(57)【要約】  本発明は、インフルエンザ重症化の治療薬又は予防薬を提供することを目的とし、具体的には新規ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ４（ＰＤＫ４）阻害剤を提供することを目的とする。本発明は、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つで表わされる化合物はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＤＫ４阻害剤、医薬組成物、又は化粧品組成物に関する。【選択図】  なし2013153821.tif 000018
2013153821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つで表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＤＫ４阻害剤：
【化１】
2013153821.tif 000009
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化２】
2013153821.tif 000010
［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示し、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化３】
2013153821.tif 000011
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つで表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物：
【化４】
2013153821.tif 000012
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化５】
2013153821.tif 000013
［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示し、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化６】
2013153821.tif 000014
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項３】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、インフルエンザ感染後の重症化である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、食欲不振である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、ミトコンドリア病、又はＡＴＰ産生の低下を伴う疾患又は障害である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、糖尿病である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、癌である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つで表わされる化合物、又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を配合してなる化粧品組成物：
【化７】
2013153821.tif 000015
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化８】
2013153821.tif 000016
［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示すい、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化９】
2013153821.tif 000017
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ４（以下「ＰＤＫ４」という）を阻害する化合物及びその薬理学的に許容されるエステル誘導体並びにそれらの薬理学的に許容される塩に関する。また、本発明はＰＤＫ４の発現又は活性化が発症若しくは増悪化に関与する疾患群の、治療法又は予防法に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ感染後の重症化、食欲不振、ミトコンドリア病、又はＡＴＰ産生の低下を伴う疾患又は障害、糖尿病、又は癌の治療薬又は予防薬、あるいはその治療方法又は予防方法に関する。更に、本発明は、新規のＰＤＫ４を阻害する化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を含有する化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
健常な成人がインフルエンザウイルスに感染しても大事には至らずに回復し、感染したウイルスに対する免疫が獲得される。しかし、高齢者や小児がインフルエンザウイルスに感染すると多臓器不全（ＭＯＦ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）やインフルエンザ脳症（ＩＡＥ：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）を来すことがあり、死に至るケースも稀ではない。最近ではインフルエンザウイルスに感染した患者にノイラミニダーゼ阻害剤などの１９９０年代後半に開発された抗ウイルス薬が投与されている。しかし、２０１２年に臨床試験データの大規模解析からオセルタミビル（タミフル）およびザナミビル（リレンザ）などの投与により、初期症状の軽減（インフルエンザの症状が１日ほど早く収まる効果）は確認されたが、感染後の重症化を防ぐ効果は確認できないとする報告書が発表されている。（非特許文献１）【０００３】
ミトコンドリアに局在するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」という）は糖代謝の制御に重要な酵素であり、ＰＤＫによるリン酸化により不活化される。ヒトやマウスでは４種のＰＤＫアイソザイム（ＰＤＫ１−４）が存在する。ＰＤＫ４が糖尿病及び癌の発症、増悪化にも関与していることが知られている（非特許文献２及び３参照）。癌や糖尿病でＰＤＫの過剰発現によるＰＤＨの低下が起きていることからＰＤＫ阻害剤は癌や糖尿病の薬剤の分子標的として注目され、探索が行われてきた。【０００４】
しかし、これまでＰＤＫ４を１００μＭ以下のＩＣ５０で阻害できる化合物は見出されていない。例えばＡＺＤ７５４５、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ３ｒなどはＰＤＫのアイソザイム１，２及び３をサブμＭオーダーのＩＣ５０で阻害するが、ＰＤＫ４は逆に活性を促進することが報告されている。ＰＤＫ４はＰＤＫ１−３と異なり準活性化状態で存在しており、このことがＰＤＫ４阻害剤の開発を困難にしている一因と考えられている。またＰＤＫ４の阻害剤として報告されているジクロル酢酸は阻害活性が弱く、また神経毒性など副作用が大きいため、医薬として使用することができなかった（非特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ：  １８  ＪＡＮ  ２０１２  ＤＯＩ：１０．１００２／１４６５１８５８．ＣＤ００８９６５．ｐｕｂ３
【非特許文献２】Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１：１２８：１００１−１００８
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．（２００９）４２３：２４３−２５２
【非特許文献４】Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００８）２８３：２５３０５−２５３１５
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、従来の化合物よりも阻害活性の強い新規のＰＤＫ４を阻害する化合物を提供することを目的とする。
【０００７】
発明者の木戸らはインフルエンザ重症化の発症機序を解析し、ＩＡＥやＭＯＦを併発する患者では、ウイルス感染によって末梢血中のアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」という）レベルが低値を示すこと、及び、ミトコンドリアの脂肪酸代謝酵素（Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２：ＣＰＴ２）に温度感受性の遺伝子多型が存在することを報告してきた（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００７）２９９：８５−９２；Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ（２００８）２９：７１８−２７）。本発明者らは、さらに、３週齢のマウスにインフルエンザウイルスを感染させてミトコンドリアのエネルギー産生系遺伝子の発現量の網羅的解析を行った結果、インフルエンザウイルス感染後、サイトカイン産生の上昇、発熱に伴いＰＤＫ４遺伝子の発現誘導が起こることを見出した。これらの研究結果から、インフルエンザ感染患者が重症化するときに、急性のミトコンドリア機能の活性低下による全身性のＡＴＰの枯渇があり、ＰＤＫ４阻害剤によりこの急性重症化を防止できると推定した。
【０００８】
発明者の中野、大村らは１９８０年代から蛋白リン酸化酵素の阻害剤（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ：ＰＫ）、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅおよびその関連物質などを見出してきた（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（２００９）６２：１７−２６）。そこで本発明者らは、上記木戸らの推定に基づき、インフルエンザ感染患者の重症化防止の新規薬剤を提供するために新たなＰＤＫ４阻害剤の探索を行った。ＰＤＫはＳｅｒ／Ｔｈｒ  ｋｉｎａｓｅであるが、強力な汎Ｋｉｎａｓｅ阻害剤として知られているＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅでは全く阻害されない。ＰＤＫ４のＡＴＰ結合部位の構造を解析した結果、ＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅはＰＤＫ４のＡＴＰ結合部位に入れないことが明らかとなった。そこで、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅより小さい分子の天然物を中心に、ＰＤＫ４をμＭオーダーで阻害する化合物を探索した結果、本発明の化合物を見出した。本発明の化合物について、インフルエンザ感染マウスモデルを用いて実験した結果、食欲不振、体重減少等の重症化や死亡を抑制する作用を有することを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
また、上述の通り、インフルエンザ感染患者が重症化した場合、ＰＤＫ４遺伝子の発現の誘導の他、ウイルス感染によって末梢血中のＡＴＰレベルが低値を示すこと、ミトコンドリアの脂肪酸代謝酵素（ＣＰＴ２）に温度感受性の遺伝子多型が存在することから、本発明のＰＤＫ４阻害剤は、ＣＰＴ又はミトコンドリアＡＴＰ産生酵素群に変異を持つ疾患の治療にも有用であると考えられる。
【００１０】
更に、インフルエンザ感染患者の重症化防止や食欲不振の改善に加えて、ＰＤＫ４が糖尿病及び癌の発症、増悪化にも関与していることが上述の通り知られている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）１２８：１００１−１００８；及びＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００９）４２３：２４３−２５２参照）ことから、本発明のＰＤＫ４阻害剤はこれらの疾患の治療にも有用であると考えられる。
【００１１】
よって、本発明は、インフルエンザ重症化の治療薬又は予防薬を提供することを目的とする。また、本発明は、別の態様において、新規ＰＤＫ４阻害剤を提供することを目的とする。更に、本発明は、新規ＰＤＫ４阻害剤を有効成分とする、ミトコンドリア機能および食欲不振の改善、癌あるいは糖尿病などの疾患の治療薬、代謝改善による化粧品を提供することを課題とする。
【００１２】
よって、一態様において、本発明は、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つで表わされる化合物（以下、総称して「本発明の化合物」という）又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＤＫ４阻害剤、医薬組成物、又は化粧品組成物に関する：
【００１３】
【化１】
2013153821.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【００１４】
【化２】
2013153821.tif 000004
［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示し、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【００１５】
【化３】
2013153821.tif 000005
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【００１６】
具体的には、前記医薬組成物は、ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬である。より具体的には、これに限定されるものではないが、ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害には、インフルエンザ感染後の重症化、食欲不振、ミトコンドリア病、又はＡＴＰ産生の低下を伴う疾患又は障害、糖尿病、又は癌が含まれる。
【００１７】
本明細書において、「直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基」とは、直鎖又は分岐状の炭素数が１〜６個の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２，３−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、及びシクロヘキシル基などが挙げられ、好ましくは、Ｃ１〜５アルキル基であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、又は２，３−ジメチルプロピル基である。更に好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、及びイソブチル基である。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ７〜Ｒ１１における直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基として、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基（例えば、ｎ−プロピル基）であり、より好ましくは、メチル基である。Ｒ５及びＲ６における直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基として、好ましくは、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、及びイソブチル基であり、より好ましくは、ｉ−プロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、及びイソブチル基であり、最も好ましくは、ｉ−プロピル基である。例えば、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、メチル基、エチル基、又はプロピル基（例えば、ｎ−プロピル基）（好ましくは、メチル基）を示し、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、及びイソブチル基（好ましくは、ｉ−プロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、及びイソブチル基、より好ましくは、ｉ−プロピル基）である。また、一般式（ＩＩ）において、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、メチル基、エチル基、又はプロピル基（例えば、ｎ−プロピル基）（好ましくは、メチル基）を示し、Ｒ９はメチル基、エチル基、又はプロピル基（例えば、ｎ−プロピル基）（好ましくは、メチル基）を示す。一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、メチル基、エチル基、又はプロピル基（例えば、ｎ−プロピル基）（好ましくは、メチル基）を示す。
【００１８】
好ましい態様において、本発明の一般式（ＩＩ）で表わされる化合物は、以下の（ＩＩ−ａ）又は（ＩＩ−ｂ）で表わされる。下記一般式（ＩＩ−ａ）及び（ＩＩ−ｂ）においては、実線と破線で表わされる結合が二重結合を示す場合、Ｒ８は存在しない。
【００１９】
【化４】
2013153821.tif 000006
【００２０】
また、好ましい態様において、本発明の一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、以下の（ＩＩＩ−ａ）で表わされる。
【００２１】
【化５】
2013153821.tif 000007
【００２２】
特に、本願発明者らは、酵素阻害実験や動物実験において、それぞれ以下の式で表わされるＫＩＳ７、ＫＩＳ２８、ＫＩＳ３７、ＫＩＳ１１６、及びＫＩＳ２４がＰＤＫ４を阻害し、急性のインフルエンザ重症化を防止する強い活性があることが確認した。
【００２３】
【化６】
2013153821.tif 000008
【００２４】
本発明の化合物は、上記化合物の他、これらの化合物の薬理学的に許容されるエステル誘導体を包含する。ここで、「薬理学的に許容されるエステル誘導体」は、生体内において代謝されて、本願発明の化合物を与える基を含む化合物であって、医薬として体内に投与することが許容可能なエステルのことである。本明細書において、エステルは、エステル結合した化合物の他、アミド結合した化合物を含む。エステルは、生体内のエステラーゼにより分解されて活性型の化合物を与えてもよい。例えば、エステルとしては、置換され又は置換されていない、低級アルキルエステル、低級アルケニルエステル、低級アルキルアミノ低級アルキルエステル、アシルアミノ低級アルキルエステル、アシルオキシ低級アルキルエステル、アリールエステル、アリール低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、水酸化アミドを挙げることができる。エステルとして、好ましくは、プロピオオン酸エステル又はアシルエステルである。また、本明細書において「一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表わされる化合物」又は「本発明の化合物」とは、それが明らかに適さない場合を除き、明示されていない場合にも、それぞれ、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表わされる化合物又は本発明の化合物の薬理学的に許容されるエステル誘導体をも含む。
【００２５】
本明細書において「薬理学的に許容される塩」とは、本発明の化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体が、無機又は有機の塩基又は酸と結合して形成した塩であって、医薬として体内に投与することが許容可能な塩のことである。このような塩は、例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９（１９７７）等に記載されている。塩としては、例えば、カルボン酸基等の酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。なお、本発明の化合物の水和物又は溶媒和物及び本発明の化合物の薬理学的に許容される塩の水和物又は溶媒和物も本発明の化合物に包含される。また、本明細書において「一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表わされる化合物」又は「本発明の化合物」とは、それが明らかに適さない場合を除き、明示されていない場合にも、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体の薬理学的に許容される塩、水和物及び溶媒和物、並びに一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体の薬理学的に許容される塩の水和物又は溶媒和物、又は本発明の化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体の薬理学的に許容される塩、水和物及び溶媒和物、並びに本発明の化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体の薬理学的に許容される塩の水和物又は溶媒和物をも含む。
【００２６】
本発明の化合物は不斉炭素を有することがあることから、光学異性体が存在することがある。本発明の化合物としては、右旋性（＋）又は左旋性（−）の何れの化合物であってもよいし、ラセミ体などのこれらの異性体の混合物であってもよい。また、本発明の化合物は、特に断らない限り、いずれの互変異性体、又は幾何異性体（例えば、Ｅ体、Ｚ体など）も含むものである。
【００２７】
本明細書において、ＰＤＫ４阻害剤とは、ＰＤＫ４の阻害を目的として使用される薬剤であれば特に限定されない。好ましくは、本発明のＰＤＫ４阻害剤は医薬組成物として提供されるものである。そのような医薬組成物は、ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療又は予防用とすることができる。ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害としては、例えば、インフルエンザ感染後の重症化（インフルエンザ感染後の体重減少、摂食障害、及び／又は摂水障害を含む）、食欲不振、ミトコンドリア病、ＡＴＰ産生の低下を伴う疾患又は障害、糖尿病、又は癌を挙げることができる。ここで、ミトコンドリア病とは、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素群に変異を有することに基づく疾患又は障害のことであり、例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ＭＥＬＡＳ等を含む。また、ＡＴＰ産生の低下を伴う疾患又は障害としては、例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼの変異に基づく疾患又は障害を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明の医薬組成物においては、その種類は特に限定されるものではなく、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製することができる。また、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、本発明の化合物は以下のように新規な酵素阻害活性と動物モデルでの薬効を示すことが明らかにされた。本発明の化合物はＰＤＫ４をμＭオーダーで阻害する初めての薬剤である。具体的には本発明の化合物は唯一の既存薬であるジクロロ酢酸と比べて１００倍以上低い投与量で強い効果を示すことが確認された。よって、本発明の化合物は、新規で阻害活性の強いＰＤＫ４阻害剤を提供することができる。より具体的には、インフルエンザ感染マウスモデルに本発明の化合物を投与した場合には、マウスを体重減少さらに死亡から守る作用が確認された。また摂食、摂水が非感染マウスに近いレベルまで回復するとともに生化学的な解析からＡＴＰレベルなどが改善することが観察された。本発明の化合物はインフルエンザ感染による急性の重症化を防止する作用が示された。よって、本発明の化合物は、インフルエンザの重症化、特には体重減少、摂食障害、及び／又は摂水障害を治療し又は予防することができる。具体的には、本発明の化合物にはインフルエンザ感染による体重減少を抑制する効果があることから、本発明の化合物はインフルエンザ感染による体重減少の抑制剤として利用できる。また、本発明の化合物は、インフルエンザ感染による摂水量の減少を抑制することができることから、本発明の化合物はインフルエンザ感染による摂水量減少の抑制剤として利用できる。更に、本発明の化合物は摂食量の減少が抑えられていた。よって、ＫＩＳ７は、インフルエンザ感染によるインフルエンザ感染による摂食量の減少を抑制する効果があることから、本発明の化合物はインフルエンザ感染による摂食量減少の抑制剤として利用できる。更には、本発明の化合物は、ＡＴＰレベルの低下に依存する疾患又は障害の治療又は予防に有効である。また、本発明の化合物は、インフルエンザ感染による重症化防止に加え、ＰＤＫ４を阻害することにより期待される疾患での効果が認められており、このような疾患の治療又は予防に有効である。更に、本発明の化合物は、ミトコンドリア機能の活性化に伴う細胞の代謝改善により、化粧品としての効果が認められており、化粧品としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】インフルエンザ感染による急性重症化機構の解析結果とＰＤＫ４阻害剤による重症化防止の可能性を説明した模式図である。
【図２】ＰＤＫアイソザイムの中でＰＤＫ４だけが準活性化状態にあることを示した模式図である。（ｉ）無秩序なＣ末端テイル及び（ｉｉ）閉じた活性部位溝を有する閉構造（Ｃｌｏｓｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（Ｔ状態）がＰＤＫ２−ＡＤＰ構造で観察される。部分的に規則的な交差テイル及び開いた活性部位溝を有する活性のある中間開構造（Ｒ’状態）が、ヒトａｐｏ−ＰＤＫ２、ａｐｏ−ＰＤＫ１、及び本願のＰＤＫ４−ＡＤＰ構造で存在する。完全に規則的な交差テイル及び開いた活性部位溝を有する活性開構造（Ｒ状態）がヒトａｐｏ−ＰＤＫ３−Ｌ２、ＰＤＫ３−Ｌ２−ＡＤＰ、ＰＤＫ３−Ｌ２−ＡＴＰ（１Ｙ８Ｐ）、ＰＤＫ２−Ｌ２（３ＣＲＫ）、及びＰＤＫ２−Ｌ２−（ＡＭＰ−ＰＮＰ）（３ＣＲＬ）構造で存在する。
【図３】ＫＩＳ７、及びＫＩＳ２８の構造とＰＤＫ４阻害活性を示した図である。
【図４】ＫＩＳ７、ＫＩＳ３７、ＫＩＳ１１６，ＫＩＳ２４と既存のＰＤＫ阻害剤の活性を比較した図である。左から順に、使用した化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、ＰＤＫ１によるＰＤＨのリン酸化の阻害活性（ＰＤＨＫ１）、ＰＤＫ２によるＰＤＨのリン酸化の阻害活性（ＰＤＨＫ２）、ＰＤＫ４によるＰＤＨのリン酸化の阻害活性を示す。各ＰＤＫのＰＤＨのリン酸化の阻害活性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）（μＭ）で示す。
【図５】インフルエンザ感染マウスモデルへの、ＫＩＳ７、ＫＩＳ２８、ＫＩＳ３７、ＫＩＳ１１６及びＫＩＳ２４投与試験のスケジュール（７日目まで投与）を示す図である。
【図６】インフルエンザ感染マウスモデルにおけるマウスの体重変化を示すグラフである。インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ７を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスにおける体重変化を丸印で示す。対照として、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス（ひし形）、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス（四角）、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウス（三角）を用いた。縦軸はマウスの体重（ｇ）を示し、横軸は感染後の経過日数（感染初日を０日目とする）を示す。
【図７】インフルエンザ感染マウスモデルにおけるマウスの摂水（左図）及び摂食（右図）の変化を示すグラフである。インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ７を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスにおける摂食及び摂水の変化を丸印で示す。対照として、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス（ひし形）、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス（四角）、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウス（三角）を用いた。右図の縦軸はマウスの摂水量（ｇ／マウス）を示し、左図の縦軸はマウスの摂食量（ｇ／マウス）を示す。両方の図において、横軸は感染後の経過日数（感染初日を０日目とする）を示す。
【図８】インフルエンザウイルス感染７日後のマウスの頸部より採取した血液について、各血液パラメーターを測定した結果を示すグラフである。血液パラメーターは、血糖値（ｍｇ／ｄＬ）（左上図）、乳酸値（ｍＭ）（右上図）、β−ヒドロキシ酪酸（ｍＭ）（左下図）、及びＡＴＰレベル（ｍＭ）（右下図）とした。各グラフにおいて、横軸は左から、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ７を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを示す。各グラフの縦軸は、各パラメーターの数値（血糖値（ｍｇ／ｄＬ）（左上図）、乳酸値（ｍＭ）（右上図）、β−ヒドロキシ酪酸（ｍＭ）（左下図）、及びＡＴＰレベル（ｍＭ）（右下図））を示す。
【図９】インフルエンザウイルス感染７日後のマウスの各組織中のＡＴＰ値を示すグラフである。グラフは左から、心臓、肝臓、及び筋肉を示す。各グラフにおいて、横軸は左から、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ７を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを示す。各グラフの縦軸は、各組織中のＡＴＰ濃度（μｍｏｌ／ｇ  ｗｅｔ  ｔｉｓｓｕｅ）を示す。
【図１０】インフルエンザウイルス感染７日後のマウスの肝臓組織中のＰＤＨ酵素活性を示すグラフである。横軸は左から、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ７を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウス、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを示す。縦軸は、肝臓中のＰＤＨ活性（ΔｍＯＤ／分）を示す。
【図１１】ＫＩＳ７投与群のインフルエンザ感染後１４日間の生存率を示すグラフである。縦軸は生存率（％）を示し、横軸は感染後の経過日数（感染初日を０日目とする）を示す。インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ７を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを丸印で示す。対照として、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウスをひし形で、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウスを四角で示す。
【図１２】ＫＩＳ２４の構造とＫＩＳ２４投与群のインフルエンザ感染後１４日間の生存率を示すグラフである。グラフの縦軸は生存率（％）を示し、横軸は感染後の経過日数（感染初日を０日目とする）を示す。インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ２４を１．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを丸印で示す。対照として、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウスをひし形で、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウスを四角で示す。また、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを三角で示す。
【図１３】ＫＩＳ３７及びＫＩＳ１１６の構造と投与群のインフルエンザ感染後１４日間の生存率を示すグラフである。グラフの縦軸は生存率（％）を示し、横軸は感染後の経過日数（感染初日を０日目とする）を示す。インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のＫＩＳ２４を１．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与したマウスを丸印で示す。対照として、インフルエンザ非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウスをひし形で、インフルエンザ感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与したマウスを四角で示す。
【図１４】癌細胞足場非依存性増殖にたいするＫＩＳ７、ＫＩＳ３７、Ｋ及びＫＩＳ２４  の作用を示す図である。  ＫＩＳ７、ＫＩＳ３７、Ｋ及びＫＩＳ２４はＰＤＫ４阻害と同じオーダーの３μＭでがん細胞ＨｅＬａＳ３の軟寒天中でのコロニー形成を阻害した。またＫＩＳ７、ＫＩＳ２４、ＫＩＳ３７及びＫＩＳ１１６はＲａｓで癌化した細胞の足場非依存性スフェアー増殖をμＭ−１０μＭオーダーで抑制した。一方、ＫＩＳ７、ＫＩＳ３７及びＫＩＳ１１６は正常細胞の足場依存性増殖は数十μＭオーダーで全く阻害しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の化合物は、市販の化合物を出発物質として適宜当業者周知の化学合成の方法を採用して合成することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、通常の薬学的に許容される担体を用いて、常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。
【００３３】
別の態様において本発明は、本発明の化合物の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ＰＤＫ（特には、ＰＤＫ４）の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係する疾患又は障害の治療方法又は予防方法に関する。あるいは、本発明は、ＰＤＫ（特には、ＰＤＫ４）が発症又は増悪化に関係する疾患又は障害の治療又は予防のための本発明の化合物の使用に関する。
【００３４】
本発明の化合物及び医薬組成物は、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で投与することができる。本化合物を哺乳動物等に投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、体重、性別、投与ルート、投与形態、薬剤への反応性、疾患の種類等により適宜設定することができ、例えば、通常成人１日当たり５０〜５００ｍｇを１日１〜数回に分けて投与する。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は米国特許仮出願第ＵＳ６１／６２３，５０１号の優先権を主張する。本願が優先権を主張する米国特許仮出願第ＵＳ６１／６２３，５０１号記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００３６】
（実施例１）ＰＤＫ阻害活性の測定
（１）被験物質とその溶液の調製    
被験物質ＫＩＳ７（ゴシポール）とＫＩＳ２４（ベータラパコン）はＥｎｚｏ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、ＫＩＳ３７（クリプトタンシノン）はＡｂｃａｍ（ＵＳＡ）、ＫＩＳ１１６（ジヒドロタンシノンＩ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （ＵＳＡ）、ＫＩＳ２８はナミキ商事（日本）、陽性対照物質ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）は和光純薬（日本）より購入した。
被験物質（ＫＩＳ７、ＫＩＳ２８、ＫＩＳ２４、ＫＩＳ３７、及びＫＩＳ１１６）および陽性対照物質（ジクロロ酢酸：ＤＣＡ）はジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、希釈して試験濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。
（２）Ｏｆｆ−ｃｈｉｐ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙによるＰＤＫ２及びＰＤＫ４阻害活性の測定
ＰＤＫ２及びＰＤＫ４阻害活性は、１００μＭＡＴＰ存在下でＰＤＨのＥ１サブユニットのリン酸化を測定することで決定した。
１）アッセイバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．５）にて調製した５μＬの４倍濃度被験物質溶液、５μＬの４倍濃度基質（組換ヒトＰＤＨ）／ＡＴＰ／金属溶液および１０μＬの２倍濃度ヒト組換ＰＤＫ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて５時間反応させた。
２）６０μＬのＴｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓｉｓｔ  ＭＳＡ；Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して反応を停止させた。
３）反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをＬａｂＣｈｉｐ３０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて分離し、定量した（ゲルシフトアッセイ）。基質ペプチドピーク高さ（Ｓ）とリン酸化ペプチドピーク高さ（Ｐ）から計算される生成物比（Ｐ／（Ｐ＋Ｓ））にてリン酸化活性を評価した。
４）阻害率は次のように計算した。全ての反応成分を含むウェルのリン酸化活性を阻害０％、酵素非添加のリン酸化活性を阻害１００％とし、各被験物質試験ウェルのリン酸化活性から阻害率を計算した。【００３７】
（３）結果
ＫＩＳ７及びＫＩＳ２８のＰＤＫ４阻害活性を図３に示す。また、ＰＤＫ２阻害活性、及びＰＤＫ４阻害活性について、ＫＩＳ７と既知のＰＤＫ阻害物質とを比較した結果を図４に示す。ＡＺＤ７５４５、化合物Ｋ、ノバルティス３ｒがＰＤＫ４を活性化するのに対し、ＫＩＳ７はＰＤＫ４を阻害することが示された。また、ＫＩＳ７によるＰＤＫ４阻害は、ＤＣＡやＲａｄｉｃｉｃｏｌと比較して顕著に低用量で達成された。また、ＫＩＳ２４、ＫＩＳ３７及びＫＩＳ１１６のＰＤＫ２及びＰＤＫ４阻害活性を、図１２（ＫＩＳ２４）、及び図１３（ＫＩＳ３７及びＫＩＳ１１６）に示す。
以上の図にも示す通り、ＫＩＳ７、ＫＩＳ２８、ＫＩＳ２４、ＫＩＳ３７、及びＫＩＳ１１６は、それぞれ、４．０μＭ、１３．２μＭ、３μＭ、１１μＭ、及び＜４μＭという、強いＰＤＫ４阻害活性を示した。【００３８】
（実施例２）インフルエンザ感染マウスモデルでのＫＩＳ７の効果（７日間投与）
（１）マウス、インフルエンザウイルス、及び試薬
５週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ）を購入し、６週目（体重１６．４−１８．１ｇ）に麻酔（ケタラール６２．５ｍｇ／ｋｇとセラクタール１２．５μｇ／ｋｇの混合）を筋肉注射後、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ  ８／３４  株（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／ＰＲ８／８／３４株）を１０ＰＦＵ／２０μＬ／ｍｏｕｓｅで経鼻感染させた。非感染群として、ウイルスを希釈する際に用いた生理食塩水（大塚製薬）を２０μＬ／ｍｏｕｓｅで経鼻で投与した。感染させた日を０日目（Ｐｒｅ−０）とした。ＫＩＳ７は、２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で、溶媒であるＤＭＳＯが５％になるように生理食塩水で希釈した溶液として、感染翌日（１日目：Ｄａｙ１）から７日目（Ｄａｙ７）まで１日２回腹腔内に投与した。各実験における群分けは、以下の計４群とし、各群１０匹（１ケージ５匹）のマウスを用いた：
１）非感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与した群、
２）感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水を腹腔内投与した群、
３）感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中の各ＫＩＳ化合物（ＫＩＳ７）を２．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与した群、
４）比較として、感染マウスに５％ＤＭＳＯ生理食塩水中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を５６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与した群。【００３９】
（２）体重、摂食量、摂水量の測定
体重は、１日１回、個別に測定した。摂食量と摂水量は、１ケージに５匹入っているマウスの、餌の量、水の量を１日１回測定し、その変化量を５匹でわることで、１匹あたりの平均値として算出した。【００４０】
（３）末梢血中の生化学的パラメーターの測定
インフルエンザウイルス感染７日後のマウスを各群５匹ずつ用い、頸部より血液を採取後、各パラメーターを測定した。
（３−１）血糖値の測定
血糖値は、メディセーフ（登録商標）ミニＧＲ−１０２（ＴＥＲＵＭＯ  ＣＯＲＰＯＬＡＴＩＯＮ  ＪＡＰＡＮ）を用い、製造者により提供された取扱説明書に従って血液を数滴用いて測定した。測定原理は、血液をチップ先端より吸引すると、血液は試験紙に展開され、血液中のグルコースは、試験紙に含まれるグルコースオキシダーゼの作用により、過酸化水素とグルコン酸を生成する。更に生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼの作用により、反応試験部に含まれる４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンと反応し、キノン系色素が生成される。この赤紫色の呈色を比色定量し、血液中のグルコース量を算出した。【００４１】
（３−２）乳酸値の測定
乳酸値は、ラクテート・プロ  ＬＴ−１７１０（株式会社ＡＲＫＲＡＹ）を用い、製造者により提供された取扱説明書に従って血液を数滴用いて測定した。測定原理は、血液を電極に供給すると反応層中の電子伝達体であるフェリシアン化カリウム（酸化型）が溶け、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＤ）との間で酵素反応が行われ、フェロシアン化カリウム（還元型）を生成する。次に電極に一定電圧を印加してフェロシアン化カリウムを酸化し、その時発生する酸化電流を計測する。この酸化電流を、生成したフェロシアン化カリウム量、すなわち乳酸濃度に換算し、算出した。【００４２】
（３−３）β−ヒドロキシ酪酸の測定
血液中のケトン体の代表としてβ−ヒドロキシ酪酸値を測定した。β−ヒドロキシ酪酸値は、プレシジョン  エクシード（Ａｂｏｔｔ  Ｊａｐａｎ）を用い、製造者により提供された取扱説明書に従って血液を数滴用いて測定した。測定原理は、電極に血液を滴下すると、血液中のβ−ヒドロキシ酪酸（β−ＯＨＢ）が電極中のβ−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼと反応し、電子伝達物質を介して微弱な電流を生じる。電流の強さは、滴下した血液中のβ−ＯＨＢ濃度によることから、この電流を測定し、β−ヒドロキシ酪酸値を算出した。【００４３】
（３−４）ＡＴＰ値の測定
ＡＴＰ値は、ＡＭＥＲＩＣ−ＡＴＰ  ｋｉｔ（応用酵素医学研究所株式会社）を用い、製造者により提供された取扱説明書に従い、血液からＡＴＰを抽出し、ルシフェラーゼ反応を用いて測定した。【００４４】
（４）マウスの各組織中のＡＴＰ値の測定
ＡＴＰ値は、ＡＭＥＲＩＣ−ＡＴＰ  ｋｉｔ（応用酵素医学研究所株式会社）を用い、製造者により提供された取扱説明書に従い、各組織からＡＴＰを抽出し、ルシフェラーゼ反応を用いて測定した。具体的には、心臓は全量、脳、肝臓は約半分、筋肉は右後ろ脚の筋肉部位をインフルエンザウイルス感染７日後のマウスから全量摘出し、ホモジナイザー（ウルトラタラックス  Ｔ２５  デジタル：ＩＫＡジャパ株式会社）にてＡＴＰ抽出液中で粉砕後、そのホモジナイズ液を、遠心分離した後、その上清を回収することで各組織中のＡＴＰを抽出した。各組織中のＡＴＰ値は、用いる組織の量によって値が変わるので、用いた各組織湿重量あたりのＡＴＰ値として算出した。【００４５】
（５）マウス肝臓組織中のＰｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＰＤＨ）酵素活性の測定
インフルエンザウイルス感染７日後のマウスを各群５匹ずつ用い、肝臓のＰＤＨ酵素活性を測定した。ＰＤＨの活性測定は、Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＰＤＨ）Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＭＳＰ１８（Ｍｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて製造者により提供されたプロトコールに従い測定した。測定原理は、マイクロプレートにＰＤＨがイムノキャプチャーされ、そのＰＤＨ上でＰＤＨの活性化とともにＮＡＤ＋からＮＡＤＨに還元される反応を利用し、そこにレポーターを共役して反応させ、その吸光度を測定することにより活性の高さを測定した。具体的には、肝臓を約半分ダウンス型ホモジナイザーにてＰＢＳ（−）中で粉砕後、まずＢＣＡアッセイ法にてタンパク量を測定し、２３．７ｍｇ／ｍＬに合わせた。ホモジナイズ液を調整した後、プロトコールに従い、マイクロプレートに充填した。１ウェルあたり、８００μｇ充填した。最後に色試薬と反応させ、吸光度の変化を測定することにより、ＰＤＨ酵素活性とし、活性の強さは、１分間あたりのＯＤ値の変化として表した。【００４６】
（６）結果
体重変化に関する結果を図６に示す。対照である感染マウスにＤＭＳＯのみ投与した群及び感染マウスにＤＣＡを投与した群では、それぞれ、５日目及び６日目からマウスの体重が減少したのに対し、ＫＩＳ７投与群では非感染マウスと同等に全く体重減少が観察されなかった。よって、ＤＣＡはインフルエンザ感染による体重減少をほとんど抑制できないにもかかわらず、ＫＩＳ７にはインフルエンザ感染による体重減少を抑制する効果があることが示された。【００４７】
摂食、摂水の変化に関する結果を図７に示す。図７の左に示す摂水量の変化においては、比較対照である感染マウスにＤＣＡを投与した群が７日目に明らかに摂水量が大きく減少しているのに対し、ＫＩＳ７投与群では摂水量の減少が抑えられていた。また、図７の右に示す摂食量の変化においては、比較対照である感染マウスにＤＣＡを投与した群が６日目から摂食量が急激に減少するのに対し、ＫＩＳ７投与群では摂食量の減少が抑えられていた。よって、ＫＩＳ７は、インフルエンザ感染による摂食量及び摂水量の減少を抑制する効果があることが示された。【００４８】
インフルエンザウイルス感染７日後のマウスの血液パラメーターを測定した結果を図８に示す。いずれの血液パラメーターにおいても、ＫＩＳ７投与群では非感染マウスと同等の数値を示した。特に、血糖値及びβ−ヒドロキシ酪酸はＤＣＡ投与群でほとんど改善されていないにもかかわらず、ＫＩＳ７投与群では非感染群と同等の数値を示した。【００４９】
インフルエンザウイルス感染７日後のマウスの各組織中のＡＴＰ値を測定した結果を図９に示す。心臓及び肝臓において、ＫＩＳ７投与群では非感染マウスと同等のＡＴＰ値を示し、インフルエンザウイルス感染によるＡＴＰの減少を抑制した。【００５０】
インフルエンザウイルス感染７日後のマウスの肝臓組織中のＰＤＨ酵素活性を測定した結果を図１０に示す。ＫＩＳ７投与群及びＤＣＡ投与群において、非感染マウスと同等のＰＤＨ活性が確認され、ＫＩＳ７及びＤＣＡがインフルエンザウイルス感染によるＰＤＨ活性の低下を抑制することが示された。【００５１】
（実施例３）インフルエンザ感染マウスモデルにおけるＫＩＳ７、ＫＩＳ３７、及びＫＩＳ２４の効果（１４日間投与）
マウス及びウイルスは実施例２と同じものを使用し、ＫＩＳ化合物として、ＫＩＳ７に加えて、ＫＩＳ３７及びＫＩＳ２４についても実験を行った。ＫＩＳ２４及びＫＩＳ３７の投与量をそれぞれ１．３ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇとする以外は実施例２と同様の方法により感染及び投与を行った。感染時のマウスの体重は、１５．８−１７．８ｇであった。ウイルス感染後１４日間投与を続け、その間の生存率、体重、摂食量、摂水量の測定を実施例２と同様に行った。また、ウイルス感染後１４日間の生存率を測定した。【００５２】
ＫＩＳ７、ＫＩＳ２４、及びＫＩＳ３７投与について、インフルエンザ感染後１４日間の生存率の結果をそれぞれ図１１、図１２、及び図１３に示す。ＫＩＳ化合物非投与群では８日目からマウスが死亡し始め、１４日目には半数以上のマウスが死亡した。一方で、ＫＩＳ７投与群は、１１日目まで生存率１００％を維持し、１４日目においても生存率７０％を達成した。また、ＫＩＳ２４投与群では、６日目に死亡例が出た者の、１４日目において生存率９０％を達成した。更に、ＫＩＳ３７投与群は１０日目まで生存率１００％を維持し、１４日目においても生存率８０％を維持した。
なお、体重、摂食量、摂水量の改善効果は、ＫＩＳ７と同様の結果が得られた（非図示）。よって、ＫＩＳ７、ＫＩＳ２４及びＫＩＳ３７は、インフルエンザ感染における体重減少、摂食及び摂水障害の改善、各種パラメーターを改善するのみならず、死亡を抑制し、生存率を高める効果を奏することが示された。【００５３】
（実施例４）ＫＩＳ７、ＫＩＳ２４、及びＫＩＳ３７の癌細胞足場非依存性増殖に対する作用【００５４】
（１）実験方法
がん細胞ＨｅＬａＳ３の軟寒天中でのコロニー形成試験は常法を用いた（Ｃ．Ｏｎｅｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ２００８；１３：１−１２９）。ＨｅＬａＳ３細胞（４×１０４）を３ｍｌの軟寒天培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地、１０％子牛血清、０．３６％寒天）に混ぜて６ｃｍの細胞培養用プレートウェルに投入した。プレートウェルには５ｍｌの基層寒天培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地、１０％子牛血清、０．７％寒天）を予め投入した。３７度の炭酸ガスインキュベーター中で８日間培養後生成したコロニーをＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した。【００５５】
（２）結果
ＫＩＳ７、ＫＩＳ２４、及びＫＩＳ３７の癌細胞足場非依存性増殖に対する作用を図１４に示す。ＫＩＳ７、ＫＩＳ３７、Ｋ及びＫＩＳ２４はＰＤＫ４阻害と同じオーダーの３μＭでがん細胞ＨｅＬａＳ３の軟寒天中でのコロニー形成を阻害した。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月10日(2014.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＤＫ４阻害剤：
【化１】
2013153821.tif 000033
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項２】
下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＤＫ４阻害剤：
【化２】
2013153821.tif 000034
［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、水素原子、あるいは直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示し、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項３】
下記一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＤＫ４阻害剤：
【化３】
2013153821.tif 000035
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項４】
下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物であって、ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬である医薬組成物：
【化４】
2013153821.tif 000036
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項５】
下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物であって、ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬である医薬組成物：
【化５】
2013153821.tif 000037
［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、水素原子、あるいは直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示し、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項６】
下記一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物であって、ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬である医薬組成物：
【化６】
2013153821.tif 000038
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【請求項７】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、インフルエンザ感染後の重症化である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、食欲不振である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、ミトコンドリア病、又はＡＴＰ産生の低下を伴う疾患又は障害である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が、糖尿病である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＰＤＫ４の発現又は活性化が発症又は増悪化に関係し又は寄与する疾患又は障害が癌である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つで表わされる化合物、又はその薬理学的に許容されるエステル誘導体あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を配合してなる化粧品組成物：
【化７】
2013153821.tif 000039
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、ホルミル基又は２−カルボキシフェニルイミノメチル基を示し、Ｒ３〜Ｒ６は、同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化８】
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［式中、実線と破線で表わされる結合は単結合又は二重結合を示し、Ｒ７及びＲ８は同一又は異なって、水素原子、あるいは、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示し、Ｒ９は直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］；
【化９】
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［式中、Ｒ１０及びＲ１１は同一又は異なって、直鎖又は分岐状のＣ１〜６アルキル基を示す］。
【国際調査報告】
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