(57)【要約】【課題】スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法、及び得られた抽出物を含有する機能性食品又は医薬品組成物を提供する。【解決手段】本発明のスフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法は、（１）天然物からスフィンゴ脂質を含有する脂質を抽出する工程、（２）工程（１）により得られた抽出物からクロマトグラフィーにより分画してスフィンゴ糖脂質を得る工程、及び（３）前記スフィンゴ糖脂質を酸加水分解した後、その分解物から脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する工程を含む。得られる抽出物は、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進機能が高く、且つ腸管から吸収されにくいので、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬の有効成分として有用である。【選択図】図６
2013111823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の工程：
（１）天然物からスフィンゴ脂質を含有する脂質を抽出する工程、
（２）工程（１）により得られた抽出物からクロマトグラフィーにより分画してスフィンゴ糖脂質を得る工程、及び
（３）前記スフィンゴ糖脂質を酸加水分解した後、その分解物から脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する工程、
を含む、スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記天然物が、ナマコ又はトウモロコシである、請求項１に記載のスフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法。
【請求項３】
スフィンゴイド塩基を含む抽出物を含有する機能性食品組成物又は医薬品組成物。
【請求項４】
前記抽出物がスフィンゴイド塩基構造を有する化合物である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物がスフィンゴ脂質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物がセラミドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
糖尿病、肥満、又はメタボリックシンドロームの予防又は治療あるいは予防又は治療を補助するための請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記スフィンゴイド塩基がＧＬＰ−１分泌を促進する機能を有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記スフィンゴイド塩基が、
【化１３】
2013111823.tif 000017
で示される４−スフィンゲニン（ｄ１８：１４ｔ）、
【化１４】
2013111823.tif 000018
で示される４，８−スフィンガジエニン（ｄ１８：２４ｔ，８ｔ（ｃ））、
【化１５】
2013111823.tif 000019
で示される４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン（ｔ１８：１８ｔ（ｃ））、
【化１６】
2013111823.tif 000020
で示される９−メチル−４，８−スフィンガジエニン（９−Ｍｅ−ｄ１８：２４ｔ，８ｔ）、
【化１７】
2013111823.tif 000021
で示される４，８，１０−スフィンガトリエニン（ｄ１８：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）、及び、
【化１８】
2013111823.tif 000022
で示される９−メチル−４，８，１０−スフィンガトリエニン（ｄ１９：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）
からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法に関し、より詳細には腸管ホルモン分泌促進成分の製造方法、並びに腸管ホルモン分泌促進成分を含む機能性食品及び医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物を摂取すると腸管から種々のホルモンが分泌され、種々の生理機能を発揮することが知られている。腸管ホルモンのうちで、膵蔵のβ細胞からインスリンを放出促進する能力を持つホルモンがインクレチンと称されている。インクレチンの具体例として、グルカゴン様ペプチド（以下、ＧＬＰ−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １）と呼ぶ）及びＧＩＰ（ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が知られている。インクレチンはインスリン分泌を介して、血糖の組織取り込みを調節する重要なホルモンである。インクレチン分泌の障害は糖尿病発症の原因となる。【０００３】
腸管よりインクレチン分泌を促進する食物由来の成分として、糖類、アミノ酸、ペプチド、脂質や脂肪酸類が知られている。いずれも栄養素として人体に利用される。また、腸管ホルモン分泌をコントロールしてインスリン放出を促進し、糖尿病を治療しようとする医薬品が開発されている。体内で分解されにくいＧＬＰ−１誘導体を投与するアプローチと、体内でのＧＬＰ−１分解を抑える分解酵素阻害剤（ＤＰＰ４インヒビター）が次世代糖尿病薬として注目されている。【０００４】
腸管からのインクレチン分泌の分子メカニズムに関して、腸管のインクレチン分泌細胞上に存在する受容体蛋白質（ＧＰＲ１２０）に対して、食物由来の脂肪酸が結合することによりシグナルが細胞に入り、インクレチン分泌が誘導される。この作用を強く持つ脂肪酸は長鎖不飽和脂肪酸である。天然物の中では、αリノレン酸（αＬＡ）やＤＨＡが最も強いインクレチン分泌作用を持つことが知られている。【０００５】
スフィンゴ脂質は、図１に示す構造を持つ物質の総称であり、動物や植物に広く存在する。長鎖塩基成分（スフィンゴイド塩基類）と脂肪酸が酸アミド結合したセラミドを共通構造とし、それにさらに糖又はリン酸及び塩基が結合する。糖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質とリン酸及び塩基とが結合したスフィンゴリン脂質に分類される。スフィンゴ脂質には、美肌効果や大腸がん予防効果などの可能性が示唆されており、その食品機能が注目されている。動物の長鎖塩基成分（スフィンゴイド塩基）の多くは、１８個の炭素を持つ長鎖アミノアルコールである、スフィンゴシン（２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール）である。
【化１】
2013111823.tif 000003
【０００６】
スフィンゴシン以外のスフィンゴイド塩基として種々の構造体が、動物や植物由来スフィンゴ脂質より発見されている。スフィンゴ脂質、その成分であるセラミド、さらにその成分であるスフィンゴイド塩基自体にも、種々の生物活性が報告されている。特に、スフィンゴシンがリン酸化されたスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、細胞膜上に存在するＳ１Ｐ受容体のリガンドとして、細胞運動制御、アクチン骨格形成、細胞増殖、接着結合形成のような様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。【０００７】
スフィンゴ脂質及びその構成成分が種々の生理活性を持つことから、本発明者等は、これらがインクチン分泌促進作用を持つ可能性を考え、さらに種々のスフィンゴ脂質及びその構成成分のインクレチン分泌促進作用を検討した。なお、スフィンゴ脂質、その成分であるセラミド、さらにその成分であるスフィンゴイド塩基がインクレチン分泌促進作用を有するという報告はこれまで無い。【０００８】
スフィンゴイド構造を持つ化合物、例えばスフィンゴ脂質及びセラミドは、消化管内で一部分解されることがわかっている。よって、スフィンゴ脂質あるいはセラミドを経口投与した場合に、その分解物（例えば、スフィンゴイド塩基）がＧＬＰ−１分泌促進効果を示すことが考えられる。【０００９】
しかし、スフィンゴ脂質は腸管で分解されにくく、さらに、スフィンゴ脂質あるいはその構成成分（例えばセラミドやスフィンゴイド塩基）は腸管で吸収されにくい。ＧＬＰ−１分泌に関与する細胞は小腸下部あるいは大腸上部に存在することから、摂取したスフィンゴ脂質あるいはその構成成分はその作用部位であるＧＬＰ−１分泌細胞まで到達する点で有利である。一方、αリノレン酸は、小腸でほとんどが吸収され、ＧＬＰ−１分泌細胞に到達する量は摂取量の一部である。故に、スフィンゴ脂質あるいはその構成成分は、αリノレン酸より少ない量でαリノレン酸と同等のＧＬＰ−１分泌促進効果を発揮することが期待できる。スフィンゴ脂質あるいはその構成成分は、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たり、αリノレン酸より高いＧＬＰ−１分泌促進効果が期待できる。特に、スフィンゴ脂質は、腸管で分解されにくいために、スフィンゴ脂質やセラミドを投与するよりも、脂肪酸受容体に作用してＧＬＰ−１を分泌促進する本体であるスフィンゴイド塩基を直接投与する方がＧＬＰ−１分泌促進に有利であることは容易に推測できる。スフィンゴイド塩基が腸管で吸収されにくいことからも、一般的脂質（例えばαリノレン酸）を投与するよりも、スフィンゴイド塩基を投与することが、過剰な栄養素となり肥満を誘発する可能性が低いという点で有利であることが容易に推測できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２０１０，３３（１０）：２２７７−２２８４
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０１０，１５１（５）：１９８４−１９８９
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１（１）：９０−９４
【非特許文献４】Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００９，５０  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ９１−９６
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００９，１７９１（７）：６９２−６９６
【非特許文献６】Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００７  Ｏｃｔ；８７（４）：１４０９−１４３９
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６９  Ｊｕｌ  ２９；１８７（１）：１１３−１２１
【非特許文献８】Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０１０．５１：１７６１-１７６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記次世代糖尿病薬などの臨床結果から、ＧＬＰ−１の血中濃度を上昇させることが糖尿病治療に有効であることが明確になってきている。一方、ＧＬＰ−１は満腹中枢を刺激して、食欲を抑制することが知られている。ＧＬＰ−１誘導体の臨床結果により、肥満抑制効果が明確に示された。したがって、食物を摂取すれば、腸管からＧＬＰ−１が放出され、ＧＬＰ−１の血中濃度が上昇するので、自然に食物を摂取することは、糖尿病を予防することにもつながるといえる。【００１２】
しかし、食物は栄養ともなるので、食物を摂取過剰することで、肥満、ひいては糖尿病を招く。カロリーの取り過ぎで肥満状態に陥ると、生活習慣病として糖尿病が誘発されることは周知である。したがって、ＧＬＰ−１の血中濃度を上昇させるために、食物を過剰に摂取することは、糖尿病の予防又は治療方法として適切でない。【００１３】
本発明の目的は、食物中からカロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進能の高い成分あるいは、腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を取り出す方法を提供することにより、肥満あるいは糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、食物中に存在し、ＧＬＰ−１放出活性などの腸管ホルモン分泌促進能がカロリー当たりあるいは分子（モル数）当たり高い成分、あるいは腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を取り出し、これを摂取することにより、肥満あるいは糖尿病の予防あるいは治療が可能ではないかと考えた。かかる発想の下に、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進活性の高い成分、あるいは腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を、食品成分中に探した。鋭意努力の結果、動植物に広く存在するスフィンゴ脂質の成分である、スフィンゴイド塩基類が高いＧＬＰ−１分泌促進活性を持つことを発見した。スフィンゴイド塩基類は腸管から吸収されにくいことがわかっている。【００１５】
本発明は、下記（１）〜（３）の工程：
（１）天然物からスフィンゴ脂質を含有する脂質を抽出する工程、
（２）工程（１）により得られた抽出物からクロマトグラフィーにより分画してスフィンゴ糖脂質を得る工程、及び
（３）前記スフィンゴ糖脂質を酸加水分解した後、その分解物から脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する工程、
を含む、スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法を提供する。【００１６】
前記天然物は、ナマコ又はトウモロコシであることが好ましい。【００１７】
本発明は、また、スフィンゴイド塩基を含む抽出物を含有する機能性食品組成物又は医薬品組成物を提供する。【００１８】
前記抽出物は、スフィンゴイド塩基構造を有する化合物であることが好ましい。【００１９】
前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物は、スフィンゴ脂質であることが好ましい。【００２０】
前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物は、セラミドであることが好ましい。【００２１】
本発明の組成物は、糖尿病、肥満、又はメタボリックシンドロームの予防又は治療あるいは予防又は治療を補助するために好適である。【００２２】
前記スフィンゴイド塩基は、例えばＧＬＰ−１分泌を促進する機能を有する。【００２３】
前記スフィンゴイド塩基は、
【化２】
2013111823.tif 000004
で示される４−スフィンゲニン（ｄ１８：１４ｔ）、
【化３】
2013111823.tif 000005
で示される４，８−スフィンガジエニン（ｄ１８：２４ｔ，８ｔ（ｃ））、
【化４】
2013111823.tif 000006
で示される４−ヒドロキシ−８−スフィンゲニン（ｔ１８：１８ｔ（ｃ））、
【化５】
2013111823.tif 000007
で示される９−メチル−４，８−スフィンガジエニン（９−Ｍｅ−ｄ１８：２４ｔ，８ｔ）、
【化６】
2013111823.tif 000008
で示される４，８，１０−スフィンガトリエニン（ｄ１８：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）、及び、
【化７】
2013111823.tif 000009
で示される９−メチル−４，８，１０−スフィンガトリエニン（ｄ１９：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）
からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のスフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法によれば、食物中からカロリー当たりの腸管ホルモン分泌促進能が高い成分あるいは腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を分画して取り出すことができる。抽出物は、肥満、糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬品として提供することができる。【００２５】
本発明者等は、食品成分の脂肪から腸管ホルモン分泌促進する成分を抽出する方法を確立し、分離された成分を含む機能性食品や医薬品の提供を試みた。目的の成分の純度を向上させることにより、夾雑物が持つ可能性のある副作用の危険を回避できる。あるいは活性本体の構造や性質を明らかにすることにより、目的の成分の安定的供給を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】スフィンゴ脂質の構造を示す図である。
【図２】トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基アルデヒド誘導体のＧＣクロマトグラムである。
【図３】ナマコ由来スフィンゴイド塩基のＧＣクロマトグラムである。
【図４】ナマコあるいはトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基によるＳＴＣ−１細胞からのＧＬＰ−１分泌促進活性を示すグラフである。
【図５】スフィンゴシン、ナマコあるいはトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基によるＳＴＣ−１細胞からのＧＬＰ−１分泌促進活性を示すグラフである。
【図６】スフィンゴシン、ナマコあるいはトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基の経口投与によるマウス門脈のＧＬＰ−１分泌促進効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明のスフィンゴ塩基を含む抽出物の製造方法を、以下に説明する。使用する原料は、スフィンゴ脂質を含有する天然物であれば特に限定されない。該天然物の例には、ナマコ、魚の脳、牛の脳等の動物由来、並びにトウモロコシ、小麦、米糠等の植物由来が挙げられ、好ましくはナマコ及び／又はトウモロコシである。前記天然物に、脂質を溶解する溶媒（例えばクロロホルムとメタノールとの混合液をクロロホルム：メタノール＝２：１の混合比）で添加し、スフィンゴ脂質を含む総脂質を抽出する。抽出した総脂質中のグリセロ脂質を分解する。
【００２８】
溶媒（例えばメタノール）中に総脂質を溶解して、アルカリ（例えば水酸化カリウム）を加えて、アルカリの最終濃度０．２〜０．５Ｎの弱アルカリ性として、加熱（例えば３０〜４０℃、０．５〜２時間）加熱する。
【００２９】
アルカリ加水分解後、クロロホルムと水を加えて、クロロホルム層と水層が分離するようにする。例えば、２倍量のクロロホルムとその４割量の水を加えて、撹拌し、分離したクロロホルム層を回収する。
【００３０】
次に、クロロホルム層を水洗する。例えば、クロロホルム量の半量のメタノールと半量の水を加えて撹拌後、クロロホルム層を回収する。クロロホルム層にアルカリ安定性の脂質画分（粗スフィンゴ脂質画分）が含まれる。
【００３１】
租スフィンゴ脂質画分を、各種クロマログラフィーを用いて精製する。例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーやシリカゲルカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーを用いる。
【００３２】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、例えばガラスカラムにクロロホルムに懸濁したシリカゲルを充てんし、クロロホルムに溶解した租スフィンゴ脂質画分をカラムに供する。溶出液は、例えば、クロロホルム：メタノールの混合比を段階的にメタノールの比率を上げて溶出する。例えば、クロロホルム：メタノール＝９５：５、クロロホルム：メタノール＝９０：１０、クロロホルム：メタノール＝８０：２０、クロロホルム：メタノール＝７０：３０というように、段階的にメタノール比率の高い溶出液で溶出する。各溶出液は、カラム容量と等量から１．５倍量を用いる。
【００３３】
溶出液ごとに３〜５画分に分別して溶出液を採取する。クロロホルムとメタノールの混合比は、段階的に変えても連続的に変えてもかまわない。
【００３４】
画分の一部を、標品（スフィンゴミエリン、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、セラミド、コレステロール）と共に、薄層クロマトグラフィーに展開して画分の成分を調べる。スフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド）が含まれるフラクションを集めて、エバポレーターと窒素ガスで濃縮乾固したものを、スフィンゴ糖脂質画分とする。
【００３５】
スフィンゴ糖脂質（グリコシルセラミド）画分に含水メタノール性１Ｎ塩酸を加えて酸加水分解する。７５〜８５℃で１０〜２０時間、酸加水分解する。分解物をヘキサンで３、４回洗浄し、脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する。
【００３６】
残ったメタノール層に４Ｎ  ＫＯＨを加えてｐＨを９．７以上に調整し、およそ等量の水を加えた後、等量のジエチルエーテルで３回スフィンゴイド塩基を抽出する。採取したジエチルエーテルを等量の水で洗った後、窒素乾固して、スフィンゴイド塩基とする。
【００３７】
調製したスフィンゴイド塩基にメタノールと１／５量の０．２Ｍ過沃素酸水溶液を加え、暗所で１時間反応させる。その後、およそ等量のヘキサンで３回抽出し、集めたヘキサン層を等量の水で洗浄した後に、窒素ガスで濃縮する。
【００３８】
得られたアルデヒド誘導体溶液の一部をＧＣ−ＭＳに供する。ＧＣ−ＭＳ分析には例えば、ＧＣ−１７Ａ，ＱＰ５０５０Ａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（いずれも、Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いる。カラムは、ＤＢ−１（０．２５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３０ｍ，０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いる。カラム温度は、８０℃〜１６０℃（昇温２℃／ｍｉｎ）、１６０℃〜２００℃（昇温１℃／ｍｉｎ）、インターフェースとインジュクターの温度は２５０℃とする。
【００３９】
トウモロコシから調製したスフィンゴイド塩基の成分をＧＣ−ＭＳで構造解析した結果を、図２及び表１に示す。それらの主成分は、次の通りである。
【表１】
2013111823.tif 000010
【００４０】
【化８】
2013111823.tif 000011
【化９】
2013111823.tif 000012
【００４１】
化合物２及び化合物３の８位には、シス型とトランス型の両方が存在するところ、本調製サンプルには、シス型が多く含まれる。
【００４２】
ナマコから調製したスフィンゴイド塩基の成分をＧＣ−ＭＳで構造解析した結果を図３及び表２に示す。それらの主成分は次の通りである。
【表２】
2013111823.tif 000013
【００４３】
【化１０】
2013111823.tif 000014
【化１１】
2013111823.tif 000015
【化１２】
2013111823.tif 000016
【００４４】
化合物４、化合物５及び化合物６以外にも、炭素鎖が１７や１６のものなどの多種類のスフィンゴイド塩基が存在する。
【００４５】
ＧＬＰ−１分泌促進物質を含む機能性食品、あるいはＧＬＰ−１分泌促進物質を有効成分として含む医薬の用途としては、以下の用途がある。
【００４６】
ＧＬＰ−１の濃度増加にともなう対象疾患又は症状として、例えば、（１）膵臓β細胞からインスリン分泌を促進することによる糖尿病治療薬（２）膵臓β細胞の分化増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬。又はβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上；（３）胃酸分泌抑制による胃酸過多治療；（４）腸管運動抑制による下痢治療（５）神経の可塑性や生存を維持し、神経障害による疾患の治療；及び（６）食欲抑制による肥満予防治療、などが対象となる。ただし、対象疾患又は症状は、上記に限定されるものでなく、ＧＬＰ−１の濃度亢進による治療及び症状改善のすべてが対象となる。
【００４７】
本発明の組成物は、有効成分としてのスフィンゴイド塩基を含む抽出物以外に、薬理学上あるいは食品学上許容される担体や助剤を、本発明の効果を阻害しない範囲で添加することができる。そのような添加剤の例には、コーンスターチ、結晶セルロース、ラクトース等の賦形剤；澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；メチルセルロース又はその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン等の結合剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等の滑沢剤；キサンチン誘導体、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、果糖、ブドウ糖、ソルビトール等の甘味料、矯味剤、クエン酸等の酸味料、香料、着色剤、ビタミン類、ミネラル類、脂質等が挙げられる。
【００４８】
本発明の組成物の形状は、特に限定されず、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤が挙げられる。
【００４９】
本発明の組成物の用法は、特に制限がない。医薬では、経口と非経口（静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与等）のいずれでもよい。本発明の組成物の摂取時期は、食前及び食後のいずれでもよく、好ましくは食事前もしくは食事と同時に摂取する。
【００５０】
本発明の組成物の機能性食品としての摂取量は、摂取する対象の年齢、体重や既往症（例えば肥満症）によって変わり得る。
【００５１】
本発明の組成物の医薬品としての用量は、投与される患者の年齢、体重や既往症（例えば肥満症）によって変わり得る。
【００５２】
本発明は、また、上記組成物を含む食品を提供する。食品には、食品の中に本発明の組成物を添加しておくことで、腸管ホルモン、特にＧＬＰ−１の分泌を促進することができる。食品の例は、特に限定されず、例えば、サラダ、唐揚げ、豆腐、こんにゃく等の惣菜；スープ；パン、米飯及びヌードル；クッキー、マフィン、ケーキ、チップス、スナック、チョコレート、ゼリー、プリン、チューインガム、キャンディ等の菓子類；ヨーグルト、牛乳等の乳製品；ハム、ソーセージ、かまぼこ等の魚肉練り製品；コーヒー、ジュース、スポーツ飲料等の飲料；並びにドレッシング、醤油、ソース等の調味料等の一般加工食品が挙げられる。
【実施例】
【００５３】
〔実施例１〕トウモロコシ又はナマコからのスフィンゴイド塩基の調製
１）総脂質抽出
クロロホルム−メタノール（２：１）混液を用いたＦｏｌｃｈ法にて、乾燥トウモロコシ粉末又はナマコ粉末１００ｇから総脂質を抽出した。得られた総脂質にメタノール１００ｍLと４Ｎ  ＫＯＨ  １０ｍLを加え、３７℃で１時間インキュベーションしてグリセロ脂質を分解した。これにクロロホルム２００ｍLと水８０ｍLを加えて、分液漏斗で下層のクロロホルム層のみを集めた。集められたクロロホルム層にさらにメタノール１００ｍLと水９０ｍLを加えて水洗し、再び分液漏斗で下層を集めた。このクロロホルム層からアルカリ安定性の脂質画分（粗スフィンゴ脂質画分）を回収した。【００５４】
２）ケイ酸カラムクロマトグラフィーによるスフィンゴ糖脂質の精製
シリカゲル６０（０．０６３−０．２００ｍｍ  カラムクロマトグラフィー用、ＭＥＲＣＫ）４６ｇを、適量のクロロホルムに懸濁し、ガラス製カラム（直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）に充填した。弱アルカリ分解処理した上記の試料を、少量のクロロホルムに溶解してカラムに供した。溶出溶媒としてクロロホルム５０ｍL、クロロホルム−メタノール（９５：５）１００  ｍL、同（９０：１０）１００ｍL、同（８０：２０）１００ｍL、同（７０：３０）１００ｍL、及びメタノール１００ｍLをこの順番に用い、溶出した各フラクションを集めた。
クロロホルム５０ｍL・・・フラクション１
クロロホルム−メタノール（９５：５）１００ｍL・・・フラクション２，３
クロロホルム−メタノール（９０：１０）１００ｍL・・・フラクション４，５，６，７
クロロホルム−メタノール（８０：２０）１００ｍL・・・フラクション８，９，１０，１１
クロロホルム−メタノール（７０：３０）１００ｍL・・・フラクション１２，１３
メタノール１００ｍL・・・フラクション１４，１５【００５５】
３）スフィンゴ糖脂質の薄層クロマトグラフィー
シリカゲル薄層プレート（２５ＨＰＴＬＣ  Ｐｌａｔｅｓ  １０ｘ１０  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、ＭＥＲＣＫ）に標品とサンプルをスポットし、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝６４：１６：２）で展開した。次いで、硫酸銅発色試薬｛２ｍLのＨ２ＳＯ４、２０ｍLの３３％酢酸水溶液（６．６ｍL酢酸＋１３．４ｍL水）、２０ｍLのＨ３ＰＯ４、３６０ｍLの０．５％  ＣｕＳＯ４水溶液（１．８ｇＣｕＳＯ４＋３６０ｍL水）を混合して調製｝に前記プレートを浸し、ドライヤーで乾燥させた後、ホットプレートで加熱して発色させた。【００５６】
４）ケイ酸カラムクロマトグラフィーによるスフィンゴ糖脂質の精製
各フラクションを回収して、標品（スフィンゴミエリン、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、セラミド、コレステロール）と共にＴＬＣに供し、スフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド）が含まれるフラクション（フラクション１１〜１４）を合わせ、エバポレーターと窒素ガスで濃縮乾固したものを、スフィンゴ糖脂質画分とした。スフィンゴ糖脂質画分は、乾燥粉末に対しての回収率がトウモロコシで約０．０５％、ナマコで約０．５％であった。【００５７】
５）グルコシルセラミドの酸加水分解（スフィンゴイド塩基の調製）
トウモロコシ又はナマコ由来グルコシルセラミド４ｍｇに、１ｍLの含水メタノール性１Ｎ塩酸（濃塩酸４．３ｍLに水４．７ｍLを加え、メタノールで５０ｍLに希釈）を加え、ネジ口チューブ中で、８０℃で１６時間ブロックヒーターにて反応させた。室温に冷却した後、１ｍLのヘキサンで３回洗浄し、脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去した。残ったメタノール層に４Ｎ  ＫＯＨを２００μＬ加えｐＨを９．７以上に調整し、１ｍLの水を加えた後、１ｍLのジエチルエーテルで３回スフィンゴイド塩基を抽出した。採取した３ｍLのジエチルエーテルは等量の水で洗った後、窒素乾固したものの重量を測定し、１ｍｇ／ｍLの濃度になるようにクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）に溶解し、−３０℃で保存した。【００５８】
〔実施例２〕トウモロコシあるいはナマコから調製したスフィンゴイド塩基の構造の推定
実施例１により調製したスフィンゴイド塩基をＧＣ−ＭＳにより分析した。具体的には、酸加水分解によって得られたスフィンゴイド塩基溶液１００μＬを、ガラスチューブに移して窒素乾固し、メタノール１ｍLと０．２Ｍ過沃素酸水溶液（過沃素酸ナトリウム４２８．０ｍｇを水に溶かして１０ｍLにメスアップしたもの）２００μＬを加え、暗所で１時間反応させた。その後、１ｍLヘキサンで３回抽出し、集めたヘキサン層を３ｍLの水で洗浄した後、窒素ガスで濃縮した。得られたアルデヒド誘導体溶液１μＬをＧＣ−ＭＳに供した。【００５９】
ＧＣ−ＭＳ分析には、ＧＣ−１７Ａ、ＱＰ５０５０Ａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（いずれもＳｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いた。カラムはＣＰ−Ｓｉｌ  ８８（０．２５ｍｍ  ＩＤ×５０ｍ、０．２ｍｍ；Ｃｈｒｏｍｐａｋ、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。カラム温度は８０℃〜１６０℃（昇温２℃／ｍｉｎ）、１６０℃〜２００℃（昇温１℃／ｍｉｎ）、インターフェースとインジェクターの温度は２５０℃とした。トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基の測定結果を、図２及び表１に示した。ナマコ由来スフィンゴイド塩基の測定結果を、図３及び表２に示した。【００６０】
〔実施例３〕ＳＴＣ−１に対するＧＬＰ−１分泌促進活性の測定
下記のサンプルのＳＴＣ−１（腸管のホルモン分泌細胞の株化細胞：Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１３４９−１３６３（１９９０）参照）からのＧＬＰ−１分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ−１細胞を４×１０５細胞／ｍLの濃度で１ｍLずつ１２ウェルプレートに蒔いた。４８時間培養後、各サンプル（μｍｏｌ、ＤＭＳＯ溶液）を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６４２９））（５００μL）に溶解したものを添加した。１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ−１量をＥＬＩＳＡで測定した。【００６１】
使用したサンプルは、ＤＭＳＯ（コントロール）、αリノレン酸２０μＭ、スフィンゴシン１０μＭ、及び４０μＭ、ナマコ由来スフィンゴイド塩基１０及び４０μＭ、トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基１０及び４０μＭであった。濃度は、最終濃度である。ＥＬＩＳＡは、Ｒａｔ  ＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｗａｋｏ（和光純薬工業、２９−５９２０１）を用いた。図４に、各サンプルのＧＬＰ−１放出特性を示す。【００６２】
〔実施例４〕ＳＴＣ−１に対するＧＬＰ−１分泌促進活性の測定
下記サンプルのＳＴＣ−１（腸管のホルモン分泌細胞の株化細胞：Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１３４９−１３６３（１９９０）参照）からのＧＬＰ−１分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ−１細胞を４×１０５細胞／ｍLの濃度で１ｍLずつ１２ウェルプレートに蒔いた。４８時間培養後、各サンプル（μｍｏｌ、ＤＭＳＯ溶液）をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６４２９））（５００μL）に溶解したものを添加した。１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ−１量をＥＬＩＳＡで測定した。【００６３】
使用したサンプルは、ＤＭＳＯ（コントロール）、αリノレン酸１０μＭ、４０μＭ及び１００μＭ、スフィンゴシン４μＭ、１０μＭ及び４０μＭ、ナマコ由来スフィンゴイド塩基４基４０μＭ、１０μＭ及び４０μＭ、並びにトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基４μＭ、１０μＭ及び４０μＭである。濃度は最終濃度である。ＥＬＩＳＡは、Ｒａｔ  ＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｗａｋｏ（和光純薬工業、２９−５９２０１）を用いた。結果を図５に示す。【００６４】
実施例３及び実施例４の結果から、ＳＴＣ−１に対するＧＬＰ−１分泌促進活性に関して、スフィンゴシンがαリノレン酸と同程度であるのに対し、ナマコ由来スフィンゴイド塩基及びトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基がαリノレン酸より分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進能の高い活性を持つことがわかる。【００６５】
〔実施例５〕マウス投与試験
ＩＣＲマウス、オス８週齢を１８時間絶食後、グルコースを１．５ｍｇ／ｇ体重、経口投与した。直後に、以下のサンプル２７ｍｇ／ｇ体重を０．５％ＣＭＣに懸濁し、経口投与した。コントロールには、０．５％ＣＭＣ溶液のみを投与した。Ｎ数は３又は４とした。使用したサンプルは、αリノレン酸、スフィンゴシン、トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基、又はナマコ由来スフィンゴイド塩基である。【００６６】
サンプルの投与１時間後、門脈より採血し、血漿を得て、−８０℃で凍結保存した。保存血漿サンプルを融解後、ＧＬＰ−１量をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡとしては、Ｒａｔ  ＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｗａｋｏ（和光純薬工業、２９−５９２０１）を用いた。結果を図６に示す。有意差検定は、Ｓｃｈｅｆｆｅの多重検定を用いた。図中、＊印は、コントロールと比べて有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。【００６７】
スフィンゴシンの経口投与では、血漿ＧＬＰ−１濃度に関してコントロールと有意な差が得られなかった。一方、トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基及びナマコ由来スフィンゴイド塩基は、経口投与で腸管からのＧＬＰ−１分泌を有意に促進した。スフィンゴイド塩基のＧＬＰ−１分泌促進効果は、αリノレン酸とほぼ同程度かあるいはより強いことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のスフィンゴイド塩基を含む抽出物は、腸管ホルモン分泌促進を目的とする医薬や機能性食品の有効成分として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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