(57)【要約】  ＧＩＩに属する略全ての遺伝子型のヒトノロウイルスに反応し、ヒトノロウイルスＧＩＩを一括して検出することが可能な抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体の提供。  ヒトノロウイルスＧIIのカプシド構造タンパクのＰドメインに存在する下記式（１）及び（２）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープ、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれに相当するアミノ酸からなるエピトープの１以上に結合する抗ヒトノロウイルスＧII抗体。  Ｐ−Ｘ1−Ｘ2−Ｐ−Ｇ−Ｅ      ・・・（１）  Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｆ−Ｙ−Ｘ6−Ｌ−Ｘ7−Ｐ−Ｘ8       ・・・（２）  〔式中、Ｘ1はＬ、Ｖ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｍ又はＲを示し、Ｘ2はＦ、Ｙ又はＭを示し、Ｘ3はＶ又はＧを示し、Ｘ4はＮ又はＳを示し、Ｘ5はＱ、Ｐ又はＳを示し、Ｘ6はＳ、Ｔ又はＩを示し、Ｘ7はＡ又はＳを示し、Ｘ8はＭ又はＶを示す。〕【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトノロウイルスＧIIのカプシド構造タンパクのＰドメインに存在する下記式（１）及び（２）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープ、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれに相当するアミノ酸からなるエピトープの１以上に結合する抗ヒトノロウイルスＧII抗体。
Ｐ−Ｘ1−Ｘ2−Ｐ−Ｇ−Ｅ      ・・・（１）
Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｆ−Ｙ−Ｘ6−Ｌ−Ｘ7−Ｐ−Ｘ8       ・・・（２）
〔式中、Ｘ1はＬ、Ｖ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｍ又はＲを示し、Ｘ2はＦ、Ｙ又はＭを示し、Ｘ3はＶ又はＧを示し、Ｘ4はＮ又はＳを示し、Ｘ5はＱ、Ｐ又はＳを示し、Ｘ6はＳ、Ｔ又はＩを示し、Ｘ7はＡ又はＳを示し、Ｘ8はＭ又はＶを示す。〕
【請求項２】
式（１）で表されるアミノ酸領域が配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１９番目〜４２４番目のアミノ酸領域又はこれに相当する領域であり式（２）で表されるアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１６番目〜５２５番目のアミノ酸領域又はこれに相当する領域である請求項１記載の抗ヒトノロウイルスＧII抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を含むヒトノロウイルスＧII検出試薬。
【請求項４】
ヒトノロウイルスＧIIを含む疑いのある検体を請求項１又は２に記載の抗体と反応させ、免疫学的測定法により当該ウイルスを検出することを特徴とするヒトノロウイルスＧIIの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトノロウイルスＧＩＩに対する抗体に関する。より詳しくは、検体中のヒトノロウイルスＧＩＩを免疫学的測定法により検出するための抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトノロウイルス（Human norovirus）は、ヒトに経口感染して、十二指腸から小腸上部で増殖し、感染性胃腸炎を起こす。十二指腸付近の小腸上皮細胞を脱落させ、おう吐、下痢、腹痛などの症状を引き起こす。感染から発症までの潜伏期間は１２時間〜７２時間（平均１〜２日）で、症状が収まった後も便へのウイルスの排出は１〜３週間程度続き、７週間を越える排出も報告されている。食中毒報告患者のうち約７割がノロウイルス感染症である。【０００３】
ノロウイルスは、約７，５００塩基のプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つエンベロープを持たないウイルスである。ノロウイルスのゲノムには３つの蛋白質コード領域（ＯＲＦ）が存在しており、ＯＲＦ１はウイルスの複製に関与する非構造タンパク質、ＯＲＦ２はカプシド構造タンパク質（ＶＰ１）、ＯＲＦ３はマイナーな構造タンパク質（ＶＰ２）をコードしていることが報告されている。また、ノロウイルスは、カプシド遺伝子配列の類似性をもとに、ゲノグループＩ〜Ｖ（ＧＩ〜ＧＶ）の５つのグループに分類され、このうち、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶがヒト感染の主流となる。中でもゲノグループＩ（ＧＩ）とゲノグループＩＩ（ＧＩＩ）は遺伝的多様性に富んでおり、ヒト由来試料からは、進化系統の異なる様々なウイルスが検出され、ゲノグループＩは１４種或いはそれ以上ゲノタイプ（遺伝子型）、ゲノグループＩＩは１７種或いはそれ以上のゲノタイプに分類できるとされている。【０００４】
ノロウイルスの検出は、カプシド構造タンパク質を、抗体を用いてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法（非特許文献１参照）やイムノクロマトグラフィー法（非特許文献２参照）により検出することが行われている。したがって、ヒトノロウイルス抗原を的確に検出するためには、全ての遺伝子型に反応する抗体が必要となる。【０００５】
しかしながら、抗原の共通領域を認識して反応する抗体は容易に入手できず、これまでは、特定のアミノ酸配列を有するノロウイルス抗原ペプチドまたはそれのフラグメントに対する抗体（例えば、特許文献１参照）を複数組み合わせた試薬を作成し、異なる遺伝子型のノロウイルスを其々検出することが行われている。
したがって、遺伝子型の異なる多数のノロウイルスＧＩＩを一括して検出できる抗体の創生が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５４２７１５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「改良ノロウイルス抗原検出EIAキットの評価」、月刊医学と薬学 Vol.61 No.1 Page.93-98 (2009.01.25)
【非特許文献２】「ノロウイルス抗原迅速診断薬クイックナビ-ノロの評価 」、月刊医学と薬学 Vol.61 No.5 Page.779-785 (2009.05.25)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＩＩに属する略全ての遺伝子型のヒトノロウイルスに反応し、ヒトノロウイルスＧＩＩを一括して検出することが可能な抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題に鑑み、ゲノグループＧＩＩのヒトノロウイルスに共通して反応する抗体を得るべく検討したところ、ＧＩＩに属するヒトノロウイルスのキャプシド蛋白のＰ（Protruding）領域の特定部位に結合する抗体が、ＧＩＩのヒトノロウイルスに対して幅広く結合し、当該ＧＩＩに属する遺伝子型（ＧＩＩ／１〜ＧＩＩ／１７）のヒトノロウイルスの略全てを特異的に検出できることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は以下の１）〜４）に係るものである。
１）ヒトノロウイルスＧIIのカプシド構造タンパクのＰドメインに存在する下記式（１）及び（２）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープ、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれに相当するアミノ酸からなるエピトープの１以上に結合する抗ヒトノロウイルスＧII抗体。
Ｐ−Ｘ1−Ｘ2−Ｐ−Ｇ−Ｅ      ・・・（１）
Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｆ−Ｙ−Ｘ6−Ｌ−Ｘ7−Ｐ−Ｘ8       ・・・（２）
〔式中、Ｘ1はＬ、Ｖ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｍ又はＲを示し、Ｘ2はＦ、Ｙ又はＭを示し、Ｘ3はＶ又はＧを示し、Ｘ4はＮ又はＳを示し、Ｘ5はＱ、Ｐ又はＳを示し、Ｘ6はＳ、Ｔ又はＩを示し、Ｘ7はＡ又はＳを示し、Ｘ8はＭ又はＶを示す。〕
２）式（１）で表されるアミノ酸領域が配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１９番目〜４２４番目のアミノ酸領域又はこれに相当する領域であり式（２）で表されるアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１６番目〜５２５番目のアミノ酸領域又はこれに相当する領域である上記１）の抗ヒトノロウイルスＧII抗体。
３）上記１）又は２）に記載の抗体を含むヒトノロウイルスＧII検出試薬。
４）ヒトノロウイルスＧIIを含む疑いのある検体を上記１）又は２）の抗体と反応させ、免疫学的測定法により当該ウイルスを検出することを特徴とするヒトノロウイルスＧIIの検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗ヒトノロウイルス抗体を用いれば、ＧＩＩ群のヒトノロウイルスを網羅的に検出することができ、ＧＩＩに属する多数の遺伝子型のヒトノロウイルスを一括して効率よく検出することができる。また、本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、遺伝子変異が少ないと考えられるＰドメイン上のアミノ酸領域に結合し得ることから、これを用いた検出試薬は、流行の型に合わせて抗体を構成し直す必要が無いと云う利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−２】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−３】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−４】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−５】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−６】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−７】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−８】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−９】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図１−１０】ＧIIの属する２１種の遺伝子型を有するヒトノロウイルス株のカプシド構造タンパクのアミノ酸配列のアライメント図。
【図２】抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）とノロウイルスとの結合状態を示したＸ線結晶構造解析による構造図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、アミノ酸領域を示す式中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載する。
本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、ヒトノロウイルスＧＩＩのカプシド構造タンパクのＰドメインに存在する下記式（１）及び（２）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープ、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれに相当するアミノ酸からなるエピトープの１以上に結合するものである。
Ｐ−Ｘ1−Ｘ2−Ｐ−Ｇ−Ｅ      ・・・（１）
Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｆ−Ｙ−Ｘ6−Ｌ−Ｘ7−Ｐ−Ｘ8       ・・・（２）
〔式中、Ｘ1はＬ、Ｖ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｍ又はＲを示し、Ｘ2はＦ、Ｙ又はＭを示し、Ｘ3はＶ又はＧを示し、Ｘ4はＮ又はＳを示し、Ｘ5はＱ、Ｐ又はＳを示し、Ｘ6はＳ、Ｔ又はＩを示し、Ｘ7はＡ又はＳを示し、Ｘ8はＭ又はＶを示す。〕
【００１４】
ここで、「ヒトノロウイルスＧＩＩ」とは、ＧＩＩ（ゲノグループＩＩ）に属するヒトノロウイルスを意味する。
ヒトノロウイルスのカプシド構造タンパク（ＶＰ１）は、ｓｈｅｌｌ領域（Ｓドメイン）と突出領域（Ｐドメイン）から成ることが知られている。Ｓドメインは、ＶＰ１のアッセンブリーを司ると考えられている。一方、Ｐドメインは、更にＰ１とＰ２サブドメインに分かれ、Ｐ１サブドメインは、Ｓドメインと相互作用し、カプシドの物理的安定性を増強すること、Ｐ２サブドメインは，ウイルス粒子の最外郭に位置し、マウスノロウイルスでは中和抗体の標的となることが報告されている。
本発明の式（１）及（２）で表されるアミノ酸領域、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれに相当するアミノ酸は、ヒトノロウイルスＧＩＩのカプシド構造タンパクのＰドメイン上に存在し、各遺伝子型で保存性の高い領域及びアミノ酸で遺伝子変異が少ないと考えられるが、これまでに斯かる領域又はアミノ酸を認識する抗体は知られていない。
【００１５】
上記式（１）において、Ｐはプロリン、Ｇはグリシン、Ｅはグルタミン酸を示す。
Ｘ1はＬ（ロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｔ（スレオニン）、Ｓ（セリン）、Ｍ（メチオニン）又はＲ（アルギニン）を示す。
Ｘ2はＦ（フェニルアラニン）、Ｙ（チロシン）、Ｓ（セリン）又はＭ（メチオニン）を示すが、Ｆであるのが好ましい。
【００１６】
式（１）で表されるアミノ酸領域としては、以下の（１−１）〜（１−９）であるものが好適に挙げられる。
（１−１）Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−２）Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−３）Ｐ−Ｎ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−４）Ｐ−Ｔ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−５）Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−６）Ｐ−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−７）Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
（１−８）Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｖ−Ｓ
（１−９）Ｐ−Ｒ−Ｍ−Ｐ−Ｇ−Ｅ
【００１７】
上記式（２）において、Ｆはフェニルアラニン、Ｙはチロシン、Ｌはロイシン、Ｐはプロリンを示す。
Ｘ3はＶ（バリン）又はＧ（グリシン）を示すが、Ｖであるのが好ましい。
Ｘ4はＮ（アスパラギン）又はＳ（セリン）を示すが、Ｎであるのが好ましい。
Ｘ5はＱ（グルタミン）、Ｐ（プロリン）又はＳ（セリン）を示すが、Ｑであるのが好ましい。
Ｘ6はＳ（セリン）、Ｔ（スレオニン）又はＩ（イソロイシン）を示すが、Ｓ又はＴであるのが好ましい。
Ｘ7はＡ（アラニン）又はＳ（セリン）を示すが、Ａであるのが好ましい。
Ｘ8はＭ（メチオニン）又はＶ（バリン）を示すが、Ｍであるのが好ましい。
【００１８】
式（２）で表されるアミノ酸領域としては、以下の（２−１）〜（２−８）であるものが好適に挙げられる。
（２−１）Ｖ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｙ−Ｓ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｍ
（２−２）Ｖ−Ｎ−Ｐ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｍ
（２−３）Ｖ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｍ
（２−４）Ｖ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｖ
（２−５）Ｖ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｙ−Ｓ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｍ
（２−６）Ｇ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｍ
（２−７）Ｖ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｙ−Ｓ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｖ
（２−８）Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｆ−Ｙ−Ｉ−Ｌ−Ｓ−Ｐ−Ｖ
【００１９】
上記式（１）又は（２）で表されるアミノ酸領域は、ヒトノロウイルスＧIIのカプシド構造タンパクのＰドメインに存在するが、例えば、ＧＩＩ／１型の４８５株を例に挙げると、式（１）で表されるアミノ酸領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１９番目〜４２４番目のアミノ酸領域に該当し、式（２）で表されるアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１６番目〜５２５番目のアミノ酸領域に該当する。
本発明において、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１９番目〜４２４番目のアミノ酸領域に相当する領域、５１６番目〜５２５番目のアミノ酸領域に相当する領域、及び４８３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸とは、例えば、ＧＩＩ／１型の４８５株のＶＰ１アミノ酸配列をもとに、遺伝子情報処理ソフトウェアGENATYXを用い各遺伝子型とのアライメントをとった場合に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１９番目〜４２４番目のアミノ酸領域、５１６番目〜５２５番目のアミノ酸領域、及び４８３番目のアミノ酸に対応する領域又はアミノ酸を意味する（図１参照）。ＶＰ１のアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある欠失にかかわらず、各ヒトノロウイルスＧIIのＰドメインにおけるアミノ酸配列中の特定領域を決めることが可能である。相同する領域は、三次元構造中で同じ領域に存在すると考えられ、ヒトノロウイルスＧIIについて同様のエピトープを有するものと推定できる。
【００２０】
例えば、図１のＮＧ１株を例にとると、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１９番目〜４２４番目のアミノ酸領域に相当する領域は、４２６番目〜４３１番目のアミノ酸領域となり、５１６番目〜５２５番目のアミノ酸領域に相当する領域は、５２３番目〜５３２番目のアミノ酸領域となり、４８３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸は４９０番目のアミノ酸となる。
【００２１】
本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、上記のアミノ酸領域に含まれるエピトープ又はアミノ酸からなるエピトープに結合するものである。
ここで、「エピトープ」とは、抗原決定基であり、抗体と特異的に結合する構造部位を意味する。本発明におけるエピトープは、上記のアミノ酸領域の一部の連続したアミノ酸の他、該領域の不連続なアミノ酸であってもよい。
また、「結合」とは、リガンドと基質間の相互作用を意味し、バックグラウンドまたは非特異的或いは特異的相互作用とは区別され得る。
【００２２】
本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、少なくとも上記式（１）又は（２）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープ、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれに相当するアミノ酸からなるエピトープに結合するものであればよく、これらのエピトープの全てに結合するものが好ましい。
式（１）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープとしては、好適には、「Ｘ1」であり、式（２）で表されるアミノ酸領域に含まれるエピトープとしては、好適には、「Ｘ4」及び／又は「Ｙ−Ｘ6−Ｌ」が挙げられる。
【００２３】
したがって、ＧＩＩ／１型の４８５株の例においては、式（１−１）で表されるアミノ酸領域のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４２０番目のＬ、式（２−１）で表されるアミノ酸領域のうち５１７番目のＮ、５２０番目〜５２２番目のＹ−Ｓ−Ｌ及び４８３番目のＥから選ばれる１以上をエピトープとするものが好適に挙げられる。
また、ＧＩＩ／１型のＮＧ１株の例においては、式（１−２）で表されるアミノ酸領域のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４２７番目のＶ、式（２−２）で表されるアミノ酸領域のうち５２４番目のＮ、５２７番目〜５２９番目のＹ−Ｓ−Ｌ及び４９０番目のＥから選ばれる１以上をエピトープとするものが好適に挙げられる。
【００２４】
抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、後記表１に示すように、４８５株（ＧＩＩ／１）、ＮＧ１株（ＧＩＩ／２）、８０９株（ＧＩＩ／３）、１８−３株（ＧＩＩ／３）、３３６株（ＧＩＩ／３）、１０４株（ＧＩＩ／４）、７５４株（ＧＩＩ／５）、７ｋ株（ＧＩＩ／６）、４４５株（ＧＩＩ／６）、１０−２５株（ＧＩＩ／７）、Ｕ２５株（ＧＩＩ／８）、８７６株（ＧＩＩ／１２）、ＮＧ１５株（ＧＩＩ／１３）、４７株（ＧＩＩ／１４）、Ｋａｍｏ株（ＧＩＩ／１５）、Ａｌｐｈ株（ＧＩＩ／１７）のＧＩＩ／１〜ＧＩＩ／１７に分類されるＧＩＩ遺伝子群の略全てに結合することができ、ＧＩ遺伝子群ノロウイルスには結合しない、と云う反応性を有する。
【００２５】
本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体が由来する動物種は特に限定されないが、抗体作成の容易さの面では、ラットが好ましい。
また、本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはそれらの１つ以上の一部、例えば、重鎖、軽鎖、ＦｃまたはＦ（ａｂ）一部のような任意の要求された類型であることができる。
【００２６】
本発明で使用される抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものが包含される。
【００２７】
抗ヒトノロウイルス抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、遺伝子組換ＧＩＩノロウイルス様中空粒子（ＶＬＰ）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２８】
遺伝子組換ノロウイルスＧＩＩ  ＶＬＰは、ヒトノロウイルスＧＩＩのカプシドの遺伝子配列をトランスファーベクターに挿入し、バキュロウイルスＤＮＡと、前述のプラスミドをＳｆ９細胞に同時にトランスフェクションし、相同組み換えを利用し、組み換えウイルスを作製し増殖させシードウイルスを得る。その後、Ｔｎ５細胞でタンパク質の発現を行うことにより細胞中又は培養上清中から目的の組換ノロウイルスＧＩＩ  ＶＬＰを公知の方法で精製することにより得ることができる。
【００２９】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００３０】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から採血し、血清成分を精製することでポリクローナル抗体を得ることができる。血清成分を精製する際には、感作抗原を固定化したアフィニティーカラム等を使用することができる。
【００３１】
また、モノクローナル抗体を作製する際には、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばＰ３Ｘ６３、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ２／０等が適宜使用される。
【００３２】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜６０００のＰＥＧ、３０〜６０％濃度）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞（ハイブリドーマ）の形成が行われる。
【００３３】
融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
【００３４】
得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。
【００３５】
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
【００３６】
本発明の抗ヒトノロウイルス抗体を任意の免疫学的測定方法に適用することにより、検体中のヒトノロウイルスＧＩＩを特異的に測定・検出することができる。
免疫学的測定法としては、特に制限されないが、抗ノロウイルスＧＩＩ抗体と標識抗ノロウイルスＧＩＩ抗体を用いたサンドイッチ法が好ましく、固定化抗ノロウイルスＧＩＩ抗体と標識抗ノロウイルスＧＩＩ抗体を用いる方法がさらに好ましい。
固定化抗ノロウイルスＧＩＩ抗体としては、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子、磁性粒子、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜等の不溶性支持体に固定化したものが好ましい。
また、標識抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体としては、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ）、タンパク（例えば、アビジン）、低分子化合物（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、FITC）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム） 、ラテックス粒子（例えば、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子）、金属（例えば、金、銀、白金等の貴金属）コロイド粒子、炭素原子等を用いることができる。
【００３７】
検体中のノロウイルスＧＩＩの検出は、検体中のノロウイルスを固定化抗ノロウイルスＧＩＩ抗体と反応させることにより行われるが、サンドイッチ法による場合には、検体含有液と固定化抗ノロウイルスＧＩＩ抗体を反応させ、次いで前記標識抗体を反応させること、或いは固定化抗ノロウイルスＧＩＩ抗体と標識抗体とを同時に反応させることにより行うことができる。反応終了後、検体中のノロウイルスと固定化抗ノロウイルスＧＩＩ抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定すれば、検体中のノロウイルスＧＩＩ量が測定できる。標識量の測定は、標識体の種類に応じた手段で行うことができる。例えば、標識として酵素、アビジンを用いた場合には、反応後、基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光（蛍光ラテックス粒子を含む）又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、及び炭素粒子等は、目視或いは反射光等で信号を測定する。
本発明のノロウイルスＧＩＩの検出方法としてはＥＬＩＳＡ及びイムノクロマトグラフ法がより好ましい。
【００３８】
本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体を含む検出試薬（キット）は、固定化された本発明の抗ヒトノロウイルスＧＩＩ抗体の他、例えば検体用希釈液、標識抗ノロウイルスＧＩＩ抗体、反応基質等により構成されるのが好ましい。
【実施例】
【００３９】
実施例１  抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体の取得
本発明の方法に使用する抗体は以下の方法で作成した。
GIIノロウイルス様中空粒子(VLP)50μgをマウス腹腔にアジュバントと共に数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確認した。追加免疫（静脈内）後3日目に脾臓を取り出し、脾細胞を得た。これとマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール3500の存在下(10：1細胞)で融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。この細胞を1週間CO2気下37℃で培養し、その培養上清中の抗ノロウイルス抗体の有無を調べた。そこで抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を限界希釈法により希釈し2週間培養し、同様に培養上清の抗ノロウイルス抗体の有無を調べた。更にその後、抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を再度限界希釈し、同様の培養を行った。この段階で抗ノロウイルス抗体を産生している細胞を、フラスコにて培養し、その一部をジメチルスルホキシド(DMSO) 10%含有ウシ胎児血清(FCS)にサスペンドし(5×106個/mL)、液体窒素中に保存した。【００４０】
次に各ウェルの上清を用い、ノロウイルスに対する培養上清中の産生抗体の反応性を調べた。ノロウイルス様中空粒子(VLP)を140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH7.3(以下、PBS,pH7.3と略す)に溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート（Nunc-ImmunoTMModule F8 MaxisorpTM Surface plate, Nalge Nunc International社製）のウェルに、1ウェル当たり100μLの、上記ノロウイルス様中空粒子(VLP)/PBS,pH7.3溶液を加え、0.05μg/ウェル、4℃、12時間の条件下で、ノロウイルスウイルス様中空粒子(VLP)をマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたノロウイルス様中空粒子(VLP)/PBS,pH7.3溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、145mM NaCl,3.6mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4,0.05%(v./v.) Tween20(以下、PBS-Tと略す)を200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の吸着過剰分のノロウイルス様中空粒子(VLP)を洗浄した。この洗浄工程を計2回行った。【００４１】
その後、145mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM KH2PO4,1%(wt./v.) BSA,5%(wt./v.) ラクトース(以下、抗原固相プレート用ブロッキング液と称す)を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件化でノロウイルス様中空粒子(VLP)固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。培養上清中の抗体の反応性を確認する為に、このブロッキング完了後のノロウイルス様中空粒子(VLP)固相化マイクロタイタープレートを用いた。上記ノロウイルス様中空粒子(VLP)固相化マイクロタイタープレートのウェルへ、ハイブリドーマ培養上清を100μL/ウェルで加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えておいた培養上清をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。【００４２】
その後、ウェルへPeroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins(DAKO社製)を100μL/ウェル(2000倍希釈：0.55μg/mL)で加え、37℃、1時間加温した。この酵素標識抗体の希釈には、145mM NaCl,3.6mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4,0.05%(v./v.) Tween20,0.5%(wt./v.) BSA(以下、酵素標識抗体希釈液と称す)を用いた。その後、ウェルに加えておいた酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへ3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(以下、TMBと略す)溶液(TMB One-Step Substrate System：DAKO社製)をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分放置した。その後直ちに、そのウェル内の基質反応液へ313mM H2SO4溶液(以下、反応停止液と称する)を100μL/ウェルで添加し、ウェル内での酵素反応を停止させた。【００４３】
その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした(Josephy P.D. , Mason R.P. et al.(1982) J. Biol. Chem.257 , 3669-3675)。尚、TMBを用いた比色定量の方法は、1981年にBos E.S.らが最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされており、本技術の根幹は確固たる基盤の上に成り立っている(Bos E.S. et al. (1981) J. Immunoassay. 2 , 187-204)。【００４４】
その結果、固相化したノロウイルス様中空粒子(VLP)へ抗ノロウイルス抗体の強い反応性を示すモノクローナル化ハイブリドーマ細胞を選択し、本培養上清中のイムノグロブリンのクラスとサブクラスをImmunoglobulin Typing Kit,Mouse(和光純薬工業社製)を用いて、培養上清原液100μLから、各クローン毎に確認した。その結果を基に、得られた単クローン細胞ライブラリーの中から、IgGクラスに限定して後述する腹水化へ移行した。
次に、これらの細胞を25mLのフラスコで培養し、更に75mLのフラスコで培養した。この細胞をプリスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。【００４５】
モノクローナル化ハイブリドーマ細胞の選択においては、固相化したノロウイルス様中空粒子(VLP)へ抗ノロウイルス抗体の強い反応性を示すモノクローナル化ハイブリドーマ細胞を選択する代わりに、固相化したノロウイルス様中空粒子(VLP)のＰドメインへ抗ノロウイルス抗体の強い反応性を示すモノクローナル化ハイブリドーマ細胞を選択することにより、さらに再現性良くＰドメイン上のアミノ酸領域に結合し得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
モノクローナル化ハイブリドーマ細胞の選択においては、下記実施例３に記載の方法と同様の方法でモノクローナル抗体とノロウイルスとの結合状態を確認することにより、Ｐドメイン上のアミノ酸領域に結合し得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを再現性良く選択することができる。
上記実施例１の方法において、GIIノロウイルス様中空粒子(VLP)を免疫する代わりに、ノロウイルス様中空粒子(VLP)のＰドメインタンパク質を免疫する事により、再現性良くＰドメイン上のアミノ酸領域に結合し得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを再現性良く取得することができる。Ｐドメインタンパク質の取得方法は実施例３に記載のある通りである。
また、本発明の式（１）及び（２）で表されるアミノ酸領域、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８３番目のアミノ酸又はこれらに相当するアミノ酸配列を選択してこれらアミノ酸配列からなるポリペプチドを製造し、該ポリペプチドを免疫する事により、再現性良くPドメイン上のアミノ酸領域に結合し得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを再現性良く取得することができる。
該ポリペプチドはヒトノロウイルスGIIの抗原として使用することができる。【００４６】
＜抗ノロウイルスGIIモノクローナル(IgG)抗体の精製＞
得られた腹水(10mL)と混濁血清処理剤(FRIGEN（登録商標）ＩＩ：協和純薬工業社製)を、腹水1.5容に対してFRIGEN（登録商標）ＩＩを1容の比率で混和し、1〜2分攪拌振とうすることで、腹水からの脱脂を行った。遠心機で3000rpm(1930×g)、10分間遠心分離を行い、清澄化された腹水遠心上清(10mL)を分取した。この腹水遠心上清(10mL)に硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降したイムノグロブリン画分をPBSで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計2回行い、腹水からのイムノグロブリン粗画分を得た。得られたイムノグロブリン粗画分(10mL)に対して等量の20mMリン酸ナトリウム, pH7.0(以下、20mM NaPB,pH7.0と称す)を混合し、プロテインGカラム(HiTrap Protein G HP,5mL：Amersham BioSciences社製)を用いてアフィニティー精製を行った。サンプルをプロテインGカラムに吸着後、20mM NaPB,pH7.0(50mL)をプロテインGカラム内に通し、サンプル中のIgG以外の夾雑物を洗浄除去した。その後、プロテインGカラムにアフィニティー吸着したIgGは、0.1M グリシン-HCl,pH2.7で溶出させ、カラムからの溶出直後の溶出画分を1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl,pH9.0(以下、Tris(hydroxymethyl)aminomethaneをTrisと略す)で中和し回収した。中和後、アフィニティー精製物に対して500倍容のPBSで4℃、6時間の透析を行い、本透析は計2回行った。本透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ(Viskase Companies社製)で行った。そこで得られたIgG溶出画分を、抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）の精製物とし、4℃での保存ならびに後述する操作に用いることとした。尚、本精製には、BioLogic LPシステム(Bio Rad Laboratories社製)に上述のプロテインGカラムを接続し、流速は1mL/minで一貫して行った。【００４７】
実施例２  抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体の反応性
実施例１で得られた抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）を用いて、以下の手順でイムノクロマト法を利用したノロウイルスGII検出試薬を作成した。
ニトロセルロースメンブレンシートに抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）を0.36〜1.45 mg/mL含有する溶液を0.25〜1.00 μL/5mmの量で、線状に塗布しテストラインとした。コントロールラインは抗マウスグロブリン抗体を上記同様に塗布した。
抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）を結合させたラテックスを0.04〜0.15w/v%含有する溶液を抗体結合ラテックス溶液（5B-18-3M）とした。ラテックス溶液をコンジュゲートパッドに含浸させ、乾燥したものを作成した。
プラスチック製バッキングシート上に、サンプルパッド、上記メンブレン、コンジュゲートパッド及び吸収パッドをこの順で隣り合う部材が一部重なるように貼り付けた後に、プラスチックラミネートで被覆し、5mm幅に切断して、テストストリップを作製する。
上記で作成した試薬を、下記の手順でノロウイルスの各遺伝子型との反応を確認した。
ノロウイルスの各遺伝子型の組換え抗原を希釈液に浮遊し、浮遊した抗原75μLを上記で作成したテストストリップのサンプルパッドに滴下した。15〜30℃で15分間静置した後、ラインの有無を確認した。結果を表１に示す。尚、124株とは、Hu/NV/GI/Aichi124-89/89/JP（GeneBank accession number: AB031013）株を意味し、258株とは、Hu/NV/GI/Funabashi258/96/JP（GeneBank accession number: AB078335）株を意味し、645株とは、Hu/NV/GI/Kashiwa645/99/JP（GeneBank accession number: BD011871）株を意味し、CV株とは、Hu/NV/GI/Chiba407/87/JP（GeneBank accession number: AB042808）株を意味し、W18株とは、Hu/NV/GI/WUG1/00/JP（GeneBank accession number: AB081723）株を意味し、#8株とは、Hu/NV/GI/8/99/JP（GeneBank accession number: AB058547）株を意味し、485株とは、Hu/NV/GII/Noda485/00/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、NG1株とは、Hu/NV/GII/NG1/02/JP（GeneBank accession number: AB195225）株を意味し、809株とはHu/NV/GII/Sanbu809/98/JP（GeneBank accession number: BD011876）を意味し、18-3株とは、Hu/NV/GII/Matsudo18/00/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、336株とは、Hu/NV/GII/Kashiwa336/00/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、104株とは、Hu/NV/GII/Narita104/97/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、754株とは、Hu/NV/GII/Ichikawa754/98/JP（GeneBank accession number: BD011877）株を意味し、7k株とは、Hu/NV/GII/Ueno7k/94/JP（GeneBank accession number: AB078337）株を意味し、445株とは、Hu/NV/GII/Sanbu445/00/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、10-25株とは、Hu/NV/GII/Osaka10-25/99/JP（GeneBank accession number: BD011881）株を意味し、U25株とは、Hu/NV/GII/SaitamaU25/**/JP（GeneBank accession number: AB039780）株を意味し、1876株とは、Hu/NV/GII/Chitta/Aichi76-96/96/JP（GeneBank accession number: AB032758）株を意味し、NG15株とは、Hu/NV/GII/NG15/03/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、47株とは、Hu/NV/GII/Kashiwa47/97/JP（GeneBank accession number: AB078334）株を意味し、Kamo株とは、Hu/NV/GII/Kamo8/03/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味し、Alph株とは、Hu/NV/GII/Alph23/**/JP（GeneBank accession number: 未登録）株を意味する。【００４８】
【表１】
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【００４９】
表１より、抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）は、485株(GII/1)、NG1株(GII/2)、809株(GII/3)、18-3株(GII/3)、336株(GII/3)、104株(GII/4)、754株(GII/5)、7k株(GII/6)、445株(GII/6)、10-25株(GII/7)、U25株(GII/8)、876株(GII/12)、NG15株(GII/13)、47株(GII/14)、Kamo株(GII/15)、Alph株(GII/17)のGII/1〜GII/17に分類されるGII遺伝子群の略全てに結合することができ、GI遺伝子群ノロウイルスには結合しないことが示された。【００５０】
実施例３  X線結晶構造解析
抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）とノロウイルスとの結合状態を把握するため、以下の手順でX線結晶構造解析を行った。
（１）サンプルの調製
＜ノロウイルスP領域のタンパク質発現、精製と結晶化＞
ノロウイルスVietnam026 GII.10のP領域の全長に近い（アミノ酸残基224-538）P領域（アミノ酸の長さ314）を、E.coliでの発現のためにデザインし、BamHIとNotI(New England Biolabs)制限酵素サイトで切断したpMal-c2xベクターに挿入し、発現クローンを作製した。これをE.coli BL21細胞(Invitrogen)にトランスフォームし、発現は、IPTG（1mM）で22℃で18時間誘導した。His-tagged融合P領域タンパク質は、Niカラム（Qiagen）で精製し、HRV-3Cプロテアーゼ（Novagen）により、4℃で一晩処理した。その後、再度その処理液をNiカラムに通すことで、P領域を精製した。
P領域はSuperdex 200カラム（GE）で分子ふるいクロマトグラフィーにより、さらに精製し、2-10mg/mlまで濃縮した後、結晶化の前にGFB（0.35M NaCl、2.5mMトリスpH 7.0、0.02% NaN3）に保存した。【００５１】
＜抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体(5B-18-3M)のFab フラグメントの調整＞
精製した5B-18-3M IgGを約60 mg使用し、Fabの調整をした。5B-18-3M IgG は、100mM dTTで37℃で1時間還元した。還元した5B-18-3M IgGは、透析カセットで4℃で1時間透析を行い、20mM HEPES(pH 7.7)を含むGFBにBuffer置換し、4℃で48時間2mMヨードアセトアミドを含むGFBでアルキル化した。その後、カセットをヨードアセトアミドを含まない新しいGFBに移し、4℃で1h Buffer置換を行った。5B-18-3M IgGは、5mg/mLに濃縮し、キット（pierce,Rockford, USA）を用いてパパインで消化した。消化した5B-18-3M IgGは、プロテインAカラムでFabのみ精製し、Fabは、さらにSuperdex 200カラム（GE）で分子ふるいクロマトグラフィーにより精製し、5mg/mLに濃縮した後GFBに保存した。
精製したそれらの、ノロウイルス GII.10のP領域と、5B-18-3M Fabは、1:1で混合し25℃で1時間反応させ、最終的に分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。【００５２】
＜ノロウイルスP領域と抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体(5B-18-3M)のFab の複合体の共結晶化＞
上記、ノロウイルスP領域と抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体(5B-18-3M)のFab の複合体はハンプトンリサーチ社の試薬とhanging-drop vapor diffusion法を用いるのとは少し異なる状況下で結晶化させた。
この研究のために、P領域-Fab複合体の結晶は、GII.10 P領域-Fab複合体とPEG400(40% v/v)、PEG3350(5% w/v)、0.1M酢酸(pH5.5)を含むGFBを1:1の比率で混合し、成長させた。データ収集の前に結晶は、30%のエチレングリコールにGFBを含む凍結防止剤へ移した。【００５３】
（２）構造解析
抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）とノロウイルスGII.10キャプシドタンパクP領域との複合体の結晶のX線回析データは、アルゴンヌ国立研究所（Argonne, IL）のビームライン、Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-IDと22-BMを使用して作成された。回析データは蛋白・低分子データ処理ソフトウェアHKL2000とプログラムパッケージXDSによって処理した。構造は、PDB( Protein Data Bank) コード1WEJを抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体のFabのサーチモデルとし、PDB コード２OBRをノロウイルスキャプシドP領域のサーチモデルとして、分子置換による構造解析ソフトPHASERを用いて、回析データと抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）とノロウイルスGII.10キャプシドタンパクP領域アミノ酸配列より立体構造を構築した。
その後、モデル構築ソフトCOOT内に構築されているマニュアルモデルで立体構造を調整し、精密化プログラムREFMACのTLS refinementと自動構造決定ソフトウェアPHENIXで修正を行い、CCP4によって、重ね合わせ（superposition）と平均二乗偏差（RMSD）が計算され、分子グラフィックスツールPyMOLに描画した。【００５４】
（３）結果
これにより得られた、図２の構造よりGII.10キャプシドタンパクP領域に抗ノロウイルスGIIモノクローナル抗体（5B-18-3M）が結合している部位のノロウイルスGII.10キャプシドタンパクP領域のアミノ酸配列の同定を行ったところ、3箇所の部位が明らかとなった。その後、各遺伝子型のアミノ酸配列の相同性比較を行った結果、図１に示すように、各遺伝子間で非常に保存された3ヶ所の領域であるという結果が得られた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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