(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトラールを有効成分とするＰＰＡＲγ活性抑制剤（ただし、皮脂抑制、ニキビ予防又は改善、あるいはフルクトースの過剰摂取に起因する肥満、高脂血症又は脂肪肝の予防又は改善に使用する場合を除く）。
【請求項２】
シトラールを有効成分とする脂肪細胞の分化及び／又は成熟抑制剤（ただし、フルクトースの過剰摂取に起因する肥満、高脂血症又は脂肪肝の予防又は改善に使用する場合を除く）。
【請求項３】
シトラールを有効成分とする脂肪合成抑制剤（ただし、フルクトースの過剰摂取に起因する肥満、高脂血症又は脂肪肝の予防又は改善に使用する場合を除く）。
【請求項４】
シトラールを有効成分とする肥満（フルクトースの過剰摂取に起因する肥満を除く）の予防又は改善剤。
【請求項５】
シトラールを有効成分とする脂質異常症（フルクトースの過剰摂取に起因する高脂血症を除く）の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma、ＰＰＡＲγと記載する）の活性を抑制することができる素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、Ｃ末端側のリガンド結合領域にリガンドが結合することで活性化される転写因子であり、グルココルチコイド、エストロゲン及びビタミンＤ等をリガンドとする核内受容体のスーパーファミリーの一つである（非特許文献１）。ＰＰＡＲはリガンドとの結合により活性化されると、レチノイドＸレセプター（retinoid X receptor：ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子の上流に存在するＰＰＡＲ応答配列（peroxisome proliferator response element：ＰＰＲＥ）に結合して標的遺伝子の発現を活性化する（非特許文献２及び３）。
【０００３】
ＰＰＡＲには、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδ及びＰＰＡＲγと呼ばれる３種のアイソフォームが同定されている。これらは、発現組織が異なっており、それぞれ違った生体機能を有していることが報告されている（非特許文献４）。例えば、ＰＰＡＲγは、栄養が十分にある状態でエネルギー貯蔵に作用し、いわゆる倹約遺伝子として働く分子である。特にＰＰＡＲγ２は、脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。ＰＰＡＲγのリガンドとして知られるチアゾリジン誘導体は脂肪細胞分化を強力に誘導することにより、脂肪細胞を小型化してインスリン感受性を高めることが知られており、インスリン抵抗性改善剤、糖尿病治療薬として広く使用されている（非特許文献５）。
【０００４】
ＰＰＡＲγの活性を抑制することによって、脂肪細胞の分化及び／又は成熟が抑制されるので脂肪合成を抑制することができ、ひいては肥満や、脂質異常症、脂肪肝の予防又は改善、さらには生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）の予防又は改善が可能になる。
【０００５】
さらにＰＰＡＲγは、皮脂腺細胞（sebaceous cell）で発現していることが知られている。ラット皮脂腺細胞を用いた培養試験においては、ＰＰＡＲγのアゴニストＢＲＬ−４９６５３が皮脂腺細胞の脂質産生細胞への分化を促進したことが示されている（非特許文献６）。Ｂ領域の紫外線（ＵＶＢ）や薬剤誘導性の酸化ストレス刺激により、表皮癌細胞や皮脂腺細胞のＰＰＡＲγが活性化されると、ＰＰＡＲγ活性に依存的なシクロオキシゲナーゼ２の発現亢進が起こり、炎症反応が惹起されたことも報告されている（非特許文献７）。
【０００６】
したがって、ＰＰＡＲγの活性を抑制することによって、皮脂腺における過剰な脂質産生の抑制を介して、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患又は皮膚トラブルの予防又は改善もまた可能になる。
【０００７】
シトラール（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール）は、柑橘類やレモングラス等に含まれる香気成分であり、主に香料として使用されており、また血流促進成分としても知られている（特許文献１）。コショウの辛み成分であるピペリン（（２Ｅ，４Ｅ）−１−ピペリジノ−５−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，４−ペンタジエン−１−オン）は、古くから殺虫成分として用いられていた物質であり、また温感物質としても知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−０２４１８４号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１６０９２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ann. N.Y. Acad. Sci. (1993) 684:157-173
【非特許文献２】細胞 (1999) 31(6):218-234
【非特許文献３】J Lipid Res. (1996) 37:907-925
【非特許文献４】Endcrinology (1996) 137:354-366
【非特許文献５】Diabetes. (2000) 49:759-767
【非特許文献６】Dermatol. (1998) 196:43-46
【非特許文献７】Dermatol. (2006) 126:42-48
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＰＰＡＲγの活性を抑制することができる素材の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはシトラール又はピペリンがＰＰＡＲγアンタゴニスト活性を有しており、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制、脂肪合成の抑制、皮脂の抑制、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患又は皮膚トラブルの予防又は改善、あるいは肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群等の疾患又は状態の予防若しくは改善のための有効成分として有用であることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）シトラール又はピペリンを有効成分とするＰＰＡＲγ活性抑制剤。
（２）シトラール又はピペリンを有効成分とする脂肪細胞の分化及び／又は成熟抑制剤。
（３）シトラール又はピペリンを有効成分とする脂肪合成抑制剤。
（４）シトラール又はピペリンを有効成分とする皮脂抑制剤。
（５）シトラール又はピペリンを有効成分とするニキビ予防又は改善剤。
（６）シトラール又はピペリンを有効成分とする肥満予防又は改善剤。
（７）シトラール又はピペリンを有効成分とする脂質異常症の予防又は改善剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＰＰＡＲγ活性抑制剤は、ＰＰＡＲγアンタゴニスト活性を有し、ＰＰＡＲγ活性化を抑制することができる。本発明のＰＰＡＲγ活性抑制剤は、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制、脂肪合成の抑制、さらには肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）等の疾患若しくは状態の予防又は改善のために使用することができる。さらに本発明のＰＰＡＲγ活性抑制剤は、皮脂産生の抑制や、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患又は皮膚トラブルの予防又は改善のために使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
【００１５】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１６】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患、症状若しくは状態の発生の防止又は遅延、あるいは個体の疾患、症状若しくは状態の発生の危険性を低下させることをいう。
【００１７】
シトラール（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール）は、特開昭５２−１４８００９号公報、特開平９−１８８６４５号公報、特開２００６−１２４３４８号公報等に記載の方法に従って、化学的に合成することができる。あるいは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬工業等から購入することができる。
ピペリン（（２Ｅ，４Ｅ）−１−ピペリジノ−５−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，４−ペンタジエン−１−オン）は、例えば、コショウ科植物等のピペリンを含有する生薬の抽出エキス及び乾燥エキスを用いることができる。あるいは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬工業等から購入することができる。
【００１８】
後記実施例に示すように、シトラール又はピペリンは、ＰＰＡＲγにアンタゴニストとして作用し、ＰＰＡＲγに依存的な遺伝子の転写活性を抑制する作用を有する。前述のとおり、ＰＰＡＲγはエネルギー貯蔵に作用する分子であり、またＰＰＡＲγのリガンドにより脂肪細胞分化や（非特許文献５）、皮脂腺細胞の脂質産生細胞への分化（非特許文献６）が促進されることが知られている。すなわち、シトラール又はピペリンは、新規ＰＰＡＲγアンタゴニストであり、ＰＰＡＲγ活性抑制のために使用することができる。さらに、シトラール又はピペリンは、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制のため、脂肪細胞の脂肪合成の抑制のため、皮脂の抑制のため、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患又は皮膚トラブルの予防、治療又は改善のため、あるいは肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）等の疾患若しくは状態の予防、治療又は改善のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する組織、器官、細胞等における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。シトラール及びピペリンは、各々単独で使用されてもよく、又は組み合わせて使用されてもよい。
【００１９】
したがって一態様において、本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とするＰＰＡＲγ活性抑制剤を提供する。また本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とする脂肪細胞の分化及び／又は成熟抑制剤を提供する。また本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とする脂肪合成抑制剤を提供する。また本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とする皮脂抑制剤を提供する。また本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とするニキビ予防又は改善剤を提供する。また本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とする肥満予防又は改善剤を提供する。また本発明は、シトラール又はピペリンを有効成分とする脂質異常症の予防又は改善剤を提供する。
一実施形態において、上記剤は、本質的にシトラール又はピペリンから構成され得る。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ＰＰＡＲγ活性抑制剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、脂肪細胞の分化及び／又は成熟抑制剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、脂肪合成抑制剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、皮脂抑制剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、ニキビ予防又は改善剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、肥満予防又は改善剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、脂質異常症の予防又は改善剤の製造のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。
一実施形態において、上記の剤の脂肪細胞の分化及び／又は成熟抑制作用、脂肪合成抑制作用、皮脂抑制作用、ニキビ予防又は改善作用、肥満予防又は改善作用、あるいは脂質異常症の予防又は改善作用は、ＰＰＡＲγ活性抑制によってもたらされる。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、ＰＰＡＲγ活性抑制のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、脂肪細胞の分化及び／又は成熟抑制のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、脂肪合成抑制のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、皮脂抑制のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、ニキビ予防又は改善のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、肥満の予防又は改善のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。また本発明は、脂質異常症の予防又は改善のためのシトラール又はピペリンの使用を提供する。
さらに本発明は、ニキビの予防、治療又は改善において使用されるためのシトラール又はピペリンを提供する。さらに本発明は、肥満の予防、治療又は改善において使用されるためのシトラール又はピペリンを提供する。さらに本発明は、脂質異常症の予防、治療又は改善において使用されるためのシトラール又はピペリンを提供する。
【００２２】
さらに、シトラール又はピペリンは、ＰＰＡＲγ活性抑制のため、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制のため、脂肪合成の抑制のため、皮脂抑制のため、ニキビ予防又は改善のため、あるいは肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群等の疾患若しくは状態の予防又は改善のための組成物、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品等の製造のために使用することができる。
【００２３】
上記組成物、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。シトラール又はピペリンは、当該組成物、医薬、医薬部外品、化粧料、飲食品等に素材として配合され、ＰＰＡＲγ活性抑制のため、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制のため、脂肪合成の抑制のため、皮脂抑制のため、ニキビ予防又は改善のため、あるいは肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群等の疾患若しくは状態の予防又は改善のための有効成分であり得る。
【００２４】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、シトラール又はピペリンを有効成分として含有する。当該医薬、医薬部外品又は化粧料は、シトラール又はピペリンを単独で含有していてもよく、又は薬学的に若しくは化粧料として許容される担体を組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、保湿剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられ、さらに化粧料においては、美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）等が挙げられる。さらに、当該医薬、医薬部外品又は化粧料は、シトラール又はピペリンのＰＰＡＲγ活性抑制作用が失われない限り、他の有効成分、薬理成分又は化粧成分を含有していてもよい。
【００２５】
上記医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。また上記化粧料は、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧料に使用され得る任意の形態であり得る。
【００２６】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、シトラール又はピペリンから、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分、薬理成分又は化粧成分を組みあわせて、常法により製造することができる。当該医薬又は医薬部外品におけるシトラール又はピペリンの含有量は、１〜１００質量％が好ましく、１０〜９０質量％がより好ましく、２０〜８０質量％がさらに好ましい。また当該化粧料におけるシトラール又はピペリンの含有量は、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましく、０．１〜３質量％がさらに好ましい。
【００２７】
上記飲食品は、シトラール又はピペリンを有効成分として含有する。当該飲食品は、ＰＰＡＲγ活性抑制、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制、脂肪合成の抑制、皮脂抑制、ニキビ予防又は改善、あるいは肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群等の疾患若しくは状態の予防又は改善等の効果を得ることが企図され、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品、家畜用飼料、家畜用飲料、ペットフード等であり得る。
【００２８】
上記食品の形態としては、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、スープ類、食用油、調味料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ等）、ならびに家畜用飼料、ペットフード等が挙げられ、飲料の形態としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、ニアウオーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等が挙げられる。
【００２９】
上記種々の形態の飲食品は、シトラール又はピペリンを単独で、又は他の飲食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて、公知の飲食品の製造法により製造することができる。上記飲食品等におけるシトラール又はピペリンの含有量は、０．０００５〜１．５質量％が好ましく、０．００２５〜０．３質量％がより好ましく、０．００５〜０．１質量％がさらに好ましい。
【００３０】
あるいは、上記医薬品、医薬部外品又は飲食品の投与量（有効摂取量）は、シトラール又はピペリンの質量に換算して、一日あたり２〜５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重が好ましく、１０〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重がより好ましく、２０〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重がさらに好ましい。
【００３１】
本発明のさらに別の態様において、シトラール又はピペリンは、ＰＰＡＲγ活性抑制のため、脂肪細胞の分化及び／又は成熟の抑制のため、脂肪合成の抑制のため、皮脂抑制のため、ニキビ予防又は改善のため、あるいは肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群等の疾患若しくは状態の予防、治療又は改善のために、それらを必要とする対象に有効量で投与され得る。
一実施形態において、当該投与は、健康促進又は美容目的での、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患又は皮膚トラブルの予防又は改善、肥満の予防又は改善、体重の低下又は増加の防止、体脂肪量の低下又は増加の防止、あるいは血中脂質量の低下又は増加の防止等を企図して、非治療的に行われる。
【００３２】
投与の対象としては、ＰＰＡＲγ活性化の抑制を必要とする動物、脂肪細胞の分化及び／若しくは成熟の抑制を必要とする動物、脂肪合成の抑制を必要とする動物、皮脂抑制を必要とする動物、ニキビの予防又は改善を必要とする動物、あるいは肥満や脂質異常症の予防若しくは改善を必要とする動物等が挙げられる。あるいは、投与の対象としては、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患、又は肥満、脂質異常症、脂肪肝、生活習慣病や内臓脂肪症候群等の疾患若しくは状態に罹患している動物、その疑いのある動物、又はその危険性の高い動物が挙げられる。またあるいは、投与の対象としては、上記疾患若しくは状態に罹患している又はその危険性があるとは診断されていないが、健康促進又は美容目的で、ニキビ等の皮膚脂質異常を伴う皮膚疾患又は皮膚トラブルの予防又は改善、体重や体脂肪量の低下若しくは増加の防止、又は血中脂質量の低下若しくは増加の防止を所望する動物が挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３３】
好ましい投与量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与の用量、経路、間隔、及び摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、ヒトに経口投与する場合、投与量は、シトラール又はピペリンの質量に換算して、成人１人当たり、２〜５０００ｍｇ／日とすることが好ましく、１０〜１０００ｍｇ／日がより好ましく、２０〜５００ｍｇ／日がさらに好ましい。
【００３４】
あるいは、投与対象は、動物由来の組織、器官、細胞、又はそれらの培養物若しくは分画物であり得る。当該組織、器官、細胞、又はそれらの分画物は、ＰＰＡＲγを発現するか又はＰＰＡＲγを有する、天然由来又は生物学的若しくは生物工学的に改変された組織、器官、細胞、又はそれらの分画物である。したがって本発明はまた、当該組織、器官、細胞、又はそれらの培養物若しくは分画物においてＰＰＡＲγの活性を抑制する方法を提供する。本方法は、例えば、ＰＰＡＲγを有し且つＰＰＡＲγ活性を抑制したい細胞をシトラール又はピペリンの存在下で培養する工程を含む。細胞が細胞培養物の場合、添加されるシトラール又はピペリンの濃度は、１〜１００μＭであり、好ましくは５〜５０μＭであり、より好ましくは１０〜３０μＭである。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＰＰＡＲγ活性阻害試験
試験物質として、ピペリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、シトラール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、陽性対照として、ＰＰＡＲγアンタゴニストであるＧＷ９６６２（和光純薬工業）を用いた。
アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ−１を２４穴プレートにまき、ＤＭＥＭ（５％チャコール処理ウシ胎児血清）中で１日培養した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列を含むレポータープラスミド（pG5-Luc；invitrogen）と、ヒトＰＰＡＲγ２リガンド結合部位（NCBI Ref Seq NM_015869，nt703-1606，配列番号１）をｐＢＩＮＤベクター（invitrogen）に挿入したｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ−ＬＢＤとを同時に各々０．２５μｇ／ウェルとなるようにトランスフェクション試薬（Superfect Transfection Reagent；QIAGEN）を用いて上記細胞に導入した。ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ−ＬＢＤベクターは、細胞に導入するとＰＰＡＲγ２リガンド結合部位とＧＡＬ４結合配列に結合する部位との融合蛋白質を発現する。当該融合蛋白質は、ＰＰＡＲγ２リガンドと結合することによりＧＡＬ４結合配列とも結合し、その下流のホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写を活性化する。よって、ホタルルシフェラーゼ活性を測定することによって、ＰＰＡＲγ２リガンドの結合量を決定することができる。また当該ベクターにはウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれているので、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することにより、当該ベクターの導入効率を求めることができる。
【００３６】
ベクター導入の３時間後、培養液をＤＭＥＭ（５％チャコール処理ウシ胎児血清）に交換し、さらに３時間後、培養液を、表１記載の試験物質を含むＤＭＥＭ（−ウシ胎児血清）培地に交換した。１時間後、ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾンを添加して一晩培養し、ＰＢＳにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて細胞を溶解し、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。試験物質存在下でのＰＰＡＲγアゴニストにより惹起されるＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性：Ｌｕｃ活性）を測定することにより、当該試験物質のＰＰＡＲγアンタゴニスト活性を評価した。ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（Ｌｕｃ活性）は以下のように定義した。
ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（Ｌｕｃ活性）
＝（ｐＧ５−ＬｕｃによるホタルＬｕｃ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ−ＬＢＤによるウミシイタケＬｕｃ活性）
コントロール（試験物質非添加）でのＬｕｃ活性を１００として、各試験物質存在下でのＬｕｃ活性の相対値（％）を求めた。コントロールに対する有意差検定はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0005923381.tif 000002
【００３８】
実施例２：脂肪細胞分化への影響
マウス前駆脂肪細胞由来細胞株３Ｔ３−Ｌ１を１２穴プレートにまき、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一日培養した。各試験物質を添加しさらに一日培養した後、試験物質を添加した分化誘導培地（５μｇ／ｍＬインスリン、１μＭロシグリタゾン、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ）に交換した。以後、試験物質を添加した分化誘導培地にて２日おきに培地交換を行い、６日後に細胞を回収した。陰性対照として、分化誘導培地に交換せず同期間培養した細胞（未分化群）を調製した。
得られた細胞からトータルＲＮＡを調製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社）を用いた定量的ＰＣＲにより、Ｆａｂｐ４、ＳＲＥＢＰ１ｃ及びＦＡＳ各遺伝子の発現量を測定した。Ｆａｂｐ４は脂肪細胞の分化マーカーとして知られている。ＳＲＥＢＰ１ｃおよびＦＡＳは脂肪細胞における主要な脂質合成関連遺伝子である（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２００９，２０（２）：１４０−１４８）。
測定した各遺伝子の発現量は、内部標準（３６Ｂ４遺伝子発現量）により補正した。得られた値は、コントロール（試験物質未添加）における発現量を１としたときの相対値として求めた。得られた値は平均値±標準誤差にてグラフ化した（ｎ＝３）。コントロールに対する有意差検定はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
0005923381.tif 000003
【配列表】
0005923381000001.app