(57)【要約】抗ＤＤＲ１抗体を作製してその抗腫瘍活性について鋭意研究を行った結果、ヒトＤＤＲ１のアミノ酸配列の中でもＳｔａｌｋ領域に結合する抗体がそれ以外の領域に結合する抗体と比較して抗体単独で強い活性を有することを見出した。同時に当該抗体は、（ｉ）細胞の増殖を抑制する活性、（ｉｉ）細胞の遊走を阻害する活性、（ｉｉｉ）細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害する活性、（ｉｖ）細胞内に取り込まれる活性、（ｖ）細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させる活性、（ｖｉ）細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させる活性、の群から選択される１つ以上の活性を有することを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＤＲ１（Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体。
【請求項２】
細胞の増殖を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
細胞の遊走を阻害することを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
細胞内に取り込まれることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
細胞が癌細胞である、請求項２から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
癌が、肺癌、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌または胆管癌である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の抗体；
（ａ）受託番号FERM BP-11399として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃１１５）、
（ｂ）受託番号FERM BP-11398として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃２７）、
（ｃ）受託番号FERM BP-11397として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃２４）。
【請求項１１】
請求項１０に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の抗体が有するＣＤＲ配列と、同一のＣＤＲ配列を有する抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体と、ＤＤＲ１への結合を競合する抗体。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体が結合するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失および／または他のアミノ酸に置換された抗体であって、当該付加、欠失および／または置換がなされる前の抗体と同等のＤＤＲ１のStalk領域への結合活性を有する抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
低分子化抗体である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
細胞傷害剤が連結された、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の細胞を培養し培養上清から回収される抗体。
【請求項２３】
ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のハイブリドーマ；
（ａ）受託番号FERM BP-11399として寄託されたハイブリドーマ（＃１１５）、
（ｂ）受託番号FERM BP-11398として寄託されたハイブリドーマ（＃２７）、
（ｃ）受託番号FERM BP-11397として寄託されたハイブリドーマ（＃２４）。
【請求項２５】
請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む癌の治療または予防剤。
【請求項２６】
癌が、肺癌、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌または胆管癌である、請求項２５に記載の癌の治療または予防剤。
【請求項２７】
請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項２８】
請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞遊走阻害剤。
【請求項２９】
請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞におけるDDR1のリン酸化阻害剤。
【請求項３０】
請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞におけるDDR1の発現量抑制剤。
【請求項３１】
請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞におけるＴＧＦβの発現量抑制剤。
【請求項３２】
細胞傷害剤をさらに含む、請求項２５から３１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３３】
哺乳動物に対して、請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療または予防方法。
【請求項３４】
哺乳動物に対して、請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞増殖を抑制する方法。
【請求項３５】
哺乳動物に対して、請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞の遊走を阻害する方法。
【請求項３６】
哺乳動物に対して、請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞におけるリン酸化を阻害する方法。
【請求項３７】
哺乳動物に対して、請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞におけるDDR1の発現を抑制する方法。
【請求項３８】
哺乳動物に対して、請求項１から１８、または２２のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞におけるＴＧＦβの発現を抑制する方法。
【請求項３９】
細胞傷害剤をさらに投与する、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２１に記載の細胞を培養し培養上清から抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性を有する新規なＤＤＲ１抗体およびそれを有効成分として含む癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＤＤＲ１、ＥＤＤＲ１、ＮＥＰ、ＮＴＲＫ１、ＣＡＫとも称される。以下ＤＤＲ１という。）は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のホモロジータンパク質としてヒト胎盤組織よりクローニングされた分子量１０５ｋＤａのＲＴＫであり（非特許文献１）、リガンドであるコラーゲンとの結合により生じる自己リン酸化を通じて下流分子へのシグナル伝達を起こす事が知られている（非特許文献２）。ＤＤＲ１は一回膜貫通型であり、その細胞外ドメインはＮ末端からＤｉｓｃｏｉｄｉｎ（ＤＳ）領域とＳｔａｌｋ領域より構成され、前者はコラーゲンへの結合、後者はＤＤＲ１のｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎに必要であり、コラーゲンによるＤＤＲ１の自己リン酸化には両者が必要であると報告されている（非特許文献３、４）。【０００３】
ＤＤＲ１の分子機能としては、細胞の形態変化、接着、遊走、浸潤、増殖、アポトーシス抑制などへの寄与が示唆されている。これらの機能推定の根拠となった実験事実は、ＤＤＲ１過剰発現株または発現抑制株でのフェノタイプ解析やコラーゲン処理により細胞に生じる現象に基づいている。現在までに、マウスマクロファージでの接着、浸潤亢進（非特許文献５）、ヒト前立腺癌細胞での浸潤能亢進、アポトーシス抑制（非特許文献６）、ヒト大腸癌細胞でのアポトーシス抑制、増殖亢進（非特許文献７）、ヒト肺癌細胞での遊走能亢進、浸潤能亢進（非特許文献８）といった実験結果が報告されており、ＤＤＲ１の癌の増殖、転移への分子機能関与が強く示唆されている。また、ＤＤＲ１の癌組織における高発現、活性化については下記事例に示す複数の癌種において報告されている；グリオーマ（非特許文献９）、乳癌（非特許文献１０）、子宮内膜癌（非特許文献１１）、卵巣癌（非特許文献１２）、肺癌（非特許文献１３）、胆管癌（非特許文献１４）。加えて、ＤＤＲ１の発現と癌の予後や転移との相関については、グリオーマ（非特許文献１５）、肺癌（非特許文献８）において報告されている。一方近年では、ＤＤＲ１のコラーゲン結合活性やキナーゼ活性を介さない機能の存在も示唆されており（非特許文献１６）、ＤＤＲ１の作用機序にはまだ未知の部分もある。【０００４】
ＤＤＲ１を癌治療の標的とするという点においては、ＤＤＲ１が乳癌などの癌細胞で高発現していることを示す実験結果から、ＤＤＲ１を介して起こる事象（リン酸化など）を指標としてそれが阻害されるかどうかを測定することにより、癌治療剤をスクリーニング可能であるという着想がすでに開示されている（特許文献１）。また、ＤＤＲ１に対するポリクローナル抗体を作製して、それがＤＤＲ１とコラーゲンとの結合を中和すること、癌細胞におけるコラーゲンの細胞保護作用を抑制することが報告されている（特許文献２）。さらに、ＤＤＲ１に対するモノクローナル抗体を作製して、それがＤＤＲ１のＤＳ領域、中でも５３番目のトリプトファン残基を中心としたエピトープに結合すること、コラーゲンにより誘導されるＤＤＲ１のリン酸化を阻害すること、大腸癌ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて抗体単独では顕著な抗腫瘍活性を示さなかったが、化学療法剤であるイリノテカンと併用した場合に抗腫瘍活性を示すことなどが報告されている（特許文献３）。しかしこれまでのところ、抗体単独でもｉｎ  ｖｉｖｏで高い抗腫瘍効果を示すことのできる抗ＤＤＲ１抗体の例は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ１９９５／００２１８７
【特許文献２】ＷＯ２００６／０９８４６５
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０１９７０２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３；９０：５６７７−８１
【非特許文献２】Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００８；１８０：１２７７−８９
【非特許文献３】Ｃｕｒａｔ  Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：４５９５２−５８
【非特許文献４】Ａｂｄｕｌｈｕｓｓｅｉｎ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８；２８３：１２０２６−１２０３３
【非特許文献５】Ｆｒａｎｃｏ  Ｃ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００９；１０５：１１４１−８
【非特許文献６】Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００８；９９：３９−４５
【非特許文献７】Ｋｉｍ  Ｈ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６：１７６７２−８１
【非特許文献８】Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｈ．ら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．２０１０；２４：３１１−９
【非特許文献９】Ｒａｍ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２００６；７６：２３９−４８
【非特許文献１０】Ｋｉｍｍａｎ  Ｍ．Ｌ．ら、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；７：１−２０
【非特許文献１１】Ｃｏｌａｓ  Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１；１２９：
【非特許文献１２】Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎ−Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｖ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；１０：４４２７−３６
【非特許文献１３】Ｒｉｋｏｖａ  Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ  ２００７；１３１：１１９０−２０３
【非特許文献１４】Ｇｕ  Ｔ．Ｌ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ１５６４０
【非特許文献１５】Ｙａｍａｎａｋａ  Ｒ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；２５：５９９４−６００２
【非特許文献１６】Ｈｉｄａｌｇｏ−Ｃａｒｃｅｄｏ  Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；１３：４９−５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は抗腫瘍活性を有する新規な抗ＤＤＲ１抗体を提供することにある。また、該抗体を有効成分として含む癌治療または予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、抗ＤＤＲ１抗体を作製してその抗腫瘍活性について鋭意研究を行った結果、ヒトＤＤＲ１のアミノ酸配列の中でもＳｔａｌｋ領域に結合する抗体は、それ以外の領域に結合する抗体と比較して抗体単独で強い抗腫瘍活性を有することを新たに見出した。また同時にそれらの抗体は、
（ｉ）細胞の増殖を抑制する活性、
（ｉｉ）細胞の遊走を阻害する活性、
（ｉｉｉ）細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害する活性、
（ｉｖ）細胞内に取り込まれる活性、
（ｖ）細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させる活性、
（ｖｉ）細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させる活性、
の群から選択される１つ以上の活性を有することを見出した。【０００９】
本発明は、このような知見に基づくものであり、具体的には以下の発明に関する。
〔１〕  ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体。
〔２〕  細胞の増殖を抑制することを特徴とする、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕  細胞の遊走を阻害することを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の抗体。
〔４〕  細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害することを特徴とする、〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔５〕  細胞内に取り込まれることを特徴とする、〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔６〕  細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させることを特徴とする、〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔７〕  細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させることを特徴とする、〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔８〕  細胞が癌細胞である、〔２〕から〔７〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔９〕  癌が、肺癌、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌または胆管癌である、〔８〕に記載の抗体。
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の抗体；
（ａ）受託番号FERM BP-11399として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃１１５）、
（ｂ）受託番号FERM BP-11398として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃２７）、
（ｃ）受託番号FERM BP-11397として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃２４）。
〔１１〕  〔１０〕に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の抗体が有するＣＤＲ配列と、同一のＣＤＲ配列を有する抗体。
〔１２〕  〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の抗体と、ＤＤＲ１への結合を競合する抗体。
〔１３〕  〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の抗体が結合するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体。
〔１４〕  〔１〕から〔１３〕のいずれか一項に記載の抗体において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失および／または他のアミノ酸に置換された抗体であって、当該付加、欠失および／または置換がなされる前の抗体と同等のＤＤＲ１のStalk領域への結合活性を有する抗体。
〔１５〕  モノクローナル抗体である、〔１〕から〔１４〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔１６〕  キメラ抗体またはヒト化抗体である、〔１〕から〔１５〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔１７〕  低分子化抗体である、〔１〕から〔１６〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔１８〕  細胞傷害剤が連結された、〔１〕から〔１７〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔１９〕  〔１〕から〔１８〕のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
〔２０〕  〔１９〕に記載の核酸を含むベクター。
〔２１〕  〔２０〕に記載のベクターを保持する宿主細胞。
〔２２〕  〔２１〕に記載の細胞を培養し培養上清から回収される抗体。
〔２３〕  ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体を産生するハイブリドーマ。
〔２４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のハイブリドーマ；
（ａ）受託番号FERM BP-11399として寄託されたハイブリドーマ（＃１１５）、
（ｂ）受託番号FERM BP-11398として寄託されたハイブリドーマ（＃２７）、
（ｃ）受託番号FERM BP-11397として寄託されたハイブリドーマ（＃２４）。
〔２５〕  〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む癌の治療または予防剤。
〔２６〕  癌が、肺癌、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌または胆管癌である、〔２５〕に記載の癌の治療または予防剤。
〔２７〕  〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤。
〔２８〕  〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞遊走阻害剤。
〔２９〕  〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞におけるDDR1のリン酸化阻害剤。
〔３０〕  〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞におけるDDR1の発現量抑制剤。
〔３１〕  〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含む、細胞におけるＴＧＦβの発現量抑制剤。
〔３２〕  細胞傷害剤をさらに含む、〔２５〕から〔３１〕のいずれか一項に記載の薬剤。
〔３３〕  哺乳動物に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療または予防方法。
〔３４〕  哺乳動物に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞増殖を抑制する方法。
〔３５〕  哺乳動物に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞の遊走を阻害する方法。
〔３６〕  哺乳動物に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞におけるリン酸化を阻害する方法。
〔３７〕  哺乳動物に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞におけるDDR1の発現を抑制する方法。
〔３８〕  哺乳動物に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、細胞におけるＴＧＦβの発現を抑制する方法。
〔３９〕  細胞傷害剤をさらに投与する、〔３３〕から〔３８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４０〕  〔２１〕に記載の細胞を培養し培養上清から抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法。【００１０】
また、本発明は以下の発明に関する。
〔４１〕  癌を罹患している対象に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
〔４２〕  発癌していると診断された対象に対して、〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
〔４３〕  対象が発癌しているか診断する工程、および発癌していると診断された対象に対して〔１〕から〔１８〕、または〔２２〕のいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与する工程を含む、癌の治療方法。
〔４４〕  前記診断が、対象から得た生体試料におけるＤＤＲ１の発現レベルを指標とすることを特徴とする、〔４２〕または〔４３〕に記載の方法。
〔４５〕  前記診断において、ＤＤＲ１の正常対照レベルと比較した場合の発現レベルの上昇により、前記対象が発癌していることが示唆される、〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕  癌が、ＤＤＲ１を発現している癌である、〔４１〕から〔４５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４７〕  癌が、正常よりもＤＤＲ１を多く発現している癌である、〔４１〕から〔４５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４８〕  癌が、肺癌、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌または胆管癌である、〔４１〕から〔４５〕のいずれか一項に記載の方法。【００１１】
さらに、本発明は以下の発明に関する。
〔ａ〕  癌の治療剤もしくは予防剤、細胞増殖抑制剤、細胞遊走阻害剤、細胞におけるDDR1のリン酸化阻害剤、細胞におけるDDR1の発現量抑制剤、または細胞におけるＴＧＦβの発現量抑制剤の製造における、本発明の抗体の使用。
〔ｂ〕  癌の治療もしくは予防方法、細胞増殖を抑制する方法、細胞の遊走を阻害する方法、細胞におけるリン酸化を阻害する方法、細胞におけるDDR1の発現を抑制する方法、または細胞におけるＴＧＦβの発現を抑制する方法において使用するための、本発明の抗体。
〔ｃ〕  本発明の抗体を使用する段階を含む、癌の治療剤もしくは予防剤、細胞増殖抑制剤、細胞遊走阻害剤、細胞におけるDDR1のリン酸化阻害剤、細胞におけるDDR1の発現量抑制剤、または細胞におけるＴＧＦβの発現量抑制剤を製造するためのプロセス。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗ＤＤＲ１抗体のクローン番号、サブクラスおよびＤＤＲ１、ＤＤＲ２への結合活性を示す表である。表中の値は、ＥＬＩＳＡ法での４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４５０）、および、２次抗体が存在する場合と存在しない場合とでの吸光度差（Δａｂ  ＯＤ４５０）を表わす。各抗体はいずれもＤＤＲ１に特異的に結合する抗体であることが示された。
【図２】抗ＤＤＲ１抗体が結合するＤＤＲ１の領域を示す。（ａ）全長のＤＤＲ１（Ｆｕｌｌ  ＬｅｎｇｔｈまたはＦＬ）、ＤＳ領域が欠失したＤＤＲ1（ΔＤＳ）およびＳｔａｌｋ領域が欠失したＤＤＲ1（ΔＳｔａｌｋ）を表わす模式図である。（ｂ）ＩＰ−ウェスタン法により各抗体とＦＬ−ＤＤＲ１、ΔＤＳ−ＤＤＲ１、ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１との結合を評価した写真である。免疫沈降（ＩＰ）には各抗ＤＤＲ１抗体を用い、ウェスタンブロッティングには抗ＦＬＡＧ抗体を用いた。抗ＤＤＲ１抗体＃１１５、＃２７、＃２４はいずれもＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合することが示された。一方、２０Ｍ１０２はＤＤＲ１のＤＳ領域に結合することが示された。
【図３】抗ＤＤＲ１抗体のヒト肺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍活性を表わすグラフである。ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３を移植したマウスにＰＢＳ（陰性対照）または抗ＤＤＲ１抗体を腹腔内投与し、腫瘍体積の経時変化を測定した。＃１１５、＃２４、＃２７ではいずれも腫瘍増殖の抑制効果が認められた。中でも＃１１５が最も強い腫瘍増殖の抑制効果を示した。一方、２０Ｍ１０２は腫瘍増殖の抑制効果を示さなかった。
【図４】抗ＤＤＲ１抗体のリガンド依存的な細胞遊走の阻害活性を表わすグラフである。（ａ）ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３のリガンド依存的な細胞遊走活性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムＴＭを用いて測定した。リガンドにはコラーゲンタイプ４を用いた。縦軸は、リガンドによる細胞遊走が完全に阻害された場合を１００とした場合の、各抗ＤＤＲ１抗体の遊走阻害度（％）を表わす。阻害度がマイナスの値となるのは、リガンド単独時に比べて抗体添加により細胞遊走量が増加していることを表わす。＃１１５、＃２４においてリガンド依存的な細胞遊走の阻害が観察された。（ｂ）ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３のリガンド依存的な細胞遊走活性をＣｕｌｔｒｅｘアッセイキットを用いて測定した。リガンドにはコラーゲンタイプ４を用いた。縦軸は、リガンドによる細胞遊走が完全に阻害された場合を１００とした場合の、各抗ＤＤＲ１抗体の遊走阻害度（％）を表わす。＃１１５、＃２４、＃２７においてリガンド依存的な細胞遊走の阻害が観察された。
【図５】抗ＤＤＲ１抗体のリガンド依存的なＤＤＲ１のリン酸化阻害活性を表わす写真である。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄにおけるリガンド依存的なＤＤＲ１のリン酸化を、７９６位のチロシンがリン酸化されたＤＤＲ１（ｐＹＤＤＲ１）を特異的に認識するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した。リガンドにはコラーゲンタイプ１またはコラーゲンタイプ４を用いた。＃２７、＃２４においてリガンド依存的なＤＤＲ１のリン酸化阻害が観察された。
【図６】抗ＤＤＲ１抗体の細胞内への取り込みを表わすグラフである。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄに抗ＤＤＲ１抗体とＭａｂＺＡＰ（サポリン標識抗マウスＩｇＧ抗体）を添加し、細胞増殖が阻害されるかどうかを調べることにより、抗ＤＤＲ１抗体の細胞内への取り込みを評価した。縦軸は、抗ＤＤＲ１抗体、ＭａｂＺＡＰともに非添加の場合の細胞増殖を１とした場合の、抗ＤＤＲ１抗体およびＭａｂＺＡＰ添加時の細胞増殖の比を表わす。＃１１５、＃２４において細胞内への取り込みが観察された。
【図７】抗ＤＤＲ１抗体によるＤＤＲ１の発現量の低下を表わす写真である。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７ＤにＰＢＳ（陰性対照）または抗ＤＤＲ１抗体を添加し、細胞におけるＤＤＲ１の発現量をウェスタンブロッティングにより検出した。アクチンを内部コントロールとして用いた。＃１１５、＃２４においてＤＤＲ１の発現量の低下が観察された。
【図８】抗ＤＤＲ１抗体のリガンド依存的なＴＧＦβの発現抑制活性を表わすグラフである。ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３とマウス線維芽細胞ＭＲＣ５の共培養系におけるリガンド依存的なＴＧＦβ  ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。リガンドにはコラーゲンタイプ１を用いた。縦軸は、リガンド・抗体無添加時（コントロール）を１としたときのＴＧＦβｍＲＮＡ量の比を表わす。＃１１５においてリガンド依存的なＴＧＦβ発現の抑制が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、抗腫瘍活性を有する新規な抗ＤＤＲ１抗体を提供する。
本発明者らは、ＤＤＲ１（Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）タンパク質の細胞外領域のうち、Ｓｔａｌｋ領域に結合する抗体は、それ以外のｄｉｓｃｏｉｄｉｎ（ＤＳ）領域などに結合する抗体と比較して、抗体単独でも強い抗腫瘍活性を有することを初めて見出した。すなわち本発明は、ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体を提供する。
【００１４】
本発明で用いられるＤＤＲ１の動物種は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。ヒトＤＤＲ１の遺伝子配列およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３９９３およびＮＰ＿０５４６９９としてそれぞれ登録されている。ヒト以外では、マウスのＤＤＲ１の遺伝子配列およびアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７５８４およびＮＰ＿０３１６１０として、ラットのＤＤＲ１の遺伝子配列およびアミノ酸配列がＮＭ＿０１３１３７およびＮＰ＿０３７２６９としてそれぞれ登録されている。他の動物種についても当業者であれば、種間における相同性を利用した遺伝子クローニングなどにより配列を決定することが可能である。
【００１５】
ＤＤＲ１は一回膜貫通型の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、構造的には細胞外領域、膜貫通（ＴＭ）領域、細胞内領域（キナーゼ領域）に大別される。ヒトＤＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：２に、塩基配列を配列番号：１に示す。さらに細胞外領域にはＤｉｓｃｏｉｄｉｎ（ＤＳ）領域とＳｔａｌｋ領域が含まれており、ＤＳ領域はリガンドであるコラーゲンとの結合に関与すると考えられている。本明細書においては、ヒトＤＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号：２）における、３２番目から１８５番目までのアミノ酸配列からなる領域をＤＳ領域、１９９番目から４１２番目までのアミノ酸配列からなる領域をＳｔａｌｋ領域と呼称する。ヒトＤＤＲ１のＤＳ領域のアミノ酸配列を配列番号：３に、Ｓｔａｌｋ領域のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。ヒト以外のＤＤＲ１においても、ヒトＤＤＲ１との配列相同性から各領域に対応する領域を同様に決定することができる。
【００１６】
本発明における抗体の結合活性は、例えばＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）やＢｉａｃｏｒｅ、ウェスタンブロッティング、ＦＡＣＳなどの当業者に公知の手法を用いて測定することができる。本発明において「結合する」とは、上記のような方法により測定された結合活性の値が、陰性対照の結合活性の値あるいは当該測定方法のバックグラウンドの値よりも２倍以上高いことを意味し、好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上高いことを意味する。
【００１７】
ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体は、後述の実施例１に記載のように、ＤＤＲ１タンパク質をマウスなどの動物に免疫して抗ＤＤＲ１抗体を複数取得した後に、スクリーニングによりそれらの中からＳｔａｌｋ領域に結合する抗体を選択することによって作製することができるし、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いて、あらかじめＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に該当する部分タンパク質を作製し、それをマウスなどの動物に免疫することによって作製することもできる。
【００１８】
本発明が提供する抗ＤＤＲ１抗体の好ましい態様の一つとして、細胞の増殖を抑制することを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が挙げられる。
【００１９】
本発明における細胞としては、生体の組織から回収された初代培養細胞であってもよいし、それらを何らかの方法で不死化することで樹立された細胞株であってもよい。細胞の表現型としては、通常の細胞に比べて、ＤＤＲ１遺伝子やＤＤＲ１タンパク質を多く発現している細胞が好ましい。細胞に発現しているＤＤＲ１遺伝子の量は、ＤＤＲ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲやＧｅｎｅＣｈｉｐ解析などの当業者に公知の手法を用いて、細胞に発現しているＤＤＲ１タンパク質の量は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングや免疫組織染色（ＩＨＣ）などの当業者に公知の手法を用いてそれぞれ評価することができる。
【００２０】
本発明において「細胞の増殖を抑制する」とは、抗ＤＤＲ１抗体を細胞に接触させた場合、当該抗体を接触させなかった場合に比べて細胞の増殖が低下することを意味する。細胞増殖の低下には、細胞が生存している状態で増殖速度が低下することも含まれるし、アポトーシスやネクローシスなどにより細胞死が誘導されることも含まれる。細胞増殖の抑制は、抗ＤＤＲ１抗体が細胞表面のＤＤＲ１に結合した結果として引き起こされることが好ましい。細胞増殖の抑制はｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されてもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖の抑制は、［３Ｈ］チミジン取り込み法やＭＴＴ法、ＷＳＴ法などの当業者に公知のアッセイ系により測定することができるし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞増殖の抑制は、マウスにヒトの細胞を移植する異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。
【００２１】
評価系における細胞の増殖が完全に抑制された場合を１００％とした場合、抗ＤＤＲ１抗体により増殖が例えば３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上抑制されることが好ましい。先行文献（特許文献３）に開示されているＤＤＲ１のＤＳ領域に結合する抗体２０Ｍ１０２が、ｉｎ  ｖｉｖｏで約２０％の増殖抑制を示したのに対し（上記文献Ｆｉｇｕｒｅ６参照）、本発明が提供するＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体＃２４、＃２７は、それぞれ４８％、６１％、＃１１５は７１％の増殖抑制をｉｎ  ｖｉｖｏで示すことを本発明者らは見出した（後述の実施例３参照）。
【００２２】
本発明が提供する抗ＤＤＲ１抗体の好ましい態様の一つとして、細胞の遊走を阻害することを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が挙げられる。
【００２３】
細胞の遊走は、生体内などでの細胞の自発的な移動を説明する現象であり、細胞の遊走を阻害する抗体は、癌細胞の浸潤や転移を抑制できる可能性があり有用と考えられる。本発明において「細胞の遊走を阻害する」とは、抗ＤＤＲ１抗体を細胞に接触させた場合、当該抗体を接触させなかった場合に比べて細胞の遊走活性が低下することを意味する。細胞遊走の阻害は、実施例４などに記載の、チャンバー間の細胞の移動を検出するアッセイ系により測定することができる。ＤＤＲ１タンパク質を細胞表面に発現している細胞においては、ＤＤＲ１の細胞外領域にリガンドが結合することによって細胞遊走が刺激され、特にコラーゲンがリガンドとして結合することによって細胞遊走が誘導されることが知られている（Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｈ．ら，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．（２０１０）２４，３１１−３１９）。コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲンあるいはＩＶ型コラーゲンが適している。細胞遊走の阻害は、抗ＤＤＲ１抗体がＤＤＲ１とリガンドとの結合を阻害した結果として引き起こされることが好ましい。
【００２４】
本発明が提供する抗ＤＤＲ１抗体の好ましい態様の一つとして、細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害することを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が挙げられる。
ＤＤＲ１のリン酸化としては、好ましくはＤＤＲ１に含まれるチロシン残基のリン酸化であり、特に好ましくはＤＤＲ１のアミノ酸配列における７９６番目のチロシン残基のリン酸化である。ＤＤＲ１のリン酸化は、細胞の生存あるいは細胞の浸潤・転移などのシグナルを伝えることが知られており、ＤＤＲ１のリン酸化を阻害する抗体は、癌細胞の増殖あるいは浸潤・転移を抑制できる可能性があり有用と考えられる。本発明において「ＤＤＲ１のリン酸化を阻害する」とは、抗ＤＤＲ１抗体を細胞に接触させた場合、当該抗体を接触させなかった場合に比べてリン酸化されるＤＤＲ１の割合が低下することを意味する。ＤＤＲ１のリン酸化の阻害は、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。ＤＤＲ１タンパク質を細胞表面に発現している細胞においては、ＤＤＲ１の細胞外領域にリガンドが結合することによってＤＤＲ１のリン酸化が起こり、特にコラーゲンがリガンドとして結合することによってＤＤＲ１のリン酸化が誘導されることが知られている（Ｖｏｇｅｌ  Ｗ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（１９９７）１，１３−２３）。コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲンあるいはＩＶ型コラーゲンが適している。ＤＤＲ１のリン酸化の阻害は、抗ＤＤＲ１抗体がＤＤＲ１とリガンドとの結合を阻害した結果として引き起こされることが好ましい。ＤＤＲ１のリン酸化は、ＤＤＲ１の自己リン酸化によって引き起こされてもよいし、他のキナーゼによるリン酸化によって引き起こされてもよい。
【００２５】
ＤＤＲ１のリン酸化は、例えば以下の方法により測定することが可能である。ＤＤＲ１発現細胞（例えば、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＳＫ−ＭＥＳ−１、Ｐａｎｃ−１、ＭＦＥ−２８０、ＨＣＴ−１１６、ＢＴ４７４、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＢｘＰＣ３など）をコラーゲンで刺激し、その後細胞からＤＤＲ１タンパク質を抽出する。抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、抽出されたＤＤＲ１タンパク質のチロシン残基がリン酸化されていることを確認する。より具体的には、実施例５に記載の方法により測定することが可能である。上記の細胞にＤＤＲ１が発現していることは、以下の文献（Ｌ'ＨＯＴＥ  Ｃ．Ｇ．Ｍ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２００２）１６，２３４−６、Ｒｉｋｏｖａ  Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ（２００７）１３１，１１９０−２０３、Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００８）１８０，１２７７−８９）などから公知であり、また本発明者らによるＧｅｎｅＣｈｉｐ解析、ウェスタンブロッティング解析等によっても確かめられている。
【００２６】
本発明が提供する抗ＤＤＲ１抗体の好ましい態様の一つとして、細胞内に取り込まれることを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が挙げられる。
細胞表面に存在する物質が何らかのメカニズムを介して能動的に細胞内に取り込まれる現象があることはすでに知られている。抗ＤＤＲ１抗体の細胞内への取り込みは、好ましくは細胞表面に発現しているＤＤＲ１タンパク質に抗ＤＤＲ１抗体が結合した結果として引き起こされる。細胞内に取り込まれる抗体は、毒素などの細胞障害活性を有する化合物をコンジュゲートさせることにより癌細胞の増殖を抑制できる可能性があり有用と考えられる。本発明において「細胞内に取り込まれる」とは、抗ＤＤＲ１抗体を細胞に接触させた場合、陰性対照の抗体を接触させた場合に比べて取り込まれる抗体の量が多いことを意味する。抗体の細胞内への取り込みは、当該抗体を毒素で直接標識したり、あるいは実施例６のように当該抗体に毒素標識された２次抗体を結合させたりすることによって、細胞内に取り込まれた毒素の量として測定することができる。細胞の表現型としては、通常の細胞に比べてＤＤＲ１を多く発現している細胞が好ましく、そのような細胞は、ＤＤＲ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲやＧｅｎｅＣｈｉｐ解析などの遺伝子レベルの解析や、ＤＤＲ１タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングや免疫組織染色（ＩＨＣ）などのタンパク質レベルの解析により選択することができる。
【００２７】
本発明が提供する抗ＤＤＲ１抗体の好ましい態様の一つとして、細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させることを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が挙げられる。
ＤＤＲ１の発現量の低下は、ＤＤＲ１タンパク質の分解の促進によるものであってもよいし、ＤＤＲ１タンパク質の翻訳の抑制によるものであってもよい。また、ＤＤＲ１ｍＲＮＡの分解の促進によるものであってもよいし、ＤＤＲ１ｍＲＮＡの転写の抑制によるものであってもよい。ＤＤＲ１の発現量を低下させる抗体は、癌細胞においてＤＤＲ１が関与する生存や浸潤・転移などの現象を抑制できる可能性があり有用と考えられる。本発明において「ＤＤＲ１の発現量を低下させる」とは、抗ＤＤＲ１抗体を細胞に接触させた場合、当該抗体を接触させなかった場合に比べてＤＤＲ１の発現量が低下することを意味する。ＤＤＲ１の発現量の低下は、抗ＤＤＲ１抗体が細胞表面のＤＤＲ１に結合した結果として引き起こされることが好ましい。ＤＤＲ１のｍＲＮＡ量は、ＤＤＲ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。また、ＤＤＲ１のタンパク質量は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。
【００２８】
ＤＤＲ１の発現量は、例えば以下の方法により測定することが可能である。ＤＤＲ１発現細胞（例えば、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＳＫ−ＭＥＳ−１、Ｐａｎｃ−１、ＭＦＥ−２８０、ＨＣＴ−１１６、ＢＴ４７４、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＢｘＰＣ３など）からＤＤＲ１タンパク質を抽出する。抽出されたＤＤＲ１タンパク質をウェスタンブロッティングにより検出する。より具体的には、実施例７に記載の方法により測定することが可能である。
【００２９】
本発明が提供する抗ＤＤＲ１抗体の好ましい態様の一つとして、細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させることを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が挙げられる。
ＴＧＦβの発現量の低下は、ＴＧＦβタンパク質の分解の促進によるものであってもよいし、ＴＧＦβタンパク質の翻訳の抑制によるものであってもよい。また、ＴＧＦβｍＲＮＡの分解の促進によるものであってもよいし、ＴＧＦβｍＲＮＡの転写の抑制によるものであってもよい。ＴＧＦβは、腫瘍形成に促進的に働くと報告されている上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）時に発現が上昇する事が知られているマーカー分子であり、ＴＧＦβの発現量を低下させる抗体は、細胞の上皮間葉移行を抑制することで腫瘍形成を阻害できる可能性があり有用と考えられる。即ち本発明における抗ＤＤＲ１抗体の態様の一つには、細胞の上皮間葉移行（ＥＭＴ）を阻害することを特徴とする抗ＤＤＲ１抗体が含まれてもよい。本発明において「ＴＧＦβの発現量を低下させる」とは、抗ＤＤＲ１抗体を細胞に接触させた場合、当該抗体を接触させなかった場合に比べてＴＧＦβの発現量が低下することを意味する。ＤＤＲ１タンパク質を細胞表面に発現している細胞においては、コラーゲンによってＤＤＲ１を介してＴＧＦβの発現が誘導される可能性が示唆されている（Ｇｕｅｒｒｏｔ  Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１）１７９，８３−９１）。コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲンあるいはＩＶ型コラーゲンが適している。ＴＧＦβの発現量の低下は、抗ＤＤＲ１抗体がＤＤＲ１とコラーゲンとの結合を阻害した結果として引き起こされることが好ましい。ＴＧＦβのｍＲＮＡ量は、ＴＧＦβ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。また、ＴＧＦβのタンパク質量は、ＴＧＦβタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。
【００３０】
ＴＧＦβの発現量は、例えば以下の方法により測定することが可能である。ＤＤＲ１発現細胞（例えば、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＳＫ−ＭＥＳ−１、Ｐａｎｃ−１、ＭＦＥ−２８０、ＨＣＴ−１１６、ＢＴ４７４、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＢｘＰＣ３など）をコラーゲンで刺激する。この際、線維芽細胞（ＭＲＣ５など）を共培養してもよい。細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへの逆転写反応を行った後、ＴＧＦβに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＧＦβのｍＲＮＡ量を測定する。より具体的には、実施例８に記載の方法により測定することが可能である。
【００３１】
本発明における細胞は、好ましくは癌細胞であり、より好ましくはＤＤＲ１を発現している癌細胞である。特に好ましくは正常細胞よりもＤＤＲ１を多く発現している癌細胞である。そのような細胞は、ＤＤＲ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲやＧｅｎｅＣｈｉｐ解析などの遺伝子レベルの解析や、ＤＤＲ１タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングや免疫組織染色（ＩＨＣ）などのタンパク質レベルの解析により選択することができる。
【００３２】
本発明の癌細胞の癌種は特に限定されないが、例えば、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌など）、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、胆管癌、大腸癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、メラノーマ、甲状腺癌、膀胱癌、骨肉腫などを挙げることができる。好ましくは肺癌（非小細胞肺癌）、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、胆管癌などである。
【００３３】
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の抗体を提供する；
（ａ）受託番号FERM BP-11399として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃１１５）、
（ｂ）受託番号FERM BP-11398として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃２７）、
（ｃ）受託番号FERM BP-11397として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体（＃２４）。
【００３４】
上記の各ハイブリドーマは、以下のとおり国際寄託されている。以下に各ハイブリドーマの国際寄託を特定する内容を記載する。なお、下記寄託機関（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）の業務は、２０１２年４月１日をもって独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に承継されている。
【００３５】
（ａ）＃１１５
（１）寄託機関の名称・あて名：
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター 
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（２）受託日（寄託日）：２０１１年７月２２日
（３）受託番号：FERM BP-11399
（４）寄託者が付した識別のための表示：DDR1 hybridoma #115 110627
【００３６】
（ｂ）＃２７
（１）寄託機関の名称・あて名：
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター 
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（２）受託日（寄託日）：２０１１年７月２２日
（３）受託番号：FERM BP-11398
（４）寄託者が付した識別のための表示：DDR1 hybridoma #27 110629
【００３７】
（ｃ）＃２４
（１）寄託機関の名称・あて名：
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター 
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（２）受託日（寄託日）：２０１１年７月２２日
（３）受託番号：FERM BP-11397
（４）寄託者が付した識別のための表示：DDR1 hybridoma #24 110629
【００３８】
後述の実施例に記載されているように、上記の（ａ）〜（ｃ）に記載の抗体は、いずれもＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体である。当業者であれば、例えば後述の実施例に記載の方法などを用いて、ハイブリドーマにより産生される抗体の塩基配列およびアミノ酸配列を決定することが可能であり、その配列をもとに公知の遺伝子工学的手法を用いて組換え抗体を作製することが可能である。
【００３９】
また本発明は、上記の（ａ）〜（ｃ）に記載の抗体が有するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有する抗体を提供する。抗体には、Ｈ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、Ｌ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の６つのＣＤＲが存在するが、これらのうちのいずれか１つのＣＤＲが同一であればよく、より好ましくはＨ鎖の３つのＣＤＲあるいはＬ鎖の３つのＣＤＲが同一であればよく、さらに好ましくは６つのＣＤＲがすべて同一であればよい。当業者であれば、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の抗体が有するＣＤＲを適当な他の抗体に移植することによって、当該抗体とほぼ同等のＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域への結合活性を有する抗体（ＣＤＲ移植抗体）を作製することが可能であり、そのような抗体は当該抗体と同様に有用である。抗体のＣＤＲ領域およびＦＲ領域の位置およびナンバリングシステムは、例えば、Ｋａｂａｔらによって定義されている（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）。
【００４０】
本発明は、本発明の抗体とＤＤＲ１への結合を競合する抗体を提供する。
本発明において「ＤＤＲ１への結合を競合する」とは、抗体のＤＤＲ１への結合を測定するアッセイ系において、ある抗ＤＤＲ１抗体を共存させた場合に、本発明の抗体のＤＤＲ１への結合活性が低下することを意味する。そのような抗体は、本発明の抗体と同一かあるいは非常に近接した抗原決定基（エピトープ）に結合する抗体であると考えられるため、本発明の抗体と同様に有用である。ここでのＤＤＲ１への結合の測定には、ＤＤＲ１タンパク質の全長を用いてもよいし、ＤＤＲ１タンパク質の細胞外領域を用いてもよい。また、ＤＤＲ１タンパク質のＳｔａｌｋ領域を用いてもよい。
【００４１】
ＤＤＲ１への結合の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどの当業者に公知のアッセイ系により測定することができる。例えば、酵素標識を利用する競合ＥＬＩＳＡアッセイは好ましい交叉ブロッキングアッセイである。ＤＤＲ１への結合の競合は、例えば以下の方法により測定することが可能である。マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたＤＤＲ１タンパク質を、被検抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、抗ＤＤＲ１抗体が添加される。被検抗体と抗ＤＤＲ１抗体がＤＤＲ１への結合を競合した場合、ウェル中のＤＤＲ１タンパク質に結合する抗ＤＤＲ１抗体の量は低下する。結合する抗体量は、抗ＤＤＲ１抗体を予め標識しておくことによって、容易に測定することができる。例えば、抗ＤＤＲ１抗体をビオチン標識し、アビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートとその適切な基質を使用することにより、結合する抗体量を測定することができる。他には、抗ＤＤＲ１抗体を放射性標識あるいは蛍光標識することにより、結合する抗体量を測定することができる。
【００４２】
さらに、被検抗体と抗ＤＤＲ１抗体とが異なる動物種に由来する定常領域を有する場合には、その動物種に由来する抗体の定常領域を特異的に認識する標識抗体によって、結合する抗体量を測定することもできる。あるいは同じ動物種由来の抗体であってもサブクラスが相違する場合には、各サブクラスを特異的に認識する標識抗体によって、結合する抗体量を測定することができる。
【００４３】
本発明は、本発明の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体を提供する。
抗体のエピトープは、抗原のアミノ酸配列を互いにオーバーラップする形でカバーする一群のペプチド（ペプチドアレイなど）を合成し、各ペプチドに対する抗体の結合活性を測定する方法により同定することができる（Ｐｏｅｔｚ  Ｏ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００５）５，２４０２−１１）。あるいは、抗原−抗体の結晶構造解析を行う方法（Ｖｙａｓ  Ｎ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）４１，１３５７５−８６）、抗原のアミノ酸配列を１アミノ酸ずつアラニンに置換した一群の変異タンパク質を作製し、各変異体に対する抗体の結合活性を測定する方法（アラニンスキャン、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｂ．Ｃ．＆  Ｗｅｌｌｓ  Ｊ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４，１０８１−５）、ランダムペプチドや抗原の部分ペプチドが提示されたファージライブラリーの中から、抗体に結合するペプチド配列をスクリーニングする方法（Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．＆  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ  Ｖ．Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９７）９７，３９１−４１０）などによっても同定することができる。そのようにして同定されたエピトープが本発明の抗体が結合するエピトープと同一であるかあるいは本発明の抗体が結合するエピトープと非常に近接している場合には、当該エピトープに結合する抗体は本発明の抗体と同等の結合活性を有していると考えられるため、本発明の抗体と同様に有用である。「エピトープが非常に近接している」とは、エピトープの位置の違いが好ましくは５アミノ酸以内、より好ましくは４アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内、特に好ましくは２アミノ酸以内、最も好ましくは１アミノ酸であることを意味する。
【００４４】
本発明の抗体が結合するエピトープに結合する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、本発明の抗体が結合するエピトープを上述の方法により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、本発明の抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。
【００４５】
本発明は、本発明の抗体に１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失および／または他のアミノ酸に置換された抗体であって、当該付加、欠失および／または置換がなされる前の抗体と同等のＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域への結合活性を有する抗体を提供する。
本発明において「同等のＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域への結合活性を有する」とは、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失および／または他のアミノ酸に置換された抗体のＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域への結合活性が、当該付加、欠失および／または置換がなされる前の抗体と比較して好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であることを意味する。そのような抗体は、本発明の抗体とほぼ同じ性質を有していると考えられるため、本発明の抗体と同様に有用である。
【００４６】
アミノ酸の付加、欠失および／または置換は、例えば部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  Ｔ．ら，Ｇｅｎｅ（１９９５）１５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．＆Ｓｍｉｔｈ  Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ  Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８５）８２，４８８−４９２）など当業者に公知の手法により行うことができる。あるタンパク質と比較して、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失および／または置換されたタンパク質においてもその生物学的活性が維持されることはすでに知られている（Ｍａｒｋ  Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｗａｎｇ  Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４，１４３１−１４３３）。
【００４７】
アミノ酸置換が行われる場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質が保存されているアミノ酸置換の例としては、例えば疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）などの各群内でのアミノ酸置換を挙げることができる。
【００４８】
付加、欠失および／または置換が行われるアミノ酸の位置は特に限定されないが、抗原への結合や抗体の構造維持に関与していないアミノ酸に対して付加、欠失および／または置換が行われることが好ましい。抗体を定常領域と可変領域に分けた場合、当業者であれば定常領域内にそのような位置を容易に特定することができる。さらに可変領域をフレームワーク領域とＣＤＲ領域に分けた場合、当業者であればフレームワーク領域内にそのような位置を過度の負担なく特定することができる。当業者であればＣＤＲ領域内にそのような位置を特定することも可能である。
【００４９】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても構わないが、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗原を動物に免疫するハイブリドーマ法や抗体ライブラリーをスクリーニングするファージディスプレイ法などの公知の手段を用いて取得することが可能である。本発明のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体だけでなく、ハイブリドーマに由来しないヒト化抗体やキメラ抗体も含まれる。
【００５０】
抗体のサブクラスは特に限定されない。例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが好ましいが、より好ましくはＩｇＧである。
【００５１】
ハイブリドーマ法では、例えば以下のようにしてモノクローナル抗体を取得することができる。まず、抗原となるＤＤＲ１タンパク質を用意して、これを通常の免疫方法により動物に免疫する。免疫された動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法により公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。得られたハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗ＤＤＲ１抗体を産生するハイブリドーマを選択する。具体的には、実施例１に記載の方法によりモノクローナル抗体を取得することが可能である。
【００５２】
モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、ＤＤＲ１遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるＤＤＲ１タンパク質が取得できる。ヒトＤＤＲ１遺伝子の塩基配列は既に公知である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３９９３）。すなわち、ＤＤＲ１をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＤＤＲ１タンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のＤＤＲ１タンパク質も同様に使用できる。精製は通常のイオンクロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーを単数回又は複数回、組み合わせて又は単独で使用することにより生成することができる。また、少なくともＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域の一部を含む部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば抗体のＦｃ断片やペプチドタグ等を利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を前記の様に発現ベクターに挿入することにより作製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）。このようにして精製されたＤＤＲ１タンパク質を哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。
【００５３】
さらに、部分ペプチドとして、ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域の全部または少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列とは、好ましくは６個以上、さらに好ましくは８個以上の連続するアミノ酸配列である。また、少なくとも５個以上の連続するアミノ酸配列は、ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に特異的な配列であって、かつ抗原性を有するアミノ酸配列である。
【００５４】
該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、サルなどを免疫動物とすることができる。中でもマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。
【００５５】
公知の方法にしたがって上記の動物を感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に４から２１日毎に数回投与される。感作抗原は、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。さらに、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００５６】
このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
【００５７】
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下ＨＧＰＲＴ欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下ＴＫ欠損と省略する）などが公知である。ＨＧＰＲＴやＴＫの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下ＨＡＴ感受性と省略する）を有する。ＨＡＴ感受性の細胞はＨＡＴ選択培地中でＤＮＡ合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ経路を利用してＤＮＡの合成を継続することができるためＨＡＴ選択培地中でも増殖するようになる。
【００５８】
ＨＧＰＲＴ欠損やＴＫ欠損の細胞は、それぞれ６チオグアニン、８アザグアニン（以下８ＡＧと省略する）、あるいは５'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをＤＮＡ中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他Ｇ４１８耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって２−デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  Ｄ．Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ  Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  Ｉ．Ｓ．Ｊ．、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ  Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等のようなミエローマ細胞を利用することができる。
【００５９】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、例えばケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行なうことが可能である。
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。さらに融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
【００６０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１から１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を培養液に添加することができる。
【００６１】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量１０００から６０００程度のＰＥＧを、通常３０から６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
【００６２】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばＨＧＰＲＴやＴＫの欠損を有する細胞は、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、ＨＡＴ感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、ＨＡＴ培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記ＨＡＴ培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。
【００６３】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。培養上清中に感作抗原と反応する抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかを決定することができる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実施的に同質なＤＤＲ１タンパク質が好適に使用できる。
【００６４】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をＤＤＲ１タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平１−５９８７８号）。この方法によって得られる抗ＤＤＲ１抗体は、ＤＤＲ１タンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。
【００６５】
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＤＤＲ１タンパク質を免疫することによって、抗ＤＤＲ１ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバールウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞からヒト抗体を単離することもできる（ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２）。さらに不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトＤＤＲ１を異物と認識する。したがって、ヒトＤＤＲ１に対するヒト抗体を容易に得ることができる。
【００６６】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
【００６７】
本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５）。
【００６８】
例えば、抗ＤＤＲ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗ＤＤＲ１抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全ＲＮＡが抽出される。細胞から全ＲＮＡを抽出するための方法として、たとえば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）などを用いることができる。
【００６９】
抽出された全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）等を使用してｍＲＮＡを精製することができる。あるいは、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）などのように、細胞から直接ｍＲＮＡを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからｍＲＮＡを得ることもできる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを合成することができる。ｃＤＮＡは、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等によって合成することができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅のために、５'−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＰＣＲを用いた５'−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ  Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ  Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）を利用することができる。さらにこうしたｃＤＮＡの合成の過程においてｃＤＮＡの両末端に後述する適切な制限酵素サイトを導入できる。
【００７０】
得られたＰＣＲ産物から目的とするｃＤＮＡ断片が精製され、次いでベクターＤＮＡと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするｃＤＮＡの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えばジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。
【００７１】
可変領域をコードする遺伝子を得るために、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使ったＰＣＲ法を利用することもできる。まず抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。ｃＤＮＡライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるｍＲＮＡは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアＲＮＡを添加した後に精製される。あるいは一定量のＲＮＡを抽出できる場合には、抗体産生細胞のＲＮＡのみでも効率よく抽出することができる。たとえば１０以上、あるいは３０以上、好ましくは５０以上の抗体産生細胞からのＲＮＡ抽出には、キャリアＲＮＡの添加は必要でない場合がある。
【００７２】
得られたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をＰＣＲ法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２，５８１−５９７などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してＰＣＲ法を行う。
【００７３】
具体的には、たとえばヒトＩｇＧをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。ＩｇＧの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に３'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方５'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。
【００７４】
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるＰＣＲ産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの抗原に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
【００７５】
目的とする抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡが得られた後に、該ｃＤＮＡの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該ｃＤＮＡが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する制限酵素である。さらに１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域（Ｃ領域）をコードする遺伝子と、前記Ｖ領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なる抗体のことを言う。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記Ｖ領域遺伝子を挿入して、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。
【００７６】
具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを保持した発現ベクターの５'側に、前記Ｖ領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列を配置しておくことができる。両者を同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
【００７７】
本発明の抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、当該抗体をコードするＤＮＡを発現する組換え細胞を得ることができる。
【００７８】
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。Ｈ鎖とＬ鎖を組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することによって、Ｈ鎖とＬ鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３）。
【００７９】
抗体を発現させるための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、例えば、哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、Ｖｅｒｏなど）、両生類細胞（アフリカツメガエル卵母細胞など）、昆虫細胞（ドロソフィラＳ２、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５など）などを用いることが可能である。
【００８０】
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）などのニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
【００８１】
更に真菌細胞としては、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属）、糸状菌（アスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属）などを用いることができる。
【００８２】
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ストレプトミセス、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
【００８３】
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３'側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させた発現ベクターを構築することができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
【００８４】
また、その他に本発明の抗体の発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等を示すことができる。
【００８５】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）を利用することができる。また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーはＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
【００８６】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）を利用することができる。あるいはａｒａＢプロモーターはＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
【００８７】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ  Ｓ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（ｒｅｆｏｌｄｅｄ）。
【００８８】
発現ベクターに挿入される複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカー挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等の選択マーカーを利用することができる。
【００８９】
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。本発明は、このようにして形質転換された宿主細胞を培養し産生された抗体に関する。例えば、形質転換された宿主細胞を培養し培養上清などから回収される抗体が含まれる。
【００９０】
また本発明は、形質転換された宿主細胞を培養し、抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法も提供する。当該製造方法における抗体の回収は、本発明の抗体が培地や培養上清に分泌される場合は、培地や培養上清を回収する。本発明の抗体が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後に抗体を回収する。
【００９１】
また、組換え抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、哺乳類動物、昆虫を用いることもできる。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を利用することができる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ｅｂｅｒｔ  Ｋ．Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
【００９２】
また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードする核酸を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Susumu et al., Nature (1985) 315: 592-4）。
【００９３】
さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードする核酸を植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8）。
【００９４】
前記のように発現、産生された抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．＆  Ｌａｎｅ  Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００９５】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性（相互作用）クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。
【００９６】
必要に応じ、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【００９７】
本発明の組換え抗体のＣ領域として、動物抗体由来のＣ領域を使用できる。例えばマウス抗体のＨ鎖Ｃ領域としては、Ｃγ１、Ｃγ２ａ、Ｃγ２ｂ、Ｃγ３、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃεが、Ｌ鎖Ｃ領域としてはＣκ、Ｃλが使用できる。また、マウス抗体以外の動物抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、Ｃ領域を修飾することができる。本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する免疫原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え抗体とすることができる。遺伝子組換え抗体とは、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを含む。
【００９８】
これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体を言う。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡとインフレームで連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたＤＮＡを発現させることによって、培養中に産生される該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用できる。例えばＨ鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、およびＣεをＣ領域として利用することができる。またＬ鎖においてはＣκ、およびＣλをＣ領域として使用できる。これらのＣ領域のアミノ酸配列ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾することができる。
【００９９】
一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）およびヒト抗体由来のＣ領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における免疫原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【０１００】
抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）にはさまれた３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）で構成されている。ＣＤＲは、実質的に抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む。一方ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため一般に、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を他の抗体に移植することができるとされている。
【０１０１】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
【０１０２】
具体的には、マウスの抗体のＣＤＲをヒトのＦＲに移植するための方法として、たとえばＯｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲが公知である。Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにおいては、ヒト抗体のＦＲを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のＣＤＲをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのＦＲのそれぞれについて用意される。一般に、マウスＣＤＲのヒトＦＲへの移植においては、マウスのＦＲと相同性の高いヒトＦＲを選択するのが、ＣＤＲの機能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスＣＤＲに隣接しているＦＲのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトＦＲを利用するのが好ましい。
【０１０３】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。特異的なプライマーセットによってヒトＦＲが個別に合成される。その結果、各ＦＲにマウスＣＤＲをコードするＤＮＡが付加された産物が得られる。各産物のマウスＣＤＲをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、上記産物のオーバーラップしたＣＤＲ部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトＦＲがマウスＣＤＲの配列を介して連結される。
【０１０４】
最終的に３つのＣＤＲと４つのＦＲが連結されたＶ領域遺伝子は、その５'末端と３'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。該発現ベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするＤＮＡを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（ＥＰ２３９４００、ＷＯ９６／０２５７６）。
【０１０５】
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、ＣＤＲを介して連結されたときに該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のＦＲを好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するようにＦＲのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスＣＤＲのヒトＦＲへの移植に用いたＰＣＲ法を応用して、ＦＲにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、ＦＲにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたＦＲには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異ＦＲ配列が選択できる（Ｓａｔｏ  Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９３）５３，８５１−８５６）。
【０１０６】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作する。次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞と融合させることによって、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体が取得できる（特公平１−５９８７８）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばＵ２６６などを利用することができる。
【０１０７】
また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより所望のヒト抗体が取得できる（ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のＶ領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列が決定できる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列を決定した後、当該Ｖ領域配列を所望のヒト抗体Ｃ領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上に挙げたような好適な発現細胞に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８）。
【０１０８】
本発明の抗体には、ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する限り、ＩｇＧに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはＩｇＭに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
【０１０９】
さらに、本発明の抗体は、ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する限り、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することもできる。また、一方の認識部位がＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域を認識し、他方の認識部位がＤＤＲ１以外の抗原を認識する二重特異性抗体とすることも可能である。ＤＤＲ１以外の抗原としては、例えば、ＤＤＲ１と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であってもよいし、あるいは、細胞障害性物質やＴ細胞などの免疫細胞の表面抗原であってもよい。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
【０１１０】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがＨ鎖とＬ鎖を有する抗体の１／２分子であっても良いし、Ｈ鎖のみからなる抗体の１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【０１１１】
さらに、本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やヒアルロン酸などの高分子物質、蛍光物質、発光物質、酵素等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体であってもよい。このようなコンジュゲート抗体は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【０１１２】
本発明は、本発明の抗体が低分子化された抗体を提供する。
低分子化抗体は、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。ＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、付加、欠失および／または置換を含むことができる。さらにＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する限り、ＶＨおよびＶＬのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。また、抗体断片はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  （Ｆｖ）２）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
【０１１３】
抗体断片は、抗体を酵素で消化して生成させることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Ｃｏ  Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ  Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ  Ａ．Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５、Ｌａｍｏｙｉ  Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｅ．＆  Ｗａｌｋｅｒ  Ｂ．Ｗ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７）。
【０１１４】
消化酵素は、抗体を特定の位置で切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。一方、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる：
パパイン消化：Ｆａｂ；
ペプシン消化：Ｆ（ａｂ'）２またはＦ（ａｂ'）；
プラスミン消化：Ｆａｃｂ。
【０１１５】
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨとＶＬとを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ  Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬは、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。
【０１１６】
Ｖ領域は、たとえば上記のようなＰＣＲ法によって連結することができる。ＰＣＲ法によるＶ領域の連結のために、抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列、および抗体のＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡが鋳型として利用される。増幅すべきＤＮＡの両端の配列に対応する配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ法によって、Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡを用意する。ペプチドリンカーをコードするＤＮＡもＰＣＲを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの５'側に、別に合成された各Ｖ領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［ＶＨ  ＤＮＡ］、［ペプチドリンカーＤＮＡ］、［ＶＬ  ＤＮＡ］の各ＤＮＡと、アセンブリーＰＣＲ用のプライマーを利用してＰＣＲ反応を行う。アセンブリーＰＣＲ用のプライマーは、［ＶＨ  ＤＮＡ］の５'側にアニールするプライマーと、［ＶＬ  ＤＮＡ］の３'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーＰＣＲ用プライマーとは、合成すべきｓｃＦｖの全長配列をコードするＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーＤＮＡ］には各Ｖ領域ＤＮＡと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのＤＮＡが連結され、さらにアセンブリーＰＣＲ用のプライマーによって、最終的にｓｃＦｖの全長が増幅産物として生成される。一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを発現させることにより、該ｓｃＦｖが取得できる。
【０１１７】
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の低分子化抗体を指す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，６４４４−６４４８、ＥＰ４０４０９７、ＷＯ９３／１１１６１）。ダイアボディーは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でＶＬおよびＶＨがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおける当該ポリペプチド鎖のリンカーは、一般に、同一鎖中のＶＬとＶＨが互いに結合できない程度に十分短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、２〜１２残基が好ましく、さらに３〜１０残基が好ましく、特には５残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、ｓｃＦｖを形成できず、別のポリペプチド鎖間で２つのＦｖを形成するように二量体化する。その結果、ダイアボディーは２つの抗原結合部位を有することとなる。
【０１１８】
ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ Ｐ．Ｊ．＆  Ｋｏｒｔｔ  Ａ．Ａ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１，１７７−１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。あるいは、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点として２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカーで、
［ＶＨ］−［リンカー］−［ＶＬ］−［リンカー］−［ＶＨ］−［リンカー］−［ＶＬ］
の順に結ぶことによっても作製できる。なお2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VL］
［VH］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VH］
［VH］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VL］
［VL］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VH］
［VL］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VH］
複数のリンカーは、同じ種類のリンカーであってもよいし、異なる種類のリンカーであってもよい。
【０１１９】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）９，２９９−３０５に開示されるリンカー）等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、１から１００アミノ酸、好ましくは３から５０アミノ酸、更に好ましくは５から３０アミノ酸、特に好ましくは１２から１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、ｓｃＦｖの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。
【０１２０】
あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してＶ領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-ＢＳＯＣＯＥＳ）などを用いることが可能である。
【０１２１】
また本発明は、本発明の抗体に細胞傷害剤が連結された抗体を提供する。
本発明において細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害することにより細胞の増殖を抑制する、あるいは細胞死を誘導する物質を意味する。例としては化学療法剤、毒素、サイトカイン、酵素、放射性同位体などが挙げられる。酵素には、抗体酵素／プロドラッグ治療（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＡＤＥＰＴ）のようにそれ自身は細胞障害活性をもつものではないが、プロドラッグを活性化するなど細胞障害の目的で使用できるものも含まれる。細胞傷害剤は、化学修飾の手法を用いることにより本発明の抗体に共有結合を介して連結することができる。抗体を化学修飾する方法はこの分野ではすでに確立されている（例えばＵＳ５０５７３１３、ＵＳ５１５６８４０など）。また、細胞傷害剤がタンパク質の場合には、本発明の抗体との融合タンパク質として連結することもできる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと細胞傷害剤をコードするポリヌクレオチドとをインフレームで連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。本発明の抗体と細胞傷害剤は直接連結してもよいし、上述のペプチドリンカーを介して連結してもよい。
【０１２２】
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を含むベクターを提供する。用いることのできるベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば種類に特に制限はなく、市販の種々のベクターを利用することができる。遺伝子クローニング用のベクターとしては例えばＭ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクターなどが挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されない。例えば、試験管内発現用のベクターとしては例えばpBESTベクター（プロメガ社製）などが、大腸菌発現用のベクターとしては例えばｐＧＥＸ、ｐＥＴ、pBluescriptベクター（Stratagene社製）などが、培養細胞発現用のベクターとしては例えばpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）などが、動物細胞発現用のベクターとしてはｐｃＤＮＡ、生物個体内発現用のベクターとしては例えばpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが挙げられる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、例えば、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック社製）を用いて行うことができる。
【０１２３】
さらに本発明は、上記のベクターを保持する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は特に制限されず、目的に応じて、例えば大腸菌（例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３））や種々の動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ）などの様々な宿主細胞を好適に用いることができる。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。産生系には、in vitroおよびin vivoの産生系が含まれる。
【０１２４】
宿主細胞へのベクターの導入には、例えば、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（Boehringer Mannheim製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法など当業者に公知の手法を用いることができる。また、Free Style 293 Expression System（Invitrogen社製）を用いて、遺伝子導入からポリペプチドの発現までを行うこともできる。
【０１２５】
また本発明は、DDR1のStalk領域に結合する抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
具体的には、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のハイブリドーマを提供する；
（ａ）受託番号FERM BP-11399として寄託されたハイブリドーマ（＃１１５）、
（ｂ）受託番号FERM BP-11398として寄託されたハイブリドーマ（＃２７）、
（ｃ）受託番号FERM BP-11397として寄託されたハイブリドーマ（＃２４）。
【０１２６】
上記の（ａ）〜（ｃ）のハイブリドーマは、いずれもＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域に結合する抗体を産生する。また、上記の（ａ）〜（ｃ）のハイブリドーマは、細胞の増殖を抑制する抗体、細胞の遊走を阻害する抗体、細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害する抗体、細胞内に取り込まれる抗体、細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させる抗体および／または細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させる抗体を産生する。
【０１２７】
また本発明は、本発明の抗体を有効成分として含む癌の治療または予防剤を提供する。
本明細書において「治療」とは、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、癌細胞の増殖や転移、癌による症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であることができ、癌の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であることもできる。本明細書における「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける癌の治療すべてを含む。そしてさらに、癌の素因があるが未だ発癌していると診断されていない対象の発癌の予防、癌の進行や症状を抑制すること、または癌の進行や症状を軽減させることなども「治療」に含まれる。
【０１２８】
本発明の抗体は、細胞の増殖を抑制する活性、細胞の遊走を阻害する活性、細胞におけるＤＤＲ１のリン酸化を阻害する活性、細胞内に取り込まれる活性、細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させる活性および／または細胞におけるＴＧＦβの発現量を低下させる活性など、癌細胞の増殖や浸潤・転移の抑制に有用な特徴を有していることから、癌の治療または予防剤の有効成分として開発することが可能である。
また本発明の抗体は、発癌していると診断された対象に投与することによって癌を治療する方法において使用することが可能である。当該診断は、好ましくは、対象から得た生体試料におけるＤＤＲ１の発現レベルを指標とし、ここでＤＤＲ１の正常対照レベルと比較した場合の発現レベルの上昇は、当該対象が発癌していることを示唆する。
【０１２９】
本発明の薬剤の対象となる癌の種類は特に限定されないが、ＤＤＲ１を発現している癌であることが好ましく、正常よりもＤＤＲ１を多く発現している癌がさらに好ましい。そのような癌は、ＤＤＲ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲやＧｅｎｅＣｈｉｐ解析などの遺伝子レベルの解析や、ＤＤＲ１タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングや免疫組織染色（ＩＨＣ）などのタンパク質レベルの解析により選択することができる。
【０１３０】
本発明の薬剤の対象となる癌種は特に限定されないが、例えば、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌など）、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、胆管癌、大腸癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、メラノーマ、甲状腺癌、膀胱癌、骨肉腫などを挙げることができる。好ましくは肺癌（非小細胞肺癌）、乳癌、グリオーマ、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、胆管癌などである。
【０１３１】
また本発明は、本発明の抗体を有効成分として含む、細胞増殖抑制剤、細胞遊走阻害剤、細胞におけるDDR1のリン酸化阻害剤、細胞におけるDDR1の発現量抑制剤、または細胞におけるＴＧＦβの発現量抑制剤に関する。本発明の薬剤は、細胞傷害剤をさらに含むこともできる。
【０１３２】
また本発明の抗体を有効成分として含む薬剤は、本発明の抗体を用いて癌を治療または予防する方法、細胞増殖を抑制する方法、細胞の遊走を阻害する方法、細胞におけるリン酸化を阻害する方法、細胞におけるDDR1の発現を抑制する方法、または細胞におけるＴＧＦβの発現を抑制する方法とも表現できる。即ち本発明は本発明の抗体の有効量を対象動物に対して投与することを特徴とする、癌の治療または予防方法、細胞増殖を抑制する方法、細胞の遊走を阻害する方法、細胞におけるリン酸化を阻害する方法、細胞におけるDDR1の発現を抑制する方法、または細胞におけるＴＧＦβの発現を抑制する方法に関する。ここで対象となる動物は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
また本発明のこれらの方法では、細胞傷害剤をさらに投与することもできる。
【０１３３】
また、本発明の薬剤を製造するための本発明の抗体の使用、癌の治療または予防、細胞の増殖抑制、細胞の遊走阻害、細胞のリン酸化阻害、細胞のDDR1発現抑制、または細胞のＴＧＦβ発現抑制に使用される本発明の抗体とも表現できる。
【０１３４】
本発明の癌の治療または予防剤は、直接投与対象（患者等）に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＵＳＡ）。本発明の薬剤は、必要に応じ本発明の抗体をその他の医薬成分と組み合わせて製剤化することもできる。例えば医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【０１３５】
また本発明の薬剤は、例えば水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。経口投与及び非経口投与のための剤形及びその製造方法は当業者に周知であり、本発明の薬剤に対し薬学的に許容される担体等を混合等することにより、常法に従って製造することができる。本発明においては、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、ベヒクル、着色料、着香料、保存料、防腐剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、香味剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。これらを適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって、本発明の薬剤を製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
【０１３６】
本発明の薬剤は、経口投与または非経口投与のいずれでも投与可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与などである。投与量は患者の体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲あるいは患者１人あたり０．００１ｍｇから１００００ｍｇの範囲で適宜選択することができるがこれに限定されるものではない。投与される対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【０１３７】
また本発明は、本発明の抗体または薬剤を含有するキット、および本発明の各種方法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットには本発明の抗体または薬剤が含まれる。本発明のキットには、さらに適宜、使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
【０１３８】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１３９】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【０１４０】
〔実施例１〕
１−１  抗原の調製
ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）ｃｅｌｌｓ）にヒトＤＤＲ１細胞外領域とマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域を融合したＦｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）発現ベクターを遺伝子導入し、Ｇ４１８  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法により、ｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質産生ＣＨＯ細胞株をクローニングした。ｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃの塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：５および６に示す。無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ、ＧＩＢＣＯ）を用いて回収したｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質産生ＣＨＯ細胞株の培養上清を、結合緩衝液（２０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、ＧＥヘルスケア）に添加した。結合緩衝液で非結合タンパク質を洗浄した後、溶出緩衝液（１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）を用いて、中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を分注したチューブにｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質の画分を回収し、分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過キット（ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＴＭ、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、精製タンパク質のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３５−７．６５、タカラバイオ）への緩衝液置換及び濃縮を行った。文献（Ｐａｃｅ  Ｃ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．（１９９５）４：２４１１−２４２３）の計算式に従い算出したモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度から精製タンパク質の濃度を算出した。【０１４１】
１−２  抗ＤＤＲ１抗体産生ハイブリドーマの作製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）２匹およびＭＲＬ／ｌｐｒマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）５匹に、前項で作製した抗原（ｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質）を以下の通り免疫した。初回免疫としてＦＣＡ（フロイント完全アジュバントＨ３７  Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でエマルジョン化した抗原を１００μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。２週間後にＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でエマルジョン化した抗原を５０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。以後１週間間隔で追加免疫を３回行った。抗原に対する血清抗体価の上昇を、１−４項に示したＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）で確認後、最終免疫としてリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ（−））、日水製薬）に希釈した抗原を１０μｇ／ｈｅａｄ静脈内投与した。最終免疫の３日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１と称す、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９７）を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いた常法に従い細胞融合した。１０％  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（以下、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０と称す）にて融合細胞を培養した。融合の翌日に、融合細胞を半流動培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）に懸濁し、ハイブリドーマの選択培養を行うと共に、ハイブリドーマのコロニー化を実施した。融合後９日目または１０日目にハイブリドーマのコロニーをピックアップし、ＨＡＴ選択培地（１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ、２ｖｏｌ％  ＨＡＴ  ５０ｘ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（大日本製薬）、５ｖｏｌ％  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））の入った９６−ウェルプレートに、１ウェル当り１コロニーを播種した。３〜４日培養後、各ウェルの培養上清を回収し、１−４項に示したＥＬＩＳＡ法により、上記抗原、及びマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域を融合した対照タンパク質に対する結合活性を測定することにより、ヒトＤＤＲ１細胞外領域に対する結合活性を有するハイブリドーマを選択した。【０１４２】
１−３  ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
上記で得られたハイブリドーマを、ＦＢＳとしてｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＨＡＴ選択培地で培養した。該培養上清２０〜５０ｍＬに、溶媒をＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）に置換したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、該培養上清１０ｍＬ当り５０μＬ加え、４℃で一晩転倒混和した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズを回収した後、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．３）にて抗体を溶出し、直ちに中和Ｂｕｆｆｅｒ（トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．８）で中和した。精製抗体は、分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過キット（ＡｍｉｃｏｎＴＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３５−７．６５、日水製薬）への緩衝液置換及び濃縮を行い、０．２２μｍの滅菌フィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて滅菌した。【０１４３】
１−４  ヒトＤＤＲ１への結合活性
抗ＤＤＲ１抗体の結合活性は、以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。Ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．６、０．０２％  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）で１μｇ／ｍＬに希釈した抗原（ｈＤＤＲ１−ＥＣＤ−ｍＩｇＧ２ａＦｃタンパク質）、またはマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域を融合した対照タンパク質を、９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ  ９６  ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭ  ｐｌａｔｅｓ ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））に８０μＬ／ウェルで分注後、４℃で一晩以上インキュベーションした。０．０５ｖｏｌ％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｔＰＢＳ（−））で３回洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ（ナカライテスク）の１／５希釈液）にて該プレートを４℃で一晩以上ブロッキングした。緩衝液を除去後、該プレートにＤｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を８０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間インキュベーションした。該プレートをｔＰＢＳ（−）で３回洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒで１／５０００に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を８０μＬ／ウェルで添加し室温で１時間インキュベーションした。該プレートをｔＰＢＳ（−）で５回洗浄後、発色基質Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を８０μＬ／ウェルで添加し室温で２０分インキュベーションした。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を８０μＬ／ウェル添加した後、４０５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。各抗体の結合活性を図１に示す。各抗体はいずれもＤＤＲ１に強く結合する一方、ＤＤＲ２にはほとんど結合せず、ＤＤＲ１に特異的に結合する抗体であることが示された。【０１４４】
〔実施例２〕ヒトΔＤＳ−ＤＤＲ１、ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１およびＦＬ−ＤＤＲ１への結合活性
抗ＤＤＲ１モノクローナル抗体がＤＤＲ１のどの領域に結合するのかを試験した。ＤＤＲ１のＤＳ領域、Ｓｔａｌｋ領域をそれぞれ欠失した変異体をチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯに一過性に発現させて、抗ＤＤＲ１モノクローナル抗体による免疫沈降実験を行った。【０１４５】
２−１  発現ベクターの作製
ヒトＤＤＲ１の３２番目から１８５番目までのアミノ酸が欠失したΔＤＳ−ＤＤＲ１タンパク質を発現するために、相当するｃＤＮＡ領域をＰＣＲ法により除去し、３１番目のアミノ酸と１８６番目のアミノ酸をｉｎ−ｆｒａｍｅで融合させるようなｃＤＮＡ配列を発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入した。この際、ヒトＤＤＲ１のカルボキシル末端にはＦＬＡＧタグを融合させた。以下この発現ベクターをｐＣＸＮＤ３−ΔＤＳ−ＤＤＲ１−ＦＬＡＧと呼ぶ。ｐＣＸＮＤ３はサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチン−ウサギβグロビンプロモーターを有する発現ベクターである。ΔＤＳ−ＤＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：８に、塩基配列を配列番号：７に示す。【０１４６】
ヒトＤＤＲ１の１９９番目から４１２番目までのアミノ酸が欠失したΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１タンパク質を発現するために、相当するｃＤＮＡ領域をＰＣＲ法により除去し、１９８番目のアミノ酸と４１３番目のアミノ酸をｉｎ−ｆｒａｍｅで融合させるようなｃＤＮＡ配列を発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入した。この際、ヒトＤＤＲ１のカルボキシル末端にはＦＬＡＧタグを融合させた。以下この発現ベクターをｐＣＸＮＤ３−ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１−ＦＬＡＧと呼ぶ。ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：１０に、塩基配列を配列番号：９に示す。【０１４７】
ヒト全長ＤＤＲ１（ＦＬ−ＤＤＲ１）タンパク質を発現するために、相当するｃＤＮＡ配列を発現ベクターｐＣＸＮＤ３に挿入した。この際、ヒトＤＤＲ１のカルボキシル末端にはＦＬＡＧタグを融合させた。以下この発現ベクターをｐＣＸＮＤ３−ＤＤＲ１−ＦＬＡＧと呼ぶ。ＦＬ−ＤＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：１２に、塩基配列を配列番号：１１に示す。【０１４８】
ΔＤＳ−ＤＤＲ１、ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１、ＦＬ−ＤＤＲ１の模式図を図２（ａ）に示す。【０１４９】
２−２  組換えタンパク質の発現
２×１０６個のＣＨＯ細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈに播種し一晩培養した。翌日、ｐＣＸＮＤ３−ＤＤＲ１−ＦＬＡＧ、ｐＣＸＮＤ３−ΔＤＳ−ＤＤＲ１−ＦＬＡＧおよびｐＣＸＮＤ３−ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１−ＦＬＡＧの３種類の発現ベクター各２４μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ細胞にそれぞれ一過性にトランスフェクションした。【０１５０】
２−３  免疫沈降法による抗ＤＤＲ１抗体のΔＤＳ−ＤＤＲ１、ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１およびＦＬ−ＤＤＲ１への結合活性評価
トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養したＣＨＯ細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ））で溶解した。細胞・溶液混合物を超音波破砕機（トミー精工）で破砕後、４℃で１５分間遠心した。１．２μｇの抗ＤＤＲ１抗体を上清液に加えて氷上で一晩インキュベーションした後、プロテインＧ−セファロース（ＧＥヘルスケア）を３０μＬ加えて４℃で１時間振とう培養した。４℃、５分間の遠心により細胞溶解バッファーで３度免疫沈降物を洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーに懸濁し９５℃で１０分加熱した。ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて免疫沈降物を電気泳動した後、ゲルをｉＢｌｏｔＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｉＢｌｏｔＴＭゲルトランスファースタックス、ニトロセルロース、レギュラー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてニトロセルロースフィルターに転写した。フィルターをＯＤＥＹＳＳＥＹブロッキングバッファー（Ｌｉ−ＣＯＲ）でインキュベーション後にウサギ抗ＦＬＡＧ抗体（ＴＢＳ−Ｔ／３％ＢＳＡで１：１０００希釈、ＳＩＧＭＡ）を添加し、４℃で一晩インキュベーションした。フィルターをＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄しＴＢＳ−Ｔ／３％ＢＳＡにて１：２４０００希釈したＡｌｅｘａ６８０標識抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後、室温で２時間インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄、さらにＴＢＳで５分間、１回洗浄後、フィルターを赤外線イメージングシステムＯＤＹＳＳＥＹ（Ｌｉ−ＣＯＲ）を用いてスキャンした。【０１５１】
抗ＤＤＲ１抗体＃１１５、＃２７、＃２４はいずれもΔＤＳ−ＤＤＲ１を免疫沈降したが、ΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１は免疫沈降しなかった。以上から上記の抗ＤＤＲ１抗体はいずれもＤＤＲ１のＳｔａｌｋ領域を認識していることが明らかとなった。逆に、２０Ｍ１０２はΔＳｔａｌｋ−ＤＤＲ１を免疫沈降したが、ΔＤＳ−ＤＤＲ１は免疫沈降しなかったことから、ＤＤＲ１のＤＳ領域を認識していることが明らかとなった（図２（ｂ））。【０１５２】
〔実施例３〕抗ＤＤＲ１抗体によるヒト肺癌移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定
３−１  ヒト肺癌移植マウスモデルの作製
ＡＴＣＣより入手したヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３をＨＢＳＳで５×１０７個／ｍＬになるように懸濁した。日本チャールズリバー株式会社より購入したＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１＜ｎｕ＞／ＣｒｌＣｒｌｊ  ｎｕ／ｎｕ（ＢＡＬＢ−ｎｕ／ｎｕ）マウスの皮下へ上記細胞懸濁液２００μＬ（１×１０７個／マウス）を移植した。腫瘍体積の平均値が約１５０ｍｍ３になった時点でマウスを群分けし当該試験に供した（ｎ＝４）。【０１５３】
３−２  抗体調製および投与
抗ＤＤＲ１抗体はＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬになるように調製し、週２回、２週間、４０ｍｇ／ｋｇでヒト肺癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照としてはＰＢＳを同様に投与した。【０１５４】
３−３  抗腫瘍効果の評価
ヒト肺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、抗ＤＤＲ１抗体の投与開始時（腫瘍移植後２５日目）から抗ＤＤＲ１抗体の最終投与より４日後（腫瘍移植後３９日目）までの腫瘍増殖量（Δｍｍ３、ｎ＝４の平均値）から以下の式により算出した。【０１５５】
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×１００【０１５６】
３−４  統計処理
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析はＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｉｏｎ５．０を用いてＬＳＤ法による対照群と処置群との比較を実施した。また、９５％の信頼性度（＊；ｐ＜０．０５）をもって有意とした。【０１５７】
３−５  結果
抗ＤＤＲ１抗体＃１１５は最も強い７１％の腫瘍増殖抑制効果を示した。＃２４、♯２７もそれぞれ４８％，６１％の強い腫瘍増殖抑制効果が観察された。一方、２０Ｍ１０２は腫瘍増殖の抑制効果を示さなかった（図３）。【０１５８】
〔実施例４〕抗ＤＤＲ１抗体によるリガンド依存的細胞遊走アッセイ
４−１  ＲＴ−ＣＩＭ  ｓｙｓｔｅｍを用いた細胞遊走アッセイ
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３におけるコラーゲン依存的な細胞遊走の抗ＤＤＲ１抗体による阻害活性を評価した。実験手順は、機器付属のプロトコールに従った。上記細胞をＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ）にて回収後、１２０００ｒｐｍ、５分、４℃にて遠心した。更にＰＢＳ（ナカライテスク）にて洗浄後、血清を除いた培地に懸濁させ、抗体処理細胞については、１０μｇ／ｍＬ  抗ＤＤＲ１抗体となる様抗体溶液を添加して３０分培養した。Ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ用の培養溶液については、１０μｇ／ｍＬ  抗ＤＤＲ１抗体、１００μｇ／ｍＬ  コラーゲンタイプ４（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ）となる様、血清を除いた培地で調製した。Ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ、ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒから成るＣＩＭ−ｐｌａｔｅのｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒの各メンブレンを５μｇ／ｍＬにＰＢＳで調製したｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ溶液（Ｓｉｇｍａ）４０μＬ／ウェルでｃｏａｔｉｎｇした。Ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒに抗体・コラーゲン溶液を１６０μＬ／ウェルで添加し、ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒを合体させた。次いで、抗体処理細胞を５×１０４個／ウェルとなる様ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒの各ウェルに添加後、３７℃インキュベーター内に設置したｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍによりｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒのメンブレン裏側に遊走した細胞量を電気抵抗値により測定した（遊走時間１０時間）。リガンド（コラーゲン）のみを添加し抗ＤＤＲ１抗体を添加しない群を陰性対照とした。【０１５９】
コラーゲン非添加時の遊走細胞量をバックグラウンド値とし、各群の測定値からバックグラウンド値を引いた値を各群の細胞遊走量とした。抗ＤＤＲ１抗体の遊走阻害活性は、以下の式により算出した。【０１６０】
遊走阻害活性（％）＝（１−抗体処理群の遊走細胞量／対照群の遊走細胞量）×１００【０１６１】
その結果、＃１１５、＃２４においてコラーゲン依存的な細胞遊走の阻害が観察された（図４（ａ））。【０１６２】
４−２  Ｃｕｌｔｒｅｘを用いた細胞遊走アッセイ
Ｃｕｌｔｒｅｘ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｒｅｖｉｎｇｅｎ）を用い、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３におけるコラーゲン依存的な細胞遊走の抗ＤＤＲ１抗体による阻害活性を評価した。実験手順は、キット付属のプロトコールに従った。上記細胞をＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ）にて回収後、１２０００ｒｐｍ、５分、４℃にて遠心した。更にＰＢＳ（ナカライテスク）にて洗浄後、血清を除いた培地に懸濁した。抗体処理細胞については、１０μｇ／ｍＬ  抗ＤＤＲ１抗体となる様抗体溶液を添加して３０分培養した。Ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ用の培養溶液については、１０μｇ／ｍＬ  抗ＤＤＲ１抗体、１００μｇ／ｍＬ  コラーゲンタイプ４（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ）となる様、血清を除いた培地で調製した。Ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ、ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒから成るＣｕｌｔｒｅｘ  ｋｉｔのｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ底面の各メンブレンを５μｇ／ｍＬにＰＢＳで調製したｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ溶液（Ｓｉｇｍａ）４０μＬ／ウェルでｃｏａｔｉｎｇした。Ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒに抗体・コラーゲン溶液を１５０μＬ／ウェルで添加し、ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒを合体させた。次いで、抗体処理細胞を１×１０４個／ウェルとなる様ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒの各ウェルに添加後、３７℃で１９時間遊走させた。その後、ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒのメンブレンを付属のｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを添加したｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ中に浸し、メンブレンを透過して遊走した細胞量を蛍光波長４８５ｎｍ/５２０ｎｍにて測定した。リガンド（コラーゲン）のみを添加し抗ＤＤＲ１抗体を添加しない群を陰性対照とした。【０１６３】
コラーゲン非添加時の遊走細胞量をバックグラウンド値とし、各群の測定値からバックグラウンド値を引いた値を各群の細胞遊走量とした。抗ＤＤＲ１抗体の遊走阻害活性は、以下の式により算出した。【０１６４】
遊走阻害活性（％）＝（１−抗体処理群の遊走細胞量／対照群の遊走細胞量）×１００【０１６５】
その結果、＃１１５、＃２４、＃２７においてコラーゲン依存的な細胞遊走の阻害が観察された（図４（ｂ））。【０１６６】
〔実施例５〕抗ＤＤＲ１抗体によるリガンド依存的リン酸化阻害アッセイ
５−１  電気泳動
ヒト乳癌細胞株Ｔ４７ＤをＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＳＴ）、１／１００×Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ２、３（Ｓｉｇｍａ）、１／１００×Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、１／１００×ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ））で溶解し、−８０℃にて凍結させた。その後、細胞溶液を超音波破砕機（トミー精工）で破砕し、４℃で１０分間遠心した（２０，０００×ｇ）。ＮｕＰＡＧＥ−ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、７０℃で１０分加熱した。調製したタンパク溶液をＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭ  Ａｃｅ  ７．５％（和光）を用いて２０ｍＡで１時間電気泳動した。【０１６７】
５−２  ウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイ
ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭ  Ａｃｅ  ７．５％にて電気泳動したタンパク質を、トランスファーバッファー（ＢｉｏＲａｄ）にて７０Ｖで３時間かけて、０．４５μｍのポリビニリデンジフルオライドフィルター（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動的にトランスファーした。フィルターをＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク）で一晩インキュベーションすることによってブロッキングした。フィルターをＴＢＳＴ（０．０５ｖｏｌ％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で５分間４回洗浄し、抗ＤＤＲ1抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（東洋紡）にて１：３０００希釈）、抗ｐＹ７９６ＤＤＲ１抗体（ＬＹＡＧＤＹＹＲＶＱＧペプチド（ここでＹはリン酸化チロシンを表わす）（配列番号：１５）に対するウサギポリクローナル抗体、ＭＢＬにて作製）（Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（東洋紡）にて１：３０００希釈）で室温にて２時間インキュベーションした。フィルターをＴＢＳＴにて５分間４回洗浄し、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（東洋紡）にて１：１０，０００希釈したＨＲＰ標識抗ラビット第二抗体（ＣＳＴ）で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで５分間３回洗浄し、さらにＴＢＳで５分間１回洗浄後、フィルターをＬＡＳ４０００（富士フィルム）を用いてスキャンした。【０１６８】
５−３  抗体によるリガンド依存的リン酸化阻害アッセイ
抗ＤＤＲ１抗体による，癌細胞内のリガンド依存的リン酸化阻害能力を試験した。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄを６−ウェルプレートに１×１０６個／ウェルの密度で播種し、２４時間後に血清を除いた培地に交換後、３時間培養した。１０μｇ／ｍＬとなるように、抗ＤＤＲ１抗体を添加し、３７℃で３０分インキュベーション後、１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲンタイプ１（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ）、コラーゲンタイプ４（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ）を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。ついで細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭ  Ａｃｅ  ７．５％（和光）を介して分離し、５−２項のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。その結果、＃２７、＃２４によりリン酸化チロシン抗体のブロットが減弱した（図５）。これは、これらの抗ＤＤＲ１抗体がＤＤＲ１のリガンドであるコラーゲンのリン酸化誘導作用を阻害する機能を持ちうることを強く支持する。コラーゲンによるＤＤＲ１のシグナル伝達経路の詳細は、該抗ＤＤＲ１抗体にてＤＤＲ１の自己リン酸化を制御する現象を用いて、今後さらに研究されうる。【０１６９】
〔実施例６〕抗ＤＤＲ１抗体による細胞表面ＤＤＲ１取り込みアッセイ
ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄを５×１０３個／ウェルで播種し、３７℃で２４時間培養した。抗ＤＤＲ１抗体とＭａｂＺＡＰ（サポリン標識抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ最終濃度５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、３７℃で３日間培養した。その後、細胞増殖測定用試薬ＷＳＴ−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、同仁化学研究所）を１０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で１時間培養後、４６０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。【０１７０】
このアッセイ系では、抗ＤＤＲ１抗体およびそれに結合したＭａｂＺＡＰが細胞内に取り込まれるとサポリンの毒性によって細胞増殖が阻害されるため、細胞増殖を測定することで抗ＤＤＲ１抗体の細胞内への取り込みを評価することができる。抗ＤＤＲ１抗体、ＭａｂＺＡＰともに非添加時の細胞増殖を１とした場合の、抗ＤＤＲ１抗体およびＭａｂＺＡＰ添加時の細胞増殖の比を算出し、抗ＤＤＲ１抗体の細胞内への取り込みを測定した。その結果、＃１１５、＃２４において細胞増殖阻害が検出され、＃１１５、＃２４が細胞表面のＤＤＲ１に結合して細胞内に取り込まれる事が確認された（図６）。【０１７１】
〔実施例７〕抗ＤＤＲ１抗体によるＤＤＲ１の発現量の低下
抗ＤＤＲ１抗体の細胞におけるＤＤＲ１の発現量を低下させる能力を試験した。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄを６−ウェルプレートに５×１０５個／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。１０μｇ／ｍＬとなるように抗ＤＤＲ１抗体を添加し、３７℃で２４時間インキュベーションした。ついで細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、５−１項の細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭ  Ａｃｅ  ７．５％（和光）を介して分離し、５−２項のウエスタンブロッティングに従い免疫ブロットした。【０１７２】
検出抗体には、抗ＤＤＲ１抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  1にて１：３０００希釈）と抗アクチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  １にて１：３０００希釈）を用い、各抗体で室温にて２時間インキュベーションした。フィルターをＴＢＳＴにて５分間４回洗浄し、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ２にて１：１０，０００希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ第二抗体（ＣＳＴ）とＨＲＰ標識抗ヒツジ第二抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで５分間３回洗浄し、さらにＴＢＳで５分間１回洗浄後、フィルターをＬＡＳ４０００（富士フィルム）を用いてスキャンした。その結果、＃１１５、＃２４においてＤＤＲ１の発現量の低下が観察された（図７）。【０１７３】
〔実施例８〕抗ＤＤＲ１抗体によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＧＦβ  ｍＲＮＡ変動解析
抗ＤＤＲ１抗体の癌細胞・線維芽細胞共培養系における癌細胞ＴＧＦβ  ｍＲＮＡ発現抑制活性を測定した。ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３とマウス線維芽細胞株ＭＲＣ５を各１００００個，３３３３個／ウェルとなる様、Ｎａｎｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ（ＳＣＩＶＡＸ）に播種、最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるようコラーゲンタイプ１（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ）を添加し、３７℃にて２４時間培養した。ＲＮＡｅａｓｙ  ９６  ｗｅｌｌ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して逆転写反応を行った。更に  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦβ  ｐｒｏｂｅ／ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｕｍａｎ  ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｂｅ／ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）によりＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ここで、ヒトＴＧＦβに特異的なプライマーを用いることによって、マウス線維芽細胞に由来するＴＧＦβ  ｍＲＮＡを検出することなく、ヒト癌細胞に由来するＴＧＦβ  ｍＲＮＡのみを検出することができる。測定値はｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｐ値より、コラーゲンおよび抗体で処理されていないサンプルを1とした場合の相対的なｍＲＮＡ発現量を算出した。その結果、癌細胞においてコラーゲンによって上昇するＴＧＦβ  ｍＲＮＡが、＃１１５によって抑制される現象が観察された（図８）。ＴＧＦβは、腫瘍形成に促進的に働くと報告されている上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）時に発現上昇する事が知られているマーカー分子であり、本結果は、コラーゲンによりＤＤＲ１を介して誘導されるＥＭＴを、＃１１５が阻害する可能性を示唆している。【０１７４】
〔実施例９〕抗体可変領域配列の決定
抗ＤＤＲ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｃＤＮＡを合成した。非特許文献（Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８９）１６０，１２５０−６、Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．Ｔ．＆  Ｂｅｎｄｉｇ  Ｍ．Ｍ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９，５７９）に基づきマウス抗体可変領域増幅用プライマーを合成し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）によってＰＣＲを行い、抗体の可変領域遺伝子を単離した。【０１７５】
単離した各ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。【０１７６】
〔実施例１０〕抗ＤＤＲ１抗体２０Ｍ１０２の調製
１０−１  発現ベクターの作製
ＷＯ２０１０／０１９７０２（特許文献３）の配列番号：１６〜１９に記載されている抗ＤＤＲ１抗体２０Ｍ１０２の重鎖、軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列を合成し、発現ベクターｐＣＸＮＤ３、ｐＣＸＺＤ１に制限酵素サイトを利用してそれぞれ挿入した。以下、ｐＣＸＮＤ３−２０Ｍ１０２  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ、ｐＣＸＺＤ１−２０Ｍ１０２  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎとする。ｐＣＸＮＤ３、ｐＣＸＺＤ１はともにサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチン−ウサギβグロビンプロモーターを有する発現ベクターである。マーカー遺伝子としてｐＣＸＮＤ３はネオマイシン耐性遺伝子を、ｐＣＸＺＤ１はゼオシン耐性遺伝子が挿入されている。【０１７７】
１０−２  安定的発現クローンの取得
制限酵素処理で断片化したｐＣＸＮＤ３−２０Ｍ１０２  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ、ｐＣＸＺＤ１−２０Ｍ１０２  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ各５μｇずつを混合し、７．５×１０６個のチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯへエレクトロポレーション法（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ、ＢｉｏＲａｄ）でトランスフェクションした。翌日、ネオマイシンおよびゼオシンを添加して約３週間培養し、薬剤耐性クローンを選択した。各クローンの培養液を回収し、１０−３項に示したヒトＤＤＲ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓを固相化したＥＬＩＳＡ法により２０Ｍ１０２を高発現するクローンを選択した。ヒトＤＤＲ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓの塩基配列を配列番号：１３に、アミノ酸配列を配列番号：１４に記載する。【０１７８】
１０−３  ヒトＤＤＲ１への結合活性
Ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍＬに希釈した抗原（ヒトＤＤＲ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓ）を９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ  ９６  ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭ  ｐｌａｔｅｓ  ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））に６０μＬ／ウェルで分注後、４℃で一晩以上インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ、ナカライテスク）の１／５希釈液）にて室温で２時間以上ブロッキングした。ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ除去後に、１０−２項の薬剤耐性クローンの培養液を１００μＬ添加し、室温で２時間インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒで１／５０００に希釈したアルカリフォスファターゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色試薬ＢｌｕｅＰｈｏｓ（ＫＰＬ）を６０μＬ／ウェルで添加後、６００ｎｍにおける吸光度をマイクロプレ−トリーダー（ＷＡＬＬＡＣ  ＡＲＶＯ  ＳＸ、パーキンエルマー）で測定した。その結果、ＣＨＯ細胞において発現された２０Ｍ１０２は、特許文献３に記載の通りＤＤＲ１への結合活性を有することが確認された。【０１７９】
１０−４  ヒト肺癌移植マウスモデルを用いた抗腫瘍効果の測定
ＡＴＣＣより入手したヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９９３をＨＢＳＳで５×１０７個／ｍＬになるように懸濁した。日本チャールズリバー株式会社より購入したＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１＜ｎｕ＞／ＣｒｌＣｒｌｊ  ｎｕ／ｎｕ（ＢＡＬＢ−ｎｕ／ｎｕ）マウスの皮下へ上記細胞懸濁液２００μＬ（１×１０７個／マウス）を移植した。腫瘍体積の平均値が約１５０ｍｍ３になった時点でマウスを群分けし当該試験に供した（ｎ＝５）。【０１８０】
１０−５  抗体調製および投与
抗ＤＤＲ１抗体はＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬになるように調製し、週２回、２週間、４０ｍｇ／ｋｇでヒト肺癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照としてはＰＢＳを同様に投与した。【０１８１】
１０−６  抗腫瘍効果の評価
ヒト肺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、抗ＤＤＲ１抗体の投与開始時（腫瘍移植後２０日目）から抗ＤＤＲ１抗体の最終投与より４日後（腫瘍移植後３４日目）までの腫瘍増殖量（Δｍｍ３、ｎ＝４の平均値）から以下の式により算出した。【０１８２】
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×１００【０１８３】
１０−７  統計処理
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析はＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｉｏｎ５．０を用いてＬＳＤ法による対照群と処置群との比較を実施した。また、９５％の信頼性度（＊；ｐ＜０．０５）をもって有意とした。【０１８４】
１０−８  結果
抗ＤＤＲ１抗体２０M１０２はＮＣＩ−Ｈ１９９３モデルにおいて顕著な抗腫瘍効果は観察されなかった。（図３）。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
本発明によって、抗体単独でもin vivoで高い抗腫瘍効果を示すことができる抗DDR1抗体を得ることができた。本発明によって、化学療法剤を使用せずとも、癌などの腫瘍に対し治療を行うことが可能になり、患者にとって有益であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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