(57)【要約】  標的物質との特異性及び結合性が高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的、かつ簡便に製造する方法を開発し、提供することを目的とする。  一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる複合体形成工程、前工程後の溶液と固相担体を混合して、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して複合体を固相担体に固定化する固定化工程、固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する回収工程、複合体中の一本鎖核酸を回収後、核酸増幅法によって増幅させる増幅工程、及び増幅工程で得られた二本鎖核酸を一本鎖化した後、分子内立体構造を形成させる一本鎖核酸調製工程を含む核酸アプタマーの製造方法を提供する。
2013024763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸アプタマーの製造方法であって、
一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる複合体形成工程、
複合体形成工程後の溶液と固相担体を混合し、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して、複合体を固相担体に固定化する固定化工程、
固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する回収工程、
複合体中の一本鎖核酸を回収後、該一本鎖核酸を核酸増幅法によって増幅させる増幅工程、及び
増幅工程で得られた二本鎖核酸を一本鎖化した後、分子内立体構造を形成させる一本鎖核酸調製工程を含む前記製造方法。
【請求項２】
一本鎖核酸調製工程で得られる一本鎖核酸を新たな一本鎖核酸ライブラリーに用いて、複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを複数回繰り返す反復工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
反復工程において複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを2〜15回繰り返す、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
反復工程後に得られる一本鎖核酸の中から、連続する5〜20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を二次構造中に一以上含み、かつ前記二本鎖領域内の1〜10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる一本鎖核酸分子を選択する選択工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
複合体形成工程において、前記溶液が前記一本鎖核酸との間で標的物質との結合を競合し合う競合物質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記核酸がDNAである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記標的物質がペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記結合子がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記固相担体が親水性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
複合体形成工程及び／又は回収工程で使用する溶液又はバッファが界面活性剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
標的物質に結合する核酸分子であって、
連続する5〜20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を一以上含み、かつ
前記二本鎖領域内の1〜10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる前記核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が一本鎖核酸又は二本鎖核酸からなる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子がDNAである、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記標的物質がペプチドである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記ペプチドが転写調節因子、シグナル伝達因子、タンパク質リガンド、又は受容体タンパク質である、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記転写調節因子がNF-κBである、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記NF-κBがp50であって、配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
配列番号３及び４、配列番号５及び６、又は配列番号７及び８で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号９〜２１で示される塩基配列を含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子を有効成分とする標的物質の機能阻害剤。
【請求項２１】
請求項２０に記載の標的物質機能阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて試料中に存在するその核酸分子が結合する標的物質を検出する方法。
【請求項２３】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて試料中のNF-κB p50を検出する方法。
【請求項２４】
表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス測定法、比濁法、比色法又は蛍光法を用いて検出する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子を一以上含むNF-κB p50検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アプタマー、特にDNAアプタマーの効率的な作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、低分子化合物に代わる医薬又は診断薬の新たな有効成分として核酸アプタマーが、siRNA等の他の機能性核酸と共に注目され、その医療応用に向けて様々な研究及び開発が世界各国で進められている。【０００３】
核酸アプタマーは、それ自身が有する立体構造によってタンパク質等の標的物質と強固、かつ特異的に結合し、その機能を阻害又は抑制することができる機能性核酸である。核酸アプタマーは、通常、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法と呼ばれるin vitroセレクション法（試験管内選別法）によって、ランダムな塩基配列を含む核酸ライブラリーから、標的物質に結合する核酸分子として製造される（特許文献１〜３、非特許文献１〜４）。【０００４】
従来、核酸アプタマーは、RNAで構成されるRNAアプタマーが主流であったが、RNAは不安定であり、また製造コストが高いことから、近年では、生体内で安定であり、かつ安価に製造できるDNAアプタマーに研究開発がシフトしつつある（特許文献４、非特許文献５〜８）。しかし、RNAアプタマーと比べて、DNAアプタマーを効率的に製造するのは困難であった。通常、SELEX法では、標的物質と核酸アプタマーが結合して形成される複合体を単離する方法として、（１）疎水性相互作用を利用してタンパク質をニトロセルロースフィルターにトラップすることによって複合体を回収する方法、（２）ゲル電気泳動時のゲル移動度のシフトによって複合体を回収する方法、又は（３）標的物質を予め標識化しておき、その標識に基づいて標的物質をアフィ二ティ担体等に固定化し、これをDNAライブラリーと混合する方法が採用される。【０００５】
しかし、DNAの場合、RNAよりも疎水性が高いことから、ニトロセルロースフィルター上に非特異的に吸着してしまうため（１）の方法ではバックグラウンドが高くなってしまうという問題があった。また（２）の方法では、泳動可能なゲルサイズに制限があるため、大容量での標的物質-DNA複合体形成には不適であり、複数種類の異なる配列からなるDNAライブラリーは、電気泳動上でそのバンドが乱れやすく、ニトロセルロースフィルター法のようにトラップ後の複合体の洗浄操作ができない等の問題点があった。さらに、（３）の方法は、標的物質の固相結合面にDNAが結合しにくいため、結合能の高いアプタマーが得られないことや、標的物質と固相担体の双方に結合したDNAも得られてしまう結果、バックグラウンドが高くなる等の問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO1991/019813
【特許文献２】WO1994/008050
【特許文献３】WO1996/040159
【特許文献４】WO1992/014843
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lauhon C.T. and Szostak J.W., 1995, J. Am. Chem. Soc., 117: 1246-1257
【非特許文献２】Zhao X., et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34: 3755-3761
【非特許文献３】Fan X., et al., 2004, J. T. Lis, 101: 6934-6939
【非特許文献４】Jeong S., et al., 2010, Oligonucleotides, 20: 155-161
【非特許文献５】Cho M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 15373-15378
【非特許文献６】Tok J., et al., Electrophoresis, 2010, 31: 2055-2062
【非特許文献７】Hamula C.L., et al., 2008, Anal. Chem. 80: 7812-7819
【非特許文献８】Bock L.C., et al., 1992 Nature, 355: 564-566
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、標的物質との特異性及び結合性が高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的、かつ簡便に製造する方法を開発し、提供することを目的とする。【０００９】
また、本発明は、非ワトソン・クリック型塩基対合を二本鎖領域内に含み、標的物質に特異的に、かつ強固に結合することのできる核酸分子を提供することを目的とする。【００１０】
さらに、本発明は、前記核酸分子を有効成分とする標的物質の機能阻害剤及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決するために、SELEX法を改変することで、DNA等の非特異的吸着を抑え、バックグラウンドを低減することのできる新たな核酸アプタマーの製造方法の開発に成功した。すなわち、従来のSELEX法では、標的物質を固相担体に先に結合し、これに一本鎖核酸ライブラリーを加えることによって、固相担体上の標的物質に結合した核酸アプタマーを回収する方法が採用されていたが、先に標的物質と一本鎖核酸ライブラリーを混合して一本鎖核酸と標的物質との複合体を形成させ、次いで、標的物質及び／又は固相担体に吸着している結合子に基づいて、標的物質を固相担体に固定化し、遊離状態の一本鎖核酸を洗浄することで、複合体を形成した一本鎖核酸のみを効率的に回収することに成功した。これによって、非特異的吸着に基づくバックグラウンドを低減すると共に、標的物質に極めて強固、かつ特異的に結合する核酸アプタマーを製造することが可能となった。本発明は、上記開発結果に基づくものであって、以下を提供する。【００１２】
（１）核酸アプタマーの製造方法であって、一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる複合体形成工程、複合体形成工程後の溶液と固相担体を混合し、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して、複合体を固相担体に固定化する固定化工程、固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する回収工程、複合体中の一本鎖核酸を回収後、該一本鎖核酸を核酸増幅法によって増幅させる増幅工程、及び増幅工程で得られた二本鎖核酸を一本鎖化した後、分子内立体構造を形成させる一本鎖核酸調製工程を含む前記製造方法。【００１３】
（２）一本鎖核酸調製工程で得られる一本鎖核酸を新たな一本鎖核酸ライブラリーに用いて、複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを複数回繰り返す反復工程をさらに含む、（１）に記載の製造方法。【００１４】
（３）反復工程において複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを2〜15回繰り返す、（２）に記載の製造方法。【００１５】
（４）反復工程後に得られる一本鎖核酸の中から、連続する5〜20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を二次構造中に一以上含み、かつ前記二本鎖領域内の1〜10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる一本鎖核酸を選択する選択工程をさらに含む、（２）又は（３）に記載の製造方法。【００１６】
（５）複合体形成工程において、溶液が標的物質との結合を前記一本鎖核酸との間で競合し合う競合物質を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。【００１７】
（６）前記核酸がDNAである、（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。【００１８】
（７）前記標的物質がペプチドである、（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。【００１９】
（８）前記結合子がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである、（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。【００２０】
（９）前記固相担体が親水性である、（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。【００２１】
（１０）複合体形成工程及び／又は回収工程で使用する溶液又はバッファが界面活性剤を含む、（１）〜（９）のいずれかに記載の製造方法。【００２２】
（１１）標的物質に結合する核酸分子であって、連続する5〜20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を一以上含み、かつ前記二本鎖領域内の1〜10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる前記核酸分子。【００２３】
（１２）前記核酸分子が一本鎖核酸又は二本鎖核酸からなる、（１１）に記載の核酸分子。【００２４】
（１３）前記核酸分子がDNAである、（１２）に記載の核酸分子。【００２５】
（１４）前記標的物質がペプチドである、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の核酸分子。【００２６】
（１５）前記ペプチドが転写調節因子、シグナル伝達因子、タンパク質リガンド、又は受容体タンパク質である、（１４）に記載の核酸分子。【００２７】
（１６）前記転写調節因子がNF-κBである、（１５）に記載の核酸分子。【００２８】
（１７）前記NF-κBがp50であって、配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、（１６）に記載の核酸分子。【００２９】
（１８）配列番号３及び４、配列番号５及び６、又は配列番号７及び８で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、（１７）に記載の核酸分子。【００３０】
（１９）配列番号９〜２１で示される塩基配列を含む、（１８）に記載の核酸分子。【００３１】
（２０）（１１）〜（１９）のいずれかに記載の核酸分子を有効成分とする標的物質の機能阻害剤。【００３２】
（２１）（２０）に記載の標的物質機能阻害剤を含む医薬組成物。【００３３】
（２２）（１１）〜（１５）のいずれかに記載の核酸分子を用いて試料中に存在するその核酸分子が結合する標的物質を検出する方法。【００３４】
（２３）（１６）〜（１９）のいずれかに記載の核酸分子を用いて試料中のNF-κB p50を検出する方法。【００３５】
（２４）表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス測定法、比濁法、比色法又は蛍光法を用いて検出する、（２２）又は（２３）に記載の方法。【００３６】
（２５）（１６）〜（１９）のいずれかに記載の核酸分子を一以上含むNF-κB p50検出用キット。【００３７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-177112号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の核酸アプタマーの製造方法によれば、標的物質との特異性及び結合性が高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的、かつ簡便に製造することができる。【００３９】
本発明の非ワトソン・クリック型塩基対合を二本鎖領域内に含む核酸分子によれば、標的物質に特異的に、かつ強固に結合することのできる核酸分子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の核酸アプタマーの製造方法の工程フロー図である。図中、実線で囲んだ工程は必須工程であり、破線で囲んだ工程は任意工程であることを示す。
【図２】本発明の核酸アプタマーの製造方法で使用する一本鎖核酸ライブラリーを構成する一本鎖核酸の一次構造の概念図を示す。
【図３】NF-κB p50を標的物質とする本発明の核酸分子の二本鎖領域にみられる、コンセンサス配列（ａ）、及び本発明の製造方法で得られたDNAアプタマーに見られたコンセンサス配列の具体的塩基配列（（ｂ）〜（ｄ））、各鎖の配列番号、及びそれらの塩基対合を示す。コンセンサス配列（ａ）の塩基配列中、「W-W」で記載した塩基対は、「a-t」又は「t-a」を示す。また、二本鎖領域の各塩基間における「｜」は、ワトソン・クリック型塩基対を、「○」、又は「●」は、それぞれ「a-g」若しくは「g-a」、又は「g-t」若しくは「t-g」からなる非ワトソン・クリック型塩基対を示す。
【図４】本発明の核酸アプタマー製造方法で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの塩基配列、クローン名、クローン数及び中央領域における塩基配列の配列番号を示す。最上部は、製造方法に用いた一本鎖核酸ライブラリーの配列である。各DNAアプタマーの塩基配列において、NF-κBの結合する天然型のコンセンサスDNA配列（配列番号２９）と類似した配列を黒枠で囲っている。下線は分子内で塩基対合によって二本鎖領域（ステム構造）を形成すると推測される領域を示す。太字は5R01または5R14または5R05の配列と比較して、その類似クローン配列中で変異している塩基を示す。ハイフン（-）は一塩基欠失変異を示す。
【図５】固相担体としての各種磁気ビーズへの一本鎖DNAの非特異的吸着をリアルタイムPCRにより検出した結果を示す。
【図６】図４に示したNF-κB p50結合性DNAアプタマーのうち3つのクローン（5R01、5R14、5R05）について、そのコンセンサス配列及び二次構造と、各クローンにおけるNF-κB p50との解離定数（Kd値）を示す。最上部は、公知のNF-κB p50結合コンセンサス配列である。白ボックスは、5′末端側プライマー結合領域を、黒ボックスは、3′末端側プライマー結合領域を示す。
【図７】本発明の方法で製造された３つのNF-κB p50結合性DNAアプタマークローン（5R01、5R14、5R05）とNF-κB p50との相互作用を検出した表面プラズモン共鳴（SPR：Surface Plasmon Resonance）のセンサグラムを示す。
【図８】図7で示した各NF-κB p50結合性DNAアプタマークローンから5′末端側のプライマー配列領域を含む配列を取り除いた一本鎖DNA変異体（5R01-68、5R14-68、5R05-68）及び非ワトソン・クリック型塩基対を除いた対照用のCont-68（公知のNF-κB p50結合コンセンサス配列を含む）の塩基配列及び二次構造を示す。
【図９】図８で示した３つのクローン及び対照用のCont-68と、NF-κB p50との相互作用を検出したSPRのセンサグラムを示す。
【図１０】変異体5R01mut-68（A）、対照用の5R01-68（B）及びCont-68（C）のそれぞれについて、塩基配列及び二次構造、NF-κB p50との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラム並びにNF-κB p50との解離定数（Kd値）を示す。
【図１１】5R01-68（A）、対照用の5R01mut-68（B）、対照用のTaq-59（C）のそれぞれについて、塩基配列及び二次構造、NF-κB p50、Taq DNAポリメラーゼ、及びAP-1との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
１．定義
本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
【００４２】
本明細書において、「核酸」又は「核酸分子」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドのみが連結したDNA、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドのみが連結したRNA、又はそれらの組み合わせのような自然界に存在する天然型核酸が該当する。また、本発明の核酸は、その一部又は全部が非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸も含むことができる。
【００４３】
本明細書において、「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾されたヌクレオチドであって、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する、又は天然型ヌクレオチドを構成するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含む、自然界に存在しないヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2′-デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシドが挙げられる。さらに、前記糖修飾を有するヌクレオシドには、置換五単糖（2′-O-メチルリボース、2′-デオキシ-2′-フルオロリボース、3′-O-メチルリボース、1′，2′-デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖、置換六単糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。また、本発明の非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）であってもよい。「塩基類似体」には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、「非天然型核酸」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された核酸類似体をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2′-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体を含むこともできる。なお、本明細書においては、以下、便宜的に、上記非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸は、総括して「修飾核酸」と呼ぶ。
【００４５】
本明細書において、「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。核酸アプタマーは、一般に、RNAのみで構成されるRNAアプタマーとDNAのみで構成されるDNAアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は、特に限定はしない。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNAとRNAの組み合わせで構成されるアプタマー、修飾核酸をそれらの一部に含むアプタマー、修飾核酸のみで構成されるアプタマーなどを含む。好ましくは、DNAアプタマーである。
【００４６】
本明細書において「標的物質」とは、核酸分子、特に核酸アプタマーの結合対象となり得る物質をいう。標的物質の種類は、核酸分子が結合し得る生体物質であれば、特に制限はしない。例えば、ペプチド（オリゴペプチド、又はポリペプチド）、核酸、脂質、糖（糖鎖を含む）、又は低分子化合物が挙げられる。好ましくはペプチド、より好ましくはポリペプチド、すなわちタンパク質である。標的物質は、目的に応じて適宜選択することができる。通常は、生体物質が有する特有の生物学的機能を阻害若しくは抑制又は亢進させることを目的として選択される。特有の生物学的機能には、例えば、触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能、広くは細胞情報伝達を担うタンパク質-タンパク質間相互作用などの生体物質間相互作用が挙げられる。使用する標的物質は、天然由来の物質、化学合成物質、遺伝子組換え物質等いずれを用いてもよい。不純物が混在しない精製された単一物質を使用することが好ましい。また、標的物質がポリペプチドの場合、タグ配列を融合した融合ポリペプチドであってもよい。タグ配列としては、例えば、ヘキサヒスチジン（His）、FLAG、HA、myc又はGFPが挙げられる。
【００４７】
２．核酸アプタマーの製造方法
２−１．概要
本発明の第１の実施形態は、核酸アプタマーの製造方法である。本発明によれば、一本鎖核酸の非特異的吸着によるバックグラウンドを低減し、標的物質に対して特異性の高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的に、かつ簡便に製造することができる。
【００４８】
２−２．構成
本発明の工程フローを図１に示す。この図が示すように、本発明の製造方法は、複合体形成工程（１０１）、固定化工程（１０２）、回収工程（１０３）、増幅工程（１０４）及び一本鎖核酸調製工程（１０５）を必須の工程として含む。また、本発明の製造方法は、必要に応じて反復工程（１０６）及び／又は選択工程（１０７）を任意の工程として含むことができる。このうち、選択工程（１０７）は、増幅工程（１０４）と一本鎖核酸調製工程（１０５）間、及び／又は反復工程（１０６）後に行うことができる。以下、それぞれの工程について、具体的に説明をする。
【００４９】
（１）複合体形成工程
「複合体形成工程」（１０１）とは、一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合し、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる工程である。
【００５０】
本発明において、「一本鎖核酸ライブラリー」とは、核酸アプタマーの候補分子を包含する同一の及び／又は異なる複数の一本鎖核酸で構成されるプールをいう。ただし、一本鎖核酸の全部又は一部の塩基が互いに対合することによって形成される二本鎖核酸がその一部に含まれていてもよい。一本鎖核酸ライブラリーは、前述のように核酸アプタマー候補を包含するライブラリーであることから、ライブラリーを構成する各一本鎖核酸は、原則としてセルフフォールディングによる高次構造を形成している。
【００５１】
当該ライブラリーを構成する一本鎖核酸の一次構造は、図２で示すように5′末端側及び3′末端側にプライマーが結合するプライマー結合領域（２０１、２０３）を有し、その間に位置する中央領域（２０２）を含む。プライマー領域の塩基長は、それぞれ15〜40塩基である。また、中央領域の塩基長は、20〜80塩基である。したがって、一本鎖核酸ライブラリーを構成する一本鎖核酸の塩基長は、50〜160塩基の範囲内である。
【００５２】
5′末端側及び3′末端側のプライマー結合領域（２０１、２０３）は、それぞれフォワードプライマー（２０４）に対応する塩基配列とリバースプライマー（２０５）に相補的な塩基配列を有する。それぞれのプライマーの塩基配列は、プライマーが分子内で二次構造を形成しない配列及び／又はフォワードプライマーとリバースプライマーどうしが連続する二本鎖領域を形成しない配列であること、Tm値が50〜80℃、55〜75℃、又は60〜70℃の範囲内にあること、両プライマーのTm値が大きく異ならないこと、及び各プライマーのGC含量が40〜60 ％、又は45〜55 ％であることが好ましい。
【００５３】
一本鎖核酸ライブラリーを構成する各一本鎖核酸の中央領域（２０２）の塩基配列は、ランダムな又は特定の塩基配列からなる。本発明の製造方法において初回に使用する場合、中央領域は、原則としてランダムであることが望ましい。前記特定の塩基配列とは、所定の選択圧を受けた一本鎖核酸における塩基配列をいう。ここで、「所定の選択圧を受けた一本鎖核酸」とは、例えば、本発明の製造方法が後述する反復工程（１０６）を含む場合に、2回目（2ラウンド目）以降に使用する一本鎖核酸ライブラリーの構成一本鎖核酸が該当する。
【００５４】
一本鎖核酸ライブラリーの調製は、当該分野で公知の方法に従って適宜調製すればよい。例えば、本発明の方法が標的物質に結合し得る未知の核酸アプタマーを製造することを目的とする場合、初回に使用する一本鎖核酸ライブラリーは、多数の異なる一本鎖核酸の集団で構成されていることが好ましい。したがって、この場合には、例えば、核酸合成機を利用して一本鎖核酸ライブラリーを化学合成によって調製すればよい。例えば、一本鎖DNAライブラリーを調製するのであれば、DNAシンセサイザーを用いて、設計した塩基配列を合成プログラムに入力することで、目的のライブラリーを得ることができる。塩基配列を各メーカーに合成委託して、所望の一本鎖核酸ライブラリーを作製してもよい。また、本発明の製造方法が後述する反復工程（１０６）を含む場合であって、2ラウンド目以降に使用する一本鎖核酸ライブラリーについては、その反復工程（１０６）直前のラウンドで得られた一本鎖核酸に基づいて調製すればよい。
【００５５】
なお、本発明の製造方法において、初回に使用する一本鎖核酸ライブラリーは、後述の一本鎖核酸調製工程（１０５）に記載する、一本鎖核酸の分子内高次構造形成処理を予め行っておくことが好ましい。また、後述の固定化工程（１０２）で使用する固相担体に非特異的に結合をする一本鎖核酸を低減するために、一本鎖核酸ライブラリーは、予め固相担体（二種以上の固相担体を用いるときには、それぞれの固相担体について）に非特異的に結合する一本鎖核酸の除去処理を行っておくことが好ましい。この処理は、一本鎖核酸ライブラリーを含む溶液中に固相化工程で使用する固相担体を適量加えて混合した後、その固相担体を回収、除去した後の溶液を一本鎖ライブラリーとして使用すれば足りる。
【００５６】
本発明において、「複合体」とは、一本鎖核酸ライブラリーを構成する一本鎖核酸、具体的には、一本鎖核酸によって形成される核酸アプタマーの候補分子と標的物質とが結合して形成される核酸−標的物質複合体をいう。
【００５７】
本工程で使用する溶液は、核酸と標的物質とが複合体を形成できる溶液であれば、その種類、性質は特に制限しない。好ましくは水又は水溶液である。水溶液の場合、pHは、5.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0、より好ましくは6.5〜7.6の範囲であればよい。また、塩濃度は、最終濃度で20〜500 mM、好ましくは50〜300 mM、より好ましくは90〜180 mMの範囲であればよい。好ましい水溶液は、バッファである。例えば、上記pH範囲が適応範囲であるpH緩衝液（例えば、リン酸バッファ、クエン酸−リン酸バッファ、トリス−塩酸バッファ又はHEPESバッファ）に、適当な塩（例えば、NaCl、CH3COOK）を最終塩濃度が上記範囲となるように添加したものである。具体的には、例えば、PBSバッファ（1.1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）が挙げられる。上記pHバッファの組成は、例えば、Sambrook, J. et. al.,(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の公知組成に基づいて、必要に応じて微調整すればよい。
【００５８】
上記溶液は、必要に応じて、さらに還元剤や界面活性剤を含んでいてもよい。
【００５９】
還元剤には、例えば、DTT（ジチオトレイトール）や2-メルカプトエタノールが挙げられる。溶液中の還元剤の最終濃度は、0.5〜10 mM、好ましくは1〜5 mMの範囲であればよい。
【００６０】
また、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Nonidet P40（NO-40）、Triton X-100、Triton X-114、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、n-オクチル-β-グルコシド、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10が挙げられる。溶液中の界面活性剤の最終濃度は、容量/容量（V/V）で0.005 ％〜0.1 ％、好ましくは0.01 ％〜0.08 ％の範囲であればよい。
【００６１】
さらに、本工程で使用する溶液は、競合物質を含んでいてもよい。本明細書において、「競合物質」とは、前記一本鎖核酸との間で標的物質との結合を競合し合う物質をいう。競合物質の種類は、一本鎖核酸と標的物質をめぐって競合し得る物質であれば、特に制限はしない。例えば、核酸、ペプチド、脂質、糖、又は低分子化合物が挙げられる。目的の核酸アプタマーである一本鎖核酸と同様の性質を有する物質、例えば、標的物質上の結合部位が同じであるような物質が好ましい。そのような物質としては、目的の一本鎖核酸に類似の塩基配列を有する核酸（一本鎖核酸及び／又は二本鎖核酸）が該当する。具体的には、例えば、標的物質が転写調節因子である場合、その転写調節因子が本来結合するゲノム配列上の塩基配列等が相当する。競合物質が前記核酸である場合、競合物質が標的物質と複合体を形成した場合であっても、一本鎖核酸のようなプライマー結合領域（２０１、２０３）を持たないようにデザインして調製しておくことによって、後述する増幅工程（１０４）で増幅されず、除去することができる。競合物質が溶液に含まれることで、より強固に標的物質に結合する核酸アプタマーを製造することが可能となる。
【００６２】
複合体を形成させるためには、一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを、9:1〜1:9、好ましくは5:5（容量：容量）で混合し、4〜40℃、好ましくは15〜37℃の範囲内で、5分〜30分以上、例えば、10分〜1時間程度、好ましくは20分〜40分程度インキュベートすればよい。
【００６３】
形成された複合体は、次の固定化工程（１０２）前に洗浄してもよい。溶液中で標的物質と複合体を形成しなかった遊離状態の一本鎖核酸を洗浄によって除去又は低減することで、遊離一本鎖核酸の非特異的結合によるバックグラウンドをより低減することができるからである。複合体の洗浄は、標的物質の種類、複合体の分子サイズや特性に基づいて、当該分野で公知の方法を用いて行えばよい。例えば、標的物質がタンパク質の場合、分子サイズにより核酸のみが通過する限外濾過膜を用いて複合体を遊離の一本鎖核酸から分離することができる。洗浄用バッファの組成は、上記複合体形成に用いたバッファと同様の組成でよい。また、複合体形成に用いたバッファと同様に、洗浄用バッファにも還元剤や界面活性剤を含んでいてもよい。還元剤や界面活性剤の濃度や組成は、複合体形成に用いたバッファと同様でよい。もっとも、この段階で、遊離一本鎖核酸を除去せずとも、又は完全に除去できなくとも、続く、固定化工程（１０２）や回収工程（１０３）においても洗浄操作により、残存する遊離一本鎖核酸を除去することができる。したがって、洗浄は、必要に応じて行えばよい。
【００６４】
（２）固定化工程
「固定化工程」（１０２）とは、前工程後の溶液と固相担体を混合して、複合体を固相担体に固定化する工程である。
【００６５】
本発明において「固相担体」とは、固体状態の担体であって、例えば、磁気ビーズ、高分子多糖支持体（例えば、セファロース、セファデックス、アガロース）、シリカ、ガラス、金属(例えば、金、白金、銀)、プラスチック、セラミックス、樹脂（天然又は合成樹脂）、又はそれらの組み合わせを含む。その材質は限定しないが、前工程後の溶液中に含まれる複合体を形成していない遊離状態の一本鎖核酸等による当該固相担体への非特異的な結合を回避又は低減するために、固相担体表面は、親水性であることが好ましい。この場合、固相担体自体が親水性であってもよいし、固相担体が疎水性でその表面を親水性コーティング処理したものであってもよい。担体の形状は、特に限定はしない。例えば、球体形状、略球体形状、平板形状、略平板形状、繊維形状などが挙げられる。ビーズのような略球体形状の粒子は、結合表面積が大きく、操作性も高いことから、本工程における固相担体の形状として、特に好ましい。
【００６６】
本工程において、「固定化」とは、複合体を固相担体と連結させることをいう。複合体の固相担体への固定化は、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して行われる。
【００６７】
本明細書において、「結合子」とは、標的物質と固相担体の連結を介在する分子をいう。結合子は、結果的に標的物質及び固相担体間の連結を介在することができれば、単一分子のみならず、二以上の連結する異なる分子も包含し得る。結合子の具体例としては、例えば、低分子化合物、アミノ酸若しくはペプチド、核酸若しくはその構成物（ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。ここでいう低分子化合物は、分子量約数百〜数千の天然物又は化学合成物である。例えば、ビタミン類（ビオチンを含む）、テルペノイド（例えば、カロチノイド、ヘム、クロロフィル）、又はポリフェノール（例えば、フラボノイド、カテキン、タンニン）が該当する。ペプチドは、抗体（ヒト化抗体又は多価抗体のような組換え抗体を含む）又は酵素を包含するタンパク質又はその機能性断片を含む。核酸は、DNA、RNA、LNA（Locked Nucleic Acid：LNAは登録商標）若しくはPNA（Peptide Nucleic Acid）のような核酸類似物、又はそれらの断片を含む。本発明における好ましい結合子としては、例えば、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンからなる結合子、前記ビオチンにさらにレクチンが結合したレクチン−ビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンからなる結合子、一以上の抗体のみからなる結合子、又は抗体及びプロテインA、G又はLからなる結合子が挙げられる。
【００６８】
結合子は、標的物質、固相担体又はその両方に吸着されている。ここでいう「吸着」とは、結合子を標的物質又は固相担体に化学的吸着、物理的吸着及び／又は親和力によって固定化することをいう。ここでいう化学的吸着は、共有結合、イオン結合、水素結合のような化学結合を含み、また物理的吸着は、クーロン力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用を含む。
【００６９】
結合子が標的物質又は固相担体の一方にのみ吸着されている場合、その結合子は、結合子が吸着されていない相手側の物質を特異的に認識し、結合することができる。例えば、固相担体に結合子が吸着されている場合、その結合子は標的物質を特異的に認識し、結合する。より具体的には、例えば、抗体又は抗体と結合したプロテインAが結合子として固相担体に吸着されている場合、その抗体は、標的物質を特異的に認識し、結合する。それ故、標的物質と固相担体を溶液中で混合することによって、標的物質と固相担体とが結合子を介して連結される。複合体形成工程（１０１）後の標的物質は、その一部又は全部が核酸アプタマーの候補である一本鎖核酸と複合体を形成している。したがって、この工程により、複合体を固相担体に固定化することができる。
【００７０】
結合子が標的物質及び固相担体のそれぞれに吸着されている場合、それらの結合子（便宜的に、以降、標的物質に吸着された結合子を「第１結合子」、固相担体に吸着された結合子を「第２結合子」という）は、互いに特異的に結合することができる。例えば、標的物質に第１結合子であるビオチンが、固相担体に第２結合子であるアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンが、それぞれ吸着されている場合、標的物質と固相担体を溶液中で混合することによって、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンが互いに特異的に結合する。その結果、標的物質と固相担体がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンの結合を介して連結される。また、標的物質に第１結合子である抗標的物質マウスモノクローナルIgG抗体が、固相担体に第２結合子であるウサギ抗マウスIgG抗体又はプロテインAが、それぞれ吸着されている場合、標的物質と固相担体を溶液中で混合することによって、抗標的物質マウスモノクローナルIgG抗体とウサギ抗マウスIgG抗体又はプロテインAが互いに特異的に結合する。その結果、標的物質と固相担体が抗体−抗体又は抗体−プロテインAの結合を介して連結される。結果的に、複合体を固相担体に固定化することができる。
【００７１】
なお、本工程において結合子を介した固相担体へ複合体の固定化に直接寄与するのは複合体中の標的物質である。したがって、本工程では、複合体のみならず、複合体を形成していない遊離状態の標的物質も同時に固相担体に固定化され得る。しかし、一本鎖核酸を担持していない遊離状態の標的物質が固相担体に固定化されたとしても、一本鎖核酸の非特異的吸着の低減を目的の一つとする本発明への影響はないか又は非常に軽微であり、本発明の達成において、特段の阻害要因とはならない。
【００７２】
標的物質や固相担体への結合子の吸着方法は、標的物質、固相担体及び／又は結合子の種類によって異なる。したがって、それぞれの種類や目的に応じて当該分野で公知の方法によって適宜吸着させればよい。ただし、標的物質に結合子を吸着させる場合には、前記複合体中の一本鎖核酸と標的物質との結合を阻害しない又は解離させない結合子及び／又は吸着方法であることが望ましい。また、標的物質及び固相担体のいずれに結合子を吸着させる場合であっても、本工程及び次の回収工程（１０３）における操作で容易に解離しない方法で吸着させることが好ましい。
【００７３】
吸着方法の例として、標的物質や固相担体が官能基を有する場合には、例えば、その官能基と共有結合が可能な活性官能基（例えば、アルデヒド基、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ニトロ基）を有する結合子か、又はそのような活性官能基を導入した結合子を用いて、両官能基間の求核的付加反応、求核置換反応若しくは求電子置換反応のような化学反応による共有結合を介して、標的物質や固相担体に結合子を吸着させることができる。そのような共有結合が可能な官能基の組み合わせは、例えば、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とエステル基、チオール基とマレイミド基、アジド基とアセチレン基、アジド基とアミノ基、ヒドラジン基とケトン基、ヒドラジン基とアルデヒド基がある。これらの官能基どうしを化学反応により共有結合させる方法は、当該分野では周知の技術である。例えば、標的がタンパク質の場合、ビオチンを結合子としてタンパク質を吸着させる場合には、ビオチンにN−ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）などを用いて活性エステル基を導入した後、タンパク質のアミノ基と当該エステル基との間でアミド結合を形成させることによって、タンパク質をビオチン吸着させることができる。標的物質にビオチンを吸着させる場合には、各種ビオチン化試薬がメーカーから市販されており、それらを利用してもよい。
【００７４】
また、標的物質が抗原であり、かつ第１結合子がその抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する抗体である場合、適当な溶液中で両者を接触させることによって、アフィニティー結合により第１結合子を標的物質に吸着させることができる。例えば、標的物質がポリペプチドであって、そのポリペプチドを特異的に認識できる抗体が存在する場合には、その抗体を第１結合子として該ポリペプチドに吸着させることができる。また、標的物質のポリペプチドを特異的に認識できる抗体が存在しない場合であっても、そのポリペプチドとタグ配列との融合ポリペプチドの合成が可能であれば、そのタグ配列を特異的に認識できる抗体を第１結合子として該ポリペプチドに吸着させることができる。
【００７５】
結合子の吸着時期は、限定はしないが、標的物質に結合子を吸着させる場合には、複合体形成工程（１０１）後、本工程前であることが好ましい。複合体形成工程（１０１）前に標的物質に結合子を吸着させた場合、結合子の吸着によって標的物質と一本鎖核酸との結合が抑制又は阻害される可能性があるからである。したがって、標的物質に結合子を吸着させる場合は、複合体形成工程（１０１）後、本工程前の適当な時期、例えば、複合体形成工程（１０１）後に得られる複合体を含む溶液に対して、上記いずれかの吸着方法により標的物質に結合子を吸着させればよい。また、固相担体に結合子を吸着させる場合には、少なくとも本工程において複合体を含む溶液と固相担体を混合する前に吸着させておくことが好ましい。結合子が吸着した固相担体を用いることで標的物質の固相担体への固定化をより確実にすることができるからである。したがって、固相担体に結合子を吸着させる場合は、少なくとも本工程において複合体を含む溶液と固相担体を混合する前に、上記いずれかの吸着方法により固相担体に結合子を吸着させればよい。具体的には、例えば、標的物質であるタンパク質に第１結合子としてビオチンを、また固相担体である磁気ビーズに第２結合子としてストレプトアビジンを、それぞれ吸着させる場合、タンパク質へのビオチン吸着は、複合体形成工程（１０１）後得られる複合体を含む溶液に対して、例えば、市販のビオチン化試薬を用いて添付にプロトコルに従い吸着させればよい。その後、未吸着のビオチンは、例えば、限外濾過等の当該分野で公知の方法により洗浄、除去しておくことが好ましい。また、磁気ビーズへのストレプトアビジンの吸着は、複合体形成工程（１０１）とは独立に、予め磁気ビーズに公知の方法を用いてストレプトアビジンを吸着させておけばよい。例えば、磁気ビーズがTosyl基やエポキシ基を有する場合には、ストレプトアビジンと混合するだけで、そのままストレプトアビジンの1級アミノ基と共有結合により吸着させることができる。また、磁気ビーズがカルボキシル基を有する場合には、カルボジイミドによる活性化によってストレプトアビジンの1級アミノ基と共有結合により吸着させることができる。これらは当該分野で周知の方法である。また、予めストレプトアビジンが吸着された市販の磁気ビーズを購入して利用してもよい。
【００７６】
標的物質の固相担体への固定化に供する結合子は、複数種であってもよい。例えば、標的物質に異なる複数の第１結合子を吸着させる場合である。具体的には、例えば、ビオチンと抗標的物質抗体を独立した第１結合子として一の標的物質に吸着させる場合が挙げられる。この場合、標的物質上における各第１結合子の認識部位及び／又は吸着部位が互いに重複及び／又は競合しないものを選択することが好ましい。それぞれの第１結合子に対応する第２結合子を吸着させた異なる固相担体を用いて、固定化工程（１０２）及び後述する回収工程（１０３）を実行することで、固相担体への非特異的吸着により混入する一本鎖核酸のバックグラウンドをより低減することができる。具体的には、前述のビオチンと抗標的物質抗体を第１結合子として吸着させた標的物質を用いる場合、ストレプトアビジンを第２結合子として吸着させた固相担体である磁気ビーズを用いて、固定化工程（１０２）及び回収工程（１０３）を行った後、プロテインGを第２結合子として吸着させた固相担体であるセファロースビーズを用いて、再び固定化工程（１０２）及び回収工程（１０３）を行う場合が挙げられる。
【００７７】
なお、本工程では、複合体と共に一本鎖核酸と複合体を形成していない遊離状態の標的物質も固相担体に固定化される。しかし、後述する増幅工程（１０４）において、複合体から標的物質を除去して一本鎖核酸を回収する際に、このような複合体を形成していない標的物質も同時に除去されることから問題とはならない。
【００７８】
（３）回収工程
「回収工程」（１０３）とは、前記固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する工程である。
【００７９】
固定化工程（１０２）後の固相担体には、前述のように複合体が結合子を介して固定化されている。本工程では、固相担体の特性に基づいてこの複合体−固相担体を溶液から分離し、回収することを特徴とする。固相担体の特性とは、固相担体に特有の性質をいう。例えば、磁力、比重、蛍光、発光、親和力等が含まれる。
【００８０】
具体的には、例えば、固相担体が磁気ビーズであれば、固定化工程（１０２）後の溶液中の複合体−固相担体を、磁石（磁気マグネット）を用いて回収した後、バッファを用いて洗浄し、標的物質や固相担体に非特異的に吸着した一本鎖核酸を洗浄、除去することで、回収することができる。また、固相担体が高分子多糖支持体、シリカ、金属（磁気ビーズを含む）又はガラスであれば、遠心によって複合体−固相担体を沈殿させ、上清を除去した後、バッファを用いて洗浄することで、同様に複合体−固相担体を回収することができる。さらに固相担体が蛍光物質を担持した高分子多糖支持体等であれば、FACSのような蛍光検出器によって、回収することができる。それぞれの具体的な選択方法は、当該分野で公知の技術を用いて固相担体の有する特性に基づいて適宜定めればよく、特に限定はしない。
【００８１】
本工程で洗浄に用いるバッファには、複合体形成工程（１０１）で使用したバッファと同様の組成のバッファを使用することができる。さらに、バッファは、必要に応じて還元剤や界面活性剤を含んでいてもよい。使用する還元剤には、例えば、DTT（ジチオトレイトール）や2-メルカプトエタノールが挙げられる。溶液中の還元剤の最終濃度は、0.5〜10 mM、1〜5 mMの範囲であればよい。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Nonidet P40（NO-40）、Triton X-100、Triton X-114、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、n-オクチル-β-グルコシド、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10が好ましい。溶液中の界面活性剤の最終濃度は、容量/容量（V/V）で0.005 ％〜0.1 ％、0.01 ％〜0.08 ％の範囲であればよい。
【００８２】
洗浄は、上記バッファを用いて1〜数回行えばよい。2〜3回行うことが好ましい。洗浄温度や洗浄時間は、特に限定はしないが、15〜50℃、又は20〜40℃で、10分〜1時間行えばよい。
【００８３】
（４）増幅工程
「増幅工程」（１０４）とは、複合体中の一本鎖核酸を回収後、核酸増幅法によって増幅させる工程である。
【００８４】
本工程では、まず、必要に応じて回収工程（１０３）で回収された複合体−固相担体から複合体の溶出を行う。溶出方法は、結合子の種類によって異なる。例えば、結合子が抗体である場合には複合体−固相担体を酸処理等によって解離させた後、必要に応じてアルカリを加え、中和処理を行うことによって、複合体−固相担体から複合体を溶出することができる。また、結合子がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである場合、7 M以上の尿素及び／又は2 M以上のβ-メルカプトエタノールを含む溶液中で加熱処理することによって、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンの結合を解離させ、複合体を溶出することができる。さらに、標的物質が糖鎖修飾された物質で、結合子がレクチンである場合、グルコース等の糖を添加することによって複合体を溶出することができる。これらの方法は、当該分野で公知の方法に従い、適宜行えばよい。
【００８５】
複合体一本鎖核酸を回収する方法は、複合体を形成する標的物質の種類によって異なる。したがって、その標的物質と核酸からなる複合体から核酸を回収する当該分野で公知の方法に基づいて行えばよい。例えば、標的物質がタンパク質のようなペプチドの場合、アルカリ法やフェノール／クロロホルム法のようなタンパク質変性法によってタンパク質を凝固、除去することによって、目的の一本鎖核酸を回収することができる。また、標的物質が脂質又は低分子化合物の場合、例えば、溶出バッファを加えた後、加熱処理をして核酸の二本鎖構造を破壊する、又は溶出バッファにキレート剤を添加した状態、若しくは溶出バッファのpHを結合バッファと変えた状態で加熱処理をして核酸の二本鎖構造を破壊することによって、標的物質と核酸との結合を解離させた後、アルコール沈殿法等によって解離した一本鎖核酸を回収することができる。また、標的物質を固相担体に結合子で固定化する際に、結合子中に光照射や還元剤などで切断可能なリンカーを加えておくことで、標的物質を結合した核酸とともに固相担体から切り出し、上述の操作によってアルコール沈殿法等により核酸分子を回収することもできる。また、前述のように、固定化工程（１０２）で複合体と共に固相担体に固定化された、複合体を形成していない標的物質も、本工程で除去することができる。
【００８６】
続いて、回収後の一本鎖核酸を、当該分野で公知の核酸増幅法によって増幅させる。「核酸増幅法」とは、プライマーとポリメラーゼ等の酵素を用いて鋳型となる核酸の特定領域を増幅する方法をいう。本工程で用いる核酸増幅法は、当該分野で公知のいずれの方法を使用すればよい。例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、ICAN（等温遺伝子増幅）法等が挙げられる。好ましくはPCR法である。
【００８７】
前記反応で用いられるポリメラーゼは、使用する核酸増幅方法によって適宜定められるが、通常は、DNAポリメラーゼ、特に熱耐性DNAポリメラーゼを使用する。このような耐熱性核酸ポリメラーゼは、TaKaRa社、New England Biolab社、Roche社、ライフテクノロジー社、Roche社、Promega社等の各メーカーから様々な種類のものが市販されており、それらを利用することもできる。一般に、核酸増幅法で使用されるポリメラーゼには、フィデリティー（fidelity）の高いものが好まれるが、本工程で使用するポリメラーゼは、必ずしもフィデリティーが高い必要はなく、Taqポリメラーゼのように、しばしばエラーが導入され得るポリメラーゼであってもよい。
【００８８】
核酸増幅法の反応条件は、増幅させる塩基配列の長さ、鋳型用核酸、すなわち回収した一本鎖核酸の量、プライマーのTm値、使用するポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等を勘案して決定すればよい。例えば、PCR法であれば、前記一本鎖核酸ライブラリーの各一本鎖核酸を構成する5′末端側プライマー結合領域（２０１）に対応する配列をフォワードプライマー（２０４）に、3′末端側プライマー結合領域（２０３）に相補的な配列をリバースプライマー（２０５）に用いる。このとき、リバースプライマーを標識子で標識しておくことによって、その標識子に基づいて、増幅反応後の反応溶液から増幅産物である二本鎖核酸を選択的に分離、精製したり、その後、その二本鎖核酸のうち目的の一本鎖核酸に相補する他方の一本鎖核酸をその標識子に基づいて分離、除去することができるので便利である。市販のポリメラーゼを用いる場合には、添付のバッファに、塩（MgCl2等）及びdNTP(N=A、G、C又はT)を適当な濃度で加えて反応液を調製すればよい。PCRを変性、アニーリング及び伸長の3ステップで行う場合、各ステップの温度と反応時間は、例えば、熱変性ステップを90℃〜98℃で30秒〜1分間、アニーリングステップを50℃〜60℃で30秒〜1分間、伸長ステップを70℃〜75℃で40秒〜2分間程度行えばよい。また、サイクル数は、通常、10サイクル〜40サイクルでよい。好ましくは15サイクルから20サイクルである。
【００８９】
本工程の終了後、一本鎖調製工程までの間に、得られた増幅核酸を必要に応じて精製してもよい。精製によって未反応のデオキシヌクレオチド及びプライマー、又はポリメラーゼ等を除去することができる。精製方法は、当該分野で公知のいずれの方法であってもよい。例えば、エタノール沈殿法やスピン式ゲル濾過カラムを用いた精製方法が挙げられる。後者は、迅速、かつ簡便に核酸を精製することができるので好ましい。このようなカラムは、バイオ関連事業の各社から市販されており、それらを利用することもできる。
【００９０】
（５）一本鎖核酸調製工程
「一本鎖核酸調製工程」（１０５）とは、増幅工程（１０４）で得られた二本鎖核酸を一本鎖化する工程である。
【００９１】
増幅工程（１０４）後の核酸は、通常、標的物質と特異的に結合する一本鎖核酸からなる核酸アプタマーではなく、それに相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と塩基対合した二本鎖核酸の状態で存在している。そこで、本工程では、その二本鎖核酸を一本鎖に調製した後、目的の一本鎖核酸において分子内高次構造を形成させて、核酸アプタマーの調製を行う。
【００９２】
二本鎖核酸の一本鎖化は、一般に熱変性によって行われる。熱変性は、60〜90℃の範囲で行えばよい。このとき変性時に使用する溶液中に1〜7 Mの尿素が含まれていてもよい。その後、変性ゲルを用いて電気泳動を行い、目的のサイズのバンドをゲルから溶出して精製する等の当該分野で公知の方法によって二本鎖の一本鎖化とその精製を行うことができる。
【００９３】
なお、本工程において調製される一本鎖核酸には、目的の核酸アプタマーを形成し得るものと、目的とする一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する対となるものが混在する。本工程では、一本鎖化した核酸に分子内高次構造を形成させる前に、そのような相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸を除去し、目的の核酸アプタマーを形成する一本鎖核酸のみを分離してもよい。このような目的の塩基配列を有する一方の一本鎖核酸のみを分離するには、例えば、前述のように、リバースプライマーを標識子で標識しておくことによって、達成できる。この方法を用いれば、標識子に基づいて、増幅反応後の反応溶液から増幅産物である二本鎖核酸を選択的に分離、精製することも可能となる。具体的には、例えば、ビオチンで標識したリバースプライマーを用いる場合が挙げられる。PCRを行った後、エタノール沈殿法等によって反応液中の増幅された二本鎖核酸を回収した後、その懸濁液にストレプトアビジンを添加して、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成させ、これによって二本鎖核酸を分離、精製する。その後、精製された二本鎖核酸を変性させて、一本鎖化し、変性ゲル電気泳動でその両鎖の移動度の違いによってフラクション化して、目的の一本鎖核酸のみをゲルより分離、精製することができる。
【００９４】
調製した一本鎖核酸に分子内高次構造を形成させるためには、例えば、一本鎖核酸に加熱・冷却処理を行えばよい。具体例を挙げると、一本鎖核酸を複合体形成工程（１０１）で使用したバッファ（例えば、PBSバッファ）に溶解し80〜98℃、好ましくは85〜95℃で30秒〜5分、好ましくは30秒〜3分熱変性させた後、室温等に放置して徐冷するか又は段階冷却することによって分子内高次構造を形成させればよい。段階冷却は、例えば、熱変性後、一旦50〜70℃で1分〜20分程度冷却させた後、さらに温度を15〜35℃に下げて冷却すればよい。
【００９５】
本工程によって、標的物質に特異的に結合する核酸アプタマーを製造することができる。得られた核酸アプタマーは、当該分野で公知の通常の核酸クローニング技術を用いて、その塩基配列を同定することができる。例えば、得られた核酸アプタマーを直鎖状に変性させ、適当なクローニングベクター内に挿入後、サイクルシークエンス反応等によって、塩基配列を決定することができる。これらは、公知の方法であり、例えば、Life Technologies社のBig Dye Terminator Cycle Sequencing Kit等の市販のキットを用いて、シーケンサーを用いて実施することができる。
【００９６】
（６）反復工程
「反復工程」（１０６）とは、複合体形成工程（１０１）から一本鎖核酸調製工程（１０５）まで（本明細書では、以降、これらの一連の工程を「ラウンド」と称する）を複数回繰り返す工程である。
【００９７】
本工程は、前述のように、任意工程である。しかし、一本鎖核酸調製工程（１０５）後に、標的物質との特異性がより高い核酸アプタマーを絞り込むためには、本工程を2ラウンド以上繰り返すことが好ましい。具体的には、例えば、2〜15ラウンド、2〜8ラウンド、又は2〜5ラウンドである。
【００９８】
各ラウンドにおいて、複合体形成工程（１０１）で使用する一本鎖核酸ライブラリーは、初回のラウンドを除き、原則として直前のラウンドの一本鎖核酸調製工程（１０５）で得られる一本鎖核酸のプールを新たな一本鎖核酸ライブラリーとして用いる。初回のラウンドは、前述のように多数の異なる一本鎖核酸の集団で構成されていることが好ましいことから、原則として、化学合成によって調製した一本鎖核酸ライブラリーを用いることが望ましい。各ラウンドで使用する一本鎖核酸ライブラリーには、必要に応じて、各ラウンドにおけるそれぞれの工程、すなわち複合体形成工程（１０１）から一本鎖核酸調製工程（１０５）の諸条件は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。ラウンドの条件が異なる場合として、例えば、各ラウンドで使用する溶液やバッファの組成を変更することが挙げられる。具体的には、ラウンド前半のバッファは、洗浄条件をマイルドにして、核酸アプタマー候補をより多く獲得し、ラウンド後半のバッファには、3 M程度の尿素を混和して、洗浄条件を厳しくすることで標的物質により強固に結合する一本鎖核酸のみを分離することができる。さらに、複合体形成工程（１０１）における標的物質と一本鎖核酸ライブラリーの濃度を各ラウンドで変更することもできる。例えば、ラウンドを重ねる毎に標的物質と一本鎖核酸ライブラリーの濃度を低くして、複合体形成条件をより厳しくすることによって、標的物質により強固に結合する一本鎖核酸のみを分離することができる。
【００９９】
（７）選択工程
「選択工程」（１０７）とは、反復工程（１０６）後に得られる一本鎖核酸から、所定の構造を有する一本鎖核酸分子を選択する工程である。本工程は、任意の工程であり、後述するように、標的物質とより強固に結合する核酸アプタマーを製造することを目的とする場合に選択的に行うことができる。
【０１００】
ここでいう所定の構造とは、一本鎖核酸分子が核酸アプタマーとして二次構造を形成した場合、その予想される二次構造が二本鎖領域を一以上含み、かつその少なくとも一つの二本鎖領域内に非ワトソン・クリック型（non-Watson-Crick型）塩基対が含まれる構造をいう。
【０１０１】
本発明者らは、本発明の製造方法により得られる核酸アプタマーにおいて、標的物質との結合領域と予測される二本鎖領域内に非ワトソン・クリック型塩基対を有するものが、その標的物質と極めて強固に結合することを見出した。本工程は、その知見に基づくものである。
【０１０２】
本工程は、反復工程（１０６）後、すなわちラウンドの最終工程である一本鎖核酸調製工程（１０５）後に得られたそれぞれの一本鎖核酸について、前述の一本鎖核酸調製工程（１０５）に記載した方法を用いて塩基配列を決定し、M-fold（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/）等のソフトウェアを用いて決定した塩基配列から二次構造を予測する。その中から、二次構造内に、連続する5〜20塩基、7〜18塩基、8〜17塩基、又は10〜15塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域、すなわちステム領域を一以上含み、かつその二本鎖領域の少なくとも一つにおいて1〜5塩基対、1〜7塩基対、1〜8塩基対、又は1〜10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる一本鎖核酸配列を選択する。
【０１０３】
本明細書において、「非ワトソン・クリック型塩基対」とは、グアニン（g）、アデニン（a）、シトシン（c）、チミン（t）及びウラシル（u）の各塩基において、グアニンとシトシン（g-c）、アデニンとチミン（a-t）又はウラシル（a-u）以外の塩基対をいう。また、通常の二本鎖DNAで形成される塩基対とは異なる水素結合様式の塩基対も含まれる（NagaswamyU., et al., Nucl. Acid Res. 2000, 28: 375-376）。好ましくは、グアニンとアデニン（g-a）若しくはチミン（g-t）、又はグアニンとグアニン(g-g)、アデニンとアデニン(a-a)等からなる塩基対である。
【０１０４】
本工程は、最終ラウンド終了後の他、各ラウンド後、次のラウンド開始前までの間に行うこともできる。後者の場合、本工程で得られた所定の構造を有する一本鎖核酸を次のラウンドの一本鎖核酸ライブラリーとして使用して、一ラウンド内の各工程の諸条件を厳しくすることで、より一層強固に標的物質に結合する核酸アプタマーを製造することができる。
【０１０５】
２−３．効果
本発明の製造方法によれば、従来法の核酸アプタマー、特にDNAアプタマーの製造方法と比較して、特異性が高く、かつ100〜1000倍以上強い結合能を有する核酸アプタマーを効率的に製造することができる。
【０１０６】
３．核酸分子
本発明の第２の実施形態は、標的物質に結合する核酸分子である。
【０１０７】
３−１．構成
本発明の核酸分子は、その分子内に、二本鎖領域を一以上含み、かつ前記二本鎖領域の少なくとも一つが非ワトソン・クリック型塩基対を含むことを特徴とする。
【０１０８】
本発明の核酸分子は、前述の「１．定義」の項で説明したように、原則としてDNA、RNA、又はそれらの組み合わせのような天然型核酸が該当する。また、本発明の核酸は、その一部又は全部が非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸を含んでいてもよい。好ましい本発明の核酸形態は、DNAである。
【０１０９】
「二本鎖領域」とは、核酸分子を構成するヌクレオチド鎖間において塩基対が連続して形成された領域をいう。連続する塩基対の長さは、5〜20塩基、7〜18塩基、8〜17塩基、又は10〜15塩基である。本発明の核酸分子は、二本鎖領域を二以上含む場合、各二本鎖領域は、同一又は異なる塩基対から構成される。異なる塩基対から構成される場合、各二本鎖領域の長さは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、それぞれの二本鎖領域は、互いに塩基対を形成しない領域（例えば、ミスマッチ部位、ギャップ、バルジ構造、又はインターナルループ構造を含む）によって分断されていてもよいし、連続していてもよい。
【０１１０】
「非ワトソン・クリック型塩基対」とは、前述のように、グアニン、アデニン、シトシン、チミン及びウラシルの各塩基において、グアニンとシトシン、アデニンとチミン又はウラシル以外の塩基対をいう。好ましくは、グアニンとアデニン若しくはチミン、又はグアニンとグアニン(g-g)、アデニンとアデニン(a-a)等からなる塩基対である。
【０１１１】
非ワトソン・クリック型塩基対は、本発明の核酸分子内に存在する前記二本鎖領域の少なくとも一つに含まれていればよい。一つの二本鎖核酸領域内に含まれる非ワトソン・クリック型塩基対は、1〜5塩基対、1〜7塩基対、1〜8塩基対、又は1〜10塩基対である。一つの二本鎖核酸領域内における非ワトソン・クリック型塩基対の位置は、特に限定はしない。
【０１１２】
本発明の核酸分子において非ワトソン・クリック型塩基対を含む二本鎖領域は、標的物質との結合に直接関与する領域である。したがって、その塩基配列は、標的物質によって異なる。標的物質に結合することが既に知られている二本鎖領域の塩基配列に基づき、その一部に非ワトソン・クリック型塩基対を導入した塩基配列であればよい。例えば、特定の標的物質に結合する本発明の核酸分子は、その標的物質に結合する公知のデコイDNA、RNAアプタマー、又はDNAアプタマーにおいて標的物質結合部位と予想される二本鎖領域の塩基配列に基づき、その両鎖に非ワトソン・クリック型塩基対を導入したものであればよい。
【０１１３】
本発明の核酸分子は、標的物質に結合する。「標的物質」とは、前述の「１．定義」の項で説明したように、核酸分子の結合対象となり得る生体物質をいう。標的物質の種類は、特に制限はしないが、ペプチド、核酸、脂質、糖、又は低分子化合物が挙げられる。好ましくはペプチド、より好ましくはポリペプチド、すなわちタンパク質である。特に、特定の塩基配列を有する核酸と結合する転写調節因子、シグナル伝達因子、タンパク質リガンド（サイトカイン、ケモカインを含む）、又は受容体タンパク質は、本発明の核酸分子の標的物質として好ましい。
【０１１４】
転写調節因子の具体例としては、例えば、NF-κB、SP1、E2F、AP-1、STAT-1等が挙げられる。
【０１１５】
シグナル伝達因子の具体例としては、例えば、Raf、Cytohesin 1、Phospholipase A２、HER3等が挙げられる。
【０１１６】
タンパク質リガンドの具体例としては、例えば、VEGF、EGF、NGF、HGF、KGF、bFGF、PDGF、IL-2、-3、-6、-8、-10、-20、IFN-α、-β、-γ、TGF-β、BMP、Activin、TNF-α、Wnt、RANKLが挙げられる。
【０１１７】
本発明の核酸分子は、上記標的物質に結合することによって、標的物質が有する特有の生物学的機能を阻害若しくは抑制又は亢進することができる。通常は、機能阻害又は抑制作用を有する。
【０１１８】
本発明の核酸分子は、二本鎖核酸及び／又は一本鎖核酸からなる。以下、二本鎖核酸及び一本鎖核酸断片のそれぞれについて、具体的に説明をする。
【０１１９】
＜二本鎖核酸＞
二本鎖核酸からなる場合、各ヌクレオチド鎖の長さは、限定はしないが、例えば、5〜50-mer、7〜40-mer、又は10〜35-merの範囲が好ましい。塩基対合する各鎖の長さは、同じである必要はない。例えば、一方のヌクレオチド鎖が他方のヌクレオチド鎖に対して7-mer以上長い場合が挙げられる。この場合、長い側のヌクレオチド鎖は、他方のヌクレオチド鎖と対応しない一本鎖領域内で分子内アニールによってヘアピン構造を形成してもよい。このヘアピン構造内に形成されたステム領域も本発明の二本鎖領域に包含される。
【０１２０】
また、二本鎖核酸を構成する各ヌクレオチド鎖は、二本鎖領域の5′側及び／又は3′側に互いに塩基対合を形成しない一本鎖領域を含むことができる。二本鎖核酸は、これらの一本鎖領域がリンカー核酸のようにループ構造を形成して二本鎖核酸の双方のヌクレオチド鎖を連結したダンベル型の閉環状核酸も包含する。このようなダンベル型核酸は、直鎖状の二本鎖核酸に比べてヌクレアーゼ等の核酸分解酵素に対する分解耐性能を有しており、本発明の核酸分子として好ましい。
【０１２１】
また、二本鎖核酸を構成する各ヌクレオチド鎖の一方又は両方は、5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、国際出願番号PCT/JP2011/059619に記載のヘアピン型DNAを含むこともできる。このヘアピン型DNAは、具体的には、第１核酸領域、第2核酸領域及び第3核酸領域の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された構造を有する。
【０１２２】
「第1核酸領域」とは、2〜5-merの任意ヌクレオチドからなる核酸領域である。本核酸領域の塩基は、グアニン、アデニン、シトシン又はチミンのいずれであってもよいが、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、gc含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がg及び／又はcで構成されていることがもっとも好ましい。
【０１２３】
「第2核酸領域」とは、5′‐gna‐3′又は5′‐gnna‐3′の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各nは、独立に、天然型塩基（g、a、t、若しくはc）、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかからなる。
【０１２４】
「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム構造を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ構造をそれぞれ構成し、全体として、例えば、配列番号３７又は３８の塩基配列を有する7〜14-merのヌクレオチドからなるヘアピン型DNAが形成される。
【０１２５】
このようなヘアピン型DNAを、二本鎖核酸の一方又は両方の3′末端にホスホジエステル結合によって連結することによって、二本鎖核酸の核酸分解酵素に対する分解耐性を向上させて生体内での安定性を高めることが可能となる。
【０１２６】
＜一本鎖核酸＞
本発明の核酸分子を構成する一本鎖核酸は、分子内アニールによって二次構造を形成し、分子内に一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する。前記二本鎖領域は、このステム構造内に含まれる。さらに、ステム構造は、一以上のミスマッチ部位及び／又は一以上のバルジ構造を含んでいてもよい。
【０１２７】
一本鎖核酸のヌクレオチド鎖の長さは、分子内に少なくとも一つの二本鎖領域を含み得る長さを有していれば、特に限定はしない。例えば、15〜100-mer、20〜90-mer、又は30〜80-merの範囲が好ましい。
【０１２８】
また、一本鎖核酸もその5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、前述のヘアピン型DNAを含むことができる。
【０１２９】
本発明の核酸分子が一本鎖核酸の場合、好適な形態として核酸アプタマーが挙げられる。DNAアプタマーは、核酸の安定性の面から特に好ましい。
【０１３０】
＜二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNA＞
本発明の核酸分子が二本鎖RNA又は一本鎖RNA（例えば、RNAアプタマー）からなる場合、それらをコードするDNAも利用することができる。そのようなDNAの塩基配列は、例えば、二本鎖RNA又は一本鎖RNAを構成する塩基配列中のウラシル（U）をチミン（T）に置換した塩基配列となる。
【０１３１】
二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNAは、例えば、RNAアプタマーをコードするDNAであれば、そのRNAアプタマーを鋳型として、そのアプタマーの3′末端塩基配列に全部又は一部が相補するプラマーを用いて、逆転写反応を行うことによって調製することができる。逆転写反応は、当該分野で公知の技術を使用すればよい。例えば、上述のMolecular Cloningに記載の方法に準じて行うことができる。また、本発明のDNAは、二本鎖RNA及び一本鎖RNAの塩基配列情報に基づいて、当技術分野で公知の化学合成法によって製造することもできる。
【０１３２】
さらに、前記二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNAは、それを発現可能な状態で発現ベクターに挿入されていてもよい。「発現可能な状態」とは、発現ベクター内のプロモーターの下流に二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNAを該当するRNAが発現可能なように連結することをいう。本発明の発現ベクターには、宿主内で自律的に増殖し得るプラスミド又はウイルスを使用することができる。そのようなプラスミドとしては、例えば、宿主が大腸菌（Escherichia coli）の場合、pET、pGEX6p、pMAL、pREST等が、宿主が枯草菌（Bacillus subtilis）の場合、pUB110、pTP5等が、宿主が酵母の場合、YEp13、YEp24、YCp50等が、宿主が植物の場合、pBI系、pRI系又はpGW系のバイナリーベクター等が挙げられる。また、ウイルスとしては、宿主が大腸菌の場合、λファージ（λgt11、λZAP等）が、宿主が哺乳動物の場合、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等が、宿主が昆虫の場合、バキュロウイルス等が、宿主が植物の場合、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等が挙げられる。
【０１３３】
３−２．NF-κBを標的物質とする核酸分子の具体例
以下にNF-κBを標的物質とする本発明の核酸分子を具体例を挙げて説明する。
【０１３４】
NF-κBは、免疫反応において主要な役割を担う転写因子の一つであり、炎症反応、細胞増殖、及びアポトーシス等に関与することから、創薬ターゲットとして注目され、その機能を阻害し得る核酸分子の開発が世界各国で行われている。例えば、NF-κBが結合する共通配列を有する二本鎖DNA断片を含むデコイDNA（WO/1996/035430；Miyake T., et al., Mol. Ther., 2001, 19: 181-187；Kim K.H., et al., Exp. Mol. Pathol., 2008, 86: 114-120；Isomura I., A. Morita, Microbiol. Immunol., 2006, 50: 559-563；Mann M.J., Invest., 2000, 106: 1071-1075）やRNAアプタマー（Lebruska L.L. and Maher III L.J., Biochemistry, 1999, 38:3168-3174；N.J. Reiter, L.J. Maher III, S.E. Butcher, Nucleic Acids Res., 2008, 36:1227-1236；Chan R., et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e36；S.E. Wurster, L.J. Maher III, RNA, 2008, 14:1037-1047）が挙げられる。
【０１３５】
しかし、これらの核酸分子は、NF-κBに対する結合能（解離定数、Kd）が、どちらも数nM程度であった。これに対して、本発明の核酸分子は、NF-κBに対する結合能がpMオーダーであり、既知の核酸分子よりも100倍以上高い結合能を有する。
【０１３６】
NF-κBのp50を標的物質とする本発明の核酸分子は、コンセンサス配列として図３（ａ）に示す配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含むことを特徴とする。塩基配列中、「W-W」で記載した塩基対は、「a-t」又は「t-a」を示す。また、二本鎖領域の各塩基間における「｜」は、ワトソン・クリック型塩基対を、「○」又は「●」は、それぞれ「a-g」若しくは「g-a」、又は「g-t」若しくは「t-g」からなる非ワトソン・クリック型塩基対を示す。この図で示すように、NF-κBのp50を標的物質とする本発明の核酸分子は、連続する11塩基が互いに塩基対合するコンセンサス配列において、4塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなることを特徴とする。このようなコンセンサス配列に含まれる具体的な塩基配列としては、例えば、図３（ｂ）に示す配列番号３及び４で示される塩基配列、図３（ｃ）に示す配列番号５及び６で示される塩基配列、そして図３（ｄ）に示す配列番号７及び８で示される塩基配列が挙げられる。
【０１３７】
前述のように、NF-κBのp50を標的物質とする本発明の核酸分子は、上記コンセンサス配列からなる二本鎖領域を一以上含んでいれば、二本鎖核酸及び／又は一本鎖核酸のいずれの形態であってもよい。例えば、二本鎖核酸の場合、上記コンセンサス配列の5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、上記ヘアピン型DNAを含んでいてもよい。また、一本鎖核酸の場合、DNAアプタマーが好適な例として挙げられる。例えば、前記図３（ｂ）に示す配列番号３及び４で示される塩基配列からなる二本鎖領域を分子内に有する、図４の配列番号９〜１１で示される中央領域を含むDNAアプタマー、具体的には、例えば、クローン5R01、5R09及び5R43、図３（ｃ）に示す配列番号５及び６で示される塩基配列からなる二本鎖領域を分子内に有する、図４の配列番号１２〜１８で示される中央領域を含むDNAアプタマー、具体的には、例えば、クローン5R14、5R13、5R34、5R10、5R26、5R27及び5R11、及び図３（ｄ）に示す配列番号７及び８で示される塩基配列からなる二本鎖領域を分子内に有する、図４の配列番号１９〜２１で示される中央領域を含むDNAアプタマー、具体的には、例えば、クローン5R05、5R28及び5R19が挙げられる。
【０１３８】
３−３．効果
これらのDNAアプタマーは、下記実施例で示すように、従来知られていたNF-κB p50を標的物質とするRNAアプタマーやDNAアプタマーよりも100〜1000倍以上強い結合能を有する。このように、本発明の核酸分子によれば、核酸分子内に含まれる少なくとも一つの二本鎖領域が非ワトソン・クリック型塩基対を有することで、従来の核酸アプタマーの標的物質に対する結合能を飛躍的に向上させることができる。
【０１３９】
４．標的物質機能阻害剤
本発明の第３の実施形態は、標的物質の機能阻害剤である。
【０１４０】
４−１．構成
本発明の標的物質機能阻害剤は、前記実施形態２の核酸分子を有効成分とする。
【０１４１】
本明細書において「標的物質機能阻害」とは、標的物質が有する、触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能のような生物学的機能を、有効成分である核酸分子の結合によって阻害又は抑制することをいう。
【０１４２】
本発明の標的物質機能阻害剤における前記核酸分子の含有量は、製薬上有効な量であればよい。
【０１４３】
本明細書において「製薬上有効な量」とは、標的物質機能阻害剤の有効成分である第２実施形態の核酸分子がその薬効である標的物質機能阻害を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体等に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量を言う。その具体的な量は、標的物質の種類、核酸分子の有する抑制活性、使用する剤形、また、生体への投与を目的とする場合には、被検体であるその生体の情報及び投与経路によって異なる。生体への投与の具体例として、ヒトに投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被験者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
【０１４４】
標的物質機能阻害剤の一投与単位あたりにおける本発明の核酸分子の含有量は、例えば、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重60 kg）に対して、前述のNF-κB p50を標的物質とする本発明の核酸分子を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01 ％(w/v)〜約20 ％(w/v)、好ましくは約0.1 ％(w/v)〜約10 ％(w/v)で含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【０１４５】
５．医薬組成物
本発明の第４の実施形態は、医薬組成物である。
【０１４６】
５−１．構成
本発明の医薬組成物は、前記実施形態３に記載の標的物質機能抑制剤を少なくとも一つ含有する。また、本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、前記標的物質機能抑制剤の効果を維持するために、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤又は界面活性剤が挙げられる。
【０１４７】
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、或いはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４８】
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【０１４９】
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
【０１５０】
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【０１５１】
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【０１５２】
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５３】
このような担体は、必要に応じて適宜使用すればよい。本発明の薬物組成物は、上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤（例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等）、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【０１５４】
「界面活性剤」としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する。
【０１５５】
本実施形態の医薬組成物は、上記担体を一以上包含することが可能である。
【０１５６】
さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、抗生物質を所定量含有していてもよい。
【０１５７】
本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。通常は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。
【０１５８】
例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
【０１５９】
非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は、組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物も、それぞれの投与方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例えば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、例えば、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることができる。
【０１６０】
薬物を植物に投与する場合には、薬剤組成物の剤形は、液体、固体（半固体を含む）又はその組み合わせが挙げられる。溶液剤、油性分散液剤、エマルション剤、懸濁製剤、粉剤、散剤、ペースト剤、ゲル剤、ペレット剤、錠剤及び粒剤とすることができる。
【０１６１】
なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
【０１６２】
５−２．製造方法
本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
【０１６３】
例えば、注射剤の場合には、第２の実施形態の核酸分子を製薬上許容可能な溶媒に溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
【０１６４】
「薬学的に許容可能な溶媒」としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【０１６５】
５−３．投与方法
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患等の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明の核酸分子を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明の核酸分子を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【０１６７】
本発明の医薬組成物は、有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
【０１６８】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。有効成分である核酸分子が標的物質に結合してその機能を抑制することができれば、いずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経肺、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。前述のように血流を介して本発明の医薬組成物を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性も比較的低いからである。
【０１６９】
６．標的物質検出方法
本発明の第５の実施形態は、前記第２実施形態に記載の核酸分子を用いた標的物質の検出方法である。
【０１７０】
６−１．構成
第２実施形態に記載の核酸分子は、その核酸分子の標的物質と極めて強固に、かつ特異的に結合し得るため、核酸分子のその性質を利用して試料中に存在する標的物質を検出することができる。
【０１７１】
第２実施形態に記載の核酸分子と標的物質間の結合を利用した方法であれば、検出方法自体は公知の検出方法を用いればよい。例えば、SPR法、水晶振動子マイクロバランス法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
【０１７２】
SPR（表面プラズモン共鳴）は、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。SPR法は、この現象を利用した測定方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、予め第２実施形態の核酸分子を金属薄膜表面上に固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させ、当該核酸分子と標的物質との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することにより試料中の標的物質を検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。
【０１７３】
QCM（水晶振動子マイクロバランス：Quartz Crystal Microbalance）法は、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用した方法である。この方法を用いたQCMセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえることができる。本発明においては、電極表面に、前記SPR法と同様に予め核酸分子を固定化しておき、試料を電極表面に接触させることによって、核酸分子と標的物質との結合により生じる水共振周波数の変化量から試料中の標的物質を定量的に検出することができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、Christopher J., et al.(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169を参照すればよい。
【０１７４】
比濁法は、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料中に第２実施形態の核酸分子を添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中の標的物質を定量的に検出することができる。
【０１７５】
また、標的物質に対する抗体と併用することにより標的物質を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体に第２実施形態の核酸分子を固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在する標的物質と前記核酸分子とを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗標的物質抗体を加えて標的物質に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗標的物質抗体を検出することにより、試料中の標的物質を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
【０１７６】
このような検出方法の具体的な例として、標的物質がNF-κB p50のときに、核酸分子が第２実施形態に記載したコンセンサス配列として図３（ａ）に示す配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む核酸分子が挙げられる。例えば、図３（ｂ）に示す配列番号３及び４で示される塩基配列、図３（ｃ）に示す配列番号５及び６で示される塩基配列、そして図３（ｄ）に示す配列番号７及び８で示される塩基配列を有する核酸分子であり、より具体的には、例えば、前記コンセンサス配列の5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、第２実施形態に記載したヘアピン型DNAを含む核酸分子、あるいは前記図４の配列番号９〜２１で示される中央領域を含むDNAアプタマー、より具体的には、例えば、クローン5R01、5R09、5R43、5R14、5R13、5R34、5R10、5R26、5R27、5R11、5R05、5R28及び5R19が挙げられる。試料中のヌクレアーゼ濃度が高く、核酸分子を利用できない場合には、測定前に試料をヌクレアーゼインヒビターで処理する等した後に用いればよい。
【０１７７】
６−２．効果
本発明の検出方法によれば、第２実施形態の核酸分子の標的物質への強固かつ特異的な結合を利用して、試料中の微量な標的物質を高感度に検出することが可能となる。
【０１７８】
７．NF-κB p50検出キット
本発明の第６の実施形態は、第２実施形態のNF-κB p50結合性核酸分子を一以上含むNF-κB p50を検出するためのキットである。本キットは、前記態様であるNF-κB p50結合性核酸を使用して試料中のNF-κB p50を検出することができる。
【０１７９】
本キットは、第２実施形態記載のNF-κB p50結合性アプタマーの他、必要に応じて標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、又は試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を含むことができる。さらに、そのキットの使用説明書を包含することもできる。
【実施例】
【０１８０】
＜実施例１：核酸アプタマーの高効率製造法の開発＞
Ｉ．固相担体の条件検討
本発明の核酸アプタマーの製造方法において、使用する固相担体への一本鎖核酸の非特異的吸着を低減させるために、固相担体の最適条件を検討した。【０１８１】
（方法）
固相担体には、メーカー市販のストレプトアビジンでコートされた2種類の磁気ビーズを用いた。磁気ビーズA(NewEnglandBiolabs社、Hydrophilic Streptavidin Magentic Beads）は、ビーズ表面が親水性であり、磁気ビーズB(NewEnglandBiolabs社、Streptavidin Magnetic Beads）は、ビーズ表面が疎水性である。【０１８２】
これらの磁気ビーズを用いて、磁気ビーズへの一本鎖DNAの非特異的吸着について検証した。具体的には、配列番号２２に示す43塩基からなるランダム領域（Nで示す）を含む一本鎖DNAで構成された一本鎖核酸ライブラリー（全長79-mer）8 pmoLを含む溶液に50 μgの磁気ビーズA、又はBをそれぞれ混合した後、50 mLサイズのファルコンチューブを用いて、0.05 % Nonidet P-40及び2.5 mM DTTを含む40 mLのPBSバッファで磁気ビーズを洗浄し、溶液中の一本鎖DNAを除去した後、磁気ビーズに非特異的に吸着したDNA量をリアルタイムPCRにより検出した。リアルタイムPCRには、配列番号２３で示すリバースプライマーと配列番号２４で示すフォワードプライマーを用いた。なお、ライブラリーを構成する一本鎖DNAに相補的なリバースプライマーは、5′末端のチミン（t）をビオチン化修飾している。それ故、PCR増幅された産物をストレプトアビジンと混合した後、変性ゲル電気泳動を行うことにより、未反応のリバースプライマー及び5′末端がビオチン化された配列２２に示す一本鎖DNAの相補配列は、ストレプトアビジンと結合して移動度が遅くなることから、ゲルシフト法により目的の一本鎖DNAの増幅産物を選択的に調製できる。【０１８３】
PCRの反応条件は、SYBR Green I（Lonza 社）とROX Dye（Life Techonologies社）の存在下で、95℃を30秒、50℃を30秒、そして65℃を2分の3ステップで、PCRを30サイクル行い、Mx3005P（Agilent Technologies社）によって、その増幅過程を検出した。【０１８４】
（結果）
結果を図５に示す。この図が示すように、疎水性表面を有する磁気ビーズBは、親水性表面を有する磁気ビーズAよりもより多くの増幅産物が得られた。この結果は、親水性表面を有する固相担体の方が疎水性表面を有する固相担体よりも一本鎖核酸の非特異的吸着が少なく、本発明の製造方法における固相担体に適していることが示された。【０１８５】
なお、前記磁気ビーズの洗浄に用いたバッファ中に、上記Nonidet P-40等の非極性界面活性剤を添加すると、無添加のときと比較して固相担体である磁気ビーズの収集性が向上することが明らかとなった（データ示さず）。【０１８６】
ＩＩ．NF-κB p50を標的物質とするDNAアプタマーの製造
次に、本発明の核酸アプタマー製造方法を用いて、標的物質を転写因子であるNF-κB p50とし、それに強結合するDNAアプタマーの作製を行った。【０１８７】
（方法）
化学合成した配列番号２５で示す、43塩基からなるランダムな塩基配列の中央領域（Nで示す）を含む一本鎖DNAからなる一本鎖核酸ライブラリー（全長95-mer）を用いて、複合体形成工程（１０１）から一本鎖核酸調製工程（１０５）を1ラウンドとして、後述の反復工程（１０６）を行った。【０１８８】
以下、本発明の製造方法における各工程について、具体的に説明する。【０１８９】
（１）複合体形成工程（１０１）
前記一本鎖核酸ライブラリーは、PBS緩衝液（1.1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）に溶解した。一本鎖DNA分子内で高次構造を形成させるため、90℃で3分間加熱後、60℃で3分間冷却し、さらにその後25℃に置く加熱・冷却処理を行った。その後、この溶液と等量の0.1 % Nonidet P-40及び5 mM DTTを含むPBS緩衝液と混合した。【０１９０】
次に、固相担体である磁気ビーズの前処理を行った。磁気ビーズには、前記「Ｉ．固相担体の条件検討」の結果から、磁気ビーズA(Hydrophilic Streptavidin Beads、New England Biolabs)を用いた。磁気ビーズに非特異的に吸着する一本鎖DNAを前記一本鎖核酸ライブラリーから除くため、その一本鎖核酸ライブラリー溶液を0.2 mgのストレプトアビジン磁気ビーズ(Hydrophilic Streptavidin Beads、New England Biolabs)と共に室温で30分間インキュベーションし、マグネットスタンドと遠心操作により磁気ビーズを取り除き、上清液を回収した。【０１９１】
そして、標的タンパク質である組換えヒトNF-κB p50 (rhNF-κB、Promega社)と表１に記載の割合で混合し、25℃で30分間インキュベーションすることで一本鎖DNAとNF-κB p50の複合体を形成させた。複合体形成のための一本鎖核酸ライブラリーやNF-κB p50の濃度比、本工程に使用した反応液容量等は、ラウンド毎に調整した。詳細については後述の反復工程（１０６）に記載した。
【表１】
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【０１９２】
（２）固定化工程（１０２）
本実施例では、結合子としてビオチン及びストレプトアビジンを用いた。ビオチンは、標的物質に吸着する第１結合子であり、ストレプトアビジンは、前記磁気ビーズに吸着された第２結合子に相当する。【０１９３】
前記使用したNF-κB p50は、ビオチン化されていないことから、ここでは、まず、複合体形成後の溶液に、0.09容量の10 mM ビオチン化試薬（EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin、Thermo Scientific社）を添加し、25℃で15分間インキュベーションした。これにより、溶液中の複合体に含まれるNF-κB p50と複合体未形成の遊離NF-κB p50とがビオチン化された。【０１９４】
バックグラウンドの増大を防ぐため、未反応のビオチン化試薬をマイクロコン50（Merck社）による限外濾過による洗浄操作で取り除いた。【０１９５】
洗浄後のビオチン化複合体を含む溶液をストレプトアビジン磁気ビーズ(Hydrophilic Streptavidin Beads、New England Biolabs)（p50 monomer換算で 1 pmolあたり6.8〜8μg）と混合して室温で10分間インキュベーションし、ビオチン−ストレプトアビジンの結合子によって、複合体を磁気ビーズに固定化した。その後、タンパク質や磁気ビーズに非特異的に吸着した一本鎖DNAを洗浄するため、磁気ビーズを40 mLの0.05 % Nonidet P-40及び2.5 mM DTTを含むPBSバッファ(以降、本明細書では「バッファA」とする)に懸濁し、37℃で撹拌しながら30分間インキュベーションを行った。この洗浄操作をもう一度繰り返した。【０１９６】
（３）回収工程（１０３）
固定化工程（１０２）後の磁気ビーズに400 μLの溶出液（100 mMクエン酸ナトリウム pH 5.0、7 M 尿素、3 mM EDTA）を加えて、90℃で5分間加熱して、溶出液を回収した。その後、この回収した溶出液にフェノール・クロロホルム処理を行い、イソプロピルアルコールによる沈殿操作により、NF-κB p50に結合していた一本鎖DNAを回収した。【０１９７】
（４）増幅工程（１０４）
PCRには、配列番号２６で示すリバースプライマーと配列番号２７で示すフォワードプライマーを用いた。リバースプライマーは、5′末端のチミン（t）をビオチン化修飾している。PCRは、最終濃度0.025 U/μLのExTaq DNA ポリメラーゼ（タカラバイオ社）と添付バッファを用いて行った。反応組成は、最終濃度が2 mM MgCl2、0.2 mM dNTP (N=A,G,C,T)となるように調製し、サイクル条件は、94℃を30秒、50℃を30秒、そして72℃を1分の3ステップで、DNA増幅量に応じて、15サイクル又は20サイクルで行った。【０１９８】
（５）一本鎖核酸調製工程（１０５）
増幅工程（１０４）後の増幅産物を含むPCR溶液からエタノール沈殿により二本鎖DNAを回収した後、ストレプトアビジンを利用したゲルシフト法により一本鎖DNAを調製した。具体的には、回収された二本鎖DNA（PCR溶液0.4 mL）を、10 μLのSA緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 7.6、50 mM NaCl、1 mM EDTA）に懸濁し、75℃で3分間加熱後、10 μLのストレプトアビジン溶液（5 mg/mL、SA緩衝液に溶解）を加えて、25℃で30分間インキュベーションした。増幅工程（１０４）で使用されたリバースプライマーの5′末端の塩基は、ビオチン化されていることから、この操作によって、ビオチン化二本鎖DNAとアビジンの複合体が形成される。この複合体を含む溶液に、同容量の変性ゲル用ローディングバッファ（10 M尿素、1×TBE溶液）を加えて、75℃で3分間加熱して、一本鎖化した後、7 M 尿素を含む6 % ポリアルアミド変性ゲルで電気泳動し、増幅された目的の一本鎖DNAをゲルから回収することによって、不要なビオチン化された一本鎖DNAを除去した。得られた一本鎖DNAをPBS緩衝液（1.1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）に溶解し、90℃で3分間加熱後、60℃で3分間冷却し、さらにその後25℃に置く加熱・冷却処理を行って一本鎖DNA分子内で高次構造を形成させた。その後、この溶液と等量の0.1 % Nonidet P-40及び5 mM DTTを含むPBS緩衝液と混合し、新たな一本鎖核酸ライブラリーとして次のラウンドに使用した。【０１９９】
（６）反復工程（１０６）
本実施例では、本工程を5ラウンド行った。各ラウンドにおける一本鎖核酸ライブラリー及び標的物質であるNF-κB p50の濃度等の条件については、前記表１に示す通りである。【０２００】
最初のラウンドでは、前述のように化学合成とゲル精製により調製した一本鎖DNAからなる一本鎖核酸ライブラリーを直接用いた。このラウンドでの一本鎖DNAの分子種総数は、333 pmolを用いた。これは、一本鎖DNA約2×1013分子に相当する。ラウンドを繰り返す過程で、一本鎖DNA-NF-κB p50の複合体形成条件を厳しくするために、徐々に一本鎖核酸ライブラリーとNF-κB p50の濃度を低くしていった。また、3ラウンド以降は、一本鎖核酸ライブラリーとNF-κB p50を混合して複合体を形成させる際に、配列番号２８で示す競合DNA分子としてNF-κB mini46（46-mer）を過剰量加えた。各ラウンドの終了時には、40mLのバッファAを用いて、37℃にて30分間で洗浄を2回行った。ただし、5ラウンド目のみ、さらに、バッファAに3 M尿素を加えたバッファ1 mLを用いて、室温で15分間転倒混和することによって洗浄した。これによって、洗浄条件を厳しくし、NF-κB p50に強く結合する一本鎖DNA断片を選別するようにした。【０２０１】
（７）NF-κB p50結合性DNAアプタマーの同定
5ラウンド終了後に得られた各一本鎖DNAにおける中央領域の塩基配列を決定し、得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの一次構造、及びその塩基配列から推定される二次構造を同定した。【０２０２】
まず、5ラウンド終了後に回収した各一本鎖の一部を鋳型として、ビオチン化されていない配列番号２６と配列番号２７で示されるプライマーを用いて、50 μLの反応スケールで、前記増幅工程（１０４）と同様の反応組成、サイクル条件で15サイクルPCRを行った。その後、増幅産物の一部（2 μL）をTOPO TA クローニングキット(Life Technologies社)を用いてクローニングした。得られた大腸菌のクローンから、プラスミドを回収し、42クローンについてシークエンシングを行い、前記中央領域の塩基配列を決定した。【０２０３】
（結果）
得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの塩基配列、クローン名、クローン数及び配列番号を図４に示す。この図で示すように、中央領域の塩基配列は、大きく３つの配列群、すなわち、配列番号９〜１１で示す塩基配列を有する配列群、配列番号１２〜１８で示す塩基配列を有する配列群、そして配列番号１９〜２１で示す塩基配列を有する配列群に分類された。それぞれの配列には、配列番号２９で示すNF-κBの結合する天然型のコンセンサスDNA配列と類似した配列が存在していた。それらのコンセンサスに類似する配列は、図５で示すように、ヘアピン構造のステム部分に位置することがわかった。興味深いことに、このステム部分の配列には、天然型のDNA配列と異なり、非ワトソン・クリック型のG-AとG-Tの塩基対が含まれていることが明らかとなった。【０２０４】
＜実施例２：NF-κBに結合するDNAアプタマーの結合能＞
実施例１で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマークローンのうち、各配列群においてクローン数の多かった5R01、5R14、5R05（図４参照）を用いて、NF-κB p50への結合能について解析した。【０２０５】
（方法）
各クローンの一本鎖DNA（全長95-mer）は、実施例１で得られたクローンのプラスミドを鋳型として、ビオチン化された配列２６及び配列２７のプライマーを用いてPCR増幅した後、実施例１で示した一本鎖核酸調製工程と同様の手順で、ストレプトアビジンを利用したゲルシフト法により調製した。【０２０６】
各NF-κB p50結合性DNAアプタマークローンのNF-κB p50への結合能は、BIACORE3000（GEヘルスケア社）を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）法により測定した。SPR法では、ランニングバッファにバッファAを用い、設定温度25℃で測定を行った。具体的には、ストレプトアビジンコートされたセンサーチップ（SAチップ）に、各クローンの3′末端領域に相補的な塩基配列を有し、5′末端の塩基がビオチン化された配列番号30で示すDNAプローブ(21-mer)を固定化した後、流速5 μL/minで、PBSにより50 nMに希釈した各一本鎖DNAクローン（95-mer）の溶液を60 μL（12分間相当）インジェクションし、プローブとのハイブリダイゼーションによってSAチップに固定化した。【０２０７】
固定化されたクローンDNAとNF-κB p50との結合・解離の検出は、2.5 nM又は5 nMのNF-κB p50溶液(バッファAにより希釈、dimerで換算)をKinetic Injectionモードによってインジェクションすることでモニターした。測定条件は、流速20 μL/min、タンパク質インジェクションは、6分間、インジェクション終了後のタンパク質解離の測定は6分間とした。チップの再生（結合タンパク質の解離）は、2 MのNaCl溶液を5 μL（15秒相当）インジェクションすることで行った。なお、ハイブリダイゼーションにより固定化されたDNAは、流速25 μL/minで0.05 M NaOH溶液を5 μL（12秒相当）インジェクションにより除去することができ、異なるDNA配列での結合解析にも同じチップを使用できた。【０２０８】
（結果）
図７に結果を示す。この図は、上記３つのクローンとNF-κB p50との相互作用を検出したセンサグラムである。この図が示すように、いずれのクローンもNF-κB p50に非常に強く結合すること、そして、NF-κB p50インジェクション終了後のセンサグラムのパターンから、結合したクローンのNF-κB p50からの解離が極めて遅いことが明らかとなった。BIACORE3000付属の解析ソフトを用いて、反応モデル1:1 binding with mass transferでのフィッティングにより解離定数 Kdを算出した結果、Kd＝2.1〜3.5 pMで、解離速度定数も10-5（1/s）のオーダーであった。【０２０９】
＜実施例３：NF-κB p50に結合するDNAアプタマー変異体の結合能＞
実施例２で検証したNF-κB p50結合性DNAアプタマークローン5R01、5R14、5R05を切り詰めた変異体におけるNF-κB p50への結合能について解析した。【０２１０】
（方法）
各NF-κB p50結合性DNAアプタマークローンから5′末端側のプライマー配列領域を含む配列を取り除いた一本鎖DNA変異体（68-mer、配列番号３１、３２、３３）の結合能について、実施例２と同様にSPR法により解析した。各種DNA断片の配列を図８に示す。これら結合解析に使用した一本鎖DNA変異体は、化学合成とゲル精製により調製した。なお、図中、Cont-68（配列番号３４）は、既知のNF-κB p50結合コンセンサス配列を含む二本鎖DNAをアデニンのテトラループ（AAAA）で連結した一本鎖DNAに相当する。また、SPR解析において、各種一本鎖DNAのプローブへのハイブリダイゼーションによるSAチップへの固定化は、流速20 μL/minで、PBSにより250nMに希釈した各種DNA断片（68-mer）溶液を20 μL（1分間相当）インジェクションすることで行った。【０２１１】
（結果）
図９に結果を示す。この図は、上記３つのクローン及び対照用のCont-68とNF-κB p50との相互作用を検出したSPRのセンサグラムである。【０２１２】
実施例２で検証したNF-κB p50結合性DNAアプタマーのそれぞれの5′末端側プライマー結合領域を含む配列を取り除いた一本鎖DNA変異体の結合能は、Kd＝5.7〜8.7 pMであった（図８及び９）。一方、対照である天然型のDNA配列をステムに持つヘアピン型DNA Cont-68の結合能は、従来から知られている値に近く、Kd=3.5 nMであった（図８及び９）。この結果から、本発明の製造方法で得られた非ワトソン・クリック型塩基対を含む二本鎖領域を包含するDNAアプタマーは、従来のデコイDNAに用いられるDNA断片よりも、その結合能が数百〜約1000倍も高いことが明らかとなった。【０２１３】
＜実施例４：NF-κB p50結合性DNAアプタマー5R01-68変異体のNF-κB p50への結合能＞
実施例１で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの各クローンの共通構造は、前述のように、通常の二本鎖DNAとは異なる非ワトソン・クリック型塩基対を含む（図４）。そこで、NF-κB p50結合性DNAアプタマー5R01の変異体であって、実施例３で調製した5R01-68の二本鎖領域中に存在する5箇所の非ワトソン・クリック型塩基対、すなわち、2箇所のG-T塩基対及び3箇所のG-A塩基対を、全てワトソン・クリック型塩基対であるG-C塩基対に変えた配列番号３５で示される変異体5R01mut-68について、NF-κB p50への結合能をSPR法により測定した。【０２１４】
（方法）
変異体5R01mut-68は、配列番号３５で示される塩基配列に基づき、化学合成により調製した。実施例２と同様の方法によりNF-κB p50に対する結合能を検証した。同時に、非ワトソン・クリック型塩基対を含む5R01-68とCont-68を対照用として用い、同様に結合能を測定した。【０２１５】
（結果）
図１０に結果を示す。この図は、変異体5R01mut-68（A）、対照用の5R01-68（B）及びCont-68（C）のそれぞれについて、NF-κB p50との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラムである。変異体5R01mut-68は、Cont-68よりも結合能が20倍以上強かったが、5R01-68と比較すると解離速度定数が10倍大きくなっており、非ワトソン・クリック型塩基対を有する5R01-68よりもNF-κB p50から解離しやすくなっていることがわかった。この結果から、本発明の製造方法で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの各クローンにおける共通構造中の非ワトソン・クリック型塩基対は、NF-κB p50との結合に寄与していることが明らかとなった。【０２１６】
＜実施例５：NF-κB p50結合性DNAアプタマーのNF-κB p50に対する結合特異性＞
実施例１で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーのNF-κB p50結合選択性を調べた。【０２１７】
（方法）
実施例３で調製した非ワトソン・クリック型塩基対を有する5R01-68及び、実施例４で調製した非ワトソン・クリック型塩基対を含まない5R01mut-68を固定化したセンサーチップを用いて、NF-κB p50以外の転写因子であるAP-1タンパク質(プロメガ社)、及びTaq DNAポリメラーゼ (Roche社、1U= 0.05 pmol換算)への結合をSPR法によって検証した。【０２１８】
対照用アプタマーとして、公知の抗Taq DNAアプタマーを組み込んだ59-mer のDNA断片Taq-59（配列番号３６)を化学合成により調製し、5R01-68及び5R01mut-68と同様に、各種タンパク質への結合をSPR法によって検証した。【０２１９】
（結果）
図１１に結果を示す。この図は、5R01-68（A）、5R01mut-68（B）、対照用のTaq-59のそれぞれについて、NF-κB p50（●）、Taq DNAポリメラーゼ（○）、及びAP-1（△）との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラムである。この図から、5R01-68及び5R01mut-68のAP-1やTaq DNAポリメラーゼへの結合能は非常に弱く、本発明の製造方法で得られたDNAアプタマーが標的物質であるNF-κB p50に特異的に結合できることが明らかとなった。【０２２０】
なお、上記各実施例において検証したDNAアプタマー等のSPR法の結果から算出したNF-κB p50への解離定数（Kd値）を表２にまとめた。
【表２】
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【０２２１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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