(57)【要約】本発明は、Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを有効成分とする医薬、医薬組成物または食品、生活習慣病などの疾患の予防又は治療のための方法及び使用を提供する。
2013129220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを有効成分とする医薬ないし医薬組成物。
【請求項２】
Met(M)のアナログがCys(C)である、請求項1に記載の医薬ないし医薬組成物。
【請求項３】
His(H)のアナログがTyr(Y)、Phe(Ｆ)またはTrp(W)である、請求項1に記載の医薬ないし医薬組成物。
【請求項４】
有効成分がＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
【請求項５】
有効成分がＭＨで表されるジペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
【請求項６】
生活習慣病治療薬、糖尿病治療薬、糖・脂質代謝改善薬、抗不安剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬または抗うつ薬である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
【請求項７】
Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを添加することを特徴とする、生活習慣病改善、抗不安または睡眠改善用食品。
【請求項８】
ＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択されるジペプチドを添加することを特徴とする、請求項７に記載の食品。
【請求項９】
ＭＨで表されるジペプチドを添加することを特徴とする、請求項７又は８に記載の食品。
【請求項１０】
Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病の患者又はその予備群に投与する工程を含む、生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病を予防又は治療する方法。
【請求項１１】
前記ジペプチドがＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ジペプチドがＭＨである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病を予防又は治療するためのMet(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドの使用。
【請求項１４】
前記ジペプチドがＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ジペプチドがＭＨである、請求項１３又は１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生活習慣病治療薬、糖尿病治療薬、抗不安剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬、抗うつ薬などの医薬ないし医薬組成物に関する。また、本発明は、糖尿病を含む生活習慣病の改善、抗不安または睡眠改善用食品に関する。さらに本発明は、生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病を予防又は治療する方法及びこれらの疾患を予防又は治療するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代のストレス社会を反映し、不安障害、統合失調症、うつ病などの精神疾患の増加が問題となっている。不安感は、生体において危険を回避するための警告として本来必要なものであるが、過剰な不安感は上記精神疾患の発症や症状の進行に関与するとともに、生活習慣病の発症リスクを上昇させることが知られており、精神的ストレスを緩和する食品や医薬品の開発が期待されている。さらに、精神的ストレス緩和作用と抗糖尿病作用など生活習慣病改善作用を併せ持つ経口投与で有効な機能性素材が開発できれば理想的であるが、そのような素材は知られていない。【０００３】
特許文献１は、乳清タンパク質由来の生理活性ペプチドであるβ−ラクトテンシン（Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が、経口投与においてコレステロール低下作用を有すること、κ−カゼイン由来の回腸収縮ペプチドの断片であるＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇが、血清コレステロールを低下させる作用を有することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2002-080495
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、副作用がなく、生活習慣病の改善作用と抗不安活性を併せ持つ機能性素材、それを含む医薬及び食品、生活習慣病などの疾患の予防又は治療方法及び疾患を予防または治療するための使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、精神的ストレス緩和、生活習慣病の改善に着目し、抗不安作用とインスリン感受性増強作用を併せ持つ新しいペプチドを単離した。【０００７】
本発明は、以下の医薬ないし医薬組成物、生活習慣病改善、糖・脂質代謝改善、抗不安または睡眠改善用食品を提供するものである。
項１．  Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを有効成分とする医薬ないし医薬組成物。
項２．  Met(M)のアナログがCys(C)である、項1に記載の医薬ないし医薬組成物。
項３．  His(H)のアナログがTyr(Y)、Phe(Ｆ)またはTrp(W)である、項1に記載の医薬ないし医薬組成物。
項４．  有効成分がＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択される、項１〜３のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
項５．  有効成分がＭＨで表されるジペプチドである、項１〜４のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
項６．  生活習慣病治療薬、糖尿病治療薬、糖・脂質代謝改善薬、抗不安剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬または抗うつ薬である、項１〜５のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
項７．  Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを添加することを特徴とする、生活習慣病改善、抗不安または睡眠改善用食品。
項８．  ＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択されるジペプチドを添加することを特徴とする、項７に記載の食品。
項９．  ＭＨで表されるジペプチドを添加することを特徴とする、項７又は８に記載の食品。
項１０．  Met(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドを生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病の患者又はその予備群に投与する工程を含む、生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病を予防又は治療する方法。
項１１．  前記ジペプチドがＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択される、項１０に記載の方法。
項１２．  前記ジペプチドがＭＨである、項１０又は１１に記載の方法。
項１３．  生活習慣病、糖尿病、不安、睡眠障害、統合失調症またはうつ病を予防又は治療するためのMet(M)またはそのアナログとHis(H)またはそのアナログを含むジペプチドの使用。
項１４．  前記ジペプチドがＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭおよびＷＭからなる群から選択される、項１３に記載の使用。
項１５．  前記ジペプチドがＭＨである、項１３又は１４に記載の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチドまたはそのアナログを有効成分とする生活習慣病改善（特にインスリン感受性の向上ないし糖尿病の改善）、抗不安薬、睡眠障害治療薬、統合失調症治療薬、抗うつ薬、或いはこれら疾患の予防薬は、副作用が低く長期の服用に適したものである。【０００９】
また、本発明の薬剤ないし食品は経口投与で有効である。【００１０】
さらに、天然の短鎖ペプチドは食品として摂取することも可能であり、疾患には至らないが、糖尿病を含む生活習慣病、不安傾向や睡眠に問題を有する個体が食品として摂取することで、疾患を予防することが期待できる。【００１１】
本発明のペプチドは、 牛乳β-ラクトグロブリンの酵素消化物であるので、副作用は問題にならない。また、牛乳β-ラクトグロブリンは牛乳中に多量に含まれるので、低コストで製造できる。【００１２】
本発明の有効成分であるペプチドは、チーズ生産過程で大量に生成する乳清タンパク質を食品添加物用の酵素で消化することで得られる。このペプチドはインスリン感受性を増強することからエネルギー代謝改善作用も期待できる。抗不安作用とエネルギー代謝改善作用を併せ持つ初めてのジペプチドである。【００１３】
本発明のペプチドは、ヒトや家畜（ウシ、ブタ、ヒツジなど）、ペット（イヌ、ネコ）などが日常的に摂取することで、糖尿病を含む生活習慣病、不安、睡眠障害、インスリン抵抗性などの改善などに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】高架式十字迷路（Elevated Plus-Maze test ;EPM）。マウスは通常高い場所を怖がるため、オープンアームには出てこない。抗不安薬処置により、オープンアームでの滞在時間の割合が増加する。サンプル投与30分後にマウスを迷路中央部に置き、5分間行動を測定した。
【図２】高架式十字迷路試験  実験方法。ddYマウス♂ 22-28 g、24 ℃前後。
【図３】β-lactoglobulinサチライシン消化物による抗不安作用 (n=7, i.p., EPM)。Mean ±SEM (n=7)
【図４】β-lactoglobulinサーモリシン消化物による抗不安作用 (n=5-7, i.p., EPM)。Mean ±SEM (n=5-7), *p< 0.05 vs. cont.
【図５】β-lactoglobulinサーモリシン消化物のHPLC分画
【図６】Fraction A〜Fの高架式十字迷路における抗不安作用。(各フラクションの1/9を腹腔内投与, n=2)。
【図７】腹腔内投与によるMHの抗不安作用。Mean ±SEM (n=6-7), *p < 0.05 vs. cont.
【図８】Open field 試験 (OF)  マウスは通常円の周辺部を好み、中央部への探索行動は極めて少ない。抗不安薬処置により、円中心部での探索行動の割合が増加する。
【図９】Open field 試験  実験方法。ddYマウス♂ 24-28 g。
【図１０】オープンフィールド試験におけるMH投与による抗不安作用。Mean ±SEM (n=11), # p < 0.10 vs. cont.
【図１１】糖代謝に及ぼす影響。インスリン負荷試験(ITT)の試験方法。ddYマウス♂ 24-28 g。
【図１２】MHのインスリン感受性上昇作用
【発明を実施するための形態】
【００１５】
薬理作用
本発明において、抗不安作用は、抗不安薬をスクリーニングするための不安関連行動評価法として開発され，広く用いられている高架式十字迷路試験により評価することができる（図１）。具体的には抗不安薬の候補物質を経口投与または腹腔内投与し、３０分後に高架式十字迷路にマウスを置いて、オープンアームに侵入した回数とオープンアーム上での滞在時間の変化を指標として、抗不安作用の強さを評価することができる。
【００１６】
本発明の医薬ないし医薬組成物は、抗不安作用を有するため、うつ病の予防ないし治療薬、抗不安剤、睡眠改善剤などとしても有用であり得る。
【００１７】
本発明において、インスリン抵抗性の改善はインスリン負荷試験（ＩＴＴ）により評価することができる。本明細書において、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）は、図１１に示すように、インスリン投与の３時間前にインスリン抵抗性改善薬の候補物質を哺乳動物(ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター)に経口投与、静脈投与または腹腔内投与し、インスリン投与の０〜１時間後に血糖値を測定し、インスリンによる血糖値低下の増強作用に基づき、インスリン抵抗性の改善作用の強さを評価することができる。投与する動物としては、健常な哺乳動物でもよく、インスリン抵抗性のモデル動物がより好ましい。インスリン抵抗性のモデル動物としては、例えばFLSマウス（自然発症脂肪肝モデル動物）、ob/obマウス、db/dbマウス、KKマウス、KKAyマウス、Akitaマウス、SDTラット、OLETFラット、TSODマウス、NSYマウス、Wistar fattyラット、Zucker fattyラット、GKラット、インスリン抵抗性・サルコペニアモデルラット（加齢とともにインスリン抵抗性を示す高脂肪高炭水化物食長期摂取SDラット）が挙げられる。
【００１８】
本発明の好ましい有効成分は経口投与で有効であるのが確認されている。
【００１９】
有効成分
本発明者は、牛乳／乳清の主要タンパク質であるβ−ラクトグロブリンのプロテアーゼ加水分解物の中で、ＭＨまたはそのアナログが抗不安及びインスリン感受性増強という２つの作用を併せ持つことを見出した。本発明の医薬／医薬組成物、食品の有効成分は、ＭＨまたはそのアナログである。
【００２０】
ペプチドとしては、Ｍ(Met)とH(His)を有する２〜８個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜６個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜４個、最も好ましくは２〜３個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００２１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の好ましいペプチドは、牛乳由来のβ−ラクトグロブリンにおいて、MH或いはそのN末端もしくはC末端にβ−ラクトグロブリン由来のアミノ酸が付加された２〜８個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜６個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜４個、最も好ましくは２〜３個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、本発明の好ましいペプチドは、逆配列であるHM或いは、MHのアナログであり、MはCys(C)で置換されていてもよく、H(His)はY(Tyr)、F(Phe)またはW(Trp)で置換されていてもよい。M、Hのアナログは、両方置換されていてもよいが、一方のみ置換されていることがより好ましい。本発明の好ましい有効成分は、ＭＨ、ＭＹ、ＭＦ、ＭＷ、ＨＭ、ＹＭ、ＦＭまたはＷＭである。本発明の有効成分であるペプチドは、単独で用いてもよく、２種以上のペプチドを併用してもよい。
【００２３】
ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体のアミノ酸、Ｄ体のアミノ酸或いはＤＬ体のアミノ酸（Ｄ体とＬ体が混合されたアミノ酸であればラセミ体といずれか一方のエナンチオマーが過剰なアミノ酸のいずれも含まれる）のいずれを使用してもよい。好ましくはＬ体のアミノ酸のみ、或いはＤ体のアミノ酸のみからなるペプチド、特にＬ体のアミノ酸のみからなるペプチドがよい。
【００２４】
また、本発明で使用するペプチドが２以上の不斉炭素を含む場合、各エナンチオマーないしジアステレオマー或いはこれらの任意の比率の混合物のいずれの形態であってもよい。エナンチオマーまたはジアステレオマーの分離は、通常のカラムで行ってもよく、光学活性カラムを使用したり、光学活性基を導入して誘導体の形態で光学分割した後、その光学活性基を除去する方法や、光学活性の酸または塩基との塩を形成して光学分割するなどの公知のいずれの方法を用いてもよい。
【００２５】
ペプチドまたはそのアナログの塩としては、酸付加塩と塩基塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、過塩素酸などの無機塩、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
【００２６】
溶媒和物としては、水(水和物の場合)、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメトキシエタンなどの溶媒和物が挙げられる。
【００２７】
本発明のペプチドは、天然のタンパク質（特にβラクトグロブリン）ないしポリペプチドの加水分解により得ることもでき、化学合成により得ることもできる。加水分解されるタンパク質ないしポリペプチドとしては、哺乳動物の乳(特に乳清タンパク質)、例えば牛乳由来の乳清タンパク質の多量に含まれるβ-ラクトグロブリン本発明のジペプチド配列が含まれる。牛乳由来のβ-ラクトグロブリンが、本発明の有効成分ペプチドの供給源として特に好ましい。これらの食品素材由来のペプチドは、そのまま或いは必要に応じて濃縮、脱塩、精製等の処理を行うことにより、そのまま食品とすることができる。
【００２８】
タンパク質の加水分解には、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ぺプシン、カルボキシペプチダーゼ、サーモリシンなどの動物、植物ないし微生物由来の加水分解酵素の使用が例示され、これらの酵素を用い、ｐＨを酵素に応じて適切な値に調製し、３０〜４０℃程度の温度下に３０分から４８時間程度反応させることにより、本発明の有効成分のペプチドを得ることができる。得られた反応液から本発明のペプチドを精製して用いてもよく、食品素材を酵素分解した場合には、そのまま或いは他の食品素材に添加して食品ないし食品組成物とすることもできる。加水分解酵素は、ウシ、ブタなどの哺乳動物、食品として用いることができる微生物(パン酵母、ビール酵母などの食用酵母など)などの食品として利用可能な酵素が好ましい。
【００２９】
加水分解は、強酸(例えば塩酸、硝酸、硫酸など)または強塩基(水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属炭酸水素塩)などの存在下に水中で、１〜１００℃の温度で、３０分から４８時間反応させることにより、本発明の有効成分のペプチドを得ることができる。加水分解の反応生成物は、ｐＨを調製した後、そのまま使用してもよく、精製により有効成分のペプチドを分離して使用してもよい。
【００３０】
また本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することもできる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、反応性カルボキシル基を有する原料と、反応性アミノ基を有する原料とをＨＢＴＵ等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドなどのカップリング剤を用いた方法等のペプチド合成において通常の方法により縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【００３１】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００３２】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００３３】
本発明のペプチドは、酵素法によっても合成することが可能である（WO2003/010307参照）。
【００３４】
本発明のペプチドの投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれを採用することも可能であり、経口的あるいは非経口的に投与することができる。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、成人１日あたり通常は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチド(有効成分)は通常、製剤用担体と混合して調製した医薬組成物の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００３５】
本発明のペプチドはそれ自体食品または医薬として利用することができ、或いは単独で、もしくは適当な無毒性の経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤とともに、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠など）、カプセル、トローチ、粉末、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、クリーム、注射剤（アミノ酸輸液、電解質輸液等の輸液に配合する場合を含む）、或いは腸溶性の錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの徐放性製剤などの食品用もしくは医薬用の製剤にすることが可能である。食品中のペプチドの含有量は適宜選択が可能であるが一般に、０．０１〜１００重量％の範囲である。
【００３６】
具体的には、医薬または食品に加えることができる製剤用担体ないし経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤のような物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００３７】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００３８】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００３９】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００４０】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００４１】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００４２】
直腸投与剤または膣投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００４３】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００４４】
本発明に係るペプチドを添加・配合して調製しうる食品の具体的形態としては、例えば、飲料類（コーヒー、ココア、ジュース、清涼飲料、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料）、ガム、グミ、ゼリー、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビスケット、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷等）、レトルト食品、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、ゼリー状飲料等）、等を挙げることができる。本発明のペプチドを添加・配合して調製しうる食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、病者用食品・病者用組合せ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）又は高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）としてもよく、素錠、フィルムコート錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセルとソフトカプセルとのいずれも含む。）、チュアブルタイプ、シロップタイプ、ドリンクタイプ等とすることもできる。本発明に係るペプチドを添加・配合した食品の調製は、それ自体公知の方法で行うことができる。
【実施例】
【００４５】
次に実施例により本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【００４６】
（高架式十字迷路実験）
高架式十字迷路（Eleveted plus maze：EPM）は、２つのオープンアーム（open arm; 25cm×5cm）と２つのクローズドアーム（closed arm; 25cm×5cm×15cm）からなり、それらのアームは床から50cm高くなった中央プラットフォームと結合している（図１参照）。高い位置にあるにも関わらず、クローズドアームの周りには囲いがあるために、マウスは安全に歩行する事ができる。一方、オープンアームの周囲は開放されていて囲いがないために、オープンアームを歩行するマウスは高い位置から転落するという不安感を感じる。そのために、マウスがオープンアームにいる時間が長いほど、あるいは進入回数が多いほど、マウスの不安感は緩和されており、抗不安活性の指標となる。【００４７】
オープンアームの一つに面している中央プラットフォーム上にマウスを置いて試験を開始した。５分の試験時間の間、オープンアーム内で過ごした累積時間(time in open arms)、オープンアームを訪れた回数（visit to open arms）、いずれかのアームを訪れた回数の総数(total visits)を記録した。オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージ、オープンアームを訪れた回数のパーセンテージを不安の指標として計算した。【００４８】
（統計解析）
高架式十字迷路試験で得たデータを、平均とSEMで表した。データを１方向または２方向ANOVAにより解析し、引き続いて多重比較のためのFisher試験を行った。【００４９】
（オープンフィールド試験）
図9に示されるように、マウスに試験の３０分前に本発明の有効成分となるペプチドを投与し、その３０分後にオープンフィールドに置き、円中心部での探索行動の割合を評価した。【００５０】
（インスリン負荷試験（ITT））
図１１に示されるように、マウスにインスリン投与の３時間前に本発明の有効成分となるペプチドを投与し、その３時間後にインスリンを投与し、インスリン投与の１５分後、３０分後、６０分後に血糖値を測定した。【００５１】
実施例１〜３及び比較例１(抗不安作用)
（実験及び結果）
生理食塩水溶水に溶解したβラクトグロブリンのサーモリシン消化物(実施例１)、βラクトグロブリンのサーモリシン消化物のフラクションＡ〜Ｆ(実施例２, n = 2)、ＭＨ(実施例３)、βラクトグロブリンのサチライシン消化物(比較例１)をマウスを高架式十字迷路またはオープンフィールド上に置く前に各々図面に示される量で腹腔内投与（i.p）あるいは経口投与した（n = 4〜11）。そして各ペプチドないしアミノ酸の投与群と非投与群（0 mg/kg、control）において、オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージとオープンアームを訪れた回数、アームを訪れた総数(total visits)を比較した。実験方法及び結果を図１〜図１０に示す。図１〜図１０に示されるように、本発明のペプチド（MH）またはそれを含むフラクションＡは、有意または有意傾向をもってアームを訪れる回数とアーム（高架式十字迷路）で過ごす時間の割合または中央部（オープンフィールド）での探索行動の回数を延長ないし増加した。【００５２】
さらに、MHは経口投与でも抗不安作用を示すことが明らかとなり、その最小有効用量は1 mg/kgであった。また、オープンフィールド試験においても、MH投与 (0.1 mg/kg, i.p.) によって中心円の滞在時間が増加する傾向が認められたことから、複数の評価系において強力な抗不安作用を示すものと考えられる。【００５３】
β−ラクトグロブリンのサーモリシン消化物は、β−ラクトグロブリン水溶液 (20 mg/ml) にサーモリシン (E:S=1:100) を添加し、37℃で5時間インキュベートして得た。実験動物は雄性ddY系マウス (21-28 g) を用い、投与30分後に試験を開始し、5分間その行動を観察した。高架式十字迷路試験では、壁のあるクローズドアームと壁のないオープンアームからなる高さ50 cmの十字の迷路を使用し、オープンアームでの滞在時間の割合の増加により抗不安活性を評価した。オープンフィールド試験では、高さ50 cmの壁で覆われた直径60 cmの円形 (25区画) の装置を用い、中央円での探索行動の増加で評価した。【００５４】
なお、酵素消化物は逆相HPLCで分画し、各フラクションの抗不安活性を測定した。活性が認められたフラクションＡのペプチドをプロテインシーケンサーと質量分析計で同定し、その配列に基づき化学合成したものについて、さらに抗不安活性を検討した。抗不安活性の強いペプチドは、MHであった。【００５５】
βラクトグロブリンのサーモリシン消化物のＨＰＬＣのフラクションＡ〜Ｆを得る方法・条件は図５に示し、抗不安作用の結果は図６に示す。【００５６】
フラクションＡから単離されたＭＨは、プロテインシーケンサーと質量分析計（M＋1＝287.1457）により確認した。【００５７】
実施例４
本発明のペプチドMHのインスリン感受性に及ぼす影響について試験した。具体的には、図１１に示すインスリン負荷試験を行い、インスリン投与の１５分後、３０分後、６０分後における血糖値を測定した。結果を図１２に示す。【００５８】
図１２の結果から、本発明のペプチドはインスリン感受性を増強できることが示された。インスリン抵抗性の増大は糖尿病患者の重大な問題であり、本発明のペプチドは、インスリン患者のサプリメント、食品として或いは医薬としても優れている。【００５９】
MHペプチドは、マウス腹腔内投与（1 mg/kg）によりインスリンによる血糖低下作用を有意に増強することが判明した。【００６０】
また、本発明のペプチドは同時に不安を抑制できるため、ヒト或いはペット(イヌ、ネコなど)、家畜(ウシ、ブタ、ヒツジなど)などのストレスが多く、運動不足でインスリン抵抗性、さらには生活習慣病が問題となっている哺乳動物において、有用である。【００６１】
インスリン負荷試験は、肥満・糖尿病モデル動物における長期投与実験で得られる結果とよく一致することが判明しており、本発明ペプチドのエネルギー代謝改善作用が期待できる。【００６２】
実施例５
脳における神経活動マーカー発現に対するMH投与の影響を検討した。
雄性ddYマウスに生理的食塩水およびMH (1 mg/kg)を腹腔内投与し60分後に開腹し、４％パラホルムアルデヒド溶液で灌流固定した。なお、開腹5分前にペントバルビタールを腹腔内投与することにより麻酔を行った。脳サンプルを常温で1日4 %パラホルムアルデヒド溶液に浸した後、20 %スクロース溶液中 (4 ℃)で2日間脱水した。さらに脳サンプルの凍結切片を抗c-Fos抗体で免疫染色し、海馬におけるc-Fos発現変化を観察した。その結果、生理的食塩水を投与したcontrol群のc-Fos発現細胞数が47であるのに対し、MH投与後は84と上昇した。したがって、海馬における神経活動が上昇していると考えられ、MHは抗不安作用に加え抗うつ作用も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月28日(2014.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨで表されるジペプチドを有効成分とする医薬ないし医薬組成物であって、糖尿病治療薬、糖・脂質代謝改善薬、抗不安剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬または抗うつ薬である、医薬ないし医薬組成物。
【請求項２】
ＭＨからなるジペプチドを添加することを特徴とする、生活習慣病改善、抗不安または睡眠改善用食品。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
糖尿病治療薬、糖・脂質代謝改善薬または抗不安剤である、請求項１に記載の医薬ないし医薬組成物。
【国際調査報告】
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