(57)【要約】【課題】中性域での選択的な抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインAの細胞膜外ドメインに比べて、酸性域における免疫グロブリンとの結合性が低下した、プロテインAの細胞膜外ドメインの改良型タンパク質を提供する。【解決手段】プロテインA細胞膜外ドメインと免疫グロブリンGのFc領域が結合した複合体の立体構造座標データにおいて、Fc領域から10Aの距離内にあって、露出表面積比20%以上であるアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換した上記改良型タンパク質、好ましくは上記タンパク質群で構成されるライブラリから選択された配列の解析から特定した部位のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換した上記改良型タンパク質とする。これらの置換は組み合わされていても良い。【選択図】図５
2012165544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項２】
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのZドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項３】
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのEドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項４】
配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのDドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項５】
配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのAドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常定常に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項６】
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのCドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項７】
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項８】
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのZドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項９】
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのEドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項１０】
配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのDドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項１１】
配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのAドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常定常に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項１２】
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのCドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項１３】
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号7、8、10〜12、15、20〜23、25〜27のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
【請求項１４】
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号13、14、16〜19、24、61〜71のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
【請求項１５】
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのZドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号9又は72で示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
【請求項１６】
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのCドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのCドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか１項に記載のタンパク質のアミノ酸配列と任意のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンデム型タンパク質。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか１項に記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか１項に記載のタンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化するためのスペーサーのアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなるスペーサー付タンパク質。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２１】
配列番号28〜30、43〜60、77〜91のいずれかで示される、請求項20の塩基配列からなる核酸。
【請求項２２】
請求項20又は21に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンの定常領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインAの抗体結合ドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した変異型タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
請求項20〜22のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項２４】
請求項23に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項２５】
請求項1〜19のいずれか１項に記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。
【請求項２６】
請求項1〜19のいずれか１項に記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
【請求項２７】
請求項25に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体結合性タンパク質であるプロテインAの細胞膜外ドメインの新規改良型タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、及び該タンパク質の抗体結合性を利用した抗体の捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であるプロテインAは、抗体の一種である免疫グロブリンG、免疫グロブリンA、および免疫グロブリンMの定常領域に対して親和性を有することが知られている（非特許文献1、非特許文献2）。【０００３】
プロテインAは、複数のドメインからなるマルチドメイン型膜タンパク質で、免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に対する結合活性（以下抗体結合活性と呼ぶ）を示すのは、このうちの一部の細胞膜外ドメインである（非特許文献2）。たとえば、図1および図3に示すNCTC8325株由来のプロテインAの場合、抗体結合活性を示すのは、E、D、A、B、Cの5つのドメインである。これらは、60アミノ酸弱の小型タンパク質で、そのアミノ酸配列の間には高い相同性が見られる（図2）。また、プロテインAを切断して各々のドメイン単独を単離しても、抗体結合活性は保たれることが知られている（非特許文献3）。【０００４】
一方、Zドメインは、Bドメインの配列をもとに合成された人工タンパク質で（非特許文献3）、Bドメインとは、アミノ酸残基が2箇所異なる（図2）。このAla1ValとGly29Alaの2置換により、抗体結合性が失われことはないが構造が安定化することが知られており、その熱変性温度は90℃程度になる（非特許文献3）。【０００５】
プロテインAの細胞膜外ドメイン(E、D、A、B、C)およびZドメインは、現在、その選択的な抗体結合活性を利用した多くの製品が上市されている（例えば、抗体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー用担体(特許文献1、2)や抗体を検出するための検査試薬、研究試薬など）。プロテインAの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は、中性域で高く、強酸性域で低いことが知られている（非特許文献4）。【０００６】
ゆえに、抗体の単離、回収、精製を目的とした場合、まず、血清等の抗体を含む試料溶液を中性状態にして、プロテインAの細胞膜外ドメインを固定化したビーズ等の水不溶性の固相支持体に接触させ、抗体を選択的に吸着させる。この後、pH7の中性溶液で洗浄し抗体以外の成分を除去する。最後にpH3.0の強酸性溶液を加え抗体を固定化したプロテインAから脱着させ、強酸性溶液と共に溶出させることが一般的である（特許文献1、2、3）。これにより、高い純度で抗体を単離、回収、精製することができる。【０００７】
しかし、抗体はpH3.0程度の強酸性溶液におくと変性凝集等で劣化することがあり、抗体の種類によっては、本来の機能を失う場合もある（非特許文献4）。これを防ぐために、pH3.0より高いpHの弱酸性域で溶出処理することが試みられるが、プロテインAの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は強いので、弱酸性域では抗体はプロテインAから溶出せず、十分な回収量が得られない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第3995018号明細書
【特許文献２】特開昭63-258500号公報
【特許文献３】特開昭63-267281号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ForsgrenA and Sjoquist J (1966) "Protein A" from S. Aureus. J Immunol. 97, 822-827.
【非特許文献２】Boyle M.D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press,Inc., San Diego, CA, USA.
【非特許文献３】Tashiro M,Montelione GT. (1995) Structures of bacterial immunoglobulin-binding domainsand their complexes with immunoglobulins. CurrOpin Struct Biol. 5, 471-481.
【非特許文献４】Gagnon P. (1996) Purification Tools for Monoclonal Antibodies,Validated Biosystems Inc., Tucson, AZ, USA.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来技術における問題点を解消することにあり、より具体的には、中性域での選択的な抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインAの細胞膜外ドメインに比べて、酸性域における免疫グロブリンの定常領域との結合性が低下した改良型タンパク質を提供するとともに、この改良型タンパク質を用いて、抗体を変性させることなく容易に捕捉、回収可能にすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、プロテインAの細胞膜外ドメインを固定化した固相支持体から抗体を酸溶出する際に、抗体が強酸によって劣化するのを防ぐには、弱酸性溶液で固相支持体から溶出できるようにプロテインAの細胞膜外ドメインのアミノ酸配列を改変すれば良いと考え、鋭意研究の結果、中性域における改変タンパク質の免疫グロブリン定常領域との結合性が、野生型プロテインAと同程度であり、かつ酸性域における改変タンパク質の抗体結合性は、野生型プロテインAに比べて大きく低下する新規なプロテインA変異体の配列の設計法を構築した。そして、これら設計に基づき合成された変異型タンパク質が、意図どおりの物性を有することを確認し、本発明を完成するに至ったものである。【００１２】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
（1）
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a）
配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（2）
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのZドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（3）
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのEドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（4）
配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのDドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（5）
配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのAドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常定常に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（6）
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのCドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（7）
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（8）
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのZドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（9）
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのEドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（10）
配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのDドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（11）
配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのAドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常定常に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（12）
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのCドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（13）
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号7、8、10〜12、15、20〜23、25〜27のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
（14）
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号13、14、16〜19、24、61〜71のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
（15）
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのZドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号9又は72で示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
(16)
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのCドメインタンパク質の変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのCドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
（17）
（1）〜（16）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と任意のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンデム型タンパク質。
（18）
（1）〜（17）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
（19）
（1）〜（18）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化するためのスペーサーのアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなるスペーサー付タンパク質。
（20）
（1）〜（19）のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
（21）
配列番号28〜30、43〜60、77〜91のいずれかで示される、（20）の塩基配列からなる核酸。
（22）
（20）又は（21）に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンの定常領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインAの抗体結合ドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した変異型タンパク質をコードする核酸。
（23）
（20）〜（22）のいずれかに記載の核酸を含有する組換えベクター。
（24）
（23）に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
（25）
（1）〜（19）のいずれかに記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。
（26）
（1）〜（19）のいずれかに記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
（27）
（25）に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、中性域において本来の抗体結合活性を維持しつつ、配列番号1、3〜6で表されるアミノ酸配列からなるプロテインAの各野生型ドメイン（B、E、D、A、またはC）、あるいは配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるZドメインに比べて、酸性域における免疫グロブリンの定常領域との結合性が大きく低下させる変異型タンパク質が提供可能となる。さらにこれら変異型タンパク質からなる抗体補足剤を使用して捕捉した抗体を、弱酸性領域において変性のない状態でより容易に溶出することが可能となる。【００１４】
一方、現在、野生型のプロテインA細胞膜外ドメインは、抗体の精製用のアフィニティークロマトグラフィー担体や抗体検出のための検査試薬として市販され、ライフサイエンスの各分野で広範に利用されている。また、近年の抗体医薬をはじめとする抗体関連産業の発展をうけて、これらの製品の需要が飛躍的に拡大している。したがって、多くのプロテインA細胞膜外ドメイン含有製品において、本発明のような改良型タンパク質を野生型と代替することにより、酸溶出に伴う抗体の劣化を低減することを可能にし、抗体を扱う広範な技術分野において、その技術発展に大いに資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325由来のプロテインAの遺伝子の構造を示す図である。
【図２】プロテインAの抗体結合ドメインのアミノ酸配列を示す図である（下線部はBドメインとの相違部分）。
【図３】Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325由来のプロテインAの遺伝子の塩基配列を示す図である（下線部が抗体結合ドメインに対応）。
【図４】プロテインA・Bドメインとヒト免疫グロブリンGのFc領域の複合体の立体構造を示す図である。
【図５】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図６】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(ステップワイズ法)の結果を示すグラフである。
【図７】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図８】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図９】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図１０】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の改良型タンパク質は、上記プロテインAのアミノ酸配列をもとに人為的に設計したアミノ酸配列からなるものであって、中性域での選択的な抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインAの細胞膜外ドメインに比べて、酸性域での抗体結合活性が弱く、弱酸性溶液での抗体の溶出を可能にする。
【００１７】
本発明の改良型タンパク質の態様は以下の（ア）〜（カ）で示される。
（ア）プロテインAのBドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのBドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質における、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００１８】
（イ）プロテインAのZドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのZドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００１９】
（ウ）プロテインAのEドメイン変異型タンパク質。
本発明におけるプロテインAのEドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはGln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいは、b）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、さらに1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいは、c）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、ヒスチジン置換部位以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２０】
（エ）プロテインAのDドメイン変異型タンパク質
本発明におけるプロテインAのDドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいは、b）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、さらに1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列であるか、あるいは、c）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、ヒスチジン置換部位以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２１】
（オ）プロテインAのAドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのAドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２２】
（カ）プロテインAのCドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのCドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２３】
1．改良型タンパク質のアミノ酸配列の設計
上記（ア）〜（カ）の変異型タンパク質は、以下のように選定された変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基に基づき設計され、遺伝子工学的手法等により得られる。
【００２４】
本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位は、プロテインA・Bドメインと免疫グログリンGのFc領域が結合した複合体の立体構造原子座標データ（参照文献4）、およびファージディスプレイ法により得られた変異型プロテインAライブラリからのスクリーニング実験の頻度解析データを用いて選定したものである。
【００２５】
酸性域におけるプロテインAの細胞膜外ドメインの抗体結合性を低下させるには、Fc領域との結合に直接関与しているプロテインAの細胞膜外ドメインの結合表面のアミノ酸残基およびその周辺のアミノ酸残基を野生型から非野生型に置換すればよい。
【００２６】
したがって、まず、プロテインA・Bドメインと免疫グログリンGのFc領域が結合した複合体において、Fc領域から一定の距離の範囲内に存在するプロテインA・Bドメインのアミノ酸残基を特定し、これを変異対象部位の候補とする。ついで、アミノ酸置換に伴うプロテインAの細胞膜外ドメインの構造不安定化を最小限にするために、上記の候補のうち、プロテインA・Bドメインの分子表面に露出しているアミノ酸残基のみを変異対象部位と決定した。
【００２７】
したがって、具体的には、後記実施例に示されるように、上記の距離範囲を10オングストローム以内と設定し、かつ露出表面積比を20%以上とすることで、プロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号1）のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が変異対象部位として選定された。続いて、この18個の変異対象部位のうち、高い効果が期待できるより好ましい変異対象部位を、ファージディスプレイ法により得られた変異型プロテインAライブラリからのスクリーニング実験の配列解析データを用いて選定した。
【００２８】
具体的には、後記実施例に示されるように、配列解析データにおいて、ヒスチジン残基の頻度が野生型のアミノ酸残基の頻度より大きい部位とすることで、プロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号1）のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が好ましい変異対象部位として選定された。
【００２９】
ところで、上記したように、プロテインAの各細胞膜外ドメインは配列相同性が高く（図2）、加えて、立体構造が実験的に明らかにされているD、E、およびZドメインは、Bドメイン単独の構造とほとんど差異がないことから（参照文献5〜8）、Bドメイン−Fc複合体の立体構造についての知見は、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体にも適用できる。
【００３０】
即ち、Eドメイン−Fc複合体、Dドメイン−Fc複合体、Aドメイン−Fc複合体、Cドメイン−Fc複合体、及びZドメイン−Fc複合体の立体構造は未だ明らかにされていないが、上記、各細胞膜外ドメインの配列相同性とB、D、E、およびZドメイン単独の立体構造の類似性を基に判断すれば、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体が、Bドメイン−Fc複合体と相同の構造を形成することは、当然に類推することができる。
【００３１】
したがって、上記選択した18個の変異対象部位が、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体においても、Bドメイン−Fc複合体と同等の空間的配置に位置することが強く期待され、Bドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた5位、6位、9位、10位、11位、13位、14位、15位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、35位および36位の18個の変異対象部位は、Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。
【００３２】
また、スクリーニング実験の頻度解析データを用いて選定した5位、9位、10位、11位、15位、18位、27位、28位、35位および36位の10個の好ましい変異対象部位は、Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても好ましい変異対象部位として選定することができる。
【００３３】
即ち、プロテインA・Zドメインのアミノ酸配列（配列番号2）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Eドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号3）のうちのHis5、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはHis5、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Dドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号4）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Aドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号5）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Cドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号6）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、変異対象部位として選定された。
【００３４】
一方、該変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、ヒスチジンが最良である。これは、ヒスチジンが、中性域と酸性域の間で側鎖のプロトンの解離により化学的状態が大きく変化するので、プロテインAの各ドメインの抗体結合性を中性域と酸性域で大きく変化させることができるからである。
【００３５】
したがって、後記実施例に示されるように、本発明の改良型タンパク質は以下を包含する。すなわち、上記  （ア）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Bドメイン変異体、および上記  （イ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Zドメイン変異体、および上記  （ウ）  の態様に対応する、Asp6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Gln15His、Leu17His、Asn18His、Ala24His、Asp25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはAsp6His、Gln10His、Asn11His、Gln15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Eドメイン変異体、および上記  （エ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Ala25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Dドメイン変異体、および上記  （オ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Aドメイン変異体、および上記  （カ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Cドメイン変異体。なお、ここで、Eドメインの5位とB、C、およびZドメインの18位の野生型のアミノ酸残基はヒスチジンであるので、これをヒスチジンに置換しても、置換の前後で変化しないことから、EドメインにおいてHis5His、B、C及びZドメインにおいてHis18Hisは除外してある。
【００３６】
上記から明らかなように、本発明の改良型タンパク質の設計において、選定される変異対象部位は一つに限られるものではない。複数の変異対象部位の中から適宜選択して、それらを組み合わせた点変異体あるいは多重変異体を改良型タンパク質とすることができる。その選択は、無作為に行ってもよいし、構造活性相関等の他の公知の情報を加味してもよい。また、プロテインAの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異と組みあわせてもよい。
【００３７】
具体例を挙げれば、変異対象部位として、6位と11位と15位と24位と25位を選択し6位と11位と25位にヒスチジン残基を導入したAsn6His/Asn11His/Glu15Asp/Glu24Gln/Glu25HisプロテインA・Bドメインの五重変異体（配列番号7）、6位と24位と25位と32位と36位を選択し6位と24位と32位と36位にヒスチジン残基を導入したAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/
Gln32His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの五重変異体（配列番号8）、6位にヒスチジン残基を導入したAsn6HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号10）、24位にヒスチジン残基を導入したGlu24His プロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号11）、32位にヒスチジン残基を導入したGln32HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号12）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号13）、5位と9位と10位と11位と13位と15位と25位と27位と28位と35位と36位を選択し5位と9位と10位と11位と15位と27位と28位と35位と36位にヒスチジン残基を導入したPhe5His/Gln9His/Gln10His/Asn11His/Phe13Leu/Glu15His/Glu25Asp/Arg27His/Asn28His/Lys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの11重変異体（配列番号14）、5位と6位と9位と10位と11位と13位と15位と25位と27位と28位と35位と36位をを選択し5位と6位と9位と10位と11位と15位と27位と28位と35位と36位にヒスチジン残基を導入したPhe5His/Asn6His/Gln9His/Gln10His/Asn11His/Phe13Leu/Glu15His/Glu25Asp/Arg27His/Asn28His/Lys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの12重変異体（配列番号15）、5位と9位と10位と11位と13位と15位と24位と25位と27位と28位と31位と35位と36位を選択し5位と9位と10位と11位と15位と27位と28位と35位と36位にヒスチジン残基を導入したPhe5His/Gln9His/Gln10His/Asn11His/Phe13Leu/Glu15His/Glu24Gln/Glu25Asp/Arg27His/Asn28His/Ile31Leu/Lys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの13重変異体（配列番号16）は、上記（ア）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。
【００３８】
また、配列番号17〜27、65〜71のプロテインA・Bドメインの多重変異体と61〜64のプロテインA・Bドメインの点変異体も、上記（ア）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。変異対象部位として、6位と24位と25位と32位と36位を選択し6位と24位と32位と36位にヒスチジン残基を導入したAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/Gln32His/Asp36HisプロテインA・Zドメインの五重変異体（配列番号9）および36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Zドメインの点変異体（配列番号72）は、上記（イ）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。変異対象部位として、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Cドメインの点変異体（配列番号74）、9位にヒスチジン残基を導入したGln9HisプロテインA・Cドメインの点変異体（配列番号75）、9位と36位にヒスチジン残基を導入したGln9His
/Asp36HisプロテインA・Cドメインの二重変異体（配列番号76）は、上記（カ）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。以上のように、後記実施例で示されるように、本発明の改良型タンパク質では、複数の種類のアミノ酸配列を設計することができる。
【００３９】
上記、配列番号7〜27、61〜72、74〜76に示した点変異体および多重変異体を含む本発明の改良型タンパク質は、抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型のプロテインAの各細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンの定常領域に対し酸性領域での結合活性が低下する限り、一個もしくは数個のアミノ酸残基に挿入や付加の変異が、または、置換したヒスチジン残基を除く一個もしくは数個のアミノ酸残基に欠失や置換の変異がさらに生じても良い。
【００４０】
例えば、本発明の改良型タンパク質をHisタグなどのタグ付きタンパク質、あるいは他のタンパク質との融合タンパク質の形態で合成する場合、合成した後にタグと改良型タンパク質の間を、あるいは他のタンパク質と改良型タンパク質の間を配列特異的タンパク分解酵素で分解しても、上記改良型タンパク質のN末端側もしくはC末端側に1乃至数個のアミノ酸残基が残る場合もあり、また、大腸菌等を用いて本発明の改良型タンパク質を生産する際には、N末端側に開始コドン由来のメチオニン等が付加されることがあるが、後記実施例で示されるように、これらのアミノ酸残基の付加により、抗体結合性が大きく変化することはない。また、後記実施例で示されるように、これらのアミノ酸残基の付加により、設計された変異が及ぼす効果を失うこともない。したがって、本発明の改良型タンパク質は当然これらの変異も含む。
【００４１】
なお、このようなアミノ酸残基の付加のない改良型タンパク質を作成するためには、たとえば、大腸菌等を用いて生産した改良型タンパク質を、さらにメチオニルアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて、N末のアミノ酸残基を選択的に切断し（参照文献9）、反応混合物よりクロマトグラフィー等で分離精製することで、得ることができる。
【００４２】
また、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列は、該アミノ酸配列と任意のリンカー配列とを交互に複数回繰り返したタンデム型アミノ酸配列としても良い。たとえば、[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列A−[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列B−[アミノ酸配列（a）]としても良く、あるいは、[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列C−[アミノ酸配列（b）]−リンカー配列D−[アミノ酸配列（c）]としても良い。
【００４３】
このタンデム型アミノ酸配列の設定は、野生型のプロテインAがリンカー配列を介した複数の抗体結合ドメインの繰り返し構造となっていること（図1および図3）、野生型のプロテインAを切断して各々のドメイン単独を単離しても抗体結合活性は保たれること（参照文献3）から明らかなように、単独でも機能する抗体結合ドメインを野生型のプロテインAは複数繰り返し、局所的な濃度を上げることで抗体結合性の効果を高めている点からみて、その設定は有効である。
【００４４】
また、本発明の改良型タンパク質は、任意の他のタンパク質のアミノ酸配列を連結した融合型アミノ酸配列からなる融合タンパク質としても良い。たとえば、[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列E−タンパク質A、あるいは、タンパク質B−リンカー配列F−[アミノ酸配列（a）] −リンカー配列G−タンパク質C−リンカー配列H−[アミノ酸配列（c）] としても良い。この融合型アミノ酸配列の設定は、野生型のプロテインAが抗体結合ドメインと他のドメインが連結したマルチドメイン構造となっていること（図1および図3）、野生型のプロテインAを切断して各々のドメイン単独を単離しても抗体結合活性は保たれること（参照文献3）、即ち、抗体結合ドメインと他の機能を担うタンパク質を連結することで抗体結合活性を含む複数の機能を担うことを可能にしているとから、その設定は有効である。
【００４５】
また、本発明の改良型タンパク質は、固定化反応ためのスペーサーのアミノ酸配列をC末端やN末端、あるいは中央部に付加してもよい。たとえば、[アミノ酸配列（a）]−スペーサー配列A、あるいは、スペーサー配列B−[アミノ酸配列（b）]、あるいは、[アミノ酸配列（c）]−スペーサー配列C−[アミノ酸配列（d）]としても良い。スペーサーは、固定化反応の効率化や促進、固定化担体との立体障害の軽減などの目的で使用される。スペーサーのアミノ酸配列や鎖長は、用いる固定化反応の種類等に応じて適切な選択をすればよく、たとえば、GlyArgAlaCysGly（参照文献10）やlyGlyGlyGlyCysAlaAspAspAspAspAspAsp（参照文献11）などを利用することができる。ただし、本発明の改良型タンパク質において、用いるスペーサーのアミノ酸配列や鎖長は、特に限定されるものではない。
【００４６】
2．改良型タンパク質の製造
（1）遺伝子工学的手法による改良型タンパク質の製造
a．改良型タンパク質をコードする遺伝子
本発明においては、上記設計された改良型タンパク質を製造するため、遺伝子工学的方法を使用することできる。
【００４７】
このような方法に使用する遺伝子は、上記（ア）〜（カ）に示されるタンパク質のアミノ酸配列をコードするか、より具体的には、a)配列番号7〜27、61〜72、74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはb）配列番号7〜27、61〜72、74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸残基が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ中性域に比べて酸性域での結合活性が低下するタンパク質をコードするか、あるいはc）配列番号7〜27、61〜72、74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列においてヒスチジン残基以外の1又は数個のアミノ酸残基が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ中性域に比べて酸性域での結合活性が低下するタンパク質をコードする核酸からなるものであって、たとえば、より具体的には、配列番号28〜30、43〜60、77〜91のいずれかで示される塩基配列からなる核酸である。
【００４８】
また、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ対応する各野生型プロテインA・細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンの定常領域に対し酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質するタンパク質をコードする核酸もあげられる。
【００４９】
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。たとえば、高い相同性（相同性が60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましく90％以上、もっとも好ましくは95％以上）を有する核酸がハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1％SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００５０】
さらに、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸と上記任意のリンカー配列をコードする核酸をそれぞれ交互に複数連結したものでもよく、または該核酸と任意のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸とを連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。
【００５１】
b．遺伝子、組み替えベクターおよび形質転換体
前記した本発明の遺伝子は、化学合成、PCR、カセット変異法、部位特異的変異導入法などにより合成することができる。たとえば、末端に20塩基対程度の相補領域を有する100塩基程度までのオリゴヌクレオチドを複数化学合成し、これらを組み合わせてオーバーラップ伸長法（参照文献12）を行うことにより目的の遺伝子を全合成することができる。
【００５２】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記の塩基配列を含む遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の遺伝子を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００５３】
プラスミドDNAとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばpK4，pRK401，pRF31等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110，pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13，YEp24，YCp50等）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００５４】
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、本発明の改良型タンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
【００５５】
そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子の塩基配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。
また、製造するタンパク質の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグ配列としては、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、BioEaseタグなどの公知のタグをコードする塩基配列を利用することができる。
【００５６】
遺伝子がベクターに挿入されたか否かの確認は、公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができる。たとえば、プラスミドベクターなどの場合、コンピテントセルを用いてベクターをサブクローニングし、DNAを抽出後、DNAシーケンサーを用いてその塩基配列を特定することで確認できる。他のベクターについても細菌あるいは他の宿主を用いてサブクローニング可能なものは、同様の手法が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを利用したベクター選別も有効である。
【００５７】
形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の改良型タンパク質が発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００５８】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、開始コドン、本発明の改良型タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）BL21などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６０】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６１】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００６２】
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。ついで、PCRの増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SyberGreen液等により染色し、増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００６３】
c．形質転換体培養による改良型タンパク質の取得
組替えタンパク質として製造する場合、本発明の改良型タンパク質は、上述の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。培養物とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６５】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20〜37℃で12時間〜3日間行う。
【００６６】
培養後、本発明の改良型タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を採取する。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
【００６７】
また、タンパク質の生合成反応にかかわる因子（酵素、核酸、ATP、アミノ酸など）のみを混合させた、いわゆる無細胞合成系を利用すると、生細胞を用いることなく、ベクターから本発明の改良型タンパク質を試験管内で合成することができる（参照文献13）。その後、前記と同様の精製法を用いて、反応後の混合溶液から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
【００６８】
単離精製した本発明の改良型タンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するため、該タンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる（参照文献14）。
【００６９】
（2）他の手法による改良型タンパク質の製造
本発明の改良型タンパク質は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによっても製造することができる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
【００７０】
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている（参照文献15）。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的の変異型タンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィーなどを利用することができる（参照文献16）。
【００７１】
3．改良型タンパク質の固定化
本発明の改良型タンパク質は、その抗体結合性を利用して、抗体捕捉剤として利用することができる。該抗体捕捉剤は、抗体の精製や除去、抗体を利用した研究、診断、治療、検査等に用いることができる。
【００７２】
本発明の抗体捕捉剤は、本発明の改良型タンパク質を含む限りにおいて、どのような形態であってもよいが、好ましくは、本発明の改良型タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化した形態が適切である。用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機-有機、有機-無機などの複合担体などが挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の選択性が良好であるため好ましい。
【００７３】
ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例として挙げられる。
【００７４】
市販品としては多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L等を例示することができる。ただし、本発明においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。又、本発明に用いる水不溶性担体としては、本抗体捕捉剤の使用目的および方法からみて、表面積が大きことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。
【００７５】
担体の形態としては、ビーズ状、線維状、膜状(中空糸も含む)など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10〜2500μmのものが使いやすく、とりわけ、リガンド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。
【００７６】
さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。
【００７７】
上記担体への改良型タンパク質の固定化においては、改良型タンパク質の立体障害を小さくすることにより捕捉効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
【００７８】
上記の担体へ導入される改良型タンパク質およびスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。
【００７９】
担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化し（担体が元々持っている官能基よりリガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変え）、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、捕捉剤の滅菌時または利用時に蛋白類が担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。
【００８０】
4．改良型タンパク質および抗体捕捉剤の性能確認試験
上記のようにして製造された改良型タンパク質および抗体捕捉剤は、以下の性能確認試験を行い良好なものを選択することができるが、後記実施例で示すように、本発明の改良型タンパク質および抗体捕捉材はいずれも良好な性能を有していた。
【００８１】
（1）抗体結合性試験
本発明の改良型タンパク質の抗体結合性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、表面プラズモン共鳴（SPR）法などを利用して確認・評価することができる。中でもSPR法は、生体間の相互作用をラベルなしでリアルタイムに経時的に観察することが可能であることから、改良型タンパク質の結合反応を速度論的観点から定量的に評価することができる。
【００８２】
また、水不溶性の固相支持体に固定化した改良型タンパク質の抗体結合性は、上記のSPR
法や液体クロマトグラフィー法で確認・評価することができる。中でも液体クロマトグラフィー法は、抗体結合性に及ぼすpH依存性を的確に評価することができる。
【００８３】
（2）改良型タンパク質の熱安定性試験
本発明の改良型タンパク質の熱安定性は、円偏光二色性（CD）スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法、加熱後の残留活性などを利用して評価することができる。中でもCDスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、改良型タンパク質の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。
【００８４】
参照文献1；Forsgren A and Sjoquist J (1966) "Protein A" from S.
Aureus. J Immunol. 97, 822-827.
参照文献2；Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins.
Academic Press, Inc., San Diego,
CA, USA.
参照文献3；Tashiro M, Montelione
GT. (1995)
Structures of bacterial immunoglobulin-binding domains and their complexes
with immunoglobulins. Curr Opin Struct
Biol. 5, 471-481.
参照文献4；Deisenhofer
J. (1981) Crystallographic
refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with
fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A
resolution. Biochemistry. 20(9), 2361-2370.
参照文献5；Gouda H, Torigoe H, Saito A,
Sato M, Arata Y, Shimada I. (1992) Three-dimensional solution structure of the
B domain of staphylococcal protein A: comparisons of the solution and crystal
structures. Biochemistry. 31(40), 9665-9672.
参照文献6；Tashiro M.; Tejero R.;
Zimmerman D.E.; Celda B.; Nilsson B.; Montelione G.T. (1997) 
High-resolution solution NMR structure
of the Z domain of staphylococcal protein A. Journal of Molecular Biology,
272(4), 573-590.
参照文献7；Starovasnik, M.A., Skelton,
N.J., O'Connell, M.P., Kelley, R.F., Reilly, D., Fairbrother, W.J. (1996) Solution
structure of the E-domain of staphylococcal protein A. Biochemistry 35,
15558-15569.
参照文献8；Graille,
M., Stura, E.A., Corper, A.L., Sutton, B.J., Taussig, M.J., Charbonnier, J.B.,
Silverman, G.J. (2000) Crystal
structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab
fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell
receptors and superantigen activity. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 5399-5404.
参照文献9；D'souza VM, Holz RC. (1999) The methionyl aminopeptidase from
Escherichia coli can function as an iron(II) enzyme. Biochemistry 38, 11079-11085.
参照文献10；特開昭63-267281号
参照文献11；特開2005-112827号
参照文献12；Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pullen J. M. and Pease L. R.
(1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene
splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.
参照文献13；岡田雅人、宮崎香 (2004) タンパク質実験ノート(上)、羊土社
参照文献14；大野茂男、西村善文監修 (1997) タンパク質実験プロトコール1−機能解析編、秀潤社
参照文献15；大野茂男、西村善文監修 (1997) タンパク質実験プロトコール2−構造解析編、秀潤社
【００８５】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８６】
なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。L-アラニン残基;Ala、L-アルギニン残基;Arg、L-アスパラギン酸残基;Asp、L-アスパラギン残基;Asn、L-システイン残基;Cys、L-グルタミン残基;Gln、L-グルタミン酸残基;Glu、L-グリシン残基;Gly、L-ヒスチジン残基;His、L-イソロイシン残基;Ile、L-ロイシン残基;Leu、L-リジン残基;Lys、L-メチオニン残基;Met、L-フェニルアラニン残基;Phe、L-プロリン残基;Pro、L-セリン残基;Ser、L-スレオニン残基;Thr、L-トリプトファン残基;Trp、L-チロシン残基;Tyr、L-バリン残基;Val。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端(以下N末端という)が左側に位置し、カルボキシル末端(以下C末端という)が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【００８７】
本明細書においては、核酸が有する塩基について、アデニン;A、チミン;T、ウラシル;U、グアニン;G、およびシトシン;Cの略号を用いて記載する。また、混合塩基について、以下の略号を用いる。R=(AまたはG)、Y=(CまたはT)、M=(AまたはC)、K=(GまたはT)、S=(GまたはC)、W=(AまたはT)、H=(A,CまたはT)、B=(G,TまたはC)、V=(G,CまたはA)、D=(G,AまたはT)、N=(A,C,GまたはT)。DNAにおけるチミンT)は、RNA中ではウラシル(U)に対応し、DNAとしての配列情報はRNAとしての配列情報をも包含する。本明細書においては、DNAおよびRNAの塩基配列を、その5’末端が左側に位置し、3’末端が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【実施例１】
【００８８】
1）プロテインA細胞膜外ドメインの変異部位及び置換するアミノ酸残基の選定
まず、プロテインAのBドメインとヒト免疫グロブリンGのFc領域の複合体の立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein
Data Bank（PDB;http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）よりダウンロードした（PDBコード：1FC2）。ついで、Fc領域から10オングストロームの距離の範囲内に存在するプロテインA・Bドメインのアミノ酸残基であって、かつ、プロテインA・Bドメイン単独の場合で20%以上の露出表面積比をもつアミノ酸残基を該立体構造座標データを用いて計算し、変異対象部位として選定した。選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号1]で示されるプロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個である。図４は、これらの変異対象部位の位置を複合体の構造上に表示したものである。【００８９】
ところで、プロテインAの各細胞膜外ドメインは配列相同性が高く（図2）、加えて、立体構造が実験的に明らかにされているD、E、およびZドメインは、Bドメイン単独の構造とほとんど差異がないことから（参考文献5〜8）、Bドメイン−Fc複合体の立体構造についての知見は、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体にも適用できる。【００９０】
即ち、Eドメイン−Fc複合体、Dドメイン−Fc複合体、Aドメイン−Fc複合体、Cドメイン−Fc複合体、及びZドメイン−Fc複合体の立体構造は未だ明らかにされていないが、上記、各細胞膜外ドメインの配列相同性とB、D、E、およびZドメイン単独の立体構造の類似性を基に判断すれば、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体が、Bドメイン−Fc複合体と相同の構造を形成することは、当然に類推することができる。したがって、上記選択した18個の変異対象部位が、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体においても、Bドメイン−Fc複合体と同等の空間的配置に位置することが強く期待され、Bドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた5位、6位、9位、10位、11位、13位、14位、15位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、35位および36位の18個の変異対象部位は、Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。【００９１】
即ち、選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号1]で示されるプロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインのアミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号3]で示されるプロテインA・Eドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、His5、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号4]で示されるプロテインA・Dドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号5]で示されるプロテインA・Aドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号6]で示されるプロテインA・Cドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個である。【００９２】
一方、該変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、ヒスチジンが最良である。これは、ヒスチジンが、中性域と弱酸性域の間で側鎖のプロトンの解離により化学的状態が大きく変化するので、プロテインAの各ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で大きく変化させることができるからである。したがって、各改良型プロテインA細胞膜外ドメインの変異部位及び置換するアミノ酸残基を以下のように選定した。【００９３】
プロテインA・Bドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Zドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Eドメイン変異体；Asp6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Gln15His、Leu17His、Asn18His、Ala24His、Asp25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Dドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Ala25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Aドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Cドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。【００９４】
なお、ここで、Eドメインの5位とB、C、およびZドメインの18位の野生型のアミノ酸残基はヒスチジンであるので、これをヒスチジンに置換しても、置換の前後で変化しないことから、EドメインにおいてHis5His、B、C及びZドメインにおいてHis18Hisは除外してある。【００９５】
本実施例の計算は、ccp4i 4.0 (Daresbury Laboratory, UK Science and
Technology Facilities Council)、Surface Racer 3.0 for
Linux（登録商標）（Dr. Oleg Tsodikov, The University of
Michigan）、Red Hat Enterprise Linux（登録商標） WS release 3（レッドハット）（以上ソフトウエア）、Dell
Precision Workstation370（デル）（以上ハードウエア）を用いて行った。
【実施例２】
【００９６】
2）変異型プロテインAライブラリのスクリーニング実験による好ましい変異部位の選定
上記、Bドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた5位、6位、9位、10位、11位、13位、14位、15位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、35位および36位の18個の変異対象部位のうち、より高い効果が期待できる好ましい変異対象部位を選定した。18個の変異対象部位のいずれか一つ以上がヒスチジン残基に置換した変異体の総数は、各部位が野生型のアミノ酸残基かヒスチジン残基のどちらか一方であるとすると、理論的には262,143（2の18乗より1引いた数）種類存在する。このような多数の変異体のなかからより高い効果が期待できる変異体を特定するには、進化分子工学技術を活用して変異型プロテインAライブラリを構築し、これより適切にスクリーニングすることで良好な変異体を選択すればよい。さらに得られた良好な変異体のアミノ酸配列を統計的に解析することで、より高い効果が期待できる好ましい変異対象部位を選定することができる。【００９７】
2-1）遺伝子ライブラリの作製
変異型プロテインAライブラリを構築するために必要となる遺伝子ライブラリは、[配列番号32]〜[配列番号35]で示される核酸配列を有するポリヌクレオチドをまず化学合成し、ついでこれらを組み合わせてオーバーラップ伸長法（参考文献12）を行うことで作製した。【００９８】
[配列番号32]〜[配列番号35]で示される核酸配列を有するポリヌクレオチドは、[配列番号1]で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質をコードする核酸配列の一部に対応し、オーバーラップに必要な20塩基長程度の相補領域をそれぞれの末端に有している。【００９９】
また、[配列番号32]で示される配列のプロテインAのBドメインの5’末端側には、塩基配列がGAATTCのEcoRIの制限酵素サイト、塩基配列がGGCGGTGGAGGCのグリシンリンカ―（GlyGlyGlyGly）、および塩基配列がCCATGGのNcoIの制限酵素サイトを付与し、[配列番号35]で示される配列のプロテインAのBドメインの3'末端側には、塩基破裂がAAGCTTのHindIIIの制限酵素サイトを付与している。【０１００】
さらに、上述の18個の変異対象部位に相当する位置には、野生型のアミノ酸とヒスチジンを共にコードすることができる混合塩基を導入した。即ち、5位においてはPheあるいはHisを共にコードすることができるYWTを、6位においてはAsnあるいはHisを共にコードすることができるMAYを、9位においてはGlnあるいはHisを共にコードすることができるCAWを、10位においてはGlnあるいはHisを共にコードすることができるCAWを、11位においてはAsnあるいはHisを共にコードすることができるMAYを、13位においてはPheあるいはHisを共にコードすることができるYWTを、14位においてはTyrあるいはHisを共にコードすることができるYATを、15位においてはGluあるいはHisを共にコードすることができるSAWを、17位においてはLeuあるいはHisを共にコードすることができるCWKを、24位においてはGluあるいはHisを共にコードすることができるSAWを、25位においてはGluあるいはHisを共にコードすることができるSAWを、27位においてはArgあるいはHisを共にコードすることができるCRYを、28位においてはAsnあるいはHisを共にコードすることができるMAYを、31位においてはIleあるいはHisを共にコードすることができるMWTを、32位においてはGlnあるいはHisを共にコードすることができるCAWを、35位においてはLysあるいはHisを共にコードすることができるMAWを、36位においてはAspあるいはHisを共にコードすることができるSATを導入した。【０１０１】
なお、混合塩基の組み合わせによっては、野生型のアミノ酸とヒスチジンのみならず第３のアミノ酸がコードされる場合もある。例えば、5位において用いたYWTは、TTT、TAT、CTT、CATの4種の配列を実現するが、それぞれPhe、Tyr、Leu、Hisをコードするので、第3のアミノ酸としてTyrとLeuが5位に導入される可能性が生じる。これらの第3のアミノ酸の存在を含めて当該ライブラリの配列多様性を算出すると、核酸配列として3.4×107個の、アミノ酸配列として2.5×107個の、分子種が理論的に作製されることになる。【０１０２】
2-2）T7ファージ・ディスプレイ法による変異型プロテインAライブラリの構築
上記のように設計、合成を行った遺伝子ライブラリを制限酵素EcoRIとHindIIIで処理し、T7ファージベクター(Novagen)とライゲーション反応（16℃、16時間）を行って、T7ファージゲノム上のg10遺伝子の3’末端側に連結した。【０１０３】
T7ゲノムは、T7 Select1-1b(Novagen)の試薬を用いて付属のT7 Select（登録商標） System Manualの手順に従った。連結したT7ファージゲノムを用いて、試験管内でのT7ファージ粒子パッケージング反応（22℃、2時間）を行ってファージを作製した。この時点のファージ・ライブラリは、プラーク・アッセイ法で調べたところ、約5.4×107個のファージを形成していることがわかった。【０１０４】
これを初期ライブラリとして、200mL LB培地にてO.D.600=1.0まで培養した大腸菌BLT5403株に感染させて増幅操作を行った。感染から約4時間後、遠心操作によって増幅したファージを上澄み溶液から回収した（T7ファージは溶菌作用があり、増幅後、大腸菌を壊して菌体外に放出する）。回収した上澄み溶液に、1/6容量の50％ポリエチレングリコール（PEG、分子量8000）溶液と、1/10容量の5M NaCl溶液を加えて4℃で一昼夜の撹拌を行った。【０１０５】
その後、遠心操作によるPEG沈殿でファージを粗精製した。PEG沈殿させたファージをTST buffer（10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl,
0.1% Tween20）で溶解させて、0.22μm径の除粒フィルターで濾過した。これによって、変異型プロテインA・Bドメインを提示したファージ・ライブラリ溶液を調整した。【０１０６】
2-3）ヒトモノクローナル抗体に対する結合スクリーニング
まず、モノクローナル抗体（ヒト免疫グロブリンG1）溶液（濃度3.36μＭ） 500μLとジメチルスルホキシド 50μｌにD-Biotinoyl-ε-aminocaproic
acid-N-hydroxy-succinimide ester(Roche) 1．4mgを溶かした溶液 25μｌを混合して3時間反応させ、未反応のD-Biotinoyl-ε-aminocaproic
acid-N-hydroxy-succinimide esterを取り除いて、ビオチン化モノクローナル抗体を作製した。【０１０７】
ついで、このビオチン化モノクローナル抗体溶液（濃度  0.5〜0.6μＭ） 500μｌにストレプトアビジン磁気ビーズ（Promega）0.6mLを混合し、抗体を磁気ビーズに固定化させた。このビオチン化抗体を固定した磁気ビーズ0.65mLに、上記で調整した変異型プロテインA・Bドメインを提示したファージ・ライブラリ溶液を加えて25℃で1時間振盪放置した。その後、TST buffer（10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween20）で10〜20回程度の洗浄操作を行うことで抗体と結合しないファージを除去した。【０１０８】
抗体と特異的に結合したファージを回収するために、50mM 酢酸ナトリウム溶液（pH5.0）を加え、充分混合したのち溶出させた。溶出したファージは、上記2-2)に記載の感染-増幅-PEG沈殿操作を行って、変異型プロテインA・Bドメインを提示したファージ・ライブラリ溶液を再び調整した。【０１０９】
上記2-2)および2-3）の操作をファージ・ディスプレイ法の1ラウンドとして、合計5ラウンドのスクリーニング実験を繰り返し行った。なお、スクリーニング実験に用いた溶出液は、2ラウンド目からpH6.0の50mM 酢酸ナトリウム溶液を用い、かつストレプトアビジン磁気ビーズ(promega)の量を徐々に少なくしてスクリーニングの選択圧を段階的に変化させた。【０１１０】
2-4）スクリーニングにより選択された良好な変異体の配列解析
5ラウンドのスクリーニング実験を行ったのち、溶出液内のファージを、プラーク・アッセイ法を用いて、LB培地プレート上にクローン化する。そして、96ウェルプレートにO.D.600=1.0まで培養した大腸菌BLT5403株を各ウェルに200μLずつ加え、LB培地プレート上のプラークをつついた爪楊枝でウェルを撹拌してファージを感染させ、37℃で一昼夜培養するとファージが溶菌してクローン化したファージ溶液ができる。【０１１１】
上記操作で用意されたファージが提示している変異型プロテインA・Bドメインのアミノ酸配列を確認するために、上記の96ウェルプレートからファージ溶液1μLをPCR反応溶液に混合して、ファージDNAを熱処理によって取り出し、PCRを行い （アニール53℃、5秒）
、変異型プロテインA遺伝子を増幅した。【０１１２】
使用したプライマーは、センスプライマーとして（配列番号36）、アンチセンスプライマーとして（配列番号37）を用いた。センスプライマー（配列番号36）はT7ファージゲノムのg10遺伝子上の配列をコードしたもので、アンチセンスプライマー（配列番号37）は、プロテインAのBドメインのC末端の配列と塩基配列がAAGCTTのHindIIIの制限酵素サイトをコードしたものである。得られた増幅物をExo nuclease(New England Biolabs)とAntarctic
Phosphatase (New England Biolabs) で処理した後、DNA sequencing法 (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1)によって、その核酸塩基配列を解析した。【０１１３】
クローン化した合計91種類のファージのg10遺伝子の3’末端側にある変異型プロテインA・Bドメインの核酸配列決定したところ、[配列番号28、29、43〜56] の16種のいずれかの配列に収束していることが確認された。この16種の核酸配列に対応するアミノ酸配列は、[配列番号7、8、14〜27] の16種である。【０１１４】
2-5) 良好な変異体のアミノ酸配列の統計的解析
クローン化した91種類のファージから得られた16種のアミノ酸配列は、結合スクリーニングにより選択された、より高い効果が期待できる良好な変異体群のごく一部である。即ち、16種のアミノ酸配列は、良好な変異体を母集団としたときの抽出標本とみなすことができるので、標本の統計的な解析から母集団の平均像を推定することができる。【０１１５】
表1は、各変異対象部位でどのようなアミノ酸置換が起こったかを16種のアミノ酸配列から求めたものである。表1に示される出現頻度の値は、各変異対象部位で下線を引いた野生型のアミノ酸からヒスチジン残基への置換が適切か否かの指標になる。例えば、5位ではPheの値が0.19であるのに対しHisの値は0.63と高く、これは5位がヒスチジン置換により中性域の結合活性を維持しつつ酸性域の結合活性が低下するような、より高い効果が期待できる変異対象部位として好ましいことを示している。同様の解析を進めれば、5位と共に9位、10位、11位、15位、27位、28位、35位、36位も変異対象部位として好ましいことがわかる。野生型のアミノ酸がもともとヒスチジン残基である18位を加えると、上記1)で選択した18個の変異対象部位のうち、5位、9位、10位、11位、15位、18位、27位、28位、35位、36位の10個が好ましい変異対象部位であることがわかる。【０１１６】
【表１】
2012165544.tif 000003
【０１１７】
以上の10個の好ましい変異対象部位は、上記1)で述べたように、プロテインA・Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。【０１１８】
即ち、好ましい変異対象部位として選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号1]で示されるプロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号3]で示されるプロテインA・Eドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、His5、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号4]で示されるプロテインA・Dドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号5]で示されるプロテインA・Aドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号6]で示されるプロテインA・Cドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個である。【０１１９】
したがって、上記1)で選定した各改良型プロテインA細胞膜外ドメインの変異部位及び置換するアミノ酸残基のうち、好ましいものとして以下を選定した。【０１２０】
プロテインA・Bドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Zドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Eドメイン変異体；Gln9His、Gln10His、Asn11His、Gln15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Dドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Aドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Cドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。【０１２１】
なお、上記1)で述べたように、Eドメインの5位とB、C、およびZドメインの18位の野生型のアミノ酸残基はヒスチジンであるので、これをヒスチジンに置換しても、置換の前後で変化しないことから、EドメインにおいてHis5His、B、C及びZドメインにおいてHis18Hisは除外してある。
【実施例３】
【０１２２】
3）改良型プロテインA細胞膜外ドメインの設計
上記から明らかなように、本発明の改良型タンパク質の設計において、選定される変異対象部位は一つに限られるものではない。複数の変異対象部位の中から適宜選択して、それらを組み合わせた点変異体あるいは多重変異体を改良型タンパク質とすることができる。その選択は、無作為に行ってもよいし、構造活性相関等の他の公知の情報を加味してもよい。また、プロテインAの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異と組みあわせてもよい。【０１２３】
例えば、ファージ・ディスプレイ法のスクリーニング実験から得られた[配列番号7]で示されるAsn6His/Asn11His/Glu15Asp/Glu24Gln/Glu25HisプロテインA・Bドメインの五重変異体、あるいは[配列番号8] で示されるAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/ Gln32His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの五重変異体のアミノ酸配列でもよい。また、このBドメインのスクリーニング実験から得られた[配列番号8] の五重変異体の5つの変異Asn6His、Glu24His、Glu25Gln、Gln32His、Asp36Hisを、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインのアミノ酸配列に導入した[配列番号9]で示されるAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/
Gln32His/Asp36HisプロテインA・Zドメインの五重変異体のアミノ酸配列でもよい。【０１２４】
さらには、例えば、6位にヒスチジンを導入したAsn6HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号10）、24位にヒスチジンを導入したGlu24HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号11）、32位にヒスチジン残基を導入したGln32HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号12）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号13）、9位にヒスチジン残基を導入したGln9HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号61）、10位にヒスチジン残基を導入したGln10HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号62）、15位にヒスチジン残基を導入したGlu15HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号63）、27位にヒスチジン残基を導入したArg27HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号64）、9位と36位にヒスチジン残基を導入したGln9His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号65）、10位と36位にヒスチジン残基を導入したGln10His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号66）、15位と36位にヒスチジン残基を導入したGlu15His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号67）、27位と36位にヒスチジン残基を導入したArg27His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号68）、35位と36位にヒスチジン残基を導入したLys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号69）、9位と32位にヒスチジン残基を導入したGln9His/Gln32HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号70）、10位と32位にヒスチジン残基を導入したGln10His/ Gln32HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号71）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Zドメインの点変異体（配列番号72）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Cドメインの点変異体（配列番号74）、9位にヒスチジン残基を導入したGln9HisプロテインA・Zドメインの点変異体（配列番号75）、あるいは9位と36位にヒスチジン残基を導入したGln9His/Asp36HisプロテインA・Cドメインの二重変異体（配列番号76）のアミノ酸配列でもよい。【０１２５】
以下の実施例では、本発明の改良型プロテインA細胞膜外ドメインうちの、[配列番号7]〜[配列番号13]、[配列番号61]〜[配列番号72]、[配列番号74]〜[配列番号76]で示されるアミノ酸配列を具体例として選び、これらの配列で示す変異型タンパク質を実際に合成した。加えて、[配列番号1]で示される野生型のプロテインA・Bドメイン、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメイン、および[配列番号6]で示される野生型のプロテインA・Cドメインも合成し、これらと比較することで、改良型タンパク質の分子特性を評価した。【０１２６】
4）改良型プロテインA細胞膜外ドメインアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列の設計
改良型プロテインA細胞膜外ドメインをコードする遺伝子の塩基配列（[配列番号28]〜[配列番号30]、[配列番号57]〜[配列番号60]、[配列番号77]〜[配列番号91]）については、上記の各改良型プロテインA細胞膜外ドメインのアミノ酸配列に基づき設計した。これらの改良型タンパク質は、タグなし、融合なしの単純タンパク質として大腸菌を用いて製造されるため、設計した遺伝子の塩基配列の5’末端には開始コドン配列が付加される。このことから、野生型のプロテインA・Bドメイン乃至改良型タンパク質M-PABは、[配列番号1]、[配列番号7]、[配列番号8]、[配列番号10] 〜[配列番号13] または[配列番号61]〜[配列番号71]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。野生型のプロテインA・Zドメイン乃至改良型タンパク質M-PAZは、[配列番号2]、[配列番号9]または[配列番号72]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。野生型のプロテインA・Cドメイン乃至改良型タンパク質M-PACは、[配列番号6] 、[配列番号74]〜[配列番号76]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。なお、これらN末端のMetは、大腸菌内に存在するメチオニルアミノペプチダーゼ等の酵素の影響で選択的に切断されて合成されることもある。【０１２７】
5）改良型プロテインA細胞膜外ドメインの製造
以下に示すように、まず、野生型及び改良型のプロテインA・Bドメイン、ZドメインまたはCドメインをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いて、Metが付加された野生型（M-PAB01）及び改良型（M-PAB2〜19）プロテインA・Bドメイン、野生型（M-PAZ01）及び改良型（M-PAZ03、M-PAZ08）プロテインA・Zドメイン、野生型（M-PAC01）及び改良型（M-PAC08、M-PAC09、M-PAC13）プロテインA・Cドメインを製造した。これらのタンパク質のアミノ酸配列の構成及び変異を表2に示す。【０１２８】
【表２】
2012165544.tif 000004
【０１２９】
5-1）M-PABまたはM-PAZ発現用プラスミドの合成
M-PAB02〜M-PAB03については、上記2）で作成したファージDNAを鋳型に、制限酵素認識配列を含むプライマーを加えPCRを行い（アニール49℃, 15秒）、PAB遺伝子領域を増幅した。【０１３０】
使用したプライマーは、センスプライマーとして（配列番号36）、アンチセンスプライマーとして（配列番号37）を用いた。得られた増幅物は、アガロース電気泳動法(3%, 100V）で確認後、QIAquick PCR
Purificationkit(Qiagen)を用いて精製した。その後、制限酵素NcoIとHindIII (日本ジーン, 37℃,一昼夜）で消化した変異型PAB遺伝子(pab02またはpab03)と、同じ制限酵素で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET16bまたはpET21d(Novagen)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。【０１３１】
正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolonyPCR法、DNA sequencing法 (GE  Healthcare Bioscience, BigDye
Terminator v1.1) により選別し、QiaprepSpin Miniprep
kit(Qiagen)を用いてM-PAB発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。【０１３２】
M-PAZ01については、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインをコードする配列塩基を含むプラスミドを鋳型に、制限酵素認識配列を含むプライマーを加えPCRを行い（アニール49℃, 15秒）、PAZ遺伝子領域を増幅した。【０１３３】
使用したプライマーは、センスプライマーとして CACCATGGTGGATAACAAACを、アンチセンスプライマーとしてTAGGATCCTTATTTTGGTGCTTGTGCATCを用いた。得られた増幅物は、アガロース電気泳動法(3%, 100V）で確認後、QIAquick PCR Purification
kit(Qiagen)を用いて精製した。【０１３４】
その後、制限酵素Nco
IとBamH I (日本ジーン, 37℃, 一昼夜）で消化したPAZ遺伝子(paz01)と、同じ制限酵素で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET16b (Novagen)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolony PCR法、DNA sequencing法 (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1) により選別し、Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PAZ発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。【０１３５】
M-PAB01またはM-PAZ03については、 [配列番号1]および[配列番号9]で示されるプロテインA・Bドメインおよび改良型プロテインA・Zドメインをコードする配列塩基を含む人工合成プラスミド（Biomatik）より調整した。まず、このプラスミドを制限酵素NdeIとXhoI (日本ジーン, 37℃,一昼夜）で消化し、同じ制限酵素で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET21a(Novagen)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリン含むLBプレート培地で選択した。Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PAB01またはM-PAZ03発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3)
株（Novagen）を形質転換した。【０１３６】
M-PAB04〜M-PAB08については、作製したM-PAB01またはM-PAZ01のプラスミドベクターを鋳型にしてQuikChange（登録商標） Multi Site-Directed
Mutagenesis Kit （Stratagene）を用いて、変異導入を行った。その際に用いたプライマー配列は、[配列番号38]〜 [配列番42]に示す。M-PAB09〜12については作製したM-PAB01のプラスミドベクターを鋳型に、M-PAB13〜17については作製したM-PAB08のプラスミドベクターを鋳型に、M-PAB18〜19は作製したM-PAB07のプラスミドベクターを鋳型に、QuickChange (登録商標) Site-Directed Mutagenesis
Kit (Stratagene) を用いて、変異導入を行った。その際に用いたフォワードプライマー配列は[配列番号92]〜 [配列番96]で示すもので、リバースプライマーは各フォワードプライマー配列に相補的な配列からなるものである。M-PAZ08については、作製したM-PAZ01のプラスミドベクターを鋳型にQuickChange (登録商標) Multi Site-Directed
Mutagenesis Kit (Stratagene) を用いて、変異導入を行った。その際に用いたプライマー配列は、[配列番号42]に示す。得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolony PCR法、DNA sequencing法 (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1) により選別し、Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PAB発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。
M-PAC01、M-PAB08、M-PAB09、M-PAB13については、発現用プラスミド(GenScript)を購入し、これを発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。【０１３７】
5-2）組換えタンパク質の発現と精製
LB培地で前培養した大腸菌BL21(DE3) 形質転換体を、50μL/10mLで100μg/mLアンピシリンを含むLB培地に継代し、O.D.600 = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。最終濃度1mM でIPTGを加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mLのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った。破砕液は濾過滅菌後、濾液をTST (25mMTris-HCl(pH7.6),
150mM NaCl, 0.1% Tween20) で平衡化したIgGSepharose 6 Fast
Flow (GE Healthcare Bioscience) microspinに加え、M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質を結合させた。未吸着成分をTSTで洗浄後、TSTを50mM
Na3citrate (pH7.0)に置換し、さらに0.5M acetate (pH2.5)に置換してM-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質を溶出した。溶出液は50mM Na phosphate (pH6.8)で透析を行った後4℃で保存した。【０１３８】
6）得られた改良型プロテインA細胞膜外ドメインの純度
上記5）で得られた、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質の純度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で以下のように確認した。精製後の各タンパク質をそれぞれ75μM程度の濃度の水溶液に調製したのち、Tricine-SDS-PAGE（16%T, 2.6%C, 100V, 100min）を行いCBB(G-250) 染色によりバンドを検出し純度を確認した。その結果、各タンパク質は、測定したすべての試料においてメジャーバンドとして検出され、精製度も充分であることが確認された。【０１３９】
7) 改良型プロテインA細胞膜外ドメインの固定化
上記5）で得られた、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質は、そのアフィニティリガンドとしての特性を評価するために、以下の方法で固定化し、アフィニティクロマトグラフィーカラムを作成した。【０１４０】
HiTrap NHS-activated HP（GE
Healthcare）1mLのカラムを用いて、Sepharose上のN-ヒドロキシスクシインミド（NHS）とプロテインAの上の第1級アミンとがアミド結合を形成することを利用してリガンドタンパク質を固定化する。固定化方法は、カラムに6mLの1mM HClを流してカラム中のイソプロパノール溶液を置換し、そこに1mLのリガンドタンパク質溶液（濃度 2.6〜2.8mg/mL）を注入して4℃で一昼夜反応させる。そして、溶液A（0.5M Tris-HCl 、0.5M
NaCl pH8.3)と溶液B（0.1M acetate、0.5M NaCl pH4.0）を用いて、洗浄操作およびブロッキング操作を行う。溶液Aを6mL、溶液Bを6mL、そして溶液Aを6mLという順番で溶液を流し、溶液Aに置換した状態で4℃、6時間反応させて未反応のNHSをTrisと反応させるブロッキング操作を行う。つづいて、溶液Bを6mL、溶液Aを6mL、溶液Bを6mLという順番で溶液を流して洗浄操作を行って、TST buffer（25mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl,
0.1% Tween20）で平衡化してアフィニティカラムの作製を完了する。
【実施例４】
【０１４１】
8）固定化カラムを用いた改良型タンパク質の抗体結合性評価（グラジエント法）
以下のようにして、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質を固定化したカラムを用いてpH勾配アフィニティクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出するpHを調べることで、改良型プロテインAの酸性域での抗体結合性を評価した。【０１４２】
まず、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience) にセットし、TST buffer（25mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl,
0.1% Tween20）を0.5mL/minの条件で流し平衡化させた後、100〜200μLの1mg/mLのサンプル（IgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体）を注入した。次いで、TST bufferを50mM  citrate Na(pH7.0) に置換し、さらに0.5mL/minの流速で10minかけて連続的に500mM 酢酸溶液（pH2.5）へ置換することで、pH勾配(pH7.0→2.5/10min)を実現した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUV検出器(280nm)とpH検出器の出力から、モノクローナル抗体が溶出するピークのpHを記録した。【０１４３】
その結果、M-PAB03を固定化したカラムにおいては、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質（M-PAB01）を固定化したカラムに比べて約1.1ポイントの高いpHで、HiTrapTM  rProtein
A FF (GE Healthcare)に比べて約1.2ポイントの高いpHで、ヒト化モノクローナル抗体が溶出することが明らかになった（図5、図7）。また、M-PAB08とM-PAB13を固定化したカラムは、M-PAB01に比べてそれぞれ約1.1ポイントと約2.0ポイントの高いpHで、M-PAZ08を固定化したカラムは、M-PAZ01に比べて約0.7ポイント高いpHで、M-PAC08とM-PAC13を固定化したカラムは、M-PAC01に比べてそれぞれ約1.0ポイントと約1.7ポイントの高いpHで、ヒト化モノクローナル抗体が溶出することが明らかになった（図7〜10）。【０１４４】
9）固定化カラムを用いた改良型タンパク質の抗体結合性評価（ステップワイズ法）
以下のようにして、各M-PABおよびM-PAZタンパク質を固定化したカラムを用いてステップワイズpHアフィニティクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出状態を、各pHで調べることで、改良型プロテインAの酸性域での抗体結合性を評価した。【０１４５】
まず、M-PABまたはM-PAZタンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTA prime plus (GE Healthcare Bioscience)にセットし、リン酸バッファ（50mM Na2HPO4/NaH2PO4 (pH7.0)）を0.5mL/minの条件で流し平衡化させた後、100〜200μLの1mg/mLのサンプル（IgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体）を添加した。5mLのリン酸バッファで洗浄、5mLの溶出バッファ（20mM クエン酸ナトリウム, pH4.0）で溶出を行った。その後、500mM 酢酸溶液（pH2.5）でカラムを洗浄し、最後に10mLのリン酸バッファでカラムを再平衡した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUV検出器（280nm）の出力から、ヒトポリクローナルFc領域のステップワイズpHの溶出するパターンを得られた。【０１４６】
その結果、M-PAZ01を固定化したカラムを用いてpH4.0で溶出すると、pH4.0で少しずつ溶出しpH3.9で溶出ピークを示した。M-PAB02を固定化したカラムを用いてpH4.0で溶出すると、pH3.9の溶出ピークのみを示した。M-PAB03を固定化したカラムを用いてpH4.0で溶出すると、溶出溶液を流し始めてすぐにpH6.4のところで溶出し始め、pH5.7の溶出ピークを示した。HiTrapTM  rProtein
A FF (GE Healthcare) を用いてpH4.0で溶出すると、pH3.7の溶出ピークを示した（図6）。
【実施例５】
【０１４７】
10）表面プラズモン共鳴法による改良型タンパク質の抗体結合性評価
以下のようにして、中性域および弱酸性域における各M-PABおよびM-PAZタンパク質の抗体結合性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。【０１４８】
まず、センサーチップの測定セルにIgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体をアミンカップリング法により固定化した。測定のコントロールとして、カルボキシメチル基をエタノールアミンでブロッキングした対照セルを用いた。センサーチップとして、CM5 (Biacore)を用いた。次いで、単離精製した各M-PABまたはM-PAZタンパク質を、中性領域のランニング緩衝液であるHBS-P (10mM
HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)に溶解し、それぞれ3種の濃度の試料溶液を調製した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。収集したデータは、Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて解析し、1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせ、解離平衡定数KDを算出した。【０１４９】
その結果、改良型タンパク質M-PAZ03は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質M-PAZ01に比較し、pH7.4での結合性は同程度であるが、pH5.0での抗体結合性は約1/25に低下した（表3）。【０１５０】
【表３】
2012165544.tif 000005
【０１５１】
中性域および弱酸性域における各M-PABおよびM-PAZタンパク質の抗体結合性をさらに調べるため、再度SPR法による評価試験を行った。【０１５２】
試料の調整法は、上述とまったく同じである。SPRの測定は、Biacore
T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。収集したデータは、Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて解析し、1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせ、解離平衡定数KDを算出した。【０１５３】
フィッティングの精度を向上させるため、pH7.4では計算式［Rmax ＝リガンド固定化量×（アナライトの分子量／リガンドの分子量）×リガンドの結合部位数］を用いてRmaxをあらかじめ定めて、これを固定値として扱い非線形回帰計算を行った。pH5.0では、Rmaxをあらかじめ定めずに、これを変動値として扱いFit GlobalまたはFit Localモードで非線形回帰計算を行った。【０１５４】
その結果、改良型タンパク質M-PAB08、M-PAZ08は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質M-PAB01、M-PAZ01と比較し、pH7.4での結合性は同程度であるが、pH5.0での抗体結合性はそれぞれ約1/140、約1/30に低下した（表4）。また、M-PAB13、M-PAB14、M-PAB16、M-PAB17、M-PAB19は、pH5.0での抗体結合性が大きく低下したため、定量下限を下回り、解離平衡定数を算出するに至らなかった。【０１５５】
【表４】
2012165544.tif 000006
【０１５６】
11）円偏光二色性スペクトル法による改良型タンパク質の熱安定性評価
以下のようにして、各M-PABおよびM-PAZタンパク質の熱安定性を円偏光二色性（CD）スペクトルにより評価した。なお、CDスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。CDスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、どの程度の温度で各々の改良型プロテインAが変性するのかを明らかにすることができる。【０１５７】
まず、単離精製した各タンパク質をそれぞれ5〜25μMの濃度で含む水溶液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0）に調製した。この試料溶液を円筒型セル（セル長0.1cm）に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計（日本分光）を用いて、20℃の温度で測定波長を260nmから195nmに移動させCDスペクトルを得た。同じ試料を98℃に加熱、さらに98℃から20℃に冷却し260nmから195nmのCDスペクトルを得た。加熱後再冷却したスペクトルが加熱前のスペクトルと同様であるか否か、すなわちスペクトルの回復率は、各タンパク質の熱変性に対する可逆性の指標となる。【０１５８】
野生型プロテインA・Bドメイン（M-PAB01）及び改良型プロテインA・Bドメイン（M-PAB2〜17）については、いずれのタンパク質もあまり回復しなかったのに対し（回復率40%以下）、野生型プロテインA・Zドメイン（M-PAZ01）及び改良型プロテインA・Zドメイン（M-PAZ03、M-PAZ08）は十分な回復が認められた（回復率60〜90%）。これは、可逆性の高低はBドメインであるかZドメインであるかという野生型の配列の差異によって主に決定され、ヒスチジン置換が可逆性に対して及ぼす影響は小さいことを意味している。【０１５９】
次いで、測定波長を222nmに固定し20℃から100℃に1℃/minの速度で昇温させてモル楕円率の経時変化を測定した。得られた熱融解曲線について二状態相転移モデルの理論式（非特許文献：有坂、バイオサイエンスのための蛋白質科学入門）を用いて解析し、変性温度Tm、およびTmにおける変性のエンタルピー変化dHmを決定した。【０１６０】
その結果、改良型プロテインAの多くはヒスチジン置換によって安定性が低下するものの、M-PAB08とM-PAZ08は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質(M-PAB01あるいはM-PAZ01)とほぼ同等の安定性を有していることが明らかになった（表5）。【０１６１】
【表５】
2012165544.tif 000007
【図１】
2012165544.tif 000008
【図２】
2012165544.tif 000009
【図３】
2012165544.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月27日(2013.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1で示されるアミノ酸配列のプロテインAのBドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項２】
配列番号2で示されるアミノ酸配列のプロテインAのZドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Gln9、sp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項３】
配列番号3で示されるアミノ酸配列のプロテインAのEドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項４】
配列番号4で示されるアミノ酸配列のプロテインAのDドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項５】
配列番号5で示されるアミノ酸配列のプロテインAのAドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項６】
配列番号6で示されるアミノ酸配列のプロテインAのCドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項7に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項8に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項1〜6のいずれか１項に記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。
【請求項１１】
請求項10に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体結合性タンパク質であるプロテインAの細胞膜外ドメインの新規改良型タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、及び該タンパク質の抗体結合性を利用した抗体の捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であるプロテインAは、抗体の一種である免疫グロブリンG、免疫グロブリンA、および免疫グロブリンMの定常領域に対して親和性を有することが知られている（非特許文献1、非特許文献2）。
【０００３】
プロテインAは、複数のドメインからなるマルチドメイン型膜タンパク質で、免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に対する結合活性（以下抗体結合活性と呼ぶ）を示すのは、このうちの一部の細胞膜外ドメインである（非特許文献2）。たとえば、図1および図3に示すNCTC8325株由来のプロテインAの場合、抗体結合活性を示すのは、E、D、A、B、Cの5つのドメインである。これらは、60アミノ酸弱の小型タンパク質で、そのアミノ酸配列の間には高い相同性が見られる（図2）。また、プロテインAを切断して各々のドメイン単独を単離しても、抗体結合活性は保たれることが知られている（非特許文献3）。
【０００４】
一方、Zドメインは、Bドメインの配列をもとに合成された人工タンパク質で（非特許文献3）、Bドメインとは、アミノ酸残基が2箇所異なる（図2）。このAla1ValとGly29Alaの2置換により、抗体結合性が失われことはないが構造が安定化することが知られており、その熱変性温度は90℃程度になる（非特許文献3）。
【０００５】
プロテインAの細胞膜外ドメイン(E、D、A、B、C)およびZドメインは、現在、その選択的な抗体結合活性を利用した多くの製品が上市されている（例えば、抗体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー用担体(特許文献1、2)や抗体を検出するための検査試薬、研究試薬など）。プロテインAの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は、中性域で高く、強酸性域で低いことが知られている（非特許文献4）。
【０００６】
ゆえに、抗体の単離、回収、精製を目的とした場合、まず、血清等の抗体を含む試料溶液を中性状態にして、プロテインAの細胞膜外ドメインを固定化したビーズ等の水不溶性の固相支持体に接触させ、抗体を選択的に吸着させる。この後、pH7の中性溶液で洗浄し抗体以外の成分を除去する。最後にpH3.0の強酸性溶液を加え抗体を固定化したプロテインAから脱着させ、強酸性溶液と共に溶出させることが一般的である（特許文献1、2、3）。これにより、高い純度で抗体を単離、回収、精製することができる。
【０００７】
しかし、抗体はpH3.0程度の強酸性溶液におくと変性凝集等で劣化することがあり、抗体の種類によっては、本来の機能を失う場合もある（非特許文献4）。これを防ぐために、pH3.0より高いpHの弱酸性域で溶出処理することが試みられるが、プロテインAの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は強いので、弱酸性域では抗体はプロテインAから溶出せず、十分な回収量が得られない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第3995018号明細書
【特許文献２】特開昭63-258500号公報
【特許文献３】特開昭63-267281号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Forsgren A and Sjoquist J (1966) "ProteinA" from S. Aureus. J Immunol.97, 822-827.
【非特許文献２】Boyle M. D.P.,Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA.
【非特許文献３】Tashiro M, Montelione GT. (1995)Structures ofbacterial immunoglobulin-binding domains and their complexes withimmunoglobulins. Curr Opin Struct Biol.5, 471-481.
【非特許文献４】GagnonP. (1996) Purification Tools for MonoclonalAntibodies, Validated Biosystems Inc., Tucson, AZ, USA.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来技術における問題点を解消することにあり、より具体的には、中性域での選択的な抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインAの細胞膜外ドメインに比べて、酸性域における免疫グロブリンの定常領域との結合性が低下した改良型タンパク質を提供するとともに、この改良型タンパク質を用いて、抗体を変性させることなく容易に捕捉、回収可能にすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、プロテインAの細胞膜外ドメインを固定化した固相支持体から抗体を酸溶出する際に、抗体が強酸によって劣化するのを防ぐには、弱酸性溶液で固相支持体から溶出できるようにプロテインAの細胞膜外ドメインのアミノ酸配列を改変すれば良いと考え、鋭意研究の結果、中性域における改変タンパク質の免疫グロブリン定常領域との結合性が、野生型プロテインAと同程度であり、かつ酸性域における改変タンパク質の抗体結合性は、野生型プロテインAに比べて大きく低下する新規なプロテインA変異体の配列の設計法を構築した。そして、これら設計に基づき合成された変異型タンパク質が、意図どおりの物性を有することを確認し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１２】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
（1）
配列番号1で示されるアミノ酸配列のプロテインAのBドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の
（a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a）
配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（2）
配列番号2で示されるアミノ酸配列のプロテインAのZドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（3）
配列番号3で示されるアミノ酸配列のプロテインAのEドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（4）
配列番号4で示されるアミノ酸配列のプロテインAのDドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の
（a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（5）
配列番号5で示されるアミノ酸配列のプロテインAのAドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の
（a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（6）
配列番号6で示されるアミノ酸配列のプロテインAのCドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（7）
配列番号1で示されるアミノ酸配列のプロテインAのBドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（8）
配列番号2で示されるアミノ酸配列のプロテインAのZドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（9）
配列番号3で示されるアミノ酸配列のプロテインAのEドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（10）
配列番号4で示されるアミノ酸配列のプロテインAのDドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（11）
配列番号5で示されるアミノ酸配列のプロテインAのAドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（12）
配列番号6で示されるアミノ酸配列のプロテインAのCドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列。
（b） （a） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（c） （a） 又 （b） のヒスチジン置換アミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が、1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質。
（13）
配列番号1で示されるアミノ酸配列のプロテインAのBドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の
（a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号7、8、10〜12、15、20〜23、25〜27のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
（14）
配列番号1で示されるアミノ酸配列のプロテインAのBドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の
（a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号13、14、16〜19、24、61〜71のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
（15）
配列番号2で示されるアミノ酸配列のプロテインAのZドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号9又は72で示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
(16)
配列番号6で示されるアミノ酸配列のプロテインAのCドメインタンパク質に由来する変異型タンパク質であって、以下の （a） 〜 （c） のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのCドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質。
（a） 配列番号74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列。
（b） （a） のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列。
（c） （a） 又は （b）
のアミノ酸配列において、ヒスチジン残基置換部位以外のアミノ酸残基が1個若しくは数個欠失又は置換されたアミノ酸配列。
（17）
（1）〜（16）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と任意のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンデム型タンパク質。
（18）
（1）〜（17）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
（19）
（1）〜（18）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と該タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化するためのスペーサーのアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなるスペーサー付タンパク質。
（20）
（1）〜（19）のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
（21）
配列番号28〜30、43〜60、77〜91のいずれかで示される、塩基配列からなる（20）に記載の核酸。
（22）
（20）又は（21）に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンの定常領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインAの抗体結合ドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した変異型タンパク質をコードする核酸。
（23）
（20）〜（22）のいずれかに記載の核酸を含有する組換えベクター。
（24）
（23）に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
（25）
（1）〜（19）のいずれかに記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。
（26）
（1）〜（19）のいずれかに記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
（27）
（25）に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の捕捉剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、中性域において本来の抗体結合活性を維持しつつ、配列番号1、3〜6で表されるアミノ酸配列からなるプロテインAの各野生型ドメイン（B、E、D、A、またはC）、あるいは配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるZドメインに比べて、酸性域における免疫グロブリンの定常領域との結合性が大きく低下させる変異型タンパク質が提供可能となる。さらにこれら変異型タンパク質からなる抗体捕捉剤を使用して捕捉した抗体を、弱酸性領域において変性のない状態でより容易に溶出することが可能となる。
【００１４】
一方、現在、野生型のプロテインA細胞膜外ドメインは、抗体の精製用のアフィニティークロマトグラフィー担体や抗体検出のための検査試薬として市販され、ライフサイエンスの各分野で広範に利用されている。また、近年の抗体医薬をはじめとする抗体関連産業の発展をうけて、これらの製品の需要が飛躍的に拡大している。したがって、多くのプロテインA細胞膜外ドメイン含有製品において、本発明のような改良型タンパク質を野生型と代替することにより、酸溶出に伴う抗体の劣化を低減することを可能にし、抗体を扱う広範な技術分野において、その技術発展に大いに資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC8325由来のプロテインAの遺伝子の構造を示す図である。
【図２】プロテインAの抗体結合ドメインのアミノ酸配列を示す図である（下線部はBドメインとの相違部分）。
【図３】Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC8325由来のプロテインAの遺伝子の塩基配列を示す図である（下線部が抗体結合ドメインに対応）。
【図４】プロテインA・Bドメインとヒト免疫グロブリンGのFc領域の複合体の立体構造を示す図である。
【図５】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図６】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(ステップワイズ法)の結果を示すグラフである。
【図７】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図８】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図９】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【図１０】固定化カラムを用いた改良型タンパク質の酸性域での抗体結合性評価(グラジエント法)の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の改良型タンパク質は、上記プロテインAのアミノ酸配列をもとに人為的に設計したアミノ酸配列からなるものであって、中性域での選択的な抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインAの細胞膜外ドメインに比べて、酸性域での抗体結合活性が弱く、弱酸性溶液での抗体の溶出を可能にする。
【００１７】
本発明の改良型タンパク質の態様は以下の（ア）〜（カ）で示される。
（ア）プロテインAのBドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのBドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Bドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質における、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００１８】
（イ）プロテインAのZドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのZドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAのZドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号2で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００１９】
（ウ）プロテインAのEドメイン変異型タンパク質。
本発明におけるプロテインAのEドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Eドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号3で示されるアミノ酸配列において、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはGln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいは、b）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、さらに1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいは、c）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、ヒスチジン置換部位以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２０】
（エ）プロテインAのDドメイン変異型タンパク質
本発明におけるプロテインAのDドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Dドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号4で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいは、b）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、さらに1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列であるか、あるいは、c）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、ヒスチジン置換部位以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２１】
（オ）プロテインAのAドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのAドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Aドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号5で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）の変異導入アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２２】
（カ）プロテインAのCドメイン変異型タンパク質
本発明のプロテインAのCドメイン変異型タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に結合活性を有し、かつプロテインAの野生型Cドメインに比べ、免疫グロブリンの定常領域に対する酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質であって、
a）配列番号6で示されるアミノ酸配列において、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36のうちの、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列からなるか、あるいはb）上記a）のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるか、あるいはc）上記a）又はb）の該アミノ酸配列において、上記置換したヒスチジン残基以外の1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失又は置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２３】
1．改良型タンパク質のアミノ酸配列の設計
上記（ア）〜（カ）の変異型タンパク質は、以下のように選定された変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基に基づき設計され、遺伝子工学的手法等により得られる。
【００２４】
本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位は、プロテインA・Bドメインと免疫グロブリンGのFc領域が結合した複合体の立体構造原子座標データ（参照文献4）、およびファージディスプレイ法により得られた変異型プロテインAライブラリからのスクリーニング実験の頻度解析データを用いて選定したものである。
【００２５】
酸性域におけるプロテインAの細胞膜外ドメインの抗体結合性を低下させるには、Fc領域との結合に直接関与しているプロテインAの細胞膜外ドメインの結合表面のアミノ酸残基およびその周辺のアミノ酸残基を野生型から非野生型に置換すればよい。
【００２６】
したがって、まず、プロテインA・Bドメインと免疫グロブリンGのFc領域が結合した複合体において、Fc領域から一定の距離の範囲内に存在するプロテインA・Bドメインのアミノ酸残基を特定し、これを変異対象部位の候補とする。ついで、アミノ酸置換に伴うプロテインAの細胞膜外ドメインの構造不安定化を最小限にするために、上記の候補のうち、プロテインA・Bドメインの分子表面に露出しているアミノ酸残基のみを変異対象部位と決定した。
【００２７】
したがって、具体的には、後記実施例に示されるように、上記の距離範囲を10オングストローム以内と設定し、かつ露出表面積比を20%以上とすることで、プロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号1）のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が変異対象部位として選定された。続いて、この18個の変異対象部位のうち、高い効果が期待できるより好ましい変異対象部位を、ファージディスプレイ法により得られた変異型プロテインAライブラリからのスクリーニング実験の配列解析データを用いて選定した。
【００２８】
具体的には、後記実施例に示されるように、配列解析データにおいて、ヒスチジン残基の頻度が野生型のアミノ酸残基の頻度より大きい部位とすることで、プロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号1）のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が好ましい変異対象部位として選定された。
【００２９】
ところで、上記したように、プロテインAの各細胞膜外ドメインは配列相同性が高く（図2）、加えて、立体構造が実験的に明らかにされているD、E、およびZドメインは、Bドメイン単独の構造とほとんど差異がないことから（参照文献5〜8）、Bドメイン−Fc複合体の立体構造についての知見は、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体にも適用できる。
【００３０】
即ち、Eドメイン−Fc複合体、Dドメイン−Fc複合体、Aドメイン−Fc複合体、Cドメイン−Fc複合体、及びZドメイン−Fc複合体の立体構造は未だ明らかにされていないが、上記、各細胞膜外ドメインの配列相同性とB、D、E、およびZドメイン単独の立体構造の類似性を基に判断すれば、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体が、Bドメイン−Fc複合体と相同の構造を形成することは、当然に類推することができる。
【００３１】
したがって、上記選択した18個の変異対象部位が、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体においても、Bドメイン−Fc複合体と同等の空間的配置に位置することが強く期待され、Bドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた5位、6位、9位、10位、11位、13位、14位、15位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、35位および36位の18個の変異対象部位は、Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。
【００３２】
また、スクリーニング実験の頻度解析データを用いて選定した5位、9位、10位、11位、15位、18位、27位、28位、35位および36位の10個の好ましい変異対象部位は、Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても好ましい変異対象部位として選定することができる。
【００３３】
即ち、プロテインA・Zドメインのアミノ酸配列（配列番号2）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Eドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号3）のうちのHis5、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはHis5、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Dドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号4）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Aドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号5）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、プロテインA・Cドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号6）のうちのPhe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個が、好ましくはPhe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個が、変異対象部位として選定された。
【００３４】
一方、該変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、ヒスチジンが最良である。これは、ヒスチジンが、中性域と酸性域の間で側鎖のプロトンの解離により化学的状態が大きく変化するので、プロテインAの各ドメインの抗体結合性を中性域と酸性域で大きく変化させることができるからである。
【００３５】
したがって、後記実施例に示されるように、本発明の改良型タンパク質は以下を包含する。すなわち、上記  （ア）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Bドメイン変異体、および上記  （イ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Zドメイン変異体、および上記  （ウ）  の態様に対応する、Asp6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Gln15His、Leu17His、Asn18His、Ala24His、Asp25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはAsp6His、Gln10His、Asn11His、Gln15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Eドメイン変異体、および上記  （エ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Ala25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Dドメイン変異体、および上記  （オ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Aドメイン変異体、および上記  （カ）  の態様に対応する、Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisの、好ましくはPhe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上を含むプロテインA・Cドメイン変異体。なお、ここで、Eドメインの5位とB、C、およびZドメインの18位の野生型のアミノ酸残基はヒスチジンであるので、これをヒスチジンに置換しても、置換の前後で変化しないことから、EドメインにおいてHis5His、B、C及びZドメインにおいてHis18Hisは除外してある。
【００３６】
上記から明らかなように、本発明の改良型タンパク質の設計において、選定される変異対象部位は一つに限られるものではない。複数の変異対象部位の中から適宜選択して、それらを組み合わせた点変異体あるいは多重変異体を改良型タンパク質とすることができる。その選択は、無作為に行ってもよいし、構造活性相関等の他の公知の情報を加味してもよい。また、プロテインAの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異と組みあわせてもよい。
【００３７】
具体例を挙げれば、変異対象部位として、6位と11位と15位と24位と25位を選択し6位と11位と25位にヒスチジン残基を導入したAsn6His/Asn11His/Glu15Asp/Glu24Gln/Glu25HisプロテインA・Bドメインの五重変異体（配列番号7）、6位と24位と25位と32位と36位を選択し6位と24位と32位と36位にヒスチジン残基を導入したAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/
Gln32His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの五重変異体（配列番号8）、6位にヒスチジン残基を導入したAsn6HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号10）、24位にヒスチジン残基を導入したGlu24His プロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号11）、32位にヒスチジン残基を導入したGln32HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号12）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号13）、5位と9位と10位と11位と13位と15位と25位と27位と28位と35位と36位を選択し5位と9位と10位と11位と15位と27位と28位と35位と36位にヒスチジン残基を導入したPhe5His/Gln9His/Gln10His/Asn11His/Phe13Leu/Glu15His/Glu25Asp/Arg27His/Asn28His/Lys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの11重変異体（配列番号14）、5位と6位と9位と10位と11位と13位と15位と25位と27位と28位と35位と36位をを選択し5位と6位と9位と10位と11位と15位と27位と28位と35位と36位にヒスチジン残基を導入したPhe5His/Asn6His/Gln9His/Gln10His/Asn11His/Phe13Leu/Glu15His/Glu25Asp/Arg27His/Asn28His/Lys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの12重変異体（配列番号15）、5位と9位と10位と11位と13位と15位と24位と25位と27位と28位と31位と35位と36位を選択し5位と9位と10位と11位と15位と27位と28位と35位と36位にヒスチジン残基を導入したPhe5His/Gln9His/Gln10His/Asn11His/Phe13Leu/Glu15His/Glu24Gln/Glu25Asp/Arg27His/Asn28His/Ile31Leu/Lys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの13重変異体（配列番号16）は、上記（ア）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。
【００３８】
また、配列番号17〜27、65〜71のプロテインA・Bドメインの多重変異体と61〜64のプロテインA・Bドメインの点変異体も、上記（ア）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。変異対象部位として、6位と24位と25位と32位と36位を選択し6位と24位と32位と36位にヒスチジン残基を導入したAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/Gln32His/Asp36HisプロテインA・Zドメインの五重変異体（配列番号9）および36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Zドメインの点変異体（配列番号72）は、上記（イ）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。変異対象部位として、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Cドメインの点変異体（配列番号74）、9位にヒスチジン残基を導入したGln9HisプロテインA・Cドメインの点変異体（配列番号75）、9位と36位にヒスチジン残基を導入したGln9His
/Asp36HisプロテインA・Cドメインの二重変異体（配列番号76）は、上記（カ）の態様に含まれる本発明の改良型タンパク質の一例である。以上のように、後記実施例で示されるように、本発明の改良型タンパク質では、複数の種類のアミノ酸配列を設計することができる。
【００３９】
上記、配列番号7〜27、61〜72、74〜76に示した点変異体および多重変異体を含む本発明の改良型タンパク質は、抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型のプロテインAの各細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンの定常領域に対し酸性領域での結合活性が低下する限り、一個もしくは数個のアミノ酸残基に挿入や付加の変異が、または、置換したヒスチジン残基を除く一個もしくは数個のアミノ酸残基に欠失や置換の変異がさらに生じても良い。
【００４０】
例えば、本発明の改良型タンパク質をHisタグなどのタグ付きタンパク質、あるいは他のタンパク質との融合タンパク質の形態で合成する場合、合成した後にタグと改良型タンパク質の間を、あるいは他のタンパク質と改良型タンパク質の間を配列特異的タンパク分解酵素で分解しても、上記改良型タンパク質のN末端側もしくはC末端側に1乃至数個のアミノ酸残基が残る場合もあり、また、大腸菌等を用いて本発明の改良型タンパク質を生産する際には、N末端側に開始コドン由来のメチオニン等が付加されることがあるが、後記実施例で示されるように、これらのアミノ酸残基の付加により、抗体結合性が大きく変化することはない。また、後記実施例で示されるように、これらのアミノ酸残基の付加により、設計された変異が及ぼす効果を失うこともない。したがって、本発明の改良型タンパク質は当然これらの変異体も含む。
【００４１】
なお、このようなアミノ酸残基の付加のない改良型タンパク質を作成するためには、たとえば、大腸菌等を用いて生産した改良型タンパク質を、さらにメチオニルアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて、N末のアミノ酸残基を選択的に切断し（参照文献9）、反応混合物よりクロマトグラフィー等で分離精製することで、得ることができる。
【００４２】
また、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列は、該アミノ酸配列と任意のリンカー配列とを交互に複数回繰り返したタンデム型アミノ酸配列としても良い。たとえば、[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列A−[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列B−[アミノ酸配列（a）]としても良く、あるいは、[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列C−[アミノ酸配列（b）]−リンカー配列D−[アミノ酸配列（c）]としても良い。
【００４３】
このタンデム型アミノ酸配列の設定は、野生型のプロテインAがリンカー配列を介した複数の抗体結合ドメインの繰り返し構造となっていること（図1および図3）、野生型のプロテインAを切断して各々のドメイン単独を単離しても抗体結合活性は保たれること（参照文献3）から明らかなように、単独でも機能する抗体結合ドメインを野生型のプロテインAは複数繰り返し、局所的な濃度を上げることで抗体結合性の効果を高めている点からみて、その設定は有効である。
【００４４】
また、本発明の改良型タンパク質は、任意の他のタンパク質のアミノ酸配列を連結した融合型アミノ酸配列からなる融合タンパク質としても良い。たとえば、[アミノ酸配列（a）]−リンカー配列E−タンパク質A、あるいは、タンパク質B−リンカー配列F−[アミノ酸配列（a）] −リンカー配列G−タンパク質C−リンカー配列H−[アミノ酸配列（c）] としても良い。この融合型アミノ酸配列の設定は、野生型のプロテインAが抗体結合ドメインと他のドメインが連結したマルチドメイン構造となっていること（図1および図3）、野生型のプロテインAを切断して各々のドメイン単独を単離しても抗体結合活性は保たれること（参照文献3）、即ち、抗体結合ドメインと他の機能を担うタンパク質を連結することで抗体結合活性を含む複数の機能を担うことを可能にしているとから、その設定は有効である。
【００４５】
また、本発明の改良型タンパク質は、固定化反応ためのスペーサーのアミノ酸配列をC末端やN末端、あるいは中央部に付加してもよい。たとえば、[アミノ酸配列（a）]−スペーサー配列A、あるいは、スペーサー配列B−[アミノ酸配列（b）]、あるいは、[アミノ酸配列（c）]−スペーサー配列C−[アミノ酸配列（d）]としても良い。スペーサーは、固定化反応の効率化や促進、固定化担体との立体障害の軽減などの目的で使用される。スペーサーのアミノ酸配列や鎖長は、用いる固定化反応の種類等に応じて適切な選択をすればよく、たとえば、GlyArgAlaCysGly（参照文献10）やGlyGlyGlyGlyCysAlaAspAspAspAspAspAsp（参照文献11）などを利用することができる。ただし、本発明の改良型タンパク質において、用いるスペーサーのアミノ酸配列や鎖長は、特に限定されるものではない。
【００４６】
2．改良型タンパク質の製造
（1）遺伝子工学的手法による改良型タンパク質の製造
a．改良型タンパク質をコードする遺伝子
本発明においては、上記設計された改良型タンパク質を製造するため、遺伝子工学的方法を使用することできる。
【００４７】
このような方法に使用する遺伝子は、上記（ア）〜（カ）に示されるタンパク質のアミノ酸配列をコードするか、より具体的には、a)配列番号7〜27、61〜72、74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはb）配列番号7〜27、61〜72、74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸残基が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ中性域に比べて酸性域での結合活性が低下するタンパク質をコードするか、あるいはc）配列番号7〜27、61〜72、74〜76のいずれかで示されるアミノ酸配列においてヒスチジン残基以外の1又は数個のアミノ酸残基が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ中性域に比べて酸性域での結合活性が低下するタンパク質をコードする核酸からなるものであって、たとえば、より具体的には、配列番号28〜30、43〜60、77〜91のいずれかで示される塩基配列からなる核酸である。
【００４８】
また、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ対応する各野生型プロテインA・細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンの定常領域に対し酸性領域での結合活性が低下した上記変異型タンパク質をコードする核酸もあげられる。
【００４９】
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。たとえば、高い相同性（相同性が60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましく90％以上、もっとも好ましくは95％以上）を有する核酸がハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1％SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００５０】
さらに、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸と上記任意のリンカー配列をコードする核酸をそれぞれ交互に複数連結したものでもよく、または該核酸と任意のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸とを連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。
【００５１】
b．遺伝子、組み替えベクターおよび形質転換体
前記した本発明の遺伝子は、化学合成、PCR、カセット変異法、部位特異的変異導入法などにより合成することができる。たとえば、末端に20塩基対程度の相補領域を有する100塩基程度までのオリゴヌクレオチドを複数化学合成し、これらを組み合わせてオーバーラップ伸長法（参照文献12）を行うことにより目的の遺伝子を全合成することができる。
【００５２】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記の塩基配列を含む遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の遺伝子を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００５３】
プラスミドDNAとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばpK4，pRK401，pRF31等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110，pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13，YEp24，YCp50等）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００５４】
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、本発明の改良型タンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
【００５５】
そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子の塩基配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。
また、製造するタンパク質の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグ配列としては、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、BioEaseタグなどの公知のタグをコードする塩基配列を利用することができる。
【００５６】
遺伝子がベクターに挿入されたか否かの確認は、公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができる。たとえば、プラスミドベクターなどの場合、コンピテントセルを用いてベクターをサブクローニングし、DNAを抽出後、DNAシーケンサーを用いてその塩基配列を特定することで確認できる。他のベクターについても細菌あるいは他の宿主を用いてサブクローニング可能なものは、同様の手法が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを利用したベクター選別も有効である。
【００５７】
形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の改良型タンパク質が発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００５８】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、開始コドン、本発明の改良型タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）BL21などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６０】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６１】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００６２】
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。ついで、PCRの増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SybrGreen液等により染色し、増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００６３】
c．形質転換体培養による改良型タンパク質の取得
組替えタンパク質として製造する場合、本発明の改良型タンパク質は、上述の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。培養物とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６５】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20〜37℃で12時間〜3日間行う。
【００６６】
培養後、本発明の改良型タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を採取する。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
【００６７】
また、タンパク質の生合成反応にかかわる因子（酵素、核酸、ATP、アミノ酸など）のみを混合させた、いわゆる無細胞合成系を利用すると、生細胞を用いることなく、ベクターから本発明の改良型タンパク質を試験管内で合成することができる（参照文献13）。その後、前記と同様の精製法を用いて、反応後の混合溶液から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
【００６８】
単離精製した本発明の改良型タンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するため、該タンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる（参照文献14）。
【００６９】
（2）他の手法による改良型タンパク質の製造
本発明の改良型タンパク質は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによっても製造することができる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
【００７０】
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている（参照文献15）。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的の変異型タンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィーなどを利用することができる（参照文献16）。
【００７１】
3．改良型タンパク質の固定化
本発明の改良型タンパク質は、その抗体結合性を利用して、抗体捕捉剤として利用することができる。該抗体捕捉剤は、抗体の精製や除去、抗体を利用した研究、診断、治療、検査等に用いることができる。
【００７２】
本発明の抗体捕捉剤は、本発明の改良型タンパク質を含む限りにおいて、どのような形態であってもよいが、好ましくは、本発明の改良型タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化した形態が適切である。用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機-有機、有機-無機などの複合担体などが挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンの定常領域を有するタンパク質の選択性が良好であるため好ましい。
【００７３】
ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例として挙げられる。
【００７４】
市販品としては多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L等を例示することができる。ただし、本発明においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。又、本発明に用いる水不溶性担体としては、本抗体捕捉剤の使用目的および方法からみて、表面積が大きことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。
【００７５】
担体の形態としては、ビーズ状、線維状、膜状(中空糸も含む)など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10〜2500μmのものが使いやすく、とりわけ、リガンド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。
【００７６】
さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。
【００７７】
上記担体への改良型タンパク質の固定化においては、改良型タンパク質の立体障害を小さくすることにより捕捉効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
【００７８】
上記の担体へ導入される改良型タンパク質およびスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。
【００７９】
担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化し（担体が元々持っている官能基よりリガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変え）、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、捕捉剤の滅菌時または利用時に蛋白類が担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。
【００８０】
4．改良型タンパク質および抗体捕捉剤の性能確認試験
上記のようにして製造された改良型タンパク質および抗体捕捉剤は、以下の性能確認試験を行い良好なものを選択することができるが、後記実施例で示すように、本発明の改良型タンパク質および抗体捕捉剤はいずれも良好な性能を有していた。
【００８１】
（1）抗体結合性試験
本発明の改良型タンパク質の抗体結合性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、表面プラズモン共鳴（SPR）法などを利用して確認・評価することができる。中でもSPR法は、生体間の相互作用をラベルなしでリアルタイムに経時的に観察することが可能であることから、改良型タンパク質の結合反応を速度論的観点から定量的に評価することができる。
【００８２】
また、水不溶性の固相支持体に固定化した改良型タンパク質の抗体結合性は、上記のSPR
法や液体クロマトグラフィー法で確認・評価することができる。中でも液体クロマトグラフィー法は、抗体結合性に及ぼすpH依存性を的確に評価することができる。
【００８３】
（2）改良型タンパク質の熱安定性試験
本発明の改良型タンパク質の熱安定性は、円偏光二色性（CD）スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法、加熱後の残留活性などを利用して評価することができる。中でもCDスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、改良型タンパク質の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。
【００８４】
参照文献1；Forsgren A and Sjoquist J (1966) "Protein A" from S.
Aureus. J Immunol. 97, 822-827.
参照文献2；Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins.
Academic Press, Inc., San Diego,
CA, USA.
参照文献3；Tashiro M, Montelione GT. (1995) Structures
of bacterial immunoglobulin-binding domains and their complexes with
immunoglobulins. Curr Opin Struct Biol.
5, 471-481.
参照文献4；Deisenhofer J. (1981) Crystallographic
refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with
fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A
resolution. Biochemistry. 20(9), 2361-2370.
参照文献5；Gouda H, Torigoe H, Saito A, Sato M, Arata Y, Shimada I. (1992) Three-dimensional
solution structure of the B domain of staphylococcal protein A: comparisons of
the solution and crystal structures. Biochemistry. 31(40), 9665-9672.
参照文献6；Tashiro M.; Tejero R.; Zimmerman D.E.; Celda B.; Nilsson B.;
Montelione G.T. (1997) 
High-resolution solution NMR
structure of the Z domain of staphylococcal protein A. Journal of Molecular
Biology, 272(4), 573-590.
参照文献7；Starovasnik, M.A., Skelton, N.J., O'Connell, M.P., Kelley, R.F.,
Reilly, D., Fairbrother, W.J. (1996) Solution structure of the E-domain of
staphylococcal protein A. Biochemistry 35, 15558-15569.
参照文献8；Graille, M., Stura, E.A., Corper, A.L., Sutton,
B.J., Taussig, M.J., Charbonnier, J.B., Silverman, G.J. (2000) Crystal structure of a
Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a
human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and
superantigen activity. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 5399-5404.
参照文献9；D'souza VM, Holz RC. (1999) The methionyl aminopeptidase from
Escherichia coli can function as an iron(II) enzyme. Biochemistry 38, 11079-11085.
参照文献10；特開昭63-267281号
参照文献11；特開2005-112827号
参照文献12；Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pullen J. M. and Pease L. R.
(1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene
splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.
参照文献13；岡田雅人、宮崎香 (2004) タンパク質実験ノート(上)、羊土社
参照文献14；大野茂男、西村善文監修 (1997) タンパク質実験プロトコール1−機能解析編、秀潤社
参照文献15；大野茂男、西村善文監修 (1997) タンパク質実験プロトコール2−構造解析編、秀潤社
【００８５】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８６】
なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。L-アラニン残基;Ala、L-アルギニン残基;Arg、L-アスパラギン酸残基;Asp、L-アスパラギン残基;Asn、L-システイン残基;Cys、L-グルタミン残基;Gln、L-グルタミン酸残基;Glu、L-グリシン残基;Gly、L-ヒスチジン残基;His、L-イソロイシン残基;Ile、L-ロイシン残基;Leu、L-リジン残基;Lys、L-メチオニン残基;Met、L-フェニルアラニン残基;Phe、L-プロリン残基;Pro、L-セリン残基;Ser、L-スレオニン残基;Thr、L-トリプトファン残基;Trp、L-チロシン残基;Tyr、L-バリン残基;Val。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端(以下N末端という)が左側に位置し、カルボキシル末端(以下C末端という)が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【００８７】
本明細書においては、核酸が有する塩基について、アデニン;A、チミン;T、ウラシル;U、グアニン;G、およびシトシン;Cの略号を用いて記載する。また、混合塩基について、以下の略号を用いる。R=(AまたはG)、Y=(CまたはT)、M=(AまたはC)、K=(GまたはT)、S=(GまたはC)、W=(AまたはT)、H=(A,CまたはT)、B=(G,TまたはC)、V=(G,CまたはA)、D=(G,AまたはT)、N=(A,C,GまたはT)。DNAにおけるチミンT)は、RNA中ではウラシル(U)に対応し、DNAとしての配列情報はRNAとしての配列情報をも包含する。本明細書においては、DNAおよびRNAの塩基配列を、その5’末端が左側に位置し、3’末端が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【実施例１】
【００８８】
1）プロテインA細胞膜外ドメインの変異部位及び置換するアミノ酸残基の選定
まず、プロテインAのBドメインとヒト免疫グロブリンGのFc領域の複合体の立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein
Data Bank（PDB;http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）よりダウンロードした（PDBコード：1FC2）。ついで、Fc領域から10オングストロームの距離の範囲内に存在するプロテインA・Bドメインのアミノ酸残基であって、かつ、プロテインA・Bドメイン単独の場合で20%以上の露出表面積比をもつアミノ酸残基を該立体構造座標データを用いて計算し、変異対象部位として選定した。選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号1]で示されるプロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個である。図４は、これらの変異対象部位の位置を複合体の構造上に表示したものである。
【００８９】
ところで、プロテインAの各細胞膜外ドメインは配列相同性が高く（図2）、加えて、立体構造が実験的に明らかにされているD、E、およびZドメインは、Bドメイン単独の構造とほとんど差異がないことから（参考文献5〜8）、Bドメイン−Fc複合体の立体構造についての知見は、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体にも適用できる。
【００９０】
即ち、Eドメイン−Fc複合体、Dドメイン−Fc複合体、Aドメイン−Fc複合体、Cドメイン−Fc複合体、及びZドメイン−Fc複合体の立体構造は未だ明らかにされていないが、上記、各細胞膜外ドメインの配列相同性とB、D、E、およびZドメイン単独の立体構造の類似性を基に判断すれば、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体が、Bドメイン−Fc複合体と相同の構造を形成することは、当然に類推することができる。したがって、上記選択した18個の変異対象部位が、E、D、A、C、及びZドメイン−Fc複合体においても、Bドメイン−Fc複合体と同等の空間的配置に位置することが強く期待され、Bドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた5位、6位、9位、10位、11位、13位、14位、15位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、35位および36位の18個の変異対象部位は、Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。
【００９１】
即ち、選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号1]で示されるプロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインのアミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号3]で示されるプロテインA・Eドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、His5、Asp6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Gln15、Leu17、Asn18、Ala24、Asp25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号4]で示されるプロテインA・Dドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Ser11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Ala25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号5]で示されるプロテインA・Aドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、Asn18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個、[配列番号6]で示されるプロテインA・Cドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Asn6、Gln9、Gln10、Asn11、Phe13、Tyr14、Glu15、Leu17、His18、Glu24、Glu25、Arg27、Asn28、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36の18個である。
【００９２】
一方、該変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、ヒスチジンが最良である。これは、ヒスチジンが、中性域と弱酸性域の間で側鎖のプロトンの解離により化学的状態が大きく変化するので、プロテインAの各ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で大きく変化させることができるからである。したがって、各改良型プロテインA細胞膜外ドメインの変異部位及び置換するアミノ酸残基を以下のように選定した。
【００９３】
プロテインA・Bドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Zドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Eドメイン変異体；Asp6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Gln15His、Leu17His、Asn18His、Ala24His、Asp25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Dドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Ala25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Aドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Asn18His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Cドメイン変異体；Phe5His、Asn6His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Phe13His、Tyr14His、Glu15His、Leu17His、Glu24His、Glu25His、Arg27His、Asn28His、Ile31His、Gln32His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
【００９４】
なお、ここで、Eドメインの5位とB、C、およびZドメインの18位の野生型のアミノ酸残基はヒスチジンであるので、これをヒスチジンに置換しても、置換の前後で変化しないことから、EドメインにおいてHis5His、B、C及びZドメインにおいてHis18Hisは除外してある。
【００９５】
本実施例の計算は、ccp4i 4.0 (Daresbury Laboratory, UK Science and Technology
Facilities Council)、Surface Racer 3.0 for Linux（登録商標）（Dr. Oleg Tsodikov, The University of Michigan）、Red Hat Enterprise Linux（登録商標） WS release 3（レッドハット）（以上ソフトウエア）、Dell Precision Workstation370（デル）（以上ハードウエア）を用いて行った。
【実施例２】
【００９６】
2）変異型プロテインAライブラリのスクリーニング実験による好ましい変異部位の選定
上記、Bドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた5位、6位、9位、10位、11位、13位、14位、15位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、35位および36位の18個の変異対象部位のうち、より高い効果が期待できる好ましい変異対象部位を選定した。18個の変異対象部位のいずれか一つ以上がヒスチジン残基に置換した変異体の総数は、各部位が野生型のアミノ酸残基かヒスチジン残基のどちらか一方であるとすると、理論的には262,143（2の18乗より1引いた数）種類存在する。このような多数の変異体のなかからより高い効果が期待できる変異体を特定するには、進化分子工学技術を活用して変異型プロテインAライブラリを構築し、これより適切にスクリーニングすることで良好な変異体を選択すればよい。さらに得られた良好な変異体のアミノ酸配列を統計的に解析することで、より高い効果が期待できる好ましい変異対象部位を選定することができる。
【００９７】
2-1）遺伝子ライブラリの作製
変異型プロテインAライブラリを構築するために必要となる遺伝子ライブラリは、[配列番号32]〜[配列番号35]で示される核酸配列を有するポリヌクレオチドをまず化学合成し、ついでこれらを組み合わせてオーバーラップ伸長法（参考文献12）を行うことで作製した。
【００９８】
[配列番号32]〜[配列番号35]で示される核酸配列を有するポリヌクレオチドは、[配列番号1]で示されるアミノ酸配列からなるプロテインAのBドメインタンパク質をコードする核酸配列の一部に対応し、オーバーラップに必要な20塩基長程度の相補領域をそれぞれの末端に有している。
【００９９】
また、[配列番号32]で示される配列のプロテインAのBドメインの5’末端側には、塩基配列がGAATTCのEcoRIの制限酵素サイト、塩基配列がGGCGGTGGAGGCのグリシンリンカ―（GlyGlyGlyGly）、および塩基配列がCCATGGのNcoIの制限酵素サイトを付与し、[配列番号35]で示される配列のプロテインAのBドメインの3'末端側には、塩基配列がAAGCTTのHindIIIの制限酵素サイトを付与している。
【０１００】
さらに、上述の18個の変異対象部位に相当する位置には、野生型のアミノ酸とヒスチジンを共にコードすることができる混合塩基を導入した。即ち、5位においてはPheあるいはHisを共にコードすることができるYWTを、6位においてはAsnあるいはHisを共にコードすることができるMAYを、9位においてはGlnあるいはHisを共にコードすることができるCAWを、10位においてはGlnあるいはHisを共にコードすることができるCAWを、11位においてはAsnあるいはHisを共にコードすることができるMAYを、13位においてはPheあるいはHisを共にコードすることができるYWTを、14位においてはTyrあるいはHisを共にコードすることができるYATを、15位においてはGluあるいはHisを共にコードすることができるSAWを、17位においてはLeuあるいはHisを共にコードすることができるCWKを、24位においてはGluあるいはHisを共にコードすることができるSAWを、25位においてはGluあるいはHisを共にコードすることができるSAWを、27位においてはArgあるいはHisを共にコードすることができるCRYを、28位においてはAsnあるいはHisを共にコードすることができるMAYを、31位においてはIleあるいはHisを共にコードすることができるMWTを、32位においてはGlnあるいはHisを共にコードすることができるCAWを、35位においてはLysあるいはHisを共にコードすることができるMAWを、36位においてはAspあるいはHisを共にコードすることができるSATを導入した。
【０１０１】
なお、混合塩基の組み合わせによっては、野生型のアミノ酸とヒスチジンのみならず第３のアミノ酸がコードされる場合もある。例えば、5位において用いたYWTは、TTT、TAT、CTT、CATの4種の配列を実現するが、それぞれPhe、Tyr、Leu、Hisをコードするので、第3のアミノ酸としてTyrとLeuが5位に導入される可能性が生じる。これらの第3のアミノ酸の存在を含めて当該ライブラリの配列多様性を算出すると、核酸配列として3.4×107個の、アミノ酸配列として2.5×107個の、分子種が理論的に作製されることになる。
【０１０２】
2-2）T7ファージ・ディスプレイ法による変異型プロテインAライブラリの構築
上記のように設計、合成を行った遺伝子ライブラリを制限酵素EcoRIとHindIIIで処理し、T7ファージベクター(Novagen)とライゲーション反応（16℃、16時間）を行って、T7ファージゲノム上のg10遺伝子の3’末端側に連結した。
【０１０３】
T7ゲノムは、T7 Select1-1b(Novagen)の試薬を用いて付属のT7 Select（登録商標） System Manualの手順に従った。連結したT7ファージゲノムを用いて、試験管内でのT7ファージ粒子パッケージング反応（22℃、2時間）を行ってファージを作製した。この時点のファージ・ライブラリは、プラーク・アッセイ法で調べたところ、約5.4×107個のファージを形成していることがわかった。
【０１０４】
これを初期ライブラリとして、200mL LB培地にてO.D.600=1.0まで培養した大腸菌BLT5403株に感染させて増幅操作を行った。感染から約4時間後、遠心操作によって増幅したファージを上澄み溶液から回収した（T7ファージは溶菌作用があり、増幅後、大腸菌を壊して菌体外に放出する）。回収した上澄み溶液に、1/6容量の50％ポリエチレングリコール（PEG、分子量8000）溶液と、1/10容量の5M NaCl溶液を加えて4℃で一昼夜の撹拌を行った。
【０１０５】
その後、遠心操作によるPEG沈殿でファージを粗精製した。PEG沈殿させたファージをTST buffer（10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl,
0.1% Tween20）で溶解させて、0.22μm径の除粒フィルターで濾過した。これによって、変異型プロテインA・Bドメインを提示したファージ・ライブラリ溶液を調製した。
【０１０６】
2-3）ヒトモノクローナル抗体に対する結合スクリーニング
まず、モノクローナル抗体（ヒト免疫グロブリンG1）溶液（濃度3.36μＭ） 500μLとジメチルスルホキシド 50μｌにD-Biotinoyl-ε-aminocaproic acid-N-hydroxy-succinimide ester(Roche) 1．4mgを溶かした溶液 25μｌを混合して3時間反応させ、未反応のD-Biotinoyl-ε-aminocaproic
acid-N-hydroxy-succinimide esterを取り除いて、ビオチン化モノクローナル抗体を作製した。
【０１０７】
ついで、このビオチン化モノクローナル抗体溶液（濃度  0.5〜0.6μＭ） 500μｌにストレプトアビジン磁気ビーズ（Promega）0.6mLを混合し、抗体を磁気ビーズに固定化させた。このビオチン化抗体を固定した磁気ビーズ0.65mLに、上記で調製した変異型プロテインA・Bドメインを提示したファージ・ライブラリ溶液を加えて25℃で1時間振盪放置した。その後、TST buffer（10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween20）で10〜20回程度の洗浄操作を行うことで抗体と結合しないファージを除去した。
【０１０８】
抗体と特異的に結合したファージを回収するために、50mM 酢酸ナトリウム溶液（pH5.0）を加え、充分混合したのち溶出させた。溶出したファージは、上記2-2)に記載の感染-増幅-PEG沈殿操作を行って、変異型プロテインA・Bドメインを提示したファージ・ライブラリ溶液を再び調製した。
【０１０９】
上記2-2)および2-3）の操作をファージ・ディスプレイ法の1ラウンドとして、合計5ラウンドのスクリーニング実験を繰り返し行った。なお、スクリーニング実験に用いた溶出液は、2ラウンド目からpH6.0の50mM 酢酸ナトリウム溶液を用い、かつストレプトアビジン磁気ビーズ(promega)の量を徐々に少なくしてスクリーニングの選択圧を段階的に変化させた。
【０１１０】
2-4）スクリーニングにより選択された良好な変異体の配列解析
5ラウンドのスクリーニング実験を行ったのち、溶出液内のファージを、プラーク・アッセイ法を用いて、LB培地プレート上にクローン化する。そして、96ウェルプレートにO.D.600=1.0まで培養した大腸菌BLT5403株を各ウェルに200μLずつ加え、LB培地プレート上のプラークをつついた爪楊枝でウェルを撹拌してファージを感染させ、37℃で一昼夜培養するとファージが溶菌してクローン化したファージ溶液ができる。
【０１１１】
上記操作で用意されたファージが提示している変異型プロテインA・Bドメインのアミノ酸配列を確認するために、上記の96ウェルプレートからファージ溶液1μLをPCR反応溶液に混合して、ファージDNAを熱処理によって取り出し、PCRを行い （アニール53℃、5秒）
、変異型プロテインA遺伝子を増幅した。
【０１１２】
使用したプライマーは、センスプライマーとして（配列番号36）、アンチセンスプライマーとして（配列番号37）を用いた。センスプライマー（配列番号36）はT7ファージゲノムのg10遺伝子上の配列をコードしたもので、アンチセンスプライマー（配列番号37）は、プロテインAのBドメインのC末端の配列と塩基配列がAAGCTTのHindIIIの制限酵素サイトをコードしたものである。得られた増幅物をExo nuclease(New England Biolabs)とAntarctic
Phosphatase (New England Biolabs) で処理した後、DNA sequencing法 (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1)によって、その核酸塩基配列を解析した。
【０１１３】
クローン化した合計91種類のファージのg10遺伝子の3’末端側にある変異型プロテインA・Bドメインの核酸配列決定したところ、[配列番号28、29、43〜56] の16種のいずれかの配列に収束していることが確認された。この16種の核酸配列に対応するアミノ酸配列は、[配列番号7、8、14〜27] の16種である。
【０１１４】
2-5) 良好な変異体のアミノ酸配列の統計的解析
クローン化した91種類のファージから得られた16種のアミノ酸配列は、結合スクリーニングにより選択された、より高い効果が期待できる良好な変異体群のごく一部である。即ち、16種のアミノ酸配列は、良好な変異体を母集団としたときの抽出標本とみなすことができるので、標本の統計的な解析から母集団の平均像を推定することができる。
【０１１５】
表1は、各変異対象部位でどのようなアミノ酸置換が起こったかを16種のアミノ酸配列から求めたものである。表1に示される出現頻度の値は、各変異対象部位で下線を引いた野生型のアミノ酸からヒスチジン残基への置換が適切か否かの指標になる。例えば、5位ではPheの値が0.19であるのに対しHisの値は0.63と高く、これは5位がヒスチジン置換により中性域の結合活性を維持しつつ酸性域の結合活性が低下するような、より高い効果が期待できる変異対象部位として好ましいことを示している。同様の解析を進めれば、5位と共に9位、10位、11位、15位、27位、28位、35位、36位も変異対象部位として好ましいことがわかる。野生型のアミノ酸がもともとヒスチジン残基である18位を加えると、上記1)で選択した18個の変異対象部位のうち、5位、9位、10位、11位、15位、18位、27位、28位、35位、36位の10個が好ましい変異対象部位であることがわかる。
【０１１６】
【表１】
2012165544.tif 000018
【０１１７】
以上の10個の好ましい変異対象部位は、上記1)で述べたように、プロテインA・Bドメインのみならず、D、A、C、及びZドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。
【０１１８】
即ち、好ましい変異対象部位として選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号1]で示されるプロテインA・Bドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号3]で示されるプロテインA・Eドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、His5、Gln9、Gln10、Asn11、Gln15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号4]で示されるプロテインA・Dドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Ser11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号5]で示されるプロテインA・Aドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、Asn18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個、[配列番号6]で示されるプロテインA・Cドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Phe5、Gln9、Gln10、Asn11、Glu15、His18、Arg27、Asn28、Lys35、Asp36の10個である。
【０１１９】
したがって、上記1)で選定した各改良型プロテインA細胞膜外ドメインの変異部位及び置換するアミノ酸残基のうち、好ましいものとして以下を選定した。
【０１２０】
プロテインA・Bドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Zドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisいずれか一つ以上。
プロテインA・Eドメイン変異体；Gln9His、Gln10His、Asn11His、Gln15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Dドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Ser11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Aドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Asn18His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
プロテインA・Cドメイン変異体；Phe5His、Gln9His、Gln10His、Asn11His、Glu15His、Arg27His、Asn28His、Lys35His、Asp36Hisのいずれか一つ以上。
【０１２１】
なお、上記1)で述べたように、Eドメインの5位とB、C、およびZドメインの18位の野生型のアミノ酸残基はヒスチジンであるので、これをヒスチジンに置換しても、置換の前後で変化しないことから、EドメインにおいてHis5His、B、C及びZドメインにおいてHis18Hisは除外してある。
【実施例３】
【０１２２】
3）改良型プロテインA細胞膜外ドメインの設計
上記から明らかなように、本発明の改良型タンパク質の設計において、選定される変異対象部位は一つに限られるものではない。複数の変異対象部位の中から適宜選択して、それらを組み合わせた点変異体あるいは多重変異体を改良型タンパク質とすることができる。その選択は、無作為に行ってもよいし、構造活性相関等の他の公知の情報を加味してもよい。また、プロテインAの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異と組みあわせてもよい。
【０１２３】
例えば、ファージ・ディスプレイ法のスクリーニング実験から得られた[配列番号7]で示されるAsn6His/Asn11His/Glu15Asp/Glu24Gln/Glu25HisプロテインA・Bドメインの五重変異体、あるいは[配列番号8] で示されるAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/
Gln32His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの五重変異体のアミノ酸配列でもよい。また、このBドメインのスクリーニング実験から得られた[配列番号8] の五重変異体の5つの変異Asn6His、Glu24His、Glu25Gln、Gln32His、Asp36Hisを、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインのアミノ酸配列に導入した[配列番号9]で示されるAsn6His/Glu24His/Glu25Gln/ Gln32His/Asp36HisプロテインA・Zドメインの五重変異体のアミノ酸配列でもよい。
【０１２４】
さらには、例えば、6位にヒスチジンを導入したAsn6HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号10）、24位にヒスチジンを導入したGlu24HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号11）、32位にヒスチジン残基を導入したGln32HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号12）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号13）、9位にヒスチジン残基を導入したGln9HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号61）、10位にヒスチジン残基を導入したGln10HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号62）、15位にヒスチジン残基を導入したGlu15HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号63）、27位にヒスチジン残基を導入したArg27HisプロテインA・Bドメインの点変異体（配列番号64）、9位と36位にヒスチジン残基を導入したGln9His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号65）、10位と36位にヒスチジン残基を導入したGln10His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号66）、15位と36位にヒスチジン残基を導入したGlu15His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号67）、27位と36位にヒスチジン残基を導入したArg27His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号68）、35位と36位にヒスチジン残基を導入したLys35His/Asp36HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号69）、9位と32位にヒスチジン残基を導入したGln9His/Gln32HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号70）、10位と32位にヒスチジン残基を導入したGln10His/ Gln32HisプロテインA・Bドメインの二重変異体（配列番号71）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Zドメインの点変異体（配列番号72）、36位にヒスチジン残基を導入したAsp36HisプロテインA・Cドメインの点変異体（配列番号74）、9位にヒスチジン残基を導入したGln9HisプロテインA・Zドメインの点変異体（配列番号75）、あるいは9位と36位にヒスチジン残基を導入したGln9His/Asp36HisプロテインA・Cドメインの二重変異体（配列番号76）のアミノ酸配列でもよい。
【０１２５】
以下の実施例では、本発明の改良型プロテインA細胞膜外ドメインうちの、[配列番号7]〜[配列番号13]、[配列番号61]〜[配列番号72]、[配列番号74]〜[配列番号76]で示されるアミノ酸配列を具体例として選び、これらの配列で示す変異型タンパク質を実際に合成した。加えて、[配列番号1]で示される野生型のプロテインA・Bドメイン、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメイン、および[配列番号6]で示される野生型のプロテインA・Cドメインも合成し、これらと比較することで、改良型タンパク質の分子特性を評価した。
【０１２６】
4）改良型プロテインA細胞膜外ドメインアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列の設計
改良型プロテインA細胞膜外ドメインをコードする遺伝子の塩基配列（[配列番号28]〜[配列番号30]、[配列番号57]〜[配列番号60]、[配列番号77]〜[配列番号91]）については、上記の各改良型プロテインA細胞膜外ドメインのアミノ酸配列に基づき設計した。これらの改良型タンパク質は、タグなし、融合なしの単純タンパク質として大腸菌を用いて製造されるため、設計した遺伝子の塩基配列の5’末端には開始コドン配列が付加される。このことから、野生型のプロテインA・Bドメイン乃至改良型タンパク質M-PABは、[配列番号1]、[配列番号7]、[配列番号8]、[配列番号10] 〜[配列番号13] または[配列番号61]〜[配列番号71]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。野生型のプロテインA・Zドメイン乃至改良型タンパク質M-PAZは、[配列番号2]、[配列番号9]または[配列番号72]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。野生型のプロテインA・Cドメイン乃至改良型タンパク質M-PACは、[配列番号6] 、[配列番号74]〜[配列番号76]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。なお、これらN末端のMetは、大腸菌内に存在するメチオニルアミノペプチダーゼ等の酵素の影響で選択的に切断されて合成されることもある。
【０１２７】
5）改良型プロテインA細胞膜外ドメインの製造
以下に示すように、まず、野生型及び改良型のプロテインA・Bドメイン、ZドメインまたはCドメインをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いて、Metが付加された野生型（M-PAB01）及び改良型（M-PAB2〜19）プロテインA・Bドメイン、野生型（M-PAZ01）及び改良型（M-PAZ03、M-PAZ08）プロテインA・Zドメイン、野生型（M-PAC01）及び改良型（M-PAC08、M-PAC09、M-PAC13）プロテインA・Cドメインを製造した。これらのタンパク質のアミノ酸配列の構成及び変異を表2に示す。
【０１２８】
【表２】
2012165544.tif 000019
【０１２９】
5-1）M-PABまたはM-PAZ発現用プラスミドの合成
M-PAB02〜M-PAB03については、上記2）で作成したファージDNAを鋳型に、制限酵素認識配列を含むプライマーを加えPCRを行い（アニール49℃, 15秒）、PAB遺伝子領域を増幅した。
【０１３０】
使用したプライマーは、センスプライマーとして（配列番号36）、アンチセンスプライマーとして（配列番号37）を用いた。得られた増幅物は、アガロース電気泳動法(3%, 100V）で確認後、QIAquick PCR
Purificationkit(Qiagen)を用いて精製した。その後、制限酵素NcoIとHindIII (日本ジーン, 37℃,一昼夜）で消化した変異型PAB遺伝子(pab02またはpab03)と、同じ制限酵素で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET16bまたはpET21d(Novagen)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。
【０１３１】
正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolonyPCR法、DNA sequencing法 (GE  Healthcare Bioscience, BigDye
Terminator v1.1) により選別し、QiaprepSpin Miniprep
kit(Qiagen)を用いてM-PAB発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。
【０１３２】
M-PAZ01については、[配列番号2]で示されるプロテインA・Zドメインをコードする塩基配列を含むプラスミドを鋳型に、制限酵素認識配列を含むプライマーを加えPCRを行い（アニール49℃, 15秒）、PAZ遺伝子領域を増幅した。
【０１３３】
使用したプライマーは、センスプライマーとして CACCATGGTGGATAACAAACを、アンチセンスプライマーとしてTAGGATCCTTATTTTGGTGCTTGTGCATCを用いた。得られた増幅物は、アガロース電気泳動法(3%, 100V）で確認後、QIAquick PCR Purification
kit(Qiagen)を用いて精製した。
【０１３４】
その後、制限酵素Nco IとBamH I (日本ジーン,
37℃, 一昼夜）で消化したPAZ遺伝子(paz01)と、同じ制限酵素で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET16b (Novagen)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolony PCR法、DNA sequencing法 (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1) により選別し、Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PAZ発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。
【０１３５】
M-PAB01またはM-PAZ03については、 [配列番号1]および[配列番号9]で示されるプロテインA・Bドメインおよび改良型プロテインA・Zドメインをコードする塩基配列を、人工合成プラスミド（Biomatik）より調製した。まず、このプラスミドを制限酵素NdeIとXhoI (日本ジーン, 37℃,一昼夜）で消化し、同じ制限酵素で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET21a(Novagen)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリン含むLBプレート培地で選択した。Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PAB01またはM-PAZ03発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3)
株（Novagen）を形質転換した。
【０１３６】
M-PAB04〜M-PAB08については、作製したM-PAB01またはM-PAZ01のプラスミドベクターを鋳型にしてQuikChange（登録商標） Multi Site-Directed
Mutagenesis Kit （Stratagene）を用いて、変異導入を行った。その際に用いたプライマー配列は、[配列番号38]〜 [配列番号42]に示す。M-PAB09〜12については作製したM-PAB01のプラスミドベクターを鋳型に、M-PAB13〜17については作製したM-PAB08のプラスミドベクターを鋳型に、M-PAB18〜19は作製したM-PAB07のプラスミドベクターを鋳型に、QuickChange (登録商標) Site-Directed Mutagenesis
Kit (Stratagene) を用いて、変異導入を行った。その際に用いたフォワードプライマー配列は[配列番号92]〜 [配列番号96]で示すもので、リバースプライマーは各フォワードプライマー配列に相補的な配列からなるものである。M-PAZ08については、作製したM-PAZ01のプラスミドベクターを鋳型にQuickChange (登録商標) Multi Site-Directed
Mutagenesis Kit (Stratagene) を用いて、変異導入を行った。その際に用いたプライマー配列は、[配列番号42]に示す。得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolony PCR法、DNA sequencing法 (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1) により選別し、Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PAB発現用又はM-PAZ発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。
M-PAC01、M-PAB08、M-PAB09、M-PAB13については、発現用プラスミド(GenScript)を購入し、これを発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。
【０１３７】
5-2）組換えタンパク質の発現と精製
LB培地で前培養した大腸菌BL21(DE3) 形質転換体を、50μL/10mLで100μg/mLアンピシリンを含むLB培地に継代し、O.D.600 = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。最終濃度1mM でIPTGを加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mLのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った。破砕液は濾過滅菌後、濾液をTST (25mMTris-HCl(pH7.6),
150mM NaCl, 0.1% Tween20) で平衡化したIgGSepharose 6 Fast
Flow (GE Healthcare Bioscience) microspinに加え、M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質を結合させた。未吸着成分をTSTで洗浄後、TSTを50mM sodium
citrate (pH7.0)に置換し、さらに0.5M acetate (pH2.5)に置換してM-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質を溶出した。溶出液は50mM Na phosphate (pH6.8)で透析を行った後4℃で保存した。
【０１３８】
6）得られた改良型プロテインA細胞膜外ドメインの純度
上記5）で得られた、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質の純度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で以下のように確認した。精製後の各タンパク質をそれぞれ75μM程度の濃度の水溶液に調製したのち、Tricine-SDS-PAGE（16%T, 2.6%C, 100V, 100min）を行いCBB(G-250) 染色によりバンドを検出し純度を確認した。その結果、各タンパク質は、測定したすべての試料においてメジャーバンドとして検出され、精製度も充分であることが確認された。
【０１３９】
7) 改良型プロテインA細胞膜外ドメインの固定化
上記5）で得られた、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質は、そのアフィニティリガンドとしての特性を評価するために、以下の方法で固定化し、アフィニティクロマトグラフィーカラムを作成した。
【０１４０】
HiTrap NHS-activated HP（GE Healthcare）1mLのカラムを用いて、Sepharose上のN-ヒドロキシスクシインミド（NHS）とプロテインAの上の第1級アミンとがアミド結合を形成することを利用してリガンドタンパク質を固定化する。固定化方法は、カラムに6mLの1mM HClを流してカラム中のイソプロパノール溶液を置換し、そこに1mLのリガンドタンパク質溶液（濃度 2.6〜2.8mg/mL）を注入して4℃で一昼夜反応させる。そして、溶液A（0.5M Tris-HCl 、0.5M
NaCl pH8.3)と溶液B（0.1M acetate、0.5M NaCl pH4.0）を用いて、洗浄操作およびブロッキング操作を行う。溶液Aを6mL、溶液Bを6mL、そして溶液Aを6mLという順番で溶液を流し、溶液Aに置換した状態で4℃、6時間反応させて未反応のNHSをTrisと反応させるブロッキング操作を行う。つづいて、溶液Bを6mL、溶液Aを6mL、溶液Bを6mLという順番で溶液を流して洗浄操作を行って、TST buffer（25mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl,
0.1% Tween20）で平衡化してアフィニティカラムの作製を完了する。
【実施例４】
【０１４１】
8）固定化カラムを用いた改良型タンパク質の抗体結合性評価（グラジエント法）
以下のようにして、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質を固定化したカラムを用いてpH勾配アフィニティクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出するpHを調べることで、改良型プロテインAの酸性域での抗体結合性を評価した。
【０１４２】
まず、各M-PAB、M-PAZまたはM-PACタンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience) にセットし、TST buffer（25mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl,
0.1% Tween20）を0.5mL/minの条件で流し平衡化させた後、100〜200μLの1mg/mLのサンプル（IgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体）を注入した。次いで、TST bufferを50mM  citrate Na(pH7.0) に置換し、さらに0.5mL/minの流速で10minかけて連続的に500mM 酢酸溶液（pH2.5）へ置換することで、pH勾配(pH7.0→2.5/10min)を実現した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUV検出器(280nm)とpH検出器の出力から、モノクローナル抗体が溶出するピークのpHを記録した。
【０１４３】
その結果、M-PAB03を固定化したカラムにおいては、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質（M-PAB01）を固定化したカラムに比べて約1.1ポイントの高いpHで、HiTrapTM  rProtein
A FF (GE Healthcare)に比べて約1.2ポイントの高いpHで、ヒト化モノクローナル抗体が溶出することが明らかになった（図5、図7）。また、M-PAB08とM-PAB13を固定化したカラムは、M-PAB01に比べてそれぞれ約1.1ポイントと約2.0ポイントの高いpHで、M-PAZ08を固定化したカラムは、M-PAZ01に比べて約0.7ポイント高いpHで、M-PAC08とM-PAC13を固定化したカラムは、M-PAC01に比べてそれぞれ約1.0ポイントと約1.7ポイントの高いpHで、ヒト化モノクローナル抗体が溶出することが明らかになった（図7〜10）。
【０１４４】
9）固定化カラムを用いた改良型タンパク質の抗体結合性評価（ステップワイズ法）
以下のようにして、各M-PABおよびM-PAZタンパク質を固定化したカラムを用いてステップワイズpHアフィニティクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出状態を、各pHで調べることで、改良型プロテインAの酸性域での抗体結合性を評価した。
【０１４５】
まず、M-PABまたはM-PAZタンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTA prime plus (GE Healthcare Bioscience)にセットし、リン酸バッファ（50mM Na2HPO4/NaH2PO4
(pH7.0)）を0.5mL/minの条件で流し平衡化させた後、100〜200μLの1mg/mLのサンプル（IgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体）を添加した。5mLのリン酸バッファで洗浄、5mLの溶出バッファ（20mM クエン酸ナトリウム, pH4.0）で溶出を行った。その後、500mM 酢酸溶液（pH2.5）でカラムを洗浄し、最後に10mLのリン酸バッファでカラムを再平衡した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUV検出器（280nm）の出力から、ヒトポリクローナルFc領域のステップワイズpHの溶出するパターンを得られた。
【０１４６】
その結果、M-PAZ01を固定化したカラムを用いてpH4.0で溶出すると、pH4.0で少しずつ溶出しpH3.9で溶出ピークを示した。M-PAB02を固定化したカラムを用いてpH4.0で溶出すると、pH3.9の溶出ピークのみを示した。M-PAB03を固定化したカラムを用いてpH4.0で溶出すると、溶出溶液を流し始めてすぐにpH6.4のところで溶出し始め、pH5.7の溶出ピークを示した。HiTrapTM 
rProtein A FF (GE Healthcare) を用いてpH4.0で溶出すると、pH3.7の溶出ピークを示した（図6）。
【実施例５】
【０１４７】
10）表面プラズモン共鳴法による改良型タンパク質の抗体結合性評価
以下のようにして、中性域および弱酸性域における各M-PABおよびM-PAZタンパク質の抗体結合性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。
【０１４８】
まず、センサーチップの測定セルにIgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体をアミンカップリング法により固定化した。測定のコントロールとして、カルボキシメチル基をエタノールアミンでブロッキングした対照セルを用いた。センサーチップとして、CM5 (Biacore)を用いた。次いで、単離精製した各M-PABまたはM-PAZタンパク質を、中性領域のランニング緩衝液であるHBS-P (10mM
HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)に溶解し、それぞれ3種の濃度の試料溶液を調製した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。収集したデータは、Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて解析し、1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせ、解離平衡定数KDを算出した。
【０１４９】
その結果、改良型タンパク質M-PAZ03は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質M-PAZ01に比較し、pH7.4での結合性は同程度であるが、pH5.0での抗体結合性は約1/25に低下した（表3）。
【０１５０】
【表３】
2012165544.tif 000020
【０１５１】
中性域および弱酸性域における各M-PABおよびM-PAZタンパク質の抗体結合性をさらに調べるため、再度SPR法による評価試験を行った。
【０１５２】
試料の調製法は、上述とまったく同じである。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。収集したデータは、Biacore T100 Evaluation
Softwareを用いて解析し、1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせ、解離平衡定数KDを算出した。
【０１５３】
フィッティングの精度を向上させるため、pH7.4では計算式［Rmax ＝リガンド固定化量×（アナライトの分子量／リガンドの分子量）×リガンドの結合部位数］を用いてRmaxをあらかじめ定めて、これを固定値として扱い非線形回帰計算を行った。pH5.0では、Rmaxをあらかじめ定めずに、これを変動値として扱いFit GlobalまたはFit Localモードで非線形回帰計算を行った。
【０１５４】
その結果、改良型タンパク質M-PAB08、M-PAZ08は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質M-PAB01、M-PAZ01と比較し、pH7.4での結合性は同程度であるが、pH5.0での抗体結合性はそれぞれ約1/140、約1/30に低下した（表4）。また、M-PAB13、M-PAB14、M-PAB16、M-PAB17、M-PAB19は、pH5.0での抗体結合性が大きく低下したため、定量下限を下回り、解離平衡定数を算出するに至らなかった。
【０１５５】
【表４】
2012165544.tif 000021
【０１５６】
11）円偏光二色性スペクトル法による改良型タンパク質の熱安定性評価
以下のようにして、各M-PABおよびM-PAZタンパク質の熱安定性を円偏光二色性（CD）スペクトルにより評価した。なお、CDスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。CDスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、どの程度の温度で各々の改良型プロテインAが変性するのかを明らかにすることができる。
【０１５７】
まず、単離精製した各タンパク質をそれぞれ5〜25μMの濃度で含む水溶液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0）に調製した。この試料溶液を円筒型セル（セル長0.1cm）に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計（日本分光）を用いて、20℃の温度で測定波長を260nmから195nmに移動させCDスペクトルを得た。同じ試料を98℃に加熱、さらに98℃から20℃に冷却し260nmから195nmのCDスペクトルを得た。加熱後再冷却したスペクトルが加熱前のスペクトルと同様であるか否か、すなわちスペクトルの回復率は、各タンパク質の熱変性に対する可逆性の指標となる。
【０１５８】
野生型プロテインA・Bドメイン（M-PAB01）及び改良型プロテインA・Bドメイン（M-PAB2〜17）については、いずれのタンパク質もあまり回復しなかったのに対し（回復率40%以下）、野生型プロテインA・Zドメイン（M-PAZ01）及び改良型プロテインA・Zドメイン（M-PAZ03、M-PAZ08）は十分な回復が認められた（回復率60〜90%）。これは、可逆性の高低はBドメインであるかZドメインであるかという野生型の配列の差異によって主に決定され、ヒスチジン置換が可逆性に対して及ぼす影響は小さいことを意味している。
【０１５９】
次いで、測定波長を222nmに固定し20℃から100℃に1℃/minの速度で昇温させてモル楕円率の経時変化を測定した。得られた熱融解曲線について二状態相転移モデルの理論式（非特許文献：有坂、バイオサイエンスのための蛋白質科学入門）を用いて解析し、変性温度Tm、およびTmにおける変性のエンタルピー変化dHmを決定した。
【０１６０】
その結果、改良型プロテインAの多くはヒスチジン置換によって安定性が低下するものの、M-PAB08とM-PAZ08は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質(M-PAB01あるいはM-PAZ01)とほぼ同等の安定性を有していることが明らかになった（表5）。
【０１６１】
【表５】
2012165544.tif 000022
【国際調査報告】
2012165544.tif 000023
2012165544.tif 000024
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