(57)【要約】【課題】目標分子に対する結合能を有し、検出感度を増強することのできるマーカ分子を提供する。【解決手段】本発明にかかるマーカ分子は、少なくとも３個のアミノ酸と、蛍光体を含むマーカ分子であって、アミノ酸は、それぞれ独立して少なくとも１つの標識と結合し、アミノ酸は、直接またはスペーサ基を介して相互に結合し、マーカ分子は全体として少なくとも３つの標識を含む。さらに、少なくとも１つの末端のアミノ酸は、結合基を介して生体関連物質と結合する。【選択図】図１
2013081036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つのアミノ酸と、３つ以上の標識団と、を含むマーカ分子であって、前記アミノ酸は、それぞれ独立して少なくとも１つの標識団と結合し、前記アミノ酸は、直接またはスペーサ基を介して相互に結合し、前記マーカ分子は全体として少なくとも３つ以上の標識団を含むことを特徴とするマーカ分子。
【請求項２】
さらに、少なくとも１つの末端の前記アミノ酸は、結合基を介して生体関連物質と共有結合できることを特徴とする請求項１に記載のマーカ分子。
【請求項３】
前記アミノ酸は、前記標識団と結合できるアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のマーカ分子。
【請求項４】
前記標識団は、発色団、蛍光発光団、リン光発光団および吸収団からなる群から少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のマーカ分子。
【請求項５】
直接またはスペーサ基を介して共有結合により相互に連結された５つの前記標識団と結合できるアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のマーカ分子。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のマーカ分子を少なくとも１つ含む生体関連物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の目標分子との結合能を有するマーカ分子に関する。特に、本発明は、目標分子との結合能を有し、目標分子に対する検出感度を増強したマーカ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、分析装置等による目標分子の微量検出を目的として、目標分子との結合能を有し、蛍光発光団等により標識されたマーカ分子を用いる技術が知られている（特許文献１乃至４参照）。【０００３】
特許文献１には、電気泳動システムを用いて分離された分子種の物理的性質を特定するための、セグメント中に２以上の標識されたアミノ酸を含み、当該標識は蛍光発光団他から選択される、マーカ分子および当該マーカ分子を２以上含むマーカ分子組成物が記載されている。【０００４】
特許文献２には、標的組織との相互作用によって実質的な蛍光を発光する近赤外蛍光プローブが記載されている。【０００５】
特許文献３には、蛍光検出等電点電気泳動法において、試料物質の等電点を確認するための蛍光発光団色素を含むオリゴペプチドである蛍光検出等電点電気泳動用マーカが記載されている。【０００６】
特許文献４には、抗体等のタンパク質を、選択的に、染料分子、同位体標識、蛍光体標識等と結合させる技術が記載されている。【０００７】
これらの従来技術によれば、目標分子の特性に適合する標識、目標分子に対する選択的な標識、または特定の相互作用下にある目標分子に適合する標識を用いて、目標分子に由来する蛍光等が検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００５−５１７４５１号公報
【特許文献２】特表２００２−５１４６１０号公報
【特許文献３】特開平９−１７１０２０号公報
【特許文献４】特開２００４−１２５７５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、タンパク質等の目標分子に対する標識団の結合能を維持しながら、目標分子に対する検出感度それ自体を増強する技術については、今までに報告がない。また、特許文献１記載のマーカ分子は、蛍光発光団に加えてタンパク質または核酸を含むため、このような巨大分子を含む標識と結合した目標分子は、電気泳動による分析は可能であっても、目標分子の動的挙動や立体構造に基づく本来の機能の一部を失うおそれがあった。さらに、マーカ分子が有毒の金属イオン等を含有すると、マーカ分子により生体内における周辺の細胞も含めた生理活性が阻害されるおそれがあった。【００１０】
本発明は、目標分子に対する結合能を有し、目標分子に対する検出感度を増強することのできるマーカ分子を提供することを主目的とする。また、本発明は、タンパク等の目標分子の機能を温存しながら、目標分子に対する検出感度が増強された標識が可能なマーカ分子を提供することを目的とする。また、本発明は、生体適合性を有する、マーカ分子を少なくとも一つ含む生体関連物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した目的を達成するために鋭意研究したところ、本発明者らは、目標分子に対する検出感度の増強が可能であるとともに、タンパク質等と比較して低分子量の分子構造を有し、重金属を含有しない、マーカ分子を見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
（１）  少なくとも３つのアミノ酸と、３つ以上の標識団と、を含むマーカ分子であって、  前記アミノ酸は、それぞれ独立して少なくとも１つの標識団と結合し、  前記アミノ酸は、直接またはスペーサ基を介して相互に結合し、  前記マーカ分子は全体として少なくとも３つ以上の標識団を含むことを特徴とするマーカ分子。【００１３】
（２）  さらに、少なくとも１つの末端の前記アミノ酸は、結合基を介して生体関連物質と共有結合できることを特徴とする請求項（１）に記載のマーカ分子。【００１４】
（３）  該アミノ酸は、前記標識団と結合するアミノ酸を含むことを特徴とする請求項（１）または（２）に記載のマーカ分子。具体的には、標識団と結合するアミノ酸として、リジン、アルギニン、グルタミン、システイン等を挙げることができる。【００１５】
（４）  該標識団は、発色団、蛍光発光団、りん光発光団および吸収団からなる群から少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項（１）乃至（３）のいずれか１項に記載のマーカ分子。【００１６】
（５）  直接またはスペーサ基を介して共有結合により相互に連結された５つの前記標識団と結合できるアミノ酸を含むことを特徴とする請求項（１）乃至（４）のいずれか１項に記載のマーカ分子。【００１７】
（６）  請求項（１）乃至（５）のいずれか１項に記載のマーカ分子を少なくとも１つ含む生体関連物質。
【発明の効果】
【００１８】
上記のように構成することにより、本発明によれば、目標分子に対する結合能を有し、目標分子に対する検出感度を増強することが可能なマーカ分子を提供できる。また、本発明によれば、タンパク質等の目標分子の機能を温存しながら、目標分子に対する検出感度が増強された標識が可能なマーカ分子を提供できる。さらに、本発明によれば、生体適合性を有する、マーカ分子を少なくとも一つ含む生体関連物質を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図。
【図２】本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図。
【図３】本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図。
【図４】本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図。
【図５】本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図。
【図６】本発明の一実施形態にかかるマーカ分子による生体関連物質の例を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態にかかるマーカ分子について説明する。
【００２１】
図１は、本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図である。
【００２２】
図１は、標識団と結合できるアミノ酸としての直鎖状に結合した５つのアミノ酸Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５を含むマーカ分子１０を例示しているが、本発明の実施形態にかかるマーカ分子の分子構造に含まれるアミノ酸の数は、これに限定されず、アミノ酸の数は３個以上であればよい。以下、マーカ分子１０が５個のアミノ酸を含む場合について説明する。
【００２３】
マーカ分子１０は、アミノ酸Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、および標識Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５からなる。隣接するアミノ酸どうしは、ペプチド結合により結合することができる。各標識は１つのアミノ酸に共有結合し、具体的には、標識Ｃ１はアミノ酸Ａ１に、標識Ｃ２はアミノ酸Ａ２に、標識Ｃ３はアミノ酸Ａ３に、標識Ｃ４はアミノ酸Ａ４に、および標識Ｃ５はアミノ酸Ａ５に、それぞれ結合している。これらのアミノ酸と標識との結合は、任意の適切な結合基を介してもよい。
【００２４】
また、マーカ分子１０において、末端のアミノ酸Ａ１は、タンパクＰと結合している。この結合は、適宜、標識するタンパクＰに適合する結合基を介してもよい。
【００２５】
好適には、アミノ酸Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５は、それぞれリジンとすることができるが、これらに限定されない。マーカ分子１０に含まれる３個以上のアミノ酸は、同一でもよく、異なる種類のアミノ酸を組み合わせてもよい。リジンの他に、アルギニン、システイン、グルタミン等を好適に用いることができる。
【００２６】
好適には、標識Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５は、発色団、蛍光発光団、リン光発光団および吸収団からなる群から選択される。例えば、標識Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５は、ポルフィリン、フルオレセイン、ローダミン、シアニン系色素等の発色団、蛍光発光団、リン光発光団、吸収団を用いることができる。なお、これらの標識Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５は、これに限定されるものではなく、全て同一でもよく、一部が異なっていてもよく、一部が存在しなくてもよい。
【００２７】
これまで、蛍光発光団を含むアミノ酸は知られていたが、吸収団や蛍光発光団といった標識団は、疎水性を有することが多く、３個以上のアミノ酸にそれぞれ標識団を結合させることは困難であった。しかしながら、アミノ酸に標識団を結合する際、有機溶媒及び溶媒中のイオン強度の調整により、検出感度の高いマーカ分子を作成できることとなった。
【００２８】
有機溶媒の一例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド、アセトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ブタノール及びこれら化合物の混合物を使用することが含まれる。
【００２９】
このように構成することにより、本実施形態にかかるマーカ分子１０は、標識と結合したアミノ酸をペプチド結合により相互に結合することにより、複数の標識を一体として、タンパクＰに結合することができる。また、マーカ分子１０は、タンパクとの結合数と比較して、より多くの複数の標識を一体としていることから、１つの目標分子としてのタンパクにおける検出感度を増強することができる。さらに、マーカ分子１０は、標識団以外の分子構造に重金属等の有害物質を含まず、生体適合性を有する標識としての機能を有することができる。
【００３０】
本実施形態のマーカ分子が、高い検出感度を有することについて、そのメカニズムは不明であるが、例えば、シアニン系色素は、溶液中で会合し、共鳴蛍光を示すことが知られているように、３個以上のアミノ酸に結合された標識団においても、標識に関する部分の立体構造に変化が生じ、標識団の会合が促進され、検出感度が増大すると考えられる。
【００３１】
図２は、本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図である。図２に示すマーカ分子２０は、前述のマーカ分子１０の構造に加えて、任意にスペーサ基となるスペーサ分子Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４を含むことができる。
【００３２】
スペーサ分子Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４は、それぞれ、存在しないか、標識が結合したアミノ酸どうしの結合に適合した任意の結合基とすることができる。いずれかのスペーサ分子を省略してもよい。
【００３３】
このように構成することにより、本実施形態にかかるマーカ分子２０は、標識が結合したアミノ酸どうしの結合に適合させて、任意にスペーサ分子を含み、複数の標識を一体として、タンパクＰに結合することができるという効果を有する。
【００３４】
図３は、本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図である。図３に示すマーカ分子３０は、前述のマーカ分子１０の構造に加えて、任意にスペーサ分子Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５を含むことができる。さらに、マーカ分子３０は、任意に結合基Ｌを介して、生体関連物質の一例であるタンパクＰと結合することができる。
【００３５】
本発明において、生体関連物質とは、生体に関連する物質であり、マーカ分子の目標分子として用いることができれば、限定されない。例えば、タンパク、ペプチド、脂質、糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、抗原、抗体、ビタミン、ホルモン、レクチン、酵素、ウイルス等が挙げられる。また、天然物でも合成化合物であってもよい。
【００３６】
スペーサ分子Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５は、それぞれ、存在しないか、標識とアミノ酸との結合に適合した任意の結合基とすることができる。いずれかのスペーサ分子を省略してもよい。
【００３７】
結合基Ｌは、マーカ分子３０の末端アミノ酸（図３においてアミノ酸Ａ１）とタンパクＰとの結合に適合した任意の結合基とすることができる。
【００３８】
このように構成することにより、本実施形態にかかるマーカ分子３０は、標識団とアミノ酸との結合に適合させて、任意にスペーサ分子を含み、さらに、末端アミノ酸Ａ１とタンパクＰとの結合に適合させて、任意に結合基を介して、複数の標識を一体として、タンパクＰに結合することができるという効果を有する。
【００３９】
図４は、本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図である。図４に示すマーカ分子４０は、前述のマーカ分子１０の構造に加えて、任意にスペーサ分子Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４を含むことができる。さらに、マーカ分子４０は、任意に結合基Ｌを介して、タンパクＰと結合することができる。
【００４０】
このように構成することにより、本実施形態にかかるマーカ分子４０は、標識団が結合したアミノ酸どうしの結合に適合させて、任意にスペーサ分子を含み、さらに、末端アミノ酸Ａ１とタンパクＰとの結合に適合させて、任意に結合基を介して、複数の標識団を一体として、タンパクＰに結合することができるという効果を有する。
【００４１】
図５は、本発明の一実施形態にかかるマーカ分子の構造を表す図である。図５に示すマーカ分子５０は、前述のマーカ分子１０の構造に加えて、スペーサ分子Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５を含むことができる。さらに、マーカ分子５０は、任意に結合基Ｌを介して、タンパクＰと結合することができる。
【００４２】
このように構成することにより、本実施形態にかかるマーカ分子５０は、標識団が結合したアミノ酸どうしの結合、および標識団とアミノ酸との結合に適合させて、任意にスペーサ分子を含み、さらに、末端アミノ酸Ａ１とタンパクＰとの結合に適合させて、任意に結合基を介して、複数の標識を一体として、タンパクＰに結合することができるという効果を有する。
【００４３】
図６は、本発明の一実施形態にかかるマーカ分子を少なくとも１つ含む生体関連物質の例を表す図である。図６に示すマーカ分子１００は、目標分子としてのタンパク１１０に結合している。タンパク１１０は、緩衝液等で満たされた基板１２０との相互作用が可能な状態で基板１２０に接触している。したがって、マーカ分子１００は、基板１２０と相互作用するタンパク１１０の挙動を観察するためのマーカとしての機能を有することができる。
【００４４】
一実施形態において、基板１２０は、表面にミオシンまたはミオシンの部分構造が固定化されており、タンパク１１０は、アクチンまたはアクチンの部分構造を含む。これらのタンパク周囲の緩衝液にＡＴＰ等の高エネルギーリン酸が含有されていると、タンパク１１０はモータータンパクとして基板１２０の上を移動することができる。本発明にかかるマーカ分子１００は、このように移動するタンパク１１０の位置を反映する生体関連物質とすることができる。
【００４５】
このように構成することにより、本実施形態にかかるマーカ分子１００は、目標分子と比較して低分子量の蛍光団等を用いた標識とすることができる。したがって、マーカ分子１００は、目標分子の動的挙動や立体構造に基づく機能を温存して、マーカとして機能することができるという効果を有する。
【００４６】
以上のように構成することにより、本発明にかかるマーカ分子によれば、目標分子に対する結合能を有し、目標分子に対する検出感度を増強することが可能なマーカ分子を提供できる。また、本発明によれば、タンパク質等の目標分子１分子の機能を温存しながら、目標分子に対する検出感度が増強された標識が可能なマーカ分子を提供できる。さらに、本発明によれば、生体適合性を有する、マーカ分子を少なくとも一つ含む生体関連物質を提供できる。
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００４８】
（ポリペプチドの蛍光修飾）
ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社のカスタムペプチドで受託合成したＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ （１０ＡＡ、＞９５％Ｐｕｒｉｔｙ）を、１０ｍＭ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝９．５）に溶解させ、そこに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を、リジンモノマーモル比で２５倍量添加した。さらに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒの濃度を、緩衝液（２０ｍＭ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝９．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ）にて、０．３ｍＭとなるよう調整し、２５℃、３０分間反応させた。試料を限外濾過フィルタ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｎａｎｏｓｅｑ  ３Ｋ）に入れ、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ  ＡＧ−２２８、１２，０００×ｇ、４℃、１５分）を行った。上部に残った溶液に、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を総量５００μＬになるように添加し、限外濾過フィルタ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｎａｎｏｓｅｑ  ３Ｋ）に入れ、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ  ＡＧ−２２８、１２，０００×ｇ、４℃、１５分）を行い、この操作を２回繰り返した。
【００４９】
（蛍光修飾ペプチドへのＳＭＣＣの導入）
上記蛍光修飾ペプチド溶液のリジン１０量体モル量に対して、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ  ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を５倍量加え、２５℃、３０分間反応させた。反応を停止させるために、グリシンをＳＭＣＣモル比で３０倍量加え、２５℃、３０分間インキュベートした。得られた試料を、限外濾過フィルタ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｎａｎｏｓｅｑ  ３Ｋ）に入れ、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ  ＡＧ−２２８、１２，０００×ｇ、４℃、１５分）を行った。上部に残った溶液に、２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ＝６．５）、２０ｍＭ  ＫＣｌ溶液を総量５００μＬになるように添加し、限外濾過フィルタ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｎａｎｏｓｅｑ  ３Ｋ）に入れ、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ  ＡＧ−２２８、１２，０００×ｇ、４℃、１５分）を行い、この操作を２回繰り返した。ここで生成された蛍光クラスターを、ＰＱＤ５５５と名付けた。
【００５０】
（蛍光修飾ペプチド（ＳＭＣＣ）−アクチン）
ＰＱＤ５５５溶液のＳＭＣＣモル量に対して、単量体−アクチンを２倍量加え、２５℃、３０分間反応させた。反応停止のために、２−メルカプトエタノールを一滴入れ、２５℃、１０分間反応させた。さらにＦ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｍ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１／９倍量（体積比）加え、２５℃、６０分間インキュベートして重合させた後、遠心分離（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＸＬ−７０、７０．１Ｔｉ、４０，０００ｒｐｍ、４℃、４０分）を行い、沈殿を回収した。回収したペレットをＧ−Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ＝８．５）、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ２−メルカプトエタノール）で洗浄、懸濁し、ゲル濾過溶液（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．０２％（Ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で５００ｍＬ×４、透析を行い、試料を回収した。透析後、試料をゲル濾過溶液（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．０２％（Ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で平衡化したゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）にてゲル濾過を行った。ゲル濾過した１．５μＭ蛍光リジン５量体−Ｇ−アクチンと、７５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２．０ｍＭ  ＭｇＣＬ２、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．８μｇ／ｍＬファロイジンを一晩重合させた。蛍光顕微鏡撮影画面をコンピューターに取得し、蛍光強度を比較したところ、Ｑ−ｄｏｔ（インビトロン社）を用いた場合の約２倍の明るさを示した。
【００５１】
以上、実施形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施形態に記載の範囲には限定されないことは言うまでもない。上記実施形態に、多様な変更または改良を加えることが可能である。また、その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【符号の説明】
【００５２】
１０、２０、３０、４０、５０、１００  マーカ分子
１１０  タンパク
１２０  基板
【図１】
2013081036.tif 000003
【図２】
2013081036.tif 000004
【図３】
2013081036.tif 000005
【図４】
2013081036.tif 000006
【図５】
2013081036.tif 000007
【図６】
2013081036.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月12日(2014.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体関連物質に対する標識が可能なマーカ分子であって、
少なくとも３つのアミノ酸と、３つ以上の標識団とからなり、
前記アミノ酸は、それぞれ独立して少なくとも１つの標識団と結合し、
前記アミノ酸は、直接またはスペーサ基を介して相互に結合し、
前記マーカ分子は全体として少なくとも３つ以上の標識団を含むことを特徴とするマーカ分子。
【請求項２】
さらに、少なくとも１つの末端の前記アミノ酸は、結合基を介して前記生体関連物質と共有結合できることを特徴とする請求項１に記載のマーカ分子。
【請求項３】
前記アミノ酸は、前記標識団と結合できるアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のマーカ分子。
【請求項４】
前記標識団は、発色団、蛍光発光団、リン光発光団および吸収団からなる群から少なくとも一つ選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のマーカ分子。
【請求項５】
直接またはスペーサ基を介して共有結合により相互に連結された５つの前記標識団と結合できるアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のマーカ分子。
【請求項６】
機能を温存しながら生体関連物質を検出する方法であって、
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のマーカ分子を含む溶液に前記生体関連物質を混合し、前記マーカ分子と前記生体関連物質とを結合させる工程（Ａ）、
前記マーカ分子が結合した前記生体関連物質を回収する工程（Ｂ）、
前記標識団の標識強度を測定する工程（Ｃ）、
を有することを特徴とする生体関連物質の位置検出方法。
【請求項７】
機能を温存しながら生体関連物質の位置を検出する方法であって、
前記生体関連物質がアクチンまたはアクチンの部分構造を含むタンパクであり、
緩衝液で満たされた基板表面にミオシンまたはミオシンの部分構造を固定化する工程（Ｄ）、
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のマーカ分子と前記生体関連物質とを前記基板表面で結合させる工程（Ｅ）、
前記緩衝液に高エネルギーリン酸を含有させる工程（Ｆ）、
前記標識団の標識強度を測定する工程（Ｇ）、
を有することを特徴とする生体関連物質の位置検出方法。
【国際調査報告】
2013081036.tif 000009
2013081036.tif 000010
2013081036.tif 000011
2013081036.tif 000012