(57)【要約】  ＦＲＥＴ計測では、ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブを用いる。ＦＲＥＴ計測の計測対象とする検査サンプルは、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物を含む。この計測で得られる複数組の蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleを用いて、検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否か判定をする。
2013141368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲＥＴ計測装置であって、
ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含むサンプルが流れる管路と、
前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する光源部と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出し、さらに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する蛍光パラメータ算出部と、
前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする判定部と、を有することを特徴とするＦＲＥＴ計測装置。
【請求項２】
前記判定部は、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求め、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求め、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する、請求項１に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項３】
前記判定部は、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETと、を複数組求めることにより、前記第１の範囲を定め、
前記判定部は、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、前記第２の範囲を定める、請求項２に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項４】
前記判定部は、複数組の前記蛍光寿命τFRETと前記比ＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、前記蛍光寿命τFRETが小さくなるほど前記比ＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に基いて前記第１の範囲を定め、
前記判定部は、複数組の前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値と前記比ＲNON-FRETの平均値を求め、２つの前記平均値に基いて前記第２の範囲を定める、請求項３に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項５】
前記判定部は、前記蛍光寿命τFRET及び前記比ＲFRETをそれぞれ横軸及び縦軸に採ったスキャッタグラムにおいて、前記第１の組の群に含まれる蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleの各プロット位置から前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に至る最短距離の逆数が大きくなる程値が大きくなる重み付け係数を、前記第１の組の群に含まれる蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleのプロット毎に決定し、決定した前記重み係数の加算値を、前記第１の組の群の数として用いる、請求項４に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項６】
前記特性の判定に用いる前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、前記判定の前に、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択された情報である、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項７】
前記ＦＲＥＴプローブが生体細胞に取り込まれ、
前記受光部は、前記生体細胞に取り込まれた前記ＦＲＥＴプローブの発する前記蛍光を受光するとき、前記レーザ光の前記ＦＲＥＴプローブによる側方散乱光と前方散乱光を計測し、前記側方散乱光と前方散乱光の計測結果に基づいて、前記ＦＲＥＴプローブを取り込んだ前記生体細胞が生細胞か否かを判定することにより、前記生細胞の発する蛍光から得られる蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組のみを前記特性の判定に用いる、請求項２〜６のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項８】
前記判定部は、前記ドナー蛍光の蛍光強度を前記ドナー蛍光の蛍光寿命τsampleで除算して得られる除算値を複数求めて前記除算値の分布を得、前記分布において、前記除算値の平均値を中心として予め定められた範囲に含まれる除算値を持つ蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組を前記判定部の前記特性の判定に用いる、請求項２〜７のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項９】
管路、光源部、受光部、蛍光パラメータ算出部、及び判定部を有する装置を用いて行うＦＲＥＴ計測方法であって、
ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含むサンプルを管路に流す工程と、
光源部が、前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する工程と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより、受光部が、前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する工程と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、蛍光パラメータ算出部が、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出するとともに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleとを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する工程と、
前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、判定部が、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする工程と、を有する、ことを特徴とするＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１０】
前記特性の判定をする工程は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、前記蛍光寿命τsampleと前記蛍光強度の比Ｒsampleの前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する工程と、を有する請求項９に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１１】
前記第１の範囲は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETと、を複数組求めることにより、定められ、
前記第２の範囲は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、定められる、請求項１０に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１２】
前記第１の範囲を定めるとき、前記判定部が、複数組の前記蛍光寿命τFRETと前記比ＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、前記蛍光寿命τFRETが小さくなるほど前記比ＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に基いて前記第１の範囲として定め、
前記第２の範囲を定めるとき、前記判定部が、複数組の前記蛍光寿命τNON-FRETと前記比ＲNON-FRETの平均値を求め、前記平均値に基いて前記第２の範囲を定める、請求項１１に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１３】
前記判定部が前記特性の判定に用いる前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、前記判定の前に、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択した情報である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー蛍光物質を含むプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質を含むプローブ要素Ｙとを含み、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブを用いたＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法に関する。ＦＲＥＴとは、蛍光共鳴エネルギー移動をいう。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質（以降、タンパクともいう）の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用の解析が行われている。ＦＲＥＴ現象により生じる蛍光を測定することにより、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を測定することができる。ＦＲＥＴは、ドナー蛍光物質が照射されたレーザ光により励起したとき、蛍光を発することなく接近しているアクセプタ蛍光物質に励起エネルギーの一部が移動して、アクセプタ蛍光物質が蛍光を発する現象をいう。【０００３】
従来、タンパク質等の生体物質に蛍光物質を与えてＦＲＥＴの発生の有無を調べるとき、蛍光物質の発する蛍光強度の変化に基いてＦＲＥＴの発生の有無を調べる方法が用いられてきた。この方法では、具体的には、ドナー蛍光物質から励起エネルギーの一部が移動することにより、ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の蛍光強度が低下する低減量、アクセプタ蛍光物質が、移動した励起エネルギーを用いてアクセプタ蛍光を発することにより蛍光強度が増加する増加量が計測される。しかし、この方法では、上記低減量及び増加量は、測定対象物に含まれるドナー蛍光物質やアクセプタ蛍光物質の量（標識量）に応じて変化するため、必ずしもＦＲＥＴの発生の有無を正しく判定することができなかった。【０００４】
これに対して、ドナー蛍光物質やアクセプタ蛍光物質が、生体細胞等の測定対象物に含まれる標識量に影響を受け難い方法として、ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の蛍光寿命を計測し、この蛍光寿命の変化によってＦＲＥＴの発生の有無を判定する方法が知られている（特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２４０４２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記方法では、蛍光寿命の変化を、ドナー蛍光の蛍光強度が低下する低減量及びアクセプタ蛍光の蛍光強度の増加量とともに用いることによってＦＲＥＴの発生の有無をより正確に判定することができる。上記方法では、ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の種類が１種類（蛍光寿命が同じ）であれば正確に蛍光寿命の変化を捉えて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定することができる。しかし、ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光が、異なる蛍光寿命を持つ複数種類の蛍光成分を含んでいる場合、正確にＦＲＥＴの発生の有無を判定することができない場合があった。特に、生体物質等を計測対象とする場合、標識として用いるドナー蛍光物質やアクセプタ蛍光物質は、蛍光タンパクを用いる。しかし、蛍光タンパクには複数種類の蛍光成分（複数種類の蛍光寿命を持った成分）を発するため、蛍光タンパクをドナー蛍光物質に用いると、正確にＦＲＥＴの発生の有無を判定することができない場合があった。このため、ＦＲＥＴの計測結果から、生体細胞等の測定対象物内に含んだ薬剤等の検査対象物の特性を正確に把握することも難しかった。【０００７】
そこで、本発明は、薬剤等の検査対象物の特性を正確に把握するために、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができるＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、ＦＲＥＴ計測装置である。当該装置は、管路と、光源部と、受光部と、蛍光パラメータ算出部と、判定部を有する。
前記管路には、ＦＲＥＴプローブと検査対象物と、を含むサンプルが流れる。
前記ＦＲＥＴプローブは、ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するプローブである。
前記検査対象物は、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である。
前記光源部は、前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する。
前記受光部は、前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する。
前記蛍光パラメータ算出部は、前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出し、さらに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する。
前記判定部は、前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする。【０００９】
前記判定部は、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定めることが好ましい。
この場合、前記判定部は、前記蛍光寿命τsampleと前記蛍光強度の比Ｒsampleの前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求める。さらに、前記判定部は、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求める。前記判定部は、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する。【００１０】
前記判定部は、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETと、を複数組求めることにより、前記第１の範囲を定めることが好ましい。その際、前記判定部は、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、前記第２の範囲を定めることが好ましい。【００１１】
前記判定部は、複数組の前記蛍光寿命τFRETと前記比ＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、前記蛍光寿命τFRETが小さくなるほど前記比ＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に基いて前記第１の範囲を定め、前記判定部は、複数組の前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値と前記比ＲNON-FRETの平均値を求め、２つの前記平均値に基いて前記第２の範囲を定める、ことが好ましい。【００１２】
また、前記判定部は、前記蛍光寿命τFRET及び前記比ＲFRETをそれぞれ横軸及び縦軸に採ったスキャッタグラムにおいて、前記第１の組の群に含まれる蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleの各プロット位置から前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に至る最短距離の逆数が大きくなる程値が大きくなる重み付け係数を、前記第１の組の群に含まれる蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleのプロット毎に決定し、決定した前記重み係数の加算値を、前記第１の組の群の数として用いる、ことも好ましい。【００１３】
前記判定部が前記特性の判定に用いる前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択した情報である、ことも好ましい。【００１４】
例えば、前記ＦＲＥＴプローブが生体細胞に取り込まれる場合、前記受光部は、前記生体細胞に取り込まれた前記ＦＲＥＴプローブの発する前記蛍光を受光するとき、前記レーザ光の前記ＦＲＥＴプローブによる側方散乱光と前方散乱光を計測し、前記側方散乱光と前方散乱光の計測結果に基づいて、前記ＦＲＥＴプローブを取り込んだ前記生体細胞が生細胞か否かを判定することにより、前記生細胞の発する蛍光から得られる蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組のみを前記特性の判定に用いる、ことが好ましい。
また、前記判定部は、前記ドナー蛍光の蛍光強度を前記ドナー蛍光の蛍光寿命τsampleで除算して得られる除算値を複数求めて前記除算値の分布を得、前記分布において、前記除算値の平均値を中心として予め定められた範囲に含まれる除算値を持つ蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組を前記判定部の前記特性の判定に用いる、ことが好ましい。【００１５】
本発明の他の一態様は、管路、光源部、受光部、蛍光パラメータ算出部、及び判定部を有する装置を用いて行うＦＲＥＴ計測方法である。当該方法は、
ＦＲＥＴプローブと検査対象物と、を含むサンプルを管路に流す工程と、
光源部が、前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する工程と、
受光部が、前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する工程と、
複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する工程と、
検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする工程と、を有する。
前記ＦＲＥＴプローブは、ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するプローブである。
前記検査対象物は、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である。
蛍光信号を出力する工程では、前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより、受光部が、前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する。
複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する工程では、前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、蛍光パラメータ算出部が、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出するとともに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleとを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する。
前記特性の判定をする工程では、前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、判定部が、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする。【００１６】
前記特性の判定をする工程は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、前記蛍光寿命τsampleと前記蛍光強度の比Ｒsampleの前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する工程と、を有することが好ましい。【００１７】
前記第１の範囲は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETと、を複数組求めることにより、定められることが好ましい。
前記第２の範囲は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、定められる、ことが好ましい。【００１８】
前記第１の範囲を定めるとき、前記判定部が、複数組の前記蛍光寿命τFRETと前記比ＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、前記蛍光寿命τFRETが小さくなるほど前記比ＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に基いて前記第１の範囲として定め、
前記第２の範囲を定めるとき、前記判定部が、複数組の前記蛍光寿命τNON-FRETと前記比ＲNON-FRETの平均値を求め、前記平均値に基いて前記第２の範囲を定める、ことが好ましい。【００１９】
前記判定部が前記特性の判定に用いる前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択した情報である、ことが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
上述のＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法では、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができる。これによって、薬剤等の検査対象物の特性を正確に把握することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、計測プローブの種々の状態を説明する図である。
【図２】図１に示す計測プローブのドナー蛍光物質及びアクセプタ蛍光物質のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。
【図３】本発明のＦＲＥＴ計測装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。
【図４】本実施形態の受光部の一例を示す概略構成図である。
【図５】本実施形態の制御・処理部の一例を示す概略構成図である。
【図６】本実施形態の分析部の一例を示す概略構成図である。
【図７】（ａ）は、本実施形態で用いるスキャッタグラム中に定められた領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETの一例を示す図であり、（ｂ）及び（ｃ）は、領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETの設定方法を説明する図である。
【図８】（ａ），（ｂ）は、本実施形態のＦＲＥＴ発生の有無の判定に用いるデータの取得方法を説明する図である。
【図９Ａ】本実施形態のＦＲＥＴ計測方法で得られた計測結果の例を示す図である。
【図９Ｂ】本実施形態のＦＲＥＴ計測方法で得られた計測結果の例を示す図である。
【図９Ｃ】本実施形態のＦＲＥＴ計測方法で得られた計測結果の例を示す図である。
【図１０】本実施形態のＦＲＥＴ計測方法のフローの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明のＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法について詳細に説明する。
【００２３】
［計測プローブ］
本実施形態で用いる計測プローブは、ＦＲＥＴ計測装置の一実施形態である後述するフローサイトメータ１０で用いるプローブであり、ドナー蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｙとを含むＦＲＥＴプローブである。プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近して（あるいは結合）してドナー蛍光物質とアクセプタ蛍光物質が近接したとき（例えば数ｎｍの範囲内に位置するとき）、ＦＲＥＴが発生する。本実施形態のフローサイトメータ１０は、このＦＲＥＴプローブを、検査対象物（例えば薬剤）とともに含んだ検査サンプルを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。検査サンプルは、例えば、計測プローブ及び検査対象物を取り込んだ生体細胞である。検査サンプルは、計測プローブ及び検査対象物を、生体細胞を介さず液中に直接含んだ懸濁液であってもよい。
この計測プローブを用いることにより、検査対象物は、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近（あるいは結合）させる接近・結合特性、あるいはプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近（結合）した状態からプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かを調べることができる。例えば、薬剤が、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとの接近（あるいは結合）を誘発する特性、あるいは、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとの接近（あるいは結合）を阻止する特性を有するかを調べることができる。また、生体細胞内、例えば細胞核内に取り込まれた検査プローブと検査対象物との間の作用の強弱を、生体細胞の中で調べることができる。また、生体細胞の環境が変化することによって、あるいは生体細胞が例えば細胞核内で、ある物質を生成することによって、検査プローブと検査対象物との間の作用の変化を調べることができる。
なお、本実施形態のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとは、２つの別体の要素で１つのプローブ本体が形成されてもよいし、１つのプローブ本体の一部がプローブ要素Ｘ、プローブ要素Ｙとして形成されてもよい。１つのプローブ本体の一部がプローブ要素Ｘ、プローブ要素Ｙであり、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）する場合、１つのプローブ本体の屈曲角度が大きくなって折れ曲がった形状に変形することによってプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが互いに接近（あるいは結合）する。プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが分離する場合、１つのプローブ本体が折れ曲がった状態から屈曲角度が小さくなるように変形することによってプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが互いに分離することになる。
【００２４】
図１（ａ）〜（ｃ）は、計測プローブ１の種々の状態を説明する図である。計測プローブ１は、ドナー蛍光物質２を含むプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質３を含むプローブ要素Ｙとを含む。
図１（ａ）では、ドナー蛍光物質２で標識されたプローブ要素Ｘと、アクセプタ蛍光物質Ｙで標識されたプローブ要素Ｙとが互いに分離された状態を示している。この状態で検査対象物４が与えられると、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近（あるいは結合）し、これによりドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３がＦＲＥＴを発生させる程度に近接する。さらに、図１（ｂ）の状態において、さらに、別の検査対象物５を与えると、標識されたプローブ要素Ｘと、アクセプタ蛍光物質Ｙで標識されたプローブ要素Ｙとは、ドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３がＦＲＥＴを発生しない程度に分離される。本実施形態では、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近（あるいは結合）させる特性、あるいはプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙの接近（あるいは結合）した状態からプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを分離する特性を有することが未知である検査対象物４，５のような検査対象物を、ＦＲＥＴ計測装置の計測対象として用いる。勿論、ＦＲＥＴは、ドナー蛍光物質２にレーザ光が照射されることにより発生する。
また、図１（ａ）〜（ｃ）では、プローブ要素Ｘ，Ｙにそれぞれドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３が紐付けされるように標識されるが、紐付けの方法は特に限定されず、どのような方法であってもよい。
【００２５】
図２は、ドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。ドナー蛍光物質２は、例えばＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）が用いられ、アクセプタ蛍光物質３は、例えばＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）が用いられ得る。
曲線Ａ１はドナー蛍光物質２のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ａ２はドナー蛍光物質２の蛍光放射スペクトルである。また、曲線Ｂ１はアクセプタ蛍光物質３のエネルギー吸収スペクトルであり、曲線Ｂ２はアクセプタ蛍光物質３の蛍光放射スペクトルである。
図２に示されるように、ドナー蛍光物質２が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４０５ｎｍ〜４５０ｎｍである。また、アクセプタ蛍光物質３が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４７０ｎｍ〜５３０ｎｍである。
【００２６】
一般に、ドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３との距離が２ｎｍ以下である場合、レーザ光の照射によりドナー蛍光物質２が吸収したエネルギーの一部が、クーロン相互作用によりアクセプタ蛍光物質３へ移動する。アクセプタ蛍光物質３は、クーロン相互作用によりドナー蛍光物質２から移動したエネルギーを吸収することにより励起され、蛍光を発する。この現象が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。この場合、ドナー蛍光物質２の蛍光放射スペクトルである曲線Ａ２は、アクセプタ蛍光物質３のエネルギー吸収スペクトルである曲線Ｂ１と波長領域でより多く重なっていることがＦＲＥＴを強く発生させる点で好ましい。
このような計測プローブ１を用いるとき、後述するフローサイトメータ１０では、計測プローブ１にレーザ光を照射することにより計測プローブ１の発する蛍光を受光する。この蛍光の受光により、フローサイトメータ１０は、ドナー蛍光物質２が発するドナー蛍光の蛍光寿命（以降、ドナー蛍光寿命という）τsampleとレシオメトリＲsampleを算出する。レシオメトリＲsampleとは、ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度（以降、ドナー蛍光強度という）に対するアクセプタ蛍光物質３が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度（以降、アクセプタ蛍光強度という）の比である。フローサイトメータ１０は、このドナー蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleとを組として、複数組の蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleを算出する。この複数組の蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleを用いて、フローサイトメータ１０は、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができる。このため、フローサイトメータ１０は、検査対象物が接近・結合特性あるいは分離特性を有するか否かの特性の判定を正確に行うことができる。なお、以降の説明では、ドナー蛍光物質２が発する蛍光はドナー蛍光といい、アクセプタ蛍光物質２が発する蛍光はアクセプタ蛍光という。
【００２７】
［ＦＲＥＴ計測装置］
図３は、本発明のＦＲＥＴ計測装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
本実施形態のフローサイトメータ１０は、例えば、計測プローブ１と検査対象物５を含んだサンプルにレーザ光を照射し、サンプルが発する蛍光を計測する。計測された蛍光信号を用いることにより、フローサイトメータ１０は、ＦＲＥＴの判定を行う。図３に示されるように、フローサイトメータ１０は、管路２０と、光源部３０と、受光部４０，５０と、制御・処理部１００と、分析部１５０と、を備える。
【００２８】
管路２０は、高速流を形成するシース液とともにサンプルが懸濁した検査液を同時に流し、計測プローブ１を含むサンプルが一列に流れるラミナーシースフローを形成する。管路２０の途中には、レーザ光の照射位置があり、測定点を形成している。この測定点で、計測プローブ１を含むサンプルが順次レーザ光の照射により蛍光を発する。管路２０の出口には、サンプルを回収する回収容器２２が設けられている。
サンプルに含まれる計測プローブ１は、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘ及びプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）してドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とが近接した状態（ＦＲＥＴは発生する状態）において、検査対象物５が与えられたとき、図１（ｃ）に示すように、プローブ要素Ｘ及びプローブ要素Ｙとが分離されてドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３との間でＦＲＥＴが生じない状態に変化したか否かを判定するために、ＦＲＥＴの判定を行う例を用いて説明する。
【００２９】
光源部３０は、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を管路２０の測定点を通過する計測プローブ１に照射する。計測プローブ１にレーザ光が照射されることにより、ドナー蛍光物質２が主にエネルギーを吸収する。例えば、ドナー蛍光物質２がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプタ蛍光物質３がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）である場合、ドナー蛍光物質２が主にエネルギーを吸収する波長４０５ｎｍ〜４５０ｎｍのレーザ光が用いられる。光源部３０は、例えば、半導体レーザである。光源部３０が出射するレーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ〜１００ｍＷである。光源部３０から出射したレーザ光の照射を受けた計測プローブ１は、蛍光を発し、この蛍光は受光部５０で受光される。
【００３０】
受光部４０は、管路２０を挟んで光源部３０と対向するように配置されている。受光部４０は、測定点を通過する計測プローブ１によってレーザ光が前方散乱することにより、計測プローブ１が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。受光部４０から出力される前方散乱の散乱光信号は、制御・処理部１００に供給される。受光部４０から制御・処理部１００に供給される散乱光信号は、後述する信号処理部１２０において、増幅され位相検出器１２６及びローパスフィルタ１２８で処理される。また、受光部４０から出力される前方散乱光の散乱光信号は、計測プローブ１が管路２０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００３１】
受光部５０は、測定点を通り、光源部３０から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交する平面と、測定点を通り、管路２０中の計測プローブ１の移動方向に対して直交する平面との交線上に配置されている。受光部５０は、測定点にてレーザ光を照射された計測プローブ１が発する蛍光を受光し、さらに、計測プローブ１によってレーザ光が側方散乱することにより生成される側方散乱光を受光する光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を備える。
【００３２】
図４は、本実施形態の受光部５０の一例を示す概略構成図である。図４に示されるように、受光部５０は、レンズ系５１と、ダイクロイックミラー５２，５７と、バンドパスフィルター５３，５４，５８と、光電変換器５５，５６，５９と、を備える。
レンズ系５１は、計測プローブ１が発する蛍光を集束させる。ダイクロイックミラー５７は、ドナー蛍光及びアクセプタ蛍光を透過し、レーザ光の側方散乱光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められ、ダイクロイックミラー５２は、アクセプタ蛍光を透過し、ドナー蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められている。
【００３３】
バンドパスフィルター５３，５４，５８は、光電変換器５５，５６，５９の受光面の前面に設けられる。バンドパスフィルター５３，５４，５８は、所定の波長帯域の光のみを透過させる。具体的には、バンドパスフィルター５３は、ドナー蛍光分子２が主に蛍光を発する波長帯域（図２においてＡで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。また、バンドパスフィルター５４は、アクセプタ蛍光物質３が主に蛍光を発する波長帯域（図２においてＢで示される帯域）の蛍光を透過するように設定されている。バンドパスフィルター５８は、レーザ光の波長帯域の光のみを透過するように透過の波長帯域が設定されている。
【００３４】
光電変換器５５，５６，５９は、受光した光を電気信号に変換する。光電変換器５５，５６は、例えば、光電子増倍管を備えたセンサである。光電変換器５９は、例えば、フォトダイオードである。光電変換器５５，５６が受光する蛍光は、強度変調されたレーザ光よりも位相が遅れている。そのため、光電変換器５５，５６は、強度変調されたレーザ光に対する位相差の情報を持った光信号を受光し、電気信号に変換する。光電変換器５５，５６，５９から出力された信号（蛍光信号、散乱光信号）は、制御・処理部１００に供給される。
【００３５】
図５は、本実施形態の制御・処理部１００の一例を示す概略構成図である。図５に示されるように、制御・処理部１００は、信号生成部１１０と、信号処理部１２０と、コントローラ１３０と、を備える。
信号生成部１１０は、レーザ光の強度を時間変調するための変調信号を生成する。変調信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号であり、１０ＭＨｚ〜４００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
信号生成部１１０は、発振器１１２と、パワースプリッタ１１４と、増幅器１１６，１１８と、を備える。発振器１１２により生成された変調信号は、パワースプリッタ１１４により分けられ増幅された後、光源部３０と信号処理部１２０とに供給される。信号生成部１１０が変調信号を信号処理部１２０に供給するのは、後述するように、変調信号に対するドナー蛍光物質２の発した蛍光（ドナー蛍光）の位相差、より具体的には、変調信号に対する蛍光信号の位相差を求めるための参照信号として用いるためである。また、変調信号は、光源部３０が出射するレーザ光の振幅を変調するための信号として用いられる。
【００３６】
信号処理部１２０は、蛍光信号と変調信号とを用いて、計測プローブ１が発するドナー蛍光の変調信号に対する位相差の情報を求める。さらに、信号処理部１２０は、受光部４０から送られてきた前方散乱光の散乱光信号と光電変換器５９から送られてきた側方散乱光の散乱光信号とを用いて、前方散乱光の強度及び側方散乱光の強度の情報を求める。
信号処理部１２０は、増幅器１２２，１２３，１２４，１２５と、位相差検出器１２６と、ローパスフィルタ１２８と、を備える。
増幅器１２２，１２３，１２４，１２５は、光電変換器５５，５６，５９及び受光部４０から出力される蛍光信号、散乱光信号を増幅し、増幅した蛍光信号、散乱光信号を位相差検出器１２６に出力する。
【００３７】
位相差検出器１２６は、受光部４０、光電変換器５５，５６，５９及び受光部４０から出力されたドナー蛍光及びアクセプタ蛍光の蛍光信号、前方散乱光の散乱光信号及び側方散乱光の散乱光信号のそれぞれについて、変調信号（参照信号）に対する位相差を検出する。位相差検出器１２６は、不図示のＩＱミキサを備えている。ＩＱミキサは、参照信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。また、ＩＱミキサは、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。なお、前方散乱光及び側方散乱光の散乱光信号は、レーザ光の散乱による信号であるため、変調信号（参照信号）に対する位相差は０である。
ローパスフィルタ１２８は、位相差検出器１２６から出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分と高周波成分を含む信号から、高周波成分を取り除き、蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を取り出す。これにより、信号処理部１２０は、ドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第１の位相差）の情報を得る。また、ローパスフィルタ１２８は、位相差検出器１２６から出力された前方散乱光及び側方散乱光の散乱光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分と高周波成分を含む信号から、高周波成分を取り除き、散乱光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を取り出す。
【００３８】
コントローラ１３０は、信号生成部１１０が設定された変調周波数の正弦波信号を変調信号として生成するように、信号生成部１１０を制御する。また、コントローラ１３０は、信号処理部１２０により出力された蛍光信号及び散乱光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分をＡＤ変換する。
【００３９】
コントローラ１３０は、増幅器１３４と、Ａ／Ｄ変換器１３６と、システム制御器１３８と、を備える。増幅器１３４は、処理部１２０から送られた蛍光信号及び散乱光信号ののｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅し、Ａ／Ｄ変換器１３６に出力する。Ａ／Ｄ変換器１３６は、蛍光信号及び散乱光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号をサンプリングし、分析装置１５０に供給する。システム制御器１３８は、計測部４０から出力されるトリガ信号の入力を受ける。また、システム制御器１３８は、発振器１１２とＡ／Ｄ変換器１３６を制御する。
【００４０】
分析部１５０は、ドナー蛍光の蛍光信号、アクセプタ蛍光の蛍光信号、前方散乱光の散乱光信号及び側方散乱光りの散乱光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号から、蛍光寿命、蛍光強度、前方散乱光強度、側方散乱光強度などを算出する。
分析部１５０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置である。図６は、本実施形態の分析部１５０の一例を示す概略構成図である。図６に示されるように、分析部１５０は、ＣＰＵ１５２と、メモリ１５４と、入出力ポート１５６と、を有し、プログラムを起動することにより、パラメータ算出部１６０と、判定部１６２と、を備える。
また分析部１５０には、入出力ポート１５６を通して、ディスプレイ２００が接続されている。また、分析部１５０は、入出力ポート１５６を通して、コントローラ１３０とも接続されている。
【００４１】
ＣＰＵ１５２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサである。ＣＰＵ１５２は、パラメータ算出部１６０、判定部１６２の各種計算を実質的に実行する。
メモリ１５４は、コンピュータ上で起動することにより、パラメータ算出部１６０、判定部１６２をモジュールとして形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらの部分により算出された処理結果や入出力ポート１５６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備える。
【００４２】
入出力ポート１５６は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号、散乱光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を受ける。また、入出力ポート１５６は、各部により算出された処理結果をディスプレイ２００に出力する。
ディスプレイ２００は、各部により求められた各種情報や処理結果などを表示する。
【００４３】
パラメータ算出部１６０は、コントローラ１３０から供給されるドナー蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を用いて、ドナー蛍光物質２の蛍光寿命を算出する。例えば、パラメータ算出部１６０は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値から、変調信号に対する蛍光信号の位相差（第１の位相差）を求める。また、パラメータ算出部１６０は、求めた位相差を用いて、ドナー蛍光物質２の蛍光寿命を算出する。具体的に、パラメータ算出部１６０は、τsample ＝ｔａｎθ／（２πｆ）に基づいて、位相差θのｔａｎ成分を変調信号の角周波数２πｆ（ｆは変調周波数）で除算することにより、計測プローブ１のドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出する。蛍光寿命は、レーザ光の照射により発せられる蛍光成分が、１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数で表される。
【００４４】
パラメータ算出部１６０は、さらに、コントローラ１３０から供給されるドナー蛍光の蛍光信号、アクセプタ蛍光の蛍光信号、前方散乱光の散乱光信号、及び側方散乱光の散乱光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を用いて、ドナー蛍光の蛍光強度、アクセプタ蛍光の蛍光強度、前方散乱光の強度、及び、後方散乱光の強度を算出する。具体的には、パラメータ度算出部１６０は、ドナー蛍光及びアクセプタ蛍光それぞれの蛍光信号、前方散乱光及び側方散乱光の散乱光信号のｃｏｓ成分（実数部）及びｓｉｎ成分（虚数部）の値の２乗加算和の平方根を求めることで、蛍光強度、前方散乱光、及び側方散乱光の強度を算出する。
【００４５】
判定部１６２は、計測プローブ１が測定点を通過する毎に計測して得られる複数組の蛍光寿命τsampleと比（以降、レシオメトリという）Ｒsampleを用いて、検査対象物５が分離特性を有するか否かの特性の判定をする。上記蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleの組の数をＮとする。具体的には、判定部１６２は、ＦＲＥＴが発生するときの蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleのとり得る第１の範囲と、ＦＲＥＴが発生しないときの蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleのとり得る第２の範囲を、予め定めておく。判定部１６２は、計測された蛍光寿命τsampleと蛍光強度のレシオメトリＲsampleの複数組全体の中から、上記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した第１の組の群の数Ｎ1の上記複数組全体の数Ｎに対する第１の比率Ｎ1／Ｎを求める。同様に、判定部１６２は、第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した第２の組の群の数Ｎ2の上記複数組全体の数Ｎに対する第２の比率Ｎ2／Ｎを求める。判定部１６２は、求めた第１の比率Ｎ1／Ｎと第２の比率Ｎ2／Ｎを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、検査対象物５の分離特性の有無を判定する。
上記第１の範囲及び第２の範囲に関して、判定部１６２は、例えば以下の方法を用いて設定することができるが、これ以外の方法を用いて第１の範囲及び第２の範囲を設定することもできる。
【００４６】
具体的には、判定部１６２は、横軸に蛍光寿命τsampleをとり、縦軸にレシオメトリＲsampleをとったスキャッタグラムにおいて、上記第１の範囲で定まる領域を領域ＺFRETとし、上記第２の範囲で定まる領域を領域ＺNON-FRETとする。図７（ａ）は、領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETの一例を示す図である。
このとき、第１の範囲の設定、すなわち、領域ＺFRETの設定は、計測プローブ１を含み、計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、フローサイトメータ１０で計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比であるレシオメトリＲFRETと、を複数組求めることにより定めることができる。
同様に、第２の範囲の設定、すなわち、領域ＺNON-FRETの設定も、計測プローブ１を含み、計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、フローサイトメータ１０で計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比であるレシオメトリＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、定めることができる。
【００４７】
領域ＺFRETの設定については、判定部１６２は、ポジティブコントロールサンプルを用いて得られた複数組の蛍光寿命τFRETとレシオメトリＲFRETのデータを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、蛍光寿命τFRETが小さくなるほどレシオメトリＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、この回帰直線あるいは回帰曲線に基いて蛍光寿命τFRET及びレシオメトリＲFRETのとり得る範囲を定めることで、領域ＺFRETを定めることが好ましい。判定部１６２は、例えば、蛍光寿命τFRETの標準偏差をστとしたとき、例えば±ａ・στ（ａは、例えば１以上３以下の与えられた数）の範囲によって規定される蛍光寿命τFRETのとり得る範囲±Δτを上記回帰直線あるいは回帰曲線の周りに付加し、さらに、レシオメトリＲFRETの標準偏差をσRとしたとき、ｂ・σR（ｂは、例えば１以上３以下の与えられた数）で規定される±ΔＲをレシオメトリＲFRETの平均値に付加して、レシオメトリＲFRETのとり得る範囲を定める。
また、判定部１６２は、複数組の蛍光寿命τNON-FRETとレシオメトリＲNON-FRETの平均値を求め、この平均値に基いて蛍光寿命τNON-FRETとレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲を定めることで、領域ＺNON-FRETを定めることが好ましい。判定部１６２は、例えば、蛍光寿命τFRETの標準偏差をστとし、レシオメトリＲFRETの標準偏差をσRとしたとき、例えばｃ・στ（ｃは、１以上３以下の与えられた数）の値及びｄ・σR（ｄは、例えば１以上３以下の与えられた数）の値のうち、小さい方、あるいは大きい方を半径とする円、あるいは両者を半径とする楕円の領域を領域ＺNON-FRETとして定めることができる。あるいは、スキャッタグラム中にプロットされたデータの数のうち、４０％〜１００％のデータが含まれる、上記平均値を中心とした円によって領域ＺNON-FRETを定めることもできる。
ポジティブコントロールサンプルを用いて得られたスキャッタグラム中のプロットされた複数のデータ（ポジティブコントロールサンプルのデータ）の領域と、ネガティブコントロールサンプルを用いて得られたスキャッタグラムｇ中のプロットされた複数のデータ（ネガティブコントロールサンプルのデータ）の領域との間に重なりがある、すなわち、ネガティブコントロールサンプルを用いて定めた領域ＺNON-FRET中に、ポジティブコントロールサンプルを用いて得られたスキャッタグラム中のプロットされたデータが多数含まれている場合がある。この場合、ポジティブコントロールサンプルのデータのうち、領域ＺNON-FRETに含まれるデータを除いた残りのデータを用いて、領域ＺFRETを設定することができる。ポジティブコントロールサンプルのデータが、領域ＺNON-FRETに含まれ易い場合と、ネガティブコントロールサンプルのデータが、領域ＺFRETに含まれ易い場合とがある。後者の場合、領域ＺFRETを先に設定し、ネガティブコントロールサンプルのデータから、この領域ＺFRETに含まれるネガティブコントロールサンプルのデータを除いて、領域ＺNON-FRETを設定することができる。
【００４８】
図７（ｂ）は、ポジティブコントロールサンプルを用いて得られた蛍光寿命τFRETとレシオメトリＲFRETの複数組がプロットされた結果と設定された領域ＺFRETの例を示し、さらに回帰直線の例を示している。図７（ｃ）は、ネガティブコントロールサンプルを用いて得られた蛍光寿命τNON-FRETとレシオメトリＲNON-FRETの複数組がプロットされた結果と領域ＺNON-FRETの例を示している。
【００４９】
図８（ａ）は、検査サンプルを用いて、ドナー蛍光強度とアクセプタ蛍光強度を二軸として、フローサイトメータ１０で計測して得られるドナー蛍光強度とアクセプタ蛍光強度をプロットしたスキャッタグラムを示す。このスキャッタグラムでは、領域Ｚ1に含まれるデータのみを選択して、ＦＲＥＴの有無を判定することが好ましい。すなわち、検査対象物５の特性の判定に用いる複数のプロット、すなわち、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、判定の前に、ドナー蛍光の蛍光強度及びアクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択された情報であることが好ましい。例えば、ドナー蛍光強度及びアクセプタ蛍光強度のそれぞれが予め設定された値以上である蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組を判定部１６２のＦＲＥＴの判定、ひいては検査対象物５の特性の判定に用いることが好ましい。このようなデータは、プローブ要素Ｘ及びプローブ要素Ｙに多数のドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３が標識として付着していることに由来するので、ＦＲＥＴの有無の判定をより正確に行うことができる。より好ましくは、ドナー蛍光強度及びアクセプタ蛍光強度のそれぞれが予め設定された値以上であり、かつ、別に設定された値以下である蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組を、ＦＲＥＴの判定、ひいては検査対象物５の特性の判定に用いることが好ましい。
【００５０】
なお、判定部１６２は、蛍光寿命τFRET及びレシオメトリＲFRETをそれぞれ横軸及び縦軸に採ったスキャッタグラムにおいて、領域ＺFRETに位置する蛍光寿命τsample及びレシオメトリＲsampleの各プロットした位置から上述した回帰直線（図７（ｂ）参照）あるいは回帰曲線に至る最短距離の逆数（あるいは最短距離の二乗の逆数）が大きくなる程値が大きくなる重み付け係数によりプロットの数を重み付けして累積した値を、領域ＺFRET内に位置するプロットの数Ｎ1として用いることもできる。つまり、スキャッタグラム中の領域ＺFRET内のプロット毎に上記重み係数を決定し、この重み係数の加算値を、領域ＺFRET内に位置するプロットの数Ｎ1として用いることもできる。上記回帰直線あるいは回帰曲線の近傍に位置するデータが少ないほど、上記加算した値が小さくなる。この場合、判定部１６２は、上記重み付けにより得られた加算した値を、データのばらつきを考慮した領域ＺSAMPLE内に位置する第１の組の群の数Ｎ1の情報として取得することになるので、ＦＲＥＴの発生の有無をより正確に判定することができる。また、領域ＺNON-SAMPLE内に位置する蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleの各プロットの位置から領域ＺNON-SAMPLEの平均値の位置に至る最短距離の逆数（あるいは最短距離の二乗の逆数）が大きくなる程値が大きくなる重み付け係数によりプロットの数を重み付けして累積した値を、つまり、各プロット毎に上記重み係数を決定し、この重み係数を加算した値を、領域ＺNON-SAMPLE内に位置する第２の組の群の数Ｎ2の情報として用いることもできる。
【００５１】
また、計測プローブ１が生体細胞に取り込まれ、計測プローブ１を取り込んだ生体細胞がレーザ光の照射を受ける場合、判定部１６２は、検査サンプルを用いてフローサイトメータ１０で計測した前方散乱光の強度と側方散乱光の強度を横軸及び縦軸にとったスキャッタグラムにおいて、予め定めた生体細胞が生細胞であることを示す領域Ｚ2に含まれるデータのみを選択して、ＦＥＲＴの有無の判定に用いてもよい。生体細胞が死細胞である場合、生体細胞の表面に凹凸が形成され、細胞のサイズも縮小することから、レーザ光の散乱特性にも変化が生じる。図８（ｂ）に示す領域Ｚ3は、死細胞である領域である。このような領域Ｚ2,Ｚ3は予め生細胞及び死細胞を用いてフローサイトメータ１０を通して計測することにより、予め取得することができる。
【００５２】
また、図７（ｂ）に示す領域ＺFRETに含まれるプロットされたデータを用いて、回帰分析あるいは主成分分析を行うことによって回帰直線が得られたとき、判定部１６２は、回帰分析あるいは主成分分析によって求められる回帰直線の軸あるいは主成分軸の軸方向の分散と、この軸方向に対して直交する方向における分散の比を利用して、ＦＲＥＴの発生の有無の信頼性の判定を行うこともできる。例えば、複数種類のサンプルについて計測したとき、分散比が小さい（扁平率が大きい）結果ほど信頼性が高いと判定することも可能である。
【００５３】
また、ドナー蛍光強度をドナー蛍光の蛍光寿命で除算した除算値は、ドナー蛍光物質２によってプローブ要素Ｘが標識された量に比例するので、判定部１６２は、複数の計測プローブ１を計測して得られる複数の上記除算値から、除算値の分布を表すヒストグラムをつくり、このヒストグラムにおいて、除算値の平均値±ｅ・σ（σは除算値の標準偏差であり、ｅは１以上２以下の与えられた数）の範囲に含まれるデータのみを用いてＦＲＥＴの有無の判定、ひいては、検査対象物５の分離特性の有無の判定をしてもよい。除算値の平均値±ｅ・σの範囲に含まれるデータは、プローブ要素Ｘを標識するドナー蛍光物質２の量が概略揃っているので、ＦＲＥＴも安定して発生し易い。
【００５４】
図９Ａは、ポジティブコントロールサンプルを管路２０に流してフローサイトメータ１０で計測した結果のスキャッタグラムの例を示す。
図９Ｂ，Ｃは、２種の検査対象物質５を、計測プローブ１に加えた検査サンプルを管路２０に流してフローサイトメータ１０で計測した結果のスキャッタグラムの例を示す。なお、図９Ａに示すように、ポジティブコントロールサンプルのデータのうち、領域ＺFRET内に位置するデータ数は、全体のデータ数の３７．１％であり、領域ＺNON-FRET内に位置するデータ数は、全体のデータ数の２４．５％であった。
これに対して、図９Ｂに示す例では、領域ＺFRET内に位置する第１の組の群のデータ数（プロット数）の第１の比率Ｎ1／Ｎは、６．６６％であり、領域ＺNON-FRET内に位置する第２の組の群のデータ数（プロット数）の第２の比率Ｎ2／Ｎは、５８％である。
図９Ｃに示す例では、領域ＺFRET内に位置する第１の組の群のデータ数（プロット数）の第１の比率Ｎ1／Ｎは５．４１％であり、領域ＺNON-FRET内に位置する第２の組の群のデータ数（プロット数）の第２の比率Ｎ2／Ｎは６０％である。これらの２種の検査対象物質５を用いた例では、いずれもＦＲＥＴが発生し難くなり、２種の検査対象物質５は分離特性を有すると判定する。さらに、判定部１６２は、図９Ｃに示す例において用いた検査対象物質５の方が、図９Ｂに示す例において用いた検査対象物質５に比べてＦＲＥＴが発生しにくいと判断し、図９Ｃに示す例において用いた検査対象物５の方が、図９Ｂに示す例において用いた検査対象物５に比べてより高い分離特性を有すると判定する。
勿論、判定部１６２は、第１の比率Ｎ1／Ｎと第２の比率Ｎ2／Ｎのそれぞれに閾値を設定しておき、得られた第１の比率Ｎ1／Ｎと第２の比率Ｎ2／Ｎを、それぞれの閾値と比較することにより、ＦＲＥＴの発生の有無を判定し、この判定によって分離特性の有無を判定してもよい。
【００５５】
このように、本実施形態のフローサイトメータ１０は、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いるので、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができ、ひいては、薬剤等の検査対象物５が接近・結合特性あるいは分離特性を有するか否かの特性の判定を正確に行うことができる。
【００５６】
判定部１６２は、ＦＲＥＴが発生するときの蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleのとり得る第１の範囲と、ＦＲＥＴが発生しないときの蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、上述した第１の比率Ｎ1／Ｎと第２の比率Ｎ2／Ｎを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。このため、判定部１６２は、検査対象物５の特性の有無をより正確に判定することができる。
【００５７】
判定部１６２は、ポジティブコントロールサンプルを用いて、フローサイトメータ１０で計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETとレシオメトリＲFRETを複数組求めることにより、第１の範囲、すなわちスキャッタグラムにおける領域ＺFRETを定める。また、判定部１６２は、ネガティブコントロールサンプルを用いて、フローサイトメータ１０で計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETとレシオメトリＲNON-FRETを複数組求めることにより、第２の範囲、すなわちスキャッタグラムにおける領域ＺFRETを予め定める。したがって、同じフローサイトメータ１０の装置を用いて、検査サンプルの計測及び検査対象物５の判定を正確に行うことができる。
【００５８】
また、判定部１６２は、複数組の蛍光寿命τFRETとレシオメトリＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、蛍光寿命τFRETが小さくなるほどレシオメトリＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、この回帰直線あるいは回帰曲線に基いて第１の範囲、すなわちスキャッタグラムにおける領域ＺFRETを定める。さらに、判定部１６２は、複数組の蛍光寿命τNON-FRETとレシオメトリＲNON-FRETの平均値を求め、この平均値に基いて第２の範囲、すなわちスキャッタグラムにおける領域ＺNON-FRETを定める。このため、フローサイトメータ１０のオペレータの恣意によらずに定量的に第１の範囲及び第２の範囲を定めることができる。
【００５９】
［ＦＲＥＴ計測方法］
図１０は、本実施形態のＦＲＥＴ計測方法の一例のフローを示す図である。図１０に示すフローは、図１（ｂ）に示す状態にある計測プローブ１に検査対象物５を与えたとき、検査対象物５は、図１（ｃ）に示すような作用を発する特性を有するか、すなわち、検査対象物５は、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを分離する特性を有するか否かを判定する例を用いて説明する。
【００６０】
まず、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）し、ドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とが近接し、ＦＲＥＴが発生する状態に位置する状態にある計測プローブ１が用意される。この計測プローブ１と検査対象物５とを含ませた検査サンプルが作成される。
この状態で、計測プローブ１のプローブ要素Ｘ、プローブ要素Ｙの種類は既知であるので、予めフローサイトメータ１０で計測されて設定され、メモリ１５４に記憶されていたスキャッタグラムにおける領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETを、判定部１６２は呼び出して、スキャッタグラム内に設定する（ステップＳ１０）。このようなスキャッタグラムと領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETは、ディスプレイ２００に表示される。
領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETは、例えば、予めポジティブコントロールサンプル及びネガティブコントロールサンプルを用いてフローサイトメータ１０で計測されることで抽出される。領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETは、例えば、計測された蛍光寿命τFRETとレシオメトリＲFRETの複数の組と、蛍光寿命τNON-FRETとレシオメトリＲNON-FRETの複数の組のスキャッタグラムから、上述したように主成分分析あるいは回帰分析を含む統計的処理により設定される。
【００６１】
次に、フローサイトメータ１０は、作成された検査サンプルを管路２０に流す（ステップＳ２０）。このとき、光源部３０が、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を管路２０に出射する（ステップＳ３０）。これにより、レーザ光の収束した管路２０上の測定点を通過する計測プローブ１は、レーザ光の照射を受けて蛍光を発する。さらに、受光部５０は、計測プローブ１の発した蛍光を受光して、蛍光信号を出力する（ステップＳ４０）。
【００６２】
信号処理部１２０は、受光部５０が出力した蛍光信号を信号処理して、蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を生成する。すなわち、信号処理部１２０は、計測プローブ１が発するドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第１の位相差）の情報を求める。
【００６３】
さらに、分析部１５０は、蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を用いてドナー蛍光の蛍光寿命τSAMPLEと、ドナー蛍光強度に対するアクセプタ蛍光強度の比であるレシオメトリＲSAMPLEを算出する（ステップＳ５０）。本実施形態では、サンプル中の計測プローブ１が管路２０の計測点を通過してレーザ光の照射を受けるたびに、蛍光寿命τSAMPLEとレシオメトリＲSAMPLEが算出されるので、検査サンプルの全てを調べたとき、極めて多数の蛍光寿命τSAMPLEとレシオメトリＲSAMPLEのデータが得られる。したがって、判定部１６２は、蛍光寿命τSAMPLEとレシオメトリＲSAMPLEに関する多数のデータを取得するたびに、スキャッタグラムにプロットする（ステップＳ６０）。こうして図９Ｂ，Ｃに示されるようなスキャッタグラムが作成される。
【００６４】
判定部１６２は、予め設定された領域ＺFRET及び領域ＺNON-FRETのそれぞれに含まれるデータ数をカウントし、第１の比率Ｎ1／Ｎと第２の比率Ｎ2／Ｎを算出する（ステップＳ７０）。
判定部１６２は、さらに、第１の比率Ｎ1／Ｎと第２の比率Ｎ2／Ｎを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する（ステップＳ８０）。具体的には、第１の比率Ｎ1／Ｎが予め定められた閾値Ｔｈ1以下であり、かつ、第２の比率Ｎ2／Ｎが予め定められた閾値Ｔｈ2以上であるか否かを判定する。
判定結果が肯定である場合、ＦＲＥＴの発生はないと判断し、判定部１６２は、検査対象物５は分離特性を有すると判定する（ステップＳ９０）。一方、判定結果が否定である場合、ＦＲＥＴの発生はあると判断し、判定部１６２は、検査対象物５は分離特性を有さないと判定する（ステップＳ１００）。
【００６５】
本実施形態では、第１の比率Ｎ1／Ｎが予め定められた閾値Ｔｈ1以下であり、かつ、第２の比率Ｎ2／Ｎが予め定められた閾値Ｔｈ2以上であるか否かを判定するが、判定部１６２は、第１の比率Ｎ1／Ｎが予め定められた閾値Ｔｈ1以下であるか否かと、第２の比率Ｎ2／Ｎが予め定められた閾値Ｔｈ2以上であるか否、のいずれか一方のみを判定条件に用いることもできる。
また、判定部１６２は、検査対象物５と計測プローブ１を含む検査サンプルを計測したときの第１の比率Ｎ1／Ｎを、ポジディブコントロールサンプルの計測プローブ１を計測したときの第１の比率Ｎ1／Ｎで除算した値を１から減算して得られる減少率（下記式参照）が予め定められた閾値以下であるか否かを判定条件に用いることもできる。
減少率＝１−（検査サンプルの第１の比率Ｎ1／Ｎ）／（ポジディブコントロールサンプルの第１の比率Ｎ1／Ｎ）
【００６６】
図９Ｂに示す例では、上記減少率は０．８２０（＝１−６．６６％／３７．１％）であり、図９Ｃに示す例では、上記減少率は０．８５４（＝１−５．４１％／３７．１％）である。この場合、閾値として例えば０．３０を設定する場合、判定部１６２は、図９Ｂに示す例及び図９Ｃに示す例はいずれも、分離特性を有すると判定することができる。また、図９Ｃに示す例の減少率の値は、図９Ｂに示す例の減少率の値に比べて大きいため、判定部１６２は、図９Ｃに示す例のほうが、図９Ｂに示す例に比べてより高い分離特性を有すると判定することができる。
【００６７】
このような判定結果は、ディスプレイ２００に表示される。
こうして、フローサイトメータ１０は、検査対象物５が計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙを分離する特性を有するか否かを短時間に判定することができる。
【００６８】
本実施形態のＦＲＥＴ計測方法は、例えば、白血病の分子標的治療薬の感受性試験の開発に好適に用いることができる。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、遺伝子の異常（９番と２２番の染色体の転座）により、異常タンパク（ＢＣＲ−ＡＢＬ）が細胞内に発生し発症する慢性骨髄性増殖疾患である。例えば、計測プローブ１のプローブ要素Ｘ及びプローブ要素Ｙとして、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬が用いられる。この試薬は、ＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子により修飾され、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片からなる。この試薬には、例えばＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ及びそれらの変異体よりなる群から選択される蛍光タンパクが連結される。この試薬を用いて本実施形態のＦＲＥＴ計測方法でＦＲＥＴの有無を判定することにより、検査対象物５としてのチロシンキナーゼ阻害薬剤を効率よくスクリーニングすることができる。このような試薬については、特開２００９−２７８９４２号公報に記載されている。
【００６９】
以上、本発明のＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態および例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００７０】
１  計測プローブ
２  ドナー蛍光物質
３  アクセプタ蛍光物質
４，５  検査対象物
１０  フローサイトメータ
２０  管路
２２  回収容器
３０  光源部
４０，５０  受光部
５１  レンズ系
５２，５７  ダイクロイックミラー
５３，５４，５８  バンドパスフィルター
５５，５６，５９  光電変換器
１００  制御・処理部
１１０  信号生成部
１１２  発振器
１１４  パワースプリッタ
１１６，１１８  増幅器
１２０  信号処理部
１２２，１２３，１２４，１２５  増幅器
１２６  位相差検出器
１２８  ローパスフィルタ
１３０  コントローラ
１３４  増幅器
１３６  Ａ／Ｄ変換器
１３８  システム制御器
１５０  分析装置
１５２  ＣＰＵ
１５４  メモリ
１５６  入出力ポート
１６０  パラメータ算出部
１６２  判定部
２００  ディスプレイ
Ｘ，Ｙ  プローブ要素
【図１】
2013141368.tif 000003
【図２】
2013141368.tif 000004
【図３】
2013141368.tif 000005
【図４】
2013141368.tif 000006
【図５】
2013141368.tif 000007
【図６】
2013141368.tif 000008
【図７】
2013141368.tif 000009
【図８】
2013141368.tif 000010
【図９Ａ】
2013141368.tif 000011
【図９Ｂ】
2013141368.tif 000012
【図９Ｃ】
2013141368.tif 000013
【図１０】
2013141368.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月2日(2014.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲＥＴ計測装置であって、
ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含むサンプルが流れる管路と、
前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する光源部と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出し、さらに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する蛍光パラメータ算出部と、
前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする判定部と、を有し、
前記判定部は、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求め、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求め、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する、ことを特徴とするＦＲＥＴ計測装置。
【請求項２】
前記判定部は、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETと、を複数組求めることにより、前記第１の範囲を定め、
前記判定部は、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、前記第２の範囲を定める、請求項１に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項３】
前記判定部は、複数組の前記蛍光寿命τFRETと前記比ＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、前記蛍光寿命τFRETが小さくなるほど前記比ＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に基いて前記第１の範囲を定め、
前記判定部は、複数組の前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値と前記比ＲNON-FRETの平均値を求め、２つの前記平均値に基いて前記第２の範囲を定める、請求項２に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項４】
前記判定部は、前記蛍光寿命τFRET及び前記比ＲFRETをそれぞれ横軸及び縦軸に採ったスキャッタグラムにおいて、前記第１の組の群に含まれる蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleの各プロット位置から前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に至る最短距離の逆数が大きくなる程値が大きくなる重み付け係数を、前記第１の組の群に含まれる蛍光寿命τsample及び比Ｒsampleのプロット毎に決定し、決定した前記重み係数の加算値を、前記第１の組の群の数として用いる、請求項３に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項５】
前記特性の判定に用いる前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、前記判定の前に、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択された情報である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項６】
前記ＦＲＥＴプローブが生体細胞に取り込まれ、
前記受光部は、前記生体細胞に取り込まれた前記ＦＲＥＴプローブの発する前記蛍光を受光するとき、前記レーザ光の前記ＦＲＥＴプローブによる側方散乱光と前方散乱光を計測し、前記側方散乱光と前方散乱光の計測結果に基づいて、前記ＦＲＥＴプローブを取り込んだ前記生体細胞が生細胞か否かを判定することにより、前記生細胞の発する蛍光から得られる蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組のみを前記特性の判定に用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項７】
前記判定部は、前記ドナー蛍光の蛍光強度を前記ドナー蛍光の蛍光寿命τsampleで除算して得られる除算値を複数求めて前記除算値の分布を得、前記分布において、前記除算値の平均値を中心として予め定められた範囲に含まれる除算値を持つ蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleの複数の組を前記判定部の前記特性の判定に用いる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項８】
管路、光源部、受光部、蛍光パラメータ算出部、及び判定部を有する装置を用いて行うＦＲＥＴ計測方法であって、
ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含むサンプルを管路に流す工程と、
光源部が、前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する工程と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより、受光部が、前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する工程と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、蛍光パラメータ算出部が、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出するとともに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleとを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する工程と、
前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、判定部が、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする工程と、を有し、
前記特性の判定をする工程は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、前記蛍光寿命τsampleと前記蛍光強度の比Ｒsampleの前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する工程と、を有する、ことを特徴とするＦＲＥＴ計測方法。
【請求項９】
前記第１の範囲は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τFRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETと、を複数組求めることにより、定められ、
前記第２の範囲は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記判定部を通して計測されるドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETと、を複数組求めることにより、定められる、請求項８に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１０】
前記第１の範囲を定めるとき、前記判定部が、複数組の前記蛍光寿命τFRETと前記比ＲFRETを回帰分析あるいは主成分分析を行うことにより、前記蛍光寿命τFRETが小さくなるほど前記比ＲFRETが増大する回帰直線あるいは回帰曲線を求め、前記回帰直線あるいは前記回帰曲線に基いて前記第１の範囲を定め、
前記第２の範囲を定めるとき、前記判定部が、複数組の前記蛍光寿命τNON-FRETと前記比ＲNON-FRETの平均値を求め、前記平均値に基いて前記第２の範囲を定める、請求項９に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１１】
前記判定部が前記特性の判定に用いる前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleは、前記判定の前に、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度に基いて選択した情報である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の一態様は、ＦＲＥＴ計測装置である。当該装置は、管路と、光源部と、受光部と、蛍光パラメータ算出部と、判定部を有する。
前記管路には、ＦＲＥＴプローブと検査対象物と、を含むサンプルが流れる。
前記ＦＲＥＴプローブは、ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するプローブである。
前記検査対象物は、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である。
前記光源部は、前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する。
前記受光部は、前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する。
前記蛍光パラメータ算出部は、前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出し、さらに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する。
前記判定部は、前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする。
前記判定部は、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定める。この場合、前記判定部は、前記蛍光寿命τsampleと前記蛍光強度の比Ｒsampleの前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求める。さらに、前記判定部は、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求める。前記判定部は、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の他の一態様は、管路、光源部、受光部、蛍光パラメータ算出部、及び判定部を有する装置を用いて行うＦＲＥＴ計測方法である。当該方法は、
ＦＲＥＴプローブと検査対象物と、を含むサンプルを管路に流す工程と、
光源部が、前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する工程と、
受光部が、前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する工程と、
複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する工程と、
検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする工程と、を有する。
前記ＦＲＥＴプローブは、ドナー蛍光物質で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識したプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するプローブである。
前記検査対象物は、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙの接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である。
蛍光信号を出力する工程では、前記強度変調した前記レーザ光を前記サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより、受光部が、前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する。
複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する工程では、前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、蛍光パラメータ算出部が、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出するとともに、前記蛍光信号を用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記ＦＲＥＴプローブの前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleとを組として、複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを算出する。
前記特性の判定をする工程では、前記複数組の蛍光寿命τsampleと比Ｒsampleを用いて、判定部が、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かの特性の判定をする。
前記特性の判定をする工程は、
前記判定部が、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第１の範囲と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記蛍光寿命τsampleと前記比Ｒsampleのとり得る第２の範囲を、予め定め、前記蛍光寿命τsampleと前記蛍光強度の比Ｒsampleの前記複数組全体の中から、前記第１の範囲に含まれる第１の組の群を抽出し、抽出した前記第１の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第１の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第２の範囲に含まれる第２の組の群を抽出し、抽出した前記第２の組の群の数の前記複数組全体の数に対する第２の比率を求める工程と、
前記判定部が、前記第１の比率と前記第２の比率を用いて、前記ＦＲＥＴの発生の有無を判定することにより、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する工程と、を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2013141368.tif 000015
2013141368.tif 000016
2013141368.tif 000017