(57)【要約】  本発明は、検体を調製した液体試料を濾過フィルターによって濾過した後に、被検出物を捕捉する物質を結合させたクロマト媒体を有する液体試料検査具上で、前記液体試料中の前記被検出物を検出又は定量する液体試料検査方法において、  前記濾過フィルターは、２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルターと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルターとを備えている液体試料検査方法に関する。本発明によれば、検体中の被検出物を、イムノアッセイ法により、展開不良を起こすことなく、精度よく検出することができる。
2013073558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を調製した液体試料を濾過フィルターによって濾過した後に、被検出物を捕捉する物質を結合させたクロマト媒体を有する液体試料検査具上で、前記液体試料中の前記被検出物を検出又は定量する液体試料検査方法において、
前記濾過フィルターは、２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルターと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルターとを備えている液体試料検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の液体試料検査方法において、
前記樹脂製フィルターの気孔率は、７０％以上である液体試料検査方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の液体試料検査方法において、
前記樹脂製フィルターは、ポリビニルアルコールを用いて形成されている液体試料検査方法。
【請求項４】
検体を含む液体試料を濾過フィルターで濾過して液体試料検査具に滴下する検体抽出ノズルにおいて、
前記濾過フィルターは、２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルターと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルターとを備えている検体抽出ノズル。
【請求項５】
請求項４に記載の検体抽出ノズルにおいて、
前記樹脂製フィルターの気孔率は、７０％以上である検体抽出ノズル。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の検体抽出ノズルにおいて、
前記有機ポリマーとして、ポリビニルアルコールを用いている検体抽出ノズル。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の検体抽出ノズルと、この検体抽出ノズルを装着させる容器本体とを備えている検体抽出容器。
【請求項８】
被検出物を捕捉する物質を結合させたクロマト媒体を有する液体試料検査具と、請求項７に記載の検体抽出容器とを備えている液体試料検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイ法を用いた液体試料検査方法並びに検体抽出ノズル、検体抽出容器及び液体試料検査キットに関する。本願は、２０１１年１１月１４日に、日本に出願された特願２０１１−２４９１３０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細菌やウィルス等の病原体の感染、妊娠の有無、血糖値の測定など、様々な検査を数分から十数分の短時間で行うことができる簡易検査試薬又はキットが提供されている。これらの検査キットによる検査方法としては、より簡便で、より短時間での検出が可能であることから、イムノアッセイ法が広く用いられている。
しかし、イムノアッセイ法により検査した場合、患者から実際に採取された検体の分析において、被検出物が検体中に存在しないにも関わらず陽性と判定してしまったり（いわゆる偽陽性）、被検出物が検体中に存在するのに陰性と判断してしまったり（いわゆる偽陰性）、と誤判定が生じることがあった。かかる誤判定は、原因の特定を遅らせ、早期治療、早期処置に支障をきたしかねないため、誤判定を抑制する濾過フィルターや、該濾過フィルターを有したアッセイキットが開発されている。【０００３】
誤判定は、アッセイ装置のクロマト媒体上に添加された検体中に含まれる混入物が該クロマト媒体中の細孔を塞ぎ、溶液中の成分の移動が阻害される結果、非特異的な反応が起こることによって発生すると考えられる。そこで、検体を適当な緩衝液で希釈することにより調製された液体試料を予め濾過することにより、誤判定を抑制し得ることが期待できる。また、クロマト媒体に滴下された検体が充分に展開されない場合には、クロマト媒体上がブロードに染色されてしまい、陽性か陰性かの判断自体が困難な場合がある。そこで、検体を適当な緩衝液で希釈し、得られた液体試料を濾過することにより、予め検体中に含まれる混入物を除去して、このような展開不良も軽減し得る。【０００４】
液体試料の濾過において、目詰まりを防止するとともに、緩衝液の増加による被検出物の検出感度の低下を防止するために、特許文献１では、特に目詰まりの発生がフィルターの孔ないし気孔の変形に基づくものであることに着目して、濾過チューブに強剛性フィルターを用いることとしている。
当該特許文献１では、濾過チューブ中に検体抽出液に検体を抽出させた液体試料を入れて、先端に取り付けた濾過フィルターを通して濾過し、濾液をイムノアッセイ装置中のクロマト媒体に滴下する際に、濾過フィルターとして、フィルターの厚さ方向に潰れにくく、または、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えている強剛性フィルターを採用している。より具体的には、液体試料を濾過する時の液体や空気によるフィルターにかかる圧力が０．２ＭＰａを超えても、濾過前対濾過時の厚さの変化量が５％以上とならず、好ましくは２％以上とならず、また、湾曲等の変形をしにくい剛性を備えているとは、上記同様の圧力がかかっても濾過時のフィルターの曲率半径が２ｃｍ以下とならないフィルターを用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−３６７８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の方法では、偽陽性の軽減についての記載はあるが、クロマト展開の不良によりクロマト媒体がブロードに染色される結果、陽性か陰性かの判断自体が困難な場合の改善については一切記載がない。【０００７】
そこで、本発明は、展開不良を防止し、検査時においても良好な操作性を備え、容易かつ低コストで作製できる検体抽出ノズル、検体抽出容器及びこれを備えた液体試料検査キット、及びこれらの検体抽出ノズル、検体抽出容器又は液体試料検査キットを用いた液体試料検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下に関する。
［１］検体を調製した液体試料を濾過フィルターによって濾過した後に、被検出物を捕捉する物質を結合させたクロマト媒体を有する液体試料検査具上で、前記液体試料中の前記被検出物を検出又は定量する液体試料検査方法において、前記濾過フィルターは、２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルターと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルターとを備えている液体試料検査方法。
［２］前記液体試料中の前記被検出物を検出又は定量する方法が、被検出物を含む溶液と、被検出物に特異的に結合する標識物質とを、被検出物と特異的に結合する捕捉試薬が塗布されたクロマト媒体に対して、垂直方法に通過させるか、或いは、水平方向に展開させることにより行う［１］に記載の液体試料検査方法。
［３］前記クロマト媒体の平均孔径が０．５〜５０μｍ、好ましくは、１０〜３０μｍである［１］又は［２］に記載の液体試料検査方法。
［４］［１］〜［３］のいずれか１つに記載の液体試料検査方法において、前記樹脂製フィルターの気孔率は、７０％以上である液体試料検査方法。
［５］［１］〜［４］のいずれか１つに記載の液体試料検査方法において、前記樹脂製フィルターは、ポリビニルアルコールを用いて形成されている液体試料検査方法。
［６］被検出物が、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、肺炎マイコプラズマ若しくはノロウィルス、又はこれら病原微生物由来のタンパク質若しくはこれらに対する抗体である［１］〜［５］に記載の液体試料検査方法。
［７］検体を含む液体試料を濾過フィルターで濾過して液体試料検査具に滴下する検体抽出ノズルにおいて、前記濾過フィルターは、２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルターと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルターとを備えている検体抽出ノズル。
［８］前記検体抽出ノズルが、
検体抽出容器本体の開口端部に液密に内篏される篏合部と、
前記開口端部の端縁に係合させるフランジと、
液体試料の量を絞りつつ流動させ液体試料を好適に滴下できるようにしたノズル部と、を備えており、
前記濾過フィルターが前記篏合部内に備えられている、［７］に記載の検体抽出ノズル。
［９］［７］又は［８］に記載の検体抽出ノズルにおいて、前記樹脂製フィルターの気孔率は、７０％以上である検体抽出ノズル。
［１０］［７］〜［９］のいずれか１つに記載の検体抽出ノズルにおいて、前記有機ポリマーとして、ポリビニルアルコールを用いている検体抽出ノズル。
［１１］［７］〜［１０］のいずれか１つに記載の検体抽出ノズルと、この検体抽出ノズルを装着させる容器本体とを備えている検体抽出容器。
［１２］前記容器本体が、前記容器本体の一端側が開口し、他端が閉塞した有底筒状であり、前記開口端部に蓋が被冠できるように構成されている［１１］に記載の検体抽出容器。
［１３］前記開口端部の外周面に雄螺子部が形成されており、前記雄螺子部の終端側近傍に外方に張り出したフランジ部を有している［１２］に記載の検体抽出容器。
［１４］前記蓋が、円形の天板部と天板部の外縁から立ち上がる側壁部を有しており、前記側壁部の内壁に前記容器本体の雄螺子部に螺合することのできる雌螺子部が形成されている［１２］又は［１３］に記載の検体抽出容器。
［１５］被検出物を捕捉する物質を結合させたクロマト媒体を有する液体試料検査具と、［１１］〜［１４］のいずれか１つに記載の検体抽出容器とを備えている液体試料検査キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検体中の被検出物を、イムノアッセイ法により、展開不良を起こすことなく、精度よく検出することができるという効果を奏する。また、検査時においても、良好な操作性を有し、容易かつ低コストで検査具が製造できるという効果も奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態として示した液体試料検査キットの液体試料検査具を示した断面図であって、同図（ａ）〜（ｃ）は、液体試料が検査される各工程を示したものである。
【図２】本発明の一実施形態として示した液体試料検査キットの容器本体及びその蓋を、一部を断面視して示した側面図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態として示した液体試料検査キットの検体抽出ノズルの側面図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態として示した液体試料検査キットの検体抽出ノズルの底面図である。
【図４】本発明の一実施形態として示した液体試料検査キットの濾過フィルターを模式的に示した斜視図である。
【図５】実施例１、比較例１〜５の抽出ノズルを用いた液体試料検査具に、液体試料を滴下して展開させた後のメンブレン上の染色結果を示した図である。
【図６】ＲＧＢ比を用いて展開が不良であるか否かを判定する場合の、メンブレンの分割方法の一例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態に係る液体試料検査方法及び液体試料検査キットについて、詳細に説明する。
本発明の方法は、被検出物を捕捉するための捕捉物質が結合したクロマト媒体を有する液体試料検査具（いわゆるテストストリップ）を用いて液体試料中の被検出物を検出する、いわゆるイムノアッセイ法で、検体を調製した液体試料を濾過フィルターによって濾過した後、前記液体試料検査具上で該液体試料中の被検出物を検出又は定量する液体試料検査方法であって、前記液体試料を、２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルターと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルターとを備えた濾過フィルターに濾過させることを特徴とする方法である。
【００１２】
このイムノアッセイ法とは、いわゆるサンドイッチ法として総称される測定原理を利用するものが一般的であり、被検出物、被検出物に特異的に結合する捕捉物質、被検出物に特異的に結合する標識物質の３種の複合体をクロマト媒体上に形成させて、標識物質を検出し、前記複合体すなわち被検出物を検出又は定量する方法である。被検出物と捕捉物質と標識物質との間の反応としては、抗原抗体反応、リガンドとレセプターとの結合反応等が挙げられる。
【００１３】
上記方法を用いた本発明の液体試料検査キットは、図１に示す、被検出物を捕捉する物質Ｑを結合させたクロマト媒体５を有する液体試料検査具１と、図２，図３Ａ、Ｂに示す、液体試料を濾過して図１に示す液体試料検査具１上に滴下する検体抽出ノズル９を具備した検体抽出容器２とを備えたものであって、検体抽出ノズル９の濾過フィルター３が、２．５μｍ以上の孔径を有する図４に示すガラス繊維製フィルター３ａと、有機ポリマーの発泡性樹脂材料よりなる樹脂製フィルター（以下、「発泡性樹脂フィルター」ということがある。）３ｂとを備えて構成されている。
【００１４】
図１は、液体試料検査具１を長手方向に直交する方向から視た断面図であり、同図（ａ）〜（ｃ）は、液体試料検査具１により被検出物Ｐを検査する各工程を模式的に示している。液体試料検査具１は、図１（ａ）に示すように、短冊上に形成された基板上の一端側から順に、調製された検体である液体試料Ｓを滴下するためのサンプルパッド４、被検出物Ｐに特異的に結合する抗体等の捕捉物質Ｑが結合したクロマト媒体５、及び吸収パッド６が配列され、更にサンプルパッド４とクロマト媒体５との間に介在させるコンジュゲートパッド７とを備えて構成されている。ここで、液体試料検査具１は、裏側片と検査結果を視認できる判定表示窓を有する表側片とを備え、これらを嵌合等させて互いに組み付けた棒状の容器にサンプルパッド４、クロマト媒体５、吸収パッド６及びコンジュゲートパッド７を収容して使用することができる。また、裏側片と表側片とは一体成形されていてもよい。容器としてはプラスチック、エラストマー等の樹脂材料など、公知の素材が使用でき、透明性、不透明性、成形性、強度等、目的に応じ適宜選択可能である。
【００１５】
イムノアッセイ法には、フロースルー方式とイムノクロマト方式（ラテラルフロー方式）が知られている。フロースルー方式は被検出物Ｐを含む溶液と、被検出物に特異的に結合する標識物質とを、被検出物Ｐと特異的に結合する捕捉試薬が塗布されたクロマト媒体５に対して垂直方向に通過させ、被検出物Ｐに特異的に結合する捕捉物質Ｑ、被検出物Ｐ、標識物質の複合体を膜上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出又は定量を行う。イムノクロマト方式は、同様なクロマト媒体５を用い、被検出物Ｐを検出する原理はフロースルー方式と同様であるが、該クロマト媒体５に対して被検出物Ｐを含む液体試料Ｓを水平方向に展開させる点でフロースルー方式と異なる。２種類の方法のうち、簡便さ、迅速さの面からイムノクロマト方式がより好ましい。
なお、イムノクロマト方式においては、クロマト媒体５上に、被検出物Ｐに特異的に結合する検出試薬である標識物質を滴下等により添加し、捕捉試薬、被検出物及び標識物質の複合体を形成させる方法と、被検出物Ｐに特異的に結合する抗体等の捕捉物質Ｑに結合した標識化合物を含むコンジュゲートパッド７をあらかじめ液体試料検査具１に組み込んでおく方法とがある。
このような液体試料検査具１としては、一般にイムノクロマト方式として知られる方法を利用するものであることが、展開不良を解消するという効果からも好ましい。
【００１６】
本明細書に係る液体試料検査において、用いた液体試料のメンブレン（クロマト媒体）の検出領域における展開が不良であるか否かの判定は、以下の目視による方法によって確認することができる。
（目視による判定方法）
被検出物を含む液体試料がクロマト媒体のメンブレン中を展開後、メンブレン上の目的のバンドが検出される領域（検出領域）まで展開されているかを目視で確認する。
【００１７】
目視により、展開が不良であるか否かを確認する場合には、目的のバンドが検出され、かつ、メンブレン上のその他の領域がほとんど染色されないと、展開が良好であると判定する。一方、メンブレン上の目的のバンドが検出される領域の手前までが濃く染色されており、かつ、目的のバンド検出領域まで展開されていない場合や、メンブラン全体が染色されており、かつ、目的のバンドが検出される領域付近が濃くブロードに染色される場合には、展開が不良であると判定する。
【００１８】
上記目視によって判定した展開が不良であるか否かは、例えば、以下のＲＧＢ比を用いて数値化して確認することもできる。
【００１９】
（ＲＧＢ比を用いた判定方法）
メンブレン上の領域のうち、バンドの視認性に影響する１又は２以上の領域につき、各領域の色を抽出し、ＲＧＢ値の解析を行い、ＲＧＢ比を算出する。
ＲＧＢ比を算出することによって展開が不良であるか否かを確認する場合につき、図６を用いて具体的に説明する。
まず初めに、メンブレン２６を、図６のように、バンドを含む１又は２以上の領域（図６では、７〜９の３領域）とそれ以外の領域とに分割する。
なお、メンブレンの分割方法は、バンドを含む少なくとも１箇所を設定し、フィルターメンブレンの検出領域のサイズによって、適宜、分割数を設定できる。
次に、バンドの視認性に影響する領域（図６では、７〜９の３領域）について、各領域の色を抽出し、ＲＧＢ値の解析を行う。
各領域のＲＧＢ値の測定は、市販のＲＧＢ測定装置或いはソフトを用いて行えばよく、例えば、カラーアナライザーRGB-1002（（株）佐藤商事製）等の装置や、汎用のペイントソフト（Microsoft Paint（マイクロソフト社製）、Photoshop（Adobe社製）、Corel Painter（Corel社製）等）を用いることができる。なお、ＲＧＢ測定装置を用いない場合は、判定部分の画像をＰＣに取り込み、画像解析ソフトを用いてＲＧＢ値を算出することができる。
上記で測定した各領域のＲＧＢ値から、ＲＧＢ比を求める。
ＲＧＢ比は、Ｒ値−（Ｇ値とＢ値の平均値）により求めることができる。
ＲＧＢ比が低いほど、色味は白色に近づくため、展開が良好であると考えられる。また、ＲＧＢ比が高いほど、色味は赤色に近づくため、展開が不良であると考えられる。本発明に係る液体試料検査方法においては、ＲＧＢ比が１５以下であると、展開が良好であると判断し、１５より大きい場合には、展開が不良であると判断した。
【００２０】
クロマト媒体５は、紙やガラス繊維ろ紙、ニトロセルロースなどの多孔質物質が挙げられ、特に好ましい原料としてはニトロセルロースが挙げられる。上記クロマト媒体５の平均孔径は０．５〜５０μｍが用いられることが多く、１０〜３０μｍが好ましい。
【００２１】
検体抽出容器２は、図２に示す、検体抽出液Ｗに検体を抽出させた液体試料Ｓを収容する容器本体１０と、容器本体１０に連結させて用いる図３Ａ、Ｂに示す検体抽出ノズル９とを備えたものである。
図２に示すように、容器本体１０は、一端側が開口し他端が閉塞した有底筒状に形成されており、開口端部１０ａに蓋１１が被冠できるようになっている。
【００２２】
容器本体１０は、合成樹脂により形成されており、開口端部１０ａの外周面には雄螺子部１２が形成されるとともに、雄螺子部１２の終端側（容器本体１０底部側）近傍に外方に張り出したフランジ部１３を有している。また、検査時において、検体抽出容器２から液体試料検査具１に検体抽出液Ｗを滴下させる操作を伴うことを考慮すると、容器本体１０は弾性変形可能な素材を含み構成されていることが好ましい。弾性変形可能な素材としては、弾力性と可撓性とを有する素材であって、耐薬性、成形性を有するものであればよく、臭気を伴わないものがより好ましい。具体的には、熱可塑性樹脂、シリコン樹脂、熱可塑性エラストマー等が例示される。これらの樹脂を組み合わせてもよい。熱可塑性樹脂の場合、例えば、オレフィン系樹脂の場合、熱可塑性樹脂エラストマー、水素添加スチレン系熱可塑性樹脂エラストマーと組み合わせることで成形性が向上することが知られている。熱可塑性樹脂としては、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、メタロセン触媒直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）等のポリエチレンや、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＥＶＡ等が挙げられる。これらは、２種類以上を組み合わせたポリマーブレンド、ポリマーアロイでもよい。
【００２３】
蓋１１は、円形の天板部１１ａと天板部１１ａの外縁から立ち上がる側壁部１１ｂを有しており、側壁部１１ｂの内壁には容器本体１０の雄螺子部１３に螺合自在な雌螺子部１４が形成され、容器本体１０に対して蓋１１が着脱自在とされている。
【００２４】
図３Ａに示すように、検体抽出ノズル９は、その基端部側９ａを容器本体１０の開口端部１０ａに嵌着させて、ノズル先端９ｂ側から検体を含ませた液体試料Ｓを滴下させるものである。この検体抽出ノズル９は、容器本体１０の開口端部１０ａに液密に内嵌される嵌合部１５と、開口端部１０ａの端縁に係合させるフランジ１６と、液体試料Ｓの量を絞りつつ流動させ液体試料Ｓを好適に滴下できるようにしたノズル部１７とを備えて形成されているとともに、嵌合部１５内に濾過フィルター３を備えている。
【００２５】
ノズル部１７の内径１７ａは、該嵌合部１５の内径１５ａよりも僅かに小径に形成されて嵌合部１５との間に幅狭の段部１９を有し、該濾過フィルター３を嵌合部１５内に配置した際に濾過フィルター３の周縁部１８を段部１９に係止できるようになっている。
図３Ａ，Ｂに示すように、ノズル部１７の内孔は、断面略円形に形成されており、段部１９から先端に向かって漸次縮径した第１テーパ部２０と、第１テーパ部２０の先端側でノズル部１７先端に向かって内壁が漸次拡開するように形成された第２テーパ部２１とを備えており、更に第１テーパ部２０と第２テーパ部２１の壁面には、段部１９からノズル部１７先端に向かってそれぞれ形成された突条２２Ａ，２２Ｂが等間隔に環状配置されている。
【００２６】
図４に示すように、濾過フィルター３の外形は、少なくとも２．５μｍ以上の孔径を有するガラス繊維製フィルター３ａと、発泡性樹脂フィルター３ｂとを積層させて円板形状に形成されているとともに、図３Ａに示す検体抽出ノズル９の嵌合部１５内径よりも僅かに大寸法となっている。また、濾過フィルター３において、発泡性樹脂フィルター３ｂはガラス繊維製フィルター３ａよりも検体抽出ノズル９の先端側、基端側、又はその双方に配されて、ガラス繊維製フィルター３ａを保護するとともに液体試料を濾過するようになっている。
また、容器本体１０内の検体抽出液Ｗに取り込まれた鼻ぬぐい液等の検体は、鼻腔等の検体採取部位から剥離した細胞や分泌物等の成分を含んでいるため、濾過フィルター３の内部には所定の孔径を有する気孔２５が多数形成されており、図１に示す液体試料検査具１のクロマト媒体５において誤判定をすることを防止し得るように、所期の被検出物Ｐを好適に濾過できるようになっている。
【００２７】
濾過フィルター３は、３種類以上のフィルターを組み合わせて作製されたものであってもよい。
濾過フィルター３に孔径又は保留粒子径の異なるものをいくつか組み合わせる場合は、孔径又は保留粒子径の大きなフィルターを上流側（容器本体１０側）に、小さなフィルターを下流側（ノズル部１７側）に、両フィルターが重なるように配置することが、濾過時における液体試料Ｓの目詰まりを回避する上で好ましい。例えば、２つのフィルターを組み合わせる場合、１段目のフィルターに孔径又は保留粒子径が大きいフィルターを用い、２段目のフィルターに孔径が小さいフィルターを用いることが好ましい。
【００２８】
濾過フィルター３を構成するフィルターの中で最小孔径又は保留粒子径を有するフィルターの最小孔径又は保留粒子径は、クロマト媒体５の孔径以下であることが好ましい。すなわち、例えば用いるクロマト媒体５の孔径が１０μｍ以上の場合、濾過フィルター３の少なくとも１つは、気孔２５の孔径が１０μｍ以下であることが好ましい。
【００２９】
濾過フィルター３は精密濾過用としても、粗濾過用としても用いることができるが、少なくとも１種類の濾過フィルター３の気孔２５の孔径又は保留粒子径はクロマト媒体５の孔径以下であり、１０μｍ以下が好ましい。
【００３０】
本発明及び本願明細書において、「孔径」とは、フィルターの気孔２５のうち最大の孔のことをいい、例えばバブルポイント法により測定することができる。また、「保留粒子径」とは、濾過フィルターを通過する粒子の直径の最大値のことをいい、これは、例えばＪＩＳ  ３８０１、ＪＩＳ  Ｚ  ８９０１で規定される硫酸バリウムなどを自然濾過したときに漏洩粒子径の最大値により求める、あるいは、超純水（Milli-Q Water）にて希釈した一定粒子径のラテックス粒子を自然濾過し、濾過前後の溶液の吸光度から、粒子保留率を算出することにより求めることができる。保留粒子径は、実質的には濾過フィルターの孔径に相当する。
また、気孔率とは、空隙率ということもでき、全自動細孔径分布測定装置（水銀ポロシメーター）により測定される。
【００３１】
ガラス繊維製フィルター３ａと、発泡性樹脂フィルター３ｂのそれぞれの厚みは、０．０５ｍｍ〜３５ｍｍであればよく、０．１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましく、１ｍｍ〜５ｍｍであるのがより好ましい。濾過フィルター３が２種類以上の柔軟性を持つフィルターを組み合わせて作製された場合、フィルター全体の厚みは０．１〜５０ｍｍが好ましく、０．５〜３０ｍｍがより好ましく、１〜１０ｍｍがさらに好ましい。なお、ガラス繊維製フィルター３ａと、発泡性樹脂フィルター３ｂの厚みは、図４に示した比率となるものに限定されるものではない。
【００３２】
本発明において用いられる濾過フィルター３は、ガラス繊維製フィルター３ａと、発泡性樹脂フィルター３ｂとを備えている。濾過フィルター３が、ガラス繊維製フィルター３ａ及び発泡性樹脂フィルター３ｂから形成されている場合、濾過フィルター３を構成するガラス繊維製フィルター３ａは、１枚であってもよく、同種類又は異種類のガラス繊維製フィルター３ａを２枚以上組み合わせてもよい。同様に、濾過フィルター３を構成する発泡性樹脂フィルター３ｂも、１枚であってもよく、同種類又は異種類の発泡性樹脂フィルター３ｂを２枚以上組み合わせてもよい。
【００３３】
ガラス繊維製フィルター３ａは、孔径又は保留粒子径が２．５μｍ以上、好ましくは２．５〜３．５μｍとなるようにガラス繊維を重ねたものである。本発明で用いられるガラス繊維製フィルター３ａは、孔径又は保留粒子径が比較的大きいため、柔軟性を有している。濾過フィルター３が備えるガラス繊維製フィルター３ａの厚みは特に制限はないが、濾過性と柔軟性の点から、２００μｍ〜１５００μｍであることが好ましい。
【００３４】
また、本発明において用いられるガラス繊維製フィルター３ａの空隙率は、４０％から９０％の範囲内であることが好ましい。ガラス繊維製フィルター３ａの空隙率が４０％以上であることにより、液体試料中の異物などにより目詰まりが生じ難く、また、検体が生体試料の場合には、生体試料の吸着が生じた場合に目詰まりし難くなり、連続測定を行った場合にも、目詰まりによるフィルターの濾過圧力の上昇を抑制できる。また、ガラス繊維製フィルター３ａの空隙率が９０％以下であることにより、フィルター内における液体試料の過度の拡散を抑制でき、より正確な測定が可能になる。また、フィルターに適度な強度を備えさせられるため、フィルターの取り扱い時や測定時の液体移動相の圧力などによる破損を抑制し得る。
【００３５】
発泡性樹脂フィルター３ｂは、ガラス繊維製フィルター３ａを保護し、濾過圧力による破損から防止する機能を備える。このため、発泡性樹脂フィルター３ｂは、ガラス繊維製フィルター３ａの全面を覆う必要はなく、Ｏリング状等のように、ガラス繊維製フィルター３ａの一部のみを覆うように積層させてもよい。なお、発泡性樹脂フィルター３ｂは、濾過フィルターとしても機能し得るため、ガラス繊維製フィルター３ａの全面を覆うように形成させることが好ましい。
【００３６】
発泡性樹脂フィルター３ｂは、比較的高い柔軟性を有していることが好ましい。このため、発泡性樹脂フィルター３ｂの気孔率は、７０％以上が好ましく、７０〜９８％がより好ましく、８０％〜９８％がさらに好ましく、８５％〜９８％がよりさらに好ましく、８５％〜９５％であることが特に好ましい。また、本発明で用いる発泡性樹脂フィルター３ｂの孔径又は保留粒子径は、５０〜８００μｍが好ましく、５０〜３００μｍがより好ましく、５０〜１００μｍがさらに好ましい。
【００３７】
発泡性樹脂フィルター３ｂは、ポリアミド系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、及びポリビニル系ポリマーからなる群より選択される１種以上の有機ポリマーの発泡体からなることが好ましい。具体的には、ポリアミド、アラミド、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリエステル、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアリルエーテルケトン、ポリアミドイミド、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、酢酸セルロース、ポリメチルペンテン、ポリブテン、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエチレンオキサイド、ポリパラメチルスチレン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリビニルエーテル、ポリビニルブチラール、ポリビニルホルマール、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、キシレン樹脂、アミノ樹脂、グアナミン樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ビニルエステル樹脂、ジアリルフタレート樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、ケイ素樹脂、ポリイミド、アルキド樹脂、フラン樹脂、フェノール樹脂、フッ素樹脂、ポリ−ｐ−ヒドロキシ安息香酸、およびマレイン酸樹脂よりなる群から選ばれた１種もしくは２種以上の混合物を、発泡体に成型したものが挙げられる。
本発明においては、ポリビニル系発泡性樹脂、とりわけ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのポリビニルアルコール系、ポリビニルアセタール系のいずれかで構成される発泡性樹脂からなるフィルターを用いることが好ましい。
【００３８】
上記特許文献１に記載のイムノアッセイキットのように、濾過フィルター３として強剛性フィルターを用いた場合には、濾過フィルター３は検体抽出ノズル９に形成された嵌合部１５内に嵌入させる際に嵌合部１５内の形状に合わせて弾性変形しない。したがって、液体試料を確実にフィルタリングするためには、強剛性フィルターの寸法と嵌合部１５内の寸法とを高精度に合わせて強剛性フィルターを嵌合部１５内に密に嵌着させなければならないが、上記強剛性フィルターでは、嵌合部１５内と強剛性フィルターとの間に物理的な寸法誤差が生じやすいため該強剛性フィルターの厚みを持たせる必要が生じ、全体として液体試料のフィルタリングに時間が掛かってしまうという問題があった。
また、嵌合部１５内と強剛性フィルターとの間の物理的な寸法誤差を略無くして強剛性フィルターを作製したとしても、強剛性フィルターはその硬さゆえに、嵌合部１５内に強剛性フィルターを挿入配置させ難く、検体抽出ノズル９を適切に製造し難いという問題があった。
一方で、検査操作時においても、検体溶液の前処理の際、圧力がかかりすぎて操作性が低下したり、フィルターが抜けるおそれがあるなど、検査従事者の操作性を考慮する上で改良すべき課題もあった。
【００３９】
これに対して、本発明においては、ガラス繊維製フィルター３ａと発泡性樹脂フィルター３ｂとを積層させた濾過フィルター３が柔軟性を有することによって、図３Ａに示すように、嵌合部１５内に挿入配置する際に嵌合部１５の内径に合わせて弾性変形（収縮）し、図４に示す濾過フィルター３の平板面３ｔが段部１９を完全に覆うように配置された状態で弾性復帰して、濾過フィルター３の周面２３が嵌合部１５の内壁面２４に付勢しながらフィットするようになっている。
すなわち、検体抽出容器２の濾過フィルター３は、柔軟性を有しているため、検体抽出容器２内にフィットさせて配置することができる。したがって、濾過フィルター３の寸法と嵌合部１５内の寸法とを高精度に整合させる工程を省いて濾過フィルター３を嵌合部１５内に容易に配置することができ、検体抽出容器２ないし液体試料検査キットの製造コストを抑えることができるという効果を奏する。
また、嵌合部１５内と濾過フィルター３との間に物理的な寸法誤差が生じにくいため、液体試料Ｓを確実に濾過フィルター３に通すことができる。したがって、濾過フィルター３を可及的に薄くしつつ確実に濾過配置することができ、液体試料Ｓの濾過を短時間で確実に行うことができるという効果を奏する。
【００４０】
被検出物Ｐとしては、例えばインフルエンザウィルス、ＲＳウィルス、アデノウィルス、下痢症の原因微生物、肺炎マイコプラズマ、ロタウィルス、ノロウィルス等の病原微生物、若しくは該病原微生物由来のタンパク質等の物質又はそれらに対する抗体、生理活性物質の類、細菌等が産生する毒素、及び各種腫瘍マーカーを挙げることができる。上記の病原微生物若しくは該病原微生物由来のタンパク質等の物質又はそれらに対する抗体等を被検出物として用いる場合、特にインフルエンザウィルス、アデノウィルス、肺炎マイコプラズマ及びノロウィルス等のように、急性症状を呈する可能性があり、短時間で特定する必要がある病原体の診断に、極めて有用である。
【００４１】
検体は、生体試料としては鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻汁、咽頭拭い液、唾液、痰などの粘膜分泌物、便懸濁液、尿、血液成分、臓器抽出液、各種組織抽出液、又はこれらを適当な緩衝液によって希釈した希釈液等が挙げられる。
また、非生体試料を検体として用いることも可能である。生体試料を検体とした場合では、本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、咽頭拭い液、又は便懸濁液を検体とした場合に極めて有用である。
【００４２】
被検出物Ｐを捕捉するための捕捉物質Ｑは、被検出物Ｐと特異的反応により結合して複合体を形成する物質である。従って、一般には被検出物Ｐが細菌、ホルモン、ウィルス等およびこれらに由来する物質、その他バイオマーカー等の場合には、これらに対し特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。このような捕捉物質Ｑを上述したクロマト媒体表面に結合させる方法としては、タンパク質をニトロセルロースメンブレン等に固定するための公知の方法で行うことができる。捕捉物質Ｑが結合したクロマト媒体５の調製は、例えば、捕捉物質Ｑを緩衝液等に希釈した溶液をクロマト媒体に吸着してその後乾燥することにより行われる。捕捉物質Ｑは、例えばスポット状やライン状に固定すればよい。
【００４３】
標識物質とは、被検出物に特異的に結合し、複合体を形成した後に何らかの手段で検出可能なように標識されたものである。一般的には、捕捉試薬について述べたものと同じものが酵素や貴金属コロイド等で標識化されたものが挙げられる。例えば、被検出物Ｐがウィルス等の抗原物質である場合には、該ウィルスに対する抗体であって、貴金属コロイド等で標識化された抗体が挙げられる。標識物質としては、具体的には、酵素、蛍光発光性標識、放射性同位元素、貴金属コロイド、着色ラテックス等が挙げられる。標識物質は、液体試料を液体試料検査具１に添加した後に、液体試料検査具１に添加してもよく、またあらかじめ液体試料検査具１に組み込んでおいてもよい。あらかじめ液体試料検査具１に組み込まれる場合、標識物質はコンジュゲートパッド７と呼ばれる形で、パッドに含まれた状態で組み込まれる。標識物質を含むパッドには、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。
【００４４】
検体抽出液Ｗとは、患者や環境等から採取した被検出物を含む可能性がある検体から、被検出物を抽出し懸濁するための溶液である。検体を検体抽出液Ｗにより抽出又は懸濁した抽出液が、液体試料として液体試料検査具１に滴下等により添加されて、液体試料検査具１に供される。
【００４５】
患者や環境から採取した検体の中には、検体抽出液Ｗの塩組成やｐＨに対して影響を与える物質が含まれる可能性がある。性状が変化した検体抽出液Ｗを用いた場合、被検出物の検出に悪影響を与える可能性があるため、検体抽出液Ｗには、通常、塩及びｐＨを一定に維持するための緩衝剤が含まれる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液等を使用することができ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が例示できる。さらに検体抽出液Ｗには特異的な凝集反応を阻害しない範囲で非特異反応を防止することを目的として界面活性剤を含有させることが可能である。界面活性剤としては、特に限定されず、公知の界面活性剤が使用できる。具体的には、Ｂｒｉｊｉ３５、ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、オクチル-β-Ｄ-グルコシド、トリトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ノニデットＰ４０等が例示できる。これらは二種以上混合して使用することもできる。
【００４６】
検体抽出液Ｗにはその他、非特異反応を防止することを目的として、ウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、グリシン等のアミノ酸、ウサギやマウス等の血清等を含有させることも可能である。
【００４７】
次に、液体試料検査キットの使用方法と作用について、インフルエンザウィルス感染の診断を行うウィルス診断キットを例として説明する。
液体試料検査キットを用いてインフルエンザウィルスの有無を検査するにあたっては、まず、検体採取器具（不図示）として例えば綿棒を用い、綿棒を鼻腔内に挿入して鼻甲介を数回擦るようにして粘膜表皮を採取する。
【００４８】
粘膜表皮の採取に合わせて、図２に示す蓋１１を容器本体１０から取り外し、検体を採取した綿棒を容器本体１０内の検体抽出液Ｗに浸漬する。そして、容器本体１０の外側から綿棒を数回つまんだり上下させたりして検体抽出液Ｗに綿棒を十分に浸透させた後、検体抽出液Ｗをしごく様に綿棒を容器本体１０から引き抜く。
【００４９】
その後、図３Ａに示すように、上記容器本体１０の開口端部１０ａに検体抽出ノズル９の嵌合部１５を内嵌させて液体試料を滴下できる検体抽出容器２とする。
そして、検体抽出容器２のノズル先端９ｂ側を下方に向けて図２に示す容器本体１０の中間部（胴部）１０ｂを把持すると、液体試料が容器本体１０から検体抽出ノズル９に向かって流動し、嵌合部１５に設置された濾過フィルター３を通る。
【００５０】
このようにして液体試料Ｓは、濾過フィルター３によって濾過されて検体抽出ノズル９のノズル部１７先端に移動するので、更に容器本体１０の胴部１０ｂを強く把持することで、液体試料Ｓを図１（ａ）に示す液体試料検査具１のサンプルパッド４上に滴下することができる。
【００５１】
図１（ａ）に示すように、サンプルパッド４に液体試料Ｓが添加されると、液体試料Ｓは、同図（ｂ）に示すように、コンジュゲートパッド７に浸透しつつ該パッド７に担持された特異抗体と反応しながら同図（ｃ）に示すようにクロマト媒体５に浸透する。そして、液体試料Ｓに被検出物Ｐである抗原が存在していると、この抗原とクロマト媒体５に固定された抗体とが抗原抗体反応を起こしてクロマト媒体５上に着色標識が現れる。そのため、この着色標識を、クロマト媒体５の判定領域において視認することにより検査結果を知ることができる。また、クロマト媒体５に浸透した余分な液体試料Ｓは、吸収パッド６によって吸収される。この際、吸収パッド６が着色されるため、この着色度合を液量確認領域において視認することにより液体試料の過不足を確認することができる。
【００５２】
以上のように、本発明の検体抽出容器２及び液体試料検査キットによれば、濾過フィルター３が柔軟性を有しているため、該濾過フィルター３を検体抽出ノズル９の嵌合部１５内にフィットさせて配置することができる。したがって、濾過フィルター３の径寸法と嵌合部１５の内径寸法とを高精度に合わせる工程を省いて濾過フィルター３を嵌合部１５内に容易に配置することができ、検体抽出容器２ないし液体試料検査キットの製造コストを抑えることができるという効果が得られる。
【００５３】
また、濾過フィルター３を嵌合部１５の内壁に付勢させた状態で配置することができ、検体抽出ノズル９の嵌合部１５と濾過フィルター３との間に物理的な寸法誤差が生じ難いため、液体試料Ｓを確実に濾過フィルター３によって濾過することができる。したがって、濾過フィルター３を可及的に薄くしつつ、液体試料Ｓの濾過を短時間で確実に行うことができるという効果が得られる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。【００５５】
［実施例１、比較例１〜５］
（試験方法）
表１に記載のフィルター種、孔径のフィルターを濾過フィルターとして用いて、実施例１、比較例１〜５の抽出ノズルを作成した。なお、実施例１の抽出ノズルについては、ノズルの滴下口側からガラス繊維フィルター、ＰＶＡフィルターの順に、また、比較例５の抽出ノズルについては、ノズルの滴下口側からガラス繊維フィルター、焼結フィルターの順に、各フィルターを積層した。
液体試料としては、市販のインフルエンザ検査キット（チェックＦｌｕＡ・Ｂ、アルフレッサファーマ製）に付属の検体抽出液に、生体由来粘性物質が４０％相当量となるように添加して作成した擬似鼻腔ぬぐい液を用いた。
まず、検体抽出容器本体部（ＬＬＤＰＥ製）に前記各抽出ノズルをセットして作成した検体抽出容器に液体試料を入れ、容器本体の中ほどをつまむことによって圧力を加えて濾過を行った。得られた濾液８０μＬを前記キットのテストプレート滴下部（サンプルパッド）に添加し、展開させ、メンブレン（クロマト媒体）の判定領域における展開不良発生の有無を目視で確認した。結果を表１及び図１に示す。表１の「展開」の欄中、Ａは展開が良好に起こり、目的のバンドが検出されたことを、Ｂは目的のバンドは検出されたものの、展開不良によってメンブレン上のその他の領域もブロードに染色されたことを、Ｃは展開不良によって、メンブレン上がブロードに染色され、かつ目的のバンドが検出できなかったことを、それぞれ意味する。【００５６】
【表１】
2013073558.tif 000003
【００５７】
この結果、図５に示すように、実施例１の抽出ノズルを用いた場合には、目的のバンドが検出され、かつメンブレン上のその他の領域がほとんど染色されず、滴下した液体試料がメンブレン中を良好に展開したことが確認された。一方で、ガラス繊維フィルターを用いなかった比較例１及び２を用いた場合には、メンブレン上の目的のバンドが検出される領域の手前までが濃く染色されており、展開が不良であり、液体試料が目的のバンド検出領域まで展開されなかった。また、ガラス繊維フィルターのみを含む比較例３及び４を用いた場合には、目的のバンドは検出されたものの、その他の領域も広く染色されてバックグラウンドが高くなっており、やはり展開が上手くいっていなかった。さらに、ガラス繊維フィルターと焼結フィルターを組み合わせた比較例５の抽出ノズルを用いた場合には、液体試料はメンブレン上を、比較例１及び２の場合よりも長く展開されたものの、メンブレン全体が染色されており、特に目的のバンドが検出される領域付近が濃くブロードに染色されたため、目的のバンドは確認できなかった。
なお、メンブレン上の展開の程度につき、実施例１と目的のバンドが検出された比較例３、４を対象に、図６に示す１から９の領域のうちバンドの視認性に影響する３領域（７〜９）につき、各領域の色を抽出し、ＲＧＢ値の解析を行い、ＲＧＢ比を算出した。なお、ＲＧＢ比は下記式１より求めた。結果を表２に示した。
ＲＧＢ値の測定については、ＰＣに取り込んだ画像をMicrosoft Paint（マイクロソフト社製）を用いて算出し、下記式からＲＧＢ比を算出した。
ＲＧＢ比＝Ｒ値−（Ｇ値とＢ値の平均）・・・（１）
この結果、比較例３、４は実施例１と比較して、ＲＧＢ比が高いことから、展開不良であることが数値においても確認できた。【００５８】
【表２】
2013073558.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の液体資料検査方法は、検体中の被検出物を、イムノアッセイ法により、展開不良を起こすことなく、精度よく検出することができるため、例えば、細菌やウィルス等の病原体の感染、妊娠の有無、血糖値の測定等に好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００６０】
１  液体試料検査具
２  検体抽出容器
３  濾過フィルター
３ａ  ガラス繊維製フィルター
３ｂ  樹脂製フィルター（発泡性樹脂フィルター）
５  クロマト媒体
９  検体抽出ノズル
Ｐ  被検出物
Ｑ  捕捉物質
Ｓ  液体試料
Ｗ  検体抽出液
【図１】
2013073558.tif 000005
【図２】
2013073558.tif 000006
【図３Ａ】
2013073558.tif 000007
【図３Ｂ】
2013073558.tif 000008
【図４】
2013073558.tif 000009
【図６】
2013073558.tif 000010
【図５】
2013073558.tif 000011
【国際調査報告】
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2013073558.tif 000013
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