(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からの二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）であって、該精製抽出物がシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する、精製抽出物。
【請求項２】
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からの二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）であって、各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）が、１３．０〜１６．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０〜２．５０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．４０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．２０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを示す、新規の精製抽出物。
【請求項３】
第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールまたはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の抽出溶媒を乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加すること、
第２の工程において、１０℃〜１００℃の範囲の温度で３０分〜７２時間の範囲の期間に亘って、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出法から選択される少なくとも１種の抽出方法に繰り返し供して、第１の抽出物を得ること、
第３の工程において、前記第１の抽出物を０．５倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して、懸濁した抽出物を得ること、
第３の工程において、０．５倍容量〜２０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画するとともに、該ブタノール層を回収して、ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得ること、
逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１種の更なる精製プロセスに前記ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を供して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物の総重量（１００％）に対して、３０％〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療および予防用の二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を得ること、
のプロセスにより調製される請求項１または２に記載の二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を調製する方法。
【請求項４】
炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療および予防する、有効成分としてシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された請求項１もしくは２に記載の二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、
前記炎症性疾患が、湿疹、アトピー性皮膚炎、結膜炎、歯周病、鼻炎、中耳炎、咽頭喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱滑膜炎、腱鞘炎、筋炎，肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、慢性炎症性疾患、または急性炎症性疾患から選択され
前記アレルギー疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、昆虫アレルギー、食品アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性結膜炎、または過敏症から選択され
前記喘息疾患が、イエダニ、動物の毛またはフケ、ゴキブリ、食品、薬物、咳、タバコの煙、大気汚染、食品添加物、身体活動、天候の変化、黄砂、またはストレスの外的要因により引き起こされる喘息から選択される、
医薬組成物。
【請求項５】
炎症性疾患、アレルギー疾患、または喘息疾患を予防または緩和する、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された請求項１または２に記載の二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を含む健康機能性食品であって、
前記炎症性疾患が、湿疹、アトピー性皮膚炎、結膜炎、歯周病、鼻炎、中耳炎、咽頭喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱滑膜炎、腱鞘炎、筋炎，肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、慢性炎症性疾患、または急性炎症性疾患から選択され、前記アレルギー疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、昆虫アレルギー、食品アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性結膜炎、または過敏症から選択され
前記喘息疾患が、イエダニ、動物の毛またはフケ、ゴキブリ、食品、薬物、咳、タバコの煙、大気汚染、食品添加物、身体活動、天候の変化、黄砂、またはストレスの外的要因により引き起こされる喘息から選択される、
健康機能性食品。
【請求項６】
炎症性疾患、アレルギー疾患、または喘息疾患の治療または予防に採用される医薬の製造へのシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された請求項１もしくは２に記載の二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を含有する精製抽出物の使用であって、
前記炎症性疾患が、湿疹、アトピー性皮膚炎、結膜炎、歯周病、鼻炎、中耳炎、咽頭喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱滑膜炎、腱鞘炎、筋炎，肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、慢性炎症性疾患、または急性炎症性疾患から選択され、前記アレルギー疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、昆虫アレルギー、食品アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性結膜炎、または過敏症から選択され
前記喘息疾患が、イエダニ、動物の毛またはフケ、ゴキブリ、食品、薬物、咳、タバコの煙、大気汚染、食品添加物、身体活動、天候の変化、黄砂、またはストレスの外的要因により引き起こされる喘息から選択される、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多量の有効成分を含有するシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum：ヤマトラノオ）から単離された精製抽出物、その調製、ならびに有効成分としてそれを含む炎症、アレルギーおよび喘息の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、炎症反応は、組織または細胞が、その組織または細胞における或る有機的な変化をもたらす任意の侵襲を受けた場合の浮腫、疼痛などと関連する人体の正常な反応である。近年、多種多様なサイトカインが炎症性疾患に関与することがわかってきた。
【０００３】
アレルギー反応は、反応のタイプに応じて４つのカテゴリー、すなわち、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型、またはアレルゲンによって引き起こされる再感作時間から反応が始まる時間までの期間のタイプに応じて２つのカテゴリー、すなわち、Ｉ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型などの即時型アレルギー反応、およびＩＶ型などの遅延型アレルギー反応に分類され得る。
【０００４】
なかでも、ＩｇＥ抗体が関与し、アナフィラキシー型アレルギーと呼ばれるＩ型アレルギーは、気管支喘息、皮膚炎または胃腸炎などのアトピー性疾患、花粉症などのアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギーなどを引き起こす。
【０００５】
喘息は、様々な臨床症状、例えば、咳、気流障害により引き起こされる呼吸困難、急性または慢性の気道炎症、気道過敏症（ＡＨＲ）および構造的リモデリングを特徴とする気道の複合症候群とされ、可逆的で回復可能な場合もあるが、非可逆的で回復することができない場合もある。大半の喘息はアレルギー性疾患であり、慢性気道炎症および気管支過敏症を特徴とする（非特許文献１）
【０００６】
喘息は、２つのタイプ、すなわち、外因性喘息および内因性喘息に分類され得る。外因性喘息は、抗原への曝露により引き起こされ、その抗原に対する皮膚試験または気管支誘発試験において陽性反応を示す。通常、発症年齢は若年化している。喘息は、主に、チリダニであるデルマトファゴイデス（Dermatophagoides）および花粉、動物の上皮、真菌などにより引き起こされる。内因性喘息は、上気道感染、運動、情動不安定、湿度気候（climate of humidity）の変化により引き起こされ、成人患者に一般的である。また、血清中のＩｇＥの増加による皮膚試験によって、外因性喘息のＩｇＥ抗原を検出することができる。
【０００７】
病態生理学に関し、喘息は、Ｔ−ヘルパー２（Ｔｈ２）細胞制御型慢性炎症により認識され、免疫細胞からのサイトカイン、ケモカイン、シグナル伝達分子、接着分子および成長因子などの様々な炎症メディエーター、ならびに気道における構造細胞が喘息の様々な段階に関与する（非特許文献２）。喘息を患う患者の気管支において好酸球、肥満細胞、肺胞マクロファージなどの活性化された炎症細胞は、システインロイコトリエン、プロスタグランジンなどの様々な炎症メディエーターを放出し、強力な気管支収縮に関与する（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）
【０００８】
したがって、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３など、およびＩｇＥの炎症細胞の活性化に関与する様々なサイトカインの増殖、ならびに炎症細胞から放出されたシステインロイコトリエンの増殖が炎症、アレルギー反応および喘息の主要因であることから、これまで、それらの増殖から阻害剤を開発するための多くの研究がなされてきた。
【０００９】
本発明者らは、炎症細胞の増殖に対する強力な阻害活性を有する、植物、動物などの天然資源由来の安全かつ有効な強力な治療剤を開発することに注力しており、最終的にシュードリシマキオン・ロンギフォリウム（Pseudolysimachion longifolium：セイヨウトラノオ）の抽出物が強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性および抗喘息活性を示し（特許文献１）、更にはベルプロシド（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシベンゾイルカタルポール）、ピクロシドＩＩ（６−Ｏ−４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイルカタルポール）、ベルミノシド（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシシンナモイルカタルポール）、６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール（６−Ｏ−３，４−ジメトキシベンゾイルカタルポール）、ミネコシド（６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルカタルポール）、カタルポールなどの上記抽出物から単離された様々な化合物も強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性および抗喘息活性を示す（特許文献２）ことを見出している。
【００１０】
しかしながら、植物抽出物がカタルポール誘導体などの有効成分を極めて僅かしか含有しないことから、シュードリシマキオン・ロンギフォリウムの抽出物を使用する大規模生産および工業化は困難である。
【００１１】
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムは、韓国、中国、日本、サハリン島、およびロシアに分布する多年生草本である。
【００１２】
特許文献１に開示されるシュードリシマキオン・ロンギフォリウムの抽出物の抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性に対する以前の研究に基づき、本発明者らは、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示すより強力でより豊富な成分を調製するためのより効率的な方法を開発することを試みた。
【００１３】
しかしながら、上記引用文献（それらの開示が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の抽出物よりも、より強力でより豊富な抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示すシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された成分を調製する効率的な方法についてはどこにも報告または開示されていなかった。
【００１４】
したがって、本発明者らは、従来技術に開示される従来の調製方法によって調製された精製抽出物よりも、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物に由来するカタルポール誘導体などの有効成分をより豊富に含有する精製抽出物を調製するための新規な工業化された方法を見出し、上記精製抽出物は、ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける、好酸球の増殖、血漿中および気管支肺胞洗浄液中の免疫グロブリンおよび炎症性ケモカインの放出に対する阻害試験、ならびに気道の応答性亢進および杯細胞過形成の抑制などの様々なインビボ試験を通して、より強力な抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】韓国特許第１０−８６００８０号
【特許文献２】韓国特許出願公開第１０−２００６−１２５４９９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Minoguchi K and Adachi M., Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I. editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104
【非特許文献２】Elias JA et al., J Clin Invest., 111, pp 291-7, 2003
【非特許文献３】Maggi E., Immunotechnology 3, pp233-244, 1998
【非特許文献４】Pawankar R. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001
【非特許文献５】Barnes PJ et al., Phamacol. Rev. 50, pp515-596, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに由来するカタルポール誘導体などの有効成分を豊富に含有する精製抽出物を調製する新規な方法、およびそれにより調製される抽出物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療および予防に有効量の有効成分としてシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに由来するカタルポール誘導体などの有効成分を豊富に含有する精製抽出物を含む医薬組成物および健康食品を提供する。
【００１９】
また、本発明は、抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示すシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに由来するカタルポール誘導体などの有効成分を豊富に含有する精製抽出物の使用を提供する。
【００２０】
また、本発明は、哺乳動物において炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療または予防する方法であって、薬学的に許容可能なその担体と共に、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに由来するカタルポール誘導体などの有効成分を豊富に含有する有効量の精製抽出物を上記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療または予防する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物に由来するカタルポール誘導体を豊富に含有する新規な精製抽出物を提供することである。
【００２２】
本明細書で開示される「カタルポール誘導体」の用語は、ベルプロシド、カタルポシド、のピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールなどを含む。
【００２３】
本明細書で開示される「シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム」の用語は、栽培されたまたは天然に生育した植物および商業的に入手可能な植物を含むが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではない。
【００２４】
本明細書で開示される「新規な精製抽出物」の用語は、（ａ）ブタノールで分画した精製抽出物（以下、「ＡＴＣ１」と示す）および（ｂ）二次分画による精製抽出物（以下、「ＡＴＣ２」と示す）を含む。
【００２５】
具体的には、「ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）」の用語は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して２０％〜２５％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、１％〜５％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および１％〜５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有することを特徴とするか、または、
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に１２．３％〜４７％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、且つ各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）が１５．０〜１８．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．１０〜２．６０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．００〜１．３０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．３０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１６．０〜１７．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０〜２．５０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．２０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０〜２．２０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１６．２０〜１６．９９（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．４０〜２．４５（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．１９（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０〜２．１９（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールであることを特徴とする。
【００２６】
より具体的には、「ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）」の用語は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０〜８０（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１種の抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加すること、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出法、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１種の抽出方法に繰り返し供して第１の抽出物を得ること、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得ること、および約０．５倍容量〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加して水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポールおよび０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療および予防する、ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得ることのプロセスにより調製されることを特徴とする。
【００２７】
したがって、本発明の別の実施の形態では、本発明は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０〜８０（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１種の抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加する工程、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出法、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１種の抽出方法に繰り返し供して第１の抽出物を得る工程、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得る工程、および約０．５倍容量〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポールおよび０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療および予防する、ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得る工程を含む、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離したブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を調製する方法も提供する。
【００２８】
具体的には、「二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）」の用語は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して４０％〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１％〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、３％〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２％〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、２％〜８％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および３％〜８％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有することを特徴とするか、または、
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に３６．５％〜９１％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、且つ各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）が、１３．０〜１６．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０〜２．５０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．４０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．２０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１４．０〜１５．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３０〜２．４５（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２０〜１．３５（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．１０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１４．５０〜１４．９９（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３５〜２．４３（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２５〜１．３４（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．０１〜２．０９（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールであることを特徴とする。
【００２９】
より具体的には、「二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）」の用語は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０〜８０（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１種の抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加すること、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出法、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１種の抽出方法に繰り返し供して第１の抽出物を得ること、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得ること、第３の工程において、約０．５倍容量〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収してブタールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得ること、およびブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を、逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１種の精製プロセスに供して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％〜１０％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポール、および２％〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療および予防する、二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を得ることのプロセスにより調製されることを特徴とする。
【００３０】
したがって、本発明の別の実施の形態では、本発明は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０〜８０（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１種の抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加する工程、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出法、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１種の抽出方法に繰り返し供して第１の抽出物を得る工程、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得る工程、第３の工程において、約０．５倍容量〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収してブタールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得る工程、ならびにブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を、逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１種の更なる精製プロセスに供して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％〜１０％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポール、および２％〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療および予防する、二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を得る工程を含む、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を調製する方法も提供する。
【００３１】
具体的には、「更なる精製プロセス」の用語は、（ｉ）逆相分配クロマトグラフィー、（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィー、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー、または（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー、好ましくは逆相分配クロマトグラフィー、または極性物質を溶出しながら、非極性物質を保持することができる固定相としての任意の樹脂、例えばセファデックス、セファデックスＬＨ２０、セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−１０、セファロース、スーパーデックス、メチルアクリレート樹脂、カルボキシメチルセルロース、スルホプロピルセルロース、カルボキシメチルセファデックス、スルホプロピルセファデックス、カルボキシメチルセファロース、スルホプロピルセファロースなどのセファデックス樹脂；Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｘ、ＨＰ２０、ＰＲＰ−ｈ１ポリマーなどのスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを使用する逆ポリマー樹脂、もしくはメタクリレート支持樹脂など；ＢＰＣ（結合相クロマトグラフィー）製品、YMC Co. Ltdから入手したシリカ製品、DAISO Co. Ltdから入手したシリカ製品、ASAHI Co. Ltdから入手したシリカ製品、COSMOSYL Co. Ltdから入手したシリカ製品などの通常のシリカゲル；YMC Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、DAISO Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、ASAHI Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、CHEMCO Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、Merck Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、COSMOSYL Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、FUJI Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品などのＨＰＬＣフィルターに使用されるＯＤＳ製品を使用する任意のクロマトグラフィーから選択される。
【００３２】
（ｉ）逆相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施形態では、「上述の逆相分配クロマトグラフィーにおける固定相」は、極性物質を溶出しながら非極性物質を保持することができる固定相としての逆相物質などの任意の固定相、好ましくは、シリカゲル系固定相、ポリスチレンなどのポリマー系固定相、より好ましくはＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、１４、Ｃ１６、Ｃ１８などのシリカゲル誘導体であってもよく、またはＰＳ−２、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢなどのポリマー系固定相、更に好ましくは、逆相シリカゲル（Ｃ１８（ＩＶ）−Ｄ）、YMC Co. Ltd.によるＯＤＳ−Ａ／ＯＤＳ−ＡＱ製品、CHEMCO Co. Ltd.によるＳＰ−Ｃ−ＯＤＳ製品、DAISO Co. Ltd.によるＳＰ−ＯＤＳ−ＲＰＳ製品、COSMOSYL Co. Ltd.による５Ｃ１８製品、FUJI Co. Ltd.によるＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ製品などであってもよい。
【００３３】
（ｉ）逆相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施形態では、「上述の（ｉ）逆相分配クロマトグラフィーにおける移動相」は、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ブタノールなどの低級アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはそれらの混合物、好ましくは水、メタノール、エタノール、ブタノールなどの低級アルコール、またはそれらの混合物、より好ましくは水とメタノールとの混合溶媒、更に好ましくは極性物質を溶出するため９０：１０（ｖ／ｖ）から開始して６０：４０（ｖ／ｖ）までの水とメタノールとの混合溶媒から選択される少なくとも１種の溶媒であってもよい。
【００３４】
（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施形態では、「上述の順相分配クロマトグラフィーにおける固定相」は、非極性物質を溶出しながら、極性物質を保持することができる、固定相としての順相物質、好ましくはシリカゲル、フルオロシル、またはアルミナ系固定相、ＣＮ、ジオール、またはＮＨ２部分ポリマー系固定相など、より好ましくはシリカゲル、フルオロシル、またはアルミナ系固定相などの任意の固定相であってもよい。
【００３５】
（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施形態では、「上述の（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィーにおける移動相」は、非極性物質を溶出するために、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、エタノール、ジエチルエーテル、２−プロパノールまたはそれらの混合物、好ましくはヘキサン、ヘプタン、酢酸エチルまたはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の溶媒とすることができる。
【００３６】
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーにおける固定相」は、荷電した架橋部分を有する固定相としての任意の高分子固定相であってもよく、好ましくは陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、または合成吸着剤など、より好ましくは、ＡＧ  ５０Ｗ−ｘ８、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０、Ｄｏｗｅｘ  ６０Ｗ−ｘ８、ＳＫＩＢなどの強酸性陽イオン交換樹脂；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−６７、Ｄｏｗｅｘ  ３−ｘ４Ａなどの弱酸性陽イオン交換樹脂；ＤＩＡＩＯＮ  ＳＫＩＢ、ＤＩＡＩＯＮ  ＰＫ２１６、ＤＩＡＩＯＮ  ＣＲ２０、ＤＩＡＩＯＮ  ＵＢＫ５５５（Mitsubishi Chemical Co.）、ＴＲＩＬＩＴＥ  ＳＰＣ  １６０Ｈ、ＴＲＩＬＩＴＥ  ＳＰＣ  １８０Ｈ、ＴＲＩＬＩＴＥ  ＳＰＣ  ４００ＪＨ（Samyang Co. Ltd.）、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ２００Ｃ  Ｎａ、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＣＧ５０、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＣＲ１３１０  Ｎａ、ＡＭＢＥＲＪＥＴ  ２００Ｈ、ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ  １３１  ＷＥＴ、ＡＬＢＥＲＬＹＳＴ  ２３２  ＷＥＴ（ROHM and HAAS Co. Ltd.）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＶＰ  ＯＣ  １８００、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＶＰ  ＯＣ  １８１２、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＭＤＳ１３６８  Ｎａ、Ｌｅｗａｉｔｉｔ  Ｋ１２２１（Bayer Co. Ltd.）、ＰＵＲＯＬＩＴＥ  ＰＣＲ８３３ＣＡ、ＰＵＲＯＬＩＴＥ  Ｃ１４５（Purolite Co. Ltd.）、ＭＦＧ２１０、ＭＦＧ  ２５０（Finex Co. Ltd.）などの強塩基性陽イオン交換樹脂；ＳＡ１１Ａ、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａなどの強塩基性陰イオン交換樹脂；またはＣａｐｔｏＱ（GE Healthcare Co. Ltd.）、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＥＡ（Tosoh Co. Ltd.）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（GE Healthcare Co. Ltd）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＨＩＣＡＰ（Merck KGaA Co. LtdまたはDarmstadt Co. Ltd.）などのそれと同様の特性を有する樹脂、更に好ましくは、ＳＡ２１Ａ；ＳＰ２０７、ＨＰ２０ＳＳ、ＨＰ２０などの吸着剤、より好ましくはＨＰ２０であってもよい。
【００３７】
（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーにおける固定相」は、試料のサイズにより分離することができる固定相としての任意のゲル型固定相であってもよく、好ましくは、ｓｅｐｈａｄｅｘ（例えば、ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）などのデキストラン系ゲル、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ４００)などのポリアクリルアミド系ゲル、ＳｕｐｅｒｏｓｅまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）などのアガロース系ゲル、またはデキストランと組合せたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標））、もしくは架橋アガロースゲル（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標））などのそれらの組合せであってもよいが、本明細書ではそれらに限定されない。「上述の（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーにおける移動相」は、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ［２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール］、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジアセテート）、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）］、ＢＥＳ［Ｎ．Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）］、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸］、ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）など；好ましくは酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液または酢酸アンモニウム緩衝液からなる群から選択される緩衝溶液としてもよい。
【００３８】
本発明の好ましい実施の形態では、本発明は、（ｉ）逆相分配クロマトグラフィー、（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィー、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー、（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組合せに加えて、本明細書に開示される更なる精製プロセスとして（Ｖ）ゲル浸透クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーを行うこともできる。
【００３９】
また、本発明は、上述の調製方法により調製した（ａ）ブタノールで画分した精製抽出物（以下、「ＡＴＣ１」と示す）または（ｂ）二次分画による精製抽出物（以下、「ＡＴＣ２」と示す）などの新規な精製抽出物を提供する。
【００４０】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からブタノールで分画した新規の精製抽出物（ＡＴＣ１）であって、該新規の精製抽出物がシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に１２．３％〜４７％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、該カタルポール誘導体が、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および０．３〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは２０％〜２５％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、１％〜５％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．５％〜５％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および１％〜５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる、新規の精製抽出物も提供する。
【００４１】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からブタノールで分画した新規の精製抽出物（ＡＴＣ１）であって、各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）が、１５．０〜１８．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．１０〜２．６０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．００〜１．３０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．３０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１６．０〜１７．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０〜２．５０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．２０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０〜２．２０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１６．２０〜１６．９９（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．４０〜２．４５（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．１９（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０〜２．１９（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを示す、新規の精製抽出物も提供する。
【００４２】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からの二次分画による新規の精製抽出物（ＡＴＣ２）であって、該新規の精製抽出物がシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に３６．５％〜９１％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、該カタルポール誘導体が、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して４０％〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１％〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、３％〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２％〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、２％〜８％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および３％〜８％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる、新規の精製抽出物も提供する。
【００４３】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からの二次分画による新規の精製抽出物（ＡＴＣ２）であって、各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）が、１３．０〜１６．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０〜２．５０（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０〜１．４０（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．２０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１４．０〜１５．０（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３０〜２．４５（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２０〜１．３５（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００〜２．１０（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１４．５０〜１４．９９（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３５〜２．４３（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１５〜１．２４（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．０１〜２．０９（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを示す、新規の精製抽出物も提供する。
【００４４】
本明細書で開示される「精製抽出物」の用語は、真空抽出法、凍結乾燥法、または熱風乾燥法などにより調製される乾燥形態として使用されてもよい。
【００４５】
本明細書に開示される「炎症性疾患」の用語は、湿疹、アトピー性皮膚炎、結膜炎、歯周病、鼻炎、中耳炎、咽頭喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱滑膜炎、腱鞘炎、筋炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患などを含むが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではなく、好ましくは湿疹、アトピー性皮膚炎、リウマチ性関節炎、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患などである。
【００４６】
本明細書に開示される「アレルギー疾患」の用語は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、昆虫アレルギー、食品アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性結膜炎、過敏症などを含むが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではなく、好ましくはアレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、昆虫アレルギー、食品アレルギー、薬物アレルギー、より好ましくはアレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎である。
【００４７】
本明細書に開示される「喘息疾患」の用語は、イエダニ、動物の毛またはフケ、ゴキブリ、食品、薬物、咳、タバコの煙、大気汚染、食品添加物、運動などの身体活動、天候の変化、黄砂、ストレスなどの様々な外的要因により引き起こされる任意の喘息を含むが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではない。
【００４８】
本明細書で開示される「予防」の用語は、本発明の組成物を投与することによって、本明細書で開示される或る特定の疾患または障害の発症を阻害または遅延する任意の作用を含み、また、本明細書で開示される「治療」の用語は、本発明の組成物を投与することによって、本明細書で開示される或る特定の疾患または障害と関連する症状を緩和または有利に変化させる任意の作用を含む。
【００４９】
本発明者らは、新規な工業化された精製抽出物を調製する方法が、従来技術に開示される従来の方法により調製された粗抽出物（様々なＨＰＬＣ分析を通して８．４９％（ｗ／ｗ）にすぎないカタルポール誘導体含有量）と比較して、より豊富な、すなわち３６．５％〜９１．０％（ｗ／ｗ）のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物に由来するカタルポール誘導体などの有効成分を提供できることを見出し、例えば、本発明の精製抽出物（ＡＴＣ１）は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して、１７．６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．７２％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２．６２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１．０８％（ｗ／ｗ）ピクロシドＩＩ、１．２６％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポール、および２．３６％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール（実施例２を参照されたい）を含有し、本発明の精製抽出物（ＡＴＣ２）は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して、４３．８３％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１．８０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、７．０７％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２．９３％（ｗ／ｗ）ピクロシドＩＩ、３．８５％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポール、および６．１５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有するのに対し、従来技術に開示される従来の方法によって調製された粗抽出物（ＣＸ）は、粗抽出物に対して、５．９％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．２１％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．８２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．４０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．４２％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および０．７４％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有するに過ぎず、また、本発明の精製抽出物は、好酸球の増殖、血漿および気管支肺胞洗浄液中の免疫グロブリンおよび炎症性ケモカインの放出に対する阻害試験、ならびにＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける気道応答性亢進の抑制および杯細胞過形成の抑制などの様々なインビボ試験を通して従来の調製方法によって調製した精製抽出物よりも強力な抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示した。
【００５０】
したがって、本発明の他の態様によれば、本発明は、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療および予防のため、有効成分としてシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから上述の方法により調製された有効成分を豊富に含有する精製抽出物を含む医薬組成物を提供する。
【００５１】
本発明は、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療および予防のため、有効成分としてシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから上述の方法により調製された有効成分を豊富に含有する精製抽出物と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
また、本発明の別の態様によれば、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから上述の方法によって調製された有効成分を豊富に含有する精製抽出物の炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療または予防用に採用される医薬の製造に対する使用を提供する。
【００５３】
本明細書で定義される「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」の用語は、「薬学的添加物」、すなわち、医薬を製造するのに使用される不活性な原料を含む。薬学的添加物として、色素、香味料、結合剤、軟化剤、充填剤、滑剤、防腐剤、および他にも多くの分類が挙げられる。一般的な賦形剤として、当該技術分野（食品医薬品局のホームページ：www.fda.govまたは医薬品情報オンラインwww.drugs.comを参照されたい）または以前の文献（例えば、Rowe, Raymond C et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 7th Edition, 2012）でよく知られている、コーンスターチ、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖、ゼラチン、ステアリン酸カルシウム、二酸化ケイ素、シェラック、およびグレーズが挙げられる。
【００５４】
また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物において炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を治療または予防する方法が提供され、上記方法は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから上述の方法によって調製された有効成分を豊富に含有する、治療的有効量の精製抽出物を、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患を患う哺乳動物に投与することを含む。
【００５５】
炎症性疾患、アレルギー疾患、または喘息疾患の治療および予防用の本発明の組成物は、上記組成物の総重量あたり０．１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％で上記抽出物を含んでもよい。
【００５６】
本発明による組成物を薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油を含有する医薬組成物として提供することができる。上記製剤は、追加的に、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、当該技術分野でよく知られている任意の手順を採用することにより、患者に投与した後の上記有効成分の即時放出、持続放出または遅延放出を提供するように製剤化されてもよい。
【００５７】
例えば、本発明の組成物を、油、プロピレングリコールまたは注射剤を製造するのに通常使用される他の溶媒に溶解することができる。担体の好適な例として、生理学的食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルなどが挙げられるが、それらに限定されない。局所投与あたりは、本発明の抽出物を軟膏およびクリームの形態に製剤化することができる。
【００５８】
本組成物を含有する医薬製剤は、経口剤形（粉末、錠剤、カプセル、軟カプセル、水性薬剤、シロップ、エリキシル、丸剤、粉末、サシェ、粒剤）、または局所用調製物（クリーム、軟膏、ローション、ジェル、香膏、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアロゾルなど）、または注射用調製物（溶液、懸濁液、エマルション）などの任意の形態に調製してもよい。
【００５９】
医薬剤形の本発明の組成物は、それらの薬学的に許容可能な塩の形態で使用されてもよく、さらに、単独でまたは他の薬学的活性化合物と適当な関連のもと、また同じく、それらと組合せて使用されてもよい。
【００６０】
本発明の抽出物の望ましい用量は、被験体の状態および体重、重症度、薬剤の形態、投与経路および期間に応じて変化し、当業者により選択されてもよい。しかしながら、所望の効果を得るため、一般的には、１日当たり体重１ｋｇ当たり本発明の独創的な抽出物を０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与することが推奨される。上記用量は、１日１回投与されてもよく、１日に数回に分けて投与されてもよい。
【００６１】
本発明の医薬組成物を、様々な経路で哺乳動物（ラット、マウス、家畜またはヒト）などの被験動物に投与することができる。全ての投与様式を考慮する。例えば、投与は経口で、経直腸で、または静脈内、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、硬膜外もしくは脳室内の注射により行うことができる。
【００６２】
また、様々な機能性健康食品および保健用食品の調製において、本発明の独創的な抽出物を主成分または添加物および補助剤として使用することができる。
【００６３】
したがって、本発明の他の目的は、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の予防または緩和用のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから上述の方法により調製された有効成分を豊富に含有する精製抽出物を含む健康機能性食品を提供することである。
【００６４】
「機能性健康食品」の用語は、本明細書では「ヒトまたは哺乳動物において目的とする疾患を予防または改善するため本発明の抽出物を従来の食品に添加することにより物理的機能性または生理学的機能性などの増強された機能性を有する機能性食品」と定義される。
【００６５】
本発明の他の目的は、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の予防または緩和のための食品学的に許容可能な添加物と共に、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから上述の方法によって調製された有効成分を豊富に含有する精製抽出物を含む保健用食品を提供することである。
【００６６】
「保健用食品」の用語は、本明細書では「添加物の形態として少量で、または粉末、顆粒、カプセル剤、丸剤、錠剤などの形態として全量で、特定の意図した効果を示さないが、全体的な意図した効果を示す本発明の抽出物を含有する食品」と定義される。
【００６７】
本明細書で定義される「食品学的に許容可能な添加物」は、「直接または間接に、任意の食品の成分となる、またはそうでなければ任意の食品の特徴に影響を及ぼす、または合理的にそれが予想される用途の任意の物質」を含み、その起源に応じて３つの群、すなわち、（１）ケトン、グリシン、クエン酸ナトリウム、ニコチン酸などの化学合成添加物；（２）カキ色素、カンゾウ抽出物、結晶セルロース、グアーガムなどの天然添加物；（３）Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、防腐剤、タール色素などのそれらとの混合添加物など、または当該技術分野もしくは以前の文献（GSFA Online：www.codexalimentarius.net/gsfaonline/index.htmlのホームページの“Codex General Standard for Food Additives”（GSFA, Codex STAN 192-1995）を参照されたい）でよく知られている、食品におけるその機能による様々なカテゴリー、例えば、増粘剤、熟成剤、漂白剤、捕捉剤、湿潤剤、固化防止剤、清澄剤、硬化剤、乳化剤、安定剤、増ちょう剤、塩基および酸、気泡剤、栄養素、着色剤、香味剤、甘味料、保存剤、抗酸化剤などに分類され得る。
【００６８】
或る物質がその食品における特定の目的のために食品に添加される場合、それは直接添加物と呼ばれ、間接食品添加物は、その包装、保存または他の取り扱いによって微量でその食品の一部となるものである。
【００６９】
本明細書に開示される「保健用食品または健康機能性食品」の用語は、食品、健康飲料、栄養補助食品などに含めることができ、目的とする疾患を予防または改善するために、粉末、顆粒、錠剤、懸濁液、エマルション、シロップ、チューイングタブレット、カプセル、飲料などの薬学的な投与形態；または食品形態、例えばパン、餅、ドライフルーツ、キャンディー、チョコレート、チューイングガム、アイスクリーム、低脂肪乳などの牛乳、乳糖加水分解済みの牛乳、山羊乳、加工乳、発酵乳、バター、濃縮乳、ミルククリーム、バターオイル、ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、粉ミルク、乳清などの乳製品、ハンバーグ、ハム、ソーセージ、ベーコンなどの加工肉製品、加工卵製品、魚粕などの魚肉製品、即席麺、乾麺、生麺（wet noodles）、フライドヌードル、ノンフライ麺、ゼラチン化乾麺、加熱調理済み麺、凍結乾燥麺、パスタなどの麺製品、ティーバッグ、浸出茶などの茶製品、フルーツ飲料、野菜飲料、炭酸清涼飲料水、豆乳飲料、乳酸飲料配合飲料などの健康飲料、醤油、味噌、唐辛子ペースト、チュンジャン（カラメルで色付けした発酵大豆製品の一種）、チョングッチャン（バチルス・サブチリスによる自然発酵大豆）、混合ペースト、酢、ソース、ケチャップ、カレー粉、ドレッシングなどの調味料、マーガリン、ショートニング、ピザなどへと配合してもよいが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではない。
【００７０】
また、上述の抽出物を目的の障害を予防および改善する食品または飲料に添加することができる。機能性健康食品または保健用食品としての食品または飲料における上述の抽出物の量は、一般的には、機能性健康食品組成物用の食品の総重量の約０．０１ｗ／ｗ％〜約１００ｗ／ｗ％の範囲であってもよい。特に、機能性健康食品、保健用食品または特殊な栄養食品における本発明の抽出物の好ましい量は各食品の意図される目的に応じて変化し得るが、一般的に、上記食品組成物１００％あたり麺類などの食品において約０．０１％〜５％、保健用食品において４０％〜１００％の範囲の割合の量で本発明の抽出物を添加物としての用途に使用することが好ましい。
【００７１】
本発明の健康飲料組成物が指定される割合で必須の成分として上記抽出物を含有する場合、他の液体成分については何らの制限もなく、他の成分は、従来の飲料などの様々な消臭剤（deodorant）または天然の糖質とすることができる。上述の天然の糖質の例は、ブドウ糖、果糖などの単糖、マルトース、ショ糖などの二糖、デキストリン、シクロデキストリンなどの従来の糖、ならびにキシリトールおよびエリスリトールなどの糖アルコールなどである。上述のもの以外の消臭剤として、有利には、タウマチン、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなどのステビア抽出物などの天然の消臭剤、およびサッカリン、アスパルテームなどの合成消臭剤などを用いてもよい。上述の天然の糖質の量は、一般的には、本発明の飲料組成物１００ｍｌ当たり約１ｇ〜２０ｇ、好ましくは５ｇ〜１２ｇの範囲の割合である。
【００７２】
上述の組成以外の成分は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル、または電解質、合成香味剤、着色剤、およびチーズ、チョコレートなどの場合の品質改良剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド接着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料などに使用される炭化剤である。上述のもの以外の成分は、天然果汁ジュース、果汁飲料、および野菜飲料を調製するための果汁であってもよく、上記成分は独立してまたは組合せて使用され得る。上記成分の比率はさほど重要ではないが、一般的には、本発明の組成物１００ｗ／ｗ％当たり約０ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の範囲である。上記抽出物をそれに含む追加可能な食品の例は、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品などである。
【００７３】
本発明の独創的な抽出物は、毒性およびそれに対する副作用がなく、安全に使用することができる。
【００７４】
本発明の組成物、使用および調製物において、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修飾および変更を行うことができることが当業者に明らかであろう。
【００７５】
本発明は、以下の実施例によってより具体的に説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないことが理解されるべきである。
【発明の効果】
【００７６】
本発明に記載されるように、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物に由来するカタルポール誘導体などの有効成分を、従来技術に開示される従来の調製方法によって調製された精製抽出物よりも豊富に含有する精製抽出物を調製するための独創的で新規な工業化された方法が提供され、上記精製抽出物は、ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける、好酸球の増殖、血漿中および気管支肺胞洗浄液中の免疫グロブリンおよび炎症性ケモカインの放出に対する阻害試験、ならびに気道の応答性亢進および杯細胞過形成の抑制などの様々なインビボ試験を通して、より強力な抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示した。したがって、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療および予防用の治療薬または機能性健康食品として上記精製抽出物を使用することができる。
【００７７】
本発明の上記および他の目的、特徴および他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明によって更に明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】比較例１で調製されたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図２】実施例１で調製されたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの本発明の精製抽出物（ＡＴＣ１）のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図３】実施例２で調製されたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの本発明の精製抽出物（ＡＴＣ２）のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図４】ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける気道応答性亢進に対する本発明の精製抽出物の抑制効果を示す図である。
【図５】気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞の動員に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図６】血清中の免疫グロブリン（総ＩｇＥ）の放出に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図７】血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥの放出に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図８】ＩＬ−１βの放出に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図９】炎症性サイトカインの放出に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図１０】炎症性サイトカインの放出に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図１１】炎症性サイトカインの放出に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【図１２】気管支肺胞洗浄液の組織学的検査を使用する肺組織細胞への炎症細胞の動員に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を表す図である。
【図１３】気管支肺胞洗浄液の組織学的検査を使用する肺組織細胞への炎症細胞の動員に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を表す図である。
【図１４】気管支肺胞洗浄の組織学的検査を使用する肺組織細胞への粘液分泌に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を表す図である。
【図１５】気管支肺胞洗浄の組織学的検査を使用する肺組織細胞への粘液分泌に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明の組成物、使用および調製物において、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な修飾および変更を行うことができることが当業者に明らかであろう。
【００８０】
本発明を、以下の実施例においてより具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないと理解されるべきである。
【実施例】
【００８１】
以下の参照例、実施例および実験例は、その範囲を限定することなく本発明を更に説明することを意図するものである。
【００８２】
比較例１．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物の調製
１−１．粗抽出物（ＡＴＥ）の調製
１ｋｇの乾燥シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（ＧＡＰに従い、大韓民国忠清北道陰城郡蘇伊面２４４で栽培した）を小片に切断し、１０Ｌの４０％エタノールと混合した。混合物を室温で２４時間撹拌し、３回に亘って７８℃で１２時間の還流抽出により抽出して濾過物を回収した。抽出物を濾紙で濾過して細片を除去した。回収した濾過物を減圧下で５５℃〜６５℃にてロータリーエバポレーター（EYELA、Ｎ−２１００、日本）で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、比較例として使用する２０２ｇの乾燥粗抽出物（以下、「ＡＣＥ」と示す）を得た。
【００８３】
１−２．粗抽出物（ＡＴＭ）の調製
１．１ｋｇの乾燥シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（ＧＡＰに従い、大韓民国忠清北道陰城郡蘇伊面２４４で栽培した）を小片に切断し、５Ｌのメタノールと混合した。混合物を室温で２４時間撹拌し、３回に亘って７８℃で１２時間の還流抽出により抽出して濾過物を回収した。抽出物を濾紙で濾過して細片を除去した。回収した濾過物を減圧下で５５℃〜６５℃にてロータリーエバポレーター（EYELA、Ｎ−２１００、日本）で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、比較例として使用する１００．５ｇの乾燥粗抽出物（以下、「ＡＴＭ」と示す）を得た。
【００８４】
１−３．成分分析
表１の条件に従ってＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０モデル、米国）を使用して成分分析を行い、結果を図１に示す。
【００８５】
図１からわかるように、各成分を、それぞれ９．５４８分（ベルプロシド）、１０．８１７分（ベラトルム酸）、１６．７２８分（カタルポシド）、２０．３４６分（ピクロシドＩＩ）、２１．８５３分（イソバニロイルカタルポール）、および３０．４６２分（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）に検出したことを確認した。
【００８６】
数式１に従って、試料中の各成分の含有量（％）をＨＰＬＣパターン（保持時間）に基づいて算出した。
【００８７】
各成分の含有量＝標準の濃度（ｍｇ／ｍｌ）／被験試料の濃度（ｍｇ／ｍｌ）×Ａｔ／Ａｓ×標準の純度（％）［数式１］
式中、「Ａｔ」は被験試料中の成分面積を示し、「Ａｓ」は被験試料のサンプリングした容量と標準とが互いに同一である場合の標準における成分面積を示す。
【００８８】
【表１】
0005923222.tif 000002
【００８９】
結果として、表２に見られるように、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物には、僅か８．４９％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体、すなわち５．９％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．２１％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．８２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．４０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．４２％（ｗ／ｗ）のイソバニリルカタルポール、および０．７４％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールがそれぞれ含まれていることが確認された。
【００９０】
【表２】
0005923222.tif 000003
【００９１】
実施例１．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの精製抽出物（ＡＴＣ１）の調製
比較例１に従って従来の方法により調製したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物（ＡＣＥ）を２Ｌの蒸留水に懸濁し、懸濁物を２Ｌのブタノールに添加して、ブタノール可溶性画分と水溶性画分とに分画した。ブタノール可溶性画分を回収し、減圧下で濃縮し、乾燥して、試験例として使用する８２ｇの本発明のブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得た。
【００９２】
表１の条件に従ってＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０モデル、米国）を使用して成分分析を行い、結果を図２に示す。
【００９３】
図２からわかるように、各成分を、それぞれ、９．５４５分（ベルプロシド）、１０．８２１分（ベラトルム酸）、１６．７２７分（カタルポシド）、２０．３４５分（ピクロシドＩＩ）、２１．８５３分（イソバニロイルカタルポール）、および３０．４６２分（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）に検出したことを確認した。
【００９４】
数式１に従って、試料中の各成分の含有量（％）をＨＰＬＣパターン（保持時間）に基づいて算出した。
【００９５】
結果として、表３に見られるように、本発明のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムのブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）には、２５．６４％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体、すなわち１７．６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．７２％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２．６２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１．０８％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２６％（ｗ／ｗ）のイソバニリルカタルポール、および２．３６％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールがそれぞれ含まれていることが確認された。
【００９６】
【表３】
0005923222.tif 000004
【００９７】
実施例２．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの精製抽出物（ＡＴＣ２）の調製
実施例１による本発明のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムのブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を、７５ｍｌの混合溶媒（蒸留水：メタノール＝１：０．００３）に溶解し、溶出溶媒（蒸留水：メタノール＝９０：１０→６０：４０）を使用して懸濁物を溶出しながら、逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ１８（ＩＶ）−Ｄ−７５−１２０ｎｍ、AGC Si-Tech Co. Ltd.、日本、４５０ｇ）に７５ｇの上記溶液を充填した。最初の溶出溶媒系（蒸留水：メタノール＝９０：１０）による８．４Ｌの溶出液を回収し、減圧下で濃縮した。後の溶出溶媒系（蒸留水：メタノール＝６０：４０）による５．６Ｌの溶出液を回収し、減圧下で濃縮し、乾燥して、試験例として使用する３３ｇの二次分画による本発明の精製抽出物（ＡＴＣ２）を得た。
【００９８】
表１の条件に従ってＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０モデル、米国）を使用して成分分析を行い、結果を図３に示す。
【００９９】
図３からわかるように、各成分を、それぞれ、９．５２５分（ベルプロシド）、１０．８１８分（ベラトルム酸）、１６．７２１分（カタルポシド）、２０．３４６分（ピクロシドＩＩ）、２１．８５７分（イソバニロイルカタルポール）、および３０．４６２分（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）に検出したことを確認した。
【０１００】
数式１に従って、試料中の各成分の含有量（％）をＨＰＬＣパターン（保持時間）に基づいて算出した。
【０１０１】
結果として、表４に見られるように、本発明のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）には、６５．６３％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体、すなわち４３．８３％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１．８０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、７．０７％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２．９３％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、３．８５％（ｗ／ｗ）のイソバニリルカタルポール、および６．１５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールがそれぞれ含まれていることが確認された。
【０１０２】
【表４】
0005923222.tif 000005
【０１０３】
実験例１．ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける総血清ＩｇＥレベルの予備測定
比較例で調製した粗抽出物よりも薬学的に強力な活性を示す精製抽出物を見出すため、文献（Elias, J. A. et al., J. Clin. Invest., 111, pp297-297, 2003）に開示される方法により以下の予備試験を行った。
【０１０４】
１−１．動物の感作および気道曝露
関連する呼吸器病原体について日常的に血清学的にスクリーニングされた６週齢の特定病原体除去雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約２０ｇ）をORIENT Co.（韓国ソウル）から購入し、１週間に亘って実験環境に馴化させた。
【０１０５】
簡潔には、２００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の水酸化アルミニウム２ｍｇ中に乳化した２０μｇのＯＶＡ（オブアルブミン；Ａ５５０３、ミズーリ州セントルイスのSigma）を隔週で腹腔内注射してマウスを感作した。最初の感作から２８日目〜３４日目に超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２、日本国東京のOmron Corp.）を使用し、ＯＶＡ（ＰＢＳ中１％）により気道を通して３０分間マウスを曝露した。抗原処理の２４時間後、気道の応答性亢進を測定し、最後の曝露の４８時間後にマウスを犠牲した。最後の曝露の２４時間後にペントバルビタール（Ｅｎｔｏｂａｌ（商標）、Hanrim Pharm. Co. Ltd.）の過剰摂取によりマウスを犠牲し、気管切開を行った。１．２ｍｌの生理学的食塩溶液（ＰＢＳ）を肺に滴下注入した後、気管挿管を介して３回の吸引により（合計１．５ｍｌ）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を得た。
【０１０６】
群を幾つかの群、すなわち、（ａ）正常対照群（ＮＣ）：ＯＶＡ処理群またはＯＶＡ非処理群、（ｂ）喘息誘発群（ＯＶＡ）：ＯＶＡで処理して喘息を誘発した群、および（ｃ）比較群：ＯＶＡ吸入の１時間前に陽性対照群（Ｍ３０、モンテルカスト、３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、Sigma-Aldrich Co. Ltd.、ＳＭＬ−０１０１）で処理した群に分けた。
【０１０７】
試験群は各群６匹のマウスからなり、ＯＶＡ吸入の１時間前に様々な濃度の被験試料であるＡＴＣ１（３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）およびＡＴＭ（３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）をマウスに経口投与した。
【０１０８】
表５に示されるように、喘息誘導群（ＯＶＡ）の血清中の総ＩｇＥレベルは有意に増加したのに対し、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ１、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した被験試料群の総ＩｇＥレベルは、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物（ＡＴＭ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）で処理した群における総ＩｇＥレベルよりも減少した。（表５を参照されたい）
【０１０９】
【表５】
0005923222.tif 000006
【０１１０】
実験例２．ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける気道応答性亢進試験を使用する抗喘息効果
ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける気道応答性亢進を使用して実施例で調製した被験試料の抗喘息効果を確認するため、文献（Elias, J. A. et al., J. Clin. Invest., 111, pp297-297, 2003）に開示される方法により以下の試験を行った。
【０１１１】
１−１．動物の感作および気道曝露
関連する呼吸器病原体について日常的に血清学的にスクリーニングされた６週齢の特定病原体除去雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約２０ｇ）をORIENT Co.（韓国ソウル）から購入し、１週間に亘って実験環境に馴化させた。
【０１１２】
簡潔には、２００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の水酸化アルミニウム２ｍｇ中に乳化した２０μｇのＯＶＡ（オブアルブミン；Ａ５５０３、ミズーリ州セントルイスのSigma）を隔週で腹腔内注射してマウスを感作した。最初の感作から２８日目〜３４日目に超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２、日本国東京のOmron Corp.）を使用し、ＯＶＡ（ＰＢＳ中１％）により気道を通して３０分間マウスを曝露した。抗原処理の２４時間後、気道の応答性亢進を測定し、最後の曝露の４８時間後にマウスを犠牲した。最後の曝露の２４時間後にペントバルビタール（Ｅｎｔｏｂａｌ、Hanrim Pharm. Co. Ltd.）の過剰摂取によりマウスを犠牲し、気管切開を行った。１．２ｍｌの生理学的食塩溶液（ＰＢＳ）を肺に滴下注入した後、気管挿管を介して３回の吸引により（合計１．５ｍｌ）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を得た。
【０１１３】
マウスの群（ｎ＝６）を調査し、マウスに以下の処理を受けさせた：（１）正常対照群（ＮＣ）としてＯＶＡ非処理群、（２）喘息誘発群（ＯＶＡ）としてＯＶＡで処理し、吸入する対象群、（３）ＯＶＡ吸入の１時間前に既知の喘息治療薬で処理する陽性対照群（モンテルカスト、３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、Sigma-Aldrich Korea、ＳＭＬ−０１０１、Ｍ３０）、（４）様々な濃度の被験試料、すなわち、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの精製抽出物（ＡＴＣ２）をＯＶＡ吸入の１時間前に経口投与する被験試料群。
【０１１４】
１−２．気道の応答性亢進の評価
マウスの気道の応答性亢進を評価するため、装置（ワンチャンバー全身容積脈波記録法、ＯＣＰ３０００、韓国ソウルのAll Medicus）を使用して気道抵抗を測定し、測定値を気道閉塞の程度を反映するＰｅｎｈ値（エンハンスドポーズ（Enhance Pause））により統計学的に算出した。安静呼吸時の基底値を測定し、超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２、日本国東京のIMRON Corp.）により３分間ＰＢＳを吸入した後のＰｅｎｈ値を測定するプロセスによって３分間に亘りＰｅｎｈ値を測定した。
【０１１５】
その後、様々な濃度、１２ｍｇ／ｍｇ、２５ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌのメタコリン（Ａ２２５１、ミズーリ州セントルイスのSigma）を、濃度を増加させながら吸入させ、Ｐｅｎｈ値を測定した。メタコリン吸入後のＰｅｎｈ値の増加を百分率（％）で表し、ベースラインのＰｅｎｈ値を１００％に設定した。Ｐｅｎｈの値を数式２に従って算出し、結果を図４に示す。
【０１１６】
Ｐｅｎｈ＝（Ｔｅ／ＲＴ−１）×ＰＥＦ／ＰＩＦ［数式２］
Ｔｅ：呼気時間（吸入から次の吸入までの時間）
ＲＴ：緩和時間（息を吐く間に呼気量が１回の呼気量の３０％程度に達する時間）
ＰＥＦ：最大呼気流量
ＰＩＦ：最大吸気流量
【０１１７】
その結果、喘息誘発群（ＯＶＡ）としてＯＶＡで処理し、吸入した対照群におけるＰｅｎｈ値は急激に増加したのに対し、正常対照群（ＮＣ）としてＯＶＡで処理しなかった群におけるＰｅｎｈ値は、メタコリンの濃度が増加するにつれて徐々に増加したことを確認した。
【０１１８】
間もなく、モンテルカスト（ＭＯ）で処理した陽性対照群、また同じく、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ−１０、ＡＴＣ−２５およびＡＴＣ−５０）を経口投与した被験試料群におけるＰｅｎｈ値は、メタコリンの濃度に関わらず有意に減少した（表６を参照されたい）。
【０１１９】
【表６】
0005923222.tif 000007
【０１２０】
そのようなＰｅｎｈ値の変化は、低用量メタコリン処理群におけるＰｅｎｈ値よりも高用量メタコリン処理群の場合に顕著であり、また、同じ濃度のメタコリンに対して、被験試料中のＰｅｎｈ値は用量依存性に著しく減少したことを確認した。
【０１２１】
したがって、本発明の精製抽出物は気道の応答性亢進を効果的に抑制し、そのため、上記精製抽出物が喘息疾患、気道のアレルギー性疾患の治療または予防に有用であることを確認した。
【０１２２】
実験例３．ＢＡＬＦ中の好酸球および炎症細胞のレベルに対する効果
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球および炎症細胞のレベルに対する実施例で調製した被験試料の阻害効果を確認するため、文献（Chen M. et al., Immunolgy, pp376-384, 2011）に開示される方法により以下の試験を行った。
【０１２３】
実験例１で調製した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収して炎症細胞のレベルを測定した。
【０１２４】
トリパンブルーで染色することにより死細胞を排除した後、血球計数器の少なくとも５つの正方形における細胞を数えて炎症細胞の総数を算定した（Daigle I. et al., Swiss Med Wkly, 131, pp 2317, 2001）。１００μｌのＢＡＬＦをスライドにのせ、Ｃｅｌｌｓｐｉｎ機（Ｃｙｔｏ１２．５＋ｃｌｉｐ５、韓国のHanil Science Industrial）を使用して遠心分離（２００×ｇ、４℃、１０分間）し、スライド上に細胞を固定した。製造業者の指示書に従って細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（商標）染色試薬（スイス国のSysmex、カタログ番号３８７２１）により染色した。統計学的有意性を独立平均に関するスチューデントの両側ｔ検定により特定し、有意性に関する臨界値をＰ＜０．０５に設定した。
【０１２５】
図５に示されるように、喘息誘発群（ＯＶＡ）としてＯＶＡで処理し、吸入した対照群における好酸球および炎症細胞の総数は、正常対照群（ＮＣ）としてＯＶＡで処理しなかった群の総数と比べて有意に増加した。
【０１２６】
モンテルカスト（ＭＯ）で処理した陽性対照群、また同じく、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ−５、ＡＴＣ−１０、ＡＴＣ−２５およびＡＴＣ−５０）を経口投与した被験試料群において好酸球および炎症細胞の総数は有意に減少した（表７を参照されたい）。
【０１２７】
【表７】
0005923222.tif 000008
【０１２８】
実験例４．血清中のＩｇＥおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルに対する効果
血清中のＩｇＥおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルに対する実施例で調製した被験試料の阻害効果を確認するため、文献（Kay, A.B., The New England Journal of Medicine, 344, pp30-37, 2001）に開示される方法により以下の試験を行った。
【０１２９】
実験例１で調製した血清および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収して血清中のＩｇＥおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルを測定した。
【０１３０】
血清および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡプレート）に添加し、２０μｇ／ｍｌのＯＶＡ（米国ミズーリ州のSigma）を含有する０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝溶液（ｐＨ８．３）で４℃にて終夜被覆した。１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳを使用して非特異的反応を阻害した後、試験用の血清を１：４００に希釈し、室温にて２時間、共に反応させた。洗浄後、血清を希釈した（×３００）抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体（ＭＣＡ４１９、英国オックスフォードのSerotec）と共に２時間反応させ、希釈した（×４０００）ＨＲＰ複合ヤギ抗ラットＩｇＧポリクローナルＡ（ＳＴＡＲ１１０Ｐ、英国のSerotec）と共に室温で１時間反応させた。洗浄後、溶液を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（５２−００−０２、KPL）基質で染色し、２ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止し、４５０ｎｍで分光計（Ｖｅｒｓａｍａｘ、米国のMolecular Devices）を使用して吸光度を測定した。
【０１３１】
図６および図７に示されるように、喘息誘導群（ＯＶＡ）としてＯＶＡにより処理し、吸入した対照群における血清中のＩｇＥおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルは有意に増加したのに対し、モンテルカスト（ＭＯ）で処理した陽性対照群、また同じく、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ−５、ＡＴＣ−１０、ＡＴＣ−２５およびＡＴＣ−５０）を経口投与した被験試料群における上記レベルは有意に減少した（表８を参照されたい）。
【０１３２】
【表８】
0005923222.tif 000009
【０１３３】
したがって、本発明の精製抽出物が血清中のＩｇＥおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルを効果的に阻害し、そのため、上記精製抽出物がアレルギー製疾患および喘息疾患の治療または予防に有用であることを確認した。
【０１３４】
実験例５．ＢＡＬＦ中の炎症性サイトカインのレベルに対する効果
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）およびＩＬ−１βのレベルに対する実施例で調製した被験試料の阻害効果を確認するため、文献（Renz H. et al., J. Exp. Med., 1777, pp1175-1180, 1993）に開示されるサンドイッチ酵素免疫吸着アッセイ法により以下の試験を行った。
【０１３５】
血清および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）をサイトカイン抗体で被覆した９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡプレート）に添加し、室温にて２時間に亘り抗原抗体反応を誘導した。製造業者の手引きに従って各サイトカインと特異的に反応するＥＬＩＳＡキット（米国カリフォルニア州のBiosource Int.）を使用して、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）およびＩＬ−１βのレベルを特定した。
【０１３６】
図８および図９〜図１１に示されるように、ＯＶＡ処理の４８時間後、喘息誘発群（ＯＶＡ）としてＯＶＡで処理し、吸入した対照群におけるＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）およびＩＬ−１βのレベルは、正常対照群（ＮＣ）としてＯＶＡで処理しなかった群のレベルと比べて有意に増加した。
【０１３７】
モンテルカスト（ＭＯ、３０ｍｇ／ｋｇ）で処理した陽性対照群、また同じく、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ−１０、ＡＴＣ−２５およびＡＴＣ−５０）を経口投与した被験試料群におけるＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）およびＩＬ−１βのレベルの増加は、有意に減少した（表９を参照されたい）。
【０１３８】
【表９】
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【０１３９】
したがって、本発明の精製抽出物がＢＡＬＦ中のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）およびＩＬ−１βのレベルを効果的に阻害し、そのため、上記精製抽出物がアレルギー性疾患および喘息疾患の治療または予防に有用であることを確認した。
【０１４０】
実験例６．肺組織学
実施例で調製した被験試料の抗喘息効果を確認するため、文献（Kwak YG. et al., J. Clin. Invest., 111, pp1083-1092, 2003）に開示される方法により、気管支肺胞組織あたり以下の組織学的分析を行った。
【０１４１】
気管支肺胞洗浄を行わなかったＢＡＬＢ／ｃマウスから得た肺組織を１０％の中性緩衝ホルマリンで２４時間固定した。パラフィンに包埋した後、４厚の切片を作製し、組織をＨ＆Ｅ溶液（ヘマトキシリン；Ｓｉｇｍａ  ＭＨＳ−１６およびエオシン；Ｓｉｇｍａ  ＨＴ１１０−Ｉ−３２）で染色し、無作為に選択した各切片の５つの領域の炎症スコアを特定した。（炎症スコア０：気管支周辺に炎症を起こした細胞は見られない、炎症スコア１：気管支周辺に散発的に炎症を起こした細胞が見られる、炎症スコア２：大半の気管支周辺に薄い炎症を起こした細胞層が見られる、炎症スコア３：大半の気管支周辺に厚い炎症を起こした細胞層が見られる）。
【０１４２】
図１２、図１３に示されるように、喘息誘発群（ＯＶＡ）としてＯＶＡで処理し、吸入した対照群において、好酸球を含む多くの炎症細胞が細気管支周辺に見られ、上皮細胞の過形成、ならびに気管筋の肥大も見られたのに対し、モンテルカスト（ＭＯ、３０ｍｇ／ｋｇ）で処理した陽性対照群、また同じく、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ−１０、ＡＴＣ−２５およびＡＴＣ−５０）を経口投与した被験試料群において炎症を起こした細胞の浸潤は有意に減少した（表１０を参照されたい）。
【０１４３】
【表１０】
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【０１４４】
実験例７．杯細胞形成の評価
実施例で調製した被験試料の抗喘息効果を確認するため、文献（Lee KS. et al., FASEB J., 20, pp455-465, 2006）に開示される方法により、気管支肺胞組織あたり以下の杯細胞形成分析を行った。
【０１４５】
気管支肺胞洗浄を行わなかったＢＡＬＢ／ｃマウスから得た肺組織を１０％の中性緩衝ホルマリンで２４時間固定した。パラフィンに包埋した後、４厚の切片を作製し、組織を過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ染色キット、Ｔ−Ｋ７３０８、米国カリフォルニア州のIMEB）で染色して細気管支上皮細胞中の杯細胞の割合を特定した。
【０１４６】
図１４、図１５に示されるように、細気管支上皮細胞中の杯細胞の割合は、正常な対照群（Ｎｃ）と比較して、喘息誘発群（ＯＶＡ）としてＯＶＡにより処理し、吸入した対照群において有意に増加したのに対し、細気管支上皮細胞中の杯細胞の割合はモンテルカスト（ＭＯ、３０ｍｇ／ｋｇ）で処理した陽性対照群、また同じく、様々な濃度の被験試料（ＡＴＣ−１０、ＡＴＣ−２５およびＡＴＣ−５０）を経口投与した被験試料群でも有意に減少した（表９を参照されたい）。
【０１４７】
実験例８．ラットにおける経口投与による急性毒性試験
６週齢のＳＰＦ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに本発明の抽出物を投与することにより、急性毒性試験を行った。
【０１４８】
２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、５０００ｍｇ／ｋｇの本発明の抽出物を、２匹のラットからなる各群に経口投与し、ラットの症状を１４日間に亘り観察した。抽出物の投与の後、全ての臨床上の変化、すなわち、死亡率、臨床兆候、体重の変化を観察し、血液学検査および血液生化学検査などの血液検査を行った。検視により腹部臓器および胸部臓器の異常な変化を観察した。
【０１４９】
いずれの群またはいずれの性別においても、死亡率の変化、臨床兆候、体重変化および重大な知見を全く示さなかった。さらに、５０００ｍｇ／ｋｇの本発明の抽出物で処理した試験群において何らの毒性も示さなかった。
【０１５０】
したがって、本発明で調製した本発明の抽出物が経口投与においてＬＤ５０（５０００ｍｇ／ｋｇ超）を示す強力で安全な物質であったことが確認された。
【０１５１】
［発明の形態］
以下に製剤化方法および賦形剤の種類を記載するが、本発明はそれらに限定されない。代表的な調製例を以下に記載する。
【０１５２】
注射用調製物
ＡＴＣ１抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３．０ｍｇ
メチルパラベン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．８ｍｇ
プロピルパラベン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１ｍｇ
注射用蒸留水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
【０１５３】
有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に制御し、その後、全ての成分を２ｍｌアンプルに充填して、従来の注射用調製物の方法により滅菌することにより注射用調製物を調製した。
【０１５４】
粉末調製物
ＡＴＣ２抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５００ｍｇ
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
タルク．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｍｇ
【０１５５】
上記成分を混合し、密封パッケージに充填することにより粉末調製物を調製した。
【０１５６】
錠剤調製物
ＡＴＣ１抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２００ｍｇ
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
【０１５７】
上記成分を混合し、打錠することにより錠剤調製物を調製した。
【０１５８】
カプセル調製物
ＡＴＣ２抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
タルク．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
【０１５９】
上記成分を混合し、従来のゼラチン調製物の方法によりゼラチンカプセルに充填することにより錠剤調製物を調製した。
【０１６０】
液体調製物
ＡＴＣ１抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｇ
多糖類．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｇ
レモンフレバー．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｇ
【０１６１】
有効成分を溶解した後、全ての成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、従来の液体調製物の方法により滅菌することによって液体調製物を調製した。
【０１６２】
健康食品調製物
ＡＴＣ２抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
混合ビタミン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
ビタミンＡアセテート．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．７０ｇ
ビタミンＥ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１．０ｍｇ
ビタミンＢ１．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．２ｇ
ビタミンＣ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｍｇ
ビオチン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｇ
ニコチン酸アミド．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１．７ｍｇ
葉酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｇ
パントテン酸カルシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５ｍｇ
混合ミネラル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
硫酸第一鉄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１．７５ｍｇ
酸化亜鉛．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１５ｍｇ
リン酸二カルシウム....．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５５ｍｇ
クエン酸カリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９０ｍｇ
炭酸カルシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
塩化マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２４．８ｍｇ
【０１６３】
上述のビタミンおよびミネラルの混合物は、様々に変化し得る。かかる変化は、本発明の趣旨および範囲から逸脱するものではないものとする。
【０１６４】
健康飲料調製物
ＡＴＣ１抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
クエン酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
オリゴ糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｇ
濃縮アンズ....．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｇ
タウリン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１ｇ
蒸留水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９００ｍｌ
【０１６５】
有効成分を溶解し、混合し、８５℃で１時間撹拌し、濾過した後、全ての成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、従来の健康飲料調製物の方法により滅菌することによって健康飲料調製物を調製した。
【０１６６】
上述の本発明について、該発明が様々に変化し得ることが明らかであろう。かかる変化は本発明の趣旨および範囲から逸脱するものとされず、当業者に自明であろう全てのかかる修飾が添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明に記載されるように、本発明は、従来技術に開示される従来の調製方法によって調製された抽出物よりも、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物に由来するカタルポール誘導体などの有効成分を豊富に含有する精製抽出物を調製するための独創的で新規な工業化された方法を提供し、上記精製抽出物は、ＯＶＡ感作／曝露マウスモデルにおける、好酸球の増殖、血漿中および気管支肺胞洗浄液中の免疫グロブリンおよび炎症性ケモカインの放出に対する阻害試験、ならびに気道の応答性亢進および杯細胞過形成の抑制などの様々なインビボ試験を通して、従来技術に開示される従来の調製方法によって調製された精製抽出物よりも強力な抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示した。したがって、炎症性疾患、アレルギー疾患または喘息疾患の治療および予防用の治療薬または機能性健康食品として上記精製抽出物を使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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