(57)【要約】  本発明は、再生溶液との接触による剥離やリガンドとアナライトとの分子間相互作用の阻害などの問題を引き起こさない、改善された非特異吸着防止剤を利用することのできる分子間相互作用測定手段を提供する。本発明に係る分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法は、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位に前記界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理工程を含むことを特徴とする。前記界面活性剤としてはノニオン性界面活性剤が好ましい。前記界面活性剤の水溶液の濃度は、０．０００１重量％以上０．１重量％以下が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理が施されていることを特徴とする、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
【請求項２】
前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤である、請求項１に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
【請求項３】
前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレアートからなる群から選ばれる少なくとも１種のエステルエーテル型ノニオン性界面活性剤である、請求項１または２に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
【請求項４】
前記分子間相互作用測定方法が反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
【請求項５】
ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、請求項１〜３のいずれか一項に記載された界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位に前記界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理工程を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載された分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
【請求項６】
前記界面活性剤の水溶液の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、請求項５に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載されたセンサーチップを使用する分子間相互作用測定方法であって、
非特異的吸着防止処理が施された測定部位に、少なくともアナライトと非特異的吸着物を含む試料溶液を接触させる試料溶液接触工程（Ａ）を含むことを特徴とする、分子間相互作用測定方法。
【請求項８】
前記試料溶液接触工程（Ａ）の後、リガンドに結合したアナライトを剥離するための再生溶液を接触させる再生処理工程（Ｂ）およびさらなる試料溶液接触工程（Ａ）それぞれを少なくとも１回ずつ繰り返す、請求項７に記載の分子間相互作用測定方法。
【請求項９】
前記試料溶液、再生溶液またはその両方が、さらに請求項１〜３のいずれか一項に記載された界面活性剤を含む、請求項７または８に記載の分子間相互作用測定方法。
【請求項１０】
前記試料溶液、再生溶液またはその両方に含まれる界面活性剤の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はノンラベルの分子間相互作用測定方法、特にＲＩｆＳ（Reflectometric Interference Spectroscopy：反射型干渉分光法）と、そのセンサーチップに対する非特異吸着に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ノンラベルの分子間相互作用測定方法、すなわち、生体分子や有機高分子などの分子間相互作用により発生するシグナルを測定することにより、放射性物質や蛍光体などの標識を用いることなく、測定対象物を直接的かつ定量的に検出する方法の研究開発が進められている。たとえば、光学薄膜の干渉色変化を利用する検出法であるＲＩｆＳ（Reflectometric Interference Spectroscopy：反射型干渉分光法）が提案され、実用化もされている。その他にも、ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴）やＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance：水晶発振子マイクロバランス）などの分子間相互作用測定方法も知られている。【０００３】
上記のような分子間相互作用測定方法においては、分子間相互作用に関与する一方の分子（リガンド、たとえば抗体）を表面に固定化したセンサーチップが用いられ、このリガンドに分子間相互作用に関与するもう一方の分子（アナライト、たとえば抗原）を分子間相互作用により特異的に結合させるようにする。しかしながら、そのような所期の分子間相互作用以外にも、静電的相互作用や疎水性相互作用によって、試料溶液中に含まれるアナライト以外の各種の分子がしばしばセンサーチップの表面に非特異的に吸着する。このような非特異吸着は、分子間相互作用に基づく測定法においてノイズとなるシグナルを発生させ、測定精度を低下させる原因となる。そのため、従来は通常、センサーチップの表面にリガンドを固定化した後、試料溶液を接触させる前に、非特異吸着を抑制するための物質（非特異吸着防止剤）でセンサーチップの表面を処理している。【０００４】
分子間相互作用測定方法やその他の生体関連物質を対象とした測定方法において、非特異吸着防止剤としては、いわゆるブロッキング剤と呼ばれている、ＢＳＡに代表されるタンパク質などが慣用されており（たとえば特許文献１）、ヘパリンやデキストラン硫酸などもブロッキング剤としての利用が提案されている（特許文献２）。また、各種のポリマー、たとえば特定のアクリルアミド系ポリマー（特許文献３）なども非特異吸着防止剤としての利用が提案されている。【０００５】
さて、ＲＩｆＳ等の分子間相互作用検出法において、センサーチップ（ロット）ごとのばらつきによる測定結果への影響を抑制したり、コストを低減したりするために、あるサンプルについて固定化されたリガンドにアナライトを結合させて測定を行った後、再生溶液を用いてリガンドに結合したアナライトを剥離させて、次のサンプルについてまた固定化されたリガンドにアナライトを結合させて測定を行うというように、一枚のセンサーチップを用いて繰り返し測定を行う場合がある。しかしながら、従来のＢＳＡ等をブロッキング剤として使用した場合、再生溶液を添加すると、アナライトがリガンドから剥離するのみならず、ブロッキング剤も一部がセンサーチップ表面から剥離することが知られており（非特許文献１）、ブロッキング剤による効果が薄れるとともに、測定値を変動させて測定の正確性を損ねるおそれがある。この場合、剥離したブロッキング剤を補充するためにブロッキング処理工程を追加して行うことも考えられるが、測定工程の煩雑化を招くため好ましいことではない。【０００６】
また、従来のＢＳＡ等をブロッキング剤として使用した場合、そのブロッキング剤はセンサーチップ表面のリガンドが固定化されていない部位を被覆するのみならず、リガンドも重畳的に被覆してしまうため、非特異的吸着を防止する効果と引き替えに、リガンドとアナライトとの分子間相互作用を阻害してしまうおそれもある。ポリマーについても、一般的に分子量１万以上と定義されることを考慮に入れると、その分子の大きさから、ＢＳＡ等のブロッキング剤と同様に分子間相互作用の阻害が起こると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−６６７９９号公報
【特許文献２】特開２００３−３１５３３４号公報
【特許文献３】特開２０１０−１６９６０４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】田中ら, BUNSEKI KAGAKU 56(9), pp.705-712 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＢＳＡなどの従来のブロッキング剤について見られた、再生溶液との接触による剥離やリガンドとアナライトとの分子間相互作用の阻害などの問題を引き起こさない、改善された非特異吸着防止剤を利用することのできる分子間相互作用測定手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、界面活性剤、たとえば商品名「Ｔｗｅｅｎ２０」として知られているポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートを、従来の分子間相互作用測定方法において用いられている各種の溶液における一般的な濃度よりも低い濃度で含有する水溶液で、センサーチップの表面を処理することにより、当該表面を当該界面活性剤で被覆し、非特異吸着防止剤として機能させることができることを見いだした。さらに、このような非特異的吸着防止剤としての界面活性剤が、再生溶液との接触による剥離やリガンドとアナライトとの分子間相互作用の阻害などの問題を引き起こさないことを見いだし、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理が施されていることを特徴とする、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［２］  前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤である、［１］に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［３］  前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレアートからなる群から選ばれる少なくとも１種のエステルエーテル型ノニオン性界面活性剤である、［１］または［２］に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［４］  前記分子間相互作用測定方法が反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップ。
［５］  ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、［１］〜［３］のいずれか一項に記載された界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位に前記界面活性剤からなる被膜を形成する非特異的吸着防止処理工程を含むことを特徴とする、［１］〜［４］のいずれか一項に記載された分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
［６］  前記界面活性剤の水溶液の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、［５］に記載の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法。
［７］  ［１］〜［４］のいずれか一項に記載されたセンサーチップを使用する分子間相互作用測定方法であって、非特異的吸着防止処理が施された測定部位に、少なくともアナライトと非特異的吸着物を含む試料溶液を接触させる試料溶液接触工程（Ａ）を含むことを特徴とする、分子間相互作用測定方法。
［８］  前記試料溶液接触工程（Ａ）の後、リガンドに結合したアナライトを剥離するための再生溶液を接触させる再生処理工程（Ｂ）およびさらなる試料溶液接触工程（Ａ）それぞれを少なくとも１回ずつ繰り返す、［７］に記載の分子間相互作用測定方法。
［９］  前記試料溶液、再生溶液またはその両方が、さらに［１］〜［３］のいずれか一項に記載された界面活性剤を含む、［７］または［８］に記載の分子間相互作用測定方法。
［１０］  前記試料溶液、再生溶液またはその両方に含まれる界面活性剤の濃度が０．０００１重量％以上０．１重量％以下である、［７］〜［９］のいずれか一項に記載の分子間相互作用測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明において、界面活性剤によるセンサーチップ表面の処理は、最初に所定の非特異吸着防止処理工程として行われるが、その後、再生処理工程を行っても、センサーチップ表面を被覆した界面活性剤は実質的に（測定値に影響を与えるほど）剥離しないので、追加の非特異吸着防止処理工程を設けなくとも、測定精度を低下させることなく同じセンサーチップを用いて測定を継続することができる。【００１３】
しかも、ＢＳＡのような従来のブロッキング剤を用いる場合に比べて、センサーチップ表面に固定化されたリガンドとアナライトとの分子間相互作用を阻害しないので、測定感度を向上させることができる。【００１４】
さらに、本発明においては、ＢＳＡ等のタンパク質等ほど分子量が大きくない界面活性剤を低濃度で使用するので、非特異吸着防止処理工程のために用いる水溶液以外にも、測定に悪影響を及ぼすことなく、試料溶液や剥離溶液に溶解させたまま使用してもよく、非特異吸着防止効果をより一層持続させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＲＩｆＳに基づく分子間相互作用測定方法の、本発明における実施形態の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、実施例１で取得した測定値（Δλ）の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、比較例１で取得した測定値（Δλ）の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
−センサーチップ−
本発明で用いる分子間相互作用測定方法用のセンサーチップは、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層が設けられているものである。これらの層は、ＲＩｆＳ用の無修飾のセンサーチップにおいては、その最表面に形成されている光学薄膜を指す。ただし、本発明において、分子間相互作用測定方法はＲＩｆＳに限定されるものではなく、「ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる層」が表面に形成されているセンサーチップを用いるものであれば、ＲＩｆＳ以外の分子間相互作用測定方法において本発明を応用することが可能である。
【００１７】
一般的に、分子間相互作用測定方法用のセンサーチップは、上記のような所定の層（光学薄膜）の表面の少なくとも一部にリガンドが固定化されており、そこが所定のシグナルを測定するための測定部位とされる。本発明では、そのような測定部位に対して、界面活性剤からなる被膜を形成する（界面活性剤で被覆する）ことによる非特異的吸着防止処理が施されている。非特異的吸着防止処理の方法、すなわち界面活性剤からなる被膜の形成方法は特に限定されるものではないが、後述するような手順にしたがって、界面活性剤の水溶液を測定部位に接触させる方法が好適である。
【００１８】
・界面活性剤（非特異的吸着防止剤）
本発明では、非特異的吸着剤、すなわち、生体物質の非特異的吸着を防止するために測定部材の表面を被覆する物質として、界面活性剤を用いる。以下に例示する界面活性剤は、いずれか１種を単独で用いても、本発明の作用効果を損なわない範囲において２種以上を混合して用いてもよい。
【００１９】
界面活性剤には、アニオン（陰イオン）界面活性剤、カチオン（陽イオン）界面活性剤および両性界面活性剤を包含するイオン性界面活性剤と、ノニオン（非イオン）性界面活性剤が包含される。
【００２０】
たとえば、静電的相互作用に起因する非特異的吸着を防止することを特に考慮する場合、非特異的吸着防止剤としてノニオン性界面活性剤が好適である。
【００２１】
ノニオン性界面活性剤には、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型などのものが包含されるが、中でもエステルエーテル型のものが好ましい。エステルエーテル型のノニオン性界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（東京化成工業株式会社、商品名「Ｔｗｅｅｎ２０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（同「Ｔｗｅｅｎ４０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート（同「Ｔｗｅｅｎ６０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（同「Ｔｗｅｅｎ８０」）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（同「Ｔｗｅｅｎ８５」）が挙げられる。なお、これらのエステルエーテル型のノニオン性界面活性剤の商品は、いずれも一分子中のポリオキシエチレン数の平均が約２０であり、仮に一分子中のポリオキシエチレン数を２０としたときの分子量は、いずれも２０００以下である。また、エーテル型のノニオン性界面活性剤としては、たとえば、ジエチレングリコールモノドデシルエーテル、エチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリエチレングリコールモノセチルエーテル（ｎ≒２３、なおｎはオキシエチレンユニット数、以下同じ）、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｎ≒２５）、ポリエチレングリコールモノ-4-オクチルフェニルエーテル（ｎ≒１０）、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテルが挙げられる。
【００２２】
−センサーチップの製造方法−
・非特異的吸着防止処理工程
界面活性剤を用いた非特異的吸着防止処理が施されている本発明の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップは、前記所定の層（光学薄膜）の表面にリガンドが固定化されている測定部位に、前記界面活性剤の水溶液を接触させることにより、前記測定部位を前記界面活性剤で被覆する、非特異的吸着防止処理工程を通じて製造することができる。
【００２３】
すなわち、上記のような非特異的吸着防止剤としての界面活性剤は、その水溶液を測定部位に接触させることで、その測定部位を被覆し、非特異的吸着を防止する性能を発揮するようになる。
【００２４】
換言すれば、前記測定部位に前記界面活性剤の水溶液を接触させることは、前記測定部位を前記界面活性剤で被覆することにより、前記測定部位の非特異的吸着を防止する方法となる。
【００２５】
非特異的吸着防止処理工程に用いる界面活性剤の水溶液の濃度は、界面活性剤の種類や処理時間の長さに応じて適宜調整することも可能であるが、一般的には０．１重量％以下、より好ましくは０．０５重量％以下、好ましくは０．０１重量％以下であり、また一般的には０．０００１重量％以上、好ましくは０．００１重量％以上である。界面活性剤の濃度が上記下限値よりも低い場合、また詳細な理由は不明であるが上限値より高い場合も、非特異吸着防止能が発揮されないおそれがある。界面活性剤の濃度が上記上限値よりも高い場合は、密閉流路内で気泡が発生しやすくなり、送液系に悪影響を及ぼすおそれが高まる。
【００２６】
界面活性剤の水溶液の接触のさせ方は特に限定されるものではなく、当該水溶液が移動（流下）している状態において接触させてもよいし、当該水溶液が静止した状態で接触させてもよい。前者の接触の態様としては、たとえば図１に示すような使用状態にあるセンサーチップに対して、光学薄膜の表面にリガンドを固定化した後、非特異的吸着防止剤の水溶液をフローセルにより形成される密閉流路から導入することにより、上記センサーチップの表面に接触させて非特異的吸着防止処理を施すことが好適である。このような態様は、次に述べる後者の態様に比べて、非特異吸着防止能被験物（Ａ）による被覆を十分な水準に到達させる（平衡させる）までの時間が短くて済む。また、後者の接触の態様として、あらかじめ光学薄膜の表面にリガンドが固定化されているセンサーチップを、容器内に収められた非特異的吸着防止剤の水溶液に単に浸漬するようにしてもよい。
【００２７】
処理時間、すなわちセンサーチップ表面と界面活性剤の水溶液との接触時間は特に限定されるものではないが、センサーチップの表面が界面活性剤で十分に被覆される（飽和状態に達する）までの時間を確保することが適切である。
【００２８】
非特異吸着防止処理工程が、前述したように、密閉流路に界面活性剤の水溶液を送液することでセンサーチップと接触させるような態様で行われる場合、適切な処理時間を判断するために、当該処理工程の開始前から分子間相互作用測定方法による測定値を取得し始め、以後連続的に取得し続けることが好適である。処理時間の経過と共に測定値が変化し（ＲＩｆＳにおいては通常ボトムピーク波長が長波長側に移る）、そのような変化の観察を通じて非特異吸着防止処理が進行し、センサーチップ表面に界面活性剤の被膜が形成されていく様子を随時確認することができる。やがて測定値は変化しなくなり、ないし変動が十分に小さくなり、それによってセンサーチップの表面における界面活性剤の被覆が飽和に達したものと判断することができ、非特異吸着防止処理工程を終了させることができる。
【００２９】
・その他の工程
界面活性剤を用いた非特異的吸着防止処理が施されている、本発明の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップの製造方法は、上記のような非特異的吸着防止処理工程以外に、従来と同様の各種の工程を含むことができる。
【００３０】
たとえば、センサーチップ（光学薄膜）の表面は、製造当初は無修飾であり、アナライトとの接触に先だって、アナライトに応じたリガンドを固定化しておく必要がある。
【００３１】
センサーチップ（光学薄膜）の表面にリガンドを固定化する工程の態様は特に限定されるものではなく、公知の各種の手法を採用して行うことができる。たとえば、無修飾の光学薄膜（たとえばＳｉＮ）の表面を、末端にアミノ基を有するシランカップリング剤で処理してアミノ基で修飾し、つづいてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）−ＰＥＧ４−ビオチンで処理して当該アミノ基にビオチンを結合させ、このビオチンにアビジンを反応させた後に、ビオチン化したリガンド（たとえば抗体）を反応させることにより、表面に当該リガンドが固定化されたセンサーチップを作製することができる。また、上記の手法において、末端にカルボキシル基を有するシランカップリング剤を用いることによりカルボキシル基で修飾し、つづいてＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride）およびＮＨＳで処理してそのカルボキシル基を活性エステル化した後、アミノ基を有するリガンド（典型的にはタンパク質、たとえば抗体）を反応させることによっても、表面に当該リガンドが固定化されたセンサーチップを作製することもできる。
【００３２】
このようなリガンドを固定化するための各種の処理は、表面が無修飾のセンサーチップおよびフローセルからなる測定部材を検出装置にセットした後、その処理のための試薬や洗浄液を順次送液することによって行うこともできるし、測定部材を検出装置にセットする前に一部の処理を行っておき、セットした後に残りの処理を行うようにすることもできる。
【００３３】
−ＲＩｆＳの実施形態−
以下、図１を参照しながら、界面活性剤による非特異的吸着防止処理が施されている本発明の分子間相互作用測定方法用のセンサーチップを使用する、ＲＩｆＳに基づく分子間相互作用測定方法の一実施形態について説明する。
【００３４】
分子間相互作用測定方法用の測定装置１は、主に、測定部材１０，白色光源２０，分光器３０，光伝達部４０，制御装置５０などから構成されている。白色光源２０，分光器３０，光伝達部４０などは、好ましくは測定装置本体に収容されており、この測定装置本体に、例えばＰＣ（Personal Computer）の形態をとる制御装置５０が制御可能に接続される。また、測定部材１０は、一般的には矩形であり、好ましくは上記測定装置本体に着脱可能な形態である。
【００３５】
測定部材１０は、少なくとも基板１２ａと、その上に形成された光学薄膜１２ｂを含む、センサーチップ１２を基本として構成され、通常はさらに、アナライト６２を含む試料溶液６０等の各種の溶液を送液するための密閉流路１４ｂを形成するために、フローセル１４が当該センサーチップ１２に積載される。測定部材１０（センサーチップ１２およびフローセル１４）は、ディスポーザブルタイプのものとすることができる。基板１２ａは、代表的にはＳｉ（シリコン）製の基板であり、光学薄膜１２ｂは、代表的にはＳｉＮ（窒化シリコン）膜である。
【００３６】
基板１２ａは、たとえばＳｉ（シリコン）製が好ましい。一方、光学薄膜１２ｂは、基板の材質（屈折率）に応じて選択される、白色光を用いたときに観測されるボトムピークが適切な範囲となるような屈折率および厚みを有する材質で形成される。たとえば、基板１２ａがＳｉ基板である場合、光学薄膜１２ｂは、ＳｉＮ、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、ＺｒＯ2、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）などの酸化膜または窒化膜であることが好ましく、ＳｉＮ膜が特に好ましい。これらの酸化膜または窒化膜はいずれも、可視光領域（波長約４００から８００ｎｍの範囲）における屈折率が１．８〜２．４で、Ｓｉ基板の上層に形成される光学薄膜としての性能を満たしており、なおかつ当該光学薄膜自体がある程度、非特異的吸着を抑制する効果を有している。たとえば、ＳｉＮ膜の膜厚を約４５〜９０ｎｍとすることにより、ボトムピークをおよそ４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲に調節することができる。
【００３７】
フローセル１４は、たとえばシリコーンゴム（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ）製の、透明な部材であり、センサーチップ１２に密着させることができる。フローセル１４には少なくとも１つの溝１４ａが形成されている。フローセル１４をセンサーチップ１２に密着させると、密閉流路１４ｂが形成される。溝１４ａの両端部はフローセル１４の表面から露出しており、一方の端部が送液部（たとえばシリンジポンプ）に接続されて試料溶液６０等の各種の溶液が供給される流入口１４ｃとして機能し、他方の端部は廃液部に接続されて試料溶液６０等の各種の溶液の流出口１４ｄとして機能するようになっている。
【００３８】
フローセル１４の少なくとも１つの溝１４ａの底部に位置する、センサーチップ１２の表面（光学薄膜１２ｂの上層）の少なくとも一部には、アナライト６２と結合するリガンド１６が固定化されており、当該部位にて測定が行われる。
【００３９】
リガンド１６には、分析の対象とするアナライト６２に応じて、それと特異的に結合する適切な物質が選択される。たとえば、アナライト６２が抗原となるタンパク質ないしペプチドであればその抗体となるタンパク質が、アナライト６２が核酸であればそれと相補的な塩基配列を有する核酸が、アナライト６２が糖であればそれと結合するレクチン（タンパク質）などが、リガンド１６として使用される。
【００４０】
光伝達部４０は、白色光源２０からの白色光を測定部２００に導くための第一の光伝達経路としての第一の光ファイバ４１と、第一の光ファイバ４１からの白色光の照射による反射光を測定部２００から分光器３０に導くための第二の光伝達経路としての第二の光ファイバ４２とを備えている。第一の光ファイバ４１の白色光源２０側の端部は、当該白色光源２０の接続ポートに接続されている。接続ポートに接続された光ファイバ４１は光入射端面がハロゲンランプ２１に対向するように配置されている。第二の光ファイバ４２の分光器３０側の端部は、当該分光器３０の受光を行う接続ポートに接続されている。
【００４１】
上記各光ファイバ４１，４２は、いずれも微細ファイバを束ねた構造となっている。そして、第一の光ファイバ４１と第二の光ファイバ４２のフローセル１４側の端部は、各々の微細ファイバが一つの束となるように複合的に寄り合わされている。即ち、第一の光ファイバ４１を構成する微細ファイバは、フローセル１４側の端面において中央に分布し、第二の光ファイバ４２を構成する微細ファイバは第一の光ファイバ４１の微細ファイバの束を取り囲むようにその周囲に分布している。
【００４２】
白色光源２０は、ハロゲンランプと、これを格納する筐体とから構成されている。筐体には、第一の光ファイバ４１を接続するための接続ポートが設けられている。なお、本実施形態では白色光源を用いているが、これに限られるものではなく、後述する反射率極小波長の変化を検出しうる波長域にわたって分布する光を発光する光源であればよい。
【００４３】
白色光源２０が点灯すると、その白色光が第一の光ファイバ４１を介して測定部２００に照射され、その反射光が光ファイバ４２を介して分光器３０に導かれる。この分光器３０は、受光部で受光する光に含まれる一定の波長間隔ごとの光について光強度を検出し、分光強度として制御装置５０に出力する。
【００４４】
なお、本実施形態においては、測定部材１０からの反射光を分光器３０で受光するようにしているが（反射型ＲＩｆＳ）、測定部材１０として光透過性のものを用いて、白色光源２０からの光を測定部材１０に照射し、測定部材１０を透過してきた光を受光するように分光器３０を配置し、透過光の分光強度を検出するよう変形することも可能である。
【００４５】
制御装置５０は、オペレータから検出動作の実行の入力を受け付けて、測定装置１０への検出動作制御の実行指令を出力する。これにより、制御装置５０は、制御部として機能する。
【００４６】
また、制御装置５０は演算部としても機能する。制御装置５０は、分光器３０から測定光の分光強度のデータを取得し、各波長帯域ごとに、測定光の分光強度を基準となる白色光の分光強度で除して反射率を算出する。基準光の分光強度データは、あらかじめ装置組み立て調整時に測定して保有していたものでもよいし、その他の手段によりたとえば測定の都度取得したものでもよい。算出された反射率に基づき反射スペクトルが作成され、反射率極小波長（λ）が決定される。また、ある基準となる反射率極小波長（ベースライン）に対する、測定された反射率極小波長の変化量（Δλ）を取得することもできる。
【００４７】
反射スペクトルの波形は、通常、微小な凹凸が繰り返されるような不規則な形状を呈しており、反射率極小波長を算出・特定するのが困難な状態となっている場合があるが、たとえば、公知の手法を用いて反射スペクトルを高次関数で近似することにより波形を滑らかにし、高次多項式からその解（最小値）を求めて、これを反射率極小波長の値として特定することができる。
【００４８】
マイコン（図示せず）は、制御装置５０の制御指令に応じて白色光源２０の点灯と消灯を切り換える制御を行ったり、制御装置５０の設定温度指令に応じて温度制御部の温度制御を行ったりする。
【００４９】
温度調節手段（図示せず）は、例えば、ペルチェ素子のような加温と冷却を行う温度調節素子と温度検出素子とを備え、これらは測定部材１０に併設される。そして、制御装置５０が、マイコンを通じて温度検出素子により測定部材１０の温度を検出し、温度調節素子による加温又は冷却によって、設定温度となるように温度制御を実行する。
【００５０】
検出を行う際には予め測定部材１０の暖気が行われる。即ち、制御装置５０は、予め定めた設定温度となるようマイコンに指令を送り、マイコンは温度制御部の温度制御を実行する。暖気により測定部材１０の温度が安定してから、分析を始める。
【００５１】
制御装置５０は、測定を継続するか判定を行い、継続しない場合には処理を終了する。かかる判定は、例えば、予め測定時間が設定され、当該測定時間が経過したか否かを判定してもよいし、測定の終了の入力を受けるまで測定を継続する設定として、測定終了の入力の有無を判定してもよい。測定を継続する場合には、再び、分光強度の測定が実行される。測定を繰り返すことにより、制御装置５０は、周期的に反射率の算出、反射スペクトルの作成および反射率極小波長の決定を行い、その時系列的な変化を記録する。
【００５２】
・アナライト接触工程
分子間相互作用測定方法は、非特異的吸着防止処理が施された測定部位に、少なくともアナライトと非特異的吸着物を含む試料溶液を接触させる試料溶液接触工程（Ａ）を含む。
【００５３】
アナライト６２は、固定化されたリガンド１６と特異的に結合する物質である。たとえば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む），核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む），脂質，糖などの生体分子や、薬剤物質，内分泌錯乱化学物質などの生体分子と結合する外来物質、その他の生体関連物質などがアナライト６２となり得る。がんの診断等において重要な指標となる、血液中に存在する腫瘍マーカー（たとえばα−フェトプロテイン）は、重要なアナライトの一例である。
【００５４】
分子間相互作用測定方法に供されるアナライト６２を含む、または含んでいる可能性のある試料溶液は、一般的に、生体から採取した検体から調製される。検体としては、たとえば、ヒトおよびヒト以外の動物（たとえばほ乳類）から採取される血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。このような検体は、必要に応じて、各種の液体（純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液等）と混合したり、精製処理をした上で試料溶液として用いてもよい。このような試料溶液は通常、多種多様な非特異吸着物、特に生体分子を含んでいる。非特異吸着物として典型的な生体分子には、タンパク質、核酸、糖、その他各種の生物由来物質が含まれる。本発明において非特異吸着防止剤として用いる界面活性剤は、このような物質のセンサーチップ表面への非特異吸着を防止ないし十分に抑制することができる。
【００５５】
試料溶液は、さらに、前記非特異吸着防止処理工程において用いたものと同様の界面活性剤を含んでいてもよい。その場合の試料溶液に含まれる界面活性剤の濃度も、前記非特異吸着防止処理工程において用いた水溶液と同様の範囲内で適宜調節することが好ましい。試料溶液が界面活性剤を含む場合、もしもセンサーチップ表面を被覆している界面活性剤の一部が剥離したとしても（特にアナライト接触工程が２回目以降のときに、その前に行われた再生処理工程により）、当該試料溶液中の界面活性剤が直ちにその剥離を補填し、常に界面活性剤の被膜が十分に形成されている状態（飽和状態）で測定を行うことができる。
【００５６】
・再生処理工程
前記試料溶液接触工程（Ａ）の後、リガンド１６に結合したアナライト６２を剥離するための再生溶液を接触させる再生処理工程（Ｂ）を行ってもよい。
【００５７】
上記のような再生溶液は公知であり、たとえば、グリシン−ＨＣｌ溶液などを用いることができる。
【００５８】
再生溶液は、さらに、前記非特異吸着防止処理工程において用いたものと同様の界面活性剤を含んでいてもよい。その場合の再生溶液に含まれる界面活性剤の濃度も、前記非特異吸着防止処理工程において用いた水溶液と同様の範囲内で適宜調節することが好ましい。
【００５９】
このような再生処理工程（Ｂ）の後、再び試料溶液接触工程（Ａ）を行うことにより、センサーチップを交換することなく別の試料溶液についての測定を続けて行うことができる。さらにその後、再生処理工程（Ｂ）および試料溶液接触工程（Ａ）を繰り返し、測定を続けることが可能である。再生溶液が界面活性剤を含む場合、もしも再生工程においてセンサーチップ表面を被覆している界面活性剤の一部が剥離したとしても、当該再生溶液中の界面活性剤が直ちにその剥離を補填し、界面活性剤の被膜が十分に形成されている状態（飽和状態）で次のアナライト接触工程に移行することができる。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
（１．無修飾のセンサーチップの作製工程）
シリコンウエハ（１００）の上に、ＳｉＮ（窒化ケイ素）を６６．５ｎｍの厚さになるようＣＶＤで蒸着し、ＳｉＮからなる光学薄膜を最表面に有する無修飾のセンサーチップを作製した。【００６１】
（２．センサーチップ表面のカルボキシル基修飾工程）
１００μｌのＴｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ（Ｇｅｌｅｓｔ, Ｉｎｃ.製）を、０．１ｍｌ酢酸と１０ｍｌの超純水との混合溶液中に徐々に滴下し、室温にて１時間撹拌した。そこに上記工程で作製した無修飾のセンサーチップを浸漬し、更に室温にて１時間撹拌した。このようにして作製されたカルボキシル基修飾されたセンサーチップを、超純水で洗浄した後、空気ブローにより水滴を除去し、さらに８０℃の乾燥器内で１時間乾燥させた。【００６２】
（３．センサーチップ表面の抗体固定化工程）
ＮＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．製）、ＷＳＣ（ｄｏｊｉｎｄｏ製）がそれぞれ５０ｍＭ，２００ｍＭになるよう、２５ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．０）で調製した。そこに、上記工程によりカルボキシル基修飾されたセンサーチップを室温にて２０分間浸漬し、カルボキシル基が活性エステル化されたセンサーチップを作製した。センサーチップを超純水で洗浄後、空気ブローにより水滴を除去した。抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体（ｃｌｏｎｅ１Ｄ５；ミクリ免疫研究所(株)製）を２０ｕｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）で希釈した抗体希釈液に、センサーチップを室温にて３０分間浸漬させた。センサーチップを超純水で洗浄後、空気ブローにより水滴を除去し、最後に１Ｍエタノールアミン塩酸塩水溶液（ｐＨ８．５）に室温にて２０分間浸漬させることで、未反応の活性エステルのブロッキングを行い、抗体固定化センサーチップを得た。【００６３】
（４．測定準備工程）
ＲＩｆＳ方式の分子間相互作用測定装置（商品名「ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ」、コニカミノルタオプト(株)製）の電源を入れて光源が安定するまで約２０分間待機した。【００６４】
上記の抗体固定化センサーチップに、幅２．５ｍｍ×長さ１６ｍｍ×深さ０．１ｍｍの溝及びこの溝の両末端にそれぞれ直径１ｍｍの貫通口を有するフローセル（コニカミノルタオプト(株)製）を積載して、密閉流路が形成された測定部材を構築した。この測定部材を上記測定装置にセットし、シリンジポンプ（Ｅｃｏｎｏｆｌｏ７０−２２０５；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ製）により、上記測定装置が備えているチップカバーを通して、測定装置外部から密閉流路に液体を送液し、センサーチップ表面に接触させることが可能な状態にした。【００６５】
（５．非特異吸着防止剤処理工程）
非特異吸着防止剤としての界面活性剤である「Ｔｗｅｅｎ２０」（東京化成工業株式会社）を、前記ＰＢＳバッファーを用いて０．００１重量％の濃度に調整した処理液を調製した。この非特異吸着防止剤処理液を、前記シリンジポンプにより２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で２０分間、測定部材の密閉流路に導入し、前記工程によりアナライト（抗ＡＦＰ抗体）が固定化されたセンサーチップの表面に接触させて、センサーチップの表面を上記界面活性剤で被覆し、測定基準となる分光反射率が最小となる波長λ0（ベースライン）が約５７０ｎｍ付近で安定するのを確認した。【００６６】
（６．非特異吸着防止確認工程）
非特異吸着の防止効果を確認するために、前記分子間相互作用測定装置の測定を開始後、６００ｓｅｃ後に、１０×ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．製）を超純水により１０倍希釈して調製した１％ＢＳＡ溶液を２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で５分間、計１００μＬ測定部材の密閉流路に導入し、前記工程により界面活性剤による処理が施されたセンサーチップの表面に接触させて、非特異吸着による測定値（Δλ）の上昇がないことを確認した。【００６７】
（７．アナライト接触工程）
上記非特異吸着防止剤処理液を用いて、アナライトとしてα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＧｍｂＨ製）を、それぞれ１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を調製した。この２種類の濃度のアナライト溶液を、前記分子間相互作用測定装置の測定を開始後１２００ｓｅｃ、１８００ｓｅｃ後に、前記シリンジポンプにより２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で５分間、計１００μＬ測定部材の密閉流路に導入し、前記工程により界面活性剤による処理が施されたセンサーチップの表面に接触させて、センサーチップの表面に固定化されているリガンドにアナライトを結合させた。【００６８】
（８．再生溶液処理工程）
再生溶液として１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．５）を、前記分子間相互作用測定装置の測定を開始してから２４００ｓｅｃ後に、前記シリンジポンプにより２０μＬ／ｍｉｎの送液速度で５分間、計１００μＬ測定部材の密閉流路に導入し、前記工程によりアナライトがリガンドと結合しているセンサーチップの表面に接触させて、当該アナライトおよびリガンドを解離させた。【００６９】
（９．２回目のアナライト接触工程）
前記分子間相互作用測定装置の測定を開始してから３０００ｓｅｃ後、３６００ｓｅｃ後に、前記第７工程と同様にして、２回目のアナライト接触工程を行った。【００７０】
（１０．２回目の再生溶液処理工程）
前記分子間相互作用測定装置の測定を開始してから４２００ｓｅｃ後に、前記第８工程と同様にして、２回目の再生溶液処理工程を行った。【００７１】
図２に、上記の実施例１（第７工程〜第１０工程）で取得した測定値（Δλ）の経時変化を表すグラフを示す。【００７２】
［比較例１］
前記第５工程「非特異吸着防止剤処理工程」を行う代わりに、前記第３工程「センサーチップ表面の抗体固定化工程」を経た前記抗体固定化センサーチップを１０×ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．製）を超純水により１０倍希釈して調製した１％ＢＳＡ溶液に室温で３０分間浸漬させ、これを用いて前記第４工程「測定準備工程」において測定部材を構築するようにしたこと以外は、実施例１と同様にして第１工程〜第１０工程を行った。【００７３】
図３に、上記の比較例１（第７工程〜第１０工程）で取得した測定値（Δλ）の経時変化を表すグラフを示す。【００７４】
＜考察＞
非特異吸着防止剤としてＢＳＡを使用した比較例１（図２）と比較して、Ｔｗｅｅｎ２０を使用した実施例１（図３）ではアナライトを導入時のレスポンス（Δλ）が高く、高感度化されていることが分かる。また、比較例１（図２）では、再生溶液での処理後のベースラインは当初のベースラインよりも下がっており、センサーチップ表面を被覆していたＢＳＡの剥離が起きたことが分かる。これに対して、実施例１（図３）では、再生溶液での処理後のベースラインは当初のベースラインよりも下がらず、ほぼ等しいレベルを維持しており、界面活性剤の剥離は起きていない、あるいは剥離が起きたとしても処理液中に含まれる界面活性剤によりすぐに補給されると考えられる。したがって繰り返しの使用に耐えうる優れた非特異吸着防止剤といえる。
【符号の説明】
【００７５】
１    測定装置
１０    測定部材
１２    センサーチップ
１２ａ  基板
１２ｂ  光学薄膜
１４    フローセル
１４ａ  溝
１４ｂ  密閉流路
１４ｃ  流入口
１４ｄ  流出口
１６    リガンド
２０    白色光源
３０    分光器
４０    光伝達部
４１    第一の光ファイバ
４２    第二の光ファイバ
５０    制御装置
６０    試料溶液
６２    アナライト
【図１】
2013002193.tif 000002
【図２】
2013002193.tif 000003
【図３】
2013002193.tif 000004
【国際調査報告】
2013002193.tif 000005
2013002193.tif 000006
2013002193.tif 000007
2013002193.tif 000008