(57)【要約】  リボヌクレアーゼ−４を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤、及び、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法であって、（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が８．０〜１０．０の画分を溶出する工程、（ｃ）前記溶出した蛋白質画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量３０ｋＤａ以下の画分を回収する工程、を有することを特徴とする方法。
2013018169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボヌクレアーゼ−４を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される１又は２以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対するリボヌクレアーゼ−４の質量比が１／８０以上である、抗菌剤組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の抗菌剤組成物を含有する抗菌用医薬品。
【請求項４】
請求項２に記載の抗菌剤組成物を含有する飲食品。
【請求項５】
請求項２に記載の抗菌剤組成物を含有する飼料。
【請求項６】
ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤の製造におけるリボヌクレアーゼ−４の使用。
【請求項７】
ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法であって、
（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が８．０〜１０．０の画分を溶出する工程、
（ｃ）前記溶出した蛋白質画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量３０ｋＤａ以下の画分を回収する工程、
を有することを特徴とする、方法。
【請求項８】
リボヌクレアーゼ−４を製造する方法であって、
（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が８．０〜１０．０の画分を溶出する工程、
（ｃ）前記溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過処理して膜透過画分を回収する工程、
（ｄ）前記膜透過画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量３０ｋＤａ以下の画分を回収する工程、
を有することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレアーゼ−４（Ribonuclease-4）を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤、及び乳由来の原料からリボヌクレアーゼ−４を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（ＬＦ）は、生体内では、涙、唾液、末梢血、乳等に含まれている鉄結合性蛋白質であり、大腸菌（大腸菌）、カンジダ属酵母、クロストリジウム属細菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている（非特許文献１）。また、ブドウ球菌及び腸球菌に対して、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有することが知られている（非特許文献２）。【０００３】
また、ラクトフェリン分解物を含有する病原性大腸菌の消化管上皮細胞への付着阻害組成物が知られている（特許文献１）。
この他にも、ラクトフェリンのペプシン消化物から得られるラクトフェリン由来ペプチドであるラクトフェリシン（登録商標）が抗菌活性を有することが知られている（非特許文献３、４）。
さらには、上記ラクトフェリンやラクトフェリン分解物にラクトフェリン類以外の成分を組み合わせて、抗菌活性を増強する方法が検討されている。【０００４】
例えば、ラクトフェリン類の分解物、ラクトフェリン関連抗菌性ペプチド、またはこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、カゼイン分解物とを有効成分とする抗菌剤が知られている（特許文献２）。【０００５】
また、ラクトフェリン類の分解物、ラクトフェリン関連抗菌性ペプチド、及びこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、金属を結合する蛋白質とを有効成分とする抗菌剤が知られている（特許文献３）。金属を結合する蛋白質には、ラクトフェリン類、トランスフェリン、コンアルブミン、カゼインホスホペプチドが記載されている。【０００６】
また、ラクトフェリン類の分解物及び／またはこの分解物の抗菌性ペプチドと、リゾチームとを有効成分とする抗菌剤が記載されている（特許文献４）。【０００７】
また、ラクトフェリン類の酵素分解物、ラクトフェリン類の酵素分解物から得られる抗菌ペプチド、またはラクトフェリン類のアミノ酸配列の一部を含む化学合成したペプチドと脂肪酸の乳化物からなる組成物が知られている（特許文献５）。【０００８】
この他、ニューキノロン系抗菌剤及びラクトフェリン類の加水分解物又はラクトフェリン類の加水分解物由来の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤が知られている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−２９２７８９号公報
【特許文献２】特開平５−２５５１０９号公報
【特許文献３】特開平５−３２００６７号公報
【特許文献４】特開平６−１９９６９８号公報
【特許文献５】特開平９−１２４５０４号公報
【特許文献６】特開平１１−９２３７５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ウェルシュ（Welsh, J.K.）ら、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics）、第９４巻、１９７９年、第１〜９頁
【非特許文献２】ノンネッケ（Nonnecke, B.J.）ら、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Journal of Dairy Science）、第６７巻、１９８４年、第６０６〜６１３頁
【非特許文献３】ベラミー（Bellamy, W.）ら、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）、第１１２１巻、１９９２年、第１３０〜１３６頁
【非特許文献４】ベラミー（Bellamy, W.）ら、ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology）、第７３巻、１９９２年、第４７２〜４７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来、ラクトフェリンやラクトフェリン加水分解物（以下、「ラクトフェリン類」と記載することがある）には抗菌活性が知られていた。そして、ラクトフェリン類の抗菌活性をさらに向上させるために、ラクトフェリン類と各種化合物とを組み合わせる方法が検討されてきた。
しかしながら、ラクトフェリン類の抗菌効果を顕著な程度に高める組み合わせはほとんど知られていない。
特に、ラクトフェリン類に添加する量が極めて少量であっても、ラクトフェリン類の抗菌活性を高める方法が求められていた。
さらには、日常的な摂取による副作用がなく、安全性の高い抗菌剤が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ラクトフェリンの製造工程で得られる精製途中の蛋白質画分が、ラクトフェリンの抗菌活性を顕著に高めることに着目し、当該蛋白質成分について鋭意検討した。
そして、上記成分の中から、自らが抗菌活性を有しない乳由来の蛋白質であるリボヌクレアーゼ−４が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を顕著に高めることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１３】
前記課題を解決する本願第一の発明は、リボヌクレアーゼ−４を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤、である。【００１４】
本願第二の発明は、本願第一の発明の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される１又は２以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対するリボヌクレアーゼ−４の質量比が１／８０以上である、抗菌剤組成物である。【００１５】
本願第三の発明は、本願第二の発明の抗菌剤組成物を含有する抗菌用医薬品である。【００１６】
本願第四の発明は、本願第二の発明の抗菌剤組成物を含有する飲食品である。【００１７】
本願第五の発明は、本願第二の発明の抗菌剤組成物を含有する飼料である。【００１８】
本願第六の発明は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤の製造における、リボヌクレアーゼ−４の使用である。【００１９】
本願第七の発明は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法であって、
（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が８．０〜１０．０の画分を溶出する工程、
（ｃ）前記溶出した蛋白質画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量３０ｋＤａ以下の画分を回収する工程、を有することを特徴とする、方法である。【００２０】
本願第八の発明は、リボヌクレアーゼ−４を製造する方法であって、
（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が８．０〜１０．０の画分を溶出する工程、
（ｃ）前記溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過処理して膜透過画分を回収する工程、
（ｄ）前記膜透過画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量３０ｋＤａ以下の画分を回収する工程、
を有することを特徴とする方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の抗菌活性増強剤の製造方法におけるゲル濾過クロマトグラフィー溶出曲線を示す図である（一部写真）。
【図２】本発明の抗菌活性増強剤の製造方法におけるゲル濾過クロマトグラフィー溶出曲線を示すである（一部写真）。
【図３】本発明の抗菌活性増強剤のＳＤＳ電気泳動図（写真）を示す。
【図４】本発明の抗菌活性増強剤のＳＤＳ電気泳動図を示す（写真）。
【図５】本発明の抗菌活性増強剤（リボヌクレアーゼ−４）に関する質量分析法によるアミノ酸配列（配列番号４）解析結果を示す。上段、下段は、２回の解析結果を示す。下線部は、質量分析の結果に基づくデータベース検索により、ウシ・リボヌクレアーゼ−４の配列中でヒットした部分を示す。
【図６】本発明の抗菌活性増強剤のデンシトグラムを示す（一部写真）。
【図７】本発明の抗菌活性増強剤のデンシトグラムを示す（一部写真）。
【図８】ヒト・ラクトフェリシンの一次構造（アミノ酸配列：配列番号１、配列番号２）を示す。
【図９】ウシ・ラクトフェリシンの一次構造（アミノ酸配列：配列番号３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の実施可能な範囲内で自由に変更することができる。
【００２３】
［抗菌活性増強剤］
本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が本来的に有する抗菌活性を増強する効果を有するものである。
本発明の抗菌活性増強剤は、リボヌクレアーゼ−４のみからなるものであってもよいが、リボヌクレアーゼ−４を有効成分として含む限り、他の成分、例えば後述する製剤化に用いられる成分を含んでいてもよい。また、本発明の抗菌活性増強剤は、リボヌクレアーゼ−４を有効成分として含む限り、リボヌクレアーゼ−４以外の乳由来の蛋白質（但し、ラクトフェリンを除く）を含んでいてもよいが、抗菌活性増強剤中に含まれる蛋白質に対するリボヌクレアーゼ−４の純度は、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．１％以上、特に好ましくは１．０％以上である。ラクトフェリンの混在量については後述する。
また、本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と液体同士で混合してもよく、粉末同士で混合してもよい。粉末化して混合することで、錠剤、トローチ等の製剤化の際に操作が容易となる。
【００２４】
本発明の抗菌活性増強剤の有効成分であるリボヌクレアーゼ−４は抗菌活性を有していない。そして、本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と併用又は混合して、初めて抗菌活性増強剤としての効果を発揮する。
【００２５】
本発明の一形態の抗菌活性増強剤を添加したラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の効果は、後記する本試験例において示されるとおり、前記抗菌活性増強剤を添加していないラクトフェリン又はラクトフェリン分解物と比較して、大腸菌の菌数を少なくとも１／１９以下に低減することができる。換言すればＣＦＵ（colony forming unit）で表される菌数（例えば、大腸菌の量）を１／１９以下に低減することができるのである。
【００２６】
すなわち、本発明の抗菌活性増強剤における抗菌活性の増強とは、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物とを併用することにより、特定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が有する大腸菌に対する抗菌活性を１９倍以上に増強する性質を有するものである。
【００２７】
特定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物により微生物の菌数が１／ｎに低減し、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と抗菌活性増強剤を併用したときに微生物の菌数が1／ｍ（但しｍ＞ｎ）に低減すれば、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が有する抗菌活性はｍ／ｎに増強されたことになる。
抗菌活性の増強の程度の評価は、一定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物に、本発明の抗菌活性増強剤を種々の量で加えたときに、最も高い抗菌活性を示す条件で行うことが好ましい。
なお、本発明の抗菌活性増強剤は、抗菌作用増強用医薬組成物、抗菌作用増強剤、及び抗菌作用増強用添加剤として使用することも可能である。
【００２８】
本発明において、「抗菌」とは微生物の増殖を抑制すること（抗菌）、対象物から微生物を除いて減らすこと（除菌）、微生物を殺すこと（殺菌）のいずれの概念も含んでいる。
従って、本発明の抗菌活性増強剤は、除菌補助剤又は殺菌補助剤と言い換えることができる。同様に、本発明の抗菌活性増強剤は、除菌組成物又は殺菌組成物と言い換えることができる。
【００２９】
本発明において、増強される抗菌活性の対象となる微生物は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が抗菌作用を示す微生物であれば特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属、サルモネラ属、リステリア属、バシラス属、クロノバクター属、クレブシエラ属、シュードモナス属等のグラム陰性細菌、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属等のグラム陽性細菌、カンジダ属酵母等の真菌等が挙げられる。
【００３０】
［リボヌクレアーゼ−４］
本発明の有効成分であるリボヌクレアーゼ−４は、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳を乳原料として用いて陽イオン交換処理、限外膜濾過処理、及びゲル濾過担体によるゲルろ過処理によって調製することができるものである。
また、リボヌクレアーゼ−４は、乳原料中にホエイ（乳清）蛋白質が含まれるものであれば特に制限なく調製することができる。
例えば、ウシ由来のリボヌクレアーゼ−４は、１４７アミノ酸残基、分子量が１７ｋＤ、等電点が９．１８のタンパクである。リボヌクレアーゼ−４は、リボヌクレアーゼ活性や癌細胞に対する細胞毒性を示すことが知られるが、これまでその他の生理活性については知られていなかった。
さらに、リボヌクレアーゼ−４は、乳や乳製品を原料として得られるリボヌクレアーゼ−４に限られず、乳に含まれるリボヌクレアーゼ−４と同等の構造を有する限り、乳以外の動物の体液や組織から得られる蛋白質、又は、化学合成品もしくは組換え蛋白質であってもよい。また、リボヌクレアーゼ−４又はそのフラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。保存的バリアントとしては、配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等を含む配列を有する蛋白質、又は、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であって、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する蛋白質が挙げられる。
【００３１】
［ラクトフェリン］
本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリンは、市販品の他、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳、ホエイ等からイオン交換クロマトグラフィー等の常法により分離したラクトフェリン、ラクトフェリンから常法により鉄を除去したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンに鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属を一部又は完全にキレートさせた金属不飽和ラクトフェリン、または金属飽和ラクトフェリンのいずれであっても使用することができる。
また、組換えＤＮＡ技術により得られる組換え真菌、組換え乳牛（トランスジェニック・カウ）等により生産されるヒト・ラクトフェリン等も、同様に本発明に使用することができる。
【００３２】
［ラクトフェリン加水分解物］
本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリン加水分解物は、市販品の他、本発明のラクトフェリンを酸又は酵素で加水分解して得られる加水分解物を使用することができ、例えば特願平３−１７１７３６号の発明に記載された方法によって得ることができる。
【００３３】
なお、本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリン加水分解物とは、当該ラクトフェリン加水分解物から単離又は精製されたラクトフェリン由来ペプチドも含まれるものである。
ラクトフェリン由来ペプチドとしては、例えば、ラクトフェリシン（登録商標）を例示することが可能であって、ヒト・ラクトフェリシン（ラクトフェリシンＨ）、ウシ・ラクトフェリシン（ラクトフェリシンＢ）のそれぞれが挙げられる。
図８は、ヒト・ラクトフェリシン（ラクトフェリシンＨ）の一次構造（アミノ酸配列：配列番号１、２）、図９はウシ・ラクトフェリシン（ラクトフェリシンＢ）の一次構造（アミノ酸配列：配列番号３）をそれぞれ示す。
【００３４】
酸によりラクトフェリンの加水分解を行う場合は、ラクトフェリンを水溶液とし、これに無機酸又は有機酸を添加し、所定温度に所定時間加熱して加水分解する。酵素により加水分解を行う場合は、ラクトフェリンを水溶液とし、使用する酵素の至適ｐＨに調製し、これにペプシン、トリプシン等の酵素を加え、所定温度に所定時間保持して加水分解する。加水分解後は酵素を常法により失活させる。酸又は酵素による加水分解で得られた分解物は、抗菌性を有するペプチドを含有する、種々の分子量を有する分解物の混合物である。上記加水分解による分解度は、６〜２０％の範囲が望ましい。なお、上記分解度は、ケルダール法により試料の全窒素を、またホルモール滴定法により試料のホルモール態窒素を測定し、これらの値から次式により算出する。
【００３５】
分解度＝（ホルモール態窒素／全窒素数）×１００
【００３６】
上記、酸又は酵素によって加水分解して得られた反応液（ラクトフェリン分解物の溶液）は、常法により冷却し、必要に応じて常法により中和、脱塩、脱色し、更に必要に応じて分画し、得られた溶液をそのまま、又は濃縮した濃縮液で、あるいは濃縮後乾燥した粉末として使用する。また、前記のとおり、加水分解物からラクトフェリシンのような抗菌性ペプチドを単離してもよい。
【００３７】
［本発明の有効成分］
本発明における抗菌活性増強剤の有効成分は、リボヌクレアーゼ−４からなっており、当該成分が、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の抗菌活性を増強する作用効果を有している。
【００３８】
本発明者らは、リボヌクレアーゼ−４を見いだすにあたって、抗菌活性を増強する成分である蛋白質が、少なくとも１）当該蛋白質が単独では抗菌活性を示さないこと、２）当該蛋白質の分子量が１０〜３０ｋＤａであること、３）当該蛋白質の等電点が８．０〜１０．０であること、を満たす成分であることを突き止めている。そして、その有効成分がリボヌクレアーゼ−４であることを見出した。
【００３９】
リボヌクレアーゼ−４のアミノ酸配列から予想される等電点は９．１８である。
リボヌクレアーゼ−４は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する限り、断片であってもよい。
【００４０】
ここで、本発明の有効成分となり得る前記の蛋白質（リボヌクレアーゼ−４）は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を全く含まないことが好ましいが、有効成分のリボヌクレアーゼ−４中に混在するラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の割合が、質量比で４．０％以下であれば、蛋白質全体として抗菌活性は示さないものであることを確認している。
【００４１】
尚、本発明者らは、乳由来の蛋白質としてアンジオジェニン（アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）、及びアンジオジェニン−２（Angiogenin-2）が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有することを見出している。本発明の抗菌活性増強剤の有効成分は、リボヌクレアーゼ−４に加えて、アンジオジェニンを含んでいてもよい。
【００４２】
［抗菌活性増強剤の使用量］
本発明の抗菌活性増強剤は、、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物に対して使用する場合、抗菌活性増強剤中のリボヌクレアーゼ−４：ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物（質量比）は、好ましくは１：８０〜１：１、より好ましくは１：８０〜１：１０、より好ましくは１：６０〜１：１０、さらに好ましくは１：４０〜１：１０である。
【００４３】
また、本発明の抗菌活性増強剤を、ラクトフェリン分解物の中でも特にラクトフェリン由来のペプチドであるラクトフェリシン（登録商標）に併用又は混合して使用するときは、抗菌活性増強剤中のリボヌクレアーゼ−４：ラクトフェリシン＝１：１〜４：１の割合で使用することが好ましく、抗菌活性増強剤リボヌクレアーゼ−４：ラクトフェリシン＝１．５：１〜２．５：１の割合で使用することがより好ましい。
【００４４】
［抗菌剤組成物］
本発明の抗菌剤組成物は、本発明の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される１又は２以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中のリボヌクレアーゼ−４の質量比が１／８０以上であることを特徴としている。ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対するリボヌクレアーゼ−４の質量比は、１／８０以上であれば特に制限されないが、好ましくは１／６０以上、より好ましくは１／４０以上である。ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比の上限は特に制限されないが、例えば、１／１以下、又は１／１０以下でも高い抗菌活性が期待できる。
尚、通常のホエイ中に含まれるリボヌクレアーゼ−４とラクトフェリンの質量比は、およそ１：２００である。
本発明の抗菌剤組成物は、医薬品、飲食品、飼料、化粧品、医薬部外品等に配合することができる。
【００４５】
［医薬品］
本発明の医薬品は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の医薬品の形態としては特に制限されず、公知の方法により種々の態様に製剤化して投与することができ、好適な実施の態様において経口投与することができる。製剤化する際には、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を混合した状態で使用される。
【００４６】
例えば、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造できる。
製剤化する場合、製剤中のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の含有量は特に限定されるものではない。基本的に本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物による副作用はほとんどないと考えられるが、医薬品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。そして、医薬品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン（登録商標）からなる組成物の含有量としては、通常０．０１〜６質量％、好ましくは１〜５質量％である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
【００４７】
製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。具体的製剤として、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む。）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コーティングしたものを含む。）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。
【００４８】
これらの製剤に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を例示することができる。
【００４９】
また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を、それぞれ例示することができる。
【００５０】
更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を、それぞれ例示することができる。
【００５１】
錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
【００５２】
また、併用する医薬組成物は、本発明の薬剤中に有効成分として含有させてもよいし、本発明の薬剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。
なお、抗菌用の医薬組成物としては、歯みがきや口腔内洗浄液等の医薬品又は医薬部外品等を例示することができる。
【００５３】
［飲食品］
本発明の飲食品は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の飲食品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。そして、飲食品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン（登録商標）からなる組成物の含有量としては、通常０．０１〜６質量％、好ましくは１〜５質量％である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
【００５４】
本発明の飲食品の形態としては特に制限されず、例えば、ラクトフェリンやラクトフェリン加水分解物の粉末やこれらの水溶液（シロップ等）等を本発明の抗菌活性増強剤とともに配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられ、さらに、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、餃子の皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、パン等を挙げることができる。
【００５５】
このような飲食品は、例えば、ラクトフェリン（ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等の形態を含む）に、本発明の抗菌活性増強剤、及び、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより、製造することができる。
また、飲食品の好適な形状としては、液状、タブレット状のサプリメント等を例示することができる。
【００５６】
［飼料］
本発明の飼料は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の飼料中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。そして、飼料中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン（登録商標）からなる組成物の含有量としては、通常０．０１〜６質量％、好ましくは１〜５質量％である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
【００５７】
本発明の飼料の形態としては特に制限されず、例えば、ラクトフェリンやラクトフェリン加水分解物の粉末やこれらの水溶液（シロップ等）等を本発明の抗菌活性増強剤とともに配合することができ、例えば、本発明の抗菌活性増強剤及びラクトフェリンに、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００５８】
［リボヌクレアーゼ−４の製造方法］
本発明の抗菌活性増強剤の有効成分であるリボヌクレアーゼ−４は、例えば乳由来の原料を出発原料として以下の工程を有する方法により製造することができる。
すなわち、（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が８．０〜１０．０の画分を溶出する工程、（ｃ）前記の溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過処理して膜透過画分を回収する工程、（ｄ）前記膜透過画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量３０ｋＤａ以下の画分を回収する工程、を有する方法である。
【００５９】
また、本発明の製造方法は、前記（ｄ）工程に続いて、（ｅ）前記分子量３０ｋＤａ以下の画分を、分画分子量１０ｋＤａの限外濾過膜に通液して１０ｋＤａ以上の濃縮液を回収する工程、を含めることもできる。
【００６０】
なお、本発明の抗菌活性増強剤が、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、又はラクトフェリン由来ペプチドの抗菌活性を増強するために用いられる場合は、前記製造工程における（ｃ）の工程を実施せずに、（ｂ）の工程の直後に（ｄ）の工程を実施する方法によって製造されたリボヌクレアーゼ−４の画分を本発明の抗菌活性増強剤として用いることが可能である。
その場合、有効成分であるリボヌクレアーゼ−４の蛋白質純度は９６質量％以上であれば良く、それ以外の成分としてラクトフェリンが４．０質量％以下であれば、製造した抗菌活性増強剤それ自体は実質的に抗菌活性は示さないものである。
【００６１】
この理由としては、前記（ｂ）の工程後の回収画分には、リボヌクレアーゼ−４とともに乳由来のラクトフェリンが混在しているが、（ｃ）の工程を実施せずに、（ｂ）の工程の直後に（ｄ）の工程を実施する方法によって製造されたリボヌクレアーゼ−４の画分には、後記する試験例１で明らかなとおり、わずかにラクトフェリンが全蛋白質の４質量％以下の量で混在していることが確認された。そして、このような微量のラクトフェリンが混在している場合であっても、製造されたリボヌクレアーゼ−４の画分は、その画分単独では大腸菌等の細菌に対して、抗菌活性を示さないことを確認している。
すなわち、本発明の抗菌活性増強剤をラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、又はラクトフェリン由来ペプチドの抗菌活性を増強するために用いられる場合は、（ｃ）の工程を実施せずに、（ｂ）の工程の直後に（ｄ）の工程を実施する方法によって製造されたリボヌクレアーゼ−４の画分を本発明の抗菌活性増強剤として用いたとしても、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、又はラクトフェリン由来ペプチドの抗菌活性の抗菌活性増強に影響のない範囲であるものである。
【００６２】
これに対して、（ｂ）の工程の直後に（ｃ）の工程を実施し、（ｄ）工程を経て製造されたリボヌクレアーゼ−４の画分は、蛋白質純度が約１００％であることが判明した。
【００６３】
このように、本発明の抗菌活性増強剤の製造方法を検討する中で明らかになったものとして、乳由来の原料から、リボヌクレアーゼ−４を製造するには、前記（ａ）〜（ｄ）の工程を有する方法によって、高純度で製造することが可能である。そして、前記方法を実施することにより、従来のリボヌクレアーゼ−４の製造方法に比して、顕著に純度が高いリボヌクレアーゼ−４を提供することが可能である。
これにより、本発明の抗菌活性増強剤以外の用途にリボヌクレアーゼ−４を使用する場合であっても、本発明の製造方法を用いることによって、様々な用途のために高純度のリボヌクレアーゼ−４を提供することが可能であるという効果も兼ね備えているのである。
【００６４】
本発明の抗菌活性増強剤の有効成分であるリボヌクレアーゼ−４の製造方法は、一般的な乳由来の原料からラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼを製造する方法と一部共通するが、（ｃ）又は（ｄ）の工程を有する点で相違するものである。すなわち、３０ｋＤａ以下の低分子蛋白質のみを回収するために、分子量約８万ダルトンのラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼは殆ど含まれないものである。
【００６５】
さらに、本発明の抗菌活性増強剤の製造方法について、以下に詳細に説明する。
【００６６】
まず、乳原料を陽イオン交換体に接触させて吸着処理を行う。
乳原料としては、前記抗菌活性増強作用を有する蛋白質を含む限り特に制限されず、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の生乳の他、脱脂乳等の加工乳、ホエイ等の分画物、組換え乳牛（トランスジェニック・カウ）等により生産される乳等が挙げられる。乳は、初乳、移行乳、常乳、末期乳等のいずれであってもよい。
【００６７】
陽イオン交換体としては、イオン交換基として弱酸性基又は強酸性基を有するものが用いられる。弱酸性のイオン交換基又は強酸性基としては、イオン交換基としての目的とする働きを有する交換基を任意で選択することができる。弱酸性のイオン交換基の例としては、カルボキシル基、カルボキシメチル基等が挙げられる。強酸性のイオン交換基の例としては、スルホプロピル基が挙げられる。
【００６８】
陽イオン交換体は特に限定されず、必要に応じて任意で選択可能である。好ましい陽イオン交換体の例としては、架橋型の多糖類（アガロース、デキストラン、セルロース等）、親水性シリカゲル、合成ポリマー等からなる多孔性粒子に弱酸性又は強酸性のイオン交換基を導入したもの等が挙げられる。弱酸性のイオン交換体の具体例としては、セパビーズＦＰ−ＣＭ１３（三菱化学社製、交換基：カルボキシメチル基）や、ＣＭ−セファデックスＣ−５０（ＧＥヘルスケア社製、交換基：カルボキシメチル基）、ＣＭ−セファロース−ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製、交換基：カルボキシメチル基）が挙げられる。また、強酸性のイオン交換体の具体例としては、ＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、ＳＰ−セファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア社製）が挙げられる。
【００６９】
陽イオン交換体の樹脂の形、サイズ、表面状態、材質等は任意であり必要に応じて選択可能である。使用形態の例としては、イオン交換体樹脂が既に充填されたプレパックカラムや、陽イオン交換体の樹脂ビーズをカラム等の媒体に充填したもの等が挙げられる。これらの場合、一種類の陽イオン交換体を１つの媒体と組み合わせて用いる事が簡便性の面から好ましい。しかしながら、必要に応じて複数の媒体のそれぞれに樹脂ビーズを詰めたものを直列または並列に接続してクロマトグラフィーを行ってもよい。媒体の形状は必要に応じて選択できるが、洗浄が容易で、かつ含まれる樹脂ビーズ等に多くの接触面を与える形状であることが好ましく、また内壁は凹凸の無い平らな表面であることが好ましい。
【００７０】
具体的には円筒形（円柱状、棒状）や円錐状等、円形面を有する形状が媒体の形状として好ましく使用できる。媒体の材質は任意で選択できるが、好ましくはステンレス、ガラス、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アクリル樹脂等が使用できる。媒体のサイズは、適宜処理スケールによって選択してよく、例えば数立方センチメートルから数立方メートルの規模まで任意に選択できる。
本発明に好ましく使用することができる市販のプレパックカラムとしては、Ｈｉｐｒｅｐ  ＣＭＦＦ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製、交換基：カルボキシメチル基）、Ｈｉｐｒｅｐ  ＳＰＦＦ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製、交換基：スルホプロピル基）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０シリーズ（東ソー社製、交換基：カルボキシメチル基）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０シリーズ（東ソー社製、交換基：スルホプロピル基）等が挙げられる。
【００７１】
乳原料と陽イオン交換体との吸着処理（接触）は任意で選択可能である。吸着処理は例えば、バッチ式攪拌法、カラム連続法等の方法で行うことができる。乳原料と陽イオン交換体を十分に接触させることができれば、いずれの処理も実施可能である。１つの処理で行っても、複数の吸着処理を組み合わせて行っても良い。
【００７２】
バッチ式の場合、一定量の乳原料から多くの収量を望む場合には多くの陽イオン交換体を用い、一定量の陽イオン交換体で多くの収量を望む場合には多くの乳原料を用いることが適当である。バッチ式における乳原料と陽イオン交換体の混合体積比率は、陽イオン交換体の吸着能や具体的な吸着処理方法に応じて任意に調整することができる。
【００７３】
ここで、陽イオン交換体の特性は、硬質タイプと軟質タイプの２つに大きく区分されるが、本発明ではいずれのタイプも使用可能である。
硬質タイプは、イオン強度またはｐＨによってイオン交換体自身の体積はほとんど変化せず、また流速の変化等により陽イオン交換体にかかる圧力が変化しても陽イオン交換体自体の体積はほとんど変わらない。したがって、硬質タイプは、陽イオン交換体をカラム内に保持して高流速で通液するカラム連続法により適している。
【００７４】
一方、軟質タイプの陽イオン交換体はイオン強度またはｐＨによってイオン交換体自身の体積が大きく変化し、また流速の変化等により陽イオン交換体にかかる圧力が変化すると陽イオン交換体自体の体積が容易に変化する。そのため、軟質タイプの陽イオン交換体をカラム内に保持して高流速で通液することは困難である。特に脱脂乳やホエイ等を通液する時は他の塩類溶液等を通液する時に比べて陽イオン交換体層内で大きな圧力損失が生じる。したがって、軟質タイプの陽イオン交換体は、もっぱらバッチ法に適している。
なお、前記のセパビーズＦＰ−ＣＭ１３（三菱化学社製）、ＣＭ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、ＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、ＳＰ−セファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア社製）は硬質タイプであり、ＣＭ−セファデックスＣ−５０（アマシャム社製）は軟質タイプである。
【００７５】
乳原料と陽イオン交換体を吸着処理させる温度は、０℃未満では乳原料の凍結や、粘度上昇等が生じる恐れがあり、６０℃を超える場合は、乳中の蛋白質、例えば乳中の塩基性蛋白質が変性する可能性があるため、０〜６０℃の範囲で行われる事が好ましい。なお、２５〜６０℃であっても、吸着に長時間を要する場合等では、乳中の蛋白質、例えば乳中の塩基性蛋白質が少しずつ変性していく可能性があることから、特に０〜２５℃で行われることが好ましい。また、未殺菌の乳原料を使用する場合は、細菌の繁殖を防ぐため、０〜１０℃で実施することが望ましい。
【００７６】
乳原料と陽イオン交換体の吸着処理時間（接触時間）については、吸着処理時の温度、採用する吸着処理方式（バッチ式またはカラム連続法）等を勘案して適宜条件を選択することができる。例えば、バッチ式の場合は、乳原料と陽イオン交換体の吸着処理時間は１分以上２４時間以下が好ましく、１０分以上６時間以下がより好ましい。また、カラム連続法の場合は、線流速１０ｃｍ／ｈ以上１０００ｃｍ／ｈ以下であることが好ましい。
【００７７】
次に、吸着処理後の陽イオン交換体を洗浄処理する。このときの洗浄液としては、イオン強度が０．０７未満と低い塩類水溶液、又は中性若しくは弱酸性領域の緩衝液を用いることも可能であるが、製造コストの面から考慮すると水で洗浄することが好ましい。
【００７８】
吸着処理後の陽イオン交換体については、使用された乳原料をどのような方法で洗浄除去してもよい。たとえば乳原料と陽イオン交換体が入った容器から陽イオン交換体のみを移動して他の場所で洗浄しても良いし、前記容器から乳原料を移動させてその後陽イオン交換体を容器中で洗浄しても良い。
【００７９】
次いで、洗浄処理を終えた陽イオン交換体に溶出溶媒を接触させてリボヌクレアーゼ−４を含む画分を溶出する。
【００８０】
なお、この工程で使用する溶出溶媒は、イオン強度は特に制限されないが、例えば、０．０７以上１．７以下の範囲のものを使用することが好ましい。これにより、等電点が８．０〜１０．０の溶出画分を得ることが可能である。
該溶出溶媒としては、イオン強度を上記の範囲に調整した中性又は弱酸性領域の緩衝液を用いることもできる。しかしながら、製造コストの面から考慮すると塩類のみを溶解した水溶液（塩類溶液）を用いることがより好ましい。本願で使用できる塩類は必要に応じて一種あるいは二種以上の組合せを任意で選択可能である。
好ましい塩類溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウム等からなる群から選ばれる１種又は２種以上の混合物からなる塩類の水溶液であり、具体的には１〜５％の塩化ナトリウム溶液、好ましくは１．５〜３．５％の塩化ナトリウム溶液等が例示される。
【００８１】
次に、得られた溶出液に対して、分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜を用いた膜分離法によって膜処理を行い、その膜透過画分を回収する。
【００８２】
限外濾過膜の運転方法は、水及び分画分子量以下の分子量を有する成分を透過させて除去する通常の限外濾過法と、膜を透過した透過液と等量の水を、膜上の保持液に添加しながら連続運転する流水濾過法（ダイアフィルトレーション）の２つに区分されるが、本発明においてはいずれの方法も使用できる。特に、後者の流水濾過法は、濃縮と同時に脱塩処理を行うことができるとともに、保持液からの低分子量成分を高度に除去できる点でより好ましい。
なお、前者の通常の限外濾過法を用いた場合には、限外濾過の後に、透析やゲル濾過等の方法で脱塩処理を行うことが好ましい。
【００８３】
限外濾過膜は、一般に市販されている限外濾過膜であれば何れも使用できる。具体例としては、ＩＲＩＳ３０３８膜及びＩＲＩＳ３０７２膜（いずれもローヌ・プーラン社製）、あるいはＧＲ−６１ｐｐ膜（ＤＤＳ社製）等が挙げられ、いずれも分画分子量３０ｋＤａ（分子量３０ｋＤａをカットオフ）の性質を有するものである。
限外濾過膜の材質は有機材料製又は無機材料製の何れであっても使用可能であり、コスト面、汎用性等を考慮して選択すればよい。
限外濾過処理時の溶出液の温度は、使用する膜の耐熱温度以下であれば（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら８０℃以下）実施可能であるが、蛋白質の変性を防ぐ観点からは、０〜６０℃、例えば２５〜６０℃、又は０〜２５℃が挙げられる。
【００８４】
限外濾過時の圧力は、使用する膜の耐圧限界以下であれば（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０．６ＭＰａ以下）いずれの圧力でも可能である。尚、耐圧限界値付近での使用は膜の寿命を縮める可能性があるため、耐圧限界の２／３以下（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０４ＭＰａ以下）で行うことが好ましい。
使用する限外濾過膜モジュールは、管型、中空糸型、平膜型、スパイラル型等いずれの形式でも可能である。ただし、中空糸型内圧式等のモジュールでは、中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、圧力等を考慮して行うことが好ましい。
【００８５】
次に、前記の限外濾過膜分離法によって膜処理された膜透過画分について、ゲル濾過法による分離処理を行う。
【００８６】
本発明においてゲル濾過処理に用いられるゲル濾過担体としては、一般に市販されている分画分子量の範囲が１００ｋＤａ以下、好ましくは５０ｋＤａ以下の性能を有するゲル濾過樹脂であれば何れも使用できる。具体例としては、例えば、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ（いずれも東ソー社製）等が挙げられる。また、このようなゲル濾過担体を用いてゲル濾過を実施する場合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等のシステムを用いて実施することが好ましい。
【００８７】
なお、ゲル濾過処理に用いられる移動相としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液、又はこれらの緩衝液に０．５Ｍ程度の塩類を溶解してイオン強度を高めた緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液のｐＨは、ゲル濾過担体として用いられる樹脂特性に適したｐＨであることが好ましい。
【実施例】
【００８８】
次に実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
まず、実施例及び試験例で使用した手法及び試験法について記載する。
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳゲル電気泳動法）］
本発明の抗菌活性増強剤の成分組成を特定するために、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen社製）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。さらに、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen社製）を用いて染色した。【００８９】
［質量分析］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた染色後のゲルは、デンシトグラフ（ＡＴＴＯ社製）で撮影し、解析ソフトによるバンドの確認を行った。得られたスポットをゲルから切り出し、目的の蛋白画分を脱色し、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（商品名：ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ、ＢＲＵＫＥＲ社製）にて質量分析した。
測定結果は、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）検索により、蛋白質を同定した。【００９０】
［抗菌活性増強試験］
抗菌活性増強試験は、本発明の抗菌活性増強剤をラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等に混合した試料について、抗菌活性を測定するものである。対照として、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等のみの試料についても抗菌活性を測定した。
具体的な試験の手順は、例えば下記のとおりである。【００９１】
（１）試料の調製
少なくとも下記の試料を調製した。ラクトフェリンの試験では、試料２について抗菌活性増強剤の濃度が異なる２種類を調製する。
検討試料１：ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等
検討試料２：ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等、及び抗菌活性増強剤の混合物
検討試料３：抗菌活性増強剤
また、１％のＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ培地を用い、５ｍＬのポリスチレンチューブに大腸菌Ｋ−１２株を植菌し、３７℃のインキュベーター内で６時間前培養し、これを試験用菌液とする。【００９２】
（２）試験方法
９６穴プレート上にて上記の試料と共に前培養した大腸菌を１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃にて設定時間培養する。設定時間培養後に大腸菌を含む培養液を０．８５％生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地上にプレーティングした後、３７℃、設定時間培養後に生じたコロニー数（ＣＦＵ：Colony Forming Units）を測定する。
なお、上記検討試料の他、前記培地溶液のみで大腸菌を培養したものをコントロールとする。【００９３】
（３）結果
各検討試料のＣＦＵの値から抗菌活性を評価する。抗菌活性の増強の程度については、試験後に残存した大腸菌数（ＣＦＵ）同士を比較して算出する。例えば、試験後の試料１のＣＦＵが１００で、試料２のＣＦＵが１０のとき、試料２の抗菌活性は、試料１の１０倍であるとすることができる。【００９４】
＜実施例１＞
本発明の抗菌活性増強剤を製造した。
陽イオン交換樹脂としてＣＭ−セファデックス（CM-Sephadex）Ｃ−５０（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。当該陽イオン交換樹脂１７０ｍＬを充填したカラムに、未殺菌の脱脂乳２０リットルを通液して陽イオン交換樹脂に乳蛋白質を吸着させた。
次いで、カラム内の陽イオン交換樹脂を脱イオン水で十分に洗浄し、０．２７Ｍ塩化ナトリウム（国産化学株式会社製）を通液して、樹脂に吸着した蛋白質を溶出させた。続いて、溶出溶媒として１．７Ｍ塩化ナトリウムを通液し、樹脂に吸着した蛋白質画分を溶出させ、蛋白質画分の溶出した溶出液を回収した。【００９５】
この溶出液を、分画分子量３０ｋＤａの遠心式限外濾過膜（商品名：Amicon Ultra、Millipore社製）を用いた遠心分離（４，０００×ｇ、１５分間）を行い、膜透過画分を回収した。【００９６】
さらに、膜透過画分をクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、ゲル濾過担体 ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにて分離し、図１に示される分子量約１４ｋＤのピークαを分取した。図１はゲル濾過ＨＰＬＣの溶出曲線を示している。【００９７】
次いで、分画分子量１０ｋＤａの遠心式限外濾過膜（商品名：Amicon Ultra、Millipore社製）にて脱塩濃縮し、濃縮液側の画分を回収することにより、本発明の抗菌活性増強剤を製造した。【００９８】
製造した抗菌活性増強剤の限外濾過膜よる分子量分布は、１０〜３０ｋＤａであり、等電点は８．０〜１０．０であり、アミノ酸配列の解析結果から、当該抗菌活性増強剤の主成分は、リボヌクレアーゼ−４であることが判明した。【００９９】
＜実施例２＞
本発明の抗菌活性増強剤を製造した。
陽イオン交換樹脂としてＣＭ−セファデックス（CM-Sephadex）Ｃ−５０（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。当該陽イオン交換樹脂１７０ｍＬを充填したカラムに、未殺菌の脱脂乳２０リットルを通液して陽イオン交換樹脂に乳蛋白質を吸着させた。
次いで、カラム内の陽イオン交換樹脂を脱イオン水で十分に洗浄し、０．２７Ｍ塩化ナトリウム（国産化学株式会社製）を通液して、樹脂に吸着した蛋白質を溶出させた。続いて、溶出溶媒として１．７Ｍ塩化ナトリウムを通液し、樹脂に吸着した蛋白質画分を溶出させ、蛋白質画分の溶出した溶出液を回収した。【０１００】
この溶出液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）に希釈し、ゲル濾過担体 ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにて分離し、図２に示される分子量約１４ｋＤのピークαを分取した。図２はゲル濾過ＨＰＬＣの溶出曲線を示している。【０１０１】
さらに、分画分子量１０ｋＤａの遠心式限外濾過膜（商品名：Amicon Ultra、Millipore社製）にて脱塩濃縮し、濃縮液側の画分を回収することにより、本発明の抗菌活性増強剤を製造した。【０１０２】
製造した抗菌活性増強剤の分子量分布は、１０〜３０ｋＤａであり、等電点は８．０〜１０．０であり、アミノ酸配列の解析結果から、当該抗菌活性増強剤の主成分は、リボヌクレアーゼ−４であることが判明した。【０１０３】
＜実施例３＞
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）９５ｇに対して、実施例１と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を５ｇ添加して均一混合し、ラクトフェリンの抗菌活性を増強した抗菌用医薬品を製造した。【０１０４】
＜実施例４＞
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）９５ｇに対して、実施例２と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を５ｇ添加して均一混合し、混合物の添加量が１０質量％となるように発酵乳に添加して発酵乳食品を製造した。【０１０５】
次に試験例を示して本発明の抗菌活性増強剤の物理的性質および抗菌活性増強作用を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験例１では、実施例１及び実施例２にて製造した抗菌活性増強剤の成分について、物理的性質の検討を行った。【０１０６】
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例１及び実施例２で製造した抗菌活性増強剤の成分組成を特定するために、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen社製）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
さらに、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen社製）で染色した。【０１０７】
実施例１で製造した抗菌活性増強剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。また、実施例２で製造した抗菌活性増強剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。図３、図４ともに、左図は、陽イオン交換樹脂からの溶出液の電気泳動図（ただし、Ｍは分子量マーカーを示す）を表し、右図はゲル濾過処理後の抗菌活性増強剤の電気泳動図を表す。【０１０８】
その結果、いずれのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果においても、本発明の抗菌活性増強剤に１４ｋＤａのバンドαが確認された。特に、実施例１で製造した抗菌活性増強剤には、バンドα以外の成分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認することはできなかった。なお、実施例２で製造した抗菌活性増強剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図４）では、８０ｋＤａ付近にわずかに染色されたバンドβが検出された。【０１０９】
２）質量分析法による解析
実施例１、実施例２の各抗菌活性増強剤について、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３、図４に相当）により分画・検出された染色後の各ゲルの中から１４ｋＤａ付近のバンドαをゲルから切り出し、ゲル中の蛋白質部分を脱色し、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（商品名：ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ、ＢＲＵＫＥＲ社製）にてペプチドの質量分析を行った。
質量分析の結果は、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）検索により蛋白質を同定した。【０１１０】
実施例１及び実施例２により製造された抗菌活性増強剤について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された１４ｋＤａのバンドαは、データベース検索により、図５において表されるとおり、いずれもウシのリボヌクレアーゼー４（Ribonuclease-4、RNase-4）由来の蛋白質であることが明らかになった。【０１１１】
３）抗菌活性増強剤に含まれる有効成分の含有量
実施例１、実施例２の各抗菌活性増強剤について、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画・検出された染色後の各ゲル（図３、図４におけるそれぞれ右図）を、デンシトグラフ（ＡＴＴＯ社製）で撮影し、解析ソフトによるバンドの確認を行った。図６は、実施例１の抗菌活性増強剤におけるデンシトグラムである。また、図７は、実施例２の抗菌活性増強剤におけるデンシトグラムである。【０１１２】
その結果、図６のデンシトグラムを表１に表されるとおり数値化した結果、実施例１に記載された方法に基づいて乳由来の原料から本発明の抗菌活性増強剤を製造した場合、有効成分であるリボヌクレアーゼ−４は、抗菌活性増強剤にほぼ１００質量％の割合で含有していることが判明した。デンシトグラム上でも、リボヌクレアーゼ−４に相当するピークα以外に、その他のピークは検出されなかった。
換言すれば、実施例１に記載された方法により、乳由来の原料からリボヌクレアーゼ−４を製造することにより、高純度でリボヌクレアーゼ−４を回収できることを意味するものである。【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
また、図７のデンシトグラムを表２に表されるとおり数値化した結果、実施例２に記載された方法に基づいて乳由来の原料から本発明の抗菌活性増強剤を製造した場合、ピークαとして検出された有効成分であるリボヌクレアーゼ−４は、抗菌活性増強剤に９６．８質量％の割合で含有していることが判明した。
なお、図４において、８０ｋＤａ付近にわずかに染色されたバンドβについて、デンシトグラムからピークβとして検出され、ピークβは抗菌活性増強剤に３．２質量％の割合で含有していることが確認された。【０１１５】
また、ピークβについて蛋白質の同定を行ったところ、ラクトフェリン由来の蛋白質であることが確認された。なお、実施例２に記載の方法により製造された抗菌活性増強剤（ピークα：９６．８質量、及びピークβ：３．２質量％）は、それ自体では抗菌活性を示さなかった。【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
［試験例２］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリンの抗菌活性を増強する作用を有することを確認するために行った。【０１１８】
（１）試料の調製
ラクトフェリンとしてウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）を脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例１に記載された方法により製造された抗菌活性増強剤（リボヌクレアーゼ−４を１００質量％含有）を脱イオン水で希釈して使用した。
前記のウシ・ラクトフェリンと抗菌活性増強剤を用いて、以下の試料１〜５を調製した。
・試料１：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）
・試料２：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）の混合物
・試料３：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（６４μｇ／ｍＬ）の混合物
・試料４：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（１００μｇ／ｍＬ）の混合物
・試料５：抗菌活性増強剤（１００μｇ／ｍＬ）
さらに、１％のＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ培地（Becton Dickinson社製）を用い、５ｍＬのポリスチレンチューブに大腸菌Ｋ−１２株（NBRC 3301）を１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう植菌し、３７℃のインキュベーター内で６時間前培養して、試験用菌液とした。【０１１９】
（２）試験方法
９６穴プレート上にて前記の試料とともに試験用菌液を１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃にて１７時間培養した。
１７時間培養した後に、大腸菌を含む培養液を０．８５％生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地（ラピッドメディアRM-SPC、森永乳業社製）上にプレーティングした後、３７℃で１６時間培養して、培地上に生じたコロニー数（ＣＦＵ：Colony Forming Units）を測定することにより、各試料の抗菌活性を評価した。
なお、試料１〜５の他に、前記培地溶液のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【０１２０】
（３）試験結果
本試験の結果を表３に示す。表３において、有意差検定はｐ＜０．００１である。
その結果、培地のみで培養したコントロールでは、１７時間後に菌数が１．７×１０8ＣＦＵ／ｍＬに増加したのに対し、ラクトフェリンを含む試料１では、菌数が初菌数よりも低減して、３．６×１０5ＣＦＵ／ｍＬの範囲となった。【０１２１】
これに対して、ラクトフェリンに抗菌活性増強剤を添加した試料３では、１．８×１０4ＣＦＵ／ｍＬとなり、ラクトフェリンと比較して菌数が大きく減少した。
さらに、抗菌活性増強剤の量を１／２に減量した試料２でも、３．６×１０4ＣＦＵ／ｍＬとなり、試料３と同様に菌数が減少した。【０１２２】
また、抗菌活性増強剤を試料２のおよそ３倍量添加した試料４では、抗菌活性の有意な増強効果は認められなかった。
試料１と試料２の菌数の比較によれば、試料２の抗菌活性は試料１の抗菌活性の約１９倍以上であった。また、試料１と試料３の菌数の比較によれば、試料３の抗菌活性は試料１の抗菌活性の約１０倍以上であった。【０１２３】
一方、抗菌活性増強剤を単独で使用した試料５では、菌数が１．９×１０8ＣＦＵ／ｍＬとなり、単独では抗菌活性を有していないことが明らかになった。
本試験結果から、本発明の抗菌活性増強剤にはラクトフェリンの抗菌活性を増強する作用を有することが判明した。
これによりラクトフェリン等の抗菌物質と本発明を組み合わせた組成物を製造することにより、従来の抗菌物質の効果を顕著に高めた優れた抗菌用組成物を提供できることが明らかになった。【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
［試験例３］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリン加水分解物であるラクトフェリシン（商標登録）の抗菌活性を増強することを確認することを目的とした。
（１）試料の調製
試験例２で使用したウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）をペプシンで加水分解し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、凍結乾燥して得られたウシ・ラクトフェリシン粉末を用いた。
ウシ・ラクトフェリシン粉末は、脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例１で得られた抗菌活性増強剤を脱イオン水で希釈して使用した。【０１２６】
上記のウシ・ラクトフェリシンと抗菌活性増強剤を用いて下記の試料６〜８を調製した。
試料６：ウシ・ラクトフェリシン（１６μｇ／ｍＬ）
試料７：ウシ・ラクトフェリシン（１６μｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）の混合物。
試料８：抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）【０１２７】
（２）試験方法
試験例２と同様の試験方法にて試験した。試料６〜８の他に、培地のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【０１２８】
（３）結果
試験例３の結果を表４に示す。表４で、培地のみで培養したコントロールでは１７時間後に菌数が１．０×１０8ＣＦＵ／ｍＬに増加した。【０１２９】
ウシ・ラクトフェリシン１６μｇ／ｍＬを含む試料６では、菌数が１．８×１０4ＣＦＵ／ｍＬに減少したが、さらに抗菌活性増強剤を添加した試料７では、菌数が２．５×１０2ＣＦＵ／ｍＬ以下となり、顕著に菌数の減少が見られた。
ここで、試料６と試料７の菌数の比較によれば、試料７の抗菌活性は試料６の抗菌活性の約７２倍以上であった。【０１３０】
一方、抗菌活性増強剤のみを添加した試料８では菌数が１．２×１０8ＣＦＵ／ｍＬとなり、全く抗菌活性が見られなかった。
本試験結果から、ウシ・ラクトフェリン分解物と本発明の抗菌活性増強剤の組み合わせにより、顕著な抗菌活性の増加が認められた。【０１３１】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を有効成分とする抗菌剤に添加することにより、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を顕著に向上させることができる。【０１３３】
また、本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物に対して極めて少量を混合するだけで効果を発揮することから、製品の組成や物性に影響を与えずに、飲食品や飼料、医薬品、化粧品等に配合することができる。【０１３４】
さらに、本発明の抗菌活性増強剤の有効成分は、乳由来の成分から得られるリボヌクレアーゼ−４であることから、副作用の心配がほとんどなく、安心して日常的に摂取することができる。
【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年7月10日(2013.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
［リボヌクレアーゼ−４］
本発明の有効成分であるリボヌクレアーゼ−４は、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳を乳原料として用いて陽イオン交換処理、限外膜濾過処理、及びゲル濾過担体によるゲルろ過処理によって調製することができるものである。
また、リボヌクレアーゼ−４は、乳原料中にホエイ（乳清）蛋白質が含まれるものであれば特に制限なく調製することができる。
例えば、ウシ由来のリボヌクレアーゼ−４は、１４７アミノ酸残基、分子量が１７ｋＤａ、等電点が９．１８のタンパクである。リボヌクレアーゼ−４は、リボヌクレアーゼ活性や癌細胞に対する細胞毒性を示すことが知られるが、これまでその他の生理活性については知られていなかった。
さらに、リボヌクレアーゼ−４は、乳や乳製品を原料として得られるリボヌクレアーゼ−４に限られず、乳に含まれるリボヌクレアーゼ−４と同等の構造を有する限り、乳以外の動物の体液や組織から得られる蛋白質、又は、化学合成品もしくは組換え蛋白質であってもよい。また、リボヌクレアーゼ−４又はそのフラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。保存的バリアントとしては、配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等を含む配列を有する蛋白質、又は、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であって、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する蛋白質が挙げられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
限外濾過時の圧力は、使用する膜の耐圧限界以下であれば（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０．６ＭＰａ以下）いずれの圧力でも可能である。尚、耐圧限界値付近での使用は膜の寿命を縮める可能性があるため、耐圧限界の２／３以下（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０．４ＭＰａ以下）で行うことが好ましい。
使用する限外濾過膜モジュールは、管型、中空糸型、平膜型、スパイラル型等いずれの形式でも可能である。ただし、中空糸型内圧式等のモジュールでは、中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、圧力等を考慮して行うことが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
さらに、膜透過画分をクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、ゲル濾過担体  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにて分離し、図１に示される分子量約１４ｋＤａのピークαを分取した。図１はゲル濾過ＨＰＬＣの溶出曲線を示している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
この溶出液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）に希釈し、ゲル濾過担体  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにて分離し、図２に示される分子量約１４ｋＤａのピークαを分取した。図２はゲル濾過ＨＰＬＣの溶出曲線を示している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
これに対して、ラクトフェリンに抗菌活性増強剤を添加した試料３では、３．６×１０4ＣＦＵ／ｍＬとなり、ラクトフェリンと比較して菌数が大きく減少した。
さらに、抗菌活性増強剤の量を１／２に減量した試料２でも、１．８×１０4ＣＦＵ／
ｍＬとなり、試料３と同様に菌数が減少した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
【表３】
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【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
【表４】
2013018169.tif 000017
【国際調査報告】
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2013018169.tif 000019
2013018169.tif 000020
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