(57)【要約】  本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含み、該糖修飾ヌクレオシドは、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドは、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子と結合し得る。本発明によれば、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた高脂血症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、
該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして
該オリゴヌクレオチドが、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子と結合し得る、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記架橋構造が、−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−、または−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記架橋構造が、−ＣＨ２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲ１−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−ＮＲ１−Ｏ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子が、ヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子である、請求項１から３のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、前記アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子の３’非翻訳領域に結合し得るオリゴヌクレオチドである、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレチドのベースとなる塩基配列が、３〜１７、２０〜２４および２６〜５３のいずれか１つに示される塩基配列を含む、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、１０〜２５塩基である、請求項１から６のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、高脂血症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する高脂血症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中のトリグリセリド（ＴＧ）が高い値を示す高ＴＧ血症は、動脈硬化症の独立したリスクとして広く認識され、冠動脈疾患や脳血管疾患の予防において、高いコレステロール（Ｃｈｏｌ）値を示す高Ｃｈｏｌ血症に次いで治療の重要性が認識され始めている。家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）は、高ＴＧ血症と高Ｃｈｏｌ血症を併発する遺伝病で、罹患頻度は人口の１〜２％と高く、６０歳未満の心筋梗塞患者の２０％を占めると報告されている。高ＴＧ血症と高Ｃｈｏｌ血症の合併症に対する治療は、スタチンを中心とした高Ｃｈｏｌ血症治療に主眼が置かれ、高ＴＧ血症についてはフィブレート系薬剤がスタチンとの併用により副作用を誘発しやすいこともあり、十分な治療ができないことが多い。【０００３】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）は、高比重リポタンパク質（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＤＬ）やＴＧリッチリポタンパク質の構成タンパク質であり、ＴＧリッチリポタンパク質の加水分解に関わるリポタンパク質リパーゼ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ：ＬＰＬ）の働きを阻害することにより、血清ＴＧ値を上昇させる作用がある。ＡｐｏＣ３遺伝子のプロモーター領域の多型で高ＴＧ血症を示すこと、ＡｐｏＣ３ノックアウトマウスにおいて低Ｃｈｏｌ血症および低ＴＧ血症を示し、ＡｐｏＣ３を過剰に発現するトランスジェニックマウスにおいて高ＴＧ血症を示すことなどから、ＡｐｏＣ３が高ＴＧ血症に対する新しい創薬ターゲットとなることが示唆される。【０００４】
特許文献１は、ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とする２’ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾型オリゴヌクレオチドを報告している。しかし、この修飾型オリゴヌクレオチドは、生体内での安定性は非常に優れているが、アンチセンス分子として標的ＲＮＡとの結合親和性が低く、薬効の発揮には非常に高用量が必要であるという問題がある。【０００５】
ところで、非特許文献１〜９および特許文献２は、新たな架橋型人工核酸を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７５９８２２７号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１１／０５２４３６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1997年、第38巻、p. 8735-8738
【非特許文献２】S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1998年、第39巻、p. 5401-5404
【非特許文献３】S. K. Singhら、Chem. Commun.、1998年、第4巻、p. 455-456
【非特許文献４】A. A. Koshkinら、Tetrahedron、1998年、第54巻、p. 3607-3630
【非特許文献５】S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.、2001年、第9巻、p. 1001-1011
【非特許文献６】S. M. A. Rahmanら、Angew. Chem. Int. Ed.、2007年、第46巻、p. 4306-4309
【非特許文献７】S. M. A. Rahmanら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids、2007年、第26巻、p. 1625-1628
【非特許文献８】K. Miyashitaら、Chem. Commun.、2007年、第36巻、p. 3765-3767
【非特許文献９】S. M. A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.、2008年、第130巻、p. 4886-4896
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた高脂血症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子の特定の標的配列と結合し得るオリゴヌクレオチドに架橋型人工核酸を含有させることによって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた高脂血症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供できることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
本発明は、糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供し、該糖修飾ヌクレオシドは、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドは、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子と結合し得る。【００１１】
１つの実施態様では、上記架橋構造は、−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−、または−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。【００１２】
１つの実施態様では、上記架橋構造は、−ＣＨ２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲ１−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−ＮＲ１−Ｏ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す。【００１３】
１つの実施態様では、上記アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子は、ヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子である。【００１４】
１つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドは、上記アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子の３’非翻訳領域に結合し得るオリゴヌクレオチドである。【００１５】
１つの実施態様では、上記オリゴヌクレチドのベースとなる塩基配列は、配列番号３〜１７、２０〜２４および２６〜５３のいずれか１つに示される塩基配列を含む。【００１６】
１つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、１０〜２５塩基である。【００１７】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、高脂血症治療剤を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本研究によれば、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた高脂血症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】オリゴヌクレオチドで処理したマウスＮＭｕｌｉ細胞のＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図２】オリゴヌクレオチドで処理したヒトＨｕｈ-７細胞のＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図３】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡまたはＡｐｏＣ３−１−Ｓを投与した高脂肪食負荷マウスの血清トリグリセリド値を示すグラフである。
【図４】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡまたはＡｐｏＣ３−１−Ｓを投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図５】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡまたはＡｐｏＣ３−１−Ｓを投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３タンパク質発現レベルを示すグラフである。
【図６】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）またはＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）を投与した高脂肪食負荷マウスの血清トリグリセリド値を示すグラフである。
【図７】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）またはＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）を投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図８】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）またはＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）を投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３タンパク質発現レベルを示すグラフである。
【図９】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣを投与した高脂肪食負荷マウスの血清トリグリセリド値を示すグラフである。
【図１０】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣを投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１１】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣを投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３タンパク質発現レベルを示すグラフである。
【図１２】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０またはＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６を投与した高脂肪食負荷マウスの血清トリグリセリド値を示すグラフである。
【図１３】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０またはＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６を投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１４】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０またはＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６を投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３タンパク質発現レベルを示すグラフである。
【図１５】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを単回静脈内投与した高脂肪食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルの投与終了後の経時変化を示すグラフである。
【図１６】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを単回静脈内投与した高脂肪食負荷マウスの血清トリグリセリド値の投与終了後の経時変化を示すグラフである。
【図１７】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを投与した高脂肪食負荷慢性抗トリグリセリド血症マウスの投与終了後の肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図１８】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを投与した高脂肪食負荷慢性抗トリグリセリド血症マウスの血清トリグリセリド値の投与開始後の経時変化を示すグラフである。
【図１９】オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを投与した高脂肪食負荷慢性抗トリグリセリド血症マウスの投与終了後の血清アディポネクチン濃度を示すグラフである。
【図２０】各種オリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した通常食負荷マウスの血清トランスアミナーゼ値を示すグラフである。
【図２１】各種オリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した通常食負荷マウスの肝臓でのＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図２２】各種オリゴヌクレオチドを単回静脈内投与した通常食負荷マウスの肝臓内のオリゴヌクレオチド核酸の蓄積量を示すグラフである。
【図２３】各種オリゴヌクレオチドで処理したマウスＮＭｕｌｉ細胞のＡｐｏＣ３ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００２１】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。
【００２２】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。
【００２３】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。
【００２４】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を１つあるいは炭素数１から６の同一のまたは異なる任意の直鎖アルキル基を２つ有するアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の環状アルキル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数２〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の任意の芳香族炭化水素、および炭素数６から１２の任意の環構造のうち、当該環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された任意の複素芳香族基を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該複素芳香族基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」は、炭化水素のみで構成された炭素数３から１２の任意の芳香族炭化水素化合物、および炭素数３から１２の任意の環構造のうち、当該環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された任意の複素芳香族化合物を包含する。用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
【００３０】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、核酸塩基および糖を含むグリコシルアミンをいう。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに、擬似塩基および／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、核酸塩基と、糖にリン酸基が共有結合された糖とを含むグリコソミン（ｇｌｙｃｏｓｏｍｉｎｅ）をいう。ヌクレオチドは、任意の種々の置換基で修飾され得る。
【００３２】
本明細書において、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドをいう。デオキシリボヌクレオチドは任意の種々の置換基で修飾され得る。
【００３３】
本明細書において、用語「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。
【００３４】
本明細書において、用語「リボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドをいう。リボヌクレオチドは、任意の種々の置換基で修飾され得る。
【００３５】
本明細書において、用語「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、リボヌクレオチドを含む核酸をいう。
【００３６】
本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。好適には、糖部分が修飾された糖修飾ヌクレオシドが挙げられる。
【００３７】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」をいう。「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体も含む。そのような誘導体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
【００３８】
以下、本発明について詳述する。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含む。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、互いに、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更する。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更する。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）と結合し得る。
【００４２】
ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔｍ）は特に限定されない。例えば、２本鎖核酸を形成する異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸は、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有していなくともよい。
【００４３】
ヒトＡｐｏＣ３遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００００４０；５３３塩基）を含む。マウスＡｐｏＣ３遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２３１１４；５２４塩基）を含む。ＡｐｏＣ３としては、好ましくはヒトＡｐｏＣ３である。
【００４４】
１つの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡｐｏＣ３遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合し得るオリゴヌクレオチドである。３’非翻訳領域は、例えば、ヒトＡｐｏＣ３遺伝子の場合は配列番号１の３４７位から５３３位であり、マウスＡｐｏＣ３遺伝子の場合は配列番号２の３５３位から５２４位である。
【００４５】
１つの実施態様では、本発明のオリゴヌクレチドのベースとなる塩基配列は、配列番号３〜１７、２０〜２４および２６〜５３のいずれか１つに示される塩基配列を含む。
【００４６】
「ベースとなる塩基配列」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが含む糖修飾ヌクレオシドについて、天然の塩基に置き換えることにより表される塩基配列をいう。例えば、配列番号３の塩基配列からなるＡｐｏＣ３−１−Ｓは構成する塩基は全て天然の塩基であるのに対し、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）、ＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）、およびＡｐｏＣ３−２−ＮＣは、ＡｐｏＣ３−１−Ｓの一部の塩基を糖修飾された塩基に置換した塩基配列、すなわち、配列番号３をベースとした塩基配列からなる。
【００４７】
「配列番号３〜１７、２０〜２４および２６〜５３のいずれか１つに示される塩基配列を含む」とは、当該配列番号で示される塩基配列の５’側および／または３’側が、標的配列に結合し得る限り伸長されたものであってもよいことを意味する。このような塩基配列の設計および糖修飾する塩基の決定は、ＡｐｏＣ３遺伝子の遺伝子配列情報に基づいて適宜行い得る。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドが含む糖修飾ヌクレオシドは、４’位と２’位との間に架橋構造を有する。
【００４９】
上記架橋構造の１つは、−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−、−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＲ１−、−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−、または−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲ１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。このような架橋構造を、以下、ＡＭという場合がある。
【００５０】
ＡＭとしては、例えば、無置換アミド（４’−ＣＯ−ＮＨ−２’）、Ｎ−メチルアミド（４’−ＣＯ−ＮＣＨ３−２’）、Ｎ−イソプロピルアミド（４’−ＣＯ−Ｎ（ｉＰｒ）−２’）、Ｎ−ベンジルアミド（４’−ＣＯ−Ｎ（Ｂｎ）−２’）、アセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−２’）、Ｎ−メチルアセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＣＨ３−２’）、Ｎ−オキシアセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｏ−２’）、Ｎ−メチル−Ｎ−オキシアセトアミド（４’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＣＨ３−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＭヌクレオシド（モノマー）またはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、特許文献２に記載の方法により合成することができる。
【００５１】
上記架橋構造の他の１つは、−ＣＨ２−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−Ｏ−で表される。このような架橋構造を、以下、ＢＮＡという場合がある。
【００５２】
ＢＮＡとしては、例えば、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＮＡヌクレオシド（モノマー）またはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、非特許文献３〜７に記載の方法により合成することができる。
【００５３】
上記架橋構造の他の１つは、−ＣＨ２−ＮＲ１−Ｏ−、または−（ＣＨ２）２−ＮＲ１−Ｏ−で表され、
ここで、Ｒ１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す。このような架橋構造を、以下、ＮＣという場合がある。
【００５４】
ＮＣとしては、例えば、オキシアミノ（４’−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−２’）、Ｎ−メチルオキシアミノ（４’−ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＣヌクレオシド（モノマー）またはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、非特許文献８〜１１に記載の方法により合成することができる。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、特に限定されないが、好適には１０〜２５塩基である。より好適には１３〜２０塩基である。
【００５６】
糖修飾ヌクレオシド、特に糖修飾がＡＭである糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、上述のように、４’位と２’位との間の架橋構造、特にアミド結合を含む架橋構造により固定されているため、各種ヌクレアーゼにより分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。例えば、ｍＲＮＡと安定な２本鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害し（アンチセンス法）、あるいはゲノム中の２本鎖ＤＮＡとの間で３本鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。また、アミド結合を含む架橋構造は、生体適合性が高いことも期待され、さらにタンパク質などの生体成分を認識するためのアプタマーとしての機能も期待できる。
【００５７】
ＡｐｏＣ３遺伝子は、ＴＧリッチリポタンパク質の加水分解に関わるリポタンパク質リパーゼ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ：ＬＰＬ）の働きを阻害することにより、血清トリグリセリド（ＴＧ）値を上昇させる作用がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス核酸として、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡと結合して、ＡｐｏＣ３の遺伝子発現を抑制し得る。ＡｐｏＣ３の遺伝子発現を抑制することによって、ＡｐｏＣ３により阻害されていたＬＰＬ活性が回復し、血清ＴＧ値が低下し得る。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドは、高脂血症治療剤としての効果を奏する。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する高脂血症治療剤は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤とすることができる。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６０】
（実施例１：オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＣ３遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現抑制）
（オリゴヌクレオチドの標的領域の選定）
ヒトのＡｐｏＣ３遺伝子の塩基配列（配列番号１：５３３塩基）をＧｅｎＢａｎｋより入手した（アクセッション番号：ＮＭ＿００００４０）。マウスのＡｐｏＣ３遺伝子の塩基配列（配列番号２：５２４塩基）をＧｅｎＢａｎｋより入手した（アクセッション番号：ＮＭ＿０２３１１４）。以下の４つの観点でこれらの塩基配列をコンピュータソフトで解析し、オリゴヌクレオチドの標的として適している領域の塩基配列を選定した。
（１）ソフトｍＦｏｌｄ（M. Zuker、Nucleic Acids Res.、2003年、第31巻、p. 3406-3415）を用いて、ＡｐｏＣ３遺伝子のｍＲＮＡの折れ畳み構造を計算した。オリゴヌクレオチドが結合しやすいように、ｍＲＮＡ上でステムループ構造を形成しにくい領域を選択した。
（２）ソフトＪｕｓｔＢｉｏ（ＵＲＬ：http://www.justbio.com/）を用いて、ヒトとマウスのＡｐｏＣ３遺伝子の塩基配列を比較した。マウスで評価した結果に基づいてヒトへの適用を可能にするように、ヒトとマウスとの間で塩基配列が同じ領域を選択した。
（３）オリゴヌクレオチドと２本鎖核酸を形成した際に熱安定性が高くなるように、ＧＣ含量が多い領域を選択した。
（４）ソフトＢｌａｓｔ（S. F. Altschulら、J. Mol. Biol.、1990年、第215巻、p. 403-410）を用いて、標的領域の塩基配列と類似した塩基配列がゲノムの他の領域に存在するかどうかを探索した。他のｍＲＮＡにオリゴヌクレオチドが結合しないように、ゲノムの他の領域の塩基配列と類似性が低い塩基配列からなる領域を選択した。【００６１】
以上の４つの条件に最も適したオリゴヌクレオチドの標的領域を選択し、これに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計した（表１）。なお、表１において、ＰＳ骨格とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）をいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にＳ−オリゴヌクレオチドという。表１に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてＳ−オリゴヌクレオチドである。表１において、マウスＡｐｏＣ３遺伝子（配列番号２）に対する標的領域を併せて示す。また、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣおよびＡｐｏＣ３−２−ＢＮＡ１３はそれぞれ、ヒトＡｐｏＣ３遺伝子（配列番号１）の４０位から５８位および４０位から５２位を標的領域とする。オリゴヌクレオチドのそれぞれ対応する塩基配列を、表１に示したとおり配列番号３〜１６に示す。【００６２】
【表１】
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【００６３】
（オリゴヌクレオチドの調製）
特許文献２に記載の方法によりＡＭモノマー（アミダイト体）を合成した。非特許文献３〜７に記載の方法によりＢＮＡモノマー（アミダイト体）を合成した。非特許文献８〜１１に記載の方法によりＮＣモノマー（アミダイト体）を合成した。これらをＤＮＡ合成用モノマー体として用いて、ＤＮＡ合成機により必要に応じて１ｍｇから１００ｍｇ（ｉｎ  ｖｉｖｏグレード）のオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製、凍結乾燥処理に供した。得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認した。【００６４】
表１に記載のように、合成したオリゴヌクレオチド（ＡｐｏＣ３オリゴヌクレオチド）は、糖修飾ヌクレオシドを含まないＳ−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド：ＡｐｏＣ３−１−Ｓなど）、ＢＮＡ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド：ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡなど）、ＮＣ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（ＮＣ−オリゴヌクレオチド：ＡｐｏＣ３−１−ＮＣなど）およびＡＭ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（ＡＭ−オリゴヌクレオチド：ＡｐｏＣ３−ａｍｉｄｏ２０など）である。【００６５】
（マウス肝細胞に対するオリゴヌクレオチド添加実験）
２．０×１０５個／ｍＬに調製したマウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉの細胞を、１ウェルあたり２ｍＬずつ６ウェルプレートに播き、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間培養した。オリゴヌクレオチドの最終濃度が５０ｎＭとなるように、１μＭオリゴヌクレオチド含有溶液１１０μＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１４．３μＬおよびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４２５．７μＬを混合し、混合液を室温にて２０分間インキュベートして、このうち５００μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ１５００μＬを各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチド添加４時間後に培地を交換した。さらに２０時間後に細胞を回収し、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で細胞を破砕し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを分光光度計で定量し、ＲＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。オリゴヌクレオチドを添加しなかったものをコントロールとした。【００６６】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１０μｇからＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡおよびＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量を評価した。コントロールのｍＲＮＡ量を１としたときの結果を以下の図１に示す。【００６７】
オリゴヌクレオチドとして、ＡｐｏＣ３−１−Ｓ、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−２−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−３−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−４−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−５−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−６−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−７−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−８−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−９−ＢＮＡ１３を用いた。ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量を定量するためのＴａｑｍａｎプローブとしてＭｍ００４４５６７０＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を定量するためのＴａｑｍａｎプローブとしてＭｍ９９９９９９１５＿ｇ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。【００６８】
図１から明らかなように、オリゴヌクレオチドで処理したマウスＮＭｕｌｉ細胞では、無処理のマウスＮＭｕｌｉ細胞よりもＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ発現量が低かった。すなわち、用いたオリゴヌクレオチドはいずれもＡｐｏＣ３遺伝子の発現を抑制することがわかった。【００６９】
（ヒト肝細胞に対するオリゴヌクレオチド添加実験）
マウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉに代えてヒト肝臓細胞株Ｈｕｈ-７の細胞を用いたこと、およびオリゴヌクレオチドの最終濃度として５０ｎＭのほかに１０ｎＭも試したこと以外は、上記と同様に実験を行った。結果を図２に示す。なお、オリゴヌクレオチドとしては、ＡｐｏＣ３−２−ＢＮＡ１３、ＡｐｏＣ３−４６−ＢＮＡ１４、ＡｐｏＣ３−５１−ＢＮＡ１４、ＡｐｏＣ３−２−ＮＣを用いた。【００７０】
図２から明らかなように、オリゴヌクレオチドで処理したヒトＨｕｈ-７細胞では、無処理のヒトＨｕｈ-７細胞よりもＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ発現量が低かった。すなわち、用いたオリゴヌクレオチドはいずれもＡｐｏＣ３遺伝子の発現を抑制することがわかった。【００７１】
（実施例２：オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＣ３遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現抑制１）
（マウスに対するオリゴヌクレオチド投与実験）
被験動物として６週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本クレア）を各投与群で例数５匹となるように準備した。２週間の高脂肪食（Ｆ２ＷＴＤ１：コレステロール０．３％含有，オリエンタル酵母工業株式会社製）負荷の後、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡまたはＡｐｏＣ３−１−Ｓあるいは生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ：コントロール）を腹腔内投与した（２０ｍｇ／ｋｇ／回）。１週間に２回、計５回投与を行ない、最後の投与から２週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、ＰＢＳで心臓より灌流し、肝臓を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−８０℃にて保存した。【００７２】
（血清トリグリセリド値の定量）
マウス尾静脈より採血した血液を室温にて２０分間静置した後、５０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心して血清を分離した。それぞれの血清について、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて血清トリグリセリド値を定量した。血清２μＬに発色試液を３００μＬ加えて３７℃にて５分間加温し、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。結果を図３に示す。【００７３】
図３から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ投与群では、血清トリグリセリド値（ＴＧ）はコントロールの約１５％であった。オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−Ｓ投与群では、ＴＧはコントロールの約４６％であった。ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡを含むオリゴヌクレオチドはＴＧなどの低減に有効であることがわかった。【００７４】
（肝臓からのｍＲＮＡの抽出および定量：リアルタイムＰＣＲ）
凍結した肝臓の切片を１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でホモジナイズし、クロロホルム２００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した。上清２２０μＬをイソプロパノール４００μＬに添加して転倒混和し、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した後、イソプロパノールを除去した。次いで、７５％エタノール８００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを含む沈殿をＲＮＡフリー水（Ｗａｔｅｒ，ＤＥＰＣ  ｔｒｅａｔｅｄ，ＲＮａｓｅ  ｔｅｓｔｅｄ；ナカライテスク株式会社）８０μＬに溶解した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを分光光度計で定量し、ＲＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。【００７５】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１０μｇからＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡおよびＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、マウスのＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するマウスのＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量を評価した。コントロールのｍＲＮＡ量を１としたときの結果を以下の図４に示す。【００７６】
ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量を定量するためのＴａｑｍａｎプローブとしてＭｍ００４４５６７０＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を定量するためのＴａｑｍａｎプローブとしてＭｍ９９９９９９１５＿ｇ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。【００７７】
図４から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ投与群では、コントロールよりもＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量が有意に少なかった。オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−Ｓ投与群では、コントロールと同等のｍＲＮＡ量であった。【００７８】
（ＡｐｏＣ３タンパク質量の定量：ウェスタンブロッティング）
ＢＩＯ  ＲＡＤ  ＤＣ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて血清中のタンパク定量を行なった。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｇｅｌｓ（１６％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の各レーンに血清（タンパク質量５０μｇ）ずつアプライし、２００Ｖにて４０分間電気泳動した。Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて１８０ｍＡにて９０分間ブロッティングを行ない、次いでＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ（ナカライテスク株式会社）を用いて１時間ブロッキングを行なった。得られたメンブレンに対し、１次抗体として、抗ａｐｏＣ-ＩＩＩポリクローナルウサギ抗体（ａｐｏＣ-ＩＩＩ  Ｍ−７５，Santa Cruz Biotechnology社）を反応させ、二次抗体として、抗ウサギポリクローナル抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ，Santa Cruz Biotechnology社）を反応させた。次いで、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，GE healthcare社）を用いてメンブレンを発色させ、マウスのＡｐｏＣ３のタンパク質量を定量した。結果を図５に示す。【００７９】
図５から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ投与群では、コントロールよりもＡｐｏＣ３のタンパク質量が顕著に少なかった。【００８０】
以上より、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡを含むオリゴヌクレオチドはＡｐｏＣ３遺伝子の発現を抑制することによって、ＴＧなどの低減に有効であることがわかった。【００８１】
（実施例３：オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＣ３遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現抑制２）
オリゴヌクレオチドとしてＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）またはＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）を用いたこと、投与量を２０ｍｇ／ｋｇ／回に代えて１０ｍｇ／ｋｇ／回としたこと、および採血と肝臓の採取の日を最後の投与から２週間後に代えて１週間後としたこと以外は、実施例２と同様に実験を行った。結果を図６〜８に示す。【００８２】
図６から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）投与群およびＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）投与群では、血清トリグリセリド値（ＴＧ）はコントロールの約５０％であった。ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡおよびＡｐｏＣ３−１−ＮＣを含むオリゴヌクレオチドはＴＧの低減に有効であることがわかった。【００８３】
図７から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）投与群では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量はコントロールの約８０％であり、ＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）投与群では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量はコントロールの約６０％であった。【００８４】
図８から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ（Ｔ，Ｃ）投与群およびＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）投与群では、コントロールよりもＡｐｏＣ３のタンパク質量が顕著に少なかった。【００８５】
以上より、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡおよびＡｐｏＣ３−１−ＮＣを含むオリゴヌクレオチドはＡｐｏＣ３遺伝子の発現を抑制することによって、ＴＧの低減に有効であることがわかった。なお、肝毒性が見られないことを、トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いた血清中のＡＳＴおよびＡＬＴの値の測定により確認した。【００８６】
（実施例４：オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＣ３遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現抑制３）
オリゴヌクレオチドとしてＡｐｏＣ３−２−ＮＣを用いたこと、および投与量を２０ｍｇ／ｋｇ／回に代えて５ｍｇ／ｋｇ／回としたこと以外は、実施例２と同様に実験を行った。結果を図９〜１１に示す。【００８７】
図９から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣ投与群では、血清トリグリセリド値（ＴＧ）はコントロールの約６０％であった。ＡｐｏＣ３−２−ＮＣを含むオリゴヌクレオチドはＴＧの低減に有効であることがわかった。【００８８】
図１０から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣ投与群では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量はコントロールの約８０％であった。【００８９】
図１１から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−２−ＮＣ投与群およびＡｐｏＣ３−１−ＮＣ（Ｔ，Ｃ）投与群では、ＡｐｏＣ３のタンパク質量は、コントロールの約６０％であった。【００９０】
以上より、ＡｐｏＣ３−２−ＮＣを含むオリゴヌクレオチドはＡｐｏＣ３遺伝子の発現を抑制することによって、ＴＧの低減に有効であることがわかった。なお、血清中のＡＳＴおよびＡＬＴの値から肝毒性は見られなかった。【００９１】
（実施例５：オリゴヌクレオチドによるＡｐｏＣ３遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現抑制４）
オリゴヌクレオチドとしてＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０またはＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６を用いたこと、およびオリゴヌクレオチドの投与を１週間に２回、計５回（２０ｍｇ／ｋｇ／回）腹腔内投与に代えて３日間に２回（２０ｍｇ／ｋｇ／回）尾静脈内投与としたこと以外は、実施例２と同様に実験を行った。結果を図１２〜１４に示す。【００９２】
図１２から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０投与群では、ＴＧはコントロールの約９０％であり、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６投与群では、ＴＧはコントロールの約８０％であった。ＡｐｏＣ３−１−ＡＭを含むオリゴヌクレオチドはＴＧの低減に効果があることがわかった。【００９３】
図１３から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０投与群およびＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６投与群では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量はコントロールの約２０％であった。【００９４】
図１４から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ２０投与群およびＡｐｏＣ３−１−ａｍｉｄｏ１６投与群では、ＡｐｏＣ３のタンパク質量はコントロールの約５０％であった。【００９５】
以上より、ＡｐｏＣ３−２−ＡＭを含むオリゴヌクレオチドはＡｐｏＣ３遺伝子の発現を抑制することによって、ＴＧの低減に効果があることがわかった。【００９６】
（実施例６：オリゴヌクレオチドの静脈内単回投与によるＡｐｏＣ３遺伝子の発現抑制および血清ＴＧ値の減少）
マウスＡｐｏＣ３遺伝子（配列番号２）の４６位から５８位またはヒトＡｐｏＣ３遺伝子（配列番号１）の４０位から５２位の標的領域に相補的なオリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ（ＣＴＧｃａｔｇｇｃａＣＣＴ：５’末端を左端に記載。天然のＤＮＡをアルファベット小文字、大文字は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを表す。リン酸骨格は全てホスホロチオエート化している。この塩基配列を配列番号１７に示す）の調製は、実施例１に記載のオリゴヌクレオチドの調製にしたがって行なった。【００９７】
被験動物として８週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊに３週間の高脂肪食（Ｆ２ＷＴＤ１）を負荷したこと、オリゴヌクレオチドとしてＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを用いたこと、オリゴヌクレオチドの投与を単回（２１ｍｇ／ｋｇ／回）の尾静脈内投与とし、および採血および肝臓摘出を投与後２、７日後に行なったこと以外は、実施例２と同様に実験を行った。投与後の肝臓内ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡレベルの経時変化および血清トリグリセリド値の経時変化を図１５および１６にそれぞれ示す。【００９８】
図１５から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ投与群では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量は、投与２日後においてコントロールの約５０％であり、遺伝子抑制効果が確認された。【００９９】
図１６から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ投与群では、ＴＧは、投与２日後において約４０％減少し、一週間後においても効果が持続していた。【０１００】
以上より、オリゴヌクレオチドの単回投与により、１週間以上効果が持続することが認められた。【０１０１】
（実施例７：慢性的な高ＴＧ血症を有するＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるオリゴヌクレオチド投与によるＡｐｏＣ３遺伝子の発現抑制、血清ＴＧ値の減少および代謝改善）
被験動物として６週齢のＡｐｏＥノックアウトマウス（オス：自家繁殖により入手した慢性的な高ＴＧ血症の動物モデル）を各投与群で例数３匹となるように準備し、２週間の高脂肪食（Ｆ２ＷＴＤ１）を負荷したこと、オリゴヌクレオチドとしてＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡを用いたこと、オリゴヌクレオチドの投与について、投与２日前に絶食下採血を行ない、ＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡまたは生理食塩水を週１回にて計５回、続いて２週に１回の総計６回の頻度にて皮下投与を行なったこと（１０ｍｇ／ｋｇ／回）、この間に尾静脈より数回採血し、そして最終日に肝臓を採取した。肝臓内ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡの定量および血清中の総ＴＧ値の測定は実施例２の手順を用いて行なった。マウス血清のアディポネクチン濃度は、ＣｉｒｃｕＬｅｘＴＭ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（株式会社医学生物学研究所製）を用いて、プロトコルに従って定量した。【０１０２】
投与終了後の肝臓内ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡレベル、投与開始後の血清トリグリセリド値の経時変化、および投与終了後の血清中のアディポネクチン濃度を、図１７〜１９にそれぞれ示す。【０１０３】
図１７から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ投与群では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量は、投与後３ヶ月の後に、コントロールの約５０％にまで低下していた。【０１０４】
図１８から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ投与群では、血清中の総ＴＧ値は、投与後１週間後には低下が著しく、その後を通じても平均４０％の低下が見られた。【０１０５】
図１９から明らかなように、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ投与群では、脂肪より産生される動脈硬化抑制因子である血中のアディポネクチンタンパク質が、コントロール群と比較し３倍程度増加しており、代謝改善が認められた。【０１０６】
また病理組織学的解析の結果、肝臓において、両群共に脂肪肝の様相が認められるものの、オリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１３−２−ＢＮＡ投与群のほうが脂肪肝の病態が有意に軽微であることが確認された。【０１０７】
（実施例８：糖部架橋型人工核酸２’，４’−ＢＮＡＡＭ［Ｎ−Ｒ］を用いた検討）
本実施例では、糖部架橋型人工核酸２’，４’−ＢＮＡＡＭ［Ｎ−Ｒ］のＲをメチル基（Ｍｅ）、イソプロピル基（ｉＰｒ）、ベンジル基（Ｂｎ）と様々に変えたアナログを合成し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬効を検証した。【０１０８】
以下の表２に示す各種オリゴヌクレオチドを設計および調製した。オリゴヌクレオチドの調製は、実施例１に記載のオリゴヌクレオチドの調製にしたがって行なった。いずれのオリゴヌクレオチドとも、塩基配列は配列番号５に示すとおりである。【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
被験動物として９週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊを各投与群で例数４匹となるように準備して通常食（日本クレア株式会社製）の条件下、表２中の各種オリゴヌクレオチドを単回（２．８４μｍｏｌ／ｋｇ／回）で尾静脈内投与し、そして採血および肝臓摘出を投与後３日後に行なった。肝臓内ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡの定量は実施例２の手順を用いて行なった。肝臓中に蓄積されたオリゴヌクレオチド分子を、以下に示すＥＬＩＳＡを応用した手法により定量した。得られた血清中のトランスアミナーゼ類（ＡＳＴ、ＡＬＴ）を、以下に示すように定量した。【０１１１】
肝臓中オリゴヌクレオチド分子の定量は以下のように行なった：投与済みのマウス肝臓組織の切片をＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ＡＬＤＲＩＣＨ社製）１ｍＬ中でホモゲナイズし、１０，０００ｒｐｍにて３分間冷却遠心し、上清をＢＩＯ  ＲＡＤ  ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてタンパク質定量を行なった。各上清１０μＬ、プローブ（５’−ｇａａ  ｔａｇ  ｃｇａ  ｔａａ  ｔａａ  ａｇｃ  ｔｇｇ  ａｔａ  ａ−３’：３’末端ビオチン化；配列番号１８）および鋳型ＤＮＡ（５’−ｔｃｇ  ｃｔａ  ｔｔｃ−３’：５’末端リン酸化および３’末端ジゴキシゲニン化；配列番号１９）をストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）へ分注し、３７℃にて１時間インキュベーションした。各ウェルの溶液を除き、ウェルを洗浄し、ジゴキシゲニンラベル化リン酸化ＤＮＡプローブとＴ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ株式会社製）を注入し、１５℃にて２時間インキュベーションした。各ウェルの溶液を除き、ウェルを洗浄し、抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）を加え、３７℃にて１時間インキュベーションした。各ウェルの溶液を除き、ウェルを洗浄し、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加し、発光を定量した。【０１１２】
ＡＳＴ値およびＡＬＴ値は、トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて定量した。血清１０μＬにＡＳＴ値測定用またはＡＬＴ値測定用基質酵素液２５０μＬを加えて３７℃にて５分間加温し、発色試液２５０μＬを加えて３７℃にて２０分間加温した。次いで、反応停止液１ｍＬを加えた後、分光光度計を用いて５５５ｎｍの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて各値を算出した。【０１１３】
投与終了後の血清中のトランスアミナーゼ値（投与群ごとに左側にＡＳＴ、右側にＡＬＴ）、肝臓内ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡレベル、および肝臓内オリゴヌクレオチド核酸量を図２０〜２２にそれぞれ示す。【０１１４】
図２０から明らかなように、投与群の間で血清トランスアミナーゼ値の大きな差は認められなかった。【０１１５】
図２１から明らかなように、ＡｐｏＣ３の遺伝子発現抑制効果は、ｍＲＮＡのオリゴヌクレオチドＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ−１６投与群で最も大きく、５０％程度の抑制がみられた。ＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿Ｍｅ−１６投与群は、ＡｐｏＣ３−１−ＢＮＡ−１６投与群と同等程度の発現抑制効果を有していた。次いでＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿Ｍｅ＿Ｂｎ−１６、ＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿ｉＰｒ−１６の順に抑制効果がみられた。ＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿Ｂｎ−１６は抑制効果が一見認められなかった。【０１１６】
図２２から明らかなように、標的の肝臓での各オリゴヌクレオチドの核酸蓄積量については、疎水性の高い置換基であるイソプロピル基（ｉＰｒ）またはベンジル基（Ｂｎ）を有するＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿ｉＰｒ−１６、ＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿Ｂｎ−１６、ＡｐｏＣ３−１−Ａｍ＿Ｍｅ＿Ｂｎ−１６で高い蓄積が認められた。蓄積量と薬効の解離は、置換基の嵩高さによって、アンチセンス法に要する酵素であるＲＮａｓｅＨによる認識能が低下したためであると推測される。【０１１７】
以上より、２’，４’−ＢＮＡＡＭ［Ｎ−Ｒ］は、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡと同等の効果を有することに加え、２’，４’−ＢＮＡＡＭ［Ｎ−Ｒ］の置換基を適切に設定することによって、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを上回る薬効および動態を付与し得ることが示唆された。【０１１８】
（実施例９：マウス初代培養肝細胞に対するオリゴヌクレオチド添加実験）
本実施例では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ全体に均等に分布させた種々の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ搭載アンチセンス分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価した。【０１１９】
以下の表３および４に示す各種オリゴヌクレオチドを調製した（各種オリゴヌクレオチドの対応する配列は、これらの表中に示すように配列番号１６、２０〜５３に示す）。これらのオリゴヌクレオチドの設計は、配列長を１４マーに限定し、マウスＡｐｏＣ３遺伝子の塩基配列（配列番号２）から、ｍＡｐｏＣ３−｛１５ｎ−９｝−ＢＮＡ（１４），ｎ＝１〜３５にて規則的に標的領域を選択した。表３および４において、マウスＡｐｏＣ３遺伝子（配列番号２）に対する標的領域を併せて示す。また、オリゴヌクレオチドｍＡｐｏＣ３−５１−ＢＮＡ（１４）は、ヒトＡｐｏＣ３遺伝子（配列番号１）の４４位から５７位を標的領域とする。オリゴヌクレオチド調製は、実施例１と同様に行なった。【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳＩＧＭＡ社製，５％ＦＢＳ，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，１％Ｇｌｕｔａｍａｘ含有）にて３．３×１０５個／ｍＬに調製したマウス肝初代培養細胞を、１ウェルあたり１００μＬずつ９６ウェルプレート播き、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間培養した。オリゴヌクレオチドの最終濃度が１０ｎＭとなるように１００ｎＭオリゴヌクレオチド含有溶液を１１μＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．５５μＬおよびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３８．４５μＬと混合し、混合液を室温にて２０分間インキュベートして、このうち５０μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ５０μＬとを各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチド添加４時間後に培地を交換した。さらに２０時間後にＣｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、細胞破砕溶液からＴｏｒａｌ  ＲＮＡをｃＤＮＡにした。オリゴヌクレオチドを添加しなかったものをコントロールとした。得られたｃＤＮＡを用いたｍＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ量の定量を、実施例１と同様に行なった。結果を図２３に示す。【０１２３】
図２３から明らかなように、ｍＡｐｏＣ３−９６−ＢＮＡ（１４）（塩基配列が配列番号２５に対応するオリゴヌクレオチド）を除くほぼ全てのオリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチドで処理したマウス肝細胞のｍＲＮＡ発現量がオリゴヌクレオチド添加なしの無処理の細胞コントロールと比べてＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ発現量が低く、発現抑制効果がみられた。さらに、塩基配列が配列番号２２、２７、３０、３４、３８、または４０〜５２に対応するオリゴヌクレオチドで処理したマウス肝細胞では、ＡｐｏＣ３のｍＲＮＡ発現量が極めて低く、特に高い発現抑制効果がみられた。発現抑制効果は、例えば、オリゴヌクレオチドが３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を標的領域とする場合（例えば、塩基配列が配列番号４０〜５２に対応するオリゴヌクレオチド）によく観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本研究によれば、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた高脂血症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、心筋梗塞などの冠動脈疾患や脳血管疾患の予防において期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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