(57)【要約】  安価に且つ簡便に作製できる、質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片の作製方法を提供することを課題とする。  解決手段として、１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；を備えた方法を用いて、質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片を作製する。
2013014853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えた、質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片の作製方法。
（ａ）１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；
（ｂ）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；
（ｃ）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；
（ｄ）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；
【請求項２】
トリプシンによる断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理である請求項１記載の作製方法。
【請求項３】
濃度測定用ペプチド断片が、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）又はＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１又は２記載の作製方法。
【請求項４】
濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結され、且つ前記タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結される濃度測定用ペプチド断片とは異なるアミノ酸配列からなる濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの３’末端に連結されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の作製方法。
【請求項５】
安定同位体標識タンパク質が、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｎｔｃｐタンパク質をコードするＤＮＡの一部が連結体ＤＮＡに置換されたＤＮＡを発現させることにより得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の作製方法。
【請求項６】
以下の工程（Ａ）〜（Ｇ）を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法。
（Ａ）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；
（Ｂ）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；
（Ｃ）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；
（Ｄ）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；
（Ｅ）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料を、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片を調製する工程；
（Ｆ）工程（Ａ）〜（Ｄ）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｅ）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；
（Ｇ）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；
【請求項７】
以下の工程（Ａ’）〜（Ｇ’）を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法。
（Ａ’）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；
（Ｂ’）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を調製する工程；
（Ｃ’）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；
（Ｄ’）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的タンパク質の濃度を算出する工程；
（Ｅ’）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料に、工程（Ｄ’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識タンパク質を添加して、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片、及び濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；
（Ｆ’）工程（Ｅ’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｅ’）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；
（Ｇ’）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；
【請求項８】
以下の工程（Ａ’’）〜（Ｆ’’）を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法。
（Ａ’’）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；
（Ｂ’’）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料に、工程（Ａ’’）で調製された安定同位体標識タンパク質を添加して、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片、安定同位体標識標的ペプチド断片、及び安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を調製する工程；
（Ｃ’’）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；
（Ｄ’’）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；
（Ｅ’’）工程（Ｄ’’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｂ’’）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；
（Ｆ’’）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；
【請求項９】
標的タンパク質をトリプシンにより断片化処理する前に、該標的タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させ、あらかじめ標的タンパク質を精製する工程（ｐ）をさらに備えたことを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の定量方法。
【請求項１０】
トリプシンによる断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理である請求項６〜９のいずれか記載の定量方法。
【請求項１１】
濃度測定用ペプチド断片が、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）又はＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載の定量方法。
【請求項１２】
濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結され、且つ前記タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結される濃度測定用ペプチド断片とは異なるアミノ酸配列からなる濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの３’末端に連結されていることを特徴とする請求項６〜１１のいずれか記載の定量方法。
【請求項１３】
安定同位体標識タンパク質が、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｎｔｃｐタンパク質をコードするＤＮＡの一部が連結体ＤＮＡに置換されたＤＮＡを発現させることにより得られることを特徴とする請求項６〜１２のいずれか記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片の作製方法や、試料中の標的タンパク質の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬剤に対する感受性の個人差を遺伝子レベルで解析して医薬の開発に応用する、薬理ゲノミクスに関する研究が盛んに行われている。薬剤に対する感受性の個人差を診断できるようになれば、試行錯誤的な投薬を実施することなく、治療の初期から適切な投薬が可能な、いわゆる個別化治療が可能となる。特に、がん治療の分野においては、従来の抗がん剤と比較して副作用の少ない分子標的薬が盛んに開発されており、臨床現場においても使用されるようになってきている（例えば、特許文献１参照）。分子標的薬は標的となるタンパク質に特異的に作用する薬剤であるため、個々の患者におけるタンパク質発現量のプロファイルを解析し、どのような標的タンパク質が高発現しているかを知ることができれば、適切な個別化治療を計画したり実施することが可能となると考えられている。【０００３】
しかし、現在、臨床現場において主に使用されている検査法は、単一のタンパク質を検出することを目的としたものであり、多数の異なるタンパク質を同時に検出することはできない。さらに、上記検査法の多くは抗体を用いたものであるため、交差反応等のため特異的な定量検査を行うことが困難であり（例えば、非特許文献１、２参照）、また、タンパク質ごとに異なる抗体を使用しなければならないことから、多数のタンパク質を検出するためには莫大な手間と費用がかかる。このような問題を解決するために、最近、マイクロアレイ遺伝子発現分析法の開発が進み、様々な種類のＲＮＡ発現を一度に定量することが可能な遺伝子発現検査方法が確立されてきている（例えば、非特許文献３〜６参照）。しかし、分子標的薬の標的タンパク質の多くは細胞膜上に発現する膜タンパク質であり、膜タンパク質発現量とＲＮＡ発現量との相関性は極めて悪いことから、マイクロアレイ解析により得られたＲＮＡ発現プロファイルが、必ずしも患者のタンパク質発現プロファイルと一致するとは考えられていない。以上のことから、マイクロアレイ解析の結果に基づいて、分子標的薬による個別化治療を行うことは困難であり、実際に発現しているタンパク質を、網羅的に定量することが可能な検査方法を確立することが強く求められている。【０００４】
近年、質量分析法（mass spectrometry）の進展がめざましく、種々の生物学材料の検出や測定にこの方法が応用されている。これまでに、エレクトロスプレー・イオン化法による質量分析計（mass spectrometer；ＭＳ）や、質量分析計の前に液体クロマトグラフ（liquid chromatograph；ＬＣ）部を連結した液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）や、直列に接続された２台の質量分析計からなるタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）や、タンデム質量分析計の前に液体クロマトグラフ部を連結した液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）等、種々の機能をもつ質量分析計が開発されており、生物学材料の測定、定量に広く利用されている（例えば、特許文献２〜４参照）。【０００５】
最近、安定同位体標識を用いた質量分析法が開発され、生物学材料の検出や測定に利用されている。この方法は、安定同位体で標識化したタンパク質を用いて、試料中のタンパク質を質量分析法により定量するもので、血清中におけるリュウマチ患者の診断マーカーであるＣ−反応性タンパク質（C-reactive protein：ＣＲＰ）や哺乳類組織試料及び体液中のβアミロイドの定量に用いた例が報告されている。また、特許文献５〜７において、本発明者らは、このような質量分析法を改良し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた膜タンパク質及び代謝酵素の絶対発現量を一斉定量する方法を確立している。かかる方法では、標的タンパク質に含まれる標的ペプチド断片と同一アミノ酸配列からなる安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として用いることにより、トリプシン消化した生体試料中の標的ペプチド断片の絶対量を定量することができ、すなわち標的タンパク質の発現量を求めることができる。しかし、安定同位体標識ペプチド断片の合成には、１種類あたりの費用に１０万円前後かかってしまうことから、コストを抑えることが課題とされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１９２６０３号公報
【特許文献２】特開２００４−２８９９３号公報
【特許文献３】特開２００４−７７２７６号公報
【特許文献４】特表２００４−５３３６１０号公報
【特許文献５】国際公開第２００７／０５５１１６号パンフレット
【特許文献６】特開２０１０−１９７１１０号公報
【特許文献７】特開２０１０−８５１０３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Baron et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 10: 1175-1185 (2001)
【非特許文献２】Michaud et al., Nature Biotechnology, 21: 1509-1512 (2003)
【非特許文献３】Golub et al., Science 286: 531-537 (1999)
【非特許文献４】Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA98: 13790-13795 (2001)
【非特許文献５】Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Suppl.1): S316-S322 (2001)
【非特許文献６】Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 15149-15154 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、［１］安価に且つ簡便に作製できる、質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片の作製方法や、かかる安定同位体標識標的ペプチド断片を用いた試料中の標的タンパク質の定量方法を提供することにある。また、本発明の別の課題は、［２］タンパク質のトリプシンによる断片化処理を評価するための、質量分析における評価用タンパク質を提供することにある。さらに、本発明の別の課題は、［３］トリプシンによる消化率の低いタンパク質を正確に定量することができる、質量分析における標的タンパク質の定量方法を提供することにある。本発明の別の課題はまた、［４］タンパク質の定量性を改善することができる、質量分析における標的タンパク質の定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題［１］を解決すべく鋭意検討する中で、疾患の治療又は診断の指標となる標的タンパク質を感度よく定量できる、標的ペプチド断片を多数見いだしている。かかる標的ペプチド断片を定量するために、内部標準となる安定同位体標識標的ペプチド断片が必要となる。もし、安定同位体標識標的ペプチド断片をインビトロでタンパク質合成により発現させ、さらに精製するステップを経ずに調製することができれば、より安価で且つ簡便に安定同位体標識標的ペプチド断片を作製できると考えた。本発明者らは、特許文献６において、既知のタンパク質と同一のアミノ酸配列が存在せず、かつ質量分析計によって十分な感度を有している評価用ペプチド断片を開示している。かかる評価用ペプチド断片の用途は、質量分析計を用いたタンパク質の定量における前処理効率を評価することにあるが、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を定量するための濃度測定用ペプチド断片として応用できるかどうかについて検討した。上記評価用ペプチド断片の中からＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）を濃度測定用ペプチド断片として選択し、かかる濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡと、３６種類の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに結合したタンデム結合ＤＮＡとの連結体ＤＮＡを用いて、安定同位体標識アミノ酸の存在する無細胞タンパク質合成系によって安定同位体標識タンパク質を調製し、かかる安定同位体標識タンパク質を断片化処理して調製したペプチド断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定したところ、濃度測定用ペプチド断片を定量した結果を用いて、上記安定同位体標識タンパク質を精製なしに、安定同位体標的ペプチド断片を定量できることが見いだされた。また、安定同位体標識標的ペプチド断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量したところ、少なくとも１０ｆｍｏｌの検出感度で測定できることも見いだした。さらに無細胞タンパク質合成系によって合成される安定同位体標識タンパク質は、合成条件が最適化されていないなどの原因により完全に合成されないケースが考えられる。そこで、そのようなケースを検出するために、濃度測定用ペプチド断片（ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ：配列番号１）を安定同位体標識タンパク質のアミノ末端側に付加するとともに、濃度測定用ペプチド断片（ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ：配列番号２）をカルボキシル末端側に付加し、両末端の濃度測定用ペプチド断片の濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量・比較することにより、安定同位体標識タンパク質が完全に合成されたことを評価する方法を検討した。安定同位体標識タンパク質の完全長が合成されたかどうかを検証するためのモデルタンパク質として、model protein 1（ＭＰ１）（配列番号４９）及び、model protein 2（ＭＰ２）（配列番号５０）を用いて検討したところ、合成したモデルタンパク質のうち完全に合成されたものを定量・評価できることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１０】
また本発明者らは、上記課題［２］を解決すべく鋭意検討する中で、タンパク質が完全に消化され、断片化したことを評価できる評価用タンパク質を調製することをめざしている。これまで発明者らは、その過程において、２種類の評価用ペプチド断片（ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ［配列番号１］及びＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ［配列番号２］）をそれぞれ４つずつ組み込んだ配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる評価用タンパク質（第二世代評価タンパク質）を基準として、第二世代評価タンパク質全体が消化処理された場合に、測定対象の標的タンパク質が完全に消化されたと評価できるかどうかを検討した。難消化性と予想される数多く存在する細胞膜タンパク質（以下、単に「膜タンパク質」という）のうち、ランダムに選択した１２種類の膜タンパク質について消化率を解析したところ、８種類の膜タンパク質については第二世代評価タンパク質よりも消化率は低く、すなわち完全に消化されたと評価できる膜タンパク質は４種類の膜タンパク質（３３％）にとどまり、評価用タンパク質の選択について改善の余地があった。本発明者らは、上記検討する過程において、特に消化率の低いNa+/Taurocholate cotransportingpolypeptide（ｎｔｃｐ）に着目した。かかるｎｔｃｐタンパク質において、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより検出されるペプチド部位（ＧＩＹＤＧＤＬＫ［配列番号７］）を、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなる評価用ペプチド断片へ置換した評価用タンパク質（第三世代評価タンパク質）を構築し、再度検討を行ったところ、かかる第三世代評価タンパク質は、上記膜タンパク質を含む１０種類の膜タンパク質のうち、７種類の膜タンパク質よりも消化率は低かった。すなわち第三世代評価タンパク質が完全消化された場合に、同様に完全に消化されたと評価できる膜タンパク質の割合は７０％であることから、第三世代評価タンパク質を用いて消化効率を評価できる標的タンパク質の割合が、第二世代評価タンパク質と比べ、大幅に上昇することを見いだし、本発明を完成させた。【００１１】
さらに本発明者らは、上記課題［３］を解決すべくタンパク質の消化処理方法を鋭意検討している。これまでリシルエンドペプチダーゼは、タンパク質の定量値に影響を与えることは知られていなかったが、たまたまトリプシンと併用してリシルエンドペプチダーゼを用いたところ、標的タンパク質の断片化処理効率を向上させ、それにより標的タンパク質の定量の効率を改善させる効果があることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
本発明者らはまた、上記課題［４］を解決すべく鋭意検討する中で、試料中に含まれる共雑物を除去することにより、測定対象の標的タンパク質の定量性を上昇できると考えた。共雑物を除去する方法としてＳＩＳＣＡＰＡ法が知られているが、かかるStable Isotope Standards and Capture by Anti−peptide Antibodies（ＳＩＳＣＡＰＡ）法では、タンパク質試料を消化処理した後に抗体を用いてペプチド断片を濃縮する方法であり、使用できる抗体がペプチド断片に結合するものに限定されるため、汎用性に課題があった。タンパク質試料を消化処理する前に抗体を用いてタンパク質を濃縮することは、共雑物の持込が多いことが懸念材料であったが、試しに行って検討したところ、意外にも定量性を改善できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち本発明は、（１）（ａ）１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（ｂ）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；（ｃ）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（ｄ）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；の工程（ａ）〜（ｄ）を備えた、質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片の作製方法や、（２）トリプシンによる断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理である上記（１）記載の作製方法や、（３）濃度測定用ペプチド断片が、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）又はＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の作製方法や、（４）濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結され、且つ前記タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結される濃度測定用ペプチド断片とは異なるアミノ酸配列からなる濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの３’末端に連結されていることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の作製方法や、（５）安定同位体標識タンパク質が、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｎｔｃｐタンパク質をコードするＤＮＡの一部が連結体ＤＮＡに置換されたＤＮＡを発現させることにより得られることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の作製方法に関する。【００１４】
また本発明は、（６）（Ａ）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（Ｂ）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；（Ｃ）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（Ｄ）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；（Ｅ）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料を、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片を調製する工程；（Ｆ）工程（Ａ）〜（Ｄ）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｅ）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；（Ｇ）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；の工程（Ａ）〜（Ｇ）を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法に関する。【００１５】
また本発明は、（７）（Ａ’）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（Ｂ’）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を調製する工程；（Ｃ’）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（Ｄ’）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的タンパク質の濃度を算出する工程；（Ｅ’）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料に、工程（Ｄ’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識タンパク質を添加して、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片、及び濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；（Ｆ’）工程（Ｅ’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｅ’）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；（Ｇ’）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；の工程（Ａ’）〜（Ｇ’）を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法に関する。【００１６】
また本発明は、（８）（Ａ’’）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（Ｂ’’）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料に、工程（Ａ’’）で調製された安定同位体標識タンパク質を添加して、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片、安定同位体標識標的ペプチド断片、及び安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を調製する工程；（Ｃ’’）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（Ｄ’’）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；（Ｅ’’）工程（Ｄ’’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｂ’’）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；（Ｆ’’）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；の工程（Ａ’’）〜（Ｆ’’）を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法に関する。【００１７】
さらに本発明は、（９）標的タンパク質をトリプシンにより断片化処理する前に、該標的タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させ、あらかじめ標的タンパク質を精製する工程（ｐ）をさらに備えたことを特徴とする上記（６）〜（８）のいずれか記載の定量方法や、（１０）トリプシンによる断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理である上記（６）〜（９）のいずれか記載の定量方法や、（１１）濃度測定用ペプチド断片が、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）又はＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（６）〜（１０）のいずれか記載の定量方法や、（１２）濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結され、且つ前記タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結される濃度測定用ペプチド断片とは異なるアミノ酸配列からなる濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの３’末端に連結されていることを特徴とする上記（６）〜（１１）のいずれか記載の定量方法や、（１３）安定同位体標識タンパク質が、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｎｔｃｐタンパク質をコードするＤＮＡの一部が連結体ＤＮＡに置換されたＤＮＡを発現させることにより得られることを特徴とする上記（６）〜（１２）のいずれか記載の定量方法に関する。【００１８】
また本発明の実施の形態として、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｎｔｃｐタンパク質の一部が評価用ペプチド断片に置換された評価用タンパク質を挙げることができる。【００１９】
また本発明の実施の形態として、（ａ）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料を、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理し、標的ペプチド断片を調製する工程；（ｂ）安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、標的ペプチド断片の定量を行う工程；を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法（１）を挙げることができる。【００２０】
さらに本発明の実施の形態として、［１］（ａ）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料を、該標的タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させ、標的タンパク質を精製する工程；（ｂ）標的タンパク質をトリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片を調製する工程；（ｃ）安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、標的ペプチド断片の定量を行う工程；を備えた試料中の標的タンパク質の定量方法（２）や、［２］トリプシンによる断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理である上記［１］記載の定量方法（２）を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２１】
安定同位体標識標的ペプチド断片を外注すると、１種類あたり約１０万円の費用がかかるのに対し、本発明の作製方法によると、１種類あたり約４０００円で安定同位体標識標的ペプチド断片を合成できることから、経済的に優れている。また、本発明の作製方法により、精製するステップを経ずに安定同位体標識標的ペプチド断片を作製することができるため、簡便性にも優れている。さらに、より多くの標的タンパク質を同定・定量することができることから、これまで解析に手をつける余裕がなかったタンパク質の解析も手軽に行えるようになり、薬物動態研究の更なる発展に貢献できる。また本発明の評価用タンパク質を用いると、トリプシンによる消化処理効率が低い膜タンパク質などの標的タンパク質の多くについて、高い効率で消化処理が行われたことを確認しつつ測定作業を進めることができる。また、本発明の定量方法（１）によると、タンパク質の消化処理効率を高めることができることから、より正確に標的タンパク質を定量することができる。また、本発明の定量方法（２）によると、抗体が標的ペプチド断片に結合する抗体に限定されないため、抗体を選択する幅が広がる。さらに、本発明の定量方法（２）によると、試料中の共雑物の影響を抑えることにより、定量性を高めることができることから、低濃度の微量の標的タンパク質、例えば大きな容量の血液等に含まれる微量の標的タンパク質を定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】大腸菌Triose Phosphate Isomerase（ＴＰＩ）タンパク質（標的ペプチド断片；ＱＩＤＡＶＬＫ［配列番号４８］）（第一世代評価タンパク質）、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（標的ペプチド断片；ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ［配列番号１］及びＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ［配列番号２］）（第二世代評価タンパク質）のトリプシン消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−■−は第一世代評価タンパク質の消化率を、…●…は第二世代評価タンパク質の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が２４時間の評価値を１００とした場合の百分率を示す。
【図２】第二世代評価タンパク質及びｎｔｃｐタンパク質（配列番号８）におけるＧＩＹＤＧＤＬＫ（配列番号７）を、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）へ置換したタンパク質（配列番号５）（第三世代評価タンパク質）のトリプシン消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−■−は第二世代評価タンパク質の消化率を、…●…は第三世代評価タンパク質の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が２４時間の評価値を１００とした場合の百分率を示す。
【図３】Organic Anion Transporting Polypeptide 1（ｏａｔｐ１）タンパク質と第三世代評価タンパク質のトリプシン消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−■−はｏａｔｐ１タンパク質の消化率を、…●…は第三世代評価タンパク質の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が２４時間の評価値を１００とした場合の百分率を示す。
【図４】Bile salt export pump（ｂｓｅｐ）タンパク質と第三世代評価タンパク質のトリプシン消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−■−はｂｓｅｐタンパク質の消化率を、…●…は第三世代評価タンパク質の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が２４時間の評価値を１００とした場合の百分率を示す。
【図５】Breast cancer resistance protein（ｂｃｒｐ）タンパク質と第三世代評価タンパク質のトリプシン消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−■−はｂｃｒｐタンパク質の消化率を、…●…は第三世代評価タンパク質の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が２４時間の評価値を１００とした場合の百分率を示す。
【図６】Glucose transporter 1（ｇｌｕｔ１）タンパク質と第三世代評価タンパク質のトリプシン消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−■−はｇｌｕｔ１タンパク質の消化率を、…●…は第三世代評価タンパク質の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が２４時間の評価値を１００とした場合の百分率を示す。
【図７】本発明の膜タンパク質を定量する方法（１）におけるタンパク質酵素処理工程の概要を示す図である。図中、Ｋはリシン残基を、Ｒはアルギニン残基を示す。
【図８】ｎｔｃｐタンパク質を、トリプシン単独により消化した場合と、リシンエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）とトリプシンを組み合わせて消化した場合の、消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−◆−はＬｙｓ−Ｃによる３時間の消化後にトリプシン消化した場合の消化率を、…●…はトリプシンのみで消化した場合の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が１６時間の定量値を１００とした場合の百分率を示す。
【図９】Monocarboxylate transporter 1（ｍｃｔ１）タンパク質を、トリプシン単独により消化した場合と、リシンエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）とトリプシンを組み合わせて消化した場合の、消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、−◆−はＬｙｓ−Ｃによる３時間の消化後にトリプシン消化した場合の消化率を、…●…はトリプシンのみで消化した場合の消化率をそれぞれ示す。トリプシン消化率は、トリプシン消化時間が１６時間の定量値を１００とした場合の百分率を示す。
【図１０】4F2 heavy chain（４Ｆ２ｈｃ)、Multidrug resistance protein-6（ｍｒｐ６）、ATP-Cassette binding proteins G5（ａｂｃｇ５）、ATP-Cassette binding proteins G8（ａｂｃｇ８）、Organic anion transporting polypeptide 1（ｏａｔｐ１）、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｎｔｃｐ、Glucose transporter 1（ｇｌｕｔ１）、Betaine/GABA（ｂｇｔ１）、及びＮａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅを、トリプシン単独で１６時間消化した場合と、Ｌｙｓ−Ｃによる３時間の消化後にトリプシンで消化した場合とでは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量値が変化することを示す図である。
【図１１】抗体を用いたペプチド断片を濃縮する方法として、従来法（ＳＩＳＣＡＰＡ）と本発明における方法との比較を示す図である。
【図１２】ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）の細胞膜画分に含まれるＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ  ａｌｌ［９６３−９７０］）、及びＥＧＦＲの２つのバリアント（ＥＧＦＲ  ｍｕｔ［Ｌ８５８Ｒ］及びＥＧＦＲ  ＷＴ［Ｌ８５８］）の発現量を、ＥＬＩＳＡ（上段）並びにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（下段）により定量した結果を示す図である。
【図１３】本発明の安定同位体標識タンパク質及び安定同位体標識ペプチド断片の作製方法の概要を示す図である。
【図１４】３６種類の一般診断マーカーの標的ペプチド断片のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる検出感度を示した図である。
【図１５】本発明の安定同位体標識タンパク質が完全に合成されたことを評価する方法の概要を示す図である。
【図１６】２種類のタンパク質（ＭＰ１及びＭＰ２）のアミノ末端に付加した濃度測定用ペプチド断片（ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ：配列番号１）（図中「濃度測定用ペプチド断片Ａ」）の濃度と、かかる２種類のタンパク質のカルボキシル末端に付加した濃度測定用ペプチド断片（ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ：配列番号２）（図中「濃度測定用ペプチド断片Ｂ」）の濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量した結果を示す図である。左図にＭＰ１を用いた場合の結果を示し、右図にＭＰ２を用いた場合の結果を示す。また各値は平均（Mean）±標準偏差（ＳＥＭ）（ｎ＝４）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片の作製方法としては、（ａ）１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（ｂ）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；（ｃ）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（ｄ）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；の工程（ａ）〜（ｄ）を備えた方法であれば特に制限されず、ここで「質量分析における安定同位体標識標的ペプチド断片」とは、質量分析において、定量対象である標的ペプチド断片を定量するときに、測定ごとに定量値が変動することを補正するための内部標準として用いる安定同位体標識標的ペプチド断片のことをいう。また、本発明の質量分析とは、ペプチド断片試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、目的に応じてＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などを使用することができ、分析部において、イオン化したペプチド断片試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を適宜選択することができる。また２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用することも、質量分析計へ導入前に標的タンパク質を含む試料を液体クロマトグラフ（ＬＣ）やＨＰＬＣで分離することもできまた、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。
【００２４】
また、本発明の試料中の標的タンパク質の定量方法としては、（Ａ）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（Ｂ）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片及び安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；（Ｃ）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（Ｄ）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；（Ｅ）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料を、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片を調製する工程；（Ｆ）工程（Ａ）〜（Ｄ）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｅ）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；（Ｇ）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；の工程（Ａ）〜（Ｇ）を備えた方法や、（Ａ’）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（Ｂ’）安定同位体標識タンパク質を、トリプシンにより断片化処理し、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を調製する工程；（Ｃ’）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（Ｄ’）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的タンパク質の濃度を算出する工程；（Ｅ’）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料に、工程（Ｄ’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識タンパク質を添加して、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片、及び濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を調製する工程；（Ｆ’）工程（Ｅ’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｅ’）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；（Ｇ’）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；の工程（Ａ’）〜（Ｇ’）を備えた方法や、（Ａ’’）標的タンパク質に含まれる１種又は２種以上の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したタンデム結合ＤＮＡと、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとの連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより、安定同位体標識タンパク質を調製する工程；（Ｂ’’）１種又は２種以上の標的タンパク質を含む試料に、工程（Ａ’’）で調製された安定同位体標識タンパク質を添加して、トリプシンにより断片化処理し、標的ペプチド断片、安定同位体標識標的ペプチド断片、及び安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を調製する工程；（Ｃ’’）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量する工程；（Ｄ’’）安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値から、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を算出する工程；（Ｅ’’）工程（Ｄ’’）で得られる濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を内部標準として、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、工程（Ｂ’’）で得られる標的ペプチド断片の定量を行う工程；（Ｆ’’）標的ペプチド断片の定量値から、標的タンパク質の濃度を算出する工程；の工程（Ａ’）〜（Ｆ’）を備えた方法であれば特に制限されないが、試料中の１種又は２種以上の標的タンパク質をトリプシンにより断片化処理する前に、該標的タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させ、あらかじめ標的タンパク質を精製する工程（ｐ）をさらに備えた方法が好ましく、ここで試料としては、特に制限されるものではないが、具体的に、生体から採取された細胞、組織、又は血液等を、凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた破砕処理や、分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理することにより得られる細胞膜画分の試料を挙げることができる。また、本発明の標的タンパク質を精製する工程（ｐ）としては、標的タンパク質に特異的な抗体と標的タンパク質との抗体−抗原反応を利用し、アフィニティー精製する方法を備えた工程であれば特に制限されず、アフィニティー精製する方法としては、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡやＰｒｏｔｅｉｎＧを共有結合させた磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ等のＰｒｏｔｅｉｎビーズに結合させた抗体を用いる免疫沈降法や、プラスチック、シリコン、ガラスなどの固相に結合させた抗体を用いるＥＬＩＳＡ法等を挙げることができ、ＥＬＩＳＡ法を好適に例示することができる。用いる抗体の種類数としては、標的タンパク質に対応する種類数であれば特に制限されない。
【００２５】
本発明の標的タンパク質とは、定量対象のタンパク質のことをいう。標的タンパク質としては、特に制限されないが、例えば疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を挙げることができ、具体的には、例えば、一般診断において診断対象となるタンパク質である、血清アミラーゼ（アクセッションナンバーＰ０４７４５、Ｐ０４７４６、Ｐ１９９６１）、Ａｐｏ−Ａ１（アクセッションナンバーＰ０２６４７）、Ａｐｏ−Ａ２（アクセッションナンバーＰ０２６５２）、Ａｐｏ−Ｂ（４８＋１００）（アクセッションナンバーＰ０４１１４）、Ａｐｏ−Ｂ１００（アクセッションナンバーＰ０４１１４）、Ａｐｏ−Ｃ２（アクセッションナンバーＰ０２６５５）、ＡｐｏＣ３（アクセッションナンバーＰ０２６５６）、Ａｐｏ−Ｅ（アクセッションナンバーＰ０２６４９）、ＧＯＴ（細胞質）（アクセッションナンバーＰ１７１７４）、ＧＯＴ（ミトコンドリア）（アクセッションナンバーＰ００５０５）、ＧＰＴ（アクセッションナンバーＱ８ＴＤ３０）、ＬＤＨ＿Ｍ（アクセッションナンバーＰ００３３８）、ＬＤＨ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０７１９５）、ＡＬＰ（アクセッションナンバーＰ０５１８６）、γ−ＧＴＰ（アクセッションナンバーＰ１９４４０、Ｐ３６２６８、Ａ６ＮＧＵ５）、ＺＴＴ（アクセッションナンバーＰ０１８５７）、ＣＨＥ（アクセッションナンバーＰ０６２７６）、ＣＥＡ（アクセッションナンバーＰ０６７３１）、ＰＳＡ（アクセッションナンバーＰ０７２８８）、ＣＡ１２５（アクセッションナンバーＱ８ＷＸＩ７）、ＣＡ１５−３（アクセッションナンバーＰ１５９４１）、ＣＹＦＲＡ（アクセッションナンバーＰ０８７２７）、ＰＩＶＫＡ−II（アクセッションナンバーＰ００７３４）、血清ＨＥＲ２タンパク質（アクセッションナンバーＰ０４６２６）、ＣＲＰ（アクセッションナンバーＰ０２７４１）、ＡＦＰ（アクセッションナンバーＰ０２７７１）、ＳＣＣＡ１（アクセッションナンバーＰ２９５０８）、ＳＣＣＡ２（アクセッションナンバーＰ４８５９４）、ＮＳＥ（アクセッションナンバーＰ０９１０４）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０２７９４）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ＿Ｌ（アクセッションナンバーＰ０２７９２）、ｅｌａｓｔａｓｅ１（アクセッションナンバーＱ１４２３７）、Ｐｒｏ−ＧＲＰ（アクセッションナンバーＰ０７４９２）、ＰＡＰ（アクセッションナンバーＰ１５３０９）等を挙げることができる。
【００２６】
上記２種以上の標的タンパク質としては、例えば、１０種以上、２０種以上、３０種以上、３５種以上、４０種以上の標的タンパク質や、２〜５０種、２〜４０種、２〜３６種、１０〜５０種、１０〜４０種、１０〜３６種、２０〜５０種、２０〜４０種、２０〜３６種、３０〜５０種、３０〜４０種、３０〜３６種、３６種の標的タンパク質等を選択することができる。
【００２７】
本発明のトリプシンによる断片化処理としては、トリプシンを使用してタンパク質を断片化する処理であればよく、トリプシン処理を効率よく行うために緩衝液中で行う例を好適に挙げることができ、さらに他の酵素や化学物質などを含んでもよい。また安定同位体標識タンパク質や標的タンパク質のアルギニン残基及びリシン残基の両方の部位を効率よく切断できるという点から、トリプシンによる断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理であることが好ましい。トリプシンの反応条件としては、例えば、３０℃〜４５℃において１〜３６時間であることが好ましく、３６〜３７℃において１６〜２４時間であることがさらに好ましい。また、リシルエンドペプチダーゼの反応条件としては、例えば、１５〜４５℃において１〜３６時間であることが好ましく、１５〜２５℃において２〜４時間であることがさらに好ましい。
【００２８】
本発明の１種又は２種以上の標的ペプチド断片としては、
（１）標的タンパク質のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列からなるペプチド断片であること；（２）標的タンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチド断片であること；（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、；（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０〜６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０〜９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分〜５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分〜５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６〜５８分では１００％移動相Ｂ、６０〜９０分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の条件（ｉ）〜（ｖ）の液体クロマトグラフィーによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０〜７０分の範囲内であるペプチド断片であること；の（１）〜（３）からなる必須クライテリアを満たすペプチド断片を選択する工程；及び（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、上記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（５）アミノ酸残基数が４〜３０のペプチド断片である場合、スコア３を付与する；（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン−アルギニン、アルギニン−リジン、リジン−アルギニン、リジン−リジンではないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（１１）メチオニン、システインを含まないペプチド断片である場合、スコア１０を付与する；（１２）トリプトファンを含まないペプチド断片である場合、スコア１を付与する；（１３）グルタミン酸を含まないペプチド断片である場合、スコア１を付与する；（１４）ヒスチジンを含まないペプチド断片である場合、スコア２を付与する；（１５）プロリンを含むペプチド断片である場合、スコア２を付与する；の（４）〜（１５）からなる選択クライテリアに基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチド断片を優先的に選択する工程；
により選択されるペプチド断片であり、かつＣ末端にアルギニン残基又はリシン残基を有するペプチド断片であれば特に制限されないが、上記選択クライテリア（４）において、疎水アミノ酸の含量が５０％以下であり、且つ、上記選択クライテリア（５）において、アミノ酸残基数が６〜１６のペプチド断片であることがより好ましい。また、上記選択クライテリア（６）における、タンパク質データベースとしては、Protein Information Resource（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ＆ＴｒＥＭＢＬ、Protein Research Foundation（ＰＲＦ）、NCBI Protein Database、UniProt(http://www.uniprot.org/)等の公知のタンパク質データベースであれば特に制限されないが、中でも、NCBI Protein DatabaseやUniProt（http://www.uniprot.org/）であることが好ましい。上記選択クライテリア（６）における、「タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチド断片」としては、具体的には、アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、又は、アスパラギン−Ｘ−システインの配列を含まないペプチド断片であって、上記Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるペプチド断片等を好適に例示することができる。
【００２９】
上記必須クライテリア（３）における、各アミノ酸における溶出時間パラメータとしては、既知のアミノ酸配列からなるペプチド断片を、（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０〜６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０〜９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分〜５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分〜５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６〜５８分では１００％移動相Ｂ、６０〜９０分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の（ｉ）〜（ｖ）の条件からなる液体クロマトグラフィーにより分離することにより得られる溶出時間データに基づいて設定されたものであれば特に制限されないが、より具体的には、例えば、アラニン（Ａ）の溶出時間パラメータとしては−０．６７２を、システイン（Ｃ）の溶出時間パラメータとしては＋１を、アスパラギン酸（Ｄ）の溶出時間パラメータとしては＋０．７６９を、グルタミン酸（Ｅ）の溶出時間パラメータとしては＋０．０８１を、フェニルアラニン（Ｆ）の溶出時間パラメータとしては＋１６．３０９を、グリシン（Ｇ）の溶出時間パラメータとしては−０．２５１を、ヒスチジン（Ｈ）の溶出時間パラメータとしては−２．９９５を、イソロイシン（Ｉ）の溶出時間パラメータとしては＋７．７６３を、リジン（Ｋ）の溶出時間パラメータとしては−３．２０１を、ロイシン（Ｌ）の溶出時間パラメータとしては＋１０．４６８を、メチオニン（Ｍ）の溶出時間パラメータとしては＋８．３１３を、アスパラギン（Ｎ）の溶出時間パラメータとしては−１を、プロリン（Ｐ）の溶出時間パラメータとしては＋２．１９５を、グルタミン（Ｑ）の溶出時間パラメータとしては−１を、アルギニン（Ｒ）の溶出時間パラメータとしては−０．０１３を、セリン（Ｓ）の溶出時間パラメータとしては−２．１８１を、トレオニン（Ｔ）の溶出時間パラメータとしては＋４．２１５を、バリン（Ｖ）の溶出時間パラメータとしては＋６．４２２を、トリプトファン（Ｗ）の溶出時間パラメータとしては＋１８．６５を、チロシン（Ｙ）の溶出時間パラメータとしては＋７．３７を好適に挙げることができる。上記（ｉ）〜（ｖ）の条件からなる液体クロマトグラフィーによるペプチド断片の溶出時間は、これらの各アミノ酸の溶出時間パラメータに基づいて算出することができる。
【００３０】
また、上記必須クライテリア（３）において、「予測溶出時間が３０〜７０分の範囲内であるペプチド断片」とは、上記各アミノ酸における溶出時間パラメータに基づいて、（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０〜６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０〜９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分〜５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分〜５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６〜５８分では１００％移動相Ｂ、６０〜９０分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の条件（ｉ）〜（ｖ）の液体クロマトグラフィーによる溶出時間を算出したときに、３０〜７０分の範囲内で溶出されると予測されるペプチド断片を意味し、ここで「溶出時間」とは、液体クロマトグラフに導入してから流出してくるまでに掛かる時間、すなわち、液体クロマトグラフィー用カラムにおける保持時間を意味する。また、上記ペプチド断片の予測溶出時間は、３０〜７０分の範囲内であれば特に制限されず、例えば、３０〜６５分、３０〜６０分、３５〜７０分、３５〜６５分、３５〜６０分、４０〜７０分、４０〜６５分、４０〜６０分などであってもよいが、４０〜６０分であることが好ましい。
【００３１】
上記標的ペプチド断片としては、具体的には、例えば、一般診断において診断対象となるタンパク質を定量するための配列番号１３〜４８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を挙げることができる。すなわち、血清アミラーゼ（アクセッションナンバーＰ０４７４５、Ｐ０４７４６、Ｐ１９９６１）の部分配列である、ＳＳＤＹＦＧＮＧＲ（配列番号１３）、及びＩＹＶＳＤＤＧＫ（配列番号１４）；Ａｐｏ−Ａ１（アクセッションナンバーＰ０２６４７）の部分配列である、ＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫ（配列番号１５）及びＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫ（配列番号１６）；Ａｐｏ−Ａ２（アクセッションナンバーＰ０２６５２）の部分配列である、ＳＰＥＬＱＡＥＡＫ（配列番号１７）；Ａｐｏ−Ｂ（４８＋１００）（アクセッションナンバーＰ０４１１４）の部分配列である、ＩＥＩＰＬＰＦＧＧＫ（配列番号１８）及びＥＦＱＶＰＴＦＴＩＰＫ（配列番号１９）；Ａｐｏ−Ｂ１００（アクセッションナンバーＰ０４１１４）の部分配列である、ＮＰＮＧＹＳＦＳＩＰＶＫ（配列番号２０）及びＮＩＩＬＰＶＹＤＫ（配列番号２１）；Ａｐｏ−Ｃ２（アクセッションナンバーＰ０２６５５）の部分配列である、ＴＹＬＰＡＶＤＥＫ（配列番号２２）；ＡｐｏＣ３（アクセッションナンバーＰ０２６５６）の部分配列である、ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号２３）；Ａｐｏ−Ｅ（アクセッションナンバーＰ０２６４９）の部分配列である、ＬＧＰＬＶＥＱＧＲ（配列番号２４）；ＧＯＴ（細胞質）（アクセッションナンバーＰ１７１７４）の部分配列である、ＩＴＷＳＮＰＰＡＱＧＡＲ（配列番号２５）及びＬＡＬＧＤＤＳＰＡＬＫ（配列番号２６）；ＧＯＴ（ミトコンドリア）（アクセッションナンバーＰ００５０５）の部分配列である、ＦＶＴＶＱＴＩＳＧＴＧＡＬＲ（配列番号２７）；ＧＰＴ（アクセッションナンバーＱ８ＴＤ３０）の部分配列である、ＩＬＶＳＧＧＧＫ（配列番号２８）及びＴＰＳＳＷＧＲ（配列番号２９）；ＬＤＨ＿Ｍ（アクセッションナンバーＰ００３３８）の部分配列である、ＬＶＩＩＴＡＧＡＲ（配列番号３０）；ＬＤＨ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０７１９５）の部分配列である、ＩＶＶＶＴＡＧＶＲ（配列番号３１）；ＡＬＰ（アクセッションナンバーＰ０５１８６）の部分配列である、ＦＰＦＶＡＬＳＫ（配列番号３２）；γ−ＧＴＰ（アクセッションナンバーＰ１９４４０、Ｐ３６２６８）の部分配列である、ＬＦＱＰＳＩＱＬＡＲ（配列番号３３）及びＧＧＬＳＶＡＶＰＧＥＩＲ（配列番号３４）；ＺＴＴ（アクセッションナンバーＰ０１８５７）の部分配列である、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号３５）及びＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号３６）；ＣＨＥ（アクセッションナンバーＰ０６２７６）の部分配列である、ＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫ（配列番号３７）及びＦＷＴＳＦＦＰＫ（配列番号３８）；ＣＥＡ（アクセッションナンバーＰ０６７３１）の部分配列である、ＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦＩＡＫ（配列番号３９）；ＰＳＡ（アクセッションナンバーＰ０７２８８）の部分配列である、ＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲ（配列番号４０）；ＣＡ１２５（アクセッションナンバーＱ８ＷＸＩ７）の部分配列である、ＬＴＳＰＶＶＴＴＳＴＲ（配列番号４１）及���ＦＰＤＩＦＳＶＡＳＳＲ（配列番号４２）；ＣＡ１５−３（アクセッションナンバーＰ１５９４１）の部分配列である、ＳＳＶＰＳＳＴＥＫ（配列番号４３）及びＡＴＴＴＰＡＳＫ（配列番号４０）；ＣＹＦＲＡ（アクセッションナンバーＰ０８７２７）の部分配列である、ＩＬＧＡＴＩＥＮＳＲ（配列番号４５）；ＰＩＶＫＡ−II（アクセッションナンバーＰ００７３４）の部分配列である、ＡＮＴＦＬＥＥＶＲ（配列番号４６）；血清ＨＥＲ２タンパク質（アクセッションナンバーＰ０４６２６）の部分配列である、ＶＬＱＧＬＰＲ（配列番号４７）及びＧＧＶＬＩＱＲ（配列番号４８）；等を例示することができる。
【００３２】
上記２種以上の標的ペプチド断片としては、定量対象の標的タンパク質の種類数とその種類に対応した標的ペプチド断片であればよく、例えば、１０種以上、２０種以上、３０種以上、３５種以上、４０種以上の標的ペプチド断片や、２〜５０種、２〜４０種、２〜３６種、１０〜５０種、１０〜４０種、１０〜３６種、２０〜５０種、２０〜４０種、２０〜３６種、３０〜５０種、３０〜４０種、３０〜３６種、３６種の標的ペプチド断片等を選択することができる。
【００３３】
本発明のタンデム結合ＤＮＡとは、標的ペプチド断片をコードするＤＮＡの転写方向が同一となるように連結したＤＮＡのことをいう。本発明のタンデム結合ＤＮＡとしては、標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに２以上結合したＤＮＡであれば特に制限されず、ここで２以上結合したＤＮＡとしては、例えば１０以上、２０以上、３０以上、３５以上、４０以上結合したＤＮＡや、２〜５０、２〜４０、２〜３６、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３６、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３６、３０〜５０、３０〜４０、３０〜３６、３６結合したＤＮＡ等を挙げることができる。標的ペプチド断片をコードするＤＮＡは、標的ペプチド断片のアミノ酸配列情報を基に、適宜選択することができる。また、本発明のタンデム結合ＤＮＡは、標的ペプチド断片がタンデムに結合する間にリンカーＤＮＡが挿入されるＤＮＡであってもよく、ここでリンカーＤＮＡとしては、標的ペプチド断片のフレームシフトが生じず、且つ終止コドンが出現しないように設計されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡであれば特に制限されないが、トリプシンの切断部位周辺のアミノ酸が切断効率に影響を与えることを考慮すると、標的タンパク質において、標的ペプチド断片前後のアミノ酸をコードするＤＮＡを好適に例示することができる。また、トリプシンによる断片化処理により、標的ペプチド断片とリンカーＤＮＡ由来のペプチド断片とを切断できるようにするために、リンカーＤＮＡの３’末端のコドンは、アルギニン残基又はリシン残基であることが好ましい。さらに、リンカーＤＮＡの塩基数は特に制限されず、例えば３塩基、６塩基、９塩基、１２塩基等を例示することができる。
【００３４】
本発明の濃度測定用ペプチド断片とは、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度を測定するために、質量分析により定量するペプチド断片のことをいう。本発明の濃度測定用ペプチド断片としては、アミノ酸残基数が３〜２０のペプチド断片であって、Ｃ末端にアルギニン残基（Ｒ）又はリシン残基（Ｋ）を有し、Ｃ末端以外にはアルギニン残基又はリシン残基を有さず、天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列からなる、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより検出可能であるペプチド断片であれば特に制限されないが、アミノ酸残基数は８、１０又は１２であって、１若しくは２のプロリン、又はグリシンを含み、且つ、ヒスチジンを含まないペプチド断片が好ましく、具体的には、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）、ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）、ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号３）及びＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号４）を挙げることができ、これらの中でもＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）やＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）を好適に例示することができる。本発明の濃度測定用ペプチド断片は、天然に存在するペプチド断片と区別して定量することができるため、試料に添付して使用することができる。また、本発明の濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡは、濃度測定用ペプチド断片のアミノ酸配列情報を基に、適宜選択することができる。
【００３５】
本発明の連結体ＤＮＡとは、本発明のタンデム結合ＤＮＡと濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡとが連結したＤＮＡのことをいう。また本発明の濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡは、タンデム結合ＤＮＡの５’末端又は３’末端のいずれかに連結されていればよいが、安定同位体標識タンパク質のタンパク質合成が完全に行われたことを評価する場合、濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結され、且つ前記タンデム結合ＤＮＡの５’末端に連結される濃度測定用ペプチド断片とは異なるアミノ酸配列からなる濃度測定用ペプチド断片をコードするＤＮＡが、タンデム結合ＤＮＡの３’末端に連結されることが好ましく、その場合に用いる濃度測定用ペプチド断片としては、本発明の濃度測定用ペプチド断片であれば特に制限されないが、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）及びＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）を好適に例示することができる。安定同位体標識タンパク質のタンパク質合成が完全に行われたことの評価は、タンデム結合ＤＮＡの５’末端に存在する濃度測定用ペプチド断片及び３’末端に存在する濃度測定用ペプチド断片の濃度を算出し、かかる濃度比率を基に行うことができる。
【００３６】
本発明の安定同位体標識アミノ酸としては、安定同位体元素を含むアミノ酸であればよく、例えば１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上の安定同位体標識元素を含み、安定同位体で標識されたアミノ酸であれば特に制限されない。安定同位体で標識されるアミノ酸としては、２０種類のＬ−アミノ酸（Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン）であって、標的ペプチド断片に含まれるアミノ酸であれば特に制限されないが、トリプシンによる切断部位であるＬ−アルギニン及び／又はＬ−リジンが好ましい。
【００３７】
本発明の安定同位体標識タンパク質は、連結体ＤＮＡの他、例えば輸送シグナル配列やグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン等のタンパク質精製のためのタグ配列をコードするＤＮＡを備えたＤＮＡを発現させることにより得られる、タグを含む安定同位体標識タンパク質であってもよいが、タンパク質精製のためのタグ配列をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを発現させることにより得られる安定同位体標識タンパク質が好ましい。また、本発明の安定同位体標識タンパク質としては、具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるｎｔｃｐタンパク質をコードするＤＮＡの一部が連結体ＤＮＡに置換されたＤＮＡを発現させることにより得られる安定同位体標識タンパク質を挙げることができる。ここでｎｔｃｐタンパク質をコードするＤＮＡの一部としては、ｎｔｃｐタンパク質において、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量できるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましく、具体的にはＧＩＹＤＧＤＬＫ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００３８】
本発明の安定同位体標識タンパク質は、本発明の連結体ＤＮＡを、安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより調製することができ、安定同位体標識アミノ酸の存在する系としては、安定同位体標識アミノ酸の存在する無細胞タンパク質合成系や生細胞タンパク質合成系を挙げることができる。すなわち、無細胞タンパク質合成系において安定同位体標識アミノ酸に加えて安定同位体非標識アミノ酸を材料としてタンパク質を合成させることや、生細胞タンパク質合成系において本発明の連結体ＤＮＡで形質転換した細胞を安定同位体標識アミノ酸存在下で培養することにより、本発明の連結体ＤＮＡから本発明の安定同位体標識タンパク質を調製することができる。
【００３９】
無細胞タンパク質合成系を用いた本発明の安定同位体標識タンパク質の発現は、本発明の連結体ＤＮＡや上記安定同位体標識アミノ酸の他、安定同位体標識タンパク質合成のために必要な安定同位体非標識アミノ酸、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンホスフェート等の高エネルギーリン酸結合含有物）などを用いて行うことができる。温度、時間等の反応条件は、適宜最適な条件を選択して行うことができ、例えば温度は２０〜４０℃、好ましくは２３〜３７℃であり、また反応時間は１〜２４時間、好ましくは１０〜２０時間である。上記「無細胞タンパク質合成用細胞抽出液」とは、リボソーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に関与する翻訳系又は転写系／翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞からの抽出液をいう。具体的には、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の細胞抽出液を挙げることができる。かかる細胞抽出液の調製は、例えばPratt, J.M.ら、Transcription and trasnlation-a practical approach(1984)、pp.179-209に記載の方法に従い、上記細胞をフレンチプレス、グラスビーズ、超音波破砕装置等を用いて破砕処理し、タンパク質成分やリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えてホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈殿させることによって行うことができる。
【００４０】
また、無細胞タンパク質合成系を用いた本発明の安定同位体標識タンパク質の発現は、小麦胚芽抽出液を備えたPremium Expression Kit（セルフリーサイエンス社製）や大腸菌抽出液を備えたRTS 100, E.coli HY Kit（Roche Applied Science社製）や無細胞くんQuick（大陽日酸社製）等市販のキットを適宜使用して行ってもよい。発現させた安定同位体標識タンパク質が不溶性の場合、グアニジン塩酸塩、尿素等のタンパク質変性剤を用いて適宜可溶化させてもよい。可溶化させた後は、トリプシンによる断片化処理が阻害されないように、タンパク質変性剤の濃度を調整する。安定同位体標識タンパク質は、さらに分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理や、アフィニティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー等を用いた精製処理により調製することもできるが、かかる分画処理や精製処理を行わないで調製する安定同位体標識タンパク質を好適に例示することができる。
【００４１】
他方、生細胞タンパク質合成系を用いた本発明の安定同位体標識タンパク質の発現は、生細胞に本発明の連結体ＤＮＡを導入し、かかる生細胞を栄養分や抗生物質などの他、上記安定同位体標識アミノ酸、安定同位体標識タンパク質合成のために必要な安定同位体非標識アミノ酸等を含む培養液中で培養することにより行うことができる。ここで生細胞としては、本発明の連結体ＤＮＡを発現させることができる生細胞であれば特に制限されず、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などの生細胞を挙げることができ、簡便性や費用対効果の面から考慮すると、大腸菌が好ましい。本発明の連結体ＤＮＡの発現は、遺伝子組換え技術により、それぞれの生細胞で発現できるように設計された発現ベクターへ組み込み、かかる発現ベクターを生細胞へ導入することにより行うことができる。また本発明の連結体ＤＮＡの生細胞への導入は、使用する生細胞に適した方法で行うことができ、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、FuGENE（登録商標） 6 Transfection Reagent（ロシュ社製）やLipofectamine 2000 Reagent（インビトロジェン社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いた方法などを挙げることができる。
【００４２】
生細胞タンパク質合成系により発現させた本発明の安定同位体標識タンパク質は、安定同位体標識タンパク質を含む生細胞を破砕処理や抽出処理することにより調製することができる。破砕処理としては、凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた物理的破砕処理を挙げることができる。また抽出処理としては、グアニジン塩酸塩、尿素等のタンパク質変性剤を用いた抽出処理を挙げることができる。安定同位体標識タンパク質は、さらに分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理や、アフィニティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー等を用いた精製処理により調製することもできるが、かかる分画処理や精製処理を行わないで調製する安定同位体標識タンパク質を好適に例示することができる。
【００４３】
本発明の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片は、検量線を作成し、かかる検量線に基づいて液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、定量することができる。検量線の作成と検量線に基づいた定量は、以下のようにして行うことができる。
【００４４】
（安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片定量のための検量線の作成）
検量線は、数段階の濃度が既知の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片に、内部標準として濃度が既知の濃度測定用ペプチド断片を規定量加え、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、各濃度の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片と非標識濃度測定用ペプチド断片とのＭＳスペクトルの面積比若しくはピーク高比を算出することにより作成することができる。安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の量は、質量分析計の直線的な測定範囲内であることが好ましい。なお、濃度が既知の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片は、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてＦ−ｍｏｃ法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成したものを用いることができるが、本発明の作製方法により得られた濃度が既知の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を用いてもよい。また、濃度が既知の濃度測定用ペプチド断片は、一般的な化学合成法により製造することができる。かかるペプチド合成法として、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法や、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法のいずれも採用することができる。
【００４５】
（検量線に基づいた安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量）
安定同位体標識タンパク質を、トリプシンによる断片化処理により調製した本発明の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を含むペプチド試料中に、内部標準として濃度が既知の濃度測定用ペプチド断片を規定量加え、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片／濃度測定用ペプチド断片のマススペクトル面積比を算出し、該面積比から、上記検量線を用いて、本発明の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片を定量することができる。なお、濃度が既知の濃度測定用ペプチド断片は、一般的な化学合成法により製造することができる。かかるペプチド合成法として、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法や、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法のいずれも採用することができる。
【００４６】
安定同位体標識タンパク質の濃度は、本発明の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値（Ｍ）として算出することができる。また、安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度は、安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値（Ｍ）と安定同位体標識タンパク質に含まれる安定同位体標識標的ペプチド断片数を、式（安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片の定量値［Ｍ］）×（安定同位体標識タンパク質に含まれる安定同位体標識標的ペプチド断片数）に入力することにより算出することができる。このようにして得られた本発明の濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片は、内部標準として本発明の標的ペプチド断片の定量のために用いることができる。
【００４７】
本発明の標的ペプチド断片は、検量線を作成し、かかる検量線に基づいて液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、定量することができる。検量線の作成と検量線に基づいた定量は、以下のようにして行うことができる。
【００４８】
（標的ペプチド断片定量のための検量線の作成）
検量線は、数段階の濃度が既知の標的ペプチド断片に、内部標準として本発明の濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を規定量加え、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析を行い、各濃度における標的ペプチド断片と本発明の安定同位体標識標的ペプチド断片とのＭＳスペクトルの面積比若しくはピーク高比を算出することにより、作成することができる。標的ペプチド断片の量は、質量分析計の直線的な測定範囲内であることが好ましい。なお、濃度が既知の標的ペプチド断片は、一般的な化学合成法により製造することができる。かかるペプチド合成法として、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法や、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法のいずれも採用することができる。また、上記濃度が既知の標的ペプチド断片は、本発明の連結体ＤＮＡを安定同位体アミノ酸の存在しない系で発現させることによりタンパク質を調製し、かかるタンパク質をトリプシンなどで処理することにより単離することもでき、かかる標的ペプチド断片の濃度は、濃度測定用ペプチド断片の定量値に基づき算出することができる。
【００４９】
（検量線に基づいた標的ペプチド断片の定量）
標的タンパク質を含む試料を、トリプシンにより断片化処理により調製した本発明の標的ペプチド断片を含むペプチド試料中に、内部標準として本発明の濃度が既知の安定同位体標識標的ペプチド断片を規定量加え、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、標的ペプチド断片／安定同位体標識標的ペプチド断片のマススペクトル面積比を算出し、該面積比から検量線を用いて算出することにより、標的ペプチド断片を定量することができる。
【００５０】
標的タンパク質の濃度は、算出した標的ペプチド断片の定量値と標的タンパク質に含まれる標的ペプチド断片数に基づき、式（標的ペプチド断片の定量値［Ｍ］）／（標的タンパク質に含まれる標的ペプチド断片数）に入力することにより算出することができる。
【００５１】
本発明の評価用タンパク質とは、試料中に含まれるタンパク質のトリプシンによる断片化処理を評価するために、質量分析により定量対象となるタンパク質のことをいう。ここで試料としては、特に制限されるものではないが、具体的に、生体から採取された細胞、組織、又は血液等を、凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた破砕処理や、分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理することにより得られる細胞膜画分の試料を挙げることができる。本発明の評価用タンパク質におけるｎｔｃｐタンパク質の一部としては、ｎｔｃｐタンパク質において、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量することができるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、具体的にはＧＩＹＤＧＤＬＫ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
【００５２】
本発明の評価用ペプチド断片とは、本発明の評価用タンパク質において、質量分析により定量するペプチド断片のことをいう。本発明の評価用ペプチド断片としては、アミノ酸残基数が３〜２０のペプチド断片であって、Ｃ末端にアルギニン残基（Ｒ）又はリシン残基（Ｋ）を有し、Ｃ末端以外にはアルギニン残基又はリシン残基を有さず、天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列からなる、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより検出可能であるペプチド断片であれば特に制限されないが、アミノ酸残基数は８、１０又は１２であって、１若しくは２のプロリン、又はグリシンを含み、且つ、ヒスチジンを含まないペプチド断片が好ましく、具体的には、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）、ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号２）、ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号３）及びＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号４）を挙げることができ、これらの中でもＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）を好適に例示することができる。なお、本発明の評価用ペプチド断片と本発明の濃度測定用ペプチド断片とは、用途は異なるため、それぞれ異なる用語で定義しているが、両ペプチド断片は、実質的には同一の範疇に含まれるペプチド断片である。
【００５３】
本発明の評価用タンパク質は、例えば次の方法で作製することができる。すなわち、上記評価用タンパク質のアミノ酸配列からｃＤＮＡ配列を設計し、核酸オリゴ合成及びＰＣＲ等によって、ｃＤＮＡを合成する。さらに、ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み大腸菌等によってタンパク質を合成する。得られた合成タンパク質は、タグ配列を利用した精製法等の公知の条件・方法によって精製することができる。精製した評価用タンパク質は、アミノ酸分析によって正確な量（濃度）を算出することができる。
【００５４】
本発明の評価用タンパク質を用いると、質量分析において、試料中に含まれるタンパク質のトリプシンによる断片化処理を評価することができる。ここで試料中に含まれるタンパク質としては、例えば本発明の標的タンパク質や４Ｆ２ｈｃ、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｂｃｒｐ、ｎｔｃｐ、ｂｇｔ１、ｇｌｕｔ１等の膜タンパク質などを具体的に挙げることができる。本発明の評価用タンパク質を用いた評価は、例えばトリプシンによる断片化処理前の標的タンパク質を含む試料に、既知量の評価用タンパク質を加え、トリプシンによる断片化処理を行い、得られた評価用ペプチド断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量し、得られた定量値を基に行うことができる。評価用ペプチド断片の定量は、検量線を作成し、かかる検量線に基づいて行うことができる。また、トリプシンによる断片化処理前の標的タンパク質を含む試料に、本発明の評価用タンパク質とともに、本発明の安定同位体標識タンパク質を加え、トリプシンによる断片化処理を行うことにより、安定同位体標識標的ペプチド断片を調製することもできる。その場合、本発明の安定同位体標識タンパク質における濃度測定用ペプチド断片としては、評価用ペプチド断片と異なるアミノ酸配列からなるペプチド断片を選択することが好ましい。
【００５５】
検量線は、数段階の濃度が既知の評価用ペプチド断片に、内部標準として安定同位体標識評価用ペプチド断片を規定量加え、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析を行い、得られた各濃度における評価用ペプチド断片と安定同位体標識評価用ペプチド断片とのＭＳスペクトルの面積比若しくはピーク高比を算出することにより、作成することができる。評価用ペプチド断片の量は、質量分析計の直線的な測定範囲内であることが好ましい。
【００５６】
トリプシンによる断片化処理後、得られた評価用ペプチド断片に、内部標準として既知量の安定同位体標識評価用ペプチド断片を加え、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、評価用ペプチド断片／安定同位体標識評価用ペプチド断片のマススペクトル面積比を算出し、該面積比から検量線を用いて算出することにより、評価用ペプチド断片を定量することができる。
【００５７】
トリプシンによる消化処理前の評価用タンパク質の量（Ａ［ｍｏｌ］）及びトリプシンによる消化処理後の質量分析により定量された評価用ペプチド断片の定量値（Ｂ［ｍｏｌ］）を、式（Ｂ／［Ａ×評価用タンパク質に含まれる評価用ペプチド断片数］）に入力することにより、評価値を算出することができる。評価値が０．８０以上、好ましくは０．９０以上、より好ましくは０．９５以上の時にタンパク質のトリプシンによる断片化処理が十分行われていると評価できる。また、トリプシンによる断片化処理が十分行われたトリプシン消化時間における評価値（Ｃ）及び異なるトリプシン消化時間における評価値（Ｄ）の値を、式（消化率＝Ｄ／Ｃ）へ入力することにより、消化率を算出し、かかる消化率を基に評価することもできる。ここでトリプシンによる断片化処理が十分行われたトリプシン消化時間としては、例えば１６〜３６時間を挙げることができ、２０〜３０時間が好ましく、２４時間がより好ましい。消化率が０．８０以上、好ましくは０．９０以上、より好ましくは０．９５以上の時にタンパク質のトリプシンによる断片化処理が十分行われていると評価できる。
【００５８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
［本発明の評価用タンパク質の構築］
質量分析において、試料中に含まれるタンパク質のトリプシンによる断片化処理を評価するために、評価用タンパク質を用いて消化率を算出する。すなわち、評価用タンパク質の消化率が１００％であるとき、タンパク質はトリプシンによる消化処理過程において未消化によるロスをすることなく測定されたと評価できる。しかし、従来の評価用タンパク質を用いた場合は、消化率が１００％であったとしても、タンパク質のトリプシンによる消化率が低い場合、完全に消化されていない可能性が考えられた。そこで、評価用タンパク質が完全消化された場合には、タンパク質が完全に消化されたと評価できる評価用タンパク質を作製するために、一般的に消化率が低いとされている膜タンパク質の中から新しい評価用タンパク質の選抜を行った。具体的には、以下の方法にしたがってマウス肝臓の細胞膜画分を単離した。【００６０】
マウス肝臓を細切し、組織湿重量の１／１００量のＰＭＳＦ及びプロテアーゼインヒビターを含む氷冷した低張緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を加えた。テフロン（登録商標）製ホモジナイザー（１０ストローク）により組織を破砕し、３０分間氷中で静置した後、再び、テフロン（登録商標）製ホモジナイザー（２０ストローク）により組織を破砕した。このようにして得られた破砕組織懸濁液を全組織ライセートとした。また、上記のテフロン（登録商標）製ホモジナイザーによる組織を破砕処理後に顕微鏡で組織の破砕状況を確認し、細胞が十分に破砕されていなかった場合には、破砕組織懸濁液を窒素ガス細胞破砕器に移し、nitrogen cavitation法（４５０ｐｓｉ、１５分、４℃）によって、細胞を破砕することにより全組織ライセートを調製した。【００６１】
上記全組織ライセートを遠心（１０，０００ｇ、１０分、４℃）して上清を回収し、debris分画を取り除いた。得られた上清を、さらに超遠心（１００，０００ｇ、４０分、４℃）し、ペレットを回収した。このペレットを、氷冷したサスペンジョン緩衝液［２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ  （８．５６％  ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４］で懸濁した。作製した懸濁液を、３８％スクロース溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に重層して、超遠心（１００，０００ｇ、４０分、４℃）し、中間層を回収した。この中間層を、再度、超遠心（１００，０００ｇ、４０分、４℃）し、得られたペレットを細胞膜画分とした。回収した細胞膜画分を、氷冷したサスペンジョン緩衝液［２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ  （８．５６％  ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４］で懸濁した。【００６２】
上記細胞膜画分に８Ｍ尿素溶液を添加することによりタンパク質を変性させ、その後システイン残基のＳＨ基を保護するために、２５０μｇ／ｍｌ ＤＴＴ存在下でインキュベーション（室温、３０分間）する処理と、６２５μｇ／ｍｌ ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）存在下でインキュベーション（室温、６０分間）する処理とを行った。その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩを用いてＵｒｅａの最終濃度が１．２Ｍになるように混合液を調製した。かかる混合液を５本のチューブに等量分注し、トリプシン０．５μｇを加えた後、３７℃恒温槽中でそれぞれのチューブを１、４、８、１６及び２４時間インキュベーションした。トリプシン消化により得られたペプチド断片を、質量分析装置（ＡＰＩ５０００  ｏｌｄ）を用いて定量した。コントロールとして、インビトロで発現させた大腸菌Triose Phosphate Isomerase（ＴＰＩ）タンパク質（標的ペプチド断片；ＱＩＤＡＶＬＫ［配列番号４８］）（第一世代評価タンパク質）及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（評価用ペプチド断片；ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ［配列番号１］及びＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ［配列番号２］）（第二世代評価タンパク質）を用いた。図１に示すとおり、第一世代評価タンパク質よりも第二世代評価タンパク質の方が消化率は低い。【００６３】
１２種類の膜タンパク質（４Ｆ２ｈｃ、ｍｒｐ６、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｏａｔｐ２、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｂｃｒｐ、ｎｔｃｐ、ｂｇｔ１、及びＮａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ）について、トリプシンによる消化率を求めた。その結果、４種類の膜タンパク質（４Ｆ２ｈｃ、ｏａｔｐ１、ｂｓｅｐ、及びＮａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ）の消化率は、第二世代評価タンパク質の消化率よりも高かったが、８種類のタンパク質（ｍｒｐ６、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ２、ｍｃｔ１、ｂｃｒｐ、ｎｔｃｐ、及びｂｇｔ１）については、第二世代評価タンパク質よりも低いことが示された。その中でも、ｎｔｃｐタンパク質が最もトリプシンによる消化率が低いことが示された。そこで、ｎｔｃｐタンパク質（配列番号８）のトリプシン処理により産生されるペプチド断片、すなわちＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる標的ペプチド断片であるＧＩＹＤＧＤＬＫ（配列番号７）を、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなる評価用ペプチド断片へ置換したタンパク質（配列番号５）（第三世代評価タンパク質）を構築した。かかる第三世代評価タンパク質の消化率を検証した結果、第二世代評価タンパク質よりもさらに消化率が低いことが明らかとなった（図２）。また、１０種類の膜タンパク質（４Ｆ２ｈｃ、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｂｃｒｐ、ｎｔｃｐ、ｂｇｔ１、及びｇｌｕｔ１）と消化率を比較した結果、第三世代評価タンパク質は、ｍｃｔ１、ｎｔｃｐ及びｂｇｔ１を除く７種類のタンパク質（４Ｆ２ｈｃ、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｂｓｅｐ、ｂｃｒｐ、及びｇｌｕｔ１）と比べ消化率が低いことが示された（図３〜６）。この結果は、第二世代評価タンパク質は、１２種類の膜タンパク質のうち、４種類の膜タンパク質と比べ消化率が低いのに対し、第三世代評価タンパク質は、１０種類の膜タンパク質のうち、７種類の膜タンパク質と比べ消化率が低いことを示しており、第三世代評価タンパク質は、第二世代評価タンパク質よりもより多くの標的タンパク質の消化処理を評価できることが明らかとなった。
【実施例２】
【００６４】
［本発明のトリプシンにより断片化処理の改良］
難消化性タンパク質である膜タンパク質のトリプシンによる消化率を高めるために、消化方法を改良することを考えた。トリプシンは、リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する酵素であるが、アルギニン残基における切断効率と比較して、リシン残基における切断効率が低いと考えられていた。そこで、本実験においては、リシン残基を切断する活性を有する酵素であるリシルエンドペプチダーゼ（以下、「Ｌｙｓ−Ｃ」と記載する場合もある）を、トリプシンと組み合わせて用いることによって、効率的なタンパク質の分解が可能となるかどうかを検討した（図７）。
上記実施例１で調製した細胞膜画分を、トリプシン単独で消化したときの消化率と、Ｌｙｓ−Ｃによる３時間の消化後に、トリプシンで１６時間消化したときの消化率とを比較した。トリプシン及びＬｙｓ−Ｃの反応条件は以下のとおりである。
＜トリプシン＞
トリプシン：Sequencing Grade Modified Trypsin，Frozen（プロメガ社製）
濃度：タンパク質量の１／１００量
バッファー組成：１．２Ｍ  ｕｒｅａ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％ProteaseMaxTM Surfactant
温度：３７℃
＜Ｌｙｓ−Ｃ＞
Ｌｙｓ−Ｃ：Lysyl Endopeptidase生化学用（和光純薬工業社製）
濃度：タンパク質量の１／１００量
バッファー組成：１．２Ｍ  ｕｒｅａ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％ProteaseMaxTM Surfactant
温度：室温（１５〜２５℃）【００６５】
結果を図８及び９にそれぞれ示す。図８及び９に示されるように、ｎｔｃｐタンパク質及びｍｃｔ１タンパク質の両方のタンパク質の消化率は、トリプシン単独と比較して、Ｌｙｓ−Ｃ消化後にトリプシンで消化した場合に、大幅に上昇することが明らかとなった。次に、トリプシン単独で１６時間消化した場合と、Ｌｙｓ−Ｃによる３時間の消化後にトリプシンで消化した場合の、４Ｆ２ｈｃ、ｍｒｐ６、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｎｔｃｐ、ｇｌｕｔ１、ｂｇｔ１、及びＮａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量値の違いを検討した。図１０に結果を示すように、ｎｔｃｐは、トリプシン単独で消化した場合の定量値が３．７２であるのに対し、Ｌｙｓ−Ｃ消化後にトリプシンで消化した場合の定量値は２６．２であり、７倍もの差が認められた。以上のことから、トリプシンでの消化を行う前に、Ｌｙｓ−Ｃで消化を行うことにより、効率よく断片化処理を行うことができ、より正確な定量値を得ることが可能となることが明らかとなった。
【実施例３】
【００６６】
［本発明の標的タンパク質を含む試料の調製方法の改良］
細胞膜画分には夾雑物が多く含まれているため、このことがトリプシンによる消化率を低下させる原因であると考えられた。夾雑物を除く方法として、ＳＩＳＣＡＰＡ法が知られている。ＳＩＳＣＡＰＡ法は、タンパク質試料を消化処理して得られたペプチド断片を、ペプチド断片を認識する抗体を用いてアフィニティー精製を行うことにより、濃縮する方法である（図１１、左）。ＳＩＳＣＡＰＡ法を行うと、質量分析前のタンパク質試料に含まれる夾雑物を少なくすることができるため、検出されるペプチド断片のピーク強度を上昇させることができるが、標的ペプチド断片に対する抗体がその都度必要となるため、簡便性の面で問題があった。タンパク質を認識する抗体で濃縮できれば、標的ペプチド断片を認識する抗体に限定されないため、使用できる抗体の幅が広くなると考えた。そこで、消化処理する前のタンパク質試料に対して、タンパク質を認識する抗体を用いてアフィニティー精製する方法を検討した（図１１、右）。【００６７】
ヒト肺がん細胞株（Ｈ１９７５）を回収した後、組織湿重量の１／１００量のＰＭＳＦ及びプロテアーゼインヒビターを含む氷冷した低張緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）に懸濁し、その後上記実施例１の方法にしたがって細胞膜画分を調製した。かかる細胞膜画分に対して、抗ＥＧＦＲ抗体を用いたアフィニティー精製を行った。以下に詳しい方法を述べる。キット（ＰａｔｈＳｃａｎ(R)Ｔｏｔａｌ  ＥＧＦＲｅｃｅｐｔｏｒ  ＳａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＃７２５０［Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製］）の、抗ＥＧＦＲ抗体が固相化されたマイクロウェルストリッププレートに、上で調製した細胞膜画分を加えた。そのプレートを３７℃、２時間インキュベーションした。その後ウェルの溶液を捨て洗浄を行い、アフィニティー精製を行った。【００６８】
アフィニティー精製によりＥＧＦＲタンパク質を濃縮した後、上記実施例２におけるトリプシンによる消化処理によりペプチド断片試料を得た。標的ペプチド断片は、ＥＧＦＲが有するＥＬＩＩＥＦＳＫ（配列番号９）（ＥＧＦＲ  ａｌｌ［９６３−９７０］）、並びにＥＧＦＲの２つのバリアントがそれぞれ有するＩＴＤＦＧＲ（配列番号１０）（ＥＧＦＲ  ｍｕｔ［Ｌ８５８Ｒ］）及びＩＴＤＦＧＬＡＫ（配列番号１１）（ＥＧＦＲ  ＷＴ［Ｌ８５８］）を選択した。かかる３種類の標的ペプチド断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量した（図１２）。ＥＧＦＲタンパク質を濃縮した場合の試料と、非濃縮の場合の試料とを比較した結果、ＥＧＦＲタンパク質を濃縮したことによりＥＧＦＲ  ａｌｌ（９６３−９７０）、ＥＧＦＲ  ｍｕｔ（Ｌ８５８Ｒ）及びＥＧＦＲ  ＷＴ（Ｌ８５８）のピーク強度は、それぞれ１３．６倍、７．９倍及び１６．０倍に上昇していることが明らかになった。また、上記ペプチド断片を含む試料と血清（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ，ｆｒｏ，  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｅ  ＡＢ  ｐｌａｓｍａ，ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｈ４５２２［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製］）とを混合し、かかる混合液をＥＬＩＳＡにより解析したところ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果と矛盾しないことがわかった（図１２）。これらの結果から、ＥＧＦＲタンパク質を濃縮したことにより夾雑タンパク質を除去することができ、その結果イオンサプレッションを低減させることによりピーク強度が上昇したことが考えられる。
【実施例４】
【００６９】
［本発明の安定同位体標識タンパク質の調製］
質量分析による標的タンパク質の定量解析を網羅的に行う場合、内部標準として使用する安定同位体標識標的ペプチド断片は、定量する標的ペプチド断片に応じた数だけ必要となる。安定同位体標識標的ペプチド断片は、外注することが一般的だが、１種類あたりの費用に１０万円前後かかってしまうことから、コストの面で問題があった。そこで、より安価で且つ簡便に安定同位体標識標的ペプチド断片を作製する方法を検討した。安定同位体標識標的ペプチド断片の調製は以下の方法にしたがって行った。なお、図１３に方法の概要を示す。【００７０】
一般診断マーカーを検出する３６種類の標的ペプチド断片をコードするＤＮＡがタンデムに連結されたタンデム結合ＤＮＡの５’末端へ、濃度測定用ペプチド断片（ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ：配列番号１）をコードするＤＮＡを連結させた連結体ＤＮＡを合成した。かかる連結体ＤＮＡをｐＥＴ−ｖｅｃｔｏｒへ挿入し、大腸菌抽出液（無細胞くんQuick［大陽日酸社製］）とエネルギーとしてのＡＴＰ及び安定同位体標識したリジン、アルギニンを含む反応溶液中で、３０℃で１６時間のインキュベートを行うことで、安定同位体標識タンパク質を発現させた。安定同位体タンパク質を含む反応溶液を８Ｍ Ｕｒｅａ存在下で可溶化処理を行った後、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画を行った後、ＣＢＢ  Ｒ−２５０による検出により、安定同位体標識タンパク質が発現していることを確認した。上記可溶化処理を行った溶液を、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でＵｒｅａの最終濃度が１．２Ｍになるように調整した後、タンパク質量の１／１００量のトリプシンを添加し、３７℃で１６時間のインキュベートを行うことで安定同位体標識標的ペプチド断片を調製した。濃度測定用ペプチド断片の絶対量は、安定同位体標識タンパク質の絶対量に等しいので、濃度測定用ペプチド断片の濃度をＬＣ-ＭＳ／ＭＳによる絶対定量法により測定することで安定同位体標識タンパク質の濃度を算出した。【００７１】
［安定同位体標識標的ペプチド断片の検出感度］
２０２０ｆｍｏｌの安定同位体標識タンパク質を含む上記可溶性画分に対して、上記実施例２におけるトリプシンによる消化処理を行った後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより安定同位体標識ペプチド断片の検出感度を測定した。結果を図１４に示す。得られた３６種類のペプチド断片のピークエリア（counts）に、「１０ｆｍｏｌ／２０２０ｆｍｏｌ」を乗じると、すべてのペプチド断片において、検出可能な１０００counts以上を示したことから、１０ｆｍｏｌのペプチド断片を十分検出できる感度であることが明らかになった。【００７２】
以下に、消化処理により得られた３６種類のペプチド断片を示す。
ＳＳＤＹＦＧＮＧＲ（配列番号１２）：血清アミラーゼ
ＩＹＶＳＤＤＧＫ（配列番号１３）：血清アミラーゼ
ＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫ（配列番号１４）：Ａｐｏ−Ａ１
ＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫ（配列番号１５）：Ａｐｏ−Ａ１
ＳＰＥＬＱＡＥＡＫ（配列番号１６）：Ａｐｏ−Ａ２
ＩＥＩＰＬＰＦＧＧＫ（配列番号１７）：Ａｐｏ−Ｂ（４８＋１００）
ＥＦＱＶＰＴＦＴＩＰＫ（配列番号１８）：Ａｐｏ−Ｂ（４８＋１００）
ＮＰＮＧＹＳＦＳＩＰＶＫ（配列番号１９）：Ａｐｏ−Ｂ１００
ＮＩＩＬＰＶＹＤＫ（配列番号２０）：Ａｐｏ−Ｂ１００
ＴＹＬＰＡＶＤＥＫ（配列番号２１）：Ａｐｏ−Ｃ２
ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号２２）：Ａｐｏ−Ｃ３
ＬＧＰＬＶＥＱＧＲ（配列番号２３）：Ａｐｏ−Ｅ
ＩＴＷＳＮＰＰＡＱＧＡＲ（配列番号２４）：ＧＯＴ  細胞質
ＬＡＬＧＤＤＳＰＡＬＫ（配列番号２５）：ＧＯＴ  細胞質
ＦＶＴＶＱＴＩＳＧＴＧＡＬＲ（配列番号２６）：ＧＯＴ  ミトコンドリア
ＩＬＶＳＧＧＧＫ（配列番号２７）：ＧＰＴ
ＴＰＳＳＷＧＲ（配列番号２８）：ＧＰＴ
ＬＶＩＩＴＡＧＡＲ（配列番号２９）：ＬＤＨ  Ｍサブユニット
ＩＶＶＶＴＡＧＶＲ（配列番号３０）：ＬＤＨ  Ｈサブユニット
ＦＰＦＶＡＬＳＫ（配列番号３１）：ＡＬＰ
ＬＦＱＰＳＩＱＬＡＲ（配列番号３２）：γ−ＧＴＰ
ＧＧＬＳＶＡＶＰＧＥＩＲ（配列番号３３）：γ−ＧＴＰ
ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号３４）：ＺＴＴ
ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号３５）：ＺＴＴ
ＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫ（配列番号３６）：ＣＨＥ
ＦＷＴＳＦＦＰＫ（配列番号３７）：ＣＨＥ
ＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦＩＡＫ（配列番号３８）：ＣＥＡ
ＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲ（配列番号３９）：ＰＳＡ
ＬＴＳＰＶＶＴＴＳＴＲ（配列番号４０）：ＣＡ１２５
ＦＰＤＩＦＳＶＡＳＳＲ（配列番号４１）：ＣＡ１２５
ＳＳＶＰＳＳＴＥＫ（配列番号４２）：ＣＡ１５−３
ＡＴＴＴＰＡＳＫ（配列番号４３）：ＣＡ１５−３
ＩＬＧＡＴＩＥＮＳＲ（配列番号４４）：ＣＹＦＲＡ
ＡＮＴＦＬＥＥＶＲ（配列番号４５）：ＰＩＶＫＡ−ＩＩ
ＶＬＱＧＬＰＲ（配列番号４６）：ＨＥＲ２
ＧＧＶＬＩＱＲ（配列番号４７）：ＨＥＲ２
【実施例５】
【００７３】
［本発明の安定同位体標識タンパク質の完全長が合成されたことを評価する方法］
上記実施例４に記載の方法により作製された安定同位体標識タンパク質やそれを構成する各安定同位体標識標的ペプチド断片の濃度は、濃度測定用ペプチド断片の濃度として定量しているが、これは安定同位体標識タンパク質が完全に合成されることを前提としている。なんらかの原因で安定同位体標識タンパク質が完全に合成されないケースも考えられるので、そのようなケースを検出する方法の検討を行った。すなわち、濃度測定用ペプチド断片を安定同位体標識タンパク質のアミノ末端側に加えてカルボキシル末端側に付加し、両末端の濃度測定用ペプチド断片の濃度を測定し、かかる両末端の濃度測定用ペプチド断片の濃度を比較することにより、安定同位体標識タンパク質が完全に合成されたかどうかを評価できるかどうかを検討した（図１５）。まず、安定同位体標識タンパク質の完全長が合成されたかどうかを検証するためのモデルタンパク質として、ＭＰ１（配列番号４９）及びＭＰ２（配列番号５０）を設計した。ＭＰ１は、標的ペプチド断片がタンデムに連結したタンデム結合タンパク質（配列番号５１）のアミノ末端に、濃度測定用ペプチド断片（ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ：配列番号１）（以下、「濃度測定用ペプチド断片Ａ」という）が付加し、且つかかるタンデム結合タンパク質のカルボキシル末端に、濃度測定用ペプチド断片（ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ：配列番号２）（以下、「濃度測定用ペプチド断片Ｂ」という）が付加したものである。また、ＭＰ２は、標的ペプチド断片がタンデムに連結したタンデム結合タンパク質（配列番号５２）のアミノ末端に、濃度測定用ペプチド断片Ａが付加し、且つかかるタンデム結合タンパク質のカルボキシル末端に、濃度測定用ペプチド断片Ｂが付加したものである。続いてかかる２種類のタンパク質（ＭＰ１及びＭＰ２）を発現させるために、タンデム結合タンパク質をコードするタンデム結合ＤＮＡの５’末端に濃度測定用ペプチド断片Ａを連結させ、かつ、タンデム結合ＤＮＡの３’末端に濃度測定用ペプチド断片ＢをコードするＤＮＡを連結させた連結体ＤＮＡを合成した。合成した連結体ＤＮＡをｐＥＴ−ｖｅｃｔｏｒへ挿入し、大腸菌抽出液（無細胞くんQuick［大陽日酸社製］）とエネルギーとしてのＡＴＰを含む反応溶液中で、３０℃で１６時間のインキュベートを行うことで、タンパク質を合成した。なお、今回は、安定同位体標識モデルタンパク質が完全に合成されたかどうかを評価することに着目して解析を行ったので、タンパク質の合成は、安定同位体標識アミノ酸非存在下で行った。【００７４】
合成した２種類のタンパク質（ＭＰ１及びＭＰ２）を、８Ｍ Ｕｒｅａ存在下で可溶化処理を行った後、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でＵｒｅａの最終濃度が１．２Ｍになるように調整した後、タンパク質量の１／１００量のトリプシンを添加し、３７℃で１６時間のインキュベートを行うことで標的ペプチド断片並びに濃度測定用ペプチド断片Ａ及びＢを調製した。濃度既知（５００ｆｍｏｌ）の安定同位体標識濃度測定用ペプチド断片Ａ及びＢを内部標準として用い、濃度測定用ペプチド断片Ａ及びＢの濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量し、得られた濃度測定用ペプチド断片Ａ及びＢの定量値（表１、図１６）を、式（濃度測定用ペプチド断片Ｂの定量値／濃度測定用ペプチド断片Ａの定量値）に代入することにより、完全に合成されたモデルタンパク質の割合（図１５、表１の「完全長の比率」）を算出した。その結果を表１に示す。モデルタンパク質としてＭＰ２を用いた場合、「完全長の比率」は０．８７であった。すなわち、合成されたＭＰ２のうち、８７％が完全長のものであると評価することができた。他方、モデルタンパク質としてＭＰ１を用いた場合、「完全長の比率」は０．２３であった。すなわち、合成されたＭＰ１のうち、２３％が完全長のものであると評価することができた。【００７５】
以上の結果から、濃度測定用ペプチド断片を安定同位体標識タンパク質のアミノ末端側及びカルボキシル末端側に付加し、両末端の濃度測定用ペプチド断片の濃度を測定することにより、安定同位体標識タンパク質のタンパク質合成が完全に行われたことを評価できることが明らかとなった。例えば、合成した安定同位体標識タンパク質が、上記ＭＰ２の結果で示すように大部分が完全長である場合、完全長のものを精製するステップを経ずに安定同位体標識タンパク質を調製することができる。また、合成した安定同位体標識タンパク質が、上記ＭＰ１の結果で示すように完全長のものの割合が少ない場合、タンパク質の合成条件を検討することや、カルボキシル末端にＨＡＴタグなどのタグを付加し、完全長の安定同位体標識タンパク質を精製するなどの対策を講じて、安定同位体標識タンパク質を調製することができる。【００７６】
【表１】
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【００７７】
濃度測定用ペプチド断片Ａ及びＢの定量値は、平均（Mean）±標準偏差（ＳＥＭ）（ｎ＝４）で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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