(57)【要約】  連続発酵法により安定的かつ低コストに化学品を製造する化学品の製造方法および化学品製造装置を提供する。本発明の化学品の製造装置は、撹拌機構を備えない発酵槽内で細胞を培養し、原料を発酵させて化学品を生成する化学品生成ステップと、化学品を含む培養液を分離膜モジュールに供給する培養液供給ステップと、前記培養液をろ過して、透過液を分離するろ過ステップと、ろ過されない濃縮液を前記発酵槽内に還流する還流ステップと、前記分離膜モジュールまたは配管に気体を供給する気体供給ステップと、を含み、前記培養液の撹拌は、前記培養液供給ステップと前記ろ過ステップと前記還流ステップにおけるポンプによる前記培養液の強制循環と、前記気体供給ステップでの気体供給により行われることを特徴とする。
2013146807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撹拌機構を備えない発酵槽内で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成する化学品生成ステップと、
前記化学品生成ステップで生成した化学品を含む培養液を分離膜モジュールに供給する培養液供給ステップと、
前記培養液供給ステップで供給された培養液をろ過して、前記化学品を含んだ透過液を分離するろ過ステップと、
前記ろ過ステップでろ過されない濃縮液を前記発酵槽内に還流する還流ステップと、
前記分離膜モジュールまたは配管に気体を供給する気体供給ステップと、
を含み、前記培養液の撹拌は、前記培養液供給ステップと前記ろ過ステップと前記還流ステップにおけるポンプによる前記培養液の強制循環と、前記気体供給ステップでの気体供給により行われることを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項２】
前記ポンプによる培養液の循環速度が０．１ｍ／ｓ以上１．０ｍ／ｓ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項３】
前記気体が、酸素を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項４】
前記気体供給ステップは、前記気体の供給を間欠的に行い、
前記気体供給ステップにおいて前記気体の供給を停止している間は、前記発酵槽への気体の供給量を増加させることを特徴とする、請求項３に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項５】
前記ろ過ステップは、前記ろ過操作を間欠的に行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項６】
前記細胞が細菌であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項７】
前記細菌が、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）のいずれかに属する細菌であることを特徴とする請求項６に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項８】
前記細菌が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のいずれかであることを特徴とする請求項７に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項９】
前記細胞が酵母であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１０】
前記化学品が、アミノ酸であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一つに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸が、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンであることを特徴とする請求項１０に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１２】
前記化学品が有機酸であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１３】
前記化学品が乳酸であることを特徴とする、請求項１２に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１４】
前記化学品がカダベリンであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１５】
発酵原料を細胞によって発酵培養することにより、該発酵原料を、化学品を含有する培養液に変換する、撹拌機構を有しない発酵槽と、
前記培養液から化学品を分離する分離膜を有する分離膜モジュールと、
前記発酵槽から前記分離膜モジュールに培養液をポンプにより送液する培養液循環手段と、
前記分離膜モジュールの下部、または前記発酵槽と前記分離膜モジュールとを連通する配管に、気体を供給する気体供給手段と、
を備え、前記培養液循環手段による前記培養液の循環と、前記気体供給手段による気体供給により培養液を撹拌することを特徴とする連続発酵装置。
【請求項１６】
前記発酵槽に気体を供給する発酵槽気体供給手段を備え、
前記気体供給手段は、前記分離膜モジュールへの前記気体の供給を間欠的に行い、前記気体供給手段が前記分離膜モジュールへの前記気体の供給を停止している間は、前記発酵槽気体供給手段により前記発酵槽への気体の供給量を増加させることを特徴とする、請求項１５に記載の連続発酵装置。
【請求項１７】
前記発酵槽の底壁が下向き凸型の錐面状または球面状底壁であり、培養液を分離膜モジュールに送液する配管の接続部を該凸型底壁の凸部先端に有することを特徴とする請求項１５または１６に記載の連続発酵装置。
【請求項１８】
前記発酵槽の底壁を頂角１２０度以下の錐面状底壁としてなることを特徴とする請求項１７に記載の連続発酵装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続発酵による化学品の製造方法および連続発酵装置に関するものである。より詳細には、発酵槽と前記発酵槽に接続された分離膜モジュールを有する循環機構を備え、発酵槽に撹拌機構を持たない製造装置を用いて、連続発酵により化学品を製造する方法、および連続発酵装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物や細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  ｏｒ  Ｓｅｍｉ−Ｂａｔｃｈ発酵法）と（２）連続発酵法（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ発酵法）とに分類することができる。上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、また、純菌培養による生産物発酵においては培養菌以外の雑菌による汚染が起きる可能性が低いというメリットがある。しかし、時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、生産物阻害や浸透圧の上昇などの影響により生産性および収率が低下する。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのは困難である。【０００３】
一方、連続発酵法は、発酵槽内における目的物質の蓄積を回避する事により、上述の回分および流加発酵法に比べ長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できる。従来の連続培養は、発酵槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の培養液を槽外へ排出することによって、発酵槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論的には無限に培養を持続できる。
連続培養に関して、最近では、有機高分子分離膜を用いた連続培養装置が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０９７２６０号
【特許文献２】日本国特開２００８−２１２１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の連続培養では、長期間の培養において、発酵槽内の培養液を均質にするためにマグネット式、またはモーター式の撹拌機で長時間撹拌する必要があり、その動力コストは常に課題となってきた。また、発酵槽に設ける撹拌機は、摺動面が存在するその構造から完全にコンタミネーションを避けることが難しく、培養時間が長くなる連続培養においては、コンタミネーションの発生原因として大きな懸念点の一つである。また、培養に好適な酸素供給量は細胞により異なるが、酸素供給量が大きい場合、撹拌により発泡し、液漏れやコンタミネーションが発生するおそれが高い。【０００６】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、連続発酵法において、動力エネルギーの削減およびコンタミネーションの発生低減を実現し、安定的かつ低コストに化学品を製造しうる連続発酵による化学品の製造方法および連続発酵装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の化学品の製造方法は、撹拌機構を備えない発酵槽内で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成する化学品生成ステップと、前記化学品生成ステップで生成した化学品を含む培養液を分離膜モジュールに供給する培養液供給ステップと、前記培養液供給ステップで供給された培養液をろ過して、前記化学品を含んだ透過液を分離するろ過ステップと、前記ろ過ステップでろ過されない濃縮液を前記発酵槽内に還流する還流ステップと、前記分離膜モジュールまたは配管に気体を供給するステップと、を含み、前記培養液の撹拌は、前記培養液供給ステップと前記ろ過ステップと前記還流ステップの行われる循環路におけるポンプによる前記培養液の強制循環と、前記気体供給ステップでの気体供給により行われることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明の実施の形態で用いられる連続発酵装置の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、図１の連続発酵装置で用いられる発酵槽の形状の一例を示す概略図である。
【図３】図３は、発酵槽に回転式撹拌翼を有する連続発酵装置の一例を示す概略図である。
【図４】図４は、比較例１、２および実施例１〜４の膜間差圧の変化図である。
【図５】図５は、比較例３、４および実施例５、６の膜間差圧の変化図である。
【図６】図６は、比較例５、６および実施例７、８の膜間差圧の変化図である。
【図７】図７は、循環ポンプを有しない連続発酵装置の一例を示す概略図である。
【図８】図８は、比較例７及び実施例９、１０、１１の膜間差圧の変化図である。
【図９】図９は、比較例７及び実施例９、１１、１２、１３、１４、１５の膜間差圧の変化図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、本発明の実施の形態にかかる化学品の製造方法および連続発酵装置を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施の形態により本発明が限定されるものではない。
【００１０】
１．連続発酵装置
連続発酵装置の一例について、図１を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態にかかる連続発酵装置の概略図である。
【００１１】
図１に示すように、連続発酵装置１００は、発酵槽１、分離膜モジュール２、および発酵槽１と分離膜モジュール２とを接続する配管８１および８２を備えている。発酵槽１と分離膜モジュール２とは、配管８１および８２を介して接続されることで循環系を形成している。
【００１２】
発酵槽１は、その内部に培養液が入れられるように構成されている。具体的には、発酵槽１は、耐圧性、耐熱性および耐汚れ性に優れる材質で作られる。発酵槽１には、円筒型、多角筒型など様々な形状が適用可能である。発酵槽１は、発酵原料、細胞、その他発酵に必要な固体、液体または気体を注入することができ、必要に応じて滅菌でき、さらに密閉することが可能な形状を備えればよい。発酵槽１内は、発酵槽１の外部から発酵槽１内部に雑菌が入り増殖することを防ぐため、加圧状態に維持されることが好ましい。発酵槽１内の気圧を管理するために、後述の発酵槽圧力計２３等の機構が設けられる。
【００１３】
また、発酵槽１は、図２に示すような形状であってもよい。発酵槽１の底壁１ａは、図２に示すように下向き凸型を成し、その凸型底壁の凸部先端８９に培養液を分離膜モジュール２に送液する配管８１の接続部を有していても良い。底壁１ａは、錐面状または球面状が好ましく、さらに好ましくは凸部先端の頂角が１２０度以下の錐面状底壁である。
【００１４】
分離膜モジュール２は、多数の中空糸膜または平膜等の分離膜を備える。分離膜モジュール２の詳細については、後述する。
【００１５】
連続発酵装置１００は、制御装置２８を備えていてもよい。制御装置２８は、各種の演算を行うことができる。また制御装置２８は、各種センサの検知結果、使用者の入力、および各種設定に基づいて、連続発酵装置１００内の各部の動作を制御する。
【００１６】
連続発酵装置１００はさらに、発酵槽圧力調整バルブ２２、発酵槽圧力計２３、温度制御部３、ｐＨ制御部５、レベル制御部６を発酵工程に主に関与する機構として備える。
【００１７】
また、発酵槽気体供給装置２１を備えていてもよく、これは発酵槽１内に気体を供給する。供給された気体は、回収され、再び発酵槽気体供給装置２１により発酵槽１内に供給されてもよい。
【００１８】
発酵槽圧力調整バルブ２２は、制御装置２８の制御に基づいて、発酵槽圧力計２３が検出した発酵槽１内の気圧が上限に達すると発酵槽１内の空気を外部に放出する。こうして、発酵槽１内の圧力が適切に保たれる。なお、雑菌混入を抑制するために、発酵槽１内の圧力は、外気圧よりも高く保たれることが好ましい。
【００１９】
温度制御部３は、温度センサおよび温度調整部を備える。温度センサは発酵槽１内の培養液の温度を検知する。温度センサによる検知結果が一定の範囲を示すように、制御装置２８による制御を受けて、温度調整部が動作する。こうして、発酵槽１内の温度が一定に維持されることで、発酵または細胞の増殖に適した温度環境が維持される。温度調整部は、加熱および冷却の一方又は両方の機能を有することができる。
【００２０】
ｐＨ制御部５は、ｐＨセンサ５１および中和剤供給ポンプ１０を備える。ｐＨセンサ５１は発酵槽１内の培養液のｐＨを検知する。中和剤供給ポンプ１０は中和剤槽と発酵槽１とを接続する配管上に設置されており、中和剤を発酵槽１内に添加する。中和剤供給ポンプ１０は、制御装置２８の制御に基づいて、ｐＨセンサ５１の検知結果が所定の範囲を示すように動作する。なお、中和剤としては酸および／またはアルカリが用いられる。
【００２１】
レベル制御部６は、レベルセンサ６１および培地供給ポンプ９を備える。培地供給ポンプ９は、培地槽と発酵槽１とを接続する配管上に配置される。制御装置２８の制御に基づいて、発酵槽１内の培養液量が所定の下限を下回ったことをレベルセンサ６１の検知結果が示すと、発酵槽１へ培地を供給するように培地供給ポンプ９が稼働し、培養液量が上限に達したことを示すと、培地供給ポンプ９の動作を停止させる。こうして、発酵槽１内の培養液量が適切に保たれる。
【００２２】
連続発酵装置１００は、発酵槽１と分離膜モジュール２との間で培養液を循環させる循環系を備える。具体的には、連続発酵装置１００は、発酵槽１と分離膜モジュール２の１次側とを連通する配管８１、および分離膜モジュール２の分離膜を透過しなかった濃縮液を発酵槽１に戻す配管８２を備える。なお、本発明の実施の形態では、配管８１は分離膜モジュール２の下部に接続されているので、分離膜モジュール２には下部から培養液が供給される。発酵槽１から分離膜モジュール２に培養液を供給する配管８１上には、循環ポンプ８が配置される。循環ポンプ８は、発酵槽１から分離膜モジュール２に向かって培養液を送るように稼働する。
【００２３】
循環ポンプ８としては、培養する細胞の成育に影響しないせん断応力を有するポンプであればポンプの種類は特に限定されないが、渦巻ポンプ、ギアポンプなどの遠心ポンプ、プランジャーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ロータリーポンプ、チューブポンプなど一般的なポンプを用いることが出来るが、渦巻ポンプが特に好ましい。また、せん断応力としては、２０００Ｐａ以下であることが好ましく、１０００Ｐａ以下であるポンプがより好ましい。
【００２４】
また、連続発酵装置１００は、分離膜モジュール２に接続され、ろ液（つまり透過液）を装置外に排出する配管８３を備える。この配管８３上には、ろ過を行うための駆動力を与える機構が設置される。例えばろ過ポンプ１１が設けられると共に、ろ過バルブ１２が設けられる。
【００２５】
連続発酵装置１００は、分離膜モジュール２を逆圧洗浄する構成を備えていても良い。逆圧洗浄とは、分離膜の２次側から１次側に洗浄用液体（以下、「洗浄液」と称することがある。）を通すことによって、分離膜を洗浄することである。連続発酵装置１００は、洗浄液を収容する洗浄液槽、洗浄液槽と分離膜モジュール２との２次側とを接続する配管８４、配管８４上に設けられた洗浄ポンプ１３、洗浄バルブ１４を備える。洗浄ポンプ１３により、洗浄液が分離膜モジュール２に向けて送られる。配管８４には、圧力計、流量計、滅菌用装置、滅菌用フィルタなどが設置されていてもよい。
【００２６】
また、連続発酵装置１００には差圧制御部７が設置されていても良い。差圧制御部７は、分離膜モジュール２の膜間差圧（ＴＰＤ：Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を検知することができる。つまり、分離膜モジュール２の１次側（培養液が供給される側）と２次側（透過液すなわちろ液が排出される側）との間での差圧を検知する。
【００２７】
さらに、連続発酵装置１００は、分離膜モジュール２の１次側に気体を供給する構成になっている。
【００２８】
連続発酵装置１００では、特に、分離膜モジュール２に対して、分離膜モジュール２の下部、および発酵槽１と分離膜モジュール２とを連通する配管８１の少なくとも一方から気体が供給される。特に、気体供給源、気体供給口、および気体供給源からの気体の供給速度を調整することのできる機構が設けられる。
【００２９】
具体的には、連続発酵装置１００は、モジュール気体供給制御バルブ１５、モジュール気体供給装置１６、配管気体供給制御バルブ１７、配管気体供給装置１８、ポンプ前配管気体供給制御バルブ１９、ポンプ前配管気体供給装置２０を備える。
【００３０】
ただし、モジュール気体供給装置１６、配管気体供給装置１８、およびポンプ前配管気体供給装置２０のうち、少なくともいずれか１つの気体供給源が設けられていればよい。つまり、これらの装置のうち１つのみ、２つのみ、または３つ全部が設けられた構成が、本発明の実施の形態に含まれる。モジュール気体供給制御バルブ１５、配管気体供給制御バルブ１７、ポンプ前配管気体供給制御バルブ１９は、それぞれ、モジュール気体供給装置１６、配管気体供給装置１８、ポンプ前配管気体供給装置２０と対を形成する部材である。
【００３１】
モジュール気体供給装置１６は、分離膜モジュール２に対して、分離膜の１次側に、つまり培養液が供給される側に、配管８６を介して接続される。配管８６は、分離膜モジュール２に培養液を供給する配管８１とは異なる管である。つまり、モジュール気体供給装置１６は、培養液の供給路とは別の流路により、分離膜モジュール２に直接接続される。また、配管８６は分離膜モジュール２の下部に接続されている。本書において「下部」とは、分離膜モジュール２の底部であってもよいし、底面から分離膜モジュール２の高さの１／３までの範囲を指してもよい。配管８６を介して、モジュール気体供給装置１６は、気体を分離膜モジュール２の下部から送り込むことができる。モジュール気体供給制御バルブ１５は、配管８６上に配置され、開閉することで気体の供給量を調整することができる。
【００３２】
配管気体供給装置１８は、循環ポンプ８の下流側で、配管８７によって、配管８１に接続される。配管気体供給制御バルブ１７は、配管８７上に設けられ、開閉することで気体の供給量を調整することができる。配管気体供給装置１８は、発酵槽１と分離膜モジュール２とを連通する配管８１に気体を供給する。
【００３３】
ポンプ前配管気体供給装置２０は、循環ポンプ８の上流側で、配管８８によって、配管８１に接続される。ポンプ前配管気体供給制御バルブ１９は、配管８８上に設けられ、開閉することで気体の供給量を調整することができる。ポンプ前配管気体供給装置２０は、発酵槽１と分離膜モジュール２とを連通する配管８１に気体を供給する。
【００３４】
配管８６〜８８には、発酵槽１内に雑菌が入らないように、滅菌用装置や滅菌用フィルタなどが設置されてもよい。
【００３５】
気体供給口とは、気体を培養液または液体内に放出する部分である。気体供給口は、気泡を発生させるように形成されていることが好ましい。発生される気泡は微細気泡でもよいし粗大気泡でもよい。気泡の大きさは、分離膜の種類および気体供給量等の条件によって、気体供給口の形状を変えることで変更される。気体供給口は、塩化ビニル製またはステンレス製の配管に、空気吐出孔を設けることで形成されていてもよいし、多孔性のゴム、セラミック、メンブレンを用いた散気管なども使用することができる。気体供給口の大きさは、規定した量の気体が供給可能で、かつ、発酵液による詰まりが発生しない大きさであればよい。発酵系の中に雑菌が入らないように、気体供給口に滅菌用フィルタなどを設置することもできる。
【００３６】
実施の形態１では、気体供給口は、配管８６〜８８の２つの端部のうち、分離膜モジュール２側の端部に設けられている。言い換えると、配管８６〜８８は、気体供給源から気体供給口までを繋ぐ管である。
【００３７】
気体供給口は、分離膜モジュール２の下部に設けられてもよいし、循環ポンプ８を用いて発酵槽１から分離膜モジュール２へ培養液を供給する構成では、発酵槽１と循環ポンプ８の間、または循環ポンプ８と分離膜モジュール２の間のいずれに設けられてもよい。
【００３８】
また、供給される気体の線速度を測定する機構が設置されていても良く、例として、図１には、流量計９１、９２および９３が示される。流量計９１は、配管８６に設けられ、配管８６内を通過する気体の流量を測定することができる。流量計９１は、モジュール気体供給装置１６により供給される気体の線速度の測定に利用される。また、流量計９２は、配管８７に設けられ、配管８７内を通過する気体の流量を測定することができる。流量計９２は、配管気体供給装置１８により供給される気体の線速度の測定に利用される。また、流量計９３は、配管８８に設けられ、配管８８内を通過する気体の流量を測定することができる。流量計９３は、ポンプ前配管気体供給装置２０により供給される気体の線速度の測定に利用される。
【００３９】
本発明の実施の形態における連続発酵装置１００は、発酵槽１に回転軸や撹拌翼といった、機械的な撹拌機構を有しない。培養液の撹拌は、発酵槽１と分離膜モジュール２を接続する配管８１および８２、ならびに分離膜モジュール２内の循環ポンプ８による送液と、分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体によってのみ起こる。すなわち、発酵槽１が循環系から切り離されたときに、発酵槽１内で培養液の攪拌が起きない構成を指す。なお、発酵槽１に直接接続された発酵槽気体供給装置２１は、撹拌機構に含まれない。発酵液の循環速度および気体の線速度は、後述するように制御される。
【００４０】
２．分離膜モジュール
分離膜モジュール２は、分離膜と、分離膜を収容するケースとを備える。
分離膜モジュール２に用いられる分離膜は、有機膜、無機膜のいずれであってもよい。分離膜は、培養液のろ過に使用でき、気体供給による衝撃に対して耐久性を持つ膜であればよい。例えば、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン製、ポリスルホン製、ポリエーテルスルホン製、ポリテトラフルオロエチレン製、ポリエチレン製、ポリプロピレン製、セラミックス製の膜が挙げられる。特に、発酵液による汚れが発生しにくく、かつ洗浄がしやすく、さらに気体供給による衝撃に対する耐久性に優れているポリフッ化ビニリデン製の分離膜が好ましい。
【００４１】
分離膜は、発酵液の中の細胞を効果的に分離するため、平均細孔径が０．００１μｍ以上１０μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが好ましい。また、分離膜の形状は、平膜、中空糸膜などいずれの形状のものも採用することができるが、モジュール体積に対して膜面積の広い中空糸膜が好ましい。膜の平均孔径は、ＡＳＴＭ：Ｆ３１６−８６記載の方法（別称：ハーフドライ法）にしたがって決定される。なお、このハーフドライ法によって決定されるのは、膜の最小孔径層の平均孔径である。
【００４２】
なお、ハーフドライ法による平均孔径の測定の標準測定条件は、以下のとおりである。
使用液体：エタノール
測定温度：２５℃
昇圧速度：１ｋＰａ／秒
平均孔径［μｍ］は、下記式より求まる。
平均孔径［μｍ］＝（２８６０×表面張力［ｍＮ／ｍ］）／ハーフドライ空気圧力［Ｐａ］
【００４３】
エタノールの２５℃における表面張力は２１．９７ｍＮ／ｍである（日本化学会編、化学便覧基礎編改訂３版、ＩＩ−８２頁、丸善（株）、１９８４年）ので、本発明における標準測定条件の場合は、
平均孔径［μｍ］＝６２８３４．２／（ハーフドライ空気圧力［Ｐａ］）
にて求めることができる。
【００４４】
外圧式中空糸膜の外径は、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下であることが望ましい。外径が０．５ｍｍ以上であることで、中空糸膜中に流れるろ過液の抵抗を比較的小さく抑えられる。また、外径が３ｍｍ以下であることで、発酵液または気体による外圧により中空糸膜がつぶれることを抑制できる。
【００４５】
内圧式中空糸膜の内径は、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下が望ましい。内径が０．５ｍｍ以上であることで、中空糸膜中に流れる発酵液の抵抗を比較的小さく抑えることができる。また、内径が３ｍｍ以下であることで、膜表面積を確保することができるので、使用モジュール本数の増大を抑制することができる。
分離膜モジュール２のケースは、耐圧性に優れる材質で作られており、円筒型、多角筒型など、発酵液をモジュールの１次側へ供給することができる形状であれば良い。発酵液の流れやハンドリング製を考慮すると、ケースは円筒型であることが好ましい。
【００４６】
３．化学品の製造方法
本実施形態の製造方法は、連続発酵により化学品を製造する方法であって、以下のステップ（ａ）〜（ｅ）を備え、培養液の撹拌は、培養液供給ステップとろ過ステップと還流ステップにおけるポンプによる培養液の強制循環と、気体供給ステップでの分離膜モジュールまたは配管への気体供給により行われることを特徴とする：
（ａ）発酵槽内で培養液中の細胞を撹拌機構による撹拌を行わずに培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成する化学品生成ステップ
（ｂ）前記化学品生成ステップで生成した化学品を含む培養液を分離膜モジュールに供給する培養液供給ステップ
（ｃ）前記培養液供給ステップで供給された培養液をろ過して、前記化学品を含んだ透過液を分離するろ過ステップ
（ｄ）前記ろ過ステップでろ過されない濃縮液を前記発酵槽内に還流する還流ステップ
（ｅ）前記分離膜モジュールまたは配管に気体を供給する気体供給ステップ。
【００４７】
３−１．化学品の製造工程（ａ）［細胞］
本書において、「細胞」とは、微生物および培養細胞、ならびに真核細胞および原核細胞を包含する概念である。微生物としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母；大腸菌、乳酸菌、コリネ型細菌などの細菌；糸状菌；放線菌等が用いられる。培養細胞は、多細胞生物由来の細胞であり、例えば動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。化学品の製造に用いられる細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００４８】
真核細胞は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持ち、細胞核（以下、単に「核」と称する）を有さない原核生物とは明確に区別される。化学品の製造には、真核細胞のうちで酵母を好ましく用いることができる。化学品の製造に好適な酵母としては、例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が挙げられる。この中でも特に好ましい種は、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４９】
原核細胞は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持たず、細胞核（核）を有する真核生物とは明確に区別される。化学品の製造には、例えば、原核細胞のうちで乳酸菌を好ましく用いることができる。
【００５０】
細胞は、目的とする化学品、原料、培養条件等に応じて選択される。
Ｌ−アミノ酸を生産する細胞として、例えば、発酵工業においてよく使用される大腸菌やコリネ型細菌などの細菌が挙げられる。
【００５１】
具体的には、Ｌ−スレオニン生産菌としては、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）に属する細菌等が挙げられる。この中でも特に好ましい種は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【００５２】
また、Ｌ−リジン生産菌としては、エシェリシア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌等が挙げられる。この中でも特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである。
【００５３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムが好ましい。
【００５４】
Ｌ−トリプトファン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００５５】
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびセラチア・マルセセンス等が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−グルタミン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびフラボバクテリウム・リゲンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｇｅｎｓｅ）等が挙げられる。
【００５７】
Ｌ−アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、セラチア・マルセセンス、エシェリシア・コリおよびバチルス・サブチリス等が挙げられる。
【００５８】
Ｌ−アラニン生産菌としては、ブレビバクテリウム・フラバムおよびアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）等が挙げられる。
【００５９】
Ｌ−ヒスチジン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・アモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、セラチア・マルセセンス、エシェリシア・コリ、バチルス・サブチリスおよびストレプトマイセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等が挙げられる。
【００６０】
Ｌ−プロリン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、カルチア・カテナフォルマ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｃａｔｅｎａｆｏｒｍａ）、セラチア・マルセセンスおよびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００６１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムまたはエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００６２】
Ｌ−アスパラギン酸生産菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、エシェリシア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００６３】
Ｌ−チロシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００６４】
Ｌ−メチオニン生産菌としては、エシェリシア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカムが好ましい。
【００６５】
Ｌ−セリン生産菌としては、エシェリシア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、アルスロバスター・オキシダンス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。
【００６６】
Ｌ−バリン生産菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、セラチア・マルセセンスおよびクレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等が挙げられる。
【００６７】
Ｌ−ロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびセラチア・マルセセンス等が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−アミノ酸の生産能力を持つ微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一例として、日本国特開平２−２１９５８２号公報に記載されているＬ−スレオニン生産性の向上したプロビデンシア・レトゲリ、および特表平３−５００４８６号公報に記載されているＬ−アラニン生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカム等が挙げられる。
【００６９】
培養液中に含まれるＬ−アミノ酸の分離および精製は、従来知られているろ過、濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。
【００７０】
Ｄ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸脱水素酵素の酵素活性が増強された野生型株の細胞を用いることが好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。野生型株としては、例えば乳酸菌として、乳酸を合成する能力を有するラクトバチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。
【００７１】
例えば、Ｄ−乳酸を選択して生産する能力を有する乳酸菌としてはスポロラクトバチルス属に属するＤ−乳酸生産菌が挙げられ、好ましい具体例として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ）が使用できる。さらに好ましくは、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ  ２３４９２、ＡＴＣＣ  ２３４９３、ＡＴＣＣ  ２３４９４、ＡＴＣＣ２３４９５、ＡＴＣＣ  ２３４９６、ＡＴＣＣ  ２２３５４９、ＩＡＭ  １２３２６、ＩＡＭ  １２３２７、ＩＡＭ  １２３２８、ＩＡＭ  １２３２９、ＩＡＭ  １２３３０、ＩＡＭ  １２３３１、ＩＡＭ  １２３７９、ＤＳＭ  ２３１５、ＤＳＭ  ６４７７、ＤＳＭ  ６５１０、ＤＳＭ  ６５１１、ＤＳＭ  ６７６３、ＤＳＭ  ６７６４、ＤＳＭ  ６７７１などとスポロラクトバチルス・イヌリナスＪＣＭ  ６０１４などが挙げられる。
【００７２】
また、細胞に、Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある）を組み込むことによりＤ−乳酸脱水素酵素の酵素活性を付与、あるいは増強することもできる。つまり、化学品の生成には、組換え細胞も好適に用いられる。
【００７３】
組換え細胞を用いてＤ−乳酸を製造する場合、宿主細胞としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、酵母が特に好ましい。また、酵母のうちサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がさらに好ましい。
【００７４】
Ｄ−ＬＤＨは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびＤ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていればよく、特定の配列には限定されない。例えば、Ｄ−ＬＤＨとしては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、バシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）、カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、ミナミカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｇｉｇａｓ）、およびマルオカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）由来の遺伝子が好ましく、バシラス・ラエボラクティカス、およびアメリカカブトガニ由来の遺伝子がさらに好ましい。
【００７５】
Ｌ−乳酸を製造する場合、Ｌ−乳酸脱水素酵素の酵素活性が増強された、野生型株の細胞を用いることが好ましい。酵素活性を増強する方法としては、従来知られている薬剤変異による方法を用いることができる。野生型株としては、例えば乳酸菌として、乳酸を合成する能力を有するラクトバチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。また、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌、または得られる乳酸の光学純度が高い乳酸菌を選択して用いることができる。
【００７６】
また、Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。また、乳酸生産能力を人為的に付与された、あるいは乳酸生産能力を人為的に増強された細胞を用いることができる。例えば、細胞に、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、「Ｌ−ＬＤＨ」と称することがある）が導入することで、Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強することができる。つまり、組換え細胞も好適に用いられる。
【００７７】
組換え細胞を用いてＬ−乳酸を製造する場合、宿主細胞としては、原核細胞である大腸菌および乳酸菌；ならびに真核細胞である酵母などが好ましい。酵母は特に好ましく用いられる。また、酵母のうちサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がさらに好ましい。
【００７８】
Ｌ−ＬＤＨは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていればよく、特定の配列には限定されない。例えば、Ｌ−ＬＤＨとして、対糖収率の高い乳酸菌由来、ほ乳類由来、またはカエル由来の遺伝子を用いることができる。ほ乳類由来の遺伝子としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好適に用いることができる。また、カエル由来の遺伝子としては、特にコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００７９】
Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨには、遺伝的多型性の遺伝子、および変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（“Ｍｕｔａｎ（ミュータン：登録商標）”―Ｋ（タカラバイオ社製））を用いる方法、およびランダム変異導入用キット（ＢＤ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などにより実行される。また、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸を、ＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
用いる乳酸生産微生物としては、特に、５０％以上の対糖収率を示す微生物が好ましい。対糖収率とは、消費した全糖量に対する乳酸の生産量の比率である。
【００８０】
ピルビン酸を製造する場合について述べる。ピルビン酸を生産する細胞としては、例えば、シュードモナス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌が挙げられる。また、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌がより好ましい。さらに、突然変異または遺伝子組換えによって、性質の一部が改変された細菌が用いられてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を変異、または欠失させた細菌も好ましく用いられる。
【００８１】
またカビおよび酵母なども好ましく用いられる。例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）、カンジダ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｎｄｉｄａ）、またはシゾフィリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に属するカビおよび酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、またはシゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）などに属するカビおよび酵母を用いてピルビン酸を製造することが出来る。
【００８２】
培養液に含まれるピルビン酸の分離および精製は、ろ過および陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、日本国特開平６−３４５６８３に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００８３】
コハク酸を製造する場合について述べる。コハク酸を生産する細胞としては、例えば、アナエロビオスピリラム属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）やアクチノバシラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム  サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、およびＪａｍｅｓ．Ｂ．Ｍｃｋｉｎｌａｙ（ジェームズ．Ｂ．マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）を挙げることができる（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（アプライド  マイクロバイアル  アンド  マイクロバイオロジー），７１，６６５１−６６５６（２００５）。また、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）やブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などのコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；およびエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）などが好適である。
【００８４】
また、遺伝子組換えによってコハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることで、コハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、日本国特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、非特許文献１（Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ  Ｈｉｒａｏ  ｅｔ．  ａｌ．（ヒラオ  トシヒコら）、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（アプライド  マイクロバイアル  アンド  マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９））に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸−ギ酸開裂酵素（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅｌｙａｓｅ）と乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の欠損株である大腸菌ＡＦＰ１１１株などを使用することができる。
【００８５】
イタコン酸を製造する場合について述べる。イタコン酸を生産する細胞としては、例えばカビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは、アスペルギルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、あるいはウスティラゴ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ）に属するカビ、およびカンジダ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）に属する酵母が挙げられる。中でも、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、ウスティラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ・シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、およびウスティラゴ・ラベンホルスティナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉｎａ）のカビ、あるいはカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を、イタコン酸の生産に好ましく用いることができる。
【００８６】
カダベリンを製造する場合について述べる。カダベリンを生産することが可能な細胞としては、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性が増強された微生物が好ましい。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が１または２種類以上組み込まれている組換え微生物が挙げられる。
【００８７】
カダベリンを製造する場合、組換え微生物としては大腸菌およびコリネ型細菌が好ましく、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌がさらに好ましい。更には、微生物は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく、遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが更に好ましい。また、コリネ型細菌の属が、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる少なくとも１つの属であることが好ましい。更に好ましくは、コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【００８８】
［培地］
発酵原料（以下、単に「原料」と称する。）とは、発酵によって目的の化学品を生じる物質である。原料は、細胞、培養条件、および目的とする化学品等に応じて、変更可能である。
【００８９】
培養に用いられる培地は、原料を含むと共に、細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得る成分を含む。本書では、特に限定しない限り、「培地」とは液体培地を指す。培地は、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を含有する。
【００９０】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類；これら糖類を含有する澱粉、澱粉加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ケーンジュース；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの抽出物もしくは濃縮液；甜菜糖蜜またはケーンジュースのろ過液；シラップ（ハイテストモラセス）；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された精製糖；酢酸やフマル酸等の有機酸；エタノールなどのアルコール類；並びにグリセリンなどが使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００９１】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源が使用され、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００９２】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜使用することができる。
【００９３】
［培養液］
培養液とは、培地およびその中で培養されている細胞を含み、培養の結果として生成された化学品を含み得る。
【００９４】
分離膜モジュール２により得られるろ液には、実質的に細胞は含まれないが、説明の便宜上、ろ液も培養液と称することがある。
【００９５】
［培養］
連続発酵装置１００では、発酵槽１内へ原料を導入しつつ、発酵槽１内から培養液を引き抜くことで、連続培養が行われる。
【００９６】
培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、細胞濃度を高くした後に、連続培養を開始しても良い。この際、必要に応じて、細胞の引き抜きを行うこともできる。高濃度の細胞を接種し、培養開始とともに連続培養を行っても良い。
【００９７】
原料の導入について説明する。図１では、培養実行中に培地供給ポンプ９が稼働することで、発酵槽１内に培地が導入され、その結果として原料が導入される。
【００９８】
培養実行中、原料の導入は停止されずに常に行われていてもよいし、状況に応じて原料の導入と停止とが切り替えられてもよい。例えば、上述したように、培地の導入の開始および停止が、レベルセンサ６１の検出結果に基づいて行われてもよいし、図示しないタイマの計測結果に基づいて一定の時間毎に行われてもよい。なお、原料の導入が自動で行われる形態だけでなく、手動で行われる形態も、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９９】
次に、培養液の引き抜きについて説明する。培養液中の細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得るのに好ましい。
【０１００】
連続発酵装置１００は、循環系によって培養液を引き抜くことで、化学品の回収を行いつつ、細胞濃度を高く維持しながら、連続培養を行うことができる。循環系を用いた培養液の引き抜きの詳細については、後述する。
【０１０１】
発酵槽１には、分離膜モジュール２につながる配管８１の他に、引き抜き用の流路が接続されていてもよく、培養液の引き抜きが、この引き抜き用の流路を通じて行われてもよい。このとき、培養液の液体部分だけでなく、細胞も引き抜かれてもよい。
【０１０２】
培養中に、発酵槽１に新たな細胞が導入されてもよい。細胞の導入は、手動で行われてもよいし、自動的に行われてもよい。
【０１０３】
発酵槽１においては、原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料の供給および培養液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【０１０４】
連続培養操作は、管理上、通常、単一の発酵槽１で行うことが好ましい。しかしながら、細胞を増殖させつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽１の数は問わない。発酵槽１の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽１を用いることもあり得る。その場合、複数の発酵槽１を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、高い生産性が得られる。
【０１０５】
図１の連続発酵装置１００においては、発酵槽１内の培養液は、温度制御部３、ｐＨ制御部５、レベル制御部６、発酵槽気体供給装置２１等によって、発酵に適した条件が維持される。
【０１０６】
細胞の培養は、通常、ｐＨが３以上１０以下で、温度が１５℃以上６５℃以下の範囲で行うことができる。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた範囲内に調整される。連続発酵装置１００においては、制御装置２８の制御の下、ｐＨ制御部５によってｐＨが自動制御され、温度制御部３によって温度が自動制御される。
【０１０７】
３−２．培養液のろ過工程（ｃ）
ろ過工程により、培養液から連続的に化学品を回収することができ、かつ培養を継続することができる。具体的には、図１においては、循環ポンプ８によって、培養液が発酵槽１から引き抜かれ、配管８１を通って分離膜モジュール２に供給される。培養液は、分離膜モジュール２によって、濃縮液と透過液とに分離される。
【０１０８】
図１の循環ポンプ８はクロスフロー循環ポンプに該当し、分離膜モジュール２ではクロスフローろ過が行われる。クロスフローろ過によって、培養液の剪断力で膜に付着する微生物等の汚れを、効果的に除去することができる。クロスフローにさらに膜の１次側への気体供給を組み合わせることによって、より高い洗浄効率を実現することができる。
【０１０９】
ろ過の駆動力は、発酵槽１と分離膜モジュール２との液位差（水頭差）を利用するサイホンによって得られてもよいし、クロスフロー循環ポンプにより発生する膜間差圧によって得られてもよい。また、ろ過の駆動力として、分離膜モジュール２のろ液側に吸引ポンプが設置されてもよい。図１の形態では、ろ過ポンプ１１が吸引ポンプに該当する。
【０１１０】
クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引ポンプの吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。さらに、分離膜モジュール２の１次側に導入する気体または液体の圧力を配管８１または８２に図示しないバルブを設けて変化させることによっても膜間差圧を制御することができる。分離膜モジュール２の１次側の圧力と、ろ液側の圧力との差を膜間差圧として検出し、この膜間差圧に基づいて、ポンプの制御等を行うことができる。
【０１１１】
図１の構成では、循環ポンプ８によって、発酵槽１から分離膜モジュール２へ培養液が供給される。また、差圧制御部７によって検知された膜間差圧に応じて、循環ポンプ８およびろ過ポンプ１１の動作が制御されることで、分離膜モジュール２に供給される培養液の量が適切に調整される。
【０１１２】
ろ過は連続的に行うこともできるし、間欠的に行うこともできる。間欠的にろ過を行う場合、例えばろ過を５〜１２０分間継続して実行する毎に、所定の時間（例えば０．１〜１０分間）ろ過を停止することができる。より好ましくは、ろ過を５〜１０分間継続するごとに、０．２５〜３分間ろ過を停止する。後述するように、気体供給は、ろ過停止中に行っても良いし、ろ過中に行っても良い。
【０１１３】
３−３．分離および循環工程（ｂ、ｄ）
培養液中の細胞は分離膜を透過しないので、分離膜モジュール２を通過した濃縮液（透過しなかった液体）では、細胞濃度が高められている。濃縮液が配管８２を通って発酵槽１に戻されることで、発酵槽１内に細胞が保持される。分離膜モジュール２の分離膜を透過したろ液は、配管８３を通って装置外に排出される。こうして、非透過液が発酵槽１内に還流され、かつ分離膜を透過したろ液が分離される。その結果、発酵槽１内の細胞濃度は高く保たれ、かつ化学品が連続的に培養系から分離される。
【０１１４】
循環系培養液の循環速度は、モジュール断面積あたりの流量であるクロスフロー速度（ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ）が０．１ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ以上、１．０ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ以下が好ましい。さらに好ましくは、０．１ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ以上、０．５ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ以下である。速度が０．１ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ以上であることで、膜に付着する微生物等の汚れを除去するためのクロスフローせん断力が得られる。また、速度が１．０ｍ３／ｍ２／ｓｅｃ以下であることで、培養液の発泡量を抑えることができる。泡が過剰に発生すると、泡が排気口から溢れることによってコンタミネーションが発生したり、泡によってレベルセンサ６１が発酵槽１内の液面の位置を誤検知したりといった問題が起きやすい。
【０１１５】
また、ろ過を行っていない間も、循環系における培養液の循環は継続されることが好ましい。
循環速度は、循環ポンプ８が制御装置２８によって制御されることで、調整される。
【０１１６】
３−４．気体供給工程（ｅ）
製造装置への気体の供給工程としては以下の二つがある。
第１の気体供給工程（ｅ）は、図１の構成においては、循環系での気体供給、すなわち、分離膜モジュール２と、発酵槽１と分離膜モジュール２とを接続する配管８１において、細胞による発酵のための気体供給と兼ねてスクラビング洗浄として実行される。具体的な気体供給方法について以下に記載する。図１に示す構成では、モジュール気体供給装置１６、配管気体供給装置１８、およびポンプ前配管気体供給装置２０のうち、いずれか１つまたは２つ以上の装置によって、気体が供給される。気体の供給によって、分離膜モジュール２内の分離膜から、汚れが除去される。
【０１１７】
気体供給の開始時には、モジュール気体供給制御バルブ１５、配管気体供給制御バルブ１７、およびポンプ前配管気体供給制御バルブ１９の少なくとも１つが、制御装置２８の制御により、または手動により開かれる。気体供給の停止時には、同様に、制御装置２８の制御または手動により、これらのバルブが閉じられる。
【０１１８】
気体供給時には、分離膜モジュール２への液体の供給が行われる。気体供給によるスクラビング洗浄効果と、分離膜モジュール２における液体の流れによる洗浄効果とが合わさることで、高い洗浄効果が得られる。
【０１１９】
特に図１の構成では、気体供給時に、分離膜モジュール２に発酵槽１から培養液が供給される。具体的には、気体が供給されているときに、循環ポンプ８が稼働する。このとき、ろ過ポンプ１１が停止され、かつろ過バルブ１２が閉、すなわち、ろ過を停止してもよい。また、ろ過ポンプ１１が稼働し、かつろ過バルブ１２が開かれていてもよい。
【０１２０】
こうして、培養液の流れによる剪断力と気体供給によるスクラビング洗浄効果とにより、高い洗浄効果が得られる。
【０１２１】
供給される気体としては、ガスボンベ、ブロアー、コンプレッサー、あるいは配管によって供給される圧縮ガスなどを使用することができる。つまり、モジュール気体供給装置１６、配管気体供給装置１８、およびポンプ前配管気体供給装置２０としては、気体を圧縮し、その一方で、一定の圧力でその気体を供給することが可能な装置、または、圧縮された気体を収容しており、一定の圧力でその気体を供給することが可能なタンクが用いられる。
【０１２２】
供給される気体は、酸素を含有する気体であることが好ましく、純酸素であってもよい。また、酸素の濃度は、発酵に悪影響のない気体、例えば、空気、窒素、二酸化炭素、メタン、または前記気体らの混合気体などを混合することで、調整可能である。酸素の供給速度を上げるときは、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、培養液を加圧する、あるいは気体供給量を上げるなどの手段を用いることができる。
【０１２３】
酸素の供給速度を下げる必要があれば、二酸化炭素、窒素、メタンおよびアルゴンなど、酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【０１２４】
図１の構成では、分離膜モジュール２に供給される気体量は、流量計９１、９２および９３で計測することができる。制御装置２８は、流量計９１〜９３で計測された気体供給量を検知し、バルブ１５、１７および１９の開閉の度合いを変化させることにより供給量を調整することができる。
【０１２５】
モジュール気体供給装置１６のみによって気体が供給される場合、気体の供給速度は、流量計９１の検知結果に基づいて、モジュール気体供給バルブ１５が開閉されることで調整される。また、配管気体供給装置１８により気体が供給される場合、気体の供給速度は、流量計９２の検知結果に基づいて配管気体供給バルブ１７が開閉されることで調整される。また、ポンプ前配管気体供給装置２０により気体が供給される場合、気体の供給速度は、流量計９３の検知結果に基づいてポンプ前配管気体供給バルブ１９が開閉されることで調整される。
【０１２６】
なお、気体供給量の調整は、制御装置２８および自動バルブによって自動制御されてもよいし、手動バルブを用いて手動制御されてもよい。
【０１２７】
気体の供給量に特に制限はないが、好ましくは次の式（１）で算出される、分離膜モジュール断面積あたりの気体供給量である気体の線速度は０．１５ｃｍ／ｓ以上であることが望ましく、７０ｃｍ／ｓ以下であることが望ましい。さらに好ましくは、０．３０ｃｍ／ｓ以上、３５ｃｍ／ｓ以下である。線速度が０．１５ｃｍ／ｓ以上であることで、分離膜の洗浄効果、ならびに気体供給による培養液の撹拌および酸素供給等の効果が得られる。気体線速度が７０ｃｍ／ｓ以下であることで、培養液の発泡量を抑えることができる。連続発酵装置１００は、上述したように、発酵槽１の中から外に空気を逃がすための発酵槽圧力調整バルブ２２および排気口を備えるので、泡が排気口から溢れるとコンタミネーションが発生しやすい。気体供給量を上記の量以下とすることにより、発泡量が抑えられ、このような問題が起きにくくなる。また、泡によってレベルセンサ６１が発酵槽１内の液面の位置を誤検知するという問題も起きにくくなる。
気体線速度（ｍ／ｓ）＝気体供給量（ｍ３／ｓ）×１００÷（分離膜モジュール内部断面積（ｍ２）×（１００−膜充填率（％）））      ・・・（１）
【０１２８】
本実施の形態による連続発酵装置１００を利用すると、発酵効率を向上させることも可能である。モジュール気体供給装置１６、配管気体供給装置１８またはポンプ前配管気体供給装置２０等により供給された気体は、培養液と接触し、配管の中で培養液と接触しながら流れ、分離膜モジュール２の中で、分離膜に接触して膜を揺らし、分離膜モジュール２から発酵槽１まで、配管の中で培養液と接触しながら流れて発酵槽１に入る。発酵槽１に培養液と共に導入された気体は、発酵槽１中の培養液と混合され、撹拌された後、発酵液面の上部にある空間に上昇し、培養液との接触が終わる。一方、例えば、図３に示すような従来使用される連続発酵装置２００では、発酵槽１に発酵槽気体供給装置２１により直接気体が供給され、発酵槽１中で撹拌された後、すぐに発酵液面の上部にある空間に上昇し、発酵液との接触が終わる。
【０１２９】
モジュール気体供給装置１６、配管気体供給装置１８またはポンプ前配管気体供給装置２０等による気体供給の実行条件、すなわち気体供給実行のタイミング、頻度、１回の気体供給時間等は、具体的に限定されるものではない。気体供給の実行条件は、膜間差圧、膜間差圧の変化、発酵槽１内の圧力、供給する気体の種類、培養される細胞の種類、製造される化学品の種類、および原料の種類等の様々な条件に応じて変更可能である。例えば、気体供給は、連続して行っても良いし、前回の気体供給終了から所定時間が経過する毎に行われてもよいし、分離膜モジュール２におけるろ過量または膜間差圧が所定の値に達する毎に行われてもよい。気体供給開始時および終了時を決定するために、連続発酵装置１００は、図示しないタイマ等の計測器が設けられていてもよい。
【０１３０】
間欠的に気体供給を行う場合、気体供給頻度は、０．１回／時間以上３６０回／時間以下が好ましく、より好ましくは１２回／時間以上１２０回／時間以下である。気体供給頻度が３６０回／時間以下であることで、培養液の発泡による不具合、ろ過膜への損傷、および運転コストの上昇などの問題が発生しにくい。また、気体供給による洗浄頻度が０．１回／時間以上であることで、洗浄効果を充分に得ることができ、発酵槽１内の圧力を充分に高く維持できるので雑菌混入を抑制することができる。
【０１３１】
１回の気体供給時間は、気体供給頻度、膜間差圧、膜間差圧の変化、発酵槽内の圧力、化学品の生産速度により決定される。
【０１３２】
気体供給を間欠的に行う場合の洗浄時間は、５秒／回以上１時間／回以下の範囲であり、より好ましくは１０秒／回以上６００秒／回以下である。気体供給時間が１時間／回以内であることで、ろ過膜の損傷および乾燥、並びに運転コストの上昇などの問題の発生が抑制される。また、気体供給時間が５秒／回以上であることで、洗浄効果を充分に得ることができると共に、発酵槽１内の圧力低下を抑制することができるので、雑菌の混入を抑制することができる。なお、気体供給時間に応じて、気体の線速度を調整することが可能である。
【０１３３】
本実施の形態にかかる化学品の製造方法において、前記第１の気体供給工程とは別に、第２の気体供給工程として、発酵槽１に気体を供給する工程をさらに備えてもよい。図１の構成では、発酵槽１へ気体を供給する工程は、発酵槽気体供給装置２１によって実行可能である。
【０１３４】
特に、第１の気体供給工程による気体供給（循環系気体供給とする）が間欠的に行われる場合、循環系での気体供給を停止している間に、発酵槽１へ気体を供給することで、微生物の生育に必要な気体の供給量を維持することができる。つまり、連続発酵装置１００において循環系での気体供給が間欠的に実行される場合、循環系で気体供給の停止時には、制御装置２８により、発酵槽気体供給装置２１等の他の機構による発酵槽１への気体の供給速度が、循環系での気体供給時におけるこれら他の機構による発酵槽１への気体の供給速度よりも大きくなるように、制御される。供給速度をどの程度大きくするかは、発酵の条件等に応じて変更可能である。
【０１３５】
４．化学品
本書に述べる製造方法によって得られる化学品は、細胞が培養液中に生産する物質である。化学品としては、例えば、アルコール、有機酸、ジアミン、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、上記製造方法は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
【０１３６】
例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオールおよびグリセロール等が挙げられる。
【０１３７】
また、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸およびクエン酸等を挙げることができる。また、ジアミンとしてはカダベリン、核酸であればイノシン、グアノシンおよびシチジン等を挙げることができる。
【０１３８】
アミノ酸としては、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシン等が挙げられ、特に、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＬ−グルタミン酸が好適である。
【実施例】
【０１３９】
以下、実施例を示して本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。以下の実施例および比較例で用いた連続発酵装置の概略構成は、図１（回転式撹拌翼なし）または図３（回転式撹拌翼あり）に示すとおりである。回転式撹拌翼の有無については各実施例、および比較例において明記する。また、以下の例では、化学品として、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＤ−乳酸を連続発酵により製造した。【０１４０】
［Ａ．Ｌ−スレオニン濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＬ−スレオニン濃度の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−スレオニンを含む培養液を２５μＬ取り、そこに１５０μｌのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μｌのＬ−メチオニン（２ｇ／Ｌ）を加える。上記の溶液に、さらに９００μｌのエタノールおよび１５０μｌの０．２Ｍジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を加え混合する。上記の溶液を３７℃の温度で１時間静置後、下記条件でＨＰＬＣ分析を行った。
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル＝７：３（流速１．２ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−スレオニンを標品として分析を行い、横軸にＬ−スレオニン濃度、縦軸にＬ−スレオニン面積／Ｌ−メチオニン（内標）面積の面積比をプロットして作成した。【０１４１】
［Ｂ．Ｌ−リジン濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＬ−リジン濃度の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−リジンを含む培養液を２５μＬ取り、そこに４００μＬのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μＬの１，４−ブタンジオール（２ｇ／Ｌ）を加えた。上記の溶液に、１５０μＬの０．２ＭＤＮＦＢを添加後、３７℃で１時間反応させた。
その溶液５０μｌをアセトニトリル１ｍＬに溶解し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した上清１０μＬを以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４５：５５（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−リジンを標品として分析を行い、横軸にＬ−リジン濃度、縦軸にＬ−リジン面積／１，４−ブタンジオール（内標）面積の面積比をプロットして作成した。【０１４２】
［Ｃ．Ｄ−乳酸濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＤ−乳酸濃度の測定は、次の方法で行った。Ｄ−乳酸を含む培養液を１００μＬ取り、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。    
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）            
・移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）            
・検出方法：電気伝導度            
・温度：４５℃            
検量線は、濃度既知のＤ−乳酸を標品として分析を行い、横軸にＤ−乳酸濃度、縦軸に検出ピーク面積をプロットして作成した。【０１４３】
［Ｄ．グルコース濃度の測定方法］
グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。【０１４４】
［Ｅ．膜ろ過モジュールの製作］
東レ（株）製加圧式ポリフッ化ビニリデン中空糸膜モジュール“ＨＦＳ１０２０”を解体して、接着固定されていない部分のみを切り出した。こうして切り出されたポリフッ化ビニリデン中空糸膜をケース内に収容することで、分離膜モジュールを作製した。ケースとしては、ポリカーボネート樹脂の成型品を用いた。作製された膜ろ過モジュールの容量は０．０１６Ｌであり、有効ろ過面積は２８０平方ｃｍであった。【０１４５】
［Ｆ．連続発酵によるＬ−リジンの製造に用いられる遺伝子組換え株の作製］
Ｌ−リジン生産能力をもつ微生物として、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＡＴＣＣ１３０３２株と略す。）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ）遺伝子破壊株の作製を行った。具体的には、日本国特開２００８−２１２１３８に記載の方法により、遺伝子改変を行った。得られた菌株を、コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株（以下、ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株と略す。）と称する。ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用いて、後述するようにＬ−リジンの連続発酵を行った。【０１４６】
［Ｇ．連続発酵によるＤ−乳酸の製造に用いられる遺伝子組換え株の作製］
Ｄ−乳酸生産能力をもつ微生物として、ＰＤＣ１遺伝子、ＳＥＤ１遺伝子、およびＴＤＨ３遺伝子座にアメリカカブトガニ由来のｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を作製した。具体的には、ＷＯ２０１０／１４０６０２に記載の方法により、遺伝子改変を行った。得られた菌株を、ＳＵ０４２株と称する。ＳＵ０４２株を用いて、後述するようにＤ−乳酸の連続発酵を行った。【０１４７】
［Ｈ．連続発酵によるＬ−スレオニンの製造］
（比較例１）
図３に示す連続発酵装置２００を稼働させ、Ｌ−スレオニンの連続発酵を実施した。分離膜には、［Ｅ］で作製した中空糸膜を利用した。Ｌ−スレオニン連続発酵における運転条件として、以下の実施例および比較例に共通の条件は下記のとおりである。
共通条件
・微生物：プロビデンシア・レトゲリＳＧＲ５８８−７７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０５２８）
・培地：Ｌ−スレオニン発酵培地（表１）
・発酵液容量：３．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・温度：３７（℃）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７に調整
・循環速度  ０．３ｍ／ｓ
・ろ過速度：２２５ｍＬ／ｈ（一定）【０１４８】
【表１】
2013146807.tif 000003
【０１４９】
また、この比較例に特有の条件（変更条件）は以下のとおりである。
変更条件
・回転式撹拌翼：あり、撹拌速度３５０（ｒｐｍ）
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体の線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１０００ｍＬ／ｍｉｎ
以下の培地等の条件は実施例および比較例で共通である。なお、目的とする化学物質にかかわらず、発酵における原料のうち炭素源にはグルコースを用いた。窒素源および無機塩類としては、それぞれ後述の物質を用いた。【０１５０】
まず、１００ｍＬのグルコースブイヨン培地（１％グルコース、３％ブイヨン（ニッスイ社製））を投入した５００ｍＬ容の三角フラスコに、寒天培地から掻き取ったプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を植菌した。これを温度３７℃、回転数１４０ｒｐｍで撹拌しながら培養した（つまり前培養を行った）。得られた前培養液を、３ＬのＬ−スレオニン発酵培地（表１）が投入された連続発酵装置２００に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽１内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｌ−スレオニン発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＬ−スレオニンの製造を行った。【０１５１】
ろ過液中に含まれるＬ−スレオニン濃度および残存グルコース濃度を、［Ａ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。
比較例１での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＬ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図４に示す。
比較例１では、発酵槽１内の発酵液が著しく発泡したのち、発酵槽上部にある回転式撹拌翼４のシール部分から液漏れが起こっていた。発酵槽１内の培養液をサンプリングし、顕微鏡観察を行ったところ、コンタミネーションが発生していることが確認された。【０１５２】
（比較例２）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。
・回転式撹拌翼：なし
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体の線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１０００ｍＬ／ｍｉｎ
比較例２での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＬ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図４に示す。
比較例２では、回転式撹拌翼のシール部分からのコンタミネーションのリスクが無い。そのため、連続発酵終了時の培養液の顕微鏡観察を行ったが、コンタミネーションは発生していないことが確認できた。しかしながら、生産速度および対糖収率が大幅に低下してしまった。【０１５３】
（実施例１）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：５００ｍＬ／ｍｉｎ
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２に供給される気体の線速度：１７．７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・回転式撹拌翼：なし
実施例１での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＬ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図４に示す。
比較例１と比べるとＬ−スレオニン生産速度は減少するものの、気体供給量が少ないにも関わらず対糖収率が向上し、発酵効率の向上効果とともに、気体供給量の削減効果も得られた。更には膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。一方の比較例２と比較すると生産速度、対糖収率ともに向上した。
このように簡便な装置構成の変更により、連続発酵による化学品の生産性を高めることができ、かつ、従来では不可能であった回転式撹拌翼を無くし、コンタミネーションのリスクを大幅に低下させることが可能となった。【０１５４】
（実施例２）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は、比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：５００ｍＬ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・配管８１に供給される気体の線速度：１７．７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・回転式撹拌翼：なし
実施例２での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＬ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図４に示す。
比較例１および２と比べるとＬ−スレオニンの対糖収率が更に向上し、発酵効率の向上効果とともに気体供給量の削減効果も得られた。更には膜間差圧の上昇速度も比較例１および２より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。また、実施例１に比べて対糖収率が更に向上した。【０１５５】
（実施例３）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は、比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：５００ｍＬ／ｍｉｎ
・配管８１に供給される気体の線速度：１７．７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・回転式撹拌翼：なし
実施例３での培養開始から１２０時間後における（定常期に入った時点）におけるＬ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表２に示す。また、膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図４に示す。
比較例１および２と比べるとＬ−スレオニンの対糖収率が更に向上した。膜間差圧の上昇速度も比較例１および２より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。また、実施例１に比べて対糖収率が更に向上した。【０１５６】
（実施例４）
実施例３と同じ条件による試験を図２に示す形状の発酵槽１を有する連続発酵装置を用いて連続発酵を行った。実施例４での培養開始から１２０時間後における（定常期に入った時点）におけるＬ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表２に示す。また、膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図４に示す。
比較例１および２、実施例１、２および３と比べ生産速度が大幅に向上した。【０１５７】
【表２】
2013146807.tif 000004
【０１５８】
［Ｉ．連続発酵によるＬ−リジンの製造］
（比較例３）
図３に示す連続発酵装置２００を用いて、Ｌ−リジンの連続発酵を実施した。分離膜には、［Ｅ］で作製した中空糸膜を利用した。Ｌ−リジン連続発酵における運転条件として以下の実施例および比較例に共通の条件は下記のとおりである。
共通条件
・微生物：コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株
・培地：Ｌ−リジン発酵培地（表３）
・発酵液容量：３．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・温度：３０（℃）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７．３に調整
・循環速度  ０．３ｍ／ｓ
・ろ過速度：２２５ｍＬ／ｈ（一定）  【０１５９】
【表３】
2013146807.tif 000005
【０１６０】
変更条件
・回転式撹拌翼：あり、撹拌速度３５０（ｒｐｍ）
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体の線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：５００ｍＬ／ｍｉｎ【０１６１】
まず、５ｍＬのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、０．７％ミートエキストラクト（ｍｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌した。これを温度３０℃、で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表３に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で前培養を行った。得られた前培養液を、３ＬのＬ−リジン発酵培地が投入された連続発酵装置２００に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽１内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｌ−リジン発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。【０１６２】
適宜、ろ過液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度は［Ｂ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。
比較例３での培養開始から１２０時間後における（定常期に入った時点）Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。
比較例３では、発酵槽１内の発酵液が著しく発泡したのち、発酵槽１上部にある回転撹拌翼４のシール部分から液漏れが起こっていた。発酵槽１内の培養液をサンプリングし、顕微鏡観察を行ったところ、コンタミネーションが発生していることが確認された。【０１６３】
（比較例４）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は、比較例３と同様の条件下で連続発酵を行った。
・回転式撹拌翼：なし
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体の線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：５００ｍＬ／ｍｉｎ
比較例４での培養開始から１２０時間後における（定常期に入った時点）Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。
比較例４では、回転式撹拌翼からのコンタミネーションのリスクが無い。そのため、連続発酵終了時の培養液の顕微鏡観察を行ったが、コンタミネーションは発生していないことが確認できた。しかしながら、生産速度および対糖収率が大幅に低下してしまった。【０１６４】
（実施例５）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は、比較例３と同様の条件下で連続発酵を行った。
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：２５０ｍＬ／ｍｉｎ
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２に供給される気体の線速度：８．９ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・回転式撹拌翼：なし
実施例５での培養開始から１２０時間後における（定常期に入った時点）Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。
比較例３と比べるとＬ−リジン生産速度は減少するものの、気体供給量が少ないにも関わらず対糖収率が向上し、発酵効率の向上効果とともに、気体供給量の削減効果も得られた。更には膜間差圧の上昇速度も比較例３より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。一方の比較例４と比較すると生産速度、対糖収率ともに向上した。
このように簡便な装置構成の変更により、連続発酵による化学品の生産性を高めることができ、かつ、従来では不可能であった回転式撹拌翼を無くし、コンタミネーションのリスクを大幅に低下させることが可能となった。【０１６５】
（実施例６）
実施例５と同じ条件による試験を図２に示す形状の発酵槽１を有する連続発酵装置を用いて連続発酵を行った。実施例６での培養開始から１２０時間後における（定常期に入った時点）Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。
比較例４および３、実施例５と比べ生産速度が大幅に向上した。【０１６６】
【表４】
2013146807.tif 000006
【０１６７】
［Ｊ．連続発酵によるＤ−乳酸の製造］
（比較例５）
図３に示す連続発酵装置２００を用いて、Ｄ−乳酸の連続発酵を実施した。分離膜には、［Ｅ］で作製した中空糸膜を利用した。Ｄ−乳酸連続発酵における運転条件として共通の条件は下記のとおりである。
共通条件
・微生物：サッカロマイセス・セレビセ    ＳＵ０４２株
・培地：発酵培地（表５）
・発酵液容量：１．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・温度：３２（℃）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・ｐＨ調整：５Ｎ水酸化カルシウム水溶液によりｐＨ４．５に調整
・循環速度  ０．３ｍ／ｓｅｃ
・ろ過速度：２２５ｍＬ／ｈ（一定）【０１６８】
【表５】
2013146807.tif 000007
【０１６９】
変更条件
・回転式撹拌翼：あり、撹拌速度４００（ｒｐｍ）
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体の線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１２５ｍＬ／ｍｉｎ
まず、５ｍＬのＳＣ培地（グルコース１００ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ６．７ｇ／Ｌ、ロイシンを除く標準１９種アミノ酸１５２ｍｇ／Ｌ、ロイシン７６０ｍｇ／Ｌ、イノシトール１５２ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸１６ｍｇ／Ｌ、アデニン４０ｍｇ／Ｌ、ウラシル１５２ｍｇ／Ｌ）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったＳＵ０４２株を植菌した。これを温度３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で前培養を行った。得られた前培養液を、１．０ＬのＤ−乳酸発酵培地が投入された連続発酵装置２００に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽１内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｄ−乳酸発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。【０１７０】
適宜、ろ過液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度は［Ｃ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。
比較例５での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表６に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図６に示す。
比較例５では、発酵槽１内の発酵液が著しく発泡したのち、発酵槽１上部にある回転撹拌翼４のシール部分から液漏れが起こっていた。培養液をサンプリングし、顕微鏡観察を行ったところ、コンタミネーションが発生していることが確認された。【０１７１】
（比較例６）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、下記条件以外は、比較例５と同様の条件下で連続発酵を行った。
・回転式撹拌翼：なし
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２および／または配管８１に供給される気体の線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１２５ｍＬ／ｍｉｎ
比較例６での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表６に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図６に示す。
比較例６では、回転式撹拌翼からのコンタミネーションのリスクが無い。そのため、連続発酵終了時の培養液の顕微鏡観察を行ったが、コンタミネーションは発生していないことが確認できた。しかしながら、生産速度および対糖収率が大幅に低下してしまった。【０１７２】
（実施例７）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・モジュール気体供給装置（１６）による気体供給量：５０ｍＬ／ｍｉｎ
・配管気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・分離膜モジュール２に供給される気体の線速度：１．７７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・回転式撹拌翼：なし
実施例７での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表６に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図６に示す。
比較例５と比べると同等のＤ−乳酸の生産速度を示した一方で対糖収率は向上し、発酵効率の向上効果が得られるとともに、気体供給量の削減効果も得られた。更には膜間差圧の上昇速度も比較例５より抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。一方の比較例６と比較すると、生産速度、対糖収率ともに向上した。
このように簡便な装置構成の変更により、連続発酵による化学品の生産性を高めることができ、かつ、従来では不可能であった回転式撹拌翼を無くし、コンタミネーションのリスクを大幅に低下させることが可能になった。【０１７３】
（実施例８）
実施例７と同じ条件による試験を図２に示す形状の発酵槽１を有する連続発酵装置を用いて連続発酵を行った。
実施例８での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表６に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図６に示す。
比較例５および６、実施例７と比べ生産速度が大幅に向上した。【０１７４】
【表６】
2013146807.tif 000008
【０１７５】
（比較例７）
図７に示す連続発酵装置３００を用いて、Ｄ−乳酸の連続発酵を実施した。分離膜には、［Ｅ］で作製した中空糸膜を利用した。比較例７、及び実施例９〜１５のＤ−乳酸連続発酵における運転条件として共通の条件は下記のとおりである。
共通条件
・微生物：サッカロマイセス・セレビセ  ＳＵ０４２株
・培地：発酵培地（表５）
・温度：３２（℃）
・ｐＨ調整：５Ｎ水酸化カルシウム水溶液によりｐＨ４．５に調整
・ろ過速度：２２５ｍＬ／ｈ（一定）
・回転式撹拌翼：なし
・モジュール気体供給装置（１６）による供給気体の線速度：１．７７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ【０１７６】
変更条件
・循環ポンプ：  ポンプによる循環なし
・循環速度：０  ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：１．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５ｍＬ
・前培養培地量  ５０ｍＬ【０１７７】
まず、ＳＣ培地（グルコース１００ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ６．７ｇ／Ｌ、ロイシンを除く標準１９種アミノ酸１５２ｍｇ／Ｌ、ロイシン７６０ｍｇ／Ｌ、イノシトール１５２ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸１６ｍｇ／Ｌ、アデニン４０ｍｇ／Ｌ、ウラシル１５２ｍｇ／Ｌ）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったＳＵ０４２株を植菌した。これを温度３０℃で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表５に示した培地を投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で培養を行った（前培養）。得られた前培養液を、Ｄ−乳酸発酵培地が投入された連続発酵装置２００に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽１内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｄ−乳酸発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。
適宜、ろ過液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度は［Ｃ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。
比較例７での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表７および８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図８及び９に示す。
比較例７では、Ｄ−乳酸生産速度及び対糖収率が著しく低く、また、分離膜モジュール２における膜間差圧の上昇が速く、長時間の連続運転が困難であった。【０１７８】
（実施例９）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  チューブポンプ  コールパーマー社製マスターフレックスＬ／Ｓ
・循環速度：０．５  ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：１．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５ｍＬ
・前培養培地量  ５０ｍＬ
実施例９での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表７及び８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図８及び９に示す。
比較例７と比べると、Ｄ−乳酸の生産速度、対糖収率はともに向上し、更には膜間差圧の上昇速度も比較例７より抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１７９】
（実施例１０）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  チューブポンプ  コールパーマー社製マスターフレックスＬ／Ｓ
・循環速度：０．１  ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：１．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５ｍＬ
・前培養培地量  ５０ｍＬ
実施例１０での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表７に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図８に示す。
比較例７と比べると、Ｄ−乳酸の生産速度、対糖収率はともに向上し、更には膜間差圧の上昇速度も比較例７より抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１８０】
（実施例１１）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ社製チューブポンプＬ／Ｓ
・循環速度：１．０ｍ／ｓ
実施例１１での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表７に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図８に示す。
比較例７と比べると、Ｄ−乳酸の生産速度、対糖収率はともに向上し、更には膜間差圧の上昇速度も比較例７よりも抑えられて非常に低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１８１】
【表７】
2013146807.tif 000009
このように０．１ｍ／ｓから１．０ｍ／ｓの強制循環を行うことで、分離膜を閉塞させること無く、長期間安定した生産性の高い化学品の連続生産ができ、かつ、従来では不可能であった回転式撹拌翼を無くし、コンタミネーションのリスクを大幅に低下させることが可能になった。【０１８２】
（実施例１２）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  渦巻ポンプ  アルファラバル社製ＬＫＨ
・循環速度：０．５ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：１（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、０．２ＭＰａ、２０ｍｉｎの加圧蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５ｍＬ
・前培養培地量  ５０ｍＬ
実施例１２での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。
比較例７はもとより、実施例９と比較しても、Ｄ−乳酸の生産速度、対糖収率は著しく向上し、更には膜間差圧の上昇速度も比較例７より抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１８３】
（実施例１３）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  ダイヤフラムポンプ  タクミナ社製ＡＰＬＳ−２０
・循環速度：０．５ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：２０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．３８（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、０．２ＭＰａ、２０ｍｉｎの加圧蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５０ｍＬ
・前培養培地量  １０００ｍＬ
実施例１３での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。
比較例７に比べてＤ−乳酸の生産速度、対糖収率は著しく向上し、膜間差圧の上昇速度は、比較例７はもとより実施例９よりも抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１８４】
（実施例１４）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  ベーンポンプ  伏虎金属工業社製小型ラジアルベーンポンプＶＢＢ
・循環速度：０．５ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：１（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５ｍＬ
・前培養培地量  ５０ｍＬ
実施例１４での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。
比較例７はもとより、実施例９と比較しても、Ｄ−乳酸の生産速度、対糖収率がやや向上し、更には膜間差圧の上昇速度も比較例７より抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１８５】
（実施例１５）
図１に示す連続発酵装置１００を使用し、以下の条件以外は比較例７と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・循環ポンプ：  ギアポンプ  ＩＳＭＡＴＥＣ社製マグネットカップリング式ギアポンプＭＣＰ−Ｚ
・循環速度：０．５ｍ／ｓｅｃ
・発酵液容量：１（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０１６（Ｌ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌
・前々培養培地量  ５ｍＬ
・前培養培地量  ５０ｍＬ
実施例１５での培養開始から１２０時間後（定常期に入った時点）におけるＤ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）および対糖収率（％）を表８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。
比較例７に比較して、Ｄ−乳酸の生産速度、対糖収率が向上し、更には膜間差圧の上昇速度も比較例７より抑えられて低い値のまま推移しており、膜洗浄効果も現れていることが確認できた。【０１８６】
【表８】
2013146807.tif 000010
このように様々なポンプによる強制循環を行うことで、分離膜を閉塞させることなく長期間安定した生産性の高い化学品の連続生産ができ、かつ、従来では不可能であった回転式撹拌翼を無くし、コンタミネーションのリスクを大幅に低下させることが可能になった。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明は、発酵槽と発酵槽に接続された分離膜モジュールを有する循環機構を備え、撹拌機能を持たない、または撹拌を循環機構におけるポンプによる培養液の強制循環と気体の供給によって実現する製造装置を用いて連続発酵により化学品を製造するという簡便な方法により、分離膜モジュール運転と連続発酵の長期安定性と、発酵成績を向上させることができるため、広く発酵工業において利用され、発酵生産物である化学品を低コストで生産することが可能となる。
【符号の説明】
【０１８８】
１  発酵槽
１ａ  底壁
２  分離膜モジュール
３  温度制御部
４  回転撹拌翼
５  ｐＨ制御部
６  レベル制御部
７  差圧制御部
８  循環ポンプ
９  培地供給ポンプ
１０  中和剤供給ポンプ
１１  ろ過ポンプ
１２  ろ過バルブ
１３  洗浄ポンプ
１４  洗浄バルブ
１５  モジュール気体供給制御バルブ
１６  モジュール気体供給装置
１７  配管気体供給制御バルブ
１８  配管気体供給装置
１９  ポンプ前配管気体供給制御バルブ
２０  ポンプ前配管気体供給装置
２１  発酵槽気体供給装置
２２  発酵槽圧力調整バルブ
２３  発酵槽圧力計
２８  制御装置
５１  ｐＨセンサ
６１  レベルセンサ
８１  配管
８２  配管
８３  配管
８４  配管
８６  配管
８７  配管
８８  配管
８９  底壁先端部
９１  流量計
９２  流量計
９３  流量計
１００、２００、３００  連続発酵装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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