(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン組成物であって、
少なくとも１種のノロウイルスＶＬＰ抗原及び少なくとも１種のロタウイルスＶＰ６抗原を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
抗原性カプシドペプチド及び抗原性カプシドタンパク質から成る群から選択されるノロウイルス抗原を更に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ノロウイルス抗原が、ＧＩ及びＧＩＩノロウイルス並びにこれらの遺伝子型から成る群由来である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ノロウイルス抗原がＧＩＩ−４  ＶＬＰである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＧＩＩ−４  ＶＬＰが一価である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ノロウイルス抗原が２種以上のＶＬＰタイプを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ロタウイルスＶＰ６抗原が、ｒＶＰ６タンパク質、２層ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰ及びＶＰ６タンパク質を含むＶＬＰ並びにこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ｒＶＰ６が、細管、球体、シート及びこれらの組み合わせから成る群から選択される多量体の形態である、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
無菌で非毒性の薬学的に許容可能な生理学的担体を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ノロウイルス及びロタウイルスへの感染、ウイルスを原因とする下痢及び嘔吐を伴う疾患並びに胃腸炎から成る群から選択される疾患の予防に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物の製造方法であって、
単一の宿主において少なくとも１種のノロウイルスＶＬＰ抗原及び少なくとも１種のロタウイルスＶＰ６抗原を同時発現させること、あるいは
（ａ）少なくとも１種のノロウイルスＶＬＰ抗原を作製、単離及び精製し、
（ｂ）少なくとも１種のロタウイルスＶＰ６抗原を作製、単離及び精製し、
（ｃ）前記ノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原を混合するステップを含む
ことを特徴とする製造方法。
【請求項１２】
前記抗原を、組み換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞宿主において作製する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に幼児における胃腸炎を予防するためのワクチン製剤に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１種のノロウイルス抗原及び少なくとも１種のロタウイルス抗原を含む混合ワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、世界では５０００００人を超える幼児がロタウイルス胃腸炎が原因で死亡している。レオウイルス科に属するロタウイルス（ＲＶ）は、先進国でも幼児に重篤な下痢を引き起こす最も重要な病原体であり、発展国と比較すると死亡数は少ないものの、数多くの子供が費用のかかる入院となる。経口生ロタウイルスワクチンが２００６年から利用できるようになった。現在、ＷＨＯ及び数多くの国々が共に、全ての健康な子供へのロタウイルスのワクチン投与を推奨している。
【０００３】
経口生ロタウイルスワクチンの開発において、タンペレ大学のＴｉｍｏ  Ｖｅｓｉｋａｒｉ教授は重要な役割を果たした。ロタウイルスワクチンの最初の臨床試験は１９８２年、タンペレで行われた。Ｖｅｓｉｋａｒｉ教授及び彼のチームは、現在認可を受けている２種類の経口生ロタウイルスワクチンである五価ウシ／ヒト遺伝子再集合体ワクチンＲｏｔａ  Ｔｅｑ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社）及びヒトロタウイルスワクチンＲｏｔａｒｉｘ（登録商標）（ＧＳＫ社）の効力及び安全性を確立するための枢要な治験において尽力した（Ｖｅｓｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ｈｕｍａｎ−ｂｏｖｉｎｅ（ＷＣ３）ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６；３５４：２３−３３；Ｖｅｓｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ２  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｉｎｆａｎｔｓ：ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００７；３７０：１７５７−６３）。
【０００４】
現在利用可能な経口の弱毒生ロタウイルスワクチンは、有効且つ多くの国において成功裡に使用されているが、長期間にわたってのその使用を制限することになるかもしれない安全性の問題を潜在的に抱えている。アカゲザルロタウイルスをベースとした初期の経口生ロタウイルスワクチン（ＲｏｔａＳｈｉｅｌｄ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ社）は、このワクチンの１回目を受けた約１００００人に１人が発症したと考えられる腸重積症との関連から米国において１９９９年に認可を取り消された。現在認可を受けているロタウイルスワクチンはこのような大きなリスクを伴いはしないものの、稀に起きる可能性は排除できない。
【０００５】
更に、２０１０年、この２つの認可を受けた生ロタウイルスワクチンがブタサーコウイルス（ＰＣＶ）ＤＮＡを含有していることが判明した。この発見の重要性は不明なものの、一方のワクチンは一時的に使用が差し止められ、ロタウイルスワクチン被接種者総数が減少した。これらの問題は共に生ワクチンだけに限られており、代替物となる非生ロタウイルスワクチンを開発する必要があることを共に強調している。
【０００６】
ロタウイルスのゲノムは、３層のウイルスの中心のコア内に納められた１１分節の２本鎖ＲＮＡから成る。この３層は、ｄｓＲＮＡに結合したコアタンパク質ＶＰ２、内側のカプシドタンパク質ＶＰ６及びヘマグルチニンスパイクタンパク質ＶＰ４を有する外側のカプシド糖タンパク質ＶＰ７から成る。主要カプシドタンパク質ＶＰ６がウイルスグループの特異性を決定し、また最も良好に保存され、免疫原性であり、また豊富にあるロタウイルスタンパク質である。外側のカプシドタンパク質ＶＰ７及びＶＰ４は中和エピトープを含有し、中和抗体に基づいて防御免疫を誘導する。
【０００７】
経口生ロタウイルスワクチンによって誘導される能動的な防御のメカニズムは完全にはわかっていない。表面タンパク質ＶＰ７及びＶＰ４は血清型特異的中和抗体を誘導すると知られている。しかしながら、血清型特異的免疫では説明できない血清型間での顕著な交差防御がある。ＶＰ６は、ロタウイルス感染及びワクチン接種後の免疫優勢タンパク質である。ＶＰ６は中和抗体を誘導しないが、異種ロタウイルス特異的免疫を誘導する。
【０００８】
最初のロタウイルス組み換えＶＰ６（ｒＶＰ６）タンパク質はｒＢＶ発現系から２０年以上前に作製された（Ｅｓｔｅｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）。ＶＰ６は単独で、様々な数の三量体から構成される細管、球体及びシートを含めたオリゴマー構造体をインビトロで形成する（Ｌｅｐａｕａｌｔ  Ｊ，Ｅｍｂｏ  Ｊ，２０，２００１）。ｒＢＶにおけるＶＰ２及びＶＰ６の同時発現により、２層のウイルス様粒子（ｄｌ  ＶＬＰ）が形成される。ＶＰ２、ＶＰ６及び（ＶＰ４を伴う又は伴わない）ＶＰ７の同時発現は、天然の感染性のロタウイルス粒子に似た３層のＶＬＰをもたらす。免疫原性及びワクチンの効力についての動物モデルを使用した研究の大多数は、アジュバントと共に様々なロタウイルスＶＬＰ又は非ヒト組み換えＶＰ６タンパク質を使用して成し遂げられた。ＶＬＰ又は組み換えＶＰ６タンパク質を使用した、非生サブユニットロタウイルスタンパク質ワクチンのヒトでの臨床試験はこれまで成し遂げられていない。
【０００９】
多くの地域においてロタウイルスが根絶又は減少すると、今度はノロウイルスを原因とする症例が相対的に多くなる。ノロウイルス（ＮＶ）はカリシウイルス科に属し、全ての年齢群のヒトにおいて散発性の急性非細菌性胃腸炎を引き起こし、世界中で起きている胃腸炎の大流行と関連づけられている。ＮＶにより、世界では５歳未満の子供が年間約１００万人入院し、２０００００人を超える患者が死亡している。ロタウイルスに続き、幼児における急性胃腸炎の原因となる２番目に重要なウイルスはノロウイルスである。
【００１０】
ノロウイルスのゲノムは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１〜３）にまとめられた約７．６ｋｂの１本鎖ＲＮＡから成る。ＯＲＦ１は、他のｓｓＲＮＡウイルスと同様にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている。ＯＲＦ２は主要カプシドタンパク質ＶＰ１をコードし、ＯＲＦ３は、小構造タンパク質ＶＰ２をコードする。ヒトに影響を及ぼす殆どのＮＶは２つの遺伝子群（ＧＩ及びＧＩＩ）に属し、これらの２つの遺伝子群は少なくとも８種類のＧＩ遺伝子型及び１７種類のＧＩＩ遺伝子型に分割される。近年、散発性胃腸炎の症例及び大流行の大部分の主な原因は遺伝子型ＧＩＩ−４である。
【００１１】
カプシドＶＰ１タンパク質独自の特色は、中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと自己集合するその能力である。遺伝子群Ｉノーウォークウイルスカプシド遺伝子の組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）へのクローニングは、２０年前の最初のノロウイルスＶＬＰの作製につながった（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.１９９２）。これらのＶＬＰは、形態的及び抗原的に天然のＮＶに類似している。ノロウイルスＶＬＰの三次元構造を低温電子顕微鏡及びコンピュータ画像処理技法を用いて見てみると、ノロウイルスカプシドが、直径３８ｎｍの９０個の二量体にまとめられた１８０分子のＶＰ１カプシドタンパク質を含有するＴ＝３正二十面体対称構造を形成していることがわかる。ノロウイルスＶＬＰは、診断のための血清学的アッセイにおける抗原の源として、またノロウイルスの候補ワクチンの開発のために広く使用されている。ノロウイルスの結合及び侵入のための受容体は完全には明らかになっていないが、昨今、ＮＶがヒト組織／血液型抗原（ＨＢＧＡ）を受容体として認識することが判明した。ＨＢＧＡの中でも、最も一般的に見出される血液型はＡＢＯ（ＡＢＨ）血液型及びルイス式血液型である。これらの複合糖質は赤血球、粘膜上皮細胞上で又は体液中の遊離抗原として見出される。更に、昨今、ＮＶによるＨＢＧＡの認識が株特異的であることが発見され、幾つかのはっきりとした受容体結合パターンが特定されている。
【００１２】
ノロウイルスの場合、生ワクチンという選択肢はない。ノロウイルスは培地で培養できないからである。このため、ノロウイルスの候補ワクチンは、ＶＬＰワクチン又は可溶性抗原ワクチンであった又はそうなると考えられる。
【００１３】
非複製型サブユニットワクチン及び現代のワクチン設計におけるサブウイルス粒子の使用は、Ｂ型肝炎に感染した患者の血液中で発見されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）粒子の発見と共に８０年代半ばに始まった。弱毒生ウイルス又は不活化ウイルス又はその遺伝子材料を除去してあることから、これらのワクチンは概して安全であり、また比較的容易且つ費用効率高く大量に製造される。サブユニットタンパク質ワクチンの例は、生きているウイルスの中空の殻を模倣していることからその生きているウイルスと同様の抗原性及び免疫原性を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ワクチン誘導性の血清中和抗体はウイルス感染症からの防御にとって重要である。ＶＬＰの重要な特徴には、ＶＬＰが天然のウイルスに似ているため立体配座依存性の中和エピトープを保持することが含まれる。
【００１４】
ＮＶ  ＶＬＰ及びＲＶ  ＶＰ６タンパク質には、これらをワクチン候補として有望なものにしている幾つかの興味深い特徴又は主要な属性がある。その反復性の多価構造体から、ＶＬＰの免疫原性は極めて高い。抗原がＶＬＰの表面上に整然と高密度で反復的に提示されることにより、極めて少量でも強い抗体応答が惹起されるが、単量体として提示される同じ抗原は通常、非免疫原性である。Ｂ細胞はこれらの反復構造体によって効率的に活性化され（ＶＬＰ又はｒＶＰ６三量体が六角形にまとめられ、集まってより高次の構造体、例えば細管になるにつれて）、これが細胞表面上でのＢ細胞受容体の架橋につながる。プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわち樹状細胞（ＤＣ）による、マクロピノサイトーシス及びエンドサイトーシスを通じたナノ粒子の取り込みに最適である、特にはサイズ範囲が約４０ｎｍのＶＬＰの粒子状であるという性質（Ｆｉｆｉｓ  Ｔ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７３）。従って、ＶＬＰは、生きているウイルスと同様に、他の細胞を必要とすることなく直接ＤＣを活性化し、成熟させる。ＤＣは、自然及び適応免疫応答の活性化において中心的な役割を果たし、長命のメモリーＩｇＧの産生に関係し、またナイーブＴ細胞の活性化が可能な唯一のＡＰＣである。ＶＬＰは、細胞内複製の不在下で効率的にＣＴＬを刺激する（Ｋｅｌｌｅｒ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０）。従って、ＶＬＰは、細胞性免疫（ＣＭＩ）及び体液性免疫応答の両方における刺激において効率的である。
【００１５】
既に上述したように、ＶＰ６は、ロタウイルスの最も豊富にあり且つ免疫原性であるサブグループ特異的抗原である。多量体構造体を形成するＶＰ６の能力及びＶＰ６が引き出すことができる強い免疫応答が、ＶＰ６を優れたロタウイルスワクチン候補としている。ＶＰ６はロタウイルスに対する中和抗体を誘導しないが、その代わりに交差反応性免疫を促進する強いＴヘルパー（Ｔｈ）細胞応答を引き出すことによって異型交差防御免疫を誘導する（Ｂｕｒｎｓ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｐａｒｅｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ）。ＶＰ６特異的ＣＤ４＋Ｔｈ細胞は、ＶＰ７及び／又はＶＰ４分子上の中和エピトープに特異的なＢ細胞に同種の支援を提供する（Ｅｓｑｕｉｒｅｌ  ＦＲ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ  ２０００，１４５，８１３）。加えて、ＶＰ６特異的ＣＤ４＋Ｔｈ細胞は、粘膜における直接的な細胞毒性メカニズム又は抗ウイルスサイトカイン産生によりマウスロタウイルス感染から防御することが示された。
【００１６】
ロタウイルス及びノロウイルス感染症の重症度及び現在入手可能なワクチンの不足を考えると、非生ノロウイルス及びロタウイルスワクチンの両方が、特には小児における急性胃腸炎の予防に必要とされる。ＮＶ及びＲＶに対する免疫応答は複雑であり、防御の相関物は完全には明らかになっていない。まとめると、ＮＶ  ＶＬＰを含めたＶＬＰ及びＲＶのＶＰ６タンパク質に起因する上記の独特の性質は、これらの２種類の成分から成るワクチンが、ＮＶ及びＲＶ感染に対する免疫化のための実行可能なストラテジーとなることを示唆している。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、混合ワクチン中に含まれたノロウイルス及びロタウイルス抗原が互いに干渉せず、ワクチン中に存在する抗原のそれぞれに対する相乗的免疫を引き出すという驚くべき発見に基づく。
【００１８】
従って、本発明は、少なくとも１種のノロウイルスＶＬＰ抗原及び少なくとも１種のロタウイルスＶＰ６抗原を含むワクチン組成物を提供する。
【００１９】
一部の実施形態において、ワクチン組成物は更に、抗原性カプシドペプチド及び抗原性カプシドタンパク質から成る群から選択されるノロウイルス抗原を含む。この抗原はいずれのノロウイルス株由来であってもよく、例えばＧＩ及びＧＩＩ遺伝子群及びこれらの遺伝子型に属するものである。一部の実施形態において、ノロウイルス抗原は、好ましくは一価の形態のＧＩＩ−４  ＶＬＰである。幾つかの別の実施形態において、ノロウイルス抗原は２種以上のＶＬＰ型を含む。
【００２０】
一部の実施形態において、ロタウイルスＶＰ６抗原は、ｒＶＰ６タンパク質、２層ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰ及びＶＰ６タンパク質を含むＶＬＰから成る群から選択される。ｒＶＰ６は、細管（tubule）、球体（sphere）又はシートの多量体の形態になり得る。
【００２１】
本発明は更に、特には幼児において胃腸炎を予防するための上記のワクチンの用途を提供する。本発明のこの態様は、予防を必要とする患者（特には幼児）における胃腸炎の予防方法にも発展させ得て、患者に本明細書に記載のワクチン組成物をワクチン接種することを含む。
【００２２】
更に、本発明は、本明細書に記載のワクチン組成物の製造方法を提供する。この方法は、（ｉ）単一の宿主において少なくとも１種のノロウイルス抗原及び少なくとも１種のロタウイルス抗原を同時発現させること又は（ｉｉ）（ａ）少なくとも１種のノロウイルス抗原を作製、単離及び精製し、（ｂ）少なくとも１種のロタウイルス抗原を作製、単離及び精製し、（ｃ）これらのノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原を混合するステップを含む。好ましくは、抗原を、組み換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞宿主において作製する。
【００２３】
本発明の他の目的、態様、詳細及び利点は、以下の図、詳細な説明及び実施例から明らかとなる。
以下において、本発明を、添付の図面を参照しながら好ましい実施形態によりより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】バキュロウイルス発現ノロウイルスＧＩＩ−４  ＶＬＰ（レーンＡ）、ロタウイルスｒＶＰ６（レーンＢ）、２層ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰ（レーンＣ）、カクテルワクチン（ノロウイルスＧＩＩ  ＶＬＰ＋ｒＶＰ６、レーンＤ）及びキメラワクチン（同時感染ノロウイルスＧＩＩ−４カプシド及びロタウイルスＶＰ６、レーンＥ）の純度を示すページブルー染色１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。様々なタンパク質を、ゲルの右側で矢印で示している。各タンパク質の対応する分子量（ｋＤａ）は、ゲルの左側で示している。
【図１Ｂ】組み換えタンパク質で作られた形態学的構造体の電子顕微鏡写真である。タンパク質を精製し、構造体を電子顕微鏡で観察し、続いて３％酢酸ウラニルで染色した。ＶＬＰ構造体がノロウイルス（ＮＶ）ＧＩＩ−４カプシドについて検出され、ロタウイルス（ＲＶ）ＶＰ２／ＶＰ６（パネルＡ、Ｃ）及び管状構造体がＶＰ６タンパク質について観察された（パネルＢ）。ＧＩＩ−４  ＶＬＰ及びＶＰ６の細管の両方がパネルＤ（カクテルワクチン製剤）及びパネルＥ（キメラワクチン製剤）で観察された。
【図２】様々な用量及び投与経路（筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ））でのＧＩＩ−４  ＶＬＰでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化後のノロウイルス（ＮＶ）特異的ＩｇＧ応答のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図３】様々な用量のＧＩＩ−４  ＶＬＰの皮内経路での免疫化後のＮＶ特異的ＩｇＧ血清エンドポイント滴定アッセイの結果を示す。
【図４】様々な用量のＧＩＩ−４  ＶＬＰで免疫化したマウスの血清におけるＮＶ特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動力学を示す（ＥＬＩＳＡで測定）。上のパネルは皮内投与による免疫化の結果を示し、下のパネルは筋肉内投与による免疫化の結果を示す。
【図５】ＥＬＩＳＡで試験した、ＧＩＩ−４  ＶＬＰの筋肉内投与による免疫化後のＮＶ特異的ＩｇＧ応答の期間を示す。
【図６】ＧＩＩ−４  ＶＬＰを単独で又はｒＶＰ６とのカクテル若しくはキメラ製剤として皮内（上のパネル）又は筋肉内（下のパネル）投与して免疫化したマウスの実験グループから採取した血清のＩｇＧエンドポイント滴定アッセイのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】ｒＶＰ６を単独で又はＧＩＩ−４  ＶＬＰとのカクテル若しくはキメラ製剤として皮内（上のパネル）又は筋肉内（下のパネル）投与して免疫化したマウスの実験グループから採取した血清のＩｇＧエンドポイント滴定アッセイのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８】ＧＩＩ−４  ＶＬＰを単独で又はｒＶＰ６とのカクテル若しくはキメラ製剤として使用して免疫化した後のマウスのＮＶ特異的便ＩｇＧエンドポイント滴定アッセイの結果を示す。
【図９】ＧＩＩ−４  ＶＬＰ単独、カクテル製剤又はキメラ製剤を皮内（左のパネル）又は筋肉内（右のパネル）投与して免疫化したマウスのＮＶ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブタイプ抗体応答のエンドポイント滴定アッセイを示す。
【図１０】ｒＶＰ６、カクテル製剤又はキメラ製剤を皮内（左のパネル）又は筋肉内（右のパネル）投与して免疫化したマウスのＲＶ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブタイプ抗体応答のエンドポイント滴定アッセイを示す。
【図１１】単独又はカクテル若しくはキメラワクチン製剤での免疫化後のＧＩＩ−４（上のパネル）又はｒＶＰ６（下のパネル）特異的ＩｇＧ抗体の平均アビディティインデックス（％）を示す。５０％以上のアビディティインデックスは高アビディティとみなされる。
【図１２】上のパネルは様々なＮＶ遺伝子型（ＧＩＩ−１２及びＧＩ−３）に対するＧＩＩ−４  ＶＬＰ誘導ＩｇＧ抗体の交差反応性を表す。下のパネルは、ＥＬＩＳＡで測定した幾つかのヒト（Ｇ１Ｐ８、Ｇ２Ｐ６、Ｇ４Ｐ６、Ｇ８Ｐ１０、Ｇ１２Ｐ４）、ウシ（ＢＲＶ）及びアカゲザル（ＲＲＶ）ロタウイルス株に対するｒＶＰ６誘導抗体の交差反応性を示す。
【図１３】同種ＧＩＩ−４  ＶＬＰ（パネルＡ）又は異種ＧＩ−３  ＶＬＰ（パネルＢ）のヒト組織／血液型抗原（ＨＢＧＡ）Ｈタイプ３（推定ＮＶ  ＧＩＩ−４受容体）への結合をブロックするＮＶ  ＧＩＩ−４特異的血清抗体の能力を示す。パネルＣは、ＧＩＩ−４  ＶＬＰのＨタイプ３への結合を最大限ブロックするのに必要な血清のエンドポイント力価を示す。ブロッキングインデックスは以下のようにして計算した：１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図１４】様々なワクチン製剤で免疫化したマウスから収穫した脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。上のパネルは細胞を収穫した日のＧＩＩ−４  ＶＬＰ特異的ＩｇＧ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を示し、下のパネルは、ＧＩＩ−４  ＶＬＰと共に４日間にわたって培養した後のＧＩＩ−４  ＶＬＰ特異的ＡＳＣの数を示す。上のパネルと下のパネルとの間でのＡＳＣの数の差がメモリーＢ細胞の応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、少なくとも１種のノロウイルス（ＮＶ）抗原及び少なくとも１種のロタウイルス（ＲＶ）抗原を含む混合ワクチン製剤に関する。
【００２６】
驚くべきことに、多くの他の混合ワクチンと同様に、ノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原が互いの免疫原性を阻害しないことが判明した。本ワクチンにおいて、混合ワクチン中の個々の抗原間での干渉はないため、本発明の混合ワクチンは、ワクチン中に存在する抗原のそれぞれに対する免疫を引き出すことができる。適切には、組み合わせの一方の成分に対する免疫応答は、個別に測定した場合のその成分の免疫応答の少なくとも５０％であり、好ましくは１００％又は実質的に１００％である。免疫応答は適切には、本明細書の実施例において説明するように、例えば抗体応答により測定し得る。本ワクチン製剤は個々の抗原間での負の干渉を起こさないだけでなく、相乗効果ももたらす。
【００２７】
本発明での使用に適したノロウイルス抗原には、以下に限定するものではないが、抗原性カプシドタンパク質、ペプチド、単量体、二量体、ＶＬＰ又はこれらの組み合わせが含まれる。ノロウイルス抗原は、ＧＩ又はＧＩＩ遺伝子群に属し且つ所望の遺伝子型を有するノロウイルス由来となり得る。一部の実施形態において、ノロウイルス抗原は、ＧＩＩ−４、ＧＩＩ−１２及びＧＩ−３ＶＬＰから成る群から選択される。遺伝子型ＧＩＩ−４が世界中での急性ノロウイルス胃腸炎の主な原因であることから、本ワクチンでの使用に好ましいノロウイルス抗原はＧＩＩ−４  ＶＬＰである。好ましくは、ＶＬＰは一価である。
【００２８】
ロタウイルスＶＰ６は、交差反応性の抗ロタウイルス応答を誘導する最も豊富にあり且つ免疫原性のロタウイルスタンパク質であるサブグループ特異的抗原である。本ワクチン製剤で免疫化したマウスのロタウイルス特異的血清抗体は、ヒトに感染するロタウイルス血清型の大多数の場合と同様に、サブグループ１及び２に属する様々なヒト、ウシ及びサルロタウイルス株に対して交差反応性であった（図１２）。
【００２９】
多量体若しくは他の形態のロタウイルスＶＰ６、組み換えＶＰ６（ｒＶＰ６）又はＶＰ６を含むロタウイルスＶＬＰを本ワクチン製剤においてロタウイルス抗原として使用し得る。組み換えバキュロウイルス中でのＶＰ２及びＶＰ６の同時発現により、２層のウイルス様粒子（ｄｌ  ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰ）が形成される。このようなＶＬＰは、本ワクチン製剤における使用に適したロタウイルス抗原に含まれる。ロタウイルス抗原はいずれのロタウイルス株由来にもなり得るが、好ましくはヒトロタウイルス由来である。
【００３０】
上記のノロウイルス及びロタウイルス抗原は、本ワクチン製剤においていずれの所望の組み合わせでも使用し得る。一部の実施形態において、ワクチン製剤は１価のＧＩＩ−４ノロウイルスＶＬＰ及びロタウイルスｒＶＰ６タンパク質を好ましくは多量体の形態で含む。幾つかの他の実施形態において、ワクチン製剤は、１価のＧＩＩ−４ノロウイルスＶＬＰ及びロタウイルス２層ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰを含む。
【００３１】
ノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原は、天然源から単離及び精製し得る。他の実施形態において、これらの抗原は、適切な発現系における組み換え技術により作製し得て、適切な発現系には、以下に限定するものではないが、酵母細胞（例えば、Ｓ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉ））、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）及び哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が含まれる。各発現系に適した発現ベクターは、当業者に周知である。
【００３２】
本ワクチンは、単独ノロウイルス及びロタウイルスワクチンの組み合わせをいずれの比でも含み得るが、好ましくは等量（１：１）である。混合ワクチンは、少なくとも２つのやり方で処方し得る。第１のやり方においては、ノロウイルスワクチン及びロタウイルスワクチンを組み換えタンパク質として別々に製造し（ＶＬＰ、単量体、二量体、三量体、球体、細管、シート又はこれらのいずれの組み合わせの形態で）、インビトロにて特定の比で混合すると「カクテル」ワクチンと称される液体製剤が得られる。第２のやり方においては、ノロウイルスカプシド及びロタウイルスＶＰ６のキメラタンパク質は、所望の宿主（例えば、Ｓｆ９昆虫細胞）に適切な発現系（例えば、ノロウイルスカプシド遺伝子及びロタウイルスＶＰ６遺伝子を発現する組み換えバキュロウイルス）を同時感染させることで得られる。このようなワクチン製剤を本明細書では「キメラ」ワクチンと称する。
【００３３】
遺伝子型特異的（同型）免疫応答に加えて、交差反応性（異型）免疫応答の誘導が、ノロウイルス、ロタウイルス等のウイルスが問題となる場合に極めて重要である。これらのウイルスには多数の様々な遺伝子型／血清型及び株がある。理想的なワクチンは、ワクチン中のウイルスと同種及び異種の多種多様な株に対する応答を誘導する。一部の実施形態において、ＧＩ−３（ノロウイルス遺伝子群Ｉに属する）及びＧＩＩ−１２（ノロウイルス遺伝子群ＩＩに属する）ＶＬＰは、ワクチン製剤中に存在するＧＩＩ−４  ＶＬＰに対する異種抗原として特定された。ＧＩＩ−４特異的単独又は混合ワクチンで免疫化したマウスは、遺伝子群を越えて及びその間で異種抗原の両方に対して反応性の抗体を産生した。ロタウイルスＶＰ６単独ワクチンと比較しての、混合ワクチンで免疫化したマウスの血清におけるＧＩ−３に対する交差反応性免疫応答における約５０％の上昇は、ワクチン製剤中に存在しているロタウイルスＶＰ６タンパク質のアジュバント効果を示している。言い換えると、本混合ワクチンの抗原性成分は相乗効果をもたらす。実施例において、ＲＶ  ＶＰ６タンパク質が、ワクチン抗原によって誘導される免疫応答を広げ、また血清のブロッキング活性を上昇させる観点からアジュバントとして作用する能力を有することが実証される。
【００３４】
交差反応性応答に加えて、本混合ワクチン製剤は、全身にわたって強く長期間続く（メモリー）ブロッキングＩｇＧ抗体応答並びにノロウイルス及びロタウイルスに特異的な細胞性免疫をいかなる免疫経路であっても誘導する（好ましくは皮内及び筋肉内経路）。これらの応答は、感染後に生まれる短期間の遺伝子型特異的な自然な免疫応答と対照的である。このため、局所的な粘膜免疫応答とは対照的な全身性の免疫応答が、長期間にわたる防御には必要と考えられる。
【００３５】
血清ＩｇＧ抗体の腸管内腔内への移動が、腸管感染からの重要な防御メカニズムとなりそうである。本明細書に記載のもののような非経口（ＩＤ／ＩＭ）で投与するワクチンによって引き出される全身的な免疫応答が高ければ高いほど、移動する抗体のレベルは高くなり、また防御はより良好なものになると予想することができる。
【００３６】
更に、本ワクチン製剤は、バランスのとれた混合型の免疫応答、すなわちＴヘルパー（Ｔｈ）細胞タイプ１及びＴｈ２タイプ応答を誘導する。この両方のタイプの免疫応答がノロウイルス及び／又はロタウイルスへの感染に対する防御を仲介しているらしいことを考えると、このことは重要な観察結果である。
【００３７】
加えて、本ワクチン製剤は、実施例において実証されるように、高アビディティ抗体の強力な誘導物質である。高アビディティ抗体は、ワクチンの防御効力と大きく相関することが示された。
【００３８】
更に、本発明は、本明細書で使用のワクチン製剤で遺伝子群間での交差防御が達成可能であることを示す。本明細書に記載のＧＩＩ−４  ＶＬＰ（いわゆる一価ワクチン）としての特定の株／遺伝子型のノロウイルスからのＶＬＰでの免疫化は、ワクチン製剤（本明細書で使用のＧＩ−３及びＧＩＩ−１２）に含まれていない他の遺伝子型に対する交差反応性又は異型免疫応答を誘導するだけでなく、本明細書において記載するように異種のウイルスの結合もブロックし、またウイルスを中和する。
【００３９】
免疫刺激を引き出す有効成分、すなわちノロイルス及びロタウイルス抗原に加えて、本製剤は、無菌で非毒性の薬学的に許容可能な生理学的担体を含み得る。一部の実施形態において、ワクチン製剤は更に、細菌又は真菌による汚染を防止するためにフェノール、２−フェノキシエタノール又はチメロサール等の保存料を含み得る及び／又は悪条件下でワクチンを安定させ、また免疫原がバイアルの壁面に付着するのを防止するためにスクロース、ラクトース、アミノ酸、ゼラチン等の安定剤を含み得る。
【００４０】
一部の実施形態において、本ワクチン製剤は、有効量の１種以上のアジュバントを含み得る。これらのアジュバント物質の主な特徴の１つは一般にワクチン抗原によって誘導される免疫応答の範囲を広げることである。用語「有効量のアジュバント」には、投与した抗原に対する免疫応答を刺激することができるある量のアジュバント、すなわち、例えば本明細書の実施例において説明するような血清における交差反応性及びブロッキング抗体活性に関して測定する、投与した抗原組成物の免疫応答を上昇させる量が含まれる。適切で効果的な上昇には、アジュバントを加えていない同じ抗原組成物と比較して５％を越えて、好ましくは２５％を越えて、特には５０％を越えての上昇が含まれる。ワクチン製剤での使用に適したアジュバントは当業者に公知である。
【００４１】
本ワクチン製剤は様々な形態で提供し得て、以下に限定するものではないが、水溶液、乾燥粉末（凍結乾燥製剤）が含まれる。例えば、水溶液を、注射、鼻からの送達（例えば、スプレー、点鼻薬）及び口からの送達による投与に適した形態で提供し得る。
【００４２】
ワクチン製剤は、当業者にはすぐにわかるように、様々な経路で投与し得る。好ましくは、本発明のワクチン製剤を非経口の注射により投与し、これには以下に限定するものではないが筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）注射が含まれる。
【００４３】
様々な投与レジメンを本ワクチン製剤に適用し得る。重篤な急性ロタウイルス胃腸炎及びノロウイルス胃腸炎は生後６か月〜３歳に同様のピーク発生率を有しているため、混合ノロウイルス／ロタウイルスワクチンのターゲットは、以下の２つの非限定的なやり方で、この年齢層の子供になり得る。
【００４４】
（ａ）ノロウイルス＋ロタウイルス注射用ワクチンを、乳幼児の定期予防接種スケジュールの一部にし得る。乳幼児には２回のワクチンで十分と考えられ、後から追加量を投与する場合もある。フィンランドでは、定期予防接種のスケジュールは、生後３、５、１２か月である。本ノロウイルス＋ロタウイルスワクチンは、そのようなスケジュールに合う。他国の予防接種スケジュールは若干異なるものの、提案するワクチンは、生後２、４及び１２か月、４、６及び１２か月等の異なるプログラムでも容易に採用し得る。
【００４５】
（ｂ）ノロウイルス＋ロタウイルス注射用ワクチンを、生後１２〜１５か月でのロタウイルスの追加ワクチン接種及びノロウイルスの一次ワクチン接種として使用し得る。投与は２回行われ得る。この選択肢は、生後２〜６カ月の時点でロタウイルスに対する一次免疫化に経口生ロタウイルスワクチンを使用し続ける場合に採用し得る。ロタウイルスに対する免疫は２歳及び３歳で衰えることが知られていて、追加のワクチン接種が多くの場合において望ましい。しかしながら、経口生ワクチンは追加のワクチン接種には使用することができない。より高い年齢、すなわち通常の追加ワクチン接種時期では腸重積症のリスクが高くなるからである。
【００４６】
生後１２〜１５か月の間で２回にわたって投与されるノロウイルス＋ロタウイルス注射用ワクチンは、ロタウイルスの追加ワクチン接種及びノロウイルスの一次ワクチン接種としての役割を果たし得る。生後１２か月未満の乳幼児でもノロウイルス胃腸炎に罹患することは（少ないながら）あるものの、多くの場合、この年齢を越えてから発症し、ワクチンは依然として小児におけるノロウイルス胃腸炎の症例の大半を予防する可能性を有し得る。
【００４７】
本ワクチンは、薬学的な有効量の本ワクチン製剤を患者にワクチン接種することによって、ノロウイルス及びロタウイルスへの感染、ノロウイルス及びロタウイルスによって誘発される下痢、嘔吐を伴う疾患（norovirus- and rotavirus-induced diarrheal and vomiting diseases）及び胃腸炎を予防し又は減少させ、またそれを必要とする患者においてノロウイルス及びロタウイルスに対する免疫応答を誘導するのに使用し得る。ワクチンの「薬学的な有効量」とは、ノロウイルス及びロタウイルスからワクチン被接種者を防御する免疫応答を引き出すことが可能な量のことである。
【実施例】
【００４８】
当業者には、テクノロジーが進歩するにつれて本発明の概念を様々なやり方で実施可能なことが明白である。本発明及びその実施形態は下記の実施例に限定されず、請求項の範囲内で変化し得る。
【００４９】
実施例１：ノロウイルスＶＬＰの作製及び精製
ノロウイルスＧＩＩ−４カプシド遺伝子の抽出及びクローニング
ノロウイルスＧＩＩ−４を１９９９年、フィンランドにおいて患者の便から単離した。便からのＲＮＡを、ＱｉａＡｍｐ  ＲＮＡウイルスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を使用して抽出した。ノロウイルスＶＰ１カプシド遺伝子（１６２０ｂｐ）の完全遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により以下のプライマー：ＪＶ２４順方向（５’−ＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（Ｂｕｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）及び逆方向（５’−ＴＴＡＴＡＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して増幅した。ＶＰ１カプシド配列の完全長ＤＮＡコピーを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１０ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）でシーケンシングすることによって得た。問題のノロウイルス株を、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ（ＦＢＶＥ）に基づいて遺伝子クラスタに分類した（ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース受入番号ＡＦ０８０５５１）。完全ＶＰ１カプシド遺伝子を、以下のプライマー：ＧＩＩ−４−順方向（５’ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＴＧＡＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及びＧＩＩ−４−逆方向（５’ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を使用してＰＴＣ−２００  ＤＮＡエンジン（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で増幅した。増幅した断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）にクローニングし、更にバキュロウイルスｐＦａｓｔＢａｃ１トランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。化学的にコンピテントなＴＯＰ１０大腸菌細胞への形質転換後、ＶＰ１を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１０ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でシーケンシングすることによって検証した。
【００５０】
ノロウイルスＧＩＩ−１２及びＧＩ−３カプシド遺伝子の抽出及びクローニング
フィンランドにおいて、ノロウイルスに感染した患者から便検体を回収した。ＲＮＡを上述したように抽出した（Ｑｉａｇｅｎ社）。ノロウイルスＧＩＩ−１２  ＶＰ１カプシド遺伝子及びＧＩ−３  ＶＰ１カプシド遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲにより以下のプライマー：
ＧＩＩ−１２−順方向（５’−ＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
ＧＩＩ−１２逆方向（５’ＴＴＡＣＴＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ＧＩ−３順方向（５’−ＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び
ＧＩ−３逆方向（５’−ＴＧＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＣＣＴＡＡＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を使用して増幅した。アンプリコン（１．６Ｋｂ）をシーケンシングし、株を、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ及びＦＢＶＥに基づいて分類した（ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース受入番号：ＧＩＩ−１２  ＡＪ２７７６１８、ＧＩ−３  ＡＦ４１４４０３）。ノロウイルスＶＰ１カプシド遺伝子（ＧＩＩ−１２、ＧＩ−３）はコドン最適化された。ＧＩＩ−１２をｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌトランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、ＧＩ−３をｐＦａｓｔＢａｃ１トランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。
【００５１】
ノロウイルスカプシド組み換えバキュロウイルス（ＢＶ）ストックの調製
組み換えバクミドを作りだすために、ｐＦａｓｔＢａｃコンストラクトを、製造業者の指示通りにＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりＤＨ１０ＢａｃＴＭコンピテント大腸菌に形質転換した。バクミドＤＮＡを２ｍｌのオーバーナイトＬＢ培養物からＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡミニプレップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により精製した。組み換えバクミドＤＮＡをＰＣＲにより分析してバクミド中の遺伝子の存在を検証した。ｐＵＣ／Ｍ１３を分析するために、順方向及び逆方向プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。ＶＬＰが、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系に従った組み換えバキュロウイルスを感染させたスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）昆虫細胞で作製された。より明確に説明すると、Ｓｆ９細胞を、マルチディッシュ６ウェル（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、デンマーク）に１ｘ１０6細胞／ｍｌ（無血清培地）（Ｓｆ  ９００  ＳＦＭ  ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で播種し、セルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してバクミドＤＮＡ（１μｇ）によりトランスフェクションを行った。細胞を２６℃で成長させ、トランスフェクションから７２時間後に収穫した。細胞懸濁液を５００ｘｇで５分間にわたって遠心分離にかけ、上清（Ｐ１バキュロウイルスストック）をアリコートし、４℃で保存した。Ｓｆ９細胞にバキュロウイルスＰ１ストックで感染させ、感染から６日後（ｄｐｉ）に細胞懸濁液を５００ｘｇで５分間にわたって遠心分離し、アリコートした上清（Ｐ２バキュロウイルスストック）を４℃で保存した。Ｐ２ストックの感染多重度（ＭＯＩ）として表わされるバキュロウイルス力価（プラーク形成単位：ｐｆｕ）を、ＢａｃＰａｋラピッドタイターキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）で求めた。
【００５２】
組み換え（ｒ）ノロウイルスカプシドの発現並びにＶＬＰの作製及び精製
ノロウイルスＶＬＰの作製のために、２００ｍｌのＳｆ９細胞培養物を密度１ｘ１０6細胞／ｍｌで準備し、細胞に感染多重度１のＰ２ストックで感染させた。６日目に、感染させた細胞培養物を３０００ｘｇでの３０分間にわたる４℃での遠心分離により清澄化した。上清中のＶＬＰを、１００，０００ｘｇでの２時間にわたる４℃での超遠心分離（Ｌ８−６０Ｍウルトラセントリフュージ、ベックマンＳＷ−３２．１  Ｔｉロータ）により濃縮し、ペレットを３ｍｌの０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）に再懸濁させた。ＶＬＰを１０〜６０％の不連続スクロース勾配にロードし、１００，０００ｘｇでの１時間にわたる４℃での超遠心分離に供した。画分を、底部に孔を開けて回収した。約２５個の画分が回収され、各画分を、カプシドタンパク質の発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。第１のスクロース勾配画分の指示した画分の分析により、３５％スクロースに遊走したカプシドタンパク質のはっきりとしたピークが示され、これらの画分をプールした。更に、ＧＩＩ−４  ＶＬＰを追加の不連続スクロース勾配（３５〜６０％）で精製した。ＶＬＰを含有する画分を回収し、プールした。スクロースを一晩にわたる１Ｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対する透析により除去した。ＶＬＰを限外濾過により濃縮した。簡単に説明すると、最高１５ｍｌの透析済みの生成物を、製造業者の指示通りにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０ｋＤａ遠心分離フィルタ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ドイツ）を使用して濃縮した。ＶＬＰをＰＢＳ中で４℃で保存した。全体のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡプロテインアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を使用して数量化した。純度及び完全性を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く濃度分析、ＥＭにより検証した。
【００５３】
実施例２：ロタウイルス抗原
Ａ．ロタウイルスｒＶＰ６の作製及び精製
ロタウイルスＶＰ６の抽出及びクローニング
ＶＰ６遺伝子セグメントの完全ヌクレオチド配列を得るために、Ｇ１［Ｐ８］ＲＴ−ＰＣＲ強陽性の急性胃腸炎患者から得た１０％便懸濁液のＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡウイルスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）により抽出した。抽出したｄｓＲＮＡを、１３６２ｂｐのＶＰ６を作りだすアンプリコンの特異的プライマー対（Ｍａｔｔｈｉｊｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）とのＲＴ−ＰＣＲ反応に供した。アンプリコンを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＴＭ  ３１０ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によりシーケンシングした。ＶＰ６アンプリコンの配列はコドン最適化され、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングされた。
【００５４】
ロタウイルスＶＰ６組み換えバキュロウイルス（ＢＶ）ストックの調製
ストックの調製は、本質的に、ノロウイルスに関して上述した通りに行われた。
【００５５】
ロタウイルスｒＶＰ６の作製及び精製
組み換えＶＰ６の作製については、２００ｍｌのＳｆ９昆虫細胞に、感染多重度５ｐｆｕ／細胞、細胞濃度１ｘ１０6細胞／ｍｌでＶＰ６の遺伝子を含有している組み換えバキュロウイルスを感染させた。培養物の上清を６ｄｐｉで回収し、１０００ｒｐｍで２０分間にわたって＋４℃で清澄化した。組み換えタンパク質を、１０００００ｘｇでの１．５時間にわたる＋４℃での超遠心分離により濃縮し、ペレットを０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）に再懸濁させ、連続スクロース勾配（１０〜６０％）で、１０００００ｘｇ、１６時間、＋４℃で精製した。追加のスクロース勾配精製も適用し得る。ＶＰ６タンパク質を含有するスクロースの画分をプールし、一晩にわたってＰＢＳに対して透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ５０遠心分離フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）での遠心分離により濃縮した。タンパク質をＰＢＳ中で４℃で保存した。全体のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡプロテインアッセイを使用して数量化した。純度及び完全性を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く濃度分析、ＥＭにより検証した。
【００５６】
Ｂ．２層（ｄｌ）ロタウイルスＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰの作製及び精製
ロタウイルスＶＰ２の抽出及びクローニング
ＶＰ２遺伝子セグメントの完全ヌクレオチド配列を得るために、同じＧ１［Ｐ８］ＲＴ−ＰＣＲ陽性急性胃腸炎患者のＲＮＡをＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡウイルスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）により、ロタウイルスｒＶＰ６の作製及び精製に関して説明したように抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＶＰ２の特異的プライマー対（Ｍａｔｔｈｉｊｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を使用して行うことによって２６６２ｂｐのアンプリコンを作製した。このアンプリコンを、ＶＰ６に関して用いたやり方と同様のやり方で精製及びシーケンシングした。ＶＰ２アンプリコンの配列はコドン最適化され、またｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングされた。
【００５７】
ロタウイルスＶＰ２組み換えバキュロウイルス（ＢＶ）ストックの調製
ストックの調製は、本質的に、ノロウイルスに関して上述した通りに行われた。
【００５８】
ロタウイルスｄｌ  ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰの作製及び精製
ロタウイルス２層（ｄｌ）ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰを作製するために、Ｓｆ９昆虫細胞に、同感染多重度／細胞、細胞濃度１ｘ１０6細胞／ｍｌでＶＰ２及びＶＰ６の遺伝子を含有する組み換えＢＶを同時感染させた。培養物の上清を７ｄｐｉで回収し、１０００ｒｐｍで２０分間にわたって＋４℃で清澄化した。組み換えＶＰ２／６−ＶＬＰを、組み換えノロウイルスＶＬＰと同様に濃縮し、連続スクロース勾配で精製した。ＶＰ２及びＶＰ６を含有するスクロースの画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１００遠心分離フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）での遠心分離により濃縮した。ＶＬＰをＰＢＳ中で４℃で保存した。全タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡプロテインアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して数量化した。ＶＰ２／６の純度及び完全性を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＭで検証した。ＶＰ２／ＶＰ６サンプル中のＶＰ６の割合を、濃度分析により数量化した。
【００５９】
実施例３：キメラタンパク質（ＧＩＩ−４カプシド＋ＶＰ６）の作製及び精製
キメラタンパク質調製物を、Ｓｆ９昆虫細胞に、感染多重度５のノロウイルスＧＩＩ−４  ｒＢＶ及び感染多重度５のロタウイルスＶＰ６  ｒＢＶを同時感染させることによって作製した。同時感染させた昆虫細胞の上清を、６ｄｐｉで収穫した。細胞培養物を、３０００ｘｇでの３０分間にわたる４℃での遠心分離により清澄化し、上清を１０００００ｘｇで２時間にわたって４℃で超遠心分離した。ペレットを０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）に再懸濁させ、キメラタンパク質を、連続スクロース勾配（１０〜６０％）により１０００００ｘｇで３時間にわたって４℃で同時精製した。両方の組み換えタンパク質（それぞれＮＶカプシド及びＲＶ  ＶＰ６）を含有する画分を、底部に孔を開けて回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。キメラタンパク質を含有する４０％スクロースからの画分をプールし、スクロースをＰＢＳに対する透析により除去した。透析済みの生成物を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ３０ｋＤａ遠心分離フィルタ装置で濃縮した。生成物をＰＢＳ中で４℃で保存した。全体のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡプロテインアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して数量化した。各タンパク質の純度及び完全性を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く濃度分析、ＥＭにより検証した。
【００６０】
実施例４：ノロウイルス及びロタウイルスＶＬＰのキャラクタリゼーション
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び濃度数量化
サンプルを、アクリルアミド１２％の分離ゲルとアクリルアミド５％の濃縮ゲルのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけた。サンプルを５分間にわたって、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、６２．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２５％グリセロール及び０．０１％ブロモフェノールブルー（Ｂｉｏｒａｄ社）を含有するレムリサンプルバッファ中で沸騰させた。ゲルをＰａｇｅＢｌｕｅ  ＴＭタンパク質染色溶液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、リトアニア）で染色した。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質の帯を、ＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）ＦＣソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ社、米国）で製造業者の指示に従って数量化した。
【００６２】
図１Ａは、矢印で印をつけた、期待される分子量の特定されたタンパク質ののったページブルー染色ゲルの写真である。ＧＩＩ−４カプシド及びロタウイルスＶＰ６のキメラタンパク質が、スクロース勾配の同じ画分で検出された。図１Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の精製されたタンパク質を示す。
【００６３】
電子顕微鏡法（ＥＭ）
調製物を、３％酢酸ウラニル（ＵＡ）（ｐＨ４．６）で陰性染色した。３μｌのタンパク質サンプルをカーボンコートグリッドに３０秒間にわたって適用した。グリッドを乾燥させ、３μｌのＵＡをグリッドに更に３０秒間にわたって適用した。過剰な液体を除去し、グリッドを、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ１２電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｏｐｔｉｃｓ社、オランダ）（１２０ｋＶで動作）で観察した。
【００６４】
各タンパク質を、ＥＭ下でモルホロジーについて観察し（図１Ｂ）、ＧＩＩ−４  ＶＬＰ、ｒＶＰ６細管及びｄｌ  ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰを含めた高次構造体が確認された。ｒＶＰ６の細管を示すが、いずれの形態のｒＶＰ６タンパク質も構築され得て、以下に限定するものではないが、三量体並びに球体及びシートを含めた高次多量体構造体が含まれる。ＧＩＩ−４  ＶＬＰ及びｒＶＰ６を比１：１でカクテルに混合しても、タンパク質の完全性又はカクテル中のいずれの成分のモルホロジーも損なわれなかった。同様の形態学的特徴がカクテルワクチン及びキメラワクチンでも認められ、ＧＩＩ−４  ＶＬＰで充填されたｒＶＰ６細管を特定している。ＮＶカプシド及びＲＶ  ＶＰ６の他の構造体も形成され得る。
【００６５】
実施例５：マウスの免疫化
生後７〜９週間の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜５匹のマウス／グループ）を、０週目及び３週目の２回にわたる異なるワクチンの皮内（ＩＤ）又は筋肉内（ＩＭ）投与により免疫化した。一部の例において、マウスはワクチンで１度しか免疫化されなかった。免疫化に使用したワクチンは以下の通りであった：ＧＩＩ−４  ＶＬＰ、ｒＶＰ６タンパク質、ｄｌ  ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰ、カクテル（ＧＩＩ−４  ＶＬＰとｒＶＰ６との混合物）、キメラワクチン及びカクテルＶＬＰ（ＧＩＩ−４  ＶＬＰとｄｌ  ＶＰ２／ＶＰ６  ＶＬＰとの混合物）。採用したワクチン用量は、５０μｇ、１０μｇ、１μｇ及び０．１μｇであった。殆どの場合、マウスを、１０μｇの単独ワクチン製剤又は２０μｇの混合ワクチン（カクテル又はキメラ）で免疫化した。１０μｇの各単独ワクチン成分をカクテルワクチンは含有している。例えば、カクテルワクチンを得るために、ＰＢＳ中の１０μｇのＧＩＩ−４  ＶＬＰを１０μｇのＰＢＳ中のｒＶＰ６とインビトロで混合し、＋４℃で保存した。血液（血清）サンプル及び便を０（採血前、免疫のない血清）、２、３及び４週目に回収した。マウスを、最後の免疫化から２週間後に安楽死させ、便、全血及びリンパ組織を回収した。ワクチン製剤を投与していないナイーブなマウスをコントロールとして使用した。
【００６６】
実施例６：ワクチンによって誘導される免疫応答の用量反応、動力学及び期間
マウスのグループ（５匹のマウス／グループ）を、０日目及び２１日目にＩＭ及びＩＤ経路で１０、１又は０．１μｇのＧＩＩ−４  ＶＬＰで免疫化した。血清を０、２、３及び４週目に回収し、マウスを５週目に殺した。回収した各血清を１：２００の希釈でＮＶ特異的ＩｇＧについて試験した。用量１０及び１μｇで同様の応答レベルが誘発されたが、用量０．１μｇでは若干低い応答が観察された（図２）。加えて、上記のマウスグループからのプールした血清のエンドポイント力価は同様であった（図３）。コントロールであるナイーブなマウスはＮＶに応答しなかった。図４は、毎週回収した血清で測定された免疫応答の動力学を示す。免疫化の時点を矢印で示す。結果は、１回の免疫化が極めて強力な免疫応答を、特には用量１０μｇ及び１μｇで誘導することを示す。用量５０μｇは、用量１０μｇと同様の応答を誘導し、これは用量１０μｇで応答がプラトーに達することを示す。つまり、これらの結果から用量１０及び１μｇが最適な用量であることがわかる。ただし、その他の用量のワクチン製剤も使用し得る。加えて、用量１０μｇでは、２５週目まで衰えることのない長期間にわたって持続する免疫応答が誘導された（図５）。
【００６７】
実施例７：便の分析
血清から腸管内腔内へのＩｇＧの移動は、ＮＶ、ＲＶ等の腸内病原菌からの防御と関連づけられている。ＲＶ感染からの防御を仲介する又は疾患から回復させる、腸管内でのＩｇＧの能力は、小児における受動免疫グロブリン処置から明らかになっている。
【００６８】
単独ワクチン製剤又は混合ワクチンのＩｇＧの考えられ得る移動への影響を試験するために、新鮮なマウスの便を、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、１％アプロチニン及び１０μＭのロイペプチン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有する１０ｍＭのＴｒｉｓバッファに懸濁させ、ボルテックスにより均質化した１０％の便懸濁液を再構成した。均質化した懸濁液を氷上で２０分間にわたって維持し、１５分間にわたって１８０００ｘｇ、＋４℃で遠心分離に供した。上清を抽出し、−８０℃で保存した。
【００６９】
便サンプルを、血清抗体ＥＬＩＳＡについて説明したように、若干の変更を加えてノロウイルスＧＩＩ−４及びロタウイルスＶＰ６特異的ＩｇＧについてＥＬＩＳＡで試験した。コーティング及びブロッキング後、便サンプル（１０％便懸濁液）を１：２から連続的に１：３２まで２倍希釈し、プレートに加えた。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を１：３０００に希釈し、プレートを展開し、上述したように吸光度を測定した。
【００７０】
図８は、極めて高いレベルのＮＶ特異的ＩｇＧが免疫化マウスの便で検出されたが、コントロールのマウスの便では検出されなかったことを示す。
【００７１】
実施例８：血清分析
マウスのグループを、上述したように各単独ワクチン製剤又は混合ワクチンで免疫化した。ＩｇＧサブタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを、免疫化マウスの血清から測定することによってワクチン製剤によって誘導される免疫応答のタイプを求められるようにした。Ｔヘルパー（Ｔｈ）１／Ｔｈ２ダイコトミーと優勢な免疫グロブリンアイソタイプとの関係を求めた。ＩｇＧ１はＴｈ２タイプ応答、ＩｇＧ２ａはＴｈ１タイプ応答と分類された。Ｔｈ１タイプは細胞性免疫を促進し、Ｔｈ２タイプは体液性免疫を促進する。
【００７２】
ノロウイルス血清ＩｇＧ及びＩｇＧサブタイプＥＬＩＳＡ
免疫化マウス及びコントロールのマウスからの血清を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａについて試験した。ノロウイルスＧＩＩ−４、ＧＩＩ−１２及びＧＩ−３  ＶＬＰを、１０ｍＭのＰＢＳ中、それぞれ濃度０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）で９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）のコーティング（４℃、一晩）に使用した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、プレートを室温（ＲＴ）で１時間にわたって５％のスキムミルク（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するＰＢＳでブロックした。次にウェルを３回、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１時間にわたって３７℃で、１％のスキムミルクを含有するＰＢＳ−Ｔ中で１：２００に希釈した１００μｌの血清又は２倍希釈系列と共にインキュベートした。全ての血清サンプルを２重のウェルで試験した。６回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ中の１％ミルク中で１：４０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をウェルに加えた。
【００７３】
抗ＧＩＩ−４  ＩｇＧサブタイプ応答を、ＰＢＳ−Ｔ中の１％ミルク中で１：６０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ  ＨＲＰ抱合体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して調べた。インキュベーション後（１時間、３７℃）、プレートを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）基質を濃度０．４ｍｇ／ｍｌで添加した。プレートを暗所において室温で３０分間にわたってインキュベートし、反応を２Ｍの硫酸（Ｈ2ＳＯ4）で止めた。波長４９０ｎｍでの吸光度（光学密度、ＯＤ）を、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で測定した。ナイーブなマウスからの１つの既知の陽性血清サンプル及び１つの陰性血清サンプルをコントロールとして全てのプレートに加えた。ブランクのウェル（血清を入れていないウェル）からのバックグラウンドシグナルを、プレートでのＯＤ測定値の全てから引いた。正味の吸光度値が設定したカットオフ値より高い場合はサンプルを陽性とみなし、計算は以下の通りに行われた：平均ＯＤ（ナイーブなマウス）＋３ｘＳＤ及び少なくとも０．１００ＯＤ。
【００７４】
ロタウイルス血清ＩｇＧ及びＩｇＧサブタイプＥＬＩＳＡ
ＶＰ６タンパク質を、バイカーボネート／カーボ―ネートバッファ（０．１ｍＭのＮａ2ＣＯ3、０．８ｍＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５５）中、濃度１μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）で９６ウェルマイクロタイタープレートのコーティングに使用した。上記のステップ後、ＥＬＩＳＡを、ノロウイルスの場合のＥＬＩＳＡと同様にして行った。交差反応性ロタウイルス特異的血清抗体の検出に関して、ポリクローナルウサギ抗ロタウイルス（ヒト）（ＤＡＫＯ）をバイカーボネート／カーボネートバッファで１：２００に希釈し、１００μｌ／ウェルをマイクロタイタープレートのコーティングに使用した（＋４℃、一晩）。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、プレートを、上述したようにして調製した１００μｌ／ウェルのロタウイルス抗原（４℃、一晩）でコーティングした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、プレートを＋３７℃で１時間にわたって５％のスキムミルクを含有するＰＢＳでブロックした。このステップの後、ＥＬＩＳＡを、ノロウイルスの場合の血清ＥＬＩＳＡと同様にして行った。
【００７５】
血清ＩｇＧの強度及びサブタイプ
図６、７はそれぞれノロウイルス及びロタウイルス特異的血清ＩｇＧ滴定を示す。コントロールのマウスを除いて、免疫化したマウスのどのグループについてもエンドポイント力価はかなり高かった（逆数力価＞４〜５ｌｏｇ１０）。これらの結果は、混合ワクチン中の成分による特異的免疫応答の相互阻害又は抑制がないことを示している。
【００７６】
図９、１０は、本発明のワクチン製剤の全てが、バランスのとれた混合型、すなわちＴｈ１タイプ及びＴｈ２タイプの免疫応答を誘導することを示している。この両方のタイプの免疫応答がノロウイルス及び／又はロタウイルスへの感染からの防御を仲介しているらしいことを考えると、このことは重要な観察結果である。Ｔｈ細胞はＢ細胞を支援し（細胞間の接触又は可溶性サイトカインにより）、特にはワクチン全般が誘導しようとする長期間にわたるメモリー応答に必要なメモリーＢ細胞への分化を支援する。ＲＶ  ＶＰ６特異的Ｔｈ細胞はマウスロタウイルス感染からの防御を誘導し、またＲＶの異型のＶＰ４又はＶＰ７分子上の中和エピトープに特異的なＢ細胞に同種の支援を行う（Ｅｓｑｕｉｖｅｌ  ＦＲ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０００；Ｐｅｒａｌｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００９）。従って、Ｔｈ細胞は、異型の免疫応答の誘導に重要である。
【００７７】
実施例９：免疫応答のアビディティ
抗体アビディティは、機能的抗体の成熟又は親和性の成熟の尺度である。高アビディティの抗体は、ワクチンの防御効力と大きく相関することが示されている（Ｍａｋｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。発明者は、血液中に高アビディティのＮＶ特異的ＩｇＧ抗体を有するより年齢の高い子供は、抗体が低アビディティの２歳未満の子供よりＮＶへの感染が少ないことを以前に示している（Ｎｕｒｍｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００７８】
ＮＶ及びＲＶ抗体のアビディティを求めるために、尿素溶出により低アビディティの抗体を除去した［Ｋａｎｎｏ  ａｎｄ  Ｋａｚｕｙａｍａ，２００２］。ＥＬＩＳＡアッセイを、追加の尿素インキュベーションステップを除いて上述のように行った。抗原（ノロウイルスＧＩＩ−４  ＶＬＰ又はロタウイルスＶＰ６タンパク質）をコーティングしたプレート上での血清のインキュベーション後、血清をプレートから吸引し、ＰＢＳ−Ｔ中の８Ｍの尿素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した。５分間のインキュベーション後、処理を繰り返した。プレートを４回洗浄し、それからＨＲＰ抱合抗マウスＩｇＧを添加し、プレートを上述したようにして展開した。アビディティインデックスを、［尿素がある場合のＯＤ／尿素がない場合のＯＤ］ｘ１００％として計算し、インデックスの値が５０％を超える場合を高アビディティとみなした。
【００７９】
単独又は混合ワクチンでの免疫化は、高アビディティのＮＶ−及びＲＶ特異的ＩｇＧ抗体を誘導した（アビディティインデックスはそれぞれ５０％を超える）。結果は、本ワクチン製剤が、防御特性を有する高アビディティ抗体の強力な誘導物質であることを示す（図１１）。
【００８０】
実施例１０：交差反応性免疫応答
異なる血清型（Ｇ１Ｐ８、Ｇ２Ｐ６、Ｇ４Ｐ６、Ｇ８Ｐ１０、Ｇ１２Ｐ４、ＢＲＶ、ＲＲＶ）のロタウイルスを胎児アカゲザル腎臓（ＭＡ１０４）細胞（ＭＡ１０４）中で培養し、交差反応性研究のためのＥＬＩＳＡにおける抗原として使用するために用意した。
【００８１】
免疫化したマウス及びコントロールのマウスからの血清を、実施例８で説明したようにＥＬＩＳＡでノロウイルス及びロタウイルス抗体について試験した。ノロウイルスＧＩＩ−４誘導血清抗体は、異種ＧＩ−３及びＧＩＩ−１２抗原に対して交差反応性であった（図１２、上のパネル）。更に、ワクチン製剤で免疫化したマウスのロタウイルス特異的血清抗体は、サブグループ１及び２に属する様々なヒト、ウシ及びサルロタウイルス株に対して交差反応性であった（図１２、下のパネル）。
【００８２】
驚くべきことに、ロタウイルスＶＰ６抗原では、ロタウイルスＶＰ６単独ワクチンと比較して、混合ワクチンで免疫化したマウスの血清におけるＧＩ−３に対する交差反応性免疫応答は約５０％上昇した（図１２、上のパネル）。この結果は、本混合ワクチンの抗原性成分により相乗効果がもたらされることを示している。
【００８３】
実施例１１：ブロッキングアッセイ
ブロッキングアッセイは、ＮＶについての代替中和アッセイである。ＮＶは、インビトロの培地では成長しないため、古典的な意味でのウイルスが結合して許容細胞に感染するのをブロックする抗体での中和アッセイを行うことができない。近年、ヒト組織／血液型抗原（ＨＢＧＡ）が、とりわけ粘膜表面の細胞（例えば、腸細胞）上で発現するＮＶの受容体として発見された。例えば、糖Ｈタイプ３がＮＶ  ＧＩＩ−４の推定上の受容体として特定されているため、ＧＩＩ−４  ＶＬＰは上記の糖に結合する（Ｌ  Ｈｕｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。受容体へのＮＶ  ＶＬＰの結合は、中和特性を有する抗体でブロックされると予測される。実際、ＧＩＩ−４  ＶＬＰのＨタイプ３への結合は、飲用水媒介の急性胃腸炎の大流行中にＮＶに感染しなかった子供からの血清でブロックすることができた（Ｋ  Ｎｕｒｍｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＮＶへの感染からの防御は、血清の強力なブロッキング活性と相関関係にあった。従って、抗体のブロッキング活性は、様々なワクチンアプローチを考慮にいれる場合、ＮＶ防御の関連する代替マーカーになり得る。
【００８４】
ＮＶ  ＶＬＰのＨＢＧＡ  Ｈタイプ３への結合をブロックするためのアッセイを、免疫化したマウス及びコントロールのマウスの血清で行った。マイクロタイタープレートを、濃度２μｇ／ｍｌでＰＢＳ中のＧＩＩ−４又はＧＩ−３  ＶＬＰ（ｐＨ７．２）でコーティングし、４時間にわたって室温でインキュベートした。洗浄後、プレートをＰＢＳ中の５％のミルクと共に一晩、４℃でインキュベートした。１：２００〜１：６４００まで連続的に希釈した血清をウェルに加え、プレートを１時間にわたって３７℃でインキュベートした。血清を吸引後、１００μｌのビオチン化Ｈタイプ３又はＬｅｗｉｓ  Ｂ（Ｌｅｕb）（Ｌｅｃｔｉｎｉｔｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社、モスクワ、ロシア）（コントロール）を、１％のミルクを含有するＰＢＳ−Ｔ中の濃度２０μｇ／ｍｌ又は４０μｇ／ｍｌで添加した。３７℃での４時間後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン抱合ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の１：２０００希釈物を添加し、１時間にわたって３７℃でインキュベートした。呈色反応の進行及び波長４９０ｎｍでの吸光度の測定を上述した通りに行った。血清なしでインキュベートしたウェルのＯＤ測定値を、Ｈタイプ３のＧＩＩ−４  ＶＬＰへの結合についての最大シグナルとみなした。ブロッキングインデックスは以下のようにして計算した：１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。ＶＬＰの陰性コントロールＬｅｕbＨＢＧＡへの結合は検出されなかった。ブランクのウェル（ＨＢＧＡが入っていないウェル）からのバックグラウンドシグナルを、試験したサンプルのＯＤ値の全てから引いた。
【００８５】
図１３Ａ及び１３Ｂはそれぞれ、ＧＩＩ−４及びＧＩ−３のその推定上の受容体Ｈタイプ３への結合のブロッキングを示している。混合ワクチンと比較すると、単独ワクチンで免疫化したマウスのＨタイプ３へのＧＩＩ−４  ＶＬＰの結合を最大限ブロックするには２倍大きい力価が必要であった（図１３Ｃ）。この結果は、混合ワクチン中のｒＶＰ６タンパク質が、ＧＩＩ−４特異的血清のブロッキング活性を抑制又は阻害していないことを示す。それどころか、混合ワクチン製剤で免疫化したマウスの血清の注目に値するブロッキング活性は、これまでの実験で検出されたものと同様のｒＶＰ６タンパク質のアジュバント効果を示す。更に、発明者のデータは、遺伝子群間の交差防御が、発明者の研究で使用したワクチン製剤で容易に検出可能であることを示す。この種の観察結果は、ノロウイルスワクチン研究の分野において極めて稀である。また、この結果は、ウイルスの１つの株／遺伝子型（いわゆる一価ワクチン）での免疫化は、上述したようにワクチン製剤に含まれていない他の株に対する交差反応性又は異型免疫応答を誘導するだけではなく、異種ウイルスの結合もブロックし、それを中和することを示す。
【００８６】
実施例１２：抗体分泌細胞（ＡＳＣ）ＥＬＩＳＰＯＴ
抗体分泌細胞（ＡＳＣ）は、プラズマＢ細胞及び病原体からの長期間にわたる防御を担い、ワクチン接種で誘導しようとするメモリー応答の特徴である病原体への再曝露と同時に迅速に病原体に反応するメモリーＢ細胞（メモリー応答）に分割される。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、免疫化したマウスの脾臓におけるＩｇＧ抗体分泌プラズマ細胞及びメモリーＢ細胞の頻度を検出した。
【００８７】
安楽死させたマウスの脾臓をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）に回収した。脾臓の構造体をメスで切断し、７０μｍセルストレーナ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、米国）で単細胞懸濁液に解離させた。懸濁液を３００ｘｇで１０分間にわたって遠心分離し、細胞をＨＢＳＳに再懸濁させた。赤血球を１：１０に希釈したＨＢＳＳで溶解させ、その後、懸濁液のモル濃度を２ｘＨＢＳＳで回復させた。脾細胞懸濁液を３回洗浄し、凍結培地（４０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で凍結させ、後に使用するために液体窒素中で保存した。
【００８８】
９６ウェルＰＶＤＦプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を一晩、＋４℃でノロウイルスＧＩＩ−４  ＶＬＰ又はロタウイルスＶＰ６タンパク質で、濃度４０μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル中）でコーティングした。脾細胞を液体窒素から解凍し、洗浄し、培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０）に懸濁させた。プレートを洗浄、ブロックした後、脾細胞を濃度４ｘ１０5細胞／ウェルで添加し、一晩、＋３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。プレートを６回、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をウェルに希釈１：１０００で添加した。３時間の室温でのインキュベーション後、プレートをしっかりと洗浄し、ＤＡＢ基質（ＳｉｇｍａＦＡＳＴ  ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で展開し、スポットを数えた。コントロールであるナイーブな動物のウェルに現れるスポットを実験グループから引いた。データを、ＧＩＩ−４  ＶＬＰ又はＶＰ６特異的抗体分泌細胞（ＡＣＳ）として表わし、１ｘ１０6細胞ごとに正規化した。
【００８９】
一部の例では、細胞をインビトロで４日間にわたってＧＩＩ−４  ＶＬＰ又はｒＶＰ６と共にインキュベートし、洗浄し、メモリーＢ細胞の数量化との関連で説明したようにプレーティングした。インビトロでの刺激を受けていない細胞で行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られたスポットを、活発に分泌するプラズマ細胞とみなした。４日間にわたって培養した細胞で得られたスポットは、プラズマ細胞でできたスポットを引いた後、メモリーＢ細胞活性を表す。
【００９０】
図１４は、本ワクチン製剤がＮＶ及びＲＶ特異的ＩｇＧ抗体を産生するプラズマＢ細胞を誘導することを示す。また、特異的ＩｇＧ抗体を分泌するメモリーＢ細胞が高頻度で単独及び混合ワクチンで同様の量で誘導され、誘導される応答がメモリー応答であることを示す。
【００９１】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【配列表】
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