(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプルにおける総ヘモグロビンに対する総糖化ヘモグロビンのパーセント、または総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって：
ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、該血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）第１酸化剤、３）第２酸化剤、および４）糖化ヘモグロビンを糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に消化するプロテアーゼ、に接触させることによって生成され、該フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの機能的断片もしくは誘導体であり、該機能的断片もしくは該誘導体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性の少なくとも５０％を保持するものであり、該誘導体は、保存的アミノ酸置換を含む、工程；
ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；ならびに、
ｃ）工程ｂ）において生成される信号を、較正曲線に適用することによって、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなく、該サンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを決定する工程、
を含み、ここで、該第１酸化剤は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸ナトリウム、過ヨウ素酸ナトリウム、およびクロールアミンＴからなる群より選択され、該第２酸化剤は、テトラゾリウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム、フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、およびヨウ素酸カリウムからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記第１酸化剤が、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンか、またはＮ−エチルマレイミドであり、前記第２酸化剤がテトラゾリウム塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶解バッファーが、前記第１酸化剤または前記第２酸化剤を含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項４】
前記溶解バッファーが、前記第１酸化剤および前記第２酸化剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶解バッファーが、前記第１酸化剤、前記第２酸化剤、および前記プロテアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶解バッファーが前記プロテアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１酸化剤および前記第２酸化剤が、単一組成物中に処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１酸化剤および前記第２酸化剤が、別の組成物中に処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼが、前記第１酸化剤または前記第２酸化剤と共に、単一組成物中に処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１酸化剤、前記第２酸化剤、および前記プロテアーゼが、単一組成物中に処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、前記ペルオキシダーゼ、および前記発色性物質が、単一組成物中に処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記発色性物質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、または１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液サンプルが、全血液、または収集血球である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼか、またはエキソ型プロテアーゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、サーモリシン、スブチリシン、およびウシすい臓プロテアーゼから成る群から選ばれる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物起源の中性プロテアーゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼが、２から３０のアミノ酸残基の糖化ペプチドを生成する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロテアーゼが、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基、あるいは、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基を含む糖化ペプチドを生成する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記糖化ペプチド、または糖化アミノ酸を含む、前記タンパク断片が、前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび前記ペルオキシダーゼに、順次、または同時に接触される、請求項１〜１０および１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
疾患または障害の予後または診断に使用される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患または障害が、糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
血液サンプルにおける総ヘモグロビンに対する総糖化ヘモグロビンのパーセント、または総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって：
ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；
ｂ）第１酸化剤；
ｃ）第２酸化剤；
ｄ）ヘモグロビンを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に加水分解するプロテアーゼ；
ｅ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼであって、該フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの機能的断片もしくは誘導体であり、該機能的断片もしくは該誘導体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性の少なくとも５０％を保持するものであり、該誘導体は、保存的アミノ酸置換を含む、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；
ｆ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；
ｇ）較正曲線を構築するために使用される、既知パーセントの糖化ヘモグロビン、または既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有する較正因子（単数または複数）、ならびに、
ｈ）請求項１に記載の方法を実行するための指示書、
を含み、ここで、該第１酸化剤は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸ナトリウム、過ヨウ素酸ナトリウム、およびクロールアミンＴからなる群より選択され、該第２酸化剤は、テトラゾリウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム、フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、およびヨウ素酸カリウムからなる群より選択される、キット。
【請求項２６】
前記第１酸化剤および前記第２酸化剤が、前記溶解バッファーの中に含まれる、請求項
２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記第１酸化剤および前記第２酸化剤が、前記プロテアーゼと同じバッファーに含まれる、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、前記ペルオキシダーゼ、および前記発色性物質が、単一組成物中に処方される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記第１酸化剤が、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンか、またはＮ−エチルマレイミドであり、前記第２酸化剤がテトラゾリウム塩である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記発色性物質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、または１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）である、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼか、またはエキソ型プロテアーゼである、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、サーモリシン、スブチリシン、およびウシすい臓プロテアーゼから成る群から選ばれる、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
前記プロテアーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物起源の中性プロテアーゼである、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
血液サンプルにおける総ヘモグロビンに対する総糖化ヘモグロビンのパーセント、または総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって：
ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、該血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）テトラゾリウム塩である酸化剤、および３）糖化ヘモグロビンを糖
化ペプチドまたは糖化アミノ酸に消化するプロテアーゼ、に接触させることによって生成され、ここで、該フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの機能的断片もしくは誘導体であり、該機能的断片もしくは該誘導体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性の少なくとも５０％を保持するものであり、該誘導体は、保存的アミノ酸置換を含む、工程；
ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；ならびに、
ｃ）工程ｂ）において生成される信号を、較正曲線に適用することによって、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなく、該サンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを決定する工程、
を含む、方法。
【請求項３８】
前記溶解バッファーが前記酸化剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶解バッファーが前記プロテアーゼを含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記酸化剤および前記プロテアーゼが、単一組成物中に処方される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩である、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記発色性物質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、または１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）である、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼか、またはエキソ型プロテアーゼである、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、サーモリシン、スブチリシン、およびウシすい臓プロテアーゼから成る群から選ばれる、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロテアーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物起源の中性プロテアーゼである、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記機能的断片または前記誘導体が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性の少なくとも９０％を保持する、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
血液サンプルにおける総ヘモグロビンに対する総糖化ヘモグロビンのパーセント、または総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって：
ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；
ｂ）テトラゾリウム塩である酸化剤；
ｃ）ヘモグロビンを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に加水分解するプロテアーゼ；
ｄ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼであって、該フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの機能的断片もしくは誘導体であり、該機能的断片もしくは該誘導体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性の少なくとも５０％を保持するものであり、該誘導体は、保存的アミノ酸置換を含む、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；
ｅ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；
ｆ）較正曲線を構築するために使用される、既知パーセントの糖化ヘモグロビン、または既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有する較正因子（単数または複数）、ならびに、
ｇ）請求項３７に記載の方法を実行するための指示書、
を含む、キット。
【請求項５０】
前記酸化剤が、前記溶解バッファーの中に含まれる、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記プロテアーゼが、前記溶解バッファーの中に含まれる、請求項４９または５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記酸化剤および前記プロテアーゼが、単一組成物中に処方される、請求項４９に記載のキット。
【請求項５３】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５４】
前記テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩である、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記発色性物質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、または１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）である、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項４９〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼか、またはエキソ型プロテアーゼである、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、サーモリシン、スブチリシン、およびウシすい臓プロテアーゼから成る群から選ばれる、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記プロテアーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物起源の中性プロテアーゼである、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
前記機能的断片または前記誘導体が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性の少なくとも９０％を保持する、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／８３３，３９０号および２００６年１１月１３日に出願された同第６０／８５８，８０９号（これらの全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府が支援した研究または開発についての陳述
適用していない。
【０００３】
発明の分野
本発明は、血液サンプルにおける糖化ヘモグロビンのパーセントを定量するための直接的酵素アッセイに関する。
【背景技術】
【０００４】
糖化ヘモグロビンは、タンパクを構成するアミノ酸のアミノ基の、還元性糖、例えばアルドースのアルデヒド基との、非酵素的、不可逆的結合によって生産される物質である。例えば、特許文献１を参照されたい。このような非酵素的、不可逆的結合反応は、「アマドリ転位」とも呼ばれ、したがって、前述の糖化タンパクも、ある場合には「アマドリ化合物」と呼ばれることがある。
【０００５】
ある種の疾患の進行、例えば、糖尿病合併症および加齢過程において、タンパクの非酵素的糖化の関与が報告されている（非特許文献１および非特許文献２）。この反応は、糖のアダクトおよび架橋の形成を通じて標的分子の機能不全を招く。インビトロおよびインビボにおける非酵素的糖化においてもっとも重要な「早期」修飾であるアマドリ転位にたいし相当の関心が寄せられている。
【０００６】
糖化タンパクについては種々のアッセイが知られる。例えば、特許文献１によれば、糖化タンパクを含むサンプルを、プロテアーゼＸＩＶ、すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｕｓ由来のプロテアーゼで処理し、その後（または、サンプルを前述のプロテアーゼで処理している間に）ＦＡＯＤ（フラクトシルアミノ酸オキシダーゼ）をサンプルと反応させ、このＦＡＯＤ反応によって消費される酸素の量を測定するか、または、得られる反応産物の量を測定して、糖化タンパクの量を定量する方法が開示される。
【０００７】
別の例では、特許文献２の開示によれば、サンプル中の糖化タンパクの量は、サンプルを、第１に、プロテアーゼとペルオキシダーゼの混合物である試薬と反応させ、第２に、ケトアミンオキシダーゼと反応させることによって定量することが可能である。特許文献２はさらに、この組み合わされたペルオキシダーゼ／プロテアーゼ酵素試薬、およびさらにケトアミンオキシダーゼを含むキットを開示する。特許文献３も、キメラアマドリアーゼを用いて糖化タンパクの量を測定するための方法およびキットを開示する。特許文献４、および特許文献５も、糖化ヘモグロビンを選択的に定量する方法を開示する。
【０００８】
糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを決めるための、以前に記載された方法は、サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することを要求する。糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセント値を決めるために化学分析機を使用する場合、二重チャンネル方式が必要とされる。この方式では、サンプルにおける、１）糖化ヘモグロビンＡ１ｃ濃度、および、２）総ヘモグロビン濃度を定量するために、二つの別々のアッセイが実行され、次いで、ＨｂＡ１ｃのパーセントを得るために、糖化ＨｂＡ１ｃの、総ヘモグロビンに対する比の計算が行われる。
【０００９】
本明細書に引用される特許、特許出願、および出版物は、全て、その全体を、引用することにより本明細書に含める。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，１２７，１３８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，００８，００６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００１４９３５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１６２２４２号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第１３０４３８５号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７）２７２（１９）：１２５０５−７
【非特許文献２】Ｂａｙｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，（１９８９）３０４：１−４１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンのパーセントを、該サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することを要することなく、直接定量する方法を提供する。総ヘモグロビンを別に測定する必要がなく、比計算の工程が必要なくなるので、本発明の方法は、完全に自動化すること、および、単一チャネル方式において各種化学分析機と共に使用することが可能である。
【００１３】
一局面において、本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって、ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤、３）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤、および４）糖化ヘモグロビンを消化して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に変換するプロテアーゼ、に接触させることによって生成され；ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；およびｃ）工程ｂ）において生成される信号を、較正曲線に適用することによって、血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなくサンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを定量する工程、を含む方法を提供する。
【００１４】
ある実施態様では、第１酸化剤は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンか、またはＮ−エチルマレイミドであり、第２酸化剤はテトラゾリウム塩である。
【００１５】
ある実施態様では、溶解バッファーは、第１酸化剤および／または第２酸化剤を含む。ある実施態様では、溶解バッファーは、第１酸化剤、第２酸化剤、およびプロテアーゼを含む。ある実施態様では、溶解バッファーはプロテアーゼを含む。
【００１６】
ある実施態様では、第１酸化剤および第２酸化剤は、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、第１酸化剤および第２酸化剤は、別の組成物中に処方される。ある実施態様では、プロテアーゼは、第１酸化剤または第２酸化剤と共に、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、第１酸化剤、第２酸化剤、およびプロテアーゼは、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、および発色性物質は、単一組成物中に処方される。
【００１７】
別の局面では、本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって、ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）テトラゾリウム塩である第１酸化剤、および３）糖化ヘモグロビンを消化して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に変換するプロテアーゼ、に接触させることによって生成され；ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；およびｃ）工程ｂ）において生成される信号を、較正曲線に適用することによって、血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなくサンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを定量する工程、を含む方法を提供する。
【００１８】
ある実施態様では、溶解バッファーは酸化剤を含む。ある実施態様では、溶解バッファーは、プロテアーゼを含む。ある実施態様では、酸化剤およびプロテアーゼは、単一組成物中に処方される。
【００１９】
ある実施態様では、テトラゾリウム塩は、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩である。
【００２０】
ある実施態様では、発色性物質は、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、または１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）である。
【００２１】
ある実施態様では、血液サンプルは、全血液、または収集血球である。
【００２２】
ある実施態様では、プロテアーゼは、エンド型プロテアーゼであるか、またはエキソ型プロテアーゼである。ある実施態様では、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナニン（ａｎａｎｉｎｅ）、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、スブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、およびウシすい臓プロテアーゼから成る群から選ばれる。ある実施態様では、プロテアーゼは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ起源の中性プロテアーゼである。ある実施態様では、プロテアーゼは、約２から約３０のアミノ酸残基の糖化ペプチドを生成する。ある実施態様では、プロテアーゼは、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基、あるいは、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基を含む糖化ペプチドを生成する。
【００２３】
ある実施態様では、ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００２４】
ある実施態様では、糖化ペプチド、または糖化アミノ酸を含むタンパク断片は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼに、順次、または同時に接触される。
【００２５】
ある実施態様では、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１：
【００２６】
【化１】
0005878096.tif 000002
に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
ある実施態様では、本法は、疾患または障害の予後または診断に使用される。ある実施態様では、該疾患または障害は、糖尿病である。
【００２８】
本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって、ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；ｂ）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤；ｃ）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤；ｄ）ヘモグロビンを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に加水分解するプロテアーゼ；ｅ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；ｆ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；およびｇ）較正曲線を構築するために使用される、既知パーセントの糖化ヘモグロビン、または既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有する較正因子（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）（単数または複数）、を含むキットを提供する。本キットはさらに、本明細書に記載される方法を実行するための指示書を含んでもよい。
【００２９】
ある実施態様では、第１酸化剤および／または第２酸化剤は、溶解バッファーの中に含まれる。ある実施態様では、第１酸化剤および／または第２酸化剤は、プロテアーゼと同じバッファーに含まれる。
【００３０】
別の局面では、本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって、ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；ｂ）テトラゾリウム塩である酸化剤；ｃ）ヘモグロビンを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に加水分解するプロテアーゼ；ｄ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；ｅ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；およびｆ）較正曲線を構築するために使用される、既知パーセントの糖化ヘモグロビン、または既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有する較正因子（単数または複数）、を含むキットを提供する。本キットはさらに、本明細書に記載される方法を実行するための指示書を含んでもよい。
【００３１】
ある実施態様では、酸化剤は溶解バッファーに含まれる。ある実施態様では、プロテアーゼは溶解バッファーに含まれる。ある実施態様では、酸化剤およびプロテアーゼは、単一組成物中に処方される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって：
ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、該血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤、３）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤、および４）糖化ヘモグロビンを消化して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に変換するプロテアーゼ、に接触させることによって生成される、工程；
ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；ならびに、
ｃ）工程ｂ）において生成される信号を、較正曲線に適用することによって、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなく、該サンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを定量する工程、
を含む、方法。
（項目２）
上記第１酸化剤が、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンか、またはＮ−エチルマレイミドであり、上記第２酸化剤がテトラゾリウム塩である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記溶解バッファーが、上記第１酸化剤または上記第２酸化剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記溶解バッファーが、上記第１酸化剤および上記第２酸化剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記溶解バッファーが、上記第１酸化剤、上記第２酸化剤、および上記プロテアーゼを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記溶解バッファーが上記プロテアーゼを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記第１酸化剤および上記第２酸化剤が、単一組成物中に処方される、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記第１酸化剤および上記第２酸化剤が、別の組成物中に処方される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記プロテアーゼが、上記第１酸化剤または上記第２酸化剤と共に、単一組成物中に処方される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記第１酸化剤、上記第２酸化剤、および上記プロテアーゼが、単一組成物中に処方される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、上記ペルオキシダーゼ、および上記発色性物質が、単一組成物中に処方される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩である、項目２に記載の方法。
（項目１３）
上記発色性物質が、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、または１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記血液サンプルが、全血液、または収集血球である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼか、またはエキソ型プロテアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナニン、サーモリシン、スブチリシン、およびウシすい臓プロテアーゼから成る群から選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記プロテアーゼが、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ起源の中性プロテアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記プロテアーゼが、約２から約３０のアミノ酸残基の糖化ペプチドを生成する、項目２に記載の方法。
（項目１９）
上記プロテアーゼが、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基、あるいは、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基を含む糖化ペプチドを生成する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
上記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２１）
上記糖化ペプチド、または糖化アミノ酸を含む、上記タンパク断片が、上記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび上記ペルオキシダーゼに、順次、または同時に接触される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、配列番号１：
【化４】
0005878096.tif 000003
に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
疾患または障害の予後または診断に使用される、項目１に記載の方法。
（項目２４）
上記疾患または障害が、糖尿病である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって：
ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；
ｂ）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤；
ｃ）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤；
ｄ）ヘモグロビンを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に加水分解するプロテアーゼ；
ｅ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；
ｆ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；
ｇ）較正曲線を構築するために使用される、既知パーセントの糖化ヘモグロビン、または既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有する較正因子（単数または複数）、ならびに、
ｈ）項目１に記載の方法を実行するための指示書、
を含む、キット。
（項目２６）
上記第１酸化剤および上記第２酸化剤が、上記溶解バッファーの中に含まれる、項目２５に記載のキット。
（項目２７）
上記第１酸化剤および上記第２酸化剤が、上記プロテアーゼと同じバッファーに含まれる、項目２５に記載のキット。
（項目２８）
上記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、上記ペルオキシダーゼ、および上記発色性物質が、単一組成物中に処方される、項目２５に記載のキット。
（項目２９）
血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって：
ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、該血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）テトラゾリウム塩である酸化剤、および３）糖化ヘモグロビンを消化して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に変換するプロテアーゼ、に接触させることによって生成される、工程；
ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；ならびに、
ｃ）工程ｂ）において生成される信号を、較正曲線に適用することによって、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなく、該サンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを定量する工程、
を含む、方法。
（項目３０）
上記溶解バッファーが上記酸化剤を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記溶解バッファーが上記プロテアーゼを含む、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
上記酸化剤および上記プロテアーゼが、単一組成物中に処方される、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって：
ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；
ｂ）テトラゾリウム塩である酸化剤；
ｃ）ヘモグロビンを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に加水分解するプロテアーゼ；
ｄ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；
ｅ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；
ｆ）較正曲線を構築するために使用される、既知パーセントの糖化ヘモグロビン、または既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有する較正因子（単数または複数）、ならびに、
ｇ）項目２８に記載の方法を実行するための指示書、
を含む、キット。
（項目３４）
上記酸化剤が、上記溶解バッファーの中に含まれる、項目３３に記載のキット。
（項目３５）
上記プロテアーゼが、上記溶解バッファーの中に含まれる、項目３３または３４に記載のキット。
（項目３６）
上記酸化剤および上記プロテアーゼが、単一組成物中に処方される、項目３３に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、単一チャネルＨｂＡ１ｃ酵素アッセイ法の時間経過を示す。
【図２】図２は、酵素によるＨｂＡ１ｃアッセイの較正曲線を示す。Ｘ−軸は、較正サンプルについて既知のグルコシル化Ａ１ｃのパーセントを示し、Ｙ−軸は、７００ｎｍにおける吸光度値について、試薬Ｒ１ａおよびＲ１ｂ添加の８分後および５分後における対応差を示す。
【図３】図３は、実施例１に記載の、単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイと、ＴｏｓｏｈのＨＰＬＣ法との間の相関を示す。Ｙ軸は、サンプルについて、実施例１に記載の単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイによって測定されたＨｂＡ１ｃ値を示し；Ｘ−軸は、対応サンプルについて、ＴｏｓｏｈのＨＰＬＣ法によって測定されたＨｂＡ１ｃ値を示す。
【図４】図４は、実施例２に記載の１酸化剤による酵素ＨｂＡ１ｃアッセイの較正曲線を示す。Ｘ−軸は、較正サンプルについて既知の、糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを示し；Ｙ−軸は、試薬Ｒ１ａおよびＲ１ｂ添加８分後および５分後における吸光度値の対応差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、血液サンプルにおける糖化ヘモグロビンのパーセントを、血液サンプルにおける総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接的に定量するための酵素法を提供する。一局面では、本法は、プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼによって触媒される酵素反応と結合して、血液サンプルにおける、低分子量還元性物質（主に、アスコルビン酸、および遊離チオ含有分子）および高分子量還元性物質（主にヘモグロビン）を選択的に酸化する、二つの異なる型の酸化剤を利用する。別の局面では、本発明は、プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼによって触媒される酵素反応と結合して、血液サンプルにおける、高分子量還元性物質（主にヘモグロビン）を選択的に酸化する、一型の酸化剤を利用する。本発明はさらに、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。
【００３４】
Ａ．定義
別様に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野において通常の技量を有する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書において参照される、全ての特許、特許出願、公開特許出願、およびその他の刊行物は、その全体を参照により本明細書に含める。もしもこのセクションに記載される定義が、本明細書において参照される、特許、特許出願、公開特許出願、およびその他の刊行物に記載される定義に反するか、またはその他の点で一致しない場合は、本セクションに記載される定義が、参照により本明細書に含められる定義に優先する。
【００３５】
本明細書で用いる「ある」は、「少なくとも一つの」、または「一つ以上」を意味する。
【００３６】
本明細書で用いる「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」または（ＦＡＯＤ）は、下記の反応に示すように、アマドリ産物の酸化的脱糖化を触媒し、対応するアミノ酸、グルコソン、および、Ｈ２Ｏ２を生成する酵素を指す：
【００３７】
【化２】
0005878096.tif 000004
上式において、Ｒ１は、還元性糖のアルドース残基を表し、Ｒ２は、アミノ酸、タンパク、またはペプチドの残基を表す。アマドリアーゼの、他の同義語としては、アマドリアーゼ、フルクトシルアミン：酸素オキシドレダクターゼ（ＦＡＯＯ）、およびフルクトシルバリンオキシダーゼ（ＦＶＯ）が挙げられる。本発明の目的のために、「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」という名称が使用されるが、ただし、同様の全ての化学的同義語も考慮の対象とされる。「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」はさらに、アマドリ産物の酸化的脱糖化を触媒し、対応するアミノ酸、グルコソン、およびＨ２Ｏ２を生成する酵素活性を依然として実質的に保持する、機能的断片または誘導体も含有する。通常、機能的断片または誘導体は、そのアマドリアーゼ活性の少なくとも５０％を保持する。機能的断片または誘導体は、そのアマドリアーゼ活性の、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持することが好ましい。さらに、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、その活性を実質的に変えない、保存的アミノ酸置換を含むことが可能であることが意図される。アミノ酸の適切な保存的置換は、当業者には既知であり、得られる分子の生物活性を変えることなく一般的に実行してよい。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非本質的領域における単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変えないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。このような例示の置換は、下記の表１に記載されるものにしたがって実行することが好ましい。
【００３８】
【表１】
0005878096.tif 000005
他の置換も許容可能であり、経験的にか、または、既知の保存的置換にしたがって判断してもよい。
【００３９】
本明細書で用いる「ペルオキシダーゼ」とは、過酸化水素が特異的酸化剤であり、広範な基質が電子供与体として活動する、一群の反応を触媒する酵素を指す。この用語は、その活性を実質的に変えない保存的アミノ酸置換を含有することが意図される。主な市販のペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００４０】
本明細書で用いる「組成物」とは、二つ以上の産物または化合物の、任意の混合物を指す。組成物は、溶液、縣濁液、液体、粉末、ペースト、水溶液、非水溶液、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００４１】
Ｂ．糖化ヘモグロビンのパーセントを直接定量する方法
一局面では、本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって、ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤、３）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤、および４）糖化ヘモグロビンを消化して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に変換するプロテアーゼ、に接触させることによって生成され；ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；およびｃ）工程ｂ）において生成される信号を較正曲線に適用することによって、血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなくサンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを定量する工程、を含む方法を提供する。
【００４２】
別の局面では、本発明は、総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを直接定量するための方法であって、ａ）血液サンプル中の赤血球を溶解バッファーによって分解してヘモグロビンを放出する工程；ｂ）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤によって分解物を酸化する工程；ｃ）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤によって分解物を酸化する工程；ｄ）該分解物をプロテアーゼに接触させて、糖化ペプチドおよび／または糖化アミノ酸を含むタンパク断片を形成する工程；ｅ）該タンパク断片をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程；ｆ）ペルオキシダーゼの存在下、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応において工程ｅ）で生成されるＨ２Ｏ２によって、かつ、未反応の第２酸化剤によって発色性物質を酸化させて測定可能な信号を生成する工程；ｇ）工程ｆ）において生成される信号を評価する工程；および、ｈ）該信号を較正曲線と比較することによって、サンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別途の測定することなしに定量すること、を含む方法を主題とする。
【００４３】
別の局面では、本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量を別途の測定することなく、直接定量するための方法であって、ａ）血液サンプル中の赤血球を溶解バッファーによって分解してヘモグロビンを放出する工程；ｂ）Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンおよび／またはＮ−エチルマレイミドである第１酸化剤によって分解物を酸化する工程；ｃ）テトラゾリウム塩である第２酸化剤によって分解物を酸化する工程；ｄ）該分解物をプロテアーゼに接触させて、糖化ペプチドおよび／または糖化アミノ酸を含むタンパク断片を形成する工程；ｅ）該タンパク断片をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程；ｆ）ペルオキシダーゼの存在下、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応において工程ｅ）で生成されるＨ２Ｏ２によって発色性物質を酸化させて測定可能な信号を生成する工程；ｇ）工程ｆ）において生成される信号を評価する工程；および、ｈ）該信号を較正曲線と比較することによって、サンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別途の測定することなしに定量すること、を含む方法を提供する。
【００４４】
血液サンプルの分解、第１酸化剤による酸化、第２酸化剤による酸化、分解物のプロテアーゼによる断片化は、同時に、または別工程によって行ってもよい。ある実施態様では、サンプル中の赤血球の分解および第１酸化剤による酸化、赤血球の分解および第２酸化剤による酸化、第１酸化剤および第２酸化剤による酸化、または、赤血球の分解および第１酸化剤および第２酸化剤による酸化、を含む諸工程が同時に実行される。ある実施態様では、赤血球の分解およびプロテアーゼによる分解物の断片化、第１酸化剤による酸化およびプロテアーゼによる分解物の断片化、第２酸化剤による酸化およびプロテアーゼによる分解物の断片化、または、第１酸化剤および第２酸化剤による酸化およびプロテアーゼによる分解物の断片化、を含む諸工程が同時に実行される。ある実施態様では、赤血球の分解、第１酸化剤および第２酸化剤による酸化、および分解物の断片化を含む諸工程が同時に実行される。ある実施態様では、第１酸化剤および／または第２酸化剤は、溶解バッファーに含まれるか、または、溶解バッファーの添加と同時に血液サンプルに添加される。ある実施態様では、プロテアーゼも、第１および第２酸化剤と共に溶解バッファーに含まれるか、または、溶解バッファーおよび第１および第２酸化剤が、血液サンプルに添加されるのと同時に、血液サンプルに添加される。ある実施態様では、第１および／または第２酸化剤は、赤血球分解物に添加される前に、プロテアーゼ液と共に同じ溶液中に存在する。ある実施態様では、第１酸化剤および溶解バッファーは、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、プロテアーゼ、および第１酸化剤または第２酸化剤は、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、第１および第２酸化剤は、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、第１および第２酸化剤は、別の単一組成物中に処方される。ある実施態様では、溶解バッファーはプロテアーゼを含むか、またはプロテアーゼは、溶解バッファーが添加されるのと同時に血液サンプルに添加される。
【００４５】
第１酸化剤は、低分子量（分子量＜３０００）の還元性物質を選択的に酸化する一型の酸化剤である。第１酸化剤は、高分子量（分子量＞３０００）の還元性物質よりも、低分子量還元性物質に対してより高度の酸化力を有する。血液サンプルにおける低分子量物質の例としては、アスコルビン酸、および遊離チオ含有分子がある。第１酸化剤の例は、Ｄｅｓｓ−ＭａｒｔｉｎペルヨージナンおよびＮ−エチルマレイミドである。第１酸化剤の他の例は、ヨード酢酸ナトリウム、過ヨウ素酸ナトリウム、およびクロールアミンＴである。ある実施態様では、一つを超える第１酸化剤（例えば、Ｄｅｓｓ−ＭａｒｔｉｎペルヨージナンおよびＮ−エチルマレイミドの両方）が使用される。
【００４６】
第２酸化剤は、高分子量（分子量＞３０００）の還元性物質を選択的に酸化する一型の酸化剤である。第２酸化剤は、低分子量還元性物質よりも、高分子量還元性物質に対してより高度の酸化力を有する。血液サンプルにおける高分子量物質の例はヘモグロビンである。第２酸化剤の例は、テトラゾリウム塩（例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩、または２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩）である。第２酸化剤の他の例として、ドデシル硫酸ナトリウム、フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、およびヨウ素酸カリウムがある。ある実施態様では、一つを超える第２酸化剤が使用される。
【００４７】
別の局面では、本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、該血液サンプル中の総ヘモグロビンを別のプロセスにおいて測定することなく、直接定量するための方法であって、ａ）糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する工程であって、該タンパク断片は、血液サンプルを、１）該血液サンプル中の赤血球からヘモグロビンを放出させる溶解バッファー、２）テトラゾリウム塩である酸化剤、および４）糖化ヘモグロビンを消化して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に変換するプロテアーゼ、に接触させることによって生成され；ｂ）工程ａ）において生成されるＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼの存在下に発色性物質に接触させて測定可能な信号を生成する工程；およびｃ）工程ｂ）において生成される信号を較正曲線に適用することによって、血液サンプル中の総ヘモグロビンを別に測定することなくサンプル中の総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを定量する工程、を含む方法を提供する。本明細書に記載される任意のテトラゾリウム塩を使用してよい。工程ａ）およびｂ）は、順次実行してもよいし、同時に実行してもよい。ある実施態様では、溶解バッファーは酸化剤を含む。ある実施態様では、溶解バッファーはプロテアーゼを含む。ある実施態様では、溶解バッファーは、酸化剤とプロテアーゼを含む。ある実施態様では、酸化剤およびプロテアーゼは、単一組成物中に処方される。
【００４８】
本法を用いて定量することが可能な血液サンプルとしては、全血、または収集血球が挙げられる。血液サンプル中の赤血球は、溶解バッファーにおいて分解されヘモグロビンを放出する。赤血球を溶解し、ヘモグロビンを放出することが可能である限り、いずれの溶解バッファー（例えば、酸性、またはアルカリ性ｐＨ範囲）を使用することも可能である。溶解バッファーは、一般に、界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥ）、およびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）を含む。
【００４９】
本法においては、適切なものであれば、いずれのプロテアーゼの使用も可能である。エンド型プロテアーゼ、またはエキソ型プロテアーゼのいずれも使用することが可能である。例示のエンド型プロテアーゼとしては、トリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＶＩＩ、プロテアーゼＸＸＩ、リシル−エンドペプチダーゼ、プロレザー、およびブロムラインＦが挙げられる。例示のエキソ型プロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼ、またはカルボキシペプチダーゼが挙げられる。一例では、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、アナニン、サーモリシン、スブチリシン、またはウシすい臓プロテアーゼである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｓ，Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｓ，およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｓ由来のメタロプロテアーゼおよび中性プロテアーゼを使用してもよい。
【００５０】
プロテアーゼは、適切であれば、任意のサイズの糖化ペプチドを生成するために使用することが可能である。例えば、プロテアーゼは、約２から約３０アミノ酸残基の糖化ペプチドを生成するために使用することが可能である。別の例では、プロテアーゼは、糖化グリシン、糖化バリンまたは糖化リシン残基、または、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リシン残基を含む糖化ペプチドを生成するために使用される。
【００５１】
糖化ペプチドおよび／または糖化アミノ酸は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに接触させられる。いずれのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を使用することも可能である。フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、精製してもよいし、または、組み換え的に生産してもよい。いずれの天然の生物種を使用してもよい。一実施例では、使用されるＦＡＯＤは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．起源のものである（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３，１９９７を参照されたい）。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ３２８３０（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１９）：１２５０５−１２５０７（１９９７）、および米国特許第６，１２７，１３８号に開示される、他のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを使用することも可能である。アマドリ産物の酸化的脱糖化を触媒して、対応するアミノ酸、グルコソン、およびＨ２Ｏ２を生成する酵素活性を依然として保持する、アマドリアーゼの、機能的断片または誘導体も使用が可能である。
【００５２】
通常、アマドリアーゼの機能的断片または誘導体は、その酵素活性の少なくとも５０％を保持する。アマドリアーゼの機能的断片または誘導体は、その酵素活性の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持することが好ましい。
【００５３】
米国特許出願公開第２００５／００１４９３５号に記載されるＦＡＯＤの酵素活性を有するキメラタンパクのいずれものものも使用することが可能である。ある実施態様では、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、Ｎ末端からＣ末端へ向かって：ａ）約５から約３０アミノ酸残基の、細菌リーダー配列；およびｂ）ＦＡＯＤを含む第２ペプチジル断片を含む。ある実施態様では、ＦＡＯＤは、下記のアミノ酸配列：
【００５４】
【化３】
0005878096.tif 000006
を含む。
【００５５】
このキメラタンパクは、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）において生産してもよい。生産されるタンパクは、精製し、その酵素活性について定量されてもよい。ＦＡＯＤの酵素活性の定量法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）および米国特許第６，１２７，１３８号を参照）。アマドリアーゼの酵素活性の、四つの例示のアッセイがＴａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）に開示される。
【００５６】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼによって触媒される反応によって生成される過酸化水素は、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応によって定量される。発色性物質およびペルオキシダーゼが反応に加えられ、発色性物質は、過酸化水素によって酸化され、キノネイミンまたはＢｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ緑色誘導体などの有色物質、およびＨ２Ｏを形成する。生成されるキノネイミンまたはＢｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ緑色産物の量は、約５００ｎｍから約８００ｎｍ（例えば、７００ｎｍの周辺）の吸光度を測定することによって定量することが可能である。理論によって拘束されることを望むものではないが、血液分解物中の高分子量物質と反応しない第２酸化剤がさらに、この発色性物質と反応して有色産物を形成する場合があり、したがって、測定された吸光度は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセントおよび糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを反映する。発色性物質の例として、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、および１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）がある。ペルオキシダーゼの一例は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００５７】
ある実施態様では、糖化ペプチドおよび／または糖化アミノ酸は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼに、順次または同時に接触させられる。ある実施態様では、ＦＡＯＤ、ペルオキシダーゼ、および発色性物質は、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、ＦＡＯＤ、ペルオキシダーゼ、および発色性物質は、異なる組成物中に処方され、同時に、または異なる時点で反応に添加される。
【００５８】
血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントは、吸光度（例えば、７００ｎｍ周辺の吸光度）を較正曲線と比較することによって決定される。本法を用いると、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントが、該血液サンプルの総ヘモグロビンを別途の測定することなく決定される。較正曲線は、較正因子、すなわち、既知のパーセントの糖化ヘモグロビン、または既知のパーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃを有するサンプル（血液サンプルおよび人工的較正因子を含む）を用いて定められる。例えば、実施例１を参照されたい。
【００５９】
ある実施態様では、較正曲線は、総ヘモグロビンを別途の測定することなく、未知のサンプルと同じ工程を実行することによって、較正サンプルについて信号レベル（例えば、７００ｎｍ周辺の吸光度）を定量し；かつ、較正サンプルの信号レベルと、較正サンプルの既知パーセントの糖化ヘモグロビンまたは既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃの間の相関をグラフに描くことによって調製される。例えば、適切な、より高次の物質との比較によって割り当てられた、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ値のパーセントを有する全血サンプルは、較正因子として使用することが可能である。それとは別に、糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントは、ＨＰＬＣなどの、別の公認された方法によって決めてもよい。較正因子に関して測定される吸光度値は、較正曲線を定めるために、期待されるＨｂＡ１ｃ値に対してプロットされる。
【００６０】
較正曲線を定めるためには、全血サンプル以外の較正因子を使用してもよい。適切な、より高次の参照物質との比較によって割り当てられるパーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃ値を有する、適切に平衡される、タンパク基質液に溶解した、溶血サンプル（分解血液サンプル）、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、および糖化アミノ酸誘導体も、人工的較正因子として使用することが可能である。例えば、較正サンプルは、１０％ＢＳＡ、および、種々のパーセントのＨｂＡ１ｃ（例えば、５％から１２％）に対応する、適切量の合成フルクトシルプロピルアミン（糖化アミノ酸）を有する、リン酸バッファー液として調製してもよい。人工較正因子は、分解工程を使用しなくともよいことを除いては、未知サンプルの場合と同様に試験してもよい。これらの較正因子に関して測定される吸光度値は、較正曲線を定めるために、期待されるＨｂＡ１ｃ値に対してプロットされる。人工較正因子は、有効期限延長のために、凍結化または安定化されてもよい。
【００６１】
本法は、任意の適切な目的のために使用することが可能である。本法は、疾患または障害、例えば、糖尿病の予後または診断において使用されるのが好ましい。
【００６２】
Ｃ．糖化ヘモグロチンパーセント定量用キット
本発明は、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、総ヘモグロビン含量を別途に測定することなく、定量するためのキットであって、ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；ｂ）低分子量還元性物質を選択的に酸化する第１酸化剤；ｃ）高分子量還元性物質を選択的に酸化する第２酸化剤；ｄ）ヘモグロビンを加水分解して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に変換するプロテアーゼ；ｅ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；ｆ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；およびｇ）較正曲線を構築するために使用される、糖化ヘモグロビンまたは糖化ヘモグロビンＡ１ｃ較正因子（単数または複数）（糖化ヘモグロビンの既知パーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃの既知パーセントを有する較正因子（単数または複数））、を含むキットを提供する。
【００６３】
ある実施態様では、第１酸化剤は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンか、またはＮ−エチルマレイミドであり、第２酸化剤はテトラゾリウム塩である。
【００６４】
ある実施態様では、溶解バッファーは、第１酸化剤および／または第２酸化剤を含む。ある実施態様では、溶解バッファーはプロテアーゼを含む。ある実施態様では、溶解バッファーは、第１酸化剤、第２酸化剤、およびプロテアーゼを含む。ある実施態様では、第１酸化剤および第２酸化剤は、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、第１酸化剤および第２酸化剤は、別の組成物中に処方される。ある実施態様では、プロテアーゼは、第１酸化剤および／または第２酸化剤と共に、単一組成物中に処方される。
【００６５】
本発明はさらに、血液サンプルにおける総糖化ヘモグロビンのパーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントを、血液サンプル中の総ヘモグロビン含量の別途の測定を要することなく、直接定量するためのキットであって、ａ）血球を溶解してヘモグロビンを放出させる溶解バッファー；ｂ）テトラゾリウム塩である酸化剤；ｃ）ヘモグロビンを加水分解して糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を含むタンパク断片に変換するプロテアーゼ；ｄ）糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ；ｅ）ペルオキシダーゼおよび発色性物質；およびｆ）較正曲線を構築するために使用される、糖化ヘモグロビンの既知パーセント、または糖化ヘモグロビンＡ１ｃの既知パーセントを有する較正因子（単数または複数）、を含むキットを提供する。ある実施態様では、酸化剤は溶解バッファーに含まれる。ある実施態様では、プロテアーゼは溶解バッファーに含まれる。ある実施態様では、酸化剤およびプロテアーゼは、溶解バッファーに含まれる。ある実施態様では、酸化剤およびプロテアーゼは、単一組成物中に処方される。
【００６６】
ある実施態様では、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼは、単一組成物中に処方される。ある実施態様では、較正因子は、凍結乾燥形状または溶液として存在してもよい、糖化ヘモグロビンＡ１ｃの既知パーセントを有する血液サンプルである。
【００６７】
ある実施態様では、キットは、溶解バッファー、Ｒ１ａ試薬、Ｒ１ｂ試薬、およびＲ２試薬を含む。ある実施態様では、溶解バッファーは、第１酸化剤（例えば、Ｎ−エチルマレイミドおよび／またはＤｅｓｓ  Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン）を含む。ある実施態様では、Ｒ１ａ試薬は、プロテアーゼおよび第１酸化剤（例えば、Ｎ−エチルマレイミドおよび／またはＤｅｓｓ  Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン）を含む。ある実施態様では、Ｒ１ｂ試薬は、第１酸化剤（例えば、Ｎ−エチルマレイミドおよび／またはＤｅｓｓ  Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン）、および第２酸化剤（例えば、テトラゾリウム塩）を含む。ある実施態様では、Ｒ２試薬は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および発色性物質（例えば、ＤＡ−６４）を含む。例えば、溶解バッファーは、０．１〜１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えば、約０．１％、約０．２％、約０．５％、約１％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％）；５〜１００ｍＭ  ＣＨＥＳ（例えば、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ）、ｐＨ約８．７；０．１〜５０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（例えば、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ）；０．１〜５％  ＳＤＳ（例えば、約０．１５％、約０．２５％、約０．３５％、約０．４５％、約０．５５％、約０．７５％、約１％、約２．５％、約５％）；０．００１〜１ＫＵ／ｍｌカタラーゼ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約２Ｕ／ｍｌ、約３Ｕ／ｍｌ、約４Ｕ／ｍｌ、約５Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約５０Ｕ／ｍｌ、約１００Ｕ／ｍｌ、約５００Ｕ／ｍｌ、約１ＫＵ／ｍｌ）；０．００１〜１ＫＵ／ｍｌアスコルビン酸オキシダーゼ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約２Ｕ／ｍｌ、約４Ｕ／ｍｌ、約５Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約５０Ｕ／ｍｌ、約１００Ｕ／ｍｌ、約１ＫＵ／ｍｌ）を含んでもよい。Ｒ１ａ試薬は、０．１〜１０ＫＵ／ｍｌ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐプロテアーゼ（例えば、約０．１ＫＵ／ｍｌ、約２ＫＵ／ｍｌ、約３．０ＫＵ／ｍｌ、約３．５ＫＵ／ｍｌ、約４．０ＫＵ／ｍｌ、約４．５ＫＵ／ｍｌ、約５ＫＵ／ｍｌ、約１０ＫＵ／ｍｌ）；１〜１００ｍＭ  ＭＥＳ（例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ）、ｐＨ約７．０；１〜１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（例えば、約１ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約１０ｍＭ）；０．０１〜１０ｍＭ  Ｄｅｓｓ  Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（例えば、約０．０１ｍＭ、約０．０１５ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ）；０．０１〜５ｍｇ／ｍｌメチル４−ヒドロキシベンゾエートナトリウム塩（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ）；および０．００１〜１ｍｇ／ｍｌゲネティシン（Ｇ４１８）（例えば、約０．００１ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ）を含んでもよい。Ｒ１ｂ試薬は、０．１〜５０ｍＭ  ＭＥＳ水和物（例えば、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、���１．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ）；０．１〜５０ｍＭ  ＷＳＴ−３（２−（４−ヨードぺニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩（例えば、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約２．９ｍＭ、約３．０ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ）；および、０．０１〜１０ｍＭ  Ｄｅｓｓ  Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（例えば、約０．０１ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ）を含んでもよい。Ｒ２試薬は、０．０１〜１０ＫＵ／ｍｌフルクトシルバリンオキシダーゼ（例えば、約０．０１ＫＵ／ｍｌ、約０．０１２ＫＵ／ｍｌ、約０．０１３ＫＵ／ｍｌ、約０．０１３５ＫＵ／ｍｌ、約０．０１４ＫＵ／ｍｌ、約０．０１４５ＫＵ／ｍｌ、約０．０１５ＫＵ／ｍｌ、約０．０１５５ＫＵ／ｍｌ、約０．０１６ＫＵ／ｍｌ、約０．０５ＫＵ／ｍｌ、約０．１ＫＵ／ｍｌ、約１ＫＵ／ｍｌ、約５ＫＵ／ｍｌ、約１０ＫＵ／ｍｌ）；１〜５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ）、ｐＨ約８．０；０．１〜１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えば、約０．１％、約０．２％、約０．５％、約１％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％）；０．０１〜１０ＫＵ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（例えば、約０．０１ＫＵ／ｍｌ、約０．０５ＫＵ／ｍｌ、約０．０８ＫＵ／ｍｌ、約０．０９ＫＵ／ｍｌ、約０．１ＫＵ／ｍｌ、約１．０ＫＵ／ｍｌ、約５ＫＵ／ｍｌ、約１０ＫＵ／ｍｌ）；０．０１〜１０ｍＭ  ＤＡ−６４（例えば、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０７５ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０８５ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ）；および、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌゲネチシン（Ｇ４１８）（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含んでもよい。本キットはさらに、本明細書に記載される方法を実行するための指示書を含んでもよい。本キットは、実施例１に詳述されるように使用されてもよい。
【００６８】
本発明のキットは、適切であれば、任意の包装の中に納められてよい。適切な包装としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、バイアル、瓶、ジャー、屈曲性包装などが挙げられる。キットはさらに、本明細書に記載される方法の内のいずれかを実行するための指示書を含んでもよい。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
単一チャネルＨｂＡ１ｃ酵素アッセイ
この単一チャネルＨｂＡ１ｃ試験は、サンプルが分解され、低分子量および高分子量の信号干渉物質を除去するための薬剤と反応させられる、酵素アッセイである。分解された全血サンプルに対し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐプロテアーゼによる徹底的プロテアーゼ消化が行われる。このプロセスによって、ヘモグロビンβ鎖から、糖化バリンを含むアミノ酸が放出される。次に、糖化バリンは、大腸菌において生産される、特異的組み換えフルクトシルバリンオキシダーゼ（ＦＶＯ）酵素の基質として使用される。この組み換えＦＶＯは、選択的薬剤の存在下に、Ｎ−末端バリンを切断し、過酸化水素を生産することが可能である。次に、この過酸化水素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）触媒反応、および適切な発色源を用いて測定される。ＨｂＡ１ｃ濃度は、適切な較正曲線を用いることによって、直接％ＨｂＡ１ｃとして表される。
【００７０】
Ｉ．試薬の組成
溶解バッファー：５０ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９．４、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３ｍＭ  Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン、および２．５ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド。
【００７１】
試薬Ｒ１ａ：２５ｍＭ  ＭＥＳバッファーｐＨ６．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０００Ｕ／ｍｌ中性プロテアーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、２ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド。
【００７２】
試薬Ｒ１ｂ：２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン、２ｍＭ  ＷＳＴ−３（２−（４−ヨードぺニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造））。
【００７３】
試薬Ｒ２：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、５Ｕ／ｍｌの、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、５０Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ、および０．５ｍＭ発色源  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（製品名ＤＡ−６４、Ｗａｋｏによって製造）。
【００７４】
ＩＩ．アッセイ手順
溶解バッファー（５００μＬ）を、サンプルカップ、またはエッペンドルフ微小遠心管などの適切な容器に投じた。試験前、全血サンプルを穏やかに反転して混合することによって、沈着した赤血球を再縣濁させた。十分に再縣濁させた全血サンプル（４０μＬ）を、適切なパイペッターを用い、泡立てることなく、溶解バッファーと穏やかに混ぜ合わせた。次に、この混合物を室温で５から１０分インキュベートした。混合物が、全く粒状の物質を含まない透明な赤色液となったとき、完全な分解が観察された。
【００７５】
試薬Ｒ１ａおよびＲ１ｂを、使用前に７０：３０容量比で混ぜ合わせた。試薬Ｒ１ｂをＲ１ａに注入し、これらの試薬を穏やかに反転して混ぜ合わせ試薬Ｒ１ａｂを形成した。
【００７６】
試薬Ｒ１ａｂ（１７０μＬ）および分解物（２０μＬ）をキュベットに加え、混ぜ合わせた。このキュベットを３７℃で５分インキュベートした。この反応はさらに室温で実行することが可能である。インキュベーション後、５０μＬの試薬Ｒ２をキュベットに加えた。７００ｎｍにおける吸光度を３分間監視した。較正因子、コントロール、およびサンプルの吸光度値は、Ａ１におけるＯ．Ｄ．値（Ｒ２添加直後の吸光度）から、Ａ２におけるＯ．Ｄ．値（Ｒ２添加３分後の吸光度）を差し引くことによって、すなわち、ΔＡ７００＝（Ａ２−Ａ１）を求めることによって計算した。反応の時間経過を図１に示す。未知サンプルの値は、ＨｂＡ１ｃ％単位で直接表される較正曲線、例えば、図２に示す較正曲線を用いて求めた。
【００７７】
較正曲線（図２）は、前述の手順にしたがって、既知パーセントの糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（６．２５％、１０．００％、および１５．００％）を有する三つの標準サンプルについてΔＡ７００を測定することから得られたデータを用いて作成した。較正因子は、適切な全血材料を、ＨＰＬＣ法を用いてＨｂＡ１ｃ値に関して試験することによって調製した。較正に用いた全血材料は、有効期限延長のために、凍結化または安定化することが可能である。
【００７８】
表２に示すように、前述の方法によって得た、糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセント値（「獲得値」表題のカラム）は、サンプルの期待値と一致する。サンプルの期待値は、ＨＰＬＣによって得た。期待値の範囲は、受容可能な数値範囲を示す。
【００７９】
【表２】
0005878096.tif 000007
ＩＩＩ．単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイの精度
測定精度を、二つの異なる％ＨｂＡ１ｃレベルの新鮮全血サンプル（サンプルＩＤ  １０８１０２８５、低ＨｂＡ１ｃ、およびサンプルＩＤ  １０８１０２４４、高ＨｂＡ１ｃ）について１６回反復して評価した。評価は、Ｈｉｔａｃｈｉ９１７オートアナライザー装置、および、本実施例に記載する単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイを用いて行った。本実験には、正常コントロールおよび病的正常コントロールを含めた。
【００８０】
本実験に使用される、確認された％ＨｂＡ１ｃ値を有する全血サンプルは、保証付き供給業者ＰｒｏＭｅｄＤｘ，ＬＬＣ（１０  Ｃｏｍｍｅｒｃｅ  Ｗａｙ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ０２７６６）から入手し、サンプルには、それを収集するために用いられたプロトコール、インフォームドコンセントがＩＲＢ承認済みであるというＩＲＢ保証書がついていた。
【００８１】
下記の表３は、単一チャネル酵素ヘモグロビンアッセイの精度を示す。
【００８２】
【表３】
0005878096.tif 000008
ＩＶ．単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイの確度
確度を証明するために、個々の全血サンプル（下記にＩＤシリーズを示す）について、単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイを用い、現今市販されるＨｂＡ１ｃ装置（Ｔｏｓｏｈ  Ｇ７：ＨｂＡ１ｃ分散分析モード）である、Ｔｏｓｏｈ  ＨｂＡ１ｃ  ＨＰＬＣアッセイと比較した。この確度実験試験は、Ｈｉｔａｃｈｉ９１７オートアナライザー装置において行った。
【００８３】
本実験に使用される、確認された％ＨｂＡ１ｃ値を有する全血サンプルは、保証付き供給業者ＰｒｏＭｅｄＤｘ，ＬＬＣから入手し、サンプルには、それを収集するために用いられたプロトコール、インフォームドコンセントがＩＲＢ承認済みであるというＩＲＢ保証書がついていた。
【００８４】
この比較実験には３０個の試験サンプルが含まれ、得られた結果を、下記の表４に示す。“Ｔｏｓｏｈ  ％ＨｂＡ１ｃ”は、これらのサンプルについて、Ｔｏｓｈｏ  ＨｂＡ１ｃ  ＨＰＬＣ法を用いて得た数値を示す。“ＤＺ  ％ＨｂＡ１ｃ”は、本実施例に記載される、単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイを用いて得られた対応数値を示す。
【００８５】
【表４】
0005878096.tif 000009
図３は、本実施例に記載される、単一チャネル酵素ヘモグロビンＡ１ｃアッセイを用いて得られたＨｂＡ１ｃ値（％）を、ＴｏｓｏのＨＰＬＣ法によって得られた結果に対してプロットしたグラフを示す。図３に示すように、勾配は１．０５であり；二つの方法の間の相関係数は０．９６であり；ｙ切片は−０．３６７であった。
【００８６】
（実施例２）
１つの酸化剤による単一チャネルＨｂＡ１ｃ酵素アッセイ
本実施例の単一チャネルＨｂＡ１ｃ試験の手順は、血液サンプル中の還元性物質を酸化するためにただ一つの酸化剤を使用したことを除いては、実施例１に記載する手順と同様であった。
【００８７】
Ｉ．試薬の組成
溶解バッファー：５０ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９．４、および２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００。
【００８８】
試薬Ｒ１ａ：２５ｍＭ  ＭＥＳバッファーｐＨ６．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０００Ｕ／ｍｌ中性プロテアーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）。
【００８９】
試薬Ｒ１ｂ：２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および２ｍＭ  ＷＳＴ３（２−（４−ヨードぺニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造））。
【００９０】
試薬Ｒ２：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、５Ｕ／ｍｌの、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、５０Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ、および０．５ｍＭ発色源  （Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（製品名ＤＡ−６４、Ｗａｋｏによって製造）。
【００９１】
ＩＩ．アッセイ手順
溶解バッファー（５００μＬ）を、サンプルカップ、またはエッペンドルフ微小遠心管などの適切な容器に投じた。試験前、全血サンプルを穏やかに反転して混合することによって、沈着した赤血球を再縣濁させた。十分に再縣濁させた全血サンプル（４０μＬ）を、適切なパイペッターを用い、泡立てることなく、溶解バッファーと穏やかに混ぜ合わせた。次に、この混合物を室温で５から１０分インキュベートした。混合物が、全く粒状の物質を含まない透明な赤色液となったとき、完全な分解が観察された。
【００９２】
試薬Ｒ１ａおよびＲ１ｂを、使用前に７０：３０容量比で混ぜ合わせた。試薬Ｒ１ｂをＲ１ａに注入し、これらの試薬を穏やかに反転して混ぜ合わせ試薬Ｒ１ａｂを形成した。
【００９３】
試薬Ｒ１ａｂ（１７０μＬ）および分解物（２０μＬ）をキュベットに加え、混ぜ合わせた。このキュベットを３７℃で５分インキュベートした。インキュベーション後、５０μＬの試薬Ｒ２をキュベットに加えた。７００ｎｍにおける吸光度を３分間監視した。較正因子、コントロール、およびサンプルの吸光度値は、Ａ１におけるＯ．Ｄ．値（Ｒ２添加直後の吸光度）から、Ａ２におけるＯ．Ｄ．値（Ｒ２添加３分後の吸光度）を差し引くことによって、すなわち、ΔＡ７００＝（Ａ２−Ａ１）を求めることによって計算した。反応の時間経過を図１に示す。
【００９４】
図４は、既知パーセントの、糖化ヘモグロビンＡ１ｃに対してプロットした、前述の手順にしたがってサンプルのΔＡ７００を測定して得たデータ（Ｙ−軸）を示す。図４は、糖化ヘモグロビンＡ１ｃのパーセントは、総ヘモグロビンを別途の測定することなく、単一酸化剤テトラゾリウムによる試薬システムを用いて直接定量することも可能であることを示す。ただし、結果（確度および相関）は、実施例１に記載する２酸化剤使用の試薬システムによって得られたものほど良好ではなかった。
【００９５】
上に、明瞭と理解のために、例示と実施例を借りてやや詳細に本発明を記載したわけであるが、当業者には、いくつかの変更および改変が実行可能であることは明白であろう。したがって、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと考えてはならず、範囲は、付属の特許請求項によって定められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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