(57)【要約】従来の血栓溶解剤による治療方法や風船療法とは異なる方法で、心筋梗塞や脳梗塞などの梗塞を治療するための医薬組成物を提供する。hsa-miR-145などのオートファジーエンハンサーを梗塞治療用医薬組成物の有効成分として用いる。特にhsa-miR-145などのオートファジーエンハンサーをリポソーム化した状態で梗塞治療用医薬組成物の有効成分として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートファジーエンハンサーを有効成分とする梗塞治療用医薬組成物。
【請求項２】
オートファジーエンハンサーがhsa-miR-145である、請求項１に記載する梗塞治療用医薬組成物。
【請求項３】
オートファジーエンハンサーをリポソーム化した状態で含む、請求項１または２に記載する梗塞治療用医薬組成物。
【請求項４】
静脈投与形態を有する、請求項１乃至３のいずれかに記載する梗塞治療用医薬組成物。
【請求項５】
上記梗塞が、心筋梗塞、脳梗塞または脊髄梗塞である請求項１乃至４のいずれかに記載する梗塞治療用医薬組成物。
【請求項６】
オートファジーエンハンサーを梗塞を有する患者に投与する工程を含む、梗塞の治療方法。
【請求項７】
オートファジーエンハンサーがhsa-miR-145である、請求項６に記載する梗塞治療方法。
【請求項８】
オートファジーエンハンサーをリポソーム化した状態で投与する、請求項６または７に記載する梗塞治療方法。
【請求項９】
オートファジーエンハンサーを静脈投与する、請求項６乃至８のいずれかに記載する梗塞治療方法。
【請求項１０】
梗塞を治療するために用いられる、オートファジーエンハンサー。
【請求項１１】
オートファジーエンハンサーがhsa-miR-145である、請求項１０に記載するオートファジーエンハンサー。
【請求項１２】
梗塞治療用医薬組成物を製造するための、オートファジーエンハンサーの使用。
【請求項１３】
オートファジーエンハンサーがhsa-miR-145である、請求項１２に記載する使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、梗塞治療用医薬組成物に関する。より詳細には、オートファジーを亢進する作用を有する「オートファジーエンハンサー」の梗塞治療剤としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞は、虚血性心疾患の一つであり、心臓の冠動脈の血流量が減少して、心筋が虚血状態になり壊死してしまった状態をいう。冠動脈の血流量減少は、主として動脈硬化などの何らかの要因によって狭窄を起こすことによる。【０００３】
心筋梗塞の治療方法としては、詰まった血栓を血栓溶解剤（例えば、tPAなど）で溶解させる方法、及び血管内にカテーテルを入れてバルーンで膨らませる風船療法等がある。血栓溶解剤の静脈注射による治療方法は簡便であるが、再閉塞しやすいことが知られている。また、胃潰瘍等の出血性疾患を有する患者には注意が必要である。一方、風船療法は再開通の成功率が高く、また風船療法後にステントを留置することにより再狭窄を予防することが可能な方法であるものの、それでもなお、再狭窄することがある。また風船療法は、心臓カテーテル室を有する限られた医療施設でしか実施することができないという制約がある。【０００４】
ところで、miRNAとは、遺伝子発現を抑制する作用を有する２１〜２５塩基程度の1本鎖RNAである。ゲノム上にコードされている非コード領域に由来するsmall RNAである。一般に、miRNAは、単一またはクラスター化されたmiRNA前駆体から転写される遺伝子から生成される。すなわち、遺伝子からの一次転写物であるpri-miRNAが転写され、次いでpri-miRNAから成熟型miRNAへの段階的プロセシングにおいて、pri-mRNAから特徴的なヘアピン構造を有する約７０〜８０塩基のpre-miRNAが生成し、さらにDicerの介在によりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成される。miRNAは分化、細胞増殖、アポトーシスなどの生物にとって欠かすことのできない生命現象に深く関わっていると考えられている。【０００５】
なかでもhsa-miR-145は、２３塩基からなるmiRNAであり、抗がん作用、平滑筋の増殖および分化の制御に関与していると推測されている（特許文献１、非特許文献１，２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2009/105759
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Noguchi, et. al., J. Vet. Med. Sci., 74(1), 1-8, 2012
【非特許文献２】Eric M. Small, et. al., Nature, 469, 336-342, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来の血栓溶解剤による治療方法や風船療法とは異なる方法で、心筋梗塞や脳梗塞などの梗塞を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。特に、心筋梗塞や脳梗塞を生じている局所部位に、選択的且つ非侵襲的に到達して治療することが可能な、梗塞組織治療用の医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決して本発明の目的を達成すべく鋭意研究していたところ、梗塞を生じている組織部位にmiRNAであるhsa-miR-145を投与することにより梗塞部位の大きさ（梗塞サイズ）が縮小すること、また当該miRNAにオートファジーを亢進する作用があること、つまり「オートファジーエンハンサー」として機能することを見出した。これらの知見から、本発明者らは、オートファジーエンハンサー、特にhsa-miR-145が梗塞組織の修復改善に有効に作用し、梗塞組織を治療する遺伝子療法の有効成分として有用であると確信して、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、下記の実施形態を有するものである。【００１１】
（Ｉ）梗塞治療用医薬組成物
（I-1）．オートファジーエンハンサーを有効成分とする梗塞治療用医薬組成物。【００１２】
（I-2）．オートファジーエンハンサーが、hsa-miR-145, Rapamycin, Carbamazepine, Sodium Valproate, Verapamil, Loperamide, Amiodarone, Nimodipin, Nitrendipine, Niguldipine, Primozide, Calpastatin, Calpeptin, Clonidine, Pilmenidine, 2’,5’-dideoxyadenosine, Minoxidil, Penitrem A, Fluspiriline, Trifluoperazine, 及びTrehaloseからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）に記載する梗塞治療用医薬組成物。【００１３】
（I-3）．上記オートファジーエンハンサーをリポソーム化させた状態で含む、（I-1）または（I-2）に記載する梗塞治療用医薬組成物。【００１４】
（I-4）．静脈投与形態を有する、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する梗塞治療用医薬組成物。【００１５】
（I-5）．上記梗塞が、心筋梗塞、脳梗塞または脊髄梗塞である（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する梗塞治療用医薬組成物。【００１６】
（I-6）．上記心筋梗塞が、重症大型心筋梗塞である（I-5）に記載する梗塞治療用医薬組成物。【００１７】
（II）梗塞治療方法
（II-1）．梗塞患者にオートファジーエンハンサーを投与する工程を有する、梗塞患者の梗塞治療方法。【００１８】
（II-2）．オートファジーエンハンサーが、hsa-miR-145, Rapamycin, Carbamazepine, Sodium Valproate, Verapamil, Loperamide, Amiodarone, Nimodipin, Nitrendipine, Niguldipine, Primozide, Calpastatin, Calpeptin, Clonidine, Pilmenidine, 2’,5’-dideoxyadenosine, Minoxidil, Penitrem A, Fluspiriline, Trifluoperazine, 及びTrehaloseからなる群から選択される少なくとも１種である、（II-1）に記載する梗塞治療方法。【００１９】
（II-3）．オートファジーエンハンサーをリポソーム化した状態で投与する、（II-1）または（II-2）に記載する梗塞治療方法。【００２０】
（II-4）．オートファジーエンハンサーを静脈投与する工程である、（II-1）乃至（II-3）のいずれかに記載する梗塞治療方法。【００２１】
（II-5）．上記梗塞患者が、心筋梗塞、脳梗塞または脊髄梗塞の患者である（II-1）乃至（II-4）のいずれかに記載する梗塞治療方法。【００２２】
（II-6）．上記心筋梗塞患者が、重症大型心筋梗塞患者である（II-5）に記載する梗塞治療方法。【００２３】
なお、これらの（II-1）〜（II-6）の梗塞治療方法に関する発明において、「オートファジーエンハンサー」という用語は、前述する（I-1）〜（I-6）のいずれか１に規定される「梗塞治療用医薬組成物」に置換することができる。【００２４】
（III）オートファジーエンハンサーの新規用途
［III-1］梗塞治療用オートファジーエンハンサー：
（III-1-1）梗塞を治療するために用いられる、オートファジーエンハンサー。【００２５】
（III-1-2）．オートファジーエンハンサーが、hsa-miR-145, Rapamycin, Carbamazepine, Sodium Valproate, Verapamil, Loperamide, Amiodarone, Nimodipin, Nitrendipine, Niguldipine, Primozide, Calpastatin, Calpeptin, Clonidine, Pilmenidine, 2’,5’-dideoxyadenosine, Minoxidil, Penitrem A, Fluspiriline, Trifluoperazine, 及びTrehaloseからなる群から選択される少なくとも１種である、（III-1-1）に記載するオートファジーエンハンサー。【００２６】
（III-1-3）．上記オートファジーエンハンサーがリポソーム化された状態のものである、（III-1-1）または（III-1-2）に記載するオートファジーエンハンサー。【００２７】
（III-1-4）．梗塞の治療がオートファジーエンハンサーを静脈投与する方法によるものである、（III-1-1）乃至（III-1-3）のいずれかに記載する梗塞治療方法。【００２８】
（III-1-5）．上記梗塞が、心筋梗塞、脳梗塞または脊髄梗塞である（III-1-1）乃至（III-1-4）のいずれかに記載するオートファジーエンハンサー。【００２９】
（III-1-6）．上記心筋梗塞が、重症大型心筋梗塞である（III-1-5）に記載するオートファジーエンハンサー。【００３０】
［III-2］オートファジーエンハンサーの使用：
（III-2-1）梗塞治療用医薬組成物の製造のためのオートファジーエンハンサーの使用。【００３１】
（III-2-2）．オートファジーエンハンサーが、hsa-miR-145, Rapamycin, Carbamazepine, Sodium Valproate, Verapamil, Loperamide, Amiodarone, Nimodipin, Nitrendipine, Niguldipine, Primozide, Calpastatin, Calpeptin, Clonidine, Pilmenidine, 2’,5’-dideoxyadenosine, Minoxidil, Penitrem A, Fluspiriline, Trifluoperazine, 及びTrehaloseからなる群から選択される少なくとも１種である、（III-2-1）に記載する使用。【００３２】
（III-2-3）．上記オートファジーエンハンサーがリポソーム化された状態のものである、（III-2-1）または（III-2-2）に記載する使用。【００３３】
（III-2-4）．梗塞治療用医薬組成物が静脈投与形態を有するものである、（III-2-1）乃至（III-2-3）のいずれかに記載する使用。【００３４】
（III-2-5）．梗塞が、心筋梗塞、脳梗塞または脊髄梗塞である（III-2-1）乃至（III-2-4）のいずれかに記載する使用。【００３５】
（III-2-6）．上記心筋梗塞が、重症大型心筋梗塞である（III-2-5）に記載する使用。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の梗塞治療用医薬組成物は、有効成分としてオートファジーエンハンサー、特にhsa-miR-145を含有することを特徴とする。本発明の梗塞治療用医薬組成物によれば、梗塞部位に、有効成分であるオートファジーエンハンサー、特にhsa-miR-145を投与することにより、梗塞サイズを縮小させることができ、梗塞治療に有効に使用することができる。特に本発明の医薬組成物は、後述する実施例２で示すように、心筋梗塞、とりわけ重症大型心筋梗塞に対して、その梗塞サイズを縮小させる効果に優れている。【００３７】
当該重症大型心筋梗塞は、左室リモデリングが進行し心不全に陥るため、生命予後が悪い疾患である。本発明の梗塞治療用医薬組成物によれば、当該重症大型心筋梗塞の治療後の生命予後を良好に改善することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】重症大型心筋梗塞モデル動物（ウサギ）の心臓組織をEvans Blue 染色及びTTC染色を行った染色画像を示す（実施例２）。（Ａ）は、hsa-miR-145含有リポソームに代えて、生理食塩水を静脈投与した重症大型心筋梗塞モデル動物（コントロール群）の心臓組織の染色画像、（Ｂ）は、hsa-miR-145含有リポソームを静脈投与した重症大型心筋梗塞モデル動物（hsa-miR-145投与群）の心臓組織の染色画像を示す。
【図２】上記hsa-miR-145投与群（n=5）及びコントロール群（n=5）の心臓の梗塞サイズを、心臓全体の危険領域に対する心臓の梗塞領域の占める割合（％）として示した図である。
【図３】実施例３で行ったウエスタンブロッティングの電気泳動像を示す。hsa-miR-145で処理したH9c2細胞内での各タンパク質（FRS2、KLF5、Myocardin、LC3B、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2、β-actin）の発現状況を示す。
【図４】hsa-miR-145で処理したH9c2細胞を電子顕微鏡下で撮影した画像を示す。(Ａ)細胞内でオートファゴソームが形成されていること、（Ｂ）細胞内でオートリソソームが形成されていることがわかる（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の梗塞治療用医薬組成物は、オートファジーエンハンサーを有効成分とすることを特徴とする。
【００４０】
ここでオートファジーとは、細胞が有する自浄作用であり、古くなって不要となった細胞の構成要素を、一部の細胞質とともに小胞様構造（オートファゴソーム）によって包み込み、リソソームの酵素を受けて分解する機構である。オートファジーには、細胞内代謝と恒常性の維持などに必要な基礎的なオートファジーと、ストレスに反応して誘導されるオートファジーとがある。こうしたオートファジーの作用により、細胞内での異常なタンパク質の蓄積が防止される。また、過剰にタンパク質が合成されたり、細胞内での栄養環境が悪化したとき、また細胞質内に病原微生物等が侵入したときなどに、オートファジーが作用して、それらを除去乃至浄化する。このようにオートファジーは、生体内の恒常性維持に関与している。またオートファジーは、細胞が飢餓に陥ったときや、虚血や炎症などの病的状態に陥ったときにも誘導される。
【００４１】
本発明において「オートファジーエンハンサー」とは、上記細胞の自浄作用である「オートファジー」を亢進させる作用を有するものをいう。具体的には、後述する実施例にて細胞のオートファジーを亢進することが示されたmiRNAの一種であるhsa-miR-145、並びに従来からオートファジーを亢進させる作用を有することが知られているRapamycin, Carbamazepine, Sodium Valproate, Verapamil, Loperamide, Amiodarone, Nimodipin, Nitrendipine, Niguldipine, Primozide, Calpastatin, Calpeptin, Clonidine, Pilmenidine, 2’,5’-dideoxyadenosine, Minoxidil, Penitrem A, Fluspiriline, Trifluoperazine, 及びTrehalose（S. Sarkar et al., Cell Death and Diffentiation 16, 46-56, 2009）を挙げることができる。なお、これらのオートファジーエンハンサーは、本発明の梗塞治療用組成物の有効成分として、一種単独で使用してもよいし、また細胞のオートファジーを亢進するという効果を損なわない限り、２種以上を任意に組み合わせて使用することもできる。好ましくはhsa-miR-145、またはhsa-miR-145と他の１または２以上のオートファジーエンハンサーとの組み合わせである。
【００４２】
ここでhsa-miR-145は、ヒト由来のマイクロRNAとして公知のオリゴヌクレオチドであり、the microRNA database （miRBase）（http://www.mirbase.org/）にアクセッション番号MI0000461として登録されている（EntrezGene:406937, HGNC:31532）。
【００４３】
hsa-miR-145の塩基配列を、配列番号１に示す。また、これがプロセッシング生成される前の分子であるヘアピンループ構造を有するprimary miRNA（pri-miRNA）の塩基配列を、配列番号２に示す。
【００４４】
なお、hsa-miR-145は、当該塩基配列（配列番号１）に基づいて、公知の核酸合成法により合成することが可能であるし、また、Applied Biosystems等から商業的に入手することも可能である。但し、梗塞治療用医薬組成物には、hsa-miR-145の製造方法の別に限らず、人工的に化学合成されるか、生化学的に合成されたもの、生物体内で合成されたもの、または80塩基以上の２本鎖RNA（pri-miRNA）が体内若しくは体外で分解されて生成されたものであってもよい。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、有効成分として上記オートファジーエンハンサーを、その投与経路に応じて、医薬品に通常使用される、薬学的に許容される担体または添加剤とともに配合することにより製造することができる。オートファジーエンハンサーとして、特にhsa-miR-145などの核酸を用いる場合は、通常、遺伝子治療剤の製造に使用される薬学的に許容される担体または添加剤とともに配合することにより製造することができる。
【００４６】
投与経路としては、オートファジーエンハンサーを患部（梗塞を生じている組織）に到達させることのできる投与経路であればよく、経口投与、及び非経口投与（例えば、静脈内投与、患部への直接投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、経肺投与など）の別を問わない。好ましくは、注射や点滴による静脈内投与または患部への直接投与である。
【００４７】
注射剤や点滴剤の場合、オートファジーエンハンサーとともに配合する担体または添加剤としては、通常注射剤や点滴剤に使用されるものを広く用いることができ、例えば、担体としては、蒸留水；塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物を含む水溶液；マンニトール、ラクトース、デキストランまたはグルコース等の糖類を含む水溶液；グリシンやアルギニン等のアミノ酸類を含む水溶液；有機酸とグルコース等の糖類を含む水溶液：塩とグルコース等の糖類を含む水溶液を挙げることができる。また、これらに必要に応じて、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、または界面活性剤等の助剤を用いて、溶液状、懸濁状、または乳濁状に調製することもできる。また、添加剤として、薬学的に許容される抗酸化剤や保存剤を配合してもよい。なお、注射剤や点滴剤は、粉末化（スプレードライ）または凍結乾燥などの操作により、用時溶解用の固形製剤として調製することもできる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、オートファジーエンハンサーをそのまま注射用蒸留水等の担体に溶解させて含むものであってもよいし、またオートファジーエンハンサーをリポソーム化した状態で含むものであってもよい。ここでリポソーム化とは、オートファジーエンハンサーがリポソームの中に封入された状態（リポソームに内包された状態）、及びオートファジーエンハンサーがリポソームの表面に付着した状態のいずれをも包含する趣旨で使用される。
【００４９】
リポソームとしては、本発明のオートファジーエンハンサーを内部に封入（内包）することができるか、または表面に付着することができるものであればよい。特に限定されないが、オートファジーエンハンサーとして、例えばhsa-miR-145を用いる場合、当該hsa-miR-145はアニオン性であることから、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、およびその他の正電荷を有するリポソーム、リン酸カルシウム、デキストランおよびポリエチレングリコール等を成分とするリポソームを例示することができる。なお、これらのリポソームも商業的に入手可能であり、例えばリポフェクタミンはインビトロジェン等から、FuGENE 6 Transfection Reagentはロシュから購入することができる。
【００５０】
リポソームの内部に薬剤等を封入する方法は周知であり、本発明のオートファジーエンハンサーもこれに従ってリポソーム内部に封入することができる。例えば、上記のような商業的に入手可能なリポソームを使用する場合は、その販売業者から提供されるマニュアルに従って調製できる。またそうでない場合は、例えば、オートファジーエンハンサーを含む溶液と、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類及びコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することで、内部にオートファジーエンハンサーが封入されたリポソームを得ることができる。
【００５１】
リポソームの平均粒子径は、毛細血管を通過させることを考慮すると150nm以下であることが好ましい。より好ましくは140nm以下であり、さらに好ましくは、120nm以下であり、一層好ましくは100nm以下である。また、平均粒子径は、30nm以上であることが好ましく、より好ましくは50nm以上であり、さらに好ましくは70nm以上である。なお、ここで平均粒子径は、レーザー回折・散乱法によって求められる粒度分布における積算値50％での粒径を意味する。
【００５２】
注射剤や点滴剤の他、本発明の医薬組成物は、経口投与の形態を有することもでき、かかるものとしては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、または散剤等の固形製剤の形態を挙げることができる。これらの製造には、定法に従って、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することができ、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、滑沢剤、抗酸化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、着色料、風味料等を、制限なく挙げることができる。
【００５３】
なお、本発明の医薬組成物に含まれるオートファジーエンハンサーの含有量は、医薬組成物の投与経路やオートファジーエンハンサーの種類によって相違するものの、オートファジーエンハンサーとしてhsa-miR-145を例にすれば、通常、一回投与の医薬組成物中に、hsa-miR-145が10〜1000μg、好ましくは50〜160μg、さらに好ましくは70〜80μgの割合で含まれるように配合することができる。他のオートファジーエンハンサーを用いる場合も、これを基準に適宜設定することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞などの梗塞患者に対して、当該梗塞の治療剤として使用することができる。好ましくは心筋梗塞の治療であり、より好ましくは重症大型心筋梗塞の治療である。
【００５５】
本発明の医薬組成物の投与量は、心筋梗塞、脳梗塞又は脊髄梗塞等の梗塞の種類や重篤度、また患者の年齢や体重等により適宜決定することができる。好ましくは、梗塞組織の少なくとも一部を再生修復するのに適切な量であり、これを本発明では、「医薬的に有効量」ともいう。かかる有効量の目安として、一回投与あたりのオートファジーエンハンサーの投与量として、hsa-miR-145を例にすれば、10〜1000μg、好ましくは50〜160μg、さらに好ましくは70〜80μgとなるような割合を挙げることができる。他のオートファジーエンハンサーもこれを基準として適宜設定することができる。
【００５６】
なお、本発明の医薬組成物の投与回数は、１日1回でも数回であってもよく、梗塞患者の症状に応じて適宜選択される。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５８】
実施例１．hsa-miR-145含有リポソームの調製
hsa-miR-145 (5 nM; Applied Biosystemsから入手)をRNaseを含まない蒸留水100μlに溶解し、これに400μlの血清低減培地Opti-MEM(GIBCO)を入れてボルテックスを用いて30秒間、振盪混合した。その後、得られた混合物にLipofectamine RNAiMax  (Invitrogen) 10μlを入れて、再びボルテックスを用いて30秒間、振盪混合した。次いで、得られた混合物を、10分間、室温でインキュベートし、これに300μlのOpti-MEMを入れて800μlとした。斯くして調製したhsa-miR-145含有リポソームを、下記の実施例２で使用した。【００５９】
実施例２．心筋梗塞への適用とその治療効果
上記実施例１で調製したhsa-miR-145含有リポソームを、重症大型心筋梗塞のモデル動物の梗塞部位に投与して、梗塞に対するhsa-miR-145の治療効果を評価した。【００６０】
１．実験方法
重症大型心筋梗塞の病態モデル動物は、日本白色種ウサギ（雄、体重約２kg）を用いて、その冠動脈を30分間虚血することで作製した。【００６１】
当該病態モデル動物（n=5）に、実施例１で調製したhsa-miR-145含有リポソームを、体重１kgあたり0.035mgの割合で静脈内投与し、投与後14日目に、麻酔下で殺して心臓を摘出した（hsa-miR-145投与群）。また、コントロール群として、重症大型心筋梗塞の病態モデル動物（n=5）に、上記hsa-miR-145含有リポソームに代えて、生理食塩水を、体重１kgあたり0.5mlの割合で静脈内投与し、投与後14日目に、麻酔下で殺して心臓を摘出した。【００６２】
斯くして摘出した各群（hsa-miR-145投与群、コントロール群）の心臓を、それぞれEvans Blue Dyeを用いて染色し、虚血領域と非虚血領域を決定した。また、同心臓をTTC染色することで梗塞領域を決定した。【００６３】
またこれらの染色を指標として、梗塞領域のサイズを、心臓全体のうち危険領域（虚血を生じる領域）100％に対する割合（%）として求めた。【００６４】
２．実験結果
図１に、各群（hsa-miR-145投与群、コントロール群）の心臓狭窄部位（心臓閉塞部位）における染色組織を示す。図１中、（Ａ）はコントロール群の心臓組織の染色画像、（Ｂ）はhsa-miR-145投与群の心臓組織の染色画像である。Evans Blue 染色により青色に染色された領域が非虚血領域で、青色に染色されない領域が虚血領域であり、TTC染色により灰色に染色された領域が梗塞領域である。【００６５】
図２に、hsa-miR-145投与群（n=5）とコントロール群（n=5）の各心臓について梗塞サイズを対比した結果を示す。図２に示すように、hsa-miR-145投与群の心臓の梗塞サイズは、hsa-miR-145を投与しないコントロール群の心臓の梗塞サイズよりも有意に小さかった。この結果から、hsa-miR-145には梗塞部位の大きさを縮小させる作用があることが確認された。【００６６】
なお、hsa-miR-145の発現量の測定は、公知の方法で実施することが可能である。具体的には摘出した心臓の梗塞部、境界部および正常部から各々組織を採取する。採取組織をホモジナイズ後、トリゾール試薬（Applied Biosystems; AB）にて溶解し、RNAを抽出する。TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (AB)を用いてRTを行い、Real-time PCRにてhsa-miR-145の発現をTaqMan miRNA primer (AB)を用いて調べる。【００６７】
ここでRT-PCRに用いるフォーワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブについては公知の方法に基づいて適宜選択することが可能である。【００６８】
実施例３．hsa-miR-145の作用機序の検証
前述する実施例２で、hsa-miR-145が心筋梗塞巣の縮小、及び心機能の保存に有効であることが確認された。そこで、当該hsa-miR-145の作用機序の検証を行った。
（１）実験方法
（1-1）試料の調製
上記実施例１で調製したhsa-miR-145含有リポソームを、ラットの心臓由来細胞であるH9c2細胞にトランスフェクションした。具体的には、hsa-miR-145の最終濃度が20nMまたは40nMになるように調製し、当該hsa-miR-145含有リポソームの存在下でH9c2細胞を37℃で72時間培養した。【００６９】
培養後、得られたH9c2細胞からタンパク質をすべて抽出した。具体的には、セルスクレーパー（住友ベークライト、日本）を用いて、培養したH9c2細胞を培養シャーレから掻き取り、Phosphate Buffered Saline（PBS（−）、TAKARA、日本）に浮遊させ、これを15 ml容量の遠心管に回収し、回転数2000 rpmで3分間遠心した。遠心後、上清を除き、沈渣にLysis Buffer（1% NP-40、0.1% deoxycholic acid、0.1 % SDS、150 mM NaCl、1 mM EDTA）と、1% Proteinase Inhibitor Cocktail（SIGMA）を加えてボルテックスにて撹拌し、細胞を完全に溶解した。これを氷上にて20分間静置した後、4℃条件下、12000 rpmで20分間、遠心にかけ、その上清を回収して、これをタンパク抽出液とした。タンパク抽出液中のタンパク質濃度は、DC Protein Assey Kit（BIO-RAD、Hercules、CA、USA）を用い、同キットのプロトコールに従い、分光光度計（Biophotometer Plus、eppendorf、Hamburg、Germany）にて測定した。【００７０】
マイクロチューブに、上記で調製したタンパク抽出液（totalタンパク質量100 μg）と５×SDS溶液（0.25 M Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、0.5% Bromophenol Blue、0.5% M DTT、 50% Glycerol）20μlを添加混合し、これを滅菌蒸留水で全量を100μlとした。次いで、これをブロックインキュベーター（ASTEC、福岡、日本）にて98℃で５分間加熱し、氷上にて５分間急冷した。【００７１】
（1-2）ウエスタンブロッティング
上記でSDS処理したタンパク質を、XV PANTERA SYSTEM（DRC株式会社、東京、日本）あるいはイージーセパレーター（登録商標）（和光）にて電気泳動した。泳動後、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell（BIO-RAD）を用い、PVDFメンブレン（PerkinElmer Life Science、Boston、MA、USA）にブロッティングした。なお、PVDFメンブレンは予めメタノールで親水化し、Blotting Buffer（48 mM Tris、40 mM Glycine）に浸漬、浸盪させて使用した。ブロッティングは15 V、370 mA、40分の条件で実施した。【００７２】
ブロッティング終了後、5% スキムミルク（Cell Signaling、Danvers、MA、USA）を添加したTris Buffered Saline-Tween 20（TBS-T）（20 mM tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1% Tween20）に浸漬し、室温で１時間浸盪しブロッキングを行った。TBS-Tにて洗浄後、一次抗体希釈液（2% bovine serum albumin、0.01% アジ化ナトリウム添加TBS-T）で希釈した一次抗体液に４℃で一晩浸漬した。一次抗体には図３に示す各タンパク質（FRS2、KLF5、Myocardin、LC3B、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2、及びβ-actin）に対する抗体を用いた。翌日、TBS-Tにて洗浄後、5% スキムミルクで希釈した二次抗体液に浸漬し、１時間浸盪した後、TBS-Tにて洗浄した。二次抗体には、抗マウスあるいはラビットモノクローナル西洋ワサビ標識抗体（#7076あるいは#7074、Cell Signaling）（1:4000）を用いた。【００７３】
次いで、Western Lightning（登録商標） ECL Pro（PerkinElmer）を用いて発色させ、ImageQuant Las 4000 mini（GE Healthcare Japan、東京、日本）を用い、Chemiluminescenceにて検出した。【００７４】
ローディングのコントロールとして、同じメンブレンを用い、一次抗体をanti-human β-actin mouse monoclonal antibody（AC-15、SIGMA）（1:4000）として用い、室温で１時間感作させた後、上記のプロトコールに従い、検出した。【００７５】
（1-3）比較実験
hsa-miR-145に代えて、5’-GUAGGAGUAGUGAAAGGCC-3’（ダーマコン社製）（配列番号３）の塩基配列を有するmiRNAを用いた以外は、上記実施例３（1-1）及び（1-2）と同様の方法で実験を行った。【００７６】
（２）実験結果
上記の実験で得られたウエスタンブロッティングの電気泳動像を、図３に示す。図中、電気泳動像中のcontrolは、上記の比較実験の結果を示す。【００７７】
これからわかるように、hsa-miR-145を導入した細胞において、LC3-B IからIIへの顕著なコンバート、及びPI3K/Akt（p-Akt）のシグナルの亢進が認められた。一方、KLF5及びFRS2（Fibroblast growth factor receptor substrate 2）はいずれも発現の低下がみられた。【００７８】
図４に、最終濃度40 nMのhsa-miR-145で処理したH9c2細胞を電子顕微鏡で観察した結果を示す。図４に示すように、細胞内のオートファゴソーム（図４（Ａ））及びオートリソソーム（図４（Ｂ））の形成が認められた。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１はhsa-miR-145の塩基配列を示す。配列番号２はhsa-miR-145の前駆物質であるヘアピンループ構造を有するprimary miRNAの塩基配列を示す。配列番号３は、実施例３で、比較実験用に使用したmiRNAの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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