(57)【要約】大腸組織の被検領域を分子レベルで解析することによってＡＣＦを検出するための方法を提供する。すなわち、ＡＣＦ（異常腺窩）を検出する方法であって、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、及びＧＳＴｐからなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子をＡＣＦ検出用マーカーとして用い、大腸組織の被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーを検出する、ＡＣＦ検出方法；ヒト由来の大腸組織中のＡＣＦを検出するためのマーカーであって、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、又はＧＳＴｐである、ＡＣＦ検出用マーカー；並びに前記ＡＣＦ検出方法を用いて、被検者の大腸組織の被検領域中のＡＣＦを検出した結果に基づき、当該被検者の結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスクを評価する、ヒトの結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスク評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＣＦ（異常腺窩）を検出する方法であって、
Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、及びＧＳＴｐからなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子をＡＣＦ検出用マーカーとして用い、
大腸組織の被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーを検出する、ＡＣＦ検出方法。
【請求項２】
前記被検領域が、ＡＣＦであることが疑われる領域を含む、請求項１に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項３】
前記被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーの量と、前記被検領域と同一の大腸組織内の正常組織領域中の当該ＡＣＦ検出用マーカーの量とを比較する、請求項２に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項４】
前記被検領域が、生体から採取された検体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項５】
前記ＡＣＦ検出用マーカーの検出を、生体内で行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項６】
前記ＡＣＦ検出用マーカーを蛍光標識することにより検出する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項７】
前記ＡＣＦ検出用マーカーがｍＲＮＡ又はタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項８】
前記被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーを、蛍光物質で標識されたプローブ又は特異的抗体を用いて蛍光標識した後、分光検出を可能とする内視鏡又は消化管ビデオスコープを用いて検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
【請求項９】
ヒト由来の大腸組織中のＡＣＦを検出するためのマーカーであって、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、又はＧＳＴｐである、ＡＣＦ検出用マーカー。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法を用いて、被検者の大腸組織の被検領域中のＡＣＦを検出した結果に基づき、当該被検者の結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスクを評価する、ヒトの結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスク評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＣＦ（異常腺窩）特異的に高発現している分子を指標として、ＡＣＦを検出する方法に関する。
本願は、２０１１年１２月２７日に日本国に出願された特願２０１１−２８５２１４号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌は、日本における死亡原因第一位、米国においては癌による死亡原因の第二位である。米国では年間約１５万人に新たな結腸直腸癌が発見されており、年間５万人以上が死亡している（アメリカ癌協会による推定）。一方で、結腸直腸癌は、良性腫瘍から悪性腫瘍への進行に数十年かかる例も多いため、早期におけるリスク評価・発見は、良好な予後及び予防に貢献すると期待される。【０００３】
現在一般的に行われている結腸直腸腺腫・腫瘍スクリーニング検査方法として、便潜血検査、注腸Ｘ線造影検査、全大腸内視鏡検査、Ｓ状結腸内視鏡検査等が存在する。しかしながら、例えば便潜血検査の場合、腺腫や腫瘍以外の要因でも血液が検出されるケースがあるため、結腸直腸腺腫・腫瘍に対する特異性が高いとは言えず、早期検出を目的とした場合には擬陽性となりやすい。一方で注腸Ｘ線造影検査は、形態の大きな進行癌は検出することができるが、小さな病変は検出しにくいという欠点がある。【０００４】
また、内視鏡による検査は、直接病変部位を視認するため、検査結果の信頼性が高く、結腸直腸癌死亡率及び発生率の低下に貢献することが示されている。しかしながら、早期癌では病変部位が微小であるため、内視鏡による検査では検出が困難である、という問題がある。【０００５】
このように、結腸直腸癌は、高リスク群や早期癌を効果的に抽出する検出技術が依然として未熟であるため、ある程度病期が進行した段階で初めて診断される場合が多い。そこで、早期に、かつ低侵襲若しくは非侵襲に、結腸直腸癌のリスク評価・発見を行うことを可能にする、感度・特異度の高い検査方法が望まれている。【０００６】
結腸直腸癌を早期病変の段階から検出する方法として、核酸やタンパク質の解析技術を用いて分子レベルで解析する方法が注目されている。例えば、結腸直腸癌のリスク要因として、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）に代表されるような遺伝的背景があり、被験者の遺伝子を解析することによって結腸直腸癌のリスク評価を行うことができる。また近年では、ＦＡＰの様な特徴的な遺伝的背景を有する群と有さない群のいずれにおいても、年齢（５０歳以上）や肥満・飲酒・喫煙といった生活習慣因子が、将来の結腸直腸癌リスクを高めることが知られている。このため、将来の結腸直腸癌を予測する手法として、生活習慣に起因する分子異常（エピジェネティクス、発現異常）が注目されている。実際に、ＧＷＡＳ（ゲノムワイド関連解析）研究成果等から、結腸直腸癌との関わりが示唆される分子が多数見出されている。【０００７】
大腸における分子異常を捉える技術として、糞便や血液中の核酸解析技術が開発されてきている。しかしながら、微小病変由来の核酸は非常に微量であり、早期の分子異常を検出することは難しい。特に、５０ｃｒｙｐｔｓ以下で構成されている、又は大きさが直径１ｍｍ以下の微小病変内の変化が血液中に反映されることは、解析装置の感度の点からみても困難である。また、糞便中には、多量の腸内細菌の他、病変以外の領域から剥離した上皮細胞も含まれているため、ノイズが多くなる。このため、糞便を検体として早期の結腸直腸癌・結腸直腸腺腫を検出するためには、癌化・腺腫化の早期に、正常組織よりも発現量が増大する優れた分子マーカーが必要である。このように、大腸における早期の分子異常を検出することによって早期に結腸直腸癌リスクを評価する技術開発は、未だ実現していない。【０００８】
一方、異常腺窩（ＡＣＦ）は、発癌物質（アゾキシメタン）を投与したラットの大腸においてメチレンブルーに濃染される微小病変として、１９８７年にＢｉｒｄらにより報告された。ＡＣＦは、形態学的に検出できる最初の異常形態であり（例えば、非特許文献１参照。）、細胞増殖活性の亢進やＫ−ｒａｓ変異が認められたことから、結腸直腸癌や結腸直腸腺腫の発症との関わりが示唆されている。ヒト大腸摘出標本においても、同様にメチレンブルーで濃染される病変が癌患者やポリープ患者において認められ、当該病変の数は健常人、ポリープ患者、癌患者の順に多くなることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。これらの知見を受けて、結腸直腸癌予防研究の指標としてＡＣＦが用いられるケースが増えてきた。【０００９】
１ｍｍ以下の微小ＡＣＦは、通常の内視鏡検査により検出することは困難であり、一般的には、拡大内視鏡を用いて検出される。しかしながら、拡大内視鏡検査は作業に長時間を要することから、使用機会が限られており、早期の結腸直腸癌の一次スクリーニングに用いることは難しい。このように、微小ＡＣＦを顕微鏡・内視鏡的に検出し、結腸直腸癌リスクを評価する技術開発は実現していなかった。【００１０】
また、ＡＣＦを分子レベルで解析するために、有用なマーカー分子の探索が行われている。具体的には、ＡＣＦにおいて発現量が変動する分子として、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２)、β  ｃａｔｅｎｉｎ (ｃａｔｅｎｉｎ, ｂｅｔａ１)、ｉＮＯＳ（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、及びＣＤ４４ (ＣＤ４４  ｍｏｌｅｃｕｌｅ)等が報告されている。但し、いずれも小規模試験からの報告であり、結腸直腸癌とは異なり、ＡＣＦ病変における分子変動についての大規模試験評価に関する報告は、未だなされていない。【００１１】
例えば、ＣＯＸ２先行研究（非特許文献３参照。）の例では、大腸全体のサンプルを用いて分子変動を解析しているため、ＡＣＦに対する特異性が低く、周辺組織と比較した場合のＡＣＦのみにおける分子変動が解析されていなかった。また、ｃｙｃｌｉｎＤ１先行研究（非特許文献４参照。）やｉＮＯＳ先行研究（非特許文献５参照。）、ＣＤ４４先行研究（非特許文献６参照。）では、免疫染色データのみの解析であるため、定量性や特異性に乏しく、医療応用されるまでに至っていない。さらにｉＮＯＳ先行研究（非特許文献７参照。）やＥＧＦＲ先行研究（非特許文献８参照。）では、５０ｃｒｙｐｔｓ程度の大きさのＡＣＦを解析対象としており、より早期段階の微小ＡＣＦ分子変動の解析は行っていない。このように、ＡＣＦのマーカー分子として使用できる可能性が示唆されている分子は幾つか知られているものの、いずれも臨床的に利用可能な程度に信頼できるものではない。【００１２】
つまり、５０ｃｒｙｐｔｓ以下で構成されているＡＣＦや直径１ｍｍ以下である微小ＡＣＦに代表される微小病変段階（すなわち、早期）において、発現量が変動する分子を解析し、将来の結腸直腸癌リスクを分子生物学に捉えて、簡便に評価することは、未だ実現できていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−２２９０５４号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】ケロフ（Kelloff）、他３９名、２００６年、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clinical Cancer Research）、第１２巻、第１２号、第３６６１〜３６９７ページ。
【非特許文献２】タカヤマ（Takayama）、他９名、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（The New England Journal of Medicine）、１９９８年、第３３９巻、第１８号、第１２７７〜１２８４ページ。
【非特許文献３】フィケラ（Fichera）、他１２名、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（Journal of Surgical Research）、２００７年、第１４２巻、第２３９〜２４５ページ。
【非特許文献４】ポールセン（Paulsen）、他５名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００５年、第６５巻、第１２１〜１２９ページ。
【非特許文献５】ク（Xu）、他３名、ワールド・ジャーナル・ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology）、２００３年、第９巻、第６号、第１２４６〜１２５０ページ。
【非特許文献６】ブーン（Boon）、他４名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００２年、第６２巻、第５１２６〜５１２８ページ。
【非特許文献７】タカハシ（Carcinogenesis）、他４名、カルシノジェネシス（carcinogenesis）、２０００年、第２１巻、第７号、第１３１９〜１３２７ページ。
【非特許文献８】コーヘン（Cohen）、他１９名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００６年、第６６巻、第５１２６〜５１２８ページ。
【非特許文献９】フジカワ（Fujikawa）、他7名、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Journal of the American Chemical Society）、２００８年、第１３０巻、第１４５３３〜１４５４３ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、大腸組織の被検領域を分子レベルで解析することによってＡＣＦを検出するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ヒト由来の大腸組織においては、Ｍｅｔ（ｍｅｔ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、Ｃｄｈ１（Ｃａｄｈｅｒｉｎ  １）、Ｃｔｎｎｂ１（Ｃａｔｅｎｉｎ  ｂｅｔａ）、及びＧＳＴｐ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｉ）が、直径１ｍｍ以下である、又は５０ｃｒｙｐｔｓ以下で構成されている微小なＡＣＦ中で、正常組織よりも発現量が増大していることを見出し、本発明を完成させた。【００１７】
（１）  本発明の第一の態様は、ＡＣＦ（異常腺窩）を検出する方法であって、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、及びＧＳＴｐからなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子をＡＣＦ検出用マーカーとして用い、大腸組織の被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーを検出する、ＡＣＦ検出方法である。
（２）  前記（１）のＡＣＦ検出方法において、前記被検領域は、ＡＣＦであることが疑われる領域を含むことが好ましい。
（３）  前記（２）のＡＣＦ検出方法においては、前記被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーの量と、前記被検領域と同一の大腸組織内の正常組織領域中の当該ＡＣＦ検出用マーカーの量とを比較することが好ましい。
（４）  前記（１）〜（３）のいずれかのＡＣＦ検出方法において、前記被検領域は、生体から採取された検体であることが好ましい。
（５）  前記（１）〜（３）のいずれかのＡＣＦ検出方法において、前記ＡＣＦ検出用マーカーの検出を、生体内で行うことが好ましい。
（６）  前記（１）〜（５）のいずれかのＡＣＦ検出方法において、前記ＡＣＦ検出用マーカーは、当該ＡＣＦ検出用マーカーを蛍光標識することにより検出することが好ましい。
（７）  前記（１）〜（６）のいずれかのＡＣＦ検出方法において、前記ＡＣＦ検出用マーカーは、ｍＲＮＡ又はタンパク質であることが好ましい。
（８）  前記（１）〜（７）のいずれかのＡＣＦ検出方法においては、前記被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーを、蛍光物質で標識されたプローブ又は特異的抗体を用いて蛍光標識した後、分光検出を可能とする内視鏡又は消化管ビデオスコープを用いて検出することが好ましい。
（９）  本発明の第二の態様は、ヒト由来の大腸組織中のＡＣＦを検出するためのマーカーであって、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、又はＧＳＴｐである、ＡＣＦ検出用マーカーである。
（１０）  本発明の第三の態様は、前記（１）〜（８）のいずれかのＡＣＦ検出方法を用いて、被検者の大腸組織の被検領域中のＡＣＦを検出した結果に基づき、当該被検者の結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスクを評価する、ヒトの結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスク評価方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るＡＣＦ検出方法により、ヒトのＡＣＦを分子生物学的な手法を用いて検出することができる。特に、本発明に係るＡＣＦ検出方法は、直径１ｍｍ以下である、又は５０ｃｒｙｐｔｓ以下で構成されている微小ＡＣＦをも、精度よく検出することができる。
ＡＣＦは結腸直腸癌や結腸直腸腺腫の指標とされるため、本発明に係るＡＣＦ検出方法は、結腸直腸癌や結腸直腸腺腫の早期検出や、発症リスク評価等にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１において、コントロールサンプル（正常組織のサンプル）及びＡＣＦサンプル（ＡＣＦ部位のサンプル）におけるＭｅｔの発現量相対値の分布を示した図である。
【図２】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＣｄｈ１の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図３】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＣｔｎｎｂ１の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図４】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＧＳＴｐ１の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図５】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＥＧＦＲの遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図６】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＮＯＳ２の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図７】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＣＤ４４の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図８】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＣｔｓｂの遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図９】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＰＣＮＡの遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図１０】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＦｚｄ１の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図１１】実施例１において、各サンプルの、１８ＳｒＲＮＡ発現量でノーマライズした後のＣＯＸ２の遺伝子発現量の分布を示した図である。
【図１２】実施例１において、サンプルのＡＣＦ病変部のＨＥ染色及び免疫組織化学（ＧＳＴｐ１）染色の画像である。
【図１３Ａ】実施例２において、ヒト大腸外科切除標本をＧＳＴｐ１蛍光プローブにより蛍光染色し、顕微鏡を用いて撮像されたＡＣＦ病変の蛍光観察画像である。
【図１３Ｂ】実施例２において、ヒト大腸外科切除標本をＧＳＴｐ１蛍光プローブにより蛍光染色し、内視鏡を用いて撮像されたＡＣＦ病変の蛍光観察画像である。
【図１４Ａ】実施例２において、ヒト大腸外科切除標本をＧＳＴｐ１蛍光プローブにより蛍光染色し、顕微鏡を用いて撮像された大腸癌病変の蛍光観察画像である。
【図１４Ｂ】実施例２において、ヒト大腸外科切除標本をＧＳＴｐ１蛍光プローブにより蛍光染色し、内視鏡を用いて撮像された大腸癌病変の蛍光観察画像である。
【図１５】実施例２において、ヒト大腸外科切除標本をＧＳＴｐ１蛍光プローブにより蛍光染色した蛍光観察画像から、ＡＣＦ病変部と正常領域における蛍光強度を比較した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明及び本願明細書において、ＡＣＦ特異的発現上昇分子とは、同一個体中の大腸組織において、周辺の正常組織よりもＡＣＦにおいて、遺伝子発現レベルが上昇している分子を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、大腸とは、盲腸、結腸、直腸、及び肛門管を含む領域を示し、大腸組織とは、大腸粘膜及び大腸上皮を含む組織を示す。
【００２１】
本発明及び本願明細書において、領域の直径とは、当該領域が円形又は楕円形である場合には、直径（楕円形の場合は長径）を示し、当該領域が円形又は楕円形以外である場合には、当該領域を円形に近似させた場合の近似円の直径、又は当該領域を楕円形に近似させた場合の近似楕円の長径を意味する。
【００２２】
本発明に係るＡＣＦ検出方法は、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、及びＧＳＴｐからなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子をＡＣＦ検出用マーカーとして用い、ヒト由来の大腸組織の被検領域中の前記ＡＣＦ検出用マーカーを検出することを特徴とする。ＧＳＴｐは複数のアイソフォームが存在する場合があるが、大腸組織において発現しているアイソフォームであればよく、１種類のアイソフォームのみを検出してもよく、複数のアイソフォームを検出してもよい。これらの４種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子はいずれも、微小ＡＣＦ、具体的には、直径１ｍｍ以下であるＡＣＦ又は５０ｃｒｙｐｔｓ以下で構成されているＡＣＦにおいて、周辺正常組織よりも発現量が増大している分子である。このため、これらの４種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子は、いずれもＡＣＦ検出、特に微小ＡＣＦ検出のための臨床上有用なマーカー分子であり、これらのＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量を指標とする（ＡＣＦ検出用マーカーとして用いる）ことにより、比較的大きなＡＣＦ（すなわち、形態異常が進行したＡＣＦ）のみならず、早期の微小なＡＣＦをも精度よく検出することができる。
【００２３】
本発明に係るＡＣＦ検出方法においては、前記４種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子の少なくとも１種類の分子を検出すればよく、一の被検領域に対して２種類以上の分子を検出してもよい。
【００２４】
ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量（ＡＣＦ検出用マーカー）を検出する被検領域は、ヒト由来の大腸組織中の領域であれば特に限定されるものではないが、ＡＣＦであることが疑われる領域（被疑ＡＣＦ領域）を含む領域であることが好ましい。被疑ＡＣＦ領域としては、例えば、大腸組織中のメチレンブルーによって濃染された領域がある。メチレンブルー染色では、ＡＣＦ以外の領域も染色されてしまうが、本発明に係るＡＣＦ検出方法では、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量を指標とすることにより、メチレンブルー染色よりも精度よくＡＣＦを検出することができる。被疑ＡＣＦ領域としては、その他、内視鏡観察、顕微鏡観察や画像解析等により形態異常が観察されている領域等が挙げられる。
【００２５】
本発明に係るＡＣＦ検出方法における被検領域の大きさは、特に限定されるものではなく、例えば、被疑ＡＣＦ領域の大きさ等を考慮して適宜決定することができるが、被検領域に占める被疑ＡＣＦ領域の割合が高いほうが好ましい。被検領域に占める正常組織領域の割合が高すぎる場合には、当該被疑ＡＣＦ領域が実際にＡＣＦであった場合でも、当該被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子量と正常組織中のＡＣＦ特異的発現上昇分子量との差が検出し難くなる。例えば、直径が１ｍｍ以下の被疑ＡＣＦ領域を含める場合、被検領域の直径は１ｍｍ以下であることが好ましく、１ｍｍ未満であることがより好ましく、０．５ｍｍ以下であることがさらに好ましい。また、５０ｃｒｙｐｔｓ以下で構成されている被疑ＡＣＦ領域を含める場合、被検領域の大きさは５０ｃｒｙｐｔｓ以下であることが好ましく、５０ｃｒｙｐｔｓ未満であることがより好ましく、２５ｃｒｙｐｔｓ以下であることがさらに好ましい。
【００２６】
なお、本発明において検出対象とされる４種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子は、いずれもＡＣＦにおいて正常組織よりも遺伝子発現レベルが上昇している分子であり、直径が１ｍｍ以下である微小ＡＣＦと同様に、比較的大きいＡＣＦ、例えば、１００〜１５０ｃｒｙｐｔｓで構成されているＡＣＦも、良好に検出することができる。
【００２７】
本発明に係るＡＣＦ検出方法において検出されるＡＣＦ特異的発現上昇分子は、遺伝子発現量を反映する分子であればよく、ｍＲＮＡであってもよく、タンパク質であってもよい。すなわち、本発明に係るＡＣＦ検出方法は、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の情報を、ＲＮＡレベルやタンパク質レベルで取得することにより、当該被検領域のＡＣＦを検出することができる。
【００２８】
各ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出方法は、検出結果が被検領域中の各分子の量や濃度に依存する方法であればよく、検体中のｍＲＮＡやタンパク質の検出に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して用いることができる。中でも、発現解析において用いられている方法で行うことが好ましい。各方法は常法により行うことができる。
【００２９】
被検領域中にＡＣＦが含まれている場合には、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量は、大腸組織内の正常組織中よりも多くなる。このため、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量と、大腸組織内の正常組織中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量とを比較することにより、被検領域中のＡＣＦを検出することができる。すなわち、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が正常組織中よりも多い場合には、当該被検領域中にＡＣＦが含まれており、正常組織中とほぼ同等又はそれ以下である場合には、当該被検領域中にはＡＣＦが含まれていないと判断することができる。被検領域と正常組織領域とにおけるＡＣＦ特異的発現上昇分子の量の比較は、各領域の単位表面面積又は単位体積当たりで行ってもよく、各領域に含まれている単位核酸量又は単位タンパク質量当たりで行ってもよい。
【００３０】
本発明においては、同一個体の大腸組織において、被検領域とその周辺の正常組織とを比較することが好ましい。各ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量は個体差があるが、同一個体中で比較することにより、個体差による影響を抑えることができる。
【００３１】
用いる検出方法の種類や感度によっては、正常組織ではＡＣＦ特異的発現上昇分子は検出されず、ＡＣＦにおいてのみ検出される場合がある。この場合には、被検領域において当該ＡＣＦ特異的発現上昇分子が検出された場合には、当該被検領域中にＡＣＦが含まれており、当該ＡＣＦ特異的発現上昇分子が検出されなかった場合には、当該被検領域中にはＡＣＦは含まれていない、と判断される。
【００３２】
ＡＣＦ検出用マーカーがｍＲＮＡである場合、すなわち、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量をＲＮＡレベルで求める場合、各ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出方法としては、各分子に特異的なプライマーを用いた核酸増幅反応を利用した方法や、各分子に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションを利用した方法等が挙げられる。核酸増幅反応を利用した方法としては、例えば、被検領域に含まれているＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことによって、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出し、若しくは正常組織領域中の量と比較可能な程度に定量的に測定する方法が挙げられる。被検領域からのＲＮＡの抽出、逆転写反応、ＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅反応は、当該技術分野において公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。
【００３３】
核酸増幅反応を利用した方法においては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質により標識されたプライマー等を用いることにより、増幅されたＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識し、定量的に検出することができる。一方、ハイブリダイゼーションを利用した方法においては、蛍光物質により標識されたプローブや、ハイブリダイズした場合に初めて蛍光を発するように修飾されたプローブを用いることにより、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識し、定量的に検出することができる。
【００３４】
ＡＣＦ検出用マーカーがタンパク質である場合、すなわち、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量をタンパク質レベルで求める場合、各ＡＣＦ特異的発現上昇分子は、例えば、各分子を特異的に認識する抗体（特異的抗体）を用いた免疫学的手法により検出することができる。具体的には、標識物質により標識した各分子の特異的抗体を、被検領域中の当該分子に結合させた後、当該標識物質からのシグナルを測定することにより、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識し、定量的に検出することができる。標識物質による標識は、各分子の特異的抗体に直接標識物質を結合させてもよく、当該特異的抗体に特異的に結合する二次抗体に結合させてもよい。標識物質としては、抗原抗体反応や、２分子の結合の有無を検出する際に一般的に用いられている標識物質の中から適宜選択して用いることができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質、磁性体、放射性同位体等が挙げられる。高感度であり、かつ安全性が高い点から、蛍光物質を標識物質として用いることが好ましい。抗原抗体反応は、常法により行うことができる。免疫学的手法以外には、例えば、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の活性を示す特異的なプローブを用い、当該プローブを検出することによっても、タンパク質であるＡＣＦ特異的発現上昇分を検出することができる。
【００３５】
ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出は、生体から採取された検体に対して行うことができる。例えば、生体の大腸組織の部分領域を外科的に切除して採取された大腸組織切除サンプルから、顕微鏡下で被疑ＡＣＦ領域を含む被検領域のサンプルを採取することができる。この際、必要に応じて、同一の大腸組織切除サンプルから、正常組織領域、好ましくは被検領域の周辺の正常組織のサンプルを採取する。また、予め生体内の大腸組織をメチレンブルー染色し、濃染された領域を含む被検領域を外科的に切除することにより、生体から直接被検領域のサンプル（バイオプシーサンプル）を採取することができる。大腸組織切除サンプルの場合と同様に、被検領域の周辺の正常組織のサンプルも、生体から採取することができる。このようにして採取された被検領域や正常組織領域のサンプルを、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出に供する。生体内の大腸組織のメチレンブルー染色は、常法により行うことができる。
【００３６】
ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出は、生体内で行うこともできる。例えば、ＡＣＦ特異的発現上昇分子に特異的な標識済みプローブや、直接又は間接的に標識したＡＣＦ特異的発現上昇分子の特異的抗体、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の活性を示す特異的な標識済みプローブを、生体の大腸内の被検領域を含む領域に塗布又は噴霧し、当該領域に存在するＡＣＦ特異的発現上昇分子を当該プローブ又は特異的抗体と結合させて標識した後に、当該標識を検出することにより、ＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することができる。
【００３７】
生体内においてＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出を行う場合には、ＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識して検出することが好ましい。具体的には、まず、蛍光物質で標識されたプローブや特異的抗体を用いて被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識する。その後、分光検出を可能とする大腸内を視覚的に検出可能な装置（内視鏡や消化管ビデオスコープ等）を用いて当該標識から発される蛍光を光学的に検出し、蛍光画像を得る。得られた蛍光画像を解析することにより、ＡＣＦ特異的発現上昇分子を高感度かつ定量的に検出することができる。
【００３８】
生体内におけるＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出は、蛍光内視鏡を用いることにより、より簡便かつ効率よく行うことができる。より具体的には、例えば、生体の体腔内に少なくとも一部が入れられ、該体腔内の撮影対象の画像を取得する内視鏡システムであって、前記撮影対象内部の特定の物質と結合若しくは反応する感受性蛍光薬剤又は当該撮影対象内部に蓄積される蛍光薬剤を前記撮影対象に向けて吐出する薬剤吐出手段と、該薬剤吐出手段を制御する吐出制御手段と、前記蛍光薬剤を励起させるための励起光及び該励起光とは異なる分光特性の照射光を発する光源部と、該光源部からの前記励起光及び照射光を前記撮影対象に向けて伝播する光学系と、前記体腔内に入れられる部位に設けられるとともに、前記励起光によって前記撮影対象から放射される蛍光及び前記照射光によって前記撮影対象から放射される当該蛍光とは異なる波長帯域の光とを撮影可能な撮像手段とを備える内視鏡システムを用いて行うことができる（特開２００７−２２９０５４号公報参照。）。蛍光薬剤として、ＡＣＦ特異的発現上昇分子に特異的なプローブや特異的抗体を蛍光物質で標識したものを用いればよい。
【００３９】
本発明に係るＡＣＦ検出方法において、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出に供される試料は、ヒトの大腸由来であればよい。例えば、ヒトから直接外科的切除により採取された大腸組織であってもよく、生体から採取された大腸組織又はそれを構成する細胞を生体外で培養したものであってもよい。なお、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、又はＧＳＴｐが、ヒトと同様に、ＡＣＦにおいて正常組織よりも発現が上昇する動物種に対しても、当該動物由来の大腸組織の被検領域中のＭｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、及びＧＳＴｐからなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することによって、ＡＣＦを検出することができる。
【００４０】
被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が正常組織中の量よりも多いかどうかという情報は、被検領域中にＡＣＦが存在しているか否かを判断する際に有用である。よって、本発明に係るＡＣＦ検出方法により得られた検出結果は、ＡＣＦ診断のために提供される情報として有用である。
【００４１】
また、ＡＣＦは将来結腸直腸癌へと進行する可能性が高いことから、本発明に係るＡＣＦ検出方法により得られた検出結果は、結腸直腸癌の存在リスクの判断や、将来の結腸直腸癌発症リスクを、早期に低侵襲に評価する際に、非常に有効な情報である。例えば、本発明に係るＡＣＦ検出方法により、被検者の大腸組織において、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が周辺の正常組織領域中よりも多く、当該被検領域にＡＣＦが検出された場合には、当該被験者が将来結腸直腸癌又は結腸直腸腺腫を発症するリスクが高いと評価することができる。逆に、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が周辺の正常組織領域中と同等若しくは少なく、当該被検領域にＡＣＦが検出されなかった場合には、当該被験者が将来結腸直腸癌又は結腸直腸腺腫を発症するリスクが低いと評価することができる。
【実施例】
【００４２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４３】
［実施例１］
Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、ＧＳＴｐ１、ＥＧＦＲ、ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２）、ＣＤ４４、Ｆｚｄ１、Ｃｔｓｂ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ）、ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）、及びＣＯＸ２の全１１種類の候補分子に対して、同一個体中の周辺正常組織と被疑ＡＣＦ領域とにおける遺伝子発現レベルを比較し、これらの候補分子群のうちＡＣＦ特異的に遺伝子発現レベルが上昇している分子を同定した。
具体的には、下部内視鏡検査を受診した患者から採取された大腸生検サンプルから、顕微鏡下でＡＣＦ部位であることを確認した領域のみを採取したサンプルと、当該患者から下部内視鏡下で採取された正常組織サンプルとをそれぞれ調製し、各サンプル中の各分子の発現量を測定し、比較した。より詳細に、下記に示す。【００４４】
採取された直腸部の大腸粘膜組織を顕微鏡下で観察し、ＡＣＦ部位であることが確認された部位のみをＡＣＦサンプルとして切除した。その際、市販されている最小サイズの生検器具（直径：１ｍｍ）を用いて、直径が１ｍｍ以下の大きさの微小ＡＣＦを選択して採取した。一方で、拡大内視鏡観察下で正常と認められた部位を、コントロールサンプルとして採取した。ＡＣＦサンプル及びコントロールサンプルは、いずれも、一人の患者から複数採取した。【００４５】
ＡＣＦサンプル及びコントロールサンプルは、核酸分解を防ぐために、生検後直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に浸漬させた。その後、ＭａｇｎａＬｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）及びＱＩＡＧＥＮ  ＲＮａｓｅ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、ＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）処理により残存しているＤＮＡを消化した。バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてＲＩＮ６以上であることが確認されたＲＮＡを添加した反応溶液中で、３７℃で６０分間のＲＴ反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。前増幅反応として、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、各候補分子を増幅するためのプライマーセットを用いて、サイクル数の少ない前増幅反応を行った。プライマーセットは、表１に記載の市販のもの（アプライドバイオシステムズ社製）をそれぞれ用いた。具体的には、７μＬのＲＴ反応後の反応溶液と、事前に各プライマーセットを混合した溶液１２．５μＬ、２５μＬの核酸増幅試薬（Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、アプライドバイオシステムズ社製）、５．５μＬの超純水をそれぞれ添加して、最終容量５０μＬの反応溶液を調製した。各反応溶液をＰＣＲ装置（エッペンドルフ社製）にセットし、９５℃で１０分間の熱処理を行った後、９５℃で１５秒間、６０℃で４分間の熱反応を１４サイクル行った。反応後、反応液を２０倍に希釈したものを、リアルタイムＰＣＲサンプルとして供した。【００４６】
【表１】
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【００４７】
前増幅を行ったｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを実施し、各候補分子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。具体的には、０．２ｍＬの９６ウェルプレートに、前増幅反応後の各ｃＤＮＡを５μＬずつ分注した後、各ウェルに４μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅試薬（Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬのプライマープローブセットを添加し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。この９６ウェルプレートをリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社製）にセットし、５０℃で２分間、９５℃で１０分間の熱処理を行った後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の熱反応を４０サイクル行い、経時的に蛍光強度を測定した。【００４８】
蛍光強度の計測結果を分析し、各サンプルから回収されたＲＮＡ中の候補分子の遺伝子発現量を算出した。各遺伝子発現量は、１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現量でノーマライズした。候補分子ごとの各サンプルのノーマライズ後の遺伝子発現量の分布結果を図１〜１１にそれぞれ示す。各図中、「ＣＯＮ」はコントロールサンプルの結果であり、「ＡＣＦ」はＡＣＦサンプルの結果である。【００４９】
この結果、同一個体中の正常組織における発現量とＡＣＦにおける発現量とを比較したところ、Ｍｅｔ、Ｃｄｈ１、Ｃｔｎｎｂ１、ＧＳＴｐ１、及びＥＧＦＲの５種類の分子は、ＡＣＦ病変（ＡＣＦサンプル）では、周辺正常組織（コントロールサンプル）と比較し、統計的に有意に発現量が増大していた。つまり、これらの５種類の分子は、ＡＣＦ特異的に遺伝子発現レベルが上昇しており、ヒト由来の大腸組織中のＡＣＦを検出するためのマーカーとして有用であることが分かった。【００５０】
また、コントロールサンプルにおける遺伝子発現量を１とし、同一患者から採取されたＡＣＦサンプルにおける遺伝子発現量の相対値を算出したところ、特にＭｅｔは、６０％以上のＡＣＦサンプルにおいて発現量相対値が１．３以上を示し、５０％以上のＡＣＦサンプルにおいて発現量相対値が１．５以上を示したことから、臨床検査等の高い信頼性が求められる検査においても充分に適用可能なＡＣＦ検出用マーカーであることが期待できる。【００５１】
残る６種類の分子では、ＡＣＦサンプルとコントロールサンプルにおいて、発現量に統計的な有意差は確認されなかった。但し、ＣＯＸ２は、発現量相対値が１．３以上を示したＡＣＦサンプルは約２０％しかなかったものの、発現量相対値が１．３以上を示したＡＣＦサンプルのうちの約７５％で、発現量相対値が１．５以上を示した。つまり、ＣＯＸ２は、ＡＣＦ検出において、感度は不充分だが、特異度が良好なマーカーとして使用可能であることが示唆された。【００５２】
また、下部内視鏡検査を受診した患者から採取された大腸生検サンプルのＡＣＦ病変におけるＧＳＴｐ１タンパク質発現を、免疫染色で確かめた。具体的には、ＨＥ染色と、ＧＳＴｐ１タンパク質に対する特異的な抗体を用いた免疫組織化学染色（一次抗体：ＧＳＴ−πウサギポリクローナル抗体（製品番号：ＭＳＡ−１０２、ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｇｎｓ社製）、二次抗体：パーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇヤギポリクローナル抗体（製品名：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、製品番号：Ｋ５０２７、Ｄａｋｏ社製））を行った。この結果、図１２に示すように、ＡＣＦ病変部において、ＧＳＴｐ１タンパク質発現が認められた。【００５３】
［実施例２］
実施例１の結果から、ヒト大腸ＡＣＦにおいて、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方でＧＳＴｐ１の高発現が認められた。そこで、ＧＳＴｐ１蛍光プローブを用いて、ヒト大腸外科切除標本におけるプローブ反応を検討した。本検討で使用したＧＳＴｐ１蛍光プローブは、ＧＳＴｐ１の基質構造を有しており、ＧＳＴｐ１との酵素反応によって蛍光特性の変化が生じる酵素活性検出蛍光プローブであり、励起波長４９０ｎｍ／吸収波長５２０ｎｍの蛍光特性を有する（非特許文献９）。【００５４】
具体的には、ヒト大腸外科切除標本にＧＳＴｐ１蛍光プローブ溶液を散布したのち、顕微鏡及び内視鏡下でＡＣＦ病変部を蛍光観察した。より詳細には、まず、大腸癌又は潰瘍性大腸炎と診断され、摘出手術を受ける患者に対して、術前に下部内視鏡検査を実施し、メチレンブルー染色によりＡＣＦ病変部の局在を確認した。次いで、摘出手術直後の外科切除標本を温ＰＢＳで洗浄し、縦方向に切り開いた後、ＧＳＴｐ１蛍光プローブ溶液を散布し、３７℃で２０分間、暗室状態で反応させた。プローブ反応後、温ＰＢＳで組織を洗浄し、顕微鏡及び内視鏡で、ＡＣＦ病変部及び大腸癌病変部の蛍光観察・評価をおこなった。顕微鏡は、実体顕微鏡ＭＶＸ１０（オリンパス株式会社）に、ＥＸ（励起）フィルターとして４６０〜４９０ｎｍのバンドパスフィルターを、ＥＭ（吸収）フィルターとして５１０ｎｍＩＦフィルター又は５１０〜５５０ｎｍのバンドパスフィルターを組み合わせて用いた。内視鏡は、硬性鏡内視鏡の光源の励起波長を４６５〜４９０ｎｍとし、蛍光フィルターとして５１０〜５５０ｎｍのバンドパスフィルターを用いたものを使用した。【００５５】
顕微鏡画像により撮像されたＡＣＦ病変の蛍光画像を図１３Ａに、内視鏡により撮像されたＡＣＦ病変の蛍光画像を図１３Ｂにそれぞれ示す。図１３Ａ及びＢ中、白矢印で示した部位が、メチレンブルーで染色された部位であり、ＡＣＦ病変である。また、顕微鏡画像により撮像された大腸癌病変部の蛍光画像を図１４Ａに、内視鏡により撮像された大腸癌病変部の蛍光画像を図１４Ｂにそれぞれ示す。図１４Ａ及びＢ中、白矢印で示した部位が大腸癌病変部である。図１３及び１４に示すように、正常領域と比べてＡＣＦ及び大腸癌病変部において、周辺正常領域よりも蛍光強度が上昇しており、強いプローブ反応が認められた。【００５６】
さらに、画像解析により、ＡＣＦ病変部と正常領域における蛍光強度を調べた結果を図１５に示す。この結果、同一患者のＡＣＦ病変部において検出された蛍光強度は、正常領域において検出された蛍光強度と比較して、顕微鏡では相対値が２．３、内視鏡では相対値が２．５となった。当該結果からも、ヒト大腸組織のＡＣＦ病変部において、ＧＳＴｐ１蛍光プローブが優先的に取り込まれることが認められた。【００５７】
これらの結果から、ＧＳＴｐ１蛍光プローブを用いることにより、顕微鏡イメージングと内視鏡イメージングのいずれによってもＡＣＦ病変部の検出が可能であることが明らかである。特に、顕微鏡観察のみならず内視鏡観察においてもＡＣＦ病変部の判別に十分な蛍光強度及びコントラストが得られたことから、生体内での観察によっても、ＧＳＴｐ１蛍光プローブを用いることによりＡＣＦ病変部が検出可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明に係るＡＣＦ検出方法により、ヒトのＡＣＦを分子生物学的手法により精度よく検出することができるため、本発明に係るＡＣＦ検出方法は、学術研究のみならず、結腸直腸癌・結腸直腸腺腫診断のための臨床検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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