(57)【要約】  本発明は、独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の高い植物細胞等を効率的に作製することを可能にする、前記細胞内小器官の形質転換方法であって、前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を植物細胞内にて発現させる工程と、前記細胞内小器官の回復因子と前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子とをコードするＤＮＡを含む発現カセットを該植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入する工程と、前記植物細胞内にて前記発現カセットが導入されなかった前記細胞内小器官が、前記機能阻害因子により破壊される工程とを含む方法を提供する。
2013077420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法であって、
前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を植物細胞内にて発現させる工程と、
前記細胞内小器官の回復因子をコードするＤＮＡと、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡとを含む発現カセットを、該植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入する工程と、
前記植物細胞内にて前記発現カセットが導入されなかった前記細胞内小器官が、前記機能阻害因子により破壊される工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記機能阻害因子はバルナーゼであり、前記回復因子はバルスターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞内小器官がプラスチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記機能阻害因子の発現は、刺激に応答して誘導される、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられる、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも一つのベクター
（ａ）前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含むベクター
（ｂ）前記細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター、及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡを含む発現カセットと、該発現カセットの両側に位置し、前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列とを含有するベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法により作製された形質転換体。
【請求項７】
下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも一つのＤＮＡが導入された形質転換体
（ａ）前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター、及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体の子孫又はクローンである形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体は、植物細胞、植物組織、植物器官、植物体及び種子からなる群から選択されるいずれか一つである請求項６〜８のうちのいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子の発現産物を含む、請求項６〜９のうちのいずれか一項に記載の形質転換体の加工物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法に関し、より詳しくは、前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を植物細胞内にて発現させ、前記細胞内小器官の回復因子をコードするＤＮＡと、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡとを含む発現カセットを該植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入し、前記植物細胞内にて前記発現カセットが導入されなかった前記細胞内小器官を前記機能阻害因子により破壊する、前記細胞内小器官の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチド（色素体）やミトコンドリア等の細胞内小器官は独自のゲノムＤＮＡを有し、核のゲノムＤＮＡと同様に遺伝子組換えによって形質転換体を作製することができる。プラスチドやミトコンドリア等の細胞内小器官における遺伝子組み換えにおいて、導入された遺伝子は母性遺伝を示すので、花粉を介して形質転換体が環境中に拡散する危険性が少ない。また、プラスチドやミトコンドリア等の細胞内小器官においては核ゲノムに導入された遺伝子とは異なり、ジーンサイレンシングを受けないため、導入遺伝子の安定した発現が望める。さらに、プラスチドは強力なタンパク質合成能及びタンパク質蓄積能を有しているので、タンパク質の大量生産に適している。そのため、かかる形質転換方法は、バイオマスや機能性食材や医薬品材料等の生産・開発に多大に貢献することが期待されており、プラスチドの一種である葉緑体のゲノムＤＮＡに遺伝子を導入する形質転換方法については、タバコにおいて最初に報告され（非特許文献１）、それ以降、多種の植物において研究が進められている。【０００３】
しかしながら、タバコ（非特許文献２〜４）、ジャガイモ（非特許文献５）、ナス（非特許文献６）等の双子葉植物においては、形質転換した葉緑体のみを有するホモプラズミック化した植物が得られるとの報告はあるものの、葉片からの組織培養を数回繰り返すことを要する。また、同じ双子葉植物でもナタネにおいてホモプラズミック性の植物は得られていない（非特許文献７）。単子葉植物では、イネにおいてのみ葉緑体形質転換体が得られているもののヘテロプラズミック個体しか得られず、培養細胞の長期選抜によっても、ヘテロプラズミックの解消が困難とされている（非特許文献８及び９）。イネ以外の単子葉植物においても、トウモロコシ等の単子葉植物では葉片からの個体再生がほぼ不可能なため、ホモプラズミック個体の選抜は困難であると考えられる。【０００４】
このように、プラスチド等は一つの細胞中に多い場合は１００個以上存在することもあるため、独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換では、まず形質転換した細胞内小器官と野生型の細胞内小器官とが混在しているヘテロプラズミック性の細胞が作出されることが多い。また、ホモプラズミック性の細胞、ヘテロプラズミック性の細胞及び野生型プラスチド等のみを含む細胞が混在している、キメラ性の植物組織や植物体が得られる場合もある。ホモプラズミック性の植物体においては、導入遺伝子が高発現するという利点、さらに目的遺伝子が母性遺伝により全ての次世代種子に遺伝するという特性を持つが、ヘテロプラズミック性やキメラ性の形質転換体においては、導入した目的遺伝子の植物１個体あたりの発現量はホモプラズミック性の１個体の場合よりも低くなり、次世代への遺伝も不均一になることが問題となる（非特許文献７〜９）。これまでにも、多くの植物において独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法が開発されており、汎用性の高いヘテロプラズミック性やキメラ性の解消方法の開発もそれにあわせて強く望まれている。しかしながら、かかる解消方法は開発されていなかった。【０００５】
一方、バチルス属の一種  バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するＲＮＡ分解酵素としてバルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）というタンパク質が知られている。また、このバルナーゼに特異的に結合する細胞内阻害因子としてバルスター（ｂａｒｓｔａｒ）というタンパク質も知られている。さらに、植物において、バルナーゼを雄性器官で発現させることにより雄性不稔性植物を作出し（非特許文献１０）、バルスターによりその雄性不稔性を回復させることが可能であるという報告例もある（非特許文献１１〜１３）。しかしながら、バルナーゼやバルスターをプラスチド等の細胞内小器官において機能させて利用した例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｖａｂ  Ｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９０年、８７巻、８５２６〜８５３０ページ
【非特許文献２】Ｓｖａｂ  Ｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９３年、９０巻、９１３〜９１７ページ
【非特許文献３】Ｒｕｆ  Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１年、１９巻、８７０〜８７５ページ
【非特許文献４】Ｖｅｒｍａ  Ｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、１４５巻、１１２９〜１１４３ページ
【非特許文献５】Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＴら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、１６８巻、１４９５〜１５００ページ
【非特許文献６】Ｓｉｎｇｈ  ＡＫら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、２０１０年、１９巻、１１３〜１１９ページ
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ  Ｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２０１０年、２９巻、３７１〜３８１ページ
【非特許文献８】Ｋｈａｎ  ＭＳら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９年、１７巻、９１０〜９１５ページ
【非特許文献９】Ｌｅｅ  ＳＭら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ、２００６年、２１巻、４０１〜４１０ページ
【非特許文献１０】Ｍａｒｉａｎｉ  Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年、３４７巻、７３７〜７４１ページ
【非特許文献１１】Ｍａｒｉａｎｉ  Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、３５７巻、３８４〜３８７ページ
【非特許文献１２】Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＤＧら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００２年、３１巻、１１３〜１２５ページ
【非特許文献１３】Ｊａｇａｎｎａｔｈ  Ａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、８２巻、１号、４６〜５２ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、プラスチド等の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の高い植物細胞や該植物細胞で殆ど構成されているホモプラズミック性の高い植物体等を効率的に作製することを可能とする、植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、図１に示す通り、植物の葉の核ゲノムには、葉緑体への移行シグナルペプチドを付加したＲＮＡ分解酵素  バルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）の遺伝子を導入し、葉緑体のゲノムにはバルナーゼを阻害するバルスター（ｂａｒｓｔａｒ）遺伝子を導入した。なお、バルナーゼ遺伝子の発現は、エストラジオール誘導性プロモーターにより行った。その結果、バルスター遺伝子を有する形質転換葉緑体は、バルナーゼを誘導発現した場合でも該酵素の影響を受けず、野生型葉緑体のみが破壊されることを本発明者らは見出した。また、かかる方法により、効率的に植物細胞、植物組織、または植物体中の形質転換葉緑体の割合を高め、ひいては葉緑体の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の植物細胞や該植物細胞で殆ど構成されているホモプラズミック性の高い植物体を効率的に得られること等も見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
なお、植物におけるバルナーゼの利用は、植物の雄性器官特異的にバルナーゼを発現させることで花粉を崩壊させて不稔を起こさせることが主であったため、葉緑体等の独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官にバルナーゼを局在させた場合の効果については本発明において初めて明らかになった。【００１０】
従って、本発明は、植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法、該方法により用いられるベクター、及び該方法により作製された形質転換体に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法であって、
前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を植物細胞内にて発現させる工程と、
前記細胞内小器官の回復因子をコードするＤＮＡと、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡとを含む発現カセットを該植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入する工程と、
前記植物細胞内にて前記発現カセットが導入されなかった前記細胞内小器官が、前記機能阻害因子により破壊される工程と、を含む方法。
（２）  前記機能阻害因子はバルナーゼであり、前記回復因子はバルスターである（１）に記載の方法。
（３）  前記細胞内小器官がプラスチドである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  前記機能阻害因子の発現は、刺激に応答して誘導される（１）〜（３）のうちのいずれか一に記載の方法。
（５）  （１）〜（４）のうちのいずれか一に記載の方法に用いられる、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも一つのベクター
（ａ）前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含むベクター
（ｂ）前記細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター、及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡを含む発現カセットと、該発現カセットの両側に位置し、前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列とを含有するベクター。
（６）  （１）〜（４）のうちのいずれか一に記載の方法により作製された形質転換体。
（７）  下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも一つのＤＮＡが導入された形質転換体
（ａ）前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター、及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡ。
（８）  （６）又は（７）に記載の形質転換体の子孫又はクローンである形質転換体。
（９）  前記形質転換体は、植物細胞、植物組織、植物器官、植物体及び種子からなる群から選択されるいずれか一つである（６）〜（８）のいずれか一に記載の形質転換体。
（１０）  前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子の発現産物を含む、（６）〜（９）のうちのいずれか一に記載の形質転換体の加工物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換において、該細胞内小器官の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の植物細胞や該植物細胞で殆ど構成されているホモプラズミック性の高い植物体等を効率的に作製することが可能となる。特にプラスチドの形質転換において、効率的に植物細胞、植物組織、または植物体中の形質転換プラスチドの割合を高めることにより、同じ量の細胞あたりの外来導入遺伝子の発現総量が高くなるため、物質生産能の高いプラスチド形質転換植物を作出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の形質転換方法の一態様を示す概略図である。
【図２】本発明の形質転換方法に用いられる遺伝子の構成を示す概略図である。（Ａ）は葉緑体への移行シグナルを付加したバルナーゼをコードするＤＮＡを核に導入するためのベクター（ｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎ）の構成の一部を示す。「Ｇ１０−９０」は合成プロモーターを示し（Ｉｓｈｉｇｅ  Ｆ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９９年、１８巻、４号、４４３〜４４８ページ  参照）、「ＸＶＥ」は転写活性化因子が融合しているエストロジェン受容体をコードするＤＮＡを示し、「３５Ｓ」は３５Ｓプロモーターを示し、「ＨＰＴ」はハイグロマイシン耐性遺伝子を示し、「ＬｅｘＡ」はエストラジオール誘導性プロモーターを示し、「ＴＰ」はシロイヌナズナ由来ＲｂｃＳの葉緑体移行性ペプチドをコードするＤＮＡを示し、「Ｂａｒｎａｓｅ」はバルナーゼをコードするＤＮＡを示し、「Ｔ」はターミネーターを示す。（Ｃ）は葉緑体においてバルスターを発現させるためのベクター（ｐＮｔａｇＢＳ）の構成の一部を示す。「ｔｒｎＩ」及び「ｔｒｎＡ」は各々タバコ葉緑体のｔｒｎＩ遺伝子及びｔｒｎＡ遺伝子の周辺領域（アクセッション番号  Ｚ０００４４：１０３４１７−１０５３３５（１．９ｋｂ）で示される領域、及びアクセッション番号  Ｚ０００４４：１０５３３０−１０６９４４（１．６ｋｂ）で示される領域）を示し、「Ｐｒｒｎ２」はファージ由来のＴ７Ｇ１０配列を付加したタバコ葉緑体由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターを示し、「ＰｐｓｂＡ」はタバコ葉緑体由来の光合成遺伝子  ｐｓｂＡのプロモーターを示す。また、「ａａｄＡ」はスペクチノマイシン耐性遺伝子を示し、「Ｂａｒｓｔａｒ」はバルスターをコードするＤＮＡを示し、「ＧＦＰ」はＧＦＰをコードするＤＮＡを示し、「ＴｐｓｂＡ」、「Ｔｒｐｓ１６」及び「ＴｒｂｃＬ」は各々ｐｓｂＡ遺伝子、タバコ葉緑体由来のリボソームタンパク質Ｓ１６をコードするＤＮＡ及びタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６遺伝子のターミネーターを示す。（Ｂ）は葉緑体においてＧＦＰを発現させるためのベクター（ｐＮｔａｇ；ｐＮｔａｇＢＳに対するコントロールベクター）の構成の一部を示す。
【図３】ｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎを導入した系統において、エストラジオール処理を施すことにより、バルナーゼの発現が誘導され、該系統の葉切片からの不定芽形成が阻害されたことを示す写真である。
【図４】葉緑体に導入したバルスターによってバルナーゼによる再分化不定芽の形成抑制が阻害されたことを示す写真である。「ｂａｒｎａｓｅ／ＧＦＰ」は核にバルナーゼ遺伝子、葉緑体にｐＮｔａｇを導入したタバコにおける結果を示し、「ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ」は核にバルナーゼ、葉緑体にｐＮｔａｇＢｓを導入したタバコにおける結果を示す（図５〜８においても同様）。
【図５】バルナーゼによる葉緑体の崩壊の様子と、バルスターによる該崩壊の抑制の様子とを観察した結果を示す、プロトプラスト細胞の顕微鏡写真である。「ＷＴ／ｂａｒｓｔａｒ」は核が野生型で葉緑体にｐＮｔａｇＢｓを導入したタバコにおける結果を示す（図７においても同様）。また、スケールバーは５０μｍであることを示す。
【図６】再分化不定芽のホモプラズミック化におけるバルナーゼ誘導の有無の影響を調べる工程を示す概略図、該工程において培養を開始してから２週間後及び４週間後に得られた再分化不定芽の蛍光顕微鏡写真、及び該４週間後に得られたプロトプラスト細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図７】ホモプラズミック性の不定芽の作出割合を示すグラフである。
【図８】ヘテロプラズミック性の一次再分化個体から調製した二次再分化不定芽のＧＦＰの蛍光を観察した顕微鏡写真である。なお、図中Ａのパネルは、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒの一次再分化個体  Ｂｎ／Ｂｓ−６から調製した二次再分化不定芽の観察結果を示し、ＢのパネルはＷＴ／ｂａｒｓｔａｒの一次再分化個体  ＷＴ／Ｂｓ−５から調製した二次再分化不定芽の観察結果を示す。
【図９】タバコ葉緑体のｔｒｎＩ及びｔｒｎＡ遺伝子のゲノム領域の概略図である。なお、図９の上部（野生型）は野生型のタバコ葉緑体のゲノム領域を示し、下部（組換え型）は、ｐＮｔａｇＢＳにより形質転換したタバコ葉緑体のゲノム領域を示す。また、「ＢｇｌII」は各ゲノム領域における制限酵素ＢｇｌIIの切断部位を示し、「ＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブ」は、内在性の葉緑体ＤＮＡ由来の配列であるＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブがハイブリダイズする部位を示す。
【図１０】葉緑体形質転換の材料であるｂａｒｎａｓｅ／ＷＴ（Ｂｎ／ＷＴ）及びヘテロプラズミック性の一次再分化個体（Ｂｎ／Ｂｓ−６）を、ＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブを用いたサザンブロットにより分析した結果を示す写真である。なお、図中「Ｍ」はサイズマーカーを示し、黒三角はｐＮｔａｇＢＳにより形質転換したタバコ葉緑体のゲノム由来のバンド（７．８ｋｂのシグナル）を示し、白三角は野生型のタバコ葉緑体のゲノム由来のバンド（４．５ｋｂのシグナル）を示す（図１１〜１３においても同じ）。
【図１１】葉緑体形質転換の材料である野生型の個体（ＷＴ／ＷＴ）及びヘテロプラズミック性の一次再分化個体（ＷＴ／Ｂｓ−５）を、ＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブを用いたサザンブロットにより分析した結果を示す写真である。
【図１２】ヘテロプラズミック性の一次再分化個体  Ｂｎ／Ｂｓ−６から調製した二次再分化個体を、ＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブを用いたサザンブロットにより分析した結果を示す写真である。各レーンに付された１〜２２の番号は各個体に付された番号（個体番号）を示し、アスタリスクは、野生型のタバコ葉緑体のゲノム由来のバンドが殆ど検出されない、ホモプラズミック化された細胞の構成比率が極めて高い植物体であることを示す。
【図１３】ヘテロプラズミック性の一次再分化個体  ＷＴ／Ｂｓ−５から調製した二次再分化個体を、ＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブを用いたサザンブロットにより分析した結果を示す写真である。各レーンに付された１〜３１の番号は個体番号を示す。
【図１４】「ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ」におけるエストラジオール非誘導的なバルナーゼ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた結果を示す、電気泳動の写真である。「ＮｔＡｃｔ９」は内部標準としてＲＴ−ＰＣＲによって増幅したアクチン遺伝子の結果を示し、「１」及び「２」はエストラジオール処理を施さなかった「ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ」の各々異なる個体における結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜形質転換方法＞
本発明の形質転換方法は、植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法であって、
前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を植物細胞内にて発現させる工程と、
前記細胞内小器官の回復因子をコードするＤＮＡと前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡとを含む発現カセットを該植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入する工程と、
前記植物細胞内にて前記発現カセットが導入されなかった前記細胞内小器官が、前記機能阻害因子により破壊される工程とを含む方法である。
【００１４】
そして、かかる方法によって、後述の実施例において示す通り、前記細胞内小器官の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の高い植物細胞や該植物細胞で殆ど構成されているホモプラズミック性の高い植物体等を効率的に作製することが可能となる。
【００１５】
なお、本発明において「ホモプラズミック」とは、細胞、組織、器官又は個体等において、前記細胞内小器官のＤＮＡの遺伝子型が単一で存在する状態のことを示し、特に断りのない限り、細胞、組織、器官又は個体等において、形質転換型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官のみが存在している状態のことを示す。すなわち、「ホモプラズミック性の植物細胞」とは、特に断りのない限り、形質転換型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官のみを有している植物細胞のことを示し、ホモプラズミック性の植物組織、植物器官又は植物体とは、ホモプラズミック性の細胞のみで構成されている植物組織、植物器官又は植物体のことを示す。また、「ホモプラズミック性の高い植物細胞」とは形質転換型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官の割合が高い（通常８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上）植物細胞のことを示し、「ホモプラズミック性の高い植物組織、植物器官又は植物体」とはホモプラズミック性の細胞及び／又はホモプラズミック性の高い植物細胞の構成比率が高い（通常８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上）植物組織、植物器官又は植物体のことを示す。
【００１６】
本発明において「ヘテロプラズミック」とは、細胞、組織、器官又は個体等において、異なる遺伝子型の前記細胞内小器官のＤＮＡが混在している状態のことを示す。すなわち、「ヘテロプラズミック性の植物細胞」とは、形質転換型ゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官と野生型ゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官とが混在している植物細胞のことを示し、「ヘテロプラズミック性の植物組織又は植物体」とは、ヘテロプラズミック性の植物細胞にて構成されている植物組織、器官若しくは植物体、又はホモプラズミック性の植物細胞（形質転換型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官のみを有している植物細胞、野生型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官のみを有する細胞）とヘテロプラズミック性の細胞とが混在している植物組織、植物器官若しくは植物体のことを示す。また、本発明において「ホモプラズミック性の植物細胞（形質転換型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官のみを有している植物細胞、野生型ゲノムＤＮＡを有する前記細胞内小器官のみを有する細胞）とヘテロプラズミック性の細胞とが混在している状態」のことを「キメラ性」とも称する。
【００１７】
本発明において「植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官」とは、核以外の独自のゲノムＤＮＡを有する植物細胞の細胞内小器官、すなわちプラスチド（色素体）又はミトコンドリアを意味する。なお、プラスチドは緑化組織においては葉緑体という名称を持つ器官として存在しており、他の植物組織では、アミロプラスト、エチオプラスト、エライオプラスト、有色体（ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ）、白色体（ｌｅｕｃｏｐｌａｓｔ）等の器官として存在している。また、植物体の全てのプラスチドはプロプラスチド（原色色素体）という未分化の色素体から分化して得られるものである。さらに、これらプラスチドは互いに分化ないし再分化し、各々の植物組織に必要な機能に応じて形態を変化させることができる。しかしながら、プラスチドＤＮＡはこれら形態変化に応じて変化することなく、またプラスチドＤＮＡに外来遺伝子を挿入した場合においても、これら形態変化に応じてかかる外来遺伝子の挿入は変化することはない。
【００１８】
本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、タバコ、ジャガイモ、ナス、ナタネ等の双子葉植物や、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等の単子葉植物が挙げられる。
【００１９】
また、本発明において「前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子」としては特に制限はなく、さらにかかる因子をコードするＤＮＡは前記発現カセットに１種のみ含まれていてもよく、複数種含まれていてもよい。
【００２０】
本発明にかかる「前記細胞内小器官の機能阻害因子」とは、前記細胞内小器官の機能を阻害することにより、該細胞内小器官の形成、発達、維持、増殖を抑制し、ひいては該細胞内小器官を破壊させる因子のことである。かかる機能阻害因子としては、好ましくは、ＤＮＡの複製、転写、分配、タンパク質合成、代謝等の前記細胞小器官における必須の機能に関与する因子又は該機能を標的とする因子であり、例えば、バルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）やＲＮａｓｅＴ１等のＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素、パパイン等のタンパク質分解酵素、アデニンヌクレオチド輸送体、ＤＴＡ（ジフテリア毒素Ａ鎖）が挙げられる。
【００２１】
これらの中では、後述の実施例において示す通り、対応する機能阻害因子と特異的に結合して当該因子の機能を効率良く抑制することができるバルスターと組み合わせて利用できるという観点から、本発明にかかる「前記細胞内小器官の機能阻害因子」はバルナーゼであることが好ましい。
【００２２】
なお、本発明にかかる「バルナーゼ」は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するＲＮＡ分解酵素であり、典型的には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｍ１４４４２で特定されるＤＮＡ配列がコードするタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質）のうち分泌移行シグナル領域（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の１〜２６番目のアミノ酸残基）を除くタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列のうちの４０〜１４９番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、以下「野生型バルナーゼ」とも称する）である。
【００２３】
また、本発明にかかる「バルナーゼ」のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。従って、このような変異体も、ＲＮＡ分解活性及びバルスターとの結合能が野生型バルナーゼのそれらと実質的に同等である限り、本発明に含まれる。
【００２４】
バルナーゼの変異体としては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列のうちの４０〜１４９番目のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「複数」とは、通常、２０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００２５】
また、バルナーゼにおいて、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の９９番目のグルタミン酸残基は、基質であるＲＮＡの結合に重要であり（Ｋａｔｒｉｎ  ＢＡＳＴＹＮＳら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、１９９４年、３００巻、７３７〜７４２ページ  参照）、さらに当該アミノ酸配列の１１２番目のグルタミン酸残基はバルスターとの結合に重要である（Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、２７０巻、１１１〜１２２ページ  参照）ことが報告されている。
【００２６】
なお、前記９９番目のグルタミン酸残基及び１１２番目のグルタミン酸残基は、各文献においては各々６０番目のグルタミン酸残基及び７３番目のグルタミン酸残基に相当する。
【００２７】
また、バルナーゼとバルスターとの結合に関与するアミノ酸残基は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の１２２番目のアルギニン残基、１２６番目のアルギニン残基、１４１番目のヒスチジン残基であり、それらアミノ酸残基を変異させた場合には、バルナーゼとバルスターの結合活性が低下又は消失することが報告されている（Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ及びＡｌａｎ  Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９５年、２４８巻、４７８〜４８６ページ、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９４年１０月１日、２巻、１０号、９４５〜９５１ページ、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、１６０巻、２１３〜２２６ページ  参照）。
【００２８】
なお、１２２番目のアルギニン残基、１２６番目のアルギニン残基及び１４１番目のヒスチジン残基は、各文献においては各々８３番目のアルギニン残基、８７番目のアルギニン残基及び１０２番目のヒスチジン残基に相当する。
【００２９】
さらに、バルナーゼ及びバルナーゼと基質との複合体については構造解析の結果が多々報告されている（バルナーゼのＸ線結晶構造解析については、「Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、１９９９年、５５巻、３８６〜３９８ページ  参照。バルナーゼのＮＭＲ解析については、Ｂｙｃｒｏｆｔ  Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、８６９７〜８７０１ページ  参照。バルスターのＸ線結晶構造解析については、Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｖ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１９９３年、１７巻、３２５〜３２８ページ  参照。バルナーゼと基質アナログであるグアノシンー３’−リン酸との複合体のＸ線結晶構造解析については、Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｖ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９３年、３３０巻、１３７〜１４０ページ  参照。バルナーゼと基質アナログであるデオキシテトラヌクレオチドＣＧＡＣとの複合体のＸ線結晶構造解析については、Ｂｕｃｋｌｅ  Ｍ．及びＦｅｒｓｈｔ  Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、３３巻、１６４４〜１６５３ページ。バルナーゼとバルスターの複合体のＸ線結晶構造解析については、Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｖ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１巻、１６５〜１７７ページ、及び、Ｂｕｃｋｌｅ  Ｍ．ら．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、３３巻、８８７８〜８８８９ページ  参照）。
【００３０】
そして、これらの構造解析の結果に基づき、バルナーゼの活性中心は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の１４１番目のヒスチジン残基及び１１２番目のグルタミン酸残基であることも報告されている（Ｍｏｓｓａｋｏｗｓｋａら．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８９年、２８巻、３８４３〜３８５０ページ  参照）。さらに、基質であるＲＮＡ分子中のグアニン塩基との結合には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の９６番目のセリン残基、９７番目のアスパラギン残基、９８番目のアルギニン残基及び９９番目のグルタミン酸残基が関与し、また、ＲＮＡ分子中のリン酸基との結合には当該アミノ酸配列の６６番目のリシン残基、１２２番目のアルギニン残基、１２６番目のアルギニン残基、１４１番目のヒスチジン残基が関与していることも明らかになっている。さらに、これらのアミノ酸残基においては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の６６番目のリシン残基、１１２番目のグルタミン酸残基及び１４１番目のヒスチジン残基を、各々他のアミノ酸残基に置換した場合には、バルナーゼの酵素活性が大幅に低下することも明らかになっている。
【００３１】
従って、本発明にかかる「バルナーゼ」としては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８６４４１．１で特定されるアミノ酸配列の６６番目のリシン残基、９６番目のセリン残基、９７番目のアスパラギン残基、９８番目のアルギニン残基、９９番目のグルタミン酸残基、１１２番目のグルタミン酸残基、１２２番目のアルギニン残基、１２６番目のアルギニン残基、１４１番目のヒスチジン残基には変異が導入されていないことが好ましい。
【００３２】
また、バルナーゼの変異体のＲＮＡ分解活性が野生型バルナーゼの活性と実質的に同等であるかどうかは、例えば、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、２７０巻、１１１〜１２２ページに記載の方法に沿って調べることができる。すなわち、バルナーゼの変異体一定量あたりによるＲＮＡ（例えば、酵母のトータルＲＮＡやｔＲＮＡ）の分解速度が、野生型バルナーゼのそれを１００とした際に、通常５〜２００、好ましくは１０〜１５０、より好ましくは３０〜１２０であれば、調べたバルナーゼの変異体のＲＮＡ分解活性が野生型バルナーゼのそれと実質的に同等であると判定することができる。
【００３３】
さらに、バルナーゼの変異体のバルスターとの結合能が野生型バルナーゼのそれと実質的に同等であるかどうかは、例えば、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ、好ましくは０．００１ｐＭ〜１０ｐＭ（後述の野生型バルスターに対する野生型バルナーゼの解離定数（０．０１ｐＭ）の０．１〜１０００倍）、より好ましくは０．００１ｐＭ〜０．１ｐＭ（後述の野生型バルスターに対する野生型バルナーゼの解離定数（０．０１ｐＭ）の０．１〜１０倍）であれば、調べたバルナーゼの変異体のバルスターとの結合能が野生型バルナーゼのそれと実質的に同等であると判定することができる。
【００３４】
また、本発明にかかる「前記細胞内小器官の機能阻害因子」は、「前記細胞内小器官への移行シグナルペプチド」を付加したとしても、それらの融合タンパク質の合成自体は細胞質内において行われるため、前記植物細胞が死ぬ蓋然性が高いことが予想された。しかしながら、驚くべきことに、後述の実施例において示す通り、「前記細胞内小器官の機能阻害因子」に「前記細胞内小器官への移行シグナルペプチド」を付加することにより、植物細胞自体の死を避けつつ、前記細胞内小器官のみを特異的に破壊できることを見出した。
【００３５】
従って、本発明にかかる「前記細胞内小器官への移行シグナルペプチド」は、前記機能阻害因子と融合させた形式にて植物細胞の細胞質等において合成されることにより、該機能阻害因子をプラスチド又はミトコンドリアに移行させるシグナルを有していればよく、例えば、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（ＲｂｃＳ）の葉緑体移行シグナルペプチド（Ｎｉｗａ  Ｙら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９９年、１８巻、４号、４５５〜４６３ページ  参照）、ＣＲＲ４の葉緑体移行シグナル（Ｏｋｕｄａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、２８１巻、４９号、３７６６１〜３７６６７ページ  参照）、ＡｔＴａｄＡの葉緑体移行シグナル（Ｋａｒｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｃｋ、ＲＮＡ、２００９年、１５巻、１２５１〜１２５７ページ  参照）ミトコンドリアＲＮＡエディティング因子（ＭＥＦ１）遺伝子（Ｚｅｈｒｍａｎｎ  Ａら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００９年２月、２１巻、５５８〜５６７ページ  参照）のミトコンドリア移行シグナルペプチドなどが挙げられる。
【００３６】
かかる移行シグナルペプチドと前記機能阻害因子との融合の形式は、該移行シグナルが機能すれば特に制限はなく、前記機能阻害因子のＮ末端側、Ｃ末端側のいずれに前記移行シグナルペプチドを融合させてもよく、さらに直接的に、又はリンカーを介して間接的に融合させてもよい。かかるリンカーペプチドの長さが通常１〜１００アミノ酸であり、好ましくは１〜３０アミノ酸である。
【００３７】
また、本発明において「前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質」は、さらに他の機能性タンパク質と融合していてもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、前記融合タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、又は前記機能阻害因子と前記移行シグナルペプチドとの間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、融合タンパク質に付与したい機能が該融合タンパク質の精製や検出等であれば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼタンパク質、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
【００３８】
本発明において、前記融合タンパク質を植物細胞内にて発現させる方法としては特に制限はなく、適宜公知の手法を選択して利用することができる。かかる公知の技術としては、例えば、後述の「前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含むベクター（以下、「細胞内発現用ベクター」とも称する）」を植物細胞に導入する方法が挙げられる。
【００３９】
なお、本発明にかかる「植物細胞」には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【００４０】
また、前記融合タンパク質の植物細胞内における発現は、一過的なものであってもよく、恒常的なものであってもよく、刺激に応答して誘導されるものであってもよいが、前記融合遺伝子の発現は、前記細胞内小器官の機能阻害を介して、前記植物細胞からなる植物体の成育に影響するという観点から、前記機能阻害因子の発現は、刺激に応答して誘導されることが好ましい。かかる刺激としては、例えば、特定の化合物の存在下又は非存在下における生育、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射が挙げられる。
【００４１】
これらの刺激においては、植物体や培養細胞が非意図的な刺激を環境から受ける可能性があることや、目的遺伝子の非誘導的な発現が低いものの一定程度みとめられるが、通常環境中には存在しない特定の化学物質であれば、植物体や培養細胞が非意図的な刺激を受けることはなく、中でも誘導安定性の知見が豊富にあり非誘導的な発現が低いことから、エストラジオール、テトラサイクリン、デキサメタゾン、テブフェノジド、メトキシフェノジド、エタノール、銅の存在下における生育であることが好ましい。
【００４２】
なお、本発明にかかるエストラジオールによる前記機能阻害因子の発現誘導は、双子葉植物を本発明の対象とする際にはＺｕｏ  Ｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、２０００年、２４巻、２６５〜２７３ページに記載のベクターや方法を用いて行うことができる。また、単子葉植物を本発明の対象とする場合にはＯｋｕｚａｋｉ  Ａ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２０１１年、３０巻、５２９〜５３８ページに記載のベクターや方法を用いて当該発現誘導を行うことができる。
【００４３】
また、前記融合タンパク質の植物細胞内における発現が恒常的なもの又は刺激に応答して誘導されるものである場合には、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡは該植物細胞の核ゲノムＤＮＡに挿入されることになるが、かかる場合、核ゲノムＤＮＡの挿入遺伝子（前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ）のコピー数は低コピー（１〜５）であることが好ましく、１コピーであることがより好ましい。前記発現が刺激に応答して誘導されるものであっても該刺激に非依存的な発現が僅かに生じることがあり、さらにこの僅かな発現でも植物の生長を阻害する場合があるため、前記コピー数が多いと前記刺激に非依存的な発現量が増加する傾向にある。また前記コピー数が多いと、サイレンシングにより前記融合タンパク質の植物細胞内における発現が抑制され易くなる傾向にもあるため、前述の通り、前記コピー数は低コピーであることが好ましい。
【００４４】
また、後述の実施例において示す通り、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが核ゲノムＤＮＡに１コピー挿入され、ヘテロ接合体である場合にも十分に機能することが実証されているため、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを核ゲノムＤＮＡに導入した当代の植物を前述の植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換に利用できることが明らかになっている。従って、前記細胞内小器官の形質転換における時間と労力を低減させるという観点から、さらにホモ接合体にした場合には前記刺激に非依存的な発現量が増加する傾向にあるという観点から、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを核ゲノムＤＮＡに導入した植物はヘテロ接合型のものであることが好ましく、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが核ゲノムＤＮＡに１コピー挿入されているヘテロ接合型のものであることがより好ましい。
【００４５】
また、本発明の前記ベクターを植物細胞に導入する方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法、レーザーアブレーションを用いる方法、ウイスカ法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００４６】
本発明にかかる「前記細胞内小器官の回復因子」は、前記機能阻害因子による前記細胞内小器官の機能の阻害を直接的に又は間接的に抑制できる因子のことを意味する。かかる回復因子としては、例えば、前記機能阻害因子としてバルナーゼを利用する場合には、バススターが挙げられる。さらに、前記機能阻害因子に結合することにより該因子の機能を阻害する物質、より具体的には、前記機能阻害因子に対する抗体（一本鎖抗体、ナノ抗体）、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーが挙げられる。
【００４７】
なお、本発明にかかる「バルスター」は、バチルス・アミロリケファシエンスに由来し、バルナーゼに特異的に結合する細胞内阻害因子であり、典型的には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｘ１５５４５で特定されるＤＮＡ配列がコードするタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＡ３３５５１．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質）（以下「野生型バルスター」とも称する）である。
【００４８】
また、本発明にかかる「バルスター」のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。従って、このような変異体も、バルナーゼとの結合能が野生型バルスターのそれと実質的に同等である限り、本発明に含まれる。
【００４９】
バルスターの変異体としては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＡ３３５５１．１で特定されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「複数」とは、通常、２０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００５０】
また、バルスターにおいては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＡ３３５５１．１で特定されるアミノ酸配列の３９番目のアスパラギン酸残基はバルスターとの結合に重要であることが報告されている（Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、２７０巻、１１１〜１２２ページ  参照）。
【００５１】
なお、本明細書において、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＡ３３５５１．１で特定されるアミノ酸配列においては、最初のメチオニン残基（開始コドンがコードするメチオニン残基）を０番目として各アミノ酸残基を特定することにする。
【００５２】
さらに、バルナーゼとバルスターとの結合に関与するアミノ酸残基は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＡ３３５５１．１で特定されるアミノ酸配列においては、３５番目のアスパラギン酸残基、３９番目のアスパラギン酸残基であり、それらアミノ酸残基を変異させた場合には、バルナーゼとバルスターの結合活性が低下又は消失することが報告されている（Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ及びＡｌａｎ  Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９５年、２４８巻、４７８〜４８６ページ、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９４年１０月１日、２巻、１０号、９４５〜９５１ページ、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、１６０巻、２１３〜２２６ページ  参照）。
【００５３】
従って、本発明にかかる「バルスター」としては、これらアミノ酸残基には変異が導入されていないことが好ましい。
【００５４】
また、野生型バルナーゼとのバルスターの変異体の結合能が野生型バルスターのそれと実質的の同等であるどうかは、例えば、Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、２７０巻、１１１〜１２２ページに記載の方法に沿って得られる、バルスターの変異体とバルナーゼとの解離定数が、通常０．００１ｐＭ〜１ｎＭ（後述の野生型バルスターに対する野生型バルナーゼの解離定数（０．０１ｐＭ）の０．１〜１０万倍）、好ましくは０．００１ｐＭ〜１０ｐＭ（後述の野生型バルスターに対する野生型バルナーゼの解離定数（０．０１ｐＭ）の０．１〜１０００倍）、より好ましくは０．００１ｐＭ〜０．１ｐＭ（後述の野生型バルスターに対する野生型バルナーゼの解離定数（０．０１ｐＭ）の０．１〜１０倍）であれば、調べたバルスターの変異体の野生型バルナーゼとの結合能が野生型バルスターのそれと実質的に同等であると判定することができる。
【００５５】
本発明において、「前記回復因子をコードするＤＮＡと前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡとを含む発現カセットを該植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入する方法としては特に制限はなく、適宜公知の手法を選択して利用することができる。かかる公知の技術としては、例えば、後述の「前記細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡを含む発現カセットと、該発現カセットの両側に位置し、前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列とを含有するベクター（以下、「細胞内小器官形質転換用ベクター」とも称する）」を植物細胞に導入する方法が挙げられる。
【００５６】
なお、本発明の当該ベクターを植物細胞に導入する方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法（Ｏ‘Ｎｅｉｌｌ  Ｃら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９３年、３巻、５号、７２９〜７３８ページ  参照）、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａ  Ｋら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９８年４月、１４８巻、１８２１〜１８２８ページ  参照）、アグロバクテリウムを介する方法（Ｂｌｏｃｋ  Ｄｅ  Ｍら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８５年、４巻、６号、１３６７〜１３７２ページ  参照）、レーザーアブレーション法（例えば、細胞内小器官形質転換用ベクターを結合させた金粒子をレーザーにより植物細胞の細胞小器官に導入する方法、Ｋａｊｉｙａｍａ  Ｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００８年、１０６巻、２号、１９４〜１９８ページ  参照）、パーティクルガン法、ウイスカ法（Ｎａｇａｔａｎｉ  Ｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｔｅｃｈ．、１９９７年、１１巻、４７１〜４７３ページ、Ｆｒａｍｅ  ＢＲら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９４年、６巻、９４１〜９４８ページ  参照）等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００５７】
また、プラスチド（葉緑体）への遺伝子導入を、例えば、ポテトにおいて行う場合には、Ｓｉｄｏｒｏｖら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９９年、１９巻、２号、２０９〜２１６ページに記載の方法を参照して行うことができ、トマトにおいて行う場合には、例えば、Ｒｕｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１年、１９巻、８７０〜８７５ページ（非特許文献３）に記載の方法を参照して行うことができ、キャノーラにおいて行う場合には、Ｈｏｕら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、１２巻、１１１〜１１４ページに記載の方法を参照して行うことができる。さらに、レスクェラフェンドリにおいて行う場合には、Ｓｋａｒｊｉｎｓｋａｉａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、１２巻、１１５〜１２２ページに記載の方法を参照して行うことができ、ペチュニアにおいて行う場合には、Ｚｕｂｋｏら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、１３巻、５２３〜５３０ページに記載の方法を参照して行うことができる。また、ダイズにおいて行う場合には、Ｄｕｆｏｕｒｍａｎｔｅｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年、５５巻、４７９〜４８９ページに記載の方法を参照して行うことができ、ニンジンにおいて行う場合には、Ｋｕｍａｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４年、１３６巻、２８４３〜２８５４ページに記載の方法を参照して行うことができ、ワタにおいて行う場合には、Ｋｕｍａｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年、５６巻、２０３〜２１６ページに記載の方法を参照して行うことができる。さらに、ポプラにおいて行う場合には、Ｏｋｕｍｕｒａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、２００６年、１５巻、６３７〜６４６ページに記載の方法を参照して行うことができ、レタスにおいて行う場合には、Ｌｅｌｉｖｅｌｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００５年、５８巻、７６３〜７７４ページに記載の方法を参照して行うことができ、シロイヌナズナにおいて行う場合には、Ｓｉｋｄａｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９９８年、１８巻、２０〜２４ページに記載の方法を参照して行うことができる。また、カリフラワーにおいて行う場合には、Ｎｕｇｅｎｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、１７０巻、１３５〜１４２ページに記載の方法を参照して行うことができ、キャベツにおいて行う場合には、Ｌｉｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２００７年、２６巻、１７３３〜１７４４ページに記載の方法を参照して行うことができ、シュガービートにおいて行う場合には、Ｄｅ  Ｍａｒｃｈｉｓら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、２００９年、１８巻、１７〜３０ページに記載の方法を参照して行うことができる。さらに、タバコ（ベンサミアナ）において行う場合には、Ｄａｖａｒｐａｎａｈら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、５２巻、２４４〜２５０ページに記載の方法を参照して行うことができ、ナスにおいて行う場合には、Ｓｉｎｇｈら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，２０１０年、１９巻、１１３〜１１９ページ（非特許文献６）に記載の方��を参照して行うことができ、イネにおいて行う場合には、Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、２００６年、２１巻、３号、４０１〜４１０ページ（非特許文献９）に記載の方法を参照して行うことができる。
【００５８】
そして、かかる方法によって植物細胞の前記細胞内小器官に導入された前記発現カセットは、該発現カセットの両側に位置する前記ＤＮＡ配列と前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡとの間にて相同組換えが生じることによって、前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入されることになる。
【００５９】
以上、本発明の形質転換方法にかかる各工程について説明したが、当該方法は、より詳しくは以下の通り実施することができる。
【００６０】
例えば、タバコ等の双葉用植物に本発明の形質転換方法を適用する場合には、先ず、該植物の植物細胞（例えば、葉の植物細胞）に前記公知の方法にて、本発明にかかる細胞内発現用ベクターを導入する。次いで、かかる植物細胞からカルス（又は該カルスから出芽した不定芽）を調製し、さらに前記ベクターがゲノムＤＮＡに導入されたカルス等を選抜する。なお、かかる選抜は公知のＤＮＡ検出技術（例えば、ＰＣＲ、サザンブロッティング、シークエンシング）を用いて行うことが出来る。次に、このようにして得られたカルス等を植物個体に再生させた後、該個体の植物細胞（例えば、葉切片）に本発明にかかる細胞内小器官形質転換用ベクターを前記公知の方法にて導入する。次いで、かかる植物細胞からカルス等を調製し、さらに当該ベクターが前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入されたカルス等を前記公知のＤＮＡ検出技術を用いて選抜する。
【００６１】
そして、このようにして得られたカルス等の植物細胞においては、後述の実施例において示す通り、前記胞内小器官形質転換用ベクターが導入されなかった前記細胞内小器官は前記機能阻害因子によって積極的に破壊されるため、発現されることが所望されている因子が発現している前記細胞内小器官の割合が高くなる。
【００６２】
また、以上の方法でホモプラズミック性の植物個体又はホモプラズミック性の高い植物個体が得られなくとも、後述の実施例において示す通り、本発明の方法によれば、ヘテロプラズミック性の個体（ヘテロプラズミック性の植物細胞にて構成されている植物体やキメラ性の植物体）から再度カルス等を調製し、該カルス等から植物個体を再生させることにより、効率良くホモプラズミック性の植物個体又はホモプラズミック性の高い植物個体を得ることができる。
【００６３】
また、後述の通り、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含む細胞内小器官形質転換用ベクターを用いることにより、当該ベクターが前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入されたカルス等を選択圧をかけて培養（例えば、薬剤等を添加した培地上での培養）することにより選択することができる。
【００６４】
さらに、前記機能阻害因子の発現を刺激を与えて誘導する場合には、特に選択マーカーを含む細胞内小器官形質転換用ベクターを用いることが好ましい。前記細胞内小器官形質転換用ベクターが導入されたごく最初の期間は、前記回復因子を発現する葉緑体が少なすぎるため、かかる期間に刺激を与えて前記機能阻害因子の発現を誘導した場合には植物細胞の葉緑体の大部分を占める野生型葉緑体を崩壊させることになり、前記細胞内小器官形質転換用ベクターが導入された植物細胞でさえ増殖が困難となる。そのため、細胞内小器官形質転換用ベクターとして選択マーカーを含むものを用い、当該ベクターを導入した植物細胞を先ずは該選択マーカーに対応する選択圧をかけて培養した後に、前記機能阻害因子を刺激に応答させて誘導発現させることが特に好ましい。
【００６５】
従って、本発明の形質転換方法の好適な一態様として下記も挙げられる。
【００６６】
植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官の形質転換方法であって、
前記細胞内小器官の回復因子をコードするＤＮＡと、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡと、選択マーカーをコードするＤＮＡとを含む発現カセットを、植物細胞の前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入する工程と、
前記選択マーカーに対応する選択圧をかけて、前記植物細胞を培養する工程と、
前記培養の後に、前記細胞内小器官の機能阻害因子と前記細胞内小器官への移行シグナルペプチドとを含む融合タンパク質を前記植物細胞内にて、刺激に応答させて誘導発現させる工程と、
前記植物細胞内にて前記発現カセットが導入されなかった前記細胞内小器官が、前記機能阻害因子により破壊される工程と、
を含む方法。
【００６７】
「前記選択マーカーに対応する選択圧をかけて、前記植物細胞を培養する期間」としては、３〜２０週間であることが好ましく、４〜８週間であることがより好ましい。前記期間が前記下限未満であると、形質転換した前記細胞内小器官を含む細胞の増殖が組織を形成するのに十分ではなく、再分化不定芽形成に至り難い傾向にあり、前記上限を超えると、供試した外植体の再分化能が低下する傾向がある他、培養変異により奇形の植物や雄性不稔性の植物が得られる可能性が高くなるなどの望ましくない性質があらわれることもあり、さらに選択マーカーによっては内在性の遺伝子に変異を生じることで選択圧に耐性となった非葉緑体形質転換体の再分化不定芽が得られ易い傾向にある。
【００６８】
また、かかる選択圧として、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、除草剤等の薬剤の培地への添加が挙げられる。さらに、かかる薬剤の培地に添加する濃度は、用いる薬剤の種類や選択マーカーの発現強度を考慮しながら、当業者であれば適宜調製することができる。
【００６９】
なお、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡが導入された植物細胞の選抜には、抗生物質や除草剤等の薬剤による選択が従前より行われている。しかしながら、かかる薬剤による選択のみでは、該ＤＮＡが導入された植物細胞をうまく選抜することができず、ヘテロプラズミック性やキメラ性の形質転換体しか得られない植物種もある。また、かかる方法によってホモプラズミック性の形質転換体が得られる植物種においても、長い期間をかけての選抜を要する。
【００７０】
そこで、前記の通り、薬剤等による選択と、前記機能阻害因子及び前記回復因子を利用した選択とを組み合わせた２段階の選抜を行うことにより、いずれの植物においてもホモプラズミック化を促進することができる。さらに、プラスチド等の形質転換の効率が極めて低く、わずかな形質転換プラスチド等しか含まない植物細胞等しか得られず、ＰＣＲ分析でしか組換え型ＤＮＡが検出できなかった植物種についても、２段階選抜により形質転換プラスチド等の割合を向上させることが可能となる。
【００７１】
また、カルス等からの植物個体の再生は、当該技術分野における常法を用いることができる。かかる常法としては、例えば、「Ｎａｇａｔａら、Ｐｌａｎｔａ、１９７１年、９９巻、１２〜２０ページ」、「Ａｋａｍａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９９２年、１２巻、７〜１１ページ」、「Ｖｉｓｓｅｒら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、７８巻、５９４〜６００ページ」、「Ｓｈｉｌｌｉｔｏら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８９年、７巻、５８１〜５８７ページ」、「Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１９９０年、２巻、６０３〜６１８ページ」、に記載された方法が挙げられる。
【００７２】
さらに、例えば、タバコ以外の植物に本発明の形質転換方法を適用する場合には、ナス科の植物においてはタバコと同様に葉切片を、ナタネ等のブラシカ属の植物においては葉切片の代わりに無菌播種した幼植物の胚軸を、カボチャ等のウリ科の植物においては子葉外植体の基底部を、遺伝子導入の対象となる外植体として各々選択することにより、前記タバコ等の場合と同様の方法にて、本発明を実施することができる。（カボチャ等については、Ｎａｎａｓａｔｏ  Ｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０１１年８月、３０巻、８号、１４５５〜１４６４ページ  参照）。さらに、単子葉植物の場合、例えば、イネにおいては葉切片の代わりに種子由来のカルスを、ムギ類及びトウモロコシにおいては葉切片の代わりに未熟胚由来のカルス又は子葉由来のカルスを、遺伝子導入の対象となる外植体として選択することにより、前記タバコ等の場合と同様の方法にて、本発明を実施することができる（トウモロコシにおいて、種子由来のカルスを用いる方法については、Ｉｓｈｉｄａ  Ｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００７年、２巻、７号、１６１４〜１６２１ページに記載の方法又はＯｎｅｔｏら、Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｊｏｕｒａｎｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０年、５巻、２５号、３５６１〜３５７０ページに記載の方法を参照のこと、子葉由来のカルス方法については、Ａｈｍａｄａｂａｄｉら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，２００７年、１６巻、４３７〜４４８ページに記載の方法を参照のこと）。
【００７３】
＜形質転換用ベクター＞
本発明は、前記形質転換方法に好適に用いられる、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも一つのベクターを提供する。
（ａ）前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含むベクター
（ｂ）前記細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡを含む発現カセットと、該発現カセットの両側に位置し、前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列とを含有するベクター。
【００７４】
本発明の前記（ａ）に記載のベクターにおいて、「前記植物細胞において機能するプロモーター」は前述の通り、植物細胞において前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターである。
【００７５】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターが挙げられる。
【００７６】
また、誘導的に発現させるためのプロモーター、すなわち前記刺激に応答して発現を誘導するプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ８０遺伝子とｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６は植物ホルモンのアブシジン酸によっても誘導される。さらに、エタノールによって誘導されるａｌｃプロモーターや、テトラサイクリンによって誘導されるテトラサイクリン応答性プロモーターも挙げることができる。また、後述の実施例において示すような、特定の化学物質の受容体と特定の転写活性ドメイン等とを融合させたタンパク質を恒常的に細胞内に発現させ、当該融合タンパク質が前記化学物質を受容した際に核へ移行して、前記転写活性ドメインが結合することにより、下流に存する遺伝子の発現を誘導することができるプロモーターも挙げることができる。かかるプロモーターとしては、例えば下記プロモーターが挙げられる。
【００７７】
大腸菌のＳＯＳレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）のリプレッサーであるＬｅｘＡの部分配列、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）由来のＶＰ１６の転写活性ドメイン及びエストロゲン受容体の制御領域が融合した合成転写活性化因子ＸＶＥと、エストラジオールとが結合することによって活性化されるＬｅｘＡ応答配列を備えたプロモーター（図２の（Ａ）  参照）、
Ｃ１転写活性ドメイン及びエストロゲン受容体が融合した合成転写活性化因子と、エストラジオールとが結合することによって活性化される、ＥＲ応答配列を備えたプロモーター（Ｂｒｕｃｅ  Ｗ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２０００年、１２巻、６５〜８０ページ  参照）、
ＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位、ＶＰ１６の転写活性ドメイン及びエストロゲン受容体リガンド結合部位が融合した合成転写活性化因子と、エストラジオールとが結合することによって活性化される、ＧＡＬ４応答配列を備えたプロモーター（Ｚｈａｎｇ  Ｓ．、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ、２００１年、２３６巻、８５〜９６ページ  参照）、
ＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位、ＶＰ１６の転写活性ドメイン及びグルココルチコイド受容体リガンド結合部位が融合した合成転写活性化因子と、デキサメタゾンとが結合することによって活性化される、ＧＡＬ４応答配列を備えたプロモーター（Ａｏｙａｍａ  Ｔ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９７年、１１巻、６０５〜６１２ページ  参照）、
テトラサイクリンリプレッサー、ＶＰ１６の転写活性ドメイン及びグルココルチコイド受容体リガンド結合部位が融合した合成転写活性化因子と、デキサメタゾンとがテトラサイクリン非存在下にて結合することによって活性化される、ＧＡＬ４応答配列を備えたプロモーター（Ｂｏｈｎｅｒ  Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９９年、１９巻、８７〜９５ページ  参照）、
グルココルチコイド受容体ＤＮＡ結合部位、ＶＰ１６の転写活性ドメイン及びＨｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓエクジソン受容体リガンド結合部位が融合した合成転写活性化因子と、テブフェノジドとが結合することによって活性化される、グルココルチコイド受容体応答配列を備えたプロモーター（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９９年、１９巻、９７〜１０６ページ  参照）、
ＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位、ＶＰ１６の転写活性ドメイン及びＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａエクジソン受容体が融合した合成転写活性化因子と、メトキシフェノジドとが結合することによって活性化される、ＧＡＬ４応答配列を備えたプロモーター（Ｐａｄｉｄａｍ  Ｍ．ら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，ｅｃｄｙｓｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔｓ．」、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、２００３年、１２巻  参照）、
ＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位、Ｃ１転写活性ドメイン及びＯｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓエクジソン受容体が融合した合成転写活性化因子と、メトキシフェノジドとが結合することによって活性化される、ＧＡＬ４応答配列を備えたプロモーター（Ｕｎｇｅｒ  Ｅ．、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、２００２年、１１巻、４５５〜４６５ページ  参照）。
【００７８】
また、これらプロモーターの例の記載からも明らかなように、当業者であれば、特定の化学物質と、それに対応した受容体と、転写活性化部位と、ＤＮＡ結合部位と、該ＤＮＡ結合部位に対応した応答配列を備えたプロモーターとを適宜選択して組み合わせ、植物細胞において前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを誘導的に発現させるためのシステムを構築することが可能である。さらに、かかるシステムにおいて、当該ＤＮＡの発現等を指標として、合成転写活性化因子のアミノ酸置換体やプロモーターの塩基置換体も、当業者であれば適宜公知の技術を用いて調製することができる。
【００７９】
本発明の前記（ｂ）に記載のベクターにおいて、「前記細胞内小器官において機能する第一のプロモーター及び第二のプロモーター」は前記細胞内小器官において特異的に、前記回復因子をコードするＤＮＡ又は前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターである。
【００８０】
かかるプロモーターとしては、前記細胞内小器官がプラスチドである場合には、例えば、葉緑体由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーター（Ｐｒｒｎ２）、葉緑体由来の光合成関連遺伝子ｐｓｂＡのプロモーター（ＰｐｓｂＡ）、葉緑体由来の光合成関連遺伝子ｒｂｃＬプロモーター、ｐｓａＡプロモーターが挙げられる。前記細胞内小器官がミトコンドリアである場合には、例えば、ＡＴＰ９プロモーター、ｒｒｎ２６プロモーター、ｒｒｎ１８プロモーターが挙げられる。
【００８１】
なお、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターとは同じ種類のプロモーター（例えば、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターとは共にＰｒｒｎ２）であってもよく、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターとは異なる種類のプロモーター（例えば、前記第一のプロモーターがＰｒｒｎ２であり、前記第二のプロモーターがＰｐｓｂＡ）であってもい。また、前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターとは異なっていてもよく、同一であってもよい。すなわち、前記細胞小器官においては一つのプロモーターに複数の遺伝子を連結させて一つのターミネーター配列を連結し、ポリシストロニックにｍＲＮＡを発現させ、翻訳の段階でそれぞれの単一のタンパク質を合成することができるため（Ａｒａｉ  Ｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００４年、４５巻、９号、１１７６〜１１８４ページ  参照）、複数の遺伝子（前記回復因子をコードする遺伝子、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードする遺伝子、後述の選択マ―カー等）を単一のプロモーター（前記第一のプロモータ−または前記第二のプロモーター）及びターミネーターによって発現させてもよい。
【００８２】
さらに、前記発現カセットに、発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡが複数種含まれている場合には、該複数種のＤＮＡそれぞれに対して前記第二のプロモーターを作動可能に連結させてもよい。この場合、複数の前記第二のプロモーターは互いに同じ種類のプロモーターであってもよく、互いに異なった種類のプロモーターでもよい。さらに、前述したように、複数種の発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡを一のポリシストロニックｍＲＮAとして発現させるべく、前記第二のプロモーターは単一のプロモーターであってもよい。
【００８３】
本発明の前記（ｂ）に記載のベクターにおいて、「前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列」としては、前記細胞内小器官がプラスチドである場合には、例えば、葉緑体のｔｒｎＩ遺伝子、ｔｒｎＡ遺伝子、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤを含む葉緑体ゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列が挙げられる。前記細胞内小器官がミトコンドリアである場合には、例えば、ｒｒｎ１８又はｒｒｎ２６を含むミトコンドリアゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列が挙げられる。また「前記細胞内小器官に特異的なゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列」としては、前記発現カセットが挿入される部位が遺伝子をコードしていない領域であり、該領域を含むゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列であることが好ましく、さらに当該挿入される部位を中心として約１０００〜４０００塩基の範囲内のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ配列であることがより好ましい。
【００８４】
また、本発明のベクターは、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリリンカー、エンハンサー、リボゾーム結合部位等を適宜含むことができる。一般に、前記プロモーターの下流に、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ等が位置し、さらに該遺伝子の下流にターミネーターが位置する。
【００８５】
かかるターミネーターとしては、例えば、ｐｓｂＡ遺伝子のターミネーター（ＴｐｓｂＡ）、葉緑体由来のリボソームタンパク質Ｓ１６のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）、葉緑体由来のｒｐｓ１６遺伝子のターミネーター（ＴｒｂｃＬ）、ミトコンドリア由来ＡＴＰ９ターミネーター、ｒｒｎ２６ターミネーター、ｒｒｎ１８ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターを挙げることができる。
【００８６】
また、選択マーカーを含むベクターを用いることにより、後述の実施例において示す通り、植物細胞における本発明のベクターが導入の有無を薬剤等の添加により選抜することができる。かかる選択マーカーとしては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ）、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子（ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素阻害型除草剤耐性遺伝子（ｍＡＬＳ））等が挙げられる。
【００８７】
＜植物の形質転換体＞
本発明は、前記形質転換方法により作製された形質転換体を提供する。また、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも一つのＤＮＡが導入された形質転換体も提供する
（ａ）前記植物細胞において機能するプロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結している前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）植物における独自のゲノムＤＮＡを有する細胞内小器官において機能する第一のプロモーター、該第一のプロモーターに作動可能に連結している前記回復因子をコードするＤＮＡ、前記細胞内小器官において機能する第二のプロモーター、及び該第二のプロモーターに作動可能に連結している前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子をコードするＤＮＡ。
【００８８】
なお、前記（ｂ）のＤＮＡは、前記細胞内小器官において機能するプロモーターや発現されることが所望されている因子をコードしている。したがって、本発明の形質転換体において、前記（ｂ）のＤＮＡは前記細胞内小器官のゲノムＤＮＡに導入されるものである。
【００８９】
また、本発明の形質転換方法によれば、前記細胞内小器官の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の高い植物細胞にて殆ど構成されているホモプラズミック性の高い植物体を効率的に作製することができる。一旦、かかるホモプラズミック性の高い植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫又はクローンを得ることができる。すなわち、一旦、ホモプラズミック性の高い植物体が得られれば、交配等で作出した後代個体において、バルナーゼ等が遺伝分離して抜けた場合でも、該後代個体のホモプラズミック性は維持されるため、ホモプラズミック性の高い個体の自殖後代を作出することによって、又はホモプラズミック性の高い個体を雌性親として交配することによって、ホモプラズミック性の高い植物体の子孫を得ることができる。また、ホモプラズミック性の高い個体由来のさし芽によって、ホモプラズミック性の高い個体由来の葉や根を無菌的に培養して脱・再分化させた植物を育成することによって、ホモプラズミック性の高い植物体のクローンを得ることができる。
【００９０】
さらに、本発明においては、該植物体のみならず、その子孫又はクローンから得られる繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、カルス、プロトプラスト等）、該植物体を構成する植物細胞、植物組織（例えば、表皮、維管束）及び植物器官（例えば、葉、茎、根）も本発明の形質転換体として提供することができる。
【００９１】
さらに、本発明は、前記細胞内小器官において発現されることが所望されている因子の発現産物を含む、前記形質転換体の加工物を提供する。
【００９２】
かかる加工物は、従来より植物から作られている加工物全般のことであり、例えば、植物体からの抽出液、植物体の乾燥粉末、加工食品が挙げられる。また、かかる加工食品としては、イネであれば米飯及び煎餅等、小麦であればパン及び麺類等、トウモロコシであればコーン油、コーンスターチ及びコーンチップス等、ダイズであれば大豆油、豆腐及び納豆等、ジャガイモであればポテトチップス及びデンプン等、トマトであればケッチャップ等、キャノーラであればキャノーラ油等が挙げられる。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９４】
（実施例１）
＜バルナーゼ誘導発現バイナリーベクター  ｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎの作製及びアグロバクテリウムへの導入＞
バルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）をエストラジオールによって誘導発現し、葉緑体へ移行して機能させるため、「Ｚｕｏ  Ｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、２０００年、２４巻、２６５〜２７３ページ」の記載に準じて、ｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎを設計し、下記の通り作製した。【００９５】
先ず、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来バルナーゼ遺伝子配列を持つプラスミドベクターｐＢａｒｎａｓｅを鋳型とし、プライマーｂｎＦ−ＳａｌＩ（５’−ＧＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧＴＴ−３’、配列番号：１）及びプライマーｂｎＲ−ＰａｃＩ（５’−ＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＴＣ−３’、配列番号：２）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅断片をクローニングサイトの隣接部位にＸｈｏＩサイトを持つｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入してクローニングを行い、ｐＢｎＳＰとした。【００９６】
また、シロイヌナズナ由来ＲｂｃＳ−１Ａの葉緑体移行シグナル配列を増幅するため、ＲｂｃＳ−１Ａが挿入されているプラスミドベクターを鋳型としてプライマーＡｔＴＰＦ−ＸｈｏＩ  ５’−ＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＣ−３’（下線部はＸｈｏＩサイトを示す。配列番号：３）及びプライマーＡｔｔＴＰＲ−ＳａｌＩ  ５’−ＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＴＡＡＣＴＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴ−３’（下線部はＳａｌＩサイトを示す。配列番号：４）を用いてＰＣＲ法により増幅断片を得た。そして、得られたＲｂｃＳ−１Ａの葉緑体移行シグナル配列０．１７Ｋｂの増幅断片をＸｈｏＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＢｎＳＰのＸｈｏＩ／ＳａｌＩサイトへ挿入し、ｐＴＰｂａｒｎａｓｅとした。次いで、ｐＴＰｂａｒｎａｓｅをＸｈｏＩ及びＰａｃＩで消化し、ＲｂｃＳ−１Ａ−Ｂａｒｎａｓｅを含む断片をエストラジオール誘導発現ベクターｐＥＲ８（Ｚｕｏ  Ｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、２０００年、２４巻、２６５〜２７３ページ  参照）の薬剤誘導性プロモーター下流のＸｈｏＩ及びＰａｃＩ部位へ挿入し、これをｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎとした（図２のＡ  参照）。そして、ｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎをアグロバクテリウムＥＨＡ１０５株（Ｈｏｏｄ  ＥＥら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、１９９３年、２巻、２０８〜２１８ページ）へ導入し、タバコの核形質転換に用いた。【００９７】
（実施例２）
＜バルナーゼ遺伝子導入タバコの作出（核形質転換）＞
タバコの核へのバルナーゼ遺伝子導入は下記の通りに行った。【００９８】
先ず、タバコ（品種；ＳＲ１）の種子を、有効塩素濃度０．５％の次亜塩素酸溶液に数滴のＴｗｅｅｎ２０を加えた滅菌溶液にて１０分間滅菌処理した。次いで、滅菌水で洗浄した後、滅菌した種子をＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ及びＳｋｏｏｇ  Ｆ、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ、１９６２年、１５巻、３号、４７３〜４９７ページ  参照）に播種し、１６時間明期、２５度のインキュベータにおいて４週間以上生育させた。【００９９】
このようにして得られたタバコの葉を材料とし、アグロバクテリウム法（Ｈｏｒｓｃｈ  Ｒ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５年、２２７巻、１２２９〜１２３１ページ  参照）によってｐＮｔＬｅｘｔｐＢｎの導入を行った。そして、カルベニシリン５００ｍｇＬ−１及びハイグロマイシン５０ｍｇＬ−１を含むＭＳＢＮ培地（ＭＳ培地にＢＡ１．０ｍｇＬ−１及びＮＡＡ０．１ｍｇＬ−１を加えた再分化培地）による選抜を行った。次いで、選抜したハイグロマイシン耐性の不定芽をＭＳ培地に移植し、発根させてハイグロマイシン耐性個体を作出した。そして、遺伝子が導入されていることを確認するために、ハイグロマイシン耐性個体の葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ分析においてＨＰＴ遺伝子及びバルナーゼ遺伝子の増幅を行った。その結果、１４個体においてＰＣＲ分析によるバンドが確認され、これらをバルナーゼ遺伝子導入系統とした。【０１００】
（実施例３）
＜バルナーゼ発現による葉緑体の機能阻害＞
次に、バルナーゼ遺伝子を導入した独立の前記１４系統において、エストラジオール処理特異的にバルナーゼが発現することにより、生育が阻害される系統を選抜した。すなわち、５ｍｍ角の葉切片を６つ作製し、エストラジオールを０μＭ又は５．０μＭを含むＭＳＢＮ培地に置床し、２０日間培養を行った。コントロール実験として、野生型の葉切片を用いて同様に処理を行った。【０１０１】
その結果、バルナーゼ遺伝子を導入した６系統においてエストラジオール５．０μＭ処理をした場合にのみ葉切片からの不定芽形成が阻害された（図３  参照）。また、これらの６系統においては、エストラジオールがない場合は野生型と同等の不定芽形成が観察された。よって、エストラジオール処理により発現したバルナーゼが葉緑体へ移行して、葉緑体の機能を阻害し、結果的に不定芽の再分化が阻害されることが明らかになったため、以降の実験に用いることにした。【０１０２】
一方、バルナーゼ遺伝子を導入した残りの８系統においては、エストラジオール処理の有無によらず不定芽形成が阻害されており、バルナーゼの非誘導的な発現が強いものであると考えられた。なお、野生型の葉切片はエストラジオール処理の有無によらず不定芽形成が見られた。【０１０３】
次に、核染色体へのバルナーゼ遺伝子の挿入コピー数が少ない系統は、該遺伝子の非誘導的な発現が少ないと推測されることから、前記６系統について、サザンブロッティングによる分析を行い、導入遺伝子のコピー数を調査した。【０１０４】
なお、サザンブロッティングは次の通りに行った。先ず、各系統から抽出したＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄIIIで消化し、ｈｐｔプローブを用いて常法に従って行った。ｈｐｔプローブは、ｈｐｔ特異的プライマー５’−ＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号：５）および５’−ＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧ−３’（配列番号：６）を用いてＰＣＲ  ＤＩＧラベリングミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）により増幅することにより、調製した。また、検出はＤＩＧ発光検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用い、プロトコールに従って行った。【０１０５】
その結果、６系統のうちの１つ（＃７系統）は、導入遺伝子を１コピー持つ個体であることが明らかになった。そこで、バルナーゼ遺伝子が１コピー導入されている系統である＃７系統を用いて葉緑体へのバルスター遺伝子導入を行った。【０１０６】
（実施例４）
＜バルスター遺伝子を有する葉緑体形質転換プラスミドベクターｐＮｔａｇＢｓの作製＞
バルスター遺伝子を葉緑体へ導入するため、プラスミドベクターｐＮｔａｇＢｓを下記の通り作製した。なお、バルスターはバルナーゼの活性を阻害するタンパク質である。【０１０７】
先ず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来バルスター遺伝子を鋳型とし、プライマーｂｓＦＢａｍＨＩ（５’−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＴＴＡＡＣＧ−３’、配列番号：７）及びプライマーｂｓＲＢａｍＨＩ（５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ−３’、配列番号：８）を用いてＰＣＲ増幅を行った。次いで、得られた増幅断片をＢａｍＨＩで消化し、タバコ葉緑体形質転換用の遺伝子発現カセットを持つプラスミドｐＰｒｒｎ−ＴｒｂｃＬのプロモーター下流のＢａｍＨＩサイトへ挿入し、ｐＰｒｒｎ−Ｂｓ−ＴｒｂｃＬを作製した。【０１０８】
次に、タバコ葉緑体のｔｒｎＩ及びｔｒｎＡ遺伝子の間に相同組換えによってバルスター遺伝子を導入するために、タバコのｔｒｎＩ−ｔｒｎＡ領域近傍の配列を相同領域として次のようにクローニングした。ｔｒｎＩ周辺領域（タバコ葉緑体ＤＮＡ，アクセッション番号  Ｚ０００４４：１０３４１７−１０５３３５、１．９ｋｂ）を、タバコ葉のＤＮＡを鋳型とし、ＮＴ−ｔｒｎＩＦ−ＳａｃII（５’−ＧＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＧ−３’、配列番号：９）及びＮＴ−ｔｒｎＩＲ−ＮｏｔＩ（５’−ＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴ−３’、配列番号：１０）を用いてＰＣＲ増幅を行った。次いで、得られた増幅断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入し、クローニングを行い、ｐＮｔｔｒｎＩを得た。【０１０９】
また、ｔｒｎＡ周辺領域（タバコ葉緑体ＤＮＡ、アクセッション番号  Ｚ０００４４：１０５３３０−１０６９４４、１．６ｋｂ）を、タバコ葉のＤＮＡを鋳型とし、ＮＴ−ｔｒｎＡＦ−ＳａｌＩ（５’−ＧＡＧＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡ−３’、配列番号：１１）及びＮＴ−ｔｒｎＡＲ−ＡｐａＩ（５’−ＣＣＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＧＴＣ−３’、配列番号：１２）を用いてＰＣＲ増幅を行った。そして、得られた増幅断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）に挿入し、クローニングを行い、ｐｔｒｎＡを得た。【０１１０】
さらに、ｐｔｒｎＡをＳａｌＩ及びＡｐａＩで消化して得られたｔｒｎＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIベクターのＳａｌＩ／ＡｐａＩサイトへ挿入したものをｐＢｔｒｎＩとした。そして、ｐＮｔｔｒｎＩからＳａｃII及びＮｏｔＩで切り出したｔｒｎＩ断片をｐＢｔｒｎＩのＳａｃII／ＮｏｔＩサイトへ挿入し、ｐＢｔｒｎＩ−ｔｒｎＡを作製した。次いで、ｐＢｔｒｎＩ−ｔｒｎＡのＮｏｔＩ及びＳａｌＩサイトに制限酵素サイト（ＮｏｔＩ−ＢａｎIII−Ｅｃｏ１０５Ｉ−ＢｓｉＷＩ−ＰａｃＩ−ＳｒｆＩ−ＳｂｆＩ−ＳａｌＩ）を付加するために人口合成した配列ＡＰ１（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＣＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣ−３’、配列番号：１３）の挿入を行い、このベクターをｐＮｔＡＰ１とした。【０１１１】
次に、選抜マーカーとしてａａｄＡ遺伝子（スペクチノマイシン抵抗性）及び可視化マーカーとしてＧＦＰ遺伝子を発現するカセットＰｒｒｎ−Ｔ７Ｇ１０−ａａｄＡ−ＴｐｓｂＡ−ＰｐｓｂＡ−ＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１６の構築を行った。すなわち先ず、ａａｄＡの高発現を目的としてｒｒｎプロモーターの直後にファージ由来のＴ７Ｇ１０配列（５’−ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’、配列番号：１４）を付加したＰｒｒｎ−Ｔ７Ｇ１０配列(「Ｐｒｒｎ２」配列とも称する）を構築した。なお、Ｐｒｒｎは、タバコ葉緑体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰｒｒｎ−Ｆ（５’−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＣＣＣ−３’、配列番号：１５）及びＰｒｒｎ−Ｒ（５’−ＡＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＣＧＧＡ−３’、配列番号：１６）を用いて、ＰＣＲにて増幅することにより調製した。また、Ｔ７Ｇ１０は、ｐＧＥＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を鋳型とし、プライマーＴ７Ｇ１０−Ｆ（５’−ＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴ−３’、配列番号：１７）およびＴ７Ｇ１０−Ｒ（５’−ＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧ−３’、配列番号：１８）を用いて、ＰＣＲにて増幅することにより調製した。そして、Ｐｒｒｎ−Ｔ７Ｇ１０配列の下流に、ｐＬＤ２００−ＧＦＰ（Ｋａｊｉｙａｍａ  Ｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００８年、１０６巻、２号、１９４〜１９８ページ  参照）をＢａｍＨIにて消化することにより得られたａａｄＡ遺伝子の全長配列を結合させ、さらにその下流にｐＬＤ２００−ＧＦＰをＢａｍＨIおよびＳａｌIにて消化することにより得られたＴｐｓｂＡ−ＰｐｓｂＡ−ＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１６配列を配置するように連結を行った。【０１１２】
このようにして構築した、Ｐｒｒｎ−Ｔ７Ｇ１０−ａａｄＡ−ＴｐｓｂＡ−ＰｐｓｂＡ−ＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１６カセットをｐＮｔＡＰ１のＮｏｔＩ−ＳａｌＩサイトに挿入しｐＮｔａｇとした（図２のＢ  参照）。また、ｐＮｔａｇのＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩサイトへ、前記ｐＰｒｒｎ−Ｂｓ−ＴｒｂｃＬの断片を挿入し、タバコ用の葉緑体形質転換ベクターｐＮｔａｇＢｓとした（図２のＣ  参照）。【０１１３】
（実施例５）
＜バルナーゼ遺伝子導入タバコの葉緑体ＤＮＡへのバルスター遺伝子の導入（葉緑体形質転換）＞
バルナーゼ遺伝子導入系統＃７及び野生型タバコにおいて、葉切片を各々作製した。次いで、得られた葉切片の背軸側を上向きにしてＭＳＢＮ培地の中央部分に直径３．５ｃｍの円になるように置床した。そして、１６時間明期、２５度（培養条件は特に示さない場合はこの条件と同様に行った）において１日培養した後、パーティクルガン法によりバルスター遺伝子導入ベクターｐＮｔａｇ又はｐＮｔａｇＢｓの導入を行った。【０１１４】
なお、パーティクルガンには０．６μｍの金粒子と１，１００ｐｓｉのラプチャーディスクとを用い、ラプチャーディスクからサンプルまでの距離は６ｃｍとして行った。【０１１５】
このようにして遺伝子を導入した後、タバコの葉片を裏返してＭＳＢＮ培地に置き、暗所２５℃にて２日間培養した。その後、スペクチノマイシン５００ｍｇＬ−１を含むＭＳＢＮ培地（ＭＳＢＮ−ＳＰＣ培地）に移植し、選抜培養を行った。なお、培地は２週間毎に交換した。４〜６週間後、葉片より分化した不定芽をスペクチノマイシン５００ｍｇＬ−１を含むＭＳ培地に移植し、発根が見られた個体をスペクチノマイシン耐性個体とした。【０１１６】
そして、蛍光顕微鏡を用いてスペクチノマイシン耐性個体を観察した。なお、ＧＦＰ蛍光の観察にはＧＦＰ２フィルターを用いた（４８０−ｎｍ励起フィルター／５１０−ｎｍ  バリアーフィルター；Ｌｅｉｃａ  ＭＺ  １６ＦＡ，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。【０１１７】
その結果、葉の細胞内の葉緑体にのみＧＦＰ蛍光が観察されたため、葉緑体ＤＮＡに遺伝子導入が起きてＧＦＰ遺伝子が発現していることが明らかになった。また、ほぼ全ての葉緑体がＧＦＰ蛍光を示すホモプラズミック性と考えられる個体も得られたが、多くの個体については、形質転換されていない野生型葉緑体も観察されるヘテロプラズミック性の個体（ヘテロプラズミック性の植物細胞にて構成されている個体又はキメラ性の個体）であった。【０１１８】
次に、葉緑体にＧＦＰ蛍光を持つタバコより抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ分析及びサザンブロッティング分析を行った。その結果、それらの個体は葉緑体ＤＮＡの狙った部位に遺伝子挿入を持つ葉緑体形質転換体であることが明らかになった。また、ヘテロプラズミック性の個体については、形質転換された組換え型の葉緑体ＤＮＡと野生型の葉緑体ＤＮＡとが混在していることも明らかになった。【０１１９】
以降、核にバルナーゼ遺伝子、葉緑体にｐＮｔａｇを導入したタバコを「ｂａｒｎａｓｅ／ＧＦＰ」とも表記し、核にバルナーゼ遺伝子、葉緑体にｐＮｔａｇＢｓを導入したタバコを「ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ」とも表記する。また、核が野生型で葉緑体にｐＮｔａｇＢｓを導入したタバコを「ＷＴ／ｂａｒｓｔａｒ」とも表記する。【０１２０】
（実施例６）
＜ｂａｒｎａｓｅによる葉緑体崩壊のｂａｒｓｔａｒ発現による阻害＞
ホモプラズミック化しているｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒを用い、バルナーゼによる葉緑体の崩壊をバルスターによって阻害することができるかどうかを調べた。すなわち、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ及びｂａｒｎａｓｅ／ＧＦＰそれぞれから５ｍｍ角の葉片を作製し、６切片ずつエストラジオール０μＭ又は５μＭを含むＭＳＢＮ−ＳＰＣ培地にて培養した。そして、２週間後に一度培地交換し、４週間後に観察を行った。得られた結果を図４に示す。【０１２１】
図４に示した結果から明らかなように、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒはエストラジオールによりバルナーゼを誘導した場合においても再分化不定芽の形成が見られた。一方、コントロールとして用いたｂａｒｎａｓｅ／ＧＦＰにおいてはバルナーゼの誘導発現により再分化不定芽の形成が抑制されていた。また、図には示さないが、ＷＴ／ｂａｒｓｔａｒにおいては、エストラジオールの有無によらず再分化不定芽が形成されたため、バルスターが葉緑体において発現することによる植物体並びに再分化不定芽形成への影響はないと考えられる。従って、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒの葉緑体においては、バルナーゼの作用がバルスターによって阻害されていることが実証された。【０１２２】
次に、エストラジオール５μＭ処理をして形成された再分化不定芽の葉をそれぞれプロトプラスト化し、細胞中の葉緑体を観察した。得られた結果を図５に示す。【０１２３】
図５に示した結果から明らかなように、ｂａｒｎａｓｅ／ＧＦＰにおいては葉緑体の機能阻害による崩壊が見られたが、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒにおいてはバルナーゼによる葉緑体の崩壊が抑制されていた。【０１２４】
以上の結果より、バルナーゼによる葉緑体の機能阻害は、葉緑体にバルスターを発現させることによって抑制できることが明らかになった。さらに、バルナーゼとバルスターとの相互作用がこれまで利用例のなかった葉緑体内においても機能することも明らかになった。【０１２５】
（実施例７）
＜ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムによるホモプラズミック化の促進＞
ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムを用いた場合にヘテロプラズミック性の葉からホモプラズミック性の二次不定芽が再分化する割合が向上するかどうかを調査するため、以下の実験を行った。【０１２６】
ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ及びコントロールであるＷＴ／ｂａｒｓｔａｒについて、ＧＦＰ蛍光を持たない野生型の葉緑体と形質転換した葉緑体の両方が混在しているヘテロプラズミック性の葉を持つ独立の４系統を実験材料として用いた。各系統、２枚のヘテロプラズミック性の葉からそれぞれ４つずつ５ｍｍ角の葉切片を作製し、合計８つの断片から均等に４切片ずつエストラジオール０μＭ又は１０μＭを含むＭＳＢＮ−ＳＰＣ培地培地にて培養し、２週間毎に培地交換を行った。そして、４週間後までに再分化した全ての二次不定芽を独立に切り分け、それぞれの不定芽について葉のＧＦＰ蛍光を観察した。得られた結果を図６に示す。また、不定芽全体の全ての葉緑体にＧＦＰ蛍光が観察された場合のみをホモプラズミック性の不定芽とし、ホモプラズミック性の不定芽の作出割合を調査した。得られた結果を図７に示す。【０１２７】
図６及び７に示した結果から明らかなように、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒ４系統においては、エストラジオールを含む培地で培養した場合、ホモプラズミック性の不定芽の割合は３４．８％となり、エストラジオールを含まない培地におけるそれ（１３．７％）に比べて約３倍となった。また、バルナーゼ遺伝子を持たないＷＴ／ｂａｒｓｔａｒにおいて、エストラジオール処理のない場合のホモプラズミック性不定芽の割合は６．２％となり、エストラジオールのある場合のそれは２．９％となった。【０１２８】
このように、エストラジオール処理を行うことにより、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒは、ＷＴ／ｂａｒｓｔａｒに対して、ホモプラズミック性の不定芽の作出割合が５〜１０倍となることが明らかとなり、バルナーゼにより野生型葉緑体を積極的に破壊し、バルスターを発現させた形質転換葉緑体を残すｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムの利用により、不定芽の再分化においてホモプラズミック化不定芽の割合を増加させることが可能であることが示された。【０１２９】
（実施例８）
＜ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムによるホモプラズミック化の促進＞
ヘテロプラズミック性を示すｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒの一次再分化個体  Ｂｎ／Ｂｓ−６の葉片と、ヘテロプラズミック性を示すＷＴ／ｂａｒｓｔａｒの一次再分化個体  ＷＴ／Ｂｓ−５の葉片とを４週間、１０μＭエストラジオールを含むＭＳＢＮ−ＳＰＣ培地にて培養した。なお、「Ｂｎ／Ｂｓ−６」や「ＷＴ／Ｂｓ−５」の表記は「核型／葉緑体型−個体番号」を示すものである。そして、得られた全ての二次不定芽を独立に切り分け、ＭＳ−ＳＰＣ培地に並べ、ＧＦＰ蛍光を観察した。得られた結果を図８に示す。【０１３０】
図８に示した結果から明らかなように、Ｂｎ／Ｂｓ−６より得られた二次不定芽にはＧＦＰの蛍光を示す組換え型の葉緑体が多く存在しており、個々の二次不定芽全体においてＧＦＰの強い蛍光が観察された（図８のＡ  参照）。一方、ＷＴ／Ｂｓ−５より得られた二次不定芽には野生型の葉緑体が混在しており、不定芽全体のＧＦＰの蛍光が弱く観察された（図８のＢ  参照）。【０１３１】
以上のことからも、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムの利用により、不定芽の再分化において、個々の不定芽を構成する細胞におけるホモプラズミック化を促進するとともに、ホモプラズミック化された細胞のみで構成される不定芽の割合を増加させることが可能であることが示された。【０１３２】
（実施例９）
＜ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムにより得た二次再分化個体における組換え型葉緑体ＤＮＡの検出＞
ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムを利用した場合に、ホモプラズミック化された細胞の構成比率が植物体において高いことを確認するため、すなわち組換え型の葉緑体ＤＮＡを高い割合で植物体が保有していることを確認するため、二次再分化個体の葉緑体ＤＮＡの遺伝子型をサザンブロット分析によって調査した。【０１３３】
すなわち、実施例８で作出した二次不定芽（図８  参照）をスペクチノマイシン（５００ｍｇＬ−１）を含む発根培地へ移植して３週間培養し、発根したものを二次再分化個体とした。そして、これら二次再分化個体のサザンブロット分析は次のような条件で常法に従って行った。【０１３４】
先ず、分析材料からトータルＤＮＡを抽出し、１．５μｇの該ＤＮＡをＢｇｌIIを用いて消化し、内在性の葉緑体ＤＮＡ由来の配列であるＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブを用いて検出した。なお、トータルＤＮＡをＢｇｌIIで消化し、ＮｔｔｒｎＩｏｕｔプローブを用いた場合、野生型の葉緑体は４．５ｋｂ、組換え型の葉緑体は７．８ｋｂにシグナルが検出されることが想定される（図９  参照）。【０１３５】
また、分析材料として、バルナーゼ遺伝子を核に挿入した＃７系統の葉緑体にｐＮｔａｇＢｓを導入した一次再分化個体  Ｂｎ／Ｂｓ−６より得られた全ての二次再分化個体を用いた。また、核染色体が野生型のタバコの葉緑体にｐＮｔａｇＢｓを導入した一次再分化個体  ＷＴ／Ｂｓ−５より得られた全ての二次再分化個体についても分析を行った。さらに、コントロールとして、葉緑体形質転換の材料である野生型の個体（ＷＴ／ＷＴ）、＃７系統（ｂａｒｎａｓｅ／ＷＴ）、一次再分化個体であるＢｎ／Ｂｓ−６及びＷＴ／Ｂｓ−５を用いた。得られた結果を図１０〜１３に示す。【０１３６】
図１０及び１１に示した結果から明らかなように、野生型（ＷＴ／ＷＴ）及び＃７系統（ｂａｒｎａｓｅ／ＷＴ）においては、４．５ｋｂのシグナルのみが検出されたため、これら植物体は野生型葉緑体のみを持つことが示された。また、一次再分化個体Ｂｎ／Ｂｓ−６及びＷＴ／Ｂｓ−５については、野生型の４．５ｋｂのシグナルと組換え型の７．８ｋｂのシグナルとが同等のレベルで検出されたため、ヘテロプラズミック性であることが示された。【０１３７】
かかるヘテロプラズミック性の一次再分化個体  Ｂｎ／Ｂｓ−６から調製した二次不定芽にエストラジオール処理を行い、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムを利用して得られた二次再分化個体２３個体の分析を行ったところ、図１２に示した結果から明らかな通り、２３個体全てにおいて組換え型のシグナルが検出された。そのうち９個体については、７．８ｋｂの想定される組換え型のシグナルが強く検出されており、ホモプラズミック化された細胞の構成比率が植物体において極めて高くなっていることが示された。【０１３８】
一方、バルナーゼ遺伝子を核に持たない一次再分化個体  ＷＴ／Ｂｓ−５より得られた二次再分化個体３１個体については、図１３に示した結果から明らかな通り、１個体（ＷＴ／Ｂｓ−５−２８）のみにおいて組換え型ＤＮＡのシグナルが強く検出されたが、想定される位置とは異なるバンドサイズのものであった。その他の３０個体においては、組換え型のシグナルが野生型と同等に検出されるものと野生型のシグナルが強く検出されたものがあった。なお、明確な組換え型のシグナルが検出されなかった個体もあったが、それらの葉を観察した際に葉緑体においてＧＦＰ蛍光が観察されたため、それらの個体はサザン分析による検出限界以下の組換え型ＤＮＡを保持していると考えられた。【０１３９】
以上の結果より、ヘテロプラズミック性を示す一次再分化個体の葉片から二次再分化個体を作出する際に、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムを利用することにより、植物体においてホモプラズミック化された細胞の割合が高くなり、ヘテロプラズミック性が解消された二次再分化個体の作出効率が向上することが明らかとなった。【０１４０】
（実施例１０）
＜バルナーゼ遺伝子の誘導処理がない場合のわずかなホモプラズミック化促進について＞
上記の通り、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムにより効率的にホモプラズミック化が促進された。一方、バルナーゼ遺伝子の発現を誘導しなくとも、ｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒにおいて、ＷＴ／ｂａｒｓｔａｒと比較すると若干（２倍）ホモプラズミック化の促進が見られた（図７  参照）。バルナーゼ遺伝子導入タバコにおいて、バルナーゼ遺伝子はエストラジオール誘導性プロモーターに連結しているものの、エストラジオールを処理しない場合にも非誘導的にわずかに発現していることがＲＴ−ＰＣＲ分析により確認された（図１４  参照）。よって、エストラジオール処理をしない場合においても非誘導的なバルナーゼの発現の影響によりｂａｒｎａｓｅ／ｂａｒｓｔａｒシステムがわずかに作用し、ホモプラズミック化の促進が観察されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
以上説明したように、本発明によれば、プラスチド等の殆どが形質転換されているホモプラズミック性の高い植物細胞、及び該植物細胞にて殆ど構成されているホモプラズミック性の高い植物体等を効率的に作製することが可能となる。特にプラスチドの形質転換においては、同じ量の細胞あたりの外来導入遺伝子の発現総量が高くなるため、物質生産能の高いプラスチド形質転換植物を作出することが可能となる。【０１４２】
したがって、本発明はプラスチド等の形質転換方法による遺伝子拡散防止や、バイオマス並びに機能性食材や医薬品材料の物質生産系に有効に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１〜１２、１５〜１８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号１３
＜２２３＞  人工的に合成されたオリゴヌクレオチドの配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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