(57)【要約】【課題】アジド基とシクロオクチン基とを、触媒不存在下、特に銅触媒不存在下で、反応して得られるハイドロゲル、特に生体適合性材料に用いることができるハイドロゲルの提供。【解決手段】ａ）ヒアルロン酸及びカルボキシメチルデキストランなどの第１のポリマー部位；ｂ）ａ）と同種又は異種の、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸及びカルボキシメチルデキストランなど第２のポリマー部位；及びｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基；を有するハイドロゲルであって、該ハイドロゲルは、ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基を介して、ａ）第１のポリマー部位とｂ）第２のポリマー部位とが架橋する構造を有する上記ハイドロゲルにより、上記課題を解決する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体及びキトサンからなる群から選ばれる第１のポリマー部位；
ｂ）上記ａ）と同種であっても異種であってもよいが、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体及びキトサンからなる群から選ばれる第２のポリマー部位；及び
ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基；
を有するハイドロゲルであって、
該ハイドロゲルは、前記ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基を介して、前記ａ）第１のポリマー部位と前記ｂ）第２のポリマー部位とが架橋する構造を有する、上記ハイドロゲル。
【請求項２】
前記ａ）第１のポリマー部位と前記ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基との間にスペーサー基Ｘ１を有し、ここで、当該Ｘ１は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、請求項１記載のハイドロゲル。
【請求項３】
前記ｂ）第２のポリマー部位と前記ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基との間にスペーサー基Ｘ２を有し、ここで、当該Ｘ２は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、請求項１又は２記載のハイドロゲル。
【請求項４】
前記Ｘ１は、前記ａ）第１のポリマー部位の−ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ１−を形成する請求項２又は３に記載のハイドロゲル。
【請求項５】
前記Ｘ２は、前記ｂ）第２のポリマー部位の−ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ２−を形成する請求項３又は４に記載のハイドロゲル。
【請求項６】
前記Ｘ１は、前記ａ）第１のポリマー部位の−ＮＨ２基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ１−を形成する請求項２又は３に記載のハイドロゲル。
【請求項７】
前記Ｘ２は、前記ｂ）第２のポリマー部位の−ＮＨ２基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ２−を形成する請求項３又は６に記載のハイドロゲル。
【請求項８】
前記−Ｘ１−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−である請求項２〜７のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項９】
前記−Ｘ１−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項２〜７のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１０】
前記−Ｘ２−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−である請求項３〜９のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１１】
前記−Ｘ２−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項３〜９のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１２】
前記ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基は、前記ａ）第１のポリマー部位の全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％で存在する請求項１〜１１のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１３】
前記ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基は、前記ｂ）第２のポリマー部位の全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％で存在する請求項１〜１２のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１４】
前記ａ）第１のポリマー部位；及び前記ｂ）第２のポリマー部位が、ヒアルロン酸である請求項１〜１３のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１５】
前記ａ）第１のポリマー部位；及び前記ｂ）第２のポリマー部位が、カルボキシメチルデキストランである請求項１〜１３のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１６】
前記ａ）第１のポリマー部位；及び前記ｂ）第２のポリマー部位が、キトサンである請求項１〜１３のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載のハイドロゲルを有する生体適合性材料。
【請求項１８】
前記生体適合性材料が癒着防止材料である請求項１７記載の材料。
【請求項１９】
前記生体適合性材料がドラッグデリバリシステム担体である請求項１７記載の材料。
【請求項２０】
前記生体適合性材料が細胞封入用材料である請求項１７記載の材料。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項記載のハイドロゲルを作成するためのキット。
【請求項２２】
Ａ）  ａ）ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体及びキトサンからなる群から選ばれる第１のポリマーであって、且つ該第１のポリマーがアジド基を有する、第１のポリマーを含む液を準備する工程；
Ｂ）  ｂ）上記ａ）と同種であっても異種であってもよいが、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体及びキトサンからなる群から選ばれる第２のポリマーであって、且つ該第２のポリマーがシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有する、第２のポリマーを含む液を準備する工程；及び
Ｃ）  前記ａ）第１の液と前記ｂ）第２の液とを混合する工程；
を有することにより、前記アジド基とシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体とのクリック反応により、トリアゾール環又はその誘導体が形成され、該トリアゾール環又はその誘導体を介して、前記第１のポリマーと前記第２のポリマーとを架橋する構造を有するハイドロゲルを形成する、ハイドロゲルの製造方法。
【請求項２３】
工程Ｃ）が生体内で行われることを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項２２又は２３記載の製造方法によりハイドロゲルを作成するためのキット。
【請求項２５】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたヒアルロン酸であって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該ヒアルロン酸。
【請求項２６】
前記−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−である請求項２５記載のヒアルロン酸。
【請求項２７】
前記−Ｘ３−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項２５記載のヒアルロン酸。
【請求項２８】
下記式（１）（式（１）中、Ｒのうち少なくとも１つは式（１）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｎは１００〜２０，０００の整数を示す）を有する請求項２５又は２６記載のヒアルロン酸。
【化１】
2012165462.tif 000018
【請求項２９】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたヒアルロン酸であって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該ヒアルロン酸。
【請求項３０】
前記−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−である請求項２９項記載のヒアルロン酸。
【請求項３１】
前記−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項２７記載のヒアルロン酸。
【請求項３２】
下記式（２）（式（２）中、Ｒのうち少なくとも１つは式（２）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｎ’は１００〜２０，０００の整数を示す）を有する請求項２９又は３０記載のヒアルロン酸。
【化２】
2012165462.tif 000019
【請求項３３】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたカルボキシメチルデキストランであって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該カルボキシメチルデキストラン。
【請求項３４】
前記−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−である請求項３３記載のカルボキシメチルデキストラン。
【請求項３５】
前記−Ｘ３−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項３３記載のカルボキシメチルデキストラン。
【請求項３６】
下記式（３）（式（３）中、Ｒ１のうち、１つはＣＨ２ＣＯＯＮａであり、少なくとも１つは式（３）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｉは１００〜２０，０００の整数を示す）を有する請求項３３又は３４記載のカルボキシメチルデキストラン。
【化３】
2012165462.tif 000020
【請求項３７】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたカルボキシメチルデキストランであって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該カルボキシメチルデキストラン。
【請求項３８】
前記−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−である請求項３７項記載のカルボキシメチルデキストラン。
【請求項３９】
前記−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項３７記載のカルボキシメチルデキストラン。
【請求項４０】
下記式（４）（式（４）中、Ｒ１のうち、１つはＣＨ２ＣＯＯＮａであり、少なくとも１つは式（４）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｉ’は１００〜２０，０００の整数を示す）を有する請求項３７又は３８記載のカルボキシメチルデキストラン。
【化４】
2012165462.tif 000021
【請求項４１】
−ＮＨ２基が−ＮＨ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたキトサンであって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該キトサン。
【請求項４２】
前記−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−である請求項４１記載のキトサン。
【請求項４３】
前記−Ｘ３−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項４１記載のキトサン。
【請求項４４】
−ＮＨ２基が−ＮＨ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたキトサンであって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該キトサン。
【請求項４５】
前記−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−である請求項４４項記載のキトサン。
【請求項４６】
前記−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である請求項４４記載のキトサン。
【請求項４７】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基（式中、Ｘ３は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたヒアルロン酸の製造方法であって、
１）ヒアルロン酸を準備する工程；
２）アジド基及びアジド基以外の官能基を有する物質を準備する工程； 
３）前記１）ヒアルロン酸を水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  前記２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５）  前記４）溶液と前記３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化反応により前記官能基と前記ヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記ヒアルロン酸を得る、上記方法。
【請求項４８】
前記２）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２）−１）分子量１万以下であり、一端がアミノ基、他端がカルボン酸基を有する化合物を準備する工程；及び
２）−２）前記化合物を、溶媒中、触媒存在下で、アジド化物と反応させる工程；
を有することにより得られる請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基（式中、Ｘ４は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたヒアルロン酸の製造方法であって、
１）ヒアルロン酸を準備する工程；
２’）シクロオクチン基及びシクロオクチン基以外の官能基を有する物質を準備する工程；
３）前記１）ヒアルロン酸を水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  前記２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５）  前記４）溶液と前記３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化反応により前記官能基と前記ヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記ヒアルロン酸を得る、上記方法。
【請求項５０】
前記２’）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２’）−１）  水酸基及びエステル基を有する物質と、シクロへプテンのブロモホルム付加体とを、有機溶媒中、触媒存在下で反応させて、1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を得る工程；
２’）−２）  1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を、溶媒中、脱臭素アルキン化して、シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を得る工程；及び
２’）−３）  シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を加水分解反応に付す工程；
を有することにより得られる請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基（式中、Ｘ３は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたカルボキシメチルデキストランの製造方法であって、
１’）カルボキシメチルデキストランを準備する工程；
２）アジド基及びアジド基以外の官能基を有する物質を準備する工程； 
３’）前記１’）カルボキシメチルデキストランを水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  前記２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５’）  前記４）溶液と前記３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化反応により前記官能基と前記カルボキシメチルデキストランのＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記カルボキシメチルデキストランを得る、上記方法。
【請求項５２】
前記２）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２）−１）分子量１万以下であり、一端がアミノ基、他端がカルボン酸基を有する化合物を準備する工程；及び
２）−２）前記化合物を、溶媒中、触媒存在下で、アジド化物と反応させる工程；
を有することにより得られる請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基（式中、Ｘ４は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたカルボキシメチルデキストランの製造方法であって、
１’）カルボキシメチルデキストランを準備する工程；
２’）シクロオクチン基及びシクロオクチン基以外の官能基を有する物質を準備する工程；
３’）前記１’）カルボキシメチルデキストランを水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  前記２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５’）  前記４）溶液と前記３’）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化反応により前記官能基と前記カルボキシメチルデキストランのＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記’）カルボキシメチルデキストランを得る、上記方法。
【請求項５４】
前記２’）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２’）−１）  水酸基及びエステル基を有する物質と、シクロへプテンのブロモホルム付加体とを、有機溶媒中、触媒存在下で反応させて、1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を得る工程；
２’）−２）  1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を、溶媒中、脱臭素アルキン化して、シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を得る工程；及び
２’）−３）  シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を加水分解反応に付す工程；
を有することにより得られる請求項５３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル及びその製造方法、並びに該ハイドロゲルの原料及び該原料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
in situ架橋ゲルは、例えば癒着防止材料、再生医療スキャフォールド、及び／又はドラックデリバリシステム担体などの医用デバイスとして用いることができ、その研究が数多くなされている。
多糖類、特にヒアルロン酸は、生体適合性に優れるため、点眼液、関節痛緩和剤、腹膜癒着防止材料などとして、広く用いられている。非特許文献１は、該ヒアルロン酸を用いたハイドロゲルについて、詳細に開示する。非特許文献１は、特に、共有結合を形成してハイドロゲルを調製する方法を網羅的に開示する。しかしながら、該共有結合を形成する方法は、生体分子との非特異的反応による細胞毒性が生じうる問題から、生体内での利用が制限されてくる。【０００３】
一方、特許文献１は、クリック反応を用いて得られるハイドロゲルを開示する。特に、特許文献１は、骨格として、ペプチド及びポリエチレングリコールを用いるハイドロゲルを開示する。しかしながら、特許文献１に用いるポリエチレングリコールは生体内で分解せず、ペプチドは抗原性を有することが多く、in vivo環境下で用いることに難点がある。実際、特許文献１は、in vivo環境下で、クリック反応をin situ架橋ゲルに用いることは全く開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０３９３０７号公報。
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ADVANCED MATERIALS Vol. 23, 12, pp. H41-H56 (2011)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、新規なハイドロゲル、特に多糖類を骨格高分子に用いた新規なハイドロゲル、より特に、in vivo環境下における生体適合性を有する、新規なin situ架橋ハイドロゲルを提供することにある。
また、本発明の目的は、上記目的以外に、上記目的に加えて、該ハイドロゲルを用いた材料、特に生分解性に優れた生体適合性材料を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、上記目的以外に、上記目的に加えて、該ハイドロゲルの製造方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記目的以外に、上記目的に加えて、該ハイドロゲルの原料となる薬剤及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、次の発明を見出した。
＜１＞  ａ）ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第１のポリマー部位；
ｂ）上記ａ）と同種であっても異種であってもよいが、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第２のポリマー部位；及び
ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基；
を有するハイドロゲルであって、
該ハイドロゲルは、ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基を介して、ａ）第１のポリマー部位とｂ）第２のポリマー部位とが架橋する構造を有する、上記ハイドロゲル。【０００８】
＜２＞  上記＜１＞において、ａ）第１のポリマー部位とｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基との間にスペーサー基Ｘ１（Ｘ１は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）を有するのがよい。Ｘ１は、好ましくはエーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。
＜３＞  上記＜１＞又は＜２＞において、ｂ）第２のポリマー部位と前記ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基との間にスペーサー基Ｘ２（Ｘ２は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）を有するのがよい。Ｘ２は、好ましくはエーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。【０００９】
＜４＞  上記＜２＞〜＜３＞のいずれかにおいて、Ｘ１は、ａ−１）第１のポリマー部位の−ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ１−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様の定義である）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。より好ましくは、Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である。または、ａ−２）第１のポリマー部位が−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−（上記Ｘ１と同様の定義である）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。また、ａ−３）第１のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様の定義である）が好ましい。【００１０】
＜５＞  上記＜３＞〜＜４＞のいずれかにおいて、Ｘ２は、ｂ−１）第２のポリマー部位の−ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ２−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様の定義である）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。より好ましくは、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）である。または、ｂ−２）第２のポリマー部位が−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−、（Ｘ２１は、上記Ｘ１と同様の定義である）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。また、ｂ−３）第１のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様の定義である）が好ましい。【００１１】
＜６＞  上記＜１＞〜＜５＞のいずれかにおいて、ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基は、ａ）第１のポリマー部位の全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。
＜７＞  上記＜１＞〜＜６＞のいずれかにおいて、ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基は、ｂ）第２のポリマー部位の全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。【００１２】
＜８＞  上記＜２＞〜＜７＞のいずれかにおいて、−Ｘ１−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
＜９＞  上記＜３＞〜＜８＞のいずれかにおいて、−Ｘ２−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。【００１３】
＜１０＞  上記＜１＞〜＜９＞のいずれかにおいて、ａ）第１のポリマー部位；及びｂ）第２のポリマー部位が、ヒアルロン酸であるのがよい。
＜１１＞  上記＜１＞〜＜９＞のいずれかにおいて、ａ）第１のポリマー部位；及びｂ）第２のポリマー部位が、カルボキシメチルデキストランであるのがよい。
＜１２＞  上記＜１＞〜＜９＞のいずれかにおいて、ａ）第１のポリマー部位；及びｂ）第２のポリマー部位が、キトサンであるのがよい。【００１４】
＜１３＞  上記＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載されるハイドロゲルを有する生体適合性材料。
＜１４＞  上記＜１３＞において、生体適合性材料が癒着防止材料であるのがよい。
＜１５＞  上記＜１３＞において、生体適合性材料がドラッグデリバリシステム担体であるのがよい。
＜１６＞  上記＜１３＞において、生体適合性材料が細胞封入用材料であるのがよい。
＜１７＞  上記＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載されるハイドロゲルを作成するためのキット。【００１５】
＜１８＞  Ａ）  ａ）ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第１のポリマーであって、且つ該第１のポリマーがアジド基を有する、第１のポリマーを含む液を準備する工程；
Ｂ）  ｂ）上記ａ）と同種であっても異種であってもよいが、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第２のポリマーであって、且つ該第２のポリマーがシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有する、第２のポリマーを含む液を準備する工程；及び
Ｃ）  ａ）第１の液とｂ）第２の液とを混合する工程；
を有することにより、アジド基とシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体とのクリック反応により、トリアゾール環又はその誘導体が形成され、該トリアゾール環又はその誘導体を介して、第１のポリマーと第２のポリマーとが架橋する構造を有するハイドロゲルを形成する、ハイドロゲルの製造方法。【００１６】
＜１９＞  上記＜１８＞において、Ｃ）混合工程は、ダブルシリンジの一方にａ）第１のポリマーを含む液を入れ、ダブルシリンジの他方にｂ）第２のポリマーを含む液を入れ、該ダブルシリンジからａ）第１のポリマーを含む液及びｂ）第２のポリマーを含む液をほぼ同時に射出して混合するのがよい。ここで、好ましくは、上記工程Ｃ）は、実施例１８に示すように、生体内で行われる。また、上記＜１８＞の製造方法において、上記＜１７＞のキットを用いてハイドロゲルを作成することもできる。【００１７】
＜２０＞  上記＜１８＞又は＜１９＞において、ａ）第１のポリマーが、アジド基との間にスペーサー基Ｘ１（Ｘ１は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）を有するのがよい。Ｘ１は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。
＜２１＞  上記＜１８＞〜＜２０＞のいずれかにおいて、ｂ）第２のポリマーが、シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体との間にスペーサー基Ｘ２（Ｘ２は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）を有するのがよい。Ｘ２は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。【００１８】
＜２２＞  上記＜１８＞〜＜２１＞のいずれかにおいて、Ｘ１は、ａ−１）第１のポリマーの−ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ１−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様のアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。または、ａ−２）第１のポリマー部位が−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様のアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。また、ａ−３）第１のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様の定義である）が好ましい。【００１９】
＜２３＞  上記＜１８＞〜＜２２＞のいずれかにおいて、Ｘ２は、ｂ−１）第２のポリマーの−ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ２−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様のアルキレン基基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。または、ｂ−２）第２のポリマー部位が−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様のアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。また、ｂ−３）第２のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様の定義である）が好ましい。【００２０】
＜２４＞  上記＜１８＞〜＜２３＞のいずれかにおいて、アジド基は、ａ）第１のポリマーの全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。
＜２５＞  上記＜１８＞〜＜２４＞のいずれかにおいて、シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体は、ｂ）第２のポリマーの全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。【００２１】
＜２６＞  上記＜２０＞〜＜２５＞のいずれかにおいて、−Ｘ１−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
＜２７＞  上記＜２１＞〜＜２６＞のいずれかにおいて、−Ｘ２−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。【００２２】
＜２８＞  上記＜１８＞〜＜２７＞のいずれかにおいて、ａ）第１のポリマー；及びｂ）第２のポリマーが、ヒアルロン酸であるのがよい。
＜２９＞  上記＜１８＞〜＜２７＞のいずれかにおいて、ａ）第１のポリマー；及びｂ）第２のポリマーが、カルボキシメチルデキストランであるのがよい。
＜３０＞  上記＜１８＞〜＜２７＞のいずれかにおいて、ａ）第１のポリマー；及びｂ）第２のポリマーが、キトサンであるのがよい。【００２３】
＜３１＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたヒアルロン酸であって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該ヒアルロン酸。Ｘ３は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−、−Ｏ−Ｘ３１−（Ｘ３１は、上記Ｘ３と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−を形成するのがよい。
＜３２＞  上記＜３１＞において、−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
＜３３＞  上記＜３１＞又は＜３２＞において、ヒアルロン酸は、下記式（１）（式（１）中、Ｒのうち少なくとも１つは式（１）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｎは１００〜２０，０００の整数を示す）を有するのがよい。【００２４】
【化１】
2012165462.tif 000002
【００２５】
＜３４＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたヒアルロン酸であって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該ヒアルロン酸。Ｘ４は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−、−Ｏ−Ｘ４１−（Ｘ４１は、上記Ｘ４と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−を形成するのがよい。
＜３５＞  上記＜３４＞において、−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
＜３６＞  上記＜３４＞又は＜３５＞において、ヒアルロン酸が、下記式（２）（式（２）中、Ｒのうち少なくとも１つは式（２）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｎ’は１００〜２０，０００の整数を示す）を有するのがよい。【００２６】
【化２】
2012165462.tif 000003
【００２７】
＜３７＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたカルボキシメチルデキストランであって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該カルボキシメチルデキストラン。Ｘ３は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−、−Ｏ−Ｘ３１−（Ｘ３１は、上記Ｘ３と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−を形成するのがよい。
＜３８＞  上記＜３７＞において、−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
＜３９＞  上記＜３７＞又は＜３８＞において、カルボキシメチルデキストランが、下記式（３）（式（３）中、Ｒ１のうち、１つはＣＨ２ＣＯＯＮａであり、少なくとも１つは式（３）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｉは１００〜２０，０００の整数を示す）を有するのがよい。【００２８】
【化３】
2012165462.tif 000004
【００２９】
＜４０＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたカルボキシメチルデキストランであって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該カルボキシメチルデキストラン。Ｘ４は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−、−Ｏ−Ｘ４１−（Ｘ４１は、上記Ｘ４と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−を形成するのがよい。
＜４１＞  上記＜４０＞において、−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
＜４２＞  上記＜４０＞又は＜４１＞において、カルボキシメチルデキストランが、下記式（４）（式（４）中、Ｒ１のうち、１つはＣＨ２ＣＯＯＮａであり、少なくとも１つは式（４）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｉ’は１００〜２０，０００の整数を示す）を有するのがよい。【００３０】
【化４】
2012165462.tif 000005
【００３１】
＜４３＞−ＮＨ２基が−ＮＨ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたキトサンであって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該キトサン。Ｘ３は、−ＮＨ−と共に、アミド基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−ＮＨ−Ｘ３−Ｎ３基は、好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ３１−、−ＮＨ−Ｘ３１−（Ｘ３１は、上記Ｘ３と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ３１−を形成するのがよい。
＜４４＞  上記＜４３＞において、−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。【００３２】
＜４５＞  −ＮＨ２基が−ＮＨ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたキトサンであって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該キトサン。Ｘ４は、−ＮＨ−と共に、アミド基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−ＮＨ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基は、好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ４１−、−ＮＨ−Ｘ４１−（Ｘ４１は、上記Ｘ４と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ４１−を形成するのがよい。
＜４６＞  上記＜４５＞において、−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。【００３３】
＜４７＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基（式中、Ｘ３は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたヒアルロン酸の製造方法であって、
１）ヒアルロン酸を準備する工程；
２）アジド基及びアジド基以外の官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ヒドラジド基、アルデヒド基、又は水酸基などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはカルボキシル基、アミノ基又はヒドラジド基、より好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であるのがよい）を有する物質を準備する工程； 
３）  １）ヒアルロン酸を、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない）でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  ２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５）  ４）溶液と３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化（例えば、カルボジイミド化、イミダゾール化などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール化であるのがよい）反応により官能基とヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記ヒアルロン酸を得る、上記方法。【００３４】
＜４８＞  上記＜４７＞において、２）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２）−１）分子量１万以下、好ましくは５千以下、より好ましくは３千以下であり、一端がアミノ基、他端がカルボン酸基を有する化合物を準備する工程；及び
２）−２）前記化合物を、溶媒中、触媒存在下で、アジド化物（例えば、イミダゾール-1-スルホニルアジド、又はトリフリックアジドなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール-1-スルホニルアジドであるのがよい）と反応させる工程；
を有することにより得られるのがよい。【００３５】
＜４９＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基（式中、Ｘ４は、単結合、又は分子量１万以下を表す）に置換されたヒアルロン酸の製造方法であって、
１）ヒアルロン酸を準備する工程；
２’）シクロオクチン基及びシクロオクチン基以外の官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ヒドラジド基、アルデヒド基、又は水酸基などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはカルボキシル基、アミノ基又はヒドラジド基、より好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であるのがよい）を有する物質を準備する工程；
３）  １）ヒアルロン酸を、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない）でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  ２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５）  ４）溶液と３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化（例えば、カルボジイミド化、イミダゾール化などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール化であるのがよい）反応により官能基とヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記ヒアルロン酸を得る、上記方法。【００３６】
＜５０＞  上記＜４９＞において、２’）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２’）−１）  水酸基及びエステル基を有する物質（例えば、グリコール酸メチル、乳酸メチル、tert−ブチルー４―ヒドロキシブチレートなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはグリコール酸メチル又は乳酸メチル、より好ましくはグリコール酸メチルであるのがよい）と、シクロへプテンのブロモホルム付加体とを、有機溶媒中、触媒（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀を挙げることができるがこれらに限定されない）存在下で反応させて、1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を得る工程；
２’）−２）  1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を、溶媒中、脱臭素アルキン化して、シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を得る工程；及び
２’）−３）  シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を加水分解反応に付す工程；
を有することにより得られるのがよい。【００３７】
＜５１＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基（式中、Ｘ３は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたカルボキシメチルデキストランの製造方法であって、
１’）カルボキシメチルデキストランを準備する工程；
２）アジド基及びアジド基以外の官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ヒドラジド基、アルデヒド基、又は水酸基などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはカルボキシル基、アミノ基又はヒドラジド基、より好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であるのがよい）を有する物質を準備する工程； 
３’）  １’）カルボキシメチルデキストランを、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない）でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  ２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５’）  ４）溶液と３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化（例えば、カルボジイミド化、イミダゾール化などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール化であるのがよい）反応により官能基とカルボキシメチルデキストランのＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記カルボキシメチルデキストランを得る、上記方法。【００３８】
＜５２＞  上記＜５１＞において、２）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２）−１）分子量１万以下、好ましくは５千以下、より好ましくは３千以下であり、一端がアミノ基、他端がカルボン酸基を有する化合物を準備する工程；及び
２）−２）  該化合物を、溶媒中、触媒存在下で、アジド化物（例えば、イミダゾール-1-スルホニルアジド、又はトリフリックアジドなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール-1-スルホニルアジドであるのがよい）と反応させる工程；
を有することにより得られるのがよい。【００３９】
＜５３＞  −ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基（式中、Ｘ４は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたカルボキシメチルデキストランの製造方法であって、
１’）カルボキシメチルデキストランを準備する工程；
２’）シクロオクチン基及びシクロオクチン基以外の官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ヒドラジド基、アルデヒド基、又は水酸基などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはカルボキシル基、アミノ基又はヒドラジド基、より好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であるのがよい）を有する物質を準備する工程；
３’）  １’）カルボキシメチルデキストランを、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない）でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  ２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５’）  ４）溶液と３’）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化（例えば、カルボジイミド化、イミダゾール化などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール化であるのがよい）反応により官能基とカルボキシメチルデキストランのＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、上記’）カルボキシメチルデキストランを得る、上記方法。【００４０】
＜５４＞  上記＜５３＞において、２’）物質の官能基がカルボン酸基であり、
該物質を、
２’）−１）  水酸基及びエステル基を有する物質（例えば、グリコール酸メチル、乳酸メチル、tert−ブチルー４―ヒドロキシブチレートなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはグリコール酸メチル又は乳酸メチル、より好ましくはグリコール酸メチルであるのがよい）と、シクロへプテンのブロモホルム付加体とを、有機溶媒中、触媒（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀を挙げることができるがこれらに限定されない）存在下で反応させて、1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を得る工程；
２’）−２）  1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を、溶媒中、脱臭素アルキン化して、シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を得る工程；及び
２’）−３）  シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を加水分解反応に付す工程；
を有することにより得られるのがよい。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、新規なハイドロゲル、特に多糖類を骨格高分子に用いた新規なハイドロゲル、より特に、in vivo環境下における生体適合性を有する、新規なin situ架橋ハイドロゲルを提供することができる。詳細には、２種類のポリマー成分を簡易な操作で生体に注入することによって、生体内において効率的なin situ架橋ハイドロゲルを形成することができるという効果を奏する。
また、本発明により、上記効果以外に、又は、上記効果に加えて、該ハイドロゲルを有する材料、特に生体適合性材料を提供することができる。ここで、本発明の生体適合性材料は、従来のポリエチレングリコール等によるハイドロゲルと比較して、優れた生分解性を有する生体適合性材料を提供することができる点で有益である。
さらに、本発明により、上記効果以外に、又は、上記効果に加えて、該ハイドロゲルの製造方法を提供することができる。
また、本発明により、上記効果以外に、又は、上記効果に加えて、該ハイドロゲルの原料となる薬剤及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本願のハイドロゲルの構造を模式的に示す図である。
【図２】ダブルシリンジを模式的に説明する図である。
【図３】本願のハイドロゲルを皮下注入した場合の組織染色図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本願に記載する発明を詳細に説明する。
本願は、ハイドロゲル、該ハイドロゲルの製造方法、ハイドロゲルの原料である特定のヒアルロン酸又は特定のカルボキシメチルデキストラン、及び該原料の製造方法を提供する。以下、順に説明する。
【００４４】
＜ハイドロゲル＞
本願は、ａ）ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第１のポリマー部位；
ｂ）上記ａ）と同種であっても異種であってもよいが、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第２のポリマー部位；及び
ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基；
を有し、
ｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基を介して、ａ）第１のポリマー部位とｂ）第２のポリマー部位とが架橋する構造を有するハイドロゲルを提供する。
【００４５】
該ハイドロゲルは、架橋点であるｃ）トリアゾール環基又はその誘導体基を中心として見ると、図１に示す模式的な構造１を有する。
即ち、図１は、本願のハイドロゲルの構造１を模式的に示す図である。
ハイドロゲルの構造１は、第１のポリマー部位２；及び第２のポリマー部位３；並びにトリアゾール環基又はその誘導体基４を有する。なお、図１において、図示を簡素化するために、４として、トリアゾール環基のみを記載する。
第１のポリマー部位２；及び第２のポリマー部位３は、トリアゾール環基４を介して架橋される。なお、第１のポリマー部位２とトリアゾール環基４との間にスペーサー基Ｘ１を有してなる。また、第２のポリマー部位とトリアゾール環基４との間にスペーサー基Ｘ２を有してなる。なお、Ｘ１及びＸ２については後述する。
【００４６】
第１のポリマー部位は、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれるのがよく、好ましくはヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、キトサンであるのがよい。
第２のポリマー部位は、第１のポリマー部位と同種であっても異種であってもよいが、第１のポリマー部位とは異なる分子からなる。第２のポリマー部位は、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれるのがよく、好ましくはヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、又はキトサンであるのがよい。
【００４７】
トリアゾール環基は、図１の４に示す通りであるが、その誘導体基として、例えばモノフッ化シクロオクチル基、又はジフッ化シクロオクチル基など、該トリアゾール基のシクロオクチル基がハロゲン基で置換される基；もしくはジメトキシアゾシクロオクチル基などの、PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 107, 5, pp. 1821-1826 (2010）（この文献はその全体が本明細書に参照として含まれる）に記載される基；などを挙げることができるがこれらに限定されない。
第１及び第２のポリマー部位は、上記の群から選ばれ、それらはＯＨ基及び／又は−ＮＨ２基を有する。トリアゾール環基又はその誘導体基は、該第１のポリマー部位の全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。また、トリアゾール環基又はその誘導体基は、第２のポリマー部位の全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。
【００４８】
第１のポリマー部位とトリアゾール環基又はその誘導体基との間にスペーサー基Ｘ１を有してもよい。なお、Ｘ１は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す。Ｘ１は、好ましくはエーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。
また、第１のポリマー部位は、上述の群から選ばれ、それらは−ＯＨ基及び／又は−ＮＨ２基を有する。Ｘ１は、該ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ１−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。
なお、−ＯＨ基は、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基などに適宜、置換され、さらにそれらが置換して、上記の基を形成してもよい。
【００４９】
第１のポリマー部位が−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。また、第１のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様の定義である）が好ましい。
【００５０】
第２のポリマー部位とトリアゾール環基又はその誘導体基との間にスペーサー基Ｘ２を有してもよい。なお、Ｘ２は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す。Ｘ２は、好ましくはエーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。
また、第２のポリマー部位は、上述の群から選ばれ、それらは−ＯＨ基及び／又は−ＮＨ２基を有する。Ｘ２は、該ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ２−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。
なお、−ＯＨ基は、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基などに適宜、置換され、さらにそれらが置換して、上記の基を形成してもよい。
【００５１】
第２のポリマー部位が−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。また、第２のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様の定義である）が好ましい。
【００５２】
本願のハイドロゲルは、高い生体適合性を持つことから、医用材料・美容整形材料・食品材料・化粧品材料などに用いることができる。特に、本願のハイドロゲルは、該ハイドロゲルを有する生体適合性材料として用いることができる。より特に、生体適合性材料として、癒着防止材料、ドラッグデリバリシステム担体、細胞封入用材料、細胞培養皿コーティング剤などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５３】
なお、癒着防止材料は、次のように用いて、生体内での癒着を防止することができる。
即ち、
Ａ）  ａ）アジド基を有するヒアルロン酸、アジド基を有するカルボキシメチルデキストラン、又はアジド基を有するキトサンを含む第１の液；を準備する工程；
Ｂ）  ｂ）シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有するヒアルロン酸、シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有するカルボキシメチルデキストラン、もしくはシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有するキトサンを含む第２の液；を準備する工程；及び
Ｃ’）  ａ）第１の液とｂ）第２の液とを、生体内の癒着を防止する領域に注入し且つａ）第１の液とｂ）第２の液とを混合する工程；
を有することにより、ハイドロゲルを形成し、該ハイドロゲルにより癒着を防止することができる。
【００５４】
また、細胞封入用材料は、次のように用いて、生体内細胞を封入することができる。
即ち、  Ａ）  ａ）アジド基を有するヒアルロン酸、アジド基を有するカルボキシメチルデキストラン、又はアジド基を有するキトサンを含む第１の液；を準備する工程；
Ｂ）  ｂ）シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有するヒアルロン酸、シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有するカルボキシメチルデキストラン、もしくはシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有するキトサンを含む第２の液；を準備する工程；及び
Ｃ”）  ａ）第１の液とｂ）第２の液とを、生体内でのターゲット細胞の近傍に注入し且つａ）第１の液とｂ）第２の液とを混合する工程；
を有することにより、ハイドロゲルを形成し、該ハイドロゲルにより、ターゲット細胞を封入することができる。
【００５５】
＜ハイドロゲルの製造方法＞
上記ハイドロゲルは、次のような方法で製造することができる。
即ち、Ａ）  ａ）ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第１のポリマーであって、且つ該第１のポリマーがアジド基を有する、第１のポリマーを含む液を準備する工程；
Ｂ）  ｂ）上記ａ）と同種であっても異種であってもよいが、上記ａ）とは異なる分子からなる、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれる第２のポリマーであって、且つ該第２のポリマーがシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体を有する、第２のポリマーを含む液を準備する工程；及び
Ｃ）  ａ）第１の液とｂ）第２の液とを混合する工程；
を有することにより、アジド基とシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体とのクリック反応により、トリアゾール環又はその誘導体が形成され、該トリアゾール環又はその誘導体を介して、第１のポリマーと第２のポリマーとが架橋する構造を有するハイドロゲルを形成して、ハイドロゲルを得ることができる。ここで、工程Ｃ）は、上述のとおり、生体内で行われることができる。
【００５６】
工程Ａ）及びＢ）は、それぞれ、第１及び第２のポリマーを含む液を準備する工程である。
第１のポリマーは、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれ、且つアジド基を有する。
また、第２のポリマーは、ヒアルロン酸、カルボキシメチルデキストラン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）及びキトサンからなる群から選ばれ、且つアジド基を有する。
第１及び第２のポリマー自体の調製については、後述する。
【００５７】
第１のポリマーを含む液は、得られた第１のポリマーを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液、ハンクス液、生理食塩水、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）やロズウエルパークメモリアルインスティテュート１６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）細胞培養培地などの溶媒に溶解することにより得ることができる。
また、第２のポリマーを含む液も、第１のポリマーを含む液と同様に、得られた第１のポリマーを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液、ハンクス液、生理食塩水、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）やロズウエルパークメモリアルインスティテュート１６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）細胞培養培地などの溶媒（第２のポリマーを含む液に用いる溶媒は、第１のポリマーを含む液に用いるそれと同じであっても異なってもよい）に溶解することにより得ることができる。
【００５８】
第１及び第２のポリマーを含む液のそれぞれの濃度は、用いる第１及び第２のポリマー、溶媒、所望とするゲル化時間などに依存するが、０．０１〜２０％、好ましくは０．５〜１０％、より好ましくは１〜５％であるのがよい。  
【００５９】
工程Ｃ）は、工程Ａ）及びＢ）で得られた液を混合する工程である。
混合は、種々の方法により行うことができる。混合体を所望の位置に配置し、その位置でゲルを形成する場合、Ｃ）混合工程は、ダブルシリンジを用いるのが好ましい。
図２は、ダブルシリンジ１１を模式的に説明する図である。
ダブルシリンジ１１は、シリンジ１２とシリンジ１３とを隣接して配置し、且つその射出部を連結してシリンジ１２内の液とシリンジ１３内の液とを混合して射出する混合射出部１４を有する。なお、図２は、ダブルシリンジの一例であって、２液を混合し且つ所望の位置に該混合液を射出する機能を有する限り、その他の構成を有してもよい。
【００６０】
ダブルシリンジを用いる場合、その一方にａ）第１のポリマーを含む液を入れ、他方にｂ）第２のポリマーを含む液を入れ、該ダブルシリンジからａ）第１のポリマーを含む液及びｂ）第２のポリマーを含む液をほぼ同時に射出して混合し、かつ所望の位置に混合体を配置するのがよい。
【００６１】
Ｃ）混合工程は、用いる第１及び第２のポリマー、溶媒などに依存するが、生理環境温度である３７℃から室温である２５℃の間の温度、常圧で行うのがよい。
【００６２】
また、好ましい態様として、工程Ａ）〜Ｃ）は、キットを用いて行うことができる。例えば、当該キットは、少なくとも、適切な量の第１のポリマーを含む液及び第２のポリマーを含む液を別個に収納したものである。従って、かかるキットも本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
第１のポリマーは、アジド基との間にスペーサー基Ｘ１（Ｘ１は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）を有するのがよい。
Ｘ１は、好ましくはエーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。
また、第１のポリマーは、上述の群から選ばれ、それらは−ＯＨ基及び／又は−ＮＨ２基を有する。Ｘ１は、該ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ１−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ１−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−であるのがよい。
なお、−ＯＨ基は、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基などに適宜、置換され、さらにそれらが置換して、上記の基を形成してもよい。
【００６４】
第１のポリマーが−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ１−を形成してもよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ１１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−を形成するのがよい。また、第１のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ１−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ１１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１１−（Ｘ１１は、上記Ｘ１と同様の定義である）が好ましい。
【００６５】
アジド基は、第１のポリマーの全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。
【００６６】
第２のポリマーは、シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体との間にスペーサー基Ｘ２（Ｘ２は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）を有するのがよい。
Ｘ２は、好ましくはエーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよく、より好ましくはエステル基、エーテル基、またはアミド基を有する、アルキレン基を有する基又は多糖類由来の基であるのがよい。
また、第２のポリマーは、上述の群から選ばれ、それらは−ＯＨ基及び／又はＮＨ２基を有する。Ｘ２は、該ＯＨ基を置換して結合し、−Ｏ−Ｘ２−を形成するのがよく、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−Ｓ−Ｓ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ２と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ２−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−であるのがよい。
なお、−ＯＨ基は、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基などに適宜、置換され、さらにそれらが置換して、上記の基を形成してもよい。
【００６７】
第２のポリマーが−ＣＯＯＹ基（Ｙは、Ｈ又はＮａなどの１価のカチオンを意味する）を有する場合、該基を置換して結合し、−ＣＯ−Ｘ２−を形成してもよく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｘ２１−、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ１と同様にアルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、好ましくは−ＣＯ−Ｏ−Ｘ２１−、−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−を形成するのがよい。また、第２のポリマー部位が−ＮＨ２基を有する場合、該基を置換して結合し、−ＮＨ−Ｘ２−を形成するのがよく、−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ２１−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ２１−（Ｘ２１は、上記Ｘ１と同様の定義である）が好ましい。
【００６８】
シクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体は、ｂ）第２のポリマーの全−ＯＨ基又は全−ＮＨ２基を１００ｍｏｌ％とした場合、５〜６０ｍｏｌ％、好ましくは１０〜５０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜３０ｍｏｌ％で存在するのがよい。
なお、シクロオクチン基誘導体は、上述と同じ定義を有する。
【００６９】
＜ハイドロゲルの原料である特定のヒアルロン酸＞
本願は、ハイドロゲルの原料である特定のヒアルロン酸を提供する。
＜＜アジド基を有するヒアルロン酸＞＞
本願は、アジド基を有するヒアルロン酸、即ち、−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基（式中、Ｘ３は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたヒアルロン酸を提供する。
Ｘ３は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−、−Ｏ−Ｘ３１−（Ｘ３１は、アルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ３−は、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
【００７０】
アジド基を有するヒアルロン酸は、下記式（１）を有するのがよい。式（１）において、Ｒのうち少なくとも１つは式（１）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｎは１００〜２０，０００の整数を示す。
【００７１】
【化５】
2012165462.tif 000006
【００７２】
＜＜シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸＞＞
本願は、シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸、即ち−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基（式中、Ｘ４は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたヒアルロン酸を提供する。
シクロオクチン誘導体基として、例えばモノフッ化シクロオクチン基、又はジフッ化シクロオクチン基など、該シクロオクチン基の一部がハロゲン基で置換される基；もしくはジメトキシアゾシクロオクチン基などの、PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 107, 5, pp. 1821-1826 (2010）（この文献はその全体が本明細書に参照として含まれる）に記載される基などを挙げることができるがこれらに限定されない。
Ｘ４は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−、−Ｏ−Ｘ４１−（Ｘ４１は、アルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ４−は、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
【００７３】
シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸は、下記式（２）を有するのがよい。式（２）中、Ｒのうち少なくとも１つは式（２）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｎ’は１００〜２０，０００の整数を示す。
【００７４】
【化６】
2012165462.tif 000007
【００７５】
＜ハイドロゲルの原料である特定のカルボキシメチルデキストラン＞
本願は、ハイドロゲルの原料である特定のカルボキシメチルデキストランを提供する。
＜＜アジド基を有するカルボキシメチルデキストラン＞＞
本願は、アジド基を有するカルボキシメチルデキストラン、即ち、−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基（式中、Ｘ３は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたカルボキシメチルデキストランを提供する。
Ｘ３は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ３−Ｎ３基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−、−Ｏ−Ｘ３１−（Ｘ３１は、アルキレン基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ３１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ３−は、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
【００７６】
アジド基を有するカルボキシメチルデキストランは、下記式（３）を有するのがよい。式（３）中、Ｒ１のうち、１つはＣＨ２ＣＯＯＮａであり、少なくとも１つは式（３）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｉは１００〜２０，０００の整数を示す。
【００７７】
【化７】
2012165462.tif 000008
【００７８】
＜＜シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するカルボキシメチルデキストラン＞＞
本願は、シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するカルボキシメチルデキストラン、即ち、−ＯＨ基の少なくとも一部が−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基（式中、Ｘ４は、単結合、又は分子量１万以下の基を表す）に置換されたカルボキシメチルデキストランを提供する。
Ｘ４は、−Ｏ−と共に、エーテル基またはエステル基を有する、アルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−Ｏ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基は、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−、−Ｏ−Ｘ４１−（Ｘ４１は、アルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｘ４１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ４−は、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
【００７９】
シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するカルボキシメチルデキストランは、下記式（４）を有するのがよい。式（４）中、Ｒ１のうち、１つはＣＨ２ＣＯＯＮａであり、少なくとも１つは式（４）−１で表す基であり、それ以外はＨを示し、ｉ’は１００〜２０，０００の整数を示す。
【００８０】
【化８】
2012165462.tif 000009
【００８１】
＜ハイドロゲルの原料である特定のキトサン＞
本願は、ハイドロゲルの原料である特定のキトサンを提供する。
＜＜アジド基を有するキトサン＞＞
本願は、アジド基を有するキトサン、−ＮＨ２基が−ＮＨ−Ｘ３−Ｎ３基に置換されたキトサンであって、ここで、当該Ｘ３は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該キトサンを提供する。。Ｘ３は、−ＮＨ−と共に、アミド基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−ＮＨ−Ｘ３−Ｎ３基は、好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ３１−、−ＮＨ−Ｘ３１−（Ｘ３１は、上記Ｘ３と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ３１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ３−が、−ＣＯ−（ＣＨ２）３−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
【００８２】
＜＜シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するキトサン＞＞
本願は、シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するカルボキシメチルデキストラン、即ち、−ＮＨ２基が−ＮＨ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基に置換されたキトサンであって、ここで、当該Ｘ４は、エーテル基、エステル基、アミド基、ヒドラジド基、ジスルフィド基、及びカルボニル基からなる群から選択される１以上の置換基を有するアルキレン基である、当該キトサン。Ｘ４は、−ＮＨ−と共に、アミド基を有するアルキレン基又は多糖類由来の基であるのがよい。また、−ＮＨ−Ｘ４−（シクロオクチン又はシクロオクチン誘導体）基は、好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ４１−、−ＮＨ−Ｘ４１−（Ｘ４１は、上記Ｘ４と同様にアルキレン基を有する基又は多糖類由来の基を示す）、より好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ４１−を形成するのがよい。特に、−Ｘ４−が、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−−又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、ｍは１以上の整数を示す）であるのがよい。
【００８３】
＜ハイドロゲルの原料である特定のヒアルロン酸の製造方法＞
本願は、ハイドロゲルの原料である特定のヒアルロン酸の製造方法を提供する。
＜＜アジド基を有するヒアルロン酸の製造方法＞＞
上述のアジド基を有するヒアルロン酸は、次の方法により製造することができる。
即ち、１）ヒアルロン酸を準備する工程；
２）アジド基及びアジド基以外の官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ヒドラジド基、アルデヒド基、又は水酸基などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはカルボキシル基、アミノ基又はヒドラジド基、より好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であるのがよい）を有する物質を準備する工程； 
３）  １）ヒアルロン酸を、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない）でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  ２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５）  ４）溶液と３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化（例えば、カルボジイミド化、イミダゾール化などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール化であるのがよい）反応により官能基とヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、アジド基を有するヒアルロン酸を得ることができる。
【００８４】
工程１）は、ヒアルロン酸を準備する工程である。ヒアルロン酸の準備は、調製しても、市販購入してもよい。
【００８５】
工程２）は、工程１）とは別に、アジド基及びアジド基以外の官能基を有する物質を準備する工程である。該物質は、アジド基を有するヒアルロン酸において、上述のスペーサー基Ｘ３及びアジド基となる箇所である。
特に、該物質の官能基がカルボン酸基である場合、次のように調製することができる。
即ち、２）−１）分子量１万以下、好ましくは５千以下、より好ましくは３千以下であり、一端がアミノ基、他端がカルボン酸基を有する化合物を準備する工程；及び
２）−２）  該化合物を、溶媒中、触媒存在下で、アジド化物（例えば、イミダゾール-1-スルホニルアジド、又はトリフリックアジドなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール-1-スルホニルアジドであるのがよい）と反応させる工程；
を有することにより得られることができる。
【００８６】
工程２）−１）の化合物として、例えば、グリシン、γ−アミノ酪酸、４−アミノ−４−オキソブタノイック酸、ガバペンチン、アミノチオ酢酸などを挙げることができるがこれらに限定されない。工程２）−１）の化合物として、好ましくはグリシン又はγ−アミノ酪酸、より好ましくはγ−アミノ酪酸であるのがよい。
工程２）−２）の溶媒として、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、クロロホルム、塩化メチレンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。工程２）−２）の溶媒として、好ましくはメタノール又はエタノール、より好ましくはメタノールであるのがよい。
また、触媒として、硫酸銅などを挙げることができるがこれに限定されない。
さらに、アジド化物として、例えば、イミダゾール-1-スルホニルアジド、又はトリフリックアジドなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール-1-スルホニルアジドであるのがよい。
ここで、工程２）−２）は、用いる化合物、用いる溶媒、用いる触媒、及び用いるアジド化物などに依存するが、０℃〜４℃の条件で行うのがよい。
【００８７】
工程３）は、上記のヒアルロン酸を、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程である。
水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩として、例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない。
また、可溶化する際に用いる有機溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルムアミド、ジオキサン、Ｎ−メチルピロリドン、トルエン、及びシクロヘキサンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはエタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、又はジメチルフォルムアミド、より好ましくはエタノール、アセトン、又はテトラヒドロフランであるのがよい。
ここで、工程３）は、用いる水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩、及び用いる有機溶媒などに依存するが、温度２０〜４０℃、ｐＨ４〜１２の条件で行うのがよい。
【００８８】
工程４）は、上記工程２）で得られた物質の、有機溶媒の溶液を得る工程である。ここで、有機溶媒として、例えばジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルムアミド、ジオキサン、Ｎ−メチルピロリドン、トルエン、及びシクロヘキサンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルムアミド、又はジオキサン、より好ましくはジメチルスルホキシドであるのがよい。工程３）で用いる有機溶媒と同じであっても異なってもよいが、残留時の体内での危険性の観点から、ジメチルスルホキシドであるのがよい。
【００８９】
工程５）は、工程４）で得られた溶液と、工程３）で得られた可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化反応により官能基とヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；である。
カルボキシル化反応は、例えば、カルボジイミド化反応、イミダゾール化反応などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはイミダゾール化反応であるのがよい。
工程５）は、工程４）で得られた溶液、工程３）で得られた可溶化体の溶液、カルボキシル化反応などに依存するが、温度２０〜４０℃、ｐＨ４〜１２の条件で行うのがよい。
【００９０】
＜＜シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸の製造方法＞＞
上述のシクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸は、次の方法により製造することができる。
即ち、１）ヒアルロン酸を準備する工程；
２’）シクロオクチン基及びシクロオクチン基以外の官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ヒドラジド基、アルデヒド基、又は水酸基などを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはカルボキシル基、アミノ基又はヒドラジド基、より好ましくはカルボキシル基又はアミノ基であるのがよい）を有する物質を準備する工程；
３）  １）ヒアルロン酸を、水にも有機溶媒にも可溶な長鎖アルキルアンモニウムカチオンを持つ塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム塩など、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩、トリオクチルメチルアンモニウム塩、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を挙げることができるがこれらに限定されない）でイオン交換し有機溶媒に可溶化させ、可溶化体の溶液を調製する工程；
４）  ２）物質の有機溶媒の溶液を得る工程；及び
５）  ４）溶液と３）可溶化体の溶液とを混合し、且つカルボキシル化反応により官能基とヒアルロン酸のＯＨ基とを反応させる工程；
を有することにより、シクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸を得ることができる。
【００９１】
上記工程１）、３）〜５）については、上述と同じである。
工程２’）は、工程１）とは別に、シクロオクチン基及びシクロオクチン基以外の官能基を有する物質を準備する工程である。該物質は、シクロオクチン基及びシクロオクチン基を有するヒアルロン酸において、上述のスペーサー基Ｘ４及びシクロオクチン基又はシクロオクチン基誘導体となる箇所である。
【００９２】
特に、工程２’）の物質の官能基がカルボン酸基である場合、次のように調製することができる。
２’）−１）  水酸基及びエステル基を有する物質（例えば、グリコール酸メチル、乳酸メチル、tert−ブチルー４―ヒドロキシブチレートなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはグリコール酸メチル又は乳酸メチル、より好ましくはグリコール酸メチルであるのがよい）と、シクロへプテンのブロモホルム付加体とを、有機溶媒中、触媒（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀を挙げることができるがこれらに限定されない）存在下で反応させて、1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を得る工程；
２’）−２）  1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を、溶媒中、脱臭素アルキン化して、シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を得る工程；及び
２’）−３）  シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を加水分解反応に付す工程；
を有することにより得ることができる。
【００９３】
工程２’）−１）は、水酸基及びエステル基を有する物質と、シクロへプテンのブロモホルム付加体とを、有機溶媒中、触媒存在下で反応させて、1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を得る工程である。
水酸基及びエステル基を有する物質として、例えば、グリコール酸メチル、乳酸メチル、tert−ブチルー４―ヒドロキシブチレートなどを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくはグリコール酸メチル又は乳酸メチル、より好ましくはグリコール酸メチルであるのがよい。
有機溶媒として、用いる水酸基及びエステル基を有する物質、用いる触媒などに依存するが、トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、又はノルマルヘキサンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
触媒として、用いる水酸基及びエステル基を有する物質、用いる有機溶媒などに依存するが、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀を挙げることができるがこれらに限定されない。
工程２’）−１）は、用いる水酸基及びエステル基を有する物質、用いる有機溶媒、用いる触媒などに依存するが、温度２０〜４０℃、ｐＨ４〜１２の条件で行うのがよい。
【００９４】
工程２’）−２）は、工程２’）−１）で得られた1-ブロモシクロオクテン基及びエステル基を有する物質を、溶媒中、脱臭素アルキン化して、シクロオクチン基及びエステル基を有する物質を得る工程である。
溶媒として、トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、又はノルマルヘキサンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
工程２’）−２）は、温度２０〜４０℃、ｐＨ４〜１２の条件で行うのがよい。
【００９５】
工程２’）−３）は、工程２’）−２）で得られたシクロオクチン基及びエステル基を有する物質を加水分解反応に付す工程である。
工程２’）−３）は、温度２０〜４０℃、ｐＨ４〜１２の条件で行うのがよい。
【００９６】
＜ハイドロゲルの原料である特定のカルボキシメチルデキストランの製造方法＞
本願は、ハイドロゲルの原料である特定のカルボキシメチルデキストランの製造方法を提供する。
なお、アジド基を有するカルボキシメチルデキストラン及びシクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するカルボキシメチルデキストランの製造方法は、それぞれ、アジド基を有するヒアルロン酸及びシクロオクチン基又はシクロオクチン誘導体基を有するヒアルロン酸の製造方法において、ヒアルロン酸の代わりにカルボキシメチルデキストランを用いることによって、提供することができる。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９８】
＜Ａ．アジド基を有するヒアルロン酸の合成＞
＜＜イミダゾール-1-スルホニルアジドの合成＞＞【００９９】
【化９】
2012165462.tif 000010
【０１００】
２００ｍＬナスフラスコにアジ化ナトリウム３．２０ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加え、脱水アセトニトリル５０ｍＬを注いで撹拌、懸濁させた。次いで、氷浴にし、窒素雰囲気下にした。この懸濁液に、塩化スルフリル４ｍＬ（５０ｍｍｏｌ）を滴下し、その後、室温で一晩撹拌した。氷浴下で、イミダゾール６．８０ｇ（０．１ｍｏｌ）を加え、室温で２４時間、撹拌し、反応溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル５０ｍＬ及び純水１００ｍＬを加え抽出した。有機相を漏斗に残し、再び純水１００ｍＬを加えて抽出した。この抽出操作を３回繰り返した。
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍＬを、水相除去後の漏斗に加えて有機相を洗浄した。この操作を３回繰り返した。
有機相を回収し、硫酸マグネシウムを加えて室温で一晩乾燥し、その後、硫酸マグネシウムを除去し、エバポレーターによって溶媒を留去した。さらに、数日間、真空乾燥させ、無色透明の題記目的物（収量５．１４ｇ（２９．７ｍｍｏｌ）、収率６０．３％）を得た。【０１０１】
＜＜γ−アジド酪酸の合成＞＞【０１０２】
【化１０】
2012165462.tif 000011
【０１０３】
３００ｍＬナスフラスコにγ−アミノ酪酸２．４１ｇ（２３．４ｍｍｏｌ）、硫酸銅４９．６ｍｇ（０．３１１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム６．００ｇ（４３．４ｍｍｏｌ）を加えた。これに、メタノール１２０ｍＬを加え、室温で撹拌した。攪拌４０分後、イミダゾール-1-スルホニルアジド４．８８ｇ（２８．２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一晩撹拌した。１２Ｍ  ＨＣｌ数ｍＬを滴下し、ｐＨを約１１から３まで酸性化した。反応溶液を分液漏斗に移し、純水２５０ｍＬ及び酢酸エチル２００ｍＬを加え、有機相を抽出した。残した水相に酢酸エチル１００ｍＬを加え、洗浄した（×３回)。有機相を回収し、硫酸マグネシウムを加えて室温で一晩乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過後、エバポレートにより溶媒を留去した。真空乾燥により、薄黄色の題記目的物（収量３．６７７ｇ（２８．４８ｍｍｏｌ）、収率１２２％）を得た。【０１０４】
＜＜アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１の合成＞＞
ヒアルロン酸のＡＧＵ（Anhydrous Glucose Units：繰返単位）：カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）：γ−アジド酪酸の量論比が１：２：２となるように、それぞれを用いた。
ナスフラスコにヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）を加え、ＤＭＳＯに溶解した。
別途、ナスフラスコにγ−アジド酪酸及びＣＤＩを加え、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してγ−アジド酪酸のカルボキシル基を活性化させ、１時間反応させた。
反応物を、ヒアルロン酸のＤＭＳＯ溶液に滴下した。なお、滴下１０分前から６０℃に加熱し、１６〜２０時間後、加熱、撹拌を終了し、室温で静置した。静置後一時間後に、純水３Ｌ中で透析し、１時間ごとに水を取り換えた。１２時間に１回透析液を交換して３日間透析を続けた後、ファルコンチューブに回収し、凍結乾燥し、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１を得た。１Ｈ−ＮＭＲにより、用いたヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）由来のプロトンと側鎖であるアジド基側に由来するプロトンとの存在比から、用いたヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）の全−ＯＨ基を１００ｍｏｌ％とした場合、アジド基は、１０．８ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例２】
【０１０５】
＜＜アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−２の合成＞＞
実施例１のヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）の代わりに、ヒアルロン酸（Ｍｗ＝８００，０００Ｄａ）を用いた以外、実施例１と同様の方法により、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−２を得た。実施例１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、アジド基は、１２．６ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例３】
【０１０６】
＜＜アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−３の合成＞＞
実施例１のヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）の代わりに、カルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）を用いて、ＡＧＵ：ＣＤＩ：γ−アジド酪酸の量論比が１：３：３とした以外、実施例１と同様の方法により、アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−３を得た。実施例１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、アジド基は、６．９ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例４】
【０１０７】
＜＜アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−４の合成＞＞
実施例３のカルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）の代わりに、カルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝１６０，０００Ｄａ）を用いた以外、実施例３と同様の方法により、アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−４を得た。実施例１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、アジド基は、２２．２ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例５】
【０１０８】
＜＜アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−５の合成＞＞
実施例３のカルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）の代わりに、カルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝５８０，０００Ｄａ）を用いた以外、実施例３と同様の方法により、アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−５を得た。実施例１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、アジド基は、２７．５ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例６】
【０１０９】
＜＜アジド基を有するキトサンＡ−６の合成＞＞
【化１１】
2012165462.tif 000012
１００ｍＬビーカー中で、キトサン０．２６９６ｇ(１．０１ｍｍｏｌ ｐｅｒ ｕｎｉｔ)を０．１ＮＨＣｌ ３０ｍＬに溶解させた。５分程度で完全に溶解した。２０ｍＬナスフラスコ中にアジド酪酸 ０．３８４８ｇ(２．９８ｍｍｏｌ、２．９ｅｑ)を加え、ＤＭＳＯ ３ｍＬに溶解させた。これにＨＯＢｔ ０．４０６１ｇ(３．０１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ)を加え、カルボニル基を活性化させた。当該溶液を、上記キトサン溶液に滴下し、さらに、ＥＤＣ １．１５２２ｇ(６．０１ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ)を加えた。１８時間後撹拌を止め、純水及び炭酸水素ナトリウム中で透析を行った。４日後透析を終了し、凍結乾燥し、目的物であるキトサンアジドを回収した。実施例１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、アジド基の存在比を確認した。
【実施例７】
【０１１０】
＜Ｂ．シクロオクチン基を有するヒアルロン酸の合成＞
＜＜シクロへプテンへのブロモホルム付加＞＞【０１１１】
【化１２】
2012165462.tif 000013
【０１１２】
三口フラスコに脱水ペンタン１００ｍＬを注ぎ、シクロヘプテン７．６２ｇ（７９．２７ｍｍｏｌ）及びカリウムtert-ブトキシド１７．７７ｇ（０．１６ｍｏｌ）を加えて、氷浴、窒素雰囲気下で撹拌した。40分後、マイクロシリンジによってブロモホルム３０．０２ｇ（０．１２ｍｏｌ）を滴下した。３０時間かけて滴下後、室温で一晩撹拌した。その後、純水２００ｍＬ及び１２Ｍ  ＨＣｌ約２ｍＬを加え、溶液を中和した（ｐＨ１０．８〜約６）。得られた液を抽出漏斗に注ぎ、有機相を回収した。また、残った水相にペンタン１００ｍＬを加え、抽出した（×３回）。回収した有機相を再び抽出漏斗に注ぎ、純水２００ｍＬを加えて洗浄した（×３回）。取り出した有機相約５００ｍＬに硫酸マグネシウムを加え、一晩乾燥し、その後、硫酸マグネシウムを濾過し、エバポレートにより溶媒を留去した。真空乾燥により、黒茶色の目的生成物を得た。【０１１３】
＜＜グリコールメチル付加＞＞【０１１４】
【化１３】
2012165462.tif 000014
【０１１５】
ナスフラスコに上記で得られたジブロミド４．０１ｇ（１４．９６ｍｍｏｌ）及びグリコール酸メチル１３．３７ｇ（０．１５ｍｏｌ）を加えた後、トルエン２０ｍＬを注ぎ溶解した。フラスコをアルミホイルで遮光した後、トリフルオロスルホン酸銀１１．４３ｇ（４４．４９ｍｍｏｌ）を加え、そのまま室温で２８時間、撹拌し、その後、エバポレーターによりトルエンを留去した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１））を行った（Ｒｆ値３．５−４）。カラム体積の２．５倍程度の溶出液を流したところでtrans体の溶出を確認した。以後の溶液を回収し、カラム体積の１０倍程度まで溶出を続けた。溶出液をナスフラスコに回収し、エバポレーターによって溶媒を留去した。その後、真空乾燥により濃黄色の目的生成物を得た（収量２．８４ｇ（１０．２３ｍｍｏｌ）、収率６８．４％）。【０１１６】
＜＜脱臭素アルキン化及び末端メチルエステルの加水分解＞＞
上記で得られた物質を、Ｅ２脱離により、ＨＢｒが引き抜かれてアルキンとした後、末端メチルエステルを加水分解し、カルボン酸とした。【０１１７】
【化１４】
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【０１１８】
ナスフラスコにナトリウムメトキシド３．７６ｇ（６９．５６ｍｍｏｌ）を加え、脱水メタノール１１０ｍＬに溶解し、さらに脱水ＤＭＳＯ６．５ｍＬを滴下し、撹拌した。10分後、上記で得られたシクロオクチン誘導体２．８４ｇ（１０．２３ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌し、その後、エバポレーターにより、メタノールを留去した。得られた溶液を抽出漏斗に加えた後、１．２Ｍ  ＨＣｌ  ２００ｍＬ及び塩化メチレン１００ｍＬを加え、抽出した。残った水相に塩化メチレン１００ｍＬを加え、抽出した（×３回）。有機相を回収し、硫酸マグネシウムを加えて一晩乾燥し、その後、硫酸マグネシウムを濾過し、エバポレーターにより溶媒を留去した。その後、真空乾燥により、濃黄色の目的生成物を得た（収量２．２４８５ｇ（１２．３４ｍｍｏｌ）、  収率１２１％）。【０１１９】
＜＜シクロオクチン基を有するヒアルロン酸の合成＞＞
ヒアルロン酸のＡＧＵ：カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）：上記で得られたシクロオクチン基を有するカルボン酸の量論比が１：２：２となるように、それぞれを用いた。
ナスフラスコにヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）を加え、ＤＭＳＯに溶解した。
別途、ナスフラスコに上記で得られたシクロオクチン基を有するカルボン酸及びＣＤＩを加え、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、上記で得られたシクロオクチン基を有するカルボン酸のカルボキシル基を活性化させ、１時間反応させた。
反応物を、ヒアルロン酸のＤＭＳＯ溶液に滴下した。なお、滴下１０分前から６０℃に加熱し、１６〜２０時間後、加熱、撹拌を終了し、室温で静置した。静置後一時間後に、純水３Ｌ中で透析し、１時間ごとに水を取り換えた。３日間、透析を続けた後、ファルコンチューブに回収し、凍結乾燥し、シクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−１を得た。
１Ｈ−ＮＭＲにより、用いたヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）由来のプロトンと側鎖であるシクロオクチン基側に由来するプロトンとの存在比から、用いたヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）の全−ＯＨ基を１００ｍｏｌ％とした場合、シクロオクチン基は、２５．３ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例８】
【０１２０】
＜＜シクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−２の合成＞＞
実施例６のヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）の代わりに、ヒアルロン酸（Ｍｗ＝８００，０００Ｄａ）を用いた以外、実施例６と同様の方法により、シクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−２を得た。実施例６と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、シクロオクチン基は、１４．６ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例９】
【０１２１】
＜＜シクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−３の合成＞＞
実施例６のヒアルロン酸（Ｍｗ＝８０，０００Ｄａ）の代わりに、カルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）を用いて、ＡＧＵ：ＣＤＩ：γ−アジド酪酸の量論比が１：３：３とした以外、実施例６と同様の方法により、シクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−３を得た。実施例６と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、シクロオクチン基は、５６．６ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例１０】
【０１２２】
＜＜シクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−４の合成＞＞
実施例８のカルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）の代わりに、カルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝１６０，０００Ｄａ）を用いた以外、実施例８と同様の方法により、シクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−４を得た。実施例６と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、シクロオクチン基は、１２．４ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例１１】
【０１２３】
＜＜シクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−５の合成＞＞
実施例８のカルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）の代わりに、カルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝５８０，０００Ｄａ）を用いた以外、実施例８と同様の方法により、シクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−５を得た。実施例６と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、シクロオクチン基は、２５．３ｍｏｌ％で存在することを確認した。
【実施例１２】
【０１２４】
＜＜シクロオクチン基を有するキトサンＢ−６の合成＞＞
実施例８のカルボキシメチルデキストラン（Ｍｗ＝４０，０００Ｄａ）の代わりに、キトサンを用いた以外、実施例８と同様の方法により、シクロオクチン基を有するキトサンＢ−６を得た。実施例６と同様に、１Ｈ−ＮＭＲにより、シクロオクチン基の存在比を確認した。
【実施例１３】
【０１２５】
＜ハイドロゲルの調製＞
＜＜ポリマー溶液の調製＞＞
アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、濃度がそれぞれ、５．０、３．０、２．０、１．５、１．０ｗｔ％となるように、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１のＰＢＳ溶液Ｘ−１〜Ｘ−５を調製した。
また、シクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−１も同様に、濃度がそれぞれ５．０、３．０、２．０、１．５、１．０ｗｔ％となるＰＢＳ溶液Ｙ−１〜Ｙ−５を調製した。【０１２６】
＜＜ハイドロゲルの調製＞＞
３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）上に、ＰＢＳ溶液Ｘ−１  １００μＬを滴下した後、ＰＢＳ溶液Ｙ−１  １００μＬを滴下し、滴下後からゲル化までの時間を測定したところ、８分１９秒でハイドロゲルＺ−１を得た。
同様に、ＰＢＳ溶液Ｘ−２〜Ｘ−４とＰＢＳ溶液Ｙ−２〜Ｙ−４とからハイドロゲルＺ−２〜Ｚ−４を得た。なお、ＰＢＳ溶液Ｘ−５とＰＢＳ溶液Ｙ−５との組合せでは、ゲル化が確認できなかった。これらの結果を表１に示す。【０１２７】
【表１】
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【実施例１４】
【０１２８】
＜ヒアルロン酸ハイドロゲルの調製＞
＜＜ポリマー溶液の調製＞＞
実施例１１において、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１の代わりにアジド基を有するヒアルロン酸Ａ−２を用い、且つシクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−１の代わりにシクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−２を用いて、それぞれ、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−２のＰＢＳ溶液Ｘ−６〜Ｘ−１０及びシクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−２のＰＢＳ溶液Ｙ−６〜Ｙ−１０を調製した。【０１２９】
＜＜ゲルの調製＞＞
実施例１１と同様の方法により、ＰＢＳ溶液Ｘ−６〜Ｘ−１０とＰＢＳ溶液Ｙ−６〜Ｙ−１０とからゲルＺ−６〜Ｚ−１０を調製した。
それらの結果を表２に示す。【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
表１及び表２から、ヒアルロン酸の分子量及び用いるＰＢＳ溶液の濃度によって、ゲル化時間が異なることがわかる。
また、ハイドロゲルの膨潤度は初期重量を１００％として、ヒアルロン酸の１００％から４００％の間で体積が膨張し、ＰＢＳ中では２５０時間以上かけて分解し、１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地中では７０時間程度で分解消失した。
【実施例１５】
【０１３２】
＜カルボキシメチルデキストランハイドロゲルの調製＞
アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−４及びシクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−４を用いて、ハイドロゲルを調製した。
具体的には、実施例１１において、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１の代わりにアジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−４を用い、且つシクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−１の代わりにシクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−４を用いて、それぞれ、アジド基を有するカルボキシメチルデキストランＡ−４のＰＢＳ溶液Ｘ−１１（濃度：５．０ｗｔ％）及びシクロオクチン基を有するカルボキシメチルデキストランＢ−４のＰＢＳ溶液Ｙ−１１（濃度：５．０ｗｔ％）を調製した。
それらの溶液Ｘ−１１及びＹ−１１をそれぞれ、図２に示すダブルシリンジの各々のシリンジに充填し、３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）上に滴下したところ、ハイドロゲルＺ−１１を得た。
【実施例１６】
【０１３３】
アジド基を有するキトサンＡ−６及びシクロオクチン基を有するキトサンＢ−６を用いて、ハイドロゲルを調製した。
具体的には、実施例１１において、アジド基を有するヒアルロン酸Ａ−１の代わりにアジド基を有するキトサンＡ−６を用い、且つシクロオクチン基を有するヒアルロン酸Ｂ−１の代わりにシクロオクチン基を有するキトサンＢ−６を用いて、それぞれ、アジド基を有するキトサンＡ−６のＰＢＳ溶液Ｘ−１１（濃度：５．０ｗｔ％）及びシクロオクチン基を有するキトサンＢ−６のＰＢＳ溶液Ｙ−１１（濃度：５．０ｗｔ％）を調製した。
それらの溶液Ｘ−１１及びＹ−１１をそれぞれ、図２に示すダブルシリンジの各々のシリンジに充填し、３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）上に滴下したところ、ハイドロゲルＺ−１２を得た。
【実施例１７】
【０１３４】
＜ハイドロゲルの生体適合性＞
LIVE/DEAD Assay（ロンザ社）により、ハイドロゲルの細胞毒性について評価した。なお、細胞：NIH 3T3   NIH Swissマウス胎仔由来の線維芽細胞；培地：D-MEM（調整済み）；を用いた。
＜＜ハイドロゲル調製用ポリマー溶液の調製＞＞
実施例１で得たヒアルロン酸Ａ−１をＵＶ滅菌し、ＰＢＳに溶解し、ヒアルロン酸Ａ−１のＰＢＳ溶液Ｘ’−１（濃度５．０ｗｔ％）を得た。
同様に、実施例６で得たヒアルロン酸Ｂ−１をＵＶ滅菌し、ＰＢＳに溶解し、ヒアルロン酸Ｂ−１のＰＢＳ溶液Ｙ’−１（濃度５．０ｗｔ％）を得た。【０１３５】
＜＜細胞懸濁液の調製＞＞
細胞：ＮＩＨ３Ｔ３を培養した１５０ｃｍ３フラスコにＰＢＳ１０ｍＬを加え、洗浄・吸引し、浮遊細胞や死細胞を除去した。また、同フラスコにトリプシン５ｍＬを加え、５分間３７℃恒温槽でインキュベートし、細胞を剥離させた。
同フラスコに培地２０ｍＬを加え、剥離した細胞をトリプシンごと５０ｍＬファルコンチューブに回収した。一部を取り分け、トリパンブルーで染色して細胞数をカウントした。
ファルコンチューブに１０００ｒｐｍ、３分間、遠心分離を施し、細胞をチューブ底に集めた。
上澄み液をアスピレーターで除去し、ＰＢＳを加え、細胞分布が均一となるように、細胞濃度が５×１０６個／ｍＬとなる細胞懸濁液を調製した。【０１３６】
上記で得られた細胞懸濁液を、上記で調製したポリマー溶液Ｘ’−１及びＹ’−１の各々に加え、ポリマー濃度：３．０ｗｔ％、細胞濃度２×１０６個／ｍＬとなるＰＢＳ溶液Ｘ”−１及びＹ”−１を調製した。
得られたＰＢＳ溶液Ｘ”−１及びＹ”−１をダブルシリンジ（バクスター社製）の各々に充填し、３５ｍｍガラスボトムディッシュ（マツナミ）上に混合しながら滴下した。２時間程室温で静置し、ハイドロゲルＺ−１４を得た。
その後、ディッシュに新しい培地４ｍＬを加え、３７℃恒温槽でインキュベートした。２日後、アスピレーターで培地を吸引し、ディッシュ上に残ったゲルをＰＢＳに浸してゲルＺ−１４中に浸透した培地を除去した。ハイドロゲルＺ−１４から培地が完全に除去されたのを確認し、CalceinAM及びEthD-1を各々100μL添加した。３０分程静置し、共焦点顕微鏡を用いてゲルＺ−１４内部の蛍光画像を取得した。それぞれの色素で染色された細胞数の比から、ゲルＺ−１４に封入された細胞の生存率を算出した。具体的には、画質改善、ノイズ除去、オブジェクト分離、手動補正等を行い、一定の蛍光強度、蛍光半径のものを拾ってカウントした。ここで、生細胞を示す緑色蛍光強度と、死細胞を示す赤色蛍光強度の比を生存率とし、両者で蛍光が重なる細胞を死細胞として敢えてカウントしたとしても、該生存率は、一日目生存率が６８％、二日目生存率が６４％であった。この結果から、ハイドロゲルＺ−１４は、生体適合性を有することが確認された。
【実施例１８】
【０１３７】
＜ハイドロゲルのin vivo調製＞
実際に生きたラットに、ヒアルロン酸ベースのポリマー溶液を皮下注射してin situで生体内にハイドロゲルを形成し、周辺組織や代謝系臓器にどのような影響が表れるかを組織的に評価した。
＜＜ハイドロゲル調製用ポリマー溶液の調製＞＞
実施例１で得たヒアルロン酸Ａ−１をＵＶ照射によって３時間滅菌処理を行い、ＰＢＳに溶解し、ヒアルロン酸Ａ−１のＰＢＳ溶液Ｘ’−３（濃度２．０ｗｔ％）を得た。
同様に、実施例６で得たヒアルロン酸Ｂ−１をＵＶ滅菌し、ＰＢＳに溶解し、ヒアルロン酸Ｂ−１のＰＢＳ溶液Ｙ’−３（濃度２．０ｗｔ％）を得た。【０１３８】
＜＜ハイドロゲルのin vivo調製＞＞
得られたＰＢＳ溶液Ｘ’−３及びＹ’−３を、ダブルシリンジの各々に充填し、９週齢のＳＤラット♂の頚部に、各々のポリマー溶液を、ダブルシリンジを用いて混合しながら、合計１ｍＬを注入した。注入後、ラットに急性毒性症状は観察されず、一週間の健康状態も良好であった。
一週間後にマウスを安楽死させ、表皮切開および腹腔開腹により各臓器を観察した。ゲル周辺組織、肝臓、脾臓、腎臓を切除し、ホルマリンに浸けて保存し、後日、各臓器の組織断片を作製し、ヘマトキシン・エオシンにより染色（ＨＥ染色）した。作製した標本を光学顕微鏡で観察し、組織的評価を行った。得られた真皮組織の染色図を図３に示す。【０１３９】
＜＜表皮切開＞＞
真皮組織中にゲルの形成を確認した。したがって、ハイドロゲルがin vivo調製され、且つ最大で一週間も残存していたことがわかった。
図３より、ポリマー溶液の注入時に出血した際の赤血球が多少混入しており、ゲル周辺には広範囲の炎症が確認されたが、ＨＥ染色後の組織評価において、炎症の度合いは従来の生体適合性を有するバイオマテリアル移植時に生じる異物反応とそれほど変わらず、組織内部では炎症は見られなかった。したがって、本件発明に係るゲルは、高い生体適合性を有し、新たなin situ架橋ゲルとしての可能性が示唆された。【０１４０】
＜＜腹腔開腹＞＞
<<<肝臓>>>
肝臓表面に変色が確認された。原因は明らかではないが、ＨＥ染色後の組織評価の結果、変色は表面のみで、内部の肝組織に目立った影響は見られなかった。肝表面付近の類洞が変形しており、何らかの影響により肝細胞が収縮した可能性が高い。本実験でポリマー溶液を注入したのは頚部皮下であり、分解物は血中あるいはリンパ中に移行して臓器内部から浸潤していくと考えられるが、何故表面部分に影響が現れたのかは不明である。【０１４１】
<<<脾臓・腎臓>>>
脾臓は異物を食作用により分解するマクロファージや、Ｂ細胞・Ｔ細胞などの免疫抗体を産生する器官である。腎臓は血中の溶質のうち分子量５０，０００以下のものを糸球体濾過により尿に移行させ、体外に排出させる器官である。これらは肝臓と共に、材料を投与した際にその影響が最も強く現れる器官であるため、それぞれ回収してＨＥ染色を行い、組織的に評価した。その結果、肝表面の変色以外、脾臓、腎臓には特に目立った影響は見られず、病理組織学的に正常に保たれていることが明らかとなった。
以上の結果より、ＰＢＳ溶液Ｘ’−３及びＹ’−３並びにそれによって形成されたハイドロゲルは、生体内に入れても急性毒性は無いことがわかった。また、ＰＢＳ溶液は、in situ架橋性があることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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