができるため、従来の生体由来材料と比べてウイルス等の感染の危険もないうえ、それ自身は生体吸収性であるため、炎症等を懸念する必要もない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の粘膜隆起剤について詳細に説明する。【００２６】
本発明の粘膜隆起剤は、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、生理的ｐＨおよび／または陽イオンの存在下、水溶液中でβ構造を示す自己組織化ペプチドを主要成分とする。
本発明において、生理的pHは、pH６からpH８、好ましくは、pH６．５からpH７．５、さらに好ましくは、pH７．３からpH７．５である。また、本発明において陽イオンとは、たとえば、５mM〜５Mのナトリウムイオンまたはカリウムイオンである。【００２７】
本発明において用いられる自己組織化ペプチドは、たとえば、以下の４つの一般式で表すことができる。
（（ＸＹ）l−（ＺＹ）m）n      （Ｉ）
（（ＹＸ）l−（ＹＺ）m）n      （II）
（（ＺＹ）l−（ＸＹ）m）n      （III）
（（ＹＺ）l−（ＹＸ）m）n      （IV）
（式（Ｉ）〜（IV）中、Ｘは酸性アミノ酸、Ｙは疎水性アミノ酸、Ｚは塩基性アミノ酸を表し、ｌ、ｍおよびｎは共に整数（ｎ×（ｌ＋ｍ）＜２００）である。）
また、そのＮ末端はアセチル化されていてもよく、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。【００２８】
ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。【００２９】
これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。またイソロイシン、グルタミン酸、イソロイシンおよびリジン（ＩＥＩＫ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドも好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＩＥＩＫ）pＩ−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。さらにリジン、ロイシン、アスパラギン酸およびロイシン（ＫＬＤＬ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドも好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＫＬＤＬ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。これらの自己組織化ペプチドは８〜２００のアミノ酸残基数で構成しうるが、なかでも８〜３２残基の自己組織化ペプチドが好ましく、さらに残基数１２〜１６の自己組織化ペプチドがより好ましい。【００３０】
本発明における自己組織化ペプチドの好ましい具体例としては、（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、（Ａｃ−（ＩＥＩＫ）３Ｉ−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：２）を有するペプチドＩＥＩＫ１３、（Ａｃ−（ＫＬＤＬ）３−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：３）を有するペプチドＫＬＤが挙げられ、ＲＡＤ１６−Ｉは、PuraMatrix（登録商標）としてその１％水溶液が、株式会社スリー・ディー・マトリックスから製品化されている。PuraMatrix（登録商標）には、１％の（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドの他、水素イオン、塩化物イオンが含まれる。【００３１】
PuraMatrix（登録商標）、ＩＥＩＫ１３およびＫＬＤは、アミノ酸１２〜１６残基で長さが約５nmのオリゴペプチドであって、その溶液は酸性ｐＨであると液状を示すが、中性ｐＨに変化させることでペプチドの自己組織化が生じ、直径１０nmほどのナノファイバーを形成し、結果としてペプチド溶液はゲル化する。【００３２】
PuraMatrix（登録商標）は親水性アミノ酸としてプラス電荷を帯びたアルギニンとマイナス電荷を帯びたアスパラギン酸、疎水性アミノ酸としてアラニンの残基が交互に繰り返すアミノ酸配列を有する両親媒性ペプチドであり、ＩＥＩＫ１３は親水性アミノ酸としてプラス電荷を帯びたリジンとマイナス電荷を帯びたグルタミン酸、疎水性アミノ酸としてイソロイシン残基が交互に繰り返すアミノ酸配列を有する両親媒性ペプチドであり、そしてＫＬＤは親水性アミノ酸としてプラス電荷を帯びたリジンとマイナス電荷を帯びたアスパラギン酸、疎水性アミノ酸としてロイシンの残基が交互に繰り返すアミノ酸配列を有する両親媒性ペプチドであり、ペプチドの自己組織化はペプチドを構成するアミノ酸によるペプチド分子間の水素結合と疎水結合に起因する。【００３３】
本発明に用いる自己組織化ペプチドにおいて、平均してナノファイバーは直径１０〜２０nm、ポアサイズは５〜２００nmである。この数値範囲は天然の細胞外マトリックスであるコラーゲンとほぼ同じ大きさである。【００３４】
本発明に用いる自己組織化ペプチドの自己組織化条件には、生理的条件のｐＨおよび塩濃度があげられる。特に１価のアルカリ金属イオンの存在が重要である。つまり、生体内に多量に存在するナトリウムイオンおよびカリウムイオンがゲル化の促進に寄与する。一度ゲル化すると通常のタンパク質の変性条件、例えば高温、酸、アルカリ、タンパク質分解酵素、尿素、グアニジン塩酸塩等の変性剤を用いても、ゲルは分解しない。【００３５】
PuraMatrix（登録商標）等のこれら自己組織化ペプチドは明らかな生理活性モチーフを持たないペプチド配列であるので、本来の細胞機能が損なわれる心配がない。生理活性モチーフは、転写など多くの細胞内現象の制御に関与しており、生理活性モチーフが存在すると、そのモチーフを認識する酵素により細胞質内や細胞表面の蛋白質はリン酸化される。ペプチド粘膜隆起剤に生理活性モチーフが存在すると、各種機能蛋白質の転写活性が活性化もしくは抑制化される可能性がある。生理活性モチーフを持たないPuraMatrix（登録商標）等の自己組織化ペプチドではこうした心配がない。【００３６】
本発明に用いる自己組織化ペプチドは化学合成により製造されることから、動物由来細胞外マトリックスに起因する未知成分を含まない。この性質はＢＳＥを始めとする感染の恐れがなく、医療用としても高い安全性を有することを示す。【００３７】
天然アミノ酸からなる自己組織化ペプチドは生体適合性および生体内分解性も良好なことから、例えばマウスの心筋にPuraMatrix（登録商標）を注入すると、注入したPuraMatrix（登録商標）に細胞が浸潤し、正常組織が形成されることが報告されている。分解時間は注入場所等の条件によって異なるが、注入後およそ２〜８週間でファイバーが分解され、排出される。【００３８】
本発明の粘膜隆起剤は、糖を添加することによって粘膜隆起効果を低下させずに溶液の浸透圧を低張から等張に改善可能で、より生体安全性を高めることができる。【００３９】
本発明の粘膜隆起剤の形態としては、粉末、溶液、ゲルなどがあげられる。自己組織化ペプチドは、溶液のｐＨと塩濃度の変化によりゲル化するため、適用時に生体と接触させることによりゲル化する液剤として流通させることができる。【００４０】
臨床使用における態様としては、自己組織化ペプチドなどの成分を含む薬液がシリンダー付きのシリンジやピペットに前もって充填されている（プレフィルドシリンジ形態など）、もしくはシリンジやピペットチップの開口部から成分を補給する手段（吸引具やバルブ）によってシリンジやピペットチップに薬液を供給し、放出部から患部へ適用する方法がある。シリンジ、ピペットは２つ以上から構成される場合もある。【００４１】
以下、実施例によって、本発明の粘膜隆起材をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
ウサギ胃粘膜下注入による胃粘膜下層隆起効果
ウサギ生存したで胃粘膜下に０．２５％ペプチド水溶液、０．５％ペプチド水溶液、１．０％ペプチド水溶液、ムコアップ（生化学工業株式会社）による粘膜隆起効果の評価を行った。【００４３】
＜材料＞
・ペプチド水溶液
１．０．２５％ペプチド水溶液（ペプチド配列：Ac-(RADA)4-NH2、CPC Scientific, Inc社製；濃度：重量／体積）
２．０．５％ペプチド水溶液（ペプチド配列：Ac-(RADA)4-NH2、CPC Scientific, Inc社製；濃度：重量／体積）
３．１．０％ペプチド水溶液（ペプチド配列：Ac-(RADA)4-NH2、CPC Scientific, Inc社製；濃度：重量／体積）
４．ムコアップ（生化学工業株式会社、承認番号: 21800BZZ1012400）
・動物
日本白色種ウサギ（３．０−４．０kg、ジャパンホワイト、コンベンショナル、株式会社フナバシファーム社より購入）。室温２５℃、湿度６５％、照明時間１２時間（７：００−１９：００）で制御された飼育室内で飼育用ペレット（ＪＡ東日くみあい飼料株式会社）を給餌し、給水ボトルの自由摂水にて飼育した。絶食は試験当日の朝のみとし、給水は自由とした。【００４４】
＜方法＞
・ウサギは、セクラタール２％注射液（１００mL中にキシラジンとして２．０ｇ含有、バイエル社製）を皮下内投与後（３mg／kg）、ケタミン（１mL中にケタミンとして５０mg含有、富士ケミカル工業株式会社製）を静脈内投与（１０mg／kg）することで麻酔した。
・ウサギは正中切開により開腹した。胃体部をメスにて切開し、胃粘膜を露出させた。
・胃粘膜下に２３Ｇ注射針（テルモ社製）にてペプチド水溶液０．５mLを注入した。
・ペプチド水溶液またはムコアップ注入直後および１５分後にノギスにより肉眼的に粘膜隆起高を測定した。【００４５】
＜結果＞
ウサギ胃粘膜下層への投与前（図１）、投与直後（図２）、投与１５分後（図３）、投与３０分後において、本実施例のペプチド水溶液またはムコアップによる粘膜隆起効果の例を表１に示す。投与１５分後の粘膜隆起高が５０％以上維持されている場合、粘膜隆起材としての効果があるものと評価した。１％ペプチド水溶液、０．５％ペプチド水溶液、０．２５％ペプチド水溶液、ムコアップにおいて粘膜隆起高の維持効果が認められた。
また、参考として、ウサギ腹皮下に本実施例のペプチド水溶液、ムコアップ、又は生理食塩水を投与し、投与前（図４）、投与直後（図５）、投与１５分後、ならびに投与３０分後（図６）の腹皮膚の隆起効果を評価した例を表２に示す。投与後１５分後、ならびに投与３０分後においてペプチド水溶液がムコアップと同等の隆起効果を有し、ペプチド水溶液の物理的強度がムコアップと同等であることを確認した。【００４６】
【表１】
2013133413.tif 000002
【表２】
2013133413.tif 000003
【実施例２】
【００４７】
ミニブタ胃粘膜下注入による胃粘膜下層隆起効果
内視鏡的ミニブタ胃粘膜下層剥離術における胃粘膜下層隆起効果を０．２５％ペプチド水溶液にて評価した。【００４８】
＜材料＞
・ペプチド水溶液
１．０．２５％ペプチド水溶液（ペプチド配列：Ac-(RADA)4-NH2、CPC Scientific, Inc社製）
・動物
２０〜２１カ月齢の体重２０〜４０kgの系統NIBSのミニブタ（日生研株式会社）。
動物入手時に全例の体重測定（電子天秤：DUE600ST/ID3S-A、メトラー・トレド株式会社）、視診、触診等による観察を行い、異常の認められない動物を飼育室へ搬入した。その後、７日間の検疫期間を設け、さらにその後１１日間の馴化期間を設けた。この間に体重測定（電子天秤：DUE600ST/ID3S-A、メトラー・トレド株式会社）を４回、摂餌量測定（電子天秤：PB1501、PB3002-S/FACTのいずれかを使用、メトラー・トレド株式会社）を１日１回及び一般状態の観察を１日１回行って、検疫及び馴化とした。設定温度：２３℃（許容範囲：２０〜２８℃）、設定湿度：５５％（許容範囲：３０〜８０％）、明暗各１２時間（照明：午前６時〜午後６時）、換気回数１０回／時（フィルターを通した新鮮な空気）に維持された飼育室で動物を飼育した。検疫・馴化期間中及び測定期間中ともステンレス製ケージ（W：590×D：840×H：740mmまたはW：630×D：1130×H：710mm）を用いて個別飼育した。製造後５ヵ月以内の固型飼料（NS、日生研株式会社）を給餌器を用いて1日５００g±５ｇ(１００g当たり３２１kcal、１日当たり１６０５kcal、電子天秤：PB3002-S/FACT，PB1501のいずれかを使用)を午前中に与えた。ただし、内視鏡的粘膜下層剥離術処置の作業性を良くするため、処置日の３日前及び２日前（処置当日を０日とする）は経腸栄養剤（エレンタール、味の素ファルマ株式会社）を同カロリー分（給餌量：６２８g±１０g）給餌し、処置前日からは給餌しないこととした。使用した固型飼料（NS）と同一ロットの分析結果は、日生研株式会社及び株式会社静環検査センターで実施した成績を入手し、分析結果が試験施設で定めた基準値の範囲内であることを確認した。水道水を飲料水として自動給水装置を用いて自由に摂取させた。飲料水の水質検査結果は、ほぼ６ヵ月毎に株式会社東洋検査センターで実施した成績を入手し、試験結果が試験施設で定めた基準値の範囲内であることを確認した。【００４９】
＜方法＞
・ミニブタはアトロピン硫酸塩０．０５mg/kgおよびケタミン塩酸塩１５mg/kgの頸背部筋肉内投与による導入麻酔後、吸入麻酔機（SAFER100、株式会社アネス）を用いてＮ２Ｏ：Ｏ２＝１：１の混合ガス＋０．５〜１．５％イソフルランの条件下で麻酔を維持し、前大静脈洞にカテーテル［メディカットLCV-UKキット、日本シャーウッド株式会社、筒内をヘパリン加生理食塩液（約１０unit/mL）で満たしたもの］を挿入、頸部に縫合固定した。カテーテルを背部に廻し、粘着性布伸縮包帯で全体を体に固定し、さらに伸縮ネット包帯で保護した。
・内視鏡用器具 （オリンパス社製）を経口的に胃に挿入した。
・鉗子口より散布チューブ（オリンパス社製）を挿入した。
・胃粘膜下層に投与検体を５mLのペプチド水溶液を局注し粘膜面を膨隆させ、電気メスを用いて、膨隆した粘膜下層を剥離した。
・粘膜下層剥離中に５mLのペプチド水溶液を追加局注した。
・剥離完了後、切除した粘膜組織をホルマリン固定し、ヘマトキシリン・エオシン染色による病理学的組織評価を行った。【００５０】
＜結果＞
図４において、本実施例の内視鏡的胃粘膜下層剥離術におけるペプチド水溶液の粘膜隆起効果の例を示す。表３に示したように、０．２５％ペプチド水溶液において胃粘膜下層剥離術を実施するのに十分な粘膜隆起効果が確認された。また切除された胃粘膜検体の病理学組織切片観察よりペプチド水溶液が固有筋層と粘膜の間に注入され、粘膜下層が剥離されたことが確認された（図５）。【００５１】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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