(57)【要約】  本発明は、光毒性を有さず、肝毒性及び消化器系障害が軽減された、安全性の高い線維症の治療剤又は予防剤を提供することを目的としている。本発明は、下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を提供する。2013018685.tif 000011
2013018685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式（Ｉ）で示される、ラクタム誘導体。
【化１】
2013018685.tif 000010
【請求項２】
請求項１記載のラクタム誘導体を有効成分として含有する、医薬。
【請求項３】
請求項１記載のラクタム誘導体を有効成分として含有する、線維症の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
請求項１記載のラクタム誘導体を有効成分として含有する、肺線維症の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクタム誘導体及びその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、線維芽細胞の過剰増殖並びに細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積が主な原因となって、種々の臓器の機能に悪影響を及ぼす疾患であり、特に、肺、皮膚、消化管、腎臓及び肝臓で発症する。【０００３】
線維症が一旦発症すると、線維化を受けた臓器の機能が低下するのみならず、全身にまで大きな損傷を与えることが知られている。例えば、皮膚に発症する線維症の場合、重症例においては、皮膚における瘢痕組織の増殖が患部の外見的異常では留まらず手足の運動機能にまで影響が及ぶとされている。【０００４】
また、腎線維症では、末期には腎不全に至り、人工透析又は腎臓移植による治療が必要とされ、肝線維症では、末期には肝硬化症及び肝硬変に至り、その多くが肝癌にまで進展し、肺線維症では、呼吸不全が起こり、最悪の場合は死に至るとされている。【０００５】
現在、線維症の治療には、主にコルチコステロイドなどの免疫抑制剤や抗炎症剤が使用されている。【０００６】
近年、特発性肺線維症に有効な薬剤として、ピルフェニドン（Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）が世界で初めて製造販売承認を取得した。ピルフェニドンは、各種線維化疾患動物モデルの罹患臓器において、抗線維化作用が認められている（非特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｋｕら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８年、第５９０巻、ｐ．４００−４０８
【非特許文献２】Ｇａｒｃｉａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２年、第３７巻、ｐ．７９７−８０５
【非特許文献３】Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９８年、第５４巻、ｐ．９９−１０９
【非特許文献４】Ｓｈｅｔｌａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、第１３２巻、ｐ．４９１−４９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、線維化の制御に関与するメカニズムと免疫抑制剤や抗炎症剤の作用メカニズムとは異なるものであるため、線維化疾患の治療に処方されている免疫抑制剤や抗炎症剤では線維化そのものを根本的に阻止・改善できないのが実状であり、線維化の軽減又は予防においても常に有効といえるものではなかった。【０００９】
また、特発性肺線維症治療薬のピルフェニドンは、重篤な副作用として光毒性、肝毒性及び消化器系障害が知られており、これらの副作用が認められた場合には、投薬を中止せざるを得ないのが現状であった。【００１０】
そこで本発明は、光毒性を有さず、肝毒性及び消化器系障害が軽減された、安全性の高い線維症の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗線維化作用を有し、かつ、光毒性を有さず、肝毒性及び消化器系障害が軽減されたラクタム誘導体を見出すことに成功し、本発明の完成に至った。【００１２】
すなわち、本発明は、下記の化学式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を提供する。
【化１】
2013018685.tif 000003
【００１３】
また本発明は、上記の式（Ｉ）で示されるラクタム誘導体を有効成分として含有する、医薬、特に線維症の治療剤又は予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のラクタム誘導体は、線維症のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル及び病態動物モデルに対して抗線維化作用を有し、光毒性を有さず、かつ、肝毒性及び消化器系障害が軽減されているため、安全性が高い線維症の治療剤又は予防剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおける実施例１の化合物の肺組織中ハイドロキシプロリン量に対する抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のラクタム誘導体は、下記の化学式（Ｉ）で示されることを特徴としている。
【化２】
2013018685.tif 000004
【００１７】
上記のラクタム誘導体は、特に指定しない限り、不斉炭素の存在による異性体（Ｒ体、Ｓ体、α体、β体、エナンチオマー）、旋光性を有する光学異性体（Ｄ体、Ｌ体、ｄ体、ｌ体、（＋）体、（−）体）、これらの任意の割合の混合物、ラセミ混合物を、すべて包含する。
【００１８】
上記のラクタム誘導体は、例えば、スキーム１に示される製造法に従って合成できる。
【００１９】
下記の製造法により得られた上記のラクタム誘導体は、公知の手段によって単離精製できる。公知の単離精製法としては、例えば、溶媒抽出、再結晶又はクロマトグラフィーが挙げられる。
【化３】
2013018685.tif 000005
【００２０】
上記のスキーム１中、Ｘは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を示す。
【００２１】
〔第１工程〕
式（ＩＶ）で示されるＮ−アリールピリドン化合物は、式（ＩＩ）で示されるヒドロキシピリジンに対して、金属触媒、配位子及び塩基存在下、適当な溶媒中で、一般式（ＩＩＩ）で表されるハロゲン化アリールを作用させるカップリング反応により合成できる。
【００２２】
上記のハロゲン化アリールとしては、カップリング反応がスムーズに進行する脱離基を有するもの、例えば、ヨードベンゼン、ブロモベンゼン又はクロロベンゼンが挙げられるが、ヨードベンゼン又はブロモベンゼンが好ましい。
【００２３】
上記のハロゲン化アリールの使用量は、式（ＩＩ）で示されるヒドロキシピリジン１モルに対して１〜２０モルが好ましく、１〜１０モルがより好ましい。
【００２４】
金属触媒としては、例えば、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、酢酸パラジウム若しくはテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムなどのパラジウム触媒又は酸化第一銅、ヨウ化銅若しくは銅粉末などの銅触媒が挙げられるが、銅触媒が好ましい。
【００２５】
金属触媒の使用量は、式（ＩＩ）で示されるヒドロキシピリジン１モルに対して０．００１〜１モルが好ましく、０．０１〜０．５モルがより好ましい。
【００２６】
配位子は、金属触媒に合わせて適宜選択され、パラジウム触媒の配位子としては、例えば、トリフェニルホスフィン、２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル又は４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテンなどのホスフィン誘導体が挙げられるが、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテンが好ましい。また、銅触媒を使用する場合には、配位子を添加しないことが好ましい。
【００２７】
配位子の使用量は、式（ＩＩ）で示されるヒドロキシピリジン１モルに対して０〜１モルが好ましく、０〜０．５モルがより好ましい。
【００２８】
塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム若しくは炭酸カリウムなどの炭酸アルカリ金属類、炭酸水素ナトリウム若しくは炭酸水素カリウムなどの炭酸水素アルカリ金属類、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウムなどのリン酸アルカリ金属塩類又はリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム若しくはリン酸二水素カリウムなどのリン酸水素アルカリ金属類が挙げられるが、炭酸アルカリ金属類が好ましい。
【００２９】
塩基の使用量は、式（ＩＩ）で示されるヒドロキシピリジン１モルに対して０．５〜１０モルが好ましく、１〜５モルがより好ましい。
【００３０】
反応溶媒は、通常反応を阻害しない溶媒が適宜選択され、例えば、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン若しくはエチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル系溶媒、ベンゼン若しくはトルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦ）若しくはジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）などの非プロトン性極性溶媒又は無溶媒が挙げられるが、無溶媒が好ましい。
【００３１】
反応温度は、０〜２００℃が好ましく、３０〜１５０℃がより好ましい。
【００３２】
反応時間は、反応温度などの条件に応じて適宜選択されるが、通常１〜７２時間程度で満足すべき結果が得られる。
【００３３】
〔第２工程〕
上記のラクタム誘導体は、適当な溶媒中で、式（ＩＶ）で示されるＮ−アリールピリドン化合物のジエンを還元する還元反応によって合成できる。還元反応としては、例えば、水素ガス雰囲気下、金属触媒を作用させる接触水素化が挙げられる。
【００３４】
接触水素化に用いる金属触媒としては、例えば、二酸化白金、パラジウム／活性炭又は水酸化パラジウム／活性炭が挙げられるが、二酸化白金が好ましい。
【００３５】
上記の金属触媒の使用量は、式（ＩＶ）で示されるＮ−アリールピリドン化合物１モルの重量に対して０．０５〜２００重量％が好ましく、１〜１００重量％がより好ましい。
【００３６】
水素ガスの圧力は、１〜１０気圧が好ましく、１〜５気圧がより好ましい。
【００３７】
反応溶媒は、通常反応を阻害しない溶媒が適宜選択され、例えば、メタノール、エタノール若しくは２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、酢酸エチル若しくは酢酸ｎ−プロピルなどのエステル系溶媒、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン若しくはエチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム若しくは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒若しくは水又はそれらの混合溶媒が挙げられるが、アルコール系溶媒が好ましい。
【００３８】
式（ＩＶ）で示されるＮ−アリールピリドン化合物の反応液中の濃度は、０．００１〜５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．０５〜２ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００３９】
反応温度は、０〜１００℃が好ましく、１０〜６０℃がより好ましい。
【００４０】
反応時間は、反応温度などの条件に応じて適宜選択されるが、通常３０分間〜４８時間程度で満足すべき結果が得られる。
【００４１】
上記のラクタム誘導体は、優れた抗線維化作用を有し、光毒性を有さず、肝毒性及び消化器系障害も軽減されていることから、安全性の高い医薬として用いることができ、線維症の治療剤又は予防剤として好ましく用いることができる。
【００４２】
線維症とは、線維芽細胞の過剰増殖並びに細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積が主な原因で、組織に線維化病変が形成され、種々の臓器の機能に悪影響を及ぼす疾患であり、例えば、肝線維症、肝硬変、肝臓の壊死、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、心筋線維症、腎線維症、血管線維症又は皮膚瘢痕が挙げられるが、上記のラクタム誘導体は、特に肺線維症の治療又は予防に好ましく用いられる。
【００４３】
肺線維症とは、種々の刺激により肺胞上皮又は基底膜が傷害され、その修復過程における線維芽細胞の過剰増殖並びに細胞外マトリックス成分の過剰生産及び蓄積が原因で、肺に線維化病変が形成される疾患であり、例えば、ウイルス感染による肺炎の後期に見られる肺の線維化、過敏性肺炎の進行により生じる肺線維症、特発性肺線維症又は放射線肺線維症が挙げられるが、上記のラクタム誘導体は、特に特発性肺線維症の治療又は予防に好ましく用いられる。
【００４４】
上記のラクタム誘導体が線維症の治療又は予防に有効であることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル試験を用いて評価できる。用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル試験としては、例えば、肺、肝臓、腎臓、皮膚などの各種臓器由来の線維芽細胞を包理培養したコラーゲンゲルを用いた試験（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００９年、第２２巻、ｐ．４８７−４９１、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１０年、第１５９巻、ｐ．３０４−３１５、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００６年、第７０巻、ｐ．２９８−３０５、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２年、第３０４巻、ｐ．２１７−２２２）が挙げられる。線維芽細胞は組織の線維化過程で活性化されると、過剰増殖及び細胞外マトリックス成分を過剰に産生するようになる他、収縮能を獲得する。線維芽細胞をコラーゲンゲル内で包埋培養すると、線維芽細胞の活性化（例えば、ＴＧＦ−β１の添加）により生じる線維芽細胞の収縮に伴いコラーゲンゲルが収縮し、コラーゲンゲル面積は縮小する。したがって、コラーゲンゲル面積を測定することで線維芽細胞の収縮能、すなわち、線維芽細胞の活性化を評価できる。
【００４５】
また、上記のラクタム誘導体が線維症の治療又は予防に有効であることは、病態モデル動物を用いて評価できる。用いる病態モデル動物としては、例えば、ブレオマイシンによるブレオマイシン誘発肺線維症モデル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８年、第５９０巻、ｐ．４００−４０８）、四塩化炭素による肝硬変モデル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２年、第３７巻、ｐ．７９７−８０５）、メタバナジン酸アンモニウムによる腎線維症モデル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００２年、第６４巻、ｐ．５１７−５２５）、慢性腎不全モデル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９８年、第５４巻、ｐ．９９−１０９）又はケロイドモデル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、第１３２巻、ｐ．４９１−４９６）が挙げられる。ブレオマイシン誘発肺線維症モデルは、肺線維症のモデルとして一般的であるが、その病態は特発性肺線維症に近いとされている。
【００４６】
上記のラクタム誘導体の線維症の治療又は予防に対する有効性は、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル試験を用いて、例えば、線維芽細胞の収縮能の指標であるコラーゲンゲル面積を測定し、面積の縮小を指標に評価することができる。また、上記の病態モデル動物を用いて、例えば、線維化の特徴的指標である組織中ハイドロキシプロリン量の低下を指標に評価することができる。
【００４７】
光毒性とは、一般的には皮膚内に吸収された薬剤が、光エネルギーによって光化学反応を起こし活性化された結果、毒性を獲得して組織を傷害する性質をいう。
【００４８】
上記のラクタム誘導体が光毒性を有していないことは、例えば、マウスを用いた光毒性試験又はモルモット若しくはウサギを用いた光毒性試験で評価できる。
【００４９】
肝毒性とは、服用した薬剤に肝臓が暴露されることにより、局所痛、関節痛、胃腸障害、全身倦怠感、黄疸、肝腫大、腹水、脾臓腫大、浮腫、肝性脳症、肝性昏睡又は圧痛などの症状を引き起こすものであり、ピルフェニドンで認められる肝毒性はチトクロムＰ４５０（以下、ＣＹＰ）誘導に起因するとの報告がある（ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＭＥＤＩＣＩＮＥＳ  ＡＧＥＮＣＹ、ＣＨＭＰ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔ、２０１０年、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｎｏ．ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／００２１５４）。
【００５０】
上記のラクタム誘導体の薬物代謝酵素ＣＹＰ誘導作用が低いことは、例えば、ヒト凍結肝細胞を用いたＣＹＰ誘導試験（日薬理誌、２００９年、第１３４巻、ｐ．３３０−３３３）で評価できる。
【００５１】
消化器系障害とは、服用した薬剤により、上腹部不快感、腹痛、腹部膨満感、食欲不振、悪心、嘔吐又は下痢などの症状を引き起こすものである。
【００５２】
上記のラクタム誘導体の消化器系障害作用が低いことは、例えば、ラットにおける色素を用いた胃排泄能に関する試験若しくは炭素末を用いた小腸輸送能に関する試験又はフェレット催吐に関する試験で評価できる。
【００５３】
上記のラクタム誘導体は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル又はヒト）、特にヒトに対して投与した場合に、線維症の病態の改善、治療又は予防効果を発揮できる。
【００５４】
上記のラクタム誘導体は、無添加の状態で又は医薬として許容される担体を配合した製剤として、経口的又は非経口的に投与できる。
【００５５】
上記のラクタム誘導体を含有する製剤を経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤及びマイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤又は坐剤が挙げられる。また、上記のラクタム誘導体は、適当な基剤（例えば、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物又はポリグリセロール脂肪酸エステル）と組み合わせて、徐放性製剤とすることも可能であり、線維症の治療に有効である。また、上記のラクタム誘導体のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、微粉末化又は包装化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。
【００５６】
上記のラクタム誘導体を有効成分として含有する医薬の剤形は、製剤分野で一般的に用いられている方法に従って調製できる。この場合、必要に応じて、製剤分野において一般的に用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤又は乳化剤などを含有させて調製できる。
【００５７】
錠剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤又は滑沢剤を含有させて行うことができ、丸剤及び顆粒剤の調製は、例えば、賦形剤、結合剤又は崩壊剤を含有させて行うことができる。また、散剤及びカプセル剤の調製は、例えば、賦形剤を含有させて行うことができ、シロップ剤の調製は、例えば、甘味剤を含有させて行うことができ、乳剤及び懸濁剤の調製は、例えば、界面活性剤、懸濁化剤又は乳化剤を含有させて行うことができる。
【００５８】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム又は硫酸カルシウムが挙げられる。結合剤としては、例えば、デンプンのり液、アラビアゴム液、ゼラチン液、トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液又はグリセリンが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン又は炭酸カルシウムが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム又は精製タルクが挙げられる。甘味剤としては、例えば、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン又は単シロップが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル又はステアリン酸ポリオキシル４０が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース又はベントナイトが挙げられる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン又はポリソルベート８０が挙げられる。
【００５９】
さらに、上記のラクタム誘導体を含有する製剤を上記の剤形に調製する場合は、製剤分野において一般的に用いられる、着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤などを添加してもよい。
【００６０】
上記のラクタム誘導体の投与量は、目標とする治療効果、投与方法、年齢又は体重などによって変化するので一概には規定できないが、通常一日の経口的な投与量は、有効成分として１００〜１００００ｍｇが好ましく、２００〜８０００ｍｇがより好ましい。これを１日に１〜５回に分割して投与すればよい。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を示して本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６２】
（実施例１）  ５−メチル−１−フェニルピペリジン−２−オンの合成：
〔第１工程〕  ５−メチル−１−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オンの合成：
２−ヒドロキシ−５−メチルピリジン（１０．０ｇ、９２．０ｍｍｏｌ）と酸化第一銅（０．６５６ｇ、４．５８ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１３．９ｇ、１０１ｍｍｏｌ）の混合物にブロモベンゼン（２８．８ｍＬ、２７５ｍｍｏｌ）を加え、反応容器内をアルゴン置換した後、１２０℃で１７時間撹拌した。反応混合液に酸化第一銅（０．１９７ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（４．１８ｇ、３０．２ｍｍｏｌ）とブロモベンゼン（８．６４ｍＬ、８２．５ｍｍｏｌ）を追加し、反応容器内をアルゴン置換した後、１２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をセライトろ過し、得られたろ液を減圧濃縮し、残渣に水を加えた。ジクロロメタンで抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン、ヘキサン、ジエチルエーテルを加えて再結晶を行い、析出した固体をろ取した。得られた固体及びろ液をそれぞれアミンシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝３／７〜１７／３）にて精製し、まとめて乾燥して、以下の化学式で示される５−メチル−１−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オンを１５．２ｇ（収率８９％）得た。
【化４】
2013018685.tif 000006
1H-NMR (400MHz, CDCl3)δ: 7.51-7.46 (2H, m), 7.43-7.36 (3H, m), 7.27 (1H, dd, J=9.3, 2.7 Hz), 7.12-7.10 (1H, m), 6.61 (1H, d, J=9.3 Hz), 2.11 (3H, s).
MS (ESI)： 186 ([M+H]+).【００６３】
〔第２工程〕  ５−メチル−１−フェニルピペリジン−２−オンの合成：
５−メチル−１−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オン（３．００ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）のエタノール（３０ｍＬ）溶液に二酸化白金（０．３６８ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を加え、水素雰囲気下室温で１３時間撹拌した。反応混合物をセライトろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝９／１１〜３／１）にて精製して以下の化学式で示される５−メチル−１−フェニルピペリジン−２−オン（以下、実施例１の化合物）を３．０６ｇ（定量的）得た。
【化５】
2013018685.tif 000007
1H-NMR (400MHz, CDCl3)δ: 7.42-7.36 (2H, m), 7.27-7.23 (3H, m), 3.57 (1H, ddd, J=11.9, 4.9, 1.8 Hz), 3.33 (1H, dd, J=11.9, 10.2 Hz), 2.66-2.50 (2H, m), 2.21-2.09 (1H, m), 2.01-1.93 (1H, m), 1.67-1.57 (1H, m), 1.07 (3H, d, J=6.8 Hz).
MS (ESI)： 190 ([M+H]+).
IR (KBr, cm-1)： 3050, 2935, 2899, 2873, 2827, 1646, 1589, 1490, 1458, 1412, 1354, 1277, 1219, 1181, 1149, 1076, 1027, 774, 737.
Mp: 61-62 ℃【００６４】
（実施例２）  肺線維芽細胞を包理培養したコラーゲンゲルの収縮に対する作用：
ヒト肺線維芽細胞ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔであるＨＦＬ−１細胞を包埋培養したコラーゲンゲルの収縮に対する実施例１の化合物の作用を検討した。コラーゲンゲル収縮は、Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００９年、第２２巻、ｐ．４８７−４９１に記載の方法を一部改変して評価した。【００６５】
０．０２Ｎ酢酸に溶解したラット尾由来I型コラーゲン（ベクトン・ディッキンソン）を、ペニシリン／ストレプトマイシン含有低グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＤＭＥＭ）で希釈し、同培地に懸濁したＨＦＬ−１細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）と混和した。混和液を１Ｎ  ＮａＯＨで中和し、２４ウェル平底プレートの各ウェルに０．５ｍＬ（コラーゲン濃度２．５ｍｇ／ｍＬ、細胞密度３×１０５個／ｍＬ）を分注した後、３７℃、３０分間インキュベーションし、混和液をゲル化させた。ＤＭＥＭをコラーゲンゲル上部に添加し、さらに３７℃、２４時間インキュベーションした。【００６６】
その後、ＤＭＥＭを０．９６ｍＬ添加した１２ウェル平底プレートの各ウェルにコラーゲンゲルを移して浮遊させ、デジタルカメラで各ウェルのコラーゲンゲルを撮影した。続いて、ＤＭＳＯで溶解後、ＤＭＥＭで希釈した実施例１の化合物を０．１２ｍＬ各ウェルに加え（化合物最終濃度３０００μｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯ最終濃度０．５％）、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．１２ｍＬ各ウェルに添加し（最終濃度３ｎｇ／ｍＬ）、さらに３７℃、２４時間インキュベーションした後、デジタルカメラでコラーゲンゲルを撮影した。なお、ＴＧＦ−β１非添加かつ化合物非添加を無処置対照とし、ＴＧＦ−β１添加かつ化合物非添加をＴＧＦ−β１処置対照とした。【００６７】
撮影したコラーゲンゲル画像の面積を、粒子解析ｖｅｒｓｉｏｎ３（住友金属テクノロジー）を用いて計測した。得られた面積値から、各ゲルについて化合物添加前を１としたときの化合物添加後の面積比を求め、下記式にて、ＴＧＦ−β１添加で生じたコラーゲンゲル収縮に対する抑制率（％）を算出した。
抑制率（％）＝（１−（[無処置対照の面積比]−[各ゲルの面積比]）
／（[無処置対照の面積比]−[ＴＧＦ−β１処置対照の面積比]））×１００【００６８】
その結果、ＴＧＦ−β１添加により生じたコラーゲンゲルの収縮は、実施例１の化合物の３０００μｍｏｌ／Ｌ添加により統計学的に有意に抑制された（抑制率７５．４±２８．１％（平均値±標準偏差）；Ｐ＜０．０１、ｔ検定）。【００６９】
この結果から、実施例１の化合物は肺線維芽細胞の収縮を抑制し、ひいては線維化抑制作用を示すことが明らかとなった。【００７０】
（実施例３）  マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおける評価：
マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルの肺組織中ハイドロキシプロリン量に対する実施例１の化合物の作用を検討した。マウスブレオマイシン誘発肺線維症モデルとして、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８年、第５９０巻、ｐ．４００−４０８に記載の方法を一部改変して用いた。【００７１】
ＩＣＲ系マウス（雄、１３週齢、日本チャールス・リバー）にブレオマイシン（日本化薬）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で、５日間連日、１日１回尾静脈内投与し、線維化を惹起した。線維化を惹起しないマウス（正常群）には、生理食塩水を同様に投与した。【００７２】
線維化を惹起したマウスに、ブレオマイシン投与開始日から１０日間連日、実施例１の化合物を３３ｍｇ／ｋｇの用量で、１日３回経口投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）。なお、実施例１の化合物は、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。正常群及び溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。【００７３】
実施例１の化合物投与終了日の翌日に、イソフルラン麻酔下にて放血致死後、左肺を採取した。線維化の指標である肺組織中ハイドロキシプロリン量は、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ法（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、１９６１年、第９３巻、ｐ．４４０−４４７）を一部改変して以下の通り定量した。採取した左肺（全部）に蒸留水を１ｍＬ加えホモジナイズし、これに濃塩酸を１ｍＬ加えて、１２０℃にて２４時間加熱した。その後、５Ｎ  ＮａＯＨを２．４ｍＬ加えて中和し、これを測定用試料とした。測定用試料を蒸留水で適宜希釈し、１．４％クロラミンＴ溶液を１ｍＬ加えて室温にて２０分間反応させた後、３．１５Ｍ過塩素酸及び２０％パラジメチルアミノベンズアルデヒド／２−メトキシエタノール溶液を各々１ｍＬ加えて６０℃にて２０分間反応させた。その後、直ちに水浴中で冷却し、吸光度を測定した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｏｄｅｌ  ６８０）にて測定波長５７０ｎｍを測定した。肺組織（左肺）中のハイドロキシプロリン量は、直線回帰解析により得られた検量線（１〜１５μｇ）から算出した。【００７４】
肺組織中ハイドロキシプロリン量の定量結果を図１に示す。図中の値は平均値±標準誤差（ｎ＝１０）を示す。図中の「正常」は、線維化を惹起しないマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（正常群）を示し、「溶媒」は、線維化を惹起したマウスに０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒群）を示し、「実施例１の化合物」は、線維化を惹起したマウスに実施例１の化合物１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを経口投与した群を示す。＃印は正常群との比較（Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定）で統計学的に有意であることを示し（＃：Ｐ＜０．０５）、＊印は溶媒群との比較（Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定）で統計学的に有意であることを示す（＊＊：Ｐ＜０．０１）。【００７５】
溶媒群の肺組織中ハイドロキシプロリン量は、正常群に比べ統計学的に有意に増加し、ブレオマイシン投与により肺線維化が惹起されていることが示された。ブレオマイシン投与により線維化を惹起したマウスに、実施例１の化合物を投与することにより、肺組織中ハイドロキシプロリン量は、正常群と同等のレベルにまで抑制され、その値は溶媒群に比べ統計学的に有意に減少した。【００７６】
この結果から、実施例１の化合物は優れた線維化抑制効果を示すことが明らかとなった。【００７７】
（実施例４）  マウスにおける化合物の光毒性評価：
マウスにおける実施例１の化合物の光毒性作用を、ピルフェニドンと比較検討した。ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雌、７週齢、日本チャールス・リバー）に、実施例１の化合物を５００及び１０００ｍｇ／ｋｇ、又はピルフェニドンを５００ｍｇ／ｋｇの用量で単回経口投与した。なお、実施例１の化合物及びピルフェニドンは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。【００７８】
投与直後、各群１０例のうち５例は紫外線照射装置（デルマレイ−２００  タイプＡ・ＮＢ及びデルマレイ−２００  タイプＡ・Ｂ；テルモクリニカル・サプライ社）下にセットして、紫外線（照射総線量約２０Ｊ／ｃｍ２：放射照度約１．４ｍＷ／ｃｍ２、４時間照射）を照射し（紫外線照射動物）、各群の残りの５例は非照射とした（非照射動物）。紫外線の照射終了後（０．５、２４、４８及び７２時間後）、耳介の皮膚に発現した紅斑及び浮腫の程度を肉眼的に観察し、紫外線照射動物の観察時に、相応する各群の非照射動物についても観察し、両者を比較して光毒性の有無を評価した。【００７９】
溶媒群及び実施例１の化合物の５００及び１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、紫外線照射動物及び非照射動物のいずれにも紅斑及び浮腫はみられなかった。一方、ピルフェニドンの５００ｍｇ／ｋｇ投与群では、非照射動物の全てにおいて紅斑及び浮腫はみられなかったが、紫外線照射動物の５例中４例で照射後２４時間に紅斑がみられた。【００８０】
この結果から、ピルフェニドンが光毒性を示すのに対し、実施例１の化合物は、光毒性を示さないことが明らかとなった。【００８１】
（実施例５）  ヒト凍結肝細胞を用いた薬物代謝酵素ＣＹＰ誘導試験：
ヒト凍結肝細胞を用いた薬物代謝酵素ＣＹＰ誘導試験を実施し、実施例１の化合物の薬物代謝酵素ＣＹＰに対する誘導作用を評価した。【００８２】
Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社）を用いてヒト凍結肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社）の懸濁液を調製した。４８ウェルプレートに、１ウェルあたり１．２×１０５個の細胞を播種し、４８時間の前培養を行った。前培養後、実施例１の化合物及びピルフェニドンそれぞれを１０、１００及び１０００μｍｏｌ／Ｌ含むＣＰ培地（Ｃｅｌｓｉｓ社）で２４時間培養した。陰性対照群は、０．１（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯを含むＣＰ培地（Ｃｅｌｓｉｓ社）で２４時間培養した。【００８３】
実施例１の化合物及びピルフェニドンの暴露２４時間後に、ＫＨＢ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｓｉｓ社）で細胞を洗浄した。洗浄後、１２５μｍｏｌ／Ｌ  Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ含有ＫＨＢ  Ｂｕｆｆｅｒを０．３ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させた。反応後の上清を２０μＬ分取し、氷冷したＫＨＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  １８０μＬで希釈し、これを測定用試料とした。【００８４】
測定用試料を２０μＬ分取し、０．１％ギ酸水溶液１８０μＬを添加して、撹拌後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ＨＰＬＣによる分析は以下の条件で実施した。ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍはＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用した。カラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＭＧＩＩＩ  ２．０ｍｍ  ＩＤ×５０ｍｍ  Ｃ１８（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ社）を使用した。移動相は０．１％ギ酸／アセトニトリルを用いた。ＭＳ／ＭＳ  ｓｙｓｔｅｍはＡＰＩ−４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により得られたクロマトグラムから、ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅの代謝物である６β−ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ量を定量し、ＣＹＰ３Ａ４酵素活性（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／１０６  ｃｅｌｌｓ）を算出した。【００８５】
その結果を表１に示す。なお、ＣＹＰ３Ａ４酵素活性の値が大きいほど、化合物の薬物代謝酵素ＣＹＰに対する誘導作用が高いことを示す。また、化合物を暴露していない陰性対照群のＣＹＰ３Ａ４酵素活性を１．００とした場合における化合物で処理した際のＣＹＰ３Ａ４酵素活性を誘導倍率として示した。【００８６】
【表１】
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【００８７】
この結果から、実施例１の化合物はピルフェニドンより薬物代謝酵素ＣＹＰに対する誘導作用が低いことが明らかとなった。これは、実施例１の化合物の肝毒性が低いことを示唆するものであった。【００８８】
（実施例６）  ラットにおける化合物の消化器系障害評価：
実施例１の化合物の消化器系障害作用を、ラットにおける胃排泄能試験によりピルフェニドンと比較検討した。ＳＤ系ラット（雄、６週齢、日本チャールス・リバー）に、実施例１の化合物を３０ｍｇ／ｋｇ、又はピルフェニドンを３０ｍｇ／ｋｇの用量で単回経口投与した。なお、実施例１の化合物及びピルフェニドンは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。【００８９】
被験化合物投与前日から１８時間以上ラットを絶食させた。被験化合物投与６０分後に０．１％エバンスブルー溶液を０．２ｍＬの容量（２００μｇ）で経口投与した。０．１％エバンスブルー溶液投与３０分後に頸椎脱臼によりラットを安楽死させ、直ちに開腹し、胃を摘出した。摘出した胃を６．３ｍｏｌ／Ｌの尿素液４ｍＬ中に浸漬、振とうした。さらにアセトン ８ｍＬ、２０％ＺｎＳＯ４  ０．４ｍＬ、１Ｎ  ＮａＯＨ  ０．４ｍＬの順に添加し、振とうを繰り返した。その後、溶液から胃を取り出し、メスシリンダーを用いて溶液の容量を測定した。溶液を濾紙で濾過後、波長６２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で測定した。検量線用標準液から作成した検量線を用いて、溶液中のエバンスブルー色素の濃度を求めた。溶液中に含まれるエバンスブルー色素量を算出し、胃残存色素量とした。胃残存色素量及び胃排泄能は下記式より算出した。
胃残存色素量（μｇ）＝濃度（μｇ／ｍＬ）×容量（ｍＬ）
胃排泄能（％）＝（１−胃内残存色素量（μｇ）／投与したエバンスブルーの量（μｇ））×１００【００９０】
また、実施例１の化合物の消化器系障害作用を、ラットにおける小腸輸送能試験によりピルフェニドンと比較検討した。ＳＤ系ラット（雄、６週齢、日本チャールス・リバー）に、実施例１の化合物を３０ｍｇ／ｋｇ、又はピルフェニドンを３０ｍｇ／ｋｇの用量で単回経口投与した。なお、実施例１の化合物及びピルフェニドンは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して用いた。溶媒群には、０．５％メチルセルロース溶液を同様に投与した。【００９１】
被験化合物投与前日から１８時間以上ラットを絶食させた。被験化合物投与６０分後に５％炭素末懸濁液（１０％アラビアゴム（和光純薬工業）に炭素末（和光純薬工業）を５％の割合で懸濁させた液）を１ｍＬの容量で経口投与した。５％炭素末懸濁液投与３０分後に頸椎脱臼によりラットを安楽死させ、直ちに開腹し、胃及び腸管を、腸間膜を剥離しながら摘出した。腸管をのばして、小腸全長（胃幽門部から盲腸開口部まで）及び胃幽門部から炭素末懸濁液先端部までの距離を、メジャーを用いて測定した。小腸全長に対する５％炭素末懸濁液の移行率を小腸輸送能（％）として、下記式により算出した。
小腸輸送能（％）＝胃幽門部から炭素末懸濁液先端部までの距離／小腸全長×１００【００９２】
胃排泄能試験及び小腸輸送能試験の結果を表２に示す。表中の値は平均値±標準誤差（ｎ＝８）を示す。表中の「溶媒」は０．５％メチルセルロース溶液を経口投与した群（溶媒群）を示し、「実施例１の化合物」は実施例１の化合物３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した群を示し、「ピルフェニドン」はピルフェニドン３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した群を示す。【００９３】
【表２】
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【００９４】
この結果から、実施例１の化合物はピルフェニドンより胃排泄能及び小腸輸送能に及ぼす影響が低いことが明らかとなった。これは、実施例１の化合物の消化器系障害作用が低いことを示唆するものであった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の新規なラクタム誘導体は、優れた抗線維化作用を有し、光毒性を有さず、肝毒性及び消化器系障害も軽減されていることから、安全性の高い医薬として用いることができ、特に、線維症の治療剤又は予防剤として利用できる。
【図１】
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【国際調査報告】
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