(57)【要約】  検体中の夾雑物が、固相支持体、リガンドなどに非特異吸着することを抑制し、アッセイブランクの増加を抑制することができる検体希釈用液およびそれを用いた蛍光測定方法を提供する。重量平均分子量が２０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．００１〜５質量％含有する検体希釈用液である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が２０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．００１〜５質量％含有することを特徴とする検体希釈用液。
【請求項２】
重量平均分子量が５０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．０１〜２質量％含有することを特徴とする請求項１に記載の検体希釈用液。
【請求項３】
前記検体が生体試料であることを特徴とする請求項１又は２に記載の検体希釈用液。
【請求項４】
ｐＨ４〜９に調整されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の検体希釈用液。
【請求項５】
界面活性剤を含有することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の検体希釈用液。
【請求項６】
前記界面活性剤を、検体希釈用液に対して、０．００００１〜１質量％含有することを特徴とする請求項５に記載の検体希釈用液。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の検体希釈用液を含むことを特徴とする検体希釈用液のキット。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項に記載の検体希釈用液に検体を混合した混合液を、金属膜上に固相支持体が固定されたセンサーチップ上に供給した後、蛍光測定を行うことを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項９】
前記混合溶液を供給した後、検体中のアナライトに結合する蛍光標識抗体を供給して洗浄した後、前記蛍光測定を行うことを特徴とする請求項８に記載の蛍光測定方法。
【請求項１０】
前記固相支持体が、カルボキシメチルデキストランであることを特徴とする請求項８または９のいずれかに記載の蛍光測定方法。
【請求項１１】
前記蛍光測定を、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）、または、全反射ＡＴＲ蛍光法で行うことを特徴とする請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）、全反射ＡＴＲ（Attenuated Total Reflection）蛍光法などの蛍光測定方法を用いて、主として生体試料を検体として用いて、極微量のアナライトを検出する際に、検体を希釈するための検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、極微量な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした様々な検体検出装置が用いられている。このような検体検出装置の一つとしては、表面プラズモン共鳴現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、高精度にアナライト検出を行えるようにしたＳＰＦＳ装置が挙げられる。【０００３】
この表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属薄膜表面で減衰全反射（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光（粗密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。【０００４】
そして、この電場増強効果により、金属薄膜の表面近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出する方法である。【０００５】
ところで、このようなＳＰＦＳ測定において、アナライトを捕捉するための抗体を高密度に固定化できるカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を、リガンドの固相支持体として用いることが考えられる。ここで、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）、結合し得る分子または分子断片をいう。【０００６】
このＣＭＤ自体は、一般的に非特異吸着が比較的生じ難いとされているものの、実際には、種々の分子量を有し、広範な分子量分布を有するＣＭＤを、固相支持体として使用するような際には、図４の模式図で示したように、検体中のタンパク質や脂質などの種々の夾雑物１が、固相支持体３やリガンド４に付着し、固相支持体３やリガンド４に付着した夾雑物１に蛍光標識抗体５が付着してしまう場合がある。【０００７】
このように、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて、医療、バイオテクノロジーなどの分野において、特に、例えば、血清、血漿、全血、鼻腔液、腹腔液などの生体試料を検体として用いて、極微量のアナライト６を検出する際には、検体中のタンパク質や脂質などの種々の夾雑物１が、固相支持体３やリガンド４に付着し、固相支持体３やリガンド４に付着した夾雑物１に蛍光標識抗体５が非特異的に付着してしまう場合がある。【０００８】
このように夾雑物１を介して、蛍光標識抗体５が固相支持体３やリガンド４に僅かでも付着してしまうと、屈折率が変化して、電場増強効果に影響を及ぼすことになり、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクが大きく増加し、極微量なアナライト６の高感度且つ高精度なＳＰＦＳ測定の障害となってしまうという問題がある。【０００９】
しかも、ＳＰＦＳ測定においては、センサーチップ表面への夾雑物１の吸着によって、電場増強効果が大きく低下するリスクを有しており、例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）、発光酵素免疫測定法(ＣＬＥＩＡ(Chemiluminesent Enzyme Immunoassay))などの従来の測定方法以上に、センサーチップ表面への非特異吸着を防止する必要がある。【００１０】
下記の表１は、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡなどの従来法と、ＳＰＦＳ測定における上記の問題を、すなわち、特異反応が測定結果に及ぼす影響度を示す表である。このように、従来法に比較して、ＳＰＦＳ測定においては、夾雑物の非特異吸着が測定に及ぼす影響が大きいことが分かる。【００１１】
【表１】
2013042603.tif 000003
【００１２】
従来、このような夾雑物の非特異吸着を防止する方法としては、特許文献１（特開平８−３２７６２９号公報）に開示される前処理方法がある。【００１３】
すなわち、特許文献１には、非特異反応を起こす物質を取り除く検体の前処理方法として、非特異反応を起こす物質を吸収する免疫測定用の担体や抗体などの物質を結合した磁性粒子を検体に混合し、磁力により磁性粒子を分離して、検体中の非特異反応を起こす物質を除くようにした検体の前処理方法が記載されている。【００１４】
また、特許文献２（特開平９−０８９８９３号公報）には、測定溶液中に添加するだけで、吸着物質を除去するか、または、吸着を阻害する、赤血球を担体とする間接凝集免疫測定用の非特異反応吸収試薬が開示されている。【００１５】
この非特異反応吸収試薬として、特許文献２では、デキストランの少なくとも６０％の水酸基が、硫酸エステル基で置換されたデキストラン化合物、または、その塩を用いることで、検体中の非特異反応の原因物質を除去する効果の高い非特異反応吸収試薬が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開平８−３２７６２９号公報
【特許文献２】特開平９−０８９８９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、このような特許文献１に記載される検体の前処理方法では、検体中の夾雑物を除去する効果は、未だ十分ではなく、上記のように、例えば、血清、血漿、全血、鼻腔液、腹腔液などの生体試料を検体として用いて、極微量のアナライトを検出する際、特に、センサーチップ表面への夾雑物の吸着によって、電場増強効果が大きく低下するリスクを有するＳＰＦＳ測定において適用するには十分ではなかった。【００１８】
すなわち、特許文献１では、特定の担体や抗体に吸収される特定の夾雑物は除去できるものの、その他の夾雑物は除去できず、この除去できなかった夾雑物が、固相支持体、リガンドおよびセンサーチップ表面等に非特異的に吸着してしまう場合があった。【００１９】
また、検査対象であるアナライトがごく僅かしか存在しない検体では、検体の前処理によってアナライトが磁性粒子とともに除去されてしまい、極微量のアナライトを検出することができない場合があった。【００２０】
一方、特許文献２の非特異反応吸収試薬では、非特異反応吸収試薬を測定溶液（検体）に添加するだけであるため、誤ってアナライトが測定前に除去されることは防止できるが、種々の夾雑物の付着を十分に防止できるものではなかった。【００２１】
従って、特許文献２の非特異反応吸収試薬でも、上記のように、例えば、血清、血漿、全血、鼻腔液、腹腔液などの生体試料を検体として用いて、極微量のアナライトを検出する際には、特に、センサーチップ表面への夾雑物の吸着によって、電場増強効果が大きく低下するリスクを有するＳＰＦＳ測定において適用するには十分ではなかった。【００２２】
本発明は、このような現状に鑑み、検体中の夾雑物が、固相支持体、リガンドなどに非特異吸着することを抑制し、アッセイブランクの増加を抑制することができる検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
すなわち、本発明は、下記［１］〜［１１］に示される検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法を提供する。【００２４】
[1]  重量平均分子量が２０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．００１〜５質量％含有することを特徴とする検体希釈用液。【００２５】
［２］  重量平均分子量が５０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．０１〜２質量％含有することを特徴とする[１]に記載の検体希釈用液。【００２６】
［３］  前記検体が生体試料であることを特徴とする［１］または［２］に記載の検体希釈用液。【００２７】
［４］  ｐＨ４〜９に調整されていることを特徴とする[１]から[３]のいずれかに記載の検体希釈用液。【００２８】
［５］  界面活性剤を含有することを特徴とする[１]から[４]のいずれかに記載の検体希釈用液。【００２９】
［６］  前記界面活性剤を、検体希釈用液に対して、０．００００１〜１質量％含有することを特徴とする[５]に記載の検体希釈用液。【００３０】
［７］  [１]から[６]のいずれかの検体希釈用液を含むことを特徴とする検体希釈用液のキット。【００３１】
［８］  [１]から[６]のいずれかに記載の検体希釈用液に検体を混合した混合液を、金属膜上に固相支持体が固定されたセンサーチップ上に供給した後、蛍光測定を行うことを特徴とする蛍光測定方法。【００３２】
［９］  前記混合液を供給した後、前記検体中のアナライトに結合する蛍光標識抗体を供給して洗浄した後、前記蛍光測定を行うことを特徴とする［８］に記載の蛍光測定方法。【００３３】
［１０］  前記固相支持体が、カルボキシメチルデキストランであることを特徴とする［８］または［９］に記載の蛍光測定方法。【００３４】
［１１］  前記蛍光測定を、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）、または、全反射ＡＴＲ蛍光法で行うことを特徴とする［８］から［１０］のいずれかに記載の蛍光測定方法。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、検体中の夾雑物が、固相支持体、リガンドなどに非特異吸着することを抑制し、アッセイブランクの増加を抑制することができる検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本発明に係る検体希釈用液と生体由来の検体を混合し、夾雑物の表面にカルボキシメチルデキストランが付着している状態を説明する模式図である。
【図２】図２は、図１の混合液が送液された蛍光測定装置のセンサーチップ表面の状態を説明する模式図である。
【図３】図３は、図２のセンサーチップ表面に、蛍光標識物質とコンジュゲートした蛍光標識抗体溶液を送液した後にレーザー光で照射している状態を説明する模式図で、本発明の一作用を説明する図である。
【図４】図４は、関連技術の検体希釈用液を用いて検体を処理し、この溶液と蛍光標識抗体溶液が送液されたセンサーチップ表面の状態を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいてより詳細に説明する。
１．検体希釈用液の調製
図１は、本発明に係る検体希釈用液を生体由来の検体と混合した溶液中を示しており、夾雑物の表面にカルボキシメチルデキストランが付着している状態を説明する模式図である。図２は、図１の混合液が送液されたセンサーチップ表面の状態を説明する模式図である。
【００３８】
本発明に係る検体希釈用液は、重量平均分子量が２０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを含むものであり、例えば、血清、血漿、全血、鼻腔液、腹腔液などの生体試料を検体として用いて稀釈した場合に、図１に示すように、夾雑物１の表面にこのカルボキシメチルデキストラン分子２が付着することになる。
【００３９】
すなわち、高感度イムノアッセイ測定においてセンサー（固相）表面は、中性または負電荷帯電の状態が一般的であるが、アニオン性糖鎖を有する所定の重量平均分子量のカルボキシメチルデキストランを所定の質量％で検体希釈用液や検体を含む溶液中で使用することで、カルボキシメチルデキストランと夾雑物１とが互いに吸着するだけでなく、図３に示すように、夾雑物１に吸着した状態のカルボキシメチルデキストランと、センサー表面とがともに負電荷であることによりクーロン斥力Ｆが作用し互いに反発し合うので、夾雑物１のセンサー（固相）表面への吸着をこのクーロン斥力Ｆにより好適に抑制することができる。
【００４０】
これにより、図２および図３の概略図に示したように、表面にカルボキシメチルデキストラン分子２が付着した夾雑物１は、固相支持体３、リガンド４などに非特異吸着しづらい。従って、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを効率良く抑制することができる。
【００４１】
このため、蛍光測定においては、夾雑物１を介して、蛍光標識抗体５が固相支持体３やリガンド４に付着することが抑制される（図３及び図４を対比して参照）。その結果、付着に起因する屈折率変化が低減し、夾雑物１やその付着物が電場増強効果に悪影響を及ぼすことが軽減され、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクが大きく増加することがなく、Ｓ／Ｂを向上することができる。これにより、特に、極微量なアナライト６の高感度且つ高精度なＳＰＦＳ測定を実現することができる。
【００４２】
一方、検体希釈用液中に含有されるカルボキシメチルデキストランの重量平均分子量が２０００００を下回ると、あるいは、検体希釈用液中に含有されるカルボキシメチルデキストランの重量平均分子量が２０００００〜１００００００の範囲内であっても、その含有量が０．００１質量％を下回る（検体処理時の終濃度では０．０００５質量％を下回る）と、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着することを抑制する効果が期待できず、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクが増加してしまう。
【００４３】
逆に、検体希釈用液中に含有されるカルボキシメチルデキストランの重量平均分子量が１００００００を超えると、あるいは、検体希釈用液中に含有されるカルボキシメチルデキストランの重量平均分子量が２０００００〜１００００００の範囲内であっても、その含有量が５質量％を超える（検体処理時の終濃度で２．５質量％を超える）と、検体希釈用液の粘度が高くなり過ぎて反応性が低下してしまう。
【００４４】
また、好ましくは、重量平均分子量が５０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して０．０１〜２質量％含有すること（終濃度０．００５〜１．００質量％では検体の処理に用いられること）が望ましい。
【００４５】
このような検体希釈用液によれば、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを抑制する効果がより期待できる上に、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクをより低減することができる。しかも、検体希釈用液の粘度が不必要に高くなるのを抑制し、反応性の低下をより軽減でき、Ｓ／Ｂをより向上することができる。
【００４６】
さらに、より好ましくは、重量平均分子量が５０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．１〜０．５質量％（検体処理時の終濃度では０．０５〜０．２５質量％）含有するのが望ましい。
【００４７】
このような検体希釈用液によれば、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを抑制する効果がさらにより期待でき、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクをより低減し、しかも、検体希釈用液の粘度が不必要に高くなるのをさらに抑制し、反応性の低下をさらに軽減でき、Ｓ／Ｂをさらに向上することができる。
【００４８】
また、本発明に係る検体希釈用液のｐＨは、４〜９であるのが望ましい。このように、検体希釈用液のｐＨが４〜９であれば、カルボキシメチルデキストラン分子２が負に帯電する約ｐＨ３．５より高いｐＨに維持されて、カルボキシメチルデキストラン分子２同士が相互に反発し、凝集することがないことから、保存安定性に優れ、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを高く抑制することができる。
【００４９】
さらに、例えば、検体中の夾雑物のうち生体中に存在するヒストンやリボソーム等の夾雑物は、ｐＨ７付近では正に帯電していることから、図２に示すように、蛍光測定前の検体の処理において、負に帯電したカルボキシメチルデキストラン分子２に夾雑物１が電気的に引き寄せられて吸着する。
【００５０】
そして、図３に示すように、蛍光測定の場面では、センサーチップ表面付近に存在し、負に帯電したリガンド４やリガンド４の固相支持体３などに対して、負に帯電したカルボキシメチルデキストラン分子２のクーロン斥力Ｆが作用して、夾雑物１がカルボキシメチルデキストラン分子２とともにリガンド４やリガンド４の固相支持体３などから引き離された状態に維持される。
【００５１】
この結果、夾雑物１がリガンド４やリガンド４の固相支持体３などへ非特異的に吸着することが効率良く抑制される。そして、アナライト６とリガンド４との特異的な反応が確保される。
【００５２】
また、センサーチップの表面の等電点測定を実施した際に、例えば、カルボキシメチルデキストランの固相支持体３を有する基板表面の等電点はｐＨ２〜３程度であった。
【００５３】
従って、このような場合に、検体希釈用液をｐＨ４以上とすることで、検体希釈用液中のカルボキシメチルデキストラン分子２の帯電状態をアニオン性に容易に保持し、その状態を有効に利用できるため好ましい。また、抗原抗体反応においてｐＨ９以下での反応条件とすることが一般的であり、その上限はｐＨ９以下とするのが好ましい。
【００５４】
なお、この場合、検体希釈用液の主成分としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ），ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）などを用いることができる。
【００５５】
また、本発明に係る検体希釈用液は、界面活性剤を含有するのが望ましい。界面活性剤を含有することによって、例えば夾雑物１が脂質の場合に界面活性剤が作用してミセルを形成等することから、検体中のアナライト６や夾雑物１の凝集を抑制することができる。この結果、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着することを抑制することができる。
【００５６】
この場合、界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、ＣＭＤと同じ帯電状態にしてクーロン斥力を利用する観点から、アニオン性界面活性剤が好ましく、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、モノアルキル硫酸塩、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩などが使用可能である。
【００５７】
この場合、界面活性剤は、検体希釈用液に対して、０．００００１〜１質量％含有されていること（終濃度０．０００００５〜０．５質量％で検体の処理に用いられること）が望ましい。
【００５８】
これにより、検体中のアナライト６や夾雑物１の凝集を好適に抑制することができる。また、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを抑制することができる。しかも、反応性の低下をより効果的に軽減することができる。
【００５９】
また、本発明に係る検体希釈用液は、生体試料を検体とする検体希釈用液であることが望ましい。
【００６０】
このように、例えば、血清、血漿、全血、鼻腔液、腹腔液などの生体試料を検体とする検体希釈用液であれば、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着することを効率良く抑制することができる。
【００６１】
また、本発明に係る蛍光測定方法は、検体希釈用液に検体を混合した混合液を、金属薄膜７上に固相支持体３が固定されたセンサーチップ上に供給した後、蛍光測定を行うことを特徴とする。
【００６２】
このように、検体希釈用液に検体を混合した混合液を用いることによって、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを効率良く抑制することができ、その結果、アッセイブランクの増加を抑制し検出対象のアッセイシグナル（Ｓ）とアッセイブランクシグナル（Ｂ）との比であるＳ／Ｂ（ＳＮ比）が向上した蛍光測定を行うことができる。
２．蛍光測定方法について
本発明に係る蛍光測定方法では、上記のように調製した検体希釈用液に検体を混合した混合液を、金属薄膜７上に固相支持体３が固定されたセンサーチップ上に供給する。その後、検体中のアナライト６に結合する蛍光標識抗体５を供給して洗浄した後、蛍光測定を行うようにすれば良い。
【００６３】
また、本発明に係る蛍光測定方法は、前記混合溶液を供給した後、検体中のアナライト６に結合する蛍光標識抗体５を供給して洗浄した後、蛍光測定を行うのが望ましい。このように、検体中の夾雑物１が、リガンド４やリガンド４の固相支持体３などに非特異吸着するのを高く抑制することができ、その結果、アッセイブランクの増加を抑制しＳ／Ｂ（ＳＮ比）が向上し、極微量のアナライト６を高感度で、かつ高精度に測定できる。
２−１．センサーチップの作製
この場合、センサーチップは、誘電体部材８の上面に、金属薄膜７を形成したものである（図２および図３参照）。誘電体部材８としては、特に限定されるものではないが、光学的に透明な、例えば、ガラス、セラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性、光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むのが好ましい。
【００６４】
また、誘電体部材８の材質は、少なくとも励起光に対して光学的に透明な材料から形成されていれば、その材質は、上記のように特に限定されないが、安価で取り扱い性に優れるセンサーチップを提供する上で、例えば、樹脂材料から形成されていることが好ましい。
【００６５】
誘電体部材８を樹脂材料から形成する場合は、例えば、
・ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、
・ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、
・環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、
・ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、
・ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、
ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
【００６６】
また、金属薄膜７の材質としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これら金属の合金から構成しても良い。
【００６７】
すなわち、このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するように、表面プラズモン光（粗密波）による電場増強が大きくなるので、金属薄膜７として好適である。また、金属薄膜７の形成方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易であるので望ましい。
【００６８】
さらに、金属薄膜７の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、および、それらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
【００６９】
なお、電場増強効果の観点からは、金属薄膜７の厚さは、より好ましくは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、および、それらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
【００７０】
金属薄膜７の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモン光（粗密波）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜７であれば、大きさ（縦×横）の寸法、形状は、特に限定されない。
２−２．リガンドの固相支持体の固定
２−２−１  ＳＡＭの形成
この誘電体部材８の金属薄膜７の上面に、リガンド４の固相支持体３が固定される（図２および図３参照）。
【００７１】
この固相支持体３を固定化する足場として、誘電体部材８の金属薄膜７上に、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）が形成されるのが望ましい（図示省略）。
【００７２】
ＳＡＭは、固相支持体３を固定化する足場として、また、ＳＰＦＳ用センサーチップを蛍光測定方法に用いた場合に、蛍光分子の金属消光を防止する目的で、誘電体部材８の金属薄膜７とは接していない、センサーチップもう一方の表面、すなわち金属薄膜７に対して誘電体部材８とは反対側の金属薄膜７の表面に形成される。
【００７３】
ＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。
【００７４】
炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭが、透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有しており、光学的な影響が少ないので好適である。
【００７５】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、誘電体部材８の金属薄膜７の表面に、マスク材からなる層が形成されたものを、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。
【００７６】
このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄薄膜７の表面上で自己組織化し、ＳＡＭが形成される。また、ＳＡＭを形成する代わりに「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよい。
【００７７】
この場合、スペーサ層は、有機物とケイ素から構成される化合物で、分子中に２種以上の異なった反応基を持つシランカップリング剤などを用いて形成することが好ましい。シランカップリング剤としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ-ＯＨ〕を与えるエトキシ基またはメトキシ基を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有する分子が特に利用できる。
２−２−２  固相支持体の固定
このように誘電体部材８の金属薄膜７上にＳＡＭが形成された後、ＳＡＭの金属薄膜７とは接していないもう一方の表面にリガンド４の固相支持体３が固定される（図２および図３参照、一部不図示）。
【００７８】
この固相支持体３は、図２および図３に示したように、３次元構造を有するものであることが望ましい。この場合、「３次元構造」とは、後述するリガンド４の固定化を、センサーチップ表面（およびその近傍）の２次元に限定することなく、センサーチップ表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相支持体３の構造をいう。
【００７９】
このような固相支持体３は、特に限定されるものではないが、例えば、
・グルコース、カルボキシメチル化グルコース、
・ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、
・オレフィン類、スチレン類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類、
・それぞれに包含される単量体、からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましい。
【００８０】
さらに、例えば、
・デキストラン、デキストラン誘導体などの親水性高分子、
・ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、
・オレフィン類、スチレン類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類、
・それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子、
を含むことがより好ましい。
【００８１】
また、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）が、生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。この場合、ＣＭＤの分子量は、１ｋＤａ以上５０００ｋＤａ以下が好ましく、４ｋＤａ以上１０００ｋＤａがより好ましい。
【００８２】
このように、固相支持体３が、カルボキシメチルデキストランであれば、アナライト６を捕捉するための抗体を高密度に固定化でき、極微量のアナライト６を高感度で、かつ高精度に測定できる。また、検体希釈用液に含有されたカルボキシメチルデキストランとの帯電特性おける相互作用を有効に利用できる。
【００８３】
また、固相支持体３（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として、２ｎｇ／ｍｍ2未満を有することが好ましい。この場合、固相支持体３の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。
【００８４】
このような高分子が、ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、ＳＰＦＳ用センサーチップを蛍光測定方法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
２−３  リガンドの固定
このように誘電体部材８の金属薄膜７上にＳＡＭおよび固相支持体３を形成した後、リガンド４が、固相支持体３に固定化される（図２および図３参照）。
【００８５】
すなわち、リガンド４が、固相支持体３の３次元構造の中に分散して固定化され、例えば、ＳＰＦＳ用センサーチップを蛍光測定方法に用いた際に、検体中のアナライト６を固定（捕捉）させる目的で用いられる（図２および図３参照）。
【００８６】
このような「分子」または「分子断片」としては、特に限定されるものではなく、例えば、
・核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、
・タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、
・アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、
・糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、
・脂質、
・これらの修飾分子、複合体
などが挙げられる。
【００８７】
この場合、タンパク質としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００８８】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。このリガンド４の固定化方法としては、例えば、以下の方法が使用できる。
・カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化する。
【００８９】
そして、このように活性エステル化したカルボキシル基と、リガンド４が有するアミノ基とを、水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法、
・ＳＡＭが有するカルボキシル基を、上述のようにしてリガンド４が有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法、
などが挙げられる。
【００９０】
なお、固相支持体３の中および外面に固定化されたリガンド４の密度は、１フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１ナノｍｏｌ／ｃｍ2以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ2以下がより好ましい。すなわち、リガンド４の密度が上記範囲内であると、信号強度が大きくなるために望ましい。
２−４．試料溶液の調製
上記のように調製した検体希釈用液に検体を混合した試料溶液（混合液）を調製する。
【００９１】
なお、ここで用いられる試料溶液は、検体を用いて調製された溶液であり、例えば、検体と試薬とを混合して検体中に含有されるアナライト６に、蛍光物質を結合させるための処理をしたものが挙げられる。
【００９２】
このような検体としては、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液が好ましい。
【００９３】
また、検体中に含有されるアナライト６は、例えば、
・核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、
・タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、
・アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、
・糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、
・脂質、
・これらの修飾分子、複合体
などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
２−５．試料溶液とセンサーチップとの接触
このように調製した試料溶液を、上記のように誘電体部材８の金属薄膜７上にＳＡＭ、リガンド４の固相支持体３が固定されたセンサーチップと接触させる（図２参照）。
【００９４】
この場合、接触方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、センサーチップ上に流路を形成して試料溶液を送液して接触させる方法や、センサーチップ上にウェルを形成してこのウェル内に試料溶液を供給する方法などを採用することができる。
【００９５】
なお、送液の場合には、送液中の検体中に含有されるアナライト６の初期濃度は、１００μｇ／ｍｌ〜０．００１ｐｇ／ｍｌであってもよい。また、送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍｌ、好ましくは０．１〜１ｍｌである。さらに、送液の流速は、通常１〜２,０００μｌ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μｌ／ｍｉｎである。
２−６洗浄工程
このように試料溶液を、誘電体部材８の金属薄膜７上にＳＡＭ、リガンド４の固相支持体３が固定されたセンサーチップと接触させた後（図２参照）、センサーチップの表面を洗浄する。
【００９６】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に、Ｔｗｅｅｎ２０(モノ-9-オクタデカノエート ポリ（オキシ-１，２-エタンジイル）の誘導体)，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を溶解させ、好ましくは、界面活性剤を０．００００１〜１重量％含有するもの、
・塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０〜５００ｍＭ含有するもの
などが望ましい。
【００９７】
また、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌで、ｐＨが１．５〜４．０のものであってもよい。洗浄液を送液する場合には、循環させる温度および流速は、上記の試料溶液を循環させる温度および流速と同じであることが好ましい。なお、洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
２−７．蛍光標識抗体溶液とセンサーチップとの接触
２−７−１  蛍光標識抗体の作製
蛍光標識抗体５は、蛍光物質とコンジュゲートされた抗体である（図３参照）。
蛍光標識抗体５の作製方法としては、
・例えば、蛍光物質にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法、
・イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する抗体と蛍光物質とを反応させ固定化する方法、
・スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体と蛍光物質とを反応させ固定化する方法、
・ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する抗体と蛍光物質とを反応させ固定化する方法、
・あるいは、ビオチン化された蛍光物質とストレプトアビジン化された抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光物質とビオチン化された抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００９８】
また、蛍光物質とは、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、蛍光は、燐光など各種の発光も含む。本発明で用いられる蛍光物質は、金属薄膜７による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光物質のいずれであってもよい。
【００９９】
一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルターを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光物質が好ましい。
【０１００】
このような蛍光物質としては、
・例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光物質（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、
・ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光物質（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、
・ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光物質（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、
・クマリン・ファミリーの蛍光物質（インビトロジェン（株）製）、
・ローダミン・ファミリーの蛍光物質（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）、
・シアニン・ファミリーの蛍光物質、
・インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光物質，オキサジン・ファミリーの蛍光物質、
・チアジン・ファミリーの蛍光物質，スクアライン・ファミリーの蛍光物質、
・キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光物質，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）
・ファミリーの蛍光物質（インビトロジェン（株）製）、
・ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光物質、
・ピレン・ファミリーの蛍光物質、
・トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光物質、
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）
などが挙げられる。
【０１０１】
さらに、米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光物質も本発明で用いることができる。
【０１０２】
また、本発明に使用可能な蛍光物質は、上記有機蛍光物質に限られない。例えばＥｕ，Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光物質も、本発明に用いられる蛍光物質となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光物質の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【０１０３】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜７に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光物質を用いることが望ましい。
【０１０４】
例えば、金属薄膜７として金を用いる場合には、金属薄膜７による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光物質を使用することが望ましい。
【０１０５】
従って、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７などの近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光物質を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光物質を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。
【０１０６】
一方、金属薄膜７として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光物質を使用することが望ましい。なお、これら蛍光物質は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
２−７−２  蛍光標識抗体溶液とセンサーチップとの接触
試料溶液とセンサーチップとを接触させてセンサーチップ上のリガンド４にアナライト６を結合させる（図２参照）。そして、このセンサーチップに対して、蛍光標識抗体５を含む溶液を接触させて蛍光標識抗体５をアナライト６に結合させる（図３参照）。この工程は、好ましくは上記洗浄工程の後に行われる。また、この工程に続いて、さらに上記洗浄工程を行うことがより好ましい。
【０１０７】
蛍光標識抗体溶液をセンサーチップに送液して蛍光標識抗体５をアナライト６に結合させる際に、送液する蛍光標識抗体溶液の濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ以上、１０，０００μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、１μｇ／ｍｌ以上、１，０００μｇ／ｍｌ以下であることがより好ましい。
【０１０８】
また、蛍光標識抗体溶液を送液する際の好ましい流速は、試料溶液の送液の場合と同様である。
２−８．蛍光測定
このようにして得られたセンサーチップに、誘電体部材８の、金属薄膜７を形成していないもう一方の表面（図２において誘電体部材８の下面）から、プリズムを経由して励起光としてのレーザー光９を照射し（図３参照）、励起された蛍光物質から発光された蛍光量を測定する。
【０１０９】
本発明に係る蛍光測定方法で用いる光源は、金属薄膜７にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザー光を光源として用いることが好ましい。
【０１１０】
レーザー光９は、光学フィルター、集光レンズなどを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。レーザー光９の照射により、減衰全反射（ＡＴＲ）の条件において、金属薄膜７の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光物質を励起する。
【０１１１】
なお、電場増強効果によるフォトン増加量は、誘電体部材８の屈折率、金属薄膜７の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。蛍光物質は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１１２】
また、用いるレーザー光９としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ，０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ；波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜７に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。），０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザーなどが挙げられる。
【０１１３】
なお、「プリズム」は、各種フィルターを介したレーザー光９が、ＳＰＦＳ用センサーチップに効率よく入射することを目的としており、屈折率が誘電体部材８と同じであることが好ましい。
【０１１４】
本発明は、減衰全反射の条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の誘電体部材」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１１５】
なお、「光学フィルター」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルター、偏光フィルター、カットフィルター、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。この場合、「減光（ＮＤ）フィルター」（または、中性濃度フィルター）は、入射レーザー光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１１６】
また、「偏光フィルター」は、レーザー光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。さらに、「カットフィルター」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、ＳＰＦＳ用センサーチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ，および蛍光物質の自家蛍光を除去するフィルターであって、例えば、干渉フィルター，色フィルターなどが挙げられる。
【０１１７】
また、「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１１８】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１１９】
このようにして得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出するようになっている。より具体的には、既知濃度の標的抗原、または、標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて、被測定検体中のアナライト（標的抗原量もしくは標的抗体）量を測定シグナルから算出する。
【実施例】
【０１２０】
[実施例１]
１．センサーチップの作製
屈折率（ｎd）１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の誘電体部材８（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、この支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した。【０１２１】
その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。このようにして得られた基板を、１ｍＭに調製した１０−アミノ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍｌに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。この基板を、エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。【０１２２】
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を１ｍｇ／ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水（ＭＥＳ）（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。【０１２３】
次に、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ｃＴｎＩ  ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＦ４；２．５μｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）溶液に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに１次抗体を固相化した。
２．試料溶液の調製
心筋トロポニン（ｃＴｎ）をまったく含まない血清に対して、標準抗原である心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を、検体希釈用液による希釈後（２倍希釈）の最終濃度が１００ｐｇ／ｍｌとなるように添加し、これを評価検体（試料溶液）とした。なお、アッセイシグナルは、標準抗原ｃＴｎＩを添加し、最終濃度が１００ｐｇ／ｍｌとした。【０１２４】
また、検体希釈用液中の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）は、０．０５質量％（検体希釈用液に対して）添加し、検体希釈用液の主溶液としては、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いた。【０１２５】
さらに、このように調製した試料溶液については、重量平均分子量が、それぞれ、
・１００００（「ＣＭＤ−Ｌ（商品名）」名糖産業株式会社製）、
・４００００（「ＣＭＤ−Ｄ４０（商品名）」名糖産業株式会社製）、
・２０００００（「ＣＭＤ−ＧＨ（商品名）」名糖産業株式会社製）、
・５０００００（「ＣＭＤ−５００（商品名）」名糖産業株式会社製）、
・１００００００（「ＣＭＤ（商品名）」名糖産業株式会社製）、
のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を含む検体希釈用液について、質量％を０〜１０の間で変更した試料溶液を準備した。【０１２６】
また、重量平均分子量が１０００００のデキストランを含む検体希釈用液について、質量％を０〜１０の間で変更した試料溶液を比較として準備した。
３．蛍光標識抗体溶液の調製
蛍光標識抗体５として、抗ｃＴｎＩ  ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（４Ｃ２；２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）の溶液とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）標識キットを用い、キット使用方法の手順に従い、室温（２５℃）で６０分間、攪拌混合することで反応させた。その後、分子量カットフィルター（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ｃＴｎＩ  ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を得た。こうして、蛍光物質で標識された抗体を含む溶液（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）を準備した。
４．蛍光測定
上述のようにして得られた各試料溶液および蛍光標識抗体溶液を個々のセンサーチップに送液してそれぞれに蛍光測定を行った。【０１２７】
個々の蛍光測定に共通する測定手順としては、次のようにして行った。まず、センサーチップの流路に、試料溶液０．１ｍｌを２５分間循環送液し、その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を１０分間循環送液して洗浄した。【０１２８】
次に、蛍光標識抗体溶液０．１ｍｌを５分間循環送液し、その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを１０分間循環送液して洗浄した。その後、プラズモン励起センサーに、ガラス製の誘電体部材８の、金属薄膜７を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザー光９（６４０ｎｍ，４０μＷ）を照射し、励起された蛍光物質から発光された蛍光量を光電子増倍管（ＰＭＴ）で検出した光量（シグナル値）を計測し、標準抗原を含む試料溶液毎のアッセイシグナルとした。【０１２９】
また、標準抗原である心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含まない試料溶液について、同様に計測し、アッセイブランクを測定した。このようにして得られた結果を、下記の表２に示した。【０１３０】
なお、表２中、ＣＭＤ添加効果判定については、
×…Ｓ／Ｂ効果％が１３０未満、
△…Ｓ／Ｂ効果％が１３０〜２１０
○…Ｓ／Ｂ効果％が２１０〜４００、
◎…Ｓ／Ｂ効果％が４００以上、
で判定した。【０１３１】
【表２】
2013042603.tif 000004
【０１３２】
この表２の結果から明らかなように、デキストランを添加した場合には、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクが大きく増加し、極微量なアナライト６の高感度且つ高精度なＳＰＦＳ測定の障害となってしまう。【０１３３】
これに対して、本発明に係る実施例ように、重量平均分子量が２０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．００１〜５質量％含有すること、即ち終濃度０．０００５〜２．５重量％で検体の処理に用いられることが、蛍光測定のバックグランドノイズであるアッセイブランクが大きく増加することがなく、アッセイブランクの増加を抑制しＳ／Ｂ（ＳＮ比）が向上した蛍光測定を行うことができることが分かる（表２中、△〜◎の範囲参照）。【０１３４】
また、この場合、好ましくは、重量平均分子量が５０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．０１〜２質量％含有すること、即ち終濃度０．００５〜１質量％で処理に用いられることが望ましいことが分かる（表２中、○〜◎の範囲参照）。【０１３５】
さらに、より好ましくは、重量平均分子量が５０００００〜１００００００であるカルボキシメチルデキストランを、検体希釈用液に対して、０．１〜０．５質量％含有すること、即ち終濃度０．０５〜０．２５質量％で検体の処理に用いられることが望ましいことが分かる（表２中、◎の範囲参照）。【０１３６】
[実施例２]
界面活性剤が、非特異吸着を抑制する効果、アッセイブランクの増加を抑制する効果を確かめるために下記の試験を行った。界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０を、０．０２５質量％添加した時と、未添加の条件で、試験を実施例１と同様にして行った。【０１３７】
カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）の重量平均分子量が、１００，０００以上の系において、ＣＭＤ濃度を０．２５質量％とした。その結果、アッセイシグナルに有意差は見られず、アッセイブランクが、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０２５質量％添加した条件で、低値化する傾向が確認できた。【０１３８】
なお、下記の表３のように、各条件のＮ＝３の平均で評価した。【０１３９】
【表３】
2013042603.tif 000005
【０１４０】
以上、本発明に係る好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例１、２では、蛍光測定方法として、ＳＰＦＳ測定について説明したが、これ以外であっても、例えば、全反射ＡＴＲ（Attenuated Total Reflection）蛍光法などの蛍光測定方法を用いることができるなど本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。【０１４１】
例えば、本発明に係る検体希釈用液と、検体希釈用液とともに用いられる他の試薬（例えば、検体の希釈に関連した試薬や上記蛍光測定方法に用いられる試薬等）とをセットにした試薬のキットとすることができる。【０１４２】
検体希釈用液とともに用いられる他の試薬のうち、上記蛍光測定方法に用いられる試薬としては、例えば、蛍光標識抗体溶液、洗浄液が挙げることができる。【０１４３】
一方、検体希釈用液とともに用いられる他の試薬のうち、検体の希釈に関連した試薬としては、界面活性剤が挙げられる。この界面活性剤としては、上述した検体希釈用液中に含めることが可能な界面活性剤や、その他にも、例えばDNAや蛋白質の電気泳動などに用いられる下記の界面活性剤が挙げることができる。後者の界面活性剤の具体例としては、
・Briji 35（登録商標、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル、Polyethylene Glycol Monododecyl Ether）、
・ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（Dodecyl-β-D-maltoside）、
・オクチル−β−Ｄ−グルコシド（Octyl-β-D-glucoside）、
・ノニデット（登録商標）P−40（ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル）、
・Triton X-100（登録商標）（ポリエチレングリコールモノ-P-イノクチルフェニルエーテル、Polyoxyethylene(10)Octylphenyl Ether）、
・Tween 20（登録商標）（mono-9-octadecanoate poly(oxy-1,2- ethanediyl)の誘導体）、
・CHAPS（登録商標）（（３−[３−コラミドプロピル]ジメチルアミノ）プロパンスルホン酸、3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate）、
・ツビッタージェント3-12(Zwittergent 3-12, ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)、
・SDS（ドデシル硫酸ナトリウム、sodium dodecyl sulfate)、これらの試薬に類するもの
を挙げることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）、全反射ＡＴＲ（Attenuated Total Reflection）蛍光法などの蛍光測定方法を用いて、生体試料を検体として用いて、極微量のアナライト６を検出する際に、検体を希釈するための検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法に適用することができる。
【符号の説明】
【０１４５】
１     夾雑物
２     カルボキシメチルデキストラン分子
３     固相支持体
４     リガンド
５     蛍光標識抗体
６     アナライト
７     金属薄膜（金属膜）
８     誘電体部材
９     レーザー光（励起光）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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