(57)【要約】（Ａ）水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下、有機原料をコハク酸に変換する工程、及び、（Ｂ）該コハク酸を回収する工程、を有するコハク酸の製造方法であって、該（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程が、（ａ１）該水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程、次いで、（ａ２）該水性媒体にアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加する工程を含むことを特徴とする、コハク酸の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下、有機原料をコハク酸に変換する工程、及び、（Ｂ）該コハク酸を回収する工程、を有するコハク酸の製造方法であって、
該（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程が、
（ａ１）該水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程、
次いで、（ａ２）該水性媒体にアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加する工程
を含むことを特徴とする、コハク酸の製造方法。
【請求項２】
前記（ａ１）水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程が、該水性媒体をアルカリ金属塩及び／又はアルカリ金属水酸化物で中和する工程である、請求項１に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項３】
前記（ａ１）水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程におけるコハク酸アルカリ金属塩濃度が１３００ｍＭ以下である、請求項１または請求項２に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項４】
前記コハク酸アルカリ金属塩が、コハク酸ジナトリウム及び／又はコハク酸ジカリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、糸状菌、及び酵母菌からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて低減するように改変された微生物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項７】
前記微生物が、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株に比べて増強するように改変された微生物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項８】
前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオン、及び炭酸ガスからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項９】
前記（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程を、嫌気的雰囲気下で行なう、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項１０】
前記（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程を、回分反応、または半回分反応で行なう、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項１１】
前記有機原料がグルコース及び／又はスクロースである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたコハク酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸、アジピン酸等の脂肪族ジカルボン酸類は、ポリエステル、ポリアミド等のポリマー原料として、また、食品、医薬品、その他化学品の合成原料として広く用いられている。これら脂肪族ジカルボン酸は、現在、化石燃料資源由来の原料より、工業的に製造されているが、近年の化石燃料資源枯渇への危惧や大気中の二酸化炭素増加という地球規模での環境問題の背景から、バイオマス資源から誘導する手法が注目されている。【０００３】
コハク酸を発酵生産させる場合には、コハク酸の生成とともにｐＨが低下するため、通常、中和によりｐＨを調整しながら反応が行われる。【０００４】
コハク酸の発酵生産におけるｐＨ調製に用いられる中和剤として、アンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の塩基性化合物の組成物が使用されることはよく知られており、これら塩基性化合物の組成物を用いた中和処理によって、ｐＨ低下による微生物の生育阻害、代謝活性の低下、死滅を防ぎ、コハク酸生産性の低下を防止できることが知られている。【０００５】
特許文献１には、一定範囲の濃度の１価カチオンを含む水性媒体中で炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムによって中和しながらコハク酸等の非アミノ有機酸を製造する方法が記載されている。
特許文献２には、微生物の培養増殖工程及び有機酸生成反応工程でナトリウム化合物及び／又はカリウム化合物によって中和することによりコハク酸等の有機酸を製造する方法が記載されている。
非特許文献１には、重炭酸ナトリウムを予め添加してアンモニア水によって中和しながらコハク酸等の有機酸を製造する方法が記載されている。
非特許文献２には、微生物をリサイクルさせた連続培養系において、中和剤を水酸化ナトリウムからアンモニア水に切り替えてコハク酸等の有機酸を製造する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０２６３４９号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−１９７８２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  Ｓｅｐ；６８（４）：４７５−８０．
【非特許文献２】Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８  Ｊｕｌ；１８（７）：１２５２−６．
【発明の概要】
【０００８】
コハク酸を発酵生産する場合には、コハク酸を高濃度に蓄積させることが求められるが、浸透圧増加によるストレス、生成物阻害による代謝活性低下等の影響により、コハク酸が高濃度に蓄積するに従って生産速度が低下するという問題があった。
特許文献１に記載の方法は、中和剤として炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウムを用いているが、これらは水に溶けにくいという性質を持つため、厳密なｐＨ制御が難しく、微生物にとってコハク酸生成に最も適した範囲にｐＨを保持する上で課題があった。
特許文献２に記載の方法は、微生物の培養増殖工程と有機酸生成反応工程とで使用される中和剤の特定の組み合わせによってコハク酸生産性を向上させる方法であり、コハク酸が高濃度に蓄積したときの生産速度の低下は依然として問題であった。
非特許文献１に記載の方法は、予め重炭酸ナトリウムを添加してコハク酸生成に適した重炭酸イオンを供給することによってコハク酸生産性を向上させる方法であり、アンモニア水を用いてｐＨ調整しながらコハク酸生成しているものの、コハク酸が高濃度に蓄積したときの生産速度の低下は依然として問題であった。
非特許文献２に記載の方法は、微生物をリサイクルさせた連続培養系における適切な中和剤を検討するために複数種類の中和剤を切り替えてｐＨ調製を行っているが、低いコハク酸濃度でほぼ一定に推移しており、コハク酸を高濃度に蓄積させること、そのときのコハク酸生産性には課題があった。
上記の特許文献１および２並びに非特許文献１および２に記載の中和処理方法はいずれもｐＨの低下を防止し、コハク酸生産性を向上させるための方法であるが、コハク酸高濃度条件における生産速度について改善の余地があり、より一層の生産性の高い中和処理技術が求められていた。
本発明の課題は、発酵液のｐＨの低下を防止し、コハク酸高濃度条件における生産速度を向上させ、コハク酸をより効率よく製造する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下、有機原料をコハク酸に変換する工程において、水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩の濃度を特定の範囲とし、次いで、アンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加することにより、コハク酸の生産速度が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］（Ａ）水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下、有機原料をコハク酸に変換する工程、及び、（Ｂ）該コハク酸を回収する工程、を有するコハク酸の製造方法であって、
該（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程が、
（ａ１）該水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程、
次いで、（ａ２）該水性媒体にアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加する工程
を含むことを特徴とする、コハク酸の製造方法。
［２］前記（ａ１）水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程が、該水性媒体をアルカリ金属塩及び／又はアルカリ金属水酸化物で中和する工程である、［１］に記載のコハク酸の製造方法。
［３］前記（ａ１）水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程におけるコハク酸アルカリ金属塩濃度が１３００ｍＭ以下である、［１］または［２］に記載のコハク酸の製造方法。
［４］前記コハク酸アルカリ金属塩が、コハク酸ジナトリウム及び／又はコハク酸ジカリウムである、［１］〜［３］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［５］前記微生物が、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、糸状菌、及び酵母菌からなる群より選択される少なくとも一種である、［１］〜［４］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［６］前記微生物が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて低減するように改変された微生物である、［１］〜［５］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［７］前記微生物が、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株に比べて増強するように改変された微生物である、［１］〜［６］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［８］前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオン、及び炭酸ガスからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する、［１］〜［７］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［９］前記（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程を、嫌気的雰囲気下で行なう、［１］〜［８］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［１０］前記（Ａ）有機原料をコハク酸に変換する工程を、回分反応、または半回分反応で行なう、［１］〜［９］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［１１］前記有機原料がグルコース及び／又はスクロースである、［１］〜［１０］のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
［１２］［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【００１１】
本発明により、発酵法によるコハク酸の製造において、コハク酸高濃度条件における生産速度を高めることができ、結果としてコハク酸の製造コストを低減できる。また、本発明は、環境問題、化石燃料資源の枯渇問題等の解決に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜本発明に用いる微生物＞
本発明に用いる微生物は、コハク酸生産能を有する微生物であれば、限定されない。
本発明において、「コハク酸生産能」とは、該微生物を培地中で培養したときに該培地中にコハク酸を生成蓄積することができることをいう。
【００１３】
本発明に用いる微生物は、本来的にコハク酸生産能を有する微生物または育種によりコハク酸生産能を付与したものでもよい。
育種によりコハク酸生産能を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられる。コハク酸生合成経路における酵素遺伝子の発現強化など公知の方法を採用することができる。例えば、コハク酸生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。
【００１４】
また、本発明では微生物の菌体の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
【００１５】
本発明に用いる微生物は、コハク酸生産能を有していれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、糸状菌、又は酵母菌からなる群より選択される微生物が挙げられる。その中でも、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、酵母菌が好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。
【００１６】
本発明に用いるコリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌またはアースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いるコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ  Ｗ，  Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｗ，  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ＫＨ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９１，  Ｖｏｌ．４１，  ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
また、上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００１８】
本発明に用いるアナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
本発明に用いるアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。
【００１９】
本発明に用いる糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等が挙げられる。このうち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）等が挙げられる。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属では、リゾパス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明に用いる酵母菌としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）  が挙げられる。
【００２１】
本発明に用いるサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）等が挙げられる。
本発明に用いるシゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。
【００２２】
本発明に用いるカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。
本発明に用いるピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ），  ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）等が挙げられる。
【００２３】
本発明に用いるクルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）は、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等が挙げられる。
本発明に用いるチゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）等が挙げられる。
【００２４】
本発明の製造方法においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨとも呼ぶ）活性が低減するように改変された微生物を用いることが好ましい。ここで、「ＬＤＨ活性」とは、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２７）をいう。「ＬＤＨ活性が低減された」とは、非改変株と比較してＬＤＨ活性が低下していることをいう。ＬＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＬＤＨ活性は完全に消失していてもよい。ＬＤＨ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫａｎａｒｅｋらの方法（Ｋａｎａｒｅｋ  Ｌ，  Ｈｉｌｌ  ＲＬ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９６４，  Ｖｏｌ．２３９，  ｐ４２０２−４２０６）によりＬＤＨ活性を測定することによって確認することができる。ＬＤＨ活性が低減した株は、ＬＤＨ遺伝子を破壊することによって作製することができ、具体的には、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）やｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈaｆｅｒ  Ａ，  Ｔａｕｃｈ  Ａ，  Ｊaｇｅｒ  Ｗ，  Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ，  Ｐuｈｌｅｒ  Ａ，  Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｖｏｌ．１４５（１），  ｐ６９−７３）等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明の製造方法においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物であってもよい。ここで、「ＰＣ活性」とは、ピルビン酸をカルボキシル化してオキサロ酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：６．４．１．１）をいう。「ＰＣ活性が増強された」とは、非改変株と比較してＰＣ活性が上昇していることをいう。ＰＣ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＰＣ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＦｉｓｈｅｒらの方法（Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＨ，  Ｍａｇａｓａｎｉｋ  Ｂ，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８４，  Ｖｏｌ．１５８（１），  ｐ５５−６２）により、ＰＣ活性を測定することによって確認することができる。
【００２６】
ＰＣ活性が増強した株の具体的な作製方法としては、例えば、特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、ｐｃ遺伝子をプラスミドにより宿主微生物中で高発現させることにより構築することができる。また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってｐｃ遺伝子の発現を増強することもできる（特開２００８−２５９４５１号公報）。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｖｅｒｔeｓ  ＡＡ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｋｕｒｕｓｕ  Ｙ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ，  Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．１４４（３），  ｐ１８１−１８５）等によって行うことができる。
具体的なｐｃ遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｃ遺伝子（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ  ＰＧ，  Ｋｒｅｕｔｚｅｒ  Ｃ，  Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｐaｔｅｋ  Ｍ，  Ｓａｈｍ  Ｈ，  Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ＢＪ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９８，  Ｖｏｌ．１４４，  ｐ９１５−９２７）などを用いることができる。また、ｐｃ遺伝子は、該コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｃ遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または該遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡであって、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好適に用いることができる。
【００２７】
さらに、本発明の製造方法においては、アセテートキナーゼ（以下、ＡＣＫとも呼ぶ）及びホスホトランスアセチラーゼ（以下、ＰＴＡとも呼ぶ）からなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が低減するように改変された微生物であってもよい。
「ＰＴＡ活性」とは、アセチルＣｏＡにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．３．１．８）をいう。「ＰＴＡ活性が低減するように改変された」とは、非改変株と比較してＰＴＡ活性が低下していることをいう。ＰＴＡ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＰＴＡ活性は完全に消失していてもよい。ＰＴＡ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫｌｏｔｚｓｃｈらの方法（Ｋｌｏｔｚｓｃｈ  ＨＲ，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９６９，  Ｖｏｌ．１２，  ｐ３８１−３８６）により、ＰＴＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００２８】
「ＡＣＫ活性」とは、アセチルリン酸とＡＤＰから酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．２．１）をいう。「ＡＣＫ活性が低減するように改変された」とは、非改変株と比較してＰＴＡ活性が低下していることをいう。ＡＣＫ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＡＣＫ活性は完全に消失していてもよい。ＡＣＫ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＲａｍｐｏｎｉらの方法（Ｒａｍｐｏｎｉ  Ｇ，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９７５，  Ｖｏｌ．４２，  ｐ４０９−４２６）により、ＡＣＫ活性を測定することによって確認することができる。
【００２９】
ＰＴＡとＡＣＫはいずれか一方を活性低下させてもよいが、酢酸の副生を効率よく低減させるためには、両方の活性を低下させることがより好ましい。
なお、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムに分類されるものも含む）においては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９９  Ｆｅｂ；１４５  （Ｐｔ２）：５０３−１３に記載されているように、両酵素はｐｔａ−ａｃｋオペロン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｘ８９０８４）にコードされているため、ｐｔａ遺伝子を破壊した場合は、ＰＴＡ及びＡＣＫの両酵素の活性を低下させることができる。
【００３０】
ＰＴＡ及びＡＣＫの活性が低減した株は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈaｆｅｒ  Ａ，  Ｔａｕｃｈ  Ａ，  Ｊaｇｅｒ  Ｗ，  Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ，  Ｐuｈｌｅｒ  Ａ，  Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｖｏｌ．１４５（１），  ｐ６９−７３）に従ってこれらの遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的には、特開２００６−００００９１号公報に開示された方法に従って行うことができる。ｐｔａ遺伝子及びａｃｋ遺伝子としては、上記ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｘ８９０８４の塩基配列を有する遺伝子のほか、宿主染色体上のｐｔａ遺伝子及びａｃｋ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
【００３１】
また、本発明の製造方法においては、フマル酸レダクターゼ（以下、ＦＲＤとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物であってもよい。ここで、「ＦＲＤ活性」とは、フマル酸を還元してコハク酸に変換する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．３．５．１、１．３．５．４）をいう。「ＦＲＤ活性が増強された」とは、非改変株と比較してＦＲＤ活性が上昇していることをいう。ＦＲＤ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＦＲＤ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＡｃｋｒｅｌｌらの方法（Ａｃｋｒｅｌｌ  ＢＡ，  Ｋｅａｒｎｅｙ  ＥＢ，  Ｓｉｎｇｅｒ  ＴＰ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９７８，  Ｖｏｌ．５３，  ｐ４６６−８３）により、ＦＲＤ活性を測定することによって確認することができる。
【００３２】
ＦＲＤ活性の増強は、例えば、ｆｒｄ遺伝子を用いた遺伝子組換え法などにより、親株である微生物を改変することによって行うことができる。また、コハク酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＳＤＨとも呼ぶ）をコードする遺伝子が、ＳＤＨ活性と同時にＦＲＤ活性を有するタンパク質をコードしている場合もある。従って、ＦＲＤ活性及びＳＤＨ活性の両方を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めてもよい。ここで、「ＳＤＨ活性」とは、コハク酸を酸化してフマル酸に変換する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．３．５．１、１．３．９９．１）をいう。ＳＤＨ活性は、公知の方法、例えばＡｃｋｒｅｌｌらの方法（Ａｃｋｒｅｌｌ  ＢＡ，  Ｋｅａｒｎｅｙ  ＥＢ，  Ｓｉｎｇｅｒ  ＴＰ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９７８，  Ｖｏｌ．５３，  ｐ４６６−８３）により、測定することができる。
【００３３】
ＦＲＤ活性が増強した株の具体的な作製方法としては、例えば、国際公開ＷＯ２００５／０２１７７０号パンフレットに記載の方法と同様にして、ｆｒｄ遺伝子またはｓｄｈ遺伝子をプラスミドにより宿主微生物中で高発現させることにより構築することができる。また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってｆｒｄ遺伝子またはｓｄｈ遺伝子の発現を増強することもできる。
具体的なｆｒｄ遺伝子としては、例えば、大腸菌由来のｆｒｄ遺伝子（国際公開ＷＯ２００５／０２１７７０号パンフレット）を挙げることができる。この遺伝子はフマル酸リダクターゼを構成する４つのサブユニット（ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ及びｆｒｄＤ）をコードする遺伝子をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を親株である微生物に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、該大腸菌由来のｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＤ遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または該遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡも好適に用いることができる。
ＳＤＨとＦＲＤ両方の活性を有するタンパク質をコードする具体的な遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｓｄｈ遺伝子（国際公開ＷＯ２００５／０２１７７０号パンフレット）などを挙げることができる。この遺伝子はコハク酸デヒドロゲナーゼを構成する３つのサブユニット（ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、及びｓｄｈＣ）をコードする遺伝子をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を親株である微生物に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、該コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、またはｓｄｈＣ遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または該遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡも好適に用いることができる。
【００３４】
さらに、本発明の製造方法においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＭＤＨとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物であってもよい。ここで、「ＭＤＨ活性」とは、オキザロ酢酸を還元してリンゴ酸に変換する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．３７）をいう。「ＭＤＨ活性が増強された」とは、非改変株と比較してＭＤＨ活性が上昇していることをいう。ＭＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＭＤＨ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＭｏｌｅｎａａｒらの方法（Ｍｏｌｅｎａａｒ  Ｄ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｓｔ  ＭＥ，  Ｄｒｙｓｃｈ  Ａ，  Ｙuｃｅｌ Ｒ  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ２０００，  Ｖｏｌ．１８２（２４），  ｐ６８８４−９１）により、ＭＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００３５】
ＭＤＨ活性が増強した株の具体的な作製方法としては、例えば、特開２００６−３２０２０８号公報に記載の方法と同様にして、ｍｄｈ遺伝子をプラスミドにより宿主微生物中で高発現させることにより構築することができる。また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってｍｄｈ遺伝子の発現を増強することもできる。
具体的なｍｄｈ遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｍｄｈ遺伝子（特開２００６−３２０２０８号公報）などを用いることができる。また、ｍｄｈ遺伝子は、該コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｍｄｈ遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または該遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡであって、ＭＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好適に用いることができる。
なお、本発明において使用する微生物は、上記改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００３６】
＜コハク酸の製造方法＞
本発明のコハク酸の製造方法は、（Ａ）水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下、有機原料をコハク酸に変換する工程（以下、「（Ａ）工程」と称する場合がある。）、及び、（Ｂ）該コハク酸を回収する工程（以下、「（Ｂ）工程」と称する場合がある。）を有するコハク酸の製造方法であって、該（Ａ）工程が、
（ａ１）該水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程、
次いで、（ａ２）該水性媒体にアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加する工程
を含むことを特徴とするものである。
【００３７】
本発明のコハク酸の製造方法に上記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを、前記（Ａ）工程に直接用いても良いが、前記（Ａ）工程を行なう前に、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養してもよい。即ち、前記微生物を予め増殖させておいた上で、前記微生物にコハク酸を生産させてもよい。後述する種培養や本培養を行なうことで、前記微生物を予め増殖させることができる。
【００３８】
種培養は、本培養に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。また、必要に応じて、前記培地に炭素源としてグルコース等の有機原料を添加してもよい。
また、種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、コハク酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
また、種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、コハク酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
【００３９】
本培養は、後述するコハク酸生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行なう場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行なう。
【００４０】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
【００４１】
また、本培養においては、前記培地に炭素源として有機原料を添加することが好ましい。本培養に用いる有機原料は、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独でも組み合わせても使用できる。
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．５〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。
【００４２】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【００４３】
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【００４４】
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【００４５】
また、本培養においては、よりコハク酸の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
【００４６】
本培養後の菌体は、後述するコハク酸生産反応（前記（Ａ）工程）に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
【００４７】
なお、種培養または本培養した微生物を、有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによってコハク酸を製造してもよいし、予め種培養または本培養を行なうことで増殖させた菌体を、有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによってコハク酸を製造してもよい。
【００４８】
以下、（Ａ）水性媒体中で微生物又はその処理物の存在下、有機原料をコハク酸に変換する工程について説明する。
【００４９】
本発明の（Ａ）工程は、（ａ１）該水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩濃度を８０ｍＭ以上に調整する工程（以下、「（ａ１）工程」と称することがある。）、次いで、（ａ２）該水性媒体にアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加する工程（以下、「（ａ２）工程」と称することがある。）を含むことを特徴とする。
【００５０】
ここで、水性媒体とは、コハク酸生産反応を行なう水溶液のことであり、後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。当該水性媒体中で、前記微生物またはその処理物と有機原料とを反応させることによりコハク酸生産反応を行なうことができる。本明細書において、水性媒体とは、反応容器に含まれる液体全てを意味する。
【００５１】
また、コハク酸アルカリ金属塩の好ましい具体例としては、コハク酸ジナトリウム、コハク酸ジカリウム等が挙げられる。
前記（ａ１）工程における水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩の濃度は、８０ｍＭ以上、好ましくは１２０ｍＭ以上、より好ましくは１６０ｍＭ以上、特に好ましくは２００ｍＭ以上である。また、水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩の濃度の上限値については特に制限はないが、本発明の効果を得たとしてもコハク酸が高濃度に蓄積するに従ってコハク酸生産速度が低下する傾向が見られることから、好ましくは１３００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、さらに好ましくは８００ｍＭ以下、特に好ましくは６５０ｍＭ以下、最も好ましくは６２０ｍＭ以下である。
本発明の効果を得るためには、水性媒体中に含有させるコハク酸アルカリ金属塩により生じるストレスによって微生物に一定の負荷を与えた状態で、そこにアンモニア及び／又はアンモニウム塩を添加してコハク酸を生成させることが必要であり、コハク酸アルカリ金属塩が上記の濃度範囲であることは、その微生物への負荷が適度なものとなる点で好ましい。
【００５２】
コハク酸アルカリ金属塩は、コハク酸アルカリ金属塩そのものを水性媒体に添加することでコハク酸アルカリ金属塩の濃度を上記範囲に調整してもよいし、コハク酸とアルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物を別々に添加することでコハク酸アルカリ金属塩を形成させ、コハク酸アルカリ金属塩の濃度を上記範囲に調整してもよい。別々に添加する場合、その順番は問わない。
ここで、アルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物としては、上記の濃度範囲でコハク酸アルカリ金属塩の濃度を調整できるものであれば特に限定されないが、ナトリウムまたはカリウムの水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等が挙げられ、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、またはそれらの混合物等が用いられる。
【００５３】
また、アルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物を水性媒体中に添加しながら、微生物またはその処理物を有機原料に作用させ、コハク酸を生成させると、生成したコハク酸が前記アルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物によって中和され、コハク酸アルカリ金属塩が生成する。したがって、コハク酸アルカリ金属塩の水性媒体中の濃度が上記範囲となるように水性媒体中に前記アルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物を添加することで調整してもよい。
この場合には、（ａ１）工程終了後、（ａ２）工程を行なう際にｐＨ調整に使用する中和剤をアルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物からアンモニア及び／又はアンモニウム塩へ切り替えればよく、本発明の効果を得るために必要なコハク酸アルカリ金属塩も有機原料から得られる点で好ましい。すなわち、本発明においては、水性媒体をアルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物を用いて中和しながら、微生物またはその処理物を有機原料に作用させることによりコハク酸アルカリ金属塩を生成させ、その濃度が８０ｍＭ以上の値になった時点で、中和剤をアルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物からアンモニア及び／又はアンモニウム塩に切り替えて、コハク酸の生産を継続することが好ましい。
【００５４】
水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩の濃度は、コハク酸の定量分析とアルカリ金属イオンの定量分析を行うことで測定することができる。このときコハク酸の濃度の値と、アルカリ金属イオンの濃度の２倍の値のうち低い方の値をコハク酸アルカリ金属塩の濃度とする。コハク酸は２価であり、アルカリ金属は１価であるためである。なお、特に（ａ１）工程において、水性媒体をアルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物を用いて中和しながら、微生物またはその処理物を有機原料に作用させることによりコハク酸アルカリ金属塩を生成させてコハク酸アルカリ金属塩の濃度を調整した場合においては、水性媒体中には、通常、コハク酸以外の有機酸等も一定量副生し、それらもアルカリ金属塩又はアルカリ金属水酸化物によって中和されることになるため、水性媒体中のコハク酸の濃度は、アルカリ金属イオンの濃度の２倍の値よりも低くなる。そのため、この場合には、水性媒体中のコハク酸の濃度をコハク酸アルカリ金属塩の濃度と考えることができる。
【００５５】
コハク酸の定量分析方法としては、液体クロマトグラフィーを用いる有機酸分析の方法等が挙げられ、例えば、以下のような条件で分析することができる。
＜有機酸分析＞
カラム：信和加工（株）製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩ．Ｄ．×  ３０ｃｍ
溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ2Ｏ）
温度：６０℃
【００５６】
アルカリ金属イオンの定量分析方法としては、イオン分析計を用いるカチオン分析の方法等が挙げられ、例えば、以下のような条件で分析することができる。
＜カチオン分析＞
カラム：東亜ディーケーケー（株）製  ＰＣＩ−３１１Ｓ
溶離液：東亜ディーケーケー（株）製  陽イオン１，２価用２Ｌ溶離液（６５４７７８０Ｋ）
温度：４０℃
【００５７】
本発明の製造方法において重要なことは、水性媒体中に含有させるコハク酸塩としてアルカリ金属塩を選択し、かつ、その水性媒体中にて、コハク酸を生成させる際のｐＨ調整に使用する中和剤としてアンモニア及び／又はアンモニウム塩を選択することである。即ち、前記（ａ１）工程の後、次いで、前記（ａ２）工程を行うことが重要である。
【００５８】
（ａ２）工程において、添加するアンモニア及び／又はアンモニウム塩の具体例としては、アンモニア（水酸化アンモニウム）、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはそれらの混合物等が挙げられ、中でもアンモニア（水酸化アンモニウム）、重炭酸アンモニウム、またはこれらの混合物が好ましい。
アンモニア及び／又はアンモニウム塩の添加方法は、水性媒体が後述するｐＨの範囲となれば特に制限はなく、（ａ２）工程を行なう間、添加し続けてもよいし、例えば、３０分間〜１時間に１回添加するなど、断続的に添加してもよい。
【００５９】
（ａ１）工程において、コハク酸アルカリ金属塩の代わりにコハク酸アンモニウムやコハク酸アルカリ土類金属塩を用いても、コハク酸高濃度条件における生産速度を高めることができるという効果は得られにくくなる傾向にある。また、（ａ２）工程において、アンモニア及び／又はアンモニウム塩の代わりにアルカリ金属やアルカリ土類金属化合物の塩や水酸化物を用いても、水性媒体のｐＨ調整自体は可能であるが、コハク酸高濃度条件における生産速度を高めることができるという効果は得られにくくなる傾向にある。
【００６０】
これは、コハク酸アルカリ金属塩によって受けるストレスと、その後、中和剤として用いられるアンモニア及び／又はアンモニウム塩によって受けるストレスが微生物の代謝活性に変化を与え、コハク酸の生産性が向上すると考えられる。アンモニア又はアンモニウム塩は、微生物のアミノ酸合成経路等のアンモニア固定経路によって取り込むことが可能であり、それら代謝経路の活性化によって還元力の獲得に有利となる。コハク酸アルカリ金属塩によってストレスを受けている状態から、この代謝活性の変化が生じることで、酸化還元バランスが改善し、コハク酸の生産性が向上すると考えられる。
非特許文献１では、予め重炭酸ナトリウムを添加しているが、コハク酸アルカリ金属塩が十分存在していない状態で、アンモニア水を用いて中和しながらコハク酸を生成させており、微生物がコハク酸アルカリ金属塩により生じるストレス負荷を受けていない状態で、アンモニア水によるストレスを与えてもコハク酸高濃度条件における生産速度を高めることができるという効果は得られないと考えられる。
非特許文献２では、微生物をリサイクルさせた連続培養系において、中和剤を水酸化ナトリウムからアンモニア水に切り替えてコハク酸を生成させているが、中和剤を切り替えたときの水性媒体中のコハク酸の濃度は約９ｇ／Ｌ（コハク酸ナトリウムの濃度は約７６ｍＭ）と低いために、この微生物は本発明の効果を得るために必要なコハク酸ナトリウムによるストレス負荷を受けていないため、コハク酸高濃度条件における生産速度を高めることができるという効果は得られないと考えられる。
【００６１】
また、以下に、（Ａ）工程におけるコハク酸生産反応条件を説明する。以下に記載する反応条件は、特に断りのない限り、（ａ１）工程、および（ａ２）工程に共通する。
【００６２】
（Ａ）工程に用いる有機原料としては、前記微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン又はセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール又はリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース又はフルクトースが好ましく、特にグルコース又はスクロースが好ましい。
【００６３】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液又は糖蜜なども使用され、具体的にはサトウキビ、甜菜又はサトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独でも組み合わせても使用できる。前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、反応液に対して、通常５％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、一方、通常３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下である。また、反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。
【００６４】
上記有機原料は、水性媒体に含ませることができる。該水性媒体としては、上述したように、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましく、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００６５】
また、水性媒体には、例えば上記した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス（炭酸ガス）を含有させることが好ましい。炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、水性媒体における炭酸イオン又は重炭酸イオンの濃度は、通常１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上であり、また、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下である。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、水性媒体１Ｌ当たり通常５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましく、一方、水性媒体１Ｌ当たり通常２５ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下、さらに好ましくは１０ｇ以下の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましい。
【００６６】
（Ａ）工程において、水性媒体のｐＨは、用いる上記微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、水性媒体中のｐＨを、通常５．５以上、好ましくは６以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは７．１以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが望ましいので、前記（ａ２）工程における反応中も必要に応じて水性媒体中のｐＨをアンモニア及び／又はアンモニウム塩によって前記範囲内に調節するとよい。
【００６７】
（Ａ）工程のコハク酸生産反応に用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体重量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
【００６８】
コハク酸生産反応の時間は、特に限定はないが、（ａ１）工程の反応時間と（ａ２）工程の反応時間とを合算して、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。（ａ１）工程と（ａ２）工程との間の時間配分に特に制限はなく、コハク酸生産反応に用いる菌体量などのその他の条件にもよるが、例えば、（ａ１）工程を３時間以上３６時間以下行ない、次いで、（ａ２）工程を３時間以上３６時間以下行なうことが好ましい。
【００６９】
コハク酸生産反応温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常２℃〜２０℃、好ましくは７℃〜１５℃高い温度で行う。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３５℃以上、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。コハク酸の生産反応の間、常に３５℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【００７０】
（Ａ）工程におけるコハク酸生産速度は、特に限定されないが、通常２ｇ／Ｌ／ｈ以上、好ましくは４ｇ／Ｌ／ｈ以上である。また、コハク酸生産速度は高いほど好ましく、コハク酸生産反応に用いる菌体量や速度を算出する時点のコハク酸蓄積濃度などその他の条件にもよるが、上限値としては、例えば、４０ｇ／Ｌ／ｈ以下である。
【００７１】
コハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なうことが好ましい。ここでいう嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
本発明の製造方法は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。本発明ではコハク酸を高濃度に蓄積させつつ、生産速度を向上させることができるという点で回分反応、もしくは半回分反応が好ましい。
【００７２】
以上のような微生物反応により、コハク酸（水性媒体中では、コハク酸塩の形で存在するが、便宜上、（Ａ）工程により得られるコハク酸塩は、コハク酸と表記するものとする。）が生成し、水性媒体中に蓄積させることができる。蓄積させたコハク酸は、後述する（Ｂ）工程により回収することができる。
【００７３】
以下、（Ｂ）コハク酸を回収する工程について説明する。
水性媒体中に蓄積したコハク酸（正確には、コハク酸アルカリ金属塩やコハク酸アンモニウム塩等のコハク酸塩）は、常法に従って、水性媒体より回収することができる。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化（晶析）あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、コハク酸を回収することができる。
【００７４】
さらに、前記（Ｂ）工程おいて得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、特に、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いることができる。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などにも用いることができる。
【実施例】
【００７５】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
なお、本実施例において、コハク酸濃度が、コハク酸アルカリ金属塩の濃度に等しいものとして、水性媒体中のコハク酸濃度を液体クロマトグラフィーにより以下に記載の条件で測定し、得られたコハク酸濃度を、コハク酸アルカリ金属塩濃度とした。
＜有機酸分析＞
カラム：信和加工（株）製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩ．Ｄ．×  ３０ｃｍ
溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ2Ｏ）
温度：６０℃【００７６】
［実施例１］
＜コハク酸ナトリウム添加、アンモニア中和によるコハク酸生産＞
（Ａ）種培養
１０００ｍＬのＡ培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）を１Ｌの試薬ビンに入れ、１２１℃で、２０分間、加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、１５ｍＬの滅菌したＡ培地を２００ｍＬの三角フラスコに入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μＬ添加し、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株（ＰＣ増強、ＬＤＨ破壊株：国際公開ＷＯ２００９／０２５３６３号パンフレット）を接種して５．５時間３０℃で培養した。５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．０２となるように接種し、３０℃、２０時間で種培養した。【００７７】
（Ｂ）本培養
リン酸水溶液（８５ｗｔ％）：９．８８ｇ、塩化カリウム：７．３２ｇ、硫酸アンモニウム：４．３９ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：２．２ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１７６ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１７６ｍｇ、ＣＳＬ（コーンスティープリガー）４４．２９ｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：１６．４ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：３．７６ｇ及び蒸留水の計２３０３ｍＬの培地を５Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液（Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液）を２２ｍＬ、あらかじめ滅菌した７２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液を１１８ｍＬ、前述の種培養の溶液を１４８ｍＬ添加した。加熱滅菌前後の重量より蒸発した液量を考慮し全量が２７８２ｍＬになるように滅菌した水を添加した。ジャーファーメンターを３０℃で保温し、ｐＨは２８％アンモニア水を用いて７．２に保ち、背圧は０．０５ＭＰａ、通気は毎分２．４Ｌ、攪拌は毎分６４０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２０ｇ／Ｌのグルコースを約７ｇ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃度が再び上昇するごとに前記の方法にてグルコース溶液の添加を繰り返して、培養開始後１９時間まで継続した。【００７８】
（Ｃ）コハク酸生産反応
リン酸水溶液（８５ｗｔ％）：５．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：３．４６ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１３８．２ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１３８．２ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：９．１４ｇ及び蒸留水１０５ｍＬを１２１℃で、２０分間、加熱滅菌した後、加熱滅菌による蒸発量を考慮し滅菌水を添加することで３２０ｍＬの溶液とした。この溶液２４ｍＬと、７２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液５５．７ｍＬと、滅菌水８０ｍＬと、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液（Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液）５４５μＬと、８５０ｍＭコハク酸ジナトリウム水溶液１００ｍＬと、前述した本培養液２４０ｍＬとを１Ｌジャーファーメンターに入れた。このときの水性媒体の全量は５００ｍＬであり、水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩（コハク酸ジナトリウム）の濃度は１７０ｍＭとなる。
上述に記載の溶液等を全て１Ｌジャーファーメンターに入れた時点を反応開始とし、次いで、水性媒体中のｐＨをアンモニア中和剤（炭酸水素アンモニウム：１０６．５ｇ、１８．３Ｎアンモニア水：２２１．５ｇ、滅菌水７０４．１ｇ）を添加することでｐＨ７．６に保ち、３９℃に保温しながら、毎分２００回転で攪拌した。
反応開始から９．４時間経過後にグルコースがほぼ消費され、反応が終了した。この時点におけるコハク酸濃度、コハク酸生産速度を表１に記載した。なお、コハク酸生産速度は、反応開始時から反応終了時までの平均値で表している。【００７９】
[比較例１]
（Ｃ）コハク酸生産反応において、水性媒体に添加する８５０ｍＭコハク酸ジナトリウム水溶液を８５０ｍＭコハク酸ジアンモニウム水溶液としたこと以外は、実施例１と同様に行った。反応開始から１４．８時間経過後にグルコースがほぼ消費され、反応が終了し、上記項目の結果を表１に記載した。【００８０】
[比較例２]
（Ｃ）コハク酸生産反応において、水性媒体のｐＨ調整に用いたアンモニア中和剤をナトリウム中和剤（炭酸水素ナトリウム：１１３．５ｇ、水酸化ナトリウム：１４５．９ｇ、滅菌水９３６．７ｇ）としたこと以外は、実施例１と同様に行った。反応開始から１２．０時間経過後にグルコースがほぼ消費され、反応が終了し、上記項目の結果を表１に記載した。【００８１】
【表１】
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【００８２】
表１より、実施例１は比較例１に対してコハク酸生産速度が５６％向上、比較例２に対しては１７％向上したことがわかる。
以上より、１７０ｍＭコハク酸ジナトリウム存在下でアンモニア中和剤を添加した条件は、１７０ｍＭコハク酸ジアンモニウム存在下でアンモニア中和剤を添加した条件や１７０ｍＭコハク酸ジナトリウム存在下でナトリウム中和剤を添加した条件と比較してコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。【００８３】
［実施例２］
実施例１と同様の条件で、（Ａ）種培養と、（Ｂ）本培養を行なった。【００８４】
（Ｃ）コハク酸生産反応
リン酸水溶液（８５ｗｔ％）：５．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：３．４６ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１３８．２ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１３８．２ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：９．１４ｇ及び蒸留水１０５ｍＬを１２１℃、２０分加熱滅菌した後、加熱滅菌による蒸発量を考慮し滅菌水を添加することで３２０ｍＬの溶液とした。
本培養液４０７ｍＬを遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分、２０℃）し、その上清３５７ｍＬを廃棄した。遠心分離により得られた菌体に、上述の３２０ｍＬの溶液のうち２４ｍＬと、滅菌水１７０．４ｍＬと、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液（Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液）５４５μＬとを添加し、菌体を懸濁させた。この懸濁液の全量と、７２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液５５．７ｍＬと、２１０ｍＭコハク酸ジナトリウム水溶液２００ｍＬとを１Ｌジャーファーメンターに入れた。このときの水性媒体の全量は５００ｍＬであり、水性媒体中のコハク酸アルカリ金属塩（コハク酸ジナトリウム）の濃度は８４ｍＭとなる。
上述に記載の溶液等を全て１Ｌジャーファーメンターに入れた時点を反応開始とし、次いで、水性媒体中のｐＨをアンモニア中和剤（炭酸水素アンモニウム：１０６．５ｇ、１８．３Ｎアンモニア水：２２１．５ｇ、滅菌水７０４．１ｇ）を添加することでｐＨ７．６に保ち、３９℃に保温しながら、毎分２００回転で攪拌した。
反応開始から６．３時間経過後にグルコースがほぼ消費され、反応が終了した。この時点におけるコハク酸濃度、コハク酸生産速度を表２に記載した。なお、コハク酸生産速度は、反応開始時から反応終了時までの平均値で表している。【００８５】
[比較例３]
（Ｃ）コハク酸生産反応において、反応液のｐＨ調整に用いたアンモニア中和剤をナトリウム中和剤（炭酸水素ナトリウム：１１３．５ｇ、水酸化ナトリウム：１４５．９ｇ、滅菌水９３６．７ｇ）に変更したこと以外は、実施例２と同様に行った。反応開始から８．６時間経過後にグルコースがほぼ消費され、反応が終了し、上記項目の結果を表２に記載した。【００８６】
【表２】
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【００８７】
表２より、実施例２は比較例３に対してはコハク酸生産速度が８％向上したことがわかる。
以上の結果より、８４ｍＭコハク酸ジナトリウム存在下でアンモニア中和剤を用いた条件は、８４ｍＭコハク酸ジナトリウム存在下でナトリウム中和剤を用いた条件と比較してコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。【００８８】
［実施例３］
＜ナトリウム中和からアンモニア中和への切り替えによるコハク酸生産＞
（Ａ）種培養、および（Ｂ）本培養は実施例２と同様の方法で行なった。
（Ｃ）コハク酸生産反応
コハク酸生産反応は以下のように行った。リン酸水溶液（８５ｗｔ％）：５．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：３．４６ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１３８．２ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１３８．２ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：９．１４ｇ及び蒸留水１０５ｍＬを、１２１℃で２０分間、加熱滅菌した後、加熱滅菌による蒸発量を考慮し滅菌水を添加することで３２０ｍＬの溶液とした。
上述の３２０ｍＬの溶液のうち２０ｍＬと、滅菌水１６８ｍＬと、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液（Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液）４４８μＬと、７２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液８６．５ｍＬと、本培養液１７５ｍＬとを１Ｌジャーファーメンターに入れた。
上述に記載の溶液等を全て１Ｌジャーファーメンターに入れた時点を反応開始とし、次いで、水性媒体中のｐＨをナトリウム中和剤（炭酸水素ナトリウム：１１３．５ｇ、水酸化ナトリウム：１４５．９ｇ、滅菌水９３６．７ｇ）を添加することでｐＨ７．６に保ち、３９℃に保温しながら、毎分２００回転で攪拌した。
反応開始から３．９時間経過後までに投入されたナトリウム中和剤の量は５４．７ｇであった。このときのコハク酸濃度を測定したところ、２０．７ｇ／Ｌであり、コハク酸ジナトリウムの濃度は１７５ｍＭであった。
この時点で、中和剤をナトリウム中和剤からアンモニア中和剤（炭酸水素アンモニウム：１０６．５ｇ、１８．３Ｎアンモニア水：２２１．５ｇ、滅菌水７０４．１ｇ）に切り替えた。
反応開始から５．０時間経過した時点のコハク酸濃度を測定したところ、２８．８ｇ／Ｌであった。中和剤の切り替え時からコハク酸濃度測定時までの平均値で表したコハク酸生産速度を表３に記載した。【００８９】
［実施例４］
（Ｃ）コハク酸生産反応において、ナトリウム中和剤からアンモニウム中和剤への切り替えを反応開始から５．０時間経過後に行ったこと以外は、実施例３と同様に行った。
この時点までに投入されたナトリウム中和剤の量は８０．２ｇであり、このときのコハク酸濃度を測定したところ、２７．６ｇ／Ｌであり、コハク酸ジナトリウムの濃度は２３４ｍＭであった。
反応開始から６．１時間経過のコハク酸濃度を測定したところ、３６．２ｇ／Ｌであった。中和剤の切り替え時からコハク酸濃度測定時までの平均値で表したコハク酸生産速度を表４に記載した。【００９０】
［実施例５］
（Ｃ）コハク酸生産反応において、ナトリウム中和剤からアンモニウム中和剤への切り替えを反応開始から６．１時間経過後に行ったこと以外は、実施例３と同様に行った。
この時点までに投入されたナトリウム中和剤の量は１０６．１ｇであり、このときのコハク酸濃度を測定したところ、３５．５ｇ／Ｌであり、コハク酸ジナトリウムの濃度は３０１ｍＭであった。
反応開始から８．２時間経過した時点のコハク酸濃度を測定したところ、４７．７ｇ／Ｌであった。中和剤の切り替え時からコハク酸濃度測定時までの平均値で表したコハク酸生産速度を表５に記載した。【００９１】
[比較例４]
（Ｃ）コハク酸生産反応において、水性媒体のｐＨ調整に最初に用いたナトリウム中和剤をアンモニア中和剤（炭酸水素アンモニウム：１０６．５ｇ、１８．３Ｎアンモニア水：２２１．５ｇ、滅菌水７０４．１ｇ）とし、その後、中和剤の切り替えを行わなかったこと以外は、実施例３と同様に行った。
反応開始から２．８時間、３．９時間（比較例６に対応）、５．０時間（実施例３に対応）、６．１時間（実施例４に対応）、８．２時間（実施例５に対応）経過した時点におけるコハク酸濃度を測定したところ、それぞれ１１．０ｇ／Ｌ、２１．７ｇ／Ｌ、２８．６ｇ／Ｌ、３４．９ｇ／Ｌ、４３．５ｇ／Ｌであった。
比較例４の結果として、実施例３、実施例４、実施例５、比較例６に対応するコハク酸生産速度をそれぞれ表３、表４、表５、表６に記載した。
なお、表３、表４、表５、および表６において、コハク酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）は、それぞれ表に記載の２つの時点でのコハク酸濃度（ｇ／Ｌ）から算出したものである。【００９２】
[比較例５]
中和剤の切り替えを行わなかったこと以外は、実施例３と同様に行った。反応開始から２．８時間、３．９時間（比較例６に対応）、５．０時間（実施例３に対応）、６．１時間（実施例４に対応）、８．２時間（実施例５に対応）経過した時点におけるコハク酸濃度を測定したところ、それぞれ８．８ｇ／Ｌ、２０．０ｇ／Ｌ、２７．７ｇ／Ｌ、３５．３ｇ／Ｌ、４５．８ｇ／Ｌであった。
比較例５の結果として、実施例３、実施例４、実施例５、比較例６に対応するコハク酸生産速度をそれぞれ表３、表４、表５、表６に記載した。【００９３】
[比較例６]
中和剤の切り替えを反応開始から２．８時間経過後に行ったこと以外は、実施例３と同様に行った。この時点までに投入されたナトリウム中和剤の量は２０．４ｇであり、このときのコハク酸濃度を測定したところ、８．９ｇ／Ｌであった（コハク酸ジナトリウムの濃度は７５ｍＭであった）。
反応開始から３．９時間経過した時点のコハク酸濃度を測定したところ、１９．１ｇ／Ｌであった。中和剤の切り替え時からコハク酸濃度測定時までの平均値で表したコハク酸生産速度を表６に記載した。【００９４】
【表３】
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【００９５】
表３より、実施例３は比較例４に対してコハク酸生産速度が１８％向上、比較例５に対して４％向上した。
以上の結果より、コハク酸ジナトリウムが１７５ｍＭ蓄積するまでナトリウム中和剤を用い、その後アンモニア中和剤に切り替えた条件は、アンモニア中和剤のみを用いた条件やナトリウム中和剤のみを用いた条件と比較してコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。【００９６】
【表４】
2013069786.tif 000005
【００９７】
表４より、実施例４は比較例４に対してコハク酸生産速度が３５％向上、比較例５に対して１３％向上した。
以上の結果より、コハク酸ジナトリウムが２３４ｍＭ蓄積するまでナトリウム中和剤を用い、その後アンモニア中和剤に切り替えた条件は、アンモニア中和剤のみを用いた条件やナトリウム中和剤のみを用いた条件と比較してコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。【００９８】
【表５】
2013069786.tif 000006
【００９９】
表５より、実施例５は比較例４に対してコハク酸生産速度が４２％向上、比較例５に対して１５％向上した。
以上の結果より、コハク酸ジナトリウムが３０１ｍＭ蓄積するまでナトリウム中和剤を用い、その後アンモニア中和剤に切り替えた条件は、アンモニア中和剤のみを用いた条件やナトリウム中和剤のみを用いた条件と比較してコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。【０１００】
【表６】
2013069786.tif 000007
【０１０１】
表６より、比較例６は比較例４に対してはコハク酸生産速度が４％低下し、比較例５に対しては８％低下した。
以上の結果より、コハク酸ジナトリウムが７５ｍＭ蓄積するまでナトリウム中和剤を用い、その後アンモニア中和剤に切り替えた条件はアンモニア中和剤のみを用いた条件やナトリウム中和剤のみを用いた条件と比較してコハク酸生産速度が低下することが明らかとなった。【０１０２】
実施例３〜５及び比較例６の結果をまとめると以下の通りである。
【表７】
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【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
［実施例６］
＜ＳＤＨゲノム増強株作製＞
（Ａ）ＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。【０１０５】
（Ｂ）ＳＤＨプロモーター置換用プラスミドの構築
ＭＪ２３３株ＳＤＨ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調整したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造社製）のＨｉｎｃII部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  カナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号１および配列番号２で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．８ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＳＤＨ７６４と命名した。
次に、ｐＳＤＨ７６４のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号３および配列番号４）を用いたＰＣＲによって行った。なお、配列番号３のＤＮＡは５‘末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒らなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＳＤＨ遺伝子Ｎ’末端断片とした。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を鋳型とし、配列番号５および配列番号６に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。なお、配列番号６のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分らなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
上記にて調製したＳＤＨ遺伝子Ｎ’末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結後、制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断し、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：：ＳＤＨ遺伝子Ｎ'末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社製）を制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断して調整したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約０．９５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＳＤＨ１５．１と命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ＳＤＨ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、実施例６（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号７および配列番号８）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で４０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．６ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号８で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で４０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．６ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＳＤＨ５．１と命名した。
次に、上記ｐＳＤＨ１５．１およびｐＳＤＨ５．１をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＳＤＨ遺伝子の５’上流領域とＮ'末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩ切断して調整したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＳＤＨ１５．２と命名した。【０１０６】
（Ｃ）ＳＤＨプロモーター置換株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株（国際公開ＷＯ２００９／０２５３６３号パンフレット）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＳＤＨ１５．２のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３  Ｖｏｌ．１４４：１８１−５）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＳＤＨ１５．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＳＤＨ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＳＤＨ遺伝子がｐＳＤＨ１５．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＳＤＨ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＳＤＨ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＳＤＨ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号９および配列番号２）を用いて分析すると、変異型では７４８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。【０１０７】
（Ｄ）フマル酸レダクターゼ酵素活性測定
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を、グルコース２％を含むＡ培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いＦＲＤ活性を測定した。酵素活性の測定は３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５)、 ０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ コハク酸ジナトリウム、２ｍＭ Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6及び酵素を含む反応液中にて２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に２μｍｏｌのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6の減少を触媒する酵素量とした。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の無細胞抽出液におけるＦＲＤ比活性は０．０２Ｕ／ｍｇ-蛋白質であった。なお、親株であるＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を同様に培養した菌体のＦＲＤ比活性は０．０１Ｕ／ｍｇ-蛋白質であったことから、ＴＺ４プロモーター置換によってブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の同活性が約２倍に高められたことが確認できた。【０１０８】
［実施例７］
＜ＭＤＨゲノム増強株作製＞
（Ａ）ＭＤＨプロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１０および配列番号１１）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．０ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩおよび制限酵素ＰａｃIで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＣｏＭＤＨ１と命名した。
次に、ｐＣｏＭＤＨ１を制限酵素ＡｐａＩおよび制限酵素ＰａｃIで切断して生じた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、プラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＡｐａＩおよび制限酵素ＰａｃIで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育したコロニーを常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩおよび制限酵素ＰａｃIで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＤＨ３７と命名した。
次にｐＭＤＨ３７を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造社製）により切断面を平滑化後、制限酵素ＸｂａＩで切断した。これによって生じた約０．９ｋｂのＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いてゲルから回収した。このＴＺ４プロモーターとＭＤＨ遺伝子のＮ末端領域を含むＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造社製）により切断面を平滑化後、制限酵素ＸｂａＩで切断して調整したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＢｇｌIIで切断することにより、約０．７ｋｂの挿入断片の一部分が認められ、これをｐＫＢ−ＭＤＨ１と命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ＭＤＨ遺伝子の５'上流領域のＤＮＡ断片の取得は、実施例６（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１２および配列番号１３）を用いたＰＣＲによって行った。これら合成ＤＮＡにはそれぞれ制限酵素ＳａｌＩまたはＸｂａＩの認識配列が含まれる。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で４５秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。増幅産物はＲａｐｉｄ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いて精製後、制限酵素ＳａｌＩおよびＸｂａＩで切断した。これによって生じた約０．６ｋｂのＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片をｐＫＢ−ＭＤＨ１を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｂａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＢｇｌIIで切断することにより、挿入断片を含む約１．２ｋｂの断片が認められ、これをｐＫＢ−ＭＤＨ２と命名した。【０１０９】
（Ｂ）ＭＤＨプロモーター置換株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、上記ｐＫＢ−ＭＤＨ２のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は実施例６の（Ｃ）で示した電気パルス法によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＫＢ−ＭＤＨ２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＭＤＨ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＭＤＨ遺伝子がｐＫＢ−ＭＤＨ２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＭＤＨ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＭＤＨ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＭＤＨ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号９および配列番号１４）を用いて分析すると、変異型では１２４２ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。【０１１０】
（Ｃ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素活性測定
上記（Ｂ）で得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を、グルコース２％を含むＡ培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた培養液１０ｍＬを集菌後、５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬで２回洗浄し、４．５Ｍのグルセロール及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をバイオラプター（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離（１０，０００Ｇ、１５分）を行った。得られた上清についてさらに、超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、６０分）を行い、その上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いＭＤＨ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ オキサロ酢酸 、０. ３２ｍＭ ＮＡＤＨ、及び酵素を含む反応液中にて２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。上記測定法によるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨのＭＤＨ比活性は３．７３Ｕ/ｍｇ−蛋白質であった。なお、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、ＭＤＨ比活性は１．２２Ｕ/ｍｇ−蛋白質であったことから、ＴＺ４プロモーター置換によって約３倍に同比活性が増加していることが確認された。【０１１１】
［実施例８］
＜ナトリウム中和からアンモニア中和への切り替えによるコハク酸生産＞
（Ａ）種培養、および（Ｂ）本培養は、実施例７で作製したＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＳＤＨ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行なった。【０１１２】
（Ｃ）コハク酸生産反応
コハク酸生産反応は以下のように行った。リン酸水溶液（８５ｗｔ％）：５．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：３．４６ｇ、硫酸マンガン・５水和物：１３８．２ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１３８．２ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：９．１４ｇ及び蒸留水１０５ｍＬを、１２１℃で２０分間、加熱滅菌した後、加熱滅菌による蒸発量を考慮し滅菌水を添加することで３２０ｍＬの溶液とした。
上述の３２０ｍＬの溶液のうち２０ｍＬと、滅菌水１０３ｍＬと、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液（Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液）４４８μＬと、７２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液１１１．５ｍＬと、本培養液１７５ｍＬとを１Ｌジャーファーメンターに入れた。
上述に記載の溶液等を全て１Ｌジャーファーメンターに入れた時点を反応開始とし、次いで、水性媒体中のｐＨをナトリウム中和剤（炭酸水素ナトリウム：１１３．５ｇ、水酸化ナトリウム：１４５．９ｇ、滅菌水９３６．７ｇ）を添加することでｐＨ７．６に保ち、３９℃に保温しながら、毎分２００回転で攪拌した。
反応開始から１０．３時間経過後までに投入されたナトリウム中和剤の量は２１９ｇであった。このときのコハク酸濃度を測定したところ、７２．８ｇ／Ｌであり、コハク酸ジナトリウムの濃度は６１７ｍＭであった。
この時点で、中和剤をナトリウム中和剤からアンモニア中和剤（炭酸水素アンモニウム：１０６．５ｇ、１８．３Ｎアンモニア水：２２１．５ｇ、滅菌水７０４．１ｇ）に切り替えた。
反応開始から１２．０時間経過した時点のコハク酸濃度を測定したところ、７９．０ｇ／Ｌであった。中和剤の切り替え時からコハク酸濃度測定時までの平均値で表したコハク酸生産速度を表９に記載した。【０１１３】
[比較例７]
（Ｃ）コハク酸生産反応において、水性媒体のｐＨ調整に最初に用いたナトリウム中和剤をアンモニア中和剤（炭酸水素アンモニウム：１０６．５ｇ、１８．３Ｎアンモニア水：２２１．５ｇ、滅菌水７０４．１ｇ）とし、その後、中和剤の切り替えを行わなかったこと以外は、実施例８と同様に行った。
反応開始から１０．３時間、１２．０時間、１８．７時間、２４．０時間（実施例８に対応）経過した時点におけるコハク酸濃度を測定したところ、それぞれ５７．７ｇ／Ｌ、６３．２ｇ／Ｌ、７０．８ｇ／Ｌ、７７．０ｇ／Ｌであった。
比較例７の結果として、実施例８に対応するコハク酸生産速度を表９に記載した。
なお、表９において、コハク酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）は、それぞれ表に記載の２つの時点でのコハク酸濃度（ｇ／Ｌ）から算出したものであり、実施例８でコハク酸生産速度を算出したときのコハク酸濃度と同程度となる１８．７時間から２４．０時間までの平均値で表したコハク酸生産速度を表９に記載した。【０１１４】
[比較例８]
中和剤の切り替えを行わなかったこと以外は、実施例８と同様に行った。反応開始から１０．３時間、１２．０時間（実施例８に対応）経過した時点におけるコハク酸濃度を測定したところ、それぞれ７１．７ｇ／Ｌ、７５．８ｇ／Ｌであった。
比較例８の結果として、実施例８に対応するコハク酸生産速度を表９に記載した。【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
表９より、実施例８は比較例７に対してコハク酸生産速度が２１２％向上、比較例８に対して５１％向上した。
以上の結果より、コハク酸ジナトリウムが６１７ｍＭ蓄積するまでナトリウム中和剤を用い、その後アンモニア中和剤に切り替えた条件は、アンモニア中和剤のみを用いた条件やナトリウム中和剤のみを用いた条件と比較してコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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