(57)【要約】【課題】  関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性を評価する方法について簡便かつ再現性の高いバイオマーカーを見出し、効果的な評価方法を提供すること。【解決手段】  被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法であって、前記被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、を有することを特徴とする、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法であって、
前記被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、
前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、
を有することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、又は関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、
前記解析する工程は、前記測定したＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた血液におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、
前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示すものであり、前記被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示すものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
前記ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、（ｉ）配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列、又は（ｉｉ）配列ＩＤ番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものである、
ことを特徴とする、方法
【請求項７】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は関節リウマチに罹患しているものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、
測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における血液由来のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定するものであり、
前記投与前および投与後における血液におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有する、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのＦＡＭ２０Ａバイオマーカー。
【請求項１０】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのバイオマーカーとしての、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有するＦＡＭ２０Ａの使用。
【請求項１１】
請求項１記載の方法に用いられるアレイであって、
ＦＡＭ２０Ａ遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の位置に固定してなることを特徴とするアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法、並びにそれに用いるバイオマーカーに関する。具体的には、本発明は、被験者から採血した血液から、本願発明に係るバイオマーカー遺伝子の発現量を測定・標準化し、その発現量から作成された遺伝子発現プロファイルに基づいて、当該被験者における関節リウマチ活動性指標を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性疾患の代表である関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：「ＲＡ」）は、慢性多発性関節炎を主症状とする全身性結合組織疾患であり、自己免疫疾患の一種である。関節リウマチは、３０〜６０歳の女性に好発し、有病者数は日本国内においては約７０万人と推測されている。関節リウマチの病態には関節滑膜における血管新生、炎症性細胞浸潤、滑膜細胞増殖、軟骨・骨破壊などが挙げられる。また、関節リウマチにおける関節炎は改善と増悪を繰り返しながら進行し、徐々に軟骨・骨破壊を引き起こし、関節リウマチ患者の日常労作の阻害や生活の質（ＱＯＬ）の低下を招く。【０００３】
このような関節リウマチの臨床においては、患者に対して最良の治療を提供するため、当該患者における関節リウマチの病態・病勢の活動性を、特定の指標を算出することにより評価している。例えば、この指標の評価においては、患者の痛みに関する自己評価、関節（疼痛関節数、圧痛関節数、腫脹関節数など）の検査・測定、および血液検査（赤沈、リウマトイド因子、ＣＲＰなど）等の評価項目を組み合わせて、関節リウマチの病態・病勢の活動性をスコア化している。そしてスコア化された指標から、当該患者の疾患の程度を評価している。また、尿中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストを指標とすることができることも報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３５３０２３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、このような指標を用いて関節リウマチの病態・病勢の活動性を評価する場合、上記のように、患者の痛みに関する自己評価が含まれるため、患者自身の主観的な判断が必要とされる。しかし、患者自身の痛み等に対する評価は、個人や観察者によってばらつきがあるため、客観的にその活動性を評価することは困難である。また、現状の血中マーカーについては、それだけで患者の病態・病勢を総合的に評価することは困難である。そこで、関節リウマチ疾患の診断および治療による予後の推定のために、より簡便で再現性の高い疾患マーカーの解明や、直接的に疾患の程度を判別する方法の開発が望まれている。  
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性を評価する方法について簡便かつ再現性の高いバイオマーカーを見出し、効果的な評価方法を提供することを目的とする。【０００７】
本発明者らは、このような課題を解決するために、ヒト関節リウマチ疾患の患者についてＦＡＭ２０Ａの遺伝子発現量に着目した結果、関節リウマチ疾患の病態活動性の程度に比例して、ＦＡＭ２０Ａの遺伝子発現量が変化することを観察した。そこで、ＦＡＭ２０Ａの遺伝子発現量について、鋭意研究を重ねた結果、被験者から採取した血液中のＦＡＭ２０Ａが関節リウマチ疾患の診断マーカーおよび治療薬の投与効果に関するマーカーとなり得ることを見出し、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を測定することにより、関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性を評価することができることを見出した。【０００８】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法であって、前記被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、を有することを特徴とする、方法が提供される。【０００９】
このような構成によれば、被験者に特別な負荷を与えることなく、採血するだけで、当該被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定することが可能となる。また、このような構成によれば、低侵襲的且つ簡便に被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定することができる。【００１０】
血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を測定することにより、関節リウマチ疾患に関連する指標の値を同定することができるため、再現性があり、従来の、患者の自己評価を含む方法に比べて信頼性が高く、かつ簡易に検査することができる。また、本願発明に係る方法を利用することにより、関節リウマチの治療薬による治療効果を判定することもできる。これは、患者自身の痛み等に対する主観的な判断を必要としないため、客観的にその効果を判定することができるため有用である。【００１１】
また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものであることが好ましい。この場合、前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、又は関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである。【００１２】
また、本発明の他の一実施形態によれば、このような方法において、前記解析する工程は、前記測定したＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた血液におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われるものであることが好ましい。この場合、前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示すものであり、前記被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示すものである。【００１３】
さらに、本発明の別の一実施形態によれば、このような方法において、前記ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、（ｉ）配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列、又は（ｉｉ）配列ＩＤ番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものであることが好ましい。【００１４】
また、本発明のさらに別の一実施形態によれば、このような方法において、前記被験者は関節リウマチに罹患しているものであることが好ましい。この場合、測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における血液由来のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定するものであり、前記投与前および投与後における血液におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである。【００１５】
また、本発明の第二の主要な観点によれば、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有する、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのＦＡＭ２０Ａバイオマーカーが提供される。【００１６】
また、本発明の第三の主要な観点によれば、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのバイオマーカーとしての、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有するＦＡＭ２０Ａの使用が提供される。【００１７】
また、本発明の第四の主要な観点によれば、上記のような方法に用いられるアレイであって、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の位置に固定してなることを特徴とするアレイが提供される。【００１８】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現細胞解析を示すグラフである。
【図２】図２は、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量とＤＡＳ２８−ＣＲＰおよびＤＡＳ２８−ＥＳＲとの相関解析結果を示すスキャッタープロット図である。
【図３Ａ】図３Ａは、メトトレキサートの投与前後における、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の変動を示す結果である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、インフリキシマブの投与前後における、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の変動を示す結果である。
【図４】図４は、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の健常者および他炎症性疾患における発現解析を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子のマイクロアレイとＰＣＲとの発現解析の相関を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量についての、健常者と関節リウマチ患者との間の有意差検定を示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量についての、疾患活動性指標であるＤＡＳ２８−ＣＲＰと臨床情報であるＣＲＰとの相関を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
本実施形態に係る被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法は、上述したように、前記被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、を有することを特徴とするものである。【００２１】
ここで、本発明の一実施形態において、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、関節リウマチの活動性の指標に正比例して発現量が変化するものであり、後述する実施例に記載するように、活動性の指標の増減を特に反映しているものである。なお、本願明細書において「遺伝子マーカー」とは、「遺伝子」とほぼ同意に用いられるものであり、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となるものであって、ここではある遺伝子の発現量と相関するときの遺伝子関連物質をいう。例えば、遺伝子それ自体、転写物であるｍＲＮＡ、翻訳物であるペプチド、遺伝子発現の最終産物であるタンパク質などが含まれる。また、遺伝子の「相対発現頻度」とは、当該遺伝子の発現量を標準化したものを意味するものであり、当該遺伝子の転写レベル（転写物などの場合）または翻訳レベルにおける発現量（ポリペプチド、タンパク質などの場合）をも包含して意味するものである。【００２２】
本実施形態において、「関節リウマチに関連する指標」とは、例えば、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度等が含まれるが、関節リウマチの病勢や病態の程度や活動性を数値化・スコア化して表すことのできるものであれば、これらに限られるものではない。【００２３】
ＤＡＳ（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）とは、ＥＵＬＡＲ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ：ヨーロッパリウマチ連盟）が推奨する評価法であるＤＡＳ（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）が推奨する評価方法である。また、ＤＡＳ２８とは、このＤＡＳを、日常の診療で使用し易いようにするため、評価する関節を２８関節に絞り込んだものである。ＤＡＳ２８では、２８関節について、（１）圧痛のある関節数、（２）腫れのある関節数、（３）血沈の１時間値、又はＣＲＰ（ｍｇ／ｄｌ）、（４）全般的な病状の評価値、の４項目を測定し、所定の公式により数値化し、疾患の活動性の絶対値を算出する。なお、血沈を用いる場合にはＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＣＲＰ値を用いる場合にはＤＡＳ２８−ＣＲＰという。本願実施例において、ＤＡＳ２８としては、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ及びＤＡＳ２８−ＣＲＰのいずれをも用いることができる。また、ＤＡＳ４４とは４４関節について測定するものである。本実施形態においては、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＤＡＳ２８−ＣＲＰやＤＡＳ２８−ＥＳＲが変動するが、特定のＤＡＳ２８−ＣＲＰやＤＡＳ２８−ＥＳＲに対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。なお、ＤＡＳ２８−ＥＳＲにおいては、５．１（４．１）以上である場合に高疾患活動性、３．２（２．７）<ＤＡＳ２８−ＥＳＲ≦５．１（４．１）である場合には中等度疾患活動性、２．６（２．３）<ＤＡＳ２８−ＥＳＲ≦３．２（２．７）である場合には低疾患活動性、そして２．６（２．３）以下の場合には寛解と分類評価される（カッコ内はＤＡＳ２８−ＣＲＰ）。また、本発明において、寛解とは、病気の症状が一時的あるいは継続的に軽減した状態、又は見かけ上消滅した状態をいう。【００２４】
また、本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する場合には、ＥＵＬＡＲ改善基準を用いることもでき、ＥＵＬＡＲ改善基準は、ＤＡＳ２８が基本となっている。治療前に対する治療後の（薬剤投与前に対して薬剤投与後の）ＤＡＳ２８値の２つを組み合わせて、治療効果を反応良好（ｇｏｏｄ）、中等度反応（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、反応なし（ｎｏ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の３段階で評価している。本実施形態においては、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例して、当該被験者における治療効果を上記３段階のいずれかに評価することができる。本実施形態においては、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＥＵＬＡＲ改善基準が変動するが、特定のＥＵＬＡＲ改善基準に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現変動量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、中等度反応に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現変動量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、反応良好や反応なしに対応する発現変動量も適宜設定される。【００２５】
本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する場合には、当該指標としてＳＤＡＩ（Ｓｉｍｐｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を用いることもできる。ＳＤＡＩとは、上述のＤＡＳの計算式が複雑であるため臨床現場において簡単に計算できるものではなかったため、臨床現場においても簡便に算出できるような評価方法として開発されたものである。このＳＤＡＩでは、その評価される関節はＤＡＳ２８と同じであり、疼痛関節数、腫脹関節数、患者全般度評価、医師全般度評価によって算出される。ＳＤＡＩにおいては、２６以上である場合に高疾患活動性、１１<ＳＤＡＩ≦２６である場合には中等度疾患活動性、３．３<ＳＤＡＩ≦１１である場合には低疾患活動性、そして３．３以下の場合には寛解と分類評価される。本実施形態において、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＳＤＡＩの値が変動するが、特定のＳＤＡＩの値に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、ＳＤＡＩの中等度疾患活動性を示す特定の値に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、その他の高疾患活動性や低疾患活動性を示す特定の値に対応する発現量も適宜設定される。【００２６】
また、本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する場合には、当該指標としてＣＤＡＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を用いることもできる。ＣＤＡＩとは、ＳＤＡＩからＣＲＰを除いたものである。ＣＤＡＩにおいては、２２以上である場合に高疾患活動性、１０<ＣＤＡＩ≦２２である場合には中等度疾患活動性、２．８<ＣＤＡＩ≦１０である場合には低疾患活動性、そして２．８以下の場合には寛解と分類評価される。本実施形態において、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＣＤＡＩの値が変動するが、特定のＣＤＡＩの値に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、ＣＤＡＩの中等度疾患活動性を示す特定の値に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、その他の高疾患活動性や低疾患活動性を示す特定の値に対応する発現量も適宜設定される。【００２７】
本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する場合には、当該指標としてＡＣＲを用いることもできる。ＡＣＲとは、アメリカリウマチ学会が定めた関節リウマチの病理程度の分類基準であるＡＣＲ改善基準である。ＡＣＲ改善基準はＡＣＲコアセットである７項目によって定められる。ＡＣＲコアセットは、（１）圧痛関節数、（２）腫脹関節数、（３）患者による疾患の評価、（４）患者による疾患活動性の全般的評価、（５）医師による疾患活動性の全般的評価、（６）患者による身体機能評価、（７）急性期反応物質、の７項目から成る。ＡＣＲ改善基準は、例えば、治療前に対して治療後に（薬剤投与前に対して薬剤投与後に）、上記（１）（２）がともに２０％以上改善し、かつ、上記（３）〜（７）の５項目のうち３項目以上が２０％以上改善した場合に、「ＡＣＲ基準２０％の改善あり（ＡＣＲ２０）」と判定される。同様に、ＡＣＲが５０％ならびに７０％改善した場合、ＡＣＲ５０、ＡＣＲ７０という基準が用いられる。なお、本願明細書において、単に「ＡＣＲ」と表記した場合には、特に言及しない限り、「ＡＣＲ改善基準」を指すものとする。本実施形態においては、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＡＣＲ基準が変動するが、特定のＡＣＲ基準に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現変動量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、ＡＣＲ５０に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現変動量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、ＡＣＲ２０やＡＣＲ７０に対応する発現量も適宜設定される。【００２８】
本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する場合には、当該指標として血清ＣＲＰ濃度を用いることもできる。血清ＣＲＰ値の正常値は０．３ｍｇ／ｄｌである。本実施形態においては、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減に比例して血清ＣＲＰ値が変動するが、血清ＣＲＰ値の正常値に対応するＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。【００２９】
また、本願発明に係る一実施形態において、「ＦＡＭ２０Ａ遺伝子」とは、（ｉ）配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列、又は（ｉｉ）配列ＩＤ番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものである。なお、ＦＡＭ２０Ａは分泌タンパク質であることがわかっている。【００３０】
本発明者らは、ＦＡＭ２０Ａの生物学的な意義を解明するため、血液に含まれる免疫細胞のうち、どの細胞がＦＡＭ２０Ａの発現ソースであるのかを、公開マイクロアレイデータベースＮＣＢＩ  ＧＥＯ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）から取得した、免疫細胞別マイクロアレイデータセットを用いて解析した。その結果を図１に示す。ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は樹状細胞、Ｂ細胞に高発現することが明らかとなった。抗原提示細胞である樹状細胞、抗体を産生するＢ細胞は、いずれもリウマチ病態に大きく寄与することが知られている。これらのことから、生物学的にも末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現が関節リウマチ病態へ関与する可能性が高いと推察された。【００３１】
本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法は、当該被験者から採取した血液中に含まれるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を測定することによって行われる。本実施形態に係る同定する方法において、被験検体は、被験者から採取した血液が挙げられ、全血、末梢血、或いは当該血液から分離取得した血清を被験検体としても良い。ここで、血清の取得方法は特に限定されるものではなく、従来存在する種々の方法、例えば血液から臨床検査用検体として取得する血清の分離方法に準じることができる。例えば、血液検体を静置した後の上清や、遠心分離したときの上清などから取得しても良い。或いは、採取した血液を試験管等に採り、室温で所定条件の下、遠心分離して得られる上清の血清を検査用検体とすることもできる。【００３２】
本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法は、被験者由来の血液を検体として簡便に検査することができる点で、関節液を採取して検査する方法に比べて、検体の取得が容易であり、通常の臨床検査に使用する検査用検体を用いることができる点で有利である。関節液は侵襲的な手法により採取されるため、痛みを伴うなどの患者負担が大きく、また出血や感染症などの合併症も危惧されることから、関節液を検査するのは、ルーチン的な検査方法としてはあまり好ましくない。一方で、本願発明のように血液を検体としてＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する場合には、上述の問題点が解消され、被験者における関節リウマチに関連する指標の値の同定を簡便に行うことができる。なお、本明細書において、ＦＡＭ２０Ａ量とは、特段に言及する場合を除きＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を意味する。【００３３】
本願発明に係る一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法では、採取した血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子を関節リウマチの活動性指標のマーカーとする。本願発明に係る方法により得られたＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量の測定結果から関節リウマチの活動性指標や病勢・病態を同定することができ、さらには、関節リウマチの診断ならびに関節リウマチ治療薬の治療効果の判定を行うこともできる。【００３４】
ここで、本願発明における一実施形態において、本願発明に係る方法を用いて関節リウマチ治療薬の治療効果を判定する場合には、関節リウマチに罹患している被験者に対して、関節リウマチ治療薬の投与前および投与後において採血を行い、その採血した投与前後の各血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を測定することによって行うことができる。その後、予め用意した、関節リウマチに関連する指標と相関する遺伝子発現プロファイルを用いて、当該各血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を比較することを特徴とする。【００３５】
本実施形態においては、上記のようにして関節リウマチ治療薬の治療効果を判定した結果、当該治療薬の投与前後におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量の増減と、実際の治療効果の評価とは、密接に関連することが判明している。例えば、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現の測定結果とＥＵＬＡＲ改善基準での評価との関係は、治療効果の程度を密接に反映することができる（後述の実施例を参照）。【００３６】
本願発明において、「関節リウマチ治療薬」又は「関節リウマチの治療薬」としては、特に限定されるものではなく、従来から公知の治療薬および今後開発されるあらゆる治療薬が含まれる。例えば、従来から公知の関節リウマチ治療薬としては、生物学的製剤、非ステロイド性抗炎症薬（消炎鎮痛薬）、ステロイド薬、免疫抑制剤などが挙げられる。生物学的製剤としては、キメラ型抗ＴＮＦ−α抗体製剤、可溶性ＴＮＦレセプターや、完全ヒト型抗ＴＮＦ−α抗体製剤、抗ＩＬ−６レセプター抗体製剤などが挙げられる。非ステロイド性抗炎症薬としては、プロスタグランジン産生抑制剤が挙げられる。具体的には、本願発明における関節リウマチ治療薬としては、メトトレキサート（ＭＴＸ）、インフリキシマブ（ＩＦＸ）、エタネルセプト（ＥＴＮ）、トシリズマブ（ＴＣＺ）、アダリムマブ（ＡＤＡ）、アバタセプト（ＡＢＴ）等が含まれるが、これらに限られるものではない。【００３７】
本願発明における一実施形態において、関節リウマチに関連する指標の値の同定は、被験者のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量と、関節リウマチ罹患者および健常者、並びに種々の関節リウマチ治療薬の投薬の有無を含む、各種疾患・健康状態におけるサンプル群におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量から予め用意された遺伝子発現プロファイルとを比較解析することによって行うことができる。或いは、関節リウマチに関連する指標の値の同定は、同一被験者（健常者および関節リウマチ罹患者含む）の関節リウマチ治療薬の投薬前における遺伝子発現量プロファイルと関節リウマチ治療薬の投薬後における遺伝子発現プロファイルとを比較解析することにより、当該被験者の関節リウマチに関連する指標の値を同定するものであってもよい。この場合、上記各種疾患・健康状態におけるサンプル群は、性別、年齢、治療薬の種類、治療薬投与後の時間等の要素によって分類してサンプリングしたものであっても良い。なお、予め用意された遺伝子発現プロファイルは、蓄積サンプル数が多ければ多いほど好ましく、本発明に係る同定方法の精度も高くなる。また、本願発明においては、このような蓄積サンプルに係るデータや予め用意された遺伝子発現プロファイルを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、当該データベースから蓄積データを取り出し、測定された被験者のデータと比較するだけで、被験者における関節リウマチに関連する指標の値をいつでも簡便に同定することができる。【００３８】
なお、本実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値の同定・解析は、測定したＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を、各種疾患・健康状態におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される遺伝子発現プロファイルと比較することによって行うことができるが、治療薬の投与後としての期間は、関節リウマチ疾患の状態を評価する上で臨床的に意義のある任意の期間を設定可能である。【００３９】
また、本実施形態において、上述の遺伝子発現プロファイルは、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量と特定の関節リウマチに関連する指標値との間で正の相関関係を示すものであることが好ましい。従って、例えば、被験者由来の血液中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量が基準発現量よりも高い場合には、当該指標は基準値よりも高い病勢活動度を示す。【００４０】
ここで、本願発明における一実施形態において、遺伝子発現プロファイルの作成・生成や、データの解析手法としてはクラスタ解析や各種アルゴリズム等の分子生物学又はバイオインフォマティクス等の分野で用いられる任意の解析手段を用いることができる。【００４１】
本願発明における一実施形態において、上記したようなＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのバイオマーカーとして用いることもできる。また、この場合はこのバイオマーカーは、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有することが好ましい。【００４２】
また、本願発明における一実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法において使用されるアレイは、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の各々異なる位置に固定してなるものである。本実施形態において、このようなアレイは、必要であればＰＣＲ用のプレートで代用することができ、この場合、前記プローブは、プレート上のウェルの各々異なる位置に配置している構成になっている。【００４３】
（実験手法）
以下に、本願発明の一実施形態に係る遺伝子マーカーの効果を証明するために使用した実験手法および物質並びにその定義を説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。
（遺伝子の定量）
また、本実施形態において、遺伝子マーカーが遺伝子または遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）である場合、遺伝子の発現量の測定（定量）は、例えば、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ法、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、ドットブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の種々の分子生物学的手法によってｍＲＮＡ量を測定することにより行うことができる。【００４４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、遺伝子又は遺伝子マーカーを特異的に検出することができるものであれば特に制限されるものではないが、１２〜２６塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、ヒトの各遺伝子の配列情報に基づいて決定する。そして、決定した配列を有するプライマーを、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて作製することができる。【００４５】
一方、遺伝子マーカーが遺伝子の翻訳物（ポリペプチド）又は最終産物（タンパク質）である場合、例えば、遺伝子マーカーに対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などによって遺伝子マーカーの発現量の測定を行うことができるが、これらの方法に限定されるものではなく、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、放射免疫測定法）、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、酵素免疫法）等、様々な手法を用いることができる。【００４６】
「遺伝子」には、ＲＮＡやＤＮＡなどの塩基配列によって示される遺伝情報をいうものである。ヒト、マウス、ラットなどの生物種間で保存されるオーソログ遺伝子なども含まれる。遺伝子は、タンパク質をコードするものだけでなく、ＲＮＡやＤＮＡとして機能するものであってもよい。遺伝子は、その塩基配列にしたがうタンパク質をコードするのが一般的であるが、当該タンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（たとえば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）や変異体や誘導体）をコードするものであってもよい。たとえば、遺伝情報による塩基配列によって示されるタンパク質とはわずかに塩基配列が異なるタンパク質であって、その塩基配列が遺伝子情報による塩基配列の相補配列とハイブリダイズするようなタンパク質をコードするような遺伝子であってもよい。【００４７】
「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡだけでなく、これに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡやこれらから構成される２本差ＲＮＡを含む概念である。また、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡを含む概念である。【００４８】
「ＤＮＡチップ」「ＤＮＡアレイ」とは、プローブＤＮＡを基板上に配した構造を有し、ハイブリダイゼーションにより、複数の遺伝子の発現を測定するものである。光学的に発現量を計測するためのものだけでなく、電気的に発現量を出力するものも含む。「ＤＮＡチップ」としては、たとえば、アフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）を用いることができる。「ＤＮＡアレイ」としては、アマシャムバイオサイエンス社のＣｏｄｅＬｉｎｋ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏａｒｒａｙ（商標）を用いることができる。なお、ＤＮＡアレイには、ＤＮＡマイクロアレイだけでなくＤＮＡマクロアレイも含む。【００４９】
「発現量」とは、遺伝子の発現量を直接的に測定した値だけでなく、所定の計算や統計学的手法によって変換された値も含む概念である。また、「遺伝子発現量」や「発現シグナル」、「遺伝子発現シグナル」、「発現シグナル値」、「遺伝子発現シグナル値」、「遺伝子発現データ」、「発現データ」等も個々の遺伝子の発現を反映する値を指すものとして同義である。【００５０】
「遺伝子発現」とは遺伝子の発現量により表現される生体の遺伝子発現の態様を指し、１個の遺伝子の発現量により表される場合及び複数の遺伝子の発現量により表される場合のいずれもが含まれる。また、「発現」も生体の遺伝子発現の態様を指すものとして同義である。
【実施例】
【００５１】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５２】
（マーカー遺伝子の探索・選定方法）
以下に、本発明のマーカー遺伝子の探索・選定方法について説明する。【００５３】
本発明者らは、埼玉医科大学総合医療センターリウマチ・膠原病内科を受診した関節リウマチ患者のうち、研究参加について文書により説明し同意を得た２１２名（計４０２検体）の末梢血サンプルを用いてマーカー遺伝子の探索を行なった。サンプルの内訳を以下の表に示す。【００５４】
【表１】
2013073041.tif 000002
【００５５】
対象被験者血液からのＲＮＡ抽出は、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。抽出ＲＮＡについて、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により収量を測定し、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により分解が無いことを確認した。次に、ＲＮＡ２５０ｎｇからＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐ  Ｋｉｔ  ＰＬＵＳ，Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応によりｃＲＮＡを増幅、同時に蛍光標識（Ｃｙ３標識）した。続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４×４４ｋに対して、蛍光標識されたｃＲＮＡを６５℃にて１７時間ハイブリさせた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により蛍光画像を読み取り、さらに、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製画像数値化ソフトＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを用いて蛍光画像における各スポットのシグナル強度の数値化を行った。【００５６】
数値化後のデータの正規化処理は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイ解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ１１を用いて、７５ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ  ｓｈｉｆｔ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎにて行なった。各プローブのＬｏｇ２（ノーマライズ値）と被験者のＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲとのＰｅａｒｓｏｎ積率相関係数、無相関検定ｐ値を算出し、疾患活動性と相関する遺伝子抽出した。【００５７】
各プローブについて算出された、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲとの無相関検定のｐ値を平均化し、その平均値の小さい順にソートして上位３０のプローブリストを得た。その結果を表２に示す。【００５８】
【表２】
2013073041.tif 000003
【００５９】
Ｔｏｐの２プローブは、ＦＡＭ２０Ａ（Ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ２０，ｍｅｍｂｅｒ  Ａ）転写産物を検出するプローブであった。当該遺伝子は、関節リウマチの疾患活動性が上昇するに従い、末梢血における発現が亢進する。【００６０】
（ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の解析）
以下に、本願発明に係るＦＡＭ２０Ａ遺伝子の解析結果について説明する。【００６１】
ＦＡＭ２０Ａ  Ｌｏｇ２（ノーマライズ値）とＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＳＤＡＩ、ＣＤＡＩとの散布図を図２に示した。また、ＦＡＭ２０ＡとＤＡＳ２８以外の臨床検査項目の相関解析結果を表３に示す。【００６２】
【表３】
2013073041.tif 000004
【００６３】
この結果から、ＦＡＭ２０Ａ  Ｌｏｇ２（ノーマライズ値）とＣＲＰ、ＥＳＲ、ＴＪＣ、ＳＪＣ、ＧＨなどのＤＡＳコンポートネント、生活機能評価指標であるＨＡＱ（ｈｅａｌｔｈ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）、また、リウマチ血液で高まるとされているＭＭＰ−３と有意な正相関が認められた。このことから、末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現量を測定することにより、関節リウマチの活動性を客観的に、かつ、総合的に捉えることができるものと考えられた。【００６４】
（薬剤投与によるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現の変動）
同一関節リウマチ患者について、薬物治療前後をフォローした際にＦＡＭ２０Ａがどのように発現変動するかを検証した。【００６５】
図３Ａは、ＭＴＸ投与２６例を２２ｗ投与時のＥＵＬＡＲ改善基準別に３群（Ｇｏｏｄ、Ｍｏｄｅｒａｔｅ、Ｐｏｏｒ）に分類し、それぞれの群ごとに、ＦＡＭ２０Ａ発現のＭＴＸ投与前後の変動を確認した結果である。ＦＡＭ２０Ａ発現は、ＥＵＬＡＲ改善基準がＭｏｄｅｒａｔｅレスポンス群では０ｗに比べ２２ｗに有意な低下、またＧｏｏｄレスポンス群においても２２ｗに低下傾向を示した。一方、Ｐｏｏｒレスポンス群ではほとんど変化が認められなかった。【００６６】
図３Ｂは、ＩＦＸ投与４６例において同様の解析を行なったものである。ＭＴＸ投与と同様の傾向が認められ、ＦＡＭ２０Ａ発現はＧｏｏｄ、Ｍｏｄｅｒａｔｅレスポンス群において２２ｗに有意な発現低下を示したが、Ｐｏｏｒレスポンス群ではほとんど変化はなかった。以上の結果より、末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現が関節リウマチの薬剤効果を反映しうるマーカーであることが示唆された。【００６７】
（健常者および他疾患との比較）
ＦＡＭ２０Ａの関節リウマチ患者、健常者、肝炎患者における発現量を比較し、ＦＡＭ２０Ａの関節リウマチ診断マーカーとしての可能性を検証した。なお、肝炎患者のサンプルは、炎症疾患コントロールとして比較に用いた。【００６８】
関節リウマチ患者サンプルとしては、先の図３Ａ示したＭＴＸ投与２６例のＭＴＸ０ｗ、２２ｗサンプルを解析に用いた。健常者サンプルとしては、健診目的で医療法人飛祥会北國クリニック（石川県金沢市）を受診した健常者のうち、末梢血遺伝子発現解析研究に参加することについて文書により説明し同意を得た１２４名の末梢血サンプル（Ｎｏｒｍ Ｈ）と、健診目的で公立松任石川中央病院（石川県白山市）を受診した健常者のうち、末梢血遺伝子発現解析研究に参加することについて文書により説明し同意を得た１００名の末梢血サンプル（Ｎｏｒｍ Ｍ）を解析に用いた。さらに炎症疾患コントロールサンプルとして、金沢大学医学部附属病院消化器内科を受診した肝炎患者のうち、末梢血遺伝子発現解析研究に参加することについて文書により説明し同意を得た６名の末梢血サンプル（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）を解析に用いた。各サンプル群のＦＡＭ２０ＡのＬｏｇ２（ノーマライズ値）の分布を図４に示す。【００６９】
Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ検定の結果、ＲＡ  ＭＴＸ０ｗとＮｏｒｍ  Ｈ、Ｎｏｒｍ  Ｍ、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓの間、また、ＲＴ  ＭＴＸ２２ｗとＮｏｒｍ  Ｈ、Ｎｏｒｍ  Ｍの間に有意差（ｐ<０．０５）が認められた。これらの結果は、ＦＡＭ２０Ａが、関節リウマチの活動性の評価マーカーとなるだけでなく、健常者、その他炎症性疾患とも区別し得る関節リウマチの診断マーカーとなる可能性を示唆するものである。【００７０】
（ＰＣＲによる解析）
「関節リウマチ患者における末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現と関節リウマチ活動性の相関」および「健常者と関節リウマチ患者における末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現の差」について、リアルタイムＰＣＲにて結果のバリデーションを行なった。【００７１】
前述した解析サンプルから、健常者１２例、リウマチ患者１５例をピックアップし、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行なった。実験には２０ｎｇ  ＲＮＡを用いた。補正のための内部標準遺伝子としてはＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。実験に用いたＦＡＭ２０Ａ検出用プライマーは以下の通りである。
Ｌｅｆｔ：ＣＧＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣ（配列ＩＤ番号３）
Ｒｉｇｈｔ：ＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴ（配列ＩＤ番号４）
また、ＧＡＰＤＨ検出用プライマーは以下の通りである。
Ｌｅｆｔ：ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ（配列ＩＤ番号５）
Ｒｉｇｈｔ：ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ（配列ＩＤ番号６）
図５Ａ〜Ｃに結果を示す。【００７２】
図５Ａは、全２７サンプルにおけるＦＡＭ２０ＡのマイクロアレイデータとＰＣＲサイクル数の相関を示したものである。データの相関は極めて良好であった（Ｒ２＝０．５２９）。また、図５Ｂは、ＰＣＲにより定量されたＦＡＭ２０Ａ発現量について、健常者１２例と関節リウマチ患者１５例との間で比較解析を行なったものである。健常者に比べ、関節リウマチ患者において有意な発現亢進が認められた。さらに、図５Ｃは、関節リウマチ患者１５例において、ＰＣＲにより定量されたＦＡＭ２０Ａ発現量とＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＣＲＰとの相関を解析したものである。マイクロアレイデータ同様、ＦＡＭ２０Ａ発現とこれら臨床指標との間に有意な正相関が認められた。【００７３】
以上の結果により、「関節リウマチ患者における末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現と関節リウマチ活動性の相関」および「健常者と関節リウマチ患者における末梢血ＦＡＭ２０Ａ発現の差」はマイクロアレイ解析のみならず、リアルタイムＰＣＲにおいても再現することが明らかとなった。【００７４】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
2013073041.tif 000005
【図２】
2013073041.tif 000006
【図３Ａ】
2013073041.tif 000007
【図３Ｂ】
2013073041.tif 000008
【図４】
2013073041.tif 000009
【図５Ａ】
2013073041.tif 000010
【図５Ｂ】
2013073041.tif 000011
【図５Ｃ】
2013073041.tif 000012
【配列表】
2013073041000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月17日(2013.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法であって、
前記被験者由来の末梢血中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、
前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、
を有することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、又は関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、
前記解析する工程は、前記測定したＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた末梢血におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、
前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示すものであり、前記被験者由来の末梢血中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示すものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
前記ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、（ｉ）配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列、又は（ｉｉ）配列ＩＤ番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものである、
ことを特徴とする、方法
【請求項７】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は関節リウマチに罹患しているものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、
測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における末梢血由来のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定するものであり、
前記投与前および投与後における末梢血におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有する、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのＦＡＭ２０Ａバイオマーカー。
【請求項１０】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのバイオマーカーとしての、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有するＦＡＭ２０Ａの使用。
【請求項１１】
請求項１記載の方法に用いられるアレイであって、
ＦＡＭ２０Ａ遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の位置に固定してなることを特徴とするアレイ。
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月20日(2014.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定する方法であって、
前記被験者由来の末梢血中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、
前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、
を有することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、又は関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、
前記解析する工程は、前記測定したＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた末梢血におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、
前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示すものであり、前記被験者由来の末梢血中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示すものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
前記ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、（ｉ）配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列、又は（ｉｉ）配列ＩＤ番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は関節リウマチに罹患しているものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、
前記測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における末梢血由来のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定するものであり、
前記投与前および投与後における末梢血におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有する、被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのＦＡＭ２０Ａバイオマーカー。
【請求項１０】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を同定するためのバイオマーカーとしての、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有するＦＡＭ２０Ａの使用。
【請求項１１】
請求項１記載の方法に用いられるアレイであって、
ＦＡＭ２０Ａ遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の位置に固定してなることを特徴とするアレイ。
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月1日(2014.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における関節リウマチに関連する指標の値を推定する方法であって、
前記被験者由来の末梢血中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、
前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の値を推定する工程と、
を有し、
前記解析する工程は、前記測定したＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた末梢血におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われるものであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、又は関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、
前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示すものであり、前記被験者由来の末梢血中のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示すものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、
前記ＦＡＭ２０Ａ遺伝子は、（ｉ）配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列、又は（ｉｉ）配列ＩＤ番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は関節リウマチに罹患しているものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、
前記測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における末梢血由来のＦＡＭ２０Ａ遺伝子の発現量を測定するものであり、
前記投与前および投与後における末梢血におけるＦＡＭ２０Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものである、
ことを特徴とする、方法。
【請求項８】
配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有する、被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定するための末梢血由来のＦＡＭ２０Ａバイオマーカー。
【請求項９】
被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定するためのバイオマーカーとしての、配列ＩＤ番号１に記載される塩基配列を有する末梢血由来のＦＡＭ２０Ａの使用。
【請求項１０】
請求項１記載の方法に用いられるアレイであって、
ＦＡＭ２０Ａ遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の位置に固定してなることを特徴とするアレイ。
【国際調査報告】
2013073041.tif 000013
2013073041.tif 000014