(57)【要約】  目的物質である２−ケトグルタル酸又はその誘導体を生産する能力を有し、キシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強された細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取することにより、目的物質を製造する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質を生産する能力を有する細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取する、目的物質の製造方法であって、
前記目的物質は２−ケトグルタル酸又はその誘導体であり、
前記細菌はキシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強されたことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細菌は、キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、これらの酵素活性が付与又は増強されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、カウロバクター属、エシェリヒア属、アグロバクテリウム属、ヘルバスピリラム属、アクチノプラネス属、カプリアビダス属、シュードモナス属、ゾベリア、サーモバチルス属、アースロバクター属、アゾスピリラム属、ハロモナス属、バチルス属、又はアスペルギルス属に属する微生物由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌は、下記のいずれかによりキシロースからキシロン酸を生成することができることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
（Ａ）キシロースデヒドロゲナーゼ活性または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼ活性を付与又は増強されている、又は、
（Ｂ）キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【請求項５】
前記グルコースデヒドロゲナーゼはピロロキノリンキノンを補酵素とし、かつ、前記細菌は、ピロロキノリンキノン生産能を有するか、又は、ピロロキノリンキノンを含有する培地で培養されることにより、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌は、キシロースデヒドロゲナーゼ、または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、キシロースからキシロン酸を生成することができる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌は、さらに２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌は、さらにコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が腸内細菌又はコリネ型細菌であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌がパントエア属細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌がパントエア・アナナティスであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌がエシェリヒア属細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌がエシェリヒア・コリであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌がコリネバクテリウム属細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記２−ケトグルタル酸誘導体が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、プトレッシン、及び、γ−アミノ酪酸からなる群より選択される物質である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸等の目的物質の製造法に関し、詳しくは、キシロースを原料として発酵法により目的物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型細菌（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節
変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。【０００３】
近年は、目的物質の発酵生産に組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献８、特許文献９）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献１０）によって、細菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。【０００４】
従来、発酵法による物質の工業生産においては、炭素源として糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されてきたが、多少高価であり、近年では、植物由来のバイオマス原料等の使用も進められている。
このようなバイオマス原料として、現在はスターチ、油脂等の可食部原料の使用が主であるが、将来的には、非可食部原料、具体的には、セルロース・ヘミセルロース、リグニンなどへの移行が必要である。非可食部バイオマスのセルロース・ヘミセルロースは、熱や酸などを用いる前処理行程、セルラーゼ酵素による糖化処理行程等を経て、５単糖、６単糖の糖へと変換され、発酵の原料として用いることができる（特許文献１１、１２）。このような５単糖、６単糖の混合糖をアミノ酸発酵等の原料とした場合、エシェリヒア・コリは、グルコースを優先的に資化することが知られており、結果、二段階増殖（ジオキシー）を示したり、生育が遅延する現象が確認されている（非特許文献２、３）。【０００５】
エシェリヒア・コリにおいては、xylA遺伝子がコードするキシロースイソメラーゼ、xylB遺伝子がコードするキシルロキナーゼによるキシロース資化経路が知られており、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカムに導入し、キシロースからＬ−アミノ酸を生産できることが知られている（非特許文献５、特許文献１３、非特許文献７）。【０００６】
一方、このような従来知られていた経路を経由せず、キシロースからキシロン酸を経由し、２−ケトグルタル酸へ５段階で至る経路がカウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）やハロフェラックス・ボルカニイ（Haloferax volcanii）に存在することが報告されている（非特許文献６）。また、該経路をエシェリヒア・コリで発現させた例が知られている（非特許文献８、特許文献１４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献８】米国特許第５，１６８，０５６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７７６，７３６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９０６，９２５号明細書
【特許文献１１】特表平９−５０７３８６号公報
【特許文献１２】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献１３】欧州特許第１５７７３９６号明細書
【特許文献１４】米国特許第７,９２３,２２６号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 Jul;56(1-2):120-125
【非特許文献３】Gonzalez, R., Biotechnol. Prog. 2002 Jan-Feb;18(1):6-20
【非特許文献４】Song S. et al., J. Bacteriol. 1997 Nov;179(22):7025-7032
【非特許文献５】Tao H., et al., J. Bacteriol. 2001 May;183(10):2979-2988
【非特許文献６】Stephens, C. et al., J. Bacteriol. 2007 Mar;189(5): 2181-2185
【非特許文献７】Gopinath, V. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011 Jul 28
【非特許文献８】Huaiwei,L et al.,Bioresour Technol. 2011 Aug 22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、キシロースを含む培地において、効率よくＬ−グルタミン酸等の目的物質を生産できる微生物、及びそれを用いた目的物質の製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、５単糖、６単糖資化能を持つアミノ酸生産菌の育種開発を目的とし、キシロースからキシロン酸を経由し、２−ケトグルタル酸へ至る経路を利用して、微生物の育種開発について検討を行った。その結果、本経路を発現させた微生物が、効率よくキシロースを資化し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。【００１１】
（１）目的物質を生産する能力を有する細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取する、目的物質の製造方法であって、
前記目的物質は２−ケトグルタル酸又はその誘導体であり、
前記細菌はキシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強されたことを特徴とする方法。
（２）前記細菌は、キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、これらの酵素活性が付与又は増強されたことを特徴とする、前記方法。
（３）キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの各々をコードする遺伝子が、カウロバクター属、エシェリヒア属、アグロバクテリウム属、ヘルバスピリラム属、アクチノプラネス属、カプリアビダス属、シュードモナス属、ゾベリア、サーモバチルス属、アースロバクター属、アゾスピリラム属、ハロモナス属、バチルス属、又はアスペルギルス属に属する微生物由来である、前記方法。
（４）前記細菌は、下記のいずれかによりキシロースからキシロン酸を生成することができることを特徴とする、前記方法：
（Ａ）キシロースデヒドロゲナーゼ活性または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼ活性を付与又は増強されている、又は、
（Ｂ）キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。
（５）前記グルコースデヒドロゲナーゼはピロロキノリンキノンを補酵素とし、かつ、前記細菌は、ピロロキノリンキノン生産能を有するか、又は、ピロロキノリンキノンを含有する培地で培養されることにより、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、前記方法。
（６）前記細菌は、キシロースデヒドロゲナーゼ、または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、キシロースからキシロン酸を生成することができる、前記方法。
（７）前記細菌は、さらに２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、前記方法。
（８）前記細菌は、さらにコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、前記方法。
（９）前記細菌が腸内細菌又はコリネ型細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１０）前記細菌がパントエア属細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１１）前記細菌がパントエア・アナナティスであることを特徴とする、前記方法。
（１２）前記細菌がエシェリヒア属細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１３）前記細菌がエシェリヒア・コリであることを特徴とする、前記方法。
（１４）前記細菌がコリネバクテリウム属細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１５）前記細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムであることを特徴とする、前記方法。
（１６）前記２−ケトグルタル酸誘導体が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、プトレッシン、及び、γ−アミノ酪酸からなる群より選択される物質であるである、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】icd遺伝子欠損株を利用したC. crescentus由来NXAオペロン発現株生育相補試験の結果を示す図。E1-αKG、M9-αKG、M9-Xyl、E1-Xylは、各々２−ケトグルタル酸又はキシロースを単一炭素源として含むM9最小培地及びE1合成培地を示す。
【図２】E.coli ccrNXAオペロンを発現するE. coli Ｌ−グルタミン酸生産菌のＬ−グルタミン酸生産培養の結果を示す図。
【図３】E. coli固有のキシロース資化経路欠損株を宿主としたccrNXAオペロン発現株によるＬ−グルタミン酸生産培養の結果を示す図。
【図４】中コピー型ベクターを用いたccrNXAオペロン発現株によるＬ−グルタミン酸生産培養の結果を示す図。
【図５】各種微生物由来のxylDホモログ遺伝子発現株によるＬ−グルタミン酸生産培養の結果を示す図。Atu、Hse、Amis、Aorは、各々Agrobacterium tumefaciens、Herbaspirillum seropedicae、Actinoplanes missouriensis、Aspergillus oryzaeを表す。
【図６】各種微生物由来のxylXホモログ発現株によるＬ−グルタミン酸生産培養の結果を示す図。Art、Atu、Cne、Zga、Tco、Seloは、各々Arthrobacter globiformis、Agrobacterium tumefaciens、Cupriavidus necator、Zobellia galactanivorans、Thermobacillus composti、Pseudomonas elodeaを表す。
【図７】各種微生物由来のxylAホモログ発現株によるＬ−グルタミン酸生産培養の結果を示す図。Hbo、Abrは、各々Halomonas boliviensis、Azospirillum brasilenseを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、目的物質を生産する能力を有する細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取する、目的物質の製造方法であって、
前記目的物質は２−ケトグルタル酸又はその誘導体であり、
前記細菌はキシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシキシロネート２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強されたことを特徴とする方法である。
【００１４】
目的物質は、２−ケトグルタル酸（α−ケトグルタル酸、αKG）又はその誘導体である。２−ケトグルタル酸の誘導体としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、プトレッシン、及びγ−アミノ酪酸が挙げられる。
【００１５】
「目的物質生産能」とは、本発明に用いる細菌を培地に培養したときに、前記目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。好ましくは、同条件で培養された野生株又は非改変株よりも、多量の目的物質を生産する能力を有することをいう。細菌は、２種類以上の目的物質の生産能を有するものであってもよい。
【００１６】
また、前記目的物質は、フリー体及び/またはその塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む。
【００１７】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、キシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強された細菌である。
本発明の細菌は、キシロネートデヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を本来的に有さないが、これらの酵素活性を付与された細菌であってもよく、これらの酵素活性を本来的に有しているが、これらの酵素活性を増強された細菌であってもよい。
【００１８】
キシロースからキシロン酸を生成する能力は、例えば、
１）キシロースデヒドロゲナーゼ活性を付与あるいは増強すること、又は
２）キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有すること、
のいずれか又は両方によって達成される。
１）に該当する微生物としては、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌が、２）に該当する微生物としては、パントエア属細菌等が挙げられる。
１）に関してはキシロースデヒドロゲナーゼ活性に加えてさらにキシロノラクトナーゼを強化してもよい。
各属に属する細菌については、後述する。
【００１９】
キシロースから生成されるキシロン酸は、キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼにより、２−ケトグルタル酸に変換される。キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼにより、２−ケトグルタル酸に至る経路は、Weimberg pathwayとも呼ばれている（J. Biol. Chem., 236: 629-636）。本明細書では、Weimberg pathway、及び、Weimberg pathwayに加えて、キシロースデヒドロゲナーゼ及び/またはキシロノラクトナーゼによりキシロースからキシロン酸に至る経路を含めて、NXA（Novel Xylose Assimilation）経路と記載することがある。
【００２０】
細菌がWeimberg pathwayを有しているか、又は同経路が導入されたか否かは、細菌抽出物のキシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を測定するか、あるいは、Weimberg pathwayを保持していない株では蓄積されるキシロン酸を資化していることを確認することによって、決定できる。また、細菌がNXA経路を保持しているか、又同経路が導入されたか否かは、前記各酵素に加えて、キシロースデヒドロゲナーゼ、及び/またはキシロノラクトナーゼの酵素活性を測定することによって決定することができる。また、これらの酵素活性は、キシロースから生成するキシロン酸を測定することによっても決定できる。
【００２１】
本発明において、キシロネートデヒドラターゼ（xylonate dehydratase）とは、次の反応を可逆的に触媒する酵素であり（EC4.2.1.82）、D-xylo-aldonate dehydratase、D-xylonate dehydratase、and D-xylonate hydro-lyaseとも呼ばれる。
【００２２】
D-キシロン酸 → ２−デヒドロ−３−デオキシ-D-キシロネート ＋ H２O
【００２３】
キシロネートデヒドラターゼ活性は、例えば、D-キシロン酸溶液と被検試料を混合して反応させた後、1% セミカルバジド塩酸塩（semicarbazide hydrochloride）水溶液と1.5%酢酸ナトリウム水溶液からなる反応停止液を加えて反応を停止させ、希釈液の250nmにおける吸収を測定することにより、測定することができる（Dahms, A.S., et al., Methods Enzymol. 1982;90 Pt E:302-5）
【００２４】
本発明において、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ（2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase）とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素である（EC4.2.1.-）。
【００２５】
２−デヒドロ３−デオキシ-D-キシロネート → 
２−オキソグルタル酸セミアルデヒド ＋H２O
【００２６】
２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性は、例えば、基質である２−ケト−３−デオキシキシロン酸溶液と被検試料を混合して反応させた後、２−ケト−３−デオキシキシロン酸の減少を測ることにより、測定することができる。
【００２７】
本発明において、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（2-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase）とは、以下の反応を可逆的に触媒する酸化還元酵素である（EC1.2.1.26）
【００２８】
2-オキソグルタル酸セミアルデヒド ＋ NAD(P) → 2-オキソグルタル酸 ＋ NAD(P)H
【００２９】
２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、例えばNAD(P)の還元を測定することにより活性測定が可能である。例えば、ピロリン酸(pH8.5)、NAD(P)と被検試料の混合液に、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドを加え、340nmにおける吸収を測定することにより、同酵素の活性を測定することができる（Adams, E., et al, (1967) J. Biol. Chem. 242, 1802-1814）。
【００３０】
キシロースデヒドロゲナーゼ（D-キシロース-1-デヒドロゲナーゼ、D-xylose 1-dehydrogenase）は、ペントースとグルクロン酸の相互変換酵素の一つで、次の反応を可逆的に触媒する酸化還元酵素である（EC1.1.1.175）。
【００３１】
D-キシロース + NAD(P)＋ → D-キシロノラクトン ＋ NAD(P)H ＋ H＋ 
【００３２】
D-キシロース-1-デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、キシロース、被検試料、及びNAD(P)を混合して反応させ、340nmにおける吸収を測定することにより、測定することができる（Stephens, C. et al., J. Bacteriol., 2007, 189(5):181-2185）。
なお、カウロバクター・クレセンタスのキシロースデヒドロゲナーゼは、D-キシロース→キシロン酸の活性を触媒することがある。
【００３３】
本発明において、キシロノラクトナーゼ（xylonolactonase）とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素である（EC3.1.1.68）。
【００３４】
D-キシロノラクトン → D-キシロン酸
【００３５】
キシロノラクトナーゼ活性は、例えば、キシロノラクトンと被検試料を混合して反応させ、残存するキシロノラクトンをヒドロキサメイト法により定量することにより、測定することができる（Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:375-379, 1988; Appl. Microbiol., Biotechnol., 27:333-336, 1988）。
【００３６】
キシロネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの各酵素をコードする遺伝子は、Weimberg pathwayを有している微生物のものであればいずれもよいが、例えば、カウロバクター（Caulobacter）属、エシェリヒア（Escherichia）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ヘルバスピリラム（Herbaspirillum）属、アクチノプラネス（Actinoplanes）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ゾベリア（Zobellia）属、サーモバチルス（Thermobacillus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾスピリラム（Azospirillum）属、ハロモナス（Halomonas）属、バチルス（Bacillus）属などに属する細菌、又はアスペルギルス（Aspergillus）属に属する糸状菌等の微生物由来の遺伝子が挙げられる。
【００３７】
カウロバクター属細菌としては、カウロバクター・クレセンタスが挙げられる。
【００３８】
カウロバクター・クレセンタスとしては、CB-15株、CB-13株が知られており、それぞれATCC 19089、ATCC33532として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）に保存されている。また、NA-1000株（J. Bacteriol., 192:3678-88 (2010)）、K31株も使用することが可能である。
カウロバクター・クレセンタスCB15株、NA1000株、K31株のゲノム配列は、それぞれ、GenBank Accession Nos. AE005673、CP001340、CP000927として登録されている。
【００３９】
カウロバクター・クレセンタスCB15株、NA1000株、及びK31株由来の各酵素の遺伝子は、GenBankに下記のGene symbolで登録されている。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
尚、カウロバクター・クレセンタス由来のキシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び２−ケトグルタリックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、各々ccrxylB、ccrxylAと記載することがある。
【００４２】
さらに、NXA経路（Novel Xylose Assimilation）の酵素としては、カウロバクター属以外に、例えば、Hypocrea jecorina (Trichoderma ressei)のxylose dehydrogenase（FEMS Microbiol Lett. 277, 249-254 (2007)；Bacillus subtilis のycbD (2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase, typeIII)；Pseudomonas putidaの2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase, typeII）、Azospirillum brasilenseの2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase, typeI、typeII, typeIII（以上、J. Bac. Chem., 282, 6685-6695, 2007）、及びこれらのホモログが挙げられる。
特に、キシロネートデヒドラターゼに関しては、エシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリのyjhG遺伝子、yagF遺伝子を用いてもよい。エシェリヒア・コリのyjhG遺伝子は配列番号３４に、yagF遺伝子は配列番号３６に示す。また、キシロネートデヒドラターゼに関しては、アグロバクテリウム属、ヘルバスピリラム属、アクチノプラネス属、アスペルギルス属に属する微生物、例えばAgrobacterium tumefaciens、Herbaspirillum seropedicae、Actinoplanes missouriensis、Aspergillus oryzaeのxylD遺伝子ホモログを用いてもよい。
また、２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドロターゼに関しては、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、ゾベリア属、サーモバチルス属、アースロバクター属に属する細菌、例えばAgrobacterium tumefaciensA、Cupriavidus necator、Pseudomonas elodea、Zobellia galactanivorans、Thermobacillus composti、Arthrobacter globiformisのxylX遺伝子ホモログを用いてもよい。
さらに、２−ケトグルタリックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼに関しては、アゾスピリラム属、ハロモナス属、バチルス属に属する細菌の遺伝子、例えばAzospirillum brasilense、Halomonas boliviensisのxylA遺伝子ホモログ、又はBacillus subtilis のycbDを用いてもよい。
上記の各遺伝子の塩基配列及びそれらがコードするアミノ酸配列は、表１１に示す。
【００４３】
後述するように、カウロバクター・クレセンタスでは、NXA経路の５つの酵素の遺伝子は、オペロン構造を有している。同オペロンの塩基配列は、GenBankにAAK22808_Caulobacter_crescentusのaccession No.で登録されている。配列番号２３に、同オペロンの塩基配列を示す。同オペロンによりコードされる２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼ、２−ケトグルタリックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、キシロースデヒドロゲナーゼ、及び、キシロノラクトナーゼのアミノ酸配列を、各々配列番号２４〜２７に示す。また、同オペロン中のxylD遺伝子の塩基配列及びそれによってコードされるキシロネートデヒドラターゼのアミノ酸配列を、各々配列番号２８及び２９に示す。配列番号２８の塩基配列は、配列番号２３の5509〜7296位に相当する。
尚、xylXの開始コドンとして２箇所が提唱されているが、配列番号２３では1175〜1177位を開始コドンとして記載した。xylDの開始コドンも2箇所提唱されており、配列番号２８の1〜3位、あるいは13〜15位を開始コドンとして使用してもよい。13〜15位が開始コドンの場合は、配列番号２９のキシロネートデヒドラターゼのアミノ酸配列は、5位のLeuから始まる。
【００４４】
グルコースデヒドロゲナーゼは、本来、以下の反応を可逆的に触媒する酵素であるが（EC1.1.1.119）、「キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ」とは、ピロロキノリンキノンを補酵素とすることにより、D-キシロースをD-キシロノラクトンに変換することができる酵素を意味する。
【００４５】
β-D-グルコース + NADP → D-グルコノ-1,5-ラクトン + NADPH + H＋
ピロロキノリンキノンは、微生物がもともと有する能力により生産されてもよいし、培地中に添加されてもよい（Appl Environ Microbiol. 2009 May;75(9) 2784-2791）。
【００４６】
本発明においては、２−ケトグルタル酸またはその誘導体を生産する細菌として、２−ケトグルタル酸の分解経路を弱化あるいは消失させておくことが望ましい。２−ケトグルタル酸の分解経路の弱化又は消失としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ及び/またはコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を弱化あるいは消失させておくことが望ましい。本発明において、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「α-KGDH」ということがある）活性とは、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル−CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、α-KGDH（E1o：α−ketoglutarate dehydrogenase, EC:1.2.4.2）、ジヒドロリポアミドＳ−サクシニルトランスフェラーゼ（E2o：dihydrolipoamide-S-succinyltransferase; EC:2.3.1.61）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をα-KGDH活性という。α-KGDH活性の確認は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。
【００４７】
E1o: 2-oxoglutarate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine = [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] S-succinyldihydrolipoyllysine + CO2
E2o：CoA + enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine = succinyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH
+ H+
【００４８】
なお、α-KGDHは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenase）、２-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）とも呼ばれる。
【００４９】
腸内細菌科、例えばパントエア・アナナティスでは、この３種それぞれの酵素活性を有するサブユニットタンパク質が複合体を形成している。そして、各サブユニットは各々sucA、sucB及びlpdによってコードされ、sucA、sucB遺伝子は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（sdhB）の下流に存在している（米国特許第6,331,419号）。尚、同特許には、これらの遺伝子はエンテロバクター・アグロメランスAJ13355の遺伝子として記載されているが、同菌株は、後にパントエア・アナナティスに再分類されている。
【００５０】
腸内細菌のα-KGDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスのsucA、sucB及び下流に存在するsucC遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列は、EP2100957A1に開示されている。また、エシェリヒア・コリのα-KGDHをコードするsucA、sucB及びsucC遺伝子は、それぞれGenbank NP_415254, NP_415255に開示されている。
【００５１】
また、コリネ型細菌では、E1oサブユニットはodhA遺伝子（sucA遺伝子とも呼ばれるGenBank Accession No. NC_003450のNCgl1084として登録されている）によってコードされ、E3サブユニットはlpd遺伝子（GenBank Accession No. Y16642）によってコードされている。一方、E2oサブユニットは、E1oサブユニットとともに２機能性タンパク質としてodhA遺伝子にコードされているか（Usuda et al., Microbiology 1996 142, 3347-3354参照）、あるいはodhA遺伝子とは別のGenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126として登録されている遺伝子によってコードされていると推測されている。従って、本発明においては、odhA遺伝子は、E1oサブユニットをコードする遺伝子であるが、併せてE2oをコードしていてもよい。
【００５２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのodhA遺伝子の塩基配列及びE1oサブユニットのアミノ酸配列（WO2006/028298）、上記GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126の塩基配列及び同配列によりコードされるE2oサブユニットのアミノ酸配列、及び、上記GenBank Accession No.NC_003450のNCgl1084の塩基配列及び同配列によりコードされるE1oサブユニットの配列は、EP2100957A1に開示されている。
本発明においては、α−KGDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含む遺伝子クラスターを総称して、「α−KGDHコードする遺伝子」ということがある。
【００５３】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（以下、「SDH」と記載することがある）は、EC:1.3.99.1の以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明において、SDH活性とは、この反応を触媒する活性を意味する。
【００５４】
コハク酸 ＋ FAD → フマル酸 ＋ FADH２
【００５５】
SDHは、微生物種によって、３つまたは４つのサブユニット構造から構成されており、これらのうち少なくとも１種のタンパク質を正常に機能しないように改変することによって活性を低下又は欠失させることができる。具体的には、SDHは以下のサブユニット（カッコ内はサブユニットをコードする遺伝子名）から構成されており、種によってはmembrane anchor proteinをsdhC単独で、あるいはsdhCとsdhDでコードしているものがある。
【００５６】
SDHA：flavoprotein subunit (sdhA)
SDHB：Fe-S protein subunit (sdhB)
SDHC：membrane anchor protein (sdhC）
SDHD：membrane anchor protein (sdhD)
【００５７】
また、SDHサブユニット複合体は、SDHとフマル酸レダクターゼ両方の活性を有している場合がある。例えば、コリネ型細菌のSDHサブユニット複合体は、SDHとフマル酸レダクターゼの両方の活性を有している（WO2005/021770）。
【００５８】
SDH活性の確認は、2,6-dichloroindophenol（DCIP）の還元を指標として測定することで行うことができる。具体的な方法はTatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch Microbiol (2005) 183: 317-324に記載されている。
本発明においては、SDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含むオペロンを総称して「SDHをコードする遺伝子」ということがある。
【００５９】
腸内細菌のSDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスの遺伝子の塩基配列及び各サブユニットは、WO2008/075483に開示されている。
【００６０】
コリネ型細菌のSDHをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのsdhオペロン（GenBank accession No.NCgl0359（sdhC） NCgl0360(sdhA) NCgl0361(sdhB)）、及びブレビバクテリウム・フラバムのsdhオペロン（特開2005-095169号、EP1672077A1、WO2008/075483）の配列が開示されている。
【００６１】
α-KGDH、SDHの活性を低下、又は欠損させるには、後述のＬ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性の低下について記載した方法を適用することができる。
【００６２】
さらに本発明の微生物としては、キシロースを細胞内に取り込む酵素の活性が強化されていてもよい。
キシロースを細胞内に取り込む酵素としては、Ｄ−キシロースパーミアーゼが挙げられ、Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子としてはxylE遺伝子が挙げられる。Ｄ−キシロースパーミアーゼをコードするエシェリヒア・コリ由来のxylE遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、各々配列番号３０、３１に示す。
【００６３】
さらに本発明の微生物としては、キシロースイソメラーゼ（xylA）及びまたはキシルロースキナーゼ(xylB)を弱化させておくことが望ましい。また、エシェリヒア・コリのキシロースイソメラーゼ（xylA）、キシルロースキナーゼ(xylB)遺伝子は、NC000913.1  gi:16131436,16131435にそれぞれ開示されている。
【００６４】
さらに本発明においては、キシロン酸が培地中に蓄積することがあり、特にエシェリヒア・コリにおいては、キシロネートデヒドラターゼの活性をさらに強化することが望ましい。例えば活性として10μmol/min/mg-protein以上、望ましくは15μmol/min/mg-protein以上、さらに望ましくは17μmol/min/mg-protein以上強化されることが好ましい。
【００６５】
次に、微生物に目的酵素の活性を付与するか、又は微生物の目的酵素の活性を増大させる方法を説明する。
【００６６】
微生物が、元来目的酵素の活性を有していない場合は、同酵素をコードする遺伝子を同微生物に導入することによって同酵素活性を付与することができる。また、微生物が目的酵素の活性を有している場合は、目的酵素をコードする外来遺伝子を導入するか、目的酵素をコードする内因性の遺伝子のコピー数を増大させるか、又は目的酵素遺伝子のプロモーター等の発現制御配列を改変するなどして、同遺伝子の発現量を増大させることによって、目的酵素活性を増大させることができる。本発明において、「目的酵素遺伝子を導入する」とは、元来目的酵素活性を有していない微生物に目的酵素遺伝子を導入するのみならず、該酵素活性を有している微生物に外来遺伝子を導入すること、及び、目的酵素活性を有している微生物に内因性遺伝子を導入し、内因性の目的酵素ゼ遺伝子の発現量を増大させることも含む。
【００６７】
目的酵素遺伝子を導入するには、例えば、同遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主微生物を形質転換する。
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229（pHSG、pSTV、pTWVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。
【００６８】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリK-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００６９】
また、目的酵素遺伝子の導入は、宿主微生物への染色体上への導入によっても達成できる。微生物の染色体上に目的酵素遺伝子を導入するためには、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する方法（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）や、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことも可能である。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、目的遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、P１ファージ等のファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターによる染色体上への目的遺伝子の導入も可能である。また、WO03/040373に記載されているように、目的物質生産に不要な遺伝子を標的にして目的酵素遺伝子を導入することも可能である。このような方法で標的配列に、目的酵素遺伝子を１コピー又は多コピー導入することができる。
【００７０】
染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、目的遺伝子又はその一部と相補的な配列を持つプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００７１】
目的遺伝子が導入されるコピー数は、１コピー以上であればいずれでもよいが、２コピー以上、より好ましくは３コピー以上、さらに好ましくは５コピー以上であることが好ましい。目的遺伝子の中でも、特にキシロネートデヒドラターゼ遺伝子は、２コピー以上導入されることが好ましい。
さらに目的酵素遺伝子は、下述するように、プロモーター等の発現調節配列の置換、変異と組み合わせることによって、活性を至適化することが可能である。特に、キシロネートデヒドラターゼ遺伝子は、前記の多コピー化に代えて、又は多コピー化と併せて、発現調節配列の置換、変異により高発現させることが好ましい。
【００７２】
目的酵素遺伝子の発現量を増大させる方法としては、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的酵素遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって同遺伝子の発現を増強させる方法が挙げられる。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。また、後記実施例で使用しているtacプロモーターのバリアント(PtacAプロモーター、PtacBプロモーター)も使用することができる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H.1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【００７３】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【００７４】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【００７５】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは使用する微生物において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。使用する微生物で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。
【００７６】
目的酵素の活性が増強したかどうかの確認は、改変株と親株又は非改変株の目的酵素の活性を比較することによって行うことができる。改変株の酵素活性が親株あるいは非改変株より上昇していれば、同酵素の活性が増強されている。また、親株が目的酵素の活性を有さない場合は、改変株で目的酵素の活性が検出できれば、同酵素の活性が増強されている。
【００７７】
目的酵素遺伝子は、上記の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、目的酵素を保持する微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。
また、目的酵素、及びそれをコードする遺伝子は、酵素活性を保持している限り、それらのホモログや人為的改変体等、又は保存的変異を有するタンパク質又はそれをコードするものであってもよい。
【００７８】
上記のようなホモログ、人為的改変体、又は保存的変異を有するタンパク質又はそれらをコードする遺伝子を、保存的バリアントと記載する。
【００７９】
目的酵素の保存的バリアントとしては、例えば前記各酵素のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。
【００８０】
「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このようなタンパク質は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように野生型遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００８１】
さらに、上記のような保存的変異を有するタンパク質は、アミノ酸配列全体に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００８２】
野生型の目的酵素遺伝子は、上記のようなアミノ酸配列をコードするものであれば、カウロバクター・クレセンタスやハロフェラックス・ボルカニイ等の遺伝子に限らず、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。
【００８３】
また、野生型遺伝子は、前記の各酵素遺伝子の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、野生型の目的酵素と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００８４】
プローブとしては、各遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００８５】
上記した各タンパク質の保存的バリアント及びそれをコードする遺伝子に関する記載は、後述の目的物質生産菌について記載した他の遺伝子についても同様に適用される。
【００８６】
本発明に用いる微生物は、本来的に目的物質生産能を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種により目的物質生産能を付与されたものであってもよい。
【００８７】
本発明に使用される微生物としては、細菌、例えばエシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属等の腸内細菌科に属する微生物や、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌が挙げられるが、これらに制限されない。
【００８８】
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００８９】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００９０】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカムATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカムATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウムATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスAJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタムATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバムATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラムATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869（コリネバクテリウム・グルタ
ミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウムATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカムATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリスATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバムATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌムATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムATCC15354
【００９１】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC:住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/）。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター  住所 郵便番号305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００９２】
腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属などに属し、目的物質を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）。腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
【００９３】
エシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361、International Journal of Systematic Bacteriology,Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある。(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345, )また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology,Jan 1993;43(1).p.162-173 参照）。尚、パントエア・アナナスは、後にさらにパントエア・アナナティスに再分類されている。
【００９４】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）（現在はパントエア・アナナティス等に再分類されている）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株（現在はパントエア・アナナティスに再分類されている）が挙げられる。
【００９５】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
【００９６】
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００９７】
パントエア・アナナティスAJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。また、同株から粘性物質低生産変異株として選択された株が、SC17株である（米国特許第6,596,517号）。AJ13355株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。また、SC17株は、プライベート番号AJ416が付与され、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター  住所 郵便番号305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。
【００９８】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA株（米国特許第6,596,517号）に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（prpC）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である（WO2010/027045）。AJ13601株は、1999年8月18日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター  住所 郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
NA1株は、前記RSFCPGのgltA遺伝子をメチルクエン酸シンターゼ遺伝子（prpC）に置き換えた構造を有するRSFPPG（WO2008/020654）を持つNP106株に相当する株である（WO2010/027045）。
【００９９】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【０１００】
以下、上記のような微生物に目的物質生産能を付与する方法、又は上記のような微生物の目的物質生産能を増強する方法について述べる。
【０１０１】
目的物質生産能を付与するには、栄養要求性変異株、目的物質のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、目的物質の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、目的物質生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強される目的物質生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【０１０２】
目的物質生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ目的物質生産能を有するものを選択することによって得ることができる。また目的物質生産菌は、遺伝子組換えによって、目的物質の生合成系酵素の酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。
【０１０３】
以下、目的物質生産能を付与する方法、及び目的物質生産能が付与された微生物について例示する。
育種によって目的物質生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、目的物質生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltBD)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
上記の遺伝子の発現の増強は、前述のNXA経路の酵素活性の増強について記載した方法により行うことができる。
【０１０４】
上記酵素遺伝子のうち、クエン酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載された微生物が例示できる。
【０１０５】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、アセチルCoA ハイドロラーゼ（WO2006/057450）などが挙げられる。
【０１０６】
目的酵素の活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【０１０７】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号, ロシア出願2006134574号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【０１０８】
さらに、コリネ型細菌においてＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490])を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
【０１０９】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させる方法として、Ｄ−キシルロースー５−リン酸フォスフォケトラーゼ（D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase ）及び/又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（fructose-6-phosphate phosphoketolase）をコードする遺伝子（これらを併せてホスホケトラーゼと呼ぶ）を導入する方法が挙げられる。  例えば、ホスホケトラーゼ活性が上昇した微生物としては、以下の微生物が挙げられる（WO2006/016705）。
【０１１０】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869ΔsucA(pVK9-xfp)、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869ΔsucA(pVK9-PS2_xpkA)
【０１１１】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。また、L-グルタミン酸生産能は、L-グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK,ybjL遺伝子を増幅することによっても付与することができる（WO2005/085419, WO2008/133161）。
【０１１２】
また、本発明に用いるＬ−グルタミン酸生産微生物としては、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物を用いることができる。例えば、欧州公開公報1078989号記載の方法により、低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。
【０１１３】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
【０１１４】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERMBP-2632；特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参
照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【０１１５】
Ｌ−グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）の破壊、PII制御タンパク質（glnB）の破壊によっても達成できる。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【０１１６】
Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する別の方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法（特開昭56-151495）などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492；特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381；特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12212 (FERM P-8123；特開昭61-202694)
【０１１７】
Ｌ−プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌やＬ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056), VKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315), および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体やBloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体を保持する菌株などが挙げられる。
【０１１８】
また、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、及びアザチジン−２−カルボキシレートに耐性な株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702株のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682およびb2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したエシェリヒア・コリ等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【０１１９】
コリネ型細菌のＬ−プロリン生産菌としては、ＤＬ−３，４−デヒドロプロリン耐性株（FERM BP-1219.米国特許4224409号公報）、クエン酸合成酵素活性がその親株の１．４倍以上に上昇した株（FERM P-5332、FERM P-5333、FERM P-5342、FERMP-5343  特許1426823号）、酢酸要求性が付与された株（FERM P-5931）が挙げられる。
【０１２０】
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、ＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン）、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【０１２１】
またＬ−アルギニン生産能を有する微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【０１２２】
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等が挙げられる。
【０１２３】
また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）；メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等として育種することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
【０１２４】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM P-7273）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【０１２５】
さらにアルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）を使用することが出来る。
【０１２６】
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンもＬ−アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによってこれらの生産能を付与することができる。（国際公開2006-35831号パンフレット）
【０１２７】
γ−アミノ酪酸（GABA; gamma-aminobutiric acid）生産菌としては、グルタミン酸デカルボキシラーゼの活性を増強した株（Microb Cell Fact. 2010 Nov 12;9:85. Amino Acids. 2010 Nov;39(5):1107-16  US20100324258号公報）を用いることが出来る。
【０１２８】
プトレッシン生産菌としては、4-hydroxybutyrate reductase; succinyl-CoA reductase (aldehyde forming); and 4-hydroxybutyrate dehydrogenaseを強化した株（WO2011047101号公報）、gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenaseを強化した株（FEBS Lett. 2005 Aug 1;579(19):4107-12.）を用いることが出来る。
【０１２９】
＜２＞目的物質の製造方法
上記のような細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取することにより、目的物質を製造することができる。
【０１３０】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。
炭素源としては、キシロースを含む限り、他の炭素源、例えばグルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
【０１３１】
キシロースと他の炭素源との混合比率はいずれもよいが、キシロース：他の炭素源（重量比）は、好ましくは１：０．１〜１００、より好ましくは１：０．１〜１０、より好ましくは１：０．１〜５、より好ましくは１：１〜５、さらに好ましくは１：１〜３である。
【０１３２】
培地中の炭素源の濃度としては、目的物質を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の炭素源濃度としては、好ましくは0.1w/v%〜50w/v%程度、より好ましくは0.5w/v%〜40w/v%程度、特に好ましくは1w/v%〜30w/v%程度である。
【０１３３】
キシロース、又はキシロースとグルコースのような６単糖との混合物は、バイオマスの十分に利用されていない供給源から得ることができる 。これらの５単糖、６単糖は、蒸気および／または濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼのような酵素を用い加水分解、又はアルカリ処理により、植物バイオマスから遊離され得る。基質がセルロース系材料である場合、セルロースは同時にまたは個々に糖に加水分解されて、目的物質の生産に用いることができる。ヘミセルロースは一般にセルロースよりも糖へ加水分解され易いため、セルロース系材料を予め加水分解して５単糖を分離し、続いて蒸気、酸、アルカリ、セルラーゼまたはそれらの組合せによる処理によりセルロースを加水分解して、６単糖を生成させることが好ましい。
さらに本発明における培地中に含まれるキシロースは、微生物にグルコース、ガラクトース、アラビノースからの変換経路を保有させて、各ヘキソースからキシロース（D-キシロース）に変換させることによって供給してもよい。
【０１３４】
窒素源としては、アンモニア、ウレア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【０１３５】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中又は菌体内に目的物質が蓄積される。
【０１３６】
また、目的物質がＬ−グルタミン酸である場合、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させるように培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。尚、酸性条件下での生育の向上、及び、効率的なＬ−グルタミン酸の析出を両立するためには、ｐＨは好ましくは５．０〜４．０、より好ましくは４．５〜４．０、さらに好ましくは４．３〜４．０であることが望ましい。尚、上記ｐＨでの培養は、培養の全期間であってもよく、一部であってもよい。
【０１３７】
採取される目的物質は、目的物質以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された目的物質の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
培養終了後の培養液から目的物質を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、従来より周知となっているイオン交換樹脂法（Nagai,H.et al.:Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の方法を組み合わせることにより、目的物質を採取できる。
また、目的物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０１３８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
以下の実施例で使用した培地組成を以下に示す。【０１３９】
〔LB培地〕
バクトトリプトン 10g/L、酵母エキス  5 g/L、NaCl  5 g/L、pH 7.0【０１４０】
〔LBGM9〕
LB培地に、最少培地成分（グルコース5g/L、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、塩化アンモニウム1g/L、リン酸2ナトリウム6g/L）を添加したもの【０１４１】
〔MSII-Glucose培地 〕
Ａ区
グルコース                 40 g/L
MgSO４・7H２O                0.5 g/L
Ｂ区
(NH４)２SO４                  20 g/L
KH２PO４                     2 g/L
NaCl                       0.5 g/L
酵母エキス                 2 g/L
CaCl２・7H２O                0.25 g/L
FeSO４・7H２O                20 mg/L
MnSO４・nH２O                20 mg/L
Trace element※             4 ml/l
L-Lys                      200 mg/L
DL-Met                     200 mg/L
DAP                        200 mg/L
Ａ区、Ｂ区を、別々に120℃、20分オートクレーブした後混合する。
※Trace element
CaCl２・2H２O               0.66 g/L
ZnSO４・7H２O               0.18 g/L
CuSO４・5H２O               0.16 g/L
MnSO４・4H２O               0.15 g/L
CoCl２・6H２O               0.18 g/L
H３BO３                     0.10 g/L
Na２MoO４                   0.30 g/L【０１４２】
〔MSII-Xylose培地〕
MSII-Glucose培地のグルコース(40 g/L)をキシロース(40 g/L)に置換したもの。【０１４３】
〔MSII-GX培地〕
MSII-Glucose培地のグルコース(40 g/L)を、グルコース(20 g/L)とキシロース(20 g/L)の混合物に置換したもの。【０１４４】
〔MSII-SX培地〕
MSII-Glucose培地のグルコース(40 g/L)を、スクロース(20 g/L)とキシロース(20 g/L)の混合物に置換したもの。【０１４５】
〔E1合成培地〕
Ａ区 
NH４Cl                       20mM
MgSO４・7H２O                 2mM
Na２HPO４                     40mM
KH２PO４                      30mM
CaCl２                       0.01mM
FeSO４・7H２O                 0.01mM
MnSO４・4-5H２O               0.01mM
Citrate                     5mM
pH Free 
フィルター滅菌
Ｂ−１区
炭素源                      50(又は100)mM
フィルター滅菌
Ｂ−２区
チアミン-HCl                1mM
フィルター(0.22μm)滅菌後、B-1に添加
Ｃ区
MES-NaOH(pH6.8)             50mM
フィルター(0.22μm)滅菌
Ａ〜Ｃ区は全て５倍濃度の溶液を調製し、Stock solutionとする。【０１４６】
〔CM-Dex培地〕
ポリペプトン            10 g/L
酵母エキス              10 g/L
グルコース              5 g/L
KH2PO4                   1 g/L
尿素                    3 g/L
MgSO4・7H2O              0.4 g/L
FeSO4・7H2O              0.01 g/L
MnSO4・5H2O              0.01 g/L
豆ろ液（大豆加水分解物） 1.2 g/L（T-N）
KOHを用いてpH 7.5に調整。【０１４７】
〔Glc培地〕
グルコース              80 g/L
(NH4)2SO4                30 g/L
KH2PO4                   1 g/L
MgSO4・7H2O              0.4 g/L
FeSO4・7H2O              0.01 g/L
MnSO4・5H2O              0.01 g/L
ビタミンB1              200 μg/L
ビオチン                 60 μg/L
豆ろ液（大豆加水分解物） 0.48 g/L (T-N)
KOHを用いてpH 8.0に調整。【０１４８】
〔Xyl培地（ビオチン制限）〕
Glc培地のグルコース（80 g/L）をキシロース（80 g/L）に置換し、さらにビオチンを除いたもの。【０１４９】
〔ＭＳ培地〕
Ａ区
グルコース or キシロース   40 g/L
グルコースとキシロース(1:1)  40g/L 
MgSO４・7H２O                1 g/L
Ｂ区
(NH４)２SO４                  20 g/L
KH２PO４                     1 g/L
酵母エキス                 2 g/L
FeSO４・7H２O                10 mg/L
MnSO４・nH２O                10 mg/L
Ａ区、Ｂ区を、別々に120℃、20分オートクレーブした後混合し、局方炭酸カルシウム50g/Lを加える。【０１５０】
〔実施例１〕パントエア・アナナティスへのNXA経路の導入
（１）NXA経路導入用プラスミドpTWV228Ptac_ccrNXAの構築
NXA経路が報告されている公知の細菌として、C. crescentus（Stephens, C. et al., J. Bacteriol. 2007, 189(5):181-2185）が知られている。C.crescentuのNXA経路の各酵素をコードする遺伝子の取得にあたり、以下の方法を採用した。【０１５１】
C. crescentusのゲノムは約4Mbであり、５つの遺伝子がオペロン構造を成している（Journal of Bacteriology, 189:2181-2185, 2007）。C. crescentusから、ゲノム公開菌株（CB-15(ATCC19089)。ATCCから入手可能）からゲノムを抽出し、各遺伝子のクローニングと発現ベクター構築を試みた。
Clontech In-Fusion Cloning Kitを利用し、発現ベクターの構築を行った。
以下の４つのDNA断片を、i)、ii)、iii)についてはC. crescentus CB-15（ATCC19089）の染色体DNAを鋳型として、iv)についてはpMW119を鋳型として、PCRにて増幅した。カッコ内は、PCRに用いたプライマーを示す。【０１５２】
i) tacプロモーター配列（以下、「Ptac」と記載する）（PtwvPtacf：配列番号１、0823Ptacr：配列番号２）
ii) xylX、ccrxylA、ccrxylB、及びxylCを含む断片（Ptac0823f：配列番号３、0819r：配列番号４）
iii) xylDとその下流約120bp領域（0819f：配列番号５、219cc0819r：配列番号６）
iv) pMW119/SmaI（219f：配列番号７、219r：配列番号８）【０１５３】
続いて、精製したi)、ii)のPCR産物を鋳型とし、PtwvPtacf及び0819rをプライマーとして、これらのPCR産物が結合した断片Ptac_xylXccrAccrBCをPCRにて増幅した。得られたPtac_xylXccrAccrBCと、前記iii)及びiv)のPCR産物の３者を、Clontech In-Fusion Cloning Kitを用いてIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpMW119Ptac_ccrNXAを取得した。【０１５４】
次に、pMW119Ptac_ccrNXAを鋳型に、PtwvPtacf及び219CC0819rをプライマーとして、Ptacを含むccrNXAオペロンを増幅した。得られた増幅産物と、SmaIで消化したpTWV228をIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpTWV228Ptac_ccrNXAを取得した。【０１５５】
（２）pUT399にカナマイシン耐性Mini-Muを搭載したプラスミドpUT-MuKmの構築
pUT399は、R6Kの複製起点を有し、接合伝達に必要なmob領域を含んでおり、pir遺伝子を持たない菌株では複製出来ないプラスミドである（Biomedal社から入手可能：R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791参照、米国特許第7090998号）。
pCE1134（特開平2-109985号公報）は、MudII1734を含むプラスミドであり、Mini-Muユニット内にKm耐性遺伝子とlacXYZ遺伝子を搭載している。以下の方法により、pCE1134のMini-Muユニット内からlacXYZ領域を欠失したDNA断片を調製し、pUT399にクローニングした。【０１５６】
pCE1134を鋳型として、プライマーattL-F（配列番号９）とnptII-R（配列番号１０）を用いて、left endとトランスポゼースをコードするMuAB遺伝子のリプレッサーであるMuCts、Km耐性遺伝子を含む断片をPCRにより取得した。また同様にpCE1134を鋳型として、プライマーattR-F（配列番号１１）とattR-R（配列番号１２）を用いて、right endを含む断片を取得した。これら２断片を鋳型として、プライマーattL-FとattR-Rを用いてcross over PCRを行い、得られた約2.3kbの断片をpUT399のSmaIサイトに導入した。こうしてプラスミドpUT-MuKmを得た。
上記のよにうして構築したMini-Muユニットは、転移ユニット内にKm耐性遺伝子とクローニングサイトとして８塩基認識のNotIサイトを持つため、種々の遺伝子がクローニング可能である。【０１５７】
（３）pTWV228Ptac_ccrNXAの薬剤耐性遺伝子の置換
pTWV228Ptac_ccrNXAのアンピシリン耐性遺伝子を、λRed法によりカナマイシン耐性遺伝子に置換した。
pUT_MuKmを鋳型として、プライマーAp-Km-fw（配列番号１３）とAp-Km-rv（配列番号１４）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子を含む配列（ntpII断片）を増幅した。
PCR反応はPrimeSTAR HS polymerase（タカラバイオ）を用い、同酵素に付属のプロトコルに従って行った。【０１５８】
pTWV228Ptac_ccrNXAを有するE. coli JM109に、ヘルパープラスミドであるRSF_Red_TER(US20090286290A1、WO2008/075483)を導入し、50 ml LB (1 mM IPTG、100 mg/L アンピシリン、25 mg/Lクロラムフェニコールを含む)培地で37℃で OD660値が0.4になるまで培養した。
上記RSF_Red_TERは、λ依存的インテグレーション（Red-driven integration）を起こさせる（λRed法）ためのヘルパープラスミドであり、lacI遺伝子によってλのgam、bet及びexoの各遺伝子の発現を誘導することができる。また、同プラスミドはレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを脱落させることができる。また、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいる。【０１５９】
前記のようにして培養した菌体を集菌後、10%グリセロール溶液で2回遠心洗浄し、1 mL 10%グリセロール溶液に懸濁した。その後、上記で得られたntpII断片でエレクトロポレーション法により形質転換し、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地で、形質転換体を選抜した。得られた形質転換体をLB (1 mM IPTG、10%スクロース、40 mg/Lカナマイシンを含む) 寒天培地に植え継ぎ、37℃で一晩培養し、単一クローンを取得した。得られた形質転換体が、100 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上で生育できないことを確認し、pTWV228Ptac_ccrNXAのアンピシリン耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換したことを確認した。得られたプラスミドをpTWVPtac_ccrNXA_Kmとした。【０１６０】
（４）xylDを含むプラスミドの構築
Clontech In-Fusion Cloning Kitを利用し、構築を行った。
まず、それぞれの遺伝子をpUC18にクローニングしたプラスミドを鋳型とし、xylD_IFS_5742-10-5（配列番号１５）とxylD_IFS_5742-10-6（配列番号１６）をプライマーとして、xylDを、含むDNA断片をPCRにて増幅した。具体的には以下の方法で、SfiIサイトを除去したpUC18にクローニングした。
C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0819-01F_4691-88-7（配列番号１７）及びCC0819-01R_5659-9-1（配列番号１８）、並びにCC0819-02F_5659-9-2（配列番号１９）及びCC0819-02R_4691-88-10（配列番号２０）をプライマーとするPCRによって、各々1130 bp、及び653 bpの断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記２つの増幅断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、xylD遺伝子が挿入されたpUC18-xylDを得た。【０１６１】
一方、pSTV28-Ptac-Ttrpを常法に従ってSmaIにて消化した。xylD遺伝子のDNA断片とベクターDNA断片とをIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミド、pSTVPtac_xylD_Ttrpを取得した。
pSTV28-Ptac-Ttrpは、以下のようにして構築した。
配列番号３２の配列を有するtacプロモーター及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（PtacTtrp）を合成し、pMW219ベクターのKpnI-BamHI間に連結することにより、pMW219-Ptac-Ttrpを得た。KpnI及びBamHIで各々消化したpSTV28とpMW219-Ptac-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドについて、KpnIとBamHIによるdouble digestionにより想定される断片長約400 bpと3 kb（正確には389 bpと2994 bp）に1本ずつバンドがあることを確認し、pSTV28-Ptac-Ttrpを得た。【０１６２】
（４）NXA経路が導入されたパントエア・アナナティスによるＬ−グルタミン酸生産
上記pTWVPtac_ccrNXA_Kmで、エレクトロポレーション法（米国特許6682912号参照）によりP. ananatis NA1株を形質転換した。pTWVPtac_ccrNXA_Kmを導入した株はLBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。【０１６３】
薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養したP. ananatis NA1株、及び各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-Xylose、又はMSII-GX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120rpmにて48時間培養し、残糖、Ｌ−グルタミン酸（Glu）、及びキシロン酸の蓄積量を測定した。結果を表２、表３に示す。【０１６４】
【表２】
2013069634.tif 000004
【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
P. ananatis NA1株をグルコースとキシロースの混合炭素源（MSII-GX培地）で培養した時には、グルタミン酸収率は25.7%であった（表２）。この時、キシロン酸の蓄積が観察され、キシロースはほとんどキシロン酸に変換されることが示唆された。P. ananatis NA1株においてキシロン酸の蓄積が観察されたことは、P. ananatisのグルコースデヒドロゲナーゼの活性によるものと推測される。
一方、P. ananatis NA1株にpTWVPtac_ccrNXA_Kmを導入した株では、グルコースとキシロースの混合炭素源（MSII-GX培地）で培養した時に、親株と比較して非常に高いグルタミン酸収率を示した（収率69.9%）。親株において、キシロースからグルタミン酸がほとんど生成されないことを考慮し、pTWVPtac_ccrNXA_Km導入株のグルコースからのグルタミン酸収率が親株と同等であると仮定すると、キシロースからNXA経路を介したグルタミン酸収率は86%程度であると見積もることができる。実際に、キシロースを単一炭素源として培養した時には（MSII-Xylose）、pTWVPtac_ccrNXA_Km導入株は、収率80%でGluを生成した（表３）。【０１６７】
〔実施例２〕エシェリヒア・コリへのNXA経路の導入
（１）E. coliにおけるNXA経路発現
TCAサイクル中の酵素であり、イソクエン酸からαKGを生成するイソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損株(Δicd)を用い、キシロースを単一炭素源とした最小培地での生育相補によるNXA経路の発現を試みた。icd遺伝子欠損株はαKGを生成できないため、キシロースを単一炭素源とした最小培地では生育できないが、NXA経路の導入によりキシロースからαKGを生成することができれば、同培地に生育可能となる。【０１６８】
具体的にはKeio Collection株のicd遺伝子欠損株であるJW1122株（http://cgsc.biology.yale.edu/Person.php?ID=99553、E. coli Genetic Resource Center at Yale CGSC, The Coli Genetic Stock Centerより入手可能）を宿主菌株とし、プラスミドによりNXA経路を導入、発現させることにより、NXA経路がE. coliでも機能し得るか否か検討した。【０１６９】
表４に構築したプラスミドとicd遺伝子欠損株における生育相補の結果を示した。C. crescentus由来のNXA経路オペロン(xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, xylD)とtacプロモータを組み合わせたプラスミドpMW119Ptac_ccrNXA（実施例１で作製）を導入した菌株が、キシロースを単一炭素源としたM9最小培地(プレート)（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）において生育することを確認した。【０１７０】
同様の検討を液体培養でも行った。36連培養装置を用い、経時的にキシロース又はαKGを単一炭素源として含むM9最小培地及びE1合成培地での生育(O.D.)を測定した。結果を図１に示した。プレートでの培養と同様に、ベクターコントロール株がキシロース単一炭素源のM9やE1培地で生育しないのに対し、NXA経路導入株では良好に生育した。これらの結果は、本菌株がキシロースをNXA経路由来で資化することにより生育したこと、即ち、C. crescentus由来NXA経路がE. coliにおいても機能したものであると考えられた。【０１７１】
【表４】
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【０１７２】
（２）E. coli Ｌ−グルタミン酸生産株でのNXA経路発現
E. coli Ｌ−グルタミン酸生産菌株として、αKGDH欠損株であるMG1655ΔsucA（米国特許出願公開第20050106688号）を用いた。同菌株に、pMW119Ptac_ccrNXA、又はコントロールとしてpMW119を導入して、MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA、及び、MG1655ΔsucA/pMW119を得た。これらの菌株を、炭素源としてグルコース（40g/L）、キシロース（40g/L）、又はグルコース及びキシロース（各20g/L）を添加したMS培地でフラスコ培養した。炭素源としてグルコースのみを含む培地では24時間、他の培地では48時間培養した。結果を図２に示す。図に記載された菌株名に付された325、425、及び513は、クローン番号を示す。【０１７３】
炭素源をグルコース及びキシロースの混合系とした場合、コントロール菌株（MG1655ΔsucA/pMW119）がＬ−グルタミン酸を15〜16g/L蓄積するのに対し、ccrNXAオペロン発現株（MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA）でのＬ−グルタミン酸蓄積は12g/L前後となり、Ｌ−グルタミン酸の蓄積、収率は低下する傾向が見られた。炭素源としてキシロース単独の場合も同様であった。副生物について、有機酸類及びキシロン酸について分析を行った。その結果、主に酢酸とキシロン酸が蓄積していることが分かった。【０１７４】
（３）E. coliにおけるNXA経路の律速点解析
上記のとおり、E. coli Ｌ−グルタミン酸生産株では、ccrNXAオペロン発現株の培養上清中にNXA経路の中間体であるキシロン酸が検出されたことから、取り込まれたキシロースの一部がNXA経路を経由している可能性が高いと考えられた。また以下の課題が推測された。【０１７５】
i) 菌体内に取り込まれたキシロースはE. coli固有のキシロース資化系とNXA経路両方が利用可能であるが、固有系最初の酵素であるキシロースイソメラーゼ(XylA)とNXA経路最初の酵素であるキシロースデヒドロゲナーゼ(XDH)の活性あるいは基質特異性の差で、一定量が固有系に利用され、NXA経路を経由する代謝フラックスの流量が少ないという可能性。
ii) NXA経路上に律速点あるいは未同定のバイパス経路があり、αKGが生成されていない可能性。【０１７６】
i)については、ccrNXAオペロン発現ベクターを低コピー型(pMW119)から中コピー型(pTWV228)に変更することによりNXA経路の各酵素量を増加させ、NXA経路への基質の引き込み量を増加させることで改善できる可能性が考えられた。
ii)については、律速点の解析とその結果を基にした育種改良を行うことにより改善できる可能性が考えられた。【０１７７】
以上のことから、
a) E. coli固有キシロース資化経路欠損株(ΔsucAΔxylA)を宿主とし、かつccrNXAオペロンを発現させ、強制的に炭素フラックスがNXA経路を経由する菌株の構築と培養評価、及び、b)  中コピー型ベクターを用いたccrNXAオペロン発現ベクターの構築と、その発現ベクターを用いた菌株の構築、及び培養評価、並びに
c)  律速点の解析、を実施した。【０１７８】
プライマーxylA-H1P1-5742-5-1（配列番号２１）、及びxylA-H2P2-5742-5-2（配列番号２２）を用いて、MG1655ΔsucAから、λ-Red法により、E. coli  固有キシロース資化遺伝子xylAを欠損させ、MG1655ΔsucAΔxylA株を得た。同菌株にpMW119Ptac_ccrNXAを導入して、xylAを欠損したccrNXAオペロン発現株を得た。
図３に、xylAを欠損したccrNXAオペロン発現株を、（３）と同様にして培養した際のＬ−グルタミン酸培養結果を示す。図３中、「ccrNXA」はpMW119Ptac_ccrNXAを示し、それに続く数字はクローン番号を示す。【０１７９】
ΔsucAΔxylA株のベクターコントロール株がキシロースを資化できず、グルコースからのみ菌体形成とＬ−グルタミン酸生産ができるのに対し、ccrNXAオペロン発現株においては、キシロースの消費とキシロース由来と考えられるＬ−グルタミン酸生産が見られた。一方で、Ｌ−グルタミン酸蓄積量はモデル菌株（ΔsucA株）には及ばないこと、及び、NXA経路の代謝中間体であるキシロン酸が蓄積していることがわかった。この結果から、NXA経路全体の代謝フラックス量が不足している可能性が示唆された。また、αKGの副生がみられなかったことから、GDHの活性発現に必要なNADPHの供給はこの段階では問題になっていないことが考えられた。【０１８０】
続いて、中コピー型ベクターを用いてccrNXAオペロン発現ベクターを構築した。pMW119Ptac_ccrNXAを鋳型とし、PtwvPtacf（配列番号１）と0819r（配列番号４）をプライマーとして、tacプロモータ領域を含むccrNXAオペロンを増幅した。pTWV228をSmaIにて消化し、tacプロモータ領域を含むccrNXAオペロンのPCR断片と共にIn-Fusion反応を行い、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpTWVPtac_ccrNXAを取得した。このプラスミドをMG1655ΔsucA株に導入し、得られた株を（３）と同様にして培養を行った。結果を図４に示した。図中、「ΔsucA」はMG1655ΔsucA株を、「/pTWV」及び「/v」はpTWV228を保持していることを、各々示す。また、pTWV110〜pTWV119は、pTWV228Ptac_ccrNXAのクローン番号を示す。【０１８１】
グルコースのみを炭素源とした場合では、中コピー型ccrNXAオペロン発現株はコントロール株とほぼ同等のＬ−グルタミン酸を蓄積した一方で、グルコース及びキシロースの混合培養系では、Ｌ−グルタミン酸蓄積はむしろ低下する傾向が見られた。また兄弟株間での成績にもばらつきが見られた。考えられる理由の一つに中コピー型発現ベクターの脱落が考えられた。また、これまでの菌株と同様にキシロン酸の蓄積が観察された。
ccrNXAオペロンのコピー数増加により、NXA経路の各酵素の活性が増加しているかを確認するため、NXA経路の最初の酵素であるXDH活性を測定した。結果を表５に示した。表５に記載された菌株の「7513」、及び「1110」は、各々クローン番号を示す。【０１８２】
【表５】
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【０１８３】
中コピー発現ベクター導入株では、低コピー発現ベクター導入株に比べて、XDH活性が約７倍に上昇していた。E. coli固有のキシロースイソメラーゼ(XylA)とXDHの分岐点で実際の菌体内でどのようにキシロースが分配されているかについては未確認であり、依然としてNXA経路の最初の酵素であるXDH活性が不足している可能性も考えられた。しかし、XDH活性が上昇してもＬ−グルタミン酸蓄積向上等の効果が見出せないことや、キシロン酸の蓄積等から、NXA経路のいずれか、又は複数の酵素が律速となっている可能性が考えられた。【０１８４】
そこで、NXA経路の律速点についての解析を行った。代謝中間体としてキシロン酸が蓄積したことから、少なくともキシロースからキシロン酸に至るまでの代謝経路よりも、キシロン酸からαKGに至る経路に律速点があると考えた。また、ccrNXAオペロンの構造上、キシロースからキシロン酸に至る経路はオペロンの三番目と四番目に位置する遺伝子によりコードされているのに対し、キシロン酸からαKGに至る経路はオペロンの一番目、二番目、五番目に位置する遺伝子によりコードされている。XDHはオペロンの三番目に位置し、その活性はin vitroで検出できているが、オペロンの五番目に位置する遺伝子によりコードされる酵素（XylD）の活性が検出できれば、NXAオペロン全体が転写、翻訳されていることの傍証にもなると考えた。そこで、キシロン酸からαKGに至る３つの反応のうちのいずれかが律速点であると推測し、以下のような実験を行った。【０１８５】
xylD、xylX、及び、ccrxylA遺伝子を各々単独発現するプラスミドpSTVPtac_xylD_Ttrp、pSTVPtac_xylX_Ttrp、及びpSTVPtac_ccrxylA_Ttrpを、以下のようにして作製した。【０１８６】
pSTV28-Ptac-xylX-Ttrpは、SfiIサイトを除いたxylXをpUC18にクローニングしたプラスミドであるpUC18-xylXを鋳型とし、xylX-IFS-5742-10-1（配列番号３８）、及びxylX-IFA-5742-10-2（配列番号３９）をプライマーに用いたPCRによりxylX断片を作製し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-Ttrpにin-fusion cloning法でクローニングすることで作製した。【０１８７】
pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrpは、SfiIサイトを除いたccrxylAをpUC18にクローニングしたプラスミドであるpUC18-ccrxylAを鋳型とし、xylA_IFS_5742-10-3（配列番号４０）、及びxylA_IFA_5742-10-4（配列番号４１）をプライマーに用いたPCRによりccrxylA断片を作製し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-Ttrpにin-fusion cloning法でクローニングすることで作製した。【０１８８】
pSTV28-Ptac-xylD-Ttrpは、SfiIサイトを除いたxylDをpUC18にクローニングしたプラスミドであるpUC18-xylDを鋳型とし、xylD_IFS_5742-10-5（配列番号４２）、xylD_IFA_5742-10-6（配列番号４３）をプライマーに用いたPCRによりxylD断片を作製し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-Ttrpにin-fusion cloning法でクローニングすることで作製した。【０１８９】
上記プラスミドpUC18-xylX、pUC18-ccrxylA、pUC18-xylDは、各々以下のようにして作製した。
C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0823-01F_4691-87-1（配列番号４４）及びCC0823-01R_4691-87-2（配列番号４５）、並びにCC0823-02F_4691-87-3（配列番号４６）及びCC0823-02R_4691-87-4（配列番号４７）をプライマーとするPCRによって、各々900bp、及び280bpの断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記２つの増幅断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、xylX遺伝子が挿入されたpUC18-xylXを得た。【０１９０】
C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0822-01F_4691-87-5（配列番号４８）及びCC0822-01R_5659-8-7（配列番号４９）、CC0822-02F_5659-8-8（配列番号５０）及びCC0822-02R_5659-8-9（配列番号５１）、CC0822-03F_5659-8-10（配列番号５２）及びCC0822-03R_5659-8-11（配列番号５３）、CC0822-04F_5659-8-12（配列番号５４）及びCC0822-04R_5659-8-13（配列番号５５）、並びにCC0822-05F_5659-8-14（配列番号５６）及びCC0822-05R_4691-87-14（配列番号５７）をプライマーとするPCRによって、各々11v02（175 bp）、12v02（325 bp）、13v02（260 bp）、14v02（193 bp）、及び15v02（544 bp）の５つの断片を増幅した。次に、11v02、及び12v02の２断片を鋳型とし、CC0822-01F_4691-87-5、及びCC0822-02R_5659-8-9をプライマーとするクロスオーバーPCRにより、これらの２断片を連結した。同様に、13v02、及び14v02の２断片を鋳型とし、CC0822-03F_5659-8-12、及びCC0822-04R_5659-8-13をプライマーとするクロスオーバーPCRにより、これらの２断片を連結した。これらの２断片と、上記15v02断片を、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で連結した。得られた連結断片を鋳型とし、CC0822-01F_4691-87-5、及びCC0822-05R_4691-87-14をプライマーに用いたPCRにより、連結断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記連結断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、ccrxylA遺伝子が挿入されたpUC18-ccrxylAを得た。【０１９１】
C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0819-01F_4691-88-7（配列番号１７）及びCC0819-01R_5659-9-1（配列番号１８）、並びにCC0819-02F_5659-9-2（配列番号１９）及びCC0819-02R_4691-88-10（配列番号２０）をプライマーとするPCRによって、各々1130 bp、及び653 bpの断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記２つの増幅断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、xylD遺伝子が挿入されたpUC18-xylDを得た。【０１９２】
ccrNXAオペロン発現株（MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA）と、上記xylD、xylX、ccrxylA遺伝子をそれぞれ単独発現するプラスミドを保持する株（MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylD_Ttrp、MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylX_Ttrp、及びMG1655ΔsucA/pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp）より粗酵素抽出液を調製し、ccrNXAオペロン発現株由来の粗酵素抽出液に、ベクター保持株、又はxylD、xylX、ccrxylAの各遺伝子の単独発現株由来の粗酵素抽出液を各々加え、キシロン酸からのαKG生成活性を測定した。結果を表６に示した。表６中、菌株名に付された「1110」は、クローン番号を示す。【０１９３】
【表６】
2013069634.tif 000008
【０１９４】
xylD遺伝子単独発現株の粗酵素抽出液を添加した系において、αKG生成活性の上昇が観察された。この結果から、xylD遺伝子がコードするキシロネートデヒドラターゼ（XylD）が、E. coliにて異種発現により構築したNXA経路上の律速点である可能性が示唆された。【０１９５】
酵素活性の測定から、ccrNXAオペロン発現株において、xylD遺伝子の発現をさらに強化することで経路全体の代謝フラックスが改善する可能性があることから、xylD遺伝子発現ベクターをccrNXAオペロン発現株に導入することにより、xylD遺伝子発現強化株を構築し、グルコース及びキシロースを炭素源としたＬ−グルタミン酸生産培養評価を実施した。ccrNXAオペロン発現株としては、MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXAと、MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXAを用いた。
培養は（３）と同様にして行った。【０１９６】
結果を表７に示した。xylD遺伝子発現強化株において、Ｌ−グルタミン酸蓄積及び収率が大幅に向上し、Ｌ−グルタミン酸蓄積はコントロール株15〜16g/Lに対して23〜25g/L、対消費糖収率はコントロール株37〜40%に対して57〜60%に達した。なお、代謝中間体であるキシロン酸は、xylD遺伝子発現強化株では見られなかった。一方、xylD遺伝子発現強化の効果は、中コピー型のccrNXAオペロン発現ベクターを搭載した発現株でのみ見られ、低コピー型ベクターによる発現株では見られなかった。これらの結果から、ベクターのコピー数増加によるNXA経路全体の活性増加とxylD遺伝子発現再強化による本経路の律速点の解消が、Ｌ−グルタミン酸生成量の向上につながったと考えられた。なお、xylD遺伝子発現強化株のキシロン酸からのαKG生成活性を測定したところ、強化前に比べて約10倍上昇していた(表８)。表７、表８に記載された菌株名に付された「1110」、「17」、「19」は、各々クローン番号を示す。【０１９７】
【表７】
2013069634.tif 000009
【０１９８】
【表８】
2013069634.tif 000010
【０１９９】
〔実施例３〕コリネバクテリウム・グルタミカムへのNXA経路の導入
（１）NXA経路導入用プラスミドpVK9Peftu_ccrNXAの構築
エロンゲーションファクターTu（EF-Tu）遺伝子tufのプロモーター配列（WO2008114721、配列番号３３、以下、「Peftu」と記載する。）の下流にxylDを連結した配列を有するプラスミドを、Clontech In-Fusion Cloning HD Kit（Clontech社）を利用して構築した。まず、C. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型に、プライマーPeftu(Pst)（配列番号５８）とPeftu_Rv（配列番号５９）を用いてPCRを行い、Peftu配列を含む断片を得た。PCR反応はPrimeSTAR HS polymeraseを用い、同酵素に付属のプロトコルに従って行った。【０２００】
また、pTWV228Ptac_ccrNXAを鋳型として、プライマーPeftu_xylXABCD_fw（配列番号６０）とPeftu_xylXABCD_rv（配列番号６１）を用いてPCRを行い、C. crescentusのxylXABCD配列を含む断片を得た。PCR反応にはPrimeSTAR GXL polymeraseを用い、同酵素に付属のプロトコルに従ってPCR反応を行った。【０２０１】
続いて、前述で得られたPeftu断片とxylXABCDを含む断片を、PstIとBamHIで処理したpVK9と混合し、Clontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってin-fusion反応を行った。pVK9は、pHSG299（タカラバイオ）のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである（特開2007-97573、米国特許出願公開20050196846号）。前記in-fusion反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にカナマイシンを終濃度50 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、目的のプラスミドpVK9Peftu_ccrNXAを取得した。【０２０２】
（２）NXA経路が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムによるＬ−グルタミン酸生産
上記pVK9Peftu_ccrNXAで、電気パルス法（特開平2-207791）によりC. glutamicum ATCC13869株を形質転換した。pVK9Peftu_ccrNXAを導入した株は、CM-Dex培地にカナマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地を使用して選抜した。また、対照株として、pVK9でC. glutamicum ATCC13869株を形質転換した株も同様の手法により選抜した。【０２０３】
得られた形質転換株のキシロース資化能およびL-グルタミン酸生産能を、坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。カナマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加したCM-Dex寒天培地にて、31.5℃で一昼夜培養した形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、Glc培地20 mLを張り込んだ坂口フラスコに植菌し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1 gを添加した後、31.5℃、120 rpmにて24時間振とう培養した。得られた培養液1 mLを、Xyl培地（ビオチン制限）20 mLを張り込んだ坂口フラスコに植菌し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1 gを添加した後、31.5℃、120 rpmで73時間振とう培養を行った。結果を表９に示した。【０２０４】
C. glutamicum ATCC13869株にpVK9を導入した株はXyl培地でほとんど増殖せず、L-グルタミン酸生産も観察されなかった。一方、C. glutamicum ATCC13869株にpVK9Peftu_ccrNXAを導入した株は、Xyl培地で増殖し、L-グルタミン酸を蓄積した。この結果から、コリネ型細菌にNXA経路を導入することにより、キシロース資化能が向上し、さらにキシロースからL-グルタミン酸が生成されることを見出した。【０２０５】
【表９】
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【０２０６】
（３）xylD遺伝子発現再強化株の構築
pVK9Peftu_ccrNXAを保持するC. glutamicum ATCC13869株では、キシロン酸が蓄積したことから、xylD遺伝子産物の活性が不足していることが推察された。そこで、pVK9Peftu_ccrNXAプラスミド上にxylD遺伝子をさらに1コピー導入することにより、xylD遺伝子が再強化されたNXA経路発現用プラスミドを構築することとした。【０２０７】
（４）xylD遺伝子発現用プラスミドpVS7PmsrA_xylDの構築
msrA（peptide methionine sulfoxide reductase A）遺伝子のプロモーター配列（以下、「PmsrA」と記載する）の下流に、C. crescentusのxylD遺伝子を連結した配列を有するプラスミドを、Clontech In-Fusion Cloning HD Kitを利用して構築した。【０２０８】
まず、C. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型に、プライマーPmsrA(Pst)（配列番号６２）とPmsrAR（配列番号６３）を用いてPCRを行い、PmsrA配列を含む断片を得た。また、pTWV228Ptac_ccrNXAを鋳型として、プライマーPmsrA_xylD_fw（配列番号６４）とPeftu_xylXABCD_rvを用いてPCRを行い、C. crescentusのxylD遺伝子配列を含む断片を得た。PCR反応はPrimeSTAR HS polymeraseを用い、同酵素に付属のプロトコルに従って行った。【０２０９】
続いて、前述で得られたPmsrA断片とxylD遺伝子を含む断片を、PstIとBamHIで処理したシャトルベクターpVS7（構築方法は以下に示す）と混合し、Clontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってin-fusion反応を行った後、この反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にスペクチノマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、目的のプラスミドpVS7PmsrA_xylDを取得した。【０２１０】
pVS7はpVC7(特開2000-201692、EP1004671)のクロラムフェニコール耐性遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されたプラスミドである。スペクチノマイシン耐性遺伝子はバチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリECE101Ｅ株から、プラスミドpDG1726を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。pDG1726を鋳型として、プライマーSpcR-F（配列番号６５）とSpcR-R（配列番号６６）を用いてPCRによりスペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅した。得られた遺伝子断片を、SmaI処理したpVC7と混合し、タカラバイオ株式会社のLigation Mix <Mighty Mix>のプロトコルに従ってライゲーション反応を行い、この反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にスペクチノマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、pVC7にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されたpVC7-spcを取得した。さらに、pVC7-spcを鋳型として、プライマーspc(GTG start)-F（配列番号６７）とspc(stop)-R（配列番号６８）を用いてPCRを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅した。【０２１１】
一方、pVC7を鋳型として、プライマーSpc-pVC7-Cm-F（配列番号６９）とSpc-pVC7-Cm-R（配列番号７０）を用いてPCRを行い、pVC7からクロラムフェニコール耐性遺伝子が除去されたDNA断片を得た。該DNA断片と、上記にてpVC7-spcより調製されたスペクチノマイシン耐性遺伝子のDNA断片とを混合し、Clontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってin-fusion反応を行った後、この反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にスペクチノマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、pVS7を取得した。【０２１２】
（５）xylD遺伝子再強化プラスミドpVK9Peftu_ccrNXA+Dの構築
pVS7PmsrA_xylDを鋳型として、プライマーME_Spc_fw（配列番号７１）とME_Peftu_xylXABCD_rv（配列番号７２）を用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Spc）とPmsrA_xylDを含むDNA断片を増幅した。得られたDNA断片を、Epicentre社のEz-Tn5TMCustom Transposome Construction Kitのプロトコルに従い、in vitroでpVK9Peftu_ccrNXAに挿入し、E. coli DH5αを形質転換した。形質転換体はカナマイシンとスペクチノマイシンを終濃度でそれぞれ50 mg/L、25 mg/Lとなるように添加したLB寒天培地で選抜した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、プラスミド上のSpc-PmsrA_xylD配列周辺の塩基配列を確認することにより、Spc-PmsrA_xylD配列の挿入箇所がPeftu_ccrNXA配列上ではないことが確認されたプラスミドをpVK9Peftu_ccrNXA+Dとした。【０２１３】
（６）xylD遺伝子が再強化されたNXA経路導入株のＬ−グルタミン酸生産
電気パルス法にてC. glutamicum ATCC13869株にpVK9Peftu_ccrNXA+Dを導入し、カナマイシン25 mg/Lを含むCMDex寒天培地に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株について、（２）と同様の方法でL-グルタミン酸生産能を検証した。その結果を表１０に示す。【０２１４】
pVK9Peftu_ccrNXA+Dを保持する株では、pVK9Peftu_ccrNXAを保持する株と比較して、D-キシロン酸の蓄積量が少なく、一方で、より多くのL-グルタミン酸が蓄積された。このことから、xylD遺伝子を再強化することにより、より効率的にNXA経路を介してD-キシロースからL-グルタミン酸を生産させることができることが示された。【０２１５】
【表１０】
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【０２１６】
〔実施例４〕
（１）NXA経路遺伝子の代替
以上の実施例では、NXA経路が報告されている公知の細菌C. crescentusの遺伝子xylX、ccrxylA、ccrxylB、xylC、xylDを利用し、NXA経路を介してキシロースからグルタミン酸を生成できることを示した。以下の実施例ではC. crescentus以外の生物種からxylD、xylX、ccrxylAのホモログ遺伝子を取得し、C. crescentusの遺伝子と代替可能であるかどうかを検証した。遺伝子源として表１１に示す生物種を選択した。併せて各遺伝子のGene symbol（GenBank）を示した。また、表１２に各遺伝子の塩基配列及びそれらにコードされるアミノ酸配列の配列表における配列番号を示した。表１２中、「オリジナル」は天然型遺伝子の塩基配列を、「最適化後」は、E. coliのコドン出現頻度（codon usage）に併せてコドンを最適化した塩基配列を、各々示す。
尚、以下の記載において、xylD、xylX、及びxylAの各遺伝子ホモログがコードする酵素を、各々XylD、XylX、XylAと記載することがある。【０２１７】
【表１１】
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【０２１８】
【表１２】
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【０２１９】
（２）XylD、XylX、XylA活性検出用プラスミドpTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km、pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km、pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Kmの構築
Clontech In-Fusion Cloning Kitを利用し、構築を行った。
まず、pTWVPtac_ccrNXA_Kmを鋳型とし、Ptac_xylXABC_F（配列番号１１１）とPtac_xylXABC_R（配列番号１１２）をプライマーとして、xylDを除くDNA断片をPCRにて増幅した。PCR産物をClontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Kmを取得した。【０２２０】
pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_KmはPtac_xylABCD_F（配列番号１１３）とPtac_xylABCD_R（配列番号１１４）を、pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_KmはPtac_xylXBCD_F（配列番号１１５）とPtac_xylXBCD_R（配列番号１１６）をプライマーとして、上記と同様の手法により構築した。【０２２１】
（３）XylD、XylX、XylA活性検出用パントエア・アナナティスの構築
上記pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Kmで、エレクトロポレーション法によりP. ananatis NA1株を形質転換した。構築した株をP. ananatis NA2 ΔxylDとした。P. ananatis NA2 ΔxylDの培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
同様にpTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_KmあるいはpTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_KmでP. ananatis NA1株を形質転換し、P. ananatis NA2 ΔxylX株、P. ananatis NA2 ΔccrxylA株を構築した。【０２２２】
（４）xylD、xylX、xylAホモログ発現プラスミドの構築
yjhG、yagF発現用プラスミドpSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp、pSTV28-Ptac-yagF-Ttrpは以下のようにして作製した。
pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrpは、E. coli MG1655株のゲノムDNAを鋳型とし、yjhG_F（配列番号１１７）及びyjhG_R（配列番号１１８）をプライマーに用いたPCRによりyjhG断片を増幅し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-TtrpにIn-Fusion cloning法でクローニングすることで作製した。【０２２３】
pSTV28-Ptac-yagF-Ttrpは、yagF_F（配列番号１１９）及びyagF_R（配列番号１２０）をプライマーに用い、上記と同様の手法により作製した。【０２２４】
xylD（Hse）発現用プラスミドpSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpは、以下のようにして作製した。tacプロモーター、xylD(Hse)及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（Ptac-xylD(Hse)-Ttrp）を合成し、EcoRVで消化したpUC57ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入）に連結することにより、pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpを得た。DNA断片を合成する際にE. coliでの発現に適するようコドン最適化を実施した。EcoRIとKpnIで各々消化したpSTV28とpUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出し、pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpを得た。【０２２５】
xylD（Amis）、xylD（Aor）、xylX（Cne）、xylX（Zga）、xylX（Tco）、xylA（Abr）、ycbDの各々を発現するプラスミドpSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp 、pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp、pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrpも、同様の手法で作製した。ただし、YcbDについてはコドン最適化を実施していない。【０２２６】
xylD（Atu）発現用プラスミドpSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpは、以下のようにして作製した。tacプロモーター、xylD(Atu)及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（Ptac-xylD(Atu)-Ttrp）を合成し、EcoRVで消化したpJET1.2ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入）に連結することにより、pJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpを得た。DNA断片を合成する際にE. coliでの発現に適するようコドン最適化を実施した。EcoRIとKpnIで各々消化したpSTV28とpJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出し、pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpを得た。【０２２７】
xylX（Atu）、xylA（Hbo）の各々を発現するプラスミドpSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrpも同様の手法で作製した。
xylX（Art）発現用プラスミドpSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrpは、以下のようにして作製した。tacプロモーター、xylX(Art)及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（Ptac-xylX(Art)-Ttrp）を合成し、EcoRVで消化したpCC1ベクター(Epicentre社より購入)に連結することにより、pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrpを得た。DNA断片を合成する際にE. coliでの発現に適するようコドン最適化を実施した。EcoRIとKpnIで各々消化したpSTV28とpCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出し、pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrpを得た。【０２２８】
（５）XylDホモログの活性検出
pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp、pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp、pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-TtrpあるいはpSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrpで、エレクトロポレーション法（米国特許6682912号参照）によりP. ananatis NA2 ΔxylD株を形質転換した。各形質転換株の培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/L、クロラムフェニコールを終濃度25 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養した各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-SX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120 rpmにて48時間培養し、Ｌ−グルタミン酸（Glu）の蓄積量を測定した。結果を図５に示す。【０２２９】
P. ananatis NA2 ΔxylDにpSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではＬ−グルタミン酸蓄積量は6.9 g/Lであったのに対し、他の形質転換株では11.1 g/L〜23.1 g/LのＬ−グルタミン酸が蓄積した。pSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではキシロースからＬ−グルタミン酸がほとんど生成されず、他の形質転換株ではNXA経路を介してキシロースからＬ−グルタミン酸が生成されたと考えられた。すなわち、xylDはC. crescentus以外のいずれの生物種由来のxylDホモログでも代替可能であることが示された。【０２３０】
（６）XylXホモログの活性検出
pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-TtrpあるいはpSTV28-Ptac-xylX(Selo)-Ttrpで、エレクトロポレーション法によりP. ananatis NA2 ΔxylX株を形質転換した。各形質転換株の培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/L、クロラムフェニコールを終濃度25 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養した各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-SX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120 rpmにて48時間培養し、Ｌ−グルタミン酸（Glu）の蓄積量を測定した。結果を図６に示す。【０２３１】
P. ananatis NA2 ΔxylXにpSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではＬ−グルタミン酸蓄積量は8.7 g/Lであったのに対し、他の形質転換株では20.5 g/L〜27.8 g/LのＬ−グルタミン酸が蓄積した。pSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではキシロースからＬ−グルタミン酸がほとんど生成されず、他の形質転換株ではNXA経路を介してキシロースからＬ−グルタミン酸が生成されたと考えられた。すなわち、xylXはC. crescentus以外のいずれの生物種由来のxylXホモログでも代替可能であることが示された。【０２３２】
（７）XylAホモログの活性検出
pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp、pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-TtrpあるいはpSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrpで、エレクトロポレーション法によりP. ananatis NA2 ΔccrxylA株を形質転換した。各形質転換株の培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/L、クロラムフェニコールを終濃度25 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。【０２３３】
薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養した各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-SX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120 rpmにて48時間培養し、Ｌ−グルタミン酸（Glu）の蓄積量を測定した。結果を図７に示す。【０２３４】
P. ananatis ΔccrxylAにpSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではＬ−グルタミン酸蓄積量は1.0 g/Lであったのに対し、他の形質転換株では18.1 g/L〜30.7 g/LのＬ−グルタミン酸が蓄積した。pSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではキシロースからＬ−グルタミン酸がほとんど生成されず、他の形質転換株ではNXA経路を介してキシロースからＬ−グルタミン酸が生成されたと考えられた。すなわち、xylAはC. crescentus以外のいずれの生物種由来のccrxylAホモログでも代替可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２３５】
本発明により、キシロース原料を用いて、発酵法により目的物質を効率よく製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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