(57)【要約】 一又は複数の実施形態において、成熟神経細胞に発現するアミロスフェロイドの標的分子であって、アミロスフェロイドが結合することにより細胞死が誘発される標的分子の提供。また、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を阻害する方法及び物質の提供。一態様において、アミロスフェロイドの結合標的分子としてのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の使用に関する。その他の態様において、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法であって、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用を阻害することを含む方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟神経細胞死を誘発するアミロスフェロイドの結合標的分子としてのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の使用。
【請求項２】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用に基づき医薬品開発を行うことを含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法であって、
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用を阻害することを含む、方法。
【請求項４】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、両者又は一方の表面立体構造に基づく競合阻害を行い得る物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３と競合してアミロスフェロイドに結合しうる物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、請求項３記載の方法。
【請求項６】
アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法であって、
アミロスフェロイドと相互作用する成熟神経細胞において、細胞膜のＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ｍＮＣＸ）、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）、及び、小胞体のリアノジン受容体（ＲｙＲ）からなる群から選択される少なくとも１つのカルシウムチャネルを阻害することを含む、方法。
【請求項７】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用を阻害することにより、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制することを含む、方法。
【請求項８】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、両者又は一方の表面立体構造に基づく競合阻害を行い得る物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３と競合してアミロスフェロイドに結合しうる物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、
アミロスフェロイドと相互作用する成熟神経細胞において、細胞膜のＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ｍＮＣＸ）、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）、及び、小胞体のリアノジン受容体（ＲｙＲ）からなる群から選択される少なくとも１つのカルシウムチャネルを阻害することを含む、方法。
【請求項１１】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物の有効成分の候補化合物のスクリーニング方法であって、
テスト化合物を用いてアミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害能を測定すること、及び、
前記測定結果に基づき候補化合物を選択することを含む、スクリーニング方法。
【請求項１２】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物の有効成分の候補化合物のスクリーニング方法であって、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４又はその一部の立体構造に基づく薬剤設計を行って合成されたテスト化合物を用い、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害能、及び／又は、アミロスフェロイドに対する結合能、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死に対する抑制能を測定すること、及び、
前記測定結果に基づき候補化合物を選択することを含む、スクリーニング方法。
【請求項１３】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の診断方法であって、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の結合パートナーをＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との結合部分として備えるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３イメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、及び、
前記シグナルのシグナルデータ若しくはイメージデータ、又は、前記シグナルデータ若しくはイメージデータから算出されるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量の測定結果に基づき、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定することを含む、診断方法。
【請求項１４】
被検体のアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を調べる方法であって、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の結合パートナーをＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との結合部分として備えるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３イメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、
前記シグナルのシグナルデータ又はイメージデータから算出されるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量を測定すること、及び、
正常個体のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量がよりも低いほど重症度が重い、及び／又は、前記被検体の以前のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量よりも高い／低い場合にそれぞれ重症度が重く／軽くなったとする基準と、前記測定結果を比較することを含む、方法。
【請求項１５】
合成、単離、又は精製された物質であって、
アミロスフェロイドに対して結合能を有し、かつ、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制でき、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４又はその一部の構造と類似する、物質。
【請求項１６】
前記Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４におけるアミノ酸配列がＲＬＮＷ（配列番号１）又はＬＮＷである部分の構造と類似する、請求項１５記載の物質。
【請求項１７】
合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
下記式（Ｉ）、（II）、又は（III）のアミノ酸配列で表わされるモチーフを含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４          （Ｉ）（配列番号７）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５          （II）（配列番号４３）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４            （III）（配列番号４８）
Ｘ１は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ２は、疎水性アミノ酸残基、又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、
Ｘ３は、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、
Ｘ４は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、
Ｘ５は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又は疎水性アミノ酸残基であり、
アミロスフェロイドに対する結合能を有する、ポリペプチド。
【請求項１８】
Ｎ末端に前記式（I）、（II）、又は（III）のアミノ酸配列で表わされるモチーフを有する、請求項１７記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列の長さが、４〜２５アミノ酸である、請求項１７又は１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害でき、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制できる、請求項１７から１９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４又はその一部の構造と類似する、請求項１７から２０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４におけるアミノ酸配列がＲＬＮＷ（配列番号１）である部分の構造と類似する、請求項２１記載のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチドの構造に類似したペプチドミミックであって、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害でき、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制できる、ペプチドミミック。
【請求項２４】
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記ポリペプチドを発現するためのベクター。
【請求項２６】
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項２３に記載のペプチドミミックを含む、組成物。
【請求項２７】
アミロスフェロイドを検出及び／又は測定するために用いる、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制するために用いる、請求項２６記載の組成物。
【請求項２９】
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害するために用いる、請求項２６記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２３に記載のペプチドミミック、請求項２４記載のポリヌクレオチド、又は請求項２５記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療に用いる、請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
アミロスフェロイドに対するプローブ又はその前駆体であって、
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項２３に記載のペプチドミミックをアミロスフェロイドとの結合部分として備える、プローブ又はその前駆体。
【請求項３３】
アミロスフェロイドのイメージング又は検出若しくは測定に用いる、請求項３２記載のプローブ又はその前駆体。
【請求項３４】
請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項２３に記載のペプチドミミックをアミロスフェロイドとの結合部分として備えるアミロスフェロイドイメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出することを含む、アミロスフェロイドイメージング方法。
【請求項３５】
請求項３４記載のアミロスフェロイドイメージング方法で得られるシグナルデータ又はイメージデータに基づき、アミロスフェロイド量を算出することを含む、アミロスフェロイド量の測定方法。
【請求項３６】
アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の診断方法であって、
アミロスフェロイドの結合パートナーをアミロスフェロイドとの結合部分として備えるアミロスフェロイドイメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、及び、
前記シグナルのシグナルデータ若しくはイメージデータ、又は、前記シグナルデータ若しくはイメージデータから算出されるアミロスフェロイド量の測定結果に基づき、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定することを含む、診断方法。
【請求項３７】
アミロスフェロイドの結合パートナーが、請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項２３に記載のペプチドミミックである、請求項３６記載の診断方法。
【請求項３８】
被検体のアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を調べる方法であって、
アミロスフェロイドの結合パートナーをアミロスフェロイドとの結合部分として備えるアミロスフェロイドイメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、及び、
前記シグナルのシグナルデータ又はイメージデータから算出されるアミロスフェロイド量を測定すること、及び、
正常個体のアミロスフェロイド量よりも低いほど重症度が重い、及び／又は、前記被検体の以前のアミロスフェロイド量よりも高い／低い場合にそれぞれ重症度が重く／低くなったとする基準と、前記測定結果を比較することを含む、方法。
【請求項３９】
アミロスフェロイドの結合パートナーが、請求項１７から２２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項２３に記載のペプチドミミックである、請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、アミロスフェロイドが結合して成熟神経細胞死を誘発する標的分子、アミロスフェロイドが誘導する神経細胞死を抑制する方法及び又は物質、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症含む）及び/又はレビー小体型認知症（dementia with Lewy bodies / Lewy body dementia / diffuse Lewy body disease, cortical Lewy body disease / sentile dementia of Lewy body type）の予防、診断、改善、治療、及び／又は医薬組成物、スクリーニング方法、イメージングプローブ、及びイメージング方法などに関しうる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、シナプス変性を経て成熟神経細胞が死に至る病である。最近の研究により、アルツハイマー病の発症は段階的であることがわかってきた。最初の段階として、シナプス変性が主に起こる段階がある。この段階は可逆的な段階である。前記可逆的段階の次の段階として、神経細胞死が起こる段階がある。この段階は不可逆的な段階であり、この不可逆的段階に至ることにより、アルツハイマー病が発症すると考えられている（非特許文献１）。【０００３】
シナプス変性は、主に、蓄積したβアミロイド（Ａβ）２量体及び１２量体がグルタミン酸受容体等に作用して起こるとされている。しかし、Ａβ２量体及び１２量体のいずれも、in vitro及びin vivoで神経細胞死を引き起こさない（非特許文献２）。よって、ヒトのアルツハイマー病の病態解析のために、可逆的なシナプス変性段階の後の不可逆的段階で起こる神経細胞死の原因と分子機構の解明が必要とされている。【０００４】
アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）は、非神経細胞及び幼若神経細胞には毒性を示さず、機能的に成熟した神経細胞を選択的に死にいたらしめるユニークなＡβ集合体である（非特許文献１）。アミロスフェロイドは、in vitroで神経細胞死を起こす直径約１０ｎｍの球状Ａβ集合体として最初に単離された（非特許文献３）。その後、この合成アミロスフェロイドに対する特異的な抗体が作製され（特許文献１及び２）、この抗体を用いてアルツハイマー病のヒト患者の脳から生体内で形成された（すなわち、ネイティブな）アミロスフェロイドが単離された（非特許文献３）。このネイティブアミロスフェロイドを用いた研究から、ｉ）ネイティブアミロスフェロイドは、合成アミロスフェロイドと同様に、成熟神経細胞に対して選択的に細胞死を誘発し、また、ｉｉ）神経細胞脱落が認められるアルツハイマー病患者の大脳皮質におけるネイティブアミロスフェロイド量は、アルツハイマー病の重症度に相関して増加していること、そして、ｉｉｉ）神経細胞脱落があまり認められないアルツハイマー病患者の小脳におけるネイティブアミロスフェロイド量は微量しか存在しないことが明らかとなった（非特許文献３）。したがってアミロスフェロイドは、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ネイティブアミロスフェロイドは、レビー小体型認知症患者の脳からも検出されており（非特許文献１）、レビー小体型認知症においてもアミロスフェロイドはその発症において重要な役割を果たすと考えられる。【０００５】
なお、アミロスフェロイドと、シナプス変性を引き起こす主な原因であるとされるＡβ２量体及び１２量体とは、ともにＡβ集合体ながら、異なる経路でＡβモノマーから形成されることが示されている。すなわち、Ａβ２量体及び１２量体はＡβ２量体を経由するのに対し、アミロスフェロイドはＡβ３量体から形成される（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１６６４４
【特許文献２】ＷＯ２００９／０５７６６４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Noguchi et al. J.Biol.Chem. vol.284 no. 47, 32895-32905 (2009)
【非特許文献２】Shankar et al. Nature Medicine 14, 837-842 (2008)
【非特許文献３】Hoshi et al. Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol.100, no.11, 6370-6375 (2003)
【非特許文献４】Matsumura et al. J.Biol.Chem. vol.286 no. 13, 11555-11562 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アミロスフェロイドは、他のＡβ集合体とは異なり、前シナプス細胞の表面に結合し、成熟神経細胞に対して細胞死を誘発すると予想された（非特許文献１）。しかしながら、アミロスフェロイドの成熟神経細胞への結合様式は不明なままであった。【０００９】
そこで、本明細書は、成熟神経細胞に発現するアミロスフェロイドの標的分子であって、アミロスフェロイドが相互作用することにより細胞死が誘発される標的分子などを開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、一又は複数の態様において、アミロスフェロイドの結合標的分子としてのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、神経細胞死のメカニズムの説明図である。
【図２】図２は、ＮＡＫの細胞外ドメイン４の配列、及び、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）が結合すると考えられる部分を示す図である。
【図３】図３は、ＡＳＰＤの結合実験（左写真）、及び、ＡＳＰＤの毒性実験（右グラフ）の結果の一例を示す。
【図４】図４は、抗ＡＳＰＤ抗体（haASD1）及び抗Ａβモノマー抗体（６E10）を用いてファーウエスタンブロッティングを行った一例を示す。
【図５】図５は、ファーウエスタンブロッティング（左）及び銀染色パターン（右）の一例を示す。
【図６】図６は、ファーウエスタンブロッティング（下段）、並びに、抗Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα１（ＮＡＫα１）抗体（上段）及び抗Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３（ＮＡＫα３）抗体（中段）を用いたウエスタンブロッティングの一例を示す。
【図７】図７は、抗ＡＳＰＤ抗体（haASD1）による免疫沈降物を抗ＮＡＫα３抗体でウエスタンブロッティングした一例を示す。
【図８】図８は、ビオチン化ＡＳＰＤを投与した成熟神経細胞から得られたアビジン分画の銀染色パターンの一例を示す。
【図９】図９は、抗ＡＳＰＤ抗体により検出された成熟神経細胞におけるＡＳＰＤの結合部位（赤）と抗ＮＡＫα３により検出されたＮＡＫα３の局在（緑）の蛍光顕微鏡観察写真の一例を示す。
【図１０】図１０は、合成ＡＳＰＤを成熟神経細胞に投与し、１時間後に細胞を固定し、抗ASPD抗体を用いて細胞に結合したＡＳＰＤ量を定量した結果のスキャチャードプロットの一例を示す。
【図１１】図１１は、ＡＳＰＤによるＮＡＫα３及びＮＡＫα１の活性阻害を測定した結果の一例を示す。
【図１２】図１２は、ＮＡＫα３の機能、構造、及び発現分布を示す。
【図１３】図１３は、ＡＳＰＤの接触が誘導する成熟神経細胞内カルシウム濃度を測定した結果の一例を示す。
【図１４】図１４は、各種カルシウムチャネル阻害剤のＡＳＰＤ活性（アポトーシス活性）に対する影響を調べた結果の一例を示す。
【図１５】図１５は、神経細胞死のメカニズムの説明図である。
【図１６】図１６は、正常者（年齢をマッチさせた非認知症者）及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者の大脳皮質におけるＮＡＫα３及びＮＡＫα１を抗体にて組織染色した結果の一例を示す。
【図１７】図１７は、正常者（年齢をマッチさせた非認知症者）及びＡＤ患者の小脳におけるＮＡＫα３を抗体にて組織染色した結果の一例を示す。
【図１８】図１８は、ＡＳＰＤ活性（アポトーシス活性）に対するＡＡＴペプチドの阻害効果を示すグラフの一例である。
【図１９】図１９は、ＡＳＰＤ活性（アポトーシス活性）に対するＡＡＴペプチドの阻害効果を示すグラフの一例である。
【図２０】図２０は、ＡＳＰＤ活性（アポトーシス活性）に対するＡＡＴペプチドの阻害効果を示すグラフの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、一又は複数の実施形態において、成熟神経細胞表面上でアミロスフェロイドが結合して作用する標的分子として、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３を同定したことに基づく。さらに、本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイドに結合能を有し、かつ、神経細胞死を抑制できるポリペプチド及び／又はペプチドモチーフを同定したことに基づく。
【００１３】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害することにより、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を阻害できる。本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を阻害することにより、好ましくは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療を可能としうる。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイド及び又はＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の測定やイメージングに基づき、好ましくは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の診断が可能としうる。さらにまた、本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイドが結合するＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の所定領域の立体構造に基づき、好ましくは、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を阻害できる化合物のスクリーニング方法を可能としうる。
【００１４】
すなわち、本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
（１）  アミロスフェロイドが結合して成熟神経細胞死を誘発する標的分子としてのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の使用；
（２）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用に基づき医薬品開発を行うことを含む、（１）記載の使用；
（３）  アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法であって、
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用を阻害することを含む、方法；
（４）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、両者又は一方の表面立体構造に基づく競合阻害を行い得る物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、（３）記載の方法；
（５）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３と競合してアミロスフェロイドに結合しうる物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、（３）記載の方法；
（６）  アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法であって、
アミロスフェロイドと相互作用する成熟神経細胞において、細胞膜のＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ｍＮＣＸ）、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）、及び、小胞体のリアノジン受容体（ＲｙＲ）からなる群から選択される少なくとも１つのカルシウムチャネルを阻害することを含む、方法；
（７）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、
アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用を阻害することにより、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制することを含む、方法；
（８）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、両者又は一方の表面立体構造に基づく競合阻害を行い得る物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、（７）記載の方法；
（９）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害が、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３と競合してアミロスフェロイドに結合しうる物質とアミロスフェロイドとの接触により行われる、（７）記載の方法；
（１０）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、
アミロスフェロイドと相互作用する成熟神経細胞において、細胞膜のＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ｍＮＣＸ）、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）、及び、小胞体のリアノジン受容体（ＲｙＲ）からなる群から選択される少なくとも１つのカルシウムチャネルを阻害することを含む、方法；
（１１）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物の有効成分の候補化合物のスクリーニング方法であって、
テスト化合物を用いてアミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害能を測定すること、及び、
前記測定結果に基づき候補化合物を選択することを含む、スクリーニング方法；
（１２）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物の有効成分の候補化合物のスクリーニング方法であって、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４又はその一部の立体構造に基づく薬剤設計を行って合成されたテスト化合物を用い、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害能、及び／又は、アミロスフェロイドに対する結合能、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死に対する抑制能を測定すること、及び、
前記測定結果に基づき候補化合物を選択することを含む、スクリーニング方法；
（１３）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の診断方法であって、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の結合パートナーをＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との結合部分として備えるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３イメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、及び、
前記シグナルのシグナルデータ若しくはイメージデータ、又は、前記シグナルデータ若しくはイメージデータから算出されるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量の測定結果に基づき、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定することを含む、診断方法；
（１４）  被検体のアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を調べる方法であって、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の結合パートナーをＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との結合部分として備えるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３イメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、
前記シグナルのシグナルデータ又はイメージデータから算出されるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量を測定すること、及び、
正常個体のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量がよりも低いほど重症度が重い、及び／又は、前記被検体の以前のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３量よりも高い／低い場合にそれぞれ重症度が重く／軽くなったとする基準と、前記測定結果を比較することを含む、方法；
（１５）  合成、単離、又は精製された物質であって、
アミロスフェロイドに対して結合能を有し、かつ、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制でき、
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４又はその一部の構造と類似する、物質；
（１６）  前記Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４におけるアミノ酸配列がＲＬＮＷ（配列番号１）又はＬＮＷである部分の構造と類似する、（１５）記載の物質；
（１７）  合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
下記式（Ｉ）、（II）、又は（III）のアミノ酸配列で表わされるモチーフを含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４          （Ｉ）（配列番号７）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５          （II）（配列番号４３）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４            （III）（配列番号４８）
Ｘ１は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ２は、疎水性アミノ酸残基、又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、
Ｘ３は、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、
Ｘ４は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、
Ｘ５は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又は疎水性アミノ酸残基であり、
アミロスフェロイドに対する結合能を有する、ポリペプチド；
（１８）  Ｎ末端に前記式（Ｉ）、（II）、又は（III）のアミノ酸配列で表わされるモチーフを有する、（１７）記載のポリペプチド；
（１９）  アミノ酸配列の長さが、４〜２５アミノ酸である、（１７）又は（１８）に記載のポリペプチド；
（２０）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害でき、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制できる、（１７）から（１９）のいずれかに記載のポリペプチド；
（２１）  Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４又はその一部の構造と類似する、（１７）から（２０）のいずれかに記載のポリペプチド；
（２２）  前記Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の細胞外ドメイン４におけるアミノ酸配列がＲＬＮＷ（配列番号１）である部分の構造と類似する、（２１）記載のポリペプチド；
（２３）  （１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチドの構造に類似したペプチドミミックであって、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害でき、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制できる、ペプチドミミック；
（２４）  （１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２５）  （１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記ポリペプチドを発現するためのベクター；
（２６）  （１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチド又は（２３）記載のペプチドミミックを含む、組成物；
（２７）  アミロスフェロイドを検出及び／又は測定するために用いる、（２６）記載の組成物；
（２８）  アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制するために用いる、（２６）記載の組成物；
（２９）  アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相互作用を阻害するために用いる、（２６）記載の組成物；
（３０）  （１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチド、（２３）記載のペプチドミミック、（２４）記載のポリヌクレオチド、又は（２５）記載のベクターを含む、医薬組成物；
（３１）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療に用いる、（３０）記載の医薬組成物；
（３２）  アミロスフェロイドに対するプローブ又はその前駆体であって、
（１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチド又は（２３）記載のペプチドミミックをアミロスフェロイドとの結合部分として備える、プローブ又はその前駆体；
（３３）  アミロスフェロイドのイメージング又は検出若しくは測定に用いる、（３２）記載のプローブ又はその前駆体；
（３４）  （１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチド又は（２３）記載のペプチドミミックをアミロスフェロイドとの結合部分として備えるアミロスフェロイドイメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出することを含む、アミロスフェロイドイメージング方法；
（３５）  （３４）記載のアミロスフェロイドイメージング方法で得られるシグナルデータ又はイメージデータに基づき、アミロスフェロイド量を算出することを含む、アミロスフェロイド量の測定方法；
（３６）  アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の診断方法であって、
アミロスフェロイドの結合パートナーをアミロスフェロイドとの結合部分として備えるアミロスフェロイドイメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、及び、
前記シグナルのシグナルデータ若しくはイメージデータ、又は、前記シグナルデータ若しくはイメージデータから算出されるアミロスフェロイド量の測定結果に基づき、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定することを含む、診断方法；
（３７）  アミロスフェロイドの結合パートナーが、（１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチド又は（２３）記載のペプチドミミックである、（３６）記載の診断方法；
（３８）  被検体のアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を調べる方法であって、
アミロスフェロイドの結合パートナーをアミロスフェロイドとの結合部分として備えるアミロスフェロイドイメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出すること、及び、
前記シグナルのシグナルデータ又はイメージデータから算出されるアミロスフェロイド量を測定すること、及び、
正常個体のアミロスフェロイド量よりも低いほど重症度が重い、及び／又は、前記被検体の以前のアミロスフェロイド量よりも高い／低い場合にそれぞれ重症度が重く／低くなったとする基準と、前記測定結果を比較することを含む、方法；
（３９）アミロスフェロイドの結合パートナーが、（１７）から（２２）のいずれかに記載のポリペプチド又は（２３）記載のペプチドミミックである、（３８）記載の方法。
【００１５】
［アミロスフェロイド］
本明細書において、アミロスフェロイド（以下、「ＡＳＰＤ」ともいう。）とは、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発できるＡβ集合体をいう。ＡＳＰＤは、「合成ＡＳＰＤ」及び「ネイティブＡＳＰＤ」を含む。合成ＡＳＰＤとは、合成Ａβを用いてin vitroで調製及び単離される直径約１０〜１５ｎｍの球状体であるＡＳＰＤをいう（非特許文献３）。また、ネイティブＡＳＰＤとは、ヒト生体内で形成されたＡＳＰＤ、とりわけ、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の患者の脳から単離されうるＡＳＰＤをいう（非特許文献１）。合成ＡＳＰＤ及びネイティブＡＳＰＤは、ともに、成熟ヒト神経細胞に細胞死を誘発する。ＡＳＰＤに特異的な立体構造を認識できる抗ＡＳＰＤ抗体も作製されている（例えば、特許文献１及び２に開示されるｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｍＡＳＤ３など）。これらの抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体の特性解析やＡＳＰＤのＮＭＲ解析の結果から、ＡＳＰＤは、これまで報告された他のＡβ集合体とは異なるユニークな立体構造をもつことがわかっている（例えば、非特許文献１のSupplemental Table S1、厚生労働科学研究費補助金（医療機器開発研究促進事業）平成22年度報告書）。具体的には、まず抗ＡＳＰＤ抗体のエピトープマップの結果から、ＡＳＰＤを形成するにあたって、その構成要素であるＡβは折り畳まれてＮ末端と中間部位が共にＡＳＰＤの表面に出ていることがわかっている。このことからＡＳＰＤに特異的な表面３次元構造を作っていることがわかる。ＡＳＰＤの二次元ＮＭＲスペクトルもこの結果を支持しており、本来Ａβモノマーで検出されるべきシグナルのうち、ＡＳＰＤ表面に出ている部位ではシグナルが観測出来る一方で、ＡＳＰＤの内側に折り畳まれた部位に由来するシグナルは内部に折り畳まれることで磁気的に非等価かつ運動性が抑制されるためシグナルが減弱し検出されなくなる。ＮＭＲ解析から得られた結果も、ＡβのＮ末端と中間部位がＡＳＰＤ表面に露出していることが示されており、抗ＡＳＰＤ抗体が認識する部位と一致していた。ＡＳＰＤ表面に出ている中間部位は、通常の凝集体では内部に折り畳まれている部位であり、ＡＳＰＤの特異な立体構造を持つ凝集体であることを示している。したがって、本明細書においてＡＳＰＤは、特許文献１及び２に開示されるＡＳＰＤに特異的な抗ＡＳＰＤ抗体に反応し、かつ、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発できるＡβ集合体ともいうことができる。ＡＳＰＤは、限定されない一又は複数の実施形態において、Ａβモノマーの約２０〜１５０量体である。ＡＳＰＤは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞毒性が高い形態として、分子量が約８４ｋＤａ〜約１７２ｋＤａであり、平均分子量が約１２８ｋＤａである。ＡＳＰＤは、限定されない一又は複数の実施形態において、溶液中でのＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で測定した直径が、約４．６ｎｍ〜約９．８ｎｍであり、平均約７．２ｎｍである。
【００１６】
合成ＡＳＰＤは、非特許文献３に開示される方法で調製できる。具体的には、合成したアミロイドβモノマー（Ａβ１−４０及び／又はＡβ１−４２）を５〜７日間かけて（Ａβ１−４０）あるいは一晩（Ａβ１−４２）ゆっくりと回転撹拌することで合成ＡＳＰＤを形成でき、０．２２μｍ―フィルターのろ液を５０ｋＤａあるいは１００ｋＤａ限外ろ過した保持液（retentate）を回収することによって精製できる。但し、本明細書において、合成ＡＳＰＤはこの製造方法によって製造されたものに限定されない。なお、合成ＡＳＰＤに使用するＡβモノマーは、ヒト及びヒト以外の動物のものが使用できる。一方、ネイティブＡＳＰＤは、非特許文献１に開示される方法で得ることができる。具体的には、アルツハイマー病等の患者の脳抽出物の１００ｋＤａ限外ろ過保持液に対し、特許文献１及び２に開示されるｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｍＡＳＤ３等のＡＳＰＤ立体構造特異的なモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行うことで得ることができる。但し、本明細書において、ネイティブＡＳＰＤはこの製造方法によって得られたものに限定されない。
【００１７】
［アミロイドβペプチド］
本明細書において「アミロイドβモノマー」とは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がβ−及びγ−セレクターゼに切断されることよって切り出されるペプチドをいい、「βアミロイド」、「Ａβ」又は「Ａβモノマー」とも表記される。また、本明細書において、Ａβはそのアミノ酸配列の長さからＡβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、及びＡβ１−４３と呼ばれるものを含みうる。本明細書において、Ａβは、ヒト型（ヒトに存在する配列）であってもよく、非ヒト型（ヒト以外の動物に存在する配列）であってもよい。また、本明細書において、Ａβは、生体内の（ネイティブな）Ａβ、及び、合成されたＡβを含みうる。合成Ａβは、特に限定されないが、公知のペプチド合成法（例えば、Ｆｍｏｃ法やＢｏｃ法）で合成でき、例えば、公知のペプチド合成機を利用して製造できる。ヒト型のＡβ１−４２（「Ａβ４２」ともいう。）は、アミノ酸配列（Ｎ末端から）：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドである。また、ヒト型のＡβ１−４１（Ａβ４１）、Ａβ１−４０（Ａβ４０）、及びＡβ１−３９（Ａβ３９）は、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端からそれぞれＡ、ＩＡ、及びＶＩＡを欠いたアミノ酸配列からなるペプチドである。さらに、ヒト型のＡβ１−４３（Ａβ４３）は、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端にトレオニン残基（Ｔ／Ｔｈｒ）が１つ付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１８】
［Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３］
本明細書において、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３（以下、「ＮＡＫα３」ともいう。）とは、ＡＴＰ１Ａ３遺伝子の遺伝子産物の膜タンパク質である「ナトリウム／カリウム輸送体ＡＴＰアーゼサブユニットα３」のことをいう。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼは、細胞質膜を介したナトリウムとカリウムの電気化学勾配を維持する役割を果たすＡＴＰアーゼ輸送体である。α３は特に神経細胞においては、膜電位の維持に関与すると考えられている。本明細書において、ＡＴＰ１Ａ３遺伝子及びＮＡＫα３は、ヒト型（ヒトに存在する配列）であってもよく、非ヒト型（ヒト以外の動物に存在する配列）であってもよい。なお、本明細書において「ヒト以外の動物」とは、特に限定されないが、ヒトＡβ及び／又はヒトＮＡＫα３のオーソログを発現する細胞を有する動物であって、一又は複数の実施形態において、例えば、哺乳類、例えば、霊長類やげっ歯類、例えば、サルやラットである。
【００１９】
ヒトＡＴＰ１Ａ３遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１５２２９６．３（ｍＲＮＡ、２０１１年５月１２日付）で特定できる。また、ヒトＮＡＫα３は、アクセッションＮｏ．ＮＰ＿６８９５０９．１（ｍＲＮＡ、２０１１年５月１２日付）で特定できる。
【００２０】
［ＡＳＰＤの標的分子であるＮＡＫα３の同定］
ＮＡＫα３は、ＡＳＰＤが結合して成熟神経細胞に細胞死を誘導する標的分子である。本明細書において「ＡＳＰＤの標的分子」とは、「ＡＳＰＤが結合して成熟神経細胞に細胞死を誘導する標的分子」を含む。ＡＳＰＤの標的分子であるＮＡＫα３は、以下のようにして同定された。すなわち、成熟神経細胞、幼若神経細胞、及びヒト胎児腎臓由来細胞であるＨＥＫ２９３細胞由来の抽出液をそれぞれ電気泳動で展開し、生体内で形成された（すなわち、ネイティブな）ＡＳＰＤをリガンドとし抗ＡＳＰＤ抗体を用いて検出することでファーウエスタンを行った。その結果、成熟神経細胞の場合のみに現れた約１０５ｋＤａのバンドからＮＡＫα３が同定された。なお、このバンドは合成ＡＳＰＤをリガンドとした場合でも検出されるが、Ａβモノマーをリガンドとし抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）を検出に使用したファーウエスタンでは現れない。また、成熟ラットの海馬ニューロン（２１ＤＩＶ）の細胞抽出物をＡＳＰＤ共存下において、抗ＡＳＰＤ抗体で免疫沈降すると、ＮＡＫα３が共沈する。
【００２１】
なお、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼαサブユニットには、α１〜４の４つがあるが、このうち神経細胞に発現しているのは、主にα１とα３である。α１は、成熟神経細胞、幼若神経細胞、及びＨＥＫ２９３細胞のすべてにおいて発現している。一方、α３は、成熟神経細胞のみで発現する。アルツハイマー病で損傷を受けやすい海馬などでは、α３のｍＲＮＡ発現量はα１の２倍から３倍以上である。したがって、ＡＳＰＤが成熟神経細胞に選択的に細胞死を誘導することは、標的分子がＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３（ＮＡＫα３）であることで説明されうる。
【００２２】
［ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞の細胞死のメカニズム］
ＡＳＰＤが標的であるＮＡＫα３とタンパク質間相互作用して成熟神経細胞の細胞死を誘発するメカニズムは、以下のように考えられる。ＡＳＰＤがＮＡＫα３と相互作用すると、成熟神経細胞のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼの機能が阻害されるため、細胞膜電位が上昇して神経細胞が過興奮状態となり電位依存性カルシウムチャネルを介して細胞外Ｃａ２＋が細胞内に多量に流入する。Ｃａ２＋の異常流入により細胞内Ｃａ２＋ホメオスタシスが失われ、その結果、細胞内Ｃａ２＋濃度が過剰に上昇して細胞死に至ると考えられる（図１参照）。より詳細には、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は、カルパインの活性化、ｐ２５／サイクリン依存性キナーゼ５（ＣＤＫ５）の活性化、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＫＳ３β）の活性化、及び、タウタンパク質の過剰リン酸化をこの順で引き起こし、成熟神経細胞に細胞死をもたらすと考えられる。但し、本開示は、これらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００２３】
［ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用］
ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死がＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用に起因することは、これまで報告されていない、従来技術の予測を超える新たな知見である。ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害できれば、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制でき、ひいては、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の治療、診断、改善、及び／又は予防が可能となる。したがって、一又は複数の実施形態において、本開示は、アミロスフェロイドが結合して成熟神経細胞死を誘発する標的分子としてのＮＡＫα３の使用に関する。ＡＳＰＤの標的分子としてのＮＡＫα３の使用は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害することでＡＳＰＤの神経細胞死を抑制すること、ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害することでアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の治療、診断、改善、及び／又は予防をすること、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用に基づく医薬組成物の開発をすることなどを含みうる。ＡＳＰＤの標的分子としてのＮＡＫα３の使用は、一又は複数の実施形態において、本明細書で開示される発明及びその実施形態を含みうる。なお、本明細書において「タンパク質間相互作用」とは、結合を含み、「ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用」とは、結果として細胞死をもたらし得る作用をＮＡＫα３に及ぼすことを含む。また、本明細書において「アルツハイマー病」は、アルツハイマー型認知症を含む。また、本明細書において「アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の治療、診断、改善、及び／又は予防」の対象は、特に限定されないが、ヒト及び／又はヒト以外の動物とすることができる。
【００２４】
したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法であって、ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害することを含む方法に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害することによりＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制することを含むアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に関する。
【００２５】
［ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害する方法］
ＡＳＰＤは、前述のとおり、ユニークな立体構造を有するＡβ集合体である。したがって、ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用に関与するＡＳＰＤ又はＮＡＫα３の部位の立体構造を模した物質（例えば、ポリペプチド、ペプチドミミック、低分子化合物、これらの塩、これらの溶媒和物など）であれば、ＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用を阻害することができる。相互作用する一方の立体構造を模した分子が存在することで競合阻害が生じると考えられるが、本開示はこの考え方に限定されなくてもよい。なお、本明細書において「物質」とは、化合物、その塩、その溶媒和物、及び／又はこれらを含む組成物を意味することができ、より具体的には、ポリペプチド、ペプチドミミック、低分子化合物、これらの塩、これらの溶媒和物、及び／又はこれらを含む組成物を意味することができる。
【００２６】
したがって、本開示におけるＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質相互作用を阻害する方法は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤ又はＮＡＫα３と、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用に関与するＡＳＰＤ又はＮＡＫα３の部位の立体構造を模した物質とを相互作用させることを含む方法に関する。また、本開示におけるＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質相互作用を阻害する方法は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３の両者又は一方の表面立体構造に基づき競合阻害を行い得る物質とＡＳＰＤとの接触により行われる方法に関する。また、本開示におけるＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質相互作用を阻害する方法は、一又は複数の実施形態において、ＮＡＫα３と競合してＡＳＰＤに結合しうる物質とＡＳＰＤとの接触により行われる方法に関する。これらのＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質相互作用を阻害する方法は、前記ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法、及び、前記アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に適用できる。
【００２７】
ＡＳＰＤは、主に、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４と相互作用する。ヒトＮＡＫα３の細胞外ドメイン４は、ＡＣＮｏ．ＮＰ＿６８９５０９．１のアミノ酸配列の８５７〜９０８番目の配列（配列番号３、図２）と推定されている。図２は、ヒトＮＡＫα１〜４における細胞外ドメイン４（配列番号３〜６）をアライメントし、実施例に示すポリペプチド（ＡＡＴペプチド）に基づいて新たに見出された２か所のモチーフ（ＡＳＰＤと相互作用するモチーフ、以下、「ＡＳＰＤ相互作用モチーフ」ともいう）の一例を囲みで示す。また、図２の２か所のＡＳＰＤ相互作用モチーフの上には、実施例に示すＡＡＴ０１ペプチド（配列番号３５）をアライメントの部分配列をアライメントしている。図２の２か所のＡＳＰＤ相互作用モチーフのうち、ＮＡＫα３の「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含むＮ末側のＡＳＰＤ相互作用モチーフは、ＮＡＫα３が他のＮＡＫαと異なる配列・構造を有する部分であり（図２）、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との特異的なタンパク質間相互作用により重要な部分であると考えられる。ＮＡＫα３の「ＹＧＱＱＷＴ」を含むＣ末側のモチーフ（ＡＡＴ０１ペプチドでは「Ｙ−ＮＬＷＲ」）を含む部分は、ＮＡＫα３とＮＡＫα１で配列構造が共通する部分である。なお、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４は、ヒトとラット間では完全に保存されている（図示せず）。
【００２８】
したがって、本開示におけるＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質相互作用を阻害する方法は、一又は複数の実施形態において、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４、「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含む部分、及び／又は、「ＹＧＱＱＷＴ」若しくは「Ｙ−ＮＬＷＲ」を含む部分の立体構造を模した物質、あるいは前記立体構造に基づき競合阻害を行い得る物質を用いて行うことができる。これらの物質は、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４、「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含む部分、及び／又は、「ＹＧＱＱＷＴ」若しくは「Ｙ−ＮＬＷＲ」を含む部分の構造に基づく薬剤設計（ＳＢＤＤ）をすることにより得ることもできる。上述したとおり、これらのＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質相互作用を阻害する方法は、前記ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法、及び、前記アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に適用できる。なお、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４はＮＡＫβサブユニットと直接相互作用している部位であることがわかっており、ＮＡＫβサブユニットとの相互作用が構造的な安定および酵素活性に影響を与えると考えられている。
【００２９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、合成、単離、又は精製された物質であって、ＡＳＰＤに対して結合能を有し、かつ、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制でき、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４又はその一部の構造と類似する物質に関する。前記物質としては、ポリペプチド、ペプチドミミック、低分子化合物、これらの塩、これらの溶媒和物、及び／又はこれらを含む組成物に関する。ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４又はその一部の立体構造は、一又は複数の実施形態において、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４、「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含む部分、及び／又は、「ＹＧＱＱＷＴ」若しくは「Ｙ−ＮＬＷＲ」を含む部分の立体構造である。これらの物質は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用の阻害、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制、或いは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、診断、及び／又は治療に使用できる。
【００３０】
本明細書において、「ペプチドミミック」とは、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）及び当該分野において公知の他の改変体が包含される。具体的には、例えば、公知のＮ置換グリシンオリゴマーであるペプトイド(S.M.Miller, R.J.Simon, S.Ng, R.N.Zuckermann, J.S. Kerr, W.H.Moos, Bioorg. Med.Chem Lett., 4, 2657(1994))、又はタンパク質のβ、γターン構造をミミックした非ペプチド化合物(M. Kahn Tetrahedron, 49, 3433(1993),コンビナトリアルケミストリー、（株）化学同人p44-64, 1997)などが例示される。本明細書において、「低分子化合物」とは、分子量が、例えば７００以下、好ましくは５００以下の化合物をいう。
【００３１】
［抗ＮＡＫα３抗体］
さらにまた、本開示は、一又は複数の実施形態において、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４、「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含む部分、及び／又は、「ＹＧＱＱＷＴ」若しくは「Ｙ−ＮＬＷＲ」を含む部分の立体構造を特異的に認識する抗ＮＡＫα３抗体に関する。前記抗ＮＡＫα抗体は、一又は複数の実施形態において、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、及び／又は、完全ヒト抗体である。これらの抗体のなかでも、一又は複数の実施形態において、ＮＡＫα３とＡＳＰＤとの相互作用を阻害しつつ、ＮＡＫα３のイオンチャネルの機能を阻害しないものが好ましい。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロスフェロイドが存在しうる条件下の成熟神経細胞のＮＡＫα３に前記抗ＮＡＫα３抗体を結合させることを含む、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法、及び、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に関する。また、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制、或いは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に使用する、前記抗ＮＡＫα３抗体を含む組成物に関する。
【００３２】
［スクリーニング方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物の有効成分の候補化合物のスクリーニング方法であって、テスト化合物を用いてＡＳＰＤとＮＡＫα３とのタンパク質間相互作用の阻害能を測定すること、及び、前記測定結果に基づき候補化合物を選択することを含むスクリーニング方法に関する。
【００３３】
また、本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物の有効成分の候補化合物のスクリーニング方法であって、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４又はその一部の立体構造に基づく薬剤設計（ＳＢＤＤ）を行って合成されたテスト化合物を用い、アミロスフェロイドとＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３とのタンパク質間相互作用の阻害能、及び／又は、アミロスフェロイドに対する結合能、及び／又は、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死に対する抑制能を測定すること、及び、前記測定結果に基づき候補化合物を選択することを含む、スクリーニング方法に関する。ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４又はその一部の立体構造は、一又は複数の実施形態において、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４、「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含む部分、及び／又は、「ＹＧＱＱＷＴ」若しくは「Ｙ−ＮＬＷＲ」を含む部分の立体構造である。
【００３４】
［カルシウムチャネル阻害剤による細胞死の抑制］
ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用に起因して細胞外から細胞内にＣａ２＋を流入させ神経を死に至らしめるのは、Ｎ型の電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）である。さらに、細胞内小器官から細胞質へのＣａ２＋流入も細胞死に関与すると考えられる。したがって、本開示は、その他の態様において、アミロスフェロイドと相互作用する成熟神経細胞において、細胞膜のＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ｍＮＣＸ）、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）、及び、小胞体のリアノジン受容体（ＲｙＲ）からなる群から選択される少なくとも１つのカルシウムチャネルを阻害することを含む、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制する方法、及び、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に関する。各カルシウムチャネルの阻害剤は、公知の阻害剤を用いてもよい。また、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制、或いは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に使用する、細胞膜のＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ｍＮＣＸ）、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）、及び、小胞体のリアノジン受容体（ＲｙＲ）からなる群から選択される少なくとも１つのカルシウムチャネルを阻害できる化合物を含む組成物又は医薬組成物に関する。
【００３５】
［ＡＳＰＤ相互作用モチーフ］
ＡＳＰＤ相互作用モチーフ（ＡＳＰＤと相互作用するモチーフ）は、下記式（I）、（II）、又は（III）のアミノ酸配列で表わされ得る。
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４          （Ｉ）（配列番号７）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５       （II）（配列番号４３）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４          （III）（配列番号４８）
前記式（Ｉ）〜（III）において、
Ｘ１は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ２は、疎水性アミノ酸残基、又はグリシン（Ｇｌｙ）であり、
Ｘ３は、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、
Ｘ４は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｘ５は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又は疎水性アミノ酸残基である。 
【００３６】
本明細書において、疎水性アミノ酸残基は、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌa）、及びメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。
【００３７】
前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフにおいて、Ｘ１は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとの相互作用を強固にする観点から、ヒスチジン又はアルギニンが好ましい。Ｘ２は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、疎水性アミノ酸残基であることが好ましく、より好ましくはロイシン、イソロイシン、バリン、及びフェニルアラニン、さらに好ましくはロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンであり、さらにより好ましくはロイシン及びフェニルアラニンである。Ｘ３は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンが好ましく、より好ましくはアスパラギンである。Ｘ４は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、トリプトファンが好ましい。Ｘ５は、同様の観点から、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸が好ましい。
【００３８】
前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとの相互作用を強固にする観点から、第７又は８番目のアミノ酸残基（すなわち、Ｘ４からＣ末端に２から４個目のアミノ酸残基）は（もしあれば）、トリプトファンであることが好ましい。
【００３９】
前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフの長さとしては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとの相互作用を強固にする観点から、３〜２５アミノ酸又は４〜２５アミノ酸が好ましく、より好ましくは３〜２０又は４〜２０、さらに好ましくは３〜１８又は４〜１８、さらにより好ましくは３〜１４又は４〜１４、さらにより好ましくは３〜１２、４〜１２又は５〜１２、さらにより好ましくは３〜８又は４〜８である。
【００４０】
ＡＳＰＤ相互作用モチーフは、一又は複数の実施形態において、下記アミノ酸配列（配列番号７〜３４、４２〜５１）で示されるモチーフが挙げられる。
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４                  （配列番号７）
Ｘ１Ｘ２ＮＷ                    （配列番号８）
ＨＸ２ＮＷ                      （配列番号９）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷ                （配列番号１０）
ＨＦＮＷ                        （配列番号４２）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５                   （配列番号４３）
Ｘ２ＮＷＸ５                    （配列番号４４）
（Ｆ／Ｌ）ＮＷＸ５              （配列番号４５）
（Ｆ／Ｌ）ＮＷＤ                （配列番号４６）
ＦＮＷＤ                        （配列番号４７）
Ｘ２Ｘ３Ｘ４                    （配列番号４８）
Ｘ２ＮＷ                      （配列番号４９）
（Ｆ／Ｌ）ＮＷ                （配列番号５０）
ＦＮＷ                        （配列番号５１）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５              （配列番号１１）
Ｘ１Ｘ２ＮＷＸ５                （配列番号１２）
ＨＸ２ＮＷＸ５                  （配列番号１３）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＸ５           （配列番号１４）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＹ              （配列番号１５）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＷ               （配列番号１６）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＬ              （配列番号１７）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＤ              （配列番号１８）
Ｘ１Ｘ２ＮＷＸ５Ｗ                （配列番号１９）
ＨＸ２ＮＷＸ５Ｗ                 （配列番号２０）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＸ５Ｗ          （配列番号２１）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＹＷ             （配列番号２２）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＷＷ            （配列番号２３）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＬＷ             （配列番号２４）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＤＷ             （配列番号２５）
Ｘ１Ｘ２ＮＷＸ５ＸＷ            （配列番号２６）
ＨＸ２ＮＷＸ５ＸＷ              （配列番号２７）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＸ５ＸＷ      （配列番号２８）
Ｘ１Ｘ２ＮＷＸ５ＸＸＷ          （配列番号２９）
ＨＸ２ＮＷＸ５ＸＸＷ          （配列番号３０）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＸ５ＸＸＷ    （配列番号３１）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＹＮＬＷ      （配列番号３２）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＷＨＳＷ      （配列番号３３）
Ｈ（Ｆ／Ｌ）ＮＷＬＳＷＦ      （配列番号３４）
【００４１】
配列番号７〜３４、４２〜５１のアミノ酸配列において、Ｘ１〜Ｘ５は上記のとおりであって、Ｘは任意のアミノ酸残基である。
【００４２】
［ポリペプチド］
本開示は、一又は複数の実施形態において、合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフを含み、アミロスフェロイドに対する結合能を有するポリペプチド（以下、「第１のポリペプチド」ともいう）に関する。第１のポリペプチドにおいて、前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフの実施形態は上述のとおりである。第１のポリペプチドは、一又は複数の実施形態において、好ましくは、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死を抑制でき、より好ましくは、さらに／或いは、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用を阻害できる。
【００４３】
第１のポリペプチドは、ＡＳＰＤ−ＮａＫα３間相互作用の阻害向上の観点から、前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフをＮ末端に有すること、すなわち、Ｎ末端の最初のアミノ酸がＸ１又はＸ２であることが好ましい。第１のポリペプチドの長さは、前記式（Ｉ）を含む長さであれば特に制限されない。前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフからなるものであってもよく、前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフにさらなるアミノ酸配列を含むものであってもよい。第１のポリペプチドの長さは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤ誘発成熟神経細胞死の抑制向上及び／又はＡＳＰＤ−ＮａＫα３間相互作用の阻害向上の観点から、５０以下、２５以下、２０以下、又は１５以下、及び／又は、３以上、４以上、５以上、６以上、９以上、又は１０以上である。
【００４４】
本開示は、その他の態様において、第２のポリペプチドであって、アミロスフェロイドに対して結合能を有し、かつ、アミロスフェロイドが誘発する成熟神経細胞死を抑制できる、合成、単離、又は精製されたポリペプチドに関する。本開示の第２のポリペプチドは、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４の立体構造又はその一部の立体構造、好ましくは、ＮＡＫα３の細胞外ドメイン４、「ＲＬＮＷ」若しくは「ＬＮＷ」を含む部分、及び／又は、「ＹＧＱＱＷＴ」若しくは「Ｙ−ＮＬＷＲ」を含む部分の立体構造をミミックしていることが好ましく、さらに／或いは、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用を阻害できることがより好ましい。第２のポリペプチドの一実施形態として、第１のポリペプチドが挙げられる。第２のポリペプチドの長さは、特に制限されないが、本開示の第１のポリペプチドと同等とすることができる。
【００４５】
本開示のポリペプチド（第１及び第２を含む、以下同様）は、一又は複数の実施形態において、前記ＡＳＰＤ相互作用モチーフと脳移行性ペプチドとが直接又はリンカーペプチドを介して結合した形態が挙げられる。脳移行性ペプチドを結合させることで、本開示のポリペプチドが血液脳関門を越えて脳に移行される効率を高めることができる。脳移行性ペプチドをとしては、従来公知のものを利用できる。
【００４６】
本開示のポリペプチドは、通常の合成方法によって適宜合成し、精製することによって調製することができる。本開示のポリペプチドは、合成、単離、及び／又は精製された形態であることが好ましい。
【００４７】
本開示のポリペプチドをＡＳＰＤと共存させること、或いは、接触させることにより、本開示のポリペプチドとＡＳＰＤとは結合する。よって、本開示のポリペプチドは、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制、及び／又は、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用の阻害に好ましくは使用でき、医薬組成物の有効成分として、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示のポリペプチドを含むアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に用いる医薬組成物に関する。
【００４８】
或いは、本開示のポリペプチドは、ＡＳＰＤのプローブ又はイメージングプローブ若しくはその前駆体として使用でき、ＡＳＰＤの検出及び／又は測定方法、ＡＳＰＤのイメージング方法、及び、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度の判定及び／又は診断方法に使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤの検出及び／又は測定用の、ＡＳＰＤイメージング用の、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度の判定及び／又は診断用の組成物、医薬組成物、又はキットであって、本開示のポリペプチドを含むものに関する。
【００４９】
［ペプチドミミック］
本開示は、さらにその他の態様として、本開示のポリペプチドの構造をミミックしたペプチドミミックに関する。本開示のペプチドミミックは、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用に対する阻害能を有する。本開示のペプチドミミックの好ましい実施形態として、前記式（Ｉ）で表わされるモチーフのペプチドミミックと脳移行性ペプチドとが直接又はリンカーを介して結合した形態が挙げられる。脳移行性ペプチドを結合させることで、本開示のペプチドミミックが血液脳関門を越えて脳に移行される効率を高めることができる。脳移行性ペプチドをとしては、従来公知のものを利用できる。
【００５０】
したがって、本開示のペプチドミミックをＡＳＰＤと共存させること、或いは、接触させることにより、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用を阻害する。よって、本開示のペプチドミミックは、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制、及び／又は、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用の阻害に好ましくは使用でき、医薬組成物の有効成分として、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示のペプチドミミックを含むアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に用いる医薬組成物に関する。
【００５１】
或いは、本開示のペプチドミミックは、ＡＳＰＤのプローブ又はイメージングプローブ若しくはその前駆体として使用でき、ＡＳＰＤの検出及び／又は測定方法、ＡＳＰＤのイメージング方法、及び、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度の判定及び／又は診断方法に使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤの検出及び／又は測定用の、ＡＳＰＤイメージング用の、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度の判定及び／又は診断用の組成物、医薬組成物、又はキットであって、本開示のペプチドミミックを含むものに関する。
【００５２】
また、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用の阻害、ＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制、或いは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療の方法に使用するペプチドミミック、又は低分子化合物をスクリーニングする方法であって、第１のポリペプチドの立体構造に基づく薬剤設計（ＳＢＤＤ）をすることを含むスクリーニング方法に関する。前記スクリーニング方法は、前記ＳＢＤＤにより設計して製造された候補化合物についてＡＳＰＤ結合能及び／又はＡＳＰＤが誘発する成熟神経細胞死の抑制を調べることを含んでもよい。
【００５３】
［ポリヌクレオチド及びベクター］
本開示は、さらにその他の態様として、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、また、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドを発現するためのベクターに関する。前記ベクターとしては、前記ポリヌクレオチドを遺伝子導入できるものであれば特に限定されないが、安全性の観点からＡＶＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターが好ましい。本開示のベクターの好ましい実施形態として脳移行性ペプチドと結合した形態が挙げられる。脳移行性ペプチドを結合させることで、本開示のベクターが血液脳関門を越えて脳に移行される効率を高めることができる。脳移行性ペプチドをとしては、従来公知のものを利用できる。
【００５４】
［医薬組成物］
本開示が医薬組成物である場合、その剤形は、投与方法に応じて適宜選択でき、例えば、注射剤、液体製剤、カプセル剤、咀嚼剤、錠剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、経口投与、非経口投与が挙げられる。本開示の医薬組成物は、投与形態や剤形に応じた従来公知の添加物（例えば、賦形剤又は希釈剤）を含有してもよい。
【００５５】
経口投与に適した剤形としては、錠剤、粒子、液体又は粉末含有カプセル、トローチ、咀嚼剤、多粒子及びナノ粒子、ゲル、フィルムなどの固形製剤；懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシルなどの液体製剤が挙げられる。前記賦形剤としては、セルロース、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、マンニトール及びクエン酸ナトリウムなどの担体；ポリビニルピロリジン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びゼラチンなどの造粒結合剤；澱粉グリコール酸ナトリウム及びケイ酸塩などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸などの滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；保存剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤及び着色剤が挙げられる。
【００５６】
本開示の医薬組成物の非経口投与としては、血流中、筋肉中又は内部器官中に直接投与することが挙げられる。非経口投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内及び皮下の投与を含む。非経口投与は、例えば、針注射器、針なし注射器及びその他の注入技術で行える。また、非経口投与に適した剤形としては、例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤を含む水溶液が挙げられる。
【００５７】
［予防、改善、及び／又は治療方法］
本明細書において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防とは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の発症を抑制すること、或いは可逆的な軽度な認知障害よりも病態の進行を進めないことを含む。また、本明細書において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の改善とは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の可逆的な軽度な認知障害の病態の進行が止まること、或いは、病態が軽度になることを含む。さらに、本明細書において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の治療とは、病態の進行を遅らせる、或いはほとんど止まらせることを含む。
【００５８】
本態様の好ましい一実施形態としては、ポリペプチド、ペプチドミミック、又は低分子化合物を含む本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。本態様の治療又は予防方法は、本開示の医薬組成物を対象に有効量投与することを含むことが好ましい。対象がヒトである場合、例えば、ポリペプチド、ペプチドミミック、又は低分子化合物の１日あたりの総量は、一般的には、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。また、一日当たりの総量は、単回又は分割投与で投与することができる。投与方法は、上述した経口／非経口投与を適宜選択できる。
【００５９】
［イメージング方法］
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤイメージングプローブ又はその前駆体であって、本開示のポリペプチド又はペプチドミミックをＡＳＰＤとの結合部分として備える、イメージング用プローブ又はその前駆体に関する。本開示のポリペプチド又はペプチドミミックに適切な標識放射性化合物で標識することで、ＡＳＰＤのイメージング用プローブとすることができる。
【００６０】
また、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤのイメージング方法に関する。イメージング方法は、前記イメージング用プローブの投与から一定時間経過後、前記プローブを投与された被検体（好ましくは、被検体の脳）から前記プローブのシグナルを検出することにより行うことができる。被検体としては、例えば、ヒト及び又はヒト以外の動物（哺乳類等）が挙げられる。また、前記プローブのシグナルの検出は、例えば、前記イメージング用プローブの標識に用いた放射性核種のシグナルを検出することを含む。本開示のイメージング方法は、さらに、検出されたシグナルを再構成処理して画像に変換することを含んでいてもよく、またさらに、変換した画像を表示することを含んでいても良い。また、本開示のイメージング方法において、シグナルの検出は、使用する分子プローブの放射性核種の種類に応じて適宜決定でき、例えば、ＰＥＴを用いた測定、ＳＰＥＣＴを用いた測定等により行うことができる。
【００６１】
ＳＰＥＣＴを用いた測定は、例えば、前記イメージング用プローブを投与された被検体から放出されるγ線をガンマカメラにより測定することを含む。ガンマカメラによる測定は、例えば、前記イメージング用プローブの標識に使用した前記放射性核種から放出される放射線（γ線）を一定時間単位で測定することを含み、好ましくは放射線が放出される方向及び放射線数量を一定時間単位で測定することを含む。本開示のイメージング方法は、さらに、放射線の測定により得られた測定された本開示のイメージング用プローブの分布を断面画像として表すこと、及び、得られた断面画像を再構成することを含んでいてもよい。
【００６２】
ＰＥＴを用いた測定は、例えば、前記イメージング用プローブを投与された被検体から、ポジトロンと電子との結合により生成する１対の消滅放射線をＰＥＴ用検出器で同時計数することを含み、さらに、計測した結果に基づきポジトロンを放出する放射性核種の位置の三次元分布を描写することを含んでいてもよい。
【００６３】
本開示のイメージング方法において、ＳＰＥＣＴの測定又はＰＥＴの測定とあわせて、Ｘ線ＣＴやＭＲＩの測定を行ってもよい。これにより、例えば、ＳＰＥＣＴにより得られた画像又はＰＥＴにより得られた画像（機能画像）と、ＣＴにより得られた画像又はＭＲＩにより得られた画像（形態画像）とを融合させた融合画像を得ることができる。
【００６４】
［判定／診断方法］
本開示のＡＳＰＤイメージング方法で得られるシグナルデータ又はイメージデータに基づき、ＡＳＰＤ量を算出してもよい。アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の患者の大脳皮質におけるネイティブＡＳＰＤ量は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の重症度に相関して増加することから、本開示のイメージング方法を行うことにより、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定又は診断できる。したがって、本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤイメージング方法で得られるシグナルデータ又はイメージデータに基づき、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定することを含む診断方法に関する。
【００６５】
なお、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の患者の大脳皮質におけるＮＡＫα３を発現する神経細胞の数は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の重症度に相関して減少する。したがって、ＮＡＫα３をイメージングすることによってもアルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定又は診断できる。したがって、本開示は、その他の態様において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の診断方法であって、ＮＡＫα３の結合パートナーをＮＡＫα３との結合部分として備えるＮＡＫα３イメージングプローブが投与された被検体から、前記イメージングプローブのシグナルを検出することを含むＮＡＫα３イメージング方法で得られるシグナルデータ若しくはイメージデータ、又は、前記シグナルデータ若しくはイメージデータから算出されるＮＡＫα３量の測定結果に基づき、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の病態の重症度を判定することを含む診断方法に関する。前記ＮＡＫα３の結合パートナーとしては、例えば、抗ＮＡＫα３抗体が挙げられる。また、ＮＡＫα３のイメージングは、ＡＳＰＤのイメージングと同様に行うことができる。
【００６６】
以下に、実施例を用いて本開示の一又は複数の実施形態をさらに説明する。
【実施例】
【００６７】
１．ＡＳＰＤは成熟神経細胞に毒性を発揮するが、未成熟神経細胞や非神経細胞であるＨＥＫ２９３細胞には毒性を発揮しない
（１−１）ＡＳＰＤ結合実験
合成ＡＳＰＤをフィルターで精製した後、ヒト胎児由来ＨＥＫ２９３細胞、成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に投与し、１時間後に固定、免疫組織染色を行った。ＡＳＰＤはＨＥＫ２９３細胞には結合せず、成熟神経細胞に結合した。その結果を図３の左に示す。同図に示すとおり、ＡＳＰＤと成熟神経細胞との結合は、抗ＡＳＰＤ抗体により阻害された。
（１−２）ＡＳＰＤ毒性実験
一定濃度のＡＳＰＤ（５μＭ）をそれぞれの細胞に投与し一晩置いた後、アポトーシス活性をロッシュ社製Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ＡＳＰＤは非神経細胞であるＨＥＫ２９３細胞、ラット海馬由来未成熟神経細胞には毒性を発揮せず、成熟神経細胞にのみ毒性を発揮した。その結果を図３の右に示す。同図に示す通り、ＡＳＰＤの成熟神経細胞に対する毒性は抗ＡＳＰＤ抗体により阻止された。
（１−３）上記及び図３から、ＡＳＰＤがその特異な立体構造により、成熟神経細胞表面にのみ存在するターゲット分子と結合し、神経毒性を発揮していることが示唆された。【００６８】
２．ＡＳＰＤの標的分子であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３の同定
（２−１）ファーウエスタン法による分析
ラット海馬由来初代培養神経細胞（図４に表示の培養日数）とＨＥＫ２９３細胞のそれぞれからＲＩＰＡ（ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）により抽出液を調製、タンパク質量を定量後、一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動分離を行い、ニトロセルロース膜に転写後、ネイティブＡＳＰＤ又はＡβモノマーと一定時間反応させた。ネイティブＡＳＰＤの結合を抗ＡＳＰＤ抗体ｈａＡＳＤ１にて、Ａβモノマーの結合は市販の抗Ａβモノマー抗体である６Ｅ１０にて、検出を行った（ファーウエスタンブロッティング）。その結果を図４に示す。
図４に示す通り、ＡＳＰＤは、成熟神経細胞由来抽出液においてのみ１０５ｋＤａのバンドを認識することがわかった。一方、Ａβモノマーではこのバンドに結合せず、５０ｋＤａ程度のバンドを認識していた。ネイティブＡＳＰＤと１０５ｋＤａのバンドの結合は、ＡＳＰＤに特異的であり、抗ＡＳＰＤ抗体だけではバンドは検出されず、ネイティブＡＳＰＤを予め過剰量の抗ＡＳＰＤ抗体で処理した場合にもバンドは検出されなかった。これはＡＳＰＤの成熟神経細胞への結合と毒性が、抗ＡＳＰＤ抗体の事前処理で失われることと相関している。【００６９】
（２−２）質量分析法による分析
図５の左に、図４のネイティブＡＳＰＤに換えて合成ＡＳＰＤを使用した場合のファーウエスタンブロッティングの結果を示す。ネイティブＡＳＰＤ（図４左）と同様に、成熟神経細胞でのみ１０５ｋＤａのバンドに合成ＡＳＰＤが結合していることが示されている。従って、合成ＡＳＰＤはネイティブＡＳＰＤと等価と考えられ、今後これを用いて解析を実施した。
図５の右に、図５左で用いた細胞由来抽出液の銀染色パターンを示す。四角で囲ったところに、未成熟神経細胞由来抽出液やＨＥＫ２９３細胞由来抽出液では検出出来ないバンドが認められた。これを切り出して質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ブルカーダルトニクス社製、商品名：Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ）によりＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅαサブユニットが検出された。【００７０】
（２−３）α３サブユニットの確認
図４左及び図５左のファーウエスタンブロッティングに用いた抽出液を使って、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα１サブユニットとα３サブユニットに選択的な抗体によるウエスタンブロッティングを行った。その結果を図６に示す。図６に示すとおり、成熟神経細胞に選択的に発現しているのはα３サブユニットであり、ＡＳＰＤが結合しているターゲットはＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３サブユニット（ＮＡＫα３）であると考えられた。【００７１】
（２−４）ＡＳＰＤ免疫沈降におけるＮＡＫα３の共沈
成熟したラット海馬由来初代培養神経細胞の抽出液、その抽出液に合成ＡＳＰＤを添加し、抗ＡＳＰＤ抗体（ｈａＡＳＤ１）あるいは対照として正常マウスＩｇＧを用いた免疫沈降物をそれぞれ、電気泳動を行い、ＮＡＫα３特異的抗体でウエスタンブロッティングを行った。その結果を図７に示す。同図に示す通り、抗ＡＳＰＤ抗体によりＮＡＫα３がＡＳＰＤと共沈してくることが明らかとなった。【００７２】
（２−５）ＡＳＰＤ免疫沈降におけるＮＡＫα３の共沈
上記（２−４）の実験から、ＡＳＰＤとＮＡＫα３が直接相互作用することが示された。その相互作用が生きている細胞上で起こることを示すために、ビオチン化したＡβを一定比率配合したビオチン化ＡＳＰＤを調製し、それを生きた成熟神経細胞（ラット海馬由来初代培養神経細胞）に投与し１時間以内に、ＡＳＰＤの構造を破壊しない条件下で細胞膜を回収し、ビオチンに強い親和性を持つアビジンで分画を行った。銀線色の結果を図８に示す。同図が示す通り、ビオチン化ＡＳＰＤ投与条件でのみ１０５ｋＤａあたりに認められるバンドがあり、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）解析からＮＡＫαであることが明らかとなった。
以上の異なる２つの実験（２−４）及び（２−５）から、ＡＳＰＤとＮＡＫα３が十分な結合の強さを持って直接相互作用することが示された。【００７３】
（２−６）蛍光顕微鏡観察
合成ＡＳＰＤを投与後、成熟神経細胞（ラット海馬由来初代培養神経細胞）上のＡＳＰＤの結合部位を抗ＡＳＰＤ抗体によって蛍光染色し、ＮＡＫa３の存在部位を特異的抗体によって蛍光染色し、そして蛍光顕微鏡観察した結果を図９に示す。同図が示す通り、ＡＳＰＤが結合する部位はＮＡＫα３の存在部位と合致することが示された。【００７４】
（２−７）解離定数
合成ＡＳＰＤを成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に投与し、１時間後に細胞を固定し、抗ＡＳＰＤ抗体を用いて細胞に結合したＡＳＰＤ量を定量した結果のスキャチャードプロットの一例を図１０に示す。また、同図のスキャチャードプロットから合成ＡＳＰＤの解離定数がＫｄ＝１．５±７．８×１０−７Ｍであることが示された。【００７５】
（２−８）ＡＳＰＤによるＮＡＫα３のＡＴＰａｓｅ活性阻害
合成ＡＳＰＤを成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に投与し約２４時間後に細胞膜を回収し、ＡＴＰａｓｅ活性を測定し、ＮＡＫの選択的阻害剤であるｏｕａｂａｉｎを用いてＮＡＫ活性を求めた。ラットにおいては、ｏｕａｂａｉｎのＫｉはα３＝３．１±０．３ｘ１０−8Ｍ、α１＝４．３±１．９ｘ１０−５Ｍである。そこで、低濃度のｏｕａｂａｉｎ（１０ｎＭ）存在下ではＮＡＫα３のみが阻害されるため、ＮＡＫα３活性を求めることが可能である（図１１の左欄のグラフ）。そして、１０ｎＭ  ｏｕａｂａｉｎ存在下では阻害されず１００μＭ  ｏｕａｂａｉｎで阻害される活性としてＮＡＫα１活性（図１１の中欄のグラフ）を求めることが可能である。図１１に示したとおり、ＡＳＰＤ処理によりＮＡＫα３活性が２０％以下になっていることがわかった。一方、ＮＡＫα１活性はＮＡＫα３活性ほど低下していないことが明らかとなった。従って、ＡＳＰＤは特にＮＡＫα３活性を強く阻害していることが明らかとなった。【００７６】
（２−９）ＮＡＫα３について
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（ＮＡＫ）の機能と構造と分布を図１２に示す。図１２上図は、ＮＡＫの機能である、ＡＴＰ加水分解と共役したナトリウム−カリウムポンプ機能を説明図の一例である。図１２中図は、ＮＡＫのαサブユニット及びβサブユニットの構造の一例を示す図である。同図に示すように、βサブユニットは、αサブユニットの細胞外ドメイン４に結合することが報告されている（Lemas et al. vol 269, 8255-8259, 1994）。図１２下図の表に示す通りα１サブユニットは全ての細胞に存在する普遍的タイプである。一方、α３サブユニットは成熟神経細胞に選択的に発現している。幼若神経ではα２サブユニットが発現しているが、成熟するとα３サブユニットに切り替わることが知られている。これらのＮＡＫα３の知見は、図３〜１１の結果とよく合致している。【００７７】
３．ＡＳＰＤが誘導する細胞死のメカニズム
（３−１）細胞内カルシウム濃度を測定
ＡＳＰＤが結合することによりＮＡＫα３の活性が阻害されるとしたならば、（１）流入したＮａがくみ出されないために膜電位が上昇し、その結果、膜電位依存的なＣａチャンネルが開口し、あるいは、（２）Ｎａの上昇に応答して細胞膜上のＮａ／Ｃａ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  （ＮＣＸ）が反応してＣａを取り込み、最終的に細胞内に異常なカルシウムの流入が起こることが予想された。そこで、成熟したラット海馬由来初代培養神経細胞にＡＳＰＤを投与したときの細胞内カルシウム濃度をＦｕｒａ  ＰＥ３蛍光カルシウム指示薬にて観察した。その結果を図１３に示す。同図に示す通り、ＡＳＰＤ投与直後から細胞内カルシウム濃度の上昇が検出され、それが最終的には細胞内カルシウム濃度が振り切れて細胞が死に至ることがわかった。これはＡＳＰＤ濃度に応じてより早く起きることも示された。【００７８】
（３−２）カルシウムチャネル阻害剤の効果
成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に、下記表１に示される各種阻害剤を同表に示される濃度で予め投与し、３０分後に合成ＡＳＰＤ  ４μＭを投与し、およそ２４時間後にアポトーシス活性を測定した。その結果を表１及び図１４に示す。同表及び同図が示す通り、ＡＳＰＤ投与後、ＮＡＫα３活性が抑制されることにより起きる神経細胞死シグナルカスケードには、膜電位依存的カルシウムチャンネルのうち、プレシナプスに多く存在するＮ型チャンネルが関わっていることがわかった。さらに、ミトコンドリアに存在するＮＣＸ、ｍＰＴＰもそれぞれ貢献していることがわかった。従って、図１５に示したように、細胞内へのカルシウム流入はまずシナプス上の膜電位依存性Ｎ型カルシウムチャンネルが活性化することで起こり、それに続いてミトコンドリアのカルシウム代謝異常が起きて、細胞死に至ることが示された。【００７９】
【表１】
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【００８０】
４．アルツハイマー病の病態とＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅα３との相関］
特異的抗体を用いてＮＡＫの分布をヒト脳で検証した。正常脳での解析からは、まずＮＡＫα１は、全体的に分布しており、これはＮＡＫα１が普遍的に存在することと合致していた（図１６左上）。一方、ＮＡＫα３はＮＡＫα１とは全く異なった分布を示し、大脳皮質においては神経突起や軸索に沿ってドット状に、あるいは錐体細胞（神経細胞）を取り巻くように分布していることがわかった（図１６右上）。小脳においては、ＮＡＫα３は神経突起や軸索に沿ってドット状に存在するほかにｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌを取り巻くように分布していた（図１７左上）。これはＢａｓｋｅｔ  ｃｅｌｌの分布と非常に良く重なる。Ｂａｓｋｅｔ  ｃｅｌｌは大脳皮質にも存在しており、ＮＡＫα３がｍＲＮＡの発現解析において抑制性神経にその発現がよく認められることと合致している。
患者脳では、アルツハイマー病で障害が大きく認められる大脳皮質ではＮＡＫα３の染色は失われていた（図１６右下）。一方、ＮＡＫα１の染色は本来の存在部位では失われているが、それ以外の部分ではむしろ量が増大しているという結果が得られた（図１６左下）。これは過去のｍＲＮＡの解析と合致している結果である（Ｓｉｅｇｅｌ  １９９８）。同時にＡＳＰＤ量を調べてみたところ、患者小脳では正常と同じレベルの極小量のＡＳＰＤしか検出されない一方で、障害が大きい大脳皮質では多量のＡＳＰＤが存在しており、これはＮＡＫα３の減少と相関していた（表２）。【００８１】
【表２】
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【００８２】
５．ＡＳＰＤに結合し、かつ、細胞死を抑制するポリペプチド
抗ＡＳＰＤ抗体がＡＳＰＤに結合することで、ターゲット分子であるＮＡＫα３との相互作用を阻止し、神経細胞死を抑制することから、同様の効果を持つペプチドの探索を行った。そのために、マイクロタイタープレートに固定したＡＳＰＤに対して、ランダムな１２アミノ酸のライブラリをウイルス表面に発現しているｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ（市販）を利用して、スクリーニングを行い、収束した配列を解析した。３回のｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙから、同じ配列を持つｐｈａｇｅが複数回重複して得られていることから、何らかの生物学的濃縮が起こり、ＡＳＰＤに結合活性があるペプチドが得られている可能性を示唆している。また、得られた配列すべてをバイオインフォマティクス的に解析すると、Ｈ（Ｈｉｓ）およびＷ（Ｔｒｐ）が有意に高頻度で出現していた。Ｈ／Ｗを多く含むペプチドモチーフの中に、ＡＳＰＤに特異的に結合するものが含まれていることを示唆している。その中から実際にＡＳＰＤ毒性を中和するものと中和しないものを調べると、毒性を中和するものは共通のモチーフを持つことがわかった。この中和活性を持つペプチドをＡｎｔｉ−ＡＤ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  （ＡＡＴ）ペプチドと名付けた。得られたＡＡＴペプチド０１〜０５を表３に示す。また、中和活性を持たないペプチド（ＰＤ）の２例を表３に示す。【００８３】
【表３】
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【００８４】
成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に、ＡＡＴペプチド（０１〜０３）  １４μＭを投与し、３０分後に合成ＡＳＰＤ  ４μＭを投与、およそ２４時間後にアポトーシス活性を測定した。その結果を図１８に示す。【００８５】
興味深いことに、ＡＡＴペプチド（０１〜０３）については、最初の４アミノ酸（ＨＬＮＷ）は、ターゲット分子であるＮＡＫα３の細胞外ドメイン４の特定部分（ＲＬＮＷ；ここはＮＡＫα３とＮＡＫα１が大きく異なるところ）と類似しており、次の４アミノ酸はそれより少し下流の部分（Ｙ−ＮＬＷＲ；ＮＡＫα３とＮＡＫα１共通）に類似している（図２）。また、最後の４アミノ酸は特定のモチーフを持たないことが示唆された。最初の４アミノ酸のモチーフのうち、３番目のＮ（Ａｓｎ）はＮＡＫα３に特異的であり（図２参照、ヒトとラットで保存されている）、これが重要であることが示された。【００８６】
成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に、ＡＡＴペプチド（０４〜０５）  ０．１４μＭを投与し、３０分後に合成ＡＳＰＤ  ４μＭを投与、およそ２４時間後にアポトーシス活性を測定した。その結果を図１９に示す。ＡＡＴ０１を短くしたＡＡＴ０４及びＡＡＴ０５は、ＡＡＴ０１と同等あるいはそれ以上の阻害効果があることが明らかとなった。【００８７】
さらに、下記表４に示すＡＡＴペプチド０６及び０７を用いて同様にＡＳＰＤのアポトーシス活性の阻害効果を確認した。【００８８】
【表４】
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【００８９】
成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に、ＡＡＴペプチド（０４、０６，０７）２．８μＭを投与し、３０分後に合成ＡＳＰＤ  ４μＭを投与、およそ２４時間後にアポトーシス活性を測定し、ＡＡＴペプチドを投与していないコントロールとアポトーシス活性を比較し、その阻害活性を算出した。その結果を図２０に示す。ＡＡＴ０４を短くしたペプチドの内、ＡＡＴ０６には、ＡＡＴ０４と同等あるいはそれ以上の阻害効果があることが明らかとなった。【００９０】
５．ＡＳＰＤとＡＡＴペプチドとの解離定数
前記ＡＡＴペプチド０１〜０３のＣ末端側にビオチンを結合させチップ上に固相化し、ＡＳＰＤをリガンドとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により解離定数を求めた。その結果を下記表５に示す。【００９１】
【表５】
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【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号７〜３９、４２〜５１：ＡＳＰＤ相互作用モチーフ／ペプチド
配列番号４０、４１：ＡＳＰＤ相互作用モチーフ／ペプチド（コントロール）
【図２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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