(57)【要約】  ソフトバイオマスの分解方法、ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法、およびソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群の提供を課題とする。  特定のエキソ型セルラーゼ、エンド型セルラーゼまたはプロセッシブ・エンド型セルラーゼから選ばれる酵素をバガス、稲わら等のソフトバイオマスに接触させる工程を含むことにより、ソフトバイオマスの分解方法を提供する。また、該ソフトバイオマスの分解方法を工程として含むことにより、ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法を提供する。さらに、特定のエキソ型セルラーゼ、エンド型セルラーゼまたはプロセッシブ・エンド型セルラーゼから選ばれる酵素を、ソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群として提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素が配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼであり、該酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含む、ソフトバイオマスの分解方法。
【請求項２】
エキソ型セルラーゼがＥｘｇＳである請求項１に記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項３】
さらに、酵素が配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼであり、該酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含む、請求項１または２に記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項４】
エンド型セルラーゼがＥｎｇＥである請求項３に記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項５】
ソフトバイオマスが稲わらである請求項１〜４のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項６】
さらに、酵素が配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼであり、該酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項７】
プロセッシブ・エンド型セルラーゼがＥｎｇＫである請求項６に記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項８】
ソフトバイオマスがバガスである請求項６または７に記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項９】
酵素をソフトバイオマスに接触させる工程が、次の１）〜３）のいずれかを産生する微生物をソフトバイオマスに接触させることによる、請求項１〜８のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法。
１）エキソ型セルラーゼ
２）エキソ型セルラーゼ及びエンド型セルラーゼ
３）エキソ型セルラーゼ、エンド型セルラーゼ及びプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【請求項１０】
微生物がクロストリジウム  セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）である、請求項９に記載のソフトバイオマスの分解方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法によってソフトバイオマスを分解する工程を含む、ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法。
【請求項１２】
標的物質が、エタノール、酢酸、酪酸、乳酸、蟻酸、水素から選択されるいずれか一種以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
次の１）〜３）のいずれか一種以上を含む、ソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【請求項１４】
エキソ型セルラーゼがＥｘｇＳであり、エンド型セルラーゼがＥｎｇＥであり、プロセッシブ・エンド型セルラーゼがＥｎｇＫである、請求項１３に記載の酵素または酵素群。
【請求項１５】
次の１）および２）を少なくとも含む、請求項１３または１４に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
【請求項１６】
ソフトバイオマスが稲わらである請求項１５に記載の酵素群。
【請求項１７】
次の１）〜３）を少なくとも含む、請求項１３または１４に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【請求項１８】
ソフトバイオマスがバガスである請求項１７に記載の酵素群。
【請求項１９】
次の１）および２）を少なくとも含む、請求項１３または１４に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【請求項２０】
次の１）および２）を少なくとも５：９５〜９５：５の割合で含む、請求項１３または１４に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はソフトバイオマスの分解方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含むソフトバイオマスの分解方法、及び、ソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群に関する。
【背景技術】
【０００２】
木材チップ等の木質バイオマスや、稲わら、バガス等のソフトバイオマスを原料として、エタノール、ブタノール等のアルコールや、乳酸等の有用な物質を製造する技術の開発が広く試みられている。
これらのバイオマス原料から有用な物質を生産するには、バイオマス原料を糖に分解した後、得られた糖を発酵する必要がある。近年、バイオマス原料は主に酵素によって糖化されている。しかし、バイオマス原料はセルロース以外にも様々な夾雑物を含むため、酵素が作用し難いという問題があった。そこで、糖化効率を上げるために、前処理としてバイオマス原料を希硫酸、加圧熱水等で蒸煮処理したり、超臨界アンモニア流体で処理したりする等の様々な方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
また、バイオマス原料の分解にあたり、有用な微生物の開発も試みられている。
例えば、特許文献２では、セルラーゼを産生するトリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を宿主として、アシドサーマス  セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のエンド型セルラーゼ（ＧＨ５）とトリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）とを融合したキメラ酵素を発現させることにより、バイオマス原料に含まれるセルロースの分解能を向上させる方法が開示されている。【０００４】
さらに、バイオマスからエタノール等の有用な物質を得るためには、糖化工程、発酵工程をそれぞれ独立して行う必要があったが、これらを一度に行える技術の開発も試みられている。
例えば、特許文献３では、改変によってセルラーゼの活性を増強し、リグノセルロース系バイオマスを直接加水分解および発酵できる微生物を提供することが開示されている。そして、活性を増強するためのセルラーゼのひとつとして、クロストリジウム  フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）において同定されたヒドロラーゼ等が挙げられており、該ヒドロラーゼをコードするポリヌクレオチド等が開示されている。
また、特許文献４では、人工セルロソームを構築することを目的として、非セルロソーム生産微生物由来のいくつかのセルラーゼと、セルロソーム生産微生物由来のドックリンドメインとを含むキメラ蛋白質を酵母に発現させる技術が開示されている。しかし、この文献においては、酵母で人工セルロソームを構築するには至っていない。【０００５】
セルロソームとは、酵素活性を示さない骨格タンパク質（ＣｂｐＡ）とセルロソーマル酵素群の２種類のコンポーネントからなる酵素複合体のことである。骨格タンパク質（ＣｂｐＡ）は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、Ｃｏｈｅｓｉｎ  ドメイン、ＳＬＨ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌａｙｅｒ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインを有する。セルロソーマル酵素群は骨格タンパク質（ＣｂｐＡ）のＣｏｈｅｓｉｎドメインに結合するためのＤｏｃｋｅｒｉｎドメインを有する。これらが結合して、酵素複合体（セルロソーム）を形成することにより、セルロースやヘミセルロースを効率的に分解することが可能となる。
セルロソームを構築する微生物は、バイオマス原料の分解、発酵において有用な微生物であるといえ、このような微生物として、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ（以下、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓと示す場合がある））等が知られている。【０００６】
クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）はグラム陽性の絶対嫌気性中温菌である。本発明者らは、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）が、同じクロストリジウム属のクロストリジウム  セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）に比べて約１Ｍｂ以上もゲノムサイズが大きいことを確認している（例えば、非特許文献１、参照）。
また、非特許文献２において、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）が、セロビオース等を含む試験試料を発酵することによって、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）等の有用な物質を産生したことが開示されており、エタノールを産生したことも示唆されている。【０００７】
さらに、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）由来のセルロソーマル酵素群として、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ５（ＧＨ５）のエンド型セルラーゼであるＥｎｇＥ（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｅ）、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ９（ＧＨ９）のプロセッシブ・エンド型セルラーゼであるＥｎｇＫ（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｋ）、同ＥｎｇＨ（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｈ）、また、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４８（ＧＨ４８）のエキソ型セルラーゼであるＥｘｇＳ（Ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｓ）等が知られている。
このうち、ＥｎｇＫは、不溶性のセルロースに対して高い活性を示したことが開示されている（例えば、非特許文献３、参照）。また、ＥｘｇＳとＥｎｇＥの混合物、ＥｘｇＳとＥｎｇＨの混合物、ＥｎｇＥとＥｎｇＨの混合物はいずれも、ＥｎｇＥ、ＥｎｇＨまたはＥｘｇＳ単独の場合と比べて結晶セルロースに対して特異的な活性を示したことも開示されている（例えば、特許文献４、参照）。【０００８】
このように、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）や、この微生物由来の酵素または酵素群は、バイオマスの分解、発酵に有用であることが示唆されている。
しかし、木質バイオマス、ソフトバイオマス等のバイオマスは試験試料、不溶性セルロースや結晶セルロース等とは異なり、バイオマスの種類に応じて、セルロース以外にも様々な夾雑物を含んでいるため、これらの実バイオマス（バガス、稲わら等）を直接分解し、発酵することが必ずしも可能であるとはいえなかった。
従って、前処理等の工程を必要とせず、糖化工程、発酵工程をそれぞれ独立して行う必要もない、実バイオマスを直接分解し、発酵できる方法の提供が望まれている。また、実バイオマスの種類に応じて、その分解および発酵が可能な微生物、酵素や酵素群等の提供も望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１６１１２５号公報
【特許文献２】特表２００７−５３０５０号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２９３４５号公報
【特許文献４】特開２０１１−１８２６７５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙ．  Ｔａｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９２，  ９０１−９０２  （２０１０）
【非特許文献２】ＲＯＢＥＲＴ  ＳＬＥＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，  Ｊｕｌｙ  １９８４，  ｐ．８８−９３
【非特許文献３】Ｔａｋａｍｉｔｓｕ  Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００６，  ７１  ｐ．６５４−６６０
【非特許文献４】Ｋｏｉｃｈｉｒｏ  ＭＵＲＡＳＨＩＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｐｔ．  ２００２，  ｐ．５０８８−５０９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はソフトバイオマスのうち、バガス、稲わら等の実バイオマスを、種類に応じて適切に分解できる方法の提供を課題とする。また、該分解方法を含み、エタノール等の有用な物質を標的物質として製造する方法の提供を課題とする。
また、本発明は、ソフトバイオマスの種類に応じて、有用に作用し得る酵素や該酵素の組合せ（酵素群）の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、特定のエキソ型セルラーゼ、エンド型セルラーゼまたはプロセッシブ・エンド型セルラーゼから選ばれる酵素をバガス、稲わら等のソフトバイオマスに接触させることにより、これらの実バイオマスが直接分解できることを見出し、本発明のソフトバイオマスの分解方法を提供するに至った。また、本発明者らは、該分解方法を含むことにより、バガス、稲わら等のソフトバイオマスからエタノール等の有用な物質を標的物質として製造できることを見出した。
そして、本発明者らは、さらに、バガス、稲わら等のソフトバイオマスの種類に応じて有用に作用し得る酵素や酵素群も見出した。【００１３】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（２０）に示される、ソフトバイオマスの分解方法、ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法、または、ソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群等に関する。
（１）酵素が配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼであり、該酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含む、ソフトバイオマスの分解方法。
（２）エキソ型セルラーゼがＥｘｇＳである上記（１）に記載のソフトバイオマスの分解方法。
（３）さらに、酵素が配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼであり、該酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含む、上記（１）または（２）に記載のソフトバイオマスの分解方法。
（４）エンド型セルラーゼがＥｎｇＥである上記（３）に記載のソフトバイオマスの分解方法。
（５）ソフトバイオマスが稲わらである上記（１）〜（４）のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法。
（６）さらに、酵素が配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼであり、該酵素をソフトバイオマスに接触させる工程を含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法。
（７）プロセッシブ・エンド型セルラーゼがＥｎｇＫである上記（６）に記載のソフトバイオマスの分解方法。
（８）ソフトバイオマスがバガスである上記（６）または（７）に記載のソフトバイオマスの分解方法。
（９）酵素をソフトバイオマスに接触させる工程が、次の１）〜３）のいずれかを産生する微生物をソフトバイオマスに接触させることによる、上記（１）〜（８）のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法。
１）エキソ型セルラーゼ
２）エキソ型セルラーゼ及びエンド型セルラーゼ
３）エキソ型セルラーゼ、エンド型セルラーゼ及びプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
（１０）微生物がクロストリジウム  セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）である、上記（９）に記載のソフトバイオマスの分解方法。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のソフトバイオマスの分解方法によってソフトバイオマスを分解する工程を含む、ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法。
（１２）標的物質が、エタノール、酢酸、酪酸、乳酸、蟻酸、水素から選択されるいずれか一種以上である、上記（１１）に記載の方法。
（１３）次の１）〜３）のいずれか一種以上を含む、ソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
（１４）エキソ型セルラーゼがＥｘｇＳであり、エンド型セルラーゼがＥｎｇＥであり、プロセッシブ・エンド型セルラーゼがＥｎｇＫである、上記（１３）に記載の酵素または酵素群。
（１５）次の１）および２）を少なくとも含む、上記（１３）または（１４）に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
（１６）ソフトバイオマスが稲わらである上記（１５）に記載の酵素群。
（１７）次の１）〜３）を少なくとも含む、上記（１３）または（１４）に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
（１８）ソフトバイオマスがバガスである上記（１７）に記載の酵素群。
（１９）次の１）および２）を少なくとも含む、上記（１３）または（１４）に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
（２０）次の１）および２）を少なくとも５：９５〜９５：５の割合で含む、上記（１３）または（１４）に記載のソフトバイオマスを分解するための酵素群。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、前処理等を必要とせず、簡便な手順により、ソフトバイオマスを直接分解し、また、エタノール等の有用な物質を製造することが可能となる。また、本発明により、ソフトバイオマスの種類に応じて有用に作用し得る酵素や酵素群を提供することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓにおける、ソフトバイオマスを原料とした標的物質の産生結果を示した図である（実施例１）。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である（実施例２）。
【図３】Ａ．ＣＢＢ染色の結果を示した図である（実施例３）。Ｂ．ウエスタンブロットの結果を示した図である（実施例３）。
【図４】ｐ−ニトロフェニル−β−グルコトシドに対する定性的な酵素活性の結果を示した図である（実施例３）。
【図５】ＡＳＣ活性の評価結果を示した図である。（実施例３）。
【図６】酵素の相乗作用の結果を示した図である（実施例４）。
【図７】セロビオース存在下での酵素の相乗作用の結果を示した図である（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明における「ソフトバイオマスの分解方法」とは、稲わら、バガス等の従来知られているソフトバイオマスに含まれるセルロースを酵素によって分解するための方法のことをいう。
本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」は、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」をソフトバイオマスに接触させる工程を含む「ソフトバイオマスの分解方法」であればよく、その他の工程を含んでいても良い。
【００１７】
ここで、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」において、「９０％以上の同一性のあるアミノ酸配列」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と他のアミノ酸配列を、可能な限り多数のアミノ酸残基が相互に一致するように並列させて比較した場合に、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上のアミノ酸残基が同一であるアミノ酸配列を意味する。ここで、アミノ酸配列を並列させる際には、最大の同一性を与えるようにギャップを含んでもよい。
また、この「９０％以上の同一性のあるアミノ酸配列」は、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよいが、さらに、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列も、本発明の「同一性を有するアミノ酸配列」に含むことができ、特に、「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」が好ましいアミノ酸配列とされる。
さらに、この「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」には、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」を含むことができる。このようなアミノ酸配列としては、基準となる配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。更に好ましくは１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００１８】
このようなアミノ酸配列を含む酵素として、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」としては、例えば、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）等を由来とする、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４８（ＧＨ４８）のＥｘｇＳ等が挙げられる。
このＥｘｇＳは、配列番号１で示される塩基配列によってコードされている。本発明において、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」は塩基配列によっても特定することができる。該エキソ型セルラーゼをコードする塩基配列であれば、配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、８５％以上の同一性を有する塩基酸配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列、さらには９５％以上の同一性を有する塩基配列も、本発明の「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」をコードする塩基配列に含まれる。
【００１９】
さらに、本発明における「ソフトバイオマスの分解方法」は「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」をソフトバイオマスに接触させる工程を含む「ソフトバイオマスの分解方法」であってもよく、その他の工程を含んでいても良い。
ここで、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」において、「９０％以上の同一性のあるアミノ酸配列」とは、配列番号４で示されるアミノ酸配列と他のアミノ酸配列を、可能な限り多数のアミノ酸残基が相互に一致するように並列させて比較した場合に、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上のアミノ酸残基が同一であるアミノ酸配列を意味する。ここで、アミノ酸配列を並列させる際には、最大の同一性を与えるようにギャップを含んでもよい。
【００２０】
また、この「９０％以上の同一性のあるアミノ酸配列」は、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよいが、さらに、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列も、本発明の「同一性を有するアミノ酸配列」に含むことができ、特に、「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」が好ましいアミノ酸配列とされる。
さらに、この「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」には、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」を含むことができる。このようなアミノ酸配列としては、基準となる配列番号４で示されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。更に好ましくは１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２１】
このようなアミノ酸配列を含む酵素として、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」としては、例えば、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）等を由来とする、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ５（ＧＨ５）のＥｎｇＥ等が挙げられる。
このＥｎｇＥは、配列番号３で示される塩基配列によってコードされている。本発明において、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」は塩基配列によっても特定することができる。該エンド型セルラーゼをコードする塩基配列であれば、配列番号３で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、８５％以上の同一性を有する塩基酸配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列、さらには９５％以上の同一性を有する塩基配列も、本発明の「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」をコードする塩基配列に含まれる。
【００２２】
さらに、本発明における「ソフトバイオマスの分解方法」は「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」をソフトバイオマスに接触させる工程を含む「ソフトバイオマスの分解方法」であってもよく、その他の工程を含んでいても良い。
ここで「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」において、「９０％以上の同一性のあるアミノ酸配列」とは、配列番号６で示されるアミノ酸配列と他のアミノ酸配列を、可能な限り多数のアミノ酸残基が相互に一致するように並列させて比較した場合に、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上のアミノ酸残基が同一であるアミノ酸配列を意味する。ここで、アミノ酸配列を並列させる際には、最大の同一性を与えるようにギャップを含んでもよい。
【００２３】
また、この「９０％以上の同一性のあるアミノ酸配列」は、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよいが、さらに、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列も、本発明の「同一性を有するアミノ酸配列」に含むことができ、特に、「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」が好ましいアミノ酸配列とされる。
さらに、この「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」には、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」を含むことができる。このようなアミノ酸配列としては、基準となる配列番号６で示されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。更に好ましくは１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２４】
このようなアミノ酸配列を含む酵素として、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」としては、例えば、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）等を由来とする、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ９（ＧＨ９）のＥｎｇＫ等が挙げられる。
このＥｎｇＫは、配列番号５で示される塩基配列によってコードされている。本発明において、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」は塩基配列によっても特定することができる。該プロセッシブ・エンド型セルラーゼをコードする塩基配列であれば、配列番号５で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、８５％以上の同一性を有する塩基酸配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列、さらには９５％以上の同一性を有する塩基配列も、本発明の「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」をコードする塩基配列に含まれる。
【００２５】
本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」において、「酵素をソフトバイオマスに接触させる」とは、ソフトバイオマスを分解するために酵素が作用し得るように、酵素をソフトバイオマスに接触させることをいう。
ここで、本発明における「ソフトバイオマス」とは、稲わら、バガス、麦わら、籾殻、エリアンサス、ミスカンサス、ネピアグラス、ソルガム、コーンストバー等のソフトバイオマスそのもの、または、これらをそのまままたは適切な大きさに裁断して水、バッファー等の溶媒に懸濁したもの（ソフトバイオマス懸濁液）等のことをいう。
また、これらのソフトバイオマスやソフトバイオマス懸濁液に、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｔｒｙｐｔｏｎ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ等の成分を加えて、本発明の実施例と同様に調製した、基質が稲わらの培地や基質がバガスの培地等も本発明の「ソフトバイオマス」に含むことができる。
【００２６】
酵素をソフトバイオマスに接触させる方法としては、ソフトバイオマスを分解するために酵素が作用し得るように酵素がソフトバイオマスに接触する方法であればよく、従来知られているいずれの方法であってもよい。
例えば、本発明の「ソフトバイオマス」がソフトバイオマスそのもの、またはソフトバイオマスを適切な大きさに裁断しただけのものである場合には、酵素または酵素を含む溶液に該ソフトバイオマスを浸漬する、酵素または酵素を含む溶液を該ソフトバイオマスに注射等によりインジェクションする、酵素または酵素を含む溶液を該ソフトバイオマスに振りかける等の方法が挙げられる。また、酵素をソフトバイオマスに接触させる際、または接触させた後に、必要に応じて、減圧、加圧等の圧力処理により、酵素をソフトバイオマスの中に浸透させてもよい。
本発明の「ソフトバイオマス」が、基質が稲わらである培地や、基質がバガスである培地等の場合には、該培地に酵素または酵素を含む溶液を添加する、該培地と酵素または酵素を含む溶液を混合する等の方法が挙げられる。
なお、この「酵素をソフトバイオマスに接触させる」方法には、酵素または酵素を含む溶液に限らず、該酵素または酵素群を産生する微生物を上記と同様の方法等でソフトバイオマスに接触させる方法も含まれる。
【００２７】
これらの「酵素をソフトバイオマスに接触させる」方法は、酵素が「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」でも、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」でも、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」であも同様であり、これらを酵素群としてソフトバイオマスに接触させる場合であっても同様である。
【００２８】
本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」では、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」とをソフトバイオマスに接触させる工程を含んでいても良い。
この工程では、それぞれの酵素がソフトバイオマスの分解にあたり最適な割合で接触できればよく、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５等の割合で接触させても良い。
【００２９】
これらの酵素は上記に列挙したような方法でソフトバイオマスに接触させることができる。これらの接触にあたり、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」をソフトバイオマスに接触させた後に、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を該ソフトバイオマスに接触させてもよい。この場合、酵素のソフトバイオマスへの接触の順番は逆であってもよい。
また、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」とを同時にソフトバイオマスに接触させてもよい。
さらに、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマスと、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマスとをそれぞれ作成した後、両者を混合してもよい。
【００３０】
これらの接触方法には、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」を産生する微生物と、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を産生する微生物とをそれぞれソフトバイオマスに接触させる場合が含まれる。
また、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」とを産生する微生物をソフトバイオマスに接触させる場合も含まれる。
【００３１】
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」とをソフトバイオマスに接触させる工程を含む「ソフトバイオマスの分解方法」において、各酵素または酵素群を接触させるソフトバイオマスは従来知られているいずれのものであってもよいが、稲わらであることが特に好ましい。
【００３２】
また、本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」では、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」と、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とをソフトバイオマスに接触させる工程を含んでいても良い。この工程では、それぞれの酵素がソフトバイオマスの分解にあたり最適な割合で接触できれば良い。
【００３３】
これらの酵素は上記に列挙したような方法でソフトバイオマスに接触させることができる。これらの接触には、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」をソフトバイオマスに接触させた後に、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を該ソフトバイオマスに接触させて、その後さらに、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を該ソフトバイオマスに接触させてもよい。この場合、酵素のソフトバイオマスへの接触の順番はいずれであってもよい。
【００３４】
また、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とを同時にソフトバイオマスに接触させてもよい。
さらに、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマス、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマスと、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマスとをそれぞれ作成した後、これらを混合してもよい。
【００３５】
これらの接触方法には、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」を産生する微生物、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を産生する微生物と、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を産生する微生物をそれぞれソフトバイオマスに接触させる場合が含まれる。
また、これらの接触方法には、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」とを産生する微生物、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とを産生する微生物、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とを産生する微生物をそれぞれソフトバイオマスに接触させる場合も含まれる。
さらに、これらの接触方法には、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」のいずれも産生する微生物をソフトバイオマスに接触させる場合も含まれる。
【００３６】
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」と、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とをソフトバイオマスに接触させる工程を含む「ソフトバイオマスの分解方法」において、各酵素または酵素群を接触させるソフトバイオマスは従来知られているいずれのものであってもよいが、バガスであることが特に好ましい。
【００３７】
さらに、本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」では、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とをソフトバイオマスに接触させる工程を含んでいても良い。
この工程では、それぞれの酵素がソフトバイオマスの分解にあたり最適な割合で接触できればよく、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５等の割合で接触させても良い。
【００３８】
これらの酵素は上記に列挙したような方法でソフトバイオマスに接触させることができる。これらの接触にあたり、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」をソフトバイオマスに接触させた後に、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を該ソフトバイオマスに接触させてもよい。この場合、酵素のソフトバイオマスへの接触の順番は逆であってもよい。
また、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とを同時にソフトバイオマスに接触させてもよい。
さらに、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマスと、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を接触させたソフトバイオマスとをそれぞれ作成した後、両者を混合してもよい。
【００３９】
これらの接触方法には、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」を産生する微生物と、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を産生する微生物とをそれぞれソフトバイオマスに接触させる場合が含まれる。
また、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とを産生する微生物をソフトバイオマスに接触させる場合も含まれる。
【００４０】
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とをソフトバイオマスに接触させる工程を含む「ソフトバイオマスの分解方法」において、各酵素または酵素群を接触させるソフトバイオマスは稲わら、バガス等の従来知られているいずれのものであってもよい。
【００４１】
本発明における、次の１）〜３）のいずれかを産生する微生物をソフトバイオマスに接触させることによる、ソフトバイオマスの分解方法において、該微生物は、次の１）〜３）のいずれかを産生する微生物であれば、従来知られているいずれの微生物であってもよいが、セルロソームを構築できる微生物であることが好ましい。セルロソームを構築できる微生物である、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）であることが特に好ましい。
なお、次の１）〜３）において「エキソ型セルラーゼ」とは「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」のことを指し、「エンド型セルラーゼ」とは「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」のことを指し、また、「プロセッシブ・エンド型セルラーゼ」とは「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」のことを指す。
１）エキソ型セルラーゼ
２）エキソ型セルラーゼ及びエンド型セルラーゼ
３）エキソ型セルラーゼ、エンド型セルラーゼ及びプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【００４２】
本発明の「ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法」は、本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」によってソフトバイオマスを分解する工程を含んでいればよく、その他の工程を含んでいても良い。本発明の「ソフトバイオマスから標的物質を製造する方法」は、ソフトバイオマスを分解した後、分解によって得られた糖等を発酵し、そのまま標的物質を製造できる方法であることが好ましい。
本発明における「標的物質」とは、本発明の「ソフトバイオマスの分解方法」を経て得られる化合物等であればいずれのものであっても良い。例えば、エタノール、酢酸、酪酸、乳酸、蟻酸、水素等を本発明の「標的物質」として挙げることができる。
【００４３】
本発明の「ソフトバイオマスを分解するための酵素または酵素群」とは、稲わら、バガス等のソフトバイオマスを分解できる酵素または酵素群のことをいい、ソフトバイオマスに含まれるセルロースをグルコース等に分解する酵素または酵素群等が挙げられる。
この本発明の「酵素または酵素群」は、次の１）〜３）のいずれか一種以上を含む酵素または酵素群であればよい。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ
【００４４】
このうち、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」としては、例えば、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）等を由来とする、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４８（ＧＨ４８）のＥｘｇＳ等が挙げられる。
また、「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」としては、例えば、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）等を由来とする、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ５（ＧＨ５）のＥｎｇＥ等が挙げられる。
さらに、「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」としては、例えば、クロストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）等を由来とする、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ９（ＧＨ９）のＥｎｇＫ等が挙げられる。
【００４５】
上記のうち、ソフトバイオマスを分解するための「酵素群」として、上記１）および２）を少なくとも含む酵素群が挙げられる。この酵素群において、上記１）および２）の各酵素はソフトバイオマスの分解にあたり最適な割合で含まれていればよく、例えば、上記１）の「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と上記２）の「配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエンド型セルラーゼ」を５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５，４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５等の割合で含んでいても良い。このような「酵素群」が分解するソフトバイオマスは、従来知られるいずれのソフトバイオマスであってもよいが、稲わらであることが特に好ましい。
【００４６】
また、ソフトバイオマスを分解するための「酵素群」として、上記１）〜３）を少なくとも含む酵素群も挙げられる。この酵素群において、上記１）〜３）の各酵素はソフトバイオマスの分解にあたり最適な割合で含まれていれば良い。このような「酵素群」が分解するソフトバイオマスは、従来知られるいずれのソフトバイオマスであってもよいが、バガスであることが特に好ましい。
【００４７】
さらに、ソフトバイオマスを分解するための「酵素群」として、上記１）および３）を少なくとも含む酵素群も挙げられる。この酵素群において、上記１）および３）の各酵素はソフトバイオマスの分解にあたり最適な割合で含まれていればよく、例えば、上記１）の「配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むエキソ型セルラーゼ」と上記３）の「配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一性のあるアミノ酸配列を含むプロセッシブ・エンド型セルラーゼ」を５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５等の割合で含んでいても良い。このような「酵素群」が分解するソフトバイオマスは、稲わら、バガス等の従来知られるいずれのソフトバイオマスであってもよい。
なお、これらの「酵素群」は、稲わら、バガス等のソフトバイオマスを分解するために作用する際に、セルロソームを構築していることが特に望ましい。
【００４８】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【実施例１】
【００４９】
＜Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓにおける、ソフトバイオマスを原料とした標的物質の産生＞
１．培地
１）基質が稲わらの培地
非特許文献２を参照して、以下の（１）〜（４）の工程により、０．５％（ｗ／ｖ）の基質が稲わらの培地を調製した。
（１）Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２０，１ｇ；ＮＨ４Ｃｌ，１ｇ；ＫＣｌ，０．５ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０．５ｇ；Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ，０．１５ｇ；Ｔｒｙｐｔｏｎ，０．５ｇ；ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，０．５ｇ；稲わら，５ｇ；ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２０ｍｌ；ｒｅｓａｚｕｒｉｎ，０．００１ｇを蒸留水で溶解して１Ｌに調整した。
（２）上記（１）工程の後、４Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整し、ｒｅｓａｚｕｒｉｎが還元される（培地の色が赤色から黄色に変わる）まで沸騰させながら、ＣＯ２ガスを吹き込んだ。
（３）上記（２）の工程の後、フラスコに栓をして、オートクレーブで滅菌した。
（４）上記（３）の工程の後、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｎａ２ＣＯ３と１．５％（ｗ／ｖ）Ｎａ２Ｓ  ９Ｈ２Ｏを含む混合溶液０．０５ｍｌを加えて、ｐＨ７．２とした。これにより、０．５％（ｗ／ｖ）の基質が稲わらの培地を得た。【００５０】
２）前培養用培地
上記１）基質が稲わらの培地の調製方法において、稲わらを除いて（１）〜（３）の工程を行った後、セロビオースを終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように添加した。これにより、セロビオースを含む前培養用培地を調製した。【００５１】
２．試料の調製
１）上記１．２）の前培養用培地でクリストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）を３７℃、１日間前培養した。
２）上記１）の培養後の培地の一部をそれぞれ、上記１．１）の基質が稲わらの培地に投入して、さらに３７℃で１ヶ月間静置培養を行った。
３）上記２）の培養後遠心分離（１５，０００ｘｇ、１５分、４℃）にて培養上清を回収し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ（０．４５μｍ）でフィルターろ過し、１μＬをガスクロマトグラフィーに供した。
ガスクロマトグラフィーのカラムはＲＴ（登録商標）−Ｑ−ＢＯＮＤ（ＲＥＳＴＥＫ製）を用い、ＳＰＬ温度を２５０℃、カラム温度を１５０℃、ＦＩＤ温度を２５０℃として、キャリヤーガスとしてＮ２を線速度３０ｃｍ／ｓｅｃで流し、エタノールおよびブタノール濃度を測定した。【００５２】
その結果、図１に示したように、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓにおいて、基質が稲わらの培地においてエタノールが９０．２２９ｐｐｍの濃度で検出された。従って、この結果より、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓが稲わらを分解し、発酵することにより、実バイオマスである稲わらから直接エタノールを生産できることが示唆された。
【実施例２】
【００５３】
＜基質に応じて適切に作用する酵素または酵素群の特定＞
１．培地
１）基質がバガスの培地
稲わらではなく、バガス，５ｇを基質とした以外は、実施例１の基質が稲わらの培地の調製方法と同様に、０．５％（ｗ／ｖ）の基質がバガスの培地を調製した。
２）基質が稲わらの培地
実施例１と同様の方法により、０．５％（ｗ／ｖ）の基質が稲わらの培地を調製した。
３）前培養用培地
実施例１と同様の方法により、０．３％（ｗ／ｖ）のセロビオースを含む前培養用培地を調製した。【００５４】
２．試料の調製
１）上記１．３）の前培養用培地でクリストリジウム  セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）を３７℃、１日間前培養した。
２）上記１）の培養後の培地の一部をそれぞれ、上記１．１）の基質がバガスの培地、または上記１．２）の基質が稲わらの培地に投入して、さらに３７℃で一定時間静置培養を行った。
３）上記２）の培養後の培地より遠心分離によって培養上清を回収し、硫安沈殿法により培養上清に含まれる全てのタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を洗浄した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）に溶解し、タンパク質溶液を得た。
４）上記３）のタンパク質溶液を上清画分とし、さらに上清画分にセルロースとしてＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１（シグマ・アルドリッジ製）（以下、Ａｖｉｃｅｌと示す場合がある）を加え、４℃で１時間保温し、遠心沈殿でＡｖｉｃｅｌと上清を分離した。この上清部分をセルロース非吸着画分（以下、非吸着画分とする場合がある）とした。また、沈殿したＡｖｉｃｅｌに吸着しているタンパク質をＳＤＳ−ＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒに溶解し、これをセルロース吸着画分（以下、吸着画分とする場合がある）とした。【００５５】
３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記２．で調製した試料（上清画分、セルロース非吸着画分、およびセルロース吸着画分）をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ染色を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色は常法に従って行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて特に濃く見られたバンドを選択し、バカスおよび稲わらの吸着画分において、これらに共通して見られた濃いバンド（図１、Ｂ１、Ｂ４、Ｒ１、Ｒ２）と、バガスの吸着画分において、顕著に濃く見られたバンド（図１、Ｂ２）、さらにほぼバガスの吸着画分のみに濃く見られたバンド（図１、Ｂ３）をそれぞれ切り出し、滅菌蒸留水でＣＢＢ脱色液を洗い流した。【００５６】
４．タンパク質の特定
上記３．にて切り出したそれぞれのバンドに含まれるタンパク質のアミノ酸配列を高速液体クロマトグラフ質量分析装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック製  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  ＥＴＤ）にて決定した。
決定されたアミノ酸配列をＣ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓゲノム配列と照合し、各バンドに含まれるタンパク質を特定し、結果を表１に示した。【００５７】
【表１】
2013121875.tif 000002
【００５８】
５．解析結果
Ｂ１、Ｒ１は同じ位置のバンドであり、ピルビン酸フェレドキシオキドレダクターゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ／ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をタンパク質として含んでいることが特定された。ピルビン酸フェレドキシオキドレダクターゼは、ピルビン酸から酢酸とＡＴＰを生産するために使われる一般的な嫌気性菌の代謝酵素である。【００５９】
Ｂ２は、配列表において、配列番号４のアミノ酸配列で示されるＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ５（ＧＨ５）のＥｎｇＥをタンパク質として含んでいることが特定された。
ＥｎｇＥはエンド型セルラーゼであり、ゲノム解析において、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓゲノム中のセルロソーム遺伝子クラスター外に存在する主要なエンドグルカナーゼであることが確認されている。さらに、図１において、基質が稲わらの培地由来の試料においても同じ位置にバンドが確認されることから、ＥｎｇＥがセルロソームの主要構成成分である可能性が高いと考えられた。【００６０】
また、Ｂ３は、配列表において、配列番号６のアミノ酸配列で示されるＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ９（ＧＨ９）のＥｎｇＫをタンパク質として含んでいることが特定された。
ＥｎｇＫは、プロセッシブ・エンド型セルラーゼであり、ゲノム解析において、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓゲノム中のセルロソーム遺伝子クラスターに含まれることが確認されている。ＥｎｇＫはＣＢＭを保有しているがＣｂｐＡのＣＢＭとはファミリーが異なる（ＣｂｐＡのファミリー：ＣＢＭ３、ＥｎｇＫのファミリー：ＣＢＭ４＿９）。【００６１】
さらに、Ｂ４、Ｒ２も同じ位置のバンドであり、配列表において、配列番号２のアミノ酸配列で示されるＧｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ４８（ＧＨ４８）のＥｘｇＳをタンパク質として含んでいることが特定された。
ＥｘｇＳは、エキソ型セルラーゼであり、ゲノム解析において、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓゲノム中のセルロソーム遺伝子クラスターに含まれるセルロソーマル酵素であることが確認されている。ＥｘｇＳはＣＢＭ（セルロース結合モジュール）を保有していないことから、ＣｂｐＡのＣＢＭがＡｖｉｃｅｌに吸着し、吸着したＣｂｐＡのｃｏｈｅｓｉｎドメインにＥｘｇＳのｄｏｃｋｅｒｉｎドメインが結合した状態で回収されたことが示唆された。
なお、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのゲノム解析において、セルロソーム遺伝子クラスターでは、ＥｘｇＳ、ＥｎｇＨ、その後にＥｎｇＫという順番に酵素がコードされているが、今回の系ではＥｎｇＨは検出されなかった。【００６２】
したがって、これらの結果より、稲わらの分解には、配列番号２のアミノ酸配列で示されるエキソ型セルラーゼ（ＥｘｇＳ）と、配列番号４のアミノ酸配列で示されるエンド型セルラーゼ（ＥｎｇＥ）が重要であることが示唆された。
また、バガスの分解には、配列番号２のアミノ酸配列で示されるエキソ型セルラーゼ（ＥｘｇＳ）、配列番号４のアミノ酸配列で示されるエンド型セルラーゼ（ＥｎｇＥ）と、配列表配列番号６のアミノ酸配列で示されるプロセッシブ・エンド型セルラーゼ（ＥｎｇＫ）が重要であることが示唆された。
【実施例３】
【００６３】
＜酵素の相乗作用の確認−１＞
１．ＢｇｌＡ、ＥｘｇＳおよびＥｎｇＫの各酵素発現の確認
以下の１）〜５）の工程により、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉを宿主として、組換えＢｇｌＡ、ＥｘｇＳおよびＥｎｇＫをそれぞれ発現した。
１）低温発現用ベクターであるｐＣｏｌｄ−ＴＦ（タカラバイオ）の可溶化タグであるＴｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒの下流にｂｇｌＡ（配列番号７）、ｅｘｇＳ（配列番号１）またはｅｎｇＫ（配列番号５）をそれぞれ挿入し、発現用ホストＥ．ｃｏｌｉ  ｏｒｉｇａｍｉに遺伝子導入した。
２）上記１）の遺伝子導入したＥ．ｃｏｌｉ  ｏｒｉｇａｍｉについて、コロニーダイレクトＰＣＲ法により、各遺伝子が導入されたコロニーをスクリーニングし、５ｍｌ  ＬＢ培地（アンピシリン添加（終濃度１００μｇ／ｍｌ））に接種した。
３）上記２）の各遺伝子が導入されたコロニーを、３７℃、１８０ｒｐｍで６時間培養した後、培養液１ｍｌを５００ｍｌ  ２×ＹＴ培地（アンピシリン添加（終濃度１００μｇ／ｍｌ））に接種した。
対数増殖期（ＯＤ６００＝０．４５〜０．５）に達したところで１５℃、１８０ｒｐｍで３０分間保温した後、終濃度１．０ｍＭとなるようＩＰＴＧを加えタンパク質発現を誘導し、１５℃、１８０ｒｐｍで２４時間保温した。
４）上記３）の蛋白質発現が誘導された各菌を、遠心沈殿（１０，０００×ｇ，、４℃、１０分）で集菌し、８ｍｌの２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に懸濁した。
温度が上がらないよう氷冷しながらおよそ３００秒間ソニケーションし、懸濁液を遠心沈殿（２０，０００×ｇ、４℃、３０分）し、上清を可溶性画分とした。沈殿を８ｍｌの同リン酸バッファーに懸濁し、沈殿をソニケーションし不溶性画分とした。
５）上記４）において得られたそれぞれの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色および免疫染色で目的タンパク質の有無を確認した。【００６４】
その結果、図３、ＡにＣＢＢ染色の結果として示したように、可溶性画分において各タンパク質（ＢｇｌＡ、ＥｘｇＳまたはＥｎｇＫ）が発現しており、発現量が増大していることが確認された。
また、この各タンパク質（ＢｇｌＡ、ＥｘｇＳまたはＥｎｇＫ）に対し、常法により、抗Ｈｉｓ抗体によってウエスタンブロットした結果を図３、Ｂに示した。その結果、不溶性画分において各タンパク質（ＢｇｌＡ、ＥｘｇＳまたはＥｎｇＫ）の発現が抑えられていることが確認された。【００６５】
２．ＥｘｇＳおよびＥｎｇＫの酵素活性の測定
上記１．において得られたそれぞれの可溶性画分における定性的な酵素活性を、以下の１）または２）によりそれぞれ評価した。
１）β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性は、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−グルコトシド溶液１ｍｌに各タンパク質（ＢｇｌＡ、ＥｘｇＳまたはＥｎｇＫ）の可溶性画分を１０μｌ添加し、３７℃で５分間保温した後、溶液の色の変化を観察することで評価した。
２）セルラーゼ活性は、次のように評価した。
１．５ｍｌチューブに分注した４９０μｌの２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に、５％（ｗ／ｖ）リン酸膨潤Ａｖｉｃｅｌ（ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：ＡＳＣ）を加え、酵素溶液を表２に示した通りに加えた。
その後、３７℃、１８０ｒｐｍで１８時間保温した後、ＤＮＳ法を用いて遊離した還元糖量を測定した。【００６６】
【表２】
2013121875.tif 000003
【００６７】
ｐ−ニトロフェニル−β−グルコトシドに対する定性的な酵素活性の結果を図４に示した。その結果、図４に示されるように、試験区ｂ（ｂｇｌＡ遺伝子を導入した大腸菌（形質転換体）から得られた可溶性画分を加えたもの）のみが黄色に発色したことから、この形質転換体にのみβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が認められた。
また、ＡＳＣ活性の評価結果の結果を図５に示した。その結果、図５に示されるように、ＥｘｇＳ（ＧＨ  ｆａｍｉｌｙ  ４８）は単独ではほぼセルラーゼ活性を示さなかった。一方、ＥｎｇＫ（ＧＨ  ｆａｍｉｌｙ  ９）単独ではごくわずかにセルラーゼ活性を示した。さらに、両者を混合することでＡＳＣの分解に相乗効果が見られ、還元糖の優位な増加による高いセルラーゼ活性が検出された。
従って、これらの結果から、組換え体のＥｘｇＳおよびＥｎｇＫはβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性は有さなかったが、両者を組み合わせることにより、高いセルラーゼ活性を示すことが確認できた。
【実施例４】
【００６８】
＜酵素の相乗作用の確認−２＞
１．ＥｘｇＳ、ＥｎｇＥおよびＥｎｇＫの各酵素発現の確認
以下の１）〜５）の工程により、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉを宿主として、組換えＥｘｇＳ、ＥｎｇＥおよびＥｎｇＫをそれぞれ発現した。
１）低温発現用ベクターであるｐＣｏｌｄ−Ｉ（タカラバイオ）にｅｘｇＳ（配列番号１）、ｅｎｇＥ（配列番号３）またはｅｎｇＫ（配列番号５）をそれぞれ挿入し、発現用ホストＥ．ｃｏｌｉ  ｏｒｉｇａｍｉに遺伝子導入した。
２）上記１）の遺伝子導入したＥ．ｃｏｌｉ  ｏｒｉｇａｍｉについて、コロニーダイレクトＰＣＲ法により、各遺伝子が導入されたコロニーをスクリーニングし、５ｍｌ  ＬＢ培地（アンピシリン添加（終濃度１００μｇ／ｍｌ））に接種した。
３）上記２）の各遺伝子が導入されたコロニーを、３７℃で１０時間培養した後、培養液１ｍｌを５００ｍｌ  ２×ＹＴ培地（アンピシリン添加（終濃度１００μｇ／ｍｌ））に接種し、対数増殖期（ＯＤ６００＝０．５）に達するまで、１４０ｒｐｍで振盪培養した。その後、速やかに４℃に冷却して３０分放置した後、終濃度０．５ｍＭとなるようＩＰＴＧを加えタンパク質発現を誘導し、１５℃、１４０ｒｐｍで２４時間保温した。
４）上記３）の蛋白質発現が誘導された各菌を、遠心沈殿（８，０００×ｇ、４℃、１０分）で集菌し、５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．３）に懸濁した。
温度が上がらないよう氷冷しながらおよそ３００秒間ソニケーションし、懸濁液を遠心沈殿（１，０００×ｇ、３分）し細胞断片等を除去した後、１５，０００×ｇ、６０分間遠心沈殿して不溶性画分を回収した。不溶性画分のペレットに０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４、８Ｍ  Ｕｒｅａ）を加え、沈殿をソニケーションによって完全に懸濁した後、４℃で２４時間保温し変性・可溶化させた。
５）上記４）において得られたそれぞれの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色により目的タンパク質の有無を確認した。その結果、各タンパク質（ＥｘｇＳ、ＥｇＥまたはＥｎｇＫ）の多くが不溶性画分で発現していることが確認された。【００６９】
２．酵素の精製
上記１．において、８Ｍ尿素（和光純薬）で可溶化しなかった各酵素のタンパク質を遠心沈殿（１５，０００×ｇ、６０ｍｉｎ）で除去し、再生セルロース膜による透析を４℃で２４時間行った。この透析ではリフォールディングｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．０、１．５ｍＭ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ（和光純薬））を４回交換した。
不溶化したタンパク質を、再度遠心沈殿（１５，０００×ｇ、６０ｍｉｎ）によって除去した後、１０％ストレプトマイシン（和光純薬）溶液（０．１５ｍｌ／ｍｌ）を加え、４℃で１時間保温した後、遠心沈殿（１５，０００×ｇ、６０ｍｉｎ）で沈殿物を除去した。
その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色および免疫染色で目的タンパク質の有無を確認した結果、各酵素の精製タンパク質（ＥｘｇＳ、ＥｇＥまたはＥｎｇＫ）が得られたことが確認できた。【００７０】
３．ＥｘｇＳ、ＥｎｇＥおよびＥｎｇＫの酵素活性の測定
上記２．において精製された各酵素を様々な比で混合し、結晶性セルロースＡｖｉｃｅｌ（Ｍｅｒｃｋ）から調製したリン酸膨潤セルロース（ＡＳＣ：ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）に対する酵素活性の相乗効果の有無を調べた。
すなわち、１．５ｍｌチューブに１Ｍ  ＣａＣｌ２  ２．５μｌ、２０ｍＭ  酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．３、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）１７５μｌ、ＡＳＣ（セルロース含量２％：セルロース終濃度０．５％）６２．５μｌを加えて３７℃で２０分保温した。
これに、上記２．において精製された各酵素をそれぞれ組み合わせ、混合比１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、０：１００の割合で混合した混合酵素溶液を１０μｌ（終濃度１．６ｍＭ）加え、３７℃で１７時間、１４０ｒｐｍで振盪しながら保温した。この割合は、ＥｘｇＳの分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を８０．４ｋＤａ、ＥｎｇＥの分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を３１．５ｋＤａ、ＥｎｇＫの分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を９７．１ｋＤａとして換算し、酵素の終濃度が１．６ｍＭとなるように調整した比であった。１７時間反応後、１００℃、５分で酵素反応を停止後、溶液中に含まれる還元糖量をＤＮＳ法を用いてセロビオース換算で測定した。【００７１】
その結果、図６、Ａ．に示されるように、ＥｘｇＳとＥｎｇＥを組み合わせた場合には、ＥｎｇＥとＥｘｇＳを７５：２５の割合で組み合わせのとき（図６、Ａ．Ｓ２５Ｅ７５）に最も高い相乗効果が見られた。しかし、図６、Ｂ．に示されるように、ＥｎｇＥとＥｎｇＫを組み合わせた場合には、いずれの割合であっても相乗効果はほとんど見られなかった。そして、図６、Ｃ．に示されるようにＥｘｇＳとＥｎｇＫの組み合わせた場合には、ＥｎｇＫとＥｘｇＳを７５：２５の割合で組み合わせのとき（図６、Ｃ．Ｋ７５Ｓ２５）に最も高い相乗効果が見られた。
したがって、この結果から、ＥｘｇＳとＥｎｇＥ、またはＥｘｇＳとＥｎｇＫを適切な割合で組み合わせることにより、酵素活性が相乗的に高まることが確認できた。
【実施例５】
【００７２】
＜酵素の相乗作用の確認−３＞
セロビオースはエキソ型セルラーゼ（セロビオヒドラーゼ：ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の酵素活性阻害物質として知られており、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来ＣｅｌＳに関する研究が行われており、セロビオース濃度５％ではその酵素活性は１／１０以下になるとの報告がされている。そこで、活性阻害物質であるセロビオース存在下におけるＥｘｇＳ、ＥｎｇＥ、ＥｎｇＫの酵素活性の相乗効果への影響を調べた。
すなわち、１．５ｍｌチューブに２．５μｌ  １Ｍ  ＣａＣｌ２、１８．２５μｌ  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０％または０．５％セロビオース（図７：０ｍｇ／ｍｌまたは５．０ｍｇ／ｍｌ））、６２．５μｌ  ＡＳＣ（セルロース含量２％：セルロース終濃度０．５％）を加えて３７℃で２０分保温した。
その後、上記実施例４、２．と同様に精製したＥｘｇＳ、ＥｎｇＥまたはＥｎｇＫをそれぞれ混合比１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、０：１００の割合で混合した混合酵素溶液（終濃度１．６ｍＭ）を１０μｌ加え、３７℃で１７時間保温した。この割合は、ＥｘｇＳの分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を８０．４ｋＤａ、ＥｎｇＥの分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を３１．５ｋＤａ、ＥｎｇＫの分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を９７．１ｋＤａとして換算し、酵素の終濃度が１．６ｍＭとなるように調整した比であった。
１７時間反応後、１００℃、５分で酵素反応を停止させた後、溶液中に含まれる還元糖量をＤＮＳ法を用いてセロビオース換算で測定した。【００７３】
結果を図７に示した。このグラフのｙ軸は反応溶液中のセロビオース濃度と加えられた酵素のモル数の比が示されており、ｘ軸は加えられた酵素とその比がアルファベットと数値でそれぞれ示されている。ｘ軸のアルファベットはｓ、ｅ、ｋがそれぞれＥｘｇＳ、ＥｎｇＥ、ＥｎｇＫを示しており、それに続く数値は加えられた酵素１．６ｍＭのうちの、その酵素の比率を表している。例えば、ｅ７５ｋ２５は、加えられた酵素１．６ｍＭのうち、ＥｎｇＥがその７５％、ＥｎｇＫがその２５％を占めていることを意味する。
棒グラフの違いは反応液中の初期セロビオース濃度を示しており、黒塗りのバーは初期セロビオース濃度が０ｍｇ／ｍであったもの、点のバーは初期セロビオース濃度５ｍｇ／ｍｌであったものを示している。
これらの結果のうち、酵素を単独で加えた場合に対するセロビオース活性の比率と、特にセロビオースによる活性阻害が低かった酵素比率（ＥｎｇＫ：ＥｘｇＳ＝７５：２５または５０：５０）について表３に示した。その結果、単独で酵素を加えた場合には、その活性がＥｘｇＳ、ＥｎｇＥ、ＥｎｇＫにおいてそれぞれ１９％、８％、１０％となり、上述のＣｅｌＳと同等の活性阻害を受けることが確認できた。しかし、ＥｘｇＳとＥｎｇＫの混合比が２５：７５（図７、ｋ７５ｓ２５）や５０：５０（図７、ｋ５０ｓ５０）の場合には、その活性阻害が緩やかになり、それぞれ４４％、４１％という高い酵素活性を維持していることが確認できた。【００７４】
【表３】
2013121875.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のソフトバイオマスの分解方法は、前処理等を必要としない、簡便な手順によるソフトバイオマスの分解方法として、幅広く活用することができる。また、本発明のソフトバイオマスの分解方法を工程として含むことにより、ソフトバイオマスから、エタノール等の有用な物質を製造することも容易となる。また、ソフトバイオマスの種類に応じて有用に作用し得る酵素や酵素群を提供することもできる。
【符号の説明】
【００７６】
［図２］
Ｍ：タンパク質マーカー、
１：Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ培養上清の上清画分（基質：バガス）
２：Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ培養上清の上清画分（基質：稲わら）
３：非吸着画分（基質：バガス）
４：非吸着画分（基質：稲わら）
５：吸着画分（基質：バガス）
６：吸着画分（基質：稲わら）
Ｂ１、Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４、Ｒ１、Ｒ２：バンド切り出し部分
［図３］
Ｍ：Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ
ｂ：ｂｇｌＡ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
Ｓ：ｅｘｇＳ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
Ｋ：ｅｎｇＫ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
［図４］
ｂ：ｂｇｌＡ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
Ｓ：ｅｘｇＳ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
Ｋ：ｅｎｇＫ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
Ｎ１：２０ｍｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）
Ｎ２：Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
［図５］
ＥｘｇＳ：ｅｘｇＳ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
ＥｎｇＫ：ｅｎｇＫ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
ＥｘｇＳ＋ＥｎｇＫ：ｅｘｇＳ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＋  ｅｎｇＫ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｏｒｉｇａｍｉ）  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ：２０ｍｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ７．４）
［図６］
Ａ．Ｓ１００：ＥｘｇＳ  １００％、Ｓ７５Ｅ２５：ＥｘｇＳ  ７５％、ＥｎｇＥ  ２５％、Ｓ２５Ｅ７５：ＥｘｇＳ  ２５％、ＥｎｇＥ  ７５％、Ｅ１００：ＥｎｇＥ  １００％
Ｂ．Ｅ１００：ＥｎｇＥ  １００％、Ｅ７５Ｋ２５：ＥｎｇＥ  ７５％、ＥｎｇＫ  ２５％、Ｅ２５Ｋ７５：ＥｎｇＥ  ２５％、ＥｎｇＫ  ７５％、Ｋ１００：ＥｎｇＫ  １００％
Ｃ．Ｋ１００：ＥｎｇＫ  １００％、Ｋ７５Ｓ２５：ＥｎｇＫ  ７５％、ＥｘｇＳ  ２５％、Ｋ２５Ｓ７５：ＥｎｇＫ  ７５％、ＥｘｇＳ  ２５％、Ｓ１００：ＥｘｇＳ  １００％
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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