(57)【要約】  ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする細胞の保存方法。本発明により、長時間保存した場合においても高い生存率及び生理活性を維持することが可能な細胞の保存方法、並びに当該保存に用いるための必須な組成を有する保存液が提供される。また、当該保存方法を用いることにより、高い生存率及び生理活性も維持した状態で、かつ細胞凝集をほとんど起こすことなく細胞の長期間保存が可能であり、更に保存後の細胞洗浄工程が不要なことから、細胞の基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする細胞の保存方法。
【請求項２】
請求項１記載の溶液が、更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する請求項１記載の保存方法。
【請求項３】
溶液中の糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である請求項１又は２に記載の保存方法。
【請求項４】
溶液中のタンパク質が生体由来タンパク質である請求項１〜３いずれかに記載の保存方法。
【請求項５】
溶液中の生体由来タンパク質がヒト血清アルブミンである請求項４記載の保存方法。
【請求項６】
ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、及びタンパク質を有効成分として含有する細胞の保存液。
【請求項７】
更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する請求項６記載の保存液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の保存方法、及び当該方法に用いるための保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学の進歩に伴い、生細胞を用いた基礎研究や治療が盛んに行われるようになってきた。このため、細胞を安全にかつ細胞の活性を維持したまま保存する技術が必要となり、種々研究がなされてきている。細胞を保存する方法として、短期間保存の場合は細胞懸濁液の状態で保存する方法が知られている（例えば、特許文献１）。また長期間保存の場合は凍結を行う保存方法が知られている（例えば、特許文献２）。特に、癌に対する免疫療法である養子免疫療法やドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）療法では、用いる細胞を調製後、すぐに使用（投与）することは作業上困難な場合が多く、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験等調製細胞の安全性に関わる品質確認試験結果判定に一定の時間を要する。このため、当該細胞を使用するまでの間、当該細胞を保存しておくことが求められている。この場合、一般的に凍結保存方法が用いられ、凍結保存用に約４０種類もの成分からなる細胞培養用培地が市販されており、また医薬品である輸液と凍害保護剤を使用して細胞を凍結保存する方法も知られている（例えば、特許文献３）。【０００３】
しかしながら細胞を凍結保存する場合、保存する行為そのものが細胞に対してダメージを与えることがあり、凍結された細胞溶液の融解後において、細胞の生存率及び生理活性が低下してしまう（例えば、非特許文献１）。このため、結果的に患者の治療に効果が期待できる程度の必要細胞数を確保できず投与できないケースや、その生理活性も低下するため患者に投与しても期待される効果が得られないといったケースが起こり得るという問題がある。特に、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のような細胞では、通常、凍結保存が試みられているが依然として保存性が低く、保存効果を高めるため細胞培養用培地を用いて非凍結状態で保存すると保存性は向上するものの、凝集を生じてしまうという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２３０３９６号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３５６号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／０２１６１８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ヒューマン  イムノロジー（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ）、第７２巻、第１００７〜１０１２頁（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、高い生存率及び生理活性を維持することが可能な細胞の保存方法、並びに当該保存に用いるための必須な組成を有する保存液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、ＮＫ細胞のような保存が困難な細胞において、高い生存率及び生理活性を維持した状態で保存が可能な保存液を見出すため、膨大な成分の組合せを１つ１つ検証した結果、驚くべきことに、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液、又はナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液を用いることにより、凍結保存を行わなくても、高い生存率及び生理活性を維持したまま冷蔵又は常温で細胞の保存が可能であり、かつ保存中に細胞の凝集が生じにくいことを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち本発明は、
（１）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする細胞の保存方法、
（２）（１）の溶液が、更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（１）の保存方法、
（３）溶液中の糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である（１）又は（２）に記載の保存方法、
（４）溶液中のタンパク質が生体由来タンパク質である（１）〜（３）いずれかの保存方法、
（５）溶液中の生体由来タンパク質がヒト血清アルブミンである（４）の保存方法、
（６）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する細胞の保存液、及び
（７）更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（６）の保存液、
に関する。【０００９】
また本発明において、
（８）細胞凝集抑制性の（１）〜（５）の保存方法、及び
（９）細胞凝集抑制用の（６）及び（７）の保存液、
が、提供され、
（１０）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中で細胞を保存することを特徴とする保存中の細胞凝集抑制方法、
（１１）（１０）の溶液が、更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（１０）の凝集抑制方法、
（１２）溶液中の糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である（１０）又は（１１）の細胞凝集抑制方法、
（１３）溶液中のタンパク質が生体由来タンパク質である（１０）〜（１２）いずれかの細胞凝集抑制方法、
（１４）溶液中の生体由来タンパク質がヒト血清アルブミンである（１３）の細胞凝集抑制方法、
（１５）ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する保存中の細胞凝集抑制液、及び
（１６）更に、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を有効成分として含有する（１５）の保存中の細胞凝集抑制液、
も、提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、高い生存率及び生理活性を維持したままで細胞を保存することが可能な細胞の保存方法が提供される。また当該方法に用いる細胞保存液が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中、又はナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質を有効成分として含有する溶液中に細胞を懸濁し、得られた細胞懸濁液を冷蔵又は常温保存することを特徴とする細胞の保存方法を提供する。すなわち、本発明の保存方法に用いる溶液（本発明の保存液）の一つの態様では、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質が実質的に必要かつ十分な成分である。また、別の態様では、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質が実質的に必要かつ十分な成分である。本発明の保存液は、これら成分以外に細胞に無害な物質、例えば、ビタミン類、アミノ酸類等を含有させてもよい。またｐＨ調整や緩衝作用を持たせる観点から、リン酸イオンのような緩衝成分を含有してもよいが、保存後の細胞をそのまま生体に投与するという観点から前記有効成分以外の成分は少なくする方が好ましい。本発明の保存液としては、本質的にナトリウム塩、カリウム塩、糖類、並びにタンパク質のみ、又は本質的にナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、並びにタンパク質のみを有効成分として含有することが好ましい。なお、本明細書において「有効成分」とは、単独で又は組み合わせて、細胞を高い生存率及び生理活性を維持したままで実質的に保存することが可能な成分であることを意味する。
【００１３】
本願明細書において「ナトリウム塩」は、溶媒に溶解した際にナトリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては炭酸水素ナトリウム（重曹：ＮａＨＣＯ３）、炭酸ナトリウム（炭酸ソーダ：Ｎａ２ＣＯ３）、過炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ４）、亜二チオン酸ナトリウム（亜ジチオン酸ナトリウム、ナトリウムハイドロサルファイト）（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、硫酸ナトリウム（芒硝：Ｎａ２ＳＯ４）、チオ硫酸ナトリウム（ハイポ）（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、ハロゲン化物としてはフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、酸化物としては酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ）、過酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ２）、水酸化物としては水酸化ナトリウム（苛性ソーダ：ＮａＯＨ）、無機塩としては水素化ナトリウム（ＮａＨ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、硫化水素ナトリウム（水硫化ナトリウム）（ＮａＨＳ）、珪酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、ホウ酸ナトリウム（Ｎａ３ＢＯ３）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、テトラクロロ金酸ナトリウム（Ｎａ［ＡｕＣｌ４］）、有機酸塩としては酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。これらのナトリウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、１種類としては塩化ナトリウムが、複数種類としては塩化ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの組み合わせ、あるいは塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムの組み合わせが好適に使用される。ナトリウム塩含有量は本発明の保存液中の終濃度として、即ち、本発明の保存液に含まれる全ナトリウムイオンの終濃度として、好ましくは０．００１〜１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００５〜５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１〜３ｍｏｌ／Ｌである。
【００１４】
本願明細書において「カリウム塩」は、溶媒に溶解した際にカリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、過炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ４）、ハロゲン化物としてはフッ化カリウム（ＫＦ）、フッ化水素カリウム（ＫＨＦ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、酸化物としては過酸化カリウム（Ｋ２Ｏ２）、酸化カリウム（Ｋ２Ｏ）、水酸化物塩としては水酸化カリウム（ＫＯＨ）、無機塩として水素化カリウム（ＫＨ）、硫化カリウム（Ｋ２Ｓ）、硫化水素カリウム（水硫化カリウム：ＫＳＨ）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、クロム酸カリウム（Ｋ２ＣｒＯ４）、塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ３）等が挙げられる。これらのカリウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化カリウムが好適に使用される。カリウム塩含有量は本発明の保存液中の終濃度として、即ち、本発明の保存液に含まれる全カリウムイオンの終濃度として、好ましくは０．０００１〜１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０００５〜５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌである。
【００１５】
本願明細書において「糖類」は、単糖、オリゴ糖又は糖アルコールを用いることができる。例えば、単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、オリゴ糖としてはトレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、糖アルコールとしてはキシリトール、ソルビトール等が挙げられる。これらの糖類は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよいが、本発明においては好ましくは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類であり、より好ましくはグルコースである。糖類の含有量は、本発明の保存液中の終濃度として、好ましくは０．０１〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜２００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌである。
【００１６】
本明細書において「炭酸水素塩」は、溶媒に溶解した際に炭酸水素イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ３）２）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）等が挙げられる。なお、炭酸水素カリウムは炭酸水素塩としてもカリウム塩としても、炭酸水素ナトリウムは炭酸水素塩としてもナトリウム塩としても、それぞれ含有することができる。本発明には、炭酸水素カリウムをカリウム塩として含有する場合や炭酸水素ナトリウムをナトリウム塩として含有する場合には、炭酸水素カリウム／炭酸水素ナトリウム以外の炭酸水素塩（例えば、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウム）を含有しない態様や、炭酸水素カリウム／炭酸水素ナトリウム以外の炭酸水素塩を含有する態様が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「炭酸塩」は、溶媒に溶解した際に炭酸イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＣＯ３）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３）、炭酸リチウム（Ｌｉ２ＣＯ３）、炭酸銅（ＩＩ）（ＣｕＣＯ３）、炭酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＣＯ３）、炭酸銀（Ｉ）（Ａｇ２ＣＯ３）等が挙げられる。なお、炭酸カリウムは炭酸塩としてもカリウム塩としても、炭酸ナトリウムは炭酸塩としてもナトリウム塩としても、それぞれ含有することができる。本発明には、炭酸カリウムをカリウム塩として含有する場合や炭酸ナトリウムをナトリウム塩として含有する場合には、炭酸カリウム／炭酸ナトリウム以外の炭酸塩（例えば、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、炭酸リチウム、炭酸銅、炭酸鉄、炭酸銀）を含有しない態様や、炭酸水素カリウム／炭酸水素ナトリウム以外の炭酸水素塩を含有する態様が挙げられる。
【００１８】
これら炭酸水素塩及び／又は炭酸塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、炭酸水素ナトリウムが好適に使用される。炭酸水素塩及び／又は炭酸塩の含有量は本発明の保存液に含まれる炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度として、好ましくは０．０００１〜１０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０００５〜５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌである。なお、炭酸水素イオンと炭酸イオン、それぞれの終濃度は、前記範囲内であることが好ましい。
【００１９】
本願明細書において「タンパク質」とは、生体由来タンパク質が挙げられる。例えば、血清成分である血清アルブミン、血清グロブリン等が挙げられる。また血清アルブミンとしては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。更に、他の生体由来タンパク質を用いて、代替することが考えられる。市販品としてはブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）等が挙げられる。また、入手可能な組換えアルブミンを使用してもよい。これらの生体由来タンパク質は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明においては、ヒト血清アルブミンが好適である。生体由来タンパク質の含有量は、好ましくは０．０１〜５０％、より好ましくは０．１〜２０％、さらに好ましくは０．２〜１０％である。
【００２０】
本発明の方法に用いる保存液の成分のうちナトリウム塩とカリウム塩の濃度比として、ナトリウムイオンとカリウムイオンの濃度比（ナトリウムイオン／カリウムイオン）は、好ましくは１／０．０００１〜１／１０、より好ましくは１／０．００１〜１／１である。
【００２１】
本発明の保存液の有効成分として使用される、ナトリウム塩、カリウム塩、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、糖類、並びにタンパク質は、それぞれ必要量秤量し、全ての成分を純水又は生理食塩水に溶解させて調製することができる。また、それぞれの成分を別々に純水又は生理食塩水に溶解させて調製し、それぞれの成分溶液を必要量混合することにより調製してもよい。上記、保存液を調製する際には、各成分を純水又は生理食塩水に溶解後に除菌工程（例えば除菌ろ過工程）を組入れてもよい。あるいは、ナトリウム塩、カリウム塩、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、糖類、並びにタンパク質からなる群より選ばれる１種以上を含む市販されている溶液を数種類組み合わせて用いてもよい。市販品としては、例えば、日本薬局方  ブドウ糖液（例えば、日新製薬社製）、日本薬局方  塩化ナトリウム液（例えば、大塚製薬工場社製）、日本薬局方  塩化カリウム液（例えば、大塚製薬工場社製）、日本薬局方  炭酸水素ナトリウム液（例えば、大塚製薬工場社製）、ブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）を、本発明の必要濃度を含むように無菌条件下で混合してもよい。
【００２２】
本発明の保存液のｐＨについて特に限定されることはないが、細胞に対して損傷を与えないｐＨであることが望ましく、例えば、ヒトリンパ球系細胞の保存に使用する場合、ｐＨ４〜９が好ましく、ｐＨ５〜８がより好ましい。ｐＨ調整には、本発明の保存方法に使用される有効成分のいずれかを用いることが可能である。
【００２３】
本発明の保存方法に用いることができる細胞としては、ヒトを含む哺乳動物から単離した種々の細胞や細胞集団、これらから誘導された細胞や当該細胞を含有する細胞集団等が挙げられる。単離された種々の細胞としては、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、臍帯血単核球、血球系細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、ＮＫ細胞等が挙げられ、誘導された細胞としては、細胞傷害活性を有する、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞等が挙げられるが、これらの細胞に限定されるものではない。これら細胞は公知の方法で調製すればよい。
【００２４】
目的とする細胞を保存液に均一に懸濁する際の細胞濃度は特に限定はなく、細胞の種類、細胞の使用用途、細胞の大きさ、保存容器のサイズ、保存期間等により適宜決定すればよいが、例えば、好ましくは１×１０４〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０５〜２×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好ましくは１×１０６〜５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。保存容器としては、細胞の保存が可能であれば特に限定はなく、試験管、フラスコ、輸液バッグ、細胞培養用バッグ、凍結保存用バッグ等を用いることができる。
【００２５】
本発明において、細胞の保存方法とは、目的とする細胞を本発明の保存液に懸濁して細胞懸濁液を調製後、冷蔵又は常温にて放置して保存する方法をいう。ここでいう冷蔵とは、０℃〜１５℃をいい、好ましくは２℃〜６℃である。常温とは１５℃〜２８℃をいい、好ましくは１８℃〜２４℃である。また、本発明においては、目的とする細胞を本発明の保存液に懸濁して細胞懸濁液を調製後、好ましくは０℃〜２８℃、より好ましくは２〜２４℃、さらに好ましくは４〜２２℃で放置して保存する。本発明の方法による細胞の保存期間は特に限定はなく、例えば５分〜１週間、好ましくは２時間〜５日間である。本発明の好適な態様において、細胞懸濁液は凍結させることなく保存される。
【００２６】
本発明の方法により保存した細胞は、保存後も高い生存率及び生理活性を維持している。更に、本発明の方法では細胞の凝集が生じにくい。すなわち、本発明により細胞凝集の抑制方法も提供される。細胞凝集は、細胞を投与する過程における注射針内での詰まり、肺毛細血管内での塞栓形成、組織への浸潤阻害などを引き起こす原因となる。また、保存後の細胞の洗浄工程を経ずにそのまま生体に投与することが可能である。
【００２７】
本発明の細胞の凝集抑制方法は、本発明の保存液にて細胞を保存することを特徴とする。本発明の保存液は前述の通りである。また、該方法に供される細胞は、本発明の保存方法に供される細胞と同じものを挙げることができる。
【００２８】
また、本発明は、前記細胞凝集抑制方法にて用いられる細胞凝集抑制液を提供する。細胞凝集抑制液は、その構成成分及び組成比は、本発明の保存液と同じである。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。【００３０】
実施例１  ２種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水及び１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０）の比較−１
（１）ＮＫ細胞集団の調製
国際公開第２０１１／０３０８５１号パンフレット記載の方法により、ＮＫ細胞集団を調製した。なお、ＮＫ細胞集団の拡大培養は２１日間行い、得られた細胞集団をＮＫ細胞として以下の実施例に使用した。【００３１】
（２）ＮＫ細胞の保存
実施例１−（１）で調製したＮＫ細胞についてトリパンブルー染色法で生細胞数を算出し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ＨＳＡを含む生理食塩水（以下１％ＨＳＡ含有生理食塩水と記載）又は１％ＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０（コージンバイオ社製、以下１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０と記載）に懸濁した。懸濁細胞液１００ｍLを分離バッグ（テルモ社製）に入れ、２２℃で静置保存した。【００３２】
（３）細胞回収率及び細胞生存率の測定
実施例１−（２）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間後（保存後）についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を算出し、さらに生細胞数と死細胞数から細胞生存率を算出した。細胞回収率は式１を用いて算出した。２４時間保存後の結果を表１に示す。
（式１）  細胞回収率（％）＝（保存後の総生細胞数／保存開始時の総生細胞数）×１００【００３３】
【表１】
2013115322.tif 000002
【００３４】
表１から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞回収率及び細胞生存率が顕著に低下するのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではいずれも低下が見られず、高い細胞回収率及び細胞生存率を維持し細胞の状態を良好に保っていた。この結果より、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の保存に適している可能性が示唆された。【００３５】
（４）細胞亜集団含有比率の解析
実施例１−（２）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間後（保存後）についてＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）で解析した。すなわち、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間（保存後）の細胞をＤＰＢＳ（ニッスイ社製）で洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製、以下、ＢＳＡと記載）を含むＤＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳと記載）中に細胞を懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（全てベックマンコールター社製）又はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体（全てベックマンコールター社製）及びＰＥ標識マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加した。同様に、各細胞集団の一部に、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、４℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳと記載）で洗浄し、再度ＤＰＢＳに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、各細胞亜集団の含有比率を算出した。結果を表２に示す。なお、表中のカッコ内は保存開始時の含有比率を示す。また、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率（ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋）はＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞中のＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率を示す。【００３６】
【表２】
2013115322.tif 000003
【００３７】
表２から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後に各細胞亜集団の含有比率の低下が見られ、特にＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞含有比率の低下が顕著であった。これに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率のいずれもほとんど低下が見られず、またＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞比率の低下も抑制され、細胞の状態を良好に保っていた。ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞はＮＫ細胞であり、ＣＤ１６は抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ活性）に重要な機能性分子であり、またＮＫＧ２Ｄは細胞傷害活性のメカニズムに関与する重要な分子である。この結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の保存液に適している可能性が示唆された。【００３８】
実施例２  ２種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水及び１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０）の比較−２
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
実施例１−（２）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、実施例１−（１）で調製したＮＫ細胞についてトリパンブルー染色法で生細胞数を算出し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁細胞液２５ｍＬをコニカルチューブ（グライナー社製）に入れ、２２℃で静置保存した。【００３９】
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
実施例１−（３）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。ただし測定は、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後及び２４時間後について実施した。結果を表３に示す。【００４０】
【表３】
2013115322.tif 000004
【００４１】
表３から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞回収率及び細胞生存率が顕著に低下するのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではいずれも低下が見られず、高い細胞回収率及び細胞生存率を維持し、細胞の状態を良好に保っていた。【００４２】
（３）細胞傷害活性の測定
実施例２−（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）及び２４時間後（保存後）について細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。すなわち慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞を（１〜２）×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。【００４３】
実施例２−（１）で保存したＮＫ細胞をエフェクター細胞として１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ又は０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５ＨＲＰＭＩで希釈後、９６穴細胞培養プレート（コーニング社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比、すなわちＥ／Ｔ比は１０、３、１、０．３の４通りとした。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０：ベルトールド社製）（励起４８５ｎｍ／測定５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「細胞傷害活性（％）」は以下の式２に従って算出した。
（式２）  細胞傷害活性（％）＝｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００【００４４】
上式において、最小放出量は、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。細胞傷害活性測定の結果を表４に示す。【００４５】
【表４】
2013115322.tif 000005
【００４６】
表４から明らかなように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞傷害活性は著しい低下・失活が見られたのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０ではほとんど低下が見られなかった。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の細胞傷害活性の維持に有効であることが示唆された。【００４７】
（４）細胞凝集状態の確認
実施例２−（１）で保存したＮＫ細胞について、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後及び２４時間後について細胞凝集の状態を観察した。細胞凝集の程度は表５によって分類し、細胞凝集状態の結果を表６に示す。【００４８】
【表５】
2013115322.tif 000006
【００４９】
【表６】
2013115322.tif 000007
【００５０】
表６に示されるように、１％ＨＳＡ含有生理食塩水では保存後の細胞凝集がほとんど確認されないのに対し、１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０では保存開始後３時間で多量の細胞凝集が確認された。この結果より、一般的に使用されている１％ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０はＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来る一方で、細胞の凝集が起こりやすい保存液であることが明らかとなった。【００５１】
実施例３  新規保存液の検討
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
実施例１−（２）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、実施例１−（１）で調製したＮＫ細胞についてトリパンブルー染色法で生細胞数を算出し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％ＨＳＡ、６．６ｇ／Ｌ  ＮａＣl（製剤名：生理食塩水、テルモ社製）、２ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（製剤名：大塚糖液、大塚製薬社製）、２ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（製剤名：メイロン静注、大塚製薬社製）及び０．４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ（製剤名：コンクライト液―Ｋ又はＫＣｌ補正液、ニプロファーマ社製）となるように各製剤を用い調製した溶液（以下、１％ＨＳＡ含有保存液Ａと記載）に懸濁した。懸濁細胞液１５ｍＬをコニカルチューブに入れ、２２℃又は４℃で静置保存した。前記１％ＨＳＡ含有保存液Ａは、ナトリウムイオン終濃度１４３．１ｍｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン終濃度５．４ｍｍｏｌ／Ｌ、糖類（グルコース）濃度２ｇ／Ｌ、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ナトリウムイオン／カリウムイオン＝２６．７／１（または１／０．０３７）であった。【００５２】
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
実施例１−（３）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。ただし測定は、保存開始０時間（保存開始時）及び２１時間後について実施した。結果を表７に示す。【００５３】
【表７】
2013115322.tif 000008
【００５４】
表７に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａは保存後の細胞回収率及び細胞生存率が保存開始時と同様に高く維持されていた。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液Ａは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。【００５５】
（３）細胞亜集団含有比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーターで解析した。ただし解析は、保存開始後２１時間について実施した。結果を表８に示す。なお、表中のカッコ内は保存開始時の含有比率を示し、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率（ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋）はＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞中のＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率を示す。【００５６】
【表８】
2013115322.tif 000009
【００５７】
表８に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａは保存後のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率が保存開始時と比較して同等であった。以上の結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ａは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。【００５８】
（４）細胞傷害活性の測定
実施例２−（３）と同様の方法で、細胞傷害活性の測定を行った。ただし、Ｅ／Ｔ比は３、１、０．３の３通りとした。細胞傷害活性測定の結果を表９に示す。【００５９】
【表９】
2013115322.tif 000010
【００６０】
表９に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａでは保存後の細胞傷害活性は保存開始時前と同様に高く維持されていた。以上の結果より、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を安定に維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ａは細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。【００６１】
（５）細胞凝集状態の確認
実施例３−（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、２１時間後について細胞凝集の状態について観察した。その結果を表１０に示す。なお、細胞凝集の程度は表５の分類に従って評価した。【００６２】
【表１０】
2013115322.tif 000011
【００６３】
表１０に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａでは保存後の細胞凝集が全く起こらないことが確認された。【００６４】
以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液ＡはＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来、なおかつ細胞の凝集が起こりにくい保存液であることが明らかとなった。この細胞凝集を防ぎ、細胞の重要な機能を高く維持することができる保存液である１％ＨＳＡ含有保存液Ａは当該目的に極めて適した保存液である。【００６５】
実施例４  ２種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｂ）の比較−３
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
実施例１−（２）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、保存液として１％ＨＳＡ含有生理食塩水を用い、また、１％ＨＳＡ含有保存液ＡにおけるＮａＣｌ濃度を５．１６ｇ／Ｌ  ＮａＣl（製剤名：生理食塩水、テルモ社製）とした１％ＨＳＡ含有保存液Ｂを用いた（ナトリウムイオン終濃度１１８．４ｍｍｏｌ／Ｌ、、カリウムイオン終濃度５．４ｍｍｏｌ／Ｌ、糖類（グルコース）濃度２ｇ／Ｌ、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ナトリウムイオン／カリウムイオン＝２２．１／１（または１／０．０４５））。セルストレーナー（ベクトン・ディッキンソン社製）にて処理した後懸濁細胞液３０ｍＬをコニカルチューブに入れ、２２℃で静置保存した。【００６６】
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
実施例１−（３）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。ただし測定は、保存開始０時間（保存開始時）、２１時間後及び３日後について実施した。結果を表１１に示す。【００６７】
【表１１】
2013115322.tif 000012
【００６８】
表１１に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞回収率及び細胞生存率が継時的に高く維持されていた。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。【００６９】
（３）細胞亜集団含有比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーターで解析した。ただし解析は、保存開始後２１時間後及び３日後について実施した。結果を表１２に示す。【００７０】
【表１２】
2013115322.tif 000013
【００７１】
表１２に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率が高く維持されており、保存開始時と比較して２１時間後でも同等の比率を維持していた。さらに３日後においても１％ＨＳＡ含有保存液Ｂはより高い比率を維持していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。【００７２】
（４）細胞傷害活性の測定
実施例２−（３）と同様の方法で、細胞傷害活性の測定を行った。ただし、測定は保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後及び３日後について実施し、標的細胞はＫ５６２及び肺癌細胞株Ａ５４９を用いた。３日後においては、再度細胞数及び生存率を測定し、生細胞数に応じてＥ／Ｔ比を設定した。細胞傷害活性測定の結果を表１３に示す。【００７３】
【表１３】
2013115322.tif 000014
【００７４】
表１３に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞傷害活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後には細胞傷害活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは高い細胞傷害活性を示しており、さらに３日後でも細胞傷害活性を有していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高く維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。【００７５】
（５）抗体依存性細胞傷害活性の測定
実施例４−（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後及び３日後について抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を測定した。ＡＤＣＣ活性は、抗ヒトＨＥＲ２特異的抗体であるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（製剤名：ハーセプチン、中外製薬社製）１０μｇ／ｍＬをあらかじめ標的細胞であるヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７に４℃で３０分反応させた後洗浄したものを使用した。また対照としてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂで処理しないＮＣＩ−Ｎ８７を用いた。これら標的細胞を実施例２−（３）と同様にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法にて評価した。ただし、Ｅ／Ｔ比は３、１、０．３の３通りとし、３日後においては、再度細胞数及び生存率を測定し、生細胞数に応じてＥ／Ｔ比を設定した。「ＡＤＣＣ活性（％）」は以下の式３に従って算出した。ＡＤＣＣ活性測定の結果を表１４に示す。
（式３）  ＡＤＣＣ活性（％）＝
（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ処理標的細胞に対する細胞傷害活性）−（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ未処理標的細胞に対する細胞傷害活性）【００７６】
【表１４】
2013115322.tif 000015
【００７７】
表１４に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＡＤＣＣ活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後にはＡＤＣＣ活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは高いＡＤＣＣ活性を示しており、さらに３日後でもＡＤＣＣ活性を有していた。以上の結果より、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を高く維持する１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。【００７８】
（６）細胞凝集状態の確認
実施例４−（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後、３日後について細胞凝集の状態について観察した。その結果を表１５に示す。なお、細胞凝集の程度は表５の分類によった。【００７９】
【表１５】
2013115322.tif 000016
【００８０】
表１５に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水同様保存後の細胞凝集が全く起こらないことが確認された。以上の結果より、１％ＨＳＡ含有保存液Ｂは従来細胞の投与用保存液として使用されていた１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して、ＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来、なおかつ細胞の凝集が起こりにくい機能的に優れた保存液であることが明らかとなった。【００８１】
実施例５  ３種の保存液（１％ＨＳＡ含有生理食塩水、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃ）の比較
（１）ＮＫ細胞懸濁液の保存
実施例４−（１）と同様の方法で、ＮＫ細胞を保存した。ただし、保存液として、１％ＨＳＡ含有生理食塩水、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ、並びに１％ＨＳＡ、２ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（製剤名：メイロン静注、大塚製薬社製）、及びＮａＣｌ  ２．２８ｇ／Ｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２６．３５ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．７３ｇ／Ｌ（ブドウ糖‐電解質液（製剤名：ソルデム４、テルモ社製））となるように各製剤を用い調製した溶液（以下、１％ＨＳＡ含有保存液Ｃと記載）を使用した。前記保存液Ｃは、ナトリウムイオン終濃度６９．２ｍｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン終濃度９．８ｍｍｏｌ／Ｌ、糖類（グルコース）濃度２６．３５ｇ／Ｌ、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ナトリウムイオン／カリウムイオン＝７．１／１（または１／０．１４１）であった。【００８２】
（２）細胞回収率及び細胞生存率の測定
実施例４−（２）と同様の方法で、細胞回収率及び細胞生存率の測定を行った。結果を表１６に示す。【００８３】
【表１６】
2013115322.tif 000017
【００８４】
表１６に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞回収率及び細胞生存率が継時的に高く維持されていた。保存液ＣはＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度が保存液Ａと異なるが、当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。【００８５】
（３）細胞亜集団含有比率の解析
実施例４−（３）と同様の方法で、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞、のそれぞれの含有比率をフローサイトメーターで解析した。結果を表１７に示す。【００８６】
【表１７】
2013115322.tif 000018
【００８７】
表１７に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ５６陽性ＣＤ１６陽性細胞及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞含有比率が高く維持されており、保存開始時と比較して２１時間後でも同等の比率を維持していた。さらに３日後においても１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃはより高い比率を維持していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の機能性分子発現を安定に維持する当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用できることが明らかとなった。【００８８】
（４）細胞傷害活性の測定
実施例４−（４）と同様の方法で、細胞傷害活性の測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表１８に示す。【００８９】
【表１８】
2013115322.tif 000019
【００９０】
表１８に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後の細胞傷害活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後には細胞傷害活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは高い細胞傷害活性を示しており、さらに３日後でも細胞傷害活性を有していた。以上の結果より、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高く維持する当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。【００９１】
（５）抗体依存性細胞傷害活性の測定
実施例５−（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後について抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を測定した。ＡＤＣＣ活性測定の結果を表１９に示す。【００９２】
【表１９】
2013115322.tif 000020
【００９３】
表１９に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して保存後のＡＤＣＣ活性の著しい低下が見られなかった。１％ＨＳＡ含有生理食塩水保存条件では２１時間後にはＡＤＣＣ活性が消失している一方、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは高いＡＤＣＣ活性を示していた。以上の結果より、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を高く維持する当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、細胞の保存液として好適に使用されることが明らかとなった。【００９４】
（６）細胞凝集状態の確認
実施例５−（１）で保存したＮＫ細胞を用いて、保存開始０時間（保存開始時）、３時間後、２１時間後、３日後について細胞凝集の状態について観察した。その結果を表２０に示す。なお、細胞凝集の程度は表５の分類によった。【００９５】
【表２０】
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【００９６】
表２０に示されるように、１％ＨＳＡ含有保存液Ａ及び１％ＨＳＡ含有保存液Ｃでは１％ＨＳＡ含有生理食塩水同様保存後の細胞凝集が全く起こらないことが確認された。【００９７】
以上の結果より、当該発明の保存液はＮａＣｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＫＣｌ濃度によらず、従来細胞の投与用保存液として使用されていた１％ＨＳＡ含有生理食塩水と比較して、ＮＫ細胞の機能を高く保持する事が出来、なおかつ細胞の凝集が起こりにくい機能的に優れた保存液であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明により、長時間保存した場合においても高い生存率及び生理活性を維持することが可能な細胞の保存方法、並びに当該保存に用いるための必須な組成を有する保存液が提供される。また、当該保存方法を用いることにより、高い生存率及び生理活性も維持した状態で、かつ細胞凝集をほとんど起こすことなく細胞の長期間保存が可能であり、更に保存後の細胞洗浄工程が不要なことから、細胞の基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。
【国際調査報告】
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