(57)【要約】  機能性核酸の塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖の核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を簡便かつ低コストで強化、向上させることを課題とする。  一本鎖核酸断片又は二本鎖核酸断片の少なくとも一の3′末端に、（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる核酸領域、（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる核酸領域、及び（C）前記（A）の核酸領域に相補的な塩基配列からなる核酸領域からなり、それらが5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結されたヘアピン型DNAを連結し、かつ一本鎖核酸断片又は二本鎖核酸断片の少なくとも一の3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている核酸断片を提供する。
2013058306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、かつ
第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを、
以下の（１）又は（２）で示される核酸断片の少なくとも1つの3′末端に連結してなる核酸分子。
（１）完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片であって、3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている二本鎖核酸断片、又は
（２）一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片であって、3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている一本鎖核酸断片
【請求項２】
前記核酸断片が請求項１の（１）に記載の二本鎖核酸断片の場合において、前記ヘアピン型DNAが連結された核酸断片の少なくとも1つが修飾されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第１核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸断片において修飾されるヌクレオチドがRNAからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記修飾がリボースにおける2′位のヒドロキシ基の置換である、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ヒドロキシ基をメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、又はブトキシ基で置換する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸断片が機能性核酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸断片が請求項１の（１）に記載の二本鎖核酸断片の場合において、前記機能性核酸がsiRNA、成熟型二本鎖miRNA又は標的分子結合核酸断片である、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸断片が請求項１の（２）に記載の一本鎖核酸断片の場合において、前記機能性核酸がshRNA、一本鎖miRNA前駆体、核酸アプタマー、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、モレキュラー・ビーコン、リボスイッチ、U1アダプター又は標的分子結合核酸断片である、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１１】
製薬上許容可能な担体を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
核酸分解酵素に対する耐性が増強された核酸分子の製造方法であって、
（１）互いに完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片において、少なくとも１つの3′末端の、当該3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つ、又は
（２）一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片において、その3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つ
を修飾する修飾工程、及び
前記少なくとも1つの3′末端に、
5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、かつ
第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを連結する連結工程
を含む前記製造方法。
【請求項１３】
前記連結工程において、前記核酸断片が請求項１２の（１）に記載の二本鎖核酸断片の場合に、修飾された核酸断片の少なくとも1つに前記ヘアピン型DNAを連結する、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記第1核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記核酸断片において修飾されるヌクレオチドがRNAからなる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記修飾がリボースにおける2′位のヒドロキシ基の置換である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ヒドロキシ基をメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、又はブトキシ基で置換する、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分解酵素に対する核酸断片の分解耐性能を向上させる方法及び該性質を有する核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、siRNA、核酸アプタマー及びデコイ核酸のような機能性核酸が医薬又は診断薬として注目され、その医療応用に向けて様々な核酸医薬品等の研究及び開発が世界各国で進められている。【０００３】
しかし、核酸は、通常、生体内でヌクレアーゼ等の核酸分解酵素により分解され易いという問題がある。特に、近年その応用性と作用効果から核酸医薬として脚光を浴びているsiRNAやRNAアプタマーは、生体内で非常に不安定なRNAで構成されていることから、生体内での核酸の安定化は、核酸医薬品の薬理効果を効率的に、かつ継続的に作用させる上で不可欠な課題となっている。また、核酸医薬品の細胞内における生理活性に関しては、修飾核酸による安定化に加えて、その活性化の機構に不明な点が多いのが現状である。【０００４】
これまでにも核酸の安定化を目的とした多くの方法や安定化核酸が報告されている。例えば、ダンベル型によるデコイ核酸の安定化が挙げられる（特許文献１〜３）。ダンベル型核酸は、二本鎖核酸断片の両末端をリンカー核酸等のループ構造で連結して閉環状にすることによって、該二本鎖核酸断片に、核酸分解酵素に対する分解耐性能を獲得させる方法である。しかし、この方法は、直鎖状の核酸断片を環化させるために複雑で、かつコストの高い工程を経ねばならない。【０００５】
また、ヌクレアーゼの分解を受けない人工的に構築された人工核酸の使用も検討されているが、生体内で分解されない人工核酸の医薬品への適用は、副作用等の安全面において問題が残る。さらに、核酸の安定化修飾によりヌクレアーゼに対する安定性は向上するものの、これらの修飾核酸の生理活性が向上することはほとんどない。【０００６】
したがって、可能な限り天然型の核酸で構成され、核酸分解酵素に対する高い分解耐性能を有し、生体内で比較的安定に維持され、さらに簡便に調製可能で安価に提供できる核酸医薬品の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2003/091432
【特許文献２】WO2005/014810
【特許文献３】US2003/040613
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、二本鎖核酸断片又は分子内フォールディングにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を簡便な調製方法で、かつ低コストで向上させる方法及びその方法により得られる核酸分子を提供することを課題とする。【０００９】
本発明は、包含する機能性核酸の生体内での安定性を高め、継続的にその薬理効果を発揮することのできる核酸分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本願発明者らは鋭意研究を重ねた結果、特定の配列からなるヘアピン型DNAを一本鎖又は二本鎖の核酸断片の少なくとも１つの3′末端に連結し、さらに少なくとも１つの核酸断片の3′末端から２つのヌクレオチドのうち少なくとも1つを修飾することによって、閉環構造でなくとも、また核酸断片に単にヘアピン型DNAを連結したときよりも核酸分子の核酸分解酵素に対する分解耐性能を強化でき、その結果、核酸断片が機能性核酸を包含する場合には、その安定化のみならず、その生物学的活性を維持又は増強できることを見出した。【００１１】
前記「特定の配列からなるヘアピン型DNA」は、7〜14塩基の特定の塩基配列からなり、分子内フォールディングによってヘアピン構造を形成する核酸分子である。このヘアピン型DNAは、mRNAやプライマーDNAのような分子内フォールディングによって高次構造を形成しない一本鎖核酸断片の末端に連結したときには、その一本鎖核酸断片に対して核酸分解酵素に対する分解耐性を付与できることが知られていた（Hirao I. et al., (1990) Nucleic Acid Symp. Ser., 22, 75-76；Hirao I. et al., (1993) FEBS Lett., 321, 169-172；Khan I.M. & Coulson J.M., (1993) Nucleic Acids Res., 21, 2967-2958；Yoshizawa S. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 2217-2221；Hirao I. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 576-582；Mestre B. et al., (1995) Bioconjug. Chem., 6, 466-472；Yoshizawa S. et al., (1997) Biochemistry 36, 4761-4767；Jolles B. et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25, 4608-4613）。【００１２】
しかし、この特定の配列からなるヘアピン型DNAを、機能性核酸を含む二本鎖核酸断片や分子内フォールディングによって高次構造を形成する一本鎖核酸断片に付与した場合に、同様の核酸分解酵素耐性効果を奏し得ることや、機能性核酸の機能を保持し得るか否かについては知られておらず、さらに、核酸安定化のためのダンベル型構造は、前述のように閉環状構造であり、非連結部位を有するダンベル型様構造（すなわち、ダンベル型構造に一箇所又は二箇所のニックが入ったような構造）が、核酸分解酵素に対して分解耐性能を有することについては、当該分野においても予想だにされていなかった。加えて、機能性核酸分子、特にアンチセンスRNAやsiRNAにおいて、2′-O-メチル置換等のリボース糖骨格における2′-ヒドロキシ基への化学修飾によって核酸分解酵素に対する耐性が付与されることは従来から知られていたものの、当該機能性核酸分子の生物学的活性（例えば、アンチセンス効果やRNAi活性）を維持、向上できることについては予想だにされていなかった。【００１３】
本願発明は、上記結果に基づいて完成されたものであり、すなわち、以下の（１）〜（１７）を提供する。【００１４】
（１）5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、かつ
第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを、
以下の（i）又は（ii）で示される核酸断片の少なくとも1つの3′末端に連結してなる核酸分子。【００１５】
（i）完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片であって、3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている二本鎖核酸断片、又は
（ii）一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片であって、3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている一本鎖核酸断片
（２）前記核酸断片が（１）（i）に記載の二本鎖核酸断片の場合において、前記ヘアピン型DNAが連結された核酸断片の少なくとも1つが修飾されている、（１）に記載の核酸分子。【００１６】
（３）前記第１核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、（１）又は（２）に記載の核酸分子。【００１７】
（４）前記核酸断片において修飾されるヌクレオチドがRNAからなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸分子。【００１８】
（５）前記修飾がリボースにおける2′位のヒドロキシ基の置換である、（４）に記載の核酸分子。【００１９】
（６）前記ヒドロキシ基をメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、又はブトキシ基で置換する、（５）に記載の核酸分子。【００２０】
（７）前記核酸断片が機能性核酸を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の核酸分子。【００２１】
（８）前記核酸断片が（１）（i）に記載の二本鎖核酸断片の場合において、前記機能性核酸がsiRNA、成熟型二本鎖miRNA又は標的分子結合核酸断片である、（７）に記載の核酸分子。【００２２】
（９）前記核酸断片が（１）（ii）に記載の一本鎖核酸断片の場合において、前記機能性核酸がshRNA、一本鎖miRNA前駆体、核酸アプタマー、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、モレキュラー・ビーコン、リボスイッチ、U1アダプター又は標的分子結合核酸断片である（７）に記載の核酸分子。【００２３】
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の核酸分子を有効成分として含む医薬組成物。【００２４】
（１１）製薬上許容可能な担体を含む、（１０）に記載の医薬組成物。【００２５】
（１２）核酸分解酵素に対する耐性が増強された核酸分子の製造方法であって、
（i）互いに完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片において、少なくとも１つの3′末端の、当該3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つ、又は
（ii）一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片において、その3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つ
を修飾する修飾工程、及び前記少なくとも1つの3′末端に、5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、かつ
第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを連結する連結工程を含む前記製造方法。【００２６】
（１３）前記連結工程において、前記核酸断片が（１２）（i）に記載の二本鎖核酸断片の場合に、修飾された核酸断片の少なくとも1つに前記ヘアピン型DNAを連結する、（１２）に記載の製造方法。【００２７】
（１４）前記第1核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、（１２）又は（１３）に記載の製造方法。【００２８】
（１５）前記核酸断片において修飾されるヌクレオチドがRNAからなる、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。【００２９】
（１６）前記修飾がリボースにおける2′位のヒドロキシ基の置換である、（１５）に記載の方法。【００３０】
（１７）前記ヒドロキシ基をメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、又はブトキシ基で置換する、（１６）に記載の方法。【００３１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-230090号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の核酸分子によれば、低コストで、かつ簡便な調製方法により、二本鎖核酸断片又は分子内フォールディングにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片に核酸分解酵素に対する分解耐性能を付与し、生体内での高い安定性を確保させことができる。それによって、前記二本鎖核酸断片又は一本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の生体内での安定性を高め、かつ生物学的活性を増強することによって、長期間にわたり継続的にその薬理効果を作用させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の核酸分子を表す概念図である。（A）2つのヘアピン型DNA（101）と各鎖の塩基長が等しい二本鎖核酸断片（102）からなる核酸分子の一例、（B）1つのヘアピン型DNA（101）と一方の鎖の塩基長が他方の鎖の塩基長よりも長い二本鎖核酸断片（103）からなる核酸分子の一例、（C）1つのヘアピン型DNA（101）と一本鎖核酸断片（108）からなる核酸分子の一例を示す。図中の星印（113）は、修飾され得るヌクレオチドの位置を表わす（以下、同様とする）。
【図２】本発明の核酸分子を構成するヘアピン型DNAの概念図を表す。ヘアピン型DNAは、第1核酸領域（201）、第2核酸領域（202）及び第3核酸領域（203）からなり、第1核酸領域（201）と第3核酸領域（203）を構成するヌクレオチドは、塩基対合してステム構造を形成する。
【図３】1つのヘアピン型DNA（301）と二本鎖核酸断片（302）からなる本発明の核酸分子であって、ヘアピン型DNAと二本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。図中、星印は、修飾され得るヌクレオチドの位置を表わす。
【図４】1つのヘアピン型DNA（401）と二本鎖核酸断片（402）からなる本発明の核酸分子であって、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含むときのヘアピン型DNAと二本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。二本鎖核酸断片（402）において、S側はsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であり、A側はsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片を表す。
【図５】2つのヘアピン型DNA（501）と二本鎖核酸断片（502）からなる本発明の核酸分子であって、非連結部位を一箇所含む場合のヘアピン型DNAと二本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。
【図６】2つのヘアピン型DNA（601）と二本鎖核酸断片（602）からなる本発明の核酸分子であって、非連結部位を一箇所含み、かつ二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含むときのヘアピン型DNAと二本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。二本鎖核酸断片（602）において、S側はsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であり、A側はsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片を表す。
【図７】2つのヘアピン型DNA（701）と二本鎖核酸断片（702）からなる本発明の核酸分子であって、非連結部位を二箇所含む場合のヘアピン型DNAと二本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。
【図８】2つのヘアピン型DNA（801）と二本鎖核酸断片（802）からなる本発明の核酸分子であって、非連結部位を二箇所含み、かつ二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含むときのヘアピン型DNAと二本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。二本鎖核酸断片（802）において、S側はsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であり、A側はsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片を表す。
【図９】2つのヘアピン型DNA（901）と二本鎖核酸断片（902）の全ての末端が連結した本発明の核酸分子であって、二本鎖核酸断片（902）内のニックの数及びその位置による態様を示す概念図である。
【図１０】1つのヘアピン型DNA（1001）と一本鎖核酸断片（1002）からなる本発明の核酸分子であって、ヘアピン型DNAと一本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。
【図１１】2つのヘアピン型DNA（1101）と一本鎖核酸断片（1102）からなる本発明の核酸分子であって、各ヘアピン型DNAと一本鎖核酸断片の連結態様を示す概念図である。
【図１２−１】実施例１で調製したホタルルシフェラーゼmRNAを標的とするsiRNAを含む各種核酸分子の分子名、塩基配列及び配列番号を示す。配列中、DNAはアルファベットの小文字標記で、RNAは大文字標記で表す。また、下線太字は、2′-O-メチルリボース(2′OMe)を含むヌクレオチドを、またイタリック太字は、2′-デオキシ-2′-フルオロリボース（F）を含むヌクレオチドを表わす。各核酸分子において、sはsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片を、aはsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片示す。siRNAのセンス鎖側の塩基とそれに対応するアンチセンス鎖側の塩基は、互いに塩基対合を形成している。なお、DNA部分は、本明細書に記載のヘアピン型DNAに相当し、図２に示すヘアピン構造を形成している。
【図１２−２】図１２−１と同様である。
【図１２−３】図１２−１と同様である。
【図１３−１】ホタルルシフェラーゼsiRNAを含む各種核酸の、HeLa細胞内におけるホタルルシフェラーゼ発現抑制効果を示す。siRNAを含む核酸で処理しなかったとき（未処理）のルシフェラーゼ相対発光量（ウミシイタケルシフェラーゼの発現量で補正；データ示さず）を発現量100％としたときの相対値を示す。ここでは、Cont.（コントロール）1、2、4〜7と共に、被検核酸分子M1〜M14を示している。
【図１３−２】図１３−１と同様である。ここでは、Cont.1、2及び被検核酸分子M1と共に、M15〜M27を示している。
【図１３−３】図１３−１と同様である。ここでは、Cont.1、2、3及び被検核酸分子M1と共に、M28及びM29を示している。
【図１３−４】図１３−１と同様である。ただし、ここでは、Cont.1、2、3、8及び被検核酸分子M1と共に、M28及びM30を示している。
【図１４】ホタルルシフェラーゼsiRNAを含む各種核酸の、NIH3T3細胞内におけるホタルルシフェラーゼ発現抑制効果を示す。siRNAを含む核酸で処理しなかったとき（未処理）のルシフェラーゼ相対発光量（ウミシイタケルシフェラーゼの発現量で補正；データ示さず）を発現量100％としたときの相対値を示す。ここでは、Cont.1及び2、被検核酸分子M1と共に、HeLa細胞を用いたときに比較的に抑制効果が高かったM15〜M27を示している。
【図１５】マウス血清中における本発明の各核酸分子の核酸分解酵素に対する安定性を示す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳導図である。図中、矢印のバンドは、本発明の核酸分子の全長に相当する位置を、また矢頭のバンド群は、本発明の核酸分子が部分分解された核酸断片に相当する位置を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
I．核酸分子
第１の実施形態において、本発明は、核酸分解酵素に対する分解耐性能を有する核酸分子に関する。図１に本発明に関連する核酸分子の構造例を模式図で示す。この図の（A）〜（C）で示すように、本発明の核酸分子は、ヘアピン型DNA（101）及び核酸断片（102、103、108）からなり、核酸断片の少なくとも１つの3′末端にヘアピン型DNAを連結し、かつ核酸断片の少なくとも１つの3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つが修飾（113）された構造を有する。
【００３５】
本明細書において、「核酸」とは、原則として、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。したがって、通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したDNA及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したRNAのような、自然界に存在する天然型ヌクレオチドが連結してなる天然型核酸が該当する。その他にも、本発明の核酸分子は、非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸も含むことができる。
【００３６】
本明細書において、「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築されたヌクレオチドであって、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する、又は天然型ヌクレオチドを構成するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含む、自然界に存在しないヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2′-デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシドが挙げられる。また、本明細書において、「非天然型核酸」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された人工核酸をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2′-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や人工核酸を含むこともできる。なお、本明細書においては、以下、便宜的に、非天然型ヌクレオチド及び非天然型核酸をまとめて「人工核酸」と呼ぶ。
【００３７】
本発明の核酸分子は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
【００３８】
１．核酸分子の構成要素
前述のように、本発明の核酸分子は、ヘアピン型DNA（101）及び核酸断片（二本鎖核酸断片：102又は103；一本鎖核酸断片：108）から構成される。以下、それぞれについて具体的に説明をする。
【００３９】
１−１．ヘアピン型DNA
本発明の核酸分子を構成するヘアピン型DNAの一例を図２に示す。この図で示すように、ヘアピン型DNAは、第１核酸領域（201）、第2核酸領域（202）及び第3核酸領域（203）の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された構造を有する。
【００４０】
「第1核酸領域」とは、2〜5個の任意ヌクレオチドからなる核酸領域である。前記ヌクレオチドは、グアニン（g）、アデニン（a）、シトシン（c）又はチミン（t）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチドをいう。本核酸領域の塩基は、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、gc含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がg及び／又はcで構成されていることがもっとも好ましい。なお、図２の例で第1核酸領域は、5′‐cgc‐3′で示される。
【００４１】
「第2核酸領域」とは、5′‐gna‐3′又は5′‐gnna‐3′の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各nは、独立に、天然型塩基（g、a、t、若しくはc）、前記塩基類似体又は修飾塩基のいずれかからなる。なお、図２の例で第2核酸領域は、5′‐gaaa‐3′で示される。
【００４２】
「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム部分を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ部分をそれぞれ構成し、全体として、例えば、配列番号６又は７の塩基配列を有する7〜14個のヌクレオチドからなるヘアピン型DNAが形成される。
【００４３】
上記ヘアピン型DNAを、次で説明する核酸断片の一以上の末端にホスホジエステル結合によって連結することによって、その核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性を向上させて生体内での安定性を高めることが可能となる。
【００４４】
１−２．核酸断片
本発明の核酸分子を構成する核酸断片は、二本鎖核酸断片又は分子内フォールディングによって高次構造を形成する一本鎖核酸断片からなる。いずれの核酸断片も、少なくとも1つの3′末端に前記ヘアピン型DNAが連結されており、かつ、少なくとも1つの3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つが修飾されていることを特徴とする。
【００４５】
これらの核酸断片は、機能性核酸の塩基配列を含むことができる。ここで「機能性核酸」とは、生体内又は細胞内において、特定の生物学的機能、例えば、酵素機能、触媒機能又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、転写、翻訳の阻害又は亢進）を有する核酸をいう。具体的には、例えば、siRNA、shRNA、miRNA（pri-miRNA、pre-miRNAを含む）、核酸アプタマー（RNAアプタマー、DNAアプタマーを含む）、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、リボスイッチ、U1アダプター、モレキュラー・ビーコン又は転写因子結合領域等が挙げられる。本発明において、好ましい機能性核酸は、RNA由来の機能性核酸、例えば、siRNA、shRNA、miRNAである。
【００４６】
以下、二本鎖核酸断片及び一本鎖核酸断片のそれぞれについて、具体的に説明をする。
【００４７】
１−２−１．二本鎖核酸断片
二本鎖核酸断片は、DNA、RNA若しくは人工核酸又はこれらの組み合わせからなる。二本鎖核酸断片を構成する各核酸断片の塩基は、本発明の核酸分子において互いに完全に又は部分的に塩基対合をしている。「完全に」とは、本明細書において、少なくとも一方の核酸断片の全ての塩基が他方の核酸断片の対応する塩基と塩基対合することをいう。したがって、各核酸断片の塩基長が等しい場合、両核酸断片の全ての塩基が互いに塩基対を形成することとなる。また、「部分的に」とは、各核酸断片の対応する塩基配列間において、一部の塩基、好ましくは連続する2以上の塩基が塩基対合を形成している状態を意味する。したがって、この場合、二本鎖核酸断片は、図１（B）で示すようにその内部に一以上の塩基のミスマッチ部位（104）、又は一以上のバルジ構造（105）を有していてもよい。
【００４８】
本発明の二本鎖核酸断片は、全体でその内部に3個以上、好ましくは5個以上、より好ましくは7個以上、さらに好ましくは10個以上の塩基対を含む。また、本発明の二本鎖核酸断片の塩基長は、特に限定はしない。それぞれの機能性核酸領域がその機能を発揮し得る範囲で適宜定めればよい。また、二本鎖核酸断片を構成する各核酸断片の塩基長は、同一であっても又は異なっていてもよい。好ましくは、同一塩基長である。各核酸断片の塩基長が異なる場合、図１（B）で示すように、長鎖側が分子内フォールディングによって一以上のループ構造及び一以上のステム構造（107）を形成してもよい。このとき、ステム構造は、その内部に一以上のミスマッチ部位（104）又は一以上のバルジ構造（105）を含むこともできる。
【００４９】
二本鎖核酸断片は、2つの3′末端を有するが、そのうち少なくとも1つには、前記ヘアピン型DNAが連結されるように構成されている。また、核酸断片の2つの3′末端のうち少なくとも1つの3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つは修飾されている。この修飾されている核酸断片には、ヘアピン型DNAが連結されていてもよいし、されていなくてもよい。つまり、二本鎖核酸断片を構成する2本の核酸断片の一方のみが修飾されている場合、前記ヘアピン型DNAは、この修飾されている核酸断片の3′末端にのみ連結されていてもよいし、修飾されていない核酸断片の3′末端にのみ連結されていてもよいし、又は修飾されている核酸断片と修飾されていない核酸断片のそれぞれの3′末端に連結されていてもよい。又は、二本鎖核酸断片を構成する2本の核酸断片の両方が修飾されている場合、前記ヘアピン型DNAは、一方の核酸断片の3′末端にのみ連結されていてもよいし、両方の核酸断片の3′末端に連結されていてもよい。好ましい態様は、ヘアピン型DNAが連結された核酸断片の少なくとも1つが修飾されていることである。すなわち、二本鎖核酸断片を構成する2本の核酸断片の一方の核酸断片のみが修飾されている場合には、ヘアピン型DNAは少なくともその修飾されている核酸断片の3′末端に連結されていることが好ましく（他方の修飾されていない核酸断片の3′末端には連結されていても、されていなくてもよい）、また、二本鎖核酸断片を構成する2本の核酸断片の両方が修飾されている場合には、ヘアピン型DNAは、一方又は両方の核酸断片の3′末端に連結されていることが好ましい。さらに、核酸断片における修飾は、3′末端から2つ目のヌクレオチドのみ、3′末端のヌクレオチドのみ、及び3′末端から2つのヌクレオチドの両方の、3つの類型が挙げられる。修飾が1つの場合、修飾されるヌクレオチドは、3′末端から2つ目のヌクレオチド又は3′末端のヌクレオチドのいずれであってもよい。好ましくは、3′末端のヌクレオチドの修飾である。また、両方のヌクレオチドが修飾される場合、それぞれのヌクレオチドは、同じ修飾を受けていてもよいし、異なる修飾を受けてもよい。なお、5′末端側には前記ヘアピン型DNAが連結されるように構成されていてもよいし、連結されないように構成されていてもよい。
【００５０】
本明細書において、「修飾」とは、核酸の修飾であって、核酸の構成単位であるヌクレオチドの一部又は全部が他の原子団と置換されること、又は官能基等が付加されることをいう。具体的には、例えば、糖修飾、塩基修飾、又はリン酸修飾が挙げられる。
【００５１】
「糖修飾」とは、ヌクレオシドを構成するリボース部の修飾である。例えば、リボヌクレオシドを構成するリボース部の修飾であって、2′位のヒドロキシ基における置換若しくは付加が挙げられる。具体的には、例えば、ヒドロキシ基をメトキシ基に置換した2′-O-メチルリボース（本明細書においては、2′-O-メチルリボースを、以下、しばしば「2′OMe」と略記する）、エトキシ基に置換した2′-O-エチルリボース、プロポキシ基に置換した2′-O-プロピルリボース、若しくはブトキシ基に置換した2′-O-ブチルリボース、ヒドロキシ基をフルオロ基に置換した2′-デオキシ-2′-フルオロリボース（本明細書においては、2′-デオキシ-2′-フルオロリボースを、以下、しばしば「F」と略記する）又はヒドロキシ基を2′-O-メトキシ-エチル基に置換した2′-O-メトキシエチルリボースが該当する。又は、ヌクレオシドの（デオキシ）リボース部の他糖への置換等が挙げられる。具体的には、例えば、リボース部のアラビノース、2′−フルオロ−β-D-アラビノース、リボースの2′ヒドロキシ基と4′位の炭素原子をメチレンで架橋したリボース誘導体、リボース環の4位の酸素を硫黄に置換したリボース誘導体への置換が該当する。または、リボフラノース環上の酸素原子（リボースの4位の酸素原子）が硫黄に置換したものも含まれる。糖修飾の場合には、修飾されるヌクレオチドの塩基は問わない。例えば、DNAの場合であれば、グアニン、アデニン、シトシン又はチミンのいずれの塩基であってもよく、またRNAの場合であれば、グアニン、アデニン、シトシン又はウラシルのいずれの塩基であってもよい。
【００５２】
「塩基修飾」とは、ヌクレオシドを構成する塩基部の修飾である。例えば、塩基部への官能基の置換若しくは付加、又は塩基部の塩基類似体への置換が挙げられる。具体的には、例えば、シトシンの5位にメチル基が置換した5-メチルシトシン、シトシンの5位にヒドロキシ基が置換した5-ヒドロキシシトシン、ウラシルの5位にフルオロ基が置換した5-フルオロウラシル、ウラシルの4位の酸素原子がチオ基に置換した4-チオウラシル、ウラシルの5位にメチル基が置換した5−メチルウラシル、及びウラシルの2位の酸素原子がチオ基に置換した2-チオウラシルのような修飾ピリミジン、アデニンの6位にメチル基の置換した6-メチルアデニン、グアニンの6位にチオ基が置換した6-チオグアニンのような修飾プリン又は他の複素環塩基等が該当する。また、前記塩基類似体には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基、2,4-ジフルオロ-5-メチルベンジル基若しくは7-(2,2′-ビエチン-5-イル）イミダゾ［4,5-b］ピリジン-3-イル基等が該当する。
【００５３】
前述のように二本鎖核酸断片は、機能性核酸の塩基配列を含むことができる。二本鎖核酸断片に含まれ得る機能性核酸としては、例えば、siRNA、成熟型二本鎖miRNA又は標的分子結合核酸断片が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。
【００５４】
＜siRNA＞
「siRNA」（低分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。siRNAは、細胞（真核細胞）へ導入することによって配列特異的な転写後遺伝子サイレンシング（いわゆる、RNA干渉）を誘導することができる（Fire A. et al．，1998，Nature，391, 806-811）。以下、本発明の核酸分子を構成する二本鎖核酸断片中にsiRNAの塩基配列が含まれる場合について説明をする。
【００５５】
二本鎖核酸断片に含まれるsiRNAは、標的遺伝子のセンス鎖塩基配列の連続する一部領域と完全に一致する塩基配列をいずれか一方の核酸断片に包含する。完全一致する塩基配列の長さは、17〜32塩基、好ましくは18〜30塩基、より好ましくは19〜25塩基である。
【００５６】
二本鎖核酸断片において、siRNAに相当する核酸領域は、原則としてRNAからなるが、１又は数個の人工核酸を含むこともできる。本明細書において「数個」とは、2〜30の整数、例えば、2〜30、2〜29、2〜28、2〜27、2〜26、2〜25、2〜24、2〜23、2〜22、2〜21、2〜20、2〜19、2〜18、2〜17、2〜16、2〜15、2〜14、2〜13、2〜12、2〜11、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3の整数をいう。
【００５７】
二本鎖核酸断片の塩基配列において、siRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は人工核酸が存在していてもよい。siRNAの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、その末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。具体的には、例えば、siRNAのセンス鎖及びRNAアンチセンス鎖の3′末端側にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）等を付加することができる。
【００５８】
siRNAの標的遺伝子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸分子は、原則として、如何なる標的遺伝子に対するsiRNAの塩基配列も包含することができる。
【００５９】
siRNAは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて公知の方法により設計すればよい。例えば、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 32:936-948, 2004）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 22:326-330, 2004）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 316: 1050-1058, 2004）らの方法に基づいて、その配列を設計することができる。また、種々の研究機関や企業によってsiRNA設計が可能なウェブサイトが公開されており、有効なsiRNAをウェブ上で設計することが可能である。代表的なsiRNA設計ウェブサイトとしては、siDirect（http://design.RNAi.jp/）、siSearch（http://www.epigeneticstation.com/epigenetic-links/detail/link-203.html）、siDESIGN Center（http://www.dharmacon.com/designcenter/designcenterpage.aspx）、siRNA Selection Server （http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/）、Gene Specific siRNA Selector（http://bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm）等が挙げられる。
【００６０】
本明細書のsiRNAを含む二本鎖核酸断片において、センス鎖を含む核酸断片及びアンチセンス鎖を含む核酸断片の少なくとも一方の核酸断片の3′末端には、前記ヘアピン型DNAが連結される。また、センス鎖を含む核酸断片及びアンチセンス鎖を含む核酸断片の少なくとも一方の3′末端から2つのヌクレオチドのいずれか又は両方は上述の修飾がなされている。核酸断片の一方のみのヌクレオチドが修飾される場合、その修飾される核酸断片は、センス鎖を含む核酸断片又はアンチセンス鎖を含む核酸断片のいずれであってもよい。好ましくはセンス鎖を含む核酸断片である。これは、本発明者らの研究結果から、センス鎖を含む核酸断片の3′末端を修飾した場合に、より強い安定性と核酸分解酵素に対する分解耐性能が付与され、高い遺伝子発現抑制効果が認められたためである。siRNAを含む二本鎖核酸断片において、修飾の種類は特に限定はしない。例えば、糖修飾や塩基修飾のいずれであってもよい。好ましくは糖修飾である。具体的には、例えば、2′OMeやFによる修飾が挙げられる。
【００６１】
上記のようなsiRNAの塩基配列を包含する二本鎖核酸断片を構成要素として含む本発明の核酸分子は、従来のsiRNAよりも安定的に生体内又は細胞内で標的遺伝子の発現をサイレンシングすることが可能となる。
【００６２】
さらに、二本鎖核酸断片は、siRNAに加えて、他の機能性核酸を含むこともできる。例えば、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片が他方の核酸断片と塩基対合しない長い領域を含む結果、その領域で分子内フォールディングにより一以上のループ構造及び一以上のステム構造を形成する場合、具体的には、例えば、図１（B）107で示すような場合、各核酸断片が塩基対を形成する領域（106）にsiRNAを含み、さらに前記分子内フォールディングによって二次構造を形成する領域（107）には、例えば、RNAアプタマーや一本鎖miRNA前駆体等の他の機能性核酸をさらに含んでいてもよい。
【００６３】
＜成熟型二本鎖miRNA＞
「miRNA」（micro RNA）とは、生体内に存在し、特定の遺伝子の発現を調節する長さ21〜23塩基長の一本鎖ノンコーディングRNAである。このRNAは、標的遺伝子のmRNA及びタンパク質因子と結合して複合体を形成し、標的遺伝子の翻訳を阻害することが知られている。miRNAは、pri-miRNAと呼ばれる一本鎖の前駆体状態でゲノムから転写された後、核内でDroshaと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりpre-miRNAと呼ばれるさらなる一本鎖前駆体状態にプロセシングされ、核外でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによってmiRNA鎖とmiRNAスター鎖からなる成熟型二本鎖miRNAとなり、そのうちmiRNA鎖がRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取り込まれて、成熟型一本鎖miRNAとして標的遺伝子発現を調整する。本発明の核酸分子において、二本鎖核酸断片は、この成熟型二本鎖miRNAの塩基配列を包含することができる。
【００６４】
二本鎖核酸断片において、成熟型二本鎖miRNAは、野生型の成熟型二本鎖miRNAと同じ塩基配列を有することが好ましい。この場合、ゲノム上にコードされたmiRNAの塩基配列に基づいて設計すればよい。
【００６５】
二本鎖核酸断片において、成熟型二本鎖miRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は人工核酸が存在していてもよい。成熟型二本鎖miRNAの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【００６６】
成熟型二本鎖miRNAが標的とする遺伝子の種類については、特に制限はしない。したがって、本発明の核酸分子によれば、所望する遺伝子のmiRNAがゲノム上に存在する場合には、そのmiRNAを用いることができる。
【００６７】
成熟型二本鎖miRNAを含む二本鎖核酸断片においても、前記siRNAを含む核酸断片と同様に、miRNA鎖を含む核酸断片及びmiRNAスター鎖を含む核酸断片の少なくとも一方の核酸断片の3′末端には、ヘアピン型DNAが連結される。また、miRNA鎖を含む核酸断片及びmiRNAスター鎖を含む核酸断片の少なくとも一方の核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドのいずれか又は両方は修飾されている。核酸断片の一方のみのヌクレオチドが修飾される場合、miRNA鎖を含む核酸断片又はmiRNAスター鎖を含む核酸断片のいずれが修飾されてもよいが、好ましくはmiRNA鎖を含む核酸断片である。
【００６８】
＜標的分子結合核酸断片＞
「標的分子結合核酸断片」とは、標的分子の結合領域を含む核酸断片をいう。「標的分子の結合領域」とは、標的とする特定の分子と特異的に及び／又は高親和性で結合することのできる核酸上の領域である。この標的分子の結合領域を有する標的分子結合核酸断片は、生体内又は細胞内において標的分子と結合することによって、その標的分子の生物学的機能を阻害又は抑制することができる。標的分子としては、例えば、DNA又はRNAに特異的に結合するタンパク質因子、核酸又は低分子化合物が挙げられる。標的分子結合核酸断片としては、例えば、特定の転写調節因子のDNA結合領域を有し、その転写因子の機能を阻害又は抑制するデコイDNA（おとりDNA）が挙げられる。
【００６９】
二本鎖核酸断片の塩基配列において、標的分子結合核酸断片は、その一方の末端又は両末端に一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は人工核酸を有してもよい。一方の末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端が前記ヘアピン型DNAと連結されるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【００７０】
標的分子結合核酸断片の標的分子については、特に制限はない。所望の標的分子の結合領域が公知であれば、それに基づいて設計、構築すればよい。
【００７１】
標的分子結合核酸断片を含む二本鎖核酸断片においても、前記siRNAを含む核酸断片と同様に、核酸断片の少なくとも一方の核酸断片の3′末端には、ヘアピン型DNAが連結される。また、核酸断片の少なくとも一方の核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドのいずれか又は両方は修飾されている。
【００７２】
上記のような標的分子結合核酸断片の塩基配列を包含する二本鎖核酸断片を構成要素として含む本発明の核酸分子は、従来の標的分子結合核酸断片よりも高い活性で、かつ安定的に生体内又は細胞内で標的分子の生物学的機能を阻害又は抑制することが可能となる。
【００７３】
１−２−２．一本鎖核酸断片
本発明の核酸分子を構成する一本鎖核酸断片は、図１（Ｃ）で示すように、分子内フォールディングによって一以上のステム構造（109）及び一以上のループ構造（110）を有する。さらに、ステム構造は、一以上のミスマッチ部位（111）及び／又は一以上のバルジ構造（112）を含んでいてもよい。
【００７４】
一本鎖核酸断片は、3′末端を1つしか有さない。そのため、その3′末端には、必ず前記ヘアピン型DNAが連結されるように構成されている。それ故、3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つは、前述の修飾を受けている。修飾が1つの場合、修飾されるヌクレオチドは、3′末端から2つめのヌクレオチド又は3′末端のヌクレオチドのいずれであってもよい。好ましくは3′末端のヌクレオチドの修飾である。また、2つのヌクレオチドが修飾される場合、それぞれのヌクレオチドは、同じ修飾を受けていてもよいし、異なる修飾を受けてもよい。なお、5′末端側には前記ヘアピン型DNAが連結されるように構成されていてもよいし、連結されないように構成されていてもよい。
【００７５】
一本鎖核酸断片に含まれ得る機能性核酸は、分子内フォールディングによって高次構造を形成し、その機能を発揮し得るものが該当する。例えば、shRNA、一本鎖miRNA前駆体、核酸アプタマー、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、モレキュラー・ビーコン、リボスイッチ、U1アダプター又は標的分子の結合領域を有する標的分子結合核酸断片が挙げられる。一方、プライマー、プローブ、成熟型一本鎖miRNA又はアンチセンスDNAのように、一般に分子内フォールディングによって高次構造を形成しない機能性核酸は、当該一本鎖核酸断片には含まれない。以下、一本鎖核酸断片に含まれ得る機能性核酸について説明をする。
【００７６】
＜shRNA＞
「shRNA」（short hairpin RNA）とは、前記siRNA又は成熟型二本鎖miRNAが適当な配列を有する短いスペーサ配列で連結された一本鎖RNAをいう。したがって、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサ配列がループ構造をとることによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成する。スペーサ配列は、通常3〜24塩基、好ましくは、4〜15塩基あればよい。スペーサ配列については、siRNA又は成熟型二本鎖miRNAが塩基対合することができる配列であれば、特に制限はない。
【００７７】
一本鎖核酸断片の塩基配列において、shRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は人工核酸が存在していてもよい。shRNAの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【００７８】
shRNAの標的遺伝子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸分子は、原則として、如何なる標的遺伝子に対するshRNAも包含することができる。また、shRNAが成熟型二本鎖miRNAを含む場合には、標的遺伝子に対するmiRNAがゲノム上に存在する限りにおいて、特に制限はなく、所望の標的遺伝子のshRNAを包含することができる。
【００７９】
上記のようなsiRNAの塩基配列を包含する二本鎖核酸断片を構成要素として含む本発明の核酸分子は、従来のsiRNAよりも安定的に生体内又は細胞内で標的遺伝子の発現をサイレンシングすることが可能となる。
【００８０】
＜一本鎖miRNA前駆体＞
「一本鎖miRNA前駆体」は、前述の「成熟型二本鎖miRNA」の項で説明したように、ゲノムから転写された後、核内でプロセシングを受け、成熟型一本鎖miRNAになるまでの間の一本鎖状態の前駆体状態のmiRNAをいう。具体的には、例えば、pri-miRNAやpre-miRNAが該当する。
【００８１】
一本鎖核酸断片において、一本鎖miRNA前駆体の配列は、ゲノム上にコードされた野生型のmiRNAと同じ塩基配列を有することができる。
【００８２】
一本鎖核酸断片において、一本鎖miRNA前駆体の一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は人工核酸が存在していてもよい。一本鎖miRNA前駆体の一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は特に限定はしないが、その末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内とすることが好ましい。
【００８３】
一本鎖miRNA前駆体が標的とする遺伝子の種類については、特に制限はしない。したがって、本発明の核酸分子によれば、発現調節を所望する遺伝子に対するmiRNAがゲノム上に存在する場合には、そのmiRNAを用いることができる。
【００８４】
上記のような一本鎖miRNA前駆体を包含する一本鎖核酸断片を含む本発明の核酸分子を適当な方法で用いることにより、特異的に、かつ従来のmiRNAよりも安定的に標的遺伝子の発現をサイレンシングすることが可能となる。
【００８５】
＜核酸アプタマー＞
「核酸アプタマー」とは、それ自身の立体構造によって標的分子に結合し、その機能を阻害又は抑制することのできる核酸をいう。RNAで構成されるRNAアプタマーと、DNAで構成されるDNAアプタマーが知られるが、本発明の核酸に含まれる核酸アプタマーは、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれで構成されていてもよい。好ましくはRNAで構成されるRNAアプタマーである。一般に、RNAはDNAと比較して、より多くの立体構造を形成できる柔軟性を有するからである。
【００８６】
核酸アプタマーは、標的分子に対する特異性及び親和性が、抗体よりも通常高く、それ故、標的分子と特異的に直接かつ強固に結合できる。また、結合に必要な標的のアミノ酸残基数が抗体のそれと比較して少なくてもよいことから、例えば、互いに相同性の高いタンパク質群の中で特定のタンパク質の機能のみを抑制させたい場合には抗体よりも優れている。アプタマーに関しては、例えば、Jaynasena S.D., (1999) Clin. Chem. 45:1628-1650を参照されたい。
【００８７】
一本鎖核酸断片の塩基配列において、核酸アプタマーの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は核酸類似体が存在していてもよい。核酸アプタマーの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜30個の範囲内であることが好ましい。
【００８８】
核酸アプタマーの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対する核酸アプタマーも包含することができる。
【００８９】
核酸アプタマーの配列は、当該分野で公知の方法により得られた核酸アプタマーの塩基配列又は公知の核酸アプタマーの塩基配列に基づけばよい。核酸アプタマーを作製する場合、RNAアプタマーであれば、例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別により作製される。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有するRNA分子で構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択し、回収後にRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、次のラウンドのRNAプールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強いRNAを選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。通常、ランダム配列領域は20〜100塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲である。標的分子への特異性を高めるためには、標的分子に類似する分子とRNAプールとを混合し、その分子と結合しなかったRNA分子からなるプールを用いればよい。このような方法によって最終的に得られたRNA分子をRNAアプタマーとして利用する。SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, 92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
【００９０】
上記のような核酸アプタマーを包含する一本鎖核酸断片を含む本発明の核酸を適当な方法で用いることにより、特異的に、かつ従来の核酸アプタマーよりも安定的に標的分子の機能を阻害又は抑制することが可能となる。
【００９１】
＜リボザイム＞
「リボザイム」とは触媒として機能するRNAの総称である。リボザイムには、例えば、RNAの特定の部位を特異的に切断する触媒機能をもつものや、核酸を連結する触媒機能をもつもの、又はアミノアシル化の触媒機能をもつものなどが知られている。本発明のリボザイムは、RNAで構成されるリボザイムのほかに、DNAで構成されるデオキシリボザイムを包含する。したがって、本発明のリボザイムは、広く一本鎖RNA及び／又はDNAとして構成されるものをさす。
【００９２】
一本鎖核酸断片の塩基配列において、リボザイムの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は核酸類似体が存在していてもよい。リボザイムの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【００９３】
リボザイムの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対するリボザイムも包含することができる。
【００９４】
＜モレキュラー・ビーコン＞
「モレキュラー・ビーコン」とは、ステム構造とループ構造とを持つヘアピン構造の一本鎖核酸であり、ループ部分と相補性のある配列の存在確認のためのプローブとして利用される遺伝子解析ツールである。通常は、蛍光剤と消光剤の距離が近いため消光されている。しかし、ループ部分に相補な配列があると、ループ部分が相補配列とハイブリダイズするため、ヘアピン構造が開き、蛍光剤と消光剤が引き離されるため、蛍光が検出される。
【００９５】
一本鎖核酸断片の塩基配列において、モレキュラー・ビーコンの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は核酸類似体が存在していてもよい。モレキュラー・ビーコンの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【００９６】
モレキュラー・ビーコンの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対するモレキュラー・ビーコンも包含することができる。
【００９７】
＜リボスイッチ＞
「リボスイッチ」とは、mRNAの5′末端の非翻訳領域等に存在するシスエレメントであり、代謝産物感受性遺伝子スイッチとして機能する。リボスイッチは、低分子有機化合物等と直接結合することによりmRNAの立体構造を変化させ、その遺伝子発現を調整することができる。
【００９８】
一本鎖核酸断片の塩基配列において、リボスイッチの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は核酸類似体が存在していてもよい。リボスイッチの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【００９９】
リボスイッチの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対するリボスイッチも包含することができる。
【０１００】
＜U1アダプター＞
「U1アダプター」とは、標的遺伝子のmRNA前駆体における3′末端エクソンに相補的な5′側の「標的ドメイン」と、U1 snRNAの5′領域に相補的な配列を有する3′側の「U1ドメイン」を含む二機能性の約25塩基からなる一本鎖核酸である（Goraczniak R. et al., 2009, Nat Biotechnol., 27：257-263）。生体内にU1アダプターを導入すると、U1 snRNAを含むU1核内低分子リボ核蛋白質(U1 snRNP)が標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリAシグナル周辺に結合し、該mRNAのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のmRNA前駆体が不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。
【０１０１】
一本鎖核酸断片の塩基配列において、U1アダプターの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチド（DNA及び／又はRNA）又は核酸類似体が存在していてもよい。U1アダプターの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1〜20個の範囲内であることが好ましい。
【０１０２】
U1アダプターの標的遺伝子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的遺伝子に対するU1アダプターも包含することができる。
【０１０３】
上記のようなU1アダプターを包含する一本鎖核酸断片を含む本発明の核酸を適当な方法で用いることにより、特異的に、かつ従来のU1アダプターよりも安定的に標的分子の機能を阻害又は抑制することが可能となる。
【０１０４】
＜標的分子結合核酸断片＞
標的分子の結合領域は、前述の「１−２−１．二本鎖核酸断片」の「標的分子結合核酸断片」の項で説明したとおりである。ここでの標的分子結合核酸断片としては、例えば、特定の選択的スプライシング調節因子のRNA結合領域（例えば、ドナー部位又はアクセプター部位）や特定のmiRNAのRNA結合領域（すなわち、標的遺伝子のmiRNA結合領域）等を有し、特定の選択的スプライシング調節因子やmiRNAの機能を阻害又は抑制するデコイRNAが挙げられる。
【０１０５】
２．核酸分子の構成
２−１．二本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸分子
二本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸分子は、最大で4つ、すなわち二本鎖核酸断片の5′末端及び3′末端のそれぞれに、前記ヘアピン型DNAを連結することができる。本発明の核酸分子は、二本鎖核酸断片の少なくとも一方の3′末端にヘアピン型DNAが連結されていれば、本発明の核酸分子の効果を奏し得る。
【０１０６】
二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結態様は、連結されるヘアピン型DNA数、及び二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類によって決定される。
【０１０７】
（１）ヘアピン型DNAを1つ有する場合
二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結には、図３で示す2つ態様がある。いずれの場合にもヘアピン型DNAが連結される核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つは、前述の修飾を有する。また、この場合、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。すなわち、RNAで構成されるsiRNAや成熟型二本鎖miRNAの塩基配列を含んでいてもよいし、DNAで構成されるデコイDNAのような標的分子の結合領域の塩基配列を含んでいてもよい。
【０１０８】
（I）二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAの5′末端が連結された核酸分子（図３（A））
本連結態様では、ヘアピン型DNAの3′末端と二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片の5′末端が連結されていない。この連結態様における本発明の核酸分子は、二本の核酸断片、すなわち、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片とヘアピン型DNAとを連結してなる核酸断片と、二本鎖核酸断片の他方の核酸断片とから構成される。
【０１０９】
本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、siRNAのセンス鎖を含む核酸断片又はアンチセンス鎖を含む核酸断片のいずれの3′末端にヘアピン型DNAの5′末端を連結するかは、特に制限はしない。ヘアピン型DNAをsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片の3′末端に連結した図４（A）で示す核酸分子、又はヘアピン型DNAをsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片の3′末端に連結された図４（B）で示す核酸分子のいずれであってもよい。好ましくは図４（A）で示すsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAの5′末端を連結した核酸分子である。これは、前述のように、本発明者らの研究結果から、センス鎖を含む核酸断片の3′末端を修飾した場合に、より強い安定性と核酸分解酵素に対する分解耐性能が付与され、高い遺伝子発現抑制効果が認められたためである。
【０１１０】
（II）二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAの5′末端が連結され、他方の核酸断片の5′末端にヘアピン型DNAの3′末端一の末端が連結された核酸分子（図３（B））
本連結態様では、ヘアピン型DNAの5′末端及び3′末端が二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片と連結されている。その結果、この連結態様における本発明の核酸分子は、
・二本鎖核酸断片の一方の核酸断片、
・ヘアピン型DNA、及び
・二本鎖核酸断片の他方の核酸断片
を5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結した一本の核酸断片で構成される。
【０１１１】
本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、以下の（i）及び（ii）の2つの核酸分子のいずれであってもよい。好ましくは、前述のようにセンス鎖を含む核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAの5′末端を連結した（i）で示す核酸分子（図４（C））である。
【０１１２】
（i）・siRNAのセンス鎖を含む核酸断片、
・ヘアピン型DNA、及び
・siRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片、
を5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結した図４（C）で示す核酸分子
（ii）・siRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片、
・ヘアピン型DNA、及び
・siRNAのセンス鎖を含む核酸断片、
を5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結した図４（D）で示す核酸分子
（２）ヘアピン型DNAを2つ有する場合
二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの非連結部位の数に基づいて、以下の（I）〜（III）で示す3つ態様に大別できる。本発明の核酸分子は、いずれの連結態様であってもよい。いずれの場合にも2本の核酸断片のうち少なくとも一方の核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結されており、また少なくとも一方の核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つは、前述の修飾を有する。好ましくはヘアピン型DNAが3′末端に連結された核酸断片において、その連結された3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている態様である。2本の核酸断片のうち両方の核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結されている場合には、いずれか一方又は両方の核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されていればよい。また、この場合、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。すなわち、RNAを主な構成要素とするsiRNAや成熟型二本鎖miRNAの塩基配列を含んでいてもよいし、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域の塩基配列を含んでいてもよい。
【０１１３】
（I）非連結部位が1つの場合
本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の一末端と一のヘアピン型DNAの一末端との間に非連結部位を１つ有する。それ故、本連結態様の核酸分子は、図５で示すように、二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片と2つのヘアピン型DNAとが連結した一本の核酸断片として構成される。本連結態様の核酸分子は、二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの非連結部位の位置に基づいて、さらに以下の（i）及び（ii）の2つの連結態様に分類できる。
【０１１４】
（i）核酸断片及びヘアピン型DNAが5′末端側から3′末端側に向かって以下の順番で連結された核酸（図５（A））
・二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、
・ヘアピン型DNA、
・二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及び
・ヘアピン型DNA 
本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5′末端と一のヘアピン型DNAの3′末端とが連結されていない。逆に、二本鎖核酸断片のそれぞれの3′末端にはヘアピン型DNAが連結されていることになる。それ故、それぞれの核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチド、すなわち4つのヌクレオチドのうち少なくとも1つ、最大で4つ全てが前述の修飾を有する。
【０１１５】
本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAを含む場合、siRNAのセンス鎖を含む核酸断片又はアンチセンス鎖を含む核酸断片のいずれが、前記「一方の核酸断片」に相当するかは、特に限定はしない。すなわち、図６（A）で示すように、前記「一方の核酸断片」がsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であって、「他方の核酸断片」がsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片であってもよいし、図６（C）で示すように、前記「一方の核酸断片」がsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片であって、「他方の核酸断片」がsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であってもよい。好ましくは、siRNAのセンス鎖を含む核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結されている図６（A）又は（C）で示すような核酸分子である。
【０１１６】
（ii）核酸断片及びヘアピン型DNAが5′末端側から3′末端側に向かって以下の順番で連結された核酸分子（図５（B））
・ヘアピン型DNA、
・二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、
・ヘアピン型DNA及び
・二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片
本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の3′末端と一のヘアピン型DNAの5′末端とが連結されていない。したがって、本連結態様においても、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、前記（i）と同様に、siRNAのセンス鎖を含む核酸断片又はアンチセンス鎖を含む核酸断片のいずれが、前記「一方の核酸断片」に相当するかは、特に限定はしない。すなわち、図６（D）で示すように、前記「一方の核酸断片」がsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であって、「他方の核酸断片」がsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片であってもよいし、図６（B）で示すように、前記「一方の核酸断片」がsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片であって、「他方の核酸断片」がsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であってもよい。
【０１１７】
（II）非連結部位が2つの場合
本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片の一末端と各ヘアピン型DNAの一末端との間に非連結部位を有する。本連結態様の核酸分子は、図７（A）又は（B）で示すように、二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの非連結部位の位置に基づいて、さらに以下の（i）及び（ii）の連結態様に分類できる。
【０１１８】
（i）二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5′末端及び3′末端のそれぞれにヘアピン型DNAが連結された核酸分子（図７（A））
本連結態様の核酸分子は、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片に2つのヘアピン型DNAが連結された核酸断片と二本鎖核酸断片の他方の核酸断片の二本の核酸断片から構成される。すなわち、本連結態様の核酸分子において、他方の核酸断片は、その両末端（5′末端及び3′末端）にヘアピン型DNAを連結していない。それ故、前記他方の核酸断片の両末端と2つのヘアピン型DNAのそれぞれの一方の末端との間に2つの非連結部位が存在する。
【０１１９】
本連結態様では、一方の核酸断片の3′末端のみがヘアピン型DNAの5′末端と連結されている。それ故、当該一方の核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つ、最大で2つが前述の修飾を有する。
【０１２０】
本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、前記「一方の核酸断片」はsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片又はアンチセンス鎖を含む核酸断片のいずれであってもよい。すなわち、図８（A）で示すように、前記「一方の核酸断片」がsiRNAのセンス鎖を含む核酸断片であって、「他方の核酸断片」がsiRNAのアンチセンス鎖を含む核酸断片であってもよい。
【０１２１】
（ii）二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結された核酸分子（図７（B））
本連結態様の核酸分子は、二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結された二本の核酸断片から構成される。これに対して、両核酸断片の5′末端にはヘアピン型DNAが連結されていない。それ故、前記それぞれの核酸断片の5′末端と両ヘアピン型DNAの3′末端との間に2つの非連結部位が存在する。また、それぞれの核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも１つが修飾されいる。すなわち、4つのヌクレオチドのうち少なくとも1つ、最大で4つ全てが前述の修飾を有することとなる。
【０１２２】
本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、図８（B）で示すようにsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれを含む核酸断片の3′末端側にヘアピン型DNAを連結する核酸となる。
【０１２３】
（III）非連結部位がない場合（図９）
本連結態様における核酸は、二本鎖核酸断片の末端と2つのヘアピン型DNAの末端とが全て連結されている。すなわち、本連結態様における核酸は、以下の核酸断片及びヘアピン型DNAが5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結され、かつ前記核酸断片の5′末端側とヘアピン型DNAの3′末端側とが互いに連結された構成を有する。
【０１２４】
・二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、
・ヘアピン型DNA、
・二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及び
・ヘアピン型DNA 
本連結態様では、二本鎖核酸断片のそれぞれの3′末端にはヘアピン型DNAが必ず連結されていることになる。それ故、それぞれの核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチド、すなわち4つのヌクレオチドのうち少なくとも1つ、最大で4つ全てが前述の修飾を有する。
【０１２５】
本連結態様では、二本鎖核酸断片領域内のニックの位置及び数によって、以下のさらなる3つの態様がある。
【０１２６】
（i）二本鎖核酸断片領域内にニックがない場合（図９（A））
本態様において、本発明の核酸分子は、閉環状であり、いわゆるダンベル型構造を呈する。
【０１２７】
本態様において、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。特に、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域の塩基配列を含む場合、この態様は好ましい。
【０１２８】
（ii）二本鎖核酸断片を構成するいずれか一方の核酸断片領域内に一箇所のニックを有する場合（図９（B））
本態様において、本発明の核酸分子は、前記「（２）ヘアピン型DNAを２つ有する場合」の「（I)非連結部位が1つの場合」に記載の核酸と類似の構造を有する。ただし、前記（２）（I)に記載の核酸とは、ニック（非連結部位）の位置が二本鎖核酸断片を構成する核酸断片とヘアピン型DNA間ではなく、二本核酸断片内である点において異なる。
【０１２９】
本態様では、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域が挙げられる。前記ニックの位置が当該結合領域内に存在していてもよい。
【０１３０】
（iii）二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片領域内に一箇所（計二箇所）のニックを有し、両ニックが対向しない場合（図９（C））
本態様において、本発明の核酸分子は、前記（２）（II)（ii）に記載の核酸と類似の構造を有する。前記「（２）ヘアピン型DNAを2つ有する場合（II)非連結部位が2つの場合（ii）」に記載の核酸と本態様の核酸分子とは、ニック（非連結部位）の位置が二本鎖核酸断片を構成する核酸断片とヘアピン型DNA間ではなく、二本核酸断片内である点において異なる。
【０１３１】
「両ニックが対向しない」とは、二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片領域の対応する同じ位置にニックが存在しないことをいう。したがって、本態様の核酸において、二箇所のニック間には少なくとも1の、好ましくは2以上の塩基対が存在する。
【０１３２】
本態様では、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域が挙げられる。前記ニックの位置がこの結合領域内に存在していてもよい。
【０１３３】
２−２．一本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸分子
一本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸分子は、一本鎖核酸断片の3′末端に、又は5′末端及び3′末端の各末端に、ヘアピン型DNAを連結することができる。また、3′末端から2つのヌクレオチドのうち少なくとも1つは前述の修飾を有する。
【０１３４】
一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結態様は、連結されるヘアピン型DNA数によって決定される。
【０１３５】
（１）ヘアピン型DNAを1つ有する場合
一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結には、図１０（A）及び（B)で示すような2つの態様がある。本発明の核酸分子は、いずれの連結態様であってもよい。また、一本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。例えば、前述の一本鎖miRNA前駆体、shRNA、核酸アプタマー、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、モレキュラー・ビーコン又はリボスイッチU1アダプター、又は標的分子の結合領域のいずれの塩基配列も含むことができる。
【０１３６】
（I）一本鎖核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAの5′末端が連結された核酸（図１０（A））
本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAが連結した一本の核酸断片として構成される。本核酸は、5′末端が一本鎖核酸断片に、また3′末端がヘアピン型DNAに由来する。
【０１３７】
（II）一本鎖核酸断片の3′末端と5′末端にヘアピン型DNAの5′末端と3′末端がそれぞれ連結された核酸（図１０（B））
本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAが連結した閉環状核酸として構成される。
【０１３８】
（２）ヘアピン型DNAを2つ有する場合
一本鎖核酸断片の5′末端及び3′末端のそれぞれに異なるヘアピン型DNAの連結された態様である（図１１）
本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片が2つのヘアピン型DNAに挟み込まれるように、それぞれが連結した一本の核酸断片として構成される。
【０１３９】
本連結態様の核酸において、一本鎖核酸断片領域に含まれる機能性核酸の種類は問わない。例えば、前述の一本鎖miRNA前駆体、shRNA、核酸アプタマー、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、モレキュラー・ビーコン又はリボスイッチ及びU1アダプターのいずれの塩基配列も含むことができる。
【０１４０】
３．本発明の核酸分子の製造
本発明の核酸分子、すなわち、核酸分解酵素に対する分解耐性が増強された核酸分子の製造方法について説明する。
【０１４１】
本発明の核酸分子の製造方法は、修飾工程及び連結工程を含む。
【０１４２】
「修飾工程」とは、核酸分解酵素に対する増強された分解耐性を付与すべき核酸断片（以下、「分解耐性を所望する核酸断片」とする）において、所定の位置のヌクレオチドを修飾する工程である。ここでいう所定の位置とは、具体的には、分解耐性を所望する核酸断片が互いに完全に又は部分的に塩基対合した二本鎖核酸断片の場合、2つ存在する3′末端の少なくとも一方において、その3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つの位置が該当する。あるいは、分解耐性を所望する核酸断片が一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片の場合、その3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つの位置が該当する。
【０１４３】
「連結工程」とは、上述の構造からなるヘアピン型DNAを、前記分解耐性を所望する核酸断片の少なくとも1つの3′末端に連結する工程である。分解耐性を所望する核酸断片が二本鎖核酸断片の場合、ヘアピン型DNAを連結する核酸断片は、2つ存在する3′末端の一方又は両方のいずれであってもよい。好ましくは前記修飾工程において、3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも1つが修飾された核酸断片の3′末端の少なくとも1つに連結することである。すなわち、いずれか一方の核酸断片が修飾されている場合には、その核酸断片の3′末端に連結することが好ましく、両方の核酸断片が修飾されている場合には、２本の核酸断片の少なくとも1つに連結することが好ましい。
【０１４４】
修飾工程と連結工程の順序は問わない。通常、連結工程は、核酸分子の設計段階において分解耐性を所望する核酸断片の所定の3′末端にヘアピン型DNAを連結するように予め設計し、その設計された核酸分子の配列に基づいて公知の固相合成法に従って化学合成することによって達成される。核酸の化学合成法については、例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Section 3を参照されたい。その他、核酸断片とヘアピン型DNAを独立に調製し、その後、DNAリガーゼ等の酵素を用いて連結することによって達成することもできる。また、修飾工程は、修飾の位置や数を本発明の核酸分子の配列を設計する前に予め決定しておき、化学合成する際に同時に導入することで達成される。このような一部のヌクレオチドが修飾された核酸断片の化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ株式会社、Life Technologies Corporation、Sigma-Aldrich Corporation、ジーンデザイン社等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。
【０１４５】
化学合成後の本発明の核酸分子は、使用前に当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、HPLC法等が挙げられる。
【０１４６】
本発明の核酸分子が、二本の核酸断片から構成される場合、例えば、図３（A）、図７（A）及び（B）、及び図９（C）で示す構造を有する場合、本発明の核酸分子は、それぞれの核酸断片を独立に化学合成し、必要に応じて精製した後、2つの核酸断片を、好ましくは等量混合して、互いにアニーリングさせることで製造することができる。
【０１４７】
本発明の核酸分子が、一本の核酸断片から構成される場合、例えば、図３（C）、図５（A）及び（B）、図９（B）、図１０（A）及び図１１で示す構造を有する場合、本発明の核酸分子は、核酸断片を化学合成し、必要に応じて精製した後、分子内フォールディングが可能な条件下に置くことで製造することができる。
【０１４８】
本発明の核酸分子が、例えば、図９（A）、図１０（B）のような閉環状の構造を有する場合、一例として、その核酸内の適当な部位に一箇所のニックが入ったものに相当する一本の核酸断片を、前記化学合成によって調製し、必要に応じて精製した後、当該分野で公知の方法を用いて、その一本の核酸断片の両末端を連結すればよい。例えば、リガーゼ等の酵素を用いて生化学的に連結することができる。
【０１４９】
４．効果
本発明の核酸分子は、二本鎖核酸断片又は分子内フォールディングにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を、それらの少なくとも核酸断片単独の場合と比較して、又はそれらに公知のリンカー核酸若しくはヘアピン型核酸等の分解耐性を付与する核酸を連結した場合と比較して、より向上させることができる。それにより、二本鎖核酸断片等に含まれる機能性核酸の生体内での安定性を高めることが可能となり、その機能性核酸の薬理効果を継続及び／又は強化することができる。
【０１５０】
また、本発明の核酸分子は、公知のダンベル型構造の核酸のように閉環状構造でなくても、すなわち、非連結部位を一箇所又は二箇所含む構造であっても核酸分解酵素に対する分解耐性能を付与できる。このような非連結部位を有することは、本発明の核酸分子を調製する上で、従来のダンベル型核酸において行われていた核酸の環状化工程を省くことができる点、及び一本の長い直鎖状核酸として化学合成されていたそのダンベル型核酸を二本の直鎖状核酸に分断化して化学合成できる点等において、機能性核酸の調製の簡便化やその製造コストの削減上、極めて有用である。
【０１５１】
さらに、本発明の核酸分子の調製は、基本的に化学合成のみで、その後の処理は、精製とアニーリング処理程度であることから、目的の核酸を大量かつ安価に製造できる点でも優れている。
【０１５２】
本発明の核酸分解酵素に対する分解耐性が増強された核酸分子の製造方法によれば、従来生体内で核酸分解酵素による分解を受け易く、不安定であった核酸断片に核酸分解酵素に対する分解耐性能を付与することができる。分解耐性を所望する核酸断片が機能性核酸を含む場合、本方法によって、その機能及び活性をより長時間維持及び／又は強化することが可能となる。その結果、その機能性核酸の効果を増強することも可能となる。
【０１５３】
II．医薬組成物
第2の実施形態において、本発明は、医薬組成物に関する。
【０１５４】
１．医薬組成物の構成
本発明の医薬組成物は、前記第1の実施形態の核酸を有効成分として含むことを特徴とする。
【０１５５】
本発明の医薬組成物における本発明の核酸分子の含有量は、製薬上有効な量であればよい。本明細書において「製薬上有効な量」とは、医薬組成物の有効成分である本発明の核酸分子中の機能性核酸がその機能を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量を言う。具体的な用量は、使用する機能性核酸の種類、標的分子、使用する剤形、被検体の情報及び投与経路によって異なる。ヒトに投与する場合、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、通常、細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被検者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被検者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
【０１５６】
一投与単位あたりにおける本発明の核酸分子含有量の具体例として、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重60 kg）に対して、siRNAを含む本発明の核酸分子を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01％(w/v)〜約20％(w/v)、好ましくは約0.1％(w/v)〜約10％(w/v)で本発明の核酸分子を含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸分子の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒及び／又は添加剤をいう。
【０１５８】
前記「溶媒」には、例えば、水（例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液）、医薬的に許容される有機溶剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類）が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましい。また、生理的食塩水のように必要に応じて血液等と等張に調整されていることが好ましい。
【０１５９】
前記「添加剤」には、例えば、賦形剤、吸着防止剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【０１６０】
賦形剤としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム)、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１６１】
吸着防止剤としては、例えば、Tween80、Tween20、ゼラチン及び／又はヒト血清アルブミン等が挙げられる。
【０１６２】
結合剤としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【０１６３】
崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
【０１６４】
充填剤としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【０１６５】
乳化剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【０１６６】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１６７】
このような担体は、医薬組成物の形成を容易にし、またその剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、可溶化剤、吸収促進剤、保湿剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、抗酸化剤、緩衝剤等を添加することもできる。
【０１６８】
さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸分子が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、抗生物質を所定量含有していてもよい。
【０１６９】
本発明の医薬組成物の剤形は、本発明の核酸分子中に含まれる機能性核酸を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、湿布剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。本発明の場合、その有効成分が核酸形態であることから剤形は、注射剤であることが好ましい。
【０１７０】
２．医薬組成物の製造
本発明の医薬組成物の製造方法については、当業者に公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
【０１７１】
３．医薬組成物の投与方法
医薬組成物の投与方法は、投与単位形態で投与することが好ましい。経口投与、組織内投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与）、組織外投与（例えば、経皮投与、点眼、経鼻投与又は経直腸的投与）で投与することができる。本発明の医薬組成物の投与に際しては、その投与方法に適する形態であることが好ましい。例えば、組織内投与の場合、血流を介した注射が好ましく、それ故、剤形は液体（注射液）となる。
【０１７２】
注射による投与の場合、注入部位は、標的分子に対して本発明の核酸分子がその機能を発揮し、医薬組成物を投与する目的を達し得れば、特に限定しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。血流を介して本発明の医薬組成物を直ちに全身に行き渡らせることが可能であり、侵襲性が比較的低いからである。あるいは、本発明の医薬組成物の薬理効果を必要とする部位に直接注射してもよい。これは、対象部位に直接的に多量に作用させることができるからである。
【実施例】
【０１７３】
＜実施例１：siRNAを含む本発明の核酸分子の調製＞
実施例２に使用するためのsiRNAを含む本発明の核酸分子を調製した。【０１７４】
（方法）
実験に用いたsiRNAの標的は、ホタルルシフェラーゼmRNAとし、それに対する様々な核酸分子を設計した。各種核酸分子の構造とその塩基配列を図１２−１〜１２−３に示す。これらの図において、Cont.1は、ホタルルシフェラーゼmRNAに対するsiRNAを含む非修飾の二本鎖核酸断片のみからなるコントロール用核酸分子であり、従来のsiRNAと同様の構成から成る。Cont.2は、Cont.1のセンス鎖を含む核酸断片及びアンチセンス鎖を含む核酸断片のそれぞれの3′末端に、本明細書に記載のヘアピン型DNAを連結した非修飾のコントロール用核酸分子である。Cont.3〜7は、Cont.1におけるセンス鎖を含む核酸断片及びアンチセンス鎖を含む核酸断片の様々な位置に2′OMe修飾されたヌクレオチド（図１２−１において、塩基を下線太字で示す）を有するコントロール用核酸分子である。また、Cont.8は、センス鎖を含む核酸断片の5′末端と3′末端の両方に本明細書に記載のヘアピン型DNAを連結した非修飾のコントロール用核酸分子である。M1〜M31は、Cont.2又はCont.8をベースとして、ホタルルシフェラーゼmRNAに対するsiRNAを含む二本鎖核酸断片のセンス鎖を含む核酸断片及び／又はアンチセンス鎖を含む核酸断片の様々な位置に2′OMe及び／又はFを含むヌクレオチドを有する被検核酸分子である。なお、2′OMeを含むヌクレオチドは、図中、下線太字で示し、Fを含むヌクレオチドは、図中、イタリック太字で示している。【０１７５】
設計した各種核酸分子の核酸断片を公知の固相合成法に従い、ジーンデザイン社（大阪、日本）に委託して合成し、HPLC精製を行った。塩基対合するそれぞれの核酸断片が同一濃度となるようにリン酸緩衝液（pH7.4）にて混合し、75℃で加熱後室温まで徐冷してアニーリングさせて、本発明の核酸分子を調製した。【０１７６】
＜実施例２：in vitroでの本発明の核酸分子によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制＞
本実施例では、実施例１で調製したsiRNAを含む種々の核酸分子（Cont.1〜8及びM1〜M31）によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果を検証した。抑制効果の測定は、実施例１の各種核酸を、標的分子であるホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドと共にリポフェクション法によりHeLa細胞、又はNIH3T3細胞に導入し、ルシフェラーゼの発光強度を測定することで前記各種核酸の発現抑制効果を検証した。【０１７７】
（方法）
（１）細胞培養
細胞の培養は、二酸化炭素濃度5%、培養温度37℃の条件下で、10%仔ウシ血清（FBS、JRH BIOSCIENCES社）を含むそれぞれの培地に抗生物質（ペニシリン最終濃度100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL）を添加したものを用いた。HeLa細胞の培地は、MEM培地（Minimum Essential Medium Eagle、シグマ社）であり、NIH3T3細胞の培地は、DMEM培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium、シグマ社）である。【０１７８】
（２）実施例１で調製した各種核酸とプラスミドの培養細胞への導入
HeLa細胞の場合には、96穴プレートの1穴あたりに1.5×104個（100 μL）の細胞を播種し、抗生物質を含まない10% 仔ウシ血清含有MEM培地で24時間培養した。NIH3T3細胞の場合には、96穴プレートの1穴あたりに2×104個（100 μL）の細胞を播種し、抗生物質を含まない10% 仔ウシ血清含有DMEM培地で24時間培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000（インビトロジェン社）を1穴あたり0.5 μL用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド（pGL3-control、プロメガ社）を1穴あたり200 ng、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド（pGL4.74[hRluc/TK]、プロメガ社）を1穴あたり200 ng、及び前記実施例１で調製した各種核酸を最終濃度が0.1 nMとなるようにOPTI-MEM培地（インビトロジェン社）中で混合した溶液（50 μL）を添加することで行った。IC50値を求めるには、前記実施例１で調製した各種核酸を75 nMから2倍希釈する操作を7段階実施し、最終濃度が0.5 nMとなるようにOPTI-MEM培地（インビトロジェン社）中に混合した溶液（50 μL）を添加した。【０１７９】
（３）遺伝子の発現抑制効果の解析
トランスフェクション後22時間培養し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ社）を用いて、ホタルルシフェリン及びウミシイタケルシフェリンの発光をそれぞれ定量し、siRNAの標的となるホタルルシフェラーゼのタンパク質発現の抑制効果を調べた。具体的にはトランスフェクション後の細胞を1穴あたり100 μLのPBSで洗浄（HeLa細胞は2回、NIH3T3細胞は１回）した後、20 μLの細胞溶解用緩衝液を加えて、25℃で30分間静かに攪拌しながら細胞を溶解した。この溶液にLARII試薬を100 μL加えて混合し、マルチラベルリーダー（パーキンエルマージャンパン社）を用いてホタルルシフェリンの発光を検出した。続いて、Stop&Glo試薬を100 μL加えて、ウミシイタケルシフェリンの発光を検出し、それぞれの発光の強さをマルチラベルリーダー（パーキンエルマージャンパン社）を用いて数値化した。各発光検出において、バックグラウンドとしてトランスフェクションを行わなかった場合の発光量を、測定した各ルシフェリンの発光量から減じた後、標的分子であるホタルルシフェラーゼの発現量を示すホタルルシフェリンの発光量を、共発現させたコントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発現量を示すウミシイタケルシフェリンの発光量で除することによって規格化した。そして、siRNAを含む核酸の非存在下における値を100%として、種々のsiRNA存在下での標的分子とするホタルルシフェラーゼの相対活性を算出した。また、異なる種々の濃度のsiRNA存在下でも標的分子とするルシフェラーゼの相対活性を算出し、濃度に対して相対活性をプロットしたグラフからIC50値を求めた。具体的には、カレイダグラフ（Albeck Software）を用いて、計算式Y=m4+（m3-m4）/（1+10^（（LOG10（m0）−LOG10（m1））*m2））[初期値：m1=m2=m3=1、m4=100]に当てはめて、最小二乗法によるデータフィッティングにより算出した。Y（%）はsiRNA存在下での標的分子とするルシフェラーゼの相対活性、m0（nM）はsiRNA濃度、IC50値はm1（nM）に相当する。【０１８０】
（結果）
HeLa細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の相対発現量を図１３−１〜１３−４に、また発現抑制効果のIC50値を表１に、そしてNIH3T3細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の相対発現量を図１４にそれぞれ示す。
【表１】
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【０１８１】
まず、図１３−１の結果から、Cont.1で示す従来のsiRNAのみからなる核酸分子と比較して、M1〜M3は、発現抑制効果がより高いことが示された。また、M1及びM2については、Cont.2で示すヘアピン型DNAをsiRNAのセンス鎖の3′末端に連結しただけの核酸分子よりもさらに発現抑制効果が高かった（M3は、Cont.2と同程度であった）。この結果から、センス鎖又はアンチセンス鎖の3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも一を修飾（ここでは、2′OMe修飾）することが重要であることがわかった。特に、核酸断片がsiRNAを含む場合には、センス鎖の3′末端を修飾した方がより高い発現抑制効果を得ることができることが判明した。これらの発現抑制効果の向上は、核酸分解酵素に対するsiRNAの分解耐性能の向上に起因するものと考えられる。【０１８２】
これに対して、二本鎖核酸断片における一方又は両方の核酸断片の様々な位置に2′OMe修飾したヌクレオチドを多数導入した場合（Cont.4〜7、及びM4〜M14）には、逆にそのほとんどがCont.1よりも発現抑制効果を減じてしまうことが明らかとなった。以上の結果から、修飾による核酸分子の分解耐性能の向上においては、修飾されたヌクレオチドの数ではなく、修飾されるヌクレオチドの位置、すなわち、核酸断片（好ましくは3′末端にヘアピン型DNAが連結された核酸断片）の3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも一が修飾されていることが重要であることが示された。特に、センス鎖を含む核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドの少なくとも一が修飾されているときには、その分解耐性能がより増強され、高い遺伝子発現抑制効果が得られることも明らかになった。【０１８３】
また、図１３−２では、Cont.2の構成をベースとして、少なくとも一方の核酸断片の3′末端から2つのヌクレオチドを様々な組み合わせで2′OMe修飾及び／又はF修飾した核酸分子（M15〜M27）について調べた。その結果、いずれの核酸分子も従来のsiRNAと同じ構成を有するCont.1よりも発現抑制効果が高く、M18〜M20、M23〜M27では、Cont.2よりも有意に発現抑制効果が高かった。以上の結果から、図１３−１で示された、少なくともヘアピン型DNAが連結される3′末端のヌクレオチドから2つのヌクレオチドの少なくとも一が修飾されていることが重要であることが再確認された。また、M15〜M17のように、センス鎖の3′末端のヌクレオチドをF修飾した場合も、ヘアピン型DNAを結合していないCont. １よりも高い発現抑制効果が認められたことから、修飾は必ずしも2′OMe修飾である必要はないことが確認された。【０１８４】
図1３−３では、ヘアピン型DNAを連結せずに、siRNAを含む核酸断片の各3′末端を2′OMe修飾したCont.3と、ヘアピン型DNAをセンス鎖の両末端にのみ連結し、センス鎖のみの3′末端を2′OMe修飾した核酸分子（M28）とセンス鎖及びアンチセンス鎖の3′末端を2′OMe修飾した核酸分子（M29）における発現抑制効果を調べた。その結果、Cont.3では、発現抑制効果がCont.1とほとんど変わらなかった。これは、核酸分子の分解耐性能の向上には、単に3′末端のヌクレオチドから2つのヌクレオチドの少なくとも一を修飾だけでは足らず、ヘアピンDNAとの組み合わることが重要であることを示している。【０１８５】
また、一方の核酸断片（ここではセンス鎖）のみにヘアピン型DNAを連結した核酸分子（M28及びM29）の場合であっても、Cont.2と同等以上の発現抑制効果が認められた。これらの結果から、核酸断片が二本鎖（ここではsiRNA）の場合、発現抑制効果の向上には、両核酸断片（ここではセンス鎖とアンチセンス鎖）の3′末端にヘアピン型DNAが連結されている必要はなく、少なくとも一方の核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結されていれば足りることが示された。【０１８６】
さらに、図１３−４では、ヘアピン型DNAをセンス鎖の両末端にのみ連結した未修飾の核酸分子であるCont.8と、センス鎖のみの3′末端を2′OMe修飾した核酸分子（M28）と、M29のようにセンス鎖及びアンチセンス鎖の3′末端を2′OMe修飾し、かつヘアピン型DNAが連結されていないアンチセンス鎖の3′末端修飾されたヌクレオチドの数を2つにした核酸分子（M30）における発現抑制効果を調べた。M31の結果から、核酸分子の分解耐性能の向上には、少なくとも一方の核酸断片の3′末端にヘアピン型DNAが連結されていれば足りることが再確認され、さらに、ヘアピン型DNAが連結されていない核酸断片の3′末端側におけるヌクレオチドの修飾は、１つよりも2つの方がより分解耐性能が向上することが判明した。【０１８７】
また、図1４の結果から、NIH3T3細胞においてもHeLa細胞とほぼ同じ効果が得られたことから本発明の核酸分子が様々な種類の細胞において同様の効果を示すことが立証された。【０１８８】
＜実施例３：マウス血清に対する分解耐性の検証＞
本発明における核酸分子の核酸分解酵素に対する分解耐性能を検証した。【０１８９】
（方法）
種々の核酸分解酵素を含むマウス血清中におけるヘアピン型DNAが連結されたsiRNAの3′末端のヌクレオチドを2′OMe修飾した本発明の核酸分子の安定性について調べた。【０１９０】
Cont.1、Cont.2、及び本発明の核酸分子M1が最終濃度1.25 μMになるように、緩衝液（1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）にて調製し、75℃で加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせた。その後、マウス血清を最終濃度80%となるように混合し、37℃で30分間（0.5時間）、1時間、6時間及び22時間、インキュベートした。なお、本実験では、各サンプルの反応停止時間が同時になるようにするため、インキュベーションの開始時間を調整した。核酸分解反応の停止は、20 μLの反応溶液に30 μLの500 mM EDTA （pH 8.0）溶液と50 μLの10 M 尿素溶液を添加することにより行った。7 M尿素-15%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分解産物を分離し、SYBR Green II染色によりバンドパターンをバイオイメージャーFLA7000（富士フィルム）で解析した。【０１９１】
（結果）
結果を図15に示す。ヘアピン型DNAを含まないCont.1では、全長に相当するバンドが血清存在下30分後にはほとんど消失し、6時間後には全く確認できなくなった。一方、ヘアピン型DNAをsiRNAの3′末端に連結した未修飾のCont.2とヘアピン型DNAをsiRNAの3′末端に連結し、かつ当該3′末端のヌクレオチドを2′OMe修飾した本発明の核酸分子M1では、22時間後でも全長のバンドを確認できた。さらに、全長に相当するバンドの下に検出された部分分解された核酸断片に相当するバンド（図中、矢頭で示す）のパターンから、核酸分子M1の方がCont.2よりも部分分解された核酸断片が少ない。以上の結果から、ヘアピン型DNAを3′末端に連結したのみのCont. 2に対して、本発明の核酸分子は、血清中でより高い安定化を有していることが立証された。すなわち、これは、本発明の核酸分子が核酸分解酵素に対して高い文化痛い性能を有していることを示唆している。【０１９２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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