(57)【要約】本発明は、ＳＬＣ６Ａ６又はその細胞外領域に結合する新規なモノクローナル抗体を利用したがん治療薬及びＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する物質の作製を目的とする。  本発明は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６、又はＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体若しくはその断片、又はＲＮＡ干渉によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質を含む医薬組成物。
【請求項２】
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
【請求項３】
細胞外領域のポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるものである請求項２に記載の医薬組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
【請求項４】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項４に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合する、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
【請求項６】
モノクローナル抗体がヒト型化又はヒト化されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
モノクローナル抗体が融合されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
大腸癌を治療するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞を処置するための組成物に関する。具体的には、本発明は、ＳＬＣ６Ａ６若しくはその細胞外領域に結合するモノクローナル抗体若しくは抗体断片、又はＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する物質を用いたがんを処置するための新規組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界的にも死因の上位を占めており、中でも大腸がんは、がんの死亡率において上位に位置する疾患である。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加しており、年間約６万人が大腸がんに罹患し、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さとなっている。大腸がんは、大腸のみにとどまる場合には５年生存率は約９０％以上であり、早期発見が治癒率の高さに繋がるがんとして知られている。にもかかわらず死亡数の多いがんである理由は、高い罹患率に加え、リンパ節への転移が起きると５年生存率が７０％、肺や肝臓へ遠隔転移すると２５％以下と、がんの進行に伴って急激に死亡率が悪化する点が挙げられる。これら大腸がんに対しては、外科治療と化学療法が一般的であるが、近年の分子標的薬の出現によって、がん特異的な新たな治療法が模索されるようになった。がんに対する分子標的治療薬としては、乳がんに対するハーセプチン、非ホジキンリンパ腫に対するリツキサン等の抗体医薬品が優れた治療効果を示している。これら抗体医薬品は、細胞膜に存在するタンパク質（それぞれＨｅｒ２とＣＤ２０）と結合し、薬効を示すことが知られている。
大腸がんに対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、ＶＥＧＦやＥＧＦという増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸がんでの使用が承認されており、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で働く。
アービタックスは、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることでがん細胞の増殖を停止させるのが狙いである。また、抗体ががん細胞の表面に結合することで、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ―Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によりがん細胞を死滅させる作用機序も働いていると言われている。
さらに、抗体医薬品が効果を発揮する機序としては、抗体分子が腫瘍に蓄積するというＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果が挙げられる。腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため、高分子や微粒子が血管より流出しやすく、また、リンパ系が発達していないため、腫瘍組織に到達した物質は蓄積する。腫瘍組織ではこのような特性を持つために、抗体を含めた４０ｋＤａ以上の分子は腫瘍に蓄積しやすく、効果を発揮しやすいことが知られており、ＥＰＲ効果と呼ばれている（非特許文献１）。この作用は、腫瘍に効果的に薬剤を運搬させるドラッグデリバリー開発の基本となっている。
抗体医薬品に加え、近年では細胞に二本鎖ＲＮＡを導入し、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を破壊することで発現を抑制するというＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を用いた治療薬の開発も進められている。ＲＮＡ干渉は、がん細胞の増殖や転移に関与するターゲットの発現を抑制して、がんを治療する方法の一つであり、実用化を目指した開発が進められている。
一方で、分子標的薬は、正常細胞にも影響を及ぼすため致命的な副作用を示す場合がある。例えば、乳がん治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている（非特許文献２）。さらに、ハーセプチンはＨｅｒ２を標的とした抗体医薬品であるため、Ｈｅｒ２を発現している患者にしか奏効性を示さない。
大腸がん治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である（非特許文献３）。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する（非特許文献４）。また、ＥＧＦＲ下流のシグナル変化（例えばＫ−ｒａｓ変異）によるがん化には作用を示さないという問題も存在している。
以上のようにがんに対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、副作用が少なく、がん特異的な分子標的及び医薬品の新たな開発が求められていた。
そこで、本発明者らは、大腸がん細胞において特異的に発現が亢進している遺伝子を絞り込み、がん細胞に特異的に発現している膜タンパク質分子として、ＳＬＣ６Ａ６（Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６  （ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ  ６）に着目した。
ＳＬＣ６Ａ６は、６２０アミノ酸からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）にＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ［ＲｅｆＳｅｑ］  ＩＤ：ＮＭ＿００３０４３、ＮＰ＿００３０３４．２として登録されている（配列番号１：塩基配列、配列番号２：アミノ酸配列）。ＳＬＣ６Ａ６はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。
ＳＬＣ６Ａ６遺伝子は、正常組織に対し結腸がん組織において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている（特許文献１）。特許文献１では、１０種類の原発結腸腫瘍と、１０種類の正常結腸を用いて、ＤＮＡマイクロアレイにより、ｓｌｃ６ａ６を含む、結腸がん組織と正常組織との間で発現に差がある３０個以上の遺伝子が同定さており、開示された全ての遺伝子について、抗体、抗体によるポリペプチドの検出方法、がんの診断方法、抗体を含む医薬組成物への適用が示唆されている。しかしながら、ｓｌｃ６ａ６に対する抗体の作製例はなく、診断または治療目的における、タンパク質レベルでの適正、実用性又は実施可能性についても実証されていない。また、特許文献１では、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質のがん細胞における増殖や転移への関与について何も検証されていない。さらに、特許文献１には、定量ＰＣＲ法による詳細な発現パターンの解析結果が記載されているが、発現比にばらつきがあり、正常組織において結腸がん組織よりも高い発現を示す場合がある（表７）。また、定量ＰＣＲに使用されたプライマー（表６）はタンパク質のコード領域外である。治療薬として用いるには、タンパク質を検出する抗体が必要であり、かつ生きたがん細胞に抗体が結合するためには細胞膜領域に結合する抗体が必要である。抗体医薬品としての利用を行う場合には、特異的なアミノ酸配列と立体構造を認識するモノクローナル抗体が不可欠であり、治療薬への有用性を詳細に検討しなければならない。また、ＲＮＡ干渉による医薬品を開発する際には、ＳＬＣ６Ａ６発現を抑制しうる配列を明らかにし、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することにより、がん細胞の増殖や転移への影響について有用性を詳細に検討しなければならない。
ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体として、ＨＰＡ０１５０２８（ＡＴＬＡＳ社）、ｓｃ−１６６６４０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）等複数の抗体が公知である。抗体医薬品として開発するためには、キメラ化やヒト化を行う必要があるため、モノクローナル抗体でなければならならない。ＨＰＡ０１５０２８はアミノ酸残基１４３〜２１６（配列番号３（塩基配列）、配列番号４（アミノ酸配列））を含む細胞外領域を認識する抗体であるがポリクローナル抗体である。公知の抗体の中ではｓｃ−１６６６４０のみがモノクローナル抗体である。しかしこの抗体は、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基３９７〜４２４の領域に結合する。この領域は膜貫通領域から細胞内にわたっているため、この抗体は生きたがん細胞と結合することが出来ず、治療薬として利用することができない。
以上の理由から、これらの従来の抗体は、抗体医薬品として利用できる抗体として十分ではなかった。また、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することが、がん細胞にどのような影響を与えるか、解析されていなかった。
【特許文献１】特表２００６−５１５３１８号公報
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２１１５−２１２１，１９８４
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４５９３−４５９９，１９９７
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４
【発明の開示】
【０００３】
一般的にがんの手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが問題である。また、化学療法や放射線治療は副作用が問題となっている。さらに、従来の抗体医薬品は副作用の発生に加えて、奏効性を全く示さないがんが存在する。そこで、がんに対する新たな医薬品の開発が求められていた。
本発明は、膜タンパク質であるＳＬＣ６Ａ６が、がんの組織において過剰発現されるタンパク質であり、診断及び処置の対象として有用なマーカーであるという発見に基づいている。本発明は、大腸がん特異的に発現するＳＬＣ６Ａ６と結合し、がんの治療薬として安定して供給し得るモノクローナル抗体及びその断片を有効成分として含む抗がん剤を提供することが目的である。また、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制できる物質として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはこれらを発現出来る発現ベクターを有効成分として含む抗がん剤を提供することが目的である。
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６を認識するモノクローナル抗体を作製し、当該モノクローナル抗体を用いたがんの治療用抗体を開発することに成功し、本発明を完成させた。また、ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現する細胞を用い、発現を抑制できるＲＮＡｉ用の核酸配列を複数同定することで、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体若しくはその断片、又はＲＮＡ干渉によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質を含む医薬組成物。
（２）ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（３）細胞外領域のポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるものである前記（２）に記載の医薬組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（４）受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（５）前記（４）に記載のモノクローナル抗体又はその断片が認識するエピトープに結合する、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（６）モノクローナル抗体がヒト型化又はヒト化されたものである、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（７）モノクローナル抗体が融合されたものである、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（８）大腸癌を治療するための、前記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
本発明により、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＳＬＣ６Ａ６モノクローナル抗体並びにそのフラグメント、並びに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを含む医薬組成物、特に大腸癌治療用医薬組成物が提供される。本発明の抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントは、単独、あるいは少なくとも１種類の治療薬に結合させる、あるいは他の治療様式と組み合わせて用いることができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することが出来る物質は、既存のドラッグデリバリーシステムを用いて標的の臓器へ輸送し、がん細胞の増殖、浸潤、移動を抑制することで、治療薬として利用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ＳＬＣ６Ａ６タンパク質の細胞外領域に対応する塩基配列を有する核酸をプローブとし、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより組織を染色した写真である。
【図２】ＳＬＣ６Ａ６発現細胞の解析結果を示す図である。
【図３】ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域であるアミノ酸残基１４５〜２１３のペプチドに反応するモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡを用いて解析した結果を示す図である。
【図４】ＳＬＣ６Ａ６抗体である４Ｂ９ｂを用いて大腸がん組織を染色した結果を示す図である。がん部のみが特異的に染色された。
【図５】ＳＬＣ６Ａ６抗体である４Ｂ９ｂを用いて正常組織を染色した結果を示す図である。大腸がんのみが特異的に染色された。
【図６】１０種類の大腸癌細胞に関して、ＳＬＣ６Ａ６の発現をリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す図である。発現量に差はあるものの、全ての細胞で発現が検出された。
【図７】１０種類の大腸がん細胞を４Ｂ９ｂ抗体及び５Ｈ１２ｄ抗体を用いて解析した結果を示す図である。大腸がん細胞全てに関して、反応していることが示された。
【図８】マウスＩｇＧをキメラ化した抗体の活性をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図９】マウスＩｇＧをキメラ化した４Ｂ９ｂ抗体でがん組織、正常組織を染色した結果を示す図である。がんが浸潤している先端部分（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｆｒｏｎｔ）がより強く染色されることが示された。
【図１０】ヒトＩｇＧをキメラ化した抗体の活性をＥＬＩＳＡで解析した結果を示す図である。
【図１１】サブクラスＩｇＧの抗体について、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示す図である。１９Ｂ１０、７Ｃ１１及び１２Ｅ８が細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６を認識していることが示された。
【図１２】ＳＬＣ６Ａ６をマウス乳癌細胞４Ｔ１で過剰発現させた細胞の形態を示す図である。
【図１３】ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株させた細胞のＥカドヘリン、Ｎカドヘリン、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの変化を観察した結果を示す図である。β−Ａｃｔｉｎは電気泳動に用いたタンパク質量の差を確認するために用いた。ＥＭＴで見られる表現型の変化が観察された。
【図１４】ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた株（Ｌ３１及びＬ３５）と発現させていない株（４Ｔ１）をＢａｌｂ／ｃマウスへ移植し、抗体添加による腫瘍サイズの増加を観察した結果を示す図である。発現させた株のみ抗体によって増殖が抑制されていることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１２年３月６日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１２−０４９１９２号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ  ６）と呼ばれる分子またはその細胞外領域を認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物に関する。この抗体は、特に大腸がん細胞に特異的に結合する。また、本発明はＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むベクターを用いる。このｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは大腸がん細胞の増殖、転移を特異的に抑制する。従って、本発明の医薬組成物はがん、特に大腸癌の治療に有用である。
本発明のモノクローナル抗体を取得するには、免疫原として、本来の立体構造を有する状態にある、ヒトＳＬＣ６Ａ６の全長タンパク質（配列番号１（塩基配列）、配列番号２（アミノ酸配列））、あるいは細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６（配列番号３（塩基配列）、配列番号４（アミノ酸配列））を含む部分タンパク質（以下、総称してタンパク質と表現する場合がある）を用いる。生きた細胞を認識するため、膜タンパク質本来の立体構造を認識できる抗体を取得する。
本発明の医薬組成物に使用されるモノクローナル抗体（以下「本発明のモノクローナル抗体」ともいう）は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有する立体構造の状態にあることをいう。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識することができる。特に、細胞外領域として、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３〜２１６の領域（配列番号４）を認識することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列の１個もしくは数個（例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号４に示すアミノ酸配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上の相同性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、タウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測される。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ，７６，１−１５，１９８３）で解析することにより確認することができると考えられる。
あるいは、本発明のモノクローナル抗体はＳＬＣ６Ａ６に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明のモノクローナル抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
変異型ポリペプチドと本発明のモノクローナル抗体との結合は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
また、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳなどで比較することにより確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６に対し、従来の抗体よりも高い親和性を有している。
従来の抗体は、細胞外領域を認識しないために、生きた細胞に結合できず治療薬として用いることが出来ない点に問題があった。これに対し、本発明のモノクローナル抗体は、従来の抗体と異なり細胞外領域を認識するとともに、従来の抗体よりも高い親和性を有するため、がん細胞表面に存在するＳＬＣ６Ａ６と高い親和性で結合し、生体内でＳＣＬ６Ａ６の機能を直接的に抑制するほか、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性によりがん細胞を死滅に導くことが可能になる。
本発明のモノクローナル抗体は、ｓｌｃ６ａ６のｍＲＮＡバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のＳＬＣ６Ａ６だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と広範に結合することが可能である。
本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、あるいはモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、（ｓｃＦｖ）２、ＤｉＡｂｏｄｙ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、標識抗体などが挙げられる。いずれも、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４Ｂ９ｂ」（以下「４Ｂ９ｂ」という）及び「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５Ｈ１２ｄ」（以下「５Ｈ１２ｄ」という）と称し、どちらも、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１  千葉県流山市東深井１０５番地）が、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託した。その受託番号は、「４Ｂ９ｂ」については「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３」であり、５Ｈ１２ｄについては「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４」である。さらに細胞株として、「３Ａ３」、「１９Ｂ１０」、「２３Ｇ１２」、「７Ｃ１１」、「１２Ｅ８」、「６Ｇ３」、「１８Ａ１０」、「２２Ａ４」、「２３Ｈ６」。「２６Ｆ３」、「２Ｆ２」、「７Ｈ８」、及び「１９Ｃ２ｊ」を取得した。「３Ａ３」、「１９Ｂ１０」、「２３Ｇ１２」、「７Ｃ１１」、「１２Ｅ８」はサブクラスＩｇＧであり、残りの抗体はＩｇＭであった。本発明は、当該ハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
これらの特徴を有する本発明のモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なり、ＷＯ／２０１０／０９８４７１に開示されるように、膜タンパク質を発現させた細胞を生着させる免疫法を用いて得られるものである。当業者において一般的に実施されている製法では作製が困難である。それは、
（１）抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する、
（２）細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない、
などの理由による。
本発明のモノクローナル抗体は、本発明者らが抗体の製法（特に免疫方法）に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
本発明のモノクローナル抗体は、以下の特徴を有する。
本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６が本来有する立体構造をもとに作製された故に、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体（ＨＰＡ０１５０２８）と比較して結合力が非常に高く、従来の抗体では困難であった細胞膜上のＳＬＣ６Ａ６と十分に結合することができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体（ｓｃ−１６６６４０）に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができ、治療薬として利用することが可能である。
加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体はがんの治療に利用することにより、がんによる死亡率を減少させることが出来る。
また、本発明は、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明のＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ（ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列のうち、第１４５番目から第２１３番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。）を指す。
ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であってもよい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＧのＨ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳＬＣ６Ａ６タンパク質をＷＯ／２０１０／０９８４７１に開示される方法を用いて免疫することにより調製することが可能である。モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。
本発明のがん治療剤には、ＳＬＣ６Ａ６抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される抗がん剤や担体を適宜結合させることができる。
本発明においては、ＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することで、がん細胞の増殖や転移を抑えることによって、がんの進行や転移を抑制することが出来る。つまり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ））と呼ばれる方法によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する物質を提供することが出来る。これらはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）やｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）またはこれらを発現出来る発現ベクターを有効成分とし、既存のドラッグデリバリーシステムを用いてがんの治療薬（がんの進展または転移の抑制剤）として利用できる。
ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質の具体例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はこれらを発現できる発現ベクターなどが挙げられる。これらが細胞に導入されると、ＲＮＡｉ現象が生じ、相同な配列を有するＲＮＡが分解される。このようなＲＮＡｉ現象は、線虫，昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
本発明においてはｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においては、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の発現を抑制することができる。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたもの、あるいは生物体内で合成されたものか、もしくは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡを言い、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＳＬＣ６Ａ６遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡが効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくはＳＬＣ６Ａ６遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の３’末端付近の配列でもよい。さらに、ｍＲＮＡとして転写される場合、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のタンパク質をコードする領域の終止コドンより下流のｍＲＮＡ領域（３’−ＵＴＲ）に配列を作製しても良い。
本発明ではｓｉＲＮＡを、ＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができ、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。例えば、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の核酸配列（配列番号１又は３）の一部に対して少なくとも約７０％、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも約１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約１９ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも約２１ヌクレオチド長である。
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる因子として、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
ｓｈＲＮＡは、好ましくは３’突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
本発明で用いるＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質（即ち、上記したようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）は、人工的に化学合成してもよく、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、ＳＬＣ６Ａ６の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
さらに本発明においては、ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質（好ましくは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。
本発明のがん治療剤は、がんの治療のために広く使用することができるが、好ましくは発がん及びがんの浸潤・転移を抑制するための薬剤として使用することができる。
本発明のがん治療剤の投与対象のがんの種類は特に限定されず、ＳＬＣ６Ａ６を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん（肝臓がん）、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、子宮がんである。
本発明のがん治療剤の投与方法は、非経口投与（例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分（本発明のモノクローナル抗体、又はＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質）の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分（抗体の場合）は、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１５ｍｇ／日であることが好ましく、より好ましくは２−１２ｍｇ／日である。
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。本発明のがん治療剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを投与する場合は、その有効量は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、被験者に投与すべき有効量を、被験者の身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの要素を考慮して容易に決定することができる。一般に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非経口投与（例えば静注）の場合約０．１〜１．５ｍｇ／ｋｇである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の発現解析
本実施例では、新たながん細胞特異的な膜タンパク質を同定し、診断や治療目的の抗体を作製する目的で、新たな膜タンパク質マーカーの同定を行った。５種類の大腸がん培養細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０）で共通して発現し、２種類の正常細胞（大腸内視鏡検査を受けた健常者２名由来の正常大腸剥離細胞）では発現していない遺伝子をＤＮＡマイクロアレイによって同定した。
１８０個得られた候補遺伝子の中から、定量性ＰＣＲ法により５症例のがん患部と健常部とで、２倍以上の差のみられる遺伝子２５個を絞り込んだ。さらにその遺伝子群の中から、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により、がん部特異的に転写がみられる遺伝子を複数同定した。その中で、東京大学システム生物医学ラボラトリーのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｍ．ｏｒｇ／）上で公開されている３９種類の正常組織すべてで発現が見られない遺伝子を調べたところ、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６  （ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ，ＳＬＣ６Ａ６）遺伝子を同定した。
ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のがん部、健常部での発現を確認するために、ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３０４３）の５４６１−５８７８（４１８  ｂｐ）に位置する配列に対してプローブを作製し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｙｚａｔｉｏｎ法により組織を分析した。
大腸がん組織パラフィン切片（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）をキシレン処理後、エタノール、ＰＢＳの順で水和を行い、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。７μｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｒｅｉｎａｓｅ  Ｋ  （Ｒｏｃｈｅ）で３０分間処理し、４％パラホルムアルデヒド溶液で再固定した。０．２５％無水酢酸０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で１０分間アセチル化し、エタノールで脱水した。３００ｎｇ／ｍｌプローブ（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を含むｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に６０℃で１６時間反応させた後、５×洗浄液（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で６０℃２０分間、５０％ホルムアミド・２×洗浄液で６０℃２０分間洗浄し、ＲＮａｓｅＡで３７℃３０分間処理した。
２×洗浄液、ＴＢＳＴで洗浄した後、０．５％ブロッキング反応液（Ｒｏｃｈｅ）、２０％熱処理羊血清（Ｓｉｇｍａ）と順次反応させた。ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）と２時間の反応を行い、ＰＢＳで洗浄後にＮＢＴ／ＢＣＩＰ液（Ｒｏｃｈｅ）中で発色させた。ケルネヒトロート液（Ｍｕｔｏｈ）で対比染色後、脱水処理し、マリノール（Ｍｕｔｏｈ）で封入した後に顕微鏡で観察を行った。図１に結果を示した。図１に示されるように、大腸がんのがん部は、健常部と比べ特異的に染色された。
【実施例２】
【０００７】
モノクローナル抗体の作製
（１）細胞
ＭＣＦ７−１４は、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４を継代したものを用いた。Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＷｉＤｒ、２９３Ｔは、国立がん研究センター東病院より入手した。Ｃｏｓ７細胞は東京理科大より入手した。
ＭＣＦ７−１４、ＳＷ６２０、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ２０１を、１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）で、ＷｉＤｒはＥ−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）、ＨＣＴ１１６はＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ社）、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８０、２９３Ｔ及び残りの細胞はＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）で、それぞれ８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。
（２）ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のクローニング
ＭＣＦ７−１４を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応を行なった。
プライマー配列
2013133450.tif 000002
ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および６０℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。  得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）を用いて、ｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。増幅断片をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。
（３）ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株の作製
上記（２）で作製したプラスミドを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ社製）を用いてＭＣＦ７−１４細胞へ導入した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。
ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう添加した実施例２（１）記載の培地で細胞を培養し、３〜５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＳＬＣ６Ａ６を過剰発現している細胞を選び出すため、培養したＭＣＦ７−１４及び遺伝子導入した細胞それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。
培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社、クローン９Ｅ１０）をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ  ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ  ５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、シグナルを観察し、ＭＣＦ７−１４よりもシグナルの高い株を３種類選択した。
（４）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ
上記（３）で得られた３種類の細胞を１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）で２回洗浄した。細胞に２×ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  （０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％（ｗ／ｖ）Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．２％（ｗ／ｖ）  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を２００μＬ添加し１分間氷上に放置した後、スクレーパーで細胞溶液を回収した。超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）で３０秒間細胞を破砕し、抽出液を得た。それぞれの細胞について抽出液を作製し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定後、同じタンパク質量となるよう調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、トランスブロットＳＤセル（バイオラッド社）を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いＰＶＤＦメンブレン（ＰＩＥＲＣＥ社）にタンパク質を転写した。ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄を行った。ｃ−ｍｙｃ抗体をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで１万倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）でシグナルを検出した。
図２に結果を示した。ＳＬＣ６Ａ６遺伝子を導入した細胞の中で最も発現が顕著であったクローンを免疫用の細胞として用いた。
（５）細胞の移植
１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社）を用いて回収し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）で２回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍＬとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
生理食塩水に３．５％（ｗ／ｖ）となるよう抱水クロラール（Ｓｉｇｍａ社製）を溶解して、３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。６〜８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ−ｎｕ／ｎｕ系統（日本クレア社製））の腹腔内に３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を０．２ｍＬ投与して麻酔した。マウスの第４乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を１乳腺あたり１×１０６個、２４Ｇの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。１匹のマウスに対して、２箇所の移植となるように、胴体左右両方の第４乳腺にそれぞれ移植を行った。
（６）スクリーニング用ＳＬＣ６Ａ６部分タンパク質の発現と精製
実施例２（３）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６の領域（配列番号４）をコードするＤＮＡ（配列番号３）をｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングした。以下のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行なった。
プライマー配列
2013133450.tif 000003
ＰＣＲ反応は、９４℃、２分間のプレインキュベーションを行なった後、９８℃、１０秒間のデナチュレーション、５８℃、３０秒間のアニーリング、および６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて、ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ組み込んだ。
増幅断片の塩基配列をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。このベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）  トリプトン（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社））で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＳＬＣ６Ａ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。１ＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ  酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ  Ｃに透析して、精製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を得た。
（７）抗血清の解析
上記（６）で得た組換えタンパク質を１０μｇ／ｍｌを１００μＬずつ、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  ｗｅｌｌプレート（ヌンク社）に入れ、室温で１時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ  ７．４）で洗浄した後、５％となるようＴＢＳ−Ｔで希釈したスキムミルク（ＧＩＢＣＯ社）を入れ、３０分室温でブロッキングを行った。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、マウスの尾静脈より回収した血漿をＴＢＳ−Ｔで１／２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。  最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して抗体の力価を解析し、細胞融合に用いるマウスの選択に利用した。
（８）細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号  ＣＲＬ−１５８０）と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０８個の脾臓細胞と０．２５×１０８個の骨髄腫株とを混合し、ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に細胞密度が０．２５×１０８個／ｍＬとなるよう懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう３０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１〜１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり５〜１２個のコロニーが形成された。
（９）モノクローナル抗体の取得
移植７ヶ月後に脾臓細胞を取り出し、上記（８）に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。ＳＬＣ６Ａ６を認識する抗体を選択するために、上記（３）及び（７）記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識を用いた。
図３は、得られたクローンを上記（７）と同様の方法で解析した結果である。「３Ａ３」、「１９Ｂ１０」、「２３Ｇ１２」、「７Ｃ１１」、「１２Ｅ８」、「６Ｇ３」、「１８Ａ１０」、「２２Ａ４」、「２３Ｈ６」、「２６Ｆ３」、「２Ｆ２」、「７Ｈ８」、及び「１９Ｃ２ｊ」はクローン番号を示す。以下では、ハイブリドーマ細胞が作る抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
（１０）組織染色
４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体を用いて免疫染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）をキシレンで脱パラフィン処理、エタノールで親水化した。０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、加圧水蒸気下（１２０度）で１０分間処理し、抗原賦活化を行った。３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで処理した後、４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体それぞれと４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ社）で室温１時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＤＡＢ試薬（ＤＡＫＯ社）で５分間発色させた。蒸留水で水洗後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＷＡＫＯ）を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。
図４に、大腸癌患者の癌部及び正常部に対して免疫染色を行った結果を示した。がん部が特異的に染色されていることが示された。
（１１）正常組織の組織染色
４Ｂ９ｂ及び５Ｈ１２ｄを用いて、ヒト正常組織の免疫染色を行った（図５）。方法は（１０）に記載されている方法と同様である。
図５において、パネルＡ〜Ｈは、それぞれＡ：大腸、Ｂ：胃、Ｃ：回腸、Ｄ：肝臓、Ｅ：膵臓、Ｆ：心筋、Ｇ：肺、Ｈ：胎盤を示している。抗体がＩｇＭであるため多少のバックグラウンドは観察されているが、細胞膜が染色されるのは大腸癌のみであった。
（１２）リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
培養した細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。ｃＤＮＡはｔｏｔａｌ  ＲＮＡから１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて合成した（Ｒｏｃｈｅ社）。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＳＬＣ６Ａ６  ｃＤＮＡのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒキャピラリー中のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒｅ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｉ  （ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．５μＭの各プライマー配列を含有する反応液（２０μｌ）で行った。使用したｐｒｉｍｅｒはＳＬＣ６Ａ６  ＴａｇＭａｎプローブＨｓ００１６１７７８（アプライドバイオシステム社）を用いた。
鋳型ｃＤＮＡの段階的希釈によりＰＣＲ産物を直線領域で最適化した。定量的ＰＣＲの分析はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア３．３版を用いて行った。結果を図６に示す。
（１３）ＦＡＣＳ解析
１０種類の大腸癌細胞をそれぞれ９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、スクレーパーで剥がし、１．５ｍＬチューブに回収した。４Ｂ９ｂ、５Ｈ１２ｄ抗体をそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるよう添加し、６０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで１／１０００希釈して添加し、３０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＰＢＳで２回洗浄後、Ｇｕａｖａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で解析を行った。結果を図７に示す。
図７より、全ての大腸癌細胞に対し本発明の抗体が反応することが明らかになった。
【実施例３】
【０００８】
（１）マウスＩｇＧ化遺伝子の構築
４Ｂ９ｂ抗体を発現するハイブリドーマ細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて抽出し、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ用の酵素としてはＫＯＤＰｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、特に記載がない限りメーカー推奨のプロトコールで実験を行った。抗体のＨ鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号９と配列番号１０のＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、３０℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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抗体のＬ鎖可変領域断片を増幅するために、配列番号１１と配列番号１２のＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、３０℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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精製したＰＣＲ増幅断片を１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社）及び２×ＧｏＴａｑ  Ｍａｘｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と混合し、７０℃、１５分間反応後、４℃、２分間氷冷することで、３’末端へｄＡを付加した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、いわゆるＴＡクローニング法によりＨ鎖断片及びＬ鎖断片をクローニングした。
（ｉ）Ｈ鎖の構築
続いて、シグナル配列を付加するため、ヒト−マウスキメラＩｇＧ１抗体を発現するＣＨＯ細胞（国立がん研究センターがん治療対策部門より入手）から上記と同様の方法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、配列番号１３と配列番号１４のＰｒｉｍｅｒでＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、１５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）を行って断片を得た。
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並行してマウスＩｇＧ１を発現するハイブリドーマ細胞（すでに作製済みの抗マウスアルブミンモノクローナル抗体Ｃ、クローンＡＬＢ１）から同様にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した後、配列番号１５と配列番号１６のＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、１５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
［００７２］
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上記のように調製した抗体Ｈ鎖のシグナル配列、可変部、定常部を、ＰＣＲ反応により連結した。シグナル配列と可変部、定常部を混合し、配列番号１３と配列番号１６を用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、３０秒間のアニーリング、６８℃、１分間のエロンゲーションのサイクルを３２サイクル）を行い、連結された断片を得た。
これらを、上記ＴＡクローニングと同じ方法でｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒへクローニングした後、シグナル配列の５’側及び定常部の３’側にある制限酵素（ＮｏｔＩ）を利用して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡ（インビトロジェン社）へクローニングした。
（ｉｉ）Ｌ鎖の構築
Ｌ鎖についてもＨ鎖と同様に、シグナル配列、可変部、定常部をそれぞれクローニングし、結合させることで断片を得た。
シグナル配列を付加するために、配列番号１７と配列番号１８のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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定常部のクローニングには、配列番号１９と配列番号２０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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Ｈ鎖と同様に、シグナル配列と可変部、定常部を混合し、配列番号１７と配列番号２０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結した。これらの断片をｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ）を用いてｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へクローニングした。マウスＩｇＧ１化したＳＬＣ６Ａ６抗体のＨ鎖のＤＮＡ配列は配列番号２１、アミノ酸配列は配列番号２２で示される。Ｌ鎖も同様であり、ＤＮＡ配列は配列番号２３、アミノ酸配列は配列番号２４で示される。
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（２）マウスＩｇＧ化抗体の発現と精製
１０ｃｍ  ｄｉｓｈ  ４枚に９０％コンフルエントとなるようＣｏｓ７細胞を培養し、（１）で作製したＨ鎖及びＬ鎖発現用ベクターをＣｏｓ７細胞へＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて導入し、タンパク質の一過性発現を行った。導入条件はメーカー推奨の方法で行った。２４時間後に１０ｃｍ  ｄｉｓｈ  ２０枚に継代し、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライ社）とを添加した培地で６日間培養を行った。培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを用いて精製した。遺伝子導入したＣｏｓ７の培養上清２００ｍＬに対し、１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対し、培養液を１〜３ｍｌ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。次に１ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  （ｐＨ２．５））で抗体タンパク質を溶出させ、３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０〜７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳに置換した。
（３）ＥＬＩＳＡによる活性測定
実施例２．（７）と同様の方法で活性測定を行った。この際、抗体濃度を０〜４０μｇ／ｍＬとした。活性測定の結果を図８に示した。マウスＩｇＧ化した抗体でも活性のあることが確認された。
（４）免疫組織染色
実施例２．（１１）に記載の方法で面積組織染色を行った。３症例の大腸がん患者の組織サンプルについて、それぞれ正常部（ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ）、がん部（Ｃａｎｃｅｒ）、がん浸潤部（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｆｒｏｎｔ）を染色した２つの症例（Ａ及びＢ）結果を図９に示した。正常部から腫瘍先端部に行くにしたがって、明確に染色されることが示されている。つまり、本発明のＳＬＣ６Ａ６抗体は、大腸癌に結合する、特に大腸癌が広がっている浸潤部分に強く結合する、ということが示された。これは、治療用抗体を開発する上で、癌が広がりつつある部分に結合し、がんを抑制できるという点として非常に優れていることを示している。また、抗体だけではなく、ターゲットであるＳＬＣ６Ａ６も大腸癌治療のターゲットとして優れていると考えている。
【実施例４】
【０００９】
（１）ヒトＩｇＧ化
実施例３．（１）に示される方法と同様の方法で、シグナル配列、可変部、及び定常部をそれぞれクローニングした後、連結することで発現ベクターを作製した。ヒトＩｇＧ１定常部及びシグナル配列のクローニングには、ヒト―マウスキメラＩｇＧ１抗体を発現するＣＨＯ細胞（国立がん研究センターがん治療対策部門より入手）から増幅を行った。
（ｉ）Ｈ鎖の構築
Ｈ鎖可変部のクローニングには配列番号２５と配列番号２６のｐｒｉｍｅｒを、定常部では配列番号２７と配列番号２８のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、１分間のエロンゲーションのサイクルを３２サイクル）により断片を得た。
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Ｈ鎖シグナル配列は、配列番号２９と配列番号３０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、２０秒間のエロンゲーションのサイクルを３２サイクル）により断片を得た。
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マウス抗体の場合と同様に、シグナル配列、可変部、定常部を配列番号２５と配列番号３０のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結し、これらの断片をｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＮｏｔＩ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクターへクローニングした。
（ｉｉ）Ｌ鎖の構築
Ｌ鎖についてもマウスＩｇＧ１のＬ鎖構築と同様に、シグナル配列、可変部、定常部をそれぞれクローニングし、結合させることで断片を得た。
可変部のクローニングには、配列番号３１と配列番号３２のｐｒｉｍｅｒを、定常部のクローニングには配列番号３３と配列番号３４を、シグナル配列部分は配列番号３５と配列番号３６を用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のプレインキュベーション、９４℃、１５秒間のデナチュレーションを行ない、続いて、５８℃、１５秒間のアニーリング、及び６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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Ｌ鎖についてもシグナル配列、可変部、定常部を列番号３１と配列番号３６のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結した後、定常部と配列番号３６と配列番号３７のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ反応により連結した。これらの断片をｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ）を用いてｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へクローニングした。マウスＩｇＧ１化したＳＬＣ６Ａ６抗体のＨ鎖は配列番号３７：塩基配列、配列番号３８：アミノ酸配列、Ｌ鎖は配列番号３９：塩基配列、配列番号４０：アミノ酸配列である。
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（２）ＥＬＩＳＡによる活性測定
実施例４で作製したプラスミドを実施例３．（２）及び（３）に記載の方法で細胞への遺伝子導入、及び精製を行うことで調製したヒトＩｇＧ化抗体の活性測定を行った。この際、抗体濃度を０〜４０μｇ／ｍＬとした。活性測定の結果を図１０に示した。ヒトＩｇＧ化した抗体でも活性のあることが確認された。
【実施例５】
【００１０】
上記記載の抗体以外に新たに作製したサブクラスＩｇＧのモノクローナル抗体それぞれについて、ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ細胞を用いた免疫染色、及びＦＡＣＳ解析を行った。２９３Ｔ細胞に実施例２（３）と同様の方法でＳＬＣ６Ａ６遺伝子を導入し、一過性発現株を作製した。遺伝子導入３日後に細胞を回収し、実施例２．（１３）と同様の方法で細胞を染色して解析を行った。
実験結果を図１１に示した。取得されたサブクラスＩｇＧ抗体の中で少なくとも３種類のクローン（１９Ｂ１０、７Ｃ１１、１２Ｅ８）は、ＳＬＣ６Ａ６を過剰発現させた細胞と反応することが示された。
【実施例６】
【００１１】
（１）抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）
ヒトＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２で処理したヒト末梢血単核球を作用細胞として、下記の標的細胞を作用細胞：標的細胞＝２５：１、１２．５：１、６．２５：１、３．１３：１の比率で混合し、０．１μｇ／ｍＬのヒト化抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を添加し、４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。抗体及び作用細胞を添加し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により、ＡＤＣＣを測定した。細胞の死滅に伴って培養液中に遊離したＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）がテトラゾリウムをホルマザンへ変化させることを利用しており、吸光度５００ｎｍの変化で検出することが出来る。
ヒト大腸癌細胞Ｃａｃｏ２株
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１５株
ヒト大腸癌細胞ＤＬＤ−１株
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６株
ヒト大腸癌細胞ＬｏＶｏ株
ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０株
ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０株
ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒ株
【実施例７】
【００１２】
（１）補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）
ＨＣＴ１５細胞（ヒト大腸癌由来ＳＬＣ６Ａ６陽性細胞）に、２５μｇ／ｍＬのＳＬＣ６Ａ６抗体又はキメラ化ＳＬＣ６Ａ６抗体のいずれかを添加した。これにフルオレセイン標識ヒト補体Ｃ１ｑを１０μｇ／ｍＬ添加。標識Ｃ１ｑによる蛍光染色性をフローサイトメトリーにより測定した。次に、ＨＣＴ１５細胞又はＨＴ−２９（ＳＬＣ６Ａ６陽性細胞）、及びＣＯＬＯ２０１細胞（ＳＬＣ６Ａ６弱陽性細胞）に、２．２μｇ／ｍＬの抗ＳＬＣ６Ａ６抗体を添加した。これにヒト補体を添加し培養した。細胞外に放出されたＬＤＨ量をＣｙｔｏＴｏｘ９６を用いて測定し、補体による細胞溶解率を算出した。
【実施例８】
【００１３】
（１）ＳＬＣ６Ａ６数の抑制作用（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）及びＣＯＬＯ２０１（ＳＬＣ６Ａ６低レベル発現株）を、抗ＳＬＣ６Ａ６抗体１５０μｇ／ｍＬの存在、非存在下で１日あるいは５日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した後、細胞のＳＬＣ６Ａ６数を求めた。細胞あたりのＳＬＣ６Ａ６数は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８でラベルした、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体４Ｂ９ｂを用い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８のモル吸光係数を用いて細胞あたりのＳＬＣ６Ａ６数を算出した。
【実施例９】
【００１４】
（１）細胞株の作製
実施例２（３）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６の下流にＩＲＥＳ及びＧＦＰ遺伝子を導入した。ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片は、ｐＭＸｓ−ＩＧベクター（東京大学  北村俊雄氏より購入）から制限酵素（ＸｈｏＩとＳａｌＩ）を用いてＩＲＥＳ−ＧＦＰ部分を切り出し、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｌａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社）を用いて末端を平滑化した。また、実施例２．（２）で作製したｐＥＦ６−ＳＬＣ６Ａ６ベクターのＳＬＣ６Ａ６下流部分を制限酵素（ＰｍｅＩ）で処理し、同様にＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて平滑化した。ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片を平滑化したｐＥＦ６−ＳＬＣ６Ａ６ベクターでクローニングし、ｐＥＦ６−ＳＬＣ６Ａ６−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを構築した。このＰｌａｓｍｉｄをマウス乳癌細胞４Ｔ１へＦｕｇｅｎｅ６を用い導入した。導入方法は、実施例２．（３）と同様の方法で行った。ＧＦＰの蛍光を示す細胞を複数クローニングし、形態を観察した所、遺伝子導入を行っていない細胞に比べ細胞が浮遊しやすい形態を示した（図１２）。
（２）表現型の解析
ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株させた細胞を培養し、実施例２．（４）に示される方法でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析を行った。この際、Ｅカドヘリン抗体、Ｎカドヘリン抗体、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（ＢＤ社）はそれぞれ１μｇ／ｍＬで用いた。実験結果を図１３に示す。上皮間葉移行（ＥＭＴ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）で見られる表現型の変化が観察された。つまり、ＳＬＣ６Ａ６はタウリンを輸送するだけでなく、過剰発現により癌細胞をよりがん幹細胞に近づける機能を果たしている可能性が示唆された。
【実施例１０】
【００１５】
（１）Ｂａｌｂ／ｃマウス可移植性ＳＬＣ６Ａ６細胞４Ｔ１−ＳＬＣ６Ａ６に対する効果  実施例９で作製したＳＬＣ６Ａ６を過剰発現する４Ｔ１細胞に対し、実施例３で作製したマウスＩｇＧ化抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける作用を解析した。遺伝子導入後に樹立した細胞Ｌ３１及びＬ３５を５×１０５個を実施例２．（５）に記載の方法と同様に乳腺へ移植した。移植後１３日目にマウスＩｇＧ化抗体５０μｇ／ｋｇを投与し、０、７、１２、１５日目に腫瘍のサイズ（直径）を測定した。
結果を図１４に示した。ＳＬＣ６Ａ６を発現する細胞の増殖が添加した抗体によって妨げられている結果を得た。
【実施例１１】
【００１６】
実施例１０の結果をさらに詳細に解析するため、マウス乳癌４Ｔ１−ＳＬＣ６Ａ６（ＳＬＣ６Ａ６遺伝子導入株）細胞をヌードマウス（１群５〜７匹、雌）の第四乳腺に移植し、７日目より投与を開始した。ＳＬＣ６Ａ６抗体（総投与量０．３〜１００ｍｇ／ｋｇ）は、１日１回、ｄａｙ１、５、９（投与開始日＝ｄａｙ１）の計３回尾静脈投与した。対照群はマウスＩｇＧ１（総投与量１００ｍｇ／ｋｇ）を同様のスケジュールで尾静脈投与した。
（２）ヌードマウス可移植性ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１５に対する効果
ＳＬＣ６Ａ６抗体単剤
ヒト大腸癌ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）細胞をヌードマウス（１群５〜１０、雌）の背部皮下に移植し、腫瘍体積が２００〜３００ｍｍ３に達した時点より投与を開始した。ＳＬＣ６Ａ６抗体（０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）は、１日１回、週２回、４〜５週間腹腔内投与した。対照群はヒトＩｇＧ１を同様のスケジュールで腹腔内投与した。
（３）ＳＬＣ６Ａ６抗体＋タキソール
ヒト大腸癌ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）細胞をヌードマウス（１群７〜１３匹）の背部皮下に移植し、腫瘍体積が２００〜３００ｍｍ３に達した時点より投与し、腫瘍体積を測定することにより抗腫瘍効果を検討した。
【実施例１２】
【００１７】
（１）細胞増殖試験
ヒト大腸癌ＨＣＴ１５（ＳＬＣ６Ａ６高レベル発現株）細胞を用い、ＳＬＣ６Ａ６抗体の存在下、細胞を３日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
【実施例１３】
【００１８】
（１）ヒト大腸癌細胞でのＳＬＣ６Ａ６過剰発現株の作製
実施例１０．（１）で作製したｐＥＦ６−ＩＲＥＳ−ＧＦＰをＣＯＬＯ２０１、ＳＷ６
２０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ細胞へ導入し、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンで薬剤選択を行い、安定発現株を得た。
【実施例１４】
【００１９】
（１）ＲＮＡｉ用ベクターの作製
ＲＮＡｉによりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制できるような配列を設計した。配列を設計するソフトウエアｓｉＤｉｒｅｃｔｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｄｉｒｅｃｔ２．ｒｎａｉ．ｊｐ／）を用いた。安定的に発現が抑制される細胞を取得するために、４種類の配列を設計し、ｓｈＲＮＡの構築を行った。合成オリゴＤＮＡ２本を相補的な配列が含まれるよう設計し、アニーニングさせて（９４℃、１０分間のデナチュレーション後、１２時間かけて温度を室温まで下げる）Ｐｌａｓｍｉｄベクターへ挿入する断片を作製した。そして、ｐＣＡＧベクター（東京理科大学村上研究室より入手）へｐｒｉｍｅｒ上に設計した制限酵素（ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ）を用いてクローニングした。
作製した４種類のｓｈＲＮＡ配列としては、配列番号４１、４４、４７、５０で示される。それぞれの配列を作製するために用いたｐｒｉｍｅｒ配列は、配列番号４１に示す配列の作製には配列番号４２と４３に示すプライマーを、配列番号４４に示す配列の作製には配列番号４５と４６に示すプライマーを、配列番号４７に示す配列の作製には配列番号４８と４９に示すプライマーを、配列番号５０に示す配列の作製には配列番号５１と５２に示すプライマーを用いた。
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Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：
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Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：
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Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：
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Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：
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Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：
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（２）大腸癌細胞でのＳＬＣ６Ａ６発現抑制
大腸癌細胞ＨＣＴ１５及びＨＴ−２９に、実施例１０．（１）で構築したベクターを実施例２．（３）と同様の方法で導入を行った。遺伝子導入試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを含む培地で薬剤選択し、細胞株を得た。ＳＬＣ６Ａ６の発現が抑制されていることを実施例２．（４）と同様の方法でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで解析した。
（３）抗体による移動能抑制試験（メンブレン移動試験）
実施例９．で作製した細胞を無血清培地に懸濁後、コントロールカルチャーインサート（ＢＤ社）のトランスウエル（フィルター上部：上室）に１×１０５個となるよう入れ、さらにＳＬＣ６Ａ６抗体あるいはマウスＩｇＧ１抗体を５０μｇ／ウエルとなるよう添加し、３７℃で３日間培養した。トランスウエルのメンブレン（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅは８μｍ）を移動した細胞（フィルター下部：下室）を０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ＭｉｌｌｉＱを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。
【実施例１５】
【００２０】
（１）抗体による浸潤能抑制試験（マトリゲル透過性試験）
実施例１１．で作製した細胞を無血清培地に懸濁後、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤ社）のトランスウエル（フィルター上部：上室）に１×１０５個となるよう入れ、さらにＳＬＣ６Ａ６抗体あるいはマウスＩｇＧ１抗体を５０μｇ／ウエルとなるよう添加し、３７℃で３日間培養した。トランスウエルのメンブレン（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅは８μｍ）を移動した細胞（フィルター下部：下室）を０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ＭｉｌｌｉＱを用いて余分な色素を除いた後に、細胞数を観察した。
【実施例１６】
【００２１】
（１）抗体による移動能抑制試験（スクラッチアッセイ）
実施例１１．で作製した細胞をプラスチックプレートで培養し、その培養面をスクラッチした。ＳＬＣ６Ａ６抗体を添加及び非添加した培地で１２時間培養を行い、スクラッチ部分の面積変化の割合を測定することで、それぞれの細胞の運動能を測定した。
【実施例１７】
【００２２】
（１）コロニー形成試験
実施例１１．で作製した細胞をＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔｏ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて解析した。ソフトアガー中に１×１０２個／ｗｅｌｌとなるよう細胞を入れ、２週間培養した後に形成されたコロニーを測定した。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明により、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制する核酸が提供される。本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞と特異的に結合することでがん治療に利用することができる。発現を抑制する核酸は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞の増殖及び転移の進行を抑制することが出来る。
【受託番号】
【００２４】
（１）微生物の表示：「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４Ｂ９ｂ」
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３
原寄託日：２０１０年７月２１日
国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６
（２）微生物の表示：「ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５Ｈ１２ｄ」
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４
原寄託日：２０１０年７月２１日
国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６
【配列表フリーテキスト】
【００２５】
配列番号５〜２０、２５〜３６、４１〜５２：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月8日(2014.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体、又はＲＮＡ干渉によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質を含む、大腸癌を治療するための医薬組成物であって、
前記抗体は、
（a）配列番号22に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号24に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗体；又は、
（b）配列番号38に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号40に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗体
であり、
前記ＲＮＡ干渉によりＳＬＣ６Ａ６の発現を抑制することができる物質は、配列番号41、44、47及び50からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列からなるｓｈＲＮＡである、
前記医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体が、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生されるものである、請求項１記載の医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月2日(2015.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体を含む、大腸癌を治療するための医薬組成物であって、
前記抗体は、
（a）配列番号22に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号24に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗体；又は、
（b）配列番号38に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号40に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗体
である、
前記医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体が、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１３又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１４であるハイブリドーマにより産生されるものである、請求項１記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2013133450.tif 000088
2013133450.tif 000089
2013133450.tif 000090
2013133450.tif 000091