(57)【要約】  蛍光消光プローブを用いる標的核酸の検出において、測定のための労力およびコストの増加を抑えながら、より多種類の標的核酸を同時に測定することができる核酸プローブおよびそれを用いた標的核酸の測定方法を提供すること。  標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質である核酸プローブ。
2012173274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、
少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、
該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、
該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、
上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質である核酸プローブ。
【請求項２】
第１の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、
少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、
該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、
該核酸プローブが上記第１の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記第１の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記第１の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、
上記蛍光消光物質がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡおよびＣＲ６Ｇからなる群より選ばれるいずれかである第１の核酸プローブと、
第２の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、
少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、
該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、
該核酸プローブが上記第２の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記第２の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記第２の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、
上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれるいずれかである第２の核酸プローブ、とを含む標的核酸配列測定用キット。
【請求項３】
サンプル中の標的核酸配列を検出する方法であって、
第１の核酸プローブと第２の核酸プローブを上記サンプルに添加する工程、
該サンプルを、上記核酸プローブとそれらの標的核酸配列とがハイブリダイズする条件に保ちながら、上記第１の核酸プローブに由来する蛍光と第２の核酸プローブに由来する蛍光を測定する工程、および、
該サンプルを、上記核酸プローブとそれらの標的核酸配列とがハイブリダイズしない条件に保ちながら、上記第１の核酸プローブに由来する蛍光と第２の核酸プローブに由来する蛍光を測定する工程を有し、
上記第１の核酸プローブは、第１の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有し、
少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、
該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、
該核酸プローブが上記第１の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、
上記蛍光消光物質がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡおよびＣＲ６Ｇからなる群より選ばれるいずれかであり、
上記第２の核酸プローブは、第２の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有し、
少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、
該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、
該核酸プローブが上記第２の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記第２の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記第２の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、
上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれるいずれかである標的核酸配列の検出方法。
【請求項４】
標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、
少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、
該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、
該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、
６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長帯における所定波長の蛍光強度が、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記標的核酸配列とハイブリダイズしていない場合と比べて４０％以下となる核酸プローブ。
【請求項５】
バインディングプローブと蛍光プローブからなる核酸プローブセットであって、
上記バインディングプローブは、オリゴヌクレオチドからなり、標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸結合領域と、上記蛍光プローブとハイブリダイズする蛍光プローブ結合領域とを含み、
上記標的核酸結合領域は、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、該標的核酸結合領域中の末端塩基のうち蛍光プローブ結合領域側の塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在するように、その塩基配列が設計され、
上記蛍光プローブは、オリゴヌクレオチドからなり、上記蛍光プローブ結合領域が上記バインディングプローブの３’末端側にあるときは、３’末端塩基が蛍光消光物質で標識され、上記蛍光プローブ結合領域が上記バインディングプローブの５’末端側にあるときは、５’末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質が、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる核酸プローブセット。
【請求項６】
バインディングプローブ、第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからなる核酸プローブセットであって、
上記バインディングプローブは、オリゴヌクレオチドからなり、５’末端側から、上記第１の蛍光プローブとハイブリダイズする第１の蛍光プローブ結合領域、標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸結合領域、および、上記第２の蛍光プローブとハイブリダイズする第２の蛍光プローブ結合領域を有し、
上記標的核酸結合領域は、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、該標的核酸結合領域中の５’側末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在し、かつ、上記標的核酸結合領域中の３’側末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在するように、その塩基配列が設計され、
上記第１の蛍光プローブは、オリゴヌクレオチドからなり、５’末端塩基が第１の蛍光消光物質で標識され、
上記第２の蛍光プローブは、オリゴヌクレオチドからなり、３’末端塩基が第２の蛍光消光物質で標識され、
上記第１の蛍光消光物質は、上記第２の蛍光消光物質とは異なり、
上記第１の蛍光消光物質と第２の蛍光消光物質のうちの一方は、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質であり、
もう一方の蛍光消光物質は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡ、ＣＲ６Ｇ、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質である核酸プローブセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関し、より詳しくは核酸の分析のために用いる核酸プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の測定においては、標的核酸と特異的にハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ蛍光物質で標識された核酸プローブが広く用いられている。核酸プローブの中でも、プローブを標識する蛍光物質として、グアニンに近接すると蛍光強度が弱まる蛍光消光物質を用いた蛍光消光プローブが注目を集めている（非特許文献１〜３参照）。市販されている蛍光消光プローブとしてＱプローブ（登録商標）、ユニバーサルＱプローブ（登録商標；非特許文献２参照）およびＡＢプローブ（非特許文献３参照）がある。Ｑプローブ（登録商標）を測定対象の溶液に加え蛍光測定をすることにより、ＳＮＰタイピングや遺伝子の定量を簡便に行うことができる。蛍光消光プローブはその構造がシンプルであること、プローブ設計にトライアル・アンド・エラーが不要であることおよび精度の高い測定結果が得られるという優れた利点がある（特許文献１〜５参照）。【０００３】
核酸プローブを標識する蛍光消光物質として商業的に利用されているのは、現在のところＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡ、ＣＲ６Ｇの４種類である。これらの蛍光消光物質はいずれも蛍光波長が異なるため、この蛍光波長の違いを利用して複数種の標的核酸を１反応液中で同時検出することができる。
例えば、ＴＡＭＲＡで標識された標的核酸Ａ用の核酸プローブ１と、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識された標的核酸Ｂ用の核酸プローブ２を同一のサンプルに添加して、ＴＡＭＲＡの蛍光強度とＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの蛍光強度を測定することにより、１反応チューブ内で２種類の標的核酸（標的核酸Ａ、Ｂ）を同時に検出することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．６，ｅ３４
【非特許文献２】「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，２００９年７月１５日，第８１巻（第１４号），ｐ．５６７８−５６８５
【非特許文献３】「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，２００７年２月１日，第７９巻（第３号），ｐ．９７４−９７９
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３４３７８１６号公報
【特許文献２】特許第３９６３４２２号公報
【特許文献３】特開２００８−１８２９７４号公報
【特許文献４】国際公開第２０１０／０１３３１７号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０１３７７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年の遺伝子解析技術の高速化により、蛍光消光プローブを用いる標的核酸の測定分野においても測定の更なる高速化、より多種類の遺伝子・標的核酸の同時検出、測定コストの低減が求められている。
従って、本発明の目的は、蛍光消光プローブを用いる標的核酸の測定を、コストと労力の増加を抑えながら、一層高速化することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的は、以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明は、標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質である核酸プローブを提供する。
また、本発明は、標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長帯における所定波長の蛍光強度が、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記標的核酸配列とハイブリダイズしていない場合と比べて４０％以下となる核酸プローブを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、蛍光消光プローブを用いる標的核酸の検出において、測定のための労力およびコストの増加を抑えながら、より多種類の標的核酸を同時に測定することができる核酸プローブおよびそれを用いた標的核酸の測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の核酸プローブの一例を示す模式図。
【図２】ＡＴＴＯ６５５を標識した蛍光消光プローブの蛍光強度を示すグラフ。
【図３】ＡＴＴＯ６８０を標識した蛍光消光プローブの蛍光強度を示すグラフ。
【図４】ＡＴＴＯ７００を標識した蛍光消光プローブの蛍光強度を示すグラフ。
【図５】本発明の核酸プローブセットの一例を示す模式図。
【図６】本発明の核酸プローブセットの一例を示す模式図。
【図７】蛍光強度の温度依存性を示すグラフ。
【図８】蛍光消光率の温度依存性を示すグラフ。
【図９】融解曲線の負の一次微分を示すグラフ。
【図１０】リアルタイムＰＣＲ測定の結果を示すグラフ。
【図１１】ＳＮＰタイピングの結果を示すグラフ。
【図１２】蛍光強度の温度依存性を示すグラフ。
【図１３】蛍光消光率の温度依存性を示すグラフ。
【図１４】ＳＮＰタイピングの結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、本発明において、単に「ヌクレオチド」というときは、ポリヌクレオチドを構成するモノマーのことをいい、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドおよびＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドに限られず、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、２’，４’−ＢＮＡNC、２’，４’−ＢＮＡCOCのような人工的に合成されたモノマーであってもよい。
「オリゴヌクレオチド」というときは、ヌクレオチドモノマーから構成されるオリゴマーのことをいい、このオリゴマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡまたはＰＮＡのみから構成されていてもよいし、これらのキメラ分子であってもよい。
また、本発明において「核酸」、「ポリヌクレオチド」というときは、上記ヌクレオチドから構成されたポリマーのことを意味する。
【００１１】
本発明でいう「標的核酸」とは、定量、分析等の対象となる核酸のことをいい、種々の核酸または遺伝子の一部である場合も含むものとする。
また、本発明でいう「標的核酸配列」とは、標的核酸中の塩基配列領域であって、本発明の核酸プローブがハイブリダイズしたときに、本発明の核酸プローブと対をなす塩基配列領域を意味する。標的核酸が遺伝子やプラスミドのような塩基長の長い核酸である場合に、本発明の核酸プローブと対をなす塩基配列領域を特定するために使用する。
【００１２】
本発明の核酸プローブは、一本鎖のオリゴヌクレオチドから構成された核酸プローブであり、標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する必要がある。標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列の一例として、標的核酸配列と相補的な塩基配列を挙げることができる。標的核酸の塩基長が短い場合には、標的核酸が標的核酸配列であってもよい。標的核酸が遺伝子やプラスミドのような塩基長の長い核酸である場合、本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的核酸の一部である標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列とする。本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的核酸配列と完全に相補的である必要はないが、８５％以上の相補性を有することが好ましく、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上である。
【００１３】
本発明の核酸プローブの塩基長は、標的核酸または標的核酸配列とハイブリダイズしうるものであれば、特に制限はないが、モノマーとしてデオキシリボヌクレオチドのみからなるＤＮＡプローブの場合、４塩基以下であるとハイブリダイズ効率が低いという点で好ましくなく、５１塩基以上であると非特異的なハイブリッドが生じやすくなるという点で好ましくないことがある。従って、本発明の核酸プローブがＤＮＡプローブの場合、塩基長は５〜５０塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜３５塩基、特に好ましくは１０〜２０塩基である。
【００１４】
本発明の核酸プローブは、モノマーとしてデオキシリボヌクレオチドのみからなるＤＮＡプローブでもよいが、デオキシリボヌクレオチドの代わりに、より塩基間相互作用の強いＬＮＡやＢＮＡを含んでもよい。ＬＮＡやＢＮＡを用いることにより、デオキシリボヌクレオチドのみからなる核酸プローブと比べて、ＤＮＡプローブより短い塩基長でＴｍ（融解温度）を同程度にすることができる。
【００１５】
本発明の核酸プローブは、少なくとも一方の末端塩基が後述する蛍光消光物質で標識されたものである。蛍光消光物質が標識された塩基は、シトシンである必要がある。
上記蛍光消光物質の標識位置はヌクレオチドの糖部位、リン酸部位、塩基部位のいずれでもよい。糖部位においては、３’末端の３’位又は２’位ＣのＯＨ基、又は５’末端を脱リン酸化して得られる５’位ＣのＯＨ基である。リン酸部位をスルホン酸基またはスルホニル基に置換してから標識してもよい。
【００１６】
５’末端ヌクレオチドに蛍光消光物質を標識する場合には、まず、常法に従って５’末端のリン酸基にリンカーとして、例えば、−（ＣＨ2）n−ＳＨを導入する。このようなリンカーは市販のものを使用することができる（例えば、Midland Certified Reagent Company社、米国）。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このリンカーにＳＨ基反応性を有する蛍光消光物質またはその誘導体を結合させることにより蛍光消光物質で標識されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。当該蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィーなどで精製して、本発明の核酸プローブとすることができる。
なお、オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光消光物質を標識した核酸プローブをポリメラーゼとともに使用する場合、３’末端をリン酸化するなど、３’末端からの伸長を防ぐ措置を講じるべきである。
【００１７】
また、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに蛍光消光物質を標識することもできる。この場合は、リボースまたはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にリンカーとして、例えば、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2を導入する。このようなリンカーも市販のものを使用することができる（例えば、Midland Certified Reagent Company社、米国）。別の方法として、リボースまたはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にリン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にリンカーとして、例えば、−（ＣＨ2）n−ＳＨを導入する。この場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。
【００１８】
上記のリンカーにアミノ基またはＳＨ基に反応性を有する蛍光消光物質またはその誘導体を結合させることにより蛍光消光物質で標識されたオリゴヌクレオチドを合成することができる。当該オリゴヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーなどで精製して、本発明の核酸プローブとすることができる。リンカーとして−（ＣＨ2）n−ＮＨ2を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link aminomodifier、クロンテック社）を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該オリゴヌクレオチドに蛍光消光物質を結合させることができる。
【００１９】
標的核酸の測定においては、本発明の核酸プローブが標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズした際に、核酸プローブ中の蛍光消光物質と標的核酸配列中のグアニン塩基とが近接することにより、蛍光消光物質の発蛍光が通常の場合より弱まることを利用する。このため、本発明の核酸プローブは、標的核酸配列とハイブリダイズし得る塩基配列を有するとともに、標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、核酸プローブ中の蛍光消光物質と標的核酸配列中のグアニン塩基とが近接するように設計する必要がある。図１を用いて説明すると、本発明の核酸プローブ５が標的核酸１０中の標的核酸配列１１とハイブリダイズしたときに、核酸プローブ５中の蛍光消光物質４で標識されたシトシン塩基と対となる位置にくる標的核酸配列１１中の塩基（図１中（１）で示し、以下塩基１と略す。）がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列１１中の塩基（塩基１）を中心とする５塩基（図１中（１）、（２）および（３）で示した塩基）の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在するように、核酸プローブ５の塩基配列を設計する必要がある。本発明の核酸プローブ５が標的核酸配列１１にハイブリダイズしたとき、上記５塩基の範囲内にグアニン塩基があれば、ハイブリダイズにより蛍光消光物質４の蛍光強度が大きく減少し、標的核酸１０の測定に利用することができる。
【００２０】
蛍光消光プローブが標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしたときの蛍光消光の程度は、以下の式１で求められる蛍光消光率として評価することができる。
［式１］    蛍光消光率（％）＝（Ｆ1−Ｆ2）／Ｆ1×１００
式中、Ｆ1は標的核酸配列が存在しない条件、または、標的核酸配列と本発明の核酸プローブとがハイブリダイズしない条件での蛍光強度、
Ｆ2は、標的核酸配列と本発明の核酸プローブとが共存した条件、または、標的核酸配列と本発明の核酸プローブとがハイブリダイズする条件での蛍光強度である。
標的核酸の測定を行う場合、測定波長や絶対的な蛍光強度にも依存し一概には言えないが、蛍光消光率が４０％以上であれば蛍光消光を明確に識別できるので好ましい。より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上である。
【００２１】
本発明の核酸プローブは、上記蛍光消光物質としてＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる化合物を用いる。ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００はいずれもＡＴＴＯ−ＴＥＣ社から入手して使用することができる。カタログ番号はＡＴＴＯ４６５がＡＤ  ４６５−３１、ＡＴＴＯ６５５が、ＡＤ  ６５５−３１、ＡＤ  ６５５−３５、ＡＴＴＯ６８０がＡＤ  ６８０−３１、ＡＤ  ６８０−３５、ＡＴＴＯ７００がＡＤ  ７００−３１、ＡＤ  ７００−３５である。
【００２２】
ＡＴＴＯ４６５はアクリフラビンの誘導体であり、下記［化学式１］で示される構造を有する。
［化学式１］
2012173274.tif 000003
【００２３】
ＡＴＴＯ６５５の体系名は１−（３−カルボキシプロピル）−１１−エチル−２，２−ジメチル−４−（スルホナトメチル）−３，４，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロ−２Ｈ−１３−オキサ−１，６，１１−トリアザペンタセン−１−イウムであり、下記［化学式２］で示される構造を有する。
［化学式２］
2012173274.tif 000004
【００２４】
ＡＴＴＯ４６５で標識した本発明の核酸プローブは、遊離した状態では、４９０ｎｍ〜５５０ｎｍの波長域で強い蛍光を示し、５０８ｎｍ付近で蛍光強度が最大となる。本発明者らは、末端のシトシン塩基をＡＴＴＯ４６５で標識した核酸プローブが標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在する場合、遊離の状態と比べて、蛍光強度が著しく弱くなることを見いだした。この蛍光消光の割合は５０８ｎｍ付近で顕著であるので、ＡＴＴＯ４６５で標識した核酸プローブを標的核酸の測定に使用する場合、５０８ｎｍ付近で蛍光測定を行うことが好ましい。励起波長としては４５３ｎｍ近辺を用いることが好ましい。
【００２５】
ＡＴＴＯ６５５で標識した本発明の核酸プローブは、遊離した状態では、図２にバツ（×）で示されるように、６６０ｎｍ〜７２０ｎｍの波長域で強い蛍光を示し、６８４ｎｍ付近で蛍光強度が最大となる。
本発明者らは、末端のシトシン塩基をＡＴＴＯ６５５で標識した核酸プローブが標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在する場合、図２に丸（○）で示されるように６８０ｎｍ〜８００ｎｍの波長域で、ハイブリダイズ前と比べて顕著に蛍光が消光することを見いだした。ＡＴＴＯ６５５で標識した核酸プローブを用いて標的核酸を測定する場合、蛍光消光率が最大となる６８４ｎｍ近辺で行うことが好ましい。励起波長としては６６３ｎｍ近辺を用いることが好ましい。
【００２６】
ＡＴＴＯ６８０で標識した本発明の核酸プローブは、遊離した状態では、図３にバツ（×）で示されるように６９０ｎｍ〜７６０ｎｍの波長域で強い蛍光を示し、７１２ｎｍ付近で蛍光強度が最大となる。
本発明者らは、末端のシトシン塩基をＡＴＴＯ６８０で標識した核酸プローブが標的核酸配列中の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在する場合、図３に丸（○）で示されるように６９０ｎｍ〜７６０ｎｍの波長域でハイブリダイズ前と比べて顕著な蛍光消光を示すことを見いだした。ＡＴＴＯ６８０で標識した核酸プローブを用いて標的核酸を測定する場合、蛍光消光率が最大となる７００ｎｍ近辺で行うことが好ましい。励起波長としては６８０ｎｍ近辺を用いることが好ましい。
【００２７】
ＡＴＴＯ７００で標識した本発明の核酸プローブは、遊離した状態では、図４にバツ（×）で示されるように６９０ｎｍ〜７６０ｎｍの波長域で強い蛍光を示し、７０２ｎｍ付近で蛍光強度が最大となる。
本発明者らは、末端のシトシン塩基をＡＴＴＯ７００で標識した核酸プローブが標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在する場合、図４に丸（○）で示されるように７２０ｎｍ〜７６０ｎｍの波長域でハイブリダイズ前と比べて顕著な蛍光消光を示すことを見いだした。ＡＴＴＯ７００で標識した核酸プローブを用いて標的核酸を測定する場合、蛍光消光率が大きく、かつ、遊離状態での蛍光強度も強い７２０ｎｍ近辺で行うことが好ましい。励起波長としては７００ｎｍ近辺を用いることが好ましい。
【００２８】
従来蛍光消光核酸プローブの蛍光消光物質として商業的に利用されているのは、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸（商品名：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬとしてインビトロジェン社から入手できる）、2-オキソ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-2H-1-ベンゾピラン-3-カルボン酸（商品名：Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅとしてインビトロジェン社から入手できる）、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）、ＣＲ６Ｇ（カルボキシローダミン６Ｇ）の４種類である。
【００２９】
グアニン塩基との近接による蛍光消光を利用する場合、蛍光測定波長は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅが４５５ｎｍ付近、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬが５１３ｎｍ付近、ＣＲ６Ｇが５５５ｎｍ付近、ＴＡＭＲＡが５８０ｎｍ付近である。これら４種の蛍光消光物質を、それぞれ異なる配列の核酸プローブに標識することにより、１反応液中で４種類までの標的核酸配列を同時に検出することができた。言い換えると、蛍光消光プローブの標識として商業的に利用されてきた蛍光消光物質は従来４種類のみであり、このため、１つの系で同時検出できる標的核酸配列の種類は最大でも４種類に限られていた。
上記の通り、従来用いられてきた蛍光消光プローブの蛍光測定波長は、４４０〜５９０ｎｍの波長域に限られていた。従来の蛍光測定装置の観測可能な波長域は通常２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲である。このため、例えば、６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長域における所定波長の蛍光強度が、グアニンとの近接により大きく減少（例えば、４０％以下）する蛍光消光プローブを用いることにより、従来の蛍光測定装置を用いて、１つの系で同時検出できる標的核酸配列の種類が増加する。
【００３０】
上記本発明の核酸プローブの蛍光消光測定波長は、それぞれ離れている（例えば、ＡＴＴＯ４６５：５０８ｎｍ、ＡＴＴＯ６５５：６８４ｎｍ、ＡＴＴＯ６８０：７００ｎｍ、ＡＴＴＯ７００：７２０ｎｍ）ので、当該４種のプローブを１つのサンプル中で併用しても各プローブ由来の蛍光を識別することができる。また、本発明の核酸プローブの蛍光消光測定波長は、上記４種の従来の蛍光消光プローブとも異なり、かつ、一般的な蛍光測定装置の観測域に入っている。このため、本発明の核酸プローブは、従来の蛍光消光プローブの代わりとして用いることができる。また、従来の蛍光消光プローブとともに測定系に添加して使用することもでき、これにより測定コストを増加することなく、１サンプル中で８種類までの標的核酸配列を同時に検出でき、標的核酸測定の更なる高速化、低コスト化を達成することができる。
【００３１】
上記本発明の核酸プローブは、従来の蛍光消光プローブの代わりに、核酸の塩基配列多型の分析に用いることができる。
【００３２】
本発明の核酸プローブの別の局面として、標的核酸中の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長帯における所定波長の蛍光強度が、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記標的核酸配列とハイブリダイズしていない場合と比べて４０％以下となる核酸プローブが提供される。
【００３３】
上記した通り、グアニンと蛍光消光物質との近接による蛍光消光の測定波長は、従来４４０〜５９０ｎｍの波長域に限られていた。このため、６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長域における所定波長の蛍光強度が、グアニンとの近接により４０％以下に減少する本発明の蛍光消光プローブを用いることにより、従来の蛍光測定装置を用いながら、１つの系で同時検出できる標的核酸配列の種類が増加し、標的核酸測定の更なる高速化、低コスト化を達成できる。
【００３４】
上記蛍光消光プローブに用いる蛍光消光物質としては、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１７９５８５号明細書に記載された蛍光物質が挙げられる。好適な蛍光消光物質の具体例としては、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０、ＡＴＴＯ７００を挙げることができる。
【００３５】
また、本発明の核酸プローブの塩基配列の設計に当たっては、グアニン含量を２５％以下でできるだけ少なくすること、ＧＣ含量を７０％以下とすること、蛍光消光物質を標識した塩基の隣の塩基をグアニン以外の塩基とすることが好ましい。
【００３６】
本発明の別の局面として、第１の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記第１の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記第１の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記第１の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡおよびＣＲ６Ｇからなる群より選ばれるいずれかである第１の核酸プローブと、
第２の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記第２の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記第２の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記第２の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれるいずれかである第２の核酸プローブ、とを含む標的核酸配列測定用キットが提供される。
【００３７】
当該標的核酸測定用キットは、従来の蛍光消光プローブである第１の核酸プローブに加えて、第１の核酸プローブとは蛍光消光の測定波長が異なる第２の核酸プローブを用いて、従来の蛍光消光プローブの測定波長とは異なる波長域を第２の標的核酸配列の測定に利用する。第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同一の標的核酸（例えば、遺伝子）上にあってもよいが、別の標的核酸（遺伝子）中の配列であってもよい。同一の遺伝子上に第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列を設定することにより、例えば、１遺伝子上の２箇所の変異を同時に測定することができる。また、別の遺伝子上に第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列を設定することにより、１サンプル中の２種の遺伝子を同時に測定することができる。
【００３８】
上記標的核酸測定用キットの好ましい別の態様としては、
（１）第１の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬである第１の核酸プローブ、
（２）第２の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅである第２の核酸プローブ、
（３）第３の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＴＡＭＲＡである第３の核酸プローブ、
（４）第４の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＣＲ６Ｇである第４の核酸プローブ、
（５）第５の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５である第５の核酸プローブ、
（６）第６の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ６５５である第５の核酸プローブ、
（７）第７の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ６８０である第６の核酸プローブ、および、
（８）第８の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有する核酸プローブであって、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該標識された塩基がシトシンであり、該核酸プローブが上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ７００である第７の核酸プローブ、からなる群より選ばれる５つ以上の核酸プローブを含む標的核酸配列測定用キットが挙げられる。
【００３９】
従来商業的に利用されてきた蛍光消光プローブ用の蛍光消光物質は４種類のみであったので、蛍光消光プローブを用いて標的核酸配列を測定する場合に、１つの測定系（サンプル）で同時に測定できる標的核酸配列の種類の上限は４種類であった。しかし、上記本発明の標的核酸配列測定用キットを用いることにより、測定波長を変えるだけで、該キットが５種類の核酸プローブを含む場合には５種の標的核酸配列を、８種の核酸プローブを含む場合には８種の標的核酸配列を１反応液中で測定することができ、多種類の標的核酸および標的核酸配列の測定をさらに高速化、低コスト化することができる。
【００４０】
また、本発明の別の局面によれば、
サンプル中の標的核酸配列を検出する方法であって、第１の核酸プローブと第２の核酸プローブを上記サンプルに添加する工程、このサンプルを、上記核酸プローブとそれらの標的核酸配列とがハイブリダイズする条件に保ちながら、上記第１の核酸プローブに由来する蛍光と第２の核酸プローブに由来する蛍光を測定する工程、および、上記サンプルを、上記核酸プローブとそれらの標的核酸配列とがハイブリダイズしない条件に保ちながら、上記第１の核酸プローブに由来する蛍光と第２の核酸プローブに由来する蛍光を測定する工程を有し、
上記第１の核酸プローブは、第１の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有し、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、この蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、第１の核酸プローブが第１の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる第１の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる第１の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡおよびＣＲ６Ｇからなる群より選ばれるいずれかであり、
上記第２の核酸プローブは、第２の標的核酸配列とハイブリダイズしうる塩基配列を有し、少なくとも一方の末端塩基が蛍光消光物質で標識され、この蛍光消光物質で標識された塩基がシトシンであり、第２の核酸プローブが第２の標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、上記シトシン塩基と対となる第２の標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記シトシン塩基と対となる第２の標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも一つのグアニン塩基が存在するように、上記塩基配列が設計され、かつ、上記蛍光消光物質がＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれるいずれかである標的核酸配列の検出方法が提供される。
【００４１】
上記本発明の標的核酸配列の測定方法では、従来の蛍光消光プローブである第１の核酸プローブに加えて、第１の核酸プローブとは蛍光消光の測定波長が異なる第２の核酸プローブを用いて、従来の蛍光消光プローブの測定波長とは異なる波長域を第２の標的核酸の測定に利用する。上記標的核酸測定用キットと同様、第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列は、同一の標的核酸（例えば、遺伝子）上にあってもよいが、別の標的核酸（遺伝子）中の配列であってもよい。
第１、第２の核酸プローブとは塩基配列の異なる、第３、第４の核酸プローブを用いてもよく、それにより、１サンプル中のさらに多くの標的核酸配列を検出することができる。
【００４２】
また、本発明の別の局面によれば、
バインディングプローブと蛍光プローブからなる核酸プローブセットであって、
上記バインディングプローブは、オリゴヌクレオチドからなり、標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸結合領域と、上記蛍光プローブとハイブリダイズする蛍光プローブ結合領域とを含み、
上記標的核酸結合領域は、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、該標的核酸結合領域中の末端塩基のうち蛍光プローブ結合領域側の塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在するように、その塩基配列が設計され、
上記蛍光プローブは、オリゴヌクレオチドからなり、上記蛍光プローブ結合領域が上記バインディングプローブの３’末端側にあるときは、３’末端塩基が蛍光消光物質で標識され、上記蛍光プローブ結合領域が上記バインディングプローブの５’末端側にあるときは、５’末端塩基が蛍光消光物質で標識され、該蛍光消光物質が、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる核酸プローブセットが提供される。
【００４３】
上記本発明の核酸プローブセットは、上記非特許文献２に記載されるユニバーサル蛍光消光プローブの一種である。図５に本発明の核酸プローブセットの一例の模式図を示す。図５に示す核酸プローブセットは、蛍光プローブ結合領域７がバインディングプローブ９の３’末端側にあるので、蛍光消光物質４は蛍光プローブ６の３’末端塩基に標識されている。本発明の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ６は、蛍光プローブ結合領域７にハイブリダイズする塩基配列であればよく、異なる標的核酸１０または標的核酸配列１１を測定する場合であっても、蛍光プローブ６は同じものを用いることができる。このため、本発明の核酸プローブセットを用いて標的核酸１０または標的核酸配列１１の分析を行う場合、蛍光消光物質４を有する高価な蛍光プローブ６を、分析対象ごとに調製する必要がないので、分析のためのコストを抑えることができる。
【００４４】
本発明の核酸プローブセットでは、蛍光消光物質４としてＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれるいずれかを使用する。ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００はいずれもグアニンと近接することにより、遊離の状態と比べて蛍光が消光する。このため、標的核酸結合領域８の塩基配列を、標的核酸配列１１とハイブリダイズでき、かつ、その末端塩基のうち蛍光プローブ結合領域７側の塩基（図５中１２で示す）と対となる標的核酸配列１１中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記塩基１を中心とする５塩基の範囲（図５中１、２または３で示す塩基）に少なくとも１つのグアニン塩基が存在するように設計し、さらに、蛍光プローブ結合領域７がバインディングプローブ９の３’末端側にあるときは、蛍光プローブ６の３’末端塩基を蛍光消光物質４で標識し、蛍光プローブ結合領域７がバインディングプローブ９の５’末端側にあるときは、蛍光プローブ６の５’末端塩基を蛍光消光物質４で標識することにより、蛍光消光物質４の蛍光消光作用を利用して標的核酸配列１１の分析に好適に使用できる。
【００４５】
本発明の核酸プローブセットは、標的核酸結合領域８がバインディングプローブ９の５’末端側に位置する場合と、３’末端側に位置する場合の２通りあるが、図５に示されるように、標的核酸結合領域８をバインディングプローブ９の５’末端側とした場合、３’末端側とする場合と比べてより高い蛍光消光率を示すので好ましい。
蛍光プローブ６中の、蛍光消光物質４が標識された末端塩基は、アデニンまたはチミンとすることが好ましい。
【００４６】
本発明の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ６とバインディングプローブ９との融解温度を「Ｔｍ２」とし、蛍光プローブ６とバインディングプローブ９とがハイブリダイズした複合体と、標的核酸配列との融解温度を「Ｔｍ１」とすると、Ｔｍ２はＴｍ１より高いことが好ましく、Ｔｍ２−Ｔｍ１の値は５℃以上であることがより好ましい。また、Ｔｍ２は９５℃以上であることが好ましい。
【００４７】
また、本発明の別の局面によれば、
バインディングプローブ、第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからなる核酸プローブセットであって、
上記バインディングプローブは、オリゴヌクレオチドからなり、５’末端側から、上記第１の蛍光プローブとハイブリダイズする第１の蛍光プローブ結合領域、標的核酸配列とハイブリダイズする標的核酸結合領域、および、上記第２の蛍光プローブとハイブリダイズする第２の蛍光プローブ結合領域を有し、
上記標的核酸結合領域は、上記標的核酸配列とハイブリダイズしたときに、該標的核酸結合領域中の５’側末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在し、かつ、上記標的核酸結合領域中の３’側末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基がグアニン塩基であるか、または、上記末端塩基と対となる上記標的核酸配列中の塩基を中心とする５塩基の範囲に少なくとも１つのグアニン塩基が存在するように、その塩基配列が設計され、
上記第１の蛍光プローブは、オリゴヌクレオチドからなり、５’末端塩基が第１の蛍光消光物質で標識され、
上記第２の蛍光プローブは、オリゴヌクレオチドからなり、３’末端塩基が第２の蛍光消光物質で標識され、
上記第１の蛍光消光物質は、上記第２の蛍光消光物質とは異なり、
上記第１の蛍光消光物質と第２の蛍光消光物質のうちの一方は、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質であり、
もう一方の蛍光消光物質は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡ、ＣＲ６Ｇ、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００からなる群より選ばれる蛍光消光物質である核酸プローブセットが提供される。
【００４８】
図６に上記核酸プローブセットの一例の模式図を示す。図６に示す核酸プローブセットは、ＡＢＣ−ＰＣＲ（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ）方法（非特許文献３参照）で従来使用されているＡＢプローブの代わりとして使用することができる。上記の通り、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡ、ＣＲ６Ｇ、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００はいずれも蛍光消光の観測波長が異なるため、これらを組み合わせて使用することができる。
【００４９】
上記本発明の核酸プローブまたは核酸プローブセットを標的核酸または標的核酸配列の測定に用いる場合、測定用サンプル中での濃度は、１ｎＭ〜１μＭとすることが好ましい。また、測定用サンプル中での本発明の核酸プローブの濃度は、標的核酸または標的核酸配列１モル当たり０．０１〜１０モルの範囲で用いることが好ましい。
【実施例】
【００５０】
＜実施例１＞  ＡＴＴＯ６５５で標識した核酸プローブの蛍光消光測定
配列番号１に示すオリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンにＣ６リンカーを介してＡＴＴＯ６５５（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を標識し、核酸プローブ１を作製した。なお、プローブの作製は、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に委託した。
配列番号１：５’−ＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’【００５１】
［測定１］
ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2：１．５ｍＭを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中に、上記核酸プローブ１を終濃度４０ｎＭ、配列番号２の標的核酸を終濃度３２０ｎＭとなるように添加し、サンプル１を調製した。
配列番号２：５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＡ−３’【００５２】
分光光度計（パーキンエルマー社製；LS50B）を用いて、サンプル１について６３０ｎｍ〜８００ｎｍの蛍光強度を測定した。なお、測定温度は２７℃、スリット幅は、２ｎｍとした。結果を図２に丸（○）で示す。【００５３】
［測定２］
サンプル１に配列番号２の標的核酸を添加しなかったこと以外は測定１と同様にして蛍光強度を測定した。結果を図２にバツ印（×）で示す。
図２に示す結果から、ＡＴＴＯ６５５で標識した核酸プローブ１が配列番号２の標的核酸とハイブリダイズすることにより、標的核酸中のグアニンとＡＴＴＯ６５５とが相互作用し、ＡＴＴＯ６５５が著しく蛍光消光することが明らかとなった。蛍光消光の程度は６８０ｎｍより長波長側で顕著であり、６８２〜８００ｎｍの間で９０％を超え、６８４ｎｍでの消光率は９０．９％であった。【００５４】
＜実施例２＞  ＡＴＴＯ６８０で標識した核酸プローブの蛍光消光測定
配列番号１に示すオリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンにＣ６リンカーを介してＡＴＴＯ６８０（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を標識し、核酸プローブ２を作製した。なお、プローブの作製は、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に委託した。【００５５】
［測定３］
ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2：１．５ｍＭを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中に、上記核酸プローブ２を終濃度４０ｎＭ、配列番号２の標的核酸を終濃度３２０ｎＭとなるように添加し、サンプル２を調製した。【００５６】
分光光度計（パーキンエルマー社製；LS50B）を用いて、サンプル２について６５０ｎｍ〜７６０ｎｍの蛍光強度を測定した。なお、測定温度は２８℃、スリット幅は、２ｎｍとした。結果を図３に丸（○）で示す。【００５７】
［測定４］
サンプル２に配列番号２の標的核酸を添加しなかったこと以外は測定３と同様にして蛍光強度を測定した。結果を図３にバツ印（×）で示す。
図３に示す結果から、ＡＴＴＯ６８０で標識した核酸プローブ２が配列番号２の標的核酸とハイブリダイズして、ＡＴＴＯ６８０とグアニンとが近接することにより、ＡＴＴＯ６８０が著しく蛍光消光することが明らかとなった。６９４ｎｍより長波長側での消光率は８０％以上であり、７００ｎｍでの消光率は８４．８％であった。【００５８】
＜実施例３＞  ＡＴＴＯ７００で標識した核酸プローブの蛍光消光測定
配列番号１に示すオリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンにＣ６リンカーを介してＡＴＴＯ７００（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を標識し、核酸プローブ３を作製した。なお、プローブの作製は、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に委託した。【００５９】
［測定５］
ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2：１．５ｍＭを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中に、上記核酸プローブ３を終濃度４０ｎＭ、配列番号２の標的核酸を終濃度３２０ｎＭとなるように添加し、サンプル３を調製した。【００６０】
分光光度計（パーキンエルマー社製；LS50B）を用いて、サンプル３について６７０ｎｍ〜７６０ｎｍの蛍光強度を測定した。なお、測定温度は２８℃、スリット幅は、２ｎｍとした。結果を図４に丸（○）で示す。【００６１】
［測定６］
サンプル３に配列番号２の標的核酸を添加しなかったこと以外は測定５と同様にして蛍光強度を測定した。結果を図４にバツ印（×）で示す。
図４に示す結果から、ＡＴＴＯ７００で標識した核酸プローブ３が配列番号２の標的核酸とハイブリダイズして、ＡＴＴＯ７００とグアニンとが近接することにより、ＡＴＴＯ７００が著しく蛍光消光することが明らかとなった。７１６ｎｍより長波長側での消光率は６０％以上であり、７２０ｎｍでの消光率は６８．３％であった。【００６２】
以上の実施例１〜３の結果から、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０およびＡＴＴＯ７００のいずれもが標的核酸中のグアニンと相互作用することにより顕著な蛍光消光を示すこと、蛍光消光プローブ用の蛍光消光物質として有用であることが示された。【００６３】
＜実施例４＞  ＡＴＴＯ６５５で標識した蛍光消光プローブによる標的核酸の検出
配列番号３に示すオリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンにＣ６リンカーを介してＡＴＴＯ６５５（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を標識し、核酸プローブ４を作製した。
配列番号３：５’−ＣＣＣＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣ−３’【００６４】
［測定７］
ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2：１．５ｍＭを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中に、上記核酸プローブ４を終濃度５０ｎＭ、配列番号４の標的核酸を終濃度１．６μＭとなるように添加し、サンプル４を調製した。
配列番号４：５’−ＧＡＴＣＡＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＧＧＧ−３’【００６５】
リアルタイムＰＣＲ装置（ロシュアプライドサイエンス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０）を用いて、サンプル４の温度を４０℃から９５℃まで変化させながら、６７０ｎｍの蛍光強度を測定した。結果を図７に四角（□）で示す。【００６６】
［測定８］
サンプル４に標的核酸を添加しなかったこと以外は測定７と同様にして蛍光強度の測定を行った。結果を図７に黒丸（●）で示す。
図７に示す結果から、７５℃以下の条件であれば核酸プローブ４を用いて標的核酸を検出できることが明らかである。【００６７】
上記式１中、Ｆ1を核酸プローブのみ（測定８）の蛍光強度、Ｆ2を標的核酸が存在するとき（測定７）の蛍光強度として蛍光消光率を求めた。結果を図８に示す。上記の通り、蛍光消光プローブによる標的核酸の測定は蛍光消光率が４０％以上の条件で行うことが好ましいが、図８の結果から約７０℃以下であれば蛍光消光率が４０％以上となり標的核酸の検出に適していることが分かる。【００６８】
［融解曲線分析］
図９に、測定７と測定８で得られた蛍光強度（Ｆ）を温度（Ｔ）で微分した値（−ｄＦ／ｄＴ）のグラフを示す。測定７の値を四角（□）で、測定８の値を黒丸（●）で示している。このグラフから、５０％の核酸プローブが遊離状態にある温度（Ｔｍ）を極小値として判別することができる。サンプル中に標的核酸が存在しない測定８では明確な極小は見られないが、サンプル中に標的核酸が存在する測定７では７０℃から８０℃の間に明確な極小を確認でき、Ｔｍは７２．３℃であった。【００６９】
＜実施例５＞  リアルタイムＰＣＲによる標的核酸の測定
本発明の核酸プローブを用いて標的核酸の定量を行うことができるか確認するために、核酸プローブ４を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、標的核酸の測定を行った。
リアルタイムＰＣＲ測定は、リアルタイムＰＣＲ装置（ロシュアプライドサイエンス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０）を用いて行った。ＰＣＲ反応液はいずれも２０μＬとし、プローブとして上記核酸プローブ４（終濃度０．２μＭ）、フォワードプライマー（配列番号５、終濃度０．３μＭ）、リバースプライマー（配列番号６、終濃度１μＭ）、標的核酸として日鉄環境エンジニアリング株式会社が分離したノニオン界面活性剤分解菌由来のＩＴＳ遺伝子、ｄＮＴＰ  ＰＬＵＳ（ロッシュ社製、終濃度：各０．２ｍＭ）、ＢＳＡ（終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）、所定量のＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社製）およびＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（クロンテック社製）を含む。
配列番号５：５’−ＡＧＴＡＴＴＣＴＧＣＧＣＡＴＧＣＧＧＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＡＴＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＡ−３’【００７０】
上記ノニオン界面活性剤分解菌由来のＩＴＳ遺伝子を１０コピー、１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピー含む６種のサンプルと、対照として上記遺伝子を含まないサンプルについて、以下のサイクルでリアルタイムＰＣＲ測定を行った。
（１）ホットスタート：９５℃、３００秒、１回
（２）ＰＣＲサイクル：５０回
（２−１）９５℃、１０秒    熱変性工程
（２−２）６２℃、２０秒    アニーリング工程
（２−３）７２℃、１０秒    伸長工程
蛍光の励起波長は６１０ｎｍ、検出波長は６７０ｎｍとした。【００７１】
得られた蛍光強度を以下の式２に代入し、ＩＴＳ遺伝子を含む上記６種のサンプルについて蛍光消光率を求めた。
［式２］
蛍光消光率＝［１−（Ｇ62,n／Ｇ95,n）／（Ｇ62／Ｇ95）］×１００
ここで、
Ｇ62：顕著な蛍光変化が見られる前の任意サイクル（本試験の場合１４サイクル目）におけるアニーリング工程時の蛍光強度
Ｇ95：顕著な蛍光変化が見られる前の任意サイクル（本試験の場合１４サイクル目）における熱変性工程時の蛍光強度
Ｇ62,n：ｎサイクル目におけるアニーリング工程時の蛍光強度
Ｇ95,n：ｎサイクル目における熱変性工程時の蛍光強度
である。【００７２】
得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットしたものを図１０に示す。この図から、標的核酸であるＩＴＳ遺伝子の初期量を蛍光消光率によって明確に識別できることが明らかである。また、これらのデータを基にして検量線を作成することにより、標的核酸を正確に定量することができる。
以上の結果から、この実験から本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を正確に定量できることが明らかとなった。【００７３】
＜実施例６＞  ＳＮＰタイピング解析
ＡＴＴＯ６５５で標識した本発明の核酸プローブ（核酸プローブ５）を用いて、ヒトＰＰＡＲγ遺伝子（Ｃ／Ｇ）を標的とするＳＮＰタイピング解析を行った。
ボランティアの口腔細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＰＡＲγ遺伝子の３種の遺伝型（Ｃアレルホモ、ＧアレルホモおよびＣＧヘテロ）についてそれぞれゲノムＤＮＡを調製した。なお、Ｃアレルホモは野生型遺伝子のホモ接合型（ｗ）、Ｇアレルホモは変異型遺伝子のホモ接合型（ｍ）、ＣＧヘテロは野生型と変異型のヘテロ接合型（ｈ）である。
鋳型としての上記３種のゲノムＤＮＡ、フォワードプライマー（配列番号７；終濃度０．１５μＭ）、リバースプライマー（配列番号８；終濃度０．５μＭ）、下記の核酸プローブ５（終濃度０．１５μＭ）、ＢＳＡ（終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）、所定量のLC480 Genotyping Master（ロシュアプライドサイエンス社製）をＰＣＲ反応容器に添加してＰＣＲを行い増幅産物を得た後、増幅産物を標的核酸として核酸プローブ５との間の解離曲線解析を行った。なお、ＰＣＲ反応液は、いずれも２０μＬとした。
配列番号７：５’−ＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧ−３’ 
配列番号８：５’−ＡＣＣＴＴＧＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡ−３’【００７４】
核酸プローブ５は、配列番号９に示すオリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンにＣ６リンカーを介してＡＴＴＯ６５５（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を標識し、核酸プローブ５を作製した。
配列番号９：５’−ＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣ−３’【００７５】
ＰＣＲおよび解離曲線解析は、リアルタイムＰＣＲ装置（ロシュアプライドサイエンス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０）を用いて行った。
ＰＣＲは以下のサイクルで行った。
（１）ホットスタート：９５℃、３００秒、１回
（２）ＰＣＲサイクル：５０回
（２−１）９５℃、１０秒    熱変性工程
（２−２）６２℃、２０秒    アニーリング工程
（２−３）７２℃、１０秒    伸長工程【００７６】
解離曲線解析は、サンプルの温度を４０℃から９５℃まで変化させながら、６７０ｎｍの蛍光強度を連続的に測定した。得られた蛍光強度値を温度で微分した値を図１１に丸（○）で示す。
また、変異型、ヘテロ接合型および標的核酸を含まない対照サンプル（ｃ）についても同様に測定を行った。【００７７】
図１１に示す結果から、野生型遺伝子のホモ接合型のＴｍは６６℃で変異型遺伝子のホモ接合型（Ｔｍ：５９℃）と明確に区別できた。また、ヘテロ接合型では２つのＴｍが観測された。これらの結果から、本発明の核酸プローブがＳＮＰタイピング解析に有用であることが明らかとなった。【００７８】
＜実施例７＞  ＡＴＴＯ４６５で標識した核酸プローブの蛍光消光測定
配列番号９に示すオリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンにＣ６リンカーを介してＡＴＴＯ４６５（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を標識し、核酸プローブ６を作製した。なお、プローブの作製は、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に委託した。【００７９】
［測定９］
ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2：１．５ｍＭを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中に、上記核酸プローブ６を終濃度５０ｎＭ、配列番号１０の標的核酸を終濃度１．６μＭとなるように添加し、サンプル５を調製した。
配列番号１０：５’−ＧＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡ−３’【００８０】
リアルタイムＰＣＲ装置（ロシュアプライドサイエンス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０）を用いて、サンプル５の温度を４０℃から９５℃まで変化させながら、励起波長を４５０ｎｍとし、測定波長５００ｎｍにて蛍光強度を測定した。結果を図１２に実線で示す。【００８１】
［測定１０］
サンプル５に標的核酸を添加しなかったこと以外は測定９と同様にして蛍光強度の測定を行った。結果を図１２に破線で示す。図１２に示す結果から、７５℃以下の条件であればＡＴＴＯ４６５で標識した核酸プローブ６を用いて標的核酸を検出できることが明らかである。【００８２】
上記式１中、Ｆ1を核酸プローブのみ（測定１０）の蛍光強度、Ｆ2を標的核酸が存在するとき（測定９）の蛍光強度として蛍光消光率を求めた。結果を図１３に示す。上記の通り、蛍光消光プローブによる標的核酸の測定は蛍光消光率が４０％以上の条件で行うことが好ましいが、図１３に示す結果から約７２℃以下であれば蛍光消光率が４０％以上となり標的核酸の検出に適していることが分かる。【００８３】
＜実施例８＞  ＳＮＰタイピング解析
ＡＴＴＯ４６５で標識した本発明の核酸プローブを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子（Ｃ／Ｇ）を標的とするＳＮＰタイピング解析を行った。
核酸プローブ５の代わりに核酸プローブ６を使用したこと以外は実施例６と同様の手順にてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。次いで増幅産物を標的核酸として核酸プローブ６との間の解離曲線解析を行った。励起波長を４５０ｎｍとし、測定波長５００ｎｍにて蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度値を温度で微分した値を図１４にバツ（×）で示す。
また、変異型（ｍ）および標的核酸を含まない対照サンプル（ｃ）についても同様に測定を行った。【００８４】
図１４に示す結果から、野生型遺伝子のホモ接合型のＴｍは６９℃で変異型遺伝子のホモ接合型（Ｔｍ：６３℃）と明確に区別できた。これらの結果から、ＡＴＴＯ４６５で標識した本発明の核酸プローブがＳＮＰタイピング解析に有用であることが明らかとなった。【００８５】
＜実施例９＞  核酸プローブセット
本発明の核酸プローブセットを用いてヒトβアクチン遺伝子量を定量する例を示す。
まず、ヒトβアクチン遺伝子の全長配列を有するｍＲＮＡを市場から入手し、これを１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7又は１０8コピー含む７種の試料を調製する。次いで、逆転写酵素を用いる周知の方法によりこれらの試料からぞれぞれｃＤＮＡを調製する。【００８６】
次に、リアルタイムＰＣＲ用の反応溶液として、上記試料から得たヒトβアクチン遺伝子のｃＤＮＡを有する７種のＰＣＲ反応溶液および当該ｃＤＮＡを含まないＰＣＲ反応溶液を調製する。各反応溶液に配列番号１１のフォワードプライマーと、配列番号１２のリバースプライマーを添加することにより、ＰＣＲ反応によってヒトβアクチン遺伝子の一部（配列番号１３）である標的核酸配列を含む２６２ｂｐの核酸が増幅される。各反応溶液には、さらに配列番号１４の塩基配列からなるバインディングプローブと、配列番号１５の塩基配列を有し、ＬＮＡのみから構成され、３’末端ヌクレオチドをＡＴＴＯ４６５で標識した蛍光プローブを添加する。
配列番号１１：５’−ＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣ−３'
配列番号１２：５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ−３'
配列番号１３：５’−ＧＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧ−３’
配列番号１４：５’−ＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＧＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴ−３’
配列番号１５：５’−ＡＣＣＡＣＴＡＣＣＣＡＴＣＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡ−ＡＴＴＯ４６５−３’【００８７】
上記バインディングプローブは、５’末端側にヒトβアクチン遺伝子の一部（配列番号１３）と相補的な塩基配列からなる標的核酸結合領域を持ち、３’末端側に蛍光プローブと相補的な塩基配列からなる蛍光プローブ結合領域を持つ。バインディングプローブの合成にあたっては、３’末端塩基をリン酸化することが好ましい。【００８８】
各ＰＣＲ反応溶液に対し、リアルタイムＰＣＲ測定を行い蛍光消光率を求め、ＰＣＲ反応液中の初期遺伝子数と、ｎサイクル時の蛍光消光率との関係を示す検量線を作成する。初期の遺伝子数が未知のサンプルに対して、同様にリアルタイムＰＣＲ測定により蛍光消光率を求め、その値をこの検量線に当てはめることにより、サンプル中のヒトβアクチンの初期遺伝子数を求めることができる。
また、蛍光プローブの蛍光消光物質として、ＡＴＴＯ４６５に代えて、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６８０またはＡＴＴＯ７００を用いても、蛍光の励起波長と測定波長を変更することによって、同様に標的核酸を定量することができる。
【符号の説明】
【００８９】
１：本発明の核酸プローブ中の、蛍光消光物質を標識したシトシン塩基と対となる位置にくる標的核酸中の塩基
１〜３：塩基１を中心とする５塩基の範囲の塩基
４：蛍光消光物質
５：本発明の核酸プローブ
６：蛍光プローブ
７:蛍光プローブ結合領域
８：標的核酸結合領域
９：バインディングプローブ
１０：標的核酸
１１：標的核酸配列
１２：標的核酸結合領域中の末端塩基のうち蛍光プローブ結合領域側の塩基
１３：標的核酸結合領域中の５’側末端塩基
１４：標的核酸結合領域中の３’側末端塩基
４１：第１の蛍光消光物質
４２：第２の蛍光消光物質
６１：第１の蛍光プローブ
６２：第２の蛍光プローブ
７１：第１の蛍光プローブ結合領域
７２：第２の蛍光プローブ結合領域
【図１】
2012173274.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2012173274.tif 000017
【図１４】
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【配列表】
2012173274000001.app
【国際調査報告】
2012173274.tif 000019
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