(57)【要約】本発明は、高精度かつ簡便に、さらにコンタミネーションのリスクを軽減しつつ、HLA-A*24:02アリルを特異的に検出する方法を提供することを課題とする。その解決手段として、本発明は、配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも16番目までのDNA配列からなるPCRプライマーを含有するプライマーセット、それを含むキット、及びそれを利用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ１）配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも16番目までのDNA配列からなるフォワードPCRプライマー
を含有する、プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のフォワードPCRプライマー（Ａ１）、及び
（Ａ２）配列番号2で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも20番目までのDNA配列からなるリバースPCRプライマー
を含有する、プライマーセット。
【請求項３】
請求項１若しくは２に記載のプライマーセット、及び
（Ｂ）配列番号3で表されるDNA配列の部分配列であって、429、437、440、442、443、447及び449番目の塩基のいずれか一塩基を含む15〜25塩基の連続したDNA配列；又は
その相補的配列
からなるオリゴヌクレオチドが標識された配列特異的結合プローブ
を含有する、リアルタイムPCR用キット。
【請求項４】
（１）ヒトDNA検体を鋳型として、請求項３に記載のキットを用いてリアルタイムPCRを行う工程；及び
（２）工程（１）においてシグナルが検出されたヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであると決定する工程
を含有する、ヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであるか否かを判定する方法。
【請求項５】
（１）ヒトDNA検体を鋳型として、請求項３に記載のキットを用いてリアルタイムPCRを行う工程；及び
（２）工程（１）においてシグナルが検出されたヒトDNA検体の採取元であるヒトを、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチンを投与する対象として選別する工程
を含有する、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチン投与対象群のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HLA-A*24:02を検出する方法、及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新しい腫瘍特異抗原が次々に同定されてきており、それに伴い新しい免疫療法の開発が進んでいる。うち、癌免疫療法は腫瘍抗原に特異的なCD8陽性T細胞を生体内で惹起させるワクチン療法が主流である。ワクチン療法による癌免疫療法に関して種々の臨床応用が行われている。腫瘍特異抗原の一部である10個前後のアミノ酸残基がHLA分子に結合した、ペプチド・HLA複合体を認識することにより、腫瘍特異的なCD8陽性T細胞が惹起される。このことを利用して、HLAに結合するペプチドを抗原にしたペプチドワクチン療法が開発されている。【０００３】
現在、日本国内では、日本人が多く保有しているHLA-A*24:02に結合するペプチドを利用するペプチドワクチン療法の開発が先行している。このペプチド投与により効果が期待されるのはHLA-A*24:02アリルを保持している患者に限られる。このため、投与前に予め対象患者がHLA-A*24:02を保持していることを確認する必要がある。【０００４】
HLAの検査はDNAタイピングが現在、最も一般的な検査方法であり、代表的な手法として、PCR-SBT (Sequencing-Based Typing)、PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) 及びPCR-SSP (Sequence Specific Primers) 等が知られている。【０００５】
ペプチドワクチンの投与前にHLA-A*24を検出する方法として、PCR-SSPを基本とした方法が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nakatsugawa Mら、「Comparison of speedy PCR-ssp method and serological typing of HLA-A24 for Japanese cancer patients.」、「Journal of Immunoassay and Immunochemistry」、2011年4月、32(2)、pp. 93-102
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の方法のうち、PCR-SBTはHLA遺伝子のDNA配列をシークエンサーで解読する必要があり、操作が煩雑で、また解析のために専用のソフトウェアが必要になるという問題点があった。また、従来のPCR-SSPには、正確性を向上するためにはプライマーセットの数を増やさなければならないという問題点があった。さらに、従来のPCR-SSPでは、PCR産物を電気泳動で確認しなければならいため、コンタミネーションのリスクがあった。コンタミネーションのリスクは、とりわけ遺伝子検査の分野においては信頼性を大きく損ねるものである。【０００８】
PCR-SBTを利用すれば、上記の問題点のために簡便とは言い難いにせよ、HLA-A*24:02アリルのみを特異的に検出すること自体は可能である。しかしながら、そもそも従来のPCR-SSO及びPCR-SSPでは、HLA-A*24:02アリルのみを特異的に検出することはできなかった。【０００９】
したがって、本発明は、従来の方法に比べて、より簡便に、さらにコンタミネーションのリスクを軽減しつつ、HLA-A*24:02アリルを特異的に検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、A*24:02:01:01及びA*24:20のそれぞれの塩基配列は、HLAの211番目の塩基が、A*24:02:01:01ではCであるのに対して、A*24:20ではAである点のみにおいて異なることに着目した。本発明者らは、この211番目の塩基を標的塩基とし、当該標的塩基においてミスマッチを形成するようなフォワードPCRプライマーを、所定のリバースPCRプライマー及び配列特異的結合プローブと組み合わせてリアルタイムPCRを行うことにより、HLA-A*24:02アリルを特異的に検出できることを見出した。【００１１】
本発明は上記の新しい知見に基づいてさらなる研究を重ねることにより完成されたものである。本発明は、以下の実施形態を含む。
項１
（Ａ１）配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも16番目までのDNA配列からなるフォワードPCRプライマー
を含有する、プライマーセット。
項２
項１に記載のプライマー（Ａ１）、及び
（Ａ２）配列番号2で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも20番目までのDNA配列からなるリバースPCRプライマー
を含有する、プライマーセット。
項３
項１若しくは２に記載のプライマーセット、及び
（Ｂ）配列番号3で表されるDNA配列の部分配列であって、429、437、440、442、443、447及び449番目の塩基のいずれか一塩基を含む15〜25塩基の連続したDNA配列；又は
その相補的配列
からなるオリゴヌクレオチドが標識された配列特異的結合プローブ
を含有する、リアルタイムPCR用キット。
項４
（１）ヒトDNA検体を鋳型として、項３に記載のキットを用いてリアルタイムPCRを行う工程；及び
（２）工程（１）においてシグナルが検出されたヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであると決定する工程
を含有する、ヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであるか否かを判定する方法。
項５
（１）ヒトDNA検体を鋳型として、項３に記載のキットを用いてリアルタイムPCRを行う工程；及び
（２）工程（１）においてシグナルが検出されたヒトDNA検体の採取元であるヒトを、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチンを投与する対象として選別する工程
を含有する、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチン投与対象群のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高精度かつ簡便に、さらにコンタミネーションのリスクを軽減しつつ、HLA-A*24:02アリルを特異的に検出する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(A)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(A)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:20/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図３】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(A)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*02:01/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図４】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(A)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*11:01/11:01のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図５】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(A)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*23:01/29:01のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図６】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(A)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、TEバッファー（ネガティブコントロール）に対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図７】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図８】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06 、HLA-A*11:01/11:01及びHLA-A*23:01/29:01それぞれのゲノムDNA、並びにTEバッファー（ネガティブコントロール）に対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図９】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(A) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１０】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(A) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:20/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１１】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(A) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*02:01/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１２】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(A) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*11:01/11:01のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１３】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(A) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*23:01/29:01のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１４】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(A) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、TEバッファー（ネガティブコントロール）に対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１５】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(B) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１６】QuantiTect Multiplex PCR Kit、プライマーセット(B) 及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06 、HLA-A*11:01/11:01及びHLA-A*23:01/29:01それぞれのゲノムDNA、並びにTEバッファー（ネガティブコントロール）に対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１７】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１８】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)を用いて、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及びHLA-A*23:01/29:01それぞれのゲノムDNA、並びにTEバッファー（ネガティブコントロール）に対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図１９】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２０】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、HLA-A*24:20/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２１】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、HLA-A*02:01/02:06のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２２】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、IPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、HLA-A*11:01/11:01のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２３】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、HLA-A*23:01/29:01のゲノムDNAに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２４】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、TEバッファー（ネガティブコントロール）に対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２５】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、プライマーセット(B)及びA*24:02検出用プローブ (i)、並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ(i)を用いて、HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及びHLA-A*23:01/29:01それぞれのゲノムDNA、並びにTEバッファー（ネガティブコントロール）それぞれに対してリアルタイムPCRを行った後、それぞれのPCR産物をアガロース電気泳動に供した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２６】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー-及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ(i)又は(ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (i)又は(ii)を用いて、HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及びHLA-A*23:01/29:01それぞれのゲノムDNA、並びにTEバッファー（ネガティブコントロール）のそれぞれに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２７】TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix、配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー-及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、プライマー及びプローブの濃度をそれぞれ変化させながらHLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及びHLA-A*23:01/29:01それぞれのゲノムDNA、並びにTEバッファー（ネガティブコントロール）のそれぞれに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２８】配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、日本人由来細胞株ゲノム100サンプルに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図２９】配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、日本人由来細胞株ゲノム100サンプルに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図３０】配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、日本人由来細胞株ゲノム100サンプルに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図３１】配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、日本人由来細胞株ゲノム100サンプルに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図３２】配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、日本人由来細胞株ゲノム100サンプルに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【図３３】配列番号12で表されるDNA配列からなるフォワードPCRプライマー及び配列番号23で表されるDNA配列からなるリバースPCRプライマー、並びにA*24:02検出用プローブ (ii)；並びにIPC用プライマーセット及びIPC用プローブ (ii)を用いて、日本人由来細胞株ゲノム100サンプルに対してリアルタイムPCRを行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．  プライマーセット
１．１  フォワードプライマー（Ａ１）
本発明のプライマーセットは、
（Ａ１）配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも16番目までのDNA配列からなるフォワードPCRプライマー
を含有する、プライマーセットである。
【００１５】
配列番号1は、HLAのDNA配列の、190〜211番目の部分配列に相当する。
【００１６】
フォワードPCRプライマー（Ａ１）は、配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から好ましくは16〜21番目、より好ましくは19番目までのDNA配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
フォワードPCRプライマー（Ａ１）は、3’末端に位置する塩基、すなわちHLAのDNA配列の211番目塩基に相当する塩基がCである。A*24:02:01:01及びA*24:20のHLA塩基配列はそれぞれ、HLAの211番目の塩基が、A*24:02:01:01ではCであるのに対して、A*24:20ではAである点のみにおいて異なる。したがって、フォワードPCRプライマー（Ａ１）は、A*24:02:01:01及びA*24:20のHLA塩基配列とそれぞれハイブリダイズさせるとA*24:20のHLA塩基配列とのみ、211番目の位置において一塩基ミスマッチを生じる。しかしながら、一般に、PCRプライマーとしての働きは、一塩基のみのミスマッチでは損なわれないことが知られている。そこで、ミスマッチによるPCR阻害を達成するためには、通常は、ミスマッチ部位から1又は2塩基5’塩基側にも別途ミスマッチを設けることが行われている。しかも、フォワードPCRプライマー（Ａ１）がA*24:20のHLA塩基配列との間に生じるミスマッチはいわゆるC-Tミスペアーであり、これは一般にPCR伸張反応を阻害しにくいとされる。したがって、フォワードPCRプライマー（Ａ１）を用いると、たとえA*24:20のHLA塩基配列を試料として用いたとしても、上記ミスマッチが原因でPCR伸張反応が起こらなくなるとは考えられにくい。しかしながら、本発明者らは、予想に反して、フォワードPCRプライマー（Ａ１）を用いると、A*24:20のHLA塩基配列を試料として用いた場合に、ミスマッチが原因で伸張反応が起こらないことを突き止めた。したがって、フォワードPCRプライマー（Ａ１）を用いると、さらに所定のリバースプライマーと組み合わせることにより、A*24:02:01:01とA*24:20を見分けることができる。
【００１８】
さらに、本発明者らは、フォワードPCRプライマー（Ａ１）を用いると、さらに所定のリバースプライマーと組み合わせることにより、A*24:02:01:01だけに限らず、A*24:02全般を、A*24:20から見分けることができることを見出した。
【００１９】
１．２  リバースプライマー（Ａ２）
本発明のプライマーセットは、さらに、
（Ａ２）配列番号2で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも20番目までのDNA配列からなるリバースPCRプライマー
を含有していてもよい。
【００２０】
配列番号2は、HLAのDNA配列の、882〜910番目の部分配列の相補的配列に相当する。
【００２１】
リバースPCRプライマー（Ａ２）は、配列番号2で表されるDNA配列のうち、3’末端から好ましくは少なくとも21番目までの、より好ましくは23番目までのDNA配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
リバースPCRプライマー（Ａ２）は、3’末端から2塩基目までに位置する2塩基、すなわちHLAのDNA配列の909番目及び910番目の塩基と相補的な塩基がT及びGである。A*23:01:01、並びにA*24:04及びA*24:20のHLA塩基配列はそれぞれ、HLAの909番目及び910番目の塩基が、A*24:02:01:01、A*24:04及びA*24:20ではC及びAであるのに対して、A*23:01:01ではT及びTである点において異なる。したがって、リバースPCRプライマー（Ａ２）は、A*23:01:01、A*24:02:01:01、並びにA*24:04及びA*24:20のHLA塩基配列とそれぞれハイブリダイズさせると、A*23:01:01のHLA塩基配列とのみ、909番目及び910番目の位置において二塩基ミスマッチを生じる。このミスマッチはPCR伸張反応を阻害する。したがって、リバースPCRプライマー（Ａ２）を用いると、A*23:01:01のHLA塩基配列を試料として用いた場合に、二塩基ミスマッチが原因でPCR伸張反応が起こらない。したがって、リバースPCRプライマー（Ａ２）を用いると、さらに所定のフォワードプライマーと組み合わせることにより、A*23:01:01を、A*24:02:01:01、A*24:04及びA*24:20から見分けることができる。
【００２３】
さらに、本発明者らは、リバースPCRプライマー（Ａ２）を用いると、さらに所定のフォワードプライマーと組み合わせることにより、A*23:01:01を、A*24:02:01:01に限らずA*24:02全般、A*24:04及びA*24:20から見分けることができることを見出した。
【００２４】
２．  リアルタイムPCR用キット
本発明のリアルタイムPCR用キットは、上記１．に記載のプライマーセット、及び
（Ｂ）配列番号3で表されるDNA配列の部分配列であって、429、437、440、442、443、447及び449番目の塩基のいずれか一塩基を含む15〜25塩基の連続したDNA配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドが標識された配列特異的結合プローブを含有する。
【００２５】
上記１．に記載のプライマーセットは、好ましくは、
（Ａ１）配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から16〜21番目までのDNA配列からなるフォワードPCRプライマー；及び
（Ａ２）配列番号2で表されるDNA配列のうち、3’末端から少なくとも21番目までのDNA配列からなるリバースPCRプライマー
を含有する。
【００２６】
上記１．に記載のプライマーセットは、より好ましくは、
（Ａ１）配列番号1で表されるDNA配列のうち、3’末端から19番目までのDNA配列からなるフォワードPCRプライマー；及び
（Ａ２）配列番号2で表されるDNA配列のうち、3’末端から23番目までのDNA配列からなるリバースPCRプライマー
を含有する。
【００２７】
２．１  配列特異的結合プローブ（Ｂ）
本発明で用いる配列特異的結合プローブ（Ｂ）は、配列番号3で表されるDNA配列の部分配列であって429、437、440、442、443、447及び449番目の塩基のいずれか一塩基を含む15〜25塩基の連続したDNA配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドが標識された配列特異的結合プローブである。
【００２８】
配列番号3で表されるDNA配列は、HLA-A*24:02:01:01の1〜1,000番目の部分配列に相当する。
A*24:02及びA*24:04は、429番目〜449番目のDNA配列に含まれる7塩基においてDNA配列が相違する。具体的には、A*24:02は、429、437、440、442、443、447及び449番目の塩基が、それぞれ順にA、C、T、G、C、T及びCなのに対して、A*24:04はそれぞれ順にC、G、C、C、T、G及びGである点においてDNA配列が相違する。
【００２９】
具体的には、例えば、配列番号3で表されるDNA配列の427〜451、429〜449又は433〜451番目のDNA配列からなるオリゴヌクレオチドが標識された配列特異的結合プローブを用いることができる。
【００３０】
配列特異的結合プローブ（Ｂ）を上記プライマーセットとともに用いることにより、211番目の塩基がCであり、909及び910番目の塩基がそれぞれC及びAであり、かつ、429、437、440、442、443、447及び449番目のいずれかの塩基が配列番号3の塩基配列と一致するHLA（例えば、A*24:02:01:01のHLA）のDNAをリアルタイムPCRにより検出できる。
【００３１】
さらに、本発明者らは、配列特異的結合プローブ（Ｂ）を上記プライマーセットとともに用いることにより、A*24:02:01:01に限らずA*24:02全般のHLAのDNAだけを特異的にリアルタイムPCRにより検出できることを見出した。
【００３２】
上記検出の精度は、詳細には、日本人を対象としたときに、現在報告されているA*24:20及びA*24:04を陽性とせずに判定できる精度である。上記検出の精度は、日本人について未報告のアリルが含まれる群に対しても、A*24:02を特異的に検出できる精度である。具体的には、上記検出の精度は、抗原型がA*24と異なるアリル、並びにA*24:08、A*24:13、A*24:19、A*24:24、A*24:29、A*24:44、A*24:89、A*24:94、A*24:89、A*24:109及びA*24:129のいずれも陽性とせずに判定できる精度である。
【００３３】
配列特異的結合プローブ（Ｂ）を上記プライマーセットとともに用いてリアルタイムPCRを行うことにより、Plus/Minus Assayを行うことができる。また、この方法により単一の反応系で検出することができ、内部標準（internal positive control）反応が同時に進むため、PCR阻害による偽陰性の可能性を排除できる。
【００３４】
配列特異的結合プローブ（Ｂ）は、リアルタイムPCRにより検出するための標識を有している。標識は、例えば蛍光標識である。リアルタイムPCRにおける検出方式の違いに応じて、標識の方式を選択する。
【００３５】
リアルタイムPCRにおける検出方式としては、特に限定されないが、例えば以下に示すものが挙げられる。
【００３６】
例えば、DNAポリメラーゼの5’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解されることにより蛍光を発することを利用して検出を行う方式（この方式に使用されるプローブを「加水分解プローブ」という。）が挙げられる。加水分解プローブの代表的な例として、市販のTaqMan（登録商標）Probeが挙げられる。
【００３７】
また、それぞれ異なる蛍光色素で標識されたプローブを使用し、一本鎖状の標的DNAには二つのプローブが互いに隣接してハイブリダイズして蛍光を発するが、二本鎖状の標的DNAにはプローブがいずれもハイブリダイズせず、蛍光を発しないことを利用して検出を行う方式（この方式に使用されるプローブを「ハイブリダイゼーションプローブ」という。）が挙げられる。
【００３８】
さらに、融解曲線分析を行うことにより検出を行う方式が挙げられる。融解曲線分析とは、核酸のアニーリングと熱変性をリアルタイムで追跡することをいう。プローブとターゲットのハイブリッドのTm は、ミスマッチがあると著しく低下する。融解曲線分析では、このことを利用して、ミスマッチの有無を検出する。
【００３９】
融解曲線分析は、PCR後に行うこともできる。
【００４０】
この方式のためには、先述のハイブリダイゼーションプローブの他、1種類の物質で標識されたプローブも用いることができる。
【００４１】
融解曲線分析では、配列特異的結合プローブと標的DNAのハイブリッドの融解をモニターすることにより、わずか一塩基のミスマッチであっても識別することができる。
【００４２】
融解曲線分析は、ハイブリダイゼーションプローブを用いる場合、詳細には次のような分析である。一方のオリゴヌクレオチドは標的DNAのミスマッチを生じない部分にハイブリダイズする。このプローブはアンカープローブとして機能する。もう一方のオリゴヌクレオチド（検出用プローブ）は、ミスマッチを生じ得る部分に結合する。ミスマッチを生じる場合、この検出用プローブのTm はアンカープローブのTm に比べて約5℃低くなる。DNA 増幅が完了した直後、適宜装置を用いて融解曲線分析を実行し異なる遺伝子型を識別する。この解析の間、温度を徐々に上げながら（例えば、1 秒当たり0.1 〜 0.2℃）継続して蛍光測定を行う。この操作により標的DNAに結合しているプローブの融解の動態をモニターすることができる。温度が上昇するに従い、短い変異プローブから融解されていく。融解により、2 種類の蛍光色素間の距離が離れるため、蛍光シグナルが減少する。プローブとターゲットのハイブリッドのTm はプローブの長さやGC 含有量だけでなく、ハイブリッドのホモロジーの程度にも依存する。したがって、より完全に結合したプローブほど融解のTm が高くなり、安定性に欠くミスマッチを含むDNA に結合したプローブではTm が低くなる。
【００４３】
リアルタイムPCRにおける検出方式としては、さらに、Molecular Beacon、Eclipse Probes（structured Probe）、HyProbe(adjacent hybridization Probes)及びQ Probeなどを用いる方式、並びにRNAとDNAからなるキメラProbeを用いるサイクリングProbe法及びInvader（登録商標） Probeを用いるInvader Plus（登録商標）法等も挙げられる。
２．２  その他のコンポーネント
本発明のPCR用キットは、さらに、その他の構成要素（コンポーネント）を含有していてもよい。
【００４４】
そのような構成要素としては、特に限定されないが、通常PCR用キットに含有されるようなものが挙げられる。
【００４５】
通常PCR用キットに含有されるような構成要素としては、特に限定されないが、例えば、dNTP（デオキシヌクレオチド三リン酸）、耐熱性DNAポリメラーゼ、Mg2+、PCRバッファー及び説明書等が挙げられる。
【００４６】
dNTP は、dTTPの代わりにdUTPを含有するものであってもよい。dNTP がdTTPの代わりにdUTPを含有する場合、ウラシルを含むDNA を分解する酵素であるUNG（Uracil-N -glycosylase）を利用することにより、以前に行ったPCR 増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性を防ぐことができる。すなわち、万が一以前に行ったPCR 増幅産物が反応系に混入したとしても、PCR 増幅産物はdUTPを取り込んでいるため、ウラシルを含むDNA を分解する酵素であるUNGを作用させることにより、このようなキャリーオーバーによる偽陽性を防止することができる。したがって、本発明のPCR用キットは、さらに、UNGを含有してもよい。
【００４７】
２．２．１  耐熱性DNAポリメラーゼ
耐熱性DNAポリメラーゼとしては、特に限定されないが、市販されているものの中からプローブの種類に応じて適宜選択できる。なお、本発明は、鋳型DNAとハイブリダイズさせたフォワードPCRプライマー（Ａ１）の3’末端にミスマッチが形成されたか否かを指標として判定を行うことを目的とするものであるので、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有さない耐熱性DNAポリメラーゼが好ましい。
【００４８】
配列特異的結合プローブ（Ｂ）として、加水分解プローブを使用する場合は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼが好ましい。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、Taq DNA polymerase及びTth DNA Polymeraseが好ましいものとして挙げられる。Taq DNA polymeraseとしては、通常のTaq DNA polymeraseに加えて、化学修飾型のAmpliTaq Gold（登録商標） DNA Polymerase、HotStarTaq（登録商標） DNA Polymerase及びFastStart Taq DNA Polymerase、並びにアプタマーを用いたホットスタート酵素であるAptaTaq DNA Polymerase、又は、抗Taq 抗体を利用したHot Start PCRシステム（TaKaRa Taq TM Hot Start Version等）等も用いることができる。
【００４９】
Molecular Beacon Probe又はHyprobeを用いる方式、並びにサイクリングプローブ法及びInvader Plus法等を採用する場合は、Proof-reading活性を欠失しており、かつ5’→3’ エキソヌクレアーゼ活性及び3’→5エキソヌクレアーゼ活性をいずれも有さない酵素を用いる。
そのような酵素としては、特に限定されないが、例えば、Taq Δ exo DNA polymerase 、KOD(exo-) DNA polymerase、Exo- Pfu DNA polymerase及びVent(exo-) DNA polymerase等が挙げられる。
【００５０】
２．２．２  Mg2+
Mg2+としては、特に限定されないが、例えば、MgCl2及びMgSO4としてPCR用キットに含有される。特に限定されないが、通常、1.5〜2.5 mMのMg2+が必要である。
【００５１】
２．２．３  バッファー
バッファーは、通常、使用する酵素の種類に応じて選択する。バッファーとしては、特に限定されないが、市販のPCR用バッファー、又は市販のPCR用キットに含有されるバッファーと同一のものを用いることができる。これらの市販品は、バッファー組成が開示されていない場合が多い。Taqポリメラーゼを使用する場合の標準的なバッファーの組成を以下に挙げる。
50 mM KCl
10mM Tris-HCl（pH 8.4〜9.0, 25℃）
1.5 mM MgCl2
0.01 % ゼラチン又は0.01 % Triton X-100
本発明のPCR用キットは、バッファーを使用時に比べて10倍程度高い濃度のものを含有していてもよい。この場合、使用時にバッファーを希釈して使用する。
【００５２】
３．判定方法
本発明の、ヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであるか否かを判定する方法は、
（１）ヒトDNA検体を鋳型として、上記２．に記載のキットを用いてリアルタイムPCRを行う工程；及び
（２）工程（１）においてシグナルが検出されたヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであると決定する工程
を含有する、ヒトDNA検体がHLA-A:24:02を有するヒト由来のものであるか否かを判定する方法である。
【００５３】
ヒトDNA検体としては、ヒトゲノムDNAを含有していればよく、特に限定されないが、例えば、血液、口腔粘膜、毛髪、爪及び血痕（血液をろ紙液に滴下したもの）等が挙げられる。
【００５４】
ヒトDNA検体としては、好ましくは、血液検体を用いることができる。血液検体としては、採血により調製されたものを直接用いることもできるし、採血により得られたものに所定の処理を加えたものを用いることもできる。所定の処理としては、特に限定されないが、例えば、加熱及び凍結等が挙げられる。
【００５５】
リアルタイムPCRには、通常用いられる市販の装置を使用することができる。市販の装置としては、特に限定されないが、例えばABI 7500 Fast及びABI 7500 Fast Dx（Life Technologies）等が挙げられる。
【００５６】
リアルタイムPCRの条件は、通常の条件で行うことができる。
【００５７】
プライマー及びプローブそれぞれについての濃度並びに反応容量は、例えば市販のプレミックス溶液（例えば、Taq DNA Polymerase、dNTPs、MgCl2及びバッファーの混合液）を使用する場合には、当該プレミックス溶液が推奨するところにしたがって決めることができる。市販のプレミックス溶液としては、特に限定されないが、例えば、TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix （Life Technologies）、QuantiTect（登録商標） Multiplex PCR Kit（QIAGEN）等が挙げられる。TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mixの推奨するところによれば、プライマー900 nM、プローブ250 nM、反応系を20μLとすることができる。また、QuantiTect（登録商標） Multiplex PCR Kitの推奨するところによれば、プライマー400 nM、プローブ200 nM、反応系を25μLとすることができる。
【００５８】
アニーリング温度及びエクステンション温度に応じて適したTm値のプライマーを選択する。
【００５９】
PCR条件は、適宜設定できる。特に限定されないが、例えば、次の条件が挙げられる。
（１）  50℃  2分
（２）  95℃  10〜15分
（３）  95℃  15秒
（４）  68℃  1分
（５）  （３）及び（４）を1サイクルとして、これを残り39サイクル（全合計が40サイクルとなるように）繰り返す。ただし、抗体型又はアプタマーのホットスタートを利用する場合は、活性化のための時間が不要となるため、上記（２）は0〜15分であってもよい。
【００６０】
本発明により、日本人のようなアリル頻度を有する群に対して、HLA-A:24:02の検出を簡便かつ高精度に行うことができる。
【００６１】
さらに、例えば、東南アジアにおいて、A*24サブタイプの一つであるA*24:07アリルが高頻度に報告されている国がある。日本ではA*24:07アリルの頻度は低い。A*24:02とA*24:07との配列相違は、412番目の一塩基のみである。この一塩基の相違に着目することによって、A*24:07を特異的に検出できるプライマーを設計できる。そのようなプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列番号4で表されるDNA配列からなるフォワードプライマー等が挙げられる。Tm値を68℃付近に設定すれば、このフォワードプライマーを用いてPCRを行うことにより、DNA増幅が観察された検体をA*24:07アリル陰性であると判定することができる。したがって、A*24:07アリルを高頻度に含む群に対しては、本発明の判定方法を基礎として、さらにA*24:07を特異的に検出できるプライマーを別途用いることによって、HLA-A:24:02の検出を簡便かつ高精度に行うことができる。また、アリル頻度が日本人と異なる他の群に対しても、本発明を基礎として同様の改良を加えることにより、HLA-A:24:02の検出を簡便かつ高精度に
行うことができる。
【００６２】
４．スクリーニング方法
本発明の、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチン投与対象群のスクリーニング方法は、
（１）ヒトDNA検体を鋳型として、上記２．に記載のキットを用いてリアルタイムPCRを行う工程；及び
（２）工程（１）においてシグナルが検出されたヒトDNA検体の採取元であるヒトを、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチンを投与する対象として選別する工程
を含有する方法である。
【００６３】
現在、日本国内では、日本人が多く保有しているHLA-A*24:02に結合するペプチド（HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチン）を利用するペプチドワクチン療法の開発が先行している。そのようなHLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチンとしては、例えば、OTS102、OCV-101、 OCV-105、WT4869、S288310、S488410及びOTSGC-A24等が挙げられる。
【００６４】
HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチンの投与により治療効果が期待されるのはHLA-A*24:02アリルを保持している患者に限られる。このため、投与前に予め対象患者がHLA-A*24:02を保持していることを確認することができれば、HLA-A:24:02拘束性ペプチドワクチンを投与する対象をスクリーニングできる。
【００６５】
ヒトDNA検体、リアルタイムPCRの諸条件及び対象群については、上記３．判定方法においてした説明と同様である。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００６７】
１．材料と方法
１−１．プライマー及びプローブの設計
Primerの設計に関し、A*24:02:01:01の配列を基に909〜910番目をReverse Primerの3’末端に設定することでA*23:01:01を検出せずにA*24:02:01:01を検出できる事は報告されている（Bunce M, O'Neill CMら、「Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 Primer mixes utilizing sequence-specific Primers (PCR-SSP).」、「Tissue Antigens」、1995年11月、46(5)、pp. 355-67）。【００６８】
A*24:02:01:01と相補的なForward Primerは、他のアリルに対しては3’末端一塩基のみ配列が相違することとなる。具体的には、Forward Primer の3’末端塩基がCで、例えばA*24:20の相補鎖はTとなり、この場合は最も伸長反応の起こりやすいとされるC-Tミスペアーを生じる（Kwok Sら、「Effects of Primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies.」、「Nucleic Acids Res.」、1990年2月、18(4)、pp. 999-1005；Huang MMら、「Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.」、「Nucleic Acids Res.」、1992年9月、20(17)、pp. 4567-73）。この問題を解決するためにはPrimerの各塩基にLNA(Locked Nucleic Acid)を用いる方法（Latorra Dら、「Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) Primers.」、「Hum Mutat.」、2003年7月、22(1)、pp. 79-85）やallele specific competitive blocker（Orou Aら、「Allele-specific competitive blocker PCR: a one-step method with applicability to pool screening.」、「Hum Mutat.」、1995年、6(2)、pp. 163-9）を用いる方法などが存在する。【００６９】
A*24:02:01:01検出Primer、Probeの配列は下記に示した。Primerに関しては上記の3’末端から5’ 末端側に16〜26merのPrimerを設計した。
本発明の実施例としては最も汎用されているTaqMan（登録商標） Probesを用いた。
Probeに関しては例えば、A*24:02:01:01の429番目〜449番目の配列（21mer）と433〜451番目の配列（19mer）を設計した。蛍光色素はFAMを用いた。クエンチャーについてはTAMRAとダーククエンチャーであるATTO540Qを用いた。Taqman Probeの設計に関しては、一塩基の配列相違があれば、LNAやMGBを含むProbeで検出が可能（Ugozzoli LAら、「Real-time genotyping with oligonucleotide Probes containing locked nucleic acids.」、「Anal Biochem.」、2004年1月、324(1)、pp. 143-52；de Kok JBら、「Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms using novel minor groove binding DNA oligonucleotides (MGB Probes).」、「Hum Mutat.」、2002年5月、19(5)、pp. 554-9）である為、A*24:02:01:01の429番目から449番目までのどの配列相違箇所をターゲットしても構わない。【００７０】
また検体の分注ミスや、PCR阻害による偽陰性を防ぐために内部陽性コントロールとしてRNaseP遺伝子のPrimer、Probe配列を設計した。
Primer、Probeはシグマジェノシスまたは日本遺伝子研究所から購入した。【００７１】
＜A*24:02:01:01検出Primer、Probe＞
Forward Primer（5’−3’）
26mer GCCACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号5）
25mer CCACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号6）
24mer CACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号7）
23mer ACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号8）
22mer CTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号9）
21mer TCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号10）
20mer CCTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号11）
19mer CTCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号12）
18mer TCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号13）
17merCGTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号14）
16mer GTCCCCAGGCTCCCAC （配列番号15）
15mer TCCCCAGGCTCCCAC （配列番号16）
Reverse Primer（5’−3’）
29mer ACGCACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号17）
28mer CGCACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号18）
27mer GCACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号19）
26mer CACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号20）
25mer ACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号21）
24mer CGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号22）
23mer GTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号23）
22mer TGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号24）
21mer GCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号25）
20mer CCCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号26）
19mer CCTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号27）
18mer CTCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号28）
17mer TCCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号29）
16mer CCAGGTAGGCTCTCTG （配列番号30）
Probe（5’−3’）
(i)  (FAM-)AGAACCTGCGGATCGCGCTCC(-TAMRA) （配列番号31）
(ii)  (FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q) （配列番号32）【００７２】
＜内部陽性コントロール検出Primer、Probe＞
Forward Primer（5’−3’）
TGCAGATTTGGACCTGCGAG （配列番号33）
Reverse Primer（5’−3’）
TGAGCGGCTGTCTCCACAAG （配列番号34）
Probe（5’−3’）
(i)  (HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-TAMRA) （配列番号35）
(ii)  (HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q) （配列番号35）【００７３】
１−２．PCR master mix
DNA増幅酵素として、Taq Δexo DNA polymeraseを用いた。
一般的なリアルタイムPCR master mix 試薬であるTaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix (Life Technologies)、QuantiTect Multiplex PCR Kit(QIAGEN)を用いた。QuantiTect Multiplex PCR Kit(QIAGEN)はUracil-DNA Glycosylase,heat-labile(Roche)を25 μlの反応に0.25 units 加えて行った。【００７４】
１−３．ヒト由来ゲノムDNA
米国CTL社よりHLA typed PBMCを購入し、ゲノムDNAをQIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)で精製した。またヒューマンサイエンス財団よりヒト細胞由来細胞ゲノムDNAを購入し、それらに関してはAlleleSEQR HLA-A(Abbott Laboratories)、Assignソフトウェア(Conexio Genomics)、UniTray（登録商標） (Life Technologies)、Micro SSP Allele Specific HLA Class I DNA Typing Tray(One Lambda Inc)を用いてHLA-Aのタイピングを行った。【００７５】
ゲノムDNAは、100ng/μL、1ng/μLを2μL加えてリアルタイムPCR反応を行った。
１−４．リアルタイムPCR
リアルタイムPCRはABI 7500 Fast, ABI 7500 Fast Dx (Life Technologies)を用いた。
条件は以下の通りである。
TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix 
50℃2min、95℃10minを行った後、95℃15sec、68℃1minを40サイクル行った。
QuantiTect Probe PCR +UNG Kit、QuantiTect Multiplex PCR Kit
50℃2min、95℃15minを行った後、95℃15sec、68℃1minを40サイクル行った。
２．結果【００７６】
２−１．Primerの検討(Tm値)
一般的にPCRを行う際に最長と考えられる26merPrimerセット（A）と最近接塩基対パラメータ(Nearest Neighbor Parametes（杉本  直己、「最近接塩基対パラメータを用いた核酸の安定性予測とその機能との関係」、「生物物理」（吉岡書店）、vol. 33、pp. 61-67)（B）を用いてTm値が68℃付近となるPrimerセットを選択し、Primerの長さを最適化した。Tm値を68℃付近に設定したのは、アニーリング、エクステンション温度を68℃で行う設定であり、例えばアニーリング、エクステンションの温度が60℃であれば、Tm値が60℃付近のPrimerが選択される。ProbeはA*24:04とA*24:02:01:01アリルと相違が見られる429番目から449番目すべての配列を含むものを選んだ。Primer及びProbe濃度、反応容量は各Maser Mixが推奨する濃度で行った。Maser Mixは、TaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix、QuantiTect Multiplex PCR Kitを用いた。TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mixに関してはPrimer 900nM、Probe 250nM、反応系は20μL、QuantiTect Multiplex PCR KitはPrimer 400nM、Probe 200nM、反応系は25μLで行った。リアルタイムPCR装置はABI7500 Fast を用いた。ゲノムDNAのアリルは (i) A*24:02/A*02:06、(ii) A*24:20/A*02:06、(iii) A*02:01/A*02:06、(iv) A*11:01/A*11:01及び(v) A*23:01/A*29:01である。【００７７】
(A)
Forward Primer（5’−3’）
26mer GCCACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC（配列番号5）
Reverse Primer（5’−3’）
26mer CACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG（配列番号17）【００７８】
(B)
Forward Primer（5’−3’）
16mer TCCCCAGGCTCCCAC（配列番号16）
Reverse Primer（5’−3’）
16mer TCCAGGTAGGCTCTCTG（配列番号29）
A*24:02検出用プローブ (i) ((A),(B)共通)
(FAM-)AGAACCTGCGGATCGCGCTCC(-TAMRA) （配列番号31）【００７９】
両マスターミックスとも26merと長いPrimerセット(A)ではA*24:02以外のアリルでもシグナルが検出され、特にA*24:20を含む、(ii) A*24:20/A*02:06は顕著にシグナルの増幅が見られた。しかし、Tm値を68℃付近に最適化した(B)のPrimerセットではA*24:02陰性ゲノムの増幅は見られなかった。TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix（図１〜８）、QuantiTect Multiplex PCR Kit（図９〜１６）の結果を示した。【００８０】
２−２．Primerの検討(IPC-Internal Positive Control)
(B)のPrimerセット反応液に下記の内部陽性コントロール(IPC-Internal Positive Control)用のPrimer,Probeを加えて測定を行った。内部陽性コントロールを加えることで、何らかの要因でPCR反応が阻害される事やサンプリングミスによる偽陰性を防止できる。IPCのシグナルが検出され、HLA-A*24:02検出シグナルが検出されなければ、陰性であると断定できる。マスターミックスはTaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix、QuantiTect Multiplex PCR Kitを用いた。IPCのPrimerはRNaseP遺伝子の領域から選択し、なるべくHLA-A*24:02検出系に影響を与えないよう、増幅領域を短く設定(69bp)し、Primer濃度も低濃度(0.1μM)で加えた。IPCのProbe濃度は各マスターミックスの推奨濃度(TaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix-250nM, QuantiTect Multiplex PCR Kit-200nM)で行った。HLA-A*24:02検出Primer、Probe濃度は、各マスターミックスの推奨濃度で行った。TaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mixに関してはPrimer 900nM、Probe 250nM、反応系は20μL、QuantiTect Multiplex PCR KitはPrimer 400nM、Probe 200nM、反応系は25μLで行った。リアルタイムPCR装置はABI7500 Fast を用いた。【００８１】
TaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix の結果を示した（図１７〜２４）。
HLA-A*24:02の結果は、IPC Primer、Probeを加えなかった時と同様の結果で、IPCのシグナルはすべてのゲノムで検出された。またアガロースゲル電気泳動の結果、HLA-A*24:02検出の目的バンド(800bp付近)はA*24:02/02:06とA*11:01/11:01ゲノムでバンドが見られた（図２５）。A*11:01アリルはProbeに設定した配列に相違はあるが、Primer領域はA*24:02の配列とほぼ同じ配列であり、増幅が確認されている。リアルタイムPCRでシグナルが検出されないのは、Probe配列の相違があるためであることが確認される。IPCのバンドはゲノムDNAを加えたすべてで確認され、リアルタイムPCRの結果を反映した。QuantiTect Multiplex PCR Kitも同様の結果であった。【００８２】
＜内部陽性コントロール検出Primer、Probe＞
Forward Primer（5’−3’）
TGCAGATTTGGACCTGCGAG（配列番号33）
Reverse Primer（5’−3’）
TGAGCGGCTGTCTCCACAAG（配列番号34）
IPC用プローブ (i)（5’−3’）
(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-TAMRA) （配列番号35）【００８３】
２−３．Primerの最適化
作製したPrimerの組み合わせによるリアルタイムPCRを行い、Primerの最適化を行った。master mix 試薬であるTaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix (Life Technologies)を用いた。Primer、Probe濃度は900nM、Probe濃度は250nM、反応系は20μL、で行った。ゲノムDNAは(i) A*24:02/A*02:06は100ng/μL、1ng/μL、(ii) A*24:20/A*02:06、(iii) A*02:01/A*02:06、(iv) A*11:01/A*11:01、(v) A*23:01/A*29:01は100ng/μLにTE bufferで調整し、反応系に2μL加えた。測定機器はABI 7500 Fastを用いた。表１に結果を示した。【００８４】
結果の判定は、Baselineを3〜15で解析し、シグナルが(i) 100ng/μL、1ng/μLの結果が0.05以上で(ii)〜(v)のシグナルが0.05以下である時、○とした。(i)のA*24:02陽性ゲノムが0.05以下であるまたは、(ii)〜(v)の陰性アリルでシグナルの上昇が見られ、シグナルが0.05以上であった場合は×とした。【００８５】
【表１】
2013157625.tif 000002
【００８６】
２−４．Probeの最適化
上記の検討で使用したA*24:02検出用プローブ (i) (FAM-)AGAACCTGCGGATCGCGCTCC(-TAMRA) （配列番号31）は5’末端から2番目にG（グアニン）塩基が存在する。G塩基は蛍光消光作用があるため、なるべく5’末端にない方が望ましい。またTAMRAクエンチャーはそれ自身蛍光を持つため、スペクトル全体にバックグランドを発生させる。A*24:02検出用Probeの配列は、A*24:04とA*24:02:01:01アリルと相違が見られる429番目から449番目の配列ミスマッチを標的にすればよく、例えば、437番目〜449番目の配列をターゲットに433〜451番目の配列（19mer）を設計した。またTAMRAクエンチャーからダーククエンチャーのATTO540Qクエンチャーに変更した。これをA*24:02検出用プローブ (ii) とする。【００８７】
A*24:02検出用プローブ (ii)
(FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q) （配列番号32）
またIPC用のProbeもTAMRAクエンチャー（IPC用プローブ (i)）からATTO540Qクエンチャー（IPC用プローブ (ii)）に変更した。【００８８】
IPC用プローブ
(i) (HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-TAMRA) （配列番号35）
(ii) (HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q) （配列番号35）
上記のTAMRAクエンチャーProbe（IPC用プローブ (i)）、及びATTO540QクエンチャーProbe（IPC用プローブ (ii)）をそれぞれ用いてリアルタイムPCRを行った。master mix 試薬であるTaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix (Life Technologies)を用いた。【００８９】
Primerに関しては上記表からForward Primer-19mer（配列番号12）、Reverse Primer-23mer（配列番号23）を選択した。Primer、Probe濃度は900nM、Probe濃度は250nM、反応系は20μL、で行った。ゲノムDNAは(i) A*24:02/A*02:06は100ng/μL、1ng/μL、(ii) A*24:20/A*02:06、(iii) A*02:01/A*02:06、(iv) A*11:01/A*11:01、(v) A*23:01/A*29:01は100ng/μLにTE bufferで調整し、反応系に2μL加えた。測定機器はABI 7500 Fastを用いた。図２６に結果を示した。
改良されたFAM-ATTO540Qのほうがシグナルの上昇が見られた。IPCに関しては同等であった。【００９０】
２−５．Primer、Probe濃度の最適化
Primer、Probe濃度の最適化を行った。過剰なPrimerは一般に無関係な DNA の増幅を引き起こし、最終的に PCR 生成物が均一でなくなるおそれがあり、過剰なProbeはバックグラウンドを上昇させる原因となる。下記のPrimer、Probeを用いて、濃度の検討を行った。master mix 試薬であるTaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix (Life Technologies)を用いて、反応系は20μLで行った。ゲノムDNAは(i) A*24:02/A*02:06は100ng/μL、1ng/μL、(ii) A*24:20/A*02:06、(iii) A*02:01/A*02:06、(iv) A*11:01/A*11:01、(v) A*23:01/A*29:01は100ng/μLにTE bufferで調整し、反応系に2μL加えた。測定機器はABI 7500 Fastを用いた。【００９１】
図２７に結果を示した。A*24:02検出Primerの濃度を100nM 、300nM、900nMとしてリアルタイムPCRを行った。いずれの組み合わせもA*24:02陽性ゲノムでのみシグナルの上昇が見られた。100nMは明らかにシグナル値が低いが、300nM、900nMは同等であった。次にPrimer濃度を300nMに固定し、Probe濃度を100,200,400nMとした結果、FAMProbe、HEXProbe共に濃度が上昇するに従い、シグナルも上昇した。いずれの組み合わせもA*24:02陽性ゲノムでのみシグナルの上昇が見られた。本系はPrimer・Primer濃度に依存しないことが示された。【００９２】
＜A*24:02検出用＞
Forward Primer-19mer(100,300,900nM)
Reverse Primer-23mer(100,300,900nM)
A*24:02検出用プローブ(ii) (FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q)(100,200,400nM) （配列番号32）【００９３】
＜IPC用＞
Forward Primer-TGCAGATTTGGACCTGCGAG(100nM固定) （配列番号33）
Reverse Primer-TGAGCGGCTGTCTCCACAAG(100nM固定) （配列番号34）
IPC用プローブ(ii) (HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q) (100,200,400nM) （配列番号35）【００９４】
２−６．日本人由来細胞株ゲノムの測定
ヒューマンサイエンス財団より購入した日本人由来細胞株(PSC細胞株)ゲノム100サンプルを用いてHLA-Aのタイピングを行った。タイピングにはまずAlleleSEQR HLA-A(Abbott Laboratories)、Assignソフトウェア(Conexio Genomics)を用い、A*24:02の可能性があるものに関しては、UniTray（登録商標） (Life Technologies)、Micro SSPTM Allele Specific HLA Class I DNA Typing Tray(One Lambda Inc)を用いてさらにタイピングを行い、A*24:02であることを確認した。100サンプル中A*24:02陽性は68サンプル、陰性は32サンプルであった。【００９５】
100サンプルのゲノムを配列特異的なPrimer、Probeを用いた HLA-A*24:02検出系で測定を行った（図２８〜３３）。Primer、Probeは下記に示した条件で行った。ゲノム濃度は100ng/μL、1ng/μLに調整し、2μLを加えた。反応ボリュームは20μLで測定機器はABI 7500 Fast Dxを用いた。解析方法はBaseline 3〜15に設定し、シグナルが40サイクルで0.05以上のものを陽性とした。【００９６】
表２に結果を示した。陽性ゲノム68サンプルはすべて0.05以上のシグナルが得られ、陰性ゲノム32サンプルはシグナルの上昇は見られなかった。IPCのシグナルは100サンプルすべて0.05以上のシグナルを示した。【００９７】
＜A*24:02＞
Forward Primer-19mer(300nM)
Reverse Primer-23mer(300nM)
(ii) (FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q)(200nM) （配列番号32）【００９８】
＜IPC＞
Forward Primer-TGCAGATTTGGACCTGCGAG(100nM) （配列番号33）
Reverse Primer-TGAGCGGCTGTCTCCACAAG(100nM) （配列番号34）
(ii) (HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q) (200nM) （配列番号35）【００９９】
【表２】
2013157625.tif 000003
【０１００】
３．考察
Primer、Probeを最適化し、簡便で精度の高いA*24:02検出系を構築した。特にA*24:20アリルはA*24:02と一塩基の配列相違であり、またForward PrimerでA*24:20を陽性としないPrimerを設計するためには、C(Primer)-T(template)ミスマッチを伸長しないように設計しなければならなかった。本法ではPrimerの長さを最短に設計し、ミスマッチ率を上げる事で誤ったC-Tミスマッチ伸長を起こらないようにした。本検討では22mer〜16merのForward Primerを用いる事で、解決する事ができ、単一反応系で測定系が完結する。【０１０１】
日本人のアリル頻度を参照して設計し、日本人由来のゲノムDNAを100サンプル測定したところ、感度、特異度100％の精度で測定する事ができた。【０１０２】
また日本以外でも本測定系は応用することが可能である。日本では、A*24サブタイプの中でA*24:20アリルが高頻度に報告されているが、東南アジアではA*24サブタイプの一つであるA*24:07アリルが高頻度に報告されている国もある。A*24:02とA*24:07との配列相違は412番目の一塩基のみであり(A*24:02(C)-A*24:07(G))であり、Forward Primerの3’末端が配列相違箇所になるように設定し、Tm値を68℃付近に設定すれば、(GACAGGGAAAGTGAAGGCCCAC)（配列番号4）同様に、A*24:07を陰性と判断できる系になる。このように反応系を増やすことで精度の上昇も可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
［配列番号１］フォーワード・プライマー
［配列番号２］リバース・プライマー
［配列番号３］ホモ・サピエンス
［配列番号４］フォーワード・プライマー
［配列番号５］フォーワード・プライマー
［配列番号６］フォーワード・プライマー
［配列番号７］フォーワード・プライマー
［配列番号８］フォーワード・プライマー
［配列番号９］フォーワード・プライマー
［配列番号１０］フォーワード・プライマー
［配列番号１１］フォーワード・プライマー
［配列番号１２］フォーワード・プライマー
［配列番号１３］フォーワード・プライマー
［配列番号１４］フォーワード・プライマー
［配列番号１５］フォーワード・プライマー
［配列番号１６］フォーワード・プライマー
［配列番号１７］リバース・プライマー
［配列番号１８］リバース・プライマー
［配列番号１９］リバース・プライマー
［配列番号２０］リバース・プライマー
［配列番号２１］リバース・プライマー
［配列番号２２］リバース・プライマー
［配列番号２３］リバース・プライマー
［配列番号２４］リバース・プライマー
［配列番号２５］リバース・プライマー
［配列番号２６］リバース・プライマー
［配列番号２７］リバース・プライマー
［配列番号２８］リバース・プライマー
［配列番号２９］リバース・プライマー
［配列番号３０］リバース・プライマー
［配列番号３１］プローブ
［配列番号３２］プローブ
［配列番号３３］フォーワード・プライマー
［配列番号３４］リバース・プライマー
［配列番号３５］プローブ
【図１】
2013157625.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2013157625.tif 000019
【図１７】
2013157625.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013157625.tif 000038
2013157625.tif 000039
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