(57)【要約】筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤であって、有効成分としてコンドロイチナーゼを含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与することで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤を提供する。これにより、前記コンドロイチナーゼが、前記筋線維の外周囲に存在するコンドロイチン硫酸を分解するため、前記コンドロイチン硫酸による筋線維の再生の阻害を消失させ、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが可能となる。
2013039244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤であって、
有効成分としてコンドロイチン硫酸を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる
骨格筋再生促進剤。
【請求項２】
前記酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、前記コンドロイチン硫酸の分解活性を有する哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素のいずれかを含む
請求項１に記載の骨格筋再生促進剤。
【請求項３】
前記筋原性疾患が、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含む
請求項１又は２に記載の骨格筋再生促進剤。
【請求項４】
前記骨格筋再生促進剤が、前記酵素を有効成分とする注射用製剤である
請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨格筋再生促進剤。
【請求項５】
前記骨格筋再生促進剤が、幹細胞治療、筋肉量の抑制機能を有するサイトカインに由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療のいずれかを含む治療と併用して用いられる
請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨格筋再生促進剤。
【請求項６】
コンドロイチン硫酸を分解する酵素を有効成分とする、筋疾患又は筋原性疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤に関し、詳しくは、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能な骨格筋再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む健全な哺乳動物の筋（筋肉、筋組織）に過剰な負荷を与えると、当該筋の一部は損耗するが、通常、当該筋は、再生能力を有しており、前記損耗した筋の一部は、前記負荷に耐えるために、速やかに再生され、肥大化する。【０００３】
前記筋の再生及び肥大化は、通常、以下のようになされる。即ち、前記筋が前記負荷などの刺激を受けると、当該筋の筋線維の細胞（筋細胞）の基底膜と形質膜との間に局在する筋衛星細胞が活性化し、増殖を開始する。ここで、前記筋衛星細胞とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を兼ね備える幹細胞に対応する。そして、前記増殖した筋衛星細胞は、筋線維の細胞の由来となる筋芽細胞となって、既存の筋線維と融合し、当該融合された筋線維を含む筋が再生、肥大化することになる。【０００４】
一方、何らかの理由により筋に損傷（疾患）を有する筋疾患患者は、前記筋の再生能力が極めて低下していたり、当該筋の再生能力があったとしても前記筋線維が容易に崩壊（損耗）したりする。そのため、前記筋疾患患者は、前記筋の再生速度よりも崩壊速度が上回り、筋萎縮を招く場合が多い。【０００５】
又、前記筋疾患のうち、代表的な筋原性疾患である筋ジストロフィーの患者では、前記筋線維の崩壊と再生が繰り返し生じているにも関わらず、健常者と比較して、前記筋線維の崩壊速度が前記筋線維の再生速度よりも速い。そのため、前記筋原性疾患患者は、自己の筋の萎縮が次第に進行し、その結果、若年期で死に至ることになる。【０００６】
上述した筋疾患又は筋原性疾患の治療方法として、前記筋の再生速度を亢進（向上）させる方法が、多数、報告されているものの（非特許文献１−３）、現時点では、良好な治療方法が確立されていない状況である。【０００７】
ところで、神経再生医療において、損傷した軸索を再生（伸長）する方法として、神経系の細胞外に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する方法が挙げられる。【０００８】
前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、神経系において主要な細胞外マトリックス成分であり、神経回路網の形成に関与する成分である。一方、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、脊髄損傷などの外傷性障害を受けた成体の脳神経系において前記軸索の再生を阻害する成分となる。つまり、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、場面に応じて、必要成分にも阻害成分にもなるのである。【０００９】
そこで、前記外傷性傷害を受けた神経損傷部位に、当該部位に発現したコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する細菌由来のコンドロイチン分解酵素、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）を投与すると、当該コンドロイチナーゼＡＢＣが前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）に作用し、当該コンドロイチン硫酸（ＣＳ）が分解（除去）される。すると、前記神経系において軸索の再生の阻害成分が消失するため、当該軸索の再生が促進され、新たな神経回路網が構築されるだけでなく、神経機能の回復も実現される。このような例は、多数、報告されている（非特許文献４−６）。【００１０】
又、前記神経系における圧迫障害を伴う疾患として、椎間板ヘルニアが挙げられる。前記椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出などに起因する疾患であり、突出した髄核が当該髄核付近の神経を刺激するため、腰痛などの症状が現れる疾患である。【００１１】
前記椎間板ヘルニアの治療について、特開平１１−１４７８３７号公報（特許文献１）には、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物が開示されている。前記グリコサミノグリカン分解酵素とは、グリコサミノグリカンを不飽和オリゴ糖および不飽和二糖に分解する酵素で、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解するコンドロイチナーゼに対応する。ここでは、前記コンドロイチナーゼを含む医薬組成物を脊髄硬膜外腔内に投与することで、当該脊髄硬膜外腔に遊走した椎間板ヘルニアの髄核を効率的に消化し、又、炎症細胞による髄核の貪食を促進する。その結果、前記特許文献１に記載の発明では、極めて効率的且つ有効に硬膜外遊走髄核を消失させ、更に、脊髄に全く影響を与えないという効果を有するとしている。【００１２】
又、前記コンドロイチナーゼが、肥厚性瘢痕やケロイドの治療に適用された例がある。例えば、国際公開第２００９／０７２６５４号（特許文献２）には、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｃを分解する酵素を含有する、弾性線維形成促進剤が開示されている。ここでは、前記弾性線維形成促進剤を、前記肥厚性瘢痕やケロイドの部位に投与することで、当該肥厚性瘢痕やケロイドの組織体積の縮小や当該ケロイドなどの根治治療へつながる組織の正常化の過程も評価することが可能となるとしている。
ＣＳを分解する酵素として、ＣｈＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどのコンドロイチナーゼがあるが、近年、Hyal-1やPH-20などの哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素にもＣＳを分解する活性があることが知られている（非特許文献７、８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】埜中征哉、「臨床神経学 12」、１９９８年、ｐ．997-1000
【非特許文献２】Grounds, M. D.、「Curr. Opin. Neurol. 12」、１９９９年、ｐ．535-543
【非特許文献３】Anderson, J. E.、「Biochem. Cell Biol. 76」、１９９８年、ｐ．13-26
【非特許文献４】Bradbury, E. J.、外７名、「Nature 416」、２００２年、ｐ．636-640
【非特許文献５】Silver, J.、外１名、「Net. Rev. Neurosci. 5」、２００４年、ｐ．146-156
【非特許文献６】Carulli, D.、外３名、「Curr. Opin. Neurobiol. 15」、２００５年、ｐ．116-120
【非特許文献７】Robert, S and Mark J. J.、「Chem. Rev. 106」、２００６年、p．818-839
【非特許文献８】Hafida, E. H.、「Arthritis Res Ther 7」、２００５年、p．R756-R768
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平１１−１４７８３７号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０７２６５４号
【発明の概要】
【００１５】
しかしながら、前記非特許文献１−６、前記特許文献１、２には、上述した筋疾患又は筋原性疾患の治療について記載がなく、現時点では、これらの治療方法が確立されていないという問題がある。
【００１６】
一方、in vitroの筋芽細胞（C2C12 細胞）培養系において、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の発現量を低下させることで、筋分化の進行が促進されることが本発明者により見出されている。そこで、in vivoにおいても、同様に、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の発現量を低下させることで、筋分化の亢進、筋線維の肥大化、筋再生の誘導が期待出来る可能性がある。
【００１７】
そこで、本発明は、前記問題を解決するためになされたものであり、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤に関し、詳しくは、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能な骨格筋再生促進剤を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤（骨格筋再生治療薬）として本発明に係る新規な骨格筋再生促進剤を完成させた。
【００１９】
即ち、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分としてコンドロイチン硫酸を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤である。
本発明の他の面は、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進するために使用されるコンドロイチン硫酸を分解する酵素であって、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる、該酵素、に関する。
本発明の他の面は、骨格筋再生に有効な量のコンドロイチン硫酸を分解する酵素を、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与する工程を含む、筋疾患又は筋原性疾患における骨格筋再生促進方法、に関する。
【００２０】
これにより、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤を、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に投与すると、当該酵素が、前記筋線維（細胞）の外周囲に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解することになる。そのため、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）による筋線維の再生の阻害を消失させ、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが可能となる。又、前記酵素は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患のいずれでもない健全な筋線維に対して副作用が殆ど無く、非常に安全である。そのため、本発明の骨格筋再生促進剤は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に対象を限定した安全性の優れる骨格筋再生促進剤として有効である。
【００２１】
又、前記酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、コンドロイチン硫酸の分解活性を有する哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素のいずれかを含むよう構成することが出来る。
【００２２】
又、前記筋原性疾患が、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含むよう構成することが出来る。
【００２３】
又、前記骨格筋再生促進剤が、前記酵素を有効成分とする注射用製剤であるよう構成することが出来る。
【００２４】
又、前記酵素の投与量が、一投与当たり０．１ｍＩＵ／ｇ〜１０．０ｍＩＵ／ｇであるよう構成することが出来る。
【００２５】
又、前記酵素の投与形態が、０．５ＩＵ／ｍＬ〜２００．０ＩＵ／ｍＬの範囲の所定濃度の酵素を、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所、１μＬ〜５０００μＬの範囲の投与量ずつ投与する形態であるよう構成することが出来る。
【００２６】
又、前記骨格筋再生促進剤が、幹細胞治療、筋肉量の抑制機能を有するサイトカインに由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療のいずれかを含む治療と併用して用いられるよう構成することが出来る。
又、本発明によれば、コンドロイチン硫酸を分解する酵素を有効成分とする、筋疾患又は筋原性疾患治療剤も提供される。
本発明の他の面は、筋疾患又は筋原性疾患を治療するために使用されるコンドロイチン硫酸を分解する酵素に関する。
本発明の他の面は、筋疾患又は筋原性疾患の治療に有効な量のコンドロイチン硫酸を分解する酵素を、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物に投与する工程を含む、筋疾患又は筋原性疾患の治療方法、に関する。
より詳細には、本発明は、以下のとおりである。
（１）  筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤であって、有効成分としてコンドロイチン硫酸を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤。
（２）  前記酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、前記コンドロイチン硫酸の分解活性を有する哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素のいずれかを含む、（１）に記載の骨格筋再生促進剤。
（３）  前記筋原性疾患が、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含む、（１）又は（２）に記載の骨格筋再生促進剤。
（４）  前記骨格筋再生促進剤が、前記酵素を有効成分とする注射用製剤である（１）〜（３）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（５）  前記酵素の投与量が、一投与当たり０．１ｍＩＵ／ｇ〜１０．０ｍＩＵ／ｇである（１）〜（４）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（６）  前記酵素の投与形態が、０．５ＩＵ／ｍＬ〜２００．０ＩＵ／ｍＬの範囲の所定濃度の酵素を、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所、１μＬ〜５０００μＬの範囲の投与量ずつ投与する形態である、（１）〜（５）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（７）  前記骨格筋再生促進剤が、幹細胞治療、筋肉量の抑制機能を有するサイトカインに由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療のいずれかを含む治療と併用して用いられる、（１）〜（６）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（８）  コンドロイチン硫酸を分解する酵素を有効成分とする、筋疾患又は筋原性疾患治療剤。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤では、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能となる。また、本発明は、骨格筋促進試薬としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】生理食塩水（Vehicle）の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図と、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。
【図２】第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。
【図３】第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積の一例を示す棒グラフである。
【図４】生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。
【図５】生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から７日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。
【図６】生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。
【図７】生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合の一例を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、添付図面を参照して、本発明に係る骨格筋再生促進剤の実施形態について説明し、本発明の理解に供する。尚、以下の実施形態は、本発明を具体化した一例であって、本発明の技術的範囲を限定する性格のものではない。
【００３０】
＜骨格筋再生促進剤＞
【００３１】
本発明に係る骨格筋再生促進剤は、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤である。更に、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分としてコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤である。
【００３２】
ここで、有効成分として含まれる酵素は、筋線維（細胞）の周辺に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素であれば、特に限定されない。前記酵素として、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどのコンドロイチナーゼを用いることが出来る。又、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解活性を併せて有する酵素でも良く、例えば、HYAL-1やPH-20などの哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素を用いることもできる（非特許文献７、８）。
【００３３】
ここで、コンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、Proteus vulgaris由来であり、コンドロイチナーゼＡＣは、例えば、Flavobacterium heparinum由来である。又、コンドロイチナーゼＡＣIIは、例えば、Arthrobacter aurescens由来であり、コンドロイチナーゼＡＣIIIは、例えば、Flavobacterium sp. Hp102由来である。又、コンドロイチナーゼＢは、例えば、Flavobacterium heparinum由来であり、コンドロイチナーゼＣは、例えば、Flavobacterium sp. Hp102由来である。
【００３４】
又、前記酵素は、１種類の酵素であっても、複数種の酵素の混合物であっても良い。又、本明細書に記載の酵素は、これら両方の意味を包含する。
【００３５】
又、前記酵素は、ＣｈＡＢＣ又は哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素であると、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解亢進の観点から好ましく、当該ＣｈＡＢＣならば、Proteus vulgaris由来のＣｈＡＢＣであると更に好ましい。
【００３６】
又、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤は、製剤学的に公知の方法によって調整・製剤することが出来る。ここで、前記骨格筋再生促進剤は、溶液状態、凍結状態、乾燥状態などの状態であってもよい。
【００３７】
又、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤は、主として注射用製剤に使用される。ここで、前記骨格筋再生促進剤を、溶液状態の注射用製剤に使用する場合、当該注射用製剤を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させ、或いは保存し、注射剤として投与に使用することが出来る。又、前記骨格筋再生促進剤を、乾燥状態の注射用製剤に使用する場合、当該注射用製剤を前記容器中に密封状態で保持させて、流通させ、或いは保存し、投与前に注射用蒸留水、（リン酸緩衝）生理食塩水、ブドウ糖水溶液、ソルビトール水溶液等の溶媒（溶剤）に溶解し、注射剤として投与に使用することが出来る。
【００３８】
又、前記筋疾患は、哺乳動物の筋が損傷した非遺伝性疾患であれば、特に限定されない。前記筋疾患として、例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性強皮症、混合性結合組織病などの膠原病、トキソプラズマ症、トリコモナス症、化膿性筋炎、ガス壊疽、壊死性筋炎、急性ウイルス性筋炎などの感染症を含む炎症性筋疾患、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症などの内分泌性筋疾患、高脂血症治療薬、ステロイドなどの中毒性筋疾患などが挙げられる。又、前記筋疾患は、筋肉そのものに原因があって筋肉が萎縮する筋原性疾患（myopathy）とは異なるものの、脊髄前角細胞と末梢神経の損傷により筋肉が萎縮する神経に原因がある神経原性疾患（neuropathy）も該当するので、当該筋疾患として、例えば、乳児脊髄性筋萎縮症(ウェルドニッヒ・ホフマン病)、シャルコ・マリー・ツース病、先天性ミエリン形成不全症、筋萎縮性側索硬化症などを含んでも構わない。
【００３９】
又、前記筋原性疾患は、哺乳動物の筋が損傷する遺伝性疾患であれば、特に限定されない。前記筋原性疾患として、例えば、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィーなどを含むミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症などを含むイオンチャネル病などが挙げられる。又、前記筋ジストロフィーとして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーなどが挙げられる。
【００４０】
又、前記筋原性疾患は、筋ジストロフィーであると、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による筋線維の再生亢進の観点から好ましく、当該筋ジストロフィーのうち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであると更に好ましい。
【００４１】
又、前記哺乳動物は、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維（細胞）を有する哺乳動物であれば、特に限定されない。前記哺乳動物として、例えば、ヒト、チンパンジー、ドッグ、ラット、マウスなどが挙げられる。
【００４２】
又、前記コンドロイチナーゼを含む骨格筋再生促進剤を前記筋疾患又は前記筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与する方法は、前記骨格筋再生促進剤を前記筋線維の細胞周辺に浸透させる方法であれば、特に限定されない。前記投与方法として、例えば、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、直腸内投与、経皮投与などが挙げられるが、筋肉内投与が好ましい。
【００４３】
又、前記酵素の投与量は、前記筋線維の再生を亢進させる投与量であれば、特に限定されない。前記酵素の投与量として、例えば、一投与当たり０．１ｍＩＵ／ｇ〜１０．０ｍＩＵ／ｇであると、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による筋線維の再生亢進の観点から好ましい。仮に、体重６０ｋｇのヒトを対象とする場合、例えば、前記酵素の投与量として、０．１ｍＩＵ／ｇ〜６．７ｍＩＵ／ｇの範囲が挙げられる。
【００４４】
又、前記酵素の投与形態は、前記筋線維の再生を亢進させる投与形態であれば、特に限定されない。前記酵素の投与形態として、例えば、０．５ＩＵ／ｍＬ〜２００．０ＩＵ／ｍＬの範囲の所定濃度の酵素を、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所、１μＬ〜５０００μＬの範囲の投与量ずつ投与する形態であると、前記筋線維の所定領域に発現したコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を網羅的に分解することが可能となり、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による筋線維の再生亢進の観点から好ましい。例えば、前記酵素がＣｈＡＢＣである場合、２．０ＩＵ／ｍＬのＣｈＡＢＣを、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所（例えば、２箇所〜１０箇所）、３０μＬの投与量ずつ投与すると、効果的に、前記筋線維を再生させ、肥大化を亢進させることが可能となる。仮に、体重６０ｋｇのヒトを対象とする場合、例えば、通常の筋肉内投与の投与量は、１０００μＬ〜２０００μＬの範囲が挙げられる。
【００４５】
ここで、本明細書における酵素の１Ｕ（単位）は、至適ｐＨ及び至適温度付近の条件において、当該酵素から１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量と定義される。例えば、前記ＣｈＡＢＣの１Ｕとは、ｐＨ８．０、３７℃で１分間にコンドロイチン６−硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。各種コンドロイチナーゼであっても同様である。
【００４６】
又、前記酵素は、骨格筋再生促進剤（医薬、治療薬）として使用できる程度に精製され、骨格筋再生促進剤として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。又、前記酵素は、所定以上の比活性を有することが好ましいが、例えば、前記酵素が前記ＣｈＡＢＣである場合、その比活性が１００Ｕ／ｍｇ蛋白以上に精製された酵素であると、好ましく、更に、比活性が３００Ｕ／ｍｇ蛋白以上に精製された酵素であると、尚好ましい。
【００４７】
又、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分として前記酵素を含有する限り、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤などの通常骨格筋再生促進剤（医薬）に用いられる添加剤を含んでも構わない。
【００４８】
例えば、本発明に係る骨格筋再生促進剤を、注射用製剤として使用する場合には、前記酵素を、注射用蒸留水、（リン酸緩衝）生理食塩水、ブドウ糖水溶液、ソルビトール水溶液等の溶媒に所定濃度だけ溶解させた溶液を作製し、前記作製した溶液を注射用製剤として使用すればよい。
【００４９】
＜実施例＞
【００５０】
以下に、本発明の実施例としてマウスを用いた評価方法、試験例を具体的に説明するが、本発明の適用が本実施例に限定されるものでない。
【００５１】
＜評価方法＞
（１−１）筋線維の切片作製
【００５２】
筋線維の再生の評価対象となるマウスの（骨格）筋線維の切片は、当該マウスの前脛骨筋の筋線維を当該筋線維に対して直角方向に切断することにより摘出させる。前記摘出された切片は、その切断方法により、前記筋線維に直角な横断面となり、前記筋線維の短手方向の断面となる。前記切片は、筋線維の崩壊を防止するために、液体窒素で冷却したイソペンタンに入れて、急速凍結させる。
【００５３】
次に、前記急速凍結させた切片を、クライオスタットを用い、厚さ１０μｍの切片として作製し、ＡＰＳ（アミノシラン）コートスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）上に貼り付け、パラフィン伸展器上で乾燥後、−８０℃で保存する。これにより、評価用の切片を得ることが出来る。
【００５４】
（１−２）免疫蛍光染色による筋線維（細胞）の形態観察
前記（１−１）で作製した切片を、溶媒がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）である４ｗ／ｖ％濃度のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて室温で３０分間処理し、固定化させる。
【００５５】
次に、前記固定化させた切片を前記ＰＢＳで洗浄後、２％ヤギ血清を含むM.O.M.マウスIgブロッキング試薬（M.O.M. Immunodetection kitの試薬、英国Vector社製）で処理し、１時間静置してブロッキング処理を行う。
【００５６】
一方、抗ラミニン抗体（Sigma社製）と、抗ＣＳ切り株抗体（2-B-6）（生化学工業株式会社製）とをM.O.M.希釈溶液（M.O.M. Immunodetection kitの試薬、Vector社製）で希釈し混合した混合液を、一次抗体として作製する。前記抗ラミニン抗体は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で400倍希釈し、前記抗ＣＳ切り株抗体は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で200倍希釈する。
【００５７】
ここで、前記抗ラミニン抗体は、筋線維（細胞）の基底膜に存在するラミニン（Laminin）を認識する抗体であり、前記抗ラミニン抗体を認識する二次抗体[Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) （Invitrogen社製）]と組み合わせることにより、緑色の蛍光として、当該筋線維の外縁を観察することが出来る。又、前記抗ＣＳ切り株抗体は、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素が分解したコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の切り株構造を認識する抗体である。前記抗ＣＳ切り株抗体を認識する二次抗体[Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1（ガンマ１）（Invitrogen社製）]と組み合わせることにより、筋組織切片中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の切り株構造を赤色の蛍光として検出することができる。
【００５８】
前記作製した一次抗体を、前記ブロッキング処理後の切片に滴下し、４℃で終夜反応させ、当該反応後の切片を前記ＰＢＳで３回洗浄する。
【００５９】
一方、Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) （Invitrogen社製）及びAlexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1（ガンマ１）（Invitrogen社製）を前記M.O.M.希釈溶液で希釈し混合した混合液を、二次抗体として作製する。前記Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で200倍希釈し、前記Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1（ガンマ１）は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で200倍希釈した。
【００６０】
そして、前記洗浄後の切片に、前記作製した二次抗体を滴下し、３７℃で１時間反応させ、当該反応後の切片を前記ＰＢＳで３回洗浄する。更に、当該洗浄後の切片に、前記ＰＢＳで希釈したHoechst 33342（Invitrogen社製）を滴下し、室温で２０分間反応させる。ここで、前記Hoechst 33342は、前記ＰＢＳに対して体積で500倍希釈する。前記Hoechst 33342は、筋線維の中心核を蛍光青色に染色し、これにより、当該筋線維の中心核を観察することが出来る。
【００６１】
更に、前記反応後の切片を前記ＰＢＳで適宜洗浄後、当該洗浄後の切片を所定の封入剤（FLUOROSHIELD、ImmunoBioScience Corp.製）を用いて封入し、所定のオールインワン蛍光顕微鏡（BZ-800、KEYENCE製）により観察する。前記オールインワン蛍光顕微鏡の設定条件は、筋線維中の核の存在（局在）を鮮明にするために、デジタル化された画像中の蛍光青色を赤色の擬似カラーに変更する設定条件とする。
【００６２】
（１−３）画像解析
前記（１−２）で得られた筋線維の画像を解析することで、筋線維について定量評価する。前記定量評価を行う場合、下記の２種類の値を算出することで行う。
【００６３】
（１−３−１）筋線維の細胞の断面積
前記画像のうち、１視野（９１８μｍ×６３４μｍ）内に存在する中心核を有する筋線維をすべて（１００〜２００個／視野、１検体あたり少なくとも３視野）抽出し、当該抽出した全ての筋線維の細胞の断面積（ＣＳＡ）（cross-sectional area）を計測した。そして、前記計測した断面積を抽出数で除算することで、一細胞当たりの平均断面積を算出した。ここで、一細胞当たりの平均断面積が大きい程、前記筋線維の再生（増殖）、肥大化が亢進（活性化）していることを示す。
【００６４】
（１−３−２）中心核が存在しない筋線維の細胞の割合
前記画像のうち、１視野（９１８μｍ×６３４μｍ）内に存在する筋線維をすべて（１００〜２００個／視野、１検体あたり少なくとも３視野）抽出し、当該抽出した筋線維の細胞のうち、中心核が存在しない細胞の数を計測した。そして、前記計測した中心核が存在しない細胞の数を抽出数で除算した割合（％：百分率）を算出した。前記中心核が存在しない細胞の割合が高い程、前記筋線維の再生、肥大化および筋線維の安定化が亢進していることを示す。
【００６５】
＜試験例＞
（２−１）健全（正常）マウスを用いた薬効薬理試験
【００６６】
健全なマウスの筋（線維）に本発明に係る骨格筋再生促進剤を投与することで、当該筋線維の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
【００６７】
ここで、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＥＣ4.2.2.4  生化学工業株式会社製）（ＣｈＡＢＣ）を無菌的に生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に所定濃度（例えば、２．０ＩＵ／ｍＬ）溶解した注射用製剤を用いた。
【００６８】
生後５週間（週齢）〜６週間経過後の野生型マウス（C57BL/10系統  約２０ｇ相当  日本ＳＬＣ株式会社製）に、ソムノペンチル（共立製薬株式会社製）を腹腔投与し、麻酔をかけた。そして、前記野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に、所定の注射器を用いて、前記注射用製剤を３０μＬ投与した。そのため、当該注射用製剤の投与量は、前記ＣｈＡＢＣに対して一回につき６０ｍＩＵに相当する投与量である。前記マウスに対しては、前記ＣｈＡＢＣの投与量は、３．０ｍＩＵ／ｇとなる。
【００６９】
又、対照実験として、前記野生型マウスの右後肢の前脛骨筋に、前記注射用製剤に用いた生理食塩水のみを３０μＬ投与した。
【００７０】
次に、各製剤（薬剤）の投与直後から７日経過後のマウスを用いて、前記（１−１）−（１−２）により、筋線維の切片を作製し、蛍光観察を行った。
【００７１】
ここで、前記蛍光観察は、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による切り株構造の蛍光シグナルのみを観察するΔＣＳ観察と、個々の筋線維の細胞の形態と核の局在を検出するLaminin／Hoechst観察とした。
【００７２】
図１は、生理食塩水（Vehicle）の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図と、ＣｈＡＢＣの投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。尚、左下の白色横線のスケールバーは１００μｍである。
【００７３】
前記生理食塩水の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察では、図１に示すように、前記切り株構造に対応する蛍光シグナルが全く観察されなかった。これにより、前記生理食塩水の投与により、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解は行われないことが理解される。
【００７４】
一方、前記ＣｈＡＢＣの投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察では、図１に示すように、前記蛍光シグナルが、各筋線維の外周囲を縁取るように観察された、これにより、前記ＣｈＡＢＣの投与により、前記筋線維の膜の外縁に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解が行われたことが理解される。
【００７５】
又、前記生理食塩水及び前記ＣｈＡＢＣの投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図１に示すように、筋線維の中心核を示す赤色の蛍光シグナルが全く観察されなかった。ここで、前記中心核を有する筋線維が存在する場合、筋線維の再生、増殖に関与する筋衛星細胞が活性化していることを意味する。そのため、前記中心核を有する筋線維の細胞が全く観察されないということは、前記筋衛星細胞の活性化が見られず、前記生理食塩水及び前記ＣｈＡＢＣの投与によって、筋線維の再生、肥大化は特に促進されないことを意味する。従って、これにより、前記ＣｈＡＢＣの投与によって筋組織内のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）は分解されるものの、健全マウスの筋線維の再生、肥大化に殆ど影響を与えないことが理解される。言い換えると、前記ＣｈＡＢＣの投与は、健全な筋に対して、副作用が殆ど無く、非常に安全性が高いことが示唆される。
【００７６】
（２−２）筋疾患のマウスを用いた薬効薬理試験
次に、筋疾患（損傷）したマウスの筋に本発明に係る骨格筋再生促進剤を投与することで、当該筋線維の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
【００７７】
前記筋疾患をマウスの筋に生じさせるために、以下の方法を採用した。即ち、コブラ毒として知られるNaja mossambica mossambica由来カルジオトキシン（ＣＴＸ）は、筋に投与すると、当該筋の筋線維の細胞膜を破壊して、当該筋線維を壊死させるという特徴を有する。一方、前記ＣＴＸは、前記筋の再生に関与する細胞、例えば、筋衛星細胞、血管、末梢神経のいずれにも影響（障害）を与えないという特徴を有する。そのため、前記ＣＴＸを前記筋に投与したとしても、当該筋線維の再生は、いずれ開始されることになる。又、前記ＣＴＸは、投与直後から筋線維の壊死が始まり、当該投与直後から２４時間（１日）経過後に、前記壊死された筋線維内にマクロファージが侵入する。そして、前記投与直後から７２時間（３日）経過後に、筋線維の再生を示す筋幹細胞が出現し始める。つまり、筋に対する前記ＣＴＸの投与は、当該筋の筋線維に擬似的に疾患（損傷）を生じさせることが可能なのである（例えば、Jin, Y.、外５名、「Acta Neuropathol. 99」、２０００年、ｐ．619-627を参照）。
【００７８】
そこで、前記ＣＴＸを（骨格）筋に投与したマウスを筋損傷（疾患）モデルのマウスとし、当該筋損傷モデルのマウスに更に前記ＣｈＡＢＣを投与することで、当該筋損傷モデルのマウスの筋の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
【００７９】
先ず、所定の濃度（例えば、１０μＭ）の前記ＣＴＸのみを３０μＬだけ前記野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に投与し、そのマウスを第一のマウスとした。尚、前記ＣＴＸは、生理食塩水により前記濃度に調製した注射用製剤とし、注射器により投与した。
【００８０】
次に、前記第一のマウスとは別の野生型マウスを用意し、当該野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に、前記濃度のＣＴＸのみを３０μＬだけ投与し、当該投与直後から３日経過後に、当該前脛骨筋に前記所定濃度（２．０ＩＵ／ｍＬ）のＣｈＡＢＣを３０μＬだけ追加投与し、そのマウスを第二のマウスとした。ここで、前記ＣｈＡＢＣの投与量は、一回につき６０ｍＩＵである。
【００８１】
尚、前記第二のマウスにおいて、前記ＣＴＸの投与直後から３日経過後に前記ＣｈＡＢＣを投与した理由は、当該３日経過後に前記筋衛星細胞に由来する筋芽細胞の融合が観察されるようになるため、発明者は、その時期に発現する前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解させれば、前記筋線維の再生、肥大化が著しく亢進されると考えたからである。
【００８２】
又、前記第一のマウス及び前記第二のマウスとは別の野生型マウスを用意し、当該野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に、ＣＴＸとＣｈＡＢＣの混合液（混合液中のＣＴＸ濃度：１０μＭ、ＣｈＡＢＣ濃度：２．０ＩＵ／ｍＬ）を３０μＬ投与し、そのマウスを第三のマウスとした。ここで、前記ＣｈＡＢＣの混合量は、上述した投与量に対応し、６０ｍＩＵである。
【００８３】
そして、各製剤の投与直後から７日経過後のマウスを用いて、前記（１−１）−（１−３）により、筋線維の切片を作製し、蛍光観察、画像解析を行った。
【００８４】
ここで、前記蛍光観察は、前記Laminin／Hoechst観察とし、前記画像解析は、筋線維の細胞の断面積とした。
【００８５】
図２は、第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。尚、左下の白色横線のスケールバーは１００μｍである。
【００８６】
図３は、第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積の一例を示す棒グラフである。尚、図３に示す＊は、Ｐ＜０．０１のｔテストを示す。
【００８７】
前記第一のマウス（ＣＴＸ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図２に示すように、中心核を有する細胞が肥大化することなく密集していることが観察される。これにより、前記ＣＴＸの投与により、前記筋線維の壊死に対応して、当該筋線維の再生が、通常通り、発現していることが理解される。
【００８８】
一方、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）及び前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図２に示すように、中心核を有する筋線維が肥大化していることが観察される。これにより、前記ＣｈＡＢＣの投与により、前記筋線維の再生、肥大化が亢進されていることが理解される。
【００８９】
又、前記第一のマウス（ＣＴＸ）、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積では、図３に示すように、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）及び前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積が、前記第一のマウスの筋線維における細胞の断面積と比較して、有意に大きいことが感得される。これにより、筋疾患に対応する筋損傷モデルのマウスの筋に前記ＣｈＡＢＣを投与すると、当該ＣｈＡＢＣが、筋線維の再生を阻害するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解し、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが理解される。
【００９０】
尚、前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積は、図３に示すように、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積と比較して、有意に大きいことが感得される。そのため、前記ＣｈＡＢＣは、前記ＣＴＸが筋に投与された時点、言い換えると、前記ＣＴＸにより筋線維の壊死が始まる時点と同時に投与した方が、当該筋線維の再生、肥大化に効果的であることが理解される。
【００９１】
これについて、発明者は、以下のように推察している。即ち、前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）において、前記ＣＴＸが前記筋線維の内部に浸透すると同時に、当該ＣＴＸとともに投与されたＣｈＡＢＣが当該筋線維の内部に浸透し、当該筋線維の周辺に発現するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を即時に分解する。そのため、前記筋線維の再生時には、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）が分解された状態となり、当該筋線維の再生の阻害を効果的に防止し、当該再生速度を亢進させたと推察する。
【００９２】
（２−３）筋原性疾患のモデルマウスを用いた薬効薬理試験
更に、筋原性疾患のモデルマウスの筋に本発明に係る骨格筋再生促進剤を投与することで、当該筋線維の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
【００９３】
前記筋原性疾患のモデルマウスは、以下の方法を採用した。即ち、ジストロフィン遺伝子の変異によりジストロフィンタンパク質が筋線維の膜上で欠損しているｍｄｘマウスは、生後３週間経過後に自己の筋線維の壊死が起こり始めるとともに、壊死後の筋線維の再生も生じることが知られている（例えば、Nonaka, I.、「Lab. Anim. Sci. 48」、１９９８年、ｐ．8-17を参照）。つまり、前記ｍｄｘマウスには、所謂デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋原性疾患が生じている。
【００９４】
そこで、前記ｍｄｘマウスを筋原性疾患モデルのマウスとし、当該筋原性疾患モデルのマウスに前記ＣｈＡＢＣを投与することで、当該筋原性疾患モデルのマウスの筋の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
【００９５】
先ず、生後５週間〜６週間経過後のｍｄｘマウス（C57BL/10系統  約２０ｇ相当、日本クレア株式会社製）の左後肢の前脛骨筋に前記所定濃度（２．０ＩＵ／ｍＬ）のＣｈＡＢＣを３０μＬだけ投与した。ここで、前記ＣｈＡＢＣの投与量は、一回につき６０ｍＩＵである。又、対照実験として、前記ｍｄｘマウスの右後肢の前脛骨筋に生理食塩水を３０μＬだけ投与した。
【００９６】
そして、各製剤の投与直後から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスを用いて、前記（１−１）−（１−３）により、筋線維の切片を作製し、蛍光観察、画像解析を行った。
【００９７】
ここで、前記蛍光観察は、前記Laminin／Hoechst観察とし、前記画像解析は、中心核が存在しない筋線維の細胞の割合とした。
【００９８】
図４は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。又、図５は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から７日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。又、図６は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。尚、図４〜図６は、同一寸法であり、図６における左下の白色横線のスケールバーは１００μｍである。
【００９９】
図７は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合の一例を示す棒グラフである。尚、図７に示す＊は、Ｐ＜０．００５のｔテストを示す。
【０１００】
前記生理食塩水の投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図４〜図６に示すように、３日、７日、１４日経過後のいずれであっても、中心核を有する細胞がまばらに観察された。又、前記中心核が存在しない細胞の割合では、図７に示すように、３日、７日、１４日経過後のいずれであっても、約３０％〜約４０％であった。これにより、前記ｍｄｘマウスの筋線維の細胞は、壊死と再生とを一定頻度で繰り返していることが理解される。
【０１０１】
一方、前記ＣｈＡＢＣの投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図４〜図６に示すように、７日経過後の筋線維の細胞が最も大きく、肥大化していることが観察された。又、前記中心核が存在しない細胞の割合では、図７に示すように、７日経過後の中心核が存在しない細胞の割合が最も高く、約５０％であった。これにより、前記ｍｄｘマウスの筋線維に前記ＣｈＡＢＣを投与すると、当該ＣｈＡＢＣの投与直後から７日までの間に、当該筋線維の再生速度がその壊死速度よりも上回り、当該筋線維の再生、肥大化が亢進したことが理解される。言い換えると、前記ＣｈＡＢＣが、筋原性疾患の筋線維の再生を助長し、当該筋線維を安定化（壊死回避）させたことが理解される。
【０１０２】
尚、前記ＣｈＡＢＣの投与から１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合は、図７に示すように、７日経過後のｍｄｘマウスの筋線維におけるそれと比較して低下している。これは、前記ＣｈＡＢＣの投与の効果が消失したためと考えられる。一方、前記ＣｈＡＢＣを投与したｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合は、図７に示すように、前記生理食塩水を投与したｍｄｘマウスの筋線維におけるそれと比較して、全体的に高いことが感得される。
【０１０３】
そのため、発明者は、前記ＣｈＡＢＣの投与による筋線維の再生の亢進は、所定期間のみ有効であるものの、当該ＣｈＡＢＣを所定周期で繰り返し投与すれば、当該筋線維の再生の亢進の継続により、当該筋原性疾患の筋の壊死の阻止又は遅延を促すことが出来ると考えている。
【０１０４】
又、上述した試験例では、主としてマウスを哺乳動物として採用して、前記ＣｈＡＢＣの薬効薬理試験を実施したが、他の哺乳動物、例えば、ヒトであっても、同様の作用効果を得ることが出来ると推認される。
【０１０５】
又、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素として、上述した試験例では、前記ＣｈＡＢＣを採用したが、原理原則から考慮すると、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素の種類にはよらないため、例えば、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどのコンドロイチナーゼを採用しても、同一の作用効果を奏する。又、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解活性を併せて有する酵素、つまり、実質的にコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素であれば、どのような酵素でもよく、例えば、HYAL-1などのヒアルロン酸分解酵素を採用しても、同一の作用効果を奏する。
【０１０６】
又、前記筋原性疾患として、上述した試験例では、前記ｍｄｘマウスの筋ジストロフィーを採用したが、原理原則から考慮すると、前記筋原性疾患の種類にはよらないため、例えば、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含む筋原性疾患を採用しても、同一の作用効果を奏する。
【０１０７】
このように、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分としてコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素を含み、哺乳動物の筋疾患又は筋原性疾患の筋線維に投与することで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤である。
【０１０８】
これにより、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤を、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に投与すると、当該酵素が、前記筋線維の外周囲に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解することになる。そのため、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）による筋線維の再生の阻害を消失させ、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが可能となる。又、前記酵素は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患のいずれでもない健全な筋線維に対して副作用が殆ど無く、非常に安全である。そのため、本発明の骨格筋再生促進剤は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に対象を限定した安全性の優れる骨格筋再生促進剤として有効である。
【０１０９】
現在、筋疾患や筋原性疾患について、幹細胞治療（例えば、橋本有弘、「蛋白質 核酸 酵素 49」、２００４年、p.741-748など）や筋肉量の抑制機能を有するサイトカイン（例えば、フォリスタチン）に由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療（例えば、Nakatani, M.、外１１名、「FASEB J. 22」、２００８年、ｐ.477-487など）、これらの研究が、臨床適用に向けて活発に展開されている。本発明に係る骨格筋再生促進剤（実施例では、ＣｈＡＢＣ）を用いた治療法は、これらの治療法と併用することにより、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に対してより効果的な治療法となると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
以上のように、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、通常の筋疾患はもちろん、筋ジストロフィーなどの筋原性疾患の骨格筋再生促進剤として有用であり、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能な骨格筋再生促進剤として有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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