(57)【要約】  本発明は、イヌの歯周病の場合に、感染した細菌の病原性の強弱を判定する方法を提供することを課題とする。  本発明の発明者らは、イヌの歯周病の主要な病原体がPorphyromonas gulaeという細菌であることを見出し、さらにこの細菌の線毛を形成するタンパク質であるフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAをコードする遺伝子、fimA遺伝子が主に3種類のグループに分けられること、そしてそのそれぞれのグループごとに、歯周病の原因細菌としての病原性との関連性において相関関係を有することを明らかにし、本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を有する、グループCに分類されるPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAの部分ペプチド。
【請求項２】
それぞれ、SEQ ID NO: 21のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項1に記載のFimAの部分ペプチド。
【請求項３】
請求項1または2に記載の部分ペプチドを含む、タンパク質。
【請求項４】
SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のタンパク質。
【請求項５】
SEQ ID NO: 5のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項4に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項1または2に記載の部分ペプチドまたは請求項3〜5のいずれかに記載のタンパク質に対して結合するが、SEQ ID NO: 2または4のアミノ酸配列を有するタンパク質に対しては結合しない、抗体。
【請求項７】
口腔内スプレー、ジェルなどの形状で適用する、請求項6に記載の抗体。
【請求項８】
請求項1または2に記載の部分ペプチドまたは請求項3〜5のいずれかに記載のタンパク質を免疫源として含む、グループCに分類されるPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAに対するワクチン。
【請求項９】
属するグループが未知のPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのグループを、グループA〜グループCの3つのグループに分類する工程；
グループBおよびグループCに分類されるPorphyromonas gulaeを病原性群と判定する工程；
を含む、イヌの歯周病におけるPorphyromonas gulaeの病原性の強度を判定する方法。
【請求項１０】
グループCに分類されるPorphyromonas gulaeを高病原性と判断する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
FimAのアミノ酸配列を、Porphyromonas gulaeのFimAタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を全塩基配列決定することにより特定する、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
属するグループが未知のPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列を、グループA〜グループCの3つのグループに分類する工程；
グループBおよびCに分類されるPorphyromonas gulaeを病原性群と判定する工程；
を含む、Porphyromonas gulaeのグループの同定方法。
【請求項１３】
Porphyromonas gulaeのFimAのグループを、
イヌの歯垢中に存在する細菌のDNAに対して、グループAのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-tga gaa tat caa atg tgg tgc agg ctc acg-3'（SEQ ID NO: 9）および5'-ctt gcc tgc ctt caa aac gat tgc ttt tgg-3'（SEQ ID NO: 10）〕、または〔5'-ttc ata cgt cga cga ctg cg-3'（SEQ ID NO: 15）および5'-ttg agg gtt gat tac caa gt-3'（SEQ ID NO: 16）〕、グループBのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-taa gat tga agt gaa gat gag cga ttc tta tgt-3'（SEQ ID NO: 11）および5'-att tcc tca gaa ctc aaa gga gta cca tca-3'（SEQ ID NO: 12）〕、または〔5'-aac tac gac gct ata tgc aa-3'（SEQ ID NO: 17）および5'-tag aca aac tat gaa agt t-3'（SEQ ID NO: 18）〕、グループCのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-cga tta tga cct tgt cgg taa gag ctt gga-3'（SEQ ID NO: 13）および5'-tgt ggc ttc gtt gtc gca gaa tcc ggc atg-3'（SEQ ID NO: 14）〕、または〔5'-gat ttg ctg ctc ttg cta tga cag ctt gta-3'（SEQ ID NO: 19）および5'-ttt agt cgt ttg acg ggt cga tta cca agt-3'（SEQ ID NO: 20）〕を使用して、PCRにより線毛タイプを検出する工程；
により、グループA〜グループCに分類する、請求項12に記載のPorphyromonas gulaeのグループの同定方法。
【請求項１４】
Porphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのグループを、グループA〜グループCの3つのグループに分類するためのプライマーセット；
を含む、Porphyromonas gulaeのグループの同定のためのキット。
【請求項１５】
グループAのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-tga gaa tat caa atg tgg tgc agg ctc acg-3'（SEQ ID NO: 9）および5'-ctt gcc tgc ctt caa aac gat tgc ttt tgg-3'（SEQ ID NO: 10）〕、または〔5'-ttc ata cgt cga cga ctg cg-3'（SEQ ID NO: 15）および5'-ttg agg gtt gat tac caa gt-3'（SEQ ID NO: 16）〕、
グループBのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-taa gat tga agt gaa gat gag cga ttc tta tgt-3'（SEQ ID NO: 11）および5'-att tcc tca gaa ctc aaa gga gta cca tca-3'（SEQ ID NO: 12）〕、または〔5'-aac tac gac gct ata tgc aa-3'（SEQ ID NO: 17）および5'-tag aca aac tat gaa agt t-3'（SEQ ID NO: 18）〕、
グループCのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-cga tta tga cct tgt cgg taa gag ctt gga-3'（SEQ ID NO: 13）および5'-tgt ggc ttc gtt gtc gca gaa tcc ggc atg-3'（SEQ ID NO: 14）〕、または〔5'-gat ttg ctg ctc ttg cta tga cag ctt gta-3'（SEQ ID NO: 19）および5'-ttt agt cgt ttg acg ggt cga tta cca agt-3'（SEQ ID NO: 20）〕、
をプライマーセットとして含む、請求項14に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ歯周病の原因菌と考えられているPorphyromonas gulaeの線毛タイプを分類することに関する。本発明はまた、その様な線毛タイプの分類に基づいて、歯周病の病原性を予測することに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯周組織において発生し、歯周組織を破壊する疾患の総称である。ヒトの場合、我が国においても、高齢者のあいだでの罹患率が非常に高いことが知られている。【０００３】
動物の場合でも、特にコンパニオンアニマルであるイヌやネコの場合でも、歯周病は罹患率が高い口腔感染症として知られている。例えば、米国においては、3歳以上のイヌの85％、3歳以上のネコの75％が、それぞれ歯周病に罹患していると言われている。しかし、イヌやネコの場合にはヒトと異なり口腔内の歯科治療が一般的ではないため、歯周病は単なる口腔感染症にとどまらず、病態の進行に伴って複数の歯が欠損し、場合によっては寿命の短縮まで生じかねない、深刻な疾患である。【０００４】
ヒトの歯周病の場合、感染する細菌の種類、あるいは同一種の細菌内での細菌株の種類に応じて、感染の際の病原性が異なることが知られている（非特許文献1）。イヌやネコの場合でも、動物の歯周病の病原体の病原性を判定することができれば、歯周病発症リスクを予測できるうえに、歯周病に罹患した動物の治療方針を決定する際にも、症状に合わせた治療方法を選択することができる。しかし、これまで、動物の歯周病の病原体の病原性の強弱を判定する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nakano K., et al., Oral Microbiol. Immunol., 2004, 19, 205-209
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、イヌの歯周病の場合に、感染した細菌の病原性の強弱を判定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは、イヌの歯周病の主要な病原体と考えられているPorphyromonas gulaeにおいて、この細菌の線毛を形成するタンパク質であるフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAをコードする遺伝子、fimA遺伝子が主に3種類のグループに分けられること、そしてそのそれぞれのグループごとに、歯周病の原因細菌としての病原性との関連性において相関関係を有することを明らかにし、本発明を完成した。【０００８】
具体的には、本発明は、Porphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列を、ヒトにおける主要な歯周病原性細菌として知られているPorphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列との比較に基づいて、近隣結合法（Neighbor-joining法）で解析を行った結果、Porphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列と類似すると判定された群（グループBおよびC）とPorphyromonas gulaeに特異的なアミノ酸配列である群（グループA）とに分類された。また、歯周病原性の強さを反映するマウス腹腔モデルを用いた検討の結果、グループAの病原性は低く、グループBは中等度であり、グループCは強度であることを見い出した。【０００９】
これらの各グループのPorphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列の比較から、それぞれのグループのタンパク質またはそれをコードするDNAに特徴的な領域を明らかにした。このうち、病原性が高いグループCのFimAに特徴的な部分ペプチドのアミノ酸配列を明らかにすることにより、特徴的な部分ペプチド自体、この部分ペプチドを含むタンパク質（例えば、SEQ ID NO: 6を有するタンパク質など）、この様なタンパク質に対する抗体、特にグループCのFimAに特徴的な部分ペプチドまたはそのような特徴的な部分ペプチドを含むタンパク質に対して結合するが、それ以外のグループ（すなわちグループAまたはグループB）のFimAタンパク質に対しては結合しない抗体を提供することができることを見出した。上述したような特徴的な部分ペプチドまたはその部分ペプチドを含むタンパク質は、生体に対してグループCのPorphyromonas gulaeのFimAに対して免疫を生じさせるためのワクチンとして利用することができ、これらの部分ペプチドまたはタンパク質に対する抗体は、口腔内で使用する歯周病の治療薬として利用することができることもまた見出した。【００１０】
また、それぞれの群に特異的な遺伝子配列を利用して、イヌの口腔内から採取したデンタルプラークの分析からPorphyromonas gulaeの存在およびFimAグループを特定する方法を構築した。これにより、イヌのデンタルプラークを用いた歯周病のリスク判定の確立に至った。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、イヌの歯周病感染の主要な病原体であるPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列に基づいて、グループA〜グループCの3つのグループに分類することにより、イヌの歯周病発症リスクの強弱を判定することができる。また、病原性の判定結果に基づいて、イヌの歯周病の治療方法を、感染した細菌の病原性の強弱に依存して選択することができる。また、治療の効果が出ているかどうかの判断材料にもなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、グループA、グループBおよびグループCに分類されるFimAタンパク質をそれぞれ有する代表的な細菌株、ATCC51700、D044、およびD049のFimAタンパク質のアラインメントを示す。
【図２】図2は、Porphyromonas gulae（図中、「Pgu」と示す）のフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAの推定アミノ酸配列（SEQ ID NO: 2）を、Porphyromonas gingivalis（図中、「Pgi」と示す）と比較した系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の発明者らは、イヌの歯周病の原因となる細菌の検索を行い、Porphyromonas gulaeがイヌの歯周病の主要な病原体であることを見出した（Kato Y., et al., J. Vet. Dent., Vol. 28 No. 2 Summer 2011, 84-89）。ヒトにおいて、歯周病の原因となる細菌と考えられているものとして、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、およびCampylobacter rectusなどが高病原性のものとして知られている。今回イヌの口腔内に常在していることが明らかになったPorphyromonas gulaeは、ヒトにおける歯周病の病原体として重要視されているPorphyromonas gingivalisと同属の細菌であった。一方、この検討の結果、イヌの口腔内において、Porphyromonas gingivalisは非常にわずかしか存在しておらず、ヒトでの歯周病とイヌでの歯周病は異なる機序によるものと考えられた。
【００１４】
Porphyromonas gingivalisは、これまでに、線毛を形成するタンパク質であるフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAタンパク質を規定する遺伝子fimAの遺伝子型によって、ヒトの歯周病の病原性が大きく異なることが知られていた。Porphyromonas gingivalisの場合、fimAの遺伝子型は、I型、Ib型、II型、III型、IV型、およびV型の6種類のグループに分類されることが知られており、このうち、II型、IV型、およびIb型の3種類は歯周炎の患者から高頻度で分離される高い病原性を有するものであることが知られており、一方I型、III型、およびV型の3種類は歯周炎ではないヒトから高頻度で分離される低い病原性を有するものであることが知られている。
【００１５】
本発明の発明者らは、イヌの口腔内から得られたPorphyromonas gulaeも線毛FimAタンパク質を有することから、さらにこの細菌のFimAをコードする遺伝子、fimA遺伝子の配列を詳細に解析した。その結果、Porphyromonas gulaeのFimAが3種類のグループ（それぞれ、グループA、グループB、およびグループCに分けられること、そしてそのそれぞれのグループごとに、歯周病の原因細菌としての病原性との関連性において相関関係を有することを明らかにし、本発明を完成した。
【００１６】
ここで、本明細書中で調べられたPorphyromonas gulaeのうち、グループAに分類されるFimAタンパク質を有する細菌株としては、例えば、D024、D025、D028、D034、D035、D036、D042、D043、D060、D066、D067、およびD068、ATCC51700などが挙げられるが、これらには限定されない。グループBに分類されるFimAタンパク質を有する細菌株としては、例えば、D040、D044、D052、D053、D077、およびB43などが挙げられるが、これらには限定されない。グループCに分類されるFimAタンパク質を有する細菌株としては、例えば、D049などが挙げられるが、これらには限定されない。
【００１７】
すなわち、本発明は、Porphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列を、Porphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列との比較に基づいて、近隣結合法（Neighbor-joining法）で解析を行った結果、Porphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列と類似すると判定された群（グループBおよびC）とPorphyromonas gulaeに特異的なアミノ酸配列である群（グループA）とに分類された。また、マウス腹腔モデルを用いた検討の結果、グループAの病原性は低く、グループBは中等度であり、グループCは強度であることを見い出した。また、それぞれの群に特異的な遺伝子配列を利用して、イヌの口腔内から採取したデンタルプラークの分析からPorphyromonas gulaeの存在およびFimAグループを特定する方法を構築した。これにより、イヌのデンタルプラークを用いた歯周病のリスク判定の確立に至った。
【００１８】
グループAに分類される代表的なPorphyromonas gulaeとしてATCC51700を選択し、そのfimAのヌクレオチド配列を、SEQ ID NO: 1として示し、その配列によりコードされるFimAのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 2として示す。グループBに分類される代表的なPorphyromonas gulaeとしてD044を選択し、そのヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 3として示し、その配列によりコードされるFimAのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 4として示す。グループCに分類される代表的なPorphyromonas gulaeとしてD049を選択し、そのヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 5として示し、その配列によりコードされるFimAのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 6として示す。
【００１９】
この方法において、イヌから採取された特定のPorphyromonas gulae株のFimAタンパク質を、アミノ酸配列のレベルでPorphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列と比較する。この場合、まず、上述した特定のPorphyromonas gulae株からFimAタンパク質をコードするfimA遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、このヌクレオチド配列に基づいて、このPorphyromonas gulae株のFimAタンパク質のアミノ酸配列を特定する。その後、公知になっているいくつかのPorphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列と、近隣結合法（Neighbor-joining法）での解析により系統樹を作成し、Porphyromonas gulaeのFimAタンパク質のアミノ酸配列を分類する。
【００２０】
このような解析を行った結果、Porphyromonas gulaeのFimAタンパク質のアミノ酸配列は、グループA〜グループCの3つのグループに分類されることが明らかになった。グループAは、Porphyromonas gulaeに特異的な配列を有するグループであり、グループBは、Porphyromonas gingivalisの低病原性群であるIII型と類似する配列を有するグループであり、そしてグループCは、Porphyromonas gingivalisの高病原性群であるIV型と類似する配列を有するグループである。
【００２１】
本発明において、Porphyromonas gulaeの標準株として、ATCC51700を使用して、検討を進めた。その結果、グループAの細菌は、動物モデル（すなわち、マウス膿瘍モデル）における病原性が低く、グループBの細菌は、動物モデルにおける病原性がやや高く、そしてグループCの細菌は、動物モデルにおける病原性が非常に高いことが明らかになった。これらの結果を表1にまとめる。
【００２２】
【表１】
2013089166.tif 000002
【００２３】
本発明においては、このような態様に基づいて、Porphyromonas gulaeのグループのより簡便な同定法を提供する。具体的には、イヌから歯垢を採取し、この中に存在する細菌のDNAを抽出する。この細菌DNAの中に含まれているPorphyromonas gulaeのDNAを鋳型として、Porphyromonas gulaeに特異的なプライマーセット（5'-ttg ctt ggt tgc atg atc gg-3'（SEQ ID NO: 7）および5'-gct tat tct tac ggt aca ttc aca-3’（SEQ ID NO: 8））を使用した初期スクリーニングにより、Porphyromonas gulaeを検出する。この初期スクリーニングについて陽性であったサンプルについて、さらに、グループAのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット（5'-tga gaa tat caa atg tgg tgc agg ctc acg-3'（SEQ ID NO: 9）および5'-ctt gcc tgc ctt caa aac gat tgc ttt tgg-3'（SEQ ID NO: 10））、グループBのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット（5'-taa gat tga agt gaa gat gag cga ttc tta tgt-3'（SEQ ID NO: 11）および5'-att tcc tca gaa ctc aaa gga gta cca tca-3'（SEQ ID NO: 12））、グループCのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット（〔5'-cga tta tga cct tgt cgg taa gag ctt gga-3'（SEQ ID NO: 13）および5'-tgt ggc ttc gtt gtc gca gaa tcc ggc atg-3'（SEQ ID NO: 14）、または〔5'-gat ttg ctg ctc ttg cta tga cag ctt gta-3'（SEQ ID NO: 19）および5'-ttt agt cgt ttg acg ggt cga tta cca agt-3'（SEQ ID NO: 20）〕）を使用して、PCRにより線毛タイプを検出する。この方法によれば、複雑なタンパク質のアミノ酸配列を比較して系統樹を作成するという負荷の高い作業を行わずに、Porphyromonas gulaeのグループ分けを、PCRを用いて行うことが可能になる。
【００２４】
本発明においては、これらの知見に基づいて、Porphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列を、グループA〜グループCの3つのグループに分類することを可能にする、Porphyromonas gulaeのグループの同定のためのキットもまた、提供することができる。
【００２５】
この様なキットにおいては、例えば、Porphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列をグループA〜グループCの3つのグループを分類するためのプライマーセットなどを使用することができる。
【００２６】
例えば、グループAのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-tga gaa tat caa atg tgg tgc agg ctc acg-3'（SEQ ID NO: 9）および5'-ctt gcc tgc ctt caa aac gat tgc ttt tgg-3'（SEQ ID NO: 10）〕、または〔5'-ttc ata cgt cga cga ctg cg-3'（SEQ ID NO: 15）および5'-ttg agg gtt gat tac caa gt-3'（SEQ ID NO: 16）〕、
グループBのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-taa gat tga agt gaa gat gag cga ttc tta tgt-3'（SEQ ID NO: 11）および5'-att tcc tca gaa ctc aaa gga gta cca tca-3'（SEQ ID NO: 12）〕、または〔5'-aac tac gac gct ata tgc aa-3'（SEQ ID NO: 17）および5'-tag aca aac tat gaa agt t-3'（SEQ ID NO: 18）〕、
グループCのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-cga tta tga cct tgt cgg taa gag ctt gga-3'（SEQ ID NO: 13）および5'-tgt ggc ttc gtt gtc gca gaa tcc ggc atg-3'（SEQ ID NO: 14）〕、または〔5'-gat ttg ctg ctc ttg cta tga cag ctt gta-3'（SEQ ID NO: 19）および5'-ttt agt cgt ttg acg ggt cga tta cca agt-3'（SEQ ID NO: 20）〕、
をプライマーセットとして含むことができる。しかし、本願明細書に開示された内容を参照した当業者であれば、プライマーセットは、これらには限定されないことを当然理解することができ、そしてグループA〜グループCの3つのグループPorphyromonas gulaeの線毛fimAの配列を参照して、その他のプライマーセットも適宜選択することができる。
【００２７】
本発明においては、さらにこれらの知見に基づいて、グループCのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット〔5'-cga tta tga cct tgt cgg taa gag ctt gga-3'（SEQ ID NO: 13）および5'-tgt ggc ttc gtt gtc gca gaa tcc ggc atg-3'（SEQ ID NO: 14）〕を使用して増幅されるSEQ ID NO: 21のヌクレオチド配列部分により規定されるアミノ酸配列（SEQ ID NO: 2）を有する、グループCに分類されるPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAの部分ペプチドを提供することができ、またこのような部分ペプチドを含むタンパク質（例えば、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を有するタンパク質）もまた、提供することができる。この部分ペプチドは、他のグループ（すなわち、グループAまたはグループB）のFimAと比較して、グループCのFimAに特徴的な配列であり、この部分ペプチドが、グループCのPorphyromonas gulaeの非常に高い病原性と関連している可能性が予想された。
【００２８】
この部分ペプチドに対して特異的に結合する抗体（すなわち、この部分ペプチドまたはこの部分ペプチドを含むタンパク質（例えば、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を有するタンパク質）に対して結合するが、それ以外のグループ（すなわちグループAまたはグループB）のFimAタンパク質に対しては結合しない抗体）を生体内において生成させることにより、またはそのような結合特性を有する抗体を口腔内スプレー、ジェルなどの形状で外来性に適用することにより、グループCのPorphyromonas gulaeが関与する動物の歯周病または関連疾患を治療することができる。
【００２９】
このような本発明の一態様として、上述した部分ペプチドまたはこの部分ペプチドを含むタンパク質を免疫源として含む、グループCに分類されるPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAに対するワクチンもまた提供することができる。
【実施例】
【００３０】
実施例1：Porphyromonas gulaeのFimAの解析
本実施例において、イヌの口腔から得られたPorphyromonas gulaeの様々な株から、FimAタンパク質のアミノ酸配列を特定することを試みた。【００３１】
まず、Porphyromonas gulaeは、20個体のイヌの口腔から歯垢を採取することにより得た。これらのイヌ個体の歯垢は、スケーラーを使用してそれぞれの個体の歯の表面から採取した。採取した歯垢を、滅菌プラスチックチューブ中の滅菌蒸留水中に分散させ、この細菌分散液から細菌のDNAを採取した。【００３２】
次に、得られたDNAを鋳型として使用して、グループAのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット（5'-ttc ata cgt cga cga ctg cg-3'（SEQ ID NO: 15）および5'-ttg agg gtt gat tac caa gt-3'（SEQ ID NO: 16））、グループBのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット（5'-aac tac gac gct ata tgc aa-3'（SEQ ID NO: 17）および5'-tag aca aac tat gaa agt t-3'（SEQ ID NO: 18））、またはグループCのPorphyromonas gulaeの線毛fimAに対して特異的なプライマーセット（5'-gat ttg ctg ctc ttg cta tga cag ctt gta-3'（SEQ ID NO: 19）および5'-ttt agt cgt ttg acg ggt cga tta cca agt-3'（SEQ ID NO: 20））を使用して、PCRを行った。PCRの反応条件は、最初の変性を95℃にて5分間行ったのち、94℃で30秒、62℃で30秒、そして72℃で30秒を1サイクルとして30サイクルの反応を行い、最後に72℃で5分間の最終伸長反応を行う条件で行った。【００３３】
上述のPCR反応を行った結果増幅されたPorphyromonas gulaeのfimA遺伝子のヌクレオチド配列を、配列決定した。解析の結果、13株の細菌（D024、D025、D028、D034、D035、D036、D042、D043、D060、D066、D067、およびD068、ATCC 51700）から1155 bpのヌクレオチド配列が、6株の細菌（D040、D044、D052、D053、D077、およびB43）から1164 bpのヌクレオチド配列が、そして1株の細菌（D049）から1167 bpのヌクレオチド配列が、それぞれ得られ、それぞれがグループA、グループB、そしてグループCと分類した。それぞれのグループの代表的な配列として、グループAに属する細菌株ATCC51700のfimA遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 1として、グループBに属する細菌株D044のfimA遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 3として、そしてグループCに属する細菌株D049のfimA遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 5として、それぞれ示す。これらのグループA〜グループCの3種類のFimAタンパク質について、配列間の類似性を示すために、アラインメントを作成した（図1）。【００３４】
次に、これらの得られたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、およびSEQ ID NO: 6）を、近隣結合法（Neighbor-joining法）を用いた解析においてPorphyromonas gingivalisのfimA遺伝子のヌクレオチド配列と比較して、Porphyromonas gulaeのFimAタンパク質のアミノ酸配列を分類した。分類の結果を、図2に示す。この図において、「Pgu」の記載は、Porphyromonas gulaeのタンパク質であることを示す。この系統樹において、13株の細菌から得られた類似するアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO: 2）は、Porphyromonas gingivalisのFimAのアミノ酸配列とは比較的異なっており、独自のグループを構成することが明らかになった（このグループをグループAと呼ぶ）。6株の細菌から得られた類似するアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO: 4）は、Porphyromonas gingivalisの低病原性群であるIII型のFimAと類似する配列を有することが明らかになった（このグループをグループBと呼ぶ）。1株の細菌から得られたアミノ酸配列（SEQ ID NO: 6）は、Porphyromonas gingivalisの高病原性群であるIV型のFimAと類似する配列を有することが明らかになった（このグループをグループCと呼ぶ）。【００３５】
実施例2：マウス膿瘍モデルにおける各菌株の病原性の評価
本実施例においては、様々なPorphyromonas gulaeをマウスの背部皮下に投与し、それにより生じる炎症性の変化を調べることを目的として行った。このマウス膿瘍モデルにおける病原性は、歯周病原性を反映することを過去に示している（Nakano K., et al., Oral Microbiol. Immunol., 2004, 19, 205-209）。【００３６】
得られた細菌株は、Gifu Anaerobic Medium（GAM）培地中で連続的に増殖させ、得られたコロニーが目的とするPorphyromonas gulaeの株であることを実施例1で示されるPCRにより確認した。増殖させた細菌を回収し、滅菌したリン酸バッファー（0.15 Mの塩化ナトリウムを含む10 mMリン酸バッファー、pH 7.4）中で洗浄した。【００３７】
すべての動物実験は、大阪大学大学院歯学研究科動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行った。メスのBALB/cマウス（5週齢）を滅菌食および自由飲水の条件下で飼育した。90匹のマウスを、10匹ずつ9つの群に分割し（8つの実験群と、1つの対照群）、Porphyromonas gulaeをマウスの背部皮下に投与した際に生じる炎症性の変化を調べた。実験群としては、Porphyromonas gulae株であるD049、D044、D040、ATCC51700、D035、D036、そしてD034を使用した。そして陰性対照としては、細菌の代わりにPBSを投与した群、そして陽性対照としては、Porphyromonas gingivalisの高病原性株の一つであるOMZ314を投与した群を使用した。【００３８】
マウスが40日齢の時に、正中線から1 cm右側の背部皮下に、0.1 mlの細菌懸濁液（1×109コロニー形成単位（CFU））（各試験群）または0.1 mlのリン酸バッファー（対照群）を投与した。【００３９】
それぞれのマウスは、感染の兆候、例えば膿瘍形成、びらんの形成などによりモニタリングされ、また感染の体重および脾臓重量についてモニタリングされた。脾臓重量は、感染後2週間後に、全てのマウスを麻酔下にて安楽死させ、脾臓を取り出してその重量を測定した。結果を表2にまとめた。【００４０】
【表２】
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【００４１】
この結果から、グループAの細菌株では非常にわずかしか病原性が示されなかったが、グループBの細菌株では多くの場合に膿瘍を形成すること、そしてグループCの細菌株ではすべての動物において致死が生じることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の方法により、イヌの歯周病感染の主要な病原体であるPorphyromonas gulaeのフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAのアミノ酸配列に基づいて、主にグループA〜グループCの3つのグループに分類することにより、イヌの歯周病の病原性の強弱を判定することができる。また、このように病原性の判定結果に基づいて、イヌの歯周病の治療方法を、感染した細菌の病原性の強弱に依存して選択することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
SEQ ID NO: 1：Porphyromonas gulaeの標準株（グループA）であるATCC51700のフィンブリリンタンパク（Fimbrillin）、FimAをコードするfimA遺伝子のヌクレオチド配列。【００４４】
SEQ ID NO: 2：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列によりコードされるFimAのアミノ酸配列。【００４５】
SEQ ID NO: 3：グループBのPorphyromonas gulaeのFimAをコードするfimA遺伝子のヌクレオチド配列。【００４６】
SEQ ID NO: 4：SEQ ID NO: 3のヌクレオチド配列によりコードされるFimAのアミノ酸配列。【００４７】
SEQ ID NO: 5：グループCのPorphyromonas gulaeのFimAをコードするfimA遺伝子のヌクレオチド配列。【００４８】
SEQ ID NO: 6：SEQ ID NO: 5のヌクレオチド配列によりコードされるFimAのアミノ酸配列。【００４９】
SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8：Porphyromonas gulaeに特異的なプライマーセット。【００５０】
SEQ ID NO: 9およびSEQ ID NO: 10：グループAのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーペア。【００５１】
SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12：グループBのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーペア。【００５２】
SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14：グループCのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーペア。【００５３】
SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16：グループAのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーペア。【００５４】
SEQ ID NO: 17およびSEQ ID NO: 18：グループBのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーペア。【００５５】
SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20：グループCのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーペア。【００５６】
SEQ ID NO: 21：SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14の組み合わせのプライマーペアにより増幅された、グループCのPorphyromonas gulae線毛fimA遺伝子のヌクレオチド配列の部分配列。【００５７】
SEQ ID NO: 22：SEQ ID NO: 21の部分ヌクレオチド領域中に含まれる、グループCのPorphyromonas gulae線毛FimAタンパク質の部分ペプチド。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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