(57)【要約】  【課題】  本発明は、歯科用インプラントの移植後において、インプラント周囲の機能的な歯周組織形成を可能とするインプラントを提供することを課題とする。  【解決手段】  本発明の歯科用インプラントは、歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊が、インプラントの表面に配置されており、細胞塊が配置されるインプラントの表面が、インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面の全体又は一部であることを特徴とする。
2013115128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントであって、
ここで、歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊が、前記インプラントの表面に配置されており、
前記細胞塊が配置される前記インプラントの表面は、前記インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面の全体又は一部である
ことを特徴とする歯科用インプラント。
【請求項２】
請求項１に記載のインプラントであって、
前記歯胚組織由来の細胞塊が、歯胚間葉組織由来または歯小嚢組織由来の細胞塊であることを特徴とするインプラント。
【請求項３】
請求項１に記載のインプラントであって、
前記細胞塊が歯胚組織由来であって、前記歯胚組織が、帽状期、鐘状前期、および、鐘状後期からなる群より選択されるいずれか１つの発生段階にあることを特徴とするインプラント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のインプラントであって、
インプラント移植後に矯正可能であることを特徴とするインプラント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のインプラントであって、
前記形成される歯周組織が、
（ｉ）機能的なセメント質および機能的な歯根膜を有する、および
（ｉｉ）機能的な神経線維を有する
のうちの少なくとも一方の特徴を有するインプラント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のインプラントであって、
前記インプラントは、インプラントの表面全体またはその一部に、表面コーティング剤のコーティング層をさらに含み、前記細胞塊が前記コーティング層の表面上に配置されていることを特徴とするインプラント。
【請求項７】
請求項６に記載のインプラントであって、
前記表面コーティング剤が、ハイドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、および、コラーゲンからなる群より選択されることを特徴とするインプラント。
【請求項８】
機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法であって、
前記インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれるインプラント表面の全体またはその一部に、歯胚組織由来又は歯根膜組織由来の細胞塊を配置する工程を含むことを特徴とするインプラントの製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載のインプラントの製造方法であって、
前記歯胚組織由来の細胞塊が、歯胚間葉組織由来または歯小嚢組織由来の細胞塊であることを特徴とするインプラントの製造方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のインプラントの製造方法であって、
前記細胞塊が歯胚組織由来であって、前記歯胚組織が、帽状期、鐘状前期、および、鐘状後期からなる群より選択されるいずれか１つの発生段階にあることを特徴とするインプラントの製造方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のインプラントの製造方法であって、
前記インプラント移植後に、前記インプラントが矯正可能であることを特徴とするインプラントの製造方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のインプラントの製造方法であって、
前記形成される歯周組織が、
（ｉ）機能的なセメント質および機能的な歯根膜を有する、および
（ｉｉ）機能的な神経神経線維を有する
のうちの少なくとも一方の特徴を有するインプラントの製造方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２に記載のインプラントの製造方法であって、
前記細胞塊を配置する工程の前に、インプラントの表面全体またはその一部であって、インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面上に、表面コーティング剤のコーティング層を形成する工程をさらに含み、
前記細胞塊が前記コーティング層の表面上に配置されていることを特徴とするインプラントの製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のインプラントの製造方法であって、
前記表面コーティング剤が、ハイドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、および、コラーゲンからなる群より選択されることを特徴とするインプラントの製造方法。
【請求項１５】
歯を欠損した哺乳動物へのインプラントの移植方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインプラントを、前記歯を欠損した部位に移植する工程を含むことを特徴とするインプラントの移植方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のインプラントの移植方法であって、前記動物が非ヒト哺乳動物であることを特徴とするインプラントの移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯科用インプラントおよびその製造方法に関する。より具体的には、機能的な歯周組織の形成を可能とする歯科用インプラントおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虫歯や歯周病により喪失した歯の機能を再び獲得するために種々の治療手段が知られている。例えば、金属やセラミックス等の人工材料により作製される義歯を歯根に埋める方法が知られている。また、例えば、完全に歯根まで喪失した場合には、健康な歯にブリッジをかけつつ義歯を置く方法が知られている。
さらに近年、この歯科置換医療の先端的治療法の一つとして、口腔インプラント治療が実施されている。口腔インプラント治療とは、喪失歯部位の顎骨にチタン等の人工歯根を植立する手段である。【０００３】
しかし、天然歯の歯根と、歯科用インプラント（人工歯根）には大きな違いが存在する。それは、天然歯の歯根は歯周組織の一部である歯根膜で被われていているのに対し、歯科インプラントの移植部位には、通常、歯根膜を有していないことである。
天然歯の周囲には、歯根側のセメント質と外側の歯槽骨を繋ぐ線維状の歯根膜組織が存在する。セメント質は、歯根面の保護と歯根膜を歯根面に付着させる機能を有している。また、歯根膜は、大きく分けて、１）咬合力の緩衝作用、２）歯の移動能（歯科矯正治療などに用いられるメカニクス）、および、３）咬合および矯正などの侵害刺激（痛み刺激等）を中枢神経系へ伝える神経伝達機能の３つの機能を有することが知られている。このうち、特に歯根膜は、歯の咬合力を緩衝するために、歯根の長軸方向に対して垂直方向に走行する繊維を有しており、この歯根膜組織における線維の走行が、歯根膜の機能発現のために必要不可欠な構成であることが知られている。【０００４】
しかしながら、歯科用インプラントを移植した場合、インプラント移植部位に天然歯の周囲に存在するような機能的な歯周組織を形成することができない。そのため、歯科インプラントの移植部位は、長期間の使用における咬合力により、それらを支える歯槽骨の吸収を引き起し、使用に耐えることができなくなるという問題点を有していた。
このように、歯科用インプラントを移植した際にも、天然歯と同様の歯周組織を形成可能な技術が長い間望まれていた。【０００５】
これまで、移植後のインプラント周囲に歯周組織を形成させるために、歯周組織由来の培養細胞を用いることが検討されてきている。
<非特許文献１>
本文献は、ラット歯根膜から採取した前駆細胞由来の培養細胞の利用について開示している。本文献は、ＳＬＡ処理したインプラントへ、培養細胞をマトリゲルとともにコーティングすることを開示している。また、本文献は、このインプラントを、ラットの歯牙欠損部に移植した場合に、歯周組織が形成されたことについて言及している。
しかし、本文献においてインプラントの周囲に形成された歯根膜の走行は、インプラントの長軸方向と平行であり、天然歯根膜と相違するものである。歯根膜の走行は、歯の咬合力を支えるのに重要な意味を持つため、このような歯根膜を有する歯周組織は、咬合力を支える機能を期待することができない。【０００６】
<非特許文献２>
本文献には、ＥＭＤ（エムドゲイン）処理したチタンインプラントを顎骨に移植し、同時に歯根膜から採取したＰＤＬ細胞を移植部に注入する方法が開示されている。この方法は、インプラント周囲の歯周組織の形成を図るために、エナメルマトリックスタンパクを主成分として薬剤を併用するものである。そして、本文献は、上皮組織の混入していない歯槽骨と結合した組織の形成について言及している。しかし、形成された歯周組織中に歯周組織の１つであるセメント質の構造は認められていない。また、歯周組織中の歯根膜の走行も確認されていない。【０００７】
このように、現在まで、機能的な歯周組織を形成可能な歯科用インプラントについては報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｉｎ  Ｙ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．  ２０１１  Ｆｅｂ；９０（２）：２５１−６．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｄｅｃ  １３．
【非特許文献２】Ｃｒａｉｇ  ＲＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．  ２００６；３２（５）：２２８−３６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、歯科用インプラントの移植後において、インプラント周囲に機能的な歯周組織形成を可能とするインプラントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、歯科用インプラントの表面上に歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊を配置させることで、インプラント移植後のインプラントの周囲に機能的な歯周組織を形成させることができることを見出した。
すなわち、本発明は、機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントであって、ここで、歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊が、前記インプラントの表面に配置されており、前記細胞塊が配置される前記インプラントの表面は、前記インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面の全体又は一部であることを特徴とする歯科用インプラントに関する。【００１１】
ここで、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記歯胚組織由来の細胞塊が、歯胚間葉組織由来または歯小嚢組織由来の細胞塊であることを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記細胞塊が歯胚組織由来であって、前記歯胚組織が、帽状期、鐘状前期、および、鐘状後期からなる群より選択されるいずれか１つの発生段階にあることを特徴とする。【００１２】
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記インプラントがインプラント移植後に矯正可能であることを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記形成される歯周組織が、（ｉ）機能的なセメント質および機能的な歯根膜を有する、および、（ｉｉ）機能的な神経線維を有する、のうちの少なくとも一方の特徴を有することを特徴とする。【００１３】
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記インプラントは、インプラントの表面全体またはその一部に、表面コーティング剤のコーティング層をさらに含み、前記細胞塊が前記コーティング層の表面上に配置されていることを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記表面コーティング剤が、ハイドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、および、コラーゲンからなる群より選択されることを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記インプラントは、歯槽骨の再生を促進することができることを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントの一実施態様においては、前記インプラントは、歯槽骨の再生能を改善することができることを特徴とする。
なお、以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明の歯科用インプラントであることはいうまでもない。【００１４】
また、本発明の別の態様は、機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法であって、前記インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれるインプラント表面の全体またはその一部に、歯胚組織由来又は歯根膜組織由来の細胞塊を配置する工程を含むことを特徴とするインプラントの製造方法に関する。
ここで、本発明の機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法の一実施態様においては、前記歯胚組織由来の細胞塊が、歯胚間葉組織由来または歯小嚢組織由来の細胞塊であることを特徴とする。【００１５】
また、本発明の機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法の一実施態様においては、前記細胞塊が歯胚組織由来であって、前記歯胚組織が、帽状期、鐘状前期、および、鐘状後期からなる群より選択されるいずれか１つの発生段階にあることを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法の一実施態様においては、インプラント移植後に、前記インプラントが矯正可能であることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法の一実施態様においては、前記形成される歯周組織が、（ｉ）機能的なセメント質および機能的な歯根膜を有する、および、（ｉｉ）機能的な神経線維を有する、のうちの少なくとも一方の特徴を有することを特徴とする。
また、本発明の機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法の一実施態様においては、前記細胞塊を配置する工程の前に、インプラントの表面全体またはその一部であって、インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面上に、表面コーティング剤のコーティング層を形成する工程をさらに含み、前記細胞塊が前記コーティング層の表面上に配置されていることを特徴とする。【００１７】
また、本発明の機能的な歯周組織を形成可能とする歯科用インプラントの製造方法の一実施態様においては、前記表面コーティング剤が、ハイドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、および、コラーゲンからなる群より選択されることを特徴とする。
なお、以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明の歯科用インプラントの製造方法であることはいうまでもない。【００１８】
また、本発明の別の態様は、歯を欠損した哺乳動物へのインプラントの移植方法であって、上記インプラントを、前記歯を欠損した部位に移植する工程を含むことを特徴とするインプラントの移植方法に関する。
また、本発明の歯を欠損した哺乳動物へのインプラントの移植方法の一実施態様においては、前記動物が非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の歯科用インプラントによれば、インプラント移植後において、インプラント周囲に機能的な歯周組織を形成させることができる。
なお、本発明の歯科用インプラントによれば、インプラント移植後においてインプラント周囲に機能的な歯周組織を形成させることができるのみならず、インプラント移植部位周辺の歯槽骨の再生を促進することができる。また、本発明の歯科用インプラントによれば、インプラント移植部位周辺の歯槽骨の再生能も改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ（上段）は、胎齢１８日のＣ５７／ＢＬ／６マウスより摘出した歯胚、アダルトマウス由来の天然歯の画像を示す。図１Ｂ（下段）は、胎齢１８日のＣ５７／ＢＬ／６マウス由来の歯胚より分離した歯小嚢組織、アダルトマウス由来天然歯より分離した歯根膜組織の画像を示す。
【図２】図２は、歯根膜除去モデルに対して歯小嚢組織を移植した際の、移植後２１日目の歯周組織におけるＨＥ染色像を示す。ＨＥ染色像は、顎骨の前頭断切片を染色したものであり、切歯方向から後頭部方向へ見た像である。図２Ａは、歯小嚢組織を移植しなかった対照区のＨＥ染色像を示し、図２Ｂは、歯小嚢組織を移植した区のＨＥ染色像を示す。なお、図中において、アスタリスク（＊）はアンキローシス形成部位を示し、Ｄは象牙質を示し、ＡＢは歯槽骨を示し、Ｃはセメント質を示し、ＰＤＬは歯根膜を示す。
【図３】図３は、本発明の一実施の形態である、ハイドロキシアパタイト（ＨＡともいう）のコーティング層を有するインプラントの当該コーティング層の上に、歯小嚢組織を貼りつけたインプラント（歯小嚢付与ＨＡインプラント）の移植モデルの概略図を示す。図３Ａは、天然歯列を示し、図３Ｂは第一臼歯の抜歯および歯肉治療を示し、図３Ｃは移植窩の作製を示し、図３Ｄは歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植を示す。
【図４】図４Ａは、本発明の一実施の形態である、歯小嚢組織を巻き付けたＨＡインプラント（歯小嚢付与ＨＡインプラント）の実体像（左中図）、および、それらのＧＦＰ蛍光像（右中図は側面から撮影した画像を示し、右図は底面から撮影した画像を示す）を示す。また、歯小嚢組織を巻き付ける前のハイドロキシアパタイトのコーティング層を有するインプラント（ＨＡインプラント）の実体像を示す（左図）。図４Ｂは、ＨＡインプラントおよび歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植直後（左図）と、移植後２１日目のＣＴ画像を示す（左中図、右中図、右図）。矢印は歯根膜腔の形成を示す。
【図５】図５は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植後の歯周組織（下段）、天然歯の歯周組織（上段）、および、ＨＡインプラント移植後の周囲の組織（中断）のＨＥ染色像を示す。ｉｍｐはインプラントを示す。
【図６】図６は、本発明の一実施の形態である、ＧＦＰマウス由来の歯小嚢組織を付与したＨＡインプラントを口腔内に移植し、移植後２１日目におけるインプラント周囲の実体像、ＧＦＰ蛍光像、および、実体像とＧＦＰ蛍光像との重ね合わせた図を示す（上段の画像は舌側の側面より撮影した画像を示し、下段の画像は上顎側（上方）より撮影した画像を示す）。矢印はインプラントを示す。
【図７】図７は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した際に形成された歯根膜のアザン染色像（右図）、および、天然歯歯根膜のアザン染色像（左図）を示す。
【図８】図８は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した際に形成された歯周組織（下段）、および天然歯の歯周組織（上段）を、走査型電子顕微鏡を用いて撮影した画像を示す。
【図９】図９は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した際に形成された歯周組織を、透過型電子顕微鏡を用いて撮影した画像を示す。
【図１０】図１０は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した際に形成された歯周組織における、チタン（Ｔｉ）、カルシウム（Ｃａ）、またはリン（Ｐ）の元素の分布をＸ線マイクロアナライザーを用いて解析した画像を示す（図１０中の上段の画像）。図１０中下段の画像は、各元素分布を解析した画像（上段の画像）に対応する実体像を示す画像である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した際に形成された歯周組織における、チタン（Ｔｉ）、カルシウム（Ｃａ）、またはリン（Ｐ）の元素の分布をＸ線マイクロアナライザーを用いて解析した画像、および当該３元素の分布の画像を重ね合わせた画像を示す。
【図１２】図１２は、インプラント移植後に形成された歯根膜組織における神経線維解析に用いたインプラント移植モデルにおける、切歯と、臼歯と、インプラントとの位置関係を示した模式図を示す。
【図１３】図１３Ａは、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント、天然歯、ＨＡインプラントに矯正力を加えた試験において、矯正前および矯正後の画像を重ねた像を示す。図１３Ｂは、矯正力をかけた際の、天然歯、移植後のＨＡインプラント、および、移植後の歯小嚢付与ＨＡインプラントの移動距離を表わすグラフを示す。
【図１４】図１４は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント、天然歯、および、ＨＡインプラントに矯正力を加えた後、６日目の圧迫側における骨吸収マーカー（ＣＳＦ−１）および牽引側における骨形成マーカー（Ｏｃｎ）の発現をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより解析した切片の画像を示す。図中、矢印はＣＳＦ−１の発現部位を示し、矢頭はＯｃｎの発現部位を示す。
【図１５】図１５は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント、天然歯、および、ＨＡインプラントの周囲の歯根膜領域において、末梢神経マーカーであるＮｅｕｒｏ  Ｆｉｌａｍｅｎｔの発現を観察した際の画像（位相差像、蛍光像、および位相差像と蛍光像とを重ね合わせた画像）を示す。
【図１６】図１６は、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント、天然歯、および、ＨＡインプラントの周囲の歯根膜に対し、矯正力により侵害刺激を加え、その２時間後に三叉神経髄路核で発現するｃ−Ｆｏｓタンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより解析した切片の画像を示す。図中、矢印はｃ−Ｆｏｓタンパク質の発現部位を示す。Ｔは、三叉神経脊髄路核を示す。
【図１７】図１７上段は、三壁性骨欠損モデルの作製工程を示す模式図である。また、図１７下段は、三壁性骨欠損モデルの実体写真、３次元構築したマイクロＣＴ画像（３次元ＣＴ画像）、および、マイクロＣＴ画像（前頭断および水平断）を示す。図１７Ａは第一臼歯の抜歯と骨の治療を示し、図１７Ｂは三壁性骨欠損の作製を示し、図１７Ｃはインプラントの移植を示す。
【図１８】図１８は、三壁性骨欠損モデルに対して本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント（下段）、または、ＨＡインプラント（中段）を移植した際の移植日（０日目）、ならびに、移植日より１４日目、２８日目、および５０日目の三壁性骨欠損モデルの歯槽骨の３次元ＣＴ画像を示す。また、図１８上段は、三壁性骨欠損モデルに対してインプラント等を移植しなかった際の三壁性骨欠損モデルの歯槽骨の３次元ＣＴ画像を示す。なお、図中、矢印は、歯槽骨が本来の高さまで再生されていることを示す。
【図１９】図１９は、三壁性骨欠損モデルに対して本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した際の、移植日（０日目）、ならびに、移植日より１４日目、２８日目、および５０日目の歯槽骨のマイクロＣＴ画像を示す（上段：矢状断、中段：水平断、下段：前頭断）。図中の矢頭は、歯根膜腔様の間隙を示す。
【図２０】図２０は、三壁性骨欠損モデルに対して、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント、または、ＨＡインプラントを移植した際の、移植日５０日目における歯槽骨の再生量の割合を示すグラフである。また、対象として、インプラントを移植しなかった三壁性骨欠損モデルにおける歯槽骨の再生量の割合を示す。なお、グラフ中１００％は、歯槽骨欠損前の状態の歯槽骨の量を示す。
【図２１】図２１は、三壁性骨欠損モデルに対して、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント（下段）、またはＨＡインプラント（中断）を移植した際の、移植日（０日目）および移植日より５０日目における歯槽骨の矢状断の切断面の画像を示す。また、対象として、歯槽骨側面が欠損していない通常の歯槽骨へＨＡインプラントを移植した（上段）際の移植日（０日目）および移植日より５０日目における歯槽骨の矢状断の切断面の画像を示す。
【図２２】図２２は、三壁性骨欠損モデルに対して、本発明の一実施の形態である歯小嚢付与ＨＡインプラント、または、ＨＡインプラントを移植した際の、移植日５０日目におけるインプラントの歯槽骨内への落ち込みの量を示すグラフである。また、対象として、歯槽骨側面が欠損していない通常の歯槽骨へＨＡインプラントを移植した際の移植日５０日目におけるインプラントの歯槽骨内への落ち込みの量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る歯科用インプラントは、機能的な歯周組織形成を可能とする歯科用インプラントであって、歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊が、インプラントの表面に配置されており、細胞塊が配置されるインプラントの表面が、インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面の全体又は一部であることを特徴とする。
【００２２】
「インプラント」とは、一般に、医療目的でヒトまたは動物に対して使用される生体内に埋め込むための器具である。本明細書においては、「インプラント」とは、特に、失われた歯に代えて顎骨に埋め込むための歯科用の人工歯のことを言う。
【００２３】
本発明に使用されるインプラントの材料としては生体為害性がなく、生体親和性を有し、咬合に耐えうる強度の高い材料であれば、従来よりインプラントの材料として用いられているものを使用できる。インプラントの材料としては、例えば、金属製、金属合金製、プラスチック材料製、セラミック製、複合材料、骨代替材料等を挙げることができる。
【００２４】
本発明において、インプラントとして使用し得る金属および金属合金としては、例えば、チタニウム、鋼鉄、鉄、合金鋼、鉄合金、チタニウム合金、ＣｏＣｒ合金、銀、銅、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等を挙げることができる。
【００２５】
本発明において、インプラントとして使用し得るプラスチック材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、テレフタル酸ポリエチレン、ポリアミド類、ポリウレタン類、ポリシロキサン類、ポリシロキサンエラストマー類、ポリエーテルエーテルケトン類、ポリスルホン類、ポリサッカライド類およびポリラクチド類等の重合体があげられる。
【００２６】
本発明において、インプラントとして使用し得るセラミック材料としては、例えば、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化チタニウム、酸化シリコン等の酸化物または窒化物、例えば、ハイドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウム、ガラスおよびガラスセラミック、好ましくは生理的条件下で溶解もしくは分解するガラスおよびガラスセラミック等があげられる。
【００２７】
本発明のインプラントに使用される材料は、生体適合性や力学的適合性の観点からは、チタンまたはチタン合金を用いることがより好ましい。また、骨代替材料としては、自家歯牙、同種個体より得られる歯牙、または、異種個体より得られる歯牙等を挙げることができる。
【００２８】
本発明に使用されるインプラントの形状や大きさは、移植先の歯牙の欠損部に合わせて、当業者が適宜設計することができる。
【００２９】
また、本発明の一実施の態様においては、歯科用インプラントは、その表面上に、表面コーティング剤のコーティング層を形成させることができる。
本明細書において「表面コーティング剤」とは、インプラントへ細胞塊を接着させる際の足場の形成に使用されるものをいう。インプラント表面に形成される表面コーティング剤のコーティング層は、インプラントへの細胞塊の接着を向上させることができる。
【００３０】
本発明に使用される表面コーティング剤としては、例えば、ハイドロキシアパタイト、α―ＴＣＰ（リン酸三カルシウム）、β―ＴＣＰ、または、コラーゲン等のゲル材料を挙げることができる。
特に、ハイドロキシアパタイトは、骨形成を促進させる生物活性を有しており、インプラント移植後のインプラント周囲におけるセメント質形成の促進や、インプラントの骨への生着を促進させることができる。このような点において、ハイドロキシアパタイトは、表面コーティング剤として使用されることが好ましい。
【００３１】
なお、本発明のインプラントの材料として、例えばハイドロキシアパタイトを使用する等、表面コーティング剤と同様の効果を有するものをインプラントの材料として使用することができる。このとき、インプラントはすでに表面コーティング剤のコーティング層と同じ層を有しているものとして、インプラント表面上に、直接、歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊を配置することができる。または、インプラントの材料とは異なる表面コーティング剤をさらにインプラント表面上にコーティングし、さらにその表面上に細胞塊を配置することもできる。
【００３２】
表面コーティング剤は、インプラントの表面全体または一部であって、インプラント移植時にレシピエントの歯槽骨に囲まれる表面上を覆うようにコーティングすることができる。また、表面コーティング剤のコーティング層は、インプラントと、インプラントへ配置する細胞塊との間に介在するように形成される。
【００３３】
インプラント移植時に、レシピエントの歯槽骨に囲まれる表面上とは、インプラントの表面上であって、インプラント移植直後にレシピエントの歯牙欠損部内へ埋もれる部分をいう。この部分は、将来、レシピエントの歯周組織と連結することになる。
【００３４】
表面コーティング剤のコーティング方法は、当業者に周知の方法により行うことができる。
例えば、ハイドロキシアパタイトをインプラントにコーティングする際には、蒸着、プラズマ溶射法等により行うことができる。表面コーティング剤の層の厚さや表面コーティング剤のコーティングの範囲は、コーティング対象のインプラントや移植先の欠損部に応じて、当業者が適宜設定することができる。本発明の一実施の態様においては、例えば、コーティング層の厚みを、１μｍ〜２μｍとすることができる。
また、上記のように表面コーティング剤のコーティング層をインプラント表面に形成させる以外に、ハイドロキシアパタイトなどの表面コーティング剤が、すでにコーティングされている市販のインプラントを使用することもできる。
【００３５】
「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成されたセメント質、歯根膜、歯槽骨、及び、歯肉から構成される組織をいう。本発明のインプラントの移植により形成される歯周組織は、特に、セメント質、歯根膜、および歯槽骨である。本発明のインプラント移植後に形成されるセメント質および歯根膜は、レシピエント側の歯槽骨や歯肉等と連結することにより、歯周組織を形成する。
【００３６】
セメント質、歯根膜、及び、歯槽骨は、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。染色方法としては、例えば、通常のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を用いることができる。組織染色を行うにあたり、当業者であれば、例えば、サンプルを４％パラフォルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）にて固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて脱灰し、パラフィン包埋し、その後、厚さ１０マイクロメートルの連続切片を作製するなどの工程を経て、ＨＥ染色を行うことができる。また、当業者であれば、上記例示以外にも、一般的な方法に従って組織染色を行い、組織学的評価を行うことが可能である。
【００３７】
本明細書において「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Ｂｕｄ  ｓｔａｇｅ）、帽状期（Ｃａｐ  ｓｔａｇｅ）から鐘状期（Ｂｅｌｌ  ｓｔａｇｅ）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。
【００３８】
本発明の一態様において、本発明に使用し得る歯胚組織としては、帽状期、鐘状期前期、鐘状期後期にある歯胚を使用することができる。これらの帽状期、鐘状期前期、鐘状期後期にある歯胚は、インプラントとともに移植された場合に、機能的な歯周組織への高い分化能を有する点において好ましい。特に、鐘状期前期にある歯胚を使用することがより好ましい。鐘状期前期にある歯胚由来の細胞塊は、セメント質の形成を伴う機能的な歯周組織の形成をより促進させることができる点において好ましい。
なお、例えば、マウスの場合、胎齢１３〜１５日が帽状期に相当し、胎齢１６〜１８日が鐘状前期に相当し、胎齢１９日〜生後が鐘状後期に相当する。
【００３９】
また、本発明に使用し得る歯胚として、細胞培養技術により人工的に形成した「再生歯胚」を用いることもできる。再生歯胚を使用する場合にも、好ましい発生段階において細胞塊を採取することができる。本発明に使用される再生歯胚は、どのような方法で作製したものであってもよいが、例えば、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法によって作製することができる。
【００４０】
再生歯胚の製造方法は、例えば、国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレット、特開２００８−２９７５６号公報、特開２００８−２０６５００号公報、特開２００８−２０００３３号公報、特開２００８−２９７５７号公報、国際公開第２０１１／０５６００７号パンフレット、国際公開第２０１１／０５６００８号パンフレットに記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００４１】
歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物の顎骨や歯周組織等から採取することができる。歯胚及び組織の採取、ならびに、歯胚からの組織の分離は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚のほか、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用の観点から、親知らずの歯胚を用いることが好ましい。
【００４２】
本明細書において、「細胞塊」とは、インプラントの表面に配置される、歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊をいう。また、細胞塊は、由来する組織の全体又はその一部であって、組織を形成している細胞間同士の機能的な結合を少なくとも部分的に維持しているものをいう。
【００４３】
本発明に使用され得る歯胚組織由来の細胞塊には、歯胚間葉組織、歯小嚢組織等が含まれる。歯胚間葉組織は、蕾状期、帽状期、または鐘状期前期の歯胚中に存在する。また、歯小嚢組織は、鐘状期前期および鐘状期後期の歯胚に存在する。また、本発明に使用される歯根膜組織は、完成歯より採取することができる。歯胚組織からの歯胚間葉組織、歯小嚢組織等の組織の分離、および、完成歯からの歯根膜組織の分離は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
【００４４】
また、細胞塊は、生体より摘出した組織を物理的に幾つかの細胞の塊へ切断して使用することもできる。このとき、細胞塊は、組織を形成していた際の細胞間同士の機能的な結合が部分的に保たれるように切断されることが好ましい。特に、切断後の細胞塊が、組織の外側および内側が区別可能に形状を保持していることがより好ましい。このように、本発明に使用される細胞塊は、組織を形成していた際の細胞間同士の機能的な結合を部分的に有していることにより、インプラントとともに移植された際に、正常な機能を有する歯周組織の形成を可能とする。なお、切り離された細胞塊の形状は、インプラントの表面上へ配置しやすい形状を有していれば特に制限されず、例えば、短冊状のように細長く切り離すことができる。このような細胞塊の切り離しは、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよい。
【００４５】
インプラント表面上へ細胞塊を配置する方法は、特に制限されない。例えば、短冊状に切り離した細胞塊を、互いの細胞塊が重ならないようにインプラント表面上へ貼り付けることができる。または、互いの細胞塊が重ならないようにインプラント表面上へ巻き付けるようにして、配置することもできる。このとき、細胞塊を貼りつけたインプラントを大気中で少し乾燥させると、接着性が向上する。また、インプラント表面上に表面コーティング剤のコーティング層を有しているときは、表面コーティング剤のコーティング層のさらに表面へ細胞塊を配置することができる。
【００４６】
本発明の一態様において、細胞塊をインプラント表面上へ配置する位置は、インプラント移植後に、レシピエントの歯槽骨に囲まれる表面上の全体または一部に配置することができる。また、インプラントがレシピエントの歯槽骨に移入される範囲まで配置されていることが好ましい。また、細胞塊において、組織の内側を形成した側面が、インプラント表面に接触するように配置されることが好ましい。このように配置することで、組織の外側を形成していた側面がレシピエントの歯槽骨と対向することになる。
なお、本明細書において、例えば、歯小嚢細胞を配置したインプラントを、歯小嚢付与インプラントという。
【００４７】
また、本発明の別の態様は、本発明に係るインプラントの製造方法で製造されたインプラントを歯牙の欠損部に移植する工程を含む、インプラントの移植方法を提供する。
本発明に係るインプラントによれば、インプラント移植後において、インプラント周囲に機能的な歯周組織を形成させることができる。
【００４８】
本発明に係る口腔内の歯の欠損部へのインプラントの移植方法においては、インプラントに配置されている歯胚組織由来または歯根膜組織由来の細胞塊において、組織の内側を形成していた側が、インプラントの表面上と接触していることが好ましい。これにより、組織の外側を形成していた側が、レシピエントの歯周組織と対向するように配置される。このように、歯胚組織由来または歯根膜由来の細胞塊を実際の天然歯の歯周組織に存在する状態に近づけることで、機能的な歯周組織の形成を促進させることができる。
【００４９】
なお、欠損部とは、抜歯等により歯肉に設けられた部分を意味し、形状に特に制限はない。本発明のインプラントを埋設可能である限り、欠損場所、目的とする歯の種類は特に限定されない。
欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（ｇｕｉｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法により骨の再生を行って骨量を増加させてもよい。インプラント対象となる欠損部位へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。
また、欠損部へのインプラントの移植の際に、インプラント表面上に張り付けた細胞塊が表面から剥がれてしまうことを防ぐために、インプラント径よりも少し大きめの径を有する欠損部を外科的に形成させることもできる。このような大きな径を有する欠損部へインプラントを移植した場合には、移植後のインプラントとレシピエントの歯槽骨との間の空間が、周囲の組織からの血液によって満たされる。
【００５０】
本発明に係るインプラントの移植方法では、移植対象を、インプラントの製造に用いた歯胚組織または歯根膜組織を摘出した動物と同種とすることが好ましく、歯胚組織または歯根膜組織を摘出した個体と同一個体とすることがさらに好ましい。動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等を含む哺乳動物を挙げることができる。非ヒト哺乳動物とすることも好ましい。
【００５１】
インプラントの移植部位は、当業者が、目視やＣＴ画像などによって形態的に容易に観察することができる。ＣＴ画像やＣＴ断面像も、当業者に公知の機器を用いることにより、容易に撮影することができる。ＣＴ撮影には、例えば、実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ  Ｒ＿ｍＣＴ（リガク）を用いることができ、例えば、９０ｋＶ，１５０ｍＡ、断層厚１０ｍｍのような条件下で行うことができる。また、当業者であれば、ＣＴ撮影後、適当な画像解析ソフトを用いて画像構築及び解析等を行うことができる。画像解析ソフトとしては、例えば、小動物用画像ファイリングソフトウェア  ｉ−  ＶＩＥＷ  タイプＲ、および高精細３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェア  Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いることができる。また、当業者であれば、上記例示以外にも、同様の機器を用いて適切な条件を設定し、同様な画像解析ソフトを利用して、ＣＴ撮影及び解析を行うことが可能である。
【００５２】
本発明のインプラントによれば、レシピエントへの移植後において、インプラント周囲に機能的な歯周組織を形成させることができる。本発明において、機能的な歯周組織とは、（ｉ）機能的なセメント質および機能的な歯根膜を有している、または、（ｉｉ）機能的な神経線維を有していることを言い、好ましくは、（ｉ）および（ｉｉ）の両方の特徴を有しているものをいう。
すなわち、機能的な歯周組織は、例えば、機能的なセメント質および機能的な歯根膜を有している否かで評価することができる。機能的なセメント質および機能的な歯根膜とは、例えば、ＨＥ染色、アザン染色等による組織学的分析をした際に、天然歯の歯周組織と同等の層構造を有しているかを確認することで評価することができる。ここで、天然歯の歯根膜は、通常、歯根の長軸方向に対して垂直方向に走る歯根膜の繊維を有している。この歯根膜は、特に、歯の咬合力を支えるのに重要な役割を担っている。従って、天然歯と同様に、インプラントの長軸方向に対して垂直に走る歯根膜の線維が形成されているかを解析することで、特に歯根膜の機能を評価することができる。歯周組織の形態の解析や歯根膜の走行の解析は、上記方法の他、例えば、走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡によりその形態を観察することも可能である。また、歯周組織における、硬組織−線維性組織−硬組織の３層構造を確認するために、例えば、Ｘ線マイクロアナライザーを用いて元素の分布を解析することにより、歯周組織の層構造を確認することができる。
別の方法としては、下記実施例４に記載するような、矯正力の負荷に対する骨リモデリングの機能を評価することができる。または、移植後のインプラントが矯正力の負荷により移動可能であるか否かを解析することで評価することができる。骨リモデリングの評価には、例えば、矯正力負荷後に骨形成マーカーおよび／または骨吸収マーカーの発現を解析することで評価できる。本発明のインプラントを移植した際に形成される歯周組織は、天然歯と同様の矯正力を加えた場合に、天然歯と比較して６８％以上の移動量を有しており、好ましくは、８０％以上の移動量を有する。
【００５３】
また、機能的な歯周組織は、例えば、機能的な神経線維を有しているか否かで評価することができる。機能的な神経線維とは、歯周組織に対する刺激等があった場合に、中枢神経系へ刺激を伝達することができる神経線維をいう。神経線維が機能的であるか否かは、例えば、下記実施例６に記載する方法のように、評価対象の歯周組織に対して矯正力負荷による刺激を加えた後、三叉神経路核におけるｃ−ｆｏｓの発現解析により評価することができる。
【００５４】
また、本発明の歯科用インプラントによれば、機能的なセメント質や歯根膜の形成のみならず、歯槽骨の再生を促進し、また、歯槽骨の再生能も改善することができる。本明細書において、「歯槽骨の再生能を改善する」とは、歯槽骨を一部欠くような移植部位において、本発明に係る歯科用インプラントを移植することにより、従来のインプラントを移植した場合またはインプラントを移植しなかった場合と比較して、歯槽骨の本来の形状により近づくように歯槽骨を再生可能とすることをいう。これにより、本発明に係る歯科用インプラントは、移植後にインプラントが歯槽骨の一部の欠損のために、次第に歯槽骨内へ落ち込んでしまう等の事態を防ぐことが可能であり、移植したインプラントの位置（例えば、高さ）や方向等を維持することを可能とする。
【００５５】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００５６】
本明細書において、数値範囲等を示すのに用いられるあらゆる数値は、特に明示がない限り、用語「約」の意味を包含するものとして解釈される。例えば、「１０倍」とは、特に明示がない限り、「約１０倍」を意味するものと理解される。
【００５７】
本明細書中に引用される文献は、それらのすべての開示が、本明細書中に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それらの先行技術文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解する。
【００５８】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００５９】
<<実施例１．歯根膜除去モデルにおける歯小嚢組織移植による歯周組織形成能の解析>>
（歯小嚢組織の調製）
本実験における歯小嚢組織は、鐘状期にある胎齢１８日のＣ５７／ＢＬ／６マウスより得た。具体的には、歯小嚢組織は、下顎第一臼歯となる歯胚より分離した。歯胚の摘出は、Ｎａｋａｏらの方法（Ｎａｋａｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００７；  ４（３）：２２７−３０．）に準じて行った。
摘出した胎齢１８日の歯胚から歯小嚢組織を摘出する方法は下記のようにして行った。歯胚をＣａ２＋およびＭｇ２＋含有ＰＢＳ（−）（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）にて２回洗浄後、１００  Ｕ／ｍｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｉ  （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｌａｋｅｗｏｏｄ，  ＮＪ）を用いて、室温で２分間の酵素処理を行った。その後、２０Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（タカラバイオ、滋賀、日本）を含む１０％  Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＣＳ；  Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）、および１００  Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００  ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （ＳＩＧＭＡ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）  を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｄ−ＭＥＭ；  ＷＡＫＯ，  大阪，  日本）中で２５Ｇ針  （ＮＮ−２５１６Ｒ、テルモ、東京、日本）にて、物理的に組織を分離した。マウス胎齢１８日の歯胚より分離した歯小嚢組織は、嚢状の形態を有していた（図１参照）。【００６０】
（歯根膜除去モデルの作製および歯小嚢組織の移植）
歯根膜除去部位における歯周組織形成能を解析するために、Ｓａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１；  ２８６（４４），  ３８６０２−１３．）にならい、４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの第二臼歯の歯根膜を除去した（歯根膜除去モデル）。より具体的には、深麻酔下のマウスにおいて、手技上の問題より便宜的に下顎第一臼歯を抜歯した。その後、第一臼歯に隣接した第二臼歯との歯槽中隔から２５Ｇ針（ＮＮ−２５１６Ｒ、テルモ、東京、日本）を用いて第二臼歯の頬側側面の歯根膜を物理的に除去した。
マウス胎齢１８日の歯胚より分離した歯小嚢組織を短冊状に複数の細胞塊へ物理的に切り離した。次に、歯小嚢組織の内側を形成していた細胞塊の側面が、歯根膜が除去された第二臼歯歯根側に向くように、歯根膜除去部位に貼り付けるように移植した。またこのとき、それぞれの細胞塊が重ならないよう歯根膜除去部位に貼り付けた。移植後２１日目に顎骨を摘出し、ＨＥ染色にて歯小嚢組織移植部位の組織解析を行った。【００６１】
歯小嚢組織を移植しなかった対照区においては、歯根膜を除去した部位の歯根膜組織の大部分が骨様組織で埋め尽くされるアンキローシスが生じていた（図２Ａ中のアスタリスク）。これに対し、歯小嚢組織を移植した区では、正常なセメント質と歯根膜が形成されていた。また、歯小嚢組織を移植した群では、歯根の長軸方向に対して垂直に走行を有する歯根膜組織が認められ、天然歯と同等の歯周組織構造が形成されていた（図２Ａ、および、図２Ｂ）。このことから、歯小嚢組織は、セメント質、歯根膜組織、および、歯槽骨で構成される歯周組織すべての組織を形成可能であり、歯根膜損傷部位においても歯周組織を形成可能であることが示された。【００６２】
<<実施例２．歯小嚢組織を付与したインプラントの移植による歯周組織形成能の評価）>>
（インプラントの調製）
移植用のインプラント体は、直径０．６ｍｍのチタン線（株式会社ニラコ、東京、日本）を長さ１．７ｍｍ分切り出し、根尖方向となる側より０．５ｍｍ程度を円錐形に成形することで作製した。インプラント体の表面は、真空蒸着によりハイドロキシアパタイトのコーティングを行い、厚さ２μｍのハイドロキシアパタイトの層で覆うことにより、ハイドロキシアパタイトコーティングされたインプラント体（以下、ＨＡインプラント）（山八歯材工業株式会社、愛知県、日本）を作製した。
ＨＡインプラント周囲には、実施例１と同様の方法により、胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウスより摘出した歯小嚢組織を巻き付けた（（以下、歯小嚢付与ＨＡインプラント；図４Ａ）。なお、歯小嚢組織は、外科的に短冊状へいつくかの細胞塊へ切り離したものを使用した。ＨＡインプラントへの細胞塊の配置は、細胞塊同士が重ならないように巻き付けることにより行った。また、歯小嚢組織の内側を形成していた細胞塊の側面を、ＨＡインプラントの表面と接着させた。【００６３】
（歯小嚢付与ＨＡインプラントの顎骨への移植および生着評価）
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯を抜歯し、歯牙欠損部を設け、４−５日間の歯肉の治癒期間を設けた。その後、下顎第一臼歯の抜歯部位の歯肉切開・剥離を行った。歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ−Ｍａｔｅ  Ｐｌｕｓ、ナカニシ、東京、日本）および歯科用リーマー（ＭＡＮＩ、栃木、日本）を用いて歯牙欠損部の歯槽骨を切削し、直径０．９ｍｍ、深さ１．２ｍｍの移植窩を形成した。移植窩に、上記で作製した歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した。なお、歯小嚢組織を巻きつけていないＨＡインプラントを移植した対照区も作製した。８−０ナイロン縫合糸（ベアーメディック、千葉、日本）で、インプラント移植部位を歯肉縫合した（図３）。各インプラント体を移植したマウスは、移植直後および移植後２１日目にマイクロＣＴ撮影を行った（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｍｉｃｒｏ  Ｘ−ｒａｙ  ＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ｒ＿ｍＣＴ、  株式会社リガク、  東京、  日本）。画像データは、統合画像処理ソフト（ｉ−ＶＩＥＷ−３ＤＸ、株式会社モリタ、大阪、日本）を用いて、インプラントとレシピエントの歯槽骨との結合を経時的に評価した。また、移植後２１日目において、インプラントを含む顎骨をレシピエントマウスより摘出し、ＨＥ染色にて組織学的評価を行った。【００６４】
移植２１日後において、ＨＡインプラントを移植した対照区では、インプラント表層に直接歯槽骨が結合したオッセオインテグレーションを呈していた（図４Ｂおよび図５）。それに対して、歯小嚢組織を付与したＨＡインプラントでは、インプラント表層と周囲歯槽骨との間に歯根膜腔が認められた（図４Ｂ下段、右中図中の矢印）。また、歯小嚢組織を付与したＨＡインプラントでは、ＨＥ染色像において、インプラント表層からセメント質、歯根膜、歯槽骨といった、天然歯の歯周組織と同等の組織構造が認められた（図５）。【００６５】
さらに、形成される歯周組織がインプラントとともに移植される歯周組織由来のものであるかを確認するために、ＧＦＰマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウス（日本エスエルシー株式会社、日本））由来の歯小嚢組織を付与したＨＡインプラント体を同様に作製・移植し、移植部位を観察した。移植部位は、蛍光実体顕微鏡（ＡｘｉｏＬｕｍｅｒ，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｊｅｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＧＦＰ発色を撮影した。その結果、２１日目にインプラント周囲の歯根膜、歯槽骨領域にＧＦＰマウス由来の組織の形成が観察された（図６）。このことから、歯小嚢組織を付与したインプラントを移植することにより、歯周組織形成を伴ってレシピエントの顎骨に生着している可能性が示された。【００６６】
<<実施例３．インプラント移植後に形成された歯周組織の解析>>
実施例２に示すように、歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植は、顎骨に生着した歯周組織を形成させた。そこで、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後に形成された歯根膜の走行を解析するため、天然歯の歯周組織、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後２１日目のインプラント周囲の歯周組織、および、歯小嚢組織を巻き付けていないＨＡインプラント移植後２１日目のインプラント周囲の歯周組織をアザン染色により染色し、歯根膜の走行を解析した。
また、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後に形成された歯周組織の形態を解析するため、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後２８日目のインプラント周囲の歯周組織を、走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡により観察し、インプラント移植後に形成された歯周組織の形態を解析した。
さらに、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後に形成された歯周組織において、硬組織−線維性組織−硬組織の３層構造が形成されているかを確認するため、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後２８日目のインプラント周囲の歯周組織について、Ｘ線マイクロアナライザーを用いたチタン（Ｔｉ）、カルシウム（Ｃａ）、およびリン（Ｐ）の元素分布の解析を行った。【００６７】
（アザン染色による歯根膜の走行の解析）
実施例２と同様の方法により、歯小嚢付与ＨＡインプラントを４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯欠損部へ移植した。移植後２１日目に顎骨を摘出し、顎骨を４％パラホルムアルデヒド溶液にて２４時間固定した。その後、１０％ギ酸クエン酸ナトリウムおよび２２．５％ギ酸脱灰液を用いて７２時間の脱灰操作を行った。脱灰操作の後、顎骨のパラフィン包埋を行った。包埋後は、顎骨より６μｍ厚の切片をクライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；  Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作製した。【００６８】
次に、６μｍの厚さに作製したパラフィン切片を、キシレンに６分間浸漬した。その後、１００％、９０％、７０％アルコールにそれぞれ各３分間浸漬してパラフィンを取り除いた。パラフィンを取り除いた切片に対して、流水を５分間かけて水になじませた後、１０％トリクロール酢酸・１０％重クロム酸カリウムに１５分間浸漬した。再び切片に流水をかけた後、アゾカルミンＧ液に３０分間浸漬して核ならびに細胞質を染色した。アゾカルミンＧ液を流水により洗浄した後、アニリン・アルコールに１０秒間浸漬し分別を行い、酢酸アルコールに１分間浸漬して分別を停止した。分別停止後に切片を流水により洗浄し、５％リンタングステン酸に１時間浸漬した。浸漬後、再度流水により洗浄した後、アニリン青・オレンジＧ混合液に１０分間浸漬して歯根膜線維を染色した。最後に１００％アルコールで分別を行い、キシレンに６分間浸漬して透徹した。その後、マリノールを用いて封入を行い組織解析を実施した。【００６９】
歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植後、２１日目にインプラント周囲に形成された歯根膜組織は、天然歯の歯根膜の走行のように、インプラントの長軸方向に対して垂直方向の走行を有していた（図７）。【００７０】
（電子顕微鏡による形態解析）
実施例２と同様の方法により、歯小嚢付与ＨＡインプラントを４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯欠損部へ移植した。インプラント移植後２８日目に、マウスを深麻酔下において、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液を用いて経心的灌流固定を行った。経心的灌流固定後、マウスの顎骨を摘出し、その後、顎骨を４℃の条件下で３１％四塩化オスミウムにて後固定を行った。次に、顎骨をエタノールでの脱水後、臨界点乾燥器（ＨＣＰ−２、日立、東京、日本）中で乾燥させ、エポキシ樹脂に置換・包埋した。
エポキシ樹脂により包埋した試料の一部は、ダイヤモンドディスクを用いて、移植したインプラントの中央部が切断面となるように矢状断に切り出した。切り出した試料は、イオンスパッター装置（Ｅ−１０３０、日立）を用いて導電処理を行い、Ａｕ−Ｐｄ蒸着の処理を行った。その後、Ａｕ−Ｐｄ蒸着した試料を、走査型電子顕微鏡（Ｓ−４７００、日立）を用いて、加速電圧を５ｋＶとして観察した。また、上記の方法と同様にして、天然歯についても別のＣ５７ＢＬ／６マウスより試料を作製し、走査型電子顕微鏡により天然歯の歯周組織の形態を観察した。
また、歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植したマウスより作製したエポキシ樹脂包埋後の試料の一部について、ウルトラミクロトーム（ＵＬＴＲＡＣＵＴ−ＵＣＴ；  Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、１００ｎｍの超薄切した切片を作製した。作製した切片は、透過型電子顕微鏡（Ｈ−７６００、日立）を用いて、加速電圧を７５ｋＶとして観察した。【００７１】
上述のように、歯小嚢付与ＨＡインプラント移植２８日におけるインプラント周囲の歯周組織の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を取得し、観察した。その結果、ＳＥＭ画像では、インプラント表層から歯槽骨に向かって走行する密な歯根膜の線維束と、層板状のセメント質の形成とが観察され、天然歯とほぼ同様な組織形態が認められた（図８）。また、インプラント移植後のインプラント周囲の歯周組織を観察したＳＥＭ画像では、インプラント表層と歯根膜線維との結合が観察された（図８下段）。また、インプラント移植後のインプラント周囲の歯周組織を観察した透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像では、セメント質と歯根膜線維との結合も観察された（図９中の矢印）【００７２】
（Ｘ線マイクロアナライザーによる元素分析）
歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後のインプラント周囲の歯周組織において、硬組織-線維性組織-硬組織の３層構造をより明確に解析するために、Ｘ線マイクロアナライザーを用いて元素分布の解析を行った。解析対象の元素として、インプラントの構成元素であるチタン（Ｔｉ）、骨組織とセメント質の構成元素であるカルシウム（Ｃａ）、およびリン（Ｐ）を選択し、各元素の分布を解析した。また、元素分布の解析は、上記の走査型電子顕微鏡の解析で使用した同じマウス由来の試料（エポキシ樹脂に包埋し、ダイヤモンドディスクで矢断状に切り出した試料）について、電子線マイクロアナライザー（ＥＰＭＡ−１６１０、島津製作所、京都、日本）を用いて上記３元素の分布の解析を行った。
解析結果より、チタン製のインプラント表層にＣａおよびＰの分布がみられた（図１０）。インプラント表面のハイドロキシアパタイトコーティングの厚さが２μｍ以下と非常に薄いことから、このインプラント表層におけるＣａおよびＰの分布は、ＣａおよびＰを構成元素に含むセメント質由来のものであると考えられる。従って、インプラント表層にセメント質からなる硬組織が形成されていることが明らかとなった。また、インプラント移植後のインプラント周囲の歯周組織のＳＥＭ画像において、線維が走行している部分では、ＣａとＰの分布が認められなかった。歯根膜は、ＣａとＰを構成元素として含まないため、ＣａとＰの分布が認められなかった部分は、歯根膜領域が確保されていることが明確となった。
また、各構成元素の分布画像を重ね合わせ、３元素の分布をより明確に観察したところ、インプラント表面上（Ｔｉ表面上）に、ＣａおよびＰの集積する箇所を確認することができた（図１１）。【００７３】
<<実施例４．インプラント移植後に形成された歯根膜の機能解析>>
歯小嚢付与ＨＡインプラント移植後に形成された歯根膜の機能を解析するため、天然歯、移植後２１日目の歯小嚢付与ＨＡインプラント、移植後２１日目の歯小嚢組織を巻き付けていないＨＡインプラントに対して、実験的矯正を行い、経時的な歯およびインプラントの移動量を計測した。また、実験的矯正による骨リモデリングの解析として、矯正力負荷後の歯周組織における骨吸収マーカーと骨形成マーカーの発現を解析した。【００７４】
（インプラントの実験的矯正）
天然歯およびインプラントの実験的矯正、および、矯正力負荷による天然歯およびインプラントの移動量の解析方法は、下記のようにして行った。実施例２の方法と同様にして、歯小嚢付与ＨＡインプラントまたはＨＡインプラントをＣ５７／ＢＬ／６マウスへそれぞれ移植した。移植後２１日目に、マウスを深麻酔下に固定した。直径０．０１０インチのニッケルチタンワイヤー（ＶＩＭ−ＮＴ，  Ｏｒａｌｃａｒｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を下顎切歯と、矯正対象とする天然歯又はインプラントにレジン固定を行った。ダイヤルテンションゲージ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を用いて、水平的に１０ｇ−１５ｇの荷重を負荷した。矯正力は、天然歯、ＨＡインプラント、歯小嚢付与ＨＡインプラントに対して舌側から頬側方向（歯列側面に対して垂直方向であって、口腔の外側方向）に１４日間加えた。【００７５】
なお、マウス下顎切歯は顎骨の前方向にはえており、臼歯は上部方向に萌出している。移植したインプラントは、臼歯側に移植している（図１２）。矯正前、矯正後３日目、７日目、矯正後１４日目でマイクロＣＴにより撮影を行った。撮影された画像データＴＲＩ／３Ｄ−ＢＯＮ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒａｔｏｃ、大阪、日本）を用いて、矯正力による経時的な移動距離の測定を行った。【００７６】
その結果を図１３に示す。歯小嚢組織を巻き付けていないＨＡインプラントにおいては、矯正力負荷によるインプラントの移動は認められなかった。それに対して、天然歯では矯正力負荷から７日目にかけて７７．０±５．５μｍの移動が認められた。歯小嚢付与ＨＡインプラントにおいては、矯正力負荷から７日目にかけて５５．６±６．３μｍの移動が認められた。天然歯および歯小嚢付与ＨＡインプラントにおいて、７日目以降は、緩やかに歯の移動が認められた（図１３Ａ、および図１３Ｂ）。【００７７】
（矯正力負荷後の骨吸収マーカーおよび骨形成マーカーの発現解析）
次に、実験的矯正によるインプラント移植部位の骨リモデリングを解析した。骨リモデリング解析方法として、骨吸収のマーカーであるＣｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＣＳＦ−１）と、骨形成のマーカーであるＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（ＯＣＮ）の発現解析を行った。
具体的には、まず、ＧｅｎＢａｎｋより公開されているｍＲＮＡ配列情報より、ＯＣＮならびにＣＳＦ−１の遺伝子配列を特異的に増幅可能なプライマーを設計した。そのプライマーにＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列を付加して、ＰＣＲにより標的配列を増幅した。得られたＰＣＲ産物と、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびジゴキシゲニン  （ＤＩＧ）  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ  （Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて、ＤＩＧ標識したＲＮＡプローブを合成した。
次に、前述の方法と同様にして天然歯およびインプラントの実験的矯正を行い、矯正６日目に顎骨を摘出した。摘出した顎骨を４％パラホルムアルデヒド溶液にて２４時間固定した後、１０％ギ酸クエン酸ナトリウムおよび２２．５％ギ酸脱灰液を用いて７２時間の脱灰操作を行った。その後、顎骨を１２．５％（ｗ／ｖ）および２５％（ｗ／ｖ）の各Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に１２時間ずつ順に浸漬し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）を用いて凍結包埋した。包埋後は顎骨を１０μｍ厚の切片をクライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；  Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作製した。
厚さ１０μｍの凍結切片を作製後、凍結切片を１０分間４％パラホルムアルデヒド溶液処理により固定し、１分間アセチル化溶液に浸した。１時間のプレハイブリダイゼーション後、先に合成したＲＮＡプローブを７０℃で１６時間ハイブリダイズさせた。アルカリホスファターゼ標識した抗ＤＩＧ  Ｆａｂ  ＦｒａｇｍｅｎｔｓとＮＢＴ／ＢＣＩＰ  （Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた免疫学的手法により、３０℃において適切な時間で酵素発色させてｍＲＮＡの局在を検出した。
なお、試験に用いたプライマーを下記に示す。
・マウス  オステオカルシン（ｍＯＣＮ）、フォーワードプライマー（配列番号１）
ＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣ
・マウス  オステオカルシン（ｍＯＣＮ）、リバースプライマー（配列番号２）
ＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧ
・マウス  ＣＳＦ１（ｍＣＳＦ１）、フォーワードプライマー（配列番号３）
ＴＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡ
・マウスＣＳＦ１（ｍＣＳＦ１）、リバースプライマー（配列番号４）
ＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＣＡ【００７８】
その結果、圧迫側ではＣＳＦ−１  ｍＲＮＡを発現する破骨細胞の局在が認められ、牽引側ではＯＣＮ  ｍＲＮＡを発現する骨芽細胞の局在が認められた（図１４）。このことから、歯小嚢組織を巻き付けたＨＡインプラントは、歯の移動を可能とする機能を有する歯周組織が形成していることが示された。【００７９】
<<実施例５．インプラント移植後に形成された歯根膜組織における神経線維の解析>>
天然歯の歯根膜組織には、歯の機能および恒常性維持のために、末梢神経が侵入しており、求心性の刺激伝達による機能を担っている。そこで、移植後２１日目のＨＡインプラント、および、移植後２１日目の歯小嚢付与ＨＡインプラントの周囲の歯根膜組織においても、正常な機能を有する神経線維が形成しているかどうかを評価した。
まず、実施例２の方法と同様にして、歯小嚢付与ＨＡインプラントおよびＨＡインプラントをＣ５７／ＢＬ／６マウスへ移植した。そして、移植後２１日目に、歯小嚢付与ＨＡインプラントまたはＨＡインプラントを含む顎骨をレシピエントマウスより摘出した。摘出した顎骨を４％パラホルムアルデヒド溶液にて２４時間固定した後、１０％ギ酸クエン酸ナトリウムおよび２２．５％ギ酸脱灰液を用いて７２時間の脱灰操作を行った。その後、顎骨を１２．５％（ｗ／ｖ）および２５％（ｗ／ｖ）の各Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に１２時間ずつ順に浸漬し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）を用いて凍結包埋した。包埋後は顎骨を１０μｍ厚の切片をクライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；  Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作製し、それら組織切片の免疫染色を行った。
インプラント周囲に形成した歯根膜における神経線維を検出するために、神経線維マーカーであるｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔの免疫染色を行った。一次抗体はｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ＳＭＩ３１２（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＮＦ  Ａｂ；  １：１０００，  Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）を用い、二次抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ（１：５００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。これらの免疫染色画像は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ；  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｊｅｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光を検出し、神経線維を観察した。【００８０】
歯根膜領域が形成されないＨＡインプラントにおいては、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（ＮＦ）で染色される神経線維の侵入は一切認められなかった。一方、歯周組織が形成された、歯小嚢付与ＨＡインプラントの歯根膜組織内には、天然歯と同様に、ＮＦ陽性の神経線維が認められた（図１５）。これにより、歯小嚢付与ＨＡインプラントは、移植後に、神経線維を有する歯根膜組織を形成させることができることが示された。【００８１】
<<実施例６．インプラント移植後に形成された歯根膜組織における神経線維の機能解析>>
過度の咬合力などにより歯の組織に対して侵害刺激が加わった際に、歯根膜内に配行する末梢神経が、侵害刺激を延髄の三叉神経脊髄路核へ投影することによって痛みを認知する。この機構は、組織の傷害や、機能不全化を回避・抑制することを可能とし、生体防御に関わっている。従って、歯周組織を有するインプラントにおいても、神経線維が形成しているだけでなく、それらの末梢神経が中枢神経と連携機能していることが重要である。
そこで、歯小嚢組織付与ＨＡインプラント移植後、インプラント周囲に形成された歯根膜内に侵入している神経線維が、中枢に侵害刺激を伝達しうることが可能か評価した。評価方法は、天然歯、移植２１日後のＨＡインプラント、移植後２１日目の歯小嚢付与ＨＡインプラントに実験的矯正力を加えた後、痛み刺激の指標である三叉神経脊髄路核において産生誘導されるｃ−Ｆｏｓタンパク質の発現を解析することにより行った。【００８２】
具体的には、まず、実施例２の方法と同様にして、歯小嚢付与ＨＡインプラントおよびＨＡインプラントをＣ５７／ＢＬ／６マウスへ移植した。移植後２１日目において、深麻酔下にマウスを固定した。天然第一臼歯、および顎骨に生着したインプラントに対して、実施例４と同様に、１０〜１５ｇの矯正力を舌側から頬側に向けて負荷した。矯正刺激開始から２時間後にて、麻酔下のマウス胸壁をハサミを用いて開放した。その後、心臓を露出させた、左心室下部から２５Ｇ針を刺入し、ペリスタポンプを用いて心臓から全身へＰＢＳ（−）溶液を灌流させた。また、左心房を切除することにより脱血経路を確保した。完全に脱血した後、続けて４％パラホルムアルデヒド溶液を同様に全身へ還流させることにより固定を行った。【００８３】
その後、実施例５に記載の方法と同様にして、マウスの頭蓋骨内から延髄組織の摘出を行い、１２．５％（ｗ／ｖ）および２５％（ｗ／ｖ）の各Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に１２時間ずつ順に浸漬した。浸漬後、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）を用いて延髄組織を凍結包埋した。包埋後は４０μｍ厚の切片をクライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；  Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）により作製した。【００８４】
作製した切片は、０．３％Ｈ２Ｏ２を加えたメタノールにより内在性ペルオキシダーゼをブロックし、３％の血清でブロッキングを行った。その後、ａｎｔｉ−ｃ−Ｆｏｓ  Ａｂ（１：１０，０００，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）で反応させ、一次抗体としてｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：３００，  Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｕｒｏｒａ，  Ｏｈｉｏ）と反応させた。その後ＰＡＰ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ（１：３０００，  Ｃａｐｐｅｌ）を用いて免疫染色を行った。【００８５】
ＨＡインプラントに対する矯正力負荷に対しては、ｃ−Ｆｏｓタンパク質の発現は認められなかった。天然歯ならびに歯小嚢付与ＨＡインプラントにおいては、矯正刺激２時間後にｃ−Ｆｏｓ発現を認め、歯根膜に対する侵害刺激が中枢神経に伝達されたことが示された（図１６）。これらの結果から、歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した場合には、侵害刺激を伝達可能な神経機能がインプラント周囲の歯根膜内に形成していることが示された。【００８６】
≪実施例７．三壁性骨欠損モデルにおけるインプラント移植後の歯槽骨再生の解析≫
歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植により歯槽骨の再生が可能であるかを明らかとするために、インプラント移植部位の歯槽骨の１側面の骨を欠く三壁性骨欠損モデルを作製し、当該モデルへ歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植後、歯槽骨の再生量の解析を行った。
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯を抜歯し、２〜３週間の骨組織の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉の切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ−Ｍａｔｅ  Ｐｌｕｓ、ナカニシ、東京、日本）および歯科用リーマー（ＭＡＮＩ、栃木、日本）を用いて歯槽骨を切削し、直径０．８ｍｍ、深さ１．２ｍｍの移植窩を形成した。移植窩が存在する場所の歯槽骨の頬側骨をテーパードフィッシャータイプのカーバイドバー（ＭＡＮＩ、栃木、日本）を用いて削去し、頬側骨を欠く三壁性骨欠損モデルを作製した（図１７）。移植窩に歯小嚢付与ＨＡインプラントまたはＨＡインプラントを移植し、８−０ナイロン縫合糸（ベアーメディック、千葉、日本）で歯肉縫合を行った。インプラントを移植したマウスは、移植直後、ならびに、移植より１４日目、２８日目、および５０日目にマイクロＣＴ装置（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｍｉｃｒｏ  Ｘ−ｒａｙ  ＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ｒ＿ｍＣＴ、  リガク、東京、  日本）を用いてマイクロＣＴ画像を取得した。また、取得したマイクロＣＴ画像（スライス画像）データを、統合画像処理ソフト（ｉ−ＶＩＥＷ−３ＤＸ，  モリタ、大阪、日本）を用いて３次元構築し、３次元ＣＴ画像を取得した。得られたマイクロＣＴ画像および３次元ＣＴ画像を用いて、移植部位の歯槽骨における頬側骨の再生を経時的に評価した。
なお、その際に対象区として、インプラント移植の行わない三壁性骨欠損のみを作製したサンプルを作製し、同様に歯槽骨における頬側骨の再生を経時的に評価した。【００８７】
インプラントを移植しなかった三壁性骨欠損モデル区、三壁性骨欠損モデルに対してＨＡインプラントを移植した区、三壁性骨欠損モデルに対して歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した区についての、移植直後、ならびに移植より１４日目、２８日目、および５０日目の３次元ＣＴ画像を図１８に示す。ＨＡインプラントを移植した区及びインプラントを移植しなかった区では、５０日目において、ある程度の歯槽骨の再生を観察することができたが、本来歯槽骨が存在すべき位置（図中の点線）まで歯槽骨が再生しなかった。特に、ＨＡインプラントを移植した区では、インプラント自体が、歯槽骨内へ沈み込んでしまっていた。一方で、歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植したものは、移植後５０日目において、歯槽骨が、ほぼ完全に回復していた。また、歯小嚢付与ＨＡインプラント自体も、移植先の歯槽骨において、移植時と同様の位置を維持していた。
また、歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した三壁性骨欠損モデルにおける、移植より１４日目、２８日目、および５０日目のマイクロＣＴ画像を図１９に示す。移植より１４日目において歯槽骨の再生がみられ、移植より５０日目においては、ほぼ完全に回復した歯槽骨を観察することができた。ここで、再生された歯槽骨と歯小嚢付与インプラントとの間には、歯根膜腔様の間隙が認められた（図１９中の矢頭）。このように、歯小嚢付与インプラントは、歯根膜形成のみならず、歯槽骨再生を伴ったインプラントの生着を可能とすることができた。【００８８】
さらに、三壁性欠損モデルに対し歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した区、三壁性欠損モデルに対しＨＡインプラントを移植した区、およびインプラントを移植しなかった三壁性骨欠損の３種類の区において、移植０日目と５０日目とにおける画像の重ね合わせたものを作成し、歯槽骨の再生面積の定量化を行った。その結果を図２０に示す。図２０に示すように、歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植区では、他の２区と比較して、有意に高い歯槽骨の再生量が認められた。【００８９】
また移植後のインプラントの歯槽骨への落ち込みを評価するために、実施例２と同様に作製した（三壁性骨欠損ではない）移植窩へＨＡインプラントを移植した区と、三壁性骨欠損モデルに対してＨＡインプラントを移植した区と、三壁性骨欠損モデルに対して歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した区において、移植０日目と移植より５０日目のインプラントの垂直的な移動量を測定し、グラフ化した（図２１および図２２）。その結果、三壁性骨欠損モデルに対してＨＡインプラントを移植した区では、移植したインプラントの沈みこみが観察されたのに対し、歯槽骨を欠損していない（移植窩へＨＡインプラントを移植した区、および、三壁性骨欠損モデルに対して歯小嚢付与ＨＡインプラントを移植した区においては、インプラントの沈み込みが観察されなかった。これより、歯小嚢付与ＨＡインプラントの移植によりインプラント自体の落ち込みが防止されることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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