(57)【要約】  本発明は、  固体基板1110と、固体基板1110に設けられた複数のナノポア1120、1121と、固体基板1110に配置された導電性薄膜1130a、1130b、1131a、1131bとを備え、導電性薄膜1130a、1130b、1131a、1131bの少なくとも一部がナノポア1120、1121に面して設けられている生体ポリマーの特性解析チップ1100と、  ナノポア1120、1121に進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、  ラマン散乱光の集光系と、集光した光を特定の波長範囲において異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置とを具備する生体ポリマーの光学的解析装置に関し、前記光源及び照射光学系から外部光を特性解析チップ1100に照射し、解析チップ1100における生体ポリマーのラマン散乱光を前記検出装置において検出し、その検出結果から生体ポリマーを構成するモノマー単位の特性を解析する。
2012165400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体ポリマーの光学的解析装置であって、
固体基板と、該固体基板に設けられた複数のナノポアと、該固体基板に配置された導電性薄膜とを備え、該導電性薄膜の少なくとも一部が該ナノポアに面して設けられている生体ポリマーの特性解析チップと、
前記ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、
ラマン散乱光の集光系と、集光した光を特定の波長範囲において異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置と
を具備し、前記光源及び照射光学系から外部光が前記特性解析チップに照射され、該解析チップにおける生体ポリマーのラマン散乱光が前記検出装置において検出されることを特徴とする生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項２】
生体ポリマーの光学的解析装置であって、
固体基板と、該固体基板に設けられた複数のナノポアと、該固体基板に配置された導電性薄膜とを備え、該導電性薄膜の少なくとも一部が該ナノポアに面して設けられている生体ポリマーの特性解析チップと、
前記ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、
ラマン散乱光の集光系と、集光した光を指定の波長帯ごとに異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置と
を具備し、前記光源及び照射光学系から外部光が前記特性解析チップに照射され、該解析チップにおける生体ポリマーのラマン散乱光が前記検出装置において検出されることを特徴とする生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項３】
前記生体ポリマーが少なくとも4種類のモノマーで構成され、前記分離部が、該生体ポリマーを構成するモノマーの種類ごとに透過光と反射光の強度比が少なくとも4種類に区別されるような異なる比率で光を分割するものであることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項４】
前記外部光を前記導電性薄膜に照射することにより、前記導電性薄膜が前記ナノポアの開口部に面する端部において近接場を発生させ、前記ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項５】
前記導電性薄膜が鋭角の端部を有し、該鋭角の端部が前記ナノポアの開口部に面して配置されていることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項６】
前記特性解析チップが導電性薄膜をナノポア1個当たり少なくとも2つ備え、該少なくとも2つの導電性薄膜が前記ナノポアの開口部をはさんで互いに対向して配置されていることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項７】
前記導電性薄膜が金属で形成されていることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項８】
前記導電性薄膜がグラファイトで形成されていることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項９】
前記導電性薄膜の厚さが0.1nm〜10nmであることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１０】
前記固体基板の前記ナノポアの中心軸方向における中間の深さに前記導電性薄膜が配置されていることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１１】
前記ナノポアの深さが、生体ポリマーを構成するモノマー単位の3倍以上の大きさであることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１２】
前記検出装置において検出されたラマン散乱光の光強度の比から生体ポリマーの特性を解析するデータ処理部をさらに具備することを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１３】
生体ポリマー中のモノマーを1単位ずつ前記ナノポア中に進入させる試料移動機構をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１４】
前記生体ポリマーが、核酸、ペプチド核酸、タンパク質、糖鎖、及びアプタマーからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１５】
前記生体ポリマーの特性解析が核酸の塩基配列の決定である、請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１６】
生体ポリマーの光学的解析装置であって、
固体基板と、該固体基板表面に配置された複数対の導電性薄膜とを備え、対となる該導電性薄膜はある間隔で対向して配置されている生体ポリマーの特性解析チップと、
生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、
ラマン散乱光の集光系と、集光した光を指定の波長帯ごとに異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置と
を具備し、前記光源及び照射光学系から外部光が前記特性解析チップに照射され、該解析チップにおける生体ポリマーのラマン散乱光が前記検出装置において検出されることを特徴とする生体ポリマーの光学的解析装置。
【請求項１７】
請求項１に記載の生体ポリマーの光学的解析装置において、特性解析チップに外部光を照射し、ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させる工程と、
前記ラマン散乱光を検出装置において検出する工程と、
前記ラマン散乱光の検出結果に基づいて生体ポリマーの特性を解析する工程と
を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析方法。
【請求項１８】
前記生体ポリマーが、核酸、ペプチド核酸、タンパク質、糖鎖、及びアプタマーからなる群より選択されることを特徴とする請求項１７に記載の生体ポリマーの特性解析方法。
【請求項１９】
核酸の塩基配列を決定することを特徴とする請求項１７に記載の生体ポリマーの特性解析方法。
【請求項２０】
固体基板と、前記固体基板に設けられた少なくとも1つの流路とを備えた生体ポリマーの特性解析チップであって、外部光を照射することにより、前記流路に進入した生体ポリマーのラマン散乱を発生させることを特徴とする生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２１】
前記流路が導電性薄膜によって形成されていることを特徴とする請求項２０に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２２】
前記流路の少なくとも1か所に先鋭端を有する突起形状が形成されており、該突起形状が、流路の進行方向に対して流路の2つの壁面のいずれかに形成されていることを特徴とする請求項２１に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２３】
前記流路の少なくとも2か所に先鋭端を有する突起形状が形成されており、該突起形状が、流路の進行方向に対して流路の2つの壁面から対向して形成されていることを特徴とする請求項２１に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２４】
前記突起形状が近接場を発生させ、前記近接場を用いて前記ラマン散乱を発生させることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２５】
前記流路の少なくとも1か所に、金属ナノ粒子が流路を横断して1列以上固定されていることを特徴とする請求項２１に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２６】
前記金属ナノ粒子が近接場を発生させ、前記近接場を用いて前記ラマン散乱を発生させることを特徴とする請求項２５記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２７】
前記流路の少なくとも1か所に、金属ナノ構造体が流路を横断して1列以上固定されていることを特徴とする請求項２１に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【請求項２８】
前記金属ナノ構造体が近接場を発生させ、前記近接場を用いて前記ラマン散乱を発生させることを特徴とする請求項２７に記載の生体ポリマーの特性解析チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノサイズのポアが開いた薄膜状のデバイスを用いて生体ポリマーの特性を解析する装置及び方法に関するものであり、特に薄膜に近接場を形成し、DNA、RNAなどの核酸を標識することなく光学的に検出することにより配列解析を行うデバイスの構造、解析装置及び解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
次々世代DNAシーケンサを実現するアプローチとしてナノポアを用いる手法が注目を集めている。DNAを標識することなく、換言すると酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることがナノポア方式の大きな特長と考えられている。ナノポアはその形成法により大別して2種類に分類される。一方はナノサイズの開口（以下「ナノポア」という）を形成するチャンネルタンパク質を2分子膜に埋設したいわゆるバイオナノポアと、もう一方は半導体材料に微細加工を施してナノポアを形成するいわゆる固体ナノポアである。【０００３】
また、このようなナノポアを用いるDNAの解析法として、現在2種類の方法が提案されている。第1の手法は、封鎖電流方式である。すなわち、ナノポアが形成された薄膜の両側に液槽を設け、それぞれの液槽に電解質溶液と電極を設け、電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。電流の大きさは一次近似としてナノポアの断面積に比例する。DNAがナノポアを通過すると、DNAがナノポアを封鎖し、有効断面積が減少するため、電流が減少する。この減少量を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、DNAの1本鎖と2本鎖との差異が識別できる。またバイオポアの一形態において、封鎖電流の大きさからDNAの塩基の種類が判別可能と報告されている（非特許文献１、以下「第1の従来例」ともいう）。ただしバイオポアに用いる2分子膜は有機低分子が弱い力で集合して形成される繊細な薄膜であり、機械的な安定性に課題があると考えられる。またチャンネルタンパク質が2分子膜へ組み込まれる工程が自然現象に依存するため、チャンネルの数の制御や再現性に課題がある。一方、固体ナノポアは薄膜として半導体基板などを用いるため、バイオポアより構造の安定性の点で有利と考えられる。またナノポアを機械的に形成するため、工業的な生産が可能という利点もある。また薄膜材料として半導体基板以外にもグラフェン（graphene）を利用してそれに設けた固体ナノポアを通過する生体分子を分析する装置及び方法も報告されている（特許文献１）。しかし固体ナノポアにおいては、封鎖電流によるDNAの塩基の種類の識別の成功は報告されていない。【０００４】
第2の手法は、トンネル電流方式である。すなわち、ナノポアに面して電極対を対向して設け、電極間に電圧をかけることにより、ナノポアを通過するDNAと電極間のトンネル電流を測定し、トンネル電流の大きさからDNAを解析する方式が提案されている。関連技術として、走査プローブ顕微鏡を用い、糖を修飾したヌクレオシドを有機溶媒に溶解してナノギャップ電極間に導入し、トンネル電流を計測すると、トンネル電流の平均値が塩基の種類によって異なるとの報告がある（非特許文献２、以下「第2の従来例」ともいう）。しかし試料はヌクレオシドである（リン酸を有しない）ため鎖状の核酸ではないこと、試料を修飾する必要があること、試料を有機溶媒に溶解する必要があること、ナノポアを用いていないこと、などの実験条件上の制約があること以外に、トンネル電流には分布があり、塩基の種類の間で重なりがあるため、塩基を識別する能力が低い、という課題もある。【０００５】
一方、単分子の核酸を標識せずに計測する別のアプローチとして、TERS（Tip Enhanced Raman Scattering）法が報告されている（非特許文献３、以下「第3の従来例」ともいう）。この方法では、AFM（原子間力顕微鏡）のプローブの先端に銀を形成し、マイカ基板に固定した鎖状の核酸分子をAFMによりスキャンして核酸分子のAFM像を取得した後、プローブを核酸に近接させ、レーザ光を照射する。するとプローブ先端に局所的な光の増強場（近接場）が形成され、核酸を励起する。励起された核酸が放つラマン散乱光を分光計測することにより、核酸のラマン散乱スペクトルを取得する。得られる信号のS/Nは近接場に含まれる核酸塩基の数よりも大きいことから、1塩基の計測が可能な感度が得られる。またラマン散乱スペクトルは波数に対する強度パターンという2次元的情報を有するため、封鎖電流やトンネル電流など1次元の情報と比較して情報量が飛躍的に多く、定性における識別能が高い、という特長をもつ。近接場の大きさはプローブ先端の曲率で決まり、この第3の従来例の空間分解能は約10nmのオーダーとされる。これは核酸の塩基数に換算して約30塩基分の長さに相当するため、この方法で得られる結果には多数の塩基の情報が重複する。重複した情報から個々の塩基の情報を割り出すために、例えばプローブを核酸の鎖に沿って走査し、ラマン散乱スペクトルの変化（差分）から、近接場に入った塩基と近接場から出た塩基を推察することを繰り返し、配列情報を求める方法（以下「差分法」と記す）が提案されている。この方法を実施するためには核酸を予め固体基板に固定する必要があり、また計測には高分解能の微動ステージを含むAFM装置が必要であり、AFMのプローブをサブnmの精度で3次元的に走査するという繊細な操作が必要である。すなわち装置構成や操作が複雑であるという課題がある。【０００６】
また、例えば複数のナノポアを有するデバイス（マルチナノポア）を用いて複数のDNAの塩基配列を同時に解析する場合には、複数のナノポアから発生する信号を同時に検出することが必要である。例えば、4つの塩基に対応する2色の蛍光の組合せを用いて標的DNAを蛍光標識オリゴヌクレオチドに変換し、蛍光標識オリゴヌクレオチドをナノポアアレイにおいて分析し、発生する2色の蛍光シグナルに基づいて標的DNAの塩基配列を決定する方法が報告されている（非特許文献４）。この方法では、標的DNAを分析用のオリゴヌクレオチドに変換する操作が必要であり、また蛍光を使用するため費用が嵩む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO2009/035647号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Clarke, J. et al., Nat. Nanotech.第4巻第265-270頁, 2009年
【非特許文献２】Chang, S. et al., Nano Lett.第10巻第1070-1075頁, 2010年
【非特許文献３】Bailo, E. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 第47巻第1658-1661頁, 2008年
【非特許文献４】McNally, B. et al., Nano Lett. 第10巻第2237-2244頁, 2010年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
バイオポアを利用して封鎖電流により生体ポリマーを解析する方法（第1の従来例）は、機械的安定性が低く、再現性のある結果を安定に得ることが困難である。またナノポアを利用してトンネル電流により生体ポリマーを解析する方法（第2の従来例）は、塩基の識別能が低く、核酸の塩基配列を高精度に読み取ることが困難である。TERSを利用して生体ポリマーを解析する方法（第3の従来例）は、装置構成が複雑であり、繊細な操作が必要である。また、従来例では複数のナノポアの測定など複数の試料の同時測定が困難であるという課題がある。【００１０】
従って、本発明の課題は、機械的安定性に優れ、高い空間分解能及び感度で、かつ簡単な装置構成で、生体ポリマーの特性を解析するための装置及び方法を提供することである。また本発明の課題は、複数のナノポアで発生する信号を同時に、すなわち高スループットで、精度よく検出する装置及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、固体ナノポアにおいて、基板に適当な導電性薄膜を適当な配置で設けることにより、又は固体基板上に流路を設けることにより、ナノポア又は流路に進入する生体ポリマーの特性をラマン散乱に基づいて解析する際の空間分解能を高め、また感度を改善することができることを見出した。また、ラマン散乱光を検出する際に、ラマン散乱光を各波長で異なる比率で分割し、分割された光を複数の検出画素を有する検出器で検出し、分割された対応する画像位置の強度の比率を算定することによって複数のナノポアで発生する信号を高スループットで検出でき、算定された比率から生体ポリマーの特性を解析できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものであり、具体的には以下を包含する。【００１２】
［1］生体ポリマーの光学的解析装置であって、
生体ポリマーの光学的解析装置であって、
固体基板と、該固体基板に設けられた複数のナノポアと、該固体基板に配置された導電性薄膜とを備え、該導電性薄膜の少なくとも一部が該ナノポアに面して設けられている生体ポリマーの特性解析チップと、
前記ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、
ラマン散乱光の集光系と、集光した光を特定の波長範囲において異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置と
を具備し、前記光源及び照射光学系から外部光が前記特性解析チップに照射され、該解析チップにおける生体ポリマーのラマン散乱光が前記検出装置において検出されることを特徴とする生体ポリマーの光学的解析装置。【００１３】
［2］生体ポリマーの光学的解析装置であって、
固体基板と、該固体基板に設けられた複数のナノポアと、該固体基板に配置された導電性薄膜とを備え、該導電性薄膜の少なくとも一部が該ナノポアに面して設けられている生体ポリマーの特性解析チップと、
前記ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、
ラマン散乱光の集光系と、集光した光を指定の波長帯ごとに異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置と
を具備し、前記光源及び照射光学系から外部光が前記特性解析チップに照射され、該解析チップにおける生体ポリマーのラマン散乱光が前記検出装置において検出されることを特徴とする生体ポリマーの光学的解析装置。【００１４】
［3］前記生体ポリマーが少なくとも4種類のモノマーで構成され、前記分離部が、該生体ポリマーを構成するモノマーの種類ごとに透過光と反射光の強度比が少なくとも4種類に区別されるような異なる比率で光を分割するものであることを特徴とする［1］又は［2］に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００１５】
［4］前記外部光を前記導電性薄膜に照射することにより、前記導電性薄膜が前記ナノポアの開口部に面する端部において近接場を発生させ、前記ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させることを特徴とする［1］〜［3］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００１６】
［5］前記導電性薄膜が鋭角の端部を有し、該鋭角の端部が前記ナノポアの開口部に面して配置されていることを特徴とする［1］〜［4］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００１７】
［6］前記特性解析チップが導電性薄膜をナノポア1個当たり少なくとも2つ備え、該少なくとも2つの導電性薄膜が前記ナノポアの開口部をはさんで互いに対向して配置されていることを特徴とする［1］〜［5］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００１８】
［7］前記導電性薄膜が金属で形成されていることを特徴とする［1］〜［6］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００１９】
［8］前記導電性薄膜がグラファイトで形成されていることを特徴とする［1］〜［6］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２０】
［8-2］グラファイトがグラフェンであることを特徴とする［8］に記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２１】
［9］前記導電性薄膜の厚さが0.1nm〜10nmであることを特徴とする［1］〜［8］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２２】
［9-2］前記固体基板が光を実質的に透過する薄膜部分を有し、該薄膜部分にナノポアが設けられていることを特徴とする［1］〜［9］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２３】
［9-3］前記固体基板の表面に前記導電性薄膜が配置されていることを特徴とする［1］〜［9］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２４】
［10］前記固体基板の前記ナノポアの中心軸方向における中間の深さに前記導電性薄膜が配置されていることを特徴とする［1］〜［9］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２５】
［11］前記ナノポアの深さが、生体ポリマーを構成するモノマー単位の3倍以上の大きさであることを特徴とする［1］〜［10］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２６】
［12］前記検出装置において検出されたラマン散乱光の光強度の比から生体ポリマーの特性を解析するデータ処理部をさらに具備することを特徴とする［1］〜［11］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２７】
［13］生体ポリマー中のモノマーを1単位ずつ前記ナノポア中に進入させる試料移動機構をさらに備えることを特徴とする［1］〜［12］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２８】
［14］前記生体ポリマーが、核酸、ペプチド核酸、タンパク質、糖鎖、及びアプタマーからなる群より選択されることを特徴とする［1］〜［13］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００２９】
［15］前記生体ポリマーの特性解析が核酸の塩基配列の決定である、［1］〜［14］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００３０】
［15-2］前記検出装置からの計測値を記録するフレームバッファメモリをさらに備えることを特徴とする［1］〜［15］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置。【００３１】
［16］生体ポリマーの光学的解析装置であって、
固体基板と、該固体基板表面に配置された複数対の導電性薄膜とを備え、対となる該導電性薄膜はある間隔で対向して配置されている生体ポリマーの特性解析チップと、
生体ポリマーのラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、
ラマン散乱光の集光系と、集光した光を指定の波長帯ごとに異なる比率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える検出装置と
を具備し、前記光源及び照射光学系から外部光が前記特性解析チップに照射され、該解析チップにおける生体ポリマーのラマン散乱光が前記検出装置において検出されることを特徴とする生体ポリマーの光学的解析装置。【００３２】
［17］［1］〜［16］のいずれかに記載の生体ポリマーの光学的解析装置において、特性解析チップに外部光を照射し、ナノポアに進入した生体ポリマーのラマン散乱光を発生させる工程と、
前記ラマン散乱光を検出装置において検出する工程と、
前記ラマン散乱光の検出結果に基づいて生体ポリマーの特性を解析する工程と
を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析方法。【００３３】
［18］前記生体ポリマーが、核酸、ペプチド核酸、タンパク質、糖鎖、及びアプタマーからなる群より選択されることを特徴とする［17］に記載の生体ポリマーの特性解析方法。【００３４】
［19］核酸の塩基配列を決定することを特徴とする［17］又は［18］に記載の生体ポリマーの特性解析方法。【００３５】
［19-2］前記生体ポリマーが、前記ナノポアに進入することができない第2のポリマーを含む試料溶液中に存在することを特徴とする［17］〜［19］のいずれかに記載の生体ポリマーの特性解析方法。【００３６】
［19-3］前記ラマン散乱光の透過光及び反射光の強度比を基準又は対照と比較し、生体ポリマーを構成するモノマーの種類を同定するものであり、［17］〜［19］のいずれかに記載の生体ポリマーの特性解析方法。
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、生体ポリマーの光学的解析装置及び解析方法が提供される。本発明の解析装置は、固体ナノポア方式に基づくため、構造の安定性が高く、信頼性が高いものであり、またラマン散乱により2次元的に、高空間分解能かつ高感度で生体ポリマーの特性を解析することができる。また、2次元的に配置された複数のナノポアにおいて同時に複数の生体ポリマーを解析することができるため、本発明の解析装置及び解析方法は簡便かつ高スループットである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】生体ポリマー特性解析用のナノポアチップの模式図である。
【図２】ナノポアチップの断面の模式拡大図である。
【図３】生体ポリマーの光学的解析装置の構成概略図である。
【図４】試料セルの構成概略を示す断面図である。
【図５】鋭角を有する三角形状の金属薄膜の構造を示す模式図（A）と、その金属薄膜の近傍に発生する近接場のシミュレーション結果（B）を示す。
【図６】2つの三角形状の金属薄膜の構造を示す模式図（A）と、それらの金属薄膜の近傍に発生する近接場のシミュレーション結果（B）を示す。
【図７】核酸塩基の典型的なラマン散乱スペクトルを示す。
【図８】実施例６で検出される2分割像（透過光及び反射光）のスペクトル分布（A及びB）と、塩基種ごとの比率計算結果（C）を示す。
【図９】生体ポリマー特性解析用のナノポアチップの変形例の模式図である。
【図１０】ナノポアチップの変形例の断面の模式拡大図である。
【図１１】実施例２のマルチナノポアチップの模式図である。
【図１２】マルチナノポアチップを用いた生体ポリマーの光学的解析装置の構成概略図である。
【図１３】実施例３のナノポアチップの断面の模式拡大図である。
【図１４】実施例４のナノポアチップの模式図である。
【図１５】実施例５のナノポアチップの模式図である。
【図１６】実施例５のナノポアチップの断面の模式拡大図である。
【図１７】実施例６の検出装置の構成概略図である。
【図１８】実施例６でのフィルタ及びミラーの特性図である。
【図１９】実施例６での別のダイクロイックミラーの例（模式図）を示す。
【図２０】実施例７の検出装置の構成概略図である。
【図２１】突起状構造を有する流路を備えた特性解析チップの構成概略図である。
【図２２】試料セルの構成概略を示す断面図である。
【図２３】突起状構造を有する流路を備えた特性解析チップの変形例の構成概略図である。
【図２４】一列の金属ナノ粒子を有する流路を備えた特性解析チップの構成概略図である。
【図２５】一列の金属ナノ構造体を有する流路を備えた特性解析チップの構成概略図である。
【図２６】複数列の金属ナノ粒子を有する流路を備えた特性解析チップの構成概略図である。
【図２７】複数列の金属ナノ構造体を有する流路を備えた特性解析チップの構成概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、2011年6月3日に出願された日本国特許出願第2011-124871号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【００４０】
本発明は、ナノポアとラマン散乱（好ましくはチップ増強ラマン散乱：TERS）を利用して生体ポリマーの特性を解析するためのデバイス（生体ポリマーの特性解析チップ）と、ラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系と、ラマン散乱光を検出するための検出装置とを備えた生体ポリマーの光学的解析装置、並びに該解析装置を用いて生体ポリマーの特性を解析する方法に関する。本発明の解析装置では、光源及び照射光学系から外部光が特性解析チップに照射され、該解析チップにおいて発生した生体ポリマーのラマン散乱光が検出装置により検出される。
【００４１】
まず、生体ポリマーの特性解析チップ（以下、「解析チップ」ともいう）について説明する。解析チップは、固体基板と、前記固体基板に設けられた少なくとも1つのナノポアと、前記固体基板に配置された少なくとも1つの導電性薄膜とを備える。
【００４２】
あるいは、生体ポリマーの特性解析チップは、固体基板と、前記固体基板に設けられた少なくとも1つの流路とを備えるものであってもよい。
【００４３】
固体基板は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料を含む）から形成することができる。電気的絶縁体材料の例としては、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリスチレン、ポリプロピレンが挙げられる。固体基板のサイズ及び厚さは、ナノポアを設けることができるものであれば特に限定されるものではなく、後述する生体ポリマーの解析時に使用する解析装置の構成要素（検出器など）と適合するように調整する。固体基板は、当技術分野で公知の方法により作製することができ、あるいは市販品として入手することも可能である。例えば、固体基板は、フォトリソグラフィ及びエッチング、レーザーアブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、化学蒸着（CVD）、電子線若しくは収束イオンビームなどの技術を用いて作製することができる。固体基板は、表面への他の分子の吸着を避けるために、コーティングされていてもよい。
【００４４】
固体基板は、ナノポア又は流路を設けるための薄膜部分を有することが好ましい。すなわち、ナノサイズの孔又は流路を形成するのに適した材料及び厚さの薄膜部分を固体基板に設けることによって、ナノポア又は流路を簡便かつ効率的に固体基板上に形成することができる。そのような薄膜部分は、固体基板と同じ材料であってもよいし、あるいは別の電気的絶縁体材料から形成されてもよい。ナノポア又は流路の形成の点から、薄膜部分の材料は、例えば酸化シリコン（SiO2）、窒化シリコン（SiN）、酸窒化シリコン（SiON）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが好ましい。また後述する外部光の励起効率と集光効率の点から、薄膜部分（及び場合によっては固体基板全体）は、実質的に透明であることが好ましい。ここで「実質的に透明」とは、外部光をおよそ50％以上、好ましくは80％以上透過できることを意味する。また薄膜部分は、単層であっても複層であってもよく、複層である場合には、後述する導電性薄膜が薄膜部分の層に挟まれて配置されてもよい。固体基板の薄膜部分の厚さは、10nm〜200nm、好ましくは15nm〜100nm、より好ましくは20nm〜50nmである。薄膜部分は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（LPCVD）により、固体基板上に形成することができる。
【００４５】
固体基板には、少なくとも1つのナノポア、好ましくは2以上のナノポアが設けられる。本発明において「ナノポア」及び「ポア」とは、ナノメートル（nm）サイズの孔であり、固体基板、好ましくは固体基板の薄膜部分の表裏を貫通する孔である。すなわち、本発明において使用する解析チップは、いわゆる固体ナノポアに区分される。また本発明において「開口」とは、ポアの固体基板表面に出ている部分を指す。生体ポリマーの特性解析時に、試料溶液中の生体ポリマーやイオンなどは一方の開口からナノポアに進入し、同じ又は反対側の開口からナノポア外に出る。
【００４６】
ポアのサイズ（すなわち開口サイズ）は、解析対象の生体ポリマーの種類によって適切なサイズを選択することができ、例えば1nm〜100nm、好ましくは1nm〜50nmであり、具体的には1nm以上2nm以下、3nm以上5nm以下、10nm以上50nm以下などである。ssDNA（1本鎖DNA）の直径は約1.5nmであり、ssDNAを解析するためのポア径の適切な範囲は1.5nm〜10nm程度、好ましくは1.5nm〜2.5nm程度である。dsDNA（2本鎖DNA）の直径は約2.6nmであり、dsDNAを解析するためのポアの径の適切な範囲は3nm〜10nm程度、好ましくは3nm〜5nm程度である。他の生体ポリマー、例えばタンパク質、糖鎖などを解析対象とする場合も同様に、生体ポリマーの外径寸法に応じたポア径を選択することができる。ナノポアの深さは、固体基板又は固体基板の薄膜部分の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポアの深さは、生体ポリマーを構成するモノマー単位の2倍以上、好ましくは3倍以上、より好ましくは5倍以上の大きさとする。例えば生体ポリマーとして核酸を選択する場合には、ナノポアの深さは、塩基3個以上の大きさ、例えば約1nm以上とすることが好ましい。これにより、生体ポリマーをその形状と移動速度を制御しながらナノポアに進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。またポアの形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
【００４７】
ポアは、固体基板に少なくとも1つ設けることができ、複数のポアを設ける場合には、規則的に配列することが好ましい。複数のポアを配置する間隔は、使用する検出器、集光系、分離部の能力に応じて、0.1μm〜10μm、好ましくは0.5μm〜4μmとすることができる。ポアは、当技術分野で公知の方法により、例えば透過型電子顕微鏡（TEM）の電子ビームを照射することにより、ナノリソグラフィー技術又はイオンビームリソグラフィ技術などを使用することにより、固体基板に形成することができる。
【００４８】
固体基板には、少なくとも1つの導電性薄膜が配置される。導電性薄膜は、導電性又は光散乱特性を有する材料で形成することができる。そのような材料としては、金属、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケルなど；グラファイト、例えばグラフェン（単層又は複層のいずれでもよい）などが挙げられる。
【００４９】
導電性薄膜の厚さは、採用する材料に応じて、0.1nm〜10nm、好ましくは0.1nm〜7nmとする。導電性薄膜の厚さが小さいほど、発生する近接場を限定することができ、高分解能かつ高感度での解析が可能となる。また導電性薄膜の大きさは特に限定されるものではなく、使用する固体基板及びナノポアの大きさ、使用する励起光の波長などに応じて適宜選択することができる。
【００５０】
導電性薄膜の形状は、外部光を照射することにより近接場を発生し、増強することができる形状であれば、任意の形状とすることができる。このような近接場を発生するプローブは当技術分野で公知であり、例えば、チップ増強ラマン散乱（TERS）により近接場を発生及び増強することができる鋭角の端部を有する形状、金属ボウタイ構造などが知られている。
【００５１】
導電性薄膜が鋭角の端部を有する形状である場合、その端部の角度は10〜80度、好ましくは20〜60度、より好ましくは20〜40度とする。このような近接場光を形成するための導電性薄膜（光散乱体）の好ましい形状については、例えば特開2009-150899号公報を参照されたい。なお、導電性薄膜の端部の頂点部分は、厳密な意味での点でなくともよく、一定以下、好ましくは10nm以下の曲率半径を有する丸みを帯びた形状等であってもよい。鋭角の端部以外の導電性薄膜の形状は、特に限定されるものではなく、角のない円形や、角を有する場合には端部の頂点の角度より鈍角であれば、自由に選択することができる。また導電性薄膜の全体の形状は、鋭角の端部を有する限り、任意の形状とすることができ、三角形、四角形及び五角形などの多角形、扇形、円形と三角形の合成形などとすることが可能である。
【００５２】
一方、導電性薄膜の形状として金属ボウタイ（bow-tie）構造を採用することも可能である。即ち、円形、楕円形又は多角形の2つの導電性薄膜を、その形状の凸部が互いに対向するように配置する。このような金属ボウタイ構造については、例えば米国特許第6,649,894号を参照されたい。金属ボウタイ構造は、近接場が形成される領域にギャップ（開口）を挿入した構造とみなすことも可能である。ギャップの挿入によって異方性が導入され、検出感度が改善される。このような技術についての説明は、例えば米国特許第6,768,556号及び同第6,949,732号を参照されたい。
【００５３】
導電性薄膜は、その少なくとも一部がナノポアに面して設けられている限り、固体基板の表面上に配置されてもよいし、あるいは固体基板の間に配置されてもよい。例えば、固体基板の表面上に、ナノポアの開口部に面して配置することができる。あるいは、固体基板上のナノポアの中心軸方向におけるほぼ中間の位置（深さ）に導電性薄膜を配置することができる。この場合、導電性薄膜は、固体基板の薄膜部分によって挟まれた構造となることが好ましい。これにより、近接場はナノポアの中心軸方向（深さ方向）の中間付近に形成されるため、生体ポリマーの形状と移動速度を制御しながらナノポア内で生体ポリマーのラマン散乱光を発生させることができ、高精度及び高感度に解析を行うことが可能である。なお、導電性薄膜を固体基板に配置する場合には、照射される外部光の偏光方向を考慮して配置することが好ましい。
【００５４】
また、導電性薄膜は、各ナノポアに対して少なくとも1つ配置されていればよく、奇数であっても偶数であってもよい。例えば、導電性薄膜は、各ナノポアに対して1つ、2つ、3つ、4つ又はそれ以上を配置することが可能である。後述する実施例に記載のように、導電性薄膜が複数存在すると、強い光の場が形成されるため、各ナノポアに対して2つ以上の導電性薄膜を配置することが好ましい。あるいは、導電性薄膜は、上述した形状を1単位として、複数の単位を有する1つの薄膜とすることも可能である。具体的な例は、実施例５のような2つの単位が連結されている薄膜構造物とすることができる。
【００５５】
導電性薄膜は、その端部がナノポアの開口部に面して配置されていることが好ましい。より具体的には、導電性薄膜を、ナノポア中心軸に対して直交する面内に、かつ薄膜の端部をナノポアの開口部に面して配置する。また少なくとも2つの導電性薄膜を配置する場合には、これらの導電性薄膜が、ナノポアの開口部をはさんで互いに対向して配置されることが好ましい。このような場合、外部光を導電性薄膜に照射することにより、導電性薄膜がナノポアに面する端部において近接場を発生させて、ナノポアを進入する生体ポリマーのラマン散乱光を発生させる。
【００５６】
導電性薄膜は、当技術分野で公知の方法により作製し、固体基板に配置することができる。例えば、導電性薄膜を銀で形成する場合には、所望の厚さの銀薄膜をスパッタリングにより基板に形成した後、所望の形状を電子ビームにより形成することができる。また導電性薄膜を単層のグラフェンで形成する場合には、グラファイトから作製したグラフェンを支持基板にのせ、電子ビームを照射して所望の形状のグラフェンを形成することができる。
【００５７】
上述した解析チップに外部光を照射することにより、前記ナノポアに進入した生体ポリマーが励起されてラマン散乱光を発生し、そのラマン散乱光の検出結果に基づいて生体ポリマーの特性を解析することができる。好ましくは、解析チップの導電性薄膜に外部光を照射することにより、該導電性薄膜がナノポアの開口部に面する端部において近接場を形成させ、その近接場光で生体ポリマーを二次元的に走査する。形成される近接場の厚さは基本的に導電性薄膜の厚さと同等である、すなわち導電性薄膜はナノポアの中心軸に直交するため、形成される近接場の中心軸方向の厚さは導電性薄膜の厚さと同程度である。そのため、上述した解析チップを用いることにより、高空間分解能かつ高感度で生体ポリマーを解析することができる。
【００５８】
また、ナノポアに替えて、対に配置された導電性薄膜の間、すなわち流路に、生体ポリマーを導入し、固体表面に沿って移動させることで、生体ポリマーのラマン散乱光を検出してもよい。流路を形成する導電性薄膜の対は、生体ポリマーを導入することができ、かつラマン散乱に適当な間隔で配置されていることが好ましい。流路は、導電性薄膜によって形成されていることが好ましいが、他の材質で形成されていてもよい。また、流路の幅、形状なども、解析対象の生体ポリマーの種類及び大きさ、発生させる近接場などを考慮して、当業者であれば適宜設計することが可能である。
【００５９】
一実施形態において、流路の少なくとも1か所に先鋭端を有する突起形状が形成されている。突起形状は、近接場を発生することができるものであれば任意の数及び位置で、任意の形状で形成することができる。例えば、ナノポアに関連して上述した導電性薄膜の形状とすることができる。一例として、突起形状は、流路の進行方向に対して、流路の2つの壁面のいずれかに、又は流路の進行方向に対して流路の2つの壁面から対向して、形成することができる。
【００６０】
別の実施形態では、流路の少なくとも1か所に、金属ナノ粒子又は金属ナノ構造体が流路を横断して1列以上固定されている。金属ナノ粒子又は金属ナノ構造体は、近接場を発生することができるものであれば、任意の数及び位置で、任意の形状及び材質で形成することができる。
【００６１】
上述した解析チップに外部光を照射することにより、前記流路に進入した生体ポリマーが励起されてラマン散乱光を発生し、そのラマン散乱光の検出結果に基づいて生体ポリマーの特性を解析することができる。好ましくは、解析チップの流路における突起形状、金属ナノ粒子又は金属ナノ構造体の部分に外部光を照射することにより、その部分に近接場を発生させ、その近接場を用いてラマン散乱を発生させて、生体ポリマーを二次元的に走査する。形成される近接場の厚さは基本的に流路の厚さと同等である。そのため、上述した解析チップを用いることにより、高空間分解能かつ高感度で、さらには高いS/N比で、生体ポリマーを解析することができる。
【００６２】
次に、ラマン散乱光を発生させるための光源及び照射光学系について説明する。
【００６３】
光源は、ラマン散乱光を発生させることができる波長の外部光（励起光）を照射する、当技術分野で公知の光源を使用することができる。光源としては、例えば限定されるものではないが、クリプトン（Kr）イオンレーザ、ネオジム（Nd）レーザ、アルゴン（Ar）イオンレーザ、YAGレーザ、窒素レーザ、サファイアレーザなどを使用することができ、波長約400〜900nmの外部光を照射するものである。発生するラマン散乱光は、通常のラマン散乱、共鳴ラマン散乱、チップ増強ラマン散乱（TERS）、表面増強ラマン散乱（SERS）などによる光である。
【００６４】
また、光源から外部光を解析チップに照射し収束させるために、光源と組み合わせて、レンズ（レンズ及び対物レンズ）、ミラー（ハーフミラー、ダイクロイックミラーなど）、ビームエキスパンダー、NDフィルタを備えた照射光学系を使用することが好ましい。照射光学系は、バックグラウンドシグナル（背景信号）を低下させるために、フィルタ（バンドパス干渉フィルタなど）又はフィルタユニット、共焦点ピンポール、遮光板、吸収端などと組みあわせてもよい。このようなラマン散乱光を発生させるための装置構成は、当技術分野において公知であり、当業者であれば適宜好ましい構成要素を選択することができる。
【００６５】
続いて検出装置について説明する。検出装置は、励起光をカットするフィルタ、ラマン散乱光の集光系と、集光した光を特定の波長範囲において異なる反射率で透過光及び反射光に分割する分離部と、分割された光を検出器に結像する結像光学系と、結像された光を検出するための2次元検出器とを備える。
【００６６】
ラマン散乱の集光系として、1又は複数の対物レンズ、及び／又は1又は複数のミラーを使用することができる。必要に応じて、1又は複数のフィルタを備えていてもよい。分離部は、波長に応じて異なる比率（反射率）で光を透過光及び反射光に分割することができるものであれば特に限定されるものではない。特定の波長範囲の全域にわたって、全て異なる比率で分割するものでもよい。例えば、ダイクロイックミラー、又は同様の特性を有する他のミラーを用いることができる。ダイクロイックミラーの特性の一例は図18（B）に示すとおりであり、高い波数の光ほど高い比率で光を透過（又は反射）させる。また、他のミラーの特性の一例は図19に示すとおりであり、特徴的なラマン散乱ピークの波数ごとに階段状に変化する比率で光を透過（又は反射）させる。好ましくは、前記分離器は、生体ポリマーを構成するモノマーの種類ごとに透過光と反射光の強度比が少なくともその種類の数だけ（例えば少なくとも4種類で）区別することができるように、特定の波長範囲で異なる比率で光を分割するものである。
【００６７】
結像光学系は、使用する2次元検出器に光を結像することができるものであれば特に限定されるものではなく、例えば1又は複数の結像レンズ（アロマティックレンズなど）を用いることができる。
【００６８】
2次元検出器は、結像された光学像を電気的信号に変換して2次元の画像として出力することができる。また使用する解析チップにおけるナノポアの数及び配置や流路の形状に応じて、1又は複数の2次元検出器を使用することができる。そのような2次元検出器としては、CCD（電荷結合素子）エリアセンサ、CMOS（相補型金属酸化膜半導体）エリアセンサ、他の高感度素子のエリアセンサなどが挙げられる。使用する2次元検出器は、適当な画素サイズ及び画素数であってよく、またその形式（背面照射型、正面照射型など）も特に限定されるものではない。好ましくは、2次元検出器は、異なる比率で分割された透過光及び反射光をそれぞれ検出する画素を有するものとする。2次元検出器は、検出の高速化に伴う感度低下を防ぐために、光電子増倍機構、例えばイメージインテンシファイアを有するか、あるいは素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型CCDカメラ（EM-CCD）などを使用することが好ましい。また、2次元検出器のフレームレート（動作速度）は1kHz以上であると特に好ましい。
【００６９】
また、検出装置は、ラマン散乱光の画像情報を直接記録することができる大容量メモリを備えることが好ましく、それによりケーブル、ボード、コンピュータなどを介することなく高速に解析を行うことができる。例えば、本発明の解析装置は、検出装置からの計測値を記録するフレームバッファメモリをさらに備えることが好ましい。また、本発明の解析装置は、前記検出装置からの計測値をデジタル化し、出力するための出力装置（例えばコンピュータ、モニタ）と接続してもよい。
【００７０】
上述したように、検出装置では、ラマン散乱光は集光系により集光され、分離部において例えば各波長で異なる反射率で透過光及び反射光に分割され、分割された光が結像されて2次元検出器で検出される。このような検出装置の構成及び動作方法は、例えば国際公開WO 2010/150468号及びUS 2012/097864 A1に記載されている。本明細書の実施例では、このような検出装置を「2分割比率分光検出装置」と称する。
【００７１】
本発明においては、ラマン散乱を波長分散させることなく、2つの分割された2次元像として計測するため、2次元に高密度に配置された複数のナノポア又は流路からのラマン散乱光を同時に検出することができ、複数のナノポア又は流路を通過する生体ポリマーを高スループットに解析することが可能になる。
【００７２】
本発明の解析装置は、検出装置において検出されたラマン散乱光の光強度の比から生体ポリマーの特性を解析するデータ処理部をさらに備えることが好ましい。そのようなデータ処理部は、例えばコンピュータユニットである。
【００７３】
また本発明の解析装置は、生体ポリマーの移動速度を制御する機構、すなわち試料移動機構を備えることが好ましい。試料移動機構は、例えば所定のタイミングで、生体ポリマー中のモノマーを1単位ずつ、解析チップのナノポア又は流路中に進入させる。そのような機構としては、例えば電気泳動により生体ポリマーを駆動する試料駆動装置（任意関数発生器、電極など）を使用することができる。このような試料移動機構によって、生体ポリマー中のモノマーが順次ナノポア又は流路に進入し、離脱するように生体ポリマーの移動を制御することができ、個々のモノマー（構成単位）に対応するラマン散乱光を経時的に検出することができる。
【００７４】
また生体ポリマーの移動速度を制御する方法として、生体ポリマーを含む試料溶液の粘性を高める方法がある。例えば解析チップ周囲の温度を制御して、試料溶液の温度を低下させ、試料溶液の粘性が高くなることによって、生体ポリマーのブラウン運動が抑えられる。あるいは、試料溶液に測定対象以外の第2のポリマーを添加することにより、試料溶液の粘性を高くできると同時に、生体ポリマーの立体構造を直鎖状にすることができるため、生体ポリマーの形状と移動速度を制御することが可能となる。その際、第2のポリマーとしては、好ましくはナノポアの内径又は流路の幅よりも大きいサイズのポリマー、より好ましくは3次元的にクロスリンクされたポリマーを用いることにより、第2のポリマーはナノポアに進入することができず、測定対象でない第2のポリマーによるラマン散乱を排除することが可能となる。
【００７５】
生体ポリマーの移動速度を制御する別の方法は、解析チップの上部及び下部又は流路に存在するそれぞれの試料溶液に圧力差を印加する方法である。生体ポリマーが電気泳動によってナノポア又は流路を通過しようとする力と反対向きの力を生体ポリマーに印加することにより、生体ポリマーがナノポア又は流路を通過する速度を低下させることができる。
【００７６】
生体ポリマーの形状及び／又は移動速度を制御しながら解析チップのナノポア又は流路に進入させることにより、生体ポリマーの主軸とナノポア又は流路の中心軸とは概ね一致する。試料移動機構により生体ポリマーを駆動することにより、生体ポリマーはナノポア又は流路を通過し、生体ポリマーを構成する単位要素（モノマー）は順次、解析チップに形成された近接場を通過する。すなわちポリマーの主軸方向に沿って配列するモノマーが順次近接場にさらされ、光を吸収し、ラマン散乱光を生じる。このラマン散乱光を検出装置により検出及び計測することにより、モノマーに由来するラマン散乱光の情報が順次得られる。
【００７７】
本発明においては、上述した本発明の生体ポリマーの光学的解析装置を用いて、生体ポリマーの特性解析を行うことができる。本発明において「生体ポリマー」とは、単位構造の低分子（単量体、モノマー）が複数連結した多量体（オリゴマー）や高分子（ポリマー）のうち、生体に存在するもの及び生体に存在するものから誘導されるものを意味する。具体的には、核酸、例えば一本鎖DNA（ssDNA）及び二本鎖DNA（dsDNA）、一本鎖RNA（ssRNA）及び二本鎖RNA（dsRNA）、DNAとRNAとからなるハイブリッド核酸など；ペプチド核酸；タンパク質及びペプチド、例えばD-及びL-アミノ酸からなるタンパク質及びペプチド；糖鎖、例えば多糖、糖タンパク質中の糖鎖；アプタマー、例えばRNAアプタマーなどが含まれる。なお、生体ポリマーには、自然には存在しない配列や構成要素を含むポリマーが含まれ、例えばpoly(A)、poly(T)、poly(G)、poly(C)などの配列又は任意の配列を有する人為的に合成されたポリマー分子も含まれる。また、生体ポリマーには、当技術分野で公知の核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応）によって調製された核酸や、ベクターにクローニングされている核酸も含まれる。これらの生体ポリマーを含む試料の調製方法は、当技術分野で周知であり、当業者であれば、生体ポリマーの種類に応じて適宜調製方法を選択することができる。
【００７８】
本発明において「解析」とは、生体ポリマーの特性解析を指す。好ましい実施形態においては、「解析」とは、生体ポリマーを構成する単位であるモノマーの配列順序を解析すること、例えば核酸の塩基配列を解析することを指す。生体ポリマーの特性解析を行うために、生体ポリマーを構成するモノマー（生体ポリマーが核酸の場合には塩基）ごとのラマン散乱光を検出し、その検出結果に基づいて、モノマーの定性（識別）を行う。
【００７９】
ラマン散乱光は、上述の検出装置によって、波長ごとに異なる比率で透過光と反射光に分割され、透過光強度と反射光強度が2次元検出器に2次元像として検出される。このラマン散乱光の光強度の比から、生体ポリマーの特性を解析する、すなわち生体ポリマーを構成するモノマーの定性を行うことができる。従って、本発明では、生体ポリマーを構成するモノマーのラマン散乱光を順次得て、得られたラマン散乱光の検出結果を基準（標準）と比較し、モノマーの定性（すなわち種類）を判定し、これらの工程を時系列的に順次実行することにより、生体ポリマーにおいてモノマーが配列する順序を決定する、すなわち配列解析を行うことができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。【００８１】
［実施例１］シングルポア構成のナノポアチップとそれを用いた生体ポリマーの特性解析
本発明による生体ポリマーの特性解析用のナノポアチップの構成の一例を図１を用いて説明する。図１は、ナノポアチップ100の模式図である。図示のようにナノポアチップ100は、基板110、ナノポア120、及び導電性薄膜130、などから構成される。図示の通り、基板110の最も広い面（以下基板面）と平行な平面をxy面、導電性薄膜130とナノポア120を結ぶ方向をx軸、xy面と垂直な方向をz軸と定義する。ナノポア120は、基板面と概垂直に形成される、換言するとナノポアの中心軸はz軸と平行である。【００８２】
図２は本実施例のナノポアチップ100のナノポア120の中心軸121を含むxz断面の模式拡大図である。基板110はz軸上方の基板面に薄膜部分111を有し、さらにその上方に導電性薄膜130を有する。また基板はz軸下方にテーパー状の窪み（以下「窓部112」という）を有し、そこに基板の薄膜部分111が露出している。この窓部112の薄膜部分111にナノポア120が形成される。図示の通り、導電性薄膜130の1つの端部131は、ナノポア120の開口部の上端に面している。図１に略記した通り、この端部131の平面形状は先鋭端となっており、この先鋭端がナノポア120に面している。【００８３】
次に本発明による生体ポリマーの光学的解析装置の構成の一例を図３を用いて説明する。図３は、本実施例の生体ポリマーの光学的解析装置200の構成概略図である。解析装置200は、光源210、ビームエキスパンダー220、ダイクロイックミラー230、対物レンズ240、フィルタ250、2分割比率分光検出装置260（詳細は実施例６及び７に記載する）、終端270、xyz微動ステージ600、試料駆動装置700、試料セル300、パソコンなどの計測制御装置（不図示）などから構成される。試料セル300にはナノポアチップ100が収納される。【００８４】
図４は、試料セル300の構成概略を示すxz断面図である。試料セル300は、ナノポアチップ100、上部部材310、下部部材320、ねじ類（不図示）などから構成される。下部部材320は、その内部にO-リング330、試料用流路410、420、430、試料用チャンバー440、電極用チャンバー450が形成され、また試料用接続ポート460、470、電極用接続ポート480が形成される。下部部材320には試料用接続ポート460、470を介して試料送液チューブ（不図示）が気密に接続され、また電極用接続ポート480を介して銀塩化銀電極（不図示）が気密に接続される。銀塩化銀電極の塩化銀を有する端は電極用チャンバー450に収納され（不図示）、その銀を有する端（以下、銀端）は電極用接続ポート480の外部に露出する。前記試料送液チューブ、試料用接続ポート460、試料用流路410、試料用チャンバー440、試料用流路420、電極用チャンバー450、試料用流路430、試料用接続ポート470、試料送液チューブには、試料溶液（不図示）が隙間なく（気泡の混入なしに）満たされる。従って、試料用チャンバー440内の試料溶液は電極用チャンバー450において銀塩化銀電極と接触し、両者は電気化学的に導通する。上部部材310についても下部部材320と同様である。【００８５】
次に本発明によるナノポアチップの動作の概要を図１から図８を用いて説明する。まず試料セル300の準備を行う。具体的には上部部材310と下部部材320との間にナノポアチップ100をはさんでO-リング330で圧接し、上部及び下部の試料用チャンバー540及び440を気密に形成する。試料送液チューブから試料溶液として100mM KCl水溶液を導入し、試料用チャンバー540、440、電極用チャンバー450に試料溶液を満たす。【００８６】
次に試料セル300を解析装置200へ設置する。具体的には試料セル300を微動ステージ600に固定する。微動ステージ600と、図示しない目視用光学系を用いて、試料セル300内のナノポアチップ100の薄膜部分111に光学系の焦点を合わせる。試料セル300に設置した2つの銀塩化銀電極を試料駆動装置700に接続する。試料駆動装置700は電圧源又は電流源を内蔵し、上部試料用チャンバー540を基準として、下部試料用チャンバー440に電圧を印加することができる。【００８７】
解析装置の光学系は以下の通り動作する。具体的には光源210から出射したレーザ光を、ビームエキスパンダー220（又はレンズ対、ビームシェーパなど）を通して整形した後、ダイクロイックミラー230により反射し、対物レンズ240により、ナノポアチップ100の薄膜部分111に集光する。レーザ光は薄膜部分111を通過して導電性薄膜130を照射し、その端部131（ナノポア120の開口部に面する）に強い近接場光が生じる。この近接場光が形成される領域（以下「近接場」という）に生体ポリマーを導入すると近接場光は生体ポリマーを励起し、生体ポリマーを構成するモノマーに特有のラマン散乱光を生じる。ラマン散乱光を対物レンズ240で集光し、ダイクロイックミラー230を通過し、フィルタ250によりレイリー散乱光及びアンチストークス線を除去し、ラマン散乱光のうちストークス線を2分割比率分光検出装置260に入射し、2分割比率分光検出装置260を用いて（ストークス線の）ラマン散乱光の透過及び反射スペクトルの違いを強度比の違いとして検出する。薄膜部分111や導電性薄膜130を通過した光は、終端270で吸収あるいは無関係な方向に拡散する。【００８８】
測定対象である生体ポリマーの一例として、DNAの測定手順は以下の通りである。すなわち、試料として例えば長さ10kb（knt）の1本鎖DNAを1nMの濃度となるよう100mM KCl水溶液に溶解したものを使用した。これを下部試料溶液として、試料用チャンバー440に導入する。試料駆動装置700を用いて下部試料用チャンバー440に100mVの負電圧を印加すると、ナノポア120を通して、試料溶液中のイオンが電気泳動され、電流（イオン電流）が流れる。近接場には当初は水とKClのみが存在するため、水のみのラマン散乱光が観測される。DNAは電気泳動によって下部試料用チャンバー440からナノポア120を通して上部試料用チャンバー540へと電気泳動される。DNAがナノポア120を通過する際、DNAの構成要素である核酸塩基は、導電性薄膜130の端部131に形成される近接場の中に進入する。すると当該塩基特有のラマン散乱光が発生し、2分割比率分光検出装置260によりそのラマン散乱スペクトルに基づく強度比が取得される。DNAの電気泳動を続けると、核酸塩基も移動し、近接場の外に離脱する。すると当該塩基特有のラマン散乱光が消滅する。さらに泳動を続けるとDNAの配列上の次の塩基が同様に順次近接場に進入及び離脱する工程を繰り返し、塩基の配列に対応するラマン散乱スペクトルに基づく強度比の変化が経時的に取得される。各塩基毎に異なる強度比となるようにし、その信号を経時的に取得し、その時間変化から、DNAの塩基配列を求める。以上が本実施例の動作の概要である。【００８９】
以下、各構成要素について詳細に説明する。【００９０】
本実施例におけるナノポアチップ100は以下の手順で作製した。基板110としてシリコン基板を用い、その表面にLPCVD（減圧化学気相成長）により厚さ約20nmの酸化膜を形成した（この酸化膜は最終的に薄膜部分111となる）。電子ビーム（EB）リソグラフィにより基板底面に窓部のパターンを形成し、リアクティブイオンエッチングにより表面層を除去した後、KOH（水酸化カリウム）ウエットエッチによりシリコンを除去することにより、薄膜部分111を有する窓部112を形成した。導電性薄膜130として、銀の薄膜をスパッタリングにより基板表面に形成した。銀の膜厚は約5nmとした。銀の薄膜の上にレジストを塗布し、図１に示す三角形様のパターンをEBリソグラフィにより形成し、三角形様パターン以外の領域の銀をエッチングにより除去し、レジストを除去した。最後に、透過型電子顕微鏡（TEM）で基板を観察し、三角形の端部131にTEMの電子ビームを照射することにより、ナノポア120を形成した。ナノポアの内径は約10nmであった。本実施例では薄膜部分111を酸化シリコンを用いて形成したが、窒化シリコン等も同様に使用できる。【００９１】
本実施例では導電性薄膜130の材料として銀を用いたが、この材料は銀に限定されず、一般に導電性を有する材料であれば任意の材料を用いることができ、一般には金属が好適に使用できる。導電性薄膜として使用可能な他の金属として、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族の金属や、金、銅などがある。【００９２】
本実施例では試料セル300、特に上部部材310と下部部材320の中央部（試料用チャンバー440、540を外部と隔てる部分）に透明な部材を採用した。採用できる透明部材として、ガラス、石英、光源波長において透明度の高いアクリルなどのプラスチック材料がある。下部部材320の中央部に透明な部材を採用することにより、光源210からのレーザ光を効率よくナノポアチップ100に照射することが可能である。また上部部材310の中央部に透明な部材を採用することにより、ナノポアチップ100を通過した透過光や散乱光を反射することなしに通過させ、背景光を抑制することが可能である。【００９３】
図３及び図４において対物レンズ240と試料セル300（に含まれるナノポアチップ100）とをやや離して図示したが、実際の装置では両者は極力近づけることが望ましい。好ましくは対物レンズ240とナノポアチップ100との距離は3mm以下、好ましくは1mm以下に近接することが望ましい。これにより、励起光による励起効率と、散乱光の集光効率を上げ、高感度な測定を行うことが可能である。また対物レンズ240は液浸タイプが好ましく用いられる。対物レンズは高開口が好ましく、開口数≧0.8が特に良好である。【００９４】
本実施例における生体ポリマーの光学的解析装置は、第3の従来例と同様の顕微鏡一体型レーザラマン分光装置を元に構築した。ただしxyz微動ステージ600としては顕微鏡に付属のステージを使用し、AFM用のピエゾステージは使用しなかった。本実施例では光源210として出力1mW、波長531nmのKrイオンレーザを使用した。試料駆動装置700としては任意関数発生器を使用し、必要に応じて任意関数発生器をアッテネータ（抵抗分圧器）と組み合わせて使用した。試料駆動装置700は、出力電圧範囲は0から±10VのDC、又は任意の波形を出力可能である。任意波形の典型例としてパルス波が挙げられ、パルスのピークの時間幅は10ナノ秒単位で、パルスのピークの電圧値も前述の出力電圧範囲で、任意に出力可能である。【００９５】
以下、本実施例の動作について詳細に説明する。【００９６】
ナノポアチップ100の基板110は主としてシリコン（Si）で形成される。基板の厚さは約700μmである。基板の薄膜部分111は酸化シリコン（SiO2）で形成され、厚みも約20nmと薄い。従って、基板の窓部112において、レーザ光は薄膜部分111を通過して導電性薄膜130を照射する。導電性薄膜130をレーザ光で照射することにより、その端部131に強い近接場が生じる。この近接場のz方向の厚みは導電性薄膜130の厚みと同程度、すなわち5〜10nm程度である。【００９７】
窓部112以外において、基板110は約700μmの厚みがある。基板110の材料であるSiがレーザ光を吸収、反射、散乱するため、窓部112以外の領域の上に形成される薄膜部分111やその上に形成される導電性薄膜130には、レーザ光がほとんど到達しない。したがって、この窓部112以外の領域については導電性薄膜130における近接場の形成が抑制される。つまり上記の構成により、導電性薄膜130における近接場の形成を、主に窓部112の領域、特に目的とする端部131に限定でき、目的以外の領域における背景光の発生を抑制できる、という特長がある。【００９８】
以下、本実施例及び後述する変形例で採用した構造について、近接場の形成をシミュレーションにより解析し比較した結果を述べる。【００９９】
本実施例のごとく三角形の導電体に光を入射させたとき、その近傍に発生する近接場光分布をFTDT法（時間領域光伝播ソルバーOptiFDTD, Optiwave System Inc.）を用いて計算した。この計算においては、解析領域の大きさをX、Y、Zそれぞれの方向に、0.3×0.2×2.6umとした（なお、X、Y、Zは図５及び図６だけで使用する座標系であり、YはXZ平面に垂直な方向である）。また導電体の材料は銀とし、厚さは10nm、先端尖り角は90度とした。入射波は波長780nmの平面波とし、導電体の面から一波長離れた位置に波源を発生させた(λ＝780nm)。入射波の偏光方向はX方向とした。境界条件はXY側面は周期的境界条件、Z方向側面は吸収境界条件とした。メッシュサイズは計算領域全体で均一に2.6nmとした。【０１００】
図５のAは解析した構造の模式図である。また図５のBに、近接場強度密度（Ｉ）の計算結果と、入射波の強度密度（Ｉin）との比のXY平面分布を、縦軸にプロットした。図示の通り薄膜三角形の先端に最も強い光の場が生じ、その最大値は入射強度比で約1100倍となった。【０１０１】
また、この三角形の薄膜を2つ設けて頂点を互いに3nm隔てて対向させた場合についても計算を行い、その結果を図６のA及びBに示した。これは後述する変形例に相当する。この場合、約7100倍の増強効果が得られた。【０１０２】
以上のシミュレーションの結果をまとめると、本実施例や、特に後述する変形例のごとき構造及び形状の導電性薄膜を用いることにより、光電場の増強効果を強く有する近接場が形成されることが示唆された。【０１０３】
DNAがナノポア120に進入した直後、塩基由来のラマン散乱光が観測された時点において、試料駆動装置700を用いて、下部試料用チャンバー440に印加する電圧の絶対値を低下させ、DNAの電気泳動速度を低下することができる。また印加電圧の絶対値を低下させた状態で電圧の極性を反転する（下部試料用チャンバー440を陽電圧とする）ことにより、DNA鎖を低い速度で逆向きに泳動することができる。この条件で塩基由来のラマン散乱光が観測されなくなるまで泳動することにより、DNA鎖の先端を近接場の外まで押し戻すことができる。この状態から印加電圧の絶対値を低下させたまま電圧の極性を元に戻す（下部試料用チャンバー440を陰電圧とする）ことにより、DNA鎖の先頭からゆっくりと泳動し、ラマン散乱計測を繰り返すことが可能である。これによりラマン散乱スペクトルを十分な精度で計測するに必要な時間にわたって、測定対象である塩基を近接場の中に留めることができる。【０１０４】
試料駆動装置700を用いて下部試料用チャンバー440に印加する電圧は一定（DC）とすることが可能である他、パルス波とし、DNAの泳動と停止を短い周期で繰り返すことも可能である。この場合、パルス波のパルス幅を調節することが可能である（パルス幅変調）。1周期の内のパルスがONの時間の割合（デューティ比）を低くし同OFFの時間の割合を高くすることにより、1周期の内の泳動時間を短くし同停止時間を長くすることが可能である。例えば周波数帯域100MHzの任意関数発生器を用いることにより、パルス幅を10ns単位で可変であるため、1周期の長さを例えば10msとした場合、デューティ比を1/1,000,000の分解能で調節可能である。すなわち、DNA鎖の平均移動速度をデューティ比に応じて極めて高い分解能で（低く）調節することが可能となる。またパルス波高の調節（パルス高変調）と組み合わせることにより、泳動速度をさらに精密に調節することも可能である。泳動電圧や、そのパルス幅の制御により、ラマン散乱スペクトルを十分な精度で計測するに必要な時間にわたり、測定対象である塩基を近接場の中に留めることができる。また停止時間内にラマン散乱スペクトルを取得することにより、測定対象が計測中に近接場に進入したり離脱したりすることにより信号が変動する不都合を回避し、計測値を高精度化することも可能である。【０１０５】
また、下部試料用チャンバー440に印加する電圧が正圧と負圧の間を周期的に繰り返すことも可能である。この際、時間平均した電圧がやや負圧になるように調節することにより、電圧を単純に一定の負圧とする場合と比較して、DNA鎖を安定に引き伸ばし、かつゆっくりとナノポア120を通して上部試料用チャンバー540に泳動させることができ、DNA鎖中の個々の塩基に基づくラマン散乱を感度良く計測することが可能となる。【０１０６】
DNA鎖の泳動速度を制御する別の手段として、試料溶液の粘性を高めることが効果的である。ナノポアチップ周辺の温度を制御する機構を追加し、試料溶液の温度を低下させれば、試料溶液の粘性が高くなると同時に、DNA鎖のブラウン運動が抑えられるため、DNA鎖のラマン散乱計測に良好な条件となる。また、試料溶液に測定対象以外のポリマーを添加することにより、試料溶液の粘性を高くできると同時に、DNA鎖の立体構造を直鎖状にすることができるため、DNA鎖のラマン散乱計測に良好な条件となる。ポリマーとしてはキャピラリ電気泳動用の分離媒体を用いてもよい。好ましくはナノポアの内径よりも大きい、さらに好ましくは3次元的にクロスリンクされたポリマーを用いることにより、測定を妨害することなく、粘性のみを高くすることができる。特に後述の実施例の図13によれば、増強場すなわち計測領域をナノポア内部に閉じ込めることが可能であり、この場合、測定対象でないポリマーは計測領域に進入させずに、測定対象である生体ポリマー、例えばDNA鎖のみを測定領域に進入させることが可能となり、測定対象でないポリマーによるラマン散乱を排除することが可能となる。【０１０７】
DNAの電気泳動速度を低下する目的のため、微小な泳動速度を実現し、かつそれを正確に制御する他の方法も採用できる。第1の方法として上下の試料用チャンバー（440及び540）間の電圧を高感度に検出する計測電極の対を、上下の試料用チャンバーにそれぞれ新たに（既存の銀塩化銀電極とは別に）設けることができる。この場合、計測電極の対を用いて計測した実際の電圧を元に、銀塩化銀電極に印加する電圧をフィードバック制御することにより、上下の試料用チャンバーの間に所定の微小電圧を正確に印加できる。第2の方法として、ポテンショスタット方式を採用可能である。この場合、既存の1対の銀塩化銀電極をそれぞれ試料極と対極とみなし、対極側の試料用チャンバー440及び540に新たに参照極を設け、試料極と参照極の間の電圧が設定した値になるように、試料極と対極に流れる電流を制御することができる。以上の方法により所定の微小電圧を上下の試料用チャンバー440及び540間に正確に印加でき、微小な泳動速度を実現し、かつそれを正確に制御することができる。第3の方法として、ガルバノスタット方式を採用可能である。この場合、既存の1対の銀塩化銀電極をそれぞれ試料極と対極とみなし、片方からもう片方へ流れる電流をモニターしながら所定値になるようにフィードバック制御することができる。この方法により、所定の微小電流を上下の試料用チャンバー440及び540間に正確に流すことができ、微小な泳動速度を実現し、かつそれを正確に制御することができる。【０１０８】
DNA鎖がナノポア120を通過する速度を制御するさらに別の方法を説明する。下部試料用チャンバー440に満たされる試料溶液と、上部試料用チャンバー540に満たされる試料溶液に圧力差を持たせることにより、DNA鎖が電気泳動によってナノポアを通過しようとする力と、反対向きの力がDNA鎖に加えられるようにすれば、DNA鎖がナノポアを通過する速度を低下させることができる。例えば、下部試料用チャンバー440に満たされる試料溶液は大気圧にする一方で、上部試料用チャンバー540に満たされる試料溶液にポンプ機構やピエゾ機構により大気圧以上の圧力を印加すると、上部試料用チャンバー540から下部試料用チャンバー440に向かう方向、すなわちDNA鎖の電気泳動と逆方向の圧力を生じさせることができる。この圧力差は、上部と下部の試料溶液の組成差、例えばイオン濃度差などに基づく浸透圧によって制御してもよい。この圧力差により、DNA鎖の電気泳動と逆方向に、つまり上部試料用チャンバー540から下部試料用チャンバー440に向かう方向に、試料溶液をナノポア120中にバルクとして流動させ、DNA鎖の通過速度を低下させてもよい。この試料溶液流動は、ナノポア120の内表面に電荷を持たせ、ナノポア120内部に電気浸透流を生じさせることによっても実現できる。試料溶液流動は、さらに以下のような効果を生じさせることも可能である。試料溶液がDNA鎖を包み込むように流動し、DNA鎖をナノポア120内部でその中心軸付近に局在させると同時に、DNA鎖を中心軸方向に引き伸ばすことが可能である。これはDNA鎖の各塩基を安定に増強場の中央を通過させることを可能とし、精度の高いラマン散乱計測を実現できる。【０１０９】
図７に、核酸塩基の典型的なラマン散乱強度（スペクトル）の例を示す。4種類の塩基A、C、T及びGは、それぞれ特徴的な波数（以下「特徴帯」ともいう）において散乱光強度がピークを示す。この例におけるA、T、Gの特徴帯のピークはそれぞれa1、t1、g1で示され、波数はそれぞれ約730、1180、650cm-1である。Cのピーク位置c1（すなわち約1730cm-1）は、Tのピーク位置t2（すなわち1600cm-1）とやや重複するが、Tに固有の特徴帯t1の有無を勘案することによりTとCを判別可能である。上記以外にも、CとTの特徴帯として、C：1260cm-1、T：1360cm-1を適用できる可能性もある。このようにピークそのものを識別して検出する場合には、例えば10 cm-1の分解能でラマン散乱スペクトルを検出する必要がある。つまり、ナノポア1箇所当たり400cm-1から1800cm-1までの波数範囲を140分割以上で分割して検出する必要があり、そのため検出器には多くの画素数が必要となる。また、多くの画素で測定するため、高速に測定することが望まれる場合には適当ではない。本実施例のように、2分割比率分光検出装置により、ラマン散乱光のスペクトルの違いを強度比の違いとして検出することで、ナノポア1箇所当たり、基本的に2画素の信号で検出及び識別が可能になり、検出器の画素を少なくし低コスト化ができ、高速繰返し測定も可能になる。なお、具体的には、図８に示すように、ラマン散乱光を特定の波長範囲においてそれぞれ異なる比率で透過光及び反射光に分割し、透過光と反射光との強度比率から4種類の塩基を判別することができる（詳細は実施例６で記載する）。【０１１０】
本実施例ではA、C、T、Gのスペクトルを取得してDNAの解析を行う場合について例示したが、本発明の応用範囲はこれに限定されない。例えばUのスペクトルを解析することにより、RNAの解析を行うことができる。またメチル化Cのスペクトルを取得することにより、DNAのメチル化を直読可能となる。さらにアミノ酸のスペクトルを取得することにより、ペプチドやタンパク質の解析が、また糖のスペクトルを取得することにより、糖鎖の解析が可能となる。【０１１１】
本実施例による生体ポリマーの光学的解析装置は、固体ナノポアに基づくため、構造の安定性が高く信頼性が高い、という特長がある。また本実施例はラマンスペクトルを指標としてモノマーの種類の判定を行う。スペクトル計測では、強度比と強度という2次元的情報を有するため、トンネル電流強度などの1次元の情報と比較して情報量が飛躍的に多く、定性における識別能が高く、従って塩基の識別能が高い、という特長がある。本実施例は近接場をナノポア120の開口部に固定し、試料駆動装置700を用いることにより、DNAを泳動し、近接場との相対位置関係を制御した。これにより、核酸を予め固体基板110に固定する必要が無く、高分解能の微動ステージやAFMも必要ない。またAFMのプローブをサブnmの精度で2次元的に走査するという繊細な操作も必要ない。すなわち装置構成や操作が簡便である、という特長がある。【０１１２】
［実施例１の変形例］
実施例１の変形例として、下記の構成のごときナノポアチップ100aを実施することが可能である。図９は、本変形例によるナノポアチップ100aの模式図である。図示のようにナノポアチップ100aは、基板110、ナノポア120、及び導電性薄膜130a、130b、などから構成される。すなわち、実施例１における導電性薄膜130に相当する導電性薄膜を2つ有する点が、（1つの導電性薄膜130しか有さない）実施例１と異なる。図10は本変形例のナノポアチップ100aのナノポア120の中心軸121を含むxz断面の模式拡大図である。図示の通り、導電性薄膜130a、130bは薄膜部分111のｚ軸上方に形成され、それらの端部131a、131bは、ナノポア120の開口部の上端にそれぞれ面し、互いに対向している。つまり導電性薄膜130aと130bは、ナノポア120の孔径とほぼ同じ距離を隔てて設置される。【０１１３】
本変形例によるナノポアチップ100aのための解析装置や、動作は実施例１と同様である。異なるのは、レーザ光照射によって生じる近接場光が、導電性薄膜130a、130bの端部131a、131bの間隙に生じることである。また実施例１で示したシミュレーション結果から示唆される通り、両方の導電性薄膜に由来する近接場光が互いに強め合い、近接場の強度が増強する。また導電性薄膜130a、130bの存在により、近接場のx方向の分布が制限され、ナノポア120の孔径程度に局限される。結果として、本変形例の近接場の形状の対称性が高く、従って均一性が高い。また本変形例は、近接場の強度が前述のとおり入射光量比で約7,000倍程度と高い（図６）ため、高感度であり、近接場が空間的に均一で、空間分解能も高い、という特長がある。【０１１４】
［実施例２］マルチナノポア解析装置構成
本発明による生体ポリマー特性解析用のマルチナノポアチップの構成の一例を図11を用いて説明する。図11は、本実施例２のマルチナノポアチップ1100の模式図である。図示のようにマルチナノポアチップ1100は、基板1110、ナノポア1120、1121、及び導電性薄膜1130a、1130b、1131a、1131b、などから構成される。図示の通り、本実施例のマルチナノポアチップ1100は、ナノポア及び対向する導電性薄膜などからなる上記変形例の単位構造、すなわち図10に例示される単位構造を、1つの基板1110に複数有する。【０１１５】
次に本実施例における生体ポリマーの光学的解析装置の構成の一例を図12を用いて説明する。図12は、本実施例２の生体ポリマーの特性解析を行うマルチ解析装置2000の構成概略図である。マルチ解析装置2000は、光源210、ビームエキスパンダー220、ダイクロイックミラー230、対物レンズ240、フィルタ250、2分割比率分光検出装置2010、終端270、xyz微動ステージ600、試料駆動装置700、試料セル300、パソコンなどの計測制御装置（不図示）などから構成される。試料セル300にはマルチナノポアチップ1100が収納される。【０１１６】
次に本実施例の動作の概略を説明する。本実施例２の動作は実施例1と同様であるが、ナノポアチップとして複数の単位構造を有するマルチナノポアチップ1100を用いる。従って、マルチナノポアチップ1100上の複数の場所において、試料に由来するラマン散乱光がそれぞれ独立に生じる。このラマン散乱光は対物レンズ240で集光し、ダイクロイックミラー230を通過し、フィルタ250によりレイリー散乱光を除去した後、2分割比率分光検出装置2010の検出面上に結像する。個々のナノポア開口部からのラマン散乱光はポリマーの種類毎に異なる比率でその強度を分割した2分割像として検出され、マルチナノポアからのラマン散乱光を同時に検出・識別することが可能になる。ラマン散乱を波長分散させて検出する従来方式の場合は、実施例１に記載のように、ナノポア1箇所当たり140以上の画素が必要となる。2次元検出器の画素サイズが8ミクロン、結像倍率60倍の場合、基板上で隣接するナノポアとの距離が20ミクロン程度になるとスペクトルの重なりが生じ、測定が困難になる。本発明では、ラマン散乱を波長分散させることなく輝点の像として測定できるため、隣に配置されたナノポアからの分散像が重なることなく測定できる。従って、マルチナノポアチップ上でナノポア同士の間隔を狭く配置することができる。たとえば、0.5ミクロンから数ミクロン程度の正方格子の格子点状に配置することが可能で、高密度配置が可能になる。特にラマン散乱測定では、高解像度・高NAのレンズで検出するため、視野サイズが小さくなる。本実施例のように高密度で配置できることで、より多くのナノポアでの測定が可能になり、解析のスループットを向上させることができる。【０１１７】
また、波長分散させる場合、マルチナノポアチップ1100の光学系中心軸に対する設置位置は測定毎に変動し得るため、その都度、ナノポア毎に、その検出面上での位置から、画素座標と波長の関係、すなわち波長校正を行う必要があるが、本実施例の場合、輝点の像を検出するだけでよいため、波長校正などの操作は必要でなく、簡便に計測を行うことができる。【０１１８】
電気泳動によりナノポアを通過するDNA鎖は一般に高速である。例えば電圧100mVを印加時、塩基長10kb（knt）の1本鎖DNAのナノポア通過時間は約1msであり、一塩基あたりの増強場滞在時間（増強場の空間的な広がりは無限小と仮定）は0.1μsに過ぎない。したがって、この条件下で各塩基からのラマン散乱信号を独立に計測するためには、2分割比率分光検出装置2010の動作速度を1MHz以上にする必要がある。従来の顕微鏡システムで蛍光、燐光、散乱光等を高感度に計測する場合、特に2次元状に分布する測定対象を同時計測する場合には、検出器の動作速度は通常30Hz以下、特に速い速度で1KHz未満である。したがって検出器の動作速度を1KHz以上、好ましくは1MHzにすることは、本発明においてナノポアとそれを通過するDNA鎖のラマン散乱スペクトル計測とを組み合わせることによって生じる新しい課題である。このような超高速検出を実現する手段としては、従来の顕微鏡システムで一般に用いられているCCD（電荷結合素子）よりも、CMOS（相補型金属酸化膜半導体）の方が好ましい。CCDでは検出エリア全体、あるいは1列単位で画素を順番にAD変換を行うのに対して、CMOSでは2次元状に配列するすべて検出画素についてAD変換を同時に行うこともでき、AD変換に要する時間を数百〜数千倍短縮することができるためである。CMOSに限らず、検出画素毎にAD変換機能を有する検出器であれば同様の効果を得ることができる。また、検出器で取得される大量の信号をケーブルやボードを介して制御用コンピュータに転送し、内臓のハードディスク等に書き込むに要する時間を削減するため、検出器に大容量のメモリを内蔵させることにより、上記を介さずに大量の信号を保管することも有効である。一方、検出の高速化に伴い、個々の計測の露光時間が著しく低下する。これによる感度低下を防ぐため、増強場を導入すること、液浸形の高開口対物レンズを用いること、あるいは検出器にアバランシェフォトダイオードなどの高感度素子を用いたり、イメージインテンシファイア、電子増倍型CCD（EM-CCD）などの増倍機能を持たせること等は、本発明にとって好ましい構成である。すなわち、本発明においては、増倍機構を有する検出器を使用することが好ましい。【０１１９】
本実施例２によると複数のナノポアについてラマン散乱スペクトルを同時に取得可能であるため、計測の多重度が高く、結果の信頼性が高い、という特長がある。また、多重度の高い計測を行う場合におけるスループットが高い、という特長がある。【０１２０】
本実施例の変形例として、個々のナノポア毎に独立した試料用チャンバーを設け、それぞれのナノポアを用いて異なる試料を同時に計測することも可能である。また、この変形例は、複数の試料を並列に計測できるため、スループットが高い、という特長がある。【０１２１】
なお本例では、導電性薄膜対（例えば、1130aと1130b、又は、1131aと1131b）の間にナノポアが形成され、そのナノポア内を生体ポリマーが通過する構成である。ナノポアに変えて、導電性薄膜対の間を流路とすることでも実施できる。基板面に平行に生体ポリマーを移動させることで、導電性薄膜対（1130aと1130b、又は、1131aと1131b等）の間を通過させ、そのときに発するラマン散乱光を同様に検出することで、複数の試料を並列に計測することができ、スループットの高い解析が可能になる。【０１２２】
［実施例３］サンドイッチ構造のナノポアチップ
本発明による生体ポリマー特性解析を行うナノポアチップの構成の一例を図13を用いて説明する。図13は、本実施例３のナノポアチップ100bのナノポア120の中心軸121を含むxz断面の模式拡大図である。基板110はz軸上方の基板面に薄膜部分111aを有し、その上に導電性薄膜130a、130bを有し、さらにその上に薄膜部分111bを有する。その他は実施例１の変形例（図10）と同様である。【０１２３】
本実施例３のナノポアチップ100bの作製法は実施例１（の変形例）と類似であるが、導電性薄膜130a、130bのパターンをEBリソグラフィで形成した後に、膜厚約20nmのSiO2からなる薄膜部分111bをスパッタリングにより形成し、その後TEMによりナノポアを形成した点が異なる。薄膜部分111bは薄いため、ナノポアチップ100bの外観は、実施例１（の変形例）と同様、すなわち図９のごとくである。【０１２４】
本実施例３の動作は実施例１（の変形例）と同様であるが、以下の点が異なる。第1に、導電性薄膜130a、130bが薄膜部分111bにより被覆されているため、試料と相互作用可能な近接場はナノポア120の内部に局限される。残りの近接場は薄膜部分111aや薄膜部分111bの内部に封じ込められるため、生体ポリマーを含む試料と相互作用できない。従って目的とするナノポア120内部以外の空間に存在する試料からの背景信号が生じず、S/Nが高い、という特長がある。第2に、近接場はナノポア120の中心軸方向のちょうど中央付近に形成されるため、試料であるDNA等の生体ポリマーのxy方向の運動がナノポアによって制限されており、従って試料が均一な近接場と相互作用することができるため、得られる信号の再現性が高い、という特長がある。第3に、ナノポア120を通過する過程においてDNAが軸方向に伸長されるため、高次構造が解消され、個々の塩基を順番に近接場に導入でき、試料の配列上の観測領域と測定時刻との対応関係が単純化し、解析が容易になる、という特長がある。【０１２５】
［実施例４］導電性薄膜に通電するナノポアチップ
本発明による生体ポリマー特性解析用のナノポアチップの構成の一例を図14を用いて説明する。図14は、本実施例４のナノポアチップ100cの模式図である。図示のようにナノポアチップ100cは、基板110、ナノポア120、及び導電性薄膜130a、130b、配線パターン132a、132b、コンタクト133a、133b、などから構成される。配線パターン132a、132b、コンタクト133a、133bは、それぞれ導電性薄膜130a、130bと電気的に導通する。【０１２６】
配線パターン132a、132b、コンタクト133a、133bは、前述の実施例における導電性薄膜130a、130bと同様に形成した。異なるのは、配線パターンやコンタクトの材質として金を用いたことと、厚さとして配線パターンは1ミクロン、コンタクトは100ミクロンを採用したことなどである。【０１２７】
本実施例４による生体ポリマーの光学的解析装置は実施例１〜３と同様であるが、以下の点が異なる。すなわち、本実施例４はコンタクト133a、133bからカードエッジコネクタ（不図示）を介して、試料駆動装置700の第2の電圧出力に逆位相となるように接続した。【０１２８】
本実施例４の動作は前述の各実施例と同様であるが、以下の点が異なる。すなわち、本実施例４では試料駆動装置700からパルス状の電圧を試料用チャンバーに印加することにより、生体ポリマーをナノポア120を通して泳動した。またレーザ照射によって近接場を導電性薄膜130a、130bの端部に形成した。試料駆動装置700のパルスがOFFの時は、泳動電圧が解除されるとともに、コンタクト133a、133bには逆位相、すなわちONパルスが印加され、このパルス電圧は配線パターン132a、132bを通じて導電性薄膜130a、130bに伝達され、その端部131a、131b（不図示）に印加される。すると生体ポリマーであるDNAのリン酸基は導電性薄膜130a、130bの陽極側の端部に誘引されるため、この間、DNAの泳動が一時的に強制的に停止させられる。この間に、生体ポリマーのラマン散乱光に基づく強度比を取得する。同様に、試料駆動装置700のパルスがONの時は、泳動電圧が印加されるとともに、コンタクト133a、133bには逆位相、すなわちOFFパルスが印加され、DNAの泳動の一時強制停止が解除されるため、DNAの泳動が再開する。この間はラマン散乱光を検出しない。【０１２９】
本実施例４では泳動電流のパルス駆動だけでなく、導電性薄膜への電圧印加による生体ポリマーの強制停止／解除を泳動電流のパルスと同期して行うことにより、生体ポリマーのナノポアを通した移動をより精密に制御できる、という特長がある。【０１３０】
［実施例５］導電性薄膜としてグラフェンを使用したナノポアチップ
本発明による生体ポリマー特性解析用のナノポアチップの構成の一例を図15及び図16を用いて説明する。図15は、本実施例５のナノポアチップ100dの模式図である。ナノポアチップ100dは、基板110、ナノポア120、及び導電性薄膜130c、130d、などから構成される。図示のように本実施例５は実施例３と類似であるが、主に以下の点が異なる。第1に、導電性薄膜130c、130dとして単層のグラファイト、すなわちグラフェン（graphene）を用いた。第2に、導電性薄膜130c、130dの平面形状は、枠状の構造により周囲を取り囲む形で互いに連結されている。換言すると、導電性薄膜130c、130dは、空隙134a、134bを有する1枚の薄膜状の構造物である。（空隙134a、134bもナノポア120の部分で互いに連結している）。第3に、ナノポア120の直径として2nmのものを採用した点が異なる。【０１３１】
図16は、ナノポア120の中心軸121を含むxz断面の模式拡大図である。拡大率が高いため、導電性薄膜130c、130dの外枠は図示されていない。【０１３２】
本実施例５のナノポアチップ100dの作製法は実施例３と類似であるが、基板110に薄膜部分111aを形成した後の工程が異なる。すなわち、別途、機械的剥離法を用いてグラファイトからgrapheneを作製し、単層であることを光学顕微鏡により確認した。Schneiderら、Nano Letters (2010) 10, 1912に記載のwedging法を用いて、このgrapheneを、作業用の支持基板の上に転送した。高焦点のTEM（加速電圧300kV）を用いて、支持基板ごとgrapheneに対して電子ビームを照射してカーボンを打ち抜き、空隙134a、134bとその連結部分を形成した。支持基板をTEMから取り出し、再度wedging法を用いて、基板110の薄膜部分111aの上に上記加工を施したgrapheneを転送した。その後は実施例３と同様に、薄膜部分111bをスパッタリングにより形成し、さらにTEMを用いて（空隙134a、134bの連結部分に電子ビームを照射して）ナノポア120を形成した。【０１３３】
本実施例５の動作は実施例３と同様であるが、以下の点が異なる。第1に、導電性薄膜130c、130dをgrapheneで形成したため、その厚みが約0.3nmと極めて薄い。従って、その端部131a、131bの間に形成される近接場の厚みも1nm以下と極めて薄く、DNAの塩基数にして1〜3塩基程度と、空間分解能が高い、という特長がある。つまり前述の差分法による解析の誤差が少なく、塩基の種類をより高い確度で識別できる、という特長がある。第2に、導電性薄膜130c、130dをgrapheneで形成したため、その端部131a、131bの厚みが極めて薄く、厚み方向で考えると鋭く尖っている。近接場は先端が鋭く尖っていると電場が集中して増強効果が高まる、という特長がある。第3に、導電性薄膜130c、130dをgraphene（すなわち炭素）で形成したため、銀と比較して水溶液中での酸化などに対する安定性が高い、という特長がある。なお本実施例では単層のgrapheneを用いたが、2層ないし15層程度のgrapheneを用いることも可能である。これら複層のgraphene又はgraphiteを用いる場合でも、5nm以下の極めて薄い導電性薄膜を形成することができるため、上記と同様の効果を得ることができるばかりでなく、強度が高いという特有の効果もある。第4に、ナノポアの内径が小さいため、試料の通過速度を抑制することができる、という特長がある。【０１３４】
本実施例５の変形例として、導電性薄膜130c、130dの外枠を撤去してそれぞれ独立させ、実施例４のごとく配線を引き出して外部装置に接続する方法を採用可能である。外部装置としてトンネル電流の計測装置を採用することにより、導電性薄膜130c、130dの端部131a、131b間の試料を通して流れるトンネル電流を計測することが可能となる。この変形例は、端部の厚みが薄いため、トンネル電流計測における空間分解能が高い、という特長がある。この変形例を実施例１ないし実施例５と組み合わせることにより、ラマン測定とトンネル電流測定を同時に行うことができる。両者の結果を相補的に用いることにより、解析結果の信頼性を向上することが可能である。また一方の結果を用いてDNAの塩基の存在を検出し、他方の計測タイミングの同期を取ることにより、計測のS/Nを高め、解析結果の信頼性を向上することも可能である。【０１３５】
また本発明による導電性薄膜を設けたナノポアチップを、蛍光計測方式、例えば蛍光プローブを用いるナノポアシーケンサに適用することも可能である。この場合、導電性薄膜によって形成される近接場を活用することにより、高感度で、かつ高い空間分解能を達成可能である。【０１３６】
さらに上述した本発明を構成する各要素や従来の技術を2種類以上組み合わせて、さらに解析精度を向上することも有効である。【０１３７】
［実施例６］2分割比率分光検出装置
本発明の生体ポリマーの光学的解析装置における検出装置の構成についての一例を図17を用いて説明する。図17は本実施例６の生体ポリマー解析用の検出装置の構成図である。図3及び図12に記載の光源、ビームエキスパンダーの部分は省略した。【０１３８】
測定基板としてナノポアチップ100又はマルチナノポアチップ1100を使用する。以下の説明ではマルチナノポアチップ1100の場合について説明する。基板上の複数のナノポア120から、試料に由来するラマン散乱光がそれぞれ独立に生じる。このラマン散乱光は対物レンズ240で集光し、ダイクロイックミラー230を通過し、フィルタ250によりレイリー散乱光を除去した後、2分割比率分光検出装置260で検出される。2分割比率分光検出装置260は、2分割比率分光検出装置用ダイクロイックミラー32、補助フィルタ17a、17b、結像レンズ18a、18b、2次元センサカメラ19a、19b、2次元センサカメラコントローラ20a、20bで構成される。【０１３９】
集光されたラマン散乱光は、2分割比率分光検出装置用ダイクロイックミラー32により、波長ごとに異なる比率で分割された光束に分離される。分離された光束をそれぞれ、補助フィルタ17a、17bを通し、その像を結像レンズ18a、18bで、2次元センサカメラ19a、19b（高感度冷却2次元CCDカメラ）に結像させ、検出する。カメラの露光時間の設定、光画像の取り込みタイミングなどの制御は、2次元センサカメラコントローラ20a、20bを介して制御PC 21が行う。なお、フィルタユニット250には、光源であるレーザ光除去用のノッチフィルタと、検出する波長帯を透過させるバンドパス干渉フィルタを組み合わせて用いる。レーザ光除去用のノッチフィルタは使用するレーザ専用の周知の特性のフィルタを使用する。バンドパス干渉フィルタ（及び補助フィルタ17a、17b）の概略特性を図18（A）に、2分割比率分光検出装置用ダイクロイックミラー32の概略特性を図18（B）に示す。なお横軸は波数として表示した。【０１４０】
なお、装置は、自動ピントあわせ機構、また基板位置調整などのための、透過光照明、反射光照明、透過光・反射光観察用鏡筒とTVカメラ（不図示）とモニタ22を備える。ハロゲン照明などで基板1100の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。【０１４１】
本実施例で使用する2次元センサカメラ19a、19bとして、CCDエリアセンサを使用する。種々の画素サイズ、画素数のCCDエリアセンサを使うことができる。たとえば、画素サイズが16×16マイクロメータで、画素数512×512画素の高感度電子増倍型冷却CCDカメラを使用する。なお、2次元センサカメラとしては、CCDエリアセンサの他、C-MOSエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。CCDエリアセンサにも、構造によって、背面照射型、正面照射型があり、どちらも使用できる。また、本実施例のように素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型CCDカメラ（EM-CCD）なども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、−20℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減でき、測定の精度を高めることができる。【０１４２】
ナノポア1箇所あたりのCCDの必要画素は3×3画素程度又はそれ以上であり、その中央部でナノポアでのラマン散乱の輝点を検出する。512×512画素のCCDエリアセンサの場合、同時に最大29000個のナノポアでのラマン散乱を検出し、識別することも可能である。ナノポア同士の配置間隔を拡げれば、その分だけ同時計測ナノポア数は減少する。ナノポアのサイズがそれ以上であったり、基板サイズがより広い場合は、エリアを区切って分割して計測することも可能である。この場合、基板の位置を移動させるためのX−Y移動機構部をステージ下部に配置し、制御PC 21で照射位置への移動、光照射、光像検出を制御する。本実施例ではX−Y移動機構部は図示していない。【０１４３】
次にラマン散乱光の検出と識別について説明する。具体的には、マルチナノポアチップ1100の複数のナノポアから、試料に由来するラマン散乱光を検出して、その試料成分、つまりは塩基の種類を識別して強度を測定する方式について説明する。【０１４４】
図17では、二次センサカメラ（CCDカメラ）19a、19bへの総合結像倍率を20倍とし、各ナノポアからのラマン散乱光を計測する。マルチナノポアチップ1100内のナノポアが、4マイクロメータ×4マイクロメータの格子状に配置する場合、ナノポア同士の間隔を5分割してCCD画素で検出することになる。【０１４５】
例えば、分散素子を使って波長分散させる場合、格子点の最も近接する間隔は4マイクロメータであり、CCD画素数で5画素である。5画素以内にラマン散乱スペクトルを分散させることになり、スペクトル分離することが実質困難である。さらに、実際の結像画像では、個々のナノポアの発光輝点は1画素に収まらず広がりを持つため、数画素にわたって結像され、重なりがより大きくなるので、スペクトル分離がさらに困難になる。【０１４６】
本実施例では、ナノポアからのラマン散乱光を分散させることなく結像させるので、そのような制約はなくなる。高密度に配置されるマルチナノポアチップの測定に有効である。【０１４７】
各塩基のラマン散乱光（例えば図７）は、2次元CCDカメラ19a、19bにそれぞれ異なる比率で到達することになる。2次元CCDカメラ19a、19bでは波長方向の情報はなく、輝点の輝度情報のみが得られる。具体的には、ラマン散乱光は、図７に示されるスペクトルと図18（B）に示されるスペクトルの積によって決まる反射光像と透過光像とに分離され、それぞれの輝点が得られる。輝点がA、C、G、Tそれぞれ由来のラマン散乱像のとき、各輝点に含まれるスペクトル分布と比率を図８に示す。図８（A）は図７のラマン散乱光に対する各塩基の透過光スペクトル成分で、（B）が反射光スペクトル成分になる。各塩基のラマン散乱スペクトル（図７）が異なるため、塩基種ごとに2分割比率分光検出装置用ダイクロイックミラー32により透過するスペクトル成分と、反射するスペクトル成分が異なり、検出される透過強度と反射強度が異なる。つまり、図８（C）のように、塩基種毎に、全強度に対する透過強度の比率が異なり、この比率から塩基種を識別することができ、ナノポアを通過する塩基が判定可能になる。このように、波長ごとに異なる比率で分割するダイクロイックミラーを使用し、ひとつの輝点の光強度を分割し、それらを異なる画素にて検出することで、4種の塩基からのラマン散乱を識別し、検出することができる。制御PC 21では、各CCDカメラの画像から、各ナノポアの輝点を抽出し、その強度の比を算定し、塩基の種類を識別する。【０１４８】
なお、使用できるダイクロイックミラーの特性は本実施例に示すものに限らず、4種以上のラマン散乱を、その反射強度と透過強度の比率が異なる（区別できる）組合せとなる特性を有するものであれば適用可能である。またDNAの塩基配列以外にもRNA配列などに適用できる。【０１４９】
また、2次元CCDカメラ19a、19bは2つである必要はなく、1個でもよい。この場合は分割された像を同じ2次元CCDカメラに結像させる際、画像を横にずらすなどして位置が異なるようにすればよい。【０１５０】
本実施例では、4種の塩基の識別について説明したが、3種でも、また5種、6種以上の組み合わせも可能である。【０１５１】
本実施例では、ダイクロイックミラー32として、指定の波数範囲において、透過率が、実質的にほぼ0％からほぼ100％までのほぼ線形的な特性を有する2色性ミラーを使用するが、ほぼ10％からほぼ80％までのほぼ線形的な特性であってもよい。また使用する複数の散乱スペクトルにあわせて、任意の波数帯ごとに透過率・反射率が異なる特性の分割ミラーであってもよい。たとえば、特徴的なラマン散乱ピークの波数ごとに階段状に変化する特性のミラー（図19に模式的に図示）でも同様に可能である。【０１５２】
本実施例によれば、複数のナノポアを精密配置し、複数の検出画素を備えた複数の検出器の特定画素に各ナノポアに進入した生体ポリマー由来のラマン散乱光をそれぞれ結像させ、検出器ごとの強度比を測定することで、生体ポリマーを構成するモノマーの種類を識別することができる。特に検出器である2次元CCDカメラを1台又は2台で、モノマー3種又は4種以上を識別検出することができる。これにより、装置コストを抑えることができる。当然のことながら1分子ごとに検出することも可能である。【０１５３】
また、本実施例では、ナノポアを一定間隔の格子状に配置する基板を使用する。ナノポアを格子状に配置することで、透過像と反射像内の相対応する輝点の識別が容易になる。格子状に捕捉領域を配置する基板を使わない場合にも対応する。ランダムに形成されている場合でも、両方の画像を比較し、パターン解析し、又は基準マーカを参照して、相互に対応する輝点を判定すればよく、これによっても同様の効果が得られる。【０１５４】
また、1発光輝点あたりのCCDの画素数は、5×5画素としているが、4×4画素、5×4画素、4×3画素、3×3画素などに調整することが可能である。これらの画素数で検出しても高密度に捕捉した分子を高効率で検出識別することができる。【０１５５】
［実施例７］2分割比率分光検出装置の別構成
本発明の生体ポリマーの光学的解析装置における検出装置の構成についての一例を説明する。図20は本実施例７の生体ポリマー特性解析用の検出装置の構成図である。図17と同様、図3及び図12に記載の光源、ビームエキスパンダーの部分は省略した。【０１５６】
測定基板としてナノポアチップ100又はマルチナノポアチップ1100を使用する。以下の説明ではマルチナノポアチップ1100の場合について説明する。基板上の複数のナノポアから、試料に由来するラマン散乱光がそれぞれ独立に生じる。このラマン散乱光は対物レンズ240で集光し、ダイクロイックミラー230を通過し、フィルタ250によりレイリー散乱光を除去した後、2分割比率分光検出装置2010で検出される。2分割比率分光検出装置2010は、2分割比率分光検出装置用ダイクロイックミラー32、ミラー40a、40b、40c、補助フィルタ17a、17b、結像レンズ18c、2次元センサカメラ19c、2次元センサカメラコントローラ20cで構成される。【０１５７】
まず、分割のためのダイクロイックミラー32により、波長ごとに異なる比率で透過光と反射光に分割する。分割された光束をそれぞれ、反射光はミラー40aで反射し、結像レンズ18cに指定の角度で導く。透過光はミラー40bと40cで折り曲げ、同じ結像レンズ18cに別の指定の角度で導く。両光束は異なる角度で結像レンズ18cに入射することで、2次元センサカメラ19c（高感度冷却2次元CCDカメラ）に対して、それぞれの画像をずらして結像させる。補助フィルタ17a、17bは迷光除去のため、バンドパス干渉フィルタを使う。場合により、補助フィルタは使わなくてもよい。2次元センサカメラ19cの画像は2次元センサカメラコントローラ20cを介して制御PC 21で収集し解析を行う。なお、分割透過光と分割反射光の光路の長さは、なるべく同じになるようにしているが、必ずしも同じでなくてもかまわない。図では結像倍率は、両光束で同じであるが、異なるようにしてもよい。同じ輝点の分割透過光像と分割反射光像であることが判断されれば解析可能である。【０１５８】
本実施例に拠れば、2次元CCDカメラ1台で複数のナノポアに由来するラマン散乱光を検出できるため、計測が簡便になるとともに、2次元CCDカメラの個体差による感度補正をする必要がなく、また、測定のタイミングを制御する必要もないので、測定精度が向上する。【０１５９】
［実施例８］突起状構造を有する流路を備えた特性解析チップ
本実施例の生体ポリマー特性解析用ナノ流路チップの構成の１実施例を、図２１を用いて説明する。ナノ流路チップ800は、基板810、流路820、カバーガラス840などから構成される。カバーガラス840上には、流路820の両端に相当する位置に測定試料を導入するための開口部851と、導出するための開口部852を有する。流路820は基板810上の導電性薄膜によって形成されており、中央の観察領域830は突起構造831を有しており、実施例１記載の増強場を発生させる。つまり、流路の1か所に先鋭端を有する突起形状（突起状構造）が形成されており、該突起形状が、流路の進行方向に対して流路の一方の壁面に形成されている。【０１６０】
本実施例による生体ポリマーの特性解析を行う解析装置の構成は実施例１と同様である（図３参照）が、試料セルの構成が異なる。図２２は、試料セル8300の構成概略を示す断面図である。試料セル8300は、ナノ流路チップ800、上部部材8310、下部部材8320、ねじ類（不図示）などから構成される。上部部材8310は、その内部にＯ−リング8330、試料用流路8340、8350、電極用流路8360、8370、試料用接続ポート8341、8351、電極用接続ポート8361、8371が形成される。上部部材8310には試料用接続ポート8341、8351を介して試料送液チューブ（不図示）が気密に接続され、また電極用接続ポート8361、8371を介して銀塩化銀電極（不図示）が気密に接続される。銀塩化銀電極の塩化銀を有する端は電極用流路チャンバーに収納され（不図示）、その銀を有する端（以下、銀端）は電極用流路の外部に露出する。前記試料送液チューブ、試料用流路8340及び8350、試料用接続ポート8341及び8351、電極用流路8360及び8370、電極用接続ポート8361及び8371には、試料溶液（不図示）が隙間なく（気泡の混入なしに）満たされる。従って、試料セル8300及びナノ流路チップ800内の試料溶液は銀塩化銀電極と接触し、両者は電気化学的に導通する。【０１６１】
本実施例の動作の概要を図３、図２１及び図２２を用いて説明する。まず試料セル8300の準備を行う。具体的には上部部材8310と下部部材8320との間にナノ流路チップ800をはさんでＯ−リング8330で圧接し、試料用流路8340及び8350とナノ流路チップ800の開口部851及び852とを気密に接続する。試料送液チューブから試料溶液として100mM KCl水溶液を導入し、試料セル8300の試料用流路8340、8350、電極用流路8360、8370、試料用接続ポート8341、8351、電極用接続ポート8361、8371、及びナノ流路チップ800の流路820に試料溶液を満たす。【０１６２】
次に試料セル8300を解析装置200へ設置する。具体的には試料セル8300を微動ステージ600に固定する。微動ステージ600と、図示しない目視用光学系を用いて、試料セル8300内のナノ流路チップ800の観察領域部分830に光学系の焦点を合わせる。試料セル8300に設置した2つの銀塩化銀電極を試料駆動装置700に接続する。試料駆動装置700は電圧源又は電流源を内蔵し、試料導入側の電極用接続ポート8361を基準として、試料導出側の電極用接続ポート8371に電圧を印加することができる。【０１６３】
解析装置の光学系、及び測定対象であるDNAの測定手順は、実施例１に記述した通りである。電気泳動によって測定試料が導電性薄膜860の端部831に形成される近接場を通過する際の、増強ラマン散乱光の時間変化を取得する。【０１６４】
本実施例のナノ流路チップ作製法は実施例１（の変形例）における導電性薄膜130の作製法と同様である。シリコン基板810上に金薄膜860を形成し、レジストを塗布後、図２１に示す測定領域830のパターンをEBリソグラフィにより形成し、それ以外の領域の金をエッチングにより除去し、レジストを除去し、最後にカバーガラス840を被せて固定した。突起構造831の寸法については、実施例１と同等である。また突起構造831と導電性薄膜860に挟まれた流路820の幅は約30nmである。これは実施例１に記載のナノポアの孔径とほぼ同じであり、例えばDNA分子が凝集せずに通過可能である。【０１６５】
本実施例では導電性薄膜860の材料として金を用いたが、この材料は金に限定されず、一般に導電性を有する材料、一般には金属が好適に使用できる。導電性薄膜として使用可能な他の金属として、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族の金属や、銀、銅などがある。【０１６６】
本実施例で用いたカバーガラス840の材料は、ガラス、石英、光源波長において透明度の高いアクリルなどのプラスチック材料などである。【０１６７】
本実施例において、測定試料は流路に沿って基板810と水平に進行する。即ち、本実施例の生体ポリマー特性解析用チップは、ナノポアではなくナノサイズの流路を有するという点で、実施例１と異なる。この構造の利点は、基板の上下に試料用チャンバーを設ける必要が無いことである。実施例１においては、対物レンズとチップとの間に試料用チャンバーが存在するため、観察時はチャンバー内部の試料溶液から生じる信号によって背景光が増加することがある。本実施例によれば、その影響を排除することができるため、ノイズ成分が減少する。さらに試料用チャンバーが無くなることで、今まで以上に対物レンズを測定領域に近接させることができる。従って、実施例１に比べてよりNAの高いレンズが使用可能となるため、信号強度が増加する。結果として、実施例１に比べて、高いS/Nで観察することができる、という特徴がある。【０１６８】
なお本実施例に近い変形例として、下記の構成のごときナノ流路チップ800aを実施することが可能である。図２３は本変形例によるナノ流路チップ800aの模式図である。基本構成は上記実施例及び図２１と類似であるが、図示のようにナノ流路チップ800aは、測定領域に2つの突起形状831、832を有する点が、（1つの突起形状831しか有さない）図２１と異なる。2つの突起形状の端部は、流路の左右の壁面からそれぞれ互いに対向している。端部の間隔は約30nmである。これは図２１の場合のナノポアの孔径とほぼ同じであり、例えばDNA分子が凝集せずに通過可能である。【０１６９】
本変形例によるナノポアチップ800aのための解析装置や、動作も同様である。本変形例の効果の特徴についても、前述の通りである。また、本実施例及び変形例に記載の流路820を、基板810表面に二次元的に複数配置することも可能である。【０１７０】
［実施例９］一列のナノ粒子を有する流路を備えた特性解析チップ
本実施例の生体ポリマー特性解析用ナノ流路チップの構成の１実施例を、図２４を用いて説明する。ナノ流路チップ900は、基板910、流路920、カバーガラス940などから構成される。カバーガラス940上には、流路920の両端に相当する位置に測定試料を導入するための開口部951と、導出するための開口部952を有する。流路920は基板910上の導電性薄膜960によって形成されており、中央の観察領域930にはナノ粒子931が流路920の幅全体に渡って一列固定されており、実施例１記載の増強場を発生させる。図示のように本実施例は実施例８と類似であるが、測定領域に突起形状が存在せず、その代わりにナノ粒子が固定されている点で異なる。その他は実施例８と同様である。【０１７１】
本実施例のチップ作製方法は以下の通りである。まず実施例８の手順に従い、ナノサイズの流路920を作製する。基板表面にレジストを塗布し、EBリソグラフィによって流路パターンを形成する。次に、金ナノ粒子931を固定する。流路920を含む基板910全体にレジストを塗布し、EBリソグラフィ（ポジ）によって流路上に金ナノ粒子931を固定するためのパターンを形成する。ポストベークを行い、純水でリンスし、流路の一部が露出した状態にする。スパッタリングによって露出部分にSiO2薄膜を形成した後、アセトンによってレジストを除去する。最終的に流路920の底の一部分にSiO2の薄膜が存在する状態となる。シランカップリング剤を反応させ、SiO2薄膜上に官能基を付加する。前記官能基に対して金ナノ粒子931を反応させ、結合させる。最後にカバーガラス940を被せ、固定する。【０１７２】
本実施例９の動作は実施例１（の変形例）と同様である。金ナノ粒子931を用いた場合、増強場は個々の粒子の周辺及び粒子間の間隙に生じる。流路920の高さ（導電性薄膜960の膜厚に等しい）と金ナノ粒子931の直径と同等に、流路920の幅を金ナノ粒子931の直径の整数倍にすることで、金ナノ粒子931は流路920に最密に充填され、その結果、測定試料は増強場を通過するようになる。【０１７３】
本実施例によれば、金ナノ粒子931を使用することで実施例８と同様の効果を得ることができる。また実施例８と比較して、比較的簡便にチップを作製できるという特徴がある。【０１７４】
本実施例ではナノ粒子931の材料として金を用いたが、この材料は金に限定されず、一般に導電性を有する材料、一般には金属が好適に使用できる。導電性薄膜として使用可能な他の金属として、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族の金属や、銀、銅などがある。また、樹脂製のビーズを固定した後、スパッタリングによって各種金属を表面コートし、その後加熱等によって樹脂成分を排除することでも、同様の効果が得られる。【０１７５】
なお本実施例に近い変形例として、下記の構成のごときナノ流路チップ900aを実施することが可能である。図２５は本変形例によるナノ流路チップ900aの模式図である。基本構成は図２４と類似であるが、図示のようにナノ流路チップ900aは、測定領域930aに円筒状の金属構造体931aを有する点が、図２４の場合と異なる。【０１７６】
本変形例の作製方法は、流路920の作製方法と同様、EBリソグラフィによる。本変形例によるナノ流路チップ900aのための解析装置や、動作は実施例８と同様である。本変形例の効果の特徴についても、実施例８に記載の通りである。本変形例では円筒状の金属構造体931aを配置したが、その形状は三角柱、四角柱などの多角柱状とすることもできる。また、本実施例及び変形例に記載の流路920を、基板910表面に二次元的に複数配置することも可能である。【０１７７】
［実施例１０］複数列のナノ粒子を有する流路を備えた特性解析チップ
本実施例の生体ポリマー特性解析用ナノ流路チップの構成の１実施例を、図２６を用いて説明する。ナノ流路チップ1000は、基板1010、流路1020、カバーガラス1040などから構成される。カバーガラス1040上には、流路1020の両端に相当する位置に測定試料を導入するための開口部1051と、導出するための開口部1052を有する。流路1020は基板1010上の導電性薄膜1060によって形成されており、中央の観察領域1030にはナノ粒子1031が流路1020の幅全体に渡って複数列固定されており、実施例１記載の増強場を発生させる。図示のように本実施例は実施例９と類似であるが、ナノ粒子1031が一列ではなく、複数列固定されている点で異なる。その他は実施例９と同様である。【０１７８】
本実施例のチップ作製方法は実施例９と同様である。本実施例の動作は実施例８（の変形例）と同様であるが、以下の点が異なる。金ナノ粒子を用いた場合、増強場は個々の粒子の周辺及び粒子間の間隙に生じる。このため、実施例８と比較して広い範囲で増強場を発生させることができる。実施例８における増強場は、突起形状の先端部分の直径30nmの範囲に限定されていたが、本実施例によれば増強場の範囲を最大でレーザ光の照射スポットのサイズまで広げることができるという特徴がある。また実施例８及び実施例９と比較して、1ピクセルあたりの信号強度を高くすることができるという特徴がある。【０１７９】
素子サイズが16um/pixelのEM-CCDを用いて、拡大倍率20倍で観察した場合、CCDの1ピクセルはナノ流路チップ1000上の0.8umに相当する。ナノ粒子1031の直径が0.1umであり、流路1020に最密充填で固定されている場合、CCD1ピクセルに相当する領域中には、金ナノ粒子1031が流路1020の進行方向に、およそ10列存在する。つまり、1ピクセルが示す信号強度は、およそ10列の金ナノ粒子1031による増強効果の積算となる。例えば実施例９において泳動速度が1のとき測定試料が増強場に存在する時間を1とした場合、本実施例においては泳動速度が1のとき測定試料が増強場に存在する時間は10となる。即ち、上記構成のナノ流路チップ1000を用いることで、実施例９と同等の効果をおよそ10倍の泳動速度で得ることができる。【０１８０】
以上のように、本実施例によれば、より効率良くかつ簡便な増強観察が可能となる。また本実施例は、特に生体モノマー担体での測定に適している。【０１８１】
なお本実施例に近い変形例として、下記の構成のごときナノ流路チップ1000aを実施することが可能である。図２７は本変形例によるナノ流路チップ1000aの模式図である。基本構成は図２６と類似であるが、図示のようにナノ流路チップ1000aは、測定領域1030aに円筒状の金属構造体1031aを有する点が、図２６の場合と異なる。【０１８２】
本変形例の作製方法は、流路1020の作製方法と同様、EBリソグラフィによる。本変形例によるナノ流路チップ1000aのための解析装置や、動作は実施例８と同様である。本変形例の効果の特徴についても、実施例８に記載の通りである。本変形例では円筒状の金属構造体1031aを配置したが、その形状は三角柱、四角柱などの多角柱状とすることもできる。また、本実施例及び変形例に記載の流路1020を、基板1010表面に二次元的に複数配置することも可能である。【０１８３】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明により、生体ポリマーの光学的解析装置及び解析方法が提供される。本発明の解析装置は、固体ナノポア方式に基づくため、構造の安定性が高く、信頼性が高いものであり、またラマン散乱により2次元的に、高空間分解能かつ高感度で生体ポリマーの特性を解析することができる。また、複数のナノポアにおいて同時に複数の生体ポリマーを解析することができるため、本発明の解析装置及び解析方法は簡便かつ高スループットである。従って、本発明は、生体ポリマーの特性を解析することが望まれる分野、例えばバイオテクノロジー、生化学、医療などの分野で有用である。
【符号の説明】
【０１８５】
17a、17b  補助フィルタ
18a、18b、18c  結像レンズ
19a、19b、19c  2次元センサカメラ
20a、20b、20c  2次元センサカメラコントローラ
21  制御PC
22  モニタ
32  2分割比率分光検出装置用ダイクロイックミラー
40a、40b、40c  ミラー
100、100a、100b、100c、100d  ナノポアチップ
110  基板
111、111a  基板の薄膜部分
111b  薄膜部分
112  基板の窓部
120  ナノポア
121  ナノポアの中心軸
130、130a、130b、130c、130d  導電性薄膜
131、131a、131b  導電性薄膜の端部
132a、132b  配線パターン
133a、133b  コンタクト
134a、134b  空隙
200  解析装置
210  光源
220  ビームエキスパンダー
230  ダイクロイックミラー
240  対物レンズ
250  フィルタ、フィルタユニット
260  2分割比率分光検出装置
270  終端
300  試料セル
310  上部部材
320  下部部材
330  O-リング
410、420、430  試料用流路
440  （下部）試料用チャンバー
450  電極用チャンバー
460、470  試料用接続ポート
480  （下部）電極用接続ポート
540  （上部）試料用チャンバー
580  （上部）電極用接続ポート
600  xyz微動ステージ
700  試料駆動装置
800、800a  ナノ流路チップ
810  基板
820  流路
840  カバーガラス
851、852  開口部
830、830a  観察領域、測定領域
831、832  突起構造、端部
860  導電性薄膜
900、900a  ナノ流路チップ
910  基板
920  流路
930、930a  観察領域、測定領域
931  ナノ粒子
931a  円筒状の金属構造体
940  カバーガラス
951、952  開口部
960  導電性薄膜
1000、1000a  ナノ流路チップ
1010  基板
1020  流路
1030、1030a  観察領域、測定領域
1031  ナノ粒子
1031a  円筒状の金属構造体
1040  カバーガラス
1051、1052  開口部
1060  導電性薄膜1100  マルチナノポアチップ
1110  基板
1120、1121  ナノポア
1130a、1130b、1131a、1131b  導電性薄膜
2000  マルチ解析装置
2010  2分割比率分光検出装置
8300  試料セル
8310  上部部材
8320  下部部材
8330  Ｏ−リング
8340  試料用流路
8341  試料用接続ポート
8350  試料用流路
8351  試料用接続ポート
8360  電極用流路
8361  電極用接続ポート
8370  電極用流路
8371  電極用接続ポート
【図１】
2012165400.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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