(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可撓性材料のトップシート（２；２２）及びボトムシート（３；２３）を含み、互いに接合されて２つのエンドエッジ（４）及び２つのサイドエッジ（５）を形成している細胞培養のための膨張可能なバイオリアクターバッグ（１）であって、１つのバッフル（６）又は複数のバッフル（６）が、２つのエンドエッジ（４）のいずれか１つまでの最短距離が２つのエンドエッジ間の最短距離の約四分の一より大きい領域でボトムシートから伸延していて、少なくとも１つのバッフル（６）が管状であって、管状バッフルが、バッフル１つに付き１つの細胞懸濁液ディフューザーを介してボトムシートに、かつバッフル１つに付き１つの入口／出口ポートを介してトップシートに接合されている、膨張可能なバイオリアクターバッグ。
【請求項２】
バッフル（６）がボトムシート（３；２３）及びトップシート（２；２２）に接合されている、請求項１記載の膨張可能なバイオリアクターバッグ。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞懸濁液ディフューザー（１０；２０；３０）が、ボトムリング（２４；３４）又はプレート、ボトムリング又はプレートをチューブコネクター（２７；３７）に結合する複数のストラット（２５；３５）、及びストラット間の複数の開口（２６；３６）を含む、請求項１又は請求項２記載の膨張可能なバイオリアクターバッグ。
【請求項４】
トップシートの少なくとも１つのポート（４２；５２）が、さらに、バッグ（４１；５１）の外部で少なくとも１つの細胞分離装置に接続されている、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の膨張可能なバイオリアクターバッグ（４１；５１）。
【請求項５】
細胞分離装置が、保持液側及び透過液側を有するミクロフィルター又はウルトラフィルターである、請求項４記載の膨張可能なバイオリアクターバッグ（４１；５１）。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の膨張可能なバイオリアクターバッグ（１）が、エンドエッジ（４）とほぼ平行な可動軸（７）の回りでベース（９）に対して旋回可能に載置された支持体（８）上に載置されているバイオリアクター。
【請求項７】
ａ）ポリマー材料のトップシート及びボトムシートからなり、互いに接合されて２つのエンドエッジ（４）及び２つのサイドエッジ（５）を形成する膨張可能なバイオリアクターバッグであって、１つのバッフル（６）又は複数のバッフル（６）が、２つのエンドエッジのいずれか１つまでの最短距離が２つのエンドエッジ間の距離の約四分の一より大きい領域でボトムシートから伸延する、膨張可能なバイオリアクターバッグを提供するステップと、
ｂ）エンドエッジとほぼ平行な可動軸の回りでベースに対して旋回可能に載置された支持体上にバイオリアクターバッグを載置するステップと、
ｃ）細胞培養培地及び細胞接種材料をバッグに供給するステップと、
ｄ）可動軸を中心にして支持体を揺動し、トップシート内のポートを介して少なくとも１つのガスを供給することにより提供される攪拌下でバッグ内の細胞を培養して細胞懸濁液を形成するステップと
を含む、細胞培養方法であって、少なくとも１つのバッフルが管状であり、細胞懸濁液ディフューザーを介してボトムシートに、かつ入口／出口ポートを介してトップシートに結合されている、方法。
【請求項８】
当該方法が、さらに、ｂ’）トップシートの入口／出口ポートを少なくとも１つの細胞分離装置及びポンプに接続するステップ、及びｄ）細胞懸濁液ディフューザー及び管状バッフルを介して細胞分離装置に細胞懸濁液を循環させるステップを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞分離装置がミクロフィルターであって、標的生体分子をステップｄ）で透過液として回収し、保持液をバッグに再循環するか、或いはフィルターがウルトラフィルターであって、ステップｄ）で標的生体分子が保持液内に留まり、これをバッグに再循環する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
培養をバッチ又はフェドバッチモードで行い、培養の終了時細胞懸濁液を細胞懸濁液ディフューザー、管状バッフル及び出口ポートを介して、さらに細胞分離装置を介してバッグから抜き出す、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養のための可撓性バッグに関し、より特定的には、揺動することにより攪拌下で培養するための膨張可能な可撓性バッグに関する。本発明はまた、可撓性バッグ内で細胞を培養する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセシング産業は伝統的に発酵及び細胞培養のための製造工程でステンレス鋼のシステム及び配管を使用している。これらのデバイスは蒸気滅菌し再使用するように設計される。しかし、洗浄及び消毒は費用と労力を要する作業である。また、必要な配管と付属設備を有するこれらの伝統的なシステムの据え付け後コストは法外であることが多い。さらにそのうえ、これらのシステムは通例特定のプロセス用に設計されており、新しい用途のために容易に再構成することができない。これらの制限のため、最近十年間では新しい手法が採用されるようになっており、通常のステンレス鋼タンクに代わってプラスチックの一回使用で使い捨てされるバッグ及び配管材料が使用されるようになった。
【０００３】
特に、伝統的にステンレス鋼から作成されるバイオリアクターは、多くの用途で、細胞培養のために必要とされる必要な通気と混合を提供するために揺動される使い捨てのバッグによって置き換えられている。これら一回使用のバッグは通例無菌で提供され、費用と時間がかかる洗浄及び滅菌工程が省かれる。これらのバッグは作業中無菌の環境を維持することにより汚染のリスクを最小にするように設計されている。
【０００４】
一般に使用されているバッグは「ピロースタイル」とされる。これは、主として、プラスチックの２枚の可撓性シートを互いに継ぎ合わせることによって低コストで製造することができるからである。さらなるシートを使用して壁構造体を作成し得る三次元バッグも記載されている。
【０００５】
成功した使い捨て式バイオリアクターシステムの１つは、バイオリアクターバッグが配置される揺動テーブルを使用する。バイオリアクターバッグには部分的に液体栄養培地と所望の細胞が充填されている。テーブルはバッグを揺り動かして、バッグ内の細胞の一定の動きを提供し、また掻き乱される空気−液体表面からの効率的なガス交換も提供する。バッグは、通例、空気、二酸化炭素、窒素又は酸素の導入のための少なくとも１つのガス供給管、及び呼吸ガスの除去を可能にする少なくとも１つの排気管を有する。栄養は他の管を介して加えることができる。
【０００６】
細胞を高密度に培養する場合、曝気が細胞に供給するのに充分でない可能性がある。混合を改良するために縁に沿ってバッフルを設けたバッグが米国特許出願公開第２０１０／０２０３６２４号及び米国特許第７１９５３９４号に記載されているが、目下のところ目的とする細胞密度に達するには充分でない。従って、揺動テーブルバイオリアクターにおける改良された通気が必要とされている。
【０００７】
伝統的に、細胞培養はバッチモードで行われている。バッチ式操作においては、バイオリアクターに培地と小量の細胞を蒔き、さらに栄養分を供給することなく細胞を高密度になるまで増殖させる。やがて細胞は栄養分の欠如又は毒性の代謝産物の蓄積のために死ぬ。これによって、収穫を行う時点が最終的に決定される。この方法には幾つかの欠点がある。まず、必須の栄養分が枯渇し、そのため最終細胞密度が低くなり、結果として産物収量が低くなり得る。次に、毒性の代謝副産物の蓄積のために可能な組換えタンパク質産物の生成と質が損なわれることが多い。
【０００８】
操作の代わりのモードはフェドバッチ式である。基礎培地で培養を開始し、ある時点で、他の場合には限定されるようになり得る特定の栄養の補充給餌を開始する。これらの栄養分は別々に、又はまとめて加えることができ、また連続的又はバッチ式に追加することができる。この方策は早期の栄養分枯渇を相殺し、培養時間を延長し、最大の細胞密度を増大することにより、例えば細胞により産生される組換えタンパク質の高収量の可能性を増やす意味がある。しかし、一般にフェドバッチ方策は毒性の代謝産物の蓄積を妨げることはなく、その結果培養中に条件が変化することになる。これらの変化は、例えばあまり有利でないグリコシル化パターンの点で産物の品質に悪影響を与え得る。
【０００９】
長い間、灌流培養は、幾つかのプロセスで経済性がより良好であることが認められている。この操作で、細胞はバイオリアクター内に留まり、毒性の代謝副産物は連続的に除かれる。栄養分を含有する給餌が絶えず加えられる。この操作は高い細胞密度を達成することができ、より重要なことに、細胞を数週〜数か月の間高い生産状態に維持することができる。これで、ずっと高い収量が達成され、必要なバイオリアクターの大きさが低減される。また、初代又はその他の成長の遅い細胞を培養するのにも有用な技術である。灌流操作は、ヒト細胞及び遺伝子療法用途に必要とされる大量の細胞を増殖させるのに大きな可能性がある。細胞のみでなく産物をもバイオリアクター容器内に保持するための方策を伴った新しい灌流プロセスが最近記載され、バイオプロセス社会で一定の関心がもたれている。このプロセスでは、低いカットオフの細孔径を有する中空糸フィルターを用いて、細胞及び標的タンパク質、例えば抗体のような高分子の粒子を低分子の廃棄物から分離する。高分子の粒子は保持液(retentate)内、従ってリアクター内に残り、低分子量のものは連続的に除去される。この方策によって、高い細胞密度のみでなく非常に高い産物濃度もリアクター容器内で得られる。
【００１０】
灌流培養におけるもう１つの最近の進展は米国特許第６５４４４２４号に記載されている交互接線流（ＡＴＦ）法である。
【００１１】
膨張可能なバッグ内での灌流培養が米国特許出願公開第２０１１／００２０９２２号及び米国特許第６５４４７８８号に記載されており、配管を介してろ液を除去するためにフィルターをバッグの内部に設けることを検討している。この配置ではフィルターの構築に厳しい制約が課され、またフィルターの目詰まりのリスクが大きい。さらに、フィルターが詰まると、培養物全体を新しい膨張可能なバッグに移さなければならない。従って、可撓性バッグ灌流培養に使用するための改良された構築物が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７６２９１６７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの態様は、高密度細胞培養に適した膨張可能なバイオリアクターバッグを提供することである。これは、請求項１に定義されているバッグによって達成される。この構成の１つの利点は、バッフルが改良された混合及び曝気を提供し、これが高い生存細胞密度における長期の培養を可能にすることである。
【００１４】
本発明の別の態様は、膨張可能なバッグ内で効率的な細胞培養を可能にすることである。これは、請求項１４に定義されている方法によって達成される。
【００１５】
本発明のさらなる適切な実施形態は従属請求項に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明によるバッフルを有する膨張可能なバイオリアクターバッグを示す（平面図及び側面図）。
【図２】図２は、本発明による代わりのバッフル配置を有するバッグを示す（平面図）。
【図３】図３は、旋回可能な支持体上に搭載された本発明によるバッグを示す（側面図及び平面図）。
【図４】図４は、旋回可能な支持体上に搭載された本発明によるバッグを示す（側面図及び平面図）。
【図５】図５は、本発明によるバッグのトップシート及びボトムシートを示す。
【図６】図６は、本発明による細胞懸濁液ディフューザーを示す。
【図７】図７は、本発明による細胞懸濁液ディフューザーを示す。
【図８】図８は、本発明によるＡＴＦ灌流培養のためのセットアップ構成を示す。
【図９】図９は、本発明によるＴＦＦ灌流培養のためのセットアップ構成を示す。
【図１０】図１０は、ＴＦＦシステム（Ａ）及びＡＴＦシステム（Ｂ）を用いて本発明に従って培養されたＣＨＯ細胞による組換えＩｇＧ産生の動態を示す。
【図１１】図１１は、ＴＦＦシステム（Ａ）を用いた本発明による２９日間の灌流プロセス及びＡＴＦシステム（Ｂ）を用いた本発明による２７日間の灌流プロセスにおける細胞密度、生存率及び灌流速度を示す。
【図１２】図１２は、ＴＦＦ灌流培養を総計４９日間続けたときの図１０Ａと同じデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
用語「灌流」は、本明細書で使用する場合、細胞培地が連続的に交換されながら細胞がバイオリアクター容器内に留まる細胞培養モードを意味する。細胞培地の交換は、例えばフィルターを通して行うことができ、これは、抑制性又は毒性の低分子廃棄物を除去することができ、かつ栄養分を連続的に加えることができることを意味する。フィルターはミクロ（精密）フィルターであることができ、この場合細胞により発現された標的タンパク質は透過液中に回収することができる。また、ウルトラ（限外）フィルターであることもでき、発現されたタンパク質は細胞懸濁液中に留まることが可能であるため、バッチ式収穫作業で回収することができる。
【００１８】
用語「バッフル」は、本明細書で使用する場合、膨張可能なバイオリアクターバッグ内に配置され、バッグの揺動中にバッグの内部の流体の流れを掻き乱すことができる物体を意味する。
【００１９】
用語「ポート」は、本明細書で使用する場合、材料をバッグに出し入れする輸送のため、又はトランスデューサーの搭載のために適合させた、膨張可能なバッグ内の開口を意味する。ポートは管継ぎ手を備えていることが多い。
【００２０】
実施形態の詳細な説明
図１〜５に図示されている１つの態様において本発明は細胞培養用の膨張可能なバイオリアクターバッグ１を開示し、このバッグは可撓性材料のトップシート２とボトムシート３を含んでおり、これらのシートは互いに接合されて２つのエンドエッジ（端辺）４と２つのサイドエッジ（側辺）５を形成しており、ここで、１つのバッフル６又は複数のバッフル６が、ボトムシート３の、２つのエンドエッジ４のいずれか１つ（すなわち最近接エンドエッジ）までの最短距離が２つのエンドエッジ４間の最短距離Ｄの約四分の一より大きい領域でボトムシート３から伸延している。バッグは一般に長方形であり得、その場合エンドエッジ４のいずれか１つ（最近接エッジ）までの最短距離はボトムシート３のいずれの点でもＤ／２を超えることはない。従って、バッフル６は、エンドエッジ４までの最短距離がエンドエッジ４間の最短距離Ｄの約四分の一〜二分の一、すなわちＤ／４〜Ｄ／２である領域でボトムシート３から伸延し得る。幾つかの実施形態においてエンドエッジまでの距離はＤ／３〜Ｄ／２であり得る。さらに、約Ｄ／２であることもでき、この場合バッフル６はバッグの中央に位置することになる。図３及び４に図示されているように、バッグ１は、エンドエッジ４に対してほぼ平行な可動軸７の回りで旋回可能にベース９に対して据え付けられ得る。可動軸７はバッグ１の下に位置し得、バッグは支持体８上に載置され得、例えば各エッジ４からボトムシート３上の可動軸７の投影までの距離はおよそＤ／２である。可動軸上に据え付けられる適切な旋回可能な支持体は例えばＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であることができる。トップシート２及びボトムシート３の可撓性材料は、厚さが例えば５０〜５００μｍの範囲であるプラスチックフィルム又はラミネートのようなポリマー性材料であり得る。ラミネートは、１以上のポリマー性材料に加えて、例えばポリマー又は無機酸化物又は金属であり得るバリヤ層を含んでいてもよい。トップシート２は特にバッグの内部が確実に目に見えるように透明であることができる。トップシート２とボトムシート３はバッグの使用中の位置に関して規定される。すなわち、使用中、トップシート２はボトムシート３の上方に位置する。トップシートとボトムシートはまた、ポート１１；Ｐ１〜Ｐ１０；４２；５２が好ましくはトップシート２上に配置されて、ボトムシート３の滑らかな外面が得られ、支持体８上に載ったままでいるのに適切であるようになっているという点でも区別され得る。サイドエッジ５はエンドエッジ４より長くてよい。
【００２１】
バッフル６の中央配置の利点は、バッグが部分的に細胞懸濁液で充填され、膨張し、軸７を中心にして揺動されるとき、本質的に全ての細胞懸濁液が繰り返しバッフルを通過するということである。これにより、攪拌強度が増大し、空気−液体界面でのガス交換が改良され、一方攪拌は繊細な細胞に損傷を与えないように十分穏やかなままである。
【００２２】
幾つかの実施形態において、バッフル６はボトムシート３とトップシート２の両方に接合される。これの１つの利点は、バッフル６の安定性が改良されることである。
【００２３】
図１〜４に示した幾つかの実施形態において、バッフル６は一般に円柱形であり、例えば円形又はほぼ楕円形の断面を有する。断面の形状は円、楕円、尖った楕円(pointed ellipse)、翼形(hydrofoil, airfoil)又は細長い滴形等でよいが、角のある、例えば平行四辺形、多角形等であることもできる。ほぼ円柱形の幾何学的形状の１つの利点は、攪拌強度の適切な増大が得られることである。別の利点は、バッフルが例えば押出棒又は配管材料から容易に製造することができることである。
【００２４】
図２〜４に示した幾つかの実施形態において、少なくとも１つのバッフル６、例えば２つのバッフルが管状である。この１つの利点は、バッフルが、使用前のつぶしたバッグの容易な包装及び貯蔵を可能にするのに十分に可撓性であるが、バッグの作動中流体力に耐えるのに十分な剛性をもつようにすることができるということである。別の利点は、この管状構造により、バッグに出し入れするためにバッフルを通した材料の輸送が可能になることである。管状バッフルは、例えば、バッグの包装時その構造体をつぶすことができるが、バッグが充填され及び／又は膨張したとき開いた管状形状を完全に回復するのに十分に弾力性であるエラストマー性材料から製造することができる。エラストマー性材料は、例えば架橋シリコーンゴム又はその他の加硫ゴム材料であることができる。厚い壁及び／又は高い剛性を有する配管材料を使用する場合、管状バッフルは、バッグの膨張前及び膨張中バッグのトップシートとボトムシートを分離した状態に保つ柱として機能し得る。
【００２５】
図４、５及び６に示したある種の実施形態において、管状バッフル６；３１は、細胞懸濁液ディフューザー１０；２０；３０、例えばバッフル６；３１の１つにつき１つの細胞懸濁液ディフューザーを介してボトムシート３；２３に、また入口／出口ポート１１；Ｐ９；Ｐ１０、例えばバッフル１つにつき１つの入口／出口ポートを介してトップシート２；２２に接合することができる。細胞懸濁液ディフューザー１０；２０；３０は、バッグから管状バッフルの内腔への、又は内腔からバッグ内への細胞懸濁液（通例増殖培地に懸濁された細胞）の輸送を可能にする構造体であることができる。細胞による目詰まりのリスクなしにこれを達成するために、細胞懸濁液ディフューザーは、細胞より数桁大きい、例えば約１又は２ｍｍより小さい寸法のない開口２６；３６を有することができる。この細胞懸濁液ディフューザー−管状バッフルアセンブリは、邪魔する構造体なしにディフューザー及びバッフルを通る細胞懸濁液のための開いた流路を提供するように設計することができる。管状バッフル６；３１は、これらの実施形態において、浸漬管ということもできる。トップシートの入口／出口ポート１１；Ｐ９；Ｐ１０は、内側に管状バッフル（浸漬管）を、また外側に配管を取り付けることができるように内側と外側の両方に管継ぎ手を含み得る。また、外側には、ポートに一体化されるか又は配管を介して取り付けられる無菌のコネクターも含み得る。無菌コネクターの例には、例えば、無菌流路を含む完全なアセンブリを作成するために通常の周囲条件下でバッグ、配管、センサー、ポンプヘッド（揚程）、バルブ、フィルター（例えば中空糸フィルター）等のような内部が無菌の流路構成部分の接続を可能にするＲｅａｄｙＭａｔｅ（商標）コネクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がある。或いは、これらの構成部分は例えば、Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔｕｂｅ  Ｆｕｓｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて熱可塑性の配管材料の無菌溶接によって接続し得る。
【００２６】
幾つかの実施形態において、バッグは無菌のコネクターを備えており、放射線を照射される。全てのポートは、微生物がバッグ内に侵入することができないようにクロージャー、無菌コネクター又は無菌ろ過グレードフィルターを備えることができる。その際、バッグは、バッグアセンブリの生物汚染度に応じて無菌状態を確保する線量を用いてガンマ線、電子ビーム又は高エネルギーＸ線のような電離放射線で照射することができる。線量は例えば１０〜５０ｋＧｙのように１０ｋＧｙより高くすることができる。バッグ、バッフル、ポート、コネクター及びフィルターは放射線耐性材料、例えばエチレン（コ）ポリマー、シリコーン、スチレン（コ）ポリマー、ポリスルホン等から有利に構築することができる。
【００２７】
ある種の実施形態において、少なくとも１つ、例えば各々のバッフルがほぼＳ字形のような湾曲した形状を有する。この１つの利点は、Ｓ字形のバッフルが、細胞懸濁液と接触するバッフルの長さが直線状のバッフルと比べてより長いという点で、より効率的に攪拌を強化することである。別の利点は、管状バッフル（浸漬管）を細胞懸濁液ディフューザー及びポートと接続するとき、ディフューザーとポートを互いに独立して配置することができる一方で、ディフューザーとポートをボトムシート及びトップシートに対して垂直に保つことができるということである。もう１つ別の利点は、Ｓ字形のバッフル形状は、直線状のバッフルを含むバッグと比較してバッグの製造、包装及び輸送が容易になることである。形状は、バッフルの長さ軸に対してほぼ平行な平面内で湾曲していることができる。バッフルは、この平面がバッグのエンドエッジ４とほぼ平行になるように設置し得る。この設定により、攪拌は特に十分に強化される。湾曲した形状の管状バッフル（浸漬管）は、例えば架橋シリコーンのようなエラストマーの成形によって製造することができる。
【００２８】
図５〜７に示した幾つかの実施形態において、少なくとも１つ、例えば各々の細胞懸濁液ディフューザー２０；３０は、ボトムリング２４；３４又はプレート３８、ボトムリング又はプレートをチューブコネクター２７；３７に結合する複数のストラット２５；３５、並びにストラット間の複数の開口２６；３６を含んでいる。開口の数は例えば２、３又は４であることができる。ボトムリング２４；３４又はプレート３８は、例えば溶接又は接着剤接合によりディフューザーをボトムシート３；２３に結合するのに使用することができ、ボトムシート３；２３に面して本質的に平らな面を有することができる。ストラット２５；３５は耐荷重性であり、作動中の流体力によって生じる荷重並びにバッグの包装及び取扱い中に課される力を吸収できる寸法であるべきである。上で述べたように、開口２６；３６は長さと幅が両方とも約１又は２ｍｍより大きく、例えばディフューザーの大きさに応じて長さ５〜２５ｍｍ、幅２．５〜１０ｍｍであることができる。細胞懸濁液ディフューザー２０；３０の全体の形状はほぼ円錐台でよく、円錐台の頂部に円柱形のチューブコネクター２７；３７を有し得る。チューブコネクター２７；３７は継ぎ手を管状バッフル（浸漬管）に固定できるように１以上のあご３９を含み得る。この場合バッフル／浸漬管はさらにケーブルタイのようなつなぎ材で固定することもできる。また、ディフューザー２０；３０の内部のキャビティもほぼ円錐台形であって細胞懸濁液の滑らかな流路を提供し得る。この開示されたディフューザー設計の１つの利点は、スムーズな細胞懸濁液の流れを可能にしつつ機械的に安定なことである。別の利点は、ボトムシート３；２３に容易に接合されることである。さらに１つの利点は、開口２６；３６がボトムシートに近接していることであり、特にディフューザーが、ボトムシート３；２３上で旋回軸７の投影の近く、例えば２つのエンドエッジ４のいずれかまでの最短距離が２つのエンドエッジ４間の最短距離Ｄの約四分の一又は三分の一より大きい領域に配置された場合、バッグの揺動中に空気の泡が管状バッフル（浸漬管）に入る傾向が低下する。
【００２９】
図８及び９に示したある種の実施形態において、トップシート上の少なくとも１つのポート４２；５２はさらに、バッグ４１；５１外側の少なくとも１つのフィルター４３；５３及び／又は少なくとも１つの重力デバイスのような１つ（又は少なくとも１つ）の細胞分離装置に接続される。細胞分離装置は、細胞懸濁液を細胞富化部分と細胞枯渇部分に分離することができるいかなるデバイスでもよく、フィルター、又は例えば重力沈降タンク、遠心分離機若しくはハイドロサイクロンのような重力デバイスであることができる。細胞分離装置を接続する１つの利点は、そのバッグを細胞の灌流培養に使用することができることである。
【００３０】
図８及び９に示した幾つかの実施形態において、フィルター４３；５３はミクロフィルター（通例細孔径が０．１〜１０μｍ）又はウルトラフィルター（通例分子量カットオフが１〜１０００ｋＤａ）であり、保持液側と透過液側がある。かかるフィルターは多くのフォーマット、例えば中空糸カートリッジ、フラットシートカセット、スパイラルモジュール、プリーツフィルター、スピンフィルター等を有することができる。ミクロフィルターは細胞を保持液側に保持する一方で、懸濁液の全て又は殆ど全ての溶解した構成部分を透過液側に通過させる。これは、細胞により発現されたタンパク質のような標的種を透過液から連続的に回収することができるという利点を有する。ウルトラフィルターは細胞を保持し、分子量カットオフは、高分子の標的種も保持液内に保持され、一方小さい分子である毒性又は細胞抑制性代謝産物は透過液に通過させ、連続的に除去することができるように選択することができる。これの１つの利点は、効率的な細胞培養を達成することができ、その後１つの明確に定義されたバッチで標的種を回収することができることである。
【００３１】
図８に示したある種の実施形態において、細胞分離装置はさらに空気作動式膜ポンプ（例えば、Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡから入手可能）のような往復ポンプ４４に接続される。かかる構成はＡＴＦ（交互接線流）と称される灌流培養法に使用することができ、この場合、ポンプは外方ストロークで、細胞分離装置、例えば中空糸カートリッジのようなフィルター４３を通して細胞懸濁液をポンプチャンバー内に引き出す。そこで細胞枯渇部分、例えば透過液が作り出され、ポンプの内方ストロークの際細胞懸濁液は、細胞富化懸濁液が管状バッフル（浸漬管）及び細胞懸濁液ディフューザーを介してバッグ４１に戻される前に、再び細胞分離装置を通過する。
【００３２】
図９に示した幾つかの実施形態において、トップシートの２つのポート５２が、ポンプ５４を介して細胞分離装置の保持液側に接続されて保持液ループを形成している。この場合、細胞懸濁液は１つの細胞懸濁液ディフューザー及び１つの管状バッフル（浸漬管）を介して第１のポートから細胞分離装置の保持液側を通して引き出され、トップシートの第２のポートを介してバッグ５１に戻される。第２のポートは管状バッフル（浸漬管）及び細胞懸濁液ディフューザーに取り付けてもよいが、戻り送達の細胞懸濁液は必ずしもディフューザーを必要としないので、バッグ内部にある配管の一部のみに取り付けてもよい。これらの実施形態は例えば接線流ろ過（ＴＦＦ）による灌流培養に適している。この場合、細胞分離装置は中空糸カートリッジ、フラットシートカセット又はスパイラルモジュールのようなフィルター５３であり、細胞懸濁液がフィルターの保持液側を通過するとき、細胞枯渇部分を透過液として回収することができる。第２のポンプ５５はフィルターから透過液を抜き出すために使用され得る。
【００３３】
図３、４及び１０に示されている１つの態様において、本発明は、
ａ）互いに接合されて２つのエンドエッジ４と２つのサイドエッジ５を形成している可撓性材料のトップシート２とボトムシート３からなる膨張可能なバイオリアクターバッグを準備するステップ、ここで、２つのエンドエッジ４のいずれか（最も近いもの）までの最短距離が２つのエンドエッジ４間の距離の約四分の一より大きい領域で１つのバッフル６又は複数のバッフル６がボトムシートから伸延している、
ｂ）エンドエッジ４にほぼ平行な可動軸７の回りでベース９に旋回可能に載置された支持体８上にバイオリアクターバッグを載置するステップ、
ｃ）細胞培養培地及び細胞接種材料をバッグ１に提供するステップ、
ｄ）可動軸７の回りで支持体８を揺動することで提供される攪拌の下でバッグ１内の細胞を培養し、細胞懸濁液を形成し、トップシート２のポートを介して少なくとも１つのガスを供給するステップ
を含む、細胞培養の方法を開示する。
【００３４】
この方法の１つの利点は、中央に配置されたバッフルの存在により、細胞懸濁液に出入りする効率的なガス輸送が得られ、良好な細胞培養条件と高い生存細胞密度に達する可能性が得られることである。この方法は上記バッグの実施形態のいずれかを使用して実施し得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、培養中の細胞はタンパク質のような標的生体分子を発現する。標的生体分子はタンパク質、例えばモノクローナル抗体であることができるが、また例えばワクチンとして、若しくは遺伝子療法において使用される核酸、例えばプラスミド、又はウィルス粒子であることもできる。細胞は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＭＤＣＫ細胞であることができるが、例えば昆虫細胞、細菌細胞、例えばＥ  Ｃｏｌｉ、又は真菌細胞、例えばＰ  Ｐａｓｔｏｒｉｓであることもできる。細胞は懸濁液中で自由に増殖することができるが、ミクロキャリア、例えばＣｙｔｏｄｅｘ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような支持粒子上で増殖することもできる。
【００３６】
図４〜９に示されている幾つかの実施形態において、少なくとも１つのバッフル６；３１は管状であり、細胞懸濁液ディフューザー１０；２０；３０を介してボトムシート３；２３に、また入口／出口ポート１１；Ｐ９，Ｐ１０を介してトップシート２；２２に接合されており、方法はさらに、トップシートの入口／出口ポート４２；５２をフィルター４３；５３のような少なくとも１つの細胞分離装置、及びポンプ４４；５４に接続するステップｂ’）、並びに細胞懸濁液ディフューザー及び管状バッフルを介して細胞懸濁液を細胞分離装置又はフィルターに循環させるステップｄ）を含んでいる。１つの利点は、外部の細胞分離装置を用いて効率的な灌流培養を実施することが可能なことである。また、この方法は、培養中、例えば培養中のバイオマス低減のため、又は宿主細胞のウィルス感染に関する減容のために、細胞密度を操作することが望まれるときはいつでも、使用することが可能である。管状バッフルはこれらの実施形態において浸漬管ともいうことができる。
【００３７】
幾つかの実施形態において、フィルター４３；５３はミクロフィルターであり、標的生体分子はステップｄ）で透過液として回収され、一方細胞に富む保持液はバッグ４１；５１に再循環される。その１つの利点は、標的生体分子の連続的な回収を達成することができることである。
【００３８】
幾つかの実施形態において、フィルター４３；５３はウルトラフィルターであり、ステップｄ）で標的生体分子は細胞に富む保持液中に留まり、この保持液がバッグ４１；５１に再循環される。その利点は、標的生体分子を明確に定義されたバッチで回収することができることである。
【００３９】
幾つかの実施形態において、細胞懸濁液は、ステップｄ）で、往復ポンプ４４の外方ストロークによりフィルター４３の保持液側を越えて送られ、次に往復ポンプの内方ストロークにより保持液側を越えて細胞懸濁液ディフューザーを介してバッグ４１内に戻される。往復ポンプ４４は、空気作動式膜ポンプであり得、中空糸カートリッジであってもよいフィルターに直接据え付けられ得る。
【００４０】
幾つかの実施形態において、細胞懸濁液は、ステップｅ）で、ポンプにより、フィルター５３の保持液側を越えてループ内でトップシートのポート５２を介して、例えば第２の管状バッフル（浸漬管）及び第２の細胞懸濁液ディフューザーを介してバッグ５１に戻される。ポンプ５４は例えば蠕動ポンプ、膜ポンプ又は遠心ポンプであり得、またフィルター５３から透過液を抜き出すために第２のポンプ５５を加えることも可能である。
【００４１】
幾つかの実施形態において、生存細胞の密度は少なくとも４０又は少なくとも１５０ＭＶＣ／ｍＬ（百万生存細胞／ｍＬ）、例えば４０〜２１０ＭＶＣ／ｍＬ又は１００〜２１０ＭＶＣ／ｍＬである。本発明の方法を用いると、驚くほど高い生存細胞密度で細胞培養を行うことが可能である。
【００４２】
幾つかの実施形態において、バッグの容積は少なくとも２００ｍＬ、例えば２００ｍＬ〜５００Ｌである。バッグ内の細胞懸濁液の容積はバッグ容積の少なくとも４０％、例えば４０〜５０％であり得る。その１つの利点は、懸濁液の容積が比較的大きければ細胞懸濁液ディフューザー内への空気の巻き込みがさらに減ることである。揺動速度は例えば２０〜３０揺動／分（ｒｐｍ）であることができ、揺動角度は例えば６〜８度であることができる。
【００４３】
幾つかの実施形態において、培養はバッチ式又はフェドバッチ式に行われ、培養期間の終了時細胞懸濁液はバッグから細胞懸濁液ディフューザー、管状バッフル（浸漬管）及び出口ポートを介して、さらに細胞分離装置、例えばフィルターを介して抜き出され、標的生体分子を含む細胞枯渇部分、ろ液又は透過液を回収することができる。フィルターは直交流／接線流フィルター、例えば中空糸カートリッジ、フラットシートカセット若しくはスパイラルモジュール、又は通常流フィルター、例えばプリーツフィルター若しくはデプスフィルターであることができる。このように開示されたバッグを直交流フィルターと共に使用する１つの利点は、バッグ自体をフィルターの保持液ループのためのリザーバーとして使用することができ、他の容器に移す必要がないことである。バッグの底部から細胞懸濁液を抜き出すため、全ての細胞懸濁液をバッグから取り出すことも容易であり、これは、懸濁液で満たされたとき取り扱いが非常に難しい大きいバッグからの標的生体分子の通常流ろ過回収時に特に重要である。
【実施例】
【００４４】
細胞株
ＩｇＧを産生するＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株を全ての実験で使用した。振盪フラスコによる拡大培養中、メトトレキセート選択圧を実施した。
【００４５】
細胞培養培地及び添加物
細胞は、４〜５ｍＭのグルタミンを補充したＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ  ＸＰ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させた。この培地は、ＴＦＦシステムを用いた第１の培養の前半部分では４５ｍＭのグルコースを含有していた。この培養の後半部分及びＴＦＦシステムを用いた第２の培養、並びにＡＴＦシステムを用いた培養では、グルコースの初期濃度は前より低く、２０〜２５ｍＭに近かった。さらに、後者の培養では、３％のＩＳ  ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ−ＣＤ  ＸＰサプリメント（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｒｅｆ．９１１２２）を培地に加えた。３％のフィードサプリメント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｒｅｆ．Ｃ１６１５）を補充したＨｙｃｌｏｎｅ培地ＰＦ−ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ｒｅｆ．ＳＨ３０３５９．０２）も使用した。主要な炭素及びエネルギー源、すなわちグルコース及びグルタミンの初期濃度はそれぞれ約２０〜２５ｍＭ及び４ｍＭであった。培養培地はさらに２種の抗生物質（ストレプトマイシン及びペニシリンＧ）及び１種の抗真菌剤（アムホテリシン）を含有する抗生物質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した。ＩＳ培地は粉末として提供され、培地の再構成が必要であった。ｐＨ及びオスモル濃度はそれぞれ７（±０．１）及び３００〜３３０ｍＭに調節した。その後、培地を０．２μｍ膜（ＵＬＴＡ−ＸＸ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でろ過した。管状バッフル／浸漬管内の泡の出現に応じてブースト添加によりＭｅｄｉｃａｌ  Ａｎｔｉ−ｆｏａｍ  Ｃ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｃａｔ．１８１１０７０−０７０５）をリアクター内５０ｐｐｍの濃度まで加えた。グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ．Ｇ６１５２）又はグルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．９６７００）のバッチ式補充は細胞の必要性に応じて実施した。
【００４６】
細胞培養
バイオリアクターに播種する前に、ＩＳ培地を用いて振盪フラスコ内で（少なくとも４継代）細胞を増殖させた。本文中に述べる場合を除いて全ての実験で、ＣＨＯ細胞を０．５ＭＶＣ／ｍＬ（百万生存細胞／ｍＬ）の播種密度で接種した。プロトタイプの１０Ｌ  ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌｂａｇｓ（図５に示したような３３×５６ｃｍのトップシート２２及び底部シート２３を含み、７．５ｃｍのＳ字形シリコーン熱成形ゴム配管がＰ９及びＰ１０ポートをボトムシート２３上のそれぞれの細胞懸濁液ディフューザー２０と接続しており、各々が２つの５×２０ｍｍの開口を有する）を備えたＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  ２０／５０を全ての培養に使用した。表１に、図５のバッグのいろいろな出入ポートの用途を記載する。
表１：図５のバッグの出入ポート
Ｐ４  溶存酸素（ＤＯ）プローブ
Ｐ５  ｐＨプローブ
Ｐ６  フィルター付きガス入口
Ｐ７  フィルター上ヒーター付きガス出口
Ｐ３  注射器及び試料採取ポートの添加用隔膜
Ｐ１  培地及び添加物（Ｇｌｃ、Ｇｌｎ、消泡剤）用の添加パイプ
Ｐ１０  細胞懸濁液ＯＵＴ（ＡＴＦ及びＴＦＦへの）並びにＩＮ（ＴＦＦ）のための管状バッフル／浸漬管
Ｐ８  アルカリ添加用管
Ｐ２  接種管
Ｐ９  細胞懸濁液ＩＮ（ＴＦＦから）のための管状バッフル／浸漬管。
【００４７】
ｐＨは、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３の添加（液体表面上への滴下）により上方調節し、ヘッドスペース内への（０〜５％空気混合物のヘッドスペース内への）ＣＯ２パルスにより下方調節した。溶存酸素（ＤＯ）は、Ｏ２（０〜１００％）のパルスにより、及び／又は揺動スピードの増大により上方調節し、揺動スピード低下により下方調節した。バイオリアクターの重量は、灌流の間、セットポイント重量（４ｋｇ）と、このセットポイントからの最小及び最大偏差（±０．３ｋｇ）を設定することによって調節した。培養のセットポイントを表２に示す。
【００４８】
【表１】
0005923529.tif 000002
ＡＴＦセットアップ
ＷＡＶＥバイオリアクターを、バッグ上の管状バッフル／浸漬管（Ｐ１０ポート）を介して、ＡＴＦ−２ポンプ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）に結合した中空糸カートリッジに無菌で接続した（図５及び８）。バイオリアクターと中空糸モジュールとの間の外部の管（ｃ−ｆｌｅｘ、内径８ｍｍ）はできるだけ短くなるように設計した。従って、中空糸カートリッジまでの管状バッフル／浸漬管の全体の長さ（バッグの底部の固定点からＡＴＦへの接続点Ｐ１０ポートまで）は４１〜４７ｃｍであった。このシステムに、圧縮空気及び真空ポンプ（Ｉｌｍｖａｃ）を備えた。中空糸フィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）の細孔径は０．２μｍで、フィルター面積は８５０ｃｍ2であった。
【００４９】
図７に、ＡＴＦ−バイオリアクターセットアップ構成の概要を示す。アルカリ及び添加ボトルは溶接により接続したので、切り離し、再充填し、再度システムに溶接することができた。１つは１０ｍｌ、もう１つは５０ｍｌの２つの注射器を用いて、グルコースとグルタミンを注入した。
【００５０】
ＴＦＦセットアップ
Ｐ１０管状バッフル／浸漬管を（ＲｅａｄｙＭａｔｅ（商標）継ぎ手により）フィルターに、またＰ９管状バッフル／浸漬管をそのフィルターの他端につなぐことにより、バイオリアクターを中空糸カートリッジ（上記ＡＴＦと同じ仕様だがＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＲＴＰＣＦＰ−２−Ｅ−４Ｘ２ＭＳとして）に接続した（図５及び９）。細胞懸濁液を、バイオリアクターから、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ６２０Ｓポンプによりフィルターを通して送った。次に、保持された細胞を、ポートＰ９を介してバイオリアクターに戻した。また、使い捨ての圧力センサー（ＳｃｉＬｏｇ，ＵＳＡ）も、（ＲｅａｄｙＭａｔｅ（商標）継ぎ手を用いて）フィルターの前後及び透過液側に接続した。
【００５１】
分析アッセイ
バイオリアクター及び回収ラインからの試料を毎日一回又は二回取った。バイオリアクター（揺動中）からの試料を即座に、生細胞の数（生存細胞密度、単位は百万生存細胞／ｍＬ（ＭＶＣ／ｍＬ））及び細胞の総数（合計細胞密度、単位は百万細胞／ｍＬ）を計数するＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｆｌｅｘ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳＡ）で分析して細胞増殖をモニターし、平均細胞直径を測定した。試料中のグルタミン、アンモニア、グルコース、乳酸塩の濃度、ｐＯ２及びｐＣＯ２もＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  Ｆｌｅｘで測定した。その後、バイオリアクターからの試料を３３００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに等分し、ＬＤＨ分析のために−２０℃及び−７０℃にした。次いで、バイオリアクターからの試料を３３００ｒｐｍで５分遠心分離し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに等分し、−２０℃に保った。試料中のｍＡｂ濃度はプロテインＡ  ＨＰＬＣ法を用いて分析した。
【００５２】
実施例１
ＡＴＦ及びＴＦＦ灌流
ＣＨＯ細胞増殖
ＣＨＯ細胞を両方のろ過システム、すなわちＡＴＦ又はＴＦＦシステムで培養した。図１０は、ＴＦＦ灌流（図１０Ａ）及びＡＴＦ灌流（図１０Ｂ）培養中に得られた細胞密度、生存率及び灌流速度を示す。プロセス中２つの異なる種類の培養培地を用いた（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＰＦ−ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙ及びＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ  ＸＰ）。剪断応力を最小にするために、ＴＦＦシステムの外部のループ内の循環流量を０．３Ｌ／ｍｉｎ、すなわち約１０００ｓ-1に設定した。このパラメーターにより、細胞のリアクターの外部にいる、すなわち室温である滞留時間を１ｍｉｎ未満にすることも可能であった。ＡＴＦシステムの平均流量は全プロセス中１Ｌ／ｍｉｎであった。ＴＦＦシステムのバイオリアクターでは、４ＬのＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ  ＸＰ培地中に０．４ＭＶＣ／ｍＬを接種し、ＡＴＦシステムのバイオリアクターでは、Ｈｙｃｌｏｎｅ培地中に５ＭＶＣ／ｍＬを接種した。より高い細胞密度に迅速に達し、その後両方の培養を並行して比較することができるように、より高い接種を選択した。従って、両方のプロセスを比較する目的で、ＴＦＦシステムで使用したＩＳ培地を１１日の培養後Ｈｙｃｌｏｎｅ培地に変えた。ＩＳ培地を用いると、両方の培養間の比較が数日間、すなわちＡＴＦ及びＴＦＦ培養でそれぞれ３〜６日目及び１１〜１８日目に可能であった。
【００５３】
プロセスの初期、ＴＦＦシステムを用いた培養は、定常期のバッチ培養からとった接種材料のために貧弱な細胞増殖を示した。３日目、細胞密度が約２ＭＶＣ／ｍＬに達した時、灌流を開始し、約１．２〜１．５Ｌ／ｄに維持した。５〜６日目に灌流速度を１ｗｖ／日未満に減らし、培養培地の取扱いのため１８日目に８時間灌流を停止した。Ｈｙｃｌｏｎｅ培地はその後１８日目に新たなＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤＸＰ培地に変更した。
【００５４】
８日間培養後、細胞密度を約２０ＭＶＣ／ｍＬに維持するために最初のブリード（bleed, 抜き取り）を実施した。追加のブリードを９〜１１、１３〜１５、１７〜１８、及び２０〜２１日毎日実施した。１日の灌流速度を計算するときにはブリード容積を考慮した。
【００５５】
ＡＴＦ培養では、バイオリアクターの接種直後に灌流を開始した。ＴＦＦシステムでは、灌流速度を約１．５ｗｖ／日に保ち、速度を計算するときにはブリードを考慮した。さらに、細胞密度を約２０ＭＶＣ／ｍＬに維持することは、このプロセスで、４、６、７、９及び１０日目に培養物のブリードを実施することによっても達成された。
【００５６】
攪拌速度の増大
両方の培養で、ＤＯ制御は揺動スピードによって行った。先の実験により、ＣＨＯ細胞濃度を約２０ＭＶＣ／ｍＬに保つときＤＯをＳＰ値（３５％）付近に維持するのに必要とされる攪拌速度（２２〜２６ｒｐｍ、７°）を決定することができた。入口ガスのＯ２の富化は、細胞が利用可能な酸素の量をさらに増大することが必要なときに使用した（表３及び４）。ＤＯ  ＳＰ値を達成し、高い生存率（・９５％）を維持するためのこれらのパラメーターの使用はＡＴＦ及びＴＦＦシステムの両方で確認された。
【００５７】
【表２】
0005923529.tif 000003
【００５８】
【表３】
0005923529.tif 000004
細胞内代謝
ＴＦＦシステムの場合、１１日目まで、ＩＳ培地中のグルコースの初期濃度は、Ｈｙｃｌｏｎｅ培地及びＨｙｃｌｏｎｅ培地の後に使用したＩＳ培地中の同濃度より高かった（約２０ｍＭ）。これら後者におけるグルコースの初期濃度の２０ｍＭへの低下により、培養物中の乳酸塩の蓄積を低下させることが可能であった（２０〜２５ｍＭ対３５ｍＭ）。これらの条件下で、残留グルコース濃度は低く３〜５ｍＭ付近のままであり、毎日行ったグルコースの注入を両方のシステムで１５ｍＭから２２ｍＭに増加した。ＴＦＦシステムでは残留グルコース濃度が増大したが、ＡＴＦシステムではグルコースの注入の増加はより高い残留グルコース濃度を達成するのに充分ではなかった。両方の培養培地中に存在するグルタミンの初期濃度は約４ｍＭであった。両方のシステムで、２ｍＭを達成するようにグルタミンの毎日の注入を行ったが、グルタミンは注入後毎日完全に排出された。アンモニアの蓄積は４〜５ｍＭ付近であり、これは通常毒性とは考えられない。従って、グルタミンの制限を回避するために、培養の最後の４日間グルタミンの標的を２ｍＭから４ｍＭに増大することに決定した。結果として、残留グルタミン濃度は少なくとも０．２ｍＭより高く維持された。
【００５９】
１０〜１５ｐｇ／細胞／ｄという組換えＩｇＧの最大の比速度並びに２００ｍｇ／Ｌ／ｄに近い容積測定生産性がＡＴＦ及びＴＦＦの両方のシステムで得られた。
【００６０】
結論
本バッグはＡＴＦ及びＴＦＦ灌流システムの両方で細胞増殖を非常に良好に支持した。酸素輸送はＷＡＶＥバイオリアクターで充分であり、システムのセットアップに制限は検出されなかった。いろいろな揺動／角度設定を使用し、いろいろな培地を試験した。結果はシステムのロバスト性を示している。毎日のブリードを用いてこの初期検討段階中の高過ぎる細胞密度を回避した。
【００６１】
ＡＴＦ及びＴＦＦシステムの両方がＩＳ培地又はＨｙｃｌｏｎｅ培地を用いた細胞増殖及び生存率に関して等価な性能を有するようである。ＴＦＦシステムの場合、約２０〜３０ＭＶＣ／ｍＬの高い細胞密度で、高い生存率（・９５％）が１８日間維持された。興味深いことに、培養の最後の数日間揺動を８°に増大しても生存率に影響はなかった。すなわち、以前と同様９０％超に維持された。
【００６２】
実施例２
高密度ＡＴＦ及びＴＦＦ灌流
ＣＨＯ細胞増殖
ＩＳ培地を用いてＴＦＦ及びＡＴＦの両方のシステムでそれぞれ４９日間及び２７日間ＣＨＯ細胞を培養した（図１１及び１２）。ＡＴＦシステムを用いた培養は２７日間の培養後停止したが、ＴＦＦを用いた培養は２２日間追加して続けた。先の培養と同様、必要に応じて消泡剤Ｃの添加を、最も一般的には３日又は７日毎に行った。両方のプロセスで、２日間の培養後、７日目まで１ｗｖ／ｄの灌流速度を使用した。ここでも、ＣＨＯ細胞増殖及び生存率に関して同様な結果が得られた。実際、約２０〜３０ＭＶＣ／ｍＬのＣＨＯ細胞濃度及び９５％を超える生存率が観察された。角度７°で２２〜２６ｒｐｍの攪拌速度により、ＳＰ値に近いＤＯの維持と高い生存率（・９５％）の保持が可能であった。ＡＴＦシステムにおいて先の培養中使用した値、すなわち１Ｌ／ｍｉｎで流量を増大することが決定された。同一の条件で両方のろ過装置を評価するために、ＴＦＦの外部のループの流量も１Ｌ／ｍｉｎに増大したが、これは３４００ｓ-1の剪断応力値に相当する。さらに、ＡＴＦシステムにおける高い生存率を維持する目的で、灌流速度を１．５Ｌ／ｍｉｎに増大した。
【００６３】
ＴＦＦシステムでは、再循環流量を０．７Ｌ／ｍｉｎから１Ｌ／ｍｉｎに増大してもＣＨＯ細胞増殖及び生存率に影響はなかった。従って、この流量を使用して、細胞の高い生存率を得ることが可能である。灌流速度は１．５ｗｖ／ｄからそれぞれＡＴＦ及びＴＦＦ培養の培養終了時の４及び５ｗｖ／ｄまで次第に増大した。ＡＴＦを用いた培養の最後の３日間、灌流速度を４ｗｖ／ｄに増大したが、生存率は増大せず（８８〜９０％付近）、不十分な細胞増殖が観察された。この結果は１６．５〜１７．５μｍから１８〜１８．５μｍへの細胞の平均細胞直径の増大と関連していた。従って、細胞の状態は両方のろ過システムでもはや同等ではないように見えたので、ＡＴＦ培養の中止を決定した。
【００６４】
驚くべきことに、ＴＦＦシステムでは、灌流速度を５ｗｖ／ｄに増大すると非常に高い細胞密度、すなわち約１００ＭＶＣ／ｍＬが得られた。２３日目以降、８０〜１０５ＭＶＣ／ｍＬというこれらの高い細胞密度を維持するためにブリードを毎日実施した。すると、これらの高い細胞濃度（約１００ＭＶＣ／ｍＬ）は１週間高い生存率（９２〜９５％）で維持された。この後、細胞密度は１２０〜１３０ＭＶＣ／ｍＬに増大し、毎日のブリードによりさらに１週間９４％より大きい細胞生存率を維持しつつ維持することができた。言い換えると、培養は１００ＭＶＣ／ｍＬより大きい細胞密度及び９４％より大きい細胞生存率で２週間以上安定に保たれた。その後、灌流速度をさらに１０ＲＶ／日まで増大したところ、驚くべきことに、２００ＭＶＣ／ｍＬを超える細胞密度が最大２１４ＭＶＣ／ｍＬで観察され、一方細胞生存率は９４％より大きかった。この極めて高い細胞密度は２日間保たれ、その後灌流速度を再び低下させた。合計で、ＴＦＦ培養は灌流バッグを用いて４９日間行った。
【００６５】
【表４】
0005923529.tif 000005
細胞内代謝
両方のシステムで、より高い細胞密度に達したとき、グルコースの制限を回避するために、毎日行ったグルコースの注入を増やした。乳酸塩の蓄積は３５〜４０ｍＭを越えなかった。かかる濃度は細胞に対して毒性とは考えられない。両方の培養培地中に存在するグルタミンの初期濃度は約４ｍＭであった。グルタミンの注入を増大したけれども、培養中にグルタミンの幾らかの制限が起こった。培養の最後の数日の間、制限を回避するために実際に注入を増やした。アンモニアの蓄積は両方の培養で４ｍＭに近く、約１００ＭＶＣ／ｍＬの細胞密度がグルタミン添加の増大を必要としたときのＴＦＦ培養ではさらにより高かった（約７ｍＭ）。
【００６６】
ＩｇＧ産生
１０〜１５ｐｇ／細胞／ｄの組換えＩｇＧの最大の比速度及び２００ｍｇ／Ｌ／ｄに近い容積測定生産性が得られた。ＴＦＦシステムを用いて同様な結果が２０日目まで得られた。
【００６７】
結論
２つのＳ字形管状バッフル／浸漬管を有する図５のバッグは、細胞分離のためにＡＴＦ及びＴＦＦ方策を用いることによりＷＡＶＥバイオリアクターシステムで外部の灌流を支持することが繰り返し示されている。また、発泡又はフィルターの目詰まりの問題なくＴＦＦシステムで極度の細胞密度に達することが可能であることが示されている。
【００６８】
ＡＴＦを用いた２つの培養実験とＴＦＦを用いた２つの培養実験を行った。４つの最初の実験（ＡＴＦ及びＴＦＦ）の間、細胞密度は毎日の細胞ブリードにより２０〜３０ＭＶＣ／ｍＬに維持された。この細胞密度で健全な細胞増殖を可能にするためには１．５ｗｖ／日の灌流速度が必要であった。Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＳ（給餌濃縮物補充を伴うか伴わないで使用した）及びＨｙｃｌｏｎｅの２つの市販の培地を用いて匹敵する細胞増殖及び生存率が得られ、これらのシステムが培地の改変に対して堅牢であることを示した。
【００６９】
ＴＦＦシステムを用いて、１００ＭＶＣ／超の細胞密度が５ｗｖ／日で達成された。この細胞密度は２週を越えて保たれ、毎日の細胞ブリードで維持された。さらに、灌流速度を１０ｗｖ／日に増大すると、＞２００ＭＶＣ／ｍＬ、最高２１４ＭＶＣ／ｍＬの極めて高い細胞密度が得られた。この結果は予想外であり、バッフル付きのバッグでないと達することができなかったものである。このＴＦＦシステムで、１つの中空糸カートリッジは詰まることなく４週間使用された。中空糸カートリッジのこの長い寿命は、おそらく、この培養物が絶えず増殖しており、３週間の間優れた生存率（・９４％）を維持したという事実に記することができよう。ＡＴＦシステムを用いた実験を並行して行った。このシステムを用いて、４６ＭＶＣ／ｍＬの最大細胞密度が達成された。
【００７０】
本明細書では、最良の態様を含めて本発明を開示し、また当業者がいずれのデバイス又はシステムも作り使用し、そして任意の援用された方法を実行することを含めて本発明を実施できるようにするために、例を使用した。本発明の特許性のある範囲は特許請求の範囲に定義されており、当業者には自明の他の例を包含し得る。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有する場合、又は特許請求の範囲の文言と実質的に異ならない等価な構造要素を含む場合、特許請求の範囲内に入ると考えられる。個々の実施形態及び／又は態様の要素及び特徴を組み合わせて別の実施形態を創成し得ることに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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